INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL

CIIDIR - MICHOACÁN

POTENCIAL DE Heterorhabditis indica (RHABDITIDA: HETERORHABDITIDAE) COMO ESTRATEGIA DE MANEJO DE Copturus aguacatae (COL: CURCULIONIDAE) y Phyllophaga spp. (COL: MELOLONTHIDAE)

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN : PRODUCCION AGRICOLA SUSTENTABLE

PRESENTA:

MA. GUADALUPE SÁNCHEZ SAAVEDRA

DIRECTORES DE TESIS:

DR. HIPÓLITO CORTEZ MADRIGAL

M.C. SALVADOR OCHOA ESTRADA

JIQUILPAN, MICHOACÁN NOVIEMBRE 2001

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AGRADECIMIENTOS

Al Instituto Politécnico Nacional, a través del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional CIIDIR-IPN unidad Michoacán, por el espacio que me brindó para realizar este posgrado.

A la Secretaria de Investigación y Posgrado (SIP) del IPN y al Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología (COECYT-Michoacán) por el apoyo económico brindado para el desarrollo de este proyecto.

A la universidad Autónoma Chapingo (UACH) por el apoyo brindado para la realización de la fase experimental correspondiente al análisis de suelos.

A la junta local de Sanidad Vegetal de Atapan, Los Reyes, Michoacán por facilitar la colecta de barrenador de ramas Copturus aguacatae.

A mi comité de asesores y revisores, M.C. Ignacio García Ruiz, Dr. David Cristóbal Acevedo y al Dr. Luis Fernando Ceja Torres por las observaciones y sugerencias a la presente tesis.

Al M.C. Salvador Ochoa Estrada por su asesoría en el desarrollo del trabajo, por sus sugerencias y por la orientación para afinar el escrito a través de sus observaciones y correcciones.

Un agradecimiento especial a mi director de tesis Hipolito Cortez Madrigal, que por su amplia experiencia en el campo de la investigación y su atinada guía permitió concluir en buen término este trabajo, así como por sus valiosos consejos y orientación para incursionar en el campo de la investigación.

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A los investigadores del CIIDIR-Michoacán por sus conocimientos compartidos contribuyendo a mi formación profesional.

Al señor José Antonio Cortez, por formar parte del equipo de trabajo y por su sincera amistad.

A mis compañeros de generación, especialmente a mis amigos: Rosa Isela, Anahi, Esmeralda, Claudia, Melissa, Humberto, Víctor, Fercho, Laura, Candy y Cecy; por compartir momentos importantes brindándome una amistad sincera y por acompañarme en este trayecto de aprendizaje.

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DEDICATORIAS

A Dios. Por permitirme llegar a este momento tan especial en mi vida. Por los triunfos y los momentos difíciles que me han enseñado a valorarte cada día más.

A mis padres: María Saavedra Ramírez y Saúl Sánchez Zambrano a quien debo la vida y mis logros, agradezco el cariño, la comprensión, la paciencia y el apoyo que me han brindado para culminar esta importante etapa de mi vida. Gracias a sus consejos, por el amor que siempre me han brindado, por cultivar e inculcar ese sabio don de la responsabilidad.

A mis Hermanos: Cecilia por ser el ejemplo de una hermana mayor, por su apoyo y por estar siempre presente brindándome aliento; José Manuel por ser mi ejemplo a seguir, motivarme a luchar en los momentos difíciles y por siempre estar ahí cuando lo necesito y Alfonzo por que se que cuento con el incondicionalmente.

A mis sobrinos: Maury, Sol y Saúl por siempre contagiarme su alegría, através de sus ocurrencias.

A Josué por ser parte importante de mi vida, por soportarme, comprenderme y apoyarme en los momentos más difíciles.

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CONTENIDO

ÍNDICE DE CUADROS ……………………………………………………………………...... Ix

ÍNDICE DE FIGURAS …………………………………………………………………………… X

RESUEMEN ……………………………………………………………………………………….. Xi

ABSTRACT…………………………………………………………………………………………. Xiii

CAPITULO I: REVISION DE LITERATURA ...... 1

1.1 El barrenador de las ramas del aguacate C. aguacatae ...... 1 1.1.1 Importancia y distribución geográfica...... 1 1.1.2 Plantas hospederas ...... 2 1.1.3 Biología, hábitos y daño ...... 3 1.1.4 Fluctuación poblacional ...... 5 1.1.5 Enemigos naturales ...... 6 1.1.6 Medidas de Control ...... 8 1.1.6.1 Cultural ...... 8 1.1.6.2 Biológico ...... 8 1.1.6.3 Químico ...... 9

1.2 El complejo gallina ciega Phyllophaga spp. como plagas agrícolas ...... 10 1.2.1 Importancia y distribución geográfica...... 10 1.2.2 Plantas hospederas ...... 11 1.2.3 Biología hábitos y daño...... 12 1.2.4 Especies importantes ...... 14 1.2.5 Fluctuación poblacional ...... 15 1.2.6 Enemigos naturales ...... 16 1.2.7 Medidas de control ...... 17 1.2.7.1 Cultural ...... 17 1.2.7.2 Biológico ...... 18 1.2.7.3 Químico ...... 19

1.3 Los nematodos entomopatógenos (NE) ...... 20 1.3.1 Importancia de los NE ...... 20 1.3.2 Morfología y taxonomía ...... 20 1.3.3 Ciclo de vida (Steinernema y Heterorhabditis) ...... 22 1.3.4 Modo de acción ...... 24 1.3.5 Requerimientos ambientales ...... 25 1.3.5.1 Humedad ...... 25 1.3.5.2 Temperatura ...... 25 1.3.5.3 Radiación solar ...... 27

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1.3.5.4 Tipo de suelo ...... 27 1.3.6 Especificidad y rango de hospederos ...... 28 1.3.7 Especies importantes de nematodos entomopatógenos su uso en manejo de plagas ...... 29 1.3.8 Multiplicación y comercialización ...... 30 1.3.9 Formulación y estrategias de aplicación ...... 31

1.4 Objetivo general ...... 35

1.5 Literatura citada ...... 36

CAPITULO II: PARASITISMO DE LARVAS DE COPTURUS AGUACATAE (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) POR HETERORHABDITIS INDICA ...... 50

(RHABDITIDA: HETEROHABDITIDAE) ...... 50

2.1 Introducción ...... 50 2.1.1 Objetivo ...... 52

2.2 Materiales y métodos ...... 53 2.2.1 Material biológico ...... 53 2.2.2 Efecto de H. indica en larvas de C. aguacatae in vitro ...... 53 2.2.2.1 Bioensayo preliminar ...... 53 2.2.2.2 Evaluación de dosis ...... 54 2.2.3 Bioensayo preliminar con larvas dentro de ramas ...... 54 2.2.4 Técnicas de aplicación de H. indica en larvas dentro de ramas ...... 55 2.2.5 Caracterización del aserrín de galerías de C. aguacatae ...... 56 2.2.5.1 Análisis granulométrico de partículas ...... 56 2.2.5.2 Determinación del contenido de humedad ...... 57 2.2.5.3 Determinación del pH ...... 57 2.2.5.4 Conductividad eléctrica (C.E.) ...... 57

2.3 Resultados y discusión ...... 58 2.3.1 Susceptibilidad de larvas de C. aguacatae hacia H. indica ...... 58 2.3.2 Bioensayo preliminar dentro de ramas ...... 61 2.3.3 Estrategias de aplicación de H. indica en ramas ...... 62 2.3.4 Caracterización de aserrín ...... 64

2.4 Conclusiones ...... 67

2.5 Literatura citada ...... 68

CAPITULO III: INFECTIVIDAD DE HETERORHABDITIS INDICA (RHABDITIDA: HETERORHABDITIDAE) EN ADULTOS Y LARVAS DE PHYLLOPHAGA SPP...... 73

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3.1 Introducción ...... 73 3.1.1 Objetivos ...... 76

3.2 Materiales y métodos ...... 77 3.2.1 Localización geográfica de los tres tipos de suelos analizados ...... 77 3.2.1.1 Clima ...... 77 3.2.1.2 Vegetación ...... 78 3.2.1.3 Suelo ...... 78 3.2.2 Metodología ...... 80 3.2.2.1 Material biológico ...... 80 3.2.2.2 Bioensayos con larvas ...... 80 3.2.2.3 Bioensayos con adulto ...... 81 3.2.2.4 Caracterización físico-química de diferentes suelos ...... 82 3.2. 2.5 Infectividad de H. indica en los diferentes suelos ...... 82

3.3 Resultados y discusión ...... 84 3.3.1 Mortalidad de larvas por H. indica ...... 84 3.3.2 Mortalidad de adultos ...... 87 3.3.3 Infectividad de H. indica en tres tipos de suelo ...... 88

3.4 Conclusiones ...... 93

3.5 Literatura citada ...... 94

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ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1 Clasificación de los nematodos entomopatógenos (Tanada y Kaya, 1993)……………………………………………………………………………………… 21

Cuadro 2 Tolerancia relativa de Steinernema y Heterorhabditis a las condiciones ambientales (Grewal, 2002)…………………………………………………………… 27

Cuadro 3 Tiempo de viabilidad de Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. en las formulaciones (Grewal y Peters, 2005)…………………………………………… 34

Cuadro 4 Mortalidad de C. aguacatae en función de diferentes concentraciones del nematodo Heterorhabditis indica…………………………………………………… 60

Cuadro 5 Resultados del bioensayo preliminar del efecto de H. indica sobre larvas de C. aguacatae dentro de ramas………………………………………………………. 61

Cuadro 6 Mortalidad de C. aguacatae dentro de ramas mediante diferentes estrategias de aplicación del nematodo H. indica……………………………… 63

Cuadro 7 Tamaño de partícula de aserrín de las galerías de C. aguacatae. ……………. 65

Cuadro 8 Mortalidad de larvas de Phyllophaga spp. en suelo y composta………………. 85

Cuadro 9 Características físico-químico de tres suelos regionales Michoacán………… 89

Cuadro10 Mortalidad de Galleria mellonella en tres suelos de Michoacán……………… 90

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura1 Ciclo biológico de los Steinernematidos y Heterorhabditos (Griffin et al., 2005)…………………………………………………………………………… 23

Figura 2 Aspecto de larva de C. aguacatae muerta por H. indica………………… 58

Figura 3 Emergencia de nematodos juveniles (J3) de larvas de C. aguacatae…. 59

Figura 4. Tiempo de mortalidad de C. aguacatae tratadas in vitro con el nematodo Heterorhabditis indica……………………………………………… 59

Figura 5 Ubicación del área de estudio y de los sitios experimentales………….. 77

Figura 6 Larva de Phyllophaga spp. infectada con Heterorhabditis indica 48 h después de inoculada con nematodos……………………………………….. 84

Figura 7 Tiempo de mortalidad in vitro de Phyllophaga sp. infestadas con el

nematodo H. indica en suelo………………………………………………….. 85

Figura 8 Tiempo de mortalidad de adultos de Phyllophga sp. tratados con con el nematodo Heterorhabditis indica…………………………………………... 87

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RESUMEN

El barrenador de ramas, Copturus aguacatae Kissinger (Coleoptera: Curculionidae) es una importante plaga del aguacate en México. Su control, basado en productos químicos trae importantes costos económicos y ambientales. Una alternativa la constituye el control biológico, donde los nematodos entomopatógenos serían importantes candidatos, pues han demostrado su eficacia en el control de otras plagas barrenadoras. Por su parte el complejo de especies de “gallina ciega” Phyllophaga spp. constituye una de las plagas agrícolas de mayor importancia económica en México, debido fundamentalmente a sus hábitos polífagos y amplia distribución. Como habitantes del suelo, los nematodos entomopatógenos (NE) son una alternativa ambientalmente sostenible para el control de gallinas ciegas. Para conocer el potencial del nematodo Heterorhabditis indica Poinar cepa Tab-03 en el control de C. aguacatae, bioensayos con larvas, fuera y dentro de ramas fueron implementados. Fuera de ramas se evaluaron cuatro concentraciones: 1% (2500 nematodos m-1), 0.1% (250 nematodos m-1), 0.01% (25 nematodos m-1) y 0.001% (2.5 nematodos m-1). Se estimo la mejor dosis y el tiempo en que murió el 50% de las larvas (TL50). Los bioensayos dentro de ramas incluyeron cuatro estrategias de aplicación: savia (“baba”) de nopal, grenetina, agua, y agua + cubierta de plástico. Tiras de esponja de 5 x 6 cm fueron empapadas con una suspensión de nematodos a concentraciones de 500 nematodos ml-1 + el tratamiento correspondiente. Las ramas fueron envueltas con las esponjas y se incubaron a 25 ± 1° C durante 15 días. Para Phyllophaga spp. se desarrollaron bioensayos con larvas y adultos colectados en el Noroeste de Michoacán. Larvas de 3° instar fueron colocadas en recipientes de plástico de 5 x 6 cm, con sustrato en el fondo (suelo o composta). Al igual que para C. aguacatae Concentraciones de 2 500 nematodos m-l fueron adicionados e incubadas a 25±1 ºC. Lecturas diarias de mortalidad iniciaron a las 24 h y transcurrieron durante cinco días. Estudios adicionales incluyeron el efecto de tres tipos de

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suelos regionales en la infectividad de H. indica; dos de la meseta purépecha (“topure” y “charanda”) y uno representativo de la ciénaga de Chapala (Vertisol- salino). Los bioensayos para adultos fueron de manera similar a las larvas, la diferencia fue que aquí se uso una esponja como sustrato. Para C. aguacatae los resultados mostraron alta virulencia de H. indica hacia larvas de la plaga; El TL50 estimado fue de 28.8 h, mientras que el 100% de mortalidad se alcanzó 44 h después. La dosis óptima fue de 0.1% (250 nematodos ml-1) con una mortalidad del 93.3 ± 5.7%. La emergencia de juveniles fluctuó desde 386 hasta 3,426.66 por larva. Sin embargo, bajo las condiciones de estudio, los resultados indican fuertes limitaciones de H. indica para penetrar e infectar a C. aguacate dentro de las galerías. Aunque hubo tendencia de mayor mortalidad en los tratamientos respecto al testigo, solo se obtuvieron juveniles en el tratamiento agua+cubierta de plástico. Al parecer el ingreso de H. indica a las galerías es altamente influenciado por la presencia de aserrín dentro de ellas, lo que pudiera minimizarse mediante aplicaciones más tempranas. Similar influencia mostró la técnica de aplicación utilizada. Trabajos futuros deben enfocarse a la evaluación de tiempos, dosis y diferentes técnicas de aplicación. Con respecto a los resultados para Phyllophaga la mortalidad de larvas inducida por H. indica fue baja (40-46%), sin existir diferencias entre el sustrato utilizado. Los suelos charanda y topure presentaron las mejores características físico-químicas para la actividad de los NE, lo que fue acorde con la mayor mortalidad registrada en larvas de Galleria mellonella en ambos suelos (88.09% y 88.33%), comparado con el suelo vertisol-salino, donde ocurrió la menor mortalidad (18.75%). A diferencia de las larvas, los adultos de Phyllophaga fueron altamente susceptibles a H. indica. El TL50 estimado fue de 49 h, mientras que el 99% de mortalidad se alcanzó a las 86.6 h. Sin embargo, en ningún cadáver tratado con el nematodo se registró emergencia de juveniles. Con base a los resultados se puede concluir que el nematodo H. indica pudiera ser un buen candidato para el manejo de Phyllophaga spp. pues causó mortalidad en larvas y adultos.

