Facultad de Biología Doctorado Interuniversitario en Acuicultura

TESIS DOCTORAL

Estrategias de manejo genético y reproductivo para la fundación, domesticación y cultivo de stocks de cherna, Polyprion americanus

Nédia Remália Delma Matusse

Marzo 2015

PABLO PRESA MARTÍNEZ, Dr. en Genética y Profesor Titular de Universidad en la Facultad de Ciencias del Mar de la Universidad de Vigo, MONTSERRAT PÉREZ RODRÍGUEZ, Dra. en Biología y Científico Titular de OPIs del Instituto Español de Oceanografía – Centro Oceanográfico de Vigo, y JOSÉ BENITO PELETEIRO ALONSO, Dr. en Biología y Científico Titular de OPIs del Instituto Español de Oceanografía – Centro Oceanográfico de Vigo, en calidad de directores de investigación,

INFORMAN

Que la memoria titulada “Estrategias de manejo genético y reproductivo para la fundación, domesticación y cultivo de stocks de cherna, Polyprion americanus", que presenta Dña. NÉDIA REMÁLIA DELMA MATUSSE, para optar al Grado de Doctora por la Universidad de Vigo, ha sido realizada bajo su dirección en el Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología de la Universidad de Vigo y en el Área de Acuicultura del Instituto Español de Oceanografía de Vigo. El presente compendio de trabajos experimentales, cumple los requisitos científicos de rigor, objetividad, autenticidad y originalidad, por lo que AUTORIZAN SU ADMISIÓN A TRÁMITE, en formato de Tesis Doctoral, para su presentación y defensa ante el tribunal examinador.

En Vigo, 02 de febrero de 2015

Fdo.: Pablo Presa Martínez Fdo.: Montse Pérez Rodríguez Fdo.: José Benito Peleteiro Alonso

Fdo. (El doctorando): Nedia R. D. Matusse

AGRADECIMENTOS

Antes de iníciar os meus agradecimentos gostaria de explicar a forma como surgiu e decorreu esta tese. Desde que comecei a estudar a carreira universitária na área de produção animal no curso de Eng. Zootécnica, sempre tive o desejo de trabalhar com peixes e conhecer todas as possiveis formas de explorar a área. Nunca trabalhei duas vezes com a mesma espécie e sempre mudei de área de estudo. Começei com nutrição de tilápias, passei para a reprodução e nutrição de linguados e acabei por fazer uma tese de mestrado. Parece fácil deduzir que não segui um plano, mas sim que me entusiasmei com coisas que apareciam e que me ofereciam alguma oportunidade de aprendizagem. Assim foi com esta tese. Precisava de um tema para uma tese de doutoramento, algo compatível com a realidade e necessidade de meu País (Moçambique). Não levei muito tempo a decidir embora tivesse meus temores, me aproximei mais a área de genética molecular. Seguiram- se poucos anos para o que deveria para me tornar parecida a meus orientadores e sei que para mim não é fim. Um amigo disse-me um dia: “cada dia é um presente, e não um direito adquirido”. Por esse motivo quero em primeiro lugar agradecer a Deus pela vida e disposição mental. Mais enquanto se vive, há gastos, necessidades em vários sentidos e notamos o encaixe perfeito de algumas peças, como um quebra-cabeça. Somente com o suporte fundamental é que obtemos êxito.

Agradeço ao MCT (Ministério de Ciência e Tecnológia) de Moçambique, por ter apostado em mim e contribuido financeiramente através de uma subvenção predoctoral do programa de bolsas para pós-graduados de Mundial Bank/Associação Internacional de Desenvolvimento (IDA), em Espanhã durante a minha formação. A Universidade de Vigo por me terem concedido esta oportunidade de cursar o Doutorado em Aquacultura; ao Centro Oceanográfico de Vigo (IEO) por me autorizar a realizar práticas, colecta de amostras e todo matérial que me foi necessário para a pesquisa.

Tenho muito mais por agradecer aos meus orientadores, que me aguentaram estes anos, ao Dr. Pablo Presa Martínez da Universidade de Vigo, por ter aceitado no desáfio de orientar uma estudante com dificuldades em se espressar na lingua Espanhola. Agradeço principalmente todo o empenho e generosidade que sempre teve para a realização deste trabalho, tentando sempre conciliar as suas demais actividades académicas com a minha tese. À Dra Montse Perez, primeiro por ter ariscado em colocar-me em parte no projecto GENMOL2 com a espécie em questão, pela orientação oferecida e paciência, na ajuda com todo tipo de matérial e disponibilidade demonstrada, que foram importantes para a realização desta tese. Jamais chegarei a ter seu nível intelectual mais para mim foi com muito gosto que estive perto de si estes dois anos e meio, adquirido os conhecimentos que tenho hoje sobre genética. Ao Dr. Tito Peleteiro, por toda ajuda na parte zootécnica desta Tese, na aquisição de amostras e de dados durante o curso. Sou uma rapariga felizarda, por lhe ter como orientador, seu animo e bom humor foi contagiante.

Ao colega Dr.Alfonso Pita, que agradeço especialmente por toda a orientação e ajuda na resolução das dúvidas que apresentei de principiante, a ajuda no laboratorio e na redação de manuscritos e ao colega Manuel Nande pela ajuda no Capítulo 2. Aos demais colegas de trabalho de laboratório Rexenmar XB4: (Yassine, Borja, José, M. Isabel e Angie) quero dedicar-vos este pedaço de um provérbio: “…se voce para de aprender, logo esquecerá o que sabe”. Em convivência aprendi muito de diferentes formas, sería interessante lembrar-me de cada bom e/ou mau momento passado ao vosso lado.

Aos investigadores e técnicos do Instituto Español de Oceanografia IEO-Vigo, que sustentou o material de pesquisa utilizado no estudo do capítulo 1. Ao persoal participante das empresas IGAFA, Luso Hispana de Acuicultura, e Aquarium Finisterrae, que gentilmente fornecerem amostras dos estoques empregadas no Capítulo 1 e em especial ao Antonio Vilar (Aquarium Finisterrae) e Jose Luis Rodríguez Villanueva (IGAFA). Ao SC Department of Natural Resources- Marine Resources Research Institute, Hollings Marine Lab (Tanya L. Darden) e ao Departamento de Oceanografia e Pescas da Universidade dos Açores e ao IEO-Canárias pela gentileza de nos fornecerem amostras de cherne que foram utilizadas no capítulo 2 desta tese. Ao Evaristo Mañanós do Consejo Superior de Investigaciones Científicas de Castellón, pela ajuda com as análises dos esteróides sexuais do Capítulo 3. Aos companheiros de planta de cultivo do IEO-Vigo principalmente (Castora, Gloria e Ernesto), pela simpátia, bom ambiente e ajuda prestada para obtenção de fotos, detalhes de maneio dos chernes e transporte, guardo um carinho espécial por voces e pelos demais que não irei citar.

Ao Tio Loiro Machava pela amizade e paciência nas correções autográficas do Português e sugestões e toda ajuda prestada principalmente em alguns tramites académicos em Moçambique. Aos meus pais Delma Fugel e André Matusse pelo amor incondicional, paciência com a minha larga ausência (10 anos), apoio e presença constante, vocês são os melhores pais que poderia sonhar ter. Aos meus irmãos Adriel Timótio e Eunício Joel pelo carinho amizade e compreensão de minha longa ausência fisica. Sem vocês a vida teria muito menos brilho.

As amigas em espécial a Elda Canda pelas longas conversas sobre o que “não estudavamos”, a Cristina Cambule pelos desáfios que passamos juntas ainda que com uma distância fisíca e pudemos melhorar na melhor parte de nossas vidas, a Teresa Perez amiga e médica de todos os dias, seu estimulo para lutar e vencer o que venci foi fundamental, Marjori pelo carinho que me passaste não tens idade para ser minha mãe mais cuidaste de mim como se fosses, a Lassalette Cunha pela amizade e bons momentos passados, Odete e Daphne Marino que me escutaram muitas vezes deram-me forças e me fizeram sorrir debaixo da neve e virtualmente em vários momentos e ao Joel Rodolfo pela amizade e ajuda na realizção da capa deste trabalho.

Enfim, às pessoas queridas que, ao longo dos anos, tocaram a minha vida, me ajudaram, sem sequer saber. Com palavras, olhares, ouvidos, abraços, estímulo… Vocês foram presentes de Deus para mim!

A todos os meus mais sinceros agradecimentos “é impossivel ser feliz sozinho”.

Aos meus pais (Delma e André) e a sobrinha Karén.

“Leave no stone unturned Leave your fears behind And try to take the path less travelled by That first step you take is the longest stride”. Nickelback

SUMÁRIO Índice de contenidos ...... i Lista de tabelas ...... ii Lista de figuras ...... iii Resumen ...... iv Resumo...... vi Abstract ...... viii RESUMEN EN CASTELLANO ...... 3 ÍNTRODUÇÃO Íntrodução ...... 13 Objectivos gerais da tese ...... 16 Introduction ...... 20 Objectives of the thesis ...... 23 CAPITULO I. DERIVA GENÉTICA DA PRIMEIRA GERAÇÃO E O RISCO ENDOGÁMICO EM ESTOQUES DE CULTIVO DE CHERNE POLYPRION AMERICANUS Resumen/Resumo/Abstract ...... 27 Íntrodução ...... 30 Matériais e métodos ...... 33 Resultados ...... 38 Discussão ...... 46 Referências bibliográficas ...... 51 CAPITULO II. ESTRUTURA GENÉTICA E DINÂMICA POPULACIONAL DE CHERNE (POLYPRION AMERICANUS) NO ATLÂNTICO NORTE Resumen/Resumo/Abstract ...... 59 Introdução ...... 62 Material e métodos ...... 64 Resultados ...... 70 Discussão ...... 84 Referências bibliográficas ...... 88 CAPITULO III- POTÊNCIAL REPRODUTIVO DO CHERNE (POLYPRION AMERICANUS) CULTIVADOS EM CATIVEIRO NA COSTA DE GALICIA Resumen/Resumo/Abstract ...... 95 Introdução ...... 98 Matériais e métodos ...... 100 Resultados e discussão ...... 103 Conclusão ...... 119 Referências bibliográficas ...... 120 CONCLUSÃO ...... 127 REFERÊNCIAS GERAIS ...... 133 PRODUÇÃO CIENTÍFICA DA TESE ...... 145

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LISTA DE TABELAS (descrição abreviada)

Capitulo I

Tabela 1. Tabela de amostragem do cherne ...... 35 Tabela 2. Marcadores moleculares empregados ...... 35 Tabela 3. Paramêtros estimados con microssatélites...... 39 Tabela 4. Estatística de paramêtros diversidade genética...... 40 Tabela 5. Simulação de progênies F1 e F2...... 42 Tabela 6. Distribuições Rxy (Parentesco)...... 45

Capitulo II

Tabela 1. Amostragem mundial do cherne...... 65 Tabela 2. Condições de amplificação dos microssatélites ...... 67 Tabela 3. Paramêtros genéticos estimados sobre microsatélites ...... 71 Tabela 4. AMOVA sobre variança molecular ...... 74 Tabela 5. Paramêtros de diferenciação génica ...... 75 Tabela 6. Taxas de migração a escala mundial ...... 76 Tabela 7. Taxas de migração no Norte Atlântico ...... 77 Tabela 8. Evolutionary divergence entre os estoques regionais de P. americanus ...... 80 Tabela 9. Haplótipos de CO I mtADN sequênciados na espécie ...... 81

Capítulo III

Tabela 1. Dados de cultivo de cherne nos viveiros ...... 102

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LISTA DE FIGURAS (descrição abreviada)

Introdução Geral

Figura 1. Foto da espécie Polyprion americanus em cultivo ...... 13 Figura 2. Mapa de distribuição de P. americanus...... 14

Capitulo I

Figura 1. Colecção de amostras de cherne em viveiros galegos ...... 34 Figura 2. Análise das Coordenadas Principais (PCoA) ...... 41 Figura 3. Frequência do índice de parentesco Rxy ...... 43

Capítulo II

Figura 1. Locais conhecidos comuns de captura da espécie P. americanus ...... 62 Figura 2. Localização da colecção das amostras de P. americanus ...... 66 Figura 3. Frequências alélicas dos microssatélites nas populações...... 72 Figura 4. Análise das Coordenadas Principais (PCoA) ...... 73 Figura 5. Árvore filogenética construida com o gene mitocondrial CO I ...... 79 Figura 6. Network de relacção molecular entre os haplótipos CO I ...... 82 Figura 7. Árvore filogenética construida com o gene nuclear Rodopsina ...... 83

Capítulo III

Figura 1. Distribuição mundial de capturas do cherne ...... 99 Figura 2. Mapa de localização estoques do cherne en Galicia ...... 101 Figura 3. Temperatura de cultivo empregada no ensaio ...... 104 Figura 4. Relação comprimento-peso do cherne cultivado ...... 106 Figura 5. Média do peso e comprimento do cherne cultivado ...... 108 Figura 6. Corte histológicos de gónadas masculinas e femeninas de cherne...... 112 Figura 7. Gónadas femininas-ovários (A) e masculinas-testículos (B)...... 113 Figura 8. Concentrações hormonais empregadas nos tratamentos...... 115 Figura 9. Fotos de ovos e larvas do cherne obtidos em viveiro ...... 119

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Resumen

La cherna Polyprion americanus es un componente de las pesquerías dirigidas y multiespecíficas en todo su rango de distribución y recientemente ha sido seleccionada por su gran potencial en acuicultura: los adultos pueden alcanzar 100 cm de longitud, muestran una baja tasa de mortalidad natural y son muy longevos. Dado que es una de las especies más prometedoras para la acuicultura, en la última década se fundaron varios stocks en criaderos gallegos.

Capítulo 1. Es bien sabido que la domesticación y la gestión de recursos en un criadero requieren una estrategia adecuada para la fundación inicial del stock de reproductores y su manejo reproductivo. Por lo tanto la combinación de marcadores genéticos con estrategias clásicas de domesticación parece ser un método útil para evitar la deriva genética y los efectos adversos derivados de la consanguinidad. En este estudio hemos aplicado marcadores microsatélites a los cuatro stocks de chernas disponibles en criaderos gallegos, para determinar su grado de divergencia genética frente a una población salvaje del Atlántico. Demostramos que existe diferenciación genética significativa (5.43% de la varianza genética) debida a deriva de muestreo y que una pronunciada pérdida de diversidad (44% de la diversidad alélica) es patente en el 80% de los stocks, con respecto a la riqueza genética de la población salvaje. El uso de marcadores moleculares también ayuda a evitar la endogamia, permitiendo establecer la relación genética dentro de un lote de reproductores. Hemos probado el resultado de dos estrategias de apareamiento dentro y entre poblaciones, con el objetivo de determinar la estrategia más adecuada de gestión de este recurso en el espacio y tiempo usando simulaciones in silico. Nuestros resultados muestran que un escenario de cruzamientos inter-criadero resulta mucho más ventajoso para evitar la endogamia que el apareamiento dentro de cada criadero.

Capítulo 2. Los estudios genéticos previos han sugerido una diferenciación importante de P. americanus entre el Atlántico Norte y Atlántico Sur, bien usando ADN mitocondrial bien marcadores microsatélites. Sin embargo, no ha podido demostrarse hasta el momento si existe o no una mayor estructuración dentro del Atlántico Norte, aparentemente homogéneo. Hemos aplicado marcadores microsatélites neutros y secuencias nucleares y mitocondriales, a un muestreo temporal de chernas del Atlántico Norte para clarificar esta situación. Los datos experimentales muestran un valor de diferenciación global entre muestras de 13%, principalmente debido a la divergencia entre los diferentes pools génicos (24%): Atlántico Norte, Atlántico Sur, Sudáfrica y Oceanía. Sin embargo, las poblaciones atlánticas parecen conectarse sistemáticamente a través de migraciones longitudinales desde Carolina USA hacia aguas del este Atlántico. Este resultado es clave para entender la dinámica de poblaciones que rige a las chernas, así como para el diseño correcto de las estrategias de explotación.

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Capítulo 3. Aunque la cherna (Polyprion americanus) es una especie de alto valor comercial, muestra alta tasa de crecimiento en la fase juvenil, tiene carne de buena calidad y un gran potencial en acuicultura, todavía hay poca información en cuanto a su tecnología de cultivo. El objetivo de este estudio es describir el comportamiento reproductivo de la cherna en criaderos gallegos. Los experimentos se realizaron en tres criaderos diferentes a lo largo de la costa de Galicia, el Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), el Instituto Gallego de Formación en Acuicultura (IGAFA) y el Aquarium Finisterrae, entre 2011 y 2013. Durante ese período se efectuó el seguimiento de parámetros tales como crecimiento, nutrición y reproducción. Se tomaron muestras sanguíneas en el IEO-Vigo para el análisis de la madurez sexual mediante la técnica de Ramos (1986), donde se midieron los niveles de varias hormonas, i.e. 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) y la testosterona 11-ceto (11-KT). Aunque la madurez sexual se ha confirmado en algunos individuos, solamente se observó un desove en un tanque de prueba, con y sin inducción hormonal. En cuanto al género, tanto el peso como el crecimiento evolucionaron significativamente en los stocks del IGAFA y del IEO y se observaron diferencias significativas en la ganancia de peso entre sexos, en los tanques del Aquarium Finisterrae y el IEO.

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Resumo

O cherne Polyprion americanus é um componente da pesca dirigida e multiespecífica em todo o sua faixa de distribuição e recentemente foi identificada pelo seu grande potêncial na aquacultura: os adultos podem alcançar os 100 cm de comprimento, mostram uma baixa taxa de mortalidade natural e são de longa vida. Dado que é uma das espécies mais promissoras para a aquacultura, na última década fundaram-se vários estoques em viveiros galegos.

Capítulo 1. Sabe se perfeitamente que a domesticação e a gestão dos recursos em viveiros requerem de uma estratégia adequada para a fundação inicial de um estoque de reprodutores e o seu maneio reprodutivo. Por tanto, combinação de marcadores genéticos com estratégias clássicas de domesticação parece ser um método útil para evitar a deriva genética e os efeitos adversos derivados da consanguínidade. Neste estudo aplicamos marcadores microsatélite a quatro estoques de chernes disponiveis em viveiros galegos para determinar o grau de divergência genética, assim como a uma população salvagem do Atlântico. Demostramos que existe diferenciação genética significativa (5.43% da variança genética) devido a deriva de amostragem e que uma pronunciada pérda da diversidade (44% da diversidade alélica), é patente em 80% dos estoques com respeito a riqueza genética da população salvagem. O uso de marcadores moleculares tambem ajuda a evitar a endogámia, permitindo estabelecer a relação genética dentro de um lote de reprodutores. Provamos o resultado de duas estratégias de acasalamento dentro e entre populações, com o objectivo de determinar a estrátegia mais adequada de gestão deste recurso no espaço e no tempo usando simulações in silico. Nossos resultados mostram que um cenário de cruzamentos inter-viveiros resultaría muito mais ventajoso para evitar a endogamia que ao acasalamento dentro de cada viveiro.

Capítulo 2. Estudos genéticos anteriores a este, sugeriram uma difrenciação importante entre populações do Norte Atlântico e do Atlântico Sul utilizando o ADN mitocondrial e marcadores microssatélite. No entanto, não foi possivel demostrar-se até ao momento se existe ou não uma maior estrutura dentro do Norte Atlântico, aparentemente homogenio. Aplicamos marcadores de microsatelite neutros e sequências, nucleares e mitocondriais a um mostreio temporal de chernes do Atlântico Norte para clarificar esta situação. Os dados experimentais mostram um valor de diferenciação global entre amostras de 12.7% principalmente devido a divergência entre os três diferentes pools génicos: Norte Atlântico, Atlântico Sul e Oceanía. No entanto, as populações atlánticas parecem conectar-se sistemáticamente através de migrações longitudinais desde Caroline até as águas sul ocidentais. Este resultado é chave para entender a dinâmica de populacional que regen nos chernes, assim como para o desenho correto das estratégias de exploração.

Capítulo 3. O Cherne (Polyprion americanus) é uma espécie com um alto valor comercial, alta taxa de crescimento na fase juvenil, boa qualidade de carne e ter grande potêncial na aquacultura ainda

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são escassas informações desta espécie, principalmente em dados relacionados com o seu cultivo em cativeiro. O objectivo deste estudo visa descrever o comportamento reprodutivo do cherne em viveiros galegos. A experiência foi conduzida em três unidades de cultivo diferentes, no Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), no Instituto Galego de formação em Aquacultura (IGAFA) e no Aquarium Finisterrae, no período de 2011 a 2013. Durante o periodo em que decorreu o ensaio, se efectuou o monitóramento de parametros como o crescimento, alimentação e reprodução. Recolheram-se amostras de sangue, no IEO-Vigo para a confirmação da atividade sexual utilizando a técnica de Ramos (1986), onde foram medidos os níveis de 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) e 11-keto testosterona (11-KT). Embora a maturação sexual tenha sido confirmada em alguns individuos, somente foram observadas desovas em um tanque de ensaio, com e sem indução sexual. Em relação ao genero sexual, peso e crescimento apresentaram-se evoluidos de forma signifivativa (P<0.05), para os estoques de IGAFA e IEO. Para o estoque do Aquarium Finisterrae e do IEO o ganho de peso não foi observado diferenças significativas entre os sexos.

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Abstract

The wreckfish Polyprion americanus is a component of directed and admixed species fisheries throughout its range and has recently been identified for its large aquaculture potential: adults reach 100 cm in length, show low natural mortality rates and longevity. Since it is one of the most promising species for aquaculture several stocks were founded in Galician hatcheries in the last decade.

Chapter 1. It is well known that domestication and management of hatchery stocks require an adequate strategy for the initial broodstock foundation and its further reproductive management. Therefore the combination of genetic markers with classic domestication strategies seems to be a useful approach to skip genetic drift and consanguineous-derived adverse effects. In this study we have first applied microsatellite markers to the four wreckfish stocks being harvested in Galician hatcheries to determine the extent of their genetic divergence as well as their wild source Atlantic population. We show that a significant genetic differentiation (5.43% of the whole genetic variance) was created among broodstock by sampling drift and that a pronounced loss of diversity (44% of allelic diversity) is patent in 80% of them regarding the genetic richness of the wild source population. The use of molecular markers also helps avoid uncontrolled inbreeding, by allowing establish genetic relatedness within a broodstock batch. Using computer simulations we have tested the outcome of two mating strategies within and between stocks, aiming to determine the most suitable management strategy to this resource in space and time before reproduction and hatchery transfers begun. Our results show that interhatchery breeding scenario results far more advantageous in retardation of inbreeding than mating within each stock.

Chapter 2. Previous genetic studies on wreckfish have suggested a significant differentiation between North Atlantic and South Atlantic populations using mitochondrial DNA and microsatellite markers. Nevertheless it remains elusive whether further structuring exists within the apparently homogeneous north Atlantic stock. We have applied neutral microsatellite markers and both, nuclear and mitochondrial sequences to temporal wreckfish samples from the whole north Atlantic in order to clarify the above scenario. Experimental data showed a global 12.7% differentiation among samples mainly due to divergence among three different gene pools: North Atlantic, South Atlantic and Oceania. However, Atlantic populations seem to be systematically connected through longitudinal migrations from Caroline waters to south-western Euro-African waters. This result is key to understand wreckfish population dynamics as well as to properly design its exploitation rules.

Chapter 3. Although the wreckfish (Polyprion americanus) has high commercial value, high growth rate in the juvenile phase, good quality meat and great potential in aquaculture, there is still little information regarding its cultivation technology. The aim of this study is to describe the

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reproductive behavior of wreckfish in Galician hatcheries. The experiments were conducted from 2011 to 2013 in three different hatcheries along the coast of Galicia, the Oceanographic Centre of Vigo (IEO-Vigo), the Galician Institute for training in Aquaculture (IGAFA) and the Aquarium Finisterrae. Parameters such as growth, nutrition and reproduction were tracked throughout the period. Blood samples were taken at IEO-Vigo for confirmation of sexual activity using the Ramos technique (1986), where levels of various hormones were measured, i.e. 17-beta-estradiol (E2), testosterone (T) and 11-keto testosterone (11-KT). Although sexual activity has been confirmed, spawning was only observed in one test tank, with and without sexual induction. Regarding gender, both growth and weight evolved significantly (P <0.05) in the strains of IGAFA and IEO. No significant differences in weight gain were observed between sexes in the tanks of Aquarium Finisterrae and IEO. These swarm of results allow to be optimistic about the feasibility of domestication of this grouper species because we accumulate more and better know-how priors to its cultivation as regarding starting points in previously domesticated species.

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Resumen en Castellano

Resumen en Castellano

Generalidades taxonómicas sobre Polyprion americanus

La cherna Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801) pertenece a la familia de los Serranideos. Su nombre científico proviene del latín (polus = muchos, prion = sierra), en alusión a sus prominentes aletas espinosas. Esta especie se confunde en ocasiones con otras pertenecientes al mismo género, como Polyprion oxygeneios, Polyprion mocone y Polyprion yaneri. Estas tres especies tienen una distribución geográfica que en algunas áreas solapa con P. americanus. P. oxygeneios se encuentra comúnmente en las costas de América del Sur, Australia y en el Océano Índico, P. mocone también se encuentra en las costas de Australia y Nueva Zelanda, y P. yaneri se encuentra sólo en las costas de Chile.

Tanto P. americanus tanto P. oxygeneios pueden alcanzar entre 1,5 y 2 m de longitud (Roberts, 1996) pueden vivir más de 60 años y su etapa juvenil es pelágica (~ 50 m de profundidad) desde el nacimiento hasta cerca de los 4 años, y demersales cuando son adultos (1.000 m de profundidad) (Francis et al., 1999; Sedberry et al., 1999). P. americanus se considera una especie en peligro crítico en Brasil según la IUCN, y tanto en Bermudas como en Sudáfrica es una especie protegida (Wakefield et al., 2013). Esta especie es un gran teleósteo también de gran tamaño y físicamente similar al Mero, Epinephelus marginatus (Lowe, 1834), que tiene una cabeza espinosa, boca grande, cuerpo robusto, espinas finas de aspecto ovalado en su ornamentación, escamas de tamaño pequeño que se distribuyen por todo el cuerpo, incluyendo la cabeza y la base carnosa de las aletas dorsal y anal (Figura 1).

Figura 1. Espécimen de P. americanus perteneciente al stock del IEO-Vigo

3 Resumen en Castellano

Distribución geográfica y migración de la especie Polyprion americanus

La especie P. americanus es cosmopolita y se encuentra en regiones anti-tropicales. La mayoría de las chernas jóvenes (hasta los 30 cm) son comúnmente capturadas en el norte del Océano Atlántico, por lo general asociadas con objetos flotantes, donde pueden vivir durante su primer año (Roberts, 1989, 1996; Francis et al., 1999; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000). En su etapa demersal, a los 300-1000 m de profundidad, han sido vistas en las islas de Azores y Madeira (28°S - 31°S) (Sedberry et al., 1996; Machias et al., 2003) principalmente en la época de desove (Peres y Klippel, 2003), que tiene lugar en los meses de Noviembre a Marzo en el centro y sur del Océano Atlántico, desde los 23°37`S hasta 46°S. El desove tiene lugar durante el invierno y la primavera en la región Sur del Pacífico, el Océano Índico y el Mar Mediterráneo (Figura 2; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000). Es un pez con una actividad migratoria juvenil como se observa en los ejemplares capturados en el Atlántico Norte, que son supuestamente movidos por la corriente del Golfo. Sin embargo, no se sabe con certeza el origen de estos peces emigrantes o el tiempo que tardan en completar esta migración (Peres y Klippel, 2003). Se sabe que la migración de estos peces tiene dirección atlántico norte a partir de su región central, de finales del invierno a principios de primavera, motivados por la búsqueda de aguas más cálidas. Las chernas del hemisferio Sur también inician migración hacia el norte (Sur del Brasil) para el desove, durante el invierno y la primavera, procedentes de la costa Argentina, y retornan hacia el sur en verano. En el sudeste de América, Australia y Nueva Zelanda se encuentran meros con diferentes ciclos de vida (Peres, 2000; Peres y Haimovici, 2003). Esta migración es un factor importante en esta especie, ya que afecta a la diversificación genética, pues aumenta la diversidad de alelos en las poblaciones involucradas en la migración.

Figura 2. Mapa de distribución mundial (en color rojo) de la cherna Polyprion americanus (Aquamaps, 2013).

4 Resumen en Castellano

Aspectos anatómicos y comportamiento de P. americanus

La cherna es un pez de larga vida (60-80 años) y de mortalidad baja (0.05% - 0.09%). Durante la etapa juvenil el crecimiento es muy rápido y en el período adulto el crecimiento es más lento y diferente en cada sexo. Al igual que la mayor parte de los peces teleósteos, P. americanus es una especie exclusivamente carnívora (Wooton, 1990; Peres, 2000), con una boca grande y protráctil, un estómago bien desarrollado, con un solo ciego pilórico e intestino corto y proporcional a la longitud del cuerpo del pez. Las presas usuales del P. americanus son especies de hábitos bentónicos, demersales y pelágicos y a menudo se encuentran en los mismos lugares que los meros. Según Peres y Haimovici (2003), durante la juventud se alimentarían más de pescado como Merluccius hubbsi, y en la fase adulta preferirían más los calamares (Illex argentinus) y los cangrejos (Chaceon notialis).

Estructura reproductiva y genética de P. americanus

En la especie P. americanus las gónadas se separan de los riñones por la vejiga natatoria. Es una especie dioica y la organización de los ovarios y de los testículos sigue un patrón de peces teleósteos dioicos. Los huevos y los juveniles son pelágicos y éstos, asociados a objetos flotantes cerca de la superficie, pueden pasar cuatro años antes de tornarse demersales. El ciclo reproductivo anual está sincronizado en un grupo de población en particular, con múltiples desoves entre 2 y 7 millones de huevos, de acuerdo con el tamaño de la hembra, la época de desove y la maduración tardía, que se alcanza a los 70 cm en los machos y entre 74 y 90 cm en las hembras, i.e. se considera adulto siempre que llegue a los 69 cm, talla en la que pertenecen al grupo de edad de 8 a 12 años (Sedberry et al., 1999; Peres y Klipel, 2003). Poco se sabe sobre el cultivo de la cherna y su reproducción en cautividad, por lo que es una de las limitaciones para la reproducción de la especie en acuicultura (Suquet et al., 2001). Algunas experiencias de reproducción natural exitosas llevadas a cabo en el Atlántico Sur, Galicia, el Pacífico y el Mediterráneo y la inducción reproductiva en Grecia, han demostrado que es viable el cultivo en cautividad (Capítulo 3; Papandroulakis et al., 2008). Pero el logro de huevos viables y el desarrollo esperado todavía están en cuestión.

