Untersuchungen zur Eignung entomopathogener und zur Identifizierung hyperparasitärer Pilze als Antagonisten der Honigbienenmilbe Varroa destructor

Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften der Fakultät für Biologie und Biotechnologie an der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum

Arbeitsgruppe Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie

vorgelegt von

Markus Holt

aus

Gladbeck

Bochum

Februar 2010

Investigations into the suitability of entomopathogenic fungi and the identification of hyperparasitic fungi as antagonists of the honeybee mite Varroa destructor

Dissertation to obtain the degree Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) Faculty of Biology and Biotechnology International Graduate School of Biosciences Ruhr-University Bochum

SG Behavioural Biology and Didactics of Biology

submitted by

Markus Holt

from

Gladbeck

Bochum

February 2010

Gutachter:

Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner

Prof. Dr. Günter A. Schaub

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ...... 7 1.1 Die westliche Honigbiene Apis mellifera und ihr Parasit Varroa destructor ...... 7 1.2 Ansätze und Probleme bisheriger Bekämpfungsstrategien ...... 12 1.3 Entomopathogene Pilze als Antagonisten von Varroa destructor ...... 14 1.4 Zielsetzung ...... 19 2 Material und Methoden ...... 21 2.1 Versuchstiere und verwendete Pilzstämme ...... 21 2.2 Medien und Puffer ...... 22 2.3 Bestimmung optimaler Kulturbedingungen ...... 23 2.4 Bestimmung einer ausreichenden Oberflächensterilisationsdauer gesammelter Milben ...... 23 2.5 Ermittlung geeigneter Konservierungsmethoden gesammelter Milben ... 24 2.6 Erfassung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Bienenlarven ...... 25 2.7 Bestimmung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen und Milben ...... 27 2.8 Erfassung des Pilzwachstums aus behandelten Milben ...... 30 2.9 Halbfreilandversuch an Apis mellifera-Völkern zur Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und -puppen sowie Varroa destructor ...... 30 2.10 Erfassung der subletalen Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen ...... 33 2.11 Erfassung des Einflusses entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von Adultbienen ...... 37 2.12 Screening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische Varroapathogene Pilze ...... 39 2.13 Identifizierung von Pilzen im Pilzscreening ...... 40 2.14 Statistik und Parameter der grafischen Darstellung ...... 44 3 Ergebnisse ...... 46 3.1 Voruntersuchungen ...... 46 3.1.1 Kulturbedingungen ...... 46

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3.1.2 Wirkung unterschiedlicher Oberflächensterilisationszeiten auf das Pilzwachstum aus Milben ...... 48 3.1.3 Einfluss der Konservierungsmethode der Milben auf das Pilzwachstum ...... 50 3.2 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Larven ...... 51 3.3 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen ...... 52 3.3.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 52 3.3.2 Metarhizium anisopliae: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 54 3.3.3 Beauveria bassiana: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 56 3.3.4 Paecilomyces fumosoroseus: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 58 3.4 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Milben ...... 60 3.4.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 60 3.4.2 Metarhizium anisopliae: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 62 3.4.3 Beauveria bassiana: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 64 3.4.4 Paecilomyces fumosoroseus: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität ...... 66 3.5 Pilzwachstum aus behandelten Milben ...... 68 3.5.1 Lecanicillium muscarium ...... 68 3.5.2 Metarhizium anisopliae ...... 69 3.5.3 Beauveria bassiana ...... 70 3.5.4 Paecilomyces fumosoroseus ...... 71 3.6 Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und -puppen sowie Varroa destructor im Halbfreilandversuch ...... 72 3.6.1 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Bienen pro Volk ...... 73 3.6.2 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Larven pro Volk ...... 74

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3.6.3 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Puppen pro Volk ...... 75 3.6.4 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenfall pro Tag und Volk ...... 76 3.6.5 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenendbefall adulter Bienen ...... 77 3.6.6 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenendbefall verdeckelter Brut ...... 78 3.7 Subletale Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen ...... 79 3.7.1 Ernährungszustand im Langzeit-in-vitro-Assay ...... 79 3.7.2 Nahrungsaufnahme im Langzeit-in-vitro-Assay ...... 80 3.7.3 Lernleistung von Adultbienen im PER-Assay ...... 82 3.7.4 Diskriminationsfähigkeit von Adultbienen im Langzeit-PER-Assay...... 84 3.7.5 Einfluss entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von Adultbienen ...... 86 3.8 Sreening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische Varroapathogene Pilze ...... 88 3.8.1 Populationsdynamik und Milbenbefall von Apis mellifera-Völkern ...... 89 3.8.2 Korrelation der Abundanz von Varroa destructor in Bienenvölkern und des Pilzwachstums aus Milben ...... 92 3.8.3 Spektrum identifizierter Spezies im Pilzscreening ...... 95 3.8.4 Charakteristika von Meira geulakonigii ...... 101 3.8.5 Charakteristika von Simplicillium lamellicola ...... 104 4 Diskussion ...... 109 5 Zusammenfassung ...... 126 6 Summary ...... 128 7 Literatur ...... 130

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Die westliche Honigbiene Apis mellifera und ihr Parasit Varroa destructor

Die westliche Honigbiene Apis mellifera LINNAEUS (Hymenoptera) ist eine von neun Arten der Gattung Apis und unter ihnen die einzige, die außerhalb des Sippenzentrums Asien verbreitet ist. Ursprünglich im nördlichen Afrika vorkommend, dehnte sie postglazial in prähistorischer Zeit ihr Verbreitungsgebiet in den eurasischen Raum aus (Whitfield et al. 2006). In historischer Zeit erfolgte eine anthropogen bedingte weltweite Verbreitung, so dass Apis mellifera inzwischen ein Kosmopolit ist, der alle tropischen, subtropischen und gemäßigten Klimate besiedelt und nur in den Polregionen fehlt. Im Zusammenhang mit der weltweiten Industrialisierung der Landwirtschaft nahm ihre ökonomische Bedeutung als Bestäuber wichtiger menschlicher Nutzkulturen gegenüber der Bedeutung der traditionell genutzten Produkte (Honig, Wachs) enorm zu. Beispielsweise ist allein die kalifornische Mandelindustrie auf die Bestäubung durch eine Million Bienenvölker angewiesen (Ratnieks et al. 2010). Inzwischen wird der weltwirtschaftliche Wert, der durch die erbrachten Bestäubungsleistungen entsteht, auf 153 Milliarden Euro pro Jahr (Angabe für 2005) geschätzt, entsprechend 9,5 Prozent des Wertes der jährlichen Weltagrarproduktion an Lebensmitteln (Gallai et al. 2008). Auf Obst- und Gemüsekulturen entfallen dabei jeweils 50 Milliarden Euro p.a.; die Bedeutung für Kulturen essbarer Ölfrüchte wird auf 39 Milliarden Euro p.a. taxiert (Southwick et al. 1992; Gallai et al. 2008). Ihrer wirtschaftlichen Bedeutung entsprechend stellt der Befall mit Parasiten eine latente Gefahr für Bienenvölker in Kultur dar; dabei ist die intrakolonial hohe Dichte verwandter Individuen sowie die in der Regel ebenfalls hohe Dichte von Bienenvölkern in menschlicher Obhut ein die Ausbreitung von Pathogenen prinzipiell begünstigender Faktor. Apis mellifera wird von einigen, inzwischen gut untersuchten

Parasiten befallen: Paenibacillus larvae ASH EMEND. GENERSCH ist ein ausschließlich die Bienenbrut befallendes Pathogen, ebenso der Pilz Ascosphaera apis OLIVE AND

SPILTOIR, während Aspergillus flavus LINK neben Bienenbrut auch andere Organismen, aber nur sehr selten adulte Bienen befällt. Das Grampositive Bakterium

7 Einleitung

Paenibacillus larvae beispielsweise ist in einer Dosis von nur etwa zehn Sporen infektiös für junge Larven, die es mit dem Futter aufnehmen. Die Proliferation findet im Mitteldarm der Larven ohne sichtbare Gewebszerstörungen statt, wie Yue mit FISH (fluorescence-in-situ-hybridization)-Analysen zeigen konnte (Yue et al. 2008). Während die Bakterien in diesem Stadium als Kommensalen im Wirt leben, werden später Proteasen exprimiert, die lytisch auf interzelluläre Strukturen wirken und den Bakterien nach Degradation des Darmepithels einen Übertritt ins Hämozoel ermöglichen. In der Folge bildet sich durch Auflösung der Wirtsgewebe eine fadenziehende Masse, die zu einem Schorf eintrocknet, der von Arbeiterinnen aufgenommen wird, die so zur Verbreitung des Pathogens beitragen. Verflug zwischen eng zusammenstehenden Völkern bedingt dann die schnelle Ausbreitung der Infektion auch interkolonial. Während die Transmission von Paenibacillus larvae horizontal stattfindet, verläuft sie bei allen anderen Parasitosen von Apis mellifera vertikal – wie auch bei Melissococcus plutonius BAILEY AND COLLINS, einem Pathogen, das eine vergleichbare Symptomatik zeigt, aber auf Kolonieebene in der Regel nicht letal wirkt. Im Gegensatz zu den beiden vorgenannten Pathogenen befallen die Sporidien Nosema apis ZANDER und Nosema ceranae FRIES nur adulte Bienen; hier erfolgt die Verbreitung durch von infizierten Arbeiterinnen im Volk abgegebenen Kot, der bei seiner Beseitigung durch bis dahin nicht betroffene Imagines zu deren Ansteckung führt. Nosemainfektionen verlaufen nicht letal – dies gilt auch für den Befall mit einem weiteren Vertreter der Protozoa, Malpighamoeba mellificae PRELL. Im Wesentlichen sind die Wirt-Parasit-Beziehungen zwischen Apis mellifera und ihren Pathogenen stabil: Das Immunsystem des einzelnen Individuums ebenso wie supraindividuelle Adaptionen gegenüber Pathogenen schließen Totalverluste auf

Volksebene in der Regel aus. Das gilt auch für den Befall mit Acarapis woodi RENNIE, einer Milbe, die die thorakalen Tracheen adulter Bienen besiedelt und bei massivem Befall durch Einschränkung der Respirationsfähigkeit zur Flugunfähigheit der Tiere führt. Mitte des 20. Jahrhunderts kam es zu ersten Beobachtungen eines bis dahin auf Apis mellifera unbekannten Parasiten: 1952 wurde die Milbe Varroa destructor

ANDERSON AND TRUEMAN; (Mesostigmata: Varroidae) erstmals auf Apis mellifera in den östlichen Küstenregionen der damaligen UdSSR entdeckt (bis 2000: Varroa jacobsoni OUDEMANS (Anderson et al. 2000)). In der Folge kam es sowohl zu einer

8 Einleitung natürlichen Migration Richtung Westen als auch zu anthropogen bedingten Verschleppungen. Mitte der 50er Jahre des 20. Jahrhunderts wurde Varroa in Pakistan gefunden, 1967 erreichte sie Bulgarien und 1977 Westdeutschland (Ritter 1982). Die Milbe ist inzwischen mit Ausnahme der Polregionen sowie Australiens weltweit verbreitet. Varroa destructor ist ein durchschnittlich 1 Millimeter langer und 1,5 Millimeter breiter Vertreter der Mesostigmata und damit – gemessen an der Größe des Wirtes – der größte bekannte Ektoparasit. Der gesamte Lebenszyklus ist an den Wirt gebunden und gliedert sich in zwei Phasen: Während der phoretischen Phase kommt es auf adulten Bienen zur Ausbreitung zwischen Völkern (Kuenen et al. 1997). Als obligater Parasit ist Varroa hochadaptiert in Bezug auf die Ausbeutung von Wirtssignalen: Kirchner konnte erstmals nachweisen, dass die Milben in der Lage sind, Lichtreize und Vibrationen wahrzunehmen; derartige Vibrationen sind ein häufig verwendetes Signal in Apis mellifera-Staaten (Kirchner 1987, 1993; Kirchner et al. 1986). In der phoretischen Phase halten sich die Milben auf den Bienen bevorzugt zwischen den überlappenden Sterniten auf und ernähren sich von der Hämolymphe des Wirtes (Sammataro et al. 2000). Während der reproduktiven Phase migrieren adulte Weibchen in Brutzellen des Wirtes kurz vor deren Verdeckelung. Hierbei sind olfaktorische Signale von zentraler Bedeutung. Die Milben sind vermutlich aufgrund der distinkten Kohlenwasserstoffbouquets von Arbeiterinnen in der Lage, nach dem Verlassen einer Brutzelle gezielt auf Bienen derjenigen Alterskohorte zu wechseln, die sich innerhalb des Volkes hauptsächlich um die Brutpflege kümmert, so dass die Wahrscheinlichkeit maximiert wird, in die unmittelbare Nähe von Brutzellen zu gelangen (Kraus 1993; Chiroudi et al. 1997; Kuenen et al. 1997). Zellen, in denen Drohnen aufgezogen werden, zeigen einen acht- bis zehnfach höheren Befall als Arbeiterinnenzellen, was zum einen in der höheren Frequenz begründet liegt, mit der Drohnenbrutzellen durch Arbeiterinnen aufgesucht werden, zum anderen in der längeren Puppenruhe männlicher Bienen (Boot et al. 1995). Die Identifikation geeigneter Brutzellen, i.e. Zellen, in denen sich eine Larve im fünften Larvenstadium 15 - 20 Stunden (Arbeiterinnen) bzw. 40 - 50 Stunden (Drohnen) vor der Verdeckelung der Zelle befindet, wird ebenfalls durch das Differenzierungsvermögen von Varroa gegenüber kutikulären Kohlenwasserstoffen des Wirtes ermöglicht. Garrido konnte an Honigbienen erstmals für Insekten zeigen, dass es einen kairomonalen Effekt polarer, kutikularer Fraktionen von Larven unmittelbar nach der

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Verdeckelung auf die Initiation der Oogenese von Varroa gibt (Garrido et al. 2004). Drei Tage nach Verdeckelung wird ein erstes Ei gelegt, aus dem sich innerhalb von sechs Tagen ein adultes Männchen entwickelt (Steiner et al. 1994). Aus den folgenden Eiern entwickeln sich Weibchen, die noch in der Zelle begattet werden. Die Nymphenstadien ernähren sich während der Entwicklung von der Hämolymphe der Bienenlarve, die einer „feeding zone“ genannten, vom adulten Weibchen geschaffenen Öffnung der Puppenkutikula des Wirtes entnommen wird (Donzé et al. 1994). Ein bis zwei Tochtermilben gelangen zur Reife und verlassen mit der Muttermilbe und der schlüpfenden Biene die Zelle. Martin ermittelte für Arbeiterinnenbrutzellen eine Reproduktionsrate zwischen 1,3 und 1,5, für Drohnenbrutzellen eine Rate zwischen 2,2 und 2,6 (Martin 1994a, 1994b). Ursprünglicher Wirt der Milbe war die östliche Honigbiene Apis cerana

FABRICIUS. Ihr Verbreitungsgebiet umfasst den Indischen Subkontinent, Südostasien sowie Teile Chinas und des östlichen Russlands. Neben Apis mellifera ist sie der einzige von Menschen als Nutztier gehaltene Vertreter der Gattung. Die genauen Umstände des Wirtswechsels sind nicht bekannt. Als wahrscheinlich wird angenommen, dass es während einer sympatrischen Phase nach Verbringen von Völkern der westlichen Honigbiene nach Ostasien und damit ins Verbreitungsgebiet des ursprünglichen Wirtes in der ersten Hälfte des 20. Jahrhunderts, die zunächst für einen unbekannten Zeitraum eine Koexistenz der beiden Apisarten ohne Wirtswechsel beinhaltete, zu einem Wirtswechsel in diesem Gebiet kam (Oldroyd 1999). Die Gattung Varroa umfasst vier Arten; innerhalb der Art Varroa destructor werden sechs Haplotypen unterschieden, von denen vier Apis mellifera parasitieren. Zwei dieser Haplotypen, der japanisch-thailändische und der koreanische sind hochpathogen für Apis mellifera (De Guzman et al. 1999). Der Befall von Völkern der westlichen Honigbiene mit diesen Haplotypen führt – mit Ausnahme von Populationen in Südamerika und vermutlich einigen Regionen in Afrika – obligat innerhalb von längstens drei bis vier Jahren zum Tod der Völker (Beetsma 1994). Ursächlich hierfür sind Vitalitätsverluste durch den Verlust von Hämolymphe während der Ontogenese, was zu einem reduzierten Gewicht der adulten Tiere führt; diese Vitalitätsverluste bedingen zum Beispiel bei Drohnen eine reduzierte Flugleistung (Duay et al. 2002). Parasitierte Adulti von Apis mellifera zeigen aber nicht nur signifikante Unterschiede in Bezug auf die Quantität ihrer Hämolymphe, auch die

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Proteinkonzentration in der Hämolymphe sinkt, und die Quotienten hoch- und niedermolekularer Fraktionen differieren in Abhängigkeit vom Parasitierungsgrad (Weinberg et al. 1985). Die durchschnittliche Lebensdauer von Arbeiterinnen reduziert sich in Korrelation zum steigenden Brutbefallsgrad stark parasitierter Kolonien im Spätsommer um bis zu 50 Prozent (Ritter et al. 1984; Kovac et al. 1988). Untersuchungen an Arbeiterinnen zeigten eine Verminderung der assoziativen Lernfähigkeit und eine reduzierte Rückkehrrate zum Volk (Kralj et al. 2007). Unabhängig von den Schäden durch den Entzug von Hämolymphe kommt es zu Schäden durch Viren, als deren Vektor Varroa fungiert, nachgewiesen exemplarisch für das Kashmir bee virus, das Sacbrood virus, das Israeli acute paralysis virus und das Deformed wing virus (Boecking et al. 2008). Letzteres beispielsweise führt während der Ontogenese zur Entwicklung nichtfunktionaler Flügel, so dass adulte Tiere für den Staat essentielle Aufgaben nicht wahrnehmen können. Dabei ist das Deformed wing virus auch für Varroa infektiös, ohne allerdings klinische Symptome zu verursachen, die bekannt geworden wären: Strangspezifische RT-PCR-Ansätze konnten zeigen, dass virenreplikationsassoziierte DNA auch in den Milben auftrat (Gisder et al. 2009). Für das Israeli acute paralysis virus demonstrierte Ball in Untersuchungen an britischen Apis mellifera-Kolonien, dass persistierende, für die Bienen subletale Virusvorkommen mit steigendem Befall durch Varroa „aktiviert“ und damit letal werden können (Ball 1989). Letale Schäden durch Varroa treten bei Apis cerana nicht auf – Wirt und Parasit befinden sich im evolutiven Gleichgewicht. So vermehrt sich Varroa aus bisher unbekannten Gründen nicht in Arbeiterinnenbrut, mehrfach befallene Drohnenbrut kommt nicht zum Schlupf, so dass die in die Zellen migrierten Milben und ihre Nachkommen mit den parasitierten Drohnen sterben, und adulte Bienen sind in der Lage, Varroamilben auf anderen Bienen und in Brutzellen zu erkennen und diese durch Allo- und Auto-„grooming“ zu entfernen, beziehungsweise auszuräumen (Peng et al. 1987; Boecking et al. 1999; Boot et al. 1999). Auf Volksebene trägt ein „absconding“ genanntes Verhalten, bei dem relativ stark befallene Nester verlassen werden und damit der Anteil der Milben, der sich in Brutzellen befindet, zurückbleibt, zu einer Reduzierung der Parasitenlast bei. Den gleichen Effekt hat (für die das Nest verlassende Kohorte) das Schwärmen; dieses zentrale Element der Vermehrung aller hoch eusozialen Bienenarten wird bei von Menschen gehaltenen Völkern von

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Apis mellifera aber zumindest teilweise unterdrückt, da es aus ökonomischer Perspektive unerwünscht ist.

1.2 Ansätze und Probleme bisheriger Bekämpfungsstrategien

Das obligate Sterben von Varroa befallener Bienenvölker macht – um wirtschaftliche Einbußen bis zur maximalen Größe des wirtschaftlichen Gesamtnutzens der westlichen Honigbiene zu vermeiden – weltweit den Einsatz von Bekämpfungsmaßnahmen erforderlich. 177 von Menschen genutzte Kulturen sind ganz oder teilweise von der Bestäubung durch Honigbienen abhängig (Crane 1990). Für die USA schätzt Levin den wirtschaftlichen Nutzen auf 19 Milliarden Dollar pro Jahr, während Southwick 1,6 - 5,7 Milliarden Dollar angibt (Levin 1984; Southwick et al. 1992). Für Neuseeland werden die durch Varroa verursachten jährlichen Schäden auf 267 - 602 Milllionen US-Dollar pro Jahr taxiert (McNeely et al. 2001). Klassische Bekämpfungsmittel bis in die jüngste Zeit waren Akarizide auf der Basis von Organophosphaten, Pyrethroiden und Amidinen. Allerdings reichern sich diese fettlöslichen Substanzen im Bienenwachs und damit letztendlich auch im Honig an, was aus lebensmittelhygienischer Sicht unerwünscht ist (Martel et al. 2007). Darüber hinaus kam es Mitte der 1990er Jahre zum Auftreten von Resistenzen (Milani 1999). Standard in der Bekämpfung von Varroa destructor sind zurzeit organische Säuren, namentlich Ameisensäure, Oxalsäure und Milchsäure (Calderone 1999; Nanetti et al. 2003). Sie haben den Vorteil, ohnehin natürlicher Bestandteil des Honigs zu sein. Zum richtigen Zeitpunkt appliziert, treten in den Bienenprodukten keine Residuen auf, die oberhalb des natürlicherweise vorhandenen Levels liegen. Ihr Nachteil besteht darin, dass sie ein hohes Anwenderwissen voraussetzen: Ameisensäure wirkt varroazid auch in verdeckelten Brutzellen, die Applikation von Oxal- und Milchsäure ist demgegenüber nur in brutfreien Phasen der Volksentwicklung erfolgversprechend; darüber hinaus ist die therapeutische Wirkung von Ameisensäure stark von abiotischen Faktoren wie der Umgebungstemperatur und -feuchte abhängig. Der zielgenaue Einsatz aller drei Säuren setzt außerdem voraus, dass genaue Informationen zum Befallsgrad eines Volkes mit Varroa

12 Einleitung destructor vorliegen. Zudem ist ihr therapeutischer Index gering: Die Schadensschwellen für Varroa destructor und Apis mellifera liegen dicht beieinander; Überdosierung können zum Totalverlust des Bienenvolkes führen, Unterdosierungen sind unwirksam. In jüngerer Zeit wurde versucht, ursprünglich bei Apis cerana identifizierte Varroatoleranzmerkmale, i.e. das Entfernen infizierter Brut und das Allo- und Autogrooming von Arbeiterinnen, die in geringem Ausmaß auch bei Apis mellifera beobachtet wurden, durch gezielte Selektion auf Populations- und individueller Ebene zu selektieren. Versuche mit Völkern vermeintlich varroatoleranter Herkünfte aus Ostasien zeigten allerdings, dass die Varianz im Befall auf milbenspezifische Faktoren zurückzuführen war (Harris et al. 2003). Versuche, in denen die Pathogenität des in Südamerika vorkommenden Milben-Haplotyps in Bezug auf Bienen dortiger, varroatoleranter Herkünfte (sogenannte „afrikanisierte“ Bienen, eine Hybride aus europäischen und afrikanischen Unterarten von Apis mellifera) und europäischer Herkünfte getestet wurden, wiederum kamen zu dem Schluss, dass es offenbar auch bienenspezifische Toleranzfaktoren gibt; allerdings scheinen sie nicht unabhängig von weiteren Parametern aufzutreten: Varroatolerante Bienen aus dem tropischen Brasilien zeigten diese Toleranz in gemäßigten Klimaten nicht mehr – ein Effekt, der möglicherweise auf unter diesen Bedingungen veränderte Individuenstärken des einzelnen Volkes und eine stärkere, saisonal klimabedingte Populationsdynamik des Bienenvolkes zurückzuführen ist (Rosenkranz 1999; Correa-Marques et al. 2002). Angenommen werden auch höhere Fitnesskosten eines ausgeprägten Groomingverhaltens in gemäßigten Klimaten (Vandame et al. 2002). Dem entgegen stehen Berichte über langfristig ohne Behandlung überlebende, nicht bewirtschaftete Populationen auch in Europa (Le Conte et al. 2007). Unklar ist, ob es auch in bewirtschafteten Bienenvölkern zu einem mutmaßlich stabilen Wirt-Parasit-Verhältnis kommen könnte: Sich selbst überlassene Völker in Schweden zeigten eine geringere Zahl aufgezogenen Nachwuchses und es traten vermehrt Brutkrankheiten auf – diese Faktoren können zum einen den beobachteten verringerten Parasitenbefall erklären, sind zum anderen in Populationen in Kultur unerwünscht und unterliegen damit Manipulationsversuchen durch die Bienenhalter; es erscheint fraglich, ob unter diesen Bedingungen der gleiche Selektionsdruck existiert, wie in unbeeinflussten Völkern und ob es somit zu analogen adaptiven Prozessen kommt (Rosenkranz et al. 2005). Für die Annahme, bienenspezifische

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Faktoren seien nicht unerheblich, spricht auch die Beobachtung, dass L5-Stadien europäischer Honigbienen sich im Vergleich zu denen afrikanisierter Honigbienen doppelt so attraktiv für Varroa zeigten (Guzman-Novoa et al. 1999). Da Aumeier diesen Effekt in in vitro-Wahlversuchen aber nicht nachweisen konnte, spielen offenbar auch hier bisher unbekannte Effekte auf supraindividueller Ebene eine Rolle (Aumeier et al. 2002). Trotzdem wird versucht, mit Ansätzen auf individueller Ebene Honigbienenarbeiterinnen, die ein ausgeprägtes Ausräum- und Putzverhalten zeigen, zu fertilisieren und mithilfe des aus den männlichen Nachkommen gewonnenen Spermas Eier dieser Arbeiterinnen in vitro zu befruchten, um Königinnen zu erhalten, die eine hohe Heritabilität der gewünschten Merkmale zeigen (Bienefeld et al. 2007; Büchler et al. 2008). Das gleiche Ziel verfolgen Microarrayversuche, die differentielle Expressionsmuster von Puppen aus nicht varroatoleranten und toleranten Völkern vergleichen. Navajas fand hier eine Korrelation der Expression die neuronale Entwicklung steuernder Gene und des Grooming- bzw. Hygieneverhaltens (Navajas et al. 2008). Bisher liegen zu diesen Versuchen allerdings noch keine Ergebnisse vor, die ein Überleben von Honigbienen ohne Behandlung erhoffen lassen. Versuche mit Micrococcacaeen und Bacillacaeen als Kontrollagentien haben sich bisher ausschließlich auf Laborassays beschränkt (Tsagou et al. 2004).

