ISOLEMENT D'un FLAVONOL Chez Kotschya Africana Endl. Var

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO FACULTE DES SCIENCES DOMAINE SCIENCES ET TECHNOLOGIE MENTION CHIMIE Laboratoire de Chimie Organique et de Substances Marines

Mémoire de recherche en vue de l’obtention du diplôme de Master II Parcours : Chimie - Biologie

ISOLEMENT D’UN FLAVONOL chez Kotschya africana Endl. var. bequaertii (De Wild.) Verdc. (FABACEAE) ET ETUDE DES ACTIVI TES LARVICIDE ET ANTIOXIDANTE

Présenté publiquement par : Mlle RAKOTOARISOA Malalatiana Fiderana Le 28 février 2020

Devant le Jury composé de : Président : Madame Amélie RAHARISOLOLALAO Professeur Emérite

Rapporteur : Monsieur Maonja Finaritra RAKOTONDRAMANGA Maître de conférences

Examinateurs : Monsieur Rivoarison RANDRIANASOLO Professeur

Madame Fanomezana Mihaja RATSOAVINA Maître de conférences

Année universitaire : 2017 -2018

REMERCIEMENTS

Avant tout, je remercie Dieu Tout Puissant de m’avoir donné la force, le courage et pour le soutien inestimable qu’Il m’a apporté à la réalisation de ce mémoire. Ce travail n’arriva pas à son terme sans l’aide de plusieurs personnes que j’aimerais remercier ici :  Au Docteur Maonja Finaritra RAKOTONDRAMANGA, Maitre de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, Responsable du « Laboratoire de Chimie Organique et de Substances Marines (LCO-SM) pour m’avoir accueillie dans son équipe et qui a consacré son temps pour m’encadrer avec patience pour le bon déroulement de ce travail d’initiation à la recherche. Veuillez recevoir, Monsieur le Docteur, le témoignage de mon profond respect et ma reconnaissance.

 Au Professeur Amélie RAHARISOLOLALAO, Professeur Emérite à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo qui a accepté de présider ce mémoire. Veuillez recevoir, Madame le Professeur, toute ma considération avec mes remerciements les plus sincères.

 Au Professeur Rivoarison RANDRIANASOLO, Professeur à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, Responsable du Parcours Chimie - Biologie, qui m’a accueillie au sein du parcours Chimie- Biologie et qui a accepté d’examiner ce mémoire. Que ce manuscrit soit pour moi, Monsieur le Professeur, l’occasion de vous exprimer mon respect et ma gratitude.

 Au Docteur Fanomezana Mihaja RATSOAVINA, Maitre de Conférences à la Faculté des Sciences à l’Université d’Antananarivo, qui a accepté de juger ce travail malgré ses emplois du temps très chargés. Je vous suis très reconnaissante.

 Au Docteur Andrianambinina RAZAKARIVONY, Maitre de Conférences à la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo pour son aide et ses précieux conseils. Qu’il trouve ici l’expression de ma sincère reconnaissance.

 A tous les Enseignants de la Faculté des Sciences qui nous ont formés durant nos études universitaires.

 Un tout grand merci à l’équipe du laboratoire LCO SM, LPNB, LaCASN, et LIA qui m’a aidée et soutenue dans l’accomplissement de ce travail.

 Plus personnellement, je tiens à remercier mes parents, pour leur engagement solennel et leur persévérance tout au long de mes études. Mes pensées vont également à ma famille et mes amis qui me soutiennent et m’entourent depuis de nombreuses années.

A tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce travail, mes plus sincères remerciements.

TABLE DES MATIERES LISTE DES ABRÉVIATIONS ...... i LISTE DES FIGURES ...... iii LISTE DES TABLEAUX ...... v INTRODUCTION ...... 1 I. GENERALITES...... 4 I.1. Généralités sur la plante étudiée ...... 5 I.1.1. Les FABACEAE ...... 5 I.1.2. Position systématique de Kotschya africana bequaertii ...... 6 I.1.3. Caractéristiques et répartition géographique de Kotschya africana ...... 6 I.1.4. Etude chimiotaxonomique sur Kotschya ...... 7 I.2. Flavonoïdes et intérêts biologiques ...... 9 I.2.1. Biosynthèse des flavonoïdes ...... 9 I.2.2. Classes des flavonoïdes ...... 11 I.2.3. Intérêts biologiques des flavonoïdes ...... 12 I.3. Culex quinquefasciatus et filariose lymphatique ...... 12 I.3.1. Position systématique de Culex quinquefasciatus ...... 12 I.3.2. Cycle de vie de Culex quinquefasciatus ...... 13 I.3.3. Physiopathologie et épidémiologie de la filariose lymphatique ...... 13 I.3.4. Traitement et prévention de la filariose lymphatique ...... 15 II. MATERIELS ET METHODES ...... 16 II.1. Matériel végétal ...... 17 II.2. Méthode d’analyse chimique ...... 18 II.2.1. Criblage phytochimique ...... 18 II.2.2. Obtention de l’extrait de Kotschya africana ...... 18 II.3. Analyse structurale ...... 21 II.3.1. Spectroscopie infrarouge ...... 21 II.3.2. Spectroscopie de masse ...... 22 II.3.3. Résonance magnétique nucléaire ...... 23 II.4. Méthode d’analyse biologique ...... 24 II.4.1. Test d’activité antioxydante dans un extrait ...... 24 II.4.2. Test de toxicité aigüe de l’extrait hydroalcoolique de Kotschya africana ...... 25 II.4.3. Effet larvicide de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya africana ...... 26 II.5. Expression et analyses des résultats...... 29 III. RESULTATS ET DISCUSSION ...... 30 III.1. Résultats des études chimiques ...... 31

III.1.1. Résultats du criblage phytochimique ...... 31 III.1.2. Rendement d’extraction...... 32 III.1.3. Résultats de la chromatographie sur couche mince ...... 32 III.1.4. Résultats du fractionnement et purification de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya africana ...... 34 III.2. Résultats de l’analyse spectrale ...... 35 III.2.1. Résultat de la spectroscopie infrarouge ...... 35 III.2.2. Résultat de la spectroscopie de masse ...... 36 III.2.3. Interprétation du spectre RMN du produit RMF01 ...... 37 III.3. Résultats de l’analyse biologique ...... 49 III.3.1. Résultat de l’activité antioxydante ...... 49 III.3.2. Toxicité aiguë de l’extrait brut de Kotschya africana ...... 50 III.3.3. Sensibilité des larves de Culex quinquefasciatus par l’extrait à l’AcOEt ...... 50 CONCLUSION ...... 52 REFERENCES ...... 54 WEBOGRAPHIE ...... 66 ANNEXES ...... 67

LISTE DES ABRÉVIATIONS AcOEt : Acétate d’éthyle BuOH : butanol CNARP : Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques CCM : Chromatographie sur couche mince

CD3OD : méthanol deutérié CLBP : Chromatographie liquide à basse pression

COSY : COrrelated SpectroscopY d : Diamètre DCM : Dichlorométhane DL : Dose létale DL50 : Dose létale provoquant 50 % de mortalité d’une population étudiée DL90 : Dose létale provoquant 90 % de mortalité de population étudiée DPPH : 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil ED : eau distillée e.s.m : écart-type standard à la moyenne Endl. Var. : Endless variety HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation Hz : Hertz J : constante de couplage MeOH : Méthanol nm : nanomètre N : Normalité

N I/C : nombre d’insaturation et/ou cycle OMS : Organisation Mondiale de la Santé P : seuil de signification ppm : partie par million Rf : référence frontale RMN : Résonance Magnétique Nucléaire u.m.a.: unité de masse atomique

UV : ultraviolet 13C : carbone 13 1H : proton  : déplacement chimique

LISTE DES FIGURES Figure 1 Partie aérienne de Kotschya africana bequaertii. [W2] ...... 7 Figure 2 Voie de biosynthèse des flavonoïdes...... 10 Figure 3 Principales classes de flavonoïdes. (EJAZ et al., 2017) ...... 11 Figure 4 Cycle de vie simplifié de Culex quinquefasciatus. [W4] ...... 13 Figure 5 Carte de Madagascar montrant la zone d’endémisme de la filariose lymphatique. .. 14 Figure 6 Structure de l’ivermectine...... 15 Figure 7 Lieu de la récolte du matériel végétal. (Source : [W5]) ...... 17 Figure 8 Séchoir du CNARP...... 17 Figure 9 Broyeur de marque WILEY MILL modèle n°2...... 17 Figure 10 Macération de poudre de Kotschya africana………………………………………10 Figure 11 Evaporateur rotatif...... 18 Figure 12 Protocole d’extraction, de fractionnement, et d’analyse de l’extrait de Kotschya africana bequaertii...... 19 Figure 13 Fractionnement et purification de l’extrait à l’AcOEt sur colonne de silice...... 21 Figure 14 Appareillage lors de la spectroscopie infrarouge de type Brucker Alpha II...... 22 Figure 15 Appareillage RMN utilisé...... 24 Figure 16 Structure du DPPH avant et après la réaction avec un antioxydant...... 25 Figure 17 Lieu de collecte de larves de moustiques: rivière d’Imamba Sabotsy Namehana (à gauche), rizière d’Antanandrano (à droite)...... 26 Figure 18 Matériels utilisés au cours de la collecte des larves...... 26 Figure 19 Protocole du test de sensibilité de larves de Culex quinquefasciatus par l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya. africana...... 28 Figure 20 Profil chromatographique de l’extrait à l’AcOEt de Kotschya africana sur une plaque de silice...... 33 Figure 21 Diagramme de fractionnement et purification du produit RMF01 issue de l’extrait à l’AcOEt...... 34 Figure 22 Profil chromatographique de RMF01, F64-2 et F64-3, observé sous UV 365 nm. 35 Figure 23 Spectre infrarouge du produit RMF01...... 36 Figure 24 Spectre de masse du produit RMF01...... 37 1 Figure 25 Spectre RMN H du produit RMF01 dans du CD3OD...... 37 13 Figure 26 Spectre RMN C du produit RMF01 dans du CD3OD...... 40 Figure 27 Structure de base de RMF01 d'après le spectre RMN 13C...... 41

iii

Figure 28 Spectre COSY du produit RMF01 dans du CD3OD...... 41 Figure 29 Corrélation entre les protons de RMF01 sur COSY...... 42 Figure 30 Spectre HSQC de RMF01 extrait de Kotschya africana...... 42 Figure 31 Spectre HMBC de RMF01...... 44 Figure 32 Séquence a du Noyau aromatique A d’après le spectre HMBC de RMF01...... 45 Figure 33 Séquence b du noyau aromatique B d’après le spectre HMBC de RMF01...... 45 Figure 34 Combinaison des séquences a et b de RMF01...... 46 Figure 35 Séquence c de l'ose...... 47 Figure 36 Hypothèse de structure de RMF01...... 47 Figure 37 Profils chromatographiques sur plaque de silice de l’extrait méthanolique, de l’extrait à l’AcOEt et du produit RMF01 après révélation au DPPH...... 49 Figure 38 Mortalité des larves de Culex quinquefasciatus sous l’effet de l’extrait AcOEt de Kotschya africana...... 50

LISTE DES TABLEAUX Tableau I Etudes antérieures sur le genre Kotschya...... 8 Tableau II Résultats du criblage phytochimique de l’extrait hydroalcoolique...... 31 Tableau III Masse et rendement des extraits de K. africana...... 32 Tableau IV Références frontales Rf de différents constituants de l’extrait à l’AcOEt...... 33 Tableau V Résumé de l’interprétation du spectre RMN du proton de RMF01...... 38 Tableau VI Représentation de corrélation entre le proton H et son carbone porteur C avec les déplacements chimiques correspondants...... 43 Tableau VII Correspondance entre les déplacement chimiques  des carbones et protons ... 48 Tableau VIII Comparaison des doses létales DL50 et DL90 de K. africana avec la littérature...... 51

