palavras-chave cogumelos; actividade antioxidante; fenólicos; sinergismos; análise discriminante.

resumo A actividade antioxidante dos cogumelos comestíveis Boletus edulis, gambosa, Cantharellus cibarius, Craterellus cornucopioides e oreades foi avaliada considerando as diferentes contribuições individuais e combinadas dos extractos. A capacidade bloqueadora do radical foi avaliada através das reacções baseadas na transferência do átomo de hidrogénio (HAT) e transferência do electrão único (HET): actividade bloqueadora do radical 2,2-difenil-1-picril- hidrazilo (DPPH) e poder redutor, respectivamente. Três tipos de interacções (sinergética, aditiva, e efeitos sinergéticos negativos) foram observadas, tendo sido o sinergismo o efeito predominante. Verificou-se que o Mariasmus oreades (Mo) estava presente nas melhores misturas (melhor propriedades antioxidantes e efeitos sinergéticos) enquanto o Cantharellus cibarius (Cci) estava presente nas piores misturas (mais baixas propriedades antioxidantes e efeitos sinergéticos negativos). Nos ensaios individuais, embora os resultados do Marasmius oreades tenham sido muito bons, o conteúdo fenólico e actividade antioxidante mais elevada foi verificada no Boletus edulis. Foram utilizadas duas análises discriminantes considerando espécies de cogumelos num caso e misturas de cogumelos noutro caso. As cinco espécies de cogumelos individuais foram incluídas em cinco grupos individuais, mas um resultado similar não pode ser obtido para as espécies de cogumelos combinados, no qual apenas os casos contendo Cci foram separados em clusters individuais.

keywords ; antioxidant activity; phenolics; synergism; discriminant analysis

abstract The antioxidant activity of Boletus edulis, Calocybe gambosa, Cantharellus cibarius, Craterellus cornucopioides and Marasmius oreades edible mushrooms was evaluated considering the different contribution of individual and combined extracts. The radical scavenging capacity was evaluated through hydrogen atom transfer (HAT) and single electron transfer (ET) reaction based assays: 2,2- Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity and reducing power, respectively. The inhibition of lipid peroxidation was studied in lipossomes solutions by the -carotene-linoleate system. Three types of interactions (synergistic, additive and negative synergistic effects) were observed, being synergism the most abundant effect. Marasmius oreades (Mo) was present in the best mixtures (better antioxidant properties and synergistic effects) while Cantharellus cibarius (Cci) was the present in all the worst mixtures (lowest antioxidant properties and negative synergist effects). In the individual assays, despite the very good results obtained for M. oreades, the highest phenolics content and antioxidant activity was observed for Boletus edulis. Two discriminant analyses were performed considering mushroom species in one case and mushroom mixtures in the other. The five individual mushroom species were clustered in five individual groups, but a similar result could not be obtained for the combined mushroom species, for which only the cases containing Cci were separated in individual clusters.

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INDÍCE

I. INTRODUÇÃO…………………………………………………………………………10

1.1. Os cogumelos no Reino dos Fungos...... 10

1.2. Caracterização das espécies de cogumelos estudadas ...... 13 1.2.1. Boletus edulis Bull. 1782 ...... 13 1.2.2. Calocybe gambosa (Fr.) Donk 1962 ...... 13 1.2.3. Cantharellus cibarius Fr. 1821 ...... 14 1.2.4. Craterellus cornucopioides (L.) Pers. 1825 ...... 15 1.2.5. Marasmius oreades (Bolton) Fr. 1836 ...... 16

1.3. Potencial farmacológico de Basidiomicetos ...... 17

1.4. Stress oxidativo, radicais livres e antioxidantes ...... 20

1.5. Efeitos sinergísticos ...... 24 II. MATERIAL E MÉTODOS ...... 24

2.1. Material biológico e preparação das amostras ...... 25

2.2. Reagentes e padrões...... 25

2.3. Fenóis totais ...... 25

2.4. Actividade antioxidante ...... 26 2.4.1 Actividade bloqueadora de radicais DPPH...... 26 2.4.2 Poder redutor ...... 26 2.4.3 Inibição da descoloração do β-caroteno ...... 27

2.5. Análise estatística ...... 27 III. RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 28 IV. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS ...... 45 V. REFERÊNCIAS ...... 47

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores experimentais do conteúdo fenólico (mg/g), actividade antioxidante

EC50 (mg/mL), das espécies de cogumelos (média  SD; n=3). Em cada coluna, as diferentes letras traduzem diferenças significativas entre os valores (p0,05), sendo que aos maiores valores quantitativos correspondem letras iniciais do alfabeto...... 36

Tabela 2. Concentrações de fenóis (mg/g), actividade antioxidante EC50 (mg/mL), das misturas de cogumelos (média  SD; n=3). Em cada coluna as diferentes letras traduzem diferenças significativas entre os valores (p0,05), sendo que aos maiores valores quantitativos correspondem letras iniciais do alfabeto...... 37

Tabela 3. Valores experimentais versus valores teóricos da actividade antioxidante EC50, das misturas de espécies de cogumelos (média  SD; n=3)...... 38 Tabela 4. Parâmetros da análise discriminante para as espécies individuais de cogumelos...... 41 Tabela 5. Parâmetros da análise discriminante para as misturas de espécies de cogumelos...... 41 Tabela 6. Correlação entre variáveis discriminantes e funções discriminantes canónicas padronizadas para as espécies de cogumelos. As variáveis estão ordenadas pelo tamanho absoluto da correlação na função...... 42 Tabela 7. Correlação entre variáveis discriminantes e funções discriminantes canónicas padronizadas para as misturas de cogumelos. As variáveis estão ordenadas pelo tamanho absoluto da correlação na função...... 43

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Boletus Edulis Bull...... 13 Figura 2. Calocybe gambosa (Fr.) ...... 14 Figura 3. Cantharellus cibarius Fr...... 15 Figura 4. Craterellus cornucopioides (L.) Pers...... 15 Figura 5. Marasmius oreades (Bolton) Fr...... 16 Figura 6. Efeito sinergístico na actividade bloqueadora de DPPH (a), poder redutor (b) e inibição da peroxidação lipídica (c) : exemplo da mistura Cratarellus cornucopioides + Marasmius oreades...... 39 Figura 7. Efeito sinergístico negativo na actividade bloqueadora de DPPH a), poder redutor b) e inibição da peroxidação lipídica c): exemplo da mistura Cantharellus cibarius + Cratarellus cornucopioides...... 40 Figura 8. Análise canónica das espécies de cogumelos...... 42 Figura 9. Análise canónica das misturas de cogumelos...... 43

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I. INTRODUÇÃO

1.1. Os cogumelos no Reino dos Fungos

Os organismos da linhagem fúngica incluem cogumelos, bolores, mofo, e leveduras, assim como muitos outros organismos menos conhecidos (Alexopoulos et al., 1996). Os fungos, organismos eucariotas, foram separados das plantas por Whittaker, passando a ter o seu próprio reino em 1969, devido a várias características entre as quais os factos de nenhum fungo ser fotossintético, de que os fungos devem absorver nutrientes produzidos por outros organismos e de diferirem das plantas na composição da sua parede celular, na sua estrutura e nos seus modos de reprodução (Whittaker, 1969). Os fungos filamentosos são caracterizados por serem organismos não-móveis constituídos por filamentos com crescimento apical designados hifas, ao conjunto das quais se chama micélio. Um ciclo de vida com reprodução sexuada e assexuada, usualmente de um talo comum, talo haplóide resultando de meiose zigótica e heterotróficos. Os componentes da parede são quitina (beta-1,4-homopolímeros ligados a N-acetilglucosamina em estado microcristalino) e glucanos principalmente alfa-glucanos (ligações -1,3 e -1,6) (Griffin, 1994; Alexopoulos et al., 1996). Actualmente, a maioria dos cientistas divide o reino Fungi em sete filos diferentes: Basidiomicota, Ascomicota, Zigomicota, Chitridiomicota, Glomeromicota, Blastocladiomicota, Neocallimastigomicota embora estes dois últimos sejam menos conhecidos (Seif et al., 2005; James et al., 2006a; James et al., 2006b; Liu et al., 2006; Steenkamp et al., 2006.). As espécies do filo Basidiomicota, englobam a maioria das espécies de cogumelos e incluem organismos (classe Basidiomicetos) que têm corpos de frutificação macroscópicos, suficientemente grandes para serem visualizados a olho nú. Os mais conhecidos géneros neste filo são Agaricus (incluindo a variedade mais comercializada), Amanita (incluindo espécies mortais e com propriedades alucinogénicas), Boletus sp., e Cantherellus (conhecido pelo delicioso e bonito “Chanterelle”) (Arora, 1986; Margulis & Schwartz, 1988; Alexoploulos et al., 1996). Os cogumelos morilhas e trufas são espécies do filo Ascomicota. Saccharomyces cerevisiae é outra espécie deste filo amplamente estudada e valorizada pelas suas aplicações biotecnológicas. Os Ascomicotas assexuados, tal como espécies Penicillium ou

