Instituto Nacional De Pesquisas Da Amazônia Programa De Pós-Graduação Em Botânica Coordenação De Tecnologia E Inovação Laboratório De Bioprospecção E Biotecnologia

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA

TERPENOS DE CULTURAS IN VITRO DE Duroia saccifera (RUBIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIBACTERIANA, ANTIANGIOGÊNICA E ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS

STEFHANIA ALZATE LOZANO

MANAUS, AMAZONAS 2020

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BOTÂNICA COORDENAÇÃO DE TECNOLOGIA E INOVAÇÃO LABORATÓRIO DE BIOPROSPECÇÃO E BIOTECNOLOGIA

TERPENOS DE CULTURAS IN VITRO DE Duroia saccifera (RUBIACEAE) E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIBACTERIANA, ANTIANGIOGÊNICA E ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS

Dissertação apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação ciências biológicas (botânica) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Botânica.

Orientadora: Dra. Cecília Veronica Nunez.

MANAUS, AMAZONAS 2020

Sinopse: Estudo-se a fitoquímica e algumas atividades biológicas de extratos de culturas in vitro de Duroia saccifera, além de descrever diferenças envolvidas nos métodos de propagação in vitro e no tempo da indução da calogênese. Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, cultivo vegetal in vitro, terpenos, iridoide, β-sitosterol, estigmasterol, ácido oleanólico, ácido ursólico, éster metílico de monotropeína, calogênese.

Dedico a mis padres Adiela y Carlos y a mis seis hermanos por el amor y apoyo

incondicional que me han brindado

durante estos años.

“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo

menos outros dez”-Bernard Shaw

RESUMO Duroia saccifera (Mart. Ex Roem. & Schult.) K. Schum. (Rubiaceae) ocorre na floresta Amazônica. Extratos de plantas in natura da espécie têm apresentado atividade antioxidante, antimicrobiana inclusive frente a Mycobacterium tuberculosis mostrando seu potencial medicinal. Com base nisso, esse trabalho teve como objetivo estudar fitoquímica e algumas atividades biológicas de extratos de culturas in vitro de D. saccifera, além de descrever diferenças envolvidas nos métodos de propagação in vitro e no tempo da indução da calogênese, baseando-se no perfil químico dos extratos hexânicos, acetato de etila (AcOEt) e metanólicos (MeOH) de plântulas, calos, e suspensões celulares. Mudas de plântulas de D. saccifera foram utilizadas para a preparação dos extratos de plântulas e como fonte de explantes para iniciar o estabelecimento dos cultivos de calos e suspensões celulares. O material vegetal foi extraído com os solventes orgânicos hexano, AcOEt e MeOH, os extratos AcOEt dos calos e MeOH das plântulas foram fracionados em coluna aberta. Todos os extratos e frações foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC). Os extratos dos calos e as suspensões foram testados em ensaios antimicrobiano e antioxidante, os extratos das suspensões celulares foram testados frente a sua atividade angiogênica. Os extratos de calos e suspensões celulares apresentaram um perfil químico semelhante, sendo os extratos das plântulas notavelmente diferentes, porém, todos os extratos se mostraram ricos em terpenoides com os reveladores testados. A comparação do perfil químico dos extratos das culturas e de explantes com diferentes graus de diferenciação, possibilitou verificar a presença de iridoides somente nas culturas com células diferenciadas. Do extrato AcOEt obteve-se uma mixtura de β-sitosterol e estigmasterol e outra de ácido oleanólico e ursólico, obtidas pela primeira vez em culturas in vitro desta espécie. O fracionamento do extrato MeOH de plântulas resultou no isolamento do iridoide éster metílico de monotropeína, obtido pela primeira vez na espécie. Os extratos AcOEt dos calos e suspensões, e o extrato hexânico dos calos apresentaram atividade bacteriostática. O extrato AcOEt das suspensões celulares apresentou atividade antiangiogênica significativa. Os resultados encontrados neste trabalho demonstram o grande potencial das culturas in vitro de D. saccifera para o suprimento de metabólitos secundários ativos, principalmente terpenoides, e estimulam a continuação do fracionamento do extrato de AcOEt dos calos e MeOH das plântulas, para isolar, identificar e analisar outras possíveis substâncias ativas que podem levar à descoberta de novos medicamentos para o tratamento da tuberculose.

Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, cultivo vegetal in vitro, terpenos, iridoide, β- sitosterol, estigmasterol, ácido oleanólico, ácido ursólico, éster metílico de monotropeína, calogênese.

ABSTRACT

Duroia saccifera (Mart. Ex Roem. & Schult.) K. Schum. (Rubiaceae) occurs in the Amazon rainforest. In natura plant extracts of the species have shown antioxidant, antimicrobial even against Mycobacterium tuberculosis activity, showing their medicinal potential. Based on this, the objective of this work was to study phytochemically and some biological activities of extracts of in vitro D. saccifera cultures, as well as to describe differences involved in in vitro propagation methods and calogenesis induction time, based on the chemical profile of the extracts hexanes, ethyl acetate (EtOAc) and methanolic (MeOH) from seedlings, calli, and cell suspensions. Seedlings of D. saccifera were used to prepare seedling extracts and as a source of explants to initiate the establishment of callus and cell suspension cultures. The plant material was extracted with the organic solvents hexane, EtOAc and MeOH. Callus EtOAc and seedling MeOH extracts were fractionated in open column. All extracts and fractions were analyzed by Comparative Thin Layer Chromatography (TLC). Callus extracts and suspensions were tested in antimicrobial and antioxidant assays; cell suspension extracts were tested for angiogenic activity. Callus extracts and cell suspensions had a similar chemical profile, and the seedling extracts were remarkably different, however, all extracts were rich in terpenoids. The comparison of the chemical profile of the extracts of the cultures and explants with different degrees of differentiation made it possible to verify the presence of iridoids only in cultures with differentiated cells. A mixture of β-sitosterol, stigmasterol and oleanolic and ursolic acid were obtained from the EtOAc extract. Seedling fractionation resulted in the isolation of the iridoid monotropein methyl ester, obtained for the first time in the species. Of the extracts tested, the EtOAc extracts of callus and suspensions and hexanic callus extract showed bacteriostatic activity. EtOAc extract from cell suspensions showed significant antiagiogenic activity. The results found in this work demonstrate the great potential of D. saccifera in vitro cultures for the supply of mainly terpenoid active secondary metabolites and stimulate the continued fractionation of callus EtOAc extract and seedling MeOH to isolate, identify and analyze other possible active substances that may lead to the discovery of new drugs for the treatment of tuberculosis.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, in vitro plant culture, terpenes, iridoid, β-sitosterol, stigmasterol, oleanolic acid, ursolic acid, monotropein methyl ester, calogenesis.

AGRADECIMENTOS

Agradezco a Dios por todas las bendiciones que me ha dado hasta ahora. A mi familia, por toda la fuerza, apoyo, compresión, animo y amor que siempre me brindan; mis padres Adiela y Carlos, mis sobrinos y mis hermanos Pao, Caro, Dianis, Juanchis, Mi chiku y el pequeño Cris a quienes amo con todo mi corazón. A mis amigos que están en Colombia y que me apoyaron desde la distancia, siempre tuvieron palabras de aliento en mis momentos de mayor debilidad. À minha orientadora a Dra. Cecilia Veronica Nunez pelos ensinamentos, apoio e pela confiança. A senhora é uma inspiração para mim, obrigada por tudo. As minhas amigas Ana, Aline, Fabi, Gigi, Lorena e Kalynne pelos momentos compartilhados, ajuda, aventuras, conversas e me ensinar a fazer uma pós-graduação sem morrer na tentativa. Aos colegas e amigos do Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia do INPA, que contribuíram direta ou indiretamente para a realização desse trabalho, em especial a Andrei, David, Marjory, Laísley, Priscila, Vanessa, Jennifer, Weison, Maitê e Nadia, e os meninos do Labb 1, muito obrigada pelo seu acolhimento, amizade, companhia e apoio nesses dois anos, levo todos vocês no meu coração. Ao Programa de Pós-Graduação em Botânica do INPA pela valiosa oportunidade, infraestrutura e amparo, por ser minha segunda casa. À CAPES pela concessão da bolsa e apoio financeiro para o projeto. A todos que de alguma forma ajudaram e/ou estiveram presentes durante todo o período, meu grande obrigado!

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 15 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 16 2.1 Metabólitos secundários 16 2.1.1 Terpenos 18 2.1.2 Iridoides 19 2.2 Cultivo de tecidos vegetais 20 2.2.1 Seleção do material vegetal 22 2.2.2 Esterilização do material vegetal 22 2.2.3 Multiplicação e cultivo 22 2.2.4 Enraizamento e aclimatação para transplante ao solo 23 2.3 Calogênese 24 2.4 Suspensões Celulares 25 2.5 Culturas de células diferenciadas 25 2.6 Familia Rubiaceae 26 2.8 Gênero Duroia 27 2.7 Aspectos químicos da família Rubiaceae 35 2.9 Duroia saccifera 37 2.10 Atividade Antimicrobiana 38 2.10.1 Mycobacterium tuberculosis 39 2.11 Ensaio da Membrana Corioalantoica (CAM) 40 2.12 Atividade antioxidante 41 3. OBJETIVOS 42 3.1. Objetivo Geral 42 3.2. Objetivos específicos 42 4. MATERIAIS E MÉTODOS 43 4.1 Indução da calogênese 43 4.2. Estabelecimento de culturas de células em suspensão 43 4.4 Seleção de explantes foliares ao longo da indução da calogênese 44 4.3 Seleção de plântulas para extração 44

4.5 Preparação dos extratos 45 4.6 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) 46 4.7 Fracionamento do extrato AcOEt em cromatografia em coluna aberta (CCA). 47 4.8 Fracionamento do extrato MeOH das plântulas por cromatografia em coluna aberta (CCA). 50 4.9 Identificação das substâncias isoladas 51 4.10 Ensaios biológicos e químico 51 4.10.2 Ensaio da Atividade antibacteriana por microdiluição em caldo 51 4.10.3 Ensaio da Membrana Corioalantoica (CAM) 52 4.10.4 Avaliação da Atividade Antioxidante 53 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 54 5.1 Indução da calogênese e estabelecimento de culturas de células em suspensão. 54 5.2 Obtenção dos extratos das culturas in vitro de D. saccifera 55 5.3 Obtenção dos extratos dos calos durante a calogênese 56 5.4 Comparação do perfil químico dos extratos das culturas in vitro por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) 57 5.5 Comparação do perfil químico dos extratos de explantes com diferentes graus de diferenciação. 60 5.6 Fracionamento do extrato AcOEt dos calos de D. saccifera 62 5.7 Fracionamento do extrato MeOH das plântulas de D. saccifera 65 5.8 Identificação das substâncias isoladas 67 5.8.1 Identificação da substância I e II (mistura do estigmasterol e β-sitosterol) 67 5.8.2 Identificação da substância III e IV (mistura do ácido ursólico e ácido oleanólico) 70 5.8.3 Identificação da substância V (éster metílico de monotropeína) 74 5.9 Ensaios químico e biológicos 78 5.9.1 Ensaio da Atividade antibacteriana por microdiluição em caldo 78 5.9.2 Ensaio da Membrana Corioalantóica (CAM) 79 5.9.3 Avaliação da atividade antioxidante 82 6. CONCLUSÕES 83 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 84 8. ANEXOS 98

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Reguladores de crescimento das plantas (PGRs), principais efeitos e exemplos de utilização (López-Vázquez 2019) 23 Tabela 2. Substâncias isoladas das espécies do gênero Duroia 29 Tabela 3. Sistemas de eluição utilizados no primeiro fracionamento do extrato AcOEt de D. saccifera. 47 Tabela 4. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento da fração C1. 5-11. 48 Tabela 5. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento da fração 39-41 de C1.5-11. 48 Tabela 6. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento do extrato MeOH das plântulas de D. saccifera. 50 Tabela 7.Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante 54 Tabela 8. Rendimento percentual dos extratos hexanicos, AcoEt e matanólicos obtidos de culturas in vitro de D. saccifera (rendimento a partir da massa seca). 56 Tabela 9. Rendimento percentual dos extratos hexanicos, AcoEt e matanólicos obtidos dos calos de Duroia saccifera durante a calogênese (rendimento a partir da massa seca). 56 Tabela 10. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para β-sitosterol e estigmasterol (300 MHz, CDCl3). 69 Tabela 11. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para ácido ursólico e ácido oleanólico (300 MHz, CDCl3) 73 Tabela 12. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para o ester metílico de monotropeína (300 MHz, DMSO-d) 77 Tabela 13. Porcentagem de inibição dos extratos de Duroia saccifera frente às bactérias testadas 79 Tabela 14. Resultados dos ensaios de atividade antioxidante frente ao DPPH e ao complexo Fe3+/fenantrolina, dos extratos, ± desvio padrão. 82

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Exemplos da diversidade estrutural de metabólitos secundários em plantas 17 Figura 2. Estrutura do isopreno 19 Figura 3. Estrutura geral e sistema de numeração para os iridoides (R = H ou glicose). 19 Figura 4. Possíveis rotas de desenvolvimento para induzir a divisão celular derivada de explantes de plantas tomados de uma planta mãe e cultivados in vitro (Grout 2017). 221 Figura 5. A. Calo de Duroia macrophylla: a). Calo com clorofila, b). Calo friável, c) Calo compacto; B. Calo friável de D. saccifera. 24 Figura 6. Diversidade química e distribuição dos principais metabólitos secundários nas subfamílias de Rubiaceae. ¡Error! Marcador no definido.36 Figura 7. Detalhes morfológicos de D. saccifera (Rubiaceae). ¡Error! Marcador no definido.37 Figura 8. Aparência das plântulas selecionadas para a extração. ¡Error! Marcador no definido.45 Figura 9. Fluxograma geral da preparação dos extratos de D. saccifera. ¡Error! Marcador no definido. Figura 10. Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt dos calos de D. saccifera 49¡Error! Marcador no definido. Figura 11. Fluxograma do fracionamento do extrato MeOH das plântulas de D. saccifera. 51 ¡Error! Marcador no definido. Figura 12. Indução da calogênese de D. saccifera ¡Error! Marcador no definido. 54 Figura 13. Aparência das células em suspensão retiradas para preparação dos extratos. 55 Figura 14. Placas de CCDC dos extratos hexânicos, AcOEt e MeOH de plântulas, calos e suspensões celulares de D. saccifera. 55 ¡Error! Marcador no definido. Figura 15. Placas CCDC dos extratos hexanicos, AcOEt y MeOH dos extratos dos calos durante a calogênese de D. saccifera. 60 ¡Error! Marcador no definido. Figura 16. Placas de CCDC do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. 63 ¡Error! Marcador no definido. Figura 17. Placas de CCDC das frações C1. 5-11 do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. 63 ¡Error! Marcador no definido. Figura 18. Placas de CCDC da substância I e II. 64 ¡Error! Marcador no definido. Figura 19. Placas de CCDC das frações reunidas C2. 39-41 do fracionamento do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. 64 ¡Error! Marcador no definido. Figura 20. Placas de CCDC da substância II e III. 65 ¡Error! Marcador no definido. 13

Figura 21. Placas de CCDC do extrato MeOH obtido das plântulas de D. saccifera. 65 ¡Error! Marcador no definido. Figura 22. Placas de CCDC da reunião das frações 8 a 10 do extrato MeOH obtido das plântulas de D. saccifera. 66 ¡Error! Marcador no definido. Figura 23. Cromatograma de purificação por CLAE da fração 8-10 (H2O/MeOH 80:20). 66 ¡Error! Marcador no definido. 1 Figura 24. Espectro de RMN de H da susbtância I e II (CDCL3, padrão TMS, 300 MHz). 67 ¡Error! Marcador no definido. Figura 25. Expansão do espectro de RMN de 1H da subtância I e II, indicando hidrogênios de um esteróide com esqueleto estigmastano 68 ¡Error! Marcador no definido. Figura 26. Espectro de RMN de 13C da substância I e II (CDCL3, 75 MHz). 68 ¡Error! Marcador no definido. Figura 27. Estrutura química do a: β-sitosterol e b: estigmasterol. 71 1 Figura 28. Espectro de RMN de H da susbtância III e IV (CDCL3, padrão TMS, 300 MHz). 71 Figura 29. Expansão do espectro de RMN de 1H da subtância III e IV 71 13 Figura 30. Espectro de RMN de C da substância III e IV (CDCL3, 75 MHz). 72 Figura 31. Estrutura química do a: ácido ursólico; b: ácido oleanólico 73 Figura 32. Cromatograma da fração 8-10, indicando o tempo de retenção em 2,1 min da substância V e o íon molecular obtido em EM/CL. 75 Figura 33. Espectro de RMN de 1H da susbtância V (DMSO-d6, 300 MHz). 75 Figura 34. Expansão do espectro de RMN de 1H da subtância V 76 ¡Error! Marcador no definido. Figura 35. Estrutura química do ester metílico de monotropeína. 77 Figura 36. Atividade antiangiogênica do extrato AcOEt das suspensões celulares de D. saccifera 80 Figura 37. Atividade antiangiogênica da substância V, ester metílico de monotropeína 81

