Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

EKSPLORASI JENIS DAN POTENSI DNA BARCODE ANGGREK Thrixspermum SECARA IN SILICO

Siti Rohimah1, Luluk Mukarramah2 , Vita Sindiya3, Veren Yuliana S.4, Gita Ayu K.5, Mukhamad Su’udi*6

1, 3, 4, 5, 6Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Jember e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

Diterima :30 Oktober 2018 Abstrak. Thrixspermum merupakan anggrek yang memiliki ciri khas ber- Disetujui : 25 November 2018 bunga dalam waktu yang singkat. Akibatnya, dalam pengklasifikasian menggunakan morfologi cenderung sulit untuk dilakukan. Sehingga perlu e-ISSN : 2541-4208 adanya pengklasifikasian menggunakan cara alternatif misalnya dengan p-ISSN : 2548-1606 marka molekuler menggunakan DNA. Tujuan dari penelitian ini adalah mencari barkode DNA dari beberapa spesies Thrixspermum yang ada pada DOI: 10.15575/biodjati.v3i2.3409 GenBank NCBI. Berdasarkan data dari NCBI, hanya terdapat 19 spesies dari Thrixspermum yang telah diteliti sekuennya. Dari total 19 spesies tersebut, setelah dilakukan pensejajaran sekuen menunjukkan bahwa pada lokus matK dan rbcL memiliki tingkat homologi yang tinggi, sementara pada lokus ITS menunjukkan lebih banyak variasi genetik. Terdapat dua spesies yakni T. annamense dan T. marguense yang berpotensi memiliki barcode pada lokus ITS. Selain itu, didapatkan pohon filogenetik dari 19 spesies Thrixspermum yang telah diketahui senkuennya pada NCBI. Kata Kunci : Thrixspermum, ITS, pohon filogenetik

Abstract. Thrixspermum is an orchid that has the characteristic of flowering in a short time. As a result, classification using morphology tends to be difficult to perform. Therefore, an alternative method such as molecular markers using DNA is needed for classification purpose. This study was performed to identify DNA barcodes of several Thrixspermum found in the NCBI database. Based on data from NCBI, there are only 19 species of the genus Thrixspermum with sequence have been explored. Of total 19 species, after sequence alignment showed that the matK and rbcL loci had high homology level, while at the ITS locus showed more genetic variant. There are two species namely T. annamense and T. marguense posses potential barcodes at ITS locus. In addition, a phylogenetic tree from 19 species of Thrixspermum was constructed based on the sequences deposited in NCBI. Keywords: Thrixspermum, ITS, phylogenetic tree Cara Sitasi Rohimah, S., Mukarramah, L., Sindiya, V., S. Yuliana, V., K. Ayu, A. & Su’udi, M. (2018). Eksplorasi Jenis Dan Potensi DNA Barcode Anggrek Thrixspermum Secara In Silico. Jurnal Biodjati, 3 (2), 148- 156. Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