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ABSTRACT

The borer branches Copturus aguacatae Kissinger (Coleoptera: Curculionidae) is an important pest of avocados in Mexico. Its control, based on chemicals brings significant economic and environmental costs. An alternative is biological control, where entomopathogenic nematodes which would be important candidates as they have proven their efficiency in controlling other pests drill. For its part the species complex white grubs Phyllophaga spp. is an agricultural pest of major economic importance in Mexico, mainly due to their polyphagous habits and wide distribution. As inhabitants of the soil, entomopathogenic nematodes (EN) is an environmentally sustainable alternative to control white grubs. For to know the potential of the nematode Heterorhabditis indica Poinar strain Tab-03 in the control of the pest, larval bioassays, inside and outside of branches were implemented. Four concentrations outside of branches were evaluated: 1% (2500 nematodes m-1), 0.1% (250 nematodes m-1), 0.01% (25 nematodes m-1) and 0.001% (2.5 nematodes m-1). The best dose and the time where 50% of the larvae died (LT50) were estimated. Bioassays inside of branches included four application strategies: sap ("baba") of “nopal”, gelatin, water, and water + plastic cover. Sponge strips of 5 x 6 cm were soaked with nematode suspension concentrations of 500 nematodes ml-1 + the corresponding treatment. The branches were wrapped with sponges and incubated at 25 ± 1 ° C for 15 days. To Phyllophaga spp. bioassays with larvae and adults collected in northwestern Michoacán were developed. Larvae of 3° instars were placed into plastic containers of 5 x 6 cm with substrate (soil or composta). Concentrations of 2 500 nematodes ml-1 were added and incubated at 25 ± 1 °C. Daily Readings mortality started 24 h after and passed during five days. Additional studies included the effect of three types of regional soil on the infectivity of H. indica: two of the Purepecha Plateau ("topure" and "Charanda") and one representative of the Cienega of Chapala (Vertisol-saline). Bioassays for adults were similar to the larvae; the difference was that here was used one sponge as substrate. Results for C. aguacatae showed high virulence of H. indica on larvae of the pest; the estimated LT50 was 28.8 h, whereas 100% mortality was reached 44 h later. The optimal dose was 0.1% (250 nematodes ml-1) with 93.3 ± 5.7% of mortality. The emergence of juveniles ranged from 386 to 3426.66. However, under the study conditions, the results indicate strong constraints of H. indica to penetrate and infect C. aguacatae inside the galleries. Although there was a trend of higher mortality in treatments than the control, only juveniles were

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obtained in the treatment water + plastic cover. Apparently H. indica entry to the galleries is highly influenced by the presence of sawdust in them and the application technique used, which could be minimized by early applications. Future work should focus on the evaluation of the time, dose and different application techniques. With respect to the results to Phyllophaga the larval mortality was similar in soil and composta (46% and 40%). “topure” and “Charanda” soils had the best physical-chemical activity of the EN, which was consistent with the higher mortality in larvae of Galleria mellonella in both soils (88.09% and 88.33%) compared with saline-clay soil, where the lowest mortality occurred (18.75%). Unlike larvae, adults of Phyllophaga were highly susceptible to H. indica. The LT50 was estimated at 49 h while 99% mortality was reached at 86.6%. However, never was registered nematodes emergency in the treatments. Based on the results it can be concluded that the nematode H. indica could be a good candidate for the management of Phyllophaga spp. they caused mortality in larvae and adults. In adults could be using the technique of autodiseminación by light traps baited with nematodes.

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CAPITULO I: REVISION DE LITERATURA

1.1 El barrenador de las ramas del aguacate C. aguacatae

1.1.1 Importancia y distribución geográfica

El barrenador de ramas, Copturus aguacatae Kissinger (Coleoptera: Curculionidae) constituye una de las principales plagas del cultivo del aguacate. El principal daño es ocasionado por las larvas al barrenar las ramas del árbol que generalmente llegan hasta la médula. Cuando las poblaciones del barrenador son altas, como ocurre en las plantaciones comerciales, la gran cantidad de galerías y el peso de los frutos ocasionan la ruptura de ramas perdiéndose por consiguiente importante cantidad de frutos. También, provoca ligera defoliación y aborto de flores y frutos (Equihua-Martínez et al., 2007; Equihua y Estrada, 2008).

Aunque en fuertes infestaciones el insecto puede dañar prácticamente todo el árbol, existe preferencia por el estrato medio, las ramas que reciben la mayor radiación solar y las ramas de 1.5-3.0 cm de diámetro, conocidas como ramas terciarias (Coria et al., 2007).

El barrenador de ramas del aguacate afecta fuertemente a huertos ubicados en altitudes de 1200 m o menores; su incidencia disminuye al incrementarse la altitud hasta un máximo de 2100 m. Cuando el insecto inicia su aparición su distribución es en forma aleatoria; una vez que la plaga aumenta e invade los ábolesvecinos, su distribución es en agregados (Coria et al., 2007). Se estima que junto con los barrenadores del hueso Conotrachelus aguacatae Barber y C. persea Barber (Coleóptera: Cucurlionidae), las pérdidas fluctúan de 2 a 3 ton por ha. El control de ambos insectos incluye un poco más del 15% del costo total del cultivo (SENASICA, 2009).

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Copturus aguacatae es un fuerte problema fitosanitario que limita la comercialización de la fruta, tanto a nivel nacional como internacional (NOM- 066-FITO, 2002; Talavera y Padilla, 2003). C. aguacatae es nativo de México y hasta la fecha solo se le encuentra en este país en donde daña todos los cultivares existentes (Coria-Avalos et al., 2009). Es una plaga de amplia distribución en las zonas productoras de aguacate de México (Talavera y Padilla, 2003; Equihua-Martínez et al., 2007; SENASICA, 2010).

Existen reportes de su distribución en áreas aguacateras de la región central de México; entre ellas, el estado de México, Puebla, Morelos, Nayarit, Guerrero, Querétaro, Oaxaca, Michoacán, Veracruz (Equihua-Martínez et al., 2007; SAGARPA, 2009; SENASICA, 2010), asi como: Jalisco, Colima y Guanajuato (Equihua-Martínez et al., 2007; SENASICA, 2010). Dado que C. aguacatae es plaga endémica de México, es una de las limitantes para la exportación de frutos a países donde se cultiva aguacate, por lo que existe una campaña permanente para su erradicación. Hasta el 2010, el único municipio de Michoacán libre del barrenador era Acuitzio (NOM-066-FITO, 2002).

1.1.2 Plantas hospederas

El aguacate Persea americana L. (Lauraceae) parece ser el único hospedero registrado para la plaga; sin embargo, se conoce que existen diversas especies cultivadas y silvestres de la familia Lauraceae en México; entre ellas, el “chinino” P. schiedeana (Sánchez-Pérez, 1999), lo que permite pensar en la existencia de hospederos alternas del barrenador.

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1.1.3 Biología, hábitos y daño

Los adultos son de C. aguacatae cuerpo robusto y coloración pardo rojizos. Los machos son ligeramente más pequeños que las hembras con un tamaño medio de 4.0 x 1.8 mm (largo y ancho), mientras que las hembras miden de 5.2 x 2 mm. Presentan el rostrum fuertemente inclinado hacia la región ventral, ojos ovalados y puntiagudos ventralmente, élitros alargados con el ápice redondeado, las antenas son geniculadas y la masa antenal grande formada por cuatro segmentos. Los huevos inicialmente son hialinos de 0.5 mm x 0.3 mm y se tornan de color gris claro a medida que se acercan a la eclosión (Equihua- Martínez et al., 2007; Castañeda-Vildózola, 2009). Las larvas son del tipo curculioniforme, de color blanco lechoso, cápsula cefálica café claro y pasan por cinco instares. Las larvas de primer instar miden de 1.2 a 4.9 mm de longitud; las del segundo varían de 5.3 a 7.0 mm; en el tercer instar las larvas llegan a medir desde 7.4 hasta 9.4 mm; en el cuarto instar larvario miden de 9.5 a 10.8 mm y finalmenté, las del quinto y último instar adquieren su máximo tamaño que es de 10.9 a 12 mm. La pupa es exarata, alargada, de 6.0 a 8.0 mm por 2.0 a 2.5 mm en la parte más ancha; inicialmente son de color blanco y posteriormente cambian a color crema claro (Equihua-Martínez et al., 2007; SAGARPA, 2009).

Las diferentes altitudes a las que se cultiva el aguacate en México influyen en la incidencia del barrenador de ramas. Así, en altitudes superiores a 2100 msnm, el insecto es raro o prácticamente desaparece (Coria et al., 2007). De igual manera, la duración del ciclo biológico de la plaga varía en relación con la altitud; a mayor altitud, mayor tiempo de desarrollo. Con base en lo anterior, se tendrán diferentes tiempos del ciclo de vida, dependiendo de las condiciones antes señaladas.

El ciclo del barrenador de ramas presenta metamorfosis completa; es decir, pasa por huevo, larva, pupa y adulto. En el estado de Michoacán, el huevo tiene un

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periodo de incubación de 10 a 12 días (Talavera y Padilla., 2003; Coria et al., 2007). En Atlixco Puebla, las oviposturas se detectan durante los meses de agosto y septiembre (Huerta de la Peña, 1990). Tanto larvas como pupas pasan su periodo de vida dentro de las ramas. Coria et al. (2007) señalan una duración de 128 ± 2.0 días o 1295.6 unidades calor (u.c) para la región de Ziracuaretiro, Michoacán; ampliamente contrastante es lo mencionado por Talavera y Padilla. (2003), quienes registraron un periodo de 248 días para los municipios de Uruapan, Nuevo Parangaricutiro, e incluso Ziracuaretiro Michoacán. Lo anterior es acorde con lo registrado en Nayarit, donde el ciclo transcurrió en alrededor de 230 días (Urías-López y Salazar-García, 2008). En otras regiones del país como Atlixco Puebla, se menciona que las larvas se registran prácticamente durante todo el año en sus diferentes instares (Huerta de la Peña, 1990).

El periodo pupal de C. aguacatae dura de 21.5-25 días (Talavera y Padilla., 2003; Coria et al., 2007); sin embargo, para las condiciones del estado de Nayarit el periodo de pupa transcurrió durante 50 días (Urías-López y Salazar-García et al., 2008), mientras que en Atlixco Puebla, se observan pupas desde el mes de mayo hasta julio, lo que sugiere un mayor periodo de tiempo (Huerta de la Peña, 1990). El estado de imago dura alrededor de 24±5.6 días (Coria et al., 2007).

Para el adulto, Talavera y Padilla (2003) reportan 42 días para hembras y machos, mientras que Coria et al. (2007) reportan una longevidad en las hembras de 58.95 ± 3.72 días (783.41 ± 46.98 u.c.). La duración del ciclo completo para el estado de Michoacán fue de 215.8 días (Coria et al., 2007), mientras que para el mismo Estado, Talavera y Padilla. (2003) reportan 285 días, muy similar al reportado para Nayarit (292 días) (Urías-López y Salazar-García, 2008).

En general se acepta que C. aguacatae presenta una sola generación por año (Talavera y Padilla., 2003; Equihua-Martínez et al., 2007; Urías-López y Salazar-

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García, 2008); sin embargo, existe un reporte donde se señala la posibilidad de dos generaciones por año (Coria-Avalos, 2009).

El daño inicia con la ovipostura de las hembras, al destruir la corteza con el pico para depositar sus huevecillos bajo de ella. Al emerger, las larvas barrenan la rama hasta llegar a la médula, lo que causa ligera defoliación y aborto (González et al., 2000; Equihua-Martínez et al., 2007). En ramas gruesas y troncos, las larvas no penetran más de 2 cm de profundidad en un área de daño que no es mayor de 4 cm (SAGARPA, 2009). La entrada de la perforación se caracteriza por la acumulación de aserrín y savia que varía del color crema hasta el café claro u oscuro (Equihua-Martínez et al., 2007; Urías-López y Salazar-García, 2008). C. aguacatae prefiere ramas con diámetros que oscilan de 1.5 a 3 cm denominadas ramas terciarias, que son ramas de años anteriores (Urías-López y Salazar-García, 2008).

Urías-López y Salazar-García (2008) indicaron que el número de barrenos puede variar de un año a otro dependiendo de la densidad poblacional. Se han registrado desde 2.5-5 hasta 18.1 barrenos-árbol. El nivel de daño también se ve influenciada por el nivel de fertilización; es decir, las poblaciones del barrenador de ramas ocurrieron en mayor cantidad en árboles con fertilización deficiente, comparado con árboles con fertilización balanceada.

1.1.4 Fluctuación poblacional

En Michoacán, los adultos aparecen a principios de junio, con una actividad máxima de mediados de julio a mediados de septiembre (Equihua-Martínez et al., 2007). En Atlixco Puebla, los adultos se registran de la segunda semana de junio hasta septiembre, en grupos que fluctúan de 2-6 adultos por hoja (Huerta de La Peña, 1990).

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En Nayarit, Urías-López y Salazar-García (2008) después de dos años de observaciones, registraron las más bajas poblaciones de larvas durante el segundo semestre del año, con variaciones de 2.5 a 5 barrenos/árbol; en el primer semestre del año se incrementaron, con el mayor pico poblacional de enero a febrero (más de 10 barrenos/árbol) manteniéndose similar hasta junio. Se identificaron dos picos poblacionales: el más abundante (6.2 y 6.7 larvas/árbol) ocurrió a partir de la última semana de mayo y su población se incrementó hasta la última semana de agosto; a partir de esta fecha la población decreció y desapareció en la última semana de noviembre. El pico poblacional menos abundante (1.7 larvas/árbol) se detectó desde la última semana de diciembre hasta finales de febrero (Coria et al, 2007).

1.1.5 Enemigos naturales

Existen reportes de que C. aguacatae cuenta con diversos enemigos naturales, los que en algún momento pudieran ser empleados en un control biológico deliberado de la plaga. Los grupos de enemigos naturales incluyen: depredadores, parasitoides y hongos entomopatógenos (Huerta de la Peña et al., 1990; González et al., 2000; Coria et al., 2007; Hernández-Fuentes et al., 2009; Hernández–López, 2010).

Se ha registrado la presencia de los siguientes himenópteros parasíticos: Eupelmus sp. (Eupelmidae), Euderus sp. (Eulophidae), Eurydinoteloides sp. (Pteromalidae), Erythmellus sp. (Mymaridae), Oncophanes sp. (Braconidae) y Prosierola bicarinata (Brues) (Bethylidae) (Huerta de la Peña et al., 1990). Recientemente fue registrado en el estado de México un nuevo parasitoide de C. aguacate correspondiente al género Urosigalphus Ashmead (Braconidae). Son especies de avispas especializadas en parasitar larvas de curculiónidos; entre

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ellos, U. avocadoae que parasita al barrenador de ramas (Hernández-Fuentes et al., 2009); sin embargo, pocos esfuerzos se han realizado para evaluarlos como agentes de control biológico (González et al., 2000).

Respecto a depredadores, el único reporte que se tiene es que la incubación del huevo puede ser afectada hasta en un 20% por la actividad depredadora de aves silvestres (Coria et al., 2007).

Por otro lado, se conocen algunas especies de hongos que infectan diferentes estados de desarrollo de la plaga; así se ha registrado hasta un 2.5% y un 6.96% de mortalidad en larvas por los hongos Metarhizium sp. y Beauveria bassiana, en ese orden. En pupas, se cuantificó una mortalidad del 24.24%, con una proporción en el ataque del 6.6% y 19.8% para M. anisopliae y B. bassiana, respectivamente. Para el imago, se cuantificó una mortalidad del 29.09 %, del que un 5.45% correspondió a M. anisopliae y el resto a B. bassiana (Coria et al., 2007).

Aunque no se conocen reportes de nematodos entomopatógenos aislados de C. aguacatae, estudios sobre el efecto de estos organismos en otras especies de barrenadores (Saphiro y McCoy, 2000; Cortez-Madrigal, 2009) y en el mismo C. aguacatae (Huerta de la Peña et al., 1990), sugieren que los nematodos entomopatóegnos pudieran tener potencial en el manejo de la plaga.

Por otro lado, la conservación en campo de los enemigos naturales de plagas es de gran importancia para el equilibrio del ecosistema, pues no solo afecta el incremento de las poblaciones de plagas, sino también el equilibrio de todos los fitófagos del agroecosistema. Por supuesto, la reducción y aplicación correcta de las aplicaciones de agroquímicos es una de las primeras medidas (Cortez- Madrigal, 2005).

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1.1.6 Medidas de Control

La categoría del aguacate como cultivo de exportación hace que las plagas del cultivo tenga mayor importancia, principalmente las de clasificación cuarentenaria, como es el caso de C. aguacatae. Por lo anterior, la estrategia que se ha seguido para el control y reconocimiento de áreas “temporalmente” libres de la plaga con fines de exportación ha sido el manejo integrado de plagas, donde básicamente se incluyen los métodos de control cultural, biológico y químico (SENÁSICA, 2009).