Según Sedberry et al. (1996), tras comparar la longitud de fragmentos de polimorfismos de la restricción de la región ND1 del ADN mitocondrial del P. americanus, indicaron una homogeneidad genética dentro de las poblaciones del Atlántico Norte, y también en la población del Sur. El haplotipo de ADN mitocondrial para la población del Atlántico Este indica que este grupo tiene una mayor similitud que el de Brasil, Australia y Nueva Zelanda, que tenían las mismas endonucleasas. En otro estudio poblacional de cherna, con marcadores microsatélites llevado a cabo por Ball et al. (2000), se puso de manifiesto la existencia de un grupo genéticamente homogéneo en el Atlántico Norte. Los autores utilizaron muestras de peces recogidas en el 5 Resumen en Castellano

archipiélago de Madeira y las Azores, en Portugal continental y el norte de África en Marruecos, y obtuvieron una gran distancia genética entre la población de P. americanus del Brasil y de la región del Pacífico Sur (Este de Australia y Nueva Zelanda) similar a la observada entre P. americanus y P. oxygeneios, lo que sugiere la posibilidad de una tercera especie del género Polyprion ubicado en las costas de Australia y Nueva Zelanda.

Objectivos de la Tesis Doctoral

La cherna (Polyprion americanus) es una especie con origen Atlántico, que se encuentra también en la costa Sudamericana, donde se distribuye en numerosos núcleos de poblaciones. El interés de esta especie en acuicultura es alto, debido a sus cualidades organolépticas, facilidades de adaptación zootécnica, bajo índice de mortalidad y resistencia en cultivo. En España es una de las especies con prioridad para la domesticación a causa de su valor de cultivo a escala industrial, por lo que se han mantenido stocks de la especie en cautiverio durante los últimos años. Si bien se lograron algunas puestas, las mismas no tuvieron viabilidad en cautiverio.

En esta Tesis Doctoral se analizan los aspectos relacionados con la aplicación de la Genética a la gestión de los stocks de reproductores de cherna disponibles en Galicia lo que constituye el capítulo 1, que tiene por título Deriva genética en primera generación de cultivo y riesgo endogámico en stocks de cultivo de la cherna, Polyprion americanus. En el capítulo 2, titulado Estructura genética y dinámica poblacional de la cherna (Polyprion americanus) en el Atlántico Norte, hemos aplicado marcadores microsatélites neutros y secuencias, nucleares y mitocondriales, a un muestreo temporal de chernas del Atlántico Norte, para clarificar la diferenciación entre el Atlántico Norte y Atlántico Sur sugerida en trabajos genéticos anteriores. El capítulo 3, bajo el título Potencial reproductivo de la cherna (Polyprion americanus) cultivada en cautiverio en la costa de Galicia, está dedicado al manejo reproductivo de la especie en cautividad.

El objetivo principal del Capítulo 1 consistió en detectar la causa y cuantificar la erosión genética asumida de los cuatro stocks de cherna mantenidos en cautividad, con respecto a su población originaria del Este Atlántico. Se utilizaron los peces mantenidos en cautiverio en el Centro Oceanográfico de Vigo (COV) del Instituto Español de Oceanografía, del IGAFA (Instituto Gallego de Formación en Acuicultura), el Aquarium Finisterrae sito en A Coruña y muestras de las chernas mantenidas en la empresa Luso Hispana de Acuicultura en Valdoviño. Todos ellos están aclimatados desde 2007 y son candidatos a formar uno o dos stocks de reproductores seleccionados. Para poder efectuar el diseño de los stocks de reproductores se avanzó en la identificación genética de los mismos y en la determinación del parentesco dentro de cada unidad de cultivo, como un paso decisivo para evitar la endogamia cuando estos peces se reproduzcan. Por otro lado, dado que en la actualidad se han obtenido pocas puestas espontáneas, en este capítulo tratamos de dibujar el escenario probable de la evolución de los parentales, calculando el

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coeficiente de endogamia mediante la simulación de apareamiento aleatorio en dos situaciones con ventajas reproductivas en relación con las prácticas actuales en cautiverio.

Para todo ello, en este capítulo aplicamos marcadores microsatélites a los cuatro stocks de cherna disponibles para determinar el grado de divergencia genética, así como a una población salvaje del Atlántico. Demostramos que existe diferenciación genética significativa (5.43% de la varianza genética) debida a la deriva de muestreo y que una pronunciada pérdida de diversidad (44% de la diversidad alélica) es patente en el 80% de los stocks con respecto a la riqueza genética de la población salvaje. El uso de marcadores moleculares también ayuda a evitar la endogamia, permitiendo establecer la relación genética dentro de un lote de reproductores. Hemos probado el resultado de dos estrategias de apareamiento dentro y entre poblaciones, con el objetivo de determinar la estrategia más adecuada de gestión de este recurso en el espacio y tiempo usando simulaciones in silico.

Con el fin de preservar la variabilidad residual en programas de cría para la comercialización a pequeña escala, se pueden considerar 3 posibles estrategias como guía de un plan a corto plazo para mejorar la productividad. La primera, considerando que la divergencia genética entre los stocks de reproductores es elevada (5.4%) y se prevé que aumente si se mantienen los stocks independientes, consistiría en favorecer el apareamiento entre reproductores de distintos stocks. La segunda consistiría en realizar cruces entre F1 y reproductores salvajes, lo que contribuirá a reducir la endogamia. La redistribución de los individuos en las generaciones posteriores también contribuiría a diluir los grupos de hermanos y restaurar la pérdida de diversidad genética entre los reproductores, evitando el apareamiento entre futuros grupos de hermanos F1, si bien se perdería la trazabilidad del parentesco dentro del stock. La tercera opción consiste en programar modelos de cría selectiva, como los de mínimo parentesco, para preservar la diversidad teniendo en cuenta el tamaño efectivo. Los resultados de este capítulo muestran que un escenario de cruzamientos inter- criadero resultaría mucho más ventajoso para evitar la endogamia que el apareamiento dentro de cada criadero.

El objetivo del Capítulo 2 consistió en definir la estructura genética de la especie P. americanus y entender el patrón de migración entre poblaciones naturales, en diferentes puntos de su hábitat en la costa del Océano Atlántico, en comparación con grupos externos de otras localidades. Estudios genéticos anteriores han sugerido una diferenciación importante entre el Atlántico Norte y Atlántico Sur usando ADN mitocondrial y marcadores microsatélites. Sin embargo, no ha podido demostrarse hasta el momento si existe o no una mayor estructuración dentro del Atlántico Norte, aparentemente homogéneo. Hemos aplicado marcadores microsatélites neutros y secuencias nucleares y mitocondriales, a un muestreo temporal de cherna del Atlántico Norte para clarificar esta situación. Los datos experimentales muestran un valor de diferenciación global entre muestras del 12% principalmente debido a la divergencia entre los cuatro pools génicos (24%): Atlántico

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Norte, Atlántico Sur, Sudáfrica y Oceanía. Sin embargo, las poblaciones atlánticas parecen conectarse sistemáticamente a través de migraciones longitudinales desde el Oeste hacia el Este atlántico.

En este estudio se definen tres rutas principales de migración significativa. La más importante, incluye la migración masiva desde Blake Plateau (USA) hacia el resto de las muestras del Atlántico Nordeste, y en menor medida a la inversa desde Azores hacia Blake Plateau. También existe migración significativa entre los archipiélagos de Macaronesia. Otra ruta de migración mejor conocida conecta las poblaciones de Australia y Nueva Zelanda. Finalmente se detectó una débil conexión de la población de Brasil con Sudáfrica.

Por otra parte, el bajo soporte observado en la reconstrucción filogenética basada en secuencias del CO I mitocondrial, no apoya la existencia de migración entre las poblaciones de América del Sur (Brasil y Argentina) y Nueva Zelanda. Los resultados obtenidos en la reconstrucción filogenética y el network mutacional, indican que la población de Sudáfrica podría ser considerada como una subespecie, según este gen mitocondrial. De hecho, las estimaciones de divergencia evolutiva promedio entre los grupos, definidos como aquellos obtenidos en la filogenia, muestra que la divergencia entre el Sudáfrica y el Atlántico es mayor que la observada entre el outgroup P. oxygeneios y el Atlántico. El bajo nivel de divergencia observada con el ADN mitocondrial (CO I) entre todas las muestras de P. americanus, con la excepción de Sudáfrica, sugiere que todas estas poblaciones pertenecen al mismo linaje mitocondrial. Estos resultados son clave para entender la dinámica de poblaciones que rige a las chernas, así como para el diseño correcto de las estrategias de explotación.

El Capítulo 3 tuvo como objetivo describir el comportamiento reproductivo de los stocks de P. americanus en cautiverio, para lograr resultados positivos en su manipulación. Para ello, se examinó la biología reproductiva de la especie en cautiverio, la influencia de factores ambientales (fotoperiodo, temperatura, efecto de inducción hormonal con 2.25 mg de LHRHa para la reproducción) y se trató de determinar los mecanismos para mejorar la reproducción de la cherna. Los experimentos se realizaron en tres criaderos de la costa de Galicia, el Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), el Instituto Gallego de Formación en Acuicultura (IGAFA) y el Aquarium Finisterrae, entre 2011 y 2013. Durante ese período se efectuó el seguimiento de parámetros tales como crecimiento, nutrición y reproducción. Se tomaron muestras sanguíneas en el IEO-Vigo para el análisis de la madurez sexual y se midieron los niveles de varias hormonas, i.e. 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) y la testosterona 11-ceto (11-KT). Aunque la madurez sexual se ha confirmado en algunos individuos, solamente fue observado un desove en un tanque de prueba, con y sin inducción sexual.

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En cuanto al peso y crecimiento, ambos géneros evolucionaron significativamente (p < 0.05) en los stocks del IGAFA y del IEO. Se observaron diferencias significativas en la ganancia de peso entre sexos en los tanques del Aquarium Finisterrae y del IEO. La cherna en cautiverio mostró un crecimiento alométrico positivo; observamos que los reproductores del Aquarium Finisterrae mostraban un crecimiento promedio mayor, pero éste no fue significativamente diferente al de los otros dos stocks mantenidos en el IEO y el IGAFA. Sin embargo, sí se observaron diferencias significativas entre el crecimiento de machos y hembras, con éstas ganando peso más rápidamente.

Otro aspecto importante fue la relación de la maduración con el volumen de agua de los tanques de cultivo. Los tanques de mayor capacidad proporcionaron un entorno más natural, lo que parece favorecer la obtención de puestas. Las únicas puestas espontáneas se han obtenido en el tanque del Aquarium Finisterrae con un volumen de 3.500 m3 y no en el IEO donde los reproductores se mantuvieron en tanques de 120 m3, ni en el IGAFA donde el tanque fue de 40 m3. Es importante tener en cuenta que el resto de las condiciones ambientales fueron básicamente similares. El estudio citológico de las gónadas de cherna, realizado sobre muestras salvajes obtenidas en el puerto de Vigo y procedentes de aguas de las Azores, no mostró ninguna evidencia del hermafroditismo, como ocurre en el mero y que había sido apuntado por otros autores que consideraban a la cherna como una especie gonocórica (Roberts, 1989) o hermafrodita (Jones, 1980). El análisis de los esteroides sexuales en el período diciembre 2010 a septiembre 2011, incluyendo la etapa de maduración gonadal y de reposo, muestran actividad sexual en los machos, que alcanzaron niveles de 0.29 ng/ml de testosterona y de 0.07 ng/ml de 11-Keto-testosterona, así como en las hembras, que mostraron 0.22 ng/ml de estradiol. Aunque no se haya conseguido inducir una maduración eficiente, estos resultados indican que la actividad reproductiva se concentra entre los meses de enero y junio y que hay una clara actividad de maduración gonadal de los gametos masculinos y femeninos en esa época. En vista de un posible bloqueo en el proceso reproductivo de esta especie en cautiverio, se ensayó la inducción hormonal por vía intramuscular con 25 µg/kg de la hormona LHRHa en hembras en avanzado estado de maduración (oocito de 1.200 µm de diámetro), tras la que se observó una reacción positiva a la dosis de inducción y se logró completar el ciclo de maduración y la puesta.

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Introdução

Introdução

Introdução

Generalidades taxonómicas sobre a espécie Polyprion americanus

O Cherne Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801), pertence a familia dos Serranideos. O seu nome científico provém do latin (polus = vários, prion = serra), e isso descreve uma de suas carcaterísticas em apresentar opérculos cortantes. É uma espécie que facilmente é confundida por outras pertencentes ao mesmo género Polyprion, como o Polyprion oxygeneios, o Polyprion mocone e o Polyprion yaneri. Estas três espécies tem uma distribuição geográfica em certos locais, comuns aos do P. americanus. O P. oxygeneios é vulgarmente encontrado nas costas da América do Sul, Austrália e do oceano Índico, o P. mocone é também encontrado nas costas Australianas e nas da Nova Zelândia e o P. yaneri encontrado somente nas costas do Chile.

Tanto o P. americanus como o P. oxygeneios, podem atingir entre 1.5 até 2 m de comprimento (Roberts, 1996) podem viver mais de 60 anos e na fase juvenil são pelágicos (~50 m) desde a eclosão até atingirem aproximadamente 4 anos e demersais quando adultos (até 1000 m) de profundidade (Francis et al., 1999; Sedberry et al., 1999). Esta espécie Polyprion americanus é considerada estar em perigo critíco no Brasil segundo a IUCN, em Bermuda e na África do sul é uma espécie protegida (Wakefield et al., 2013). Esta espécie é um teleosteo de grande porte também fisicamente muito parecido ao mero, Epinephelus marginatus (Lowe, 1834), que é conhecido por apresentar uma cabeça espinhosa, boca enorme, corpo robusto, finos espinhos em sua ornamentação de aspecto oval, escamas de pequeno tamanho que se distribuem por todo o corpo incluindo a cabeça, base carnuda das barbatanas dorsais e anais (Figura 1).

Figura 1. Espécimen de P. americanus pertencente ao estoque de IEO-Vigo

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Distribuição geográfica e migrações da espécie Polyprion americanus

O P. americanus é uma espécie cosmopolitana das regiões anti-tropicais. A maior parte dos chernes juvenis (até aos 30 cm) são capturados ao longo da parte Norte do Atlântico, geralmente associados a objectos flutuantes onde podem viver por mais de um ano (Roberts, 1989; 1996; Francis et al., 1999; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000). Os chernes demersais adultos, de 300 a 1000 m de profundidade, são capturados nos Arquipélagos dos Azores e da Madeira (28 a 31°S) (Sedberry et al., 1996; Machias et al., 2003), principalmente durante a época de desova (Peres & Klippel, 2003). No Centro e no Sul do Atlântico entre 23°37`S até 46 °S nos meses de Novembro a Março, e durante o inverno e primavera na região Sul do Pacífico, no oceano Indíco e no mar Mediterrâneo (Figura 2; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000). A migração em grande escala é permitida devido ao grande porte. Durante a sua fase juvenil a atividade migratória é de caracter sazonal e quando adultos o deslocamento é de caracter reproductivo. Os peixes capturados na região Norte Atlântica são movidos através das correntes do Golfo, porém não se sabe ao certo a origem destes peixes emigrantes nem o tempo para completar essa migração (Peres & Klippel, 2003). Sabe se que o deslocamento desses peixes tem a direção Norte apartir do Centro Atlântico, tem uma razão por busca de águas mais quentes, isso no final do inverno e início da primavera. Os chernes do hemisfério Sul (região Sul do Brasil) ganham também sentido de deslocamento para o Norte, vindos da costa Argentina, durante o inverno e primavera, área conhecida como área de desova e retornam a parte Sul no verão. Na parte Sudeste da América do Sul, Austrália e Nova Zelândia são encontrados os chernes nas diferentes fases de vida (Peres, 2000; Peres & Haimovici, 2003). Esta migração apresenta um factor importante para esta espécie, pois afecta a diversificação genética da mesma, aumentando a diversidade alélica das populações com a migração.

Figura 2. Mapa de distribuição mundial (em cor vermelha) do cherne Polyprion americanus (Aquamaps, 2013).

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Aspectos anatómicos e comportamento

O cherne é um peixe com longa vida (60 a 80 anos) e mortalidade baixa entre (0.05 e 0.09). Durante a fase juvenil tem um rápido crescimento e durante a fase adulta o crescimento é lento e diferente entre os sexos. Tal como a maioria dos peixes teleóteos o P. americanus é uma espécie exclusivamente carnivora (Wooton, 1990; Peres, 2000), com uma boca grande e protrátil, um estômago desenvolvido, com um único ceco pilórico e intestino curto proporcional ao comprimento do corpo do peixe. As presas habituais do P. americanus em ambiente selvagem são espécies com hábitos bentónicos, demersais e pelágicos e que são frequentemente encontradas nos mesmos lugares que os chernes. Segundo Peres & Haimovici (2003), foi constatado que durante a fase juvenil eles se alimentavam mais de peixes como Merluccius hubbsi, e quando adultos teriam preferência por lulas (Illex argentinus) e carangueijos (Chaceon notialis).

Estrutura reprodutiva e genética com marcadores moleculares de Polyprion americanus

Em Polyprion americanus as gónadas estão separadas dos rins através de uma bexiga natatória. É uma espécie dióica e que a organização dos ovários e testículos segue um padrão de peixes teleosteos e dióicos. Os ovos e os juvenís são pelágicos e estes podem passar os últimos quatro anos antes de tornarem se demersais, associados á objectos flutuantes próximos a superfície.

Como o ciclo reprodutivo é anual, sincronizado entre um determinado grupo populacional, com multiplas desovas entre 2 a 7 milhões de acordo com o tamanho da fêmea e com maturação sexual tardia dos 70 cm para os machos e entre os 74 e 90 cm para as fêmeas, considerado se adulto desde que atinge 69 cm, quando geralmente apresentam a faixa etária de 8 aos 12 anos (Sedberry et al., 1999; Peres & Klipel, 2003). Esta característica sexual é influênciada pela temperatura do habitat em que se encontra. Pouco se sabe sobre o cultivo do cherne e da sua reprodução em cativeiro tornando-se uma das limitações da potência reprodutiva da espécie em aquacultura (Suquet et al., 2001). Algumas experiências de reproduções naturais bem sucedidas realizadas no Sul do Atlântico, Galícia, Pacífico e no Mediterrâneo e de indução com ovos inviáveis na Grécia relacionadas à reprodução do cherne, tem demostrado que existe uma viabilidade no seu cultivo em cativeiro (Capitulo 2; Papandroulakis et al., 2008). Porém a obtenção dos ovos viáveis e o desenvolvimemto esperado ainda são questionados.

Segundo Sedberry et al. (1996), comparações do comprimento de fragmentos de polimorfismos de restrição na região do ND1 com ADN mitocondrial do P. americanus indicaram uma homogeniedade genética dentro das populações do Norte Atlântico, e também na população encontrada no Sul. O haplótipo do ADN mitocondrial para a população do Este Atlântico indica que este grupo tem maior semelhança em relação ao Brasil, Austrália e Nova Zelândia que apresentavam as mesmas endonucleases. Neste tipo de estudo populacional do cherne, poude-se

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verificar com a análise de ADN feita por Ball et al. (2000), que revelou um estudo que garantiza a existência de um grupo genéticamente homogénio do Norte Atlântico, em amostras de peixes colectadas no Arquipélago da Madeira e dos Açores, em Portugal continental e no Norte de África em Marrocos. E relatou uma grande separação genética entre a população de Polyprion americanus do Brasil e da região Sul do Pacífico (Leste da Austrália e em Nova Zelândia). O mesmo nível de separação genética é observado entre P. americanus e P. oxygeneios, sugerindo a possibilidade da existência de uma terceira espécie do género Polyprion localizado nas costas de Austrália e Nova Zelândia.

Objectivos gerais da Tese de Doutorado

O Cherne (Polyprion americanus) é uma espécie que teria origem nas costas Atlânticas e também muito encontrada na costa Sul do continente Sul Americano, onde se distribuem numerosos núcleos de populações naturais. O interesse desta espécie na aquacultura é alto, devido as suas qualidades organolépticas, facilidade zootécnica em domesticar, baixo índice de mortalidade e resistência no cultivo. Em Espanha é uma das espécies com prioridades em domesticação por conta do seu valor em cultivo em escala industrial, de modo que nos ultimos anos que se vem mantendo exemplares da espécie em cativeiro. Se bem que somente se conseguiram algumas desovas e estas mesmas não obtiveram sucesso em cativeiro.

Nesta Tese de Doutorado foram analizados aspectos relacionados com a aplicação da genética e gestão de estoques de reprodutores de cherne, disponíveis em Galicia o que constitue o capítulo 1, que tem por título Deriva genética na primeira geração de cultivo e risco endogámico em estoques de cultivo de cherne, Polyprion americanus. No capítulo 2, com o título Estrutura genética e dinámica populacional do cherne (Polyprion americanus) no Norte Atlântico, foram aplicados marcadores microssatélites neutros e sequências, nucleares e mitocondriais, a uma amostragem temporal dos chernes do Norte Atlântico para clarificar a diferenciação entre o Norte Atlântico e Sul sugerida por trabalhos genéticos anteriores. O capítulo 3, esta com o título Potencial reprodutivo do cherne (Polyprion americanus) cultivado em cativeiro na costa de Galicia, dedicado ao maneio da espécie em cativeiro.

O objectivo principal do Capítulo 1 foi de detectar a causa e quantificar a erosão genética observada nos quatro estoques de cherne mantidos em cativeiros de cultivo, em relação a população originária dos Açores. Foram utilizados peixes em cativeiro do Centro Oceanográfico de Vigo (COV) do Instituto Espanhol de Oceanográfia, do IGAFA (Instituto Galego de Formação em Aquacultura), o Aquarium Finisterrae localizado em A Coruña e as amostras de cherne mantidas na empresa de Isidro del la Cal em Valdoviño. Todos eles estavam ambientados desde 2007 e são candidatos a formar um ou dois estoques de reprodutores selecionandos. Para poder efectuar o

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desenho dos estoques de reprodutores, avançou se na identificação genética dos mesmos e para a determinação do parentesco dentro de cada unidade de cultivo, como um passo decisivo para evitar se a endogamia, quando estes peixes finalmente se reproduzam. Por outro lado, dado que actualmente houve desovas espontâneas, neste capítulo tratamos de desenhar o cenário provável da evolução parental, calculando o coeficiente de endogamia mediante a simulação de acasalamento aleatório em duas situações com vantagens reprodutivas em relação às práticas atuais em cativeiro. Por otro lado, dado que actualmente se obtiveram poucas desovas espontâneas, neste capítulo tratou se de desenhar um cenário provável da evolução parental.

Para tal, neste capítulo utilizaram-se marcadores microssatélites em quatro estoques de cherne disponíveis para determinar o grau de divergência genética, assim como na população selvagem do Atlântico. Demostrou se que existe uma diferenciação genética significativa (5.43% de variação genética) devido a deriva de amostragem e que uma pronunciada perda da diversidade (44% da diversidade alélica) que é patente nos dois estoques com respeito à riqueza genética da população selvagem. O uso de marcadores moleculares também ajuda a evitar a endogamia permitindo estabelecer uma relação genética dentro de um lote de reprodutores. Provou se o resultado de duas estratégias de acasalamento dentro e entre populações, com o objectivo de determinar a estratégia mais adequada de gestão neste recurso no espaço e no tempo usando simulações in silico.

Com o fim de preservar a variabilidade resídual em programas de criação em pequena escala para a comercialização, se podem considerar três possíveis estratégias como guias de um plano em curto prazo para melhorar a productividade. A primeira, considerando que a divergência genética entre os estoques de reprodutores é elevada (5.4%) e se prevé que aumente assim que se mantiverem os estoques independentemente, consitiria em favorecer o acasalamento entre os reprodutores de diferentes estoques. A segunda consitiria em realizar um cruzamento entre a F1 e reprodutores selvagens, o que contribuirá para reduzir a endogamia. A redistribuição dos indivíduos nas gerações posteriores também pode contribuir para que se diluiam os grupos de irmãos e restaurar a perda da diversidade genética entre os reprodutores, evitando o acasalamento entre futuros grupos de irmãos F1, bem como a perda da traçabilidade do parentesco dentro do estoque. A terceira opinião consiste em programar modelos de criação selectiva, como os de minímo parentesco, para preservar a diversidade tendo em conta ao tamanho efectivo. Os resultados deste capítulo mostram que o cenário de cruzamentos inter-tanques de cultivo resultaria muito mais vantajoso para evitar se a endogamia de acasalamentos dentro de cada tanque de cultivo.

O objectivo do Capítulo 2 foi o de definir a estrutura génetica da espécie P. americanus e entender o padrão de migração entre as populações naturais em diferentes pontos do seu habitat natural, na costa do oceano Atlântico, comparação com os grupos externos das outras localidades. Estudos genéticos anteriores sugeriram uma diferenciação importante entre o Norte Atlântico e o Sul, utilizando o ADN mitocondrial e marcadores microssatélites. Porém, não foi possível demostrar se

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até ao momento se existe ou não uma maior estruturação dentro do Norte Atlântico, que é aparentemente homogénia. Aplicaram-se marcadores microssatélites neutros e sequências, nucleares e mitocondriais, em uma amostragem temporal de chernes do Norte Atlântico para clarificar esta situação. Os dados experimentais mostram um valor de diferenciação global entre as amostras de 12.7% principalmente devido à divergência entre os três diferentes pools génicos: Norte Atlântico, Sul e Oceania. Porém, as populações Atlânticas parecem ter maior conectividade sistematicamente através das migrações longitudinais desde o Oeste para o Este Atlântico.

Neste estudo, definiram se três rotas principais de migração significativa. A mais importante incluí a migração em massa apartir de Blake Plateau, até ao resto dos locais de amostragem do Norte Atlântico e em menor tamanho a inversa desde os Açores até a Blake Plateau. Também existe uma migração significativa entre os arquipélagos Macaronésios. Outra rota de migração mais conhecida das populações é a de Austrália e Nova Zelândia. Por fim se detectou uma debil conexão entre o Brasil e a África do sul.

Por outra parte, o baixo suporte observado na recosntrução filogenética baseada nas sequências do CO I, o que apoia a existência de migração entre as populações da América do Sul (Brasil e Argentina) e Nova Zelândia. Segundo os resultados obtidos na reconstrução filogenética e a Network mutacional, tudo parece indicar que a população da África do sul poderia ser considerada como uma espécie separada. De facto, as estimas de divergência evolutiva média entre os grupos, definidos como sendo aqueles obtidos na filógenia, mostram que a divergência entre a África do Sul e o Atlântico é maior que o observado entre o outgroup P. oxygeneios e o Atlântico. O baixo nível de divergência observada com o ADN mitocondrial (CO I) entre todas as amostras de P. americanus com a excepção da África do Sul, sugerem que todas estas populações em realidade pertencem a mesma linhagem mitocondrial. Estes resultados são a chave para entender a dinâmica das populações de cherne, assim como para o desenho correcto das estratégias de exploração.

O Capítulo 3 teve como objectivo de descrever o comportamento reprodutivo dos estoques de P. americanus em cativeiro, para obter resultados positivos na sua manipulação reprodutiva. Para isso, examinou se a biología reprodutiva da espécie em cativerio, a influência dos factores ambientais (fotoperíodo, temperatura, efeito de indução hormonal com 2.25 mg de LHRHa para a reprodução) e assim tratou-se de determinar os mecanismos para melhorar a reprodução do cherne. As experiências realizaram se em três diferentes tanques de cultivo, localizados em diferentes pontos da costa de Galícia, o Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), o Instituto Gallego de Formação em Aquacultura (IGAFA) e o Aquarium Finisterrae, entre os anos de 2011 e 2013. Durante esse período foram efectuados seguimentos de parámetros tal como os de crescimento, nutrição e reprodução. Tomaram se amostras sanguineas dos peixes do IEO-Vigo para análises de maturação sexual, e mediram se os níveis de várias hormonas, como o 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) e a 11-Keto-testosterona (11-KT). Ainda que a maturação sexual tenha sido confirmada em alguns

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dos indíviduos, somente foi observada uma desova em um dos tanques experimentais, com e sem indução sexual.

Quanto ao peso e ao crescimento de ambos os géneros sexuais evoluiram significativamente (P < 0.05) nos estoques de IGAFA e do IEO. Observaram diferenças significativas no ganho de peso entre sexos nos tanques de Aquarium Finisterrae e no IEO. O cherne em cativerio mostrou um crescimento alométrico positivo. Observou se que os reprodutores do Aquarium Finisterrae mostravam um crescimento médio maior, e este não foi significativamente diferente dos outros dois estoques mantidos no IEO e em IGAFA. Enquanto que, se observaram as diferenças significativas entre o crescimento dos machos e das fêmeas, com as fêmeas ganhando peso mais rápidamente.

Outro aspecto importante foi a relação da maturação sexual com o volume de água nos tanques de cultivo. Os tanques com maior capacidade proporcionaram um ambiente mais natural, o que parece favorecer na obtenção de desovas. As únicas desovas espontâneas foram obtidas no tanque de cultivo do Aquarium Finisterrae, que apresenta um volume de 3.500 m3 enquanto que no IEO os reprodutores se mantiveram em tanques de 120 m3e em IGAFA onde estavam em um tanque de 40 m3. É importante ter em conta que o resto das condições ambientais é básicamente similar. O estudo citológico das gónadas de cherne, realizado sobre as amostras selvagens obtidas no porto de Vigo e provenientes dos Açores, não mostraram evidência alguma de hermafroditismo, como o que ocorre com o mero, que anteriormente havia sido referido por alguns autores, que consideravam o cherne como uma espécie gonocórica (Roberts, 1989) ou como sendo hermafrodito segundo (Jones, 1980) lhe definiu. A análise dos esteróides sexuais no período de Dezembro de 2010 a Setembro de 2011, incluindo o passo de maturação gonadal e o de repouso mostrou uma actividade sexual dos machos que alcançaram níveis de 0.29 ng/ml de testosterona e de 0.07 ng/ml de 11-Keto- testosterona, assim como para as fêmeas com 0.22 ng/ml de estrádiol. Ainda que não tenham alcançado a maturação, estes resultados nos indicam que a actividade reprodutiva se concentra entre os meses de Janeiro a Junho e mostram que existe uma clara actividade de maturação gonadal nos gametas masculinos e femeninos. Em vista de um possível bloqueo no processo reprodutivo desta espécie em cativeiro, fez-se um ensaio de indução hormonal por vía intra-muscular com 25 µg/kg de LHRHa em fêmeas em estado avançado de maturação (1.200 µm de diámetro), também foram observadas reacções positivas na dose de indução e se alcançou completar o ciclo de maturação e a desova.

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Introduction

General Taxonomy of Polyprion sp.

Wreckfish Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801) belongs to the family Serranidae. Its scientific name comes from Latin (polus = many, prion = saw) and it describes one of its characteristics of presenting cutting cappings. This species is easily confused with other ones belonging of the same genus like Polyprion oxygeneios, Polyprion mocone and Polyprion Yaneri. These three species have a geographical distribution common to the P. americanus sites. The P. oxygeneios is commonly found on the coasts of South America, Australia and the Indian Ocean, P. mocone is also located on the coast of Australia and New Zealand, and P. Yaneri is just found in the coast of Chile.