INTRODUCTION

Madagascar, par sa position biogéographique, offre une très grande diversité écologique et floristique. Les plantes constituent une source immense de molécules chimiques d’intérêts biologiques largement exploitées dans les industries pharmaceutiques, agroalimentaires et cosmétologiques. (ANDREW, 2001). La famille des fabacées représente la troisième des grandes familles de plantes à fleurs dans le monde après les Orchidées et les Astéracées, et elle compte environ 18 000 espèces (SCHNEIDER et HUYGHE, 2015). Les fabacées font l’objet de nombreuses recherches des métabolites secondaires, particulièrement les composés phénoliques. Des chalcones (praecansone) isolés à partir de Tephrosia aequilata sont dotés d’activités antimicrobiennes (TARUS et al., 2002), des dérivés de flavonoïdes (furanoflavonoide karanjin et pyranoflavonoide karanjachromene) issue de grains de Millettia pinnata ont des activités larvicides contre les moustiques (PERUMALSAMY et al., 2015) . Un flavanol (kotstrigoisoflavanol) provenant de l’extrait de Kotschya strigosa a des propriétés antioxydantes (AWOUAFACK et al., 2016) . Isoler de molécule antioxydante à partir du genre Kotschya africana est la principale raison de cette étude, en se basant sur la chimiotaxonomie du genre en vue d’une investigation phytochimique et biologique. Actuellement, la société scientifique, biologiste et chimiste, met en évidence le rôle tragique du processus oxydatif incontrôlable induit par les espèces réactives oxygénées. Ces oxydants sont les sources de différentes états pathologiques tels que le vieillissement et le cancer et indirecte sur la peroxydation des lipides des denrées alimentaires (LEVERVE, 2009 ; DANY, 2010). Quel que soit le cas, le risque est aggravé avec l’accumulation de ces molécules dans l’organisme en aboutissant à une chaîne réactionnelle radicalaire qui dégrade les molécules vitales biologiques (VALKO et al., 2006 ; LADOH et al., 2014). Les composés phénoliques trouvent également leur application dans les domaines des luttes antivectorielles (MUSAU et al., 2016). Une grande partie des maladies infectieuses est transmise à l’homme par l’intermédiaire des insectes. C’est le cas notamment de la dengue hémorragique et du chikungunya (transmis par Aedes), du paludisme (transmis par les anophèles), et aussi de la filariose lymphatique ayant comme vecteur les culicidés (surtout Culex quinquefasciatus) et qui demeure encore comme une épidémie persistante à Madagascar. (WARMONT, 2018 ; AUBRY et GAÜZERE, 2019). C’est dans le but de trouver une nouvelle stratégie de lutte antivectorielle contre Culex quinquefasciatus, qu’est la seconde raison de ce travail.

Les moustiques sont généralement contrôlés par les insecticides conventionnels, tel que le dichlorodiphenyltrichloroethane ou DTT, qui ont montré des effets secondaires sur la santé comme la reprotoxicité, ainsi que sur l’environnement, en développant de résistance chez les moustiques traités (ZACHARIA et TANO, 2011 ; OMS, 2017). Ceci a encouragé la proposition d’autres moyens de lutte. La méthode biologique a fait l’objet d’une nouvelle lutte plus sûre et plus sélective. Elle est représentée par l’utilisation de microorganisme et des extraits de végétaux (SAYAH et al., 2014). Notre travail est focalisé spécifiquement sur l’étude préliminaire phytochimique de l’extrait méthanolique de Kotschya africana de la famille Fabaceae afin de donner une approche biologique sur l’utilisation traditionnelle de cette plante et de vérifier la chimiotaxonomie du genre Kotschya par l’isolement de molécules, par la recherche des activités antioxydante et larvicide avec l’extrait de cette plante. La première partie de ce livre est consacrée à la synthèse bibliographique, la seconde partie à l’étude chimique et biologique de l’extrait de cette plante, et les résultats sont donnés dans la troisième partie. Une conclusion générale et quelques perspectives seront présentées à la fin de ce document.

I. GENERALITES

I.1. Généralités sur la plante étudiée

I.1.1. Les FABACEAE

La Famille des FABACEAE ou LEGUMINOSAE est une plante dicotylédone qui comprend 766 genres répartis dans trois sous-familles : - Faboideae ou Papilionoideae caractérisée par des fleurs typiques en papillon. - Caesalpinioideae dont les fleurs sont pseudo-papilionacées. - Mimosoideae présentant des fleurs régulières. (AUGIER, 2015)

Elle regroupe des arbres, des arbustes, des lianes et des plantes herbacées, dont les feuilles sont munies de stipules. C'est une famille cosmopolite (SAUQUET, 2016). Les FABACEAE ont la propriété de fixer l’azote atmosphérique grâce à des organes particuliers situés sur les racines, les nodosités, et renfermant des bactéries symbiotiques. Elles sont de ce fait souvent riches en protéines et constituent des aliments de choix pour l’homme et les animaux. (SANDERSON et al., 2004)

De nombreuses plantes Fabaceae ont joué un rôle important dans l’histoire de l’industrie pharmaceutique, notamment comme source de matière première à l’image de la lécithine de Glycine max Merr., présente dans toutes les cellules vivantes et qui est un constituant important des cellules nerveuses et cérébrales . La spartéine, isolée de Cytisus scoparius (L.) Link est un alcaloïde ganglioplégique utilisé en cardiologie et en obstétrique. (BRUNETON, 1999) Les diverses investigations phytochimiques menées sur cette famille ont montré également une richesse remarquable en métabolites secondaire surtout les furanocoumarines et les isoflavonoïdes, isolés particulièrement à partir du genre Bituminaria, qui ont des activités antibactérienne sur S. aureus et sur E. coli. (SALIMA et al., 2014)

I.1.2. Position systématique de Kotschya africana bequaertii

Kotschya africana Endl. Var. bequaertii appartient au: Règne : PLANTAE Embranchement : TRACHEOPHYTA Classe : MAGNOLIOPSIDA Ordre : FABALES Famille : FABACEAE Genre : Kotschya espèce : africana ( De Wild.) variété : bequaertii Verdc. (UMBERTO, 2001) D’autres synonymes de Kotschya africana bequaertii existent, comme Smithia kotschyi Benth., Smithia bequaertii De Wild, Smithia chamaecrista var. stipulata R.Vig, Smithia chamaecrista var. genuina R.Vig., et Smithia chamaecrista Benth. Kotschya est connue sous les noms vernaculaires de sorindrana, soarindrana, hivaniva, nivaniva ou ramangorona. (ROSKOV et al., 2014).

I.1.3. Caractéristiques et répartition géographique de Kotschya africana

Kotschya africana bequaertii est une plante dicotylédone (Figure 1). C’est un arbuste, pouvant atteindre 2 m de haut. La plante est ligneuse avec des fleurs en forme d’aile appendiculée unilatérale et de couleur jaune. Les feuilles sont composées de plusieurs folioles. Les tiges sont généralement recouvertes de poils glandulaires.

Figure 1 Partie aérienne de Kotschya africana bequaertii. [W2] Le genre Kotschya constitue la majorité de savanes arbustives d'Afrique [W1]. Kotschya africana est présente en Afrique subsaharienne comme en Mozambique, Ethiopie, Burundi, Tanzanie et en Madagascar. Le genre Kotschya est une plante envahissante à Madagascar. Il appartient à la tribu des Aeschynomeneae .Le spécimen malagasy se trouve sur les régions d’Analamanga, Hautes Matsiatra et d’Ihorombe. [W3] Trois espèces se trouvent dans la grande ile mais il est à noter que la sous espèce bequaertii de Madagascar est distincte de celle trouvée en Afrique. (LABAT, 1996) En Tanzanie, Kotschya est utilisé comme répulsif des acariens de poulet et acaricide. (SAMWEL et al., 2019). D’après les enquêtes ethnopharmacologiques qui ont été menées pendant la récolte de la plante, la tisane des feuilles cuites de cette plante est utilisée contre la nausée, la fièvre et les brûlures.

I.1.4. Etude chimiotaxonomique sur Kotschya

D’après la littérature, les triterpenes et les flavonoïdes sont les familles chimiques couramment rencontrées dans le genre Kotschya (tableau I). Une étude récente des extraits de la partie aérienne de Kotschya strigosa a permis d’isoler une nouvelle structure d’isoflavone (le kotstrigoisoflavanol) à partir de la fraction à l’acétate d’éthyle. Celle-ci possède une activité antioxydante (AWOUAFACK et al., 2016). Des Chercheurs Tanzaniens ont porté leur investigation sur l’activité larvicide contre Culex quinquefasciatus et Anophèles gambia des extraits éthanoliques de tige et racine de six espèces de Kotschya. Ils ont parvenus à isoler une nouvelle structure de triterpenes, qui est le cycloartenone. (ESTER et al., 2012)

Tableau I Etudes antérieures sur le genre Kotschya. espèce Molécules isolées Activité biologique Références étudiée K. strigosa *Activité larvicide K. uguenensis, contre les larves (ESTER et al., K. strigosa, d’Anopheles gambiae 2012) K. speciosa, et sur Culex (ESTER et al., K. thymodora quinquefasciatus 2015) K. aeschynomenoides Cycloartenone * Activité (DENIS et al., (triterpènes) antiplasmodiale 2011)

Kotstrigoisoflavanol (isoflavone) Activité antioxydante (AWOUAFACK K. strigosa v is - à - vis du radical et al., 2016) DPPH

Diomestine (flavone)

Activité antibacterienne contre Escherichia coli (GITU, 2009) K. africana et Staphylococus aureus et antifongique

Lupeol sur Candida albicans. (triterpènes)

I.2. Flavonoïdes et intérêts biologiques

Les flavonoïdes sont des molécules très répandues dans le règne végétal. Les flavonoïdes sont des composés polyphénoliques comprenant 15 atomes de carbone formant une structure C6-C3-C6, soit deux noyaux aromatiques reliés par un pont de 3 carbones (DERBEL et GHEDIRA, 2005).

I.2.1. Biosynthèse des flavonoïdes

Les flavonoïdes ont une origine biosynthétique commune dérivant de la voie de l’acide shikimique. Le précurseur de ces molécules est le 4-hydroxycinnamate-coenzyme A synthétisé à partir de la phénylalanine. La voie biosynthétique de ces polyphénols est présentée dans la figure 2. Les enzymes intervenant dans la voie de différenciation des classes de flavonoïdes ont été plutôt bien caractérisées. Tous les flavonoïdes sont formés via un intermédiaire commun la 2’, 4, 4’, 6’- tétrahydroxychalcone. Ce précurseur dérive de la condensation de trois molécules d’acétylcoenzyme A, qui correspondront au cycle A, et d’une molécule de 4-hydroxycinnamatecoenzyme A, permettant la formation des cycles B et C. Ce mécanisme est catalysé par la chalcone synthase. La cyclisation de cette chalcone stéréospécifique par la chalcone isomérase forme la (S)-4’, 5, 7-trihydroxyflavanone conduisant au squelette de base des flavonoïdes. Plusieurs enzymes (synthase, réductase, hydroxylase) contribuent à l’apparition des différentes classes de flavonoïdes. Dans chaque classe de flavonoïde, les molécules sont ensuite diversifiées par hydroxylation (flavonoïde 3’-hydrolase, flavonoïde 3’,5’- hydroxylase), méthylation (O-méthyltransférase), glycosylation (rhamnosyl transférase, flavonoid glycosyl transférase), acylation (acyl-CoA transférase) ou polymérisation. (CHEBIL, 2006).