1.3 Entomopathogene Pilze als Antagonisten von Varroa destructor

Angesichts der nach wie vor evidenten Herausforderung, eine nachhaltige und effiziente Bekämpfungsstrategie gegen Varroa destructor zu entwickeln, sind etwa ab dem Jahr 2000 zunehmend auch entomopathogene Pilze als potentielle Antagonisten von Varroa ins Blickfeld der Forschung gerückt. Auch wenn die Lebenszyklen entomopathogener Pilze komplex sind und zahlreiche, auf einzelne Gattungen beschränkte Besonderheiten ausweisen, gleichen sie sich in wesentlichen Aspekten ihrer Biologie häufig: Aus Dauersporen, die im Fall von Zygosporen aus Hyphenfusionen, im Fall von Azygosporen durch Abschnürung terminaler Hyphenenden hervorgegangen sind, entwickeln sich in Phasen, in denen die Wirte aktiv sind, infektionsfähige Konidien. Konidien werden ohne das Zwischenstadium

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Dauerspore ebenfalls gebildet, wenn entomopathogene Pilze in ihren Wirten zur Reife gekommen sind und es zu direkten Infektionen weiterer Wirte kommen kann. Der exakte Mechanismus der Differenzierung zwischen Ziel- und Nichtzielorganismen ist in Bezug auf Insekten noch unklar. Aus Studien an Pflanzen wird geschlussfolgert, dass spezifische Induktoren exprimiert werden, die mit membrangebundenen Rezeptoren von Wirtszellen interagieren und zur Expression eines Produktes führen, das seinerseits an Rezeptoren auf der Oberfläche des Pathogens bindet und über Messengermoleküle die Expression für die Infektion essentieller Enzyme initiiert (Bölker 2002). Bei Kontakt zu Wirtsoberflächen kommt es zur Bildung eines Appressoriums, aus dem ein Keimschlauch austritt, der die Kutikula des Wirtes mechanisch oder histolytisch durchdringt; daran beteiligt sein können trypsinähnliche Proteasen, Carboxypeptidasen, Aminopeptidasen, Esterasen, Lipasen, Chitinasen und weitere Enzyme, die überwiegend aus

Untersuchungen an Metarhizium anisopliae METSCHNIKOW und Beauveria bassiana

BALSAMO bekannt sind (Leger et al. 1991, 1993, 1996, 1997; Poinar et al. 1998). Die Bildung von Appressorien kann aber bei manchen Arten auch in vitro auf nichtartifiziellen Oberflächen ausgelöst werden. In einigen wenigen Fällen dringt der Parasit auch ohne vorherige Ausbildung eines Appressoriums ein (Brobyn et al. 1977). Lytische Enzyme sowie Lektine können, zum Beispiel im Fall von Metarhizium anisopliae, bereits auf der Oberfläche der Konidien vorhanden sein; zwingende Voraussetzung für die Keimung ist zudem das Vorhandensein von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf der Wirtskutikula. Zwar können unspezifische Kohlenstoff- beziehungsweise Stickstoffquellen in vitro auch eine Keimung initiieren, qualitative und quantitative Differenzen hierbei scheinen jedoch ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Wirtserkennung zu spielen (Andrews et al. 1997). Innerhalb des Wirtes werden dann zellwandlose Protoplasten gebildet, die mutmaßlich vom Immunsystem des Wirts nicht oder nur schlecht detektiert werden können, oder es kommt zur Bildung zönozytischer Hyphen oder einzelliger „hyphal bodies“ (Beauvais et al. 1989). Der Tod des Wirtes tritt durch Faktoren wie den Verbrauch seiner Stoffwechselreserven, mechanische Zerstörung von Geweben, die Freisetzung von Toxinen wie Pyridin-2,6- Dicarbonsäure oder eine Kombination dieser Effekte ein (Claydon et al. 1982; Pell et al. 2001). Hawksworth listet nahezu 750 entomopathogene Pilzspezies aus 56 Gattungen auf, die mit Arthropoden assoziiert sind (Hawksworth et al. 1995). Auf der Basis

15 Einleitung dieses Pools sind mittlerweile über 20 Mykopestizide entwickelt worden, überwiegend auf der Basis der Ascomyzeten Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarium ZIMMERMANN und Paecilomyces fumosoroseus

WIZE, die im Wesentlichen gegen Homopteren, Coleopteren, Lepidopteren, Dipteren und Orthopteren zum Einsatz kommen (Shah et al. 1999; de Faria et al. 2007). Ein kommerzielles Produkt, das aus einem Beauveria bassiana-Isolat entwickelt worden ist, wird gegen die Milbe Tetranychus urticae KOCH in Gewächshauskulturen von Rosen eingesetzt, Metarhizium anisopliae wurde erfolgreich gegen Ixodes ricinus

LINNAEUS sowie Boophilus annulatus SAY, Hyalomma excavatum KOCH und

Rhipicephalus sanguineus LATREILLE verwendet (Wright et al. 1996; Gindin et al. 2002; Strasser et al. 2007). Schon seit etwa 20 Jahren und damit sehr gut untersucht sind ebenfalls die Wirt-Parasit-Interaktionen für Paecilomyces fumosoroseus, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana sowie insbesondere Lecanicillium muscarium und die Weiße Fliege Trialeurodes vaporariorum WESTWOOD, die ein bedeutender Schädling in Gewächshauskulturen ist; auf Basis dieser Erkenntnisse sind gleichsam kommerzielle Produkte entwickelt worden, die seitdem erfolgreich gegen Trialeurodes, aber auch andere wirtschaftlich bedeutende phytophage Arthropoden appliziert werden (Wraight et al. 2000; de Faria et al. 2001, 2007; Malsan et al. 2002). Die Pilze zeichnen sich durch leichte Kultivierbarkeit, ein begrenztes Wirtsspektrum, eine hohe Pathogenität für verschiedene Stadien von Trialeurodes vaporariorum und ihre Nichtpathogenität für Menschen aus (Ferron 1978; Mier et al. 1991; Ortiz-Caton et al. 1996). In Assoziation zu Milben, die wie Tetranychus urticae Parasiten wirtschaftlich bedeutender Kulturen oder Nutztiere sein können, sind 58 Pilzspezies bekannt, die in der Lage sind, Wirte aller drei Ordnungen der Actinotrichida sowie innerhalb der Anactinotrichida Vertreter der Ixodida und Gamasida zu infizieren: 24 Spezies sind 45 Wirten der Actinotrichida, 16 zehn Wirten der Ixodida und 18 insgesamt 14 Wirten der Gamasida zugeordnet. Allein in Ixodes ricinus fand Kalsbeek sechs Hyphomyceten; van der Geest beschreibt 30 Pilze für 16 Milbenfamilien (Kalsbeek et al. 1995; van der Geest et al. 2000). Zwei dieser in Milben gefundenen Pilze –

Neozygites floridana WEISER AND MUMA und Hirsutella thompsonii FISHER – sind in anderen Arthropodenklassen bisher nicht nachgewiesen worden (Chandler et al. 2000). Zwar ist Neozygites floridana als gamasidenspezifisch klassifiziert und könnte daher ein potentieller Antagonist für Varroa destructor sein, ohne gleichzeitig Apis

16 Einleitung mellifera negativ betreffende Seiteneffekte zu haben, allerdings konnte dieser Pilz nicht in vitro kultiviert werden. Demgegenüber infiziert der zweite bisher nur Milben zugeordnete Pilz Hirsutella thompsonii ausschließlich Vertreter der Actinedida und wird erfolgreich gegen Phyllocoptruta oleivora ASHMEAD in Zitruskulturen und

Eriophyes guerreronis KEIFER auf Kokospalmen eingesetzt (McCoy 1981; Lampedro et al. 1989; Allen et al. 1994). Versuche zur Kontrolle von Vertretern der Ixodida konzentrierten sich daher auf für diese Gruppe unspezifische Pilze, namentlich Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces farinosus BROWN AND SMITH, Paecilomyces fumosoroseus und Lecanicillium muscarium. Bittencourt konnte zeigen, dass Metarhizium, isoliert aus anderen Arthropodenklassen, in der Lage war, Boophilus microplus CANESTRINI, einen wirtschaftlich bedeutenden Parasiten auf Vieh, in vitro zu infizieren (Bittencourt et al. 1994a, 1994b). Metarhizium anisopliae- und Beauveria bassiana-Isolate, die in Ostafrika außerhalb der Acari gefunden wurden, befielen im Experiment

Rhipicephalus appendiculatus NEUMANN (Mwangi et al. 1995). Anfang der letzten Dekade wurden erste Versuche unternommen, eine potentiell antagonistische Wirkung unspezifischer entomopathogener Pilze auf Varroa destructor und Apis mellifera zu testen. Dabei ist die Unterscheidung der Pilze in (Labor-)Stämme für das Verständnis wichtig; die Pilze werden in der Folge der Einfachheit halber aber nur unter ihrem Artnamen angesprochen – gemeint ist in allen Fällen der der jeweiligen Untersuchung zugrundeliegende Stamm im Sinne eines infraspezifischen Taxons respektive das Isolat einer Art. Kanga gibt für zwei Isolate von Hirsutella thompsonii und Metarhizium anisopliae, die in Laborversuchen an Milben auf Puppen und an Versuchsvölkern (nur Hirsutella thompsonii) getestet wurden, bei denen eine konidienhaltige Detergenslösung versprüht wurde, an, diese seien geeignet, Varroapopulationen signifikant zu reduzieren, ohne Bienen zu schädigen; er bestimmte eine LT90 von vier Tagen für Hirsutella thompsonii und von sechs Tagen für Metarhizium anisopliae (Kanga et al. 2002). Für Bienen schloss er anhand vergleichbarer Pilzwachstumsraten aus toten, nicht oberflächensterilisierten Bienen, sie würden durch die Pilzstämme nicht negativ beeinflusst. Eine strenge Korrelation zwischen der Zahl gefallener Milben und den aus diesen ohne Oberflächensterilisation gewachsenen Pilzen sah er als Beleg für eine Infektion von Varroa destructor durch Hirsutella thompsonii an. In einem weiteren Versuch an Völkern, die entweder mit

17 Einleitung

Konidienpulver oder dem pyrethroidhaltigen Tierarzneimittel Apistan behandelt wurden, fand Kanga vergleichbare Mortalitätsraten und schlussfolgerte daraus auf eine Eignung von Metarhizium als Kontrollagens (Kanga et al. 2003, 2005). In einem Versuch, in dem 2006 Metarhizium-Konidien mit Hilfe von mit ihnen bedeckten Kunststoffstreifen appliziert wurden, bestätigten sich die Ergebnisse (Kanga et al. 2006). Bei neun untersuchten Isolaten von Hirsutella thompsonii, die Peng ausschließlich in vitro in Bezug auf ihre Wirkung auf Milben und Honigbienenpuppen testete, indem sie Milben über eine reife Hirsutella-Kultur laufen ließ beziehungsweise Puppen auf eine Hirsutella-Kultur legte, wurde für drei Isolate eine Infektionsfähigkeit für Varroa destructor gefunden (Peng et al. 2002). Peng gibt für diese drei Isolate eine LT50 von zwei, drei und vier Tagen an; eine negative Wirkung auf Bienenpuppen wurde nicht festgestellt. Als Kontrollen wurden Gruppen verwendet, die zu Medienplatten ohne Pilzkulturen Kontakt hatten. Shaw fand demgegenüber für alle von ihr im Laborexperiment untersuchten Isolate eine Infektionsfähigkeit für Varroa; alle wiesen darüber hinaus eine der Kontrollgruppe vergleichbare oder höhere (bis zu 100 Prozent innerhalb des Untersuchungszeitraums) Mortalität, bezogen auf adulte Bienen, auf (Shaw et al. 2002). In den Versuchen von Gerritsen an zuvor nicht vereinheitlichten Völkern mit drei kommerziell erhältlichen Produkten auf der Basis von Metarhizium anisopliae- und Lecanicillium muscarium-Stämmen zeigten sich keine signifikant erhöhten Sterberaten für Varroa destructor und Apis mellifera (Gerritsen et al. 2006). 2006 untersuchte James den Metarhizium-Stamm, mit dem Kanga gearbeitet hatte, vor dem Hintergrund der Fragestellung, welche Applikationsform die effektivste sei, konnte dieses Mal aber keinerlei signifikante Effekte des Pilzes finden; zusätzlich waren längstens nach 20 Tagen (Kanga 2003: 40 Tage) noch keimfähige Konidien vorhanden (Kanga 2003; James et al. 2006). Meikle verglich drei Gruppen in vivo: Eine wurde mit einem aus Varroa destructor isolierten Beauveria bassiana-Stamm behandelt, eine weitere als Kontrolle mit einem als Matrix dienenden Pulver, während die dritte Gruppe unbehandelt blieb (Meikle et al. 2007). Die Völker waren aus einer zuvor nicht vereinheitlichten Grundgesamtheit gebildet worden und differierten in Bezug auf die erfassten Parameter „Bienenmasse“ und „Fläche verdeckelter Brut“. Völker der mit Konidien behandelten Gruppe wiesen einen signifikant erhöhten Milbenfall am sechsten und achten Tag nach Applikation auf. Milben aus den mit Konidien behandelten Völkern zeigten, ohne zuvor oberflächensterilisiert worden zu

18 Einleitung sein, in allen Fällen ein signifikant höheres relatives Pilzwachstum. In einer Repetition mit einer größeren Zahl nicht vereinheitlichter Völker und vier verschiedenen Gruppen (Konidien und Carnaubawachsmatrix, Konidien und Weizenmehlmatrix, Weizenmehl, keine Behandlung) trat ein verstärkter Milbenfall in der Konidien-Carnaubawachsgruppe auf; dieser war allerdings nicht signifikant erhöht (Meikle et al. 2008b). Der Milbenfall der Konidien-Weizenmehlgruppe lag unterhalb des Falls der Weizenmehlgruppe und an drei Tagen auch unterhalb des Falls der Kontrolle. Signifikant erhöhtes relatives Pilzwachstum aus einer Konidiengruppe wertet Meikle als Beleg für die Eignung des Pilzes als Varroaantagonist. Eine zweite Wiederholung erbrachte keinerlei Belege für eine signifikante Reduktion der Parasitenlast der Versuchsvölker (Meikle et al. 2009). Effekte entomopathogener Pilze auf Apis mellifera auf subletaler Ebene wurden bisher in keiner Studie untersucht. Dabei könnte zum Beispiel eine Beeinträchtigung des Lernvermögens und der Diskriminationsfähigkeit bei einem staatenbildenden Insekt, das über komplexe Fähigkeiten zur räumlichen Orientierung und olfaktorischen Differenzierung im Zusammenhang mit der Kommunikation innerhalb des Staates verfügt, negative Konsequenzen haben. Gleiches gilt für eine physiologische Belastung durch die pathogenbedingte Induktion einer Immunantwort – auch dieser Aspekt ist bisher nicht untersucht worden. Dabei ist inzwischen auch für die Honigbiene die Aktivierung einer Kaskade bestätigt, wie sie für andere Insekten beschrieben ist (Evans et al. 2006; Müller et al. 2008; Randolt et al. 2008).

1.4 Zielsetzung

Entomopathogene Pilze erscheinen vor dem Hintergrund der Schwierigkeiten der etablierten Behandlungsmethoden gegen Varroa destructor lohnend für eine Erforschung als potentielle Antagonisten zu sein. Die bisherigen Untersuchungen zeigen sehr variable respektive widersprüchliche Ergebnisse, die zum Teil möglicherweise auf die Diversität dieser sehr pleomorphen Pilze zurückzuführen sind – allerdings differierten die Resultate nicht nur zwischen den beteiligten Gruppen, sondern auch bei Untersuchungen an identischen Isolaten innerhalb einer Gruppe. Viele dieser Studien basieren auf unterschiedlichen methodischen Ansätzen, die

19 Einleitung

Interpretationen der Ergebnisse schwierig und ihre Vergleichbarkeit unmöglich machen. Keine einzige Untersuchung beschäftigte sich mit der Frage einer potentiellen Wirkung entomopathogener Pilze auf die Larvenstadien und das Puppenstadium von Apis mellifera. Ebenso wenig standen mögliche subletale, aber für die Bienen bedeutsame Effekte, wie eine Beeinträchtigung der Futteraufnahme, des Lernvermögens oder des Immunsystems im Fokus von Untersuchungen. Und schließlich lag keine Untersuchung vor, die sich mit dem Einfluss beschäftigt, den in den Populationen vorhandene Pilze auf die Dynamik dieser Populationen und damit auch auf die Varroapathologie von Apis mellifera haben könnten und die dabei möglicherweise bisher in Varroa unentdeckte Pilze findet. Die vorliegende Arbeit sollte anhand von vier Stämmen derjenigen Spezies entomopathogener Pilze, die bisher hauptsächlich Gegenstand von Untersuchungen waren, die genannten Lücken schließen, um eine valide, reproduzierbare Methodenbasis zur Untersuchung entomopathogener Pilze in Bezug auf ihre Wirkung auf Varroa destructor und Apis mellifera zu schaffen. Dies sollte eine bisher noch nicht existente Untersuchung einer möglichen letalen Wirkung auf Larven und Puppen von Apis mellifera einschließen. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob es eventuell subletale Effekte entomopathogener Pilze auf Apis mellifera gibt, die in den bisherigen Versuchen methodisch bedingt nicht hätten festgestellt werden können. Schließlich sollte versucht werden, in vivo einen möglichen Zusammenhang zwischen der Abundanz von Varroa destructor in Bienenvölkern und dem Vorkommen von Pilzen in Varroa destructor zu untersuchen und im Rahmen eines Screenings varroaspezifische und damit eventuell als Antagonisten geeignete Pilze zu erfassen.

20 Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Versuchstiere und verwendete Pilzstämme

Die Honigbienen (Apis mellifera) stammten aus Versuchsvölkern der AG Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie der Ruhr-Universität Bochum, die im Botanischen Garten der Ruhr-Universität Bochum sowie auf dem Versuchsgelände der AG im Lottental, ebenfalls Bochum, untergebracht waren. Für die Unterbringung wurden Holzkästen (im Folgenden „Magazine“ genannt) mit einer Grundfläche von 520 x 380 mm eingesetzt, die aus einzelnen, 220 mm hohen Modulen bestanden und damit dem im Jahresverlauf schwankenden Raumbedarf eines Bienenvolkes angepasst werden konnten. Die Magazine schlossen unten mit einem Rahmen (im Folgenden „Gitterboden“ genannt) gleicher Grundfläche ab, der mit einem Edelstahlgitter der Maschenweite 2 x 2 mm bespannt war, so dass von den im Magazin befindlichen Bienen abfallende Organismen in einer unterhalb des Gitters anbringbaren Polyethylenwanne gesammelt werden konnten, ohne durch Bienen verschleppt werden zu können. Die Völker wurden einheitlich nach anerkannten Praxisregeln geführt und verfügten alle über eine Königin. Die Milben (Varroa destructor) stammten ebenfalls aus Versuchsvölkern der AG. Völker, die Bestandteil des Screenings auf entomopathogene Pilze waren, oder Donorvölker für Versuche an Milben wurden entgegen der sonst üblichen Praxis im Spätsommer von der Applikation varroazider Mittel ausgenommen, um die Ergebnisse nicht zu verfälschen, beziehungsweise eine ausreichende Anzahl von Versuchsmilben zur Verfügung zu haben. Sämtliche Versuche an Apis mellifera und Varroa destructor orientierten sich an den derzeit gültigen Standards für Untersuchungen an Honigbienen (OEPP/EPPO 2001). Die in den Untersuchungen zu Kulturbedingungen unspezifischer entomopathogener Pilze, in den in vitro-Assays, im Versuch zur Duftdifferenzierung und im Halbfreilandversuch untersuchten Pilze stammten vom Landesgesundheitsamt Stuttgart (Metarhizium anisopliae (M.a. 153), Paecilomyces fumosoroseus (P.fr. 9), Beauveria bassiana (B.b. 29)) beziehungsweise der Firma Koppert BV, Niederlande (Lecanicillium muscarium („Mycotal“)). Sämtliche Untersuchungen fanden in den Jahren 2005 - 2009 statt.

21 Material und Methoden

2.2 Medien und Puffer

Die Zusammensetzung von Medien und Puffern ist im Text erläutert; komplexere Medien und Puffer sind nur namentlich erwähnt, ihre Zusammensetzung ist Tabelle 2.1 zu entnehmen.

Tabelle 2.1: Komplexere Medien und Puffer, die im Text nur namentlich aufgeführt werden. Medium/Puffer Bestandteil Bezugsquelle Malzextraktagar (MEA) 30 g/l Malzextrakt Roth 5 g/l Pepton Applichem 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter Sabouraud Dextrose Agar 10 g/l Pepton Applichem (SDA) 40 g/l Glucose-Monohydrat Baker 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter Yeast Pepton Dextrose Agar 40 g/l Glucose-Monohydrat Baker (YPDA) 10 g/l Pepton Applichem 10 g/l Hefeextrakt Applichem 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter Potato Dextrose Agar (PDA) 4 g/l Kartoffelextrakt Applichem, 20 g/l Glucose-Monohydrat anwendungsfertige 15 g/l Agar Mischung ddH2O add. 1 Liter H2O-Agar 15 g/l Agar Applichem ddH2O add. 1 Liter CM-Flüssigmedium 1,5 g/l KH2PO4 Fluka 0,5 g/l KCl Applichem 0,5 g/l MgSO4 Riedel-de Haën 3,7 g/l NH4Cl Roth 10 g/l Glucose-Monohydrat Baker 2 g/l Trypton Applichem 2 g/l Hefeextrakt Applichem 1ml/l 0,1% ZnSO4 Applichem 1 ml/l 0,1% FeCl2 Applichem 1ml/l 0,1% MnCl2 Applichem ddH2O add. 1 Liter Lysepuffer (600 µl) 22 µl 1M Tris pH 8 Applichem 220 µl 250 mM EDTA Applichem 88 µl 5 M NaCl Roth 2,2 µl 20% SDS Roth ddH2O add. 600 µl TE-Puffer 10 mM Tris pH 7,5 Applichem 1 mM EDTA Applichem

22 Material und Methoden

2.3 Bestimmung optimaler Kulturbedingungen

Untersucht wurden Malzextraktagar (MEA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA), Yeast Pepton Dextrose Agar (YPDA) und Potato Dextrose Agar (PDA).

Je Liter Kulturmedium wurden die angegebenen Mengen in ddH2O gelöst und im Autoklaven bei 121°C sterilisiert. Anschließend wurden sterile 9 mm-Petrischalen je etwa 3 mm hoch mit dem Medium gefüllt. Die Beimpfung erfolgte mit unmittelbar zuvor geernteten Sporen aus Stammkulturen: Reife Sporen wurden mit 9 ml 0,85% NaCl/0,1% Tween 80 (im Folgenden auch (Konidien-)Erntelösung genannt) pro Petrischale durch Abkratzen mit einem sterilen Löffel suspendiert. Um ebenfalls losgelöstes Myzel oder Kultursubstrat zu entfernen, wurde anschließend zweimal durch sterile Filter (Sartorius 288) filtriert. Alle verwendeten Glasgeräte wurden zuvor ebenfalls heißluftsterilisiert. Die Erfassung der Sporenkonzentration in der Suspension erfolgte über Auszählung eines Aliquots in einer Neubauerzählkammer. Anschließend wurde die Impfsuspension mit 0,85% NaCl/0,1% Tween 80 auf 107 Sporen/ml eingestellt. Zur Inokulation wurden je 5 µl mit einer sterilen Pipettenspitze zentral auf die Platte gesetzt. Die Kultur erfolgte bei 25°C im Dauerdunkel für 14 Tage im Wärmeschrank (Memmert UNB 500). Die Erfassung der Parameter „Koloniedurchmesser“ und „Konidiendichte“ wurde wie folgt durchgeführt: Zunächst wurden die Petrischalen auf Millimeterpapier gesetzt, um den Koloniedurchmesser zu erfassen. Anschließend wurde mit einem sterilen Spatel (Breite 2 cm) ein Quadrat ausgestochen, das in eine neue Petrischale überführt wurde und dessen Konidien wie oben beschrieben geerntet wurden. Die Auszählung erfolgte wiederum in einer Neubauerzählkammer.

2.4 Bestimmung einer ausreichenden Oberflächensterilisationsdauer gesammelter Milben

Unter den Gitterboden stark von Varroa destructor befallener Völker wurde zum Auffangen der Milben eine Polyethylenwanne geschoben. Aus dem täglichen Milbenfall der Versuchsvölker wurden die Milben manuell abgesammelt, gepoolt und auf sieben Versuchsgruppen verteilt. Die Milben wurden in der Folge – mit

23 Material und Methoden

Ausnahme der Sterilisationszeit – gleich behandelt: Zunächst erfolgte durch Eintauchen in 0,5% NaOCl die Oberflächensterilisation – je nach Gruppe für 10, 15, 20, 40, 60, 120 oder 240 Sekunden. Anschließend wurden die Milben in steriles ddH2O überführt und für 30 Sekunden darin bewegt, um eventuell noch anhaftendes NaOCl zu entfernen. Eine weitere Gruppe wurde keiner Oberflächensterilisation unterzogen, sondern nur in sterilem ddH2O geschwenkt. Danach erfolgte mit sterilen

Holzstäbchen einzeln die Platzierung auf sterilen H2O-Agar-Platten und Kultur bei 25°C im Dauerdunkel. Einsetzendes Pilzwachstum wurde täglich erfasst, Milben, die Pilzwachstum zeigten, wurden zur Vermeidung von Kreuzinfektionen unter sterilen Bedingungen entfernt.

2.5 Ermittlung geeigneter Konservierungsmethoden gesammelter Milben

Aus dem natürlichen Totenfall stark befallener Bienenvölker wurden die gestorbenen Milben jeden Tag wie oben beschrieben gewonnen. Die Milben wurden in der Folge gepoolt und in zwei Gruppen aufgeteilt: Eine Gruppe wurde bei -26°C für sieben Tage eingefroren, die andere bei Raumtemperatur und Raumfeuchte auf Filterpapier ebenfalls für sieben Tage getrocknet. Die Milben der beiden Gruppen wurden im Fortgang gleich behandelt: Zunächst wurden sie durch Eintauchen in 0,5% NaOCl für 120 Sekunden oberflächensterilisiert, eventuell noch anhaftendes NaOCl dann durch Schwenken in sterilem ddH2O entfernt. Die Milben wurden anschließend mit sterilen Holzstäbchen auf H2O-Agar-Platten überführt und in der Folge bei 25°C und Dauerdunkel im Wärmeschrank kultiviert. Die Überwachung eventuellen Pilzwachstums erfolgte täglich. Milben, die Pilzwachstum zeigten, wurden inklusive des umgebenden Agars unter sterilen Bedingungen mit einem sterilen Spatel ausgestochen, um Kreuzinfektionen zu vermeiden.

24 Material und Methoden

2.6 Erfassung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Bienenlarven

Die Methodik basiert auf einem von Peng entwickelten, aber modifizierten Protokoll: Versuchsvölkern wurden Brutwaben mit Eiern kurz vor dem Schlupf der Larven ohne aufsitzende Bienen entnommen, ins Labor gebracht und bis zur Verwendung bei hoher Luftfeuchte gehalten (Peng et al. 1996). Im Labor wurden sterile 24-well-Platten (Gibco) wie folgt vorbereitet: Zunächst wurde eine Larvendiät, bestehend aus 20 ml Gelée royale und 10 ml einer Zuckerlösung (3,0 g Fruktose,

3,0 g Glukose (beide Baker) auf 33,3 ml steriles ddH2O), hergestellt, homogenisiert und für mindestens 30 Minuten im Thermoblock auf eine Temperatur von 35°C erwärmt. Dann wurden sechs Näpfe der 24-well-Platte mit Wasser gefüllt (jeweils diagonal gegenüberliegend ein Endnapf jeder Reihe); anschließend erfolgte das Einbringen von je 300 µl des Futters in je drei Näpfe pro Platte mit Hilfe einer Omnifax-Tubukulin-Spritze. Den Waben wurden dann unter Kaltlicht frisch aus den Eiern geschlüpfte Larven mit Hilfe einer Umlarvnadel entnommen und diese zunächst auf vorgewärmte, mit einem angefeuchteten sterilen Papier (KimWipe) ausgelegte Petrischalen gesetzt. In den Petrischalen erfolgte dann die Applikation von entweder 1x106 Konidien/Larve, die wie unter 2.3 beschrieben gewonnen wurden, oder eines entsprechenden Volumens Kontrolllösung durch Besprühen. Anschließend wurden die Larven mittels der Umlarvnadel jeweils zu zehnt in einen mit Futter ausgestatteten 24-well-Napf gesetzt (Abbildung 2.1). Die Hälterung erfolgte in der Folge im Brutschrank bei 35°C und einer relativen Luftfeuchte von 90 Prozent. Alle 24 Stunden wurden die Larven mit Hilfe steriler, gebogener Laborspatel passender Größe in neue, jeweils mit frisch zubereitetem und erwärmtem Futter befüllte Näpfe umgesetzt und dabei schrittweise vereinzelt. Beim Umsetzen war darauf zu achten, die Larven nicht um die Längsachse zu drehen, um ein allseitiges Verkleben der Kutikula (und Verschluss der Stigmen beidseitig) zu vermeiden. Tote und kranke Larven wurden entfernt und die jeweilige Zahl überlebender Larven registriert; sofern eine Larve nicht eindeutig als krank oder tot klassifiziert werden konnte, wurde sie in einem gesonderten Napf weiterkultiviert, bis Tod oder Überleben feststanden – die Datierung im Fall des Todes erfolgte dann für den Tag der Separation. Kurz vor der Verpuppung am sechsten oder siebten Tag des Larvenstadiums (Mitteldarm öffnet sich, dunklere, kaudal gelegene Zone durch

25 Material und Methoden

Abgabe von Harnkristallen wird sichtbar, und die Larve streckt sich) wurden die Larven in einen neuen, mit KimWipe-Papier ausgelegten Napf umgesetzt; zuvor wurden die Larven vorsichtig auf KimWipe-Papier gerollt, um anhaftende Futtersaftreste zu entfernen. Dieses Verfahren wurde in der Folge (nochmals 24h später) wiederholt, bis kein Kot mehr abgegeben wurde. Danach wurden die Larven unberührt im Brutschrank gehältert.

Abb. 2.1: Hälterung von Larven in vitro in 24-well-Platten. Je Reihe ist zur Erhöhung der

relativen Feuchte ein Gefäß mit ddH2O gefüllt. Larven vor der Verpuppung liegen auf sterilem Papier.

26 Material und Methoden

2.7 Bestimmung der Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen und Milben

Die Methodik zur Untersuchung der Mortalität mit Konidien unspezifischer entomopathogener Pilze behandelter Adultbienen und aufsitzender Milben war für alle untersuchten Pilze gleich und wird deshalb an dieser Stelle für beide Versuche beschrieben.  Herstellung der Applikationssuspension entomopathogener Pilze: Circa drei Wochen vor Versuchsbeginn wurden MEA-Platten aus den Pilz- Stammkulturen frisch inokuliert und bei 25°C im Dauerdunkel gehalten, um zu Versuchsbeginn eine möglichst hohe Anzahl Konidien ernten zu können. Die Konidienernte erfolgte wie unter 2.3 beschrieben.  Bereitstellung adulter Bienen: Adulte Bienen wurden Versuchsvölkern, die zuvor eine Behandlung mit 85% Ameisensäure durchlaufen hatten und deshalb als „milbenfrei“ beziehungsweise „milbenarm“ klassifiziert werden konnten, durch Abschütteln von Brutwaben durch einen Trichter in einen Eimer mit Gitterboden oder durch Absaugen von Brutwaben mit Hilfe eines modifizierten Handstaubsaugers

entnommen. Anschließend erfolgte dreiminütiges Begasen der Tiere mit CO2 und nach erfolgreicher Betäubung eine Verteilung zunächst auf mit 30 radial angebrachten Bohrungen versehene Polyethylenflaschen.  Bereitstellung von Milben: Die zur Untersuchung benötigten Milben wurden unbehandelten Versuchsvölkern, die in vorangegangenen Analysen des Milbenbefalls eine hohe Milbenabundanz aufwiesen, wie folgt entnommen: Mehrere tausend den Brutwaben aufsitzende Adultbienen wurden durch einen Trichter in einen mit einem Gitter versehenen Eimer abgeschüttelt. Danach erfolgte ein Verschluss der oberen Eimeröffnung durch ein Edelstahlsieb und durch dieses die Applikation von jeweils 40 Gramm fein vermahlener Saccharose. Der Eimer wurde anschließend manuell kreisend für etwa fünf Minuten bewegt und die von den Bienen abfallenden Milben wurden in einer unter dem Eimer stehenden Wanne aufgefangen. Diese Prozedur wurde mit jeweils fünf bis sechs Donorvölkern wiederholt, um eine ausreichende Anzahl Milben zur Verfügung

zu haben. Die gesammelten Milben wurden anschließend zweimal mit ddH2O

27 Material und Methoden

gewaschen und der gelöste Zucker durch ein Feinsieb von den Milben getrennt. Abschließend wurden die Milben auf feuchtem Laborpapier bis zu ihrer weiteren Verwendung gehältert. Von Milben befreite Bienen wurden ohne weitere Behandlung in ihre Herkunftsvölker zurückverbracht.  Besatz der Hälterungskäfige mit Bienen und Milben:

Die in Polyethylenflaschen bereitstehenden Bienen wurden erneut mit CO2 begast, den Flaschen entnommen und mit Milben besetzt: Je 50 Bienen erhielten durch einzelnes Heranführen der Bienen an die Milben mit Hilfe einer Pinzette einen Besatz von 25 Milben – das selbständige Aufsteigen auf die Biene bei Annäherung derselben diente dabei als Vitalitätstest für die Milben. Die Bienen mit den ihnen aufsitzenden Milben wurden dann in Edelstahl- Versuchskäfige (50 x 75 x 40 mm) überführt. Die Käfige besaßen eine durchlöcherte Bodenplatte und wurden an einer Seite mit einer Glasplatte zur optischen Kontrolle verschlossen. Um Verschmutzungen durch Abgabe von Kot zu reduzieren, wurden passende Papierstücke auf den Boden der Kästen gelegt, die täglich gewechselt wurden. Im Weiteren wurden Bienen und Milben in diesen in Brutschränken im Dauerdunkel bei 35°C und einer relativen Luftfeuchte von 90 Prozent gehältert. Die Verabreichung von Futter (2M Saccharoselösung) und Wasser erfolgte ad libitum. Die Hälterungskäfige wurden einzeln auf Aluminiumprofile (50 x 30 x 30 mm) in Polyethylenwannen (110 x 110 x 30 mm) gestellt, deren Rand innen 10 mm breit mit Vaseline bestrichen wurde, um ein Entkommen abgefallener aber noch lebender Milben zu verhindern (Abb. 2.2). Nach einem Tag wurden zunächst die durch das Besatzverfahren eventuell letal geschädigten Tiere erfasst und entfernt.  Zur Applikation der Suspension wurden die Käfige einzeln entnommen, die Glasscheibe durch ein Edelstahlgitter (Maschenweite 2 x 2 mm) ersetzt und die je 50 Bienen und 25 Milben mit 0,544 ml der jeweiligen Konidiensuspension, die mit Erntelösung (0,1% Tween 80, 0,5% NaCl) auf eine Konzentration 9 x 107 Konidien/ml eingestellt war, besprüht, so dass eine Konidiendosis von 1 x 106 Konidien/Biene erreicht wurde. Edelstahlgitter wurden nach Gruppen getrennt verwendet und vor Wiederverwendung jeweils durch Ausglühen sterilisiert. Die verwendeten 10-ml-Sprühflaschen waren zuvor durch Sprühtests, Auszählen der Konidienkonzentration von Ausgangs- und versprühter Suspension in einer Neubauerzählkammer und Ausplattieren einer Verdünnungsreihe versprühter

28 Material und Methoden

Suspension auf MEA-Platten auf Düsengängigkeit der Konidien und deren Keimfähigkeit nach Düsendurchgang untersucht worden. Flaschen wurden ebenfalls getrennt nach Gruppen verwendet und jeweils durch mehrmaliges

Spülen mit 70% Ethanol, gefolgt von Spülen mit ddH2O desinfiziert. Die Kontrollgruppe wurde mit 0,544 ml 0,1% Tween 80, 0,5% NaCl pro 50 Bienen besprüht, das als Emulgator für die Konidiensuspension diente.  Im Fortgang wurde der tägliche Bienen- und Milbentotenfall unter Rotlicht erfasst, um die Bienen nicht zu stören. Tote Bienen wurden ebenso wie tote Milben mit Pinzetten entfernt, die Bienen wurden nach sorgfältigem Absuchen auf noch aufsitzende Milben verworfen, die Milben gesammelt und später auf Pilzwachstum untersucht. Futter und Wasser wurden ergänzt und gegebenenfalls verschmutzte Scheiben ausgewechselt.

