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Objetivo 2. Incrementar el conocimiento científico y tecnológico acerca de la planificación y manejo de los recursos naturales, los servicios ecosistémicos y el territorio marino costero

2.1.3 ACTIVIDAD. EVALUAR LOS ORGANISMOS MARINOS CON POTENCIAL BIOACTIVO

2.1.3.1 Caracterización química de sustancias aisladas (esponjas marinas) y ensayos de bioactividad

RESUMEN Se continuó trabajando en aumentar el conocimiento del potencial uso que tiene la biodiversidad marino costera del País, con las esponjas marinas Myrmekioderma gyroderma, Aplysina lacunosa (AI) y Oceanapia peltata (OP), estudiando los extractos de alta polaridad etanólico (EtOH) y metanólico (MeOH), así como las fracciones orgánicas (FO) y acuosa (FA), identificando mediante comparación de los perfiles cromatográficos y bibliográficos cinco compuestos de naturaleza alcaloidea y un derivado de ácido grasos, en Aplysina lacunosa (N=2) y en Ocenapia peltata (N=3), lo que nos permite plantear un estudio con técnicas acopladas de (HPLC-MS y GC-MS) para hacer una total identificación con datos espectroscópicos y lograr el aislamiento de los compuestos presentes en cada uno de los extractos y fracciones. Es importante resaltar que la especie O. peltata no posee aún reportes bibliográficos de compuestos aislados. Simultáneamente se realizó la evaluación de la actividad antimicrobiana por triplicado de cada una de las esponjas, mas Agelas tubulata (AT) y Xestopongia próxima (XP) frente a 4 cepas patógenas para humanos, obteniendo que las muestras codificadas como Al3809 (9,53 ± 0,21 mm), Al3810 (9,27 ± 0,46 mm) y AT26FA (9,43 ± 0,29 mm), registraron los mayores diámetros de la zona de inhibición frente la cepa resistente Staphylococcus aureus ATCC 43300 (SARM), además se presentó una actividad leve por la fracción orgánica XPFO (7,1 ± 0,06 mm). Por otra parte, Al3809 (7,33 ± 0,29) y Al380803 (7,50 ± 0,17 mm), inhibieron Escherichia coli Betalactamasas de espectro extendido BLEE y Al380803 (7,43 ± 0,57 mm) mostró una actividad leve frente la levadura Candida albicans ATCC 10231, sin embargo contra la bacteria Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 no se observó inhibición en ninguno de los bioensayos. Los resultados obtenidos a partir de estas muestras, proporcionan posibles nuevas fuentes de productos naturales marinos con fines farmacéuticos y/o industriales para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos capaces de sobrevivir a la presencia de más de un antimicrobiano.

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INTRODUCCIÓN

La química de los productos naturales marinos ha crecido enormemente en los últimos cincuenta años. En hábitats terrestres , la comunicación entre insectos esta mediada en gran parte por las feromonas, debido a que estos compuestos deben ser volátiles, para que se dispersen con facilidad, sus estructuras químicas son relativamente sencillas y a menudo son fáciles de sintetizar. En contraste, en un entorno acuoso, como el océano, la comunicación entre los organismos vivos depende de la solubilidad en agua de los compuestos que los organismos marinos producen, como consecuencia de esto, los compuestos químicos utilizados en la comunicación de dichos organismos tienen estructuras más complejas y mayores pesos moleculares en comparación con las estructuras químicas de compuestos producidos por organismos terrestres (Bhakuni y Rawat, 2005).

La identificación de compuestos de origen marino con potencialidades para el tratamiento de afecciones comunes en la salud de los seres humanos ha sido un campo muy prolífero. Algunos ejemplos incluyen sustancias con actividad antiinflamatoria como el Manoalido (Luffariellavariabilis) el cual está disponible en el comercio; Topsentinas (Topsentia genitrix, Spongosorites sp. y Hexadella sp.), Debromohymenialdisina (DBH) (Phakelliaflabellata, Hymeniacidonaldis y Stylotellaaurantia), Halichondrin B (Halichondria okadai) y Dolastatin 10 (Dolabella auricularia), compuestos con actividad anticancerígena en etapa preclínica; Spongistatin (Hyrtios erecta) y Aurantosidos (Siliquariaspongia japonica y Homophymia confiera) agentes antifúngicos disponibles comercialmente (Duque, 1998).

La Línea Bioprospección Marina del INVEMAR continua contribuyendo desde un enfoque interdisciplinario a la generación de nuevo conocimiento y al fortalecimiento de las ciencias básicas (marinas) a través del estudio, identificación y caracterización de los principios activos presentes en esponjas marinas y responsables de la inhibición en la proliferación de microorganismos multiresistentes causantes de enfermedades.

OBJETIVOS

- Preparar los extractos totales a diferente polaridad de disolventes de 3 esponjas (Myrmekioderma gyroderma, Aplysina lacunosa y Oceanapia peltata) del caribe colombiano. - Fraccionar y purificar los extractos de esponjas marinas mediante cromatografía en capa fina y cromatografía en columna. - Evaluar la actividad antimicrobiana de extractos y fracciones de (Myrmekioderma gyroderma, Aplysina lacunosa y Oceanapia peltata) contra cepas de bacterias patógenas en humanos resistentes a antibióticos betalactámicos de los compuestos aislados en tres especies de esponjas marinas

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MARCO CONCEPTUAL

Los océanos cubren alrededor del 70 % del planeta y son los productos naturales marinos los menos estudiados (

Figura 1), lo cual indica que las probabilidades de descubrir nuevas moléculas activas es mayor (Hughes et al, 2010).

Una gran variedad de invertebrados marinos sésiles viven en sustratos bentónicos en océanos templados y tropicales. Ciertos grupos de estos invertebrados, incluyen a esponjas, celenterados (cnidarios), briozoarios y ascidias. Muchos de estos organismos, sin embargo, son de cuerpos blandos y relativamente vulnerables ante depredadores, por lo que las defensas especialmente químicas pueden ser muy importantes para ellos. El papel de los metabolitos secundarios de esponjas como agentes disuasivos de la ingesta es aún menos estudiado, en comparación con otros organismos. Algunos estudios indican que extractos de esponjas de aguas tropicales, templadas y antárticas xica; sin embargo, solamente pocos estudios han demostrado que estos extractos tengan un papel d n. En algunos casos, las mezclas naturales de metabolitos son más efectivas que un metabolito puro cuando es probado en las mismas concentraciones (Paul, 1992).

s primitivos, que datan desde la era precámbrica, y que han adquirido apariencias muy diferentes entre , producto de la presión ecológica siles que se alimentan por filtración, en ellas las corrientes de agua generadas son esenciales en su alimentación, excreción de deshechos, respiración y en algunos casos su reproducción. Pueden ser encontradas en la mayoría de los ambientes acuáticos, donde haya un sustrato para que estas se adhieran y desarrollen. El papel ecológico de los metabolitos secundarios producidos por esponjas incluyen funciones como antidepredatorios, antibióticos, antiadherentes y como agentes fotoprotectores (Harper et al., 2001).

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Figura 1. Distribución de productos naturales de origen marino por phylum, con base en el número de reportes hechos por año. Tomada y adaptada de Blunt et al. (2009).

En las esponjas, los metabolitos secundarios aparecen en respuesta a la presión ecológica del med tidos o alcaloides que han sido implicados en interacciones entre esponjas y corales, entre otros. En contraste, con las ascidias y briozoarios, la depredación en esponjas se halla restringida a un grupo especializado de consumidores, como tortugas, algunos peces y moluscos. El éxito ecológico de las esponjas se debe a la presencia de metabolitos secundarios bioactivos que representan a la mayoría de clases de compuestos los cuales han sido utilizados como base para algunos estudios químicos y farmacológicos. Tanto ensayos de laboratorio como de campo han demostrado la potencia de los extractos de esponjas y de compuestos puros que impiden que la esponja sea consumida por su depredador. Los metabolitos secundarios de esponjas pueden jugar una función importante influenciando los asentamientos y desarrollos larvarios de invertebrados marinos (Garson, 2001).

MATERIALES, METODOLOGÍA Y RESULTADOS

El material biológico (Topsentia ophiraphidites, Myrmekiodermia gyroderma, Oceanapia peltata, Neopetroxia proxima), se realizó en la Bahía de Santa Marta en Punta Betín (11°15'2.77"N 74°13'15.41"O) (Figura 22).

Recolección e identificación del material biológico

El material fue recolectado por medio de buceo autónomo, en profundidades entre los 20-25 m; una vez fuera del agua, el material se con agua de mar de manera manual para eliminar organismos y material sedimentario adherido a la esponja, posteriormente se guardaron en bolsas de plástico previamente etiquetadas y colocadas en un hielera para su congelación para ser transportado en bolsas herméticas hasta las instalaciones del Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras INVEMAR en la ciudad de Santa Marta, Laboratorio de Bioprospección Marina LabBIM (Figura 3, Tabla 1).

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Figura 2. Localización del sitio don se realizó la recolecta del material biológico.

Figura 3. Identificación material porífero. Material en bolsas herméticas (A), Topsentia ophiraphidites (B), Neopetrosia proxima (C), Myrmekiodermia gyroderma (D), Oceanapia peltata (E).

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Tabla 1. Información de material biológico recolectado.