Figure 2 Voie de biosynthèse des flavonoïdes. AS : aurone synthase, CHI : chalcone isomerase, CHS: chalcone synthase, DFR:dihydroflavonol 4-reductase, FHT: flavanone 3-hydrolase, FLS: flavonol synthase,

FNSI/FNSII: flavone synthase, IFS: isoflavone synthase, LDOX: leucoanthocyanidin dioxygenase, LCR : leucoanthocyanidin reductase. (CHEBIL, 2006)

I.2.2. Classes des flavonoïdes En se basant sur leur squelette, les flavonoïdes peuvent être divisés en différentes classes: anthocyanidines ; flavonoles ; isoflavonoles ; flavones ; isoflavones ; flavanes ; isoflavanes ; flavanols ; isoflavanols ; flavanones ; isoflavanones ; et aurones. Ils se différencient selon le degré d’oxydation du noyau pyranique central qui peut être ouvert et recyclisé en un motif furanique (dihydrofuranone). Les plus importants sont donnés ci- dessous (Figure 3) .  2-phénylbenzopyriliums : comme les anthocyanes  2-phénylchromones : flavones, flavonols et leurs dimères ou flavanones et dihydroflavonols (dérivés 2,3-dihydrogénés).  2-phénylchromanes : flavanes, flavan-3-ols et flavane-3,4-diols.  Chalcones et dihydrochalcones (le cycle pyranique est ouvert).  2-benzylidène-coumaranones (aurones). (HAVSTEEN, 2002 ; AWOUAFACK et al., 2017)

O  O

O Anthocyane Flavone Flavonol

O O O

O Flavonone Flavane Flavan-3-ol

OH O O O Flavan-3,4-diol Chalcone Dihydrochalcone Aurone Figure 3 Principales classes de flavonoïdes. (EJAZ et al., 2017)

I.2.3. Intérêts biologiques des flavonoïdes

 Propriétés antibactériennes : Des propriétés antibactériennes et antivirales des flavonoïdes vis-à-vis de différentes souches bactériennes ont également été mises en évidence (JIANG et al., 2003 ; GHEDIRA , 2005).  L’activité des flavonoïdes comme piégeurs de radicaux libres étant bien établie, des études récentes suggèrent qu’ils seraient également de puissants piégeurs du radical NO. Celui-ci étant élaboré par plusieurs types de cellules, notamment les cellules endothéliales et les macrophages ; aussi, la libération de NO due à l’activité NO synthase est importante dans le maintien de la dilatation des vaisseaux sanguins (HUK et al., 1998)  Propriétés anti inflammatoires : De nombreuses études semblent indiquer que les flavonoïdes possèdent des propriétés anti inflammatoires et qu'ils sont capables de moduler le fonctionnement du système immunitaire par inhibition de l'activité des enzymes qui peuvent être responsables des inflammations. (QI-HUI, 2019)

I.3. Culex quinquefasciatus et filariose lymphatique

I.3.1. Position systématique de Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus appartient au : Règne : ANIMALIA Embranchement : ARTHROPODA Classe : HEXAPODA Ordre : DIPTERA Famille : CULICIDAE Genre : Culex espèce: quinquefasciatus (TALAGA et al., 2015)

I.3.2. Cycle de vie de Culex quinquefasciatus

Comme la plupart des moustiques, le cycle biologique de C. quinquefasciatus passe par 3 stades de développement à partir de l’œuf, des stades larvaires suivis d’un stade nymphal et se termine par le stade adulte ou imaginal. Les stades larvaires concernent une période de croissance avec une augmentation notable de taille qui peut être de l’ordre de 10 fois. Ils durent environ 7 à 10 jours et sont marqués par 4 mues successives pour passer au stade nymphal de 2 à 3 jours (Figure 4). Ces deux premiers stades se déroulent en milieu aquatique. Une fois adulte, les moustiques rejoignent le milieu aérien et leur espérance de vie varie environ une semaine à un mois. (MATHILDE, 2015)

Figure 4 Cycle de vie simplifié de Culex quinquefasciatus. [W4]

I.3.3. Physiopathologie et épidémiologie de la filariose lymphatique

Culex quinquefasciatus est parmi les vecteurs majeurs de la filariose lymphatique. C’est pourquoi la lutte antivectorielle est nécessaire pour empêcher la prolifération de cette maladie. En effet, la piqûre du moustique introduit le ver « filaire » nommé Wuchereria bancrofti (ou filaire de Bancroft), à travers la peau de l’homme (AUBRY et GAÜZERE, 2019).

Les vers adultes vivent et se développent dans les ganglions et les vaisseaux lymphatiques conduisant à un blocage du circuit lymphatique. Ils peuvent atteindre 4 à 10 cm de longueur et ont une durée de vie de 4 à 5 ans. Durant la phase d’invasion, les symptômes de la maladie sont marqués par la fièvre, des douleurs au niveau des articulations et des difficultés respiratoires ressemblant à l’asthme. A un stade plus avancé le patient soufre d’inflammation des ganglions, de la rougeur, de la chaleur, de la douleur et de la tuméfaction sur les membres et à d’autres endroits du corps. Les œdèmes durcissent provoquant l’éléphantiasis des membres ou le gonflement d’autres organes. Cela apparait 10 à 15 ans suivant la première crise. (CHAMPETIER et al., 2000). La filariose a des impacts sur la vie socio-économique parce que les personnes présentant des séquelles de cette maladie sont moins productives et souvent victimes d’une discrimination sociale du fait des symptômes gênants de la maladie (ELZATH, 2013). Environ 120 millions de personnes se répartissant dans 72 pays dans le monde sont estimées infecter par la filariose et que 1 milliard d'êtres humains vivent dans des zones où la maladie est endémique (AUBRY et GAÜZER, 2019). A Madagascar, dans 99 districts parmi les 113, la filariose lymphatique y est endémique. La prévalence varie de 12 à 30 % sur la côte Est de Madagascar et dans la province de Mahajanga. (Figure 5) (Ministère de la Santé Publique, Service de Lutte contre les Maladies Epidémiques et Négligées ,2016).

Zones endémiques

Zones non endémiques

Figure 5 Carte de Madagascar montrant la zone d’endémisme de la filariose lymphatique. (Source : Ministère de la Santé Publique, Service de Lutte contre les Maladies Epidémiques et Négligées, 2016).

I.3.4. Traitement et prévention de la filariose lymphatique En général, l’ivermectine demeure le médicament vermicide pour le traitement de la filariose (Figure 6). D’un autre côté, afin de diminuer la transmission et de bloquer le cycle de développement de vers filaires, des moyens de lutte antivectorielle sont employés comme la pulvérisation d’insecticides sur les gites larvaire (AUBRY et GAÜZERE, 2019). Les mécanismes d’action des familles chimiques d’insecticides existantes (organochlorés, carbamates…) sont fondés sur la neurotoxicité des larves, sur leur impact au niveau de la respiration cellulaire, de la formation cuticulaire ou sur la perturbation de la mue (DARRIET et al., 2007). Cependant ces insecticides de synthèse présentent des effets indésirables non seulement sur l’environnement mais aussi sur la santé humaine (SAYAH et al., 2014). En conséquence, le choix des pesticides naturels d’origine végétale est de nos jours considéré comme un meilleur moyen pour une lutte antivectorielle, du fait qu’ils respectent l’environnement et l’écosystème (GOVINDARAJAN et al., 2013). Les plus importantes classes de produits naturels qui possèdent des activités pesticides concernent les substances phénoliques (flavonoïdes et isoflavonoïdes), les terpénoïdes, les alcaloïdes et d'autres produits comme les furanes et les lipides (RAJAONARIVONY, 1996). Des études portées sur les flavonoïdes ont montré qu’ils agissent au niveau mitochondriale des cellules larvaires en empêchant le transport d’électron, qui est une source d’énergie nécessaire à la respiration cellulaire, entrainant la mort des larves du moustique (SIMMONDS, 2003). En effet, la matrice et la membrane interne des mitochondries renferment des enzymes qui catalysent l’oxydation finale des glucides et de lipides, ainsi que la synthèse d’ATP à partir d’ADP et de phosphate inorganique. C’est également dans la matrice que se trouve l’ADN mitochondrial. Ainsi, l’action de ces flavonoïdes pourrait être l’inhibition de ces enzymes. (CLAUDE, 2006)

Figure 6 Structure de l’ivermectine. Ainsi, pour contribuer à la recherche d’insecticides d’origine végétale, notre étude portera sur l’extraction et l’évaluation de l’activité larvicide des extraits de Kotschya africana sur les larves de Culex quinquefasciatus.

II. MATERIELS ET METHODES

II.1. Matériel végétal

Les parties aériennes de Kotschya africana ont été récoltées au mois de février 2019 à Manarintsoa du district d’Andramasina, de la région d’Analamanga, et qui se trouve à 50 Km, au sud d’Antananarivo –Madagascar. Le lieu a comme coordonnées géographiques : 19°14’38’’ Sud et 47°41’38’’ Est. (Figure 7)

RN7

Figure 7 Lieu de la récolte du matériel végétal. (Source : [W5]) Pour connaitre la classification de la plante étudiée, un herbier a été identifié par le botaniste du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza. La plante a été séchée sous un courant d’air à 40 °C et à l’ombre dans le séchoir du Centre National d’Application de Recherches Pharmaceutiques (CNARP) pendant 5 jours (Figure 8). Puis, elle a été réduite en poudre à l’aide d’un broyeur de marque WILEY MILL modèle n°2 © (Figure 9).

Figure 8 Séchoir du CNARP. (Source : RAKOTOARISOA, 2019) Figure 9 Broyeur de marque WILEY MILL modèle n°2.

II.2. Méthode d’analyse chimique

II.2.1. Criblage phytochimique

Le criblage phytochimique permet de détecter les familles chimiques présentes dans une plante. Il est caractérisé par la formation de précipité avec des réactifs spécifiques, ou d’un changement de coloration (FONG et al., 1977) (Annexe 1). Pour ce test, différents réactifs ont été utilisés (Annexe 2). Pour faire le criblage phytochimique de Kotschya africana, 200 g de poudre de celle-ci a été macéré dans un mélange d’Ethanol : Eau (80:20) pendant 48 heures. Ensuite, une filtration suivie d’une évaporation du filtrat ont été effectuées pour avoir un extrait hydroalcoolique. Le criblage phytochimique est réalisé à partir de cet extrait.

II.2.2. Obtention de l’extrait de Kotschya africana

II.2.2.1. Méthode d’extraction L’extraction de Kotschya africana a été effectuée par une macération à froid. Une quantité de 700 g de poudre de la plante a été macérée dans du méthanol : eau (80 :20) pendant 4 jours (Figure 10). Ensuite un partage liquide-liquide a été effectué en utilisant des solvants de polarité croissante. Un évaporateur rotatif de marque BUCHI a été utilisé pour l’évaporation de chaque phase (Figure 11). Puis, l’extrait à l’acétate d’éthyle a été passé en chromatographie liquide à basse pression sur une colonne de silice. Ce montage permet de fractionner et purifier l’extrait pour obtenir de molécule pure à la fin.

Figure 10 Macération de poudre de Kotschya africana Figure 11 Evaporateur rotatif.

La figure 12 résume le protocole utilisé au cours de l’extraction et de l’analyse de Kotschya africana bequaertii.

700 g de poudre de plante

* Macération dans du MeOH :H20 pendant 96 h * Filtration suivie d’une évaporation à 45 °C

Résidu Extrait brut

*Ajout de MeOH 200ml et ED : 50 mL Test de toxicité aigüe Hexane

Extrait hexanique Phase aqueuse

DCM

Extrait dichlorométhanique Phase aqueuse

AcOEt

Extrait à l’acétate d’éthyle Phase aqueuse

n- BuOH

Test biologique Fractionnement et Extrait butanolique Extrait aqueux isolement par les méthodes chromatographiques Etudes de l’activité : *antioxydante Fraction *larvicide

Identification structurale du produit pur : RMN

Figure 12 Protocole d’extraction, de fractionnement, et d’analyse de l’extrait de Kotschya africana bequaertii. Pour le calcul du rendement de l’extraction, la formule suivante a été utilisée :

푀푎푠푠푒 푓푖푛푎푙푒 푑푢 푐표푚푝표푠é 표푏푡푒푛푢 푅푒푛푑푒푚푒푛푡 % = × 100 푀푎푠푠푒 푖푛푖푡푖푎푙푒 푑푒 푙′푒푥푡푟푎푖푡

II.2.2.2. Chromatographie sur couche mince (ou CCM)

Cette technique consiste à une analyse qualitative permettant de déterminer les composants chimiques d’un extrait afin d’avoir un système de solvant adéquat au fractionnement. Elle permet également de suivre la purification d’un produit. (STILL et al., 1978). L’adsorbant utilisé est la silice ayant une fluorescence à 254 nm, fixée sur une plaque en aluminium. Pour la préparation de CCM, un trait à environ 1 cm du bord inférieur de la plaque est tracé. Les produits à analyser sont déposés à l’aide d’un tube capillaire et sont espacés d’environ 0,5 cm. Pour l’élution, une cuve contenant l’éluant est préparée, puis, la plaque y est introduite. Après, la plaque est séchée et les produits sont révélés par la fluorescence et ensuite par un révélateur caractéristique des produits (DARI, 2015). Le calcul de la référence frontale ou Rf d’une espèce chimique suit la formule suivante :

