Анализ Вариабельности Генома Рода Pisum И Родственных Видов Трибы Fabeae (Vicieae) (Сем.Fabaceae)

Федеральное государственное учреждение «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук»

УДК 575.174.015.3:575.113.2:577.21

на правах рукописи

Дьяченко Елена Андреевна

Анализ вариабельности генома рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae (Vicieae) (сем.Fabaceae)

03.02.07 — Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: д.б.н., профессор Кочиева Е.З.

Москва – 2017 2

СОДЕРЖАНИЕ

Введение. 4 Глава 1. Обзор литературы. 10 1.1. Морфо-физиологические особенности и распространение 10 представителей рода Pisum. 1.2. Проблемы таксономии рода Pisum. 12 1.3. Таксономические проблемы трибы Fabeae. 17 1.4. Оценка генетической вариабельности P. sativum. 19 1.5. Характеристика генома рода Pisum. 23 1.6. Строение цитоплазматических геномов P. sativum и родственных видов 31 Fabeae. Глава 2. Материалы и методы. 35 2.1.Растительный материал. 35 2.2. Выделение растительной ДНК и РНК. 45 2.3. Проведение мультилокусного анализа. 45 2.4. Амплификация и секвенирование участков ядерного и 47 цитоплазматических геномов. 2.5. Проведение РВ-ПЦР. 49 Глава 3. Результаты и обсуждение 50 3.1. Оценка полиморфизма ядерного генома рода Pisum методами 50 мультилокусного анализа. 3.1.1. Анализ ядерного генома представителей рода Pisum методом 50 мультилокусного AFLP маркирования 3.1.2. Оценка полиморфизма семейства генов резистентности рода P. 63 sativum методом мультилокусного RGA анализа. 3.2 Анализ вариабельности участков ядерного и цитоплазматических 69 геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. 3.2.1. Анализ полиморфизма последовательности внутренних 73 транскрибируемых спейсеров рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 у рода Pisum и родственных видов Fabeae. 3.2.2. Анализ вариабельности хлоропластного генома у представителей 76

рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. 3.2.3. Комбинированный кластерный анализ на основе 94 последовательностей ядерного и хлоропластного геномов представителей трибы Fabeae 3.2.4. Анализ последовательности b/c интрона митохондриального гена 97 nad1 у образцов рода Pisum и родственных родов трибы Fabeae. 3.3. Идентификация, анализ полиморфизма и изучение экспрессии гена 104 сахарозосинтазы (Sus1) у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Заключение 117 Выводы 120 Список сокращений 122 Список литературы 123

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность и степень разработанности темы исследования. В настоящее время оценка генетического разнообразия культивируемых и дикорастущих растений является одним из приоритетных направлений биологии и имеет несомненное научное и практическое значение. Существующее генетическое разнообразие у дикорастущих сородичей культурных растений может успешно использоваться в качестве источника важных агрономических признаков, в том числе устойчивости к биотическим и абиотическим стрессам. Современные молекулярные методы позволяют оценивать геномное разнообразие культивируемых видов, маркировать и отбирать ценные генотипы, что значительно облегчает целенаправленный селекционный процесс. В настоящее время зернобобовые культуры по объемам производства уступают лишь зерновым (www.fao.org/faostat). Триба Fabeae, включающая пять родов: Pisum, Vavilovia, Lathyrus, Vicia и Lens, насчитывает наибольшее количество возделываемых видов зернобобовых, таких как горох, чина, чечевица, вика и др. Среди представителей трибы Fabeae одно из лидирующих мест в агрокультуре занимает горох посевной (Pisum sativum), являясь одной из основных бобовых культур в России и в мире. Как и все бобовые, горох богат белком (23-25%), медленноусвояемым крахмалом, клетчаткой, витаминами и минералами, является надежным источником антиоксидантов, противовоспалительных веществ, каротиноидов, омега-3 и омега-6 жирных кислот (Dahl et al., 2012). Горох посевной имеет достаточно широкий ареал возделывания и в настоящее время его успешно выращивают в разных почвенно-климатических зонах. По данным FAO всего в мире в 2014 году было произведено более 17 млн. т зеленого горошка и более 11 млн. т сушеного гороха. Лидерами по производству сухого гороха в последнее десятилетие являются Канада, Франция, Россия и Китай. В РФ в 2013-2014 гг. посевные площади гороха занимали 0,8-1,0 млн. га, а валовый сбор составил около 1,5 млн. т. (www.fao.org/faostat). Помимо пищевого и кормового, горох имеет важное агротехническое значение. Симбиоз гороха с азотфиксирующими бактериями снижает использование азотных

удобрений, обогащая почву азотом, тем самым он является хорошим предшественником для любых сельскохозяйственных культур. Анализ генетического разнообразия P. sativum, находящегося в коллекциях генетических центров, имеет огромное значение. Существующие и возделываемые в настоящее время сорта горохам, могут иметь достаточно узкий генпул (Cieslarova et al., 2011, 2012; Hagenblad et al., 2014). При этом мировые коллекции располагают значительным набором генотипов существующего видового природного разнообразия, являющиеся потенциальными донорами ценных признаков. Однако генетическое разнообразие, представленное в мировых коллекциях гороха, в настоящее время недостаточно изучено. К 2017 году полный анализ, в том числе и молекулярный, был проведен в основном для коллекции генбанка JIC (Великобритания) (Jing et al., 2010), а также основной части коллекции генбанка CZE (Чехия) (Smycal et al., 2012). Исследования других коллекций включали в основном ограниченные выборки образцов. Коллекция гороха Всероссийского института генетических ресурсов растений имени Н. И. Вавилова (ВИР) (Россия), считающаяся наиболее представительной мировой коллекцией по количеству образцов гороха (более 6,8 тысяч) также не подвергалась детальному молекулярному анализу биоразнообразия. В связи с этим оценка генетического разнообразия генофонда мировых коллекций, в том числе и ВИРа, имеет огромное значение для селекции гороха. Горох возделывается уже более 10 тыс. лет и является предметом многих исследований на протяжении шести веков, включая работы Г. Менделя. Однако сохраняется еще много вопросов относительно структуры генома и его вариабельности. Несмотря на то, что P. sativum является классическим генетическим объектом, полногеномная последовательность его еще не определена, хотя были секвенированы и проанализированы шесть транскриптомов P.sativum (Alves-Carvalho et al., 2015; Kerr et al., 2017). Был секвенирован и аннотирован пластидный геном P. sativum, однако митохондриальный геном все еще остается неизвестен. При этом достаточно хорошо были исследованы и охарактеризованы мобильные элементы генома P.sativum (Macas et al., 2007; Novak et al., 2010). В настоящее время достаточно полно описаны гены нодуляции, участвующие в процессе симбиотической азотфиксации (Борисов и др, 1994; Сидорова и др., 2008; Krusell et al., 2011), гистоновые гены (Bogdanova et al., 2007; Zaytseva et al., 2015.). Однако практически нет

данных о полиморфизме других семейств генов, таких как гены резистентности, транскрипционных факторов и др. Также в настоящее время крайне мало данных о последовательностях генома другого представителя рода Pisum – P.fulvum, который является источником устойчивости к фитопатогенам, таким как ржавчина (Barilli et al., 2009, 2010), мучнистая роса (Fondevilla et al., 2007b) и аскохитоз (Carrillo et al., 2013). Также, несмотря на большое количество исследований, остается открытым вопрос таксономии как рода Pisum, так и трибы Fabeae. В целом методы молекулярной биологии широко используются как для решения как таксономических проблем, так и изучения генетической вариабельности у различных семейств растений (Werner, 2016). Однако проведенные молекулярные исследования так однозначно не определили таксономию гороха и трибы Fabeae. Исходя из выше изложенного, исследование генетического разнообразия гороха, представленного в коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова крайне актуально и имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Полученные данные могут быть использованы для прояснения вопросов, связанных с таксономией и филогенией рода, выявления селекционно-ценных генотипов и аллельных вариантов генов. Таким образом, целью работы являлся анализ геномной вариабельности рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Для этого были поставлены следующие задачи: 1. Провести оценку межвидового полиморфизма образцов рода Pisum методом мультилокусного AFLP анализа; определить таксономический состав рода Pisum и определить положение образцов спорного таксономического ранга. 2. Провести оценку внутривидового полиморфизма селективно-нейтральных (AFLP-метод) и адаптивно-значимых (RGA-профайлинг) участков генома дикорастущих образцов P.sativum из природных популяций различного географического происхождения из коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова и сортов отечественной и зарубежной селекции. 3. Провести оценку межвидового и внутривидового полиморфизма участков ядерного (ITS), хлоропластного (trnH-psbA, rpoB-trnC, trnY-trnE-trnT, ген trnL) и митохондриального (b\c интрон гена nad1) геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.

4. Определить и охарактеризовать полногеномные последовательности генов- гомологов фермента сахарозосинтазы (Sus1) у видов трибы Fabeae, определить паттерны экспрессии гена сахарозосинтазы в различных органах у образцов вида P. sativum, отличающихся по уровню симбиотической активности.

Научная новизна и практическая значимость. В диссертационной работе проведен комплексный молекулярный мультилокусный и монолокусный анализ вариабельности ядерного и цитоплазматических геномов видов рода Pisum. Впервые был оценен уровень вариабельности селективно-нейтральных (AFLP маркирование) и адаптивно-значимых (RGA маркирование) участков генома у дикорастущих образцов P.sativum коллекции ВИР им. Н.И.Вавилова, охватывающий природный и культигенный ареал вида, а также сортов гороха посевного. Впервые выявлены группы дикорастущих образцов и сортов P.sativum с наиболее различающимися генотипами и пулами R-генов. Анализ последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров генов рДНК позволил впервые выявить наличие 6 гаплотипов P.sativum. Впервые были получены и охарактеризованы последовательности четырех участков (trnH-psbA, rpoB-trnC, trnY-trnE-trnT, ген trnL.) пластома у образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Впервые определена вторичная структура интрона гена trnL (интрон группы I) видов трибы Fabeae, охарактеризованы функциональные участки и петли интрона trnL и показано наличие пяти вариантов вторичной структуры P6 петли. Впервые были определены первичные последовательности и уровни вариабельности b/c интрона митохондриального гена nad1 (интрон группы II) рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Охарактеризованы последовательности ключевых доменов и мотивов. Впервые получены и охарактеризованы полные последовательности гена сахарозосинтазы (Sus1) и соответствующие аминокислотные последовательности Sus1 у видов трибы Fabeae; определен уровень полиморфизма кодирующей последовательности генов сахарозосинтазы. Была определена предполагаемая третичная структура белка и охарактеризована ее структура. Впервые был проведен анализ экспрессии гена сахарозосинтазы в различных органах растения у образцов

P.sativum с различным уровнем симбиотической активности. Практическая значимость работы состоит в идентификации дикорастущих образцов и сортов P.sativum, имеющих наиболее сходные и различные генотипы (данные AFLP анализа) или наборы генов/аллельных вариантов R-генов устойчивости (данные RGAанализа). Использование полученных молекулярно-генетических данных для подбора родительских пар при селекции гороха позволит повысить эффективность и сократить время, требуемое для создания сортов и линий. Методология и методы исследований. Методология работы спланирована в соответствии с поставленными целями и задачами. Мультилокусный и монолокусный анализ и статистическая обработка данных проводились согласно стандартным современным методикам. Подробно методология и методы исследования отражены в разделе «Материалы и методы». Положения, выносимые на защиту: 1. Выявлены группы дикорастущих образцов и сортов P.sativum (коллекция ВИР им. Н.И. Вавилова), имеющих наиболее сходные и различные генотипы (данные AFLP-маркирования) и наборы генов/аллельных вариантов R-генов устойчивости (данные RGA-маркирования).

2. Отсутствует зависимость между кластеризацией образцов P.sativum, определенной по данным мультилокусного AFLP- и RGA-анализа, и их географическим происхождением. 3. Наиболее полиморфным из 4 участков (межгенные спейсеры trnH-psbA, rpoB- trnC, trnY-trnE-trnT, ген trnL) хлоропластного генома представителей трибы Fabeae является rpoB-trnC. Хлоропластный геном образцов Pisum отличался более консервативными последовательностями данных участков по сравнению с другими родами трибы. 4. У анализируемых видов Fabeae показано наличие пяти типов вторичной структуры P6 петли интрона trnL (интрон группы I). Последовательность b/c интрона митохондриального гена nadI у видов Fabeae слабо полиморфна;

выявленные SNP и индели не изменяют топологию вторичной структуры b/c интрона (интрон группы II). 5. Гены-гомологи сахарозосинтазы (Sus1) 13 видов трибы Fabeae содержат 13 экзонов, кодирующих аминокислотную последовательность, содержащую 806

а.о. Экспрессия Sus1 различна у образцов P.sativum, отличающихся уровнем симбиотической активности. Последовательность Sus1 может быть использована для проведения межродовых филогенетических исследований у Fabaceae. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях, в том числе на III Московской Международной Конференции «Molecular Phylogenetics MolPhy-3» (г. Москва, 2012), VI съезде ВОГиС (г. Ростов-на-Дону, 2014), IV Международной научно-практической конференции «Современные тенденции в селекции и семеноводстве овощных культур. Традиции и перспективы» (Московская обл., Одинцовский р-н, п. ВНИИССОК, 2015), 5-й конференции, посвященной памяти профессора А. К. Скворцова (г. Москва, 2016). По теме диссертации было опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 – в рецинзируемых изданиях, рекомендованных ВАК.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. 1.1. Морфо-физиологические особенности и распространение представителей рода Pisum. Род Pisum (Горох) является одним из пяти родов трибы трибы Fabeae (сем Fabaceae) Среди представителей рода есть как однолетние, так и двулетние и многолетние виды (Говоров, 1937; Макашева, 1962, 1975). При этом выделяемые виды, подвиды и разновидности имеют схожее морфологическое строение, за исключением некоторых особенностей (Макашева, 1962,1975). Горох является самоопыляемой культурой, при этом опыление происходит в закрытом цветке. При неблагоприятных условиях (например, при сухой и жаркой погоде) может происходить перекрестное опыление, в этом случае опыление происходит в основном благодаря пчелам и некоторым другим насекомым. Подвиды и более таксоны рода Pisum более низкого ранга, как правило, различаются сочетанием морфологических признаков (форма листочков, толщина и длина стебля, его разветвленность, наличие антоциановой окраски, цвет и рисунок семян, восковой налет и др). Например, отличительной особенностью вида P. abyssinicum является наличие зубчатого края у листочков и прилистников, а вид P. elatius имеет более длинные стебель и междоузлия по сравнению с другими представителями Pisum (Фёдоров, 1975; Макашева, 1979). Естественный ареал P.sativum простирается от Ирана и Туркменистана через Переднюю Азию, северную Африку и южную Европу (Макашева, 1979; Maxted, Ambrose, 2000; Maxted et al., 2010). Однако из-за раннего культивирования (~ 10- 11 тыс. лет) крайне сложно определить точное местонахождение центра его разнообразия, особенно учитывая, что значительная часть Средиземноморского региона и Ближнего Востока была существенно изменена деятельностью человека и меняющимися климатическими условиями (Maxted et al., 2010). Другой вид, P. elatius (горох высокий), распространен преимущественно в Средиземноморье, Средней Азии, на побережье Крыма и Кавказа. Ареал распространения P. abyssinicum (горох абиссинский) ограничен горными регионами Йемена и Эфиопии, и вероятно был одомашнен независимо от P. sativum (Vershinin et

11 al., 2003). Этот вид гороха отличается исключительно коротким вегетационным периодом. Известны в основном культивируемые формы, в дикорастущем состоянии встречается редко, в основном на высоте 2000 м над уровнем моря в Эфиопии и на Аравийском полуострове.

Горох сирийский (P. syriacum = P.sativum ssp. syriacum) произрастает преимущественно в степных районах и скалистых склонах в странах Передней Азии.

Горох транскавказский (P. transcaucasicum = P.sativum ssp. transcaucasicum) включает эндемичные формы Закавказья и Поволжья.

Горох азиатский (P. asiaticum = P.sativum ssp. asiaticum) культивируется в основном в Передней, Центральной и Юго-Западной Азии. Является одним из примитивных возделываемых видов. Природные образцы вида P. fulvum были найдены в Иордании, Сирии, Ливане и Израиле (Макашева, 1979) Горох красивый (Pisum formosum), первоначально отнесенный рядом авторов к роду Pisum, в настоящее время выделен в монотипный род Vavilovia (V. formosa). Данный вид имеет схожее морфологическое строение с остальными представителями рода Pisum, но, в отличие от остальных видов гороха, растение является многолетним, имеет длинное корневище, тонкие стебли приподнимаются над почвой на 5 – 15 см. Прилистники очень узкие, полуовально-стреловидные, острые, в несколько раз мельче листочков. Листья не имеют усиков, а непарный верхний листочек превращен в острие. Цветоносы вдвое длиннее листьев, имеют один, реже два цветка. Цветки по сравнению с другими частями растения крупные. Еще одной особенностью P. formosum является его ареал произрастания: представители вида встречаются только на высоте 2700 – 3500 м над уровнем моря в горах на каменистых осыпях, в субальпийской и альпийской зонах Кавказа, в Иране, в восточном нагорье Малой Азии. Этот вид представляет исключительный интерес для раскрытия эволюции всего рода как единственный многолетний представитель гороха, находящийся на грани исчезновения. При этом данный вид так и не удалось культивировать в лабораторных условиях.

1.2. Проблемы таксономии рода Pisum. Помимо сельскохозяйственного значения, горох не одну сотню лет является предметом многочисленных исследований еще со времен опытов Грегора Менделя. Именно на горохе были открыты законы наследственности, положившие начало генетике как науке. Несмотря на столь незначительное число таксономических единиц рода Pisum, среди систематиков до сих пор нет единого мнения относительно его видового состава и границ видов. Первые попытки классификации рода Pisum были предприняты еще в XVI—XVII веках, систематики того времени руководствовались только морфологическими признаками растений. Было показано, что представители как рода Pisum, так и родственных видов трибы Fabeae очень близки по морфологическим признакам, часто представители различных таксономических единиц различаются лишь незначительными особенностями. Еще до исследований Линнея было проведено множество попыток систематизировать «горохи». Уже в середине XVI века в одном из первых печатных ботанических трудов L. Fuchsius (1543г.) различают два вида горохов: обычный мелкий полевой горох с белыми цветами и более редкий крупный огородный горох, вьющийся, с цветами телесного и белого цвета. H. Bock (1565 г.) описывает в пределах мелкосемянного полевого гороха «форму с телесно-красными цветами и семенами, становящимися бурокрасными после варки». «В пределах группы крупносемянного огородного гороха им (Бок) отмечается форма с сизо-зелеными семенами как наиболее ценная для варки.» J. Gerard (1597) впервые упоминает сахарный и штамбовый горох, J. Parkinson (1625 г.) впервые дает название сахарного гороха (P. saccharatum), а J.P.Tournefort (1700 г.) впервые выделил горох в самостоятельный род Pisum (цит. по Говоров, 1937). Карл Линней в своей ботанической классификации выделял четыре вида гороха: помимо P. sativum и P. arvense род Pisum также включал виды P. ochrus и P. maritimum, которые позднее были отнесены к роду Lathyrus. (Linnaeus, 1753 цит.по http://linnean- online.org/view/genus/Pisum.html) Позднее в различных классификациях предпринималось разделение гороха на таксономические единицы по форме или окраске плода, наличию/отсутствию пергаментного слоя, окраске цветков и их количеству и ряд других признаков. При

этом даже подвиды были разделены на множество разновидностей. Так, например, F. Alefeld в своей классификации выделял только два вида, P. formosum и P. sativum, при этом у последнего выделено 102 разновидности. Однако все эти классификации были не систематизированы, опирались на отдельные морфологические признаки. За всю историю таксономических исследований только восемь представителей гороха получали статус самостоятельного вида различными систематиками. Помимо современных видов P. sativum L. и P. fulvum Sibth. et Sm, различными систематиками выделялись такие видовые таксоны как P. formosum (Stev.) Alef. (син. P. aucheri Jaub. et Spach), P. abyssinicum А. Br., P. syriacum (Berger) Lehm., P. elatius Bieb., P. arvense L., P.humile Boiss & Noe. Сложность видового состава рода Pisum проявилась в отношении вида P. formosum (Stev.) Alef. (горох красивый), который первоначально был отнесен Х.Х. Стевеном (1812—1813 г) к роду Orobus (Orobus formosus), однако позднее F. Alefeld и Е. Boissier независимо друг от друга определили его как вид рода Pisum, переименовав его в P. formosum. Данный вид достаточно близок по морфологии к видам рода Lathyrus, в связи с этим Schott и Kotschy определяли его как связующее звено между наиболее близкими родами в трибе Vicieae (=Fabeae): Lathyrus и Pisum (Говоров, 1937). В настоящее время P. formosum выделен в самостоятельный монотипический род Vavilovia (Vavilovia formosa). Впервые в качестве самостоятельного рода V. formosa упоминается Андреем Александровичем Федоровым в 1939 году. П. М. Жуковский (1971) также считает его самостоятельным родом. Правомочность выделения V. formosa в ранг самостоятельного рода из рода Pisum поддерживается современными молекулярными исследованиями (Oskoueiyan et al., 2010.). Таксономический ранг других представителей рода также проблематичен. Так P. sativum и P. arvense, выделяемые как самостоятельные виды (Moench, 1794; de Candolle, 1825; Spach, 1834; Jaubert, Spach, 1842; Бобров, 1948), согласно другим классификациям объединяют в один вид под различными названиями, например, P. vulgare Jundz. (Jundzill, 1830; Fingerhuth, 1836; Dierbach, 1839); P. commune Clav. (A. Clavaud, 1884); P. sativum L. (Alefeld, 1866; Koernicke, 1873; Kaznowski, 1926; Gams in Hegi, 1924; Говоров, 1930, 1937; Жуковский, 1933, 1964; Lehmann, 1954; Федотов, 1960, 1964); P. arvense L. (Lamprecht, 1956, 1970 (цит. по Макашева 1979)).

Вид P. fulvum Sibth. et Sm (горох красно-желтый) по мнению большинства авторов, в том числе и по современной систематике гороха, является самостоятельным видом (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973, Макашева 1979), однако ряд систематиков отрицали его видовой статус и определяли его в ранг подвида P. sativum (Alefeld, 1866; Koernicke, 1873; Lamprecht 1961 (цит. по Макашевой)). Таксономический статус P. elatius Bieb также неоднозначен. Л.И. Говоров (1937), П.М. Жуковский (1964, 1971) и ряд других исследователей (Федотов 1960, Jaubert, Spach, 1842 (цит. по Макашевой)) в своих трудах присваивают ему статус самостоятельного вида, в то время как F. Alefeld (1866) и А.М. Дрозд (1965) считали его только разновидностью P. sativum (Alefeld 1866, Дрозд, 1965, Körnicke,1873 (цит. по Макашевой)). Еще одну точку зрения высказал известный монограф гороха В.С. Федотов, по мнению которого P. elatius является дикорастущим видом и является прародителем культурного гороха (Федотов, 1960). P. abyssinicum впервые упоминается в качестве самостоятельного вида у A. Braun (1841), при этом всё тот же F. Alefeld (1866), как в случае и с P. elatius, относил его к разновидности P. sativum. В более поздних исследованиях выделяют P. abyssinicum как обособленный от гороха посевного вид (Говоров, 1937; Федотов, 1960, 1964; Maxted, Ambrose, 2001). P. syriacum Boiss & Noe (=P. humile Boiss and Noe, P. syriacum (Berger) Lehm.) - горох сирийский, был впервые собран F.Noe в Малой Азии и определен как самостоятельный вид P.humile Boiss & Noe, позже Berger изменил название и статус данного таксона, обозначив его как P. sativum ssp. syriacum (Boiss & Noe) Berger. До недавнего времени в нашей стране была принята разработанная Л.И. Говоровым (1937) классификация, согласно которой род Pisum состоит из шести видов: P. formosum, P. fulvum, P. abyssinicum, P. humile, P. elatius, P. sativum. Л. И. Говоров считал виды P. fulvum, P. abyssinicum и P. humile достаточно близкой группой с крайне ограниченным ареалом. Согласно Л. И. Говорову, современный культивируемый горох посевной произошел в результате множественных гибридизационных событий. В результате случайных межвидовых скрещиваний P. elatius и P. fulvum были получены P. abyssinicum и P. syriacum. Горох сирийский (=P.humile – горох низкий) он рассматривал как особый вид, опираясь на исследования по скрещиванию сирийского гороха с другими представителями рода. Позже был сделан вывод о гибридном

происхождении сирийского гороха от скрещиваний P. fulvum и P. elatius (Лутков 1930, Костерин, 2017). Последующие скрещивания исходных и производных видов и дали континуум форм культивируемого гороха. Внутри P. sativum Л.И Говоров различал подвиды asiaticum, transcaucasicum и commune. Впоследствии В.С. Федотов, который в целом придерживался классификации Л.И Говорова, разделил подвид commune на два отдельных подвида – sativum и arvense. О видовой специфичности P. fulvum свидетельствуют и исследования Ben-Ze’ev и Zohary (1973). Авторами был проведен анализ скрещиваний P. fulvum с образцами P. syriacum и P. elatius и отмечена низкая завязываемость семян у гибридов, а также образование унивалентов, бивалентов, тривалентов и квадривалентов в мейозе искусственно полученных гибридов. Также в местах случайного контакта не было обнаружено спонтанных гибридов, что указывает на репродуктивную изоляцию данных видов P. fulvum, P. syriacum и P. elatius в природе. Также было отмечено, что помимо хорошей морфо-биологической обособленности P. fulvum от других видов, были отмечены различия в кариотипе (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973; Errico et al., 1991). Таксономические исследования рода Pisum с использованием молекулярно- генетических методов. В последние десятилетия для решения проблем, в том числе и таксономических, помимо морфо-физиологических все чаще используются биохимические и молекулярно-генетические методы исследования. В настоящее время современные методы (AFLP, RAPD, ISSR, SSAP, SSR, SNP), позволяющие проводить оценку вариабельности как всего генома, так и его отдельных функциональных участков, активно используются для определения границ видов, видового состава, филогенетических отношений и популяционной структуры. Однако, несмотря на широкое распространение молекулярных методов анализа, проблема систематики рода Pisum, определение его таксономического состава, эволюционных и филогенетических отношений так и остались до конца не решены. Для решения таксономических проблем рода Pisum были проведены исследования с привлечением морфо-физиологических, биохимических, цитологических и молекулярно-генетических данных. Так, например, по результатам анализа маркеров полиморфизма сайтов встраивания мобильных элементов (SSAP, Sequence Specific Amplification Polymorphism) образцов гороха из коллекции центра Джона Иннеса (JIC,

Великобритания) также помимо P. fulvum выделяют только культурный P. sativum, включая подвиды (P. sativum ssp. transcaucasicum, P. sativum ssp. elatius, P. sativum ssp. abyssinicum, P. sativum ssp. asiaticum) (Jing et al., 2010). Исследование вариабельности мобильных элементов генома гороха выявляет в роде Pisum четыре видовых таксона (P. sativum, P. fulvum, P. elatius, P. abyssinicum,), прослеживая отчетливую эволюционную историю каждого из них (Vershinin et al., 2003). В тоже время Tar’an с соавт. (2005) в результате комплексного молекулярного маркирования (RAPD, ISSR, SSR) выделяют культурный P. sativum и смешанную группу дикорастущих подвидов гороха (subsp. abyssinicum, asiaticum, elatius, transcaucasicum и var. arvense), среди которых, однако, образцы abyssinicum, asiaticum и transcaucasicum. составляют отдельные дистанцированные группы. Согласно данным D. Zohary and M. Hopf (1973), P. fulvum является наиболее дивергентным видом, в то время как P. humile, P. elatius, и P. sativum формируют единый генетический комплекс видов, представленный двумя главными дикорастущими формами (humile и elatius) и их культивируемыми производными (sativum). P. fulvum вместе с P. elatius рассматриваются как наиболее древние эволюционные линии. Было выдвинуто предположение, что северные популяции P. humile являются предковыми для культурного P. sativum, что род Pisum представлен только двумя биологическими видами P. sativum и P. fulvum. Электрофоретическое исследование белковых паттернов альбуминов и глобулинов для данных таксонов выявило весьма ограниченную дифференциацию, которая также согласовалась с выдвинутым предположением (Waines, 1975). Однако полученные данные оказались недостаточными, чтобы подтвердить роль P. humile в происхождении современного культурного гороха. Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей хлоропластной ДНК подтвердил заключение о том, что сорта P. sativum могут происходить от северных популяций P. humile (Palmer et al., 1985). Исследование полиморфизма ретротранспозонов типа Ty1-copia, проведенное T.H.N. Ellis с соавторами (1998), показало существование трех основных групп Pisum: P. fulvum, P. sativum ssp. abyssinicum и основной части генофонда Pisum. При этом авторы отмечают, что P. sativum ssp. elatius не отличается от P. sativum ssp. abyssinicum и предполагают, что образцы ssp. еlatius скорее формируют обособленную подгруппу,

таким образом лишая образцы еlatius не только видового статуса, но и подвидового (Ellis et al., 1998). Интересно, что результаты кластерного анализа в последующей работе того же коллектива авторов, проведенного использованием комбинированного набора молекулярных данных (SSR и RAPD), свидетельствуют о том, что, хотя и имеется некоторая интеграция между P. sativum ssp. elatius и основной части генофонда Pisum, также имеется обособленная группа образцов ssp. elatius, которая отличается от P. sativum ssp. abyssinicum (Kwon et al., 2012а). Проведенный филогенетический анализ с использованием метода RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphism) - маркирования показал четкое разделение P. fulvum и P. abyssinicum как друг от друга, так и от P. sativum, тогда как образцы P. elatius и P. humile на дендрограмме были рассеяны среди других таксономических кластеров (Martin-Sanz et. al., 2011).

1.3. Таксономические проблемы трибы Fabeae. Триба Fabeae, помимо вышеупомянутых Pisum и Vavilovia, объединяет ряд экономически важных родов, в числе которых, рода Lens и наиболее крупные по составу Lathyrus и Vicia, с численностью более 150 видов каждый. Морфология у представителей трибы Fabeae достаточно схожа, что затрудняет классификация как всей трибы в целом, так и отдельных родов. Выделяемые в настоящее время роды трибы Fabeae характеризуются генетической однородностью, при этом виды слабо дифференцированы и характеризуются морфологической гомоплазией, параллелизмом, прогрессивной эволюцией (Barneby, 1971; Gunn, 1976; Kupicha, 1983; Steele, Wojiiechowski, 2003). Все эти особенности сильно затрудняют классификацию трибы и являются причиной возникающих споров о ее филогении. Наиболее спорными в систематике трибы Fabeae остаются вопросы изменения статуса Orobus L., Ervum L., Bona Medik., Faba Mill., Ervilia (L.) Link., Clymenum Mill. и ряда других, которые первоначально выделяли в ранг самостоятельных родов (Linnaeus, 1753; Adanson, 1763; Alefeld, 1861; Boissier, 1872 цит. по Вишнякова и др., 2008) (www.linnean-online.org/view/genus). Существующие так называемые виковые оробоиды (V. oroboides, V. dumetorum, L. atropatanus, O. venosus, O. lathyroides

(=V.unijuga) и ряд других) сочетают в себе признаки как представителей рода Lathyrus, так и Vicia, что также осложняет классификацию этих видов. Род Lathyrus является самым представительным в трибе и насчитывает 180-200 видов, распространенных преимущественно в нетропических регионах Северного и Южного полушарий (Humphries, Parenti, 1999). Первичный центр распространения рода Lathyrus включает Средиземноморье и западную часть иранского нагорья. Вторичными центрами принято считать Северную Америку и умеренные широты Южной Америки (Keniser et al., 2005). Систематика рода Lathyrus претерпевала множество изменений. Одной из главных проблем в классификации рода часто называют высокую морфологическую гомоплазию (Kupicha, 1983, Steele, Wojciechowski, 2003). В целом род Lathyrus принято делить на несколько секций. Согласно принятой в настоящее время классификации F. Kupicha (1983) род включает 13 секций: Orobus, Lathyrostylis, Pratensis, Neurolobus, Orobon, Orobastrum, Viciopsis, Linearicarpus, Lathyrus, Aphaca, Nissolia, Clymenum, Notolathyrus. Однако, как показывают современные исследования, существующая классификация требует пересмотра. (Asmussen, Liston, 1998; Keniser et al., 2005). Вопросы происхождения и эволюции представителей трибы Fabeae также оставляют немало вопросов. Ряд исследований были направлены на изучение эволюционной истории трибы Fabeae. Как правило, авторы единодушны в статусе монофилетичного рода в отношении Pisum, Vavilovia и Lens, при этом возникают разногласия в отношении родов Lathyrus и Vicia из-за их парафилетичности. Выделяемые секции родов Vicia и Lathyrus также в основном не показывают себя как монофилетические. Так в ходе анализа полиморфизма хлоропластного гена matK было показано, что Lathyrus, Lens и Pisum могут быть включены в род Vicia (Steele, Wojciechowski, 2003). Недавнее молекулярное исследование с привлечением данных анализа вариабельности шести участков ядерного и хлоропластного геномов и охватывающее большое разнообразие видов трибы Fabeae, показало возможность значительной таксономической ревизии и выделения ряда видов и секций в таксономический ранг самостоятельного рода. Так, например, согласно полученным данным было показано, что образцы Pisum и Vavilovia формируют на дендрограмме сестринские группы и расположены внутри клады Lathyrus. На основе этого было предложено понизить

таксономический ранг и включить роды Pisum и Vavilovia в состав монофилетического род Lathyrus, который, в свою очередь, вместе с Lens предложено включить в состав рода Vicia (Schaefer, 2012). Систематика рода Vicia также остается весьма дискуссионной. На сегодняшний день общепринятой является классификация рода Vicia предложенная F. Kupicha (1976), по которой род делится на два подрода: Vicilla (Schur) Rouy (7 секций, 100 вида) и Vicia (5 секций, 32 вида). Для определения межвидовых отношений внутри рода Vicia, были использованы различные подходы: анализ морфологических признаков и молекулярных маркеров (van de Wouw и др., 2001, 2003), филогенетический анализ (Maxted, Douglas, 1997; Jaaska, 2005; Leht, Jaaska, 2002; Leht, 2005, 2009), мультилокусный анализ методами RAPD и RFLP (Потокина и др., 2008), морфологические особенности пыльцы (Endo, Ohashi, 1996), анализ белков семян с помощью SDS-PAGE (Mirali et al., 2007) и ряда других (Khalik, Al-Gohary., 2013). Однако в большинстве исследований говорится о необходимости ревизии классификации рода. В упоминаемой выше работе H. Schaefer и сотрудников (2012), помимо значительного укрупнения рода в результате включения в него Pisum, Vavilovia, Lens и Lathyrus, в тоже время предлагается, наоборот, повысить таксономический ранг секции Ervum рода Vicia до уровня отдельного рода Ervum. Также отдельные секции F. Kupicha (1976) (Ervilia, Ervoides и Trigonellopsis) могут быть исключены из рода Vicia и объединены в один род Ervilia. В этот род также могут быть включены виды V. koeieana (= Anatropostylia koeieana) и V. quadrijuga (Schaefer et al., 2012). Таким образом, несмотря на значительное количество исследований таксономии трибы Fabeae, в том числе и с привлечением молекулярных данных, в настоящее время нет единого мнения о классификации трибы.

