a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8

Contents lists available at ScienceDirect

Acta Haematologica Polonica

journal homepage: www.elsevier.com/locate/achaem

Artykuł oryginalny/Original research article

Wpływ cytotoksyczny R-amfinazy,

endorybonukleazy o działaniu

przeciwnowotworowym, na komórki chłoniaka

rozlanego z dużych komórek B w warunkach in vitro

Cytotoxic activity of R-amphinase, an anti-tumor

endoribonuclease, on diffuse large B-cell lymphoma cells in

in vitro conditions

Małgorzata Zwolińska, Barbara Cebula-Obrzut, Magdalena Witkowska,

Agata Majchrzak, Aleksandra Mędra, Piotr Smolewski *

Zakład Hematologii Doświadczalnej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, Kierownik: prof. dr hab. n. med. Piotr

Smolewski, Łódź, Polska

i n f o r m a c j e o a r t y k u l e a b s t r a c t

Historia artykułu: Onconase (ONC) and R-Amphinase (R-AM) are enzymes with anti-tumor activity, belon-

Otrzymano: 30.09.2013 ging to pancreatic ribonuclease A family, received from eggs collected from frog Rana

Zaakceptowano: 29.10.2013 pipiens. Both proteins can induce death of some types of neoplastic cells by inhibition of

Dostępne online: 06.11.2013 protein synthesis, cell growth and proliferation. The aim of this study was to assess the

cytotoxicity of R-AM, used alone or in combination with one of the most active anti-

leukemic drug, doxorubicin (DOX), on diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL)-derived cell

Słowa kluczowe:

 R-amfinaza line, Toledo. We found high cytotoxic activity of R-AM against DLBCL cells as well as

fl

 doksorubicyna in uence on expression of several apoptosis-regulating proteins. Moreover, we observed

 cytotoksyczność increase in proapoptotic activity after combination of R-AM and DOX, combination of

 apoptoza R-AM and DOX, compared with both drugs used alone. These results may justify further

 DLBCL studies on interactions of R-AM with other drugs active in DLBCL.

© 2013 Polskie Towarzystwo Hematologów i Transfuzjologów, Instytut Hematologii i

Transfuzjologii. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. Keywords:  R-amphinase  Doxorubicin  Apoptosis  Cytotoxicity  Antitumor activity 

DLBCL lymphoma

* Adres do korespondencji: Zakład Hematologii Doświadczalnej, Uniwersytetu Medycznego w Łodzi, ul. Ciołkowskiego 2, 93-510 Łódź,

Polska. Tel.: +48 42 689 51 91; fax: +48 42 689 51 92.

Adres email: [email protected] (P. Smolewski).

0001-5814/$ – see front matter © 2013 Polskie Towarzystwo Hematologów i Transfuzjologów, Instytut Hematologii i Transfuzjologii. Published by Elsevier Urban & Partner Sp. z o.o. All rights reserved. http://dx.doi.org/10.1016/j.achaem.2013.10.001

a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8 63

piśmiennictwie przedkliniczna analiza cytotoksyczności

Wstęp

R-AM zastosowanej w warunkach in vitro w skojarzeniu

z DOX na komórki linii wywodzącej się z DLBCL.

Onkonaza (ONC) jest białkiem należącym do rodziny rybo-

nukleaz trzustkowych otrzymanym po raz pierwszy z jaj

i zarodków żaby Rana pipiens [1, 2]. Jej działanie biologicz- Materiał i metody

ne, a szczególnie przeciwnowotworowe, jest ściśle związane

z aktywnością enzymatyczną cząsteczki. Odgrywa ona istotną Materiał

rolę jako mediator reakcji wewnątrzkomórkowych, może two-

rzyć aktywne biologicznie dimery, zdolne do degradacji Materiałem do badań in vitro była linia komórkowa Toledo,

dsRNA. Uszkodzenie RNA zapoczątkowuje łańcuch zmian będąca linią pochodzącą z komórek chłoniaka DLBCL,

molekularnych prowadzących do śmierci komórki. Kulmina- Toledo. Komórki tej linii są limfocytami B morfologicznie

cją tych reakcji jest aktywacja kaskady enzymów proteoli- wykazującymi cechy limfoblastów, prezentującymi anty-

tycznych – kaspaz, prowadząca do apoptozy komórki nowot- geny: CD10+, CD19+, CD20+, CD38+, CD23-, CD39-, wykazują-

worowej [3]. cymi złożone aberracje chromosomowe. Komórki linii były

ONC wywiera wpływ na przekazywanie wewnątrzkomór- inkubowane w odpowiednio dobranym medium (według

kowych sygnałów regulujących wzrost i śmierć komórek zaleceń producenta) w cieplarce (378C, w powietrzu atmosfe-

ł ś ą ż

nowotworowych. ONC wykazuje dzia anie proapoptotyczne, rycznym z zawarto ci 5% CO2), pasa owane co 2-3 dni

ł ż

hamuje cykl komórkowy w fazie G1 [4] i wzrost komórek w okresie przed za o eniem hodowli z badanymi lekami,

w przypadku nowotworów wykazujących wielolekową opor- w celu osiągniecia wzrostu ekspotencjalnego.

ność, niezależnie od ekspresji glikoproteiny P (P-gp) i mutacji

p53. W odróżnieniu od prawidłowych komórek, które Hodowle komórkowe

w fazie spoczynkowej cyklu komórkowego mogą pozosta-

wać przez dowolnie długi czas, komórki nowotworowe Hodowle zakładano w warunkach jałowych, przenosząc za-

pozostające w tej fazie szybko tracą swoją żywotność wiesinę komórek na płytki hodowlane (Nunc, Roskilde,

i ulegają apoptozie. Udowodniono aktywność cytotoksyczną Dania) zawierające 48 dołków 1 ml lub do naczynek o 40 ml