1. INTRODUÇÃO

As plantas têm sido usadas há séculos como fonte de metabólitos secundários, muitos dos quais ainda são usados na atualidade. Existem registros de aproximadamente 100.000 dessas substâncias identificadas (Fiehn 2002; Kessler 2015), muitas delas utilizadas para a produção de drogas, agroquímicos, aromatizantes, fragrâncias, corantes, biopesticidas e aditivos alimentares (Fumagali 2008; Murthy et al., 2014; França 2017). A produção de metabólitos secundários de interesse comercial tem várias limitações, algumas delas são as baixas concentrações desses metabólitos nas plantas (Wink 2003; Berg e Lubert 2008; Fumagali 2008), há ainda variação na síntese e armazenamento de metabólitos entre espécies, entre as partes das plantas, entre indivíduos e populações. Além disso, a produção está relacionada a fatores bióticos e abióticos, como temperatura, umidade, exposição a raios UV, ataques de patógenos, entre outros (Harborne 1984; Dixon 2001; Wink 2003; Fumagali 2008; Murthy et al., 2014; França 2017). Com a chegada da tecnologia na cultura de células vegetais, culturas in vitro de calos, suspensões e tecidos diferenciados têm sido considerados como uma fonte razoável de metabólitos secundários (Narayani e Srivastava 2017; Gallego et al., 2017). Esta técnica possibilita obter uma produção contínua e maior de tecidos vegetais que vão produzir metabólitos em condições uniformes, como os nutrientes, o pH do meio, a temperatura, hormônios, luz, etc., usando apenas um pequeno espaço físico, o que permite a obtenção de produtos de qualidades semelhantes procurando um rendimento mais elevado (Bhatia et al., 2015; Ochoa-Villarreal et al., 2016; Anjusha e Gangaprasad 2017; Grout 2017). O Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia (LABB) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), tem se dedicado a estabelecer e fortalecer uma linha de pesquisa relacionada ao cultivo de células e tecidos vegetais in vitro, a fim de obter culturas viáveis para a extração dessas substâncias em espécies da Amazônia. Entre as espécies estudadas está Duroia saccifera (Mart. ex Roem. & Schult.) K. Schum., uma espécie pertencente à família Rubiaceae que demonstra ser uma potencial fonte de substâncias ativas. Extratos obtidos de indivíduos in natura têm apresentado atividade antioxidante (Mesquita et al., 2015), atividade antimicrobiana (Reis et

al., 2016; Contreras 2017), e também atividade antimicobacteriana contra Mycobacterium tuberculosis (Carrion 2013; Reis et al., 2016). As pesquisas conduzidas por Souza (2016) e Brilhante (2018) no LABB, desenvolveram com sucesso culturas in vitro de calos e suspensões celulares de D. saccifera. O extrato AcOEt obtido por Brilhante (2018) e o qual faz parte da extratoteca do LABB, mostrou atividade contra Mycobacterium tuberculosis. No entanto, o extrato não havia sido fracionado, além disso, as possíveis diferenças na produção de metabólitos envolvidas nos métodos de propagação, e a ausência de estudos fitoquímicos os quais envolvem o fracionamento e análises de culturas in vitro de tecido diferenciado de D. saccifera, contribuíram para que o objetivo do presente trabalho fosse realizar o estudo fitoquímico e biológico de extratos de culturas in vitro de Duroia saccifera com a finalidade de fazer comparações, isolar e identificar/elucidar as substâncias biologicamente ativas dos extratos AcOEt dos calos e MeOH das plântulas.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Metabólitos secundários A grande diversidade de metabólitos secundários de plantas há muito tempo fascina os pesquisadores, na atualidade se tem registros de aproximadamente 100.000 dessas substâncias identificadas (Kessler 2015). Inicialmente pensou-se que eram subprodutos do metabolismo primário o qual está relacionado com processos vitais como divisão, crescimento, respiração, armazenamento e reprodução, no entanto os metabólitos secundários têm uma infinidade de funções ecológicas relacionada ao sistema de defesa em resposta a diferentes estímulos externos, por exemplo, poluição, seca, exposição a raios UV, competição e ataques de patógenos (Wink 2011; França 2017; Narayani e Srivastava 2017, Jamshidi-Kia et al., 2018), também têm sido relacionados na atração de polinizadores e dispersores de sementes, ou seja, estão envolvidos nas interações da planta com o meio ambiente, interação planta-inseto, planta-microrganismo e planta- planta (Wink 2011; Kessler 2015; Machado et al., 2017). Os metabólitos secundários são sintetizados em baixas concentrações e têm um teor inferior a 1% do carbono total (Fumagali 2008; Berg e Lubert 2008), possuem uma elevada diversidade estrutural (Figura 1), são de baixo peso molecular e a maioria deriva das vias do chiquimato,

mevalonato, além de rotas mistas (Dixon 2001; Wink 2011). Os metabólitos secundários tais como os flavonoides, terpenos, substâncias fenólicas, cumarinas, taninos, saponinas e alcaloides são geralmente classificadas segundo a sua origem biossintética, estes mostram diferentes atividades biológicas e são usados como produtos farmacêuticos, agroquímicos, aromatizantes, fragrâncias, corantes e biopesticidas (Murthy et al., 2014; Narayani e Srivastava 2017; França 2017). Essas características têm atraído um interesse crescente no estudo do metabolismo secundário de plantas e o desenvolvimento de técnicas fitoquímicas para separação, purificação e identificação de tais moléculas (Sasidharan et al., 2011; Narayani e Srivastava 2017; Jamshidi-Kia et al., 2018).

Figura 1. Exemplos da diversidade estrutural de metabólitos secundários em plantas: alcaloides (1), aminoácidos não proteicos (2), aminas (3), glicosídeos cianogênicos (4), glucosinolatos (5), monoterpenos (6), sesquiterpenos (7), diterpenos (8), triterpenos (9), flavonoides (10), poliacetilenos (11), policetídeos (12) (Wink, 2003).

Os metabólitos secundários são muito importantes para a descoberta e o desenvolvimento de novos fármacos, mais de um décimo das espécies vegetais (mais de 50.000 espécies) são utilizadas em produtos farmacêuticos (Jamshidi-Kia et al., 2018). Um exemplo são os alcaloides vincristina e vimblastina extraídos da espécie Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae),

popularmente conhecida como "vinca", que apresentam atividades antitumorais, sendo a vincristina utilizada no tratamento da leucemia infantil e a vimblastina no tratamento do câncer testicular (Priyadarshini e Keerthi 2012). Os seus derivados semissintéticos vinorrelbina e vendesina são usados no tratamento de câncer de pulmão e leucemia, respectivamente (Simões et al., 2017). Outros exemplos são o topotecano, irinotecano, etoposido e taxol utilizados no tratamento do câncer (Shakya 2016). A produção de metabólitos secundários de interesse comercial tem várias limitações, entre elas, as baixas concentrações nas quais são sintetizadas, o padrão sintético, o nível de armazenamento complexo, visto que o armazenamento se modifica de forma específica de tecido e órgão. Ademais, diferenças podem ser observadas entre indivíduos, populações e estágios de desenvolvimento, por exemplo, nos órgãos importantes para sobrevivência e reprodução, os metabólitos secundários são mais potentes e estão em maior concentração (Wink 2011; Saxena et al., 2013).

2.1.1 Terpenos A maior classe de metabólitos secundários produzidos pelas plantas é conhecida como terpenos ou terpenoides, eles formam uma família grande e diversificada de estruturas derivadas de unidades de isopreno (5 carbonos) (Figura 2). Sua biossíntese pode ser dividida em duas rotas principais, a via do ácido mevalônico onde são sintetizados a partir do acetil-CoA e rota do metileritritol fosfato (MEP) na qual são sintetizados a partir dos intermediários glicolíticos 1- desoxi-D-xilulose e metileritritol fosfato (Simões et al., 2017). Os terpenos são precursores biosintéticos para quase todos os organismos; esteroides, como o colesterol e ergosterol presentes nas membranas biológicas, são derivados do esqualeno, um triterpeno (da Cruz Monteiro e Brandelli 2017). De acordo com o número de unidades de isopreno, ou unidades C5 presentes, os terpenos são classificados como hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), sesterterpenos (C25), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). Também existem os monoterpenos irregulares e os iridoides (Cruz e Brandelli 2017, Simões et al. 2017).

Figura 2. Estrutura geral de uma unidade do isopreno

2.1.2 Iridoides Os iridoides são monoterpenos amplamente distribuídos entre muitas espécies de plantas medicinais, são formados por uma ciclização alternativa do difosfato de geranila; o núcleo denominado propriamente iridoide é de origem monoterpenoide e contém um anel ciclopentano que geralmente é fundido a um heterociclo de seis membros contendo um átomo de oxigênio (Bennett e Wallsgrove 1994) (Figura 3). Dentro da grande classe dos iridoides, quatro grupos principais podem ser distinguidos; os iridoides não glicosilados, iridoides glicosilados, iridoides ésteres acetais e os secoiridoides glicosilados.

Figura 3. Estrutura geral e sistema de numeração para os iridoides (R = H ou glicose).

O número e a natureza dos iridoides encontrados no reino vegetal são indicativos da complexidade das vias envolvidas na sua biossíntese, em Quimiossistemática representam um marcador importante em classificação vegetal, filogenia e evolução, têm sido usados como marcadores quimiotaxonômicos para as ordens Cornales, Gentianales, Lamiales e Asterales (Sampaio-Santos e Kaplan 2001). O interesse químico nos iridoides se deve ao papel chave desempenhado pelo iridoide secologanina na biossíntese de alcaloides com importantes atividades biológicas como os indol-

mono-terpenoides e certos alcaloides isoquinolínicos encontrados em Apocynaceae, Loganiaceae e Rubiaceae (Ghisalberti 1998). Além disso, entre a ampla gama de atividades biológicas relatadas para os iridoides estão a neuroprotetora, antioxidante, anticancerígena (antitumoral) e anti- inflamatória, incluindo substâncias que estão sendo estudadas como agentes terapêuticos promissores (Tundis et al., 2008; Wang et al., 2013, Yang et al., 2016; West et al., 2016).

2.2 Cultivo de tecidos vegetais Uma estratégia para obter metabólitos secundários é a coleta de material vegetal diretamente de populações selvagens, o que pode ser problemático quando tanto a quantidade de material quanto a parte da planta usada podem comprometer a viabilidade da população. Além disso, quando as taxas de crescimento são lentas, o potencial de produção da substância requerida é reduzido, o que se traduz em medicamentos caros (Ochoa-Villarreal et al., 2016, Gallego et al., 2017). Outra estratégia é o cultivo das espécies de interesse, porém uma das principais desvantagens são os baixos rendimentos e a flutuação da produção de metabólitos devido ao fato de que indivíduos enfrentam variações bióticas e abióticas, como geografia, secas, exposição a raios UV, estresse, ataques de patógenos, entre outros (Murthy et al., 2014). Com a chegada da tecnologia na cultura de células vegetais, culturas in vitro têm sido consideradas como uma fonte razoável de metabólitos secundários (Narayani e Srivastava 2017; Gallego et al., 2017). Um exemplo é a produção comercial de taxol a partir de culturas de células de Taxus sp., realizada pelas empresas Phyton Biotech, ESCAgenetic, Samyang Genex e Nattermann (Malik et al., 2011). Assim como, a optimização na fabricação de taxol com diversas culturas in vitro de Corylus avellana L. (Gallego et al., 2017). A cultura de tecidos começa a partir da característica de totipotência das células vegetais, cada célula mantém a informação genética completa da planta parental e no meio de cultura adequado é capaz de retomar a divisão celular para produzir novas células, tecidos, órgãos e plantas inteiras sob condições assépticas controladas (Bhatia et al., 2015; Grout 2017). Esta técnica possibilita obter uma produção contínua e maior de tecidos vegetais que vão produzir metabólitos em condições uniformes, como os nutrientes, o pH do meio, a temperatura, hormônios, luz, etc., usando apenas um pequeno espaço físico, o que permite a obtenção de produtos de qualidades

semelhantes procurando um rendimento mais elevado (Murthy et al., 2014; Bhatia et al., 2015; Ochoa-Villarreal et al., 2016; Anjusha e Gangaprasad 2017; Grout 2017). Sob condições de cultivo apropriadas, uma porção de tecido da planta ou explante pode crescer e se dividir dando origem a uma massa de células desdiferenciadas, amplamente vacuoladas que podem ser mantidas em um meio semissólido como calo, ou crescer como uma suspensão de células em um meio líquido (Bhatia et al., 2015, Grout 2017) (Figura 4). Quando os componentes do meio e as condições a que estão expostas as culturas conseguem restringir a organogênese e qualquer potencial embriogênico, o estado de desdiferenciação é mantido e as células em crescimento de muitas espécies podem ser exploradas como fonte de metabólitos secundários de grande importância (Grout 2017; Narayani e Srivastava 2017; Gallego et al., 2017).

Figura 4. Possíveis rotas de desenvolvimento para induzir a divisão celular derivada de explantes de plantas tomados de uma planta mãe e cultivados in vitro (Grout 2017).

Embora o estabelecimento de culturas in vitro possa variar dependendo do objetivo do estudo, ele consiste em quatro etapas as quais serão explicadas a seguir: - Seleção do material vegetal; - Esterilização do material vegetal; - Multiplicação e cultivo; - Enraizamento e aclimatação para transplante de solo.

2.2.1 Seleção do material vegetal Um explante é uma porção extraída da planta, contendo células vivas que podem responder a um meio de cultura pela retomada da divisão e crescimento celular (Grout 2017). Para selecionar o explante são levados em consideração características da planta mãe e do próprio explante, como tamanho, posição na planta, cor, lesões e idade fisiológica (Lameira et al., 2000; Bhatia et al., 2015). O explante pode ser obtido de qualquer parte da planta e a resposta pode variar dependendo da mesma; para indução de calos, os melhores explantes são os tecidos das plântulas a partir de sementes germinadas assepticamente, pois um tecido mais jovem terá melhor resposta ao estabelecimento in vitro (Smith 2013).

2.2.2 Esterilização do material vegetal O explante é muitas vezes a principal fonte de contaminantes, principalmente quando não é obtido de plântulas germinadas in vitro ou de viveiro. Entre as fendas e camadas externas do explante existem diversos microrganismos; para remover os contaminantes da superfície e aumentar o contato do desinfetante se faz uma pre-desinfestação com sabão e água (Smith 2013). Posteriormente devem ser tratados com um ou mais agentes desinfetantes, sendo os desinfetantes mais usados o hipoclorito de sódio (NaOCl), hipoclorito de cálcio (Ca(OCl)2) etanol (70%), dentre outros (Hussain et al., 2012). Os tempos de imersão, a combinação e a concentração dos agentes desinfetantes dependem do tipo de explante e devem causar o mínimo de danos aos tecidos que foram previamente selecionados (Smith 2013).

2.2.3 Multiplicação e cultivo Nesta fase o objetivo é aumentar a biomassa que pode dar origem a novas plantas ou calos até o número desejado por meio de sub-culturas repetidas, onde um papel importante é 22

desempenhado pelos Reguladores de Crescimento de Plantas (PGRs) ou hormônios (Smith 2013) (Tabela 1). O nível de reguladores de crescimento controla a formação de calos no meio de cultura e as concentrações podem variar para cada espécie de planta e podem até depender da fonte do explante, genótipo da planta, idade, estado nutricional, balanço endógeno, etc. (Hussain et al., 2012; Smith 2013). A multiplicação pode ocorrer diretamente com a formação de brotos adventícios ou embriões somáticos ou em forma indireta em forma de calo, dependendo dos PGRs e das condições de cultivo tais como temperatura, tipo de meio, luz, entre outras (Hussain et al., 2012).