Fecha de Profundidad Peso Código Nombre de la esponja Colecto Nº Cat. SIBM colecta (m) (g) 2634,2 Al38 Aplysina lacunosa 19-08-11 8-10 S. Zea INV POR1168 0 OpExt Oceanapia peltata 24-06-15 12-25 525,00 S. Zea INV POR1184 Topsentia ToExt 24-06-15 12-15 333,15 S. Zea INV POR1164 ophiraphidites Myrmekiodermia MgExt 24-06-15 12-15 667,07 S. Zea INV POR1164 gyroderma At26 Neopetrosia proxima 24-06-15 12-15 38,51 S. Zea INV POR1164

lice 60 F254 de 0.25 mm de espesor (Merck). La visualización de las placas se hizo en mpara de luz UV Spectroline modelo CX-20 a longitudes de onda (λ) 254 y 366 rico 2 N seguido de calentamiento a 120 2 minutos en una parrilla eléctrica.

Preparación extractos

- Myrmekioderma gyroderma

En el LabBIM 667.07 g de la especie M. gyroderma se secaron a temperatura ambiente (26°C aprox.) obteniendo 125.34 g de material seco. Posteriormente el material seco fue cortado hasta obtener fragmentos pequeños con el fin de aumentar la superficie de contacto entre el disolvente-material y lograr una extracción más eficiente. La muestra se dejó maceración (método de extracción sólido-líquido) durante 24 h con 500 ml de un disolvente polar (etanol), asistido con sonicación (técnica asistida por ondas ultrasónicas para mejorar los rendimientos de la extracción) 1h.

El disolvente fue eliminado mediante presión reducida (175 mbar) y 78°C en un rotaevaporador hasta lograr un extracto concentrado de 12.07 g denominado extracto etanólico MgExtEtOH. En los estudios de productos naturales en matrices marinas, es frecuente encontrar grandes cantidades de sal, las cuales interfieren en los procesos cromatográficos (separación componentes del extracto) y contrarrestan la actividad biológica que se pretende evaluar (Sánchez, 2010). Para eliminar la sal del extracto etanólico se indujo precipitación con metanol MeOH y agitación continua repetidas veces hasta que se evidenció poca o nula disolución del precipitado, las aguas madres resultantes se filtraron y finalmente se concentró el extracto resultante tras evaporación del disolvente (Figura 4).

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Los metabolitos secundarios de una especie pueden ser extraídos en diferentes disolventes de acuerdo a su solubilidad, por lo tanto se pueden encontrar a diferentes polaridades, en los ambientes marinos es recurrente encontrar compuestos de alta polaridad (hidrosolubles) y en menor proporción cadenas de ácidos grasos (hidrofóbicas), por ello se preparó siguiendo la misma metodología anterior el extracto metanólico MgExtMeOH 10.05g , bajo la misma metodología del extracto etanólico (Tabla 22 y 3). Los extractos etanólico y metanólico fueron evaluados en el Bioensayo de actividad antimicrobiana.

Los extractos totales contienen una mezcla de todos los componentes químicos afines a la polaridad del disolvente en la cual se extrajo, esta mezcla pudiese tener propiedades frente a ensayos biológicos y/o actividad selectiva, o simplemente no presentar actividad importante por los multicomponentes presentes; debido a ello, es importante realizar una segunda extracción (líquido-líquido) y separar los componentes en dos fracciones opuestas en polaridad (fracción acuosa y fracción orgánica), esto permite continuar un estudio bioguiado de la especie e identificar el punto extractivo en el cual el metabolito responsable de la actividad a evaluar está presente.

Figura 4. Proceso extracción Myrmekioderma gyroderma. Limpieza material de epibiontes (A), fragmentación material (B), maceración con disolvente (C), sonicación (D), eliminación disolvente a presión reducida (E), extractos totales (F).

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Así pues, los extractos MgExtEtOH y MgExtMeOH fueron extraídos con un disolvente polar (agua) y un disolvente apolar (diclorometano) (DCM:H2O 1:1), en un embudo de separación se dispusieron 2.69 g de extracto MgExtEtOH en 250 ml de solución; tres series de agitación fueron necesarias hasta lograr una correcta partición de los componentes y finalmente cuando se evidencia miscibilidad de reparto se obtuvieron dos fracciones FO (fracción orgánica) y FA (fracción acuosa); para el extracto MgExtMeOH se dispusieron 2.59 g bajo las misma condiciones de extracción. Posteriormente se evaluó la actividad antimicrobiana de las fracciones resultantes (Figura 5).

Figura 5. Extracción líquido-líquido.

Tabla 2. Datos del procesamiento de las muestras hasta la extracción.

Código Peso en húmedo (g) Peso seco (g) Peso del extracto (g) Código asignado* MgExt 667.07 125.34 12.07 MgExtEtOH MgExt 667.07 125.34 10.05 MgExtMeOH

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Tabla 3. Datos fraccionamiento de extracto total MgExtEtOH.

Código FA(g) Código FO (g) MgExtEtOH 1,88 MgExtMeOHFA 0,269

- Aplysina lacunosa

La FOAl (fracción orgánica) de 8.36g fue dispuesta en cromatografía en placa fina TLC por sus siglas en inglés a partir del extracto metanólico de Aplysina lacunosa Al38ET, permitió identificar los posibles compuestos presentes en el extracto y posteriormente separarlos; tras probar varios sistemas de elucíon (proporción de disolventes DCM:MeOH diclorometano-metanol respectivamente) el sistema que mostró mejor resolución en la placa fue DCM:MeOH en una proporción 92:8, es de resaltar que las señales en las placas son bien definidas al ser observadas bajo lluz ultravioleta (254 y 366nm) a onda corta y onda larga respectivamente, este resultado permite intuir que los compuestos presentes en dicho extracto son de naturaleza polar y tras una búsqueda bibliográfica nos permite intuir que los compuestos presentes son: 11-oxoaerothionin (1) aislado por (Acosta et al, 1992) el cual reportan en la FO del extracto metanólico y los ácidos grasos derivados de (2) (Carballeira et al., 1992) (Figura 6). Sin embargo se debe confirmar con técnicas acopladas de (HPLC-MS Y GC-MS) para la total identificación de datos espectroscópicos y lograr el aislamiento de los compuestos presentes en cada uno de los extractos y fracciones.

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Figura 6. Cromatofolios Aplysina lacunosa. Placas cromatográficas UV 254 nm (A), UV 366 nm (B), cromatogramas revelados con sulfato cérico (C).

El resultado anterior permite continuar con la cromatografía en placa, esta vez del tipo preparativa (ccp), esta clase de cromatografía permite separar a una mejor resolución las señales presentes bajo TLC, la aplicación de la muestra se realiza por capilaridad ascendente, y el sistema de elución debe ser el mismo que se utilizó en TLC (DCM:MeOH 92:8) durante 1h 30. La cromatografía muestra tres señales o bandas en el ancho de la placa bajo la luz ultravioleta a diferente longitud de onda (254-366nm), lo cual confirma la presencia de los compuestos polares, en la parte inferior de la placa

______Informe final BPIN VAR 2015 cromatográfica quedan retenidos los compuestos apolares y candidatos a ser analizados bajo un sistema cromatográfico de gases-masas GC-MS por sus siglas en inglés. (Figura 7).

Figura 7. Cromatografía en placa preparativa (ccp) de Aplysina lacunosa Al38ET. Aplicación muestra sobre placa preparativa (A), Placa sobre cámara de elución (B), placa cromatográfica eluída (C), placa UV 366 nm.

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- Oceanapia peltata

A partir de 172 g de Oceanapia peltata distribuidos en 4 individuos se obtuvo por la misma metodología excepto el tiempo de sonicación 2h, 11.07g de un extracto metanólico OpExtMeOH al cual se le realizó un estudio cromatográfico en capa delgada para identificar las señales de los compuestos presentes en el extracto (Tabla 4). Los cromatofolios fueron eluídos en un sistema DCM:MeOH 98:12 en proporción de disolventes, lo cual nos permitió identificar las señales que corresponden a compuestos de alta polaridad en la parte superior y retenidos los compuestos apolares en el punto de aplicación. Producto de esta cromatografía se pudieron identificar 5 señales bajo luz ultravioleta a onda corta (254nm), y una señal a onda larga (366nm), lo que nos permite inferir que en el extracto metanólico de Oceanapia peltata hay la presencia de por lo menos 3 compuestos del tipo alcaloidal (3,4, 5) (Ibrahim et al., 2013) y/o esfingolílipidos diméricos (Guillian et al., 2000) los cuales no están reportados para la especie, pero sí para el género, de acuerdo a una búsqueda realizada en la plataforma SciFinder, lo que nos motiva en continuar el estudio en una fase II, para lograr el aislamiento de los componentes afines al género de Oceanapia y evaluar su actividad antimicrobiana.

Tabla 4. Datos del procesamiento de las muestras OpExt hasta la extracción.

Código Peso en húmedo (g) Peso seco (g) Peso del extracto (g) Código asignado* OpExt 172.00 125.34 11.07 OPExtEtOH

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Figura 8. Cromatografía en capa fina preparativa de Oceanapia peltata. Placas preparativas a 254nm y 366nm. (a-e) señales de compuestos presentes en el extracto OpExtMeOH.

Los extractos y fracciones fueron evaluados en el Bioensayo de Actividad Antimicrobiana, así como las siguientes fracciones que fueron colectadas y procesadas en actividades anteriores del (BPIN-2014):

AT26FA -AT26FO (Agelas tubulata), fracción Acuosa y orgánica respectivamente. XPFO- XPFA (Xetospongia proxima), fracción acuosa y orgánica respectivamente.

