Interacções Toxicológicas Entre O Álcool E a Ecstasy

Helena de Oliveira Pontes

INTERACÇÕES TOXICOLÓGICAS ENTRE O ÁLCOOL E A ECSTASY. ESTUDOS IN VIVO E IN VITRO.

Orientador: Professora Doutora Maria de Lourdes Pinho de Almeida Souteiro Bastos

Co-orientadores: Professor Doutor Félix Dias Carvalho Professor Doutor Fernando Manuel Gomes Remião

Porto, 2009

Aos meus pais, Arminda e João Carlos À minha irmã Diana

Ao Fernando

Os estudos apresentados nesta dissertação foram realizados no Laboratório Associado REQUIMTE/Serviço de Toxicologia da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto. Estes estudos contaram com o apoio financeiro da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) através da atribuição de uma Bolsa de Doutoramento (SFRH/BD/18527/2004) e do Fundo Europeu para o Desenvolvimento Regional (FEDER) (POCI/SAU-FCF/57187/2004).

Fazem parte integrante desta dissertação os seguintes trabalhos já publicados:

Artigos em revistas internacionais com arbitragem científica

I. Pontes H, Duarte JA, Guedes de Pinho P, Soares ME, Fernandes E, Dinis- Oliveira RJ, Sousa C, Silva R, Carmo H, Casal S, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice. Toxicology. 252: 64-71.

II. Pontes H, Santos-Marques MJ, Fernandes E, Duarte JA, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Effect of chronic ethanol exposure on the hepatotoxicity of ecstasy in mice: An ex vivo study. Toxicology In Vitro. 22: 910- 20.

III. Pontes H, Guedes de Pinho P, Casal S, Carmo H, Santos A, Magalhães T, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Gas chromatography determination of acetone, acetaldehyde, ethanol and methanol in biological matrices and cell culture. Aceite para publicação no Journal of Chromatographic Science.

IV. Pontes H, Carvalho M, Guedes de Pinho P, Carmo H, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Ethanol, the forgotten artifact in cell culture. Archives of Toxicology. 82: 197–8.

V. Pontes H, Sousa C, Silva R, Fernandes E, Carmo H, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes. Toxicology (doi: 10.1016/j.tox.2008.09.009)

Resumos em actas de encontros científicos publicados em revistas com arbitragem cientifica

I. Pontes H, Marques MJ, Remião F, Carvalho F, Bastos MdL (2006) The repeated exposure of mice to ethanol increases its susceptibility to ecstasy- induced hepatotoxicity. Revista Portuguesa de Farmácia. 52:33

II. Pontes H, Marques MJ, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2006) Ethanol and ecstasy: Allied enemies of freshly isolated mouse hepatocytes. Toxicology Letters. 164 (Suppl 1):S205

III. Pontes H, Fernandes E, Duarte JA, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2007) Ethanol and ecstasy: a dangerous cocktail to the liver? Toxicology Letters. 172 (Suppl 1):S240

IV. Pontes H, Silva R, Fernandes E, Carmo H, Remião F, Carvalho F, Bastos ML (2008) Ethanol increases MDMA toxicity to primary rat hepatocytes cultures. Toxicology Letters. 180 (Suppl 1):S162

AGRADECIMENTOS

Seguir trilhos é fácil, mas quando temos que pisar terrenos onde nunca ninguém andou, temos que ser nós a fazer o nosso caminho correndo o risco de ter que voltar atrás algumas vezes, mas não é esse o encanto da ciência? Um Doutoramento é, por isso, um caminho de aprendizagem que é feito pelos nossos próprios passos, à medida que crescemos quer a nível pessoal, quer a nível científico. Mas, a beleza da caminhada depende dos que vão connosco. Por isso, gostaria de agradecer a todos aqueles que contribuiram para a concretização deste trabalho, embora temendo nunca encontrar as melhores palavras ou as palavras suficientes para exprimir a minha imensa gratidão. Gostaria, assim, de expressar o meu mais sincero agradecimento:

À Professora Doutora Maria de Lourdes Bastos, em primeiro lugar, por me ter aceite como aluna de Doutoramento e, sobretudo, pela orientação rigorosa e magistral desta dissertação e de todo o trabalho científico que a ela deu origem. Espero que, um dia, possa sentir-se muito orgulhosa desta sua pupila.

Ao Professor Doutor Félix Dias Carvalho pela co-orientação deste trabalho e pelo constante incentivo e apoio. Obrigada por nunca desanimar e por aquelas palavras de alento nas horas em que remávamos contra a corrente porque o trabalho não corria como gostaríamos.

Ao Professor Doutor Fernando Remião, pela co-orientação deste trabalho, e pela paciência e pela disponibilidade permanente para interromper tudo o que estivesse a fazer para ajudar a resolver algum imprevisto, para esclarecer alguma dúvida ou para dar uma palavra de apoio.

À Engenheira Maria Elisa Soares, pelo apoio e preocupação com que acompanha os alunos do laboratório de Toxicologia, para que consigamos ultrapassar todas as dificuldades com que nos deparamos e encaremos cada dia com um sorriso. É de facto como uma mãe para todos nós. Obrigada pela

amizade, pelo carinho, pela colaboração nos trabalhos experimentais, pelos momentos de alegria e por me ter ensinado a ser uma pessoa cada vez melhor. Nunca esquecerei os dias do famoso Coro da Toxicologia que, quando ensaiava, não deixava ninguém indiferente...

À Professora Doutora Maria Helena Carmo pela amizade com que me distingue, por todos os bons momentos que passámos, quer no laboratório, quer fora dele, e pelo apoio que me deu desde o início destes trabalhos ensinando-me que um bom trabalho surge quando somos exigentes connosco próprios. Também quero agradecer a resposta pronta, e as palavras de apoio que nunca vou esquecer, nos momentos menos bons. Obrigada, Boss!

Ao Professor Doutor José Alberto Duarte, pela sua valiosa colaboração neste trabalho, por nunca dizer que não quando lhe pedi ajuda ou conselho, mesmo que isso significasse trabalhar em dias feriados, por tudo o que me ensinou sobre microscopia e por me ter aceite como mais um dos seus alunos.

À Doutora Paula Guedes de Pinho e à Professora Susana Casal, pelo seu contributo na selecção, validação e aplicação das técnicas de cromatografia gasosa essenciais à realização deste trabalho. Obrigada pelos conhecimentos que me transmitiram!

À Renata, pela amizade que nos tornou inseparáveis, pelas gargalhadas com ou sem motivo, pelas cantorias e pelas coreografias que nos ajudavam a ultrapassar aqueles dias em que nada corria bem e pela ajuda quando o trabalho ultrapassava a capacidade das minhas duas mãos. Um obrigado muito especial por me ajudar na formatação desta dissertação. Não sei se algum dia conseguirei retribuir tudo aquilo que recebi de ti!

À Professora Doutora Márcia Carvalho, pelo incentivo, pelos conselhos úteis, e sobretudo, por me alertar para os pequenos detalhes que podem dar grandes frutos.

À Professora Doutora Eduarda Fernandes, pelo incentivo, pelo apoio e pela sua indispensável contribuição para este trabalho ao extrair a MDMA.

A todos os companheiros de laboratório (Ricardo, Miguel, Carla, Daniel, Görkem, Maria João, João, Vera, Filipa e mais recentemente a Luciana) por fazerem com que cada dia seja diferente do anterior, pelo companheirismo, pelo bom ambiente de trabalho e pela amizade que irei sempre retribuir.

Às técnicas Júlia Caramez, Conceição Morais e Graziela Fernandes (já aposentada) e à D. Celeste, pelo apoio, disponibilidade e amizade que contribuiram para que estes trabalhos corressem sempre da melhor forma.

Aos amigos que me têm acompanhado neste percurso (Vera, Elvira, Horácio, Dinis, Sirigaitas de Farmácia, Ema, Marisa), pela amizade, pelo interesse demonstrado no meu trabalho e por me ajudarem a estimular o gosto pela investigação e a curiosidade científica.

Finalmente, quero agradecer ao Fernando e à minha família, em especial ao meus pais, Arminda e João Carlos, e à minha irmã Diana, por tudo! Pelo apoio incondicional que me deram em todas as decisões que tomei e que, por vezes, obrigaram a alguns sacrifícios, pela paciência, pelo amor e carinho e pelas palavras de conforto, quando o trabalho não corria tão bem e o meu humor não era dos melhores. Espero que vocês possam orgulhar-se de mim da mesma forma que eu me orgulho de vocês!

ÍNDICE GERAL

______Índice Geral

ÍNDICE GERAL

RESUMO...... XVII ABSTRACT...... XXIII LISTA DE ABREVIATURAS...... XXIX 1. INTRODUÇÃO...... 3 1.1. História da MDMA...... 4 1.2. Relação estrutura/actividade da MDMA...... 6 1.3. Produção de MDMA...... 7 1.4. Comercialização de MDMA...... 7 1.5. Farmacocinética da MDMA...... 8 1.5.1. Absorção...... 8 1.5.2. Distribuição ...... 10 1.5.3. Metabolismo...... 10 1.5.4. Excreção...... 14 1.6. Mecanismo de acção e principais efeitos da MDMA...... 14 1.6.1. Efeito na libertação, transporte e receptores das monoaminas neurotransmissoras...... 15 1.6.2. Inibição da monoamina oxidase (MAO) ...... 19 1.6.3. Inibição da triptofano hidroxilase (TH) ...... 19 1.6.4. Alterações da expressão genética...... 20 1.6.5. Efeito neuroendócrino...... 21 1.6.6. Alterações no sistema termorregulador ...... 22 1.6.7. Efeito no fluxo sanguíneo e actividade cerebral...... 25 1.7. Efeitos tóxicos da MDMA ...... 25 1.7.1. Efeitos tóxicos agudos ...... 27 1.7.2. Efeitos tóxicos a longo prazo ...... 29 1.7.3. Mortes associadas ao consumo de MDMA...... 31 1.8. Estudos epidemiológicos sobre a utilização da MDMA...... 43 1.8.1. Onde? – Locais de consumo de MDMA ...... 53 1.8.2. Como e quando? – Padrões de consumo de MDMA...... 53 1.9. Factores condicionantes dos efeitos da MDMA ...... 54 1.9.1. Dose de MDMA...... 55 1.9.2. Condições ambientais no momento do consumo ...... 59

I Índice Geral ______

1.9.3. Características do consumidor de MDMA...... 62 1.9.3.1. Idade...... 62 1.9.3.2. Etnia ...... 64 1.9.3.3. Género...... 64 1.9.3.4. Variabilidade farmacogenética interindividual...... 68 1.9.3.4.1. Isoenzimas do citocromo P450...... 68 1.9.3.4.2. Catecol-O-metiltransferase...... 70 1.9.3.4.3. UDP-glucuronosiltransferase...... 71 1.9.3.4.4. Sulfotransferase (SULT)...... 71 1.9.3.4.5. Receptores da 5-HT ...... 71 1.9.3.4.6. Receptores da DA ...... 72 1.9.3.4.7. Transportador da 5-HT ...... 72 1.9.3.5. Orientações sexuais ...... 73 1.9.4. Alterações fisiológicas e fisiopatológicas ...... 73 1.9.4.1. Gravidez ...... 74 1.9.4.2. Patologias subjacentes ao consumo de MDMA...... 76 1.9.4.2.1. Hipo/hipertiroidismo...... 76 1.9.4.2.2. Insuficiência hepática ...... 77 1.9.4.2.3. Insuficiência renal...... 77 1.9.4.2.4. Patologias inflamatórias e infecciosas...... 79 1.9.4.2.5. Patologia cardíaca...... 79 1.9.4.2.6. Diabetes mellitus ...... 80 1.9.4.2.7. Obesidade ...... 81 1.9.5. Interacções da MDMA com outros compostos...... 81 1.9.5.1. Fármacos...... 83 1.9.5.1.1. Antidepressivos ...... 93 1.9.5.1.1.1. Inibidores selectivos da recaptação da serotonina (ISRS) ...... 93 1.9.5.1.1.2. Inibidores da monoamina oxidase (IMAO)...... 95 1.9.5.1.2. Anti-retrovirais ...... 97 1.9.5.2. Alimentos...... 99 1.9.5.3. Contaminantes das pastilhas de ecstasy...... 104 1.9.5.3.1. Excedentes e sub-produtos da síntese de MDMA...... 107

II ______Índice Geral

1.9.5.3.2. Outros estimulantes anfetamínicos [anfetamina, MTA, fenfluramina, fentermina, análogos sintéticos da anfetamina (PMA, 4- metiltioanfetamina, 2-CB) e derivados metilenodioxi (MDA,MDEA)] 109 1.9.5.3.2.1. MDA e MDEA...... 109 1.9.5.3.2.2. MTA ...... 110 1.9.5.3.2.3. Outras anfetaminas...... 111 1.9.5.3.3. Ketamina ...... 112 1.9.5.3.4. Cocaína ...... 114 1.9.5.3.5. Efedrina/pseudoefedrina...... 114 1.9.5.3.6. Cafeína...... 115 1.9.5.3.7. Paracetamol ...... 117 1.9.5.3.8. LSD ...... 118 1.9.5.3.9. Dextrometorfano (DXM)...... 118 1.9.5.3.10. Excipientes inertes ...... 119 1.9.5.4. Drogas de abuso ilícitas co-consumidas intencionalmente com MDMA...... 120 1.9.5.4.1. Derivados da Cannabis ...... 126 1.9.5.4.2. Estimulantes anfetamínicos...... 129 1.9.5.4.3. Cocaína ...... 132 1.9.5.4.4. LSD ...... 133 1.9.5.4.5. Ketamina ...... 135 1.9.5.4.6. GHB (“ecstasy líquido”) ...... 136 1.9.5.4.7. Outras substâncias alucinogénicas – Cogumelos “mágicos” ...... 137 1.9.5.5. Tabaco...... 137 1.9.5.6. Etanol ...... 139 1.9.5.6.1. Características farmacocinéticas do etanol ...... 140 1.9.5.6.1.1. Absorção...... 140 1.9.5.6.1.2. Distribuição ...... 141 1.9.5.6.1.3. Metabolismo...... 142 1.9.5.6.1.4. Excreção ...... 148 1.9.5.6.2. Mecanismos de acção e de toxicidade do etanol ...... 148 1.9.5.6.2.1. Efeitos na neurotransmissão...... 149 1.9.5.6.2.1.1. Efeitos na transmissão glutamatérgica...... 150

III Índice Geral ______

1.9.5.6.2.1.2. Efeitos na transmissão GABAérgica...... 151 1.9.5.6.2.1.3. Efeitos nas vias serotonérgicas...... 152 1.9.5.6.2.1.3.1. Efeitos nos níveis de 5-HT...... 152 1.9.5.6.2.1.3.2. Efeitos nos receptores 5-HT ...... 153 1.9.5.6.2.1.4. Aumento da libertação de DA...... 154 1.9.5.6.2.2. Alterações no sistema termorregulador ...... 156 1.9.5.6.2.3. Alterações psicomotoras...... 157 1.9.5.6.2.4. Efeitos neuroendócrinos ...... 161 1.9.5.6.2.5. Efeitos cardiovasculares ...... 163 1.9.5.6.2.6. Efeitos metabólicos...... 164 1.9.5.6.2.7. Efeitos no sistema imunitário ...... 164 1.9.5.6.2.8. Efeitos no sistema hepato-biliar ...... 166 1.9.5.6.2.9. Efeitos no tracto gastro-intestinal...... 169 1.9.5.6.2.10. Efeitos no sistema urinário...... 169 1.9.5.6.2.11. Efeitos nos músculos ...... 170 1.9.5.6.2.12. Efeitos teratogénicos...... 170 1.9.5.6.2.13. Carcinogénese...... 171 1.10. Principais considerações ...... 172 2. OBJECTIVOS ...... 177 3. TRABALHO EXPERIMENTAL ...... 179 Trabalho I. Optimização das doses de MDMA a administrar a ratinhos previamente expostos repetidamente a etanol...... 181 Trabalho II. Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice...... 187 Trabalho III. Effect of chronic ethanol exposure on the hepatotoxicity of ecstasy in mice: An ex vivo study...... 183 Trabalho IV. Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes...... 197 Trabalho V. Interacções metabólicas entre o etanol e a MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato...... 235 Trabalho VI. Gas chromatography determination of acetone, acetaldehyde, ethanol and methanol in biological matrices and cell culture...... 233 Trabalho VII. Ethanol, the forgotten artifact in cell culture...... 251

IV ______Índice Geral

4. DISCUSSÃO INTEGRADA...... 261 5. CONCLUSÕES FINAIS ...... 277 6. REFERÊNCIAS ...... 283

V Índice Geral ______

ÍNDICE DE FIGURAS

______Índice de Figuras

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química da metanfetamina, mescalina e do enantiómero farmacologicamente mais activo da 3,4-metilenodioximetanfetamina...... 6

Figura 2. Exemplos de pastilhas e cápsulas de ecstasy...... 8

Figura 3. Esquema das vias metabólicas da MDMA ...... 11

Figura 4. Oxidação dos metabolitos catecóis da MDMA a quinonas, semi- quinonas e aminocromos, e formação dos conjugados com a GSH...... 13

Figura 5. Mecanismo de acção biológica da MDMA ao nível dos neurónios serotonérgicos...... 16

Figura 6. Hipótese integrada para os efeitos termogénicos e mionecróticos da MDMA...... 24

Figura 7. Estruturas químicas dos principais estimulantes anfetamínicos encontrados na composição de pastilhas de ecstasy, além da MDMA...... 109

Figura 8. Metabolismo oxidativo do etanol...... 143

Figura 10. Mecanismos de acção biológica do etanol ao nível da neurotransmissão glutamatérgica, GABAérgica, serotonérgica e dopaminérgica...... 150

Figura 11. Fontes de complicações neurológicas do álcool e alcoolismo. .... 159

Figura 12. Percentagem de sobrevivência de ratinhos CD1, previamente expostos a 12% de etanol na água de bebida durante 8 semanas, após administração de 10 mg/kg ou 20 mg/kg de MDMA...... 185

IX Índice de Figuras ______

Figura 13. Procedimento experimental utilizado para a avaliação da influência do etanol no perfil metabólico da MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato...... 226

Figura 14. Metabolização da MDMA a MDA, HMMA e HMA...... 227

Figura 15. Preparação de amostras de meio de cultura para quantificação de MDMA, MDA, HMMA e HMA por GC-MS...... 228

Figura 16. Efeito de MDMA 1,6 mM (M) e da hipertermia na percentagem de morte celular na presença ou na ausência de etanol, DAS e KET...... 229

Figura 18. Mecanismo de resposta ao choque térmico...... 265

Figura 19. Mecanismo de activação do NF-κB...... 266

Figura 20. Esquema-resumo dos resultados obtidos no estudo das interacções hepatotóxicas entre etanol e MDMA...... 278

ÍNDICE DE TABELAS

______Índice de Tabelas

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1. Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007...... 34

Tabela 2. Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA...... 44

Tabela 3. Perfil de impurezas e conteúdo em MDMA de pastilhas vendidas como ecstasy...... 57

Tabela 4. Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA...... 86

Tabela 5. Medicamentos, alimentos, e seus constituintes, que influenciam a actividade e expressão das principais isoenzimas do CYP450 envolvidas no metabolismo da MDMA...... 100

Tabela 6. Possíveis efeitos dos Excedentes e sub-produtos da síntese de MDMA na toxicidade da ecstasy...... 108

Tabela 7. Padrões de policonsumo de drogas de abuso reportados por consumidores de ecstasy...... 121

XIII Índice de Tabelas ______

XIV

RESUMO

______Resumo

RESUMO

A 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA ou ecstasy) é uma droga de abuso que tem sido amplamente consumida desde os anos 80 devido às suas propriedades entactogénicas, empatogénicas e moderadamente alucinogénicas, bem como ao pressuposto errado de se tratar de uma droga com reduzida toxicidade. Os efeitos/toxicidade da MDMA são extremamente imprevisíveis, uma vez que são condicionados por diversos factores que vão desde a dose consumida às características genéticas, fisiológicas e fisiopatológicas do consumidor, às condições ambientais em que os consumidores a utilizam e sobretudo à co-exposição a outras substâncias que podem interagir com a MDMA. Estas interacções da MDMA podem surgir com substâncias não- psicoactivas veiculadas em alimentos ou medicamentos ou, mais preocupante, com substâncias psicoactivas ingeridas inadvertidamente como contaminantes das pastilhas de ecstasy, ou intencionalmente co-consumidas para modular os efeitos da MDMA (nesta última situação, o risco de interacção será potencialmente maior porque as doses das substâncias psicoactivas consumidas são, geralmente, superiores às ingeridas pelo consumo de pastilhas de ecstasy contaminadas). O policonsumo afirma-se, então, como o padrão mais frequente de consumo de ecstasy, com especial prevalência do co-consumo com outras substâncias psicoactivas, sobretudo tabaco, Cannabis e álcool que pode ocorrer antes, durante ou pouco tempo depois da exposição à MDMA. Estes padrões de policonsumo podem aumentar os riscos para a saúde associados ao consumo de MDMA devido às imprevisíveis reacções químicas e idiossincráticas que podem resultar da mistura de xenobióticos no organismo, conduzindo potencialmente a interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas. Entre os compostos co-consumidos com a MDMA, o etanol ocupa um lugar de destaque, uma vez que devido à sua elevada acessibilidade e aceitação social é amplamente consumido, frequentemente em grandes quantidades, pelos indivíduos das faixas etárias mais jovens, nas quais se regista, também, uma maior prevalência do consumo de MDMA. Por este

XVII Resumo ______motivo, o estudo das interacções entre estes dois compostos no organismo é de extrema importância. Quando as experiências contempladas nesta dissertação foram desenhadas, apenas existiam dados relativos ao co-consumo de MDMA e etanol que se centravam nas suas mútuas alterações farmacocinéticas e nos seus efeitos subjectivos e comportamentais em humanos. No entanto, não existiam estudos em que se avaliasse quais os mecanismos subjacentes à toxicidade hepática induzida pelo consumo de ambas as substâncias em associação. Uma vez que ambas as substâncias são metabolizadas no fígado e levam à formação de metabolitos dotados de maior toxicidade do que os seus precursores, o estudo dos efeitos hepáticos desta mistura reveste-se de extrema importância. Por esse motivo, o objectivo da investigação da qual resulta a presente dissertação foi estudar os efeitos da exposição simultânea a ecstasy e etanol a nível hepático e avaliar de que forma é que a hipertermia (reacção potencialmente fatal frequentemente associada à exposição in vivo à MDMA) poderia afectar os efeitos hepáticos desta mistura. Para atingir o objectivo proposto, numa primeira fase, foram realizados ensaios in vivo com ratinhos expostos a etanol a 12% durante 8 semanas, seguindo-se uma administração única de MDMA numa dose de 10 mg/kg. Este protocolo foi realizado no sentido de simular o padrão de consumo mais habitual destas duas substâncias, no qual o início do consumo de etanol ocorre, geralmente, antes do primeiro contacto com a MDMA. Seguidamente, foram desenvolvidos estudos ex vivo, seguindo o mesmo protocolo de exposição ao etanol. Nesta situação, apenas os hepatócitos isolados dos animais expostos ao etanol foram incubados com MDMA no sentido de tentar perceber os efeitos induzidos pela MDMA nos hepatócitos de animais expostos repetidamente in vivo ao etanol que poderiam elucidar as alterações observadas nos ensaios in vivo. Embora os resultados obtidos tenham confirmado o potencial tóxico desta mistura, o modelo experimental baseado em suspensões de hepatócitos frescos utilizado nos ensaios ex vivo tem como limitação apenas permitir incubações máximas de 3-4 horas, o que pode impedir a observação de determinados indicadores de dano ou reacção celular a uma determinada agressão. Por esse motivo, foram desenvolvidos estudos in vitro nos quais hepatócitos, em cultura primária, foram directamente expostos à

XVIII ______Resumo mistura etanol+MDMA. Este último modelo foi utilizado para esclarecer os mecanismos subjacentes à toxicidade hepática desta mistura, mas também para avaliar uma possível interacção metabólica entre os dois compostos, já que o etanol tem a capacidade de alterar a actividade de várias enzimas hepáticas, incluindo aquelas envolvidas no metabolismo da MDMA. Os resultados obtidos nos trabalhos realizados no âmbito desta dissertação permitiram-nos constatar que: (i) a pré-exposição repetida ao etanol tem um efeito sinérgico na hipertermia e hepatotoxicidade induzidas in vivo pela MDMA em ratinhos Charles-River CD-1; (ii) a pré-exposição repetida a etanol a 12% aumenta a vulnerabilidade dos hepatócitos de ratinhos Charles- River CD-1 relativamente a agressões pró-oxidantes provavelmente por diminuir o conteúdo celular em GSH e aumentar o conteúdo em GSSG, aumentando a propensão para a perturbação da homeostase dos grupos tiol intracelulares que pode resultar na perda de funcionalidades proteicas e na iniciação de uma cascata de eventos que pode culminar na morte celular; (iii) a co-exposição aguda a etanol+MDMA aumenta a toxicidade hepática induzida in vitro pela MDMA, em culturas primárias de hepatócitos obtidos de ratos Wistar, através de uma diminuição das defesas antioxidantes, diminuição das reservas energéticas das células, aumento da formação de espécies reactivas e aumento da morte celular por necrose, numa extensão dependente da temperatura de incubação; (iv) a exposição aguda in vitro ao etanol, de culturas primárias de hepatócitos obtidos de ratos Wistar, aumenta o metabolismo da MDMA a MDA, HMA e HMMA; (v) os efeitos tóxicos da mistura etanol+MDMA são marcadamente aumentados em condições hipertérmicas. Em conclusão, o co-consumo de etanol e MDMA aumenta a hepatotoxicidade da ecstasy mediante um aumento da resposta hipertérmica associada ao consumo deste derivado anfetamínico, uma diminuição das defesas antioxidantes e um aumento da morte celular por necrose.

XIX Resumo ______

ABSTRACT

______Abstract

ABSTRACT

3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA or ecstasy) is a drug of abuse that has been widely consumed since the 80s due to its entactogenic, empathogenic and light hallucinogenic properties, as well as to the erroneous presupposition of being considered a drug with low toxicity. The effects/toxicity of MDMA are extremely unpredictable since they are conditioned by several factors from the consumed dose, to the genetic, physiologic and pathophysiologic characteristics of the consumer, the environmental conditions where MDMA is consumed and, especially, to the co- exposure to other substances that can interact with MDMA. These interactions of MDMA can occur with non-psychoactive substances present in food or pharmaceuticals or, of higher concern, with psychoactive substances inadvertently ingested as contaminants of ecstasy pills, or intentionally consumed to modulate MDMA effects (in this last case, the risk of interaction will be potentially higher since the doses of psychoactive substances consumed intentionally are, generally, higher than those taken by the consumption of contaminated ecstasy pills). Substances poly-consumption is the most frequent consumption pattern of ecstasy, with high prevalence of co-consumption of other psychoactive substances especially tobacco, Cannabis and alcohol, that can occur before, during or in a short period after MDMA exposure. These poly-consumption patterns can increase the health risks of MDMA consumption due to the unpredictable chemical and idiosyncratic reactions that can result from the mixture of xenobiotics in the body, potentially leading to pharmacokinetic and/or pharmacodynamic interactions. Among the compounds co-consumed with MDMA, ethanol has an important position since, due to its high accessibility and social acceptance it is widely consumed, often in high amounts, by the younger individuals that also present high rates of ecstasy consumption. For this reason, the study of the interactions between these two compounds in the body is of extreme relevance. When the experiments included in this dissertation were designed, only data related to the mutual effects of MDMA and ethanol co-consumption on their pharmacokinetics and subjective and behavioural effects in humans was

XXIII Abstract ______available, but there were no studies evaluating the mechanisms underlying the hepatic toxicity induced by the consumption of both substances in association. Since both substances are metabolized in the liver and lead to the formation of metabolites with higher toxicity than their parent compounds, the study of the hepatic effects of this mixture has an extreme relevance. Thus, the aim of the research that resulted in the present dissertation was to study the effects of the simultaneous exposure to ecstasy and ethanol in the liver and to evaluate how hyperthermia (a life-threatening effect frequently associated with MDMA in vivo exposure) could affect the hepatic effects of this mixture. To reach the proposed goal, in a first stage, in vivo studies with mice exposed to 12% ethanol for 8 weeks followed by a single dose of 10 mg/kg MDMA, were performed. This protocol was performed to simulate the most common consumption pattern of these substances, characterized by an initiation of ethanol consumption previous to the first contact with MDMA. Subsequently, ex vivo studies, using the same protocol of ethanol exposure were performed but, this time, only the hepatocytes isolated from the animals exposed to ethanol were incubated with MDMA to clarify the effects induced by MDMA to the hepatocytes obtained from animals repeatedly in vivo exposed to ethanol that could elucidate the modifications observed in the in vivo studies. Notwithstanding the obtained results confirmed the toxic potential of this mixture, the experimental model based on freshly isolated mouse hepatocytes suspensions, used in the ex vivo studies, only allow maximum incubations of 3- 4 hours which may limit the observation of certain indicators of cellular damage or reaction towards an aggression. For this reason, in vitro studies in which primary cultured hepatocytes were directly exposed to the ethanol+MDMA mixture were developed. This last experimental model was used to clarify the underlying mechanisms of the hepatic toxicity of this mixture, but also to evaluate an eventual metabolic interaction between these two compounds, since ethanol can alter the activity of several hepatic enzymes, including those involved in MDMA metabolism. The results obtained in the studies performed in the context of this dissertation allowed us to prove that: (i) repeated pre-exposure to ethanol has a synergistic effect on the hyperthermia and hepatotoxicity induced in vivo by MDMA alone in male Charles-River CD-1 mice; (ii) repeated exposure to 12%

XXIV ______Abstract ethanol increases the vulnerability of hepatocytes, isolated from male Charles- River CD-1 mice, towards pro-oxidant aggression probably by decreasing the GSH cellular content and increasing the GSSG cellular levels, increasing the risk of impairment of intracellular thiol homeostasis that can lead to decreased protein function and to the initiation of a cascade of events that can culminate in cell death; (iii) acute co-exposure to ethanol+MDMA increases the hepatic toxicity induced in vitro by MDMA, in primary cultured Wistar rat hepatocytes, through a decrease in antioxidant defences, decrease in the cell energy stores, increase in reactive species formation and increase in cell death by necrosis, in an extent dependent on incubation temperature; (iv) acute in vitro exposure to ethanol, in primary cultured Wistar rat hepatocytes, increases the metabolism of MDMA to MDA, HMA and HMMA; (v) the toxic effects of the ethanol+MDMA mixture are markedly increased under hyperthermic conditions. Concluding, the co-consumption of ethanol and MDMA increases the hepatotoxicity of ecstasy by an increase of the hyperthermic response associated to consumption of this amphetamine derivative, a decrease of the antioxidant defences and an increase of cell death through necrosis.

XXV Abstract ______

XXVI

ABREVIATURAS

______Lista de Abreviaturas

LISTA DE ABREVIATURAS

ACTH hormona adrenocorticotrófica ou corticotrofina ADH álcool desidrogenase AG ácidos gordos AIF factor indutor de apoptose ALDH aldeído desidrogenase AMPA ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropiónico AMPc adenosina monofosfato cíclica ATP adenosina trifosfato AUC área sob a curva AVC acidente vascular-cerebral BAT tecido adiposo castanho bDNF factor neurotrófico derivado do cérebro bFGF factor básico de crescimento dos fibroblastos 2-CB 4-bromo-2,5-dimetoxianfetamina CD4+ células T auxiliares CID coagulação intra-vascular disseminada COMT catecol-O-metiltransferase CRF factor libertador de corticotrofinas CYP450 citocromo P450 DA dopamina DAG diacilglicerol DAS sulfureto dialílico DAT transportador da dopamina DEA Drug Enforcement Administration DHA 3,4-diidroxianfetamina, α-metildopamina, α-MeDA DHHA ácido 3,4-diidroxi-hipúrico DHMA 3,4-diidroximetanfetamina, N-metil-α-metildopamina, N-Me-α-MeDA, HHMA DHPA (3,4-diidroxifenil)acetona DOB 4-bromo-2,5-dimetoxianfetamina DXM dextrometorfano ECATD Estudo sobre o Consumo de Álcool, Tabaco e Droga ECG electrocardiograma EMCDDA European Monitoring Center for Drugs and Drug Addiction ESPAD European School Survey Project on Alcohol and Other Drugs EtOH etanol, álcool etílico EUA Estados Unidos da América FAEE éster etílico de ácido gordo FAS síndrome alcoólica fetal

XXIX Lista de Abreviaturas ______

FBS soro bovino fetal FSH hormona folículo-estimulante GABA ácido γ-aminobutírico GAT transportador do GABA γ-GCS γ-glutamilcisteína sintetase GH hormona do crescimento GHB γ-hidroxibutirato GI gastro-intestinal GnRH hormona libertadora de corticotrofinas GRF factor libertador da GH GSH glutationa reduzida GSSG glutationa oxidada GST glutationa-S-transferase HAP hidrocarbonetos aromáticos policíclicos HAART Highly Active AntiRetroviral Therapy, terapia anti-retroviral altamente activa HBSC/WHO Health Behaviour in School-aged Children/World Health Organization HCV virus da hepatite C HHMA 3,4-diidroximetanfetamina, N-metil-α-metildopamina, N-Me-α-MeDA, DHMA 5-HIAA ácido 5-hidroxi-indolacético HIV vírus da imunodeficiência humana HMA 4-hidroxi-3-metoxianfetamina HMHA ácido 4-hidroxi-3-metoxi-hipúrico HMMA 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina HMPA (4-hidroxi-3-metoxifenil)acetona HSE elemento de choque térmico HSF factor de choque térmico HSP proteína de choque térmico 5-HT 5-hidroxitriptamina, serotonina 5-HTP 5-hidroxitriptofano i.m. intra-muscular i.p. intra-peritoneal i.v. intra-venoso IDT Instituto da Droga e da Toxicodependência IFN-γ interferão γ IGF-1 factor de crescimento insulin-like IL interleuquina IMAO inibidores da monoamina oxidase

IP3 inositol 1,4,5-trifosfato IRC insuficiência renal crónica ISRS inibidores selectivos da recaptação da serotonina

XXX ______Lista de Abreviaturas

KET cetoconazol

LC50 concentração letal 50 LDH lactato desidrogenase LH hormona luteinizante LHRH hormona libertadora da hormona luteinizante LPS lipopolissacarídeo LSD dietilamida do ácido lisérgico MAO monoamina oxidase MBDB 3,4-metilenodioxi-α-etil-N-metil-fenetilamina, “Eden” MDA 3,4-metilenodioxianfetamina MDEA N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina, “Eva” MDHA ácido 3,4-metilenodioxi-hipúrico MDMA 3,4-metilenodioximetanfetamina, ecstasy α-MeDA α-metildopamina, 3,4-diidroxianfetamina, DHA mEH epóxido hidrolase microssomal MEOS sistema microssomal de oxidação do etanol MLA metilicaconitina MTA metanfetamina NA noradrenalina NAD+ dinucleótido de β-nicotinamida e adenina na forma oxidada NADH dinucleótido de β-nicotinamida e adenina na forma reduzida NADP+ fosfato do dinucleótido de β-nicotinamida e adenina na forma oxidada NADPH fosfato do dinucleótido de β-nicotinamida e adenina na forma reduzida NAPQI N-acetil-p-benzoquinonimina NF-κB factor nuclear κB NGF factor de crescimento neuronal NK células exterminadoras naturais (natural killer) NMDA N-metil-D-aspartato N-Me-α-MeDA N-metil-α-metildopamina, 3,4-diidroximetanfetamina, HHMA, DHMA NOS sintetase do monóxido de azoto NT-3 neurotrofina 3 ONU Organização das Nações Unidas p.o. per os PAPS adenosina 3’-fosfato 5’-fosfossulfato PCP fenciclidina Pgp glicoproteína P PI fosfatidilinositol

PI3K fosfatidilinositol-3-cinase

PIP2 fosfatidilinositol bifosfato PIPAC piperonilacetona, (3,4-mitilenodioxifenil)acetona

XXXI Lista de Abreviaturas ______

PKA proteína cinase A PLC fosfolipase C PMA p-metoxianfetamina PTH hormona da paratiróide REDOX oxidação redução RNS espécies reactivas de azoto ROS espécies reactivas de oxigénio s.c. sub-cutâneo SERT transportador da serotonina SIDA síndrome da imuno-deficiência adquirida SNC sistema nervoso central SNS sistema nervoso simpático SOD superóxido dismutase SULT sulfotransferase T4 tiroxina TG triglicerídeos TGF-β factor de crescimento transformador β TH triptofano hidroxilase THC Δ9-tetraidrocanabinol THF tetraidrofurano TNF-α factor de necrose tumoral α t-PA activador do plasminogénio do tipo tecidular TR transcriptase reversa UCP proteína desacopladora UDP uridina difosfato UE União Europeia UGT uridina 5'-difosfato glucuronosiltransferase VMAT transportador vesicular das monoaminas

XXXII

PARTE I

INTRODUÇÃO e OBJECTIVOS

______Introdução

1. INTRODUÇÃO

Desde o final da década 80, as drogas de abuso do tipo anfetamínico têm-se tornado drogas recreativas populares 1. Dentro deste tipo de drogas, a mais mediática é indubitavelmente a 3,4-metilenodioximetanfetamina (MDMA), vulgarmente designada por ecstasy. A popularidade da ecstasy pode ser explicada, em parte, pelos efeitos que os utilizadores experimentam após o seu consumo 2 (ex.: euforia, aumento da energia, aumento do desejo sexual, facilitação da interacção social), o que levou a que o consumo de drogas sintéticas do tipo anfetamínico tenha vindo a aumentar, quer entre os consumidores de droga, quer entre a população em geral, com uma maior prevalência nas faixas etárias mais jovens. O consumo desta droga, de fácil aquisição, constitui um risco considerável tendo sido amplamente descritas várias reacções adversas severas e inclusivamente fatais, que podem surgir como consequência directa da acção tóxica deste composto, bem como devido ao facto do seu consumo estar associado à adopção de outros comportamentos de risco (ex.: condução sob a influência de drogas e prática de relações sexuais promíscuas e desprotegidas). Assim, devido à sua prevalência e aos efeitos potencialmente tóxicos associados, o consumo de MDMA é motivo de preocupação entre educadores, meios de comunicação social, investigadores, clínicos e outros prestadores de cuidados de saúde 2. O principal problema associado à ocorrência de respostas tóxicas após o consumo de ecstasy reside na sua enorme imprevisibilidade e variabilidade, o que indicia a existência de factores de predisposição para a expressão de toxicidade. De facto, os efeitos provocados pelo consumo de ecstasy poderão ser condicionados pela dose ingerida, pela capacidade metabólica do indivíduo, pelas condições ambientais em que ocorre o consumo e pelo co-consumo de outras substâncias. Estes factores podem levar a alterações na formação de metabolitos activos e/ou tóxicos e, potencialmente, originar interacções nefastas ou mesmo fatais. A exposição do consumidor de ecstasy a outros compostos prende-se não só com o padrão de policonsumo de substâncias lícitas e ilícitas que está normalmente associado ao consumo desta droga de abuso, mas também à ingestão de medicamentos (para intencionalmente modular os efeitos da

3 Introdução ______ecstasy, ou durante regimes de tratamento) e à presença de vários compostos (estimulantes ou não) que aparecem como contaminantes nas pastilhas de ecstasy 3. O conhecimento da influência destes factores na toxicidade da MDMA é fundamental para o estabelecimento de medidas de prevenção de risco e de estratégias terapêuticas adequadas para o tratamento de intoxicações. Assim, na presente introdução far-se-á uma revisão da informação disponível na literatura científica sobre as propriedades farmacocinéticas, farmacodinâmicas e toxicológicas da MDMA, bem como da influência de vários factores na ocorrência de reacções adversas a esta droga de abuso.

1.1. História da MDMA

A MDMA é uma das principais drogas de abuso actualmente consumidas no cenário das festas rave, sendo conhecida por ecstasy. Muitas publicações referem que a MDMA foi originalmente patenteada como suppressor do apetite 4. No entanto, Cohen referiu em 1998 que a MDMA foi patenteada na Alemanha em 1914 como um precursor de substâncias farmacologicamente activas mas que nunca houve intenção de utilizá-la como fármaco anoréctico 5, facto confirmado por Freudenmann e colaboradores em 2006 6. A primeira referência acerca das propriedades psicoactivas da MDMA em humanos foi publicada em 1978 pelo químico que a sintetizou, Alexander Shulgin 7. Nos anos 80, a MDMA começou a ser utilizada em psicoterapia por aumentar a auto-estima, a desinibição e a capacidade de introspecção do paciente, facilitando a comunicação terapêutica e emocional, e criando sentimentos de empatia entre paciente e terapeuta 5. Esta propriedade da MDMA fez com que ela fosse incluída numa nova classe farmacológica: a dos compostos entactogénios (do grego “contacto com o íntimo”) 8. Adicionalmente, a MDMA tinha a vantagem de apresentar uma curta duração de acção, adequada à duração das consultas. No entanto, ao ser administrada por via oral em doses de 75 a 175 mg, a MDMA provocava, para além dos efeitos entactogénicos pretendidos, efeitos simpaticomiméticos agudos como, por

4 ______Introdução exemplo, aumento do ritmo cardíaco e da pressão arterial e ansiedade transitória 9, 10. Devido às propriedades da MDMA, a Organização das Nações Unidas (ONU) estabeleceu, na Convenção sobre Substâncias Psicotrópicas de 1971, que esta substância faria parte dos compostos de classe I devido ao seu reduzido ou inexistente valor terapêutico e elevado potencial de abuso, que constituem uma séria ameaça à saúde pública. Esta convenção estabelece, assim a proibição da sua utilização, com a excepção de fins científicos ou de situações médicas muito limitadas 11. Seguindo as directivas da ONU, em 1985, a Drug Enforcement Administration (DEA) dos Estados Unidos da América (EUA) também classificou a MDMA como um composto de Classe I devido ao seu elevado potencial de abuso, carência de aplicação clínica, falta de segurança para utilização (mesmo sob supervisão médica) e também por surgirem evidências de neurotoxicidade serotonérgica em ratos por acção da 3,4- metilenodioxianfetamina (MDA) 12, um composto análogo e metabolito maioritário da MDMA. Dada a controvérsia gerada em torno do seu potencial terapêutico, esta classificação foi temporariamente alterada com a inclusão deste composto numa classe menos restritiva (Classe III), sendo autorizado o seu uso sob supervisão médica. No entanto, mais tarde, em 1988, a MDMA voltou a ser incluída na Classe I, classificação que se mantém actualmente. Desde os meados dos anos 80, a MDMA tornou-se popular como droga de abuso, sobretudo entre as faixas etárias mais jovens, no contexto do aumento da popularidade das festas rave ou techno onde o consumo desta substância se generalizou, sobretudo na Europa 13. Actualmente ela pode ser encontrada na maioria das festas rave 14. A sua grande popularidade, apenas ultrapassada pela da Cannabis e derivados, deve-se aos seus efeitos estimulantes, ao aumento do estado de vigília, à indução de sensação de bem- estar e de sentimentos de confiança e empatia, à diminuição das inibições e a uma falsa percepção de inocuidade 5.

5 Introdução ______

1.2. Relação estrutura/actividade da MDMA

A MDMA é um derivado anfetamínico (com substituição funcional no anel aromático) estruturalmente semelhante à d-metanfetamina e à mescalina (Figura 1), o que lhe confere propriedades estimulantes e alucinogénicas 15. No entanto, estas propriedades alucinogénicas aparecem apenas para doses muito elevadas de MDMA 16. A ausência de propriedades alucinogénicas potentes da MDMA pode dever-se a algumas diferenças estruturais entre a MDMA e os compostos alucinogénicos como (i) a substituição no anel aromático nas posições 3 e 4 comparativamente às posições 3, 4 e 5 ou 2, 4 e 5, características dos compostos alucinogénicos, (ii) a presença de um grupo metilo no grupo amina terminal (os derivados anfetamínicos mais potentes são aminas primárias).

H3CO NH2

NHCH3

H3CO CH3 OCH3 Metanfetamina 3,4,5–trimetoxifeniletilamina (mescalina)

H O NHCH3

CH O 3

S-(+)-3,4–metilenodioximetanfetamina (MDMA, ecstasy)

Figura 1. Estrutura química da metanfetamina, mescalina e do enantiómero farmacologicamente mais activo da 3,4-metilenodioximetanfetamina

Uma vez que apresenta um centro quiral, a MDMA pode existir na forma de 2 enantiómeros distintos [S-(+)-MDMA e R-(-)-MDMA] e na forma de racemato. O estereoisómero mais activo da MDMA é o S-(+)-MDMA (responsável pelos efeitos psicoestimulantes e entactogénicos) enquanto que

6 ______Introdução nos derivados anfetamínicos alucinogénicos, que não a MDMA, a potência do esterioisómero R-(-) é maior 17. A presença do anel metilenodioxi aumenta a afinidade da MDMA para os receptores serotonérgicos e diminui a afinidade para os receptores α2 adrenérgicos, relativamente à d-anfetamina 5. A presença do grupo metilo no carbono α da cadeia alifática impede a degradação do composto pela monoamina oxidase (MAO), o que explica a acção mais potente das isopropilaminas (como a MDMA) relativamente aos análogos com estrutura feniletilamina (como a mescalina) que são preferencialmente metabolizados pela MAO-B 18.

1.3. Produção de MDMA

A produção mundial de ecstasy foi estimada em 113 toneladas em 2005 19. A Europa continua a ser o principal centro de produção de ecstasy, embora a sua importância relativa pareça estar a decrescer, já que essa produção alastrou a outras partes do mundo, nomeadamente à América do Norte e ao leste e sudeste da Ásia. Na Europa, a ecstasy é sobretudo sintetizada na Holanda (embora se observem, nesse país, alguns sinais de diminuição da produção) e, em segundo lugar, na Bélgica 20.

1.4. Comercialização de MDMA

A ecstasy é vendida sob as designações de E, M, X, XTC, Adam, Ecky, Bicky, rolls, beans, Clarity, lover’s speed, yaoto-wang, droga do abraço ou droga do amor 5, na forma de pastilhas (de várias cores, formas e tamanhos), cápsulas, pó 21 ou supositórios 22 (Figura 2). As pastilhas estão, normalmente, identificadas com vários logótipos (ex.: Calvin Klein CK, Mitsubishi, 007, Coco Chanel CC, Nike, Rolex, etc).

7 Introdução ______

Figura 2. Exemplos de pastilhas e cápsulas de ecstasy.

No período de 2000 a 2005, os preços médios de venda a retalho da ecstasy, indexados à inflação, diminuíram na maioria dos países. Em 2005, o custo médio na venda a retalho dos comprimidos de ecstasy na Europa variou entre menos de 3 euros e 15 euros a unidade 20.

1.5. Farmacocinética da MDMA

A MDMA apresenta uma elevada biodisponibilidade por via oral, um elevado volume de distribuição (cerca de 4L/kg) e uma baixa percentagem de ligação às proteínas plasmáticas (inferior a 20%). O tempo de semi-vida da MDMA varia entre as 6 e as 9 h, sendo a sua eliminação processada por via hepática e renal 23-25. Devido às suas características básicas (pKa ≅ 9.9) e ao seu peso molecular relativamente baixo, este composto atravessa facilmente as membranas das células e as camadas lipídicas, atingindo os tecidos ou fluidos biológicos com pH mais acídico do que o sangue, incluindo a saliva e o suor 23.

1.5.1. Absorção

Os efeitos biológicos e as concentrações plasmáticas de MDMA parecem seguir um perfil paralelo, com picos de concentração plasmática e de efeito biológico a ocorrerem entre 1 e 2 horas após a ingestão e um declínio de ambos até aos valores basais ao fim de 4 a 6 horas 24.

8 ______Introdução

A MDMA apresenta uma cinética linear para doses baixas, com um aumento da concentração plasmática máxima e da área sob a curva (AUC, concentração plasmática em função do tempo após administração) de uma forma dependente da dose, para doses de 50, 75, 100 e 125 mg 24, 26. No entanto, para doses de 150 mg, verificou-se que o aumento dos valores dos parâmetros farmacocinéticos da MDMA não foi proporcional à dose administrada, sugerindo uma cinética não linear para doses mais elevadas 26. Esta observação pode ser explicada pela possível saturação das suas vias metabólicas bem como pela interacção dos metabolitos com algumas das enzimas envolvidas no metabolismo da MDMA, conduzindo à inibição das mesmas 23. Aliás, foi já demonstrado que a MDMA em doses elevadas actua como inibidor competitivo da CYP2D6 em microssomas de fígado humano 27, mas que pode inclusivamente formar um intermediário metabólico por oxidação da amina terciária ou do substituinte metilenodioxi da MDMA 28 que sofre complexação com a enzima 29, envolvendo a formação de um carbeno e levando a uma inibição irreversível da CYP2D6. Esta inibição pode ocorrer durante a primeira hora após ingestão, sendo os valores basais da quantidade de enzima apenas repostos após, pelo menos, 10 dias 30. Também a recuperação urinária da MDMA é mais elevada para doses mais baixas, o que se enquadra numa farmacocinética não linear 31. Esta aparente falta de proporcionalidade entre a concentração plasmática esperada e a que é observada após administração de doses elevadas de MDMA, aliada ao facto de que muitos utilizadores de ecstasy a consomem em doses repetidas, faz antever uma potenciação dos riscos de toxicidade desta substância por aumento exagerado das suas concentrações plasmáticas 31. De facto, um estudo clínico realizado por Farré e colaboradores em 2004 revelou que as concentrações plasmáticas de MDMA atingidas após administração de uma segunda dose de 100 mg de MDMA, administrada 24 h após uma dose semelhante, não podiam ser explicadas pela simples acumulação da droga, indiciando um fenómeno de auto-inibição metabólica com duração superior a 24 h 32. O mesmo facto foi já demonstrado em primatas não-humanos 33. A biodisponibilidade da MDMA parece ser também condicionada por fenómenos de estereoselectividade, uma vez que após administração oral de uma dose única de MDMA na forma de racemato se observou que a

9 Introdução ______concentração máxima plasmática do enantiómero R-(-)-MDMA era significativamente maior do que a do enantiómero S-(+)-MDMA (farmacologicamente mais activo), o qual era mais rapidamente eliminado 34, 35. Estas diferenças estereoselectivas verificadas em humanos tinham sido previamente verificadas em ratos 36.

1.5.2. Distribuição

Devido à sua baixa taxa de ligação às proteínas plasmáticas (inferior a 20%), a MDMA difunde facilmente do plasma para o compartimento extra- vascular, apresentando um grande volume de distribuição 23. O enantiómero S- (+)-MDMA é aquele que se distribui mais extensamente 34. O perfil de distribuição da MDMA em humanos foi avaliado em estudos post-mortem que mostraram que a MDMA se acumula em muitos tecidos e órgãos onde atinge concentrações muito superiores às concentrações plasmáticas, podendo ser até 18 vezes superiores no fígado 37, 38 e 30 vezes superiores no cérebro 39.

1.5.3. Metabolismo

O metabolismo da MDMA (Figura 3) apresenta duas vias principais: (i) abertura do anel metilenodioxi, seguida de metilação de um dos grupos hidroxilo resultantes e/ou conjugação com o ácido glucurónico ou com o anião sulfato 23, 26, 40-42 e (ii) desalquilação do grupo amina com formação da 3,4- metilenodioxianfetamina (MDA) que retém acção biológica 43. A subsequente desaminação e oxidação da cadeia lateral leva à formação de fenilcetonas, posteriormente oxidadas a derivados do ácido benzóico 44, os quais, por sua vez, são conjugados com a glicina e excretados na forma de derivados do ácido hipúrico 31. A principal via metabólica no rato e no homem passa pela abertura do anel metilenodioxi da MDMA e da MDA dando origem a dois metabolitos catecóis, a N-metil-α-metildopamina (N-Me-α-MeDA) e a α-metildopamina (α-

10 ______Introdução

MeDA), respectivamente 40. Ambos são posterioremente metilados pela enzima catecol-O-metiltransferase (COMT), preferencialmente no grupo hidroxilo da posição 4 do anel aromático. Estes metabolitos monometilados estão maioritariamente presentes no plasma e urina na forma de conjugados com o ácido glucurónico ou com o anião sulfato 26, 44-46.

Figura 3. Esquema das vias metabólicas da MDMA

As isoenzimas do sistema enzimático citocromo P450 (CYP450) têm um papel preponderante na metabolização da MDMA, catalizando a desmetilenação que leva à abertura do anel metilenodioxi e a N-desmetilação (Figura 3). Esta desmetilenação pode ser catalizada pelas isoenzimas CYP2D6, CYP1A2 e, em menor extensão, pelas isoenzimas CYP2B6 e CYP3A4 40, 47, 48, mas pode também ocorrer sem catálise enzimática por um processo de oxidação espontânea que envolve o radical hidroxilo 40, 49, 50. No rato esta reacção é catalizada pelas isoenzimas CYP2D1 e CYP3A2 40. A N-

11 Introdução ______desmetilação é catalizada, no Homem, pela isoforma CYP2B6 com contribuição das isoenzimas CYP2D6, CYP1A2 e CYP3A4 e, no rato, pelas isoenzimas CYP1A2 e CYP2D1 40, 47. A presença do grupo catecol confere elevada reactividade a estes metabolitos, que facilmente são oxidados originando as respectivas o- quinonas. A oxidação das quinonas pode ainda levar à formação de aminocromos 51 com subsequente formação de polímeros do tipo da melanina 52. Os ciclos de oxidação-redução associados a esta conversão metabólica 53 resultam na formação de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e azoto (RNS) que, tal como as quinonas, podem atacar grupos nucleófilos intracelulares como a cisteína, a glutationa reduzida (GSH) e grupos sulfidrilo proteicos, levando a alterações de macromoléculas importantes como proteínas, lípidos e DNA 51, 54. Esta formação de ROS subsequente à metabolização da MDMA foi já constatada em sinaptossomas isolados de estriado de ratinho 55, em Escherichia coli sensiveis ao stress oxidativo por apresentarem deficiência na proteína OxyR (importante na defesa contra agressões pró-oxidantes) 56, em linhas celulares de neurónios granulares de cerebelo de rato 57, em células SK- N-MC transfectadas com o transportador de serotonina humano 58, em células Ito hepáticas 59, e também em culturas primárias de neurónios corticais obtidos de embriões de ratos Wistar 60. Os metabolitos quinónicos podem conjugar-se com uma molécula de GSH formando um aducto que pode sofrer uma segunda conjugação com uma nova molécula de GSH, num processo também acompanhado por formação de ROS e RNS 61, 62 (Figura 4). A metabolização da MDMA parece apresentar estereoselectividade, uma vez que, quando se administra a mistura racémica por via subcutânea a ratos ou por via oral a humanos, o enantiómero S-(+)- MDMA é metabolizado mais rapidamente do que o R-(-)-MDMA 63-65. O enantiómero R-(-)-MDMA que não for metabolizado, em conjunto com o excesso do enantiómero S-(+)-MDMA que a enzima não conseguiu metabolizar, vão ser metabolizados por outras isoenzimas que não a CYP2D6. Uma vez que a MDMA é metabolizada predominantemente pela isoforma CYP2D6 do complexo enzimático CYP450 66, está sujeita a ser alvo de interacções farmacocinéticas/toxicocinéticas com outros compostos

12 ______Introdução

(fármacos, drogas de abuso, alimentos, etc) que partilhem ou afectem a mesma via metabólica 67.

Figura 4. Oxidação dos metabolitos catecóis da MDMA a quinonas, semi-quinonas e aminocromos, e formação dos conjugados com a GSH.

A própria MDMA pode inibir a CYP2D6 mediante mecanismos que incluem uma interacção competitiva e/ou a formação de um complexo entre os metabolitos da MDMA e a enzima 26, 27, o que poderá explicar a sua farmacocinética não-linear 68-70. Por este motivo, quando ingerida, a MDMA tem a capacidade de transformar metabolizadores rápidos em metabolizadores pobres para a dose subsequente, independentemente do genótipo. Devido à presença do anel metilenodioxi, a MDMA sofre uma metabolização mais extensa do que as anfetaminas-tipo, sendo menos excretada sem biotransformação na urina 23. Cerca de 80% da MDMA é

13 Introdução ______eliminada após metabolização hepática e cerca de 20% é excretada sem biotransformação, na urina 23.

1.5.4. Excreção

A eliminação urinária da MDMA parece ser independente da dose 23, sendo a maior parte excretada nas primeiras 24 h após o consumo 34. O principal metabolito da MDMA excretado na urina é a 4-hidroxi-3- metoximetanfetamina (derivado mono-metilado da N-Me-α-MeDA) seguido do metabolito catecol N-Me-α-MeDA 71, maioritariamente na forma de conjugados glucuronatos ou sulfatos 69. Para além da urina, a MDMA pode ser detectada também na bile, suor, saliva, humor vítreo, cabelo e unhas 23, 68. A excreção da MDMA é, também, estereoselectiva, sendo o isómero S- (+)-MDMA (biologicamente mais activo) mais rapidamente excretado do que o isómero R-(-)-MDMA 34, 65, 72. Uma vez que a excreção renal deste composto com características de base fraca é a principal via de eliminação, o seu tempo de semi-vida diminui com a acidificação da urina e aumenta com a alcalinização da mesma. Por este motivo, muitas vezes os consumidores de MDMA ingerem bicarbonato para prolongar os efeitos da ecstasy.

1.6. Mecanismo de acção e principais efeitos da MDMA

A MDMA provoca, normalmente, um estado eufórico relaxado, incluindo aumento da sensação de energia, abertura emocional, aumento da capacidade de introspecção, empatia, redução de pensamentos negativos e uma diminuição das inibições 23, 73-78. A percepção dos sons e das cores também pode parecer mais intensa 74. Os vários mecanismos envolvidos no aparecimento dos efeitos da MDMA vão ser abordados de seguida.

14 ______Introdução

1.6.1. Efeito na libertação, transporte e receptores das monoaminas neurotransmissoras

A MDMA é um composto simpaticomimético de acção indirecta que resulta da indução da libertação dos neurotransmissores simpáticos [serotonina (5-HT), noradrenalina (NA), adrenalina e dopamina (DA)] a partir das vesículas dos terminais nervosos e da medula supra-renal 79. Estes neurotransmissores vão activar os respectivos receptores, resultando numa exacerbação da estimulação simpática. A MDMA induz preferencialmente a libertação de 5- HT (Figura 5) tanto in vivo 80-82 como in vitro 83-86. A MDMA liga-se ao transportador pré-sináptico da serotonina (SERT), inibindo a recaptação neuronal da 5-HT presente na fenda sináptica. Uma vez ligada ao transportador, a MDMA vai aumentar a libertação de 5-HT por um processo de difusão por permuta 87, 88. Após o transporte da MDMA para o interior do neurónio, o transportador fica novamente livre para transportar a 5-HT do terminal nervoso para a fenda sináptica 87. Este é um processo dependente do Ca2+ e é bloqueado pelos inibidores do sistema de recaptação neuronal da 5-HT (ex.: fluoxetina, imipramina) 87. Numa situação fisiológica, a 5-HT libertada para a fenda sináptica deveria ser rapidamente recaptada para manter o controlo da neurotransmissão. No entanto, quando a MDMA bloqueia o SERT, a 5-HT acumula-se na fenda sináptica onde será degradada ou recaptada por outros transportadores como os da dopamina (DAT) 58, 88. Para além do efeito ao nível da recaptação neuronal da 5-HT, a MDMA exerce também efeitos na captação vesicular da 5-HT. Em baixas concentrações, a MDMA inibe a captação de 5-HT pelas vesículas, sendo este efeito mais marcado para o estereoisómero S-(+)-MDMA 85, 90. Em altas concentrações, a MDMA entra nas vesículas por difusão passiva 5 e, por ser uma base fraca, aumenta o pH no interior das mesmas, promovendo o efluxo de 5-HT, uma vez que esta é mantida no interior das vesículas através de um gradiente de protões gerado por uma bomba de protões dependente de adenosina trifosfato (ATP) 87.

15 Introdução ______

Figura 5. Mecanismo de acção biológica da MDMA ao nível dos neurónios serotonérgicos. A MDMA promove a libertação da 5-HT por permuta ao nível do transportador SERT (1). Para concentrações mais elevadas, a MDMA penetra nas vesículas sinápticas e promove a libertação da 5-HT nelas contida (2). O aumento da 5-HT deve-se também à inibição da degradação metabólica deste neurotransmissor pela MAO ao nível da mitocôndria (3), inibição do sistema de recaptação neuronal da 5-HT pelo SERT (4) e estimulação da libertação da 5-HT na fenda sináptica (5). Esta 5-HT libertada vai estimular receptores pós-sinápticos (6). No entanto a 5-HT tem mecanismos para evitar o aumento desmesurado dos seus níveis na fenda sináptica por auto-regulação da libertação da 5-HT pelos receptores pré-sinápticos (7), aumento da formação de metabolitos e produtos de auto-oxidação da 5-HT na fenda sináptica (8). A MDMA promove ainda a diminuição das reservas de 5-HT por provocar inibição da biossíntese da 5-HT pela triptofano hidroxilase (TH) (9). As setas descontínuas indicam inibição e as setas mais largas indicam indução. Figura adaptada de Carmo 2007 89.

A libertação de 5-HT vai activar receptores pré- e pós-sinápticos levando à activação de múltiplos sistemas intracelulares que vão conduzir ao aparecimento dos efeitos neuroquímicos e moleculares desta substância 88. A activação dos receptores 5-HT1A parece ser responsável pela facilitação da interacção social, pelo menos no rato 91. É importante referir que a estimulação da libertação de 5-HT induzida pela MDMA provoca uma diminuição dos níveis cerebrais de 5-HT que faz com que 2 dias depois do consumo de MDMA os utilizadores apresentem estados de depressão 14. Para além da acção indirecta da MDMA na estimulação da libertação de 5-HT, a própria MDMA apresenta afinidade para os receptores 5-HT podendo

16 ______Introdução activá-los directamente. Esta afinidade da MDMA para os receptores da 5-HT apresenta também estereoselectividade com maior potência do estereoisómero

R-(-)-MDMA para o receptor 5-HT2A e do estereoisómero S-(+)-MDMA para o receptor 5-HT2C. Apesar de a activação dos receptores 5-HT2A estar relacionada com as propriedades alucinogénicas das anfetaminas, a MDMA tem um fraco carácter alucinogénico que pode dever-se à sua reduzida eficácia neste receptor 5. Sendo a MDMA uma droga de abuso pró-serotonérgica, tem a potencialidade de sofrer interacções farmacodinâmicas/toxicodinâmicas com compostos que tenham o mesmo mecanismo de acção ou mecanismo de acção antagónico 67, como por exemplo os antidepressivos inibidores da recaptação da 5-HT (ex.:citalopram) ou alguns antipsicóticos (ex: clozapina), respectivamente. Este potencial de interacção será abordado mais detalhadamente no ponto 1.9.5.1. O aumento de libertação da DA por acção da MDMA pode resultar de: (i) reversão do transportador 84 e/ou (ii) estimulação da síntese de DA através da acção agonista da

MDMA nos receptores 5-HT2A e 5-HT2C pós-sinápticos localizados nos neurónios GABAérgicos, de cuja activação resulta uma diminuição dos níveis do neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA) e consequente estimulação da síntese e libertação de DA 82, 92-94. Este aumento da libertação de DA poderá ter, também, como consequência, uma depleção dos seus níveis neuronais. De facto, a administração de doses de 5, 10 ou 20 mg/kg de MDMA, em 4 dias sucessivos, levou a um decréscimo nos níveis de DA e 5-HT, no núcleo estriado de ratinho, 24 h após a última administração 95. No entanto, não se observaram alterações quando estas doses foram administradas em dias alternados e os níveis de monoaminas foram medidos após 48 h 95. Também vários estudos tentaram relacionar a diminuição dos níveis estriatais de DA com os efeitos neurotóxicos a longo termo da MDMA e verificaram uma perda de DA estriatal dependente da dose 7 dias após o tratamento de ratinhos com 3 doses de 20 ou 30 mg/kg 96, 97. Quanto ao sistema adrenérgico, a nível central, a

MDMA bloqueia os receptores adrenérgicos α2 pré- sinápticos, levando ao aumento da pressão sanguínea em humanos 5. A nível periférico, a MDMA tem uma acção agonista directa e

17 Introdução ______indirecta nestes receptores, responsável por uma vasoconstricção periférica, dilatação das pupilas, aumento da salivação, diminuição da secreção de enzimas pancreáticas e de insulina, retenção urinária, diminuição da motilidade gástrica e piloerecção em humanos 98. Devido a esta acção estimulante da MDMA na libertação de catecolaminas, a exposição repetida a este derivado anfetamínico depleta as reservas dos referidos neurotransmissores, diminuindo os efeitos biológicos desta droga de abuso quando administrada repetidamente (tolerância aguda) 23. A MDMA pode ainda activar receptores nicotínicos da acetilcolina no músculo esquelético 99 e em várias áreas cerebrais 100, 101. Uma vez que este tipo de receptores está implicado no desenvolvimento de patologias psiquiátricas como a esquizofrenia e está relacionado com a função cognitiva, a interacção das anfetaminas com estes receptores, a nível central, poderá contribuir para as perturbações psiquiátricas e cognitivas que aparecem após consumo crónico destas substâncias 101, 102. A utilização de antagonistas específicos de receptores nicotínicos contendo as subunidades β2 e α7 inibiu completamente o stress oxidativo induzido pela MDMA em preparações de sinaptossomas de estriado de ratinho, prevenindo a sua neurotoxicidade neste modelo animal 55, 103, 104. A MDMA interage directamente com os receptores nicotínicos, especialmente com os subtipos heterodiméricos, o que parece ter influência no efeito da MDMA nos DAT, uma vez que a inibição da recaptação da DA induzida pela MDMA é atenuada pela metilcaconitina e pela memantina (antagonistas α7), e em menor extensão pela diidro-β-eritroidina (antagonista β2). A hiperactividade induzida pela MDMA tem sido relacionada com a libertação de 5-HT 5, 105, o que foi demonstrado pela utilização de vários agonistas e/ou antagonistas da 5-HT e com receptores da 5-HT mutantes 106- 111 . Existe também evidência de que os receptores da dopamina (D1, D2 e 112, 113 talvez D3) contribuem para os efeitos hiperlocomotores da MDMA , uma vez que o aparecimento destes efeitos sofre um atraso quando se administra um antagonista dos receptores D1 e são completamente abolidos quando se

18 ______Introdução

114 administra um antagonista dos receptores D2 . Finalmente, uma contribuição dos receptores α-adrenérgicos na hiperactividade induzida pela MDMA é também possível 115 devido à activação de receptores α1-adrenérgicos ao nível do córtex pré-frontal e das áreas ventrais-tegmentais 116. Estas alterações comportamentais produzidas pela exposição à MDMA são, também elas, condicionadas por variações estruturais nas moléculas dos metabolitos da MDMA, uma vez que os conjugados da GSH com a α-MeDA (5- glutation-S-il-α-MeDA e 6-glutation-S-il-α-Me-DA) apresentam, em ratos, diferente actividade. Foi já verificado que apenas o regioisómero 5-GSH-α- MeDA provoca alterações comportamentais, aparentemente de tipo dopaminérgico (bruxismo, tremores, hiperlocomoção e clonus), sendo o regioisómero da posição 6 comportamentalmente inactivo 117.

1.6.2. Inibição da monoamina oxidase (MAO)

Para além de aumentar a libertação e diminuir a recaptação das catecolaminas, a MDMA, em doses elevadas, impede a sua inactivação metabólica ao inibir competitivamente a MAO (Figura 5), prolongando, assim, a estimulação simpática. A MDMA inibe preferencialmente a MAO-A (com mais afinidade para a 5-HT), mas também tem capacidade para inibir a MAO-B 118. Para doses mais baixas de MDMA (não inibitórias) a MAO está envolvida na metabolização da DA e da 5-HT, levando à formação de espécies reactivas da dopamina e de H2O2. Logo, concentrações mais elevadas de MDMA, capazes de inibir a MAO, parecem diminuir a agressão oxidativa derivada da actividade desta enzima sobre as monoaminas 55, 119.

1.6.3. Inibição da triptofano hidroxilase (TH)

A MDMA tem a capacidade de inibir a enzima limitante da síntese da 5- HT, a triptofano hidroxilase (TH) 120 (Figura 5), provavelmente por um mecanismo que envolve a inactivação dos grupos sulfidrilo desta enzima pelos

19 Introdução ______metabolitos quinónicos da MDMA 5. Este mecanismo parece ser potenciado pelo efeito hipertérmico induzido in vivo pela MDMA, possivelmente como resultado do aumento da formação de espécies radicalares 5. A inibição da TH pode perdurar durante semanas após a administração de uma única dose de MDMA a ratos 5.

1.6.4. Alterações da expressão genética

A MDMA induz a proteína c-fos, uma proteína reguladora da expressão de genes que codificam para neuropéptidos e proteínas essenciais a nível neuronal e que parece estar envolvida na resposta celular ao stress e na morte celular via apoptose 88. O aumento desta proteína ao nível das amígdalas central e basolateral parece estar envolvido no perfil ansiogénico da MDMA em ratinhos 121. A MDMA parece, também, diminuir a expressão de genes como o que codifica para a sinaptotagmina IV (proteína reguladora da secreção de neurotransmissores, do transportador vesicular e da adesão das vesículas à membrana plasmática) 88. Verificou-se, em ratinhos, que a MDMA induziu o mRNA dos transportadores do GABA (GAT1 e GAT4) 88. A expressão de outros genes relacionados com a neurotransmissão GABAérgica, incluindo as proteínas do citosqueleto da família das septinas e distorfinas, é diminuída pela MDMA, o que ilustra o papel essencial deste neurotransmissor na actividade da MDMA a nível neuronal 88. A MDMA regula, ainda, os níveis de mRNA que codificam para a proteína desacopladora mitocondrial UCP3 no músculo esquelético de rato 122. O efeito da MDMA nesta proteína pode contribuir para o efeito hipertérmico da MDMA, uma vez que a UCP3 tem um papel importante no mecanismo de termogénese, actuando ao nível da dissipação do gradiente electroquímico de protões na mitocôndria, favorecendo a libertação de energia sob a forma de calor 123. Este efeito da MDMA será abordado em mais detalhe no ponto 1.6.6.

