Universidad Nacional del Centro del Perú
Facultad de Ciencias Aplicadas
Composición química por cromatografía a gases y actividad antibacteriana del aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz & Pav frente a la Escherichia coli y Staphylococcus aureus
Ponce Porras, Giancarlo Ali
Tarma 2019
Esta obra está bajo licencia https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ Repositorio Institucional - UNCP
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE CIENCIAS APLICADAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
TESIS
Composición química por cromatografía a gases y actividad antibacteriana del aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz & Pav frente a la Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
PRESENTADA POR:
PONCE PORRAS, Giancarlo Ali
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE:
INGENIERO AGROINDUSTRIAL
TARMA – PERÚ
2019
“La civilización nunca retrocede, la ley de necesidad siempre fuerza a ir hacia adelante”
Julio Verne.
II
ASESORA
Dra. Shalin Carhuallanqui Avila
III
DEDICATORIA:
A mis padres por el sacrificio que realizaron para que su hijo pueda llegar a ser un profesional y una persona de bien.
A mis amigos que siempre me estuvieron apoyando en el desarrollo de mi carrera profesional.
Giancarlo Ali Ponce
Porras
IV
AGRADECIMIENTO
A la Universidad Nacional del Centro de Perú y a la Facultad de Ciencias
Aplicadas, por la formación en la carrera profesional de Ingeniería Agroindustrial.
A la Dra. Shalin Carhullanqui Avila por su asesoría y sus sabios consejos en el transcurso del desarrollo de la tesis, y más allá de lo profesional por su invaluable ayuda como una amiga.
A los miembros del jurado examinador por los aportes que brindan en la mejora de la presente investigación.
Agradezco a mi familia por su incondicional apoyo en el transcurso de mi carrera profesional dándolo todo para ver a su hijo convertirse en un hombre de provecho y bienhechor.
Agradezco a las personas que me brindaron su apoyo de manera desinteresa para poder realizar este trabajo de investigación.
V
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como principal objetivo evaluar efectos del estado fresco y seco de salvia en la composición química, características fisicoquímicas y actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 del aceite esencial. Se realizó la clasificación taxonómica de la planta, se obtuvo el aceite esencial de la planta en estado fresco y seco, determinándose la composición química por cromatografía acoplado a espectrometría de masas, características fisicoquímicas y la actividad antimicrobiana. Se aplicó un diseño completamente al azar (DCA), como prueba estadística para determinar la diferencia significativa entre tratamientos. Los resultados mostraron que el nombre científico de la salvia es Salvia Sagittata Ruiz & Pav. Existió diferencias significativas entre los tratamientos a (p<0,05), siendo el T2 (aceite esencial de salvia en estado seco) mayor en rendimiento, índice de refracción, y índice de acidez (0,023%; 1,491, 0,081 mg KOH/g respectivamente) y T1 (0,136%; 1,460, 0,072 mg KOH/g), siendo en pH mayor en T1 con 6,5 luego T2 con 6,33. En su composición química también existe diferencias en el tratamiento T1 AE fresco, siendo sus principales componentes a Cariofileno (54, 10%), Bicyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4-methyl-3-pe) (8,11%), alpha-Terpinyl acetate (7,52%), Humulene (7,26%); y en el AE de salvia en estado seco se encontró 42 componentes, siendo sus componentes mayoritarios: Cariofileno (59,53% ), Humulene (7,59%), trans-alpha-Bergamotene (6,75%), alpha – Cubebene (4,07%) y alpha-Terpinyl acetate (4,07%). En las pruebas de inhibición de crecimiento del método de Kirby Bauer donde se tuvo los tratamientos T1, T2, T3 y T4, frente a E. coli demostrándose que el mejor tratamiento es T4 con un 27,27% de inhibición de crecimiento en estado seco y en estado fresco fue de 27,24%, mientras que para S. aureus el mejor tratamiento fue T4 con una inhibición de crecimiento de 72,09% en estado seco y en estado fresco fue 59,67%, así también se comprobó que existe diferencia significativa de las medias del tamaño del halo de inhibición de crecimiento de los microorganismos (p<0,05), corroborado con la prueba de Tukey. En el método de concentración mínima inhibitoria del aceite esencial de la salvia en estado fresco en E. coli fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado seco fue de 23,55 mg/ml y del S. aureus la CMI en estado fresco fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado seco fue de 23,55 mg/ml, siendo la concentración de menor grado fluctuación de absorbancia con tendencia de grafica en línea recta.
Palabras clave: Salvia sagittata, aceite esencial, cromatografía a gases, Kirby Bauer.
VI
SUMMARY
The main objective of the present work was to evaluate the effects of the fresh and dry state of sage on the chemical composition, physicochemical characteristics and antibacterial activity against Escherichia coli ATCC 25922 and Staphylococcus aureus ATCC 25923 of the essential oil. The taxonomic classification of the plant was carried out, the essential oil of the plant was obtained in a fresh and dry state, determining the chemical composition by chromatography coupled to mass spectrometry, physicochemical characteristics and antimicrobial activity. A completely randomized design (DCA) was applied as a statistical test to determine the significant difference between treatments. The results showed that the scientific name for sage is Salvia Sagittata Ruiz & Pav. There were significant differences between the treatments a (p <0.05), with T2 (essential oil of sage in the dry state) being higher in yield, refractive index, and acidity index (0.023%; 1,491, 0.081 mg KOH / g respectively) and T1 (0.136%; 1,460, 0.072 mg KOH / g), being in pH higher in T1 with 6.5 then T2 with 6.33. In its chemical composition there are also differences in the fresh T1 AE treatment, its main components being Caryophyllene (54, 10%), Bicyclo [3.1.1] hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4- methyl-3-pe) (8.11%), alpha-Terpinyl acetate (7.52%), Humulene (7.26%); and in the EA of sage in the dry state, 42 components were found, being its main components: Caryophyllene (59.53%), Humulene (7.59%), trans-alpha-Bergamotene (6.75%), alpha - Cubebene (4.07%) and alpha-Terpinyl acetate (4.07%). In the growth inhibition tests of the Kirby Bauer method where the T1, T2, T3 and T4 treatments were taken, compared to E. coli, showing that the best treatment is T4 with 27.27% growth inhibition in the dry and in the fresh state it was 27.24%, while for S. aureus the best treatment was T4 with a growth inhibition of 72.09% in the dry state and in the fresh state it was 59.67%, this was also verified that there is a significant difference in the means of the size of the growth inhibition halo of the microorganisms (p <0.05), corroborated with the Tukey test. In the method of minimum inhibitory concentration of the essential oil of sage in the fresh state in E. coli it was 50% or 23.72 mg / ml and in the dry state it was 23.55 mg / ml and in S. aureus the MIC in the fresh state it was 50% or 23.72 mg / ml and in the dry state it was 23.55 mg / ml, with the concentration having a lower degree of fluctuation in absorbance with a tendency to graph in a straight line.
Key words: Salvia sagittata, essential oil, gas chromatography, Kirby Bauer.
VII
INDICE
DEDICATORIA...... IV AGRADECIMIENTO...... V RESUMEN...... VI SUMMARY...... VII ÍNDICE...... VIII ÍNDICE DE TABLAS...... XII ÍNDICE DE FIGURAS...... XVI ÍNDICE DE ANEXOS...... XIX INTRODUCCIÓN...... XX
CAPÍTULO I...... 24 PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO...... 24 1.1. DETERMINACIÓN DEL PROBLEMA...... 24 1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA...... 25 1.3. OBJETIVOS DE INVESTIGACIÓN...... 26 1.3.1. Objetivo general...... 26 1.3.2. Objetivos específicos...... 26 1.4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA……………………………..……...27 1.5. DELIMITACIONES DE LA INVESTIGACIÓN...... 28 1.5.1. Espacial...... 28 1.5.2. Cuantitativa...... 29 1.5.3. Temporal...... 29
CAPITULO II...... 30 MARCO TEÓRICO...... 30 2.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN……………………...……30 2.2. TEORÍAS BÁSICAS………………………………………...……………..35 2.2.1. Salvia………………………………..………………………………35 2.2.2. Clasificación taxonómica……………………………………...…..35 2.2.3. Características morfológicas……………………………..………36 2.2.4. Propiedades……………………………………..…………………36 2.2.5. Aspectos tecno funcionales de los aceites esenciales...………36 2.2.6. Composición química de los aceites esenciales………..….…..37 2.2.7. Bacterias patógenas………………………………..…..…………38 2.2.7.1. Escherichia coli………………………………...………...38 2.2.7.2. Staphylococcus aureus……..………………..………….41
VIII
2.3. EXTRACCIÓN DE ACEITE ESENCIAL…………………...…..………..43 2.3.1. Destilación por arrastre de vapor………………………..……….43 2.3.2. Extracción con disolvente…………………………………………45 2.3.3. Extracción por fluidos supercríticos……………………..……….46 2.4. DETERMINACIÓN DE COMPONENTES DE ACEITES ESENCIAL..46 2.4.1. Las separaciones cromatográficas…………………..…………..46 2.4.2. Clasificación…………………..……………………………………47 2.4.2.1. Cromatografía de gases……………………...………….49 2.4.2.2. Cromatografía de Gases Acoplada a Espectrometría de Masas…………………………..………………………….50 2.5. ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE LOS ACEITES ESENCIALES...51 2.6. MÉTODO DE DIFUSIÓN DE DISCOS……………….....………………52 2.7. DESARROLLO DE VARIABLES…………………..…………………….53 2.8. HIPÓTESIS DE LA INVESTIGACIÓN………………………..…………54 2.8.1. Hipótesis general………………………………..…………………54 2.8.2. Hipótesis de trabajo…………………………………..…………...54 2.9. VARIABLES (OPERACIONALIZACIÓN)…………………….………….56
CAPITULO III...... 57 METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN...... 57 3.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN………………….…………..……………….57 3.2. NIVEL DE INVESTIGACIÓN………………………….…...……………..57 3.3. MÉTODOS DE LA INVESTIGACIÓN……………………..…………….58 3.4. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN………………..…………..…………58 3.4.1. Características fisicoquímicas y composición química del aceite esencial…………………………………..…………………………58 3.4.2. Actividad antibacteriana del aceite esencial de la salvia……….59 3.5. POBLACIÓN Y MUESTRA…………...…………………………………..62 3.6. TÉCNICAS, INSTRUMENTOS Y PROCEDIMIENTOS DE RECOLECCIÓN DE INFORMACIÓN O DATOS……………………….62 3.6.1. Recolección e identificación taxonómica de la materia prima....62 3.6.2. Extracción del aceite esencial……………………..……………...62 3.6.3. Análisis fisicoquímico………………..…………………………….64 3.6.4. Análisis de cromatografía a gases…………………..……………64 3.6.5. Evaluación de la actividad antibacteriana…………..…………...65 3.6.5.1. Cepas de bacterias…………..……………………….65 3.6.5.2. Actividad antibacteriana………………..…………….65 3.6.5.2.1. Método Kirby Bauer………………...…….65
IX
3.6.5.2.2. Método de determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC)...68 3.7. TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO DE INFORMACIÓN O DATOS..71
CAPITULO IV……………………………………..………………………………….72 RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÒN...... 72 4.1. EVALUACIÓN DE LA PLANTA Salvia sagittata……………..………...72 4.1.1. Clasificación taxonómica de la planta Salvia sagittata…..……..72 4.1.2. Características fisicoquímicas de Salvia sagittata………………73 4.2. EVALUACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL DE Salvia sagittata..……....73 4.2.1. Características fisicoquímicas ….………………………………..73 4.2.2. Análisis químico por cromatografía a gases………..…………...81 4.3. EVALUACIÓN DE INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DEL ACEITE ESENCIAL DE LA Salvia……….…………………..……………..………86 4.3.1. Determinar la actividad antibacteriana del aceite esencia de salvia frente Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923……………………………………………….86 4.3.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli ATCC 25922………………………………………………………………..98 4.3.3. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de Salvia en estado seco frente a Escherichia coli ATCC 25922………………………………………………………..…….100 4.3.4. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923……...………………………………………………………103 4.3.5. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923………………..…………………………………………….105 4.4. DISCUSIONES DE RESULTADOS………...... 108 4.4.1. Lugar de recolección de la materia prima………………...….…108 4.4.2. Morfología de la planta…………………..……………………….108 4.4.3. Características fisicoquímicas del aceite esencial de la Salvia………………………………………………………………109 4.4.3.1. Rendimiento del AE de la Salvia……..….………….109 4.4.3.2. Índice de refracción del AE de la Salvia ……………110 4.4.3.3. PH del AE de la Salvia……………………………….111 4.4.3.4. Índice de acidez del AE de la Salvia………………..112 4.4.4. Análisis químico por cromatografía a gases……………..…….113
X
4.4.5. Evaluación de inhibición del crecimiento del AE de la Salvia...114 4.4.5.1. Actividad antibacteriana del AE E. coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 …..…..……..114 4.4.6. Concentración mínima inhibitoria del AE de Salvia frente a E. coli ATCC 25923…………...…………………….……………………116 4.4.7. Concentración mínima inhibitoria del AE frente a S. aureus...... ………116
CONCLUSIONES...... 118 RECOMENDACIONES...... 120 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS...... 121 ANEXOS...... 128
XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica de la salvia……………..………………………35
Tabla 2. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna………..…...48
Tabla 3. Operalización de las variables de la presente investigación……………56
Tabla 4. Esquematización del diseño experimental de las características y composición química del aceite esencial……………………..…………………….59
Tabla 5. Esquematización del arreglo factorial de 4x2 con un DCA, aplicado a la investigación……………………..……………………………………………………61
Tabla 6. Clasificación taxonómica de planta Salvia sagittata………………..…...72
Tabla 7. Características fisicoquímicas de la planta de la salvia…………………73
Tabla 8. Características fisicoquímicas del aceite esencial de la Salvia…...……74
Tabla 9. Análisis de varianza (ANOVA) del rendimiento del aceite esencial de la Salvia en estado fresco y seco………..……………………………………………..74
Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores del Rendimiento…………………...………………………………………………………75
Tabla 11. Análisis de varianza (ANOVA) del índice de refracción del aceite esencial de la Salvia en estado fresco y seco…………………..…………………..76
Tabla 12. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores del índice de refracción……………………….………………………………………………….77
Tabla 13. Análisis de varianza (ANOVA) del Índice de acidez del aceite esencial de la Salvia en estado fresco y seco………………………….……………………..78
XII
Tabla 14. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores del índice de acidez………………………………….……………………………………………78
Tabla 15. Análisis de varianza (ANOVA) del pH del aceite esencial de la Salvia en estado fresco y seco……………………………………….……………………...80
Tabla 16. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores del pH.80
Tabla 17. Componente químico principal del aceite esencial de la Salvia sagittata………………………………………………………………………………..82
Tabla 18. Comparaciones de algunos componentes químicos de mayor porcentaje del aceite esencial en ambos estados de la materia prima…………..82
Tabla 19. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones del AE de Salvia Sagittata frente a la cepa bacteriana Escherichia coli………………...…...86
Tabla 20. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli……..…...87
Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli………………………………….…………………………………….88
Tabla 22. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Escherichia coli…………....89
Tabla 23. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Escherichia coli…………………………………………….………………………….89
Tabla 24. Comparación del mejor tratamiento de inhibición de AE Fresco y seco frente a E. coli………………………………………………………………………….90
XIII
Tabla 25. Análisis de varianza (ANOVA) de % de inhibición de Escherichia coli ATCC 25922…………………………………………………………………………..91
Tabla 26. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones del AE de Salvia frente a la cepa bacteriana Staphylococcus aureus ATCC 25923………..91
Tabla 27. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus…92
Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 ………………………………………………93
Tabla 29. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus...…94
Tabla 30. Prueba de comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 …………………………………….………...95
Tabla 31. Comparación del mejor tratamiento de inhibición de AE Fresco y seco frente a S. aureus……………………………………………………………………..96
Tabla 32. Análisis de varianza (ANOVA) del % de inhibición de Staphylococcus aureus ATCC 25923………………………………………………………………….97
Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para los mejores tratamientos de inhibición de Staphylococcus aureus ATCC 25923……………97
Tabla 34. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de AE de la planta Salvia sagittata en estado fresco frente a Escherichia coli………..………98
Tabla 35. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de AE de la planta Salvia sagittata en estado seco frente a Escherichia coli……...…………100
XIV
