Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici Ústav vinohradnictví a vinařství

Porovnání anthokyanů u modrých odrůd Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: Vypracovala:

Ing. Michal Kumšta Bc. Martina Smítková

Lednice 2016

Prohlášení:

Prohlašuji, že jsem práci: „Porovnání anthokyanů u modrých odrůd“ vypracovala samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědoma, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.

V Lednici dne Podpis

……………………… ……………………

Poděkování:

Touto cestou bych chtěla poděkovat vedoucímu práce Ing. Michalu Kumštovi za odborné vedení, cenné rady a připomínky, které mi v průběhu zpracování poskytl a také za pomoc s laboratorními rozbory.

OBSAH

1 ÚVOD ...... 10 2 CÍL PRÁCE ...... 11 3 LITERÁRNÍ ČÁST ...... 12 3.1 CHEMICKÁ STRUKTURA ANTHOKYANŮ A JEJICH VÝSKYT V HROZNECH ...... 12 3.1.1 Pyranoanthokyany ...... 15 3.1.2 Vliv anthokyanů na zdraví ...... 16 3.1.3 Antioxidační vlastnosti ...... 17 3.2 AKUMULACE ANTHOKYANŮ V HROZNECH A OVLIVŇUJÍCÍ FAKTORY ...... 17 3.2.1 Vliv teploty působící na hrozny ...... 18 3.2.2 Vliv slunečního svitu ...... 18 3.2.3 Vliv vody ...... 19 3.2.4 Vliv patogenů ...... 19 3.2.5 Vliv agrotechniky ...... 20 3.2.6 Anthokyany a fytohormony ...... 20 3.2.7 Vliv výživy révy ...... 21 3.3 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ STABILITU ANTHOKYANŮ ...... 22 3.3.1 Vliv pH ...... 22 3.3.2 Vliv kyslíku ...... 23 3.3.3 Vliv teploty ...... 25 3.3.4 Vliv světla ...... 26 3.3.5 Vliv enzymů ...... 26 3.3.6 Vliv oxidu siřičitého ...... 27 3.3.7 Vliv kyseliny L-askorbové ...... 27 3.3.8 Vliv cukru ...... 27 3.3.9 Kondenzační reakce ...... 28 3.3.10 Vliv kopigmentace ...... 28 3.3.11 Autoasociace anthokyanů ...... 33 3.3.12 Proanthokyanidiny ...... 33 3.3.13 Tvorba kovových komplexů ...... 33

3.4 ZMĚNY ANTHOKYANŮ V PRŮBĚHU VINIFIKACE ...... 34 3.4.1 Karbonická macerace ...... 34 3.4.2 Vliv kvasinek ...... 35 3.4.3 Vliv malolaktické fermentace ...... 36 3.4.4 Vliv čiřících prostředků ...... 37 3.4.5 Vliv filtrace ...... 37 3.4.6 Bâtonnage a její vliv ...... 37 3.4.7 Rozpad anthokyanů ...... 38 3.5 EXTRAKCE ANTHOKYANŮ A MĚŘENÍ BAREVNÝCH PARAMETRŮ 39 3.5.1 Extrakční metody anthokyanů ...... 39 3.5.2 Měření barevných parametrů ...... 40 4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ...... 43 4.1 MATERIÁL A METODY ...... 43 4.1.1 Použitý materiál ...... 43 4.1.2 Použité metody měření ...... 45 4.1.3 Použité statistické metody ...... 51 4.2 VÝSLEDKY ...... 52 4.3 DISKUZE ...... 78 5 ZÁVĚR ...... 81 6 SHRNUTÍ ...... 82 7 SUMMARY ...... 83 8 POUŽITÁ LITERATURA ...... 84

Seznam obrázků, grafů a tabulek

Obr. 1: Chemická struktura anthokyanidinů (Velíšek, 2002)...... 13 Obr. 2: Obecně chemická struktura anthokyan 3-monoglukosidu acylovaná kys. p-

kumarovou na pozici 5 glukózy (Rʹ3 a Rʹ5 – názvy aglykonu) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005)...... 14

Obr. 3: Obecně chemická struktura anthokyan -3,5-diglukosidu (Rʹ3 a Rʹ5 – názvy aglykonu) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005)...... 15 Obr. 4: Mechanismus tvorby Vitisinu A (He et al., 2012)...... 16 Obr. 5: Schéma přímé kondenzační reakce (A-T) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005)...... 30 Obr. 6: Schéma přímé (T-A) kondenzace prokyanidinů a anthokyanů (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005)...... 31 Obr. 7: Schéma reakce mezi katechinem a malvidin-3-glukosidem v kyselém médiu v přítomnosti acetaldehydu (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005)...... 32