20 ______Introdução

1.6.5. Efeito neuroendócrino

A administração de MDMA leva a um aumento dos níveis séricos de corticosterona, prolactina, renina, aldosterona e tiroxina (T4) em ratos 5, 122 e de cortisol, prolactina 24, 124, 125, hormona adrenocorticotrófica (corticotrofina ou ACTH) e hormona antidiurética (ou vasopressina) em humanos 31, 125, 126. O aumento da secreção de corticosterona, aldosterona e renina parece ser mediado pela estimulação serotonérgica resultante da administração de MDMA 5, uma vez que a libertação de algumas destas hormonas também é aumentada pela administração de agonistas serotonérgicos 127-130. Esta resposta aos agonistas serotonérgicos está significativamente diminuída nos consumidores crónicos de MDMA 127-130 embora, no caso particular do cortisol, a resposta tenha sido recuperada após um ano de abstinência do uso de MDMA 127. O mesmo não se verificou com a prolactina, o que sugere que os efeitos neurotóxicos da MDMA nos terminais serotonérgicos são prolongados e, provavelmente, dependentes do tipo de receptor serotonérgico em causa, uma vez que a libertação de prolactina é regulada pela activação de receptores

5-HT1A enquanto o efeito na secreção do cortisol parece ser mediado pelos 127 receptores 5-HT2C . Estudos in vitro utilizando hipotálamo isolado de rato indicam que a MDMA e alguns dos seus metabolitos têm também a capacidade de aumentar a libertação de oxitocina e vasopressina num modo dependente da dose 131. Este aumento foi já observado em consumidores de MDMA 132. A MDMA, mediante a activação dos receptores 5-HT1A, activa os neurónios dos núcleos supraóptico e paraventricular do hipotálamo que contêm oxitocina, levando a um aumento da libertação desta hormona e, consequentemente, dos seus níveis plasmáticos. A hormona oxitocina desempenha um papel preponderante nas relações sociais, apego e confiança 133 e a interacção oxitocina-DA pode também influenciar a aquisição e expressão de comportamentos de procura de drogas de abuso. Daí que a oxitocina possa desempenhar um papel importante, embora ainda pouco explorado, na adição ao consumo de droga 134. Portanto, o efeito da MDMA na libertação da oxitocina poderá desempenhar um papel de extrema importância nos efeitos pro-sociais da MDMA e estar na base das propriedades de reforço positivo desta droga de abuso 135.

21 Introdução ______

A MDMA altera também os níveis hipotalâmicos e gonadais das hormonas do eixo hipotálamo-hipófise-gónada em ratos macho, com diminuição dos níveis de mRNA que codifica para a hormona hipotalâmica libertadora de gonadotrofina (GnRH) que medeia a libertação das gonadotrofinas FSH (hormona folículo-estimulante) e LH (hormona luteinizante), e dos níveis séricos de testosterona 136. No entanto, os dados obtidos por Allott e colaboradores, em 2008, não confirmam a premissa de que o consumo de ecstasy resulta numa desregulação mensurável do controlo serotonérgico da actividade endócrina, uma vez que não se detectaram diferenças entre os consumidores de ecstasy e os não-consumidores nas respostas neuroendócrinas, após estimulação serotonérgica 137.

1.6.6. Alterações no sistema termorregulador

A MDMA interfere no sistema de termorregulação, podendo provocar uma elevação acentuada da temperatura corporal (no rato a temperatura basal pode sofrer um aumento de até 2ºC) cujo pico ocorre entre 40 a 60 min após a administração 80, 138-141. O aumento da temperatura corporal após administração de MDMA foi já observado em ratinhos 142, ratos 139, cobaios 143, macacos 144 e humanos 31. Este efeito hipertérmico da MDMA varia com a estirpe de animal utilizada, com a dose administrada, e é altamente dependente da temperatura ambiente, uma vez que a mesma dose de MDMA induz um efeito hipotérmico a baixa temperatura ambiente, e um efeito hipertérmico a temperatura ambiente normal (20-22ºC) ou elevada (30-33ºC) 138, 139, 142. O efeito hipertérmico da MDMA é também enantioselectivo, uma vez que a MDMA racémica e o enantiómero S-(+)-MDMA são capazes de produzir hipertermia, o mesmo não se verificando com o enantiómero R-(-)-MDMA 145. A hipertermia resultante do consumo de MDMA pode dever-se à sua acção no centro termorregulador do SNC e à vasoconstricção periférica dos vasos sanguíneos cutâneos 146. No entanto, esta resposta hipertérmica no homem parece ser também influenciada pelo aumento da actividade muscular

22 ______Introdução associado à dança intensa, pela desidratação e pela elevada temperatura ambiente em locais frequentemente sobrelotados 31. Os mecanismos subjacentes a esta resposta hipertérmica podem ser múltiplos. Apesar de normalmente o aumento da temperatura corporal envolver a activação de vias serotonérgicas, o efeito hipertérmico da MDMA parece ser mediado pelo aumento da libertação de DA. De facto, o aumento da temperatura corporal foi já revertido em ratos com a administração de um 80 antagonista dos receptores D1 da DA , ao contrário do que aconteceu com os antagonistas dos receptores serotonérgicos (ex.: ritanserina, metisergilide) e com os inibidores da recaptação da 5-HT (ex.: fluoxetina) 80, 147-149. Da mesma forma, a depleção dos níveis cerebrais de 5-HT não alterou a resposta hipertérmica induzida pela MDMA 150. No entanto, a 5-HT parece ter um papel importante na modulação da libertação da DA 151 e parece também influenciar a resposta hipertérmica devido aos seus efeitos nos mecanismos de dissipação de calor 149. Mecanismos noradrenérgicos podem também contribuir para este efeito hipertérmico da MDMA, nomeadamente via receptores α-adrenérgicos 152, existindo evidência de que a activação de receptores GABAB reverte este efeito 153. Adicionalmente, a MDMA induz um ligeiro aumento nos níveis séricos de

T4 em roedores e primatas, a qual desempenha um papel modulador na termogénese induzida pela MDMA através da regulação da expressão da UCP3 e/ou a síntese de receptores adrenérgicos 154. A activação dos receptores adrenérgicos α1 e β3 pela NA libertada por acção da MDMA, no músculo esquelético e no tecido adiposo castanho, por um mecanismo dependente da adenosina monofosfato cíclica (AMPc), leva a um aumento da disponibilidade de ácidos gordos (AG) livres e, consequentemente, à produção de calor e desnaturação proteica pela UCP3 presente nas mitocôndrias do músculo esquelético 155 (Figura 6).

23 Introdução ______

Figura 6. Hipótese integrada para os efeitos termogénicos e mionecróticos da MDMA. Neste modelo, o aumento robusto nos níveis plasmáticos de NA activa os receptores adrenérgicos α1 e β3 no tecido muscular esquelético. A activação dos receptores β3 aumenta os níveis intra-celulares de AMPc que vão activar a proteína cinase A (PKA) que, por sua vez, estimula , por fosforilação, a actividade da lipase hormono-dependente, aumentando a conversão dos triglicerídeos em ácidos gordos (AG) livres. Os AG livres fornecem os protões necessários para a ocorrência do desacoplamento mitocondrial. À medida que a temperatura do músculo aumenta, as proteínas desnaturam e pode surgir rabdomiólise como resultado da perda de integridade do músculo esquelético. A activação dos receptores α1 aumenta os níveis de cálcio intra-celulares num mecanismo dependente da fosfolipase C (PLC) que activa o fosfatidil inositol bifosfato (PIP2) a diacilglicerol (DAG) e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3). O papel do cálcio intra-celular na activação da UCP ainda não é bem conhecido. As hormonas da tiróide desempenham um papel permissivo na regulação da expressão genética e proteica da UCP3. SNS, sistema nervoso simpático. Adaptado de Mills 2004 154.

A resposta hipertérmica requer a activação e translocação para o núcleo de proteínas transreguladoras (os factores de choque térmico ou HSFs, nomeadamente o HSF-1) que se ligam ao elemento do choque térmico (HSE) do DNA, mediando a transcrição de genes responsáveis pela síntese de proteínas de choque térmico ou HSPs 156. Assim, quando se verifica uma resposta hipertérmica associada ao consumo de MDMA ocorre um aumento da

24 ______Introdução expressão da HSPs, nomeadamente da HSP70, que pretende proteger os terminais serotonérgicos da lesão prolongada produzida pela MDMA. Este aumento de expressão da HSP70 depende da indução da resposta hipertérmica pela droga e não da libertação de 5-HT nem da formação de radicais hidroxilo 157. A resposta hipertérmica induzida pela MDMA é potenciada quando os animais são previamente expostos a doses neurotóxicas desta substância 147, o que pode ter implicações para os utilizadores de MDMA que tenham danificado neurónios serotonérgicos devido ao consumo anterior desta droga. Em humanos, a presença de alterações prolongadas na termorregulação associadas ao consumo prolongado ou em altas doses da MDMA pode provocar consequências clínicas severas 158 ou mesmo fatais 159. O aparecimento de resposta hipertérmica é extremamente variável, pois é dependente das características ambientais e do indivíduo, uma vez que existem casos em que (i) não se desenvolve resposta hipertérmica à MDMA, (ii) apenas uma pastilha pode desencadear uma resposta hipertérmica fatal 14, ou (iii) o indivíduo sobrevive, mesmo depois de dar entrada no serviço de urgências com uma temperatura corporal de 42,9ºC após ter ingerido três pastilhas de MDMA 160.

1.6.7. Efeito no fluxo sanguíneo e actividade cerebral

Em humanos, a MDMA tem uma capacidade moderada de alterar o fluxo sanguíneo e a actividade cerebral de determinadas regiões do cérebro 5, 161. Esta alteração do fluxo sanguíneo cerebral parece ser mediada pela influência da MDMA na libertação de 5-HT, a qual está envolvida na sua regulação fisiológica.

1.7. Efeitos tóxicos da MDMA

A MDMA tornou-se uma droga de abuso popular devido aos seus efeitos estimulantes intensos e porque se acreditava que teria efeitos tóxicos

25 Introdução ______negligenciáveis. No entanto, um crescente número de intoxicações severas e fatais associadas ao consumo de drogas sintéticas tem sido descrito 38, havendo também estudos que apontam para que um número significativo de acidentes de viação possa ser causado por indivíduos intoxicados com compostos anfetamínicos 3, 13, 162, 163. Os efeitos tóxicos da MDMA nem sempre estão relacionados com as suas acções biológicas, têm normalmente uma origem multifactorial e parecem ser exacerbados pelas variáveis ambientais associadas ao contexto de utilização desta droga (ambientes fechados, sobrelotados, com elevadas temperaturas ambientais, com música em elevados decibéis e repetitiva) 164. No entanto, intoxicações provocadas por exposição à MDMA fora deste contexto constituem provas da acção tóxica directa deste composto. Por exemplo, a intoxicação de uma criança de 8 meses 165, uma de 13 meses 166 e outra de 20 meses 167 que ingeriram acidentalmente uma pastilha/cápsula de ecstasy, ou de um indivíduo paraplégico 168 que consumiu deliberadamente um pastilha de ecstasy. Aliado a esta origem multifactorial que condiciona o aparecimento de efeitos tóxicos está, ainda, a grande variabilidade inter-individual associada ao perfil farmacocinético desta substância. Este fenómeno pode estar na origem da existência de intoxicações fatais com a ingestão de um único comprimido 169, intoxicações graves em que o indivíduo sobreviveu após ingerir 30 comprimidos 170, ou 18 comprimidos 171 e de um caso praticamente assintomático após ingestão de 42 comprimidos 159. Assim, os efeitos adversos agudos da MDMA (incluindo a morte) estão relacionados com as características do consumidor, a dose ingerida, a frequência do consumo, a ingestão de outras substâncias e ainda das condições ambientais nas quais ocorre o consumo 172. Os principais efeitos tóxicos associados ao consumo de MDMA serão abordados de seguida.

26 ______Introdução

1.7.1. Efeitos tóxicos agudos

Tipicamente, os efeitos tóxicos agudos da MDMA em humanos incluem: aumento da pressão arterial e da frequência cardíaca 173, palpitações, náuseas, vómitos, xerostomia, midríase, arrepios, sudação, tremores, trismo (cerrar dos maxilares), bruxismo (ranger dos dentes que conduz a um maior desgaste dentário nos utilizadores 174), dor ou tensão muscular, hiper-reflexia, sensação súbita de frio ou calor, nistagmo (oscilações oculares involuntárias), inquietação, irritabilidade e insónia 5, 13, 23, 73. Podem também surgir intoxicações moderadas caracterizadas por: hiperactividade, ansiedade, taquicardia, hipertensão, aumento da temperatura corporal, confusão, ataques de pânico, delírio e episódios psicóticos com alucinações breves que desaparecem após o término da acção da MDMA 23, 31. Um dos principais sintomas de intoxicação aguda pela MDMA é a hipertermia, através dos mecanismos acima referidos 23. Têm sido descritos casos em que a temperatura corporal atingiu 43ºC 5, 175, apesar de a temperatura de 42ºC ser considerada fatal. A hipertermia pode dar origem a complicações graves e frequentemente fatais que incluem rabdiomiólise, mioglobinúria, coagulação intravascular disseminada (com consequente necrose dos tecidos) e falência renal aguda 5, 176. Para além da hipertermia e das complicações a ela associadas, a MDMA pode ainda provocar outros efeitos tóxicos agudos como a trombocitopenia, leucocitose tardia, acidose, hipoglicemia, congestão pulmonar, edema e toxicidade hepática (hepatite fulminante e necrose hepática) 159, 169, 177-181. Outros efeitos potencialmente fatais incluem acidentes vasculares cerebrais isquémicos e hemorrágicos (hemorragia subaracnóide, hemorragia intracraniana, enfarte cerebral e trombose cerebral), bem como atrofia cerebral, que podem surgir como resultado da hipertensão, angeíte cerebral ou desidratação associadas ao consumo de MDMA 179, 182-184. A lesão hepática induzida pela MDMA pode apresentar vários padrões que variam de formas benignas análogas a hepatites virais 185, 186 até formas graves com falência hepática aguda resultante de necrose hepática extensa 159, 182, 187 ou mesmo falência hepática fulminante, que obriga a recorrer a transplante hepático ou que pode ser fatal 186-190. Este efeito pode resultar da

27 Introdução ______toxicidade apresentada pela MDMA em hepatócitos 191-193 e em células Ito 59 e podem surgir como consequência da hipertermia induzida pela MDMA que desencadeia fenómenos de stress oxidativo com consequente oxidação lipídica e/ou proteica, conduzindo a lesões celulares 194. No entanto, pode ocorrer aparecimento de dano hepático sem que se verifique hipertermia e a extensão deste dano aumenta, aparentemente, com a exposição repetida, num fenómeno que parece estar relacionado com o desenvolvimento de mecanismos imunológicos de tipo auto-imune 194. As espécies reactivas formadas durante o metabolismo da MDMA e das catecolaminas libertadas como resultado da sua acção simpaticomimética podem levar a um aumento da activação do factor nuclear kappa-B (NF-κB), um dos factores de transcrição envolvidos na activação de genes de resposta imediata a estímulos deletérios e inflamatórios 195. O NF-κB pode influenciar o desenvolvimento de processos inflamatórios, bem como a regulação da expressão de enzimas antioxidantes, condicionando o balanço entre manutenção da homeostasia e resposta tóxica à MDMA, tal como já foi demonstrado a nível cardíaco 196 ou hepático 59. A MDMA pode ainda induzir uma disfunção imunológica transitória dependente dos seus níveis plasmáticos com diminuição do número de linfócitos T helper (CD4+) e um aumento do número de células natural killer (NK) 197, 198. Esta disfunção é potenciada e prolongada pela administração repetida de MDMA 199, uma vez que os utilizadores crónicos de MDMA apresentam uma diminuição quer do número de células NK quer do número de células CD4+, o que permite antever uma maior susceptibilidade a infecções e a patologias imunológicas dos indivíduos que consomem cronicamente MDMA 200. Podem surgir, também, alterações retinianas, uma vez que a MDMA parece levar a um aumento da apoptose em células da retina devido à agressão pró-oxidante exercida por esta substância 201. Um quadro de falência renal aguda é também possível 190, 202 e pode resultar dos efeitos tóxicos da MDMA sobre as células dos túbulos renais 203. Pode ainda surgir uma complicação rara e potencialmente fatal denominada hiponatrémia que surge normalmente associada à ingestão excessiva de água e/ou à secreção inapropriada de vasopressina 31, 182, 204-212. A hiponatrémia

28 ______Introdução pode ocorrer porque a MDMA induz um aumento na libertação da vasopressina 213 que leva a uma diminuição plasmática de sódio, a qual pode ser agravada com a ingestão de grandes quantidades de água e culminar em edema cerebral 13, 214, 215. Por último, para doses mais elevadas, a MDMA pode provocar também retenção urinária, o que poderá exacerbar a hiponatrémia 216. Este efeito hiponatrémico da MDMA parece dependente do seu metabolismo 217, sendo a HMMA (que resulta da metilação da DHMA pela COMT) o metabolito que parece apresentar uma maior capacidade de provocar um aumento da libertação de vasopressina 131. Para além destes efeitos tóxicos imediatos, a administração aguda de MDMA pode ainda originar o aparecimento de efeitos tóxicos de longa duração que podem persistir até sete dias após o consumo e incluem fadiga, irritabilidade, ansiedade, temperamento depressivo, insónia, tonturas e tensão muscular 13, 31. No entanto, estudos recentes sugerem que a maioria das pessoas que consomem MDMA não apresentam sintomatologia depressiva a longo prazo 218. O aparecimento de perturbações psicopatológicas (depressão, perturbações psicóticas, alterações cognitivas, episódios bulímicos, alterações impulsivas, crises de pânico e fobia social) parece estar relacionado com a quantidade, a duração e a frequência do consumo de MDMA 219. Esta redução da capacidade de interacção social após o consumo de MDMA parece não ser mediado por alterações compensatórias dos receptores 5-HT2C, uma vez que a capacidade de resposta a um indutor 5-HT2C é semelhante em animais expostos e não expostos à MDMA, não se verificando diminuição da densidade dos mesmos 220.

1.7.2. Efeitos tóxicos a longo prazo

Os efeitos tóxicos a longo prazo da MDMA surgem associados à utilização crónica desta droga de abuso e incluem o desenvolvimento de uma síndrome que afecta o maxilar inferior, erosão dentária e dor miofacial que surgem em resultado do bruxismo e do trismo 179. Existe também a possibilidade de desenvolvimento de anemia aplástica, mas aparentemente é uma complicação reversível 179.

29 Introdução ______

O consumo crónico de MDMA pode ainda levar ao agravamento dos seus efeitos hepatotóxicos com o desenvolvimento de fibrose hepática progressiva 221 que parece estar relacionada com o aumento da produção de colagénio tipo I pelas células Ito induzido pela MDMA, provavelmente através de um mecanismo que envolve fenómenos de stress oxidativo nestas células 222. O efeito tóxico a longo prazo da MDMA mais preocupante é a sua neurotoxicidade que parece afectar selectivamente o sistema serotonérgico, envolvendo um mecanismo independente da dopamina 223, sendo os axónios do núcleo rafe dorsal (nucleus raphe dorsalis), ricos em receptores 5-HT2, particularmente sensíveis 4, 224-229. Esta lesão não provoca um aumento compensatório da síntese de 5-HT nos terminais remanescentes 230. De facto, verifica-se uma redução da densidade dos locais de recaptação de 5-HT que parece correlacionar-se com a duração do consumo da MDMA 226, 231-242. Estas alterações não foram verificadas ao nível dos neurónios dopaminérgicos 234, 235, uma vez que não se detectam défices de DA, NA e dos seus metabolitos associados ao consumo de ecstasy 120. Existem, contudo, diferenças inter- espécies, já que no ratinho a MDMA é uma neurotoxina dopaminérgica 243. Há autores que defendem que a diminuição da função serotonérgica não será uma consequência, mas sim uma causa do consumo de MDMA 244, 245, uma vez que o comportamento impulsivo e a procura de drogas de abuso parecem estar associados a alterações da função serotonérgica 245. Esta lesão serotonérgica parece ser responsável pelo aparecimento de perturbações psicopatológicas 246, 247, aparentemente reversíveis após um longo período de abstinência, embora possam persistir algumas sequelas 227. O mecanismo envolvido nesta neurotoxicidade ainda não foi completamente esclarecido. No entanto, parece estar relacionado com a formação de ROS e RNA durante o metabolismo da MDMA ou durante a auto-oxidação das monoaminas neurotransmissoras libertadas por acção desta substância 248, e com a hipertermia induzida pela MDMA 50, 249. Por este motivo, a indução de hipotermia recorrendo a meios farmacológicos ou não farmacológicos tem a capacidade de reduzir ou prevenir a neurotoxicidade da MDMA 249, 250. O stress oxidativo causado pela MDMA, que parece estar na base da sua neurotoxicidade, pode ser também mediado pela formação de aductos entre os

30 ______Introdução metabolitos activos e a glutationa 54. Quando as alterações das funções serotonérgicas causadas pela MDMA se verificam ao nível do lobo occipital (responsável pela visão periférica contralateral), podem surgir alterações nos processos visuais 251, incluindo défices na capacidade visuoespacial 252. Outras alterações relacionadas com o consumo prolongado de MDMA incluem a diminuição do metabolismo da glucose no hipocampo esquerdo e alterações do EEG para padrões semelhantes aos observados em processos de envelhecimento e demência 253, 254. O uso crónico de MDMA foi também já associado a problemas do sono 255-257 e a vários problemas psicopatológicos, incluindo disfunções alimentares 219 e cardíacas 258. Pode surgir falência renal crónica associada ao consumo de MDMA por provocar angeíte necrosante a nível renal 259. O facto da MDMA ser consumida por mulheres em idade fértil tem suscitado preocupações relativamente às consequências de um possível efeito tóxico a nível embrionário. Um estudo prospectivo realizado no Reino Unido em 1998 revelou a ocorrência de várias malformações e de casos de prematuridade e aborto espontâneo, acima da média da população em geral, nos recém-nascidos de mães consumidoras de MDMA 260. Este aumento do risco de problemas durante a gestação quando a grávida consome anfetaminas é já bem documentado em estudos com animais 261. Por este motivo, o abuso destes compostos durante a gravidez, dependendo do estilo de vida da mãe, está associado a um aumento do risco de ocorrência de parto prematuro, nado- morto e atraso no crescimento intra-uterino 261-263. Os fenómenos de dependência associados à MDMA são pouco prováveis devido ao rápido desenvolvimento de tolerância aos efeitos pretendidos, acompanhado de uma intensificação dos efeitos laterais desagradáveis como o bruxismo, ansiedade e agitação 22, 264-266.

1.7.3. Mortes associadas ao consumo de MDMA

As mortes em que a ecstasy é mencionada como agente causal são pouco frequentes. Como exemplo, no Reino Unido, no ano de 1996, a

31 Introdução ______mortalidade de jovens entre os 15 e os 24 anos apresentou um índice de 2-53 mortes por cada 100 000 consumidores de ecstasy 267. No entanto, estas mortes suscitaram grande preocupação quando começaram a ser noticiadas, há alguns anos, dado ocorrerem, muitas vezes, de forma inesperada e vitimarem jovens socialmente bem integrados. A expressão «morte relacionada com o consumo de ecstasy» poderá significar que a substância foi mencionada na certidão de óbito ou que foi detectada (frequentemente em conjunto com outras drogas) através de análise toxicológica. Embora os procedimentos de comunicação de dados não estejam harmonizados, os dados dos relatórios nacionais Reitox relativos a 2004 sugerem que as mortes relacionadas com o consumo de ecstasy são raras na maioria dos países da União Europeia (UE), e muito em especial os casos em que a ecstasy é a única droga envolvida. Em 2003, vários países notificaram mortes associadas ao consumo de ecstasy: a Áustria (uma morte unicamente relacionada com MDMA), a República Checa (uma morte provavelmente devida a uma sobredosagem de MDMA), a França (oito casos associados ao consumo de MDMA), a Alemanha (dois casos associados unicamente à MDMA e oito envolvendo MDMA combinada com outras drogas — com os valores correspondentes de 8 e 11 em 2002), Portugal (a MDMA foi detectada em 2% das mortes relacionadas com o consumo de droga) e o Reino Unido (a ecstasy é mencionada em 49 certidões de óbito em 2000, 76 em 2001 e 75 em 2002) 268. Um estudo realizado no Reino Unido entre 1994 e 2003 demonstrou que o número de fatalidades associadas ao consumo de ecstasy tem aumentado de ano para ano, mostrando uma correlação positiva com a prevalência do uso de MDMA no ano anterior, o número de actos criminosos e o número de apreensões, mas correlacionado negativamente com o preço das pastilhas de ecstasy 269. Os poucos dados disponíveis nos relatórios nacionais Reitox de 2006 sugerem que as mortes relacionadas com o consumo de ecstasy se mantêm em níveis semelhantes aos mencionados nos anos anteriores. Na Europa em geral, houve referências a 78 mortes envolvendo a ecstasy 20. A Tabela 1 sumariza algumas das referências de mortes relacionadas com o consumo de ecstasy desde 1988 a 2007.

32 ______Introdução

Todas as formas severas de toxicidade induzida pela MDMA podem ser capazes de provocar a morte. Mas, para além desta letalidade directa, ocorrem mortes indirectas associadas ao consumo de MDMA que podem dever-se (i) à depressão que surge subsequentemente ao consumo de MDMA e que pode ser suficientemente intensa para provocar suicídio 270, (ii) a uma depressão pré- existente que leve à utilização deste tipo de droga como meio de suicídio 271, (iii) a acidentes devidos a comportamentos de risco verificados enquanto sob influência dos efeitos agudos da ecstasy (ex.: car surfing, andar em cima de automóveis em movimento 272, escalar postes eléctricos 178, queimaduras 273, condução temerária 274), a acidentes de viação que envolvem condutores e peões incapacitados pela MDMA 159, 272, 275. As drogas do tipo anfetamínico estiveram presentes, directa ou indirectamente, em 70 casos fatais e 467 casos de “condução sob o efeito de drogas”, entre 1999 e 2004 na Holanda 276. Devido ao aumento induzido pela MDMA nos comportamentos de condução temerária, o consumo desta substância aumenta a probabilidade de estar envolvido ou de causar um acidente de viação em 100% e 150%, respectivamente 277. Na maioria dos casos de intoxicação grave ou morte, os níveis sanguíneos de MDMA variaram entre 0,5 e 10 mg/L, o que corresponde a cerca de 40 vezes a dose recreativa habitual 270. No entanto, esta questão agrava-se se considerarmos que, frequentemente, as drogas anfetamínicas são consumidas em combinação com álcool e/ou outras drogas não- anfetamínicas como cocaína ou canabinóides 276, o que pode potenciar as alterações comportamentais, aumentando o risco de acidente, e incrementar a toxicidade directa exercida por cada uma das drogas. Como exemplo, a MDMA foi encontrada em 6 cadáveres autopsiados no Instituto Nacional de Toxicologia Forense da Noruega desde 1996 a 2000. Em nenhum dos casos a MDMA foi a única droga encontrada e apenas um dos casos correspondia a um acidente de viação 274.

33 Introdução ______

Tabela 1. Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Klys et al. 278 2007 Polónia N=1 22 M Paragem cardíaca MDMA (1,42 mg/L em S) súbita MDA (0,17 mg/L em S) Libiseller et al. 279 2007 Áustria N=1 24 M Suicídio MDMA (13,33 mg/L em S; 13,0 mg/L em U) MDEA (7,3 mg/L em S; 5,7 mg/L em U) MDA (0,43 mg/L em S; 0,38 mg/l em U) de Letter et al. 38 2006 Bélgica N=34 < 25 Sobredosagem com MDMA (0,27 – 13,51 mg/L múltiplas drogas em S) Combinação de anfetaminas Politrauma Suicídio Acidente de tráfego Infracções Falência cardiopulmonar aguda Asfixia mecância Hiperpirexia Schifano et al.269 2006 Reino N=394 42% das mortes Unido envolveram apenas MDMA Cheng et al. 280 2005 Hong N=3 20 Acidente de viação MDMA (0.36 mg/L em S) Kong 31 Acidente de viação MDMA (2,0 mg/L em S) MDMA e MDA em U 22 Acidente de viação EtOH (25 mg/100 mL em S) MDMA (0,68 mg/L em S) Ketamina (0,21 mg/L em S) Efedrina (0,40 mg/L em S) Libiseller et al. 281 2005 Áustria N=1 19 Falência MDMA (3,8 mg/L em S) cardiopulmonar Vestígios de MDA e de THC 11-hidroxi-THC (1,6 μg/L) 11-nor-9-carboxi-THC (65 μg/L) em S EtOH (0,1g/L em U) CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

34 ______Introdução

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem De Letter et al. 37 2004 Bélgica N=2 18 M Congestão EtOH (0,56 mg/mL em S; pulmonar 1,23 mg/mL em U) Edema Metadona (1,1 μg/mL em hemorrágico S) MDMA (0,271 mg/L em S; 3,29 mg/L em U) MDA (0,009 mg/L em S; 0,1 mg/L em U) 31 M Edema pulmonar MDMA (26,059 mg/L em S; 71,56 mg/L em U) MDA (0,048 mg/L em S; 3,48 mg/L em U) Dams et al. 282 2003 Bélgica N=1 Hiperpirexia MDMA (1,13 mg/L em S) CID Anfetamina, MDA e PMA em S Garcia-Repetto 2003 Espanha N=3 19 M Hiperpirexia MDMA (3,18 mg/L em S; et al. 39 Rabdomiólise 7,99 mg/L em U) Coagulopatia MDA (0,06 mg/L em S; Falência multi- 1,18 mg/L em U) orgânica 20 M Hiperpirexia MDMA (0,28 mg/L em S; Rabdomiólise 32 mg/L em U) Coagulopatia MDA (0,05 mg/L em S; Falência multi- 0,74 mg/L em U) orgânica Schifano et al. 283 2003 Reino N=167 15-29 85,6% tinha MDMA em S Unido 13,2% tinha MDA em S 0,6% tinha MDEA em S 0,6% tinha PMA em S Vuori et al. 284 2003 Finlândia N=4 18 F Convulsões EtOH (0.65 g/dL em S; Paragem 0,69 g/dL em U) respiratória Anfetaminas em U Intoxicação MDMA (1,6 mg/L em S) acidental por Moclobemida (2,3 mg/L em MDMA e S) moclobemida CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

35 Introdução ______

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Vuori et al. 284 23 M Intoxicação Anfetamins e opiáceos em (cont.) acidental por U MDMA e MDMA (2,0 mg/L em S) moclobemida Morfina (0,08 mg/L em S) Anfetamina (0,1 mg/L em S) DXM (1,1 mg/L em S) Moclobemida (2,1 mg/L em S) Ciclizina (0,3 mg/L em S) Oxazepam (1,0 mg/L em S) Diazepam (1,0 mg/L em S) Desmetildiazepam (0,1 mg/L em S) Temazepam (0,2 mg/L em S) Vestígios de alprazolam em S 18 M Hiperpirexia EtOH (0,28 g/dL em U) (43,2ºC) Anfetaminas e Intoxicação canabinóides em U acidental por MDMA (1,7 mg/L em S) MDMA e Anfetamina (0,15 mg/L em moclobemida S) MDA (0,05 mg/L em S) THC (1,8 μg/L em S) Moclobemida (7,9 mg/L em S) 19 M MDMA (2,1 mg/L em S) MDA (0,05 mg/L em S) THC (3,1 μg/L em S) Moclobemida (6,5 mg/L em S) Lidocaína (1,6 mg/L em S) de Letter et al. 285 2002 Bélgica N=1 Sobredosagem MDMA (3,10 mg/L em S) MDA em S CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

36 ______Introdução

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Gill et al. 286 2002 Nova N=22 17-41 Intoxicação aguda MDMA (n=22) Iorque (n=13) Opiáceos/cocaína em S (EUA) Lesão mecânica (n=7) (ex.: alvejamento) (n=7) Combinação de doença anterior com a intoxicação aguda (n=2) Fineschi et al. 287 1999 Itália N=2 19 M Hiperpirexia MDMA (7,15 mg/L em S; CID 31 mg/L em U) MDA (0,25 mg/L em S; 0,85 mg/L em U) 20 M Hiperpirexia MDMA (0,18 mg/L em S; 263,13 mg/L em U) MDA (0, 12 mg/L em S; 5,25 mg/L em U) MDEA (1,59 mg/L em S; 183,73 mg/L em U) O’Connor 1999 Nova N=1 27 F Edema cerebral et al. 288 Zelândia Walubo et al. 289 1999 EUA N=1 53 M Suicídio MDMA (3,05 mg/L em S) Hiperpirexia Anfetaminas em U (40,4ºC), Rabdomiólise CID Byard et al.290 1998 Austrália N=2 22 F Hiperpirexia PMA (1,32 mg/L em S) Sul (42,5ºC) MDMA (0,3 mg/L em S) CID Níveis elevados de MTA Hipercalémia em S Rabdomiólise Canabinóides em S 26 F Cianose PMA (2,2 mg/L em S) Hiperpirexia MDMA (0,82 mg/L em S) (46,1ºC) MTA (0,09 mg/L em S) Arritmia cardíaca Edema pulmonar Henry et al. 204 1998 Reino N=1 32 M Paragem MDMA (4,56 mg/L em S) Unido cardiovascular MDA (0,36 mg/L em S) EtOH (0,24 mg/mL em S) CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

37 Introdução ______

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Mueller et al. 291 1998 EUA N=1 20 F Hiperpirexia MDMA em S Lora-Tamayo 1997 Espanha N=10 23 M Agressão por arma MDMA (0,23 mg/L em S) et al. 275 branca MDEA (0,77 mg/L em S) Choque MDA (0,05 mg/L em S) hipovolémico Anfetamina (0,62 mg/L em S) 17 M Salto de uma janela MDMA (0,23 mg/L em S) Anfetamina (0,10 mg/L em S) MDA (0,04 mg/L em S) MTA (0,35 mg/L em S) 32 M Atropelamento MDMA (0,27 mg/L em S) EtOH (2,47 mg/mL em S) 39 M Morte súbita na MDMA (0,60 mg/L em S) discoteca MDEA (0,22 mg/L em S) Doença coronária MDA (0,12 mg/L em S) isquémica Anfetamina (0,22 mg/L em Oclusão da artéria S) coronária direita e EtOH (0,54 mg/mL em S) artéria circunflexa Enfarte antigo no ventrículo esquerdo 21 M Acidente rodoviário MDMA (0,17 mg/L em S) MDEA (1,07 mg/L em S) MDA (0,18 mg/L em S) Anfetamina (0,10 mg/L em S) EtOH (0,71 mg/mL em S) 26 M Acidente rodoviário MDMA (0,03 mg/L em S) MDEA (2,44 mg/L em S) MDA (0,15 mg/L em S) Benzilecgonina (0,05 mg/L em S) EtOH (0,88 mg/mL em S) 29 M Reacção adversa a MDMA (4,07 mg/L em S) drogas MDA (0,49 mg/L em S) Morte em espaço Morfina (0,38 mg/L em S) aberto Alprazolam (0,1 mg/L em S) EtOH (0,92 mg/mL em S) CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano. 38 ______Introdução

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Lora-Tamayo 30 M Morte em espaço MDMA (0,98 mg/L em S) et al. 275 (cont.) aberto Anfetamina (0,06 mg/L em Encontrado com S) seringa ao lado Morfina (0,15 mg/L em S) Edema pulmonar EtOH (0,38 mg/mL em S) agudo 27 M Edema pulmonar MDMA (8 mg/L em S) agudo Anfetamina (0,18 mg/L em Hemorragia S) pulmonar MDA (1,2 mg/L em S) Cocaína (0,04 mg/L em S) Benzilecgonina (0,13 mg/L em S) EtOH (0,9 mg/mL em S) 19 M Reacção adversa a MDMA (0,49 mg/L em S) drogas MDEA (4,32 mg/L em S) MDA (0,29 mg/L em S) Anfetamina (0,20 mg/L em S) Dipirona (1,36 mg/L em S) Parr et al. 292 1997 Austrália N=1 15 F Hiponatrémia MDMA (0,05 mg/L em S; Edema cerebral 430 ng/mL em U) Coore 293 1996 Irlanda N=1 18 F Hiperpirexia (43ºC) MDA (0,246 mg/L em S) Lesão renal MDMA e MDA em U CID Rabdomiólise Cox et al. 294 1996 Reino N=1 22 M Hiperpirexia MDMA (0,43 mg/L em S) Unido CID MDEA (0,30 mg/L em S) MDA (0,25 mg/L em S) Crifasi et al. 295 1996 EUA N=1 29 M Acidente MDMA (2,14 mg/L em S; 118,8 mg/L em U) MDA (< 0,25 mg/L em S; 3,86 mg/L em U) Dar et al. 296 1996 EUA N=1 17 M Hiperpirexia Rabdomiólise CID CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

39 Introdução ______

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Ellis et al. 186 1996 Reino N=4 21 F Hiperpirexia (41ºC) MDMA (0,11 mg/L em S; Unido HTA 0,04 mg/L em U) Taquicardia Falência renal hiperaguda CID Transplante Sepsis 18 F Icterícia progressiva Falência hepática devida ao consumo regular de ecstasy 36 F Icterícia após consumo de 1 pastilha de ecstasy Transplante Sepsis 22 F Consumo de ecstasy durante 6 meses Icterícia Transplante parcial Sepsis Fineschi et al. 297 1996 Itália N = 1 20 M Hiperpirexia MDMA (0,18 mg/L em S) CID MDEA em S Milroy et al. 182 1996 Reino N=7 21 M Colapso na rave. MDMA (4,2 mg/L em S) Unido Hiperpirexia (44ºC) Anfetamina (1,4 mg/L em Paragem cardíaca S) 20 M Colapso na MDMA (0,04 mg/L em S) discoteca ↑PA Hiponatrémia Intoxicação por água 24 M Morte na discoteca MDEA (0,187 mg/L em S) Causa Anfetamina (0,453 mg/L desconhecida em S) CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

40 ______Introdução

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Milroy et al. 182 21 M Morte na cama MDMA (2,1 mg/L em S) (cont.) após a festa MDEA (3,5 mg/L em S) Causa MDA (8,5 mg/L em S) desconhecida Anfetamina (0,256 mg/L em S) 20 M Encontrado MDMA (0,09 mg/L em S) inconsciente na MDA (0,13 mg/L em S) cama Rigidez Hiperpirexia (39,5ºC) Hipóxia cerebral Sobrevida de 4 dias 25 M Morte súbita na rua MDMA (vestígios em U) MDA (vestígios em U) 23 M Icterícia progressiva e falência hepática Consumo exagerado de ecstasy Moore et al. 72 1996 EUA N=1 20 M Intoxicação aguda MDMA (2,8 mg/L em S) por inalação de Benzoilecgonina (0,97 MDMA, cocaína e mg/L em S) heroína Morfina (0,11 mg/L em S) MDMA e MDA em U Squier et al. 298 1995 Reino N=1 30 M Convulsões MDMA, heroína, Unido Hiperpirexia anfetamina e EtOH em S Necrose cerebral Forrest et al. 299 1994 Reino N=1 21 M Asfixia MDA, MDEA e MDMA em Unido Convulsões? S Hooft et al. 272 1994 Bélgica N=1 26 M Acidente de viação MDMA (0,63 mg/L em S) em tentativa de car EtOH (1,23 g/L em S) surfing Anfetaminas em U Watson et al. 300 1993 Reino N=1 16 M Hiperpirexia Unido Rabdomiólise CID CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

41 Introdução ______

Tabela 1 (cont.). Mortes associadas ao consumo de ecstasy de 1988 a 2007.

Idade Análise Toxicológica Autor Ano Local Casos Causa Sexo postmortem Campkin et al. 301 1992 Reino N=1 18 M Hipotensão MDMA (1,26 mg/L em S) Unido Taquicardia Hiperpirexia (42ºC) Rabdomiólise CID Henry et al. 247 1992 Reino N=6 18 M Hiperpirexia Unido Falência cardiovascular 17 M Hiperpirexia CID Convulsões 20 M Hiperpirexia Rabdomiólise CID 18 M Hiperpirexia Rabdomiólise CID 21 M Acidente de viação 23 M Acidente de viação Rohrig et al. 302 1992 EUA N=2 35 M Causa MDMA (2,8 mg/L em S) desconhecida F Suicídio MDMA (0,58 mg/L em S) Depressão? Diazepam em S Screaton et al. 180 1992 N=1 19 M Hiperpirexia Rabdomiólise CID Chadwick 1991 Reino N=1 16 F Hiperpirexia MDMA (0,424 mg/L em S) et al. 169 Unido CID Suarez et al. 181 1988 EUA N=1 34 M Falência MDMA (2 mg/L em S) cardiovascular CID, coagulação intra-vascular disseminada. S, sangue. U, urina. M, masculino. F, feminino. EtOH, etanol. THC, tetraidrocanabinol. MDEA, N-etil-3,4-metilenodioxianfetamina. PMA, p-metoxianfetamina. DXM, dextrometorfano.

42 ______Introdução

1.8. Estudos epidemiológicos sobre a utilização da MDMA

Vários estudos sobre os padrões de consumo da MDMA foram já realizados. Estes estudos são normalmente levados a cabo através de questionários ou entrevistas e os intervenientes podem ser seleccionados por serem consumidores, seleccionados aleatoriamente na população ou por responderem a anúncios. Os resultados dos diferentes estudos indicam que o consumo de MDMA pela população jovem está em expansão. Foi já estimado que só no Reino Unido 500.000 jovens ingerem ecstasy em cada fim-de-semana 5. Os dados referidos coincidem, também, em que a maioria dos consumidores de MDMA misturam as pastilhas de ecstasy com outras substâncias psicoactivas, principalmente tabaco, Cannabis e álcool, sendo também frequente a combinação com cocaína, outras enfetaminas ou LSD. Uma análise mais pormenorizada destes resultados está representada na Tabela 2. Da análise da Tabela 2 pode deduzir-se que o uso combinado de ecstasy pode ser feito com substâncias psicoestimulantes (cocaína, anfetaminas, tabaco) ou com sedantes (álcool, Cannabis). Poderia especular- se que o objectivo de ambos os padrões de consumo tem uma finalidade moduladora dos efeitos da MDMA. No entanto, não se pode escamotear a possibilidade de que este policonsumo se deva à presença prévia de dependência de alguma das drogas usadas em combinação (ex.: tabaco, álcool).

44 Tabela 2. Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Bellis et al. 303 2008 Europa* Frequentadores 1341 16-35 28,7% (pelo menos 1 vez na vida) de bares e clubs Cole et al. 304 2008 Reino Unido Consumidores 80 20-22 86,3% (pelo menos 1 vez na vida) 1-6 de droga Mendes 2008 Coimbra Consumidores 223 13-23 53,8% consumo ocasional (0-1 vez/mês, 6,7% policonsumo) et al. 305 (Portugal) de MDMA 34,5% consumo habitual (+ de 1 vez/mês, 35% policonsumo) 11,7% consumo excessivo (+ de 1 vez/semana, 58,3% policonsumo) Pisetsky 2008 EUA Estudantes 9-12º 13917 4,9-7,4% (no mês anterior ao estudo) et al. 306 ano Wilkins et al. 307 2008 Nova População geral 5475 (em 1998) 15-45 1,5% em 1998 Zelândia 5504 (em 2001) 3,9% em 2006 3042 (em 2003) 1902 (em 2006) Chinet et al. 308 2007 Suiça Frequentadores 302 16-46 40,4% (pelo menos 1 vez na vida) de festas rave 14,7% (de 1 a 3 vezes no mês anterior ao do estudo) Dresen et al. 309 2007 Alemanha Condutores 247 18-29 14,6% só tinha consumido MDMA inabilitados 27% apresentava policonsumo de drogas sintéticas Goudie et al. 310 2007 Reino Unido Consumidores 40 18-45 85% (pelo menos 1 vez na vida) 1-4 de drogas * Lisboa (Portugal), Palma de Mallorca (Espanha), Veneza (Itália), Atenas (Grécia), Ljubljana (Eslovénia), Brno (República Checa), Viena (Áustria), Berlim (Alemanha), Liverpool (Reino Unido)

Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Halkitis et al. 311 2007 Nova Iorque Homens Gay e 450 18-67 74,7% (EUA) bisexuais Medina et al. 312 2007 EUA Consumidores 48 18-35 97,9% (no ano anterior ao estudo) de MDMA Yen et al. 313 2007 Taiwan Consumidores 200 14-19 62,5% usaram menos de 20 vezes de MDMA 29,5% fazem policonsumo Breen et al. 314 2006 Austrália Consumidores 852 22-24 3-4 de MDMA Chou et al. 315 2006 Taipei Adolescentes 2126 12-18 2-14,5% (pelo menos 1 vez na vida) (Taiwan) Copeland 2006 Austrália Consumidores 216 19-39 28,2% mistura MDMA com medicamentos 2 et al. 316 de MDMA Fang et al. 317 2006 China Consumidores 5,37% de drogas Halkitis et al. 318 2006 Nova Iorque Homens 131 18-40+ 56,5% (EUA) homossexuais e bissexuais consumidores de GHB Hopfer et al. 319 2006 Colorado Jovens em 782 10-32 34% (pelo menos 1 vez na vida) (EUA) tratamento por abuso de droga 45

46 Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Parsons 2006 Nova Iorque Mulheres 1104 18-49 44% (pelo menos 1 vez) et al. 320 (EUA) frequentadoras de discotecas Pavarin 321 2006 Itália Frequentadores 2015 <20-40+ 17-27,1% (pelo menos 1 vez) de festas rave 9,5-16,2% (no ano anterior) 4,4%-10% (no mês anterior) Wish et al. 322 2006 EUA Estudantes 1206 9 % (pelo menos 1 vez) universitários Wu et al. 323 2006 Texas (EUA) Mulheres de 696 18-31 15,2%(pelo menos 1 vez) (destes, 53% no ano anterior e 21% 0,5-4 baixos nos 20 dias anteriores) rendimentos Wu et al. 324 2006 EUA Consumidores 19084 16-23 13% (pelo menos 1 vez) drogas sintéticas 6% (no ano anterior) Barrett et al. 325 2005 Montreal Frequentadores 186 17-47 50% (pelo menos uma vez) (destes, 92,3% usa MDMA em 1 (Canadá) de festas Rave combinação) Clatts et al. 326 2005 Nova Iorque Homens jovens 569 17-28 47,9% (pelo menos 1 vez) (EUA) homo e 24,3% (consome cronicamente) (destes, 82.8% usou pelo bissexuais menos 1 vez e 13,3% usaram mais de 5 vezes no mês anterior) Fernández 2005 EUA Homens 172 14% (nos últimos 6 meses) et al. 327 hispânicos homo e bissexuais

Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Goldsamt 2005 Nova Iorque Estudantes do 23780 2,3% (pelo menos uma vez) et al. 328 (EUA) 6º, 7º e 8º ano Ompad et al. 329 2005 Nova Iorque Consumidores 715 17-64 23,4% (pelo menos 1 vez) (EUA) de drogas 11,9% (últimos 6 meses) Crosby et al.330 2004 EUA Homens homo e 150 31-50 14% (nos últimos 3 meses) bissexuais Lora-Tamayo 2004 Ibiza Indivíduos 70 77% (apenas MDMA na urina) et al. 331 (Espanha) presos por actos 20% (MDMA + outra droga sintética) criminosos que confessaram consumo de club drugs Scholey et al.332 2004 Internautas 763 21-25 37% (pelo menos 1 vez) “Novato” – 100% “Novato” (39%, consumiu 1-9 vezes) 1-2 pastilhas “Moderado” (48%, consumiu 10-99 vezes) “Moderado” – 3% “Pesado”(13%, consumiu mais de 100 vezes) mais de 4 pastilhas “Pesado” – 14% mais de 4 pastilhas

48 Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Van Leeuwen 2004 Denver, Jovens sem abrigo 186 16-25 25% (nos últimos 9 meses) et al. 333 Colorado e que fugiram de (EUA) casa Turner et al. 334 2003 Austália Mulheres 9512 22-27 15% (pelo menos 1 vez) Fendrich 2003 Chicago População adulta 627 18-40 49% consumiu drogas sintéticas pelo menos 1 vez et al. 335 (EUA) Gross et al. 336 2002 Montreal Frequentadores 210 16-32 65,2% (pelo menos 1 vez) (Canadá) festas rave National 2002 EUA Estudantes do 8º, 44346 13-14 2,7% em 1999 para 5,2% em 2001 (pelo menos 1 vez) Institute on 10º e 12º ano, 15-16 6% em 1999 para 8% em 2001 (pelo menos 1 vez) Drug Abuse estudantes 17-18 8% em 1999 para 11,7% em 2001 (pelo menos 1 vez) (NIDA) 337 universitários e 19-22 2% em 1991 para 14,7% em 2001 (pelo menos 1 vez) jovens adultos 19-28 3,2% em 1991 para 13% em 2001 (pelo menos 1 vez) Strote et al. 338 2002 EUA Estudantes 14000 <21-24+ 2,8% em 1997 para 4,7% em 1999 universitário Parrott et al. 339 2001 Reino Unido Jovens 768 14-28 15% (menos de 20 vezes) e Itália** 15,5% (mais de 20 vezes) Riley et al. 340 2001 Edimburgo Consumidores de 122 16-47 80% (ecstasy ou anfetamina) (destes 35% toma MDMA (Escócia) droga semanalmente) ** Roma, Pádova, Manchester e Londres

Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Winstock 2001 Reino Unido Consumidores de 1151 18-29 96% (pelo menos 1 vez) 2 ou menos et al.266 droga No último ano: 12% consumiu 2–3 vezes por semana e 22% (55%) consumiu 1 vez por semana 4 ou mais (25%) Boys et al. 341 1999 Inglaterra Sul Consumidores de 100 16-21 22% (nos últimos 90 dias) drogas e álcool 38% (pelo menos 1 vez na vida) Topp et al. 342 1999 Austrália Consumidores de 329 15-46 89% (pelo menos 1 vez/mês) 1 MDMA Instituto 1998 Oslo 15-20 Em Oslo: Nacional de (Noruega) 4,8% (pelo menos 1 vez) Pesquisa de Álcool e No total do país: Drogas da 0,3% (pelo menos 1 vez, em 1994) Noruega 274, 343 2,5% (pelo menos 1 vez, em 1998) Schifano 1998 Itália Consumidores de 150 19-28 50% (1 ou et al.219 MDMA menos) Lenton et al. 344 1997 Autrália Frequentadores de 83 13-48 76% (pelo menos 1 vez) (41% policonsumo) Boys et al. 345 Oeste festas rave 31,3% (na última festa rave)

50 Tabela 2 (cont). Estudos epidemiológicos acerca dos padrões de consumo da MDMA.

Idades Nº de pastilhas Estudo Ano Local População-Alvo N Indivíduos que consomem MDMA (%) (anos) por sessão Williamson 1997 Reino Consumidores de 158 14-59 52% usou durante o último ano 2 et al. 346 Unido droga 70% (no mês anterior) Miller et al. 347 1996 Reino Estudantes do 7722 15-16 7,3% das raparigas (pelo menos 1 vez) Unido ensino secundário 9.2% dos rapazes (pelo menos 1 vez) Webb et al. 348 1996 Reino Estudantes 3075 18-65 13% (pelo menos 1 vez) Unido universitários 2º 5,2 % usou mais de 1 ou 2 vezes ano 2,7% consome uma vez por semana Forsyth 349 1995 Glasgow Frequentadores de 135 14-44 91% (pelo menos uma vez) (Reino festas “rave” Unido) Cuomo et al. 350 1994 EUA Estudantes 742 (em 1986) 15,5% (pelo menos 1 vez, em 1986) universitários 1264 (em 1990) 24,3% (pelo menos 1 vez, em 1998) Solowij et al. 22 1992 Sidney Consumidores de 100 16-48 68% usou mais de 3 vezes 9% menos de 1 (Austrália) MDMA 33% usa uma vez por mês ou por trimestre 71% 1 18 % usa em ocasiões especiais 13% 2 7% mais de 2 Peroutka 351 1987 EUA Estudantes 369 39% usou pelo menos 1 vez no ano anterior universitários

______Introdução

O mais recente relatório do Observatório Europeu da Droga e da Toxicodependência, publicado em 2007 20, indica que em muitos países europeus a segunda substância ilegal mais consumida é algum tipo de droga sintética embora à escala europeia existam, presentemente, mais consumidores de cocaína. Preocupantemente, as taxas de prevalência do consumo destas drogas sintéticas entre os grupos etários mais jovens são significativamente mais elevadas. A prevalência do consumo de ecstasy na UE tem aumentado desde 1990, sendo, actualmente, a droga sintética mais consumida em 17 países europeus dos quais se destacam a República Checa, o Reino Unido, a Espanha e a Holanda. Na faixa etária dos 15 aos 24 anos, encontram-se taxas mais elevadas de prevalência do consumo de ecstasy ao longo da vida entre os homens (0,3-23,2%) do que entre as mulheres (0,3- 13,9%). Esta informação pode ser analisada de forma mais pormenorizada acedendo à página web da European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) e seguindo o link http://www.emcdda.europa.eu/ attachements.cfm/att_44705_PT_TDAC07001PTC.pdf. Em Portugal, o consumo de MDMA surgiu no início da década de 1990 e, à semelhança do que ocorreu nos restantes países europeus, esta droga ganhou rapidamente popularidade, particularmente entre os jovens. Segundo o relatório anual do Instituto da Droga e da Toxicodependência publicado em 2006, nos estudos nacionais de 2001 relativos à população portuguesa dos 15- 64 anos e à população escolar do 3.º Ciclo do Ensino Básico, a ecstasy surgiu com prevalências de consumo muito semelhantes às de heroína e de cocaína, chegando mesmo a ser superiores nalgumas situações, nomeadamente nos padrões de consumo recente. No caso da população reclusa, o consumo de ecstasy apresentou ainda bastante menos expressão que as drogas tradicionais. Nas populações escolares, os estudos mais recentes evidenciaram prevalências de consumo de ecstasy relevantes, embora bastante inferiores às de Cannabis, de acordo com rastreios do HBSC/WHO (Health Behaviour in School-aged Children, colaboração com a Organização Mundial da Saúde), em 2002 e 2006 (respectivamente 2,2% e 1,6%), do ESPAD (European School Survey Project on Alcohol and Other Drugs) em 2003 (4%) e do ECATD (Estudo sobre o Consumo de Álcool, Tabaco e Droga) em 2003 (entre 1,5%

51 Introdução ______dos alunos de 13 anos e 4,3% dos de 18 anos). Entre 1999 e 2003, no âmbito do ESPAD, constatou-se um importante aumento da prevalência do consumo de ecstasy (de 2,3% para 4%). Todavia, a nível do HBSC/WHO entre 2002 e 2006 verificou-se uma diminuição da percentagem de início do consumo de ecstasy. No que respeita ao estudo publicado em 2003 pelo Instituto da Droga e da Toxicodependência (IDT) sobre consumos problemáticos de drogas em populações que não incluem adolescentes, a ecstasy tinha pouca expressão nas amostras das zonas down (esferas sociais marginalizadas e estigmatizadas) e up (esferas social de elevado nível sócio-cultural), surgindo com um consumo esporádico ou único e sendo utilizada pontualmente na zona up como droga recreativa. Foi também assinalada a tendência do seu consumo entre populações juvenis de bairros periféricos, o que poderia indiciar a difusão de consumos para lá dos grupos juvenis de origem. O consumo de MDMA pela população em geral (0,8% na população portuguesa em 2005) é habitualmente baixo, mas estas frequências sobem se nos referirmos à população mais jovem 352. Estas percentagens de consumo de MDMA aumentam quando os estudos epidemiológicos se centram em populações relacionadas com a cultura rave. Um inquérito anual realizado aos leitores da revista de música Mixmag do Reino Unido, cujo público é constituído por pessoas que frequentam clubes de dança regularmente, conclui que a percentagem de pessoas definidas como grandes consumidoras de ecstasy (que consomem normalmente mais de quatro comprimidos por sessão) aumentou para mais do dobro entre 1999 e 2003, de 16% para 36% 353. Num estudo realizado no Reino Unido através da internet 332 também é mencionado um consumo de ecstasy e um policonsumo de droga cada vez mais intenso por parte dos consumidores de ecstasy experientes. A média das idades de início do consumo de MDMA é 19,8 anos 22, 219, 266, 303, 316, 321, 324, 329, 336, 342, 346, 354, 355. Cerca de 10% dos indivíduos com idade inferior a 20 anos consome MDMA 5. Geralmente, as mulheres iniciam o consumo de drogas na adolescência e, a maioria, cessa o consumo cerca dos 25 anos, provavelmente devido ao

52 ______Introdução casamento. Quando esta paragem não ocorre, normalmente o consumo é associado a binge drinking ou a hábitos tabágicos 334.

1.8.1. Onde? – Locais de consumo de MDMA

A MDMA é, habitualmente, consumida em festas rave que, normalmente, ocorrem em grandes espaços isolados como armazéns ou espaços abertos, onde a supervisão está ausente ou é mínima 15. É também consumida em festas techno e em discotecas. Estas festas decorrem tipicamente em ambientes de elevada temperatura, sobrelotados e ao som de música electrónica repetitiva, em elevados decibéis e acompanhada de espectáculos de luz. Todas estas circunstâncias podem influenciar a expressão da toxicidade da MDMA e a maior parte das intoxicações fatais relatadas na literatura está associada ao uso da MDMA neste contexto 13. Nestes locais, o álcool e outras drogas estão também disponíveis e são consumidos em grandes quantidades 314. Preocupantemente, o seu consumo tem vindo a aumentar em domicílios privados, escolas secundárias e universidades 22, 356. Habitualmente, este consumo ocorre preferencialmente durante o fim- de-semana e num contexto de grupo, com os amigos. Existe uma forte relação com o gosto pela música house, techno e trance 305.

1.8.2. Como e quando? – Padrões de consumo de MDMA

A MDMA pode ser consumida por via oral (a mais frequente), nasal (snorting, inalação do pó obtido pelo esmagamento da pastilha 14), rectal (supositórios, conhecida por shefting ou shelving) ou, menos frequentemente, por via injectável. O facto de os utilizadores experimentarem diferentes vias de administração deve-se a que 41% dos utilizadores referem diferenças nos efeitos da MDMA, dependendo da via de administração utilizada. A via injectável é a que provoca um início de acção mais rápido e produz uma experiência mais intensa, embora mais curta. O snorting produz um início de

53 Introdução ______efeito mais rápido que o comprimido, mas uma experiência mais curta, enquanto que os supositórios têm um início de acção lento, produzindo, no entanto, uma experiência mais intensa e prolongada 22. Esta diferença da farmacocinética da MDMA em função da via de administração foi já descrita em primatas não humanos 33. Para aumentar a intensidade das experiências resultantes dos efeitos da MDMA sobre as capacidades sensoriais, os utilizadores de ecstasy usam frequentemente acessórios fluorescentes (colares, pulseiras, etc) e aplicam cremes de menta nos lábios ou spray de menta em máscaras cirúrgicas 14. Os consumidores de ecstasy bebem frequentemente líquidos para evitar a hipertermia e utilizam chupa-chupas ou chupetas para aliviar o bruxismo 67, uma vez que alguns destes utilizadores são conscientes dos efeitos deletérios desta substância 357. Normalmente, o consumo de MDMA é feito num padrão de policonsumo. Num estudo australiano realizado em 2004, os utilizadores de MDMA entrevistados referiram consumir 10 ou 11 tipos de drogas ao longo da sua vida e 7 ou 8 nos 6 meses que antecederam a entrevista 314. Dentro das substâncias mais frequentemente co-consumidas com a MDMA incluem-se o tabaco, a Cannabis e o etanol 331, 332. Um outro padrão de consumo comum envolve a utilização de ansiolíticos e sedativos (opiáceos e benzodiazepinas) em conjunto com os estimulantes 346. Este uso concomitante de estimulantes e sedativos está associado, de acordo com estudos epidemiológicos, ao aumento da probabilidade do seu utilizador vir a utilizar estimulantes injectáveis, vir a sofrer efeitos adversos e vir a ser tratado devido a problemas relacionados com o consumo de drogas 346.

1.9. Factores condicionantes dos efeitos da MDMA

Como já referido, a MDMA provou ser tóxica em vários sistemas de órgãos em animais e em humanos. Contudo, o tipo e a severidade desta toxicidade são influenciados por vários factores incluindo a temperatura ambiente, o exercício, associação de drogas e níveis de hidratação. Estas variáveis, quando combinadas com a heterogeneidade dos compostos incluídos nas

54 ______Introdução pastilhas vendidas como ecstasy, dificultam a determinação das circunstâncias envolvidas nos efeitos tóxicos da MDMA em utilizadores humanos 358. Os principais factores condicionantes dos efeitos agudos e tóxicos da MDMA são abordados de seguida.

1.9.1. Dose de MDMA

Como em qualquer droga preparada e obtida ilicitamente, quer as doses quer a pureza das pastilhas de MDMA variam substancialmente como pode ser constatado por análise da Tabela 3. As pastilhas de ecstasy vendidas no mercado contêm, habitualmente, entre 80 a 150 mg de MDMA, tendo sido também encontradas dosagens superiores (até 250 mg por pastilha) 5, podendo conter também substâncias inertes e outras drogas. Normalmente, as pastilhas contêm a mistura racémica dos dois enantiómeros da MDMA 359. Como já referido, a dose ingerida de MDMA vai condicionar os seus efeitos biológicos e a sua toxicidade, nomeadamente devido ao fenómeno de auto-inibição metabólica induzido por esta molécula. Os efeitos pró-sociais em ratinhos e ratos são aumentados de forma dependente da dose 360-362. Mesmo o consumo de pequenas doses de MDMA apenas uma vez por semana pode causar efeitos prolongados em ratos que se manifestam a nível comportamental 363. Em humanos, o consumo de doses mais elevadas foi mais frequentemente associado com sensação de desorientação e com mais efeitos alucinatórios e laterais. Este padrão de consumo provoca um efeito mais prolongado, mais intenso, com um pico de efeito mais longo e mais forte, aparecem mais efeitos de “ressaca” e perde-se o “sentimento de estar a controlar” 22. No entanto, para além de influenciar a duração e intensidade dos efeitos a dose de MDMA pode influenciar a capacidade aditiva desta substância. Exemplo disso é o facto de, em condições de temperatura ambiente normal, a preferência pela MDMA em macacos aumentar em função da dose, uma vez que para uma dose de MDMA de 0,03 mg/kg, os animais preferem a ração em

55 Introdução ______vez da MDMA, enquanto que para doses mais elevadas, os animais preferem a MDMA em detrimento da ração 364. Não apenas a quantidade de MDMA consumida em cada ocasião, mas também a frequência do consumo, alteram o perfil de efeitos e de toxicidade deste composto. Doses repetidas de MDMA levam ao aparecimento de hipertermia numa forma dose-dependente em temperaturas ambientais que não originam resposta hipertérmica quando a MDMA é administrada em doses isoladas 147. O mesmo padrão de aumento de resposta foi verificado em ratos para a resposta hipercinésica associada ao consumo de MDMA 375. O consumo de várias doses de MDMA parece contribuir ainda, em primatas não-humanos, para o aparecimento de défices serotonérgicos duradouros, mesmo com apenas 2 doses de 4,3 mg/kg administradas per os com 3 horas de intervalo 33. No entanto, doses sucessivas são normalmente associadas a experiências menos intensas e de menor duração de efeitos do que a primeira dose consumida em casa ocasião, normalmente com redução dos efeitos agradáveis e aumento dos efeitos laterais. Este facto pode reflectir o desenvolvimento de taquifilaxia, fenómeno de tolerância aguda normalmente associada aos alucinogénios 22. Normalmente, aqueles que consomem um maior número de pastilhas de MDMA durante a vida têm um maior risco de, eventualmente, desenvolver perturbações psicopatológicas 219. A relevância de estudos sobre o consumo da MDMA em humanos tem vindo a aumentar devido às variações de doses consumidas 76. De facto, os resultados de um estudo realizado em 2001 no Reino Unido indicam que alguns utilizadores regulares de ecstasy consomem grandes doses de MDMA que não estão muito distantes das usadas em animais para induzir neurotoxicidade. Se considerarmos as diferenças interespécies, a maior taxa metabólica nos pequenos roedores faz com que a dose equivalente nos humanos seja menor, pelo que, em termos de saúde pública, um número significativo de indivíduos estão expostos a um sério risco de danos neurotóxicos que são ainda condicionados pela via e frequência dos consumos 266.

Tabela 3. Perfil de impurezas e conteúdo em MDMA de pastilhas vendidas como ecstasy. Dose de Outras substâncias presentes nas pastilhas com Estudo Ano Local N Origem Com MDMA Sem MDMA MDMA MDMA Cheng 2006 Hong 89 Apreensão Média 43 Ketamina, cafeína, salicilatos, paracetamol, et al. 365 Kong mg clorfeniramina, Metronidazol, sub-produtos de síntese Tanner- 2006 EUA 1214 Submissão 39% (apenas MDMA) 46% MDA, DXM, cafeína, pseudoefedrina, MTA. Smith 366 anónima 15% (MDMA+X) Baixos teores de ketamina, DOB, Heroína, PCP, PMA

Teng 2006 Taiwan 181 Apreensão 16-193 66-71% (apenas MDMA) 7% continha MDEA et al. 367 mg 7% continha MTA 4% continha anfetamina 18% continha cafeína MDA, ketamina, efedrina, paracetamol, diazepam, clorzoxazona, nicotinamida EACD*368 2004 Nova 8604 Apreensão 30,2- A maioria Ketamina, cocaína, Zelândia 172,4 mg Cheng 2003 Hong- 212 Apreensão 55% MTA, MDA e Ketamina (presente em 12% das pastilhas em 2000 e et al. 369 Kong anfetamina 42% em 2001)

Cole et al. 370 2002 Reino 80 Apreensão 20-109 100% MDEA Unido mg *EACD, Expert Advisory Committee on Drugs, Nova Zelândia

58 Tabela 3 (cont). Perfil de impurezas e conteúdo em MDMA de pastilhas vendidas como ecstasy.

Dose de Outras substâncias presentes nas pastilhas com Estudo Ano Local N Origem Com MDMA Sem MDMA MDMA MDMA Spruit 371 2001 Holanda 10000 Apreensão 48-60% (apenas MDMA) 2-7% (MDA ou MDA, MDE, anfetamina 7-13% (MDMA+X) MDEA) Baggott 2000 EUA 107 Submissão 63% (MDMA, MDA ou 29% 21% contém DXM et al. 372 de MDEA) Cafeína, efedrina, pseudoefedrina, salicilatos pastilhas para análise Sherlock 1999 Reino 25 Amnistia pombas 64% (MDEA ou MDMA) 24% Ketamina, cafeína, MTA, anfetamina paracetamol et al. 373 Unido (19-140 mg) outras (2- 105 mg) Schifano 1998 Itália 20000 Apreensão 100-150 85-90% MDA, MDEA, et al. 219 mg MBDB Giroud 1997 Suiça MDA, MDEA, MBDB, 2-CB, Cafeína, efedrina, polióis, et al. 3 LSD, testosterona, cloroquina, vasodilatadores Milroy 1996 Reino 13 0,21-12 77% (MDEA, MDMA, MDA, et al. 182 Unido mg ou misturas) Renfroe 374 1986 EUA 101 58 % (apenas MDMA) 16% MDA 26% (MDMA+X)

______Introdução

1.9.2. Condições ambientais no momento do consumo

O risco para a saúde associado ao consumo de substâncias de abuso está relacionado com as condições ambientais dos locais em que elas são usadas 376. De facto, as condições ambientais, sobretudo a temperatura, afectam grandemente os efeitos e a toxicidade da MDMA. Os efeitos da MDMA na temperatura corporal parecem ser dependentes da temperatura ambiente em ratos 139, 377-379, ratinhos 142 e macacos 380, 381. Quando administrada a ratos sob condições de temperatura ambiente elevada, a MDMA provoca hipertermia por aumentar a produção de calor pelo tecido adiposo castanho e diminuir a perda de calor por provocar vasoconstrição periférica. Pelo contrário, quando administrada a ratos em ambientes frios, a MDMA causa hipotermia inibindo a termogénese do tecido adiposo castanho e a vasoconstrição da artéria da cauda causadas pelo frio, por um mecanismo 382 que parece envolver a activação de receptores 5-HT1A e D2 . Aparentemente, a perda de 5-HT para interagir com os receptors 5-HT1A leva a perturbações na termorregulação em ratos colocados em ambientes com temperaturas elevadas 149. Estas alterações da temperatura corporal podem levar a alterações no volume de distribuição, afectando a farmacocinética da MDMA 380. Além de influenciar a resposta termogénica, a temperatura ambiente tem também influência na intensidade reforçadora relativa da MDMA (ou seja, na vontade de consumir novamente e em detrimento da comida) em macacos. De facto, o aumento da temperatura ambiente (característico dos locais onde a MDMA é consumida) aumenta a intensidade relativa de reforço de uma injecção de MDMA na dose de 0,03 mg/kg, enquanto que a diminuição da temperatura ambiente atenua significativamente a escolha de uma dose de MDMA de 0,1 mg/kg 364. O mesmo aumento do reforço foi observado em ratos que, em ambiente quente, aumentaram o número de auto-administrações de MDMA 383. Um possível mecanismo neuroquímico para explicar este aumento do reforço do consumo de MDMA pode ser uma potenciação do aumento dos níveis extracelulares de DA nas áreas do cérebro envolvidas no reforço como o nucleus accumbens 384, uma teoria confirmada em ratos 385.

59 Introdução ______

No entanto, em ratos, apesar de afectar a magnitude da resposta hipertérmica induzida pela MDMA, a temperatura ambiente não afecta a hipercinésia 375. Foi também já referido que o aumento da temperatura ambiente tem também a capacidade de aumentar a toxicidade da MDMA quer in vivo 139, 142, quer in vitro 60, 386, 387. Por exemplo, Malberg e Seiden (1998) encontraram marcadores de neurotoxicidade no cortex frontal, hipocampo e estriado, quando a MDMA foi administrada a ratos a uma temperatura ambiente de 26- 30ºC, o que não se verificou quando a administração foi feita a 20-24ºC 139. Também aqui, a DA parece ter um papel importante 93. A temperatura ambiente elevada aumenta ainda a capacidade da MDMA inibir a triptofano hidroxilase 230, o que potencialmente irá atrasar a reposição dos níveis neuronais de 5-HT. Um dos efeitos também aumentado em ambientes de temperatura mais elevada é o efeito pró-social da MDMA em ratos 383. Por outro lado, a interacção social com fêmeas, ou restrições na dissipação de calor, leva a uma potenciação do aumento da temperatura cerebral induzido pela MDMA. Este facto foi já confirmado em ratos 388 e pode estar envolvido na potenciação da neurotoxicidade da MDMA. O papel da temperatura ambiente é de tal forma importante na intensidade dos efeitos que, em relatos subjectivos, os utilizadores de MDMA referiram que “o calor foi o factor causal do início e manutenção dos efeitos” 364. Também o ruído em alto volume foi já associado a um aumento da neurotoxicidade da MDMA em ratinhos, que, nestes animais, ocorre por lesão dos terminais dopaminérgicos 389. No entanto, o mecanismo pelo qual a exposição a ambientes ruidosos aumenta a neurotoxicidade da MDMA não está ainda esclarecido. O ruído pode potencialmente agravar também a rabdomiólise ao nível do miocárdio (miocitólise), muitas vezes considerada responsável de morte súbita subsequente ao consumo de MDMA, uma vez que o ruído, por si só, pode lesar o miocárdio e, quando associado a um consumo múltiplo (binge) de MDMA, origina alterações ultra-estruturais ao nível das mitocôndrias do músculo cardíaco 390, 391. Situações de stress (ex.: imobilização, interacção social com congéneres agressivos, choques eléctricos nas patas, contusão da cauda, restrição de comida, stress pré-natal) provocam um aumento das concentrações cerebrais

60 ______Introdução de MDMA em ratinhos 392 e aumentam a auto-administração de psicoestimulantes 393. Estudos em animais demonstraram ainda que a agregação dos animais potencia os efeitos agudos de ambos os enantiómeros da MDMA 145, 394, o que levanta a problemática do consumo habitual desta substância em ambientes sobrelotados. Esta agregação influencia também comportamentos aditivos relativamente à MDMA (quer racemato quer qualquer um dos enantiómeros) que são mais evidentes em animais isolados do que em animais agregados 395. Também a actividade física contribui para o agravamento dos efeitos tóxicos agudos da MDMA 394, provavelmente por aumentar a produção de calor e contribuir, assim, para um aumento da hipertermia. De facto, utilizadores que reportaram dançar ou fazer exercício físico quando sob os efeitos da MDMA parecem apresentar, posteriormente, mais efeitos adversos. A imobilização de ratinhos aos quais foi administrada uma dose de 20 mg/kg de MDMA resultou num bloqueio da resposta hipertérmica, bem como da neurotoxicidade observada em animais não imobilizados 243. Por outro lado, o exercício extenuante provou já ser indutor da CYP1A2 396, o que pode conduzir a um aumento do metabolismo da MDMA com maior taxa de formação de metabolitos tóxicos. A ingestão de água influencia, também, a toxicidade da MDMA em ratos porque, se por um lado a ausência do consumo de água durante o período de exposição à MDMA aumenta significativamente a hipertermia quando a temperatura ambiente está elevada 375, o consumo exagerado de água pode conduzir a uma situação de hiponatrémia que resulta em edema cerebral 13, 214, 215. Os dados apresentados permitem, assim, inferir que ambientes quentes, barulhentos e sobrelotados nas festas rave podem criar as condições ideais para um aumento da resposta aguda à MDMA e, potencialmente, aumentar a propensão para o aparecimento de sequelas neuropsicológicas adversas em utilizadores de ecstasy 394.