Abb. 2.2: Aufbau des in vitro-Assays für Adultbienen. Unterbringung von je 50 Bienen und 25 Milben in Hälterungskäfigen mit Zuckerlösung (Spritze) und Wasser (1,5 ml- Reaktionsgefäß) ad libitum. Die Käfige stehen auf Aluminiumprofilen, die in Schalen,

deren Rand mit Vaseline bestrichen ist, untergebracht sind.

29 Material und Methoden

2.8 Erfassung des Pilzwachstums aus behandelten Milben

Zur Erfassung des anteiligen Pilzwachstums (i.e. der Anteil der gesammelten Milben, aus denen Pilze wuchsen) aus dem Gesamtmilbenfall der in vitro-Assays an Adultbienen und Milben (2.7) wurden die in diesen Versuchen gestorbenen Milben täglich getrennt nach Pilz- und Versuchsgruppe gesammelt und zunächst durch 120- sekündiges Eintauchen in 0,5% NaOCl gefolgt von Spülen in sterilem ddH2O für 30 Sekunden oberflächensterilisiert. Die Milben wurden dann mit sterilen Holzstäbchen auf H2O-Agar-Platten gesetzt und bei 25°C im Dauerdunkel in Klimaschränken kultiviert. Die Platten wurden täglich auf eventuelles Pilzwachstum kontrolliert; Milben, die ein Pilzwachstum zeigten, wurden zu Vermeidung von Kreuzinfektionen unter sterilen Bedingungen entfernt und verworfen.

2.9 Halbfreilandversuch an Apis mellifera-Völkern zur Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und -puppen sowie Varroa destructor

Um in Bezug auf Verwandtschaftsgrad, Milbenbefall und Altersstruktur vollkommen einheitliche Ausgangsbedingungen in jedem Versuchsvolk zu schaffen, wurden insgesamt 21 Honigbienenvölkern die Königinnen entnommen und die Bienen ohne Larvenstadien und Puppenstadium, aber mit aufsitzenden Milben in der phoretischen Phase zunächst zu drei je etwa 20000 Bienen starken Großgruppen vereinigt, die in zweiseitig vergitterten Zargen untergebracht waren und drei Tage bei 5°C im Dauerdunkel in einer Klimakammer gehältert wurden. Die zuvor entnommenen Königinnen wurden in kleinen, geschlossenen Drahtkäfigen zugehängt. Die Fütterung der Großgruppen erfolgte durch aufgelegten Futterteig (Apifonda, Südzucker AG) und mit in umgedrehten Honiggläsern mit perforiertem Deckel bereitgestellter 2M Saccharoselösung ad libitum. Zu Beginn des eigentlichen Versuchs erfolgte unter Besprühen mit Wasser eine Fusion der drei Großgruppen zu einer Supergruppe, die mechanisch durch vorsichtiges Umrühren mit einer Schaufel und Schütteln in Bezug auf eine eventuell vorhandene Nicht-Gleichverteilung der Einzelbienen vor dem Hintergrund der

30 Material und Methoden

Herkunft der Einzelbienen aus den Ausgangsgroßgruppen oder ihrer Alterstruktur respektive ihres Befalls mit Milben, homogenisiert wurde. Die Verteilung der Bienen erfolgte in gleich großen Quantitäten auf die insgesamt zehn Versuchsvölker, die in Kästen gleicher Bauart auf leeren Waben untergebracht waren und je eine der zuvor den Ausgangsvölkern entnommene Königin im Drahtkäfig unter Futterteigverschluss erhielten, so dass die Königinnen innerhalb von 24 Stunden unter Verbrauch des Futterteiges durch die Arbeiterinnen befreit wurden. Die Gabe von Wasser, Pollen und Futter erfolgte ad libitum über eine Tränke pro Versuchsgruppe sowie den Waben direkt aufgelegten Futterteig, der während des Versuchszeitraums laufend ergänzt wurde, und zugehängte Futterwaben. Die Unterbringung der Kästen erfolgte in zwei je 20 x 4 Meter großen Flugzelten am gleichen Standort und mit gleicher Ausrichtung, so dass eventuelle Lageeffekte ausgeschlossen werden konnten (Abbildung 2.3). Pilz- und Versuchsgruppe waren je in einem Zelt untergebracht, um eine eventuelle Verschleppung von Lecanicillium-Konidien zu verhindern. Die Fluglöcher der Völker in jedem Flugzelt wiesen in jeweils unterschiedliche Himmelsrichtungen und waren farbig markiert, um ein Verfliegen von Bienen zwischen den Völkern weitestgehend auszuschließen. Die Völker standen auf Holzpaletten, um sie einerseits der Bodenfeuchte zu entziehen, und andererseits durch Unterlegen von Holzkeilen exakt waagerecht ausrichten zu können. Zur Erfassung des Milbenfalls wurde unter den Gitterboden jedes Volkes eine passgenaue Polyethylenwanne geschoben, die etwa 5 Millimeter hoch mit Pflanzenöl gefüllt wurde, um ein Verwehen gefallener Milben durch Wind, vor allem aber ein Wegtragen durch fouragierende Ameisen zu verhindern. Nach dem Besatz wurde sowohl den Pilz- als auch den Kontrollvölkern 24 Stunden Zeit gegeben, sich an die Flugzelte und die zugesetzten Königinnen zu gewöhnen. Die Vorbereitung der Konidiensuspension erfolgte zunächst nach Herstellerspezifikation („Mycotal“, Koppert BV). Die additivhaltige Suspension wurde dann aber gefiltert (Sartorius 288), um die Konidien von der Additivmatrix zu trennen und die Konidiensuspension düsengängig zu machen. Anschließend wurde die Konidienzahl pro Milliliter mit Hilfe einer Neubauerzählkammer bestimmt und die Sporensuspension durch Verdünnen mit Wasser so eingestellt, dass mit vier Pumpstößen pro Wabenseite aus einer 1,5-Liter-Sprühflasche eine single-bee-Dosis von 1 x 106 Konidien appliziert werden konnte. Düsengängigkeit der Konidien und

31 Material und Methoden deren Keimfähigkeit nach Düsendurchgang waren zuvor nach Sprühtests und Ausplattieren einer Verdünnungsreihe auf MEA-Platten überprüft worden. Die Pilzgruppe wurde einen Tag nach Besatz mit Lecanicillium muscarium- Konidiensuspension besprüht, die Kontrollgruppe mit dem entsprechenden Volumen Suspension, das analog aus konidienfreier Additivmatrix hergestellt wurde, die die Firma Koppert zur Verfügung stellte. In der Folge wurde der Milbenfall täglich durch Auszählen der ins Öl gefallenen Milben erfasst, die Bienenzahl und die Zahl der Brutstadien wurden zu Beginn und nach sieben, 14 und 17 Tagen durch Auflegen eines Schätzrahmens bestimmt. Nach Ermittlung der Bienenzahl und Abschütteln der adulten Bienen in die Versuchsvölker wurde mit Hilfe der gleichen Vorgehensweise die Zahl offener oder verdeckelter Brutzellen erfasst. Die Zahl zum Zeitpunkt der Schätzung fouragierender Arbeiterinnen wurde über die Erfassung innerhalb einer Minute an- beziehungsweise abfliegender Bienen ermittelt. Der Kasteninnenwand ansitzende Bienen wurden ebenfalls zur Gesamtzahl addiert. Der relative Endbefall der Bienen wurde zum Versuchsende durch Untersuchung der Arbeiterinnen ermittelt: Alle noch in den Völkern befindlichen adulten Tiere wurden gesammelt, getötet und durch Waschen mit einer detergenshaltigen Waschlösung von den aufsitzenden Milben befreit. Die abgelösten Milben wurden anschließen in geeigneten Sieben aufgefangen und ebenso wie die Bienen einzeln gezählt. Ebenfalls durch Auswaschen und Einzelauszählung wurde der relative Milbenendbefall der verdeckelten Brut ermittelt: Zunächst wurden die verdeckelten Brutzellen gezählt, nach Einfrieren mechanisch entdeckelt und die in ihnen befindlichen Milben und Puppen mit einem scharfen Wasserstrahl ausgespült. Nach Abschluss des Versuchs wurden alle Versuchstiere nach Autoklavieren entsorgt.

32 Material und Methoden

Abb. 2.3: Aufstellung der Versuchsvölker in einem von zwei 20 x 4 Meter

großen Zelten auf waagerecht ausgerichteten Paletten mit versetzter Ausrichtung der Fluglöcher.

2.10 Erfassung der subletalen Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen

Die Bienen für diesen Versuch stammten aus milbenarmen Versuchsvölkern und wurden wie zuvor beschrieben gewonnen; ihnen standen 2M Saccharoselösung und Wasser ad libitum zur Verfügung. Die Hälterung erfolgte analog zu den anderen in vitro-Versuchen in Metallkäfigen bei 35°C und hoher Luftfeuchte im Wärmeschrank. Zu Beginn des Versuchs wurden die Bienen mit einem den in anderen Versuchen verwendeten Volumen äquivalenten Volumen Konidienerntelösung besprüht. In der Folge wurden die Tiere keiner weiteren Behandlung unterzogen, lediglich gestorbene Bienen wurden entfernt. Der Gruppe

33 Material und Methoden wurden täglich Bienen entnommen, die zunächst auf Eis betäubt und denen dann nach Fixierung des Thorax mit einer Pinzette durch Abziehen das Abdomen entfernt wurde. Bei vorsichtiger Vorgehensweise wird dabei die am Oesophagus hängende Honigblase nach kranial herausgezogen. Anschließend wurde die Honigblase mit einer feinen Schere abgetrennt und auf einer Analysewaage (Sartorius) gewogen. Der mögliche Einfluss entomopathogener Pilze auf das Lernverhalten wurde im Rahmen einer Rüsselreflexdressur (auch PER-Dressur, „Poboscis Extension Reflex- Dressur“) untersucht (Bittermann et al. 1983). Für jede Versuchsreihe wurden den Versuchsvölkern 1000 Bienen durch

Abschütteln entnommen und nach CO2-Betäubung in Metallkästen (50 x 75 x 40 mm³) mit jeweils 50 Bienen überführt. Die Kästen verfügten über eine durchlöcherte Bodenplatte und wurden an einer Seite mit einer Glasplatte verschlossen. Die Hälterung der Bienen erfolgte bei 35°C und einer relativen Luftfeuchte von 90 Prozent im Dauerdunkel des Brutschrankes. Bis zum Dressurtag standen 2M Saccharoselösung und Wasser ad libitum zur Verfügung. In der Pilzgruppe erfolgte nach Besatz die Applikation von 0,544 ml Konidiensuspension des Pilzes Lecanicillium muscarium einer Konzentration von 9 x 107 Konidien/ml, so dass eine single-bee-Dosis von 1 x 106 Konidien/Biene erreicht wurde. Analog wurde die Kontrollgruppe je Kasten mit 0,544 ml 0,1% Tween 80, 0,5% NaCl besprüht, das als Emulgator für die Konidiensuspension diente. Vor der Rüsselreflexdressur wurde den Bienen in Abhängigkeit vom erwarteten Füllungsvolumen der Honigblase und dem ermittelten durchschnittlichen Futterverbrauch Futter entzogen, so dass sie zu Beginn der Rüsselreflexdressur hungrig waren. Die am Versuch teilnehmenden Bienen wurden aus den Kästen entfernt und nach Betäubung durch Kühlung auf Eis einzeln in Reaktionsgefäße (1,5 ml, Eppendorf), deren Spitzen abgeschnitten waren, eingeführt. Die Tiere wurden am Thorax so mit Klebeband fixiert, dass Vorderbeine, Rüssel und Antennen frei beweglich blieben. Um eine Flucht aus den Reaktionsgefäßen zu verhindern, wurden diese hinter dem Abdomen der Bienen mit Papierstopfen blockiert. Etwa eine Stunde nach Einbringen der Bienen in die Reaktionsgefäße (Abbildung 2.4) begann die PER-Testphase: Die Antennen der Bienen wurden alle 30 Minuten mit einem in 2M Saccharoselösung getauchten Schmelzpunkt- Bestimmungsröhrchen (80 mm x 1 mm) berührt. Bienen, die auf die Gabe dieses unbedingten Reizes nicht mit Herausstrecken des Rüssels reagierten, wurden für die

34 Material und Methoden

Rüsselreflexdressur verworfen. In der Testphase erfolgreiche Bienen wurden anschließend in den PER-Versuchsaufbau (Abbildung 2.5) eingesetzt. Für die Rüsselreflexdressur wurden Geraniol als Dressurduft und Citral als Vergleichsduft (beide SIGMA-ALDRICH) verwendet. Dazu wurden jeweils 10 µl des Duftstoffes auf ein Stück Filterpapier (Grade 288, 90 mm Durchmesser, 80 g/m²) aufgetragen und das Filterpapier in fabrikneue Glaspasteurpipetten (Länge 150 mm) eingebracht. Als Kontrolle diente unbehandeltes Filterpapier in einer Glaspasteurpipette. Die Pipetten führten den Bienen aus einer Druckluftflasche einen konstanten Luftstrom von 50 ml/min zu, der durch ein Peltierelement auf 35°C aufgeheizt wurde. Die Gabe des Duftreizes war über ein Magnetventil steuerbar, während ein zweiter duftloser Luftstrom gleicher Durchflussmenge appliziert wurde, der eine Assoziation der bloßen Luftbewegung mit dem unbedingten Reiz verhindern sollte. Bienen, die sich auf dem drehbaren Karussell unmittelbar vor der Versuchsposition befanden, wurden durch ein Holzbrett vom gerade applizierten Duft abgeschirmt. Zusätzlich war über der Versuchsposition ein Ventilator angebracht, der für eine schnelle Abfuhr des applizierten Duftes sorgte, um die anderen auf dem Karussell befindlichen Bienen nicht zu beeinträchtigen. Die Rüsselreflexdressur beinhaltete zunächst drei Lernakte, an die sich abwechselnd acht Test- und Vergleichsakte anschlossen. Nach dem zweiten und fünften Vergleichsakt wurde eine Kontrolle durchgeführt. Nach Positionierung der jeweiligen Versuchsbiene unmittelbar vor den Pipettenspitzen und einer Gewöhnungszeit von etwa fünf Sekunden wurde der Luftstrom für sechs Sekunden mittels Magnetventilsteuerung von der Kontrollpipette auf die Pipette mit Dressurduft umgeleitet. Nach etwa zwei Sekunden wurden die Antennen der Biene mit 2M Saccharoselösung berührt und die Biene wurde nach Herausstrecken des Rüssels damit belohnt. Bienen, die auf den neutralen Luftstrom mit einem Rüsselreflex oder nicht auf den unbedingten Reiz reagierten, wurden aus dem Versuch entfernt. Auf der horizontalen, drehbaren Scheibe des „Karussells“ befanden sich Aufnahmebohrungen für 20 Reaktionsgefäße; jede Einzelbiene konnte etwa alle acht bis zehn Minuten getestet werden. Während der acht Testakte erfolgte keine Konditionierung mehr – die Tiere wurden also nur bei einer positiven Antwort auf den bedingten Reflex durch Gabe

35 Material und Methoden von Saccharoselösung belohnt. Antworten auf den Vergleichsduft oder Antworten während der zwei Kontrollakte wurden in keinem Fall belohnt. Die Klassifikation der Antworten erfolgte in den Kategorien „unbedingter Reflex“, „bedingter Reflex“, „Reaktion auf Luft“ oder „keine Reaktion“. Zur Untersuchung der Fragestellung, ob es einen Effekt der Applikation eines entomopathogenen Pilzes auf die Futteraufnahme der Einzelbiene gibt, wurde der Futterverbrauch je Einzelkasten alle 24 Stunden durch Wiegen der das Futter enthaltenden Spritze und Differenzbildung zum 24 Stunden zuvor gemessenen Wert erfasst; parallel wurde die Zahl der je Kasten noch verbliebenen Bienen ermittelt.

Abb. 2.4: Honigbienenarbeiterin in der Rüsselreflexdressur; das Tier wird während der Konditionierung mit Saccharoselösung belohnt; links oben die Spitzen der Glaspasteurpipetten, durch die Dressur- und Vergleichsduft appliziert werden.

36 Material und Methoden

Abb. 2.5: Versuchsapparatur zur Durchführung der Rüsselreflexdressur: Glaspasteurpipetten mit Peltierelement, Ventilator, „Karussell“, Signalgeber.

2.11 Erfassung des Einflusses entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von Adultbienen

Versuchsvölkern wurden adulte Bienen durch Abschütteln entnommen und mit

CO2 betäubt. Anschließend erfolgte die Verteilung auf sieben Versuchsgruppen mit je 50 Bienen. Der Versuchsgruppe „amputiert“ wurde jeweils ein Bein amputiert, um eine obligate Immunantwort auszulösen und eine Positivkontrolle zu erhalten. Die anderen Gruppen wurden mit 0,544 ml einer Konidiensuspension besprüht, so dass eine single-bee-Dosis von 1 x 106 Konidien/Biene erreicht wurde. Appliziert wurden Konidien der entomopathogenen Pilze Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, sowie Sporen von

Saccharomyces cerevisiae MEYEN. Die Negativkontrollgruppe erhielt eine äquivalente Dosis konidienfreier Erntelösung. Analog zu allen anderen in vitro-Assays wurden die

37 Material und Methoden

Honigbienen anschließend in Metallkäfigen bei 35°C und hoher Luftfeuchtigkeit im Dauerdunkel gehältert; Futter und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. 24 Stunden später wurde den Bienen nach Betäubung auf Eis Hämolymphe entnommen: Auf Thorax und Abdomen der Bienen wurde nach Abtrennen der Tibia eines Mittelbeines leichter Druck ausgeübt, bis ein Hämolymphtropfen austrat, der mit einer Eppendorfpipette aufgenommen wurde. Je 5 µl Hämolymphe wurden in ein 200 µl-Eppendorfgefäß überführt, das 1 µl einer Lösung Phenylthioharnstoff 0,1 mg/ml und des Proteaseinhibitors Aprotinin 0,1 mg/ml (beide SIGMA ALDRICH) enthielt, um ein Melanisieren der Hämolymphe zu vermeiden. Die Lagerung erfolgte bei -26°C im Gefrierschrank.

Als Teststämme für den Immunversuch wurden Escherichia coli (B) CASTELLANI

AND CHALMERS (DSM 613, DSMZ, Braunschweig) und Bacillus subtilis (168) COHN (Mikrobielle Antibiotikaforschung, Ruhr-Universität Bochum) verwendet. Aus den Stammkulturen wurden je 40 ml einer sterilen LB-Flüssigkultur (5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Trypton, 10 g/L NaCl, alle Applichem) angeimpft und über Nacht bei 37°C und 120 rpm inkubiert. Am nächsten Morgen wurden aus dieser Kultur erneut 5 ml LB flüssig angeimpft; die Inkubation erfolgte bei 37°C und 120 rpm sowie stündlicher Probennahme und Messung im Photometer (Shimadzu UVmini 1240) bis zu einer

OD650 von 0,5. Dem Ansatz wurde daraufhin ein Aliquot entnommen und mit LB flüssig 1:10 verdünnt. 1 µl dieser Verdünnung wurden dann mit je 1,5 µl der gewonnenen Hämolymphe vermischt; zwei weitere Ansätze enthielten keine Hämolymphe, sondern nur 1 µl einer Lösung Phenylthioharnstoff 0,1 mg/ml und des Proteaseinhibitors Aprotinin 0,1 mg/ml beziehungsweise sterilfiltriertes Streptomycin 100 µg/ml. Die Ansätze wurden kurz anzentrifugiert und anschließend für zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Jeder Ansatz wurde dann auf 10 µl aufgefüllt und es wurde eine Verdünnungsreihe über 6 Potenzen erstellt (je 2 µl auf 18 µl LB-Medium). 2 µl je Ansatz wurden anschließen auf sterilen LB-Platten (5 g/L Hefeextrakt, 10 g/L Trypton, 10 g/L NaCl, 15 g/L Agar, alle Applichem) ausplattiert und im Brutschrank bei 37°C inkubiert. 24 Stunden später erfolgte die Auszählung und Ermittlung der Zahl koloniebildender Einheiten (colony forming units, cfu) in Abhängigkeit von der Verdünnungsstufe.

38 Material und Methoden

2.12 Screening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische varroapathogene Pilze

Die Erfassung der Bienenzahl erfolgte wie unter 2.9 beschrieben während des jeweiligen Sommerhalbjahrs an insgesamt 215 Versuchsvölkern in vierwöchigen Abständen fünfmal je Volk. Zur Ermittlung des täglichen Milbenfalls wurde unter das Gitter des Bodens eines Volkes für je drei Tage eine passgenaue Polyethylenwanne geschoben, die ein Verwehen gefallener Milben durch Wind verhinderte. Der Milbenfall wurde für jedes Volk während des Untersuchungszeitraums an 21 Terminen durch genaues Auszählen ermittelt. Zur Untersuchung einer eventuellen Korrelation von Milbenbefall und dem Vorkommen von Pilzen wurden auf der Basis der Populationsschätzungen Völker ausgewählt, deren Milbentotenfall in Bezug auf die Erzielbarkeit eines Pilzwachstums in vitro untersucht wurde. Den zu untersuchenden Völkern wurde dazu eine passgenaue Auffangwanne untergeschoben und der tägliche Milbenfall über einen Zeitraum von bis zu zwei Wochen pro Volk gesammelt. Im Labor erfolgte dann die Oberflächensterilisation durch Eintauchen der Milben in 0,5% NaOCl für 120

Sekunden und anschließendes Spülen in sterilem ddH2O. Danach wurden die Milben

– getrennt nach Herkunftsvölkern – mit sterilen Holzstäbchen auf H2O-Agar-Platten (15 g/L Agar, Applichem) überführt und bei 25°C im Dauerdunkel in Brutschränken kultiviert. Das aus diesen Milben erfolgte Pilzwachstum wurde registriert; Milben, die ein Pilzwachstum zeigten, wurden entfernt und getrennt unter gleichen Bedingungen weiterkultiviert, um eine Kreuzinfektion der auf den Agarplatten verbliebenen Milben zu vermeiden. Der Einschub der Schubladen über bis zu zwei Wochen bedingte, dass es zur Verschleppung von Milben durch fouragierende Ameisen kam. Aus diesem Grund konnte nicht gleichzeitig der Befall des Volkes über den Milbentotenfall in der Auffangwanne erfasst werden. Allen Völkern wurden deshalb während der Phase des Milbensammelns Proben von etwa 1000 adulten Bienen entnommen, die ausgezählt und deren aufsitzende Milben nach Abwaschen mit einer Detergenslösung und Absieben ebenfalls erfasst wurden.

39 Material und Methoden

2.13 Identifizierung von Pilzen im Pilzscreening

Lactophenolblaufärbung

Um die isolierten Pilze nicht nur molekularbiologisch charakterisieren zu können, wurden mikroskopische Präparate angelegt: Nach Beladen eines Objektträgers mit 10 µl Lactophenolblau (Sigma Alrich) wurde ein transparenter, einseitig klebender Kunststofffilmstreifen auf die Wuchszone im Randbereich des Pilzes gedrückt, um Konidien und Myzel zu übertragen; der Streifen wurde anschließend auf den Lactophenolblautropfen gelegt und nach Trocknen mikroskopiert.

Flüssigkultur und DNA-Extraktion

Um Aussagen zur Spezieszugehörigkeit der im Screening aus den Milben gewachsenen Pilze treffen zu können, wurden diese auf der Basis von Sequenzdaten identifiziert: Zunächst erfolgte durch wiederholtes Überimpfen auf MEA-Platten eine Isolation der gewachsenen Pilze, bis eine Kontamination durch Fremdkulturen ausgeschlossen werden konnte. Die Kultur der isolierten Pilze erfolgte bei 25°C im Dauerdunkel in Klimaschränken. Zur Gewinnung der DNA wurde je Pilz eine Petrischale mit autoklaviertem CM-Flüssigmedium mit drei unter sterilen Bedingungen ausgestochenen Myzelstücken beimpft und drei Tage bei 25°C im Dauerdunkel kultiviert. Nach Einsetzen eines deutlichen Pilzwachstums in der Flüssigkultur wurden die Agarstücke mit Hilfe steriler Pipettenspitzen entfernt, das Myzel durch Zerreißen mit sterilen Pipettenspitzen grob zerkleinert und 2,0-ml- Reaktionsgefäße (Eppendorf) zu einem Drittel mit Myzel gefüllt. Es folgte Zentrifugation bei 16000 g für zwei Minuten und Abpipettieren des Überstandes. Je Eppendorfgefäß wurden dann 600 µl Lysepuffer zugefügt. Anschließend folgten sechs Homogenisier-Gefrier-Auftauzyklen: 1 Minute Homogenisierung im Reagenzglasschüttler (Vortex), 30 Sekunden Gefrieren in flüssigem Stickstoff, 1 Minute Auftauen im Wasserbad (GFL) bei 70°C. Danach wurde der Gefäßinhalt bei 70°C komplett aufgetaut. Anschließend wurde unter dem Abzug 1 ml Phenol (Roth) zugegeben, homogenisiert, und 15 Minuten bei 13500 g, 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Gefäß überführt und 1 ml Phenol-Chloroform-

40 Material und Methoden

Isoamylalkohol zugegeben. Danach wurde wiederum homogenisiert und bei 13500 g und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Nach erneuter Überführung des wässrigen Überstandes erfolgte die Zugabe von 0,5 Vol. 7,5M Ammoniumacetat und 1 Vol Isopropanol. Nach vorsichtigem Invertieren und Aufbewahren bei -26°C über Nacht wurde am nächsten Morgen bei 16000 g für 40 Minuten zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgegossen und das Pellet mit 300 µl 70% Ethanol gewaschen. Nach folgender Zentrifugation bei 16000 g für 10 Minuten wurde der Überstand verworfen und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Abschließend erfolgte die Zugabe von je 30 µl autoklaviertem ddH2O.

DNA-Aufreinigung

Die Proben wurden zunächst unter Vermeidung des Mitführens des nicht resuspendierten Anteils in ein neues Eppendorfgefäß überführt, mit 4 µl RNase A (10 mg/ml, Fermentas) vermischt und 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Lösung mit 1 Vol Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (Roth) versetzt, ausgeschüttelt und bei 12300 g für 10 Minuten abzentrifugiert. Der wässrige Überstand wurde unter Vermeidung des Mitführens der Interphase in ein neues Eppendorfgefäß pipettiert, bevor der Vorgang wiederholt wurde. Anschließend erfolgte ein Ausschütteln mit 1 Vol Chloroform, erneutes Ausschütteln und Abzentrifugieren bei 12300 g für 10 Minuten und danach ein Versatz mit 0,6 Vol Isopropanol. Nach Inkubation bei -26°C wurde bei 16000 g in 45 min quantitativ abzentrifugiert, mit 70% Ethanol gewaschen, bei 45°C im Thermoblock getrocknet und das Pellet danach erneut in 30 µl autoklaviertem ddH2O aufgenommen. Die Überprüfung der Extraktion und Aufreinigung erfolgte über eine Roh-DNA- Agarosegelelektrophorese auf einem 0,7% Agarosegel (NEEO Ultra, Roth) und anschließende Färbung und Dokumentation unter einer UV-Bank (Biometra BioDocAnalyze). Die aufgereinigten DNA-Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei -26°C im Gefrierschrank gelagert.