Tabla 36. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de AE de la planta Salvia sagittata en estado fresco frente a Staphylococcus aureus……...103
Tabla 37. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de AE de la planta Salvia sagittata en estado seco frente a Staphylococcus aureus……….105
XV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Vista microscópica de Escherichia coli………………………..………...39
Figura 2. Vista microscópica de Staphylococcus aureus……………………...….41
Figura 3. Diagrama de planta……………………..………………………………...44
Figura 4. Flujograma de la extracción por arrastre de vapor de aceites esenciales……………………………………………………………………………..45
Figura 5. Esquema propuesto del diseño experimental…………………..………58
Figura 6. Esquema propuesto del diseño experimental para la actividad antibacteriana…………………………………………..……………………………..60
Figura 7. Flujograma general de la obtención de aceites esenciales de la salvia en estado fresco y seco……………………………………….………………….…..63
Figura 8. Comparación de medias de la prueba Tukey del rendimiento……..….75
Figura 9. Comparación de medias de la prueba Tukey del índice de refracción.77
Figura 10. Comparación de medias de la prueba de Tukey del índice de acidez…………………………………………………………………………………..79
Figura 11. Comparación de medias de la prueba de Tukey del pH………………81
Figura 12. Componentes químicos de mayor porcentaje del aceite esencial de la Salvia sagittata…………………..……………………………………………………83
Figura 13. Cromatograma del AE de Salvia sagittata en fresco del análisis por Inyección Líquida. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER…………………………..……………..84
XVI
Figura 14. Cromatograma del AE de Salvia sagittata en seco del análisis por Inyección Líquida. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER…………………………..……………..85
Figura 15. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli………………………………………………………………………………………88
Figura 16. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Escherichia coli……………………………………………………………………………………...90
Figura 17. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus……………………………………………….……………...94
Figura 18. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus……………………………….……………………………...96
Figura 19. Curva de crecimiento de Escherichia coli frente AE de Salvia sagittata Ruiz & Pav. en estado fresco………………………………………………..……….99
Figura 20. Curva de crecimiento de Escherichia coli frente al AE de Salvia sagittata Ruiz & Pav. en estado seco……………………………………….……..101
Figura 21. Comparación de la Concentración mínima inhibitoria del AE de la Salvia en estado fresco y seco frente a Escherichia coli………………….……...102
Figura 22. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus frente AE de Salvia sagittata Ruiz & Pav. en estado fresco…………………………….………………104
Figura 23. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus frente AE de Salvia sagittata Ruiz & Pav. en estado seco………………………………………………106
XVII
Figura 24. Comparación de la Concentración mínima inhibitoria del AE de la Salvia en estado fresco y seco frente a Staphylococcus aureus………………..107
XVIII
INDICE DE ANEXOS
Anexo A. Recolección de la especie vegetal de Salvia sagittata……...………..128
Anexo B. Selección de las hojas de la especie vegetal Salvia sagittata…….....129
Anexo C. Extracción del AE de la especie vegetal Salvia sagittata………...…..130
Anexo D. Separación del aceite esencial del hidrosol ……………..…………..131
Anexo E. Aceite esencial de la Salvia sagittata…………..………………………132
Anexo F. Procedimiento para determinar el efecto antimicrobiano del aceite esencial de la especie vegetal de Salvia sagittata frente a la Escherichia coli y Staphylococcus aureus………………….………………………………………….133
Anexo G. Análisis fisicoquímicos del aceite esencial…………………………....134
Anexo H. Resultados obtenidos de las diferentes concentraciones del AE de la Salvia sagittata frente a la cepa bacteriana E. coli y S. aureus por el método de difusión en disco…………………………………..…………………………………135
Anexo I. Datos cromatográficos del aceite esencial de Salvia sagittata en fresco del análisis por Inyección Líquida………………………………………………….138
Anexo J. Resultado de composición de AE de la Salvia sagittata Ruiz y Pav en estado fresco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER…………………………..……………..………139
Anexo K. Datos cromatográficos del AE de Salvia sagittata en estado seco del análisis por Inyección Líquida……………………………………………………...140
Anexo L. Resultado de composición de AE de la Salvia sagittata Ruiz y Pav en estado seco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER…………………………..…………...….……..141
XIX
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo de investigación “Composición química por cromatografía a gases y actividad antibacteriana del aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz &
Pav. frente a la Escherichia coli y Staphylococcus aureus”, permite el estudio de hierbas aromáticas que poseen principios activos, componentes químicas con diversas acciones biológicas, que sería el origen de las propiedades beneficiosas, siendo muchas plantas que no han sido investigadas, como el caso de la salvia que es usada por la población rural, con un gran valor medicinal. Así como determinar la actividad antimicrobiana frente a bacterias causantes del deterioro de los alimentos como el Staphylococcus aureus y Escherichia coli, relacionados a las enfermedades alimentarias.
Los AE son manejados en las diversas industrias como: En la industria fitosanitaria como repelente y controlador de plagas, con ello se elaboran herbicidas, insecticidas, fungicidas, nematicidas, acaricidas, desodorizantes y desinfectantes, en la industria alimentaria como conservante de alimentos, como un conservante orgánico y no dañino para la salud, en la industria cosmética en la elaboración de perfumes, por su agradable aroma y su función de purificar el aire y abrir las vías respiratorias, en la industria farmacéutica en la elaboración antisépticos bucales, cremas antinflamatorias, antibacterianas y antiespasmódicas principalmente (Angulo F., Montañez K., Salcedo O. 2012;
Martínez, 2003).
XX
La aplicación de los AE es muy amplia, pero se busca enfocarse en este estudio a la resistencia antibiótica en bacterias. Por lo que se debe realizar investigaciones en “actividad antibacteriana” para resolver un problema que hoy en día va creciendo de forma alarmante como menciona García (2012) en su artículo científico “Resistencia antibiótica en el Perú y América Latina” que nos dice que la resistencia antibiótica en las bacterianas más importantes ha comenzado a incrementarse, evolucionando, resistiendo y multiplicándose en cepas más difíciles de tratar, así también la organización mundial de la salud
(OMS) informo recientemente a diversos medios de comunicación que nos encontramos en la era pos-antibióticos; es decir, que los antibióticos tal como los conocemos están siendo rebasados por la resistencia desarrollada de bacterias y microbios.
Hoy en día la población está en busca de opciones de conservación, porque existen reportes de intoxicaciones relacionados a conservantes químicos. El objetivo de la investigación fue evaluar la influencia de los AE de salvia en fresco y seco en la composición química, características fisicoquímicas y actividad antimicrobiana. La capacidad de adaptación que presentan estas bacterias patógenas que son difíciles de eliminar o disminuir en los alimentos, por lo que la industria hace usanza de productos químicos para inhibir su crecimiento, que son promotores de infecciones e intoxicaciones. El uso de los AE es una opción natural por sus diversos componentes que presenta.
XXI
La investigación se dividió en 4 etapas: en la primera etapa se realizó la recolección de materia prima (Salvia sagittata) y se efectuó su clasificación taxonómica, en la segunda etapa se realizó la extracción del AE por método de arrastre a vapor en estado fresco y seco, en la tercera etapa se determinó los componentes químicos por el método de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas y los análisis fisicoquímicos con la ayuda de los manuales de normas técnicas peruanas de la Instituto Nacional de Calidad
(INACAL) y en la cuarta etapa se determinó la actividad antimicrobiana, el método
Kirby Bauer es la formación de halos de inhibición frente al Staphylococcus aureus ATCC 25923 y Escherichia coli ATCC 25922 y prueba de análisis del
(MIC), concentración mínima inhibitoria.
Teniendo como Hipótesis: El estado fresco y seco de la planta producen efectos similares en composición química por cromatografía a gases, características fisicoquímicas y actividad antibacteriana frente a Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus Aureus ATCC 25923 del AE de salvia obtenida por arrastre de vapor.
La investigación se realizó mediante el método científico, de alcance explicativo y tipo aplicada, se utilizó Diseño experimental completamente al azar (DCA) para el rendimiento y los análisis fisicoquímicos, y para las pruebas de actividad antibacteriana se utilizó el diseño Completamente Aleatorizado (DBCA).
XXII
El contenido de la presente investigación está estructurado en los siguientes capítulos:
Capítulo I, el planteamiento del problema, formulación, objetivos, justificación e importancia y delimitaciones de investigación.
Capítulo II, antecedentes, teorías básicas, desarrollo de variables, hipótesis de investigación y operacionalización de variables.
Capítulo III, se establece el tipo, nivel, métodos, diseño, población y muestra; así como técnicas, instrumentos y procedimientos de recolección de información o datos.
Capítulo IV, se considera resultados y las respectivas discusiones y conclusiones, recomendaciones, referencias Bibliográficas y anexos.
Esta investigación permitió determinar la calidad de los AE de Salvia, buscando conservantes naturales que permitan eliminar o disminuir bacterias patógenas e incrementar el tiempo de vida útil de los productos y sustituyendo conservantes artificiales relacionados a las intoxicaciones alimentarias.
XXIII
CAPÍTULO I
PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO
1.1. Determinación del problema
Nuestro país presenta una megadiversidad de plantas medicinales,
precursores de la etnofarmacología y la medicina tradicional, desde la
época del incanato hasta hoy en día. Los componentes químicos de los
vegetales son considerados fármacos, descubiertos a partir de su uso en la
medicina tradicional. Por ello se puede localizar nuevos agentes activos en
las plantas naturales y medicinales (Guerrero y Núñez, 1991).
Se destaca que el AE en todo el mundo, en las industrias, solo se usa una
fracción de este líquido volátil, que proporciona el aroma a las plantas, casi
siempre tienen la característica de un olor agradable. Estudios mencionan
que las actividades biológicas son: insecticidas, propiedades antioxidantes,
actividad antimicrobiana y farmacéuticos, es una industria en un gran
proceso de crecimiento. Se debe fomentar y ampliar de estas plantas que
24
han pasado desapercibidas, que mayormente solo usadas por
comunidades en medicina tradicional (Albado et al., 2001).
Una inquietud de la agroindustria debe ser de suministrar alimentos que
contengan propiedades benéficas para los consumidores, primordialmente
en la adición de componentes naturales de uso antimicrobiano. por ello
siempre debe de estar en la búsqueda de la utilización de las plantas con
acciones antimicrobianas, para tener seguridad y calidad en los alimentos
(Stella y Marin, 2009).
La provincia de Tarma, tiene plantas medicinales de gran diversidad, que
se ignoran sus aplicaciones en el tratamiento de enfermedades, como es la
planta Salvia, usada frecuentemente en el alivio de las vías respiratorias y
digestivas así también para dolencias musculares, y su crecimiento se
puede dar en los diferentes pisos ecológicos de la sierra, siendo resistente
a la sequía y al frio, pero no tan extremos. Por todo lo mencionado en la
presente investigación se buscó determinar los componentes químicos por
cromatografía a gases, características fisicoquímicas y efecto
antibacteriano frente a la Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923, con la determinación del porcentaje de inhibición y la
concentración mínima inhibitoria (MIC) de los compuestos, ya que se
desconoce su actividad antibacteriana.
1.2. Formulación del problema
25
¿Cuáles son los efectos del estado fresco y seco de la planta en la
composición química, características fisicoquímicas y actividad
antibacteriana frente a la Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923 del aceite esencial de salvia obtenida por arrastre de
vapor?
1.3. Objetivo de la investigación
1.3.1. Objetivo general
Evaluar los efectos del estado fresco y seco de la planta en la
composición química, características fisicoquímicas y actividad
antibacteriana frente a la Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923 del aceite esencial de salvia
obtenida por arrastre de vapor.
1.3.2. Objetivos específicos
• Determinar clasificación taxonómica y características
fisicoquímicas de la salvia.
• Determinar el rendimiento de la extracción por arrastre de vapor
del aceite esencial de salvia en fresco y seco
• Determinar la composición química y características
fisicoquímicas del aceite esencial de la salvia en estado fresco y
seco.
26
• Determinar la actividad antibacteriana del aceite esencia de salvia
en estado fresco y seco frente Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923.
1.4. Justificación e importancia
La utilización de plantas principalmente es de uso medicinal, alimentario y
cosmético. Hoy en día es muy usado en la etnofarmacológia por poseer
compuestos de actividad biológica, que han logrado tener una gran
importancia, por sus múltiples usos. Los AE se encuentran en cada parte
de la planta: hojas, tallos y flores principalmente, su extracción es fácil por
los métodos existentes (Vásquez et al., 2001).
Se sabe que se ha incrementado publicaciones de productos naturales de
fuente de compuestos bioactivos y actividad antimicrobiana, esto se debe
por el interés de la persona por productos libres de microorganismos y
benéficos para la salud (Stella y Marin, 2009).
Las autoridades normativas, sanitarias, industriales y educativas del control
de las enfermedades deberían de tener un monitoreo más riguroso en la
búsqueda de contaminantes en los alimentos ya que existen diferentes
vectores de contaminación directa e indirectamente de persona a alimento
y viceversa. Y así mejorar la inocuidad de los alimentos que se consumen
(Guerrero y Núñez, 1991).
27
La ciudad de Tarma posee diversas plantas de uso tradicional y sus AE
tienen principios bioactivos. Se conocen 3000 tipos de AE de los cuales 300
son comercializados, en la industria alimentaria como conservante porque
poseen propiedades antimicrobianas, antiviral y antifúngica y saborizante
principalmente por sus antioxidantes, y también son utilizadas en la industria
farmacéutica y cosmética. Actualmente es muy requerido los AE, como
ingredientes naturales (Valverde, 2011).
Este estudio permitió conocer sobre la planta aromática Salvia, que
contienen aceite esencial, sus principales componentes químicos y
fisicoquímicos, así como su actividad antibacteriana que podría ser utilizado
como conservante natural frente a microorganismos que son muy
frecuentes en la naturaleza que es la Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923 principales bacterias causantes de
enfermedades por el consumo de vegetales regados con aguas no tratadas,
permitiendo dar alternativas de conservación de alimentos inocuos y
contribuyendo a la salud del consumidor y su bienestar.
1.5. Delimitaciones de la investigación
1.5.1. Espacial
Se utilizo la Salvia del centro poblado de Hierba buena, distrito de
Huasahuasi de la provincia de Tarma. El diseño experimental se
realizó en los laboratorios de la carrera de Ingeniería Agroindustrial y
28
los laboratorios de Ingeniería en Industria Alimentarias en Huancayo,
clasificación taxonómica de realizó en el museo nacional de recursos
naturales de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos y los
análisis de cromatografía de gases acoplado a espectrometría de
masas en el laboratorio de análisis de LABICER de la Universidad
Nacional de Ingeniería.
1.5.2. Cuantitativa
Se utilizo 40 kg de Salvia que se separó en partes iguales para
realizar su extracción de AE en estado fresco y en estado seco de la
materia prima.
1.5.3. Temporal
La ejecución del proyecto duro 12 meses desde octubre de 2018 al
mes de octubre de 2019.
29
CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
2.1. Antecedentes de la investigación
A nivel Internacional
Córdova et al. (2016), en su estudio sobre la actividad antimicrobiana del
extracto de Salvia apiana en microorganismos de clase clínica, evaluaron el
efecto antimicrobiano, del extracto disuelto en hexano proveniente de la
planta, los extractos se prepararon a diferentes diluciones: 27; 13,5; 6,8 y
3,4 mg/mL, inhibieron el desarrollo de S. aureus, Strep. pyogenes, E.
faecalis y Candida albicans. No presentaron efecto en la E. coli y Candida
tropicalis, al confrontarse con los valores del vehículo en las estimaciones
de difusión en pozo. Los resultados fueron que la Salvia tiene un efecto
antimicrobiano significativo sobre patógenos de interés clínico para su
posible empleo en las generaciones futuras como agente terapéutico.