1.4 Оценка генетической вариабельности P. sativum. В мире существует 16 основных коллекций гороха с численностью более 1000 образцов. Из них наиболее представительными по количеству образцов являются ВИР (РФ, ~ 6.8 тыс. образцов), ATFC (Австралия, ~ 6.6 тыс. образцов) и ICARDA (Сирия, ~ 6.1 тыс. образцов). Однако не все коллекции гороха генотипированы или фенотипированы. Как правило, полностью проанализированы небольшие коллекции.

Несмотря на то, что в мире существует, по крайней мере 10 коллекций P. sativum с численностью образцов более 2000, в настоящее время ни один из существующих генетических центров не занимается проблемами консервации генетического разнообразия гороха (Upadhyaya et al., 2011). Также стоит отметить, что ни одна из существующих коллекций не является преобладающей по размеру и разнообразию представленных образцов и генотипов. Несмотря на значительное число образцов, находящихся в коллекциях, существует проблема их высокой дублированности, что сильно искажает представление об истинном уровне разнообразия гороха (Smycal et al., 2011; Maxted et al., 2010; Coyne et al., 2011). Кроме того, достаточно большое количество образцов, преимущественно из Европы, Азии, Ближнего Востока (первичный центр происхождения) и Северной Африки/Эфиопии не были задокументированы. Также существует проблема отсутствия в коллекциях генетического материала дикорастущих образцов, адаптированных к местным условиям (Maxted et al., 2010). Эволюционные и исторические данные, а так же информация о степени генетического полиморфизма, как всего генома, так и отдельных его участков крайне ценна для правильного использования, сохранения и подержания генофонда гороха, в том числе для предотвращения генетической эрозии современных сортов. В процессе развития молекулярных методов исследования, как правило, проводилось на ограниченных наборах образцов. Достаточно много исследований было проведено и на отдельных наборах образцов рода Pisum. Белковые и молекулярные маркеры были использованы для оценки разнообразия среди 148 образцов гороха, представляющие стародавние и современные сорта (Baranger et al., 2004). Проведенный кластерный анализ выявил дискретные группы гороха, соответствующие фуражным, кормовым, пищевым сортам, а также дикорастущие и примитивные формы. Также была охарактеризована коллекция 148 эфиопских образцов P. sativum по 12 агрономически важным признакам и выявлены значительные различия между образцами. Основываясь на этих признаках, образцы были сгруппированы, но не было обнаружено зависимости между агрономическими группами и географическим происхождением (Keneni et al., 2005). Более позднее исследование разнообразия 24 индийских образцов P. sativum с использованием 60 случайных полиморфных RAPD-маркеров позволило выявить

высокие уровни генетических различий (0.13 - 0.30) и идентифицировать группы, соответствующие высоким и карликовым формам гороха (Choudhury et al., 2007). В другой работе с использованием 20 RAPD- и 11 AFLP-маркеров был проанализирован 21 сорт гороха немецкой селекции. Коэффициенты генетического сходства (GS) исследованных генотипов гороха варьировали от 0.80 до 0.94 . Была показана корреляция между результатами RAPD и AFLP анализов (r=0.79). Кластерный анализ, как отдельных наборов RAPD и AFLP данных, так и их комбинации, выявил некоторую степень родства, соответствующую родословной исследованных сортов (Simioniuc et al., 2002). Также AFLP маркеры были использованы для оценки геномной вариабельности 56 образцов гороха, предварительно отобранные с целью охвата максимального морфологического разнообразия. Также с помощью SSR анализа и морфологических данных была охарактеризована коллекция Эгейского Аграрного Института Турции (Aegean Agricultural Research Institute of Turkey). Авторами были выявлены маркеры, дифференцирующие образцы турецкой коллекции. Дендрограмма, построенная по данным SSR анализа, показала генетическое сходство исследованных генотипов гороха. Эти результаты предложено использовать для будущих исследований, для поддержания коллекции, а также в селекции сортов гороха (Sarıkamış et al., 2010). В работе T. Cupic и сотрудников (2009) с использованием SSR анализа, данных морфологии и родословных было показано значительное снижение генетической вариабельности у 18 стародавних и коммерческих сортов гороха P. sativum var. arvense и P. sativum ssp. sativum. SSR анализ, данные морфологии и родословных были использованы для анализа P. sativum из европейских коллекций, а также для выявления различий между P. sativum var. arvense и P. sativum ssp. sativum. Рассчитанные коэффициенты геномного сходства исследованных образцов варьировали от 0.46 до 1.00. В целом исследованные образцы хорошо группировались в соответствии с морфологическими (ботаническими и агрономическими) признаками. При этом генетические различия, детектированные с помощью SSR анализа, показали большее сходство с данными морфологического анализа, чем с данными родословных. Авторы указывают, что скрещивания между образцами arvense и sativum, а также включение в селекционные программы стародавние формы гороха, позволит предотвратить эрозию генетического пула культурного гороха (Cupic et al., 2009).

С развитием молекулярной биологии и доступностью методов стали возможны и более масштабные исследования. Так, генетическое разнообразие коллекции генбанка Китая (ICAR) из 2000 образцов было охарактеризовано с использованием 21 локуса SSR маркеров; 310 образцов коллекции генбанка США (USDA) были проанализированы с использованием 37 RAPD- и 15 SSR-маркеров. Анализ 148 образцов гороха коллекции генбанка Франции (INRA) был проведен с использованием обширного набора данных, включающих RAPD, EST и SSR-маркеры (Baranger et al., 2004; Zong et al., 2009; Kwon et al., 2012b). С использованием комбинации 25 маркеров инсерционного полиморфизма на основе ретротранспозонов (RBIP) и 10 SSR-маркеров было проведено генотипирование 1283 образцов гороха коллекции генбанка Чехии (CZE), которые охватывают большую часть представленного в коллекции культурного разнообразия гороха и был выявлен достаточно высокий уровень вариабельности. В то время как уровень генетических различий, выявленный при исследовании полиморфизма сайтов встраивания мобильных элементов (RBIP) для детекции геномной вариабельности у 145 коммерческих чешских и словацких сортов и линий составил всего 0.11-0.22, что также можно объяснить тем, что в анализ был взят локальный селекционный материал (Smykal et al., 2008). Также c использованием 45 RBIP маркеров был проведен анализ всей коллекции генбанка института Джона Иннеса (JIC) (3029 образцов), которая включала коммерческие сорта (33%), местные стародавние сорта (landraces) (19%), дикорастущие образцы (13%), и линии (26%) (Jing et al., 2010). С использованием RBIP маркеров также была исследована коллекция сортов гороха, выращиваемых в Испании. В целом RBIP маркеры позволили различить все исследуемые образцы. Данные RBIP анализа показали, что генофонд испанских популяций гороха достаточно разнообразен и представляет ценность для селекции (Martin-Sanz et al., 2011). Также был проведен комплексный анализ образцов Pisum из различных коллекций (JIC, CZE, ICAR и ATFC) с использованием 17 RBIP локусов. Все анализируемые образцы были разделены на несколько кластеров. Авторы отмечают высокую степень сродства образцов диких горохов (P. fulvum, P. sativum subp. elatius и P. abyssinicum), которые сформировали единый кластер с образцами афганского происхождения. В другом кластере была сосредоточена значительная часть P. sativum

23 subsp. sativum и образцы эфиопского происхождения. Образцы китайского происхождения из коллекции генбака Австралии (ATFC) и основная часть коллекции JIC была распределена на четыре кластера. Остальные кластеры содержали все культивируемые образцы с набором мутантных линий (Jing et al., 2012). Авторами был предложен детальный анализ коллекции генотипов гороха коллекции Китая (ICAR), так как данные генотипы могут частично отражать историческую изоляцию сельского хозяйства Восточной Азии от Южной Азии, Европы и Африки (Smycal et al., 2011). Также ряд исследований был посвящен проблеме, так называемой генетической эрозии мировых коллекций сортов и линий гороха P. sativum. Уменьшение генетического разнообразия ведет к понижению конкурентоспособности и жизнеспособности выращиваемых сортов при изменении условий окружающей среды и, поэтому, исследование мировых коллекций сортов имеет огромное значение. Проблема сортовой генетической эрозии была показана для многих важных сельскохозяйственных культур (Tenaillon et al., 2004; Megersa et al., 2014), в том числе и для бобовых (Smykal et al., 2008; Cieslarova et al., 2011, 2012; Hagenblad et al., 2014). Проведенный анализ чешской коллекции сортов гороха за последние 80 лет выявил генетическую эрозию (Cieslarova et al., 2011, 2012). Сравнение генетического разнообразия старых сортов шведской коллекции гороха, которые выращивались в XIX веке, и современных коммерческих сортов, так же показало, что генетическое разнообразие старых сортов оказалось несколько выше разнообразия современных сортов (Hagenblad et al., 2014).

1.5. Характеристика генома рода Pisum. Горох посевной (Pisum sativum) является диплоидным видом (2n=2x=14). Геном гороха состоит из пяти пар субметацентрических и двух пар метацентрических хромосом. Субметацентрические хромосомы визуально очень похожи (Murtaza et al., 2005). Общая длина гаплоидного набора хромосом составляет 111,71 мкм, средняя длина хромосомы -15,96 мкм. (Neumann et al., 2001, 2002). Вид P. fulvum также имеет семь пар хромосом, но в отличие от P. sativum на хромосоме V P. fulvum содержится спутник, а спутник на хромосоме VII имеет бóльший размер. Также эти виды отличаются соотношением длин плеч у некоторых пар хромосом (Errico et al., 1991).

Геном Pisum sativum по сравнению с другими сельскохозяйствеными культурами имеет большой размер (1C = 4.3 млрд. пн), что создает трудности в определении его полной нуклеотидной последовательности. На середину 2017 года полная последовательность генома P. sativum еще не получена, хотя работа по его определению (сорт Cameor) ведется с 2012 года в рамках международного консорциума, объединяющего лаборатории шести стран c использованием технологий высокопроизводительного секвенирования (Illumina, 454 Roche). К настоящему времени секвенировано 6 транскриптомов P. sativum (Franssen et al., 2011; Kaur et al., 2012; Duarte et al., 2014; Alves-Carvalho et al., 2015; Liu et al., 2015; Sudheesh et al., 2015; Zhukov et al., 2015; Kerr et al., 2017). Также проводятся широкомасштабные исследования по анализу и эволюции различных последовательностей генома, прежде всего мобильных элементов (Makas et al., 2007, 2015; Steinbauerova et al., 2008; Novak et al., 2010). Дополнительную информацию о строении генома гороха можно получить, основываясь на синтении генома бобовых и данных полногеномных последовательностей 12 видов Fabaceae (www.legumeinfo.org/genomes) Оценки размеров ядерного генома гороха проводились различными методами и были получены для нескольких образцов. На сегодняшний день оцененный размер генома P. sativum составляет 4.36 х109 п.н. (1С), что соответствует 9,09 мкг ДНК (2С) (www.coolseasonfoodlegume.org/organism/Pisum/sativum) (Macas et al., 2015). Из этого следует, что геном гороха в 10 раз больше генома риса и модельного бобового растения люцерны Medicago truncatula, в 4 раза больше генома сои G. max, но в 4 раза меньше генома V. faba (Zhu et al., 2005). Геном P. sativum, как и любого другого растения, состоит из уникальных последовательностей, представленных в основном функциональными генами, и повторяющихся последовательностей. В среднем GC состав геном гороха составлает 37.7%, при этом наблюдаются протяженные GC-богатые районы (Salinas et al., 1988). Показано, что около 30% остатков цитозина в геноме метилировано, при этом ~50% из них находятся в последовательности C(A/T)G (Murray et al., 1978). Отсутствие полногеномной последовательности гороха не позволяет точно оценить количество функциональных генов, однако проведенные исследования транскриптомов P. sativum предоставляют возможность оценить их примерное количество. Однако и в этом случае цифры достаточно разнятся. Так, в исследованиях

S. Franssen с соавторами (2011) сообщается об идентификации 42285 уникальных последовательностей, в то время как J. Duarte с соавторами (2014) сообщили о 66782 уникальных последовательностях (Franssen et al., 2011; Duarte et al., 2014). На основе анализа 20 сДНК библиотек гороха в геноме гороха было определено 46099 генов (Alves-Carvalho et al., 2015). В целом количество генов соответствует таковому у других представителей Fabaceae. Так, в геноме G. max было выявлено 46430 генов (Schmutz et al, 2010), C. cajan – 48690 (Varshney et al., 2011), M. truncatula – 62388 (Young et al., 2011), C. arietinum – 28269 генов (Varshney et al., 2013). Полученные последовательности генов гороха доступны в базе данных (www.bios.dijon.inra.fr/FATAL/cgi/pscam.cgi). Проведенный сравнительный анализ с модельным растением M. truncatula позволил аннотировать многие гены гороха. Проведенные исследования показали, что геном P. sativum насыщен повторяющимися последовательностями (Novak et al., 2010; Macas et al., 2015). Даже ранние исследования состава генома гороха, основанные на кинетике реассоциации ДНК и измерений поведения плавления, показывали, что различные типы повторяющихся последовательностей могут составлять 75-97% генома гороха (Murray et al., 1981). Недавние исследования с использованием технологии NGS подтвердили высокое содержание в геноме повторяющихся последовательностей, но несколько уменьшили эти значения, показав, что около 50-60% генома гороха относятся к высоко- и умеренно повторяющимся последовательностям (Novak et al., 2010). Считается, что именно мобильные элементы определяют более чем семикратную разницу в размерах генома у представителей Fabaceae (Macas et al., 2015). Геном гороха включает все типы мобильных элементов, характерные для растений: ретротранспозоны, ДНК-транспозоны и MITE-подобные элементы. Проведенные исследования по секвенированию показали, что в геноме гороха преобладают ретротранспозоны LTR-типа, число которых составляет до ~140 тысяч копий на гаплоидный геном. LTR-содержащие ретротранспозоны были представлены Ty3/gypsy и Ty1/copia мобильными элементами. Основным компонентом повторов в геноме P. sativum являются Ty3/gypsy подобные LTR-ретротранспозоны, составляющие до 38,5% генома (Macas et al., 2007b). Интересно, что 33,3% генома (то есть более 86% от всех ретротранспозонов Ty3/gypsy типа) представлены Ogre-элементами. Ogre-транспозоны – это специфичная для ряда

семейств растений (Leguminosae, Solanaceae и Salicaceae) группа ретротранспозонов, длиной 22 т.п.н., которые несколько отличны от остальных Ty3/gypsy (Neumann et al., 2003; Steinbauerova et al., 2008). Orge-элементы впервые были идентифицированы у гороха и показано, что их число в геноме гороха составляет около 65 тысяч на гаплоидный геном. Из-за размера и высокой копийности, Ogre являются важными составляющими генома и у других видов бобовых (Neumann et al., 2006; Macas et al., 2009). Вторым по распространенности в геноме P. sativum семейством Ty3/gypsy является ретротранспозон Peabody (8 т.п.н.), число копий которого составляет 16 000. Кроме этого в геноме были идентифицированы Ty3/gypsy транспозоны Cyclops и PIGY (Chavanne et al., 1998; Neumann et al., 2005). Второй тип ретротранспозонов, Ty1/copia, представлен с более низкой частотой и составляет не более 5% генома (Novak et al., 2010). Кроме того, было обнаружено, что элементы Ty1/copia хотя и менее распространены в геноме, но более разнообразны по своим последовательностям. Наиболее распространенным из ретротранспозонов типа Ty1/copia был новый мобильный элемент Ps-copia-1/751, который представлен более 25 тысю копий и составлял ~2% генома. Интересно, что последовательность данного мобильного элемента была высоко гомологична ретротранспозонам Злаковых (BARE- 1, RIRE-1, OARE-1). Другие Ty1/copia элементы генома гороха, PDR и группа SIRE1- подобных последовательностей, менее представлены в геноме гороха (Novak et al., 2010). Также были обнаружены другие ретротранспозоны, в том числе LINEs-типа (менее 500 копий на геном). Класс ДНК-транспозонов в геноме P. sativum был представлен семействами MuDR и En/Spm (каждое представлено ~ 2.2 тыс. копий на геном). Однако их общая численность не превышала тысячи копий на гаплоидный геном, составляя лишь незначительную часть (0.36%) ядерной ДНК. MITE-тип мобильных элементов представлен более чем 1000 копий на геном (Macas et al., 2007). Помимо мобильных элементов, повторяющиеся последовательности генома гороха включали кластеры рибосомальной ДНК и различные сателлитные повторы, составляющие около 2.5% генома. Были выявлены микросателлиты с единицей

повтора от 2 до 10 п.н. Наиболее часто встречающимися были микросателлиты (AAT)n,

(AT)n, и (AG)n (80,000 повторов, ~ 1.15% генома). Помимо микросателлитов в геноме

были идентифицированы два высоко специфичных для P. sativum минисателлита PisTR-A (212 п.н.) и PisTR-B (50 п.н.), копийность которых была 2x104 на гаплоидный геном. Так, длинный минисателит PisTR-A локализовался преимущественно на одной хромосоме, в то время, как PisTR-B в субтеломерных и перицентромерных районах всех хромосом (Neumann et al., 2001). Другие микросателлиты были менее представлены (Novak et al., 2010).

Теломерные повторы гороха представлены последовательностями (TTTAGGG)n, называемыми теломерами арабидопсисного типа (Richards, Ausubel, 1988), а также

двумя дополнительными теломеро-подобными последовательностями (TTAGG)n and

(TTTAGG)n (Novak et al., 2010). Как было упомянуто выше, развитие современных молекулярных методов позволило провести анализ нескольких транскриптомов гороха. Секвенирование транскриптома обеспечивает обширную информацию об экспрессируемых генах и позволяет определить ткане- и органоспецифичные транскрипты, а также реакцию растения на различные стрессовые факторы. Так, были получены и секвенированы 20 сДНК библиотек P. sativum из различных подземных и надземных органов и тканей на разных стадиях онтогенеза и при различном содержании азота в почве (Alves-Carvalho et al., 2015). Были определены ткане- и ограноспецифичные транскрипты, например, было выявлено 343, 180 и 160 генов транскрипционных факторов, специфически экспрессирующихся в клубеньках, семенах и цветках соответственно. Отдельно был проведен сравнительный анализ генов, транскрибирующихся в клубеньках P. sativum, M. truncatula и L. japonicus. Это позволило выявить 4912 клубенек-специфичных транскриптов. При этом было выявлено 311 генов, чья транскрипция в клубеньках значительно отличалась у гороха и люцерны (Alves-Carvalho et al., 2015). Проведенный в другой работе анализ транскриптома семян гороха позволил оценить эффект от мутаций в генах, участвующих в первичном метаболизме (Weigelt et al., 2009; Radchuk et al., 2010). Были исследованы изменения транскриптома при абиотическом стрессе с использованием микрочипа Ps6kOLI1 (Fondevilla et al., 2011). Были проведены анализы транскриптомов молодых клубеньков гороха и кончиков корней. Обнаружена и аннотирована 581 последовательность, которые могут рассматриваться как клубенек-специфичные гены P. sativum. (Zhukov et al., 2015).

Сравнительный анализ генома P. sativum и других видов Fabaceae. С развитием современных технологий стало доступно огромное количество информации о первичной структуре ДНК анализируемых объектов, в том числе о составе и порядке генов на хромосомах, наличии повторов, некодирующих последовательностях. Реализация проектов по секвенированию геномных проектов позволило выявить, что даже в пределах одного рода наблюдаются не только нуклеотидные замены в гомологичных областях, но и изменение состава гомологичных последовательностей, их порядок следования, т.е. так называемые хромосомные перестройки Sabir с соавторами (2014) были описаны значительные перестройки хлоропластных геномов у четырех видов рода Trifolium. В большинстве случаев с помощью хромосомных перестроек возможно отследить общего предка у родственных видов (Sabir et al., 2014). Первое молекулярное доказательство макросинтении, то есть сходство групп сцепления в геноме разных таксонов, основывалось на сопоставлении генетических карт экономически важных представителей Fabaceae. Данные трансляционной геномики позволили сделать предположение о том, что локализация генов у видов растений могут быть выведены из положений генов ортологических последовательностей в геномах видов, для которых доступна последовательность геномов. (Simon et al., 1997; Kalo et al., 2004; Aubert et al., 2006). Ранние сравнительные исследования геномов бобовых были сфокусированы на близкородственных видах одного и того же рода или трибы, основываясь в первую очередь на сравнительном картировании общих маркеров RFLP. Впервые был выявлен консервативный геномный порядок (синтения) между горохом (Pisum) и чечевицей (Lens). Идентичность их геномов составляет приблизительно 40%. Позже было показано, что маш (Vigna radiate) и вигна (Vigna unguiculata) также проявляют высокую степень сходства, при этом хромосомные перестройки произошли после расхождения этих двух видов (Zhu et al., 2005). Для создания единой генетической системы бобовых в качестве модельных систем для изучения геномики и биологии бобовых были выбраны два вида – Medicago truncatula и Lotus japonicus, которые имеют сравнительно небольшой размер генома (412 Mb и 394 Mb на гаплоидный геном), поддаются прямому и обратному генетическому анализу и, следовательно, хорошо подходят для биологических исследований (Stougaard et al., 2001).

Zhu с соавторами (2005) с использованием 60 маркеров провели анализ макросинтетических связей у 12 видов бобовых, включая горох. Как и ожидалось, степень синтении коррелирует с филогенетическим расстоянием между видами бобовых. М. truncatula и M. sativa демонстрируют крайне высокую синтению геномов. Хотя геном гороха примерно в 10 раз больше, чем у М. truncatula и имеет на одну хромосому меньше, была показана высокая коллинеарность генов, причем основные очевидные различия заключались в интерхромосомных перегруппировках (Choi et al., 2004 или Zhu et al., 2005), а значительные различия в размерах генома в основном определялись количеством повторяющихся последовательностей, в основном мобильных элементов (Macas et.al., 2007) Известно, что явление геномной синтении позволяет экстраполировать известные генетические карты на родственные виды, для которых отсутствуют такие карты. Как было упомянуто выше полностью секвенированы геномы только 8 видов Faboideae, в том числе Medicago truncatula, Lotus japonicus, Glycine max, Cicer arietinum и Cicer reticulatum, но не P. sativum. Проведенный сравнительный анализ показал, что значительные участки генома у бобовых сохраняют свое расположение. Поэтому для упрощения создания генетических карт для видов, чья геномная последовательность не определена, как, например, для гороха, на основе M. truncatula, используемой в качестве эталонного генома, и синтении с известными геномами остальных 7 видов, была создана консенсусная карта (Choi et al., 2006). Идентификация последовательностей гомологичных генам, отображенным на карте консенсуса гороха в базах данных последовательностей для других бобовых, позволила идентифицировать сравнительный порядок генов в горохе, M. truncatula, L. japonicus и сое и определить синтагенные отношения между этими бобовыми, а также найти ортологи искомых генов гороха на известных геномах.Выявление и выравнивание гомологичных последовательностей с близким геномом обеспечило более четкую картину синтетических отношений. Так, Bordat с соавторами (2011) выявил, что наибольшая степень гомологи для 13747 уникальных последовательностей гороха была обнаружена для сои (6626 предполагаемых ортологов) и люцерны. Второй по величине результат был у M. truncatula. (Bordat et al., 2011) (рис. 1.1).

С помощью анализа синтении геномов для 5 460 генов была предсказана возможная локализация на консенсусной генетической карте P. sativum и разработана база данных, с помощью которой возможно с достаточно высокой степенью вероятности определять на карте произвольную последовательность гороха (http://www.thelegumeportal. net/pea_mtr_translational_toolkit). Такой подход получил название «translational genomics» (Bordat et al., 2011).

Рис. 1.1. Синтения ортологичных генов P. sativum и трех видов Fabaceae (Bordat et al., 2011).

Сравнительное картирование также позволяет также исследовать палео-историю генома гороха. Был предложен сценарий эволюции семи хромосом гороха от палео- гексаплоидного предка (Bordat et al., 2011). Этот подход дает представление о потенциальных паралоговых областях генома, которые были получены из тех же палеохромосом. Последним крупным исследованием синтении стала работа C. Lee с соавтор. (2017), в которой авторы провели анализ генетических карт десяти видов бобовых подсемейства Faboideae. Всего в анализе было использовано 209 межвидовых генных

маркеров. В результате анализа была создана единая база, состоящая из 93 групп сцепления, из которых были идентифицированы 110 блоков синтении и другие эволюционные события (например, 13 инверсий). Помимо этого были выявлены несколько крупномасштабных эволюционных событий, таких как слияние/деление хромосом, с помощью которых можно объяснить различия в числе хромосом среди сравниваемых видов или между двумя кладами (Lee et al., 2017) (рис. 1.2)

а б Рис. 1.2 Макросинтения десяти видов бобовых. а. Хромосомы и различия в размерах генома (Zhu et al., 2005) б. Блоки синтении и геномные перестройки (Lee et al., 2017) Mt, M. truncatula; Ms, M. sativa люцерна; Lj, L. japonicas лядвенец; Ps, P. sativum горох; Ca, C.arietinum нут; Vr, V.radiata маш; Pv, Ph. vulgaris фасоль; Gm,Glycine max соя).

1.6. Строение цитоплазматических геномов P. sativum и родственных видов Fabeae. Помимо ядерного геном растений включает два цитоплазматических генома: пластидный и митохондриальный. На сегодняшний день полные нуклеотидные последовательности пластидных геномов определены более чем у 1500 видов растений (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes). Пластидный (хлоропластный) геном у подавляющего большинства цветковых растений имеет единый план строения и включает длинную уникальную

последовательность (LSC) и короткую уникальную последовательность (SSC), которые разделены парой инвертированных повторов (IR) длиной около 25 т.п.н. Размер пластома фотосинтезирующих растений колеблется в пределах 110 – 170 т.п.н, со средними значениями 154 т.п.н. Пластом содержит 120-130 генов, кодирующих белки, которые участвуют в процессе фотосинтеза, транскрипции и трансляции. Как правило, у цветковых растений сохраняется набор и расположение генов на хпДНК. Для пластомов также характерно наследование по материнской линии, отсутствие рекомбинации и медленные темпы эволюции. Пластомные гены характеризуются достаточным уровнем консерватизма, и геномная вариабельность детектируется в основном в последовательностях межгенных спейсеров и в немногочисленных интронах (Daniell et al., 2016). Таким образом, можно говорить о достаточно консервативной структуре пластома наземных фотосинтезирующих растений. Однако есть исключения. Так, например, некоторые представители бобовых подсемейства Papillionoidae, включающего трибу Fabeae, для которых характерны значительные изменения пластидного генома. Изменения пластомов этих видов, называемых IRLC (Inverted Repeat-Lacking Clade), в первую очередь связаны с потерей одного из инвертированных повторов. Кроме того, они отличаются многочисленными перестройками генома, дупликацией генов, потерей ряда генов, например, rpl22 и rps16, потерей интронов, присутствием большого количества диспергированных повторов, инверсионными вставками и переносом ряда пластидных генов в ядрерный геном (Magee et al., 2010; Sabir et al., 2014; Schwartz et al., 2017). Функциональная причина таких значительных перестроек не ясна. При этом было показано, что потеря инвертированного повтора коррелирует с высоким уровнем нестабильности пластомных последовательностей (Weng et al., 2013; Schwartz et al., 2017). Однако при этом IRLC виды M. truncatula (триба Trifolieae) и C.arientinum (триба Cicereae), которые филогенетически достаточно отдаленны, по-прежнему сохранили обычный порядок генов, в то время, как филогенетически достаточно близкие виды Pisum sativum, Vicea faba и Lathyrus sativus, относящиеся к одной трибе Fabeae, характеризуются большим количеством инверсий и вставок, приводящих к перетасовке практически всего пластома (рис. 1.3).

В настоящее время вариабельность последовательности хлоропластной ДНК является одним из основных источников определения филогении растений, что может конкурировать только с полиморфизмом ITS-последовательностей рибосомального оперона ядерного генома. Вариабельность пластома достаточно широко использовалась для исследований межвидового разнообразия и определения филогенетических отношений видов трибы Fabeae. При этом в анализ в основном бралось ограниченное количество последовательностей пластидного генома, включающих спейсеры trnT-L, trnT-trnF, matK (Kenicer et al 2005.)

Рис. 1.3. Схематичное строение пластомных геномов 12 IRLC видов бобовых (одним цветом указаны синтеничные участки) (Sabir et al., 2014).

В отличие от пластидных, число секвенированных геномов митохондрий растений чуть больше 120 (июнь 2017 г) (www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes). Анализ полногеномных сиквенсов показал, что цветковые растения имеют самые крупные митохондриальные геномы, от 200 до более чем 2400 т.п.н., состоящие из гетрогенных популяций как линейных, так и кольцевых молекул (Kubo, Mikami, 2007). При этом

размер и организация митохондриальных геномов может различаться не только между близкими видами, но даже среди линий одного и того же вида (Kitazaki, Kubo, 2010). Молекулы, называемые «главными хромосомами» (master chromosome), обычно содержат большой (> 500 п.н.) прямой и несколько инвертированных повторов. Внутри- и межмолекулярная рекомбинация между повторами может приводить к различным изомерным формам или субгеномным инверсиям, за счет инсерций или делеций последовательностей (Kubo, Mikami, 2007). Для митохондриального генома характерны вставки чужеродных фрагментов, например, последовательностей ядерного или хлоропластного генома. На май 2017 года известны полногеномные последовательности мтДНК 5 видов бобовых, только один из которых, V. faba, относится к трибе Fabeae (Negruk, 2013). МтДНК представлена кольцевой главной хромосомой длиной 588 т.п.н., GC составляет 45.04%. При этом сходство с другими митохондриальными геномами бобовых составило только 40%, а остальными известными мтДНК растений не более 25%. В геноме было выявлено 11 больших (более 500 п.н.) прямых и инвертированных повторов, самый большой из которых был 66897 п.н. Следует отметить, что суммарно повторы составляли более 200 т.п.н. или около 34% генома митохондрии. Уникальные последовательности включали 37 митохондриальных генов, кодирующих белки, гены рибосомальных РНК и 17 генов тРНК (Negruk, 2013). В отличие от хлоропластного, митохондриальный геном растений не так часто используется в филогенетических исследованиях и оценке биоразнообразия видов и родов. Причина этого в том, что структура митохондриального генома растений довольно нестабильна. Очень часто в мтДНК растений происходят крупные перестройки, в результате которых даже у близких видов часто не сохраняется одинаковый порядок генов. Однако, несмотря на такую нестабильность генома митохондрий растений в целом, они не затрагивают генные структуры, и ряд кодирующих и некодирующих областей мтДНК довольно часто применяется в молекулярных исследованиях для оценки биоразнообразия и филогении растений. Так, была показана возможность успешного использования в различных таксономических и филогенетических исследованиях растений последовательностей как интронов, так и экзонов митохондриальных генов cox, atpA, nad (Hiesel et al., 1994; Qiu, Cho, 1998; Duff, Nickrent, 1999; Freudenstein, Chase, 2001).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Растительный материал.

Для проведения анализа генома рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae была составлена коллекция из 217 образцов. В работу были включены 169 образцов рода Pisum, в том числе 83 образца Pisum sativum из дикорастущих популяций и охватывающие мировое генетическое природное разнообразие этого рода, и 10 образцов Pisum fulvum из коллекции генбанка ВИР (ФГБНУ "Федеральный исследовательский центр Всероссийский институт генетических ресурсов растений имени Н.И. Вавилова" г. Санкт-Перербург, Россия). Образцы подобраны кураторами коллекции отдела генетических ресурсов зернобобовых культур д.б.н. Вишняковой М.А. и к.б.н. Семеновой Е.В (ВИР) Образцы 66 сортов и линий отечественной и зарубежной селекции предоставлены Всероссийским Научно-исследовательским институтом Селекции и Семеноводства Овощных Культур (ВНИИССОК) (табл.2.1). Коллекция составлена зав. лабораторией селекции и семеноводства бобовых культур к.с/х.н. Прониной Е.П. Также в работе были использованы образцы других родов трибы Fabeae: Vavilovia (19 образцов), Lathyrus (15 образцов), Vicia (13 образцов) и Lens (1 образец). Для каждого этапа проведения анализа был составлен индивидуальный набор из имеющихся образцов в соответствии с поставленными задачами. Наборы образцов для каждого этапа представлены в таблице 2.1.