푑푖푠푡푎푛푐푒 푝푎푟푐표푢푟푢푒 푝푎푟 푙′푒푠푝è푐푒 푐ℎ푖푚푖푞푢푒 푟é푓é푟푒푛푐푒 푓푟표푛푡푎푙푒 = 푑푖푠푡푎푛푐푒 푝푎푟푐표푢푟푢푒 푝푎푟 푙′é푙푢푎푛푡

II.2.2.3. Chromatographie liquide à basse pression (CLBP)

La chromatographie liquide à basse pression est une méthode d’analyse quantitative. Elle permet en effet, la séparation des constituants d'un échantillon et leur isolement. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants ; tandis que la phase fixe est constituée de silice placée dans une colonne de verre munie d’un robinet. L’échantillon, entraîné par la phase mobile est adsorbé puis désorbé sur la phase stationnaire. [W6] La chromatographie sur colonne se fait en trois étapes successives. La première étape est le remplissage. La méthode du remplissage par voie humide est utilisée. Dans un bécher, la silice de 30 à 40 fois la masse de l’extrait est homogénéisée avec l’éluant pour obtenir un mélange homogène et fluide. A l’aide d’un entonnoir, le mélange est déposé dans la colonne en tapotant les parois de la colonne pour tasser la silice. La deuxième étape consiste à déposer la poudre de silice imprégnée de l’extrait sur la partie supérieure de la phase stationnaire. La troisième étape est l’élution. L’élution par gradient est utilisée. Elle consiste à utiliser des systèmes d’éluant de polarité croissante allant du solvant le moins polaire au plus polaire. L’éluat est récupéré dans des flacons. (HADJIRA, 2017)

La chromatographie sur colonne a été effectuée pour fractionner 4 g d’extrait à l’acétate d’éthyle. Une colonne de 45 cm de hauteur avec 5 cm de diamètre a été utilisée. L’adsorbant est composé de 230 g de silice normale d’épaisseur de 0,04 – 0,063 mm . Pour l’élution, le gradient de solvant DCM/ MeOH a été utilisée. (Figure 13) Les différentes fractions obtenues sont suivies en CCM, puis observés sous le rayonnement UV et révélées par pulvérisation à la vanilline sulfurique des plaques. Les fractions ayant le même profil en CCM sont rassemblées.

Figure 13 Fractionnement et purification de l’extrait à l’AcOEt sur colonne de silice.

II.3. Analyse structurale

La structure d’un produit est déterminée grâce aux techniques physiques spectroscopiques comme l’infrarouge, masse, UV et RMN.

II.3.1. Spectroscopie infrarouge

Une spectroscopie infrarouge permet de déterminer les groupements fonctionnels caractéristiques d’une molécule (Figure 14). En effet, de l’énergie est apportée à la molécule par une onde des vibrations de liaison. A chaque type de liaison correspond une fréquence de vibration qui lui est propre. Chaque groupe d’atome peut ainsi entrer en vibration, d’élongation ou de valence, mais peut aussi subir des déformations (modifications des angles de liaisons) dans le plan ou hors du plan de la molécule [W8].

Ces nombreuses possibilités font que les spectres infrarouges possèdent de nombreuses bandes d’absorption. La réalisation du spectre infrarouge consiste ainsi à mesurer la transmittance pour différentes valeurs de la longueur d’onde. La transmittance est portée en ordonnée sur le spectre, et en abscisse, le nombre d’onde  =1/ est exprimé en cm-1. (BRENON-AUDAT, 2013).

Figure 14 Appareillage lors de la spectroscopie infrarouge de type Brucker Alpha II. (Source : RAKOTONDRAMANGA, 2019)

II.3.2. Spectroscopie de masse

La spectroscopie de masse sert à déterminer les masses molaires. Les formules brutes des molécules organiques peuvent être déduites par les fragmentations qui en découlent selon les techniques d’ionisation effectuées [W8]. De plus, elle permet de caractériser la structure chimique des molécules et de réaliser des analyses quantitatives. Dans le cas d’ionisation par impact électronique, le mode de fonctionnement est de produire des ions (M±ze) à partir d’un échantillon (M) et de les séparer en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) et de leur abondance, ce qui donne lieu à des diagrammes caractéristiques appelés les spectres de masses. (BARSU, 2004) En connaissant la masse molaire d’une molécule, le nombre d’insaturation et/ou cycle pourrait être déterminé par la formule suivante :

= 1 2 2 Avec x : nombre d’atomes tétravalents y : nombre d’atomes monovalent et z : nombre d’atomes trivalents

II.3.3. Résonance magnétique nucléaire

La résonance magnétique nucléaire, ou RMN est une technique non destructive permettant l’étude structurale des composés chimiques (Figure 15). Cette technique est fondée sur les propriétés cinétiques et magnétiques des noyaux atomiques possédant un spin nucléaire non nul comme 1H et 13C, et la possibilité de les faire résonner à l’aide d’un champ magnétique (DUCAUZE et RUTLEDGE, 2009). Les différentes analyses ont été effectuées en premier lieu par deux techniques à une dimension : la RMN 1H, qui peut renseigner sur l'environnement chimique direct des protons. L’intégration des signaux fournit le nombre total de protons. L’allure permet de déterminer le nombre des H portés par les carbones voisins. Le déplacement chimique (δ ppm) des signaux permet d’identifier le type de groupements contenus dans la molécule. Le RMN 13C renseigne sur les différents types de carbone et permet de déterminer leurs nombres s’il n’y a pas chevauchement de pic. Les analyses ont été ensuite effectuées par des techniques à deux dimensions. L’analyse 1H_1H COSY (proton-proton Correlated SpectroscopY) met en évidence les couplages scalaires entre protons voisins (protons géminés et vicinaux), mais également sur les couplages entre des protons séparés par plusieurs liaisons dans le cas de systèmes conjugués. Les taches sur la diagonale du spectre COSY représentent les spectres RMN 1H monodimensionnelle. Les taches symétriques par rapport à la diagonale s’agissent des corrélations entre les protons. L’analyse HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) permet de corréler un proton avec un noyau X selon une constante de couplage 1J c’est-à-dire le proton et son carbone porteur. Enfin, l’analyse HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) permet de visualiser les corrélations hétéronucléaires entre des noyaux séparés par deux à trois liaisons 2J ou 3J ou 4J. (GANDINI, 2016)

Figure 15 Appareillage RMN utilisé. (Source : RAKOTONDRAMANGA, 2019)

II.4. Méthode d’analyse biologique

La méthode d’analyse biologique a été effectuée par des tests d’activité antioxydante, de toxicité aigüe et de sensibilité larvaire.

II.4.1. Test d’activité antioxydante dans un extrait

Les antioxydants présentent une grande diversité moléculaire agissant contre les processus d’oxydation de différentes manières. Pour étudier l’activité antioxydante de l’extrait de Kotschya africana, le test au DPPH est utilisé.

 Présentation du test au DPPH (2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl) Le 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle est un radical libre stable qui agit en se combinant avec d’autres radicaux libres (Figure 16). Ce composé a été l’un des premiers radicaux libres utilisés pour étudier la relation structure-activité des composés phénoliques. Le radical possède un électron libre sur un atome du pont d’azote. La délocalisation de cet électron se traduit par la coloration bleue-violette caractéristique du réactif. Cette délocalisation permet également au DPPH• de rester sous forme de monomère et d’être stable à température ambiante. (DIALLO, 2005).

 N N

  A   AH  

O2N NO2 O2N NO2

NO2 NO2 DPPH DPPH Figure 16 Structure du DPPH avant et après la réaction avec un antioxydant.  Test par CCM par « bioautography » La chromatographie sur couche mince par méthode « bioautography » au DPPH permet d’avoir une approche qualitative de l’activité antiradicalaire de l’extrait de la plante étudiée (RAVALISON et al, 2015). Les extraits, ou les fractions ou les produits purs à tester sont déposées sur des plaques de silice puis développées dans de système d’éluant approprié. Après séchage, les plaques sont trempées dans une solution méthanolique à 2 mg/mL de DPPH. Des activités antiradicalaires apparaissent sous forme des taches de couleur jaune sur fond violet (CAVIN, 1999).

II.4.2. Test de toxicité aigüe de l’extrait hydroalcoolique de Kotschya africana Le but de ce test est d’étudier les effets toxiques de l’extrait brut. Les essais de toxicité sont essentiels pour évaluer la sûreté ou les risques d’un produit (SEZAN et al., 2018). Les tests de toxicité ont été effectués sur des rats de souche wistar de sexe mâle et femelle, ayant une masse entre 130 et 150 g, âgés de 4 à 6 mois. Ces animaux proviennent de l’Institut Malgache de Vaccins et de Vétérinaire à Ampandrianomby -Antananarivo. Les rats ont été préalablement mis à jeûn pendant 8 h et divisés en trois lots de trois rats. Le lot témoin a reçu 10 mL/Kg d’eau distillée tandis que les deux lots traités ont respectivement reçu 1 g/Kg et 3 g/Kg de l’extrait brut. Les produits ont été administrés par voie orale par gavage à l’aide de seringue à bout non pointu. Le comportement des rats a été observé pendant les trois jours qui ont suivi l’administration des produits. Les paramètres

étudiés ont été l’activité motrice (mouvement, immobilité) et les comportements anormaux (perte de reflexe, tremblement, contractions abdominales) ainsi que la mortalité des animaux. (DHARMALINGAM et NATESAN, 2017).

II.4.3. Effet larvicide de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya africana Deux localités différentes ont été choisies pour la collecte de larves de moustiques. Ces deux localités sont la rivière d’Imamba de Sabotsy Namehana (17° 37’0’’S/ 47°24’0’’E) et le bord de rizière d’Antanandrano (18°51’25’’S /47°32’17’’E) toutes deux dans la région d’Analamanga (Figure 17). Les larves sont récoltées à l’aide d’un godet relié à un bâton en bois de 1,2 m. Ensuite, elles sont transférées dans un seau en plastique (Figure 18).

Figure 17 Lieu de collecte de larves de moustiques: rivière d’Imamba Sabotsy Namehana (à gauche), rizière d’Antanandrano (à droite).

(Source : RAKOTOARISOA, 2019).

Figure 18 Matériels utilisés au cours de la collecte des larves.

(Source : RAKOTOARISOA, 2019). Des spécimens de larves ont été identifiés auprès du Laboratoire de l’Entomologie de l’Université d’Antananarivo.

Les larves collectées ont été maintenues dans un seau en plastique contenant l’eau du site de collecte, à température ambiante, puis les larves de stade 3 et 4 ont été sélectionnées pour le test, et elles ont été transférées dans de l’eau distillée pendant 24 heures avant la manipulation (LARBHALI et al., 2010). Le test de sensibilité est réalisé suivant le protocole préconisé par l’Organisation Mondiale de la Santé. Six concentrations (50, 100, 250, 400, 500, et 1000 mg/L) d’insecticides ont été préparées par dilution dans l’éthanol de l’extrait à l’acétate d’éthyle et un lot témoin traité avec 1 mL d’éthanol. Quatre bocaux par concentration contenant chacun 20 larves ont été employés (LARHBALI, 2010). Un volume de la solution préparée a été mis dans 199 ml d’eau distillée dans chaque bocal. (OMS, 1963 et SAYAH et al., 2014). Après 24 heures de contact, les larves mortes sont dénombrées et le pourcentage de mortalité est calculé selon la formule:

푛표푚푏푟푒 푑푒 푙푎푟푣푒푠 푚표푟푡푒푠 푃표푢푟푐푒푛푡푎푔푒 푑푒 푚표푟푡푎푙푖푡é % = × 100 푛표푚푏푟푒 푑푒 푙푎푟푣푒푠 푖푛푡푟표푑푢푖푡푒푠

Conditions de validation du test (ABBOTT, 1925 ; MUTHU et al., 2012) : Suivant le taux ou pourcentage de mortalité dans le lot témoin, le test peut être valide ou non.  Lorsque le pourcentage de mortalité en témoin est inférieur à 5%: le test est valide.  Lorsque le pourcentage de mortalité en témoin est compris entre 5% et 20%: il faut procéder à des corrections suivant la correction d’Abbott, selon la formule ci-après : % 푚표푟푡푎푙푖푡é 표푏푠푒푟푣é % 푚표푟푡푎푙푖푡é 푡é푚표푖푛 푃표푢푟푐푒푛푡푎푔푒 푑푒 푚표푟푡푎푙푖푡é 푐표푟푟푖푔é푒 % = 푥 100 100 % 푚표푟푡푎푙푖푡é 푡é푚표푖푛  Lorsque le pourcentage de mortalité en témoin est supérieur à 20%: le test est invalide.