30
Miladys et al. (2016), determinó la composición y la actividad antibacteriana del aceite esencial de la muña, siendo su análisis en las bacterias: S. aureus, S. epidermidis y E. coli. Evaluando la sensibilidad antibacteriana y la concentración mínima inhibitoria. Los microorganismos fueron sensibles al aceite esencial de muña. El aceite tuvo un mayor contenido de monoterpenos oxigenados con identificada actividad antibacteriana, como el timol y carvacrol. Es prometedor su control bacteriano de este vegetal.
Cui H, et al. (2015), en su investigación “Actividad antimicrobiana y mecanismos del aceite esencial de Salvia sclarea”, se obtuvo resultados que existe una acción antimicrobiana frente a microorganismos como:
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Klebsiella pneumonia y Salmonella typhi murium en una concentración mínima (MIC) de 0,05 y 0,1% de bactericida en todos los patógenos, el estudio demuestra satisfactoriamente que el aceite esencial de la planta de estudio tiene una acción antibacteriana más eficaz frente a la bacteria gram positivo
Staphylococcus aureus y la bacteria gram negativa Escherichia coli siendo su acción de forma inmediata destruyendo sus membrana celular de ambas bacterias.
Ordaz et al. (2011), en su estudio de la composición de AE de las hojas de plantas recolectadas en Sucre (Venezuela), demuestra que los AE son biosintetizados y se obtiene de diversas partes de la planta. Los aceites esenciales de Piper tuberculatum, Scoparia dulcis, Solanum subinerme, y
31
Helicteres guazumifolia, obtenidas por arrastre de vapor, siendo sus rendimientos: 0,032%; 0,016%, 0,005% y 0,004%, respectivamente. Para la identificación de componente se utilizó el método de cromatografía a gases, encontrándose en cantidades superiores metabolitos no volátiles de estructura no terpenoidal en H. guazumifolia (30,28%), sesquiterpenoides oxigenados en P. tuberculatum (52,19%), sesquiterpenos en S. dulcis
(26,09%) y diterpenos en S. subinerme (39,67%). El diisooctilftalato fue el componente frecuente en los aceites de todas las plantas y los compuestos volátiles neofitadieno, hexadecanoato de metilo, β-ionona, trans-pinano, L- linalool, isofitol, trans-fitol, y dibutilftalato, fueron encontrados en las esencias.
Gonzales (2009), estudio el beneficio de Salvia officinalis y Euphrasia officinalis, el rendimiento del AE fue 21-34 kg/ha aumentado con el paso del tiempo y es mayor si se recoleta en la temporada de primavera. Las hojas de salvia tienen acción antifúngica y antibacteriana, por los compuestos mentol timol y b-D-glucósidos de tuyol, compuestos diterpenicos que principalmente son amargas.
Gonzales (2009), en su estudio “Interés farmacéutico de la Salvia Officinalis y de la Eupharasia officinalis” describió algunas particularidades de la planta
Salvia para poder obtener más cantidad de aceite esencial algunas de ellas es que la planta florece en mayo-julio, y sus frutos maduran en agosto, la hoja se efectúa a finales de mayo o junio (medio corte); para obtener la
32
máxima eficacia (periodo balsámico) en mayo-julio. El momento idóneo de recolección es inmediatamente después de la caída de la corola. En su segundo año, estas plantas son más ricas en aceites y dan cosechas más abundantes. Las plantas recolectadas en la tarde contienen menos AE que las recolectadas en la mañana.
Ortega et al. (2002) en su artículo científico “Salvia fitoquímica, farmacología y terapéutica” menciona que la Salvia officinalis tiene una actividad farmacología, antimicrobiana, antifúngica, hipoglucémica, y antiinflamatoria por su gran contenido de terpenos, teniendo una actividad antimicrobiana frente a Escherichia coli, Shigella sonnei y Salmonella principalmente, así también tiene una acción antifúngica. También menciona que esta especie contiene un 0,8 a 2,5% de aceite esencial teniendo como principales compuestos químicos: α-tuyona (18-43%), β-tuyona (3-8,5%), Alcanfor (4,5-
24,5), entre otros.
A nivel Nacional
Mendoza y Monsalve (2017), en su investigación sobre el Efecto antimicótico in vitro del AE de las hojas de Salvia sagittata en cepas de
Sporothrix Schenckii, comprobó que el AE de las hojas posee actividad antimicótica frente a la forma levaduriforme de Sporothrix schenckii y comparando el efecto antimicótico del aceite esencial a través del método de difusión de discos, se obtuvo que en las concentraciones de 100%, 50% y 25%, existe una inhibición de crecimiento de Sporothrix schenckii,
33
también se comprobó el efecto antimicótico en todas las concentraciones
(5,10, 20, 40, 80 µg/mL) del AE de la Salvia sobre el microorganismo por el método de dilución en agar. Se concluyó que el AE de la salvia tiene actividad antimicótica in vitro frente a la forma levaduriforme de Sporothrix schenckii.
Alzamora et al. (2014), en la investigación de la Medicina tradicional en
Perú: Actividad antimicrobiana in vitro de los AE extraídos de plantas aromáticas, en la metodología empleó método de discos y método de arrastre de vapor y las bacterias usadas fueron el Staphylococcus aureus
INS, S. aureus ATCC 6538P. La salvia puede usarse en tratamiento de trastornos respiratorios producidos por bacterias mencionadas. Su propiedad de difusión está afectada por la temperatura, sugiere que el AE de salvia se considere a 45 °C.
Pumaylle et al. (2012), en su investigación “Extracción, caracterización y evaluación de la actividad antibacteriana del aceite esencial de Senecio graveolens Wedd (Wiskataya)” menciona que la actividad antimicrobiana presentada por los AE se debe principalmente a la presencia de terpenoides, seguido por terpenoides que contienen grupos alcoholes, luego los que poseen grupos aldehídos y por último los que contienen grupos cetónicos, también se probó que el alto porcentaje de compuestos monoterpénicos poseen significativas propiedades antimicrobianas.
También menciona que el rendimiento de AE de algunas plantas tales como
34
la muña 0,19% p/p, Ruyaq muña 2,4% v/p; Orégano 1,30% v/p; Eucalipto
3% v/p y Salvia 0,80% v/p.
2.2. Teorías básicas
2.2.1. Salvia
A la planta Salvia comúnmente se le da el uso de jardinería por ser
muy aromática. Pertenece al orden Lamiales, familia Lamiaceae y
subfamilia. Es de origen mediterráneo. De tallos tetrágonos, hojas
simples, opuestas y decusadas carentes de estípulas y flores en
inflorescencias bracteadas, siendo las hojas de planta las que
V producen más contenido de 1,5% /m. (Ortega et al., 2002).
2.2.2. Clasificación taxonómica
Tabla 1. Clasificación taxonómica de la Salvia
Características Descripción División Tracheophyta Clase Magnoliopsida Orden Lamiales Familia Lamiaceae Género Salvia Epíteto especifico Sagittata Nombre científico Salvia Sagittata Ruiz & Pav. Categoría científica Vulnerable (VU) Autor del epíteto especifico Ruiz & Pav. Fuente: Ortega et al. (2002).
35
2.2.3. Características morfológicas
La Salvia varia su tamaño, pude medir hasta 70cm según el clima,
posee hojas contrapuestas, son lanceoladas, pubescentes, de color
gris verdoso con la superficie verdosa, sus flores son zigomorfas y
pentámeras de color azul-violáceo (Ortega et al., 2002).
2.2.4. Propiedades
Antioxidante, astringente, carminativa, cicatrizante, colorética,
desinfectante, diurética, espasmolítica, hemostática,
hipoglucemiante, digestiva, antiséptica, antiespasmódica,
estimulante uterino, estimulante circulatorio, sedante, disipa calor,
antitranspirante, cicatrizante, astringente (Martínez, 2003).
2.2.5. Aspectos tecno funcionales de aceites esenciales
Los aceites esenciales son componentes químicos contenidos en los
vegetales, presentan un olor aromático, líquidos volátiles. Existiendo
interés por los siguientes componentes: Estrógenos, ácidos fenoles,
ácido rosmarínico; flavonoides (1-3%): 5-metoxi salvigenina y demás
flavonas, la mayoría metoxiladas en 6; triterpenos: sobre todo
derivados carboxílicos de la serie del oleanano; diterpenos. Los
principales componentes son cetonas monoterpénicasbicíclicas, las
a- y ß-tuyonas (35-60%, predominando claramente la α-tuyona, salvo
36
raras excepciones). El AE contiene, además, componentes
mayoritarios de alcanfor (10-40%, a veces menos), cineol, borneol
(libre y esterificado). Los demás componentes identificados, se
encuentran una decena de hidrocarburos mono- y sesquiterpénicos:
pineno, canfeno, sabineno, limoneno, etc. Las proporciones de sus
componentes químicos pueden variar en función de algunos criterios:
origen geográfico, época y frecuencia de la recolección Martínez,
(2003).
2.2.6. Composición química de los aceites esenciales
Los componentes principales de los AE son: Según Burt, (2004) los
componentes químicos principales son Hidrocarburos: Mirceno,
cinemo, pinemo, canfeno, felandreno, bineno, limoneno, cariofileno,
geranioleno; en los Alcoholes son: Isoamìlico, geraniol, linalol,
citronelol, nerodinol, farsenol, Terpinol: Mentol, Bencílico, Feniletìlico;
en los Fenoles: Timol Carvacrol, Eugenol; en los Aldehídos son:
Citral, citronetal, anisaldehìdo, benzaldehído, cinamadehìdo; en las
Cetonas son : Alcanfor, carvona, mentona, piperitona, acetato
fenona; y en los Esteres son: salicilato de amilo, benzoato de metilo,
acetato de terpinilo, acetato de geranilo.
Por otra parte, Mendoza y Monsalve (2017), mencionan que el AE
está compuesto por un 35-60% de tuyona (“alfa” y “beta” tuyona,
37
segunsu origen geográfico), un 20% o más de otros monoterpenos
(1,8-cineol, alcanfor, pineno, timol y carvacrol), sesquiterpenos
(humuleno, cariofileno y viridifloral),.diterpenos (carnosol, rosmanol,
epirrosmanol, ácido carnósico, b – D- glucósidos de tuyol y mentol) y
triterpenos derivados del ursano y oleanano
Según Amani et al. (2007), en el “Boletín latinoamericano y del caribe
de plantas medicinales y aromáticas” obtuvieron resultados que los
principales componentes químicos de la salvia que se lograron
identificar son 75 compuestos los cuales representan el 95,3% del
aceite esencial.
Los principales constituyentes fueron: alpha-eudesmol (21,8%),
trans-caryophyllene (10,8%), bornyl acetate (9,7%), germacrene B
(4,8%), y delta-cadinene (4,0%). El aceite está compuesto por un
27% de monoterpenos y 69% de sesquiterpenos oxigenados de los
cuales el 37,7% corresponde a alcoholes sesquiterpénicos.
2.2.7. Bacterias Patógenas
2.2.7.1. Escherichia coli
Es una bacteria que se encuentra comúnmente en el sistema
digestivo de los seres humanos y animales de sangre
caliente. Fue el investigador alemán Theodor Escherich
38
quien describió y aisló por primera vez este microorganismo encontrado en las heces de niños (Mossel & Moreno, 1990).
La característica de esta bacteria es que posee una pared celular delgada de peptidoglucano, que imposibilita que el reactivo de tinción, sea retenido en el interior de la célula clasificándola como gram negativa; es un bacilo, aerobia y aerobia facultativa, también posee fimbrias y pilis que les valen para desplazarse (García, 2000).
Figura 1. Vista microscópica de Escherichia coli
Scheutz, (2005) refiere que su clasificación taxonómica para
Escherichia coli es:
DOMINIO: Bacteria
FILO: Proteobacteria
CLASE: Gammaproteobacteria
ORDEN: Enterobacteriales
39
FAMILIA: Enterobacteriaceae
GÉNERO: Escherichia
ESPECIE: Escherichia coli
Hábitat: Se encuentra comúnmente en la microflora del intestino del hombre y de animales de sangre caliente.
Romeu, (2012)
Incidencia en alimentos: Esta bacteria es uno de los principales contaminantes de alimentos por el mal uso o la falta de conocimiento en el momento de procesamiento de alimentos como el uso de aguas no tratadas en el riego o su mala manipulación, provocando fuertes problemas gastrointestinales, principalmente en ancianos y niños Fena,
(1996). García, (2000).
Características de crecimiento y supervivencia de
Escherichia coli: la temperatura mínima que soportan es de
8°C donde sus células no se reproducen y empiezan a morir, la temperatura adecuada de crecimiento y su máxima va
39°C a 48°C siendo los últimos grados perjudiciales para ellos. Romeu, (2012) pH: Mejor crecimiento en un pH 7, y un ph de 7.6 para un mejor metabolismo.
40
2.2.7.2. Staphylococcus aureus
El Staphylococcus aureus es una especie bacteriana
grampositiva, de un diámetro de 0.8 a 1.0 micrometros, que
se dividen en más de un plano, son inmóviles y carecen de
esporas, reconocido en 1878 por Koch y cultivadas en 1880
por Pasteur, son bacterias en forma de grano que se agrupan
en racimos y pertenece a la familia micrococacea (Pascual &
Calderón, 2000).
El Staphylococcus aureus genera un gran peligro en la salud
de las personas por los cuadros clínicos que provocan las
toxinas que estas sintetizan, esta bacteria es resistente a una
gran variedad de componentes antimicrobianos, por la gran
facilidad que tiene para adaptarse y evolucionar a estos
medios (Romero, 2007 y Shittu et al., 2006).
Figura 2. Vista microscópica de Staphylococcus aureus
41
Cervantes et al. (2014), refiere la siguiente clasificación taxonómica para Staphylococcus aureus.
DOMINIO: Bacteria
FILO: Firmicutes
CLASE: Bacili
FAMILIA: Staphylococcaceae
GÉNERO: Staphylococcus
ESPECIE: Staphylococcus aureus
Habitad: Se encuentra en varios medios como en el aire, agua, maquinarias y superficies de la industria alimentaria según menciona Romero, (2007), también dice que se puede encontrar en la piel, cabello, fosas nasales, yema de los dedos, garganta y tracto intestinal.
Incidencia en los alimentos: Se encuentra principalmente en productos relacionados con la panadería (productos con rellenos), carnes cocidas como jamón, mariscos y otros platos preparados, tiene una alta probabilidad de hallarse en productos guardados por un periodo largo antes de su consumo.
Características de crecimiento y supervivencia: la temperatura adecuada para su crecimiento va de 35°C y 40
42
ºC, y las temperaturas limites que soporta son de 7 y 48 ºC
según menciona (ICMSF, 1998). Staphylococcus aureus
tiene la capacidad de resistencia en alimentos con elevado
contenido de grasa y en alimentos secos que aún se hallan
pasteurizado.
pH: El mejor pH para su crecimiento es de 7 a 7,5 pero esta
bacteria puede crecer en pH de valores 4,5 y 9,7 (ICMSF,
1998),
Refrigeración: La bacteria sobrevive en los alimentos a
temperaturas menores de -20 °C y son resistentes a la
descongelación (ICMSF, 1998).
2.3. Extracción de aceite esencial
2.3.1. Destilación por arrastre de vapor
Existen métodos de extracción de AE en función a la planta,
permitiendo conseguir los compuestos que sintetizan. Tenemos el de
arrastre de vapor, que consiste en disponer de la planta, de bajo
contenido de agua, pues si se coloca fresca podría contener
mucílagos que oscurezca el AE, en la evaporación del agua se deja
correr para que se pueden juntar el vapor con la planta, el tejido
vegetal se rompe y libera el aceite volatil, que luego se combina y
pasa a estado gaseoso, se condensa en el serpentin, acumulandose
43
agua en el recolector y por decantacion se separa el hidrosol, y obtener el AE (Paredes y Quinatoa, 2010, p. 60).