61 Introdução ______

1.9.3. Características do consumidor de MDMA

Existem vários factores inerentes ao consumidor de ecstasy que podem condicionar o risco a que ele está sujeito quando consome esta substância, uma vez que condicionam a sua capacidade metabólica e a sua susceptibilidade ao desenvolvimento dos efeitos agudos da MDMA e que, inclusivamente, influenciam os padrões de consumo adquiridos. As principais características do consumidor que podem influenciar os efeitos da MDMA são: a idade, a etnia, o género, a variabilidade farmacogenética interindividual e a orientação sexual.

1.9.3.1. Idade

O consumo de MDMA está predominantemente associado a faixas etárias mais jovens. De facto, uma elevada proporção dos jovens com menos de 16 anos está exposta a esta droga de abuso 13. Daí que seja importante considerar o efeito da idade na expressão e actividade das enzimas envolvidas no metabolismo desta substância 397. Em ratos imaturos, os níveis de CYP3A2 são elevados e, na puberdade, diferenciam-se consoante o género, sofrendo um decréscimo selectivo nas fêmeas 398. A CYP2C11 tem níveis baixos nos ratos imaturos e aumenta, na puberdade, nos machos 398. Em humanos, existem poucas diferenças entre as actividades das CYP microssomais nas diferentes faixas etárias. No entanto, a actividade da CYP1A2, CYP2B6, CYP2C19, CYP2D6 e CYP2E1 em microssomas hepáticos humanos tende a diminuir com a idade, enquanto que a actividade da CYP2A6 e CYP4A11 tende a aumentar com a idade 398. Por outro lado, de acordo com o observado em hepatócitos humanos criopreservados, a CYP3A4 tende a aumentar com o aumento da idade, fenómeno não observado nos microssomas 398. Globalmente, com o aumento da idade assiste-se a uma diminuição da capacidade metabólica dos indivíduos que chega a ser de 30% após os 70 anos de idade 397. Para além disto, a clearance e o volume de distribuição de numerosos compostos diminui com o envelhecimento, provavelmente por uma

62 ______Introdução diminuição do volume do fígado e do fluxo hepático sanguíneo 399, 400, mais do que por uma diminuição da actividade das enzimas microssomais 401. Pensa-se que o desenvolvimento cerebral que ocorre durante a adolescência pode resultar em respostas farmacológicas que diferem crucialmente das dos adultos. Por exemplo, a potência da cocaína, ketamina e MDMA para produzir estimulação motora em ratos macho é menor nos adolescentes do que nos adultos 402. Diferenças no efeito analgésico induzido pela MDMA (mais intenso nos animais de meia idade do que nos adolescentes) podem ser encontradas em 3 grupos de ratos de idades diferentes e podem relacionar-se com diferentes graus de maturação do sistema serotonérgico em função do estadio de desenvolvimento 360. Esta diferença ao nível da farmacodinamia da MDMA com a idade pode dever-se a (i) diferentes perfis de diminuição dos níveis cerebrais de 5-HT e de bloqueios da recaptação da 5-HT, que são mais intensos nos animais mais velhos; (ii) diferente tendência para que estes efeitos sejam, ou não, persistentes 138, 403, sendo mais persistentes as alterações verificadas nos animais mais velhos; e (iii) a uma alteração da densidade dos SERT que manifesta uma diminuição ao longo dos anos 404. Devido aos vários factores referidos, os adolescentes humanos parecem exibir uma sensibilidade reduzida aos efeitos de drogas de abuso como a cocaína, a ketamina e a MDMA, o que pode levar a uma utilização de quantidades superiores destas substâncias por cada consumo, quando comparada com indivíduos mais velhos 402, 405. Por outro lado, devido ao fenómeno de tolerância, os consumidores mais velhos estão habitualmente expostos a maiores quantidades de ecstasy em cada ocasião e a maiores quantidade de outros tipos de drogas para intensificar os efeitos obtidos com a MDMA 332, aumentando a propensão ao desenvolvimento de interacções. A adolescência é um período durante o qual os rearranjos maturativos podem exercer uma forte influência na diferente vulnerabilidade aos psicoestimulantes 406, 407. De facto, os efeitos da exposição repetida de ratinhos CD-1 adolescentes à MDMA são persistentes até à idade adulta e existe uma resposta diferente à MDMA em função da idade em que ocorre a primeira exposição à substância 360. Este facto indica que os efeitos prolongados da MDMA estão associados a uma utilização precoce desta substância 403, 408.

63 Introdução ______

1.9.3.2. Etnia

As características da resposta farmacológica e toxicológica a xenobióticos, dependente da metabolização via CYP450, são normalmente muito específicas para cada grupo étnico, uma vez que a frequência das variantes alélicas que codificam para estas enzimas varia acentuadamente entre diferentes grupos étnicos 66. Um exemplo é a CYP1A2 que apresenta uma actividade inferior em indivíduos de raça negra relativamente aos caucasianos 409. Os Hispânicos representam outro bom exemplo pois, quando comparados com os Caucasianos e os Afro-Americanos, têm cerca do dobro ou triplo de actividade de CYP2A6, CYP2B6, e CYP2C8 e metade de actividade da CYP1A2 398. Para além das condicionantes farmacogenéticas, a etnia parece influenciar o padrão de consumo. Este efeito da etnia no padrão de consumo foi evidenciada no estudo de Clatts e colaboradores os quais registaram o consumo de club drugs entre homens homossexuais e bisexuais, tendo apresentado diferenças entre indivíduos de raça branca (37,5% consumiu pelo menos uma vez; 41,4% consome cronicamente), negra (13,7% consumiu pelo menos uma vez; 11,7% consome cronicamente), hispânica (38,9% consumiu pelo menos uma vez; 35,2 consome cronicamente) e outras (9.9% consumiu pelo menos uma vez; 11,7% consome cronicamente) 326. Os indivíduos de raça branca têm mais probabilidade de consumir ecstasy pelo menos uma vez na vida do que os hispânicos e os negros (44,6% versus 26,7% e 15,9%, respectivamente) 329. Os negros têm demonstrado menor probabilidade de utilizar drogas sintéticas, enquanto que os brancos, nativos americanos e jovens mestiços são normalmente mais propensos do que os outros grupos raciais/étnicos a consumir uma ou mais club drugs 324.

1.9.3.3. Género

Tal como já foi descrito para outras drogas de abuso 410, 411, o mecanismo de acção e as consequências do consumo de MDMA não são

64 ______Introdução idênticos entre homens e mulheres 233. A(s) causa(s) destas diferenças entre géneros não é conhecida, mas podem dever-se a diferenças nos perfis hormonais 412, volume e morfologia de determinadas estruturas cerebrais 413, na transmissão monoaminérgica ou na capacidade metabólica. A 5-HT está envolvida na modulação de uma variedade de funções, nomeadamente na regulação do humor e está implicada na patofisiologia da depressão e de problemas de ansiedade, patologias com maior prevalência em indivíduos do sexo feminino 414. Curiosamente, existem também diferenças de género relativamente a marcadores de integridade serotonérgica em utilizadores de MDMA, indicando uma função serotonérgica diminuída nas mulheres, quando comparada com os homens 415. Especificamente, em indivíduos que consumiram MDMA, foram encontradas reduções nas concentrações de ácido 5-hidroxiindolacético (metabolito da 5-HT) no fluído cerebrospinal, mais intensas nas mulheres do que nos homens (46% vs. 20%), o que sugere uma maior susceptibilidade das mulheres do que dos homens aos efeitos neurotóxicos da MDMA 415. Esta hipótese foi confirmada num estudo sobre a influência de algumas variáveis na neurotoxicidade serotonérgica da MDMA em várias regiões cerebrais em que apenas se registaram alterações nos neurónios serotonérgicos no grupo feminino de consumidores de doses elevadas de MDMA, o que parece indicar que as mulheres são aparentemente mais susceptíveis a desenvolver neurotoxicidade devido ao consumo de MDMA do que os homens 233. De facto, o uso de MDMA está associado a uma diminuição da densidade dos transportadores da serotonina cerebrais nas mulheres, dependente da dose e potencialmente reversível. Esta redução na densidade dos SERT não é significativa nos homens 233. No entanto, em animais de laboratório a influência do género na susceptibilidade à MDMA é bastante diferente. Em ratinhos, uma vulnerabilidade ao aumento da actividade locomotora espontânea e à exploração ambiental foi observada nos machos e não nas fêmeas 360. Adicionalmente, nestes animais, a administração de MDMA na dose de 20 mg/kg está associada a uma maior letalidade nos machos, o que sugere que eles possam ser mais sensíveis à toxicidade geral da MDMA 243. As fêmeas parecem ser mais resistentes do que os machos à toxidade da MDMA e MDA, provavelmente por um mecanismo de captação dos radicais livres que parecem

65 Introdução ______ser responsáveis pelos efeitos letais agudos destas substâncias (ex.: radical superóxido) pelas hormonas sexuais 416. Também os efeitos psicoactivos da MDMA são, geralmente, mais intensos nas mulheres do que nos homens. As mulheres têm alterações perceptivas, problemas de raciocínio, medo de perder o controlo do corpo, ansiedade, efeitos adversos e sequelas mais intensos, enquanto que os homens sofrem maiores aumentos da pressão arterial 414. Aparentemente, a dose de MDMA correlaciona-se positivamente com a intensidade das alterações perceptivas na mulher. O facto de doses iguais de MDMA (por quilograma de peso corporal) produzirem respostas mais intensas nas mulheres é consistente com a ideia de uma maior susceptibilidade das mulheres aos efeitos libertadores de 5-HT provocados pela MDMA 414. Não se observaram, no entanto, diferenças de género nos comportamentos agressivos manifestados pelos consumidores de ecstasy durante os dias subsequentes ao consumo 417. Outras diferenças de género que podem afectar as respostas biológica e toxicológica à MDMA incluem as diferentes capacidades metabólicas. De facto, existem factores hormonais que condicionam a expressão das isoenzimas do citocromo P450 398. Nos humanos, coelhos, cães e macacos as diferenças de género não influenciam a expressão microssomal do CYP450 ou de outras enzimas metabolizadoras na mesma extensão que se verifica no rato e, menos expressivamente, no ratinho 398. Apesar disso, as mulheres possuem menor actividade da CYP1A2 (7-etoxiresirufina O-desalquilase) do que os homens 409, cuja actividade se encontra também influenciada pela fase do ciclo menstrual 396. Nos ratos adultos, não se verificam diferenças de género na actividade da CYP2D6 e CYP2E1. A CYP3A2 é uma das isoenzimas específicas dos machos (níveis nos machos são 10 vezes maiores que nas fêmeas) devido à secreção pulsátil de hormona do crescimento nos machos. Os níveis mais baixos de CYP3A nas fêmeas adultas são causados por um declínio nos níveis de CYP3A2 nas fêmeas durante a puberdade 398. A indução das isoenzimas do CYP450 tende a ser maior nas fêmeas, o que se verifica nas isoenzimas microssomais CYP2B e CYP3A que apresentam uma maior indutibilidade nas fêmeas de rato do que nos ratos macho 398. Em microssomas hepáticos humanos as actividades da CYP2B6, CYP2C19 e CYP3A4 (testosterona 6β-

66 ______Introdução hidroxilase) tendem a ser mais elevadas nos microssomas de fígado de mulheres, enquanto que a CYP1A2 e a CYP2D6 tendem a ser mais elevadas nos microssomas hepáticos de homens 398. Estas diferenças a nível metabólico fazem com que a metabolização da MDMA seja feita mais rapidamente nos homens do que nas mulheres 373. Aparentemente, as mulheres estão também mais predispostas a desenvolverem hiponatrémia e edema cerebral após a utilização de MDMA, uma vez que a maioria dos casos clínicos de hiponatrémia descritos na literatura ocorreram em jovens do sexo feminino 205, 209, 210, 292, 418. Uma vez que este efeito hiponatrémico da MDMA parece dependente do seu metabolismo 217, o seu aparecimento será provavelmente condicionado pela capacidade metabólica individual que, como já foi descrito anteriormente, difere entre indivíduos do sexo feminino e masculino. Curiosamente, os indivíduos do sexo feminino são menos sensiveis aos efeitos hipertérmicos da MDMA do que os indivíduos do sexo masculino. Este facto foi confirmado num estudo realizado em ratos que constatou que a incapacidade da MDMA induzir uma resposta termogénica nas fêmeas pode dever-se ao facto de as fêmeas apresentarem (i) menor activação simpática após administração de MDMA, (ii) vasculatura menos sensível à estimulação adrenérgica α1, e mais sensível ao monóxido de azoto e (iii) menor expressão de UCP3 no músculo esquelético, quando comparadas com os machos 419. Existem ainda diferenças de género no que concerne aos padrões de consumo da MDMA. Segundo um estudo realizado em 1999 342, as mulheres iniciam o consumo de MDMA mais precocemente que os homens. No entanto, os homens apresentam taxas mais elevadas de prevalência do consumo de ecstasy ao longo da vida do que as mulheres 20. A análise conjunta da informação reunida permite inferir que, provalmente, enquanto as mulheres são mais susceptíveis a desenvolver os efeitos psicoactivos e neurotóxicos da MDMA por apresentarem menor capacidade de metabolizar esta substância, os homens, devido à sua maior taxa metabólica e maior prevalência de consumo, estarão mais sujeitos a desenvolver quadros de resposta tóxica disseminada subsequente ao seu consumo, apresentando maiores taxas de letalidade.

67 Introdução ______

1.9.3.4. Variabilidade farmacogenética interindividual

A susceptibilidade de um ou vários indivíduos aos efeitos biológicos/tóxicos de um determinado xenobiótico pode ser determinada por alterações genéticas estáveis e hereditárias. Por convenção, quando uma determinada alteração genética (mutação) atinge mais de 1% de uma população, designa-se polimorfismo. Os polimorfismos genéticos podem traduzir-se em alterações de proteínas que funcionam como receptores, originando variações farmacodinâmicas 420, ou que estão associadas ao metabolismo e transporte de xenobióticos 89, exercendo um efeito preponderante na farmacocinética dos compostos 421. Uma vez que a isoforma 2D6 do sistema citocromo P450 é a principal via metabólica da MDMA, indivíduos com variações genéticas nesta enzima (ex.: metabolizadores lentos ou metabolizadores ultra-rápidos), e noutras isoformas que contribuem minoritariamente para o metabolismo deste composto, vão apresentar concentrações plasmáticas variáveis do composto- pai e de metabolitos 48, 422, o que pode condicionar a toxicidade da MDMA. Estes polimorfismos ao nível das proteínas envolvidas na farmacocinética e na farmacodinamia da MDMA podem explicar o facto de alguns indivíduos poderem consumir MDMA regularmente sem dano aparente, enquanto outros morrem ou têm reacções tóxicas severas com consumos esporádicos ou de doses reduzidas 423. Foram já descritos polimorfismos genéticos que afectam o perfil de efeito/toxicidade da MDMA por alterar a expressão e/ou actividade de isoenzimas do citocromo P450 (CYP1A2, CYP2B6, CYP2D6, CYP3A4) 398, da COMT, da UDP-glucuronosiltransferase, da sulfotransferase, do receptor da serotonina, do receptor da dopamina, do SERT, etc 89.

1.9.3.4.1. Isoenzimas do citocromo P450

As mutações nos genes que codificam para as enzimas do CYP450 podem traduzir-se na expressão de proteínas com actividade nula, reduzida, aumentada ou alterada (por exemplo, perda de capacidade de ligação ao

68 ______Introdução substrato 89), o que dá origem a quatro fenótipos distintos: (i) metabolizador pobre, que não apresenta a enzima funcional; (ii) metabolizador intermédio que apresenta uma redução da actividade enzimática; (iii) metabolizador extensivo, que apresenta actividade enzimática normal; e (iv) metabolizador ultra-rápido que apresenta níveis enzimáticos aumentados 424. A estes diferentes fenótipos correspondem, geralmente, grandes variações na extensão da metabolização de xenobióticos. Mesmo os metabolizadores rápidos sofrem aumentos da concentração de MDMA quando expostos a um inibidor da CYP2D6, uma vez que grandes aumentos nas concentrações plasmáticas podem surgir devido à cinética não linear do metabolismo da MDMA. Nas populações caucasianas 12 a 21% dos indivíduos apresentam fenótipo de metabolizadores pobres por possuírem o alelo CYP2D6*4. Este alelo está praticamente ausente nas populações orientais, o que explica a baixa incidência de metabolizadores pobres neste grupo étnico (menos de 1%) 66. No entanto, a actividade da CYP2D6 é menor nos metabolizadores extensivos asiáticos do que nos metabolizadores extensivos caucasianos devido à elevada frequência, entre os primeiros, do alelo CYP2D6*10 que provoca deficiências na estrutura terciária e quaternária da proteína, diminuindo a expressão da enzima funcional 425. A CYP2D6*10 é uma enzima com menor afinidade e eficácia para os substratos do que a CYP2D6*1 (wildtype) 426. A mesma capacidade metabólica diminuída foi identificada em indivíduos de raça africana, associada à presença do alelo CYP2D6*17 que está relacionado com uma diminuição da afinidade da enzima para os substratos 427, 428. O fenótipo de metabolizador ultra-rápido, associado aos alelos CYP2D6*1XN, CYP2D6*2XN e CYP2D6*35X2, surge num terço da população da Etiópia e Arábia Saudita, em 1 a 5% dos caucasianos, 10% nas populações italiana e turca e 5,5% da população da Europa Ocidental 424, sendo muito raro nas populações do norte da Europa e estando praticamente ausente nos asiáticos 66. Dada a importância da CYP2D6 no metabolismo da MDMA, foi colocada a hipótese de que os indivíduos portadores de alelos codificantes para isoenzimas com menor actividade poderiam apresentar um risco aumentado de sofrer efeitos tóxicos agudos resultantes da acção farmacológica da MDMA

69 Introdução ______

(ex.: hipertermia, efeitos cardiovasculares) 267, 429. Em contraponto, os indivíduos com fenótipo de metabolizador ultra-rápido estariam mais predispostos a ser afectados por fenómenos de citotoxicidade 430 que podem incluir neurotoxicidade, cardiotoxicidade, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade 431 devido à previsível maior formação de metabolitos tóxicos 203, 386, 429, 432. Assim, o estudo da influência do genótipo dos indivíduos e/ou populações no metabolismo da MDMA permite estabelecer uma possível relação entre o fenótipo de metabolizador pobre e a ocorrência de intoxicações agudas devido a um decréscimo mais lento dos níveis plasmáticos de MDMA. Também a isoforma CYP3A4 do CYP450 apresenta acentuada variabilidade interindividual podendo o seu conteúdo hepático variar entre 40 a 50 vezes 433. Esta isoforma é a mais abundante do CYP450 humano (representa 30% do CYP450 hepático e 70% do CYP450 intestinal) 433, 434 e é a principal envolvida na oxidação dos xenobióticos 435.

1.9.3.4.2. Catecol-O-metiltransferase

Uma outra enzima que apresenta um grau de actividade sujeito a grande variabilidade interindividual é a catecol-O-metiltransferase (COMT; enzima envolvida na metilação das monoaminas neurotransmissoras, hormonas catecóis, fármacos como a levodopa, metildopa e isoprenalina e drogas de abuso como a MDMA 436) que é claramente evidente entre diferentes etnias. Entre os caucasianos, 25% dos indivíduos apresentam actividade elevada, 50% apresentam actividade intermédia, e 25% apresentam actividade reduzida 436. A COMT eritrocitária apresenta uma actividade superior em indivíduos africanos e afro-americanos (apenas 7% apresenta actividade reduzida) relativamente aos caucasianos (27% apresenta fenótipo com actividade reduzida) 437. Estes fenótipos de actividade enzimática reduzida parecem apresentar risco superior para o desenvolvimento de reacções adversas às anfetaminas 438.

70 ______Introdução

1.9.3.4.3. UDP-glucuronosiltransferase

A glucuronidação é a reacção de conjugação mais comum no metabolismo humano e está envolvida na destoxificação dos metabolitos catecóis e catecóis o-metilados da MDMA. Assim, variações farmacogenéticas da enzima UDP-glucuronosiltransferase que condicionem a sua cinética enzimática para determinados substratos podem afectar a toxicidade dos mesmos se os seus metabolitos tóxicos forem destoxificados por esta via metabólica e ela estiver comprometida 439. Os polimorfismos mais importantes desta enzima são as variações no gene UGT1A1 que resulta numa significativa redução da actividade da UGT1A1. Esta variação ocorre em 7 a10% da população em geral 440.

1.9.3.4.4. Sulfotransferase (SULT)

A sulfotransferase (SULT) está também envolvida no metabolismo de fase II dos compostos endógenos e xenobióticos, catalizando a conjugação do composto com um grupo sulfato cedido pela adenosina 3’-fosfato 5’- fosfossulfato (PAPS) 441. Esta enzima está envolvida na destoxificação dos metabolitos catecóis e catecóis o-metilados da MDMA. Também as variabilidades na actividade da SULT 441 podem estar potencialmente associadas a alterações na toxicidade dos compostos destoxificados por esta via.

1.9.3.4.5. Receptores da 5-HT

Foram já descritos fenómenos de polimorfismo genético associados aos 442 receptores 5-HT2A que resultam em alterações funcionais da proteína. Uma vez que as anfetaminas têm como alvo os receptores da 5-HT, alterações funcionais a este nível podem condicionar a resposta biológica a este tipo de drogas de abuso.

71 Introdução ______

1.9.3.4.6. Receptores da DA

Os receptores da dopamina apresentam também uma elevada prevalência de polimorfismos que afectam a variabilidade da resposta farmacológica a fármacos antipsicóticos e neurolépticos 443, 444, podendo afectar também a sua afinidade para o seu substrato endógeno, a DA 445. De facto, alguns estudos puderam já associar polimorfismos ao nível dos receptores D2 e D4 com um risco acrescido de vulnerabilidade para o abuso e risco de dependência de drogas psicoestimulantes 446, 447. Estes polimorfismos podem ter um efeito aditivo aos polimorfismos da COMT no que se refere ao risco de dependência destas drogas de abuso 447.

1.9.3.4.7. Transportador da 5-HT

O SERT (ou 5-HTT) é responsável pela manutenção das reservas intraneuronais de serotonina mediante o transporte da mesma para os terminais pré-sinápticos de forma a ficar disponível para subsequentes libertações implicadas na neurotransmissão. Os polimorfismos verificados neste transportador podem afectar o seu nível de expressão e, mais raramente, podem alterar a própria estrutura do transportador 448. Indivíduos portadores do polimorfismo que diminui a expressão dos SERT são mais susceptíveis aos efeitos induzidos pela MDMA no sistema serotonérgico, havendo maior risco de disfunção ao nível emocional 449 e cognitivo 450. Em indivíduos portadores do genótipo 5-HTTLPR (confere neurotransmissão serotonérica reduzida e parece aumentar a vulnerabilidade para os efeitos da MDMA na função cognitiva), com consumo moderado de MDMA (história de consumo de menos de 55 pastilhas ao longo da vida) não surgem défices de memória. Para indivíduos com transportador deficiente que consomem grandes quantidades de MDMA ou que já foram consumidores, observa-se um desempenho inferior nas tarefas de memória relativamente ao grupo controlo 451.

72 ______Introdução

1.9.3.5. Orientações sexuais

Aparentemente, a orientação sexual também condiciona o padrão de consumo de drogas, uma vez que mulheres lésbicas/bissexuais referem níveis de consumo de drogas (farmacêuticas ou de abuso) mais elevados do que mulheres heterossexuais, nomeadamente de ecstasy, cocaína, MTA e LSD 320. No entanto, não parece que a frequência do consumo difira entre os dois grupos 452. No caso dos homens, a frequência do consumo de MDMA é superior nos homossexuais/bissexuais do que nos heterossexuais. Assim, a identidade sexual foi associada com maiores taxas de consumo de algumas drogas, embora, no geral, os padrões e a frequência do consumo de drogas seja similar entre heterossexuais e homossexuais/bissexuais. Contudo, a orientação sexual é um marcador para vários comportamentos de risco que incluem utilização de drogas injectáveis, maior actividade sexual e maior dependência de drogas anfetamínicas (ex.: MTA) 452. Poderá ser, então, especulado que indivíduos com determinada orientação sexual poderão estar mais predipostos a iniciar determinados padrões de consumo de drogas e comportamentos de risco que poderão potenciar o aparecimento de efeitos tóxicos associados às mesmas.

1.9.4. Alterações fisiológicas e fisiopatológicas

Os efeitos agudos e tóxicos da MDMA podem, também, ser influenciados por alterações fisiológicas e fisiopatológicas que afectem o consumidor e que podem condicionar a farmacodinamia e a farmacocinética desta droga de abuso. São de destacar a gravidez, o hipo/hipertiroidismo, as insuficiências hepática e renal, as patologias inflamatórias e infecciosas, as patologias cardíacas, a diabetes mellitus e a obesidade.

73 Introdução ______

1.9.4.1. Gravidez

Devido ao facto da maioria dos consumidores de MDMA serem jovens adultos, as possibilidades de surgir uma gravidez e expor os fetos aos efeitos da MDMA é motivo de preocupação. Esta preocupação agrava-se se considerarmos que o aparecimento de gravidezes indesejadas surge muito associado ao policonsumo de drogas 334. Nestes casos o feto não estará unicamente exposto à MDMA, mas sim aos efeitos deletérios de todas as drogas consumidas, bem como às potenciais interacções que possam surgir entre elas. Existem evidências de que a exposição in utero dos fetos à MDMA durante o desenvolvimento embrionário resulta numa redução dos níveis de actividade e em deficiências de aprendizagem e memória, indicativos de dano ao nível do hipocampo, embora não afecte o grau de ansiedade dos animais quando estes atingem a idade adulta. A administração de MDMA às fêmeas de rato grávidas diminui o peso das crias, e aumenta os seus níveis de corticosterona e os níveis cerebrais do factor neurotrófico derivado do cérebro e diminui os níveis de 5-HT. Este decréscimo de 5-HT dissipa-se inicialmente, mas reaparece na idade adulta. Assim, parece evidente que a exposição à MDMA tem efeitos adversos no desenvolvimento cerebral e no comportamento 453. O consumo de MDMA durante os primeiros meses de gravidez foi também já associado ao aparecimento de situações de gastrosquise (anomalia congénita da parede abdominal anterior através da qual ocorre herniação das vísceras abdominais como estômago, intestino delgado, intestino grosso e bexiga, que se desenvolvem fora da cavidade abdominal do feto) 454. Em humanos existem ainda poucos estudos acerca do potencial teratogénico da MDMA, no entanto, um estudo prospectivo de 136 recém-nascidos expostos à MDMA in utero indicou que esta substância poderá estar associada com um aumento significativo do risco de deficiências congénitas (15,4% dos nados- vivos). Destas, as anomalias cardiovasculares (2,6% dos nados-vivos) e musculoesqueléticas (3,8% dos nados-vivos) foram predominantes 260. Felizmente, a prevalência do consumo de ecstasy durante a gravidez parece ser reduzida 455. As mulheres grávidas que consomem MDMA são normalmente jovens, solteiras, apresentam problemas psicológicos e reunem

74 ______Introdução um conjunto de factores de risco que pode comprometer a gravidez e o feto (tabagismo, consumo de álcool incluindo binge drinking, consumo de drogas ilícitas como cocaína, Cannabis, MTA, ketamina, GHB e psilocibina) 262. Durante a gravidez decorrem muitas alterações fisiológicas que podem afectar a farmacocinética e a susceptibilidade da mãe aos efeitos das substâncias consumidas durante esse período. O stress pré-natal pode aumentar os níveis plasmáticos de MDMA, parecendo envolver uma inibição do seu metabolismo, e aumentar as alterações motoras induzidas pelo consumo desta substância. Estas diferenças ao nível do metabolismo da MDMA podem afectar a propensão para sofrer reacções adversas. Uma consequência directa seria o desenvolvimento de toxicidade com doses moderadas de MDMA, uma vez que a droga acumular-se-ia no organismo em vez de ser metabolizada e eliminada. Além do referido, o stress pré-natal tem a capacidade de induzir um bloqueio prolongado da inibição reflexa (feedback) do eixo corticotrópico que regula a secreção de corticosterona e que desempenha um papel importante na neurotoxicidade da MDMA 456. Esta inibição associada ao facto de que, quer o stress prolongado, quer a MDMA estimulam a libertação de corticosterona 140, 457, 458, vai aumentar os efeitos da MDMA nos animais em estado pré-natal 405, podendo aumentar a sua neurotoxicidade. A presença de depressões pré-natais na mulher pode também agravar os efeitos da MDMA, uma vez que, por si só, a depressão pré-natal caracteriza- se por aumento de cortisol e níveis baixos de dopamina e serotonina 459. O consumo de MDMA pode ainda agravar os problemas de hipertensão que, por vezes, surgem durante a gravidez e que são sempre extremamente perigosos para a mãe e o feto 460, provavelmente por um mecanismo que envolve um aumento da libertação de aldosterona induzido pela MDMA 461. Em termos metabólicos, assiste-se durante este período a alterações da absorção dos compostos, diminuição dos níveis de albumina e glicoproteína α1- ácida que pode originar diminuição da ligação às proteínas plasmáticas, aumento da actividade das isoenzimas CYP2D6 462, CYP3A4 e CYP2C9, diminuição da actividade da CYP1A2, CYP2C19 e CYP2E1 463, aumento da actividade da UDP-glucuronosiltransferase, aumento da clearance renal 464 e alterações no metabolismo da vitamina D 465. O aumento da actividade da CYP2D6 pode levar a tolerância metabólica a variados fármacos (ex.:

75 Introdução ______fluoxetina) e consequente falência terapêutica 466 e pode aumentar a metabolização da MDMA aos seus metabolitos tóxicos, aumentando a probabilidade de fenómenos de toxicidade.

1.9.4.2. Patologias subjacentes ao consumo de MDMA

1.9.4.2.1. Hipo/hipertiroidismo

Como já foi referido, a MDMA induz um ligeiro aumento nos níveis séricos de tiroxina em roedores e humanos 154. Esta hormona desempenha um papel modulador na termogénese induzida pela MDMA através da regulação da expressão da UCP3 e/ou a síntese de receptores adrenérgicos 154. Deste modo, a existência de hipertiroidismo em roedores mimetizou os efeitos de uma temperatura ambiente elevada na termogénese induzida pela MDMA 155. Ratos com hipertiroidismo mostraram, em comparação com ratos eutiróidicos, um aumento mais marcado na temperatura corporal, na expressão de UCP3 no músculo esquelético e na letalidade consequente à exposição aguda à MDMA (40 mg/kg s.c.), de um modo linear de acordo com os níveis plasmáticos de tiroxina 155. O papel regulador das hormonas da tiróide na termogénese induzida pela MDMA foi confirmado em macacos, uma vez que o tratamento crónico de macacos com levotiroxina (3 ou 4,5 μg/kg/dia, i.m.) provocou um aumento da resposta termogénica induzida pela MDMA quando administrada em concentrações que habitualmente não afectavam a termorregulação. No entanto, o tratamento com levotiroxina não teve efeito na capacidade de reforço da MDMA (a qual já se verificou estar aumentada em ambientes quentes) 467. Em contraponto, a remoção cirúrgica das glândulas tiróide e paratiróide aboliu a capacidade da MDMA causar hipertermia e libertação de DA ao nível do estriado 468. O tratamento com tiroxina repôs parcialmente a resposta hipertérmica em animais tiróide-paratiroidectomizados 122. Complementarmente, o hipotiroidismo crónico resulta numa resposta hipotérmica à MDMA que é directamente proporcional à diminuição da expressão da UCP3. Neste caso, o suplemento agudo com T4 não alterou a expressão de UCP3 nem a resposta térmica à MDMA. Estes dados sugerem

76 ______Introdução que, apesar da hipertermia induzida pela MDMA parecer resultar de níveis aumentados de NA e AG livres, a susceptibilidade à mesma é ultimamente determinada pela regulação da termogénese dependente da UCP3 pela T4 155. Uma vez que a tiroxina é um importante regulador da termogénse 469, e a intolerância ao calor pode ser associada com o hipertiroidismo em humanos 470, aparentemente, o hipertiroidismo pode predispor os indivíduos para a hipertermia precipitada pela MDMA como parece ter acontecido numa intoxicação fatal de um indivíduo do sexo feminino de 24 anos de idade e que apresentava hiperplasia difusa da tiróide (Doença de Grave) 471.

1.9.4.2.2. Insuficiência hepática

A presença de patologias hepáticas crónicas prévias ao consumo de MDMA que comprometam o funcionamento hepático pode predispor os indivíduos para o desenvolvimento de falências hepáticas agudas. Este facto foi já verificado num paciente HIV-positivo com esteatose não alcoólica que sofreu falência hepática aguda após consumo de metanfetamina 472. O fígado tem um papel preponderante no metabolismo de compostos endógenos e exógenos. Consequentemente, a presença de determinada patologia hepática pode diminuir selectivamente a actividade de algumas isoformas do CYP450 (como é o caso da CYP2D6), numa extensão dependente da severidade da patologia em causa 473. Uma vez que nos doentes hepáticos a actividade desta enzima poderá estar diminuída, eles serão potencialmente mais susceptíveis a desenvolver sinais de toxicidade aguda associada à exacerbação dos efeitos agudos provocados pela MDMA (ex.: hipertermia, taquicardia) do que indivíduos não portadores de patologias hepáticas.

1.9.4.2.3. Insuficiência renal

A insuficiência renal crónica (IRC) corresponde a uma perda progressiva da função renal durante um período de meses ou anos e por uma sucessão de

77 Introdução ______

5 estadios durante os quais ocorre um decréscimo da taxa de filtração glomerular e da secreção tubular 474. As principais causas de IRC são o envelhecimento, a nefropatia diabética, a hipertensão, a glomerulonefrite e a doença vascular renal 474. O rim tem capacidade para metabolizar determinados compostos, apresentando uma actividade do CYP450 que corresponde a 20% da actividade do CYP450 no fígado por grama de tecido e participando, também, em reacções de conjugação 475. Esta capacidade metabólica do rim deteriora- se com a progressão da IRC, levando também a uma redução da clearance não renal (hepática, intestinal) e a uma alteração do volume de distribuição dos compostos mediante alterações da clearance hepática, diminuição da ligação às proteínas plasmáticas por alterações conformacionais da albumina e da glicoproteína ácida α1 (aumentada em processos inflamatórios agudos e crónicos) e diminuição da ligação aos tecidos, modificando a biodisponibilidade sistémica e aumentando o risco de reacções adversas 475. Num modelo de IRC em rato, verificou-se o aumento da actividade da álcool desidrogenase (ADH) e uma diminuição da actividade, dos níveis de mRNA e de expressão proteica do CYP450 a nível hepático 474, afectando algumas isoformas envolvidas no metabolismo da MDMA como a CYP3A1 e CYP3A2 (que correspondem à CYP3A4 no homem), mas não a CYP1A2 nem as CYP2D 474. Esta diminuição da actividade do CYP450 correlaciona-se com a severidade da IRC em ratos 474. Noutro estudo em ratos, a IRC não teve um efeito nas enzimas CYP1A2 e CYP2D hepáticas, mas reduziu a actividade da CYP3A, provavelmente por down-regulation da CYP3A2 476. No entanto há também casos em que se detectou uma diminuição na actividade da CYP2D6 em doentes com IRC 477. Quer a severidade quer a duração da insuficiência renal parecem influenciar o metabolismo hepático 474, 478, 479. A IRC altera ainda a eliminação hepática e intestinal através da glicoproteína-P (embora este transportador não tenha um papel preponderante na absorção e distribuição da MDMA) 480. A IRC parece também diminuir o metabolismo intestinal dos compostos, em ratos e em humanos, reduzindo as actividades de algumas enzimas (sacarase, maltase e xantina oxidase), bem como os níveis de mRNA e de expressão proteica de isoenzimas do CYP450 a nível intestinal no rato, como a

78 ______Introdução

CYP3A2, que participa no metabolismo da MDMA e corresponde à CYP3A4 no humano 474. Assim, a diminuição na clearance não-renal induzida pela IRC reduzirá o metabolismo de primeira-passagem, levando a um acentuado aumento da biodisponibilidade de fármacos com elevado efeito de primeira passagem. O aumento da biodisponibilidade resultará num aumento da concentração plasmática steady-state clinicamente relevante, agravando o risco de sofrer efeitos tóxicos de fármacos/drogas/xenobióticos metabolizados extensamente por enzimas hepáticas. Este aumento da biodisponibilidade poderá ter ainda maior relevância quando os compostos são metabolizados por enzimas polimórficas, como é o caso da MDMA, uma vez que o fenótipo de metabolizador pobre parece ser mais susceptível aos efeitos inibitórios da IRC no metabolismo do que o metabolizador rápido 475.

1.9.4.2.4. Patologias inflamatórias e infecciosas

Algumas patologias inflamatórias e infecciosas (incluindo vacinação) podem alterar a actividade do CYP450 481, nomeadamente da isoforma CYP1A2 398, o que pode levar a alteração do perfil toxicocinético de compostos metabolizados por esta isoenzima, como é o caso da MDMA.

1.9.4.2.5. Patologia cardíaca

Indivíduos que padeçam da síndrome Wolff-Parkinson-White (síndrome de pré-excitação dos ventrículos devido a uma comunicação eléctrica anormal proveniente da aurícula para o ventrículo) parecem estar particularmente em risco de sofrer morte súbita após o consumo de ecstasy 301. De facto, desfechos fatais após o consumo de MDMA parecem ser mais frequentes em indivíduos com patologias cardíacas subjacentes 178.

79 Introdução ______

1.9.4.2.6. Diabetes mellitus

A diabetes, bem como a obesidade e o jejum, podem originar alterações na secreção, sensibilidade e níveis hormonais (insulina, glucagina, hormona do crescimento), podendo alterar a expressão de enzimas metabolizadoras 482. De facto, na diabetes mellitus tipo I foram descritos aumentos pronunciados e sustentados nos níveis hepáticos e extra-hepáticos de várias proteínas do CYP450, num mecanismo aparentemente mediado pelas alterações hormonais e pela hipercetonémia, e não pela hiperglicémia, que acompanham esta patologia 483. Concretamente, a diabetes pode levar à expressão aumentada de isoenzimas do CYP450, incluindo aquelas envolvidas no metabolismo da MDMA como a 1A2, 2B, 3A, e a 2E1, envolvida na metabolização do etanol 484 e da bilirrubina UDP-glucuronosiltransferase (UGT1A1), enquanto decresce a expressão de outras enzimas microssomais e das sulfotransferases (SULTs), importantes para as reacções metabólicas de fase II de que a MDMA é alvo. Em contraste, a actividade da glutationa S-transferase (GST) in vivo, importante para o balanço dos níveis celulares de glutationa, a qual já provou ter um papel importante na expressão da toxicidade da MDMA, pode aumentar ou diminuir dependendo do balanço entre factores endógenos e o grau de stress oxidativo que pode surgir na diabetes. A síntese da glutationa (GSH) também pode estar alterada em resposta a condições patofisiológicas como a diabetes devido à regulação da expressão da γ-glutamilcisteína sintetase (γ- GCS), a enzima que cataliza o primeiro passo da síntese da GSH, e que depende da disponibilidade de cisteína para a sua síntese. No entanto, a administração de insulina e de hormona do crescimento a ratos diabéticos normaliza a actividade metabólica hepática 482. Devido a esta disfunção no sistema de defesa antioxidante que se verifica na diabetes, esta patologia pode ser um factor predisponente para um aumento do stress oxidativo e da toxicidade induzida pela MDMA.

80 ______Introdução

1.9.4.2.7. Obesidade

Foi já demonstrado que a obesidade altera a disponibilidade de determinadas substâncias em humanos, provavelmente devido a alterações na clearance hepática de compostos que sofram metabolismo de fase I e de fase II 485 como é o caso da MDMA. Para além disso, muitos modelos nutricionais de roedores obesos mostraram alterações no CYP450 hepático e nos mecanismos de conjugação, modificando a toxicidade de várias substâncias para os seus órgãos-alvo 485, 486. A actividade e a expressão proteica da CYP2E1, envolvida no metabolismo do etanol, estão aumentadas em fêmeas de ratinho obesas e tinha já sido relatada em humanos 486, 487. A actividade e expressão proteica da CYP1A2, envolvida no metabolismo da MDMA, estão diminuídas em fêmeas e machos obesos 488. A acrescer a estas alterações na expressão genética e actividade das isoformas do CYP450 está o facto de que o fígado dos indivíduos obesos apresenta frequentemente infiltrações lipídicas num quadro denominado esteatohepatite não alcoólica. Estas lesões podem influenciar significativamente a capacidade metabólica do fígado 489. Assim, dependendo do grau de obesidade do indivíduo, serão de esperar alterações ao nível do metabolismo da MDMA resultando, provavelmente, numa exacerbação dos seus efeitos agudos.

1.9.5. Interacções da MDMA com outros compostos

Sabe-se pouco acerca das drogas rave e do seu potencial para interagir com substâncias recreacionais ou prescritas. Infelizmente, existem ainda poucos estudos sobre este assunto e, por isso, temos que nos basear em casos clínicos, estudos in vitro do metabolismo destas drogas, e no conhecimento do metabolismo de outras substâncias e do seu potencial para induzir ou inibir o CYP450 para podermos inferir sobre possíveis interacções farmacodinâmicas e farmacocinéticas da MDMA. Podem surgir interacções farmacocinéticas quando um determinado composto interfira com a absorção, distribuição, metabolismo e/ou excreção da

81 Introdução ______

MDMA. Por exemplo, quando o composto que é consumido simultaneamente com a MDMA tem a capacidade de inibir a CYP2D6, pode ocorrer um aumento das concentrações plasmáticas da MDMA, aumentando a possibilidade de se verificar o aparecimento de sinais de toxicidade aguda associados ao seu consumo 67. Contudo, compostos que inibam outras isoenzimas do CYP450 (ex.: 1A2, 2B6, 3A4), para além da CYP2D6, têm mais probablidade de causar um efeito mais marcado nas concentrações de MDMA. É de especial importância a co-administração de MDMA com fármacos de estreita margem terapêutica que sejam substratos da CYP2D6 (ex.: alguns antidepressivos tricíclicos, antiarrítmicos, β-bloqueadores, antipsicóticos e tramadol), uma vez que a auto-inibição metabólica produzida pela MDMA nesta isoenzima pode aumentar desproporcionalmente os níveis do fármaco co-administrado, levando ao aparecimento de fenómenos de toxicidade. Outra via responsável por várias interacções farmacocinéticas corresponde à interferência com a glicoproteína P (Pgp), uma bomba de efluxo dependente do ATP capaz de exportar uma grande gama de substratos e presente numa grande variedade de células (ex.: enterócitos, hepatócitos, células dos túbulos proximais renais e células endoteliais dos capilares presentes também na barreira hemato-encefálica). No entanto, a MDMA e compostos análogos são apenas inibidores fracos da Pgp, pelo que, provavelmente, não irão influenciar o acesso de outros compostos ao cérebro. No entanto, não se pode excluir a possibilidade de que a co- administração destes compostos com inibidores da Pgp (ex.: ritonavir ou paroxetina) possa aumentar a biodisponibilidade da MDMA e análogos (ex.: MDE, PMA) por diminuir a sua eliminação a nível renal e também aumentar os seus níveis no cérebro (por diminuição da eliminação através da barreira hemato-encefálica) levando a efeitos laterais severos 490. As interacções farmacodinâmicas surgem quando a substância co- consumida apresenta um mecanismo de acção semelhante ou oposto ao da MDMA. Quando o composto que é consumido simultaneamente à MDMA também for pró-serotonérgico, o seu efeito pode combinar-se, levando a uma síndrome serotonérgica a nível central que inclui sintomas autónomos, cognitivos, e neuromusculares 67. Os sintomas moderados da síndrome serotonérgica manifestam-se com sudação, tremores, hiper-reflexia, e agitação; os sintomas severos incluem myoclonus (contracções involuntárias de um

82 ______Introdução músculo ou de um grupo de músculos), diarreia, e febre 491. Os casos mais graves de síndrome serotonérgica podem surgir com fármacos que bloqueiem ambas as vias que levam à diminuição dos níveis de 5-HT na fenda sináptica – a recaptação e a monoamina oxidase. Alguns compostos podem combinar estas duas características e ser simultaneamente pró-serotonérgicos e inibidores da CYP2D6, tendo assim a potencialidade de provocar interacções farmacocinéticas e farmacodinâmicas, com consequências imprevisíveis 67. Estes compostos podem ser ingeridos inadvertidamente na dieta, incluídos em regimes terapêuticos ou como contaminantes das pastilhas de MDMA (ex.: anfetaminas, MDA) 492 ou consumidos intencionalmente para aumentar os efeitos da MDMA (ex.: cocaína, dextrometorfano) ou para diminuir os seus efeitos indesejáveis (ex.: etanol, benzodiazepinas 316, sildenafil 493, anti-histamínicos 266, 5- hidroxitriptofano 316). Também os fármacos pró-serotonérgicos prescritos para tratamentos de determinadas patologias (ex.: fluoxetina, erva de S. João, tramadol, venlafaxina, lítio, clomipramina, entre outros) podem aumentar a propensão e a severidade dos sintomas serotonérgicos resultantes do consumo de MDMA.

1.9.5.1. Fármacos

Evidências recentes sugerem que está a tornar-se popular entre os utilizadores de ecstasy tentar contrariar alguns dos efeitos indesejáveis da MDMA através do uso simultâneo de fármacos ou suplementos alimentares. Normalmente o consumo de medicamentos é feito após o consumo da MDMA e é mais prevalente entre os indivíduos do sexo masculino 316, havendo, no entanto, excepções. Este fenómeno é motivo de procupação, uma vez que algumas destas combinações ecstasy+fármacos podem ter consequências potencialmente sérias para a saúde dos consumidores 316 por potenciarem os efeitos agudos e os efeitos tóxicos da MDMA. Dos medicamentos consumidos intencionalmente com MDMA, as benzodiazepinas e o sildenafil são os mais comuns, seguidos dos antidepressivos inibidores da monoamina oxidase (IMAO) e inibidores

83 Introdução ______selectivos da recaptação da 5-HT (ISRS). O 5-hidroxitriptofano (5-HTP) é o suplemento nutricional mais consumido (5% dos utilizadores de MDMA consomem este suplemento).316. No entanto, não apenas os fármacos consumidos intencionalmente para modular os efeitos da MDMA, mas também todos os outros que os indivíduos consumam como parte de qualquer tratamento farmacológico, podem influenciar a toxicidade desta droga de abuso estabelecendo, com ela, interacções farmacodinâmicas e farmacocinéticas 398. Existem vários fármacos, pertencentes a várias classes terapêuticas que são capazes de inibir as isoenzimas envolvidas no metabolismo da MDMA 398. Por exemplo, o antipsicótico haloperidol e os seus metabolitos foram já descritos como sendo potentes inibidores da CYP2D6 494. O pré-tratamento com haloperidol (1,4 mg, i.v.), ao contrário do que se verificou com o antidepressivo citalopram, não foi capaz de impedir o aumento da pressão arterial e da frequência cardíaca induzido pela MDMA (1,5 mg/kg p.o.) no homem, o que parece indicar um envolvimento da transmissão serotonérgica na ocorrência destes efeitos tóxicos agudos induzidos pela MDMA. No entanto, esta dose de haloperidol foi capaz de reduzir o humor positivo e a euforia induzidos pela MDMA 77. Segundo alguns autores, os barbitúricos têm a capacidade de reduzir ou prevenir a neurotoxicidade induzida pelos derivados metilenodioxi da anfetamina 249, 250 tal como parece acontecer com o ácido acetilsalicílico 249, 250 encontrados na composição de pastilhas vendidas como ecstasy 372. Existem, também, fármacos capazes de interagir com os mesmos receptores, transportadores e neurotransmissores que a MDMA. Por exemplo, os antipsicóticos atípicos clozapina e olanzapina, quando administrados isoladamente, reduzem a temperatura corporal em humanos e animais 495, 496 e têm a capacidade de reverter, em coelhos e ratos, a hipertermia potencialmente fatal e a vasoconstricção cutânea quando administrados 15 minutos após uma dose de 6 mg/kg i.v. de MDMA 497. Por outro lado, a clozapina demonstrou ainda poder reduzir, em ratos, o aumento da activação da termogénese ao nível do tecido adiposo castanho interescapular (iBAT) induzido pela MDMA. Este facto advoga em favor da potencial eficácia terapêutica da clozapina e compostos análogos no tratamento da hipertermia

84 ______Introdução induzida pela MDMA em humanos 498. Alguns relaxantes musculares como a succinilcolina e alguns anestésicos (ex.: anestésicos voláteis como o halotano) levam ao desenvolvimento de hipertermia maligna em pacientes predispostos, o que pode potenciar a resposta hipertérmica associada à MDMA, como já foi descrito para o halotano, uma vez que a MDMA aumentou as concentrações mioplasmáticas de cálcio e as contracções do músculo esquelético induzidas pelo halotano, mecanismos relacionados com a indução da hipertermia maligna 15. A pré-exposição a esteróides androgénicos anabolizantes (ex.: nandrolona) pode modular os efeitos neuroquímicos de compensação e comportamentais da MDMA de maneira dependente da dose 499. De facto, a nandrolona atenua o aumento de DA a 5-HT extracelular induzido pela MDMA, quando administrada em doses baixas a ratos, e passa a potenciar este aumento quando administrada em doses elevadas, podendo condicionar o potencial aditivo da MDMA 499. Por outro lado, a exposição crónica de ratinhos fêmea C57BL/6J a níveis supra-fisiológicos de corticosterona provocou um aumento da vulnerabilidade do núcleo estriado (onde se verificou um aumento da destruição das células da glia), mas não do hipocampo, à neurotoxicidade provocada pela MDMA 500. O pré-tratamento com o anti-hipertensor ketanserina (50 mg, p.o.), reduziu as alterações perceptivas, excitabilidade emocional e estado de vigília provocados pelo consumo de MDMA (1,5 mg/kg p.o.) em humanos 501. Tal como já foi referido, o 5-HTP é o suplemento nutricional mais consumido intencionalmente 316. A administração de 5-HTP-B (50 mg/kg i.p.) a ratos repõe os níveis cerebrais de 5-HT depletados pela MDMA (3 × 7,5 mg/kg, espaçadas 2 horas), sugerindo que esta abordagem terapêutica pode ser clinicamente útil em utilizadores de MDMA abstinentes 502. Os fármacos que devido às suas propriedades farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas apresentem potencial para interagir com a MDMA estão compilados na Tabela 4. De todas estas possibilidades de interacções apresentadas, aquelas que apresentam maior prevalência surgem em casos de associação de MDMA com antidepressivos e com anti-retrovirais. Por esse motivo, as interacções verificadas nestas associações serão abordadas, de seguida, mais detalhadamente.

86 Tabela 4. Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA.

Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Antidepressivos Tricíclicos Nortriptilina Norterol® substrato da CYP2D6 503 Inibição não selectiva da recaptação da NA e da Amitriptilina Adt-Zimaia®, Tryptizol® potente inibidor reversível da CYP3A4 podendo 5-HT também inibir a CYP2D6 503 Interferência com receptores para vários outros neurotransmissores Inibidores selectivos da recaptação da serotonina (ISRS) Fluoxetina Prozac®, Digassim®, Psipax®, Inibidor potente da CYP2D6 podendo também Inibição da recaptação pré-sináptica da 5-HT Selectus® inibir, em alguma extensão, as isoformas 2B6, 2C9, 2C19 e 3ª4 do CYP450 67 Paroxetina Seroxat®, Paxetil®, Denerval® Inibidor potente da CYP2D6 Inibição potente da recaptação pré-sináptica da 5- HT Citalopram Citalopram Genedec® Sertralina Zoloft® Zimelidina Inibidores da monoamina oxidase Inibição da degradação dos neurotransmissores na fenda sináptica Fenelzina Nardil® (Austrália) Inibidor irreversível e não específico da MAO Moclobemida Zorix®, Aurorix® Inibidor reversível da MAO, com maior selectividade para a MAO-A

Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Antidepressivos (cont.) Atípicos Bupropiom Zyban® Potente inibidor da CYP2D6 Inibidor da recaptação de NA e DA Antagonista nicotínico Hypericum perforatum Erva de S. João (contém Indução da CYP3A4 para doses baixas (devido à Inibidor da recaptação da 5-HT, DA e NA 507 hiperforina, hipericina, hiperforina) Fraco inibidor das MAO A e B flavonóides, taninos, etc) 504, 505 Inibição da CYP3A4 506) e da CYP2C9 para doses Afinidade para os receptores da adenosina,

altas GABAA, GABAB e glutamato down-regulation dos Alguma inibição da CYP2D6 506 β-adrenoreceptores

up-regulation dos receptores 5-HT2 no urícu pré- frontal de rato Alteração nas concentrações de neurotransmissores nas áreas cerebrais implicadas na fisiopatologia da depressão 504, 505 Antipsicóticos ® Haloperidol Haldol Potente inibidor da CYP2D6 Antagonista dos receptores dopaminérgicos D2 Pimozida Orap® Potente inibidor da CYP2D6 Clozapina Leponex® Elevada afinidade para determinados subtipos ® Olanzapina Zyprexa dos receptores 5-HT; antagonistas 5-HT2A e 5- 508 HT2C

88 Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Ansiolíticos/hipnóticos/sedativos Fenobarbital Luminaletas®, Luminal®, Indução da CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 e 398 Bialminal® CYP3A4 Diazepam Metamidol®, Unisedil®, Inibidor da fosfodiesterase nucleotídica cíclica do Bialzepam®, Valium®, Stesolid® músculo cardíaco Potencia os efeitos inotrópicos positivos da NA e adrenalina Midazolam Dormicum® Substratos da CYP3A4 509 Triazolam Halcion® Alprazolam Xanax® Zolpidem Stilnox®, Cymerion® Inibidor da CYP3A4 503 Ligação de grande afinidade aos receptores

GABAA com subunidades α1, aumentando a afinidade do neurotransmissor inibitório GABA para o seu receptor Analgésicos opiáceos Metadona Dolophine®, Amidone®, Substrato da CYP3A4 e também CYP2D6, Agonista dos receptores opióides tipo μ e 509 510 Methadose®, Physeptone®, CYP2C9, CYP2E1 , CYP2B6, CYP2C19 antagonista dos receptores NMDA do glutamato, Heptadon® Potente inibidor da CYP2D6 o que permite inibir o desenvolvimento e aquisição de dependência e tolerância aos opióides 511

Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Analgésicos opiáceos (cont.) Codeína/Diidrocodeína Euphon®, Codipront®, Codol®, Substrato da CYP2D6, CYP3A4 e UGT 512 Dafalgan Codeína®, Dol-U- Ron®, Migraleve®, Dolviran® Hidrocodona Vicodin® (EUA) Substrato da CYP2D6, CYP3A4 e UGT 512 Buprenorfina Subutex®, Buprex®, Transtec® Substrato da CYP2D6, CYP3A4 e UGT 512 Potente inibidor reversível da CYP3A4 503 Anestésicos Succinilcolina Anectine®, Quelicin® (Canada) Desenvolvimento de hipertermia maligna em Anestésicos voláteis Fluotane® indivíduos predispostos (ex.: halotano) Antiarrítmicos Amiodarona Cordarone®, Miodrone® Potente inibidor das CYP 1ª2, 2C9, 2D6 e 3ª4 513 β-bloqueador e bloqueador dos canais de potássio dos nodos sino-auricular (ou sinusal) e aurículo-ventricular, aumentando o período refractário via canais de sódio e potássio, e diminuindo a condução intra-cardíaca do potencial de acção cardíaco via canais de sódio. O resultado é um prolongamento da fase III do potencial de acção cardíaco.

90 Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Antiarrítmicos (cont.) Quinidina Dicorantil® Potente inibidor da CYP2D6 Interfere no funcionamento dos canais de sódio, cálcio e potássio cardíacos, prolongando o potencial de acção cardíaco e consequentemente, aumentando do intervalo QT do ECG Anti-retrovirais Inibidores das proteases Ritonavir Norvir® Inibidor da CYP2D6, 2B6, 2C9, 2C19, 3ª4 Nelfinavir Viracept® Substrato da CYP3A4 e 2C19 Inibidores da transcriptase reversa não-nucleosídicos Delaviridina Rescriptor® Parcialmente metabolizada pela CYP2D6 514 Efavirenz Sustiva®, Stocrin® Inibidor ou indutor da CYP3A4 e inibidor da Inibidor da transcriptase reversa 515 CYP2B6 Antibióticos Rifampicina Rifadin® Indutor da CYP1A2 516 Controla a expressão da CYP2B6, CYP2C9, CYP2C19 e CYP3A4 398 Linezolida Zyvox®, Zyvoxid® Inibidor fraco, reversível, da MAO 517 Clotrimazol Canesten® Inibidores das isoenzimas do CYP450, sobretudo 518 Itraconazol Sporanox® a CYP2B6

Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Inibidores da fosfodiesterase 5 Sildenafil Viagra® Substrato da CYP3A4 519 Anti-histamínicos de 1ª geração Difenidramina Drenoflux®, Benaderma® Inibidores da CYP2D6 520 e da CYP3A4 521 Clorfeniramina Chlor-trimeton® (EUA) Clemastina Tavégyl® Perfenazina Mutabon® Hidroxizina Atarax® Tripelenamina Benzoxale®, Cizaron® (EUA) Antitússicos Dextrometorfano Rhinathiol®, Vicks®, Drill®, Substrato da CYP2D6 Bloqueador do receptor N-metil-D-aspartato 372, 522 ® 523 Ipésandrine Agonista dos receptores σ1 e σ2 Antagonista dos receptores nicotínicos α3β4 524 Inibidor da recaptação da 5-HT 525 e, possivelmente, da DA Anti-hipertensores Ketanserina Sufrexal® (Itália) antagonista dos receptors da serotonina com

maior afinidade para os receptores 5-HT2A,

podendo também ligar-se aos receptores 5-HT2C,

5-HT2B, 5-HT1D, α-adrenérgicos, e dopaminérgicos

92 Tabela 4 (cont). Fármacos com potencial para estabelecer interacções farmacocinéticas e/ou farmacodinâmicas com a MDMA. Potenciais mecanismos para o estabelecimento de interacções com a MDMA

Grupo terapêutico / Fármaco Nome comercial Farmacocinética Farmacodinamia Suplementos nutricionais 5-HTP Repõe os níveis cerebrais de 5-HT Valeriana comum Valdispert® Indutor da CYP3A4 e da CYP2D6 de maneira linear com a dose 506 Ginkgo biloba Biloban®, Gincoben® Indutor da CYP1A2 e inibidor da CYP2D6, para baixas concentrações Inibidor da CYP1A2 e indutor da CYP2D6, para altas concentrações, provavelmente por um mecanismo de activação alostérica 506 Echinacea purpurea Inibidores do CYP450 Salva comum Outros ® 516 Fenitoína Hidantina (antiepiléptico) Indutores da CYP1A2 Omeprazol Proton®, Losec®, Omezolan®, Prazolene®, Proclor®

(antiulceroso inibidor da bomba de

protões) Contraceptivos orais Inibidores da CYP1A2 398 518 Clopidogrel e (antiagregantes plaquetários) Inibidores da CYP2B6 . ticlopidina Raloxifeno (MSRE)

______Introdução

1.9.5.1.1. Antidepressivos

Os antidepressivos são usados pelos consumidores de ecstasy para prevenir potenciais efeitos neurotóxicos da MDMA, para evitar os efeitos negativos associados à abstinência desta anfetamina, para aumentar a intensidade dos seus efeitos e para prolongar a duração do efeito ou para facilitar o sono 316. Vários estudos referem que uma percentagem considerável dos consumidores de ecstasy também consome antidepressivos. Copeland e colaboradores referiram, em 2006, taxas de 9% 316, Degenhardt, em 2005, fala em 5,8-22,4% 452 e Winstock e colaboradores reportam, em 2001, que 6% dos consumidores de ecstasy tomam antidepressivos para reduzir os efeitos desagradáveis que surgem quando os efeitos pretendidos da ecstasy desaparecem 266. Os antidepressivos mais usados em conjunto com a ecstasy são os inibidores selectivos da recaptação da serotonina (ISRS) e os inibidores da monoamina oxidase (IMAO).

1.9.5.1.1.1. Inibidores selectivos da recaptação da serotonina (ISRS)

Alguns utilizadores de MDMA fazem uma “pré-carga” com inibidores da recaptação de 5-HT (ex.: citalopram, sertralina) porque acreditam que a co- administração irá protegê-los de possíveis efeitos tóxicos a nível do SNC. No entanto, apesar de já ter sido demonstrado que a administração de MDMA (1,5 mg/kg por via oral) a indivíduos pré-expostos a inibidores da recaptação da 5- HT (citalopram, 40 mg i.v.) bloqueia os efeitos subjectivos, os efeitos vegetativos agudos e o aumento da pressão sanguínea e do ritmo cardíaco induzidos pela MDMA, esta associação não afecta a resposta hipertérmica 526 e aumenta a duração média dos efeitos 527.

93 Introdução ______

Também o pré-tratamento de humanos com fluoxetina (20 mg durante 5 dias por via oral) atenuou a maioria dos efeitos subjectivos positivos da MDMA (1,5 mg/kg por via oral), reduziu o aumento do ritmo cardíaco provocado pela MDMA, mas não impediu o aumento da pressão sanguínea 528. Estes resultados sugerem que o bloqueio da recaptação da 5-HT pela fluoxetina pode reduzir os efeitos da MDMA, confirmando a importância do SERT nos efeitos desta droga de abuso 528. Também o citalopram tem aparentemente a capacidade de reduzir ou prevenir a neurotoxicidade induzida pelos derivados metilenodioxi da anfetamina 249, 250. Já em 1998 foi descrita uma situação de uma presumível interacção entre MDMA e exposição prévia a citalopram que resultou em alterações comportamentais 529. Podem surgir interacções farmacocinéticas e farmacodinâmicas simultaneamente quando o ISRS consumido for também inibidor potente da CYP2D6 (ex.: fluoxetina, paroxetina), aumentando quer as concentrações plasmáticas de MDMA (farmacocinética), quer a actividade serotonérgica (farmacodinâmica). A fluoxetina e paroxetina são, comprovadamente, inibidores do metabolismo da MDMA in vitro 422. Concretamente, a fluoxetina é um inibidor potente da CYP2D6 e, por esse motivo, tem a capacidade de reduzir ou prevenir a neurotoxicidade induzida pelos metabolitos dos derivados metilenodioxi da anfetamina 530. No entanto, este composto atrasa a eliminação da MDMA e da MDA, aumentando o risco de desenvolvimento de sinais de toxicidade aguda, daí que deve ter-se cuidado ao recomendar a utilização de fluoxetina para prevenir a neurotoxicidade a longo prazo induzida pela MDMA 480. O tratamento prolongado com fluoxetina (6 mg/kg/dia na água de bebida durante 5 semanas) 9-12 semanas após uma exposição breve de ratos Wistar à MDMA (4 doses de 5 mg/kg administradas num período de 4 horas) reverteu a ansiedade e a depressão subsequentes ao consumo desta droga de abuso; no entanto, não teve qualquer efeito no decréscimo da capacidade de interacção social que surge após abstinência deste entactogénio 531. O mesmo tratamento com fluoxetina não afectou grandemente os níveis de 5-HT, mas diminuiu significativamente os níveis de ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA, principal metabolito da 5-HT) 531. Estes resultados indicam que a fluoxetina pode ser uma opção terapêutica válida para alguns dos efeitos deletérios a longo prazo causados pela exposição à MDMA 531 que deverá ser confirmada em humanos.

94 ______Introdução

No entanto, a fluoxetina (10 mg/kg, i.p.) administrada 30 min antes de cada dose de MDMA não é capaz de prevenir os défices dopaminérgicos agudos e de longo termo provocados pela MDMA (30 mg/kg × 3, i.p.) em ratinhos, mas consegue abolir as alterações ao nível da temperatura corporal 96. A paroxetina é um dos mais potentes inibidores da recaptação da 5-HT. Esta substância tem também uma grande capacidade de inibir a CYP2D6. O pré-tratamento com este composto (20 mg/dia durante 3 dias) provoca o decréscimo dos efeitos subjectivos e fisiológicos da MDMA (100 mg, p.o.) em humanos, apesar de aumentar os níveis plasmáticos de MDMA em 30% (com redução dos níveis de 4-hidroxi-3-metoximetanfetamina (HMMA)) 532 e de aumentar os níveis cerebrais de MDMA nos ratinhos pré-tratados com paroxetina (10 mg/kg, i.p.) 5 minutos antes da exposição à MDMA (15 mg/kg) 533. Parece assim que a paroxetina consegue interagir com a MDMA ao nível farmacodinâmico (no SERT) e a nível farmacocinético (na CYP2D6). Esta redução marcada nos efeitos da MDMA pode levar os utilizadores a consumir doses mais altas de MDMA, para conseguir obter o efeito pretendido, e a correr o risco de produzir efeitos tóxicos potencialmente letais 532. O pré-tratamento com paroxetina tem também a capacidade de contrariar parcialmente a diminuição temporária no número de células T-helper CD4+ e o aumento simultâneo do número de células NK, bem como de inibir completamente a supressão da capacidade de resposta funcional dos linfócitos à estimulação mitogénica e as alterações na secreção das citoquinas induzidas pela MDMA em humanos 534. A fluoxetina, a sertralina e a zimelidina (não comercializada em Portugal) mostraram-se capazes de contrariar o efeito hiperlocomotor induzido pela MDMA em ratos 105.

1.9.5.1.1.2. Inibidores da monoamina oxidase (IMAO)

Os IMAO causam interacções farmacodinâmicas com a MDMA em humanos 535 potenciando a inibição da degradação dos neurotransmissores na fenda sináptica. Por isso mesmo, estimulantes anfetamínicos não devem ser utilizados em conjunto, ou num intervalo inferior a 2 semanas, com qualquer

95 Introdução ______

IMAO. Como consequência desta interacção podem surgir reacções hipertensivas e estados confusacionais severos 23. A fenelzina (não comercializada em Portugal) é um inibidor irreversível e não específico da MAO indicado para o tratamento de problemas de ansiedade, bulimia, fobias, etc que já esteve envolvido em interacções medicamentosas com a MDMA 536. A moclobemida é um inibidor reversível da MAO, com maior selectividade para a MAO-A, utilizado na terapêutica para tratar a depressão e a ansiedade social e utilizado pelos consumidores de MDMA para potenciar os seus efeitos 284. A moclobemida foi já associada a quatro intoxicações fatais quando consumida simultaneamente com a MDMA, sendo a causa provável de morte o desenvolvimento de um quadro de síndrome serotonérgica 284. Quando administrada a ratos 60 minutos após exposição à moclobemida (20 mg/kg i.p.), a MDMA (10 mg/kg i.p.) produz um aumento dos níveis extracelulares de 5-HT muito superior ao verificado quando ela é administrada isoladamente, sem alterar a temperatura corporal, um fenómeno também verificado quando a MDMA (10 mg/kg i.p.) é administrada a ratos 24 horas após a administração de clorgilina (10 mg/kg i.p.) 537. Este facto pode levar ao aparecimento de fenómenos tóxicos resultantes de níveis demasiado elevados de 5-HT, habitualmente associados ao consumo de PMA, uma vez que ela própria é inibidora da MAO-A 538. Quando o mesmo ensaio foi repetido a uma temperatura ambiente superior, verificou-se uma potenciação no aumento dos níveis extracelulares de 5-HT e da resposta hipertérmica induzida pela MDMA. Então, os efeitos deletérios resultantes da exposição simultânea a MDMA e a inibidores da MAO são fortemente potenciados por temperaturas ambiente elevadas 539. De facto, as intoxicações mais graves com sintomatologia da síndrome serotonérgica ocorrem quando se consomem simultaneamente os IMAO e compostos inibidores da recaptação de 5-HT (como é o caso da MDMA) 540, tendo sido já descritas intoxicações fatais associadas ao consumo simultâneo deste tipo de substâncias 284. No entanto, contrariamente ao que se verifica com os inibidores da MAO-A, os inibidores selectivos da MAO-B (ex.: selegilina, L-deprenilo) parecem conferir uma certa protecção relativamente à neurotoxicidade da

96 ______Introdução

MDMA por vários mecanismos: (i) prevenção da depleção dos níveis cerebrais de 5-HT 541, (ii) diminuição da formação de espécies reactivas como resultado da acção da MAO-B sobre a DA recaptada para o neurónio pré-sináptico através do SERT 542, (iii) diminuição do grau de peroxidação lipídica provocada pela MDMA 541, (iv) redução do dano oxidativo mitocondrial provocado por esta substância a nível cerebral 119. Este facto indica que a MAO-B desempenha um papel importante no desenvolvimento da neurotoxicidade da MDMA, apesar de não influenciar a libertação aguda de DA nem a resposta hipertérmica induzida por esta droga de abuso, um fenómeno verificado recorrendo a uma redução da expressão proteica da MAO-B em ratos 543 e em ratinhos knockout para a MAO-B 544. Em ambas as situações foi observada protecção relativamente à depleção dos níveis cerebrais de 5-HT provocada pela MDMA.

1.9.5.1.2. Anti-retrovirais

A interacção dos anti-retrovirais com a MDMA é especialmente preocupante, uma vez que, como já foi referido, ao consumo de MDMA está associada uma maior aquisição de comportamentos de risco, que englobam comportamentos facilitatórios da transmissão de doenças sexualmente transmissíveis. Por esse motivo, existem altas taxas de infecção por HIV entre os consumidores de MDMA e análogos. Os fármacos anti-retrovirais têm sido os principais envolvidos em interacções potencialmente letais com a MDMA 204, 514. Interacções entre substâncias utilizadas em contextos recreativos (ex.: benzodiazepinas, cocaína, LSD, Cannabis e derivados, anfetamina, MDMA e opiáceos) e fármacos anti-HIV podem provocar toxicidade e influenciar os resultados clínicos da terapia anti-retroviral, sobretudo devido a uma interferência no metabolismo 509, uma vez que todos os inibidores das proteases e os inibidores não-nucleosídicos da transcriptase reversa são substratos e potentes inibidores ou indutores do CYP450 545. Concretamente, os inibidores das proteases que inibem a CYP2D6 e a CYP3A4 podem estar implicados no aumento das concentrações de MDMA quando consumidos simultaneamente 545.