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Candida, utilizados para serem classificados separadamente em Deuteromicota devido aos seus caracteres sexuais foram essenciais para a classificação em Ascomicota. Contudo a comparação da sequência do seu ácido nucleico, bem como dos caracteres fenótipicos não sexuais, permitiram a integração de fungos assexuados no filo Ascomicota (Taylor, 1995). Embora o filo Deuteromicota já não seja considerado um taxon formal na sistemática fúngica, alguns autores incluem espécies como Trichophyton (um dos envolvido na doença “pé de atleta”), Penicilllium (produtor do antibiótico penicilina) e Candida albicans (presente na flora comensal humana) (Arora, 1986; Margulis & Schwartz, 1988; Alexoploulos et al., 1996). A espécie mais conhecida do filo Zigomicota, que possui aproximadamente 600 espécies, é o „mofo preto do pão‟, tal como o Rhizopus stolonifer. No filo Chitridiomicota estão incluídos os fungos mais primitivos, mais pequenos e mais simples deste Reino. O filo Glomeromicota embora engloba um grupo de fungos virtualmente desconhecidos para o grande público, essenciais para o ecossistema terrestre. Os membros deste grupo são simbiontes mutualistas formando associações micorrízicas arbusculares intra celulares dentro das raízes da maioria das plantas herbáceas e árvores tropicais (Redecker Dirk [actualizado 2008]). Chang & Miles (1992) definem “cogumelo” como “um macrofungo com um corpo frutificante destacado, que tanto pode ser hipógeo (aéreo) como epígeo (subterrâneo), suficientemente grande para ser visível a olho nu e ser colhido à mão”. Do ponto de vista taxonómico, são principalmente basidiomicetos embora algumas espécies de cogumelos pertençam à classe de ascomicetos (Lindequist et al., 2005). Frequentemente a identificação das espécies de cogumelos é feita com base nas suas propriedades macroscópicas, microscópicas e organolépticas. Um cogumelo, na maioria dos casos, tem forma de guarda-chuva, é constituído por um chapéu (ou píleo) e um pé (ou estipe). Por baixo do chapéu apresenta uma superfície mole, o himénio, onde se produzem os esporos. O himénio pode apresentar muitas formas variadas: lâminas ou lamelas (semelhante às folhas de um livro), tubos e poros, pregas mais ou menos definidas, superfícies lisas, etc. É preciso ter em conta que as lamelas variam no modo de união ao pé e mesmo na cor (Martins, 2004). Uma espécie pode apresentar diferentes cores conforme o estado de maturação em que se encontra (Martins, 2004). O chapéu dos cogumelos pode apresentar diferentes variações na forma e na cor: plano, ogival, campanulado, cónico,

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convexo, deprimido, umbonado, mamilonado, infundibuliforme e umbilicado (Martins, 2004). O mesmo pode ocorrer com o pé: forma de radicante, sub-radicante, bolboso, inchado, bulbo-marginado (Martins, 2004). O pé tem duas estruturas determinantes na identificação dos cogumelos: a volva e o anel. O anel encontra-se no meio do pé, enquanto que a volva está na base e assemelha-se a uma série de anéis sobrepostos. A consistência do corpo também pode variar: carnosos, cartilaginosos ou gelatinosos (Soliño et al., 2001).

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1.2. Caracterização das espécies de cogumelos estudadas

1.2.1. Boletus edulis Bull. 1782

Taxonomicamente esta espécie pertence ao reino dos fungos, filo Basidiomicota, classe Agaricomicetes, ordem Boletales, família Boletaceae e género Boletus. É habitual em Portugal encontrar-se durante o Outono e na Primavera debaixo de todo o tipo de árvores. Possui vários nomes populares, como setos, míscaros, boletos e tantulhos. A carne é branca, consistente, de cheiro e sabor agradáveis, não azuleja em contacto com o ar. Tem chapéu muito carnoso, hemisférico, até 30-40 cm, em geral com a margem algo excedente. A pele é lisa, algo viscosa em húmido e aveludada em seco, de cor creme ou acastanhada clara. Tem tubos longos e soldados entre eles. Em relação aos pés são livres e acabam em pequenos poros quase brancos nos exemplares jovens, mas no fim ficam de cor amarela esverdeada ou acastanhada. O pé é de longitude muito variável, grosso, até 10 cm de diâmetro, de cor acastanhada clara, sobre a que ressalta no terço superior uma redinha branca (Martins, 2004).

Figura 1. Boletus edulis Bull (Encyclopedia of life)

1.2.2. Calocybe gambosa (Fr.) Donk 1962

Este cogumelo também designado por cogumelo de São George já conheceu vários nomes, nomeadamente Agaricus gambosus por Elias Magnus Fries em 1821, mais tarde foi rebatizado como gambosum antes de ser reclassificado como Calocybe Gambosa por Donk em 1962 (Martins, 2004). Pertence ao reino dos fungos, filo Basidiomicota, classe Agaricomicetes, ordem , família e género Efeitos sinergísticos da capacidade antioxidante de cogumelos 13 Universidade de Aveiro - Departamento de Biologia

Calocybe. É comestível e em Portugal cresce habitualmente em bosques desde finais de Abril até Junho conforme as regiões (nunca no Outono). O chapéu mede entre 5-15 cm de diâmetro, possui uma textura suave com cordilheiras. As lamelas são apertadas e desiguais. Apresenta uma cor que pode ser de branco-creme a amarelo claro. O pé é atarracado possuindo 3 a 6 cm de altura, esbranquiçado e ligeiramente estriado. O miolo é espesso e compacto com odor e sabor fortes. Quanto às características micológicas, possui lamelas no himénio, sendo livre. O chapéu é convexo e o pé desnudado (Martins, 2004).

Figura 2. Calocybe gambosa (Fr.) (Encyclopedia of life)

1.2.3. Cantharellus cibarius Fr. 1821

O Cantharellus cibarius, mais conhecido por rapazinhos, é colhido em Portugal durante quase todo o ano debaixo de qualquer tipo de árvores, quer coníferas ou caducifólias. Taxonomicamente pertence ao reino dos fungos, filo Basidiomicota, classe Agaricomicetes, ordem Cantharellales, família Cantharellaceae e género Cantharellus. A carne é dura, grossa, algo mais clara que o chapéu, muito aromática e doce em fresco. Seca muito bem ao ar, ficando com forte cheiro a pêssegos secos. O cogumelo em conjunto tem a forma de um funil achatado, de uns 8-10 cm de diâmetro. É de cor amarela ou alaranjada, de margem lobulada e pele lisa, cerácea. Não tem verdadeiras lâminas, possuindo pregas mais ou menos largas e separadas, por vezes anastomosadas, decorrentes

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e da mesma cor que o resto da frutificação. O pé é curto, carnoso, sem bolbo, nem anel, da mesma cor que o resto (Martins, 2004).

Figura 3. Cantharellus cibarius Fr. (MycoBank)

1.2.4. Craterellus cornucopioides (L.) Pers. 1825

O nome mais familiar deste cogumelo é “trompeta dos mortos”, sendo colhido em Portugal no fim do Outono ou no Inverno debaixo de carvalhos, sobreiros, etc. Esta espécie é incluída no reino dos fungos, filo Basidiomicota, classe Agaricomicetes, ordem Cantharellales, família Cantharellaceae e género Craterellus. Todo o cogumelo é „cartilaginoso‟ e tem pouca carne, a qual é fortemente aromática, sobretudo após secagem. O chapéu tem forma de funil, oco no meio que se une com o pé. É de cor preta ou acinzentada, com a margem muito irregular. A pele é lisa, algo mais clara quando está seca. Por debaixo do chapéu não existem lâminas, nem pregas, sendo liso ou ligeiramente pregado e mais acinzentado que o resto. O pé é longo, delgado, oco, cartilaginoso, sem bolbo, nem anel, da mesma cor que o chapéu (Martins, 2004)

Figura 4. Craterellus cornucopioides (L.) Pers. (MycoBank)

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1.2.5. Marasmius oreades (Bolton) Fr. 1836

Mais conhecido por “roda de bruxas”, é habitual recolhê-los em Portugal nos meses de Setembro e Outubro, em lameiros, formando círculos ou linhas perfeitas. Taxonomicamente pertence ao reino dos fungos, filo Basidiomicota, classe Agaricomicetes, ordem Agaricales, família e género Marasmius. A carne é delgada, ocre e tem um cheiro característico e sabor agradável. O chapéu é convexo, de cor ocre acastanhado, algo mais escura com tempo húmido, com um mamilo central arredondado e grosso. Tem a margem lisa, não estriada, também em tempo húmido. A pele é muito lisa e cerácea ao tacto. Pode medir até 5-7 cm de diâmetro. As lâminas são desiguais, largas, separadas, de cor creme e livres. O pé, cartilaginoso, é delgado, muito fibroso e da mesma cor que o chapéu. Tem a particularidade de se poder retorcer sem que rompa. Não tem bolbo, nem anel, nem cortina. O cheiro a ácido prússico, a cor das lâminas e a maneira de se retorcer o pé fazem dele uma espécie inconfundível (Martins, 2004).

Figura 5. Marasmius oreades (Bolton) Fr. (Encyclopedia of life)

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1.3. Potencial farmacológico de Basidiomicetos

Os produtos naturais representam uma fonte rica em compostos biologicamente activos e são um exemplo de diversidade molecular, com potencial reconhecido para a descoberta de fármacos (Grabley & Thiericke, 1999; Newman et al, 2000). Mais de 75% dos fármacos anti-tumorais e anti-infecciosos têm origem em fontes naturais (Butler, 2004). Existem também derivados de produtos naturais utilizados no tratamento de outras patologias tais como diabetes, dislipidémias, dermatites atópicas, doença de Alzheimer e doenças genéticas como tirosinémia e doença de Gaucher (Butler, 2005). Importantes produtos farmacêuticos, tais como ACE, (a enzima conversora da angiotensina), os inibidores enalapril e captopril, os agentes anti-inflamatórios não-esteróides diclofenac e naproxen, antibióticos, o β2-agonista salbutanol e o imunossupressor ciclosporina, têm origem em produtos naturais (Kinghorn, 2002). Os fungos filamentosos são produtores de alguns dos mais poderosos metabolitos secundários, que têm sido pesquisados e desenvolvidos como agentes terapêuticos. As duas maiores classes de compostos de fungos filamentosos utilizados como fármacos são os antibióticos β-lactâmicos e a estatinas. Os antibióticos β-lactâmicos tiveram origem na descoberta do primeiro agente antimicrobiano produzido por espécies de Penicillium sp. por Sir Alexander Fleming em 1920 (Fleming, 1929). Isto levou a uma procura e desenvolvimento do antibiótico (penicilina) por Florey e seus colaboradores (Florey et al., 1949) abrindo o caminho para o desenvolvimento de outros antibióticos e compostos terapêuticos. A penicilina continua a estar entre os antibióticos com um espectro de acção mais alargado e com efeitos menos tóxicos para células eucarióticas (Shu, 1998). As estatinas, outro exemplo de produtos naturais desenvolvidos com sucesso para fármacos, são correntemente usadas na redução dos riscos de hipercolesterolemia e doenças coronárias (Shu, 1998). A primeira estatina, mevastatina (também conhecida por compactina), foi originalmente isolada a partir de culturas de Penicillium sp. (Endo et al., 1976). Desde então, outros análogos da estatina foram isolados de diferentes origens, tal como a lovastatina de Aspergillus terrus (Alberts et al., 1980), ou obtidos pela conversão das estatinas em análogos mais activos, tal como a pravastatina (Haruyama et al., 1986) e sinvastatina (Hoffman et al., 1986).