ONC w różnych typach nowotworów, w tym międzybło- pojemności (Nunc, Roskilde, Dania). Wyjściowo zagęszczenie

niaku (mesothelioma) oraz w opornych na chemioterapię komórek w zakładanych hodowlach wynosiło 0,5 mln/ml.

nowotworach wieku dziecięcego, takich jak neuroblastoma Do hodowli komórek dodawano odpowiednio przygotowane

i rhabdomyosarcoma [5, 6]. medium RPMI-1640 z dodatkiem 62 ml 10% surowicy bydlę-

W ostatnich latach stwierdzono, że oocyty Rana pipiens cej, 3 ml L-glutaminy, 5 ml antybiotyku (penicyliny i strepto-

zawierają jeszcze jedną rybonukleazę, amfinazę (AMF) o moż- mycyny) (Sigma, Taufkirchen, Niemcy).

liwym działaniu przeciwnowotworowym. AMF jest cząsteczką W zakładanych hodowlach do komórek linii Toledo

o masie około 13 000, występującą w czterech wariantach dodawano pojedynczo R-AM (otrzymaną dzięki uprzejmości

różniących się od siebie sekwencją aminokwasów w 87–99%, Alphacell Corporation, New Jersey, USA, obecnie – TAmiR

w tym R-AM. Aktywność cytostatyczna i cytotoksyczna R-AM Biotechnology, Inc, Somerset, NJ, USA) pojedynczo lub w połą-

jest podobna, a nawet wyższa od tej wykazywanej przez ONC, czeniu z lekiem o udowodnionym działaniu w DLBCL –

co wzbudza nadzieje na jej potencjalne zastosowanie w kli- doksorubicyną (DOX; Doxorubicin Ebewe; Ebewe Arzneimittel

nicznej praktyce onkologicznej [7–9]. Ges.m.b.H., Unterach, Austria).

Chłoniak rozlany z dużych komórek B (diffuse large B-cell Początkowo prowadzono hodowle 24-, 48- i 72-godzinne,

lymphoma; DLBCL) jest najczęściej występującym typem po serii wstępnych doświadczeń do dalszych badań wybrano

pośród chłoniaków nieziarniczych [10]. Postęp w leczeniu 72-godzinny punkt czasowy. Badano cytotoksyczność R-AM

DLBCL poczyniony w ostatnich latach wiąże się z wprowa- dla stężeń 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 mg/ml.

dzeniem tzw. immunochemioterapii. Dołączenie do standar- W dalszych badaniach R-AM używano w optymalnym stęże-

dowej chemioterapii CHOP (schemat: cyklofosfamid, dokso- niu 20 mg/ml (najmniejsze stężenie leku wywołujące zna-

rubicyna [DOX], winkrystyna, prednizon) monoklonalnego mienny statystycznie wzrost cytotoksyczności w odniesieniu

przeciwciała anty-CD20 rytuksymabu (RIT; schemat R-CHOP) do hodowli bez dodatku leków). Dawkę 20 ng/ml DOX

znacząco zwiększyło odsetek całkowitych remisji (complete ustalono podobnie, kierując się wcześniejszymi doświadcze-

remission; CR), wydłużyło całkowity czas przeżycia i czas niami. Oceniano efekt cytotoksyczny R-AM, DOX oraz skoja-

wolny od nawrotu choroby, przy niezwiększonej istotnie rzenia R-AM+DOX. Kontrolę stanowiły równoległe hodowle

toksyczności leczenia [11, 12]. Standardowe leczenie pierw- prowadzone bez dodatku leków. Każde doświadczenie było

szej linii polega na podaniu 6–8 cykli R-CHOP w odstępach powtarzane przynajmniej pięciokrotnie.

21-dniowych [13]. Pozwala ono w tej chorobie na uzyskanie

do 60% wyleczeń. Wciąż pozostaje więc duży margines cho- Ocena cytotoksyczności badanych leków

rych, u których poprawa efektywności leczenia pozwoliłaby

na poprawę wieloletniego przeżycia. Barwienie jodkiem propydyny (JP) (Sigma-Aldrich; Saint

Jak dotąd opublikowano tylko jedno doniesienie na temat Louis, USA) zostało zastosowane jako metoda pozwalająca

aktywności przeciwnowotworowej R-AM, które dotyczyło na pomiar żywotności komórek. Po zakończeniu hodowli

działania na komórki linii białaczkowych HL-60, U-937 i Jurkat przeprowadzano dwukrotne płukanie w 1% PBS i przez

T [14]. Celem niniejszej pracy była pierwsza w dostępnym 5 minut wirowano z częstością 1100 obrotów na minutę. Po

64 a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8

odwirowaniu do komórek dodawano 100 ml PBS oraz 10 ml JP, zakończeniu hodowli z badanymi lekami, wykonano pomiar

pozostawiając próbki w ciemności w temperaturze pokojo- ekspresji białek indukujących zaprogramowaną śmierć

wej na 10 minut. Po upływie tego czasu dokonywano komórki: Bax, Bak, Bad, Smac/Diablo. Równolegle oceniono

pomiarów cytometrem przepływowym, określając procent ekspresję białek antyapoptotycznych: Bcl-2, Mcl-1, XIAP, sur-

komórek martwych (JP+). wiwiny, c-IAP1, c-IAP2. Po zakończeniu hodowli (z badanymi

lekami i kontroli bez dodatku leków), zawiesinę komórek

Ocena działania proapoptotycznego leków wirowano przez 5 minut z częstością obrotów 1100 na

minutę, następnie płukano w 2 ml PBS i ponownie wirowano

Pomiaru ilości komórek ulegających zaprogramowanej śmier- 5 minut, 1100 obrotów na minutę. Otrzymany materiał

ci (apoptozie) dokonywano za pomocą testu z Aneksyną utrwalano najpierw w 4,5 ml 80% alkoholu (30 minut