A) Fundamento:
Por efecto de temperatura del vapor (100 ºC) en un tiempo
determinado, el tejido de la planta se rompe liberando el aceite
esencial, el cual presenta a estas condiciones una presión de
vapor: (Paredes y Quinatoa, 2010, p. 60)
Figura 3. Diagrama de planta
Fuente: Paredes & Quinatoa (2010)
44
B) Flujograma de extracción por arrastre de vapor de aceites
esenciales Recepción del material vegetal
Pretratamiento de la materia prima
Deshidratado de material vegetal
Reducción de la planta
Extracción por arrastre con vapor
Condensación
Extracción del aceite
Envasado y almacenamiento
Figura 4. Flujograma de la extracción por arrastre de vapor de
aceites esenciales.
Fuente: Paredes y Quinatoa (2010)
2.3.2. Extracción con disolvente
El proceso de extracción de aceite esencial por disolventes con
lleva a riesgo de explosión e incendio característicos de muchos
solventes orgánicos y también tiene otras características
negativas como obtener una esencia impura por el uso de
solventes como alcohol, cloroformo entre otros. Estos solventes
solubilizan la esencia asimismo extraen otras sustancias como
45
ceras. Se maneja a escala de laboratorio pues a nivel industrial
resulta caro por el precio comercial de los solventes Martínez,
(2003).
2.3.3. Extracción por fluidos supercríticos
Este proceso con lleva una gran ventaja el cual es la obtención de
una esencia puro y por el otro lado que al ser un proceso reciente
con lleva a mayores gastos económicos y un proceso más
complejo que otros procesos de extracción según menciona
Martínez et. al. (2001), El proceso comienza con el
acondicionamiento del material vegetal picado en pequeños
trozos, licuado o molido, se empaca en una cámara de acero
inoxidable y se hace circular a través de la muestra un líquido
supercrítico, bióxido de carbono líquido, comúnmente. Las
esencias son así solubilizadas y arrastradas obteniendo una
esencia pura y un residuo separado, de líquido supercrítico que se
elimina por descompresión progresiva hasta alcanzar la presión y
temperatura ambiente.
2.4. Determinación de componentes de aceites esenciales
2.4.1. Las separaciones cromatográficas
La cromatografía en columna, técnica que permite separar varios
compuestos de los vegetales, como clorofilas y xantofilas, pasando
46
disoluciones de compuestos a través de una columna de vidrio
rellena de carbonato de calcio finamente dividido. Las especies que
se separan aparecen como bandas coloreadas en la columna
(Chromo que significa “color “y graphein significa “escribir “. Skoog,
Holler y Nieman, (2001, p. 730).
2.4.2. Clasificación
En la tabla 2, se muestra los métodos cromatográficos.
47
Tabla 2. Clasificación de los métodos cromatográficos en columna
Clasificación Método Fase estacionaria Tipo de equilibrio general especifico Cromatografia de Líquido-líquido, o Líquido absorbido Distribución entre líquidos (LC) (fase reparto. sobre un sólido. líquidos inmiscibles. móvil: líquida) Líquido. Fase Variedades Distribución entre única orgánicas líquido y la superficie químicamente. enlazadas a una enlazada superficie sólida. Líquido –sólido, o Sólido Adsorción adsorción. Intercambio Resina de Intercambio iónico iónico. intercambio iónico. Sustracción de Líquido en los Distribución/exclusión tamaño. intersticios de un sólido polimérico. Cromatografía de Gas- líquido Líquido absorbido Distribución entre gas gases (GC) (fase sobre un sólido. y líquido. móvil: gas) Gas – fase única Especies Distribución entre el químicamente. orgánicas líquido y la superficie acopladas a una enlazada. superficie sólida. Gas- sólido. Sólido Adsorción Cromatografía de Especies Distribución entre el fluidos supercríticos orgánicas influido supercrítico y (SFC) (Fase móvil: enlazadas a una la superficie enlazada. fluido supercrítico) superficie sólida.
Fuente: Skoog, Holler y Nieman (2001, p. 730)
48
2.4.2.1. Cromatografía de gases
El principio es que la muestra se debe volatilizar e inyectar
en la parte superior de una columna cromatografía. La
elución es causada por el movimiento de la fase móvil del
gas. La fase móvil no interacciona con las moléculas de
analito; su función es sólo transportar el analito a través de
la columna. Los dos tipos de cromatografía de gases son:
Cromatografía gas–sólidos (GSC) y la cromatografía gas–
líquida (GLC). La cromatografía gas-líquido de gran
aplicación en el campo de la ciencia y su denominación se
abrevia como cromatografía de gases (GC). La
cromatografía gas-sólidos, se produce la retención de
analitos en una fase estacionaria sólida como consecuencia
de la absorción física. La cromatografía gas-sólido, de
aplicación limitada por la retención semipermanente de
moléculas activas o polares y a la obtención de picos de
elución con colas muy significativas, se usa para
separaciones de especies gaseosas de bajo peso molecular.
Mientras que la cromatografía gas-líquido es la repartición
del analito en una fase móvil gaseosa y una fase líquida
inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte (Skoog et
al., 2001, p. 759).
49
2.4.2.2. Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas
Esta técnica es muy utilizada para poder hallar compuestos
orgánicos volátiles y semivolátiles de aceites esenciales, con
datos cualitativos y cuantitativos, es de un análisis rápido y
confiable. Ofrece una mejor identificación verídica de los
compuestos analizadas en función de su patrón de
fragmentación, el cual es identificada comparado con
información del sistema base de datos, su proceso de
identificación de compuestos simplificada consta de un
separador de fase gaseosa (móvil) y una liquida o solida
(estacionaria). Pérez, (2005).
A) Descripción de la técnica
Fase móvil: Denominada también como fase móvil gaseosa
es de bajo costo y controlada por medio de válvulas de aguja
de medidores de presión y flujo, en esta fase no interactúa
con la fase estacionaria ni con la muestra, utiliza gases como
el helio, nitrógeno y argón, esto dependiendo del tipo de
detector que se va a utilizar Sharapin, (2000)
Sistemas de inyección: Realizada con micro jeringas
contenidas de muestra, a una temperatura que permita la
50
volatilización de muestra, además el volumen inyectado debe
ser pequeño sin superar el volumen de la columna, con la
finalidad de obtener una mejor eficiencia y reproductibilidad
del análisis. (Sharapin, 2000)
Columnas: Contiene una fase estacionaria, para la
elaboración de la columna se utiliza el cobre, acero, aluminio,
vidrio y teflón según la muestra a utilizar (Sharapin, 2000)
Sistema de detectores: Su clasificación está dada por 2
tipos la universal que mide la variación de una propiedad del
gas obtenido por arrastre y el sistema específico que mide
una propiedad característica de una determinada sustancia.
Se tiene que tener en cuenta a los detectores sensibles de
flujo de masa donde la velocidad de flujo hace variar poco el
resultado (Sharapin, 2000).
2.5. Actividad antibacteriana de aceites esenciales
Los alimentos de origen animal como origen vegetal tienen sustancias
antimicrobianas. Los aceites esenciales con una alta actividad
antimicrobiana son aquellos en que la proporción de compuestos fenólicos
es mayor, fuente importante de medicamentos contra enfermedades
causadas por microorganismos. Se va ampliando el interés de las
sustancias naturales de la industria, para el control de infecciones de origen
51
microbiano. Esto es interesante, debido a la resistencia que están
presentando los microorganismos a los antibióticos comunes, haciéndose
indispensable la búsqueda de nuevas sustancias que admitan neutralizar
los mecanismos de resistencia (Rodríguez, 2005).
2.6. Método de difusión de discos
Rodríguez (2005), indica que la acción antibacteriana de los aceites
esenciales frente a la bacteria Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923 se puede determinar por el método de
difusión de disco en medios específicos en placas Petri.
En este método emplea discos de papel absorbente, impregnados con
concentraciones conocidas del antimicrobiano. Estos discos se ponen en la
superficie de una placa de agar de Müeller-Hinton de 4 mm de espesor, en
la que se acaba de inocular una suspensión de cepa por analizar, con una
turbiedad equivalente al tubo 0,5 del nefelómetro de McFarland. El disco se
humedece, el antimicrobiano difunde radicalmente hacia afuera y crece una
gradiente de concentración por disco; el antimicrobiano está en alta
concentración cerca del disco y disminuye a medida que se aleja del disco.
El diámetro de anillo de inhibición dependerá de la sensibilidad o resistencia
del microorganismo analizado, así como también de la droga y la tasa de
difusión a través del agar.
52
Es importante controlar el medio de cultivo, su espesor, tiempo de
incubación y la concentración de bacterias inoculadas, entre otros. Si se
presentan zonas de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de los
discos, la medición de los diámetros de inhibición y su comparación con los
valores de los cuadros de referencia, permiten establecer si la cepa es
resistente, intermedia o susceptible a esa droga.
La concentración mínima inhibitoria (CMI), concentración mínima de la
sustancia química para inhibir el crecimiento de microorganismos. Es el
estudio in vitro de crecimiento del microorganismo en presencia de la
concentración creciente de antimicrobianos (Flores, 2014).
2.7. Desarrollo de las variables
Variable Independiente
• Salvia en estado fresco y seco: Planta sometida a proceso de secado,
está en relación al contenido de agua en la planta. Siendo sus
indicadores planta en estado fresco y seco.
Variables dependientes
• Composición química del aceite esencial
Mide los componentes propios (metabolitos secundarios) del AE.
Siendo sus indicadores: Terpenos volátiles, aldehídos, cetonas,
esteres, entre otros.
53
• Características fisicoquímicas del aceite esencial
Mide las propiedades fisicoquímicas del AE. Sus indicadores son el pH,
índice de refracción y índice acidez.
• Actividad antibacteriana del aceite esencial
Sustancia química del AE que inhibe el crecimiento y desarrollo de
microorganismos, como bacterias. Sus indicadores Escherichia coli
ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.
2.8. Hipótesis de investigación
2.8.1. Hipótesis general
El estado fresco y seco de la planta produce efectos similares en la
composición química, características fisicoquímicas y actividad
antibacteriana frente a la Escherichia coli ATCC 25922 y
Staphylococcus aureus ATCC 25923 del AE de Salvia obtenida por
arrastre de vapor.
2.8.2. Hipótesis de trabajo (estadística)
Ho: No existe diferencia significativa en medias de la composición
química, características fisicoquímicas y actividad antibacteriana
frente a la E. coli y S. aureus del aceite esencial de salvia en estado
fresco y seco obtenida por arrastre de vapor.
54
Ho: u1 = u2
Ha: Si existe diferencia significativa en las medias de la composición química, características fisicoquímicas y actividad antibacteriana frente a la E. coli y S. aureus del AE de Salvia en estado fresco y seco obtenida por el método de arrastre de vapor.
Ha: u1 ≠ u2
55
2.9. Variables (operacionalización)
Tabla 3. Operalización de las variables de investigación.
FUENTE Y/O HIPÓTESIS VARIABLE DEFINICIÓN INDICADOR UNIDAD INSTRUMENTO
Variables Hipótesis General: independientes: Características de la planta: Contenido de - Salvia estado kilogramos Equipo de extracción por El estado fresco y seco Estado de la planta humedad de la salvia. fresco arrastre de vapor de la planta producen salvia - Salvia estado efectos similares en la seco composición química, características fisicoquímicas y Variable dependiente: Balance de materia del AE - Rendimiento % Formula actividad Rendimiento de la salvia antibacteriana frente a la Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus aureus Propiedades - Humedad % Potenciómetro ATCC 25923 del AE de Variable dependiente: fisicoquímicas del AE de - pH pH Equipos de titulación salvia obtenida por Características salvia - %Acidez % Refractómetro ABBE arrastre de vapor. fisicoquímicas - Índice de % refracción
Metabolitos del AE de Terpenos % Equipo de cromatografía salvia: Terpenos volátiles, Mono terpenos Variable dependiente: aldehídos, cetonas, Aldehídos Composición química esteres, etc. Cetonas Esteres
Variable dependiente: Sustancia química del AE, % de inhibición % Difusión de disco Actividad Antibacteriana tiene la capacidad de CMI (Concentración mg/ml inhibir el crecimiento y mínima inhibitoria) desarrollo de bacterias. E. Coli y S. aureus
56
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA DE INVESTIGACIÓN
3.1. Tipo de investigación
La investigación es tipo aplicada, que consiste en la manipulación de la
variable, en condiciones controladas, describiendo la causa que se produce,
midiendo el grado de relación existente entre dos o más variables
(Rodríguez y Valldeoriola, 2010).
3.2. Nivel de investigación
La investigación es de alcance explicativo. Descriptivo, porque requiere del
conocimiento del tema que se quiere investigar. Explicativo, porque busca
explicar los efectos de los estados de la planta salvia en la composición,
fisicoquímica y actividad antimicrobiana de su aceite esencial (Rodríguez y
Valldeoriola, 2010).
57
3.3. Métodos de investigación
El método científico, permitió evaluar los efectos estado fresco y seco de
salvia en la composición, características fisicoquímicas y actividad
antibacteriana de AE, también se aplicó el método experimental, que
intervienen sobre el objeto de estudio modificando directa o indirectamente,
conociendo sus características y relaciones esenciales (Rodríguez y
Valldeoriola, 2010).
3.4. Diseño de investigación
Se empleo el diseño experimental, debido a que las variables serán
manipuladas (Rodríguez y Valldeoriola, 2010).
3.4.1. Características fisicoquímicas y composición química del aceite
esencial
Se uso el Diseño Completamente al Azar (DCA), con 2 tratamientos
y 3 repeticiones haciendo 6 observaciones. Se efectúo las pruebas
de comparación de medias de Tukey, si resulta significativa. El
modelo aditivo lineal es: (Padrón, 2003)
Salvia
Salvia en estado fresco Salvia en estado seco
Aceite esencial de la salvia en fresco y seco
Figura 5. Esquema propuesto del diseño experimental.
58
El diseño experimental se usó para obtener los resultados como: El
rendimiento, la composición química y el análisis fisicoquímico
En la Tabla 4, se muestra el diseño experimental en características y
composición química del aceite esencial de salvia.
Tabla 4. Esquematización del diseño experimental de las
características y composición química del aceite esencial.
Aceite esencial T1 T2
r1 A1 A1
r2 A2 A2
r3 A3 A3
Donde:
Tratamiento 1: AE de la Salvia en estado fresco Tratamiento 2: AE de la Salvia en estado seco A1, A2, y A3: % Rendimiento, datos de las características fisicoquímicos y composición química.
3.4.2. Actividad antibacteriana del aceite esencial de la salvia
Se uso el arreglo factorial de 2x4x2 conducido con un diseño
completamente aleatorizado (DBCA), para determinar el mejor
tratamiento (Padrón, 2003).
El modelo aditivo lineal es:
Fuente: Padrón (2003)
59
Salvia
Salvia en estado Salvia desecada fresco
Aceite esencial Aceite esencial
C C C C C C C C 2 3 4 1 2 3 4 1
E. S. E. S. E. S. E. S. E. S. E. S. E. S. E. S. c a c a c a c a c a c a c a c a
Figura 6. Esquema propuesto del diseño experimental para la actividad
antibacteriana.
El diseño experimental se usó para obtener los resultados como: El
porcentaje de inhibición de crecimiento de microorganismos
(Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus áureos ATCC
25923), y para el análisis de la prueba de concentración mínima
inhibitoria (MIC).
60
En la Tabla 5, se muestra el esquema para el diseño de la actividad antibacteriana.