Bioensayos de actividad antimicrobiana

Los bioensayos de inhibición del crecimiento microbiano se realizaron por triplicado mediante la técnica de difusión en agar con sensidiscos, para evaluar 25 muestras obtenidas a partir del fraccionamiento extractos de esponjas y probar su capacidad de inhibición frente a microorganismos patógenos. Los bioensayos se realizaron en el área de microbiología, de acuerdo a lo descrito en el protocolo de actividad Microbiana implementado en el Laboratorio de Bioprospección Marina (LabBIM), mediante la técnica difusión en agar con sensidiscos.

Verificación de las cepas

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Para evaluar la actividad antimicrobiana de las muestras, se seleccionaron 4 microorganismos de importancia clínica, dentro de los que se contó con cepas de bacterias que presentan mecanismos de multiresistencia frente antibióticos como: Betalactamasas de espectro extendido (BLEE), Meticilino resistencia (SARM) y patógenos asociados a infecciones hospitalarias (Tabla 5). Previo a los bioensayos, todas las cepas fueron evaluadas en un entorno estéril para verificar la pureza del cultivo mediante tinción GRAM y se observó la morfología empleando un microscopio en el objetivo 100 X (Figura 9).

Tabla 5. Cepas de microorganismos patógenas seleccionadas para el bioensayo de actividad antimicrobiana.

Cepa Morfología Importancia clínica Bacilos GRAM - Resistencia a antibióticos β-Lactámicos (Echeverri-Toro et al., 2012). Escherichia coli negativos. - Patógeno asociado a infecciones hospitalarias, especialmente en BLEE Figura 9A unidad de cuidados intensivos (UCI) (Sánchez et al., 2008). Candida Levadura. - Micosis invasiva en pacientes inmunosuprimidos y hospitalizados en albicans ATCC Figura 9B las unidades de cuidado intensivo (UCI) (Bedout y Gómez, 2010). 10231 - Resistente a Meticilina (SARM) (Hernando et al., 2009; Escobar et al., 2013) Staphylococcus Cocos GRAM - Patógeno asociado a infecciones hospitalarias (especialmente en aureus ATCC positivos. unidad de cuidados intensivos (UCI)) y extrahospitalarias como: 43300 (SARM) Figura 9C fascitis necrosante, piomiositis, tromboflebitis séptica, síndrome de Waterhouse-Friderichsen, neumonía rápidamente progresiva e infecciones oculares (Hernando et al., 2009). Klebsiella Bacilos GRAM - Patógeno asociado a infecciones hospitalarias, especialmente en pneumoniae negativos. unidad de cuidados intensivos (UCI) (Sánchez et al., 2008). ATCC 10031 Figura 9D

Figura 9. Verificación de pureza de las cepas empleadas en los ensayos de actividad antimicrobiana, características macro y microscópicas de: Escherichia coli BLEE (A); Candida albicans ATCC 10231 (B); Staphylococcus aureus ATCC 43300 SARM (C) y Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 (D).

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Preparación de la cepa

24 horas antes del bioensayo se realizó un repique tomando con un asa bacteriológica redonda 3 a 5 colonias aisladas de la cepa a evaluar para suspenderlas en un tubo con 5 mL de caldo nutritivo e incubado a 37 °C por un período de 24 horas. Luego del tiempo de incubación, se extrajo 200 μL para inocular otro tubo de ensayo con 15 ml de caldo nutritivo hasta alcanzar una turbidez igual al estándar 0,5 McFarland, comparando de manera visual el inóculo y el patrón en contraste con un fondo blanco con líneas negras.

Impregnación de los sensidiscos

Los sensidiscos comerciales estériles, fueron dispuestos en cajas de Petri y posteriormente se impregnaron alícuotas de 20 μL del extracto a evaluar. Los discos fueron transportados a un desecador por un periodo de 3 h con el fin de permitir la evaporación de los solventes presentes en las muestras.

Bioensayo

Dentro de los 15 minutos siguientes del cultivo microbiano previamente ajustado al patrón estándar, se tomaron 200 μL del cultivo y se inoculó en un ambiente estéril tubos con 15 mL de agar Mueller-Hinton, para luego disponerlos en un baño termostático a 45°C durante 2 horas con agitación periódica cada 30 minutos para una fase de adaptación del microorganismo en el medio líquido.

Luego de este tiempo, se dispensó en un ambiente estéril el contenido de los tubos en cajas de Petri de 10 cm de diámetro, se dejó solidificar el medio para colocar en la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril los sensidiscos previamente impregnados con el extracto a evaluar, dejando un espacio no menor a 24 mm de distancia entre centros. Las cajas de Petri fueron refrigeradas de manera invertida a 4 °C durante una hora, con el fin de difundir las sustancias en el agar antes de incubar las placas. Por último, las cajas se incubaron a 35 ± 2ºC por un período de 24-48 horas, para realizar la lectura de los resultados.

RESULTADOS DEL BIOENSAYO

Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 6, donde se pueden apreciar los el promedio de los ensayos realizados por triplicado. Aplysina lacunosa y Agelas tubulata presentaron actividad antimicrobiana y antifúngica sobre los microorganismos ensayados, con una actividad leve pero consistente para inhibir el crecimiento de Escherichia coli Betalactamasas de espectro extendido BLEE (SARM) y Candida albicans ATCC 10231. Las muestras codificadas como Al3809 (9,53 ± 0,21 mm), Al3810 (9,27 ±

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0,46 mm) y AT26FA (9,43 ± 0,29 mm), registraron los mayores diámetros de la zona de inhibición, lo que implicó una mayor efectividad contra la cepa resistente S. aureus ATCC 43300 (SARM) (

Figura 10). Por otra parte, Al3809 (promedio: 7,33 ± 0,29) y Al380803 (promedio: 7,50 ± 0,17 mm), registraron mayor efectividad contra la bacteria GRAM negativa multirresistente (Figura 11). En el caso de la levadura C. albicans ATCC 10231, la muestra Al380803 (promedio: 7,43 ± 0,57 mm) registró la mayor actividad de inhibición respecto a las demás muestras ensayadas (Figura 12). En otros estudios de actividad antimicrobiana de extractos obtenidos de A. lacunosa se ha reportado frente a cepas bacterianas certificadas y no sobre microorganismos que poseen mecanismos de multirresistencia como Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE) y Meticilino Resistencia (SARM). Cabe destacar entre los resultados positivos, la fracción orgánica de la esponja Xetospongia próxima, XPFO (promedio: 7,1 ± 0,06 mm) al inhibir a S. aureus SARM (Figura 13). No se presentó actividad biológica contra la bacteria Klebsiella ATCC 10031. Los resultados obtenidos a partir de estas muestras, proporcionan posibles nuevas fuentes de productos naturales marinos con fines farmacéuticos y/o industriales para inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos capaces de sobrevivir a la presencia de más de un antimicrobiano.

La falta de actividad antimicrobiana mostrada por las demás muestras ensayadas, posiblemente se deba a que estas no presentan compuestos bioactivos que inhiban el crecimiento de los patógenos en estudio. Puede suceder también que la concentración del extracto no sea la adecuada para causar un efecto notorio sobre los microorganismos. Ensayos similares han evaluado extractos de esponjas como Oceanapia peltata y Myrmekioderma gyroderma, los cuales no presentaron actividad antimicrobiana; mientras que Xetospongia próxima, mostró actividad contra bacterias grampositivas y contra la levadura C. albicans (Mora et al., 2008)

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Figura 10. Actividad antimicrobiana de extractos frente a S. aureus SARM. (A) Halos de inhibición de las muestras Al3807 (1), Al3809 (2), Al3810 (3), Al380803 (4). (B) Halos de inhibición de las muestras Al380804 (5). AT26FA (09).

Figura 11. Actividad antimicrobiana de extractos frente a E. coli BLEE. (A) Halos de inhibición de las muestras Al3807 (1), Al3809 (2), Al380803 (4). (B) Halo de inhibición de la muestra AT26FA (9).

Figura 12. Actividad antimicrobiana de extractos frente a C. albicans ATCC 10231. (A) Halos de inhibición de las muestras Al3807 (1), Al3809 (2), Al380803 (4). (B) Halo de inhibición de la muestra AT26FA (09).

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Figura 13. Halo de inhibición del extracto XPFO (1) frente a S. aureus SARM.

Tabla 6. Resultados de los Bioensayos con cepas de bacterias patógenas, registrados a las 48 horas de incubación.

Diámetros Halo de Inhibición (mm) Método Difusión en sensidiscos S. C. K. aureus E. coli albicans pneumoniae Código ATCC BLEE ATCC ATCC 10031 43300* 10231 Al3807 + + NA + Al3809 + + NA + Al3810 + - NA - Al380803 + + NA + Al380804 + - NA - XPI2 - - NA - OP36FA - - NA - OP36FO - - NA - AT26FA + + NA + AT26FO - - NA - XPFO + - - - XPFA - - - - MgExtMeOH - - - - MgExtMeOHFA - - - - MgExtEtOH - - - - OpExtEtOH - - - NI Control (+) 1 ++ +++ ++ +++ Control (+) 2 ++ - +++ ++ Control (-) - - - - (+) = 7-11 mm (++) = 11-16 mm (+++) = Mas de 16 mm (-) = No se observó halo NI = No hay suficiente inoculo

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C1: Vancomicina (S. aureus ATCC 43300 SARM), Imipenen (E. coli BLEE, K. pneumoniae ATCC 10031) y Fluconazol (C. albicans ATCC 10231). C2: Cefoperazona (S. aureus ATCC 43300 SARM, E. coli BLEE, K. pneumoniae ATCC 10031) y Nistatina (C. albicans ATCC 10231). *Meticilino resistente (SARM).