PENDAHULUAN (Wulanesa et al, 2017). Namun, spesies anggrek ini memiliki morfologi yang mirip Anggrek merupakan kelompok tumbu- dengan kerabat terdekatnya, contohnya T. tsii han berbunga yang memiliki variasi tinggi, memiliki ciri vegetatif yang mirip dengan T. aktif berevolusi, sangat terspesialisasi dan be- centipeda, namun struktur bunganya mirip radaptasi untuk menarik polinator. Terdapat dengan T. subulatum (Chen & Shui, 2005). 17.000-35.000 spesies anggrek di dunia (De- Selain itu, spesies anggrek Thrixspermum stri et al, 2015). Anggrek termasuk dalam fa- juga memiliki banyak nama lain atau sinonim, mili yang terbagi menjadi 5 sub- diantaranya yang famili dan tumbuh di dataran tinggi hingga memiliki sinonim Thrixspermum arachnites; dataran rendah (Kartikaningrum et al, 2017). Thrixspermum papillosum; dan Sarcochilus Salah satu genus anggota Orchidaceae adalah arachnites. Hal tersebut merupakan salah satu Thrixspermum. Kata Thrixspermum berasal kelemahan dalam identifikasi berdasarkan ka- dari bahasa latin, yaitu kata thrix (rambut) dan rakter morfologi. Padahal identifikasi sangat sperma (biji). Thrixspermum memiliki penting dalam penentuan suatu spesies, beberapa manfaat diantaranya selain dapat terutama pada spesies yang memiliki peranan dijadikan sebagai tanaman hias juga berpotensi penting seperti berfungsi sebagai obat, atau sebagai obat, diantaranya yaitu Trixspermum yang lainnya. Berdasarkan studi literatur yang centipede Lour dan Thrixspermum pardale telah dilakukan, artikel-artikel tentang peneli- (Ridl.) Schlecht. Thrixspermum centipede di tian Trixspermum sebagian besar melaporkan digunakan untuk mengobati penyakit karakter morfologi dan persebarannya (Song et asma dengan memanfatkan seluruh bagian ta- al, 2009; O’Byrne, 2016). Sehingga perlu naman (Teoh, 2016). Thrixspermum pardale adanya alternatif identifikasi lain, selain oleh penduduk digunakan sebagai identifikasi berdasarkan morfologi untuk obat untuk mengobati bisul pada hidung den- menentukan spesies dari Thrixspermum. Salah gan cara menumbuknya bersama dengan daun satu alternatif identifikasi yang dapat Hetaeria obliqueto (Teoh, 2016). Penelitian digunakan adalah menggunakan marka tentang anggrek Thrixspermum belum banyak molekuler dengan DNA barcoding. dilakukan, baik karakterisasi maupun poten- DNA barcoding memiliki prinsip dasar sinya. Keterbatasan literatur mengenai anggrek yaitu identifikasi menggunakan sekuen DNA Thrixspermum disebabkan karena minimnya pendek “barcode” dari bagian standar genom informasi ilmiah atau publikasi tentang dari spesimen yang sedang diteliti. Urutan anggrek ini. barcode yang tidak diketahui akan Thrixspermum termasuk anggrek mono- dibandingkan dengan pustaka sekuen barcode podial dan memiliki ciri khas berbunga dalam yang telah diketahui identitasnya. Apabila waktu yang singkat. Thrixspermum tersebar di hasil perbandingan antara sekuen yang diteliti wilayah tropis dan subtropis mulai dari sesuai dengan pustaka, maka spesimen hingga dan Pasifik (O’Byrne, 2016). tersebut diidentifikasi sebagai spesimen dari Cara hidupnya epifit dengan menempel pada pustaka. Namun jika tidak sesuai, maka dapat batang pohon (Nurfadilah, 2015). Karakter mengarah kepada sekuen baru untuk spesies morfologi daun dan bunga Thrixspermum baru (Hajibabaei et al, 2007). Identifikasi spe- menjadi dasar penanda secara fenotipik untuk sies berbasis DNA merupakan metode yang membedakan kelompok tanaman tersebut cepat dan konsisten sehingga dapat dipertang Rohimah, et al. 149