Graf 1: Formy anthokyanů v červeném víně po 10 měsících zrání v různých podmínkách (Michlovský, 2015)...... 23 Graf 2: Vývoj obsahu fenolů a barvy červeného vína Madiran po 6 měsících mikrooxidace (Michlovský, 2015)...... 24 Graf 3: Vývoj anthokyanů a barevné intenzity po ohřevu rmutu a lisování během alkoholové fermentace v porovnání s klasickou vinifikací (Michlovský, 2015)...... 25 Graf 4: Bilance ztrát anthokyanů do 1. stočení mladého vína (Balík, 2010)...... 35 Graf 5: Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)...... 55 Graf 6: Celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1)...... 57 Graf 7: Celkové množství fenolických látek v hroznech (g.kg-1)...... 59 Graf 8: Antiradikálová aktivita vyjádřená v množství kys. gallové v hroznech (g.kg-1)...... 61 Graf 9: Bodový graf vyjadřující celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) vs. cukernatost (ºNM)...... 64 Graf 10: Bodový graf vyjadřující celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) vs. celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)...... 64 Graf 11: Bodový graf vyjadřující celkové množství fenol. látek v hroznech (g.kg-1) vs. celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)...... 65

Graf 12: Bodový graf vyjadřující antiradikálovou aktivitu vyjádřenou v množství kyseliny gallové (g.kg-1) vs. celk. množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)...... 65 Graf 13: Krabicový graf celkového množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické (nezahrnující odrůdy tzv. barvířky) ...... 67 Graf 14: Zastoupení hlavních skupin anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd. 69 Graf 15: Krabicový graf zastoupení peonidin-3-glukosidu (%) v hroznech pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické...... 74 Graf 16: Krabicový graf zastoupení delfinidin-3-glukosidu acylovaného kyselinou p- kumarovou (%) v hroznech pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické...... 74 Graf 17: Chromatogram odrůdy ‚Rulandské modré‘...... 76 Graf 18: Chromatogram odrůdy ‚Svatovavřinecké‘...... 76 Graf 19: Chromatogram odrůdy ‚Laurot‘...... 77 Graf 20: Chromatogram odrůdy ‚Golubok‘...... 77

Tab. 1: Přehled použitých odrůd ...... 44 Tab. 2: Křížení a původ použitých odrůd ...... 45 Tab. 3: Základní analytické parametry moštu z hroznů sbíraných v jejich technologické zralosti...... 52 Tab. 4: Obsah celkových kyselin, kyseliny vinné, jablečné a glukózy + fruktózy...... 53 Tab. 5: Vzájemná korelace mezi jednotlivými proměnnými...... 63 Tab. 6: Výsledek t-testu celkového množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1), nezahrnující odrůdy tzv. barvířky, pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické...... 66 Tab. 7: Složení anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd...... 71 Tab. 8: Výsledek t-testu složení anthokyanů (%) pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické...... 73

1 ÚVOD

Barva vína je jeden z hlavních aspektů, kterých si zákazník při nákupu tohoto produktu všímá jako první. Proto je velmi důležité při výrobě věnovat pozornost právě i této vlastnosti. Finální odstín vína je závislý na mnoha faktorech, ať už je to teplota, pH, oxid siřičitý, kyslík, obsah fenolických látek případně i světlo. Barva budoucího vína se však dá ovlivnit již přímo ve vinici a to například způsobem agrotechniky, výživou révy, ochranou před patogeny, vodním režimem a v neposlední řadě volbou odrůdy. Barevná škála červených vín se pohybuje od cihlově červené, granátové, rubínové až k fialově červené, případně se vyskytuje i odstín modrý. Anthokyany jsou sekundární rostlinné metabolity, které zodpovídají za charakteristické zbarvení hroznů. Lokalizovány jsou především ve slupce, případně i v dužnině u odrůd tzv. barvířek. Množství anthokyanů je závislé na mnoha faktorech- především je to odrůda, ročník, klimatické podmínky apod. Na celkový anthokyanový profil má pak vliv právě odrůda. Kvalitní péče o hrozny již ve vinici je základem pro produkci hodnotného vína s odpovídající barvou. Správné agrotechnické zásahy, jako je udržování optimální listové stěny nebo třeba regulace násady hroznů, mohou výrazně pomoci k vyššímu množství anthokyanů a tím i k intenzivnější barvě vína. Protože jsou anthokyany velmi nestabilní sloučeniny, mění se jejich složení během celé výroby vína. Význam je přikládán jak kvasinkám, filtraci, různým čiřícím prostředkům tak také např. jablečno-mléčnému kvašení. Avšak i nesprávné skladování může mít dopad na změnu anthokyanů a tím i na výslednou barvu vína.