V (Ann-V). Badano także procent komórek wykazujących spa- w lodówce), następnie po ponownym przepłukaniu w PBS

dek potencjału mitochondrialnego (CDm) oraz aktywację i dwukrotnym odwirowaniu (5 minut 1100 obrotów/min.)

kaspaz -3, -8 i -9. dodawano 4,5 ml 1% formaldehydu w temperaturze 08C na 15

Test z Ann-V i JP (BD Biosciences; San Jose, USA) pozwala minut. Po upływie tego czasu badany materiał był powtórnie

na wykrycie zjawiska eksternalizacji fosfatydyloseryny, płukany w PBS oraz wirowany, a następnie dodawano na

wczesnego markera apoptozy. Po zakończeniu hodowli do 1 minutę 500 ml saponiny i po raz kolejny wirowano w PBS

100 ml zawiesiny komórek dodawano Ann-V w ilości 5 ml oraz 1100 obrotów na minutę przez 5 minut. Otrzymana zawiesina

85 ml buforu. Po inkubacji w ciemności, w temperaturze komórek była znakowana przeciwciałami monoklonalnymi

pokojowej przez okres 15 minut dodawano 10 ml JP, przeciw białkom: przeciwciałem anty-Bax (DAKO Cytomation;

a następnie ponownie inkubowano w tych samych warun- Glostrup, Dania); przeciwciałem anty-Bak (Abcam; Cambridge,

kach przez 5 minut. Po upływie czasu inkubacji dokonywano Wielka Brytania); przeciwciałem anty-Bad (Abcam; Cambridge,

pomiarów w cytometrze przepływowym. Komórki Ann-V+ Wielka Brytania); przeciwciałem anty-Bcl-2 (DAKO Cytoma-

określano jako apoptotyczne. tion; Glostrup, Dania); przeciwciałem anty- Mcl-1 (Abcam;

MitoTracker jest związkiem selektywnie wiążącym się Cambridge, Wielka Brytania); przeciwciałem anty-XIAP (R&D

z mitochondrium, który ulega dyfuzji przez błonę komórkową Systems; Minneapolis, USA); przeciwciałem anty-cIAP1

i kumuluje się w aktywnych mitochondriach. Pozwala on na (R&D Systems; Minneapolis, USA); przeciwciałem anty- cIAP2

ocenę różnicy potencjałów błonowych. Wykrycie spadku (R&D Systems; Minneapolis, USA); przeciwciałem anty-Smac/

CDm świadczy o apoptozie komórki, indukowanej drogą we- Diablo (R&D Systems; Minneapolis, USA); przeciwciałem anty-

wnętrzną (mitochondrialną) aktywacji kaspaz. Celem dokona- survivin (R&D Systems; Minneapolis, USA). Po 30-minutowej

nia tych pomiarów do zawiesiny komórek otrzymanej po (w ciemności, w temperaturze pokojowej) inkubacji z przeciw-

zakończeniu hodowli (odpowiednio z lekami i bez leków) ciałami pierwszorzędowymi dodawano do materiału komór-

dodawano po 2,5 ml odczynnika M-Ros i inkubowano przez 30 kowego przeciwciała drugorzędowe związane z fluoresceiną.

minut w cieplarce (378C). Po upływie tego czasu dodawano Po zakończeniu inkubacji dokonywano pomiaru ekspresji

MitoTracker Red 580 (odczynniki firmy Molecular Probes; białek za pomocą cytometru przepływowego. Ekspresję białka

Eugene, USA) i odczytywano wyniki za pomocą cytometru oceniano na podstawie średniej intensywności fluorescencji

przepływowego. (MFI; mean fluorescence intensity).

Celem oceny aktywnej kaspazy 3 zawiesinę komórek

m ą ń

(100 l) otrzyman po zako czeniu hodowli permabilizowano Analiza cytometryczna

i utrwalano w roztworze Cytofix/Cytoperm (przez 20 minut na

lodzie), dwukrotnie przemywano i wirowano w roztworze Badania wykonywano z wykorzystaniem cytometru przepły-

Perm/Wash (wszystkie odczynniki firmy BD Biosciences; San wowego FACS Calibur (Becton Dickinson, San Diego, Califor-

Jose, USA). Następnie dodawano 10 ml przeciwciała przeciw nia, USA). W każdej analizowanej próbce mierzono fluores-

aktywnej kaspazie 3 i inkubowano otrzymany roztwór w tem- cencję 10 000 komórek. Indeks cytotoksyczności (IC) oce-

peraturze pokojowej przez 30 minut. Po upływie tego czasu niano na podstawie odsetka komórek JP+ w badanych

komórki ponownie przemywano za pomocą roztworu Perm/ hodowlach z lekami i kontrolnych. Skompensowany indeks

Wash. Otrzymany roztwór pozwalał na pomiar aktywnej cytotoksyczności (SIC), będący różnicą między odsetkiem

kaspazy 3 za pomocą cytometru przepływowego. komórek JP+ w poszczególnych hodowlach z badanymi

W celu oceny aktywności kaspaz 8 i 9 otrzymana zawie- lekami a odsetkiem komórek JP+ w kontrolach, posłużył do

sina komórek była utrwalana i permabilizowana przez 20 oceny stopnia cytotoksyczności dodanych do hodowli leków.