Tabela 1. Reguladores de crescimento das plantas (PGRs), principais efeitos e exemplos de utilização (López-Vázquez 2019) Reguladores de Exemplos Efeitos crescimento Auxinas Ácido indol-acético (AIA), Dominância apical, indução de raízes adventícias em Ácido diclorofenoxiacético estacas, indução de nódulos a partir de calos. Em altas (2,4,D), Ácido naftaleno concentrações os calos formam raízes acético (ANA) Citocininas 6-Benzilamiopurina (BAP), Divisão celular, promoção da formação de caule, Zeatina, Cinetina (KIN), crescimento de gemas laterais, na presença de auxinas (em Tidiazurona (TDZ) concentrações aproximadamente iguais) os calos continuam a produzir células meristemáticas. Em altas concentrações formam gemas Giberelinas Ácido giberélico (AG3) Alongamento do caule, promove a indução da germinação em sementes

2.2.4 Enraizamento e aclimatação para transplante ao solo O enraizamento pode ocorrer simultaneamente no meio de cultura utilizado para a multiplicação dos explantes, os meios básicos tradicionais como Murashige e Skoog (MS) e Gamborg B5 são complementados com uma auxina para induzir a formação de raízes (Lameira et al., 2000), no entanto, as vezes é necessário trocar o meio, modificando a composição nutricional e os reguladores de crescimento (Hussain et al., 2012). Para o transplante, as plantas in vitro são gradualmente transferidas do ágar para areia ou solo enriquecido em viveiro, mudando as condições de alta para baixa umidade regulando o ar, e de baixa para alta intensidade de luz (Lameira et al., 2000; Hussain et al., 2012; Smith 2013).

2.3 Calogênese O passo mais importante para iniciar uma cultura é a estimulação do explante, reativando a atividade mitótica (Bhatia et al., 2015). Quando a atividade mitótica começa, o explante pode continuar se dividindo para produzir uma massa relativamente indiferenciada de células chamada de tecido do calo (Grout, 2017). O calo é geralmente o resultado de injúrias, sendo formado pela proliferação de células no final do corte do explante, onde inicialmente é um tecido que contém tanto células diferenciadas como células indiferenciadas, posteriormente com ajuda dos reguladores de crescimento torna-se uma massa amorfa de células parenquimatosas com graus variados de diferenciação (Smith 2013; Bhatia et al., 2015; Grout 2017). O calo é geralmente composto por células grandes, vacuoladas e de paredes finas, no entanto, durante a sua formação varia significativamente em forma, textura e cor. Podem formar massas de células duras e compactas até massas onde as células são soltas, apresentando uma textura macia e friável, sendo esta última a melhor para obter metabólitos (Figura 5) (Bhatia et al., 2015). O calo pode ser branco ou esverdeado, total ou parcialmente verde pelo desenvolvimento de cloroplastos, ou púrpura devido ao acúmulo de antocianinas nos vacúolos. Em alguns casos, pode haver alguma diferenciação dentro do calo evidenciando células do floema e células do xilema lignificadas (Smith 2013; Bhatia et al., 2015).

Figura 5. A. Calo de Duroia macrophylla: a) Calo com clorofila, b) Calo friável, c) Calo compacto (Zanca et al., 2016); B. Calo friável de D. saccifera (Brilhante, 2018).

O nível de PGRs é um fator importante que controla a formação de calos (Smith 2013). O objetivo do estudo irá modular a combinação e as quantidades de reguladores no meio de cultura, pois o padrão de desenvolvimento do calo pode ser mantido ou dar início a processos de organogênese para produzir órgãos ou plantas inteiras, de modo que este tipo de cultura pode ser usado para diferentes estudos como isolamento de protoplastos, seleção celular, embriogênese somática, organogênese e produção de metabólitos secundários (Bhatia et al., 2015). Também é possível preservar os calos indefinidamente, para isso é necessário realizar subculturas sucessivas, onde os calos previamente cultivados são divididos para fornecer novos inóculos para o início do cultivo em um novo meio (Bhatia et al., 2015).

2.4 Suspensões Celulares Uma vez obtidos os calos, eles podem ser transferidos para um meio líquido, tipicamente semelhante na composição na qual o calo foi cultivado, o que denomina suspensão celular; o calo friável é o melhor inóculo para iniciá-la, já que está crescendo em cultivo e tem um alto ritmo de divisão celular (Bhatia et al., 2015). Além disso a agitação é necessária para culturas de suspensão já que serve para dividir os agregados celulares; mantém uma distribuição uniforme de células de vários tamanhos e formas; e proporciona troca gasosa para as células manterem a respiração celular no meio (Szabados et al., 1991; Bhatia et al., 2015). As suspensões de células de plantas podem fornecer sistemas competitivos de produção de metabólitos em comparação com a extração de plantas inteiras (Dicosmo e Misawa, 1995; Malik et al., 2011, Gallego et al., 2017). Onde, as suspensões, oferecem vantagens como: possibilidade de maior rendimento das substâncias bioativas, maior facilidade de produção e de aumento da escala, incremento na absorção de nutrientes, processos mais curtos e contínuos, melhor manipulação da cultura na inoculação ou coleta, regulações constantes nos diferentes estágios de operação, dentre outras (Ahmad et al., 2013; Bhatia et al., 2015).

2.5 Culturas de células diferenciadas Embora a pesquisa até o momento tenha conseguido produzir uma ampla gama de metabólitos secundários valiosos em culturas de calos ou suspensões celulares, a produção de metabólitos secundários é geralmente mais alta em tecidos diferenciados e existem tentativas de 25

cultivar plântulas e raízes para a produção de compostos medicamente importantes (Rao e Ravishankar 2002; Gallego et al., 2017). Em outros casos a cultura com células diferenciadas é necessária pois a produção de alguns metabólitos requer órgãos diferenciados, essa situação geralmente ocorre quando o metabólito de interesse é produzido apenas em tecidos ou glândulas especializadas da planta mãe (Karuppusamy 2009, Bayraktar et al., 2016, Mohiuddin 2019). Assim, é importante que os esforços de pesquisa que envolvem a cultura in vitro levem em conta as possíveis diferenças na produção de metabólitos envolvidas nos métodos de propagação.

2.6 Familia Rubiaceae Rubiaceae é uma das cinco famílias de plantas com a maior riqueza de espécies, cerca de 13.150 espécies, 611 gêneros, 65 tribos e três subfamílias (Bremer e Eriksson 2009; Rydin et al., 2009; Kainulainen et al., 2013; Mouly et al., 2014; Rydin et al., 2017). Tem distribuição cosmopolita, com espécies ocupando muitos tipos de habitat em várias regiões biogeográficas, mas a maioria é encontrada em áreas tropicais ou subtropicais (Souza e Lorenzi 2012). No Brasil existem cerca de 1.400 espécies divididas em 126 gêneros, sendo a segunda família com o maior número de espécies nas florestas amazônicas (Cardoso et al., 2017). As espécies de Rubiaceae têm hábitos que vão desde ervas, subarbustos, arbustos, até árvores e raramente cipós; a variação vegetativa na família é bastante extensa, porém eles podem ser reconhecidos por uma combinação distinta de caracteres como suas folhas simples, opostas, raramente verticilada, margem inteira, quase sempre com estipulas interpeciolares, transformada ocasionalmente em espinhos ou foliosas; as inflorescências são geralmente cimosas ou reduzidas a uma única flor; as flores são vistosas, geralmente bissexuais, actinomórficas e diclamidas; o fruto pode ser uma cápsula, esquizocarpo, drupa ou baga (Burger e Taylor 1993; Gentry 1993; Souza e Lorenzi 2012). A família Rubiaceae é um grupo monofilético, porém nas últimas décadas a classificação dentro da família apresentou diversas reorganizações, principalmente devido à influência de estudos que envolvem evidências moleculares. Embora os autores concordem que atualmente Rubiaceae é dividida em três subfamílias, Cinchonoideae, Ixoroideae e Rubioideae, o número de tribos tem aumentado (Bremer e Eriksson 2009; Rydin et al., 2009; Kainulainen et al., 2013; Mouly

et al., 2014; Rydin et al., 2017). Bremer e Eriksson (2009) baseados em estudos filogenéticos propuseram 44 tribos, porém estudos posteriores descreveram novas tribos atingindo um total de 65 tribos (Rydin et al., 2009; Kainulainen et al., 2013; Mouly et al., 2014; Rydin et al., 2017).

2.8 Gênero Duroia O gênero Duroia pertence à subfamília Ixoroideae, possui 38 espécies das quais 24 ocorrem no Brasil (Taylor et al., 2007; Flora Do Brasil 2020). Apresentam flores pistiladas e frutos solitários como características exclusivas do gênero; geralmente são árvores, arvoretas ou arbustos, os ramos são quadrangulares ou cilíndricos, frequentemente fistulosos, glabrosos ou pubescentes, as estípulas são cônicas, caducas, seríceos ou pubescentes; as folhas são opostas decussadas ou verticiladas, sésseis ou pecioladas, às vezes dotadas de protuberâncias basais cuja presença está associada a formigas. As inflorescências estaminadas são terminais, cimeiras, fasciculadas ou capitadas, frutos bacáceos, bem desenvolvidos, ovóides ou oblongos, coriáceas ou lenhosos, geralmente marrons, as sementes são numerosas, comprimidas ou suborbiculares, envoltas em uma polpa gelatinosa (Taylor et al., 2007). Em estudos fitoquímicos de espécies de Duroia foram encontrados diversos metabólitos secundários de diferentes classes químicas, por exemplo, Duroia hirsuta (Poepp.) K.Schum., que ocorre em florestas tropicais do Brasil, Colômbia e Equador, as vezes é encontrado formando um grupo de aproximadamente 20 indivíduos, onde nenhuma outra espécie de planta cresce em torno dela, por isso foi denominada de "Jardim do Diabo". Em estudos fitoquímicos com extratos da espécie se lograram isolar das raízes um iridoide tetracíclico (Page et al., 1994), uma flavona, iridoide lactona e um flavonol (Aquino et al., 1999). Existem registros que Duroia hirsuta também é utilizada como cicatrizante e mostrou atividade contra Streptococcus faecalis, Mycobacterium phlei, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus (Lopez et al., 2001). Além disso, reporta-se atividade antiviral a partir dos extratos das folhas contra o vírus simples de Herpes tipo I e II, que são importantes patógenos em humanos (Lopez et al., 2001; Khan et al., 2005). O Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia (LABB) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) vem desenvolvendo pesquisas fitoquímicas com espécies do gênero Duroia, sendo algumas destas D. longiflora Ducke, D. macrophylla Huber e D. saccifera.

Duroia longiflora ocorre nas Guianas e Amazônia central; o fracionamento da fase diclorometano do extrato metanólico das folhas de um indivíduo adulto permitiu o isolamento do biflavonoide 2α,3α-epoxy-5,7,3′,4′-tetrahydroxyflavan-(4β→8)-epicatechin, relatado pela primeira vez no gênero (Cruz et al., 2019). A espécie arbórea, D. macrophylla, popularmente conhecida como "purui-grande", que ocorre nas Guianas e no Brasil, têm sido investigada como fonte de importantes substâncias bioativas, como por exemplo, o alcaloide indólico raunitidina (Nunez et al., 2009). Martins e colaboradores (2013) analisaram a ação dos extratos de D. macrophylla contra M. tuberculosis e encontraram atividade biológica quando foram realizados ensaios com os extratos diclorometano (DCM) das folhas. Nesse estudo, também foram isolados os triterpenos ácido oleanólico e ursólico, os quais foram reportados pela primeira vez no gênero Duroia. Martins e colaboradores (2014) encontraram, também diferenças significativas nas composições químicas dos extratos analisados de D. macrophylla, atribuídas ao período de coleta, a parte da planta e ao solvente utilizado. Terpenos foram relatados principalmente nos extratos DCM, alcaloides nos extratos DCM e metanólicos (MeOH), substâncias fenólicas e flavonoides em extratos MeOH. Além disso, atividade bactericida, também foi relatada sobre as bactérias Klebsiella pneumoniae, Flavobacterium corumnare, Salmonella enteridis e Pseudomonas aeroginosa e toxicidade contra Artemia salina (Martins 2014). Os resultados mais importantes encontrados até o momento com D. macrophylla são um alcaloide indólico com estrutura inédita, que apresentou potencial citotóxico em linhagens de células tumorais, também oito alcaloides com atividade antituberculose, os quais geraram duas patentes (Nunez e Vasconcelos 2012; Nunez et al., 2014). Os estudos mais recentes em D. macrophylla descreveram a produção de metabólitos levando em conta a variação sazonal (Zanca 2015), indução de calos das folhas por meio da técnica de cultivo de tecidos vegetais, nos quais os terpenos foram encontrados (Zanca et al., 2016), avaliação de elicitores em culturas in vitro onde iridoides foram relatados (Lopez-Vasquez 2019) e obtenção do iridoide ester metílico de monotropeína, relatado pela primeira vez no gênero e obtido em culturas in vitro de raízes em suspensão (Zanca 2020).

Algumas substâncias que já foram isoladas até o momento do gênero Duroia se encontram nas classes químicas dos alcaloides, flavonoides, iridoides, triterpenos e esteroides, suas estruturas químicas se apresentam na tabela 2.

Tabela 2. Substâncias isoladas das espécies do gênero Duroia (Lopez-Vasquez 2019). Espécie Substância Classe química Flavonoide

Duroia hirsuta Aquino et al., (1999)

OCH3 OH

H3CO O OR1

OR O

(1)3,7,3′,5′-tetramethoxy-4′hydroxyflavone (2)3,7,3′-trimethoxy-4′,5′-dihydroxyflavone (3)7,3′,5′-trimethoxy-3,4′-dihydroxyflavone

Page et al., (1994) Iridoide

OR O O OH HO OH

O O H O O

(4) Duroina

O O

O O H O O

(5) Plumericina

Nunez et al. (2009) Alcaloide Duroia macrophylla indólico

O H N N H H H H O O

(6) Raunitidina

Alcaloide indólico Nunez e Vasconcellos (2012)

OCH3

OCH N NH 3 N H H H H H N

O O (7) Alcaloide indólico (sem nome)

Martins (2014) Alcaloides

H3CO indólicos

N N H H H

H O O

O (8) 10-metoxi-ajmalicina

H3CO N N H H H

H O O

O (9) 11-metoxi-ajmalicina

(10) 11-metoxi-3-isoajmalicina

OCH3

N N H H H

H O O

(11) 9-metoxi-3-isoajmalicina

OCH3

N N H H H

H O O

O (12) 9-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina

H3CO

N N H H H

H O O

O (13) 10-metoxi-19-epi-3-isoajmalicina

H3CO

N N H H H

H O O

O (14)10-metoxi-3-isorauniticina

H3CO

N N H H H

H O O

O (15) 10-metoxi-rauniticina 32

OH OCH3 HO Chalcona

O (16) 4,4’-dihidroxi-3’-metoxi-chalcona Triterpenos

OH H O H HO H (17) Ácido ursólico

OH H O H HO H

(18) Ácido oleanólico Fenilpropanoide

HO O

OCH3 OH

(19) Ácido m-metoxi-p-hidroxi-benzoico

Tanata 2017 Esteroide

H H HO

(20) Sitosterol

Zanca (2020) Iridoide CH3 O O H H H

H O H HO H OH OH H H O H H H

HO H O H H H OH (24) Ester metílico de monotropeínaOH Duroia longiflora Cruz et al., (2019) Flavonoide OH

HO O OH O OH HO O OH HO OH OH

(21) 2α,3α-epoxy-5,7,3’,4’- tetrahydroxyflavan-(4β-8)- epicatequina

Duroia saccifera Contreras (2017) Flavonoide

OCH3

H3CO O

OCH3 OH O (22) 5-hidroxi-3,4’,7- trimetoxiflavona Andrade e Nunez (2018) Flavonoide (22) 5-hidroxi-3,4’,7- trimetoxiflavona (20) Sitosterol Esteroide Triterpeno

H HO H (23) Lupeol

2.7 Aspectos químicos da família Rubiaceae Em relação à distribuição dos principais metabólitos secundários em Rubiaceae, os alcaloides indólicos são indicados como os principais marcadores químicos dessa família (Young et al., 1998, Olea 1997); iridoides, antraquinonas, glicosídeos triterpênicos, flavonoides, lignoides, terpenos e derivados fenólicos também foram registrados (Schripsema et al., 2004). Na figura 6 observa-se as três subfamílias, as quais apresentan um perfil diferente e típico, na subfamília Ixoroideae, os iridoides são encontrados como marcadores quimiotaxonômicos, já

em Cinchonoideae os alcaloides indólicos predominam sobre outras substâncias e em Rubioideae as antraquinonas são a principal classe de metabólitos secundários (Martins e Nunez 2015).

Figura 6. Diversidade química e distribuição dos principais metabólitos secundários nas subfamílias de Rubiaceae. IXO: Ixoroideae, CIN: Cinchonoideae, RUB: Rubioideae (Martins e Nunez, 2015).

Levando em conta que um único grupo de metabólitos secundários domina dentro de um determinado táxon (Wink 2003), a descrição dessas substâncias fornece informações importantes para a quimiotaxonomia dessa família. Em revisão bibiográfica feita por Martins e Nunez (2015) sobre estudos fitoquímicos de espécies de Rubiaceaes publicados entre os anos de 1990 e 2014, foi possível observar que o número de produtos descritos, a diversidade estrutural e as atividades farmacológicas relatadas para as espécies, revelam que esta família é uma fonte promissora de novas substâncias bioativas, que podem levar a novos produtos, como moléculas ativas ou mesmo protótipos de drogas.