41 Material und Methoden

Konzentrationsbestimmung

Die Bestimmung der Konzentration erfolgreicher Extraktionen erfolgte photometrisch (Shimadzu UVmini 1240 Spectrophotometer): 5 µl DNA-Extrakt wurden mit 95 µl TE-Puffer zu einer 1:10-Lösung verdünnt und in eine Photometerküvette gegeben; der Nullabgleich erfolgte gegen TE-Puffer. Die OD- Messung wurde dann mit jeweiligem Nullabgleich bei 260 und 280 nm durchgeführt.

PCR

Verwendet wurden je Ansatz 1µl 10x PCR-Puffer (Sigma Aldrich), 1µl dNTP-Mix 2mM (MWG) je 0,5 µl forward-/reverse-Primer, 0,2 µl RedTaq-Polymerase 5U/µl

(Sigma Aldrich) und ddH2O add. 10 µl. Grundsätzlich lief ein Ansatz als Negativkontrolle ohne DNA mit. Die verwendeten Primer (ITS1F (Bruns et al. 1993) und ITS4 (White et al. 1990), beide MWG) hatten folgende Sequenzen:

ITS1F 5´-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3´ ITS4 5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´

Als Protokoll für die PCR (Thermocycler: Biometra UNO Thermoblock) wurden nach Voruntersuchungen die in Tabelle 2.2 zusammengefassten Parameter verwendet.

Tabelle 2.2: Parameter der PCR der ITS-Region

Schritt Temperatur (°C) Dauer (min) Initiale Denaturierung 94 3 Denaturierung 94 0,5 Annealing 55 0,5 30 Elongation 68 1 Finale Elongation 68 3 Ende 4 ∞

Die Kontrolle der PCR auf Erfolg und eventuelle Kontaminationen erfolgte auf einem 1,7% Agarosegel.

42 Material und Methoden

PCR-Cleanup

Die Amplifikate wurden enzymatisch aufgereinigt. Verwendet wurden Exonuclease I aus Escherichia coli und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) (beide Fermentas). 5 µl des PCR-Produkts wurden mit je 0,25 µl Exonuclease I und 0,5 µl SAP versetzt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte die Inaktivierung bei 85°C für 15 Minuten (Thermomixer comfort, Eppendorf).

Sequenzierung

Die Sequenzierung erfolgte am Lehrstuhl für Biochemie I – Rezeptorbiochemie der Ruhr-Universität Bochum auf einem Applied Biosystems 3130 xl Genetic Analyzer nach den Spezifikationen des Lehrstuhls. Primer für die Sequenzierung war ITS1F wie oben beschrieben.

Datenbankabfrage, Alignment und Stammbaumkonstruktion

Die Identifizierung der Pilze erfolgte durch Abgleich mit bereits abgelegten Sequenzdaten in der EMBL Nucleotide Sequence Database (http://www.ebi.ac.uk/Tools/fasta33/nucleotide.html, Stand Juni 2009). Als Parameter wurden die in Tabelle 2.3 dargestellten Einstellungen verwendet.

Tabelle 2.3: Übersicht der für die EMBL-Abfrage verwendeten Einstellungen

Program FASTA Databases EMBL Fungi Matrix none Gap open -14 Gap extend -4 KTUP 6 Expectation upper value 10,0 Expectation lower value default DNA strand both Sequence Range Start-End Database Range Start-End Filter none Statistical estimates Regress

43 Material und Methoden

Das Alignment der Sequenzen erfolgte unter Verwendung des Programms MEGA (Molecular Evolutionary Genetics Analysis) Version 4 auf einem PC unter Windows XP (Tamura et al. 2007). Die Alignierung wurde mit ClustalW durchgeführt. Anschließend wurden alle Sites am Sequenzanfang und -ende, die nicht in allen Sequenzen ein Signal geliefert hatten, manuell entfernt. Die Berechnung eines ungewurzelten Baumes auf der Basis der Alignierung mit dem Neighbor-Joining-Verfahren wurde ebenfalls mit MEGA 4.0 durchgeführt (Saitou et al. 1987; Wägele 2001). Die Distanzwerte wurden nach dem Maximum Likelihood-Verfahren ermittelt (Tamura et al. 2004). Der Baum wurde außengruppenlos ohne orthologen Datensatz berechnet. Als Parameter für die Baumberechnung wurden die in Tabelle 2.4 dargestellten Einstellungen verwendet.

Tabelle 2.4: Übersicht der für die Baumberechnung verwendeten Einstellungen in MEGA 4.0

Data Type Nucleotide Analysis Phylogeny reconstruction Method Neighbor-Joining Gaps/Missing Data Complete Deletion Model Nucleotide: Maximum Composite Likelihood Substitutions to Include d: Transitions + Transversions Pattern among Lineages Same (Homogeneous) Rates among sites Uniform rates

2.14 Statistik und Parameter der grafischen Darstellung

Die verwendeten statistischen Tests, der Stichprobenumfang und die ermittelten Signifikanzniveaus sind zu den jeweiligen Ergebnissen angegeben. Einzelheiten zur Durchführung der Tests können Backhaus, Sachs und Siegel entnommen werden (Siegel et al. 1988; Backhaus 2008; Sachs et al. 2009). Die Darstellung der Ergebnisse erfolgt in Balken-, Linien-, Streudiagrammen, einer Streudiagrammmatrix oder Box- und Whiskerplots. Im Fall von Box- und Whiskerplots ist als unterteilende Linie der Box der Median dargestellt. Im unteren Bereich der Box wird das 25. Perzentil, im oberen Bereich der Box wird das 75. Perzentil dargestellt. Die Länge der Whisker beträgt das 1,5-fache der Höhe der Box;

44 Material und Methoden falls keine Fälle mit Werten in diesem Bereich vorhanden sind, wird die Länge durch den maximalen beziehungsweise minimalen Wert festgelegt. Ausreißer sind als Punkte dargestellt und umfassen Werte, die nicht innerhalb der Whisker liegen. Extremwerte sind durch Sterne dargestellt und umfassen all jene Fälle, deren Werte mehr als dreimal so groß sind wie die Höhe der Boxen. Im Fall von Regressionsgeraden sind die Werte der quadratischen Regression jeweils angegeben.

45 Ergebnisse

3 Ergebnisse

Um Aussagen darüber gewinnen zu können, ob als Kontrollagentien geeignet erscheinende, entomopathogene Pilze eine negative Wirkung auf die Larvenstadien beziehungsweise das Puppenstadium von Honigbienen respektive adulte Honigbienen sowie adulte Milben haben und ob eine signifikant erhöhte Pilzwachstumsrate bei Milben post mortem detektierbar war, wurden in den Untersuchungen mit einer definierten Einzeldosis Konidien des jeweils untersuchten Pilzes behandelte Individuen mit nur mit einer entsprechenden Menge der Erntelösung behandelten Individuen in der Kontrollgruppe verglichen. Die dabei verwendeten methodischen Ansätze unterschieden sich bei Honigbienen in Abhängigkeit vom untersuchen Stadium des Tieres und differierten darüber hinaus zwischen den Labor- und den Halbfreilanduntersuchungen. Im Folgenden werden deshalb vor der Ergebnisbeschreibung zunächst noch einmal kurz die verwendeten methodischen Ansätze vor dem Hintergrund der Zielsetzung des jeweiligen Versuchs erläutert.

3.1 Voruntersuchungen

3.1.1 Kulturbedingungen

Um ein für die untersuchten entomopathogenen Pilze, vor allem aber für die im Screening zu isolierenden Pilze mit unbekannten Kulturansprüchen geeignetes Medium zu finden, das eine möglichst geringe Zahl von Arten durch Nichteignung ausschließt, wurden die zur Verfügung stehenden entomopathogenen Pilze auf vier unterschiedlichen Medien kultiviert und untersucht, inwiefern sich die Zahl erntbarer Konidien pro Flächeneinheit sowie die Koloniedurchmesser unterschieden. Die PDA- und YPDA-Nährböden wiesen bei jeweils einem untersuchen Pilz (Beauveria bassiana beziehungsweise Paecilomyces fumosoroseus) deutlich geringere erzielbare Konidiendichten und Koloniedurchmesser im Vergleich zur Restgruppe auf, so dass diese beiden Medien mit Blick auf die Erfassung undetektierte Pilze in phylogenetischer Nähe zu Beauveria bassiana und

46 Ergebnisse

Paecilomyces fumosoroseus verworfen wurden. Malzextraktagar zeigte sich bei sonst ähnlichen Ergebnissen im Vergleich zu Sabouraud-Dextrose-Agar in der Kultur von Beauveria bassiana überlegen, so dass Malzextraktagar als das Medium angesehen wurde, mit dem mit vergleichsweise großer Wahrscheinlichkeit neue Pilze kultiviert werden können (Abb. 3.1).

Abbildung 3.1: Medieneignung, gemessen als Zahl erntbarer Konidien pro Quadratzentimeter

Kulturfläche (Abszisse) und als Koloniedurchmesser in Zentimetern (Ordinate), untersucht für vier Pilze und die vier Medien Sabouraud-Dextrose-Agar (SDA), Malzextraktagar (MEA), Hefe-Pepton- Dextrose-Agar (YPDA) und Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA). Die im Durchschnitt besten Ergebnisse, vor allem mit Blick auf die Kultur zukünftiger, unbekannter Pilze, lieferte Malzextraktagar. 47 Ergebnisse

3.1.2 Wirkung unterschiedlicher Oberflächensterilisationszeiten auf das Pilzwachstum aus Milben

Die Beantwortung der Frage, ob ein Pilzwachstum nach Dosisapplikation entomopathogener Pilze in den Versuchen im Labor- sowie im Halbfreilandmaßstab nachweisbar war, setzte voraus, dass in der Kultur der Milben ein Wachstum der den Milben äußerlich anhaftenden, opportunistischen Saprophyten oder anderer Pilze weitestgehend ausgeschlossen werden konnte. Ebenso sollte im Screening auf unbekannte Pilze ausschließlich eine Kultur interioren Ursprungs erfolgen. Zu ermitteln war deshalb eine Mindeststerilisationszeit, die einen weitestgehenden Ausschluss des Wachstums aus den Milben äußerlich anhaftenden Diasporen sicherstellte. Gesammelte Milben wurden deshalb gepoolt und dem Sterilans NaOCl für definierte Zeiträume ausgesetzt. Signifikante Reduktionen des erzielbaren anteiligen Wachstums (Pilze pro 100 Milben) traten nach 20 und 120 Sekunden auf – in der Folge wurde deshalb eine Oberflächensterilisationszeit von 120 Sekunden verwendet (n = 212, p (a - b) < 0,01; p (a - c, b - c) < 0,001; χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.2).

48 Ergebnisse

a

a

ab

b

b

b

c

c

Tage nach Behandlung

Abbildung 3.2: Pilzwachstum bis zu elf Tagen nach Behandlung als Ergebnis der Oberflächensterilisation von Milben mit 0,5% NaOCl-Lösung in Abhängigkeit von der Sterilisationszeit. Während bei

Sterilisationszeiten von bis zu 60 Sekunden Pilzwachstum in bis zu 40% der Fälle auftrat, sank der Wert

bei einer Sterilisationszeit von 120 Sekunden und mehr auf unter 5% (n = 212, p (a - b) < 0,01; p (a - c, b - c) < 0,001; χ2-Test, zweiseitig). 49 Ergebnisse

3.1.3 Einfluss der Konservierungsmethode der Milben auf das Pilzwachstum

Sofern Milben nicht sofort nach dem Sampling verarbeitet werden konnten, mussten sie in geeigneter Weise bis zur Aufarbeitung aufbewahrt werden. Zur Untersuchung der Frage, ob Trocknung oder Einfrieren in der Weiterkultur ein höheres relatives Pilzwachstum erwarten ließen, wurden Milbensamplings gepoolt, anschließend auf die beiden Versuchsgruppen verteilt und unter sonst einheitlichen Bedingungen kultiviert. Aus eingefrorenen Milben ließ sich ein gegenüber getrockneten Milben signifikant höheres relatives Pilzwachstum erzielen (n für die beiden Gruppen jeweils = 250; p < 0,001; ***; χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.3).

***

Abbildung 3.3: Pilzwachstum in Abhängigkeit von der Konservierungsart (luftgetrocknet/eingefroren)

gesammelter Milben; n für die beiden Gruppen jeweils = 250. Gefrorene Milben ermöglichten das Wachstum einer signifikant höheren Anzahl von Pilzen pro 100 Milben als luftgetrocknete Milben (p < 0,001; ***; χ2-Test, zweiseitig).

50 Ergebnisse

3.2 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Larven

Da applizierte Pilzsporen eines potentiellen Antagonisten von Varroa destructor mittelbar oder unmittelbar auch in offene Brutzellen gelangen, wurde untersucht, ob es einen spezifischen Effekt der zur Verfügung stehenden entomopathogenen Pilze auf Bienenbrut im Zeitraum vom L1-Stadium bis zum Schlupf gibt. Nach Applikation einer Individualdosis von 1 x 106 Konidien unmittelbar nach dem Schlupf der Larve aus dem Ei erfolgte eine Kultur in vitro mit 24-stündigem Monitoring der Larvenmortalität bis 21 Tage nach Versuchsbeginn. Die kumulierte Kurve jeder Gruppe zeigte einen asymptotischen Verlauf: Es kam zu einer hohen Mortalitätsrate in den ersten sechs Tagen nach Applikation, danach nahm die Rate bis zum Schlupf der adulten Biene stark ab. Lediglich in der Beauveria bassiana-Gruppe kam es zwischen Tag sieben und Tag neun erneut zu einem starken Anstieg – die Intergruppendifferenzen wichen aber zu keinem Zeitpunkt signifikant voneinander ab. Die kumulierte Mortalität überstieg am Versuchsende in keiner Gruppe einen Wert von 20 Prozent (N für jede Gruppe = 120; p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.4).

Kontrolle Beauveria bassiana Lecanicillium muscarium Metarhizium anisopliae Paecilomyces fumosoroseus

Tage nach Behandlung

Abbildung 3.4: Kumulierte prozentuale Mortalität mit Konidien unspezifischer entomopathogener Pilze beziehungsweise ausschließlich mit Erntelösung behandelter Larven. N für jede Gruppe = 120. Intergruppendifferenzen sind nicht signifikant; χ2-Test, zweiseitig.

51 Ergebnisse

3.3 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Adultbienen

Im Fokus der bisherigen Untersuchungen zum Einsatz von Antagonisten gegen Varroa destructor standen entomopathogene Pilze, die überwiegend aus anderen Arthropodenklassen isoliert wurden. Um verlässliche Aussagen zu deren Wirksamkeit in Bezug auf Apis mellifera treffen zu können, wurden die vier verwendeten Pilzstämme in vitro unter exakt definierten Bedingungen getestet: Pro Versuchsgruppe wurden je 50 Bienen nach Applikation einer single-bee-Dosis von 106 Konidien in Metallkäfigen im Wärmeschrank gehältert. Je Pilz wurden 60 Assays angesetzt. Pollenteig, 2M-Zuckerlösung und Wasser standen ad libitum zur Verfügung. Die Bienenmortalität wurde täglich erfasst. Die Kontrollgruppe wurde analog behandelt, zu Beginn des Versuchs aber lediglich mit einem äquivalenten Volumen Erntelösung ohne Konidien besprüht. Im Folgenden sind die Ergebnisse für die vier untersuchten Pilze aufgelöst nach Einzeltagen und kumulativ dargestellt.

3.3.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Bienen, die mit dem entomopathogenen Pilz Lecanicillium muscarium behandelt wurden, zeigten im Vergleich zur Kontrollgruppe am vierten und siebten Tag nach Applikation signifikant beziehungsweise höchstsignifikant erhöhte Mortalitätsraten (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p vier Tage nach Behandlung < 0,05; *; p sieben Tage nach Behandlung < 0,001; ***; t- Test, zweiseitig; Abb. 3.5). In der kumulierten prozentualen Mortalität unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium zeigte sich nach analogem Verlauf der Mortalitäten von Versuchsgruppe und Kontrollgruppe bis einschließlich des dritten Tages nach Behandlung eine zunehmende Diskrepanz ab dem dritten Tag nach Behandlung, in deren Folge die kumulierte Mortalität der Lecanicillium-Gruppe über derjenigen der Kontrollgruppe lag. Diese Differenz führte über die gesamte Versuchsdauer zu einer höchst signifikanten Differenz der kumulierten Raten (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

52 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium muscarium

kumulierte Bienenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium e muscarium

pp ru

g

n.s. *n.s. *** n.s.

Bienenmortalität/Versuchs

Tage nach Behandlung

Abbildung 3.5: Mortalität mit dem Pilz Lecanicillium muscarium behandelter Bienen je Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben) über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Am vierten und siebten

Tag nach Behandlung kam es zu einer signifikant erhöhten Bienensterblichkeit (p < 0,05; *; beziehungsweise p < 0,001; ***; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten höchst signifikant voneinander (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

53 Ergebnisse

3.3.2 Metarhizium anisopliae: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Metarhizium anisopliae kam es nach einer sehr geringen Mortalität an den ersten beiden Tagen zu einem leichten Anstieg des täglichen Totenfalls. Die Differenzen zwischen Kontrollgruppe und Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen waren aber zu keinem Zeitpunkt signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.6). Zwischen Kontrollgruppe und Versuchsgruppe traten unter dem Einfluss von Metarhizium anisopliae in der kumulierten prozentualen Mortalität über den gesamten Versuchsverlauf nur geringe Unterschiede auf. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

54 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Metarhizium anisopliae

kumulierte Bienenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Metarhizium

e anisopliae

pp

ru g

n.s.

Bienenmortalität/Versuchs

Tagedays nach post Behandlungtreatment

Abbildung 3.6: Mortalität mit dem Pilz Metarhizium anisopliae behandelter Bienen je Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag und kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Unterschiede in der

Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

55 Ergebnisse

3.3.3 Beauveria bassiana: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Unter dem Einfluss von Beauveria bassiana kam es nach einem sehr geringen Bienentotenfall an den ersten beiden Tagen nach Dosisapplikation zu einer Zunahme ab dem dritten Tag nach Behandlung. Signifikante Unterschiede zwischen den beiden Versuchsgruppen traten am vierten und sechsten Tag nach Applikation auf: An beiden Tagen kam es zu einem gegenüber der Kontrollgruppe erhöhten Bienentotenfall in der mit Beauveria bassiana behandelten Gruppe (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p für Tag vier und Tag sechs nach Behandlung < 0,05; *; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.7). Der erhöhte Bienentotenfall in der mit dem entomopathogenen Pilz Beauveria bassiana behandelten Gruppe an den Tagen vier und sechs spiegelt sich in einer deutlichen Divergenz der kumulierten prozentualen Mortalitäten an diesen Tagen wieder. Infolgedessen lag die Gesamtmortalität der Pilzgruppe zum Versuchsende zehn Tage nach Applikation höchst signifikant über derjenigen der Kontrollgruppe (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

56 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Beauveria bassiana

kumulierte Bienenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Beauveria bassiana

n.s. * n.s. * n.s.

Bienenmortalität/Versuchsgruppe

Tagedays nach post Behandlungtreatment

Abbildung 3.7: Mortalität mit dem Pilz Beauveria bassiana behandelter Bienen je Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben) über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Am vierten und sechsten Tag nach Behandlung kam es zu einer signifikant erhöhten Bienensterblichkeit (p < 0,05; *; t-

Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten höchst signifikant voneinander (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

57 Ergebnisse

3.3.4 Paecilomyces fumosoroseus: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Paecilomyces fumosoroseus kam es nach einer sehr geringen Mortalität an den ersten beiden Tagen zu einer leichten Zunahme des täglichen Totenfalls bis Tag sieben nach Behandlung; danach sank die Mortalitätsrate wieder leicht. Die Differenzen zwischen Kontrollgruppe und der mit Paecilomyces fumosoroseus behandelten Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen waren zu keinem Zeitpunkt signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.8). Ab Tag drei nach Applikation von Konidiendosis beziehungsweise Kontrolllösung kam es zu einer leichten Divergenz der kumulierten Mortalitäten zwischen Paecilomyces fumosoroseus- und Kontrollgruppe; nach zehn Tagen wichen die kumulierten Mortalitäten höchst signifikant voneinander ab (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

58 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Paecilomyces fumosoroseus

kumulierte Bienenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Paecilomyces fumosoroseus

n.s.

Bienenmortalität/Versuchsgruppe

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.8: Mortalität mit dem Pilz Paecilomyces fumosoroseus behandelter Bienen je

Versuchsgruppe (50 Bienen, unten) und Tag sowie kumulierte prozentuale (oben) Mortalität über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 50 Bienen. Unterschiede in der Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten höchst signifikant voneinander (p < 0,001; χ2-Test, zweiseitig).

59 Ergebnisse

3.4 Mortalität mit Pilzkonidien behandelter Milben

Ebenfalls im in vitro-Assay wurde untersucht, ob die applizierten single-bee- Dosen Auswirkungen auf die Überlebensrate adulter Weibchen von Varroa destructor in der phoretischen Phase haben: Pro Versuchsgruppe wurden je 50 Bienen aus Völkern, die unmittelbar zuvor eine Behandlung mit Varroaziden durchlaufen hatten, aber rückstandsfrei waren, mit genau 25 Milben besetzt, die direkt vor Versuchsbeginn aus hochbefallenen Völkern gewonnen wurden. Nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Kontrolllösung wurde die Milbenmortalität täglich erfasst. Im Folgenden sind die Ergebnisse für die vier untersuchten Pilze aufgelöst nach Einzeltagen und kumulativ dargestellt.

3.4.1 Lecanicillium muscarium: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Nach Applikation der Versuchsdosis des Pilzes Lecanicillium muscarium stieg die Mortalitätsrate zunächst an und erreichte Maxima an den Tagen drei und fünf nach Behandlung mit einem Milbenfall von etwa vier Milben pro Assay und Tag. Differenzen zwischen Kontrollgruppe und der mit Lecanicillium muscarium behandelten Versuchsgruppe an den einzelnen Tagen waren zu keinem Zeitpunkt signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.9). Zwischen Kontrollgruppe und Versuchsgruppe traten unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium in der kumulierten prozentualen Mortalität über den gesamten Versuchsverlauf nur geringe Unterschiede an den Tagen drei und sechs/sieben auf. Der Intergruppenvergleich zeigt zum Versuchsende keine signifikanten Differenzen (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

60 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium muscarium

kumulierte Milbenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium muscarium

n.s.

Milbenmortalität/Versuchsgruppe

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.9: Mortalität mit dem Pilz Lecanicillium muscarium behandelter Milben je Versuchsgruppe und Tag (25 Milben, unten) sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 25 Milben. Unterschiede in der Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

61 Ergebnisse

3.4.2 Metarhizium anisopliae: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Die Mortalitätsrate unter dem Einfluss von Metarhizium anisopliae erreichte ihre Maxima an den Tagen drei, fünf und sechs, bevor sie bis zum Ende der Untersuchung zehn Tage nach Applikation kontinuierlich sank. Deutliche Differenzen zwischen Kontrollgruppe und Pilzgruppe traten nicht auf; die Abweichungen der Verteilungen an den Einzeltagen waren zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraums signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.10). Zu keinem Zeitpunkt des Versuchs hatte der entomopathogene Pilz Metarhizium anisopliae einen Einfluss auf die Mortalitätsrate der Pilzgruppe, der sich in einer deutlichen Divergenz der kumulierten Mortalitäten widerspiegelte – zum Versuchsende traten keine signifikanten Differenzen auf (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

62 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Metarhizium anisopliae

kumulierte Milbenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Metarhizium

e anisopliae

pp

ru g n.s.

Milbenmortalität/Versuchs

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.10: Mortalität mit dem Pilz Metarhizium anisopliae behandelter Milben je

Versuchsgruppe und Tag (25 Milben, unten) sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben) über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 25 Milben. Unterschiede in der Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen 2 differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ -Test, zweiseitig).

63 Ergebnisse

3.4.3 Beauveria bassiana: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Im Beauveria bassiana-Versuch stieg die Mortalitätsrate innerhalb der ersten drei Versuchstage zunächst an, um dann wieder in etwa auf das Ausgangsniveau abzusinken. An den Tagen fünf und sechs lag die Mortalitätsrate der Pilzgruppe über der der Kontrollgruppe, an den Tagen sieben und zehn wies die Kontrollgruppe eine erhöhte Mortalitätsrate auf – allerdings waren die Abweichungen der Verteilungen an den Einzeltagen zu keinem Zeitpunkt des untersuchten Zeitraums signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.11). Die voneinander abweichenden Verteilungen – auf nicht signifikantem Niveau – der Mortalitätsraten von Pilz- und Kontrollgruppe in der Betrachtung der Einzeltage des Beauveria bassiana-Versuchs führen zu einem divergierenden Kurvenverlauf bei Auftragung der kumulierten Mortalitätsraten. Diese wichen aber nach zehn Tagen nicht signifikant voneinander ab (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

64 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Beauveria bassiana

kumulierte Milbenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Beauveria bassiana e

pp

ru g n.s.

Milbenmortalität/Versuchs

Tagedays nach post Behandlungtreatment

Abbildung 3.11: Mortalität mit dem Pilz Beauveria bassiana behandelter Milben je Versuchsgruppe und Tag (25 Milben, unten) sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben) über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 25 Milben. Unterschiede in der Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen 2 differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ -Test, zweiseitig).

65 Ergebnisse

3.4.4 Paecilomyces fumosoroseus: Mortalität/Versuchsgruppe und kumulierte Mortalität

Zwischen Tag zwei und fünf lag die Mortalitätsrate im Paecilomyces fumosoroseus-Versuch in beiden Gruppen bei etwa zwei Milben pro Tag; Abweichungen der Verteilungen voneinander traten auf, waren aber zu keinem Zeitpunkt des Versuchs signifikant (N pro Versuchsgruppe = 50 Bienen und 25 Milben; N gesamt = 60 Assays; p > 0,05; t-Test, zweiseitig; Abb. 3.12). Bis Tag sieben nach Behandlung kam es in der Untersuchung des entomopathogenen Pilzes Paecilomyces fumosoroseus zu einem weitestgehend ähnlichen Verlauf der kumulierten Mortalitäten. In der Folge divergierten die Kurven zwar, so dass in der Summe zum Versuchsende die Mortalität der Pilzgruppe über derjenigen der Kontrollgruppe lag, diese Differenz war allerdings nicht signifikant (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

66 Ergebnisse

Versuchsgruppe Kontrolle Paecilomyces fumosoroseus

kumulierte Milbenmortalität

Versuchsgruppe Kontrolle Paecilomyces fumosoroseus

n.s.

Milbenmortalität/Versuchsgruppe

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.12: Mortalität mit dem Pilz Paecilomyces fumosoroseus behandelter Milben je Versuchsgruppe und Tag (25 Milben, unten) sowie kumulierte prozentuale Mortalität (oben)

über zehn Tage nach Versuchsbeginn. N = 60 Assays a 25 Milben. Unterschiede in der

Mortalität pro Tag sind nicht signifikant (p > 0,05; t-Test, zweiseitig). Nach zehn Tagen differieren die Gesamtmortalitäten nicht signifikant voneinander (p > 0,05; χ2-Test, zweiseitig).

67 Ergebnisse

3.5 Pilzwachstum aus behandelten Milben

Um einen signifikanten Einfluss entomopathogener Pilze auf die Mortalität von Varroa destructor im Laborassay verifizieren zu können, wurde untersucht, welche Pilzwachstumsrate (Anteil Milben, aus denen ein Pilz wuchs) sich aus den im Milben- in vitro-Versuch gestorbenen Milben erzielen ließ: Die in diesem Versuch gestorbenen Milben wurden täglich abgesammelt, gepoolt und ein Aliquant kultiviert. Im anschließenden Monitoring bis Tag 13 nach Behandlung wurde das tägliche Pilzwachstum aus Einzelmilben erfasst; Einzelmilben, die Pilzwachstum zeigten, wurden zur Verhinderung von Kreuzinfektionen steril entfernt. Im Folgenden sind die Ergebnisse von Pilz- und Kontrollgruppe für den jeweiligen untersuchten Pilz einander gegenübergestellt. Auf der Ordinate aufgetragen ist das kumulierte, prozentuale Pilzwachstum in Prozent an den jeweiligen Tagen nach Behandlungsbeginn, auf der Abszisse sind die Tage des Samplings der Milben aufgetragen. Unterschiedliche Kreisgrößen geben das prozentuale Wachstum in Prozent in sechs Kategorien wieder (0 - 5, 5 - 10, 10 - 15, 15 - 20, 20 - 25). Der verstrichene Zeitraum bis zu einer Zunahme im Wachstum der jeweiligen Einzelgruppe ergibt sich aus der Differenz von Ordinaten- und Abszissenbetrag.

3.5.1 Lecanicillium muscarium

In der Kultur der während der Versuchsdauer des Lecanicillium muscarium- Versuchs gesammelten Milben setzte ein detektierbares Pilzwachstum in den jeweiligen Tagesgruppen etwa vier bis fünf Tage nach dem Tod der Milben ein. Erhöhte Wachstumsraten traten in der Kontrolle bei den an den Tagen fünf, sieben und acht nach Versuchsbeginn gestorbenen Milben auf, in der Pilzgruppe an Tag acht. Der Intergruppenvergleich dieser Tage zeigte aber keine signifikanten Differenzen (N Kontrolle = 128, N Lecanicillium muscarium = 146; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.13).

68 Ergebnisse

g

days post treatment e nach Behandlun nach e

g Ta

Milbenfall Milbenfall Tage days nach post Behandlungtreatment MilbenfallMilbenfall Tage days nach post treatmentBehandlung KontrolleKontrolle LecanicilliumLecanicillium muscarium muscarium

Abbildung 3.13: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des

Lecanicillium muscarium-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 128, N Lecanicillium muscarium = 146; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).

3.5.2 Metarhizium anisopliae

Die Pilzgruppe der Kultur der während der Versuchsdauer des Metarhizium anisopliae-Versuchs gesammelten Milben zeigte ein verstärktes Pilzwachstum bei Milben, die am Tag der Behandlung sowie an den Tagen zwei und drei nach Behandlung starben – das Wachstum setzte jeweils etwa vier Tage nach Milbenfall ein. In der Kontrolle kam es in der Kohorte, die vier Tage nach Behandlung fiel, ebenfalls vier Tage nach dem Milbenfall zu einem detektierbaren Wachstum. Der Intergruppenvergleich über alle Tage zeigte aber keine signifikanten Differenzen (N Kontrolle = 182, N Metarhizium anisopliae = 185; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.14).