1.1.6.1 Cultural

Consiste en la poda e incineración de ramas con indicios de daño de larvas y con ello romper el ciclo biológico del insecto, medida de control que es ampliamente utilizada y cobra mayor relevancia en huertos descuidados, donde los insectos se desarrollan favorablemente (Equihua-Martínez et al., 2007). De acuerdo con observaciones de campo, algunos productores practican una especie de “descortezado” de ramas, supuestamente para eliminar larvas de la plaga; sin embargo, no se ha documentado nada sobre su eficacia. Adicionalmente, los frutos que llegan a ser infestados por larvas de la plaga también deben ser destruidos. Otra recomendación es el deshierbe de los huertos de aguacate (SENASICA, 2009, 2010).

1.1.6.2 Biológico

Algunos reportes recomiendan el uso de hongos entomopatógenos para el control de larvas y adultos; por ejemplo, B. bassiana (INIFAP, 1998) y M. anisopliae son recomendados cuando las condiciones de humedad son superiores al 80% y ocurren temperaturas entre 18 °C y 25 °C. Previo a la

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aplicación de los hongos entomopatógenos, se recomienda realizar un riego; sin embargo, hasta donde sabemos su eficacia no ha sido documentada (SENASICA, 2009).

1.1.6.3 Químico

Los hábitos crípticos del barrenador limitan en gran medida el uso de productos químicos y su residualidad en frutos limita su comercialización; sin embargo, el uso de insecticidas químicos continua siendo una de las estrategias en el control de la plaga (SENASICA, 2009). La aplicación de insecticidas organofosforados de contacto cada 10 a 15 días en dependencia de las condiciones climáticas es una estrategia ampliamente utilizada por los productores. Los productos autorizados para el control de C. aguacatae son el malatión y el paratión metílico, productos que se recomienda aplicar durante los niveles máximos de actividad de adultos. Una vez que la larva ha penetrado al tronco y ramas, los productos son inefectivos (Equihua y Estrada, 2008; SENASICA, 2009).

Aunque el control químico es la principal estrategia de control utilizada, depender de los insecticidas químicos como única estrategia de control tiene serias desventajas; entre ellas: eliminación de enemigos naturales, aparición de plagas secundarias, resistencia de la plaga y finalmente, la contaminación ambiental (King y Saunders, 1995, Cortez- Madrigal, 2005).

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1.2 El complejo gallina ciega Phyllophaga spp. como plagas agrícolas

1.2.1 Importancia y distribución geográfica

La familia Melolontihidae conocidas comúnmente como “Gallinas ciegas” incluye algunas de las plagas de la raíz de mayor importancia económica en México (Morón, 1997). Géneros importantes como Anomala, Popillia, Macrodactylus, Cyclocephala, Strategus y Phyllophaga, se encuentran ampliamente distribuidos en gran parte del continente americano (King y Saúnders, 1984; Ramírez–Salinas y Castro-Ramírez, 2000).

Diversos factores del suelo influyen para la aparición y persistencia de la plaga en los cultivos; características agroclimáticas y de manejo del cultivo son determinantes para diferentes especies; por ejemplo, C. lunulata prefiere mayor contenido de materia orgánica, así como suelos ricos en fósforo; por su parte, P. ravida prefiere suelos con alto contenido de manganeso así como suelos ricos en fósforo; P. dentex se presenta en función del contenido de manganeso del suelo y la precipitación pluvial ocurrida, mientras que P. polyphylla mostró asociación con el porcentaje de arena y nivel de pH (Díaz-Maderos et al., 2006). Se ha propuesto que el problema de plagas polífagas como el complejo gallina ciega, actualmente ha sido agravado por la práctica del monocultivo y el uso de herbicidas residuales de acción total, como las triazinas (Cortez-Madrigal, 2005).

Del complejo de gallina ciega que más problemas causan a la agricultura destaca el género Phyllophaga spp., pues por sus hábitos ampliamente polífagos se alimentan de una gran diversidad de especies de plantas cultivadas y silvestres; consume directamente las raíces de la planta, lo que afecta su desarrollo y ocasiona la entrada de patógenos. En infestaciones fuertes llega a

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ocasionar la muerte de la planta (King, 1996; Ramírez–Salinas y Castro- Ramírez, 2000).

El género Phyllophaga se encuentra en altitudes que van desde el nivel del mar hasta los 3000 m, encontrándose el mayor número de especies entre los 500 y los 1000 m. Con respecto a la latitud, el género es de origen septentrional y se ajusta al patrón de dispersión paleoamericano; se distribuye entre los 14o y 34° N, encontrándose las especies desde Canadá hasta Sudamérica (Morón, 1997). En México, el género Phyllophaga se encuentra ampliamente distribuido incluyendo los estados de Chiapas, Guanajuato, Jalisco, Estado de México, Michoacán y Puebla (Ramírez–Salinas y Castro-Ramírez, 2000; Aragón-García et al., 2001; Marín-Jarillo, 2001; Marín y Bújanos, 2008; Pérez-Agis et al., 2008; Ramírez-Salinas et al., 2009).

1.2.2 Plantas hospederas

El género Phyllophaga es ampliamente polífago y una sola especie puede afectar un amplio abanico de cultivos; sin embargo, algunas especies presentan especificidad; por ejemplo, en cafeto (Coffea arabica L.) se encontraron P. menentriesi y P. vicina; en espárrago (Asparagus officinalis) P. menentriesi; en fresa (Fragaria anannas) P. menentriesi, P. obsoleta y P. zunilensis; en caña de azúcar (Saccharum officinarum) P. zunilensis y P. elenans; en papa (Solanum tuberosum) y en tomate (Solanum lycopersicum) P. valeriana; en pasto kikuyo (Penissetum clandestinum) P. obsoleta (Abarca y Quesada, 1997).

Otros cultivos fuertemente afectados por el complejo Phyllophaga spp. son: repollo (Brassica oleracea), maíz ( Zea mays), frijol (Phaseolus vulgaris), arroz ( Oryza sativa), melón (Cucumis melo), yuca (Manihot esculenta), agave y diferentes especies de pasto, entre otros (King y Saunders, 1984; Espinosa-Islas

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et al., 2005; Pardo-Locarno y Montoya-Lerma, 2007; Aragón-García et al., 2008, García et al,, 2009).

Aunque el daño mayor es causado por larvas al consumir raíces, los adultos afectan también árboles frutales y plantas anuales al alimentarse del follaje, entre ellos se pueden mencionar: Erythrina spp., Hibiscus esculentus, Annona spp., Ceiba sp., Sida sp., Guazuma ulmifolia, Gliricidia sepium, Spondias sp. (Coto, 2000) y Persea americana (Londoño, 2008).

1.2.3 Biología hábitos y daño

El ciclo de vida de la gallina ciega varía de 1 a 2 años, dependiendo de la especie; en algunas puede reducirse a 6 meses, y en otras, prolongarse hasta 3 años, procesos en los que el clima juega un papel importante. Factores como la lluvia, la humedad del suelo y la temperatura influyen de manera decisiva para la ovoposición y la emergencia de los adultos la cual ocurre de mayo a junio (Nájera-Rincón, 2005).

La ovoposición se da a profundidades de 2-20 cm, dependiendo de la especie y la suavidad del terreno donde sean depositados con una distribución de 20 cm, los huevos recién depositados son de forma elongada, color blanco u opacos; después, se tornan ovalados a casi esféricos y su coloración cambia a blanco translucidos (King y Saunders, 1984, Coto, 2000).

La eclosión ocurre en un lapso de 2-6 semanas dando origen a las larvas de primer instar, periodo que transcurre entre 20-30 días durante los que aumentan de 10 a 15 veces su peso inicial; en el segundo instar incrementan 5 a 7 veces su tamaño durante un periodo de 30 a 60 días. Durante el primer y segundo instar las larvas se alimenta prácticamente de materia orgánica y de

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raíces pequeñas, son muy susceptibles a condiciones adversas como encharcamientos y enfermedades por hongos. El daño ocasionado es mínimo. Las del tercer instar son gusanos blancos, gordos, carnosos y arrugados, de color blancuzco o crema y con el cuerpo en forma de “C”, las patas son bien desarrolladas y a menudo velludas (Coto, 2000). La cabeza es grande hipognata y densamente esclerotizada, amarillo pardo, con mandíbulas grandes y pueden alcanzar tamaños de hasta 50 mm. El tercer instar es la fase más voraz y longeva; inicia entre agosto-octubre y finaliza 4-8 meses después, descienden a profundidades de 30-50 cm hasta el mes de marzo para transformarse en pupa, lo que ocurre dentro de un cocón de suelo (Marín-Jarillo, 2001). Este periodo transcurre entre 30 a 45 días; posteriormente, dando lugar al imago desarrolla su aparato reproductor y para principios de lluvias el adulto empieza a emerger durando de 8 a 30 días dependiendo de la especie; algunas incluso, pueden durar hasta 2 meses (Aragón-García et al., 2005; Ramírez-Salinas et al, 2009).

Los adultos miden de 9-21 mm de largo según la especie; son pardo obscuro a naranja-pardo, algunos son brillantes y presentan pelos sobre el cuerpo, se alimentan principalmente del follaje de árboles y arbustos, aunque también consumen el néctar de las flores y en algunos casos raíces o tubérculos al igual que las larvas (Coto, 2000; Nájera-Rincón, 2005).

En maíz, el mayor daño a la raíces lo ocasionan principalmente ocho especies de ciclo anual de la familia Melolonthidae, seis de ellas pertenecen al género Phyllophaga y dos al género Anomala. En parcelas de riego la especie que causa mayor daño es P. menetriesi y para temporal P. ravida (Ramírez-Salinas y Castro-Ramírez, 2000).

Con respecto a la distribución espacial de las larvas, se ha determinado el patrón de dispersión varía durante el ciclo de vida. La distribución es en

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agregados o de contagio al inicio y al final del ciclo es aleatorio (Nájera-Rincón, 2005).

1.2.4 Especies importantes

En Guanajuato las especies de gallina ciega de importancia económica encontradas fueron: P. ravida, P. porodera, P. setifera, P. vetula, P. misteca, P. obsoleta, P. brevidens, P. polyphylla, Cyclocephala lunulata, C. comata, C. lurida coahuilae y la especie Macrodactylus mexicanus (Marin-Jarillo, 2001; Marín y Bujanos, 2008).

En Atlixco Puebla, México, Aragón-García et al. (2001) encontraron 21 especies de los géneros Phyllophaga, Macrodactylus, Anomala, Cyclocephala, Strategus y Ligyrus. La mayor diversidad específica correspondió a Phyllophaga, representado por ocho especies entre las que predominaron P. ravida que junto con P. ilhuicaminai causan daño a las raíces de los cultivos de “estatis” Limonium sinuatum (L).

En Jalisco se han registrado las siguientes especies: P. batillifer, P. beameri, P. calculiventris, P. castaniella, P. chamacayoca, P. cometes, P. dentex, P. epulara, P. etabatesiana, P. fulviventris, P. instabilis, P. integra, P. isabellae, P. lalanza, P. lenis, P. mesophylla, P. nogueirai , P. obsoleta, P. omiltemia, P. pecca, P. pilositarsis, P. polyphylla, P. praesidii, P. pruinosa, P. punctulicollis, P. ravida, P. reyesiana, P. sandersoniana, P. satifera, P. teosinteophaga, P. vetula, P. woodruffi y P. xanthe (Morón, 1997).

Para Michoacán se encuentran a : P. cazieriana, P. certanca, P. dentex, P. emburyi, P. fulviventris, P. haagi, P. hoogstraali, P. instabilis, P. michoacana, P. microdon, P.minutissina, P. obsolete, P. opaca, P. peccata, P. pruinosa, P.

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platyrhina, P. ravida, P. rorulenta, P.sinicollis, P. tancitara, P. tumulosa, P. yucateca (Morón, 1997).

1.2.5 Fluctuación poblacional

La variación temporal de adultos de Phyllophaga spp. es influenciada por factores bióticos y abióticos de mortalidad; dentro de los primeros, la precipitación y las prácticas de cultivo, como la preparación del terreno influyen en las poblaciones de larvas y adultos. En cuanto a factores bióticos aunque poco documentado, se han registrado algunos enemigos naturales de larvas (Marín-Jarillo, 2001; Ramírez-Salinas et al., 2006). La mayor concentración de larvas de Phyllophaga spp. se registran en los primeros 20 cm de profundidad del suelo (Quijije y Mendoza, 1993).

Los adultos de P. obsoleta se encuentran en mayor abundancia en el mes de marzo, y se empiezan a notar un poco antes de la primera temporada de lluvias, su presencia se extiende incluso hasta comienzos de junio (Marín- Jarillo, 2001; Vallejo et al., 2007).

En el estado de Guanajuato se observó que los picos de mayor captura de especies se asocia con el inicio de las lluvias, no obstante estas puede variar dependiendo de las localidades donde sean capturadas; por ejemplo, para la región más húmeda del sureste del Estado, las especies de Phyllopaga aparecieron en la primera quincena de junio; sin embargo, las del norte del Estado se observaron en la primera semana de julio, y en la región central ocurrió en la primera semana de junio (Marín-Jarillo, 2001).

En Jalisco, A. inconstans se detectó desde principios de abril, antes del inicio de la estación lluviosa, mientras que P. setifera, P. fulviventris, P. pruinosa, P.

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ravida, y C. lunulata comenzaron desde los últimos días de mayo y los primeros de junio, observándose una máxima actividad para la mayoría de las especies en junio y la primera semana de julio (Pérez-Domínguez, 1991).

1.2.6 Enemigos naturales

El endoparasitoide Cryptomeigenia sp. (Diptera: Tachinidae) parasita adultos durante el periodo de vuelo de P. rufotestacea con niveles de parasitismo que van del 0% al 38.7%. El díptero oviposita de 1-45 huevos en la cavidad abdominal de los escarabajos, tanto machos como hembras. Este endoparásitoide es especifico de P. rufotestacea en estado adulto (Ramírez- Salinas, et al., 2006).

Frecuentemente se han registrado parasitoides de larvas en varias especies de gallina ciega; entre ellos, especies de la familia Tiphiidae (Hymenoptera) destacando las especies del genero Tiphia, siendo las larvas del tercer instar las más susceptibles al ataque (CNRCB, 1999 a).

En el estado de Guanajuato se ha reportado la presencia de arácnidos de la familia Lycosidae (araña lobo) en el sitio donde se realizaba el apareamiento de especies de Phyllopaga, específicamente P. vetula. Su actividad depredadora inicia atacando preferentemente individuos solitarios (Marín-Jarillo, 2001).

Varios hongos del grupo de los deuteromicetos tales como Paecilomyces, Hirsutella, Verticillium (=Lecanicillium), Akanthomyces, Beauveria y Metarhizium, han sido aislados de escarabeidos; sin embargo, solamente los dos últimos han sido considerados para el desarrollo de micoinsecticidas. Ambos hongos son habitantes del suelo y están distribuidos globalmente causando epizootias esporádicas bajo condiciones naturales (Nájera-Rincón et al, 2005).

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1.2.7 Medidas de control

Si hay una plaga que debería manejarse mediante una estrategia de manejo integrado, esa es la gallina ciega. En consecuencia, para su control se recomiendan diferentes métodos; entre ellos: cultural, biológico y químico.

1.2.7.1 Cultural

La buena preparación del terreno antes de la siembra elimina buena cantidad de larvas y huevos directamente y expone otros a la acción de sus enemigos naturales; en especial las aves, pero también la radiación solar es un importante factor de mortalidad (Coto, 2000).

Se ha mencionado que parcelas con pastizales y elevadas poblaciones de malezas incrementan las poblaciones de la plaga; lo que puede también aplicarse a la presencia de plantas, arbustos o árboles prominentes que les sirven a los adultos como alimento; consecuentemente, eliminar este tipo de malezas puede ayudar al control de gallina ciega (King, 1996; Coto, 2000).

Por otro lado, Cortez-Madrigal (2005) propone que una de las causas del incremento de plagas polífagas como la gallina ciega es la eliminación de malezas mediante herbicidas totales y la práctica del monocultivo extensivo. Ello se explica por la concentración del daño en una sola especie, en este caso constituida por el cultivo. Así, Méndez-Aguilera et al., (2008) sugieren la asociación maíz-frijol, o en todo caso, favorecer la diversidad vegetal mediante plantas espontáneas útiles como el tomate verde, pues las raíces de esas plantas ofrecen mayor opción de alimento a los insectos fitófagos edáficos.