2.9 Duroia saccifera Duroia saccifera ocorre no Brasil, Colômbia, Venezuela e Peru, no Brasil ocorre nos estados do Acre, Amazonas, Pará e Rondônia, tanto em florestas de igapó, quanto no continente ou várzea (Taylor et al., 2007). É popularmente conhecida como “cabeça-de-urubu”, “puruí-da-mata” ou “puruí-grande” (Cavalcante 1974). D. saccifera é uma espécie arbórea e não atinge grandes alturas (5-10 m), o tronco é circular, com base reta ou acanalada, ritidoma marrom, estriado e escamoso, as folhas são sésseis e evidentemente pubescentes, com um par de domáceas sacciformes na base das folhas, e são geralmente habitadas por formigas do gênero Asteca (Ribeiro et al., 1999; Taylor et al., 2007); as inflorescências estaminadas são cimosas ou umbeladas, as flores estaminadas são pediceladas e com cálice hirsuto, as flores pistiladas são solitárias, sésseis com cálice pubescente e denteado, o fruto é uma baga subglobosa ou elipsoide, levemente costada e hirsuta (Figura 7) (Taylor et al., 2007).

Figura 7. Detalhes morfológicos de D. saccifera (Rubiaceae). Adaptado de Ribeiro et al., (1999).

Mesquita e colaboradores (2015) determinaram a atividade antioxidante do extrato MeOH das folhas de D. saccifera e identificaram a presença de triterpenoides, enquanto, Reis et al. (2016) avaliaram a atividade antimicrobiana e antiparasitária do extrato de D. saccifera e verificaram que

os extratos DCM dos ramos e folhas apresentaram atividade contra Candida albicans e o extrato metanolico e o extrato aquoso mostraram atividade contra C. glabrata. Além disso, relataram atividade de extratos DCM de folhas e ramos contra cepas de M. tuberculosis (Reis et al., 2016). Contreras (2017) realizou um estudo fitoquímico do extrato hexânico das folhas de D. saccifera e verificou que este apresentou atividade antibacteriana contra Salmonella enterica, Propioniubacterium acnes e Enterobacter cloacae, o fracionamento do extrato permitiu observar evidências de alcaloides, bem como a identificação do flavonoide 5-hidroxi-3,7,4' trimetoxiflavona, sendo o primeiro relato desta substância dentro do gênero Duroia. Em trabalhos desenvolvidos no campo da cultura de tecidos no LABB por Souza (2016), foi possível estabelecer mudas in vitro de plântulas de D. saccifera a partir da germinação de sementes, também estabeleceu um protocolo de indução de calos a partir das folhas de plântulas germinadas, com boa eficiência para a formação de calos friáveis, a partir dos calos foi realizado um estudo fitoquímico, do qual foi obtido um extrato hexânico que indicou a presença de terpenos e esteroides com algumas atividades biológicas significativas, dentre essas atividades com relação antiofídica, especificamente na inibição da fosfolipase A2 do veneno de Bothrops atrox. Brilhante (2018) multiplicou novamente os calos obtidos por Souza (2016) e avaliou o potencial de crescimento das células em suspensão, também realizou o estudo fitoquímico dos extratos hexânico e MeOH dos calos e verificou a presença de substâncias aromáticas, terpenoides e esteroides; a partir dos ensaios biológicos realizados se destacam os resultados do extrato de acetato de etila (AcOEt) o qual apresentou uma boa atividade frente a M. tuberculosis (cepa H37Rv), com uma concentração mínima inibitória (CIM) ≤ 25 g mL−1 (sendo a CIM do controle positivo, isoniazida, de 0,03 μg mL− 1) uma concentração inibitória para 90% da população

−1 −1 bacteriana (IC90) de 19,5 g mL e concentração bactericida mínima (CMB) de 200 g mL . No entanto até o momento o extrato AcOEt ainda não havia sido fracionado.

2.10 Atividade Antimicrobiana A busca por novos agentes antimicrobianos se torna uma linha de pesquisa cada vez mais importante devido ao surgimento de novas cepas microbianas multirresistentes aos antibióticos atualmente utilizados, afetando a capacidade de tratar doenças infecciosas comuns, além de novas infecções que terminam em alta mortalidade (Nascimento 2000; OMS 2017). Estima-se que se a 38

resistência a fármacos continuar em sua trajetória atual, 10 milhões de mortes no mundo são previstas até 2050 (Luepke et al., 2017). A diversidade estrutural de metabólitos secundários em plantas os torna uma fonte promissora de novos agentes antimicrobianos (Silva et al., 2007; Silva et al., 2008; Coutinho et al., 2008; Pereira et al., 2019). Portanto, a busca por novos metabólitos sintetizados por plantas com atividade antibacteriana constitui um campo aberto, amplo e contínuo de pesquisa. 2.10.1 Mycobacterium tuberculosis

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa contagiosa causada por uma bactéria em forma de bacilo pertencente ao gênero Mycobacterium, descoberta por Robert Koch em 1882 e denominada M. tuberculosis (Smith 2003). O complexo M. tuberculosis constitui um grupo notavelmente homogêneo geneticamente, é caracterizado por uma similaridade de 99,9% no nível de nucleotídeos e sequências idênticas de rRNA, mas diferem amplamente em termos de tropismos, fenótipos e patogenicidade no hospedeiro (Velayati e Farnia, 2016). O complexo inclui M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis, M. microti, M. canettii, M. caprae, M. pinnipedii, M. suricattae. M. mungi, M. dassie e M. oryx, destas espécies o M. tuberculosis é o membro mais conhecido por ser um patógeno do sistema respiratório de mamíferos, que infecta mais de um terço da população humana mundial e também pode infectar animais que têm contato com humanos (Velayati e Farnia 2016; Organização Mundial da Saúde - OMS 2017). Segundo a Organização Mundial da Saúde (2017), a TB é uma das 10 principais causas de mortalidade no mundo e mais de 95% das mortes por essa doença ocorrem em países de baixa e média renda; em 2016, cerca de 87% dos novos casos de TB foram registrados nos 30 países considerados de alta carga de morbidade por essa doença, entre estes o Brasil. A tuberculose é uma das principais causas de morte em pessoas com Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), pois são 20 e 30 vezes mais propensos a desenvolver TB ativa do que pessoas saudáveis. Em 2016, 40% das mortes associados ao HIV foram devido à tuberculose, nesse mesmo ano, 10,4 milhões de pessoas adoeceram com tuberculose e 1,7 milhões morreram desta doença (entre elas, 0,4 milhões de pessoas com HIV) (OMS 2017, Esmail et al., 2018). Os dois fármacos antituberculose mais eficazes e de primera linha, são isoniazida e rifampicina, a rifampicina é considerada a droga mais eficaz, no entanto em 2016 foram registrados 39

600.000 novos casos resistentes à rifampicina, dos quais 490.000 tinham tuberculose multirresistente (OMS 2017). A forma de tuberculose multirresistente pode ser tratada e curada com medicamentos de segunda linha, no entanto, as opções de tratamento de segunda linha são limitadas e requerem quimioterapia de longo prazo, com medicamentos caros e tóxicos (OMS, 2017). Além disso, nenhum novo antimicrobiano específico para TB foi introduzido nos últimos 40 anos, o que reforça a necessidade de desenvolver novos fármacos que sejam mais eficazes contra cepas resistentes, reduzindo o tempo de tratamento e que possam atuar contra o bacilo no estado de latência (O'brien e Nunn 2001; Rossetti et al., 2002; Tessema et al., 2017) Portanto, existe a necessidade de realizar estudos para a descoberta de novas opções terapêuticas, essas opções podem contemplar os produtos de origem vegetal, já que devido à sua alta diversidade química, poderiam ser a chave na busca de produtos biologicamente ativos que atuem mais efetivamente para o controle e tratamento da tuberculose.

2.11 Ensaio da Membrana Corioalantoica (CAM) A angiogênese é a formação de novos vasos sangüíneos a partir das células endoteliais de veias preexistentes, artérias e capilares; desempenha um papel significativo nas doenças isquêmicas e nas metástases de muitos tumores cancerosos representando uma das principais áreas de pesquisa do câncer nos últimos anos (Rajabi e Mousa 2017; Stryker et al., 2019; Othman 2019). A angiogênese é regulada por vários fatores, como fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator básico de crescimento de fibroblastos (FCFb), fator de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina-8 (IL-8) (Akhtar et al., 2018) As células endoteliais respondem a biomoléculas pró-angiogênicas e expandem a estrutura vascular existente para arraigar o tumor, de modo que as células tumorais possam entrar facilmente na corrente sanguínea e metastatizar. Portanto, os ensaios de angiogênese têm sido concebidos, com o objetivo primário de determinar quais biomoléculas operam de forma mais eficaz e eficiente na alteração dos processos e fatores de angiogênese em seres humanos (Stryker et al., 2019). O ensaio da Membrana Corioalantóica (CAM) é um dos ensaios mais antigos e amplamente utilizados para o estudo da angiogênese in vivo, explora o fato de que as membranas corioalantóicas estão presentes nos ovos fertilizados de todas as espécies aviárias e contêm um grande número de vasos sanguíneos (Goodwin 2007), além disso, tem vantagens como o baixo custo dos ovos de

galinha, a reprodutibilidade do método, adequado para triagem em larga escala, e a visualização de nova vascularização ser feita sob um microscópio (Stryker et al., 2019).

2.12 Atividade antioxidante A oxidação é definida como a perda de um ou mais elétrons para outra substância e o procedimento inverso pode ser considerado como redução (Larson 1997). A transferência de elétrons é um dos principais processos químicos na sobrevivência das células (Alves et al., 2010). Os radicais livres atuam como mediadores para a transferência de elétrons em várias reações bioquímicas, desempenhando funções relevantes no metabolismo (Phaniendra et al., 2015). Os radicais livres estão envolvidos na produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de importantes substâncias biológicas. No entanto, o excesso tem efeitos deletérios, como danos ao DNA, proteínas e organelas celulares, mitocôndrias e membranas, causando alterações na estrutura e funções celulares (Alves et al., 2010; Phaniendra et al., 2015). Consequentemente eles estão envolvidos em várias patologias, por exemplo, câncer, envelhecimento precoce, doenças cardiovasculares, doenças degenerativas e neurológicas, choque hemorrágico, catarata, disfunções cognitivas, etc. (Phaniendra et al., 2015; Poprac et al., 2017) Para combater os radicais livres e seus efeitos adversos, os organismos vivos produzem substâncias com a capacidade de regenerar ou prevenir danos oxidativos, desempenhando um papel como antioxidante. Além disso, outras substâncias capazes de sequestrar radicais livres podem ser obtidas de fontes externas, como alimentos, bebidas e em formas sintéticas (Kuskosk et al., 2005; Alves et al., 2010). Os antioxidantes sintéticos foram restringidos devido ao seu potencial carcinogênico, assim como outros efeitos prejudiciais, o que aumentou o interesse em encontrar antioxidantes naturais para uso em produtos alimentícios ou para uso farmacêutico (Yildirim et al., 2001; Zheng e Wang 2001; Melo e Guerra 2002; Simão 1985). A procura de substâncias antioxidantes é, sem dúvida, uma prática constante, o que justifica o interesse atual na investigação de novas substâncias com essa capacidade (Silva et al., 1999; Kuskosk et al., 2005).

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral Estudar fitoquímica e biologicamente os extratos de culturas in vitro de Duroia saccifera.

3.2. Objetivos específicos

- Estabelecer os cultivos de calos e suspensões celulares para obtenção de extratos. - Comparar o perfil químico dos extratos de plântulas, calos, e suspensões celulares de Duroia saccifera; - Comparar o perfil químico de extratos de explantes foliares de D. saccifera ao longo da indução da calogênese; - Isolar e identificar/elucidar as substâncias químicas presentes no extrato AcOEt dos calos e MeOH das plântulas germinadas in vitro de D. saccifera; - Avaliar os extratos quanto às atividades antimicrobiana angiogênica e antioxidante.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

Neste trabalho foram utilizadas mudas de plântulas de D. saccifera previamente estabelecidas por germinação in vitro, as plântulas foram mantidas na sala de crescimento do LABB do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) até o momento da utilização; neste trabalho foram repicadas para multiplicar e manter o material, posteriormente mantidas sob temperatura constante de 26 ± 2 °C, e fotoperíodo de 16:8 h (luz branca/escuro), com intensidade de 40 a 50 μmol/m2.s.

4.1 Indução da calogênese A fim de obter calos e iniciar o estabelecimento de células em suspensão para obter massa para fazer os extratos e comparar o perfil químico de calos e suspensões celulares, uma nova indução da calogênese foi realizada seguindo a mesma metodologia de Souza (2016) e Brilhante (2018). As folhas jovens das plântulas in vitro foram utilizadas como explantes para induzir a calogênese. Foram inoculados 200 tubos de ensaio com explantes no meio de cultura contendo o meio MS com 100% de nutrientes, adicionando 30 g/L de sacarose, 7 g/L de ágar gelificante e na presença de reguladores de crescimento ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D) e cinetina (KIN), nas concentrações 4 e 2 mg/L, respectivamente (Souza, 2016; Brilhante, 2018). Os calos foram mantidos na sala de crescimento do LABB sob condições controladas, temperatura constante de 26 ± 2 °C, e fotoperíodo de 16:8 h (luz branca/escuro), com intensidade de 40 a 50 μmol/m2.s. Uma vez os calos estiveram completamente formados, foram transferidos dos tubos de ensaio para frascos maiores a fim de aumentar a massa dos calos, contendo o mesmo meio de cultura utilizado para a indução. Foram conservados na sala de cultura do LABB e submetidos a cinco sub-cultivos, um a cada 30 dias. Os calos friáveis induzidos também serviram como material inicial para o estabelecimento das suspensões celulares.

4.2. Estabelecimento de culturas de células em suspensão Para o estabelecimento das suspensões, 1 g de calos friáveis foram transferidos para erlenmeyers com tampa, contendo 100 mL do meio MS com 100% de nutrientes, adicionando 30 g/L de sacarose, na presença de reguladores de crescimento ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4D) 43

e cinetina (KIN), nas concentrações 4 e 2 mg/L, respectivamente (Brilhante 2018). As suspensões foram cultivadas sob agitação contínua em incubadora com agitador orbital (TE-420 - Tecnal) a 120 rpm, sob condições controladas, temperatura constante de 26 ± 2 °C, e fotoperíodo de 16:8 h (luz branca/escuro), com intensidade de 40 a 50 μmol/m2.s e submetidas a dois sub-cultivos. Tanto a massa fresca quanto a seca foram registradas em uma balança analítica (Shimadzu Ay220).

4.4 Seleção de explantes foliares ao longo da indução da calogênese Os calos de D. saccifera demoram entre 30 e 60 dias para serem totalmente formados e o grau de diferenciação variou nesse tempo (Brilhante 2018). Para comparar o perfil químico dos extratos de explantes com diferentes graus de diferenciação, ao longo da indução da calogênese, foram utilizados 180 explantes foliares de plântulas in vitro; 20 foram utilizadas para servir como tempo zero, e 160 foram inoculadas no mesmo dia em tubos de ensaio contendo o meio de cultura para indução da formação do calo (descrito anteriormente na seção 4.1), a cada 8 dias foram retirados, pesados, e conservados no freezer 20 explantes do meio que possuíam a mesma porcentagem de formação até que o calo estivesse completamente formado, completando assim 8 tempos de diferenciação em 64 dias de cultivo.

4.3 Seleção de plântulas para extração Para realizar a comparação do perfil químico dos extratos de tecidos diferenciados foram feitos repiques das plântulas presentes no LABB, as quais estavam no meio de cultura contendo meio MS com 100% de nutrientes, 30 g/L de sacarose e 7 g/L de ágar gelificante e mantidas sob temperatura constante de 26 ± 2 °C, e fotoperíodo de 16:8 h (luz branca/escuro), com intensidade de 40 a 50 μmol/m2.s. As plântulas foram divididas em 3 deixando cada parte com mais de 3 nódulos. Os repiques foram inoculados no meio e nas condições mencionadas anteriormente, após a parte aérea estar totalmente desenvolvida foram selecionadas 30 plântulas para a extração (Figura 8).

Figura 8. Aparência das plântulas selecionadas para a extração.