10

2 CÍL PRÁCE

Cílem této diplomové práce je prostudovat literaturu týkající se tématu anthokyanů, zaměřit se na jejich formy a strukturu. Dále vybrat moštové odrůdy révy vinné a to jak klasické tak interspecifické. Následně provést uvologický rozbor zralých hroznů a stanovit jejich základní analytické parametry. Poté provést extrakci bobulí metanolem a v extraktu pak stanovit profil anthokyanů. Nakonec získané výsledky zpracovat vhodnou statistickou metodou a vyhodnotit je.

11

3 LITERÁRNÍ ČÁST

3.1 CHEMICKÁ STRUKTURA ANTHOKYANŮ A JEJICH VÝSKYT V HROZNECH

Anthokyany jsou nejčastější skupinou ve vodě rozpustných rostlinných pigmentů (Balík, Kumšta a Rop, 2013). Nacházejí se nejhojněji ve slupce hroznů a u některých odrůd (tzv. barvířek) také v dužnině (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Barvířky obecně obsahují mnohem vyšší koncentraci anthokyanů než ostatní odrůdy a často se používají pro míchání ke zvýšení barvy červeného vína (Guan et al., 2012). Anthokyany jsou přítomny ve velkém množství i v listech a to zejména na konci vegetačního období (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Tyto sekundární rostlinné metabolity jsou zodpovědné za charakteristické červené, modré a fialové zbarvení (Mori et al. 2007). Termín anthokyan pochází z řeckého anthos (květ) a kyanos (modrý) a byl uveden německým lékárníkem Ludwig Clamor Marquartem pro označení modrých pigmentů v modrých květinách (týkající se původně Chrpy polní) (Bueno et al., 2012). Anthokyanový profil a jejich celkové množství je do značné míry odrůdovou záležitostí. Významný vliv však také hraje ročník, klimatické podmínky či půdní složení (Monagas, Gomez-Cordoves a Bartolome, 2005). Ovšem anthokyanový profil zůstane přibližně stejný bez ohledu na to, kde se odrůda pěstuje. Přírodní podmínky hrají roli hlavně v úrovni celkových anthokyanů (Balík, Kumšta a Rop, 2013). Odlišné vinařské technologie pak ovlivňují obsah anthokyanů v budoucím červeném víně (Monagas, Gomez-Cordoves a Bartolome, 2005). Přestože jsou všechny strukturální geny v buňkách hroznu, které se podílejí na anthokyanové biosyntéze, uložené na membráně endoplazmatického retikula nebo v cytoplazmě, kde jsou anthokyany přímo produkovány, téměř všechny anthokyany se hromadí ve vakuolách. To znamená, že efektivní intracelulární transport anthokyanů z místa jejich syntézy do místa, kde jsou uloženy, je stěžejní problém. Zatímco biosyntéza anthokyanů byla důkladně prozkoumána, jen málo je známo o anthokyanovém transportu (He et al., 2010). Anthokyany jsou tvořeny z anthokyanidinů vázaných na cukr glykosidickou vazbou (Moreno, 2012). Tyto anthokyanidiny (nebo aglykony) sestávají z aromatického kruhu A vázaný na heterocyklický kruh C, obsahující kyslík, který je vázán vazbou uhlík-uhlík na třetí aromatický kruh B (Castaneda-Ovando et al., 2009).

12

Jedná se o polymetoxyderiváty a polyhydroxideriváty 2-fenylbenzopyryliového či flavyliového kationtu (Bueno et al., 2012). V poloze C-4‘ se nacházejí všechny sloučeniny, které jsou zde substituovány hydroxylovou skupinou. Vzájemně se však odlišují substitucí v polohách C-3, C-5, C-6, C-7, C-3‘ a C-5‘ (Balík, 2010). Vzhledem k tomu, že molekuly anthokyanů obsahují uhlíkový skelet C6-C3-C6, jsou klasifikovány mezi přirozeně se vyskytující fenoly jako flavonoidy. V podstatě se jedná o heteroglykosidy sestávající z cukerné složky a aglykonu. Molekuly anthokyanů jsou vždy glykosylovány buď v poloze C-3-O (monoglukosidy) nebo doplňkově v poloze C-5-O (diglukosidy) a do teď byla v anthokyanech, přirozeně se vyskytujících v hroznech, objevena pouze glukóza a jedna neidentifikovatelná pentóza (Balík, Kumšta a Rop, 2013).

peonidin pelargonidin kyanidin (fialový) (šarlatově červený) (fialový)

delfinidin petunidin malvidin (purpurově modrý) (purpurově modrý) (purpurový)

Obr. 1: Chemická struktura anthokyanidinů (Velíšek, 2002).