97 Introdução ______

O ritonavir (Norvir®) é um fármaco anti-retroviral, da classe dos inibidores da protease, utilizado no tratamento das infecções por HIV e da SIDA. Devido à sua capacidade de inibir várias isoformas do complexo CYP450, o ritonavir é utilizado frequentemente em associação com outros anti-retrovirais numa abordagem terapêutica para o tratamento das infecções por HIV e da SIDA denominada HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy). O ritonavir vai, assim, inibir a(s) enzima(s) que metaboliza(m) os outros inibidores das proteases, levando a concentrações plasmáticas mais altas destes fármacos, o que permite ao médico assistente reduzir as doses e a frequência das tomas, aumentando a sua eficácia clínica. No entanto, o problema do ritonavir estende-se muito para além da inibição da CYP2D6 porque sabe-se que, em exposiação aguda, o ritonavir tem a capacidade de inibir in vitro as isoformas 2B6, 2C9, 2C19, 2D6 e 3A4 do CYP450 em microsomas preparados a partir de fígado humano 515, 546, 547. Alguns casos de interacções muito graves ou mesmo fatais em indivíduos que consumiram MDMA enquanto tomavam ritonavir foram já relatados 204, 548. Concretamente, um indivíduo do sexo masculino, HIV- positivo, que já tinha tido contacto prévio com a MDMA sem sinais de toxicidade, após ter iniciado a sua terapia anti-retroviral que incluía ritonavir, ingeriu cerca de 180 mg de MDMA. Em poucas horas manifestou taquipneia, taquicardia, hipertermia, uma crise tonico-clónica e veio a falecer. Os estudos post-mortem revelaram uma concentração plasmática de MDMA 10 vezes superior à esperada, provavelmente devido a uma inibição da CYP2D6 pelo ritonavir que conduziu a uma situação de sobredosagem da MDMA 204. No entanto, a farmacocinética não linear, resultante da inibição da CYP2D6 para concentrações elevadas de MDMA, e a disfunção hepática pré-existente neste indivíduo podem ter também contribuído acentuadamente para o desenvolvimento desta intoxicação 204. A inibição da CYP2D6 pelo ritonavir parece ser causa de um aumento da toxicidade da MDMA 509, uma vez que o ritonavir tem maior afinidade para a CYP2D6 do que as anfetaminas, levando a um aumento dos seus níveis plasmáticos entre 3 a 10 vezes 549.

98 ______Introdução

1.9.5.2. Alimentos

Os alimentos ingeridos pelos consumidores de MDMA podem afectar os seus efeitos pela ocorrência de interacções farmacodinâmicas e/ou farmacocinéticas. Por exemplo, suplementos alimentares à base de Ephedra são utilizados por cerca de 1% da população para perda de peso, aumento dos níveis de energia e performance física acrescida. No entanto, devido à acção simpaticomimética destes compostos, têm grande potencial para interagir com compostos com propriedades semelhantes (ex.: MDMA) aumentando o risco de agravamento dos efeitos tóxicos derivados da Ephedra como: enfarte de miocárdio, convulsões, acidentes vasculares-cerebrais isquémicos e hemorrágicos potencialmente letais 550. Outros constituintes dos alimentos podem originar interacções farmacodinâmicas com a MDMA por serem inibidores da MAO (ex.: cumarina, flavona, entre outros) 551. De facto, algumas xantonas são potentes inibidores reversíveis da MAO-A 551, o que, como já referido anteriormente, pode levar a uma potenciação da neurotoxicidade induzida pela MDMA. No entanto, outras xantonas podem apresentar uma acção inibitória mais marcada sobre a MAO-B 552, podendo possivelmente conferir um certo grau de neuroprotecção relativamente à toxicidade da MDMA. As interacções farmacocinéticas podem surgir porque a dieta, incluindo os nutracêuticos 398, pode estar na base de alterações da actividade das enzimas do CYP450 483. Daí que seja importante saber quais os constituintes da dieta que podem afectar as principais isoenzimas do CYP450. Como exemplo, um indivíduo que consuma habitualmente hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) veiculados pelos alimentos grelhados em carvão vai ter um metabolismo de fase I mais rápido que um indivíduo que não os consuma 440, com o consequente aumento da metabolização de compostos que sejam substratos das enzimas envolvidas nesta fase do metabolismo dos xenobióticos. Quando os compostos ingeridos sofrem bioactivação metabólica através dos sistemas enzimáticos induzidos, levando à formação de compostos tóxicos, a indução das enzimas de fase I

99 Introdução ______

pode estar associada a um maior risco de desenvolvimento de respostas tóxicas. Alguns flavonóides (quercetina, luteolina, apigenina, baicaleina, crisina, flavona) têm a capacidade ainda de induzir simultaneamente enzimas de fase I e de fase II (as UGTs e o CYP450). Outros compostos que ocorrem naturalmente e também induzem as UGTs são: benzo[a]pireno, cumarina, α- angelicalactona, ácido elágico, e ácido ferúlico 440. Medicamentos, alimentos, e seus constituintes, que influenciam a actividade e expressão das principais isoenzimas do CYP450 envolvidas no metabolismo da MDMA estão compilados na Tabela 5.

Tabela 5. Medicamentos, alimentos, e seus constituintes, que influenciam a actividade e expressão das principais isoenzimas do CYP450 envolvidas no metabolismo da MDMA. Adaptado e Ioannides et al. 483

CYP1A2 Substratos antidepressivos (amitriptilina, imipramina, clomipramina), antipsicóticos atípicos (clozapina, olanzapina), cafeína, anestésicos locais (ropivacaína), teofilina, agonistas dos receptores 5- HT (zolmitriptano), ciclobenzaprina, estradiol, fluvoxamina, haloperidol, ondansetron, mexiletina, melatonina, tamoxifeno, naproxeno, paracetamol, fenacetina, propranolol, riluzol, ropinirol, tacrina, tizanidina, verapamilo, varfarina, zileuton, lidocaína Indutores vegetais da família Brassicaceae (vegetais crucíferos como os brócolos e couve-de-bruxelas, devido aos glucosinolatos 396), insulina, metilcolantreno, modafinil, nafcilina, β-naftoflavona, omeprazol, tabaco, sumo de toranja (devido à flavonona naringenina), erva de S. João (pela hiperforina), anticonvulsivantes (carbamazepina, fenobarbital), rifampicina, espinafres, alho francês, cebola, salsa, pão torrado, alimentos fritos ou grelhados com carvão (devido à formação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs, ex.: benzo[a]pireno) e aminas heterocíclicas), carne e peixe fumados, presunto, salsichas, chá verde e chá preto (por conterem cafeína) 553, elevada ingestão de TG (por aumentar a formação de corpos cetónicos), compostos metilenodioxifenilo (presentes na pimenta preta, canela, cravinho, noz- moscada) como o safrol, furanocumarinas (ou psoralenos, presentes no aipo, figo, toranja), carotenos, ruibarbo (por conter antraquinona), alicina (composto organosulfurado presente no alho) Inibidores Potentes: fluoroquinolonas (ciprofloxacina), fluvoxamina, verapamilo Ligeiros: cimetidina Outros: amiodarona e mexiletina, furafilina, interferão, metoxaleno, mibefradil, cafeína, Echinacea, enoxacina, contracepção hormonal, zileuton, pão, batatas, arroz, plantas da família Apiaceae (cenouras, aipo, funcho, salsa, por terem furanocumarinas), algumas Rutaceae (frutos cítricos, toranja, por terem furanocumarinas) e carne cozida, redução de ingestão proteica, défices de vitamina D, ingestão excessiva de colesterol, jejum, aumento do consumo de glucose

100 ______Introdução

Tabela 5 (cont.). Medicamentos, alimentos, e seus constituintes, que influenciam a actividade e expressão das principais isoenzimas do CYP450 envolvidas no metabolismo da MDMA Adaptado e Ioannides et al. 483

CYP2B6 Substratos bupropion, ciclofosfamida, ifosfamida, tiotepa, efavirenz e nevirapina, alfentanilo, propofol, tamoxifeno, valproato, artemisinina, petidina, nicotina, sertralina

Indutores fenobarbital (a sua acção indutora é inibida se houver carência em selénio), rifampicina, carbamazepina, artemisinina, clotrimazol, ifosfamida, glucocorticóides, fenitoína, ritonavir, dietas ricas em TG, jejum, bróculos e couves-de-bruxelas, chá preto e verde, flavonóides, terpenóides (cânfora, mentol, pineno, limoneno), safrol, psoraleno, alho, álcool Inibidores Potentes: orfenadrina Outros: tiotepa, ticlopidina, paroxetina, fluoxetina, sertralina, estradiol, fenciclidina, ritonavir

CYP2D6

Substratos β-bloqueadores (metoprolol, carvedilol, timolol, alprenolol, atenolol), antiarrítmicos de classe I (flecainide, lidocaína, propafenona, encainide, mexiletina), todos os antidepressivos tricíclicos (ex.: imipramina, amitriptilina), maioria dos ISRS (ex.: fluoxetina, paroxetina), opióides (codeína, tramadol), debrisoquina, dextrometorfano, venlafaxina, antipsicóticos (ex.: haloperidol, risperidona, perfenazina, tioridazina, zuclopentixol, remoxipride, aripiprazol), ondansetron e tropisetron, mianserina, fenformina, anfetamina, clorfenamina, metoclopramida, tamoxifeno, alcalóides da vinca Indutores Potentes: piperidinas e derivados (ex.: glutatimida) Intermédios: carbamazepina Outros: dexametasona, rifampicina Inibidores Potentes: bupropion, ISRS (fluoxetina, paroxetina, citalopram), quinidina Médios: duloxetina, terbinafina Ligeiros: amiodarona, cimetidina e ranitidina, sertralina Outros: celecoxib, antagonistas receptores H1 (clorfeniramina, clorfenamina, difenidramina), antipsicóticos (clorpromazina, haloperidol), cinacalcet, clemastina, clomipramina e imipramina, cocaína, doxepina, doxorrubicina, halofantrina, hidroxizina, levomepromazina, metadona, metoclopramida, mibefradil, midodrina, moclobemide, perfenazina, ranitidina, ritonavir, ticlopidina, tripelenamina, cloranfenicol, ranolazine, levomepromazina e pimozide e tioridazina

101 Introdução ______

CYP3A4 Substratos bloqueadores dos canais de cálcio (diltiazem, nifedipina, felodipina, verapamilo), imunosupressores (ciclosporina, tacrolimus, sirolimus), quimioterápicos (ciclofosfamida, docetaxel, doxorrubicina, etoposido, ifosfamida, paclitaxel, tamoxifeno, teniposido, vimblastina, vindesina, gefitinib), benzodiazepinas (flunitrazepam, midazolam, alprazolam, triazolam, clonazepam), antifúngicos azólicos (cetoconazol, itraconazol, clotrimazol), antidepressivos tricíclicos (amitriptilina, imipramina, clomipramina), antibióticos macrólidos (eritromicina, claritromicina), ISRSs (citalopram, fluoxetina, norfluoxetina, sertralina), estatinas (atorvastatina, lovastatina, sinvastatina), inibidores da fosfodiesterase-5 (PDE5) (sildenafil), buspirona, haloperidol e pimozide, venlafaxina, amiodarona, etinilestradiol e levonorgestrel, quininas, inibidores das proteases (indinavir, ritonavir, saquinavir, nelfinavir), mirtazapina, nefazodona, reboxetine, zopiclone, inibidores da transcriptase reversa não nucleosídicos (nevirapina), fentanilo e alfentanilo, budesonido, donepezil, esomeprazol e omeprazol, finasteride, glibenclamida, cisapride, terfenadina, toremifeno, barbitúricos (fenobarbital), carbamazepina, codeína, dextrometorfano, digoxina, alcalóides da cravagem do centeio, estradiol, ivabradina, lidocaína, metadona, mifepristona, montelucaste, ondansetron, paracetamol, quinidina, testosterona, teofilina, valproato, varfarina, tetraidrocanabinol, antipsicóticos atípicos (aripiprazol, risperidona, ziprasidona) Indutores anti-retrovirais inibidores da TR não nucleosídicos (efavirenz, nevirapina, etravirina), barbitúricos (fenobarbital; a sua acção indutora é inibida se houver carência em selénio), anticonvulsivantes (carbamazepina, oxcarbazepina, fenitoína, felbamato, primidona, topiramato), anti-inflamatórios (glucocorticóides, ex: dexametasona), antinarcolépticos (modafinil), antidiabéticos orais (pioglitazona, troglitazona), antibióticos (rifabutina, rifampicina), antidepressivos (hiperforina da erva de S. João em baixas doses 554, 555), antifúngicos (griseofulvina), cafestol, óleo de milho, dietas com redução calórica, indóis (presentes nos vegetais crucíferos) Inibidores Potentes: inibidores das proteases (indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir), macrólidos (claritromicina, eritromicina, telitromicina), antifúngicos azólicos (itraconazol, cetoconazol), nefazodona, quercetina Médio: aprepitante, eritromicina, fluconazol, sumo de toranja (devido à bergamotina), verapamilo Médio-Ligeiro: diltiazem Ligeiro: cimetidina Outros: amiodarona, cloranfenicol, dietil-ditiocarbamato de delaviridina, fluvoxamina, gestodeno, imatinib, mibefradil, mifepristona, norfloxacina, norfluoxetina, carambola, voriconazol, ciprofloxacina, ciclosporina, Echinacea, enoxacina, ergotamina, metronidazol, inibidores da transcriptase reversa não-nucleosídicos (efavirenz, nevirapina), ISRSs (fluoxetine), piperina, hiperforina da erva de S. João em doses elevadas 554, 555.

102 ______Introdução

Não devemos ainda descurar o efeito imprevisível que os xenobióticos (ex: dioxinas, antibióticos, hormonas promotoras do crescimento, poluentes ambientais, pesticidas) presentes nos alimentos poderão ter ao nível da farmacocinética da MDMA.

Assim, existem vários factores nutricionais que podem condicionar a expressão do CYP450: a) alterações nos níveis de macronutrientes [dietas pobres em proteínas diminuem a actividade do CYP450; elevados consumos de glucose, frutose e sacarose diminuem o metabolismo dos xenobióticos; a natureza e a quantidade dos lípidos da dieta altera a actividade do CYP450 em função da espécie em causa; a deficiência em lipótropos (metionina e colina) induz o CYP450]. b) Alterações nos níveis de micronutrientes (normalmente, a deficiência em micronutrientes (vitaminas A, C ou E) diminui ou suprime o metabolismo; no entanto, deficiência em tiamina (vitamina B1) aumenta o metabolismo; carência em ferro diminui a actividade do CYP450 intestinal e a quantidade de hemoproteína, mas não altera CYP450 hepático; o mesmo acontece com o selénio; deficiência em zinco diminui CYP450 hepático; deficiência em cobre tem uma regulação diferencial das várias proteínas do CYP450). c) Jejum e redução do consumo calórico (a redução do aporte calórico com redução ponderada da ingestão de hidratos de carbono, proteínas e lípidos, mas sem alterar o aporte de micronutrientes, leva a uma redução da actividade do CYP450; o mesmo acontece durante o jejum) 556, 557. d) “Não-nutrientes” presentes na dieta (constituintes de plantas, micotoxinas, produtos de cedência do material de embalagem, produtos gerados durante a cocção e aditivos alimentares) também têm a capacidade de alterar a actividade do CYP450 483.

103 Introdução ______

1.9.5.3. Contaminantes das pastilhas de ecstasy

Apesar de as pastilhas comercializadas nos espaços rave estarem muitas vezes identificadas com determinados logótipos com o objectivo do comprador identificar qual a droga que está a comprar, a verdade é que elas podem conter apenas substâncias inertes (bicarbonato de sódio, pó de talco, açúcares), percentagens variáveis de MDMA, uma droga completamente diferente daquela que o consumidor pretende comprar, ou a droga em causa pode estar misturada com outros contaminantes. Existe, assim, uma enorme heterogeneidade e variabilidade nos ingredients activos das pastilhas vendidas como ecstasy 13. Esta composição variável das pastilhas de ecstasy tem sido estudada desde 1986, quando Renfroe analisou o conteúdo de várias pastilhas vendidas como ecstasy nos EUA. Os resultados deste e dos estudos que lhe seguiram estão compilados na Tabela 3. A maioria dos estudos realizados conduz às mesmas conclusões: (i) apenas uma parte das pastilhas em circulação contém MDMA ou substâncias aparentadas (ex.: MDA, MDEA, MBDB e 2-CB) 3, 366, 369, 372, 373; (ii) a proporção de ingredientes activos varia largamente entre pastilhas (concretamente, a MDMA chega a variar num factor de 7 vezes entre pastilhas) 3, 366, 373; (iii) a maior parte das pastilhas apresenta na sua constituição substâncias inertes que funcionam como excipientes (ex.: açúcares, poliálcoois como o manitol, talco, bicarbonato de sódio) 3; e (iv) a maioria contém outras substâncias estimulantes ou não para além da MDMA (ex.: MTA, ketamina, cafeína, testosterona, efedrina, pseudoefedrina, LSD, cocaína, heroína, DXM, cloroquina, paracetamol, vasodilatadores, atropina, salicilatos, etc) 3, 366, 368, 369, 372, 558. Nalguns destes estudos verificou-se ainda uma diminuição do teor de MDMA e um aumento da contaminação das pastilhas de ecstasy com outras substâncias ao longo do tempo 366, 369. No entanto, na Europa, a maior parte dos comprimidos de ecstasy continuaram, em 2005, a conter MDMA ou outra substância afim (MDEA, MDA), normalmente como única substância psicoactiva presente 20.

104 ______Introdução

O teor em MDMA dos comprimidos de ecstasy varia muito entre os lotes (inclusive entre os que apresentam o mesmo logótipo), e ao longo do tempo, num mesmo país e entre países. Este fenómeno pode levar a reacções diferentes e imprevisíveis por parte dos consumidores 366. Em 2005, o teor médio de MDMA por pastilha de ecstasy variava entre 2 e 130 mg, embora na maioria dos países a média se situasse entre 30 e 80 mg de MDMA 20. Contudo, estes estudos sobre a composição e pureza das pastilhas de ecstasy têm algumas limitações que se prendem com as fontes das pastilhas de ecstasy analisadas: (i) quando as pastilhas são obtidas de apreensões policiais, provêm de lotes muito homogéneos que, normalmente, são pouco representativos, uma vez que as pastilhas contidas em cada lote apreendido têm, geralmente, a mesma origem, (ii) quando a recolha das pastilhas para análise é feita numa determinada população-alvo de uma dada área geográfica, os resultados obtidos não poderão ser generalizados, uma vez que a composição das pastilhas varia com a área geográfica 366, (iii) quando as pastilhas são obtidas através de campanhas que incentivam as pessoas a submeter para análise pastilhas que considerem suspeitas, os níveis de pureza em MDMA encontrados são normalmente muito inferiores porque as pastilhas que são submetidas são aquelas associadas à ocorrência de efeitos não esperados (tal como se verificou no estudo de Tanner-Smith realizado em 2006 no qual se incentivava o envio para análise de pastilhas de ecstasy suspeitas de serem falsas ou adulteradas 366). Também a precisão das informações prestadas pela população alvo e a duração do estudo (já que a composição e pureza das pastilhas varia ao longo dos anos 366), entre outros factores, poderão afectar as conclusões acerca dos resultados obtidos. Estas limitações levam ao aparecimento de resultados contraditórios. Em 2004, Parrott fez uma revisão de alguns estudos sobre a pureza das pastilhas de ecstasy na Europa e concluiu que, nos anos 80, as pastilhas de ecstasy eram de elevadas qualidade e pureza (90-98% continha MDMA). Contudo, no início dos anos 90 a pureza sofreu um declínio e apenas 50 a 80% das pastilhas continham MDMA. No entanto, a proporção de pastilhas contendo MDMA voltou a aumentar no final dos anos 90 e atingiu valores próximos dos 100% no início do século XXI. O declínio no conteúdo de MDMA das pastilhas está muitas vezes associado ao aumento da procura e a uma maior dificuldade

105 Introdução ______para os produtores em aceder às matérias-primas 558. Considerando as elevadas prevalências de contaminação das pastilhas de ecstasy, estudos comparativos parecem indicar que é mais provável adquirir uma pastilha de ecstasy não psicoactiva (sem compostos psicoactivos ou em doses demasiado baixas) do que comprar pastilhas contendo doses elevadas de MDMA 373. A utilização destes contaminantes (ex.: DXM, cafeína, pseudo-efedrina) nas pastilhas de ecstasy deve-se, provavelmente, à maior disponibilidade (uma vez que são compostos legais) e ao menor preço destes produtos quando comparados com a MDMA. Para além deste facto, a produção de pastilhas de MDMA é muito interessante economicamente devido à grande expansão do consumo destas pastilhas e ao elevado preço das mesmas, o que incita os produtores a fabricar comprimidos para serem vendidos como ecstasy, mesmo que estes não contenham o composto em causa 366. Assim, a pureza das pastilhas de ecstasy varia, dependendo da disponibilidade de MDMA pura importada, da capacidade dos mercados produzirem MDMA pura e dos efeitos procurados pelos consumidores da droga 559. Devido a estas impurezas, os efeitos tóxicos da MDMA são apenas uma parte dos efeitos potencialmente letais que podem resultar do consumo deste tipo de pastilhas, uma vez que os utilizadores de ecstasy podem inadvertidamente ingerir outras drogas potencialmente letais para além da MDMA. A contaminação das pastilhas de ecstasy é particularmente problemática para utilizadores com determinados factores predisponentes para o desenvolvimento de dependência e/ou patologias de foro psiquiátrico 560. O aparecimento de efeitos raros ou inesperados pode ser explicado pela presença de substâncias não estimulantes nas pastilhas de ecstasy 423. As possíveis interacções da MDMA com outros compostos incluídos na composição das pastilhas serão abordadas, mais detalhadamente, nos sub- capítulos seguintes.

106 ______Introdução

1.9.5.3.1. Excedentes e sub-produtos da síntese de MDMA

Dependendo do procedimento utilizado para obter MDMA, entre os cerca de 20 disponíveis, os compostos precursores da sua síntese incluem MDA, safrol, isosafrol, piperonal e piperonil acetona. Outros reagentes usados na síntese de MDMA são o ácido bromídrico, metilamina, cloroformato de etilo, alumino-hidreto de lítio, tetraidrofurano, cianoboro-hidreto de sódio, metanol, N- metilformamida, entre outros 561. Para além dos precursores de síntese poderem potencialmente interferir com os efeitos tóxicos da MDMA é também importante ter em conta que os compostos intermediários da síntese [isosafrol glicol, piperonilmetilcetona, N-formil-3,4-metilenodioximetilanfetamina, N-formil- 3,4-metilenodioxianfetamina e 1-(3,4-metilenodioxifenil)-2-bromopropano], poderão também hipoteticamente originar interferências com os efeitos da MDMA 562. Numa síntese bem sucedida, a MDMA resultante é um pó com cerca de 100% de pureza com um aroma característico 563. Por este motivo, segundo alguns autores, não existe evidência analítica que confirme a presença de materiais de partida, intermediários e sub-produtos de síntese nas pastilhas de ecstasy, uma vez que eles não são detectados em determinados lotes 558, 564. No entanto, estes materiais e sub-produtos de síntese foram encontrados em amostras de 89 aprensões realizadas em Hong Kong e este perfil de impurezas permite inferir qual o processo de síntese utilizado 365. Este tipo de análise qualitativa foi já proposto em 2005 por Swist e colaboradores 565, 566 para identificar o método de síntese utilizado e assim poder prever qual a origem das pastilhas. A presença destas impurezas é procupante, uma vez que estes contaminantes resultantes da preparação da MDMA podem exercer um papel importante no aparecimento de problemas de saúde associados ao consumo de pastilhas de ecstasy 4, como se pode observar na tabela seguinte (Tabela 6):

107 Introdução ______

Tabela 6. Possíveis efeitos dos Excedentes e sub-produtos da síntese de MDMA na toxicidade da ecstasy.

Composto Possível efeito

Materiais de partida MDA Sinergismo com os efeitos da MDMA 567 Aumento do risco de toxicidade por formação de metabolitos tóxicos, ROS e RNS 60, 568 Safrol e análogos Potencial carcinogénese em humanos por formação com aductos com o DNA 569 Tetraidrofurano (THF) Narcose e disfunção hepatocelular em doses altas 570 Inibe algumas isoenzimas do CYP450 (sobretudo a CYP2E1) 570 Estimulação da absorção de metabolitos reactivos de vários compostos (ex.: solventes) 570 Metanol Desenvolvimento de acidose metabólica e inibição da respiração celular devido à acumulação de formato 571 que poderá diminuir o tempo de semi-vida da MDMA por aumentar a sua eliminação urinária N-metilformamida Desenvolvimento de hepatotoxicidade 572 Piridina 365 Indução da CYP2E1 Desenvolvimento de hepatotoxicidade e nefrotoxicidade Diminuição da motilidade dos espermatozóides em ratinhos Altera do estro em ratos 573 Intermediários de síntese 1,3-bis(3,4-metilenodioxifenil)-2- Inibição dos transportadores das monoaminas numa intensidade propanamina e N-formil-1,3- semelhante à da MDMA 574 bis(3,4-metilenodioxifenil)-prop- Fraca/ausente capacidade de aumentar o potencial neurotóxico da 2-il-amina MDMA por não induzirem a libertação destes neurotransmissores 574

108 ______Introdução

1.9.5.3.2. Outros estimulantes anfetamínicos [anfetamina, MTA, fenfluramina, fentermina, análogos sintéticos da anfetamina (PMA, 4-metiltioanfetamina, 2-CB) e derivados metilenodioxi (MDA,MDEA)]

Figura 7. Estruturas químicas dos principais estimulantes anfetamínicos encontrados na composição de pastilhas de ecstasy, além da MDMA.

1.9.5.3.2.1. MDA e MDEA

A MDA pode surgir nas pastilhas de ecstasy por ser um precursor de síntese, mas pode também ser incluída intencionalmente na composição das pastilhas para aumentar os efeitos do cocktail de drogas ou devido à percepção que a síntese de MDA poderá ser mais simples do que a da MDMA 575. De facto, a MDA é também capaz, por si só, de induzir aumento da pressão sanguínea, bradicardia e aumento da actividade locomotora e tem uma acção 115 mais potente que a MDMA em receptores α1D, α2A e α1A .

109 Introdução ______

No entanto, a sua presença no produto final poderá ser responsável por um aumento da toxicidade resultante do consumo da pastilha, uma vez que a MDA sofre um metabolismo semelhante ao da MDMA e corresponde, também, a um dos metabolitos formados a partir da MDMA. A MDA é O-desmetilenada ao catecol α-Me-DA que pode sofrer oxidação à correspondente o-quinona e, posteriormente, conjugar-se com a glutationa para formar aductos. Qualquer um destes passos metabólicos leva à formação de metabolitos com maior toxicidade que o composto pai e é acompanhada pela libertação de ROS e RNS 60, 568. Uma vez que a MDA também tem a capacidade de induzir uma resposta hipertérmica semelhante à da MDMA 567, parece plausível assumir a possibilidade de ocorrer um efeito aditivo entre os dois compostos, aumentando os efeitos deletérios induzidos pela hipertermia. A ingestão combinada de MDA, anfetamina, MDMA e PMA foi já associada ao aparecimento de intoxicações fatais 282. O mesmo já se verificou pela exposição simultânea a MDEA e MDMA 297.

1.9.5.3.2.2. MTA

Foi já demonstrado que, em ratos, a combinação da MDMA com a MTA tem efeitos tóxicos mais marcados do que cada uma das drogas em separado 576 embora estas diferenças pareçam desaparecer num padrão de consumo crónico 577. A MTA e a MDMA têm afinidade para os receptores nicotínicos e são capazes de induzir a sua up-regulation, especialmente quando se utilizam doses mais elevadas. Este efeito pode levar a um sinergismo na neurotoxicidade, neurotransmissão colinérgica 100. Por outro lado, devido aos seus efeitos mais marcados no sistema dopaminérgico, a MTA tem maior potencial de abuso do que a MDMA. Logo, a sua inclusão nas pastilhas de ecstasy pode aumentar a prevalência de comportamentos de adição e dependência relativamente às mesmas 100. Enquanto a libertação aguda de 5-HT contribui para os efeitos subjectivos da MDMA como euforia, alucinações ligeiras e sentimento de proximidade para com os outros, o aumento da DA produzido pela MTA conduz

110 ______Introdução a sentimentos de auto-confiança, energia, estimulação sexual e euforia, sendo também responsável pelo potencial aditivo. A combinação das duas substâncias parece provocar efeitos eufóricos e pró-sociais sinérgicos 133. Em termos farmacocinéticos, a MTA, a MDA e a MDEA inibem in vitro a captação e a permeação da MDMA através das células do epitélio do íleo 578, pelo que poderão atrasar a sua absorção intestinal. Para além disso, a izoenzima CYP2D6 tem um envolvimento primordial na 4-hidroxilação aromática da MTA, o que faz antever uma elevada probabilidade de interacções farmacocinéticas com outras drogas que sejam substratos desta mesma enzima, como é o caso da MDMA 579.

1.9.5.3.2.3. Outras anfetaminas

As anfetaminas provocam neurotoxicidade serotonérgica e dopaminérgica, a qual leva, em ratinhos Swiss Webster, a uma sensibilização de longa duração aos efeitos locomotores de psicoestimulantes como a MDMA, p-cloroanfetamina e cocaína 580, podendo ter efeitos aditivos com as referidas substâncias. Em acréscimo, todas as anfetaminas com estrutura fenilisopropilamínica são inibidoras da CYP2D6, sendo a sua potência relativa condicionada pela presença de outros grupos funcionais 27, o que provavelmente irá conduzir a um aumento dos níveis plasmáticos de MDMA quando consumida simultaneamente com estes compostos e consequentemente aumentar o risco de desenvolvimento de toxicidade aguda. As interacções da MDMA com outras anfetaminas também se verificam quando estas são co-consumidas intencionalmente para modular os efeitos da MDMA (vide secção 1.9.5.4.2).

111 Introdução ______

1.9.5.3.3. Ketamina

A ketamina [2-(2-clorofenil)-2-(metilamino)- ciclohexanona] (Ketofen®, Ketalar®, Ketanest®, Ketaset®, Ketaject®, Ketamine 500®, Imalgen®) é um anestésico derivado da fenciclidina utilizado no contexto veterinário e clínico (analgesia e anestesia pediátrica, anestesia de emergência, obstetrícia e nos campos de guerra), com propriedades dissociativas, analgésicas e psicadélicas 581. Esta molécula foi já identificada em duas pastilhas de ecstasy conhecidas como “Strawberry Milkshake” e “White Lightning” em dosagens que variaram de 185 a 197 mg 423, que correspondem a doses de cerca de 2,5 mg de ketamina por quilo de peso corporal (para um indivíduo de 70 kg). Clinicamente, para ter alguma acção analgésica, a ketamina é normalmente administrada via i.m. numa dose de 0,5 mg/kg, que originaria concentrações plasmáticas semelhantes às obtidas pela ingestão de uma destas pastilhas analisadas. Para obter um estado de anestesia durante 10-25 minutos seria necessário administrar uma dose de 10 mg/kg i.m., pelo que um indivíduo teria que consumir várias pastilhas como as analisadas para ficar inconsciente. No entanto, o consumo de algumas pastilhas ao mesmo tempo pode produzir ataxia em alguns indivíduos. As sequelas psíquicas do consumo de ketamina parecem ser relacionadas com a dose e aparentemente são marcadamente reduzidas se a ketamina for utilizada em doses subanestésicas 582. A ketamina tem um mecanismo de acção complexo que envolve alteração da neurotransmissão glutamatérgica e monoaminérgica através de um antagonismo, de baixa afinidade, no canal catiónico dos receptores N-metil- D-aspartato (NMDA), um aumento da libertação de glutamato, alguma afinidade para os receptores opióides centrais e espinais (α e μ), receptores colinérgicos e receptores da NA e da 5-HT. Foi já descrito que a ketamina tem a capacidade de inibir a recaptação da NA, DA e 5-HT, numa forma dependente da dose, em células renais embrionárias humanas, tendo assim uma acção simpaticomimética 583, que poderá estar na base de interacções farmacodinâmicas com a MDMA. A ketamina apresenta ainda uma outra

112 ______Introdução possibilidade de interacção farmacodinâmica com a MDMA, uma vez que pode também causar aumento da temperatura corporal nalguns indivíduos 581. Devido aos seus efeitos ao nível do sistema dopaminérgico a ketamina é uma droga com propensão ao abuso e com a capacidade de induzir, em baixas doses, reforços positivos que conduzam a situações de dependência (já verificadas em modelos animais) 581. Logo, a presença de ketamina nas pastilhas de ecstasy pode levar ao aparecimento de dependência relativamente ao seu consumo, apesar de a MDMA propriamente dita ser uma substância com pouca capacidade de induzir este tipo de reacção. O consumo de ketamina veiculada nas pastilhas de ecstasy surpreende muitas vezes os consumidores que manifestam imobilidade e alucinações quando esperavam obter empatia e euforia 584. Os sintomas associados à ingestão excessiva de ketamina são muito semelhantes às da MDMA e incluem hiperactividade, ansiedade, dor no peito, palpitações, taquicardia e, em casos mais graves, rabdomiólise. Qualquer um destes efeitos pode ser aditivo com aqueles provocados pela MDMA, aumentando a toxicidade das substâncias ingeridas. Para além de poder desencadear fenómenos de interacção farmacodinâmica com a MDMA, a ketamina tem ainda o potencial de provocar interacções farmacocinéticas, uma vez que a maior parte do composto pai é metabolizado via N-desmetilação catalizada pela enzyma CYP2B6 585, 586. Foi ainda descrito que a fenciclidina (PCP, composto do qual deriva a ketamina) tem a capacidade de reduzir, em ratos, a actividade de algumas isoenzimas do sistema CYP450, incluindo a sub-família CYP2D 587, podendo aumentar os níveis plasmáticos de MDMA. Embora, por outro lado, a ketamina tenha inibido in vitro a captação e a permeação da MDMA através das células do epitélio do íleo 578, pelo que aparentemente reduzirá a sua absorção a nível intestinal. As interacções da MDMA que se verificam quando a ketamina é co- consumida intencionalmente para modular os efeitos da MDMA serão analisadas mais detalhadamente na secção 1.9.5.4.5.

113 Introdução ______

1.9.5.3.4. Cocaína

349

Contrariamente à previsão dos utilizadores , as pastilhas de ecstasy têm uma reduzida probabilidade de conter cocaína, heroína ou outros opiáceos, uma vez que a inclusão destes ingredientes nas pastilhas seria pouco vantajoso economicamente para os fabricantes de ecstasy 373. No entanto, existem várias possibilidades de interacção entre estas duas substâncias que serão abordadas adiante (vide secção 1.9.5.4.3).

1.9.5.3.5. Efedrina/pseudoefedrina

A efedrina é uma anfetamina natural encontrada na Ephedra vulgaris (Ma-Huang ou Herbal ecstasy). O consumo excessivo de efedrina foi já associado ao aparecimento de sobredosagem tóxica 588. A efedrina é um composto simpaticomimético que pode ser usado como broncodilatador ou descongestionante nasal e que tem propriedades semelhantes à adrenalina nos receptores α e β adrenérgicos, e efeitos centrais semelhantes aos de outras anfetaminas 550. A efedrina provoca libertação de NA e, em menor extensão, de DA e de 5-HT. No entanto, parece que esse efeito de libertação da NA é o que está na base dos efeitos simpaticomiméticos subjectivos desta substância 589, podendo estar também na origem de interacções farmacodinâmicas que potenciem os efeitos da MDMA. O metabolismo da efedrina também envolve uma fase de N- desmetilação a norefedrina que pode ser responsável por uma interacção farmacocinética com a MDMA 590, uma vez que competem para as mesmas vias metabólicas.

114 ______Introdução

1.9.5.3.6. Cafeína

Num estudo recente, 10% das pastilhas de ecstasy 99 analisadas continham esta xantina . Este contaminante parece ter poucas consequências para a saúde em doses baixas 591. No entanto, o consumo excessivo de cafeína foi já associado ao aparecimento de sobredosagem tóxica 588. Além disso é importante considerar que a exposição à cafeína não é apenas veiculada pela contaminação das pastilhas, mas também pelo consumo de café, refrescos de cola e bebidas energéticas muito associadas à vida nocturna e consumidas para reduzir a sonolência e o cansaço. Este composto actua como um antagonista não-selectivo dos receptores

A1 e A2 da adenosina e como um inibidor da fosfodiesterase, aumentando a libertação da DA dos terminais nervosos do núcleo estriado 592. O antagonismo nos receptores 2A2 da adenosina leva a um aumento dos níveis de acetilcolina no hipocampo, o que parece estar na base do efeito analgésico da cafeína. Por outro lado, a MDMA também tem uma acção analgésica que parece envolver um mecanismo serotonérgico a nível central (uma vez que o metisergide, um antagonista não-específico dos receptores 5-HT1, 5-HT2 e 5-HT7, preveniu o efeito analgésico da MDMA). Apesar de ambos os compostos terem uma acção antinociceptiva, a sua co-administração a ratinhos não resultou numa interacção sinérgica 593. Quando ratinhos são expostos a 10 mg/kg de cafeína 20 minutos antes de uma dose de 5 mg/kg de MDMA verifica-se uma potenciação da actividade locomotora induzida pela MDMA, provavelmente devido ao bloqueio A2 induzido pela cafeína que vai potenciar a libertação de DA induzida pela MDMA 593. Um aumento dos níveis de DA no sistema mesolímbico pode precipitar os movimentos voluntários, aumentar a motivação e o estado de alerta, reduzir o apetite e induzir insónia. Esta redução de apetite poderá estar na base da potenciação, pela cafeína, da perda de peso associada à exposição de ratos a doses neurotóxicas de MDMA (20 mg/kg, 2 vezes por dia, durante 4 dias consecutivos) 593. No entanto, o aumento da resposta hiper-locomotora não se

115 Introdução ______verificou quando a cafeína e a MDMA foram administradas simultaneamente a ratos 594. A lesão neurotóxica clássica induzida pela MDMA em ratos, caracterizada por uma redução da densidade dos SERT, é potenciada pela co- exposição a MDMA e cafeína a qual também atrasa a recuperação dos 593 receptores 5-HT2 após a down-regulation induzida pela MDMA . Pode especular-se que o aumento na libertação de DA induzido pela exposição a cafeína + MDMA aumenta a disponibilidade da DA para ser transportada para o interior dos terminais depletados em 5-HT, onde pode ser desaminada pela MAO-B, levando à formação de espécies reactivas que destroem selectivamente os terminais serotonérgicos 93. Para além do já referido, em ratos, a cafeína (10 mg/kg) leva à ocorrência de convulsões quando administrada com a MDA (7,5 mg/kg), tendo demonstrado também aumentar profundamente a intensidade e a duração da resposta hipertérmica associada à MDMA (15 mg/kg) e à MDA (7,5 mg/kg) 594. No entanto, após administrações repetidas, a resposta hipertérmica à mistura cafeína + MDMA desenvolveu tolerância, enquanto que a hipertermia resultante da exposição a cafeína + MDA se manteve 594. Para além disso, 4 semanas após a última administração da mistura, a co-exposição a cafeína + MDA induziu uma redução dos níveis de 5-HT e de ácido 5-hidroxindolacético (5-HIAA) em várias áreas cerebrais, não se verificando o mesmo com a mistura cafeína + MDMA, facto que sugere uma relação entre a manutenção dos níveis cerebrais de 5-HT e o desenvolvimento de tolerância relativamente ao aumento da hipertermia 594. De facto, sabe-se que a hipertermia desempenha um papel preponderante na severidade da perda de 5-HT associada ao consumo de anfetaminas 595. Este facto é consistente com o que se observou neste estudo em que a hipertermia e a perda de 5-HT ocorreram de forma sequencial nos animais expostos a cafeína + MDA. Por outro lado, o facto dos animais expostos a cafeína + MDMA desenvolverem tolerência ao aumento da hipertermia poderá ter contribuído para a menor depleção dos níveis de 5-HT observada nestes animais 594. A co-administração de uma única dose de cafeína (10 mg/kg s.c.) com MDMA (10 mg/kg s.c.) induziu, em ratos, uma taquicardia profunda e

116 ______Introdução persistente, mediada por um efeito simpaticomimético central, não observada após administração de cada uma dos compostos em separado 596. Se a interacção verificada no rato se generalizar ao humano, o padrão de utilização que envolve a exposição simultânea a cafeína e anfetaminas metilenodioxi-substituídas pode ter implicações agudas ou a longo termo, sérias para os utilizadores de ecstasy 594. Em termos farmacocinéticos, a cafeína (10 mM) parece não ter capacidade para inibir in vitro a captação da MDMA (0.5 mM) pelas células do epitélio do íleo, aumentando a permeação da MDMA do bordo apical para o bordo basolateral de um modelo de células da parede intestinal (Caco-2), o que leva a um aumento da AUC plasmática da MDMA quando co-administrada a ratos com cafeína (50 mg/kg p.o.), relativamente à AUC obtida quando a MDMA (10 mg/kg p.o.) é administrada isoladamente 578. Provavelmente devido à confluência dos fenómenos descritos, a cafeína (100 mg/kg i.p.) já mostrou aumentar a mortalidade após administração aguda de anfetamina (15-42 mg/kg i.p), MDMA (15 mg/kg) e o seu principal metabolito MDA (7,5 mg/kg) ou cocaína (35-90 mg/kg i.p.) a ratos 597. Este efeito na letalidade da MDMA é independente da dose de cafeína. Por outro lado, a dose de cafeína condiciona o aumento da mortalidade induzida pela MDA 594. Assim, enquanto a cafeína é considerada como segura e livremente acessível em bebidas como chá, café e bebidas não-alcoólicas, a sua ingestão com MDMA pode ter o potencial para exacerbar a toxicidade aguda desta anfetamina, constituindo um risco para a saúde dos utilizadores de ecstasy 594.

1.9.5.3.7. Paracetamol

Aparentemente, o paracetamol incluído nas pastilhas de ecstasy não se encontra em concentrações perigosas (geralmente inferiores a 200 mg por pastilha), mesmo para 373 indivíduos que consumam várias pastilhas numa noite . Por esse motivo, não existem ainda relatos de fatalidades associadas a interacções entre as duas substâncias.

117 Introdução ______

No entanto, a oxidação do paracetamol pela CYP2E1 resulta na formação do composto hepatotóxico N-acetil-p-benzoquinonimina (NAPQI). Normalmente formada em pequenas quantidades, a NAPQI pode ser destoxificada por conjugação com a GSH. No entanto, doses elevadas de paracetamol ou uma pré-depleção da GSH (como a originada pela MDMA) pode levar a um sinergismo de efeitos hepatotóxicos, agravando a lesão hepática relativamente àquela que qualquer uma das substâncias causaria isoladamente 598.

1.9.5.3.8. LSD

A dietilamida do ácido lisérgico (LSD) é uma das mais potentes substâncias alucinogénicas conhecidas. Tendo em conta o pouco que se sabe acerca do metabolismo e do mecanismo de acção da LSD, será de esperar que ela desencadeie interacções farmacodinâmicas com a MDMA, potenciando o seu efeito, sem que no entanto se observem interacções farmacocinéticas, uma vez que o seu metabolismo parece não envolver o CYP450 (vide secção 1.9.5.4.4).

1.9.5.3.9. Dextrometorfano (DXM)

O dextrometorfano (DXM) é um agente antitússico que foi já encontrado na constituição de pastilhas de ecstasy em doses que variavam de 103 a 211 mg por pastilha, que correspondem a doses consideravelmente superiores à dose terapêutica habitual (15 a 30 mg, até 4 vezes por dia). Uma vez que o DXM é aparentemente comum nas pastilhas de ecstasy e não é detectado por testes rotineiros de rastreio de drogas de abuso, pode ter um papel negligenciado em reacções adversas atribuídas à MDMA 372. De facto, doses elevadas de DXM (superiores a 300 mg) podem causar letargia ou hiperexcitabilidade, taquicardia, ataxia e nistagmo, bem como psicose do tipo da fenciclidina, efeitos causados pela acção bloqueadora do receptor NMDA do seu metabolito

118 ______Introdução dextorfano 372, 522. Para além do efeito ao nível dos receptores NMDA, o DXM 523 também actua a nível central como agonista dos receptores σ1 e σ2 (receptores sigma, produzem efeitos antidepressivos no ratinho e, nos humanos, a sua activação leva a hipertonia, taquicardia, taquipneia e midríase; a anfetamina é agonista nestes receptores), antagonista dos receptores nicotínicos α3β4 524, inibidor da recaptação da 5-HT 525 e, possivelmente, da DA. O DXM pode, assim, potenciar os efeitos da MDMA e a intoxicação por DXM deve então ser considerada em pacientes que admitam consumo de ecstasy e apresentem os referidos sintomas, particularmente se os rastreios forem negativos para MDMA e anfetaminas. Uma vez que quer a MDMA quer o DXM são substratos da CYP2D6 e, uma vez que a MDMA e os seus metabolitos inibem a actividade de CYP2D6 28, a co-administração dos compostos pode levar à competição entre os dois substratos para a enzima metabolizadora e resultar no aumento da incidência e severidade dos efeitos adversos do DXM ou, eventualmente, no aumento dos níveis de MDMA. No entanto, até à data, não foi descrita nenhuma intoxicação desta natureza 23. Aliás, curiosamente, o DXM em altas doses confere neuroprotecção, num efeito independente da metabolização do DXM a dextrorfano 599.

1.9.5.3.10. Excipientes inertes

Como já referido, a velocidade de eliminação da MDMA está dependente do pH dos fluidos de excreção como urina ou suor. De facto, quanto mais ácidos forem esses fluidos, maior o grau de ionização da MDMA e maior a sua eliminação por essas vias. Assim, a inclusão de bicarbonato de sódio nas pastilhas de MDMA é feita com o intuito de prolongar os seus efeitos, uma vez que, ao provocar uma alcalinização dos fluidos de excreção, conduzirá a um atraso na eliminação deste derivado anfetamínico.

119 Introdução ______

1.9.5.4. Drogas de abuso ilícitas co-consumidas intencionalmente com MDMA

Os consumidores de ecstasy são frequentemente consumidores de outras substâncias, combinando substâncias lícitas e ilícitas para aumentar os efeitos esperados da MDMA, bem como para suavizar os sintomas de abstinência 368. Como exemplo podem considerar-se os resultados do trabalho desenvolvido por Schifano e colaboradores em 1998 no qual 95% dos indivíduos consumidores de ecstasy entrevistados tinham consumido outra droga de abuso pelo menos uma vez 219. Os estudos relativos ao co-consumo de MDMA e outras substâncias estão compilados na Tabela 7. Este fenómeno de co-consumo torna difícil concluir definitivamente acerca dos efeitos tóxicos da MDMA a longo prazo e acresce o risco de desenvolvimento de toxicidade 13. A intensidade do padrão de consumo de MDMA altera a propensão dos indivíduos para consumir outras drogas como cocaína, anfetamina, LSD, e cogumelos alucinogénicos (contendo psilocibina), mas não altera o consumo de álcool, tabaco e Cannabis 332. Este facto foi já verificado num estudo realizado em 2008 em Coimbra em que, num universo de 223 utilizadores de MDMA, 11,7% era consumidor excessivo e, destes, 58,3% consumiam MDMA num padrão de policonsumo com outras drogas, enquanto que consumidores de MDMA mais moderados tinham prevalências de policonsumo inferiores 305. A ecstasy pode influenciar a utilização de outras drogas, sobretudo cocaína e MTA. Aparentemente, o início do consumo de ecstasy numa idade mais tardia parece diminuir o risco de consumir estas drogas, embora não afecte o consumo de heroína 355.

120

Tabela 7. Padrões de policonsumo de drogas de abuso reportados por consumidores de ecstasy. Estudo Cole et al. 370 de Sola et al. 354 Dresen et al. 309 Medina et al. 312 Yen et al. 313 Breen et al. 314 Copeland et al. 316 2008 2008 2007 2007 2007 2006 2006 N = 80 N = 14 N = 247 N = 48 N = 200 N = 852 N = 216 (Reino Unido) (Espanha) (Alemanha) (EUA) (Taiwan) (Austrália) (Austrália) Associação % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos

Tabaco Cannabis 37,7 91,7 6,5 82 Etanol 93,2 93,8 57,5 65a Cocaína 51,2 57,1 50 60 27 Anfetamina 19,8 MTA 57,1 25 4 83 Alucinogénios (ex.: LSD, PCP) 14,3 29,2 26 Ketamina 35,7 23 GHB 28,6 10 Opiáceos (ex.: heroína) 14,3 20,8 1 6 Sedativos (ex.: barbitúricos, 14,3 68,8 5 27 16 benzodiazepinas) Cogumelos “mágicos” 50 Inalantes (“poppers”) 25 Solventes Noz de Areca ou Betel 50 Nenhuma 14,6 70,5 a Destes, 69% fazem binge drinking, ou seja, consomem mais de 5 bebidas standard por noite.

121

122 Tabela 7 (cont.). Padrões de policonsumo de drogas de abuso reportados por consumidores de ecstasy.

Estudo Wish et al. 322 Wu et al. 323 Wu et al. 324 Barrett et al. 325 Clatts et al. 326 Degenhardt Liechti 2006 2006 2006 2005 2005 452 et al. 190 N = 1206 N = 696 N = 19084 N = 186 N = 569 2005 2005 (EUA) (EUA) (EUA) (Canadá) (EUA)b N = 852 N = 52 (Austrália) (Suiça) Associação % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos

Tabaco 82,1 34,6 Cannabis 98 91,4 97,4 68,5 73,8-86,6 19,2 Etanol 88,2 99,5 45,2 89,5-97,1 53,8 Cocaína 46 56,3 56,4 9,8 18,8-26,4 25 Anfetamina 31,1 36,5 48,4 14,7-20,3 19,2 MTA 1 60,5-70,6 Alucinogénios (ex.: LSD, PCP) 38 36,4 100 11,6-31,9 3,8 Ketamina 9,7 4 17,9-36,2 3,8 GHB 8,6 7,5-15,9 25 Opiáceos (ex.: heroína) 17 30,7 7,7 2,8-19,7 7,7 Sedativos (ex.: barbitúricos, 28,5 40,4 23,7-52,6 5,8 benzodiazepinas) Cogumelos “mágicos” - Inalantes (“poppers”) 38 45,1 13,0-31,9 Solventes Noz de Areca ou Betel Nenhuma 9,6 b Percentagens de policonsumo descritas pelos utilizadores crónicos de MDMA;

Tabela 7 (cont.). Padrões de policonsumo de drogas de abuso reportados por consumidores de ecstasy.

Estudo Milani Lora-Tamayo Scholey Parrott Winstock Topp et al. 342 Calafat et al. 601 et al. 600 et al. 331 et al. 332 et al. 339 et al. 266 1999 1998 2005 2004 2004 2001 2001 N = 329 N = 801 N = 59 N = 70 N = 763 N = 768 N = 1.106 (Austrália)c (Europa)f (Reino Unido) (Espanha) (Internet) (Reino Unido e (Reino Unido)c Itália) Associação % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos %inquiridos Tabaco 56 69,4 - 62 (54) 88.7 Cannabis 72,9 58,6 70 87,6 82 (82) 45 (64) 79.4 Etanol 79 80,4 88d (60) 40e (21) 67.8 Cocaína 55,7 56 73,1 58 (0,5) 37.6 Anfetamina 69 73,7 83 43 (7) 35.4 MTA Alucinogénios (ex.: LSD, PCP) 60 66,3 30 13 31.7 Ketamina 14,2 14 GHB Opiáceos (ex.: heroína) 23 25,5 (2) (5) 8.8 Sedativos (ex.: barbitúricos, 38 22,1 (18) (17) benzodiazepinas) Cogumelos “mágicos” 56 46,6 - 18.5 Inalantes (“poppers”) 39,1 51 12 (8) Solventes 21 17,5 Noz de Areca ou Betel Nenhuma - - 123 c Os valores indicados entre parêntesis indicam a percentagem de consumidores de MDMA que referiram a utilização da substância em causa na modulação das reacções desagradáveis que surgem durante a regressão dos efeitos da MDMA. d Destes, 70% consome etanol em doses consideradas perigosas. e Destes, 41% fazem binge drinking, ou seja, consomem mais de 5 bebidas standard por noite. f Média de 5 cidades: Coimbra, Modena, Nize, Palma de Mallorca, Utrecht.

124 Tabela 7 (cont.). Padrões de policonsumo de drogas de abuso reportados por consumidores de ecstasy.

Estudo Schifano et al. 219 Alvarez et al. 601 Boys et al. 345 e Williamson et al. 346 Webb et al. 348 Solowij et al. 22 1998 1997 Lenton et al. 344 1997 1996 1992 N = 150 N = 418 1997 N = 158 N = 3075 N = 100 (Itália) (Espanha) N = 83 (Reino Unido)c (Reino Unido) (Austrália) (Austrália) Associação % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos % inquiridos

Tabaco 61.7 - Cannabis 31 59.6 69,2 (55) 96,6 47 Etanol 39 63.6 19,2 30 Cocaína 33.7 - Anfetamina 32.5 34,6 41 MTA Alucinogénios (ex.: LSD, PCP) 24 31.3 26,9 19 Ketamina GHB Opiáceos (ex.: heroína) 6.7 - Sedativos (ex.: barbitúricos, 7,7 benzodiazepinas) Cogumelos “mágicos” - - Inalantes (“poppers”) 34,6 7 Solventes Noz de Areca ou Betel Nenhuma 2.6 59 24

c Os valores indicados entre parêntesis indicam a percentagem de consumidores de MDMA que referiram a utilização da substância em causa na modulação das reacções desagradáveis que surgem durante a regressão dos efeitos da MDMA

______Introdução

O estudo do padrão de consumo de outras drogas de abuso pelos consumidores habituais de MDMA 332 é consistente com a noção de limiares na progressão do consumo de drogas desde as drogas legais, a Cannabis e seus derivados e, posteriormente outras drogas ilícitas 602. Foi já descrito que o uso recreativo de MDMA é normalmente precedido pelo consumo de etanol, nicotina, Cannabis, e anfetamina, por esta ordem 602. A utilização de várias drogas de abuso pode dever-se também a uma tolerância farmacodinâmica apresentada por vários consumidores após o consumo regular de MDMA, que alegam notar uma diminuição dos seus efeitos agudos após uso continuado, o que aumenta a propensão para a utilização de outras substâncias psicoactivas ou cocktails de drogas para obter experiências agradáveis 73, 603, 604. Algumas drogas de abuso podem também afectar os efeitos da MDMA por alterarem a expressão das isoenzimas do CYP450 398. Comparado com outros policonsumidores de drogas, aqueles policonsumidores que incluem MDMA na sua lista de consumos apresentam dificuldade em adaptar-se a novos ambientes, em processar memórias recentes, e em processos de julgamento social e emocional 605. Foi também já descrito um caso de síndrome amnésica e ataxia severa após consumo concomitante de MDMA, nitrato de amilo, LSD, Cannabis e álcool 606. Embora os consumidores de ecstasy demonstrem níveis elevados de sintomas psicológicos e de disfunção executiva, estes sintomas não estão, normalmente, estatisticamente associados com o consumo de ecstasy, mas sim com o policonsumo de drogas que lhe está associado (álcool, Cannabis, opióides e inalantes, etc) 312. Drogas como a heroína parecem também potenciar a toxicidade da MDMA, embora o mecanismo subjacente a este facto permaneça por esclarecer 607. O uso simultâneo de múltiplas drogas estimulantes não só aumenta o risco de problemas relacionados com a sobre-estimulação simpaticomimética com aumento da propensão para desidratação, hipertermia 296, 608 e complicações cardiovasculares 182, mas pode também aumentar a neurotoxicidade 266.

125 Introdução ______

1.9.5.4.1. Derivados da Cannabis

A maioria dos consumidores de ecstasy (90-98%) também consome Cannabis 609. Tal como acontece com o etanol, o primeiro contacto com a Cannabis é geralmente mais precoce do que o primeiro contacto com a MDMA 355. De facto, grande parte dos co-consumidores de ecstasy e Cannabis usou derivados da Cannabis, mais ou menos regularmente, antes de iniciar o consumo de MDMA e continua a consumir estes produtos em paralelo com o 332, 334, 610 uso de MDMA . A Cannabis é sobretudo usada para ultrapassar os efeitos desagradáveis que aparecem quando a euforia inicial provocada pela MDMA se dissipa 611. O principal componente psicoactivo da Cannabis e seus derivados, o Δ9- tetraidrocanabinol (THC), é um agonista directo dos receptores canabinóides CB1 endógenos, afectando o apetite, a regulação da dor e as funções vegetativa e motora. O consumo regular de Cannabis e derivados é um factor de risco conhecido para o desenvolvimento de patologias neuropsiquiátricas (depressão, psicose e desmotivação) e défices de atenção e memória que persistem após o desaparecimento dos efeitos agudos da droga e que podem normalizar após semanas de abstinência 612. A Cannabis também contribui para problemas psicológicos, deficiências cognitivas e outros poblemas neuropsicobiológicos (perturbações do sono, disfunção sexual, imunocompetência reduzida e aumento do stress oxidativo) em utilizadores de MDMA 613. Em termos crónicos, ambas as drogas são lesivas, pelo que os policonsumidores normalmente exibem défices neurobiológicos cumulativos. 609. De facto, em humanos, o uso prolongado de MDMA e Cannabis está associado com uma variedade de efeitos psicológicos, incluindo aumento da impulsividade, ansiedade, queixas somáticas, padrões obsessivo-compulsivos e comportamento psicótico. Défices neurocognitivos (memória, aprendizagem, fluência verbal, velocidade de processamento e destreza manual) em várias áreas cerebrais (hipocampo, lobo frontal) foram reportados em utilizadores desta associação 614. Contudo, este assunto

126 ______Introdução permanece controverso, uma vez que enquanto uns grupos defendem que o principal responsável dos défices cognitivos associados ao consumo desta mistura é a MDMA 615, outros grupos refutam esta hipótese e argumentam que os défices cognitivos estão mais relacionados com o consumo de Cannabis do que de MDMA 612. Algum do défice cognitivo atribuído à MDMA parece ser devido ao consumo de THC 614, 616 bem como as queixas de sintomas neurobiológicos 617. Ambas as drogas prejudicam a memória quando administradas isoladamente, embora a deterioração devida à MDMA seja inferior à causada pelo THC. Quando co-administradas, as drogas causam uma deterioração sinérgica da memória de trabalho em ratos que se traduz numa fraca capacidade de execução dos ratos no teste comportamental Y-maze 618. Num estudo feito em ratinhos, a administração combinada de doses baixas de MDMA (3 mg/kg) e THC (0,3 mg/kg) produziu “preferência de lugar condicionada”, enquanto que a combinação de MDMA (10 mg/kg) com THC (0,3 mg/kg) decresceu significantemente essa preferência. A administração de doses baixas de THC aumentou significantemente os níveis de DA no nucleus accumbens, enquanto que uma dose baixa de MDMA não o fez. Quando a MDMA é administrada antes do THC, os níveis de DA aumentam relativamente ao efeito do THC isolado. Estes resultados mostram que uma dose baixa de THC modifica a sensibilidade dos animais aos efeitos comportamentais da MDMA e que o THC e a MDMA convergem para um mecanismo comum que modula o fluxo de DA no nucleus accumbens de ratinho 619. Alguns estudos in vitro demonstraram neurotoxicidade associada a concentrações elevadas de THC 620 contudo, a evidência de neurotoxicidade em humanos nunca foi convincente 612. Em contraponto, vários estudos atribuíram aos canabinóides propriedades antioxidantes, antiexcitotóxicas e anti-inflamatórias a nível celular, bem como neuroprotecção numa variedade de modelos de dano neuronal, quer in vitro, quer in vivo 621. Para além disso, um estudo realizado em ratos demonstrou que quer o THC quer um agonista sintético dos receptores canabinóides preveniram a hipertermia induzida pela MDMA e diminuiram a depleção de 5-HT induzida pelo consumo prolongado de MDMA em várias regiões do cérebro, bloqueando parcialmente a neurotoxicidade induzida pela MDMA em animais de laboratório 621, possivelmente através das propriedades antioxidantes do THC 612. Também foi

127 Introdução ______já demonstrado que o THC previne completamente a agressão oxidativa da MDMA, num efeito não inibido por um antagonista específico dos receptores CB1 (o AM251) 55. Este resultado aponta para propriedades antioxidantes inespecíficas do THC e não para uma interacção específica com os receptores CB1. Devido a estas propriedades, o THC parece proteger dos efeitos deletérios provocados pela oxidação da DA libertada em excesso devido ao consumo de MDMA 55. O consumo moderado de Cannabis parece, assim, melhorar ou mascarar a agressividade e os sintomas somáticos induzidos pela MDMA. Contudo, o consumo destes compostos em grandes doses está associado a vários problemas psicobiológicos que podem aparecer após um período de abstinência das duas substâncias 600. Assim, embora os efeitos agudos da Cannabis possam ser deletérios, aparentemente os efeitos prolongados da Cannabis podem proporcionar neuroprotecção contra os efeitos da MDMA e anfetaminas, uma vez que a Cannabis tem propriedades relaxantes e hipotérmicas 613. A sua co-utilização pode reflectir efeitos opostos em 3 áreas psicobiológicas: atenção, temperatura corporal e stress oxidativo. Primeiro, a MDMA aumenta o estado de alerta enquanto a Cannabis é sedante. Em segundo lugar, a MDMA causa hipertermia enquanto a Cannabis causa hipotermia. Terceiro, a MDMA aumenta o stress oxidativo, enquanto a Cannabis é antioxidante. Assim, a Cannabis pode modular as reacções agudas e sub-agudas da MDMA, reduzir a hipertermia e o stress oxidativo. Os consumidores habituais de MDMA utilizam as propriedades relaxantes da Cannabis e derivados para reduzir os sintomas típicos de anedonia (incapacidade de sentir prazer em situações normalmente prazenteiras) e depressão, que surgem nos dias após o consumo de ecstasy 622, 623. No entanto, a utlização de Cannabis pode provocar várias alterações neurovasculares que podem resultar em eventos isquémicos que poderão agravar a neurotoxicidade induzida pela MDMA 184. As alterações endócrinas encontradas em utilizadores de MDMA parecem também relacionadas com o co-consumo de Cannabis 611. O consumo de MDMA com Cannabis provoca um decréscimo significativo na IL-2 e um aumento no TGF-β1 (Transforming Growth Factor) anti-inflamatório, juntamente com uma diminuição no número total de linfócitos

128 ______Introdução

(CD4+ e NK). Foi também observada uma maior frequência de infecções ligeiras no grupo de consumidores regulares, quando comparados com os consumidores ocasionais. Estas alterações, a longo prazo, da homeostase imunológica pode resultar numa deterioração do estado de saúde geral e uma maior susceptibilidade a infecções e a doenças do foro imunológico 624. Apesar destes dados, a contribuição da utilização de Cannabis para os efeitos prolongados da MDMA permanece inconsistente 612. Resumindo, existem interacções importantes e complexas entre a MDMA e a Cannabis no que diz respeito à actividade cerebral, psicopatologia e aprendizagem 612 que se estendem também aos sistemas endócrino e imunológico. Neste contexto de policonsumo é preciso ter ainda em consideração a teoria “portal de entrada” ou “oportunidade de exposição” que sugere que a utilização de Cannabis leva ao consumo de outras drogas 625, 626 e que complica ainda mais as possibilidades de interacções com a MDMA. De facto, foi já demonstrado que as mulheres consumidoras de Cannabis têm mais predisposição para utilizarem outras drogas, uma vez que a Cannabis pode ser um ponto de partida para mulheres que estejam interessadas em experimentar drogas de abuso, uma vez que é mais facilmente obtida e mais aceite socialmente 334. As interacções farmacocinéticas entre a MDMA e a Cannabis são ainda possíveis por partilha de algumas vias metabólicas, uma vez que o componente activo da Cannabis e seus derivados (THC) é metabolizado pela CYP3A4 e pela CYP2C9 627.

1.9.5.4.2. Estimulantes anfetamínicos

Os estimulantes anfetamínicos também são neurotóxicos para as vias serotonérgicas e dopaminérgicas, num mecanismo semelhante ao da MDMA Estes estimulantes mostraram ser neurotóxicos em estudos com animais 250 e possivelmente em humanos 612. A MDMA e a MTA têm acções semelhantes no cérebro, aumentando os níveis das monaminas neurotransmissoras DA, NA e 5-HT. A principal

129 Introdução ______diferença é que a MDMA inibe sobretudo a recaptação e estimula a libertação da 5-HT, enquanto a MTA inibe sobretudo a recaptação e estimula a libertação da DA. Ambas as anfetaminas aumentam ainda os níveis destes neurotransmissores por inibirem as enzimas responsáveis pela sua metabolização e através da expulsão das monoaminas das vesículas sinápticas. Esta libertação massiva de monoaminas vai levar a um défice temporário nas suas reservas que podem necessitar de alguns dias para serem repostas 133. Estes estimulantes também se ligam aos transportadores pré-sinápticos das monoaminas, induzem a libertação aguda e inibem a recaptação de DA e 5-HT. Podem, assim, exercer efeitos tóxicos sinérgicos com a MDMA, e prolongar os seus efeitos deletérios de longa duração 612. Apesar das alterações das funções cerebrais dos utilizadores serem de longa duração, a literatura sobre as sequelas psicopatológicas de longa duração que resultam do uso de estimulantes é inconclusiva 612. O consumo repetido e/ou de grandes quantidades de anfetamina ou MTA induzem uma degeneração generalizada dos axónios pré-sinápticos serotonérgicos e dopaminérgicos levando a uma depleção de 5-HT e DA e a uma diminuição da densidade dos seus transportadores (SERT e DAT) no tecido cerebral 250, 628, 629. Consequentemente, os utilizadores crónicos de estimulantes demonstraram défices na memória de curto prazo, controlo executivo frontal e capacidades de planificação 612. Assim, o co-consumo de MDMA e outros estimulantes anfetamínicos pode aumentar a neurotoxicidade serotonérgica e os efeitos tóxicos para o sistema dopaminérgico induzidos pela MDMA 612. Ambas as substâncias MDMA e MTA provocam fenómenos de neurotoxicidade que, muito provavelmente, são causados pela formação de ROS e RNS formados devido ao metabolismo das monoaminas libertadas em excesso, ou em resposta ao esgotamento das fontes de energia. Uma vez que ambas provocam este efeito, combinar as duas substâncias pode produzir um padrão mais amplo de depleção de NA e 5-HT do que o observado quando doses equivalentes são administradas separadamente. As anfetaminas podem ainda interferir nos efeitos da MDMA, uma vez que um grande número destes compostos são substractos do transportador vesicular das monoaminas tipo 2 (VMAT2),

130 ______Introdução depletando os neurotransmissores vesiculares por um mecanismo mais relacionado com uma troca mediada pelo transportador do que devido às suas propriedades de bases fracas 630. Estes factos sugerem que a ingestão simultânea de MDMA e MTA pode ser particularmente perigosa 133. Uma vez que, quer a MDMA, quer a MTA têm sido individualmente associadas a efeitos adversos neuronais e comportamentais a longo prazo, é concebível que a combinação das duas substâncias, intencional ou inadvertida, possa ser particularmente perigosa 133. De facto, a combinação de MDMA e MTA em ratos tem tendência também a produzir uma maior variedade e intensidade de défices comportamentais (ansiedade social, crises de ansiedade e sintomas depressivos) que a exposição individual 133. A auto-administração de ambas as substâncias por animais de laboratório é aumentada em condições de temperatura ambiente elevada, o que pode explicar o elevado consumo destas substâncias em ambientes quentes e sobrelotados 133. Uma vez que a temperatura ambiente influencia largamente os efeitos tóxicos da MDMA, este maior consumo em altas temperaturas é extremamente preocupante. A depleção de 5-HT induzida pela MDMA pode inicialmente atrasar a aquisição de auto-administração de anfetamina, no entanto, a pré-exposição à MDMA pode também sensibilizar os animais para os efeitos locomotores e para o efeito da MDMA na inicialização de comportamentos de procura de droga, aumentando a probabilidade de uma reinstalação da auto-administração de anfetamina após um período de abstinência 631. Surpreendentemente, apesar das combinações de MDMA com MTA (intencionais ou não-intencionais devido à pureza das pastilhas) serem elevadas entre os utilizadores, uma pesquisa recente sugere que a administração combinada de MDMA diminui o efeito de reforço positivo da MTA em ratos testados no paradigma de auto-administração 632. Tal como a MDMA, a anfetamina induz hipertermia dependente da temperatura ambiente 633, embora a afinidade destas drogas para os diferentes transportadores das monoaminas apresente algumas diferenças 634. De facto, estudos prévios destacaram algumas diferenças nos efeitos ao nível do sistema termorregulador da MDMA e da anfetamina ou seus derivados 635. Por isso, outra interacção que será de esperar é ao nível da resposta hipertérmica

131 Introdução ______induzida por ambas as substâncias que, quando administradas em conjunto, deverão causar um efeito sinérgico a este nível. Foram já descritas intoxicações fatais associadas ao consumo simultâneo de MDMA, anfetamina, MDA e PMA que se caracterizaram por um quadro de coagulação intra-vascular disseminada induzida por hipertermia 282. A pré-exposição a MDA tem ainda a capacidade de inibir o metabolismo da MDMA, aumentando as suas concentrações a nível cerebral 533.

1.9.5.4.3. Cocaína

A cocaína é frequentemente consumida com a MDMA para aumentar os efeitos psicoestimulantes da MDMA 636. Esta droga aumenta os níveis sinápticos de DA, 5-HT e NA por se ligar aos transportadores destes neurotransmissores e inibir a sua recaptação para os terminais pré-sinápticos 636. A pré-exposição repetida de ratos adultos à MDMA mostrou aumentar a actividade motora induzida pela cocaína e promover a subsequente aquisição do comportamento de auto-administração de cocaína, o que demonstra os efeitos cruzados destas duas substâncias 637. Por outro lado, a administração simultânea de MDMA e cocaína resultou num antagonismo da “preferência de lugar condicionada” de cada uma das substâncias. No entanto, este efeito parece ser reversível em doses elevadas dos compostos em causa 638. Foram já descritas diferenças nos perfis de sensibilização psicoestimulante relacionados com a idade, quer para a cocaína, quer para as anfetaminas 406, 639. Apesar dos ratos adolescentes mostrarem um aumento no reforço condicionado da cocaína após tratamento com MDMA 408, 640, um estudo recente sugere que eles são menos vulneráveis à sensibilização induzida pela MDMA quando administrada numa dose alta e num curto intervalo de tempo 640. A toxicidade dopaminérgica induzida pela MDMA em ratinhos pode ser afectada pela co-administração de cocaína 636. Por outro lado, a administração repetida de MDMA a ratos aumenta a libertação de DA no nucleus accumbens

132 ______Introdução induzida pela cocaína. Este facto sugere que a MDMA pode alterar a vulnerabilidade para desenvolver dependência e abuso da cocaína 641. Estudos sugerem que a neurotoxicidade da MDMA requer um sistema serotonérgico 141 e dopaminérgico intacto e que a extensão da toxicidade pode aumentar se os níveis de dopamina estão aumentados 228. Este aumento nos niveis extracelulares de DA pode verificar-se após utilização de cocaína, pelo que este estimulante pode constituir uma ameaça dupla de complicações fisiológicas e neurotoxicológicas 266. A cocaína é inibidora da recaptação da 5-HT e comprovadamente inibidora do metabolismo da MDMA in vitro 422, podendo aumentar substancialmente as concentrações de MDMA in vivo, sobretudo se consumida em conjunto com outras substâncias que sejam potentes inibidores da CYP2D6. A cocaína pode ter efeitos semelhantes aos induzidos pela fluoxetina e paroxetina no que respeita às interacções com a MDMA 422. O abuso de cocaína foi já associado ao aparecimento de acidentes cerebrovasculares isquémicos e hemorrágicos, atrofia cerebral em caso de abuso crónico, e a um aumento da incidência de malformações congénitas 184 daí que possa agravar as propriedades neurotóxicas e teratogénicas da MDMA. Tal como a MDMA, a cocaína induz hipertermia dependente da temperatura ambiente 642, 643, embora a afinidade destas duas substâncias para os diferentes transportadores das monoaminas não seja comparável, quer em humanos quer em roedores 634.