Tabla 5. Esquematización del arreglo factorial de 4x2 con un DCA, aplicado a la investigación
Tratamientos
EP(1) = Fresco EP (2) = Desecada Repetici C1 C2 C3 C4 C1 C2 C3 C4 ones E.c. S.a. E.c. S.a E.c. S.a E.c. S.a E.c. S.a E.c S.a. E.c. S.a E.c. S.a.
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T2 T13 T14 T15 T16
R1 A1111 A1121 A1211 A1221 A1311 A1321 A1411 A1421 A2111 A2121 A2211 A2221 A2311 A2321 A2411 A2421
R2 A1112 A1122 A1212 A1222 A1312 A1322 A1412 A1422 A2112 A2122 A2212 A2222 A2312 A2322 A2412 A2422
Donde: C1, C2, C3, C4: Concentración del aceite esencial E. c.: Escherichia coli ATCC 25922 S.a.: Staphylococcus aureus ATCC 25923
T1, T2, T3, T4, …, T15, T16: Tratamiento del aceite esencial
R1, R2: Repeticiones
61
3.5. Población y muestra
La población fue la salvia recolectada del centro poblado de Hierba Buena
del distrito de Huasahuasi de la provincia de Tarma. La muestra fue 60 kg
de Salvia, del que se obtendrá el aceite esencial, al que se le realizo las
características físicas de la planta en estado vegetativo.
3.6. Técnicas, instrumentos y procedimientos de recolección de
información o datos
3.6.1. Recolección e Identificación taxonómica de la materia prima
La materia prima se recolecto, primeras horas de la mañana en el
centro poblado Hierba Buena, distrito de Huasahuasi. Se realizo la
clasificación taxonómica mediante el Sistema de clasificación de
Cronquist (1998).
3.6.2. Extracción del aceite esencial
El método utilizado para la extracción del aceite esencial fue el de
arreste por flujo de vapor, se utilizó dos tipos de materia (seca y
fresca), para lo cual se hiso secar una cantidad equivalente al peso
de la materia fresca utilizando las hojas, tallos y flores de la planta, el
procedimiento fue comenzando con la colocación en el contenedor
de 20 kg, que se derramó agua para la generación de vapor. Luego
la mezcla de vapor de agua y AE se condujo por un serpentín para
62
su condensación, por diferencia de densidades se extrajo el AE
(Valverde, 2011).
Materia prima Especie vegetal salvia
Recolección: Manual Recolección Estado vegetativo: Antes de floración
Empaque: Costales con, mallas Transporte para la aireación Temperatura: Ambiente
Selección Inspección visual: Partículas Extrañas pardeamiento, insectos
Temperatura: Estado fresco/Deshidratado Salvia en estado fresco Salvia en estado seco
Humedad material: Tejido en estado Acondicionamiento fresco o deshidratado Carga material vegetal: 20 kg
Tiempo: 10 horas Extracción Fluido de arrastre: Vapor de agua-temperatura de autoclave
Descarga Aceite esencial
Figura 7. Flujograma general de la obtención de aceites esenciales de la salvia en estado fresco y desecada.
Fuente: Valverde (2011)
63
3.6.3. Análisis fisicoquímico
a. Índice de acidez: Norma técnica- NTP 319.085, 1974.
b. Índice de refracción: Método recomendado por la NTP-ISO 280,
2011.
c. El análisis de pH y humedad se realizarán con métodos de la
empresa AMTEX (CK-G03 y CK-G04 respectivamente para cada
análisis).
d. Rendimiento: Para la determinación del rendimiento se empleó la
siguiente fórmula (Valverde, 2011):
푃2 푅푒푑𝑖푚𝑖푒푛푡표 % = 푃1
Dónde:
P2 = Peso del AE (g)
P1 = Peso seco de la muestra (g)
3.6.4. Análisis de cromatografía
Según Bilal Gurbuza,et. al. Rosemary (Rosmarinus officinalis L.)
cultivation studies under Ankara ecological conditions. Industrial Crops
and Products 88 (2016) 12–16. Se realizo por cromatografía de gases
acoplada a espectrometría de masas, consistió en inyectar un volumen
de 1,0 uL de muestra diluido en n-hexano, se usó Helio como
transportador a flujo constante 1,2 ml/min. La caracterización de
64
componentes se llevó a cabo comparando sus índices de retención
(Kovats índices-IK) y su espectro de masa con datos publicados en
literatura y con espectro de masa de librería de la computadora. Se
realizó este análisis en los laboratorios de LABICER de la UNI.
3.6.5. Evaluación de la actividad antibacteriana
Se determinó: Porcentaje de inhibición y concentración mínima
inhibitoria a diferentes diluciones del AE de salvia en estado fresco y
seco, frente a dos bacterias utilizadas, se explica como sigue:
3.6.5.1. Cepas de bacterias
Las cepas de bacterias fueron de cultivos de American Type
Culture Collection (ATCC) en E. coli ATCC 25922 y S. aureus
ATCC 25923 como indicadores de contaminación de heces
fecales e incumplimiento de higiene.
3.6.5.2. Actividad antibacteriana
3.6.5.2.1. Método Kirby Bauer
Entre los diferentes métodos que existen para poder obtener
la actividad antibacteriana Rodríguez (2005) menciona que
el método de difusión de disco en medios específicos en
placas Petri es el mejor para las bacterias patógenas E. Coli
ATCC 25922 y S. Aureus ATCC 25923.
65
Seleccionar las colonias: Se utilizó los microorganismos;
S. aureus ATCC 25923 y E. coli ATCC 25922. Las bacterias utilizadas fueron replicadas en agar Tripticasa Soya a 37°C de 20 a 24 h. antes del análisis.
Preparación y estandarización de suspensión del inóculo: Se realizo en tubos de ensayos con 5 ml de agua destilada, fueron llevados a la autoclave a 121 °C por 15 minutos. Se estandarizo ajustando el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland, comparando la turbidez de las suspensiones en el papel prueba de escala de McFarland.
Preparación de la placa: El trabajo se llevó acabo en la cabina de flujo laminar que asegura un ambiente libre de contaminación, el medio de cultivo utilizado fue el agar
Mueller Hinton que previamente se preparó con las indicaciones del proveedor. Una vez en la cabina con los materiales dispuesto se procedió a verter en placas petri de vidrio estériles, en una cantidad 20ml por placa. Teniendo en cuenta que en cada placa se tenga una profundidad de 4mm agar Mueller Hinton homogénea en todas, se dejó solidificar, se rotuló con la fecha y sus respectivos nombres, y con la
66
concentración de aceite esencial que se trabajó (100%, 75%,
50% y 25%).
Inoculado de placas: Una vez obtenida los tubos estandarizados a 0,5 de turbidez en la escala de McFarland se procedió a hisopar las placas Petri teniendo en cuenta un procedimiento meticuloso al momento de hisopar, retirando el exceso de líquido del hisopo presionándolo contra la pared del tubo para evitar el exceso de material patógeno. Para seguridad que el inóculo sea distribuido de manera uniforme se realizó una hisopada en tres direcciones de la superficie de la placa, de extremo a extremo ocupando toda el área de la placa sin dejar bordes descubiertos.
Colocar discos con aceite esencial: Se realizo con discos en blanco estéril, los cuales se sumergieron en AE a una temperatura ambiente, para que el disco tenga la oportunidad de empaparse bien se les dio un tiempo de 30 min. Se colocaron los discos en las ubicaciones rotuladas asegurándose la unión a la superficie del agar para no tener problemas al momento de incubar.
Para el control negativo: Se manejó discos con antibiótico, los discos se encontraban a temperatura de ambiente.
67
Para el control positivo: Se consideró la placa con AMH y
el inóculo de la bacteria.
Incubar la placa: Se realizo en un tiempo de 20 a 24 h. a
una temperatura de 37°C, cubiertas con papel Kraft y
volteadas.
Medición de zonas de inhibición: Para tal fin se utilizó el
instrumento vernier digital en las unidades de medida de
milímetro.
Interpretaciones los datos: Se realizo la prueba de Tukey
para saber si existe diferencia significativa entre las medias
de los promedios de halos de inhibición.
Porcentaje de inhibición: Para la obtención del porcentaje
de inhibición de los AE, se trabajó con la siguiente fórmula
para obtener el efecto de inhibición de cada aceite con
respecto al halo generado por el antibiótico (Martínez et al.,
1997):
퐻푎푙표 푑푒 𝑖푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖표푛 푑푒푙 푎푐푒𝑖푡푒 푒푠푒푛푐𝑖푎푙 % 푑푒 𝑖푛ℎ𝑖푏𝑖푐𝑖표푛 = 푥 100% Halo de inhibicion del control (−)
3.6.5.2.2. Método de determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC).
68
Para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC), se utilizó la maquina espectrofotómetro de turbidez que consta de
96 pozos de microplacas, contado con 8 filas y 12 columnas se preparó de tal manera que la concentración menor estuviese en la columna 1 y ascendiendo hasta el 8 con la
última concentración, las columna 9 fue utilizada como control
(positivo) y la columna 10 como control (negativo), una vez agregados en cada microplaca las concentraciones, fueron mezcladas con los medios de cultivo, y luego se determina la concentración mínima inhibitoria a una longitud de onda de
450 nm. (Ramírez y Marin, 2009)
Preparación y estandarización de suspensión del inóculo:
Se ajusto el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de McFarland, cotejando la turbidez de las suspensiones con la ayuda del papel de comparador de escala de McFarland.
Se dispuso 9,9 ml de caldo de Mueller Hinton, a este se le adiciono 0,1 ml del inoculo 0,5 de McFarland preparado cuidadosamente de anterioridad.
69
Preparación de la solución de antibiótico: Se elaboraron en frascos estériles diluciones rotulados desde C1 hasta C8
(concentración) de AE en caldo Mueller Hinton.
Preparación de las diluciones: Se preparo en 8 frascos rotulados con las diferentes concentraciones, en el primer frasco se agregó 3 ml de AE (fresco o seco) con 3 mL de caldo
Mueller Hinton, se homogenizo con la ayuda del vortex por un corto periodo y luego se retiró 3 mL de la mezcla que llevo al segundo frasco, se realizó el mismo procedimiento en todos los frascos.
Preparación de las policubetas: con asistencia de la micropipeta se agrega 50 µl de las diluciones preparadas en los frascos a las policubetas, anticipadamente agitado con la ayuda del vortex para tener una mezcla homogénea.
Siembra en las policubetas: A todas las policubetas contenedoras de AE con las diluciones se les agrega 50 µl del inoculo. También, se consideró los controles para la siembra:
Pocillo de control positivo: contiene 50 µl de caldo Mueller
Hinton y 50 µl de inoculo preparado.
70
Pocillos de control negativo: contiene 100 microlitros de
caldo Mueller Hinton.
Incubación: Una vez terminado la siembra se programa el
espectrofotómetro de turbidez a una temperatura de 37 °C,
agitación antes de cada lectura 5 s, longitud de onda 450 nm
y lectura cada hora (total 25 lecturas).
3.7. Técnicas de procesamiento de información o datos
Se efectuó un análisis de varianza para establecer el mejor
tratamiento en la composición química y características del aceite
esencial. Si existiera diferencias significativas entre las medias, se
empleará la prueba de comparaciones de medias de Tukey al 5% de
significancia. También, se efectuará el arreglo factorial de 4x2x2
conducido diseño completamente aleatorizado, con la finalidad de
determinar el mejor tratamiento, respecto a la actividad
antibacteriana. Se hará uso del Software Minitab 18 y hojas de
cálculo Microsoft Excel 2018.
71
CAPITULO IV
RESULTADOS DE LA INVESTIGACIÓN
4.1. Evaluación de la planta Salvia sagittata
4.1.1. Clasificación Taxonómica de la planta Salvia Sagittata
Se realizó la clasificación taxonómica de la salvia en el área del
Herbario San Marcos, del museo de Historia Natural, de la
Universidad Nacional Mayor de San Marcos (2018), se muestra los
resultados en la Tabla 6.
Tabla 6. Clasificación taxonómica de planta Salvia sagittata
Características Descripción División Tracheophyta Clase Magnoliopsida Orden Lamiales Familia Lamiaceae Genero Salvia
72
Epíteto especifico Sagittata Nombre científico Salvia Sagittata Ruiz &
Pav. Categoría científica Vulnerable (VU) Autor del epíteto especifico Ruiz & Pav.
4.1.2. Características fisicoquímicas de Salvia sagittata
La Salvia fue evaluado con respecto a sus características
fisicoquímicas, se muestra en la tabla 7.
Tabla 7. Características fisicoquímicas de la Salvia
Características
Altura 60-90 cm aprox.
Color de hojas Verde Física Color de flores Azul
Tamaño de las hojas 10-15 cm aprox.
pH 6,3 a 6,5 Químicas Humedad 70-74%
4.2. Evaluación del aceite esencial de Salvia sagittata
4.2.1. Características fisicoquímicas
En la tabla 8, se muestran los resultados de los análisis
fisicoquímicos del AE de Salvia sagittata en estado fresco y en el
estado seco.
73
Tabla 8. Características fisicoquímicas del aceite esencial de Salvia
Aceite esencial Estado fresco Estado seco
Rendimiento 0,0251 ± 0,005 0,0299 ± 0,0012
Índice de refracción (20 ºC) 1,460 ± 0,0075 1,491 ± 0,0072
pH 6,533 ± 0,0577 6,333 ± 0,0577
Índice de acidez (mg de KOH/1 g 0,072 ± 0,004 0,081 ± 0,003
Se efectuó el análisis de varianza (ANOVA) de las propiedades fisicoquímicas, en cuanto al rendimiento para comprobar la existencia de diferencia significativa entre los tratamientos, que se muestra en la Tabla 9.
Tabla 9. Análisis de varianza (ANOVA) del rendimiento del aceite
esencial de salvia.
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Tratamientos 1 0.000118 0.000118 8.60 0.043
Error 4 0.000055 0.000014
Total 5 0.000173
En la tabla 9, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al rendimiento de AE de
74
la salvia. Para demostrar los resultados se realizó la prueba de Tukey
para su comparación.
Tabla 10. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores del Rendimiento
Tratamiento N Media Agrupación
2 3 0,02871 A
1 3 0,01983 B
En la tabla 10 se demuestra que los dos tratamientos en fresco y
seco son estadísticamente diferentes.
0.035 0.03 B Rendimiento 0.025 0.02 A
0.015 0.02871
Rendimiento 0.01 0.01983 0.005 0 Aceite esencial fresco Aceite esencial seco Tratamiento
Figura 8. Comparación de medias de la prueba Tukey del rendimiento
Se efectuó el análisis de varianza (ANOVA) de las propiedades
fisicoquímicas, en el índice de refracción para comprobar la
75
existencia de diferencia significativa entre los tratamientos, que se muestra en la tabla 11.
Tabla 11. Análisis de varianza (ANOVA) del índice de refracción del
aceite esencial de Salvia.
Valor Valor Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. F p
Tratamiento 1 0,001442 0,001442 26,45 0,007
Error 4 0,000218 0,000055
Total 5 0,001660
En la tabla 11, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al índice de refracción del
AE de la salvia. Al hallarse diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de Tukey para su comparación.
En la Tabla 12 se demuestra que los dos tratamientos en fresco y seco son estadísticamente diferentes.
76
Tabla 12. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores del índice de refracción.
Tratamiento N Media Agrupación
2 3 1,49100 A
1 3 1,46000 B
1.495 A 1.49 1.485 Indice de 1.48 refracción 1.475 1.47 1.49 1.465 B
Indice de refracciónIndicede 1.46 1.455 1.46 1.45 1.445 Aceite esencial fresco Aceite esencial seco Tratamiento
Figura 9. Comparación de medias de la prueba Tukey del índice de
refracción.
Se efectuó el análisis de varianza (ANOVA) de las propiedades fisicoquímicas, en cuanto al índice de acidez para comprobar la
77
existencia de diferencia significativa entre los tratamientos, que se muestra en la tabla 13.