4.5 Preparação dos extratos Após o período de crescimento, os calos, células em suspensão, plântulas e explantes foliares foram retirados do meio de cultura e pesados para determinação da massa fresca, as células em suspensão foram filtradas. Após isso, o material foi congelado na temperatura de -20 °C. Posteriormente, este material foi liofilizado por aproximadamente 72 horas para retirada completa da água, resultando na massa seca total para cada material vegetal. O material obtido após a secagem foi pulverizado utilizando almofariz e pistilo. Após a pulverização, cada material foi extraído com hexano em banho de ultrassom (Unique, modelo Ultra Cleaner, Brasil) por 20 min. Após a extração, o material foi filtrado e o resíduo vegetal re-extraído com hexano, repetindo o procedimento por mais 5 vezes. O material vegetal foi seco e extraído com AcOEt pelo mesmo procedimento e finalmente com MeOH. Após as cinco extrações com cada solvente, os extratos foram concentrados em rotaevaporador (Fisatom, modelo 550, Brasil) a 100 rpm a temperatura de < 50 °C. Obtendo dessa forma os extratos hexânicos, AcOEt e MeOH dos calos, das células em suspensão, das plântulas e explantes foliares (Figura 9).

Figura 9. Fluxograma geral da preparação dos extratos de D. saccifera.

4.6 Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) Todos os extratos e frações foram analisados por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) utilizando cromatoplacas comparativas de sílica gel 60 com indicador de fluorescência UV254 nm. A eluição das placas foi realizada com diferentes sistemas de solventes orgânicos em proporções diferentes. Para a revelação das substâncias foram utilizados os reveladores químicos: anisaldeído sulfúrico, sulfato cérico (Ce(SO4)2), cloreto férrico (FeCl3), 2- aminoetil difenilborinato/polietilenoglicol (NP/PEG) e reagente de Dragendorff, e como revelador físico luz ultravioleta nos comprimentos de onda 254 nm e 365 nm.

Para realizar a comparação do perfil químico dos extratos por CCDC, as cromatoplacas foram eluídas no mesmo sistema de eluição e reveladas com anisaldeído sulfúrico. Para comparar qualitativamente a concentração de substâncias em cada extrato, as amostras foram padronizadas em uma concentração de 15 mg/mL e aplicados 2 L de cada amostra usando capilares graduados.

4.7 Fracionamento do extrato AcOEt em cromatografia em coluna aberta (CCA). O extrato AcOEt dos calos fracionado nesta pesquisa foi obtido da extratoteca do Laboratório de Bioprospecção e Biotecnologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – LABB-INPA, material resultante da Dissertação de Mestrado desenvolvida por Brilhante (2018) e o qual apresentou uma boa atividade frente a M. tuberculosis.

Para o fracionamento foi utilizado 1,7 g do extrato AcOEt. Uma pastilha com sílica foi aplicada em uma coluna aberta (h x Ø = 33,5 x 2,9 cm) empacotada com 86,8 g de sílica gel, eluída com gradientes DCM/ MeOH (Tabela 3). O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de 400 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas variou de 15 a 50 mL.

Tabela 3. Sistemas de eluição utilizados no primeiro fracionamento do extrato AcOEt de D. saccifera. Sistemas de eluição Frações coletadas DCM/MeOH 95:5 0-24 DCM/MeOH 93:7 25-38 DCM/MeOH 9:1 39-57 DCM/MeOH 85:15 58-68 DCM/MeOH 8:2 69-82 DCM/MeOH 7:3 83-86 DCM/MeOH 6:4 87-90 DCM/MeOH 1:1 91-93 MeOH 100% 94-98

Foram obtidas 98 frações que foram analisadas novamente por CCDC, aquelas que apresentavam perfis cromatográficos semelhantes foram reunidas e novamente analisadas em CCDC para a escolha do método cromatográfico de refracionamento, da fase estacionária e dos eluentes mais eficientes na separação, no total foram reunidas em 6 frações (5-11, 12-18, 19-30, 31-47, 48-78, 79-98), essas frações receberam as iniciais C1, fazendo referência ao fracionamento na coluna 1 do extrato bruto.

A fração C1.5-11 do extrato AcOEt dos calos com 126 mg foi fracionada em coluna aberta de sílica gel (h x Ø: 25 cm x 1,6 cm) empacotada com 12,6 g de sílica, foi eluída com gradientes de DCM/Acetona e finalizada com MeOH 100% frações (Tabela 4). O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de 50 mL, obtendo um total de 57 frações.

Tabela 4. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento da fração C1. 5-11. Sistemas de eluição Frações coletadas DCM/Acetona 98:2 0-31 DCM/Acetona 95:5 32-37 DCM/Acetona 9:1 38-41 DCM/Acetona 85:15 42-45 DCM/Acetona 8:2 46-49 DCM/Acetona 7:3 50-53 DCM/Acetona 1:1 54-55 MeOH 100% 56-57 As 57 frações obtidas foram analisadas novamente por CCDC, aquelas que apresentavam perfis cromatográficos semelhantes foram reunidas. A fração 7-9 (7 mg) de C1.5-11 foi analisada por RMN de 1H, 13C e bidimensionais (COSY, HSQC e HMBC) e denominada substância I e II. A fração 39-41 (50 mg) de C1.5-11 foi refracionada em coluna aberta (h x Ø: 25 cm x 1 cm) de sílica (10 g), com gradiente de DCM/Acetona até Acetona 100% frações (Tabela 5). O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de 50 mL, obtendo um total de 24.

Tabela 5. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento da fração 39-41 de C1.5-11. Sistemas de eluição Frações coletadas DCM/Acetona 98:2 0-7 DCM/Acetona 95:5 8-14 DCM/Acetona 9:1 15-22 Acetona 100% 23-24 A fração 17-18 (7 mg) foi analisada por RMN de 1H, 13C e bidimensionais e denominada substância III e IV.

O resumo detalhado do fraccionamento do extrato AcOEt dos calos está mostrado no fluxograma da figura 10.

Figura 10. Fluxograma do fracionamento do extrato AcOEt dos calos de D. saccifera 49

4.8 Fracionamento do extrato MeOH das plântulas por cromatografia em coluna aberta (CCA). Para o fracionamento extrato MeOH das plântulas foi utilizado 98 mg do extrato, uma pastilha com sílica foi aplicada em uma coluna aberta (h x Ø = 24 x 1 cm) empacotada com 9,8 g de sílica gel, eluída com gradientes DCM/MeOH (Tabela 8). O volume de cada sistema de eluição adicionado à coluna cromatográfica foi de 50 mL, enquanto que o volume das frações recolhidas variou de 5 a 10 mL.

Tabela 6. Sistemas de eluição utilizados no fracionamento do extrato MeOH das plântulas de D. saccifera. Sistemas de eluição Frações coletadas DCM/MeOH 8:2 0-10 DCM/MeOH 7:3 11-16 DCM/MeOH 1:1 17-20 MeOH 100% 21-23

Foram obtidas 23 frações que foram analisadas novamente por CCDC, as frações 8-10 foram observadas em luz UV 254 e 365 nm e reveladas com anisaldeído sulfúrico, por aprsentar perfis cromatográficos semelhantes às mesmas foram reunidas e purificadas utilizando CLAE. A amostra foi dissolvida em MeOH, foi utilizada uma coluna semi-preparativa LUNA (Phenomenex®; 250 x 10 mm 100A) com volume de injeção de 50 μL e fluxo de 4,7 mL/min. A purificação foi realizada no modo isocrático utilizando MeOH 20% (pH 5), acidificado com ácido acético. As frações obtidas correspondentes a cada pico foram analisadas por RMN de 1H, o pico 5 foi analisado por RMN de 1H, 13C e bidimensionais e denominada substância V. O resumo detalhado do fraccionamento do extrato AcOEt dos calos se mostra no fluxograma da figura 11.

Ext. MeOH (Plântulas) 98 mg

CC SiO2

Fr 8-10 23 mg Coluna semi-preparativa LUNA Volume de injeção 50 μL e fluxo de

CLAE C18 4,7 mL/min. Modo isocrático MeOH 20% (pH 5).

Substância V 5 mg

Figura 11. Fluxograma do fracionamento do extrato MeOH das plântulas de D. saccifera.

4.9 Identificação das substâncias isoladas Para determinação estrutural das substâncias isoladas, as amostras foram solubilizadas em solvente deuterado (CDCl3 ou DMSO-d6) e analisadas por métodos espectroscópicos de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de 1H de 300 MHz e 13C de 75,5 MHz (Bruker, modelo Fourier-300, Alemanha) e bidimensionais como COSY (Correlation spectroscopy), HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) e HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Coherence). Os dados obtidos por RMN foram processados pelo software ACD/NMR Processor Academic Edition, da empresa Advanced Chemistry Development, Inc. (ACD/Labs).

4.10 Ensaios biológicos e químico 4.10.2 Ensaio da Atividade antibacteriana por microdiluição em caldo Para a determinação da concentração Inibitória Mínima (CIM), os extratos foram testados frente às seguintes cepas: Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Citrobacter freundii (ATCC 13316), Escherichia coli (ATCC 11775), Edwardsiella tarda (ATCC 15947), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Propionibacterium acnes (ATCC 6919), Pseudomonas fluorescens (ATCC 13525), Salmonella enteritidis (ATCC 13076), Serratia marcescens (ATCC 13880). As

cepas foram escolhidas de acordo com sua importância clínica e sua disponibilidade. O ensaio foi realizado segundo a metodologia descrita por CLSI (2015). Os micro-organismos utilizados no ensaio foram cultivados em meio líquido Müeller- Hinton, incubados por 24h a uma temperatura de + 37 oC e posteriormente diluídos no próprio meio até a concentração de 0,5 na escala de McFarland. Os extratos foram diluídos em dimetilssulfóxido (DMSO) a 5% nas concentrações de 1000 e 500 μg/mL. Foi utilizado um controle negativo (solvente, extrato e micro-organismo), um controle positivo com antibiótico (oxitetraciclina e micro-organismo) e um controle de esterilidade do caldo (1 poço contendo apenas o caldo). As microplacas inoculadas foram lidas no espectrofotômetro a 625 nm e posteriormente mantidos em estufa com temperatura controlada (30 ºC) durante 24 horas. Após 24 horas, foi realizada uma segunda leitura no espectrofotômetro e foram adicionados 40 μL de revelador (cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazóleo) em cada poço das placas e aguardados 30 min em temperatura ambiente. Onde houve crescimento bacteriano, os poços foram revelados em vermelho, e onde não houve crescimento, os poços permaneceram incolores. A CIM é considerada a menor concentração do extrato ou substância onde não houver crescimento bacteriano ou houver uma inibição ≥ 80% (permanecerem incolor). As absorbancias foram analisadas no Excel gerando a porcentagem de inhibição e o desvio padrão.

4.10.3 Ensaio da Membrana Corioalantoica (CAM) A avaliação da atividade antiangiogênica dos extratos foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Nguyen e colaboradores (1994). Ovos fertilizados da espécie Gallus domesticus foram incubados em uma incubadora automática e digital Chocmaster®, na posição horizontal, à temperatura de 37 °C e sob umidade relativa do ar de 33%. Após 48 h de incubação (idade embrionária E2), uma abertura de 5 mm de diâmetro foi feita na casca, na região onde a câmara de ar do ovo estava localizada e foram retirados cerca de 5 mL de clara, afim de evitar-se a aderência dos embriões nas membranas ovulares. Conjuntamente, outra abertura foi feita com aproximadamente 15 mm de diâmetro na região localizada acima da Membrana Corioalantoica (CAM). Posteriormente e para minimizar a perda de umidade, as aberturas foram fechadas com fita adesiva e fita isolante.

Os embriões foram incubados por mais 72 h para que alcançassem a fase embrionária de 6 dias (E6). Nesta fase, os ovos foram abertos e implantados aos discos de metilcelulose adsorvidos com os extratos e substâncias em estudo, exatamente no terço externo da CAM. Posteriormente foram novamente fechados, continuando a incubação por mais 48 h, até chegar na idade embrionária de 8 dias (E8) de experimento, quando foi feita a avaliação da atividade antiangiogênica. As imagens de cada ovo em triplicata foram registradas com ajuda de uma câmera fotográfica. As imagens foram utilizadas para a contagem de vasos sanguíneos que interceptará o disco e vasos presentes em uma área de 0,9 cm. Os resultados foram expressos como percentual de vasos ± desvio-padrão da média.

4.10.4 Avaliação da Atividade Antioxidante Para avaliação da atividade antioxidante utilizando o método com DPPH foi preparada uma solução de DPPH solubilizando 28 mg do DPPH em 1 mL de DCM e adicionando MeOH até atingir o volume de 100 mL. Também foi preparada uma solução do ácido ascórbico com água deionizada em uma concentração de 900 μg/mL a partir da qual foram preparadas diluições resultando nas seguintes concentrações: 0, 90, 180, 360, 540 e 720 μg/mL. Posteriormente foram preparadas as curvas com DPPH, adicionando-se em seis micro-tubos 990 μL de DPPH mais 10 μL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações. Após 30 minutos, foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de 517 nm. Após a verificação da curva de calibração e sua linearidade, foi adicionada uma solução dos extratos na concentração de 0,5 mg/mL nas soluções de DPPH, em triplicata. Foi realizada a leitura da absorbância (517 nm) no espectrofotômetro das soluções após 30 minutos de reação. Para avaliação da atividade antioxidante utilizando o método com Fe3+ a curva foi feita adicionando em seis novos micro-tubos 10 μL da solução de ácido ascórbico nas diferentes concentrações, mais 10 μL da solução padrão de Fe3+ e 980 μL da solução 1,10-fenantrolina 0,25%. Após 1 hora foi realizada a leitura da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de 508 nm. Após a verificação da curva de calibração e sua linearidade, foram adicionadas uma solução dos extratos na concentração de 0,5 mg/mL nas soluções de Fe3+/ fenantrolina, em triplicata. Foi

realizada a leitura da absorbância (508 nm) no espectrofotômetro das soluções após 1 h de reação. Para ambos os testes os resultados obtidos foram expressos em equivalência com o ácido ascórbico e os resultados foram interpretados segundo a escala que se mostra na tabela 7.

Tabela 7.Escala para interpretação dos resultados da atividade antioxidante (Martins et. al., 2014).

Análise da atividade antioxidante Escala de comparação (mg de extrato/ mg de ácido ascórbico) Menor que 1,0 Muito ativo Entre 1,1 e 2,0 Ativo Entre 2,1 e 3,0 Atividade moderada Maior que 3,1 Inativo

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Indução da calogênese e estabelecimento de culturas de células em suspensão. Após 60 dias foram obtidos calos completamente formados que ainda apresentaram zonas de coloração verde, indicador de células ainda diferenciadas, aos 80 dias os calos foram completamente friáveis (Figura 12). A multiplicação alcançou 150 dias, totalizando 5 sub-cultivos em frascos. Os calos apresentaram coloração entre esbranquiçada, amarelada e aspecto friável, um indicador de uma massa celular indiferenciada. Após os repiques, o crescimento dos calos foi uniforme, com pouca ocorrência de variação na morfologia ou coloração.

Figura12 . Indução da calogênese de D. saccifera; a. plântulas in vitro; b. segmentos foliares utilizados como explantes; c. formação do calo na parte central da folha e no final dos segmentos foliares; d. transformação completa do explante em calo após 60 dias; e. aparência friável após 80 dias; f. calos subcultivado em frascos.54 Escala a-e: 0,5 cm; f: 2 cm. Foram inoculados 10 g de calos de consistência friável para iniciar as suspensões celulares. Houve um crescimento progressivo muito rápido das células ao longo de 30 dias de cultivo, no entanto, antes de estudar a produção de metabólitos, foi essencial deixar que as culturas celulares se estabilizassem (Mustafa et al., 2011), por isso as culturas foram subcultivadas mais duas vezes a cada 30 dias para estabelecer a suspensão celular e aumentar a massa de células. Durante o tempo de cultivo as suspensões mantiveram uma coloração branca (Figura 13). Uma vez estabelecidas as suspensões celulares, foram retiradas para a preparação dos extratos.

Figura 13. Aparência das células em suspensão retiradas para preparação dos extratos.

Os resultados do estabelecimento de calos e células em suspensão corroboram com o observado por Souza (2016) e Brilhante (2018) quanto aos tempos de formação total de calo, crescimento das suspensões e coloração; neste estudo a obtenção de calos completamente brancos e friáveis só foi possível após 75 dias, apresentando uma variação só de 15 dias em relação aos estudos anteriores onde o tempo foi de aproximadamente 60 dias, o que pode apontar uma estabilidade fisiológica do material vegetal de D. saccifera presente no LABB, fator importante nos estudos envolvendo cultura de tecidos vegetais.

5.2 Obtenção dos extratos das culturas in vitro de D. saccifera Além do extrato AcOEt obtido da extratoteca, foram feitas novas extrações dos calos, das células em suspenção e das plântulas. Foram obtidos 9 extratos: 3 hexânicos, 3 AcOEt e 3

metanólicos, as massas frescas obtidas após o cultivo e as massas secas finais estão descritas na tabela 8.