1.9.5.4.4. LSD

A LSD (dietilamida do ácido d-lisérgico) foi sintetizada por primeira vez em 1938 pela indústria farmacêutica Sandoz (Suiça) a partir do ácido lisérgico que existe naturalmente num fungo (Claviceps pupurea) que cresce nos grãos de trigo e centeio, na procura de um agente com actividade oxitócica. No entanto, como apresentava propriedades oxitócicas inferiores a outros compostos, a sua síntese foi abandonada. As suas

133 Introdução ______propriedades alucinogénicas foram descobertas pelo mesmo cientista que a sintetizou pela primeira vez, devido a uma ingestão acidental. A LSD consegue provocar alterações 644 comportamentais com dosagens de 25-50 ng . A co-administração da LSD com MDMA tem vindo a aumentar e a combinação do consumo destas duas substâncias recebe o nome de candyflipping ou XL. Várias páginas web referem que o uso simultâneo leva a um aumento dos efeitos centrais destas substâncias. E, de facto, foi verificado que em ratos Fawn- Hooded machos (uma estirpe com deficiência cerebral em 5-HT) a co- administração de LSD (0,04 mg/kg i.p.) e MDMA (0,15 mg/kg i.p.) resultou num sinergismo que originou uma resposta máxima do tipo da verificada para a MDMA numa dose de 1,5 mg/kg (i.p.). Este sinergismo ocorre provavelmente por um mecanismo que envolve os neurónios serotonérgicos centrais 645.

Aparentemente a LSD é agonista dos receptores pós-sinápticos 5-HT2 e

é antagonista parcial dos receptores pré-sinápticos 5-HT1A e 5-HT1B, tendo já mostrado também actividade em receptores 5-HT clonados. Teoricamente, a LSD produz libertação de glutamato nos terminais tálamo-corticais, produzindo uma dissociação entre os centros sensoriais e a capacidade cortical devido a uma modulação dos processos sensoriais, perceptivos, afectivos e cognitivos mediados pelos receptores NMDA. Contudo, desconhece-se de que forma é que o agonismo nos receptores 5-HT2C contribui para as alterações comportamentais 644. Assim, a combinação do aumento dos níveis de 5-HT sinápticos, capazes de actuar em todos os receptores envolvidos nas propriedades estimulantes da LSD e da MDMA parece ser o mecanismo subjacente à acção sinérgica destas duas substâncias 645. Uma vez que os efeitos tóxicos agudos deste composto também englobam sinais cardiovasculares (taquicardia, hipertensão), rabdomiólise e falência renal estes podem agravar a resposta tóxica da MDMA 644. A LSD é metabolizada a compostos inactivos (N-desmetil-LSD, hidroxi- LSD, 2-oxo-LSD, e 2-oxo-3-hidroxi-LSD) não tendo sido descrito metabolismo via CYP450, daí que não será de esperar que ocorram interacções farmacocinéticas com a MDMA.

134 ______Introdução

No entanto, a LSD parece induzir tolerância cruzada à mescalina, pelo que se pode esperar que o mesmo ocorra relativamente à MDMA, uma vez que é estruturalmente semelhante.

1.9.5.4.5. Ketamina

O uso recreativo da ketamina foi reportado pela primeira vez em 1971 na América do Norte e apareceu no Reino Unido nos anos 90 associado à cultura dance gay 423. Em termos recreacionais, a ketamina é frequentemente consumida por via nasal na forma de pó (100-400 mg por dose) (conhecida como K, Super K, Special K, Vitamina K, Green, Mean Green, kit-kat, keets, super acid, cat valiums e Jet), mas é também comercializada para ser fumada ou na forma de spray nasal ou de líquido, pó ou cápsulas para ingestão (350- 500 mg por dose) 423. De acordo com o já referido no sub-capítulo 1.9.5.3.3., o consumo de ketamina pode ainda indirectamente afectar a toxicidade associada ao consumo de outras substâncias, incluindo a MDMA, devido ao facto de provocar amnésia, dificultando o controlo do número de doses consumidas durante a noite e aumentando a probabilidade de ocorrência de uma sobredosagem e intoxicação. O consumo simultâneo da ketamina com outras drogas de abuso deve ser cuidadosamente considerado, uma vez que as mortes causadas pelo consumo de ketamina em Nova Iorque foram todas associadas ao consumo de múltiplas substâncias (sobretudo opióides e anfetaminas) e não ao consumo de ketamina per se 646. O risco de super-estimulação cardíaca é uma das consequências potencialmente fatais de combinar ketamina com estimulantes (ex.: anfetaminas, cocaína).

135 Introdução ______

1.9.5.4.6. GHB (“ecstasy líquido”)

O GHB (γ-hidroxibutirato, oxibato de sódio, G, ecstasy líquido, Grievous Bodily, harm, gib, sabão, scoop, nitro) é um potente agente hipnótico/sedativo derivado do neurotransmissor inibitório ácido γ-aminobutírico e tem a capacidade de atenuar os efeitos desagradáveis ou disfóricos da MDMA devido ao seu efeito no sistema dopaminérgico a nível central 647. O GHB é um pó que se dissolve em água e é vendido como droga recreativa 648 por 5 a 10 USD a dose. No início dos anos 90 era também vendido em lojas de alimentação saudável como suplemento para atletas e culturistas 648. A probabilidade de ocorrência de sobredosagem é elevada porque a concentração da solução é muitas vezes desconhecida (em 2000 eram já 60 as mortes provocadas por sobredosagem deste composto 14). O sabor desagradável da solução de GHB é muitas vezes mascarado com bebidas alcoólicas, o que aumenta a toxicidade do GHB, devido ao facto do etanol ser também um depressor central 14. Apesar de, em 2000, ter sido classificada como uma substância de Classe I devido ao elevado número de mortes e ao facto de ser considerada uma “droga de violação”, em 2002, o GHB, na forma de oxibato de sódio, passou a fazer parte da Classe III, sendo utilizado para o tratamento da narcolepsia e estando a ser estudada a sua utilização na cessação alcoólica 649, 650. O GHB produz euforia, progredindo em doses mais altas para tonturas, hiper-salivação, hipotonia, amnésia 14, sedação profunda, coma e mesmo morte que surge, habitualmente, devido a depressão do sistema respiratório 651. Interacções metabólicas com a MDMA parecem pouco prováveis, uma vez que os dois compostos não partilham vias metabólicas.

136 ______Introdução

1.9.5.4.7. Outras substâncias alucinogénicas – Cogumelos “mágicos”

Alguns cogumelos possuem propriedades alucinogénicas devido ao seu conteúdo em psilocibina. No entanto, alguns autores defendem que a psilocibina não é o componente activo destes cogumelos, mas sim que ela é convertida no seu metabolito activo psilocina por hidrólise do grupo fosfato, quimicamente (pH ácido) ou numa reacção catalizada por fosfatases. A psilocibina sofre, assim, um forte efeito de primeira passagem a nível hepático e a sua principal via de eliminação é a eliminação urinária do seu conjugado com o ácido glucurónico 652. As reacções mais comuns após ingestão oral incluem relaxamento muscular, arrefecimento dos braços e abdómen, dilatação das pupilas. À medida que o efeito fica mais forte podem aparecer alterações de humor. Se a dose for suficientemtente elevada, os efeitos podem incluir distorções visuais e auditivas e alucinações. A psilocibina/psilocina interage sobretudo com os receptores da 5-HT (5-

HT1A, 5-HT1D, 5-HT2A e 5-HT2C). Liga-se com grande afinidade aos receptores

5-HT2A pré-sinápticos e, em menor extensão aos 5-HT1A. A psilocibina e o seu metabolito activo, psilocina, não apresentam afinidade para os receptores D2 da dopamina, mas levam à sua activação através de uma acção simpaticomimética com aumento de libertação de neurotransmissores para a fenda sináptica (ao contrário do que acontece com a LSD) 652. Devido ao seu mecanismo de acção, a psilocibina/psilocina tem um forte potencial de interacção com a MDMA.

1.9.5.5. Tabaco

O tabaco é preparado através do processamento de folhas das plantas do género Nicotiniana. O tabaco tem a capacidade de induzir significativamente, e independentemente do sexo do indivíduo, algumas

137 Introdução ______isoenzimas do sistema CYP450 como a CYP1A2 398 e a CYP2E1 e, ainda, a uridina difosfato glucuronosiltransferase, resultando esta última indução numa mais rápida glucuronidação de algumas substâncias 653. Estas propriedades indutoras do tabaco eram inicialmente atribuídas aos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (ex.: benzo[a]pireno) e outros produtos de combustão. No entanto, a nicotina per se parece induzir in vivo a CYP2E1 e inibir in vitro a CYP2A6, principal enzima envolvida no metabolismo da nicotina a cotinina 653. Outras enzimas envolvidas no metabolismo da nicotina são a CYP2B6 e a CYP2E1 653. O mecanismo de acção da nicotina passa pela sua ligação aos receptores nicotínicos que levam à libertação de DA, NA, acetilcolina, 5-HT, GABA, glutamato e endorfinas 653, o que pode estar na base de interacções farmacodinâmicas

que potenciem os efeitos da MDMA. Devido ao papel importante dos receptores nicotínicos contendo subunidades β2 na adição à nicotina 654 e devido à elevada afinidade da MDMA para receptores contendo essa subunidade, pode esperar-se que a MDMA module processos de adição e dependência à nicotina 55. O rápido desenvolvimento de tolerância aos efeitos da nicotina faz com que os utilizadores rapidamente aumentem as doses consumidas para manter o efeito desejado e evitar os sintomas de abstinência. Quanto maior a dose de nicotina a que o fumador se expõe, maiores serão, potencialmente, as possibilidades de interacção com a MDMA. O problema desta interacção é uma questão importante, uma vez que os consumidores de ecstasy apresentam uma maior prevalência de fumadores (quando comparados com consumidores de Cannabis, ou não consumidores de drogas) e têm um início do consumo de tabaco mais precoce que se situa, em termos médios, nos 14,3 anos de idade 354.

138 ______Introdução

1.9.5.6. Etanol

Uma das substâncias mais fequentemente consumidas com a MDMA é o etanol (EtOH) (65% dos consumidores habituais de ecstasy consomem simultaneamente etanol 314), uma vez que é facilmente acessível e legal na maioria dos países 331, 332 e o seu consumo é encorajado por fortes medidas publicitárias empreendidas por produtores e distribuidores nos ambientes onde habitualmente se consome ecstasy (discotecas, nightclubs, afterhours, etc). Embora os dados disponíveis sobre o consumo combinado de drogas e de álcool continuem a ser limitados, o consumo de álcool, muitas vezes em quantidades consideradas perigosas para a saúde e em combinação com drogas estimulantes, constitui um motivo de preocupação crescente 20. Dos consumidores de ecstasy que bebem EtOH, uma grande parte fá-lo num padrão agudo chamado binge drinking (ex.: 69% dos utilizadores de MDMA que co-consomem EtOH referiram consumir mais de 5 bebidas por episódio 314). A utilização de EtOH sob a influência de drogas estimulantes leva a que se consumam maiores quantidades de etanol sem que se sintam efeitos imediatos. Contudo, apesar da ausência de efeitos, os riscos fisiológicos e comportamentais associados a este consumo podem ainda verificar-se 314. O consumo quer de MDMA quer de EtOH foi já associado a uma elevada prevalência de comportamentos de risco como consumo de doses excessivas de ambas as substâncias, promiscuidade sexual sem medidas de protecção 303, condução sob a influência de drogas e viajar com condutores embriagados 314. São bem conhecidos episódios de comportamento violento muitas vezes relacionados com o consumo de álcool 655, bem como uma maior prevalência de acidentes e lesões entre aqueles que consomem EtOH em maior quantidade (binge drinkers) 314. Estes comportamentos de risco são agravados quando ambas as substâncias são consumidas simultaneamente. O EtOH parece contribuir numa maior proporção para comportamentos sexuais de risco do que qualquer outra substância 656. Entre outras consequências, o aumento de práticas sexuais perigosas quando o EtOH é

139 Introdução ______consumido com ecstasy resulta no aumento da disseminação de doenças sexualmente transmissíveis 314. Normalmente, o primeiro contacto com o álcool ocorre antes do início do consumo de ecstasy 657, sendo a idade média de início do consumo de EtOH de 14,5 anos 303, 336, 355. Este facto pode levar à ocorrência de fenómenos de tolerância ao EtOH antes do primeiro contacto com a MDMA que podem estar na base de consumos de quantidades ainda maiores de bebidas alcoólicas, bem como de susceptibilidades aumentadas do organismo aos efeitos deletérios da MDMA. É importante também referir que dentro de uma mesma população de estudo, aqueles que consomem ecstasy tiveram um primeiro contacto com álcool mais precoce (14,8 anos) do que os não-consumidores de MDMA (16,5 anos) 354 e que o uso precoce de EtOH está associado com um uso precoce de cocaína, psilocibina, LSD e MDMA, sugerindo o seu potencial para funcionar como droga “de entrada” 336. Foi já descrito que as interacções dos estimulantes anfetamínicos com o EtOH levam a interacções farmacodinâmicas relevantes e a ligeiras interacções farmacocinéticas 23. Por este motivo, torna-se importante analisar as principais características farmacocinéticas e farmacodinâmicas do etanol para se poder inferir acerca do seu potencial para interagir com a MDMA, o que corresponde ao objectivo da presente dissertação.

1.9.5.6.1. Características farmacocinéticas do etanol

1.9.5.6.1.1. Absorção

Em jejum, o álcool ingerido é absorvido maioritariamente no duodeno e jejuno devido à rápida passagem pelo estômago vazio e à elevada superfície de absorção que existe nesta zona pela presença de microvilosidades nas células da mucosa. Nestas condições, o tempo para alcançar a concentração plasmática máxima varia entre os 30 e os 90 minutos. Os alimentos sólidos e as bebidas hipertónicas atrasam o esvaziamento gástrico. Nestas condições, uma quantidade considerável de álcool pode ser absorvido no estômago (até 70% do álcool ingerido) e a concentração plasmática máxima pode ser atingida

140 ______Introdução com um atraso de 4 a 5 horas 658. Esta absorção mais lenta confere maior relevância ao efeito de primeira passagem, uma vez que o atraso no esvaziamento gástrico provocado pela presença de alimentos faz com que exista menos EtOH no duodeno e jejuno, a acção da álcool desidrogenase (ADH) gástrica seja mais efectiva, menos EtOH atinja o fígado (uma vez que o sangue drenado do tracto GI é encaminhado ao fígado através do sistema porta, sendo depois enviado ao coração e finalmente à circulação sistémica), resultando numa menor passagem de álcool para a corrente sanguínea. Para doses de álcool baixas ou moderadas, o fenómeno de primeira passagem é o principal factor responsável por uma maior ou menor quantidade e rapidez com que o álcool atinge a circulação sistémica e o cérebro 659. Assim, a concentração plasmática máxima e o tempo necessário para atingi-la variam amplamente entre indivíduos e dependem de vários factores: a quantidade de EtOH consumido, a velocidade do consumo, o tipo de bebida (cerveja, vinho, bebidas espirituosas, cocktails) e, sobretudo a velocidade de esvaziamento gástrico 658. Quando a ingestão de álcool é feita muito rapidamente e em grande quantidade, os níveis cerebrais de EtOH aumentam rapidamente, activando o reflexo fisiológico do vómito 658.

1.9.5.6.1.2. Distribuição

O EtOH distribui-se na água total, o que faz com que, em situação de equilíbrio (que se atinge até às 2 horas após o consumo), as concentrações de EtOH a nível extra- e intra-celular sejam aproximadamente iguais. Contudo, este equilíbrio atinge-se mais rapidamente nos órgãos com maior vascularização (ex.: cérebro, fígado, pulmões e rins). O volume de distribuição do EtOH é influenciado pela percentagem de água e de gordura corporal. Apesar da percentagem de água corporal ser relativamente constante nos humanos (67 a 77%) existem situações que podem modificá-lo como: a fase do ciclo menstrual, a gravidez, edemas ou ascites. A gordura corporal apresenta uma grande variabilidade interindividual (5 a 50%), por exemplo entre os géneros, com uma maior percentagem nas mulheres do que nos homens 659. Por estas razões, indivíduos mais corpulentos ou com maior quantidade de

141 Introdução ______

água corporal, vão apresentar concentrações sanguíneas de EtOH inferiores aos indivíduos mais magros (que consumiram a mesma dose de EtOH no mesmo intervalo de tempo) porque nestes o EtOH ingerido se distribui num menor volume. O volume aparente de distribuição é aproximadamente de 30 L / 70 kg 660. A taxa de ligação às proteínas plasmáticas é nula 658.

1.9.5.6.1.3. Metabolismo

Em condições fisiológicas, aproximadamente 90% do álcool ingerido é metabolizado pela ADH (Km para o etanol de 2 a 5 mg/dL) a acetaldeído, acompanhado da redução do NAD+ a NADH 658 (Figura 8). A ADH é uma enzima citosólica presente em vários tecidos como o fígado (onde existem os níveis mais elevados) o rim, o pulmão e a mucosa gástrica. A ADH humana é uma proteína dimérica constituída por 2 subunidades que podem ser do tipo α, β, γ, π, χ, ou de um sexto tipo conhecido por σ or µ. Conhecem-se mais de 20 isoenzimas ADH que diferem nas suas propriedades farmacocinéticas e estão agrupadas em 5 classes diferentes 661. Para o metabolismo do EtOH e de outros álcoois alifáticos de cadeia curta as isoenzimas mais importantes pertencem à classe I que engloba as isoenzimas ADH1, ADH2 e ADH3 formadas pela associação aleatória das subunidades α, β e γ, respectivamente. Estas isoenzimas da classe I da ADH estão expressas em grande quantidade no fígado e glândulas supra-renais, e em baixa quantidade no rim, pulmão, vasos sanguíneos (no caso da ADH2) e noutros tecidos, mas não no cérebro 662. O metabolismo do EtOH dependente da ADH ocorre principalmente no fígado e é menos importante na mucosa gástrica (onde predomina a classe IV da ADH) 658. No entanto, a ADH3 presente no fígado e no estômago tem um papel pouco relevante na metabolização do EtOH quando este se encontra em concentrações inferiores a 50 mM no fígado, mas pode ter um papel importante no efeito de primeira passagem do EtOH a nível gástrico, onde o EtOH pode atingir concentrações molares 661.

142 ______Introdução

Figura 8. Metabolismo oxidativo do etanol. As enzimas álcool desidrogenase (ADH), citocromo P450 2E1 (CYP2E1), e catalase contribuem para o metabolismo oxidativo do álcool. A ADH, presente no citosol, transforma o etanol em acetaldeído. Esta reacção envolve um intermediário portador de electrões, dinucleótido nicotinamida adenina (NAD+), que é reduzida por dois electrões para formar NADH. A catalase, localizada nos peroxissomas requer peróxido de hidrogénio para oxidar o etanol. A CYP2E1, presente predominantemente nos microssomas, assume um papel importante na metabolização do etanol a acetaldeído quando o etanol está presente em concnetrações elevadas. O acetaldeído é metabolizado, sobretudo, pela aldeído desidrogenase 2 (ALDH2) na mitocôndria para formar acetato e NADH. ROS, espécies reactivas de oxigénio. RNS, espécies reactivas de azoto. Adaptado de Klaassen C.D., “Casarett & Doull's Toxicology: The Basic Science of Poisons”, McGraw-Hill, 2001 e de Zakhari S., “Overview: how is alcohol metabolized by the body?”, Alcohol Research & Health (2006) 29:245-54.

Os restantes 10% do metabolismo do álcool dependem de enzimas do CYP450 e da catalase, podendo ocorrer no fígado (onde as enzimas do CYP450 constituem o sistema microssomal de oxidação do etanol MEOS, Microsomal Ethanol Oxidising System), mas também em tecidos extra- hepáticos que não contêm ADH, como o cérebro. O sistema microssomal hepático MEOS, converte o EtOH em acetaldeído, acompanhado da conversão + 663 de NADPH em NADP e de O2 em água . Esta via metabólica adquire especial importância em situações de ingestão excessiva de álcool. A isoenzima do CYP450 maioritariamente implicada é a CYP2E1 (com Km para o etanol de 60 a 80 mg/dL, superior ao da ADH) 398, embora outras também possam contribuir para o metabolismo do álcool, como a CYP1A2 e CYP3A4 659 658, 664. Para além disso, a actividade da CYP2E1 aumenta após uma exposição continuada a grandes doses de EtOH 665 devido a uma rápida

143 Introdução ______síntese de novo da enzima que leva ao desenvolvimento de tolerância metabólica provocada por um aumento de 2 ou 3 vezes da taxa de eliminação do EtOH da corrente sanguínea 658, 666. A existência deste sistema enzimático e a sua capacidade de ser induzido, bem como a indução cruzada de outras enzimas microssomais, pode explicar os fenómenos de tolerância metabólica ao álcool pelos alcoólicos e a tolerância a muitos fármacos, mas também a particular susceptibilidade dos alcoólicos aos efeitos adversos de solventes industriais, anestésicos, fármacos de uso corrente, analgésicos não sujeitos a receita médica, agentes hepatotóxicos, carcinogénios e mesmo factores nutricionais como a vitamina A 658, 667, 668, uma vez que aumenta a bioactivação de numerosos xenobióticos com formação dos respectivos metabolitos tóxicos 669. Esta indução enzimática leva a um maior gasto energético e a um aumento na produção de acetaldeído 667 que é altamente tóxico para o organismo, mesmo em baixas concentrações 670. Outra enzima, a catalase, localizada nos peroxissomas é capaz de oxidar o EtOH em presença de peróxido de hidrogénio. Esta é considerada uma via minoritária de oxidação do EtOH, excepto quando este é consumido em jejum. Este facto deve-se a que em jejum a manutenção das reservas energéticas do organismo é assegurada pela mobilização dos depósitos lipídicos e β-oxidação dos ácidos gordos, quando na forma de derivados acil- coenzima A. Os compostos acil-coenzima A de cadeia longa sofrem β-oxidação nos peroxissomas através de uma acil CoA oxidase que consome O2 e produz

H202, o que aumenta a preponderância da catalase no metabolismo do EtOH, 671 devido à maior quantidade de H2O2 formado . Por outro lado, o consumo crónico de EtOH demonstrou provocar um aumento na produção de H2O2 nas zonas centrilobulares do fígado e na actividade da catalase, em ratos 661. O acetaldeído, formado por uma ou outra via, desempenha um papel importante na expressão da toxicidade do EtOH 672, sendo depois metabolizado a ácido acético pela aldeído desidrogenase (ALDH) 659, localizada na mitocôndria, com formação de NADH que é depois utilizado como primeiro dador de electrões da cadeia transportadora de electrões mitocondrial 661. Quando produzido em excesso, por exemplo quando se ingere EtOH em grandes quantidades, o NADH leva a um aumento da produção do radical anião superóxido ao nível dos complexos I e III da mitocôndria, originando H2O2

144 ______Introdução e outras ROS e RNS, potencialmente lesivas para a mitocôndria e, em última instância, para a célula, se não forem eficazmente destoxificadas 673. A maioria do acetato é depois transportada pela corrente sanguínea a outras partes do organismo, onde vai fazer parte de ciclos metabólicos fisiológicos levando à produção de energia ou de moléculas úteis para a manutenção da homeostasia 670. O acetaldeído é um electrófilo que causa dano celular pela formação de aductos com proteínas, levando à produção de anticorpos contra esses aductos imunogénicos, inactivação enzimática, diminuição da reparação do DNA e alterações nos microtúbulos, membrana plasmática e mitocôndria com um marcado comprometimento da utilização de oxigénio. O acetaldeído causa, ainda, depleção de glutationa e peroxidação lipídica e estimula a síntese de colagénio a nível hepático, promovendo o desenvolvimento de fibrose 667. Variações genéticas nas enzimas envolvidas no metabolismo do EtOH (ADH, CYP2E1 e catalase) influenciam o consumo, a toxicidade e a dependência do álcool 661. O EtOH pode ainda sofrer, em quantidade mínima, metabolismo não oxidativo que pode ocorrer por 2 mecanismos distintos: (i) formação de etil ésteres de ácidos gordos por reacção do EtOH com ácidos gordos e (ii) formação de fosfatidil etanol num mecanismo que envolve a fosfolipase D 661. A expressão das vias não-oxidativas aumenta quando as vias de metabolização oxidativa do EtOH estão comprometidas 661. A indução do sistema MEOS está também associada a um aumento na produção de ROS e de peroxidação lipídica, bem como a uma diminuição da capacidade de protecção contra radicais livres, enzimática e não-enzimática 669, 674, 675. Este facto pode agravar as alterações do estado redox provocadas durante o metabolismo da MDMA, potenciando o risco de desenvolvimento de toxicidade resultante da co-exposição a EtOH e MDMA, sobretudo a nível hepático onde ocorre a maior parte do metabolismo destes dois compostos (Figura 9).

145 Introdução ______

Figura 9. Hipótese que sugere possíveis interacções metabólicas entre o EtOH e a MDMA baseada na influência do primeiro nas principais isoenzimas do CYP450 metabolizadoras deste derivado anfetamínico. As setas a cheio indicam as vias metabólicas principais e, destas, as mais largas indicam as vias metabólicas mais expressivas. As setas a tracejado indicam vias metabólicas menos expressivas. As setas rosa indicam as possibilidades de interacção metabólica entre o etanol e a MDMA. O sinal (-) traduz diminuição da actividade e o sinal (+) traduz aumento de actividade.

Além de ter a capacidade de induzir a isoforma CYP2E1, o EtOH também mostrou induzir a CYP3A em vários modelos experimentais 676 como culturas primárias de hepatócitos de rato 677, linhas celulares de hepatoma de rato 678 e ensaios in vivo em ratos 679. O EtOH apresenta, ainda, num sistema in vitro de CYP2D6 supersomes®, um efeito bifásico na actividade da CYP2D6, aumentando inicialmente a sua actividade (aumento em 175% relativamente ao controlo para uma concentração de EtOH de 1,1%) para depois inibir linearmente a actividade desta isoenzima 506. De facto, foi já descrito o aumento da actividade da CYP2D6, avaliada pela capacidade de O- desmetilação do DXM a dextrorfano através da determinação destes compostos no sangue, em consumidores crónicos de EtOH 680. Para além destas isoenzimas, em concentrações de 0,1% o EtOH inibe a CYP1A1, CYP2B6, e CYP2C19 em 20 a 30%, enquanto em concentrações de 1% não inibe CYP1A2, CYP3A4, CYP2C8, e CYP2C9 681. Em ratinhos, o EtOH leva a

146 ______Introdução um aumento dos níveis de MDMA no núcleo estriado e tem um efeito neuroprotector nesta área cerebral, evitando a depleção dopaminérgica e a diminuição da actividade da tirosina hidroxilase (enzima limitante da síntese da DA) induzidas pela MDMA 392. Aparentemente, em ensaios in vivo em ratos, este aumento da concentração plasmática da MDMA provocado pela exposição ao EtOH leva a uma diminuição de aproximadamente 16% na produção de MDA quando comparada com animais expostos unicamente à MDMA 682. Estudos clínicos em voluntários humanos demonstraram que as concentrações plasmáticas de MDMA aumentaram 13% quando se combinou uma dose de 100 mg de MDMA com 0,8 g/kg de EtOH 683 e um aumento de 7 e 8,7% quando doses de 75 e 100 mg de MDMA foram combinadas com álcool (concentração de álcool em sangue = 0,06 g/dL) 684, enquanto que as concentrações plasmáticas de EtOH diminuiram, indicando uma possível interacção farmacocinética 683. Devido à elevada taxa metabólica do EtOH, o seu efeito de primeira passagem assume um papel muito importante na expressão da sua toxicidade, uma vez que leva a uma diminuição dos níveis de EtOH capazes de atingir a circulação sistémica, diminuindo, assim, os seus efeitos a nível central. No entanto, o efeito de primeira passagem do álcool é extremamente variável: quando o EtOH é ingerido em pequenas quantidades ou depois de uma refeição, este fenómeno pode chegar a ser superior a 75%; para grandes doses de EtOH, este efeito pode descer até 10% ou menos. Outros factores que influenciam este efeito são o género, a etnia ou padrão de consumo de álcool. Por exemplo, as mulheres apresentam níveis mais baixos de ADH gástrica do que os homens, e o mesmo acontece nos indivíduos de raça oriental comparativamente aos caucasianos, ou nos alcoólicos relativamente aos não alcoólicos. Convém também recordar que a administração aguda de álcool pode resultar em inibição metabólica, enquanto que o seu consumo crónico pode induzir o metabolismo microssomal, afectando o efeito de primeira passagem. A maior parte deste efeito de primeira passagem ocorre nos hepatócitos, e apenas uma pequena parte ocorre na mucosa gástrica.

147 Introdução ______

1.9.5.6.1.4. Excreção

A taxa de eliminação do álcool apresenta uma grande variabilidade interindividual (70-150 mg/kg/h), mas é independente da dose (uma vez que obedece a uma cinética de ordem zero) e apresenta pouca variabilidade intra- individual 659. As variações inter-individuais na taxa de eliminação do álcool são influenciadas por factores como: consumo crónico de álcool, dieta, jejum ou não, idade, tabagismo, e momento do dia em que ocorre o consumo 661. O álcool não metabolizado pode ser eliminado pela urina, ar expirado ou suor numa percentagem que varia entre 2 e 10%, dependendo da quantidade ingerida, e uma fracção muito reduzida é conjugada com o ácido glucurónico 685. Praticamente a metade deste álcool é eliminado através do ar expirado devido à sua elevada volatilidade 660. A importância desta via metabólica radica na sua utilidade toxicológica, uma vez que permite determinar indirectamente o grau de alcoolémia recorrendo a aparelhos denominados alcoolímetros 601.

1.9.5.6.2. Mecanismos de acção e de toxicidade do etanol

O EtOH é sobretudo um depressor do SNC e, por isso, caracteriza-se pela produção de efeitos sedativos e deterioração das funções cognitivas e do rendimento psicomotor que envolvem uma interacção com receptores de membrana associados com a transmissão glutamatérgica e GABAérgica a nível cerebral 658, 686. Contudo, o álcool tem efeitos não só nos componentes principais do SNC (cérebro e medula espinal), mas também ao nível do sistema nervoso periférico 687. As consequências neurológicas do alcoolismo apresentam uma grande variedade inter-individual, uma vez que são condicionadas por vários factores como doenças co-existentes, nomeadamente malnutrição e doença hepática, a idade de início do consumo abusivo, o género do alcoólico, e a história familiar de alcoolismo 687. Para além dos seus efeitos ao nível da neurotransmissão, o EtOH pode afectar a fluidez transmembranar das membranas celulares por alterar o seu conteúdo em colesterol, por afectar o grau de acilação dos fosfolípidos

148 ______Introdução membranares 674 e por levar à inclusão de ésteres etílicos de ácidos gordos (FAEEs) nas membranas 688. Estas alterações membranares aumentam a susceptibilidade da membrana a agressões oxidativas e podem ter graves implicações que condicionam a comunicação e a sobrevivência celular como, por exemplo, a transmissão sináptica do impulso nervoso, a actividade dos transportadores membranares com acção Ca2+, Na+ e K+-ATPásica 674 ou o transporte de GSH para a mitocôndria, essencial à sobrevivência da célula 670. Os mecanismos envolvidos nos efeitos e na toxicidade do EtOH podem estar na origem de interacções farmacodinâmicas entre o álcool e outras substâncias co-consumidas.

1.9.5.6.2.1. Efeitos na neurotransmissão

O etanol é capaz de produzir uma grande variedade de efeitos a nível cerebral por interacção com múltiplos alvos farmacológicos ilustrados na Figura 10. Alguns estudos atribuem ao EtOH, tanto propriedades sedativas, como estimulantes, dependendo da dose consumida (quanto maiores os níveis de alcoolémia, maior será o grau de depressão central), das expectativas do indivíduo e dos factores ambientais 691, 692. De facto, os efeitos centrais do EtOH correlacionam-se com os níveis de alcoolémia, apesar de existir uma grande variabilidade inter-individual.

149 Introdução ______

Figura 10. Mecanismos de acção biológica do etanol ao nível da neurotransmissão glutamatérgica, GABAérgica, serotonérgica e dopaminérgica. O etanol bloqueia não-competitivamente os efeitos do glutamato ao nível dos seus receptores NMDA e reduz a sua libertação causando lapsos de memória associados à intoxicação, hiperactividade durante a abstinência após consumo prolongado, e dano cerebral causado pelo consumo crónico 689. No sistema GABAérgico, o etanol tem um efeito potenciador nos receptores GABAA, favorecendo a ligação do neurotransmissor inibitório GABA ao receptor e aumentando o influxo de iões pelo canal de cloreto activado pelo GABA para a célula pós- sináptica, o que poderá estar na base dos efeitos ansiolíticos e depressores desta substância 658, 659. O etanol pode aumentar os níveis cerebrais de dopamina directamente ou por mecanismos indirectos como a inibição do transportador da DA ou como o aumento da libertação de 5-HT a nível central que influencia o sistema GABAérgico e aumenta a síntese da DA e pode ainda activar os receptores 5-HT3 levando a uma rápida abertura do canal transmembranar causando um aumento na condutância Na+/K+ e um subsequente rápido influxo do Ca2+ extracelular 690. As setas descontínuas indicam inibição e as setas mais largas indicam indução. DAT, transportador da DA; DA, dopamina; 5-HT, 5-hidroxitriptamina.

1.9.5.6.2.1.1. Efeitos na transmissão glutamatérgica

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório a nível cerebral 687. Em termos farmacodinâmicos, o EtOH actua, tal como a ketamina, por bloquear os efeitos do glutamato ao nível dos seus receptores NMDA de um modo não competitivo e dependente da concentração e reduz a sua libertação ao nível do hipocampo 689 (Figura 10). Este bloqueio ocorre desde concentrações sanguíneas de álcool associadas com consumo social 689 até concentrações associadas a intoxicações em humanos (0,2 – 4,6 g/L) 581. Os efeitos do EtOH no sistema neurotransmissor do glutamato são responsáveis

150 ______Introdução pelos lapsos de memória associados à intoxicação, hiperactividade durante a abstinência após consumo prolongado, e dano cerebral causado pelo consumo crónico 689. Devido ao seu efeito inibitório na transmissão glutamatérgica, o consumo crónico de EtOH leva a uma up-regulation dos receptores do glutamato no hipocampo, uma área cerebral crucial para a memória e envolvida nas convulsões epilépticas. Por isso, durante a abstinência alcoólica estes receptores do glutamato adaptados à presença de elevados níveis de EtOH podem tornar-se hiper-reactivos podendo levar a ataques e a convulsões que parecem também ser influenciados pela deficiência em tiamina e magnésio, comuns em alcoólicos como resultado da sua frequente malnutrição 687.

1.9.5.6.2.1.2. Efeitos na transmissão GABAérgica

O neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA) é o principal neurotransmissor inibitório do SNC 687.

O EtOH tem um efeito potenciador nos receptores GABAA, favorecendo a ligação do neurotransmissor inibitório GABA ao receptor e aumentando o influxo de iões pelo canal de cloreto activado pelo GABA para a célula pós- sináptica, o que poderá estar na base dos efeitos ansiolíticos e depressores desta substância 658, 659 (Figura 10). Este efeito ao nível do GABA explica a tolerância cruzada observada com outras substâncias como as benzodiazepinas e os barbitúricos, que também se ligam ao complexo receptor do GABA para produzir os seus efeitos 658. A MDMA contraria este efeito do EtOH devido à acção agonista da

MDMA nos receptores 5-HT2A e 5-HT2C pós-sinápticos localizados nos neurónios GABAérgicos, de cuja activação resulta uma diminuição dos níveis do GABA e consequente estimulação da síntese e libertação de DA 82, 92-94. Este antagonismo pode ser responsável pela diminuição da sensação de sedação produzida pelo álcool descrita pelos indivíduos que consomem simultaneamente as duas substâncias 683.

151 Introdução ______

O consumo crónico de EtOH leva a uma diminuição da sensibilidade deste receptor ao EtOH e a uma down-regulation do mesmo, o que, indirectamente, vai aumentar a actividade do glutamato. Este fenómeno também pode contribuir para o efeito proconvulsivante observado durante a abstinência de EtOH em alcoólicos 601. Uma vez que a transmissão GABAérgica parece ter um papel importante no mecanismo de acção da MDMA 88, as interferências do EtOH a este nível poderão influenciar os efeitos resultantes do consumo de ecstasy, inclusivamente o seu efeito hipertérmico, o qual pode ser revertido pela 153 activação de receptores GABAB .

1.9.5.6.2.1.3. Efeitos nas vias serotonérgicas

A interferência com as vias serotonérgicas é um ponto comum dos mecanismos de acção da MDMA e do EtOH, podendo estar na base de interacções farmacodinâmicas entre os dois compostos.

1.9.5.6.2.1.3.1. Efeitos nos níveis de 5-HT

O EtOH conduz a uma libertação de 5-HT a nível central (Figura 10). Esta 5-HT pode influenciar o sistema GABAérgico e aumentar a síntese da DA 689, tal como acontece com a MDMA. Por outro lado, o uso continuado de EtOH parece provocar um défice da função serotonérgica, observado em indivíduos alcoólicos, e que se traduz numa diminuição dos níveis de triptofano no plasma e de 5-HIAA (metabolito da 5-HT) no líquido cefalo-raquidiano 601. Existem teorias que implicam o défice cerebral de 5-HT no desenvolvimento do alcoolismo e nos transtornos comportamentais associados ao consumo de álcool e ao alcoolismo, reforçadas pelo facto da administração de inibidores da recaptação ou estimulantes da libertação de 5-HT diminuírem o consumo de álcool 693. No entanto, curiosamente, a diminuição farmacológica da função serotonérgica não leva a um aumento do consumo de álcool 601.

152 ______Introdução

Neste sentido, poder-se-ia especular que a MDMA, devido à sua acção pró- serotonérgica, poderia inibir o desejo de consumir EtOH 601, facto confirmado em ratos 694, 695. Contudo, 2 dias depois do consumo de MDMA surge uma diminuição dos níveis cerebrais de 5-HT devido à estimulação da libertação da 5-HT induzida pela MDMA, que desencadeia estados de depressão 14, que podem ser potenciados pelo efeito depressor do EtOH. A disfunção na função serotonérgica que surge como consequência da diminuição dos níveis de triptofano pode levar ao desenvolvimento de vertigens 601.

1.9.5.6.2.1.3.2. Efeitos nos receptores 5-HT

O receptor 5-HT1B parece estar envolvido no consumo de álcool e nos mecanismos de recompensa associados a este consumo, uma vez que os 696 agonistas 5-HT1B produzem, em ratos, efeitos semelhantes aos do álcool e que ratinhos knockout para este tipo de receptores apresentam menor sensibilidade aos efeitos de recompensa do álcool, sem alterar os seus efeitos aversivos 697. No entanto, o sistema serotonérgico parece ter também um papel importante na sensibilidade e/ou tolerância à ataxia induzida pelo EtOH como se pode confirmar pelo facto de ratinhos knockout para os receptores 5-HT1B serem menos sensíveis a este efeito induzido pelo EtOH e desenvolverem tolerância mais lentamente 698. Por outro lado, a administração prolongada (60 dias) de EtOH a ratos não altera o número de recptores 5-HT2, mas diminui a sua funcionalidade, uma vez que diminui a capacidade de hidrólise do fosfatidilinositol (PI) pela fosfolipase C (PLC) que é activada pela proteína G acoplada a estes receptores, diminuindo assim a produção de inositol trifosfato (IP3) e de diacilglicerol (DAG), mensageiros intracelulares secundários envolvidos no controlo de múltiplos processos celulares 699. A exposição crónica ao EtOH parece também causar um aumento de receptores 5-HT2C no plexus choroideus associada a um aumento da hidrólise do PI estimulada pela 5-HT, não observada no córtex nem no hipocampo de cérebro de rato 699. Contrariamente a este facto, concentrações elevadas de EtOH que se podem

153 Introdução ______atingir em situações de intoxicação podem inibir a actividade dos receptores 5- 699 HT2C . Foi, também, observado que a abstinência de EtOH após consumo crónico resulta numa diminuição do número de receptores 5-HT2A, não tendo qualquer efeito na afinidade dos mesmos. A diminuição dos receptores 5-HT2A está também associada a uma diminuição da hidrólise do PI estimulada pela serotonina no cortex de rato 700. Estas alterações ao nível dos receptores 5-

HT2A e também nos 5-HT2C sugerem que estes receptores poderão estar envolvidos na patogénese da dependência e da síndrome de privação do álcool 699. Estes efeitos poderão ainda provocar interacções farmacodinâmicas entre o EtOH e a MDMA, uma vez que ambos actuam nos mesmos alvos.

O EtOH pode ainda activar os receptores 5-HT3 (canais iónicos membranares que estão ligados ao sistema de sinalização celular do PI no cérebro) levando a uma rápida abertura do canal transmembranar causando um aumento na condutância Na+/K+ e um subsequente rápido influxo do Ca2+ extracelular (Figura 10). A activação dos receptores 5-HT3 pelo EtOH pode afectar a libertação de DA em áreas ricas neste neurotransmissor como o nucleus accubens e o tuberculum olfactorium. A interacção entre o sistema dopaminérgico e os receptores 5-HT3 poderá estar envolvida na dependência alcoólica 699.

1.9.5.6.2.1.4. Aumento da libertação de DA

O EtOH tem a capacidade de elevar os níveis cerebrais de DA por mecanismos directos e indirectos (Figura 10). Este aumento é, aparentemente, responsável pelos efeitos de recompensa ou reforço positivo do álcool, estando na base do desenvolvimento de adição e/ou dependência relativamente a esta substância e pode condicionar uma potenciação dos efeitos da MDMA, uma vez que este derivado anfetamínico também aumenta a libertação de DA. A administração de EtOH a ratos aumenta também a transmissão dopaminérgica nas vias mesolímbicas e aumenta a frequência de disparo dos neurónios dopaminérgicos, o que aumenta a quantidade de dopamina libertada no nucleus accumbens 701.

154 ______Introdução

O aumento da libertação directa de DA no nucleus accumbens e na área ventral tegmentada parece ocorrer por um mecanismo independente do cálcio. Este facto foi confirmado por um estudo em ratos em que uma elevada concentração de EtOH administrada por microdiálise aumentava os níveis de DA na área ventral tegmentada (área de origem das fibras dopaminérgicas), aumento que não foi atenuado por administração de uma solução alcoólica isenta de cálcio 690. Noutro estudo em ratos, apenas concentrações elevadas de EtOH (mais de 170 mM administrados por microdiálise) conseguiam aumentar os níveis extracelulares de DA no nucleus striatum (área com elevado conteúdo em terminais dopaminérgicos) 702. Os dados destes estudos sugerem que as concentrações que provocam intoxicações moderadas, não afectariam directamente os níveis extracelulares de DA. Como referido anteriormente, a libertação indirecta de DA pode ocorrer por activação dos receptores 5-HT3 pelo EtOH. Neste sentido, um estudo de microdiálise em ratos in vivo mostrou que o aumento na libertação da DA induzido pelo EtOH foi prevenido pela perfusão de um antagonista dos 703 receptores 5-HT3 . Este aumento da libertação de DA pode, ainda, ser mediado pelo aumento da libertação de opióides endógenos (endorfinas e encefalinas) por acção do álcool, que vão também modular a libertação de DA. Tal como a MDMA, o EtOH pode ainda atrasar a eliminação da DA do espaço extracelular por interferência com o DAT, cuja função é depurar o espaço sináptico da DA libertada 704, 705. Este sinergismo do EtOH e da MDMA no sistema dopaminérgico pode resultar numa potenciação dos efeitos hiperlocomotores da MDMA, uma vez que existe evidência de que os receptores da dopamina (D1, D2 e talvez D3) contribuem para estes efeitos 112, 113. O acetaldeído produzido pela metabolização do EtOH tem a capacidade de formar aductos com a DA para formar salsolinol, o qual pode contribuir para a dependência do álcool 706.

155 Introdução ______

1.9.5.6.2.2. Alterações no sistema termorregulador

Normalmente, a ingestão de pequenas quantidades de EtOH está associada a um decréscimo da temperatura corporal por indução de vasodilatação periférica com aumento das perdas de calor 687, 707, por um mecanismo que envolve o aumento da libertação e monóxido de azoto com acção a nível endotelial 708, inibição do ritmo normal de actividade mecânica espontânea do tecido muscular liso vascular (vasomoção) e diminuição das respostas contrácteis a mediadores neuro-humorais endógenos que desempenham um papel importante na manutenção do tónus vascular e na regulação do fluxo sanguíneo 709. No entanto, estudos experimentais em animais demonstraram que doses elevadas de EtOH em condições extremas de temperatura provocam um efeito poiquilotérmico, ou seja, um transtorno do mecanismo de adaptação tanto ao frio como ao calor 601. Este efeito do ácool depende basicamente de 3 factores: da temperatura ambiente, da quantidade de álcool ingerida ou administrada e do exercício ou actividade física. Por exemplo, em condições de temperatura ambiente baixa, exercício físico intenso e ingestão abundante de álcool, será de esperar uma descida marcada da temperatura corporal devido a uma inibição dos tremores (shivering) e consequente diminuição da termogénese, ao que se acrescenta um aumento das perdas de calor por aumento da vasodilatação cutânea podendo levar a uma hipotermia potencialmente fatal 687. Contudo este efeito hipotérmico do EtOH é apenas evidente para administrações agudas de EtOH, sendo afectado por fenómenos de tolerância que podem surgir rapidamente, mesmo entre duas exposições consecutivas espaçadas 24 horas 710. Quando se avalia a acção conjunta do EtOH e da MDMA em ratos mantidos a uma temperatura ambiente de 21-23ºC, o EtOH (1,5 g/kg/dia i.p. durante 4 dias) potenciou dramaticamente a hiperlocomoção induzida pela MDMA (6,6 mg/kg em quatro dias não consecutivos ou 10 mg/kg em 4 dias consecutivos) (um efeito não observado em primatas 144), mas surpreendentemente, atenuou o seu efeito hiperpirético 633, 711, 712. Para além disso, a magnitude deste último efeito aumentou com injecções repetidas (ao 4º, 6º, 11º e 13º dia da experiência) de EtOH 1,5 g/kg + MDMA 6,6 mg /kg, sugerindo sensibilização, o que leva a que à quarta injecção se observe uma

156 ______Introdução completa prevenção da hipertermia 633. No entanto, para doses mais baixas de MDMA (3,3 mg/kg), a administração de EtOH chega mesmo a provocar hipotermia à 2ª injecção. Esta observação indica que os efeitos piréticos induzidos pela combinação MDMA+EtOH estão largamente dependentes da dose de MDMA. No entanto, num estudo recente, realizado a uma temperatura ambiente de 32ºC, uma dose de 6,6 mg/kg de MDMA na presença ou na ausência de EtOH matou todos os animais em menos de 2 h sem sinais de atenuação da hipertermia por parte do EtOH 713.

1.9.5.6.2.3. Alterações psicomotoras

Os efeitos comportamentais do EtOH são dependentes da dose e o consumo de pequenas quantidades produz, inicialmente, sentimentos de euforia seguidos de depressão e estupor após ingestão de doses elevadas. Devido ao rápido desenvolvimento de tolerância, os consumidores de EtOH inexperientes desenvolvem menos efeitos agradáveis e mais disforia e embriaguez do que os indivíduos experientes 659. Indivíduos não alcoólicos com antecedentes familiares de alcoolismo manifestam efeitos estimulantes mais pronunciados e menos efeitos sedantes 659. Os primeiros efeitos negativos sobre o rendimento psicomotor (sobretudo nos comportamentos complexos que requerem estado de alerta e a tomada de decisões rápidas) surgem em torno dos 0,4 g/kg, que correponde a uma alcoolémia de 40-50 mg/dL 659. Doses de EtOH iguais ou superiores a 0,75 g/kg (alcoolémia superior a 60 mg/dL), provocam uma deterioração semelhante à produzida por outras substâncias como os opióides ou as benzodiazepinas hipnóticas 601. As áreas cerebrais mais vulneráveis ao dano produzido pelo alcoolismo crónico incluem o cerebelo, o sistema límbico (incluindo o hipocampo e a amígdala que estão envolvidos nos processos de memória, funcionamento emocional e olfacto), o diencéfalo (incluindo o tálamo e o hipotálamo que também contribuem para os processos de memória) e o córtex cerebral (envolvido no raciocínio, aprendizagem e memória espacial, visual e táctil).

157 Introdução ______

Algumas destas áreas são também as mais afectadas pela neurotoxicidade da MDMA, podendo ocorrer um agravamento mútuo dos efeitos psicomotores destas duas subtâncias. Os sintomas mais comuns que aparecem pouco tempo após o consumo de álcool são: linguagem confusa, descoordenação motora (devido à ocorrência de danos no cerebelo), marcha instável, nistagmo, diminuição da atenção ou da memória, diminuição das capacidades visuoespaciais (também provocadas pela MDMA) e, em última instância, estupor e coma. Outros efeitos do EtOH sobre o SNC incluem (i) encefalopatia alcoólica (ou de Wernicke) devida à deficiência em tiamina (síndrome aguda caracterizada por nistagmo, parálise ocular, ataxia, confusão, letargia, indiferença, delírio ligeiro, ansiedade e insónia), (ii) transtornos amnésicos alcoólicos [demência tipo Korsakoff; síndrome aguda devida à deficiência em tiamina que leva ao dano de determinadas áreas cerebrais conduzindo ao aparecimento de dificuldade em processar informação nova (amnésia anterógrada) e, mais raramente, de amnésia retrógrada], e (iii) alucinações agudas. A longo prazo, podem surgir transtornos afectivos (ex.: zelotipia), perturbações do sono (podem surgir para doses relativamente baixas de EtOH e incluem diminuição da latência, diminuição da fase REM, despertar prematuro), ansiedade, depressão, fadiga, excitabilidade, fraqueza muscular e controlo deficiente da temperatura corporal que podem durar 2-3 meses ou tornar-se crónicos 601, podendo ser agravados pela co-exposição à MDMA, uma vez que este derivado anfetamínico também está associado ao aparecimento deste tipo de efeitos. Estes fenómenos podem surgir como consequência de anomalias cerebrais como atrofia neuronal e diminuição do tamanho do cérebro observadas em indivíduos alcoólicos recorrendo a técnicas neuropatológicas e de imagiologia 687. O consumo crónico de EtOH pode ainda levar a uma redução do fluxo sanguíneo e da capacidade metabólica de determinadas áreas cerebrais, tal como acontece com a MDMA 5, 161. Se estas alterações provocadas pelo EtOH se localizarem ao nível do hipocampo, podem potenciar as lesões retinianas induzidas pela MDMA. Menores fluxos sanguíneos cerebrais foram associados a uma maior gravidade de alcoolismo e a capacidade cognitiva mais comprometida 687.

158 ______Introdução

Os indivíduos mais velhos são mais susceptíveis aos efeitos neurotóxicos do EtOH devido ao processo fisiológico de envelhecimento subjacente e também devido à maior probabilidade de desenvolvimento de interacções medicamentosas 687. Tal como o da MDMA, o potencial neurotóxico do EtOH parece dever-se ao seu metabolismo que leva à formação de radicais livres, mas também à possível implicação de alguns factores de cresciento como o NGF (Nerve Growth Factor), o bDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor), a neurotrofina 3 (NT-3) e o factor de crescimento dos fibroblastos (bFGF), mas pode também dever-se indirectamente ao dano noutros órgãos (ex.: fígado) que subsequentemente interferem com o funcionamento cerebral 687 (Figura 11).

Figura 11. Fontes de complicações neurológicas do álcool e alcoolismo. Adaptado de Oscar-Berman M., “Impairments of brain and behavior. The neurological effects of alcohol”, Alcohol research and Health (1997), 21: 65-75.

Os efeitos do EtOH ao nível do sistema nervoso periférico incluem neuropatia periférica (com torpor e fraqueza nas mãos e pés) como consequência da malnutrição frequente em alcoólicos e a “paralisia de sábado à noite” quando o indivíduo intoxicado exerce pressão em nervos vulnerabilizados ficando incapaz de distender o braço durante dias ou semanas 687. Tal como acontece com a MDMA, o EtOH aumenta o risco de lesões, acidentes de viação e ainda de comportamentos violentos 714. O EtOH mostrou ter um efeito potenciador na hiperactividade induzida pela MDMA 682 que, tal como a potenciação do efeito hipertérmico, parece estar sujeito a sensibilização, para ambas as doses de MDMA testadas (3,3 e 6,6 mg/kg), um efeito que não ocorre quando a MDMA é administrada

159 Introdução ______isoladamente. Uma vez que o aumento do efeito locomotor da MDMA pelo EtOH pode dever-se a uma potenciação da libertação de 5-HT e de DA ao nível do estriado, que foi demonstrada em cérebro de rato 715, será de esperar uma redução da potenciação da hiperlocomoção pelo EtOH em animais depletados em 5-HT 633. Isto significa que anteriores intoxicações alcoólicas graves podem incrementar o aumento na libertação de 5-HT induzido pela MDMA 716, o qual, dependendo da dose e/ou do perfil de exposição, pode induzir toxicidade serotonérgica de longa duração, detectável 6-7 dias após a administração da droga 717, 718. A combinação de EtOH e MDMA leva também a uma dissociação entre a sedação objectiva e subjectiva provocada pelo EtOH, o que faz com que os utilizadores tenham uma sensação de euforia mais prolongada e uma falsa sensação de aumento da aptidão para realizar determinadas tarefas, quando esta na realidade está comprometida 683. Quanto à alteração da percepção objectiva e subjectiva da capacidade de condução, a MDMA moderou significativamente a deterioração da capacidade de seguir a estrada induzida por doses baixas de EtOH, mas não afectou a deterioração da capacidade de seguimento de outro veículo e dos testes comportamentais realizados em laboratório com simuladores 719. Este facto é de extrema importância, uma vez que o consumo de ecstasy é frequentemente combinado com o consumo de álcool e uma proporção substancial dos utilizadores de MDMA revela conduzir sob os efeitos da MDMA e/ou outras drogas. 719. De facto, foram já reportados vários acidentes rodoviários fatais, nos quais a MDMA foi encontrada no plasma dos condutores, isoladamente ou com outras drogas ou álcool 720. Apesar do consumo de MDMA ser normalmente associado a um aumento de comportamentos impulsivos e de risco durante os períodos de abstinência, durante a exposição aguda a MDMA não induz comportamentos de impulsividade e pode inclusivamente reduzi-los. O mecanismo farmacológico que está na base desta melhoria do controlo dos impulsos pode estar relacionado com um suprimento serotonérgico e dopaminérgico agudo após uma dose única de MDMA. No entanto, quando se avalia o efeito agudo conjunto de doses moderadas de EtOH com MDMA, a MDMA não consegue mitigar o aumento da impulsividade e da aquisição de comportamentos de risco

160 ______Introdução provocado pelo EtOH. Este resultado parece indicar que o efeito estimulador central da MDMA não é suficiente para ultrapassar os efeitos induzidos pelo EtOH na aquisição de comportamentos impulsivos 684. Alguns utilizadores de MDMA referem que o EtOH elimina ou contraria os efeitos da MDMA e aumenta os efeitos laterais e os vómitos 22. O EtOH parece também contribuir para um aumento da propensão para o desenvolvimento de perturbações psicopatológicas associadas ao consumo de MDMA, uma vez que os consumidores de MDMA que consomem álcool simultaneamente têm um risco 2,5 vezes superior de desenvolver este tipo de perturbações do que os consumidores abstémios 219.

1.9.5.6.2.4. Efeitos neuroendócrinos

O EtOH aumenta a libertação do factor libertador de corticotrofinas (CRF) pelo hipotálamo, facto confirmado pela inibição da estimulação do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal pelo EtOH quando se destrói o núcleo paraventricular (área hipotalâmica onde se produz o CRF), quando se neutraliza o CRF circulante com anticorpos específicos, ou quando se bloqueiam os receptores do CRF. O consumo de EtOH, tal como de MDMA, está associado a um aumento dos níveis plasmáticos de cortisol. Este efeito é mais evidente quando se verificam perturbações gastro-intestinais induzidas pelo EtOH. Neste sentido, um estudo em voluntários saudáveis revelou que a ingestão de 1 g/kg de álcool aumentava significativamente os níveis de cortisol, ACTH e vasopressina, apenas nos indivíduos que sofreram naúseas e vómitos após o consumo de EtOH 721. Este efeito ao nível da libertação de cortisol e ACTH, em ratos, é geralmente mais expressivo em fêmeas do que em machos 722 e pode ocorrer por activação directa das glândulas que os produzem ou através de activação do eixo hipotálamo-hipófise que regula a sua libertação 722. A diurese associada à intoxicação alcoólica tem sido relacionada classicamente com a inibição da vasopressina, produzida pela hipófise. Esta teoria é confirmada por estudos em humanos nos quais se verificou uma diminuição significativa dos níveis desta hormona após a administração de uma

161 Introdução ______dose moderada de álcool (0,5 g/kg) a voluntários saudáveis 723. Este efeito do EtOH poderá, eventualmente, contrariar o efeito libertador da vasopressina da MDMA quando as duas substâncias forem consumidas em simultâneo. O consumo agudo de EtOH diminui a libertação, pelo hipotálamo, da hormona libertadora da hormona luteinizante (LHRH), o que vai levar a uma menor libertação de hormona luteinizante (LH) pela hipófise e a um decréscimo nos níveis de testosterona, uma vez que as gónadas não são estimuladas para a sua produção devido a uma acção directa do EtOH sobre as células de Leydig (células testiculares produtoras de testosterona). Esta inibição do eixo hipotálamo-hipófise-gónada mantém-se com o consumo continuado de EtOH 722 e pode ser potenciado pela co-exposição à MDMA. Nas mulheres, o consumo agudo de EtOH aumenta os níveis de estrogénios e suprime a produção de progesterona pelo corpo lúteo (o que aumenta o risco de aborto espontâneo). O consumo regular de 3 ou mais bebidas alcoólicas por dia está associado a atrasos ou ausência de ovulação (o que pode provocar infertilidade), existindo uma relação dose-resposta entre o consumo de álcool e o aparecimento de problemas menstruais. O EtOH, en doses orais entre 0,75 e 1,3 g/kg leva a um aumento dos níveis plasmáticos de prolactina (hormona produzida pela hipófise anterior, responsável pela lactação e amamentação) 724 cuja intensidade é maior se os consumidores forem descendentes de indivíduos alcoólicos 725. Este efeito do EtOH pode potenciar os aumentos dos níveis de prolactina induzidos pela MDMA. A exposição aguda e crónica ao EtOH foi já associada a uma diminuição dos níveis séricos de hormona do crescimento (GH) e de IGF-1 (insulin-like growth factor 1, uma substância que medeia muitas das acções da GH, como formação proteica e crescimento celular, ao nível dos tecidos) e da capacidade de resposta da GH a factores envolvidos na regulação da sua libertação. Verifica-se também um consequente aumento dos níveis séricos do factor libertador da GH (GRF).

162 ______Introdução

1.9.5.6.2.5. Efeitos cardiovasculares

O álcool pode ser benéfico ou prejudicial para o sistema cardiovascular, dependendo da quantidade consumida e das características do consumidor. Os efeitos benéficos do EtOH podem dever-se a numerosos mecanismos que incluem: (i) aumento das lipoproteínas de elevada densidade, (ii) prevenção da aterosclerose por interferir com os processos inflamatórios ao nível endotelial, (iii) inibição da produção de tromboxano A2, reduzindo a eficácia plaquetária na coagulação sanguínea, (iv) estimulação da dissolução de coágulos sanguíneos por aumento dos níveis sanguíneos de t-PA (tissue-type plasminogen activator) que estimula a conversão do plasminogénio na sua forma activa, plasmina, a qual aumenta a dissolução dos coágulos sanguíneos 726. Alguns destes efeitos do EtOH na coagulação sanguínea parecem ter potencial para diminuir o risco de coagulação intravascular disseminada que pode surgir após consumo de MDMA. Apesar do consumo de EtOH reduzido ou moderado poder conferir protecção contra doenças coronárias, o consumo de grandes quantidades de EtOH pode danificar o sistema cardiovascular, resultando em cardiomiopatias, arritmias, hipertensão arterial e enfarte que podem potenciar a cardiotoxicidade induzida pela MDMA. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar a hipertensão provocada pelo consumo crónico de EtOH, incluindo: (i) aumento da actividade do sistema nervoso simpático que vai aumentar a vasoconstricção e a força contráctil do coração, (ii) aumento dos níveis plasmáticos de catecolaminas, (iii) diminuição da sensibilidade dos baroreceptores das paredes arteriais e (iv) diminuição dos níveis plasmáticos de magnésio ionizado, o qual relaxa a parede dos vasos sanguíneos e estabelece um equilíbrio com os iões cálcio de forma a manter o tónus vascular 726. Tal como a MDMA, o EtOH pode exercer efeitos agudos ou crónicos a nível cardíaco. Os efeitos agudos do EtOH incluem a vasodilatação periférica, a hipotensão arterial e a taquicardia 727. O consumo crónico de EtOH pode chegar a produzir miocardite alcoólica que se traduz por lesões do miocárdio detectadas por análise bioquímica e anatomopatologica 601.

163 Introdução ______

A hipertensão arterial associada ao consumo crónico de EtOH pode aumentar o risco de desenvolvimento de AVC isquémico ou hemorrágico, sobretudo nas mulheres 714 e se consumido com substâncias também associadas a um aumento do risco de AVC como é o caso da MDMA. Contudo, em indivíduos com tensão arterial normal, o risco de AVC isquémico pode estar diminuído pela aparente capacidade do álcool de diminuir o dano dos vasos sanguíneos provocado pelos depósitos lipídicos e reduzir a coagulação sanguínea (o que pode aumentar o risco de AVC hemorrágico) 714.

1.9.5.6.2.6. Efeitos metabólicos

O consumo de EtOH em jejum (quando as reservas de glicogénio estão diminuídas) leva ao aparecimento de hipoglicemia por inibição da gluconeogénese hepática, acidose láctica, hiperuricémia, cetose alcoólica e hiperlipidémia. Quando se consome EtOH com alimentos, verifica-se um aumento da glicémia. Assim, a ocorrência destes efeitos depende muito da dose de álcool ingerida e das condições de consumo (ex.: em jejum, consumo crónico, etc) 601. Em diabéticos, o consumo de EtOH leva a um aumento da hemoglobina glicosilada, a uma diminuição da produção endógena de insulina e a um aumento da resistência à insulina 722. Devido às alterações no balanço NAD+/NADH produzidas durante o metabolismo do EtOH pela ADH, o consumo de grandes quantidades de EtOH pode levar a transtornos metabólicos como a hiperlactiacidémia e a hiperuricémia. Assim, o EtOH, sobretudo se consumido em jejum, pode agravar a acidose e a hipoglicemia provocadas pelo consumo de MDMA.

1.9.5.6.2.7. Efeitos no sistema imunitário

Apesar do sistema imunitário constituir uma protecção eficaz contra substâncias estranhas, microrganismos e processos carcinogénicos, em

164 ______Introdução determinadas circunstâncias, como o consumo exagerado de álcool, o processo inflamatório pode ameaçar os tecidos do próprio organismo. Por exemplo, as prostaglandinas e as prostaciclinas podem proteger as células de determinados tipos de agressão, enquanto que os tromboxanos, por produzirem vasoconstricção, podem promover fenómenos de hipoxia ou causar directamente inflamação ou hipóxia. Por sua vez, os leucotrienos (ex.: leucotrieno B4) podem causar lesão hepática por atrair e activar neutrófilos. O consumo crónico de EtOH, diminui a produção de prostaglandinas e prostaciclinas protectoras e aumenta a produção de tromboxanos e leucotrienos, aumentando o risco de dano celular 670. O consumo agudo de álcool produz ma diminuição significativa do número absoluto de linfócitos T-helper (ou CD4+) e de linfócitos B 198, 728. Este consumo está também associado a uma diminuição dos níveis das citoquinas pró-inflamatórias TNFα e IL-1β, bem como da IL-12, responsável pela activação dos linfócitos T. Verifica-se, ainda, um incremento nos níveis de TNFα, de citoquinas imunoreguladoras TGFβ e IL-10 e um efeito bifásico no IFNγ, que inicialmente aumenta para depois diminuir 728. No entanto, o consumo crónico de EtOH leva a uma activação crónica do sistema imunitário, a qual está relacionada com o desenvolvimento dos problemas hepáticos provocados pelo álcool 729. Por seu lado, a administração aguda de MDMA produz uma disfunção imune transitória, dependente da dose, com diminuição da razão CD4/CD8 dos linfócitos T devido a uma diminuição do número de células CD4 T-helper e a um aumento das células natural killer (NK), apesar da contagem total leucocitária se manter inalterada 728. A combinação aguda de MDMA e EtOH causa um maior efeito supressor nas células T CD4+ e um maior aumento nas células NK em humanos. A exposição a estas substâncias leva, também, a um aumento da produção das citoquinas imunossupressoras (TGF-β e IL-10) e uma troca de citoquinas tipo Th1 (IL-1 e IFN-γ) por citoquinas tipo Th-2 (IL-4 e IL-10). Observa-se assim uma desregulação da produção de citoquinas pro- e anti-inflamatórias com um desiquilíbrio no sentido da resposta anti-inflamatória. Em humanos, a função imunitária tende a voltar aos valores basais 24 horas após a exposição à MDMA 199. Este efeito transiente na homeostase imunológica, se repetida

165 Introdução ______temporariamente, pode alterar a resposta immune, com risco para o estado geral de saúde do consumidor 198, 728.

1.9.5.6.2.8. Efeitos no sistema hepato-biliar

O fígado é particularmente sensível ao dano provocado pelo EtOH, uma vez que é o principal local onde ocorre o metabolismo alcoólico 670. Sendo também a MDMA uma substância capaz de induzir hepatotoxicidade, o co- consumo de ambas poderá aumentar o risco de aparecimento de efeitos tóxicos ao nível do sistema hepato-biliar. Os mecanismos envolvidos na toxicidade hepática exercida pelo EtOH incluem: (i) formação de espécies reactivas de oxigénio produzidas durante o metabolismo do EtOH (ex.: anião superóxido, peróxido de hidrogénio) que levam a fenómenos de peroxidação lipídica com consequente lesão da membrana celular e da mitocôndria; (ii) formação do radical hidroxietilo que, por ser ainda muito reactivo e ter maior semi-vida do que o radical hidroxilo, pode lesar uma maior quantidade de estruturas celulares 730, (iii) aumento da razão NADH/NAD+, indicativa do estado redox das células, que leva a uma indução da xantina oxidase, aumentando a produção de espécies reactivas 730; (iv) aumento da produção de espécies reactivas de azoto devido à indução da sintetase do monóxido de azoto indutível (iNOS), (v) diminuição dos níveis de antioxidantes intracelulares (ex.: GSH, vitaminas A e E), e das actividades das enzimas antioxidantes (ex.: GPx, SOD), aumentando a susceptibidade celular à agressão de ROS e RNS; (vi) diminuição dos níveis de ATP devida à lesão mitocondrial provocada pelas espécies reactivas, (vii) aumento do consumo de oxigénio pelas células da zona periportal e secreção de endotelina pelas células endoteliais dos sinusóides (provoca vasoconstricção), que vão reduzir a disponibilidade de oxigénio para as células centrilobulares, desencadeando uma situação de hipóxia que faz com que esta última zona do lóbulo hepático seja mais atingida pela toxicidade do EtOH; (viii) aumento da produção de tromboxanos e leucotrienos que vão aumentar a hipoxia e o dano resultante da activação leucocitária; (ix) aumento da libertação de lipopolissacarídeo (LPS) pelas bactérias intestinais resultando num aumento da activação do factor

166 ______Introdução nuclear kappa-B (NF-κB) nas células Kupffer, aumentando a produção de TNFα que vai lesar as células directamente ou indirectamente através da estimulação da produção de leucotrienos730; (x) aumento da permeabilidade intestinal à passagem dos LPS libertados pelas bactérias da flora intestinal que, ao atingir o fígado, vão activar as células de Kupffer e aumentar a libertação de substâncias promotoras de hipoxia e inflamação; (xi) formação de aductos entre o acetaldeído ou as espécies reactivas formadas durante o metabolismo do EtOH com proteínas endógenas, levando à formação de moléculas imunogénicas que vão activar uma resposta imunológica que vai lesar as células onde estes aductos se formam; (xii) estimulação da produção de colagénio pelas células Ito (ou hepatic stellate cells ou células armazenadoras de gordura) pelo acetaldeído e seus aductos, pelo TGFβ (transforming growth factor beta) produzido pelas células Kupffer ou pelas espécies reactivas formadas durante o metabolismo do EtOH. Qualquer um destes mecanismos pode interagir com os mecanismos de hepatotoxicidade da MDMA, causando um agravamento da lesão hepática, podendo acelerar a progressão para necrose hepática ou hepatite fulminante. O EtOH interfere com a transferência da GSH sintetizada no citoplasma para a mitocôndria, o que pode conduzir a dano mitocondrial e morte celular 670. O consumo crónico de EtOH pode levar ao desenvolvimento de (i) esteatose (acumulação reversível de gordura ao nível da zona periportal do lóbulo hepático), (ii) hepatite alcoólica (reacção inflamatória aguda reversível, caracterizada por febre, icterícia e dor abdominal, que leva a necrose das células hepáticas as quais, sendo substituídas por tecido fibroso, originam um quadro de fibrose hepática), (iii) hepatite crónica e (iv) cirrose (fibrose severa irreversível em que ocorre destruição da estrutura hepática e comprometimento da funcionalidade do fígado) 670. O EtOH é hepatotóxico devido à produção de acetaldeído (potencial carcinogénico em humanos) e a alterações redox produzidas pelo NADH gerado durante a sua oxidação via ADH, o que, por sua vez, afecta o metabolismo dos lípidos (inibindo o metabolismo dos ácidos gordos ao nível da

167 Introdução ______mitocôndria, o que faz com que eles se acumulem no citoplasma), hidratos de carbono, proteínas e purinas 667. Uma dieta rica em gordura pode, também, incrementar o potencial hepatotóxico do EtOH, uma vez que o excesso de consumo de gorduras aumenta a actividade de CYP2E1 e, simultaneamente, altera a composição das membranas celulares, tornando-as mais susceptíveis à peroxidação provocada pelas espécies reactivas formadas aquando da actuação da referida enzima sobre o EtOH 670. Este dano a nível hepático pode também indirectamente ser responsável pela neurotoxicidade 687 e nefrotoxicidade 670 do EtOH. O risco de desenvolvimento de dano hepático em alcoólicos depende de factores como: (i) o estado nutricional do consumidor (a deficiência em determinados antioxidantes e vitaminas favorece o dano hepático 663), (ii) o género (as mulheres são, aparentemente, mais susceptíveis do que os homens às lesões hepáticas provocadas pelo EtOH, possivelmente por terem menores níveis de ADH gástrica e menor activação de mecanismos alternativos para contrariar a inibição do metabolismo dos ácidos gordos induzida pelo EtOH), (iii) a quantidade e padrão de consumo (quanto maior a quantidade e a frequência de consumo de EtOH, maior o risco de desenvolver hepatotoxicidade 714), (iv) os polimorfismos genéticos na actividade das enzimas envolvidas no metabolismo do EtOH (indivíduos com fenótipo de metabolizador pobre associado à ALDH e de metabolizador rápido para a CYP2E1 e ADH acumulam maiores quantidades de acetaldeído e são mais propensos a desenvolver hepatotoxicidade), (v) a infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) (a infecção por HCV aumenta o risco de dano hepático nos alcoólicos), (vi) o tabagismo (os alcoólicos que fumam mais de 1 maço de cigarros por dia têm um risco de desenvolver cirrose 3 vezes superior ao dos não fumadores) e (vii) o consumo de café (os alcoólicos que consomem 4 ou mais cafés por dia têm 5 vezes menos incidência de cirrose do que aqueles que não consomem café, embora o mecanismo subjacente a este facto continue por esclarecer) 670. Uma condição associada com doença hepática avançada, incluindo a doença hepática alcoólica, é a encefalopatia hepática (também denominada encefalopatia portal-sistémica), uma perturbação metabólica hepática

168 ______Introdução progressiva que afecta o funcionamento intelectual. Os alcoólicos com encefalopatia hepática têm o fígado de tal forma afectado por fenómenos cirróticos que a entrada de sangue venoso no fígado está obstruída, permitindo que substâncias tóxicas (ex.: amónia, manganês) e produtos intermediários do metabolismo entrem na corrente sanguínea e atinjam o cérebro onde vão interferir com as acções dos neurotransmissores 687.