69 Ergebnisse

g

days post treatment e nach Behandlun nach e

g

Ta

Milbenfall Milbenfall Tage days nach post Behandlungtreatment MilbenfallMilbenfall Tage days nach post treatmentBehandlung KontrolleKontrolle MetarhiziumMetarhizium anisopliae

Abbildung 3.14: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Metarhizium

anisopliae -Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 182, N Metarhizium anisopliae = 185; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).

3.5.3 Beauveria bassiana

Ein deutlich verstärktes Pilzwachstum trat in der Kultur der während der Versuchsdauer des Beauveria bassiana-Versuchs gesammelten Milben in beiden Gruppen bei den direkt nach Behandlung gestorbenen Milben sowie in der Tag- sieben-Kohorte der Beauveria bassiana-Gruppe auf. Es setzte zwei Tage nach dem Fall der Milben der Tag-sieben-Kohorte und vier Tage nach Fall in der Tag-eins- Kohorte ein. Während der Intergruppenvergleich aller anderen Tage keine signifikanten Differenzen zeigte, kam es in der Tag-sieben-Kohorte in der Pilzgruppe zu einem signifikant erhöhten Wachstum (N Kontrolle = 192, N Beauveria bassiana = 194; p für Tag sieben nach Behandlung < 0,05, p für alle anderen Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.15).

70 Ergebnisse

*

g

days post treatment e nach Behandlun nach e g

Ta

MilbenfallMilbenfall Tage days nach post treatmentBehandlung MilbenfallMilbenfall Tage days nach post treatment Behandlung KontrolleKontrolle BeauveriaBeauveria bassiana bassiana

Abbildung 3.15: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Beauveria bassiana -Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt für Tag sieben nach Behandlung eine signifikante Differenz zwischen den Gruppen (N Kontrolle = 192, N Beauveria bassiana = 194; p für Tag sieben nach Behandlung < 0,05, p für alle anderen Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).

3.5.4 Paecilomyces fumosoroseus

In der Kultur der während der Versuchsdauer des Paecilomyces fumosoroseus- Versuchs gesammelten Milben setzte ein Pilzwachstum in den jeweiligen Tagesgruppen etwa vier bis fünf Tage nach dem Tod der Milben ein. Erhöhte Wachstumsraten traten in der Kontrolle bei den an Tag zwei, in der Pilzgruppe bei den an den Tagen eins und zwei gestorbenen Milben auf. Die Differenzen zwischen den jeweiligen Versuchsgruppenkohorten waren nicht signifikant (N Kontrolle = 171, N Paecilomyces fumosoroseus = 182; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig; Abb. 3.16).

71 Ergebnisse

g

days post treatment

e nach Behandlun nach e g Ta

MilbenfallMilbenfall Tage days nach post Behandlungtreatment MilbenfallMilbenfall Tage days nach post treatmentBehandlung KontrolleKontrolle PaecilomycesPaecilomyces fumosoroseus

Abbildung 3.16: Kumuliertes prozentuales Pilzwachstum aus Milben, die während des Paecilomyces

fumosoroseus-Versuchs starben. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen zwischen den Einzeltagen (N Kontrolle = 171, N Paecilomyces fumosoroseus = 182; p für alle Vergleiche > 0,05, Fishers Exact Test, zweiseitig).

3.6 Wirkung entomopathogener Pilze auf Adultbienen, Bienenlarven und -puppen sowie Varroa destructor im Halbfreilandversuch

Insbesondere bei staatenbildenden Insekten sind in vitro-Versuche hoch artifiziell – eine Übertragbarkeit ihrer Schlussfolgerungen auf die Verhältnisse, wie sie unter Freilandbedingungen innerhalb eines Staates vorkommen, ist deshalb nicht ohne Weiteres möglich. Im Halbfreilandversuch wurde deshalb ergänzend zu den Laborversuchen exemplarisch die Wirkung eines entomopathogenen Pilzes – Lecanicillium muscarium – auf die Zahl adulter Bienen, Larvenstadien und Puppen sowie die Abundanz von Varroa destructor analysiert. Der Versuch wurde an zehn in Bezug auf Verwandtschaftsgrad und Alterstruktur der Einzelbienen sowie ihren Befall mit Varroa destructor vereinheitlichten, je etwa 5500 Individuen starken Völkern vorgenommen. Der Milbenfall wurde täglich, Bienenzahl und Zahl der Brutstadien wurden zu Beginn und nach sieben, 14 und 17 Tagen erfasst.

72 Ergebnisse

3.6.1 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Bienen pro Volk

Während des gesamten Versuchszeitraumes kam es zu einer kontinuierlichen Abnahme der Bienenzahl von zunächst etwa 5500 Bienen pro Volk auf etwa 1000 Bienen pro Volk zum Versuchsende. Die Bienenzahl der Völker der Pilz- und der Kontrollgruppe wichen dabei nicht signifikant voneinander ab (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.17).

Versuchsgruppe Kontrolle n.s. n.s. n.s. n.s. Lecanicillium muscarium

Anzahl Bienen/Volk

Tagedays nach post Behandlungtreatment

Abbildung 3.17: Veränderung der Bienenzahl pro Volk der Pilz- und der Kontrollgruppe nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den Versuchszeitraum von 17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen an den Einzeltagen (N

Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

73 Ergebnisse

3.6.2 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Larven pro Volk

Die Völker verfügten sieben Tage nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über ein maximal etwa 1500 Zellen umfassendes Brutnest, das in der Folge auf etwa 300 Zellen pro Volk schwand. Differenzen in der Zahl der Brutzellen zwischen den beiden untersuchten Gruppen waren nicht signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.18).

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium muscarium n.s. n.s. n.s. n.s.

(L1 – L5)/Volk Larven

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.18: Veränderung der Zahl der Brutzellen (L1 - L5-Stadium) pro Volk der Pilz- und der Kontrollgruppe nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den Versuchszeitraum von 17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen an

den Einzeltagen (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05,

t-Test, zweiseitig).

74 Ergebnisse

3.6.3 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Anzahl der Puppen pro Volk

14 Tage nach Versuchsbeginn wurden in den Völkern je etwa 350 verdeckelte Brutzellen registriert; diese Zahl stieg zum Versuchsende nur noch leicht. Es kam nicht zu einer signifikanten Differenz der Zahl verdeckelter Zellen zwischen Pilz- und Kontrollgruppe (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.19).

Versuchsgruppe

n.s. n.s. n.s. n.s. Kontrolle Lecanicillium muscarium

Puppen/Volk Anzahl

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abbildung 3.19: Veränderung der Anzahl verdeckelter Brutzellen pro Volk der Pilz- und der Kontrollgruppe nach Applikation von Konidiensuspension beziehungsweise Erntelösung über den

Versuchszeitraum von 17 Tagen. Der Intergruppenvergleich zeigt keine signifikanten Differenzen

an den Einzeltagen (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

75 Ergebnisse

3.6.4 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenfall pro Tag und Volk

Um Aussagen zu einem eventuellen Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die in den Völkern befindlichen Milben treffen zu können, wurde der Milbenfall täglich erfasst. Dazu wurde unter das Gitter des Bodens eine passgenaue, mit Pflanzenöl gefüllte Wanne geschoben, das eine Migration gefallener, aber noch lebender Milben ebenso wie das Absammeln der Milben durch fouragierende Ameisen oder ein Verwehen durch Wind verhinderte. Die gestorbenen Milben wurden täglich erfasst und anschließend entfernt. Zu Versuchsbeginn lag die Rate bei etwa 18 Milben pro Tag und Volk, fiel dann an Tag zwei auf etwa 10 Milben, um anschließend wieder auf den Ausgangswert zu steigen. Nach sieben Tagen sank der tägliche Milbenfall kontinuierlich in beiden Gruppen auf unter 10 Milben pro Tag und Volk. Zwischen den Gruppen auftretende Differenzen waren an den jeweiligen Tagen nicht signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe = je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.20).

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium n.s. muscarium

Milbenfall/TagxVolk Milbenfall/TagxVolk

Tagedays nach post Behandlung treatment Abb. 3.20: Täglicher Milbenfall pro Volk über den gesamten Versuchszeitraum. Intergruppendifferenzen an den jeweiligen Einzeltagen waren nicht signifikant (N Kontrolle/Pilzgruppe

= je fünf Völker à 5500 Bienen; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

76 Ergebnisse

3.6.5 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenendbefall adulter Bienen

Zur Ergänzung des Milbenfallmonitorings wurde zum Versuchsende der Milbenbefall adulter Bienen erfasst: Alle Bienen, die sich 17 Tage nach Applikation von Pilzsuspension und Kontrolllösung noch in den Völkern befanden, wurden gesammelt, getötet und durch Waschen mit einer detergenshaltigen Waschlösung von den aufsitzenden Milben befreit. Die abgelösten Milben wurden anschließen in geeigneten Sieben aufgefangen und ebenso wie die Bienen einzeln gezählt. Der Endbefall der adulten Bienen lag bei etwa 12 Prozent – signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium = 3812, N Kontrolle = 3125; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.21).

n.s.

Endbefall Bienen

Lecanicillium muscarium Kontrolle

Abb. 3.21: Endbefall der adulten Bienen (prozentual) zum Versuchsende. Signifikante Unterschiede zwischen Pilz- und Kontrollgruppe traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium = 3812, N Kontrolle = 3125; p für alle Vergleiche >

0,05, t-Test, zweiseitig).

77 Ergebnisse

3.6.6 Einfluss von Lecanicillium muscarium auf den Milbenendbefall verdeckelter Brut

Ebenfalls durch Auswaschen und Einzelauszählung wurde der Milbenendbefall der verdeckelten Brut ermittelt: Zunächst wurden die verdeckelten Brutzellen gezählt, nach Einfrieren entdeckelt und die in ihnen befindlichen Milben und Puppen mit einem scharfen Wasserstrahl ausgespült. Sowohl in der Pilz- als auch in der Kontrollgruppe waren etwa 20 Prozent der Zellen befallen – signifikante Unterschiede zwischen beiden Gruppen traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium = 1802, N Kontrolle = 2127; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.22).

n.s.

Endbefall Bienen

Lecanicillium muscarium Kontrolle

Abb. 3.22: Endbefall der verdeckelten Brut (prozentual) zum Versuchsende.

Signifikante Unterschiede zwischen Pilz- und Kontrollgruppe traten nicht auf (N Lecanicillium muscarium = 1802, N Kontrolle = 2127; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

78 Ergebnisse

3.7 Subletale Effekte entomopathogener Pilze auf Adultbienen

Die in vitro-Versuche konnten erfassen, ob es zu einer erhöhten Mortalitätsrate kam oder nicht – sie lieferten aber keine Erklärung, warum es zu einer solchen Erhöhung kam und ob es eventuell weitere, subletale Effekte gab, die für eine potentielle Anwendung von Bedeutung sind. Um Hinweise zu erhalten, ob entomopathogene Pilze subletale Auswirkungen auf Honigbienen haben könnten, wurden mit Pilzsporen beziehungsweise nur mit einer Kontrolllösung behandelte Gruppen in Bezug auf ihre Futteraufnahme pro Zeiteinheit als mögliches Indiz zum Beispiel einer Schädigung des Darmkanals, sowie in Bezug auf ihr Lernvermögen als mögliches Indiz für eine Beeinträchtigung wichtiger sozialer und räumlicher Orientierungskomponenten untersucht. Im Folgenden werden die jeweiligen Ansätze kurz erläutert, bevor die Ergebnisse beschrieben werden.

3.7.1 Ernährungszustand im Langzeit-in-vitro-Assay

In klassischen PER-Dressuren werden die Bienen den Völkern wenige Stunden vor Versuchsbeginn entnommen – naturgemäß ist das in einem Versuch, der über einen Zeitraum von 12 Tagen potentielle subletale Langzeiteffekte einer Behandlung mit entomopathogenen Pilzen aufdecken soll, nicht möglich. Das sich daraus ergebende Problem besteht in einem im Vergleich zur dem Volk direkt entnommenen Biene a priori nicht kalkulierbaren Sättigungszustand der in vitro ad libitum mit Futter versorgten Bienen, da Langzeit-PER-Versuche mit gekäfigten Bienen nie zuvor etabliert worden sind. Das Hungern der Einzelbiene ist aber Voraussetzung für ein Gelingen des Versuchs. In Vorserien hatte sich gezeigt, dass es starke Schwankungen bezüglich der nötigen Dauer der Hungerphase gab: Beobachtet wurden Hungerphasen von mehr als 12 Stunden, die nötig waren, um Bienen zur Versuchsteilnahme zu bewegen, aber auch eine Mortalitätsrate von über 50 Prozent nach einer Hungerphase von nur einer halben Stunde. Zunächst wurde deshalb untersucht, ob über den Versuchszeitraum Veränderungen im Honigblasengewicht und damit im Ernährungszustand auftraten, die eine Kalkulation der nötigen Dauer

79 Ergebnisse des Futterentzugs ermöglichten. Dazu wurden Bienen, denen Futter ad libitum zur Verfügung stand, getötet, die Honigblasen präparativ entnommen und gewogen. Der zeitliche Verlauf der in Kategorien zusammengefassten Ergebnisse zeigt eine deutliche Abnahme des Honigblasengewichts mit Futter ad libitum versorgter Bienen von etwa 10 mg auf deutlich unter 5 mg – diese Abnahme korrelierte mit einer beobachten Zunahme des Kotblasenvolumens mit zunehmender Versuchsdauer und der Beobachtung, dass es während der gesamten Versuchsdauer nicht zum Absetzen von Kot in den Hälterungskäfigen kam. Die Differenz zwischen erster und dritter Kategorie war hochsignifikant (p < 0,001), die Differenzen zwischen erster und zweiter beziehungsweise zweiter und dritter Kategorie waren nicht signifikant, aber dicht an der Signifikanzgrenze (p > 0,05, N je Kategorie = 18, ONEWAY ANOVA; Abb. 3.23).

a ab b

mg in Honigblasengewicht

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abb. 3.23: Veränderung des Honigblasengewichts im Untersuchungszeitraum. Einteilung in Kategorien von vier beziehungsweise fünf Tagen. Über den

Gesamtzeitraum nahm das Honigblasengewicht höchst signifikant auf unter 5 mg ab (N je Kategorie = 18, p Kategorie 1 - 3 < 0,001, p Kategorie 1 - 2, 2 - 3 > 0,05, ONEWAY ANOVA).

3.7.2 Nahrungsaufnahme im Langzeit-in-vitro-Assay

Um Aussagen zu der Frage gewinnen zu können, ob die Applikation von Konidien eines entomopathogenen Pilzes in vitro einen Einfluss auf die täglich von 80 Ergebnisse

Bienen verbrauchte Futtermenge hat, und um Richtwerte für ein zielgenaues Timing des Futterentzugs vor Beginn der PER-Dressur in Abhängigkeit vom zu erwartenden Ernährungszustand zu erhalten, wurden die Futterverbräuche von Pilz- und Kontrollgruppe an den Einzeltagen erfasst und miteinander verglichen. Futter stand den Bienen ad libitum in Laborspritzen zur Verfügung, der Verbrauch wurde über stundengenaue Entnahme und Wiegen der Spritzen vor dem Wiederauffüllen ermittelt. Der Futterverbrauch pro Stunde und Biene lag über den gesamten Versuchszeitraum bei etwa 0,002 ml. Zwischen Pilz- und Kontrollgruppe und zwischen den Einzeltagen traten keine signifikanten Differenzen auf (N = 251; p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig; Abb. 3.24).

Versuchsgruppe Kontrolle Lecanicillium n.s. muscarium

Verbrauch ml/hxBiene

Tagedays nach post Behandlung treatment

Abb. 3.24: Futterverbrauch von Pilz- und Kontrollgruppe in ml pro Biene und Stunde an den jeweiligen Einzeltagen. Zwischen den Gruppen und im Intertagesvergleich traten keine signifikanten Differenzen auf (N = 251, p für alle Vergleiche > 0,05, t-Test, zweiseitig).

81 Ergebnisse

3.7.3 Lernleistung von Adultbienen im PER-Assay

Zur Analyse potentieller Effekte eines entomopathogenen Pilzes auf das Lernvermögen von Honigbienen wurde ein Langzeit-PER-Assay verwendet. Das Lernen von Honigbienen im PER-Assay folgt dabei den Regeln von klassischer und instrumenteller Konditionierung. Die Versuchsbienen wurden mit einem Duft als unkonditioniertem Reiz konfrontiert, dem ein Kontaktieren von 2M Zuckerlösung mit den Antennen und anschließendes Trinkenlassen folgte. Während der Konditionierungsphase wurde dann der ursprünglich neutrale Duftreiz mit dem unbedingten Reiz assoziiert, so dass bei erfolgreichem Lernen auf die Duftgabe ein Herausstrecken des Rüssels folgte. Über die insgesamt vier Lernakte des Tests kam es zu einer linearen Zunahme der positiven Antworten (in Prozent der Gesamtantworten) von null im ersten Lernakt auf etwa 50 Prozent im vierten Lernakt beider Gruppen. Die Ergebnisse der Einzelakte differierten signifikant bis höchst signifikant voneinander, während zwischen den Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede auftraten. (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p für alle Vergleiche innerhalb eines Lernaktes > 0,05, p b - c < 0.05, p c - d < 0,01, p b - d < 0,001, p a - (b/c/d) < 0,001, χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.25).

82 Ergebnisse

Versuchsgruppe d Kontrolle Lecanicillium d muscarium

c

c

b b

positive Antworten in Prozent Prozent in Antworten positive

a a

Lernakt Lernakt Abb. 3.25: Lernerfolg aller am Test beteiligten Bienen der Pilz- und Kontrollgruppen über vier

Lernakte. Unterschiede zwischen den Lernakten waren signifikant bis höchstsignifikant (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p b - c < 0.05, p c - d < 0,01, p b - d < 0,001, p a - (b/c/d) < 0,001), zwischen Pilz- und Kontrollgruppe traten innerhalb eines Lernaktes keine signifikanten Unterschiede auf (p > 0,05, χ 2-Test, zweiseitig).

83 Ergebnisse

3.7.4 Diskriminationsfähigkeit von Adultbienen im Langzeit-PER-Assay

In der Langzeit-PER-Dressur erfolgte die Untersuchung eines möglichen Einflusses von Lecanicillium muscarium auf das Lernvermögen adulter Honigbienen über insgesamt 20 Tests je Einzelbiene: Je achtmal wurde die Reaktion auf den konditionierten Reiz (Geraniol) im Wechsel mit einem Vergleichsduft (Citral), unterbrochen von zwei Kontrolldurchgängen nach den Durchgängen zwei und fünf, in denen eine potentielle Reaktion auf zugeströmte Luft ohne Test- oder Vergleichssubstanz getestet wurde, analysiert. Verglichen wurden Bienen der Pilz- und der Kontrollgruppe, getestet wurde über einen Zeitraum von 12 Tagen in drei Wiederholungen. Bienen, die keine Reaktionen mehr zeigten oder auf Luft reagierten, wurden ausgeschlossen. Im Folgenden sind – als Maßstab der Diskriminationsfähigkeit – die prozentualen Antwortdifferenzen von Pilz- und Kontrollgruppe einander gegenübergestellt. Unter prozentualer Antwortdifferenz wird die Differenz zwischen gegebenen positiven Antworten auf die Testsubstanz in Prozent und gegebenen positiven Antworten auf die Vergleichssubstanz in Prozent verstanden. Die Antwortdifferenzen schwankten in der Pilzgruppe zwischen 16,7 Prozent und 37,5 Prozent, in der Kontrollgruppe zwischen 25,0 Prozent und 39,2 Prozent. Von einem Versuchsintervall abgesehen (Tage acht und neun nach Applikation von Lecanicillium muscarium beziehungsweise Kontrolllösung) lag die Antwortdifferenz der Kontrollgruppe immer über derjenigen der Pilzgruppe. In den Intervallen vier, sechs, acht, zehn und zwölf waren die Intergruppendifferenzen nicht signifikant voneinander verschieden (p > 0,05, χ2-Test, zweiseitig), im Intervall eins allerdings kam es zu einem hoch signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen, i.e., unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium lernten Honigbienen in der PER- Dressur signifikant schlechter, zwischen Test- und Vergleichssubstanz zu unterscheiden (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p Intervalle 4 - 12 > 0,05, p Intervall 2 < 0,01, χ2-Test, zweiseitig; Abb. 3.26).

84 Ergebnisse

Kontrolle Lecanicillium muscarium

n.s.

n.s.

n.s.

n.s. days post treatment

Behandlung nach Tage n.s.

**

Antwortdifferenz Testsubstanz -Vergleichssubstanz

Abb. 3.26: Prozentuale Antwortdifferenz innerhalb der Kontroll- und Pilzgruppe über einen Zeitraum von 12 Tagen in Zweitagesintervallen. Die Differenz lag in der Kontrollgruppe mit Ausnahme des vierten Intervalls stets über der der Pilzgruppe, die Intergruppendifferenzen der

Intervalle zwei, drei, vier, fünf und sechs wichen aber nicht signifikant voneinander ab (p > 2 0,05, χ -Test, zweiseitig). Im ersten Intervall kam es dagegen zu einer hochsignifikanten Intergruppendifferenz: Unter dem Einfluss von Lecanicillium muscarium lernten die Bienen deutlich schlechter (N Kontrolle = 107, N Pilz = 110; p < 0,01, **, χ2-Test, zweiseitig).

85 Ergebnisse

3.7.5 Einfluss entomopathogener Pilze auf das Immunsystem von Adultbienen

Für entomopathogene Pilze kann angenommen werden, dass sie unter Umständen auch Nichtzielorganismen in einer Weise schädigen, die über den Nachweis der Induktion einer Immunantwort belegbar ist. Eine solche Immunantwort wiederum könnte zum Beispiel mit einem reduzierten Kognitionsvermögen korrelieren. Um Hinweise auf diesen denkbaren Zusammenhang zu erhalten, wurden immunisierte beziehungsweise Kontrollbienen einem sensitiven Immunassay unterzogen, der Aufschlüsse über eine potentielle Immunantwort geben konnte. Der Nachweis einer Aktivierung der IMD- oder Toll-Kaskade erfolgt dabei über eine Suppression des Wachstums mit Hämolymphe behandelter Bienen inkubierter Bakterien (Müller et al. 2008). Es wurden Versuchsgruppen gebildet, die entweder mit Konidien von Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, beziehungsweise als Kontrolle mit Sporen von Saccharomyces cerevisiae oder konidienfreier Erntelösung besprüht wurden. Den Bienen einer weiteren Gruppe wurde zu Versuchsbeginn jeweils ein Bein amputiert, um eine obligate Immunantwort zu initiieren. 24 Stunden später wurde den Bienen nach Betäubung Hämolymphe entnommen, die mit je einer Grampositiven und einer Gramnegativen Bakterienkultur in der log-Phase in einer Verdünnungsreihe über sieben Potenzen inkubiert und dann auf Nährmedium ausplattiert wurde. Nach weiteren 24 Stunden wurde die Zahl kolonieformender Einheiten (colony forming units, cfu) als Maßstab für eine eventuell induzierte Immunantwort erfasst. Die Ergebnisse der Gruppe amputierter Bienen und der Bakterienkulturen, die – ohne Hämolymphzusatz – nur mit einer Aprotinin-Phenylthioharnstoff-Lösung beziehungsweise Streptomycinlösung versetzt wurden, validierten die Methodik der Untersuchung. Im vergleichenden Versuch mit dem Grampositiven Bakterium Bacillus subtilis zeigte sich eine gegenüber Saccharomyces cerevisiae und der Erntelösung um nahezu 90 Prozent verringerte Zahl kolonieformender Einheiten im Lecanicillium muscarium-, Metarhizium anisopliae-, und Beauveria bassiana-Ansatz. Im Paecilomyces fumosoroseus-Ansatz kam es zu keiner Reduktion (Abb. 3.27).

86 Ergebnisse

Die Untersuchung mit dem Gramnegativen Bakterium Escherichia coli B (DSM 613) bestätigte zunächst im „Amputations-“, Aprotinin/Phenylthioharnstoff-, Streptomycin- und Negativkontrollansatz die Ergebnisse des Bacillus subtilis- Versuchs. Gegenüber Saccharomyces cerevisiae war die Zahl kolonieformender Einheiten um 90 (Beauveria bassiana, Lecanicillium muscarium) bis 97 Prozent (Metarhizium anisopliae) reduziert, in der Paecilomyces fumosoroseus-Gruppe kam es zu einer Minderung von 78 Prozent (Abb. 3.28).

200 180

160 140 120 100 80 60 cfu*10^-8/ml 40 20 0

f e f in lle lia c o iana eus p s s visiae utiert nsto s o p r omy a scarium t b u ere am vkontr anis c ioha i ria m h e m lt Strep gat v fumosoro e u iziu lium N a h l ici omyces heny Be n r P ca + omyces Metar e il L Saccha Paec protinin A

Abb. 3.27: Anzahl der in einer mit Hämolymphe inkubierten Kultur von Bacillus subtilis gebildeten kolonieformenden Einheiten (cfu) in Abhängigkeit von der Behandlung der

Bienen. Bei „Aprotinin + Phenylthioharnstoff“ und „Streptomycin“ handelt es sich um

Kontrollen, die nicht Bestandteil einer differenzierenden Behandlung waren. Im Vergleich zur Saccharomyces cerevisiae-Gruppe trat eine deutliche cfu-Reduktion bei Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae und Beauveria bassiana auf.

87 Ergebnisse

200 180 160 140 120 100

cfu*10^-8/ml 80

60

40 20 0

m e rt in liae u ia tie p ri is u ssiana a p a roseus iso rev omyc o sc m pt b an u ce a e ia tr m S er iu es v um m yc u iz li enylthioharnstoff Negativkontrolle a h il m h ic ro Be a can h Metar e c L ac S Paecilomyces fumos Aprotinin + P

Abb. 3.28: Anzahl der in einer mit Hämolymphe inkubierten Kultur von Escherichia coli B gebildeten kolonieformenden Einheiten (cfu) in Abhängigkeit von der Behandlung der Bienen. Bei „Aprotinin + Phenylthioharnstoff“ und „Streptomycin“ handelt es sich

um Kontrollen, die nicht Bestandteil einer differenzierenden Behandlung waren. Im

Vergleich zur Saccharomyces cerevisiae-Gruppe trat eine deutliche cfu-Reduktion bei Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Paecilomyces fumosoroseus und Beauveria bassiana auf.

3.8 Sreening ausgewählter Völker auf potentiell spezifische varroapathogene Pilze

Eine maximale Wirtsspezifität ist von zentraler Bedeutung für die Eignung eines antagonistischen, hyperparasitären Pilz, der keine oder zumindest möglichst geringe Seiteneffekte in Bezug auf Nichtzielorganismen zeigen sollte. Potentiell spezifische

88 Ergebnisse

Hyperparasiten zu finden, die möglicherweise als Antagonisten von Varroa destructor geeignet sind, war deshalb eines der Hauptziele der vorliegenden Untersuchung. Dazu wurden über insgesamt vier Jahre (2005 - 2008) sämtliche Versuchsvölker einem Monitoring von Populationsdynamik und Varroabefall unterzogen. Repräsentative Völker dieses Monitorings (i.e. Völker, die einen sehr hohen, sehr niedrigen oder durchschnittlichen Milbenbefall aufwiesen) wurden daraufhin ausgewählt und zusätzlich auf das aus gestorbenen Milben aus diesen Völkern erfolgende Pilzwachstum untersucht, um mögliche Korrelationen zwischen Milbenbefall und anteiligem Pilzwachstum zu finden, ohne zunächst die Art beteiligter Pilze zu berücksichtigen. Im Anschluss daran wurden im Screening gefundene Pilze isoliert, in Reinkultur genommen, mikroskopisch typisiert und auf der Basis ihrer Sequenzdaten identifiziert. Im Folgenden werden die jeweiligen Ansätze kurz erläutert, bevor die Ergebnisse beschrieben werden.

3.8.1 Populationsdynamik und Milbenbefall von Apis mellifera-Völkern

Die Auswahl von Kandidatenvölkern erfolgte von 2005 - 2008 auf der Basis von Populationsschätzungsdaten und der Erfassung des Milbenfalls als repräsentativen Maßstabes für den Befall eines Volkes mit Milben. 2005 wurden 12, 2006 55, 2007 81 und 2008 67 Völker in die Untersuchung einbezogen. Die Bienenzahl wurde während des jeweiligen Sommerhalbjahres in vierwöchigen Abständen insgesamt fünfmal erfasst. Der Milbenfall wurde für jedes Volk während des Untersuchungszeitraums an 21 Terminen mit einer untergeschobenen Kunststoffwanne ermittelt. Die Abbildungen 3.29 und 3.30 zeigen exemplarisch den Verlauf der Populationsdynamik und des Milbenfalls für sechs untersuchte Völker. Trotz ähnlicher Entwicklungen in Bezug auf die Bienenzahl kam es bei ansonsten gleichen Ausgangsbedingungen und gleicher Behandlung der Völker im Jahresverlauf zu sehr unterschiedlichen Befallsgraden mit Varroa destructor, die vor dem Hintergrund der Annahme einer Beteiligung pathogener Pilze an der Mortalität von Milben als Hinweis darauf gedeutet wurden.

89 Ergebnisse

35000 200 Volk 18 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 18 180 30000 160 25000 140

120 20000 100 Bienen 15000 80 Milbenfall/Tag

10000 60

40 5000 20 0 0 35000 200 Volk 19 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 19 180 30000 160

25000 140

120 20000 100

Bienen 15000 80 Milbenfall/Tag

60 10000 40 5000 20

0 0 35000 200 Volk 14 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 14 180 30000 160

25000 140

120 20000

100 Bienen 15000 80 Milbenfall/Tag

10000 60

40 5000 20

0 0

Abb. 3.29: Entwicklung der Bienenanzahl und des täglichen Milbenfalls von drei exemplarisch ausgewählten Völkern über einen Zeitraum von etwa 150 Tagen. In allen Fällen handelte es sich um im Vorjahr gebildete Völker, die gleichartig geführt wurden. Auch bei ähnlicher Entwicklung der Bienenzahl im Jahresverlauf kam es zu sehr unterschiedlichen Entwicklungen des Varroabefalls. 90 Ergebnisse

35000 200 Volk 5 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 5 180 30000 160

25000 140

120 20000

100 Bienen 15000 Bienen Bienen 80 Milbenfall/Tag

Milbenfall/Tag

10000 60

40 5000 20

0 0 35000 200 Volk 21 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 21 180 30000 160 25000 140

120 20000 100 Bienen 15000 Bienen Bienen 80 Milbenfall/Tag Milbenfall/Tag 60 10000 40 5000 20

0 0 35000 200 Volk 4 Anzahl Bienen Milbenfall/Tag Volk 4 180 30000 160

25000 140

120 20000

100

Bienen

Bienen Bienen 15000 80 Milbenfall/Tag Milbenfall/Tag

60 10000 40 5000 20

0 0 Monat

Abb. 3.30: Entwicklung der Bienenanzahl und des täglichen Milbenfalls von drei exemplarisch ausgewählten Völkern über einen Zeitraum von etwa 150 Tagen. In allen

Fällen handelte es sich um im Vorjahr gebildete Völker, die gleichartig geführt wurden.