Tabela 8. Rendimento percentual dos extratos hexânicos, AcOEt e metanólicos obtidos de culturas in vitro de D. saccifera (rendimento a partir da massa seca).

Extrato Massa Massa Ext Rend. Ext Ext Rend. Ext Ext Rend. fresca(g) seca(g) Hex(g) Hex (%) AcOEt (g) AcOEt (%) MeOH (g) Ext MeOH (%) Calos 1695 71,77 0,1233 0,17% 0,6173 0,86% 7,4315 10,35% Células em 358,11 12,38 0,0252 0,20% 0,1317 1,06% 1,5094 12,19% suspensão Plântulas 2,77 0,54 0,0044 0,81% 0,0196 3,62% 0,1057 19,57%

Note-se que as porcentagens dos rendimentos dos três extratos das culturas com células indiferenciadas, calos e suspensões são muito similares, enquanto os rendimentos dos extratos das plântulas são notavelmente superiores, isso se deve ao fato de que a produção de substâncias é geralmente mais alta em tecidos diferenciados (Rao e Ravishankar, 2002).

5.3 Obtenção dos extratos dos calos durante a calogênese Foram obtidos 27 extratos: 9 hexânicos, 9 AcOEt e 9 metanólicos referentes aos 9 tempos da diferenciação durante a calogênese, a qual completou 64 dias. Levando em conta a pouca massa necessária para realizar a comparação por CCDC o material vegetal inicial utilizado foi pouco, as massas obtidas após o cultivo e a massa seca final estão descritas na tabela 9.

Tabela 9. Maassas dos extratos hexânicos, AcOEt e metanólicos obtidos dos calos de Duroia saccifera durante a calogênese. Dias de Massa Massa Ext Hex(mg) Ext AcOEt (mg) Ext MeOH (mg) inoculação fresca(mg) seca(mg) 1 105,5 33,8 1,0 1,2 1,0 8 160,7 34,9 1,1 0,7 1,0 16 440,9 79,0 1,5 1,4 2,4 24 764,4 343,9 4,7 12,1 28,7

32 1050 215,6 3,1 4,3 12,5 40 1690 230,3 4,6 4,9 16,3 48 1800 280,7 4,7 5,8 21,9 56 1433,6 1239,1 2,6 5,4 18,3 64 1517,1 1194,9 1,7 3,7 15,7

5.4 Comparação do perfil químico dos extratos das culturas in vitro por Cromatografia em Camada Delgada Comparativa (CCDC) Os extratos provenientes dos calos, suspensões celulares e plântulas foram eluídas em três sistemas de polaridade diferente para ter uma melhor compreensão do perfil químico dos extratos (Figura 14a-d). Os extratos de calos e suspensões celulares apresentaram um perfil químico semelhante, sendo os extratos das plântulas notavelmente diferentes; a presença de clorofila só foi evidente nos extratos das plântulas quando observados sob luz UV em 365 nm, indicando que houve uma completa desdiferenciação nas células dos calos e das células em suspensão.

Todos os extratos se mostraram ricos em terpenoides quando reveladas com Ce(SO4)2 e anisaldeído sulfúrico, com a formação de coloração roxa/lilás e apresentando uma intensidade maior nos extratos hexânicos e AcOEt dos calos (Figura 14c-d), dado que os terpenos em geral são não polares (Bir, 2000). A presença de terpenos e esteroides nos extratos dos calos de D. saccifera e D. macrophylla já foi relatada anteriormente (Souza, 2016; Brilhante, 2018; Lopez-Vazquez, 2019; Zanca 2020). Ao serem observadas na luz UV 254 e 365 nm, as cromatoplacas indicaram a presença de grupos cromóforos ou moléculas com ligações duplas conjugadas (Figura 14a-b). Quando as cromatoplacas foram reveladas com FeCl3 e reagente de Dragendorff nenhuma mancha foi visível, o que indicou a ausência ou concentrações muito baixas de substâncias fenólicas e nitrogenadas.

a b c d

DCM 100% DCM

Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms

DCM:MeOH 9:1 DCM:MeOH

Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms

DCM:MeOH 8:2 DCM:MeOH

Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms Hp Hc Hs Ap Ac AS Mp Mc Ms

Figura 14. Placas de CCDC dos extratos hexânicos, AcOEt e MeOH de plântulas, calos e suspensões celulares de D. saccifera. a: UV (λ = 254 nm); b: UV (λ = 365 nm); c: anisaldeído sulfúrico; d: Ce(SO4)2. Hp:Hexânico plântulas, Hc: Hexânico calos, Hs: Hexânico suspensões, Ap: AcOEt plântulas, Ac: AcOEt calos, As: AcOEt suspensões, M: MeOH plântula, M: MeOH calos, M: MeOH suspensões.

No sistema DCM/MeOH 9:1 foi observada uma mancha azul intensa na origem dos extratos AcOEt e MeOH das plântulas quando observados sob luz UV em 254 nm (Figura 11a). Aumentando a polaridade do sistema para 8:2 essa mesma mancha eluiu do ponto de aplicação (RF ≅0,45) e apresentou cor azul intensa quando a cromatoplaca foi revelada com anisaldeído sulfúrico indicando a presença de iridoides (Figura 11c). Os iridoides são conhecidos por serem muito sensíveis quando tratados com reagentes ácidos, o qual hidrolisa ligações glicosídicas e decompõe a estrutura dando produtos de coloração azul (Zgórka, 2008). Alguns iridoides já foram isolados de outras espécies do gênero, D. hirsuta (Page et al., 1994) e D. macrophylla (Lopez-Vazquez 2019; Zanca 2020), porém é a primeira vez que há indícios da presença de iridoides na espécie D. saccifera. Os iridoides são os marcadores quimiotaxonômicos da tribo Ixoroidae (Martins e Nunez, 2015), à qual pertence a espécie, pelo qual faz sentido ter encontrado a presença dessa classe química nos extratos. Trabalhos na área da cultura de tecidos com a espécie D. macrophylla também relatam presença de iridoides nos extratos MeOH de plântulas de viveiro, sementes, e em culturas in vitro de plântulas e calos (Lopez-Vazquez 2019), além disso foi isolado o iridoide éster metílico de monotropeína, em raízes em suspensão de D. macrophylla (Zanca, 2020). No geral os extratos dos calos e as suspensões foram similares tanto no perfil químico como nas concentrações, no entanto no sistema DCM/MeOH 9:1, quando a placa foi revelada com

Ce(SO4)2, a concentração dos possíveis terpenos no extrato das suspenções celulares foram muito baixas com relação aos calos, isso pode estar relacionado com as diferenças entre a cultura em meio semissólido dos calos e em meio líquido. Na suspensão, a disponibilidade de nutrientes e gases é maior e se distribui uniformemente, e estão mais disponíveis para as células, assim as células em suspensão podem não se encontrar num ambiente tão estressante quanto os calos e, portanto, não precisam produzir metabólitos secundários ou tem uma produção em baixas quantidades. Uma das estratégias para aumentar a produção e rendimento de metabólitos secundários é a elicitação, na qual as culturas são submetidas a fatores ou elicitores de estresse, esses fatores podem ser abióticos e bióticos, e afetam as vias bioquímicas e metabólicas das plantas (Bayraktar et al., 2016; Narayani e Srivastava 2017). A comparação do perfil químico dos extratos das diferentes culturas, demonstra o imenso potencial e importância deste campo de pesquisa e estimula a continuação de trabalhos futuros levando em conta a elicitação de culturas in vitro de D. saccifera.

5.5 Comparação do perfil químico dos extratos de explantes com diferentes graus de diferenciação. Para ter uma melhor compreensão do perfil químico dos extratos, também foram aplicados extratos hexânicos, AcOEt e metanólicos das plântulas e dos calos do item 5.2 pois eles haviam alcançado 80 dias de cultivo e o grau de diferenciação era notavelmente maior (Figura 15).

a b c

Extratos Hexanicos Extratos P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C

AcOEt

Extratos

P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C

MeOH

Extratos P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C P 0 8 16 24 32 40 48 56 64 C C

Figura 15. Placas CCDC dos extratos hexanicos, AcOEt y MeOH dos extratos dos calos durante a calogênese de D. saccifera . a: UV (λ = 254 nm); b: UV (λ = 365 nm); c: anisaldeído sulfúrico. P: Plântulas; C: calos com 80 dias de cultivo; os números fazem referência aos dias de inoculação. Extratos hexânicos: DCM: MeOH 95:5; Extratos AcOEt: DCM: MeOH 9:1; ExtratosMeOH: DCM: MeOH 8:2.

Os extratos durante a calogênese apresentaram diferenças. Na luz UV365 nm é possível observar como as manchas vermelhas da clorofila vão visualmente diminuindo até o dia 64 onde a calogênese foi completa, porém só desapareceu até os calos se tornarem totalmente friáveis e desdiferenciados.

Nos extratos hexânicos foi possível observar uma florescência na luz UV365 nm no RF ≅ 0,58, e uma mancha roxa no RF ≅ 0,41 quando a cromatoplaca foi revelada com anisaldeído sulfúrico, ambas sumiram quando os calos estiveram totalmente desdiferenciados. Nos extratos AcOEt aos 16 dias apareceu uma florescência no RF ≅ 0,55, uma mancha azul claro no RF ≅ 0,34 e uma mancha roxa RF ≅ 0,27 aos 24 dias, estas substâncias apareceram até a formação completa do calo e sua completa desdiferenciação, aumentando gradualmente sua concentração. Uma mancha azul claro e uma roxa no RF ≅ 0,63 e 0,57 respectivamente também apareceram nos extratos AcOEt só quando os calos estiveram totalmente desdiferenciados. Todas essas substâncias também estiveram ausentes no extrato das plântulas, o que indica que possivelmente a produção delas está estreitamente relacionada com a desdiferenciação celular.

Nos extratos MeOH apareceram manchas na luz UV365 nm, as quais aumentaram gradualmente sua concentração até o dia 64, após da completa desdiferenciação dos calos não foi possível observar essas substâncias. Quando as cromatoplacas foram reveladas com anisaldeído sulfúrico apareceram manchas azul intenso (RF ≅ 0,29) o que pode indicar a presença de iridoides, essas manchas apareceram nos extratos das plântulas e em todos os tempos da calogênese, sendo ausentes no extrato dos calos totalmente desdiferenciados. Um exemplo da importância da diferenciação celular na obtenção de metabólitos são as saponinas e outros metabólitos valiosos, os quais são produzidos especificamente nas raízes do Panax ginseng C.A.Mey (ginseng), sendo necessária a cultura radicular in vitro (Karuppusamy 2009). Da mesma forma, substâncias antidepressivas como hipericinas e hiperforinas, são acumuladas nas glândulas foliares de plantas como Hypericum perforatum L. sendo as células indiferenciadas incapazes de acumular esses metabólitos (Smith et al., 2002). Como outro exemplo da importância da diferenciação, encontramos as culturas de calos e brotações do Nicotiana tabacum L. (tabaco), as quais podem produzir apenas pequenas quantidades de nicotina dado que a biossíntese de lisina em anabasina ocorre nas raízes, seguida pela conversão de anabasina em nicotina nas folhas (Karuppusamy 2009).

Quando foi realizada a comparação do perfil químico dos extratos de plântulas, calos e suspensões celulares (item 5.3), só foi possível observar a presença de iridoides nos extratos AcOEt e MeOH das plântulas. Fazendo a comparação dos extratos no tempo da calogênese, só temos presença de iridoides nos extratos das plântulas e até o calo apresentar algum grau de diferenciação. Lopez-Vazquez (2019) relata a presença de iridoides no extrato MeOH de células diferenciadas, plântulas e sementes, assim como em células desdiferenciadas de calos de D. macrophylla. No entanto, os calos usados nesse estudo apresentaram consistência semifriável (com um grau menor de desdiferenciação), além disso, não foram encontradas nos extratos das suspensões celulares, onde as células estavam totalmente desdiferenciadas. Com isso, uma hipótese para que essas substâncias não tenham sido formadas neste estudo, é que pelo menos algum grau de diferenciação nas culturas de células da D. saccifera deve ocorrer antes que os iridoides possam ser sintetizados. Sabe-se que os iridoides tem uma gama de atividades biológicas relatadas, entre elas a neuroprotetora, antioxidante, anticancerígena (antitumoral) e anti-inflamatória, incluindo substâncias que estão sendo estudadas como agentes terapêuticos promissores (Tundis et al., 2008; Wang et al., 2013; Yang et al., 2016; West et al., 2016). Além disso, são monoterpenos que, juntamente com o triptofano, são precursores biossintéticos dos alcaloides indólicos (Dewick 2002), os quais possuem grande importância econômica pois geram vendas bilionárias a cada ano, é o caso da ergotamina usada para tratar a enxaqueca e a vimblastina como anticancerígeno (Schripsema e Dagnino, 2017). Na espécie do gênero D. macrophylla foi isolado um alcaloide indólico com atividade antitumoral (Nunez e Vasconcellos, 2012), e sendo D. saccifera uma espécie próxima, torna-se possível a continuação de estudos visando a produção desses alcaloides, incluindo o tratamento com diferentes elicitores, especialmente em culturas com tecidos diferenciados.

5.6 Fracionamento do extrato AcOEt dos calos de D. saccifera Antes do fracionamento, o extrato AcOEt foi analisado por CCDC. O sistema de eluição mais eficiente para o extrato AcOEt obtido dos calos da D. saccifera foi DCM/MeOH 9:1, a análise por CCDC com os reveladores Ce(SO4)2 e anisaldeído sulfúrico indicou altas concentrações de terpenos, o extrato também apresentou indícios de moléculas com duplas ligações conjugadas e/ou

substâncias aromáticas quando visualizadas em luz UV 254 e 365 nm (Figura 16). As cromatoplacas não revelaram com o FeCl3 e reagente de Dragendorff, indicando ausência ou concentrações muito baixas de substâncias fenólicas e nitrogenadas.

a c d b Figura 16. Placas de CCDC do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. Sistema de eluição: DCM/MeOH 9:1, reveladores: a) UV 254 nm, b) UV 365 nm, c) anisaldeído, d) Ce(SO4)2.

O fracionamento do extrato AcOEt resultou em 98 frações, do qual as frações de 5 a 11 foram reunidas (C1.5-11) mostrando-se ricas em terpenoides quando reveladas com Ce(SO4)2 e anisaldeído sulfúrico; observou-se fraca absorção na luz UV254 nm, também foi possível notar forte absorção frente a luz UV365 nm na região central da placa (Figura 17).

a b c d .

Figura 17. Placas de CCDC das frações C1. 5-11 do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. SistemaO fracionamento de eluição: DCM/MeOH de C1.5-11 9:1, resultou reveladores: em 50 a) frações, UV 254 nm,as frações b) UV 3657 a 9nm, foram c) anisaldeído, reunidas e d) identificada como substância I (Rf ≅ 0,73) (Ce(SOFigura4) 218. ).

O fracionamento de C1.5-11 resultou em 50 frações, as frações 7 a 9 foram reunidas e identificada como substância I e II (Rf ≅ 0,73) (Figura 18).

a b c

Figura 18. Placas de CCDC da mistura das substâncias I e II. Sistema de eluição: CHCl /MeOH 95:5, 3 reveladores: a) UV 254 nm, b) UV 365 nm, c) anisaldeído.

As frações 39 a 41 de C1.5-11 foram reunidas (Figura 19), e seu posterior fracionamento resultou em 24 frações, as frações 17 a 18 (C3. 17-18) foram reunidas e identificada como substância III e IV (Rf ≅ 0,68) (figura 20).

a b c d

Figura 19. Placas de CCDC das frações reunidas C2. 39-41 do fracionamento do extrato AcOEt obtido dos calos de D. saccifera. Sistema de eluição: DCM/ Acetona 8:2; reveladores: a) UV 254 nm, b) UV 365 nm c) anisaldeído, d) Ce(SO4)2.

a b c d

Figura 20. Placas de CCDC da mistura das substâncias III e IV. Sistema de eluição: DCM/ MeOH 95:5; 5.7 Fracionamentoreveladores: do extrato a) UV 254 MeOH nm, b) das UV plântulas 365 nm c) de anisaldeído, D. saccifera d) Ce(SO 4)2.