1.9.5.6.2.9. Efeitos no tracto gastro-intestinal

Em indivíduos não alcoólicos, o consumo agudo de EtOH pode levar ao aparecimento de sintomas sugestivos de irritação da mucosa gástrica que pode levar a gastrite crónica. O aparecimento de lesões mais importantes, como a pancreatite alcoólica, requer um historial de alcoolismo de mais de 10 anos de evolução. O consumo crónico de EtOH promove a absorção intestinal de ferro e favorece o armazenamento de ferro, importante catalizador da formação de ROS e RNS, no fígado 670. O álcool compromete, também, a absorção intestinal de cálcio no jejuno e íleo, resultando numa diminuição dos níveis séricos de cálcio que exerce um feedback negativo nas glândulas paratiróides, aumentando a libertação da hormona da paratiróide (PTH) que, por sua vez, vai provocar reabsorção de cálcio ao nível dos ossos, levando a um quadro de desmineralização óssea que pode culminar em osteoporose, a qual pode ser agravada por uma inibição directa dos osteoblastos (células formadoras de osso) e pela diminuição dos níveis de testosterona induzidos pelo EtOH 722.

1.9.5.6.2.10. Efeitos no sistema urinário

O consumo agudo e crónico de EtOH podem comprometer a função renal, particularmente se houver doença hepática estabelecida. Foram observadas alterações na estrutura e função dos rins e diminuição da sua capacidade para regular o volume e a composição do fluído e electrólitos no

169 Introdução ______organismo. Alcoólicos podem apresentar níveis sanguíneos baixos de electrólitos e alterações do balanço ácido-base. Para além disso, o EtOH pode alterar os mecanismos de controlo hormonal que controlam a função renal. Ao promover a doença hepática, o consumo crónico de EtOH tem consequentes efeitos deletérios nos rins, incluindo desregulação do teor em sódio e fluidos e mesmo falência renal aguda 731. Estes efeitos deletérios exercidos pelo EtOH no rim podem aumentar o risco de desenvolvimento de retenção urinária, hiponatrémia ou falência renal aguda ou crónica como consequência do consumo de MDMA.

1.9.5.6.2.11. Efeitos nos músculos

O efeito do EtOH no aumento da PTH pode estar na base de efeitos deletérios a nível muscular, uma vez que resulta num aumento da excreção de fósforo, levando a um quadro de hipofosfatémia que pode resultar num enfraquecimento dos músculos das articulações do ombro e da pélvis, dificultando movimentos tão simples como levantar-se de uma cadeira e subir escadas. Este efeito a nível muscular pode ter especial importância quando o EtOH é consumido com a MDMA, já que esta última é também capaz de provocar danos a nível muscular que incluem rabdiomiólise e consequente mioglobinúria.

1.9.5.6.2.12. Efeitos teratogénicos

Tal como a MDMA, o EtOH também está relacionado com o aparecimento de malformações fetais 714, pelo que a sua utilização concomitante pode agravar o risco de desenvolvimento das referidas malformações. O stress oxidativo e o metabolismo não oxidativo do EtOH desempenham um papel importante no dano induzido pelo EtOH ao feto em desenvolvimento, estando relacionado com o desenvolvimento de problemas

170 ______Introdução de nascença provocados pelo EtOH, incluindo a síndrome alcoólica fetal (FAS) 661.

1.9.5.6.2.13. Carcinogénese

O consumo de álcool tem sido relacionado com o desenvolvimento de carcinomas na cabeça e pescoço (boca, faringe, laringe e esófago), tracto digestivo (estômago, cólon e recto) e mama 732. O acetaldeído formado durante o metabolismo do EtOH tem a capacidade de formar aductos com o DNA, formando compostos carcinogénicos como a 1,N2-propanodesoxiguanosina 661. Para além disso, a CYP2E1, induzida pelo consumo de EtOH, activa numerosos pró-carcinogénios presentes no fumo do tabaco 661. Assim, na análise das interacções da MDMA com o EtOH deve entrar-se em linha de conta com: (1) variações na formação de metabolitos com diferente actividade/toxicidade quando co-administrada com EtOH, o que, em termos gerais, poderá intensificar, prolongar, contrabalançar ou não alterar os efeitos do composto original; (2) alterações na biodisponibilidade da MDMA na presença de EtOH; (3) sinergismo ou antagonismo, mais ou menos pronunciado, entre os efeito da MDMA e do EtOH na libertação de monoaminas e, particularmente, DA e 5-HT; (4) interacções entre os efeitos produzidos pela libertação de monoaminas induzida pela MDMA e os efeitos do EtOH em variados receptores envolvidos na modulação desta libertação (ex.: receptores da adenosina, receptores NMDA, e mesmo receptores nicotínicos); e, (5) vasodilatação, mais ou menos eficiente, induzida pelo EtOH que pode levar a um aumento da dissipação de calor que pode contrabalançar parcialmente os efeitos vasoconstrictores da MDMA 633. Por este motivo, o consumo de EtOH, particularmente quando se consome ecstasy ou outras drogas ilícitas, deve ser desencorajado, tendo em conta os efeitos do uso combinado de ecstasy e álcool, incluindo desidratação 314. Aliás, foram já descritas várias mortes após consumo de MDMA em que o consumo de EtOH foi também verificado (vide Tabela 1).

171 Introdução ______

É, pois, de extrema importância, e por isso constitui o objectivo desta dissertação, o esclarecimento dos mecanismos envolvidos nas interacções entre estes dois compostos, sobretudo a nível hepático onde ambos são metabolizados, dando origem a metabolitos dotados de maior toxicidade do que os compostos que lhes deram origem.

1.10. Principais considerações

De toda a informação reunida ao longo desta introdução é facilmente inferido que os efeitos causados pela ingestão de uma pastilha de ecstasy poderão ser condicionados por uma plêiade de factores que convergem num determinado indivíduo e num determinado momento, o que dificulta a atribuição dos efeitos observados nos consumidores apenas à MDMA. Particularmente preocupantes são as interacções que podem surgir entre a MDMA e outras drogas co-consumidas, propositada ou inadvertidamente, e que podem ser potencialmente fatais. A eventual presença de substâncias estranhas nas pastilhas de ecstasy é preocupante porque, se considerarmos que algumas dessas substâncias em pequenas doses podem ser menos perigosas que a MDMA (ex.: cafeína), outras podem ser mais tóxicas e produzir efeitos devastadores prolongados. É, então, simples perceber que os utilizadores de MDMA podem estar a sujeitar-se a um risco acrescido de danos físicos e/ou psicológicos induzidos pelas drogas como ansiedade, alterações psicóticas e do humor, e risco aumentado de psicose em utilizadores com alterações de personalidade esquizóide/esquizotípica pré-mórbida 560, ao ingerirem outras substâncias para além da MDMA (ex.: uso repetido de MTA, pseuso-efedrina, cafeína, cocaína, opióides) 366. Outro problema relacionado com o decréscimo da pureza dos comprimidos de ecstasy é que, à medida que o conteúdo em MDMA decresce, os utilizadores não obtêm o efeito desejado e tendem a aumentar o número de pastilhas consumidas 733 e, como consequência da contaminação das pastilhas, o risco de efeitos prejudiciais associados aos contaminantes.

172 ______Introdução

Infelizmente, este padrão de consumo de múltiplas pastilhas para atingir a reacção física esperada é muito comum entre os consumidores de MDMA 219. Conhecer quais os contaminantes presentes nas pastilhas de ecstasy é essencial também para os terapeutas e prestadores de cuidados de saúde para, mais facilmente poderem diagnosticar problemas relacionados com outras substâncias para além da MDMA e melhorar o tratamento e os cuidados a prestar ao paciente. Esta contaminação das pastilhas de ecstasy também dificulta o estudo dos efeitos da MDMA nos utilizadores frequentes, uma vez que os efeitos observados após a ingestão de uma pastilha podem dever-se a outra(s) substância(s) e não à MDMA. As pastilhas de ecstasy nem sempre são aquilo que se propõem ser. No mercado de drogas elícitas não existe controlo de qualidade e os consumidores devem estar alertados para esta ausência 423. Apesar de, aparentemente, serem conscientes dos riscos para a saúde associados ao consumo de ecstasy 22, 357, os consumidores de ecstasy não são provavelmente conscientes dos riscos inerentes às substâncias que inadvertidamente ingerem misturadas nas pastilhas de ecstasy 366. Quanto aos riscos da adopção de padrões de policonsumo de drogas, parece legítimo assumir que serão mais preocupantes as associações com drogas de fácil aquisição e elevada acessibilidade (ex.: álcool e tabaco) devido à maior propensão do seu consumo atingir taxas de prevalência mais generalizadas. No entanto, obviamente não se pode descurar o co-consumo com drogas ilegais já que habitualmente lhe está associado um padrão de agravamento de toxicidade mais marcado e potencialmente mais letal. É então essencial desenvolver programas de prevenção para aumentar o esclarecimento acerca dos riscos associados ao consumo de ecstasy em conjunto com outras drogas de abuso e enfatizar a impureza das pastilhas de ecstasy, focando o impacto destas substâncias contaminantes na saúde, especialmente para a população em risco elevado de vir a sofrer de problemas derivados do consumo de drogas 366. Devem também ser desenhados estudos longitudinais e prospectivos utilizando grupos controlo adequados para reproduzir os padrões de consumo de múltiplas drogas manifestados pelos consumidores de ecstasy 612.

173 Introdução ______

O co-consumo de EtOH com MDMA é dos mais preocupantes, uma vez que se trata de uma substância amplamente disponível e acessível, cujo potencial tóxico é muitas vezes negligenciado pelos consumidores. Para agravar esta situação, o EtOH tem ainda potencial para interagir com a MDMA, afectando os efeitos e a toxicidade deste derivado anfetamínico. Por este motivo, o estudo das possíveis interacções entre estas duas substâncias, e dos mecanismos que lhe estão subjacentes, são o objectivo primordial do trabalho experimental desenvolvido no âmbito da presente dissertação.

174

PARTE II

TRABALHO EXPERIMENTAL

______Objectivos

2. OBJECTIVOS

A presente dissertação pretende contribuir para o esclarecimento das possíveis interacções toxicológicas entre o álcool e a ecstasy, e dos mecanismos que lhes estão subjacentes. Deste modo, os estudos realizados no âmbito da presente dissertação tiveram como principais objectivos:

• Avaliação do efeito da co-exposição ou da prévia exposição repetida ao etanol na toxicidade aguda induzida pela MDMA utilizando modelos in vivo, in vitro e ex vivo, nomeadamente através da análise dos seguintes parâmetros: o Alterações histológicas a nível hepático o Estado redox das células hepáticas (quantificação dos níveis de GSH e GSSG, de ROS e RNS, e de enzimas envolvidas na homeostasia da GSH como a γ-GCS ) o Capacidade energética dos hepatócitos o Danificação mitocondrial a nível hepático o Morte celular (necrose e apoptose) o Perfil metabólico da MDMA na presença de etanol

• Avaliação, in vitro, da influência da hipertermia induzida pela MDMA na toxicidade da mistura álcool + ecstasy

Para atingir estes objectivos foram, paralelamente desenvolvidos os seguintes estudos: • Determinação da concentração de etanol em meio de cultura de células recorrendo a um método de GC-FID previamente validado para essa matriz

• Avaliação da contribuição do etanol utilizado na esterilização de superfícies na concentração deste composto nos meios de incubação de células

177 Objectivos ______

178 ______Trabalho Experimental

3. TRABALHO EXPERIMENTAL

Apresentam-se neste capítulo a descrição detalhada dos protocolos experimentais, os resultados obtidos e o respectivo tratamento estatístico, bem como a discussão dos resultados no âmbito de cada trabalho, sob a forma das publicações que originaram. São também descritos alguns resultados que aguardam publicação.

Trabalho I. Optimização das doses de MDMA a administrar a ratinhos previamente expostos repetidamente a etanol.

Trabalho II. Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice. Reprinted from Toxicology (doi:10.1016/j.tox.2008.07.064). Copyright (2008) (with kind permission of Elsevier)

Trabalho III. Effect of chronic ethanol exposure on the hepatotoxicity of ecstasy in mice: An ex vivo study. Reprinted from Toxicology In Vitro, 22: 910-20. Copyright (2008) (with kind permission of Elsevier)

Trabalho IV. Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes. Reprinted from Toxicology (DOI: 10.1016/j.tox.2008.09.009). Copyright (2008) (with kind permission of Elsevier)

Trabalho V. Interacções metabólicas entre o etanol e a MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato.

Trabalho VI. Gas chromatography determination of acetone, acetaldehyde, ethanol and methanol in biological matrices and cell culture. Aceite para publicação no Journal of Chromatoraphic Science.

Trabalho VII. Ethanol, the forgotten artifact in cell culture. Reprinted from Archives of Toxicology. 82: 197–8. Copyright (2008) (with kind permission of Springer)

179 Trabalho Experimental ______

180

Trabalho I. Optimização das doses de MDMA a administrar a ratinhos previamente expostos repetidamente a etanol.

______Trabalho I

Trabalho I. Optimização das doses de MDMA a administrar a ratinhos previamente expostos repetidamente a etanol.

a) Introdução Os efeitos induzidos in vivo pela MDMA foram já alvo de vários estudos realizados inclusivamente pelo nosso grupo de trabalho 142 que utilizaram doses de MDMA de 5, 10 e 20 mg/kg e que serviram de base para a escolha das doses de MDMA a utilizar no presente trabalho. No entanto, a avaliação da influência in vivo de uma prévia exposição repetida ao etanol nos referidos efeitos ainda não foi descrita. b) Objectivo Comparar, in vivo, os efeitos de duas doses de MDMA (10 mg/kg e 20 mg/kg) administradas a ratinhos Charles River CD-1 previamente expostos a 12% de etanol na água de bebida, durante 8 semanas. c) Metodologia Foram utilizados 8 grupos de 6 ratinhos cada (30-40 g). Destes grupos, 4 foram expostos a 5% de etanol ad libitum, na água de bebida, durante 1 semana. Após este período de adaptação, a solução de bebida foi substituída por 12% de etanol, durante 8 semanas. Os restantes 4 grupos tiveram acesso a água ad libitum durante o mesmo período. Findo este período, foram definidos os seguintes grupos:

183 Trabalho I ______

As administrações de MDMA realizadas após as 8 semanas de pré- exposição foram feitas por via intra-peritoneal e num volume de 0,1 mL de solução por 30 g de peso corporal. As soluções de MDMA foram preparadas por dissolução da mesma em soro fisiológico (NaCl 0,9%). A temperatura corporal e o comportamento dos animais foram observados durante as 24 horas seguintes à administração de MDMA. d) Resultados e discussão Após a administração de qualquer uma das doses consideradas, os grupos expostos unicamente à MDMA (M) apresentaram uma reacção anfetamínica típica, caracterizada por hiperactividade e hipertermia (atingiu 40,5ºC nos animais expostos a 20 mg/kg de MDMA e 39,5ºC nos animais expostos a 10 mg/kg de MDMA). Nos animais expostos a etanol e MDMA (E+M), verificou-se, também, um aumento marcado da temperatura corporal (atingiu 40,5ºC nos animais expostos a 20 mg/kg de MDMA e 40,3ºC nos animais expostos a 10 mg/kg de MDMA), observando-se, no entanto, uma prostração marcada que poderá dever-se unicamente ao aumento da temperatura corporal, ou eventualmente a outros mecanismos como: (i) uma diminuição das reservas de serotonina ao nível do SNC induzida pela exposição crónica ao etanol 734, diminuindo a disponibilidade de serotonina para ser libertada por acção da MDMA e, consequentemente, reduzindo a activação de receptores 5-HT1B que parecem medear, pelo menos em parte, as respostas locomotoras induzidas pelas MDMA 111; e/ou (ii) uma interacção toxicodinâmica entre o etanol e a MDMA devido ao facto do etanol contrariar a hiperlocomoção induzida pela MDMA através da activação de receptores 735 GABAA que diminuem a actividade neuronal . A administração de uma dose de 20 mg/kg de MDMA a ratinhos previamente expostos a 12% de etanol provocou um marcado aumento da mortalidade induzida pela MDMA, que não se verificou no caso da administração da dose mais baixa, como se pode observar na Figura 12:

184 ______Trabalho I

% de sobrevivência 24 horas após administração % de sobrevivência 24 horas após administração de 10 mg/kg de MDMA de 20 mg/kg de MDMA

100 100

50 50 % Sobrevivência % Sobrevivência

0 0 C E M E+M C E M E+M Grupo Grupo

Figura 12. Percentagem de sobrevivência de ratinhos CD1, previamente expostos a 12% de etanol na água de bebida durante 8 semanas, após administração de 10 mg/kg ou 20 mg/kg de MDMA.

Apesar da dose de MDMA inicialmente testada (20 mg/kg) ter sido escolhida com base em trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo 142, o aumento da mortalidade verificado quando os animais expostos a esta dose tinham sido previamente expostos a 12% de etanol, impossibilitou a continuidade do ensaio devido à ausência de um grupo estatisticamente representativo. Por esse motivo, a dose de 10 mg/kg de MDMA foi utilizada para a continuação dos estudos in vivo sobre as interacções toxicológicas entre o etanol e a MDMA a nível hepático e que deram origem ao Trabalho II apresentado de seguida. As alterações da temperatura corporal resultantes da exposição à MDMA serão também alvo de discussão no Trabalho II.

185 Trabalho I ______

186

Trabalho II. Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice.

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Toxicology 252 (2008) 64–71

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Chronic exposure to ethanol exacerbates MDMA-induced hyperthermia and exposes liver to severe MDMA-induced toxicity in CD1 mice

Helena Pontes a,∗, José Alberto Duarte b, Paula Guedes de Pinho a, Maria Elisa Soares a, Eduarda Fernandes c, Ricardo Jorge Dinis-Oliveira a,d,e, Carla Sousa a, Renata Silva a, Helena Carmo a, Susana Casal f, Fernando Remião a, Félix Carvalho a, Maria Lourdes Bastos a,∗ a REQUIMTE, Toxicology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal b CIAFEL, Faculty of Sport, University of Porto, Rua Dr. Plácido Costa 91, 4200-450 Porto, Portugal c REQUIMTE, Physical-Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal d Clinical Analysis and Public Health Department, Cooperativa de Ensino Superior, Politécnico e Universitário, CRL Rua José António Vidal, 81, 4760-409 Vila Nova de Famalicão, Portugal e Institute of Legal Medicine, Faculty of Medicine, University of Porto, Jardim Carrilho Videira, 4050-167 Porto, Portugal f REQUIMTE, Bromatology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal article info abstract

Article history: 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) is an amphetamine derivative drug with entac- Received 17 June 2008 togenic, empathogenic and hallucinogenic properties, commonly consumed at rave parties in a polydrug Received in revised form 24 July 2008 abuse pattern, especially with cannabis, tobacco and ethanol. Since both MDMA and ethanol may cause Accepted 26 July 2008 deleterious effects to the liver, the evaluation of their putative hepatotoxic interaction is of great interest, Available online 7 August 2008 especially considering that most of the MDMA users are regular ethanol consumers. Thus, the aim of the present study was to evaluate, in vivo, the acute hepatotoxic effects of MDMA Keywords: (10 mg/kg i.p.) in CD-1 mice previously exposed to 12% ethanol as drinking fluid (for 8 weeks). Body Ethanol 3,4-Methylenedioxymethamphetamine temperature was continuously measured for 12 h after MDMA administration and, after 24 h, hepatic (MDMA) damage was evaluated. Hyperthermia The administration of MDMA to non pre-treated mice resulted in sustained hyperthermia, which was Oxidative stress significantly increased in ethanol pre-exposed mice. A correspondent higher increase of hepatic heat Hepatotoxicity shock transcription factor (HSF-1) activation was also observed in the latter group. Furthermore, MDMA administration resulted in liver damage as confirmed by histological analysis, slight decrease in liver weight and increased plasma transaminases levels. These hepatotoxic effects were also exacerbated when mice were pre-treated with ethanol. The activities of some antioxidant enzymes (such as SOD, GPx and Catalase) were modified by ethanol, MDMA and their joint action. The hepatotoxicity resulting from the simultaneous exposure to MDMA and ethanol was associated with a higher activation of NF-␬B, indicating a pro-inflammatory effect in this organ. In conclusion, the obtained results strongly suggest that the consumption of ethanol increases the hyperthermic and hepatotoxic effects associated with MDMA abuse. © 2008 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) is an amphetamine derivative drug with entactogenic, empathogenic and hallucinogenic properties, commonly consumed at rave par- Abbreviations: MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, ecstasy; MDA, methylenedioxyamphetamine; ROW, relative organ weight; %DLWC, percent dry ties in a polydrug abuse pattern, especially with cannabis, lipid weight content; HSF-1, heat shock factor 1; NF-␬B, nuclear factor kappa-B; GOT, amphetamine, cocaine, tobacco and ethanol (Green et al., 2003; glutamic oxalic transaminase; GPT, glutamic pyruvic transaminase; SOD, superoxide Schifano, 2004; Breen et al., 2006; Barrett et al., 2006). The com- dismutase; GPx, glutathione peroxidase; GST, glutathione-S-transferase; GSH, glu- mon concomitant use of ethanol and MDMA has a great interaction tathione (reduced form); GSSG, glutathione (oxidised form); TBARS, thiobarbituric acid reactive substances; IHC, immunohistochemistry. potential since both compounds are metabolized in the liver to hep- ∗ Corresponding authors. Tel.: +351 222078979; fax: +351 222003977. atotoxic metabolites (Gemma et al., 2006; Green et al., 2003; Carmo E-mail addresses: [email protected] (H. Pontes), [email protected] (M.L. Bastos). et al., 2006) with higher toxicity than their parent compounds

H. Pontes et al. / Toxicology 252 (2008) 64–71 65

(Carvalho et al., 2004; Meier and Seitz, 2008). This metabolic acti- 2.3. MDMA challenge vation observed with MDMA seems to be a common feature of amphetamine derivatives, since it was already described for com- Mice were housed in four groups of six animals (control, ethanol, MDMA and ethanol + MDMA groups) and were injected intraperitoneally with saline (0.9% NaCl) pounds such as 4-MTA (Carmo et al., 2004b, 2007), 2-CB (Carmo et or 10 mg/kg MDMA (dissolved in saline) in a volume of 0.1 mL/30 g body weight al., 2004a, 2005) which showed a variable toxicity profile accord- between 9:00 and 10:00 a.m. The experiment was performed under controlled ingly to the individual metabolic capacity. In addition, ethanol can ambient temperature fixed at 20 ◦C(±2 ◦C). Subcutaneous temperature of animals alter the expression and/or activity of some drug-metabolizing was measured repeatedly after MDMA administration (see measurement of body temperature). After 24 h, animals were anaesthetized and blood was removed from enzymes (Jang and Harris, 2007), including those involved in the inferior vena cava and collected into heparinized tubes. The liver was excised MDMA metabolism. Furthermore, MDMA users are regular ethanol and weighed, after body perfusion with 0.9% NaCl solution, and used for biochemi- consumers before their first contact with MDMA (Ben Hamida et cal analysis. Samples were kept frozen (−80 ◦C) until assay. Liver sections were also al., 2006), which may represent a putative risk factor for the toxic collected for histological examination. The relative organ weight (ROW), an indica- interaction between these two drugs. In fact, our group has recently tor of tissue harm, was also calculated for each animal as a percentage of the total body weight at the sacrifice day. demonstrated that the repeated exposure of CD1 mice to ethanol seems to increase the vulnerability of freshly isolated hepatocytes 2.4. Measurement of body temperature towards pro-oxidant conditions (Pontes et al., 2008). Additionally, results reported by Pacifici and Hernández-Lopes in human sub- Subcutaneous temperatures of mice were measured using BioMedic pro- jects (Hernández-López et al., 2002; Pacifici et al., 2001) showed grammable temperature transponders (microchips BMDS IPTT-100, Plexx BV, 6660 AE ELST, Netherlands). The microchips were implanted subcutaneously between the that also the physiologic and psychopathologic effects of MDMA shoulder blades, using the BioMedic implant device, 2 days before the experiment. could be increased in presence of ethanol. Thus, the objective of the Readings of subcutaneous temperature were taken immediately prior to MDMA or present study was to evaluate, in vivo, the acute hepatotoxic effects saline injection and for 12 h thereafter using a hand held Biomedic Pocket Scanner of MDMA (10 mg/kg i.p.) in CD-1 mice previously exposed to 12% (DAS-5007). Temperature was recorded every 15 min during the first hour, every ethanol as drinking fluid (for 8 weeks). This experimental approach 30 min during the second and third hours and every hour thereafter. was designed to simulate the most common pattern of ethanol and 2.5. Plasma biochemical analysis MDMA abuse, in which the individuals are exposed to ethanol prior to the first contact with MDMA. To our knowledge, experimental 2.5.1. Plasma transaminases work addressing the in vivo effects of chronic ethanol exposure on Plasma activities of glutamic oxalic transaminase (GOT) and glutamic pyru- MDMA-induced hepatotoxicity has not been previously reported. vic transaminase (GPT) were evaluated as biomarkers hepatic damage. These determinations were performed in a Reflotron Analyser (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) using 32 ␮L of plasma for each analysis (GOT, Cat no. 10745120, 2. Materials and methods Roche Diagnostics; GPT, Cat no. 10745138, Roche Diagnostics).

2.1. Chemicals 2.5.2. Oxidative stress parameters 2.5.2.1. Sample preparation. For the quantification of protein carbonyl groups, lipid All the reagents used in this study were of analytical grade. Bovine serum peroxidation extent and GSH and GSSG concentrations, tissue samples were homog- albumin (fraction V), ␤-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced enized (1:4 m/v) in ice-cold 5% perchloric acid with an Ultra-Turrax® homogenizer. form (␤-NADPH), pyruvic acid, 2-vinylpyridine, glutathione reduced form (GSH), After the homogenization, aliquots were taken to determine protein carbonyl glutathione oxidised form (GSSG), glutathione reductase (EC 1.6.4.2), 5,5-dithiobis- groups content and protein levels. The remaining homogenates were centrifuged 2-nitrobenzoic acid (DTNB), guanidine hydrochloride, 2,4-dinitrophenylhydrazine, at 3200 × g for 10 min at 4 ◦C and the supernatants were used for the quantification 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB), xanthine, nitrotetrazolium blue chloride, xan- of lipid peroxidation and GSH/GSSG. thine oxidase from bovine milk and hydrogen peroxide solution were obtained from For measurement of antioxidant enzymes activities, liver samples were homoge- Sigma–Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). The injectable solution of sodic heparine nized (1:4 m/v) in ice cold 0.1% Triton X-100 in 50 mM phosphate buffer (pH 7.4). The was obtained from B. Braun (Lisbon, Portugal). Perchloric acid, trichloroacetic acid, homogenates were centrifuged at 3200 × g for 10 min at 4 ◦C, and the supernatants 2-thiobarbituric acid, Folin Ciocalteau reagent and all other chemicals were pur- collected for the enzymatic and protein assays. chased from Merck (Darmstadt, Germany). 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (HCl salt) was extracted and purified from high purity MDMA tablets that were provided by the Portuguese Criminal Police Department. The obtained salt was 2.5.2.2. Protein carbonyl groups. Protein carbonyl groups (ketones and aldehydes) pure and fully characterized by NMR and mass spectrometry methodologies were quantified according to Levine et al. (1994). Results were expressed as nmol of (purity > 99%). DNPH incorporated per mg of protein, calculated by using an extinction coefficient of 2.2 × 104 M−1 cm−1. 2.2. Animals 2.5.2.3. Non-specific lipid peroxidation. The extent of lipid peroxidation was mea- Adult male CD1 mice (Charles-River Laboratories, Barcelona, Spain), weighing sured by the thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assay at 535 nm (Buege 30–40 g, were used in all experiments. For at least 1 week prior to the treatment, and Aust, 1978; Carvalho et al., 1997). TBARS were expressed as malondialdehyde animals were acclimatized in polyethylene cages with wire-mesh tops, lined with equivalents per milligram of protein, calculated by using an extinction coefficient of ± ◦ − − wood shavings, at an ambient temperature of 20 2 C, humidity between 40 and 1.56 × 105 M 1 cm 1. 60% and 12 h/12 h light/dark cycle (light on from 8.00 to 20.00 h), having standard chow and tap drinking water ad libitum. After this period, animals were divided into two main groups: ethanol (n = 12) and non-ethanol (n = 12). In the ethanol main 2.5.2.4. GSH and GSSG. Tissue GSH and GSSG contents were determined by the group the tap drinking water was replaced by a 5% ethanol solution for 1 week DTNB-GSSG reductase recycling assay as described before (Pontes et al., 2008). and, afterwards, by a 12% ethanol solution for 8 weeks. The replacement of water for 5% ethanol before 12% ethanol corresponds to a required adaptation period, to 2.5.2.5. Catalase. Catalase activity was measured according to the method of Aebi avoid aversion of mice to a high ethanol concentration in the drinking fluid, since (1984), by monitoring the decomposition of H2O2 at 240 nm, calculated by using these animals do not have natural preference for 12% ethanol. The non-ethanol main an extinction coefficient of 39.4 M−1 cm−1). The enzyme activity was expressed as group had drinking tap water ad libitum for the same period. There were no differ- ␮molofH2O2 consumed per min and per mg of protein. ences in body weight between the main groups after the 8 weeks of the experiment (data not shown). During the 24-h period after MDMA administration, animals were 2.5.2.6. Glutathione-S-transferase (GST). Glutathione-S-transferase (GST) activity deprived of food but the drinking solution was allowed ad libitum. Surgical proce- was assayed according to the method of Habig et al. (1974). The formation of GSH dures for blood collection and liver excision were performed under anaesthesia and conjugate with 1-chloro-2,4-dinitrobenzene was monitored for 5 min at 340 nm. carried out between 9 and 11a.m. Animal experiments were licensed by Portuguese The GST activity was calculated by using an extinction coefficient of 9.6 mM−1 cm−1 General Directorate of Veterinary Medicine. Housing and experimental treatment and expressed as ␮mol per min per mg of protein. of animals were in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the Institute for Laboratory Animal Research (Institute for Laboratory Animal Research, 1996). The experiments complied with the current Portuguese 2.5.2.7. Selenium-dependent glutathione peroxidase (GPx). Selenium-dependent laws. glutathione peroxidase (GPx) activity was assayed by NADPH oxidation at 340 nm Author's personal copy

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(Flohe and Gunzler, 1984). The enzyme activity was calculated by using an extinc- 0.2 M sodium cacodylate), for 2 h at 4 ◦C. After a new wash with sodium cacody- tion coefficient of 6.22 mM−1 cm−1 and expressed as nmol of NADPH oxidized per late (5 min), the samples were submitted to a dehydration process using increasing min per mg of protein. concentrations of ethanol (from 50% to 100%) for 90 min. In the impregnation stage, the pieces were placed in mixtures containing absolute ethanol and LR White, with 2.5.2.8. Superoxide dismutase (SOD). Copper/zinc superoxide dismutase (CuZnSOD) increasing concentrations of resin (50% and 75% (v/v) of absolute ethanol) for 30 min and manganese superoxide dismutase (MnSOD) were assayed using the method each. In the next stage, samples were kept for two periods of 30 min each, in 100% LR of Flohé and Ötting (1984), with some modifications previously reported before White, and afterwards were mounted on covered gelatine capsules. The inclusion (Dinis-Oliveira et al., 2006). was processed in a drying oven at 60 ◦C for 22–26 h. Ultra-thin (thickness equal to 500–600 Å) sections were cut and contrasted with a saturated aqueous solution of 2.5.3. Protein quantification uranyl acetate, for 30 min, and with a solution of lead citrate, for 15 min, with washes Protein was determined by the Lowry method (Lowry et al., 1951) using bovine at the beginning and at the end of each one of these procedures. For the electron serum albumin as the standard. microscopy study a transmission electron microscope Zeiss EM 10 A, at 60 Kvolts was used. 2.5.4. Dry lipid weight content The total liver lipid content was determined according to Folch et al. (1957) and 2.8. Statistical analysis expressed on a dry weight percentage (%DLWC). Results are presented as mean ± S.E.M. (from six animals) and were tested for 2.6. Nuclear extracts and fEMSA normality with the Kolmogorov–Smirnov test. For temperature analysis, comparisons were made by analysis of variance (ANOVA) with repeated measures, followed ␬ Transcriptional activations of NF- B and HSF-1 were determined by fluorescent by the Bonferroni’s post-hoc test. The other statistical comparisons were performed electrophoretic mobility shift assay (fEMSA) using nuclear protein extracts accord- by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s multiple comparison ing to a previously reported method (Dinis-Oliveira et al., 2007). The nuclear protein test. Significance was accepted at P < 0.05. extracts were obtained from tissue homogenates (1:2.5 m/v) in cell lysis buffer (AC

Buffer) containing 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM EDTA, 0.1 mM EGTA, 1 mM ditiothreitol (DTT), 0.25 mM phenyl methylsulfonyl fluoride (PMSF) and 3. Results 20 ␮L/mL igepal (pH 7.9). To obtain the nuclear extracts, the homogenates were exposed to a freeze/thaw 3.1. Body temperature cycle and centrifuged for 10 min at 850 × g,4◦C. The pellets were washed again ◦ with AC Buffer, incubated for 15 min on ice, and centrifuged at 16,000 × g,4 C, for After administration of 10 mg/kg MDMA, animals from the 30 s. The obtained nuclear pellets were resuspended in complete lysis Buffer (BC MDMA group showed a typical amphetaminic reaction char- Buffer, containing 20 mM HEPES, 20% (m/v) Glycerol, 420 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.25 mM PMSF, 20 ␮L/mL igepal and 5 ␮g/mL of a protease acterized by hyperthermia and hyperactivity. However, in the inhibitors cocktail containing 1 mg/mL aprotinin, 1 mg/mL leupeptin and 1 mg/mL ethanol + MDMA animals, hyperactivity was not present and a pepsatin), incubated for 30 min on ice on a rocking platform at 150 rpm and cen- marked prostration was observed. × ◦ trifuged for 10 min at 16,000 g at 4 C. Aliquots of the supernatant were stored at The ethanol group presented a similar body temperature pro- −80 ◦C until assay. Protein quantification was determined by the Lowry assay and each extract aliquot was diluted to 2 mg/mL of protein. file to that of the control group. However, the ethanol + MDMA Thereafter, to perform the fEMSA electrophoresis, 20 ␮g of protein from nuclear group showed a sustained increase in body temperature that was extracts were incubated with Cy5-labeled NF-␬B or HSF-1 consensus probe in assay significantly higher than that observed for MDMA alone (Fig. 1A). buffer (200 mM HEPES, 500 mM KCl, 10 mM EDTA and 10 mM DTT) supplemented Statistical differences were found during the first 7 h after MDMA ◦ with glycerol, poly(dI-dC), DTT and igepal, at 4 C over-night. Specificity of the administration. DNA–protein complex was confirmed by the addition of a 50-fold excess of an unlabeled specific competitor (SC) (equal to the specific probe but without the Cy5 label). Nine microliters of each mixture were loaded on a 5% non-denaturating polyacry- 3.2. Heat shock factor-1 (HSF-1) activation lamide gel at 10 ◦C, 800 V, 50 mA and 30 W, in TBE buffer 1× (90 mM Tris base, 90 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.3) using an ALFexpress II DNA Analyser (Amersham The ethanol + MDMA group presented a significantly higher Pharmacia Biotech, Sweden). The temperature was regulated by an external ALF- increase of heat shock transcription factor (HSF-1) activation express II Cooler system (Amersham Pharmacia Biotech, Sweden). The following (Fig. 1B, lane 4), when compared to that induced by MDMA alone Cy5-labeled specific double stranded probes were used for NF-␬B and HSF-1 gel assays: NF-␬B, 5-GCC TGG GAA AGT CCC CTC AAC T-3; HSF-1, 5-GAT CCT CGA ATG (Fig. 1B, lane 3). TTC GCG AAA AG-3. 3.3. Nuclear factor kappa-B (NF-B) activation 2.7. Tissue preparation for light and transmission electron microscopy

3 As shown in Fig. 2, the ethanol + MDMA group presented a For light microscopy, after excision, liver was sliced in 2–4 mm pieces, approxi- ␬ mately, and fixed in 4% formaldehyde. The fixed pieces were, then, dehydrated with significant sharp activation of NF- B in mouse liver (lane 4) com- graded ethanol and included in paraffin blocks. The compound used in the transition paratively to control (lane 1), ethanol (lane 2) and MDMA (lane between dehydration and impregnation was benzene. Semi-thin sections (4 ␮m) 3) groups. This increase in NF-␬B activation was also visible in were cut in a microtome, applied on silane-coated slides and deparaffinated. The the immunohistochemistry for NF-␬B in liver sections since in the deparaffinated sections were treated for different staining protocols (Haematoxylin- ethanol + MDMA group a high number of red stained nucleus, cor- Eosin, Van Gieson) and for immunohistochemistry assays for the detection of NF-␬B. The haematoxylin–eosin staining was performed by immersion in Mayer’s responding to activated NF-␬B, was observed when compared to haematoxylin solution for 3–4 min followed by immersion in 1% eosin solution for the other groups (Fig. 2). 7 min, dehydration with graded alcohols through xylene, and mounting with DPX. To perform the NF-␬B immunohistochemical detection, NF-␬B p50 (NLS) rabbit 3.4. Structural and ultra-structural analysis polyclonal antibody (SC-114, 1:20, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, USA) was applied on deparaffinated liver sections and these samples were incubated at 37 ◦C for 2 h in a humidified chamber. The same samples were then incubated The histological analysis of hepatic sections by light and electron with a secondary anti-immunoglobulin goat anti-rabbit IgG, F(ab)2 conjugated microscopy (Fig. 3) revealed, in all groups, a preserved lobular struc- with alkaline phosphatase (SC-3838, 1:50, Santa Cruz Biotechnology Inc., California, ture and ultrastructure. The control group presented no relevant ® USA), under the same conditions, for 1 h. SIGMAFAST Fast Red TR/Naphthol AS-MX changes in the various cellular organelles while the ethanol, MDMA Tablets were used as substrate according to manufacturer’s instructions. The sections were counterstained with Mayer’s haematoxylin. The primary antibody was and ethanol + MDMA groups showed diffuse cytoplasmic vacuoliza- replaced by PBS for negative control sections. Wistar rat 14th day placenta slides tion, lysosomal activation, mitochondrial swelling and a dilatation were used as positive control. All stained sections were mounted on glass slides of the cytoplasmic reticulum and the perinuclear cisterna, alter- ® using Aquatex . For the light microscopy study, an optic photomicroscope Nikon, ations particularly evident in the ethanol + MDMA group. A severe Model Eclipse E400 was used. dilatation of the hepatic centrilobular sinusoids was evident in For electron microscopy, 1 mm3 tissue pieces were fixed in 2% gluteraldehyde (in 0.2 M sodium cacodylate) for 2 h at 4 ◦C. After three 15 min washes with 0.2 M sodium ethanol and ethanol + MDMA groups. All the groups presented cacodylate buffer at 4 ◦C, the pieces were post-fixed with 2% osmium tetroxide (in abundant cytoplasmic lipid droplets although in the control and Author's personal copy

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Fig. 1. Effect of ethanol pre-treatment on the hyperthermic effect induced by MDMA (A) and in the consequent HSF-1 transcriptional activation (B) in the liver, detected by semi-quantitative fluorescent electrophoretic mobility shift assay (fEMSA). The illustrated gel is representative of the specific HSF-1 bands (highlighted by the dotted line) obtained for the control (C), ethanol (E), MDMA (M) and ethanol + MDMA (E + M) groups by using fluorescence labeled specific probes (SP). Lane 5 represents a competitive experiment with a 50-fold molar excess of a specific competitor (SC, unlabeled specific probe). The optical density (OD) of the bands ± S.E.M. of six animals is indicated below. Body temperature results are presented as mean ± S.E.M. of six animals. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, compared to control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, compared to ethanol group; @P < 0.05, @@P < 0.01, compared to MDMA group.

MDMA groups the distribution of these droplets was preferentially of the bile canaliculi and of the sinusoids presented a normal struc- centrilobular, while in the ethanol and ethanol + MDMA groups this ture while the ethanol and the ethanol + MDMA groups presented a distribution had a diffuse pattern along the lobule. In control and pronounced deposition of collagen ﬁbres between the hepatocytes MDMA groups the interstitial space and the hepatocytes microvilli and the endothelial cells of the sinusoids, resulting in an apparent

Fig. 2. Effect of ethanol pre-treatment on NF-␬B transcriptional activation in the liver detected by semi-quantitative fluorescent electrophoretic mobility shift assay (fEMSA). The illustrated gel is representative of the specific NF-␬B bands (highlighted by the dotted line) obtained for the control (C), ethanol (E), MDMA (M) and ethanol + MDMA (E + M) groups by using fluorescence labeled specific probes (SP). Lane 5 represents a competitive experiment with a 50-fold molar excess of a specific competitor (SC, unlabeled specific probe). The optical density (OD) of the bands ± S.E.M. of six animals is indicated below. ***P < 0.001, compared to control group; ###P < 0.001, compared to ethanol group; @@@P < 0.001, compared to MDMA group. Representative light micrographs of hepatic immunohistochemistry for NF-␬B detection are also shown (the magnification bar represents 20 ␮m). A cytoplasmic red staining is observed in all images, being more pronounced in the E, M and E + M pictures where some red stained nuclei are also depicted (arrow). Author's personal copy

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Fig. 3. Transmission electron micrographs and light microscopy images (haematoxylin–eosin stain and Van Gieson’s stain) of liver sections from control, ethanol, MDMA and ethanol + MDMA groups. In the light microscopy images, a preserved lobular structure is observed. The ethanol illustrations present dilatation of the centrilobular sinusoids. Necrotic cells are punctually observed in MDMA images (arrow). More confluent necrotic areas are evident in the ethanol + MDMA slide (arrow). In the slides stained with Van Gieson, collagen content is poorly pronounced in control and MDMA images and more marked in ethanol exposed groups (arrow). The transmission electron micrographs reveal a mainly lipidic cytoplasmic vacuolization and mitochondrial swelling in all pictures, more pronounced in ethanol, MDMA and ethanol + MDMA images. Large collagen contents between endothelial and parenchymal cells are depicted in the ethanol picture (arrow). In the MDMA micrograph numerous nucleoli are also observed. An activated Kupffer cell is also shown in the ethanol + MDMA picture (arrow). The magnification bar on the light microscopy images represents 20 ␮m. The magnification bar on the electron microscopy images represents 2 ␮m. reduction of the size and density of the hepatocytes microvilli in the interstitial space. Kupffer cells with indicative signs of activation, sinusoids and in the bile canaliculi. This high collagen deposition suggested by high amounts of lysosomes, were also observed in the was also evidenced by the Van Gieson stain, which revealed a higher ethanol + MDMA group. deposition of collagen fibres (coloured in red) in both ethanol and ethanol + MDMA groups. In the ethanol group some nuclei pre- 3.5. Plasma transaminases sented chromatin condensation on their peripheral regions. In the MDMA group, nuclei with numerous and voluminous nucleoli were Concerning to GOT levels (Fig. 4A), they were slightly increased observed and in both ethanol and MDMA groups it was also noticed in the ethanol group compared to the control group. The adminis- the existence of osmiophobic confluent areas, suggesting intracel- tration of MDMA produced a significant increase of plasma levels lular oedema. In the MDMA group, some isolated necrotic cells of this transaminase in both MDMA and ethanol + MDMA groups, were observed, while in the ethanol + MDMA group some appar- the increase in this last group being significantly higher (increase ently necrotic regions were found, as well as cell fragments in the of approximately 35%) than in the MDMA group (increase of

Fig. 4. Effect of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) on plasma levels of glutamic oxalic transaminase (GOT (A)), glutamic pyruvic transaminase (GPT (B)) of control and ethanol pre-treated animals. C: control, E: ethanol, M: MDMA and E + M: ethanol + MDMA groups. Results are presented as mean ± S.E.M. from six animals. *P < 0.05, ***P < 0.001. Author's personal copy

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Table 1 Table 2 Hepatic percent dry lipid weight content (%DLWC) and liver relative organ weight Oxidative stress parameters in the control, ethanol, MDMA and ethanol + MDMA (ROW) of mice from the control, ethanol, MDMA and ethanol + MDMA groups groups

Group Liver Groups GSHred/GSSG TBARS (nmol Carbonyl groups ratio MDA/mg protein) (nmol/mg protein) ROW %DLWC Control 9.35 (0.62) 0.080 (0.004) 5.36 (0.33) Control 4.359 ± 0.198 22.38 ± 1.89 Ethanol 6.73 (0.47)** 0.129 (0.015)** 5.76 (0.28) Ethanol 5.582 ± 0.293** 19.91 ± 1.57 MDMA 7.75 (0.88) 0.097 (0.004) 4.63 (0.18) MDMA 3.686 ± 0.165### 30.93 ± 2.546*,## Ethanol + MDMA 7.43 (0.26) 0.073 (0.004)@ 5.04 (0.37) Ethanol + MDMA 4.222 ± 0.261## 21.84 ± 1.53@ Results are presented as mean ± (S.E.M.) from six animals. All groups were com- Results are presented as mean ± S.E.M. from six animals. All groups were compared, pared, however, only the statistically differences were indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, however, only the statistically differences were indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, com- ***P < 0.001, compared to control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, compared pared to control group; ##P < 0.01, ###P < 0.001, compared to ethanol group; @P < 0.05, to ethanol group; @P < 0.05, @@P < 0.01, compared to MDMA group. MDA: malondi- compared to MDMA group. aldehyde. approximately 30%) when compared to ethanol and control groups, decrease in the ethanol + MDMA group. Ethanol group presented respectively. reduced activities of both MnSOD and Cu/ZnSOD, when compared The levels of GPT (Fig. 4B) were signiﬁcantly increased in MDMA to control group, and the ethanol + MDMA group showed a signiﬁ- and ethanol + MDMA groups, especially in the ethanol + MDMA cant enhancement in MnSOD and Cu/ZnSOD activities. which presented a twofold increase in GPT levels when compared to the ethanol group. The increase of GPT present in the MDMA group 4. Discussion corresponds to a 50% increase when compared to control group.

The results obtained in the present study clearly demonstrate 3.6. Relative organ weight (ROW) and hepatic percent dry lipid that the chronic exposure to 12% ethanol prior to MDMA admin- weight content (%DLWC) istration potentiates the hyperthermic and hepatotoxic effects induced by MDMA, which was evidenced by a significant increase As it can be observed in Table 1, the ethanol group presented in several biochemical and histopathological biomarkers of toxicity. a significant increase in liver ROW, and the ethanol + MDMA group The administration of MDMA was followed by a sharp increase showed a marked decrease of this parameter when compared to in body temperature. This is an expected effect (Carvalho et al., the ethanol group. The MDMA group presented a slight decrease 2002), which can be attributed to several central and peripheral in liver ROW without statistical significance. The MDMA group also mechanisms (Walubo and Seger, 1999; Dafters and Lynch, 1998). presented a significant increase in the liver %DLWC when compared However, this is the first report of a potentiation of MDMA-related to both control and ethanol groups. hyperthermia by ethanol pre-treatment resulting not only in significantly higher body temperature scores but also in more sustained 3.7. Oxidative stress biomarkers (TBARS, carbonyl groups, hyperthermia than the one induced by MDMA alone. A corre- GSH/GSSG) sponding higher increase of hepatic heat shock transcription factor No significant changes in hepatic lipid peroxidation were (HSF-1) activation was observed (Fig. 1). This reflects a natural reac- observed between control and MDMA groups, but a significant tion of the liver to high temperatures and functions as a defence increase in TBARS levels was observed in liver of animals from mechanism towards the hyperthermic aggression by increasing the ethanol group (compared to control group) that was not vis- the synthesis of heat shock proteins (HSPs). HSPs are highly con- ible in the ethanol + MDMA group (Table 2). The same occurs with served proteins with an important role in protein folding (acting the hepatic GSH/GSSG ratio that suffers a significant reduction in like molecular chaperones), signal transduction, cell growth and the ethanol group (comparing to control group), not observed in differentiation, and in the regulation of the actin cytoskeleton, the ethanol + MDMA group. contributing for cellular homeostasis (Pirkkala et al., 2001), coun- Additionally, there were found no important changes in hepatic teracting heat shock and developing adaptation to oxidative stress protein carbonyl groups. to avoid cell death (Santos-Marques et al., 2006). This defence system may be disrupted if the hyperthermic effect surpasses the 3.8. Hepatic anti-oxidant enzymes normal physiological variations, or in the presence of other risk factors. Indeed, animals exposed simultaneously to ethanol and The MDMA group presented a significant increase in GST activ- MDMA and affected by sustained hyperthermia, may be more prone ity while the ethanol + MDMA group had a significantly reduced to deleterious phenomena. GST activity compared to control group (Table 3). Hepatic GPx and The enhancement of the MDMA-induced hyperthermic catalase activities did not present significant differences between response by ethanol may seem unexpected since ethanol is known the control, ethanol and MDMA groups, but evidenced a significant to induce vasodilatation and decrease body temperature (Huttunen

Table 3 Hepatic antioxidant enzymes activities in the control, ethanol, MDMA and ethanol + MDMA groups

Groups GST (U/mg protein) GPx (U/mg protein) Catalase (U/mg protein) SOD (U/mg protein)

Mn SOD Cu/Zn SOD

Control 1112 ± 64 252.5 ± 21.4 182.9 ± 5.9 0.233 ± 0.024 3.071 ± 0.180 Ethanol 1080 ± 123 191.2 ± 11.5 187.7 ± 9.5 0.150 ± 0.011** 2.252 ± 0.128** MDMA 1626 ± 121*,# 231.5 ± 19.3 183.1 ± 7.1 0.239 ± 0.020# 3.463 ± 0.185### Ethanol + MDMA 885 ± 109@@ 173.9 ± 13.0* 149.0 ± 13.6# 0.259 ± 0.010## 3.123 ± 0.214#

Results are presented as mean ± S.E.M. from six animals. All groups were compared, however, only the statistically differences were indicated. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, compared to control group; #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001, compared to ethanol group; @P < 0.05, @@P < 0.01, compared to MDMA group. Author's personal copy

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et al., 1998). However, this hypothermic effect is only evident for 1995), and the subsequent increase of circulating levels of free fatty acute ethanol administration and it is affected by tolerance phe- acids (Sprague et al., 2007) that are thereafter taken up by the liver. nomena that can appear as early as between two consecutive However, in the present study, ethanol was not able to modify this exposures with a delay of 24 h after the first one (Khanna et al., effect despite being widely described that the chronic exposure to 1996). The result obtained in the present study is in agreement with ethanol leads to an increase in hepatic lipid content (de la Monte a previous report of Cassel et al., who showed that ethanol inhibits et al., 2008; Pritchard and Nagy, 2005). the MDMA-induced hyperthermia by the first day of treatment, In conclusion, the obtained results strongly suggest that the con- but not on subsequent treatment days, suggesting a tolerance sumption of ethanol increases the toxic effects induced by MDMA effect on ethanol-induced hypothermia (Cassel et al., 2004). exposure, with special relevance to its hyperthermic and hepato- Ethanol pre-treatment was also able to exacerbate MDMA- toxic effects. If fact, signs of hepatic necrosis and inflammatory induced hepatotoxicity, which could be ascertained by the response were evident and consistent with drug related hepatitis. significant increase of plasma transaminases activities, biomark- These results will certainly contribute for the understanding ers of hepatic lesion, when animals were exposed to ethanol of the health risks undertaken by polydrug abusers who combine and MDMA. The increase in GOT and GPT activities were already ecstasy and ethanol and who were already associated with MDMA- described for both compounds in humans (Ellis et al., 1996; Yue et related fatalities (Schifano et al., 2003). al., 2006) and rats (Beitia et al., 2000; Montet et al., 2002). This hepatotoxic effect was also confirmed by the decrease in liver weight Conflict of interest statement when MDMA was administered to ethanol pre-exposed mice and by histological analysis of liver sections by light and electron The authors declare that there are no conflicts of interest. microscopy, which gives further evidences that the concomitant exposure to MDMA and ethanol results in a marked aggravation of Acknowledgements the hepatotoxic effects exerted by each one of the compounds at isolated exposures. This work was supported by a project from FCT and POCI- ␬ The marked increase in the activation of NF- B, one of the 2010, Portugal, by FEDER European Community co-funding transcription factors involved in the activation of immediate early (POCI/SAU-FCF/57187/2004). Helena Pontes was the recipient response genes in response to injurious and inflammatory stim- of a PhD grant from “Fundaç ão para a Ciência e Tecnologia” uli (Chen and Shi, 2002), indicates a pro-inflammatory effect as (SFRH/BD/18527/2004). ascertained by the observation of activated Kupffer cells and cor- The authors would like to thank Doctor Georgina Correia-da- responds to another cellular defence mechanism by increasing the Silva from the Biochemistry Department of the Faculty of Pharmacy activity of antioxidant enzymes such as SOD (Lenart et al., 2007). of the University of Porto for kindly provide the Wistar rat 14th day ␬ However, the activation of both NF- B and HSF-1 was not suffi- placenta slides. cient to protect cells from the toxicity of MDMA and ethanol despite being efficient in avoiding sharp modifications in oxidative stress References parameters such as GSH/GSSG ratio, protein carbonyl groups con-

tent and TBARS. Unchanged glutathione levels were also detected Aebi, H., 1984. Catalase in vitro. Methods Enzymol. 105, 121–126. in rats after a single dose of MDMA by Beitia et al. (2000). The Barrett, S.P., Darredeau, C., Pihl, R.O., 2006. Patterns of simultaneaous polysubstance increase in SOD activity due to MDMA administration verified in use in drug using university students. Hum. Psychopharmacol. 21, 255–263. ´ Beitia, G., Cobreros, A., Sainz, L., Cenarruzabeitia, E., 2000. Ecstasy-induced toxicity this study was previously reported in the kidney by Ninkovicet in rat liver. Liver 20, 8–15. al. (2008). The decrease of SOD activity following chronic ethanol Ben Hamida, S., Bach, S., Plute, E., Jones, B.C., Kelche, C., Cassel, J.C., 2006. Ethanol- consumption is also in accordance with previous reports by Chen ecstasy (MDMA) interactions in rats: preserved attenuation of hyperthermia et al. (2002). The increase in SOD activity is a specific adaptive and potentiation of hyperactivity by ethanol despite prior ethanol treatment. Pharmacol. Biochem. Behav. 84, 162–168. mechanism to a stress condition due to an increased superoxide Breen, C., Degenhardt, L., Kinner, S., Bruno, R., Jenkinson, R., Matthews, A., Newman, generation associated with MDMA exposure. Increased expression J., 2006. Alcohol use and risk taking among regular ecstasy users. Subst. Use of SOD leads to removal of reactive superoxide radical anions, min- Misuse 41, 1095–1109. Buege, J.A., Aust, S.D., 1978. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 52, imizing the generation of cytotoxic peroxynitrite and terminating 302–310. lipid peroxidation-induced chain reactions. Carmo, H., Brulport, M., Hermes, M., Oesch, F., de Boer, D., Remião, F., Carvalho, F., Catalase and GPx are other antioxidant enzymes whose activi- Schön, M.R., Krebsfaenger, N., Doehmer, J., Bastos, M.L., Hengstler, J.G., 2007. CYP2D6 increases toxicity of the designer drug 4-methylthioamphetamine (4- ties protect cells from the toxicity of H2O2. The observed decrease MTA). Toxicology 229, 236–244. of their activities in the ethanol + MDMA group evidenced that Carmo, H., Brulport, M., Hermes, M., Oesch, F., Silva, R., Ferreira, L.M., Branco, the hepatic oxidative injury was significantly more intense when P.S., Boer, D., Remião, F., Carvalho, F., Schön, M.R., Krebsfaenger, N., Doehmer, J., Bastos, M.L., Hengstler, J.G., 2006. Influence of CYP2D6 polymorphism on MDMA was administered to ethanol pre-exposed mice when com- 3,4-methylenedioxymethamphetamine (‘Ecstasy’) cytotoxicity. Pharmacogenet. pared to the other studied groups. The effect of MDMA itself on the Genomics 16, 789–799. activities of antioxidant enzymes confirmed the results previously Carmo, H., de Boer, D., Remião, F., Carvalho, F., dos Reys, L.A., de Lour- des Bastos, M., 2004a. Metabolism of the designer drug 4-bromo-2,5- obtained by our group showing no significant changes in the activ- dimethoxyphenethylamine (2C-B) in mice, after acute administration. J. ities of hepatic Mn SOD, Cu/Zn SOD, GPx and Catalase by 10 mg/kg Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 811, 143–152. MDMA (Carvalho et al., 2002). The only exception was GST, which Carmo, H., Hengstler, J.G., de Boer, D., Ringel, M., Carvalho, F., Fernandes, E., Remião, F., presented an increase in its activity never reported before. The pre- dos Reys, L.A., Oesch, F., de Lourdes Bastos, M., 2004b. Comparative metabolism of the designer drug 4-methylthioamphetamine by hepatocytes from man, mon- treatment with 12% ethanol seems to avoid the observed increase key, dog, rabbit, rat and mouse. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 369, on GST activity provoked by the administration of MDMA, which 198–205. can be explained by the GST-lowering effect already described for Carmo, H., Hengstler, J.G., de Boer, D., Ringel, M., Remião, F., Carvalho, F., Fernandes, E., dos Reys, L.A., Oesch, F., de Lourdes Bastos, M., 2005. Metabolic pathways of ethanol (Pari and Suresh, 2008). 4-bromo-2,5-dimethoxyphenethylamine (2C-B): analysis of phase I metabolism Our results also confirm the results of previous reports that with hepatocytes of six species including human. Toxicology 206, 75–89. addressed an increase in hepatic lipid content to MDMA consump- Carvalho, F., Remião, F., Soares, M.E., Catarino, R., Queiroz, G., Bastos, M.L., 1997. d- ␤ Amphetamine-induced hepatotoxicity: possible contribution of catecholamines tion (Beitia et al., 2000) probably due to an increase of -adrenergic and hyperthermia to the effect studied in isolated rat hepatocytes. Arch. Toxicol. receptors-dependent lipolysis in the skeletal muscle tissue (Unger, 71, 429–436. Author's personal copy

H. Pontes et al. / Toxicology 252 (2008) 64–71 71

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Trabalho III. Effect of chronic ethanol exposure on the hepatotoxicity of ecstasy in mice: An ex vivo study.

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Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920 www.elsevier.com/locate/toxinvit

Eﬀect of chronic ethanol exposure on the hepatotoxicity of ecstasy in mice: An ex vivo study

Helena Pontes a,*, Maria Joa˜o Santos-Marques a, Eduarda Fernandes b, Jose´ Alberto Duarte c, Fernando Remia˜o a,Fe´lix Carvalho a, Maria Lourdes Bastos a,*

a REQUIMTE, Toxicology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Anı´bal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal b REQUIMTE, Physical-Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Anı´bal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal c CIAFEL, Sport Biology Department, Faculty of Sport Science, University of Porto, Rua Dr. Pla´cido Costa 91, 4200-450 Porto, Portugal

Received 19 October 2007; accepted 14 January 2008 Available online 26 January 2008

Abstract

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA) is frequently consumed at ‘‘rave” parties by polydrug users that usually take this drug in association with ethanol. In addition, many young people are repeatedly exposed to ethanol, which likely leads to tolerance phenomena. Both compounds are metabolized in the liver, with formation of hepatotoxic metabolites, which gives high relevance to the evaluation of their putative toxicological interaction. Therefore, the aim of this study was to evaluate the toxicity induced by 0.8 and 1.6 mM MDMA to freshly isolated hepatocytes obtained from ethanol-treated mice whose tap drinking water was replaced by a 5% ethanol solution for 1 week and, afterwards, by a 12% ethanol solution for 8 weeks (ethanol group) comparatively to non-treated animals (non-ethanol group). The hepatocytes were incubated under normothermic and hyperthermic conditions in order to simulate in vitro the hyperthermic response induced in vivo by MDMA, a condition that has been recognized as a life-threatening effect associated with MDMA exposure and implicated in its hepatotoxicity. Six mice treated under the same protocol as the ethanol group were used for histological analysis, and compared to non-ethanol-treated animals. The pre-treatment of mice with ethanol caused a significant decrease in the hepatocytes yield in the isolation procedure comparatively to the non-ethanol group, which can be explained by an increase in collagen deposition along the hepatic parenchyma as observed in the histological analysis. The initial cell viability of hepatocytes suspensions was similar between ethanol and non-ethanol groups. However, the ethanol group showed a higher GSH oxidation rate, which was enhanced under hyperthermia. Additionally, a concentration-dependent MDMA-induced loss of cell viability and ATP depletion was observed for both groups, at 41 °C. In conclusion, the repeated treatment with ethanol seems to increase the vulnerability of freshly isolated mice hepatocytes towards pro-oxidant conditions, as ascertained by the increase in collagen deposition, lower hepatocyte yield and decreased glutathione levels. However, MDMA toxicity to the isolated hepatocytes was independent of ethanol pre-treatment, while significantly dependent on incubation temperature. Ó 2008 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Keywords: Ethanol, 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA); Hepatocytes; Oxidative stress

1. Introduction sumption appears to be spreading in many parts of the world, with a high prevalence among young people 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA or (EMCDDA, 2005; SAMHSA, 2005). MDMA consump- ecstasy), is a commonly used drug of abuse, whose con- tion results in a plethora of systemic and organ-speciﬁc eﬀects, including hepatic toxicity (Maurer et al., 2004)

* and also hyperthermia (Crean et al., 2006; Izco et al., Corresponding authors. Tel.: +351 222078979; fax: +351 222003977 2007b) that can be, at least in part, responsible for the (H. Pontes). E-mail addresses: hpontes@ﬀ.up.pt (H. Pontes), mlbastos@ﬀ.up.pt hepatic cellular damage (Santos-Marques et al., 2006). (M.L. Bastos). Various factors may contribute to MDMA-induced liver

H. Pontes et al. / Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920 911 toxicity, including the metabolism of MDMA (de la Torre Previous studies on MDMA and EtOH interactions et al., 2004), the increased efflux of neurotransmitters (de la have focused on pharmacokinetic (Bilsky et al., 1990; Rez- Torre et al., 2004), the oxidation of biogenic amines (Carv- vani et al., 1992; Hernańdez-Lo´pez et al., 2002; Ramaekers alho et al., 2004b), and hyperthermia (Green et al., 2004). and Kuypers, 2006), behavioural (Cassel et al., 2004; Cassel Hyperthermia corresponds to a well known life-threatening et al., 2005; Hamida et al., 2006; Ben Hamida et al., 2007; effect of MDMA in vivo (Hall and Henry, 2006) that is Izco et al., 2007a) and physiologic and psychologic (Pacifici highly dependent on ambient temperature (Carvalho et al., 2001) consequences of these drugs combination. No et al., 2002a; Von Huben et al., 2007). Our group has hepatic toxicological interactions between these com- already shown that the in vitro toxic effects induced by pounds have been reported yet. MDMA in isolated mouse hepatocytes are exacerbated Thus, the aim of the present study was to evaluate, under hyperthermic conditions (Carvalho et al., 1997; under normothermic (37 °C) and hyperthermic (41 °C) Carvalho et al., 2001). conditions, the toxic effects of MDMA in an ex vivo model, MDMA consumers are often polydrug abusers. Ethanol trying to simulate the most common pattern of EtOH and (EtOH) is, by far, the most popular drug among youth MDMA use and the hyperthermic response that occurs (Smart and Ogborne, 2000; Marques-Vidal and Dias, in vivo as a consequence of MDMA consumption. For this 2005) and it is often consumed in large amounts along with purpose, the toxicity induced by MDMA to freshly isolated MDMA use (Tossmann et al., 2001; Barrett et al., 2006). In hepatocytes obtained from EtOH-treated mice was evalu- fact, EtOH is often taken with MDMA, especially at the ated. The study included the quantification of the following beginning of the night, to get a stronger/better ‘‘high” parameters: hepatocytes yield in the isolation procedure and, in the last part of the night, EtOH is taken in high dos- and initial cell viability, reduced (GSH) and oxidised ages to decrease the long-lasting effects of MDMA such as glutathione (GSSG) content, adenosine triphosphate irritability and restlessness that persist beyond its empath- (ATP) levels and lactate dehydrogenase (LDH) leakage. ogenic and entactogenic effects (Schifano, 2004). Furthermore, one separate group of ethanol-treated mice To study the putative interaction between these two (that followed the same administration protocol as the compounds, it is crucial to consider that many young peo- ethanol group) was used for histological analysis, and ple are exposed to EtOH early in life, sometimes even compared to the control group. repeatedly, which means that many may have developed some tolerance to EtOH when taking MDMA for the first 2. Materials and methods time and concomitantly with EtOH (Hamida et al., 2006). Thus, the study of EtOH–MDMA interaction should not 2.1. Chemicals be restricted to the acute consumption of these substances. It is of extreme importance to develop an experimental All reagents used in this study were of analytical model considering this common chronic abuse pattern, grade. Collagenase (type I), bovine serum albumin (frac- since the chronic exposure to EtOH prior to the first con- tion V), 4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic tact with MDMA may induce deleterious effects that can acid (HEPES), ethyleneglycol-bis-(b-aminoethylether)- influence MDMA toxicity. N,N,N0,N0-tetraacetic acid (EGTA), b-nicotinamide ade- Both compounds, EtOH and MDMA, are metabolized nine dinucleotide reduced form (b-NADH), b-nicotinamide in the liver leading to the formation of hepatotoxic metab- adenine dinucleotide phosphate reduced form (b- olites. Most EtOH biotransformation occurs in the liver, NADPH), pyruvic acid, 2-vinylpyridine, reduced glutathi- mainly via oxidation catalyzed by alcohol dehydrogenase one (GSH), oxidised glutathione (GSSG), glutathione (ADH) and by a cytochrome P450 isoform (CYP2E1) into reductase (EC 1.6.4.2), 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid Ò the highly toxic metabolite, acetaldehyde (Gemma et al., (DTNB), trypan blue solution, trizma hydrochloride, D- 2006). The metabolism of MDMA involves N-demethyla- luciferin sodium salt and luciferase (EC 1.13.12.7) were tion to 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) and both obtained from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). MDMA and MDA are O-demethylenated to catechols [N- Perchloric acid, trichloroacetic acid, 2-thiobarbituric acid, methyl-a-methyldopamine (N-Me-a-MeDA) and a-meth- absolute ethanol (EtOH) and all other chemicals were pur- yldopamine (a-MeDA), respectively] that can undergo oxi- chased from Merck (Darmstadt, Germany). 3,4-Methylen- dation into the corresponding o-quinones (Carvalho et al., edioxymethamphetamine (HCl salt) was extracted and 2004b). These highly reactive molecules can alkylate crucial purified from high purity MDMA tablets that were pro- cellular proteins and/or DNA and further: (i) redox cycle vided by the Portuguese Criminal Police Department. originating semiquinone radicals, leading to the generation The obtained salt was pure and fully characterized by of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen spe- NMR and mass spectrometry methodologies. cies (RNS); (ii) undergo irreversible 1,4-intramolecular cyclization with subsequent formation of aminochromes 2.2. Animals and (iii) conjugate with glutathione (GSH) to form a gluta- thionyl adduct, which remains redox active and can further Animal experiments were licensed by the Portuguese react with GSH and protein thiols (Carvalho et al., 2004b). General Directorate of Veterinary Medicine. Housing Author's personal copy

912 H. Pontes et al. / Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920 and experimental treatment of animals were in accordance shaking water bath (90 oscillations/min) for 30 min at with the Guide for the Care and Use of Laboratory Ani- 37 °C and continuously gassed with carbogen (95% O2/ mals from the Institute for Laboratory Animal Research 5% CO2). After this pre-incubation period, cells were (ILAR, 1996). divided and the experiments were performed, in parallel, Adult male CD1 mice (Charles-River Laboratories, Bar- at 37 °Cand41°C. Sample aliquots were collected at time celona, Spain), weighing 35–45 g were used. For at least 0 and then the cells were incubated with MDMA hydro- 1 week prior to use, the animals were acclimatized in poly- chloride at final concentrations of 0.8 and 1.6 mM. The ethylene cages, lined with wood shavings, with wire-mesh tested MDMA concentrations were chosen based on previ- tops, at an ambient temperature of 20 ± 2 °C, humidity ous studies (Carvalho et al., 2001; Carvalho et al., 2004b) between 40% and 60% and 12 h/12 h light/dark cycle (light and on preliminary experiments, using this experimental on from 8.00 to 20.00 hours), in our animal facilities, hav- model. Additionally, liver concentrations of MDMA and ing standard chow and tap drinking water ad libitum. After its metabolites have been found to be substantially higher this adaptation period, the animals were divided into two (up to 18 times) than blood concentrations (Garcia-Rep- groups: EtOH and non-EtOH groups. In the EtOH group etto et al., 2003). Taking into account that most cases of the tap drinking water was replaced by a 5% EtOH solu- serious toxicity or fatality have involved MDMA blood tion for 1 week and, afterwards, by a 12% EtOH solution levels ranging from 2.5 to 50 lM, the concentrations used for 8 weeks until the hepatocytes isolation procedure. The in the present study are most likely attained in the in vivo replacement of water for 5% ethanol before 12% ethanol situation. On the other hand, it is important to evaluate corresponds to a required adaptation period, to avoid aver- the interactions of MDMA and its metabolites with cellular sion of mice to a high ethanol concentration in the drinking components, which is only possible using worst-case fluid, since these animals do not have natural preference for approach concentrations. The control cells were incubated 12% ethanol. The non-EtOH group remained drinking tap under the same conditions with an equivalent volume of water ad libitum, during the same period. Surgical proce- Krebs–Henseleit solution. Additional sample aliquots were dures for the isolation of hepatocytes were performed collected every hour, during a period of incubation of 3 h under anaesthesia and carried out between 10 a.m. and and were used for the evaluation of cell viability, and quan- 11 a.m. tification of GSH, GSSG, and ATP. The evaluation of cell Six mice from the EtOH group and six mice from the viability was accomplished in the same day of the experi- non-EtOH group were used for histological analysis. After ment, and the remaining samples were kept frozen 8 weeks of treatment, livers were excised under anaesthesia (80 °C) until assay. and samples were processed for optic microscopy as indicated in 2.5. 2.4. Biochemical analysis

2.3. Hepatocytes isolation and incubation During the course of the experiments, cell viability was determined by the lactate dehydrogenase (LDH) leakage Hepatocytes isolation was performed by collagenase method. perfusion as previously described (Carvalho et al., The GSH and GSSG contents in cell suspensions were 2004b). Briefly, after anaesthesia, a cannula was introduced determined by the DTNB-GSSG reductase recycling assay in the hepatic portal vein and a Hank solution with EGTA as described before (Carvalho et al., 2004a), with some and albumin was perfused to remove the blood from the modifications. Briefly, cell suspension aliquots were precip- sinusoids and to chelate calcium, cleaving the hepatic des- itated with equal volume of 10% HClO4 and centrifuged mossomes. In a second stage, the liver was perfused with a for 2 min at 16,000g (4 °C). The supernatants were kept Hank solution including collagenase and its co-factor cal- frozen at –80 °C until quantification. The thawed acidic cium. This enzyme hydrolyses the collagen molecules that supernatant was neutralized with equal volume of 0.76 M ensure the mechanical stability of the liver. The third step KHCO3 and centrifuged for 2 min at 16,000g (4 °C). For of this protocol consisted in a soft mechanical liver dissoci- measurement of total glutathione (GSHt), 100 lL/well of ation in Krebs–Henseleit solution with albumin and the the neutralized supernatants, standards or blank were cellular suspension obtained was then purified by filtration, added in triplicate to 96-well microtiter plates, followed centrifugation and washings with Krebs–Henseleit buffer by 65 lL/well of freshly prepared reagent containing supplemented with 12.5 mM HEPES (pH 7.4) to remove 0.69 mM NADPH and 4 mM DTNB in 72 mM phosphate non-parenchymatous cells, non-viable hepatocytes and buffer. Plates were then incubated at 30 °C in a plate reader other contaminants from the suspension. The viability of (BioTek Instruments, Vermont, US), for 15 min prior to the isolated hepatocytes was estimated by the trypan blue the addition of 40 lL/well of a 10 IU/mL glutathione exclusion test and was always higher than 80%. reductase (GR) solution in phosphate buffer. The stoich- Aliquots of isolated hepatocytes suspensions containing metric formation of 5-thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) was 106 viable cells per mililiter in Krebs–Henseleit solution followed for 3 min at 415 nm and compared to a standard supplemented with 12.5 mM HEPES (pH 7.4) were pre- curve. For the determination of GSSG, 10 lL of 2-vinyl- incubated, before the beginning of the experiments, in a pyridine were added to 200 lL aliquots of acidic Author's personal copy

H. Pontes et al. / Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920 913 supernatant and mixed continuously for 1 h for derivatiza- EtOH group versus 31.1 ± 2.4 millions for the EtOH group tion of GSH. GSSG was then measured as described above (P < 0.01)]. Accordingly, in the histological analysis it was for total glutathione. The molar GSH levels were calcu- observed that liver sections of EtOH pre-treated animals lated by subtracting the GSSG content from the total glu- presented a higher deposition of collagen fibres than the tathione content (GSH = GSHt 2 GSSG). control animals along the hepatic parenchyma (Fig. 1). ATP levels were evaluated through a bioluminescent However, there were no statistical differences between cell technique based in an enzyme, luciferase, that catalyses viabilities of the hepatocytes suspensions obtained from the formation of light from ATP and luciferin, as described mice of non-EtOH (87.8 ± 1.3%) or EtOH pre-treated before (Capela et al., 2007). The emitted light intensity is (86.3 ± 1.1%) groups. linearly related to the ATP concentration and was measured using a 96-well Microplate Luminometer (BioTek 3.2. Toxicity parameters Instruments, Vermont, US). Samples in 5% HClO4 were neutralized with 0.76 M KHCO3. After centrifugation for The toxicity of MDMA to freshly isolated hepatocytes 2 min at 16,000g (4 °C), 100 lL of the neutralized superna- obtained from non-EtOH mice and mice repeatedly tants were added to each well of a 96-well microplate con- exposed to 12% EtOH was evaluated, under normothermic taining 100 lL of luciferin–luciferase assay solution and hyperthermic conditions, by measuring (i) the redox [0.15 mM luciferin, 300,000 light units of luciferase from status of the hepatocytes suspensions by the quantification Photinus pyralis (American firefly), 50 mM glycine, of total glutathione (GSHt), GSH and GSSG levels, (ii) the 10 mM MgSO4, 1 mM Tris, 0.55 mM EDTA, 1%BSA energy status by determination of cellular ATP concentra- (pH 7.6)]. ATP calibration curves were routinely performed tions and (iii) the cell death-rate through the quantification (ATP standard stocks in HClO4 5% were kept at 80 °C of LDH leakage to the suspension buffer. until the assay). 3.2.1. Redox status of the hepatocytes suspensions 2.5. Tissue preparation for optic microscopy – histological 3.2.1.1. Effect of EtOH pre-treatment. Both GSH and analysis GSSG levels presented variations, which were dependent on mice EtOH pre-treatment, MDMA concentration, tem- For optic microscopy, after excision, livers were sliced in perature and time of incubation (Fig. 2). The initial levels 2–4 mm3 pieces, approximately, and fixed in 4% formalde- of total and reduced glutathione were significantly hyde. The fixed pieces were dehydrated with graded etha- decreased in the hepatocytes from the EtOH-treated group nol and included in paraffin blocks. Benzene was used in (Fig. 2b and d). The non-EtOH group presented initial the transition between dehydration and impregnation. GSHt levels of 162.3 ± 11.4 nmol/106 cells and Semi-thin sections (4 lm) were cut in a microtome, applied 137.6 ± 11.2 nmol/106 cells of GSH while the EtOH group on silane-coated slides and deparaffinized. The deparaffi- presented 101.1 ± 5.9 nmol/106 cells of GSHt (P < 0.01) nated sections were stained for collagen detection with and 71.0 ± 6.2 nmol/106 cells of GSH (P < 0.01). These Weigert’s haematoxylin, acid alcohol (for differentiation) results correspond to a depletion of the GSHt levels and and Van Gieson’s staining solution. This stain evidences GSH levels of approximately 40% and 50%, respectively, collagen fibres with a red coloration. in the EtOH-group. In accordance, the GSSG levels in the EtOH group were significantly increased, around 25% 2.6. Statistical analysis (15.1 ± 1.0 nmol of GSSG/106 cells for the EtOH group versus 12.4 ± 0.6 nmol of GSSG/106 cells for the non- Results are presented as mean ± S.E.M. (from at least EtOH group). However, it is interesting to notice that the five experiments of different preparations of hepatocytes). variation trends of GSH and GSSG levels during the 3 h For hepatocyte yield analysis, comparisons were made by period of hepatocytes incubation were similar between unpaired t-test with Welch’s correction. All other statistical the hepatocytes obtained from EtOH and non-EtOH comparisons were performed by one-way analysis of vari- groups. In both groups, GSH decreased and GSSG ance (ANOVA) followed by the Bonferroni’s post-hoc test. increased, in a time-, concentration- and temperature- Significance was accepted at P < 0.05. dependent manner, although to a different extension.