Auch bei ähnlicher Entwicklung der Bienenzahl im Jahresverlauf kam es zu sehr unterschiedlichen Entwicklungen des Varroabefalls. 91 Ergebnisse

3.8.2 Korrelation der Abundanz von Varroa destructor in Bienenvölkern und des Pilzwachstums aus Milben

Auf der Basis des jährlichen Monitorings der Versuchsvölker wurden zur Untersuchung einer eventuellen Korrelation von Milbenbefall und Vorkommen von Pilzen Völker ausgewählt, deren Milbentotenfall in Bezug auf die Erzielbarkeit eines Pilzwachstums in vitro untersucht wurde. Dazu wurden täglich über einen Zeitraum von bis zu zwei Wochen pro Volk die in die Auffangwanne gefallenen Milben gesammelt, oberflächensterilisiert und unter sterilen Bedingungen auf H2O-Agar kultiviert. In der Folge wurde das aus diesen Milben erfolgte Pilzwachstum registriert. Da der Einschub der Schubladen über bis zu zwei Wochen bedingte, dass es zur Verschleppung von Milben durch fouragierende Ameisen kam, konnte nicht gleichzeitig der Befall des Volkes über den Milbentotenfall in der Auffangwanne erfasst werden. Allen Völkern wurden deshalb Proben von etwa 1000 adulten Bienen entnommen, die exakt ausgezählt und deren aufsitzende Milben nach Abwaschen mit einer Detergenslösung und Absieben ebenfalls erfasst wurden. Im Folgenden sind die Ergebnisse für die Zusammenhänge zwischen Milbenbefall pro Biene und anteiligem Pilzwachstum zunächst getrennt für die Jahre 2005 (Abb. 3.31, N = fünf Völker), 2006 (Abb. 3.32, N = 19 Völker), 2007 (Abb. 3.33, N = 16 Völker) und 2008 (Abb. 3.34, N = 17 Völker), im Anschluss daran in einer Übersicht (Abb. 3.35, N Gesamt = 57 Völker) dargestellt. Das Quadrat des Korrelationskoeffizienten nach Pearson ist in der jeweiligen Grafik angegeben. Für 2005, 2006 und 2008 zeigt sich ein Zusammenhang zwischen Milbenbefall und Pilzwachstum – im Jahr 2007 gibt es einen solchen Zusammenhang nicht. Für die Jahre 2005 und 2008 ist die Korrelation – für 2005 allerdings vor dem Hintergrund eines geringen Stichprobenumfangs – mit mittlerer Güte belegt, in 2006 zeigte sich eine sehr starke Korrelation der beiden Variablen.

92 Ergebnisse

Abb. 3.31: Zusammenhang zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem

Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2005. Mit zunehmendem

2 Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = fünf, Pearson-Korrelation, R =0,408).

Abb. 3.32: Zusammenhang zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2006. Mit zunehmendem Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = 19, Pearson-Korrelation, R2=0,745).

93 Ergebnisse

Abb. 3.33: Zusammenhang zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2007. Eine Korrelation der beiden Variablen trat nicht auf (N = 16, Pearson-Korrelation, R2=0,004).

Abb. 3.34: Zusammenhang zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für das Jahr 2008. Mit zunehmendem

Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N = 17, Pearson-Korrelation, R2=0,466).

94 Ergebnisse

Abb. 3.35: Übersicht des Zusammenhangs zwischen Bienenbefall mit Milben (Milben pro 100 Bienen) und anteiligem Pilzwachstum (Anzahl aus 100 Milben gewachsener Pilze) für die Jahre 2005 – 2008.

Mit zunehmendem Milbenbefall nahm das anteilige Pilzwachstum ab (N Gesamt = 57, Pearson- 2 Korrelation, R =0,289). Pfeile markieren die Völker, in denen potentiell milbenpathogene Pilze gefunden wurden (siehe Kapitel 3.8.3).

3.8.3 Spektrum identifizierter Spezies im Pilzscreening

In der Untersuchung eventueller Korrelationen zwischen dem Milbenbefall von Bienenvölkern und dem Vorkommen von Pilzen in ihnen, i.e. in den Milben, stand die phylogenetische Zugehörigkeit der Pilze zunächst nicht im Fokus. In einer weiteren Analyse wurden deshalb die gefundenen Pilze typisiert, um Aussagen zur Häufigkeit verschiedener Pilzgruppen treffen zu können und potentielle Antagonisten von Varroa destructor zu identifizieren. Im Screening Pilzwachstum zeigende Milben wurden zu diesem Zweck entfernt und die aus ihnen gewachsenen Pilze über mehrere Stufen auf MEA-Agarplatten isoliert.

95 Ergebnisse

Anschließend erfolgte durch Anfertigung von Lactophenolblaupräparaten eine mikroskopische Typisierung und nach Überführung in Flüssigkulturen, DNA- Extraktion, sowie Amplifikation der ITS-Regionen der rDNA mit folgender Sequenzierung und Abgleich (FASTA) mit der EMBL Nucleotide Sequence Database (EMBL Fungi, Stand Juni 2009) eine Einordnung auf Basis der Sequenzdaten (Tabelle 3.1).

Tabelle 3.1 (Fortsetzung auf folgender Seite): Speziesidentifikation der isolierten Pilze auf der Basis des Abgleichs der Sequenzdaten mit bereits in der EMBL-Datenbank (Stand Juni 2009) publizierten Sequenzen. Beschreiber sind nur im jeweils ersten Listeneintrag aufgeführt.

Ähnlichkeit zu Isolat Spezies/EMBL Länge (bp) Referenz publizierten Sequenzen MH 01 Cladosporium sp. 8506 556 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 02 Penicillium echinulatum RAPER AND THOM 592 99,5 % EM_FUN:EU128595 MH 03 Penicillium corylophilum DIERCKX 589 98,6 % EM_FUN:AF033450 MH 04 Penicillium corylophilum 592 98,3 % EM_FUN:AY373906 MH 05 Penicillium citreonigrum DIERCKX 590 98,3 % EM_FUN:AY373908 MH 06 Cladosporium sp. 8506 545 99,0 % EM_FUN:EF120425 MH 07 Cladosporium cladosporioides DE VRIES 548 97,8 % EM_FUN:EU301112 MH 08 Cladosporium cladosporioides 560 98,7 % EM_FUN:AY251074 MH 09 Cladosporium cladosporioides 560 99,5 % EM_FUN:AJ876482 MH 10 Cladosporium cladosporioides 548 99,8 % EM_FUN:EF151439 MH 11 Cladosporium cladosporioides 557 99,5 % EM_FUN:EF405864 MH 12 Penicillium adametzioides ABE 586 99,6 % EM_FUN:AF033403 MH 13 Cladosporium oxysporum BERKELEY AND CURTIS 557 99,8 % EM_FUN:EF136374 MH 14 Simplicillium lamellicola ZARE AND GAMS 611 99,7 % EM_FUN:AF108480 MH 15 Cladosporium cladosporioides 550 99,6 % EM_FUN:AY251074 MH 16 Penicillium brevicompactum DIERCKX 560 99,8 % EM_FUN:AF521657 MH 17 Eupenicillium tularense PADEN 588 96,3 % EM_FUN:AF033487 MH 18 Cladosporium cladosporioides 534 97,8 % EM_FUN:AY251074 MH 19 Cladosporium sp. 8506 555 99,1 % EM_FUN:EF120425 MH 20 Cladosporium cladosporioides 544 99,6 % EM_FUN:EU272532 MH 21 Phlebiella christiansenii LARSSON AND HJORTSTAM 575 98,6 % EM_FUN:EU118659 MH 22 Penicillium corylophilum 589 100,0 % EM_FUN:AF034456 MH 23 Cladosporium cladosporioides 545 98,2 % EM_FUN:AF455519 MH 24 Penicillium brevicompactum 586 99,5 % EM_FUN:EF634407 MH 25 Cladosporium cladosporioides 556 98,5 % EM_FUN:AY251074 MH 26 Cladosporium sp. 8506 556 99,3 % EM_FUN:EF120425 MH 27 Cladosporium cladosporioides 557 99,4 % EM_FUNAY251074 MH 28 Penicillium corylophilum 592 100,0 % EM_FUN:AF033450 MH 29 Phlebiella christiansenii 576 99,1 % EM_FUN:EU118659 MH 30 Cladosporium cladosporioides 547 98,6 % EM_FUN:DQ810182 MH 31 Penicillium corylophilum 590 99,5 % EM_FUN:AF034457 MH 32 Cladosporium oxysporum 553 99,4 % EM_FUN:DQ912837 MH 33 Cladosporium cladosporioides 557 98,6 % EM_FUN:AY251074 MH 34 Cladosporium sp. 8506 558 98,2 % EM_FUN:EF120425 MH 35 Cladosporium cladosporioides 560 98,2 % EM_FUN:EU670719 MH 36 Simplicillium lamellicola 615 98,5 % EM_FUN:AF108480 MH 38 Cladosporium cladosporioides 556 98,9 % EM_FUN:EU272532 MH 39 Cladosporium cladosporioides 533 98,2 % EM_FUN:EU272532 MH 40 Cladosporium cladosporioides 554 98,6 % EM_FUN:AJ300334 MH 41 Cladosporium cladosporioides 558 99,1 % EM_FUN:EU272532 MH 42 Cladosporium cladosporioides 543 98,9 % EM_FUN:EU272532 MH 43 Cladosporium cladosporioides 557 98,0 % EM_FUN:AY251074 MH 44 Cladosporium cladosporioides 542 98,7 % EM_FUN:EU272532 MH 45 Yarrowia lipolytica VAN DER WALT AND ARX 585 98,1 % EM_FUN:DQ680839 MH 46 Penicillium citreonigrum str. 586 99,0 % EM_FUN:EF198645 MH 47 Meira geulakonigii BOEKHOUT, GERSON AND SZTEIJNBERG 628 99,5 % EM_FUN:AB204894

96 Ergebnisse

MH 48 Cladosporium cladosporioides 555 99,3 % EM_FUN:AY251074 MH 49 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:AF455472 MH 50 Cladosporium oxysporum 550 99,2 % EM_FUN:EF136374 MH 51 Cladosporium cladosporioides 559 99,1 % EM_FUN:AY251074 MH 52 Penicillium corylophilum 574 98,5 % EM_FUN:AY373906 MH 53 Mucor hiemalis WEHMER 641 99,0 % EM_FUN:AJ876489 MH 54 Cladosporium cladosporioides 557 98,6 % EM_FUN:EU272532 MH 55 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:AY251074 MH 56 Cladosporium cladosporioides 544 98,2 % EM_FUN:EU301112 MH 57 Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S 556 97,2 % EM_FUN:FJ037773 MH 58 Cladosporium cladosporioides 544 99,4 % EM_FUN:EU272532 MH 59 Cladosporium cladosporioides 558 98,3 % EM_FUN:AY251074 MH 61 Cladosporium sp. 8506 557 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 62 Penicillium brevicompactum 585 99,5 % EM_FUN:DQ123637 MH 63 Penicillium corylophilum 592 99,0 % EM_FUN:AF034456 MH 64 Cladosporium cladosporioides 552 98,2 % EM_FUN:EF151439 MH 65 Cladosporium cladosporioides 555 97,8 % EM_FUN:AJ876482 MH 66 Penicillium brevicompactum 578 99,8 % EM_FUN:DQ123638 MH 67 Cladosporium cladosporioides 550 98,7 % EM_FUN:EU301112 MH 68 Penicillium brevicompactum 580 98,5 % EM_FUN:AY373897 MH 69 Penicillium brevicompactum 587 98,0 % EM_FUN:DQ123637 MH 70 Cladosporium cladosporioides 557 98,7 % EM_FUN:EF136373 MH 71 Penicillium corylophilum 590 98,9 % EM_FUN:AY373906 MH 72 a Mucor hiemalis 647 99,7 % EM_FUN:DQ118992 MH 72 b Mucor hiemalis 650 98,4 % EM_FUN:AJ876489 MH 73 a Psathyrella candolleana MAIRE 709 99,0 % EM_FUN:AM712281 MH 73 b Psathyrella candolleana 710 98,4 % EM_FUN:DQ093736 MH 74 Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S 558 98,2 % EM_FUN:FJ037773 MH 75 Cladosporium sp. 8506 18 S 560 98,7 % EM_FUN:EF120425 MH 76 Cladosporium cladosporioides 556 98.0 % EM_FUN:AY251074 MH 77 Psathyrella candolleana 701 99,9 % EM_FUN:AB470847 MH 78 Cladosporium cladosporioides 536 98,2 % EM_FUN:AJ876482 MH 79 Penicillium citreonigrum str. 585 99,5 % EM_FUN:AY373908 MH 80 Penicillium brevicompactum 584 98,3 % EM_FUN:DQ123637 MH 81 Cladosporium oxysporum 18 S 552 99,4 % EM_FUN:EF136374 MH 82 Penicillium citreonigrum str. 581 99,6 % EM_FUN:AY373908 MH 83 Cladosporium cladosporioides 557 97,3 % EM_FUN:AY251074 MH 84 Mucor hiemalis f. hiemalis 648 99,2 % EM_FUN:EU484277 MH 85 Cladosporium sp. 8506 556 97,8 % EM_FUN:EF120425 MH 86 Cladosporium sp. 8506 554 98,5 % EM_FUN:EF120425 MH 87 Cladosporium cladosporioides 559 98,4 % EM_FUN:EU272532 MH 88 Penicillium brevicompactum 563 99,1 % EM_FUN:AY373897 MH 89 Cladosporium cladosporioides 541 99,4 % EM_FUN:AY251074 MH 90 Cladosporium sp. 8506 550 98,9 % EM_FUN:EF120425 MH 91 Cladosporium cladosporioides 556 97,3 % EM_FUN:EU301112 MH 92 Cladosporium sp. 8506 559 99,4 % EM_FUN:EF120425 MH 93 Cladosporium cladosporioides 523 96,7 % EM_FUN:AY251074 MH 94 Cladosporium cladosporioides 556 99,4 % EM_FUN:EU301112 MH 95 Cladosporium sp. 8506 548 98,2 % EM_FUN:EF120425 MH 96 Phlebiella christiansenii 576 99,6 % EM_FUN:EU118659

Abbildung 3.36 zeigt die Häufigkeiten der gefundenen Arten: Insgesamt wurden 97 Stämme isoliert. Vier Stämme (Cladosporium cladosporioides, Cladosporium oxysporum, Cladosporium sp. 8506, Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S) der Ordnung Capnodiales stellten 58,4 Prozent der gefundenen Pilze. Quantitativ zweitgrößte Gruppe mit 27,2 Prozent der detektierte Pilze waren die Eurotiales mit sieben Stämmen (Eupenicillium tularense, Penicillium adametzioides, Penicillium brevicompactum, Penicillium citreonigrum, Penicillium citreonigrum str., Penicillium corylophilum, Penicillium echinulatum. Die restlichen 14,4 Prozent verteilten sich auf

97 Ergebnisse ein Isolat (Psathyrella candolleana, 3,1 Prozent) der Ordnung Agaricales, je einen Vertreter der Hypocreales (Simplicillium lamellicola) mit 2,1 Prozent, der Mucorales (Mucor hiemalis) mit 4,1 Prozent, der Saccharomycetales (Yarrowia lipolytica) mit 1,0 Prozent, der Corticiales (Phlebiella christiansenii) mit 3,1 Prozent und mit Meira geulakonigii, der 1,0 Prozent stellte, auf einen Vertreter der Exobasidiomycetidae einer Ordnung incertae sedis.

Yarrowia lipolytica; 1,0 Simplicillium lamellicola; 2,1 Psat hyrella candolleana; 3,1 Phlebiella christ iansenii; 3,1 Penicillium echinulat um; 1,0 Penicillium corylophilum; 7,7

Cladosporium cladosporioides; Penicillium cit reonigrum st r.; 4,1 41,2

Penicillium cit reonigrum; 4,1

Penicillium brevicompactum; 8,2

Penicillium adamet zioides; 1,0 M ucor hiemalis; 4,1 M eira g eulako nig ii; 1,0 Eupenicillium t ularense; 1,0 Cladosporium oxysporum; 4,1 Cladosporium sp. 8506; 11,0 Cladosporium sp. ZJ8-4B 18S; 2,1 Abb. 3.36: Zuordnung von 97 im Screening isolierten Pilzen auf der Basis eines Abgleichs der Sequenzen mit der EMBL-Fungi-Datenbank und Häufigkeit nach Zuordnung: 87,7 Prozent waren

Vertreter der Pezizomycotina, 4,1 Prozent der Mucoromycotina, 3,1 Prozent der Agaricomycotina und je ein Prozent der Saccharomycotina und Ustilaginomycotina.

Die phylogenetischen Beziehungen auf der Basis der ITS-Sequenzdaten sind in Abb. 3.37 dargestellt (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, Distanzindex: Substitutionen pro Site, MEGA4). Zwei große Abteilungen innerhalb der Pilze spiegeln sich auch im Phylogramm mit dem Cluster Capnodiales- Hypocreales-Saccharomycetales-Eurotiales als Vertreter der Ascomycota und dem Cluster Agaricales-Meira geulakonigii-Corticiales als Vertreter der Basidiomycota wieder.

98 Ergebnisse

Die Mucorales als Vertreter der Zygomycota sind in der Analyse ohne direkte Verwandte und clustern, bedingt durch die untersuche DNA-Region, als Artefakt innerhalb der Basidiomycota. Nahezu alle Vertreter der beiden Cluster werden von opportunistischen, euryöken Saprobionten gestellt, in beiden Clustern tritt aber auch je ein Pilz auf, der Arten zugeordnet ist, die für Arthropoden pathogen sein können: Innerhalb der Basidiomycota handelt es sich um Meira geulakonigii (Isolat MH47- ITS1F), im Ascomycota-Cluster um Simplicillium lamellicola (Isolate MH 14-ITS1F und MH 36-ITS1F).

99 Capnodiales Ergebnisse

M

M F

F F F M F F

F F

H 1

M 1 1 H2 1 1 1 F

M H 1 1 F

S 3 S S H S S 1 F M S S 1

H 5 5 S 1 F

T M T T S 7 0 T T

H T T S F I I 1 8 I I 6 I

M H 0 - I T T S - - - - - 1 F 6 - I

5 - - - - I T S - - M H - - - - T 1 5 - I 1 - - I I - --I - I T S F

H 3 0 - IT T - - -- I S 4 T 3 M - - 5 T I 2 F 1 - 3 4 - - I T 0 9 - - I S11

H - I T S 76 - - IT F

9 M 9 3 - S 9 5 9 T S 3 I T S 9 9 3 - - H 2 - -ITT SS 888 1 - -I T 1

M 3 - -I S 11 88 6 - I TS 1F S 1 H

0 H H - T H 8 1 H -- I H S - I S 1 HH 785 M 27 - TS 1 FF H 7 4--IT 1F

H26--IITS11FFF HHH7597--ITS F M

1 M 1 - M H - F M - S M 5 S M I 1F M H H25--ITS1F MMH H5655--IT F MH19--ITTSS11FF MMHH54514--ITS1F MH18---IITS1F1FFF H3H3428--ITS

1 F - - FF F 13 ITS 1 FFFFF 9--IT 1F

MH 1---ITSS 1111 8--IT S1 11 1 S 1 1 - 111 - F H 0 --IITT SSS IT S1

M 1 9 -- I T SSS S1 F S S H SS S M H 5 ---IITTT F 1 7 - - II TTT

M T T T T

- -- I I I H 6 I I - - I

H 1 - - - - - M H 8 - - -I -

M - - - - H 7 - M H 4 9

6 4 3 0 1 M 6 4 3

M 4 4 H 4 4 H 2

M H H H H M MH MH

M M M M Hypocreales

14--ITS1F MH MH36-- 45--ITS1F ITS1F

F S1 --IT S1F 168--ITS1F HH624--IT Saccharomycetales MMH662--ITS1F H 869----ITS1F M 880-- ITS1

H2 --ITITS F

M

M 1 M - M MMM - S F

MHM IT 1 H

H M S H F

H H

H HH HHH 1

3 4 H M F

4 7

2 5 5

2 3

6 7 6 1

- 8 - H - 1 -

-

2 2 9 - 7 8 1 -

3 2 1

- I I

I - - T T - 2 I

T -

- - -

- - - - -

T - S IT -

-I - I - S

- - I -

S I I T I T 1 I

I I 1 T

S TS T F S

T T T T

1 S1 S F 1 S

1 S 1 S S F 1 F

S S F

F 1 1 F 1 1 F 1

1 F F F F F F

Eurotiales

Mucorales

M M

M M M

H H H H 2 H H 9 2

1 7 6 9

7 7 - 7 - 3 - - 3 -

- I

- I T

a I b

- Corticiales T

T S

I - - M

M

T - S1

M M - I S 1 I H

S T H F

T 1

H H 7

1 S F

F S 7

2 5 8 M F 1

2

b 1

3 4

- F

a H F

- - -

I

-

- T -

- 4

I I I

S T T T 7

1

S S S -

F

-

1 1 1 I

T F F F

S1

F 0.05 Meira geulakonigii

Agaricales

Abb. 3.37: Phylogenetische Beziehungen von 97 Isolaten auf der Basis der ITS-Sequenzdaten (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 261 Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

100 Ergebnisse

3.8.4 Charakteristika von Meira geulakonigii

Die Abbildungen 3.38 (eigene Daten rot markiert) und 3.39 verdeutlichen die Beziehungen des gefundenen Isolates mit bereits publizierten Sequenzen, die der Gattung Meira zugeordnet sind: Größte Homologie (Abb. 3.38, erste und zweite Reihe) besteht zu den Isolaten PFS 014, das Yasuda publiziert hat, und AS 004, das von Boekhout stammt und Typuskultur der Erstbeschreibung ist (Boekhout et al.

2003; Yasuda et al. 2007). Yasuda isolierte den Pilz aus Pyrus pyrifolia NAKAI- Kulturen in Japan, Boekhout aus der phytopathogenen Milbe Phyllocoptruta oleivora

ASHMEAD auf Citrus grandis OSBECK-Kulturen in Israel. Das in der vorliegenden Untersuchung gefundene Isolat aus Varroa destructor weist, verglichen mit den beiden oben beschriebenen Isolaten, zwar nur geringe Sequenzdifferenzen auf, kann aber von diesen abgegrenzt werden; Tabelle 3.2 gibt die paarweisen Distanzen zu insgesamt elf, Arten der Gattung Meira zugeordneten Sequenzen an (Maximum Composite Likelihood-Modell, 484 Sites).

Tabelle 3.2: Distanzmatrix für elf der Gattung Meira zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das eigene Isolat. Die geringsten Distanzen bestehen zu den zwei als Meira geulakonigii publizierten Isolaten. Berechnung auf der Basis von 484 Sites, Maximum Composite Likelihood-Modell.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Meira geulakonigii 1 PFS014 Meira geulakonigii 2 0,000 AS004 3 Meira argovae AS005 0,043 0,043

4 Meira argovae AS003 0,043 0,043 0,000

5 MH47-ITS1F 0,002 0,002 0,043 0,043

6 Meira sp. Vega E1-92 0,021 0,021 0,043 0,043 0,023

7 Meira argovae AS006 0,043 0,043 0,000 0,000 0,043 0,043

8 Meira argovae AS002 0,043 0,043 0,000 0,000 0,043 0,043 0,000 Meira argovae MAFF 9 0,047 0,047 0,008 0,008 0,047 0,043 0,008 0,008 240320 10 Meira sp. Vega E2-32 0,047 0,047 0,008 0,008 0,047 0,043 0,008 0,008 0,004 Meira nashicola PFS 11 0,058 0,058 0,067 0,067 0,060 0,056 0,067 0,067 0,072 0,072 002 12 Meira sp. IZ-1189 0,058 0,058 0,065 0,065 0,060 0,051 0,065 0,065 0,069 0,069 0,004

101 Ergebnisse

Abb. 3.38: Alignment für zehn der Gattung Meira zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das eigene Isolat (jeweils erste Zeile, gerahmt). Höchste Homologie (erste Reihe) besteht zu einem Isolat, das aus der Milbe Phyllocoptruta oleivora isoliert wurden; EMBL-FASTA, Juni 2009.

102 Ergebnisse

Abb. 3.39: Phylogenetische Beziehungen von elf publizierten Sequenzen, die bisher der Gattung Meira (Subtree: zwei als Meira geulakonigii identifizierte Isolate + eigenes Isolat) zugeordnet wurden + Sequenz des eigenen Isolats (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 484

Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

103 Ergebnisse

Meira geulakonigii zeigt im mikroskopischen Bild hyphenähnliche Strukturen, die als Residuen der Ausgangskultur gedeutet werden können. Reife Konidien erscheinen als fusiforme Zellen, die etwa sechs- bis siebenmal so lang wie breit sind (Abb. 3.40).

10 µm

Abb. 3.40: Mikroskopisches Präparat des eigenen Meira geulakonigii- Isolats. Färbung mit Lactophenolblau.

3.8.5 Charakteristika von Simplicillium lamellicola

Das gefundene Isolat von Simplicillium lamellicola zeigt ebenfalls sehr hohe Sequenzhomologien zu in den Datenbanken publizierten, insektenassoziierten, pathogenen Pilzen (Abb. 3.41, eigene Daten rot markiert): Die höchsten Übereinstimmungen (Distanzmatrix für Sequenzen von zwei als Simplicillium lamellicola und vier als Lecanicillium lecanii publizierte Spezies sowie für das eigene Isolat in Tabelle 3.3; Maximum Composite Likelihood-Modell, 465 Sites) fanden sich zu einem Isolat von Ilyas, der Simplicillium lamellicola aus Coccoidaeen isolierte und einem Isolat von Lee, der den Pilz in Bemisia tabaci GENNADIUS fand (Lee et al. 2007; Ilyas et al. 2009). Im Versuch zeigte sich eine hohe Pathogenität des von Polar

104 Ergebnisse untersuchten Isolats von Simplicillium lamellicola gegenüber Boophilus microplus, einer auf Vieh parasitierenden Zecke (Polar et al. 2005). Tuininga fand Simplicillium lamellicola in Bodenproben und charakterisiert ihn als insektenpathogen (Tuininga et al. 2009). Die phylogenetischen Beziehungen von sechs dieser publizierten Sequenzen, die Lecanicillium muscarium (syn. Verticillium lecanii) (vier) und Simplicillium lamellicola (zwei) zugeordnet sind, und dem eigenen Isolat zeigt Abbildung 3.42: Innerhalb des Simplicillium lamellicola-Clusters sind entsprechend der Distanzmatrix keine Differenzen zu erkennen, der Cluster setzt sich deutlich von Lecanicillium muscarium ab (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 465 Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

Tabelle 3.3: Distanzmatrix für Sequenzen von zwei als Simplicillium lamellicola und vier als Lecanicillium lecanii publizierten Spezies sowie für das eigene Isolat. Zwischen den Simplicillium

lamellicola-Isolaten und dem eigenen Isolat gibt es für den verglichenen Abschnitt keine Differenzen. Berechnung auf der Basis von 465 Sites, Maximum Composite Likelihood-Modell.

1 2 3 4 5 6 Simplicillium lamellicola 1 KYK00006 Simplicillium lamellicola 2 0,000 IAM 14701 Lecanicillium lecanii 3 0,133 0,133 CBS122175 Lecanicillium lecanii 4 0,117 0,117 0,024 EHS132 5 MH36-ITS1F 0,000 0,000 0,133 0,117 6 Lecanicillium lecanii C42 0,120 0,120 0,027 0,002 0,120

7 Lecanicillium lecanii 120 0,117 0,117 0,024 0,000 0,117 0,002

105 Ergebnisse

Abb. 3.41: Alignment für 10 den Spezies Simplicillium lamellicola (Reihen eins bis sechs, acht bis zehn) und Guignardia vaccinii (Reihe sieben) zugeordnete, publizierte Sequenzen sowie für das eigene Isolat (jeweils erste Zeile, gerahmt). Höchste Homologie besteht zu einem Isolat aus unbekannter Quelle (erste Reihe, unpubliziert) und zu einem Isolat, das aus Coccidaeen isoliert wurde (zweite Reihe); EMBL-FASTA, Juni 2009. 106 Ergebnisse

Abb. 3.42: Phylogenetische Beziehungen von sechs publizierten Sequenzen, die Lecanicillium muscarium (syn. Lamellicillium lecanii) (vier) und Simplicillium lamellicola (zwei) zugeordnet sind und dem eigenen Isolat (Alignment: ClustalW, Baum: Neighbor-Joining method, 465 Positionen, Distanzindex: Substitutionen pro Site).

107 Ergebnisse

Im Gegensatz zu den zugespitzten Sporen von Meira geulakonigii zeigen sich die Konidien im mikroskopischen Bild von Simplicillium lamellicola länglich abgerundet; sie sind etwa fünfmal so lang wie breit; ihr Verbund löst sich nach Abschnürung und bildet keine zusammenhängenden Ketten (Abb. 3.42).

10 µm

Abb. 3.43: Mikroskopisches Präparat des eigenen Simplicillium lamellicola-Isolats. Färbung mit Lactophenolblau.