Both, P. americanus and P. oxygeneios can reach between 1.5 to 2 m in length (Roberts, 1996) can live more than 60 years: a pelagic juvenile stage (~50 m) from birth until about 4 years and demersal when adults (1,000 m deep) (Francis et al, 1999; Sedberry et al., 1999). The Atlantic wreckfish is considered a critically endangered species in Brazil according to the IUCN, and is protected in both Bermuda and South Africa (Wakefield et al., 2013). This species is a large teleost very similar to grouper, Epinephelus marginatus (Lowe, 1834). It is known that has a spiny head, big mouth, sturdy, fine spines on its ornamentation oval look, and small-size scales distributed throughout the body, including the head, fleshy base of the dorsal and anal fins (Figure 1).

Figure 1. Specimen of P. americanus from IEO-Vigo

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Geographic distribution and migrations of the Atlantic wreckfish

The fish P. americanus is a cosmopolitan species found in anti-tropical regions. Most young wreckfish (up to 30 cm) are seen in the northern part of the Atlantic Ocean, usually associated with floating objects where they live and grow for a year (Roberts, 1989, 1996; Francis et al., 1999; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000). Adult become demersal at 300-1000 m depth and are seen around Azores and Madeira (28-31°S) (Sedberry et al., 1996; Machias et al., 2003) in the spawning season (Peres and Klippel, 2003) that occurs in central and southern Atlantic between 23°S and 46°37`S from November to March, and during winter and spring in the Southern Pacific, the Indian Ocean and the Mediterranean Sea (Figure 2; Sedberry et al., 1999; Ball et al., 2000).

The P. americanus is a big fish with a large migratory capacity. Its migratory activity in their youthful age is seasonal and in the adulthood begins its reproductive stage. What one see in the fish caught in the North Atlantic is being moved through the Gulf Stream, but it is not known with certainty the origin of these migrant fish or the time it would take to complete this migration (Peres and Klippel, 2003). It is known that the movement of this fish has the direction of the North Atlantic from the central region, from late winter to early spring, motivated by the search for warmer waters. The wreckfish of the Southern Hemisphere also makes a northwards migration (southern Brazil), coming from the coast of Argentina, during winter and spring, the area known as spawning, and return only to the southern part in summer. In the southeastern part of South America, Australia and New Zealand here are mere different stages of life (Peres, 2000; Peres and Haimovici, 2003). This migration is an important factor in this species, because it affects the genetic diversification, increasing allelic diversity in donor and recipient populations involved in the migration.

Figure 2. Worldwide Atlantic wreckfish distribution (red color) (Aquamaps, 2013).

21 Introdução

Anatomy and behavior of P. americanus

The wreckfish is a fish with a long life (60-80 years) and low mortality (0.05 and 0.09). During the juvenile stage growth is very fast while adults grow slower and different in each sex. Like most teleost fishes P. americanus is an exclusively carnivorous species (Wooton, 1990; Peres, 2000), with a big mouth and protractile, a stomach well developed, with one blind pyloric and short bowel proportional to the length of the fish's body. The usual preys of P. americanus in nature are species of benthic, demersal and pelagic habits and often found in the same places as groupers. According to Peres & Haimovici (2003) during youth feeds more fishes such as Merluccius hubbsi, and in the adulthood feeds rather more squid (Illex argentinus) and crabs (Chaceon notialis).

Reproductive structure and population genetics of P. americanus

Wreckfish gonads are separated from kidneys by a swim bladder. It is a dioecious species, and the organization of the ovaries and testes follows a pattern of teleost fish. Eggs and juveniles are pelagic and can spend the last four years before becoming demersal, associated with floating objects near the surface. It shows an annual reproductive cycle synchronized in a particular population group with multiple spawning events between 2 and 7 million eggs, according to the size of the female sexual maturation and late maturation. Length of 70 cm for males and from 74 to 90 cm for females is considered adult size, when often belong to age group of 8-12 years (Sedberry et al., 1999; Peres and Klipel, 2003). These sexual characteristics are influenced by the temperature of habitat in which the species lives.

Little is known about the culture of wreckfish and reproduction in captivity making it one of the limitations for reproduction of the species in aquaculture (Suquet et al., 2001). Some experiences of successful natural reproduction carried out in the South Atlantic, Galicia, the Pacific and the Mediterranean and induction with viable eggs in Greece in relation to the reproduction of wreckfish, have demonstrated its viability in captivity (see Chapter 3; Papandroulakis et al., 2008). But the achievement of viable eggs and the expected development are still under question.

According to Sedberry et al. (1996), comparisons of fragment length polymorphism of the region ND1 of mitochondrial DNA of P. americanus indicated a genetic homogeneity within populations of the North Atlantic, and in the southern population. The mtDNA haplotype for fish from the East Atlantic indicates that this group has a greater internal similarity than Brazil, Australia and New Zealand, which had the same endonuclease patterns. DNA analysis done by Ball et al. (2000) using microsatellites guarantees the existence of a genetically homogeneous group of North Atlantic fish samples collected in the archipelago of Madeira and the Azores in continental Portugal and North Africa in Morocco. They reported a large genetic distance between Atlantic wreckfish populations of Brazil and those ones in the South Pacific region (East Australia and New Zealand). The same

22 Introdução

was observed in the genetic distance between P. americanus and P. oxygeneios, suggesting the possibility of a third species of the genus Polyprion located on the coasts of Australia and New Zealand.

Objectives of the Doctoral Thesis

The wreckfish (Polyprion americanus) is a species that originated in the Atlantic coast, but it is also found on the south coast of South America, where it can be found in many small natural patches. The interest of this species in aquaculture is high, due to its organoleptic quality, easy to husbandry adaptations, low mortality rate and resistance in culture. In Spain it is one of the species with domestication priority because of its value when grown at industrial scale, so several hatcheries have captured stocks of the species in captivity in the last years. While some spawning was achieved, eggs were not successfully viable in captivity. This thesis aims to deepen the knowledge of the species at population, genetic and zootechnical level; these are the main objectives of the three chapters of the thesis:

Chapter 1. The objective of the first chapter of this thesis was to establish the causes of the genetic erosion of cultured wreckfish samples. All of them where originated from the East Atlantic and comprise four captive stocks at IEO-Vigo, IGAFA, the Aquarium Finisterrae and the company Isidro del la Cal. All those stocks belong to the first generation in captivity and were grown in Galicia since 2007. Breeding in captivity a small amount of fishes can create large inbreeding so we pursued to estimating kinship within each unit as a decisive step to avoid inbreeding when those fish are finally reproduced. Finally, we have performed a simulation of random mating in two advantageous situations with respect to current reproductive practices in hatcheries, just to give some clues on how reproductive strategies could be worked out to minimize inbreeding.

Chapter 2. The objective of the second chapter of this thesis was to describe and define the population structure of P. americanus using gene sequences (nuclear and mitochondrial). A second goal consisted on understanding the migration pattern in natural populations from the Atlantic Ocean: while migration of juveniles from the Atlantic west to the Atlantic East was suggested on population dynamics data. However, this phenomenon is still undemonstrated and requires confirmation with markers of such migration, a task that we developed in this study.

Chapter 3. The general objective of the third chapter was to develop a strategy to improve the reproduction of wreckfish in captivity, in three different units in Galicia (IEO, IGAFA, Isidro del la Cal). Our first goal was the identification of the biological limitations for the captive management of the species. The second goal was to deep in our knowledge on the reproductive biology of P. americanus in captivity, to assess the influence of environmental factors (photoperiod, temperature, effect of hormonal induction with 2:25 to play LHRHa mg) and to determine the mechanisms that could enhance wreckfish reproduction in captivity. 23

Capítulo 1

Deriva genética da primeira geração e o risco endogámico em estoques de cultivo de cherne Polyprion americanus

Capítulo 1

Resumen

La cherna Polyprion americanus es un componente de las pesquerías dirigidas y multiespecíficas en todo su rango de distribución y recientemente ha sido identificada por su gran potencial de acuicultura: los adultos pueden alcanzar los 150-200 cm de longitud, muestran una baja tasa de mortalidad natural y son muy longevos. Dado que es una de las especies más prometedoras para la acuicultura, en la última década se fundaron varios stocks en criaderos gallegos. Es bien sabido que la domesticación y la gestión de recursos en un criadero requieren una estrategia adecuada para la fundación inicial del stock de reproductores y su manejo reproductivo. Por lo tanto, la combinación de marcadores genéticos con estrategias clásicas de domesticación parece ser un método útil para evitar la deriva genética y los efectos adversos derivados de la consanguínidad. En este estudio hemos aplicado marcadores microsatélite a los cuatro stocks de chernas disponibles en criaderos gallegos para determinar el grado de divergencia genética, así como a una población salvaje del Atlántico. Demostramos que existe diferenciación genética significativa (5.43% de la varianza genética) debida a la deriva de muestreo y que una pronunciada pérdida de diversidad (44% de la diversidad alélica) es patente en el 80% de los stocks con respecto a la riqueza genética de la población salvaje. El uso de marcadores moleculares también ayuda a evitar la endogamia, permitiendo establecer la relación genética dentro de un lote de reproductores. Hemos probado el resultado de dos estrategias de apareamiento dentro y entre poblaciones, con el objetivo de determinar la estrategia más adecuada de gestión de este recurso en el espacio y tiempo usando simulaciones in silico. Nuestros resultados muestran que un escenario de cruzamientos inter- criadero resultaría mucho más ventajoso para evitar la endogamia que el apareamiento dentro de cada criadero.

Palabras claves: Cherna, Polyprion americanus, microsatélites, Fundación stock, deriva genética, sistema de apareamiento y endogamia.

27 Capítulo 1

Resumo

O cherne Polyprion americanus é um componente da pesca dirigida e multi-específica em toda sua faixa de distribuição e recentemente foi identificada pelo seu grande potêncial na aquacultura: os adultos podem alcançar os 100 cm de comprimento, mostram uma baixa taxa de mortalidade natural e são de longa vida. Dado que é uma das espécies mais promissoras para a aquacultura, na última década fundaram-se vários estoques em viveiros galegos. Sabe se perfeitamente que a domesticação e a gestão dos recursos em viveiros requerem de uma estratégia adequada para a fundação inicial de um estoque de reprodutores e o seu maneio reprodutivo. Por tanto, a combinação de marcadores genéticos com estratégias clássicas de domesticação parece ser um método útil para evitar a deriva genética e os efeitos adversos derivados da consanguínidade. Neste estudo utilizaram-se marcadores microssatélites de quatro estoques de cherne disponíveis em viveiros galegos para determinar o grau de divergência genética, assim como uma população salvagem do Atlântico. Demostramos que existe diferenciação genética significativa (5.43% da variância genética) devido a deriva de amostragem e que uma pronunciada perda da diversidade (44% da diversidade alélica), é patente em 80% dos estoques com respeito à ríqueza genética da população salvagem. O uso de marcadores moleculares também ajuda a evitar a endogamia, permitindo estabelecer a relação genética dentro de um lote de reprodutores. Provou-se o resultado de duas estratégias de acasalamento dentro e entre populações, com o objectivo de determinar a estrátegia mais adequada de gestão deste recurso no espaço e no tempo usando simulações in silico. Estes resultados mostram que o cenário de acasalamentos inter-viveiros resultaría muito mais ventajoso para evitar a endogamia que ao acasalamento dentro de cada viveiro.

Palavras chaves: Cherne, Polyprion americanus, microsatélites, Fundação estoque, deríva genética, sistema de acasalamento e endogamia.

28 Capítulo 1

Abstract

The wreckfish Polyprion americanus is a component of directed and admixed species fisheries throughout its range and has recently been identified for its large aquaculture potential: adults reach 100 cm in length, show low natural mortality rates and longevity. Since it is one of the most promising species for aquaculture several stocks were founded in Galician hatcheries in the last decade. It is well known that domestication and management of hatchery stocks require an adequate strategy for the initial broodstock foundation and its further reproductive management. Therefore the combination of genetic markers with classic domestication strategies seems to be a useful approach to skip genetic drift and consanguineous-derived adverse effects. In this study we have first applied microsatellite markers to the four wreckfish stocks being harvested in Galician hatcheries to determine the extent of their genetic divergence as well as their wild source Atlantic population. We show that a significant genetic differentiation (5.43% of the whole genetic variance) was created among broodstock by sampling drift and that a pronounced loss of diversity (44% of allelic diversity) is patent in 80% of them regarding the genetic richness of the wild source population. The use of molecular markers also helps avoid uncontrolled inbreeding, by allowing establish genetic relatedness within a broodstock batch. Using computer simulations we have tested the outcome of two mating strategies within and between stocks, aiming to determine the most suitable management strategy to this resource in space and time before reproduction and hatchery transfers begun. Our results show that interhatchery breeding scenario results far more advantageous in retardation of inbreeding than mating within each stock.

Keywords: Wreckfish, Polyprion americanus, microsatellites, stock foundation, genetic drift, mating system and inbreeding.

29 Capítulo 1

Introdução

O maior lucro industrial vem por alimentar a população humana, que cresce continuamente e faz com que a pesca marinha se expanda, para além da resistência natural dos peixes à predação (Swartz et al., 2010). Consequentemente, as capturas pesqueiras a nível mundial estão em declínio (Fisheries FAO, 2012), e sua sustentabilidade está sendo seriamente questionada por algumas unidades de cultivo de populações de peixes nas águas europeias (Baudron & Fernandes, 2014). A aquacultura foi criada com uma politica focada numa alternativa víavel nas pescas, para que de alguma forma se pudesse aliviar a escassez de peixes no seu ambiente selvagem e a recolocação de empregos na indústria da pesca. No entanto, a aplicação maciça da aquacultura não é para um ecossistema livre, por isso muitas são as questões relacionadas com a saúde e seus derivados, como por exemplo, industrialização costeira, escapes genéticos, aumento da demanda pela farinha de peixe, saúde animal na cultura intensiva, sua adequação para o consumo humano, etc. A prudência dos gestores de pesca é de buscarem o essencial para a aquacultura, independentemente do desenvolvimento que esta prática apresenta no corrente século (Asche & Tveterås, 2004). Mesmo a partir de uma única visão sectorial interessada em preservar a herança genética selvagem é necessário reiniciar o cultivo de estoques empobrecidos ou estabelecer novos estoques.

Efeito de risco fundador em cherne

A primeira questão genética é bastante negligenciada no referente a gestão de estoques de cultivo, que é o alicerce criterioso sobre o objectivo de uma unidade de cultivo (Allendorf, 1986). Seja qual seja o objectivo, o conhecimento sobre a quantidade e distríbuição da variação genética dentro da espécie em questão é essencial como fonte de enriquecimento dos estoques de cultivo, assim como para prosseguir com o reforço da população selvagem ou o reforço dos estoques comerciais. A quantidade e distribuição da diversidade genética determinam o número mínimo e o local onde os reprodutores candidatos devem ser recolhidos, para capturar o maxímo possível de um fundo genético de uma população rica. A diversidade genética é um dos principais recursos nos programas de melhoramento em espécies de aquacultura, desde altos níveis de variação que representam uma maior variância genética adicional em características produtivas (Reed & Frankham, 2001). A taxa de conversão alimentar é positivamente correlacionada com o aumento da diversidade genética de microssatélites em vários peixes, por exemplo, truta arco-íris (Overturf et al., 2003).

No entanto, a criação indivídual ou má gestão dos reprodutores, geralmente diminui a variabilidade genética presente em populações selvagens, por meio de cruzamento entre indivíduos aparentados ou pelo uso de um pequeno número de reprodutores de origem. O tamanho efectivo das unidades de cultivo de origem é condicionado pelas restrições de cultivo, onde os resultados utilizam apenas alguns indivíduos como reprodutores. A practicibilidade de desenho dos cruzamentos é trabalhosa 30 Capítulo 1

devido a erosão da diversidade genética, a qual pode ocorrer quer deliberadamente na selecção dos programas ou inadivertidamente por causa de Bottlenecks na reprodução ou a cruzamentos entre parentes.

Quando um pequeno número de reprodutores é criado descontroladamente ou com parentes acoplados, ou a contribuição de cada um é desequilibrada, há uma erosão na variação genética (Hahn, 1989; Elliot & Reilly, 2003), mesmo em estoques de cultivo de primeira geração (por exemplo, Taniguchi et al., 1983; Tessier et al., 1995). Portanto, o número de reprodutores em cativeiro, utilizados para produzir o crescimento de juvenis comerciais ou transferências de tanques de cultivo deveriam ser mantidos ao longo de um limiar mínimo, a fim de preservar a origem genética e retardar a consanguinidade, ou seja, se o Ne é reduzido, a variação genética irá alterar drasticamente a composição génica do estoque na primeira geração em relação à população de origem. Além disso, essa diversidade genética será ainda mais reduzida por consangüinidade, logo na geração F1 (remanescente tão pouco a diversidade como 1-1/2N, quando a origem de N é baixa). A consanguinidade é conhecida por deprimir traços relacionados com aptidão, tais como taxa de crescimento, por exemplo, em salmonídeos (Pante et al., 2001), a sobrevivência, ao desempenho reprodutivo, por exemplo, em camarões (Sbordoni et al., 1986; De Donato et al., 2005; Moss et al., 2007) e na aptidão geral do peixe (Danzmann et al., 1989). Uma perda de 10% da variação em Truta arco-íris promove a: 25% menos de heterozigosidade, 38% de mal-formações morfológicas, 6% de conversão alimentar, 19% menos de sobrevivência em alevinos, etc. (Kinkaid, 1976).

Por conseguinte a minimização da endogamia e estrutura genética de um estoque é fundamental para a saúde de uma unidade de cultivo, por exemplo, amêijoas (Benzie & Williams, 1996). Do ponto de vista da aquacultura, a instalação de genotipagem nos estágios iníciais de domesticação não somente apresentam um impacto significativo para prevenir ou reduzir a endogamia, mas também para o melhoramento da gestão reprodutiva e cultivo larval. Por exemplo, o conhecimento do fundo genético permite aplicar estratégias que ajudam a manter a diversidade genética dentro das populações em cultivo (Liu & Cordes, 2004). Por outro lado, o conhecimento de processos subjacentes da biológia reprodutiva permite a identificação da reprodução efectiva da população, a dinâmica de desova e desempenho indivídual reprodutivo (Le François et al., 2010).

A aquacultura adequada para o cherne

A diversificação de esforços na aquacultura inclui a domesticação de espécies novas, um fundamento onde os problemas relacionados à genética podem ser evitados. Uma dessas espécies é o cherne Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801), que representa um dos peixes teleosteos e demersais economicamente mais importantes e é conhecida pelo seu grande tamanho,

31 Capítulo 1

uma taxa de crescimento rápido que torna esta espécie um forte candidato a ser incluída na aquacultura com fortes oportunidades de mercado.

O cherne é um peixe pelágico antitropical com longa vida (Roberts, 1977; Goujon, 2004), que pode ser encontrado no mar Mediterrâneo e no oceano Atlântico (da Noruega para a África do Sul e Canadá até a Argentina), no oceano Índico, a Sul do Pacífico, Nova Zelândia, Oeste da Austrália Ball et al., (2000). Esta espécie atinge a sua maturidade sexual entre 60-90 cm aos dez anos de idade (Papandroulakis et al., 2008), no Atlântico geralmente é capturada já na sua fase demersal quando adulto, a partir de profundidades de (42-1 000 m) e atinge até 100 kg de peso e 2 m de comprimento (Peres & Haimovici, 2004; Jolivet et al., 2012) aos trinta e dois anos (Wyanski et al.,2000). No Leste do Atlântico, são encontrados juvenis de cherne com 45-55 cm e entre os 1-7 anos de idade (Goujon, 2004). São geralmente capturados ao longo da costa Norueguesa, em porções rasas na parte central do Atlântico e associados às ilhas (Ilhas Macaronésias) e ao longo do Norte da África e do Sul, incluindo o Mediterrâneo Sedberry et al. (1999). A desova de indivíduos desta espécie parece ocorrer preferencialmente na região de Blake Plateau, de Fevereiro a Março e também foi relatado no Mediterrâneo de Janeiro a Abril (Hardy, 1978). Nas ilhas Macaronésias e nas costas dos Açores esta espécie é comum ser encontrada associada em rochas em profundidades de 50 a 1 000 m (Menezes et al., 2013), e freqüentemente encontrada associada a objectos flutuantes quando juvenil, que são usados como isca para capturá-los (Sedberry et al., 1999; Machias et al., 2003).

O cultivo de cherne se destaca como sendo uma das opções mais populares para a aqüacultura comercial, uma vez que a pesca intensiva no Blake Plateau e em regiões do Atlântico (Sedberry et al., 1999) tem levantado preocupações sobre a sustentabilidade desta pescaria que resultaram na imposição de uma total admissível de capturas nos EUA. Além disso, a sub-população brasileira é considerada criticamente ameaçada pela IUCN (Perez et al., 2009) e depois do ano de 1985 não foi mais comercialmente viável em Bermuda.

Apesar das dificuldades crescentes encontradas no processo de captura do cherne na fase pelágica, devido às exigências ambientais que são muito específicas, é um peixe de fácil cultivo, por apresentar uma rápida taxa de crescimento (k valor3), que é aproximadamente 0.03/ano em ambos os sexos (Vaughan et al., 2001). Durante a vida pelágica (Kentouri et al., 1995), assim como em cultivo (de 1 a 5 kg em 10 meses), tem uma baixa mortalidade e acompanhado de um elevado valor comercial. Como consequência de tal crescimento rápido, surge um interesse crescente na Europa para a consolidação da indústria aquícola do cherne (Papandroulakis et al., 2004).

Embora seja grande a escala de dados biológicos de P. americanus, por exemplo, a dinâmica populacional, comportamento, regimes de desova, alimentação, etc., ainda é extremamente necessário lidar de forma adequada com a espécie, devido a complexidade do seu processo de

32 Capítulo 1

domesticação (Sedberry et al., 1999; Goldman & Sedberry, 2011) e as dúvidas sobre a sua estrutura genética em ambiente selvagem. A distribuição do ADN mitocondrial haplóide (Sedberry et al., 1996) e os microssatélites dados de variação (Ball et al., 2000; Suquet et al., 2001). Ao longo do oceano Atlântico, suporta-se a hipótese de um deslocamento de chernes pelágicos com o nome de Gulf Stream, local de desova bastante comum, na costa Atlântica Leste da Europa em Blake Plateau, de tal forma que, presume-se que todo o estoque do Noroeste do Atlântico é tomado como uma única unidade de gestão.

Proposta de estudo e objectivos

As conseqüências genéticas da consanguinidade, domesticação, interações genótipo-ambiente e selecção são bem conhecidas em muitas espécies, de tal modo que estudos preliminares empíricos são necessários no cultivo de cherne, para a criação de directrizes adequadas para fundar e manter seus estoques de origem. Este estudo é o primeiro a investigar os níveis de erosão genética da primeira geração de estoques de cherne em cativeiro na Europa (Galicia, NE de Espanha), antecedentes à sua reprodução e distribuição entre viveiros. Essa erosão pode ocorrer na primeira etapa da domesticação, pela perda de alelos raros e perdas do HWE sobre a população selvagem em equilíbrio (Ball et al., 2000). Os microssatélites são marcadores sensíveis para medir as mudanças de variação genética entre as amostras de viveiros e as selvagens (Tessier et al., 1995), como indicadores de perda de variação genética causadas por ambos,o Bottleneck com efeito fundador e o acasalamento não aleatório (Presa et al., 1994).

O principal objectivo deste estudo é de estabelecer a causa da erosão genética pela subdivisão de amostras do cherne originárias do Atlântico (Este), que dão origem a quatro estoques com a primeira geração em cativeiro domésticos, cultivados em tanques distribuidos pela costa de Galicia desde 2007. Com base numa pequena quantidade de peixes em cativeiro, candidato a reprodutores para a aquacultura foi verificada a determinação de parentesco dentro de cada unidade de cultivo, como passo decisivo para evitar a endogamia, quando estes peixes forem finalmente reproduzidos. Finalmente, o estudo também visa explorar o cenário provável de evolução do coeficiente de endogamia parental, seguindo a simulação de acasalamento aleatório em duas situações com vantagens reprodutivas em relação às práticas atuais em cativeiro.

Materiais e métodos

Recolha de amostras e extracção de ADN

Quatro estoques domésticos de cherne foram submetidos a uma amostragem e monitorados na primávera de 2012, em quatro centros de cultivo em Galicia (Noroeste de Espanha). Dois desses tanques de cultivo já haviam montado seus estoques em 2007 no Noroeste do Mar Cantábrico entre

33 Capítulo 1

o Cabo Finisterrae e Cedeira (Tanque de cultivo Isidro de la Cal, D_ISI, N= 39 espécimes, e o Aquárium Finisterrae, D_AQUA, N= 12 espécimes). Outras duas unidades de cultivo do cherne, que tiveram suas amostras de cherne capturadas em 2007 nos estuários do Sul de Galicia na Ría Arousa (Tanques do IGAFA, D_IGA, N= 12 espécimes e do IEO, D_IEO, N= 10 espécimes). Além disso, mais amostras selvagens foram tomadas atravês de barcos de pesca no Arquipélago dos Açores com destino ao porto de Vigo (W_AZO, N= 15 espécimes), em Março de 2012 (Figura 1 e Tabela 1). Para cada amostra de indivíduo foi recolhido um pedaço da barbatana dorsal e preservado em etanol puro até a altura em que o ADN genômico foi extraído, isolado e purificado de acordo com o método FENOSALT (Pérez & Presa, 2011). O ADN foi limpo e ressuspenso em 50 µL do tampão 0.5 x TE e mantidos a -20°C até à sua utilização directa no modelo de amplificação por PCR.

Figura 1. Dados de captura de amostras de cherne P. americanus nas costas do arquipelago dos Açores (W_AZO) e da Galicia: IEO (D_IEO), IGAFA (D_IGA), Aquário Finisterrae (D_AQUA) e a empresa Isidro del la Cal (D_ISI).

34 Capítulo 1

Tabela 1: Descrição das propriedades de amostragem de Polyprion americanus (técido barbatana) Data Localização Região atlântica N ICES Origem Código 24/04/12 Azores Nordeste 8 Xa2 Selvagem AZO1- 8 26/04/12 Azores Nordeste 3 Xa2 Selvagem AZO9-11 27/04/12 Azores Nordeste 2 Xa2 Selvagem AZO12 e 13

11/05/12 Azores Nordeste 2 Xa2 Selvagem AZO14 e 15 14/03/12 I.E.O Norte 10 Ixa Selvagem (Açores) IEO1-I10 22/03/12 IGAFA Norte 12 VIIIc Selvagem (Açores) IGA1-12 04/05/12 Aq. Finiesterre Norte 12 VIIIc Selvagem (Açores) AQUA1-12 10/05/12 Isidro Norte 39 VIIIc Selvagem (Galicia) ISI1- 39

Os marcadores microssatélites, amplificação por PCR e genotipagem

O ADN dos oitenta e oito indivíduos de cherne foram amplificados, utilizando cinco microssatélites (Tabela 2), dois deles foram anteriormente descritos por Ball et al. (2000) Pam006-

(GT)17 e Pam021-(AC)15, que apresentaram uma grande divergência entre as amostras do Norte

Atlântico e outros três microssatélites adicionais PamD1-(GACA)9, PamA5-(GTCT)13 e o

PamD2a- (GA)5CA(GA)7, relatados pela primeira vez no presente trabalho, e que foram isolados seguindo a técnica de enriquecimento FIASCO (Zane et al., 2002).

Tabela 2: Características dos cinco marcadores moleculares polimórficos de Polyprion americanus utilizados neste estudo. F: forward e R: reverse, o motivo de repetição (tandem) e as condições óptimas de PCR (temperatura de annealing (°C), concentração do primer e do Mg2+).

Cor do Locus Sequência do primer (5'----3') pb Tanden Condições óptimas marcador

D1F CCCTGTTATCATCGCTTCCT 4pmol Gel 2%(45') FAM 173 (GACA)9 1.7 Mg ² x 58°C D1R GCCATCACACCCTTCTGTTT ⁺ A5F TGGCCTTTGACTTTGAGGAC 5pmol Gel 2%(45') HEX 168 (GTCT)13 1.7 Mg ² x 58°C A5R TCATATGACCCCTCCTGCTC Triplex ⁺ D2Fa ACAGACAGCCAGGGAGAGAG 4pmol Gel 2%(45') HEX 201 (GA)5CA(GA)7 1.7 Mg ² x 58°C D2Ra GACAGTCCGTGTGACAGTCG ⁺ Pam006F CTGATGGTTAAGCTGGTGC 55°C x 112 (GT)17 HEX Pam006R CAATGTGTCTAACATTCGCC 3mM(MgSO4)

FAM

Duplex Pam021F GATCTGACAATGACCACTTTACT 55°C x 115 (AC)15 Pam021R CCTCTATAGGAATGCTGCTTTTG 3mM(MgSO4)

35 Capítulo 1

Os marcadores Pam006 e Pam021 foram co-amplificados numa única reacção com 0.3µM de cada primer, 55°C temperatura de anneling e 3.0 mM de MgCl2 (Ball et al., 2000). A amplificação do locus de PamD1 foi realizada numa única reacção utilizando 0.27 µM de cada primer (Frente 5’- CCCTGTTATCATCGCTTCCT-3’; Reverso 5’-GCCATCACACCCTTCTGTTT-3’), 1.7 mM

MgCl2 e 58°C de temperatura de annealing. Os marcadores PamA5 (Frente 5’- TGGCCTTTGACTTTGAGGAC-3’; reverso 5’-TCATATGACCCCTCCTGCTC-3’) e PamD2a (Frente 5’-ACAGACAGCCAGGGAGAGAG-3’; reverso 5’-GACAGTCCGTGTGACAGTCG-3’) foram co-amplificados utilizando 0.33 µM e 0.27 µM de cada par de primers, respectivamente,

MgCl2 1.4 mM e 58 °C de temperatura de annealing. Primers frente de cada locus foram marcados com fluoróforos como o FAM (tamanho do alelo lócus-modal: PamD1-171 bp e Pam021-112 pb) e o HEX (Pam006-112 bp, PamA5-157 bp e PamD2a-198 bp). As amplificações de PCR foram realizadas num termociclador Gradiente Mastercycler (Eppendorf) com a seguinte rotina: primeiro passo a 95 °C durante 10 minutos seguido de 35 ciclos a 95 °C durante 80 segundos, temperatura de annealing locus-específica durante 50 segundos e extensão a 72 °C durante 70 segundos; um passo de extensão final foi executado a 72 °C durante 15 minutos. Um microlitro de cada amplificação por PCR específica foram pré-homogenizados e em seguida um microlitro desta homogeinização foi adicionada a 0.25 mL de ROX fluoróforo como marcador interno (GeneScan- 500, Applied Biosystems) e 10 µl de formamida desionizada. Essa homogeinização de PCR multiplex foi utilizada para a genotipagem dos cinco marcadores em oitenta e oito indivíduos usando um analisador ABI-3130 dos serviços genómicos CACTI (Universidade de Vigo, Espanha).