3. Results 3.2.1.2. Effect of hyperthermia. GSH oxidation was clearly enhanced under hyperthermic conditions and significantly 3.1. Hepatocytes yield and initial cell viability increased when mice were pre-treated with EtOH. In fact, after 3 h of incubation, the hepatocytes obtained from During the perfusion step of the isolation procedure, the the non-EtOH group showed a GSH depletion more severe livers of EtOH pre-treated animals offered high resistance at 41 °C than at 37 °C (135.5 ± 48.0 nmol/106 cells at 37 °C to perfusion, reducing the efficiency of this process, and versus 87.6 ± 30.3 nmol/106 cells at 41 °C, for control resulting in significantly fewer viable cells at the end of cells). Considering the EtOH-group, under normothermic the isolation procedure [42.7 ± 2.8 millions for the non- conditions the GSH concentrations in the hepatocytes are Author's personal copy

914 H. Pontes et al. / Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920

Fig. 1. Histologycal analysis of liver sections obtained from control (a and b) and EtOH pre-treated animals (c and d) with Van Gieson staining for collagen. The deposition of collagen fibres is evidenced by an increase of red coloured filaments. approximately half of the concentrations of the non-EtOH earlier for 1.6 mM MDMA [GSH levels varied from group (55.2 ± 21.2 nmol GSH/106 cells for EtOH group 137.6 ± 11.2 nmol GSH/106 cells at t = 0 h to 66.2 ± 20.1 versus 135.5 ± 48.0 nmol GSH/106 cells for non-EtOH nmol GSH/106 cells at t =2h (P < 0.05) and to group, considering control cells at 37 °C and t = 3 h). 20.1 ± 19.0 nmol GSH/106 cells at t =3h(P < 0.001)] and Under hyperthermia, these concentrations can reach values also observed after 3 h for hepatocytes incubation with 6 times lower than those in the hepatocytes obtained from 0.8 mM MDMA [GSH levels varied from 137.6 ± 11.2 mice not exposed to EtOH (19.9 ± 7.4 nmol GSH/106 cells nmol GSH/106 cells at t = 0 h to 61.6 ± 8.4 nmol GSH/ for EtOH group versus 87.6 ± 30.3 nmol GSH/106 cells for 106 cells (P < 0.05)]. In hepatocytes obtained from EtOH non-EtOH group, considering control cells at 41 °C and pre-treated mice, the GSH depletion induced by MDMA t = 3 h) (Fig. 2). was more pronounced, especially under hyperthermic conditions (44.4 ± 17.1 nmol GSH/106 cells at 37 °C versus 3.2.1.3. Effect of MDMA. Hepatocytes incubation with 18.3 ± 5.8 nmol GSH/106 cells at 41 °C, for 1.6 mM MDMA also increases their oxidative stress status. The cells MDMA at t = 3 h). obtained from the non-EtOH group showed a GSH oxida- Differences in GSH depletion between MDMA concen- tion dependent on MDMA concentration, incubation time trations were not evident. However, hepatocytes obtained and temperature conditions (Fig. 2). Under normothermic from the EtOH-treated group showed, for both MDMA conditions there was a significant depletion of GSH concentrations, a higher depletion of GSH cellular levels observed after 3 h of hepatocytes incubation with 1.6 mM compared to the non-EtOH group. The initial levels of MDMA [from 137.6 ± 11.2 nmol GSH/106 cells, at GSSG were significantly higher for the EtOH-treated t = 0 h, to 58.9 ± 16.7 nmol GSH/106 cells, at t =3h group [15.1 ± 1.0 nmol GSSG/106 cells for EtOH group (P < 0.05)]. This GSH depletion was enhanced by hyper- versus 12.4 ± 0.6 nmol GSSG/106 cells for non-EtOH thermia. In fact, at 41 °C, the GSH depletion was observed group (P < 0.01)]. A time-dependent GSSG increase was Author's personal copy

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Non-EtOH group EtOH group a b 300 300 Control 800μM MDMA 1600μM MDMA Control 800μM MDMA 1600μM MDMA

200 c 200 b c c c c c b c b 100 100 kkk c c

kk k a Total GSH (nmol/million GSH Total cells) Total GSH (nmol/millio n cells)

Normothermia (37ºC) a 0 0 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 Time (h) Time (h) GSH GSSG GSH GSSG c d 300 300 Control 800μM MDMA 1600μM MDMA Control 800μM MDMA 1600μM MDMA

c f c c f 200 f c c 200 c c d f c f f a

b c 100 100 kk kc c c c a b al GSH (nmol/million cells) kkk a a Tot Total GSH (nmol/millioncells)

Hyperthermia (41ºC) a c b b b a 0 0 b 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 0 1 2 3 Time (h) Time (h) GSH GSSG GSH GSSG

Fig. 2. Effect of MDMA and hyperthermia (c and d) on GSH and GSSG levels in freshly isolated mouse hepatocytes from non-EtOH (a and c) and EtOH groups (b and d). Results are represented as mean ± SEM from at least five experiments. a P < 0.05, b P < 0.01, c P < 0.001, compared to time zero. d P < 0.05, f P < 0.001, compared to 37 °C. k P < 0.01, compared to non-EtOH group. observed in both groups (51.0 ± 7.8 nmol GSSG/106 cells 0.8 mM MDMA and 2 lM for cells incubated with for non-EtOH group and 1.6 mM MDMA at 37 °C and 1.6 mM MDMA. t = 3 h) and were significantly potentiated by hyperthermia on the non-EtOH group (93.1 ± 8.0 nmol GSSG/106 cells 3.2.3. Cell death-rate for the non-EtOH group and 1.6 mM MDMA at 41 °C Fig. 4 represents the death-rate of hepatocytes obtained and t = 3 h). from non-EtOH and EtOH-treated mice, incubated under the different conditions considered in this study, as evalu- 3.2.2. Cellular energy status ated by the LDH leakage. When hepatocytes were incu- Fig. 3 illustrates the energy status of the isolated hepato- bated at 37 °C(Fig. 4a and b), LDH leakage was similar cytes under the different experimental conditions evaluated to the control for EtOH and non-EtOH groups and for by the quantification of ATP levels. No significant differ- both MDMA concentrations tested. The hepatocytes sus- ences were observed in the initial levels of ATP between pensions showed a time-dependent loss of cell viability non-EtOH and EtOH groups. In both groups, under nor- expressed by an increase of LDH leakage, which reached mothermic conditions, ATP levels remained unchanged significance at the 3 hour time-point (23.9 ± 0.9% of during all the experiment for control cells and both LDH leakage at t = 0 h, compared to 43.2 ± 1.4% at MDMA concentrations tested. Under hyperthermic condi- t = 3 h for control cells). Under hyperthermic conditions, tions ATP levels showed a significant concentration- and the time-dependent loss of cell viability was aggravated time-dependent decrease. However, no differences were and dependent on MDMA concentration. For example, observed between EtOH and non-EtOH groups. In fact, LDH leakage results were 55.1 ± 3.3%, 82.3 ± 3.9% and for both groups, the ATP concentration, at t = 0 h, was 91.2 ± 0.4% for cells incubated with 0, 0.8 and 1.6 mM about 45 lM decreasing, at t = 3 h, to levels nearly MDMA respectively, for EtOH group at t =3h 20 lM for control cells, 10 lM for cells incubated with (P < 0.001 comparing to t = 0 h and to normothermic Author's personal copy

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Non-EtOH group EtOH group a b 55 55

50 50

45 45

40 40 M) M)

μ 35 μ 35 b 30 30

25 25

20 20

15 15

10 10 ATP Concentration ( ATP Concentration ( 5 Non-EtOH group Control 5 EtOH group Control Non-EtOH group 800μM MDMA EtOH group 800μM MDMA 0 0 Normothermia (37ºC) Non-EtOH group 1600μM MDMA EtOH group 1600μM MDMA -5 -5 0123 0123 Time (h) Time (h)

c 55 d 55

50 50

45 45

40 40 M) M) d

μ 35 μ 35 a ( b,f 30 30 a,f a 25 25 c,f 20 c,d 20 b,f,g 15 15 c,f,g 10 10

c,f,i ATP Concentration ATP Concentration ( c,f,g 5 Non-EtOH group Control 5 EtOH group Control c,f,i

Hyperthermia (41ºC) Non-EtOH group 800μM MDMA EtOH group 800μM MDMA 0 c,f,i 0 Non-EtOH group 1600μM MDMA EtOH group 1600μM MDMA -5 -5 0123 0123 Time (h) Time (h)

Fig. 3. Effect of MDMA and hyperthermia (c and d) on ATP levels in freshly isolated mouse hepatocytes from non-EtOH (a and c) and EtOH groups (b and d). Results are represented as mean ± SEM from at least five experiments. a P < 0.05, b P < 0.01, c P < 0.001, compared to time zero. d P < 0.05, f P < 0.001, compared to 37 °C. g P < 0.05, iP < 0.001 compared to control cells. conditions). However, there were no significant differences tocytes since, during the washing steps of the isolation pro- between the non-EtOH and EtOH groups. cedure, damaged cells were removed. The toxic effects of EtOH pre-treatment were also evidenced by the GSH content at the beginning of the exper- 4. Discussion iment (137.6 ± 11.2 nmol GSH/106 cells for non-EtOH group versus 71.0 ± 6.2 nmol GSH/106 cells for EtOH Our experimental observations clearly showed that the group) and during the hepatocytes incubation period as repeated in vivo treatment of mice with 12% EtOH for expressed by a severe depletion of glutathione levels, which 8 weeks compromised the hepatocyte yield after isolation. were further depleted upon MDMA exposure. In the non- This handicap for the isolation of hepatocytes from etha- EtOH group, the cells incubated with MDMA under nol-treated animals was not reported before, although this hyperthermic conditions presented a higher depletion of lower hepatocyte yield can be explained by the occurrence GSH levels and a higher increase of GSSG levels than of collagen deposition during chronic EtOH consumption the correspondent control cells (neither exposed to ethanol (Seitz and Stickel, 2006) as confirmed by the histological nor to MDMA). GSH depletion after MDMA exposure data presented in Fig. 1, which can affect the hepatic perfu- was previously reported in isolated rat (Carvalho et al., sion of the collagenase solution and, therefore, the hepato- 2004b) and mouse (Carvalho et al., 2001) hepatocytes, as cytes isolation. In spite of the well known LDH releasing it happened in the present study. However, the GSH deple- effects of ethanol (Henzel et al., 2004), in the present study, tion induced by MDMA and/or hyperthermia was not the pre-treatment of mice with EtOH did not result in sta- accompanied by a proportional increase in GSSG levels, tistical differences between the initial viability of hepato- which means that this GSH decrease was due, not only cytes, obtained from EtOH and non-EtOH groups, which to glutathione oxidation, but mainly to the formation of is likely due to a selective isolation of EtOH tolerant hepa- glutathione conjugates with MDMA reactive metabolites Author's personal copy

H. Pontes et al. / Toxicology in Vitro 22 (2008) 910–920 917

Non-EtOH group EtOH group a b 100 100 Non-EtOH group Control EtOH group Control μ μ 90 Non-EtOH group 800 M MDMA 90 EtOH group 800 M MDMA Non-EtOH group 1600 μM MDMA EtOH group 1600 μM MDMA 80 80 C) º 70 70

60 60

50 c 50 c c 40 40 c % LDH Leakage

% LDH Leakage b b 30 a 30

20 20 Normothermia (37 10 10 0123 0123 Time (h) Time (h) c d 100 100 Non-EtOH group Control EtOH group Control μ c,f,i μ c,f,i 90 Non-EtOH group 800 M MDMA 90 EtOH group 800 M MDMA μ μ Non-EtOH group 1600 M MDMA EtOH group 1600 M MDMA c,f,i

C) 80 80

º c,f,i

70 70 c,f,h c,e,i 60 60 c,f,g c,e

50 c,d,h c 50 a 40 40 a % LDH Leakage c % LDH Leakage 30 30 a

Hyperthermia (41 20 20

10 10 0123 0123 Time (h) Time (h)

Fig. 4. Eﬀect of MDMA and hyperthermia (c and d) on LDH leakage in freshly isolated mouse hepatocytes from non-EtOH (a and c) and EtOH groups (b and d). Results are represented as mean ± SEM from at least ﬁve experiments. a P < 0.05, b P < 0.01, c P < 0.001, compared to time zero. d P < 0.05, e P < 0.01, f P < 0.001, compared to 37 °C. g P < 0.05, h P < 0.01, i P < 0.001 compared to control cells.

(Carvalho et al., 2002b; Carvalho et al., 2004a). Since GSH incubation of isolated rat hepatocytes (Cobreros et al., is a crucial endogenous antioxidant in cell protection (Han 1997) and primary cultures of human and rat hepatocytes et al., 2006), its depletion may increase the cell susceptibil- (Castilla et al., 2004; Yang et al., 2005) with high concen- ity to the deleterious effects of reactive compounds, ROS trations of EtOH (P100 mM) increased oxidative stress and RNS, formed within the cells during the metabolism markers such as lipid peroxidation and GSH depletion. of MDMA and EtOH. However, the GSH depletion elic- Other studies demonstrated that either acute or chronic ited by EtOH pre-treatment (Fig. 2) did not aggravate EtOH administration to experimental animals decreased the MDMA-induced cell death as demonstrated by the tissue levels of antioxidants, including GSH, in the liver similar LDH leakage in both groups (Fig. 4). A possible (Nordmann et al., 1992), suggesting that the impairment explanation is the decreased formation of toxic GSH con- of cellular antioxidant defences along with the formation jugates with the catechol metabolites of MDMA, since less of ROS plays a role in causing oxidative damage associated GSH is available for conjugation. As already confirmed by with EtOH hepatotoxicity (Yang et al., 2005). On the other our group, these conjugates are more toxic than their par- hand, recent reports indicate that low EtOH concentra- ent compounds for primary cultures of rat and human tions (65 mM) were able to reduce the basal level of intra- renal proximal tubular cells (Carvalho et al., 2002b) and cellular oxidative stress markers in primary cultures of for rat cortical neuronal serum-free cultures (Capela human and rat hepatocytes (Castilla et al., 2004) while, et al., 2006). Deaciuc and colleagues described that GSH and GSSG The GSH depletion that results from the EtOH pre- contents in hepatocytes were not affected when rats were treatment is in accordance with the results previously fed during 7 weeks with an alcohol-containing liquid diet obtained by other groups, which evidenced that long-term (Deaciuc et al., 1999). Author's personal copy

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Another toxic event observed in cells exposed to Thus, the possible relationship of such findings requires MDMA and EtOH was a concentration- and time-depen- further in vivo testing to clarify the putative effects exerted dent depletion of cellular ATP levels that was significant by the combined use of MDMA and EtOH. under hyperthermic conditions. This depletion confirmed the results already described for MDMA alone (Carvalho Acknowledgement et al., 2004b) and denotes an inhibition of mitochondrial function under these experimental conditions (Burrows Helena Pontes thanks FCT for financial support et al., 2000; Wu and Cederbaum, 2003; Quinton and (SFRH/BD/18527/2004). Yamamoto, 2006). This effect may result from altered thiol homeostasis, and toxic metabolites formation from References MDMA and/or EtOH that can affect mitochondrial energy processes by damaging mitochondrial membranes and/or Barrett, S.P., Darredeau, C., Pihl, R.O., 2006. Patterns of simultaneous proteins (Seitz and Stickel, 2006). Additionally, the mito- polysubstance use in drug using university students. Human Psycho- chondrial dysfuntion underlying the observed ATP deple- pharmacology 21, 255–263. Ben Hamida, S., Plute, E., Bach, S., Lazarus, C., Tracqui, A., Kelche, C., tion could be directly instigated by hyperthermic de Vasconcelos, A.P., Jones, B.C., Cassel, J.C., 2007. Ethanol– conditions, as already described for tumoral cell lines and MDMA interactions in rats: the importance of interval between cardiomyocytes (Yuen et al., 2000; Qian et al., 2004; Zhao repeated treatments in biobehavioral tolerance and sensitization to the et al., 2006). combination. Psychopharmacology (Berl) 192, 555–569. Concluding, the results from the present study evi- Bilsky, E.J., Hui, Y.Z., Hubbell, C.L., Reid, L.D., 1990. Methylenedi- oxymethamphetamine’s capacity to establish place preferences and denced, for the first time, that mice pre-treatment with modify intake of an alcoholic beverage. Pharmacology Biochemistry 12% EtOH during 8 weeks increases the vulnerability of and Behavior 37, 633–638. freshly isolated mouse hepatocytes towards pro-oxidant Burrows, K.B., Gudelsky, G., Yamamoto, B.K., 2000. Rapid and conditions, as ascertained by the lower hepatocytes yield transient inhibition of mitochondrial function following methamphet- and decreased GSH levels and increased GSSG levels. This amine or 3,4-methylenedioxymethamphetamine administration. Euro- pean Journal of Pharmacology 398, 11–18. depletion of GSH content in the isolated hepatocytes alters Capela, J.P., Meisel, A., Abreu, A.R., Branco, P.S., Ferreira, L.M., Lobo, their susceptibility to one of the early consequences of A.M., Remiao, F., Bastos, M.L., Carvalho, F., 2006. Neurotoxicity of MDMA metabolism (disruption of thiol homeostasis), ecstasy metabolites in rat cortical neurons, and influence of hyperthermia. which may result in loss of protein function and the initia- Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 316, 53–61. tion of a cascade of events leading to cellular damage. Capela, J.P., Macedo, C., Branco, P.S., Ferreira, L.M., Lobo, A.M., Fernandes, E., Remiaõ, F., Bastos, M.L., Dirnagl, U., Meisel, A., However, MDMA toxicity to the isolated hepatocytes, Carvalho, F., 2007. Neurotoxicity mechanisms of thioether ecstasy evaluated by LDH leakage, was independent of EtOH metabolites. Neuroscience 146, 1743–1757. pre-treatment, while significantly dependent on incubation Carvalho, F., Remiaõ, F., Soares, M.E., Catarino, R., Queiroz, G., temperature. Thus, the in vitro mimicking of the hyperther- Bastos, M.L., 1997. D-Amphetamine-induced hepatotoxicity: possible mia induced in vivo by MDMA consumption was of contribution of catecholamines and hyperthermia to the effect studied in isolated rat hepatocytes. Archives of Toxicology 71, 429–436. extreme importance since it significantly enhanced the del- Carvalho, M., Carvalho, F., Bastos, M.L., 2001. Is hyperthermia the eterious effects induced by MDMA at 37 °C for both non- triggering factor for hepatotoxicity induced by 3,4-methylenedioxy- EtOH and EtOH groups. methamphetamine (ecstasy)? An in vitro study using freshly isolated Notwithstanding the obtained results, caution should be mouse hepatocytes. Archives of Toxicology 74, 789–793. exercised in comparing in vitro and in vivo situations, Carvalho, M., Carvalho, F., Remiao, F., Pereira, M.L., Pires-das-Neves, R., Bastos, M.L., 2002a. Effect of 3,4-methylenedioxymethamphet- because there are some in vivo factors that could not be amine (‘‘ecstasy”) on body temperature and liver antioxidant status in reproduced in this experimental model, such as uptake mice: influence of ambient temperature. Archives of Toxicology 76, and metabolism of different cell types, blood flux varia- 166–172. tions, hormones and liver zonal differences in oxygen ten- Carvalho, M., Hawksworth, G., Milhazes, N., Borges, F., Monks, T.J., sion and enzymatic distribution. Fernandes, E., Carvalho, F., Bastos, M.L., 2002b. Role of metabolites in MDMA (ecstasy)-induced nephrotoxicity: an in vitro study using rat The relevance of this study is unequivocal because the and human renal proximal tubular cells. Archives of Toxicology 76, simultaneous consumption of MDMA and EtOH has been 581–588. associated with MDMA-related fatalities (Schifano et al., Carvalho, M., Milhazes, N., Remiaõ, F., Borges, F., Fernandes, E., 2003) and road accidents (Drummer et al., 2003; Cheng Amado, F., Monks, T.J., Carvalho, F., Bastos, M.L., 2004a. Hepa- et al., 2005; Kuypers et al., 2006). To our knowledge this totoxicity of 3,4-methylenedioxyamphetamine and alpha-methyldopamine in isolated rat hepatocytes: formation of glutathione conjugates. is the first report on the hepatic toxicological interaction Archives of Toxicology 78, 16–24. of MDMA and EtOH, whose hepatic metabolism to toxic Carvalho, M., Remiaõ, F., Milhazes, N., Borges, F., Fernandes, E., derivatives is already extensively described. Previous stud- Carvalho, F., Bastos, M.L., 2004b. The toxicity of N-methyl-alpha- ies on the association of these drugs have mainly focused methyldopamine to freshly isolated rat hepatocytes is prevented by on physiologic or psychologic consequences to humans ascorbic acid and N-acetylcysteine. Toxicology 200, 193–203. Cassel, J.C., Jeltsch, H., Koenig, J., Jones, B.C., 2004. Locomotor and (Pacifici et al., 2001; Hernańdez-Lo´pez et al., 2002; Ramae- pyretic effects of MDMA – ethanol associations in rats. Alcohol 34, kers and Kuypers, 2006). 285–289. Author's personal copy

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Trabalho IV. Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes.

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Toxicology 254 (2008) 42–50

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Toxicology

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Synergistic toxicity of ethanol and MDMA towards primary cultured rat hepatocytes

Helena Pontes a,∗, Carla Sousa a, Renata Silva a, Eduarda Fernandes b, Helena Carmo a, Fernando Remião a, Félix Carvalho a, Maria Lourdes Bastos a,∗ a REQUIMTE, Toxicology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal b REQUIMTE, Physical-Chemistry Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal article info abstract

Article history: Ethanol is frequently consumed along with 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy). Received 14 July 2008 Since both compounds are hepatotoxic and are metabolized in the liver, an increased deleterious interac- Received in revised form 3 September 2008 tion resulting from the concomitant use of these two drugs seems plausible. Another important feature Accepted 4 September 2008 of MDMA-induced toxicity is hyperthermia, an effect known to be potentiated after continuous exposure Available online 20 September 2008 to ethanol. Considering the potential deleterious interaction, the aim of the present study was to evaluate the hepatotoxic effects of ethanol and MDMA mixtures to primary cultured rat hepatocytes and to elu- Keywords: cidate the mechanism(s) underlying this interaction. For this purpose, the toxicity induced by MDMA to Ethanol primary cultured rat hepatocytes in absence or in presence of ethanol was evaluated, under normothermic 3,4-Methylenedioxymethamphetamine ◦ ◦ Primary cultured rat hepatocytes (36.5 C) and hyperthermic (40.5 C) conditions. While MDMA and ethanol, by themselves, had discrete Hepatotoxicity effects on the analysed parameters, which were slightly aggravated under hyperthermia, the simultaneous Oxidative stress incubation of MDMA and ethanol for 24 h, resulted in high cell death ratios accompanied by a signiﬁcant Hyperthermia disturbance of cellular redox status and decreased energy levels. Evaluation of apoptotic/necrotic features provided clear evidences that the cell death occurs preferentially through a necrotic pathway. All the evaluated parameters were dramatically aggravated when cells were incubated under hyperthermia. In conclusion, co-exposure of hepatocytes to ethanol and MDMA deﬁnitely results in a synergism of the hepatotoxic effects, through a disruption of the cellular redox status and enhanced cell death by a necrotic pathway in a temperature-dependent extent. © 2008 Elsevier Ireland Ltd. All rights reserved.

1. Introduction 2006). One of the most commonly consumed drugs, along with ecstasy, is ethanol (EtOH) (Breen et al., 2006; Smart and Ogborne, 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (ecstasy; MDMA) con- 2000; Tossmann et al., 2001), probably due to the fact that EtOH sumption patterns have been widely described in literature is legal, cheap and widely available. In fact, EtOH is often taken (EMCDDA, 2005; Lora-Tamayo et al., 2004; SAMHSA, 2005; prior or along with MDMA, to increase the acute pleasant effects of Schifano et al., 2006; Topp et al., 1999; Tossmann et al., 2001; MDMA and to decrease the irritability and restlessness that persist Winstock et al., 2001) and are generally characterized as a polydrug after the end of the empathogenic and entactogenic effects asso- consumption scenario (Gouzoulis-Mayfrank and Daumann, 2006; ciated with ecstasy consumption (Schifano, 2004). Of note, when Hopper et al., 2006; Schifano et al., 1998, 2003), often related with EtOH is consumed to decrease the long-lasting unpleasant effects fatalities (Barrett et al., 2006; Liechti et al., 2005; Oyefeso et al., of MDMA, it is taken in large amounts (Schifano, 2004) probably 2006; Sanjurjo et al., 2004; Schifano, 2004; Schifano et al., 2003, because ecstasy users were more likely to engage in several risky behaviours such as binge drinking (Boyd et al., 2003). Liver toxicity resulting from the concomitant consumption of these two drugs is of higher concern since both compounds are Abbreviations: MDMA, 3,4-methylenedioxymethamphetamine; EtOH, ethanol; metabolized in the liver leading to the formation of hepatotoxic LDH, lactate dehydrogenase; AO/EB, acridine orange/ethidium bromide; ROS, reac- compounds (Gemma et al., 2006; Green et al., 2003). Accordingly, tive oxygen species; RNS, reactive nitrogen species; GSH, reduced glutathione; GSSG, our group has recently demonstrated that hepatocytes isolated oxidised glutathione; ATP, adenosine-5-triphosphate; ␥-GCS, ␥-glutamylcysteine synthetase; AIF, apoptosis-inducing factor. from mice exposed to 12% EtOH for 8 weeks, as drinking ﬂuid, ∗ Corresponding authors. Tel.: +351 222078979; fax: +351 222003977. showed increased vulnerability to MDMA-induced hepatotoxicity E-mail addresses: [email protected] (H. Pontes), [email protected] (M.L. Bastos). (Pontes et al., 2008b). EtOH pre-exposure has also been shown

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to modify MDMA pharmacokinetics, which results in increased The obtained hepatocyte suspension was purified by low-speed centrifugations ◦ MDMA plasma concentrations in humans (Hernández-López et al., and incubated for 30 min, at 4 C, with 500 U/mL penicillin G, 0.5 mg/mL strepto- ␮ 2002). Another important feature of MDMA-induced toxicity is mycin sulfate and 1.25 g/mL amphotericin B. The viability of isolated hepatocytes was estimated by the trypan blue exclusion test. Subsequently, a suspension of hyperthermia, an effect known to be potentiated after continuous 0.5 × 106 viable cells/mL in complete culture medium (William’s E medium supple- exposure to ethanol (Pontes et al., 2008a). mented with 2 mM l-glutamine, 0.86 ␮M insulin, 0.5 nM dexamethasone, 10 mM Considering the potential synergic effects of EtOH and MDMA HEPES, 100 U/mL penicillin G, 0.1 mg/mL streptomycin sulfate, 0.25 ␮g/mL ampho- to the liver, the aim of the present study was to evaluate the puta- tericin B, 5% FBS) was seeded in previously collagen-coated culture flasks in a density 4 2 ◦ of 6 × 10 viable cells/cm . Cells were incubated at 36.5 C with 5% CO2, for 3–4 h tive hepatotoxic interaction between EtOH and MDMA in primary ◦ for cell adhesion, washed twice with PBS, and incubated over-night at 36.5 C with cultured rat hepatocytes and to elucidate the mechanism(s) under- culture medium without FBS. The day after, cells were added five different concen- lying the observed effects. For this purpose, the toxicity induced trations of MDMA (0, 0.2, 0.4, 0.8 and 1.6 mM) in the presence or in the absence of ◦ by MDMA to primary cultured rat hepatocytes in absence or in 1.4% (m/v) EtOH, and incubated with 5% CO2 at 36.5 or 40.5 C. The tested MDMA con- presence of EtOH was evaluated, under normothermic (36.5 ◦C) centrations were chosen on the basis of previous studies from our group (Carvalho ◦ et al., 2001, 2004b) and also in previous reports that found tissue concentrations of and hyperthermic (40.5 C) conditions, to simulate the hyperther- MDMA and its metabolites substantially higher (up to 18 times) than blood concen- mic response induced in vivo by MDMA consumption. The study trations (Garcia-Repetto et al., 2003). Considering that in most of MDMA fatalities, included the evaluation of the type of cell death [acridine orange blood levels ranged from 2.5 to 50 ␮M, the concentrations used in the present study and ethidium bromide (AO/EB) staining, lactate dehydrogenase are most likely attained in the in vivo situation. On the other hand, the evaluation of the interactions of MDMA and its metabolites with cellular components is only (LDH) leakage, caspase-3 activation, Bax translocation to the mito- possible using worst-case approach concentrations. After 24 h incubation, AO/EB chondria and AIF and cytochrome c release from the mitochondria], staining was performed, and samples were collected to perform Western blotting oxidative stress parameters [reactive oxygen and nitrogen species analysis and to quantify LDH leakage, ROS and RNS formation, ATP levels, GSH and (ROS and RNS) formation, reduced (GSH) and oxidised glutathione GSSG concentrations and ␥-GCS, GST and caspase-3 activities. (GSSG) contents, ␥-glutamylcysteine synthetase (␥-GCS) and GST The evaluation of cell viability, the AO/EB staining, the quantification of ROS and RNS and the preparation of mitochondrial protein extracts to perform Western blot activities] as well as cell energy status [adenosine triphosphate were accomplished immediately after the 24-h incubation period. The remaining (ATP) levels]. samples were kept frozen (−80 ◦C) until assay.

2. Materials and methods 2.4. Acridine orange and ethidium bromide staining

2.1. Chemicals The fluorescent DNA-binding dyes ethidium bromide and acridine orange were used to distinguish necrotic from apoptotic cells. After the 24-h incubation period ␮ All chemicals used in this study were of analytical grade. Collagenase with MDMA, EtOH or MDMA + EtOH, cells were incubated with 2 g/mL acridine ␮ (type I), bovine serum albumin (fraction V), 4-(2-hydroxyethyl)-piperazine-1- orange and 2 g/mL ethidium bromide for 5 min before imaging, using a fluores- ethanesulfonic acid (HEPES), ethyleneglycol-bis-(␤-aminoethylether)-N,N,N,N- cence microscope with a standard fluorescein excitation filter (Eclipse E400 Nikon, tetraacetic acid (EGTA), ␤-nicotinamide adenine dinucleotide reduced form Japan). (␤-NADH), ␤-nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced form (␤- NADPH), pyruvic acid, 2-vinylpyridine, reduced glutathione (GSH), oxidised 2.5. Biochemical analysis glutathione (GSSG), glutathione reductase (EC 1.6.4.2), 5,5-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB), trypan blue solution, trizma® hydrochloride, d-luciferin sodium 2.5.1. LDH Leakage salt and luciferase (EC 1.13.12.7), antibiotic–antimycotic solution, insulin solu- LDH leakage to the culture media was evaluated as previously reported tion, dexamethasone, acridine orange, ethidium bromide, dihydrorhodamine (Bergermeyer and Bernt, 1974). The LDH activity was determined by following the 123, mono(cyclohexylammonium)phosphoenolpyruvate, l-␣-amino-n-butyrate, l- rate of oxidation of NADH, measured at 340 nm. Results are presented as percentage ◦ glutamate, pyruvate kinase from rabbit muscle and l-lactic dehydrogenase of control conditions at 36.5 C. from rabbit muscle, adenosine-5-triphosphate (ATP), N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p- nitroanilide (Ac-DEVD-pNA) were obtained from Sigma–Aldrich Co. (St. Louis, MO, 2.5.2. ROS and RNS quantification USA). Perchloric acid, EtOH and all other chemicals were purchased from Merck Detection and quantification of intracellular reactive species, including RNS and (Darmstadt, Germany). William’s E medium, l-glutamine, foetal bovine serum ROS were performed by the dihydrorhodamine 123 (DHR-123) assay as previously ␮ (FBS) and phosphate buffer solution (PBS) were purchased from Lonza Ltd. (Basel, reported (Capela et al., 2007). Briefly, cells were pre-incubated with 100 MDHR- Switzerland). Collagen G was purchased from Biochrom AG (Berlin, Germany). 123 for 60 min. At the end of the incubation period, cells were washed 2 times with 3,4-Methylenedioxymethamphetamine (HCl salt) was extracted and purified from PBS and added with new medium containing the tested compounds. The oxidation high purity MDMA tablets that were provided by the Portuguese Criminal Police of DHR-123 to its fluorescent product, Rhodamine 123, was measured 24 h after Department. The obtained salt was pure and fully characterized by NMR and mass incubation with EtOH, MDMA, or EtOH + MDMA, using a fluorescence plate reader spectrometry methodologies. (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) (baseline: 485 nm excitation and 528 nm emission). Results are presented as percentage of control conditions at 36.5 ◦C.

2.2. Animals 2.5.3. GSH/GSSG quantification The cellular GSH and GSSG levels were determined, after cell suspension in PBS, Animal experiments were licensed by the Portuguese General Directorate of by the DTNB–GSSG reductase recycling assay as described before (Anderson, 1985), Veterinary Medicine. Housing and experimental treatment of animals were in accor- with some modifications (Pontes et al., 2008b). The stoichiometric formation of 5- dance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the Institute thio-2-nitrobenzoic acid (TNB) was followed for 3 min at 415 nm and compared to for Laboratory Animal Research (Institute for Laboratory Animal Research, 1996). a standard curve. The molar GSH levels were calculated by subtracting the GSSG Adult male Wistar rats (Charles-River Laboratories, Barcelona, Spain), weighing content, determined after derivatization of GSH with 2-vinylpyridine, from the total 250–300 g, were used. For at least 1 week prior to use, animals were acclimatized in glutathione content (GSH = GSHt − 2 × GSSG). Results are presented as percentage polyethylene cages, lined with wood shavings, with wire-mesh tops, at an ambient of control conditions at 36.5 ◦C. temperature of 20 ± 2 ◦C, humidity between 40% and 60% and 12/12 h light/dark cycle (light on from 8.00 to 20.00 h), in our animal facilities, having standard chow and tap 2.5.4. ATP quantification drinking water ad libitum. Surgical procedures for the isolation of hepatocytes were Cellular ATP levels were evaluated through a luciferase-based bioluminescent performed under anaesthesia and carried out between 10.00 h a.m. and 11.00 h a.m. technique, as previously reported (Pontes et al., 2008b). Sample ATP levels are proportional to the intensity of the light emitted by luciferine, in a reaction catalyzed 2.3. Hepatocytes isolation and primary culture by luciferase, that was measured using a 96-well Microplate Luminometer (BioTek Instruments, Vermont, US). Results are presented as percentage of control conditions Hepatocytes isolation was performed by collagenase perfusion as previously at 36.5 ◦C. described (Pontes et al., 2008b) with some modifications. Briefly, after perfusion with a chelation agent to allow the cleavage of the hepatic desmosomes, hepatic col- 2.5.5. -GCS activity lagen was hydrolysed by ex situ perfusion with a collagenase solution supplemented ␥-Glutamylcysteine synthetase (␥-GCS), also known as glutamate cysteine ligase with its co-factor (calcium) and hepatocytes were dissociated in Krebs–Henseleit (GCL), is the first enzyme in the glutathione biosynthesis pathway, and its rate- buffer. limiting step. The activity of ␥-GCS was evaluated as previously described by Seelig Author's personal copy

44 H. Pontes et al. / Toxicology 254 (2008) 42–50 et al. (1984) with some modifications (Piner et al., 2007). ␥-GCS activity was mea- decrease in cell density due to high rate of cell death, leading to cell sured from the rate of ADP formation (assumed to be equal to the rate of oxidation of detachment. NADH) as calculated from the change in absorbance at 340 nm in reaction mixtures at 37 ◦C. Reaction medium included 0.1 M pH 7.75 Tris buffer, 150 mM KCl, 2 mM phos- 3.2. LDH leakage phoenolpyruvate, 10 mM l-glutamate, 20 mM MgCl2,10mMl-␣-amino-n-butyrate, 2 mM EDTA, 0.2 mM NADH, 5 mM ATP, 2 U/mL pyruvate kinase, and 2 U/mL lactate dehydrogenase. Results are presented as percentage of control conditions at 36.5 ◦C. Cells exposed under normothermic conditions to several MDMA concentrations suffered a slight loss of viability at the highest con- 2.5.6. GST activity centration tested [down to 90.5 ± 3.8% of control (P < 0.01 at 1.6 mM Glutathione-S-transferase (GST) activity was assayed according to the method of Habig et al. (1974). The formation of GSH conjugate with 1-chloro-2,4- MDMA)] (Fig. 2). Loss of cell viability was significantly aggravated dinitrobenzene was monitored for 5 min at 340 nm. The GST activity was calculated under hyperthermia [down to 77.1 ± 4.2% of control (P < 0.001) at by using an extinction coefficient of 9.6 mM−1 cm−1 and expressed as ␮mol/min per 1.6 mM MDMA]. EtOH, by itself, did not have a significant effect ◦ mg of protein. Results are presented as percentage of control conditions at 36.5 C. on LDH leakage but potentiated MDMA-induced loss of cell viability, which was observed for MDMA concentrations as low as 2.5.7. Caspase-3 activation Caspase-3 assay was based on a colorimetric assay by following the hydrolysis 0.4 and 0.1 mM, at normothermia and hyperthermia, respectively. of the peptide substrate Ac-DEVD-pNA by caspase 3, which results in the release of The extension of this synergic effect was, therefore, dependent on p-nitroaniline (pNA), with high absorbance at 405 nm (Jiménez et al., 2004). Briefly, MDMA concentration and on incubation temperature [at 36.5 ◦C, × 6 a lysate of approximately 3 10 cells, prepared with an appropriated lysis buffer EtOH + 1.6 mM MDMA decreased cell viability down to 71.3 ± 5.8% [50 mM Hepes, 1 mM DTT, 0.1 mM EDTA, 0.1% CHAPS (pH 7.4)], was added to an ◦ assay buffer [100 mM NaCl, 50 mM Hepes, 10 mM DTT, 1 mM EDTA, 10% glycerol, of control (P < 0.05), while at 40.5 C this co-exposure resulted in a 0.1% CHAPS (pH 7.5)] containing 16 ␮M of the caspase-3 substrate. After incubation cell viability down to 11.1 ± 1.8% of control (P < 0.001)]. at 37 ◦C for 3 h, absorbance was measured in a microplate reader at 405 nm. 3.3. ROS and RNS formation 2.5.8. Protein quantification Protein was quantified through Lowry’s assay (Lowry et al., 1951). When cells were incubated under normothermic conditions, 2.6. Western blot analysis none of the treatments resulted in detectable modification in the formation of reactive species (Fig. 3). However, after a 24-h incu- Equal amounts of proteins were separated using a 12.5% SDS-PAGE gel, followed bation period at 40.5 ◦C, EtOH increased ROS and RNS formation by blotting on a nitrocellulose membrane (Hybond-ECL; Amersham Pharmacia [to 128.7 ± 8.2% of control (P < 0.01)] and this increase was signifi- Biotech). After blotting, non-specific binding was blocked with 5% non-fat dry milk in TTBS [Tris-buffered saline (TBS) with Tween 20] and the membrane was incubated cantly potentiated by simultaneous exposure to EtOH and MDMA with anti-Bax (1:1000; sc-493 rabbit polyclonal IgG; Santa Cruz Biotechnology), [to 192.3 ± 17.2% of control (P < 0.001)]. anti-AIF (1:2000; sc-13116 mouse monoclonal IgG2b; Santa Cruz Biotechnology) or anti-cytochrome c (1:2000; sc-99 mouse monoclonal IgG1; Santa Cruz Biotechnol- 3.4. GSH/GSSG quantification ogy) or anti-␣-tubulin (1:1000; T6074 mouse monoclonal IgG1; Sigma) antibodies during 2 h at room temperature, washed and incubated with secondary horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse or anti-rabbit IgG antibodies (Amersham Phar- The changes in GSH/GSSG levels are presented in Fig. 4. macia Biotech) during 1 h. ␣-Tubulin Western blot is included as a loading protein Under normothermic conditions, MDMA exposure caused a sig- control. The membrane was then washed and developed with Western blotting nificant decrease of intracellular total glutathione (tGSH) and chemiluminescence reagents (Amersham Pharmacia Biotech) according to manu- reduced glutathione (redGSH) at the highest concentration [the facturer’s instructions, followed by exposure to X-ray films (Sigma, Kodak Biomax ± Light Film, St. Louis, USA). Optical density was measured and results of all groups redGSH levels decreased from 94.2 0.5% in control cells to were presented as percentage of controls. 82.3 ± 10.1% in cells exposed to 1.6 mM MDMA (P < 0.05) and tGSH decreased to 92.8 ± 11.2%]. This decrease was also verified when 2.7. Statistical analysis cells were co-exposed to EtOH [redGSH decreased from 97.9 ± 8.4% in cells exposed only to EtOH to 51.2 ± 7.4% in cells exposed to Results are presented as means ± SEM (from at least five experiments of different preparations of hepatocytes). Statistical comparisons were performed by one-way EtOH + 1.6 mM MDMA (P < 0.05) and tGSH levels decreased from analysis of variance (ANOVA) followed by the Bonferroni’s post-hoc test. Significance 103.0 ± 8.9% in cells exposed only to EtOH to 62.7 ± 9.0% in cells was accepted at P < 0.05. exposed to EtOH + 1.6 mM MDMA (P < 0.05)]. This decrease was only aggravated by hyperthermia in cells simultaneously exposed to 3. Results MDMA and EtOH [redGSH decreased from 84.7 ± 10.2% when cells were exposed only to EtOH at 40.5 ◦C to 1.78 ± 0.92% when cells 3.1. Acridine orange and ethidium bromide staining were exposed to EtOH + 1.6 mM MDMA (P < 0.001)]. This decrease in redGSH was accompanied by a tGSH decrease [from 93.4 ± 11.0% The ethidium homodimer cannot penetrate intact cellular mem- to 5.49 ± 0.95% (P < 0.01)]. As expected, the intracellular levels of branes and, therefore, stains the nucleus of cells in red only GSSG did not present changes among the considered experimen- when the membranes are disrupted, whereas acridine orange is tal conditions since, once formed, it is excreted to the extracellular membrane-permeable and stains living cells in green. Therefore, medium (Leier et al., 1996). under the ethidium bromide/acridine orange staining (Fig. 1), living cells appear as cells with a regular-sized green fluorescent 3.5. ATP quantification nucleus, whereas early apoptotic cells have a green fluorescent condensed, shrunken, or fragmented nucleus, and late apoptotic At 36.5 ◦C, when cells were incubated with four different cells have a red fluorescent condensed, shrunken, or fragmented MDMA concentrations, ATP levels remained unchanged compara- nucleus. Necrotic cells exhibit a red fluorescent regular-sized or tively to control cells (Fig. 5). However, co-incubation with EtOH increased nucleus. The pictures in Fig. 1 suggest that MDMA, by induced a significant decrease in ATP levels whose extension itself, did not produce evident changes in cell viability, while was dependent on MDMA concentration [ATP levels decreased EtOH exposure was able to induce some degree of necrotic cell from 87.4 ± 4.1% when cells were exposed only to EtOH, to death, especially notorious at hyperthermic conditions. This EtOH- 62.3 ± 4.3% when cells were exposed to EtOH + 1.6 mM MDMA induced necrotic cell death was aggravated by the co-exposure (P < 0.01)]. Under hyperthermia (40.5 ◦C), MDMA itself was able with MDMA under hyperthermic conditions. It was also observed a to significantly decrease ATP levels at the highest concentration Author's personal copy

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Fig. 1. Fluorescence microscope photographs from ethidium bromide/acridine orange staining of primary rat hepatocytes cultures exposed for 24 h to 1.4% (m/v) EtOH, 1.6 mM MDMA or both compounds simultaneously. The upper row corresponds to cells incubated under normothermia (36.5 ◦C) and the lower row corresponds to cells incubated under hyperthermia (40.5 ◦C). The columns correspond, from left to right, to control cells, and cells incubated with EtOH, MDMA and EtOH + MDMA, respectively. For each condition, the left image corresponds to a 200 times magniﬁcation, and the right image corresponds to a 400 times magniﬁcation.

Fig. 2. Effect of MDMA and hyperthermia on viability of primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH at 36.5 ◦C) from at least ﬁve experiments. Control cells presented 88.1 ± 2.3% of cell viability. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH.

Fig. 3. Effect of MDMA and hyperthermia on reactive species production (ROS and RNS) in primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH at 36.5 ◦C) from at least ﬁve experiments. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH. Author's personal copy

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Fig. 4. Effect of MDMA and hyperthermia on tGSH, GSH and GSSG levels in primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH at 36.5 ◦C) from at least ﬁve experiments. Control cells presented 63.5 ± 5.4 nmol of tGSH/mg protein, 59.9 ± 5.3 nmol of redGSH/mg protein and 1.80 ± 0.16 nmol of GSSG/mg protein. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH.

Fig. 5. Effect of MDMA and hyperthermia on ATP levels in primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH) from at least ﬁve experiments. Control cells presented 16.5 ± 2.0 nmol of ATP/mg protein. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH.

[from 108.7 ± 9.6% in control cells to 76.0 ± 6.3% when cells were 3.6. -GCS activity exposed to 1.6 mM MDMA (P < 0.05)] being this decrease drasti- cally potentiated by EtOH co-exposure [ATP levels decreased to As it can be observed in Fig. 6, MDMA and EtOH, by themselves, 0.25 ± 0.16% when cells were co-exposed to EtOH and 1.6 mM did not change ␥-GCS activities, neither at 36.5 ◦C nor 40.5 ◦C, at any MDMA (P < 0.001)]. of the tested concentrations. The co-incubation resulted in a slight Author's personal copy

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Fig. 6. Effect of MDMA and hyperthermia on ␥-GCS activity in primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH at 36.5 ◦C) from at least ﬁve experiments. Control cells presented 39.8 ± 8.5 mU of ␥-GCS/mg protein. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH.

Fig. 7. Effect of MDMA and hyperthermia on GST activity in primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Results are represented as mean ± SEM of the percentage of control cells (exposed neither to MDMA nor to EtOH at 36.5 ◦C) from at least five experiments. Control cells presented 190.6 ± 62.8 U of GST/mg protein. (*) Compared to control cells at 36.5 ◦C; (#) compared to 0 mM MDMA of the respective curve; (×) compared to normothermia; (+) compared to W/O EtOH. tendency for a decrease of ␥-GCS activity (down to 70.7 ± 6.3%), 3.8. Western blot analysis reaching statistical significance under hyperthermic conditions, in ◦ which ␥-GCS activities practically disappeared at the two highest At 36.5 C, the release of mitochondrial components (AIF and ◦ MDMA concentrations tested (P < 0.001). cytochrome c) seems to be inexistent. However, at 40.5 C, a significant release of AIF and cytochrome c from the mitochondrial extract was observed, under MDMA EtOH co-exposure (Fig. 8). 3.7. GST activity There was no translocation of Bax molecule from the cytoplasm to the mitochondria (data not shown). The effects of ethanol, MDMA, as well as their interaction under normothermia and hyperthermia on GST activity are presented in 3.9. Caspase-3 activity Fig. 7. In the absence of ethanol, GST activity remained unchanged, independently on MDMA concentration and on incubation temper- There were no statistical differences in caspase-3 activities ature. When cells were exposed to ethanol, a significant decrease among the different incubation conditions (data not shown). in GST activity was observed (down to 70.7 ± 6.2%) when compared to control (P < 0.05). Under hyperthermic conditions, co-exposure 4. Discussion to ethanol and MDMA was able to aggravate the decrease induced by ethanol, in an extent dependent on MDMA concentration [GST The data obtained in this study clearly demonstrated that the activity decreased to 62.7 ± 13.0% when cells were exposed to simultaneous incubation of primary cultured rat hepatocytes with ethanol + 0.4 mM MDMA (P < 0.01), to 44.4 ± 15.6% when cells were MDMA and EtOH for 24 h, leads to high cell death ratios, mainly exposed to ethanol + 0.8 mM MDMA (P < 0.001) and to 3.88 ± 1.95% through necrosis, accompanied by a significant disturbance of cel- when cells were exposed to ethanol + 1.6 mM MDMA (P < 0.001)]. lular redox status and decreased energy levels. Author's personal copy

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Fig. 8. Western blot analysis of the effect of MDMA and hyperthermia on AIF and cytochrome c release from the mitochondria of primary cultured rat hepatocytes in presence or in absence of EtOH (W/EtOH and W/O EtOH, respectively). Above the histogram, the panel shows a representative Western blotting of AIF and of cytochrome c, respectively, for each condition. Values are mean ± SEM and are expressed as percentage of control. ␣-Tubulin was used as an internal loading control. C, control; M, MDMA; E, EtOH; E + M, EtOH + MDMA.

Both EtOH and MDMA are metabolized in the liver, where EtOH GSH synthesis mediated by ethanol was dramatically aggravated can alter the expression or activity of some drug-metabolizing by MDMA co-exposure under hyperthermic conditions, with an enzymes (Jang and Harris, 2007) and where both drugs share some almost absolute inhibition of ␥-GCS activity for the two highest metabolic pathways involving the cytochrome P450 isoenzymes MDMA concentrations. The decrease on GST activity can be related and originating metabolites (Gemma et al., 2006; Green et al., 2003) to the oxidation or alkylation of sulfhydryl groups present in critical with higher toxicity than their parent compounds, as previously aminoacid residues within the enzyme active site, an effect already reported for other amphetamines (Carmo et al., 2007). Notwith- reported for MDMA metabolites (Carvalho et al., 2004a) and for standing the knowledge about the decrease of the activities of quinones and catecholamines (Monks and Lau, 1992; Bindoli et al., cytochrome P450 system isoenzymes during the culture of rat hep- 1992; van Ommen et al., 1991), formed after exposure to MDMA. atocytes, the present experimental model is adequately adapted to A significant decrease in GST activity was also previously reported the study of the interactions between ethanol and MDMA since the for ethanol (Gyamfi and Wan, 2006). GST catalyzes the nucleophilic remaining CYP enzyme activities are still sufficient to study drug attack of GSH on reactive electrophilic substrates, thereby protect- metabolism in vitro during the 24-h incubation period used in the ing various cell components from their potentially damaging effects present study (Gebhardt et al., 2003; Hewitt et al., 2007). While (Mannervik and Danielson, 1988). Thus, its higher inactivation by this metabolic interaction may represent an explanation for most simultaneous exposure to ethanol and MDMA can increase cell sus- of the synergic toxic effects found, other factors are also involved ceptibility to the deleterious effects of reactive electrophiles. These and the hyperthermic effect contributes significantly to the aggra- impairments in glutathione homeostasis induced by ethanol and vation of the observed toxicity. The MDMA-induced decrease on MDMA mixtures can contribute to their synergistic toxicity. GSH levels is in agreement with results previously reported by It was previously reported that either EtOH or MDMA is able to our group on freshly isolated mouse hepatocytes (Pontes et al., increase ROS and RNS formation, in a variety of systems, cells, and 2008b) and can be explained by oxidation of GSH to GSSG by reac- species (Das and Vasudevan, 2007; Quinton and Yamamoto, 2006). tive oxygen and nitrogen species, and formation of GSH adducts The increased formation of reactive species after incubation with with MDMA metabolites by GST (Hiramatsu et al., 1990), but also ethanol may be derived from the induction of cytochrome P450 2E1 by impaired GSH synthesis, which is also a known effect associ- activity (Morimoto et al., 1993) or by mitochondrial dysfunction ated with EtOH exposure (Lauterburg et al., 1984). In the present after reduction of GSH content and ATP generation (Cunningham study, we demonstrated, for the first time, that the impairment of et al., 1990; Colell et al., 1998). MDMA can lead to the formation of Author's personal copy

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ROS and RNS during the redox cycles associated with its metabolic decrease in antioxidant defences, an increase in reactive species conversion (Colado et al., 1997) or during the conjugation of MDMA formation, and enhanced cell death through a necrotic pathway in metabolites with GSH molecules, a pathway also accompanied by a temperature-dependent extent. the formation of reactive species (Hiramatsu et al., 1990; Monks These findings represent an important step in the elucidation et al., 2004). However, a synergism in the ROS and RNS formation, of the mechanisms underlying the EtOH-induced increase on the when cells were co-exposed to both compounds, was also never toxicity to hepatocytes caused by MDMA consumption. reported before. Concerning ATP levels, MDMA was previously reported to Conflict of interest decrease ATP in rat hepatocytes (Carvalho et al., 2004b; Beitia et al., 1999) and EtOH leads to decreased ATP levels and ATP syn- None. thesis in rats (Helzberg et al., 1987; Piquet et al., 2004). The ATP depletion caused by ethanol is probably due to mitochondrial dam- •− age induced by an overproduction of anion superoxide (O2 )at Acknowledgements mitochondrial complexes I and III, and consequently of H2O2 and other reactive oxygen species (ROS). This effect results from the This work was supported by a project from FCT and POCI- excessive NADH formation during acetaldehyde metabolism in liver 2010, Portugal, by FEDER European Community co-funding mitochondria that is used by mitochondria complex I (NADH dehy- (POCI/SAU-FCF/57187/2004). Helena Pontes was the recipient drogenase) as the first electron donor of the electron transport of a PhD grant from “Fundaç ão para a Ciência e Tecnologia” chain (Sastre et al., 2007). The potentiation of this depletion by (SFRH/BD/18527/2004). the co-incubation with EtOH and MDMA is in accordance with our previous ex-vivo study (Pontes et al., 2008b). This depletion References is an indicator of probable mitochondrial damage confirmed by the decrease of cytochrome c and AIF in the mitochondrial extract. Alvaro, A.R., Martins, J., Costa, A.C., Fernandes, E., Carvalho, F., Ambrósio, A.F., The depletion of GSH and ATP levels was accompanied by a loss Cavadas, C., 2008. Neuropeptide Y protects retinal neural cells against cell death in cell viability. Evaluation of apoptotic/necrotic features provided induced by ecstasy. Neuroscience 152, 97–105. Anderson, M.E., 1985. Determination of glutathione and glutathione disulfide in clear evidences that the cell death resulting from the co-incubation biological samples. Methods Enzymol. 113, 548–555. with EtOH and MDMA occurs through a necrotic pathway, con- Barrett, S.P., Darredeau, C., Pihl, R.O., 2006. Patterns of simultaneous polysubstance firmed by a significant increase of LDH leakage, nuclei staining use in drug using university students. Hum. Psychopharmacol. 21, 255–263. Beitia, G., Cobreros, A., Sainz, L., Cenarruzabeitia, E., 1999. 3,4- by the ethidium bromide and acridine orange technique and AIF Methylenedioxymethamphetamine (ecstasy)-induced hepatotoxicity: effect on release that was reported to be on the basis of a necrotic pro- cytosolic calcium signals in isolated hepatocytes. Liver 19, 234–241. grammed cell death pathway, explored by the groups of Boujrad et Bergermeyer, H.U., Bernt, E., 1974. UV-assay for lactate dehydrogenase with pyruvate and NADH. In: Bergermeyer, H.U. 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MDMA and EtOH in hepatocytes the classic apoptotic via, already Breen, C., Degenhardt, L., Kinner, S., Bruno, R., Jenkinson, R., Matthews, A., Newman, described for MDMA in neural cells (Capela et al., 2007, Alvaro et J., 2006. Alcohol use and risk taking among regular ecstasy users. Subst. Use al., 2008) and hepatic stellate cells (Montiel-Duarte et al., 2004), Misuse 41, 1095–1109. is discarded since there is no translocation of BAX to mitochondria Capela, J.P., Macedo, C., Branco, P.S., Ferreira, L.M., Lobo, A.M., Fernandes, E., Remião, F., Bastos, M.L., Dirnagl, U., Meisel, A., Carvalho, F., 2007. Neurotoxicity mecha- and no activation of effectors apoptotic pathways such as caspase 3, nisms of thioether ecstasy metabolites. Neuroscience 146, 1743–1757. notwithstanding the cytochrome c release from the mitochondria Carmo, H., Brulport, M., Hermes, M., Oesch, F., de Boer, D., Remião, F., Carvalho, F., (Fadeel et al., 2008). Therefore, the type of cell death subsequent to Schön, M.R., Krebsfaenger, N., Doehmer, J., Bastos, M.L., Hengstler, J.G., 2007. CYP2D6 increases toxicity of the designer drug 4-methylthioamphetamine (4- MDMA incubation is probably affected by EtOH co-exposure. Note- MTA). Toxicology 229, 236–244. worthy, hepatocytes exposed to 1 mM MDMA concentrations were Carvalho, M., Carvalho, F., Bastos, M.L., 2001. Is hyperthermia the triggering factor for previously reported to suffer an apoptotic type of cell death and hepatotoxicity induced by 3,4-methylenedioxymethamphetamine (ecstasy)? An in vitro study using freshly isolated mouse hepatocytes. Arch. Toxicol. 74, not a necrotic cell death as reported in the present study (Montiel- 789–793. Duarte et al., 2002). This apparent discrepancy can be explained by Carvalho, M., Milhazes, N., Remião, F., Borges, F., Fernandes, E., Amado, the ATP requirements of apoptosis, especially in the steps mediated F., Monks, T.J., Carvalho, F., Bastos, M.L., 2004a. Hepatotoxicity of 3,4- methylenedioxyamphetamine and alpha-methyldopamine in isolated rat by protein kinases that use ATP as a phosphoryl donor for phospho- hepatocytes: formation of glutathione conjugates. Arch. Toxicol. 78, 16–24. rylation of some proteins involved in apoptosis (Skulachev, 2006). Carvalho, M., Remião, F., Milhazes, N., Borges, F., Fernandes, E., Carvalho, F., Bastos, Since in the present study, a dramatic decrease in ATP levels was M.L., 2004b. The toxicity of N-methyl-alpha-methyldopamine to freshly isolated rat hepatocytes is prevented by ascorbic acid and N-acetylcysteine. Toxicology observed, these apoptotic pathways are probably impaired. 200, 193–203. All the evaluated parameters were significantly aggravated in Castilla, R., González, R., Fouad, D., Fraga, E., Muntane, J., 2004. Dual effect of ethanol the hepatocytes cultured under hyperthermia, which is known to on cell death in primary culture of human and rat hepatocytes. Alcohol Alcohol. be an in vivo life-threatening effect associated with ecstasy con- 39, 290–296. Colado, M.I., O’Shea, E., Granados, R., Murray, T.K., Green, A.R., 1997. In vivo evidence sumption (Green et al., 2004) and exacerbates the toxicity of many for free radical involvement in the degeneration of rat brain 5-HT following types of drugs and environmental toxicants (Gordon, 2007), includ- administration of MDMA (’ecstasy’) and p-chloroamphetamine but not the ing MDMA (Carvalho et al., 2001). The increase of EtOH and MDMA degeneration following fenfluramine. Br. J. Pharmacol. 121, 889–900. 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Trabalho V. Interacções metabólicas entre o etanol e a MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato.

______Trabalho V

Trabalho V. Interacções metabólicas entre o etanol e a MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato.

a) Introdução O estudo da influência do etanol no metabolismo da MDMA é de extrema importância, uma vez que (i) estas duas substâncias são frequentemente co-consumidas e o seu consumo simultâneo foi já verificado em intoxicações fatais subsequentes ao consumo de ecstasy 37, 281, (ii) ambas as substâncias são metabolizadas a nível hepático, onde inclusivamente partilham algumas vias metabólicas, originando compostos dotados de maior toxicidade que o composto pai 5, 736 e (iii) o etanol tem ainda a capacidade de alterar a expressão e/ou actividade de enzimas com actividade metabólica como as isoenzimas do sistema CYP450 668, incluindo aquelas envolvidas no metabolismo da MDMA. Esta indução do CYP450 pelo etanol está na base de múltiplas interacções farmacocinéticas com o etanol aumentando a bioactivação de numerosos xenobióticos com formação dos respectivos metabolitos tóxicos 669 e está também associada com um aumento na produção de ROS e na peroxidação lipídica, bem como com uma diminuição da capacidade de neutralização, enzimática e não enzimática, de radicais livres 669. Este facto pode agravar as alterações no estado redox verificadas durante o metabolismo da MDMA, potenciando o risco do desenvolvimento de toxicidade, especialmente a nível hepático, onde decorre a maior parte do metabolismo destes dois compostos. Outros estudos acerca das interacções farmacocinéticas entre o etanol e a MDMA centraram-se no efeito do etanol nas concentrações plasmáticas de MDMA 683, 684, no entanto a influência do etanol nas vias metabólicas da MDMA ainda não foi descrita. b) Objectivo Determinar se o etanol afecta o metabolismo da MDMA, se a CYP2E1 e/ou a CYP3A1 estão envolvidas numa eventual interacção metabólica, e de que forma é que a incubação de hepatócitos de rato em culturas primárias em

225 Trabalho V ______condições hipertérmicas pode afectar esta hipotética interacção metabólica, uma vez que a exposição à MDMA in vivo resulta, frequentemente, num aumento da temperatura corporal 595. b) Metodologia Neste trabalho foram utilizados hepatócitos de rato Wistar adulto obtidos pelo mesmo procedimento referido no Trabalho IV e ilustrado na Figura 13 .

Figura 13. Procedimento experimental utilizado para a avaliação da influência do etanol no perfil metabólico da MDMA em culturas primárias de hepatócitos de rato. FBS, soro bovino fetal.

Os hepatócitos assim obtidos e colocados em cultura foram expostos a 300 mM de etanol, 1,6 mM de MDMA (M) ou à combinação de ambos, em condições de normotermia (36,5 ± 0,5ºC) e de hipertermia (40,5 ± 0,5ºC). O mesmo desenho experimental foi depois repetido, mas, desta vez, a incubação com etanol, MDMA ou a mistura dos dois, foi precedida de uma incubação de uma hora com 0,18 μM de cetoconazol (KET, inibidor da CYP3A1) ou 150 μM de sulfureto dialílico (DAS, inibidor competitivo da CYP2E1). Após 24 horas de incubação, foi avaliada a viabilidade celular, através da quantificação da libertação de lactato desidrogenase (LDH) para o meio de

226 ______Trabalho V cultura. Foram quantificados, por GC-MS, recorrendo a uma técnica previamente validada pelo nosso grupo (resultados não publicados), os níveis de três importantes metabolitos da MDMA no meio de cultura: o metabolito resultante da N-desmetilação da MDMA (a 3,4-metilenodioxianfetamina ou MDA) e os metabolitos catecóis o-metilados da MDMA e da MDA (4-hidroxi-3- metoximetanfetamina ou HMMA e 4-hidroxi-3-metoxianfetamina ou HMA, respectivamente) (Figura 14).

Figura 14. Metabolização da MDMA a MDA, HMMA e HMA.

Para podermos quantificar estes metabolitos por GC-MS foi necessário recorrer a uma reacção de derivatização por fluoroacetilação de modo a conferir volatilidade aos compostos em estudo. As amostras foram tratadas como indicado na Figura 15.

227 Trabalho V ______

Figura 15. Preparação de amostras de meio de cultura para quantificação de MDMA, MDA, HMMA e HMA por GC-MS.

228 ______Trabalho V c) Resultados e discussão c.1) Viabilidade celular As células expostas a 1,6 mM de MDMA em condições normotérmicas sofreram uma perda de viabilidade de cerca de 10% relativamente às células controlo (mais 9,8 ± 2,6% de morte celular do que o controlo) (Figura 16), a qual foi significativamente agravada em condições hipertérmicas, atingindo valores próximos dos 25% [21,7 ± 2,8% acima do controlo a 40,5ºC (P < 0,05)]. A co-exposição ao etanol teve um efeito sinérgico na morte celular induzida pela MDMA, provocando 33,9 ± 11,5% de morte celular acima do controlo em normotermia (P < 0,05 quando comparado com M a 36,5ºC) ou 89,7% ± 1,6% em hipertermia (P < 0,01 quando comparado com M a 40,5ºC). A pré-incubação com DAS ou KET não reverteu os efeitos da MDMA e do etanol na percentagem de morte celular.