Таблица 2.1. Образцы рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.

Мультилокусный анализ Монолокусный анализ (AFLP- и RGA-

маркирование)

№

Образец/

№ Вид Каталог Происхождение

сорт trnL

nad1

trnT ITS2

а -

trnC

tnnH

Типгенома

Pisum

P.sativum

5.8S

trnE

P. sativum P.

род

rpoB

psbA

trnY

ITS1

сорта

b/c интрон Интрон гена 1 P.sativum 2006 arvense Дания S + + + + + + + +

2 P.sativum 2008 jomardii Египет Ab + + + + + + + +

3 P.sativum 1937 Австрия Ab + + + + + + +

4 P.sativum 2514 Сирия Ab + +

5 P.sativum 188 Памир As + + + + + + + +

6 P.sativum 1250 Памир As +

7 P.sativum 958 Туркестан As +

8 P.sativum 1251 Таджикистан As +

9 P.sativum 1866 Индия As +

10 P.sativum 1022 Германия As +

11 P.sativum 2182 Иран As + + + + + + +

12 P.sativum 3266 Армения As +

13 P.sativum 1985 Грузия Т + + + + + + +

14 P.sativum 3980 Грузия Т +

15 P.sativum 2174 Болгария Т +

16 P.sativum 2429 Алжир S +

17 P.sativum 3429 Египет S +

18 P.sativum 8093 Мадагаскар S +

19 P.sativum 6468 Судан S +

20 P.sativum 7131 Тунис S +

21 P.sativum 7584 Эфиопия S + + + + + + +

22 P.sativum 1836 Африка S +

23 P.sativum 3855 Аргентина S + +

Ojo Negro 24 P.sativum 5012 Аргентина S + espesial 25 P.sativum 8261 Long drink Бразилия S + +

26 P.sativum 8571 Венесуэла S +

27 P.sativum 693 Канада S +

28 P.sativum 925 США S +

29 P.sativum 8572 Mayfair США S +

30 P.sativum 7094 местный Перу S +

31 P.sativum 6464 Чили S +

32 P.sativum 1982 Афганистан S + + + + + + +

33 P.sativum 2595 Палестина S +

34 P.sativum 5493 Bamtam Ирак S +

Россия, 35 P.sativum 7128 местный S + + + + + + + Дагестан 36 P.sativum 3540 зеленый Япония S +

37 P.sativum 3034 местный Япония S +

38 P.sativum 8599 Бутан S + + + + + + + +

39 P.sativum 8456 Бурунди S +

40 P.sativum 1537 Манчьжурия S +

Россия, о-в 41 P.sativum 4776 S + Сахалин 42 P.sativum 6373 Монголия S + + + + + + +

43 P.sativum 5494 Монголия S +

44 P.sativum 4788 Монголия S + + + + + + +

45 P.sativum 8702 Вьетнам S +

46 P.sativum 6063 Казахстан S +

Россия, 47 P.sativum 4662 S + Приморский

край Россия, 48 P.sativum 6875 Красноярский S +

край 49 P.sativum 7700 Бангладеш S +

50 P.sativum 7034 Непал S +

Великобритания 51 P.sativum 8543 Fillbasket S + , Шри-Ланка 52 P.sativum 1865 Индия S + + + + + + +

53 P.sativum 1142 Франция S +

54 P.sativum 4650 Армения S + + + + + + +

55 P.sativum 5992 Австрия S +

56 P.sativum 8331 Греция S +

57 P.sativum 2593 Кипр S +

58 P.sativum 2175 Болгария S +

59 P.sativum 2176 Чехия S +

60 P.sativum 8413 Венгрия S +

61 P.sativum 4148 Финляндия S +

62 P.sativum 7826 Польша S + + + + + + + +

63 P.sativum 6139 Албания S + + + + + + +

64 P.sativum 3970 Бельгия S +

65 P.sativum 1027 №1337 Германия S +

66 P.sativum 1025 местный Германия S +

67 P.sativum 8585 №409179 Германия S +

68 P.sativum 3140 местный Испания S +

69 P.sativum 1930 Италия S +

70 P.sativum 1693 Великобритания S +

71 P.sativum 1699 Великобритания S +

72 P.sativum 6883 Узбекистан S +

73 P.sativum 4170 Латвия S +

74 P.sativum 3312 Россия, S +

Кировская обл. Россия, 75 P.sativum 957 Вологодская S +

обл. 76 P.sativum 1658 Швеция S +

77 P.sativum 3064 Белоруссия S +

Украина, 78 P.sativum 3324 S + Луганская обл. Украина, 79 P.sativum 4108 S + Львовская обл. Россия, 80 P.sativum 3358 Саратовская S +

обл. Россия, 81 P.sativum 8522 Тройка S + + Московская обл. 82 P.sativum 8274 Vendevil Франция S +

83 P.sativum 8638 Panu Финляндия S +

84 P.sativum Ранний 301 +

85 P.sativum Виола +

86 P.sativum Чика +

87 P.sativum Дарунок +

88 P.sativum Совинтер 1 +

89 P.sativum Викинг +

90 P.sativum Крейсер +

91 P.sativum Матрона +

92 P.sativum Фрагмент +

93 P.sativum Жегаловец +

94 P.sativum Самородок +

95 P.sativum Вера +

96 P.sativum Каира +

Ранний 97 P.sativum + грибовский

11 98 P.sativum Изумруд +

99 P.sativum Совинтер +

100 P.sativum Николас +

101 P.sativum Триумф +

102 P.sativum Сахарный 2 +

Неистощимы 103 P.sativum + й 195 104 P.sativum Милани +

105 P.sativum Амиус 1241 +

Апорт Н-Х- 106 P.sativum + 0326 107 P.sativum Первенец +

Сахарный 108 P.sativum + Бровцина Сахарная 109 P.sativum + конфетка 110 P.sativum Амброзия +

111 P.sativum Беркут +

112 P.sativum Санджина +

113 P.sativum Арфа +

114 P.sativum Ода +

115 P.sativum Лея +

116 P.sativum Рада +

117 P.sativum Фора +

118 P.sativum Джоф +

119 P.sativum Сомервуд +

120 P.sativum Преладо +

121 P.sativum Дакота +

122 P.sativum Абадор +

123 P.sativum Эштон +

124 P.sativum Тристар +

125 P.sativum Асана +

126 P.sativum Донара +

127 P.sativum Женева +

128 P.sativum Atlas +

129 P.sativum Dетенице +

130 P.sativum Lumir +

131 P.sativum Minarette +

132 P.sativum Kwartella +

133 P.sativum Emigrant +

134 P.sativum Big Ben +

135 P.sativum Desi +

136 P.sativum Frivita +

Grundmanns 137 P.sativum + Blutenmeer 138 P.sativum Zwiling +

139 P.sativum Mini +

140 P.sativum Midlfeezer +

141 P.sativum Surgevil +

Sans nain 142 P.sativum parchemim +

hatif Breton 143 P.sativum Rivalin +

Kelvedon 144 P.sativum + Wonder 145 P.sativum Arcturus +

146 P.sativum Green Arron +

A.and M. 147 P.sativum Perfection +

(Dimpled) 148 P.sativum Афила +

Horsford 149 P.sativum + market garden

150 P. sativum 9190 + + + + + + +

151 P.sativum 3980 + + + + + + +

P.sativum 152 2827 + + + + + + + asiaticum P.sativum 153 2524 + + + + + + + elatius P.sativum 154 3115 + + + + + + + elatius P.sativum 155 transcaucasicu 289 + + + + + + +

m P.sativum 156 transcaucasicu 2376 + + + + + + +

m P.sativun 157 2759 + + + + + + + abyssinicum P.sativum 158 3567 + + + + + + + abyssinicum P.sativum 159 2521 + + + + + + + humile 160 P.fulvum 701 + + + + + + +

161 P.fulvum 702 + + + + + +

162 P.fulvum 703 + + + + + +

163 P.fulvum 706 + + + + + + +

164 P.fulvum 708 + + + + + + +

165 P.fulvum 2140 + + + + + + +

166 P.fulvum 2523 + + + + + + +

167 P.fulvum 3397 + + + + + + +

168 P.fulvum 6070 + + + + + + +

169 P.fulvum 6071 + + + + + + +

170 V.formosa B + + + + + +

171 V.formosa C +

172 V.formosa D + + + + + +

173 V.formosa E +

174 V.formosa F + + + + + +

175 V.formosa G +

176 V.formosa H + + + + + +

177 V.formosa I + + + + + +

178 V.formosa J + + + + + +

179 V.formosa K +

180 V.formosa L + + + + + +

181 V.formosa M +

182 V.formosa N +

183 V.formosa O + + + + + +

184 V.formosa P + + + + +

185 V.formosa 2 + + + + + +

186 V.formosa 3 + + + + +

187 V.formosa 4 + + + + + + +

188 V.formosa 5 + + + + + + +

189 L. sativus 592 +

190 L. sativus 701 + + + + + +

191 L. cicera 356 + + + + + + +

192 L. hirsutus 1709 + + + + + +

193 L. sylvestris И-308541 + + + + + + +

194 L. aphaca 1293 + + + + + + +

195 L. nissolia 1436 + + + + + +

196 L. ochrus 380 + + + + + + +

197 L. clymenum 1370 + + + + + + +

И- 198 L. palustris + + + + + + 0139316 199 L. gmelinii 453 + + + + + +

И- 200 L. pratensis + + + + + + 0139312 201 L. odoratus И- Сатин + +

604554 202 L.maritimus 385 + +

203 L. tuberosus 1356 +

V. faba, 204 1506 Украина + + + + + + var.equina 205 V. ervilia 517 Украина + + + + + +

206 V. unijuga k-35828 + + + + + +

207 V narbonensis k-36787 + + + + + +

208 V villosa k-37026 + + + + + +

209 V. bithynica k-32547 + +

210 V hirsuta k-36792 + +

211 V.peregrina k-36771 +

212 V sativa L k-36653 + +

Россия, 213 V.angustifolia 35983 Новгородская +

обл 214 V.pannonica 34525 Грузия +

215 V. michauxii 36721 Армения +

216 V. benghalensis 34852 Португалия +

Россия, 217 L. culinaris 244 Воронежская + + + + + + +

обл

2.2. Выделение растительной ДНК и РНК.

Для выделения ДНК использовались 7-10 дневные проростки индивидуальных растений анализируемых образцов трибы Fabeae. Выделение тотальной растительной ДНК проводилось с использованием методики, предложенной Edwards с соавторами (1991) с дополнительной депротеинизацией смесью фенол/хлороформ и методики Doyle J.J (1987) для получения ДНК из растительных тканей, содержащих большое количество фенолов (V. sativa, V. faba). Обе методики позволили проводить быстрое выделение тотальной ДНК в достаточном количестве (более 5 мкг) с чистотой OD=1.6-1.8. Выделение тотальной РНК из органов 3 индивидуальных растений P. sativum проводили с помощью набора реактивов SV Total RNA Isolation System (Promega, США). Возраст растения составил 50 дней. Выделение РНК из цветков проводилось в период его полного раскрытия, возраст плода на момент выделения РНК составлял 10- 12 дней. Для минимизации индивидуальной вариабельности выделение РНК проводили трех растений каждого образца. Концентрацию выделенной ДНК и РНК определяли на спектрофотометре Qubit 3.0 с помощью соответствующих реактивов (Invitrogen, США). 2.3. Проведение мультилокусного анализа. 2.3.1. Проведение AFLP- маркирования. AFLP-анализ проводили по стандартной методике, предложенной Vos P. с сотрудниками (1995). Геномную ДНК каждого образца гидролизовали рестриктазами EcoRI/MseI, EcoRI/PstI 3 часа при температуре 370С, лигировали с соответствующими адаптерами и с использованием T4лигазы, затем проводили два последовательных раунда селективной амплификации. Для первого раунда амплификации были использованы стандартные адаптерные праймеры Eco+1, Tru+1 и PstI+1 с одним/двумя селективными нуклеотидами на 3'-конце каждого праймера. Для второго раунда амплификации были использованы сочетания EcoRI/TruI и EcoRI/PstI с тремя и четырьмя селективными нуклеотидами 3'-конца каждого праймера (табл.2.2).

Таблица 2.2 AFLP праймеры, использованные в работе. Комбинации праймеров Селективные нуклеотиды EcoRI+3/TruI+3 (E35/T55) E-ACA T-CGA EcoRI+3/TruI+3 (E35/T59) E-ACA /T-CTA EcoRI+3/TruI+4 (E35/T55C) E-ACA /T-CGAC EcoRI+3/TruI+4 (E35/T55T) E-ACA /T-CGAT EcoRI+3/TruI+4 (E35/T59A) E-ACA /T-CTAA EcoRI+3/TruI+4 (E35/T59C) E-ACA /T-CTAC EcoRI+3/PstI+3 (Е35/Р55) E-ACA/Р- CGA EcoRI+3/PstI+3 (Е35/Р59) E-ACA/Р-CTA EcoRI+3/PstI+4 (Е35/Р59A) E-ACA/Р-CTAA EcoRI+3/PstI+4 (Е35/Р59C) E-ACA/Р-CTAC

2.3.2. Проведение RGA-маркирования. RGA-маркирование проводили по стандартной методике, предложенной van der Linden с соавторами (2004). Рестрикцию геномной ДНК (300 нг) проводили с помощью эндонуклеазы MseI, далее полученные продукты лигировали T4 лигазой с адаптерными праймерами. Первый раунд амплификации проводили с использованием адаптерных (Mse) праймеров. Для второго раунда амплификации использовали специально разработанные IRD 700/800 NBS-праймеры (NBS2 5′- GTWGTYTTICCYRAICCISSCAT-3′ и NBS5 5′-YYTKRTHGTMITKGATGATGTITGG- 3′). 2.3.3. Визуализация полученных результатов AFLP и RGA анализа. Полученные амплификаты разделяли в 6%-акриламидном геле с использованием гель-анализатора LiCOR 4300 (LI-COR Biosciences GmbH, США) по стандартной методике (LiCOR operator manual). 2.3.4. Статистическая обработка AFLP- и RGA-спектров, анализ полиморфизма. Подсчет фрагментов геля был произведен вручную. В статистический анализ были включены только четкие, воспроизводимые фрагменты. Молекулярные панели AFLP фрагментов по каждой комбинации праймер/фермент документировали в программе Exel в виде бинарных матриц присутствия/отсутствия фрагмента 1/0. На основании построенных спектров и матриц были идентифицированы образец специфичные ДНК маркеры, были рассчитаны коэффициенты попарного

генетического сходства/различий с использованием коэффициентов Jaccard и Nei -Li (пакет программ STATISTICA-10.0 и PAUP 4.0). Построение дендрограммы и определение групп генетически сходных образцов производилось с использованием программ PAUP 4.0 и TREECON-1.3b. (Swofford, 2002; Van de Peer et al., 1994). Для определения корреляции между матрицами использовали тест Мантела (пакет программ PAST). 2.4. Амплификация и секвенирование участков ядерного и цитоплазматических геномов. Амплификации некодирующих участков ДНК бобовых проводилась по стандартной методике. Были использованы стандартные праймерные пары, позволяющие амплификацировать участки ядерной, хлоропластной и митохондриальной ДНК у представителей трибы Fabeae (White et al., 1990; Taberlet et al., 1991; Demesure et al., 1995; Shaw et al., 2005, 2007).

Таблица 2.3. Условия проводимых реакций

Участок/ Последовательность прямого и обратного

локализация праймеров

п.н.

отжига отжига

Температура

Оптимальная

праймеров, С

ПЦР ПЦР фрагмента, Ожидаемаядлина ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS1-5.8S-ITS2 650 59 ITS5 TCGTAACAAGGTTCCCGTAGGTG

trnH-psbA trnH CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC 300 57 хпДНК psbA GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C

rpoB-trnC rpoB CAC CCR GAT TYG AAC TGG GG 1000 59 хпДНК trnC CKA CAA AAY CCY TCR AAT TG

trnY-trnT trnT CTA CCA CTG AGT TAA AAG GG 1000 59 хпДНК trnY CCG AGC TGG ATT TGA ACC A

trnL TabC CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG 400 59 хпДНК TabD GGG GAT AGA GGG ACT TGA AC интрон гена NAD1B GCA TTA CGA TCT GCA GCT CA Nad1 1500 60 NAD 1C GGA GCT CGA TTA GTT TCT GC мтДНК

Амплификацию нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора реактивов ЗАО «Диалат ЛТД» (РФ). Реакционная смесь

объемом 15 мкл содержала 10x буфер,1,5мкМ MgCl2, 0,2 мМ каждого dNTP, по 0,5 мкМ соответствующих праймеров, 0,2 единиц Taq полимеразы и 100 нг. геномной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере BioRad Т100 (Bio-Rad, США) в режиме: денатурация - 30 с. при 95°С; отжиг праймера - 30 сек. при температуре

соответствующей tотж праймеров; элонгация ДНК - 1 мин на 1000 п.н. при 72°С; число циклов – 35; заключительная элонгация -5 мин при 72°С. Для идентификации и секвенирования полноразмерной последовательности гена сахарозосинтазы (Sus1) на основе известных последовательностей мРНК бобовых было разработано восемь праймеров: шесть праймеров локализовались непосредственно внутри гена и два - до старт-кодона и после стоп-кодона, и позволяют амплифицировать как полноразмерный ген, так и его перекрывающиеся участки длиной до 1000 п.н. (рис. 2.1)

Рис. 2.1. Схематичное изображение сайтов отжига разработанных внутренних и внешних праймеров для амплификации последовательностей генов SUS1.

С помощью разработанных праймеров была проведена амплификация и клонирование полноразмерных последовательностей генов-ортологов SUS1 у видов трибы Fabeae. Для амплификации полноразмерной последовательности гена сахарозосинтазы был использован набор реактивов производства LongAmp Taq MasterMix (New England BioLabs, USA). Амплификацию ДНК проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей 12.5 мкл буфера LongAmp Taq MasterMix, по 1 мкМ соответствующего праймера, 9.3 мкл mQ и 100 нг геномной ДНК. Амплификацию полной последовательности гена SUS1 проводили в термоциклере “BioRad” T100 (США) с предварительной денатурацией - 5 минут (95°С) в режиме: денатурация - 30 с. при 95°С; отжиг праймера - 30 с. при температуре

соответствующей tотж праймеров; синтез ДНК - 5 минут при 65°С с числом циклов - 35. Заключительная элонгация ПЦР-фрагментов проводилась 10 минут при 65°С. Все амплифицированные фрагменты были клонированы в плазмидный вектор pGEM-T (Promega, USA). Для клонирования полноразмерных последовательностей гена SUS1 у представителей трибы Fabeae была использована система Qiagen PCR

Cloning Kit (Нидерланды) согласно инструкции производителя. Проверка полученных рекомбинантных клонов производилась с помощью ПЦР со стандартными праймерами M13F и M13R. Продукты реакции амплификации разделяли в 1.5% агарозном геле в 1х ТВЕ буфере, окрашивали бромистым этидием и фотодокументировали. В качестве маркера молекулярных масс использовали DNA Ladder Mix и 100 bp DNA ladder Plus (“Fermentas”). Первичная последовательность ДНК амплифицированных участков была определена с помощью системы Big-dye (Applied Biosystems) на секвенаторе ABI 310 capillary DNA Analyzer (ЦКП «Биоинженерия» РАН). Полученные в первичные последовательности анализировались с помощью программ Chromas 1.45 и MEGA 6.0 (Tamura et al., 2013). 2.5. Проведение РВ-ПЦР. Препараты кДНК получали методом обратной транскрипции из выделенной РНК (5нг) с использованием набора реактивов GoScript Reverse Transcription System (Promega, США). Концентрация кДНК была измерена на спектрофотометре Qubit 3.0 (Invitrogen, США). Реакция РВ-ПЦР была проведена с использованием разработанных праймеров (гл. 3.3). Размер амплифицированного фрагмента составил 210 п.н. Для проведения РВ- ПЦР использовали набор набор «2.5х реакционная смесь в присутствии SYBR GreenI и ROX» (ЗАО «Синтол», Россия). Амплификацию проводили на приборе ABI Prism 7500 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США) в режиме: предварительная элонгация 950C – 5 мин., далее 40 циклов в режиме 950C – 15 сек., 620C – 50 сек. Реакции проводили с использованием двух биологических и трех технических повторностей и в каждой реакции использовали кДНК в концентрации 2 нг. В нетранслируемом контроле флуоресценция не детектирована, что указывает на отсутствие неспецифичной экспрессии. В качестве референсного для P. sativum был использован ген актина (Die et al., 2010). Оценку уровня относительной экспрессии и статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism version 7.02 (https://www.graphpad.com).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Оценка полиморфизма ядерного генома рода Pisum методами мультилокусного анализа. При изучении внутриродовой вариабельности рода Pisum методами мультилокусного анализа представляло интерес решение нескольких задач: - оценка генетической вариабельности рода Pisum и входящих в его состав видов, представленных в коллекции ВИР; и определение таксономического статуса дискуссионных образцов (transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum); - сравнение уровней биоразнообразия дикорастущих образцов P. sativum, отобранных из коллекции ВИР, которые представляют как первичные центры, так и различные географические регионы, и охватывают современный ареал вида; - оценка геномной вариабельности сортов гороха P. sativum. Для анализа полиморфизма генома гороха были выбраны методы мультилокусного анализа AFLP (анализ вариабельности ядерного генома в целом) и RGA (анализ вариабельности семейства генов устойчивости) маркирования. 3.1.1. Анализ ядерного генома представителей рода Pisum методом мультилокусного AFLP маркирования Одной из систем молекулярного анализа, которая была использована для исследования геномного разнообразия гороха, стал метод AFLP маркирования. Данный метод широко используется для анализа внутривидового полиморфизма, филогенетических отношений, идентификации видов, а также маркирования отдельных локусов (Feulner et al., 2014; Santayana et al.; 2014, Rapposelli et al., 2015). Первым этапом проведения AFLP маркирования генома рода Pisum был подбор AFLP-комбинаций праймер/фермент, позволяющих выявлять внутри- и межвидовой полиморфизм. На выборке из 5 проб ДНК было протестировано 8 комбинаций праймер/фермент с различным сочетанием рестрицирующих эндонуклеаз. Наилучшие результаты (число фрагментов в спектрах, воспроизводимость) дала комбинация рестриктаз EcoRI и TruI с праймерами E35/T55C и E35/T59T, спектры которых характеризовались достаточно высоким уровнем информативности. Для выявления межвидового и межсортового полиморфизма P. sativum были дополнительно отобраны комбинации праймеров E35/T49 и E35/T61.

3.1.1.1.Оценка межвидового генетического разнообразия видов Pisum методом AFLP анализа. Для исследования генетической вариабельности рода Pisum и его видового состава методом AFLP маркирования были отобраны 37 образцов трибы Fabeae: 16 образцов P. sativum, наиболее отдаленных по географическому происхождению, включая образцы transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum; 10 образцов P. fulvum; 11 образцов из других родов трибы Fabeae (Vavilovia, Lathyrus, Vicia и Lens) (табл.2.1). Всего при использовании отобранных праймерных комбинаций (E35/T55C, E35/T59T) у анализируемых образцов было детектировано 304 AFLP-фрагмента, из них 287 были полиморфными (94,4%). В результате проведенного молекулярного маркирования каждый из 37 анализируемых образцов был охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов (рис 3.1). Для образцов рода Pisum было выявлено 230 фрагментов, из которых 176 были полиморфными (76,5%), а 25 фрагментов были специфичны для представителей рода Pisum.

Рис. 3.1 Фрагмент AFLP-спектров видов рода Pisum и представителей других родов трибы Fabeae, полученные при использовании праймерной комбинации E35/Т59T

На основе полученных AFLP-спектров в программе PAUP 4.0 были рассчитаны значения генетических расстояний (GD) (коэффициент Nei-Li) и установлено, что полиморфизм между видами рода Pisum варьировал в пределах от 0,052 до 0,385, а среднее значение составило 0.178. Генетические расстояния между образцами P. fulvum варьировали в пределах 0,004-0,037. Расстояния между образцами P. sativum и образцами спорного таксономического статуса (0,052-0,284) не превышали внутривидовых расстояний P.

52 sativum ssp. sativum (0,069-0,336). В свою очередь, межвидовые расстояния между анализируемыми образцами трибы Fabeae варьировали от 0,191 и до 0,447. На основе полученных по результатам AFLP анализа данным методами Neighbor-joining (рис. 3.2 А) и Maximum Parsimony (рис. 3.2 Б) были построены дендрограммы. Как видно из рисунка 3.2, обе дендрограммы высоко конгруэнтны. Базальные ветви дендрограмм формируют представители родов Vavilovia, Lathyrus, Vicia и Lens, взятые в анализ в качестве внешней группы (рис. 3.2).

A. Б.

Рис.3.2 Дендрограммы генетических различий представителей бобовых на основе данных AFLP анализа. А – дендрограмма, построенная методом ближайшего соседа (Neighbor-joining; TREECON 1.3b). Б – дендрограмма, построенная методом максимальной экономии (Maximum Parsimony; PAUP 4.0).

Образцы рода Pisum формируют единый кластер (ИБ=100 %), внутри которого отдельный субкластер (ИБ=100%) формируют образцы P. sativum и спорные образцы transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum, а базальное положение на обеих

дендрограммах занимает образец P. sativum (2759). Выделяемые внутри этого субкластера отдельные группы образцов имеют низкий уровень поддержки (<50%), за исключением пары P. sativum (2008) и P. sativum (2514) (ИБ=54%). Другой субкластер образуют образцы вида P. fulvum (ИБ=100%), внутри которого выделяется несколько групп образцов с высокой поддержкой. Образцы рода Vavilovia с достаточно высоким уровнем достоверности формируют отдельный от гороха кластер. Как было сказано выше (гл.1), до настоящего времени вопрос таксономии и видового состава гороха является весьма дискуссионным (Govorov 1937; Zohary, Hopf, 1973; Vershinin et al., 2003; Jing et al., 2010; Jing et al, 2012). Даже последние исследования, основанные на данных полиморфизма молекулярных маркеров, расходятся в вопросах состава рода Pisum (Hoey et al., 1996; Tar’an et al., 2005; Jing et. al., 2010; Jing et al, 2012). Так анализ полиморфизма сайтов интеграции ретротранспозонов (SSAP) генома гороха выявляет отчетливую эволюционную историю каждого из видов рода Pisum (P.fulvum, P. elatius, P. abyssinicum, P. sativum) (Vershinin et al., 2003). С другой стороны, ряд исследований, основанных на данных комбинированного RAPD, SSR и ISSR анализов (Tar’an et al., 2005) и тех же маркеров полиморфизма сайтов встраивания мобильных элементов (Jing et. al., 2010, 2012) выделяют, помимо P. fulvum, только культурный P. sativum, включающий смешанную группу дикорастущих подвидов гороха, среди которых отдельные подгруппы составляют P. sativum ssp. transcaucasicum, P. sativum ssp. elatius, P. sativum ssp. abyssinicum, P. sativum ssp. asiaticum. Полученные нами данные также подтверждают включение анализируемых образцов transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum в состав вида P. sativum. Таким образом, в результате проведенного AFLP анализа была охарактеризована коллекция из 26 образцов рода Pisum. Для каждого исследованного образца были получены уникальные спектры, оценены уровни геномной вариабельности, определены внутривидовые генетические расстояния, построены дендрограммы, отражающие сходство исследованных геномов гороха. Данные AFLP анализа поддерживают классификацию рода Pisum, состоящего только из двух видов - P. fulvum и P. sativum, и включение анализируемых образцов transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum в состав P. sativum.

3.1.1.2. Оценка внутривидового полиморфизмагороха посевного P. sativum методом AFLP. Следующей задачей работы было исследование внутривидового полиморфизма P. sativum на расширенной выборке дикорастущих образцов различного географического происхождения, в том числе местных сортов народной селекции, а также сравнение биоразнообразия образцов гороха в регионах первичного центра происхождения и в современном культигенном ареале. Для анализа генетического разнообразия P. sativum методом AFLP были отобраны 83 образца, различающиеся по морфо-биологическим признакам и эколого- географическому происхождению (включая первичный центр происхождения)(табл. 2.1). Полученные AFLP-спектры образцов P. sativum характеризовались значительным уровнем полиморфизма. Так из детектированных 405 AFLP-фрагментов 382 были полиморфными (94,3%). Для данной выборки также было идентифицировано 54 образец-специфичных фрагментов, при этом не выявлено фрагментов, характерных для отдельных таксономических групп (рис. 3.3).

Рис. 3.3. AFLP-спектры 48 образцов P. sativum, полученные при использовании праймерной комбинации E35/Т61 (представлен фрагмент геля).

На основе полученных AFLP-спектров были рассчитаны значения генетических расстояний между исследуемыми образцами P. sativum. Внутривидовое разнообразие у

гороха посевного варьировало в пределах от 0,070 и до 0,356 (GDср=0,187), что

значительно выше внутривидового разнообразия P. fulvum (0,004-0,037, GDср=0,011).

В целом методом AFLP маркирования был выявлен довольно высокий уровень геномного разнообразия образцов P. sativum, представленного в коллекции ВИР. В свою очередь, по данным комбинированного RAPD, SSR и ISSR анализов другими авторами была выявлена еще более широкая, чем в нашем исследовании, геномная вариабельность образцов гороха. Так, уровни генетических различий 65 образцов P. sativum, преимущественно западно-европейской селекции с привлечением дикого генофонда, составили 0,01-0,66. (Tar’an et al., 2005). Также значительные генетические различия (0,21-0,74) были детектированы с у 15 индийских образцов P. sativum методом RAPD (Yadav et al., 2007). Еще более вариабельным (0,11-0,73) оказался материал из стержневой коллекции университета Banaras Hindu (Индия), изученный методом SSR-маркирования (Kumari et al., 2013). Полученные по результатам проведенного AFLP-анализа данные были использованы для построения дендрограммы (рис. 3.4). В целом полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ярко выраженной кластеризации на основе эколого-географического происхождения анализируемых образцов. На дендрограмме базальную ветвь формирует образец P. fulvum, все образцы P. sativum со 100% бутстреп-поддержкой формируют единый полиморфный кластер, внутри которого с низкими значениями бутстреп-поддержки (ИБ<50%) можно выделить три основные подгруппы образцов гороха. Наиболее дистальную и наиболее полиморфную подгруппу формируют образцы преимущественно восточноазиатского происхождения (Монголия, Маньчжурия, Красноярский край, Афганистан, Бутан, Япония, Индия, Казахстан, Египет). Самостоятельную ветвь образует образец #42 из Монголии. Небольшую обособленную подгруппу составляют образцы из Памира, Сирии и Ирана. В этой части дендрограммы наблюдается некоторое сосредоточение образцов из регионов первичного центра происхождения, однако основная их часть равномерно распределилась по дендрограмме.

Рис.3.4 Дендрограммы генетических различий представителей P. sativum на основе данных AFLP анализа методом ближайшего соседа (NJ, TREECON) (S, AS, T- обозначают типы генома).

Дополнительно к кластерному был проведен многомерный анализ главных компонент (PCA). На РСА-графике также не выявлялись отдельные группы, а анализируемые образцы формировали протяженный континуум с двумя полюсами, в

одном из которых локализовались преимущественно образцы азиатского, в другом – преимущественно европейского происхождения. Большая часть образцов гороха занимала промежуточное положение между этими дистанцированными полюсами (рис. 3.5).

Европейские образцы P.sativum

Азиатские образцы P.sativum

Рис. 3.5. РСA-график анализа данных AFLP маркирования образцов P. sativum. Зеленым цветом обозначены образцы asiaticum, красным - abyssinicum, желтым – transcaucasicum.

Анализ геномной структуры P. sativum с использованием программы STRUCTURE v2.3.4 подтвердил существование континуума форм, большинство из которых нельзя было четко отнести к какой-либо группе. Были проанализированы различные варианты количества подгрупп (к=от 2 до 15) и наилучшие результаты (LnLike=-6656.8) были получены для числа подгрупп к=5 (рис. 3.6). Однако, также никакого четкого разделения исследованных образцов гороха по эколого- географическому принципу или морфо-биологическим особенностям не наблюдалось. Образцы гороха формировали единый, но крайне полиморфный, геномный континуум. Образцы спорного таксономического статуса (transcaucasicum, abyssinicum, asiaticum) не показывали какого-либо существенного сходства и не образовывали отдельные группы, что подтверждает включение этих образцов в P. sativum. (см главу 3.1.1.1).

Рис. 3.6. Анализ геномной структуры дикорастущих образцов P. sativum для k=5 по данным AFLP анализа (программа STRUCTURE 2.3.4)

Кластерный анализ, PCA и анализ геномной структуры не выявили кластеризации образцов P. sativum по географическому происхождению или по таксономической принадлежности. На дендрограмме с низким уровнем достоверности наблюдалась кластеризация некоторых групп образцов из регионов первичного центра происхождения гороха, что может говорить о многочисленных фактах распространения биоразнообразия из первичных центров происхождения гороха. Полученные данные согласуются с результатами других исследователей. По результатам анализа образцов гороха из коллекции JIC (Великобритания) и еще семи мировых коллекций методом SSAP также отсутствовала четкая геномная структура P. sativum, а образцы различного географического происхождения образовывали несколько смешанных подгрупп (Jing et al., 2010, 2012). Отсутствие кластеризации по географической принадлежности образцов может быть обусловлено несколькими причинами. Горох, как пищевая и кормовая культура, с древнейших времен является предметом торговли, что способствует перемешиванию генотипов. Также, эта культура характеризуется широким ареалом возделывания, что может быть связано с высокой геномной пластичностью. Геномная лабильность гороха может быть связана и с насыщенностью генома мобильными элементами,

разнообразие которых, по всей видимости, и определило детектируемый генетический полиморфизм этого вида. Таким образом, впервые был проведен молекулярный AFLP анализ и охарактеризовано генетическое разнообразие 83 образцов культурного гороха P. sativum из коллекции ВИР, оценен геномный полиморфизм отобранной субколлекции, определены наиболее сходные и различающиеся генотипы. Кластерный анализ и анализ геномной структуры P. sativum не выявили групп образцов c высокой бутстреп поддержкой. На PCA графике все исследованные образцы P. sativum формировали непрерывный континуум с двумя полюсами: в одном из которых преобладали образцы из Азии, в другом – образцы из Европы. Образцы из регионов первичного центра происхождения располагались внутри единой полиморфной группы P. sativum.