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O uso medicinal de cogumelos também possui uma longa tradição. De facto, os Basidiomicetos, constituem fontes inesgotáveis de agentes terapeuticamente úteis e biologicamente activos (Mizuno, 1995; Wasser, 1995; Wasser, 2002). Em particular, na China, Japão, Coreia, Rússia, Estados Unidos e Canadá, foram já descritos efeitos benéficos de cogumelos no tratamento de tumores de estômago, esófago, pulmão, etc. (Wasser & Weis, 1999a). O número de espécies de cogumelos estimado é de aproximadamente 140 000, conhecendo-se apenas 10% (Hawksworth, 2001). Assumindo que a proporção de cogumelos utilizados é de apenas 5%, pode-se deduzir que existem cerca de 7 000 espécies desconhecidas com possíveis benefícios para a humanidade (Hawksworth, 2001). Os Basidiomicetos incluem cerca de 30 000 espécies descritas, sendo 37 % verdadeiros fungos (Kirk et al., 2001); aproximadamente 700 espécies de Basidiomicetos têm sido procuradas por possuírem actividades farmacológicas significativas (Mizuno, 1995; Wasser, 1995; Wasser & Weis, 1999a). Os macrofungos podem ser divididos em quatro grupos: (1) comestíveis, e.g. Agaricus; (2) medicinais, e.g. Ganoderma; (3) venenosos, e.g. Amanita; e (4) miscelânea, onde as propriedades estão menos definidas (Liu et al., 1995). Assim, não parece surpreendente que os cogumelos sejam uma fonte de compostos biologicamente activos. Os cogumelos crescem na obscuridade e com humidade, em ambientes altamente competitivos e protegem-se de ataques microbianos pelo desenvolvimento de substâncias protectoras naturais. Têm sido efectuados diversos estudos dos compostos derivados de cogumelos, tendo sido estabelecidos os seus efeitos no sistema humano (Zaidman et al., 2005). Os corpos de frutificação, o micélio fúngico ou o meio extracelular de organismos crescidos em cultura líquida, podem ser explorados relativamente à actividade biológica. Algumas espécies de Basidiomicetos superiores comestíveis são procuradas por inibir marcadamente diferentes tipos de tumores (Ponchet et al., 1982). Existem aproximadamente duas centenas de espécies de Basidiomicetos superiores que são procurados por possuírem esta actividade (Ponchet et al., 1982). Quer os componentes celulares, quer os metabolitos secundários de um grande número de cogumelos têm demonstrado que afectam o sistema imunitário do hospedeiro, e podem ser usados no tratamento de várias doenças (Wasser & Weis, 1999a). Aqueles que parecem reforçar ou potenciar a resistência do hospedeiro têm sido procurados para o tratamento do cancro,

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imunodeficiências (incluindo SIDA) ou imunossupressões após tratamento farmacológico (Pujol et al., 1990; Clericuzio et al., 2004). O espectro de detecção da actividade farmacológica dos Basidiomicetos é muito amplo, incluindo efeitos antifúngicos, anti- inflamatórios, antitumorais, antibacterianos, antiparasitários, imunomodeladores e hepatoprotectores; igualmente promissor é o seu papel na regulação da pressão sanguínea, bem como na cura de desordens cardiovasculares, na hipercolesterolemia e diabetes (Wasser & Weis, 1999b). Mesmo entre as espécies conhecidas, a proporção de cogumelos investigada e cujas propriedades sejam conhecidas é baixa. Este facto, juntamente com os conhecimentos sobre o grande potencial de fungos microscópicos na produção de metabolitos bioactivos [e.g. Penincilium, Aspergillus, Tolypocladium inflatum W. Gams, Claviceps purpúrea (Fr.) Tul.], a sua utilização em etnomedicina, a necessidade ecológica de fungos para a produção de metabolitos bioactivos secundários e a possibilidade de aperfeiçoamento genético, análise química e farmacológica, leva-nos a assumir que os cogumelos possuem um grande potencial de bioprosperidade (Lindequist et al., 2005).

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1.4. Stress oxidativo, radicais livres e antioxidantes

Em organismos aeróbios, os radicais livres são constantemente produzidos durante o funcionamento normal das células, na maior parte sob a forma de espécies reactivas de oxigénio (ROS). Uma vez produzidos, a maior parte dos radicais livres são removidos pelas defesas antioxidantes da célula que incluem enzimas e moléculas não enzimáticas. (Valko et al., 2007). A manutenção do equilíbrio entre a produção de radicais livres e as defesas antioxidantes é uma condição essencial para o funcionamento normal do organismo (Valko et al., 2007). Em concentrações baixas ou moderadas, as ROS podem ser benéficas para a célula, estando envolvidas em vários processos fisiológicos de sinalização e de regulação (Fridovich, 1999). No entanto, há situações em que o equilíbrio entre a produção de ROS e as defesas antioxidantes pode ser destruído devido a uma produção excessiva de ROS, ou devido a uma deficiência nas defesas antioxidantes da célula (Machlin & Bendich, 1987). A este desequilíbrio chamamos stress oxidativo e nestas situações as ROS em excesso podem oxidar e induzir danos em lípidos celulares, proteínas e DNA, levando à sua modificação e frequentemente à sua inutilização, inibindo a sua função normal (Fu et al., 1998; Ridnour et al., 2005; Valko et al., 2007). O stress oxidativo pode ter causas naturais, como o que ocorre em situações de exercício físico extremo, ou em processos inflamatórios, mas pode também ter causas não naturais como a presença de xenobióticos no organismo ou em situações relacionadas com doenças (Valko et al., 2007). De facto, a produção descontrolada de radicais livres foi já associada como causa, ou como estando relacionada com diversos processos patológicos, tais como desordens neurológicas, determinados tumores (cancro da próstata e do cólon) (Keys, 1995) e doenças coronárias (Lipworth et al., 1997). A sobreprodução de ROS tem sido inclusivamente relacionada com o processo de envelhecimento (Lachance et al., 2001). Considerando a estimativa de que 70 % das doenças crónicas e dos custos associados podem ser prevenidos, facilmente se compreende a primordial importância do conhecimento, e se possível, do controlo da produção excessiva de ROS (Fries et al., 1993). Este controlo pode ser obtido assegurando níveis adequados de antioxidantes e quelantes de radicais livres, melhorando a qualidade da dieta (maior consumo de vegetais, leguminosas e frutos), evitando comportamentos conducentes a uma maior produção de

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radicais livres e ROS como o tabaco e a exposição excessiva a poluentes ambientais e xenobióticos (Lachance et al., 2001). Também é importante salientar que existem radicais que contêm azoto designados espécies reactivas de azoto (RNS). O principal RNS é o óxido nítrico (NO.). Este radical é produzido em tecidos biológicos por sintetases de óxido nítrico (NOS) ao metabolizar arginina a citrulina (Fridovich 1999; Ghafourifar & Cadenas, 2005). O NO. é muito abundante e funciona como molécula de sinalização numa grande variedade de processos fisiológicos, tais como: neurotransmissão, regulação da pressão sanguínea, mecanismos de defesa e regulação da resposta imunitária (Bergendi et al., 1999). A sobreexpressão de RNS é designada stress nitrosamínico e pode conduzir à nitrosilação de proteínas, inibindo a sua função (Ridnour et al., 2004). Em células do sistema imunitário, durante processos inflamatórios, o NO. é produzido conjuntamente com o anião superóxido. Estes dois radicais reagem com formação de peroxinitrilo (ONOO–), que é um potente agente oxidante e pode provocar fragmentação do DNA e oxidação lipídica (Carr et al., 2000). A exposição do organismo a radicais livres, provenientes de diversas fontes, levou a que se desenvolvessem uma série de mecanismos de defesa para eliminar estes radicais livres (Cadenas, 1997). Estas defesas foram a resposta da evolução à inevitabilidade da existência de radicais de oxigénio em condições de vida aeróbia. Estas defesas podem ser enzimáticas ou não enzimáticas. As defesas antioxidantes enzimáticas são em grande número e encontram-se espalhadas por todo o organismo, tanto no meio intracelular como no meio extracelular. Exemplo destas defesas são a superóxido dismustase (SOD), a catalase (CAT), a glutationa peroxidase (GPH-Px), a glutationa redutase (GPH-R), entre outras (Valko et al., 2007). Entre as defesas antioxidantes não enzimáticas destacam-se compostos como a glutationa (GSH), o α-tocoferol (vitamina E), o ácido ascórbico (vitamina C), o ácido lipóico, os carotenóides, os flavonóides, entre outros (Valko et al., 2007). Assim, a procura e identificação de fontes naturais e seguras de antioxidantes, nomeadamente nos alimentos de origem vegetal, tem aumentado consideravelmente (Skerget et al., 2005; Ferreira et al., 2009). Os compostos fenólicos representam o maior grupo de metabolitos secundários sintetizados por plantas superiores e cogumelos, provavelmente como resultado das estratégias antioxidantes inerentes à evolução dos organismos aeróbicos (Bennick, 2002;