minut na lodzie, w roztworze Cytofix/Cytoperm, następnie Nasilenie apoptozy oceniano na podstawie odsetka komórek

przemywana i wirowana dwa razy w roztworze Perm/Wash. wykazujących aktywację kaspazy 3 w poszczególnych

Po zakończeniu tych czynności dodawano odpowiednie hodowlach (indeks apoptotyczny, IA). Obliczano skompenso-

przeciwciała przeciw aktywnym kaspazom 8 i 9 (R&D Sys- wany IA (SIA), będący różnicą pomiędzy odsetkiem komórek

tems; Minneapolis, USA) i inkubowano przed odczytem Ann-V+ w poszczególnych hodowlach z badanymi lekami

przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. a odsetkiem komórek Ann-V+ w próbkach kontrolnych.

Ocena mechanizmów regulujących apoptozę Analiza statystyczna wyników

W regulację procesu apoptozy są zaangażowane białka Analizując uzyskane wyniki, w celu porównania różnic

promujące ten proces, jak i jej inhibitory. W komórkach, po pomiędzy poszczególnymi badanymi parametrami stosowano

a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8 65

test t-Studenta. Określano średnią arytmetyczną oraz odchy- ekspresji białek antyapoptotycznych Bcl-2 (p=0,009), Mcl-1

lenia standardowe. Za istotne statystycznie przyjmowano (p = 0,002) i XIAP (p = 0,019) (Ryc. 3).

różnice, dla których poziom istotności p był mniejszy niż 0,05.

Program STATISTICA 7.0 (Tulsa, USA) posłużył do przeprowa-

Omówienie

dzenia analizy statystycznej otrzymanych wyników.

R-AM jest endorybonukleazą, która może okazać się skutecz-

Wyniki na w leczeniu chorób onkologicznych, w tym nowotworów

układu krwiotwórczego. Przedstawione powyżej badania

Ocena cytotoksyczności R-AM

Prowadzone doświadczenia rozpoczęto od ustalenia opty-

malnej dawki R-AM. Hodowle in vitro z R-AM w dawkach 1–

100 mg/ml, trwające 24, 48 i 72 godziny, pozwoliły na

wybranie dawki stosowanej w dalszej części badań. Naj-

większy efekt cytotoksyczny był obserwowany po 72 godzi-

nach hodowli. Dla komórek linii Toledo przy stężeniu leku

20 mg/ml po 72 godzinach hodowli obserwowany odsetek

komórek z dodatnim efektem cytotoksycznym był staty-

stycznie znamiennie wyższy w porównaniu z osiągniętym

w komórkach prowadzonych równolegle hodowli kontrol-

nych (p < 0,05). Dlatego stężenie R-AM 20 mg/ml oraz powyż-

szy punkt czasowy wybrano dla hodowli prowadzonych

w dalszym etapie badań.

Ocena aktywności R-AM w skojarzeniu z DOX

Dalsze doświadczenia prowadzone w hodowlach komórek

linii Toledo miały na celu ocenę cytotoksyczności R-AM

skojarzonej z klasycznym cytostatykiem, stosowanym stan-

dardowo w badanej chorobie, DOX. Połączenie R-AM z DOX

wykazywało znaczący wzrost cytotoksyczności (mediana SIC

70,5%), w porównaniu z zastosowanymi pojedynczo R-AM

czy DOX (mediana SIC odpowiednio 16,1% i 37,3%; odpo-

wiednio p < 0,001 i p = 0,003). Wykazano znamiennie więk-

sze działanie cytotoksyczne R-AM na komórki linii Toledo Ryc. 1 – A. Cytotoksyczność R-amfinazy (R-AM)

w porównaniu z kontrolą (Ryc. 1 A). Efekt cytotoksyczny zastosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu

R-AM (mediana SIA 68,5%), DOX (mediana SIA 36,2%) oraz z doksorubicyną (DOX) w stosunku do komórek chłoniaka

jej skojarzenia z DOX ewidentnie zależał od działania rozlanego z dużych komórek B, Toledo. Podano wartości

proapoptotycznego (mediana SIA 65,9%), (Ryc. 1B). średnie i odchylenia standardowe skorygowanego indeksu

cytotoksycznego (SIC), mierzonego testem z jodkiem

Mechanizmy cytotoksycznego działania R-AM propydyny (JP)

Ryc. 1 – B. Działanie proapoptotyczne R-amfinazy (R-AM)

Działanie proapoptotyczne R-AM oceniano na podstawie zastosowanej pojedynczo oraz w skojarzeniu

wywoływanych zmian w mitochondrialnym potencjale bło- z doksorubicyną w stosunku do komórek linii chłoniaka

nowym, zmian w strukturze błony komórkowej – test rozlanego z dużych komórek B, Toledo. Podano wartości

z Ann-V oraz wpływu na aktywność kaspaz (wykrywanie średnie i odchylenia standardowe skorygowanego indeksu

komórek z aktywną kaspazą 8, 9 czy 3). Linia komórkowa apoptotycznego (SIA), mierzonego testem z Aneksyną

chłoniaka DLBCL, przy medianie odsetka komórek Ann-V+ V (Ann-V)

wynoszącej 17,0%, wykazywała istotny wzrost mechaniz- Fig. 1 – A. Cytotoxic activity of R-amphinase (R-AM) used alone

mów aktywujących apoptozę, mierzonych spadkiem CDm or in combination with doxorubicin (DOX) on diffuse large

oraz wzrostem aktywności kaspaz 8, 9 i 3 (Ryc. 2). B-cell lymphoma-derived cell line, Toledo. The figure shows

mean values (and standard deviations) of corrected cytotoxic

Wpływ R-AM na ekspresję białek regulujących apoptozę index (SIC), assessed by propydium iodide test

Fig. 1 – B. Proapoptotic activity of R-amphinase (R-AM)

W dalszych doświadczeniach badano wpływ R-AM na eks- used alone or in combination with doxorubicin (DOX) on

presję białek uczestniczących w regulacji procesu apoptozy. diffuse large B-cell lymphoma-derived cell line, Toledo.