Calcul de la concentration létale 50% et 90% (BOSSOU et al., 2013) Les doses létales 50% et 90% (DL50 et DL90) sont définies comme étant les concentrations provoquant respectivement 50% et 90% de mortalité dans la population des larves traitées. Ces valeurs sont déterminées à partir d’une méthode graphique appliquant la régression linéaire: % de mortalité = f (log C) avec C : Concentration en mg/L.

L’équation de la droite de régression est de la forme : = Où Y : % de mortalité, A : une constante, B : coefficient de régression X : le logarithme décimal de la concentration (log C)

Les différentes étapes du test de sensibilité des larves sur l’extrait sont données par la figure 19.

2- Préparer 199 mL d’eau distillée dans chaque lot 1- Sélectionner 20 larves de moustiques à l’aide d’une pipette

4- dénombrer les larves mortes et vivantes 3-Ajouter 1mL de l’extrait et laisser en contact avec les moustiques pendant 24 h

Figure 19 Protocole du test de sensibilité de larves de Culex quinquefasciatus par l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya africana.

II.5. Expression et analyses des résultats

Les résultats obtenus sont exprimés sous forme de moyenne avec écart type réduit (푚 ± e.s.m). Le test « t » du student est utilisé pour comparer les moyennes entre elles. La différence est considérée comme significative pour une valeur du seuil de signification P < 0, 05. Pour les tests de sensibilité des larves, les données obtenues ont été représentées par une courbe de régression logarithmique à effet dose (HARIBALAN et al., 2015).

III. RESULTATS ET DISCUSSION

III.1. Résultats des études chimiques

III.1.1. Résultats du criblage phytochimique

Le criblage phytochimique révèle la présence de six familles chimiques dans Kotschya africana. (Tableau II)

Tableau II Résultats du criblage phytochimique de l’extrait hydroalcoolique.

FAMILLES CHIMIQUES RÉSULTAT Stéroïdes présent

Flavonoïdes présent

Leucoanthocyanes présent Polyphénols présent Tanins présent Polysaccharides présent Terpénoïdes absent

Saponine absent

Quinones absent Alcaloïdes absent

D’après ce tableau, Kotschya africana bequaertii contient de stéroïdes, de flavonoïdes, de leucoanthocyanes, de tanins, de polyphénols et de polysaccharides. Par contre, les terpénoïdes, les saponines, les quinones et les alcaloïdes n’ont pas été retrouvés dans la plante étudiée. Par rapport à la chimiotaxonomie, les polyphénols (surtout les flavonoides) sont plus répandus dans la famille des Fabaceae y compris Kotschya (AWOUAFACK et al., 2017). Le criblage phytochimique permettrait déjà d’avancer que la chimiotaxonomie de Kotschya africana est vérifiée. La présence de ces métabolites secondaires dans ce genre peut expliquer les vertus pharmacologiques particulières de certains d’entre eux comme l’activité antibactérienne et antidiarrhéique de Kotschya strigosa. (RAKOTONIRINA, 2016). Ces résultats vont permettre aussi d’interpréter les CCM des extraits à activité antioxydante par la méthode « bioautography ».

III.1. 2. Rendement d’extraction

A partir de 700 g de poudre de Kotschya africana, une quantité de 90,21 g de l’extrait méthanolique a été obtenu, ce qui donne un rendement de 12,88 %. L’extrait est pâteux avec une couleur marron foncée. Les masses et les différents rendements du partage liquide- liquide sont représentés dans le Tableau III.

Tableau III Masse et rendement des extraits de K. africana.

Type de l’extrait Masse (g) Rendement par rapport à l’extrait hydroalcoolique (%) Extrait hexanique 10,02 11,10 Extrait 5,87 6,50 dichlorométhanique Extrait à l’Acétate d’éthyle 8,04 8,91 Extrait butanolique 9,02 9,99 Extrait aqueux 50,11 55,54

D’après ce tableau, le rendement de l’extrait aqueux est le plus élevé comparé à ceux des autres extraits, ce qui signifie que l’extrait brut de Kotschya africana est riche en produits polaires.

III.1.3. Résultats de la chromatographie sur couche mince

Après plusieurs essais sur la recherche des systèmes de solvant, le mélange DCM/MeOH 8: 2 (v/v) a été choisi pour l’élution de l’extrait à l’AcOEt de Kotschya africana. Le profil chromatographique de celui-ci est représenté dans la figure 20. Révélé sous UV à 254nm et à 365nm puis à la vanilline sulfurique, le profil montre que l’extrait à l’AcOEt contient au moins huit produits. Leurs références frontales sont représentées dans le tableau IV.

h g f e d

a Extrait Extrait AcOEt AcOEt DCM/MeOH 8 : 2 DCM/MeOH 8 : 2 _ Adsorbant_ : silice_ F254

Eluant : DCM/MeOH 8 :2 Révélateur : UV puis vanilline sulfurique Figure 20 Profil chromatographique de l’extrait à l’AcOEt de Kotschya africana sur une

plaque de silice.

Tableau IV Références frontales Rf de différents constituants de l’extrait à l’AcOEt.

Produits a b c d e f g h Rf 0 0,02 0 ,14 0,41 0 ,63 0,73 0,80 0,85 UV 254 nm - - - noir noir - - - UV 365 nm blanc blanc - grenat jaune rose blanc - Couleur jaune après révélation orange orange gris orange orangé gris vert vert à la vanilline foncé clair clair sulfurique

D’après les résultats évoqués par ce tableau, l’extrait à l’AcOEt contient des produits fluorescents. Ces fluorescences pourraient être dues aux groupements chromophores ou aux doubles liaisons conjuguées que contiennent chaque produit. Révélé à la vanilline sulfurique, des taches orange et jaunes orangées apparaissent. Elles correspondent aux couleurs caractéristiques des flavonoïdes. (BAKASSO, 2009)

II.1.4. Résultats du fractionnement et purification de l’extrait à l’acétate d’éthyle de Kotschya africana

154 fractions ont été obtenues à partir de la chromatographie sur colonne de silice de 4 g de l’extrait à l’acétate d’éthyle dont la phase mobile est composée de gradient de solvant DCM/MeOH. . (Figure 21) Après lavages successifs au dichlorométhane puis à l’acétate d’éthyle de la fraction F64 suivie de CCM, un produit pur codé RMF01 et de masse 34 mg est obtenu. RMF01 apparait sous forme de poudre jaune foncée qui est soluble dans du méthanol. Il apparait sous forme de tache unique sur la plaque CCM. Il pourrait être soit le produit e soit le produit f du tableau IV.

4 g d’extrait à l’AcOEt

CLBP (L= 45 cm ; D = 5cm) Silice 0,04-0,063mm (m=230 g) DCM/ MeOH 100 :0 0 :100

1 …. 5 …. 63 …. 67 … ….. 154

Fn F1 F64 m= 60 mg

Purification par Lavage avec DCM puis Acetone

F64- 1 F64- 2 F64- 3 m= 34 mg m= 10 mg m= 5 mg

soluble dans Methanol Partie insoluble dans l’acetone soluble dans Methanol Poudre de couleur jaune foncée Poudre de couleur Poudre de couleur Codé :RMF01 jaune orangée jaune claire

Figure 21 Diagramme de fractionnement et purification du produit RMF01 issue de l’extrait à l’AcOEt.

La figure 22 montre le profil chromatographique de l’extrait à l’AcOEt et les trois fractions issues de la fraction F64 .

F64-2 F64-3 T RMF01 Hexane/AcOEt/MeOH (2 : 6 :2) . Adsorbant : silice F254

Eluant : Hexane/AcOEt/MeOH (2 : 6 :2) Révélation : UV 365nm puis vanilline sulfurique Figure 22 Profil chromatographique de RMF01, F64-2 et F64-3, observé sous UV 365 nm.

Après révélation du chromatogramme, les trois fractions issues de la fraction F64 de l’extrait à l’AcOEt se ressemblent et présentent des taches uniques et une fluorescence de couleur bleu-vert sous UV à 365nm. Elles ont les mêmes valeurs de références frontales avec

RfRMF01= RfF64-2= RfF64-3= 0,69. Or, les couleurs de chaque poudre de produit sont différentes lorsque ceux-ci sont observés à l’œil nu. RMF01 est de couleur jaune foncée, F64-2 de couleur jaune orangée et F64-3 coloré en jaune claire. Ce qui laissent supposer qu’ils s’agissaient de produits différents, et l’on ne peut pas les rassembler pour être analysés sur RMN.

III.2. Résultats de l’analyse spectrale

III.2.1. Résultat de la spectroscopie infrarouge

Différentes bandes sont observées sur le spectre infrarouge du produit RMF01 (Figure 23). Mais une distinction en 3 zones est visible. * De 3500 à 2000 cm-1, des bandes d’absorption large apparaissent dans cette zone. La bande vers 3231.44 cm-1 pourrait attribuer à l’élongation de la liaison O__H.

* La région 2000 à 1000 cm-1 contient entre autres, des bandes d’intensités moyennes qui pourraient correspondre à l’étirement longitudinal de la liaison C=C aromatique ou C_O. C’est la zone des « empreintes digitales » car de nombreuses absorptions s’y trouvent. A 1648,47 cm-1, une bande d’intensité moyenne apparait, celle-ci correspondrait à la vibration de groupement C=O. * La région 1000 - 500 cm-1 pourrait correspondre aux déformations angulaires des liaisons des composés éthyléniques ou des cycles aromatiques non conjugués.

__ O H

C=O

Figure 23 Spectre infrarouge du produit RMF01.

III.2.2. Résultat de la spectroscopie de masse

Le spectre de masse montre un pic intense de l’ion pseudo-moléculaire [M+Na]+ à m/z = 457,07 (Figure 24), ce qui pourrait correspondre à une masse moléculaire de 434 u.m.a. Par consultation des formule enfin des masses moléculaires, RMF01 a comme formule brute

C20H18O11 avec Ni /c= 12 c’est-à-dire que RMF01 contiendrait 12 insaturations et/ou cycles.

[M + Na]+ 457,07

Figure 24 Spectre de masse du produit RMF01. III.2.3. Interprétation du spectre RMN du produit RMF01

 Spectre RMN 1H D’après le spectre du proton 1H (Figure 25), deux zones sont présentes.

Zone des H aromatiques Zone des H du sucre

7,61 6,41. (d, J = 1,5 Hz) H H (dd, J = 8,8 Hz) H 6,91. (dd, J = 8,4 Hz) (d, J = 1,8 Hz) H CD3OD 6,22

1 Figure 25 Spectre RMN H du produit RMF01 dans du CD3OD.

Dans la zone des sucres dont le déplacement chimique  est compris entre 3 à 5,5 ppm (WILLIAM, 2006), 6 pics sont présents. Ils sortent respectivement à 3,35 ppm (sous forme de doublet dédoublé, J = 13,6 ; 3,01 Hz); à 3,55 ppm (doublet dédoublé avec J = 3,01; 13,6 Hz); à 3,71 et à 3,72 ppm (doublet dédoublé, J = 3,6 ; 13,1 Hz) ; à 3,81 ppm (doublet dédoublé avec J = 6,9 ; 8,5 Hz) et à 5,20 ppm (doublet, J = 6 ,8 Hz). Cela veut dire que les H sous forme de doublet ont chacun un proton voisin.

Le signal à 4,91 ppm représente le pic du méthanol deutérié CD3OD. En ce qui concerne, la zone des H aromatiques avec des déplacements chimiques  compris entre 6 à 9 ppm, 5 signaux sont observés : à  = 6,22 ppm (doublet, J= 1,8 Hz, méta couplé) , à  = 6,41ppm ( doublet avec J = 1,5 Hz , couplage méta), à 6,91 ppm ( doublet, J= 8,4 Hz, couplage ortho) ; à  =7,61 ppm (doublet dédoublé, J = 8,8 ; 2,1 Hz, couplage ortho) et à 7,79 ppm (doublet, J= 1,8 Hz, méta couplé). En fait, les valeurs de constante de couplage permettent déjà de prédire le couplage entre les protons aromatiques. (MAES, 2014) La récapitulation des informations sur le spectre RMN 13H est sur le tableau V.