3.1.1.3 Проведение AFLP анализа коллекции сортов гороха P. sativum. Для оценки генетической вариабельности, представленной у используемых в селекционных программах отечественных и зарубежных сортов и возможной генетической эрозии, была использована коллекция сортов гороха. Всего было отобрано 66 сортов и линий гороха, охарактеризованных по ряду морфо- биологических и хозяйственно ценных признаков (скороспелость, назначение, длина стебля, форма и размер боба, вкусовые качества и др.) (данные представлены д.б.н. Борисовым А.Ю., ВНИИСХМ). В результате проведенного анализа было проанализировано 4 AFLP комбинации праймер/фермент (E35/T49, E35/T61, E35/T59T, E35/T55C) и получено 347 AFLP- фрагментов, из которых 224 были полиморфными (64,6%). Как и ожидалось, уровни межсортового полиморфизма были ниже, чем у дикорастущих образцов. В результате проведенного маркирования каждый из 66 анализируемых сортов и линий гороха был охарактеризован специфичным спектром AFLP-фрагментов (рис. 3.7). На основе полученных AFLP-спектров были определены значения генетических расстояний (GD, Nei-Li) анализируемых образцов. Vежсортовой полиморфизм исследуемых образцов гороха был достаточно высок и варьировал от 0,025 до 0,261

(GDср= 0,115), в то время как для дикорастущих образцов эта величина составила

0,070-0,356 (GDср= 0,187) (см. главу 3.1.1.2).

Интересно отметить, что в целом генетические расстояния между сортами российской селекции (0,025-0,182,) были несколько меньше, чем между сортами западной селекции (0.031-0.249), что косвенно может свидетельствовать о несколько большей ограниченности генпула родительских образцов, используемых при создании новых отечественных сортов.

Рис. 3.7. AFLP-спектры образцов сортов и линий P. sativum полученные при использовании праймерной комбинации E35/Т55 (представлен фрагмент геля)

На дендрограмме сорта российской и зарубежной селекции формировали единый полиморфный кластер, без какой-либо достоверной группировки по происхождению сорта или его морфо-биологическим особенностям (рис. 3.8).

Рис.3.8. Дендрограммы генетических различий сортов P.sativum на основе данных AFLP анализа (метод NJ, TREECON).

По результатам PCA-анализа также не обнаружено какой-либо группировки образцов по происхождению либо по морфологическим признакам. Так же как и на дендрограмме, наиболее отделенное от остальных образцов положение занимают сорта Амброзия (Германия) и Эштон (Нидерланды) (рис. 3.9). Также ряд исследований был посвящен проблеме, так называемой генетической эрозии мировых коллекций сортов и линий гороха. Уменьшение генетического разнообразия ведет к понижению конкурентоспособности и жизнеспособности выращиваемых сортов при изменении условий окружающей среды и поэтому исследование мировых коллекций сортов имеет огромное значение. Проблема сортовой генетической эрозии была показана для многих важных сельскохозяйственных культур (Tenaillon et al., 2004; Megersa et al., 2014), в том числе и для бобовых (Smykal et al., 2008; Cieslarova et al., 2011, 2012; Hagenblad et al., 2014). Проведенный анализ чешской коллекции сортов гороха за последние 80 лет выявил генетическую эрозию (Cieslarova et al., 2011, 2012). Сравнение генетического разнообразия старых сортов шведской коллекции гороха, которые выращивались в 19 веке, и современных коммерческих сортов также показало, что генетическое разнообразие старых сортов оказалось несколько выше разнообразия современных сортов. (Hagenblad et al., 2014). Проведенный нами анализ коллекции сортов и линий гороха ВНИИССОК показал достаточно высокий уровень генетического разнообразия. Более высокий уровень полиморфизма, выявленный у изученных сортов, по сравнению с данными других авторов, может быть связан с тем, что основная часть проведенных ранее исследований рода Pisum была сосредоточена на ограниченных выборках местных сортов и линий. Так, уровни генетических различий исследованных образцов гороха в анализе Choudhury et al. (2007) составили 0.13 - 0.30. По данным RAPD и AFLP анализов, проведенных Simioniuc et al. (2002), генетические различия между генотипами 21 выращиваемых в Германии сортов гороха не превышали 0.15, что также может быть связано с размером и составом использованной авторами работы выборки. Аналогично уровень генетических различий, выявленный при исследовании полиморфизма сайтов встраивания мобильных элементов (RBIP) для детекции геномной вариабельности у 145 чешских и словацких сортов, составил всего 0.11-0.22, что также можно объяснить тем, что в анализ был взят локальный селекционный материал (Smykal et al., 2008). Разнообразие выращиваемого сортового материала,

вероятно, обусловлено географическими и климатическими особенностями стран произрастания гороха. Изменение климатических условий в широких пределах требует привлечения большого генетического разнообразия выращиваемых сортов.

Factor Loadings, Factor 1 vs. Factor 2 Rotation: Unrotated Extraction: Principal components

0,4

0,3

Изумруд

Амброзия 0,2 k-539 A.and M. Perfection (Dimpled) Эштон

Виола Викинг л-7394k-4782 Green Санджина Arron Преладо Чика НиколасСовинтерРаннийл-8856 Беркутгрибовский 11 Милани Самородок k-9017 Surgevil 0,1 Матрона Лея Рада Дарунок Крейсер

Factor 2 Арфа k-4917 Emigrant Каира Ода Абадор к-6360 Desi k-5498 Big Ben Амиус 1241k-8534 ПервенецСахарная конфетка АпортВера Н-Х-0326 k-8760 Atlas k-6950 Lumir Совинтер 1 к-347 Sans nain parchemim hatif Breton Тристар Женеваk-5616 Кубанец 1129 0,0 Триумф Сахарный 2 Жегаловецk-4455 Сахарный Бровцина Сомервуд k-579486 Frivita k-5865 Grundmanns Blutenmeerk-6671 Minarette НеистощимыйДонараФрагмент 195 k-9049Фора Midlfeezer Джоф Ранний 301 k-579484 Mini Асана к-7651 Rivalin

-0,1 k-516 Horsford market garden к-8797 Афила k-5869 Zwiling k-7615 Kwartella P.sat k-7669 Arcturus

k-6279 3D 2/58 Dетенице k-5063 Kelvedon Wonder -0,2

-0,925 -0,900 -0,875 -0,850 -0,825 -0,800 -0,775 -0,750 -0,725 Factor 1

Рис. 3.9. Результаты РСA анализа данных AFLP маркирования сортов гороха (программа Statistica 10).

Таким образом, проведенный нами анализ коллекций гороха показал достаточно высокий уровень вариабельности коллекции сортов гороха. Значения генетических

расстояний сортов (ВНИИССОК) (0,025-0,261, GDср= 0,115) оказались примерно в 1,5 P.ful раза ниже данного показателя у дикорастущих образцов различных эколого- P.ful

географического происхождения (0,070-0,356, GDср=0,187) (см главу 3.1.1.2) и, следовательно, можно считать, что генетическое разнообразие анализируемой коллекции сортов гороха охватывает более половины всего природного разнообразия вида P. sativum.

3.1.2. Оценка полиморфизма семейства генов резистентности P. sativum методом мультилокусного RGA анализа. Помимо AFLP анализа вариабельности случайных, селективно-нейтральных участков генома, представляло интерес исследование адаптивно-значимых семейств растительных генов у представителей рода Pisum. Семейство генов резистентности (R-гены, RGA) растений объединяет ряд генов, участвующих в формировании устойчивости растения к различным патогенам, и поэтому представляет особый интерес для исследований. Отдельный класс среди этих генов составляют NBS-LRR гены – несущие консервативные домены (NBS-домен и LRR-домен), которые определяют функцию узнавания патогена и участвуют в запуске иммунного ответа в растительной клетке. NBS-домен состоит из высоко консервативных мотивов P-петли, киназы-2, GLPL и др. Для анализа вариабельности RGA генов был разработан метод RGA (NBS) – маркирования (van der Linden et al., 2004), который основан на использовании домен-специфичных праймеров, комплементарных различным мотивам домена и позволяющие амплифицировать участки геномной ДНК фланкирующие NBS-домен R-генов растений (рис. 3.10).

Рис. 3.10. Схема расположения праймеров для проведения RGA маркирования образцов Pisum.

3.1.2.1. Анализ внутривидового генетического разнообразия семейства генов резистентности дикорастущих образцов P. sativum методом RGA-профайлинга. Для проведения RGA-маркирования в анализ были включены те же 83 дикорастущих образца различного эколого-географического происхождения P. sativum, что и для AFLP анализа. Всего с использованием двух праймерных комбинаций (NBS2/MseI, NBS5/MseI) было получено 306 RGA- фрагментов, из которых полиморфны были 282 (92.2%). Аналогично AFLP анализу каждый образец был охарактеризован индивидуальным набором RGA-фрагментов, который позволяет проводить его идентификацию, и может

отражать специфичность устойчивости отдельных образцов гороха к патогенам. Некоторые из обнаруженных фрагментов были высокоспецифичными и формировали уникальные RGA спектры, характерные для отдельных групп образцов (рис. 3.11). Данные образцы могут рассматриваться в качестве потенциально перспективных источников генов устойчивости для селекции новых сортов гороха.

Рис. 3.11. RGA-спектры дикорастущих образцов P. sativum при использовании комбинации NBS2/MseI (представлен фрагмент геля).

На основе полученных RGA-спектров были оценены уровни генетического разнообразия, проведен кластерный анализ и анализ главных компонент (PCA) исследованных образцов гороха. В результате было показано, что уровни генетического разнообразия RGA-генов варьировали в пределах 0,012-0,201

(GDср=0.103) (коэффициент Nei-Li) и были несколько ниже уровней полиморфизма,

детектированного ранее с использованием AFLP анализа (0,070-0,356, GDср=0.187). Такой высокий уровень полиморфизма может являться одной из причин высокой пластичности гороха как сельскохозяйственной культуры. Дендрограмма генетического сходства, построенная на основе данных RGA анализа, выявила некоторые группы более схожих и отдаленных образцов Pisum. При этом, также как и в случае AFLP, образцы elatius, abyssinicum, asiaticum и transcaucasicum формировали смешанные клады вместе с остальными P. sativum, не выявляя какой-либо корреляции с подвидовым статусом (рис. 3.12).

Рис. 3.12. Дендрограмма генетических различий представителей P. sativum на основе данных RGA анализа, построенная методом ближайшего соседа (NJ, TREECON).

Интересно, что разделение по географическому принципу, как и в случае AFLP анализа, также не имело высокой бутстреп-поддержки, за исключением отдельных азиатских и европейских образцов, что может быть объяснено значительным

смешением генетического материала в результате многовековой торговли и культивирования. Представлялось интересным выявить возможную корреляцию между данными RGA-анализа и морфо-биологическими показателями охарактеризованных образцов. Проведенный PCA анализ полученных данных показал наличие единой полиморфной группы образцов и отсутствие корреляции с морфо-биологическими признаками. Образцы из регионов первичного центра происхождения равномерно распределились на PCA-графике (рис. 3.13).

Рис. 3.13. Результаты РСA анализа данных RGA-маркирования дикорастущих образцов гороха (программа STATISTICA 10). Отзывчивость на внесение азота (Прибавка массы, %): красный ≥ 300%, оранжевый ~ 200%, желтый ~ 150%, зеленый ~100%, синий ≤ 50% (по данным д.б.н. Борисова А.Ю (ВНИИСХМ)).

Таким образом, впервые был исследован потенциал вариабельности семейства RGA-генов у образцов P. sativum методом мультилокусного RGA-маркирования. Проведенный анализ показал достаточно высокий уровень полиморфизма семейства генов устойчивости и наличие единой полиморфной группы, а также позволил выявить уникальные RGA-локусы

3.1.2.2. Оценка полиморфизма семейства генов резистентности сортов и линий гороха посевного методом мультилокусного RGA-профайлинга. Для проведения RGA-маркирования в анализ были включены 67 образцов сортов и линий P. sativum отечественной и зарубежной селекции, ранее проанализированные методом AFLP-маркирования. Всего с использованием двух праймерных комбинаций (NBS2/MseI, NBS5/MseI) было получено 246 RGA-фрагментов, из которых 208 были полиморфными (84,6%). Некоторые из обнаруженных фрагментов были высоко специфичными, другие были характерны для отдельных групп анализируемых образцов (рис.3.14).

Рис. 3.14. RGA-спектры образцов сортов и линий P. sativum при использовании праймерной комбинации NBS2/MseI (представлен фрагмент геля)

Рассчитанные значения генетических расстояний по результатам проведенного RGA-анализа между исследуемыми образцами сортов и линий гороха посевного

варьировали в пределах 0,023-0,145 (GDср= 0.83), что меньше чем значения генетического разнообразия генов резистентности у дикорастущих образцов P. sativum

(0,012-0,201, GDср= 0.103). Также как и по результатам анализа дикорастущих образцов гороха, выявленное генетическое разнообразие семейства R-генов у сортов и линий P. sativum оказалось ниже уровня геномного полиморфизма, определенного методом AFLP-

маркирования (0,025-0,261, GDср= 0.115). Дендрограмма генетического сходства, построенная на основе данных RGA- анализа, выявила некоторые группы более схожих и отдаленных образцов, не формируя какой-либо достоверной группы сортов (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Дендрограмма генетических различий образцов сортов и линий гороха (P. sativum) на основе данных RGA-анализа, построенная методом ближайшего соседа (NJ, TREECON).

Проведенный анализ главных компонент (PCA) также показал наличие единой полиморфной группы образцов сортов и линий отечественной и зарубежной селекции (рис. 3.16).

Factor Loadings, Factor 1 vs. Factor 2 Rotation: Unrotated Extraction: Principal components 0,4

Ранний 301 Крейсер Фрагмент k-5869 Zwiling Виола k-5616 Кубанец 1129 k-579486 Frivita Самородок Сомервуд k-8534 ПервенецЖегаловец k-539 A.and M. Perfection (Dimpled) 0,3 Совинтер 1 СовинтерВикинг Апорт Н-Х-0326Джоф к-6360 Desi Эштон

Матрона Чика 0,2 k-516 Horsford market garden k-579484 Mini P.sat 26

0,1 k-5063 Kelvedon Wonder Дакота

k-5865 Grundmanns Blutenmeer k-4782 Санджина к-7651Изумруд Rivalin Сахарная конфетка 0,0 k-4455 Сахарный Бровцина k-4917 Emigrantл-8856 Беркут P.fulP.ful 2140706 Сахарный 2 Женева Амиус 1241 k-6279 3D 2/58 Dетенице Фораk-6950 Lumir Преладо k-5498 Big Ben -0,1

Factor 2 k-6671k-7669 Minarette Arcturus k-8760 Atlas Милани к-8797 Афила Каира Асана -0,2 Абадор k-9049 Midlfeezer Вера Арфа Ранний грибовский 11Лея Амброзия Ода к-347 Sans nain parchemim hatif Breton -0,3 НеистощимыйТристар 195 k-9017 Surgevil ТриумфНиколас

P.sat 40 Донара Рада -0,4 л-7394 Green Arron

k-7615 Kwartella

-0,5 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 Factor 1 Рис. 3.16. Результаты РСA данных RGA маркирования сортов гороха (программа STATISTICA 10).

Таким образом, был оценен уровень полиморфизма семейства генов резистентности у сортов и линий гороха (P. sativum) отечественной и зарубежной селекции. Проведенный анализ показал, что генетическое разнообразие семейства R- генов у сортов несколько ниже, чем дикорастущих образцов вида P. sativum.

3.2 Анализ вариабельности участков ядерного и цитоплазматических геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Помимо мультилокусного анализа геномов видов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae представляло интерес исследование отдельных монолокусных участков ядерного, хлоропластного и митохондриального геномов. Для проведения анализа было отобрано 82 образца 30 видов, представляющих все пять родов трибы Fabeae, который включал 36 образцов рода Pisum, в том числе 10 образцов вида P. fulvum, и 46 образцов представителей родственных видов (род Vavilovia (19 образцов), Lathyrus (13), Vicia (13), Lens (1) (табл. 3.1). 26 образцов P. sativum были отобраны на основе ранее проведенных мультилокусных AFLP- и RGA-анализов для того, чтобы наиболее полно охватить генетическое разнообразие коллекции, а также включали образцы гороха спорного таксономического статуса (гл. 3.1.1.1)

Монолокусный анализ был проведен на некодирующих участках: фрагмент ядерного рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 (ядДНК); спейсеры trnH-psbA, rpoB- trnC, trnY-trnE-trnT, интрон гена trnL (хпДНК); b/c интрон гена nad1 (мтДНК). Праймеры для амплификации анализируемых участков приведенны в таблице 2.3. Образцы, используемые для анализа по каждому из участков, были приведены в главе 2 (табл.1). Данные о протяженности исследуемых участков у различных образцов, а также суммарная длина нуклеотидной последовательности для каждого из образцов приведены в таблице 3.1.

Таблица 3.1. Протяженность последовательностей исследуемых участков ядерного и цитоплазматических геномов у исследуемых образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.

Пластидный геном

геном

Ядерный Ядерный

Митохондри Митохондри альный геном альный

Образец Кат. №

№

trnL

trnT

ITS2

trnC

tnnH

5.8S

trnE

nad1

Суммарная длина, п.н. длина, Суммарная

rpoB

psbA

trnY

ITS1

b/c интрон гена гена b/cинтрон Интрон гена Интрон 1 P. sativum 1937 615 1503 194 1051 907 432 4702 2 P. sativum 2182 615 1503 194 1051 907 432 4702 3 P. sativum 1985 615 1503 194 1051 907 432 4702 4 P. sativum 7584 615 1503 194 1052 907 432 4703 5 P. sativum 1982 615 1503 194 1051 907 432 4702 6 P. sativum 7128 615 1503 194 1051 907 432 4702 7 P. sativum 8599 615 1503 194 1051 907 432 4702 8 P. sativum 6373 615 1503 194 1051 907 432 4702 9 P. sativum 4788 615 1503 194 1051 907 432 4702 10 P. sativum 1865 615 1503 194 1051 907 432 4702 11 P. sativum 4650 615 1503 194 1052 907 432 4703 12 P. sativum 6139 615 1503 194 1051 907 432 4702 13 P. sativum 188 615 1503 194 1051 907 432 4702 14 P. sativum 9190 615 1503 194 1052 907 432 4703

15 P.sativum 3980 615 1503 194 1051 907 432 4702 16 P.sativum jomardii 2008 615 1503 194 1051 907 432 4702 17 P.sativum 2006 615 1503 194 1051 907 432 4702 18 P. sativum 7826 615 1503 194 1051 907 432 4702 19 P.sativum asiaticum 2827 615 1503 194 1052 907 432 4703 20 P.sativum elatius 2524 615 1516 194 1052 907 432 4716 21 P.sativum elatius 3115 615 1503 194 1050 907 432 4701 P.sativum 22 289 615 1503 194 1051 907 432 4702 transcaucasicum P.sativum 23 2376 615 1503 194 1051 907 432 4702 transcaucasicum 24 P.sativum abyssinicum 2759 615 1503 202 1050 907 432 4709 25 P.sativum abyssinicum 3567 615 1503 194 1050 907 432 4701 26 P.sativum humile 2521 615 1516 194 1052 907 432 4716 27 P.fulvum 701 615 1516 202 1055 907 437 4732 28 P.fulvum 702 615 202 1055 907 437 3216 29 P.fulvum 703 615 202 1055 907 437 3216 30 P.fulvum 706 615 1516 202 1055 907 437 4732 31 P.fulvum 708 615 1516 202 1055 907 437 4732 32 P.fulvum 2140 615 202 1055 907 437 3216 33 P.fulvum 2523 615 202 1055 907 437 3216 34 P.fulvum 3397 615 1516 202 1055 907 437 4732 35 P.fulvum 6070 615 1516 202 1055 907 437 4732 36 P.fulvum 6071 615 1516 202 1055 907 437 4732 37 V.formosa B 612 1515 241 946 915 432 4661 38 V.formosa C 612 1515 241 2368 39 V.formosa D 612 1515 241 946 915 432 4661 40 V.formosa E 612 241 853 41 V.formosa F 612 1515 241 948 915 432 4663 42 V.formosa G 612 241 853 43 V.formosa H 612 1515 241 946 915 432 4661 44 V.formosa I 612 1515 241 946 915 432 4661 45 V.formosa J 612 1515 241 946 915 432 4661 46 V.formosa K 612 241 853 47 V.formosa L 612 1515 241 947 915 432 4662 48 V.formosa M 612 241 853 49 V.formosa N 612 241 853

50 V.formosa O 612 1515 241 946 915 432 4661 51 V.formosa P 612 241 948 915 432 3148 52 V.formosa 2 612 1515 241 937 915 432 4652 53 V.formosa 3 612 241 938 915 432 3138 54 V.formosa 4 612 1515 241 1078 915 432 4793 55 V.formosa 5 612 1515 241 948 915 432 4663 56 L. sativus 701 612 1508 237 990 663 442 4452 57 L. cicera 356 612 1508 237 997 651 447 4452 58 L. hirsutus 1709 612 1508 237 988 641 436 4422 59 L. sylvestris И-308541 612 1512 237 982 655 438 4436 60 L. aphaca 1293 612 1517 238 1011 917 441 4736 61 L. nissolia 1436 600 1516 225 744 943 432 4460 62 L. ochrus 380 612 1507 247 609 858 436 4269 63 L. clymenum 1370 612 1512 255 605 844 441 4269

64 L. palustris И-139316 612 1506 237 1098 924 441 4818

65 L. gmelinii 453 612 1499 255 991 913 437 4707

66 L. pratensis И-139312 613 1516 238 987 922 441 4717

67 L. odoratus И- 604554 1511 998 2509

68 L.maritimus 385 1511 1133 2644 69 V. faba, var.equina 1506 607 1511 340 948 1009 451 4866 70 V. ervilia 517 610 1509 361 1002 919 433 4834 71 V. unijuga k-35828 608 1519 335 1071 912 452 4897 72 V narbonensis k-36787 608 1516 345 1073 780 251 4573 73 V villosa k-37026 595 1518 350 1051 930 421 4865 74 V. bithynica k-32547 1517 1056 2573 75 V hirsuta k-36792 1493 1022 2515 76 V.peregrina k-36771 1516 1516 77 V sativa k-36653 1515 1515 78 V.angustifolia 35983 1515 1515 79 V.pannonica 34525 1516 1516 80 V. michauxii 36721 1515 1515 81 V. benghalensis 34852 1515 1515 82 L. culinaris 244 610 1518 293 1045 909 430 4805

3.2.1. Анализ полиморфизма последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 у рода Pisum и родственных видов Fabeae. В настоящее время, для оценки межвидовой и межродовой вариабельности часто используются последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомальных генов (ITS, internal transcribed spacer). ITS-последовательности, в связи с их высокой вариабельностью считаются эффективными для установления таксономической структуры многих семейств и родов, уточнения филогенетических связей и идентификации таксономической принадлежности образцов, в особенности на

видовом уровне (Feliner, Rossello, 2007; Poczai et al., 2010; Zeng et al., 2015). Для оценки вариабельности отдельных локусов ядерного генома и уточнения ряда таксономических вопросов рода Pisum с использованием последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) из коллекции бобовых были отобраны 36 образцов рода Pisum и 36 представителей родственных видов трибы Fabeae (табл 3.1). Последовательности ITS1-5.8S-ITS2 были амплифицированы у взятых в анализ образцов и секвенированы с использованием стандартных праймеров ITS4 и ITS5, а также проанализированы с помощью программы MEGA 6.0. Длина полученного участка у всех представителей рода Pisum была инвариантна и составила 615 н.п., у образцов V. formosa длина участка составила 612 п.н., а протяженность анализируемого участка у представителей родов Lathyrus и Vicia варьировала от 595 п.н. до 613 п.н.

Рис. 3.17. Фрагмент последовательности области ITS1-5.8S-ITS2.

Всего у представителей трибы Fabeae было выявлено 147 вариабельных сайтов (23,04%), а также 12 инделей, семь из которых были однонуклеотидными (рис. 3.17). Наиболее протяженные делеции были выявлены у образцов V. villosa (GCCAATWTCCH) и L. nissolia (GGTATTGTGYW). У представителей рода Pisum инделей не выявлено, однако было детектировано 20 вариабельных сайтов (3,26%), из которых 19 были парсимони – информативными (3,14%), а 11 нуклеотидных замен были видоспецифическими, из них 6 были специфичны для P. fulvum и 3 для P.sativum ITS-последовательности 24 анализируемых образцов P. sativum не отличались значительной вариабельностью: анализ внутривидовых генетических различий лишь выявил 5 нуклеотидных замен (<1%). При этом для образцов P. sativum было выявлено 6 гаплотипов, а для образцов P. fulvum – 4 гаплотипа. Значения генетических расстояний варьировали в пределах 0.000 до 0.007, в том числе и между образцами, выделяемыми рядом авторов как подвиды или даже самостоятельные виды. Внутривидовая вариабельность вида P. fulvum была еще ниже. Так, у десяти проанализированных образцов было выявлено только две нуклеотидные замены (<0,5%), а значения генетических расстояний (GD) не превышали 0.003. Анализ вариабельности образцов монотипического рода Vavilovia показал наличие трех SNPs (0,05%), а значения генетических расстояний не превышали 0.005. Как и ожидалось, межвидовые генетические различия, детектированные между образцами P. fulvum и P. sativum, были на порядок выше и варьировали в пределах 0.025-0.030. Среди образцов P. fulvum наиболее близким к P. sativum оказались образцы P. fulvum 702 и P. fulvum 703. При этом интересно отметить, что помимо наличия специфических замен для рода Vavilovia, отсутствующих в последовательностях образцов рода Pisum, генетические расстояния Pisum - Vavilovia были достаточно высоки (0.071 – 0.080) и были сопоставимы со значениями межродовых генетических расстояний у трибы Fabeae, что еще раз подтверждает правомочность выделения Vavilovia в отдельный род (Oskoueiyan et al, 2010). Как и следовало ожидать, уровень генетических различий между Pisum и представителями близкородственных родов трибы (Lathyrus, Vicia и Lens) оказался высок и составил 0.036-0.104. Ранее B.-H. Choi с соавторами (2006) при изучении рода

Vicia показал схожий уровень (до 0.107) генетических различий между представителями родов Pisum и Vicia. На основе двупараметрической модели Кимуры в программе MEGA 6.0 была построена дендрограмма, отражающая степень сходства анализируемых геномов и филогенетические отношения рода Pisum (рис. 3.18).

P.sat.arvense 2006 P.sativum 7826 P.sat.jomardi 2008 P.sativum 3980 P.sativum 6139 P.sativum 1865 P.sativum 4788 P.sativum 6373 P.sativum 8599 P.sativum 7128 P.sativum 1982 P.sativum 7584 88 P.sativum 1985 P.sativum 1937 P.sativum 2182 P.sativum 4650 P.sat.abyss 2759 P.sat.asiat 2827 P.sat.transc 289 P.sat.humile 2521 99 P.sativum 9190 P.sat.elat 2524 P.sat.elat 3115 P.sat.transc 2376 51 P.sat.abyss 3567 P.sativum 188 P.fulvum 702 P.fulvum 703 P.fulvum 701 P.fulvum 706 54 99 P.fulvum 708 P.fulvum 2140 P.fulvum 2523 64 P.fulvum 3397 P.fulvum 6070 P.fulvum 6071 Vav.formosa P Vav.formosa O Vav.formosa 2 Vav.formosa B Vav.formosa N 99 Vav.formosa J Vav.formosa D Vav.formosa C Vav.formosa H 60 Vav.formosa 5 Vav.formosa M Vav.formosa F Vav.formosa E Vav.formosa L Vav.formosa G Vav.formosa I 50 Vav.formosa K Vav.formosa 3 Vav.formosa 4 V.ervilia 51 V.villosa V.unijuga 95 V.faba 74 70 V.narborensis Lens culinaris L.ochrus 90 L.clymenum L.nissolia L.gmelinii L.palustris 54 L.aphaca L.pratensis 92 L.sativus L.cicera

62 L.hirsutus L.sylvestris Рис. 3.18. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. (MEGA 6.0, NJ, выбранная модель K2+G)

Как и ожидалось, на дендрограмме все образцы четко разделяются на две группы: первая группа включает образцы родов Pisum и Vavilovia, вторая группа представлена остальными анализируемыми образцами родов Lathyrus, Vicia и Lens. Все образцы рода Pisum формировали общий кластер и со 100% бутстреп поддержкой разделились на 2 видоспецифичных подкластера, сформированных образцами P. fulvum и P. sativum. При этом образцы спорного таксономического статуса формируют единую группу с остальными образцами P. sativum, что подтверждает данные мультилокусного AFLP- и RGA-анализов о том, что род Pisum состоит только из двух видов: P. sativum и P. fulvum. Все образцы монотипного рода Vavilovia формируют единый кластер (ИБ 100%), обособленный от видов Pisum. Представители родов Lathyrus, Vicia и Lens формируют отдельный смешанный кластер, внутри которого можно выделить только образцы рода Vicia (ИБ=54%). Такая кластеризация образцов трех родов отражает неоднозначность таксономии видов и родов трибы Fabeae. Известно, что существующие классификации расходятся в вопросах состава родов Lathyrus и Vicia, их границ, а также таксономического статуса некоторых видов. (Станкевич 1999; Kupicha 1976, 1983) Таким образом, впервые был проанализирован полиморфизм последовательности внутренних спейсеров рибосомального оперона ITS1-5.8S-ITS2 на расширенном наборе образцов рода Pisum, включающем 36 образцов, и родственных видов трибы Fabeae. Показан низкий уровень вариабельности данного участка как для рода Pisum, так и для видов P. sativum и P. fulvum.

3.2.2. Анализ вариабельности хлоропластного генома у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. В настоящее время исследование вариабельности последовательностей хлоропластной ДНК является одним из наиболее распространенных методов изучения филогенетических отношений между видами и родами растений и уточнения таксономического статуса (Borsch et al., 2009; Wan et al., 2013; Khadivi-Khub et al., 2014; Feldberg et al., 2016). Более того, именно последовательности хпДНК (например trnL-F, psbA и др.) рассматриваются как кандидаты для «штрих-кодирования»

растений, то есть в качестве последовательностей, которые можно использовать для видовой идентификации всех растений (Kress et al., 2005). Одной из целей работы была оценка внутривидового и межвидового полиморфизма участков хлоропластного генома бобовых и исследование филогенетических отношений рода Pisum и трибы Fabeae. Для этого был проведен детальный анализ и охарактеризованы нуклеотидные последовательности межгенных спейсеров хлоропластного генома: trnH-psbA, trnY - trnE - trnT, rpoB-trnC, а также интрон гена тРНК trnL, который является единственным известным интроном I типа у высших растений (Simon et al., 2003; Haugen et al., 2005).

3.2.2.1. Анализ вариабельности последовательности участка trnH-psbA. Последовательности межгенного спейсера trnH-psbA были амплифицированы и секвенированы у 72 образцов трибы Fabeae (табл. 3.1). Длина последовательности спейсера trnH-psbA у образцов рода Pisum варьировала в пределах 194-202 п.н. У образцов рода Lathyrus длина последовательностей варьировала от 225 (L. nissolia) до 255 п.н. (L. gmelinii), а у видов рода Vicia – от 335 (V. unijuga) до 361 п.н. (V. ervilia). Протяженность выровненных и используемых для анализа последовательностей у исследуемых образцов составила 434 п.н. Разница в длине спейсера у двух исследуемых видов гороха обусловлена вставкой ATTAGAAG у образцов P. fulvum, которая присутствует также в последовательностях спейсера у V. formosa, некоторых видов Lathyrus и в несколько измененной форме у видов Vicia (рис. 3.19). Интересно отметить, что у одного из образцов P. sativum ssp.abyssinicum 2759 была детектирована такая же вставка. Образцы V. formosa отличались от рода Pisum

тремя инделями (AAAG46, ATTCGTAAGAACTTAGAAG321 и

TAATTTAGACATAGTT396) (здесь и далее положение дается относительно выровненной последовательности). Представители родственных видов Fabeae (Lathyrus, Vicia и Lens) характеризовались высоким уровнем полиморфизма и наличием большого количества инделей. Для анализируемых образцов трибы Fabeae было детектировано 116 вариабельных сайтов (24.73%). В анализируемых последовательностях trnH-psbA трибы Fabeae детектированы как небольшие индели (до 5 п.н.), так и тандемные повторы протяженностью до 12 п.н. (AAAG, CTTT, ACATAT, TTAGAAG).

Наибольшее количество и протяженность инсерций в последовательности межгенного спейсера trnH-psbA было детектировано у представителей родов Vicia и Lens. Так в положении 145 была детектирована наиболее протяженная AT-богатая инсерция, длина которой варьировала от 111 н.п. у V. faba до 149 н.п. у V. unijuga.