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REFERENCIAS

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2.1.3.2 ESTUDIO DE ACTINOBACTERIAS ASOCIADAS A SEDIMENTOS MARINO COSTEROS

RESUMEN Los sedimentos marino costeros constituyen una fuente de recursos poco explorados, considerados como un ambiente de alta competencia que permite el desarrollo de grupos microbianos con potencial bioactivo como las actinobacterias. En total se aislaron 132 cepas de dos sectores del departamento del Magdalena conocidos como Caño aguas negras y Punta Betín. La evaluación de actividad antimicrobiana de los aislados se realizó por triplicado inicialmente contrastando 25 cepas de actinobacterias cultivables contra microorganismos patógenos para humanos como Escherichia coli Betalactamasas de espectro extendido- BLEE, Staphylococcus aureus ATCC 43300 (SARM), Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 y la levadura Candida albicans ATCC 10231, asimismo se determinó la actividad lignolítica mediante pruebas de tamizaje en medios indicadores con guayacol. Como resultado 11 cepas presentaron actividad antibacteriana y 4 actividad antifúngica, destacando una actividad moderada a fuerte frente a E. coli BLEE y S. aureus ATCC 43300 (SARM) de las cepas de actinobacterias codificadas como MBCAN1-1 con un promedio del diámetro de la zona de inhibición para SARM (20,3 ± 0,2 mm), MBCAN1-2 (12,3 ± 0,8 mm; 19,4 ± 1,0 mm), MBCAN1- 3 (11,3 ± 0,9 mm; 18,0 ± 0,9 mm) y SCAN2-25 de 11,1 ± 2,3 mm para S. aureus SARM y 13,3 ± 3,1 mm para Klebsiella pneumoniae ATCC 10031; además se evidenció actividad lignolítica por parte de las cepas MBCAN1-3 y SCAN2-23. La bioactividad registrada, indica la posible presencia de metabolitos producidos por los aislados bacterianos, los cuales son una fuente potencial de compuestos de importancia para la salud humana, como para el medio ambiente al tolerar compuestos aromáticos.

INTRODUCCIÓN

En Colombia, el estudio de microorganismos marinos productores de metabolitos bioactivos es reciente por lo que aún se desconoce su potencial. Las actinobacterias, pertenecen al orden Actinomycetal y comprende 63 géneros ampliamente distribuidos en ecosistemas naturales (Prashith et al., 2010), caracterizados por producir de manera prolifera importantes metabolitos secundarios, los cuales tienen aplicaciones en el campo farmacéutico, industrial y biotecnológico (León et al., 2007). Tradicionalmente, el aislamiento de este importante grupo microbiano se realizaba a partir de fuentes terrestres y sólo en las dos últimas décadas llegó a ser evidente el potencial de microorganismos marinos como productores de antibióticos con estructuras únicas y características muy propias del ambiente marino (Levy et al., 2004). La primera evidencia de la existencia de actinomicetos marinos provino de la descripción de la especie Rhodococcus marinonascens (Helmke y Weyland, 1984), recientes hallazgos permitieron aislar la especie Myceligenerans cantabricum, un nuevo taxa barotolerante

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(1.500 m de profundidad), que ha demostrado una potente actividad antibiótica y antitumoral (Sarmiento-Vizcaíno et al., 2015).

La exploración de los ambientes marino-costeros ofrece la oportunidad de encontrar nuevos productos naturales especialmente obtenidos de microorganismos, los cuales poseen una capacidad de adaptación y metabolismos, que les confiere producir de manera eficiente sustancias de interés, actualmente existen alrededor de un millón de compuestos naturales, de los cuales más de veintidós mil son de origen microbiano y diez mil cien son metabolitos bioactivos obtenidos de actinobacterias, de los cuales el 75% han sido aislados de Streptomyces sp y el 25% restante de los denominados Actinomicetos raros (Cartuche, 2013). En este sentido, el aislamiento de cepas nativas a partir de sedimentos marino-costeros representa una estrategia para conocer la biodiversidad de estos ambientes caracterizados por la alta competencia e interacción entre los grupos microbianos presentes y constituye un aporte en el estudio de microorganismos asociados a matrices marinas en Colombia.

OBJETIVOS

- Aislar, caracterizar actinobacterias asociadas a sedimentos marino costeros. - Evaluar la actividad biológica de las actinobacterias, mediante ensayos antimicrobianos y actividad lignolítica.

MARCO CONCEPTUAL

El sedimento marino, ha sido considerado un ambiente de alta competencia dado a las características particulares que presenta, como bajas concentraciones de oxígeno disuelto, composición química, el predominio de materia orgánica autóctona y alóctona y la diversidad de biomasa microbiana (Díaz-Naveas y Frutos, 2010), donde las bacterias desarrollan mecanismos que les permiten acceder a los nutrientes del medio y producir sustancias específicas que inhiben o regulan el crecimiento de ciertas poblaciones microbianas, generando una respuesta más eficiente a los factores de estrés y una ventaja en cuanto a la supervivencia respecto a otros microorganismos (Torres- Beltrán et al., 2012). La distribución de las actinobacterias en ambientes marinos ha sido poco estudiada, la mayor parte de las bacterias identificadas provienen de muestras de agua y pertenecen a especies Gram negativas, mientras que en los sedimentos donde se acumula la mayor cantidad de materia orgánica aparecen en mayor proporción bacterias Gram positivas, por lo que se convierte en un prometedor reservorio de cepas silvestres de actinobacterias bioactivas (Miravet et al., 2001; Miravet, 2003; Macas y Paccha, 2012; Torres-Beltrán et al., 2012).

Las actinobacterias o actinomicetos, son un amplio grupo de bacterias filamentosas Gram positivas que pertenecen al orden Actinomycetales, su pared celular está compuesta por péptidoglicano, el diámetro de sus hifas es inferior al de los hongos (0,5

______Informe final BPIN VAR 2015 a 2,0 μm) y la disposición de su material genético es típicamente procariota, se caracterizan por presentar un alto contenido de guanina y citosina en su ADN (51-78 % G+C; Sylvia, 2005 “ hú ” compuestos volátiles sintetizados denominado geosmina, habitan principalmente suelos cumpliendo un rol como organismos saprofíticos y se han introducido en ambientes marinos por el flujo de ríos o precipitaciones. Las actinobacterias menos evolucionadas tienen un desarrollo micelial incompleto presentado en el crecimiento activo, mientras que los más evolucionados tienen un micelio de sustrato (rizoides) y micelio fuera del sustrato (aéreos) y al presentar esporas se sitúan en el extremo de los micelios aéreos (Peña-Pérez y Castaño, 2013).

Actualmente los estudios se centran en explorar otros ambientes como fuente de aislamiento de actinobacterias, tal es el caso de los sedimentos de ríos, lagos y océanos que permiten aislar cepas silvestres no descritas, productoras de nuevos metabolitos secundarios con alta bioactividad que incluyen antibióticos, medicamentos anticancerígenos, inmunosupresores e inhibidores de enzimas (León et al., 2007; Torres- Beltrán et al., 2012; Valan et al., 2012; Cartuche, 2013).En Colombia, la búsqueda de compuestos con actividad antimicrobiana a partir de actinobacterias marinas ha sido muy poco abordada, por lo que su potencial es aún desconocido, estudios encontrados se basan en la ejecución de cultivo de cianobacterias y actinobacterias asociadas a esponjas, octocorales y sedimentos para la obtención de compuestos activos para el control de insectos y fitopatógenos (Com. Per. Dr. Howard Junka), no obstante es importante avanzar en la exploración de actinobacterias asociadas a sedimentos marinos expuestos a diferentes cargas orgánicas como fuente para el descubrimiento de nuevos productos naturales, muchos de los cuales pertenecen a clases químicas no descritas en microorganismos terrestres.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Las muestras de sedimento marino-costero fueron recolectadas en dos sectores del departamento del Magdalena que presentan diferentes cargas de materia orgánica como el Caño aguas negras- CAN (alta) y Punta Betín- PBE (mediana) (Tabla 7). CAN corresponde a un paleocauce del río Magdalena, que se extiende hasta el sistema lacustre del Complejo de Pajarales de la Ciénaga Grande de Santa Marta- CGSM (Figura 144), influenciado por el aporte de sedimentos y contaminantes procedentes de la cuenca del río, dando como característica que la zona se encuentre formada por lodos limosos, arenas finas grises oscuras y materiales enriquecidos con materia orgánica (Vergara et al., 2004). PBE lo constituye un litoral rocoso, compuesto por formaciones coralinas complejas y diversas, influenciado por el río Manzanares que desemboca en la bahía de Santa Marta, el emisario submarino que descarga aguas residuales y las actividades de la zona portuaria, las cuales generan alta turbidez (Figura 15) (Manrique- Rodríguez et al., 2006).

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Tabla 7. Sitios de muestreo de sedimento marino-costero definidos en el departamento del Magdalena Sector Sitio muestreo Coordenadas Manglar Boca Caño Aguas Negras 10° 48' 41,8"N 074° 36' 25,0"W CGSM Boca Caño Aguas Negras 10° 48' 47,5"N 074° 36' 08,1"W Salida Caño Aguas Negras 10° 48' 50,9"N 074° 36' 00,0"W Santa Marta Punta Betín 11° 15' 024"N 074° 13' 16,0"W

Figura 144. Localización del área de estudio definido en el complejo de Pajarales de CGSM. Los íconos rojos muestran las estaciones de muestreo del sedimento: Manglar caño aguas negras (MBCAN). Boca caño aguas negras (BCAN). Salida caño aguas negras (SCAN).