Para el control de adultos, una medida recomendada es el uso de trampas luminosas, especialmente blancas y negras; por ejemplo, Aragón-García et al.

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(2008) mediante trampas de luz fluorescente negra atraparon hasta 91 486 ejemplares adultos de 19 especies distribuidos en 14 géneros. Se comprobó que la abundancia de la plaga fue significativamente menor en donde previamente se colocaron trampas.

La cobertura de parcelas con polietileno y malla anti-insectos, es otra alternativa para el manejo de la plaga, ayudando a evitar la ovoposición cerca de las plantas. Así, parcelas no cubiertas presentaron hasta un 94% de daño, comparado con 9-11% en las no cubiertas (Toledo, 2002).

1.2.7.2 Biológico

La bacteria más exitosa y estudiada contra larvas de escarabajos, incluyendo Phyllophaga, ha sido Bacillus popilliae. Esta bacteria forma esporas de resistencia, que le confiere ventajas como agente de control biológico. Esta característica también asegura que la bacteria formulada será estable y almacenable por periodos más prolongados (Hidalgo, 2001). Diversos productos a base de los hongos B. bassiana y M. anisopliae han sido considerados como agentes con potencial para el control de insectos del orden Hemiptera, Coleoptera, Lepidoptera, Thysanoptera, Orthoptera; por ser estos hongos habitantes normales del suelo se aplican contra larvas de gallina ciega1 (De Faria, y Wraight, 2007; Cortez-Madrigal, H., com. Personal1).

Los nematodos entomopatógenos para el control de gallina ciega se han estudiado ampliamente. Al ser ambos habitantes del suelo, las gallinas ciegas siempre están predispuestos al ataque de nematodos y diversas especies han sido aisladas de larvas de escarabeidos; Sin embargo, como resultado de su coevolución con los patógenos del suelo, las larvas de gallinas ciegas han

1 Cortez-Madrigal, H. 2011. Profesor investigador, CIIDIR-IPN, Unidad Michoacán.

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desarrollado mecanismos de defensa que les confieren diversos grados de resistencia a los nematodos (Shapiro-Ilan et al., 2002).

Los nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae, especialmente las especies, S. Carpocapsae y H. Bacteriophora son potencialmente utilizados para el control de esta plaga (CNRCB, 1999 b; Gaugler et al., 2000). Recientemente en México se ha iniciado la comercialización de nematodos entomopatógenos, siendo la gallina ciega uno de los insectos donde se recomienda su aplicación; en frutales como el aguacate dos aplicaciones de 50 millones/ha en intervalos de 14 días del nematodo S. carpocapsae, dió como resultado 79% menos de gallina ciega Phyllophaga spp.

1.2.7.3 Químico

El insecticida más usado en la actualidad para el control de plagas del suelo es el Carbofuran el cual es vendido comercialmente como Furadan®, también el insecticida Fipronil® (Frontline o Top Spot) es efectivo contra la plaga; sin embargo, son altamente tóxicos para el hombre (Ceccon et al., 2004).

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1.3 Los nematodos entomopatógenos (NE)

1.3.1 Importancia de los NE

Los nematodos entomopatógenos de los géneros Heterorhabditis y Steinernema han sido ampliamente usados en el control de plagas (Adams y Nguyen, 2002). Estos biorreguladores se caracterizan por su asociación mutualista con bacterias de los géneros Xenorhabdus para Steinenrnema y Photorhabdus para Heterorhabditis, las que desempeñan un importante papel en la patogenicidad del complejo nematodo-bacteria (Smart, 1995). Los NE poseen numerosas ventajas para su uso; entre ellas, un amplio abanico de hospederos y con excepción del huevo, pueden actuar sobre todos los estados de desarrollo del insecto (Kaya y Gaugler, 1993; Georgis et al., 2006); presentan un estadio infectivo que puede ser cultivado en grandes cantidades sobre medios naturales o artificiales, y son fácilmente aplicados en campo ejerciendo un control efectivo

(Hazir et al., 2004; Ehlers y Shapiro.Ilan, 2005) en algunos casos incluso, su efecto en el control de plagas ha sido similar o superior al químico (Georgis et al., 2006; Aquino-Bolaños et al., 2006). Otras características importantes que han contribuido a una mayor atención de estos bioinsecticidas son, a diferencia de otros entomopatógenos, su capacidad de búsqueda y de adaptación a nuevos ambientes y a condiciones adversas, su resistencia a los agentes químicos (Palomo-Soriano y García del Pino, 2000; Koppenhofer y Grewal, 2005) y su especificidad por los insectos, lo que se asocia con su inocuidad al hombre y otros mamíferos. A todo esto se suma su efecto sinérgico al poder actuar en conjunto con otros agentes biológicos (Sankar et al., 2009).

1.3.2 Morfología y taxonomía

Los nematodos entomopatógenos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae se ubican dentro del Phylum Nematoda, clase Secernentia y

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Orden Rhabditida (Tanada y Kaya, 1993). La familia Steinernematidae contiene dos géneros, Neosteinernema y Steinernema, con solo una especie del primero y 35 para el segundo (Cuadro1), aunque recientemente se encontró una nueva especie S. scarabaei que muestra un alto potencial para el control de scarabeidos (Koppenhofer y Fuzy, 2003 a). La familia Heterorhabditidae cuenta con 10 especies descritas (Hazir et al., 2004) y uniéndose al grupo de Heterorhabditidos la nueva especie H. mexicana (Nguyen et al., 2004; Shapiro-Ilan et al., 2004).

Cuadro 1. Clasificación de los nematodos entomopatógenos (Tanada y Kaya, 1993)

Phylum Clase Orden Familia Nemata Adenophorea Mermithida Tetradonematidae Mermithidae Secernentea Rhabditida Rhabditidae Steinernematidae Heterorhabditidae Oxyuridae Diplogasterida Diplogasteridae

Tylenchida Allantonematidae Sphaerulariidae Aphelenchida Aphelenchoididae Entaphelenchidae

Las características principales consideradas en las claves taxonómicas para la identificación de NE son: cápsula cefálica, región caudal, espícula, testículos y gobernáculo del macho (Stock y Kaya, 1996).

Loa géneros Heterorhabditis y Steinernema incluyen la mayor cantidad de especies entomopatógenos y han sido detectados en regiones de todo el mundo (Woodring y Kaya, 1988, Hominick, 2002); sin embargo, uno de los factores

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determinantes para la distribución de NE son las condiciones climáticas; por ejemplo, S. carpocapsae y S. feltiae se encuentran ampliamente distribuidas en las regiones templadas, H. bacteriophora es común en las regiones continentales y climas mediterráneos y; H. indica se encuentra en gran parte de los trópicos y subtrópicos (Hazir et al., 2004).

1.3.3 Ciclo de vida (Steinernema y Heterorhabditis)

El ciclo de vida de los nematodos entomopatógenos consta de huevo, cuatro estadios juveniles y adulto (Woodring y Kaya 1988). La forma infectiva es el tercer estadio, conocido como juvenil (J3), que es el único de vida libre y de resistencia, pues tienen boca y ano cerrados (Smart, 1995). En el interior llevan la bacteria Xenorhabdus spp. Para Steinernematidos y Photorhabdus spp. para Heterorhabditidos. Una vez encontrado el insecto hospedero apropiado, es penetrado por los infectivos J3 a través de boca, ano y espiráculos; la penetración directa puede ocurrir a través de la cutícula y posiblemente por heridas del insecto (Kaya y Gaugler, 1993, Grewal et al., 2OO1). Si el modo de entrada es por boca o ano, el nematodo penetra la pared intestinal para llegar al hemocele; si entra por los espiráculos, penetra la pared de la tráquea. Los juveniles infectivos de Heterorhabditis poseen un diente dorsal en la cabeza que permite la penetración vía integumento del hospedero, particularmente alrededor de la delgada área intersegmental (Kaya y Gaugler, 1993). Cuando el juvenil infecta el hemocelo del hospedero, libera la bacteria que se multiplica rápidamente en la hemolinfa y produce sustancias que protegen el cadáver de la colonización por otros microorganismos. Por lo general, el insecto muere entre 24-48 h (Smart, 1995; Grewal et al., 2001; Hazir, 2004).

Una vez muerto el hospedero, el nematodo se alimenta de los tejidos junto con la bacteria, la que ha metabolizado previamente los tejidos. Ocurren de una a

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tres generaciones, dependiendo del tamaño del hospedero (Hazir, 2004). Cuando los recursos alimenticios en el cadáver se agotan, los juveniles J3 salen del cadáver en busca de nuevos hospederos (FFigura 1) (Adams y Nguyen, 2001; Hazir, 2004).

Emergencia y migración Juveniles infectivos de juveniles infectivos entran por aberturas naturales.

Liberación de bacteria; Agotamiento de muerte del hospedero recursos.

Loos adultos se desarrollan La progenie producida (hermafroditas en Heterorhabditis, (2-3 generaciones) hembras y machos en Steinernema

Figura1. Ciclo biológico de los Steinernematidos y Heterorhabditidos (Griffin et al., 2005).

Los heterorhabditidos tienen un ciclo similar a los steinernematidos, pero se distinguen porque los J33 que entran al hospedero son hermafroditas en heterorhabditis, mientras que en steinernematidos see requiere de hembra y macho para la fertilización (Hazir, 2004; Stock y Hunt, 2005). Por lo tanto, los heterorhabditidos solo requieren de un individuo para multiplicarse dentro del hospedero (Smart, 1995; Hazir, 2004). Sinn embargo, Griffin et al. (22001) encontraron en Indonesia una especie de Steinernema en la que en la mayoría

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de los casos ocurre la auto-fertilización y solo del 1-6% la fertilización se da entre hembra y macho.

La bacteria presenta dimorfismo que se conoce como fase I y fase II. Estas fases tienen distinta morfología de colonias, pero no muestran diferencia en la patogenicidad hacia Galleria mellonella. La fase I produce antibióticos, absorbe ciertos tintes y desarrolla grandes inclusiones intracelulares; en la fase II la bacteria no absorbe tintes, no produce antibióticos y forma inclusiones intracelulares ineficientes. Existe un estrecho mutualismo entre la bacteria y el nematodo al grado que no pueden existir el uno independientemente del otro. Cada especie de nematodo está asociado a sólo una especie de bacteria, aunque una especie de bacteria puede asociarse con más de una especie de nematodo (Hazir et al., 2004).

1.3.4 Modo de acción

Los nematodos pueden infectar al huésped activamente, donde la habilidad para encontrar al hospedero es positivamente correlacionada con el CO2 producido por el hospedero (Ramos-Rodríguez et al., 2007). Además, pueden responder a signos o características disueltas en agua, raíces y plantas dañadas por insectos, proporcionando información específica de la presencia del insecto; estas señales químicas han demostrado que aumenta la atracción y la infección por H. megadis (Lewis et al., 2006).

Los juveniles infectivos pueden buscar activamente a su hospedero o esperarlo a que pase por su hábitat, en condiciones optimas pueden dispersarse en el suelo hasta 90 cm, tanto en sentido horizontal como verticalmente, además de presentar la característica de levantar de 30-95% de su cuerpo y saltar cuando se encuentra cerca de un hospedero (Hazir et al., 2004).

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1.3.5 Requerimientos ambientales

1.3.5.1 Humedad

La humedad es fundamental para mantener el estado de hidratación, movimiento e infección de los nematodos y a menudo el factor más crítico de supervivencia (Smits, 1999). Con frecuencia las condiciones ideales de humedad no se encuentran en los suelos, por lo que para garantizar condiciones adecuadas para los juveniles infectivos es recomendable el riego durante las aplicaciones de nematodos. Por ejemplo, en el cultivo del algodón, parcelas con sistema de riego son factibles para la utilización de nematodos; así, en parcelas tratadas con S. riobrave para el control del gusano rosado del algodonero, la mortalidad se incrementó después de riegos frecuentes de campo (Shapiro-Ilan et al., 2002).

Los steinermatidos pueden sobrevivir relativamente a baja humedad del suelo; sin embargo, la capacidad de búsqueda e inefectividad del hospedero puede disminuir (Kaya y Koppenhofer, 1996). En suelos arenosos con el 7% de humedad el 100% de S. laseri sobrevivió por 24 semanas; cuando se incremento la humedad considerablemente (90%) sobrevivió por 32 semanas. Para el nematodo S. carpocapsae con el 79.5% de humedad relativa (H.R) sobrevivió 12 días el 90% de los juveniles (Molyneux, 1985).

1.3.5.2 Temperatura

El efecto de la temperatura en la supervivencia de los nematodos varía con los distintos géneros y especies. Temperaturas extremas <0º C y >40ºC son letales a numerosas especies de nematodos, dependiendo del tiempo de exposición (Hazir et al., 2001).

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Los nematodos pierden movilidad a bajas temperaturas (<10-15 °C) y se inactivan a altas temperaturas (>30 a 40 °C) (Hazir et al., 2001). En suelos con temperaturas entre 12 a 28 °C se consideran propicias para la aplicación de la mayoría de especies de nematodos. Si la temperatura del suelo está por encima de 28 °C, se recomienda una aplicación pre-riego para reducir la temperatura del suelo (Lewis, 2002). En general, los steinernematidos funcionan mejor a más bajas temperaturas que los heterorhabditidos.

Las especies de nematodos nativos de regiones templadas (S. feltiae y H. megidis) tienden a ser más tolerantes a las temperaturas frías del suelo, en comparación con las especies aisladas de regiones cálidas (S. riobrave) (Kung et al., 1991).

Especies tropicales probablemente sobreviven a temperaturas inferiores a 15 °C; sin embargo, especies adaptadas al calor pueden tolerar hasta 40 °C como es el caso de H. indica (Smith, 1996), o S. riobrave que pueden tolerar exposiciones cortas a 42°C (Grewal et al., 1999); sin embargo, afectan negativamente la tasa de metabolismo y el tiempo de vida (Hazir et al., 2004).

La temperatura es el factor más importante que afecta la supervivencia de nematodos en las formulaciones comerciales. Cada especie tiene una temperatura óptima de almacenamiento, que está muy por debajo de la temperatura óptima para la actividad y reproducción de la especie y refleja las condiciones climáticas de su lugar de origen. La mayoría de las especies puede soportar un cierto nivel de desecación a la temperatura óptima de reproducción, pero la desecación directa a temperaturas extremas puede ser letal (Grewal, 2002).

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1.3.5.3 Radiación solar

Los rayos UV pueden matar a los nematodos en cuestión de minutos. La exposición directa a la luz ultravioleta puede ser minimizada mediante aplicaciones por la mañana o tarde, o el uso de suficiente cantidad de agua (Hazir et al., 2004); sin embargo, la susceptibilidad de los nematodo a la radiación solar variará dependiendo de la especie (Cuadro 2).

Cuadro 2. Tolerancia relativa de Steinernema y Heterorhabditis a las condiciones ambientales (Grewal, 2002).

Especie de Desecación Rayos UV Calor Frio nematodo

S. carpocapsae Alta Alta Moderada Alta S. feltiae Moderada Moderada Baja Alta

S. glaseri Moderada Moderada Moderada Moderada

S. riobrave Moderada Moderada Alta Baja

S. scapterisci Alta Alta Alta Baja

H. bacteriophora Baja Baja Moderada Moderada

H. megidis Moderada Baja Baja Alta

El efecto de la humedad combinado con la radiación solar es precisamente lo que limita a los nematodos entomopatógenos a actuar solo en insectos del suelo y de hábitat crípticos como es el caso de los barrenadores.

1.3.5.4 Tipo de suelo

La textura del suelo juega un papel fundamental en el desempeño de los J3. En algunos casos, se ha reportado que los suelos con alto contenido de arcilla

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interfieren con el desplazamiento de los nematodos debido a que el tamaño del poro entre las partículas es menor que el diámetro del cuerpo de los nematodos; por el contrario, texturas arenosas y francas favorecen la actividad de los nematodos, aún con escasez de humedad (Lewis, 2002).

En general, la actividad y supervivencia de los NE es menor en suelos arcillosos que en suelos arenosos y franco-arenosos (Kaya, 1990; Kung et al., 1991; Lewis, 2002) probablemente debido a los bajos niveles de oxígeno en suelos con poros más pequeñas como suelen ser los arcillosos (Hazir et al., 2004).