Tabla 13. Análisis de varianza (ANOVA) del Índice de acidez del
aceite esencial de Salvia.
Valor Valor Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. F p
Tratamiento 1 0,000131 0,000131 8,81 0,041
Error 4 0,000059 0,000015
Total 5 0,000190
En la tabla 13, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa, referido al índice de refracción del AE de salvia. Se hallo diferencia significativa en los tratamientos, se realizó la prueba de Tukey para su comparación.
Tabla 14. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores del índice de acidez.
Tratamiento N Media Agrupación
2 3 0,08167 A
78
1 3 0,07233 B
En la Tabla 14 se demuestra que los dos tratamientos en fresco y seco son estadísticamente diferentes.
0.082 A 0.08
0.078
Indice de acidez 0.076
0.074 0.081 B Indice de acidezIndicede 0.072
0.07 0.072 0.068
0.066 Aceite esencial fresco Aceite esencial seco Tratamiento Figura 10. Comparación de medias de la prueba de Tukey del índice
de acidez.
Se efectuó el análisis de varianza (ANOVA) de las propiedades fisicoquímicas, en cuanto al índice de acidez para comprobar la existencia de diferencia significativa entre los tratamientos, que se muestra en la tabla 15.
79
Tabla 15. Análisis de varianza (ANOVA) del pH del aceite esencial
de Salvia.
Valor Valor Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. F p
Tratamiento 1 0,06000 0,060000 18,00 0,013
Error 4 0,01333 0,003333
Total 5 0,07333
En la tabla 15, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al índice de refracción del
AE de la salvia. Al hallarse diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de Tukey para su comparación.
Tabla 16. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores del pH.
Tratamiento N Media Agrupación
1 3 6,5333 A
2 3 6,3333 B
En la tabla 16 se demuestra que los dos tratamientos en fresco y seco son estadísticamente diferentes.
80
6.55
A 6.5
6.45 pH
6.4 pH 6.35 6.5 B 6.3
6.25 6.3
6.2 Aceite esencial fresco Aceite esencial seco Tratamiento
Figura 11. Comparación de medias de la prueba de Tukey del pH
4.2.2. Análisis químico por cromatografía a gases
El método para el análisis de la composición química de la planta
Salvia sagittata fue la de cromatografía de gases acoplada a
espectrometría de masas con el equipo cromatógrafo de gases.
Shimadzu, GC-2010 Plus en los laboratorios de LABICER de la
Facultad de Ciencia de la Universidad Nacional de Ingeniería que se
puede observar en el anexo I y J, a continuación, se muestra los
resultados de la prueba en la tabla 17 y 18.
81
Tabla 17. Componente químico principal del aceite esencial de
Salvia
Componente principal Aceite Análisis por inyección Análisis por inyección esencial Liquida de la muestra Liquida de la muestra fresca seca
Cariofileno Cariofileno
Salvia Sagittata
(Abundancia relativa (Abundancia relativa 54,10%) 59,53%)
Tabla 18. Comparaciones de algunos componentes químicos de
mayor porcentaje del aceite esencial de la Salvia.
Aceite esencial Aceite esencial Componentes químicos en fresco (%) en seco (%)
Alpha-terpinyl acetate 7,52 4,07
Caryophyllene 54, 10 59,53
Bieyclo [3.1.1]hept-2-ene, 8,11 0 2,6-dimethyl-6- (4-methyl- 3-pe)
Humulene 7,26 7,59
Alpha-Cubebene 3.53 4,07
82
Componentes químicos de mayor porcentaje del aceite esencial de la Salvia sagittata 70
60
50
40
30
20
10
0 Aceite esencial en fresco (%) Aceite esencial en seco (%) Alpha-terpinyl acetate
Caryophyllene
Bieyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4-methyl-3-pe)
Humulene
Alpha-Cubebene
Figura 12. Componentes químicos de mayor porcentaje del aceite esencial
de Salvia.
83
Figura 13. Cromatograma del AE de Salvia en fresco del análisis por Inyección Líquida. Universidad Nacional de
Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER.
84
Figura 14. Cromatograma del AE de Salvia sagittata en seco del análisis por Inyección Líquida. Universidad Nacional
de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER.
85
4.3. Evaluación de inhibición del crecimiento del aceite esencial de salvia.
4.3.1. Determinar la actividad antibacteriana del aceite esencia de
salvia frente Escherichia coli ATCC 25922 y Staphylococcus
aureus ATCC 25923
Los análisis se realizaron en cuatro porcentajes (25%, 50%, 75%,
100%) de pureza del AE de Salvia, demostrándose que existió
inhibición de crecimiento, se muestra en la tabla 19 y 20.
Tabla 19. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones
del AE de Salvia frente a la cepa bacteriana Escherichia
coli ATCC 25922
Concentra Escherichia Coli ción de % de Muestra Placa Placa Placa aceite Promedio Inhibici N°1 N°2 N°3 esencial ón
100% 8,46 8,44 8,34 8,41 27,25 75% 7,68 7,40 7,64 7,57 24,52
50% 0 0 0 0 0
ESTADO FRESCO SALVIAEN 25% 0 0 0 0 0
100% 9,24 8,44 7,58 8,42 27,27
75% 7,02 6,84 6,98 6,94 22,48
SECO 50% 0 0 0 0 0 ESTADO
SALVIAEN 25% 0 0 0 0 0
) ci
ug 100% 30,87 30,87 30,87 30,87
Ampi
lina
Control (
Fuente: Datos recogidos de los análisis realizados en el laboratorio
86
En la tabla 19 se muestra los resultados obtenidos para los promedios de los halos de inhibición de la bacteria Escherichia coli
ATCC 25922. El porcentaje más alto de inhibición fue de 27,27% a una concertación del 100% del AE de Salvia en estado seco. Para la comprobación estadística se efectuó el análisis de varianza
(ANOVA), en cuanto al tamaño del halo de inhibición para comprobar la existencia de diferencia significativa entre los tratamientos, que se muestra en la tabla 19.
Tabla 20. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de
inhibición del aceite esencial de la Salvia en estado fresco
frente a Escherichia coli ATCC 25922.
MC Fuente GL SC Ajust. Valor F Valor p Ajust.
Tratamiento 3 1,92739 0,642462 9494,51 0,000
Error 8 0,00054 0,000068
Total 11 1,92793
En la tabla 20, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al tamaño del halo de inhibición del AE de la Salvia sagittata en estado fresco frente a E.
87
coli ATCC 25922. Se hallo diferencia significativa en los tratamientos realizándose la prueba de Tukey para su comparación.
Tabla 21. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de
Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli ATCC 25922.
Concentración N Media Agrupación del aceite esencial 100 3 8,4133 A 75 3 7,5733 B 50 3 0,0000 C 25 3 0,0000 C
En la tabla 21 se demuestra que los cuatro tratamientos en fresco son estadísticamente diferentes
9 A 8 B A 8.41 7 7.57 B 6 25 5 50 4 75 3 100
Halo de inhibicióndeHalo 2 1 C C 0C 0 C 0 25 50Tratamiento75 100 Figura 15. Comparación de las medias la prueba de Tukey para los
valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial
de Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli
ATCC 25923. 88
Tabla 22. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de
inhibición del aceite esencial de Salvia en estado seco
frente a Escherichia coli ATCC 25922.
MC Fuente GL SC Ajust. Valor F Valor p Ajust.
Tratamiento 3 1,80357 0,601190 344,46 0,000
Error 8 0,01396 0,001745
Total 11 1,81753
En la tabla 22, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al tamaño del halo de inhibición del AE de Salvia en estado seco frente a E. coli ATCC
25922. Al hallarse diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de Tukey para su comparación.
Tabla 23. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial
de Salvia en estado seco frente a Escherichia coli ATCC
25922.
concentración N Media Agrupación del aceite esencial 100 3 8,420 A 75 3 6,9467 B
89
50 3 0,000000 C 25 3 0,000000 C
En la tabla 23 se demuestra que los cuatro tratamientos en seco son
estadísticamente diferentes.
9 A 8 7 B 6 5 25 50 4 8.42 6.94 75 3 Halo de inhibición de Halo 100 2 C C 1 0 0 0 25 50 75 100 Tratamiento Figura 16. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño
del halo de inhibición del aceite esencial de Salvia en
estado seco frente a Escherichia coli ATCC 25922.
Tabla 24. Comparación del mejor tratamiento de inhibición de AE
Fresco y seco frente a E. coli.
concentración % de inhibición Media ± Desviación del aceite estándar esencial R1 R2 R3 100 27.40 27.34 27.01 27.25 ± 0.21 100 29.93 27.34 24.55 27.27 ± 2.69
90
Tabla 25. Análisis de varianza (ANOVA) de % de inhibición de
Escherichia coli ATCC 25922
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Tratamiento 1 0.0008 0.00082 0.00 0.989
Error 4 14.5671 3.64177
Total 5 14.5679
En la tabla 25, se percibe que le valor de p valor es mayos a 0.05,
debido a esto se acepta la hipótesis nula, afirmando que no existe
diferencia significativa con respecto a los valores de % de inhibición
en E. coli ATCC 25922.
Tabla 26. Porcentaje de inhibición de las diferentes concentraciones
del AE de Salvia frente a la cepa bacteriana Staphylococcus
aureus ATCC 25923.
Concentr Staphylococcus aureus ación de Muestra Placa Placa Placa % de aceite Promedio
esencial N°1 N°2 N°3 Inhibición
100% 8,46 8,42 8,38 8,42 59,67
75% 6,42 6,02 6,20 6,21 44,01
50% 0 0 0 0 0 SALVIAEN
ESTADO FRESCO 25% 0 0 0 0 0
91
100% 10,24 10,10 10,18 10,17 72,09
75% 5,88 5,72 5,78 5,79 41,03
50% 3,04 3,00 2,94 2,99 21,19 SALVIAEN
ESTADO SECO 25% 0 0 0 0 0
)
ug 100% 14.11 14.11 14.11 14.11
Control (Oxacilina Fuente: Datos recogidos de los análisis realizados en el laboratorio
En la tabla 26 se observan los resultados obtenidos para los
promedios de los halos de inhibición de la bacteria Staphylococcus
aureus. El porcentaje más alto de inhibición fue de 72,09% a una
concertación del 100% del AE de Salvia sagittata en estado seco.
Para la comprobación estadística se efectuó el análisis de varianza
(ANOVA), en cuanto al tamaño del halo de inhibición para comprobar
la existencia de diferencia significativa entre tratamientos, que se
evidencia en la tabla 27.
Tabla 27. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de
inhibición del aceite esencial de salvia en estado fresco
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
MC Fuente GL SC Ajust. Valor F Valor p Ajust.
92
Tratamiento 5364,3 3 1,67905 0,559683 0,000 7
Error 8 0,00083 0,000104
Total 11 1,67988
En la tabla 27, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa con lo que respecta al tamaño del halo de inhibición del AE de Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus. Al hallarse diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de Tukey para su comparación.
Tabla 28. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial
de Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus
ATCC 25923.
Concentración del aceite N Media Agrupación esencial
100 3 8,4200 A
75 3 6,213 B
50 3 0,000000 C
25 3 0,000000 C
93
En la tabla 28 se demuestra que los cuatro tratamientos en fresco son estadísticamente diferentes.
9 A 8 7 B 6 5 25 50 4 8.42 75 3 6.21
Halo de inhibición de Halo 100 2 1 0 0 0 C C 25 50 75 100 Tratamiento Figura 17. Comparación de medias de Tukey para los valores
tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de
salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus.
Tabla 29. Análisis de varianza (ANOVA) del tamaño del halo de
inhibición del aceite esencial de Salvia en estado seco
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923.
MC Fuente GL SC Ajust. Valor F Valor p Ajust.
Tratamiento 3 1,68447 0,561491 16042,5 0,000 9
Error 8 0,00028 0,000035
94
Total 11 1,68475
En la tabla 29, se observa que el p valor es ˂ 0,05, por lo que se rechaza la hipótesis nula y se acepta la hipótesis alterna que existe diferencia significativa, en el tamaño del halo de inhibición del aceite esencial de Salvia en estado seco frente a S. aureus. Al hallarse diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de
Tukey para su comparación.
Tabla 24. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
valores tamaño del halo de inhibición del aceite esencial
de Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus
ATCC 25923.
Concentración del aceite N Media Agrupación esencial
100 3 10,1733 A
75 3 5,7933 B
50 3 2,9933 C
25 3 0,000000 D
95
En la tabla 30 se demuestra que los cuatro tratamientos en seco son estadísticamente diferentes.
12 A 10 10.17
8 25 6 B 50 5.79A 75 4 100 Halo de inhibicióndeHalo C 2.99 2 B D 0 0 25 50 75 100 Tratamiento Figura 18. Comparación de medias de Tukey para los valores tamaño
del halo de inhibición del aceite esencial de salvia en
estado seco frente a Staphylococcus aureus.
Tabla 31. Comparación del mejor tratamiento de inhibición de AE
Fresco y seco frente a S. aureus.
concentración % de inhibición Media ± Desviación del aceite estándar esencial R1 R2 R3 100 59.96 59.67 59.39 59.67 ± 0.28 100 72.57 71.58 72.14 72.09 ± 0.49
96
Tabla 32. Análisis de varianza (ANOVA) del % de inhibición de
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p
Tratamiento 1 231.509 231.509 1413.08 0.000
Error 4 0.655 0.164
Total 5 232.164
En la tabla 32, se percibe que el p valor es menor a 0.05, debido a esto se acepta la hipótesis alterna, afirmando que existe diferencia significativa con respecto a los valores de halos de inhibición en aceite esencial en estado fresco y seco, al afirmar que existe diferencia significativa en los tratamientos se realizó la prueba de comparación de medias Tukey.
Tabla 33. Prueba de comparación de medias de Tukey para los
mejores tratamientos de inhibición de Staphylococcus
aureus ATCC 25923
Concentración N Media Agrupación del aceite esencial
100% seco 3 72.097 A
100% fresco 3 59.673 B
97
4.3.2. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de
Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli ATCC 25922
Tabla 34. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de
AE de Salvia en estado fresco frente a Escherichia coli
ATCC 25922.
Tiempo %AE y [] concentración de aceite esencial (mg/ml) control 0,78 1,56 3,13 6,25 12,5 25 50 100 horas 0,37 0,74 1,48 2,96 5,93 11,86 23,72 47,45 positivo negativo 0 0,041 0,041 0,044 0,043 0,046 0,052 0,066 0,116 0,041 0,041 1 0,04 0,041 0,044 0,043 0,047 0,052 0,067 0,116 0,041 0,041 2 0,04 0,041 0,044 0,044 0,047 0,052 0,067 0,117 0,043 0,041 3 0,045 0,046 0,047 0,045 0,047 0,052 0,068 0,117 0,059 0,041 4 0,085 0,109 0,077 0,051 0,047 0,053 0,071 0,177 0,119 0,04 5 0,116 0,123 0,113 0,112 0,048 0,054 0,072 0,178 0,159 0,04 6 0,147 0,17 0,143 0,131 0,049 0,054 0,074 0,178 0,237 0,04 7 0,235 0,243 0,216 0,17 0,053 0,055 0,075 0,179 0,29 0,04 8 0,375 0,396 0,347 0,226 0,067 0,056 0,076 0,179 0,343 0,04 9 0,466 0,512 0,524 0,299 0,098 0,056 0,078 0,179 0,378 0,04 10 0,528 0,568 0,566 0,35 0,135 0,057 0,079 0,18 0,439 0,039 11 0,597 0,632 0,588 0,409 0,156 0,057 0,081 0,18 0,525 0,039 12 0,7 0,761 0,639 0,494 0,178 0,058 0,082 0,18 0,631 0,039 13 0,738 0,846 0,751 0,525 0,217 0,059 0,084 0,182 0,689 0,039 14 0,747 0,754 0,876 0,59 0,247 0,06 0,085 0,182 0,756 0,039 15 0,78 0,829 0,935 0,728 0,28 0,06 0,087 0,183 0,767 0,038 16 0,805 0,878 0,958 0,832 0,308 0,061 0,088 0,183 0,85 0,038 17 0,901 0,991 0,825 0,939 0,315 0,064 0,094 0,183 0,86 0,038 18 1,004 1,014 0,918 0,962 0,342 0,065 0,093 0,183 0,871 0,038 19 1,023 1,03 0,956 0,965 0,381 0,068 0,093 0,184 0,951 0,037 20 1,02 1,054 0,99 0,967 0,414 0,069 0,094 0,184 0,966 0,037 21 1,013 1,077 1,029 0,975 0,48 0,071 0,095 0,184 0,938 0,036 22 1,012 1,1 1,061 0,994 0,513 0,074 0,097 0,185 0,909 0,036 23 1,018 1,116 1,082 1,016 0,541 0,075 0,099 0,185 0,881 0,035 24 1,027 1,127 1,097 1,032 0,605 0,08 0,1 0,186 0,831 0,035
Fuente: Resultados obtenidos en el laboratorio de la universidad
98
0.78 MIC= 50% de concentracion o 1.56 23,72 mg/ml 3.13
=620 6.25 λ 12.5 25 50 100
Absorbancia DO DO Absorbancia positivo(+) negativo(-)
0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (horas)
Figura 19. Curva de crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 frente AE de Salvia en estado fresco
Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de la universidad
99
4.3.3. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de
Salvia en estado seco frente a Escherichia coli ATCC 25922.