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati gungjawabkan (Irawan et al, 2016). Hal Notepad yang nantinya akan dianalisis tersebut dikarenakan karakter DNA yang rela- menggunakan CLUSTALX. tif lebih konstan dibandingkan karakter morfo- logi (Hidayat et al, 2008). Sekuen DNA yang Pensejajaran Menggunakan CLUSTALX diperoleh dapat digunakan untuk mengetahui Semua sekuen DNA yang telah dikoleksi hubungan kekerabatan dari suatu spesies dari NCBI disejajarkan. Pensejajaran sekuen dengan cara mengkonstruksi pohon DNA dilakukan dengan menggunakan filogenetik. software CLUSTALX. Hal ini bertujuan untuk Pohon filogenetik merupakan suatu mengetahui tingkat homologi dan identifikasi gambaran evolusi yang terjadi pada sekuen yang berpotensi sebagai barcode. sekelompok makhluk hidup yang berasal dari Sekuen yang berpotensi sebagai barcode nenek moyang yang sama (Ochieng et al, adalah sekuen yang berbeda dan khas 2007). Filogenetik mengkombinasikan teknik dibandingkan yang lain. biologi molekuler dengan statistik untuk me- rekonstruksi hubungan filogenetik. Penggu- Pembuatan Pohon Filogenetik naan sekuen DNA sangat penting karena dapat Data sekuen DNA hasil pensejajaran mengetahui perubahan basa nukleotida menu- kemudian digunakan untuk membuat pohon rut waktu dan dapat memperkirakan kecepatan filogenetik menggunakan software MEGA7 evolusi yang terjadi. Hal tersebut dapat dire- dengan metode Neighbour-Joining. Pohon konstruksi hubungan evolusi antara satu spe- filogenetik bertujuan untuk mengetahui tingkat sies dengan spesies lainnya (Hidayat & Panco- kekerabatan dari setiap anggrek ro, 2008). DNA kloroplas banyak digunakan Thrixspermum. Selain itu, juga dapat untuk mengetahui hubungan kekerabatan anta- digunakan untuk melihat laju evolusinya. ra spesies angiospermae dengan tanaman lain- nya, namun memiliki tingkat evolusi yang HASIL DAN PEMBAHASAN rendah. Sehingga ada keterbatasan dalam mengamati hubungan intraspesifik (Harsono et Koleksi sampel penelitian al, 2015). Sedangkan DNA nukleus lebih ba- Hasil penelusuran jenis anggrek nyak memiliki variasi genetik karena tingkat Thrixspermum menunjukkan bahwa terdapat rekombinan yang tinggi. perbedaan yang signifikan antara jumlah spesies yang dikoleksi dari GeneBank BAHAN DAN METODE database (NCBI) dan yang disebutkan O’Byrne dalam bukunya. Berdasarkan grafik Koleksi Sampel Penelitian dapat diketahui bahwa dari total 130 spesies Sekuen DNA dikoleksi dari GenBank anggrek yang diketahui, hanya terdapat 19 NCBI dengan cara menulis nama spesies diser- jenis anggrek yang diketahui aksesinya di tai gen yang diinginkan (Contoh: Trixspermum NCBI (Gambar 1). Jumlah tersebut subulatum matK/ ITS/ rbcL). Data-data yang menunjukkan bahwa masih terdapat banyak meliputi aksesi, panjang nukleotida, sekuen jenis anggrek Thrixspermum yang belum di- parsial atau lengkap (full), serta asal anggrek eksplorasi sekuennya. Hal ini dapat menjadi disimpan ke dalam Microsoft Excel. Sementara peluang bagi para peneliti untuk mencari susunan nukleotida disimpan ke dalam sekuen dari anggrek jenis ini yang kemudian