O sistema de eluição mais eficiente para o extrato MeOH obtido das plântulas in vitro da

D. saccifera foi DCM/MeOH 8:2, na UV254 foi observada uma mancha escura a qual apareceu em cor azul intenso quando a cromatoplaca foi revelada com anisaldeído sulfúrico RF ≅ 0,43, o que indicou a presença de iridoides (Figura 21).

a b c Figura 21. Placas de CCDC do extrato MeOH obtido das plântulas de D. saccifera. Sistema de eluição:

DCM/ MeOH 8:2; reveladores: a) UV 254 nm, b) UV 365 nm c) anisaldeído

O fracionamento do extrato MeOH resultou em 23 frações, as frações 8 a 10, tiveram indícios da presença de iridoides quando reveladas com anisaldeído (RF ≅ 0,68), foram reunidas (Figura 22) e purificadas utilizando CLAE. A fração 5 proveniente da purificação por CLAE foi denominada substância V (Figura 23).

a b c

Figura 22. Placas de CCDC da reunião das frações 8 a 10 do extrato MeOH obtido das plântulas de D. saccifera. Sistema de eluição: CHCl3/ MeOH 7:3; reveladores: a) UV 254 nm, b) UV 365 nm c) anisaldeído

2: 254 nm, 8 nm 3: 280 nm, 8 nm C13FR8-10 (22.07) PURI.2 C13FR8-10 (22.07) PURI.2 C13FR8-10 (22.07) PURI.2 C13FR8-10 (22.07) PURI.2 120 120

100 100

80 254 nm 80 280 nm 60 60

mAU

40 40

20 20

0 0

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Minutes Tempo (minutos)

Figura 23. Cromatograma de purificação por CLAE da fração 8-10 (H O/MeOH 80:20). 2

5.8 Identificação das substâncias isoladas

5.8.1 Identificação da substância I e II (mistura do estigmasterol e β-sitosterol)

O fracionamento do extrato dos calos resultou em 7 mg da fração C2.7-9, a qual tinha aspecto de sólido branco. Os dados de RMN de 1H mostram a presença de vários sinais em forma de singletos na região entre 0,6 e 1,25 ppm, característicos dos hidrogênios de metila (Figura 24); dois sinais a 5,35 (d, J = 5,22 Hz) e 3,53 (sep, J = 5 Hz) sugerindo a presença de C-6 e C-3 de hidrogênios de um esteróide com esqueleto estigmastano (Figure 25) (Forgo e Kövér 2004; Khatun et al. 2012). Duas sinais em 5,15 ppm (dd, J = 15,18, 8,47 Hz) e 5,01 ppm (dd, J = 15,18, 8,47 Hz) sugeriram a presença de estigmasterol (Forgo e Kövér 2004), mas as integrais desses sinais mostraram valores metade dos sinais anteriores, indicando uma mistura de dois esteroides na proporção de 1:4, com β-sitosterol presente em maior quantidade.

1 Figura 24. Espectro de RMN de H da mistura das susbtâncias I e II (CDCl3, padrão TMS, 300 MHz).

a b

Figura 25. Expansão do espectro de RMN de 1H da mistura das substâncias I e II, indicando hidrogênios

de um esteróide com esqueleto estigmastano; a: dupleto, b: septeto (CDCl3, padrão TMS, 300 MHz).

Os dados de 13C-RMN mostraram sinais em δ 140,75 e 121,74, comuns para ambos esteróides, com sinais em δ 138,24 e 129,25 sendo pelo menos quatro vezes menos intensos, sendo estes sinais característicos do estigmasterol (Figura 26).

13 Figura 26. Espectro de RMN de C da mistura das substâncias I e II (CDCl3, 75 MHz).

A partir das análises dos espectros de HSQC (anexo 1), HMBC (anexo 2) e COSY (anexo 3) foi possível estabelecer as correlações entre os hidrogênios e carbonos das moléculas analisadas, a partir das análises e correlações observadas, a substância I e II foram identificadas como a mistura do estigmasterol e β-sitosterol (tabela 10), sendo obtidos pela primeira vez na cultura in vitro do gênero (Figura 27).

Tabela 10. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para β-sitosterol e estigmasterol (300 1 2 MHz, CDCl3); deslocamentos químicos estão em δ (ppm). : Kovganko et al. 1999; : Khatun et al. 2012.

Posição β-Sitosterol Estigmasterol 13C 1H 13C 13C 1H 13C Literatura1 Literatura2 1 37,24 1,80; 1,05 37,3 37,24 37,31 2 31,89 1,82; 1,52 31,6 32,41 31,72 3 71,81 3,53 71,8 71,81 3,53 71,85 4 42,29 2,28; 2,22 42,3 42,29 42,37 5 140,75 - 140,8 140,75 141,01 6 121,74 5,35 121,7 121,74 5,35 121,73 7 31,89 1,95; 1,52 32,1 31,65 31,72 8 31,89 1,53 32,1 31,65 31,79 9 50,1 0,91 50,2 50,1 50,19 10 36,49 - 36,5 36,15 36,17 11 21,08 1,46 21,1 21,22 21,11 12 39,76 1,99; 1,14 39,8 39,76 40,10 13 42,3 - 42,3 42,3 42,41 14 56,85 0,87 56,8 56,75 56,12 15 24,30 1,55; 1,03 24,3 24,30 23,12 16 28,94 1,82; 1,24 28,3 29,35 29,72 17 56,02 1,08 56,1 55,96 56,12 18 11,85 0,68 12,0 11,97 12,01 19 19,40 1,01 19,1 19,86 19,42 20 35,89 1,34 36,2 39,74 41,10 21 18,77 0,94 18,8 20,53 21,10 22 33,92 1,29; 0,99 34,0 138,34 5,15 138,00 23 26,00 1,15 26,2 129,25 5,01 128,95 24 45,80 0,90 45,2 51,23 50,15 25 29,1 1,64 29,2 29,70 31,72 26 19,01 0,80 18,9 21,86 21,30 27 19,84 0,82 19,1 18,70 19,06 28 23,03 1,23 23,1 25,4 25,38 29 11,85 0,85 11,9 11,97 12,28

21 21 28 29 28 29 a 22 20 22 18 20 b 18 24 24 H 17 17 11 11 23 25 23 25 19 13 27 19 13 27 H 1 1 9 14 9 14 26 26 10 8 15 10 8 15 H H 3 3 HO 5 5 6 6 Figura 27. Estrutura química do a: β-sitosterol e b: estigmasterol.

Os fitoesteróis mais comuns em vegetais são β-sitosterol, estigmasterol e campesterol (Moreau et al., 2002). O estigmasterol é sintetizado a partir de β-sitosterol pela insaturação em C- 22 (Griebel e Zeier 2010), e sua ocorrência tem sido amplamente reportada para espécies da família Rubiaceae (Hui e Lam 1964; Martins e Nunez 2015). O extrato AcOEt deste estudo apresentou atividade frente a M. tuberculosis (CIM de 25 μg mL − 1) (Brilhante, 2018), e revisões de numerosas espécies de plantas e compostos ativos com atividade antimicobacteriana, indicam o β-sitosterol e o estigmasterol como componentes fitoquímicos importantes nesse processo (Chinsembu, 2016; Tiwari et al., 2019).

Suja (2017) relatou atividade de inibição do crescimento de M. tuberculosis com uma CIM de 25 e 100 μg mL−1 para β-sitosterol e estigmasterol, respectivamente. Um estudo realizado por Saludes e colaboradores (2002) relatou que as CIMs de β-sitosterol e estigmasterol são de 128 e 32 μg mL−1, respectivamente. No presente estudo, encontramos uma mistura de ambas substâncias que possuem estruturas semelhantes, diferindo apenas na posição de um enlace duplo extra (presente no estigmasterol), o que dificultou sua separação (Xu et al., 2005; Pierre e Moses 2015).

5.8.2 Identificação da substância III e IV (mistura do ácido ursólico e ácido oleanólico)

O fracionamento do extrato dos calos resultou em 7 mg da fração C11.17-18, a qual tinha aspecto de sólido branco. Os dados de RMN de 1H mostraram a presença de vários sinais em forma de singletos na região entre 0,6 e 1,45 ppm, característicos dos hidrogênios de metila (Figura 28), assim como a presença dois tripletos em δ 5,30 e δ 5,26 ppm característicos de hidrogênios ligados aos C-12 de triterpenos pentacíclicos de esqueletos oleaneno e ursano respectivamente, além de o duplo dupleto em δ 3,22 característico dos hidrogênios ligados aos C-3 de ambos triterpenos, e dois 70

dupletos largos em δ 2,81 e 2,85 característicos de hidrogênios ligados aos carbonos 18 e 19 (C-18 e C-19) respectivamente do esqueleto oleanano (Belsner et al., 2003; Martins 2014) (Figura 29 a- b).

STEFHANIA19_C11FR17-18_CDCL3.011.001.1R.esp TMS

0.02 0.00

0.035

7.27

0.030

0.025

0.020 0.78

0.94

1.26

NormalizedIntensity 1.00 0.015 0.77

1.14

0.010

0.03

1.64

1.61

-0.19

0.21

1.67

1.56

1.68

1.73

1.71

0.005 1.91

0.73

5.29

3.22

2.03

0.09

-0.08

5.26

3.26

3.20

5.28

3.24

2.18

7.0 STEFHANIA19_C11FR17-18_CDCL3.011.001.1R.esp6.5 6.0 5.5 5.0 STEFHANIA19_C11FR17-18_CDCL3.011.001.1R.esp4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0.0040 0.0040 Chemical Shift (ppm) 1 Figura 28. Espectro de RMN de H da mistura das susbtâncias III e IV (CDCl3, padrão TMS, 300 MHz). 0.0035 0.0035

0.0030 0.0030

0.0025 a 0.0025 b

0.0020 0.0020

NormalizedIntensity NormalizedIntensity 0.0015 0.0015

0.0010 0.0010

0.0005 0.0005

5.30 5.25 5.20 5.15 5.10 3.05.05 5.00 4.95 4.90 4.852.5 2.0 1.5 Chemical Shift (ppm) Chemical Shift (ppm)

Figura 29. Expansão do espectro de RMN de 1H da mistura das subtâncias III e IV; a: sinais de hidrogênios ligados aos C -12 de triterpenos pentacíclicos de esqueletos oleaneno e ursano, b: duplo dupleto em δ 3,22 ppm característico de ambos triterpenos c: dupletos largos em δ 2,85 e 2,81 ppm característico do esqueleto oleanano (CDCl3, padrão TMS, 300 MHz). 71

Os dados de 13C-RMN mostraram sinais comuns para ambos triterpenos, duas ressonâncias em δ 125,8 (C-13) e 137,9 (C-12) ppm sugeriram a presença da à ligação dupla entre os carbonos do ácido ursólico, assim como as ressonâncias em δ 122,6 e 143,5 ppm sugeriram à ligação dupla dos carbonos C-12 e C-13 do ácido oleanólico (Figura 30).

STEFHANIA19_C11FR17-18.002.001.1R.esp 0.13

0.12

0.11

0.10 0.09 0.08 0.07

0.06

NormalizedIntensity 0.05

0.04 0.03 0.02 0.01

170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 Chemical Shift (ppm)

13 Figura 30. Espectro de RMN de C da mistura das substâncias III e IV (CDCl3, 75 MHz).

13 FiguraA partir 30 das. Espectro análises de RMNdos espectros de C da misturade RMN das de substâncias 1H, 13C eIII HMBC e IV (CDCl (anexo3, 75 4 MHz).) foi possível estabelecer correlações entre os hidrogênios e carbonos das moléculas analisadas, por comparação com dados descritos na literatura (Belsner et al., 2003, Martins, 2014), a substância III e IV foi identificada como a mistura do ácido ursólico e ácido oleanólico na proporção 1:1 (tabela 11, Figura 31), sendo estes obtidos pela primeira vez na cultura in vitro do gênero e relatados pela primera vez na espécie.

Tabela 11. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para ácido ursólico e ácido oleanólico 1 (300 Hz, CDCl3); deslocamentos químicos estão em δ (ppm). NO: Não observado. : Martins 2014.

Posição Ácido ursólico Ácido oleanólico 13C 1H 13C 13C 1H 13C Literatura1 Literatura1 1 38,5 1,72 36,8 38,3 1,63 38,5 2 26,5 1,60 27,7 29,7 1,60 28,1 3 79,2 3,22 78,7 79,2 3,22 79,1 4 38,3 - 38,5 38,5 - 38,8

5 55,2 1,34 55,2 55,2 0,76 55,3 6 18,2 1,60 18,3 18,2 1,55 18,8 7 32,9 1,72 32,9 32,6 1,50 32,7 8 39,4 - 39,5 39,2 - 39,3 9 47,5 1,63 47,3 47,6 1,55 47,6 10 38,3 - 38,0 37,0 - 37,0 11 22,9 1,90 23,1 23,6 0,92 23,8 12 125,8 5,25 125,9 122,6 5,28 122,8 13 137,9 - 137,9 143,5 - 143,5 14 41,0 - 41,2 41,6 - 41,5 15 27,6 1,60 27,7 17,1 1,60 17,3 16 25,9 1,34 25,0 23,4 0,96 23,7 17 47,9 - 48,1 47,6 - 47,3 18 52,6 2,2 52,3 41,0 2,80 41,2 19 38,7 0,99 38,5 41,9 2,84 41,5 20 38,7 0,96 38,5 30,7 - 31,0 21 30,6 1,25 30,3 32,9 1,63 32,6 22 36,7 1,71 36,7 33,7 1,30 33,9

23 28,1 0,99 28,9 28,0 0,99 28,0 24 15,6 0,77 15,6 16,9 0,77 16,8 25 15,4 0,93 15,4 15,3 0,93 15,3 26 17,1 0,82 16,8 15,4 0,76 15,5 27 23,5 1,08 23,5 25,9 1,18 26,0 28 179,1 - 179,6 180,0 - 180,0 29 17,0 0,86 17,0 33,7 0,91 33,1 30 21,9 0,96 21,4 23,5 0,93 23,7

a b

Figura 31. Estrutura química do a: ácido ursólico; b: ácido oleanólico 73

Figura 234. Estrutura química do a: ácido ursólico; b: ácido oleanólico

O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico que está presente em numerosas espécies vegetais, geralmente junto com seu isômero, ácido oleanólico (Hernández et al., 2007). Martins e colaboladores (2013) relataram o isolamento dos triterpenos ácido oleanólico e ursólico ativos contra M. tuberculosis (CIM 200 μg mL-1) a partir de extratos de D. macrophylla. Além disso, outros estudos em plantas in natura coletadas de D. macrophylla e D. saccifera encontraram atividade biológica contra três linhagens de M. tuberculosis: uma pan-suscetível H37Rv (ATCC 27294) e duas linhagens mono resistentes, uma monoresistente à isoniazida (ATCC 35822) e outra a rifampicina (ATCC 35338), os extratos brutos de folhas e galhos apresentaram valores de CIM variando de 50 a 200 μg mL-1 (Reis et al., 2016; Carrion et al., 2013).

Vários outros estudos demonstraram que os terpenos são responsáveis pela atividade antimicobacteriana (Seidel e Taylor 2004; Aguiar et al., 2005; Higuchi et al., 2008; Subramaniam 2014; Evina et al., 2017; Suja et al., 2017). Sua alta lipofilicidade é provavelmente o principal fator que permite sua penetração através da parede celular micobacteriana (Higuchi et al., 2008). O que indica que possivelmente a atividade frente a M. tuberculosis do extrato AcOEt esteja estreitamente relacionada com a presecença dos esteroides β-sitosterol e estigmasterol, e os triterpenos ácido ursólico e oleanólico. O fracionamento do extrato AcOEt tem potencial de ser estudado, para tentar obter outras possíveis substâncias ativas que podem levar à descoberta de novos medicamentos antituberculose.

5.8.3 Identificação da substância V (éster metílico de monotropeína)

O fracionamento das plântulas resultou em 5 mg da fração 8-10, a qual tinha aspecto de óleo amarelo. A análise de EM acoplada com coluna líquida de alta eficiência (CL) da substância V foi realizada no modo positivo e negativo, com fonte ESI, a amostra foi acidificada com solução de HCOOH (ácido fórmico); no modo negativo foi observada a presença de um pico no tempo de retenção 2,1 minutos e um íon molecular em 449,1332 m/z [M+HCOOH-H] (figura 32).

1 Figura 32. Espectro de RMN de H da susbtância V com supressão de H2O (DMSO-d6, 300)

()(MHz).

Atrávés da análise em conjunto com espectros de RMN foi possível obter a fórmula química 1 C17H24O11. Os dados de RMN de H mostraram a presença de sinais de um dubleto de hidrogênio desprotegido em 7,3 ppm (constante de acoplamento (J = 1,3 Hz) e um duplo dubleto em 6,0 ppm (J = 6,0 e 3,0 Hz), com integrais para um hidrogênio (1H) para cada sinal (Figura 33 e 34).

1 Figura33. Espectro de RMN de H da susbtância V com supressão de H2O (DMSO-d6, 300) ()(MHz).

Figura 266. Figura 267. Espectro de RMN de 1H da susbtância III (DMSO-d6, 300 MHz).

1 Figura 34. Expansão do espectro de RMN de H da subtância V, indicando dupleto em 7,3 ppm e duplo dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d6, 300 MHz).