Análises genéticas

A fim de minimizar os erros de genotipagem, genótipos ABI, os protocolos de ensaios foram lidos de forma independente por três pesquisadores que utilizam o software GeneMarker V1.97 (SoftGenetics). Conteúdo de informação polimórfica (PIC) foi avaliada por cada marcador microssatélite usando CERVUS 3.0.3 (Kalinowski et al., 2007). Parâmetros genéticos tais como as freqüências alélicas, número de alelos (A), riqueza alélica (RS), heterozigosidade observada (HO), heterozigosidade esperada (HE) e F- índices de fixação (Wright, 1965) foram calculados nos quatros estoques domésticos bem como as amostras selvagens do Atlântico pool, formando um conjunto que consiste num total de oitenta e oito indivíduos, utilizando FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995).

Mudanças recentes no tamanho efetivo da população genética foram exploradas em Bottleneck (Cornuet & Luikart, 1996) usando 100.000 repetições de ambos, o modelo do alelo infinito e o modelo de mutação de duas fases. O número de conjuntos de genes pool (k) na base de dados foi inferido com o de GENELAND 3.2.4 (Guillot et al., 2005a), após 2.000.000 iterações Bayesian sob o modelo espacial e o modelo de freqüência do alelo não correlacionado (Guillot et al., 2005b).

36 Capítulo 1

A probabilidade associada ao FIS foi gerada através do método de cadeia de Markov executado em GENEPOP 4.2.1 (Rousset, 2008) utilizando 20 lotes com 5.000 interações. As diferenças significativas nos parâmetros genéticos entre amostras foram avaliadas através de 15.000 permutações usando FSTAT. Locus por locus AMOVA foi executado no ARLEQUIN 3.5 (Excoffier et al., 2005), para dividir a variância genética dentro dos estoques e entre eles. O nível estatístico nominal para os índices de fixação FCT e FSC foi determinada após 1.023 permutações. A correção de testes múltiplos foi realizada utilizando o método da taxa de falsas descobertas (Benjamini & Hochberg, 1995). As componentes de variância em relação às amostras foram visualizadas num espaço bi-dimensional usando uma análise de coordenadas principais (PCoA). As duas coordenadas principais foram agregadas espacialmente como pacote de genética estatístico GENALEX 6.5 (Peakall & Smouse, 2012). Para uniformizar as contribuições genéticas por reprodutores e família, a proporção sexual (1:1) foi aleatória dentro de cada uma das unidades de cultivo, com vista a gerar o maior numero possível de famílias parentais e aplicar similar sucesso reprodutivo em todos os reprodutores. Progênies simuladas foram produzidas in silíco após o acasalamento aleatório dentro da geração de reprodutores (P) e o mesmo número de peixes reprodutores utilizado na geração de P foi escolhido aleatóriamente entre os filhotes F1. A relação sexual foi de 1:1, reforçada na geração F1 de reprodutores e acasalamento aleatório foi autorizado a produzir a próle F2 (Tabela 3 para detalhes).

A média de parentesco (Rxy) do cultivo em estoques foi calculada para todos os pares de indivíduos disponíveis de gerações passadas até ao momento, utilizando o programa de ML-RELATE software (Kalinowski et al., 2006). As distribuições dos valores de Rxy foram colocados por estoques de cultivo e agrupados em 11 categórias eqüidistantes (Rxy = 0.0 para Rxy = 1.0) para permitir comparações estatísticas inter-estoques. A variância de distribuição Rxy pontuada foi testada utilizando o Snedecor F-test (Snedecor & Cochran, 1967). O teste para comparações de distribuições inteiras Rxy entre gerações, dentro de um estoque não foi possível usando todas as estimativas de Rxy que podem oferecer por não haver graus livres disponíveis (por exemplo, o pequeno desvio foi significativo), portanto, usamos 11 pontos correspondentes aos 10 pontos sucessivos (0.1 unidades / intervalo) a partir da distribuição estatística de Rxy realizadas. As distribuições completas de valores ponderados de Rxy foram comparadas entre gerações dentro dos estoques de cultivo, usando coeficiente de concordância de Kendall's. As amostras relacionadas foram calculadas no programa IBM SPSS Statistics versão 22. As diferenças médias entre os pares de gerações dentro dos estoques foram calculados usando Wilcoxon pareado, assinada classificação calculado no programa SPSS.

37 Capítulo 1

Resultados

Variação genética dentro dos estoques

Os marcadores de microssatélites foram moderadamente polimórficos (PIC Geral = 0.623), variando entre cinco alelos do locus PamD2a (PIC = 0.402) e quinze alelos do locus Pam21 (PIC = 0.835) (Tabela 3). A média da riqueza alélica (± DP) em todos loci e estoques foi de 4.212 ± 0.567. As pontuações mais baixas do número de alelos e riqueza alélica de ambos, em comparação com o AT_POOL foram observadas nos estoques D_IGA e D_AQUA (Tabela 2).

A variação alélica de ambos e o número de alelos foram maiores no estoque D_ISI, o que foi esperado de acordo com o seu tamanho de amostra. O tamanho modal alélico do locus Pam06 em D_AQUA (Modal A = 108-110 pb) é diferente do resto das unidades populacionais.

Dezanove alelos específicos para cada estoque (37 %) fora dos cinquenta e dois contados nos oitenta e oito peixes que foram observados no estoque D_ISI (26 % dos alelos específicos). O número de alelos é fortemente afectado pelo tamanho das amostras combinadas, para que o AT_POOL contenha mais alelos do que qualquer uma das unidades de cultivo. Houve uma perda considerável da diversidade alélica nos estoques de cultivo, em comparação com o pool selvagem AT_POOL, que representa a pescaria do NE Atlântico, por exemplo, 44.23 % dos alelos foram perdidos no processo de dispersão, onde o estoque perdeu as médias dos alelos 23.00 ± 6.82, em comparação com o pool selvagem.

A heterozigosidade esperada oscilou entre 0.448-0.857 com a média (± DP) 0.643 ± 0.000. A heterozigosidade observada oscilou entre 0.321-0.843 com a média (± DP) 0.564 ± 0.049. As heterozigosidades observadas e as esperadas não foram significativamente maiores na população AT_POOL, do que nos estoques de cultivo, mas num dos casos foram significativamente menores na última, por exemplo, D_IEO (HO = 0.642) vs ATL_STO (HO = 0.570) (Tabela 2). Os quatro estoques estavam em desequilíbrio HWE, num locus (W_AZO, D_IEO, D_IGA) ou dois loci (D_ISI), enquanto que o estoque D_AQUA estava em desequilíbrio HWE para todos os cinco loci. A frequência de alelos nulos pautativa explica parcialmente o desequilíbrio HWE em média 0.096 através loci e estoques (Tabela 3).

38 Capítulo 1

Tabela 3. Parâmetros genéticos para os cinco loci microssatélites, analisados em cinco unidades populacionais de cultivo do cherne na costa leste atlântica europeia: arquipelago dos Açores (W_AZO), IEO (D_IEO), IGAFA (D_IGA), Aquárium Finisterrae (D_AQUA) e Isidro de la Cal (D_ISI). SELVAGE Locus W_AZO D_IEO D_IGA D_ISI D_AQUA Total M N 15 10 12 39 12 88 88 PamD1 A 4 6 4 5 4 8 8 Modal A 171 171 171 171 171 171 171 Range A 167-179 163-181 163-179 157-175 171-179 157-181 157-181 RS 3.017 4.856 2.993 2.426 3.242 3.147 3.147 HE 0.486 0.683 0.511 0.314 0.534 0.448 0.442 HO 0.333 0.700 0.500 0.256 0.333 0.364 0.424±0.178 * FIS 0.314 -0.024 0.022 0.184 0.376 0.188 0.177 PamA5 A 10 10 6 7 7 14 14 Modal A 157 157 157 157 157 157 157 Range A 149-179 149-173 157-181 149-171 149-171 149-181 149-181 RS 6.162 7.603 4.214 3.811 5.246 4.896 4.896 HE 0.814 0.906 0.598 0.663 0.782 0.729 0.723 HO 0.533 0.900 0.500 0.487 0.727 0.575 0.629±0.180 * * * * * * FIS 0.345 0.006 0.165 0.266 0.070 0.212 0.205 PamD2a A 2 2 2 3 3 5 5 Modal A 198 198 198 196-198 198 198 198 Range A 196-198 196-198 198-206 196-200 196-202 196-206 196-206 RS 1.995 1.986 1.600 2.436 2.599 2.364 2.364 HE 0.417 0.333 0.100 0.541 0.528 0.501 0.436 HO 0.231 0.400 0.100 0.429 0.200 0.321 0.272±0.139 * * FIS 0.446 -0.200 0.000 0.208 0.621 0.360 0.264 Pam006 A 6 4 4 10 5 10 10 Modal A 112 112 112 112 108-110 112 112 Range A 104-114 106-114 104-112 100-118 104-112 100-118 100-118 RS 4.929 3.742 3.845 5.832 4.282 5.311 5.311 HE 0.795 0.714 0.750 0.810 0.739 0.804 0.781 HO 0.800 0.375 0.600 0.795 0.917 0.750 0.697±0.213 * * * * * FIS -0.006 0.475 0.200 0.019 -0.241 0.067 0.040 Pam021 A 7 7 6 15 6 15 15 Modal A 110-114 110-112 110-114 110-114 112 110-112-114 110-112-114 Range A 104-118 104-118 94-124 94-132 94-118 94-132 94-132 RS 4.961 7.000 4.817 7.320 4.384 6.384 6.384 HE 0.793 0.900 0.764 0.897 0.705 0.857 0.833 HO 0.800 0.833 0.909 0.949 0.500 0.843 0.798±0.177 * FIS -0.009 0.074 -0.190 -0.058 0.290 0.015 -0.013 A 29 29 22 40 25 52 52 Ap 1 1 3 12 2 0 19 Total RS 4.213 5.037 3.494 4.365 3.951 4.421 4.212±0.567 HE 0.661 0.707 0.545 0.645 0.657 0.668 0.643±0.060 HO 0.539 0.642 0.522 0.583 0.535 0.570 0.564±0.049 * * * * FIS 0.184 0.093 0.042 0.096 0.185 0.146 0.120±0.063

Nota: Os seguintes parâmetros são fornecidos para cada locus e estoque: o número de indivíduos genotipados (N), o número de alelos (A), alelios privados (AP), o tamanho do alelo modal (Modal A), faixa de tamanho A (Faixa A, em pb), a riqueza alélica (RS), a heterozigosidade esperada (HE), a heterozigosidade observada (HO) e do índice de fixação FIS (Weir & Cockerham, 1984). Desvios significativos em relação equilíbrio de Hardy-Weinberg foram corrigidos com o teste sequencial de Bonferroni (*P ≤ 0,01) (Rice, 1989).

Variação genética entre os estoques

Um único gene do Atlântico abrange a todos os estoques de cultivo analisados e foram inferidos pelas análises de Bayesian realizadas (k = 1). Os testes de comparação entre pares de unidades de cultivo se mostraram ambos significativamente altos, a riqueza alélica (Rs) e a heterozigose

39 Capítulo 1

observada, no estoque D_IEO é mais alta do que na maioria dos estoques, excepto em D_ISI onde esses parâmetros eram semelhantes a este último (Tabela 4).

A maior variação molecular, a partir de partições de AMOVA foi observada dentro dos estoques a (94.57 %). A variação genética nula foi distribuída diferencialmente entre as amostras selvagens

W_AZO e entre os estoques domésticos (FCT = 0.000). E uma variação significativa entre estoques somaram 5.43 % (FST = 0.054; P <0.01). A divergência genética entre os estoques, conforme medido com o índice FST variou entre FST = 0.000 (entre W_AZO e D_IEO ou entre W_AZO e

D_IGA) e FST = 0.0981 (P <0.01) entre D_IGA e D_AQUA, o último estoque diferindo significativamente entre o resto dos estoques com exceção o de W_AZO. O estoque D_IGA também divergiu significativamente do D_ISI e D_AQUA (Figura 2).

Tabela 4. P-valores pares de comparações entre as populações de cherne: riqueza alélica RS (acima da diagonal) e heterozigosidade observada (abaixo da diagonal).

W_AZO D_IEO D_IGA D_ISI D_AQUA W_AZO - 0.111 0.264 0.717 0.605

D_IEO 0.024* - 0.002* 0.232 0.022*

D_IGA 0.630 0.012* - 0.133 0.531

D_ISI 0.703 0.047* 0.306 - 0.370

D_AQUA 0.437 0.002* 0.848 0.203 -

O enredo representa estoques sobre as duas maiores componentes de variância com percentagem (51.56 % e 31.05 %) situada no estoque selvagem (W_AZO), equidistante para o resto dos estoques em cultivo. Os estoques D_AQUA e D_ISI são claramente divergentes do resto dos estoques, na primeira e segundas coordenadas, enquanto que o D_IEO e o D_IGA não foram separados por qualquer coordenada (Figura 2). O cenário de distribuição PCoA concordou razoavelmente com os valores de divergência genética observada pelo FST (Figura 2).

40 Capítulo 1

Figura 2. Análise das principais coordenadas (PCA) com base na matriz da correlação de freqüências alélicas, que mostram as relações entre as unidades de cultivo relativas a P. americanus do Leste Atlântico. A coordenada 1 discrimina o estoque doméstico do Aquarium Finisterrae (D_AQUA), enquanto que a coordenada 2 discrimina o estoque doméstico do IGAFA (D_IGA). A divergência genética entre os estoques, estimados pelo índice de restrição do fluxo génico (FST) que é representado pelas linhas tracejadas (P<0.01) ou com linhas contínuas (P> 0.01) após a correção de Benjamini & Hochberg.

Evoluções de parentesco

A distribuição de sexo ao acaso 1:1 na geração P, gerado de 25 para 380 possíveis famílias parentais (FP), em cinco estoques e 1936 em um único lote do Atlântico AT_POOL (Tabela 4). Acasalamento aleatório produziu uma média de 20 filhotes na F1 por família exceto em AT_POOL, onde foi muito menor devido a limitações de computação. O mesmo número de famílias F1 (F1f) como em FP foi aleatóriamente seleccionado na descendência F1, para produzir uma média de prole em 20 F2 por família, ou seja, que vão de 500-3800 genótipos indivíduais. O índice de parentesco Rxy no estoque W_AZO foi calculado em 105 pares de indivíduos da geração parental (NRxyP) e em 626.640 pares de indivíduos de F1 (NRxyF1) e F2 (NRxyF2), e o procedimento semelhante foi aplicado aos estoques remanescentes (Tabela 5). A maioria dos pares de indivíduos testados nos seis estoques, através de três gerações teve relação consanguínea nula (Rxy = 0), por exemplo, W_AZO exibiu uma percentagem de Rxy = 0 de 63.81 %; 59.42 % e 56.59 % nas gerações P, F1 e F2, respectivamente (Tabela 4).

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Tabela 5. Os parâmetros utilizados na simulação de progênies: P(N), número da potência dos reprodutores; FP, número de famílias geradas a partir dos reprodutores iniciais; F1, número de filhos gerados a partir de FP; F1p, o número de reprodutores escolhidos entre prole F1; F1f, número de famílias gerada a partir dos reprodutores F1; F2, número de descendência gerada a partir F1f; NRxy (P), o número de comparações de pares de Rxy computarizados para a geração de P; NRrx (F1, F2), número de comparações de pares de Rxy computarizados nas gerações F1 e F2; % Rxy (NRxy (P-F1-F2)), percentagem de Rxy = 0 em todos os pares de comparações NRrxP, NRxyF1 e NRxyF2. Desenvolvimento de parentesco entre gerações (P-F1, F1-F2, P-F2) foi negativa para Rxy = 0,0 e foi positivo para Rxy = 0,5. Rxy mediana é a diferença líquida na média Rxy entre gerações.

%Rxy=0 Rxy = 0.0 Rxy = 0.5 Rxy mediana NRxy(P)/NRxy P (N) FP / F1 F1p/F1f / F2 (F1,F2) (NRxy (P-F1-F2)) P - F1 F1 - F2 P - F2 P - F1 F1 - F2 P - F2 P - F1 F1 - F2 P - F2 W_AZO 15 56/1120 15/56/1120 105/626640 63.81-59.42-56.59 -4.39 -2.83 -7.22 1.84 1.93 3.77 0.0380 0.0064 0.0444

D_IEO 10 25/500 10/25/500 45/124750 82.22-53.53-54.80 -28.69 1.26 -27.42 11.65 1.99 13.64 0.1074 0.0097 0.1171

D_IGA 12 36/720 12/36/720 66/258840 59.09-55.33-53.22 -3.76 -2.11 -5.88 2.12 2.35 4.45 0.0600 0.0043 0.0643

D_ISI 39 380/3800 39/380/3800 741/1804050 62.89-58.56-55.35 -4.32 -3.22 -7.54 4.85 1.14 5.98 0.0286 0.0093 0.0379

D_AQUA 12 36/720 12/36/720 66/258840 65.15-56.41-53.41 -8.74 -3.00 -11.75 9.35 0.77 10.12 0.0403 0.0049 0.0452

ESTOQUE 17.6 106.6/1372 17.6/106.6/1372 204.6/614624 66.63/56.65/54.67 -9.98 -1.98 -11.62 5.96 1.64 7.59 0.055 0.007 0.062 S ±10.65 ±1.86 ±8.92 ±4.38 ±0.66 ±4.18 ±0.032 ±0.003 ±0.033

AT_POOL 88 1936/1400 88/1936/1400 3828/979300 61.31-59.14-58.11 -2.17 -1.03 -3.20 3.93 0.29 4.22 0.0205 0.0032 0.0237

Capítulo 1

0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

WILD_P WILD_F1 WILD_F2 AZO_P AZO_F1 AZO_F2

1 0.7 0.6 0.8 0.5 0.6 0.4 0.4 0.3 0.2 0.2 0.1 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

IEO_P IEO_F1 IEO_F2 IGA_P IGA_F1 IGA_F2

0.7 0.7 0.6 0.6 0.5 0.5 0.4 0.4 0.3 0.3 0.2 0.2 0.1 0.1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ISI_P ISI_F1 ISI_F2 AQUA_P AQUA_F1 AQUA_F2

Figura 3. Frequência do índice de parentesco nas populações mostreadas (linha cinzenta; ) e a simulação da F1 (linha preta pontilhada; ) e F2 (linha pontilhada cinzenta; ) progenies.

Distribução do Rxy entre generações dentro de cada estoque

No resumo estatístico, observamos uma tendência geral de aumento da consanguinidade e diminuição nos níveis de parentesco nulo Rxy = 0, em todas as amostras através das gerações, por exemplo, W_AZO, diminuiu em 4.39 %; 2.83 % e 7.22 % conforme P para F1, F1 para F2 e P para F2, respectivamente. Ao contrário, Rxy = 0.5 o parentesco aumentou em todas as amostras através das gerações, por exemplo, W_AZO, aumentou de 1.84 %, 1.93 % e 3.77 % conforme P para F1, F1 para F2 e P a F2 (Figura 3).

O aumento geral da média de Rxy dentro dos estoques variou entre 0.0379 (D_ISI) a 0.1171 (D_IEO) e a média de 0.062 ± 0.033, sendo a transição P a F1 em todos os estoques do momento

43 Capítulo 1

inter-gerações, onde mais endogamia foi criada, ou seja, 0.055 ± 0.032 em comparação com a F1 transição a F2 0.007 ± 0.003 (Tabela 5). O aumento da média de Rxy foi significativa no estoque D_IEO (P-F1, Z-teste = 2.803, P= 0.005; P-F2, Z-teste = 2.803, P = 0.005) e no estoque D_ISI (P- F2, Z-teste = 2.191, P = 0.028; F1-F2, Z-teste = -2,395, P = 0,017) (Tabela 5). Acasalando todos os reprodutores AT_pool, produziu um aumento do Rxy não significativo de 0.024, ou seja, cerca de um terço da média entre os estoques (Tabela 5).

A distribuição de Rxy diferiu entre as gerações dos estoques D_IEO (W-test = 0.682, P = 0.001) e D_ISI (W-teste = 0.473, P = 0.006) e distribuições iguais foram observadas no resto das unidades de cultivo (Tabela 6). Diferenças na variância de distribuição de Rxy entre gerações dentro dos estoques (F-teste) foram estatisticamente significantes para D_IEO e D_AQUA (Tabela 6).

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Tabela 6. A comparação estatística das distribuições Rxy, médias e variâncias entre gerações dentro dos estoques de cherne. Distintos sobrescritos (a ou b) em Rxy significa indicar diferentes distribuições de Rxy entre as gerações envolvidas (ver Anexo 3). Os asteriscos indicam diferenças significativas (* P <0.05; ** P <0.01) na média de Rxy (Z-teste) e /ou em sua variância (F-teste) entre os pares gerações envolvidos (P, F1, F2).

Comparações da distribuição de Rxy (W-Kendall coeficiente Comparações da média de Rxy (teste-Wilcoxon) e variância de concordância) Rxy (F-teste) Generation Mean SD Variance P vs F1 P vs F2 F1 vs F2 W_AZO P 0.0965a 0.1799 0.0324 T = 1.580 T = 1.376 T = 0.561 (n=15) F1 0.1345a 0.2025 0.0410 p = 0.057 p = 0.089 p = 0.238 F2 0.1409a 0.2004 0.0402 D_IEO P 0.0476a 0.1071 0.0115 T = 2.803** T = 2.803** T = -0.153 (n=10) F1 0.1550b 0.2180 0.0475 F = 0.072** F = 0.054** F = 0.742 F2 0.1647b 0.2214 0.0490 D_IGA P 0.1141a 0.1763 0.0311 T = 1.682* T = 1.784* T = -0.866 (n=12) F1 0.1741a 0.2394 0.0573 F = 0.911 F = 0.649 F = 0.713 F2 0.1784a 0.2376 0.0565 D_ISI P 0.0843a 0.1386 0.0192 T = -1.274 T = 2.191* T = -2.395* (n=39) F1 0.1129a,b 0.1729 0.0299 F = 0.469 F = 0.373 F = 0.795 F2 0.1222b 0.1788 0.0320 D_AQUA P 0.1232a 0.2055 0.0422 T = 0.357 T = 0.561 T = -0.255 (n=10) F1 0.1635a 0.2284 0.0522 F = 0.349 F = 0.312* F = 0.896 F2 0.1684a 0.2223 0.0494 AT_POOL P 0.0988a 0.1082 0.0117 T = -0.663 T = 0.968 T = -1.070 (n=88) F1 0.1193a 0.1533 0.0235 F = 0.498 F = 0.469 F = 0.942 F2 0.1225a 0.1581 0.0250

4 5

Capítulo 1

Discussão

A aquacultura do cherne está em sua fase inicial, de modo que ter um bom começo maximizaria o seu desenvolvimento e a futuras realizações. Devido ao pouco conhecimento sobre o cultivo do cherne, não são esperadas manifestações fenotípicas de erosão genética, mas após a primeira geração em cultivo. Este estudo descreve o status genético geral dos chernes previamente cultivados em cativeiros nas costas de Galicia, seu maneio reprodutivo e transferências entre tanques. Demostrou se que os estoques de cultivo são bastante divergentes entre si, assim como o resultado da deriva genética aplicadas através do fundador Bottleneck. A redução de 44 % da variação genética é relatada na primeira geração em 80 % dos estoques de cherne examinados, quando comparado com o grupo genético natural do Atlântico, uma conseqüência relatada por um baixo número efetivo de reprodutores em outras espécies (por exemplo, Taniguchi & Perez- Enriquez, 2000). O declínio desta variação neutra é irreversível em programas de melhoramento fechados, e é indicativo de uma variação aleatória global do genoma em escala genômica, o que pode colocar em risco a potência de melhoria a partir da primeira geração de estoques de cultivados (Vuorinen, 1984). Também fornece algumas figuras de endogamia, obtidas in silico que poderiam ser úteis para descobrir óptimas estratégias reprodutivas dentro e entre os estoques de cultivo, para minimizar a taxa de endogamia entre as futuras gerações.

Variação genética dentro de cada estoque de cherne

Parâmetros genéticos dos marcadores presentes foram consistentes como a dos estudos anteriores, embora tenha demostrado uma flutuação esperada na faixa e número de alelos devido à variação espacial (local mostreado), variação temporal (anos) e o tamanho de amostras utilizadas em todos os estudos. Por exemplo, considerando apenas as águas dos Açores no Leste Atlântico, Ball et al. (2000), observaram-se quarenta e seis alelos em cento e dezaseis indivíduos, enquanto que cinquenta e dois alelos foram observados em oitenta e oito indivíduos deste estudo. A catégoria de alelos por locus em seis microssatélites foi de 8 a 31 em quatrocentos e vinte e dois indivíduos da faixa geral do Atlântico Ball et al. (2000) e de 5 a 15 alelos por locus no presente estudo em oitenta e oito indivíduos.

A heterozigosidade esperada também foi semelhante entre o presente estudo (intervalo 0.448-0.857 para cinco loci), e os estudos anteriores desta espécie em 6 loci em dez amostras do Atlântico na faixa de (0.491 – 0.881) Ball et al. (2000), com uma média ligeiramente inferior (0.643 ± 0.184) que a dos microssatélites em espécies marinhas 0.790 (DeWoody & Avise, 2000).

O déficit de heterozigotos encontrados no novo locus microssatélite PamA5, para a maioria dos estoques pode ser devido aos alelos nulos de co-segregação em baixa freqüência, no locus (ausência de homozigotos nulos e ausente em alguns estoques). No entanto, o que resta é apenas

46 Capítulo 1

hipotético, considerando que dois dos marcadores utilizados aqui (Pam006 e Pam021) estavam no HWE para a população selvagem do Atlântico (Ball et al., 2000), mas mostra aqui um desequilíbrio patente em alguns estoques. Portanto, é provável que a maioria dos casos observados em desequilíbrio HWE, foi devido à deriva da amostragem, por exemplo, o estoque D_AQUA em completo desequilíbrio de marcadores.

O facto de alguns estoques como, D_IEO (HE = 0.707) mostrou uma heterozigosidade esperada, mais alta em relação à população AT_POOL (HE = 0.668), o que indica que heterozigosidade é inútil para medir a erosão genética (Jost, 2008; Diz & Presa, 2008), ou seja, a heterozigosidade é insensível às mudanças genéticas substanciais que podem ocorrer em estoques de cultivo em aquacultura, dentro das primeiras gerações de cultivo (Hedgecock & Sly, 1990). A perda de alelos raros com qualquer redução significativa na heterozigosidade é uma indicação de Bottleneck, uma população em curto prazo (Nei et al., 1975; Allendorf, 1986), como tem sido observado em várias espécies, por exemplo, salmonídeos (Norris et al., 1999), e seria o mesmo caso durante a reprodução base em cultivo de cepas.

De facto, a diversidade não era a mesma entre os estoques de cultivo, apesar da origem comum no Leste Atlântico, o que dá a impressão de ser o resultado do desvio de amostragem. Por exemplo, 44.23 % dos alelos foram perdidos no processo de dispersão, o que em média 23 ± 6.82 dos alelos perdeu por estoque, em comparação com a população selvagem AT_POOL. Este fenómeno de extinção de alelos raros selvagens de cepas cultivadas tem sido observada em muitos estudos anteriores sobre a diversidade genética nos estoques de cultivos de primeira geração, por exemplo, o haliote (Gaffney et al., 1996).

Foram também esperadas diferenças inter-estoques, do número de alelos devido aos tamanhos diferentes que cada um apresentava para o estoque D_ISI o de maior tamanho, que mantinha 26 % dos dezanove alelos para cada população. Outro efeito colateral da deriva de amostragem foi a extinção aleatória de alelos raros que estavam presentes em toda a costa Atlântica, ou seja, 44 % do AT_POOL inicial foram perdidos em 80 % dos estoques até agora analisados e mantidos a frequência muito baixa nos 20 % restantes estoques ou seja, em apenas um estoque (ver apêndice 1). A perda de 44 % dos alelos raros em 80 % dos estoques de cultivo deve ser considerada como uma alteração genética significativa, que reduz a versatilidade de futuros programas de melhoramento. No entanto, este número é manifestado como uma subestimação em relação ao potêncial do seu meio natural, uma vez que, apesar de que se provar toda capacidade dos reprodutores em cativeiro, eles representam apenas uma pequena amostra (n = 88) de toda a população de origem do Atlântico.

No entanto, nenhum Bottleneck detectado foi significativo nos presentes estoques, sobre as distribuições em L-conformado das frequências alélicas (Cornuet & Luikart, 1996; Luikart et al.,

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1998). Curiosamente, o déficit particular de heterozigotos ocorreu em cada unidade de cultivo após a subdivisão populacional acumulada aditiva em todo o AT_POOL (ex; Barinova et al., 1998), resultando aqui um ajuste geral em que cabem todos os estoques para deriva mutacional em equilíbrio mas com um déficit significativo de heterozigose do AT_POOL e o seu afastamento de deriva mutacional em equilíbrio, sob o modelo de duas-fases-mutação. Neste sentido, a mutação deriva do equilíbrio marginal do estoque D_AQUA (P (Het. déficit) = 0.094), em comparação com o resto dos estoques é consequência do Bottleneck populacional resultante da deriva genética.

A variação genética entre os estoques

Anteriores estudos genéticos populacionais no Atlântico Norte, usando o RFLPs com 1.5 kb, PCR amplicon do gene mitocondrial DNA e ND1 (Sedberry et al., 1996) ou 10 microssatélites (Ball et al., 2000), destacou a existência de uma população única de cherne sem estrutura em todo o Atlântico, como ocorre em outras espécies que habitam numa área geográfica semelhante como por exemplo, linguados (Díaz-Ferguson et al., 2012). Os chernes adultos podem migrar normalmente pelo Atlântico, porém as larvas e os juvenis pelágicos são transportados pelo Atlântico através das correntes oceânicas (Sedberry et al., 1996; Sedberry et al., 2006), o que está de acordo com o único gene Atlântico mais provável de inferir aqui usando abordagem Bayesiana.

Tomado como referência a média FST = 0.0004 obtido apartir de 6 microssatélites em 10 amostras do Atlântico (Ball et al., 2000), a variação genética 0.054 é aqui observada entre as unidades de cultivo, é sinal de uma alta estruturação genética artificial. Os cinco cepas analisados tinham sido mantidos como linhas de cultivo separadas, desde 2007 e não houve desde então actividade reprodutiva, assim como a estruturação genética entre os estoques deve ter acumulado através da deriva genética devido ao viés de amostragem.