R-AM we wszystkich hodowlach istotnie zwiększała stężenie The figure shows mean values (and standard deviations)

białka proapoptotycznego Bax (p = 0,041) i Bad (p = 0,013). of corrected apoptotic index (SIA), assessed by Annexin

Obserwowano również istotne statystycznie zmniejszenie V test

66 a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8

– ł ą ę

Ryc. 2 – Mechanizmy działania proapoptotycznego Ryc. 3 Ekspresja bia ek reguluj cych apoptoz

ł

R-amfinazy (R-AM) na komórki linii chłoniaka rozlanego w odpowiedzi na dzia anie R-amfinazy (R-AM)

ł ż

z dużych komórek B, Toledo. Podano wartości średnie w komórkach linii ch oniaka rozlanego z du ych komórek

ś ś ś

i odchylenia standardowe odsetka komórek dodatnich B Toledo, mierzona warto ciami redniej intensywno ci

mierzonego testem z Aneksyną V, komórek ze spadkiem fluorescencji (mean fluorescence intensity; MFI). Podano

ś ł

potencjału mitochondrialnego (CDm) oraz wykazujących warto ci wzrostu/spadku ekspresji bia ek w hodowlach

aktywację kaspaz 3, 8 i 9 z lekiem w stosunku do hodowli kontrolnych

–

Fig. 2 – Mechanisms of proapoptotic activity of R-amphinase Fig. 3 Expression of apoptosis-regulating proteins in response

(R-AM) on diffuse large B-cell lymphoma-derived cell line, to R-amphinase (R-AM) in diffuse large B-cell lymphoma-

Toledo. The figure shows mean values (and standard derived cell line, Toledo, as measured by mean fluorescence

deviations) of the rates of Annexin V-positive cells, cells with intensity, MFI. N-fold increase/decrease in protein expression

drop of mitochondrial poptential as well as cells with activation in relation to the control cultures are shown

of capses -3, -8 or -9

efektywności cisplatyny oraz karboplatyny. Skojarzenie obyd-

wu leków opóźniało wzrost guza o 25 dni.

Badania przeprowadzone przez Rybak i wsp. [22] na

własne przeprowadzone in vitro na linii komórkowej DLBCL modelach in vitro i in vivo komórek raka okrężnicy HT-29

wykazały wysoką aktywność cytotoksyczną R-AM, zarówno potwierdziły synergistyczny efekt działania przeciwnowo-

zastosowanej pojedynczo, jak i w połączeniu z DOX, lekiem tworowego ONC i winkrystyny na komórki wykazujące opor-

cytostatycznym o udowodnionym działaniu w tej chorobie. ność wielolekową. Wykazano zahamowanie wzrostu komórek

Wyniki wskazujące na synergizm działania ONC, wcześ- oraz zwiększenie cytotoksyczności. Mechanizm, dzięki któ-

niej opisanej endorybonukleazy pochodzącej z jaj i zarodków remu ONC pokonuje oporność komórek na leczenie przeciw-

Rana pipiens, z innymi lekami o działaniu cytostatycznym nowotworowe, nie został w pełni poznany. Leczenie to

znajdują potwierdzenie w dostępnych publikacjach. Dotych- ponadto zwiększało istotnie czas przeżycia.

czas udowodniono korzystne współdziałanie ONC z wieloma Doświadczenia Mikulskiego i wsp. [19] zostały przeprowa-

lekami przeciwnowotworowymi. Między innymi, wykazano dzone na dwóch modelach badawczych in vivo raka piersi

wzrost skuteczności działania ONC skojarzonej z cisplatyną, MDA-MB-231 i wykazały synergizm działania ONC i doksoru-

DOX, winkrystyną, tamoksyfenem i trifluoperazyną, interfero- bicyny. Chemioterapia skojarzona w obu modelach hamowa-

nem a/b, TNF-a czy przeciwciałem anty-CD95 (FasL) [6, 18– ła wzrost nowotworu w znacznie większym stopniu niż leki

23]. Wykazano także, że ONC zwiększa wrażliwość komórek podawane osobno, a czas przeżycia wydłużył się znacząco.

śródbłonka CCL-209 oraz komórek nowotworowych na napro- Wyniki dotychczasowych badań przedklinicznych i klinicz-

mienianie [24–26]. Uważa się, że ONC może spełniać rolę nych (zakończono badanie III fazy u chorych na międzybło-

adiuwantu w przypadku chemioterapii oraz radioterapii. niaka) wskazują na dużą aktywność cytotoksyczną ONC