Figura 15. Localización del área de estudio definido en Santa Marta. El ícono rojo corresponde a la estación de muestreo del sedimento: Punta Betín (PBE).

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Recolección de muestras

Las muestras fueron recolectadas mediante draga Van Veen con superficie de muestreo de 0,08 m2 y buceo autónomo, tomando la capa de sedimento superficial por triplicado en un rango de 5 hasta 15 metros de profundidad para Punta Betín y 0,7 a 3 m para Caño aguas negras-CGSM. Las muestras fueron recolectadas en frascos estériles forrados con papel aluminio para proteger de la luz y almacenados en una nevera plástica con hielo aproximadamente a 4 °C para ser transportada al área de productos naturales marinos del laboratorio de Bioprospección marina del INVEMAR –LabBIM para su procesamiento. Adicionalmente, se tomaron muestras de agua para la caracterización de los parámetros fisicoquímicos (pH, oxígeno disuelto, salinidad y nutrientes). En la ¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.8 se presentan los datos registrados durante el muestreo de sedimentos en los sitios definidos para el aislamiento de actinobacterias asociadas a ambientes marino-costeros (¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.).

Tabla 8. Datos registrados durante muestreo de sedimento marino-costero Fecha Código* Profundidad Peso Sitio muestreo Colector colecta (m) (g) Manglar Boca Caño Aguas Negras MBCAN 2,75 100 José Campo 07-04-15 Boca Caño Aguas Negras BCAN 0,75 100 José Campo Salida Caño Aguas Negras SCAN 0,70 100 José Campo PBE05 Nelson 5 100 Bolaños 12-06-15 Punta Betín PBE10 10 100 Johan López PBE15 15 100 Johan López *En adelante las cepas se referirán con este código más un número.

Aislamiento y caracterización fenotípica

El aislamiento de actinobacterias cultivables a partir de las diferentes muestras, se realizó empleando medios sólidos con alta concentración de nutrientes, como el agar Tripticasa soja con 1 % de NaCl (TSA-I), Agar Marino (AM) y R2A. Una vez ingresada la muestra de sedimento, se pesaron 20 gramos en cajas de Petri estériles para someterlos a un tratamiento térmico en horno a 50 °C por 60 minutos con el fin de eliminar la microbiota vegetativa que acompañara la muestra, y se realizaron diluciones seriadas (1/10, 1/100 y 1/1.000) en agua de dilución o agua de peptona ajustada a la salinidad según el sitio de muestreo con agua de mar artificial. La siembra de cada una de las diluciones se realizó en superficie de placas de agar (0,1 mL) e incubadas a 22 ± 0,1 °C por un período de 15 días. Para obtener cultivos axénicos, se realizaron resiembras en agar según el medio de aislamiento empleado y se observaron las características fenotípicas como tinción de Gram para la diferenciación de las cepas (Revollo et al., 2012).

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A) B)

C) D)

Figura 16. Colecta de muestras. Recolección de sedimento mediante Draga Van Veen en Boca caño aguas negras- CGSM (A). Toma de parámetros fisicoquímicos (B). Recolección de sedimento mediante buceo autónomo en Punta Betín (C y D).

Bioensayos de actividad antimicrobiana

Los bioensayos de actividad antimicrobiana se realizaron por triplicado mediante el método de difusión en pozos (Cruz-Cantillo et al, 2010; Perez-Terrón et al, 2014;) y doble capa de agar (León et al., 2011; Subhan et al., 2015), contrastando inicialmente 25 cepas de actinobacterias cultivables contra microorganismos que presentan mecanismos de multirresistencia como Escherichia coli Betalactamasas de espectro extendido- BLEE y Staphylococcus aureus ATCC 43300 (Meticilino resistente) y cepas certificadas como Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 y Candida albicans ATCC 10231.

Verificación de las cepas testigo: Las cepas multirresistentes fueron evaluadas a través de un perfil de antibiograma, con el fin de verificar la presencia de resistencia a los antibióticos Cefoperazona en el caso de BLEE y oxacilina en el caso de SARM, los cuales se emplearon como controles en los bioensayos. Paralelo se realizaron tinciones de GRAM y tinción con azul de lactofenol, con el fin de determinar la pureza de las cepas.

Preparación de las cepas de actinobacterias: A partir de un cultivo de actinobacterias en crecimiento exponencial, se tomó con un asa bacteriológica de 3-5 colonias para

______Informe final BPIN VAR 2015 suspenderlas en 10 mL de agua de dilución estéril hasta alcanzar una escala 0,5 McFarland, de la cual se tomaron 1.000 µL para inocular tubos con 10 mL de caldo marino (MB) y caldo Tripticasa de soya (TSB), incubados a 22 °C por 72 horas. Esta suspensión se empleó como inóculo para el método de difusión en pozos.

En el caso del método de doble capa de agar, cada una de las actinobacterias evaluadas, fueron sembradas como macrocolonias en agar Marino (AM) y agar Tripticasa de Soya (TSA) e incubadas a 22 °C por 48-72 h.

Preparación de las cepas testigo: Previo al bioensayo, se preparó una suspensión microbiana de las cepas patógenas tomando con un asa bacteriológica de 3-5 colonias aisladas para suspenderlas en 10 mL de agua de dilución estéril hasta alcanzar una turbidez igual al estándar 0,5 McFarland (108 cel.mL-1).

Perforación de los pozos en la placa de agar: En el medio Mueller Hinton-MH solidificado, se realizaron siete perforaciones de 5 mm de diámetro con un sacabocados y se adicionaron 10 µL del mismo medio para evitar la dispersión de la muestra.

Desarrollo del bioensayo: Método difusión en agar con pozos: A partir de la suspensión de las cepas testigos ajustadas, se sembró de forma masiva en superficie de placas de agar MH previamente perforadas. A cada pozo se le adicionó 20 µL de un cultivo de 72 h de actinobacteria, para incubar a 35 °C por 24-48 h para observar la presencia de halos de inhibición.

Método de doble capa de agar: De las cepas testigo previamente ajustadas, se tomaron alícuotas de 1 mL para adicionarlos en tubos con 9 mL de agar MH fundido y se mantuvieron por 2 h a 45 °C con agitación cada 30 minutos para una fase de adaptación. Transcurrido el tiempo, cada tubo fue vertido a modo de doble capa sobre el cultivo de 72 h de actinobacterias sembradas como macrocolonias e incubado a 35 °C por 24-48 h para observar la presencia de halos de inhibición.

Actividad lignolítica

Se evaluaron 15 cepas de actinobacterias mediante pruebas de tamizaje en medios indicadores con guayacol (cualitativo), para determinar la presencia de actividad lignolítica. Inicialmente, se comparó el crecimiento por 4 días de cada cepa en los medios AM y agar nutritivo (AN) con y sin guayacol adicionado con CuSO4.5H2O. La detección de un color marrón-rojizo al inverso de la placa y alrededor de las colonias se consideró un indicador de la presencia de enzimas lignolíticas.

Extracción de ADN de los aislados que presentaron actividad biológica

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Inicialmente se tomaron las cepas MBCAN1-1 a MBCAN1-5 almacenadas a -70°C, correspondientes al aislamiento de la estación de Boca caño aguas negras del sistema lacustre del Complejo de Pajarales CGSM en abril. Las cepas fueron descongeladas a una temperatura de 37°C por un tiempo de 15 minutos en un baño termostato. Se procedió a hacer la activación de las cepas en medio sólido y líquido; con ayuda de un asa bacteriológica se hizo siembra masiva en AM y se tomaron 100µL de la cepa para adicionarlos a 10 mL de caldo nutritivo (CN), ambos cultivos se incubaron a 22°C por 48 h.

Con el fin de obtener un cultivo joven y puro para realizar la extracción del ADN, se tomó una colonia aislada de las cepas crecidas en AM y se repicó en otra placa de AM y en CN. Se incubaron a 22°C por 24 h.

A partir del cultivo AM se tomó una cantidad aproximada de 20 mg y se transfirió a un tubo con perlas para extracción. En el caso del cultivo líquido, se tomaron 2mL del medio de cultivo previamente agitado y se transfirieron a un tubo eppendorf para someter a centrifugación a 5000 g por 2 minutos a 4°C. En ambos casos se resuspendió en solución de lisis TD1 y se siguieron las indicaciones del kit Ultraclean Tissue & Cells MoBio Laboratories, Inc.

El ADN resultante se sometió a análisis espectrofotométrico y electroforético. El análisis espectrofotométrico se realizó empleando Nanodrop, y el análisis electroforético se realizó usando un gel de agarosa al 1,0 % en TBE 1X. Se sembraron 3 µL de cada muestra junto 3 µL de tampón de carga, y a continuación se corrió la electroforesis a 90 V por 40 minutos.

RESULTADOS

Aislamiento de cepas cultivables de actinobacterias

Se aisló un total de 132 cepas provenientes de caño aguas negras- CGSM (N =40) (Figura 17) y Punta Betín (N =92) (Figura 18). La mayoría de las cepas formaron colonias ligeramente húmedas y algo brillantes, predominaron las formas circulares e irregulares, aunque se observó en varios aislamientos colonias rizoides y grandes. El color de las colonias varió desde blancas a naranjas. Microscópicamente se observaron cocos Gram positivos, bacilos Gram positivos (algunos con esporas y células filamentosas). Es importante resaltar que en el aislamiento se evidenció olor a geosmina (tierra mojada) característico del grupo de las actinobacterias (Franco-Correa, 2009).