108 Diskussion

4 Diskussion

Entomopathogene Pilze als potentielle Antagonisten von Varroa destructor werden als aussichtsreichste mittelfristige Lösung gesehen, um Apis mellifera-Völker in Kultur halten zu können, ohne diesen Parasiten mit einer komplexen, zeitaufwändigen Methodik bekämpfen zu müssen, da Erfolge in Versuchen, durch markergestützte Selektion oder die gezielte Fertilisation und folgende Rückkreuzung von Honigbienenarbeiterinnen, die ein Varroaantagonistisches Verhalten zeigen, eine nachhaltige Varroaresistenz oder zumindest -toleranz zu erzielen, die menschliche Eingriffe obsolet macht, bisher ausblieben (Büchler et al. 2008). Kurz nach der letzten Jahrtausendwende wurde begonnen, verschiedene unspezifische entomopathogene Pilze in Bezug auf ihre Wirkung auf Varroa destructor und Apis mellifera zu testen. Auch wenn es in der Folge wiederholt zu Untersuchungen kam, die eine antagonistische Wirkung entomopathogener Pilze konstatierten, liegen bisher keine Berichte zu einem Durchbruch in Bezug auf einen Einsatz dieser Pilze gegen Varroa vor. Die in dieser Arbeit untersuchten Stämme von vier Pilzen – Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae, Lecanicillium muscarium und Paecilomyces fumosoroseus – zeigten in vitro kein Potential, den Befall von Honigbienen mit dem Ektoparasiten Varroa destructor signifikant zu senken – in allen Versuchen gab es keine signifikanten Differenzen zwischen den mit Konidien behandelten Gruppen und den Kontrollen. Maxima des täglichen Milbenfalls traten sowohl in den Pilzgruppen als auch in den Kontrollen etwa an den Tagen zwei bis fünf auf, was als Effekt der spezifischen Bedingungen, wie der Gewinnungsmethode oder dem Besprühen mit der der Ernte der Konidien dienenden Lösung gedeutet werden kann. Geringe Differenzen in der Mortalität zwischen den Kontrollen der einzelnen Versuche wiederum sind der Methodik der Gewinnung der Versuchstiere geschuldet: Die große Zahl benötigter Milben lässt sich nur aus jeweils unterschiedlichen Völkern gewinnen, zudem sind derart umfangreiche Versuche nur seriell durchzuführen; damit ist davon auszugehen, dass sich die Kohorten der verwendeten Milben (und auch Bienen) in den in vitro-Versuchen zum Beispiel in Bezug auf ihre Altersstruktur nicht gleichen. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen decken sich nicht mit den Ergebnissen der beiden anderen Studien an Milben in vitro, die sich mit den gleichen Spezies beschäftigten (Kanga et al. 2002; Shaw et al. 2002). Shaw gibt für

109 Diskussion behandelte Milben eine Mortalität von 63 bis 100 Prozent für den siebten Tag nach Behandlung, für Milben der Kontrollgruppe eine zu vernachlässigende Mortalität an und schließt die Kontrollgruppe in der Folge von der Analyse aus. In der vorliegenden Arbeit lagen die Mortalitäten der Versuchs- und Kontrollgruppen in allen Untersuchungen zwischen 70 und 80 Prozent, ohne signifikant voneinander abzuweichen. Allerdings unterscheiden sich die Untersuchungen grundsätzlich in ihrer Methodik: Im Gegensatz zur in dieser Arbeit beschriebenen Vorgehensweise applizierte Shaw die Konidiensupension durch Eintauchen der Milben und hälterte diese anschließend in Fünfergruppen auf Bienenpuppen, die in 1,5 ml- Eppendorftubes untergebracht waren, bei 25 oder 30 Grad, also bei artifiziellen Bedingungen, die sehr stark von den Verhältnissen im Brutnest von Honigbienen abweichen: Die Mortalitäten in vitro gehälterter Larvenstadien und Puppen und damit auch der Milben liegen über denen im Volk, die gewählten Temperaturen weichen erheblich von den Brutnesttemperaturen ab und eine fünffache Parasitierung von Puppen kommt allenfalls in Bienenvölkern unmittelbar vor deren Zusammenbruch vor – ein Überleben von derart stark parasitierten Puppen und damit der Milben bis zur Imaginalhäutung beziehungsweise bis zum Schlupf der Bienen erscheint äußerst fraglich. Zur Behandlung der Kontrolle macht Shaw im Übrigen keine Angaben, was die Vergleichbarkeit der Ergebnisse zusätzlich erschwert. Bestätigt werden die vorliegenden in vitro-Ergebnisse für Varroa destructor durch die Ergebnisse des Halbfreilandversuchs: Abgesehen von der Beschränkung des Flugraums gab es in Bezug auf die Haltungsbedingungen keine artifiziellen Bedingungen, die Effekte auf Milben erklären könnten; auch hier konnte eine Wirkung auf Varroa destructor nicht beobachtet werden Kanga testete einen Stamm von Metarhizium anisopliae in Laborversuchen an Milben auf Puppen, bei denen eine konidienhaltige Detergenslösung versprüht wurde, und beobachtete eine signifikante Reduktion der Varroapopulationen, ohne dass die Bienen geschädigt wurden; er bestimmte eine LT90 von sechs Tagen für Metarhizium anisopliae (Kanga et al. 2002). In einem weiteren Versuch an Völkern, die entweder mit Konidienpulver oder dem pyrethroidhaltigen Tierarzneimittel Apistan behandelt wurden, fand Kanga vergleichbare Mortalitätsraten und schlussfolgerte daraus auf eine Eignung von Metarhizium als Kontrollagens, obwohl die kumulierten Mortalitätsraten zu Versuchsende teilweise unter denen der Kontrollgruppe lagen (Kanga et al. 2003). In einem Versuch in 2006, in dem Metarhiziumkonidien mit Hilfe

110 Diskussion von mit ihnen bedeckten Kunststoffstreifen appliziert wurden, bestätigten sich die Ergebnisse (Kanga et al. 2006). 2006 untersuchte James den Metarhiziumstamm, mit dem Kanga gearbeitet hatte, vor dem Hintergrund der Fragestellung, welche Applikationsform die effektivste sei, konnte dabei aber keinerlei signifikante Effekte des Pilzes finden; zusätzlich waren längstens nach 20 Tagen (Kanga 2003: 40 Tage) noch keimfähige Konidien vorhanden (Kanga et al. 2003; James et al. 2006). In den Freilandversuchen von Gerritsen mit drei kommerziell erhältlichen Produkten auf der Basis von Metarhizium anisopliae- und Lecanicillium muscarium-Stämmen zeigten sich signifikant erhöhte Sterberaten weder für Varroa destructor noch für Apis mellifera (Gerritsen et al. 2006). Diese widersprüchlichen Ergebnisse können zum einen darin begründet liegen, dass es sich bei den untersuchten Pilzen um ausgesprochen pleomorphe Spezies handelt, was eine Vergleichbarkeit der Untersuchungen, sofern sie nicht an identischen Stämmen vorgenommen wurden, schwierig macht. So hat beispielweise das Konidienkeimverhalten verschiedener Stämme Einfluss auf die Virulenz gegenüber Wirten: Für Beauveria bassiana wurde von Talaei-Hassanloui gezeigt, dass unidirektional keimende Konidien appressorienartige Strukturen ausbildeten und hochvirulent waren, während sich bi- und multipolar keimende Konidien mit hyphenartigem Wachstum als kaum bzw. nicht virulent herausstellten (Talaei-Hassanloui et al. 2007). Ähnliche Ergebnisse fand

Altre für Paecilomyces fumosoroseus als Pathogen von Plutella xylostella LINNAEUS: Hier korrelierte die Virulenz hochsignifikant mit der Sporenlänge und der Keimgeschwindigkeit (Altre et al. 1999). Darüber hinaus ergab beispielsweise eine Revision von Verticillium lecanii auf rDNA-Basis, dass es sich um einen Komplex aus den fünf Spezies Lecanicillium attenuatum ZARE AND GAMS, Lecanicillium lecanii ZARE

AND GAMS, Lecanicillium longisporum ZARE AND GAMS, Lecanicillium muscarium und

Lecanicillium nodulosum ZARE AND GAMS handelt (Zare et al. 2000; Gams et al. 2001; Zare et al. 2001). Da einige Autoren die Revision ohne eigene Identifizierung des ihnen vorliegenden Isolats durch einfachen Ersatz des Gattungsnamens nachvollzogen haben, handelt es sich möglicherweise auch bei den im Zusammenhang mit ihrer Rolle als potentielle Varroaantagonisten aktuell diskutierten Spezies um unterschiedliche Arten (Sugimoto et al. 2003; Koike et al. 2007). Weil deren Wirtsspektren erheblich divergieren und von Lepidopteren über Homopteren bis zu Vertretern der Acari und der Annelida reichen, könnten unterschiedliche Ergebnisse zur „gleichen“ Art hierin begründet liegen. Zum anderen differieren wie

111 Diskussion auch in den in vitro-Versuchen die verwendeten Methodiken erheblich: Die in der vorliegenden Untersuchung im Halbfreilandversuch verwendeten Völker wurden durch Poolen aus Donorvölkern gebildet, so dass sie zwingend homogen in Bezug auf potentielle Toleranz- oder Resistenzfaktoren von Bienenarbeiterinnen gegenüber Varroa destructor, aber auch in Bezug auf den Verwandtschaftsgrad der Arbeiterinnen untereinander und ihre Altersstruktur waren. Ebenso stellte diese Vorgehensweise sicher, dass die Abundanz von Varroa in allen Versuchsvölkern zu Beginn exakt gleich hoch war und die Völker mit gleichen Individuenzahlen adulter Bienen sowie ohne Brutstadien, die während des Versuchs Einfluss auf die Zahl adulter Bienen haben, starteten. Diese Vorgehensweise wurde lediglich von Kanga in seinen Versuchen an Bienenvölkern gewählt (Kanga et al. 2003). Auch die Applikationstechnik der Konidien wurde unterschiedlich gehandhabt: Die Konidien der eigenen Versuche wurden als Suspension versprüht, Kanga brachte die Konidien als Pulver in die Völker ein, Shaw ließ in ihren Laborversuchen Milben über reife Pilzkulturen laufen (Shaw et al. 2002; Kanga et al. 2003). Nicht untersucht wurde in beiden Ansätzen dabei der mögliche Einfluss eines nichttoxischen, mechanischen Effekts der Applikation, vergleichbar dem nach Einbringen fein vermahlener Saccharose in Bienenvölker; mit dieser Technik wurden in der vorliegenden Untersuchung Milben für die in vitro-Versuche gewonnen (Aliano et al. 2005; Ellis et al. 2009). Für einen aus Varroa destructor isolierten Beauveria bassiana-Stamm beschreibt Meikle nach Untersuchungen an je zwei Völkern – ausgehend von einer zuvor nicht vereinheitlichten Grundgesamtheit – einer mit Konidien behandelten, einer nur mit einem als Matrix dienenden Pulver behandelten und einer nicht behandelten Gruppe einen signifikant erhöhten Milbenfall der mit Konidien behandelten Gruppe am sechsten und achten Tag nach Applikation; die Völker differierten zuvor in Bezug auf die erfassten Parameter „Bienenmasse“ und „Fläche verdeckelter Brut“ (Meikle et al. 2007). Milben aus den mit Konidien behandelten Völkern zeigten, ohne zuvor oberflächensterilisiert worden zu sein, in allen Fällen ein signifikant höheres relatives Pilzwachstum. In einer Repetition mit einer größeren Zahl nicht vereinheitlichter Völker und vier verschiedenen Gruppen (Konidien und Carnaubawachsmatrix, Konidien und Weizenmehlmatrix, Weizenmehl, keine Behandlung) trat ein erhöhter Milbenfall in der Konidien-Carnaubawachsgruppe auf, dieser war allerdings nicht signifikant erhöht (Meikle et al. 2008b). Der Milbenfall der

112 Diskussion

Konidien-Weizenmehlgruppe lag unterhalb des Falls der Weizenmehlgruppe und an drei Tagen auch unterhalb des Falls der Kontrolle. Signifikant erhöhtes relatives Milbenwachstum aus einer Konidiengruppe wertet Meikle aber als Beleg für die Eignung des Pilzes als Varroaantagonist. Eine zweite Wiederholung erbrachte keinerlei Belege für eine signifikante Reduktion der Parasitenlast der Versuchsvölker, was als Hinweis auf die Notwendigkeit einer homogenen Ausgangsbasis gewertet werden kann (Meikle et al. 2009). Die Daten der vorliegenden Arbeit belegen für drei der vier untersuchten Pilze (Lecanicillium muscarium, Beauveria bassiana und Paecilomyces fumosoroseus) signifikant eine negative Wirkung auf Bienen, die für Paecilomyces in der Kumulation über den gesamten Untersuchungszeitraum sichtbar wurde, bei Lecanicillium und Beauveria sogar signifikante Differenzen an Einzeltagen (vier und sieben respektive vier und sechs) zeigte. Die Mortalitätsraten der Bienen lagen in der vorliegenden Untersuchung nach zehn Tagen zwischen 30 und 40 Prozent in den Pilzgruppen und 20 bis 30 Prozent in den Kontrollen, was – bezogen auf die Kontrollen – die Ergebnisse von Shaw stützt, deren Methodik zur Untersuchung an Honigbienen ähnlich war (Shaw et al. 2002). In den Pilzgruppen traten in ihrer Untersuchungen Mortalitäten von bis zu 100 Prozent 14 Tage nach Behandlung auf; von wenigen Fällen abgesehen lagen sie immer über denen der Kontrollen. Für Bienen schloss Kanga in seinem Versuch aus vergleichbaren Pilzwachstumsraten aus toten Bienen, sie würden durch die Pilzstämme nicht negativ beeinflusst – allerdings wurden die Oberflächen der Bienen nicht sterilisiert, was mit Blick auf opportunistische Saprobionten problematisch sein dürfte (Kanga et al. 2003). Der Befund unterschiedlicher Ergebnisse für Bienen bestätigt die großen Unterschiede von Pathogenität und Virulenz in Abhängigkeit vom untersuchten Isolat und legt, da in den vorliegenden und den in vitro-Untersuchungen von Shaw die Mortalität der Bienen unter dem Einfluss der Pilze erhöht war, nahe, dass diese möglicherweise isolatunabhängig nicht spezifisch genug sind, um als Kontrollagens geeignet zu sein. Im Halbfreilandversuch war eine erhöhte Mortalität der Bienen ebenso wie der Larvenstadien und der Puppen nicht detektierbar – das widerspricht nicht zwingend den Ergebnissen des in vitro-Assays: In in vitro-Versuchen an gekäfigten Bienen kommt es zu Eingriffen wie zum Beispiel dem regelmäßigen Entfernen toter Bienen, das auch bei vorsichtiger Handhabung unter Rotlicht zu einer stark zunehmenden Aktivität der Bienen führt; derartige Eingriffe können damit immer als Stressoren

113 Diskussion wirken. Bienen, die solchen Stressoren ausgesetzt sind, zeigten in anderen Versuchen eine erhöhte Mortalität, so dass denkbar ist, dass unter diesem Einfluss durch Immunsuppression ein Agens pathogen werden kann, das unter natürlichen Bedingungen keine Effekte auslöst (Dustmann et al. 1988; Decourtye et al. 2003). Die Nichtpathogenität der in dieser Untersuchung getesteten Pilze in Bezug auf Varroa bestätigte sich in der Infektionsanalyse der im Versuchszeitraum gestorbenen Milben: Nur für Beauveria bassiana (sieben Tage nach Behandlung) wurde ein signifikanter Unterschied (p < 0,05) im erzielbaren relativen Pilzwachstum aus Milben der Pilz- und Kontrollgruppe gefunden – in allen anderen Gruppen zeigten sich keine Differenzen. Shaw fand in ihrer Untersuchung bei bis zu 100 Prozent der gestorbenen Milben nach sieben Tagen Mykosen, gibt aber, da die Kontrollgruppe zu Versuchsbeginn einen zu geringen Milbenfall aufwies, keinen Wert für die Kontrolle an (Shaw et al. 2002). Das ist insofern problematisch, als vor der Kultur der Milben keine Oberflächensterilisation stattfand. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen aber die zentrale Bedeutung einer ausreichenden Sterilisationsdauer für den Ausschluss oder zumindest die weitestgehende Einschränkung des Wachstums der Oberfläche anhaftender Konidien der applizierten Spezies oder opportunistischer Saprobionten: Selbst nach einer sehr langen Sterilisationszeit von 240 Sekunden kam es noch zu einem (geringen) Pilzwachstum aus nicht mit Pilzen behandelten Milben, was an ingestierten oder intersegmental überdauerten Stadien vorhandener Pilze liegen dürfte. Ausgeschlossen werden kann deshalb auch nicht, dass die signifikante Differenz auf dem 95 Prozent-Niveau auf Residuen zurückzuführen ist. Zwar unterzieht Kanga die in seinem Versuch gestorbenen Milben einer Sterilisation, korreliert aber die Absolutbeträge der Zahl gefallener Milben und der aus ihnen gewachsenen Pilze (Kanga et al. 2003). Meikle findet in seinen Freilandversuchen in Abhängigkeit von der Versuchsdauer zwischen 100 Prozent (am Tag der Behandlung) und 30 Prozent (50 Tage nach Behandlung) infizierte Milben, verzichtet aber wie Shaw auf eine Sterilisation (Shaw et al. 2002; Meikle et al. 2007, 2008a). Die vorliegende Untersuchung an zehn Bienenvölkern im Halbfreilandversuch mit Lecanicillium muscarium bestätigte die eigenen Ergebnisse aus dem Laborassay für Milben auch im Detail: Über den gesamten Untersuchungszeitraum zeigte sich keine signifikante Schädigung der Milbenpopulation im Vergleich zu Kontrollvölkern, was sich nicht nur an der Zahl gestorbener Milben, analog zur Erfassung in den in

114 Diskussion vitro-Assays feststellen lässt; auch der relative Endbefall adulter Bienen und verdeckelter Brutzellen belegt keine Wirkung des Pilzes. Im Gegensatz zum Laborassay wurde auch kein negativer Seiteneffekt gefunden – weder auf die Zahl adulter Bienen, noch auf die Zahl der Larvenstadien oder verdeckelter Brutzellen. Der Befund einer Nichtwirksamkeit gegenüber Milben und Bienen wird gestützt durch die Untersuchungen von Gerritsen, die für den gleichen Lecanicillium muscarium- Stamm sowie für einen Metarhizium anisopliae-Stamm im Freilandversuch an allerdings zuvor nicht vereinheitlichten Völkern ebenfalls keinen Effekt belegen (Gerritsen et al. 2006). Meikle konnte eine Wirkung des von ihm untersuchten Beauveria bassiana-Stamms, der nach seinen früheren Ergebnissen letal auf Varroa wirkte, in seiner jüngsten Untersuchung nicht mehr bestätigen (Meikle et al. 2006; 2007; 2008a; 2008b; 2009). Meikle arbeitete im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit ebenso wie Gerritsen mit einem nicht über eine Supergruppenbildung in Bezug auf Altersstruktur, Verwandtschaft und Varroabefall homogenisierten Bienenmaterial, was angesichts einer exponentiellen Vermehrung des Parasiten und einem Generationenabstand von nur 30 Tagen eine erhebliche Varianz zwischen den Jahren erklären kann. Zudem waren die Völker beider Gruppen nicht in Flugzelten untergebracht, was die Gefahr signifikanter Änderungen des Befallsgrades birgt (Greatti et al. 1992; Goodwin et al. 2006). Noch nie zuvor wurde untersucht, ob es letale Auswirkungen entomopathogener Pilze auf Larven von Honigbienen bereits ab dem L1-Stadium gibt. Für die untersuchten Stämme im Larven-in-vitro-Assay kann ein solcher Einfluss der Pilze auf Larven des L1- bis L5-Stadiums und auf Puppen von Apis mellifera verneint werden. In allen Gruppen kam es innerhalb der ersten sechs bis neun Tage zu einem Anstieg der kumulierten Mortalität auf etwa 15 Prozent, danach bis zum Versuchsende nach 21 Tagen nur noch zu einer leichten Zunahme auf etwa 20 Prozent. Diese Rate dürfte den artifiziellen Bedingungen eines in vitro-Versuchs geschuldet sein und deckt sich in der Kontrolle mit den beobachteten Mortalitätsraten ähnlicher Versuche an Paenibacillus larvae (Genersch, mdl.). Unter den nichtartifiziellen Bedingungen des Halbfreilandversuchs an Lecanicillium muscarium kam es ebenfalls nicht zu Auffälligkeiten – weder für die Larvenstadien noch für das Puppenstadium gab es signifikante Differenzen zwischen Pilz- und Kontrollgruppe.

115 Diskussion

Auch subletale Effekte entomopathogener Pilze, die unter Umständen Ausschlusskriterium für ihren Einsatz sein können, sind in bisherigen Untersuchungen noch nie berücksichtigt worden. Zur Klärung der Frage, ob es nicht- letale Effekte auf adulte Bienen gab, die der in vitro-Versuch nicht erfassen konnte, wurden mit Pilzsporen beziehungsweise nur mit einer Kontrolllösung behandelte Gruppen in Bezug auf ihre Futteraufnahme pro Zeiteinheit als mögliches Indiz zum Beispiel einer Schädigung des Darmkanals untersucht; in diesem Zusammenhang wurde auch analysiert, ob das Gewicht der Honigblase über den Gesamtversuchszeitraum Schwankungen unterworfen war. Klassische PER- Versuche müssen darauf keine Rücksicht nehmen: Hier werden die Bienen den Völkern wenige Stunden vor Versuchsbeginn entnommen und sind nach kurzer Zeit hungrig, was Voraussetzung für eine erfolgreiche Teilnahme der Individuen am Versuch ist (Bittermann et al. 1983). Bei über einen Versuchszeitraum von 12 Tagen je Durchgang gekäfigten Bienen aber ist der Sättigungszustand der ad libitum mit Futter versorgten Tiere nicht kalkulierbar; Langzeit-PER-Versuche mit gekäfigten Bienen wurden nie zuvor etabliert und in Vorserien zeigte sich, dass es starke Schwankungen bezüglich der nötigen Dauer der Hungerphase gab: Beobachtet wurden Hungerphasen von mehr als 12 Stunden, die nötig waren, um Bienen zur Versuchsteilnahme zu bewegen, aber auch eine Mortalitätsrate von über 50 Prozent nach einer Hungerphase von nur einer halben Stunde. Die Ergebnisse zeigen deutlich das signifikant abnehmende Honigblasengewicht von etwa 10 mg auf etwa 2 mg während des Versuchszeitraums. Dieses Ergebnis korreliert mit der Beobachtung, dass gekäfigte Bienen zumindest während des Versuchszeitraums nicht defäkieren und die Menge retenierter Fäzes permanent zunimmt – offensichtlich auf Kosten des zur Verfügung stehenden Honigblasenvolumens. Die Replizierbarkeit der Ergebnisse machte in Kombination mit den Ergebnissen der Messung des Futterverbrauchs ein passgenaues Timing des Beginns des Futterentzugs möglich, so dass eine ausreichend große Anzahl teilnahmefähiger Bienen ohne zu große Präversuchsverluste zur Verfügung stand, und eignet sich damit als Grundlage für zukünftige PER-Versuche an über lange Zeiträume gekäfigten Bienen. Eine signifikante Änderung der Futteraufnahme konnte nicht festgestellt werden: Sie lag über den gesamten Untersuchungszeitraum konstant bei etwa 0,002

116 Diskussion ml pro Stunde und Biene – dies kann als Indiz dafür gewertet werden, dass es durch die Applikation der Pilzsporen nicht zu Schädigungen des Verdauungstraktes kam. Der PER-Versuch sollte klären, ob es zu einer Beeinträchtigung des Lernvermögens durch Lecanicillium muscarium kam; dieser Aspekt ist gerade bei Honigbienen besonders wichtig: Arbeiterinnen orientieren sich während des Fouragierens in einem Umkreis von im Extremfall bis zu zehn Kilometern an himmlischen und terrestrischen Merkmalen, sie sind in diesem Zusammenhang zu einer hochdifferenzierten Mustererkennung fähig, verfügen über eine präzise endogene Chronometrie und eine sensible olfaktorische Wahrnehmung, die auch zentrales Element der Verwandtenerkennung ist (Lindauer 1963; Dyer et al. 1981; Arnold et al. 1996; Breed 1998; Moore et al. 1998; Dyer et al. 2008). Eine Beeinträchtigung dieser Fähigkeit durch ein exogenes Agens könnte einen erheblichen Einfluss auf das Funktionieren der Summe der Einzeltiere in der komplexen Sozialstruktur eines Bienenvolkes haben. Angesichts der zahlreichen, am assoziativen Duftlernen von Honigbienen beteiligten Strukturen kann bereits die Beeinträchtigung einer Komponente gravierende Folgen haben (Erber et al. 1980; Hammer et al. 1998). So ist für die systemischen Insektizide Imidacloprid und Fipronil nachgewiesen worden, dass sie auch weit unterhalb der letalen Konzentration die Besuchsraten an Futterquellen reduzieren; für Imidacloprid konnte in PER- Versuchen gezeigt werden, dass es die Fähigkeit zur Duftunterscheidung beeinträchtigt (Colin et al. 2004; Decourtye et al. 2004). Es bindet nach Untersuchungen von Nauen an nikotinische Acetylcholinrezeptoren der antennalen Loben; da nACh-Rezeptoren mit Hilfe von Immunassays auch für andere Regionen des Bienengehirns, die zentral für Lern- und Erinnerungsprozesse sind, wie die Alphaloben und die Pilzkörper nachgewiesen wurden, sind prinzipiell auch hier Beeinträchtigungen zu erwarten (Kreissl et al. 1989; Bicker 1999; Nauen et al. 2001). Die Wirkung entomopathogener Pilze beruht wesentlich auf Toxinen wie den nichtpeptidischen Agentien Oosporin und Bassianin, linearen Peptiden wie Leuconistin und Efrapeptin sowie zyklischen Peptiden, namentlich Beauvericin und Destruxin, die für diverse Spezies nachgewiesen worden sind (Khachatourians

1996). Zyklische Enniatine (C31-36H53-63N3O9) aus Fusarium spp. interagierten in

Versuchen mit GABAA-Rezeptoren in Rattengehirnen; für diesen Rezeptor wurden Gemeinsamkeiten mit GABA-Rezeptoren von Invertebraten beschrieben, so dass eine mögliche Wirkung pilzlicher Enniatine auch auf Insekten vermutet werden kann

117 Diskussion

(Anthony et al. 1993; Anke et al. 2002). Zunächst unbenommen der Beantwortung der Frage, ob eine Beeinträchtigung des Lernvermögens durch Lecanicillium muscarium auf der Wirkung ingestierter Pilztoxine, der Beeinflussung durch erst innerhalb des Bienenkörpers generierte Metaboliten des Pilzstoffwechsels oder der Induktion einer Immunantwort beruht, respektive, ob nur einer oder mehrere dieser Faktoren einen Einfluss haben und welcher physiologische Mechanismus ihm zugrunde liegt, zeigen die Ergebnisse des PER-Versuchs, dass es einen Einfluss von Lecanicillium muscarium auf die Fähigkeit zur Duftunterscheidung bei Apis mellifera gibt. Während die Lernkurve keine Auffälligkeiten zeigte, kam es innerhalb der ersten zwei Tage nach Behandlung zu einer hochsignifikanten Beeinträchtigung der Unterscheidungsfähigkeit bei Bienen, die mit Konidien von Lecanicillium muscarium in Kontakt kamen. Die daraus resultierende Annahme, der Kontakt zu Konidien könne eine subletale, negative Wirkung haben, wird durch den Befund des Immunassays gestützt: Lecanicillium muscarium induzierte sowohl in Tests mit Gramnegativen als auch in Tests mit Grampositiven Organismen eine neunfach erhöhte Antwort des Immunsystems; das galt mit einer Einschränkung (Paecilomyces fumosoroseus – Bacillus subtilis) ebenfalls für alle anderen untersuchten entomopathogenen Pilze. Damit wird die Annahme einer durch Induktion einer Immunantwort bedingten Reduktion des Lernvermögens des Individuums in den ersten beiden Tagen nach Kontakt mit dem untersuchten Stamm von Lecanicillium muscarium als bestätigt angesehen. Ob dieser Effekt tatsächlich Auswirkungen auf der Ebene des Staats hat, ließe sich nur in Versuchen an einer sehr großen Anzahl zuvor weitestgehend vereinheitlichter Völker untersuchen: Zu groß sind die interkolonialen Varianzen zum Beispiel in Bezug auf die Sammelleistung, als dass diese Fragestellung mit Versuchen an nur wenigen Völkern geklärt werden könnte. Völlig unabhängig von der Beobachtung einer Beeinträchtigung des Lernvermögens können natürlich zusätzlich auch pilzassoziierte Effekte, die ohne direkten Einfluss auf die Sozialstruktur sind und zunächst nur zu einer physiologischen Schädigung der Einzelbiene führen, durch Verringerung ihrer Vitalität, ohne ihren Tod zu verursachen, negative Konsequenzen für den Staat haben. Immunassays als Test für die Induktion einer Immunantwort nach Kontakt zu pathogenen Organismen sind für Honigbienen etabliert; so wies Randolt nach Injektion von Escherichia coli 682 über einen ähnlichen Ansatz differierende Immunantworten von Bienenlarven und Adultbienen nach (Randolt et al. 2008). Pilze initiieren nach Untersuchungen von

118 Diskussion

Hultmark und Stenbak an Drosophila melanogaster MEIGEN eine Immunantwort über die Toll-Kaskade (Hultmark 2003; Stenbak et al. 2004). Für Honigbienen nimmt Evans Gleiches an, nachdem seit der vollständigen Publikation des Genoms von Apis mellifera etliche Homologe zu beteiligten Drosophilagenen gefunden wurden (Evans et al. 2006; Weinstock et al. 2006). Inzwischen sind mit Abaecin, Apidaecin, zwei Defensinen, Hymenoptaecin und einem Lysozym sechs antimikrobielle Effektoren identifiziert, die bei Honigbienen nach Stimulation des Immunsystems exprimiert werden. Im Zusammenhang mit der Frage einer eventuellen Schädigung des Lernvermögens nach Induktion einer Immunantwort durch entomopathogene Pilze ist ein Versuch aber im Rahmen der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal verwendet worden und konnte zusammen mit den Ergebnissen der PER-Dressur zeigen, das erst die inklusive Untersuchung subletaler Effekte mit der vorgestellten Methodik eine Aussage über die potentielle Eignung entomopathogener Pilze, wie sie Kanga, Shaw und Meikle aufgrund ihrer Versuche treffen, zulässt (Kanga et al. 2002, 2003, 2006; Meikle et al. 2006, 2007, 2008a, 2008b, 2009; Shaw et al. 2002). Die Ergebnisse des vierjährigen Monitorings an 215 Versuchsvölkern verdeutlichen eine große Varianz des Parasitenbefalls zwischen den Völkern. Zwar haben zahlreiche Faktoren einen Einfluss auf die Populationsdynamik von Bienenvölkern und damit auch auf ihre Parasiten, was in Bezug auf unter Freilandbedingungen kultivierte Völker insbesondere für die Verfügbarkeit von Nahrungsquellen, die genetische Diversität innerhalb eines Volkes, aber auch die mikroklimatischen Gegebenheiten am Standort gilt, trotzdem gestattet diese Beobachtung die Vermutung, bisher unbekannte, interkolonial differierende intrakoloniale Faktoren wie zum Beispiel die Abundanz von Hyperparasiten, könnten einen nicht unerheblichen Einfluss auf die Abundanz und Pathogenität auch von Varroa destructor haben. Die Korrelationsanalyse des Befalls von Apis mellifera- Völkern mit Varroa destructor und dem Quantum der aus diesen Milben isolierbaren Pilze ohne Berücksichtigung ihrer Gattungszugehörigkeit für die Jahre 2005 bis 2008 stützt diese These: Es treten sowohl Jahre mit einer vergleichsweise starken Korrelation als auch praktisch beziehungslose Jahre auf. Ursächlich könnten zum Beispiel die erwähnten mikroklimatischen beziehungsweise klimatischen Bedingungen sein: Entomopathogene Pilze sind stenök in Bezug auf die relative Luftfeuchte. Verticillium lecanii, Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae

119 Diskussion beispielsweise zeigten in Experimenten von Ekbom und von Riba nur bei sehr hohen Feuchtewerten eine Infektiösität in Bezug auf ihre Wirte (Ekbom 1981; Riba et al. 1984). Eine Reduktion der relativen Feuchte um etwa 20 Prozent für 80 Stunden reduzierte in Versuchen von Drummond die Mortalität des vierten Larvenstadiums von Trialeurodes vaporariorum unter dem Einfluss von Verticillium signifikant (Drummond et al. 1987). Für die Sporulation entomopathogener Pilze ist eine hohe Luftfeuchte sogar essentiell und Mycar, ein kommerzielles Produkt auf der Basis von Hirsutella thompsonii, scheiterte am Markt, weil unter Feldbedingungen die relative Feuchte zu gering war, um eine Keimung zu ermöglichen (McCoy 1986; Osborne et al. 1992). Demgegenüber sinkt der Fortpflanzungserfolg von Varroa mit steigender relativer Luftfeuchte: Eine Zunahme von 59 bis 68 Prozent auf 79 bis 85 Prozent reduzierte in Versuchen von Kraus die Reproduktionsrate signifikant von 53 auf 2 Prozent (Kraus et al. 1997). Arbeiterinnen von Apis mellifera zeigen zwar gegenüber zu hohen Feuchtewerten im Brutnest eine geringere Toleranz im Sinn der Induktion einer regulierenden Antwort im Vergleich zu einer zu niedrigen Luftfeuchte, gemessen am präferierten Wert, der bevorzugte Bereich liegt mit 90 - 95 Prozent aber deutlich über dem Level, bei dem Varroa erfolgreich reproduziert (Doull 1976; Ellis et al. 2008). Da Honigbienen aber auch schon bei einer relativen Luftfeuchte von 55 Prozent im Brutnest in der Lage sind, erfolgreich zu reproduzieren, ergeben sich – basierend auf der Annahme, die relative Luftfeuchte sei bestimmender Faktor – zunächst zwei Erklärungsmuster für die Varianz zwischen den Jahren: Das Klima des jeweiligen Jahres könnte unmittelbar die Abundanz der Milben und der Pilze beeinflussen, ohne dass es einen ursächlichen Zusammenhang zwischen beiden Größen gibt, oder dies mittelbar tun, indem in Jahren mit überdurchschnittlichen relativen Feuchtewerten die Virulenz der Pilze positiv beeinflusst wird und damit die Abundanz der Milben sinkt. Weitere, nicht offensichtliche Parameter könnten stattdessen oder ergänzend natürlich ebenfalls eine Rolle spielen: Da unter den gefundenen Arten ein großer Anteil saprober Arten auftrat, ist zum Beispiel auch denkbar, dass diese Pilze von einer durch unbekannte Faktoren verursachten erhöhten Mortalität innerhalb der Varroapopulationen als Opportunisten profitierten. Dem steht allerdings entgegen, dass die Funde mutmaßlich milbenpathogener Pilze in einem Jahr geringen Varroabefalls und sämtlichst in Völkern mit einer individuell geringen Parasitenlast erfolgten.