A partir das análises dos mapas de correlação HSQC (anexo 5), HMBC (anexo 6) e COSY (anexo 7) foi possível estabelecer as correlações entre os hidrogênios e carbonos da molécula 1 Figuraanalisada 288 .(tabela Expansão 12 ),do indicando espectro de a RMNcomposição de H da de subtância três anéis, III, indicandosendo um dupleto deles componente em 7,3 ppm e de duplo um a dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d , 300 MHz).Figura molécula de glicose. Com base nos dados obtidos e consulta na literatura a 6 substância III foi 289. Espectro de RMN de 1H da susbtância III (DMSO-d6, 300 MHz). identificada sendo o iridoide éster metílico de monotropeína (methyl (1S,4aS,7R,7aS) -7-hydroxy- 7-(hydroxymethyl)-1-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy- 4a,7a-dihydro-1H-cyclopenta[c]pyran-4-carboxylate) (Figura 35), confirmando a molécula Figuraquímica 290 considera. Expansãoda dona espectroanálise ddee RMNEM; descritode 1H da pelasubtância primeira III, indicando vez por Chaudhuridupleto em 7,3e colaborado ppm e duplores dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d , 300 MHz). (1979), sendo obtido pela primeira vez na espécie Duroia saccifera. 6

1 Figura 291 . Expansão do espectro de RMN de H da subtância III, indicando dupleto em 7,3 ppm e duplo dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d6, 300 MHz).Figura 292. Espectro de RMN de 1H da susbtância III (DMSO-d6, 300 MHz).

Figura 34. Expansão do espectro de RMN de 1H da subtância V, indicando dupleto em 7,3 ppm e duplo dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d6, 300 MHz).

Figura 293. Expansão do espectro de RMN de 1H da subtância III, indicando dupleto em 7,3 ppm e duplo dupleto em 6,0 ppm sinal característico de moléculas de iridoides carboxílicos (DMSO-d6, 300 MHz).Figura Tabela 12. Deslocamentos químicos de 1H e 13C RMN observados para o éster metílico de monotropeína (300 MHz, DMSO-d); deslocamentos químicos estão em δ (ppm).

Posição Experimental Literatura (Zanca, 2020) 13C 1H 13C 1H

1 92,2 5,70 92,0 5,70 3 150,4 7,31 150,2 7,31 4 110,0 - 109,7 - 5 37,0 3,50 36,7 3,51

6 132,7 5,99 132,5 6,00 7 136,9 5,69 136,6 5,68 8 84,8 - 84,5 - 9 50,9 2,45 50,6 2,45 10 65,9 3,4 ; 3,26 65,7 3,38; 3,29 11 166,9 - 166,7 - 12 51,3 3,63 51,1 3,63 1´ 98,2 4,44 98,0 4,45 2´ 73,3 2,93 73,1 2,94 3´ 70,2 3,50 69,9 3,0

4´ 77,6 3,11 76,7 3,15 5´ 77,1 3,13 77,3 3,10 6´ 61,1 3,45 61,6 3,69 CH 12 3 O O 11 H 6 H 4 3 H 5 H 7 9 8 1 O 10 H HO H OH OH H H O H H H

HO H O H H H OH OH

Figura 35. Estrutura química do éster metílico de monotropeína.

Dentro do gênero Duroia, alguns iridoides já foram isolados da espécie D. hirsuta (Page et al., 1994) e D. macrophylla (Lopez-Vazquez, 2019; Zanca 2020) mas para D. saccifera esse é o primeiro relato. O éster metílico de monotropeína já foi relatado em várias espécies, principalmente

nas Rubiaceae D. macrophylla, Faramea hyacintina, Gardenia augusta, G. jasminoides, Morinda officinalis, Hedyotis diffusa, Oldenlandia diffusa, Canthium multiflorum, Randia spinosa, Tocoyena formosa e Galium mollugo (Zanca 2020; Wolf et al., 2019; Ma et al., 2016; Yang et al., 2016; Dinga et al., 2010; Machida et al., 2003; Hamerski et al., 2003; Parmar et al., 2000; Kouam et al., 2013, , Bolzani et al., 1996, Davini et al., 1981). Este iridoide tem atividades comprovadas contra o fungo Cladosporium cladosporioides, proporcionando proteção na germinação e desenvolvimento da planta ainda joven (Bolzani et al., 1996). Além disso, tem relatada atividade antimicrobiana frente à Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae (National Center for Biotechnology Information-NCBI, 2019). O éster metílico de monotropeína também foi encontrado em sementes, plântulas cultivadas in vitro, raízes cultivadas em suspensão e em folhas e caules de plantas jovens cultivadas in vivo de D. macrophylla (Lopez-Vazquez, 2019; Zanca 2020). O fato de esta substância ser produzida em culturas in vitro de Duroia saccifera demonstra a viabilidade na sua produção em maior escala, apontando a cultura de tecidos in vitro da espécie como uma fonte importante de biomassa para estudos que visem o estabelecimento de plataformas rentáveis para produção desta e de outras substâncias.

5.9 Ensaios químico e biológicos

5.9.1 Ensaio da Atividade antibacteriana por microdiluição em caldo A avaliação antibacteriana pelo método de microdiluição em caldo mostrou que nenhum dos extratos conseguiu atingir uma porcentagem de inibição ≥ 80%, no entanto os extratos hexânicos e AcOEt dos calos e suspensões celulares apresentaram atividade bacteriostática (Tabela 13) com inibição entre 40 e 50% na concentração de 1000 e 500 g/mL. Os extratos foram ativos principalmente contra as bactérias gram-negativas A. baumannii, S. enteritidis e S. marcescens. O controle positivo (oxitetraciclina) apresentou inibição acima de 99 % em todos os tratamentos.

Tabela 13. Porcentagem de inibição dos extratos de Duroia saccifera ± DS frente às bactérias testadas. Extrato Bactérias A.baumannii C.freundii E.coli E.tarda K.pneumoniae S.enteritidis P. acnes P. fluorescens S. marcescens Calos Hex 48% ± 0,02 - - - - 46%± 0 - - 49%± 0,02 45%± 0,01 Calos - - - - - 44%± 0 - - 45%± 0,01 AcOEt Calos ------MeOH Sus. Hex - - - - - 48%± 0 - - 48%± 0 40%± 0 51%± 0 Sus. - - - - - 51%± 0 - - 53%± 0,01 AcOEt 43%± 0,02 Sus. ------MeOH Legenda: Cor preto: inibição na concentração de 1000 μg/mL; Cor vermelho: inibição na concentração de 500 μg/mL. DS-Desvio padrão.

As culturas de calos de D. saccifera produziram substâncias como estigmasterol e β- sitosterol, ácido oleanólico e ursólico, essas moléculas são reportadas por apresentar atividade antimicrobiana frente a essas cepas bacterianas (Nna et al., 2019, Cardenas et al., 2016). Estas substâncias, podem ser responsáveis pela atividade, assim como podem estar atuando em sinergia com outras que, uma vez isoladas, podem aumentar, diminuir ou até mesmo perder sua atividade (Perruchon 2002; Singh e Singh 2003; Simões et al., 2004; Weniger et al., 2005). Muitos autores relacionam a atividade antimicrobiana de extratos brutos com a presença de terpenos em sua composição química (Singh 2003; Simões et al., 2004; Weniger et al., 2005; Subramaniam 2014). Neste trabalho, os extratos dos calos e suspensões celulares se mostraram ricos em terpenos, substâncias que em geral apresentam características apolares, o que está de acordo com as atividades demonstradas pelos extratos de baixa e média polaridade.

5.9.2 Ensaio da Membrana Corioalantóica (CAM) Foram testados os extratos hexânico, AcOEt e MeOH das suspensões celulares e também a substância éster metílico de monotropeína. Os resultados foram obtidos após 8 dias e registrados 79

por imagens de cada ovo para contagem de vasos sanguíneos interceptados pelo disco, obtendo-se o percentual de vasos inibidos. O extrato AcOEt apresentou atividade inibitória significativa de 80% e 50% nas concentrações 500 e 100 µg/mL, respectivamente, quando comparados ao controle negativo na concentração de 1000 µg/mL o extrato foi tóxico (Figura 36). Os extratos hexânico e metanólico apresentaram toxicidade inclusive na concentração de 100 µg/mL.

a b c

Figura 36. Atividade antiangiogênica do extrato AcOEt das suspensões celulares de D. saccifera. a: controle negativo; b: concentração de 100 µg/mL; c: concentração de 500 µg/mL.

Figura 352O .é Atividadester metílico antiangiogên de monotropeínaica do extrato apresentou AcOEt das atividade suspensões inibitória celulares significativa de D. saccifera deFigura 50, 60 353 e . Inibição90% nas da formaçãoconcentrações dos vasos 10, sanguíneos 50 e 100 no ensaioµg/mL, da membranarespectivamente, corioalantóica quando com o cextratoomparados AcOEt dasao suspenscontroleões celulares de D. saccifera; a: controle negativo; b: concentração de 100 µg/mL; b: concentração de 500 µg/mL. negativo (Figura 37). A substância apresentou alta selectividade, especialmente na concentração de

100 µg/mL, pois apresentou inhibição localizada ao redor do disco.

Figura 36. Atividade antiangiogênica do extrato AcOEt das suspensões celulares de D. saccifera. a: controle negativo; b: concentração de 100 µg/mL; c: concentração de 500 µg/mL. 80

Figura 354. Atividade antiangiogênica do extrato AcOEt das suspensões celulares de D. sacciferaFigura 355. Inibição da formação dos vasos sanguíneos no ensaio da membrana corioalantóica com o extrato AcOEt das suspensões celulares de D. saccifera; a: controle negativo; b: concentração de 100 µg/mL; b: concentração de 500 µg/mL.

a b c d

Figura 37. Atividade antiangiogênica da substância III, éster metílico de monotropeína. a: controle negativo; b: concentração de 10 µg/mL; c: concentração de 50 µg/mL; d: concentração de 100 µg/mL.

Desde a introdução da terapia antiangiogênica como um aspecto do tratamento do câncer em 1971 por Folkman, diferentes compostos antiangiogênicos foram relatados (Boghani et al., Figura 37. Atividade antiangiogênica da substância III, éster metílico de monotropeína. a: controle 2013;negativo; Mirzaaghaei b: concentração et al., 201 de4; Tu10 µg/mL;et al., 2016 c: concentração). As plantas de produzem 50 µg/mL; váriasd: concentração subtâncias de que 100 podem µg/mL . atingir diferentes vias envolvidas no desenvolvimento do tumor, como diferentes aspectos da angiogênese do tumor. Figura 37. Atividade antiangiogênica da substância III, éster metílico de monotropeína. a: controle Neste trabalho foi relatado que os calos de D. saccifera contêm substâncias orgânicas como negativo; b: concentração de 10 µg/mL; c: concentração de 50 µg/mL; d: concentração de 100 µg/mL. fitoesterois e terpenos. Alguns trabalhos relataram extratos brutos de plantas medicinais com atividade antiangiogênica, sendo os terpenos e fitoesterois seus principais compostos (Sagar et al., 2006; Mahadevan et al., 2008; Mirzaaghaei et al., 2014; Othman et al., 2019). Das espécies da Figura 37. Atividade antiangiogênica da substância III, éster metílico de monotropeína. a: controle famílianegativo; Rubiaceae b: concentração como Coffea de 10 µg/mL; arabica c : econcentração Gardenia de jasminoides 50 µg/mL; d:foram concentração obtidos de o 100 diterpeno µg/mL . kahweol e o iridoide glicosilado, geniposídeo, ambos com umm alto potencial antiangiogênico no ensaio da membrana corioalantoica (Koo et al., 2004; Cárdenas et al., 2011). A busca de substâncias com potencial de inibir a formação de vasos é primordial para a descoberta de novos medicamentos antitumorais. Os resultados deste trabalho demostram o potencial atiagiogênico do éster metílico

de monotropeína e dão suporte para a busca dos metabólitos presentes nos extratos que possivelmente estejam relacionados a atividade antiangiogênese.

5.9.3 Avaliação da atividade antioxidante Foram testados os extratos dos calos e suspensões celulares, na concentração de 5 mg/mL, não apresentaram atividade antioxidante nos ensaios realizados frente ao radical livre DPPH e ao complexo Fe3+/fenantrolina. A atividade antioxidante de uma amostra é considerada alta quando o valor da unidade de equivalência (mg de amostra/mg de ácido ascórbico) é próximo de 1 e, segundo os resultados observados na tabela 14, os valores de equivalência para todos os extratos testados foram altos, indicando a ausência da atividade.

Tabela 14. Resultados dos ensaios de atividade antioxidante frente ao DPPH e ao complexo Fe3+/fenantrolina, dos extratos, ± desvio padrão.

Extrato Valores médios frente ao DPPH Valores médios frente ao complexo 3+ Fe / fenantrolina 2+ |∆ABS517| [AA]eq Equiv. [Fe ] [AA]eq Equiv.

Calos Hex 0,006 0,026 -18,661 -0,047 0,047 236,10

Calos AcOEt 0,004 0,005 -2010,364 -0,037 0,063 92,66

Calos MeOH 0,011 0,066 75,452 0,110 0,294 17,48

Sus. Hex 0,002 -0,009 35,802 -0,072 0,008 923,19 Sus. AcOEt 0,012 0,072 70,168 -0,029 0,076 65,72 Sus. MeOH 0,007 0,029 247,982 -0,069 0,013 -118,50

Os antioxidantes são substâncias que são capazes de reduzir os radicais livres oxidativos. Flavonoides, outras substâncias fenólicas, carotenoides e alcaloides são os principais antioxidantes em produtos naturais, e suas atividades antioxidantes foram demonstradas em estudos anteriores (Gan et al., 2017; Pu et al., 2013; Yin et al., 2010; Stahl e Sies 2003). Neste trabalho, a comparação química por CCDC dos extratos das culturas in vitro de D. saccifera sugeriu a ausência de flavonoides ou alcaloides (sessão 5.4). Além disso, as culturas de calos e suspensões foram totalmente friáveis e esbranquiçados, o que sugere ausência de carotenoides, os quais são pigmentos responsáveis pela cor amarela, laranja, vermelha ou verde escura. A ausência das substâncias mencionadas anteriormente pode explicar a ausência da atividade antioxidante nos extratos.

6. CONCLUSÕES

 Os extratos de calos e suspensões celulares apresentaram um perfil químico semelhante, sendo os extratos das plântulas notavelmente diferentes, todos os extratos se mostraram ricos em terpenos.  A comparação do perfil químico dos extratos das culturas e de explantes com diferentes graus de diferenciação possibilitou verificar a presença de iridoides somente nas culturas com células diferenciadas.  Culturas in vitro de D. saccifera representam uma fonte importante de biomassa visando o estabelecimento de plataformas rentáveis de produção.  Substâncias antimicobacterianas previamente estudadas, β-sitosterol, estigmasterol, ácido oleanólico e ursólico foram obtidos pela primeira vez em culturas in vitro desta espécie.  As plântulas in vitro de D. saccifera são produtoras do iridoide éster metílico de monotropeína, obtido pela primeira vez na espécie.  Dos extratos testados, apenas os extratos AcOEt dos calos e suspensões e o extrato hexânico dos calos apresentaram atividade antibacteriana frente as bactérias gram-negativas A. baumannii, S. enteritidis e S. marcescens.  O extrato AcOEt das suspensões celulares e o éster metílico de monotropeína, apresentaram atividade antiangiogênica significativa.  Os extratos de calos e suspensões celulares não apresentaram capacidade antioxidante.  As culturas in vitro de D. saccifera têm um amplo potencial para o suprimento de metabólitos secundários ativos, principalmente terpenos.

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8. ANEXOS Anexo 1. Mapa de correlação COSY substância I e II

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

-0.5

-1.0

-1.5

-2

4 2 0 F1 Chemical Shift (ppm) 98

Anexo 2. Mapa de correlação HSQC substancia I e II

F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical

140

120

100

60 40

20 0 F1 Chemical Shift (ppm) 99

Anexo 3. Mapa de correlação HMBC substancia I e II

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5 F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

-0.5

-1.0

150

100

50 0 100

F1 Chemical Shift (ppm)

Anexo 4. Mapa de correlação HMBC substancia III e IV

4.0

3.5

3.0

2.5

F2 Chemical Shift (ppm)

2.0

1.5

1.0

0.5

-0.5

150

100

50 0

F1 Chemical Shift (ppm) 101

Anexo 5. Mapa de correlação COSY substancia V

F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical

-1

10 5 0 F1 Chemical Shift (ppm) 102

Anexo 6. Mapa de correlação HSQC substancia V

F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical 5

140 120

100 103

40 20

F1 Chemical Shift (ppm) Anexo 8. Mapa de correlação HMBC substancia V

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 F2 Chemical ShiftF2 (ppm) Chemical 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 150 100 50 0 F1 Chemical Shift (ppm)

104