Badania Deptały i wsp. [18] miały na celu porównanie w niektórych nowotworach litych. Jak wspomniano, AMF jest

proliferacji i żywotności komórek chłoniaka U937 inkubowa- stosunkowo niedawno zsyntetyzowaną rybonukleazą, o wła-

nych z ONC lub TNF-a. Połączenie ONC i TNF-a spowodo- ściwościach fizykochemicznych podobnych do ONC. Jak

wało całkowite zahamowanie wzrostu i śmierć ponad dotąd, Ardelt i wsp. [14] opisali aktywność cytostatyczną

połowy komórek. Mechanizm, dzięki któremu ONC wzmac- i cytotoksyczną wszystkich czterech znanych izoform AMF,

nia działanie TNF-a, jest być może zależny od aktywności w tym R-AM, w stosunku do komórek ludzkiej białaczki

czynnika NFkB i związanej z nią supresji ekspresji genów promielocytowej (HL-60), jak też komórek białaczki monocy-

odpowiedzialnych za przeżycie komórki. tarnej U-937 i komórek Jurkat T. Aktywność R-AM była nieco

Lee i wsp. [27] w badaniach in vivo i in vitro na hodowlach bardziej zaznaczona niż w przypadku ONC. Dotyczyło to

ł

ludzkiego raka niedrobnokomórkowego p uc A549 sprawdzali zarówno zatrzymania komórek nowotworowych w fazie G1

efektywność terapeutyczną ONC podanej samodzielnie lub cyklu komórkowego, jak i indukcji apoptozy przejawiającej

ą ą ę ść

w skojarzeniu z cisplatyn lub karboplatyn . Stwierdzono si we fragmentacji DNA (obecno frakcji sub-G1, dodatnia

synergizm działania leków podanych równocześnie i wzrost reakcja TUNEL) oraz aktywacją transglutaminazy.

a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8 67

Dotychczas nie prowadzono doświadczeń z R-AM in vitro komórkowej Toledo zaobserwowano istotne nasilenie działa-

na komórkach chłoniaka DLBCL. Ponadto, dokładny mecha- nia cytotoksycznego połączenia R-AM z DOX w porównaniu

nizm działania przeciwnowotworowego tego białka nie zo- z działaniem tych leków stosowanych w monoterapii. Bada-

stał do tej pory w pełni ustalony. Obserwowane działanie nia te są, jak dotąd, jedynymi dostępnymi publikacjami

biologiczne jest spowodowane aktywnością enzymatyczną oceniającymi współdziałanie R-AM i DOX.

jej cząsteczki. Znaczący wpływ na prezentowaną przez nie Co istotne, w naszych badaniach R-AM wykazywała cyto-

cytotoksyczność może mieć brak wrażliwości na działanie toksyczność w stosunku do komórek nowotworowych, bez

inhibitora rybonukleaz [8]. istotnego wpływu na zdrowe limfocyty od dawców honoro-

Udowodniono, że ONC wywołuje śmierć komórki, rozkła- wych w hodowlach 72-godzinnych. Wykazana specyfika dzia-

dając wewnątrzkomórkowe RNA, hamując syntezę białek łania leku może wynikać między innymi z faktu, że rybonu-

i hamując wzrost oraz proliferację komórki [9]. Wcześniejsze kleazy o budowie zbliżonej do ONC wykazują większe powi-

doświadczenia wykazały jej zdolność do wywoływania apop- nowactwo do komórek nowotworowych niż do komórek

tozy niektórych komórek nowotworowych u człowieka [4; 14]. prawidłowych. Może to wynikać z różnic w budowie sialogli-

Podobnie R-AM wykazała aktywność przeciwnowotworową kopeptydów błony komórkowej [29, 30–32] lub zwiększonej

przeciw komórkom ostrej białaczki szpikowej [28]. W ostat- przepuszczalności błony komórkowej komórek nowotworo-

nich badaniach własnych udowodniono, że mechanizmy wych dla makrocząsteczek, takich jak rybonukleazy [33, 34].

cytotoksycznego działania R-AM na komórki DLBCL polegają Podsumowując, w warunkach in vitro R-AM wykazuje

głównie na indukowaniu zaprogramowanej śmierci komórki wybiórczą aktywność cytotoksyczną w stosunku do komórek

poprzez wpływ na aktywność kaspaz, z eksternalizacją fosfa- linii chłoniaka DLBCL. Skojarzenie R-AM z DOX w warunkach

tydyloseryny błony komórkowej w teście z Ann-V oraz spad- hodowli in vitro komórek linii chłoniaka DLBCL istotnie

kiem potencjału mitochondrialnego w teście z MitoTracker zwiększa efekt cytotoksyczny w porównaniu ze standardo-

Red. Po 72 godzinach hodowli z R-AM wykazano istotne wym chemioterapeutykiem. W działaniu przeciwnowotworo-

zwiększenie aktywności kaspaz 3, 8 i 9, a więc indukcję wym R-AM istotnym mechanizmem jest aktywacja kaspazo-

obydwu dróg ich aktywacji zewnętrznej (receptorowej) oraz zależnej apoptozy. Wpływ na ekspresję białek biorących

wewnętrznej (mitochondrialnej). Może to wpływać korzystnie udział w regulacji procesu apoptozy widocznie jest powiązany

na potencjalne interakcje z innymi lekami przeciwnowotwo- z pobudzeniem mitochondrialnego szlaku aktywacji kaspaz.

rowymi, które mają podobne lub uzupełniające się mecha- Stanowi to przesłankę do kojarzenia endorybonukleaz o dzia-

nizmy działania cytotoksycznego. łaniu przeciwnowotworowym, w tym R-AM, z działającymi za

Dalsze wyniki bieżących badań własnych, dotyczące dzia- pośrednictwem tego mechanizmu standardowymi chemiote-

łania proapoptotycznego, wykazały w badanych hodowlach rapeutykami.

istotny wzrost stężenia proapoptotycznego białka Bax i Bad.