Dominantní postavení mezi anthokyanovými barvivy zaujímá malvidin-3- glukosid (dříve nazývaný oenin) (Pavloušek, 2011). Ovšem jeho množství v hroznech a následně ve víně je závislé na konkrétní odrůdě. Může se pohybovat od 50 % (u odrůdy ‚Sangiovese‘) až kolem 90 % (u odrůdy ‚Grenache‘) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

13

Mezi další aglykony běžně se vyskytující v hroznech patří kyanidin-3-glukosid, delfinidin-3-glukosid, petunidin-3-glukosid a peonidin-3-glukosid (Pavloušek, 2011). Pelargonidin, byl registrován v hroznech V. amurensis a jeho hybridech. V hroznech jsou anthokyany nejčastěji acylovány, neboli esterifikovány fenolickými kyselinami. Nejvíce s p-kumarovou a octovou kyselinou a příležitostně také s kávovou, pyrohroznovou a ferulovou kyselinou (Balík, Kumšta a Rop, 2013).

Obr. 2: Obecně chemická struktura anthokyan 3-monoglukosidu acylovaná kys. p-

kumarovou na pozici 5 glukózy (Rʹ3 a Rʹ5 – názvy aglykonu) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

Avšak ne všechny hrozny Vitis vinifera L. obsahují acylované anthokyany. Například široce pěstovaný kultivar ‚Rulandské modré‘ nesyntetizuje acylované anthokyany a ostatní anthokyany jsou taky na nízké úrovni. Kromě toho, další druhy hroznů jako Vitis rotundifolia a Vitis amurensis také neakumulují žádné acylované anthokyany ve své slupce (Pavloušek, 2011). Především odrůdy Vitis vinifera L. a taky některé interspecifické odrůdy obsahují monoglukosidy, zatímco diglukosidická barviva (a to především malvidin-3,5- diglukosid) můžeme nalézt jak u některých interspecifických odrůd tak hlavně u divokých odrůd Vitis spp. (Pavloušek, 2011). Interspecifické odrůdy pocházejí z mezidruhového křížení evropské révy a amerických druhů rév, mající svůj původ v USA a Kanadě, kde volně v lesích roste mnoho druhů rodu Vitis (Kraus, 2003). Do šlechtění interspecifických odrůd byly později zapojeny i asijské druhy, hlavně Vitis amurensis Rupr. Důvodem šlechtění těchto odrůd je jejich zvýšená rezistence k houbovým chorobám (Pavloušek, 2011).

14

Triglukosidické anthokyany se v hroznech nevyskytují. Diglukosidy jsou stabilnější než monoglukosidy, avšak jsou náchylnější na zhnědnutí. Monoglukosidy mají zase tendenci být více barevné (Jackson, 2008).

Obr. 3: Obecně chemická struktura anthokyan -3,5-diglukosidu (Rʹ3 a Rʹ5 – názvy aglykonu) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

Odrůdy Vitis vinifera L. syntetizují pouze monoglukosidické anthokyany. Chybí jim totiž dominantní alela regulující produkci diglukosidu. První generace vzniklá křížením s Vitis vinifera L. a interspecifickou odrůdou produkuje jak mono- tak diglukosidované anthokyany. Složité hybridy, zahrnující jedno nebo více zpětných křížení s Vitis vinifera L., produkují pouze monoglukosidické anthokyany, v případě, že už neobsahují dominantní alelu pro syntézu diglukosidů (Jackson, 2008). Obecně barva anthokyanů závisí jak na podmínkách v médiu (pH, obsahu oxidu siřičitého), tak také na molekulární struktuře či životním prostředí (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Uvolnění anthokyanů nastává hned na počátku macerace, kdy dojde k rozrušení slupky. Barvivo se prostřednictvím difuze uvolňuje z vakuol ze slupek (představující místo s vysokou koncentrací) rovnou do moštu či vína (místo s nízkou koncentrací). Tuto difuzi ovlivňuje řada faktorů: ať už se jedná o propustnost buněk, teplotu, obsah alkoholu, koncentrační gradient či typ molekul s jejich molekulární hmotností (Pavloušek, 2009).

3.1.1 Pyranoanthokyany

Obecně se předpokládá, že některé odvozené anthokyany, jako například pyranoanthokyany, se nevyskytují v čerstvých hroznech, nýbrž ve zrajících červených

15 vínech (He et al., 2010). K jejich tvorbě dochází díky reakci mezi anthokyany a molekulami s nízkou molekulovou hmotností jako je 4-vinylfenol, kyselina pyrohroznová či flavonoly (Castaneda-Ovando et al., 2009). Příkladem pyranoanthokyanů je vitisin A. Vzniká reakcí mezi malvidin-3-O- glukosidem a kyselinou pyrohroznovou, která je významným meziproduktem alkoholového kvašení. Tudíž se předpokládá, že se vitisin A v čerstvých hroznech objevit nemůže. Podobně vitisin B vzniká reakcí mezi malvidin-3-O-glukosidem a acetaldehydem, který je hlavním produktem oxidace etanolu (He et al., 2010).

Obr. 4: Mechanismus tvorby Vitisinu A (He et al., 2012).