Estudios realizados con diferentes suelos (arenosos, areno arcilloso y franco arcillosos) a diferentes niveles de humedad con las especies Heterorhabditis sp. y Steinernema glaseri mostraron que en suelos franco-arenosos con niveles más bajos de humedad las larvas de Lucilia cuprina presentaron una alta infección; en suelos arenosos y franco-arcillosos no se registró mortalidad. Con niveles de humedad cercanos a la saturación la infección fue más alta en arena fina que en los otros dos tipos de suelo. Ambas especies de nematodos parasitaron un número similar de larvas de L. cuprina en el suelo arenoso y franco-arenoso, pero en el franco-arcilloso Heterorhabditis parasitó más que S. glaseri (Molyneux y Bedding, 1984), lo que sugiere que el efecto del tipo de suelo depende también de la especie de nematodo.

1.3.6 Especificidad y rango de hospederos

Los nematodos entomopatógenos han sido probados contra un gran número de insectos plaga obteniéndose diferentes grados de éxito. En bioensayos de laboratorio, la mayoría de los insectos son altamente susceptibles al ataca de nematodos (Kaya y Gaugler, 1993, Grewal et al., 2001); sin embargo, en condiciones naturales existen barreras que limitan su actividad benéfica, como

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los rayos solares, la temperatura, humedad y tipo de suelo (Kaya y Gaugler, 1993; Woodring y Kaya, 1988; Hazir et al., 2004). Por ejemplo, las larvas foliares de lepidópteros son muy susceptibles in vitro pero en condiciones de campo difícilmente son parasitadas por nematodos (Grewal et al., 2001). Otro ejemplo son los J3 altamente letales a mosquitos en laboratorio, pero en estanques o charcos no nadan lo suficiente para alcanzar a su hospedero (Kaya y Gaugler, 1993).

En pruebas de laboratorio, S. carpocapsae infectó a más de 250 especies de insectos de más de 75 familias en 11 órdenes (Grewal et al., 2001). No obstante mediante aplicaciones en tiempos que favorezca al nematodo pueden ejercer un buen control; por ejemplo, aplicaciones en la tarde en épocas del año con mayor humedad, etc. (Hazir et al., 2004).

Especies como S. glaseri y H. bacteriophora se caracterizan por su alta movilidad y su distribución a lo largo del perfil del suelo facilitando el parasitismo de hospederos sedentarios tales como prepupas y pupas de escarabajos y lepidópteros Algunos Steinernematidos y Heterorhabditidos son polífagos. Por ejemplo, Steinernema carpocapsae puede infectar hasta 300 especies en laboratorio (Hazir et al., 2004).

1.3.7 Especies importantes de nematodos entomopatógenos su uso en manejo de plagas

Especies como S. carpocapsae y H. bacteriophora, son ampliamente utilizadas para el control de insectos en formulaciones comerciales aunque especies como S. feltiae, S. glaseri, S. riobrave, S. scapterisci, H. megidis y H. indica son también importantes controladores de insectos (Grewal, 2002); recientemente, S. scarabaei mostro potencial para el control de larvas de escarabajos (Koppenhofer y Fuzy, 2003 a, b).

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S. carpocapsae es el nematodo más estudiado, disponible y versátil de todos (Gaugler et al., 2000; Ramos-Rodríguez et al., 20079). Mata a su hospedero en aproximadamente 48 h. Su alta virulencia se debe a la asociación mutualística entre el nematodo con la bacteria Xenorhabdus nematophilus. El huésped muerto adquiere un color café y no es fétido. Es fácil de reproducir y formularse en estado parcialmente deshidratado, lo que extiende su viabilidad a varios meses (Gaugler et al., 2000). Es particularmente efectivo contra larvas de lepidópteros. S. carpocapsae sorprende o embosca a su huésped, se para sobre su cola y ataca al hospedero que pasa; por ello, esta especie es más efectiva contra insectos de gran movilidad (van Tol y Raupp, 2005).

Steinernema scarabaei, especie recientemente encontrada en poblaciones de escarabajos en Nueva Jersey, en áreas de césped. El nematodo actúa mejor contra plagas sedentarias. Cuenta con una amplia gama de actividad termal con la infectividad óptima de 17.5 a 25 oC. Debido a su estrategia de alimentación y adaptación a las larvas de escarabajo como anfitriones, S. scarabaei tiene un potencial excepcional para el control de plagas de escarabajo (Koppenhofer y Fuzy, 2003 a).

1.3.8 Multiplicación y comercialización

Para su empleo a gran escala, los nematodos entomopatógenos pueden ser reproducidos masivamente, a través de métodos in vivo e in vitro. En los procesos in vivo, un insecto funciona como un biorreactor, y en los procesos in vitro se utiliza un medio artificial. El método in vivo es muy simple y, generalmente se emplean larvas de G. mellonella debido a la disponibilidad para su cría. Los rendimientos obtenidos oscilan entre 0.5 x 105 y 4 x 105 Juveniles/larva, de acuerdo con la especie del nematodo. Sin embargo, este procedimiento carece de economía de escala, producción y equipamiento; el

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costo del material (insecto) se incrementa como una función lineal de la capacidad de producción (Soler et al., 2003).

Otro paso significativo en la evolución de la producción de nematodos, fue la transición del cultivo sólido a la técnica de fermentación líquida. Con este método, aproximadamente disminuyen los costos de producción hasta una capacidad de 50 x 1012 Juveniles/ml. Actualmente se tienen producciones consistentes de S. carpocapsae y S. feltiae en fermentadores de 15 000-80 000 L con rendimientos de hasta 100 000 Juveniles/cm3. A pesar de haberse producido Heterorhabditis por esta vía, los resultados no son tan consistentes como con Steinernema, especialmente en grandes fermentadores (7 500-80 000 L). Por esta razón, los heterorhabditidos se reproducen exitosamente por cultivo sólido (Soler et al., 2003).

1.3.9 Formulación y estrategias de aplicación

Las características de los NE permiten utilizar diferentes estrategias con la finalidad de prolongar su viabilidad, por ejemplo se ha empleado la técnica de encapsulación en una matriz polimérica (Alginato de calcio) (Kaya y Nelsen, 1985). Los nematodos formulados probaron ser estables durante 8 meses en envases cerrados a 4°C y durante 3-4 meses a temperatura ambiente. No obstante, para su aplicación se requiere de la adición previa de citrato de sodio, con el objetivo de liberar los nematodos de la matriz del gel de alginato, lo cual significa tiempo consumido en el paso de extracción (Soler et al., 2003)

Otra de las formas de inmovilizar a los nematodos para preservar sus energías lipídicas, es en capas pseudoplásticas, a través de agentes como las gomas rhansana y Xanthana (Soler et al., 2003). También se ha investigado con

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sustancias que actúan como filtros solares para proteger a los nematodos de los efectos de la radiación solar (Nickle y Shapiro, 1994)

Una de las formas más comunes y sencillas de formular nematodos es en esponjas de poliuretano, donde se almacenan pequeñas cantidades (usualmente 500-1000 JI/cm2 de superficie). Normalmente, en una sola pieza de esponja se colocan de 5-25 x 106 Juveniles, que se introduce a su vez en una bolsa de polietileno. De este modo, se pueden almacenar durante 1-3 meses a 5-10 °C (Grewal, 1998).

La formulación con vermiculita significó un avance con respecto a las esponjas y a las arcillas, porque permite lograr un producto con una mayor concentración de nematodos, una mayor estabilidad en el almacenamiento y una aplicación directa al tanque de aplicación. Con esta formulación se ha podido almacenar S. feltiae durante 4-5 meses y H. megidis por 3 meses a temperaturas de 3-5°C (Grewal, 1998).

Hasta el momento, la formulación con más éxito ha sido con gránulos dispersables en agua; para esto, se emplea un proceso de granulación húmeda convencional. Los nematodos contenidos en los gránulos, una vez rehidratados en agua o suelo húmedo durante 72 horas, probaron ser igualmente eficaces contra una plaga insectil y superiores a los nematodos sin rehidratar (Soler et al., 2003).

Aunque el concepto general de las formulaciones de los nematodos es similar a las formulaciones de plaguicidas tradicionales, los nematodos presentan desafíos únicos, como por ejemplo altas demandas de oxigeno y humedad, la sensibilidad a las temperaturas extremas, y comportamiento de los juveniles infectivos limita la elección del método de formulación y ingredientes (Grewal y Peters, 2005). El objetivo principal de las formulaciones

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de nematodos en desarrollo incluyen el mantenimiento de la calidad, la mejora de la estabilidad en el almacenamiento, la mejora en la facilidad de transporte y uso, reducción de los costos de transporte, y la mejora de la supervivencia de los nematodos durante y después de de la aplicación.

Se han elaborado formulaciones para incrementar la vida útil de los steinernematidos y heterorhabditidos, algunas están disponibles comercialmente (Cuadro 3) (Grewal y Peters, 2005).

Se comercializan siete especies. Se recomienda aplicar 250 000 nematodos/m2 para controlar la mayoría de insectos del suelo (Georgis y Gaugler, 1991). Los nematodos pueden aplicarse de diferentes formas; al igual que otros entomopatógenos, las técnicas de aspersión de plaguicidas convencionales son las más comúnmente usadas; pero también se han aplicado con el agua de riego, en los cadáveres del insecto hospedero (Shapiro et al., 2001; Koppenhofer, 2000), en motas de algodón para insectos barrenadores (Cortez- Madrigal, datos no publicados). Aunque la técnica de autodiseminación de entomopatógenos no se recomienda para los nematodos entomopatógenos (Vega, 2000) quizá en algunos insectos pudieran aplicarse de ese modo.

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Cuadro 3. Tiempo de viabilidad de Steinernema spp. y Heterorhabditis spp. en las formulaciones (Grewal y Peters, 2005)

Tiempo de vida ( meses ) Formulación Especie de nematodo 22-25°C 2-10°C Activa el movimiento de nematodos

Esponja a S. carpocapsae 0.03-0.1 2.0-3.0 H. bacteriohora 0 1.0-2.0 a Vermiculita S. carpocapsa 0.1-0.2 5.0-6.0 S. feltiae 0.03-0.1 4.0-5.0 H. megidis 0 2.0-3.0 Reduce movimiento de Nematodos

Gel de alginato S. carpocapsae 3.0-4.0 6.0-9.0 S. feltiae 0.5-1.0 4.0-5.0 Geles fluidos S. carpocapsae 1.0-1.5 3.0-5.0 S. glaseri 0.03-0.06 1.0-1.5 S. scapterisci 1.0-1.5 3.0-4.0

Concentracion liquida a S. carpocapsae 0.16-0.2 0.4-0.5 S. riobrave 0.1-0.13 0.23-0.3

Nematodos en anhidrobiósis

Polvos húmedos S. carpocapsae 2.0-3.5 6.0-8.0 S. feltiae 2.5-3.0 5.0-6.0

H. megidis 2.0-3.O 4.0-5.0 H. zealandica 1.0-2.0 3.0-4.0 S. carpocapsae 4.0-5.0 9.0-12.0

Dispersables en agua

Granulados a S. feltiae 1.5-2.0 5.0-7.0

S. riobrave 2.0-3.0 4.0-5.0

a a formulaciones disponibles comercialmente

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1.4 Objetivo general

Conocer el potencial del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis indica en el manejo de dos plagas de importancia agrícola: Copturus aguacatae y Phyllophaga spp.

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1.5 Literatura citada

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CAPITULO II: PARASITISMO DE LARVAS DE Copturus aguacatae (COLEOPTERA: CURCULIONIDAE) POR Heterorhabditis indica (RHABDITIDA: HETEROHABDITIDAE)

2.1 Introducción

Con una superficie de 121 491 ha cosechadas y una producción de 1 230 970 ton, el aguacate es uno de los principales cultivos perenes de México y hace de este país el primer productor mundial (FAOSTAT, 2009). En México, el estado de Michoacán es el principal productor, con una superficie de 98,463 ha y una producción de 1, 006,059 ton (SAGARPA, 2009). Aunque México es consumidor importante de aguacate, gran parte de la producción se exporta a diversos países, donde destaca Estados Unidos de Norteamérica, con el 41.8% de las importaciones (Salazar-García et al., 2005; INEGI, 2006). Sin embargo, la exportación de aguacate es limitada por diversos problemas de plagas, donde destaca el barrenador de ramas Copturus aguacatae Kissinger 1957 (NOM-066- FITO, 2002). Junto con los barrenadores del hueso Conotrachelus aguacatae Barber y C. persea Barber (Coleóptera: Cucurlionidae), las pérdidas del cultivo fluctúan de 2-3 ton/ha; el control de ambos insectos incluye un poco más del 15% del costo total del cultivo (SENASICA, 2009).

C. aguacatae (Coleoptera: Curculionidae) presenta amplia distribución en las zonas productoras de aguacate de México (Talavera y Padilla, 2003) y está categorizado de máximo riesgo para su introducción y establecimiento en zonas productoras de aguacate para exportación. Su daño inicia con la ovipostura de las hembras bajo la corteza de las ramas y posteriormente por la penetración de las larvas al interior de ellas. La larva barrena la rama hasta llegar a la médula, causando defoliación, aborto de flores y marchites de frutos. En altas infestaciones las ramas con frutos pueden quebrarse y así perder la producción

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(Equihua-Martínez, 2001; Equihua-Martínez et al., 2007). No obstante el pequeño tamaño del insecto, su ciclo biológico es largo (215.8-285 días), pasando por cinco instares larvarios. Se reporta una sola generación anual (Talavera y Padilla, 2003; Coria et al., 2007).

El largo ciclo biológico y el hábitat críptico de las larvas dificulta el control de C. aguacatae; se basa en la combinación de estrategias culturales (poda), aplicación de insecticidas órgano-sintéticos y de manera limitada, el control biológico mediante hongos entomopatógenos (Equihua-Martínez et al., 2007, Coria et al., 2007). La poda “obligada” del aguacate; es decir, de las ramas infestadas, no siempre es deseable, mientras que depender del control químico como estrategia principal tiene serias desventajas; principalmente por la contaminación, eliminación de enemigos naturales de plagas, y por el desarrollo de resistencia de las plagas. Adicionalmente, las limitantes impuestas en la aplicación de productos químicos en aguacate como producto de exportación y los hábitos crípticos del barrenador reducen en gran medida la eficacia de los productos químicos (González et al., 2000).

Una alternativa es el control biológico en donde el control microbiano ha cobrado fundamental importancia en los últimos años (Tanada y Kaya, 1993). Los insecticidas microbiales con mayor potencial para el manejo de barrenadores son los basados en nematodos entomopatógenos (NE) de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae (Kaya y Gaugler, 1993; Tanada y Kaya, 1993; Georgis et al., 2006).

Diversos estudios con insectos barrenadores demuestran el potencial de los NE en el control de insectos de hábitat crípticos (Saphiro y McCoy, 2000; Aquino- Bolaños et al., 2006; Cortez-Madrigal et al., 2009; Abbas, 2010). Sin embargo, solo un estudio ha sido documentado sobre el uso de NE en C. aguacatae, pero

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los resultados encontrados parecen ser inconsistentes (Huerta de la Peña et al., 1990).

Por lo anterior y siendo el aguacate uno de los cultivos de mayor importancia económica para México y Michoacán, urge desarrollar estrategias de control de plagas más sanas para el ambiente y el desarrollo humano.

2.1.1 Objetivo

Documentar el potencial del nematodo entomopatógeno H. indica cepa Tab-03 en el control de larvas de C. Aguacatae.

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2.2 Materiales y métodos

2.2.1 Material biológico

Las larvas de C. aguacatae se colectaron en campo de la región aguacatera de Atapan, Los Reyes, Mich. Las ramas de aguacate con daños por barrenador fueron transportadas al laboratorio de entomología del CIIDIR-IPN en Jiquilpan, Mich. durante los meses de marzo, abril, mayo, junio y octubre del 2010, y enero del 2011.

Se utilizó la especie de nematodo H. indica cepa Tab-03, aislada de Tabasco, México. por Cortez-Madrigal (2003) y conservada en el Laboratorio de Entomología del Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional del Instituto Politécnico Nacional (CIIDIR-IPN) en Jiquilpan, Mich. El nematodo se multiplica en larvas de Galleria mellonella (Lep: Pyralidae). Los nematodos utilizados fueron de 10 días de emergidos.