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Figura 17. Crecimiento de colonias en AM y R2A. MBCAN1 (A). MBCAN2 (B). MBCAN3 (C). SCAN1 (D). SCAN2 (E). SCAN3 (F). BCAN1 (G). BCAN2 (H). BCAN3 (I). Caño aguas negras CGSM

Figura 18. Crecimiento de colonias en Agar AM y TSA. PBE05A (A), PBE05B (B), PBE05C (C), PBE10A (D), PBE10B (E), PBE10C (F), PBE15A (G), PBE15B (H), PBE15C (I).

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En cuanto a la abundancia (Figura 19), existe diferencia significativa entre los sitios muestreados (P < 0,05), siendo mayor en Caño aguas negras-CGSM con un promedio de 3,1 x 103 ± 0,44 UFC.gr-1, mientras que Punta Betín registró un promedio de 2,8 x 102 ± 0,31 UFC.gr-1, esto se debe a que el ecosistema de manglar sustenta una amplia diversidad microbiana, favorecido por diversos factores como la rápida descomposición de hojarasca, el detrito que constituye la base de la cadena alimenticia en los ambientes marino-costeros del manglar y los exudados radicales que ofrecen una fuente de nutrientes para los microorganismos (Sánchez-Arias et al., 2010; Holguín et al., 2011).

5,00

4,50

4,00

) 3,50

1 - 3,00

(UFC.g 2,50 10

Log 2,00

1,50

1,00

0,50

0,00 Manglar caño Salida caño aguas Boca caño aguas Punta Betín 5 m Punta Betín 10 m Punta Betín 15 m Aguas negras negras negras CGSM Punta Betín Figura 19. Abundancia de actinobacterias cultivables, asociadas a ambientes marino-costeros.

Actividad antimicrobiana

Verificación de las cepas testigo: La evaluación de la sensibilidad a los antibióticos, permitió evaluar la respuesta de las cepas resistentes a los antibióticos comerciales usados como controles durante los bioensayos. Como resultado, se evidenció la presencia de la enzima betalactamasa en la cepa E. coli BLEE al observar la ausencia de inhibición por parte de la cefoperazona, un antibiótico del grupo de las cefalosporinas de tercera generación que inhibe la pared celular bacteriana (Figura 20A). Por otra parte, la cepa certificada S. aureus ATCC 43300, que incluye la respuesta resistente a los antimicrobianos meticilina y oxacilina, evidenció resistencia a la oxacilina (Figura 20B), un antibiótico betalactámico de espectro reducido que actúa inhibiendo la pared celular bacteriana (Cantón, 2010).

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A) B)

Figura 20 Perfil de antibiograma de las cepas resistentes a antibióticos comerciales. Staphylococcus aureus (A). Escherichia coli BLEE (B).

Desarrollo del bioensayo: De las 25 cepas de actinobacterias evaluadas, 11 presentaron actividad antibacteriana y 4 actividad antifúngica (Tabla 9), destacando una marcada inhibición frente a E. coli BLEE y S. aureus ATCC 43300 (SARM) por las cepas codificadas como MBCAN1-1 con 20,3 ± 0,2 mm contra S. aureus SARM, MBCAN1-2 (12,3 ± 0,8 mm; 19,4 ± 1,0 mm), MBCAN1-3 (11,3 ± 0,9 mm; 18,0 ± 0,9 mm), asimismo la cepa SCAN2-25 presentó una actividad moderada con un promedio de 11,1 ± 2,3 mm para S. aureus SARM y 13,3 ± 3,1 mm para K. pneumoniae ATCC 10031 (Figura 21). En cuanto a la levadura C. albicans ATCC 10231, el mejor promedio lo registró SCAN2-22, además no se descarta la actividad registrada de manera cualitativa a través del método de doble capa de agar por MBCAN1-1 y SCAN2-24 (Tabla 9). Estos resultados indican que las actinobacterias tienen un gran potencial antimicrobiano y representan una fuente importante de metabolitos secundarios, con una actividad de moderada a fuerte frente a cepas patógenas para humanos, incluyendo microorganismos con resistencia a antibióticos comerciales.

Tabla 9. Resultados del bioensayo de actividad antimicrobiana de actinobacterias marinas mediante los métodos doble capa de agar y difusión en pozos.

Diámetros Halo de Inhibición (mm) Método Doble capa de agar Difusión en Pozo

K. C. K. C. S. aureus S. aureus E. coli pneumoni albicans E. coli pneumoni albicans Cepa ATCC ATCC BLEE ae ATCC ATCC BLEE ae ATCC ATCC (Código) 43300* 43300* 10031 10231 10031 10231 MBCAN1-1 - - - + + +++ - - MBCAN1-2 - - - - ++ +++ - - MBCAN1-3 - - - - + +++ - - MBCAN1-4 - - - + - - - + MBCAN1-5 + ------MBCAN1-6 ------MBCAN1-7 - + ------MBCAN1-8 - + ------MBCAN1-9 ------MBCAN1------10

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MBCAN1-11 - - - - - + - - MBCAN1------12 MBCAN1------+ - - 13 MBCAN2------14 MBCAN2------15 MBCAN2------16 SCAN1-17 ------SCAN1-18 ------SCAN1-19 - - - - - + - - SCAN2-20 ------SCAN2-21 ------SCAN2-22 + + + + - + - + SCAN2-23 ------SCAN2-24 - - - + - - - - SCAN2-25 - - - - - ++ ++ - (+) = 7-11 mm (++) = 11-16 mm (+++) = Mas de 16 mm (-) = No se observó halo *Meticilino resistente (SARM).

Actividad lignolítica

Se observó que de las 15 cepas evaluadas la cepa MBCAN1-3 y SCAN2-23 presentaron un halo de color marrón en el inverso de la placa y alrededor de las colonias en crecimiento (Figura 22), por lo que son adecuadas para estudios de actividad cuantitativa. En cuanto a las demás cepas fueron capaces de crecer en los medios de cultivo con indicador, sin embargo la ausencia de degradación del guayacol puede suponer que aunque toleraron un medio contaminado, no necesariamente son capaces de degradar los contaminantes asociados. Posiblemente, su mecanismo de tolerancia estuvo involucrado con un proceso fisiológico diferente a la degradación del compuesto en mención.

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A)

B)

C)

D)

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Figura 21. Actinobacterias marino-costeras que presentaron actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos: S. aureus ATCC 43300 (A), C. albicans ATCC 10231 (B), E. coli BLEE (C), K. pneumoniae ATCC 10031. Método de difusión en agar con pozos.

A) B)

Figura 22. Bioensayos de actividad lignolítica. Cepa MBCAN1- 3 en medio agar nutritivo y agar nutritivo con guayacol (A). Cepa SCAN2-23 en medio agar nutritivo y agar nutritivo con guayacol (B).

Extracción ADN

A partir de los resultados de absorbancia se evidencia que las muestras extraídas a partir del cultivo líquido (A) presentan un mayor rendimiento y una mejor relación de pureza medida por los parámetros de relación 260/280 y 260/230 que las muestras extraídas de cultivo sólido (B) (Tabla ). De acuerdo a la relación 260/280 observada para las muestras provenientes del cultivo líquido (A) se puede afirmar que están libres de proteína alcanzando valores ideales para este parámetro >1,8. Sin embargo, la relación 260/230 no muestra un valor satisfactorio, dado que este parámetro es inferior a 2,0 en todos los casos. Si se tiene en cuenta que idealmente esta relación debería estar en el rango 2,0-2,2 es evidente la contaminación. Algunos contaminantes típicos que registran absorción a la longitud 230 nm son los contaminantes fenólicos o carbohidratos, la guanidina podría ser otro contaminante derivado de la solución de lisis del kit de extracción, se descarta el EDTA por no hacer parte del protocolo. Se recomienda un mayor tiempo de centrifugación en el paso que involucra la solución de lisis TD1, asegurando que la misma haya pasado por completo. Igualmente, en el paso de la solución TD2 se recomienda mayor tiempo (2 o 3 minutos) para asegurar que no solo se elimine toda la solución TD2, sino que cualquier residuo de la solución TD1 sea arrastrado también en este paso.

Tabla 10. Cuantificación y pureza del ADN extraído en las cepas de actinobacterias MBCAN1-1 a MBCAN1-5 Concentración Relación Relación Cepa/origen* (ng/µL) 260/280 260/230 MBCAN1-1 A 7,2 1,93 1,07 MBCAN1-2 A 48,8 1,84 1,27 MBCAN1-3 A 37,0 1,93 1,63 MBCAN1-4 A 14,0 2,04 1,55 MBCAN1-5 A 4,8 1,86 0,92

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MBCAN1-1 B 4,6 1,61 0,61 MBCAN1-2 B 4,6 1,45 0,77 MBCAN1-3 B 18,7 1,82 1,58 MBCAN1-4 B 2,5 1,59 0,60 MBCAN1-5 B 6,5 1,71 1,49 *Las muestras A corresponden a cultivos en líquido de ~24 h de crecimiento. Las muestras B corresponden a cultivos en sólido de ~24 h de crecimiento.