A análise simultânea de parcelas de PCA e pares de valores de FST permitem decifrar como os estoques derivaram separadamente da população selvagem de origem, facto também observado com parâmetros genéticos anteriores.

Como esperado, o diferencial de variação nula (FCT = 0.000), distribuída entre o estoque selvagem W_AZO e os estoques cultivados sob um cenário de alta estruturação indicam que o estoque W_AZO é parte da fonte de raiz assemelhando-se a todos os estoques. Além disso, o D_IEO e o D_IGA não foram separados uns dos outros, o que está de acordo com a sua origem a partir de amostragem da Ria de Arosa. Por outro lado, a patente de divergência significativa entre o

D_AQUA e o D_ISI (FST = 0.070), que foram mostreados simultaneamente, assim como do resto dos estoques (por exemplo, FST (D_IGA vs D_AQUA) = 0.098) sugerem que a divergência entre a primeira geração de cultivo em cativeiro de cherne em estoques em Galicia, que têm acumulado exclusivamente no processo de amostragem.

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Evolução do parentesco

A tendência geral de Rxy foi de aumentar drasticamente depois de um tamanho menor de reprodutores, ou seja, o maior aumento na média de parentesco genético do estoque D_IEO (12 %), está provavelmente relacionado ao seu menor tamanho de reprodutores (n = 10), enquanto que o oposto ocorreu no estoque D_ISI (4 % do crescimento), em que tinha o tamanho maior de reprodutores (n = 39). Esta tendência está ilustrada ao acoplarem se todos os reprodutores do AT_POOL (n = 88), que representa o menor aumento de Rxy (2.4 % em duas gerações) que é perto de um terço do aumento em média entre as existências (6.2 %) (Tabela 3). Notável, apesar de D_ISI mostrar um aumento de Rxy menor do que qualquer outro estoque foi significativo a partir de P para F2 e de F1 para F2, devido ao maior número de comparações de pares de descendentes realizado (1.804.050), em comparação com as outras unidades de cultivo com menor tamanho de reprodutores.

A diminuição do parentesco nulo (Rxy = 0) após geração P foi patente em todos os estoques conforme o esperado, após a geração de irmãos-completos e meio irmãos em F1 e F2. Essa endogamia dentro dos estoques é esperada que aumentasse ao longo de gerações (como a variação genética diminui em paralelo, por exemplo, (Barinova et al., 1998), quando as relações consangüíneas aparecem nos reprodutores, existem diferenças entre os acasalamento de reprodutores ou a sobrevivência dos ovos (ex; Sekino et al., 2003) e nenhuma nova variação é trazida do meio selvagem.

Quando todos os indivíduos P foram acoplados, os dados deste estudo indicaram os resultados generalizados de F1 em irmãos-completos e meio-irmãos, elevando o parentesco como o inferido aqui in silico para o melhor cenário de acasalamento aleatório, ou seja, todos reprodutores selecionados estaram contribuindo de igual maneira para a progênie. No entanto, a seleção aleatória dos reprodutores entre os filhos F1 e mais cruzamento de reprodutores selecionados F1P produz um menor parentesco na prole F2 (média de 0.7 %) do que na geração anterior (P a F1, média de 5.5 %) em todas as unidades de cultivo, destacando a deriva do efeito de um número limitado de reprodutores em geração P.

A endogamia é esperada com um aumento de uma taxa de ∆F = 1/2Ne por geração, ou seja, 5.7 % do esperado para o tamanho real médio dos reprodutores de 17.6, o que está de acordo com as actuais simulações que produziram um aumento de endogamia 6 % em duas gerações (veja tabela 3). Fenómeno semelhante já foi relatado por meio da redução de Ne para uma taxa de 7 % de endogamia em estudos anteriores em peixes de aquacultura (ex; Vandeputte et al., 2004).

Um máximo de 5 % de aumento de ∆F foi considerada aceitável em esquemas de melhoramento, para prevenir os efeitos colaterais da depressão por endogamia (Sonesson et al., 2004), um limiar de tolerância para o ∆F que alcançou aqui em duas gerações de todos os estoques domésticos (nr.

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de fundadores variam entre 10-15) só que com o grande número de reprodutores (D_ISI, N = 39). Por exemplo, um tamanho da população efetiva mínima de 50 é para assegurar a curto prazo a preservação da aptidão (FAO, 1980).

Estrátegias de gestão

Poude se observar um surto de cultivos em aquacultura de P. americanus na Europa, um impulso quando o desenvolvimento da base genética para a aquacultura é estabelecida. Portanto, uma avaliação mais precisa na variabilidade genética de estoques em cultivo selvagens podem ser feitos neste momento. A variação genética e a consanguinidade são motivo de preocupação nula para a produção comercial, mas são questões cruciais para o fundo de partida de um programa de domesticação de reprodutores e posteriormente, para o controle endogamico durante a manutenção dos reprodutores.

A má relação de acasalamento dos peixes é devido a uma seleção errada de reprodutores que reduz a variabilidade genética e desencadeia em depressão por endogamia (Falconer, 1989). Para isso é necessário um monitoramento genético de espécies cultivadas para estabelecer programas de melhoramento e minimizar a consanguinidade. Quando o número de reprodutores é limitado, como ocorreu com o cherne, um acasalamento compensatório é obrigatório (Doyle et al., 2001) e, portanto, o esquema reprodutivo entre reprodutores precisa ser definido entre as várias opções para o nível mais baixo de parentesco.

No entanto, o melhor cenário reprodutivo foi conseguido por meio de cruzamentos de reprodutores das cinco fontes diferentes, onde apenas 2.3 % do parentesco Rxy aumentou, o que foi visto na geração F2. Este cenário de reprodução aqui simulada, onde todos os reprodutores contribuem igualmente, está longe de ser o que realmente os poucos reprodutores contribuiem para as progênies comerciais em outras espécies, devido ao trabalho e aos custos de experiência, uma estratégia que resultaria em uma redução do tamanho da população efectiva, aumentando a deriva e endogamia de suas transições fisiológicas.

A fim de preservar a variabilidade residual em programas com menor escala de reprodutores para comercialização, várias estratégias podem ser consideradas como orientação de um plano em curto prazo para aperfeiçoar a produtividade.

A - O cenário genético divergente é forte entre os reprodutores a (5.4 %), é esperado que aumentassem os reprodutores mantidos como cepas independentes. Cinco unidades de cultivo poderiam ser mais fáceis de conseguir um único, mas a perda é evidente desde o início. A abordagem de precaução para minimizar a endogamia, é de permitir o acúmulo de divergência genética aleatória entre as ascendências independentes e atravessar-los para produzir lotes de F1. (ver; Lee & Donaldson, 2001).

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B - Realizar cruzamentos entre reprodutores F1 e com indivíduos selvagens adicionais irão contribuir reduzindo a consanguinidade. A re-distribuição de indivíduos em gerações subseqüentes também ajudaria a diluir os grupos de irmãos e a restaurar a diversidade genética perdida entre os produtores, dissolvendo futuros grupos de irmãos F1, mas a rastreabilidade de parentesco provavelmente esteja perdida.

C - Programar modelos de cruzamentos seletivos, tais como parentesco mínimo, que melhorem a preservação da diversidade de modelos aleatórios sob baixo tamanho efectivo de reprodutores (Ortega-Villaizan et al., 2011).

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55

Capítulo 2

Estrutura genética e dinâmica populacional de cherne (Polyprion americanus) no Atlântico Norte

Capítulo 2

Resumen

La cherna Polyprion americanus es un pez pelágico de larga vida con una fase adulta demersal que muestra una distribución antitropical a lo largo del océano Atlántico, el océano Indico y el océano Pacífico. Estudios genéticos anteriores han sugerido una diferenciación importante entre el Atlántico Norte y Atlántico Sur poblaciones usando ADN mitocondrial y marcadores microsatélite. Sin embargo, no ha podido demostrarse hasta el momento si existe o no una mayor estructuración dentro del Atlántico Norte, aparentemente homogéneo. Hemos aplicado marcadores microsatélite neutros y secuencias, nucleares y mitocondriales a un muestreo temporal de chernas del Atlántico Norte para clarificar esta situación. Los datos experimentales muestran un valor de diferenciación global entre muestras de 13 % principalmente debido a la divergencia entre los tres diferentes pools génicos: Atlántico Norte, Atlántico Sur y Oceanía. Sin embargo, las poblaciones atlánticas parecen conectarse sistemáticamente a través de migraciones longitudinales desde Caroline hacia aguas sur occidentales. Este resultado es clave para entender la dinámica de poblaciones que rige a las chernas, así como para el diseño correcto de las estrategias de explotación.

Palabras claves: Cherna, Población, Diversidad genética, Migración

59 Capítulo 2

Resumo

O cherne Polyprion americanus é um peixe pelágico de longa vida, demersal na fase adulta que mostra uma distribuição antitropical ao longo do oceano Atlântico, do oceano Índico e do oceano Pacífico. Estudos genéticos anteriores desta espécie, mostraram uma diferença importante entre populações do Atlântico Norte e do Atlântico Sul utilizando o ADN mitocondrial e marcadores microssatélite. No entanto, não foi possível demostrar-se até ao momento se existe ou não uma maior estrutura dentro do Norte Atlântico, aparentemente homogénio. Foram aplicados marcadores de microssatélite neutros e sequências, nucleares e mitocondriais numa amostragem temporal de chernes do Norte Atlântico para clarificar esta situação. Os dados experimentais mostraram um valor de diferenciação global entre amostras de 13 % devido principalmente a divergência entre os três diferentes pools génicos: Atlântico Norte, Atlántico Sul e Oceania. No entanto, as populações Atlânticas parecem conectar-se sistemáticamente através de migrações longitudinais desde Caroline até as águas Sul ocidentais. Este resultado é chave para entender a dinâmica populacional que rege nos chernes, assim como para o desenho correcto das estratégias de exploração.

Palavras chaves: Cherne, População, Diversidade genética, Migração.

60 Capítulo 2

Abstract

The wreckfish Polyprion americanus is a long-living pelagic fish with a demersal adult phase that shows an antitropical distribution along the Atlantic Ocean, the Indian Ocean and the Pacific Ocean. Previous genetic studies have suggested a significant differentiation between North Atlantic and South Atlantic populations using mitochondrial DNA and microsatellite markers. Nevertheless it remains elusive whether further structuring exists within the apparently homogeneous north Atlantic stock. We have applied neutral microsatellite markers and both, nuclear and mitochondrial sequences to temporal wreckfish samples from the whole north Atlantic in order to clarify the above scenario. Experimental data showed a global 13% differentiation among samples mainly due to divergence among three different gene pools: North Atlantic, South Atlantic and Oceania. However, Atlantic populations seem to be systematically connected through longitudinal migrations from Caroline waters to south-western Euro-African waters. This result is key to understand wreckfish population dynamics as well as to properly design its exploitation rules.

Keywords: world wreckfish, Population, Deep-sea fish, Genetic diversity, Migration

61 Capítulo 2

Introdução

A sistemática de Polyprion foi revista por Roberts (1986), que considerou sinônimas cerca de 20 espécies nominais dentro de duas, P. americanus e P. oxygeneios. Nesta revisão foi sinonimizado o P. moeone, originalmente descrito em Nova Zelândia, com P. americanus descrito da América. No entanto, Paxton et al. (1989) relacionou o P. moeone e o P. oxygeneios como sendo as únicas espécies válidas a ocorrer na Austrália e Nova Zelândia. Os dados genéticos obtidos por Ball et al. (2000), indicam tanto, uma profunda separação entre as amostras Polyprion americanus, similar entre qualquer P. americanus e P. oxygeneios e, que P. moeone é uma espécie válida, necessitando no entanto de uma maior clarificação sistemática do Polyprion.

O cherne Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801) é uma espécie panoceanica que ocorre no Sul do Pacífico e em ambos os lados do oceano Atlântico, incluindo o Mediterrâneo, porém excluindo os trópicos (Ball et al., 2000). O P. americanus se estende geográficamente por regiões anti-tropicais, como no Norte do oceano Atlântico (Blake Plateau), no Centro Atlântico (Bahamas, Bermuda, Ilhas dos Azores, Canárias e da Madeira, Tristan da Cunha, Gough), no Sudoeste Atlântico (entre a costa do Rio de Janeiro – Brasil e a Argentina), na região sul do Pacifico (Australia e Nova Zelândia), no oceano Indico (St. Paul e Ilhas Amsterdam) e no Mediterrâneo (Figura 1).

Figura 1. Locais conhecidos, comuns de captura da espécie Polyprion americanus.

62 Capítulo 2

O cherne é um teleosteo demersal gonocórico (Roberts, 1989) de grande longevidade, que quando jovem é geralmente situa-se próximo da superficie junto à objectos flutuantes e quando adulto vive entre 40 á 800 m de profundidade (Machias et al., 2003) e a máxima profundidade reportada foi a de 1000 m (Sedberry et al., 1999). Os ovos e larvas de cherne são pelágicos por muitos meses ou anos e presumidamente à deriva da corrente superfícial (Hardy, 1978; Goujon et al., 1993). Os juvenis podem viver mais de dois anos na superficie antes de se alojarem no fundo (Sedberry et al., 1999). A mudança de pelágicos para demersais ocorre quando atingem cerca de 50 cm de comprimento total (Sedberry et al., 1996; 1998). A população de Polyprion do Sudoeste do Pacífico submete-se a uma migração para desova no Norte (Beentjes & Francis, 1999), isto é foram observadas migrações de 700 km do Sudoeste do Pacífico em direcção ao Norte da Nova Zelândia no final do inverno (Roberts, 1996). No entanto de acordo com Ball et al. (2000), P. americanus adultos não foram documentados como sendo altamente migratórios. As migrações das populaçãos do Norte Atlântico ocorrem habitualmente entre o final do inverno e início da primavera, no sentido Centro para Norte Atlântico, na época reprodutiva e de desova em que se estima que as fêmeas produzam entre 10 %-30 % do seu peso em vitelo. Esta espécie no ambiente selvagem para se reproduzir prefer lugares com temperaturas inferiores a 16˚C, profundidades entre 450-850 m, alta pressão, ausência de luz e fundo rochoso onde a competividade inter-espécie é reduzida (Machias et al., 2003).

Há um crescente interesse nas espécies de ambas as costas do Atlântico devido a:

1) Excelente qualidade de carne, grande tamanho e alto valor comercial,

2) Aumento da pressão mundial sobre a pesca de espécies de águas profundas, incluindo o cherne,

3) Homogeniedade genética existente nos estoques (Sedberry et al., 1996; Ball et al., 2000) e,

4) Atractividade para a aquacultura, devido à excepcional taxa de crescimento da espécie durante a fase de sua vida pelágica (Kentouri et al., 1995; Papandroulakis et al., 1997). Uma das limitações do potêncial para a aqüacultura é a reprodução da espécie, ex; a falta de reposição devido aos problemas reprodutivos que apresenta em cativeiro (Suquet et al., 2001) e a escacez devido à sobrepesca em algumas regiões (Peres & Klippel, 2003).

Análises genéticas anteriores, utilizando perfis de PCR-RFLP do gene mitocondrial ND1 indicaram que não há separação entre o estoque de cherne do Nordeste Atlântico (Açores, Majorca, Madeira) e Noroeste Atlântico (Blake Plateau) (Sedberry et al., 1996). Ball et al. (2000) usando marcadores microssatélites com um conjunto de amostras semelhante das utilizadas por Sedberry et al. (1996) demostraram existir três estoques geneticamente distintos de P. americanus: O Norte do oceano Atlântico e do Mediterrâneo, do Brasil e do Sul do Pacífico (Austrália e Nova Zelândia). No entanto, nenhuma outra estruturação genética foi encontrada ao longo de todo o Norte Atlântico, área de pesca que mais interesses de exploração sustentável propicia aos Americanos e Europeus.

63 Capítulo 2

Neste sentido, o prioritário é estabelecer uma dinâmica populacional desta espécie dentro do Atlântico Norte, para melhorar a sua gestão e conservação. Entender o processo do fluxo génico e seus efeitos tornar-se-á muito importante para a pesquisa de genética, pois nos permite perceber se as populações são geneticamente isoladas uma das outras ou se constituem uma população pan- mítica (Balloux & Lugon-Moulin, 2002).

O presente trabalho teve dois objectivos principais, a saber:

A- Estabelecer uma estrutura global do P. americanus utilizando amostras da maioría das campanhas efectuadas nas últimas duas décadas, incluindo amostras de P. oxygeneous cuja distribuição é misturada com a primeira em algumas pescarías, ex; Austrália. Para este caso introduziram reconstruções filogenéticas com genes codificados do Citocromo oxidasa I do ADN mitocondrial e a Rodopsina do ADN nuclear. B- Descrever a estrutura genética das populações selvagens de P. americanus do Atlântico (Norte, Centro e Sul do Atlântico e mar Mediterrâneo) tendo em conta que não se descreveram estruturas prévias nesta área, bem como por utilizar marcadores conservativos (Sedberry et al., 1996) e microsatélites (Ball et al., 2000). Contudo, a falta de estrutura pode responder ao tipo de marcadores empregues e/ou ao desenho da amostragem utilizada para descobrir la. Neste trabalho foram aplicados marcadores microssatélites já descritos e outros novos recém-isolados, para maior colecção inter-anual de amostras de P. americanus disponíveis nos USA e Europa. Considerando que os microssatélites constituem uma das classes de marcadores moleculares mais informativos em estudos inter-populacionais (ex; Presa et al., 1994), espera se que na ausência da estrutura genética no Atlântico, possa se estabelecer ou reforçar hipóteses migratórias de Oeste – Este Atlânticos mediante o cálculo do padrão de migração entre ambos os lados dos Atlânticos.

Material e métodos

Amostragem

Utilizaram-se amostras de várias campanhas formando assim um total de quinhentos e oitenta e seis indivíduos. A primeira colecção de amostras selecionadas correspondem a campanhas anuais de P. americanus do Atlântico Norte, ex; Açores (1993, 1996, 1997 e 1998), Bermudas (1996 e 1997), Brasil (1995), Madeira (1993, 1996 e 1997), Blake Plateau (1995, 1996 e 1997), e mar Mediterrâneo (1994). A segunda colecção incluiu amostras do grupo externo de P. americanus de Austrália (1995), Nova Zelândia (1995), e África do Sul (1997) (Figura 1 e Tabela 1). Todas estas amostras estavam preservadas em 1% Sarcosyl-Urea e formam providênciadas pelo Department of Natural Resources Marine, Resources Research Institute Hollings Marine Laboratory, USA.

64 Capítulo 2

Na segunda colecção de amostras, foi feita em dois pontos Europeios, acoplando cinquenta amostras vindas das Ilhas dos Açores (2012), que foram gentilmente providênciadas por Gui Meneses (Universidade dos Açores). Estas amostras (barbatana dorsal e/ músculos) estavam conservadas em alcool a 70 %, desde o ano de colecta. Outras oitenta e duas amostras (músculos) originários das Ilhas Canárias (2013), gentilmente providênciadas por José Perez (IEO-Canárias da campanha de 02/04/13, de S/C de Tenerife to Cabo da Cruz, Canárias). A sequência de ADN desta espécie P. oxygeneios foi usada como grupo externo nas análises filógenicas.

Tabela 1: Colecção de amostras de P. americanus analisadas neste estudo: local de captura, ano de amostragem e quantidade (N) de amostras. Area Ano de amostragem Código N

Norte Atlântico Açores 1993, 1996, 1997, 1998, 2012 Azo 148

Bermuda 1996, 1997 Ber 14

Blake Plateau 1995, 1996, 1997 Bpl 204

Canárias 2013 Can 79

Madeira 1993, 1996, 1997 Mad 24

Mediterrâneo 1994 Med 8

Sul Atlântico Brasil 1995 Bra 82

Sul do Pacífico Austrália 1995 Aus 12

Nova Zelândia 1995 Nze 9

Ocêano Indíco África do Sul 1997 Saf 6

Total 586

Extração de ADN

O ADN de quatrocentos e cinquenta e quatro amostras preservadas em 1% Sarcosyl-Urea, foram extraidas seguindo o método de fenol-cloroformio descrito em Sambrook et al. (1989). As amostras de ADN das ilhas Açores (2012) e Canárias (2013), que estavam preservadas em alcool, foram extraidas utilizando o método de FENOSALT (Pérez & Presa, 2011). Os peletes foram resuspensos em 50 µL do tampão TE e a qualidade e quantidade do ADN foi determinada utilizando a NanoDrop 1000 spectrophotometer v.3.7 (Thermo Fisher Scientific). A integridade do ADN foi verificada por meio de electroforese em a 1% de gel de agarose colorido de bromuro de Etidio utilizando Nzy-DNA Ladder V (Nzytech) como marcador de peso molecular. O ADN foi purificado e mantido a -20°C até a amplificação de PCR e sequenciação.

65 Capítulo 2

Figura 2: Localização da colecção das amostras de Polyprion americanus. Aus-Austrália; Azo-Açores; Ber- Bermuda; Bra-Brasil; Bpl- Blake Plateau; Can-Canárias; Mad-Madeira; Med- Mar Mediterrâneo; Nze- Nova Zelândia; Saf- África do Sul.

Amplificação de marcadores de microsatelites

Foram desenhados dois duplexs (Tabela 2): o duplex I foi compreendido pelos loci PamD1 e PamA5 descritos no Capítulo 1, duplex II compreendia aos microssatélites Pam006 e Pam021 reportados por Ball et al. (2000). A reacção de ambos duplex I e II foi realizada num volume final de 15 μl com as seguintes concentrações dos componentes: 1XNH4 Tampão de Reacção (670 mM

Tris–HCl pH 8.8, 160 mM (NH4)2SO4, 100 mM KCl, 0.1 % stabilizer, Bioline), 0.2 mM de dNTP,

0.75 U BioTaq DNA polymerase (Bioline), 10-40 ng do ADN padrão e a concentração de MgCl2 e 4-5 pmol de cada primer (Tabela 2). A amplificação de PCR foi realizada num Mastercycler Gradient Thermocycler (Eppendorf). As condições de PCR do duplex I consistiam de uma inicial desnaturação a 96 °C por 10 min, seguido de 30 ciclos a 94 °C por 30 s, 60 °C por 1 min e 72 °C por 1 min, com a extensão final de 72 °C por 10 min. Antes de executar as reações multiplex em um seqüenciador automático, uma alíquota dos produtos amplificados foi verificada em 2 % do gel de agarose por 30 min para avaliar a amplificação correcta dos amplicões. Subsequentemente, 1 μl do producto de amplificação foi homogeinizado com 10.75 μl de Hi-Di formamide e 0.25 μl de GeneScan 500ROX (Applied Biosystem®) tamanho padrão, e corrido em uma ABI Prism-3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem®) do CACTI (Centro de Apoio Científico e Tecnológico da Investigação, Universidade de Vigo). Com o objectivo de minimizar erros de genotipagem, os

66 Capítulo 2

genotipos ABI foram lidos independetimente por três pesquisadores utilizando o software GeneMarker V1.97 (Softgenetics).

Tabela 2: Condições de amplificação dos microssatélites utilizados. pb= pares de base T= temperatura de annealing.

Locus Primer sequence (5'- 3') PCR (pb) Motif [Primer] T (°C) [MgCl2] Dye

PamD1 F: CCCTGTTATCATCGCTTCCT 173 (GACA)9 0.27 µM 58 1.7mM FAM

R: GCCATCACACCCTTCTGTTT

PamA5 F: TGGCCTTTGACTTTGAGGAC 168 (GTCT)13 0.33 µM 58 1.7mM HEX

R: TCATATGACCCCTCCTGCTC

Pam006 F: CTGATGGTTAAGCTGGTGC 112 (GT)17 0.3 µM 55 3.0mM HEX

R: CAATGTGTCTAACATTCGCC

Pam021 F: GATCTGACAATGACCACTTTACT 115 (AC)15 0.3 µM 55 3.0mM FAM

R: CCTCTATAGGAATGCTGCTTTTG

Obtenção de sequência de ADN

Foram utilizadas sequências de un fragmento de Citocromo Oxidase I (CO I) do ADN mitocondrial, e o gene da Rodopsina do ADN nuclear. Ambos os genes são comuns na identificação de espécies marinhas (Rodríguez-Cabello et al., 2013; 2014; Betancur et al., 2013; Landi et al., 2014). A selecção destes genes se efectuou de maneira que fosse possível utilizar sequências depositadas em bases de dados para comparar com as obtídas neste trabalho. No caso do CO I a base de dados utilizada para a obtenção de sequências foi o Barcode of life (Ratnasingham & Hebert, 2007) e para a Rodopsina o GenBank.

O ADN genómico de quarenta e um indíviduos (ind) para nove populações (Aus:2 ind; Az:6 ind; Ber:2 ind; Bpl:6 ind; Bra:8 ind; Can:9 ind; Mad:3 ind; Nze:2 ind e Saf:4 ind) foram usados para amplificar fragmentos com 660 bp do Citocromo oxidase I usando pares de primer Fish F2/Fish R2 descrito por (Ward et al., 2005). As condições de PCR consistiram de uma desnaturação inicial a 95°C por 10 min, seguido por 40 ciclos a 95 °C por 45 s, 50 °C por 1 min e 72 °C por 1 min, com a extensão final a 72 °C por 10 min. As reacções foram realizadas num volume final de 15 μl com as seguintes concentrações dos componentes: 1X NH4 Tampão de reacção (Bioline), 0.2 mM para cada dNTP, 1.5 U BioTaq DNA polymerase (Bioline), 0.15 µM de cada primer, 10-40 ng do ADN molde e 1.5 mM de MgCl2.

O ADN genómico de quarenta e oito indíviduos em nove populações (Aus:2 ind.; Azo:5 ind.; Ber:4 ind.; Bpl:7 ind.; Bra:9 ind.; Can:8 ind.; Mad:7 ind.; Nz:3 ind. e Saf:3 ind. ) foram usadas para

67 Capítulo 2

amplificar a fragmentos com 800 bp de Rodopsina usando os pares de primer Rh 193F/Rh 1039R descritos por (Chen et al., 2003). As condições de PCR consistiram com a inicial denaturalização a 95°C por 4 min, seguido de 30 ciclos a 95 °C por 30 s, 55 °C por 1 min e 72 °C por 1 min, com uma extensão final de 72 °C por 10 min. As reacções foram realizadas em um volume final de 15

μl com as seguintes concentrações dos componentes: 1X NH4 Tampão de reacção (Bioline), 0.2 mM por cada dNTP, 1.5 U BioTaq DNA polymerase (Bioline), 0.15 µM por cada primer, 10-40 ng do ADN molde e 1.5 mM de MgCl2. Para a purificação foi utilizada a exonuclease I e fosfatasa alcalina seguindo instrucções de manufacturação. Amplicons purificados foram sequênciados utlizando os mesmos primers nas instalações do CACTI. Se obtiveram respectivamente 37 sequências de CO I e 36 de Rodopsina.

Análises de dados de microssatélites

Os parâmetros genéticos tais como as frequências alélicas, número de alelos (A), riqueza alélica

(RS), heterozigose observada (HO), heterozigose esperada (HE) e índices de fixação (Wright, 1965) foi calculado com o FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 1995). A probabilidade associada para FIS foi gerada com o Método de Cadeias de Markov implementado em GENEPOP 4.2.1 (Rousset, 2008) usando 20 lotes de 5 000 interações em cada. As diferenças significativas nos paramêtros entre amostras foram avaliadas através de 15 000 permutações com o FSTAT. A taxa de diferenciação DEST (Jost, 2008) e sua significância estatística entre as amostras foi calculada em cima de 1 000 bootstrap usando o software DEMEtics 0.8-5 (Gerlach et al., 2010). A correção para múltiplos testes foi realizada usando a abordagem de false discovery rate approach (Benjamini & Hochberg, 1995). As relações entre amostras foram visualizadas em um espaço bidimensional, em cima de componentes de variância usando a Análise de Componentes Principais (PCoA) implementada no pacote de estatísitca para genética GenAlEx 6.5 (Peakall & Smouse, 2012). O número de pools génicos (k) foi inferido com o BAPS 6 (Corander et al., 2004) usando um spatial mixture analysis (Corander et al,. 2008a) seguido por uma admixture analysis baseado no mixture clustering de 100 000 Bayesian interações (Corander et al., 2008b). A análise de AMOVA locus por locus foi implementada no ARLEQUIN 3.5 (Excoffier et al., 2005) foi usada para dividir a variação genética do conjunto de dados inteiros em agrupamentos principais. Os níveis estatísticos nominais para os

índices de fixação FCT e FSC foram determinados após 1 023 permutações. As taxas de câmbio entre os pares de amostras foram inferidos após o método Bayesiano do genotípo multilocus implementado em BAYESASS v3.0 (Wilson & Rannala, 2003) e consistiu em 5 000.000 MCMC interações, um burn-in threshold de 1 000.000 e um intervalo de amostragem de 1 000-interação. As defínições a priori de parâmetros de mistura foram ΔM = 0.95, ΔA = 0.95 e ΔF = 0.95. As taxas de aceitação final para as alterações propostas depois de convergência foram ΔM = 0.54, ΔA = 0.72 e ΔF = 0.87).

68 Capítulo 2

Análise de dados de sequências e filógenias

Em virtu de de que na maioria dos casos, trabalhou se com amostras de tecído enviadas por outros investigadores, não se poude efectuar uma identificação morfológica dos indivíduos. Por esta razão, as sequências óbtidas foram comparadas com a ferramenta BLAST disponível em GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), para comprovar que correspondiam a espécie em estudo P. americanus. Foram obtidos um total de 74 sequências, 38 de CO I (uma delas foi eliminada por não alcançar o cumprimento suficiente) e 36 de Rodopsina, respectivamente. As sequências obtidas para os dois marcadores foram editadas com o programa BIOEDIT e alinhadas usando CLUSTALX 2.1 (Larkin et al., 2007). No caso do CO I foram usadas 7 sequências de P. americanus e 6 sequências de P. oxygeneios disponíveis em BOLD database (Ratnasingham & Hebert, 2007), as sequências obtidas de Rodopsina se alinharam com 4 sequências de P. americanus e 1 sequência de P. oxygeneios obtidas em GenBank (Benson et al., 2013).

Foi calculada a taxa de Transição/Transversão e o índice de disparidade global para todas as sequências, com o programa MEGA versão 6 (Tamura et al., 2013). Duas filogénias baseadas em ADN mitocondrial (CO I) e (Rodopsina) marcadores nucleares foram construídos utilizando software MEGA 6.0 (Tamura et al. 2013). A fim de determinar o melhor modelo de substituição, foi utilizado o Akaike Information Criterion (AIC) implementado em ModelTest (Posada, 2008) disponível em Phylemon 2.0 (Sánchez et al., 2011). A história evolutiva foi inferida usando o método de máxima Verossemelhança com base na melhor substituição segundo o critério AIC e 1000 bootstraps. A árvore inicial para a busca heurística, foram obtidos automaticamente pela aplicação de algorítmos neighbor-joining e BioNJ a uma matriz de distâncias, entre pares estimados usando a de Maximum Composite Likelihood (MCL), e em seguida, uma topológia de seleção da Verosemelhança com valor superior.