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Apak et al., 2007). Os compostos fenólicos são compostos aromáticos hidroxilados, possuindo um ou mais anéis aromáticos com um ou mais grupos hidroxilo (Bennick, 2002), sendo facilmente encontrados em vegetais, frutos, e outros alimentos que formam uma porção significativa da nossa dieta (Bennick, 2002). Os compostos fenólicos são produtos finais das vias do acetato e chiquimato (Carey, 2003) e incluem moléculas relativamente simples (ácidos fenólicos, fenilpropanóides, flavonóides) assim como compostos extremamente polimerizados (lenhinas, melaninas, taninos). Os flavonóides representam o sub-grupo mais comum e mais vastamente distribuído (Bravo et al., 1998). Actualmente, mais de 8000 flavonóides diferentes foram identificados (Andersen & Markam, 2006). Muitos alimentos que são considerados saudáveis possuem níveis de flavonóides relativamente elevados (Escarpa & Gonzalez, 2001). Os compostos fenólicos têm efeitos específicos para a saúde, ainda que sejam compostos não-nutritivos. Na nossa dieta, eles podem providenciar benefícios saudáveis associados à redução do risco de doenças crónicas, devido à sua capacidade de reduzir moléculas doando hidrogénio e eliminando oxigénios singleto (Nijveldt et al., 2001). As propriedades antioxidantes dos compostos fenólicos também são responsáveis pela estabilidade dos produtos alimentares, para além de constituírem mecanismos de defesa antioxidante de sistemas biológicos (Macheix & Fleuriert, 1998). A eficácia global dos antioxidantes fenólicos naturais depende do envolvimento do hidrogénio fenólico nas reacções de radicais, da estabilidade do radical antioxidante natural formado durante reacções de radicais, e das substituições químicas presentes na estrutura (Hall, 2001). As substituições na estrutura são provavelmente as mais significativas com respeito à capacidade do antioxidante natural controlar reacções de radicais e formar radicais antioxidantes naturais estabilizados (Barlow, 1990). O papel dos antioxidantes fenólicos (ArOH) é interromper a cadeia da reacção de acordo com a Equação 1,

Eq. 1 . . RO2 + ArOH ROOH + ArO

. em que RO2 representa o radical livre de peroxilo, ArOH um antioxidante fenólico, ROOH o radical peroxilo reduzido e ArO. a forma oxidada do antioxidante. Para se tornar efectivo o ArO. deve ser um radical livre relativamente estável, que reage . lentamente com o substrato RH, mas rapidamente com o RO2 , daí o termo “antioxidante quebrador de cadeia” (Wrigth et al., 2001).

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Existem poucos estudos na literatura relativamente à análise de compostos fenólicos em cogumelos selvagens. Os estudos que existem envolvem a sua determinação por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a um detector de fotodiodos (HPLC- DAD) ou a um detector ultravioleta, ou ainda por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS) (Barros et al., 2009; Ferreira et al., 2009). Os compostos identificados em dezasseis espécies de cogumelos entre os quais Agaricus arvensis, Lycoperdon perlatum, Agaricus silvícola, Macrolepiota procera, etc. são maioritariamente ácidos fenólicos tais como o ácido p-hidroxibenzóico, ácido protocatecuíco e ácido p-cumárico (Barros et al., 2009; Ferreira et al., 2009).

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1.5. Efeitos sinergísticos

Os extractos fitoquímicos de frutos e vegetais possuem uma forte actividade antioxidante e anti-proliferativa, sendo que a maior parte da actividade antioxidante deriva da combinação dos fitoquímicos, resultando em efeitos aditivos e/ou sinergistas (Liu, 2004). Isto explica o facto de um antioxidante isolado ser incapaz de substituir a combinação de fitoquímicos naturais nos alimentos e produzir os seus benefícios para a saúde (Liu, 2004). Além disso, há evidências de que os antioxidantes são melhor adquiridos através de um consumo alimentar completo, do que a partir dos mais variados suplementos dietéticos (Liu, 2004). A capacidade antioxidante total em frutos e vegetais e seus derivados deve-se a três tipos de interacção: (1) efeito sinergístico, detectado por Vinson e colaboradores (2001) entre extractos fenólicos de diversos frutos e a planta Glossogyne tenuifolia (Hsu et al., 2005), ou ainda por um grupo de investigadores que observou uma actividade antioxidante sinergeticamente melhorada perante a oxidação lipídica aquando do uso das vitaminas C e E em conjunto (Lambelet et al., 1985; Kagan et al., 1992; Chan et al., 1991); (2) sinergismo negativo tal como o observado em compostos fenólicos de Dalbergia odorífera quando se junta, tanto, 2,6-di-t-butil-4-metilfenol (BHT) como α-tocoferol (Wang et al., 2000) ou na mistura de três monofenóis, catequina, resveratrol e quercetina (Pinelo et al., 2004), e (3) e efeitos aditivos tal como o observado entre antocianinas de batata-doce e ácido hidroxicinâmico (Phillpott et al., 2004) ou na mistura de dois ou três compostos fenólicos combinados (Heo et al., 2007).

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II. MATERIAL E MÉTODOS

2.1. Material biológico e preparação das amostras

As espécies Boletus edulis Bull., Calocybe gambosa (Fr.) Donk, Cantharellus cibarius Fr., Craterellus cornucopioides (L.) Pers., e Marasmius oreades (Bolton) Fr. foram obtidas em superfícies comerciais, encontrando-se previamente desidratadas. As amostras (~3 g nos ensaios com espécies individuais; 1,5 g de cada espécie nos ensaios com misturas) foram submetidas a uma extracção líquido-sólido, com 100 mL de metanol e agitação durante 24h (25 ºC a 150 rpm) e filtradas através de papel Whatman nº4. O resíduo foi posteriormente lavado com metanol (2 x 100 mL). Os extractos metanólicos combinados foram evaporados a 40 ºC, o resíduo foi redissolvido em metanol de modo a atingir-se uma concentração de 50 mg/mL e armazenado a 4 ºC até utilização. Subsequentemente, foram preparadas várias concentrações dos extractos metanólicos a partir da solução inicial (20, 10, 5, 2 e 1 mg/mL).

2.2. Reagentes e padrões

Os padrões BHA (2-t-butil-4-metoxifenol), TBHQ (t-butil-hidroquinona), L-ácido ascórbico, α-tocoferol, ácido gálico e (+)-catequina foram adquiridos à Sigma (St. Louis, MO, EUA). O 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) foi obtido na Alfa Aesar (Ward Hill, MA, EUA). Os restantes reagentes foram comprados à Sigma Chemical Co. (St Louis, Mo, EUA). O metanol (99,8%) foi adquirido à Pronalab (Lisboa, Portugal). A água foi tratada com um sistema de purificação Mili-Q (TGI Pure Water Systems, EUA).

2.3. Fenóis totais

Os fenóis presentes nos extractos metanólicos foram determinados utilizando um método colorimétrico, baseado no protocolo descrito por Singleton & Rossi (1965) com algumas modificações. Para a determinação do conteúdo fenólico, a amostra (1mL) foi misturada com o reagente fenólico Folin e Ciocalteu (1mL). Após 3 min, adicionou-se solução saturada de carbonato de sódio (1mL) e perfez-se o volume da mistura com água destilada até 10 mL. A reacção foi mantida no escuro durante 90 min, e a absorvância foi lida a 725

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nm num espectrofotómetro Analytikijena 200. Na construção da curva padrão utilizou-se ácido gálico (0,01-0,4 mM; Y=2,8557X-0,0021; R2=0,9999) e os resultados são apresentados em mg de equivalentes de ácido gálico (GAEs) por g de extracto.

2.4. Actividade antioxidante

Realizaram-se ensaios químicos e bioquímicos optimizados no Laboratório de Química e Bioquímica Aplicada do Centro de Investigação de Montanha (Barros et al., 2008b), para avaliar a actividade antioxidante das amostras individuais e das misturas.

2.4.1 Actividade bloqueadora de radicais DPPH.

O efeito bloqueador de radicais livres de DPPH foi monitorizado de acordo com o método descrito por Hatano et al. (1988). As várias concentrações dos extractos (0,3 mL) foram adicionadas a uma solução metanólica de DPPH (2,7 mL a uma concentração de 6×10-5M). A mistura foi agitada vigorosamente e deixada no escuro durante 60 min (até estabilização dos valores de absorvância). A redução do radical DPPH foi avaliada medindo a absorvância a 517 nm. A actividade bloqueadora do radical (ABR) foi calculada pela percentagem de descoloração de DPPH utilizando a equação: % ABR = [(ADPPH-

AS)/ADPPH] × 100, onde As é a absorvância da solução contendo a amostra de extracto de cada concentração em particular, e ADPPH é a absorvância da solução de DPPH. A concentração de extracto correspondente a 50% de actividade bloqueadora de radicais

(EC50) foi calculada por interpolação no gráfico da % ABR em função da concentração de extracto. BHA e α-tocoferol foram usados como padrões.

2.4.2 Poder redutor

O poder redutor foi determinado de acordo com o método de Oyaizu (1986). As várias concentrações dos extractos (2,5 mL) foram misturadas com tampão fosfato de sódio (2,5 mL; 200 mM; pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1% m/v; 2,5 mL). A mistura foi incubada a 50 ºC durante 20 min. Após a adição de ácido tricloroacético (10%; 2,5 mL), a mistura foi centrifugada a 1000 rpm durante 8 min (centrífuga refrigerada Centorion K24OR). Misturou-se o sobrenadante (5 mL) com água desionizada (5 mL) e cloreto de ferro (0,1%, 1 mL) e mediu-se a absorvância a 700 nm: absorvâncias elevadas indicam um maior poder Efeitos sinergísticos da capacidade antioxidante de cogumelos 26 Universidade de Aveiro - Departamento de Biologia

redutor. A concentração de extracto correspondente a 0,5 de absorvância (EC50) foi calculada por interpolação gráfica da absorvância a 700 nm em função da concentração de extracto. Os padrões usados foram o BHA e α-tocopherol.

2.4.3 Inibição da descoloração do β-caroteno

A actividade antioxidante dos extractos metanólicos foi avaliada pelo sistema β-caroteno linoleato (Mi-Yae et al., 2003). A solução de β-caroteno foi preparada por dissolução de β- caroteno (2 mg) em clorofórmio (10 mL). Após remoção do clorofórmio da solução de β- caroteno (2 mL) por vácuo a 40 ºC, adicionou-se ácido linoleico (40 mg), emulsificador Tween 80 (400 mg) e água destilada (100 mL), e agitou-se vigorosamente. Transferiram-se alíquotas (4,8 mL) desta emulsão para diferentes tubos de ensaio contendo diferentes concentrações (0,2 mL) dos extractos. Os tubos foram agitados e incubados num banho a 50 ºC. Logo após a adição da emulsão a cada tubo, foi determinado o tempo zero de absorvância (470 nm). A absorvância foi medida em intervalos de 20 min até se verificar uma alteração no controlo. Foi preparado um branco, idêntico às amostras mas desprovido de β-caroteno.