Tabla 255. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de
AE de Salvia en estado seco frente a Escherichia coli
ATCC 25922.
Tiempo %AE y [] concentración de aceite esencial (mg/mL) Control 0,78 1,56 3,13 6,25 12,5 25 50 100 Horas 0,36 0,73 1,47 2,94 5,88 11,77 23,55 47,10 Positivo Negativo 0 0,046 0,057 0,062 0,066 0,069 0,087 0,051 0,07 0,042 0,052 1 0,044 0,054 0,052 0,057 0,063 0,09 0,068 0,07 0,043 0,05
2 0,043 0,048 0,052 0,05 0,06 0,095 0,07 0,071 0,044 0,05 3 0,045 0,052 0,052 0,048 0,06 0,096 0,073 0,074 0,063 0,05 4 0,069 0,127 0,052 0,05 0,061 0,097 0,074 0,074 0,121 0,05 5 0,116 0,196 0,061 0,055 0,065 0,1 0,077 0,075 0,171 0,049
6 0,177 0,333 0,087 0,078 0,082 0,105 0,079 0,075 0,271 0,049 7 0,26 0,373 0,148 0,122 0,109 0,115 0,08 0,075 0,323 0,049 8 0,415 0,425 0,23 0,157 0,144 0,139 0,082 0,075 0,361 0,049
9 0,488 0,541 0,356 0,229 0,184 0,169 0,083 0,076 0,419 0,05 10 0,545 0,59 0,388 0,334 0,225 0,2 0,084 0,076 0,528 0,05 11 0,598 0,66 0,451 0,36 0,295 0,219 0,085 0,077 0,603 0,05 12 0,661 0,676 0,564 0,392 0,339 0,23 0,087 0,078 0,58 0,05
13 0,738 0,767 0,697 0,425 0,367 0,232 0,089 0,078 0,602 0,05 14 0,857 0,803 0,678 0,491 0,387 0,232 0,09 0,078 0,682 0,05 15 0,9 0,829 0,709 0,536 0,408 0,231 0,091 0,079 0,715 0,05 16 0,919 0,878 0,827 0,519 0,409 0,242 0,092 0,079 0,779 0,051 17 0,992 0,965 1,088 0,494 0,422 0,272 0,093 0,08 0,791 0,051 18 0,919 0,824 0,905 0,504 0,437 0,306 0,094 0,081 0,796 0,052 19 0,952 0,862 0,974 0,469 0,48 0,305 0,094 0,081 0,811 0,051
20 0,983 0,921 1,064 0,529 0,475 0,296 0,095 0,082 0,822 0,051 21 1,007 0,96 1,096 0,574 0,473 0,295 0,096 0,083 0,826 0,051 22 1,023 0,944 1,121 0,644 0,476 0,29 0,098 0,083 0,823 0,051 23 1,036 0,952 1,142 0,731 0,474 0,285 0,099 0,085 0,812 0,051 24 1,05 0,951 1,163 0,795 0,469 0,281 0,1 0,086 0,794 0,051 Fuente: Resultados obtenidos en el laboratorio de la univesidad
100
1.4
1.2
0.78 MIC= 50% de 1 concentración 1.56 o 23,55 mg/ml
3.13 =620
λ 0.8 6.25
12.5
0.6 25
50 Absorbancia Absorbancia DO 100 0.4 positivo(+)
negativo(-) 0.2
0 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (horas)
Figura 20. Curva de crecimiento de Escherichia coli ATCC 25922 frente al AE de Salvia en estado seco.
Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de la universidad
101
En la figura 19 se observa la comparación de la concentración mínima
inhibitoria del aceite esencial de Salvia para el crecimiento de la bacteria
gram negativo Escherichia coli ATCC 25922.
25 23,72 23,55
20
15
10
5
0 Fresco Seco Figura 21. Comparación de la Concentración mínima inhibitoria del AE de Salvia
en estado fresco y seco frente a Escherichia coli.
En las figuras 19 y 20 se puede observar que la Concentración Mínima
Inhibitoria del AE de Salvia en estado fresco es 23,72 mg/ml y el seco es
23,55 mg/ml para la bacteria Escherichia coli ATCC 25922.
102
4.3.4. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de
Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus aureus
Tabla 266. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de
AE de Salvia en estado fresco frente a Staphylococcus
aureus ATCC 25923.
Tiemp %AE y [] concentración de aceite esencial (mg/ml) o control 0,78 1,56 3,13 6,25 12,5 25 50 100 horas positiv negati 0,37 0,74 1,48 2,96 5,93 11,86 23,72 47,45 o vo 0 0,041 0,042 0,041 0,044 0,046 0,056 0,069 0,119 0,047 0,043 1 0,041 0,043 0,042 0,045 0,047 0,059 0,073 0,121 0,047 0,043 2 0,042 0,043 0,042 0,045 0,047 0,061 0,072 0,121 0,048 0,043 3 0,05 0,045 0,044 0,046 0,048 0,062 0,075 0,121 0,054 0,043 4 0,054 0,054 0,049 0,048 0,049 0,063 0,079 0,121 0,083 0,043 5 0,098 0,101 0,071 0,055 0,049 0,064 0,081 0,122 0,138 0,043 6 0,134 0,165 0,132 0,086 0,049 0,065 0,084 0,122 0,172 0,043 7 0,186 0,495 0,211 0,135 0,05 0,066 0,086 0,122 0,222 0,043 8 0,551 0,762 0,677 0,194 0,051 0,067 0,088 0,123 0,597 0,043 9 0,697 0,81 0,763 0,322 0,058 0,069 0,09 0,123 0,632 0,043 10 0,751 0,861 0,824 0,648 0,082 0,07 0,092 0,124 0,744 0,043 11 0,806 0,904 0,874 0,673 0,114 0,071 0,094 0,125 0,841 0,044 12 0,852 0,937 0,896 0,788 0,151 0,072 0,095 0,125 0,888 0,044 13 0,898 0,943 0,872 0,888 0,197 0,074 0,097 0,126 0,917 0,044 14 0,959 0,989 0,908 0,878 0,259 0,075 0,099 0,127 0,958 0,044 15 1,02 1,013 0,934 0,877 0,384 0,079 0,101 0,128 0,992 0,045 16 1,097 1,055 0,965 0,898 0,429 0,084 0,103 0,128 1,036 0,045 17 1,177 1,156 1,085 0,961 0,456 0,088 0,104 0,127 1,131 0,045 18 1,216 1,164 1,093 0,974 0,426 0,092 0,105 0,128 1,199 0,046 19 1,242 1,202 1,139 1,024 0,517 0,094 0,107 0,129 1,231 0,045 20 1,264 1,228 1,169 1,06 0,614 0,096 0,109 0,129 1,237 0,046 21 1,279 1,248 1,185 1,087 0,683 0,097 0,11 0,13 1,227 0,045 22 1,29 1,265 1,199 1,109 0,768 0,099 0,111 0,13 1,222 0,045 23 1,298 1,276 1,21 1,131 0,847 0,12 0,112 0,131 1,227 0,045 24 1,3 1,286 1,215 1,147 0,906 0,14 0,113 0,132 1,234 0.045
Fuente: Resultados obtenidos en el laboratorio de la univesidad
103
1.4
1.2 MIC= 50% de 0.78 concentracion o 1.56 23,72 mg/ml 1 3.13
6.25
=620 λ 0.8 12.5
25 0.6 50
Absorbancia Absorbancia DO 100 0.4 positivo
negativo 0.2
0 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (horas) Figura 22. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus frente AE de Salvia en estado fresco Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de la universidad
104
4.3.5. Concentración mínima inhibitoria (MIC) del aceite esencial de
Salvia en estado seco frente a Staphylococcus aureus ATCC
25923.
Tabla 277. Lectura de absorbancia a diferentes concentraciones de
AE de Salvia en estado seco frente a Staphylococcus
aureus.
Tiempo %AE y [] concentración de aceite esencial (mg/ml) Control 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25 50 100 Horas 0,36 0,73 1,47 2,94 5,88 11,77 23,55 47,10 Positivo Negativo 0 0.052 0.056 0.065 0.069 0.07 0.066 0.061 0.07 0.048 0.043 1 0.049 0.05 0.054 0.056 0.059 0.067 0.063 0.066 0.048 0.043 2 0.047 0.047 0.053 0.057 0.058 0.065 0.064 0.069 0.049 0.043 3 0.047 0.044 0.05 0.055 0.058 0.064 0.064 0.07 0.055 0.042 4 0.05 0.045 0.047 0.055 0.058 0.063 0.064 0.07 0.082 0.042 5 0.119 0.063 0.049 0.055 0.059 0.062 0.064 0.071 0.141 0.042 6 0.133 0.119 0.074 0.058 0.061 0.061 0.064 0.073 0.145 0.042 7 0.158 0.148 0.13 0.074 0.077 0.06 0.064 0.074 0.195 0.042 8 0.207 0.202 0.162 0.133 0.108 0.06 0.064 0.076 0.286 0.042 9 0.418 0.37 0.217 0.159 0.161 0.061 0.066 0.078 0.412 0.042 10 0.561 0.528 0.301 0.207 0.177 0.063 0.066 0.08 0.505 0.042 11 0.601 0.596 0.451 0.28 0.205 0.08 0.066 0.082 0.696 0.042 12 0.745 0.695 0.563 0.3 0.241 0.122 0.068 0.084 0.797 0.042 13 0.828 0.79 0.613 0.334 0.275 0.158 0.069 0.086 0.832 0.042 14 0.886 0.841 0.69 0.367 0.316 0.179 0.069 0.088 0.855 0.042 15 0.891 0.876 0.795 0.415 0.361 0.195 0.07 0.09 0.893 0.042 16 0.923 0.906 0.811 0.515 0.403 0.209 0.071 0.092 0.937 0.042 17 0.983 1.013 0.817 0.516 0.405 0.281 0.072 0.093 1.032 0.042 18 1.015 0.994 0.841 0.522 0.416 0.3 0.072 0.094 1.074 0.042 19 1.056 1.032 0.928 0.577 0.526 0.301 0.074 0.095 1.12 0.042 20 1.127 1.101 0.994 0.676 0.614 0.316 0.075 0.096 1.163 0.041 21 1.197 1.162 1.021 0.761 0.64 0.321 0.077 0.097 1.185 0.041 22 1.244 1.197 1.026 0.888 0.645 0.31 0.077 0.098 1.195 0.041 23 1.271 1.21 1.044 0.948 0.714 0.29 0.079 0.099 1.197 0.04 24 1.286 1.216 1.067 1.013 0.728 0.272 0.082 0.101 1.197 0.04
Fuente: Resultados obtenidos en el laboratorio de la univesidad.
105
1.4
0.78 1.2 MIC= 50% de 1.56 concentración o 3.13 1 23,55 mg/ml
6.25 =620
λ 12.5 0.8 25
50 0.6 100
Absorbancia Absorbancia DO Positivo 0.4 Negativo
0.2
0 0 5 10 15 20 25 30 Tiempo (horas)
Figura 23. Curva de crecimiento de Staphylococcus aureus frente AE de Salvia sagittata Ruiz & Pav. en estado seco.
Fuente: Datos obtenidos en el laboratorio de la universidad.
106
En la figura 19 se observa la comparación de la concentración mínima
inhibitoria del aceite esencial de Salvia para el crecimiento de la bacteria
gram positivo Staphylococcus aureus.
25 23,72 23,55
20
15
10
5
0 Fresco Seco
Figura 24. Comparación de la Concentración mínima inhibitoria del AE de la
Salvia en estado fresco y seco frente a Staphylococcus aureus.
En las figuras 22 y 23 se puede observar que la Concentración Mínima
Inhibitoria del AE de Salvia en estado fresco es de 23,72 mg/ml y del
seco es 23,55 mg/ml para el Staphylococcus aureus ATCC 25923.
107
4.4. DISCUSIONES DE RESULTADOS
4.4.1. Lugar de recolección de la materia prima
El lugar de trabajo de recolección, fue por las condiciones que
brindaba dicha ubicación, Hierba buena, distrito de Huasahuasi-
Tarma, según menciona Gonzales J. (2009) el clima óptimo para el
crecimiento de la planta, lugar templado con una exposición media
al sol y con agua fluctuante para evitar el empapado del terreno,
planta que resiste a las sequias, pero que no sean muy prolongadas
siendo una planta termófila y xerófila.
También algunos de los factores que influyen en el crecimiento de
la planta, según Angulo F. et al (2012), manifiesta que el tipo de
suelo, agua, exposición al sol, viento y prácticas agrícolas, son
principales factores que influyen en su calidad y cantidad de sus
principios activos.
4.4.2. Morfología de la planta
En cuanto a su morfología que se observa en la tabla 6. La planta
estudiada en el presente trabajo es similar a los resultados
obtenidos por Gonzales J. (2009), en su estudio “interés
farmacéutico de la Salvia officinalis y de la Euphrasia officinalis”,
que menciona que la especie puede alcanzar a medir hasta los 90
cm de altura y 60 cm de anchura, también presenta unas hojas
108
opuestas, lanceolado-vellosas, las inferiores pecioladas, las
superiores sésiles, de color verde y sus flores son de color azul o
violeta.
4.4.3. Características fisicoquímicas del aceite esencial de la Salvia
4.4.3.1. Rendimiento del aceite esencial de salvia
En la tabla 8, muestra la evaluación fisicoquímica del AE de
salvia en estado fresco y seco obtenido por el método de
arrastre de vapor. Se obtuvo un mejor resultado del AE en
estado seco que se demuestra con las evaluaciones
estadísticas que corroboran la existencia de diferencia entre
los tratamientos, siendo el T2 ( AE de salvia en estado seco)
con 0,0287% que presenta mayor valor de rendimiento que
el T1 ( AE de salvia es estado fresco ) con 0,0198%, todo se
muestra en el análisis de varianza de la tabla 9, la cual
reporta un p valor menor a 0.05 (p<0.05), así mismo el orden
se determinó mediante la prueba de comparación de medias
de Tukey de la tabla 10, estando ambos dentro las escalas
que algunos autores mencionan como Angulo F. et al (2012),
que señala que el contenido de AE de la mayoría de las
plantas aromáticas van de 0,01 a 10% pero siendo menor a
comparación de otras especie de salvia como Salvia
pomífera teniendo rendimiento superior al 4%, Salvia
109
vellerea y Salvia lavandulaefolia de un rendimiento de 0,7 a
2,7% según menciona Pérez G. (2005) citando a Marcos et
al. (1986).