Tableau V Résumé de l’interprétation du spectre RMN du proton de RMF01.

Déplacement Allure Constante de Nombre H chimique des des couplage J équivalents Hypothèse 1H signaux (ppm)

H 3,35 doublet J = 13,6 ; 1 H 3,35 dédoublé 3,01 (Hz) C C

OH OH H 3,55 doublet J = 3,01; 13,6 1 H 3,55 dédoublé Hz C C

OH OH 3,71 doublet J = 3,6 ; 13,1 1 H H dédoublé Hz 3,71 C C

OH OH

Déplacement Allure Constante de Nombre H Hypothèse chimique des des couplage J équivalents 1H signaux (ppm) 3,72 doublet J = 3,6 ; 13,1 1 H H 3,72 dédoublé Hz C C HO HO

H 3,81 doublet J = 6,9 ; 8,5 1 H C 3,81 dédoublé Hz C HO HO H 5,20 doublet J = 6 ,8 Hz 1 H 5,20 C C

OH OH 6,22 doublet J= 1,8 Hz 1 6,41. (d, J= 1,5 Hz) H

(d, J= 1,8 Hz) H 6,41 doublet J = 1,5 Hz 1 6,22 6,91 doublet J= 8,4 Hz 1 7,61 H (dd, J = 8,8 Hz) H 6,91.

(dd, J = 8,4 Hz) 7,61 doublet J = 8,8 ; 2,1 1 dédoublé Hz 7,79 doublet J= 1,8 Hz 1

H 7,79 (d, J= 1,8 Hz)

 Spectre RMN 13C 20 signaux sont observés sur le spectre RMN 13C du produit RMF01 pouvant ainsi correspondre à au moins 20 atomes de carbone s’il n’y a pas chevauchement de pics. Ces signaux se distribuent dans 3 zones distinctes sur ce spectre. (Figure 26), *Sur la zone des carbones aliphatiques liés à un hétéroatome ( =50 à 90 ppm), 4 signaux sont présents. Ils sortent respectivement à 65,60 – 67,75 -71,51 et à 72,77 ppm. D’après la bibliographie, ces carbones appartiennent dans la zone des sucres dont le carbone anomérique pourrait se situer entre  = 90 à 105 ppm (WILLIAM, 2006). Ce qui permet de dire que la molécule pourrait contenir du sucre. *Dans la zone des aromatiques ( = 90 à 170 ppm) (MAKOKHA, 2010), 14 signaux sont présents. Ils sortent respectivement à 93,34 – 98,51 -103,31 – 104,20 - 114,78 – 116,08 –et à 121,64 ppm, dont 7 carbones aromatiques sont deblindés : 134,25– 144,57 -148,57 – 156,98 - 157,24 – 161,61 et 164,71 ppm c’est-à-dire qu’ils sont associés à des hétéroatomes. *La troisième zone est la zone de carbonyle avec un signal sortant à  = 178,03 ppm. (REDDI et al., 2016).

Zone de carbonyle Zone des C aromatiques Zone des sucres

CD3OD

Valeurs des déplacements chimiques  des C (ppm) 13 Figure 26 Spectre RMN C du produit RMF01 dans du CD3OD.

D’après le spectre RMN 13C, le nombre d’atomes de carbones aromatiques est caractéristique d’une structure de base d’un flavonoïde C6-C3-C6. Alors il y aura deux noyaux accolés et un autre noyau aromatique isolé (figure 27).

6,4 H

O 93,34 O O 164,71 156,02

98,51 104,20 178,03 6,22 H 161,66 C

O O O

Figure 27 Structure de base de RMF01 d'après le spectre RMN 13C.

 Spectre du COSY de RMF01

Il représente les corrélations entre les protons voisins (Figure 28).

Valeurs de Valeurs

déplacement

H (ppm) H

chimique



des des

Valeurs des déplacements chimiques  des H (ppm)

Figure 28 Spectre COSY du produit RMF01 dans du CD3OD.

Le proton à 6,91 ppm corrèle avec le proton à 7,61ppm deux protons aromatiques en position ortho l’un de l’autre. Le proton à 3,55 ppm corrèle avec le proton à 3,71 et à 3,81 ppm. Il a deux voisins. Le proton à 5,02 ppm anomérique corrèle avec le proton à 3,81 ppm, appartenant au carbone n°2 de l’ose, et le proton à 3,55 ppm est le proton en position 3 de l’ose (Figure 29). 6,91. H 5,02 3,81 3,55 3,71 7,61 H H H H H

C C C C

Figure 29 Corrélation entre les protons de RMF01 sur COSY.

 Spectre HSQC de RMF01 Ce spectre représente les corrélations directes entre le proton et son carbone porteur.

Alors, les carbones quaternaires n’apparaissent pas dans ce spectre. (Figure 30) Valeurs de déplacemen de Valeurs

3,72- 65,60 3,35- 65,60 3,71- 67,75 3,81- 71,51

3,55- 72,76

t schimique 6,4- 93,34 6,22- 98,51

5,20- 103,31

s s

 des C des (ppm) 7,79- 116,1 6,91- 114,78

7,61- 121

Figure 30 Spectre HSQC de RMF01 extrait de Kotschya africana.

Les protons qui sortent à 3,35 et à 3,72 ppm sont portés par le carbone à 65,60 ppm. Le proton à  = 3,71 ppm est corrélé au carbone à 67,75 ppm. Le proton à  = 3,81 ppm est porté par le carbone à 71,51 ppm. Le carbone à 72,76 ppm porte le proton à 3,55 ppm. Le carbone aromatique à 93,34 ppm porte le proton aromatique résonnant à 6,4 ppm. Le carbone aromatique à 98,51 ppm porte le proton sortant à 6,22 ppm. Le proton à  = 5,20 ppm est porté par le carbone à 103,31 ppm. Le proton à  = 6,91 ppm est porté par le carbone à 114,78 ppm. Le proton à  = 7,79 ppm est porté par le carbone à 116,1 ppm. Le proton à  = 7,61 ppm est porté par le carbone à 121,64 ppm.

Le résumé des corrélations observées sur le spectre HSQC de RMF01 est donné dans le Tableau VI.

Tableau VI Représentation de corrélation entre le proton H et son carbone porteur C avec les déplacements chimiques correspondants.

Protons H Carbones porteurs C ( en ppm) ( en ppm) 3,35 65,60 3,72 3,71 67,75 3,81 71,51 3,55 72,76 6,4 93,34 6,22 98,51 5,20 103,31 6,91 114,78 7,79 116,1 7,61 121,64

 Spectre HMBC de RMF01 Ce spectre donne les corrélations à longues distances entre les protons et les carbones qui

lui sont distants de deux, trois ou quatre liaisons (2J ou 3J ou 4J) (Figure 31).

Valeurs de Valeurs

déplacement

s s

chimique



des C (ppm) des

Valeurs des déplacements chimiques  des H (ppm)

Figure 31 Spectre HMBC de RMF01. Le spectre HMBC de RMF01 montre que :  Le proton qui sort à  = 6,22 ppm (porté par le carbone à 98,51 ppm) corrèle avec les carbones à 93,34 ; 161,61 et à 164,71 ppm.  Le proton à  = 6,41 ppm porté par le carbone à 93,34 ppm est corrélé avec les carbones à 98,34 ; 104,20 ; à 164,71 et à 178,03 ppm. Ce qui permettrait de dire que ces protons se trouvent sur le même noyau aromatique et en position méta dont la séquence a est sur la figure 32 (Noyau A).

6,4 6,22 6,4 H

O 93,34 O

164,71 156,02

98,51 104,20 178,03 6,22 H 161,66 C

O O

Figure 32 Séquence a du Noyau aromatique A d’après le spectre HMBC de RMF01.

Ensuite, le proton à  = 7 ,79 ppm porté par le carbone à 116,8 ppm corrèle avec les carbones sortant à  = 157,24 ; 148,5 ; 144,57 et à 121,66 ppm. . Le proton à  = 7, 61 ppm porté par le carbone à 121,64 ppm corrèle également avec les carbones à 148,5 ; 157,24 et à 116,08 ppm. . Les carbones à 121,47 ; 144,57 et à 148,5 ppm sont corrélés avec le proton à  = 6,91 ppm dont le carbone porteur sort à 114,78 ppm. Ces informations permettent de mettre une hypothèse que ces protons se trouvent sur un même noyau aromatique (Noyau B) et ils sont ortho et méta couplés ,noté séquence b et représenter sur la figure 33.

7,79 7,61 6,91

H 144,57 O

7,79 116,08 148,57

O 157,24 121,47 114,78 C 121,64 H 6,91

134,25C H 7,61 O

Figure 33 Séquence b du noyau aromatique B d’après le spectre HMBC de RMF01.

La combinaison des séquences a et b donne la structure de base d’un quercétine (Figure 34).

6,4 H H 144,57 O 7,79 116,08 148,57 O 93,34 O O 157,24 121,47 114,78 164,71 156,02 C 121,64 H 6,91 98,51 104,20 178,03 134,25 H 6,22 H 161,66 C C 7,61 O O O

HO O

OH O R : ose Figure 34 Combinaison des séquences a et b de RMF01.

Pour la zone du sucre : . Le proton ayant comme déplacement chimique  = 5,20 ppm porté par le carbone à 103,31 ppm corrèlent avec les carbones sortant à 65,60 ; 71,51 et à 134 ,25 ppm. . Le proton à  = 3,71 ppm porté par le carbone à 67,75 ppm corrèle avec les carbones à 103,31 et à 72,76 ppm. . Le proton à  = 3,81 ppm porté par le carbone à 71,51 ppm, est corrélé avec les carbones à 67,75 ; 72,77 et à 103,31 ppm. . Le proton à  = 3,55 ppm porté par le carbone à 72,76 ppm corrèle avec le carbone à 67,75 et à 103,31 ppm. . Le proton à  = 3,35 ppm et à 3,72 ppm portés par le carbone à 67,75 ppm corrèlent avec les carbones à 103,31 et à 72,76 ppm.

Ces corrélations sont figurés sur la séquence c (Figure 35). Ces corrélations permettent de supposer que le sucre est un pentose pyranique.

134,25 C

O 5,20 H OH O 103,3 71,51 .. .. H 3,35 66,1 H 72,76 3,81 67,75 H H 3,55 3,72 H 3,71 OH OH

Figure 35 Séquence c de l'ose.

En rassemblant les informations sur les spectres RMN mono et bidimensionnelles, RMF01 est une molécule est un quercétine, contenant un carbohydrate à cycle pyranique avec 5 atomes de carbones, en position 3. (Figure 36) OH

3' OH

HO O

5 O

OH O O OH

OH OH 2-(3’,4’dihydroxy)-5,7-dihydroxyphényl-3-(tétrahydro-3, 4, 5-trihydroxy-2H-pyran-2-yloxy)- 4H-chromèn-4-one. Figure 36 Hypothèse de structure de RMF01.