A inibição da peroxidação lipídica foi calculada usando a seguinte equação: [(Abs470 após

2h/Abs470 inicial) × 100)]. A concentração de extracto correspondente a 50% de actividade antioxidante (EC50) foi calculada por interpolação gráfica da percentagem de actividade antioxidante em função da concentração de extracto. TBHQ foi usado como padrão.

2.5. Análise estatística

Os ensaios foram efectuados em triplicado e os resultados foram expressos em valores médios ± desvio padrão (SD). As diferenças estatísticas representadas por letras (tabelas 1 e 2) foram obtidas pela análise da variância (ANOVA) seguida de um teste de Tukey com uma diferença post hoc significativa e α= 0,05, juntamente com o teste estatístico Welsh. De modo a determinar as variáveis discriminantes foi efectuada uma análise de função discriminante entre os cinco grupos, considerando as cinco espécies em estudo Boletus edulis (Be), Calocybe gambosa (Cg), Cantharellus cibarius (Cci), Craterellus cornucopioides (Cco) e Marasmius oreades (Mo), bem como dos grupos formados pelas

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misturas (Be+Cci, Be+Cco, Be+Mo, Be+Cg, Cci+Cco, Cci+Mo, Cci+Cg, Cco+Mo, Cco+Cg e Mo+Cg) seguindo o método stepwise, onde o modelo de discriminação é construído passo a passo. Em cada etapa, todas as variáveis são reconsideradas a fim de encontrar qual terá maior contributo na discriminação entre grupos. Esta variável será depois incluída no modelo, recomeçando o processo. Os valores de F para enter (3,84) e F para remove (2,71) são as orientações do procedimento stepwise. A variável é incluída no modelo se o seu valor de F for maior que o valor de F-enter e removida se o valor de F for menor que o valor de F-remove. O F-enter deve ser maior que o F-remove, devendo ambos os valores ser positivos. O valor de F para uma variável indica a sua significância estatística na discriminação entre grupos. As análises discriminantes definem uma combinação óptima de variedades, sendo que a primeira função fornece a discriminação mais geral entre grupos, a segunda providencia a segunda maior, e assim sucessivamente (Benitez et al., 2006). Estes tratamentos foram analisados usando o software SPSS v. 16.0.

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III. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Existem alguns registos de efeitos tóxicos após a ingestão de alguns dos cogumelos estudados, tal como Boletus edulis (Nieminen et al., 2005) e Cantharellus cibarius (Nieminen et al., 2006). Os resultados revelaram aumento da actividade da creatina cinase plasmática em ratos e efeitos adicionais nas transaminases hepáticas e na creatinina plasmática. Todavia, os efeitos prejudiciais requerem exposições diárias prolongadas e grandes quantidades de cogumelos ingeridas (Nieminen et al., 2005). Estes pressupostos devem ser cuidadosamente interpretados já que estes cogumelos são considerados comestíveis há milénios. Além disso, a actividade antioxidante de várias espécies de cogumelos foi já demonstrada e correlacionada com diferentes compostos antioxidantes (Ferreira et al., 2009). No entanto, ainda não existem estudos considerando misturas de cogumelos e analisando os diferentes tipos de interacções (efeito de sinergismo, aditivo ou de sinergismo negativo) inerentes às suas propriedades antioxidantes. Devido à diversidade química de compostos antioxidantes presentes nos alimentos, torna-se muito difícil separar cada composto antioxidante e estudá-lo individualmente. Adicionalmente, antioxidantes individuais dos alimentos não reflectem necessariamente a capacidade antioxidante total, já que poderão existir possíveis interacções sinergísticas entre os compostos antioxidantes presentes (Magalhães et al., 2008). Para avaliar as propriedades antioxidantes, realizaram-se ensaios baseados na transferência de átomos de hidrogénio (HAT) e na transferência do electrão único (ET): actividade bloqueadora de radicais DPPH (avaliando a redução na absorvância da solução de DPPH após exposição aos bloqueadores de radicais), poder redutor e inibição da peroxidação lipídica. A actividade antioxidante não pode ser determinada directamente, mas sim pelos efeitos antioxidantes no controlo da extensão da oxidação (Antolovich et al., 2002). Numerosos testes foram desenvolvidos para determinar a capacidade antioxidante de alimentos e amostras biológicas. Contudo, não existe um método universal capaz de avaliar a capacidade antioxidante de todas as amostras quantitativamente (Wrigth et al., 2001; Prior et al., 2005). Um método padronizado para avaliar a capacidade antioxidante deve obedecer a vários requisitos: utilizar uma fonte biologicamente relevante de radicais; ser simples; utilizar um

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método com um ponto final e mecanismo definido; usar instrumentação adequada; ter uma boa reprodutibilidade; ser adaptável a ensaios antioxidantes hidrofílicos ou lipofílicos, e à utilização de diferentes fontes de radicais e ser adaptável a análise de controlo de qualidade (Prior et al., 2005). Actualmente, os métodos mais vastamente usados para determinação da capacidade antioxidante são os que envolvem a geração de espécies radicalares. Estes ensaios foram aplicados à estimativa da actividade antioxidante em sistemas aquosos, mas não para antioxidantes lipídicos solúveis em sistemas não polares (Zaporhets et al., 2004). Baseado nas reacções químicas envolvidas, a maioria dos ensaios de capacidade antioxidante podem ser genericamente divididos em duas categorias: (1) ensaios baseados na reacção de transferência de átomo de hidrogénio (HAT), e ensaios baseados na reacção de transferência do electrão (ET) único. Estas reacções podem ocorrer em paralelo e habitualmente ocorrem juntas em todas as amostras (Prior et al., 2005). HAT e ET determinam a capacidade de bloqueio do radical (ou oxidante) da amostra em vez da capacidade antioxidante preventiva (Prior et al., 2005). Os factores que determinam o mecanismo da actividade de um antioxidante na desactivação de um radical num dado sistema são a estrutura e as propriedades do antioxidante, a sua solubilidade e o coeficiente de partição, pH e natureza do sistema (Huang et al., 2005). O mecanismo e a eficácia de antioxidantes podem também ser determinados pela energia de dissociação e potencial de ionização (Wright et al., 2001). A maioria dos ensaios baseados em HAT são cinéticos, e envolvem um esquema de reacção competitiva, no qual o antioxidante e substrato competem por radicais peroxilo gerados através da decomposição de componentes azo. Este tipo de ensaios detecta a capacidade de um antioxidante (AH= qualquer dador H) neutralizar radicais livres pela dádiva de um hidrogénio (Prior et al., 2005), de acordo com a Equação 2,

• • Eq. 2 X + AH XH + A em que X• representa um radical livre, AH um antioxidante, XH o radical livre reduzido e A• representa a forma oxidada do antioxidante. Além disso, um gerador de radical livre sintético, uma sonda molecular oxidada, e um antioxidante são os principais componentes de qualquer método baseado em HAT (Wright et al., 2001). Os ensaios baseados em HAT não dependem da natureza do solvente ou do

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pH deste (Wright et al., 2001); são habitualmente relativamente rápidos, segundos a minutos. Agentes redutores, incluindo metais (M), interferem com reacções baseadas em HAT podendo levar erroneamente a actividades aparentemente elevadas (Prior et al., 2005), como se evidencia na Equação 3.

• − •+ Eq.3 X + AH X + AH •+ • + AH + H O A + H O 2 3 − + X + H3O XH + H2O

H2O 3+ + 2+ M + AH AH + M

Os métodos baseados na transferência do electrão único determinam a capacidade do potencial antioxidante em transferir um electrão para reduzir um oxidante, incluindo metais, carbonilos e radicais que mudam de cor quando reduzidos (Wright et al., 2001). A extensão da mudança de cor está correlacionada com as concentrações de antioxidantes na amostra. Ao contrário das reacções baseadas em HAT, as baseadas na transferência do electrão único são dependentes do pH do meio. A presença de vestígios de contaminantes (particularmente metais) nas amostras pode contribuir para a elevada variabilidade e baixa reprodutibilidade e consistência dos resultados (Sartor et al., 1999). O método da actividade bloqueadora do radical difenilpicril-hidrazilo (DPPH) foi descrito por Brand-Williams et al. (1995) e posteriormente modificado por Sánchez-Moreno et al. (1998), sendo um dos métodos de determinação de actividade antioxidante mais largamente usados. O radical DPPH é um radical azotado orgânico estável, sendo comercialmente útil e que apresenta uma coloração violeta intensa. Este ensaio determina a capacidade de redução do DPPH. por antioxidantes. Ao ocorrer a redução, a solução de DPPH vai perdendo a cor sendo esta alteração monitorizada a 517 nm. Adicionalmente, os compostos testados com elevada actividade antioxidante induzem num rápido declínio da absorvância do DPPH (Antolovich et al., 2002; Amarowicz et al., 2004). Quando a solução de DPPH. é misturada com a substância que pode doar um átomo de hidrogénio, é produzida a forma reduzida do radical acompanhado por perda da cor (Ali et al., 2008). A Equação 4 representa a reacção inerente a este método,

Eq.4 X• + AH XH + A•

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em que X. representa o radical DPPH, AH a molécula doadora de hidrogénios, XH o radical reduzido e A• representa a forma oxidada do antioxidante. O conteúdo fenólico foi determinado através do método de Folin e Ciocalteu (FC). Este ensaio foi originalmente estabelecido e usado para análise de proteínas pela reacção entre o reagente e resíduos de tirosina (que contém um grupo fenólico) nas proteínas (Folin & Ciocalteu, 1927). Este método foi, além disso, adoptado para análises de fenóis totais em muitos estudos sendo, neste momento, mais comummente conhecido como ensaio de fenóis totais. O reagente de molibdotungstato oxida fenóis e origina um produto colorido com uma absorvância máxima a 745-750 nm. O ensaio de fenóis totais avalia a capacidade de redução da amostra (Singleton et al., 1999). Numerosas publicações relatam correlações lineares excelentes entre os fenóis totais determinados pelo ensaio Folin e Ciocalteu (FC) e a capacidade antioxidante (Huang et al., 2005). O mecanismo preciso da reacção FC ainda não está completamente bem definido. O reagente contém heteropolifotungstato-molibdatos que, em condições básicas, reage com compostos fenólicos para formar o anião fenolato, pela dissociação de um protão fenólico. Esta sequência de reacções de redução reversível de um ou dois electrões origina produtos de cor azul. Acredita-se que a reacção de transferência do electrão dos redutores para Mo (VI) reduzem o molibdénio (Huang et al., 2005; Prior et al., 2005), como traduzido na Equação 5,

Eq.5 Mo (VI) (amarelo) + e- → Mo (V) (azul)

em que Mo(VI) representa a forma reduzida do molibdénio, e- um electrão e Mo(V) representa a forma oxidada do molibdénio. Vários artigos descrevem a utilização de diferentes padrões no ensaio dos fenóis totais, incluindo equivalentes de catequina (Vinson et al., 2001; Katsube et al., 2003), equivalentes de ácido tânico (Nakamura et al., 2003), equivalentes de ácido clorogénico (Wang et al., 2003), equivalentes de ácido cafeico (Maranz et al., 2003), equivalentes de ácido protocatequico (Cai et al., 2003), equivalentes de ácido vanílilico (Jayasinghe et al., 2003), equivalentes de ácido gálico (Cheung et al., 2003) e equivalentes de ácido ferrúlico (Velioglu et al., 1998).