La cantidad obtenida de aceite esencial es mayor en la
materia seca que el de la fresca, en una cantidad de 0,0048
ml. Esto se debería según dice Torres y León (2011) que al
tener un alto contenido de humedad los tricomas de la planta,
dificulta la liberación del aceite esencial, bajando el
rendimiento de la extracción la materia prima. El rendimiento
del aceite de salvia común cultivado en Alberta (Canadá)
durante las tres temporadas consecutivas varió de 0,25 a 1%
calculado sobre una base de peso seco (Embong, 1977).
4.4.3.2. Índice de refracción del aceite esencial de Salvia
En la tabla 8, muestra la evaluación fisicoquímica del AE de
salvia en estado fresco y seco, con respecto a su índice de
refracción se obtuvo un mejor resultado del AE en estado
seco que se demuestra con las evaluaciones estadísticas
que corroboran la existencia de diferencia entre los
tratamientos, siendo el T2 con 1,49 que presenta mayor valor
de índice de refracción que el tratamiento T1 con 1,46; se
muestra en el análisis de varianza de la tabla 11, la cual
110
reporta un p valor menor a 0.05 (p<0.05), así mismo el orden
se determinó mediante la prueba de comparación de medias
de Tukey de la tabla 12. El aceite esencial en estado seco es
mayor en 2,08% que el aceite esencial en estado fresco.
Autores como Mendoza P. & Pérez A. (2016), mencionan que
el índice de refracción es el cociente de la luz en el vacío y la
velocidad de luz al atravesar la sustancia que viene
relacionado con el grado de pureza, que entre mayor
contenido de compuestos químicos mayor índice de
refracción.
El valor obtenido fue similar al reportado por Pitarević et al.
(1984), con 1.4629-1.4668 a 20 ºC.
4.4.3.3. pH del del aceite esencial de Salvia
En la tabla 8, muestra la evaluación fisicoquímica del aceite
esencial de salvia en estado fresco y seco, con respecto a su
pH se obtuvo un mayor resultado del AE en estado fresco
que se demuestra con las evaluaciones estadísticas que
corroboran la existencia de diferencia entre los tratamientos,
siendo el T1 con 6,5 que presenta mayor valor de pH que T2
con 6,3; todo se muestra en el análisis de varianza de la
tabla 15, la cual reporta un p valor menor a 0.05 (p<0,05), así
111
mismo el orden se determinó mediante la prueba de
comparación de medias de Tukey de la tabla 16. El pH
aumenta conforme avanza el proceso de secado (Tian et al.
2008).
4.4.3.4. Índice de acidez del aceite esencial de Salvia
En la tabla 8, muestra la evaluación fisicoquímica del AE de
salvia en estado fresco y seco, con respecto a su índice de
acidez se obtuvo un mejor resultado del AE en estado seco
que se demuestra con las evaluaciones estadísticas que
corroboran la existencia de diferencia entre los tratamientos,
siendo el T2 con 0,081 que presenta mayor valor de índice
de acidez que T1 con 0,072 todo se muestra en el análisis de
varianza de la tabla 13, la cual reporta un p valor menor a
0.05 (p<0.05), así mismo el orden se determinó mediante la
prueba de comparación de medias de Tukey de la tabla 14.
Esto implica que, aunque los valores medios de acidez
pueden ser lo suficientemente alta como para que la reacción
no sea importante, las condiciones locales pueden ser tales
que la acidez sea mucho menor que el promedio y, por lo
tanto, que esta reacción heterogénea se vuelve más
importante. Se estima que el porcentaje de la acidez está en
el rango de 55-60 (Yue et al., 1994)
112
El aceite esencial en estado seco es mayor en 11,11% que
el aceite esencial en estado fresco.
4.4.4. Análisis químico por cromatografía a gases
Ortega et al. (2002) menciona que todas las salvias presentan una
composición química compleja con abundantes metabolitos de
naturaleza terpénica: monoterpenos y sesquiterpenos constitutivos
de sus aceites esenciales. Como se observa en la tabla 17 y 18 el
aceite esencial de Salvia en estado seco tiene un mayor porcentaje
de cariofileno de 59,53% a la del fresco de 54,10% siendo este
clasificado como sesquiterpeno, uno de los principales inhibidores de
crecimiento de microorganismos según menciona Amani et al.
(2007).
En su composición química también existe diferencias entre los
tratamientos T1 y T2 que se demuestran con los datos
cromatográficos del análisis por Inyección Líquida en donde se
evidencia que el T1 tiene como principales componentes a
Cariofileno (54, 10%), Bicyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4-
methyl-3-pe) (8,11%), alpha-Terpinyl acetate (7,52%), Humulene
(7,26%); y en el AE de salvia en estado seco se encontró 42
componentes, siendo sus componentes mayoritarios: Cariofileno
(59,53% ), Humulene (7,59%), trans-alpha-Bergamotene (6,75%),
113
alpha – Cubebene (4,07%) y alpha-Terpinyl acetate (4,07%).
Componentes diferentes a los que menciona Ortega et al. (2002) en
la S. officinalis (a-tuyona de 18-43%, b-tuyona de 3-8,5%, alcánfor de
4,5-24,5%, 1,8-Cineol de 5,5-13%, humuleno 0-12% y otros
compuesto menores), en la S. lavandulifolia (alcánfor de 11-36%, ,8-
Cineol de 11-25%, a-pineno 4-11% y otros en menores cantidades),
S. sclarea donde si se encontró el componente Cariofileno pero solo
en minimas cantidades, esto se debería como menciona el autor que
la composición de los tipos de salvia varia por los factores que
influyen en su desarrollo, como también menciona Angulo F., et al.
(2012).
4.4.5. Evaluación de inhibición del crecimiento del aceite esencial de
Salvia.
4.4.5.1. Actividad antibacteriana del AE frente Escherichia coli
ATCC 25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Como se muestra los resultados de la tabla 19 y 26 de
inhibición de crecimiento de las bacterias patógenas
trabajadas en la investigación se puede concluir que el aceite
especial de la planta de Salvia sagittata es más eficiente
contra la bacteria gram positiva Staphylococcus aureus con
un porcentaje de inhibición de 72,14%, que se debería a lo
mencionado por Alderete (2017) que las susceptibilidad de
114
las bacterias gram positivas con una solo una capa de
peptidoglicano es mayor a las bacterias gram negativas que
tienen una membrana dual, la cual que impide la penetración
de diversos agentes antimicrobianos, también se debe de
mencionar que su composición química de los aceites
esenciales que varían mucho por los factores abióticos y
bióticos Gonzales J. (2009),
Con respecto a la inhibición de crecimiento de la Escherichia
coli el mejor tratamiento fue T4 en el aceite esencial en
estado seco con un porcentaje de inhibición de 27,27%. Los
resultados obtenidos son beneficiarios para el aceite esencial
y esto se debería a su composición química como evidencia
en la tabla 17 y 18 de análisis cromatográfico que el aceite
esencial en estado seco tiene un mayor porcentaje de
cariofileno de 59.53% en seco y de 54,10% en fresco que
como menciona (Pérez, 2005, Amani et al. 2007.) que es uno
de los componentes que inhiben el crecimiento de
microorganismos
4.4.6. Concentración mínima inhibitoria del AE de Salvia frente a E.
coli ATCC 25922.
115
Se hallo que la concentración mínima inhibitoria del aceite esencia
en estado fresco fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado seco fue de
23,55 mg/ frente a E. coli, esto se debería a su poca diferencia de %
de componente principal el cual es el cariofileno inhibidor de
crecimiento de microorganismos (Pérez, 2005, Amani et al. 2007.) y
que a pesar de sus diferencia en su otros componentes como el
Bieyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4-methyl-3-pe) que solo
posee el aceite esencial en estado fresco y el Trans-.alpha.-
Bergamote que solo posee el aceite esencial en seco, químicos que
no se evidencian que influyan en el análisis de concentración mínima
inhibitoria.
4.4.7. Concentración mínima inhibitoria del AE de Salvia frente a S.
aureus ATCC 25923.
Se hallo que la concentración mínima inhibitoria del aceite esencia
en estado fresco fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado seco fue de
23,55 mg/ frente a S. aureus, esto se debería a su poca diferencia de
% de componente principal el cual es el cariofileno inhibidor de
crecimiento de microorganismos (Pérez, 2005, Amani et al. 2007.) y
que a pesar de sus diferencia en su otros componentes como el
Bieyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-dimethyl-6- (4-methyl-3-pe) que solo
posee el aceite esencial en estado fresco y el Trans-.alpha.-
116
Bergamote que solo posee el aceite esencial en seco, químicos que no influyen en el análisis de concentración mínima inhibitoria.
117
CONCLUSIONES
1. La Salvia procedente del centro poblado de Hierba Buena, distrito de
Huasahuasi, provincia de Tarma tiene por nombre científico Salvia Sagittata
Ruiz & Pav.
2. El porcentaje de rendimiento de tratamientos T2 (AE de la Salvia en estado
seco) con un valor de 0,0299% es mayor al T1 (AE de la Salvia en estado
fresco) con un valor de 0,0251%.
3. En la evaluación por cromatografía de gases acoplado a espectrómetro de
masas, se encontró como principales componentes en el aceite esencial en
estado fresco a Cariofileno (54, 10%), Bicyclo [3.1.1]hept-2-ene, 2,6-
dimethyl-6- (4-methyl-3-pe) (8,11%), alpha-Terpinyl acetate (7,52%),
Humulene (7,26%); y en el AE de salvia en estado seco se encontró 42
componentes, siendo sus componentes mayoritarios: Cariofileno (59,53%
), Humulene (7,59%), trans-alpha-Bergamotene (6,75%), alpha –
Cubebene (4,07%) y alpha-Terpinyl acetate (4,07%).
4. Los tratamientos T1 y T2 ( AE de la Salvia en estado fresco y seco
respectivamente) presentaron diferencias significativas (p<0.05) en cuanto
a su índice de refracción, pH y índice de acidez, teniendo mayor índice de
refracción el T2 de 1,491% comparado al T1 que tuvo 1,460%, en cuanto
a su pH tuvo mayor valor el T2 con 6,3 comparado con el T1 que tuvo 6,5
y con respecto al índice de acidez tuvo mayor valor T2 con 0.081 mg KOH/g
comparado al T1 que tuvo 0,072 mg KOH/g.
118
5. En las pruebas de inhibición de crecimiento del método de Kirby Bauer
donde se realizó (T1, T2, T3 y T4) para E. coli. Se concluye que el mejor
tratamiento en estado fresco es el T4 con un porcentaje de inhibición de
27.25% y en estado seco de un 27.27%
6. En el método de concentración mínima inhibitoria del AE de la salvia se
concluye que CMI en estado fresco fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado
seco fue del 50% o 23,55 mg/ml frente a E. coli, por ser la última
concentración de menor grado fluctuación de absorbancia y tener la
tendencia de grafica en línea recta.
7. En las pruebas de inhibición de crecimiento del método de Kirby Bauer
donde se realizó (T1, T2, T3 y T4) para S. aureus. Se concluye que el mejor
tratamiento en estado fresco es el T4 con un porcentaje de inhibición de
59.67% y en estado seco de un 72.09%
8. En el método de concentración mínima inhibitoria del AE de la salvia se
concluye que CMI en estado fresco fue del 50% o 23,72 mg/ml y en estado
seco fue del 50% o 23,55 mg/ml frente a S. aureus, por ser la última
concentración de menor grado de fluctuación de absorbancia y tener la
tendencia de grafica en línea recta.
119
RECOMENDACIONES
- Al momento de la recolección de la materia prima (Salvia Sagittata) se
debe de tomar las precauciones necesarias de no maltratar la planta para
no tener perdidas al momento de la selección, y también afectando a la
calidad y al rendimiento del aceite esencial.
- Realizar estudios sobre rendimiento de la Salvia sagittata utilizando otros
métodos de extracción de aceite esencial y los factores que influencian en
ello (lugar, clima, madures de la planta, y otros).
- El aceite esencial de cualquier planta se debe de conservar en un lugar
frio para no alterar su composición química y en frascos oscuros para no
tener influencia de los rayos solares en su cambio químico.
- Realizar estudios si el AE de la salvia puede ser utilizado como
conservante de alimentos ya que este tiene una actividad antibacteriana.
120
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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acidity, density, and refractive index deduced from SAGE II and NMC
temperature data. Journal of Geophysical Research: Atmospheres, 99(D2),
3727-3738.
127
ANEXOS
Anexo A. Recolección de la especie vegetal de Salvia sagittata
A B
B A
A. Tesista recolectando Salvia sagittata; B. Salvia sagittata recolección de hojas tallos y flores
128
Anexo B. Selección de las hojas de la especie vegetal Salvia sagittata
A
A. Separación de residuos no deseados de la Salvia sagittata: hojas marchitas, enfermas, con insectos, contaminadas por residuos fecales de animales y plantas enredaderas.
129
Anexo C. Extracción del aceite esencial de la especie vegetal Salvia sagittata
A A
B C
A. Máquina de extracción de aceite esencial por flujo de vapor; B. Materia residual luego de la extracción del aceite esencial (Salvia sagittata); C. Hidrosol formado por la extracción del aceite esencial
130
Anexo D. Separación del aceite esencial del hidrosol
A A
B C
A. Separación del hidrosol en con los embudos o peras de decantación; B.
Separación del aceite esencial con la ayuda de la micropipeta; C. Rotulación, embazado y refrigerado del aceite esencial
131
Anexo E. Aceite esencial de la Salvia sagittata
A B
A. Aceite esencial de la Salvia sagittata en estado fresco de la materia; B. Aceite esencial de la Salvia sagittata en estado seco de la materia
132
Anexo F. Procedimiento para determinar el efecto antimicrobiano del aceite esencial de la especie vegetal de Salvia sagittata frente a la Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
A A
B C
A. Preparación del medio de cultivo; B. Preparación del aceite esencial a diferentes concentraciones con la adición de los discos para la inhibición de microorganismos; C. Siembra de las cepas bacterianas Escherichia coli ATCC
25922 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.
133
Anexo G. Análisis fisicoquímicos del aceite esencial
A B
C
A. Análisis de índice de acidez. B. Análisis de Ph. C. Índice de refracción
134
Anexo H. Resultados obtenidos de las diferentes concentraciones del
aceite esencial de Salvia frente a la cepa bacteriana Escherichia coli y
Staphylococcus aureus por el método de difusión en disco.
A A
A A
A. Prueba de Kirby Bauer con la concentración de aceite esencial al 100%
135
B B
B B
B. Prueba de Kirby Bauer con la concentración de aceite esencial al 75%
136
C D
D D
C. Prueba de Kirby Bauer con la concentración de aceite esencial al 50%; D.
Prueba de Kirby Bauer con la concentración de aceite esencial al 25%
137
Anexo I. Datos cromatográficos del aceite esencial de Salvia sagittata en
fresco del análisis por Inyección Líquida
A
A. Primera parte de cromatografía de 1 a 46 minutos de aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz y Pav en estado fresco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER
B
B. Segunda parte de cromatografía de 46 a 90 minutos de aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz y Pav. en estado fresco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER
138
Anexo J. Resultado de composición de aceite esencial de la Salvia sagittata
Ruiz y Pav en estado fresco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER
139
Anexo K. Datos cromatográficos del aceite esencial de Salvia sagittata en estado seco del análisis por Inyección Líquida
A
A. Primera parte de cromatografía de 1 a 46 minutos de aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz y Pav en estado seco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER
B
B. Segunda parte de cromatografía de 46 a 90 minutos de aceite esencial de Salvia sagittata Ruiz y Pav. en estado seco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER
140
Anexo L. Resultado de composición de aceite esencial de la Salvia sagittata
Ruiz y Pav en estado seco. Universidad Nacional de Ingeniería. Facultad de
Ciencias. Informe Técnico N° 2416 – 18 – LABICER.
141