RMF01 s’agit d’un dérivé de flavonol correspondant à la quercétine glycoside. C’est la première fois que cette molécule est isolée dans le genre Kotschya africana. En 1993, Simon et ses collaborateurs ont parvenu également à isoler le quercetin-3-O- arabinopyranoside (guaijaverin) à partir des extraits à l’acétate d’éthyle de Calluna vulgaris de la famille des ERICACEAE (SIMON et al., 1993). La comparaison des déplacements chimiques des carbones et des protons de RMF01 par rapport aux données de la littérature, est donné au tableau VI et permettant la confirmation de la structure de RMF01. Tableau VII Correspondance entre les déplacement chimiques  des carbones et protons de RMF01 par rapport aux données de la littérature. Position  H de RMF01  C de  H de Guaijavarin  C de (ppm) RMF01 (ppm) dans du Guaijavarin dans du CD3OD (ppm) DMSO-d (ppm) (SIMON (SIMON et al. 1993). et al., 1993). 2 157,24 156,2 3 134,25 133,7 4 178,03 177,5 5 161,61 161,2 6 6,22 (d, J= 1,8 Hz) 98,51 6,20 (d, J= 1,9 Hz) 98,6 7 164,71 164,2 8 6,41(d, J= 1,5 Hz) 93,34 6,40 (d, J= 1,9 Hz) 93,5 9 104,20 103,9 10 156,98 156,2 1’ 121,47 120,9 2’ 7,79 (d, J= 1,8 Hz) 116,8 7,51 (d, J = 2,1 Hz) 115,3 3’ 144,57 144,9 4’ 148,57 148,5 5’ 6,91 (d, J=8,4 Hz) 114,78 6,84 (d, J=8,5 Hz) 115,7 6’ 7,61 (dd, J= 8,8 ; 2,1 121,64 7,64 (dd, J= 8,5 ; 2,1 122,0 Hz) Hz) 1’’ 5,20 (d, J = 6,8 Hz) 103,31 5,27 (d, J= 5,2 Hz) 101,4 2‘’ 3,81 (dd, J = 6,9 ; 8,5 71,51 3,75 (dd, J = 6,8 ; 5,2 71,6 Hz) Hz) 3‘’ 3,55 (dd, J=3,01 ; 13,6 72,77 3,51 (dd, J= 6,8 ; 2,9 70,7 Hz) Hz) 4‘’ 3,71 (dd) 67,75 3,64 66,0 5‘’ 5a‘’ : 3,72 (J= 13,1 ; 3,6 65,60 5a’’ : 3,61 (dd, J= 11,3 ; 64,2 Hz) 5,4 Hz) 5b‘’ :3,35 (J = 13,6 ; 5b’’ : 3,21 (dd, J=11,3 ; 3,01 Hz) 2 Hz)

La différence de déplacement chimique des C et H de RMF01 par rapport à la guaijavarin observée sur ce tableau serait en fait liée à l’effet de solvant utilisé lors de la RMN.

III.3. Résultats de l’analyse biologique

III.3.1. Résultat de l’activité antioxydante

Après élution de l’extrait brut, de l’extrait à l’AcOEt et de RMF01 dans du DCM/MeOH du chromatogramme, le test au DPPH est positif. Des taches jaunes apparaissent, confirmant la présence de molécule ayant des activités antioxydantes (Figure 37).

Extrait Extrait brut AcOEt RMF01 DCM/MeoH 8 :2 DCM/MeOH 7:3 Adsorbant: Silice F254 Eluant: DCM/MeOH Révélateur: DPPH Figure 37 Profils chromatographiques sur plaque de silice de l’extrait méthanolique, de l’extrait à l’AcOEt et du produit RMF01 après révélation au DPPH. Le résultat de ce test par « bioautography » confronté aux résultats du criblage phytochimique du tableau II permet d’avancer que les substances naturelles responsables d’activité antioxydante de Kotschya africana pourraient être des composés phénoliques tels que les flavonoïdes, les tanins ou d’autres polyphénols. Les flavonoïdes jouent un rôle très important dans le traitement du diabète (inhibant l’aldose réductase), de la goutte (inhibant la xanthine oxydase), des inflammations (inhibant la lipoxygenase, la phospholipase et la cyclooxygenase), des hépatites, de l’hypertension, des allergies et des affections bactériennes (NABILA, 2011). Les données sur l’utilisation traditionnelle de Kotschya africana pourraient être liées à la présence des composés phénoliques dans la plante.

III.3.2. Toxicité aiguë de l’extrait brut de Kotschya africana

Après l’administration de l’extrait brut et pendant les jours d’observation, aucune mortalité n’est enregistrée chez les différents lots de rats traités par l’extrait brut. La dose létale DL50 est donc supérieure à 3 g/Kg, donc l’utilisation de l’extrait de plante ne présente aucun risque à une dose inférieure à cette valeur (AMIARD, 2011). Les signes observés sont une diminution de l’activité motrice des animaux traités (30 mn après l’administration des produits) et de somnolence chez le lot traité avec 3 g/Kg de l’extrait. Mais il y a retour à l’état physiologique normal, deux heures après l’administration des produits.

III.3.3. Sensibilité des larves de Culex quinquefasciatus par l’extrait à l’AcOEt

Des tests ont été menés sur des larves de stade 3 et 4 de Culex quinquefasciatus avec l’extrait à l’AcOEt de Kotschya africana. Les résultats du test de sensibilité sont montrés sur la courbe à effet-dose (% mortalité = f (log C)) sur la figure 38 ci-dessous. L’extrait à l’AcOEt est toxique pour les larves de moustiques. Le pourcentage de mortalité larvaire augmente avec la concentration de l’extrait utilisé, ce qui amène à dire que l’extrait a un effet larvicide sur Culex quinquefasciatus. D’après la droite de régression linéaire, les valeurs de la dose létale DL50 et de la dose létale DL90 sont respectivement estimées à la concentration log C 50=2,44 et log C90=3,164 équivaut aux valeurs respectives à 280 et 1459,62 mg/L. L’extrait à l’AcOEt possède une activité larvicide. A partir de la dose 400 mg/L de l’extrait, la courbe atteint un plateau, ça pourrait s’expliquer par le fait que chaque individu larvaire a sa propre sensibilité et réponse face à un produit larvicide (OUEDRAOGO et al., 2005).

100 90 80 y = 55,802x -86,571 70 60 50 40 30 20

pourcentage de mortalité 10 0

DL50 log(Concentration) % mortalité Linéaire (% mortalité)

Figure 38 Mortalité des larves de Culex quinquefasciatus sous l’effet de l’extrait AcOEt de Kotschya africana.

MUTHU et ses collaborateurs ont étudié l’effet larvicide de pectolinaringenin (5,7- dihydroxy- 4’,6-dimethoxy-flavone) à partir de Clerodendrum phlomidis sur Culex quinquefasciatus de stade 3 et ils ont trouvé que cette molécule inhibe la croissance et entraine la mortalité des larves à faible concentration avec un DL50 à 0,62 et un DL90 à 2,87 mg/L. (MUTHU et al., 2012). En se référant à ces doses, les doses létales obtenues à partir de l’extrait à l’acétate d’éthyle présentent un écart significatif puisque l’extrait à l’AcOEt s’agit encore d’un mélange de produit. Une étude portée sur l’extrait d’acétate d’éthyle de Caesalpinia pulcherrima (Fabaceae) sur Culex tritaeniorhynchus, a mis en évidence une dose létale DL50 à 158,17 mg/L (GOVINDARAJAN et al., 2013), ce qui est largement inferieure par rapport à la dose létale DL50 à 280 mg/L issue de l’extrait de K. africana. Mais par rapport à l’extrait de Vernonia cinerea, l’extrait de Kotschya africana s’est montré plus efficace sur Culex quinquefasciatus. (Tableau VIII)

Tableau VIII Comparaison des doses létales DL50 et DL90 de K. africana avec la littérature. Plante étudiée Valeur Valeur de Extrait/ Produit Effet Références de la la DL90 larvicide DL50 K. africana 280 1459,62 Extrait à positif mg/L mg/L l’AcOEt Vernonia 1630 4250 Extrait à positif ARIVOLI et al., cinerea mg/L mg/L l’AcOEt 2011

Caesalpinia 158,17 296,61 Extrait à positif GOVINDARAJAN pulcherrima mg/L mg/L l’AcOEt et al., 2013 Clerodedrum 179,27 440,95 Extrait positif MUTHU et al., phlomidis mg/L mg/L choloroformique 2012 Clerodedrum 0,62 2,87 mg/L pectolinaringenin positif MUTHU et al., phlomidis mg/L (5,7- dihydroxy- 2012 4’,6-dimethoxy- flavone)

En ce qui concerne l’effet larvicide de l’extrait à l’AcOEt de K. africana, ça pourrait être dû à l’effet combiné ou non des composés phénoliques présents dans la plante. Kotschya africana pourrait présenter un intérêt dans le de domaine de la lutte antivectorielle contre la filariose lymphatique.

CONCLUSION

Les plantes sont des sources prometteuses de molécules ayant des activités biologiques intéressantes. Dans ce travail d’initiation à la recherche, Kotschya africana bequaertii est choisi pour ses utilisations traditionnelles très diversifiées afin de donner des approches scientifiques et de valoriser les plantes médicinales. Les différents tests des criblages phytochimiques ont montré la présence des steroïdes, flavonoïdes, leucoanthocyanes, polyphenols, tanins et polysaccharides dans l’extrait hydroalcoolique de K. africana , ce qui vérifie la chimiotaxonomie du genre. La macération à froid suivie de partage liquide-liquide de poudre de cette plante a permis l’obtention de 5 extraits tels que : l’extrait hexanique (11,10 %), extrait au dichlorométhane (6,50 %), extrait à l’acétate d’éthyle (8,91%), extrait au butanol (9,99%) ,extrait aqueux (55,55%). Une étude chromatographique de l’extrait à l’acétate d’éthyle conduit à l’isolement d’un produit sous forme de poudre et de couleur jaune foncée. L’analyse des spectres 1H et 13C monodimensionnels et bidimensionnels (COSY, HSQC, HMBC) permet de proposer la structure d’un quercétine-3-O-pyranoside appartenant à la famille de flavonol. D’après l’analyse de spectre de masse, RMF01 a une masse moléculaire égale à M = 434 u.m.a. correspondant à la formule brute C20H18O11. C’est la première fois que cette molécule est isolée à partir de ce genre et de la famille Fabaceae. Un test au radical DPPH par méthode « bioautography » de ce produit a confirmé une activité antioxydante de l’extrait de Kotschya africana. D’après le test de toxicité aigüe, l’utilisation thérapeutique de la plante ne présente pas de risque pour une dose inférieure à 3 g/Kg. L’étude de sensibilité des larves de Culex quinquefasciatus a montré que l’extrait à l’AcOEt possède une propriété larvicide avec une dose létale DL50 à 280 mg/L. Il pourrait être employé comme larvicide naturelle. Une étude ultérieure dans le but d’isoler et identifier des molécules à activité antioxydante et larvicide issues des extraits aqueux permettrait d’avoir des molécules plus actives avec beaucoup plus de rendements. Des analyses quantitatives sur la détermination en phénols totaux, ainsi que le pouvoir antiradicalaire de l’extrait et du produit isolé, s’avèrent indispensables. Il est également envisageable d’élargir le domaine des tests biologiques pour rechercher des activités larvicides contre les autres moustiques vecteurs de maladie comme Anophèles et Aedes), ainsi que d’essayer la formulation d’un biolarvicide à base de l’extrait de Kotschya africana afin de contribuer à la lutte antivectorielle contre les moustiques pour diminuer la filariose lymphatique.