Pyranoanthokyany jsou vysoce stabilní a odolné vůči bělícím účinkům oxidu siřičitého a oxidačnímu rozkladu, a proto mohou významně přispět k barevné stálosti červených vín. Nicméně většina pyranoanthokyanů má žlutou až oranžovou barvu a přispívají k „tawny“ (hnědo-oranžovému) odstínu vína, který je typický pro stárnoucí červená vína, s výjimkou nově objeveného typu, portisinu, který je modrý (He et al., 2012). Tento pyranoanthokyan vzniká reakcí s vynilflavanolovými deriváty (Pozo- Bayon et al., 2004).

3.1.2 Vliv anthokyanů na zdraví

V dnešní době je zájem o anthokyany v důsledku jejich relativně hojného množství ve stravě velmi vysoký. Pravidelná konzumace anthokyanů a jiných polyfenolů v ovoci a zelenině je spojena s pravděpodobným snížením rizika chronických onemocnění. Anthokyany představují pigmenty s celou řadou biologických

16 aktivit, včetně antioxidačních a protizánětlivých vlastností. Také chrání před tvorbou rakovinových buněk a snižují riziko ischemických chorob srdečních (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011).

3.1.3 Antioxidační vlastnosti

Zdravotní vlastnosti anthokyanů jsou přičítány jejich typické chemické struktuře, protože jsou reaktivní vůči reaktivním formám kyslíku, jako např. hydroxidovým radikálům, singletovému kyslíku, superoxidovým radikálům, peroxidu vodíku a také reaktivním formám dusíku (Bueno et al., 2012).

3.2 AKUMULACE ANTHOKYANŮ V HROZNECH A OVLIVŇUJÍCÍ FAKTORY

Biosyntéza anthokyanů je obvykle ovlivněna řadou environmentálních faktorů jako je vystavení slunečnímu záření, teplota, voda, UV záření a další. Ty mohou významně pozměnit obsah i složení anthokyanů v hroznech ovlivněné strukturálními a regulačními geny (He et al., 2010). Anthokyany se ve slupce hromadí asi dva týdny před tím, než je jejich barva viditelná (Ribéreau-Gayon, Branco, 2005). Jejich akumulace probíhá v hypodermální vrstvě buněk slupky a u některých odrůd se ve větším množství hromadí hlavně na konci vegetačního období. Změny obsahu anthokyanů se mění během zrání bobulí a prochází několika fázemi. V první fázi množství anthokyanů narůstá velmi pozvolným tempem. V druhé fází se rychlost akumulace prudce zvyšuje a v poslední fázi se již množství stabilizuje a na konci zrání a při přezrávání hroznů dochází dokonce k poklesu anthokyanů (Balík, 2010). Anthokyany se obvykle hromadí asi o týden později po tom, co dochází k masivní akumulaci cukrů, což znamená, že cukry obsažené ve slupce mají úzký vztah s biosyntézou anthokyanů. Nicméně existují dva kontroverzní názory na tento vztah. První říká, že cukry ve slupce hrají roli regulátoru v syntéze anthokyanů. Zatímco druhý říká, že cukry jsou důležité pro tvorbu anthokyanů pouze jako substráty. Nicméně nově bylo zjištěno, že cukry mohou zvýšit expresi genu F3H (flavanon-3-hydroxylázy) a následně hromadění anthokyanů, což přináší nový důkaz pro první názor (He et al., 2010). Jestliže obsah cukru v hroznech dosáhne 40-60 g.l-1, započne se tvorba anthokyanů. Pokud se množství cukru přiblíží hodnotě 220-230 g.l-1, nastává jejich

17 snížení. Jestliže v hroznu dojde k zastavení akumulace barviva v období jeho plné zralosti, nemusí to vždy nutně představovat ztrátu barvy v budoucím víně. Naopak to mnohdy může pomoci extrahovatelnosti anthokyanů ze slupek (Balík, 2010). Během zrání se postupně zvyšuje množství malvidin-3-glukosidu a peonidin-3- glukosidu, zatímco ostatní anthokyanové monoglukosidy mají tendenci se snižovat. Děje se tak nejspíš díky tomu, že jak malvidin-3-glukosid tak také peonidin-3-glukosid jsou konečnými produkty biosyntézy anthokyanů (Canals et al., 2005).