Jurnal Biodjati, 3(2), November 2018 150

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati dapat digunakan sebagai data dalam analisis nukleotidanya. Berdasarkan hasil penelurusan bioinformatika. aksesi jenis anggrek Thrixspermum pada Sinonim merupakan istilah atau nama NCBI, dapat diketahui bahwa anggrek yang lain yang digunakan untuk menyebut jenis sua- diteliti sebagian besar berasal dari dataran tu spesies. Pemahaman terhadap sinonim suatu dan Malaysia, hanya sebagian kecil tumbuhan akan sangat membantu masyarakat yang didapatkan dari negara lain seperti akademik untuk tujuan identifikasi spesies. Jepang, Polland, USA, dan . Anggrek merupakan tumbuhan yang memiliki Aksesi dalam penelitian ini merupakan banyak sinonim pada beberapa spesiesnya. Da- hasil penelurusan menggunakan lokus gen ri total 130 jenis anggrek Thrixpermum yang matK, rbcL, dan ITS (Tabel 2). Consortium diketahui, terdapat 39 jenis anggrek Thrixper- Barcode Of Life (CBOL) merekomendasikan mum yang memiliki sinonim (Tabel 1). rbcL yang secara umum dikombinasikan den- Apabila sinonim pada anggrek-anggrek gan matK sebagai barcode untuk identifikasi tersebut tidak dipublikasikan, maka masyara- tumbuhan. Gen rbcL dan matK digunakan ka- kat cenderung akan membedakan spesies- rena eksistensi, efektifitas, dan kelestarian laju spesies anggrek yang memiliki sinonim mutasi kedua gen tersebut yang ditemukan pa- menjadi spesies yang berbeda. Sehingga da hampir semua tumbuhan. Gen rbcL dan penting sekali adanya publikasi mengenai matK juga dapat digunakan dalam analisis fi- sinonim dan nama yang telah diterima secara logenetik dan kekerabatan tanaman dalam satu luas pada suatu spesies. genus. Laju mutasi rbcL yang rendah dari gen- Hasil penelusuran juga menunjukkan gen kloroplas lainnya, seperti trnH, trnM, trnS, bahwa dari 130 spesies anggrek jenis rps18, psbH, dan ORF31, menyebabkan rbcL Thrixspermum yang diketahui, hanya terdapat masih dapat membawa informasi gen dari ne- 19 spesies yang sekuennya telah didepositkan nek moyang terdahulu (Suparman, 2012). di NCBI. Hal ini menjadi peluang besar dalam Akibat laju mutasi yang rendah tersebut, apa- identifikasi molekuler anggrek jenis ini. bila terdapat spesiasi pada suatu populasi, ma- Apabila pada identifikasi morfologi terdapat ka sekuen yang mengalami perubahan akan 39 spesies anggrek yang memiliki sinonim, terlihat dan kemungkinan dapat menjadi se- tidak menutup kemungkinan pada identifikasi buah barcode bagi spesies baru tersebut. Na- molekuler, akan terdapat spesies anggrek lain mun, laju mutasi yang rendah pada gen rbcL yang belum memiliki sinonim menjadi juga mengakibatkan tingkat homologi yang memiliki sinonim. Selain itu, akan ditemukan tinggi pada spesies dalam satu genus terutama adanya peluang perbedaan antara spesies yang jika spesies tersebut ditemukan dalam ling- telah memiliki sinonim dengan spesies kungan, habitat, atau asal yang sama. anggrek lainnya menurut urutan sekuen basa

Rohimah, et al. 151

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

Gambar 1. Grafik perbandingan jumlah spesies dari genus Thrixpermum yang di- koleksi dari GeneBank database (NCBI) dan yang disebutkan O’Byrne dalam bukunya, serta yang memiliki sinonim

Tabel 1. Jenis anggrek Thrixpermum yang memiliki sinonim Nama Sinonim Thrixspermum acuminatissimum Thrixspermum notabile ; Thrixspermum affine (subsp); Sarcochilus acuminatissimus Thrixspermum adenotrichum Cleisostoma congestum; Thrixspermum congestum Thrixspermum amplexicaule Thrixspermum oeonioides ; Sarcochilus amplexicaulis Thrixspermum annamense Thrixspermum devolium ; Ascochilus annamensis Thrixspermum batuense Sarcochilus carinatifolius; Dendrocolla carinatifolia ;

Thrixspermum carinatifolium

Thrixspermum bicristatum Thrixspermum merguense Thrixspermum centipeda Thrixspermum arachnites ; Thrixspermum papillosum ; Thrixspermum arachnites ; Sarcochilus arachnites

Thrixspermum ciliatum Thrixspermum clavatum

Thrixspermum falcilobum Thrixspermum subulatum Thrixspermum fantasticum Thrixspermum neglectum Thrixspermum formosanum Thrixspermum pricei ; Thrixspermum sasaoi ; Sarcochilus formosanus Thrixspermum fragrans Thrixspermum simondii Thrixspermum graeffei Thrixspermum oreadum Thrixspermum merguense Thrixspermum bicristatum; Thrixspermum comans; Thrixspermum comans var. bicristatum ;Thrixspermum kusuku- sense; Sarcochilus merguensis)

Thrixspermum neo-hibernicum Thrixspermum platystachys Thrixspermum pensile Thrixspermum pendulicaule Thrixspermum raciborskii Thrixspermum raciborskii var. hamatum

Thrixspermum rubrocallosum Thrixspermum clavatum

Thrixspermum xanthanthum Thrixspermum pygmaeum

Jurnal Biodjati, 3(2), November 2018 152

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

Tabel 2. Aksesi anggrek berdasarkan locus matK, rbcL, dan ITS dari NCBI Lokus ITS Lokus rbcL Lokus MatK