Stwierdzono również istotne obniżenie stężenia białek anty-

Wkład autorów/Authors' contributions

apoptotycznych Bcl-2, Mcl-1 i XIAP. Obserwacje te częściowo

potwierdzają doniesienia na temat ONC, w których obserwo-

wano wzrost stężenia białka Bax w komórkach nowotworo- PS – koncepcja pracy, analiza statystyczna, interpretacja

wych [15]. Podaje się także spadek ekspresji białka Bcl-2, Fra1 danych, przygotowanie pracy, pozyskanie środków (finanso-

i surwiwiny [15, 16]. Nie ma dotychczas badań donoszących wania). MZ – zebranie i interpretacja danych, analiza statys-

o zmianach aktywności białek regulujących apoptozę induko- tyczna, przygotowanie pracy, przygotowanie literatury. BC-O

waną działaniem R-AM. – zebranie i interpretacja danych. AgM, AlM – zebranie

danych, MW – przygotowanie pracy, przygotowanie literatury.

Ocena skojarzonego działania R-AM i DOX

Konflikt interesu/Conflict of interest

Przedstawione badania kompleksowo oceniały aktywność

przeciwnowotworową R-AM skojarzonej ze standardowym

cytostatykiem o działaniu biologicznym charakteryzującym Nie występuje.

się potwierdzoną już aktywnością przeciwnowotworową –

DOX. Różne mechanizmy działania tych leków, nakładając

Finansowanie/Financial support

się na siebie, mogłyby spowodować zwiększenie ich aktyw-

ności cytotoksycznej w odniesieniu do badanych komórek.

Uszkodzenie DNA komórki nowotworowej jest głównym Badania były sponsorowane przez grant z Ministerstwa Nauki

mechanizmem działania związków rutynowo stosowanych i Szkolnictwa Wyższego No 507-18-010 oraz, częściowo, przez

w onkohematologii. Niestety obserwowana cytotoksyczność grant Uniwersytetu Medycznego w Łodzi No 503/8-093-01/

tych leków wpływa także na aktywnie proliferujące zdrowe 503-01.

komórki, co wywołuje szereg objawów niepożądanych.

Cytotoksyczność antybiotyków antracyklinowych, do któ-

Etyka/Ethics

rych należy DOX, związana jest z ich hamującym wpływem

na replikację, transkrypcję i naprawę DNA oraz indukcję

apoptozy [17]. Przeprowadzone badania własne wykazały Treści przedstawione w artykule są zgodne z zasadami

zwiększenie efektu cytotoksycznego i dużą skuteczność Deklaracji Helsińskiej, dyrektywami EU oraz ujednoliconymi

działania R-AM w skojarzeniu z DOX. W hodowlach linii wymaganiami dla czasopism biomedycznych.

68 a c t a h a e m a t o l o g i c a p o l o n i c a 4 5 ( 2 0 1 4 ) 6 2 – 6 8



p i s m i e n n i c t w o / r e f e r e n c e s [18] Deptala A, Halicka H, Ardelt B, Ardelt W, Mikulski S, Shogen

K, et al. Potentiation of tumor necrosis factor induced

apoptosis by onconase. Int J Oncol 1998;13:11–16.

[19] Mikulski S, Newton D, Wiltrout R, Rybak S. Onconase and

[1] Ardelt W, Mikulski SM, Shogen K. Amino acid sequence of doxorubicin synergy in prolonging survival of MDA-MB-231

an anti-tumor protein from Rana pipiens oocytes and early human breast cancer bearing nude mice. Presented at the

embryos. Homology to pancreatic ribonucleases. J Biol Annual American Association for Cancer Research 1999.

–

Chem 1991;266:245 251. [20] Mikulski SM, Viera A, Ardelt W, Menduke H, Shogen K.

[2] Mosimann SC, Johns KL, Ardelt W, Mikulski SM, Shogen K, Tamoxifen trifluoroperazine (stelazine) potentiate

James MNG. Comparative molecular modeling and cytostatic/cytotoxic effects of P-30 protein, a novel protein

crystallization of P-30 protein: a novel anti-tumor protein of possessing anti-tumor activity. Cell Tissue Kinet

Rana pipiens oocytes and early embryos. Proteins Structure 1990;23:237–246.

–

Function and Genetics 1992;14:392 400. [21] Mikulski SM, Viera A, Shogen K. In vitro synergism between

[3] Grabarek J, Ardelt B, Du L, Darzynkiewicz Z. Activation of a novel amphibian oocytic ribonuclease (onconase) and

caspase and serine proteases during apoptosis induced by tamoxifen, lovastatin and cisplatin in human OVCAR-3

–

onconase (ranpirnase). Exp Cell Res 2002;278:61 71. ovarian carcinoma cell line. Int J Oncol 1992;1:779–785.

[4] Halicka HD, Juan G, Ardelt B, Mittelman A, Ardelt W, [22] Rybak SM, Pearson JW, Fogler WE, Volker K, Spence SE,

Mikulski SM, et al. Induction of differentiation and Newton DL, et al. Enhancement of vincristine cytotoxicity

apoptosis of U937 and HL-60 cells by onconase: potentiation in drug resistant cells by simultaneous treatment with

by inhibitors of protein kinases. ASCO Proceedings onconase, an antitumor ribonuclease. J NCI 1996;88:

(Abstract 18) 1996. 747–753.

[5] Michaelis M, Cinatl J, Anand P, Rothweiler F, Kotchetkov R, [23] Vasandani VM, Castelli JC, Hott JS, Saxena S, Mikulski SM,

von Deimling A, et al. Onconase induces caspase- Youle RJ. Interferon enhances the activity of the anticancer

independent cell death in chemoresistant neuroblastoma ribonuclease, onconase. J Interferon Cytokine Res

cells. Cancer Lett 2007;250:107–116. 1999;19:447–454.