Рис. 3.19. Фрагмент последовательности межгенного спейсера psbA-trnH

На основе полученных данных были рассчитаны значения генетических расстояний. Для рода Pisum не выявлено генетических различий как внутривидовых, так и межвидовых, равно как и для образцов рода Vavilovia. Генетические различия между представителями родов Pisum и Vavilovia составили 0.030. При этом выявленные различия между образцами рода Pisum и другими представителя трибы Fabeae варьировали от 0.037 до 0.085, максимальные генетические различия были детектированы между образцами V. ervilia и L. culinaris и составили 0.094. На дендрограмме с высоким уровнем бутстреп-поддержки все образцы рода Pisum объединились в один кластер, при этом не разделяясь на подгруппы по видам или подвидам (рис. 3.20). Также с высоким уровнем достоверности (ИБ 98%) на дендрограмме объединяются образцы вида V. formosa. Представители родственных видов Lathyrus, Vicia и Lens образуют смешанную группу.

P.fulvum 3397 P.fulvum 6070 P.fulvum 2523 P.fulvum 2140 P.fulvum 708 P.fulvum 706 P.fulvum 703 P.fulvum 702 P.fulvum 701 P.sat.abyss 2759 P.sativum 1937 P.sativum 2182 P.sativum 1985 P.sativum 7584 P.sativum 1982 P.sativum 7128 P.sativum 8599 97 P.sativum 6373 P.sativum 4788 P.sativum 1865 P.sativum 4650 P.sativum 6139 P.sativum 188 P.sativum 9190 P.sativum 3980 P.sat.jomardii 2008 P.sat.arvense 2006 P.sativum 7826 P.sat.asiat 2827 P.sat.elat 2524 P.sat.elat 3115 42 P.sat.transc 289 P.sat.transc 2376 P.sat.abyss 3567 P.sat.humile 2521 P.fulvum 6071 62 Vav.formosa H Vav.formosa N Vav.formosa B Vav.formosa C Vav.formosa D Vav.formosa E Vav.formosa F Vav.formosa G 5 Vav.formosa I Vav.formosa J 98 Vav.formosa K Vav.formosa L Vav.formosa M Vav.formosa O Vav.formosa P Vav.formosa 2 13 Vav.formosa 3 Vav.formosa 4 Vav.formosa 5 L.culinaris L.nissolia 13 V.narbonensis

26 V.faba 19 V.villosa V.unijuga L.ochrus 68 L.clymenum 80 L.hirsutus L.sylvestris 90 L.aphaca 38 L.pratensis 36 L.palustris 54 L.gmelinii L.sativus 84 L.cicera V.ervilia

0.02

Рис. 3.20. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae (метод ML, модель T92+G).

Таким образом, впервые были определены нуклеотидные последовательности межгенного спейсера trnH-psbA и проанализирован полиморфизм данного участка у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Была показана достаточно высокая степень консервативности данного участка у представителей рода

Pisum, при этом остальные представители трибы Fabeae характеризовались более высоким уровнем полиморфизма, а также наличием многочисленных инделей. 3.2.2.2. Анализ вариабельности последовательности спейсера rpoB-trnC. С использованием стандартных праймеров (табл. 2.3) rpoB и trnC у анализируемых образцов трибы Fabeae (табл. 3.1) были амплифицированы и секвенированы последовательности межгенного хлоропластного спейсера rpoB (ген β- субъединицей РНК-полимеразы) - trnC (ген цистеиновой тРНК). Длина нуклеотидной последовательности спейсера rpoB-trnC у образцов P. sativum варьировала от 1050 до 1052 п.н., а у образцов P. fulvum длина была инвариантна и составила 1055 п.н. У образцов видов из других родов трибы Fabeae длина последовательности значительно варьировала, минимальная и максимальная длина выявлена у видов рода Lathyrus (605 п.н. у L. clymenum, 1133 у L. maritimus). У видов рода Vicia длина спейсера варьировала от 948 (V. faba) до 1104 п.н. (V. sativa). Протяженность выровненных и используемых для анализа последовательностей спейсера rpoB-trnC у исследуемых образцов составила 1422 п.н. Последовательность спейсера характеризовалась крайне высоким уровнем полиморфизма и наличием многочисленных инделей и замен (рис. 3.21).

Рис. 3.21 Фрагмент последовательности межгенного спейсера rpoB-trnC Последовательность межгенного спейсера rpoB-trnC оказалась крайне вариабельной. Анализ нуклеотидного полиморфизма района rpoB-trnC у анализируемых представителей Fabeae выявил 539 SNPs (37.90 %), при этом число парсимони-информативных сайтов составило 286 (20.09 %).

У представителей рода Pisum последовательность спейсера rpoB-trnC незначительно варьировала по длине. Всего было детектировано 94 SNPs (6.61%), из которых 62 были парсимони-информативными. Виды P. sativum и P. fulvum, помимо нуклеотидных замен, различались наличием инсерции TCAT у образцов P. fulvum. Последовательности спейсера rpoB-trnC у представителей родов Pisum и Vavilovia различались по 205 SNPs (14.41%), из которых 139 были парсимони-информативными. На основе полученных данных были рассчитаны значения генетических расстояний (GD). В целом значения генетических расстояний между образцами рода Pisum варьировали в более широких пределах (0.000 - 0.038), чем полиморфизм участков ITS1-5.8S-ITS2 и trnH-psbA. При этом интересно отметить, что генетические различия достигали 0.038 как внутри вида P. sativum, так и между видами P. sativum и P. fulvum. Наибольшее значение генетических расстояний были детектированы между образцами P.sativum и представителями рода Vicia и достигали 0.141. Полученные последовательности содержали многочисленные индели, в том числе и достаточно протяженные. В анализируемых последовательностях были детектированы три позиции с наиболее протяженными инсерциями. Вид V. ervillia в положении 258 содержал 31-нуклеотидную AT-богатую вставку. В положении 556 у вида L. palustris была детектирована 74-нуклеотидная инсерция. Наиболее протяженная инсерция, 84 п.н., детектирована у вида L. maritimus в положении 776. Наиболее интересными оказались результаты анализа последовательностей вида V. formosa. Последовательности представленных образцов характеризовались наличием 91 вариабельного сайта (6.39%), включая 13 парсимони-информативных сайтов (0.91%), а также наличием десяти инделей, из которых две инсерции представляли собой повторы. Интересно отметить, что в целом анализируемые образцы V.formosa были богаты инделями относительно остальных представителей трибы Fabeae, в то время как у образца V.formosa 4 последовательность участка была идентична последовательностям большинства анализируемых видов. При этом детектированная в положении 930 делеция являлась самой протяженной из всех выявленных в последовательностях видой трибы Fabeae и составила 108 п.н. На основе полученных данных была построена дендрограмма, отражающая степень сходства анализируемых геномов. Как видно на дендрограмме (рис.3.22), с высоким уровнем бутстреп-поддержки все образцы гороха формируют единый кластер

(ИБ=99%), внутри которого выделяются два видовых субкластера - P. sativum (ИБ=88%) и P. fulvum (ИБ=98%). Выделяемые внутри субкластера P. sativum группы, в большинстве своем имеют низкий уровень поддержки (<50%), за исключением двух групп образцов, имеющих поддержку 96 и 99% (рис. 3.22). Внутри субкластера P. fulvum отдельные группы образцов не выделяются.

P.sativum 7128 99 P.sativum 188

86 P.sativum 3980 P.sativum 7826 99 P.sativum 1985 62 P.sativum 4788

20 P.sativum 9190 P.sativum 1937 P.sativum 1982 14 99 P.sativum 8599 P.sat.arvense 2006 P.sativum 6139 2420 P.sat.humile 2521 P.sat.elat 2524 11 P.sativum 7584 P.sativum 4650 10 P.sativum 1865 21 P.sativum 2182 93 99 P.sat.jomardi 2008 P.sativum 6373 P.sat.asiat 2827 15 39 P.sat.elat 3115 50 P.sat.transc 289

99 63 P.sat.abyss 2759 98 P.sat.abyss 3567 Psat.transc 2376 P.fulvum 702 P.fulvum 703 P.fulvum 701 P.fulvum 708 98 89 29 P.fulvum 2140 P.fulvum 706

4687 P.fulvum 2523 P.fulvum 3397 67 P.fulvum 6070 91 P.fulvum 6071 Vav.formosa 5 83 Vav.formosa 2 99 Vav.formosa 3 Vav.formosa I 91 Vav.formosa F 13 89 74 Vav.formosa H Vav.formosa L 22 Vav.formosa O Vav.formosa B 31 Vav.formosa J Vav.formosa D Vav.formosa P 92 L.palustris 68 L.maritimus 44 L.aphaca 99 L.hirsutus 56 99 L.odoratus L.sylvestris 99 L.gmelinii 43 L.pratensis 99 85 L.sativus 71 L.cicera L.nissolia 76 44 L.ohrus 62 L.clymenum 38 V.villosa V.ervillia 61 V.hirsuta V.unijuga L.culinaris 99 Vav.formosa 4 V.narborensis 75 V.faba 43 V.bythinica

0.02 Рис. 3.22. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae (ML, модель T92+G).

Интересно отметить, что на дендрограмме образцы вида V. formosa формируют кластер, удаленный от кластера Pisum, в то время как на дендрограммах, построенных

по ITS-спейсерам (рис. 3.18) и пластидному спейсеру trnH-psbA (рис. 3.20) образцы этих видов формировали сестринские клады. На дендрограмме образцы V. formosa не только расположились отдельно от образцов рода Pisum, но и оказались между образцами родов Lathyrus и Vicia. При этом один из образцов V. formosa (4, Армения) по данному участку показал высокую степень схожести с образцом V. narborensis. Таким образом, была проанализирована последовательность межгенного хлоропластного спейсера rpoB-trnC. В результате проведенного анализа был показан высокий уровень полиморфизма (37.9%) данного участка как у рода Pisum, так и у представителей других родов трибы Fabeae, а также было выявлено большое количество инделей и видоспецифичных замен.

3.2.2.3. Анализ вариабельности последовательности участка trnY-trnE-trnT. Для исследования полиморфизма хлоропластного генома Fabeae также был использован участок trnY (ген тРНК тирозина) - trnE (ген тРНК глутаминовой кислоты) – trnT (ген тРНК треонина). Данный участок был амплифицирован и секвенирован у всех анализируемых 36 образцов рода Pisum и 30 образцов родственных видов трибы Fabeae (табл. 3.1).

Рис. 3.23. Фрагмент последовательности области спейсера trnY – trnE – trnT.

Последовательности trnY-trnE-trnT у исследуемых образцов варьировали по длине, а протяженность выровненных и используемых для анализа

последовательностей составила 1115 п.н. У представителей рода Pisum длина была инвариантна и составила 907 п.н. У образцов видов рода Lathyrus длина последовательностей варьировала от 641 (L. hirsutus) до 943 п.н. (L. nissolia), а у видов рода Vicia – от 780 (V. narbonensis) до 1009 п.н. (V. faba) (табл. 3.1). В последовательности было определено положение гена trnE (69-141) и, как и ожидалось, он был инвариантен почти у всех анализируемых образцов трибы Fabeae, за исключением видов L. culinaris (3 SNPs) и V. villosa (1 SNPs). Последовательности спейсеров trnY-trnE и trnE-trnT значительно отличались по длине и уровню полиморфизма. Протяженность последовательности trnY-trnE составила всего 60 п.н. у всех изученных образцов трибы Fabeae, за исключением видов L. sativus, L. ochrus и V. villosa, протяженность последовательности у которых составила 64 п.н. Данные виды характеризовались наличием инсерции CAGG у видов L. sativus и V. villosa и TCCT у L.ochrus. У представителей трибы было детектировано 24 вариабельных сайта (37.5%). У представителей родов Pisum и Vavilovia данный участок был инвариантен. Последовательность спейсера trnE-trnT была значительно более вариабельна по длине и количеству замен. Так, протяженность участка у представителей трибы Fabeae варьировала от 508 у L. hirsutus до 876 у V. faba. В последовательности спейсера trnE- trnT было детектировано 293 вариабельных сайтов (29.4%). Последовательности спейсера trnY-trnT характеризовались наличием многочисленных инделей и замен. Всего было выявлено 317 вариабельных сайта (28.4%), из них 112 (10.1%) были парсимони-информативными. Последовательность trnY-trnE-trnT у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae содержала многочисленные инсерции и делеции, в том числе и однонуклеотидные. Наиболее протяженная инсерция была идентифицирована у V. faba (144 п.н.), наиболее протяженные делеции (391 п.н.) были идентифицированы у четырех видов Lathyrus (L. sativus, L. cicera, L. hirsutus, L. sylvestris). Последовательности trnY-trnE-trnT у представителей родов Pisum и Vavilovia

различались 20 вариабельными сайтами, а также наличием ряда инделей у V. formosa – инсерции ATAGA, AAA, CTAT и две двунуклеотидные делеции. При высокой межродовой и межвидовой вариабельности у представителей трибы Fabeae, у образцов рода Pisum последовательность trnY-trnE-trnT была более консервативна. Всего было выявлено четыре SNPs, различающих виды P. sativum и P.

85 fulvum. Анализ генетических расстояний показал, что как внутривидовые различия у образцов P.sativum и P.fulvum, так и межвидовые для рода Pisum не превышали 0.003. Значения генетических расстояний между образцами вида V. formosa не превышали 0.005. Различия между образцами родов Pisum и Vavilovia варьировали в пределах от 0.013 до 0.018. Как и ожидалось, уровень генетических различий между Pisum и образцами взятых в анализ родственных видов трибы Fabeae (Lathyrus, Vicia и Lens) оказался значительно выше и варьировал в пределах 0.019-0.100. Максимальные значения генетических расстояний были детектированы между видами L. hirsutus и L. culinaris и составили 0.120. В целом дендрограмма, построенная по нуклеотидным последовательностям фрагмента trnY-trnE-trnT, согласуется с принятой в настоящее время классификацией и соответствует результатам проведенного мультилокусного анализа (рис. 3.24). С высоким уровнем бутстреп-поддержки (97%) все образцы Pisum формируют единый кластер, внутри которого выделяются две клады образцов: P. sativum и P. fulvum. Образцы вида V. formosa на дендрограмме (ИБ 91%) формировали отдельную от Pisum сестринскую кладу. Представители родственных видов трибы Fabeae на дендрограмме формируют разнородные кластеры. Виды Lathyrus, за исключением L. ochrus и L. clymenum, формируют единый полиморфный кластер (ИБ=52%), а виды Vicia не образуют единой группы, при этом Lens culinaris формирует субкластер с V. unijuga (ИБ=50%). Таким образом, в результате проведенного анализа хлоропластного участка trnY- trnE-trnT была показана высокая степень консервативности данного участка у представителей рода Pisum, в то время как для других исследуемых родов трибы Fabeae выявлен высокий уровень полиморфизма данного участка (GD=0.012-0.124), детектированы многочисленные индели и SNPs, специфичные как для отдельных видов, так и для групп видов.

P.sativum 1937 P.sativum 2182 P.sativum 1985 P.sativum 7584 P.sativum 1982 P.sativum 7128 P.sativum 8599 P.sativum 6373 P.sativum 4788 P.sativum 1865 P.sativum 6450 P.sativum 6139 92 P.sativum 188 P.sativum 9190 P.sativum 3980 P.sat.jomardi 2008 P.sat.arvense 2006 P.sativum 7826 P.sat.asiat 2827 P.sat.elat 2524 P.sat.elat 3115 78 P.sat.transc 289 P.sat.transc 2376 P.sat.abyss 2759 P.sat.abyss 3567 P.sat.humile 2521 P.fulvum 701 P.fulvum 702 P.fulvum 703 P.fulvum 706 98 P.fulvum 708 95 P.fulvum 2140 P.fulvum 2523 P.fulvum 3397 P.fulvum 6070 P.fulvum 6071 Vav.formosa J Vav.formosa H Vav.formosa 2 Vav.formosa L

75 97 Vav.formosa 4 Vav.formosa 5 Vav.formosa B Vav.formosa D 83 Vav.formosa F Vav.formosa I Vav.formosa O Vav.formosa 3 Vav.formosa P 100 L.ochrus 81 L.clymenum L.nissolia 42 16 L.palustris 21 L.pratensis 34 L.gmelinii L.aphaca 94 43 97 L.sativus 20 L.cicera 43 L.hirsutus 99 L.sylvestris V.ervilia V.villosa 79 V.faba V.narborensis V.unijuga 56 Lens culinaris

0.01 Рис. 3.24 Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae (ML, модель T92+G).

3.2.2.4. Анализ последовательности гена trnL у представителей трибы Fabeae. Единственным интроном группы I у фотосинтезирующих растений является интрон гена лейциновой тРНК (trnL) пластомного генома. Интрон довольно интересно расположен внутри гена: встроен между U и A в антикодоновом триплете UAA. Представлялось интересным изучить вариабельность интрона гена trnL и построить его предполагаемую вторичную структуру, а также выявить и охарактеризовать консервативные участки. Анализ вариабельности нуклеотидной последовательности интрона гена trnL у представителей трибы Fabeae. Последовательности гена trnL были амплифицированы и секвенированы у 82 образцов трибы Fabeae с использованием стандартных праймеров (Shaw et al., 2005) (табл. 3.1). Полученные последовательности были выровнены, определены границы экзонов и интрона. Как и ожидалось, длины последовательностей экзонов I и II гена trnL у всех анализируемых образцов составляли 35 п.н. и 50 п.н. соответственно и были инвариантны. В отличие от экзонов, последовательности интрона гена trnL у анализируемых образцов характеризовались высоким уровнем полиморфизма. Протяженность анализируемой последовательности интрона у всех образцов P. sativum составила 432 п.н., а у образцов P. fulvum – 437 п.н. У видов рода Lathyrus длина интрона варьировала от 432 (L. nissolia) до 447 п.н. (L. cicera), а у видов Vicia – от 251 п.н. (V. narborensis) до 452 п.н. (V. unijuga) (табл. 3.1). Как и у всех растений, последовательность интрона гена trnL была А/Т-богатой (Gielly et al., 1996; Won, Renner, 2005). GC-состав интрона практически не различался у представителей анализируемых видов Fabeae (32.3-34.9%). Выровненная длина интрона trnL для всех анализируемых образцов составила 481 п.н. (табл.3.1, рис. 3.25). Последовательность интрона была достаточно вариабельной, всего детектировано 90 SNPs (18.71%), из которых парсимонии - информативных сайтов – 33 (6.86%), что несколько выше, чем показано в среднем для покрытосеменных растений (Borsch et al., 2003). Интересно отметить, что при высоком уровне полиморфизма в целом, последовательности представителей рода Pisum не содержали полиморфных сайтов, а виды P. sativum и P. fulvum различались лишь наличием дополнительного повтора последовательности TGAAT у P. fulvum. Между образцами Pisum и Vavilovia было детектировано 12 SNPs (2.49%), из которых парсимони-информативными были 11 (2.29%).

В последовательности интрона были обнаружены как многочисленные единичные нуклеотидные замены, так и индели. Для некоторых образцов были выявлены видоспецифичные делеции и дупликации, остальные инсерции встречались у групп видов.

Рис 3.25 Фрагмент последовательности интрона гена trnL

Так, например, у видов L. aphaca, L. ochrus, L. clymenum, L. palustris и V. ervillia в положении 106 от начала интрона гена trnL был дуплицирован фрагмент CAAA, у образца V. faba в последовательности содержалась дополнительная копия GAAAC в положении 285. В последовательностях интрона гена trnL были определены петли P6 и P8 (табл. 3.2). Особый интерес представляет вид V. narborensis, у которого была детектирована наименьшая длина петель P6 и P8. Протяженность петли P6 у данного вида составила всего 26 п.н., в то время как у остальных представителей трибы Fabeae средняя длина P6 составила 58.25 п.н., т.е. в 2.24 раза меньше. Протяженность петли P8 у V. narborensis составила 43 п.н., что в 4.7 раза меньше средней длины (200.5 п.н.) у видов трибы Fabeae (табл. 3.2). На основе полученных данных были рассчитаны значения генетических расстояний. У всех представителей рода Pisum значения GD были равны 0.000. Интересно отметить, что генетические расстояния между представителями родов Pisum и Vavilovia (0.021-0.024) превышали генетические различия между образцами

Pisum и некоторыми видами Lathyrus (L. palustris 0.005, L. clymenum 0.008). Максимальные значения генетических различий были детектированы между образцами V. narborensis и V. faba (0,086).

Таблица 3.2. Характеристика интрона гена trnL у видов трибы Fabeae.

Длина интрона Длина P6-loop, Тип P6- Длина P8- GC состав, Вид trnL, п.н. п.н. loop loop, п.н. % Pisum sativum 436 57 I 195 33,3 Pisum fulvum 441 57 I 200 33,1 Vavilovia formosa 436 57 I 195 33,5 Lathyrus sativus 446 57 I 205 32,3 Lathyrus cicera 451 57 I 210 32,4 Lathyrus hirsutus 439 57 I 198 33,0 Lathyrus sylvestris 435 57 I 198 33,0 Lathyrus aphaca 445 61 II 200 32,8 Lathyrus nissolia 436 57 I 195 32,8 Lathyrus ochrus 440 61 II 195 33,6 Lathyrus clymenum 445 61 II 200 33,3 Lathyrus palustris 445 61 II 200 33,0 Lathyrus gmelinii 441 57 II 200 32,7 Lathyrus pratensis 441 61 II 200 33,3 Vicia faba 455 50 III 221 32,5 Vicia ervillia 437 61 II 192 33,2 Vicia unijuga 456 61 II 211 33,1 Vicia narborensis 255 26 V 43 34,9 Vicia villosa 425 29 IV 211 31,4 Lens culinaris 434 57 I 193 32,7

На дендрограмме все образцы рода Pisum формируют единую кладу (ИБ=95), не образуя групп образцов P. sativum и P. fulvum (рис. 3.26). Образцы рода Vavilovia формируют отдельную от гороха кладу, при этом проявляя некоторое сродство с образцами L. ochrus и L. clymenum. Остальные образцы рода Lathyrus, а также образцы родов Vicia и Lens формируют смешанную группу.

P.fulvum 6070 P.fulvum 6071 P.fulvum 3397 P.fulvum 2523 P.fulvum 2140 P.fulvum 708 P.fulvum 706 P.fulvum 703 P.fulvum 702 P.fulvum 701 P.sat.humile 2521 P.sat.abyss 3567 P.sat.abyss 2759 P.sat.transc 2376 P.sat.transc 289 P.sat.elat 3115 P.sat.elat 2524 95 P.sat.asiat 2827 P.sativum 7826 P.arvense 2006 P.sativum 9190 P.sativum 188 P.sativum 6139 P.sativum 4650 P.sativum 1865 P.sativum 4788 P.sativum 6373 P.sativum 7128 55 P.sativum 8599 P.sativum 7584 P.sativum 1985 Psativum 1937 P.sativum 2182 P.sativum 1982 62 P.jamardii 2008 P.sativum 3980 Vav.formosa 3 Vav.formosa 4 Vav.formosa 2 Vav.formosa 5 Vav.formosa B 100 Vav.formosa D Vav.formosa F 50 Vav.formosa H Vav.formosa I 64 Vav.formosa J Vav.formosa L Vav.formosa O Vav.formosa P L.nissolia L.palustris L.gmelinii 60 L.aphaca 12 38 L.pratensis 13 L.hirsutus L.sylvestris 74 L.sativus 64 90 L.cicera L.ochrus 88 L.clymenum V.faba V.unijuga 29 V.villosa Lens culinaris V.ervillia V.narborensis

0,01 Рис. 3.26. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae (ML, модель T92+G, MEGA6.0).

Характеристика вторичной стуктуры интрона trnL. В настоящее время вторичная структура интрона trnL была определена у достаточно ограниченного ряда растений, таких как нимфея (Borsch et al., 2003), горечавка (Gielly et al., 1996) и у представителей сем. Dipterocarpaceae (Yulita, 2013). В качестве модельной считается вторичная структура интрона trnL у нимфеи, которая была подробно описана (Borsch et al., 2003). В структуре интрона выделяют 10 петель и 2 функциональных домена, каталитический и субстратный. Наиболее вариабельными участками интрона считаются последовательности петель P6 и P8 (Taberlet et al., 2007).

На основе полученных данных о первичной последовательности была построена вероятная вторичная структура этого интрона для анализируемых образцов Fabeae. При построении вторичной структуры у видов Fabeae были определены все 10 петель и последовательности обоих функциональных доменов. При этом было показано, что выявленные точковые замены локализовались даже в функциональных доменах и мотивах, которые считаются наиболее консервативными участками интрона (рис. 3.27). Так в последовательности каталитического центра была выявлена замена в последовательности S-центра у V. villosa G/T (рис. 3.27).

Рис 3.27. Вторичная структура интрона пластидного гена trnL.

Полиморфизм петли Р6. Известно, что петля Р6 интронов группы I может несколько различаться как по длине, так и по нуклеотидным последовательностям. При этом, как было показано, внутри родов и близкородственных групп видов различия в длине петли P6 и в ее нуклеотидной последовательности были невысоки. Так, например, в исследовании Taberlet с соавт. (2007), последовательности P6 петли у трех видов рода Solanum различалась лишь на один нуклеотид при одинаковой длине. Аналогично, последовательность данной петли у 8 родов злаковых различалась по длине не более чем на 5 нуклеотидов, при этом последовательности петли у образцов родов Triticum и Secale были полностью идентичны (Taberlet et al., 2007).

Анализ последовательностей петли Р6 у Fabeae позволил выявить значительные различия, при этом интересно то, что длина последовательностей, формирующей Р6 петлю различалась не только у представителей различных родов, но и у видов одного рода. Так, различия в размере петли Р6 у образцов некоторых видов Lathyrus и Vicia и видом V. narborensis составили 35 п.н. (табл. 3.2). Для всех анализируемых образцов Fabeae была построена вторичная структура P6 петли. Было получено пять разных типов вторичной структуры петли (рис. 3.28). Наибольшее число образцов относится к I и II типу. Интересно отметить то, что некоторые образцы одного рода имели разный тип строения петли. Так, образцы родов Pisum, Vavilovia, Lens, а также некоторые образцы рода Lathyrus (L. sativus, L. cicer, L. hirsutus, L. nissolia) формировали петли Р6 типа I. Остальные образцы рода Lathyrus образовывали петли типа II. Образцы рода Vicia, также различались по типу строения петли P6. Так, образцы V. unijuga и V. ervillia имели тип строения петли II, V. narborensis – тип III, V. faba – тип IV, V. villosa – тип V. Такие различия в строении петли P6 можно объяснить тем, что данные виды относятся к разным секциям рода Vicia: Vicilla, Vicia и Cracca (Schaefer et al., 2012).

Рис. 3.28 Предполагаемая вторичная структура петли P6.

Стоит отметить, что образцы родов Pisum и Vavilovia имели одинаковую длину и различались лишь тремя нуклеотидами, что подтверждает точку зрения об их близком родстве (Oskoueiyan et al., 2010).

Полиморфизм петли Р8. Последовательность петли P8 у видов Fabeae была крайне вариабельной и содержала в себе многочисленные нуклеотидные замены, инсерции и делеции. Ее протяженность варьировала от 43 п.н. у V.narborensis до 221 п.н. у V. unijuga (табл. 3.2). Среди единичных замен, делеций и дупликаций были детектированы как видоспецифичные, так и характерные для групп видов. При исследовании последовательности участка пластидного генома trnT-trnF выделяют 8 «горячих точек/районов» с наивысшей вероятностью инсерций, в том числе две из них расположены в I и II спиральных элементах петли P8 (Borsch et al., 2003). В нашем исследовании наиболее протяженные вставки находились в элементе I. Последовательности петли P8 у образцов рода Pisum (P. sativum и P. fulvum) различались лишь наличием однокопийного тандемного пятинуклеотидного повтора у P.fulvum в положении 201 от первого нуклеотида интрона. Образец V. formosa в своей последовательности имел идентичные индели в сравнении с P. sativum, однако содержал 7SNPs.

Рис. 3.29. Предполагаемая вторичная структура петли P8 и расположение «горячих точек» (отмечены стрелками) (по Borsch et al., 2003).

Таким образом, в данной работе был проведен анализ полиморфизма интрона гена trnL у видов трибы Fabeae и предложена его вторичная структура. Последовательность интрона была достаточно полиморфной и содержала замены даже в функциональных центрах. В результате работы были определены все функциональные участки и петли интрона гена trnL, относящегося к интронам группы I. Было показано наличие пяти типов строения вторичной структуры P6 петли. При этом виды одного рода имели различный тип строения петли P6.

3.2.3. Комбинированный кластерный анализ на основе последовательностей ядерного и хлоропластного геномов представителей трибы Fabeae Для проведения комбинированного анализа из ранее проанализированных образцов было отобрано 66. Нуклеотидные последовательности по каждому из взятых в анализ образцов были объединены в единую матрицу, которая в дальнейшем была использована для проведения кластерного анализа. Были построены дендрограммы отдельно на основе последовательностей пластома (спейсеры trnH-psbA, rpoB-trnC, trnY-trnE-trnT и интрон гена trnL) и дендрограмма на основе последовательностей пластидного генома и последовательностями ITS-спейсеров. (рис. 3.30).

P.sativum 3980 100 P.sativum 7826 80 P.sativum 7128 94 P.sativum 188 P.sativum 1985 54 P.sativum 4788 11 P.sativum 9190 P.sativum 1982 P.sativum 1937 16 99 P.sativum 8599 P.sat.arvense 2006 P.sativum 6139 3219 P.sat.humile 2521 P.sat.elat 2524 20 P.sativum 1865 P.sativum 4650 14 14 P.sativum 7584 P.sativum 2182 6 100 P.sat.jomardii 2008 P.sat.asiat 2827 98 P.sat.transc 289 49 P.sat.elat 3115 60 P.sat.abyss 2759 55 97 P.sat.abyss 3567 P.sativum 6373 100 P.sat.transc 2376 64 P.fulvum 2523 64 P.fulvum 3397 P.fulvum 6070 80 P.fulvum 6071 P.fulvum 701 P.fulvum 702 41 99 P.fulvum 703 P.fulvum 2140 P.fulvum 706 23 P.fulvum 708 Vav.formosa 5 80 Vav.formosa 2 89 Vav.formosa 3 Vav.formosa O 47 42 45 Vav.formosa H Vav.formosa J 73 Vav.formosa L 46 Vav.formosa F Vav.formosa I 18 Vav.formosa B Vav.formosa D Vav.formosa P 100 L.ochrus L.clymenum 37 L.nissolia 51 56 L.aphaca 44 L.palustris 100 L.hirsutus 94 L.sylvestris 37 97 L.gmelinii L.pratensis 94 L.sativus 70 100 L.cicera V.ervilia V.villosa Vav.formosa 4 46 V.narbonensis L.culinaris V.faba 40 38 V.unijuga

0.01 Рис. 3.30. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и видов трибы Fabeae. построенная на основе четырех последовательностей пластома (ML, модель GTR+G).

На дендрограмме, построенной на основе последовательностей пластидного генома образцы рода Pisum формируют единый кластер (ИБ=100%), внутри которого отдельные субкластеры образуют виды P. sativum (ИБ=95%) и P. fulvum (ИБ=97%). Образцы Vav. formosa формируют отдельную сестринскую кладу (ИБ=92%). Образцы видов Lathyrus формируют полиморфный кластер, при этом образцы L. ochrus и L. clymenum формируют обособленную группу. Образцы видов Vicia не образуют единого кластера, при этом образец Lens culinaris расположен внутри клады видов Vicia. На дендрограмме, построенной на основе четырех участков пластидного генома и ядерных ITS-спейсеров образцы рода Pisum также формируют единый кластер (ИБ=100%) с выделением видовых субкластеров P. sativum (ИБ=99%) и P. fulvum (ИБ=100%) (рис. 3.31). Внутри субкластера P. sativum выделяется несколько групп образцов с высокой поддержкой. Образцы видов Lathyrus на дендрограмме образуют два субкластера с высокой поддержкой, а образец L. nissolia формирует отдельную ветвь. Все образцы видов Vicia образуют единый кластер, в который также попал образец Lens culinaris, однако он имеет низкий уровень поддержки. В целом положение образцов на суммарных дендрограмме было аналогично их положению на дендрограммах, построенных по отдельным участкам, за исключением участка rpoB-trnC. Образцы видов Pisum и Vavilovia формируют обособленные кластеры, что подтверждает правомерность выделения в ранг самостоятельного рода Vavilovia. Представители родов Lathyrus и Vicia не формируют отдельные кластеры, при этом интересно отметить, что образец Lens culinaris входит в кладу Vicia, что подтверждает необходимость пересмотра классификации трибы. Таким образом, проведенный анализ как отдельных учасков хлоропластного и ядерного геномов рода Pisum и родственных родов трибы Fabeae, так и комбинированный анализ последовательностей хлоропластного генома, и суммарный анализ участков хлоропластного и ядерного геномов подтвердил, что род Pisum состоит из двух видов – P.sativum и P. fulvum. Не подтверждено выделение образцов спорного таксономического статуса transcaucasicum, asiaticum, abyssinicum, elatius в ранг самостоятельных видов, данные образцы входят в состав вида P. sativum, при этом проведенный анализ также не показал возможность выделения данных образцов и в ранг подвидов в составе P. sativum.

P.sativum 188 100 P.sativum 7826 81 P.sativum 7128 93 P.sativum 3980 40 P.sativum 1985 P.sativum 4788 0 P.sativum 9190 P.sat.humile 2521 2 P.sat.elat 2524 P.sativum 6139 P.sativum 1937 33 P.sativum 1982 34 99 P.sativum 8599 P.sat.arvense 2006 22 P.sativum 1865 P.sativum 4650 58 11 P.sativum 7584 P.sativum 2182 4 100 P.sat.jomardi 2008 P.sativum 6373 100 P.sat.asiat 2827 24 P.sat.transc 289 56 P.sat.elat 3115 48 P.sat.abyss 2759 52 100 72 P.sat.abyss 3567 P.sat.transc 2376 P.fulvum 701 P.fulvum 703 P.fulvum 702 P.fulvum 706 10049 P.fulvum 708 85 P.fulvum 2140 64 P.fulvum 2523 61 P.fulvum 3397 63 P.fulvum 6070 79 P.fulvum 6071 Vav.formosa 4 22 Vav.formosa 3 63 Vav.formosa 5 93 Vav.formosa 2 33 Vav.formosa O 83 Vav.formosa L 37 Vav.formosa H 63 Vav.formosa J 54 Vav.formosa F 13 Vav.formosa I Vav.formosa B Vav.formosa D Vav.formosa P 92 L.nissolia L.palustris 37 L.aphaca 93 100 L.hirsutus 48 L.sylvestris 71 96 L.gmelinii L.pratensis 86 L.sativus 59 100 L.cicera L.ochrus 100 L.clymenum V.ervilia V.villosa 86 V.faba V.narbonensis 89 V.unijuga 47 L.culinaris

0.01 Рис. 3.31. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae, построенная на основе четырех последовательностей пластидного генома и последовательностей ядерных ITS-спейсеров (ML, модель GTR+G).