Nama Spesies Length Length Length Aksesi Asal Aksesi Asal Aksesi Asal (bp) (bp) (bp) Thrixspermum KY966674 644P CH KX784194 717P MLY AB217767 1803F JP centipede Thrixspermum KJ733460 647P CH DQ195035 823P CH KJ733620 1626F CH formosanum Thrixspermum KJ733459 646P CH KJ733615 1623F CH tsii Thrixspermum KJ733457 646P CH KJ733613 1622F CH laurisilvaticum Thrixspermum KJ733458 646P CH KJ733614 1575F CH saruwatarii Thrixspermum KX679334 838F MLY KX784196 718P MLY merguense Thrixspermum KX784210 KX679348 826F MLY 609P MLY triangulare Thrixspermum KX784195 KX679333 791F MLY 718P MLY linusii Thrixspermum KX784193 KF545882 645P CH 725P MLY KF545892 1621F CH amplexicaule Thrixspermum KX679347 781F MLY KX784209 720P MLY tortum Thrixspermum DQ091674 682P USA elongatum Thrixspermum KF545883 654P CH KF545893 1627F CH annamense

Thrixspermum P P P japonicum KT338782 645 KR KF296714 561 MLY KF262105 736 KR Thrixspermum KX679331 854F MLY caudatum Thrixspermum US MF349945 824P raciborskii A Thrixspermum KX784211 662P MLY ventricosum Thrixspermum KX784197 721P MLY pensile Thrixspermum EF065572 1312P PL arachnites Thrixspermum AB217592 650P JP subulatum Keterangan: F= Full P= Parsial MLY= Malaysia CH= China PL= Polland KR= Korea

Rohimah, et al. 153

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

Pensejajaran sekuen DNA

Gambar 2. Hasil alignment sekuen ITS, tanda (*) menunjukkan homologi, gap menggambarkan adanya delesi atau in- sersi. Setiap warna menandai basa nitrogen tertentu.

Hasil alignment menggunakan lokus ITS oleh spesies lainnya. Sekuen tersebut memiliki memperlihatkan bahwa spesies T. subulatum, persentase keunikan sebesar 0.89%. Selain itu T. merguense dan T. annamense memiliki uru- pada urutan basa 95-96 spesies T. merguense tan sekuen yang unik dan berpotensi sebagai mengalami delesi. T annamense mengalami barcode, karena berbeda dengan spesies lain- insersi basa C dan G pada urutan basa 78 dan nya. Sekuen T. merguense dan T. annamense 111. Meskipun sekuen ITS banyak digunakan memiliki urutan yang mirip yaitu AAAAG dan untuk mengidentifikasi atau mencari barcode T. subulatum memiliki sekuen GGTGG pada pada fungi, namun tidak menutup urutan nukleotida 187-191 yang tidak dimiliki kemungkinan bahwa ITS juga dapat digunakan Jurnal Biodjati, 3(2), November 2018 154

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati untuk menemukan barcode spesifik pada filogenetik, maka keempatnya diduga kuat tumbuhan. memiliki nenek moyang yang sama. Sementara nenek moyang keempat spesies Pembuatan Pohon Filogenetik tersebut berkerabat dengan dengan T. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik subulatum. Selain itu, dapat diketahui pula Thrixspermum menunjukkan bahwa T. bahwa kemungkinan besar T. amplexicaule annamense dan T. merguense memiliki merupakan spesies tertua dari genus kekerabatan dekat dengan T. formosanum dan Thrixspermum pada pohon filogenetik T. linusii. Berdasarkan data dari pohon tersebut.

Gambar 3. Hasil rekonstruksi pohon filogenetik Thrixspermum menggunakan MEGA7 dengan metode Neighbour-Joining.