Estrutura e diversidade genética

O conteúdo G+C, número e distribuição dos haplótipos, diversidade de haplótipos, diversidade de nucleotídeos, o número médio de diferenças dos nucleotídeos e o teste de D de Tajima como teste de neutralidade foram calculados utilizando o software DNAs p 5.0 (Librado & Rozas, 2009).

Uma network de máxima parcimônia foi construído com os haplótipos CO I, para representar a distribuição espacial dos haplótipos, utilizando o algorítmo median joining (Bandelt et al., 1999), com o cálculo MP para reduzir median vectors desnecessários e links, e uma proporção de Transição/Transversão de 3:1 (recomendado para ADN mitocondrial), o resto dos parâmetros básicos propostos no programa Network 4.6.1 (Polzin & Daneschmand, 2003) foram mantidos.

O cálculo da distância molecular dentro e entre os grupos foi feita em cima de resultados de análise filogenética realizada com sequências CO I, que definiram quatro grupos regionais: Atlântico, Brasil e Nova Zelândia, África do Sul e P. oxigeneios. Para aqueles grupos foi calculado o número

69 Capítulo 2

de substituições por base a partir de uma média, com todos os pares de seqüência dentro de cada grupo. As análises foram conduzidas utilizando o modelo Maximum Composite Likelihood (Tamura et al., 2004). A variação entre os sites foi modelado com uma distribuição gamma (shape parameter = 0.05).

Resultados

Microsatelites

Amostras de Bermuda (Ber), Madeira (Mad), Mar Mediterrâneo (Med), África do sul (Saf), Austrália (Aus) e Nova Zelandia (Nze) estavam em equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) em todos os marcadores, enquanto que Blake Plateau (Bpl), Ilha dos Açores (Azo) e Brasil (Bra) mostraram desvios significativos de HWE em ao menos três microssatélites devido a deficiência de heterozigoticos (Tabela 3). Marcadores microssatélites eram polimórficos em todas as amostras excepto no mar Mediterrâneo em PamD1 e o numero de alelos por locus era de 14 em PamD1, 16 em PamA5, 25 em Pam006 e 20 em Pam021 (Figura 3). A moda alélica de cada marcador foi diferente entre amostras (ex; PamD1 tamanho modal foi de 171 nas amostras do Norte Atlântico mais 175 nas amostras de Oceania).

70 Capítulo 2

Tabela 3. Parâmetros genéticos de quatro loci microssatélites analisados em amostras de cherne, Polyprion americanus, coletadas de seus principais pontos.

Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze PamD1 N 140 8 124 17 74 6 71 6 10 9 A 6 3 5 3 5 1 11 5 3 2 Modal A 171 171 171 171 171 171 175-179 171 175 175 Range A 149-179 171-179 163-179 163-175 163-179 171 167-207 171-203 171-179 175-179

RS 1.937 1.750 2.039 1.629 1.936 1.000 4.106 4.061 1.821 1.333

HE 0.333 0.241 0.368 0.222 0.337 0.000 0.837 0.850 0.289 0.111

HO 0.271 0.250 0.290 0.118 0.230 0.000 0.704 0.833 0.100 0.111

FIS 0.184* -0.037 0.212* 0.471 0.318 NA 0.159 0.020 0.654 0.000 PamA5 N 140 7 119 15 72 7 68 4 10 9 A 9 3 6 3 9 2 7 2 3 3 Modal A 157 157 157 157 157 157 157 157 139 157 Range A 139-171 157-171 149-171 149-169 149-173 157-169 135-169 151-157 139-169 137-157

RS 2.174 2.385 2.187 2.299 3.007 1.930 3.549 1.964 2.274 2.476

HE 0.452 0.500 0.497 0.538 0.620 0.429 0.774 0.417 0.561 0.556

HO 0.407 0.286 0.437 0.667 0.444 0.571 0.603 0.500 0.600 0.778

FIS 0.099* 0.429 0.121* -0.239 0.284 -0.333 0.221* -0.200 -0.069 -0.400 Pam006 N 192 13 126 22 79 4 72 3 11 9 A 10 6 9 4 6 3 13 5 5 4 Modal A 112 112 112 112 112 110 124-140 132 114 114 Range A 104-126 104-114 100-118 104-112 104-114 110-126 122-152 106-138 110-122 110-120

RS 3.569 3.658 3.436 3.089 3.478 2.750 4.194 5.000 2.506 3.005

HE 0.777 0.776 0.759 0.698 0.763 0.708 0.849 0.917 0.473 0.694

HO 0.734 0.692 0.714 0.546 0.747 0.500 0.681 1.000 0.455 0.556

FIS 0.055* 0.107 0.059* 0.219 0.022 0.294 0.198* -0.091 0.038 0.200 Pam021 N 193 14 117 24 79 3 72 3 11 9 A 18 9 15 8 14 6 13 5 6 5 Modal A 111-115 109-111 109-111 109-111 109-111 109-123 115 111 95-103 95 Range A 93-129 95-125 93-125 99-129 97-127 109-123 101-135 105-117 95-115 95-107

RS 4.079 4.272 4.007 3.814 4.068 6.000 3.808 5.000 3.607 3.735

HE 0.832 0.863 0.825 0.809 0.832 1.000 0.771 1.000 0.782 0.799

HO 0.736 0.714 0.769 0.792 0.734 1.000 0.625 0.667 0.636 0.778

FIS 0.115* 0.172 0.067 0.021 0.118* 0.000 0.189* 0.333 0.186 0.026 Nota: Os seguintes parâmetros fornecidos para cada locus e população: o número de indivíduos genotipados (N), o número de alelos (A), alelos privados (Ap), o tamanho do alelo modal (Modal A), a faixa do tamanho

(Faixa A, em pb), a riqueza alélica (Rs), a heterozigosidade esperada (HE), a heterozigosidade observada

(HO) e do índice de fixação FIS (Weir &Cockerham, 1984). Desvios significativos em relação equilíbrio de Hardy-Weinberg foram corrigidos com o teste seqüencial de Bonferroni (* P ≤ 0.01) (Rice, 1989).

71 Capítulo 2

Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

1.0 0.8 0.6 0.4

Frequency 0.2 0.0 149 159 163 167 171 175 179 183 187 191 195 199 203 207 Locus PamD1

Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

0.8

0.6

0.4

Frequency 0.2

0.0 135 137 139 143 149 151 153 155 157 159 161 165 167 169 171 173 Locus PamA5

Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

0.8 0.6 0.4

Frequency 0.2 0.0 100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 130 132 134 136 138 140 142 144 146 148 152 Locus Pam006

Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

0.5 0.4 0.3 0.2

Frequency 0.1 0.0 93 95 97 99 101 103 105 107 109 111 113 115 117 119 121 123 125 127 129 135 Locus Pam021

Figura 3: Histogramas (pb-pares de base) de distribuição de frequências alélicas da espécie Polyprion americanus em 4 locus (PamD1, PamA5, Pam006 e Pam021).

72 Capítulo 2

Uma forte diferenciação foi observada nas duas coordinadas de PCoA (Figura 4). A primeira separa as amostras do Norte do oceano Atlântico (Bpl, Ber, Azo, Mad e Can) das colectadas em Oceania (Aus e Nze), ambos os grupos foram claramente separados do resto das amostras (Med, Saf e Bra) através da segunda coordenada (Figura 4). Uma fraca diferenciação foi observada dentro do terceiro grupo entre Med e as amostras de Bra e Saf.

Figura 4: Padrão de variação entre 10 populações de Polyprion americanus obtido com a análise das coordenadas principais (PCoA).

O maior numero provável de grupos genéticos recuperado pela análise mista (k = 1-10) foi 4 com P = 0.9997: 1) amostras do Norte Atlântico e do mar Mediterrâneo (Bpl, Ber, Mad, Azo, Can, Med), 2) Brasil (Bra), 3) África do Sul (Sfa) e 4) Oceania (Aus e Nze). A análise de misturas baseou-se no agrupamento que revelou um k = 4 com as mesmas amostras de cada grupo.

O FST global entre as populações foi altamente significativo (FST = 0.121; p = 0.000) (Tabela 4). A variação entre os grupos foi significativa em ambos os cenários avaliados com resultados de agrupamentos de BAPS (k = 4; FCT =0.241) como também de PCA-GenAlEx (k = 3; FCT =0.210)

(Tabela 4). A divergência dentro do agrupamento no Atlântico foi pequena porém significativa FST = 0.003

73 Capítulo 2

Tabela 4. Hierarquica AMOVA. Em asteristico indica a probabilidade de valores observados que eram iguais ou menores do que as esperadas por acaso, *P ≤ 0.01; ns: não significativo.

Hierarchical level Source of variation Sum of Variance % Fixation index squares component Variation

Whole dataset Among populations 144.000 0.17522 12.09 FST = 0.121*

Within populations 1264.413 1.27397 87.91

Atlantic (Including Med) Among populations 7.952 0.00373 0.31 FST = 0.003*

Within populations 987.314 1.21586 99.69

Among groups BAPS: 1)Aus Among groups 134.504 0.40626 24.13 FCT = 0.241* y Nze, 2)Saf, 3) Brz y 4) rest

Among populations within ns 9.496 0.00355 0.21 FSC = 0.003 groups

Within populations 1264.413 1.27397 75.66 FST = 0.243*

Among groups PCA: 1) Aus Among groups 121.037 0.34551 21.01 FCT = 0.210* y Nze, 2) Saf, Med y Bra, 3) rest Among populations within 22.963 0.02466 1.50 FSC = 0.019* groups

Within populations 1264.413 1.27397 77.49 FST = 0.225*

Parâmetros de diferenciação (FST e DEST) foram não-significativos em comparações aos pares dentro dos grupos (ou seja FST variou 0.000-0.005 entre as amostras do Atlântico Norte, e FST = 0.020 Mas entre Aus e Nze, mas foi altamente significativa entre eles, (o D variou de 0.626-0.788 entre a Oceania e o grupo do Norte Atlântico ) (Tabela 5).

74 Capítulo 2

Tabela 5. Comparação previsionais de diferenciação (DEST, abaixo diagonal) e fluxo gênico (FST acima de diagonal) entre amostras de cherne. Ambas as estimativas foram corrigidos para múltiplos testes após Benjamini & Hochberg (1995).

Bpl Ver Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

Bpl - 0.000 0.001 0.003 0.004 0.000 0.223* 0.094NA 0.336* 0.310*

Ber 0.002 - 0.000 0.000 0.000 0.000 0.202* 0.070NA 0.338* 0.322*

Azo 0.004 0.003 - 0.000 0.005 0.000 0.218* 0.103NA 0.328* 0.304*

Mad 0.005 0.000 0.000 - 0.001 0.000 0.223* 0.127NA 0.385* 0.369*

Can 0.007 0.000 0.005 0.000 - 0.001 0.201* 0.087NA 0.317* 0.293*

Med 0.000NA 0.000 NA 0.000 0.000 0.000 - 0.227* 0.094NA 0.417* 0.384*

Bra 0.653* 0.709* 0.670* 0.696* 0.652* 0.699* - 0.083NA 0.221* 0.204*

Saf 0.220NA 0.193* 0.259* 0.271* 0.240* 0.000NA 0.516* - 0.301NA 0.253NA

Aus 0.705* 0.626* 0.704* 0.752* 0.705* 0.788* 0.710* 0.782* - 0.020

Nze 0.649* 0.589* 0.655* 0.714* 0.649* 0.692* 0.717* 0.671* 0.021 -

Nota: P-valores obtidos após: 900 permutações. Indicativo do nível nominal ajustado (5%) para multiplas comparações é: 0.001111. NA indica que o teste de significância não esta disponível.

A taxa de migração principal significativa foi observada no âmbito do oceano Atlântico em direcção ao Leste do Blake Plateau (Bpl) para o resto de amostras do Norte Atlântico, ou seja, Bermuda (Ber; m = 0.117), Açores (Azo; m = 0.248), Madeira (Mad; m = 0.175), Ilhas Canárias (Can; m = 0.097) e do Mar Mediterrâneo (Med; m = 0.129) e do Brasil (Bra) para a África do Sul (SFA; m = 0.083) (Tabelas 6 e 7). Também as taxas de migração significativa foram observadas na direcção oposta de Açores para Blake Plateau (m = 0.166) (Tabela 6). Também taxa de migração significativa ocorreu entre as amostras de Oceania, ou seja, da Austrália (Aus) para a Nova Zelândia (Nze) m = 0.173.

75

76 Tabela 6. Taxas de migração (m) entre cherne amostras de primeira linha (doadores) para Aqueles na primeira coluna (receptores) como inferido Com BayesAss. Números

em negrito indicam as taxas de migração significativa entre as amostras de peixes pares. Os valores sombreados na diagonal corresponden as taxas de migração dentro de grupo.

Bpl Ver Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze

Bpl 0.813±0.069 0.002±0.003 0.166±0.069 0.002±0.004 0.009±0.014 0.002±0.003 0.002±0.003 0.002±0.004 0.002±0.004 0.002±0.003

Ber 0.117±0.093 0.681±0.027 0.052±0.067 0.015±0.027 0.062±0.078 0.014±0.026 0.014±0.026 0.015±0.028 0.016±0.030 0.014±0.027

Azo 0.248±0.042 0.002±0.005 0.725±0.040 0.002±0.005 0.011±0.017 0.002±0.005 0.002±0.004 0.003±0.005 0.003±0.005 0.002±0.005

Mad 0.175±0.082 0.010±0.019 0.071±0.077 0.677±0.019 0.019±0.032 0.010±0.019 0.010±0.018 0.010±0.018 0.010±0.019 0.010±0.019

Can 0.097±0.096 0.004±0.007 0.160±0.107 0.004±0.007 0.716±0.053 0.004±0.007 0.004±0.007 0.004±0.008 0.004±0.008 0.004±0.007

Med 0.129±0.092 0.020±0.037 0.041±0.067 0.019±0.035 0.029±0.051 0.686±0.036 0.019±0.036 0.019±0.036 0.019±0.036 0.019±0.035

Bra 0.011±0.015 0.004±0.008 0.007±0.012 0.004±0.007 0.005±0.009 0.004±0.008 0.952±0.025 0.005±0.009 0.004±0.008 0.004±0.007

Saf 0.033±0.054 0.027±0.050 0.029±0.051 0.025±0.044 0.037±0.059 0.025±0.045 0.083±0.076 0.694±0.050 0.025±0.045 0.023±0.044

Aus 0.019±0.033 0.016±0.029 0.020±0.036 0.015±0.029 0.018±0.033 0.015±0.027 0.020±0.034 0.015±0.028 0.848±0.072 0.015±0.028

Nze 0.018±0.034 0.018±0.032 0.018±0.033 0.018±0.033 0.018±0.033 0.018±0.033 0.018±0.033 0.017±0.033 0.173±0.069 0.685±0.033

Capítulo 2

Tabela 7. Taxas de migração (m) entre as amostras de cherne de cluster Atlântico. "Doadores" são na primeira linha e "receptores" estão na primeira coluna, como inferido Com BayesAss. Números em negrito indicam as taxas de migração significativa entre as amostras por pares. Os valores sombreados na diagonal corresponden as taxas de migração dentro de grupo.

Bpl Ver Azo Mad Can Med

Bpl 0.814±0.088 0.003±0.005 0.156±0.090 0.007±0.015 0.019±0.029 0.002±0.005

Ber 0.088±0.118 0.687±0.037 0.090±0.119 0.031±0.058 0.087±0.103 0.018±0.034

Azo 0.244±0.079 0.004±0.007 0.727±0.079 0.007±0.015 0.013±0.022 0.004±0.007

Mad 0.142±0.120 0.012±0.023 0.119±0.126 0.684±0.034 0.031±0.055 0.012±0.023

Can 0.185±0.105 0.006±0.012 0.063±0.101 0.019±0.038 0.722±0.056 0.005±0.010

Med 0.094±0.128 0.026±0.046 0.111±0.132 0.032±0.058 0.043±0.075 0.694±0.050

Análise filogenética

A análise envolveu cinquenta e duas sequências de nucleótidos da CO I, com um total de seiscentos e treze posições no final do conjunto de dados; trinta e sete das cinquenta e duas foram obtidas neste trabalho (9 das Ilhas Canárias, 7 do Brasil, 6 de Blake Plateau, 5 dos Açores, 4 da África do Sul, 3 da Madeira, 2 de Bermuda e 1 da Nova Zelândia). A história evolutiva foi inferida utilizando o método da Maximum Likelihood e 1 000 botstraps com base no modelo Hasegawa-Kishino-Yano (HKG) (Hasegawa et al., 1985). A árvore com a mais alta probabilidade de log (-1109.4004) é a mostrada na Figura 5.

A percentagem de árvores em que é agrupada a taxa associada é mostrada ao lado dos ramos. As árvores iniciais para a busca heurística foram obtidos automaticamente por algorítmos BioNJ aplicando a uma matriz de distâncias entre pares estimado, usando a abordagem de Maximum Composite Likelihood (MCL), e em seguida, uma topologia de seleção de Verossemelhança com o valor superior. A distribuição gamma discreta foi usada para modelar diferenças evolutivas entre a taxa das (cinco categorias (+ G, parâmetro = 0.0500)). As taxas evolutivas médias nas categorias originais foram 0.00, 0.00, 0.00, 0.03, e uma média de 4.97 substituições por site. As freqüências de nucleotídeos foram A = 22.65 %, T/U = 28.47 %, C = 31.06 %, e G = 17.82 %.

A árvore mais provável recupera 3 grandes Clades. O que tem maior suporte de (100 %), que reuniu sequências da África do Sul, obtidos neste estudo com as depositadas em BOLD, outro Clades consistiu em seqüências de P. oxygeneios com um suporte de 99 %. O terceiro Clades, com

77 Capítulo 2

um apoio de 82 %, foi composto por todas as amostras no Norte Atlântico e um ramo com pouco apoio (53 %) do que nas amostras da América do Sul e de Nova Zelândia. Sem discrepância entre as sequências obtidas neste trabalho com aqueles depositados em BOLD são observados.

O índice de disparidade média global (Kumar & Gadagkar, 2001) entre as sequências CO I foi 0.001. A máxima Verossemelhança estimada através de Transição/Transversão (R) foi de 4.19. O padrão de substituição e taxas foi estimado sob o modelo HKY + G (Hasegawa et al., 1985). A distribuição gamma discreta foi usada para modelar as diferenças entre sequências (4 categorias [+ G], parâmetro = 0.0500). As freqüências de nucleotídeos foram A = 21.70 %, T/U = 30.81 %, C = 29.35 %, e G = 18.14 %.

78 Capítulo 2

60 936_COI Azores 916_COI Bermuda Can20_COI Madeira Can15_COI B.P. (S. Carolina) Can8_COI Can7_COI Can6_COI Can5_COI Can4_COI Can2_COI Can1_COI Az5_COI Az1_COI Atlantic North 1137_COI 1060_COI 1054_COI

82 937_COI 847_COI 775_COI 773_COI 626_COI 624_COI 616_COI 139_COI 951_COI SCFAC569-06PamericanusKC015825 ANGBF7784-12PamericanusAB639846 Brazil 94 FOA596-04PamericanusDQ107915 Argentina FOA595-04PamericanusDQ107914 New Zealand 469_COI 302_COI 34 250_COI 258_COI Bra-Arg-Nze 53 273_COI FARG620-09Pamericanus FARG622-09Pamericanus 251_COI 264_COI 64 266_COI FARG621-09Pamericanus ANGBF7812-12|Polyprion oxygeneios|COI-5P|AB639853

81 FOA597-04|Polyprion oxygeneios|COI-5P|DQ107900 99 FOA598-04|Polyprion oxygeneios|COI-5P|DQ107901 P. oxygeneius FOA599-04|Polyprion oxygeneios|COI-5P|DQ107902 58 FOA600-04|Polyprion oxygeneios|COI-5P|DQ107903 FOA601-04|Polyprion oxygeneios|COI-5P|DQ107904 854_COI 855_COI DSFSG406-10PamericanusHQ945983 100 South Africa 852_COI 853_COI 65 DSLAG1796-12PamericanusKF489705

0.005 Figura 5. Árvore filogenética molecular de CO I obtida com um método de máxima Verossemelhança com base no modelo HKY + G. A percentagem de árvores em que o suporte bootstrap é mostrado ao lado dos ramos.

79 Capítulo 2

Estrutura e diversidade genética

O conteúdo G + C do gene CO I foi 0.479. O número de sítios polimórficos (segregação) foi S = 31, e o número total de mutações 32. O número de haplótipos foi h = 8, a diversidade de haplótipos foi Hd = 0.719 e diversidade de nucleotídeos (por local) foi Pi = 0.01446. O número médio de diferenças de nucleotídeos foi k = 7.401851. D de Tajima não foi significativa D = 0.15056 (P> 0.1). Este valor tem o significado de que a variação na sequência não está sob selecção.

Excluindo-se os gaps, houve um total de 512 posições no conjunto de dados final. Foram definidos com base nos resultados das análises filogenéticas quatro grupos populacionais: Atlântico, Brasil e Nova Zelândia, África do Sul e P. oxigeneios. As estimativas de média divergência seqüência evolutiva sobre pares dentro e entre os quatro grupos na filógenia recuperados são apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. Estimativas da média Evolutionary Divergence sobre pares de sequências dentro dos grupos e S.E. erro estandar (primeira coluna). Estimativas da Net Evolutionary Divergence entre os grupos de sequências (abaixo diagonal) e seu desvio-padrão (acima diagonal).

d+S.E 1 2 3 4

within group Atlantic BR-Arg-NZ S. Africa P. oxygeneios

1. Atlantic 0.000±0.000 ±0.002 ±0.051 ±0.037

2. BR-Arg-NZ 0.003±0.0018 0.003 ±0.056 ±0.042

3. South Africa 0.000±0.000 0.085 0.093 ±0.067

4. P. oxygeneios 0.003±0.0026 0.053 0.062 0.104

A partir das sequências CO I foi usado o programa DNAsp v. 5.0 (Librado & Rozas, 2009) para determinar a distribuição dos haplótipos. Os resultados são mostrados na Tabela 9. As posições variáveis mostradas na Tabela 9 correspondem aos amostrados na network da Figura 6.

80

Tabela 9. Polimorfismo de nucleotídeo, a freqüência absoluta e relativa de 8 CO I haplotipos de Polyprion sp. e sua distribuição em dez áreas de pesca. Haplótipos Hap.6, Hap.7 e Hap.8 correspondem a correspondência para o grupo externo P. oxygeneios.

Nucleotide position

1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5

5 3 4 6 6 7 7 8 1 4 6 0 0 0 1 3 3 5 6 6 7 9 3 5 5 5 6 6 0 1 2 Absolute haplotype frequency per fish ground Frequency Bpl Ber Azo Mad Can Med Bra Saf Aus Nze Haplotype 2 6 2 0 6 2 8 1 1 1 8 4 5 7 0 1 4 8 4 5 4 4 0 1 4 7 3 6 2 1 3 (%)

1 Hap.1 C C G T A C T C A C G T T A A A A T T T G C G G C C C G T A T 26 (50.00) 7 2 5 3 9

2 Hap .2 ...... C ...... G . 4 (7.69) 4

2 Hap .3 ...... G . 6 (11.54) 6

3 Hap .4 . . . C ...... A ...... G . 4 (7.69) 3 1

4 Hap .5 T T A . G T . A . A A C . G . G . . C C A . . . T T T A C . . 6 (11.54) 6

5 Hap .6 ...... C A G . A . C . G G C . C . . . A A . T T . . . C 4 (7.69) 4

Hap .7 ...... C A G . A . C . G G C . C . . T C A . T T . . . C 1 (1.92) 1

Hap .8 ...... C A G . A . C . G G C . C . . T C A . . T . . . C 1 (1.92) 1 1 Amostra SCFAC569-06 foram coletadas no Canada. 2 Amostra FARG621-09 (Hap.2), FARG620-09 (Hap.3) e FARG622-09 (Hap.3) foram coletadas no Mar del Plata (Argentina). 3 Amostras FOA595-04 e FOA596-04 foi coletada em New South Wales (Austrália), e ANGBF7784-12 foram coletadas no Sul do oceano Indico. 4 Amostras DSFSG406-10 e DSLAG1796-12 foram coletados na África do Sul. 5 Amostra ANGBF7812-12 foram coletadas no Sul do Oceano Indico.

81

Capítulo 2

A network de haplótipos excluindo P. oxygeneios se mostra na Figura 6. A divergência mutacional dentre o P. americanus é o primeiro grau (uma mutação) ou segundo grau (duas mutações). A divergência dentro desta espécie com a população Sul-Africana sobe para 20 mutações.

Figura 6. Network de máxima parcimônia mostrando a divergência mutacional entre haplotipes de P. americanus do Atlântico e África do Sul.

Com respeito ao gene nuclear Rodopsina, se obtiveram 36 sequências de aproximadamente 800 pb (oito das ilhas de Canárias, sete do Brazil, cinco de Blake Plateau, dois da África do Sul, cinco da Madeira, três de Bermuda, duas da Austrália, três de Nova Zelândia e uma dos Açores). Atrás do alinhamento com as sequências obtidas do GenBank (Os numeros de acesso: gi133923802, gi129561557, gi129561555, gi133923804, gi393007797) se mantiveram com um comprimento de sequência de 460 pb ainda que depois de eliminar as lacunas permaneceram 450 posições no conjunto final de dados. O numero de haplótipos foi de 5 e da diversidade de haplótipos foi Hd: 0.1717.

Esta análise envolveu quarenta e uma sequências de nucleótideos. O modelo com a menor pontuação de BIC (Bayesian Information Criterion) foi de Jukes and Cantor (Jukes & Cantor, 1969) e são considerados os mais adequados para descrever o padrão de substituição observado. No entanto, segundo o critério de Akaike o melhor modelo foi o de Hasegawa-Kishino-Yano (Hasegawa et al., 1985). A análise filogenética mediante o método de máxima Verossemelhança mostrou uma árvore com probabilidade log likelihood (-688.2777). A árvore obtida (Figura 7) foi politómica com as sequências obtidas neste trabalho e aqueles depositados no GenBank para P. americanus e P. oxygeneios. O índice de disparidade média global (Kumar & Gadagkar, 2001) foi 0.000 e o número de substituições por posiçâo sobre todos os pares de sequência foi de 0.001 ± 0.000. Tem 440 posições conservadas de 450 posições, 10 singletons e zero sites informativos

82 Capítulo 2

parcimoniosos. Por esse motivo, foi decido não construir uma network ou realizar análises genéticas adicionais dentro e entre os grupos usando esta sequência altamente conservada.

135 Rhodopsin 253 Rhodopsin 133 Rhodopsin gi133923802Polyprion gi129561557Pamericanus gi129561555Pamericanus 132 Rhodopsin 248 Rhodopsin 251 Rhodopsin 254 Rhodopsin 260 Rhodopsin 263 Rhodopsin 264 Rhodopsin 468 Rhodopsin 469 Rhodopsin 477 Rhodopsin 486 Rhodopsin 487 Rhodopsin 526 Rhodopsin 616 Rhodopsin 746 Rhodopsin 773 Rhodopsin 776 Rhodopsin 782 Rhodopsin 784 Rhodopsin 816 Rhodopsin 851 Rhodopsin 855 Rhodopsin 911 Rhodopsin 1061 Rhodopsin 1136 Rhodopsin Can3 Rhodopsin Can10 Rhodopsin Can11 Rhodopsin Can12 Rhodopsin Can13 Rhodopsin Can14 Rhodopsin Can16 Rhodopsin Can17 Rhodopsin gi133923804Pamericanus gi393007797Poxygeneios

Figura 7: Árvore filógenica molecular de Rodopsina obtida apartir do método de máxima Verossemelhança baseado no modelo HKY.

83 Capítulo 2

Discussão

Diversidade dos microssatélites

Os estudos da variação genética em populações naturais são dependentes de marcadores polimórficos específicos que geralmente oferecem a possibilidade de investigação da estrutura da população, dados científicos para proteger as populações em localização mais frágeis e finalmente a gestão em longo prazo das pescas (Çiftci & Okumu, 2003). O principal assunto da genética de populações é o estudo da variação genética das populações e o seguimento de freqüências alélicas através do tempo e do espaço, aspectos que tem repercução directamente aplicada na gestão dos recursos vivos.

Neste capítulo abordamos o estudo populacional de P. americanus em todo o mundo, com o objectivo de definir as princípais unidades de gestão do ponto de vista genético. Temos também como objectivo definir a dinâmica populacional dentro do estoque Atlântico, supostamente amplamente conectado, como é a hipótese de estudos de dinâmica reprodutiva e de populações. Se tal conectividade for confirmada, sería de interesse a gestão conjunta das pescas no Atlântico dos Estados Unidos e da UE, para proteger e optimizar a exploração de recursos.

As amostras do Blake Plateau (Bpl), Açores (Azo) e Brasil (Bra) apresentaram desvios significativos do HWE em pelo menos três microssatélites devido à deficiência de heterozigotos. Inesperadamente, estas amostras são os únicos com o maior número de indivíduos. No caso de Bpl e do Azo esta pode ser relacionada com a análise, porque foi feito com amostras de vários anos. Um efeito Wahlund inter-anual que mistura cortes poderia ser uma explicação simples para esse déficit de heterozigotos. O déficit observado no Brasil é menos esperado uma vez que consistia em um único ano de amostragem, e provavelmente poderia estar relacionada com a divergência genética desta sub-população em relação ao estoque Atlântico onde os microssatélites foram isolados.

A fixação do alelo modal 171 do lócus PamD1 nas amostras do Mediterrâneo também foram notáveis. Embora seja provavelmente devido ao pequeno tamanho da amostra análisada, também poderia reflectir no bottlenneck produzido pela população ao entrar no Mediterrâneo, tal como o relatado em outras espécies, por exemplo, Mytilus galloprovincialis (Diz & Presa, 2008).

Finalmente, as distribuições alélicas disjuntas e a divergência observada no alelo modal de todos os marcadores microssatélites, entre as amostras do Atlântico e o resto das posições geográficas ocupadas pela espécie, sugere que exista profunda divergência genética entre elas, provavelmente ao nível da espécie. Um aspecto que será discutido mais tarde sobre análises dedicadas a esse objectivo.

84 Capítulo 2

Análises de coordenadas principais e clusteres bayesianos

Observou-se uma forte diferenciação entre amostras de P. americanus do Norte Atlântico (Bpl, Ber, Azo, Mad e Can) e as amostras provenientes de Oceania (Aus e Nze), uma divergência que corresponde claramente a um isolamento por efeito da distância dentro desta espécie. Ambos os grupos foram claramente separados do resto das amostras (Med, Saf e Bra) segundo as coordenadas (ver Figura 4). Essas amostras não formam qualquer agrupamento consistente, então continua a falta de definição após estas análises.