El análisis electroforético de las muestras, permitieron observar el barrido en la muestra MBCAN1-2 A el cual puede estar relacionado con un tratamiento fuerte en el proceso de extracción, la prolongación de algún paso más de lo deseado o vórtex excesivo (Figura 23). Por lo tanto, se recomienda un mayor cuidado en el manejo de las muestras, por ejemplo, menor tiempo de exposición a temperaturas diferentes a refrigeración o congelación. Teniendo en cuenta la ausencia de EDTA en el buffer de elución y almacenamiento, el cual inhibe DNasas (Del Aguila et al., 2005), se identifica una mayor sensibilidad de las muestras extraídas a la degradación.

Figura 23. Electroforesis de ADN de las cepas de actinobacterias MBCAN1-1 a MBCAN1-5.

CONCLUSIONES

- El ecosistema de manglar favorece el desarrollo de actinobacterias, encontrándose mayor abundancia de este importante grupo microbiano en los sitios de muestreo definidos en Caño aguas negras de CGSM que la estación marina, atribuido a los factores ambientales presentes en zonas estuarinas.

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- Las cepas empleadas en los bioensayos, tienen un gran potencial antimicrobiano y representan una fuente importante de metabolitos secundarios, con una actividad moderada a fuerte frente a cepas patógenas para humanos, incluyendo microorganismos con resistencia a antibióticos comerciales. Además, la capacidad que presentaron algunas cepas para crecer en presencia de guayacol, permitió evaluar el comportamiento de estas en ambientes contaminados con compuestos aromáticos y puedan ser empleadas en procesos de biorremediación.

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2.1.3.3 AISLAMIENTO DE HONGOS ASOCIADOS A AMBIENTES MARINO COSTEROS

RESUMEN

El ambiente marino costero resulta de gran potencial para procesos de biorremediación no solo por la gran diversidad de organismos asociada a este ecosistema, sino por sus características fisicoquímicas de salinidad y pH alcalino. En ese sentido, se propuso la bioprospección de enzimas con potencial lignolítico, en hongos asociados a ambientes marino costeros del litoral caribe colombiano, como una estrategia para la biorremediación de efluentes industriales en el sector textil y de colorantes, cuyas condiciones fisicoquímicas se caracterizan por la alta fuerza iónica y pH alcalino. Con este fin, se realizaron salidas de campo a diferentes manglares de la Ciénaga Grande de Santa Marta y en las bahías de Chengue y Nenguange, en donde se tomaron muestras de cuerpos fructíferos de hongos, material leñoso en descomposición, agua y sedimentos. En total, se obtuvieron 52 aislamientos usando los medios sólidos Boyd & Kohlmeyer y extracto de malta con rifampicina. Entre los sitios de muestreo se destacó la estación de Rinconada en la Ciénaga Grande de Santa Marta, por la gran cantidad de aislamientos obtenidos (19). De igual forma, la estación de Chengue se destacó por la abundancia de hongos macroscópicos, de donde se obtuvieron 10 aislamientos.

INTRODUCCIÓN

Colombia es un país megadiverso en donde casi el 50% de su área total es el mar. La bioprospección en los recursos marinos de Colombia ha estado enmarcada en el estudio de los productos naturales, pero poco es lo que se ha analizado en cuanto al potencial biotecnológico de las enzimas presentes en tal diversidad biológica, y aún menos en los hongos asociados a este tipo de ecosistemas.

Las ligninasas son enzimas de interés por su aplicación en procesos industriales y ambientales. Las enzimas de esta clase que han sido aisladas de hongos terrestres usualmente presentan una aplicación limitada debido a la baja estabilidad térmica y las condiciones de pH óptimo de funcionamiento que suelen encontrarse en el rango ácido. En los hongos asociados a ambientes marinos también se ha mostrado la producción de este tipo de enzimas. Si se tienen en cuenta las condiciones de salinidad y pH ligeramente alcalino del medio oceánico, así como la elevada temperatura del litoral caribe colombiano, la bioprospección de enzimas lignolíticas en organismos fúngicos asociados al medio ambiente marino nacional puede redundar en el hallazgo de proteínas con características cinéticas que permitan su empleo eficiente en procesos industriales y ambientales.

Una de las aplicaciones más importantes para este tipo de enzimas consiste en la biorremediación de efluentes industriales, por ejemplo en el sector textil y del pulpado del papel. Sin embargo, el uso de estas proteínas en dichos procesos resulta limitado

______Informe final BPIN VAR 2015 debido al pH alcalino y la carga iónica de estos efluentes que inhibe tradicionalmente a muchas de las proteínas de esta clase estudiadas hasta ahora. Por este motivo, el estudio de ligininasas de hongos derivados de ambientes marinos resulta de importante valor en la búsqueda de nuevos y mejores sistemas enzimáticos. En ese sentido, se avanzó en completar una primera de fase de estudio que incluye el aislamiento de los potenciales organismos productores de enzimas lignolíticas.

OBJETIVOS

- Analizar los sitios con presencia de manglar en el litoral caribe colombiano, que pueden servir como potencial ambiente de hongos lignolíticos. - Aislar hongos morfológicamente homogéneos para evaluar su potencial lignolítico.

MARCO CONCEPTUAL

Los microrganismos marinos representan una potencial fuente de diversidad aplicable a diferentes problemas ambientales. Entre estos, encontramos a los hongos marinos, los cuales pueden ser de tipo obligado o facultativo. Los hongos marinos obligados son aquellos que crecen y esporulan exclusivamente en un ambiente marino o estuarino; mientras los hongos marinos facultativos, son aquellos hongos terrestres o dulceacuícolas capaces de crecer y con la posibilidad de esporular en ambientes marinos. Sin embargo, en la práctica es difícil distinguir entre ambos tipos de organismos y se suelen denominar de forma conjunta como hongos asociados a ambientes marinos (Kohlmeyer y Kohlmeyer, 1979; Dix y Webster, 1995).

Entre los grupos de hongos asociados al ambiente marino se encuentran en general representantes de diferentes divisiones de hongos como basidiomicetos, ascomicetos, y zigomicetos (Surajit et al., 2006; Da Silva et al., 2008; Menezes et al., 2010). Sin embargo, los principales representantes son los ascomicetos, los cuales se caracterizan por atacar la lignina del material lignocelulósico en un estado avanzado de humedad, como es el caso de los ecosistemas marinos (Sette y Bonugli-Santos, 2013).

Los hongos producen una variedad de enzimas extracelulares, tales como proteasas, lacasas, peroxidasas, amilasas, xilanasas entre otras. Las cuales han encontrado grandes aplicaciones en el campo de las medicinas, detergentes, cosméticos, biocombustibles etc. (Damare et al., 2012). Las enzimas obtenidas de hongos asociados a ambiente marinos se consideran potenciales por su probable diferencia de aquellas producidas por hongos terrestres debido principalmente a la diversidad taxonómica y las adaptaciones a la salinidad y el pH alcalino del ambiente marino (Abe et al., 2001; Abe et al., 2006; Damare et al., 2012). Dentro de estas enzimas son de especial importancia las lignolíticas, ya sea lacasas o peroxidasas (lignina-peroxidasa, manganeso-peroxidasa y peroxidasa-versatil), puesto que catalizan la oxidación por un electrón de un amplio

______Informe final BPIN VAR 2015 grupo de compuestos entre los que se encuentran aromáticos, fenólicos, amino y otros sustratos ricos en electrones.

Uno de los campos más llamativos es la biorremediación, proceso que consiste en el uso de bacterias, hongos o plantas, o enzimas derivadas de los mismos para la degradación de contaminantes en diferentes ambientes. Este concepto involucra la biodegradación, que es la transformación parcial o total o la detoxificación de compuestos contaminantes (Gouma et al., 2014).

Dentro de los procesos de biorremediación en donde la utilización de los hongos y sus enzimas ha sido ampliamente documentado se encuentra la degradación de colorantes de efluentes de la industria textil o de plásticos. Los colorantes utilizados en este tipo de industrias son moléculas orgánicas complejas, usualmente con estructuras aromáticas tipo benceno, antraquinona y de estructura azoica. De acuerdo a la estructura, los colorantes se clasifican como catiónicos (colorantes básicos), aniónicos (colorantes directos, ácidos y reactivos) y no iónicos (colorantes dispersos) (Kaushik y Malik, 2009). Los efluentes de la industria textil con alta concentración de colorantes representan un serio problema ambiental debido a que la compleja estructura aromática de los colorantes es resistente a la luz, actividad biológica, ozono y otras condiciones medioambientales típicas en un proceso normal de degradación. Además, los colorantes iónicos y no iónicos de tipo azoico liberan aminas tóxicas debido a la reactividad de los grupos azo (Joshi et al., 2004). De esta forma la búsqueda de procesos que lleven a la reducción de la carga tóxica de este tipo de residuos constituye un campo de investigación sumamente atractivo.