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O ensaio dos fenóis totais tornou-se um ensaio de rotina no estudo de antioxidantes fenólicos sendo simples e sensível (Huang et al., 2005). Contudo, algumas substâncias nomeadamente, açúcares, aminas aromáticas, dióxido sulfúrico, ácido ascórbico e outros enedioles e redutores, ácidos orgânicos, Fe(II) e Cu(I), interferem com o método dos fenóis totais; assim devem ser consideradas correcções para essas substâncias (Prior et al., 2005). O poder redutor das amostras em estudo foi determinado avaliando a conversão do complexo Fe3+/ ferricianeto para a forma ferrosa. A transformação do Fe3+ para Fe2+ é medida para determinar a capacidade do poder de redução. O antioxidante presente 3+ provoca a redução do complexo Fe /ferricianeto (FeCl3/K3Fe(CN)6) para a forma ferrosa (Fe2+) (Chung et al., 2002). Além disso, dependendo do poder redutor dos compostos avaliados, a cor amarela da solução muda para várias tonalidades de verde ou azul, podendo ser medida espectrofotometricamente a 700 nm (Yen & Chen, 1995; Amarowicz et al., 2004). Os ensaios baseados na redução do ferro podem ser sintetizados pela Equação 6,

3+ 2+ Eq.6 Fe –L + antioxidante Fe –L + antioxidante oxidado

em que L representa o ligando cromogénico selectivo do ião ferroso, que produz espécies Fe2+ coloridas –L , como resultado da reacção redox. 3+ 3- Com qualquer das espécies oxidantes, Fe –L ou Fe(CN)6 (na composição do reagente 2+ 4- ferricianeto), o produto de redução com o antioxidante, Fe –L ou Fe(CN)6 , respectivamente, reagem com o outro componente do reagente para produzir azul da 3+ Prússia, KFe[Fe(CN)6], como produto colorido. Por outras palavras, quando Fe ou 3- Fe(CN)6 são utilizados com agente oxidante (no ensaio ferricianeto modificado), ocorrem as reacções traduzidas pelas Equações 7 e 8, respectivamente originando ambas o mesmo produto (azul da Prússia) (Berker et al., 2007).

3+ Fe + antioxidante Fe2+ + antioxidante oxidado Eq.7 2+ 3− − Fe + Fe(CN)6 Fe[Fe(CN)6]

ou

Fe(CN) 3− + antioxidante 4− Eq.8 6 Fe(CN)6 + antioxidante oxidado

4− 3+ − Fe(CN)6 + Fe Fe[Fe(CN)6]

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O ensaio do poder redutor é considerado um método sensível para a determinação semiquantitativa de concentrações diluídas de polifenóis, que participam em reacções redox (Amarowicz et al., 2004). A inibição da peroxidação lipídica foi avaliada através da inibição da descoloração do β- caroteno (pela neutralização do radical livre linoleato e outros radicais livres formados nas soluções de lipossomas que atacam os modelos β-caroteno altamente insaturados, como se explica já a seguir). A peroxidação lipídica é um processo complexo, ocorrendo em múltiplas fases. É já completamente aceite que os antioxidantes retardam a peroxidação lipídica nos alimentos bem como em amostras biológicas. Consequentemente, várias técnicas estão disponíveis para determinar o valor de oxidação das membranas, lípidos derivados dos alimentos, lipoproteínas e ácidos gordos. Cada técnica determina parâmetros diferentes e nenhum método pode ser considerado absoluto para a determinação da peroxidação lipídica. Assim, o efeito de um antioxidante na peroxidação lipídica pode ser avaliado principalmente em três subcategorias: (1) perda de substratos, (2) ensaios de peróxidos, e (3) determinação de produtos finais. Substratos lipídicos que podem ser usados incluem emulsões, lipossomas de ácidos gordos ou ésteres de ácidos gordos. Sistemas biológicos podem incluir eritrócitos, lipoproteínas isoladas (mais frequentemente lipoproteínas de baixa densidade ou lipoproteínas de alta densidade). O outro substrato para a peroxidação é o oxigénio, logo, a determinação da concentração de oxigénio constitui outro índice global de peroxidação. Esta técnica é utilizada quando ocorrem interferências espectofotométricas ou os químicos são tóxicos para ensaios enzimáticos (Antolovich et al., 2002). A oxidação pelo calor induzido numa emulsão aquosa do sistema β-caroteno e ácido linoleico foi descrita como um ensaio de reacção antioxidante por Marco (1968) e depois modificado por Miller (1971). A descoloração do β-caroteno pode ser monitorizada a 470 nm (Burda & Oleszek 2001); esta descoloração pode ser utilizada como um ensaio de actividade antioxidante. O β-caroteno sofre uma rápida descoloração na ausência de um antioxidante uma vez que o radical livre derivado do ácido linoleico ataca a molécula de β- caroteno, que perde a dupla ligação e consequentemente, perde a sua coloração laranja característica. O β-caroteno é extremamente sensível para a oxidação mediada pelo radical livre derivado do ácido linoleico (Gutierrez et al., 2006).

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Antioxidantes clássicos podem doar átomos de hidrogénio para neutralizar radicais e prevenir a descoloração dos carotenóides, de acordo com a Equação 9,

• Eq.9 β-caroteno – H (laranja) + ROO β-caroteno• (descorado) + ROOH

• • β-caroteno – H (laranja) + ROO + AH β-caroteno – H (laranja) + R OOH + A

em que β-caroteno – H representa a forma reduzida do β-caroteno, ROO• o radical livre linoleato, β-caroteno• a forma oxidada do β-caroteno, ROOH a forma reduzida do radical livre, AH um antioxidante e A• representa a forma oxidada do antioxidante. Uma das vantagens do método de descoloração do β-caroteno é não necessitar de instrumentação especializada. Antioxidantes fenólicos podem neutralizar qualquer radical formado no sistema (ex, o radical livre linoleato) e, consequentemente, permitir o retardamento da descoloração do β-caroteno (Amarowicz et al., 2004). As espécies Boletus edulis, Calocybe gambosa, Cantharellus cibarius, Craterellus cornucopioides e Marasmiu oreades foram recentemente analisadas quanto aos seus nutrientes (gorduras, proteínas, glícidos, minerais), nutracêuticos (ácidos gordos, tocoferóis, ácido ascórbico e carotenóides) e actividade antimicrobiana (Barros et al., 2008a), mas não existem quaisquer relatos quanto às propriedades antioxidantes destas espécies em particular. Por outro lado, embora, já tenha sido demonstrado a existência de actividade antioxidante noutras espécies e tenham sido identificados diferentes compostos antioxidantes, nada se sabe sobre o sinergismo resultante da combinação de diferentes espécies de cogumelos. Por conseguinte, neste estudo, pretende-se avaliar as propriedades antioxidantes de amostras individuais e misturas de diferentes espécies de cogumelos através de ensaios químicos e bioquímicos: actividade bloqueadora de radicais DPPH (2-2- difenil-1-picril-hidrazilo), poder redutor, inibição da peroxidação lipídica.

Os conteúdos fenólicos e os valores de EC50 da actividade antioxidante dos cogumelos comestíveis Boletus edulis, Calocybe gambosa, Cantharellus cibarius, Craterellus cornucopioides e Marasmius oreades apresentam-se na tabela 1.

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Tabela 1. Valores experimentais do conteúdo fenólico (mg/g) e actividade antioxidante

EC50 (mg/mL) das espécies de cogumelos (média  SD; n=3). Em cada coluna, as diferentes letras traduzem diferenças significativas entre os valores (p0,05), sendo que aos maiores valores quantitativos correspondem letras iniciais do alfabeto. Actividade Inibição da Fenóis Poder redutor Espécies bloqueadora de peroxidação (mg/g) (mg/mL) DPPH (mg/mL) lipídica (mg/mL) Boletus edulis (Be) 5,03±0,07 a 2,55±0,07 b 1,21±0,05 e 1,09±0,27 e Calocybe gambosa (Cg) 1,70±0,63 d 7,14±0,63 a 4,31±0,03 b 2,77±0,02 b Cantharellus cibarius (Cci) 0,88±0,09 e 7,49±1,87 a 5,89±0,07 a 3,64±0,05 a Craterellus cornucopioides (Cco) 2,13±0,48 c 6,33±0,48 a 3,69±0,03 c 1,79±0,51 c Marasmius oreades (Mo) 3,27±0,02 b 2,78±0,02 b 2,02±0,01 d 1,57±0,38 d

Todas as espécies testadas revelaram propriedades antioxidantes (com valores de EC50 inferiores a 7,5 mg/mL), pela ordem Be>Mo>Cco>Cg>Cci. B. edulis mostrou ser a espécie

mais efectiva em todos os ensaios (valores de EC50 inferiores a 2,6 mg/mL), revelando também possuir o maior conteúdo fenólico (5,03 ± 0,07 mg/g; tabela 1). Num estudo anterior (Barros et al., 2008a) em que foram estudadas as mesmas espécies de cogumelos, verificou-se que também B. edulis possuía o maior conteúdo em tocoferóis (poderosos antioxidantes) e interessantes propriedades nutricionais com alto conteúdo em minerais (7,07 mg/100 g, peso seco), elevado valor energético (1671,83 kJ/100g) devido à contribuição dos glícidos (71,15 g/100g) e altos níveis de ácidos gordos insaturados (85 %) relativamente a ácidos gordos saturados (15 %). Revelou também uma forte actividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, com concentração mínima inibitória (MIC) menor que o padrão ampicilina. Outros autores referiram um valor ligeiramente maior de conteúdo fenólico em amostras de B. edulis da Índia (8,4 mg/g; Puttaraju et al., 2006) e Formosa (5,73 mg/g; Tsai et al., 2007). O extracto metanólico de B. edulis utilizado neste

trabalho, revelou maior poder redutor (EC50 1,21 mg/mL) mas menor actividade bloqueadora de radicais DPPH (225 mg/mL) que o extracto metanólico dos organismos da Formosa (8,98 mg/mL e 1,75 mg/mL, respectivamente) (Tsai et al., 2007).