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ANNEXES

ANNEXE 1. CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE (FONG H. H. S. et al., 1977). a) Criblage des alcaloïdes Pour le criblage des alcaloïdes, il existe trois étapes à suivre : la macération chlorhydrique, le test préliminaire et le test de confirmation. Ce dernier n’est effectué que si les deux premiers sont positifs. * Macération chlorhydrique : Environ 5g de poudre de feuille sont macérés dans 30 ml d’HCl à 12% pendant 15min. Le mélange est filtré sur coton et le filtrat obtenu est divisé dans 4 tubes à essais. Tube 1 : témoin. Tube 2 : ajout de 5 gouttes de réactif de Wagner Tube 3 : ajout de 5 gouttes de réactif de Mayer Tube 4 : ajout de 5 gouttes de réactif de Dragendorff. Pour chaque tube, si un précipité apparaît, le test serait positif. *Test préliminaire : Une solution hydroalcoolique équivalente à 25 g a été évaporée dans un cristallisoir au bain-marie. 10 mL de solution de HCl 2N y sont ajoutées et le mélange est agité avec une baguette de verre tout en chauffant dans un bain marie bouillant pendant 3 à 5 minutes. La solution acide est refroidie à température ambiante, puis additionnée de 0,5 g de NaCl. Après agitation, le mélange est filtré sur papier et le précipité est lavé avec un volume suffisant d’acide. Le filtrat obtenu est divisé dans 4 tubes à essai et on procède comme pour la macération chlorhydrique. b) Criblage des flavonoïdes et leucoanthocyanes 2 g de l’extrait hydroalcoolique sont utilisés. Cet extrait est dépigmenté à l’hexane, puis le résidu est dissous dans de l’éthanol. La solution alcoolique est répartie dans 5 tubes à essais. Tube 1 : sert de témoin. Tube 2 : (test de Wilstater) ajout de 0,5 mL de HCl concentré avec quelques graines de tournure de magnésium. Après 10 minutes, la coloration dans le tube est observée : une coloration rouge indique la présence de flavones ; une coloration variant de rouge à pourpre signifie la présence de flavonols ; si la coloration est rouge violacée, cela signifie la présence de flavanones et flavonols. Tube 3 : (test de Wilstater modifié) Ajout de 0,5 ml de HCl concentré et quelques graines de tournure de magnésium . Après dissolution du magnésium, 1 mL d’eau et 1 mL d’alcool isoamylique sont ajoutés au mélange. Après 10 minutes, si la coloration de la phase

supérieure est rouge, des flavones sont présents dans l’extrait; si elle est pourpre, il y a présence de flavonols. Tube 4 : (test de Bath Smith) ajout de 1 mL de HCl concentré. Le mélange est chauffé au bain marie pendant 30 minutes, puis laissé refroidir. Un virage de la coloration au rouge violacée indique la présence de Leucoanthocyanes. Tube 5 : ajout de 0,5 mL de HCl concentré. L’apparition d’une coloration rouge signifie la présence d’anthocyanes. c) Criblage des tanins et polyphenols 2 g a été évaporée dans un cristallisoir au bain-marie. Un volume de 15 mL d’eau distillée y est versé, puis le mélange est chauffé tout en agitant. Puis 4 gouttes de NaCl à 10% est ajouté. Ce mélange est ensuite filtré sur papier. Le filtrat est divisé dans 4 tubes à essais. Tube 1 : témoin. Tube 2 : ajout de 5 gouttes de gélatine à 1%. L’apparition d’un précipité indique la présence de polyphénols. Tube 3 : ajout de 4 à 5 gouttes de gélatine salée La formation de précipité indique la présence de tanins.

Tube 4 : ajout de 5 gouttes de FeCl3 à 10 % dans du méthanol. Une coloration en bleu-vert indique la présence de tanins condensés (catéchiques ou flavanols-3 condensés et Leucoanthocyanes ou flavanediols-3,4) ; tandis qu’une coloration noir bleuâtre indique la présence de tanins hydrolysables (galliques ou ellagiques) ; une réaction négative à la gélatine salée accompagnée d’une coloration verte ou bleu-noire avec FeCl3 signifie la présence d’autres types de composés phénoliques. d) Criblage des stéroïdes et terpénoïdes 2 g de l’extrait est utilisé puis, l’extrait est dépigmenté à l’hexane. Après l’ajout de 10 mL de dichloromethane, le mélange est agité pendant 5 à 10 minutes. Puis il est laissé décanter et sécher avec le sulfate de sodium anhydre Le filtrat ainsi obtenu est divisé dans 5 tubes à essais. Tube 1 : témoin. Tube 2 : (test de Liebermann Burchard ): ajout de 4 gouttes d’anhydride acétique puis 4 gouttes d’acide sulfurique concentré. Une coloration en pourpre signifie la présence de triterpenoïdes tandis qu’une coloration en violet ou bleu-vert indique la présence de stéroïdes. Tube 3 : (test de Salkowski ) Laisser incliner à 45°, puis 1 mL d’acide sulfurique concentré y est versé . Si l’anneau de séparation formé est de couleur rouge, cela indique une présence de stérols insaturés.

Tube 4 : (test de Badjet Kedde) ajout de quelques grains d’acide picrique. Des stéroides lactoniques sont présents dans l’extrait s’il y a virage de la coloration en rouge.

Tube 5 : (test de Keller- Killiani) addition de quelques gouttes de FeCl3 à 10 % dans l’eau puis quelques gouttes d’acide acétique glacial. Le tube est ensuite incliné à 45° . Si l’anneau de séparation formé est de couleur rouge pourpre, cela signifie la présence de desoxy-2-sucre. e) Criblage des saponines 1 g de poudre de feuille est mis en suspension dans 10 mL d’eau distillée dans un tube à essai. Le mélange est agité vigoureusement pendant quelques minutes, puis placé verticalement pendant 30 min. Une hauteur de la mousse supérieure ou égale à 3 cm indique un test positif. f) Criblage des polysaccharides Une décoction est préparée à partir de 5 g de poudre de feuille. Ensuite, le décocté est filtrée sur papier, 1 mL du filtrat est placé dans un tube à essai et ajouté de 3 mL d’éthanol. La formation d’un précipité indique la présence de polysaccharides. g) Criblage de quinones 2 g de l’extrait est dissout dans 15 mL d’eau distillée puis filtré. Puis on fait une extraction avec un mélange d’ hexane-dichlorométhane 3/1 (V/V). Ensuite, 5 mL de NH4OH est ajouté. La présence de quinones est marqué par un changement de coloration de la phase inferieure.

ANNEXE 2. PREPARATIONS DES REACTIFS DE CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE ET DES REVELATEURS 1) Réactif de Dragendorff Solution A Peser 1 ,7 g de sous-nitrate de bismuth, 20 g d’acide tartrique, les dissoudre dans 30 mL d’eau Solution B Peser 16 g d’iodure de potassium et les dissoudre dans 40 mL d’eau Révélation Au moment de l’emploi, mélanger 2,5 mL de A et 2,5 mL de B. ajouté 10 g d’acide tartrique dissout dans 50 mL d’eau 2) Réactif de Wagner Peser 2 g d’iodure de potassium et 1,27 g d’iode Mélanger ces produits dans un erlenmeyer de 250 mL et ajouter 100 mL d’eau Agiter jusqu’à dissolution complète 3) Réactif de Meyer Dissoudre 1,35 g de chlorure mercurique (II) dans 94 mL d’eau. Ajouter 5 g d’iodure de potassium. Bien agiter jusqu’à dissolution complète. Ramener à 100 ml le volume total avec de l’eau. 4) Gélatine 1% Mettre en suspension dans 100 ml d’eau, 1 g de gélatine 5) Chlorure de sodium à 10% Dissoudre 10g de chlorure de sodium dans 100 ml d’eau 6) Gélatine salée Mélanger un volume de la solution de la gélatine à un volume égal de la solution de chlorure de sodium à 10 %. 7) Acide chlorhydrique à 5% Verser 95 mL d’eau distillée dans une éprouvette et compléter à 100 mL avec de l’acide chlorhydrique 8) Réactif de Kedde Peser 2 g d’acide 3,5- dinitrobenzoïque et les dissoudre dans 100 mL de méthanol Préparer une solution potasse normale (5.6g de potasse dans 100 mL d’eau) Pulvérisation Au moment de l’emploi, mélanger à volume égal la solution d’acide et de potasse

9) Réactif de Keller-Killiani Dissoudre 10 g de chlorure ferrique dans 100 mL d’eau Au moment de l’emploi, mélanger 0,3 ml de la solution précédente de chlorure ferrique dans 50 mL d’acide acétique glacial. On prélève 3 mL du mélange pour le test de Keller- Killiani.

10) Chlorure ferrique à 10% dans le méthanol Dissoudre 1g de chlorure ferrique dans 10 mL de méthanol en agitant et en chauffant au bain- marie jusqu’à dissolution complète

11) Préparation de la vanilline sulfurique

- Solution A : 3 mL de H2SO4 concentré sont mélangés avec 50 ml d’EtOH dans un erlenmeyer. - Solution B : 3 g de vanilline sont dissous dans 50 ml d’EtOH dans un erlenmeyer. Les solutions A et B doivent être conservées au réfrigérateur. - Révélation : au moment de l ‘emploi, la solution A et la solution B sont mélangées à volumes égaux.

12) Préparation de DPPH Dissoudre 20 mg de DPPH dans 10 mL de méthanol.

Titre : ISOLEMENT D’UN FLAVONOL chez Kotschya africana Endl. var. bequaertii (De Wild.) Verdc. (FABACEAE) ET ETUDE DES ACTIVITES LARVICIDE ET ANTIOXIDANTE Laboratoire de Chimie Organique et de Substances Marines (LCO-SM), Mention Chimie, Université d’Antananarivo. Auteur: RAKOTOARISOA Malalatiana Fiderana Email: [email protected] Téléphones: 032 58 839 33, 034 01 463 95 Nombre de figures : 38 Nombre de tableaux : 8 Nombre de pages : 72

RESUME La filariose lymphatique est une maladie parasitaire due à Wuchereria bancrofti. Elle se transmet par la piqure des moustiques infectés à travers la peau de l’homme, dont Culex quinquefasciatus est le vecteur majeur. L’objectif de ce travail est d’effectuer des études chimique et biologique de l’extrait de Kotschya africana bequaertii de la famille Fabaceae. Une macération au MeOH/H2O (80: 20) de poudre de la plante, suivie d’un fractionnement sur chromatographie liquide à basse à pression sur colonne de silice de l’extrait à l’acétate d’éthyle conduisent à l’obtention d’un produit pur, déterminé par des méthodes d’analyses structurales comme la spectroscopie infrarouge, la spectrométrie de masse et la résonance magnétique nucléaire. Pour l’étude biologique, un test de toxicité aigüe avec l’extrait brut méthanolique sur des rats de souche wistar, un test d’activité antioxydante de l’extrait en utilisant le radical DPPH, ainsi qu’un test de sensibilité de larves de Culex quinquefasciatus ont été effectués. Le criblage phytochimique de l’extrait brut méthanolique révèle la présence de Stéroïdes, de Flavonoïdes, Leucoanthocyanes, de Polyphénols, Tanins et Polysaccharides. Les résultats de l’analyse structurale démontrent que l’extrait RMF01 est un flavonoïde, de la classe de flavonols nommé 2-(3’,4’dihydroxy)-5,7-dihydroxyphényl-3-(tétrahydro-3,4,5- trihydroxy-2H-pyran-2-yloxy)-4H-chromèn-4-one, ayant comme formule brute C20H18O11 et doté d’une activité antioxydante contre le radical DPPH. L’extrait à l’acétate d’éthyle provoque la mort des larves de Culex quinquefasciatus avec de doses létales DL50=280 mg/L et DL90=1459,62 mg/L. Aucun signe de toxicité aigüe n’est observé chez les rats traités par l’extrait méthanolique pour une dose inférieure à 3 g/Kg. Kotschya africana pourrait être employée comme biolarvicide dans la lutte antivectorielle pour la prévention de la filariose lymphatique. Mots clés : Kotschya africana bequaertii, filariose lymphatique, antioxydant, flavonol, larvicide, Culex quinquefasciatus, toxicité aigüe. ABSTRACT Lymphatic filariasis is a parasitic disease caused by Wuchereria bancrofti. It is transmitted by the bite of infected mosquitoes through human skin, of which Culex quinquefasciatus is the major vector. The aim of this work is to carry out chemical and biological studies of the extract of Kotschya africana bequaertii of the Fabaceae family. Maceration with MeOH/H2O (80:20) of the plant powder, followed by fractionation of the extract with ethyl acetate on a silica column by low-pressure liquid chromatography, leads to a pure product, determined by structural analysis methods such as infrared spectroscopy, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. For the biological study, an acute toxicity test with the methanolic crude extract on rats of wistar strain, a test of antioxidant activity of the extract using the DPPH radical, as well as a sensitivity test of Culex quinquefasciatus larvae was carried out. Phytochemical screening of the methanolic crude extract revealed the presence of Steroids, Flavonoids, Leucoanthocyans, Polyphenols, Tannins and Polysaccharides. The results of the structural analysis show that the extract RMF01 is a flavonoid, of the class of flavonols named 2-(3',4'dihydroxy)-5,7-dihydroxyphenyl-3-(tetrahydro-3,4,5- trihydroxy-2H-pyran-2-yloxy)-4H-chromen-4-one, having as crude formula C20H18O11 and endowed with antioxidant activity against the DPPH radical. The extract with ethyl acetate causes the death of larvae of Culex quinquefasciatus with lethal doses LD50=280 mg/L and LD90=1459.62 mg/L. No signs of acute toxicity were observed in rats treated with methanolic extract at a dose below 3 g/Kg. Kotschya africana could be used as a biolarvicide in vector control for the prevention of lymphatic filariasis. Keywords: Kotschya africana bequaertii, lymphatic filariasis, antioxidant, flavonol, larvicide, Culex quinquefasciatus, acute toxicity.