A análise de variância atribue um 24 % de toda variação ao componente entre os quatro grupos regionais. Essa variação foi significativa em ambos os cenários analisados, quer em resultados de agrupamento de GenAlEx (k = 3; FCT = 0.210) (Tabela 4 e Figura 4) ou na inferência Bayesiana usando BAPS (k = 4; FCT = 0.241). Esta grande divergência corresponde á esperada, entre subespécies altamente estruturadas. Na verdade, os quatro grupos mais prováveis obtidos através da análise de mistura foram: 1) amostras do Norte Atlântico e do Mar Mediterrâneo (Bpl, Ber, Mad, Azo, Can, Med); 2) Brasil (Bra); 3) África do Sul (SFA) e 4) Oceania (Aus e Nze). De acordo com Ball et al. (2000), existem três estoques genéticamente diferentes de P. americanus: do Norte Atlântico e o Mediterrâneo, do Brasil e do Pacífico Sul (Austrália e Nova Zelândia), embora, infelizmente esses autores não tenham incluído as amostras Sul-africanas nas suas análises. Os agrupamentos recuperados neste trabalho são principalmente congruentes com todas aquelas análises anteriores (Sedberry et al., 1996; 1999; Ball et al., 2000), mas neste trabalho, foi adicionada a população Sul-Africana que não é agrupado com qualquer outro.

O fluxo de genes e diferenciação de gene

Os parâmetros de diferenciação (FST e DEST) não foram significativos em comparações de pares dentro dos grupos, mas foram altamente significativas entre eles (ver Tabela 5). A consistência de divergência intra-regional define claramente cada uma das quatro populações consideradas, e confirma que: 1) todo o Atlântico forma um único estoque ao longo de décadas, 2) a subpopulação brasileira é claramente divergente do Norte Atlântico e muito mais no que respeita a África do Sul e Oceania, 3) as amostras de África do Sul divergem claramente do resto até mais do que a amostra brasileira em alguns casos, 4) amostras de Oceania são claramente as mais divergentes entre as regiões. Nos primeiros estudos ligados a genética desta espécie acreditava-se na costa Sul do Pacífico (Austrália e Nova Zelândia) não havia incidência da espécie P. americanus, pois esta mesma foi confundida com a P. moeone (Roberts, 1986) anos que despois foi constatada definitivamente como P. americanus. Estos resultados são consistentes com os obtidos por Ball et al. (2000), indicando que existe uma grande separação genética entre a população do Sul do Pacífico com a do Brasil.

85 Capítulo 2

A respeito da informatividade das estimas de FST e DEST, ambos são espelhos um do outro

(positivamente correlacionados, dados não mostrados), embora FST é aproximadamente três vezes menos do que DEST em todas as estimativas de divergência. Notávelmente, DEST amplia a divergência entre as populações, devido as diferenças de composição alélica da série alelo enquanto que o FST se baseia simplesmente na heterozigosidade do sistema de alelos.

Migração

As três princípais rotas de migração significativas foram detectadas apartir de microssatélites neste estudo. A maior delas, incluindo a migração massiva do Blake Plateau para o resto de amostras do Norte Atlântico e constituído por uma única maneira inversa de volta de Açores para Blake Plateau (ver Tabela 6). Outra forte implicando uma conexão entre Oceania, Austrália e Nova Zelândia. Finalmente uma mais fraca que liga o Brasil com a África do Sul.

Em relação à forte taxa de migração no Norte Atlântico, Ball et al. (2000), foi dada a hipótese de que os juvenis observados no Nordeste do Atlântico tiveram origem no local de desova em Blake Plateau. No entanto, Fenessy (1998), utilizando parasitas e Sedberry et al. (1999), utilizando RFLPs no ND1 gene mitocondrial propuseram que a desova provavelmente ocorria nos Açores e também no dorso- meso-Atlântico. Na verdade, de acordo com Sverdrup et al. (1942) e Pingree et al. (1996), a corrente dos Açores, de Canárias e o giro Norte-Subtropical poderia levar a prolé gerada nos Açores para a Madeira, as Canárias e talvez Bermuda e América, o que é congruente com o caminho de volta do Oriente para Ocidente Atlântico. Além disso, a tendência de migração dos Açores e Canárias é totalmente congruente com estudos anteriores. Os grupos de populações de P. americanus do Norte Atlântico aparentavam ser um único grupo genético caracterizado por uma troca significativa atraves de migrações e sem conexão com populações do hemisfério Sul. Passando o Atlântico Norte a ser considerado como uma unidade de gestão única. Os grupos genéticos de populações orientais e ocidentais eram considerados indistinguíveis no Atlântico Norte (Sedberry et al., 1996; Ball et al., 2000).

Também foi proposta a hipótese de que os fluxos de superfície poderiam levar juvenis pelágicos para o Mediterrâneo (Sverdrup et al., 1942), sendo também documentada como uma área de desova (Hardy, 1978). Em poucas palavras, as correntes mediam o fluxo génico no Norte Atlântico o que também é visto claramente nos presentes resultados (ver Tabela 6). Ball et al. (2000) indicam que há uma similaridade genética entre as populações do Norte hemisfério (Norte e Oeste Atlântico entre o mar Mediterrâneo). De facto, neste trabalho, as amostras do mar Mediterrâneo parecem ser totalmente atribuídas ao Cluster do Atlântico.

A migração observada entre as amostras de Austrália e da Nova Zelândia são congruentes com a similaridade genética apontada por Ball et al. (2000). Porém, entre as águas do hemisfério Sul (anti-tropicais), permitem uma livre circulação entre Bacias (Atlântico, Indíco e Pacífico). Essa

86 Capítulo 2

conectividade descrita por Sedberry et al. (1996) e por Ball et al. (2000), esta de acordo com a verificação da migração significativa entre o estoque do Pacífico Sul (Austrália e Nova Zelândia). A conexão entre Brasil e África do Sul, foi o sinal mais fraco do sistema, por isso, duvida se de sua força de um cherne no ponto de vista estatístico. Além disso, até este momento, não há nenhuma evidência de migração ou fluxo génico cruzado-equatórial (Ball et al., 2000).

Relações moleculares entre haplótipos CO I

A semelhança dos haplótipos é específica para cada grupo. Por um lado, todas as populações do Atlântico partilham o haplótipo 1 e, por outro lado, as populações Aus-Nze, partilham o haplótipo 4. Na Tabela 9 amostras do Brasil (neste trabalho) e Argentina (BOLD database), foram apresentadas na mesma coluna tal como a separação não esta bem resolvida na árvore filogenética. Eles compartilham haplótipos 2 e 3, que são bem conectados no network.

Relações filogenéticas

Não foi possível obter informações úteis para o gene nuclear da Rodopsina, dada a sua composição molecular altamente conservada. No entanto a região 5 do gene mitocondrial do citocromo c oxidase I, tem sido usado extensivamente para a identificação de espécies, e provou ser altamente efícaz na resolução da estrutura filogenética dentro e entre os grupos de espécies consideradas (Birstein et al., 2009; Kyle & Wilson, 2007). Segundo Wakefield et al. (2013) as amostras de P. americanus da Austrália e a da Nova Zelândia poderiam compreender a uma espécie separada e diferente. No entanto, não tinha sido provada uma conectividade real entre as populações do hemisfério Sul Wakefield et al. (2010).

O baixo apoio do Cluster da América do Sul e Nova Zelândia observada na árvore filogenética com base em sequências de CO I, não puderam justificar qualquer migração entre eles. No entanto, apesar da conexão entre as populações do hemisfério Sul da África do Sul e Oceania não é simples em análises de migração, tempos curtos de divergência parecem existir entre eles, como observado na divergência molecular (ver haplótipos na Tabela 9 e network na Figura 6).

A população mais distante é a África do Sul analisadas pela árvore de CO I e da network (ver Figura 6), o que leva a considerár como uma espécie separada. Na verdade, as estimativas de divergência evolutiva média entre grupos, definidos como aqueles recuperados na filogenia mostram que a divergência entre Saf ea do Atlântico é maior do que a observada entre o outgroup P. oxygeneios e o Atlântico (ver Tabela 8). O baixo nível de divergência observado com o ADN mitocondrial do CO I entre todas as amostras de P. americanus com excepção da África do Sul, sugere que todas essas populações pertencem de fato à mesma linhagem mitocondrial de espécies ao redor do mundo.

As amostras do Brasil e de Argentina pertencem ao mesmo grupo, para as sequências CO I. Para o cherne os padrões de salinidade ligados à temperatura da agua entre o Brasil e a Argentina, indicam 87 Capítulo 2

o sentido de deslocamento destes para o Norte, chegando ao Sul do Brasil no inverno e primavera, e regressam ao Sul (Argentina) no verão e Outono (Peres & Klippel, 2003). Infelizmente não temos amostras Argentinas para confirmar estes resultados com os microssatélites.

Segundo Puchnik et al. (1999) a estrutura genética da população do cherne na região Sul Atlântica, mostrou que os exemplares provenientes das sub-áreas Norte e Sul, não são genéticamente diferentes, com uma diversidade genética (Hw = 0.3589). Sedberry et al. (1996), utilizando a análise de ADN mitocondrial de amostras coletadas em Austrália, Açores, Blake Plateau, Brasil, Madeira, Majorca e Nova Zelândia, concluiu se que as populações do hemisfério Sul e as do hemisfério Norte seriam genéticamente isoladas. O presente estudo demostrou que esta espécie, P. americanus, está subdividida em mais unidades geneticamente diferentes, como o que foi visto por Ball et al. (2000).

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Potêncial reprodutivo do cherne (Polyprion americanus) cultivados em cativeiro na costa de Galicia

Capítulo 3

Resumen

La cherna (Polyprion americanus) es una especie con distribución anti-tropical. Aunque tiene alto valor comercial, alta tasa de crecimiento en la fase juvenil, carne de buena calidad y gran potencial en la acuicultura, todavía hay poca información en cuanto a su tecnología de cultivo. El objetivo de este estudio es describir el comportamiento reproductivo de la cherna en criaderos gallegos. Los experimentos se realizaron en tres criaderos diferentes a lo largo de la costa de Galicia, el Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), el Instituto Gallego de Formación en Acuicultura (IGAFA) y el Aquarium Finisterrae, de 2011 a 2013. Durante ese período se efectuó el seguimiento de parámetros tales como crecimiento, nutrición y reproducción. Se tomaron muestras sanguíneas en el IEO-Vigo para el análisis de la madurez sexual mediante la técnica de Ramos (1986), donde se midieron los niveles de varias hormonas, i.e. 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) y la testosterona 11-ceto (11-KT). Aunque la madurez sexual se ha confirmado en algunos individuos, solamente fue observado un desove en un tanque de prueba, con y sin inducción sexual. En cuanto a género, peso y crecimiento evolucionaron significativamente (P <0.05) en los stocks del IGAFA y el IEO. Se observaron diferencias significativas en la ganancia de peso entre los sexos en los tanques del Aquarium Finisterrae y el IEO.

Palabras clave: Cherna, nutrición, estado reproductivo, esteroides sexuales, criaderos gallegos.

95 Capítulo 3

Resumo

O Cherne (Polyprion americanus) é uma espécie com uma distribuição antitropical. Embora apresente alto valor comercial, alta taxa de crescimento na fase juvenil, boa qualidade de carne e ter grande potêncial na aquacultura ainda são escassas informações desta espécie, principalmente em dados relacionados com o seu cultivo em cativeiro. O objectivo deste estudo visa descrever o comportamento reprodutivo do cherne em viveiros galegos. A experiência foi conduzida em três unidades de cultivo diferentes, no Centro Oceanográfico de Vigo (IEO-Vigo), no Instituto Galego de formação em Aquacultura (IGAFA) e no Aquarium Finisterrae, no período de 2011 a 2013. Durante o periodo em que decorreu o ensaio, se efectuou o monitóramento de parametros como o crescimento, alimentação e reprodução. Recolheram-se amostras de sangue, no IEO-Vigo para a confirmação da atividade sexual utilizando a técnica de Ramos (1986), onde foram medidos os níveis de 17-beta-estradiol (E2), testosterona (T) e 11-keto testosterona (11-KT). Embora a maturação sexual tenha sido confirmada em alguns indivíduos, somente foram observadas desovas em um tanque de ensaio, com e sem indução sexual. Em relação ao genero sexual, peso e crescimento apresentaram-se evoluidos de forma signifivativa (P<0.05), para os estoques de IGAFA e IEO. Para o estoque do Aquarium Finisterrae e do IEO o ganho de peso não foram observadas diferenças significativas entre os sexos.

Palavras chave: Cherne, Avaliação de estoques, Reprodução, Esteróides sexuais, Galicia.

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Abstract

The Wreckfish (Polyprion americanus) is an antitropically-distributed species. Although it has high commercial value, high growth rate in the juvenile phase, good quality meat and great potential in aquaculture, there is still little information regarding its cultivation technology. The aim of this study is to describe the reproductive behavior of wreckfish in Galician hatcheries. The experiments were conducted from 2011 to 2013 in three different hatcheries along the coast of Galicia, the Oceanographic Centre of Vigo (IEO-Vigo), the Galician Institute for training in Aquaculture (IGAFA) and the Aquarium Finisterrae. Parameters such as growth, nutrition and reproduction were tracked throughout the period. Blood samples were taken at IEO-Vigo for confirmation of sexual activity using the Ramos technique (1986), where levels of various hormones were measured, i.e. 17-beta-estradiol (E2), testosterone (T) and 11-keto testosterone (11-KT). Although sexual activity has been confirmed, spawning was only observed in one test tank, with and without sexual induction. Regarding gender, both growth and weight evolved significantly (P <0.05) in the strains of IGAFA and IEO. No significant differences in weight gain were observed between sexes in the tanks of Aquarium Finisterrae and IEO.

Keywords: Wreckfish, nutrition, reproductive status, sexual steroids, Galician hatcheries.

97 Capítulo 3

Introdução

A aquacultura está continuamente à procura de novas espécies adequadas a cultivos intensivos e com rápido retorno económico. O cherne Polyprion americanus (Bloch and Schneider, 1801), é um teleósteo demersal novo em aquacultura, com grande potência e de carácter importante para as espécies de peixes marinhos. Habita em taludes continentais, em águas temperadas com profundidades que variam entre 800-1 000 m (Sedberry et al., 1999; Peres & Klippel, 2003), também conhecido por cherne-poveiro e vulgarmente confundido com a garoupa-verdadeira (Mycteroperca marginata) no Brasil (Condini et al., 2010). Apresenta uma ampla distribuição geográfica e é capturado principalmente no Norte do oceano Atlântico (Blake Plateau) e no Sul (Argentina, Brasil e Uruguai) (Wakefield et al., 2013); na região central do Atlântico e Ilhas (Açores, Bermuda, Ilhas Canárias, Madeira, Gough e Tristão da Cunha); sobre os montes submarinos do Atlântico (Vema); no mar Mediterrâneo, no Sul do oceano Índico (África do Sul, São Paulo e Ilhas Amesterdam); e no Sudoeste Pacífico (Sul de Austrália e Nova Zelândia), (Sedberry et al., 1999; Sadovy, 2003, Figura 1).

Esta espécie pertence à família Serranidae formada por dois géneros (Polyprion e Stereolepis) compreendendo a quatro espécies diferentes que podem ser encontradas em ambos os hemisférios Norte e Sul (Francis et al., 1999; Anderson et al., 2012). O género Polyprion inclui duas das quatro espécies, Polyprion oxygeneios (Schneider and Forster, 1801), vulgarmente conhecida como Hapuku ou garoupa, que ocorrem na mesma área de distribuição, do hemisfério Sul, especifícamente no Sul do oceano Índico. Estas duas espécies P. americanus e P. oxygeneios têm sido relatadas como as únicas espécies válidas deste género ocorrendo nas costas da Austrália e Nova Zelândia (Wakefield et al., 2013). Os P. americanus tem uma longevidade excepcional por causa da baixa taxa de mortalidade durante a fase demersal, pois na fase pelágica fica vulnerável a pesca por ser encontrado perto da superfície associados a objectos flutuantes (Roberts, 1989; Massuti et al., 1999; Riera et al., 1999), maturação tardia entre os 60-76 cm de comprimento e crescimento lento quando adulto de 2-6 kg por ano, (Ball et al., 2000; Wakefield et al., 2013).

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Figura 1. Área de distribuição mundial de capturas de Polyprion americanus para o comércio e recriação da espécie. Com margens de profundidade entre 100 a 1 000 m.

Há registos segundo Vaughan et al. (1993) de que esta espécie atinge um tamanho extremamente grande (comprimento 150-200 cm e peso 70-100 kg), uma longa vida com idades entre sessenta e dois anos para machos e setenta e seis anos para fêmeas (Haimovici & Peres, 2005) e migração bastante activa na fase adulta que pode ser a responsável pela extensa distribuição.

O P. americanus apresenta uma organização sexual que está de acordo com os padrões gerais dos teleósteos gonocóricos. Com órgãos aos pares, os ovários têm secções circulares, radial organização lamelar, um lúmen central e um conjunto de vasos sanguíneos em torno da parede externa. Os testículos são compactos com uma secção triangular, em forma tubular, e uma envaginação dorsal com um feixe vascular central e o ducto espermático. Os ovócitos produzidos ovários são amadurecidos dentro de lamelas de ciclo anual e sincronizados com desovas múltiplas (Machias et al., 2003). Experiências em reprodução bem sucedidas em cativeiro são ainda limitadas, provavelmente devido à dificuldade de se obterem indivíduos selvagens que se adaptem facilmente a vida em cativeiro com temperaturas que variam entre 12-18 °C para se reproduzirem. Os hábitos alimentares do cherne são identificados através da análise dos restos de presas encontrados nos seus intestinos, como a merluça (Merluccius hubbsi), lula argentina (Squid argentinians) e carangueijo vermelho (Chaceon notialis), (Peres, 2000).

A costa de Galicia é conhecida por apresentar um equilibrado nível de salinidade (35 ‰), disponibilidade de minerais biogénicos (polimórficos de CACO3, calcita e aragonito). As pescas no litoral desenvolvem-se fundamentalmente junto ao continente de forma restrita, com uma grande riqueza de valores de produtividade primária e secundária a nível mundial, devido às condições excepcionais do clima e oceanográficas.

99 Capítulo 3

Em Galicia encontram-se cinco centros de pesquisa aquícola (Aquarium Finisterrae, IEO-Vigo, IGAFA, Luso Hispana de Acuicultura e o O Grove) que mantém está espécie em cultivo intensivo, cada uma com sua forma zootécnica de cultivo o que permite obterem-se resultados diferentes. Alguns destes centros de cultivo foram diferenciados e comparados geneticamente a partir de quatro microssatélites polimórficos (Capitulo 1). Com uma população externa originária dos Açores, foi possível identificar uma pequena diferença de 2.65 % entre o grupo mantido em cultivo no IEO e IGAFA e uma grande diferença de 5.16 % (IEO-Aq. Finisterrae) e 9.81 % (IGAFA-Aq. Finisterrae).

Para caracterizar uma estratégia reprodutiva e estudar uma melhor forma de obter resultados positivos de P. americanus em cativeiro, o objetivo deste trabalho foi de discutir a biologia reprodutiva da espécie em cativeiro, a influência dos factores ambientais (fotoperíodo, temperatura, efeito de indução hormonal com 2.25 mg de LHRHa á reprodução) e determinar mecanismos que aperfeiçoem a reprodução do cherne em cativeiro.

Material e métodos

Amostragem

Foram utilizados para este ensaio cinquenta indivíduos da espécie P. americanus de origem selvagem e mantidos em cativeiro, como reprodutores. A captura dos peixes foi na superfície junto à objectos flutuantes e alguns encontrados a profundidades entre cento e cinquenta e a quatrocentos metros, na fase juvenil ao longo do ano de 2010, nas costas Norte e Oeste de Galicia (rías Baixas e de Arosa e no Noroeste de La coruña-Cantábrico). Os peixes utilizados como amostras foram domesticados em três tanques diferentes localizados na costa de Galicia (Figura 2), com diferentes protocolos de cultivo: o Aquarium Finisterrae com vinte e oito indivíduos (catorze fêmeas: dez machos: quatro indefinidos), IEO (Centro Oceanográfico de Vigo) com dez indivíduos e IGAFA (Instituto Galego de formação em Aquacultura) com doze indivíduos não identificados. A relação entre o peso e o comprimento foi obtida para ambos os sexos, sendo expressa pela equação y = a + b.x e o r2.

100 Capítulo 3

Figura 2: Mapa de localização dos tanques com reprodutores de P. americanus na costa de Galicia. O Aquarium Finisterrae (Aq. Finisterrae) com vinte e oito indivíduos, Centro Oceanográfico de Vigo (IEO) com dez indivíduos e o Instituto Galego de formação em Aquacultura (IGAFA) com doze indivíduos.

Alimentação

Cada grupo teve um tratamento específico de adaptação a alimentação disponibilizada sem restrições. A ementa de cada grupo baseava-se nos hábitos naturais da espécie descritos em (Peres & Haimovici, 2003). No IEO a base alimentar foi de ração semi-húmida (mistura de Cavala, Scomber scombrus; Sardinha, Sardina pilchardus; peixes brancos e multivitamínicos). Neste grupo a alimentação foi entregue duas ou três vezes por semana. No Aquarium Finisterrae a alimentação foi à base de peixe; lula; mexilhão e camarão foram entregues diariamente ad libitum. No IGAFA os peixes foram alimentados atravês da ração comercial vulgarmente utilizada para reprodutores de pregado, Psetta maxima, cujas características estão descritas na tabela 1.

101 Capítulo 3

Tabela 1. Volume dos tanques de cultivo, N= número de indivíduos (F=fêmea, M=macho, I=indefinido); peso (Kg), médias e desvio padrão do comprimento (cm).

IEO-Vigo Aq. Finisterrae IGAFA

Tanque (m³) 120 3500* 40

N 10 28 12

Relação (M : F : I) 0 : 0 : 10 10 : 14 : 4 0 : 0 : 12

Temperatura (°C) 12-18 13-16 11-17

Peso (Kg) 8-18 13-33 10-18

Comprimento (cm) 77.90 ± 4.65 89.13 ± 8.43 66.16 ± 12.57

Fotoperíodo Sombreado 12 horas com sombra Semi-sombreado

Dieta Duas ou três vezes a Diariamente ad libitum. Em dias alternativos ad semana ad libitum. Peixes descongelados. libitum. Ração seca

Ração semi humida Vitalis repro (fabricação nas (SKRETTING), com instalações), com 30% 52% de proteína e 16% de proteina e 18% de de gordura. gordura.

*É um aquário de exposição compartilhado com outras espécies como, Carcharhinus leucas, Argyrosomus regius, Pagrus pagrus (L.), Seriola Dumerlii, etc.

Identificação Sexual

Nesta parte do trabalho fez-se a observação microscópica de gónadas de cherne (ovários e testículos), com o objectivo de diferenciar os sexos, verificar o estado de maturação. Houve atenção espécial em relação ao hermafroditismo, em treze amostras comerciais adiquiridas no Porto de Vigo (la Lonja), pescados na costa Norte do Atlântico em 2011, as quais foram processadas para observação histológica segundo a técnica de Ramos (1986). Esta técnica desenvolve-se, basicamente, em cinco etapas: fixação, desidratação, inclusão (em parafina), elaboração dos blocos e execução dos cortes:

• Cada exemplar é medido e pesado individualmente e as gónadas são retiradas e pesadas. • Cada amostra é colocada numa solução de glutaraldeído a 2.5 %, em tampão cacodilato de sódio 0.1 M, de pH=7.4 (correspondente ao pH das células). A fase da desidratação consiste; na passagem das amostras por álcool com diferentes níveis de concentração, 70 %, 85 % e 100 %. • Em seguida faz-se a inclusão das gónadas em parafina. As amostras são colocadas neste soluto em moldes de plástico e cobertas com uma lamela de vidro. Os cortes, de 4 μm de espessura, foram feitos com facas de vidro, utilizando um micrótomo automático. Cada

102 Capítulo 3

corte foi corado com azul de toluidina e as lâminas foram seladas com Bálsamo do Canadá, identificadas e fotografadas com microscópio óptico.

Para certificação do estado de maturação e existência de actividade sexual dos dez reprodutores cultivados no IEO em Vigo em 2011, foi feita a análise do nível de concentração dos esteróides sexuais, estradiol (E2), testosterona (T) e 11-keto testosterona (11-KT) atravês de 1 ml de sangue do arco branquial.

Para a determinação do perfíl hormonal das amostras, optou-se por utilizar a técnica do ensaio imuno-enzimático com diagnóstico in-vitro, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay). Para cada hormona adquiriu-se um kit da marca Cayman (Testosterone EIA Kit 582701; Estradiol EIA Kit 582251 e 11-Keto Testosterona EIA Kit 582751).

Cada kit era composto por microplacas com 96 lugares, recobertos por anticorpos específicos, dos quais foram preenchidos com 50 µl de plasma duplicado. Depois de alguns passos de limpeza, esta reacção é paralizada, adicionando-lhe em seguida um substrato que ao reagir da origem a um composto colorido. A intensidade da cor será inversamente proporcional à quantidade de antígeno no plasma.

Indução hormonal para desova

Foram separadas quatro fêmeas adultas para control da dilatação abdominal. Ao atingirem uma dilatação considerável foram submetidas a biópsias ováricas (canulação) a cada quinze dias e nos últimos trinta dias a cada semana e por fim diariamente, para controlar a evolução (diamêtro) dos ovócitos. Estas fêmeas ao alcançarem ovócitos com 1 200 µ de diamêtro foram submetidas à indução hormonal, foi à forma utilizada para se conseguir ovócitos maduros, após uma evolução positiva de cada fêmea. Foi preparado o composto indutor LHRHa, com soro fisiológico para a diluição de 25 µg/kg de peso corporal de cada fêmea. Foi considerada a dilução de um 1 ml para evitar que a diluição com o principio activo LHRHa fosse disperdiçada ao ser utilizada num volume de maior concentração.

As fêmeas foram anestesiadas com fenoxietanol (0.3 ml/l), para evitarem-se riscos e estresse das mesmas durante a manipulação. Para o efeito recorreu-se a uma injeção intramuscular no lombo, com seringas descartáveis de 5 ml.

Resultados e discussão

A temperatura da água apresentou pouca variação nas recolhas realizadas diariamente nos três tanques de cultivo. De Janeiro a Dezembro do ano de 2013, a temperatura manteve-se entre 12 e 18 °C na maioria dos meses, com os maiores valores registrados nos meses de Julho a 18 °C e Outubro a 16 °C. As menores temperaturas ocorreram ao longo do outono e inverno variando entre 12 e 14

103 Capítulo 3

°C (Figura 3). Os valores de salinidade do fundo e da superfície apresentaram em geral, o mesmo padrão de variação da costa de Galicia com salinidade entre 31-35 ‰. Deste modo pode-se afirmar que o factor temperatura foi pouco relevante no comportamento e viabilidade reprodutiva entre estes três tanques de cultivo. Sabe se que tanto a temperatura como outros factores ambientais, são reguladores da periodicidade dos ciclos reprodutivos em teleósteos e responsáveis pelas taxas de enérgia (ATP) produzida e utilizada pelos ectotérmicos.

Média mensal de 2013

25 IEO A Fenist IGAFA

20 C) ° 15

10

Temperatura ( Temperatura 5

0

Figura 3. Gráfico anual de temperatura para os tanques de cultivo: IEO, IGAFA e para o Aq. Finisterrae mostreado em 2013.

O desempenho do crescimento

O coeficiente de regressão em relação ao comprimento-peso, obtido a partir de cinquenta amostras de P. americanus agrupados nos três diferentes tanques de cultivo apresentou um crescimento alométrico positivo (Figura 4). O mesmo foi verificado em amostras de P. americanus colectadas em ambiente selvagem na região de Black Plateau (Sedberry et al., 1993), em que o coeficiente foi positivo para todas as amostragens realizadas para esta região.

O comprimento e peso variaram entre 60 a 91 cm e 5.99 a 15.5 kg (IEO), 60 a 90 cm e 5.42 a 15.72 kg (IGAFA), 75 a 103 cm e 10.60 a 33.65 kg (Aq. Finisterrae). O tamanho padrão dos chernes ao atingirem a maturação sexual em ambiente selvagem onde a maioria dos indivíduos está apto a se reproduzir segundo Haimovici & Peres (2005), foi estimada em 78 cm para as fêmeas e 75 cm (9 a 10.4 anos) para machos, enquanto que para Sedberry et al. (1999), até aos 90 cm os chernes são considerados imaturos.

104 Capítulo 3

Todos os reprodutores do Aq. Finisterrae apresentaram médias de comprimentos mais altas, e um crescimento notável durante o período do ensaio, porém não de forma significativa em relação aos demais tanques (IEO e IGAFA).

105 Capítulo 3

Comprimento x Peso (IEO) 95 90 85 80 75 70 65 y = 2.2735x + 52.621 60 R² = 0.8493 Comprimento (cm) 55 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Peso (kg)

Comprimento x Peso (Igafa) 95 90 85 80 75 70 65 y = 2.2761x + 51.645 60 R² = 0.8033 Comprimento (cm) 55 50 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Peso (kg)

Comprimento x Peso (Aq. Finisterrae) 100 95 90 85 80 75 70 65 y = 1.1547x + 66.381 R² = 0.7671

Comprimento (cm) 60 55 50 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Peso (kg)

Figura 4: Coeficiente de regressão do comprimento-peso de P. americanus, mostrando os três grupos de cultivo na costa de Galícia (IEO; IGAFA e Aq. Finisterrae) de 2011 à 2014.

106 Capítulo 3

Este facto pode indicar que estes reprodutores, já tinham iniciado a maturação sexual a mais tempo. A maior parte das espécies (origem selvagem) com interesse em aquacultura apresentam disfunções reprodutivas quando criados em cativeiro (Zohar & Mylonas, 2001). No entanto, a reprodução, tem sido considerada um importante factor para o sucesso principalmente nas primeiras fases larvais, isso, porque a reprodução em cativeiro permite um maior controle na domesticação, no uso de técnicas de melhoramento genético que melhora a sobrevivência e qualidade da carne.

Em relação ao desenvolvimento ligado ao sexo, as fêmeas apresentaram-se mais evoluidas de forma significativa (P<0.05) para o comprimento do estoque do IEO. Porém não foram significativas as diferenças entre sexos para o variável peso (Figura 5). Este facto é muito comum para serranideos, como foi também visto para E. marginatus criados em cativeiro na região do ar Mediterrâneo (Marino et al., 2000), em que foi notória de forma significativa nas fêmeas reprodutoras desse cativeiro apresentaram maior tamanho que os machos e em 50% delas já se apresentavam com maturação sexual aos 11.2 anos.