Анализ широкой выборки образцов монотипического рода Vavilovia по всем проанализированным участкам показал их четкое отличие от образцов рода Pisum, что подтверждает правомерность выделения рода Vavilovia.

Расположение образцов родов Lathyrus, Vicia и Lens на большинстве построенных дендрограмм было схоже. Образцы L. ochrus и L. clymenum формируют единую группу, которая с достаточно высокими значениями достоверности выделяется из общей группы Lathyrus. Образец Lens culinaris на всех дендрограммах формирует единую кладу с образцами рода Vicia. Полученные данные свидетельствуют от необходимости пересмотра таксономии трибы Fabeae, более детального исследования как всей трибы в комплексе, так и отдельно родов Lathyrus, Vicia и Lens.

3.2.4. Анализ последовательности b/c интрона митохондриального гена nad1 у образцов рода Pisum и родственных родов трибы Fabeae. Участки митохондриального генома растений, в отличие от хлоропластного, не часто используются в филогенетических исследованиях и оценке биоразнообразия видов и родов. Однако была показана возможность успешного использования в различных таксономических и филогенетических исследованиях растений последовательностей как интронов, так и экзонов митохондриальных генов cox, atpA, nad (Hiesel et al., 1994; Qiu, Cho, 1998; Duff, Nickrent, 1999; Soltis, Soltis. 2000). Ранее митохондриальный геном бобовых практически не использовался в анализе, за исключением единичных образцов, как например Vicia faba, Medicago truncatula, Glycine max и др., для которых была определена полная последовательность мтДНК (Negruk, 2013; Chang et al., 2013; Bi et al, 2016). Однако в этих случаях были взяты в анализ отдельные единичные образцы (обычно P. sativum) и полученные последовательности не использовались для характеристики межвидовой и межродовой вариабельности генома бобовых. Для анализа мтДНК был выбран b/c интрон гена nad1, относящийся к II группе самосплайсирующихся интронов, который считается полиморфным и наиболее часто используется для проведения филогенетических исследований растений (Demesure, Sodzi, Petit, 1995; Bakker et al., 2000; Freudenstein, Chase, 2001). Для определения полиморфизма последовательности b/c интрона гена nad1 было отобрано 69 образцов трибы Fabeae, включая 32 образца рода Pisum, 12 образцов рода Vavilovia, 13 образцов рода Lathyrus, 11 образцов рода Vicia и один образец рода Lens (табл.3.2). Последовательности были амплифицированы и секвенированы с использованием стандартных праймеров (Demesure et al., 1995).

Длина последовательности b/c интрона гена nad1 у образцов P. sativum составила 1503 п.н., за исключением образца P. sativum ssp. elatius (2524), у которого интрон имел размер 1516 п.н., как и у всех анализируемых образцов P. fulvum. Последовательность данного интрона у всех образцов V. formosa имела длину 1515 п.н. (табл. 3.2). У образцов рода Lathyrus размер интрона варьировал от 1499 (L. gmelinii) до 1517 п.н. (L. aphaca), а у видов Vicia – от 1493 (V. hirsuta) до 1519 п.н. (V. unijuga). Протяженность выровненных и используемых для анализа последовательностей b/c интрона гена nad1 составила 1583 п.н. Всего в последовательностях интрона было идентифицировано 66 вариабельных сайтов (4.17%), из них парсимонии-информативными были 14 сайтов. Также был выявлен ряд инделей. Так было выявлено 20 инсерций, восемь из которых являются тандемными повторами. При этом, как правило, все индели были короткими и не превышали 6 п.н. Некоторые индели были специфичны для отдельных видов, другие присутствовали в последовательностях групп видов. Для вида P. fulvum выявлены три видоспецифичные индели. Интересно отметить, что последовательности интрона двух образцов P. sativum (elatius 2524 и humile) содержали такие же индели (инсерции GGTC, GGGA, AACCT, CCGCC и делеция TGACG), как и образцы P. fulvum, в то время как анализ других участков (хпДНК и ITS-спейсеры) показал, что последовательности этих образцов идентичны остальным образцам P. sativum и отличались от представителей P. fulvum. При этом следует отметить, что второй образец P. sativum ssp.elatius 3115 не имел общих с P. fulvum инделей (рис. 3.32). В последовательности b/c интрона гена nad1 у представителей Lathyrus и Vicia было выявлено шесть инделей относительно Pisum. Наибольшее число видоспецифичных замен было детектировано у вида L. gmelinii (5) и L. aphaca (4).

Рис. 3.32. Фрагмент сиквенса интрона b/c гена nad1 рода Pisum и близких родов бобовых.

Данные проведенного анализа показали, что уровень как межвидового полиморфизма рода Pisum, так и внутривидовой полиморфизм образцов P. fulvum и P. sativum не превышали 0,001. Значения генетических расстояний у представителей трибы Fabeae относительно рода Pisum варьировали в пределах 0,000-0,022. На основе полученных данных были рассчитаны генетические расстояния и методом ML построена дендрограмма (рис. 3.33). На дендрограмме все анализируемые образцы сформировали единую смешанную группу. Таким образом, данный интрон не может быть использован для исследования филогенетических отношений.

P.sativum 4650 P.sativum 6139 62 P.sativum 1865 P.sativum 4788 P.sativum 6373 P.sativum 8599 P.fulvum 6070 P.fulvum 701 P.sat.transc 2376 P.sat.asiat 2827 P.sativum 3980 P.sativum 1982 P.sativum 1937 P.sativum 2182 P.sativum 7128 P.sat.jomardi 2008 P.sat.elat 2524 P.sat.abyss 2759 P.fulvum 706 P.fulvum 6071 L.cicera P.sativum 7584 P.sativum 9190 P.sativum 7826 P.sat.transc 289 P.sat.humile 2521 P.fulvum 3397 9 L.odoratus P.sativum 1985 P.sativum 188 P.sat.arvense 2006 P.sat.elat 3115 P.sat.abyss 3567 P.fulvum 708 L.hirsutus L.nissolia Vav.formosa B Vav.formosa C Vav.formosa D Vav.formosa F 17 Vav.formosa H Vav.formosa I Vav.formosa J Vav.formosa L 61 Vav.formosa O Vav.formosa 2 Vav.formosa 4 L.clymenum 35 Vav.formosa 5 L.sativus L.ochrus L.palustris 53 L.maritimus 10 V.ervilia L.sylvestris L.gmelinii L.aphaca L.pratensis V.faba 42 V.bithynica L.culinaris V.peregrina V.pannonica 7 V.hirsuta V.sativa 32 V.augustofolia V.unijuga V.narborensis V.villosa

0.002 Рис. 3.33. Дендрограмма генетического сходства образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. (ML, модель JC+G)

100

Таким образом, впервые были охарактеризованы последовательности b/c интрона митохондриального гена nad1 у 69 представителей 30 видов всех пяти родов трибы Fabeae. Показано, что последовательности данного интрона достаточно консервативны по сравнению с последовательностями хлоропластного генома. Анализ вторичной структуры интрона b/c гена nad1 митохондриального генома рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Интроны II типа представляют собой обширную группу интронов, характеризующихся способностью к автономному сплайсингу. Существенное значение для сплайсинга интрона имеет его вторичная структура. В последовательностях многих интронов II типа содержатся консервативные и полуконсервативные мотивы, определяющие пространственную структуру интрона. Модель вторичной структуры интронов II типа, состоящей из шести доменных петель, впервые была предложена F.Michel с сотрудниками (1989) (рис. 3.34).

Рис. 3.34. Схематичное изображение вторичной структуры интрона b/c гена nad1 Fabeae.

Полученные данные о первичных последовательностях b/c интрона гена nad1 у исследуемых образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae позволили найти и охарактеризовать все шесть доменов (табл. 3.3), консервативные мотивы и сайты (табл. 3.4), определяющие пространственную структуру интрона и его каталитическую

101

активность, согласно моделям F. Michel и др. (1989), N. Toor и др. (2001). По большинству признаков данный интрон может быть отнесен к IIA подклассу самосплайсирующихся интронов.

Таблица 3.3. Характеристики последовательности b/c интрона митохондриального гена nad1 у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.

Σ / I II III IV V VI среднее домен домен домен домен домен домен значение Выровненная длина 288 187 106 845 38 22 1486 п.н. Длина без пробелов 279- 177- 782- 106 34-38 17-22 1395-1437 п.н. 284 187 800 57.0- 48.7- 55. 6- 53.5- 55.9- 82.4- GC состав, % 54.5-57.1 58.5 50.3 56.6 57.4 57.9 86.4 Число константных 276 172 105 796 36 15 1393 сайтов Число вариабельных 13 10 27 сайтов (без учета 1 (0.9) 2 (5.3) 0 53 (3.6) (4.5) (5.4) (3.2) инделей), (%) Число парсимони – информативных 2 3 1 6 1 0 13 сайтов

Выявленные домены b/c интрона демонстрировали определенные различия по способности накапливать мутации, что связано с различиями в функциональной значимости его отдельных участков. Кроме того, последовательности внутри каждого из шести доменов так же отличались как по степени вариабельности, так и по нуклеотидному составу. Участки, образующие петли, характеризовались бóльшим полиморфизмом, а также преобладанием в составе нуклеотидов АТ по сравнению с GC-богатыми и более консервативными стеблевыми участками петель. Наиболее консервативным доменом b/c интрона у представителей Fabeae был домен VI, который был инвариантен у всех анализируемых образцов. Домен I имеет наиболее сложную структуру и содержит в своей последовательности основную часть консервативных и полуконсервативных мотивов. Протяженность домена I у представителей трибы Fabeae составляет около 20% от общей длины интрона и варьирует у исследуемых видов от 279 до 284 п.н. В целом

102

последовательность домена I достаточно консервативна, у представителей трибы Fabeae выявлено 13 замен (4.5%), при этом у представителей рода Pisum и Vavilovia последовательность домена была инвариантна.

Таблица 3.4. Домены и выявленные консервативные мотивы Последовательность Последовательность Структура локализация 5’- конца домена 3’-конца домена I (i) домен 6-293 CCTTGT GCAAGG I (ii) 15-283 CGCGTTTGG TCGAACGT I - A 28-41 GCGA TCGC I - C 43-105 CGGAT GTCCG I – C (i) 48-100 GTTCCCC GGGG(A/G)AT I – C (ii) TACCC GGGAA I – D (i) 109-268 CTCGTCG CGACGAG I – D (ii) 122-172 GGCT GGCC D3 (ii) 221-250 AGGTGACTG T(C/A)ACT(C/A) EBS1 231-239 AATGAGCAG II (i) домен 296-482 TCACCTA TGGGTGA III домен 488-595 CGGCC GGCTG IV домен 599-1443 GTG CGC V(i) домен 1448-1485 GAGCCACA TGTGGTTC V(ii) 1460-1475 TGCAGG CTTGCA VI домен 1488-1507 GCCGG CCGGT

Известно, что последовательность этого домена в общей сложности задействована как минимум в 10 междоменных связях и насыщена целым рядом консервативных и полуконсервативных мотивов, которые были идентифицированы в анализируемых последовательностях b/c интрона nad1 у Pisum (Kelchner, 2002). Домен II у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae составляет около 13% от всей длины b/с интрона гена nad1. Его размер варьирует от 177 до 187 п.н. Всего в последовательности домена II было идентифицировано 10 замен (5.4%), в том числе одна замена между образцами родов Pisum и Vavilovia. Анализ последовательностей домена II показал наличие одной инсерции у вида L. aphaca и одной делеции у вида V. hirsuta.

103

Считается, что роль этого домена в сплайсинге менее значима и его структурный полиморфизм может быть высоким. Например, у представителей рода Gnetum протяженность последовательности домена за счет инделей разной длины варьируется от 383 до 994 п. н. (Won, Renner, 2003). Последовательность домена III составляет около 7.7% (106 п.н.) от общей протяженности интрона и характеризуется наличием только одной замены (0.9%). При высокой консервативности данного домена его функция до сих пор остается не вполне ясной. Однако известны примеры и его полного отсутствия, как, например, в интроне хлоропластного гена rpS16 у ряда видов Allium (Рыжова и др., 2009). Наиболее протяженным и интересным по количеству инделей оказался домен IV. Его длина у исследуемых образцов варьирует от 782 до 800 п.н. и составляет около 60% от всей длины b/c интрона гена nad1. Всего в последовательности домена выявлено 27 нуклеотидных замен (3.2%). Домен IV оказался наиболее интересным с точки зрения инсерций и делеций. Всего в последовательности домена идентифицировано 25 инделей, при этом четыре из них были идентифицированы между видами P. sativum и группой образцов, включающей вид P. fulvum, а также P. sativum ssp. humile 2521 и P. sativum ssp. elatius 2524. Некоторые из данных инделей также присутствовали и у вида V. formosa. Домены V и VI играют важную роль в позиционировании всех структур пре- мРНК интрона и формировании каталитически активной пространственной структуры интрона и считаются наиболее консервативными. Последовательности доменов V и VI характеризуются наименьшей протяженностью: 34-38 и 17-22 п.н. соответственно. У всех образцов рода Pisum и рода Vavilovia последовательность домена V была инвариантна. Несмотря на важную роль домена V в формировании пространственной структуры, у представителей трибы Fabeae было идентифицировано две нуклеотидные замены, что составило 5.3% и соответствовало значениям самого полиморфного домена II. Также в изученной последовательности у всех анализируемых представителей трибы Fabeae была идентифицирована инсерция (GAGC) в положении 1452 у видов L. palustris и L. maritimus, которая является повтором. Последовательность домена VI у всех проанализированных образцов была также инвариантна, за исключением наличия инсерции (CCGCC) у всех образцов вида P.

104 fulvum и образцов P. sativum ssp. humile 2521 и P. sativum ssp. elatius 2524., которые, как отмечалось ранее, имели идентичные с P. fulvum замены и индели. Таким образом, был проведен анализ b/c интрона митохондриального гена nad1 у 69 образцов трибы Fabeae, в том числе 32 образцов рода Pisum. В ходе анализа было показано наличие всех шести ключевых доменов. В домене I у всех представителей рода Pisum и родственных видов были идентифицированы консервативные и полуконсервативные мотивы. В результате анализа было показано, что первичная нуклеотидная последовательность и топология вторичных структур b/c интрон гена nad1 у представителей рода Pisum характеризовались значительной консервативностью, а уровень полиморфизма составил около 4%. Были выявлены наиболее полиморфные (домен II) и консервативные домены (домен VI). На основе выявленного полиморфизма данного интрона были рассчитаны генетические расстояния между исследуемыми образцами, однако кластерный анализ не выявил каких-либо групп образцов.

3.3. Идентификация, анализ полиморфизма и изучение экспрессии гена сахарозосинтазы (Sus1) у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Известно, что фермент сахарозосинтаза (Sus) играет ключевую роль в метаболизме углеводов у растений, осуществляя гидролиз сахарозы до УДФ- глюкозы и фруктозы - первый этап конверсии сахарозы в крахмал. Из ферментов, расщепляющих сахарозу, только SUS способен катализировать синтез и расщепление сахарозы обратимым и почти энергетически нейтральным образом (Koch, 2004) Показано, что сахарозосинтаза вовлечена в различные клеточные процессы, в том числе в наращивании биомассы, росте пыльцы, а так же вовлечена в ответные реакции организма растений на абиотический стресс (Gao et al., 2008; Coleman et al., 2010; Bologa et al., 2003). У бобовых растений показано, что сахарозосинтаза играет важную роль в азотфиксации в процессе формирования клубеньков (Aleman et al., 2010; Schubert et al., 2011) Задачами данного этапа работы были идентификация генов сахарозосинтазы у представителей трибы Fabeae, оценка их межвидового и внутривидового полиморфизма, выявление возможных аминокислотных замен, в том числе и в

105

функциональных доменах, определение третичной структуры белка и изучение экспрессии генов сахарозосинтазы в различных органах растения. Для проведения анализа были отобраны 34 образца 13 видов, представляющие все пять родов трибы Fabeae, в том числе образцы P. sativum, различающиеся по уровню симбиотической азотфиксации. Клонирование полных кодирующих последовательностей генов-гомологов Sus1 у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Как было сказано выше, фермент сахарозосинтаза кодируется семейством генов Sus, представленным у всех высших растений. У бобовых в настоящее время известна полная нуклеотидная последовательность гена сахарозосинтазы Sus1 только у люцерны (Medicago truncatula). У других представителей сем. Fabaceae известны только мРНК гена сахарозосинтазы, при этом среди представителей трибы Fabeae известны только мРНК последовательности сахарозосинтаз P. sativum и V.faba. У вида P. sativum в настоящее время известны три изоформы сахарозосинтазы (PsSus1, PsSus2, PsSus3) (Barratt et al., 2001). При этом показано, что именно Sus1 играет ключевую роль в процессе формирования клубеньков (Horst et al., 2007). На основании известных кодирующих последовательностей генов сахарозосинтаз P. sativum (J012080) и V.faba (X69773) нами были разработаны специфические праймеры, позволяющие амплифицировать полные кодирующие последовательности генов- гомологов Sus1 у исследуемых видов Fabeae, а также дифференцировать их от последовательностей Sus2 и Sus3. С использованием разработанных праймеров (1F 5’ - GAAGAATTTSAATGGCTACTG – 3’; 1R 5’ - AATAGAAGCTGAATGGACTCG – 3’; 2F 5’ - CTGAAGAGTATCTARGCAC – 3’; 2R 5’ - TCCAGTAAATATCAGATTCAGG – 3’; 3F 5’ - CTTGAGAAGACTAAGTATCCT – 3’; 3R 5’ - AAGAATTCGACTAGGAGATCA– 3’; 4F 5’ - TTACCAACATTCGCAACACTCA – 3’; 4R 5’ - MAA AGC CGG TTY CTY CAT TTC – 3’) были амплифицированы полные кодирующие последовательности гена сахарозосинтазы у 34 образцов трибы Fabeae. Длина полученных фрагментов составила около 4000 пн. Амплифицированные ПЦР продукты были клонированы с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, США). Всего было получено 34 клонированные последовательности 13 видов трибы Fabeae (табл. 3.5). Для каждого

106

образца с использованием разработанных внутригенных праймеров была определена полная нуклеотидная последовательность гена сахарозинтазы. Полиморфизм нуклеотидной последовательности генов сахарозосинтазы представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Выровненная длина последовательности гена составила 4675 п.н. Проведенный анализ гомологии полученных последовательностей гена Sus с известными мРНК сахарозосинтаз бобовых позволил определить границы всех экзонов и интронов. Анализ полученных последовательностей показал, что все они были гомологичны PsSus1, и значительно отличались от PsSus2 и PsSus3. Все полученные последовательности содержали 13 экзонов и 12 интронов, а их длина варьировала в пределах от 3428 п.н у L. aphaca до 3817 пн. у L.culinaris (табл.3.5). В настоящее время все известные последовательности генов сахарозосинтаз растений разделяют на четыре группы на основании их экзон-интронной структуры и аминокислотной последовательности соответствующего белка (Komatsu et al., 2002; Baud et al., 2004; Harada et al., 2005). Анализ экзон-интронной структуры полученных нами 34 последовательностей Sus1 показал, что все они относятся к SUS1 группе сахарозосинтаз двудольных. Длина экзонных последовательностей у всех представителей трибы Fabeae составила 2421 н.п., за исключением образца V.faba (X69773) из базы NCBI, в последовательности которого содержалась инсерция GGAAAG. В изученных последовательностях был выявлен высокий уровень полиморфизма. Полученные кодирующие нуклеотидные последовательности SUS1 содержали 352 вариабельных сайта, а общий уровень межвидового полиморфизма представителей трибы Fabeae составил 14.54%. Последовательности интронов были крайне вариабельны и содержали большое число инсерций и делеций. Протяженность интронных последовательностей гена сахарозосинтазы варьировала в пределах от 1127 п.н. до 1471 п.н. Наиболее полиморфным оказался интрон III, последовательность которого состояла в основном из видо- и родоспецифичных вставок.

107

Таблица 3.5. Протяженность полной последовательности гена сахарозосинтазы у рода Pisum и родственных видов бобовых. Образец/ Вид № ВИР/и (или) NCBI Длина гена P.sativum transcaucasicum 289 3522 P.sativum asiaticum 2827 3527 P.sativun abyssinicum 2759 3531 P.sat.humile 2521 3514 P.sativum elatius 3115 3527 P. sativum 9190 3527 P.sativum 6373 3527 P.sativum 4650 3532 P.sativum 1982 3527 P.sativum 1937 3527 P.sativum 7584 3527 P.sativum 188 3527 P.sativum 8571 3527 P.sativum 925 3527 P.sativum 6883 3527 P.sativum 3358 3527 P.sativum 8599 3527 P.sativum 5493 3527 P.fulvum 702/KP219422 3494 P.fulvum 706 /KP219423 3501 P.fulvum 2523 /KP219424 3506 V.formosa 5 3555 V.formosa D 3552 L. Sativus 701 3571 L. cicera 356 3517 L. aphaca 1293 3428 L. ochrus 380 3530 L. odoratus И- 604554 3642 V.unijuga k-35828 3747 V.cracca 3624 V sativa k-36653 3517 V. faba 1506 3535 V. faba 2267 3532 L. culinaris 244 3817

Анализ экспрессируемых последовательностей показал, что среди всех образцов трибы Fabeae наиболее полиморфными были экзоны II, XI и VI, а наиболее консервативным оказался экзон III. (табл. 3.6).

108

Таблица 3.6. Полиморфизм экзонов гена сахарозосинтазы у представителей трибы Fabeae и родственных видов бобовых

Уровень полиморфизма экзонов, % (число вариабельных сайтов, п.н.) Экзон, п.н. Род Род триба P.sativum P. fulvum Род Vicia Pisum Lathyrus Fabeae II (98) 5.10 (5) 1.02 (1) 5.10 (5) 6.12 (6) 13.27 (13) 21.43 (21) III (127) 3.15 (4) 0.79 (1) 3.15 (4) 3.15 (4) 4.72 (6) 7.87 (10) IV (152) 1.97 (3) 0.66 (1) 1.97 (3) 7.89 (12) 4.61 (7) 13.82 (21) V (193) 1.55(3) 1.04 (2) 1.55 (3) 6.74 (13) 6.22 (12) 15.54 (30) VI (336) 3.57 (12) 1.19 (4) 3.87 (13) 5.36 (18) 6.85 (23) 16.07 (54) VII (96) 1.04 (1) 0.0 1.04 (1) 7.30 (7) 9.38 (9) 15.62 (15) VIII (174) 1.72 (3) 4.60 (8) 5.75 (10) 4.60 (8) 5.75 (10) 13.22 (23) IX (117) 0.85 (1) 0.0 0.85 (1) 5.13 (6) 8.55 (10) 14.53 (17) X (167) 2.40 (4) 0.0 2.40 (4) 5.99 (10) 6.59 (11) 12.58 (21) XI (225) 3.56 (8) 1.33 (3) 5.33 (12) 8.89 (20) 6.67 (15) 16.44 (37) XII (564) 2.31 (13) 2.48 (14) 4.61 (26) 6.03 (34) 6.74 (38) 14.89 (84) XIII (139) 0.72 (1) 0.72 (1) 1.44 (2) 5.04 (7) 2.88 (4) 10.79 (15) XIV (33) 0 0.0 0 6.06 (2) 9.09 (3) 12.12 (4) Все экзоны: 2.40 (58) 1.45(35) 3.45 (84) 6.07 (147) 6.65 (161) 14.54 (352) 2421 п.н.

Анализ межвидового полиморфизма гена Sus1. Представлялось интересным рассмотреть уровень внутриродового полиморфизма кодирующих Sus1 последовательностей у представителей трибы Fabeae. Наибольшее количество замен в кодирующих последовательностях гена Sus1 было детектировано между пятью образцами рода Vicia (161 замена, 6.65%), уровень полиморфизма рода Lathyrus составил 6.07 (147 замен), среди 21 образца рода Pisum было детектировано 84 замены (3.45%) (табл. 3.6). Также благодаря наличию в базе данных последовательностей мРНК сахарозосинтаз других представителей семейства Fabaceae представлялось возможным сравнить уровень внутриродового полиморфизма у родов Vigna (V. radiate, V. angularis) (триба Trifolieae) и Medicago (M. sativa, M. truncatula) (триба Phaseoleae) и родов трибы Fabaea. Так, уровень внутриродового полиморфизма кодирующей последовательности (экзонов) данного гена у родов Vigna и Medicago составляет 1.5%

109

и 1.7% соответственно, что значительно ниже полученных нами данных о полиморфизме родов Vicia (6.65%), Lathyrus (6.07%) и Pisum (3.45%) трибы Fabaea. Интересно отметить, что уровень внутриродового полиморфизма у представителей родов Vigna и Medicago сопоставим, скорее, с уровень внутривидового полиморфизма P. fulvum (1.45%). Однако такой уровенем полиморфизма гена сахарозосинтазы представителей родов Vigna и Medicago может быть связан с ограниченным количеством известных Sus1последовательностей для этих родов. Анализ внутривидового полиморфизма гена Sus1. Отдельный интерес представляла оценка уровня внутривидового полиморфизма кодирующих последовательностей Sus1 у видов рода Pisum (P. sativum и P. fulvum), а так же V. formosa и V.faba. В анализ были взяты 18 образцов P. sativum, включая образцы спорного таксономического статуса (transcaucasicum, abyssinicum, asiaticum, elatius) и образцы, различающиеся по уровню симбиотической активности (данные д.б.н. Борисова А.Ю. (ВНИИСХМ)). Всего в последовательностях Sus1 образцов P.sativum было выявлено 67 нуклеотидных замен (2.77%) и шесть инделей. В результате проведенного анализа не было выявлено ни одной замены, характерной для всех образцов с определенным уровнем симбиотической азотфиксации. Уровень внутривидового полиморфизма кодирующей последовательности Sus1 у трех проанализированных образцов P. fulvum составил 1.45% (35 SNP). Интересно отметить, что последовательности образцов P. fulvum помимо замен содержали в интроне IX делецию 7 п.н. (MTWCATG) (в положении +1958) у образца #702 и инсерцию 5 п.н. (TAGTT) (в положении +1979) у образца #2523. Причины столь высокого уровня полиморфизма не ясны и представляют интерес в связи с достаточно узким ареалом P. fulvum, ограниченным Ближним Востоком. Последовательность Sus1 у двух образцов V. formosa, как и ожидалось, была менее полиморфной, было выявлено 27 SNPs (1.12%). Внутривидовое разнообразие последовательностей гена сахарозосинтазы у P.sativum и P.fulvum в целом было сопоставимо со средним уровнем полиморфизма у других семейств. Так, например, значения внутривидовой вариабельности генов сахарозосинтазы Sus4 сахарного тростника Saccharum officinarum, S. spontanuem,S. robustom, составила 1,5%, 1,9%, и 1,9% соответственно (Zhang et al., 2013). Тогда как

110

анализ фрагмента гена сахарозосинтазы Sus2 у гексаплоидной мягкой пшеницы показал инвариантность последовательностей этого гена на хромосомах 2A и 2D, и в то же время Sus2 гомолог на 2В хромосоме был полиморфен (Jiang et al., 2011). При этом, например, общий уровень полиморфизма последовательностей гена Sus4 среди сортов картофеля составил 7,7% (Слугина и др, 2014). Однако такой высокий уровень вариабельности гена Sus4 картофеля по сравнению с другими генами сахарозосинтаз можно, по всей видимости, объяснить тем, что при селекции сортов картофеля активно использовалась межвидовая гибридизация (Борис и др, 2011). Полиморфизм аминокислотной последовательности Sus1 у представителей рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Нуклеотидная последовательность экзонов гена сахарозосинтазы была транслирована и протяженность соответствующего белка у анализируемых видов составила 806 а.к., у образца V.faba (X69773) из базы NCBI протяженность белка составила 808 а.к. Анализ полученных последовательностей Sus1 образцов трибы Fabeae показал наличие 72 аминокислотных замен, что составило 8.91%, в том числе из них 33 замены были радикальные и 66 консервативные (рис 3.36). Представители рода Pisum содержали в своей аминокислотной последовательности 20 вариабельных сайтов, что составляет 2.48%, в то время как среди образцов рода Lathyrus было детектировано только 13 аминокислотных замен. В последовательности Sus1 V. formosa ни одна из 18 нуклеотидных замен не приводила к заменам в соответствующем белке. У образцов и P.fulvum также не было выявлено аминокислотных замен в пределах вида (рис.36), в то время как у анализируемых образцов P.sativum было выявлено 19 замен. Сравнение транслированных Sus1 мРНК последовательностей представителей других триб сем. Fabaceae из базы данных с полученными нами последовательностями представителей трибы Fabeae показало, что длина соответствующего белка у всех представителей трибы Fabeae составляла 806 а.о, в то время как у известных видов бобовых, относящихся к другим трибам, в том числе M. truncatula (триба Phaseoleae), длина соответствующего пептида составила 805 а.о. (рис. 3.35).

111

Рис. 3.35. Аминокислотные последовательности белка Sus1 у образцов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae.

112

Ранее было показано, что замена Arg → Lys в положении 578, полученная в результате мутагенезом, приводит к снижению активности сахарозосинтазы в клубеньках и, соответственно, уровня азотфиксации у P. sativum (Craig et al., 1999). У всех проанализированных последовательностях Sus1 образцов бобовых не выявлено данной замены. В ходе анализа Sus1 последовательностей видов Fabaceae, в том числе трибы Fabeae были идентифицированы два основных функционально значимых участка, кодирующих сахарозосинтазный (II – XI экзоны) и глюкозилтрансферазный (XII экзон) домены и консервативный сайт фосфорилирования Ser11, характерные для сахарозосинтаз растений (Silvente et al., 2003). В последовательностях доменов были выявлены трансмембранные мотивы FLDRIPMVFNVVILSPHGYFA в экзоне VI и FGLTVVEAMATGLPTFATLN в экзоне XII. У исследуемых образцов трибы Fabeae данные мотивы были инвариантны, а у образцов Vigna, Phaseolus и Glycine эти мотивы содержали одну и три замены соответственно (рис.3.35).

Кластерный анализ последовательностей генов сахарозосинтазы. Полученные аминокислотные Sus1 последовательности бобовых были использованы для проведения кластерного анализа (рис. 3.36). Как и ожидалось, отдельный подкластер был сформирован образцами рода Pisum с четким разделением на две группы (P.sativum и P.fulvum). Образцы спорного таксономического статуса формировали единую группу с остальными образцами P.sativum. Образцы P.sativum №J012080 и №AF07985 из базы NCBI также расположились с остальными образцами P.sativum. В целом расположение образцов трибы Fabeae соответствует принятой в настоящее время классификации предложенной F.Kupicha (1983). Таким образом, последовательность сахарозосинтазы, наряду с другими низкокопийными генами ядерного генома, может быть использована для проведения межродовых филогенетических исследований у семейства Fabaceae.

113

Рис. 3.36. Дендрограмма генетических различий, построенная по результатам анализа аминокислотного полиморфизма генов сахарозосинтазы видов трибы Fabeae (NJ, модель JTT). Зеленым отмечены образцы с высоким уровнем симбиотической активности, красным – с низким уровнем.

Определение третичной структуры Sus1. Sus белки относятся к подсемейству GT-4 гликозилтрансфераз, входящего в состав более крупного суперсемейства метал- независимых GT-B гликозилтранфераз (Lairson et al., 2008). Ранее, на основе полученной кристаллической структуры, была определена и охарактеризована четвертичная структура белка сахарозосинтазы арабидопсиса AtSus1, гомологичного Sus1 последовательностям видов Fabaceae (Zheng et al., 2011). Было показано, что AtSus1 имеет типичную структуру сахарозоинтаз, белок представляет собой тетрамер. В каждом мономере выявляют ряд доменов CTD (cellular targeting domain), EPBD (ENOD40, peptide-binding domain) домен и Rossmann-fold домен GT-B гликозилтрансферазы (Lairson et al., 2008). Наиболее вариабельным из них

114

считается CTD домен, который может отличаться по длине и составу аминокислот. EPBD домен особенно интересен в случае бобовых, тем, что он может связываться с белком нодулином ENOD40, который является гормон-подобным пептидом и вовлечен в формирование клубенька. Так как полученные последовательности белков сахарозосинтаз были высоко гомологичны по первичным аминокислотным последовательностям, для определения возможной трехмерной структуры был выбран белок Sus1 гороха (=PsSus1). Для моделирования 3D структуры PsSus1 была использована программа Phyre2 (Kelley et al. 2015). В качестве референсного был выбран GT-4 гомолог арабидопсиса AtSus1 (PDB: 3S29C) с известной кристаллической структурой. При моделировании трехмерной структуры Sus1 более 97% последовательности было предсказано с достоверностью 100% на основе известных структур белков гликозилтрансфераз растений суперсемейства GT-B(GT-4). Оставшиеся 24 аминокислотных остатка на N- конца (1-24) моделировались ab initio. Полученная структура было визуализирована с помощью программы PyMOL и представлена в виде мономера (рис.3.37).