3.2.1 Vliv teploty působící na hrozny

Na obsah anthokyanů má značný vliv také teplota, a to především v době dozrávání hroznů. Pozitivní vliv na vyšší intenzitu zbarvení mají denní teploty pohybující se okolo 15-25 ˚C. Noční teploty by se měly pohybovat v rozmezí 10-20 ˚C (Balík, 2010). Naopak vysoké teploty přes 35 ˚C jsou spojeny s degradací a inhibicí akumulace anthokyanů. Nejnižší koncentrace anthokyanů je obvykle získána v nejteplejších letech, zatímco chladnější roky jich produkují více (He et al., 2010). V horkých oblastech je akumulace anthokyanů ve slupkách potlačena. Jakékoliv globální oteplování atmosféry může ovlivnit zrání hroznů v budoucnu. U hroznů pěstovaných při vysokých teplotách bylo pozorováno snížení obsahu jednotlivých anthokyanidinů s výjimkou malvidinu. Obecně, metylace, acylace a glykosylace vedou k tepelné stabilitě anthokyanů. Pokud vysoká teplota zvyšuje rychlost degradace anthokyanů, je logické, že pouze deriváty malvidinu, které patří mezi vysoce metylované anthokyany se akumulují a ostatní anthokyany díky vysokým teplotám klesají. Kromě toho, tyto změny v anthokyanovém složení v důsledku vysoké teploty mají rovněž význam pro kvalitu hroznů a následně vína, protože mění odstín a intenzitu barvy hroznů (Mori et al., 2007).

3.2.2 Vliv slunečního svitu

Jako zdroj energie pro fotosyntézu je sluneční světlo bezpochyby jedním z nejdůležitějších klimatických faktorů ovlivňujících vývoj bobule. Vzhledem k tomu, že sluneční světlo obsahuje jak viditelné tak infračervené (tepelné) záření a velké množství z absorbovaného záření se uvolňuje ve formě tepla, je často obtížné oddělit světelný efekt od teplotního efektu. Vystavení hroznů slunečnímu záření je obecně nezbytné pro syntézu flavonolů a také podporuje akumulaci anthokyanů a navozuje

18 hluboké zabarvení hroznů. Nicméně toto zjištění není univerzální a je odrůdově závislé (Jackson, 2008). Intenzivní sluneční záření způsobuje spálení osluněných bobulí a snižuje tak akumulaci anthokyanů. S tím související zvýšení teploty může také rozvoj barvy inhibovat. Také odlistění v zóně hroznů podporuje vystavení slunečnímu záření a tím poškození slunečním úpalem, čímž opět dochází ke snížení akumulace anthokyanů (He et al., 2010).

3.2.3 Vliv vody

Stav vody je dalším environmentálním faktorem ovlivňující biosyntézu anthokyanů. V průběhu zrání může vodní deficit tuto biosyntézu velmi významně stimulovat, což vede k jejich zvýšené akumulaci (He et al., 2010). Pěstování révy vinné s omezeným přívodem vody bylo dlouhou dobu považováno jako agronomický nástroj pro zlepšení obsahu polyfenolů v bobulích. Ačkoliv koncentrace anthokyanů a dalších fenolických látek soustavně roste v reakci na vodní deficit, není jasné, zda je toto zlepšení pouze díky inhibovanému růstu bobule, ztrátě vody a koncentraci rozpuštěných látek, nebo zda vodní stres aktivně spouští biosyntézu polyfenolů (Shi et al., 2015). Obecně u révy vinné vodní deficit způsobuje menší velikost bobulí a tím také mění její látkové složení. Větší bobule mají totiž relativně vyšší množství rozpouštědla (vnitřní mezokarp) pro rozpustné látky (sekundární metabolity v exokarpu) než bobule menší, kvůli nižšímu poměru povrch:objem (Roby et al., 2004). Vodní deficit zvyšuje akumulaci anthokyanů, a to prostřednictvím stimulace hydroxylace anthokyanů, pravděpodobně pomocí genu kódující enzym F3050H (flavonoid-30,50-hydroxyláza). Tento enzym přeměňuje hydroxylované anthokyanidiny (kyanidin a delfinidin) do svých metoxylovaných derivátů (peonidin, petunidin a malvidin). Hlavními anthokyany syntetizovanými při vodním deficitu jsou peonidin- 3-O-ß-glukosid a malvidin 3-O-ß-glukosid. Protože metoxylace delfinidinu vedoucí k produkci derivátu petunidinu se objevuje pouze zřídka, zdá se, že vodní stres má větší dopad na anthokyanové složení než na jeho celkovou koncentraci (Chaves et al., 2010).

3.2.4 Vliv patogenů

Eutypin, neboli [4-hydroxy-3-(3-methyl-3-buten-1-ynyl)benzaldehyd], je toxin produkovaný patogenem zvaným Eutypa lata, způsobující eutypové odumírání révy