UCAPAN TERIMAKASIH litung. PROS SEMNAS MASY BIODIV INDON, 1(3), 509-514. Penulis mengucapkan terimakasih kepa- Hajibabaei, M., Singer, G. A. C., Hebert1, P. da LPPM Universitas Jember yang telah men- D. N. & Hickey, D. A. (2007). DNA danai penelitian ini melalui skema Hibah Ke- Barcoding: How it Complements Ris tahun 2018. , Molecular Phylogenetics and Population Genetics. Trends in Genetics, DAFTAR PUSTAKA 23(4). Harsono, T., Pasaribu, N., Sobir, Fitmawati & Chen, W. H. & Shui, Y. M. (2005). A New Prasetya, E. (2015). Variasi Intraspesifik Spesies of Thrixspermum (Orchidaceae) Berdasarkan DNA Kloroplas from China. Brittonia, 57. (CPDNA) Pada Bouea macrophylla Destri, Fudola A., Harto & Kusnadi. (2015). Griffit. Prosiding Seminar Nasional Survei Keanekaragaman Anggrek (Orchi- Biodiversitas dan Ekologi Tropika Indo- daceae) di Kabupaten Bangka Tengah dan nesia. Belitung, Provinsi Kepulauan Bangka Be- Rohimah, et al. 155

Jurnal Biodjati, 3 (2) 2018

http://journal.uinsgd.ac.id/index.php/biodjati

Hidayat, T. & Pancoro, A. (2008). Kajian Fi- lang Regency, East Java, . Bio- logenetik Molekuler dan Peranannya da- tropia, 22(2), 120-128. lam Menyediakan Informasi Dasar untuk O’Byrne, P. (2016). Trixspermum in ; Meningkatkan Kualitas Sumber Genetik 24 New and Old Spesies. Malesian Orc- Anggrek. Jurnal Agro Biogen. 4(1), 35- hid Journal, 18, 5-74. 40. Ochieng, J. W., Murigai, A. W. T. & Ude, G. Hidayat, T., Kusumawaty, D., Kusdianti., Yati, N. (2007). Review: Phylogenetics in D. D., Muchtar, A. A. & Mariana, D. Biotechnology: Principles, Obstacles, and (2008). Analisis Filogenetik Molekuler Opportunities for Resource Poor. African pada Phyllanthus niruri L. (Euphor- Journal of Biotechnology, 6(6), 639-649. biaceae) Menggunakan Urutan Basa DNA Suparman. (2012). Markah Molekuler Dalam Daerah Internal Transcribed Spaces Identifikasi Dan Analisis Kekerabatan (ITS). Jurnal Matematika dan Tumbuhan Serta Implikasinya Bagi Mata Sains,13(1), 16-21. Kuliah Genetika (Telaah Keilmuan Gene- Irawan, P. D., Tallei, T. E. & Kolondam, B. J. tika Molekuler Tumbuhan), Jurnal Bio- (2016). Analisis Sekuen dan Filoge- edukasi, 1(1), 59-68. netik Beberapa Tumbuhan Syzygium Song, X. Q., Meng, Q. W., Wing, Y. T. & (Myrtaceae) di Sulawesi Utara berdasar- Luo, Y. B. (2009). Thrixspermum odora- kan Gen matK. Jurnal Ilmiah Sains, tum (Orchidaceae), a New Species from 16(2), 43-50. Hainan Island, China. Ann. Bot. Fennici, Kartikaningrum, S., Pramanik, D., Dewanti, 46, 595-598. M., Soehendi, R. & Yufdy, M.P. (2017). Teoh, E. S. (2016). Medicinal Orchids of Asia. Konservasi Anggrek Spesies Alam Meng- Switzerland: Springer International Pub- gunakan Eksplan Biji pada Media Vacin lishing. & Went. Buletin Plasma Nutfah, 23(2), Wulanesa, W. O. S., Soegianto, A. & Basuki, 109-118. N. (2017). Eksplorasi dan Karakterisasi Nurfadilah, S. (2015). Diversity of Epiphytic Anggrek Epifit di Hutan Coban Trisula- Orchids and Host Trees (Phorophytes) in Kawasan Taman Nasional Bromo Tengger Secondary Forest of Coban Trisula, Ma- Semeru. Jurnal Produksi Tanaman, 5(1), 125-131.

Jurnal Biodjati, 3(2), November 2018 156