MATERIALES Y METODOLOGÍA

Se realizaron dos salidas de campo a los manglares de la Ciénaga Grande de Santa M h h N ° 9’5 6”; W 74°07’33 5” N nguang N ° 9’09 2”; W 74°04’36 3” E é G Santa Marta se realizó un muestreo en las 5 estaciones de monitoreo ambiental establecidas por el Laboratorio de Calidad Ambiental Marina del INVEMAR. Estos 5 ñ N 0°5 ’4 2”; W 74°28’52 7” R N 0°57’4 0”; W 74°28’55 ” A N 0°48’35 4”; W 74°36’28 6” N 0°54’26 4”; W 74°35’ 7 4” K 22 N 0°58’39 6”; W 74°34’39 4”

Aislamiento Se tomaron muestras de sedimentos, agua, material leñoso y cuerpos fructíferos de hongos. Las muestras recolectadas fueron sembradas en cajas de Petri con medio selectivo con antibióticos para disminuir el crecimiento de bacterias y permitir el crecimiento de hongos (Tabla 11). Las diferentes cepas se resembraron sucesivamente hasta observar individuos morfológicamente homogéneos. Paralelamente, se utilizó el método de incubación en cámara de humedad para el material leñoso en estado de

______Informe final BPIN VAR 2015 descomposición. En este caso, los fragmentos de material leñoso se colocaron en frascos de compota con papel de filtro humedecido con agua de mar estéril. Una vez el micelio fue visible en estas condiciones se procedió a sembrar parte del mismo en un medio con antibiótico.

Tabla 11. Medios de cultivo empleados en aislamiento de hongos marinos.

Medio Boyd & Kohlmeyer- Agar Fórmula (g.L-1) Extracto de levadura 1,0 Peptona 2,0 Dextrosa o glucosa 10 Agar 15 Agua de mar/agua destilada 1000 mL (1:1) Rifampicina 300 mg Extracto de malta-Agar Fórmula (g.L-1) Extracto de malta 50 Agua de mar 1000 mL Rifampicina 100 mg

RESULTADOS

En la Ciénaga Grande de Santa Marta, el primer día se visitaron los sitios de Caño grande y Rinconada obteniéndose 17 muestras diferentes, las cuales estuvieron compuestas de material leñoso, sedimentos y agua cenagosa de una salinidad que osciló entre los 30-40 (Figura 24).

Figura 24. Algunas de las muestras tomadas el primer día tras recorrer los puntos de Caño grande y Rinconada en la Ciénaga Grande de Santa Marta.

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En el segundo día se visitaron las estaciones de Aguas Negras y Luna obteniéndose 13 muestras entre material leñoso en descomposición con la aparente presencia de hongos, y muestras de agua y sedimentos (Figura 25). Se destaca la presencia de un hongo de coloración naranja, el cual se observa en la esquina inferior izquierda de la figura 25. La salinidad de estas zonas osciló entre 30-50.

Figura 25. Algunas de las muestras tomadas el segundo día en las estaciones de Aguas Negras y Luna en la Ciénaga Grande de Santa Marta.

Para el tercer día se visitó la estación de Km 22, el cual es un lugar caracterizado por la alta salinidad (60-80) y en donde se pudo evidenciar una baja cantidad de muestras para potencial aislamiento. En total se recolectaron 6 muestras de esta estación entre material leñoso y muestras de agua (Figura 26).

Figura 26. Algunas de las muestras tomadas el tercer día en la estación de Km 22.

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En las bahías de Nenguange y Chengue se tomaron 16 muestras entre material leñoso en descomposición, y cuerpos fructíferos de hongos macromicetos (Figura 27). Se destaca la abundante presencia de hongos macroscópicos en relación a lo encontrado en la Ciénaga Grande de Santa Marta.

Figura 27. Algunos de los hongos muestreados en los manglares de Chengue y Nenguange

Las muestras obtenidas se sembraron en medios con antibiótico y adicionalmente se colocaron en cámara de incubación donde fue posible observar crecimiento luego de 10-15 días de incubación para algunas de las muestras (Figura 28 y 29).

Figura 28. Siembras en caja, con medio Extracto de Levadura-rifampicina, de las muestras colectadas en la Ciénaga Grande de Santa Marta y bahías de Chengue y Nenguange.

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Figura 29. Muestras sembradas en cámara húmeda, (izquierda) siembra inicial; (derecha) crecimiento luego de 11 días de incubación.

Finalmente a partir de los crecimientos observados en las cajas de Petri se aislaron colonias individuales de forma sucesiva hasta obtener individuos homogéneos morfológicamente. De estos aislamientos se presentan algunos en la figura 30.

Figura 30. Aislamientos de hongos colectados en la Ciénaga Grande de Santa Marta.

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En total se obtuvieron 35 aislamientos de hongos en la Ciénaga Grande de Santa Marta, y 17 de las bahías de Nenguange y Chengue. El origen y forma de obtención de los hongos aislados se muestra en la tabla 12. La abundancia de estos organismos según el origen de la muestra se presenta en la figura 31. Se destaca la presencia de una mayor abundancia en la estación de Rinconada, en donde se obtuvieron 19 aislamientos, lo cual es casi dos veces más con respecto al segundo sitio más abundante, que fue Caño grande. Por el contrario, de la estación de Aguas negras no fue posible aislar ninguna cepa. Es interesante resaltar que a pesar de la alta salinidad encontrada en la estación de Km 22 fue posible obtener 2 aislamientos, lo que indicó la presencia de cepas halotolerantes.

Tabla 12. Hongos aislados de los lugares muestreados.

Caño Aguas Km Ambiente/Lugar Rinconada Luna Chengue Nenguange grande Negras 22 Directo 9 1 0 3 1 10 7 Campo Cámara 0 1 0 0 0 NA NA húmeda Dilución 0 1 8 0 1 0 NA NA Agua Dilución -2 0 1 0 0 1 NA NA Dilución -3 0 0 0 0 0 NA NA Dilución 0 0 0 0 0 0 NA NA Sedimento Dilución -2 0 6 0 0 0 NA NA Dilución -3 0 2 0 0 0 NA NA TOTAL 10 19 0 4 2 10 7 Gran 52 TOTAL *NA: No aplica debido a que no se efectuó el método referenciado en la fila.

Figura 31. Abundancia de hongos derivados de ambientes marinos según el lugar de muestreo

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DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES

Es generalmente aceptado que solo cerca del 7% de toda la biodiversidad fúngica ha sido descubierta hasta ahora, dejando un elevado 93% por descubrir y estudiar (Banupriya et al., 2014). Sumado a lo anterior, la gran mayoría de los estudios han sido realizados en hongos de ambientes terrestres, lo que coloca a los de origen marino como una fuente altamente potencial de nuevos recursos biológicos, capaces de aportar a la solución de diferentes problemas de la sociedad. En Colombia, la exploración de hongos marinos es escaza, encontrándose solo el trabajo realizado por Galindo et al. (2006), en el área de San Andrés, donde se estudia el potencial de estos organismos como solubilizadores de fosfatos. De esta forma, este estudio se constituye en el primer trabajo en el caribe continental colombiano sobre la exploración de hongos asociados a ambientes marinos con el fin de evaluar su potencial lignolítico.

Los resultados en la Ciénaga Grande de Santa Marta arrojaron una mayor abundancia de organismos aislados en las estaciones de Rinconada y Caño grande, lo cual, puede estar relacionado con los cambios en las condiciones de salinidad. Dicho factor ha sido encontrado como determinante en la abundancia de los hongos en ecosistemas de manglar (Mohamed y Martiny, 2011). Otro aspecto importante que puede influir en la diversidad es la vegetación de la zona de muestreo, así como la edad de los manglares. En cuanto a la diversidad de la vegetación, solo tres especies han sido reportadas en las estaciones de muestreo, las cuales son Avicenia germinans, Laguncularia racemosa y Rhizophora mangle, siendo A. germinans dominante en la estación de Rinconada, y R. mangle en la estación de Caño grande (Ibarra et al., 2014). Con respecto a la edad de los manglares, los resultados de abundancia obtenidos en este muestreo concuerdan con una mayor abundancia de hongos en manglares de mayor edad, teniendo en cuenta que la estación de rinconada es considerada de bajo nivel de perturbación en la zona de la Ciénaga Grande de Santa Marta (Ibarra et al., 2014). Por otro lado, en las estaciones del PNN Tayrona.

Al considerar los medios de cultivo empleados en el aislamiento y purificación, no se observó una diferencia en las cepas aisladas según el medio empleado. Lo anterior, es interesante si se tienen en cuenta no solo la diferencia de nutrientes entre los dos medios, sino la diferencia de salinidad, indicando una plasticidad importante de las cepas a diferentes valores de este parámetro fisicoquímico. El crecimiento de los organismos (4-5 mm) se presentó en general en un rango entre 7-15 días, lo cual es menor a otros reportes en donde se han registrado tiempos de 21 o 28 días (Duc et al., 2009; Kossuga et al., 2012), o incluso hasta 3 meses (Houbraken et al., 2010). También es importante considerar, que a pesar del considerable número de aislamientos hechos en este trabajo, muchos organismos pueden ser pasados por alto ya que las cepas aisladas pueden depender fuertemente de los medios empleados (Bugni y Ireland, 2004).

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Adicionalmente, se observó que la metodología empleada tiene un efecto importante sobre el aislamiento de los hongos. De esta forma, se encontró que el método de cámara húmeda tuvo muy poco éxito en relación a la siembra directa de material leñoso. Este resultado es diferente de lo reportado en otras investigaciones, donde el método de cámara húmeda ha sido exitoso en el aislamiento de diversos hongos D’ et al., 2006; Mabrouk et al., 2010). Es posible que se pueda mejorar la tasa de recuperación de hongos utilizando este sistema, envolviendo los pedazos leñosos en el papel filtro, para brindar un mayor contacto con la fuente de carbono.

Se evidenció que la metodología de siembra directa de material leñoso, fragmentos de cuerpo fructífero y agua fue exitosa para el aislamiento de hongos de origen marino. El aislamiento de cepas halotolerantes constituye un paso importante hacia la búsqueda de organismos para procesos de biorremediación en ambientes de elevada fuerza iónica.

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