120 Diskussion

Die Funde von Simplicillium lamellicola und Meira geulakonigii sind nach den Funden von Beauveria bassiana in Varroa durch Meikle, Steenberg und Garcia- Fernández weltweit die bisher einzigen Nachweise pathogener Pilze in Varroa (Meikle et al. 2006; Garcia-Fernández et al. 2008; Steenberg et al. 2010). Meikle allerdings fand Beauveria bassiana auf nicht oberflächensterilisierten Milben, Garcia- Fernández macht dazu keine Angaben – da Beauveria bassiana verbreitet auch aus Bodenproben isoliert wird, ist die endogene Herkunft möglicherweise nicht sicher. Die großen Sequenzhomologien des eigenen Isolats von Simplicillium lamellicola zu den Isolaten von Ilyas und von Lee, insbesondere aber der Versuch von Polar deuten auf eine mögliche Pathogenität für Varroa hin (Polar et al. 2005; Lee et al. 2007; Ilyas et al. 2009). Polar fand für Simplicillium lamellicola, der aus einer unidentifizierten Milbe isoliert wurde, in Tests gegen Boophilus microplus eine Reduktion der durchschnittlichen Lebensdauer des Wirts um 40 Prozent; Larven von Boophilus blieben durch den Pilz unbeeinflusst. Das in dieser Arbeit gefundene Isolat von Meira geulakonigii ist der weltweit zweite Fund dieses Pilzes in Arthropoden und der dritte nach der Erstbeschreibung (Boekhout et al. 2003). Die genaue Stellung der Art ist unklar; sie wird von Hibbett den Exobasidiomycetes zugeordnet (Hibbett et al. 2007). Der Großteil der Vertreter der Exobasidiomycetes kommt in einer saproben, haploiden Phase und einer dikaryotischen, parasitischen Phase vor (Begerow et al. 2006). In mehreren molekularen Analysen konnte gezeigt werden, dass die Exobasidiomyceten einen Teil der Ustilaginomyceten darstellen (Begerow ebd.). Die große Mehrheit der Arten der Ustilaginomycotina sind Parasiten höherer Pflanzen, lediglich Malassezia parasitiert auf Warmblütern. Arten der Gattung Meira nähmen als Arthropodenparasiten damit eine Sonderstellung innerhalb der Ustilaginomycotina ein, auch wenn Tanaka Meira argovae BOEKHOUT, GERSON AND SZTEIJNBERG auf Bambusschösslingen fand und Meira nach phylogenetischen Analysen neben das

Schwestertaxon Dicellomyces stellt, das mit Dicellomyces gloeosporus OLIVE ebenfalls einen Parasiten auf Bambusblättern enthält (Tanaka et al. 2008). Begerow ordnet Meira innerhalb der Exobasidiomycetes den Exobasidiales und dort der Familie Brachybasidiaceae mit den Gattungen  Brachybasidium  Dicellomyces  Exobasidiellum

121 Diskussion

 Kordyana  Meira und  Proliferobasidium zu (Begerow et al. 2006). Allerdings gilt auch für die Brachybasidiaceae, was bereits für die Exobasidiomycetes galt: In Abhängigkeit von der Auswahl der in die Untersuchung einbezogenen Spezies und der verwendeten Topologieanalyse werden sie entweder als Mono- oder als Paraphylum angesprochen. Der Fund des eigenen Isolats von Meira geulakonigii könnte aufgrund der spezifischen Besonderheiten der Spezies damit einen wichtigen Beitrag zur Klärung der phylogenetischen Beziehungen innerhalb der Ustilaginomycotina liefern. Bisher untersuchte Vertreter der Brachybasidiaceae sind Phytoparasiten auf Monokotyledonen – auch in dieser Hinsicht nähme Meira eine Sonderstellung ein, fand Boekhout sein Isolat doch auf Citrus grandis (Boekhout et al. 2003). In Studien zur möglichen evolutionären Entwicklung der Exobasidiales zeigten Vertreter der Brachybasidiaceae, dass die komplexen Strukturen, mit deren Hilfe der Wirt parasitiert wird, nicht innerhalb von Haustorien lokalisiert sind, sondern von interzellulären Hyphen gebildet werden, die Wirtszellen anliegen (Begerow et al. 2002). Die Sporulation findet auf der Oberfläche der Wirte statt. Die hilaren Appendizes der Basidiosporen sind bei Brachybasidium und Dicellomyces adaxial orientiert; probasidiale Verdickungen sind immer vorhanden. Die phylogenetischen Beziehungen der Subtaxa der Exobasidiales korrelieren mit denen ihrer Wirte, was als Hinweis auf Cospeziation verstanden wird (Begerow, ebd.). Die bisher untersuchten Vertreter der Ordnung sind dimorphisch und zeigen zyklisch ein saprobiontisches, hefeähnliches Stadium sowie parasitisch lebende Myzele (Bauer et al. 2000). Dieser Umstand könnte sowohl den Fund von Meira geulakonigii in Varroa klären, als auch das Vorkommen von hyphenartigen Strukturen im mikroskopischen Bild: Die saprobiontischen Phasen der Schwestertaxa metabolisieren in diesem Stadium überwiegend Mono- und Disaccharide und damit einfache Zucker, die zahlreich im Nektar von von Bienen aufgesuchten Blüten und in der Folge im Honig vorkommen, so dass die saprobe Phase von Meira möglicherweise in einigen Blüten oder im Stock persistiert (Begerow, mdl.). Die hyphenähnlichen Strukturen könnten demnach als Bestandteil der parasitischen Phase angesprochen werden, die sich als Residuen der Ausgangskultur in der Reinkultur finden; eine Vergleichsmöglichkeit dazu ist aus anderen Quellen allerdings

122 Diskussion nicht bekannt – bisher ist nur die Anamorphe von Meira identifiziert. Der Fund der Teleomorphen könnte – wenn sich ein Parasitieren auf Varroa destructor bestätigte – ein „missing link“ innerhalb der Ustilaginomycotina sein: Innerhalb dieser Unterabteilung der Basidiomycota mit rund 1800 Arten gibt es bisher mit Malassezia nur eine einzige Gattung, deren Anamorphe nicht auf Pflanzen sondern auf homoiothermen Vertebraten parasitiert. Eine Beschreibung auch der Teleomorphen eines Arthropodenparasiten, der sowohl auf Pflanzen als auch auf Tieren gefunden wird, könnte demnach einen wichtigen Beitrag zur Klärung der Frage leisten, wie innerhalb der Subdivisio ein Interregnumsprung in Bezug auf den Wirt möglich war. Boekhout fand den Pilz ebenfalls in einer Milbe (Boekhout et al. 2003). Das von

Boekhout gefundene Isolat wurde von Paz gegen Eutetranychus orientalis KLEIN,

Panonychus citri MCGREGOR, Tetranychus cinnabarinus BOISDUVAL und Tetranychus urticae (alle Tetranychidae), Phyllocoptruta oleivora (Eriophyidae) sowie den Nicht-

Zielorganismus Rhizoglyphus robini CLAPAREDE (Acaridae), und die Raubmilben

Phytoseiulus persimilis ATHIAS-HENRIOT, Iphiseius degenerans BERLESE und

Neoseiulus californicus MCGREGOR (alle Phytoseiidae), getestet; die Applikation von Konidien reduzierte die Milbenpopulation aller Phytophagen mit Ausnahme von Rhizoglyphus robini um 60 Prozent, die Applikation pilzlicher Metabolite um 86 Prozent, verglichen mit den Kontrollapplikationen (Paz et al. 2007a). Die Raubmilben wurden, abgesehen von Iphiseius degenerans, nicht beeinträchtigt, was für eine hohe Selektivität der untersuchten Spezies spricht. Paz´ Befund (ebd.), dass es mit konventionellen mykologischen Methoden nicht möglich war, Meira-Isolate von Citrus-Oberflächen zu gewinnen, legte den Verdacht nahe, es handele sich bei Meira nicht um einen Epi- sondern um einen Endophyten. In Anlehnung an Stone wies Paz daraufhin Meira mit klassischen Methoden, sowie rasterelektronenmikroskopisch und im Rahmen einer quantitativen Real-Time-PCR im Endokarp der Früchte nach (Stone et al. 2000). In einer weiteren Studie mit ähnlichen Ergebnissen konnte Paz beobachten, dass Meira nicht in den Körper der Milben eingedrungen war, die ohne physischen Kontakt zum Pilz gestorben waren; gleichwohl war Meira in der Lage, auf den Milbenkadavern zu wachsen (Paz et al. 2007b). Sztejnberg untersuchte ebenfalls Boekhouts Isolat und fand eine hochsignifikante antagonistische Wirkung gegenüber Phyllocoptruta oleivora, Panonychus citri, Tetranychus cinnabarinus und Sphaerothecafusca spec. (Sztejnberg et al. 2004). In Bezug auf Sphaerothecafusca spec. allerdings könne es sich Sztejnberg zufolge lediglich um einen Sekundäreffekt

123 Diskussion handeln, da die Milben mutmaßlich als Vektor fungieren. Gerson bestätigte diese Effekte: Meira geulakonigii tötete in Versuchen 80 – 90 Prozent der Individuen aus mehreren Spinnmilbenarten; auch die Beobachtung von Paz, dass die Applikation pilzfreier Extrakte des Kulturmediums signifikant auf die Milbenpopulation wirkte, wird bei Gerson bestätigt und stützt die Annahme, dass zumindest ein Teil der pathogenen Wirkung auf Pilztoxine zurückzuführen ist (Gerson et al. 2008). Darüber hinaus identifizierten quantitative RT-PCR-Untersuchungen Meira geulakonigii in Blüten und Fruchtschalen von Citrus grandis – ebenda fand Yasuda Meira geulakonigii und schloss, der Pilz sei verantwortlich für Fruchtschäden (Yasuda et al. 2007). Diese Annahme wird von Gerson nicht bestätigt, sondern im Gegenteil aufgrund der Assoziation des Pilzes mit Phyllocoptruta oleivora geschlussfolgert, der Pilz fungiere als „endophytischer Bodyguard“ auf Citrus grandis und möglicherweise anderen Pflanzen – demnach stünde die Identifikation des eigentlichen Wirtes auf Pyrus pyrifolia, wo Yasuda den Pilz fand, noch aus. Würde er gefunden, verwunderte auch der Zusammenhang zwischen der Abundanz von Meira und den beobachteten Fruchtschäden auf Pyrus nicht, die Yasuda Meira zuschrieb. Die Annahme, der Pilz sei primär milbenassoziiert und damit als Hyperparasit nur sekundär auf der Wirtspflanze zu finden, wird durch die vorliegenden Ergebnisse sehr gut gestützt, fehlt im Fall des Systems Apis mellifera – Varroa destructor – Meira geulakonigii der pflanzliche Wirt doch völlig. Zumindest theoretisch kann aber auch eine tatsächlich endophytische Herkunft des Isolats von Yasuda nicht ausgeschlossen werden. Bei Meira handelt es sich, solange keine Einigung zur phylogenetischen Stellung besteht, um eine Ordnung incertae sedis; für andere arthropodenpathogene Pilze, unter anderem Metarhizium anisopliae und drei Verticillium-Spezies, konnte Spatafora in einer Studie an sechs locis von insgesamt 69 Vertretern hauptsächlich der Clavicipitaceae zeigen, dass es in mindestens fünf bis acht Fällen zu Wirtswechseln auf Ebene des Regnums kam (Spatafora et al. 2007). Ausgehend von einem basalen, tierpathogenen Vorläufer fanden drei bis fünf Wechsel zu Pilzen, ein bis zwei Wechsel zu anderen Tieren und ein Wechsel zu Pflanzen statt. Die völlige Übereinstimmung der publizierten Sequenzdaten von Boekhout und Yasuda spricht allerdings dagegen (Boekhout et al. 2003; Yasuda et al. 2007). Da die Klassifizierung des eigenen Isolats auf der Basis von Sequenzdaten eines loci erfolgte, dieses Isolat sich aber von Boekhouts und Yasudas Isolaten – geringfügig – distinkt zeigt, wäre zu klären, inwiefern ein Vergleich von Daten weiterer locorum sowie physiologischer

124 Diskussion und morphologischer Daten eine genauere Abgrenzung des eigenen Isolats zuließe. Denkbar ist, dass es sich beim eigenen Isolat um einen möglicherweise nicht nur milben- sondern sogar Varroaspezifischen Pilz handeln könnte, der damit ein sehr aussichtsreicher Kandidat für weitergehende Untersuchungen zu seiner Einsetzbarkeit als Varroaantagonist wäre. Mit der in der vorliegenden Untersuchung etablierten Methodik ist dafür eine Grundlage geschaffen worden. Zu prüfen wäre zunächst in vitro die Hypothese, dass Meira geulakonigii ursächlich für den geringen Milbenbefall der Völker ist, in denen der Pilz vorkommt, respektive, ob Meira keinen oder einen vernachlässigbar geringen negativen Einfluss auf alle Stadien von Apis mellifera hat. Als nächster Schritt schlösse sich eine Untersuchung im Halbfreilandversuch an, um die artifiziellen Bedingungen von in vitro-Versuchen an Bienen als Einflussfaktoren auszuschließen. Nicht zuletzt wäre ein Test des Einflusses auf Nicht-Zielorganismen obligat: Der weitestgehend unkontrollierte Ex- und Import von Honigbienen, und damit auch von Varroa, bedingt immer auch die Gefahr der Verschleppung anderer Organismen; in Europa könnte Meira allochthon sein, so dass eine Abschätzung des Risikopotentials bei einer Freisetzung angebracht wäre. Vorausgesetzt, Meira erwiese sich als geeignetes Kontrollagens und ungefährlich für andere Organismen, stünde, wenn der Pilz im technischen Maßstab kultivierbar ist, ein Antagonist zur Verfügung, der zumindest einen Teil der derzeitigen Probleme in der Kontrolle von Varroa destructor lösen würde.

125 Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Vor etwa 60 Jahren fand in Ostasien ein Wirtswechsel der ektoparasitischen Milbe Varroa destructor von der östlichen Honigbiene Apis cerana auf die ursprünglich nicht sympatrisch vorkommende westliche Honigbiene Apis mellifera nach zuvor erfolgter weltweiter, anthropogen bedingter Verbreitung von Apis mellifera als Nutztier statt. Unter dem Einfluss des präadaptierten Parasiten kommt es nahezu im gesamten Verbreitungsgebiet von Apis mellifera angesichts unbefriedigender verfügbarer Bekämpfungsstrategien zu massiven Verlusten von Bienenvölkern und damit zu gravierenden wirtschaftlichen Schäden durch Ausfall dieses wichtigen Bestäubers in landwirtschaftlichen Kulturen entomophiler Nutzpflanzen. Seit der Jahrtausendwende wurde deshalb auch versucht, Hyperparasiten, und zwar vor allem Pilze, als einsetzbare Antagonisten von Varroa zu finden. Die bisher vorliegenden Studien konzentrierten sich vor allem auf die bereits gegen andere Arthropoden erfolgreich eingesetzten Pilze Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana und Paecilomyces fumosoroseus. Während einige Untersuchungen die getesteten Stämme als geeignet klassifizierten, fanden andere, zum Teil auch vom gleichen Autor und mit demselben Stamm durchgeführt, keine Effekte. Ursächlich dafür ist zum einen die große Varianz in der Pathogenität der sehr pleomorphen Spezies, die die Vergleichbarkeit der an verschiedenen Stämmen gewonnenen Ergebnisse erschwert, zum anderen die Heterogenität der zum Einsatz gekommenen und zum Teil diskutierbaren Untersuchungsmethodiken. Die vorliegende Arbeit schafft eine valide, reproduzierbare Basis, um in Frage kommende Pilze unter vergleichbaren Bedingungen zu testen. Sie führt mit in vitro- Untersuchungen an Larven ab dem L1-Stadium, PER-Tests zur Identifikation subletaler Effekte und einem Immunassay drei neue, bisher in diesem Zusammenhang nicht zum Einsatz gekommene Methoden ein, die die Beantwortung von mit bisherigen Analysen nicht zugänglichen offenen Fragen erlauben. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Stämme von Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana und Paecilomyces fumosoroseus zeigten sich sowohl in vitro als auch im Halbfreilandversuch gegenüber Varroa destructor wirkungslos. Larvenstadien und Puppenstadium von Apis mellifera wurden nicht beeinträchtigt; Lecanicillium muscarium und Beauveria

126 Zusammenfassung bassiana schädigten in vitro allerdings adulte Bienen signifikant. Zudem wurden für Lecanicillium muscarium negative subletale Effekte auf Apis mellifera nachgewiesen: Der Pilz reduzierte die Fähigkeit zu assoziativem Lernen an den ersten beiden Tagen nach Kontakt mit ihm. Diese Beobachtung korreliert mit dem Nachweis einer Induktion des Immunsystems durch einen sensitiven Test an Bacillus subtilis und Escherichia coli: Mit nur einer Ausnahme (Paecilomyces fumosoroseus/Bacillus subtilis) kam es zu einer starken Antwort, die als Beleg einer physiologischen Belastung durch diese Pilze angesehen wird. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten auch spezifische, acaripathogene Pilze gesucht werden, die als Antagonisten einsetzbar sein könnten. Die dabei zum Einsatz gekommene Methodik ist ebenfalls erstmals in diesem Zusammenhang angewandt worden und führte mit dem Fund von Simplicillium lamellicola und Meira geulakonigii zum Erfolg. Die Pilze sind nach den Funden des unspezifischen Pilzes Beauveria bassiana durch Meikle, der Beauveria aber in unsterilisierten Milben fand, und Steenberg die ersten Funde entomo- beziehungsweise potentiell acaripathogener Pilze in Varroa (Meikle et al. 2006; Steenberg et al. 2010). Das in der vorliegenden Untersuchung gefundene Isolat von Meira geulakonigii ist darüber hinaus der weltweit zweite Fund dieses Pilzes in Arthropoden und der dritte nach der Erstbeschreibung. Bei Meira handelt es sich um eine Ordnung incertae sedis. Als Arthropodenparasit wäre Meira geulakonigii eine große Ausnahme innerhalb der Ustilaginomycotina und könnte einen wichtigen Beitrag zum Verständnis von Cospeziationsprozessen beziehungsweise Wirtswechseln zwischen höheren Taxa liefern. Möglich ist, dass Meira geulakonigii in einem saprobiontischen, hefeähnlichen Stadium in Blüten oder in Bienenvölkern vorkommt, in welchem einfache Zucker metabolisiert werden, und in einem hyphenähnlichen Stadium als Milbenparasit – die Typusbeschreibung stammt von einem Isolat aus Phyllocoptruta oleivora, das später auch als Endophyt in deren Wirt Citrus grandis gefunden wurde. Für die Möglichkeit einer spezifischen Acaripathogenität des eigenen Isolats spricht, dass es in einem Apis mellifera-Volk gefunden wurde, das zu einem Cluster von Völkern gehörte, die in Korrelationsuntersuchungen der Varroaabundanz und der Zahl der aus Varroa isolierbaren Pilze einen deutlichen Zusammenhang von geringem Varroabefall und einem starken Pilzvorkommen zeigten. Ein aussichtsreicher Kandidat für einen einsetzbaren Varroaantagonisten könnte mit dem in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Isolat von Meira geulakonigii damit gefunden sein.

127 Summary

6 Summary

60 years ago the ectoparasitic mite Varroa destructor originating from the eastern honey bee Apis cerana began to infest colonies of the western honey bee Apis mellifera after its global spread by man. Preadapted, Varroa caused serious economic damage, since Apis mellifera is an important pollinator of many crops. Currently available counterstrategies are not satisfying: synthetic acaricides lead to residues in honey and wax and triggered resistance in Varroa while biotechnical methods are time-intensive. The use of organic acids is of limited success if not applied in an exact manner. Great efforts have been made to select Varroa-resistent honeybees but no success has been reported to date. Some years ago one started to test already known unspecific entomopathogenic fungi against Varroa, namely Lecanicillium muscarium, Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana and Paecilomyces fumosoroseus. Results of studies are contradictory: while some reported a reduction of mites, others did not find any effect. On the one hand this may be caused by the use of different strains of pleomorphic fungi, on the other hand studies differ in methods used and sometimes lack essential techniques like standardization of bee material. The examinations presented here create a reproducible basis for further analyses. Three techniques not yet used in honey bee-fungus interaction research are introduced to investigate potential fungus-induced effects on honey bee larvae and pupae, learning ability of adult bees and induction of immune system response of adult bees by contact with fungi. The strains analyzed in this study did not have any effect on Varroa, neither in vitro nor in semi-field studies, but harmed adult bees in two cases (Lecanicillium muscarium, Beauveria bassiana). Furthermore, Lecanicillium muscarium turned out to reduce learning ability of adult bees significantly within the first two days after application and induced a strong reaction of the immune system. A second aim of this study was to find specific acaripathogenic fungi, again using a new approach. With Simplicillium lamellicola and Meira geulakonigii two new fungi never found before in Varroa have been isolated. The own isolation of Meira geulakonigii is the third worldwide after Boekhout´s first description of Meira found in Israel (Boekhout et al. 2003). Still classified as an order incertae sedis, Meira as a member of Ustilaginomycotina is assumed to live in a saprobiontic, yeast-like phase

128 Summary und a parasitic phase with hyphae. While Simplicillium lamellicola is known to be entomopathogenic, Meira geulakonigii has only been found in mites or in plant tissues and therefore maybe is solely acaripathogenic. This hypothesis is supported by correlation analyses between 2005 and 2008: For four years dependence is shown between occurrence of fungi and frequency of mites in bee hives. Both Simplicillium and Meira have only been found in a year with such a dependence and in hives with many fungi while bees and cells are less parasitized by mites. Therefore, the present results suggest that Meira geulakonigii has the potential to be the longed for biocontrol agent to control the honey bee devastating mite Varroa destructor.

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144

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten Dissertation um sechs in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare. Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen wurde.

Bochum, den 26. Februar 2010

(Markus Holt)

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Markus Holt, geboren am 27. April 1971

Curriculum vitae seit 04.2005 Promotion in der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum Gutachter: Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner Prof. Dr. Günter A. Schaub 10.1994 – 11.2004 Studium der Biologie an der Universität Bochum Abschluss: Diplom Diplomarbeit in der AG Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie: „Mikrosatelliten-basierte Untersuchungen zur Soziogenetik des Europäischen Luchses (Lynx lynx (L.))“ 08.1981 – 06.1990 Heisenberg-Gymnasium in Gladbeck Abschluss: Allgemeine Hochschulreife, Note 1,4 08.1977 – 06.1981 Käthe-Kollwitz-Grundschule in Gladbeck seit 10.2009 Studienkoordinator des Fachbereichs Biologie der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster 02.2008 – 09.2009 Leiter des Ausbildungslabors für Biologielaboranten der Ruhrkohle AG Bildung 03.2007 – 07.2007 Selbständiger Dozent der Ruhrkohle AG Bildung 01.2005 – 09.2006 Wissenschaftlicher Mitarbeiter der AG Verhaltensbiologie und Didaktik der Biologie 01.2002 – 03.2003 Mitarbeiter des Instituts für Management und Organisation (IMO) Bochum 05.1995 – 04.2009 Mitarbeiter des Westfälischen Industriemuseums Henrichshütte Hattingen, Entwicklung und Durchführung des Programms „Ökologie der Industriebrache“

12.2006 – 01.2008 Organisation des Doktorandenforums der Internationalen Graduiertenschule Biowissenschaften der Ruhr-Universität Bochum

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Danksagung

Mein Dank gilt zuvorderst Prof. Dr. Wolfgang H. Kirchner für die Entwicklung des Themas der Arbeit, vor allem aber für seinen immer zielführenden Rat und für sein Vertrauen, das unabdingbare Basis einer selbständigen Arbeit war. Für die freundliche Übernahme des Zweitgutachtens, für konstruktive Diskussionen und die Kooperation im Rahmen des Immunassays möchte ich mich bei Prof. Dr. Günter A. Schaub bedanken – seiner Mitarbeiterin Dipl.-Biol. Jennifer Pausch sei herzlich für ihre praktische Unterstützung in der Durchführung des Assays gedankt. Wissenschaftliche Arbeit profitiert immer von einem Austausch zwischen einzelnen Disziplinen – für durchweg hilfreiche Hinweise möchte ich mich stellvertretend für alle bei Jun. Prof. Dr. Julia Bandow, Prof. Dr. Dominik Begerow, PD Dr. Elke Genersch (Länderinstitut für Bienenkunde Hohen Neuendorf), PD Dr. Minou Nowrousian und PD Dr. Christine Struck (Universität Rostock) bedanken. Ein ganz besonderer Dank gilt Dr. Pia Aumeier: Zum einen wären die Labor- und Halbfreilandversuche an Bienen und Milben genauso wie das Pilzscreening aufgrund des sehr erheblichen Versuchstierbedarfs ohne den von ihr exzellent geführten, großen Bestand an Versuchsvölkern schlicht unmöglich gewesen, zum anderen stand sie immer für einen freundschaftlichen und kompetenten Rat zur Verfügung. Dem Landesgesundheitsamt Baden-Württemberg und der Firma Koppert Biological Systems danke ich für die Zurverfügungstellung von Pilzstämmen für die Labor- und Halbfreilandversuche. Meinen Codoktorandinnen Dr. Julia Eggermann, Dr. Christina Heimken und Dr. Nina Minkley danke ich dafür, dass sie wesentlich zu einem guten Arbeitsklima beigetragen haben: Nullius boni sine socio iucunda possessio est (Seneca). Nicht zuletzt möchte ich mich bei meinen Arbeitgebern der Jahre 2007 – 2010, der Ruhrkohle AG und der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster, bedanken: Für ihr Entgegenkommen, das insbesondere in der Bereitschaft bestand, mir bis an die Grenzen des ihnen Möglichen Flexibilität einzuräumen, um neben der Arbeit die Promotion fortführen zu können.

Finis coronat opus (Ovid)

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