107 Capítulo 3

a) Média de peso total (IEO) 20 ♀ ♂ ? 18 16 14 12 10 8 Peso (Kg) Peso 6 4 2 0 fev/11 jun/11 dez/11 abr/12 jul/12 fev/14

b) Média de comprimento total (IEO)

100 ♀ ♂ ? 90 80 70 60 50 40 30

Comprimento (cm) 20 10 0 fev/11 jun/11 dez/11 abr/12 jul/12 fev/14

Figura 5: A média total do peso a) e do comprimento b) de machos e fêmeas amostras de P. americanus mantidos em cativeiro no IEO.

Em outros polyprionidaes como os Stereolepis gigas (Robalo gigante) e Polyprion oxygeneios (Hapuku), que são peixes com longa vida, em ambiente selvagem foi observado que para S. Gigas a curva de crescimento para ambos os sexos é igual, e no caso do P. oxygeneios mostraram que as fêmeas crescem mais rápido que os machos (Francis et al., 1999).

O peso das fêmeas P. americanus neste ensaio oscilou, porém para os machos o peso se manteve constante, com um leve aumento nas duas últimas amostragens com 19.1 %. Observando a biologia de Polyprion em norma geral, as fêmeas depois que atigem os 10 anos tem uma margem de crescimento sempre maior comparando às com os machos de mesmas idades, (Wakefield et al., 2013). Roberts (1989) e Haimovici & Peres (2005), observaram o mesmo resultado em fêmeas da espécie que demostraram um crescimento mais rápido em cativeiro e atingiram tamanhos maiores que os machos.

108 Capítulo 3

Variáveis Reprodutivas

Entre os três tanques de cultivo comparados somente verificaram-se desovas para o grupo de reprodutores do Aq. Finisterrae. Embora estes reprodutores sejam ainda considerados jovens estas desovas não foram às primeiras desovas deste grupo em cativeiro, sendo que elas tiveram o seu início reprodutivo no ano de 2011.

No presente ensaio em 2013 este grupo obteve trinta e uma desovas (duas destas induzidas e vinte e nove naturais), desde o dia 21 de Março até ao dia 31 de Julho deste ano. No seguinte ano 2014 obtiveram somente seis posturas naturais, no período de 15 a 24 de Junho. A reprodução desta espécie tem ainda a sua potencialidade limitada para aquacultura, área que merece um prévio entendimento para que haja melhoras (Fauvel et al., 2008), uma vez que existem trabalhos ligados a reprodução que indicam existir uma viabilidade no seu cultivo (Papandroulakis et al., 2004;2008). Em espécies como a Carpa e a Truta arco-iris, que são espécies consideradas de alta domesticação, não se reproduzem facilmente em cativeiro.

Alguns exemplos da indústria em aquacultura como o do cultivo de espécies como as Enguias de água doce (Anguilla spp.), Theyellowtail e Charuteiro-catarino (Seriola dumerili), Garoupas (Epinephelus spp.) e do Atúm-rabilho (Thunnus thynnus), em que se baseiam exclusivamente na recolha de juvenis ou adultos em ambiente selvagem para o cativeiro (Ottolenghi et al., 2004). E em algumas dessas espécies é possivel controlar a reprodução através da manipulação dos parâmetros ambientais (fotoperíodo, temperatura da água, profundidade ou volume do tanque, substrato de desova, etc.). As fêmeas da espécie Scophthalmus maximus L. (Rodavalhos), elas dependem da iluminação longos fotoperíodos (16 ou 24 horas), porém os machos não são afectados (Imsland et al., 1997).

Existem factores impossiveis de seram praticados ou simulados em cativeiro que influenciam a maturação reprodutiva em ambiente selvagem como as migrações para desovas, profundidade, hidráulica fluvial, etc. O cherne apresenta um estilo de vida em ambiente selvagem delicado, duas fases de vida, uma que é pelágica quando juvenil antes de iníciar a fase reprodutiva, e demersal quando adulto. Essa transformação esta directamente ligada à fase da primeira maturação, que é acompanhada de variações morfológicas que afectam directamente a reprodução, pois os peixes tem preferência por níveis bentónicos (450 a 850 m) para realizarem as suas desovas (Sedberry et al., 1999; Suquet, et al., 2001; Machias, et al., 2003). Por essa razão as terapias hormonais têm sido empregadas nas últimas décadas, a fim de controlar a reprodução em algumas espécies de peixes cultivados em cativeiro, para induzir ou sincronizar a maturação do ovócito (OM), a ovulação, e a desova. Como é visto no caso dos salmonídeos, que exigem a inseminação in vitro para a ovulação, e são induzidos hormonalmente com frequência.

109 Capítulo 3

Existem poucas referências de posturas para a espécie P. americanus em cativeiro, mais segundo Papandroulakis et al. (2008) que descreveu o sucesso de desovas induzidas em cativeiro, em que os reprodutores foram sub monitorados durante dois anos em que as condições de fotoperíodo foram naturais e a temperatura artifícial entre 15 ± 1 °C. Outro factor relacionado ao habitat desta espécie é o de que o Aq. Fenisterrae proporcionou de uma maior interação entre diferentes espécies num mesmo local o que aproxima a condição de vida selvagem do cherne, o que aproxima o tanque de cultivo ao seu ambiente natural.

Diferenciação sexual

Apartir da histólogia das gónadas, das amostras de P. americanus capturados no meio natural (Ilhas dos Açores) com uma média do comprimento e peso dos indivíduos de 77.1±4.8 cm e 7.7±1.2 kg, houve sincronismo na maturação sexual de ambos os sexos. Analizando cada corte histólogico, detectou-se a presença de 6 fêmeas:4 machos: 3 cortes não identificados replectos de gordura (Figura 6).

O cherne é um serranideo avaliado como gonocórico atualmente, já que anteriormente foi dado como hermafrodita (Roberts, 1989), por apresentar uma característica de difícil interpretação sexual entre os machos e fêmeas, quando juvenis ou fora da época reprodutiva e por ser ligeiramente parecido ao mero. Exigindo assim uma análise histológica das gónadas utilizando as técnicas microscópicas para diferenciação sexual.

Em espécies gonocóricas, a diferenciação sexual ocorre primeiro nas fêmeas e depois nos machos. Os primeiros sinais de diferenciação sexual nas fêmeas são a entrada das ovogonias na meiose e/ou a proliferação das células somáticas para formar a cavidade ovariana.

Nos machos, a diferenciação sexual é caracterizada pelo surgimento da espermatogonia, pelo arranjo das células germinativas e somáticas em lóbulos e pela diferenciação do sistema vascular do testículo, incluindo os ductos espermáticos Haimovici & Peres (2005). Estes mesmos autores puderam confirmar que as fêmeas apresentam dois orifícios diferenciados junto ao anús, um que corresponde ao gonoporo e o outro o tubo urinário, enquanto que os machos dispõem de sistema reprodutor e renal no mesmo orifício, caracteristica não facil de ser observada quando os peixes são bastante jovens. A identificação microscópica revela-se de grande importância na atribuição dos estados de maturação, em particular na distinção dos estados 2 e 6 (início e fim da recuperação) e 3 e 5 (pré e pós-desova).

Em maior parte das amostras, apresentavam o início de uma maturação quando a fase de crescimento inicia-se com o desencadear da meiose, quando ocorre o emparelhamento dos cromossomas homólogos, originando os ovócitos primários (OP), com núcleo central onde se distingue, na periferia, uma coroa de nucléolos, ou fase de crescimento completa, quando com a

110 Capítulo 3

vitelogénese, que leva à formação dos ovócitos secundários (OS), a qual consiste no armazenamento de grande quantidade de nutrientes (a partir da síntese de componentes celulares exteriores ao ovócito), que formam o vitelo, principal fornecedor de energia para o desenvolvimento embrionário (Costa, 2004). Nesta fase podem observar-se muitas gotas lipídicas de pequenas dimensões rodeando o núcleo.

111 Capítulo 3

B C A A Ovt Gd

D E F

OS OS OP Esp

H I G Gd OS Ovt

Esp Ovt OS

J K L EG Gd Gd

M

Figura 6: As figuras correspondem a cortes histológicos de P. americanus: fêmeas (A, D, E, H, I e M), gordura (C, J e K) e machos (B, F, G e L). ESP-espermatócitos, EG-espermatogonias, Gd-gordura, OP- ovócitos primários, OS-ovócitos secundários e OVT- ovócito em vitelogenese.

112 Capítulo 3

A natureza do indutor endógeno na diferenciação sexual ainda não está totalmente esclarecida, porém muitas evidências reforçam a idéia de que os esteróides sexuais são de fato, indutores naturais da diferenciação sexual em peixes.

Os dados histológicos indicaram que os ovários de Epinephelus marginatus (mero) são do grupo tipo síncronos, com 3-4 lotes de ovócitos em diferentes fases co-existentes no ovário. O mesmo padrão de desenvolvimento do ovário foi descrito em fêmeas selvagens.

As fêmeas de P. americanus possuem dois ovários, situados na cavidade celomática pegada a bexiga natatória em posição superior. São circulares, com organização lamelar, lúmem central, vascularização périferica (quanto mais madura mais notável), com cor rosada. Os testículos são maciços, com uma secção triangular, organizado em forma tubular, vascularização central e ducto espermático em posição mediana (Figura 7).

Figura 7: Gónadas femininas-ovários (A) e masculinas-testículos (B) de P. americanus.

113 Capítulo 3

Esteroides sexuais

A concentração de E2 foi elevada de maneira significativa (P=0.05), principalmente no mês de Junho (Figura 8A) além de alguns picos no mês de Fevereiro em diferentes amostras, sugerindo que estas amostras deveriam tratar-se de fêmeas (2, 3, 6, 8 e 9).

Com estas medidas dos níveis de estradiol nestes peixes, foi importante para revelar que estes peixes já haviam iniciado com suas actividades reprodutivas. O estradiol (hormona indutora da vitelogênese) estimula a síntese do percursor do vitelo, acionando as células foliculares e da teca, via estimulação por FSH, é responsável pela estimulação da síntese endógena (próprio ovócito) e exógena de vitelo (fígado). O estradiol induz os hepatócitos a produzirem vitelogenina que volta aos ovócitos (via corrente sanguínea) e é convertido em vitelo (Lubzens et al., 2010).

Em P. americanus o estado de maturação sexual pode se estimar, em função do estado de duresa da zona abdominal principalmente nas fêmeas de maior tamanho e em um estado mais avançado de maturação, notando se o aumento do contorno. Em serranideos como a E. marginatus que foi constatada como hermafrodita não apresentam crescimento rápido e atingem a primeira maturidade sexual tarde e ao terem a sua origem selvagem tem que se adaptar perfeitamente ao cativeiro (Spedicato et al., 1995).

114 Capítulo 3

A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.6

0.4 E2 (ng/ml) 0.2

0.0 D-10 J-11 F-11 M-11 A-11 M-11 J-11 J-11 A-11 S-11

B) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

0.8

0.6

0.4

Testosterone (ng/ml) 0.2

0.0 D-10 J-11 F-11 M-11 A-11 M-11 J-11 J-11 A-11 S-11

C) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.3

0.2

11KT (ng/ml) 11KT 0.1

0.0 D-10 J-11 F-11 M-11 A-11 M-11 J-11 J-11 A-11 S-11

Figura 8. Concentração de estradiol-E2 (A), de testosterona-T (B) e de 11-Ketotestosterona-11KT (C) em 10 amostras de P. americanus do IEO (Vigo).

A desova espontânea não ocorre normalmente em cativeiro e tratamentos hormonais até ao momento são obrigatórios, para induzir a maturação final e ovulação nas fêmeas na fase de vitelogênese. Esses resultados corroboram a hipótese de que os picos de E2 nessas amostras de

115

Capítulo 3

cherne estão relacionados com a vitelogênese, e baixa concentração deste hormônio nos machos. Também foram mensuradas as concentrações de testosterona (T), em que foram verificados níveis significativamente elevados deste hormônio nos meses de Fevereiro e Setembro para os indivíduos 4, 5 e 10 (Figura 8B).

A T é sintetizada nas células de Leydig e actua no início da gametogênese dos machos de peixe. As restantes amostras do grupo analisado tiveram concentrações de testosterona maiores que nas já identificadas como fêmeas (P<0.01). Os picos dos machos foram no mês de Fevereiro, e este aumento das concentrações de T podem estar ligados ao início da espermatogênese do cherne ou existe a probabilidade de esses peixes terem atingido a fase III – vitelogênese, na qual as células especiais da teca sob o efeito da GtH I sintetizam a T, a qual estimula as células granulosas na síntese de E2, e ambas estimulam o fígado na síntese de vitelogenina.

Segundo Lacroix et al. (1997) picos deste hormônio foram observados em Salmo salar nesta fase, na espécie Seriola lalandi lalandi, esses picos estão relacionados a machos com gametogênese parcialmente ou totalmente completa (Poortenaar et al., 2001).

Algumas fêmeas podem apresentar elevadas concentrações de T como as identificadas (6, 7 e 8) foram vistas na Figura 8B, este caso esta relacionado aos diferentes estágios de desenvolvimento da gónada. Este facto foi visto em Perca fluviatilis que mostrou altas concentrações de T na desova e estas cairam logo após (Noaksson et al., 2005), em Seriola lalandi lalandi, as concentrações de T são maiores durante a vitelogênese e na fase de maturação final dos ovócitos (Poortenaar et al., 2001).

Tanto a hormona 11-KT (11-Keto testosterona) como o a testosterona são andrógenos que induzem a espermatogénese, sendo que o T é percursor do 11-KT e este de forma marcante estimula o desenvolvimento de características sexuais secundárias em teleósteos do sexo masculino (Cavaco et al., 2001).

Através deste ensaio os resultados indicam que em indivíduos com tamanhos similares como os do que se encontrava em cativeiro, podem já ter iniciado ou apresentam actividade reprodutiva. Embora esses individuos sejam de origem selvagem podem obter desovas eficazes em cativeiro em um momento mais tardio. As fêmeas foram mais abundantes (60 %) em relação a todos os 10 exemplares identificados em relação ao sexo.

Indução hormonal para desova

Somente três das fêmeas evoluiram favoravelmente durante o processo de ovulação, a quarta fêmea entrou em regressão sexual e por esta razão foi descartada. A regulação hormonal da ovulação em teleósteos, depende das gonadotropinas hipofisárias libertadas pelo factor hipotalámico GnRH. Porém, quando os peixes se encontram em cativeiro, ainda que estes reprodutores apresentem suas

116 Capítulo 3

gónadas desenvolvidas ou até em estágios avançados a maturação final dos ovócitos e a desova, só são atingidas mediante tratamentos hormonais (Zanuy & Carrillo, 1987).

A razão destas e algumas espécies não atingirem as etapas finais do processo reprodutivo em cativeiro é desconhecida, embora, provavelmente esta dificuldade esteja ligada ao controle neuro- endócrino da reprodução nestes animais. De modo generalizado, a reprodução em peixes é controlada por um sistema endógeno, o eixo hipotálamo-hipófise-gônadas, que sintetiza e libertam diversas hormonas. Este sistema é coordenado por factores ambientais (temperatura da água, foto- período, chuvas e outros), os quais têm um papel fundamental, mas ainda pouco elucidado, no processo de desenvolvimento gónadal, maturação final, liberação e fertilização de ovócitos (Bobe & Labbé, 2009).

O uso deste análogo sintético de LHRH (hormónio liberador hipotalámico do hormónio luteinizante) actuou a nível hipofisário reproduzindo o efeito das hormonas endógenas hipotalámicas, que desencadeam na liberação das gonadotrópinas hipofisárias. Outra possivel razão que pode justificar esta dificuldade de reprodução em cativeiro, seria explicavel pelo padrão de migração que é habitual para a espécie como para os serranideos em geral, que segundo Machado et al. (2003) foi verificado para o E. morio e para o E. marginatus as fêmeas destas espécies atigem a maturação sexual a determinado tamanho 45-47 cm de comprimento, sendo elas encontradas em águas profundas rodeado de rochas ou objectos que lhes oferençam esconderijo.

As amostras de P. americanus de Aq. Fenisterrae responderam muito bem ao anestésico fenoxietanol durante a amostragem e apresentam uma rápida recuperação sem algum tipo de sequela, por isso se recomenda o uso deste composto para qualquer tipo de amostragem. A indução hormonal foi feita quando os ovócitos apresentaram um diâmetro de 1 200 µ, que para esta espécie P. americanus os tamanhos entre 1 200–1 500 µ são considerados ovócitos maduros e preparados para indução. A maior parte das posturas foi em quantidades de 1 000 a 3 700 ml de ovos fecundados e, porém a qualidade destas desovas apresentava uma média de ovos com baixa qualidade (Figura 9) e o diâmetro médio dos ovos fecundados apresentou uma média de 2.07±0.40 mm, uma fecundação em 70 % e média de taxa de eclosão em 14 %.

Na aqüacultura peixes marinhos, qualidade do ovo e sobrevivência das larvas são restrições que seguram o sucesso da produção de progênie (Brooks et al., 1997). Essa baixa percentagem de eclosão pode ser derivada a baixa qualidade dos ovos nas posturas que segundo Bobe & Labbé (2009), esta pode ser definida como potência para a fertilização, e eclosão de larvas viáveis. Existem outros estudos que utilizaram vários métodos para estabelecer qualidade dos ovos. Estes métodos envolvem medição da qualidade relacionada parâmetros, tais como flutuabilidade, taxa de fertilização, o tamanho dos ovos e diâmetro da gota lipídica. Outros estudos podem basear-se em análises bioquímicas que incluem níveis de composição de proteína da gema, os amino-ácidos

117 Capítulo 3

livres, a composição de hidratos de carbonio, conteúdo de vitaminas, actividades enzimáticas e análise dos lípidos (Kohn & Symonds, 2012), porém são análises que requerem tempo.

Para a espécie Epinephelus morio (cherne americana) selvagem a média do diâmetro para os ovócitos prontos para fecundação foi de 0.92±0.05 mm (Gimenez-Hurtado et al., 2003) e ovos com diâmetro médio de 0.95±0.25 mm em indivíduos desovantes com tamanhos correspondentes a 38 a 75 cm e a temperaturas de 22 °C comum para a espécie e em zonas de desovas habituais. Os ovos de Polyprion americanus seguem o padrão básico semelhante de desenvolvimento dos ovos da maioria dos peixes marinhos, são pelágicos e flutuam individualmente perto da superfície. São esféricos, com um diâmetro de aproximadamente 2.30 mm em ambiente selvagem eclodem em larvas do saco vitelino subdesenvolvido.

As desovas dos chernes na parte Sul americana ocorrem nos meses de Maio e Julho, período de inverno nesta região, já que para (Peres & Klipel, 2003) desde Março até Julho é uma época do ano em que os chernes desta região apresentaram se com um aumento dos valores médios mensais de peixes adultos e com desenvolvimento gonadal.

O número de ovócitos liberto por fêmea em cada ciclo reproductivo é de 2 e 7 milhões ovos por desova. A formação de um ovo é um processo complexo e após a ovulação, o ovo deve de apresentar características autossuficientes para proteger e sustentar o desenvolvimento do embrião até a eclosão, com a contribuição de alguns factores em redor. Compreender esse mecanismo subjacente aos processos do ovócito em crescimento e desenvolvimento do mesmo é essencial para perceber os factores que afetam e influenciam a qualidade dos ovos, quer como consequência da dieta, principalmente no conteúdo de lipídios, proteínas e vitaminas, nas propriedades físico- químicas da água e fotoperíodo principalmente (Bobe & Labbé, 2009). Os serranideos apresentam a particularidade de requerem condições térmicas e factores ambientais adequados que assegurem a sobrevivência das larvas para poderem efectuarem as suas desovas (Gimenez-Hurtado et al., 2003).

118 Capítulo 3

Figura 9: Fotos de ovos e larvas das desovas de P. americanus do tanque de cultivo de Aquarium Finisterrae A- Ovo recém-fecundado (0 Dia), B- Esboço de embrião (3 Dia), C- Embrião (4 Dia), D- Larva recém eclodida (7 Dia), E- larva (8 Dia) e F- Ovo sobremaduro (não fecundado).

Conclusão

O cherne Polyprion americanus, quando produzido em cativeiro, mostra um crescimento alométrico positivo. Os ensaios realizados evidenciaram que os reprodutores do grupo Aq. Finisterrae apresentaram uma média de crescimento mais alta e não foi significativamente diferente dos outros dois grupos de cultivo realizados no IEO e IGAFA. Porém foram encontradas diferenças significativas, entre o crescimento de machos e fêmeas, sendo que as fêmas engordaram mais rapidamente.

119 Capítulo 3

Outro aspecto de relevo é relativo ao volume de água em que é feito o cultivo. Os tanques de maior capacidade proporcionam um ambiente próximo do natural, permitido maiores desovas naturais. Foi o que se verificou no tanque de Aq. Finisterrae (3 500 m3) e nenhuns nos demais tanques de IEO (120 m3) e o de IGAFA (40 m3), sendo que as condições ambientais foram basicamente semelhantes.

O estudo citológico das gónadas de cherne, realizado em exemplares provenientes do meio natural, não mostraram nenhuma evidência de hermafroditismo no cherne, o que parece estar clara a teoría do gonocorismo para esta espécie (Roberts, 1989), em desacordo com (Day, 1880; Jones, 1980) que a definem como hermafrodita.

A análise dos esteróides sexuais no período de Dezembro de 2010 a Setembro de 2011, que incluem a etapa de maturação gonadal e repouso, mostra uma clara actividade sexual dos machos alcançando se níveis de 0.29 ng/ml de testosterona e de 0.07 ng/ml de 11-Keto-testosterona, como também para as fêmeas com 0.22 ng/ml de estradiol. Ainda que não chegasse a completar a maturação, por uma parte, estes resultados, focalizam a atividade reprodutiva entre os meses de Janeiro e Junho e mostram que existe uma clara actividade na maturação gonadal dos gametas tanto masculinos como femeninos.

Tendo em vista um possível bloqueio no processo reprodutivo desta espécie em cativeiro, a indução hormonal com 25 µg/kg em fêmeas em estágio de maturação avançada (diâmetro 1 200 µ) por vía intramuscular, mostra uma reacção positiva tanto para a dose de indução com LHRHa utilizada como funcional para o sistema de desbloqueo, pelo facto de terem conseguido completar todo o ciclo de maturação e postura.

Referências bibliográficas

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120 Capítulo 3

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123

Conclusões

Conclusões

Conclusões

O interese do cherne Polyprion americanus, na aquacultura é devido a sua alta productividade, baixo nível de mortalidade e resistência no cultivo. No Sul da Europa é uma das espécies com prioridades em domesticação, por conta do seu valor em cultivo em escala industrial, de modo que desde alguns anos que se vem mantendo exemplares da espécie em cativeiro. Ainda que se haja conseguido desovas, estas mesmas não obtiveram sucesso em cativeiro, sendo que esta tese teve como objectivos e conclusões da sua abordagem os seguintes:

Capítulo 1. Deriva genética em primera geração de cultivo e risco endogâmico em estoques de cultivo de cherne, Polyprion americanus

O principal objectivo deste capítulo foi o de estabelecer a causa da erosão genética pela subdivisão de amostras do cherne originárias do Leste Atlântico, que dão origem a quatro estoques com a primeira geração em cativeiro domésticos, cultivados em tanques distribuidos pela costa de Galicia desde 2007. Desde uma pequena quantidade de peixes em cativeiro, candidatos a reprodutores para a aquacultura foi perseguida a determinação de parentesco dentro de cada unidade de cultivo, como um passo decisivo para evitar a endogamia, quando estes peixes forem finalmente reproduzidos. Por fim, teve como objectivo de explorar o cenário provável de evolução do coeficiente de endogamia parental, seguindo a simulação de acasalamento ao acaso em duas situações com vantagens reprodutivas em relação às práticas actuais em cativeiro.

Conclusões

1. Neste estudo foi determinada a extensão da divergência genética dos estoques cultivados de cherne com 5.43% de variância genética e a perda acentuada da diversidade alélica de 44%. Estes resultados implicam que se perdeu muita diversidade genética no processo de domesticação, por deriva de amostragem. 2. A subdivisão populacional introduzida, só pode aumentar nas gerações em cultivo. Se bem que o potêncial genético se mantém no conjunto dos estoques, não ocorre assim em cada um dos indivíduos, situação que levaria ao baixo rendimento e colapso em poucas gerações, devido á endogamia. 3. Os resultados das duas estratégias de acasalamento dentro e entre os estoques de cultivo mostraram que o cenário de reprodução entre todos os indivíduos das pisciculturas, é uma estratégia muito mais vantajosa e que atrasa o surgimento de acasalamentos endogámicos, que se formariam dentro de cada estoque de cultivo. É aconselhavel, criar uma suposição de uma estratégia reprodutiva, um método de minimo kinship, para minimizar a endogamia, assim como introduzir temporalmente indivíduos vindos do ambiente natural.

127 Conclusões

Capítulo 2. Estructura genética e dinâmica populacional de cherne (Polyprion americanus) no Norte Atlântico

Os estudos de identificação da população no Norte Atlântico têm demonstrado que não há separação entre a população oriental e ocidental do Atlântico (Ball et al, 2000;. Sedberry et al., 1996). Os chernes adultos podem migrar através do Atlântico enquanto que as larvas e os juvenis pelágicos são transportados através do Atlântico pelas correntes oceânicas (Sedberry et al, 1996; Sedberry et al., 2006). No segundo capítulo desta tese pretende-se descrever e definir a estrutura populacional genética da espécie P. americanus, e entender o padrão de migração entre populações naturais em diferentes pontos do seu habitat ao largo do oceano Atlântico, comparando com grupos externos de outros pontos.

Conclusões

4. As diferenciações globais entre as amostras de 13 % são devido a divergência entre os três diferentes pools génicos detectados dentro da espécie, o que indica que estamos ante a três pools génicos ou unidades reprodutivas bem diferenciadas: Norte Atlântico, Sul Atlântico e Oceania, com o qual deve ter os seus efeitos na sua gestão e taxónomía. 5. A divergência da população da África do Sul faz pensar em que a sua margem taxonómica pode requerer uma actualização, já que se situam no nível de sub-espécie ou espécie diferente de P. americanus. 6. A migração sistemática longitudinal desde Caroline até as águas do Este Atlânico e vice- versa é a chave para entender a dinâmica das populações que pertencem ao estoque de cherne Atlântico, assim o desenho correcto das estratégias de explotação devem contemplar a pescaría do Sul de Caroline como a mesma unidade reprodutiva que as costas Atlânticas europeas.

Capítulo 3. Potêncial reprodutivo do cherne (Polyprion americanus) cultivada em cativeiro na costa de Galicia

Para caracterizar uma estratégia reprodutiva e estudar uma melhor forma de obter resultados positivos de P. americanus em cativeiro, o objectivo deste trabalho foi de discutir a biologia reprodutiva da espécie em cativeiro, a influência dos factores ambientais (fotoperíodo, temperatura, efeito de indução hormonal com 2.25 mg de LHRHa a reprodução) e determinar mecanismos que aperfeiçoem a reprodução do cherne em cativeiro.

Conclusões

7. O cherne produzido em cativeiro mostra um crescimento alométrico positivo. Os ensaios realizados evidenciaram que os reprodutores do grupo Aq. Finisterrae apresentaram uma média

128 Conclusões

de crescimento mais alta e não foi significativamente diferente dos outros dois grupos de cultivo realizados no IEO e IGAFA. 8. Porém foram encontradas diferenças significativas, entre o crescimento de machos e fêmeas, sendo que as fêmas engordaram mais rapidamente. 9. O volume de água em que é feito o cultivo e determinante para proporcionar um ambiente próximo do natural, permitindo maior postura natural. Assim são preferíveis os tanques como o do Aq. Finisterrae (3 500 m3) ou maiores, para obter posturas aceitaveis no futuro. 10. O estudo citológico das gónadas de cherne, realizado em exemplares provenientes do meio natural, não mostraram nenhuma evidência de hermafroditismo no cherne, o que parece estar clara a teoría do gonocorismo para esta espécie (Roberts, 1989), em desacordo com (Day, 1880; Jones, 1980) que a definem como hermafrodita. 11. A análise dos esteróides sexuais no período de Dezembro de 2010 a Setembro de 2011 mostra uma clara actividade na maturação gonadal dos gametas tanto masculinos como femeninos entre os meses de Janeiro e Junho. 12. A indução hormonal com 25 µg/kg em fêmeas em estágio de maturação avançada (diâmetro 1 200 µ) por vía intramuscular, mostra uma reacção positiva tanto para a dose de indução com LHRHa utilizada como funcional para o sistema de desbloqueo, pelo facto de terem conseguido completar todo o ciclo de maturação e postura.

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Referências gerais

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142 Produção científica da tese

Produção científica da tese

Produção científica da tese

Trabalhos sometidos a revistas SCI

• Matusse NR, Pita A, Perez M, Peleteiro JB, & Presa P. First-generation genetic drift and inbreeding risk in hatchery stocks of the wreckfish Polyprion americanus. Submitted. • Matusse NR, Pita A, Presa P. & Perez M. Genetic structure and population dynamics of wreckfish (Polyprion americanus) in the North Atlantic. In preparation. • Matusse NR, Perez M. & Peleteiro JB. Reproductive managemente of cultured stocks of wreckfish in Galician hatcheries. In preparation.

Comunicações nacionais

• Pérez M, Matusse NR, Pita A, Peleteiro JB, Trucco MI, Vilar A, Presa P. Combinación de estrategias clásicas y marcadores genéticos para la domesticación de la cherna (Polyprion americanus): una especie candidata de alto potencial acuícola. Comunicación oral, sesión genética. XIV Congreso nacional acuacultura. Universidad Laboral de Gijón. 23-25 de Septiembre de 2013. • Alfonso Pita, Nédia R. Matusse, Montse Pérez, Pablo Presa. Genetic structure and population dynamics of wreckfish (Polyprion americanus) in the North Atlantic. ICES Annual Science Conference, Spain. 15-19th September of 2014.

Comunicacions internacionais

Nédia R. Matusse, M. Pérez, A. Pita, J.B. Peleteiro, P. Presa. Genetic Background of Galician Wreckfish Polyprion americanus Broodstocks Internacional. Conference & Exposition, San Sebastián, Spain. 14-17th October of 2012. Aquaculture Europe 14.

• Alfonso Pita, Nédia R. Matusse, Montse Pérez, Pablo Presa. Genetic structure and population dynamics of wreckfish (Polyprion americanus) in the North Atlantic. ICES Annual Science Conference, Spain. 15-19th September of 2014. • N.R. Matusse, M. Pérez, A. Pita, J.B. Peleteiro, M. Trucco, P. Presa. Combining genetic markers with classic domestication strategies for the wreckfish (Polyprion americanus): A candidate species with high aquaculture potential. Aquaculture conference. Gran Canaria. 3-7 November 2013.

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