а б Рис. 3.37. 3D структурная модель PsSus1 (а) и AtSUS1 (б) мономера. CTD домен обозначен синим, EPBD домен – бирюзовым.

Предполагаемая структура Sus1 была сходна с таковой, описанной для AtSus1 (Zheng et al., 2011) и представляла собой трехлопастную структуру с основными доменами сахарозосинтаз: CTD (9-125а.о.), EPBD домен (155–274 а.о.), соединенные

115

линкерной последовательностью (126-154 а.о.), и GT-B гликозилтрансфераза с Rossmann-fold доменом (225-774 а.о.). При этом были выявлены некоторые различия, в основном в CTD доменах AtSus1 и PsSus1. На С – конце EPBD домена были выявлены 5 аминокислотных остатков (Leu-182, Arg-183, His-185, Leu-192, and Leu-194), образующие сайт связывания с ионом К+. Анализ экспрессии гена сахарозосинтазы у P.sativum. В настоящее время экспрессия генов сахарозосинтазы у бобовых изучена у ограниченного набора видов. Известно, что сахарозосинтаза играет ключевую роль в процессе азотфиксации в образовании клубеньков на корнях бобовых. Поэтому представлял интерес сравнить паттерны экспрессии гена сахарозосинтазы в различных органах у образцов P. sativum, охарактеризованных по уровню азотфиксации. В анализ были отобраны четыре образца P. sativum, из которых два имели низкий уровень симбиотической активности (№№3358 и 6883) и два – высокий (№№925 и 8571). В качестве референсного гена был использован ген актина, так как ранее была показана его стабильная экспрессия у P.sativum (Die et al., 2010). Методом РВ-ПЦР были получены паттерны экспрессии Sus1 в листе, цветке, плоде и корнях (рис.3.38).

образцы с низкой образцы с высокой симбиотической активностью симбиотической активностью Рис. 3.3 8. Паттерны экспрессии Sus1 в различных органах у образцов P. sativum, отличающихся уровнем симбиотической активности.

116

В целом ген сахарозосинтазы характеризовался достаточно высоким уровнем экспрессии. При этом было отмечено, что образцы с более низким уровнем симбиотической активности имели более высокий уровень экспрессии гена сахарозосинтазы. Таким образом, в результате проведенного анализа впервые были получены и охарактеризованы полные нуклеотидные последовательности гена Sus1 и соответствующие аминокислотные последовательности сахарозосинтазы у 34 образцов 13 видов трибы Fabeae. Впервые был охарактеризован уровень полиморфизма кодирующей последовательности генов сахарозосинтазы как для видов P. sativum и P. fulvum, так и для родов трибы Fabeae: Pisum, Lathyrus, Vicia, Vavilovia. Были идентифицированы и проанализированы все функционально значимые домены и их трансмембранные мотивы, характерные для сахарозосинтаз растений. Для четырех образцов P.sativum, характеризующихся различным уровнем симбиотической активности, были получены паттерны экспрессии и было показано, что образцы с более низким уровнем симбиотической активности характеризовались более высоким уровнем экспрессии.

117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ В ходе работы был проведен комплексный анализ полиморфизмаядерного и цитоплазматических геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. В результате проведенного мультилокусного AFLP анализа 26 образцов рода Pisum, включающего 16 образцов P. sativum (в том числе образцы спорного таксономического статуса transcaucasicum, elatius, abyssinicum, asiaticum) и 10 образцов P. fulvum, был показан достаточно высокий уровень полиморфизма. При этом значения внутривидовых генетических расстояний каждого из видов (P. sativum (0.069 - 0.336) и P.fulvum (0.004 – 0.037)) не превышали межвидовых значений GD (0.052 – 0.384), что поддерживает классификацию, согласно которой род состоит только из двух видов (P. sativum и P. fulvum), а образцы спорного таксономического статуса transcaucasicum, abyssinicum, elatius, asiaticum входят в состав P. sativum. Был проведен молекулярный анализ геномного полиморфизма 83 дикорастущих образцов P. sativum, охватывающие все эколого-географическое разнообразие гороха, представленного в ВИРе. Согласно данным мультилокусного AFLP анализа значения генетических расстояний дикорастущих образцов P. sativum составили 0.070-0.356. При этом проведенный кластерный анализ не выявил разделения образцов P.sativum на группы по их географическому происхождению и показал лишь выделение с низким уровнем достоверности некоторых образцов, преимущественно восточноазиатского происхождения. На дендрограмме не наблюдалась кластеризации образцов из регионов первичного центра происхождения гороха, что может говорить о многочисленных актах распространения биоразнообразия из первичных центров. Впервые была охарактеризована и оценена вариабельность адаптивно значимого семейства R-генов устойчивости гороха. Согласно данным RGA- маркирования вариабельность семейства R- генов у дикорастущих образцов P.sativum была достаточно высока (GD = 0.012-0.201) генетического разнообразия, детектированного методом AFLP анализа Кластерный анализ и анализ главных компонент на основе данных RGA маркирования также выявили наличие единой полиморфной группы образцов и отсутствие какой-либо корреляции с географическим происхождением или морфо-биологическими признаками.

118

В результате проведенного AFLP анализа впервые был исследован полиморфизм коллекции 66 культивируемых сортов и линий P. sativum отечественной и зарубежной селекции. Выявленные значения генетического разнообразия сортов и линий гороха (0.025 – 0.261) оказался в 1,5 раза ниже данного показателя у дикорастущих образцов из природных популяций (0.070 – 0.356). Проведенный анализ полиморфизма семейства генов устойчивости (RGA), также как и в случае AFLP анализа, выявил более низкий уровень генетических различий между сортами гороха (0.023-0.145) по сравнению с образцами из природных популяций. Также был проведен анализ полиморфизма отдельных участков как ядерного, так и цитоплазматических геномов рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. В результате проведения монолокусного анализа последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1-5.8S-ITS2) ядерного генома рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae был показан низкий уровень вариабельности данного участка как для рода Pisum, так и для видов P. sativum и P. fulvum. Впервые у P.sativum было выявлено 6 гаплотипов. Впервые был проведен анализ нуклеотидных последовательностей четырех участков (trnH-psbA, rpoB-trnC, trnY-trnE-trnT, ген trnL.) пластома рода Pisum и родственных видов трибы Fabeae. Было показано, что хлоропластный геном рода Pisum отличался более консервативными последовательностями данных участков по сравнению с другими представителями трибы. Было показано, что нуклеотидные последовательности проанализированных участков характеризуются различным уровнем полиморфизма у рода Pisum и других представителей трибы Fabeae, что, вероятно, связано с неравномерностью накопления мутаций в некодирующих участках. Наиболее консервативным оказался интрон гена trnL (18.71%), а наибольший уровень полиморфизма был показан для участка rpoB-trnC (37.9%). Впервые была определена вторичная структура интрона гена trnL (интрон группы I) видов трибы Fabeae. Были определены все функциональные участки и петли интрона гена trnL, показано наличие пяти типов строения вторичной структуры P6 петли. Показано, что виды одного рода имели различный тип строения петли P6. Впервые были определены первичные последовательности и вариабельности b/c интрона митохондриального гена nad1 (интрон группы II) у 69 образцов трибы Fabeae, в том числе 32 образцов рода Pisum. Определены последовательности всех шести

119

ключевых доменов, идентифицированы консервативные и полуконсервативные мотивы. Были выявлены наиболее полиморфные (домен II) и консервативные домены (домен VI) интрона у анализируемых видов Fabeae. Показана значительная консервативность (уровень полиморфизма составил около 4%) нуклеотидной последовательности и топологии вторичных структур b/c интрона у представителей рода Pisum. Впервые были получены и охарактеризованы полные нуклеотидные последовательности генов-гомологов Sus1 и соответствующие аминокислотные последовательности сахарозосинтазы у 34 образцов 13 видов трибы Fabeae. Был охарактеризован уровень полиморфизма кодирующей последовательности генов сахарозосинтазы как для видов P. sativum и P. fulvum, так и для родов Lathyrus, Vicia, Vavilovia. Были идентифицированы и проанализированы все функционально значимые домены и их трансмембранные мотивы, характерные для сахарозосинтаз растений. Впервые была определена предполагаемая третичная структура белка и охарактеризована ее структура. Анализ экспрессии гена сахарозосинтазы методом РВ- ПЦР в различных органах у образцов P.sativum с различным уровней симбиотической активности показал, что наиболее высокий уровень экспресии Sus1 был отмечен у образцов с низким уровнем симбиотической активности

120

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. Проведенный мультилокусный AFLP анализ межвидового полиморфизма 26 образцов рода Pisum, выявил достаточно высокий уровень вариабельности, при этом значения внутривидовых генетических расстояний каждого из видов (P.sativum (0.070- 0.336) и P.fulvum (0.004 – 0.037)) не превышали межвидовых значений (0.052 – 0.385), что поддерживает классификацию Р.Х Макашевой (1979), согласно которой род состоит из двух видов (P. sativum и P. fulvum), а анализируемые образцы спорного таксономического статуса transcaucasicum, abyssinicum, elatius, asiaticum входят в состав P. sativum. 2. Определены уровни внутривидового полиморфизма селективно- нейтральных и адаптивно-значимых участков генома 83 образцов из природных популяций различного эколого-географического происхождения, отобранных из коллекции ВИР им. Н.И.Вавилова и охватывающих природный и культигенный ареал и 66 культивируемых сортов P. sativum: - AFLP анализ селективно-нейтральных участков генома позволил выявить достаточно высокий уровень внутривидового полиморфизма дикорастущих образцов P.sativum (0.070-0.356) и сортов гороха посевного (0.025 – 0.261) отечественной и зарубежной селекции; - RGA анализ показал, что адаптивно-значимые участки генома, как у образцов из природных популяций P.sativum (0.012-0.201), так и у сортов (0.023-0.145), характеризуются более низким уровнем полиморфизма;

- показано отсутствие зависимости между кластеризацией образцов P.sativum, определенной по данным молекулярного мультилокусного AFLP- и RGA- анализа, и их географическим происхождением. Образцы из первичного центра происхождения располагались внутри единой полиморфной группы P.sativum. 3. Анализ последовательностей пяти участков цитоплазматических геномов 36 представителей рода Pisum, а также родственных видов трибы Fabeae, позволил оценить уровни вариабельности и выявить характерные видо- и родоспецифичные индели и замены. Показано, что самым консервативным из анализируемых участков является интрон гена trnL (18.71%), а наибольший уровень полиморфизма выявлен для спейсера rpoB-trnC (37.9%).

121

4. Определена возможная вторичная структура интрона b/c митохондриального гена nad1 (интрон группы II) и интрона пластомного гена trnL (интрон группы I). Выявленные SNP и индели не изменяли топологию вторичной структуры b/c интрона у анализируемых видов Fabeae. Показано наличие пяти типов вторичной структуры P6 петли интрона trnL, что явилось результатом точковых мутаций и инделей; виды родов Lathyrus и Vicia имели различные типы Р6 петли. 5. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности генов-гомологов сахарозосинтазы (Sus1) у 13 видов трибы Fabeae. Выявлены аллельные варианты кодирующей последовательности Sus1 генов видов P.sativum и P.fulvum. Были идентифицированы и проанализированы все функционально значимые домены и трансмембранные мотивы. Охарактеризована предположительная третичная структура белка. Анализ экспрессии гена сахарозосинтазы методом РВ-ПЦР в различных органах у образцов P.sativum с различным уровней симбиотической активности показал, что наиболее высокий уровень экспресии был отмечен у образцов с низким уровнем симбиотической активности.

122

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. – аминокислотне остатки

п.н. – пары нуклеотидов

ПЦР – полимеразная цепная реакция

РВ-ПЦР – полимеразная цепная реакция в реальном времени

AFLP – Amplified Fragment Length Polymorphism (полиморфизм длин амплифицированных фрагментов)

RAPD – Random Amplification of Polymorphic DNA (полиморфизм длин случайно амплифицированных фрагментов)

RFLP – Random Fragment Length Polymorphism (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов)

GD – Genetic Distance (генетические расстояния)

GS- Genetic Similarity (генетическое сходство)

RGA – Resistance Gene Analogs

R-гены – Resistance genes (гены устойчивости)

NBS – Nucleotide Binding Site (нуклеотид-связывающий домен)

LRR – Leucine-Rich Repeat (обогащенный лейцином повтор)

SNP – Single-Nucleotide Polymorphism (однонуклеотидный полиморфизм)

123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Борис К.В. Изучение внутривидового полиморфизма фрагмента гена сахарозосинтазы Sus4 картофеля (Solanum tuberosum) / К.В. Борис, Н.Н. Рыжова, Е.З. Кочиева // Генетика. – 2011. – Т. 47. – C. 190 – 198. 2. Борисов А. Ю. Выявление симбиотических генов гороха (Pisum sativum L.) с использованием экспериментального мутагенеза / А.Ю. Борисов, С. М. Розов, В. Е. Цыганов 1. и др. // Генетика. – 1994. – Т 30. – C. 1484–1494. 3. Борисов А.Ю. взаимодействие бобовых с полезными почвенными микроорганизмами: от генов растений к сортам. / А.Ю. Борисов, О.Ю. Штарк, В.А. Жуков, и др. Сельскохозяйственная Биология. – 2011. – № 3. – С. 41-47. 4. Борисов А.Ю. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 728. Горох (Симбиотическая эффективность) / А.Ю. Борисов, В.Е. Цыганов, О.Ю. Штарк, Л.М. Якоби, Т.С. Наумкина, В.П. Сердюк, М.А. Вишнякова // Под ред. И.А. Тихоновича, М.А. Вишняковой. – СПб, – 2002. – 30c. 5. Вишнякова М.А RAPD анализ видового полиморфизма рода чина Lathyrus L. Семейства Fabaceae Lind L. / М.А. Вишнякова, М.О. Бурляева, Н.В. Алпатьева, Ю.В. Чесноков // Вестник ВОГиС. – 2008. – Том 12. – № 4. – С. 595-607. 6. Говоров Л. И. Горох Культурная флора СССР // под ред. Е. В. Вульфа. – М., Л.: Сельхозгиз, – 1937. – Т. 4. – С. 229-236. 7. Дрозд А.М. Отдаленные скрещивания гороха / А.М. Дрозд //Тр. по прикл. ботанике, генетике и селекции, – 1965. – Т. 37. – В.2. – С. 130-146. 8. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи / П.М. Жуковский 2-е изд., перераб и доп. Л.:Колос. – 1964. – 791 с. 9. Жуковский П.М. Культурные растения и их сородичи /П.М. Жуковский. 3-е изд., перераб. и доп. – Д.: Колос. – 1971. – 752 с. 10. Лутков А. Н Межвидовые гибриды Pisum humile Boiss. × Pisum sativum L. / А. Н. Лутков // Тр. Всесоюз. съезда по генетике, селекции, семеноводству и племенному животноводству. Л.: Изд. Редколлегии съезда, – 1930. – Т. 2. – С. 353–367. 11. Макашева Р. Х. Основные морфологические и биологические особенности гороха / Р. Х. Макашева // Генетика и селекции гороха. – Новосибирск. – 1975. – С. 3- 36. 12. Макашева Р. Х. Горох / Р. Х. Макашева // Культурная флора СССР. Зерновые бобовые культуры. – Л.: Колос. – 1979. – Т. IV, ч. I. – 324 с. 13. Макашева Р. Х. Новые формы и разновидности у гороха посевного / Р. Х. Макашева // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. – 1962. – Т. 34. – С. 77 -85.

124

14. Потокина, Е.К. К вопросу о происхождении возделываемых бобов и внутривидовом разнообразии Vicia faba L. по результатам молекулярного маркирования генома / Е.К. Потокина, С.В. Булынцев, Н. Томоока, Д. Воган // Сельскохозяйственная биология. – 2008. – № 3. – С. 48 – 57. 15. Рыжова Н. Н. Структурные особенности интрона гена rps16 у представителей Allium sativum и родственных видов Allium / Н. Н. Рыжова, О. А. Холда, Е. З. Кочиева // Молекулярная биология. – 2009. – Т. 43. – № 5. – С. 1–11. 16. Сидорова К. К. Взаимодействие двух симбиотических генов nod3 И Nod5 в одном генотипе гороха Pisum sativum L. / К. К. Сидорова, академик В. К. Шумный, Е. Ю. Власова, М. Н. Гляненко, Т. М. Мищенко. // Доклады академии наук. – 2008. – Т. 419. – № 4. – С. 569-571. 17. Слугина М. А. Внутривидовой полиморфизм генов сахарозосинтазы картофеля сортов российской и казахстанской селекции. / М. А. Слугина, К. В. Борис, А. A. Какимжанова, Е. З. Кочиева // Генетика. – 2014. – т. 50. – № 6. – С. 677-682. 18. Станкевич А. К. Культурная флора. Вика / А. К. Станкевич, С. И. Репьев; Под ред. С. И. Репьева. – СПб.: ГНЦ-ВИР, – 1999. – Т. 4. – 491 с. 19. Федотов В.С. Отдаленная гибридизация в трибе виковых семейства бобовых / B.C. Федотов // Бюл. Бот. Сада, – 1964. – Вып. 53. -– С. 23-27. 20. Федотов, В.С. Горох / В.С.Федотов. – М.: Сельхозгиз, – 1960 – 259с. 21. Alefeld F. Landwirtschaftliche Flora / F. Alefeld // Berlin. – 1866. – P. 319-322. 22. Aleman L. Nodule-enhanced expression of a sucrose phosphate synthase gene member (MsSPSA) has a role in carbon and nitrogen metabolism in the nodules of alfalfa (Medicago sativaL.) / L. Aleman, J.L. Ortega, M. Martinez-Grimes, M. Seger, F. O. Holguin. D. J Uribe, D. Garcia- Ibilcieta, C. Sengupta-Gopalan.// Planta. – 2010. – V. 231. – P. 233-244. 23. Asmussen C.B. Chloroplast DNA characters, phylogeny, and classification of Lathyrus (Fabaceae) / C.B. Asmussen, A. Liston // Amer. J. Bot. – 1998. – V. 85. – P. 387–401. 24. Aubert G. Functional mapping in pea, as an aid to the candidate gene selection and for investigating synteny with the model legume Medicago truncatula / G. Aubert, J. Morin, F. Jacquin, K.Loridon, M.C.Quillet, A. Petit, C. Rameau, I. Lejeune-Hénaut, T. Huguet, J. Burstin // Theor. Appl. Genet. – 2006. – V.112 – P.1024–1041. 25. Bakker F.T. Mitocondrial and chloroplast DNA-based phylogeny of Pelargonium (Geraniaceae) / F.T. Bakker, A.Culham, C. E.Pankhurst, M.Gibby // American Journal of Botany. – 2000. – V. 87. – № 4. – P. 727 –734.

125

26. Baranger A. Genetic diversity within Pisum sativum using protein and PCR-based markers / A. Baranger, G. Aubert, G. Arnau, A. L. Lain, G. Deniot, J. Potier, C. Weinachter, I. Lejeune-Hnaut, J. Lallemand, J. Burstin // Theor Appl Genet. – 2004. – V. 108. – P. 1309–1321. 27. Barilli E. Characterization of resistance response of pea (Pisum spp.) against rust (Uromyces pisi) / E. Barilli, J.C. Sillero, A. Moral, D. Rubiales // Plant Breeding. – 2009. – V. 128. – P.665-670. 28. Barilli E. Mapping of quantitative trait loci controlling partial resistance against rust incited by Uromyces pisi (Pers.) Wint. in a Pisum fulvum L. intraspecific cross. / E. Barilli, Z. Satovic, D. Rubiales, A.M. Torres // Euphytica. – 2010. – V. 175 – P.151-159. 29. Barneby R. C. A new species of Lathyrus (Fabaceae) from the Death Valley region of California, Nevada. / R. C. Barneby, J. L. Reveal // Aliso. – 1971. – V. 7. – P. 361– 364. 30. Barratt D.H.P. Multiple, distinct isoforms of sucrose synthase in pea. / D.H.P Barratt, L. Barber, N.J. Kruger, A.M. Smith, T.L. Wang, C. Martin // Plant Physiol. – 2001. – V. 127. – P. 655–664. 31. Baud S. Structure and expression profile of the sucrose synthase multigene family in Arabidopsis. / S. Baud, M-N. Vaultier, C. Rochat. // Journal of Experimental Botany. – 2004. – V. 55. – №. 396. – P. 397-409. 32. Ben-Ze’ev N. Species relationship in the genus Pisum L. / N. Ben-Ze’ev , D. Zohary // Israel Journal of Botany. – 1973. – V. 22. – P. 73–91. 33. Bi C. The complete mitochondrial genome of Medicago truncatula. / C. Bi, X. Wang, Y. Xu, S. Wei, Y. Shi, X. Dai, T. Yin & N. Ye. // Mitochondrial DNA Part B: Resources. – 2016. – V. 1. – № 1. – P. 122–123. 34. Bogdanova V. S. Phenotypic effect of substitution of allelic variants for a histone H1 subtype specific for growing tissues in the garden pea (Pisum sativum L.) / V.S. Bogdanova O.E. Kosterin, V.A. Berdnikov // Genetica. – 2007. – V.130. – P. 61-72. 35. Bologa K.L. A bypass of sucrose synthase leads to low internal oxygen and impaired metabolic performance in growing potato tubers. / K.L. Bologa, A.R. Fernie, A. Leisse, M.E. Loureiro, P. Geigenberger // Plant Physiol. – 2003. – 132. – № 4. – P. 2058-72. 36. Bordat, A. Translational genomics in legumes allowed placing in silico 5460 unigenes on the pea functional map and identified candidate genes in Pisum sativum L. / A. Bordat, V. Savois, M. Nicolas, J. Salse, A. Chauveau, M. Bourgeois, J. Potier, H. Houtin, C. Rond, F. Murat, et al.// G3. Genes-Genomes-Genetics. – 2011. – V 2. – P 93–103.

126

37. Borsch T. Noncoding plastid trnT-trnF sequences reveal a well resolved phylogeny of basal angiosperms / T.Borsch, KW Hilu, D Quandt., V Wilde, C.Neinhuis, W.Barthlott // J. Evol. Biol. – 2003. – V. 16. – P. 558–576. 38. Carrillo E. Characterization of mechanisms of resistance against Didymella pinodes in Pisum spp. / E. Carrillo, D. Rubiales, A. Pérez-de-Luque, S. Fondevilla // Eur. J. Plant Pathol. – 2013. – V.135. – P.761-769. 39. Carvalho A. Full-lengthde novoassembly of RNA-seq data in pea (Pisum sativumL.) provides a gene expression atlas and gives insights into root nodulation in this species. / A. Carvalho, G. Aubert1, S. Carrere, C. Cruaud, A-L Brochot, F. Jacquin1, A. Klein, C. Martin, K. Boucherot, J. Kreplak, C. da Silva, S. Moreau, P. Gamas, P. Wincker, J. Gouzy and J. Burstin. // Susete The Plant Journal. – 2015. – V. 84. – P. 1–19. 40. Chaeyoung L. Reconstruction of a composite comparative map composed of ten legume genomes. / L. Chaeyoung, Y. Dongwoon, C. Hong-Kyu // Genes Genom. – 2017. – V. 39. – P.111–119. 41. Chang S. The Mitochondrial Genome of Soybean Reveals Complex Genome Structures and Gene Evolution at Intercellular and Phylogenetic Levels. / S Chang, Y Wang, J Lu, J Gai, J. Li, P. Chu, R. Guan, T. Zhao // PLoS ONE. – 2013 – V. 8(2). 42. Chavanne F. Structure and evolution of Cyclops: A novel giant retrotransposon of the Ty3/Gypsy family highly amplified in pea and other legume species. / Chavanne, F. Zhang, D.X. Liaud, M.F. Cerff, R. // Plant Mol. Biol. – 1998. – 37. – 363–375. 43. Choi B-H. Phylogenetic significance of stylar features in genus Vicia (Leguminosae): an analysis with molecular phylogeny / B-H. Choi, D-I. Seok, Y. Endo, H. Ohashi.// J Plant Res – 2006 – V.119 – P. 513–523. 44. Choi, H.K. Development of nuclear gene-derived molecular markers linked to legume genetic maps. / H.K. Choi, M.A. Luckow, J.Doyle, D.R. Cook // Mol. Genet. Genomics – 2006. –V. 276. – P. 56–70. 45. Choudhury P.R. Identification and detection of genetic relatedness among important varieties of pea (Pisum sativum L.) grow in India. / P.R. Choudhury, H. Tanveer, G.P. Dixit // Genetica. – 2007. – Р. 183-191. 46. Christensen S. AFLP analysis of genetic diversity in leafy kale (Brassica oleracea L. convar. acephala (DC.) Alef.) landraces, cultivars and wild populations in Europe / S. Christensen, R. von Bothmer, G. Poulsen, L. Maggioni, M. Phillip, B. A. Andersen, R. B. Jørgensen. // Genet Resour Crop Evol. – 2011. – 58: – Р. 657–666. 47. Cieslarová J. Molecular Analysis of Temporal Genetic Structuring in Pea (Pisum sativum L.) Cultivars Bred in the Czech Republic and in Former Czechoslovakia Since the Mid-20 th

127

Century. / J. Cieslarová, M. Hýbl, M. Griga and P. Smýkal. // Czech J. Genet. Plant Breed. – 2012. –V 48. – №2. – P. 61–73. 48. Cieslarova J. Molecular evidence of genetic diversity changes in pea (Pisum sativum L.) germplasm after long-term maintenance. / J. Cieslarova, P. Smy´kal, Z. Docˇkalova, P. Hana´cˇek, S. Procha´zka, M. Hy´bl, M. Griga.// Genet Resour Crop Evol. – 2011. – V. 58– P. 439–451. 49. Clemente, A. The anti-proliferative effect of TI1B, a major Bowman-Birk isoinhibitor from pea (Pisum sativum L.), on HT29 colon cancer cells is mediated through protease inhibition/ A. Clemente, M. Carmen Marín-Manzano, E. Jiménez, M. Carmen Arques and C. Domoney. Br. // J. Nutr. – 2012. – V. 108 – P.135–144. 50. Coleman H.D. Altered sucrose metabolism impacts plant biomass production and flower development. / H.D. Coleman, L. Beamish, A. Reid, J.Y. Park, S.D. Mansfield. // Transgenic Res. – 2010 – V.19 – № 2 – P. 269-83. 51. Coyne, C.J. Genetic Adjustment to Changing Climates: Pea. / C.J. Coyne, R.J. McGee, R.J. Redden, M.J. Ambrose, B.J. Furman, C.A. Miles // In Crop Adaptation to Climate Change Edited by Yadav, S.S., Redden, R.J., Hatfield, J.L., Lotze-Campen, H., Hall, A.E., Eds. Wiley Blackwell. – Chichester. –U.K. – 2011.– P. 238–250. 52. Craig J. Mutations at the rug4 locus alter the carbon and nitrogen metabolism of pea plants through an effect on sucrose synthase. / J. Craig, P. Barratt, H. Tatge, A. Dejardin, L. Handley, C.D. Gardner, L. Barber, T. Wang, C. Hedley, C. Martin, et al. // Plant J. – 1999 – V.17. – P. 353– 362. 53. Cupic T. Genetic diversity of pea (Pisum sativum L.) genotypes assessed by pedigree, morphological and molecular data / T. Cupic, M. Tucak, S. Popovic, S. Bolaric, S. Grljusic and V. Kozumplik. // Journal of Food, Agriculture & Environment – 2009– V.7 (3&4) – P. 343-348. 54. Dahl W. J. Review on the health benefits of peas (Pisum sativum L) / W. J. Dahl, L. M. Foster, R. T. Tyler // Br. J. Nutr. – 2012. – V.108 – P.3–10. 55. Daniell H. Chang Chloroplast genomes: diversity, evolution, and applications in genetic engineering. / H. Daniell, C-S. Lin, M. Yu, and W-J. // Genome Biology. – 2016– V. 17. -.P. 134-144. 56. Demesure, B. A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants / B. Demesure, N. Sodzi, R.J. Petit // Mol. Ecol. – 1995. – V. 4. – P. 129-131. 57. Dicorato W. Histone H1 during germination of pea seeds: an analysis by electrophoretic and immunofluorimetric methods. / W. Dicorato, C. Savini, M. Bracale, S. Sgorbati and M. G. Galli. // Journal of Experimental Botany. – 1995– V. 46. – № 293. – P. 1895-1903.

128

58. Die JV. Evaluation of candidate reference genes for expression studies in Pisum sativum under different experimental conditions. / JV Die, B Roman, S Nadal, CI Gonzalez-Verdejo // Planta – 2010. – V. 232 – P.145–153. 59. Doyle J.J. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue / J.J. Doyle, J.L. Doyle // Phytochem. Bull. – 1987. – V. 19. – P. 11-15. 60. Duarte J. Transcriptome sequencing for high throughput SNP development and genetic mapping in pea. / J. Duarte, N. Rivière, A. Baranger, G. Aubert, J. Burstin, L. Cornet, C. Lavaud, I. Lejeune-Hénaut, J-P Martinant, J-P Pichon, M-L Pilet-Nayel and G. Boutet. // BMC Genomics. – 2014. – V. 15 – P. 126-134. 61. Duff R.J. Phylogenetic relationships of land plants using mitochondrial small-subunit rDNA sequenses. / R.J. Duff, D.L. Nickrent // Ibid. – 1999. – V. 86 – P. 372-386. 62. Edwards, K. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis / K. Edwards, C. Johnstone, C. Thompson // Nucleic Acids Res. – 1991. – V. 19. – №6. – P. 1349. 63. Ellis, T.H.N. Polymorphism of insertion sites of Ty1-copiaclass retrotransposons and its use for linkage and diversity analysis in pea. / T.H.N. Ellis, S.J. Poyser, M.R. Knox, A.V. Vershinin, M.J. Ambrose // Mol. Gen. Genet. -1998. – V. 260. – P. 9–19. 64. Endo, Y. The pollen morphology of Vicia L. (Leguminosae). / Y. Endo, H. Ohashi // American Journal of Botany. – 1996.– V. 83. – № 8. – P. 955-960. 65. Errico A. Karyotype studies on Pisum fulvum and Pisum sativum , using a chromosome image analysis system / A. Errico, C. Conicella, G. Venora // Genom. – 1991. – V. – 34. – P. 105-108. 66. Feldberg, K. A phylogeny of Cephaloziaceae (Jungermanniopsida) based on nuclear and chloroplast DNA markers / K Feldberg, J.Vána, J.Krusche, J. Kretschmann, S. D. F. Patzak, O. A. Pérez-Escobar, N. R. Rudolf, N. Seefelder, A. Schäfer-Verwimp, D. G. Long, H. Schneider, J. Heinrichs // Organisms Diversity Evol.. – 2016– V. 16. – P. 727–742. 67. Feliner N Better the devil you know? Guidelines for insightful utilization of nrDNA ITS in species-level evolutionary studies in plants. / N. Feliner, G. & J.A. Rosselló // Molecular Phylogenetics and Evolution – 2007 – V. 44 – P. 911-919. 68. Feulner M. Floral scent and its correlation with AFLP data in Sorbus. / M. Feulner, S. Pointner, L. Heuss, G. Aas, J. Paule, S. Dötterl // Org Divers Evol – 2014 – V. 14– P. 339–348 69. Fondevilla S. Identification of a New Gene for Resistance to Powdery Mildew in Pisum fulvum, a Wild Relative of Pea. / S. Fondevilla, A.M. Torres, M.T. Moreno, D. Rubiales // Breeding Science. – 2007b – V. 57 – P. 181-184.

129

70. Fondevilla, S. Identification of genes differentially expressed ina resistant reaction to Mycosphaerella pinodesin pea using microarray technology. / S. Fondevilla, H. Küster, F. Krajinski, J.I. Cubero, D. Rubiales // BMC Genomics – 2011. – V. 12. – Р. 12-28. 71. Franssen S.U. Comprehensive transcriptome analysis of the highly complex Pisum sativum genome using next generation sequencing. / S.U. Franssen, R.P. Shrestha, A. Brautigam, E. Bornberg-Bauer, A.P.M. Weber. // BMC Genomics. – 2011 – V. 12 – P. 227. 72. Freudenstein J. V. Analysis of mitochondrial nad1b-c intron sequences in Orchidaceae: utility and coding of length change characters / J. V. Freudenstein, M. W. Chase // Systematic Botany. – 2001. – V. – 26. – P. 643–657. 73. Gao J-P. Toward Understanding Molecular Mechanisms of Abiotic Stress Responses in Rice. / J-P. Gao, D-Y. Chao, H-X. Lin. // Rice – 2008) – 1: – Р. 36–51. 74. Ghulam M. Karyotype Analysis of Pisum sativum L. / M. Ghulam, A. Naseer And S. A. Majid. // INternational Journal Of Agriculture & Biology Vol. 7, №. 1, 2005, – 118-120. 75. Gielly L. Phylogenetic use of noncoding regions in the genus Gentiana L.: chloroplast trnL (UAA) intron versus nuclear ribosomal internal transcribed spacer sequences / L.Gielly, Y.-M. Yuan, P. Kupfer, P.Taberlet // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. V. 5. №. 3. P. 460–466. 76. Gunn C. Androecium and pistil characters for the tribe Vicieae (Fabaceae) / Gunn C. R., Kluve J. // Taxon. — 1976. — Vol. 25. — P. 563–575. 77. Hagenblad J. Genetic diversity in local cultivars of garden pea (Pisum sativum L.) conserved on farm and in historical collections. / J. Hagenblad, E. Bostrom, L. Nygards and M. Leino. Genetic Resources and Crop Evolution. – 2014. – V. 61. – №2. – P. 413-422. 78. Harada T. Expression of sucrose synthase genes involved in enhanced elongation of pondweed (Potamogeton distinctus) turions under anoxia. / T. Harada, S. Satoh, T. Yoshioka, K. Ishizawa.// Ann. Botany. – 2005.– V. 96. – P. 683–692. 79. Haugen P. The natural history of group I introns / P Haugen, D Simon, D Bhattacharya // Trends Genet. – 2005. – V. 21. – P. 111-119. 80. Hiesel R. Plant mitochondrial nucleic acid sequences as a tool for phylogenetic analysis. / R.Hiesel, A.Von Haeseler A. Brennicke // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1994. – V. 91 – P. 634- 638. 81. Hoey B. K. A phylogenetic analysis of Pisum based on morphological characters, and allozyme and RAPD markers. / B. K. Hoey K.R. Crowe, V.M. Jones, N. O. Polans. // Theor Appl Genet . – 1996. – V. 92– P. 92-100. 82. Horst I. TILLING mutants of Lotus japonicusreveal that nitrogen assimilation and fixation can occur in the absence of nodule enhanced sucrose synthase. / I.Horst, T.Welham, S.