Normotermia (36,5ºC) Hipertermia (40,5ºC) ++ ++ ++ 100 100 *** ***xx *** xxx xx Sem etanol 80 Com etanol 75 + 60 + 50 + * * * x * 40 x 25 20

0 0 M DAS+M KET+M M DAS+M KET+M Mortecelular (% acimado controlo) Mortecelular (% acimado controlo) Grupos Grupos

Figura 16. Efeito de MDMA 1,6 mM (M) e da hipertermia na percentagem de morte celular na presença ou na ausência de etanol, DAS e KET. Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média da percentagem acima das células controlo (não expostas a etanol nem a MDMA) de três ensaios independentes. * Comparado com M a 36,5ºC; × Comparado com normotermia; + Comparado com “Sem etanol”.

c.2) Formação de metabolitos da MDMA Em condições normotérmicas e na ausência de etanol, a pré-incubação das células em cultura com DAS ou KET não afectou o metabolismo da MDMA a MDA e HMA (Figura 17A e E). No entanto, a pré-incubação com DAS provocou uma diminuição significativa da formação de HMMA [de 10,50 ± 0,56 nmol / 106 células para 7,75 ± 0,46 nmol / 106 células (P < 0,05)] (Figura 17C).

229 Trabalho V ______

Por outro lado, a pré-incubação com KET em condições normotérmicas provocou um aumento significativo da formação de MDA (Figura 17A).

MDA A B Normotermia (36,5ºC) Hipertermia (40,5ºC) 2.4 2.4 §§§ Sem etanol §§§

células 2.2 2.0 +++ células

6 Com etanol + 6 0.25 + ×××*** 1.6 0.20 ** 1.2 0.15 + 0.10 0.8 ***× 0.05 0.4 º º 0.00 0.0 mmol MDA de por 10 M DAS+M KET+M 10 por MDA de mmol M DAS+M KET+M Groups Grupos

HMMA C D Normotermia (36,5ºC) Hipertermia (40,5ºC)

240 240 §§§ Sem etanol §§§ células células 220 200 +++ 6 6 Com etanol 20 *** 160 ××× +++ + +++ 16 120 *** *** 12 ººº ×××ººº ××× 80 8 * 40 4 º ºº 0 0 nmol de HMMA por 10 nmol HMMA por de 10 M DAS+M KET+M M DAS+M KET+M Grupos Grupos

HMA

E Normotermia (36,5ºC) F Hipertermia (40,5ºC) 14 14

12 §§§ Sem etanol 12 +++ células células

6 ++ 6 Com etanol 1.5 10 ×××*** +++ +++ *** 8 ×××ººº 1.0 *** 6 ×××ººº

4 0.5 2

nmol de HMA por 10 0.0 nmol de HMA por 10 0 M DAS+M KET+M M DAS+M KET+M Grupos Grupos

Figura 17. Efeito da hipertermia e da co-incubação com etanol 300 mM, DAS 150 μM e KET 0,18 μM na formação de metabolitos da MDMA (MDA, HMMA e HMA) em culturas primárias de hepatócitos de rato. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média da quantidade de metabolitos formados por milhão de células vivas de três ensaios independentes. * Comparado com M a 36,5ºC; × Comparado com normotermia; + Comparado com “Sem etanol”; º Comparado com M a 40,5ºC; § Comparado com etanol+MDMA a 40,5ºC.

230 ______Trabalho V

A co-exposição ao etanol aumentou significativamente o metabolismo da MDMA a MDA e a HMA a 36,5ºC [a MDA aumentou de 0,124 ± 0,006 para 0,180 ± 0,023 mmol / 106 células (P < 0,05) e a HMA aumentou de 0,69 ± 0,03 para 1,23 ± 0,13 nmol / 106 células (P < 0,01)] não afectando a formação de HMMA. A pré-incubação com DAS ou KET foi capaz de impedir o aumento da formação de HMA induzido pelo etanol, mas não impediu o aumento na formação de MDA. Em condições hipertérmicas, o etanol aumentou significativamente a formação dos três metabolitos considerados. A co-incubação de etanol e MDMA em condições hipertérmicas resultou num aumento de 6 vezes na formação de MDA [de 0,248 ± 0,015 para 1,467 ± 0,121 mmol / 106 células (P < 0,001)], de 16 vezes na formação de HMMA [de 8,92 ± 0,40 para 145,7 ± 11,9 nmol / 106 células (P < 0,001)] e de 10 vezes na formação de HMA [de 0,818 ± 0,090 para 8,462 ± 0,752 nmol / 106 células (P < 0,001)]. A pré-incubação com DAS impediu parcialmente esta indução resultante da co-exposição ao etanol. A pré-incubação com KET também foi capaz de reverter o aumento da formação de metabolitos provocado pelo etanol, à excepção da formação de HMA. Esta maior actividade metabólica dos hepatócitos expostos ao etanol poderá ser devida à indução de várias isoenzimas do sistema citocromo P450 como a CYP2E1 e a CYP3A previamente atribuída ao etanol 676, 677. De facto, o etanol provou induzir a actividade da CYP2E em culturas de hepatócitos de rato (após 48 horas de exposição) e em ensaios in vivo em ratos 677. Por seu lado, a indução da CYP3A pelo etanol foi demonstrada, in vitro, em linhas celulares HepG2 que expressam a CYP3A4 humana e, in vivo, em ratos alimentados com a dietas contendo etanol 676. A maior formação de metabolitos dotados de maior toxicidade do que a própria MDMA 5 pode estar na base do aumento da mortalidade celular quando as células são co-expostas a etanol e a MDMA. No entanto, é importante salientar que outros factores, para além do aumento do metabolismo da MDMA, contribuem para o sinergismo na toxicidade do etanol e da MDMA. Destes, a hipertermia, efeito potencialmente letal associado com a exposição in vivo à MDMA, tem uma acção preponderante, uma vez que agrava significativamente a influência do etanol

231 Trabalho V ______no metabolismo da MDMA aumentando a formação de metabolitos hepatotóxicos. No entanto, o aumento da citotoxicidade verificado em condições hipertérmicas não se deve unicamente à maior formação de metabolitos, uma vez que, mesmo diminuindo a quantidade de metabolitos formados, recorrendo a uma pré-incubação com inibidores da CYP2E1 e da CYP3A1, não se verifica uma diminuição da percentagem de morte celular a qual se mantém elevada como nas células que não foram pré-incubadas com os inibidores, o que ilustra a importância da resposta hipertérmica na expressão da hepatotoxicidade da MDMA. Assim, dos resultados deste trabalho, podemos concluir que o etanol induz um aumento do metabolismo da MDMA , especialmente em condições hipertérmicas e, possivelmente, devido à indução de isoenzimas do sistema citocromo P450, incluindo a CYP2E1 e a CYP3A1. Para confirmar esta indução estão programados estudos, já fora do âmbito desta dissertação, que englobam a determinação da actividade, expressão e transcrição da CYP2E1 e da CYP3A1 no modelo experimental utilizado neste estudo.

232

Trabalho VI. Gas chromatography determination of acetone, acetaldehyde, ethanol and methanol in biological matrices and cell culture

______Trabalho VI

Trabalho VI. Gas chromatography determination of acetone, acetaldehyde, ethanol and methanol in biological matrices and cell culture.

Autores: Helena Pontesª, Paula Guedes de Pinhoª, Susana Casalb, Helena Carmoª, Agostinho Santosc, Teresa Magalhãesc, Fernando Remiãoª, Félix Carvalhoª, Maria Lourdes Bastosª a REQUIMTE, Toxicology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal b REQUIMTE, Bromatology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal c National Institute of Legal Medicine I.P., Faculty of Medicine, University of Porto, Alameda Prof. Hernâni Monteiro, 4200 - 319 Porto, Portugal

a) Abstract A Gas Chromatographic with Flame Ionization Detection method (GC- FID) with direct injection, using a capillary column, was validated to determine ethanol, acetaldehyde, methanol and acetone in different human matrices, such as whole blood, vitreous humour and urine, with clinical and forensic interest. This method was also employed to quantify these compounds in cell culture medium, thus being useful in basic research. A good peak resolution was achieved, with linear correlation between concentration and peak areas for all the compounds in all the matrices. The inter-day and the intra-day precision (CV%) of the method was always under 15% and 10%, respectively. The accuracy (A%) of the method, calculated as the percentage of target concentration, was within the acceptable limits. The obtained limit of detection was below 0.85 mg/L for acetaldehyde and below 0.75 mg/L for the other considered compounds. The small injection volume and the high split ratios applied, allied to the high performance of the GC column resulted in very good peak resolution and high sensitivities. This method is easy to perform, making it suitable for the routine of clinical biochemistry and forensic laboratories.

235 Trabalho VI ______b) Introduction Gas chromatographic methodologies have been reported, being the volatile fraction analysed by diversified techniques [1-5]. Chronologically, the direct sample injection in packed columns [1, 3] became obsolete and was gradually substituted by headspace techniques in capillary columns [6] and, more recently, by the selective headspace injection using Solid Phase Micro- Extraction (SPME) fibres [5, 7, 8]. However, both headspace methodologies require an accurate time- and temperature-controlled sample heating. When the automatic injectors are not available, reproducibility problems are difficult to overcome. Moreover, the influence of the biological specimen on the partitioning of the volatile compounds between liquid and headspace vapour and the selectivity of the SPME fibres increase both the complexity of method development and the total analysis time [9]. In addition, the headspace techniques usually require larger sample volumes and have higher detection limits. Ethanol, acetaldehyde, methanol and acetone are volatile compounds whose detection and quantification in biological matrices can be used as biomarkers of several diseases and/or intoxications. Ethanol consumption is under strict regulations in many circumstances, and legal Blood Alcohol Concentration (BAC) limits for driving are well established. Over-consumption of alcoholic beverages and drunkenness are almost always closely related with fatal accidents, trauma deaths, drowning, suicide and violent crimes [10]. These considerations justify the importance of the determination of ethanol levels in ante-mortem and post-mortem specimens with great importance in the forensic domain [4]. Humans are frequently exposed to naturally occurring acetaldehyde that can exist in the air and that can be ingested as a contaminant of food and alcoholic drinks since it is the main compound formed during ethanol metabolism. Additionally, humans are also exposed to acetaldehyde coming from automobile exhaust, cigarette smoke, fireplaces, and occupational settings. This compound has been associated with cancer development in experimental animals, being classified as a possible carcinogenic to humans by the International Agency for Research on Cancer (IARC) of the World Health

236 ______Trabalho VI

Organization [11]. Thus, from a clinical point of view, its quantification in biological samples is of paramount importance. The quantification of methanol in body fluids is very important for confirmation of methanol intoxication-related deaths [12] and can also be a biomarker of intentional [13], accidental (for example, by ingestion in adulterated drinks) [14] or occupational exposure [15]. Acetone can be a biomarker of ketoacidosis, which can help to diagnose ante-mortem diabetes mellitus, though it can also be a likely cause of death in binge drinkers and alcoholics [16], and can be very useful in the diagnosis of death from hypothermia [17]. Ketoacidosis is diagnosed by analysis of high levels of ketone bodies in body fluids, namely acetone, acetoacetate and particularly β-hydroxybutyrate [18]. Additionally, the quantification of acetone in biological fluids can be a biomarker of occupational exposure [15]. Given the importance of the quantification of these compounds in blood and urine from ante-mortem and post-mortem specimens we validated the present method in these matrices. However, as post-mortem compounds levels in blood do not necessarily reflect the concentration at the time of death, due to drug instability and post-mortem redistribution phenomena [19], measurements of vitreous humour (VH) concentrations could be of interest for predicting the blood concentration at the time of death in humans [20]. VH is a very useful matrix because the vitreous fluid is less influenced by autolytic processes, is simple to collect and is not affected by hemolysis [10]. Additionally, it is a clean fluid that contains less protein than urine and exhibits high stability [21]. Thus, VH has been recently demonstrated to be a suitable alternative specimen to post-mortem blood and urine, not only for the analysis of ethanol intoxications, but also for other drugs as well as endogenous biochemical constituents of the body to detect ante-mortem diseases [10]. VH is, additionally, more resistant to putrefactive changes than other specimens such as blood [8, 22]. Due to these advantages, formerly, VH determinations have been performed in order to detect various drugs, in particular ethanol [10] and also morphine [23], cocaine [24] and amitriptyline [25]. The validation of this method for its application in cell culture medium samples is also important due to the need of controlling the levels of these

237 Trabalho VI ______compounds when cell culture is used to study their effects on cell physiology and toxicity [26]. Thus, there is an obvious need to develop a cheaper, sensitive, rapid and reliable alternative gas chromatographic method. In this study it is proposed a gas chromatographic direct injection in capillary columns, to quantify ethanol, acetaldehyde, methanol and acetone, and to apply it to different matrices such as whole blood, vitreous humour, urine and cell culture medium. Based on the above mentioned rationale, the aim of this work was to develop an easy direct injection gas-chromatographic methodology to determine simultaneously some of the most important volatiles found in biological samples with clinical, forensic and research interest and to apply it to several matrices.

c) Materials and Methods c.1) Reagents All the used chemicals were of analytical grade: Ethanol (> 99.9%, Panreac, Spain), methanol (> 99.9%, Merck, Germany), 1-propanol (> 99%, Sigma-Aldrich Co., USA), acetone (> 99.9%, Merck, Germany), acetaldehyde (> 99.9%, Fluka, USA), Triton X-100 (Sigma-Aldrich Co. USA), acetonitrile (> 99.9%, Merck, Germany). William’S E culture medium was obtained from Lonza (Belgium) and supplemented with 2 mM L-glutamine (Lonza, Belgium), 5 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich Co., USA), 5 nM dexamethasone (Sigma-Aldrich Co., USA), 10 mM Hepes (Lonza, Belgium), 100 units/mL penicillin G, 100 μg/mL streptomycin sulphate and 250 ng/mL amphotericin B (Sigma-Aldrich Co., USA). c.2) Biological matrices characterization and preparation Human blood and urine samples were collected from healthy volunteers. In the experiments with whole blood, EDTA-blood was used. Post-mortem human vitreous humour was collected from autopsy samples at the North Delegation of the National Institute of Legal Medicine I.P., after accomplishment of all legal procedures to post-mortem samples collection. Prior to analysis,

238 ______Trabalho VI each sample was injected into the GC-FID to confirm the absence of each studied compound. Additionally, the interference between the tested compounds and some other volatile biomarkers of some diseases and with great forensic interest such as formaldehyde, methyl and ethyl formate, ethylene glycol, propylene glycol, glycerol, 1,4-butanediol and 2,3-butanediol was excluded. Volatile-free Blood (B), Urine (U), Vitreous Humour (VH) and Cell Culture Medium (CCM) were used to prepare the control samples and calibration curves. c.3) Calibration procedures Concentrated solutions of 500 g/L ethanol, 50 g/L methanol, 50 g/L acetaldehyde and 50 g/L acetone were prepared daily by dilution of the commercial solutions in deionised water. Daily prepared 2.2 g/L 1-propanol in deionised water was used as internal standard (IS). A stock calibrator containing 10 g/L ethanol, 1 g/L methanol, 1 g/L acetaldehyde and 1 g/L acetone was prepared daily in each tested matrix, from the concentrated solutions. The calibration curves were prepared as shown in Figure 1. These procedures resulted in final concentration of 7.5, 15, 30, 60, 120 and 240 mg/L of methanol, acetone and acetaldehyde, and with 75, 150, 300, 600, 1200 and 2400 mg/L of ethanol. Theses calibration standards, in blood and vitreous humour, undergone a 5 times dilution with a solution containing 1.2% of Triton X-100 and 1.8 g/L of acetonitrile in water, to decrease sample viscosity and therefore, facilitate volume measurements and sample injection, according to the method described by Dubowski [27]. Each tube was vortex-mixed and centrifuged at 16,000 g for 5 min at 4 ºC. A fixed volume of supernatant (0.5 μL) was injected into the chromatographic system.

239 Trabalho VI ______

Figure 1 – Flowchart for preparation of the calibration curves.

c.4) Samples preparation Blood or vitreous humour samples (100 μL) were mixed with 10 μL of IS. The samples were diluted to 500 μL with the Triton X-100 and acetonitrile solution, centrifuged and 0.5 μL of the supernatant were directly injected into the gas chromatograph as described below. Concerning urine and cell culture medium, after adding the internal standard, samples were centrifuged and 0.5 μL of the supernatant were directly injected into the gas chromatograph. c.5) Analytical Instrument settings The gas chromatograph used was a TermoFinnigan Model Focus GC equipped with a flame ionization detector. The injection port of the chromatograph was installed with a glass liner (5 mm ID) appropriated for split analysis, to prevent the contamination of the gas chromatographic column with

240 ______Trabalho VI non-volatile material from the tested matrices. For whole blood and vitreous humour, the liner was replaced after 50 injections. For cell culture medium and for urine, the liner was replaced each 100 injections. The analyses were performed under the following chromatographic conditions: Column: CPWax 57 CB, (WCOT Fused Silica), 25 m × 0.25 mm id, DF = 0.2, from Varian (USA). The temperature of the FID detector was 220ºC and the injector temperature was 220ºC. The oven temperature was programmed to 40ºC (for 2 min), followed by an increase of 5ºC/min until 200ºC. Carrier gas was helium with a flow of 1.5 mL/min. The injection of whole blood and vitreous humour was performed by means of a 10 μL Hamilton syringe (Model 701 RN) with a removable needle (needle gauge 22S), cleaned under vacuum between each injection with the Triton X-100 and acetonitrile solution. On the other hand, the injection of cell culture medium and urine was performed by means of a 5 μL SGE syringe (Model 5F-GP) cleaned under vacuum between each injection with deionised water. The volume of injection was 0.5 μL, with a split ratio of 100 and a split flow of 120 mL/min for blood and vitreous humour, and a split ratio of 60 and a split flow of 90 mL/min for urine and cell culture medium. c.6) Effect of the split ratio on the sensitivity of the method The effect of the split ratio on the sensitivity of the method was studied for whole blood with 60 mg/L acetaldehyde, acetone and methanol and 600 mg/L ethanol. Split ratios between 1:40 and 1:500 were tested: 1:40, 1:60, 1:100, 1:150, 1:200, 1:300, 1:400, 1:500, which corresponds to 60 mL/min, 90 mL/min, 120 mL/min, 150 mL/min, 300 mL/min, 450 mL/min, 600 mL/min, 750 mL/min, respectively.

c.7) Validation experiments and acceptance criteria

c.7.1) Method linearity Method linearity was determined by evaluating the regression curve and is indicated by the square correlation coefficient (R2). The line of best fit for the

241 Trabalho VI ______relationship between the ratio of peak area and internal standard area and concentration of analytes in the samples was determined by linear regression performing calibration curves in the considered concentration ranges (7.5-240 mg/L for acetaldehyde, acetone and methanol and 75-2400 mg/L for ethanol). For urine and cell culture medium, the slopes were calculated taking into account the mean of 5 calibration curves prepared in each matrix on 5 consecutive days. For whole blood and vitreous humour, the slopes were based on the mean of 3 curves prepared in these matrices on 3 consecutive days. Linearity was achieved with a minimal R2 of 0.99.

c.7.2) Precision For urine and cell culture medium, the intra-day precision of the method was determined by injecting, on the same day, 5 different replicate calibrators of each one of the 7 points of the calibration curves; the intra-day precision of the apparatus was determined by analysing 5 times, on the same day, the 7 calibrators of one of the calibration curves; the inter-day precision of the method was determined by analyzing, for 5 consecutive days, daily prepared calibrators of the 7 concentrations considered for the calibration curves. For blood and vitreous humour, due to the complexity of these samples, the intra-day precision of the method was determined injecting, on the same day, 6 independent calibrators containing 1200 mg/L of ethanol and 120 mg/L of acetaldehyde, acetone and methanol; the intra-day precision of the apparatus was determined injecting 6 times, on the same day, one of the concentrations contemplated in the calibration curves (1200 mg/L for ethanol and 120 mg/L for acetaldehyde, acetone and methanol); the inter-day precision of the method was evaluated by analyzing, for 3 consecutive days, daily prepared calibrators of all the 7 concentrations considered for the calibration curves. Precision was assessed by calculating the mean, standard deviation and coefficient of variation (CV%) of the observed values.

c.7.3) Limits of detection and quantification To determine the sensitivity of the method, the calibrators with the lowest concentrations (7.5 mg/L for methanol, acetaldehyde and acetone and 75 mg/L for ethanol) of each matrix (urine, blood, vitreous humour and cell culture

242 ______Trabalho VI medium) were progressively diluted to determine the detection (LOD) and quantification limits (LOQ). A signal-to-noise ratio of 3 was considered acceptable for estimating the detection limit [28]. This concentration that originated the peak with a signal-to-noise ratio of 3 was injected 5 times. The quantification limit (LOQ) for each matrix was estimated based on a signal-to-noise ratio of 10 obtained for calibration solutions containing the compounds of interest. The LOQ corresponds to the lowest concentration obtained by successive dilutions of standards that originate a sharp and symmetrical chromatographic peak, required for routine analysis. Peaks that were excessively broad, showing tailing or shoulders, or that did not resolve to within 10% baseline were not considered [29].

c.7.4) Accuracy (A%) Accuracy was calculated in terms of bias as the percent deviation of the mean calculated concentration at each concentration level from the corresponding theoretical concentration. Accuracy (%) = (mean calculated concentration – nominal concentration) / (nominal concentration) × 100.

d) Results d.1) Gas Chromatographic Separation Interferents were ruled out by verifying the absence of peaks in the retention times of the studies analytes (Figure 2A and 2B). As shown in Figure 2 the retention times for acetaldehyde, acetone, methanol and ethanol in all tested matrices (Figure 2C and 2D) were 1.66, 2.02, 2.70 and 3.16 min, respectively. The internal standard (1-propanol) retention time was 5.26 min. The peak at 3.71 minutes in the chromatogram 2B (whole blood and vitreous humour) corresponds to the peak of acetonitrile, which is part of the triton X-100 and acetonitrile solution used to dilute these complex matrices.

243 Trabalho VI ______

Figure 2 – Representative chromatograms obtained from blood sample without IS (2A), blood sample with IS (2B), calibrator solutions prepared in cell culture medium or urine (2C) and in blood or vitreous humour (2D) with peak identification and retention times of the quantified compounds.

d.2) Method validation

d.2.1) Linearity Regression analysis of calibration data achieved satisfactory linearity over the considered concentration range. Square correlation coefficients (R2) were always > than 0.99, indicating a linear relationship from 7.5 to 240 mg/L for acetaldehyde, methanol and acetone and from 75 to 2400 mg/L for ethanol in all the studied matrices. The slopes and square correlation coefficients are presented in Figure 3A for cell culture medium, 3B for urine, 3C for blood and 3D for vitreous humour.

244 ______Trabalho VI

245 Trabalho VI ______

Figure 3 – Calibration curves of acetaldehyde, acetone, methanol and ethanol on the 4 different considered matrices: cell culture medium (3A), urine (3B), blood (3C) and vitreous humour (3D). Results are presented as mean ± SD of 5 different injections of each calibrator of cell culture medium and urine and of 3 different injections of each calibrator of whole blood and vitreous humour.

246 ______Trabalho VI

d.2.2) Sensitivity The LOD and LOQ for each compound in each matrix are shown in Table 1.

Table1. Limits of Detection (LOD) and Quantification (LOQ) in mg/L.

Acetaldehyde Acetone Methanol Ethanol LOD LOQ LOD LOQ LOD LOQ LOD LOQ Blood 0.84 2.8 0.75 2.5 0.75 2.5 0.75 2.5

Cell Culture medium 0.15 0.5 0.38 1.23 0.75 2.5 0.38 1.23

Vitreous humor 0.15 0.5 0.15 0.5 0.75 2.5 0.25 0.83

Urine 0.15 0.5 0.75 2.5 0.5 1.67 0.25 0.83

d.2.3) Effect of the split ratio on the sensitivity of the method The effect of the split ratio on the sensitivity of the method is illustrated on Figure 4.

300000 ♦ Ethanol 20000 Methanol 18000 Acetone 250000 16000 Δ Acetaldehyde

14000 200000 12000

150000 10000

8000 100000 6000 Chromatographic Peak Area

Chromatographic Peak Area Peak Chromatographic 4000 50000 2000

0 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 Split ratio Split ratio

Figure 4 – Variation of Chromatographic peak area in blood matrix with the injector split ratio.

For the blood matrix, higher split ratios were needed to protect liners and the chromatographic column. However, if lower detection limits are needed, the split ratio can be decreased until 1:50. For the other matrices, a good peak resolution can still be obtained for ratios up to 1:30 (data not shown).

247 Trabalho VI ______

d.2.4) Inter-day precision (CV%) and accuracy (A%) of the method The results for the 4 matrices and for 3 representative concentrations are presented in Table 2. For cell culture medium and urine, the simplest matrices, the obtained coefficients of variation (CV%) were always lower than 10%. For vitreous humour and blood, due to sample manipulations, the CV% was less favourable. The average coefficients of variation (ACV%) of all the tested concentrations are presented in Table III and were always lower than 15%. The accuracy (A%) of the method for the 4 matrices and for 3 representative concentration of each compound, calculated as the percentage of target concentration, is indicated in Table 2.

d.2.5) Intra-day precision of the method and of the apparatus The intra-day precision of the method and of the apparatus for the 4 tested compounds in the 4 considered matrices are presented in Table 3 as average coefficients of variation (ACV%) that are always lower than 10%. Concerning the intra-day precision of the apparatus, the average coefficients of variation (ACV%) were always between 2% and 9% being the lowest ACV% obtained for ethanol in urine and the highest for acetaldehyde in blood. The ACV% values obtained for whole blood and vitreous humour were higher than those obtained for cell culture medium and urine due to the need of more sample manipulations (Table 3). Concerning the intra-day precision of the method, the average coefficients of variation (ACV%) were always between 3% and 9% being the lowest ACV% obtained for ethanol in blood and the highest for methanol in blood (Table 3).

248

Table 2. Inter-day precision (CV%) and accuracy (A%) of the method for the 4 matrices and for 3 representative concentrations.

Acetaldehyde Acetone Methanol Ethanol

Conc Conc Mean ± SDª CV%b A%c Mean ± SD CV% A% Mean ± SD CV% A% Mean ± SD CV% A% (mg/L) (mg/L)

15 0.258 ± 0.021 8.094 -0.3 0.326 ± 0.025 7.588 -9.4 0.249 ± 0.020 7.920 2.8 150 3.359 ± 0.213 6.327 2.0

d 60 0.788 ± 0.063 8.060 -10.5 1.099 ± 0.100 9.088 -1.0 0.799 ± 0.038 4.718 -10.7 600 10.951 ± 0.955 8.722 -22.3 CM 120 1.830 ± 0.148 8.075 7.1 2.288 ± 0.184 8.061 5.1 1.813 ± 0.034 1.878 2.8 1200 29.410 ± 1.562 5.311 3.2

15 0.248 ± 0.009 3.787 6.2 0.319 ± 0.021 6.464 -3.0 0.221 ± 0.008 3.449 -5.2 150 3.738 ± 0.276 7.385 3.3

d 60 600

U 0.859 ± 0.085 9.869 -1.1 1.262 ± 0.101 8.045 1.2 0.818 ± 0.061 7.413 6.5 12.284 ± 1.183 9.629 -1.2 120 1.579 ± 0.084 5.304 -7.9 2.444 ± 0.131 5.351 -1.1 1.582 ± 0.039 2.445 6.7 1200 23.732 ± 2.179 9.180 -1.9

15 0.077 ± 0.007 9.113 18.0 0.058 ± 0.002 3.483 -9.1 0.026 ± 0.003 10.687 -21.0 150 0.401 ± 0.055 13.720 -13.7

e 60 0.193 ± 0.006 3.078 0.166 ± 0.016 9.648 0.122 ± 0.019 15.286 600 1.685 ± 0.177 10.483

B 18.0 -11.7 -2.9 0.3 120 0.278 ± 0.041 14.592 -5.9 0.393 ± 0.030 7.511 6.9 0.257 ± 0.056 21.934 10.4 1200 3.622 ± 0.420 11.584 9.8

15 0.054 ± 0.009 10.886 -21.6 0.066 ± 0.003 5.026 19.0 0.030 ± 0.001 3.498 -16.2 150 0.644 ± 0.078 12.046 11.0

e 60 0.128 ± 0.029 22.461 -13.5 0.149 ± 0.012 9.412 -23.4 0.112 ± 0.005 4.210 -20.1 600 1.751 ± 0.114 6.496 -17.0 VH 120 0.284 ± 0.002 0.818 -2.8 0.387 ± 0.047 12.066 -1.3 0.275 ± 0.006 2.005 -1.2 1200 4.310 ± 0.750 17.413 3.9 ª Mean of A/A(IS) ± Standard Deviation b Reproducibility = (Standard Deviation / Mean) × 100 c Accuracy = (Mean Calculated Concentration-Nominal Concentration) / (Nominal Concentration) × 100 d Mean of 5 replicates e Mean of 3 replicates

249

250

Table 3. Compilation of the average coefficients of variation (ACV%) obtained for the evaluation of the intra-day precision of the GC-FID apparatus, the intra- day precision of the method, and the inter-day precision of the method.

Acetaldehyde Acetone Methanol Ethanol Cell Culture Medium 5.138 5.168 6.292 3.404

Urine Intra-day 2.322 2.060 3.839 1.957 precision of the Blood GC-FID 9.017 4.134 6.342 2.202

Vitreous Humour 4.718 2.410 6.663 4.518

Cell Culture Medium 5.978 5.042 5.697 6.207

Urine Intra-day 5.699 4.485 7.003 6.235 precision of the Blood method 3.797 5.262 8.829 2.973

Vitreous Humour 8.051 7.871 8.267 5.901

Cell Culture Medium 9.025 7.526 5.179 6.668

Urine Inter-day 5.543 5.253 6.802 8.336 precision of the Blood method 11.572 8.621 10.728 8.684

Vitreous Humour 12.254 10.759 8.777 12.854

______Trabalho VI e) Discussion Several methods for the analysis of ethanol that are also concerned with the simultaneous monitoring of acetaldehyde, methanol or acetone concentrations have been reported [9, 30-32]. GC-MS methods have also been applied to measure ethanol concentrations in different biological matrices [31, 33, 34]. However, GC-MS is a much more complex technique than GC-FID and requires highly trained personnel. In consonance with these previous methods, the technique described in the present study enables the GC-FID analysis of blood, urine, vitreous humour and cell culture medium for the presence of ethanol, acetaldehyde, acetone and methanol without any pre-treatment, in the case of urine, and cell culture medium, and with a simple dilution with triton X- 100 and acetonitrile for vitreous humour and blood. As shown in Figure 2, the selected chromatographic conditions resulted in a good chromatographic resolution, with good peak separation. In addition, the good chromatographic separation between the studied compounds and some other important volatiles such as formaldehyde, methyl and ethyl formate, ethylene glycol, propylene glycol, glycerol, 1,4-butanediol and 2,3-butanediol, recognized as biomarkers of some diseases and/or having great forensic interest, evince the interest of this method for a future adaptation to quantify these volatiles. This fact is a great advantage of this method, indicating its possible broad applicability. A very good linear correlation (R2>0.99) between the concentration and the ratio between the compound peak and the IS peak was obtained for all the tested compounds in all the tested matrices. The proposed acceptance limits for the accuracy were 100 ± 20% [28] and, only in the case of VH, and for some concentrations, the obtained accuracy results were out of these limits. The injection of 0.5 μL of blank matrices showed no interferences with other constituents from whole blood, vitreous humour, cell culture medium, and urine, allowing the detection of very small amounts of the studied compounds. The sensitivity depends on the volume injected and depends on the split ratio. In this work, and in the case of whole blood, to prevent the shelf-life of the

251 Trabalho VI ______chromatographic column, the volume injected was 0.5 μL and the split ratio was 1:100. For more sensitive determinations, 1 μL or even larger volumes can be injected and the split ratio can also be decreased, easily decreasing de LOD to levels lower than 0.1 mg/L. For the suggested chromatographic conditions, the LOD obtained with whole blood were: 0.84 mg/L for acetaldehyde, and 0.75 mg/L for acetone, methanol and ethanol. However, by changing the split ratio, the LOD can be easily decreased 10 times, which means: 0.075 mg/L for ethanol, acetone and methanol, and 0.084 mg/L for acetaldehyde [3]. f) Conclusion In conclusion, the direct GC-FID injection method using capillary columns presented here is a highly sensitive, rapid and reliable procedure to determine a plethora of volatile compounds in various biological samples. For the first time, a method was validated for the simultaneous determination of acetaldehyde, acetone, methanol and ethanol in four different matrices (human blood, urine and vitreous humour and cell culture medium). The small amounts of sample injected (0.5 μL) and the high split ratios applied (1:60 and 1:100), allied to the high performance of the GC column, result in very good peaks resolution and high sensitivities. This method is easy to perform and does not require highly and specifically trained personnel, making it suitable to the routine of clinical biochemistry and forensic laboratories. g) Acknowledgements Helena Pontes thanks FCT for financial support (SFRH/BD/18527/2004). h) References 1. Ferrari LA, Arado MG, Nardo CA, and Giannuzzi L. Post-mortem analysis of formic acid disposition in acute methanol intoxication. Forensic Sci Int;133:152-158 (2003). 2. Fukunaga T, Sillanaukee P, and Eriksson CJ. Problems involved in the determination of endogenous acetaldehyde in human blood. Alcohol Alcohol;28:535-41 (1993). 3. Tangerman A. Highly sensitive gas chromatographic analysis of ethanol in whole blood, serum, urine, and fecal supernatants by direct injection method. Clinical Chem;43:1003-9 (1997). 4. Zilly M, Langmann P, Lenker U, Satzinger V, Schirmer D, and Klinker H. Highly sensitive gas chromatographic determination of ethanol in human urine samples. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci;798:179-186 (2003).

252 ______Trabalho VI

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253 Trabalho VI ______

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254

Trabalho VII. Ethanol, the forgotten artifact in cell culture.

Arch Toxicol (2008) 82:197–198 DOI 10.1007/s00204-008-0285-y

LETTER TO THE EDITOR

Ethanol, the forgotten artifact in cell culture

Helena Pontes · Márcia Carvalho · Paula Guedes de Pinho · Helena Carmo · Fernando Remião · Félix Carvalho · Maria Lourdes Bastos

Those who work with cell cultures are certainly familiar- (as they should have, otherwise the cells will not be oxy- ized with the ritual of sanitizing everything that goes genated) and generally, both cabinets and incubators into the cabinet or into the incubators with 70% ethanol, have an ethanol-saturated atmosphere due to the as is recommended by all the rules of aseptic techniques frequent sanitization procedures. Without additional and good cell culture practices. In spite of its eVective- precautions, ethanol concentrations of 0.5 mM are easily ness in preventing microbiological contamination of the attained, and depending on the ethanol-saturation of the cultures, this gesture may have some undesirable cabinets or incubators, these concentrations can reach consequences. values of 5 mM as illustrated in Fig. 1, which represents Probably, the research groups that study the eVects of the ethanol concentrations detected on 14 independent ethanol on cell cultures are more conscious about the experiments where no precautions were taken to avoid risks of sanitizing all the material with 70% ethanol the exposure of the medium to ethanol. Both these because they need to guarantee that they have ethanol- concentrations have proven eVects on cell function free control samples. Thus, these groups routinely quan- (Charness et al. 1994; Smith and Gong 2007). In fact, it tify ethanol in the culture medium to conWrm the ethanol is well described that ethanol, as a microsomal and mito- concentrations used in their studies. However, the scien- chondrial enzymatic inducer (CYP2E1, ADH-I), can tiWc community must be aware that when 70% ethanol is inXuence the metabolism of several endogenous and used on cell culture as a surface sanitization process, if exogenous compounds causing eventual antagonisms, cautions are not taken, the cells will be exposed to high synergisms or potentiations that will necessarily aVect ethanol concentrations. These high concentrations are the Wnal results of the experiments (Jang and Harris achieved because, under normal cell culture conditions, 2007). the cell culture plates have appropriate venting systems In addition, by itself, ethanol can directly or indirectly alter the normal cell function, inXuencing cell survival, redox status, receptor functions, mitochondrial homeostasis, cell signaling, among others (Wu et al. 2006), and also aVecting the activity of infectious agents such as hepatitic C H. Pontes (&) · M. Carvalho · P. G. de Pinho · H. Carmo · virus (Trujillo-Murillo et al. 2007). F. Remião · F. Carvalho · M. L. Bastos (&) Thus, some precautions must be taken to minimize this REQUIMTE, Toxicology Department, Faculty of Pharmacy, University of Porto, “contamination” with ethanol: 70% ethanol used to sanitize Rua Aníbal Cunha 164, 4099-030 Porto, Portugal surface and objects should be completely dry before the e-mail: [email protected] Xasks or plates are opened and these should not be sprayed M. L. Bastos with 70% ethanol between coming out of the cabinet and e-mail: [email protected] going into the incubator (but obviously, in between, contact with other surfaces is forbidden). M. Carvalho Faculty of Health Sciences, University Fernando Pessoa, These concerns are crucial for every lab working with Rua Carlos da Maia 296, 4200-150 Porto, Portugal cell culture and must be taken into account during the data 123 198 Arch Toxicol (2008) 82:197–198

Acknowledgments Helena Pontes thanks FCT for her Ph.D. grant (SFRH/BD/18527/2004). 6

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123

PARTE III

DISCUSSÃO INTEGRADA E CONCLUSÕES

______Discussão

4. DISCUSSÃO INTEGRADA

Os trabalhos apresentados nesta dissertação correspondem aos primeiros estudos publicados sobre a avaliação dos mecanismos subjacentes à toxicidade hepática resultante da exposição simultânea ao EtOH e à MDMA. Esta discussão tem como objectivo fornecer uma visão integrada dos resultados obtidos nos estudos realizados, necessária à concepção de uma tese, não pretendendo assim substituir a discussão específica de cada um dos trabalhos, necessariamente mais pormenorizada. A importância destes estudos é facilmente constatada pela análise dos dados epidemiológicos relativos aos padrões de consumo de ecstasy apresentados na introdução da presente dissertação e que mostram que o consumo concomitante de ecstasy e EtOH apresenta uma elevada prevalência e parece estar associado, directa ou indirectamente, a episódios de morbilidade e mortalidade entre os consumidores. Até à data, os estudos realizados sobre os efeitos desta associação centraram-se sobretudo na influência do EtOH na farmacocinética da MDMA em ratos 682 e em humanos 683 e em alguns dos efeitos induzidos por este estimulante anfetamínico, nomeadamente a resposta hipertérmica 633, 657, 682, 695, 711, 713, as alterações subjectivas 314, 683, 719 e psicomotoras 633, 657, 682-684, 711, 712, 715, 719, 737, a neurotoxicidade 712, 716 e as alterações imunológicas 728. Outros estudos centraram-se ainda na capacidade da MDMA influenciar o padrão de consumo de EtOH 694, 695, 738, 739. Tendo em conta os conhecimentos pré-exitentes acerca da toxicidade do EtOH e da MDMA quando consumidos isoladamente, seria de esperar que o consumo simultâneo de ambos resultasse num sinergismo das respostas hepatotóxicas provocadas por cada um dos compostos. Era, no entanto, imprescindível verificar se este sinergismo realmente ocorria e quais as suas consequências a nível hepático, uma vez que o fígado é o órgão maioritariamente envolvido no metabolismo de ambas as substâncias, estando especialmente sujeito à acção tóxica dos metabolitos formados a esse nível 193, 736. Para verificar a existência de uma interacção toxicológica entre o EtOH e a MDMA foi realizado um ensaio in vivo em ratinhos CD-1 que foram expostos

261 Discussão ______a uma dose única de 10 mg/kg de MDMA administrada após uma prévia exposição repetida a EtOH a 12% durante 8 semanas (Trabalho II), no sentido de simular o padrão de consumo mais comum que geralmente se caracteriza por uma exposição continuada ao EtOH anterior ao primeiro contacto com a MDMA 657. De referir que o aumento da toxicidade da MDMA pelo EtOH foi evidente em ensaios preliminares nos quais se expuseram ratinhos CD-1, previamente expostos a EtOH, a doses de MDMA de 20 mg/kg (Trabalho I). Nestes ensaios, a percentagem de mortes do grupo EtOH+MDMA foi muito elevada (67% dos animais) e fez com que os estudos subsequentes fossem realizados com doses de MDMA de 10 mg/kg. Posteriormente, de forma a esclarecer o(s) mecanismo(s) subjacentes à toxicidade sinérgica da mistura de MDMA e EtOH que tinha sido, anteriormente, observada nos ensaios in vivo, foram também realizados ensaios ex vivo e in vitro. Nos ensaios ex vivo (Trabalho III) foram utilizadas suspensões de hepatócitos isolados de ratinhos sujeitos ao mesmo padrão de exposição ao EtOH que os utilizados no ensaio in vivo. Os hepatócitos obtidos destes ratinhos foram, posteriormente, expostos a diferentes concentrações de MDMA. Nos ensaios in vitro (Trabalhos IV e V) foram utilizadas culturas primárias de hepatócitos de rato que foram incubadas com diferentes concentrações de MDMA na presença, ou na ausência, de 300 mM de EtOH (valor aproximado do LC50 do EtOH após 24 horas de incubação a 40,5ºC, neste modelo experimental). Quer os hepatócitos em suspensão quer os hepatócitos em cultura foram incubados em condições normotérmicas (36,5ºC) e hipertérmicas (40,5ºC) com o objectivo de simular e avaliar o efeito do aumento da temperatura corporal induzido in vivo pela MDMA.

4.1. Efeitos da exposição a EtOH e MDMA no comportamento e na temperatura corporal de ratinhos CD-1

Nos ensaios in vivo uma clara interacção entre o EtOH e a MDMA foi evidente logo após a administração da MDMA, uma vez que os animais simultaneamente expostos às duas substâncias ficaram marcadamente prostrados quando comparados com os animais unicamente expostos à MDMA. Este fenómeno poderá ter sido causado pelo facto de os animais

262 ______Discussão expostos a EtOH sofrerem um aumento e um prolongamento significativos do efeito hipertérmico induzido pela MDMA, comparativamente à exposição apenas a MDMA (Trabalho II, Figura 1). De facto, os animais expostos a MDMA e EtOH apresentaram temperaturas corporais significativamente mais elevadas do que os animais expostos apenas a MDMA, um efeito que se prolongou por um período de 7 horas. Este agravamento da resposta hipertérmica induzida pela MDMA poderá, potencialmente, predispor os animais afectados para o desenvolvimento dos efeitos deletérios associados à hipertermia. Apesar do efeito hipertérmico da MDMA ser uma reacção esperada 142, o sinergismo exercido neste efeito pela prévia exposição repetida ao EtOH foi surpreendente, uma vez que o EtOH está normalmente associado a indução de vasodilatação e hipotermia. Este efeito é, no entanto, rapidamente afectado por fenómenos de tolerância 710 e, assim, a acção do EtOH que se esperaria que contrariasse o efeito hipertérmico da MDMA deixa de existir. O efeito sinérgico da prévia exposição repetida ao EtOH na hipertermia induzida pela MDMA poderá dever-se à acção directa do EtOH na libertação de DA 701, uma vez que a libertação de DA foi já associada ao desenvolvimento de hipertermia após exposição à MDMA 80, tal como amplamente referido na introdução.

4.2. Efeitos da exposição de hepatócitos em cultura a EtOH e MDMA na produção de ROS e RNS

Os estudos realizados no âmbito desta dissertação demonstraram, pela primeira vez, um sinergismo no aumento da produção de ROS e RNS quando culturas primárias de hepatócitos de rato foram expostas simultaneamente a EtOH 300 mM e MDMA 1,6 mM (Trabalho IV, Figura 3). De facto, em condições hipertérmicas, a co-incubação com EtOH e MDMA levou a um aumento significativo da formação de espécies reactivas de aproximadamente 100%, quando comparado com o efeito da exposição apenas a MDMA (p < 0,001).

263 Discussão ______

Este sinergismo está de acordo com o facto de quer o EtOH quer a MDMA serem capazes de aumentar a formação de ROS em vários modelos experimentais 674, 740. O aumento na formação de ROS e RNS pode surgir como consequência (i) da indução da CYP2E1 pelo EtOH, observada num modelo in vivo de patologia hepática alcoólica de administração intra-gástrica de EtOH 741, (ii) da disfunção mitocondrial subsequente à diminuição dos níveis de GSH e da produção de ATP provocadas pelo EtOH, já observadas em vários estudos, incluindo em hepatócitos em cultura obtidos de ratos expostos a EtOH através da dieta 742, 743, ou (iii) dos ciclos redox associados ao metabolismo da MDMA, já descritos após administração desta substância (15 mg/kg, i.p.) a ratos Dark Agouti (fenótipo metabolizador pobre para as CYP2D) 53 e (iv) da conjugação dos seus metabolitos com a GSH, fenómeno já observado, por exemplo, em microssomas de fígado de rato 61 e em ratos Sprague-Dawley machos que foram expostos a MDMA através de uma administração intra-cerebroventricular 62.

4.3. Efeitos da exposição a EtOH e MDMA nos mecanismos de defesa antioxidantes

A hipertermia mais intensa e mais prolongada resultante da co- exposição de ratinhos CD-1 a EtOH (12% durante 8 semanas) e MDMA (10 mg/kg) foi acompanhada por maior activação, a nível hepático, do factor de transcrição HSF1 (heat shock factor-1) (Trabalho II, Figura 1). De facto, observou-se um aumento significativo da intensidade óptica das bandas correspondentes ao HSF1 activado, de 189,7 ± 29,1 unidades de absorvância no grupo apenas exposto a MDMA, para 317,9 ± 48,6 no grupo exposto a EtOH+MDMA. Esta activação ocorre, normalmente, como resposta à exposição a altas temperaturas e a agressões pró-oxidantes e corresponde a um mecanismo de defesa contra a agressão, aumentando a síntese das proteínas de choque térmico (HSPs ou heat shock proteins). Estas proteínas contribuem para a homeostasia celular 744, contrariam os efeitos da agressão térmica e

264 ______Discussão favorecem a adaptação a fenómenos de stress oxidativo para evitar a morte celular 156 (Figura 18).

Figura 18. Mecanismo de resposta ao choque térmico. O HSF1 (principal HSF envolvido na resposta à agressão térmica) existe no citosol na forma inactiva em heterodímeros com a HSP70 ou a HSP90. Perante um estímulo agressivo (ex.: stress oxidativo, choque térmico, etc) ocorre a formação de proteínas não nativas que resultam da desnaturação de proteínas membranares e citoplasmáticas 745, 746 e que vão activar a resposta ao choque térmico que leva à síntese de HSPs. Estas proteínas vão competir com o HSF para as HSPs heterodiméricas. Uma vez que as HSPs têm mais afinidade para as proteínas desnaturadas do que para o HSF, este é libertado no citoplasma. O HSF é depois translocado para o núcleo onde vai formar homotrímeros que são activados por fosforilação e vão iniciar a transcrição de genes de choque térmico por ligação à região promotora da transcrição destes genes denominada elemento de choque térmico (HSE) e que vai levar a um aumento na síntese das HSPs 744, 747. Para além do referido, a activação do HSF1 é regulada por fosforilação reversível na qual podem estar envolvidas várias cinases como as Akt, ERK e JNK activadas pela agressão térmica 748. Por exemplo, a actividade do HSF1 é aumentada pela activação da Akt induzida pelo calor 749 no entanto, a activação da ERK e JNK induzida pelo calor resulta numa diminuição da actividade do HSF1 750. JNK, c-Jun N-terminal cinase; Akt, serina/treonina cinase ou PKB; ERK, cinase regulada por sinais extracelulares.

Por outro lado, o aumento da activação do NF-κB hepático (nuclear factor kappa-B) nos animais expostos a 10 mg/kg de MDMA após 8 semanas de exposição repetida a EtOH a 12% (Trabalho II, Figura 2), um dos factores de transcrição envolvidos na activação de genes de resposta imediata a estímulos deletérios e inflamatórios 195, indica que a co-exposição a etanol e MDMA exerce um efeito pró-inflamatório, confirmado pela observação, por microscopia electrónica de cortes histológicos de tecido hepático, de células Kupffer

265 Discussão ______activadas (Trabalho II, Figura 3). De facto, observou-se um aumento significativo da intensidade óptica das bandas correspondentes ao NF-κB activado, de 45,44 ± 5,97 unidades de absorvância no grupo apenas exposto a MDMA, para 88,79 ± 4,53 no grupo exposto a EtOH+MDMA. As consequências de uma maior activação do NF-κB podem ser variadas, uma vez que a sua activação pode estar relacionada com o desenvolvimento de processos inflamatórios, bem como na regulação da expressão de enzimas antioxidantes 751 (Figura 19).

Figura 19. Mecanismo de activação do NF-κB. Quando as células são atingidas por estímulos deletérios e inflamatórios (ex.: ROS e outros radicais livres, IL-1, TNF-α, LPS, luz UV, RNA de cadeia dupla, sepsis, hemorragia, isquemia 752 o inibidor do NF-κB é fosforilado pela IκB cinase (IκK) e a forma ativa do NF-κB é libertada 753. O IκB fosforilado é poliubiquitinado e degradado por um mecanismo dependente do proteossoma e o NF-κB activado é translocado para o núcleo, liga-se ao DNA e regula a transcrição de vários mediadores pró-inflamatórios como as citoquinas e as quimioquinas, factores de crescimento, inibidores da apoptose, moléculas de adesão celular endotelial, moléculas do complexo MHC, moléculas de adesão leucocitária (E-selectina, VCAM-1, ICAM- 1), outros factores de transcrição como o p-53, o c-myc ou o ras 754, enzimas antioxidantes como a MnSOD e a GPX 751, 755, enzimas pró-inflamatórias efectoras como a COX-2 756, outras enzimas como a NOS 757 e IκBα 758. O IκBα bloqueia as acções do NF-κB ligando-se ao NF-κB e restabelecendo a sua inibição 759. Adaptado de Luedde e Trautwein 2006 760.

266 ______Discussão

No mesmo estudo, verificou-se um aumento significativo da actividade da SOD (Trabalho II, Tabela 3), provavelmente como um mecanismo de defesa contra a agressão pró-oxidante habitualmente associada ao consumo de EtOH e de MDMA. De facto, um aumento da actividade da SOD como resultado da exposição aguda (dose oral única : 5, 10, 20 ou 40 mg/kg) e subaguda (5, 10, ou 20 mg/kg/dia durante 14 dias) de ratos Wistar a MDMA foi já descrito no rim 761. Este é, no entanto, o primeiro estudo que mostra um aumento da SOD hepática após exposição de ratinhos CD-1 a EtOH e MDMA. A exposição a EtOH+MDMA afectou quer a MnSOD quer a Cu/ZnSOD, provocando aumentos de, aproximadamente, 42 e 28%, respectivamente, quando comparadas com as actividades da SOD nos animais expostos apenas a EtOH. Contudo, a activação do NF-κB e do HSF1 não foi suficiente para proteger as células da toxicidade da MDMA e do EtOH, apesar de ter sido eficiente em evitar modificações marcadas em parâmetros de stress oxidativo como a razão GSH/GSSG, o conteúdo em carbonilos proteicos e o grau de peroxidação lipídica (Trabalho II, Tabela 2). A ausência de alterações nestes indicadores do estado redox do fígado foi inesperada, e poderá eventualmente dever-se a mecanismos de compensação contra a agressão oxidativa desenvolvidos pelo organismo durante o pré-tratamento com EtOH, ou mesmo a uma eficaz biossíntese das defesas antioxidantes que, segundo alguns autores, é suficiente para resistir a uma determinada agressão, em animais com um regime alimentar equilibrado 762. Esta ausência de alterações nos níveis de GSH após exposição ao EtOH está em consonância com os resultados obtidos anteriormente por Oh 762 e por Deaciuc 763 em ensaios com ratos alimentados durante 6 e 7 semanas, respectivamente, com uma dieta líquida contendo EtOH. O agravamento da diminuição dos níveis de GSH produzidos pela MDMA devido ao EtOH foi, no entanto, observado em suspensões de hepatócitos isolados de ratinhos previamente expostos ao EtOH (Trabalho III, Figura 2: os níveis de GSH atingiram, nas células obtidas de animais expostos ao etanol durante 8 semanas, e incubadas em condições normotérmicas com MDMA 1,6 mM, ao final de 3 horas, cerca de 45% dos níveis das células controlo) e quando hepatócitos de rato em cultura primária foram expostos simultaneamente aos dois compostos (Trabalho IV, Figura 4: os níveis de GSH atingiram, nas células expostas, em condições

267 Discussão ______normotérmicas a EtOH 300 mM + MDMA 1,6 mM, em 24 horas, cerca de 50% dos níveis controlo). Esta diminuição dos níveis de GSH pode ser explicada pela maior oxidação da GSH a GSSG pelas ROS e RNS cuja formação também se encontra aumentada pela exposição conjunta aos dois compostos (Trabalho IV, Figura 3), pela formação de aductos entre a GSH e os metabolitos catecóis da MDMA 192, mas também pela diminuição da síntese da GSH como resultado do decréscimo na actividade da γ-GCS (γ-glutamil cisteína sintetase, enzima limitante da síntese da glutationa) (Trabalho IV, Figura 6). Este facto foi já anteriormente descrito como resultado da exposição ao EtOH 764. Estes efeitos, nomeadamente o aumento da produção de ROS e de RNS e a diminuição da actividade da γ-GCS, foram significativamente agravados quando as células foram co-incubadas com EtOH 300 mM e MDMA 1,6 mM, em condições hipertérmicas. Por um lado, a hipertermia, por si só, já leva a um aumento do fluxo de ROS nas células por um mecanismo ainda não esclarecido, mas que parece envolver a cadeia de transporte de electrões mitocondrial 765. Por outro lado, a diminuição de actividade da γ-GCS pode corresponder a um fenómeno secundário a alterações dos níveis de cálcio que ocorrem durante a lesão celular 766, as quais já foram descritas após exposição a MDMA 767, EtOH 768, ou condições hipertérmicas 769. Sendo a GSH um importante antioxidante endógeno, a sua depleção pode aumentar a susceptibilidade do fígado aos efeitos deletérios das ROS e RNS e dos compostos reactivos formados durante o metabolismo do EtOH (acetaldeído) e da MDMA (MDA, N-metil-α-MeDA, α-MeDA, metabolitos conjugados com a GSH). Curiosamente, este aumento de susceptibilidade não se verificou no ensaio em que se utilizaram suspensões de hepatócitos isolados de ratinhos expostos ao EtOH durante 8 semanas, no qual a diminuição dos níveis de GSH produzida pelo EtOH (Trabalho III, Figura 2) não se traduziu num aumento da morte celular induzida pela MDMA (Trabalho III, Figura 4). Este fenómeno poderá, em parte, ser explicado por uma diminuição da disponibilidade da GSH para a formação de conjugados de metabolitos da MDMA com a GSH, os quais já demonstraram ser mais tóxicos que o composto pai em vários sistemas de células, como em culturas de neurónios corticais de rato 386 ou de células dos túbulos proximais de renais 203.

268 ______Discussão

Outras enzimas afectadas pela exposição conjunta a EtOH e a MDMA foram a catalase e a glutationa peroxidase (GPx), envolvidas na destoxificação do peróxido de hidrogénio (Trabalho II, Tabela 3), as quais apresentaram um decréscimo significativo de actividade, mais marcado no grupo EtOH+MDMA. De facto, a catalase e a GPx evidenciaram reduções de, respectivamente, 19% e 30% no grupo EtOH+MDMA, comparativamente ao grupo controlo. Tal é indicativo de uma maior agressão pró-oxidante no fígado neste grupo, já que uma actividade diminuída da GPx pode levar a uma maior acumulação de H2O2 e pode reflectir o envolvimento de ROS na toxicidade da mistura etanol+MDMA. Esta diminuição pode dever-se à capacidade de metabolitos da MDMA (ex.: a α-MeDA), de catecolaminas e dos aminocromos resultantes da sua oxidação inibirem enzimas contendo grupos tiol através da oxidação ou alquilação dos grupos sulfidrilo localizados no seu local activo. As orto- quinonas e os aminocromos podem ainda inibir enzimas que possuam locais de ligação à GSH (como é o caso da GPx) e/ou resíduos de cisteína que são essenciais ao correcto funcionamento da enzima 51. Para além da MDMA, o EtOH pode contribuir também para o decréscimo significativo verificado na actividade desta enzima nos animais expostos a MDMA e a EtOH, uma vez que foi já descrito em ratos que o consumo repetido de EtOH durante 90 dias leva a um decréscimo na actividade da GPx 770. Também a GST foi afectada pela exposição conjunta à MDMA e ao EtOH. A GST cataliza o ataque nucleofílico da GSH a substractos electrofílicos, protegendo os componentes celulares dos efeitos potencialmente lesivos destes compostos 771. Um decréscimo na actividade desta enzima foi observado pela co-exposição às duas substâncias quer no ensaio in vivo (Trabalho II, Tabela 3), no qual a actividade da GST sofreu uma diminuição de 20% no grupo EtOH+MDMA relativamente ao grupo controlo, quer no ensaio de exposição de culturas primárias de hepatócitos de rato à mistura EtOH+MDMA (Trabalho IV, Figura 7), onde se verificou uma redução da actividade da GST até, aproximadamente, 4% do controlo nas células expostas, em condições hipertérmicas, a EtOH 300 mM + MDMA 1,6 mM durante 24 horas. Esta alteração na actividade da GST pode ser explicada pela diminuição da actividade da referida enzima, previamente associado à exposição in vivo ao EtOH (7,9 g/kg/dia, durante 45 dias 772), que é agravada

269 Discussão ______pela co-exposição à MDMA. Tal como no caso da GPx, a diminuição da actividade da GST por acção da MDMA pode dever-se à oxidação ou alquilação de grupos hidroxilo e sulfidrilo do local activo da enzima pelos metabolitos da MDMA 192 ou, no caso dos ensaios in vivo, também pelas catecolaminas libertadas por acção deste derivado anfetamínico 51. Qualquer um destes efeitos da acção conjunta do EtOH e da MDMA na homeostase da GSH e das enzimas antioxidantes pode contribuir para o sinergismo dos seus efeitos hepatotóxicos.

4.4. Efeitos da exposição a EtOH e MDMA na mitocôndria e nos níveis energéticos da célula

Os ensaios ex vivo e in vitro realizados em células (Trabalhos III e IV) permitiram ainda constatar que a exposição conjunta a EtOH e MDMA leva a uma depleção dos níveis de ATP, evidenciando danos mitocondriais. Estes danos na mitocôndria podem resultar de uma perturbação da homeostase dos grupos tiol, e da formação de ROS, RNS e metabolitos tóxicos a partir da MDMA e/ou do EtOH que podem afectar os processos energéticos da mitocôndria (ciclo de Krebs e fosforilação oxidativa ou cadeia transportadora de electrões) ao danificarem as membranas e/ou proteínas mitocondriais (ex.: NADH desidrogenase, citocromo c redutase, e citocromo c oxidase da cadeia transportadora de electrões) 773. Esta danificação mitocondrial foi confirmada pela diminuição da quantidade de citocromo c e do factor indutor de apoptose (AIF) no extracto mitocondrial em culturas primárias de hepatócitos de rato expostos a uma mistura de EtOH 300 mM com MDMA 1,6 mM (Trabalho IV, Figura 8). A agressão mitocondrial foi também evidente na observação do tecido hepático por microscopia electrónica (Trabalho II, Figura 3) de mitocôndrias turgescentes (swelling). Para além disso, a disfunção mitocondrial subjacente à diminuição de ATP observada pode ser directamente promovida pela exposição a condições hipertérmicas, como descrito anteriormente em linhas celulares tumorais e em cardiomiócitos 774-776. Todos os factores referidos nos parágrafos supracitados podem estar na base dos efeitos tóxicos sinérgicos observados entre o EtOH e a MDMA.

270 ______Discussão

Contudo, outros factores estão também envolvidos e o efeito hipertérmico associado ao consumo de MDMA 595 contribui significativamente para o agravamento da sua toxicidade 387 e da toxicidade da mistura. A diminuição dos níveis de ATP observada nestes trabalhos confirmou os resultados obtidos previamente pelo nosso grupo em suspensões de hepatócitos de rato que provaram uma diminuição dos níveis de ATP por acção da MDMA 193. Contudo, esta é a primeira referência a um sinergismo na depleção de ATP em hepatócitos induzido pela MDMA em co-exposição com EtOH.

4.5. Indicadores de dano hepático

Da acção conjunta de todos os efeitos descritos nas alíneas anteriores, da co-exposição a EtOH e a MDMA resulta um marcado agravamento do dano hepático induzido pela MDMA isoladamente, evidenciado pelo aumento das transaminases plasmáticas (a GOT aumentou 50% e a GPT aumentou 90% no grupo EtOH+MDMA, relativamente ao controlo) nos ratinhos expostos a 10 mg/kg de MDMA após exposição repetida a EtOH a 12% (Trabalho II, Figura 4), decréscimo do peso relativo do fígado [de 5,582 ± 0,293% no grupo exposto apenas a EtOH para 4,222 ± 0,261% no grupo exposto a EtOH+MDMA (p < 0,01)] (Trabalho II, Tabela 1) e pela observação de indicadores de lesão tecidular por técnicas de microscopia óptica e electrónica (Trabalho II, Figura 3) que incluem aumento de deposição de colagénio, diminuição das microvilosidades dos hepatócitos, activação lisossómica e necrose celular. O aumento da GOT e da GPT foi já anteriormente associado à exposição quer a EtOH (em ratos 777 e em humanos 778), quer a MDMA (em ratos 779 e em humanos 186), mas o aumento destes marcadores de lesão hepática ainda não tinha sido descrito como resultado da exposição simultânea a ambos os compostos. No entanto, este agravamento do dano hepático induzido pela exposição simultânea a MDMA e EtOH não foi confirmado no trabalho realizado com suspensões de hepatócitos frescos, o que pode ser explicado por uma limitação da técnica usada, uma vez que durante o processo de isolamento dos hepatócitos, apenas aqueles hepatócitos mais resistentes que

271 Discussão ______toleraram o pré-tratamento dos animais com EtOH é que sobreviveram ao processo de isolamento, tendo os restantes sido eliminados nos vários processos de lavagem inerentes à correcta realização da técnica. Para além disso, os hepatócitos tolerantes ao EtOH continham níveis mais baixos de GSH, o que poderá resultar numa menor formação de conjugados da GSH com metabolitos catecóis da MDMA, conjugados esses que já demonstraram ser mais tóxicos que a própria MDMA em culturas de células renais humanas 203 e de neurónios corticais de rato 386, bem como após administração intra- cerebroventricular de MDMA a ratos 62. No entanto, quando se utilizaram culturas primárias de hepatócitos de rato, a maior hepatotoxicidade da mistura EtOH+MDMA, relativamente à MDMA isoladamente, foi claramente demonstrada por uma maior necrose celular induzida pela mistura, avaliada por uma maior libertação de LDH para o meio de cultura [a qual correspondeu a um decréscimo de cerca de 25% na viabilidade celular, quando as células foram co-incubadas com EtOH 300 mM e MDMA 1,6 mM, em condições normotérmicas, durante 24 horas (comparativamente à exposição apenas a MDMA, nas mesmas condições)] e pela coloração com brometo de etídio e laranja de acridina (Trabalho IV, Figuras 1 e 2). Esta hepatotoxicidade foi ainda agravada em condições hipertérmicas, de acordo com os resultados previamente obtidos pelo nosso grupo em suspensões de hepatócitos de ratinho que demonstraram que a exposição continuada a condições hipertérmicas leva a um aumento da morte celular provavelmente por um aumento sustentado da produção de ROS e consequente desenvolvimento de stress oxidativo 156. A via de morte celular apoptótica parece não ser predominante devido à ausência de translocação da proteína pró-apoptótica Bax para a mitocôndria e ausência de activação dos mecanismos efectores das vias apoptóticas mediadas pelas caspases, apesar de se assistir à libertação de citocromo c a partir da mitocôndria. Estes resultados surgem em oposição a estudos anteriores que atribuíram um mecanismo apoptótico à morte celular induzida pela MDMA em vários modelos experimentais como culturas de neurónios corticais de rato 60, de células Ito hepáticas 59 e de células retinianas 780. Esta discrepância poderá provavelmente ser explicada pelo grave declínio das reservas energéticas das

272 ______Discussão células expostas simultaneamente a EtOH e a MDMA que faz com que as vias de morte apoptótica (que envolvem gasto de ATP) estejam comprometidas.

4.6. Importância da hipertermia na toxicidade da mistura de EtOH e MDMA

A hipertermia tem sido já amplamente implicada na expressão da toxicidade resultante da exposição a MDMA, inclusivamente em trabalhos publicados pelo nosso grupo 387. De facto, a exposição das células a condições hipertérmicas parece despelotar vários mecanismos de sinalização celular que poderão, ou não, culminar na morte das células, dependendo da perturbação da homeostasia e da prevalência dos mecanismos celulares de sobrevivência ou de morte 748. A importância da hipertermia estende-se para além da exposição unicamente a MDMA, e mostra-se também um importante condicionante da toxicidade da mistura de EtOH e MDMA, como demonstrado nos trabalhos que são parte integrante desta dissertação. De facto, a exposição a condições hipertérmicas agravou a depleção dos níveis de glutationa reduzida e de ATP em suspensões de hepatócitos isolados de ratinho (Trabalho III, Figuras 2 e 3) e em culturas primárias de hepatócitos de rato (Trabalho IV, Figuras 4 e 5). A incubação das células a temperatura elevada provocou ainda um aumento da formação de ROS e RNS (Trabalho IV, Figura 3), uma maior depleção da actividade de enzimas envolvidas na homeostasia da glutationa (γ-GCS e GST) (Trabalho IV, Figuras 6 e 7) e um agravamento da lesão mitocondrial (Trabalho IV, Figura 8) resultantes da co-exposição a EtOH e MDMA. Todos estes efeitos da mistura de EtOH e MDMA que foram agravados em condições hipertérmicas resultaram numa maior percentagem de morte celular em hipertermia (Trabalho III, Figura 4 e Trabalho IV, Figuras 1 e 2), ilustrando, assim, a relevância que o desenvolvimento de uma resposta hipertérmica in vivo poderá ter na maior ou menor toxicidade exercida pela co- exposição a EtOH e MDMA.

273 Discussão ______

4.7. Interacção metabólica entre EtOH e MDMA

Uma vez que o EtOH e a MDMA partilham algumas vias metabólicas que envolvem o sistema do CYP450 e que o EtOH tem a capacidade de induzir algumas dessas isoenzimas 665, incluindo aquelas envolvidas no metabolismo da MDMA, o aumento da toxicidade da MDMA pela co-exposição ao EtOH pode também dever-se a uma interacção metabólica entre os dois compostos que parece envolver a indução das isoenzimas CYP2E1 e CYP3A1 pelo EtOH, comprovada pela pré-incubação das células com inibidores específicos de ambas as isoformas (Trabalho V), e a bioactivação de ambos os compostos a metabolitos de maior toxicidade 5, 736. De facto, em condições hipertérmicas, o EtOH aumentou significativamente a metabolização de MDMA a MDA, HMMA e HMA, resultando num aumento de 6 vezes na formação de MDA, de 16 vezes na formação de HMMA e de 10 vezes na formação de HMA. É, sobretudo, preocupante o aumento da formação dos metabolitos catecóis da MDMA (HMA e HMMA), uma vez que demonstraram ser mais tóxicos do que a MDMA e a MDA em vários modelos, incluindo hepatócitos isolados 192 e culturas de neurónios corticais de rato 386. Embora o EtOH não tenha sido ainda associado a uma indução da CYP3A1 ele provou já induzir a isoforma do CYP450 que no homem recebe a designação de CYP3A4 e que equivale à CYP3A1 (testosterona 6β-hidroxilase) no rato 676. Por outro lado, a indução da CYP2E1 pelo EtOH tem já sido amplamente descrita 665. No entanto, não se pode descartar a contribuição de outras vias metabólicas nesta interacção.

Aspectos técnicos aperfeiçoados ao longo do trabalho que validam os resultados obtidos

Como se pode verificar a partir dos resultados obtidos em culturas primárias de hepatócitos de rato, a utilização de técnicas de cultura celular no estudo dos efeitos do EtOH é de extrema utilidade, uma vez que permite utilizar tempos de incubação mais longos do que as 4 horas que correspondem ao limite máximo de incubação das suspensões de hepatócitos frescos. No

274 ______Discussão entanto, sempre que se optar por este tipo de modelos experimentais, é importante garantir que as amostras são mantidas isentas de contaminação externa pelo álcool utilizado como agente esterilizante de superfícies. Este facto é relevante não só para os estudos dos efeitos do EtOH, mas também para qualquer tipo de estudo realizado em cultura celular, uma vez que existem estudos que indicam que o EtOH, mesmo em baixas concentrações, pode alterar a actividade de várias enzimas 665, o normal funcionamento celular, a sobrevivência celular, a funcionalidade de receptores, a homeostase mitocondrial, a sinalização celular 781, a actividade de agentes infecciosos como o vírus da hepatite C 782, etc (Trabalho VII). Para se conseguir garantir a obtenção de controlos realmente isentos de EtOH é indispensável a validação de métodos sensíveis, precisos, exactos, e de fácil integração na rotina laboratorial que permitam rapidamente excluir a possibilidade de exposição das células ao EtOH quando esta exposição não é pretendida. Para proceder a esse controlo da isenção de EtOH no meio de cultura foi, então, validado o método de cromatografia gasosa, com detecção por ionização em chama, apresentado no Trabalho VI.

275 Discussão ______

276 ______Conclusões

5. CONCLUSÕES FINAIS

Os resultados obtidos nos trabalhos realizados no âmbito desta dissertação permitiram-nos concluir:

(i) a pré-exposição repetida de ratinhos Charles River CD-1 a 12% de EtOH, na água de bebida, potencia os efeitos hipertérmicos e hepatotóxicos induzidos in vivo por uma exposição aguda a MDMA, originando um quadro com sinais aparentes de necrose hepática e de resposta inflamatória;

(ii) a exposição repetida de ratinhos Charles River CD-1 a 12% de EtOH, na água de bebida, compromete a obtenção de hepatócitos viáveis através da perfusão com colagenase e aumenta a vulnerabilidade dos hepatócitos isolados a agressões pró-oxidantes por um mecanismo que engloba uma diminuição do conteúdo celular em GSH e um aumento do conteúdo em GSSG;

(iii) a co-exposição de hepatócitos de rato Wistar em cultura primária a EtOH+MDMA resulta numa toxicidade sinérgica relativamente aos efeitos induzidos pela MDMA ou pelo EtOH isoladamente, através de uma diminuição das defesas antioxidantes, diminuição das reservas energéticas das células, aumento da formação de espécies reactivas e aumento da morte celular por necrose, numa extensão dependente da temperatura de incubação;

(iv) a exposição aguda in vitro ao EtOH aumenta o metabolismo da MDMA a MDA, HMA e HMMA, sendo estes metabolitos dotados de maior toxicidade do que a própria MDMA

(v) os efeitos hepatotóxicos da mistura EtOH+MDMA são marcadamente aumentados em condições hipertérmicas.

Os resultados obtidos e discutidos na presente dissertação podem ser, assim, compilados no seguinte esquema-resumo (Figura 20).

277 Conclusões______

Figura 20. Esquema-resumo dos resultados obtidos no estudo das interacções hepatotóxicas entre etanol e MDMA.

278 ______Conclusões

Como conclusão final, o co-consumo de EtOH aumenta a hepatotoxicidade da MDMA através de um aumento da resposta hipertérmica associada ao consumo deste derivado anfetamínico, aumento da formação de metabolitos hepatotóxicos, diminuição das defesas antioxidantes, depleção das reservas energéticas das células e aumento da morte celular por necrose.

279 Conclusões______

280

PARTE IV

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

______Referências Bibliográficas

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