2.2.2 Efecto de H. indica en larvas de C. aguacatae in vitro

2.2.2.1 Bioensayo preliminar

A partir de ramas colectadas en campo, mediante tijeras de podar se abrieron las ramas para obtener larvas de C. aguacatae. Dado que fueron poblaciones de campo, la edad de las larvas varió, distinguiéndose larvas desde el 1° hasta el 3° instar, predominando 2° y 3° instar.

En recipientes de plástico de 5 x 6 cm con una toalla de papel en el fondo, se añadió 1 ml de una suspensión conocida de nematodos (2 500 ml-1) con viabilidad > 95%, más 1 ml de agua para proporcionar humedad favorable al nematodo; inmediatamente, se depositó una larva de C. aguacatae (2°-3° instar) por recipiente y se colocó la tapa, previamente perforada para favorecer

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el intercambio gaseoso. Se establecieron tres repeticiones con 10-14 larvas/repetición. Se contó con un testigo con solo aplicación de agua.

Los recipientes se mantuvieron a 25 ± 1 °C, en total oscuridad. A partir de las 24 h se realizaron lecturas cada 2 h, y con la finalidad de determinar el tiempo en que murió el 50% de la población (TL50), la frecuencia de las lecturas se acortó conforme aumentó la mortalidad. Los datos se analizaron con base a un análisis probit, previa transformación a un modelo cuadrático completo, mediante el programa estadístico SAS (1999).

2.2.2.2 Evaluación de dosis

Adicional a la concentración preliminarmente evaluada considerada como 1%, se evaluaron tres concentraciones más: 0.1% (250 nematodos ml-1), 0.01% (25 nematodos ml-1) y 0.001% (2.5 nematodos ml-1). En el análisis se incluyó la concentración del 1%. La evaluación se llevo a cabo de manera similar al bioensayo preliminar. Los datos se procesaron mediante análisis de varianza bajo un diseño completamente al azar y la separación de medias mediante Tukey (0.05).

2.2.3 Bioensayo preliminar con larvas dentro de ramas

Durante el mes de octubre del 2010 se colectaron en la región de Atapan, Los Reyes, Mich. ramas de aguacate cv. Hass con daños de C. aguacatae. Para determinar el potencial de H. indica en la mortalidad de C. aguacate dentro de ramas, se realizó un primer bioensayo a dosis de 2 500 nematodos mL-1. Mediante un aspersor manual, la suspensión de nematodos se asperjo directamente sobre la rama donde se encontraban las larvas; inmediatamente, las ramas se colocaron en bolsas de plástico herméticamente selladas para

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evitar la pérdida de humedad. Se consideraron tres repeticiones de siete ramas cada una, más un testigo con solo aplicación de agua. El experimento se desarrolló a 25 ± 1°C en completa obscuridad. Después de 10 días las ramas se abrieron para registrar el estado de las larvas. Los datos se analizaron mediante estadísticas descriptivas.

2.2.4 Técnicas de aplicación de H. indica en larvas dentro de ramas

Durante el mes de enero del 2011, ramas de aguacate cv. Hass infestadas con larvas de C. aguacatae fueron colectadas en la región de San Rafael, Los Reyes, Michoacán. y transportadas al laboratorio de entomología del CIIDIR-IPN, en Jiquilpan, Mich.

Para favorecer el ingreso del nematodo en las galerías de C. aguacatae, cuatro estrategias de aplicación fueron evaluadas: savia (“baba”) de nopal (100 g/250 ml de agua)(Tr-B), grenetina (21 g/250 ml de agua) (Tr-G), agua y agua + cubierta de plástico (Bolsipack ®)(Tr-P). Cada uno de los tratamientos incluyó un testigo sin nematodos. Se preparó una suspensión de nematodos de la especie H. indica a una concentración de 500 nematodos ml-1. Cintas de esponja de 30 x 5 cm fueron saturadas con 30 ml de la suspensión de nematodos y una rama de 20 cm infestada con larvas del barrenador fue cubierta con la esponja. Dos repeticiones fueron consideradas, con cuatro ramas por repetición. Las ramas se colocaron en bolsas de plástico, selladas para evitar la pérdida de humedad. El experimento se desarrollo a 25 ± 1°C en completa obscuridad. Después de 15 días se abrieron las ramas para registrar el estado de las larvas. Observaciones adicionales sobre la longitud de las galerías, presencia y viabilidad de los nematodos en el aserrín de las galerías y el instar larvario fueron registrados. Las larvas muertas se colocaron en

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trampas White (Woodring y Kaya, 1988) para observar la posible emergencia de los J3. Los datos se analizaron mediante estadísticas descriptivas.

2.2.5 Caracterización del aserrín de galerías de C. aguacatae

Para una mejor interpretación de los resultados de los bioensayos con larvas dentro de ramas, se consideró conveniente llevar a cabo una caracterización del “aserrín” producto de la alimentación y desechos de las larvas de C. aguacatae dentro de las galerías.

2.2.5.1 Análisis granulométrico de partículas

Con la finalidad de permitir el tamizado, una muestra de 10 g de aserrín obtenido de galerías de C. aguacatae fue secada en estufa a 120 °C durante 2 h. El aserrín se tamizo durante 10 minutos, empleando los juegos de mallas especificados en la descripción de las cribas (2. 38, 1.19, 0.50, 0.4318, 0.149 y 0.177 mm) posteriormente se peso el material que logró pasar en cada una de los tamices, incluyendo el fondo o base de los tamices. Para conocer el tamaño de las partículas se realizaron mediciones largo por ancho de dos maneras: para las partículas de las dos primeras cribas se utilizó el vernier bajo el estereoscopio, y los valores son en mm; para las últimas cinco cribas debido al diminuto tamaño de las partículas la medición se realizó mediante un micrómetro adaptado al microscopio compuesto (40X) y la unidad de medida fue en micras.

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2.2.5.2 Determinación del contenido de humedad

El contenido de humedad se realizó mediante el proceso de diferencia de pesada; para ello, se pesó 1 g de muestra, se secó a 103 ºC por 24 h, inmediatamente después se pasó al desecador por 24 h y se peso la muestra, una vez anotado el peso de los crisoles, se llevó nuevamente a la estufa por 24 h, después de este tiempo se pasó al desecador. Se repitieron las operaciones anteriores hasta obtener peso constante.

2.2.5.3 Determinación del pH

Se emplearon los métodos citados por Roffael et al. (2000). Se tomó 1 g de material de la porción fina obtenida del análisis granulométrico de las partículas, se introdujeron en un matraz, se mezclaron con 10 ml de agua destilada, y se agitaron durante 4 h. Finalizado el tiempo, se tomó la lectura del pH utilizando un potenciómetro.

2.2.5.4 Conductividad eléctrica (C.E.)

Se siguió el mismo procedimiento que para la determinación de pH; es decir, del sobrenadante utilizado para tomar la lectura de pH se toma también la lectura de C.E, utilizando para este caso un conductímetro para obtener el valor correspondiente.

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2.3 Resultados y discusión

2.3.1 Susceptibilidad de larvas de C. aguacatae hacia H. indica

De acuerdo con los resultados obtenidos el nematodo H. indica causó alta mortalidad en larvas de C. aguacatae. Los síntomas de los insectos parasitados por el nematodo fueron los característicos para el género: disminución en su movilidad y posteriormente la muerte; ausencia de olor y coloración rojo ladrillo (Figura 2) (Tanada y Kaya, 1993; Gaugler et al., 2000); nueve días después emergieron los juveniles (J3) del nematodo.

Figura 2. Aspecto de larva de C. aguacatae muerta por H. indica.

Al parecer, las larvas del barrenador fueron adecuadas para el desarrollo del nematodo, pues no obstante su pequeña talla (4.9-10 mm), el rango de juveniles que emergieron fluctuó desde 386 a 3,426.66 juveniles/larva (Figura 3). En el testigo no se registró mortalidad.

Con base al análisis probit, previa transformación a un modelo cuadrático completo (p = 0.0001), el tiempo letal estimado en que murió el 50% de la

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3500 3000 2500 2000 1500

1000 500 0 Número de juveniles 12345 678910 Número de larva

Figura 3. Emergencia de nematodos juveniles (J3) en larvas de C. aguacatae. población (TL50) con una concentración de 2 500 nematodos ml-1 (1%) fue de 28.8 h (27.2–29.7 h), mientras que el 100% con esa misma dosis se alcanzó a las 44 h (43.9– 45.9 h) (Figura 4).

120 100%= 44h 100

80 (%) (%)

d TL50= 28.8hrs

a 60 lid a

t 40 or

M M t lid20 d

0 0 10 20 30 40 50 Tiempo (hh)

Figura 4. Tiempo de mortalidad de C. aguacatae tratadaas in vitro con el nematodo Heterorhabditis indica.

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Por otra parte, de las cuatro concentraciones evaluadas, la del 1% fue la que causó la mayor mortalidad, sin existir diferencias estadísticas (p = 0.0001) con la concentración del 0.1% (Cuadro 4).

Cuadro 4. Mortalidad de C. aguacatae en función de diferentes concentraciones del nematodo Heterorhabditis indica.

Concentración (%) Número de Mortalidad (%) nematodos/ml

1 2500 96.6a ± 5.7 A

0.1 250 93.3 ± 5.7 A

0.01 25 76.6± 5.7 B

0.001 2.5 43.3 ± 5.7 C

a Medias previamente transformadas al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción ± desviación estándar seguidas de la misma letra no difieren estadísticamente (Tukey ≤ 0.05).

Lo anterior indica una alta susceptibilidad de las larvas de C. aguacate, hacia H. indica pues el TL50 está dentro del indicado para insectos susceptibles a NE, ubicado entre 24-48 h. De igual manera la baja dosis requerida (250 nematodos ml-1) para matar el 50% de la población sustenta dicha aseveración.

Ya ha sido documentada la alta virulencia de H. indica en otras larvas de curculionidos. Cortez-Madrigal et al. (2009) registraron mortalidades cercanas al 100% de larvas del picudo del nopal Metamasius spinolae después de 57 h de ser aplicado el nematodo H. indica a concentraciones de 200 juveniles infectivos ml-1. El tiempo en que murió el 50% de la población (TL50) de larvas fue de 34 h.

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2.3.2 Bioensayo preliminar dentro de ramas

Después de 10 días de incubación la mortalidad registrada en el tratamiento fue mayor que la del testigo donde en ninguno de los casos se registró mortalidad. Sin embargo, los cadáveres de los tratamientos no mostraron la sintomatología característica de los NE del género Heterorhabditis y no se recuperaron los juveniles correspondientes (Cuadro 5).

Cuadro 5. Resultados del bioensayo preliminar del efecto de H. indica sobre larvas de C. aguacatae dentro de ramas.

Tratamiento Testigo

Número de Emergencia Número de Mortalidad (%) larvas Mortalidad de larvas por rama (%) nematodos 9 11 0 2 0 10 0 0 5 0 7 0 0 3 0 8 25 0 6 0 2 0 0 5 0 9 11 0 4 0 5 16 0 1 0

Los resultados del bioensayo preliminar para determinar la capacidad de H. indica de penetrar dentro de las galerías de C. aguacate indican fuertes limitaciones para el ingreso del nematodo. Aunque en este caso la mayoría de larvas del barrenador se encontraban a poca profundidad, probablemente la estrategia de aplicación no fue la indicada. Al poco tiempo de asperjar la suspensión de nematodos, se observó escurrimiento del agua y con ello arrastre de nematodos lo que redujo el número de juveniles disponibles para entrar en la galería. Al respecto se sabe que de las técnicas de aplicación de plaguicidas, la de aspersión es la menos eficiente, pues una gran cantidad del ingrediente activo es depositado fuera del objetivo (Bateman y Chapple, 2001).

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A diferencia del trabajo, Huerta de la Peña et al. (1990) señalan haber obtenido mortalidad de larvas de C. aguacatae dentro de ramas mediante la aspersión de NE de las especies S. bibiones y H. heliothidis a dosis de de 500 y 1000 NE ml-1. Después de cinco días encontraron mortalidades que variaron desde 5% hasta 37.5%, dependiendo de la especie, donde Heterorhabditis fue superior; sin embargo, los resultados no fueron consistentes con las diferentes dosis evaluadas. Además, no se indican detalles del estudio como: edad de la larva, profundidad de la galería y emergencia de juveniles, que pudieran demostrar la capacidad de penetración de los nematodos.

A diferencia de los plaguicidas órgano-sintéticos, diversas estrategias de aplicación de nematodos han sido sugeridas (Koppenhöfer y Kaya, 2002); por ejemplo, mediante el uso de motas de algodón empapadas con suspensión de nematodos se logró una mortalidad hasta del 100% del barrenador limpio del higo Azochis gripusalis Walker (Cortez-Madrigal, datos no publicados). Por lo tanto, es probable que la evaluación de otras técnicas de aplicación pudieran eficientar la acción de H. indica.

2.3.3 Estrategias de aplicación de H. indica en ramas

Quince días después de la aplicación de los nematodos, en todos los tratamientos se registró mortalidad de C. aguacatae; sin embargo, la mayoría de los cadáveres tratados con NE no presentaron los síntomas característicos de muerte por nematodos del género Heterorhabditis. Con excepción del tratamiento a base de baba de nopal sin nematodos, en ninguno de los testigos se registró muerte de larvas (Cuadro 6).

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Cuadro 6. Mortalidad de C. aguacatae dentro de ramas mediante diferentes estrategias de aplicación del nematodo H. indica.

Tratamiento Testigo

N° de Mortalidad Nematodos- N° Mortalidad larvas por (%) emergencia Larvas (%) rama (%)

Tr-N 8 87.7 0 3 100

Tr-G 4 100 0 6 0

Tr-A 15 73.33 0 6 0

Tr-P 8 100 28 16 0

Con base a las medidas de las larvas (8 a 10 mm) a diferencia del experimento preliminar, este bioensayo se practicó en tercero y cuarto instar del barrenador, llegando el daño hasta una profundidad de 4 a 10 mm y totalmente cubiertas por excreciones del insecto (aserrín). Es importante señalar que en algunos casos el aserrín se observó húmedo y aparentemente hubo presencia de nematodos en él, lo que indica que H. indica intentó penetrar las galerías y alcanzar en algunos casos al insecto y matarlo, tal como ocurrió en el tratamiento agua + plástico (Cuadro 6); sin embargo, es probable que su movilidad se vea limitada por el aserrín, y probablemente éste interfiera también con la detección por el nematodo del C02 liberado por la larva, dificultando así su localización por los nematodos. Se sabe que uno de los factores que facilitan la localización del hospedero por los NE es el CO2 liberado por el insecto (Lewis et al., 2006; Ramos-Rodríguez et al., 2007).

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Aplicaciones más tempranas de nematodos sobre las ramas pudieran ser más eficaces; sin embargo, es necesario un conocimiento más preciso de la biología del insecto que nos permita aplicar oportunamente los nematodos.

Resultados similares a los aquí encontrados han sido reportados para otros curculionidos barrenadores. Por ejemplo, el picudo de la palma roja (RPW) Rhynchophorus ferrugineus fue altamente susceptible a las especies S. abbasi y H. indica en condiciones de laboratorio a concentraciones tan bajas como 100 y 200 JI/larva, y aunque la mortalidad fue alta, solo 11.5% y 8.6% de cadáveres produjeron juveniles infectivos (Abbas, 2010).

Es probable entonces que la mortalidad registrada en los diferentes tratamientos del presente estudio haya sido causada por los nematodos; sin embargo, el haber revisado las ramas 15 días después pudo impedir encontrarlos dentro de las larvas. Al respecto se sabe que H. indica tiene un ciclo de 9.08±2.1 días a 25 oC (Cortez-Madrigal et al., 2003).

2.3.4 Caracterización de aserrín

El aserrín de las galerías de C. aguacatae corresponde a gránulos de superficie lisa, de forma ligeramente redondeada a irregular; su tamaño es variable, encontrando partículas en todos los tamices usados e incluso en el fondo o base de los tamices (Cuadro 7).

Los valores de humedad (7.13%) son bajos respecto a los que requieren los nematodos para su movilidad, lo cual podría ser un factor determinante para el ingreso a las galerías; sin embargo, se han encontrado nematodos en suelos con 10% de humedad (Giayetto y Chichón, 2006); en condiciones de

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invernadero se han aplicado nematodos con humedades cercanas al 9%, valores que son cercanos al encontrado en el aserrín.