130

Kelly, T. Kaneko, S. Sato, S. Tabata, M. Parniske, T.L. Wang. // Plant Physiol. – 2007. – V. 144. – P. 806–820. 83. Humphries C.J. Cladistic Biogeography: Interpreting Patterns of Plant and Animal Distributions / C.J. Humphries, L.R. Parenti// 2nd edn. Oxford University Press, Oxford. . – 1999 84. Jaaska V. Isoenzyme diversity and phylogenetic affinities in Vicia subgenus Vicia (Fabaceae). / V. Jaaska. // Genetic Resources and Crop Evolution. – 1997. – V. 44. – № 6. – P. 557- 574. 85. Jaaska, VIsozyme variation and phylogenetic relationships in Vicia subgenus Cracca (Fabaceae). / V. Jaaska // Annals of Botany. – 2005– V. 96. – N 6. – P. 1085-1096. 86. Jaccard, P. Nouvelles researches sur la distribution florale / Jaccard P. // Bull. Soc. Vaudoise Sci. Natl.. – 1908. – V. 44 – P. 223-270. 87. Jiang Q. The wheat (T. aestivum) sucrose synthase 2 gene (TaSus2) active in endosperm development is associated with yield traits / Q. Jiang, J. Hou, C. Hao, et al. // Functional & Integrative Genomics. – 2011. – V. 11. – P. 49 – 61. 88. Jing R. Genetic diversity in European Pisum germplasm collections / R. Jing, M.A. Ambrose, M.R. Knox, et al. // Theor. App. Genet. – 2012. – V. 125. – № 2. – P. 367–380. 89. Jing R. The genetic diversity and evolution of field pea (Pisum) studied by high throughput retrotransposon based insertion polymorphism (RBIP) marker analysis. / R. Jing, A. Vershinin, J. Grzebyta, P. Shaw, P. Smýkal, D. Marshall, M.J. Ambrose, T.H.N. Ellis, A.J. Flavell // BMC Evol. Biol. – 2010. – V. 10. – P. 44 90. Kalo P. Comparative mapping between Medicago sativa and Pisum sativum. / P. Kalo, A. Seres, S.A. Taylor, J .Jaka, Z.A. Kevei, G.E. Kereszt, T.H.N. Ellis, G.B. Kiss // Mol. Genet. Genomics – 2004. – V.272. – P. 235-246. 91. Kaur S. Transcriptome sequencing of field pea and faba bean for discovery and validation of SSR genetic markers. / S. Kaur, L. Pembleton, N. Cogan, K. Savin, T. Leonforte, J. Paull, et al. // BMC Genomics. – 2012– V.13– №1. – P. 104. 92. Kelchner S. A. Group II introns as phylogenetic tools: structure, function and evolutionary constraints / S. A. Kelchner // American Journal of Botany. – 2002. – V. 89. – P. 1651– 1669. 93. Kelley L.A. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. / L.A. Kelley, S. Mezulis, C.M. Yates, M.N. Wass, M.J. Sternberg.// Nat Protoc .– 2015. – V.10 – №6 – P. 845–858. 94. Keneni G. Extent and pattern of genetic diversity for morpho-agronomic traits in Ethiopian highland pulse landraces: I. Field pea (Pisum sativum L.). / G. Keneni, M. Jarso, T. Wolabu, G. Dino. Genet. Resour. Crop Evol. – 2005. – V. 52 – P. 539-549.

131

95. Kerr S.C. De novo transcriptome assembly reveals high transcriptional complexity in Pisum sativum axillary buds and shows rapid changes in expression of diurnally regulated genes / S.C. Kerr, F. Gaiti, C.A. Beveridge, M. Tanurdzicr // BMC Genomics. – 2017. – V. 18. – P. 221. 96. Khadivi-Khub, A. Nuclear and chloroplast DNA variability and phylogeny of Iranian apples (Malus domestica) / A. Khadivi-Khub, S. Jahangirzadeh, E. Ahadi, et al. Plant Syst Evol – 2014. – V 300. – №8. – P. 1803–1817. 97. Khalik K. N. A. Taxonomic relationships in some Vicia species from Egypt, based on seed morphology and SDS-PAGE of seed proteins. / K. N. A. Khalik and I. H. Al-Gohary.// Acta Scientiarum. Biological Sciences – 2013– V. 35. – № 4. – P. 603-611. 98. Kitazaki K Cost of having the largest mitochondrial genome: evolutionary mechanism of plant mitochondrial genome. / K. Kitazaki, T. Kubo // J. Bot. – 2010. – Р. 1–13. 99. Koch, KSucrose metabolism: regulatory mechanisms and pivotal roles in sugar sensing and plant development. / K.Koch // Curr. Opin. Plant Biol. – 2004. – V. 7. - № 3. – P 235– 246. 100. Komatsu A. Analysis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships. / A Komatsu, T. Moriguchi, K. Koyama, M. Omura, T. Akihama. Journal of Experimental Botany – 2002. –V. 53. –Р. 61–71. 101. Kress W. J. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. / W. J. Kress, K. J. Wurdack, E. A. Zimmer, L. A. Weigt, D. H. Janzen.// PNAS. – 2005. – V. 102 – № 23 – P. 8369– 8374. 102. Krusell, L. The Clavata2 genes of pea and Lotus japonicus affect autoregulation of nodulation / L. Krusell, N. Sato, I. Fukuhara, B.E.V. Koch, C. Grossmann, S. Okamoto, E. Oka-Kira, Y. Otsubo, G. Aubert, T. Nakagawa, S. Sato, S. Tabata, G. Duc, M. Parniske, T.L. Wang, M. Kawaguchi, J. Stougaard // The Plant Journal – 2011. -V. 65, № 6 – P. 861-871. 103. Kubo T. Organization and variation of angiosperm mitochondrial genome. / T. Kubo and T. Mikami // Physiol. Plant . – 2007. – V.129. – P. 6–13. 104. Kumari P. Genetic diversity studies in pea (Pisum sativum L.) using simple sequence repeat markers. / P. Kumari, N. Basal, A.K. Singh, V.P. Rai, C.P. Srivastava and P.K. Singh. // Genet. Mol. Res. – 2013 – V.12. - № 3. – P. 3540-3550. 105. Kupicha F. K. The infrageneric structure of Lathyrus L. / F. K. Kupicha // Notes from the Royal Botanic Garden. — Edinburg. – 1983. — V. 41. – № 2. — P. 209–244. 106. Kupicha F. K. The infrageneric structure of Vicia. / F. K. Kupicha // Notes from the Royal Botanic Garden. — Edinburg. — 1976. — V. 34. - № 3. — P. 287-326. 107. Kwon S-J. Genetic diversity, population structure and genome-wide marker-trait association analysis emphasizing seed nutrients of the USDA pea (Pisum sativumL.) core collection. /

132

S-J. Kwon A.F. Brown, J. Hu, R. McGee, C. Watt, T. Kisha, G. Timmerman-Vaughan, M. Grusak, K.E. McPhee, C.J. Coyne. Genes & Genomics – 2012a – V.34 – P. 305-320. 108. Kwon, S.J. Population Genetic Sub-structure within the USDA ARS Pisum Core Collection and Its Potential as a Platformfor Association Mapping. / S.J. Kwon, A.F. Brown, J. Hu, R.J. McGee, C.A. Watt, T. Kisha, G.M. Timmerman-Vaughan, C.J Coyne // In Proceedings of the Plant & Animal Genomes XV Conference, San Diego, CA, USA, – 13–17 January –2012b. 109. Lairson L. L. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms / L. L. Lirson, B.Henrissat, G. J.Davies, S. G.Withers // Annu. Rev. Biochem. – 2008. – V. 77 – P. 521- 555. 110. Lamprecht H. Pisum fulvum Sibth. et Sm. genanalytische Studien zur Artberechtigung / H. Lamprecht // "Agri Hortigue Genetica". – 1961. – Bd. 19. – P. 269-297. 111. Leht, M. Cladistic and phenetic analysis of relationships in Vicia subgenus Cracca (Fabaceae) based on morphological data. / M. Leht // Taxon. – 2005. – V. 54. – № 4. – P. 1023-1032. 112. Leht, M. Cladistic and phenetic analysis of relationships in Vicia subgenus Vicia (Fabaceae) by morphology and isozymes. / M. Leht, V. Jaaska // Plant Systematics and Evolution. – 2002. – V. 232. – № 3-4. – P. 237-260. 113. Leht, M. Phylogeny of Vicia (Fabaceae) based on morphological data. / M. Leht// Feddes Repertorium. – 2009 – V. 120. – № 7/8. – P. 379-393. 114. Liu N. Comparative Transcriptomic Analyses of Vegetable and Grain Pea (Pisum sativum L.) Seed Development. / N. Liu, G. Zhang, S. Xu, W. Mao, Q. Hu, Y. Gong. // Frontiers in Plant Science. 2015 V. 6 – P. 1039. 115. Macas J. In Depth Characterization of Repetitive DNA in 23 Plant Genomes Reveals Sources of Genome Size Variation in the Legume Tribe Fabeae. / J. Macas, P. Novák, J. Pellicer, J. Čížková, A. Koblížková, P. Neumann, et al.// PLoS ONE – 2015– V. 8. - P. 427. 116. Macas J. Characterization of Stowaway MITEs in pea (Pisum sativum L.) and identification of their potential master elements. / J. Macas, A. Koblízková, P. Neumann // Genome – 2005. – V. 48. – P.831–839. 117. Macas J. Hypervariable 3´UTR region of plant LTR-retrotransposons as a source of novel satellite repeats. / J. Macas, A. Koblízková, A. Navrátilová, P. Neumann Gene – 2009. – V. 448. – P.198–206. 118. Macas J. Ogre elements—A distinct group of plant Ty3/gypsy-like retrotransposons. / J. Macas, P. Neumann // Gene – 2007b. – V.390. – P.108–116. 119. Macas J. Repetitive DNA in the pea (Pisum sativum L.) genome: Comprehensive characterization using 454 sequencing and comparison to soybean and Medicago truncatula. / J. Macas, P. Neumann, A. Navrátilová // BMC Genomics – 2007. – V. 8. – P. 427

133

120. Magee AM. Localized hypermutation and associated gene losses in legume chloroplast genomes. / AM Magee, S Aspinall, DW Rice, BP Cusack, M Sémon, AS Perry, S Stefanović, D Milbourne, S Barth, JD Palmer, JC Gray, TA Kavanagh, KH Wolfe // Genome Res. – 2010 – V. 20. 121. Martin-Sanz, A. Genetic diversity among Spanish pea (Pisum sativum L.) landraces, pea cultivars and the World Pisum sp. core collection assessed by retrotransposon-based insertion polymorphisms (RBIPs). / A. Martin-Sanz, C. Caminero, R. Jing, A. J. Flavell, M.Perez de la Vega // Spanish J. Agric. Res. – 2011 – V.9 – P. 166-178. 122. Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. subgenus Vicia (Leguminosae, Vicieae). / N. Maxted // Botanical Journal of the Linnean Society. – 1993.– V. 111. – № 2, –P. 155- 182. 123. Maxted N. A phenetic investigation of Vicia L. section Peregrinae Kupicha (Leguminosae, Papilionoideae, Vicieae). / N. Maxted // Edinburgh Journa l of Botany. – 1994. –V. 51, –N. 1. – P. 75-97. 124. Maxted, N. A global approach to crop wild relative conservation: Securing the gene pool for food and agriculture. / N. Maxted, S. Kell, A Toledo, E. Dulloo, V. Heywood, T. Hodgkin, D. Hunter, L. Guarino, A. Jarvis, B.Ford-Lloyd // Kew Bull. – 2010. – V. 65. – P. 561–576. 125. Maxted, N. A phenetic investigation of Vicia section Hypechusa (ALEF). Aschers & Graebner (Leguminosae, Papilionoideae, Vicieae). / N. Maxted, C. Douglas // Lagascalia. – 1997. – V. 19, –N. 1-2. – P. 345-370. 126. Megersa, M. The use of indigenous plant species for drinking water treatment in developing countries: A review. / M. Megersa, A. Beyene, A. Ambelu & B. Woldeab. // Journal of Biodiversity and Environmental Sciences. – 2014. – V.5. - №3. – P. 269–281. 127. Menancio-Hautea D. Comparative genome analysis of mungbean (Vigna radiata(L.) Wilczek) and cowpea (V. unguiculata (L.) Walpers) using RFLP mapping data. / D. Menancio- Hautea, CA Fatokum, Kumar L, D Danesh, ND Young // Theor Appl Genet. – 1993. –V 86. – P. 797–810. 128. Michel F. Comparative and functional anatomy of group II catalytic introns a review / F.Michel, K.Umesono, H.Ozeki // Gene. – 1989. – V. 82. - P. 5–30. 129. Mirali, N. Genetic diversity and relationships in some Vicia species as determined by SDS-PAGE of seed proteins. / N. Mirali, S. El- Khouri, F. Rizq // Biologia Plantarum. – 2007.–V. 51. –№ 4. – P. 660-666. 130. Murray M.G. Ancient repeated sequences in the pea and mung bean genomes and implications for genome evolution. / M.G. Murray, D.L. Peters, W.F. Thompson // J. Mol. Evol. – 1981. – V.17. – P.31–42.

134

131. Murray M.G. DNA sequence organization in the pea genome. / M.G. Murray, R.E. Cuellar, W.F. Thompson // Biochemistry – 1978. – 17. – 5781–5790. 132. Negruk V. Mitochondrial Genome Sequence of the Legume Vicia faba. / Negruk V. // Front Plant Sci. – 2013 – V.7. – №4 – P.128. 133. Nei, M. and W. Li, Mathematical model for studing genetic variation in terms of restriction endonucleases./ Nei, M. and W. Li // Proc. Natl. Acad. Sci., – 1979. – № 79. – P. 5269- 5273. 134. Neumann P. Highly abundant pea LTR retrotransposon Ogre is constitutively transcribed and partially spliced. / P. Neumann, D. Pozárková, J. Macas // Plant Mol. Biol. – 2003. – V.53. – P. 399–410. 135. Neumann P. Significant expansion of Vicia pannonica genome size mediated by amplification of a single type of giant retroelement. / P. Neumann, A. Koblízková, A. Navrátilová, J. Macas // Genetics – 2006. – V. 173. – P. 1047–1056. 136. Neumann, P. Chromosome sorting and PCR-based physical mapping in pea (Pisum sativum L.). / P. Neumann, D. Pozárková, J. Vrána, J. Dolezel, J. Macas // Chromosome Res. – 2002. –V. 10. –P. 63–71. 137. Neumann, P. Molecular and cytogenetic analysis of repetitive DNA in pea (Pisum sativum L.). / P. Neumann, M. Nouzová, J. Macas // Genome – 2001. – V. 44. – P. 716–728. 138. Neumann, P. PIGY: A new plant envelope-class LTR retrotransposon. Mol. Genet. / P. Neumann, D. Pozárková, A. Koblízková, J. Macas // Genomics– 2005. – V. 273. – P. 43–53. 139. Novák, P. Graph-based clustering and characterization of repetitive sequences in next- generation sequencing data / P. Novák, P. Neumann, J. Macas // BMC Bioinformatics.–2010.–V. 11. 140. Oskoueiyan R. Phylogenetic status of Vavilovia formosa (Fabaceae-Fabeae) based on nrDNA ITS and cpDNA sequences / R. Oskoueiyan, S.K. Osaloo, A.A. Maassoumi, T. Nejadsattari, V. Mozaffarian // Biochem. Syst. Ecol. – 2010. – V. 38. – P. 313–319. 141. Palmer J.D Chloroplast DNA variation and evolution in Pisum: patterns of change and phylogenetic analysis. / J.D. Palmer, R.A. Jorgensen, W.F. Thompson // Genetics. – 1985 – V. 109. – P. 195 – 213. 142. Poczai P. Development of intron-targeting (IT) markers for potato and cross- species amplification in Solanum nigrum (Solanaceae). / P Poczai, I Cernak, AM Gorji, S Nagy, J Taller, Polgar J // Amer J Bot – 2010. – V. 97. - P. 142–145 143. Posada D. Crandall. MODELTEST: testing the model of DNA substitution. / D. Posada, KA. // Bioinformatics. – 1998. – V. 14. №9. – P. 817-828.

135

144. Pradhan S. Global transcriptome analysis of developing chickpea (Cicer arietinum L.) seeds. / S. Pradhan, N. Bandhiwal, N. Shah, C. Kant, R. Gaur, S. Bhatia // Front. Plant Sci. – 2014. – V. 5. – P. 698. 145. Qiu Y.L. The gain of three mitochondrial introns identifies liverworts as the earliest land plants. / Y.L. Qiu, Y. Cho // Nature. 1998. V. 394. – P. 671-674. 146. Radchuk R. Sucrose non-fermenting kinase 1 (SnRK1) coordinates metabolic and hormonal signals during pea cotyledon growth and differentiation. / R. Radchuk, N.J.R. Emery, D. Weier, H. Vigeolas, P. Geigenberger, J.E. Lunn, R. Feil, W. Weschke, H. Weber // Plant J. – 2010. – V. 61. – P. 324–338. 147. Rapposelli E. AFLP fingerprinting and essential oil profiling of cultivated and wild populations of Sardinian Salvia desoleana. / E. Rapposelli, S. Melito, G. G. Barmina, M. Foddai, E. Azara, G. M. Scarpa. // Genet Resour Crop Evol – 2015. – V. 62. – P. 959–970. 148. Ritz C. M. Molecular phylogenetic relationships of the Andean genus Aylostera Speg. (Cactaceae, Trichocereeae), a new classification and a morphological identification key. / C.M. Ritz, K. Fickenscher J. Föller, K. Herrmann, R. Mecklenburg R. Wahl. // Plant Systematics and Evolution – 2016. – V. 302. – № 7. – P. –763–780. 149. Sabir J. Evolutionary and biotechnology implications of plastid genome variation in the inverted-repeat-lacking clade of legumes. / J. Sabir, E. Schwarz, N. Ellison, J. Zhang, N. A. Baeshen, M. Mutwakil, R. Jansen and T. Ruhlman. // Plant Biotechnology Journal. – 2014 – V. 12. – P. 743–754. 150. Sagan M. Sym28 and sym29, two new genes involved in regulation of nodulation in pea (Pisum sativum L.) / M. Sagan, G. Duc // Symbiosis. – 1996. – V. 20. – №. 3. – P. 229–245. 151. Salinas J Compositional compartmentalization and compositional patterns in the nuclear genomes of plants / J. Salinas, G.Matassi, L.M. Montero, G.Bernardi // Nucl. Acids Res. – 1988. –V. 16. – P. 4269–4285. 152. Santayana M. Molecular Characterization of Cultivated Species of the Genus Pachyrhizus Rich. ex DC. by AFLP Markers: Calling for More Data / M. Santayana, G. Rossel, J. Núñez, M. Sørensen, M. Delêtre, R. Robles, V. Fernández, W. J. Grüneberg, B. Heider // Tropical Plant Biol. – 2014 – V. 7. – P. 121–132. 153. Sarıkamış G. Genetic characterization of pea (Pisum sativum) germplasm from Turkey using morphological and SSR markers. / G. Sarıkamış, R. Yanmaz, S. Ermiş, M. Bakır and C. Yüksel // Genetics and Molecular Research – 2010. – V. 9. - №1. – P. 591-600 154. Schaefer H. Systematics, biogeography, and character evolution of the legume tribe Fabeae with special focus on the middle-Atlantic island lineages. / H. Schaefer, P. Hechenleitner, A.

136

Santos-Guerra, M. Menezes de Sequeira, R.T. Pennington, G. Kenicer, M.A. Carine // BMC Evol. Biol. – 2012. – V. 12 – №250. – P. 1471-2148. 155. Schmutz J. Genome sequence of the palaeopolyploid soybean. / J. Schmutz, S.B. Cannon, J. Schlueter, et al. // Nature. – 2010. – V. 463. – P. 178–183. 156. Schubert M. Plasmodesmata distribution and sugar partitioning in nitrogen-fixing root nodules of Datisca glomerata. / M. Schubert, N. K Koteyeva, P. W. Wabnitz, P. Santos, M. Buttner, N. Sauer, K. Demchenko, K. Pawlowski // Planta – 2011 – V. 233. – P. 139 –152 157. Schwartz N Cortico-Accumbens Regulation of Approach-Avoidance Behavior Is Modified by Experience and Chronic Pain. / N. Schwartz, C. Miller and H. L. Fields // Cell Reports 19, – 1522–1531. 158. Shaw J. Comparison of whole chloroplast genome sequences to choose noncoding regions for phylogenetic studies in angiosperms: the tortoise and the hare III / J. Shaw, E.B. Lickey, E.E. Schilling, R.L. Small // Am. J. of Bot. – 2007. – V. 94. – №3. – P. 275-288. 159. Shaw J. The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis / J. Shaw, E. Lickey, J.T. Beck, S.B. Farmer, W. Liu, J. Miller, K.C. Siripun, C.T. Winder, E.E. Schilling, R.L. Small // Am. J. of Bot. – 2005. – V. 92. – P. 142-166. 160. Silvente S. Heterogeneity of sucrose synthase genes in bean (Phaseolus vulgaris L.): evidence for a nodule-enhanced sucrose synthase gene. / S. Silvente, A. Camas, M. Lara. // J Exp Bot. – V. 2003. –№. 54. – P. 749–755. 161. Simioniuc D. Genetic diversity and relationships among pea cultivars revealed by RAPDs and AFLPs. / D. Simioniuc, R. Uptmoor, W. Friedt and F. Ordon // Plant Breeding. – 2002. – V. 121. – P. 429—435 162. Simon D. Phylogeny and self-splicing ability of the plastid tRNA-Leu group I intron / D. Simon, D. Fewer, T. Friedl, D. Bhattacharya. // J Mol Evol – 2003. – V. 57 – P. 710-720 163. Simon, C.J. Construction of a chickpea linkage map and its comparison with maps of pea and lentil. / C.J. Simon, F.J. Muehlbauer, // J. Hered. – 1997. – V. 88. – P. 115–119. 164. Smýkal P. Variety discrimination in pea (Pisum sativum L.) by molecular, biochemical and morphological markers/ P. Smýkal, J. Horáèek, R. Dostálová, M. Hýbl // J Appl Genet. – 2008.– V. 49. – P. 155–166 165. Smykal, P. Phylogeny, phylogeography and genetic diversity of the Pisum genus. / P. Smykal, G. Kenicer, A.J. Flavell, J. Corander, O. Kosterin, R.J. Redden, R. Ford, C.J. Coyne, N. Maxted, M.J. Ambrose, et al. // Plant Genet. Res. – 2011. – V. 9. – P. 4–18. 166. Soltis D.E. Contribution of Plant molecular systematics to studies of molecular evolution. / D.E.Soltis, P.S. Soltis. // Plant Molec. Biol. – 2000. –V. 42. - № 1. – P. 45-75.

137

167. Steele K. P. Phylogenetic analyses if tribes Trifoleae, Vicieae based on sequences of the plastid gene matK (Papilionoideae: Leguminosae) / K. P. Steele, M. F. B.Wojciechowski eds. B. Klitgaard, A. Bruneau. // Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, UK: Advances in legume systematics. – 2003. — Part 10. — P. 355–370 168. Steinbauerová, V. Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre. / V. Steinbauerová, P. Neumann, J. Macas // Mol. Genet. Genomics – 2008. – V 280. –P. 427–436. 169. Stougaard, J. Genetics and genomics of root symbiosis. / J. Stougaard // Curr. Opin. Plant Biol. – 2001. – V.4. – P. 328–335. 170. Sudheesh S. De novo assembly and characterisation of the field pea transcriptome using RNA-Seq. / S. Sudheesh, T.I. Sawbridge, N.O.I. Cogan, P. Kennedy, J.W. Forster, S. Kaur // BMC Genomics. – 2015 – V.16. - №1 – P. 611. 171. Swofford, D. L. PAUP: phylogenetic analysis using parsimony. Version 4.0b10. Sinauer Sinauer Associates, Sunderland, MA. – 2002. 172. Taberlet P. Power and limitations of the chloroplast trnL (UAA) intron for plant DNA barcoding/ P. Taberlet, E. Coissac, F. Pompanon, L. Gielly, C. Miquel, A. Valentini, T.Vermat, G. Corthier, C.Brochmann, E.Willerslev // Nucl. Acids Res. – 2007. – V. 35. – № 3. – P. 14. 173. Taberlet P. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. / P. Taberlet, L. Gielly, G. Pautou, J. Bouvet. // Plant Molecular Biology. – 1991.– V. 17 – P. 1105-1109. 174. Tamura K. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. / K. Tamura, G. Stecher, D. Peterson, A. Filipski, S. Kumar // Mol Biol Evol. – 2013. – V.30 – P. 2725- 9. 175. Tar'an B. Genetic diversity among varieties and wild species accessions of pea (Pisum sativum L.) based on molecular markers, and morphological and physiological characters. / B. Tar'an, C. Zhang, T. Warkenting, A. Tullu and A. Vandenberg // Genome. – 2005. –V. 48 – P. 257–272. 176. Tenaillon M.I. Selection versus demography: A multilocus investigation of the domestication process in maize. / M.I. Tenaillon, J. U'Ren, O. Tenaillon, and B.S. Gaut // Mol. Biol. Evol. – 2004. –V 21. – P. 1214–1225. 177. Toor N. Coevolution of group II intron RNA structures with their intron-encoded reverse transcriptases / N. Toor, G. Hausner, S. Zimmerly // RNA. – 2001. – V. 7. – P. 1142–1152. 178. Upadhyaya, H.D. Legume genetic resources: Management, diversity assessment, and utilization in crop improvement. / H.D. Upadhyaya, S.L. Dwivedi, M. Ambrose, N. Ellis,. J. Berger, P. Smýkal, D. Debouck, G. Duc, D. Dumet, A. Flavell, et al. // Euphytica – 2011. – V.180. – P. 27– 47.

138

179. Van de Peer Y. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, Y. De Wachter // Comput. Applic. Biosci. – 1994. – V. 10. – P. 569-570. 180. Van de Wouw M. A multivariate and cladistic study of Vicia ser. Vicia (Fabaceae) based on analysis of morphological characters. / M. van de Wouw, N. Maxted, B. V. Ford-Lloyd // Plant Systematics and Evolution. – 2003. – V. 237. – № 1-2. – P. 19-39. 181. van de Wouw, M. Molecular taxonomy of Vicia ser. Vicia L. based on Amplified Fragment Length Polymorphisms. / M. van de Wouw, N. Maxted, K. Chabane, B. V. Ford-Lloyd// Plant Systematics and Evolution. – 2001.– v. 229. – № 1-2. – p. 95-105. 182. Van der Linden, C.G. Efficient targeting of plant disease resistance loci using NBS- profiling / C.G. Van der Linden, E.Z. Kochieva, D.E. Wouters, M.J.M. Smulders, B. Vosman // Theor. Appl. Genet. – 2004. – V. 109– P. 384-393. 183. Varshney R.K. Draft genome sequence of pigeonpea (Cajanus cajan), an orphan legume crop of resource-poor farmers. / R.K. Varshney, W. Chen, Y. Li,.et al.// Nat. Biotechnol. – 2011. – V 30. –P. 83–89 184. Varshney R.K. Draft genome sequence of chickpea (Cicer arietinum) provides a resource for trait improvement. / R.K. Varshney, C. Song, R.K. Saxena, et al. // Nat. Biotechnol. – 2013. – V. 31. – P. 240–246. 185. Vershinin A.V. Transposable Elements Reveal the Impact of Introgression, Rather than Transposition, in Pisum Diversity, Evolution, and Domestication. / A.V. Vershinin, T.R. Allnutt, M.R. Knox, M.J. Ambrose, and T. H. N. Ellis // Mol Biol Evol. – 2003 –V. 20. - №12. – P. 2067– 2075. 186. Vos P. AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, and M. Zabeau. // Nucleic Acids Res. – 1995. – V. 23 – P. 4407-4414. 187. Waines J.G. The biosystematics and domestication of peas (Pisum L.) / J.G. Waines Bul. of the Torrey Botanical Club. – 1975. –V. 102 – P. 385-395. 188. Wan X. Q. Study of genetic relationships and phylogeny of the native Populus in Southwest China based on nucleotide sequences of chloroplast trnT-trnF and nuclear DNA. / X. Q. Wan, F. Zhang, Y. Zhong, Y. H. Ding, C. L. Wang, T. X. Hu // Plant Syst. Evol. – 2013. – V.299. – P.57–65. 189. Weigelt, K. ADP-glucose pyrophosphorylase-deficient pea embryos reveal specific transcriptional and metabolic changes of carbon-nitrogen metabolism and stress responses. / K. Weigelt, H. Küster, T. Rutten, A. Fait, A.R. Fernie, O. Miersch, C. Wasternack, R.J.N. Emery, C. Desel, F. Hosein, et al. // Plant Physiol. – 2009. – V.149. – P.395–411.

139

190. Weng, M-L. Reconstruction of the ancestral plastid genome in Geraniaceae reveals a correlation between genome rearrangements, repeats and nucleotide substitution rates. / M-L. Weng, J.C. Blazier, M. Govindu, and R.K. Jansen // Mol. Biol. Evol. –V. 2014. – V. 31 – № 3. – 645-659. 191. White, T.J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White, T. Bruns, S. Lee, J. Taylor // PCR Protocols: a guide to methods and applications. – 1990. – Ch. 38. – P. 315-322. 192. Won H. The chloroplast trnT–trnF region in the seed plant lineage gnetales / H.Won, S.S. Renner // J. Mol. Evol. - 2005. - V. 61. - P. 425–436. 193. Yadav, V.K Measurement of genetic dissimilarity in fieldpea (Pisum sativum L.) genotypes using RAPD markers. / V.K. Yadav, S. Kumar, R.K. Panwar.// Genet. Resour. Crop Evol. – 2007. – V 54. – № 6 – P.1285-1289. 194. Young N.D. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. / N.D. Young, F. Debelle, G.E.D. Oldroyd, et al. Nature. – 2011. – V 480.– P. 520–524. 195. Yulita K.S. Secondary structures of chloroplast trnL intron in dipterocarpaceae and its implication for the phylogenetic reconstruction ./ K.S. Yulita// Hayati J. Biosci. –2013 –V. 20 –№ 1 –P. 31–39. 196. Zaytseva O.O. Divergence and population traits in evolution of the genus Pisum L. as reconstructed using genes of two histone H1 subtypes showing different phylogenetic resolution. / O.O. Zaytseva, K.V. Gunbin, A.V. Mglinets, O.E. Kosterin Gene. – 2015 – V.556– P. 235-244. 197. Zeng Q. Definition of Eight Mulberry Species in the Genus Morus by Internal Transcribed Spacer-Based Phylogeny. / Q. Zeng, H. Chen, C. Zhang, M. Han, T. Li, X. Qi, Z. Xiang, N. He. PLoS ONE. 2015. 198. Zhang J. Haplotype analysis of sucrose synthase gene family in three Saccharum species / J. Zhang, J. Arro, Y. Chen, R. Ming // Genomics. – 2013. – V. 14. – P. 1471 – 2164. 199. Zhang J. Rates of Conservative and Radical Nonsynonymous Nucleotide Substitutions in Mammalian Nuclear Genes. / Zhang J. J Mol Evol. 2000. – V. 50. – P. 56–68 200. Zheng Y. The Structure of Sucrose Synthase-1 from Arabidopsis thaliana and Its Functional Implications. / Y. Zheng, S. Anderson, Y. Zhang, R.M. Garavito. // The journal of biological chemistry. – 2011. – V. 286. – №. 41. – P. 36108 –36118 201. Zhu H. Bridging Model and Crop Legumes through Comparative Genomics. / H. Zhu, H-K. Choi, D. R. Cook and R. C. Shoemaker // Plant Physiology. – 2005. – V. 137. – P. 1189–1196 202. Zhukov V.A. De Novo Assembly of the Pea (Pisum sativum L) Nodule Transcriptome. / V.A. Zhukov, A.I. Zhernakov, O.A. Kulaeva, N.I. Ershov, A.Y. Borisov, and I.A. Tikhonovich // International Journal of Genomics – 2015. – V. 16. – P. 611

140

203. Zohary, D. Domestication of pulses in the Old World. / D. Zohary and M. Hopf // Science – 1973. – V. 182 – P.887–894. 204. Zong, X. Analysis of a diverse global Pisum sp. collection and comparison to a Chinese local P. sativum collection with microsatellite markers. / X. Zong, R. Redden, Q. Liu, S. Wang, J. Guan, J. Liu, Y. Xu, X. Liu, J. Gu, L. Yan, P. Ades, R. Ford // Theor. Appl. Genet. – 2009. – V.118. – P. 193–204. 205. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction / Zuker M // Nucl. Acids Res. – 2003. – V. 31. – P. 3406–3415. 206. www.coolseasonfoodlegume.org/organism/Pisum/sativum 207. www.fao.org/faostat 208. www.graphpad.com 209. www.linnean-online.org/view/genus 210. www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ 211. www.thelegumeportal.net/