19 vinné. I když tento toxin nesnižuje expresi několika strukturních genů, podílejících se na syntéze anthokyanů, jako Chs (chalkosyntáza), F3H (flavanon-3-hydroxyláza), Dfr (dihydroflavonolreduktáza) a Ans (anthokyanidinsyntáza), může ovšem výrazně snížit expresi genu Ufgt (UDP-glukosoflavonoidglykosyltransferáza) a tím následně inhibovat akumulaci anthokyanů v hroznech (He et al., 2010). U hroznů napadených Padlím révovým je vidět významný pokles koncentrace anthokyanů ve srovnání se zdravými hrozny. Anthokyany kyanidin-3-glukosid a peonidin-3-glukosid byly postiženy méně. Zejména barevná intenzita byla ve vínech vyrobených z napadených hroznů snížena. Navíc tato vína vykazovala vyšší množství koutarové kyseliny, kaftarové kyseliny a trans-resveratrolu, pravděpodobně v důsledku zvýšení produkce fenolických látek, jako reakce na napadení patogenem (Amati et al., 1996). Negativní vztah mezi obsahem trans-resveratrolu a anthokyanů ve vínech ze zdravých a napadených hroznů, potvrzuje pozorování, že biosyntetické dráhy flavonoidů a fytoalexinů, si v průběhu zrání konkurují (Piermattei et al., 1999). Také Plíseň šedá, která produkuje řadu enzymů, jako kutinázu, proteinázu, glukanázu, lipázu či lakázu ovlivňuje barvu. Právě lakáza se podílí na destrukci anthokyanů. Tvoří se ve slupce a to velmi rychle (Michlovský, 2015).

3.2.5 Vliv agrotechniky

Agrotechnika je také důležitým faktorem, ovlivňujícím množství anthokyanů v hroznech. Jestliže dojde až k 50 % redukci násady hroznů, celkový obsah anthokyanů se zvýší. Odlistění v zóně hroznů již nemá na celkové množství anthokyanů takový vliv (Balík, 2010). Ovšem u odrůdy ‚Tempranillo‘ bylo zjištěno, že brzká defoliace zlepšila fenolové složení a napomohla akumulaci hydroxyskořicových kyselin, flavonolů a anthokyanů. Na druhou stranu, jiná studie prováděná u odrůdy ‚Cabernet Sauvignon‘ ukazuje, že při provádění defoliace v různých vývojových stádiích révy, je pro množství anthokyanů nejvýznamnější období dozrávání hroznů. Nicméně bez ohledu na načasování defoliace, je tento agrotechnický zásah pro zvýšení obsahu anthokyanů pozitivní (Baiano et al., 2015).

3.2.6 Anthokyany a fytohormony

Fytohormony, také známé jako rostlinné hormony, regulují růst rostlin. Ačkoliv jsou obvykle produkovány v extrémně nízkých koncentracích, mohou regulovat mnoho

20 aspektů růstu rostlin. Aplikace exogenních fytohormonů může výrazně modifikovat expresi genů podílejících se na biosyntéze anthokyanů, stejně jako produkci a akumulaci těchto látek v bobuli. Kyselina abscisová (dále ABA) je fytohormon reagující na stres, a to zejména na stres způsobený vodou. Jestliže je rostlina omezena v růstu na základě stresu z nedostatku vody, dojde u ní ke zvýšení obsahu ABA. Již v roce 1980 bylo zjištěno, že ABA může zvýšit obsah anthokyanů ve slupce a její aplikace by mohla výrazně zvýšit barevnou vlastnost hroznů. Také se ukázalo, že ABA může výrazně podporovat produkci anthokyanů a s tím spojenou aktivitu CHI (chalkonisomerázy), což je stěžejní enzym ve flavonoidní dráze biosyntézy anthokyanů. Roztok kyseliny abscisové by mohl podstatně zvýšit výtěžek anthokyanů bez negativního vlivu na kvalitu sklizených hroznů (He et al., 2010).

3.2.7 Vliv výživy révy

Nízký obsah dusíku v půdě patrně podporuje syntézu anthokyanů, zatímco vysoké koncentrace ji potlačují. Tento efekt je pravděpodobně důsledkem vlivu dusíku na vegetativní růst a následného zastiňování a jeho dopadu na zralost plodů (Jackson, 2008). Jedna ze studií, prováděných na odrůdě ‚Cabernet Sauvignon‘, se zabývala různými dávkami hnojení dusíkem (0, 60 a 120 kg. ha-1) a jeho následným vlivem na anthokyanová barviva. Analýza anthokyanů jasně prokázala významné rozdíly mezi nízkou dávkou dusíku (tedy bez hnojení dusíkem- 0 kg.ha-1) a mezi dávkou vysokou (120 kg.ha-1). Rozdíl mezi hnojením v množství 60 a 120 kg.ha-1 však nebyl patrný. Nejvyšší hladina anthokyanů byla zjištěna u zralých bobulí, u kterých přihnojení dusíkem neproběhlo (tedy dávka 0 kg.ha-1) (Soubeyrand et al., 2014). Je známo, že nedostatek fosforu a síry u mnoha rostlin zvyšuje obsah anthokyanů. V révě vinné nedostatek fosforu indukuje mezižilkové zčervenání listů, jak to však ovlivňuje syntézu anthokyanů v bobulích je nejasné. Ovšem vysoká hladina draslíku může snížit pH bobule a tím zredukovat jak barvu plodu tak také stabilitu u červených vín (Jackson, 2008).