Cuadro 7. Tamaño de partícula de aserrín de las galerías de C. aguacatae.

Tamaño de Tamaño de partícula Unidad de criba (mm) (L x A) medida

2. 38 2.5 x 2.3 a 1.1 x 1.9 mm

1.19 1.4 x 0.8 a 0.7 x 0.4 mm

0.50 260 x 182 a 221 x 234 c

0.43 239.20 x 156 a 174.20 x 202.80 c

0.177 156 x 135.20 a 78 x 83.20 c

0.149 78 x 62.40 a 39 x 33.80 c

Fondo 2 x1.56 a 1.30 x 1.56 c

Las lecturas registradas de pH (7.37) y C.E (119 µs) están dentro de los rangos de actividad e infectividad de los nematodos, por lo que estos valores no afectan la eficiencia de los juveniles infectivos.

Dado que las características de las galerías de diversos barrenadores donde se han aplicado exitosamente NE son diferentes a las de C. aguacatae, en donde la

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galería es bloqueada con aserrín, producto de su alimentación y excreción, no existen hasta donde sabemos estudios sobre la caracterización de ese producto. Los NE son habitantes del suelo y las características físico-químicas del mismo son determinantes en la actividad de esos organismos. De acuerdo con los análisis efectuados al aserrín, no existen limitantes químicas para que H. indica logre su eficiencia dentro de las galerías; sin embargo, las características físicas, como la variabilidad en tamaño y forma de partículas, que a su vez determina la porosidad, pudiera limitar la movilidad del nematodo tal como fue observado en el presente estudio.

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2.4 Conclusiones

El nematodo Heterorhabditis indica mostró alta virulencia hacia larvas de C. aguacate fuera de ramas en condiciones de laboratorio. El TL50 estimado fue de 28.8 h, mientras que el 100% de mortalidad estimado se obtuvo 44 h después.

La dosis óptima fue de 250 nematodos ml-1 con una mortalidad del 93.3 ± 5.7%.

Bajo las condiciones de estudio, los resultados indican fuertes limitaciones de H. indica para penetrar e infectar a C. aguacate dentro de las galerías, lo cual es altamente influenciado por la presencia de aserrín dentro de las galerías (edad de la larva) y la técnica de aplicación.

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2.5 Literatura citada

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CAPITULO III: INFECTIVIDAD DE Heterorhabditis indica (RHABDITIDA: HETERORHABDITIDAE) EN ADULTOS Y LARVAS DE Phyllophaga spp.

3.1 Introducción

El complejo de especies Phyllophaga spp. constituye una de las plagas agrícolas de mayor importancia económica debido a sus hábitos polífagos y su amplia distribución (King y Saúnders, 1984; Morón, 1997). En México, el género se encuentra ampliamente distribuido incluyendo los estados de Chiapas, Guanajuato, Jalisco, Estado de México, Puebla y Michoacán (Ramírez–Salinas y Castro-Ramírez, 2000; Aragón-García et al., 2001; Morón y Rivera-Cervantes, 2005; Marín y Bújanos, 2008; Pérez-Agis et al., 2008).

La gallina ciega se alimenta de una gran diversidad de especies silvestres y cultivadas; entre ellas: papa (Solanum tuberosum), maíz (Zea mays), repollo (Brassica oleracea), frijol (Phaseolus vulgaris), arroz (Oryza sativa), tomate (Solanum licopersicum), caña de azúcar (Sachurumm offcinarum), melón (Cucumis melo), café (Coffea arabica), yuca (Manihot esculenta) y diferentes especies de pasto y ornamentales, entre otros (King y Saúnder, 1984; Morón, 2003; Espinosa-Islas et al., 2005; Pardo-Locarno y Montoya-Lerma, 2007; Vallejo et al., 2007; Aragón-García et al., 2008).

Las larvas de Phyllopahaga dañan directamente las raíces de la planta, lo que afecta su desarrollo y en muchos casos ocasiona la muerte de la planta (King y Saúnders, 1984; Ramírez–Salinas y Castro-Ramírez, 2000). Aunque el daño mayor es a la raíz, lo adultos afectan también árboles frutales y plantas anuales al alimentarse del follaje, entre ellos se mencionan: Erythrina spp., Hibiscus esculentus, Annona spp., Ceiba sp., Sida sp., Guazuma ulmifolia, Gliricidia sepium, Spondias sp. (Coto, 2000) y Persea americana (Londoño, 2008).

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Diversos factores influyen para la aparición y persistencia de la plaga; entre ellos, características agroclimáticas y de manejo del cultivo por ejemplo, C. lunulata prefiere mayor contenido de materia orgánica y suelos ricos en fósforo; P. ravida prefiere suelos con alto contenido de manganeso y suelos ricos en fósforo; P. dentex se presenta en función del contenido de manganeso del suelo y la precipitación pluvial ocurrida; P. polyphylla mostró asociación con el porcentaje de arena y nivel de pH (Díaz-Mederos et al., 2006).

Se ha propuesto que el problema de plagas polífagas como la gallina ciega ha sido agravado por la práctica del monocultivo y el uso de herbicidas residuales de acción total, como las triazinas (Cortez-Madrigal, 2005). En ese sentido, algunos autores recomiendan un solo deshierbe en el cultivo del maíz para que durante el instar de mayor daño de la plaga (3°), existan otras plantas y el daño no sea solo en las raíces del cultivo (Díaz-Mederos et al., 2006).

Considerando lo anterior, el manejo de la plaga enfatiza en un manejo integrado de la plaga priorizando las estrategias ecológicas. Entre las estrategias de control de larvas de gallina ciega se incluyen: medidas culturales (barbechos y rotación de cultivos, barreras físicas), control biológico y control químico (King y Saúnders, 1984; Toledo, 2002); Sin embargo, la estrategia más empleada continua siendo la aplicación de productos químicos al suelo (King y Saúnders, 1984; Ceccon et al., 2004).

Los daños colaterales derivados del uso del plaguicidas han sido ampliamente documentados; entre ellos; eliminación de enemigos naturales, resistencia de la plaga e intoxicación de trabajadores, entre otros (Pimentel y Edwards, 1982; Seefoó, 2005). El hábitat, amplia distribución y polifagia de la gallina ciega (Morón, 1997; King y Saúnders, 1984; Ramírez–Salinas, y Castro-Ramírez, 2000; Morón y Rivera-Cervantes, 2005; Marín y Bújanos, 2008; Pérez-Agis et

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al., 2008; Ramírez-Salinas et al., 2009) sugiere que el uso de productos químicos para su control magnifica los efectos colaterales de esos productos.

En la actualidad se buscan estrategias de control de plagas más amigables con el ambiente; entre ellas, el uso de microorganismos patógenos de insectos como hongos y nematodos (Gaugler et al., 2000; De Faria y Wraight, 2007). Los nematodos entomopatógenos (NE) presentan habilidad para matar insectos rápidamente (24-48 hr) debido a la presencia de bacterias mutualísticas en su interior. Sus principales hospederos son los insectos del suelo, hábitat natural de los NE (Adams y Nguyen, 2002). Diversos estudios documentan la eficacia de plagas del suelo (Georgis et al., 2006; Aquino-Bolaños et al., 2006). Para el caso de larvas de la familia Scarabaeidae (gallinas ciegas) los resultados han sido variables. Así por ejemplo, Rodríguez et al. (2009) encontraron mortalidades bajas (24%) de larvas de la especie Phyllophaga elenans con el nematodo Heterorhabditis sp. aplicado a dosis de 625 NE ml-1; en contraposición, la especie Steinernema scarabaei causó mortalidades del 80 al 100% en el 3° instar de la especie Popilia japonica (Koppenhofer y Fuzy et al., 2003).

Aunque el control de la gallina ciega ha sido generalmente dirigido a las larvas (Quintero-Marín, 2003; Koppenhöffer y Fuzy 2004; Melo-Molina et al., 2007; Rodríguez et al., 2009). Se ha comprobado que mediante el control del adulto es factible reducir también las poblaciones y daños de las larvas de gallinas ciegas; por ejemplo, Badilla et al. (1999) colectaron altos porcentajes de Phyllophaga spp. mediante trampas de luz en el cultivo de la caña de azúcar en Costa rica, lo que logro reducir el daño por el insecto en el cultivo. De igual manera, en Santa Cruz Alpuyeca, Puebla, el daño de gallina ciega en cultivos de maíz fue menor en parcelas donde previamente se colocaron trampas luminosas para la captura de adultos que en parcelas donde no se utilizaron las trampas (Aragón-García et al., 2008).

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Dada su amplio abanico de hospederos, los NE pudieran también infectar y matar adultos de gallina ciega; sin embargo, hasta donde sabemos esos entomopatógenos no han sido evaluados en el control de adultos de la plaga.

3.1.1 Objetivos

Determinar la virulencia del nematodo Heterorhabditis indica cepa Tab-03 hacia larvas y adultos de Phyllophaga spp. Evaluar el efecto de tres suelos agrícolas de Michoacán en la infectividad de H. indica.

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3.2 Materiales y métodos

3.2.1 Localización geográfica de los tres tipos de suelos analizados

La comunidad ejidal de Atapan se localiza en la parte Noroccidental del Estado de Michoacán, sirve como zona limítrofe occidental entre la Meseta Purépecha y la región de la Tierra Caliente. Entre las coordenadas 19° 39' y 19° 40' de latitud norte, y entre 103° 24' y 103° 26' longitud Oeste, con altitudes entre los 1600 y 1800 m. Mientras que el ejido de Villamar se localiza entre las coordenadas 20° 01' y 20° 05' latitud Norte, y 102° 40' y 102° 35' longitud Oeste y una altitud media de 1522 m en la Cienega de Chápala (Figura 5).

Figura 5. Ubicación del área de estudio y de los sitios experimentales.

3.2.1.1 Clima

En la zona de Los Reyes de Salgado, Michoacán se tiene un clima (A)C(w2)(w), semicalido subhumedo con lluvias en verano; precipitación media anual de 1000-1200 mm y temperatura media anual de 18 a 20 °C, con menos de 5% de precipitación invernal respecto al total anual. Mientras que el municipio de

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Villamar, Michoacán presenta un clima C(w0)(w), templado sub-húmedo con lluvias en verano; precipitación media anual 200 a 300 mm, temperatura media anual de 16 a 18 °C, con menos de 5% de precipitación invernal respecto al total anual (García, 1987).

3.2.1.2 Vegetación

El municipio de Los Reyes, Michoacán se encuentra una comunidad vegetativa entre bosque encino-pino y bosque encino. En el primero se encuentra una comunidad de árboles del género Quercus y Pinus con dominancia del primero, se desarrollan en diferentes condiciones ecológicas, siendo frecuentemente en áreas forestales muy explotadas o en condiciones de disturbio del bosque de pino o de pino-encino. El bosque de encino está formado por individuos del género Quercus (Encino-Roble), en muy diferentes condiciones ecológicas, que abarca desde cerca del nivel del mar hasta los 2800 m (INEGI, 1988).

En el municipio de Villamar se tiene agricultura de riego y de temporal. La agricultura de riego se da en áreas donde el ciclo vegetativo de los cultivos está asegurado mediante el agua de riego. Se incluyen aquellas áreas con riegos parciales, ya sea de auxilio o de punteo. La agricultura de temporal, en se da en terrenos donde el ciclo vegetativo de los cultivos depende del agua de lluvia y se siembran en un 80% de los años (INEGI, 1988).

3.2.1.3 Suelo

En el área de estudio se encuentra los tipos de suelos correspondientes a Andosol y Luvisol para la zona de Atapan y Vertisol para la Cienega de Chápala (SPP, 1983).

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Los suelos Andosoles, localmente se le conoce como topure, se desarrollados en depósitos volcánicos y/o en materiales piroclásticos de color oscuro y muy porosos; de las regiones subhúmedas y húmedas. Poseen buena acumulación de humus, con textura franco arenosa. Se encuentran minerales de corto rango de ordenamiento como la imogolita y el alofano. Las principales características son la presencia del epipedón melánico, sus altos contenidos de vidrio volcánico, su estratos bien definidos y su baja densidad aparente (FAO, 2006). Los suelos Luvisoles localmente se le conocen como charanda. Es un tipo de suelo que se desarrolla dentro de las zonas con suaves pendientes o llanuras, en climas en los que existen con definidas las estaciones secas y húmedas; este término deriva del vocablo latino Luvo que significa lavar, refiriéndose al lavado de arcilla de las capas superiores, para acumularse en las capas inferiores, donde frecuentemente se produce una acumulación de la arcilla y denota un claro enrojecimiento por la acumulación de óxidos de hierro (FAO-UNESCO, 1975).

Con respecto a los Vertisoles son suelos con alto contenido de arcillas expandibles (> 40%), con anchas y profundas grietas, con abundantes slickensides (cútanes de presión) y agregados en forma de cuña. Son característicos de las cubetas de decantación y pantanos en los llanos y en valles aluviales. Para el caso de los trópico estos se forman a partir de la transformación directa de alofana en arcilla montmorillonita de tipo 2:1 expandible; hidratados y expandidos en húmedo y bastantes agrietados en seco (FAO, 2006).

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3.2.2 Metodología

3.2.2.1 Material biológico

Tanto larvas como adultos de “gallina ciega” Phyllophaga sp. fueron colectados de poblaciones silvestres; las primeras durante el mes de octubre del 2010 de zonas productoras de maíz, de la región de influencia del CIIDIR-Michoacán. Los adultos se capturaron mediante trampas luminosas colocadas en el terreno experimental del CIIDIR-IPN, en Jiquilpan, Michoacán, durante los meses de junio y julio del 2010 y 2011. La identificación a género se realizó mediante literatura especializada (Morón, 1997; Ramírez- Salinas y Castro-Ramírez, 2000; Aragón-García et al., 2001; Morón, 2003; Aragón-García y Morón, 2004; Espinosa-Islas et al., 2005).

El nematodo utilizado fue la especie H. indica cepa Tab-03, aislada de Tabasco, México por Cortez-Madrigal et al. (2003) y conservada en el laboratorio de entomología del CIIDIR-IPN. Se multiplicó en larvas de G. mellonella (Lep: Pyralidae). Los nematodos utilizados fueron de 10 días de emergidos. Se establecieron bioensayos para conocer la susceptibilidad de larvas y adultos de gallina ciega al nematodo H. indica. Las larvas y adultos utilizados correspondieron al género Phyllophaga spp.

3.2.2.2 Bioensayos con larvas

A partir de larvas del 3° colectadas en campos recipientes de plástico de 5 x 6 cm fueron utilizados; para proporcionar condiciones favorables se agrego a los recipientes dos sustratos: suelo y composta (a base de fibra de coco). Se agregó aproximadamente 3 cm del sustrato correspondiente e inmediatamente se aplicó una dosis de 2 500 nematodos ml-1 con una viabilidad superior al 95% y se colocó una larva de gallina ciega. Se establecieron tres repeticiones con diez

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larvas por repetición y un testigo sin nematodos fue incluido. El bioensayo se incubó a 25 ± 1°C y lecturas de mortalidad fueron tomadas a partir de las 24 h; a medida que la mortalidad se incrementó, los tiempos de lectura se acortaron (2, 1.5 y 1 h). Lo anterior para estimar el tiempo letal en que murió el 50% de la población (TL50). Las larvas muertas se colocaron en trampas White para comprobar la emergencia de juveniles.

Los datos sin transformar y transformados se procesaron con análisis probit y logístico. La comparación entre tratamientos fue mediante un análisis de varianza (ANOVA) y la separación de medias mediante Tukey (0.05). Se utilizó el programa estadístico SAS (1999).

Para corroborar la susceptibilidad del insecto, complementariamente se inyectaron larvas de gallina ciega con inyecciones de suspensiones de nematodos, a concentraciones de 1000 NE ml-1 y un dosis de 0.3 ml/larva.

3.2.2.3 Bioensayos con adulto

El bioensayo se llevó a cabo en recipientes de plástico de 5 x 6 cm; en el fondo, se utilizó esponja de 0.5 cm de espesor e inmediatamente se aplicó una dosis de nematodos con una viabilidad superior al 95%. Al igual que para larvas, la dosis evaluada fue de 2 500 nematodos ml-1 y los tiempos de lectura establecidos fueron similares. Tres repeticiones más un testigo sin nematodos fue incluido. Las larvas muertas se colocaron en trampas White para comprobar la emergencia de juveniles.