C. cibarius provou ter a pior capacidade antioxidante (maiores valores de EC50), o que está de acordo com o seu baixo teor fenólico (0,88 ± 0,09 mg/g; tabela 1) e em tocoferóis (Barros et al., 2008a). Apesar da sua baixa actividade antioxidante, esta espécie revelou possuir uma forte actividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus e Bacillus subtillis revelando, neste caso, uma MIC menor que a ampicilina (Barros et al., 2008a).

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Puttaraju et al (2006) também descreveram B. edulis como tendo elevada actividade antioxidante e C. cibarius como tendo uma baixa actividade antioxidante. Para Calocybe gambosa, Craterellus cornucopioides e Marasmius oreades, este é o primeiro registo das suas propriedades antioxidantes.

Os conteúdos fenólicos e os valores de EC50 da actividade antioxidante das misturas de duas espécies de cogumelos são apresentados na tabela 2.

Tabela 2. Concentrações de fenóis (mg/g) e actividade antioxidante EC50 (mg/mL) das misturas de cogumelos (média  SD; n=3). Em cada coluna as diferentes letras traduzem diferenças significativas entre os valores (p0,05), sendo que aos maiores valores quantitativos correspondem letras iniciais do alfabeto. Fenóis Actividade bloqueadora de Poder redutor Inibição da peroxidação Amostras (mg/g) DPPH (mg/mL) (mg/mL) lipídica (mg/mL) Be + Cci 2,25±0,10 d 5,78±0,20 b 2,20±0,06 f 1,76±0,01 c Be + Cco 4,04±0,34 c 4,82±0,93 c 2,25±0,03 ef 1,40±0,12 d Be + Mo 4,59±0,11 a 4,05±0,11 c 1,81±0,01 h 1,27±0,03 de Be + Cg 3,69±0,40 c 4,54±0,20 c 2,25±0,02 ef 1,13±0,03 ef Cci + Cco 0,80±0,17 e 7,86±1,44 a 6,62±0,18 a 3,32±0,17 a Cci + Mo 1,98±0,13 d 7,60±0,57 a 3,38±0,03 c 1,86±0,10 c Cci + Cg 1,11±0,14 e 7,45±0,11 a 5,73±0,26 b 2,92±0,02 b Cco + Mo 4,84±0,09 a 4,00±0,06 c 2,03±0,04 g 1,06±0,04 f Cco + Cg 4,13±0,55 bc 4,22±0,31 c 2,38±0,03 de 1,12±0,02 ef Mo + Cg 4,51±0,43 ab 4,90±0,23 bc 2,53±0,02 d 1,27±0,04 de

As misturas Be+Mo e Cco+Mo mostraram possuir maior conteúdo fenólico e menores

valores EC50 de actividade antioxidante, enquanto que Cci+Cco, Cci+Cg, Cci+Mo e

Cci+Be revelaram menor conteúdo fenólico e maiores valores EC50 de actividade antioxidante. Marasmius oreades parece ser o mais efectivo quanto à capacidade antioxidante quando combinado com outra espécie, enquanto Cantharellus cibarius parece ser o menos efectivo. Os tipos de interacções (efeito de sinergismo, aditivo ou sinergismo negativo) observados na actividade antioxidante das misturas são apresentados na tabela 3.

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Tabela 3. Valores experimentais versus valores teóricos da actividade antioxidante EC50 das misturas de espécies de cogumelos (média  SD; n=3).

Actividade bloqueadora de DPPH Poder redutor Actividade da peroxidação lipídica Espécies (mg/mL) (mg/mL) (mg/mL) Teóricoa) Experimental Efeito Teórico Experimental Efeito Teórico Experimental Efeito Be + Cci 5,02 5,78 NS 3,55 2,20 S 2,37 1,76 S Be + Cco 4,44 4,82 NS 2,45 2,25 S 1,44 1,40 A Be + Mo 2,66 4,05 NS 1,62 1,81 NS 1,33 1,27 A Be + Cg 4,84 4,54 S 2,76 2,25 S 1,93 1,13 S Cci + Cco 6,91 7,86 NS 4,79 6,62 NS 2,72 3,32 NS Cci + Mo 5,13 7,60 NS 3,96 3,38 S 2,61 1,86 S Cci + Cg 7,31 7,45 A 5,10 5,73 NS 3,21 2,92 S Cco + Mo 4,55 4,00 S 2,86 2,03 S 1,68 1,06 S Cco + Cg 6,73 4,22 S 4,00 2,38 S 2,28 1,12 S Mo + Cg 4,96 4,90 A 3,17 2,53 S 2,17 1,27 S

aOs valores teóricos foram obtidos considerando contribuições aditivas das espécies individuais. A – Efeito Aditivo: os valores teóricos e experimentais revelam diferenças inferiores a 5%.

S – Efeito sinergístico: os valores experimentais de EC50 são, em mais de 5 %, inferiores aos valores teóricos. NS – Efeito sinergístico negativo (antagonista): os valores experimentais de EC50 são, em mais de 5 %, superiores aos valores teóricos.

No ensaio da actividade bloqueadora de radicais DPPH, foi observado um sinergismo negativo (depleção da capacidade antioxidante) em 50% das misturas. As misturas Be+Cg, Cco+Mo, Cco+Cg apresentaram um efeito sinergístico, enquanto que Cci+Cg e MoCg revelaram efeitos aditivos. Considerando o ensaio do poder redutor, o sinergismo foi o principal efeito, sendo observado em 70% das misturas. As misturas Cci+Cco, Cci+Cg e Be+Mo apresentaram um sinergismo negativo. Uma vez mais, o efeito sinergístico predominou no ensaio da peroxidação lipídica, sendo observado em 70% das misturas. Be+Cco e Be+Mo revelaram efeito aditivo e apenas uma mistura, Cci+Cco, revelou sinergismo negativo (tabela 3). Globalmente, Cco+Mo (figura 6), Be+Cg e Cco+Cg mostraram efeitos sinergísticos em todos os ensaios de actividade antioxidante.

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a) 100,0 90,0 80,0 70,0 60,0 50,0 40,0

30,0 Cco + Mo 20,0 Cco 10.0 Mo Inibição DPPHInibição(%) 0 0 5 10 15 20 Concentração (mg/mL)

b) c) 2.5 100.0 90.0 2.0 80.0 70.0 1.5 60.0 50.0 1.0 40.0 30.0 Cco + Mo Cco + Mo 0.5 20.0

Abs(700nm) Cco 10.0 Cco Mo 0.0 0.0 Mo Inibição da peroxidação lipidica (%) lipidica peroxidação da Inibição 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 Concentração (mg/mL) Concentração (mg/mL)

Figura 6. Efeito sinergístico na actividade bloqueadora de DPPH (a), poder redutor (b) e inibição da peroxidação lipídica (c) : exemplo da mistura Cratarellus cornucopioides + Marasmius oreades.

Estas misturas também apresentaram o maior conteúdo fenólico e melhores propriedades antioxidantes, tal como foi já discutido e pode ser observado na tabela 2. A mistura Mo+Cg revelou sinergismo em todos os ensaios com excepção da actividade bloqueadora de DPPH, onde foi observado efeito aditivo. Apenas a mistura Cci+Cco (figura 7) revelou efeitos sinergísticos negativos em todos os ensaios de actividade antioxidante, estando de acordo com o seu menor conteúdo fenólico e piores propriedades antioxidantes (tabela 2).

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100.0 a) 90.0 80.0

70.0

60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 Cci + Cco Cci 10.0 Inibição DPPH (%) DPPH Inibição Cco 0 0 5 1 1 2 Concentração0 5 (mg/mL)0

b) c)

1.0

0.9 90.0 0.8 80.0 0.7 70.0

0.6 60.0 lipidica (%) lipidica

0.5 50.0 Abs (700 nm) nm) Abs(700 0.4 40.0 0.3 Cci + Cco 30.0 0.2 Cci 20.0 Cci + Cco 0.1 Cci Cco 10.0 0.0 0,0 Cco 0 2 4 6 8 10 Inibição da peroxidação peroxidação da Inibição 0 5 10 15 20 Concentração (mg/mL) Concentração (mg/mL)

Figura 7. Efeito sinergístico negativo na actividade bloqueadora de DPPH a), poder redutor b) e inibição da peroxidação lipídica c): exemplo da mistura Cantharellus cibarius + Cratarellus cornucopioides.

Para as restantes misturas que revelaram baixa actividade antioxidante, Cci+Cg, Cci+Mo e

Cci+Be, foi observado sinergismo negativo apenas num dos ensaios: poder redutor para a primeira mistura e capacidade bloqueadora de DPPH para as outras duas misturas. As tabelas 4 e 5 mostram os resultados da aplicação do algoritmo às espécies individuais de cogumelos e às misturas, respectivamente, de acordo com o seu conteúdo fenólico, actividade bloqueadora de DPPH, poder redutor e inibição da peroxidação lipídica. O Lambda de Wilk é um método de selecção da variável por análise discriminante stepwise (passo a passo), que selecciona variáveis para aplicar com base no valor do Lambda de Wilks. Este factor é uma medida do potencial de uma determinada variável; quanto menor for o seu valor, maior é o seu poder de discriminação entre grupos. A tolerância é a proporção da variância de uma variável não contabilizada por outras variáveis independentes na equação. Se for baixo, contribuirá com pouca informação para o modelo, podendo causar problemas.