[6] Zhao H, Ardelt B, Ardelt W, Shogen K, Darzynkiewicz Z. The [24] Lee I, Kim DH, Sunar U, Magnitsky S, Shogen K. The

cytotoxic ribonuclease onconase targets RNA interference therapeutic mechanisms of ranpirnase-induced

–

(siRNA). Cell Cycle 2008;7:3258 3261. enhancement of radiation response on A549 human lung

[7] Singh UP, Ardelt W, Saxena SK, Holloway DE, Vidunas E, Lee cancer. In Vivo 2007;21:721–728.

HS, et al. Enzymatic and structural characterisation of [25] Lee I, Lee YH, Mikulski SM, Lee J, Shogen K. Enhanced

amphinase, a novel cytotoxic ribonuclease from Rana cellular radiation sensitivity of androgen-independent

–

pipiens oocytes. J Mol Biol 2007;371:93 111. human prostate tumor cells by onconase. Anticancer Res

[8] Ardelt W, Ardelt B, Darzynkiewicz Z. Ribonucleases as 2000;20:1037–1040.

potential modalities in anticancer therapy. Eur J Pharmacol [26] Lee I, Shui C, Shogen K, Mikulski SM, Nunno M, Wallner PE.

–

2009;625:181 189. Changes in radiation response and physiological

[9] Ardelt W, Shogen K, Darzynkiewicz Z. Onconase and parameters in various tumors by onconase. The Annual

amphinase, the antitumor ribonucleases from Rana pipiens Meeting of Radiation Research Society Proceedings (Poster

–

oocytes. Curr Pharm Biotechnol 2008;9:215 225. No P06-95) 1996.

fi

[10] Grif ths R, Gleeson M, Knopf K, Danese M. Racial [27] Lee I, Kim D, Kim E, Shogen K, Glickson J. Physiological

differences in treatment and survival in older patients with mechanisms of the enhanced efficacy of cisplatin and

diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). BMC Cancer carboplatin by onconase. Presented at the Annual

2010;10:625. American Association for Cancer Research (Abstract 4951)

fi

[11] Coif er B, Lepage E, Briere J, Herbrecht R, Tilly H, Proc AACR 2005.

Bouabdallah R, et al. CHOP chemotherapy plus rituximab [28] Smolewski P, Cebula B, Zwolinska M, Linke-Szewczyk A,

compared with CHOP alone in elderly patients with diffuse Wozniak D, Shogen K, et al. Ex vivo cytotoxic activity of

–

large-B-cell lymphoma. N Engl J Med 2002;346:235 242. endoribonucleases, onconase (ranpirnase) and R-

[12] Pfreundschuh M, Trümper L, Osterborg A, Pettengell R, Amphinase, against acute myeloblastic leukemia cells.

Trneny M, Imrie K, et al. CHOP-like chemotherapy plus Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2008;112:4010.

rituximab versus CHOP-like chemotherapy alone in young [29] Nitta K, Ozaki K, Ishikawa M, Furusawa S, Hosono M,

patients with good-prognosis diffuse large B-cell Kawauchi H, et al. Inhibition of cell proliferation by Rana

lymphoma: a randomised controlled trial by the MabThera catesbeiana and Rana japonica lectins belonging to the

International Trial (MInT) Group. Lancet Oncol 2006;7: ribonuclease superfamily. Cancer Res 1994;54:920–927.

–

379 391. [30] Nitta K, Ozaki K, Tsukamoto Y, Furusawa S, Ohkubo Y,

ł

[13] Smolewski P. Standardy leczenia ch oniaków Takimoto H, et al. Characterization of a Rana catesbeiana

nieziarniczych B komórkowych. Acta Haematologica lectin mutant. Cancer Res 1994;54:928–934.

–

Polonica 2010;41:325 334. [31] Chao TY, Lavis LD, Raines RT. Cellular uptake of

[14] Ardelt B, Ardelt W, Pozarowski P, Kunicki J, Shogen K, ribonuclease A relies on anionic glycans. Biochemistry

Darzynkiewicz Z. Cytostatic and cytotoxic properties of 2010;49:10666–10673.

amphinase: a novel cytotoxic ribonuclease from Rana [32] Zhao HL, Xue C, Du JL, Ren M, Xia S, Cheng YG, et al.

–

pipiens oocytes. Cell Cycle 2007;6:3097 3102. Sustained and cancer cell targeted cytosolic delivery of

[15] Ardelt B, Juan G, Burfeind P, Salomon T, Wu JM, Hsieh TC, Onconase results in potent antitumor effects. J Control

et al. Onconase, an anti-tumor ribonuclease suppresses Release 2012;159:346–352.

–

intracellular oxidative stress. Int J Oncol 2007;31:663 669. [33] Easty DM, Ledoux L, Ambrose EJ. The action of ribonuclease

[16] Ramos-Nino ME, Littenberg B. A novel combination: on neoplastic growth. III Studies by interference

ranpirnase and rosiglitazone induce a synergistic apoptotic microscopy Biochim Biophys Acta 1956;20:528–537.

effect by down-regulating Fra-1 and Survivin in cancer [34] Sundlass NK, Eller CH, Cui Q, Raines RT. Contribution of

–

cells. Mol Cancer Ther 2008;7:1871 1879. electrostatics to the binding of pancreatic-type

ż ł ł

[17] Czy M, Szu awska A. Molekularne mechanizmy dzia ania ribonucleases to membranes. Biochemistry 2013;52:

antracyklin. Postepy Hig Med Dosw (online) 2006;60:78–100. 6304–6312.