Para estimar el TL50, los datos se procesaron mediante un análisis probit, con transformación a un modelo cuadrático completo y procesado mediante el programa estadístico SAS (1999).

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3.2.2.4 Caracterización físico-química de diferentes suelos

Dado que las características de los suelos afectan la actividad de los NE (Molyneux y Bedding, 1984; Hazir et al., 2004) se consideró importante caracterizar primero algunos de los suelos típicos del estado de Michoacán. Se seleccionaron tres tipos: topure y charanda, colectados de la región aguacatera de Atapan, los Reyes Mich. Además un suelo tipo Vertisol-salino (suelo los negrito) colectado en el municipio de Villamar, Michoacán de la región ciénaga de Chapala.

Para cada tipo de suelo se obtuvieron 7 muestras simples a una profundidad de 30 cm. Las determinaciones en el laboratorio fueron: Textura: método del Hidrómetro Bouyoucos (Van Reeuwijk, 1999); pH: con el potenciómetro y una relación 1:2 (Ansorena, 1994); conductividad eléctrica: por extracto de saturación y puente de conductividad; densidad aparente: método de la probeta, densidad real: Método del Picnómetro (Aguilera y Martínez, 1986); porosidad: por cálculo y Materia orgánica: micro- Kjeldalhl (Van Reeuwijk, 1999).

3.2. 2.5 Infectividad de H. indica en los diferentes suelos

Para determinar la capacidad infectiva de H. indica se consideraron los tres tipos de suelos antes mencionados. Se utilizaron recipientes de plástico de 5 x 6 cm y mediante una aguja de disección caliente, múltiples orificios fueron practicados en la base de uno de ellos. Ambos recipientes se ensamblaron quedando el perforado en la parte superior. En el recipiente inferior se colocó 1 cm de suelo + cuatro larvas de G. mellonella del último instar, de modo que suelo y larvas quedaron limitadas por la base del recipiente superior. A su vez, el recipiente superior se llenó con cada uno de los diferentes suelos previamente humedecido; inmediatamente se colocó 1 ml de una suspensión de

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nematodos (1500 NE ml-1). Se establecieron tres repeticiones por tratamiento y un testigo con solo agua fue considerado. Los bioensayos se establecieron a temperatura ambiente. La mortalidad se revisó a las 48 h. Se realizó un análisis de varianza previa transformación al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción, procesado mediante el paquete estadístico SAS (SAS, 1999).

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3.3 Resultados y discusión

3.3.1 Mortalidad de larvas por H. indica

Los síntomas de los insectos parasitados por el nematodo fueron los característicos para el género (Tanada y Kaya, 1993): disminución en su movilidad y posteriormente la muerte; ausencia de olor (Smart, 1995; Grewal et al., 2001; Hazir et al., 2004), coloración rojo ladrillo (Figura 6) y nueve días después, la emergencia de juveniles (J3) del nematodo (Pérez-Bocourt et al., 2006).

Figura 6. Larva de Phyllophaga spp. infectada con Heterorhabditis indica 48 h después de inoculada con nematodos.

Con la dosis evaluada (2 500 ml-1) la mayor mortalidad registrada después de cinco días de incubación fue de 46% para el tratamiento con suelo y de 40% para composta, sin registrar diferencias significativas (p ≤ 0.05) entre ambos sustratos (Cuadro 8).

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Cuadro 8. Mortalidad de larvas de Phyllophaga spp. en suelo y composta.

Tratamiento Mortalidad±Ds1

Suelo 46.67± 20.81 A

Composta 40.00± 10.00 A

1 Medias de mortalidad ± desviación estándar, seguidas de la misma letra no difieren estadísticamente (Tukey, 0.05).

Aunque se establecieron cinco días de incubación, la máxima mortalidad se alcanzo a las 86 h para suelo y a las 40 h para composta (Figura 7).

50 45 40 35 (%) 30 25 suelo 20 compost 15 10

Mortalidad 5 0 050100150 Tiempo (h)

Figura 7. Tiempo de mortalidad in vitro de Phyllophaga sp. infestadas con el nematodo H. indica en suelo.

Con base a mediciones de longitud las larvas (2.4-3.3 cm) se encontraban en el 3° instar larvario (Aragón-García, 2005; Ramírez-Salinas et al., 2009),

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mencionado este como el más resistente a los NE (Quintero-Marín, 2003, Melo- Molina et al., 2007; Rodríguez et al, 2009) lo que podría explica la baja mortalidad obtenida. Aunque el poco tiempo de exposición de los nematodos con Phyllophaga (cinco días), pudiera ser otro factor que influyera en la baja mortalidad, otros estudios con tiempos de mayor exposición han reportado mortalidades similares a los obtenidos en este estudio; por ejemplo, Rodríguez et al. (2009) registraron para el 3° instar de P. elenans una mortalidad del 24%, con dosis de 625 nematodos larva-1 después de 30 días de aplicados. Para la misma especie, Quintero-Marín (2003) reportó mortalidades del 15% al 30% con el nematodo Heterorhabditis sp. y señaló que el mayor porcentaje de mortalidad (13.11%) fue a los cinco días.

Es indudable que el estado de desarrollo influye significativamente en la efectividad de los nematodos entomopatógenos; sin embargo, también variará de acuerdo con la especie de gallina ciega y la del nematodo (Melo-Molina et al., 2007; Rodríguez et al., 2009), por ejemplo resultados con P. japonica con H. bacteriophora mostraron su mayor penetración en L3, mientras que A. orientalis mostró un aumento de la susceptibilidad de la L2 (60%) frente a L3 (30%), con la misma especie de nematodo (Koppenhöffer y Fuzy 2004).

Diversas causas pueden explicar las diferencias en el grado de susceptibilidad entre los estados de desarrollo de las especies de larvas de gallina ciega; entre ellas se mencionan diversas característica de tipo morfológico y fisiológico que estarían influyendo en su control; comportamientos defensivos y evasivos de las larvas; una fuerte respuesta inmune asociada a la edad, los estados iníciales del insecto poseen una respuesta de anticuerpos más baja que los estados maduros (Koppenhöffer y Fuzy, 2004). Las pruebas de inyección con suspensiones de nematodos confirmaron la resistencia de larvas de gallina ciega a los nematodos, pues la mortalidad fue similar a la registrada en los bioensayos en sustrato (42.85%).

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3.3.2 Mortalidad de adultos

A diferencia de las larvas, los adultos fueron muy susceptibles al nematodo H. indica. El tiempo en que murió el 50% de la población (TL50) se estimó en 49.0 h (47.5 – 51.4 h), mientras que el 99% se estimó en 86.6 h (75.759–109.652 h) (Figura 8).

120 99% = 86.6

100

80

TL50 =49.0 h 60

40 Mortalidad (%)

20

0 0 20406080100 Tiempo (h) Figura 8. Tiempo de mortalidad de adultos de Phyllophga sp. tratados con el nematodo Heterorhabditis indica.

Aunque los resultados son similares a los señalados para otros coleópteros adultos (Cortez-Madrigal et al., 2009), con la dosis evaluada (2 500 ml-1) los tiempos de mortalidad sobrepasan los mencionados para otros insectos infectados con NE (Tanada y Kaya, 1993). La ausencia de olor putrefacto en el cadáver del insecto confirmaron la muerte de la plaga por H. indica; sin embargo, en ninguno de los ejemplares se obtuvieron juveniles de nematodos. La única evidencia que se tuvo del efecto del nematodo sobre adultos de la

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plaga fue la ausencia de olor putrefacto y el hecho de no registrar mortalidad en el testigo. Durante 2011 se repitió el bioensayo con resultados similares.

Con base a los resultados, puede decirse que los adultos de Phyllophaga spp. fueron altamente susceptibles al nematodo, lo que indica que la bacteria mutualista del nematodo actúa sin dificultad; sin embargo, condiciones fisiológicas del insecto pueden no ser aptas para la reproducción de juveniles. Se sabe que los juveniles se alimentan de los tejidos del insecto para lo cual la bacteria juega un papel importante al hacer una especie de “yohgurt” que permite pre-digerir los tejidos para el nematodo. En este caso, puede ser que existan componentes específicos que afecten el desarrollo de los nematodos; o bien, que los adultos de gallina ciega recién emergidos no cuenten con las reservas de energía suficientes para la reproducción de los juveniles.

Los estudios sobre NE en gallina ciega han sido enfocados a larvas de la plaga (Quintero-Marin, 2003; Koppenhöfer y Fuzy, 2003; Koppenhöffer y Fuzy, 2004; Melo-Molina et al., 2007; Rodríguez et al., 2009) pero hasta donde se sabe no sobre los adultos. El conocer que los adultos son susceptibles a NE abre una perspectiva para utilizar estos entomopatógenos en el control de la plaga, quizá mediante la estrategia de autodiseminación (Vega et al., 2000); sin embargo, el hecho de que no hubo emergencia de juveniles infectivos limitaría dicha estrategia. Por lo tanto, dilucidar las causas de ese fenómeno sería de gran importancia para futuros estudios sobre el uso de NE en adultos de la plaga.

3.3.3 Infectividad de H. indica en tres tipos de suelo

El resultado textural de los suelos de topure y charanda muestran un alto porcentaje de arena seguida de limo y finalmente menor contenido de arcilla. La clase textural para los suelos conocidos como topure es franco arenosa y para

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charanda franco areno arcillosa, por el contrario los suelos de los negritos presentan mayores contenidos de arcilla, seguido de arena y poco cantidad de limo, clasificándose como arcillosos (Cuadro 9). Con respecto a la materia orgánica la charanda presenta alto porcentaje, los suelos los negritos presentan un porcentaje muy alto, mientras que en el topure el porcentaje es bajo (Castellanos et al., 2000).

Cuadro 9. Características físico-químicas de tres suelos regionales de Michoacán.

Tipo de Textura suelo ( %) Clase Da Porosidad M.O Ph C.E Arena Limo Arcilla textural (g/ cm3) ( %) (%) (dS)

Topure 53.04 34.13 12.70 Franco 0.99 58.75 3.16 6.04 1.52 arenoso

charanda 49.04 28.94 22.01 Franco 1.07 54.29 3.77 5.85 1.12 Areno arcilloso

Suelo los Negritos 35.18 14.13 50.68 Arcilloso 1.05 42.30 4.25 9.33 8.28

Da :Densidad aparente M.O: Materia orgánica pH: Potencial de hidrogeno C.E: Conductividad eléctrica

Por lo anterior la combinación de materia orgánica y clase textural da como resultado una densidad aparente baja tal como se presenta en el topure de acuerdo con Shaykewich y Zwarich (1968), los cuales mencionan que la materia orgánica presenta un efecto benéfico sobre la disminución de la densidad aparente magnificándose en suelos con menor contenido de arcilla. El mayor porcentaje de porosidad se encuentra en el topure y charanda y el menor en los

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negritos. Los suelos de charanda y topure son moderadamente ácidos, libres de sales a diferencia de suelos los negritos los cuales se clasifican como extremadamente alcalinos con alto contenido de sales (Castellanos et al., 2000).

Los suelos que presentaron la mayor mortalidad fueron los suelos de charanda (88.09%), sin diferir estadísticamente con los de topure (83.33%); los suelos colectados de la región de los negritos presentaron la menor mortalidad (18.75%) de larvas de G. mellonella y en el tratamiento testigo no se registró mortalidad. (Cuadro 10).

Cuadro 10. Mortalidad de G. mellonella en tres suelos de Michoacán.

Tipo de suelo Mortalidad ± Ds1 Charanda 88.09± 2.06ª

Topure 83.33± 4.1 A

S. los negritos 18.75± 6.25B

1 Medias de mortalidad ± desviación estándar ± seguidas de la misma letra, no difieren estadísticamente (Tukey ≤ 0.05).

Las clases texturales correspondientes a topure y charanda son adecuados para los requerimientos de los nematodos; sin embargo, a pesar que el suelo los negritos presentan condiciones menos favorables para los nematodos con respecto al tamaño de partícula del suelo, pH y salinidad, se obtuvo mortalidad de G. mellonella, lo que muestra el potencial de H. indica en diversos tipos de suelos.

Se ha reportado que las texturas arenosas y francas favorecen la actividad de los nematodos, aún con escasez de humedad (Lewis, 2002); por el contrario, los suelos con alto contenido de arcilla interfieren con el desplazamiento de los J3

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debido a que el tamaño del poro entre las partículas es  0.002 mm para arcillas (Landon, 1986; Gee y Bauder1986), siendo menor que el diámetro del cuerpo de los nematodos (0.50 mm para H. indica) (Poinar et al., 1992; Lewis, 2002). También la actividad y supervivencia de los NE es menor en suelos arcillosos que en suelos franco-arenosos (Lewis, 2002) probablemente, debido a los bajos niveles de oxígeno en suelos con poros más pequeñas como suelen ser los arcillosos (Hazir et al., 2004).

Molyneux y Bedding (1984) reportaron que en suelos con diferentes textura y variando los niveles de humedad con las especies Heterorhabditis sp. y Steinernema glaseri, mostraron que en suelos franco-arenosos con niveles bajos de humedad, las larvas de Lucilia cuprina presentaron una alta infección; en suelos arenosos y franco-arcillosos no se registró mortalidad. Con niveles de humedad cercanos a la saturación la infección fue más alta en arena fina que en los otros dos tipos de suelo. Ambas especies de nematodos parasitaron un número similar de larvas de L. cuprina en el suelo arenoso y franco-arenoso, pero en el franco-arcilloso Heterorhabditis parasitó más que S. glaseri, lo que sugiere que el efecto del tipo de suelo depende también de la especie de nematodo y de las condiciones de humedad.

Aunque se cuenta con pocos trabajos que señalan los valores adecuados de pH, C.E y M.O, es probable que valores cercanos a la neutralidad para el caso de pH sean los más adecuados. La C.E nos da información acerca de la salinidad del suelo, por lo que valores bajos serian también adecuados para los nematodos, sin embargo existen especies altamente tolerantes a la salinidad como es el caso del nematodo utilizado H. indica.

Cuando se tienen altos porcentajes de materia orgánica, existe mayor cantidad de microorganismos por lo que las cantidad de oxigeno se reduce, esto puede ser un factor de supervivencia de los infectivos juveniles y si además se agregan

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cantidades altas de humedad (suelos saturados de agua) los niveles de oxigeno disminuyen aún mas, provocando la disminución de nematodos entomopatógenos (Hazir et al., 2004).

Existen reportes que indican que mayores porcentajes de materia orgánica pueden ser nocivas para los nematodos fitopatogenos, debido a segregación de sustancias toxicas como el amoníaco y ácido nitroso (Ferris y Bongers, 2006), lo cual podría tener un efecto similar para los nematodos entomopatógenos.

El hecho de que H. indica pueda infectar y matar larvas y adultos de gallina ciega y de que su actividad infectiva se mantuvo en los tres tipos de suelo evaluados, sugiere que H. indica pudiera ser considerado para el manejo de la plaga en cultivos para las condiciones mencionadas. Los suelos topure y charanda donde el nematodo mostró una alta infectividad, son representativos de la meseta purépecha, región donde se producen importantes cultivos como aguacate y durazno. Los suelos vertisoles, son representativos de la región Cienega de Chápala, y muchos de esos suelos presentan diferentes grados de salinidad. En ambas regiones, el complejo de especies de gallina ciega son un problema agrícola importante y los nematodos pudieran formar parte de un manejo integrado de la plaga. Sin embargo, otros estudios sobre dosis y técnicas de aplicación deben ser desarrollados.

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3.4 Conclusiones

El nematodo H. indica fue capaz de infectar y matar larvas y adultos de Phyllophaga spp. La mortalidad de las larvas del 3° instar vario del 40% al 46% entre y 40 h y 86 h respectivamente.

Los adultos de Phyllophaga spp. fueron altamente susceptibles al nematodo; el TL50 estimado fue de 49.0 h, y la máxima mortalidad (99%) se alcanzo en 86.6 h. Sin embargo, en ningún caso se obtuvieron juveniles del nematodo.

Los suelos que favorecieron la mayor mortalidad G. mellonella fueron los suelos de charanda y topure, mientras que los que presentaron la menor mortalidad fueron los suelos de los negritos de la región de Cienega de Chápala.

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3.5 Literatura citada

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