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Tabela 4. Parâmetros da análise discriminante para as espécies individuais de cogumelos.

F de remoção 2 Lambda de Wilk Significância Tolerância 1-Tolerância(R ) 2,71

Poder redutor 0,0018 193660,2897 0,0000 0,9999 0,0001 Conteúdo fenólico 0,0000 40,5665 0,0000 0,9152 0,0848 Inibição da peroxidação lipídica 0,0000 10,2192 0,0000 0,6122 0,3878 Actividade bloqueadora de radicais 0,0000 6,4332 0,0000 0,6570 0,3430 DPPH

Tabela 5. Parâmetros da análise discriminante para as misturas de espécies de cogumelos.

2 Lambda de Wilk F de remoção Significância Tolerância 1-Tolerância (R ) Poder redutor 0,0021 235,2535 0,0000 0,9028 0,0972 Conteúdo fenólico 0,0003 29,6423 0,0000 0,9669 0,0331 Inibição da peroxidação lipídica 0,0002 17,1959 0,0000 0,9460 0,0540 Actividade bloqueadora de 0,0002 8,9159 0,0000 0,8973 0,1027 radicais DPPH

Analisando as espécies de cogumelos, a análise discriminante (AD) definiu quatro dimensões. O que interessa para o método é que as quatro foram utilizadas durante a análise. Porém, apenas as primeiras duas apresentaram um Eigenvalue superior a 1, pelo que apenas estas foram apresentadas no diagrama (figura 8).

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Figura 8. Análise canónica das espécies de cogumelos.

A primeira dimensão AD separa todas as espécies (médias da variância canónica, MCV: Be=-1027,765, Cg=409,600, Cci=1143,484, Cco=124,693 e Mo= -650,011), estando mais fortemente correlacionado com o poder redutor (tabela 6).

Tabela 6. Correlação entre variáveis discriminantes e funções discriminantes canónicas padronizadas para as espécies de cogumelos. As variáveis estão ordenadas pelo tamanho absoluto da correlação na função. Função

1 2 3 4

Poder redutor 1,0000* -0,0016 -0,0056 -0,0040

Conteúdo fenólico -0,0085 0,8732* -0,4794 0,0873

Inibição da peroxidação lipidica 0,0039 0,2061 0,8434* -0,4963

Actividade bloqueadora de radicais DPPH 0,0029 -0,0742 -0,0819 0,9939*

*Maior correlação absoluta entre cada variável e qualquer função discriminante.

Quanto às misturas de espécies, a AD também definiu quatro dimensões, sendo 99,6% da variância observada explicada pelas primeiras duas (figura 9).

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Figura 9. Análise canónica das misturas de cogumelos. A primeira dimensão separa principalmente Be+Cci, Cci+Cco, Cci+Mo e Cci+Cg das restantes misturas (MCV: Be+Cci=-7,068, Cci+Cco=40,844, Cci+Mo=4,031, Cci+Cg=30,854) provando estar mais relacionada com o poder redutor (tabela 7). A segunda dimensão DA confirmou a separação de Be+Cci e Cci+Mo (MCV: Be+Cci = - 6,145 e Cci+Mo = -4,263, Cci+Cg = 30,854), e está mais correlacionada com os conteúdos fenólicos (tabela 7).

Tabela 7. Correlação entre variáveis discriminantes e funções discriminantes canónicas padronizadas para as misturas de cogumelos. As variáveis estão ordenadas pelo tamanho absoluto da correlação na função. Função

1 2 3 4

Poder redutor 0,8151* 0,3995 -0,3837 0,1699

Conteúdo fenólico -0,2323 0,7883* 0,1526 0,5489

Inibição da peroxidação lipídica 0,3212 -0,2823 0,8083* 0,4047

Actividade bloqueadora de radicais DPPH 0,1161 -0,3507 -0,3734 0,8510*

*Maior correlação absoluta entre cada variável e qualquer função discriminante. Efeitos sinergísticos da capacidade antioxidante de cogumelos 43 Universidade de Aveiro - Departamento de Biologia

O diferente comportamento verificado pode ser explicado com base na natureza química e reactividade dos compostos presentes nas misturas, nomeadamente tocoferóis, ácido ascórbico, açúcares e maioritariamente, compostos fenólicos. Estes compostos podem sofrer polimerização e outras reacções que promovem importantes alterações estruturais e, como consequência, variações na sua actividade antioxidante. Por exemplo, a capacidade bloqueadora por parte dos compostos fenólicos é atribuída à sua habilidade dadora de hidrogénio: quanto maior o número de grupos hidroxilo, maior é a possibilidade de actividade bloqueadora de radicais livres (Pinelo et al., 2004). A disponibilidade dos grupos hidroxilo depende tanto da estrutura química como da conformação espacial, que pode modificar a reactividade das moléculas. Contudo, quando o grau de polimerização excede um valor crítico, o aumento da complexidade molecular promove um decréscimo na capacidade antioxidante, provavelmente devido a um impedimento, que reduz a disponibilidade dos grupos hidroxilo (Pinelo et al., 2004).

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IV. CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS FUTURAS

Neste trabalho, foram observados três tipos de interacções (efeito sinergístico, aditivo e sinergístico negativo), sendo o sinergismo o efeito mais abundante. Marasmius oreades está presente nas misturas com maior conteúdo fenólico e actividade antioxidante mais elevada, enquanto Cantherellus cibarius está presente nas misturas com menor potencial antioxidante. Nos ensaios individuais, embora tenham sido obtidos bons resultados para M. oreades, o maior conteúdo fenólico e actividade antioxidante foram registados para Boletus edulis. Tendo em conta a análise discriminante, as espécies individuais provaram possuir distintos recursos considerando a actividade antioxidante, uma vez que foi obtido um grupo separado para cada espécie. Em relação às misturas, os resultados obtidos mostraram uma maior homogeneidade, uma vez que não foi possível obter um grupo individual para cada mistura. Na verdade, apenas as misturas Cci foram claramente separadas, confirmando a actividade antioxidante significativamente mais baixa e o menor conteúdo fenólico de Cantharellus cibarius. Alguns produtos naturais com actividade antioxidante podem ser úteis no auxílio do sistema protector endógeno do organismo (enzimas como superóxido dismutase, glutationa peroxidades, catalase e glutationa redutase), podendo ser utilizados como nutracêuticos (Kanter, 1998). Nesta perspectiva, os antioxidantes presentes na nossa dieta assumem uma grande importância como possíveis agentes protectores que ajudem o corpo humano na redução dos danos oxidativos. Os cogumelos são conhecidos como alimentos funcionais e como uma fonte para o desenvolvimento de fármacos e nutracêuticos (Chang, 1999; Yang et al., 2002; Barros et al., 2007) nomeadamente de compostos antioxidantes (Yen & Hung, 2000; Mau et al., 2004; Cheung & Cheung, 2005; Lo & Cheung, 2005). Efectivamente, os cogumelos contêm vários compostos fenólicos reconhecidos como excelentes antioxidantes devido à sua capacidade para bloquear radicais livres por transferência de um único electrão e às excelentes propriedades redox dos seus grupos hidroxilos fenólicos (Bors & Saran, 1987). Todos estes factores revelam-se de extrema importância já que cerca de dois terços das mortes relacionadas com tumores parecem poder ser evitadas através de um estilo de vida saudável (Anand et al., 2008). Assim, uma dieta adequada que envolva o consumo de

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antioxidantes, pode minimizar os riscos de cancro (Liu et al., 2003). Alguns autores sugerem também a ocorrência de efeitos sinergísticos por parte dos fitoquímicos presentes em frutos e vegetais, e que levam a uma considerável actividade antioxidante e anticancerígena (Liu et al, 2003). Uma dieta rica nestes alimentos poderá trazer benefícios devido à complexa mistura de fitoquímicos presentes. Por outro lado, um único antioxidante, por mais eficaz que seja, não pode substituir a combinação de fitoquímicos naturais existente nos alimentos. Recentemente, a suspeita de toxicidade associada a alguns compostos antioxidantes sintéticos usados nos alimentos, suscitou ainda mais o interesse por produtos naturais com as mesmas funções (Fukushima & Tsuda, 1985). Algumas indústrias, nomeadamente aquelas relacionadas com a produção de aditivos alimentares, cosméticos e farmacêuticos têm aumentado os seus esforços no sentido de obter compostos bioactivos após extracção e purificação a partir de produtos naturais (Haliwell, 1997). Os compostos antioxidantes podem eliminar radicais livres, retardando o processo de peroxidação dos lípidos que representa uma das principais causas de deterioração de produtos alimentares durante o processo de armazenamento afectando a cor, o sabor, a textura e o seu valor nutricional (Halliwell, 1997; Haliwell & Gutteridge, 1999). Tendo em conta que dos três tipos de interacções verificadas neste estudo com a combinação de diferentes espécies de cogumelos, o efeito sinergístico predominou, uma mistura de cogumelos e, consequentemente, dos seus antioxidantes poderá trazer benefícios para a saúde. Este pressuposto poderá servir de base para futuras investigações representando um estímulo na exploração e possível aplicação de fitoquímicos/nutracêuticos ao nível da indústria alimentar e farmacêutica úteis na prevenção e combate a determinadas doenças. Futuramente, deveriam testar-se as espécies com maior potencial antioxidante em linhas celulares, avaliando o seu efeito na viabilidade celular de um painel de linhas celulares tumorais. Com os melhores extractos poderiam estudar-se alterações a nível do ciclo celular, proliferação e apoptose celular, assim como analisar possíveis danos no DNA ou capacidade antioxidante protectora do DNA. Seria também interessante identificar e quantificar compostos responsáveis pelas propriedades bioactivas, em particular antioxidantes, tais como compostos fenólicos, tocoferóis, ácido ascórbico, carotenóides, ácidos gordos e açúcares.

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V. REFERÊNCIAS

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