21

3.3 FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ STABILITU ANTHOKYANŮ

Molekuly anthokyanů nejsou příliš stabilní a jejich koncentrace ve víně prudce klesá v prvních několika měsících během toho, jak víno zraje. Molekuly anthokyanů kompletně zmizí během několika let, i když víno zůstává červené. Toto snížení je způsobeno díky kombinacím reakcí s různými jinými sloučeninami ve víně, zejména s tříslovinami (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Stabilita anthokyanů je ovlivněna několika faktory, jako je pH, teplota skladování, chemická struktura, jejich koncentrace, světlo, kyslík, přítomnost enzymů, flavonoidy, rozpouštědla, proteiny a kovové ionty (Castaneda-Ovando et al., 2009).

3.3.1 Vliv pH

Anthokyany můžeme nalézt v různých chemických formách v závislosti na hodnotě pH v roztoku. Při pH 1 jde o flavyliový kation, jedná se o převládající druh a přispívá k červené a fialové barvě. Při hodnotě pH 2-4 převažují chinonické modré formy. V Rozmezí pH 5-6 mohou být pozorovány pouze dvě bezbarvé formy a to karbinolová pseudobáze a chalkon (Castaneda-Ovando et al., 2009). Chalkony jsou velmi slabě žluté barvy a existují ve dvou izomerních formách cis a trans (Ribéreau- Gayon, Traduction, 2005). U pH hodnoty vyšší než 7 dochází k degradaci anthokyanů v závislosti na jejich substitučních skupinách (Castaneda-Ovando et al., 2009). U mladých červených vín se anthokyany vyskytují převážně v dynamické rovnováze mezi pěti hlavními molekulárními stavy: jeden vázaný na oxid siřičitý a čtyři volné formy. Většina forem je bezbarvých v rozmezí pH, které je typické právě pro víno. Červená barva pochází primárně z malého podílu anthokyanů, které jsou ve flavyliovém stavu. Podíl závisí i na množství volného oxidu siřičitého ve víně (Jackson, 2008). Stabilita anthokyanů je ovlivněna substituenty na kruhu B a přítomností dalších hydroxylových nebo metoxylových skupin, které snižují stabilitu aglykonu v neutrálním médiu. Proto je pelargonidin nejstabilnější anthokyanidin. Aglykony, monoglykosidy a většinou diglykosidické deriváty jsou stabilnější v neutrálním pH. Toto chování je vysvětleno tím, že molekuly cukru zabraňují degradaci nestabilních zprostředkovatelů na fenolické kyseliny a aldehydové sloučeniny. Na základě výzkumu anthokyanové stability a barevných variací v závislosti na pH se usuzuje, že významná

22 změna v barvě těchto sloučenin je v alkalické oblasti v důsledku jejich nestability (Castaneda-Ovando et al., 2009).

3.3.2 Vliv kyslíku

Kyslík nemá vliv na celkovou koncentraci anthokyanů, ale zvyšuje podíl červené barvy a odolnost proti bělícím účinkům oxidu siřičitého. Hustota barvy se také může v průběhu zrání vína v nerezových tancích snížit, přídavek kyslíku tomu ovšem brání. Obecně skladování vína v nádobách nepřístupných pro vzduch vede k nižší koncentraci barvy. Teplota hraje v těchto reakcích také důležitou roli. Přídavek kyslíku by měl být kontrolován a nikoliv dávkován ve velkém množství. To by mohlo způsobit nadměrné množství acetaldehydu, přílišnou polymeraci a srážení barevné hmoty (du Toit et al., 2006). Také zdravotní stav hroznů je v tomto případě velmi důležitý, protože jinak může dojít k reakcím, které se podílejí na snížení barvy (Steidl, 2006). Graf 1 ukazuje, že k poklesu anthokyanů u provzdušňování dochází především u jejich volných forem. Provzdušněním se však zvyšuje podíl anthokyanů vázaných na třísloviny, které zůstávají stálé. Dochází sice k poklesu celkových anthokyanů, avšak počet molekul v barevném stavu roste a to vysvětluje vyšší barevný odstín. Navíc vázané formy velmi barvu stabilizují (Michlovský, 2015).

Graf 1: Formy anthokyanů v červeném víně po 10 měsících zrání v různých podmínkách (Michlovský, 2015).

23

V průběhu zrání a stárnutí vína může být použitím dubových sudů podporována reakce s acetaldehydem. Tyto sudy umožňují průnik kyslíku a oxidaci vína, stejně jako uvolnění ellagových tříslovin. Tyto třísloviny mohou sloužit jako oxidační kofaktory. Také mikrooxidace tuto reakci podporuje. Nicméně pokud víno oxiduje příliš rychle, může dojít k rozpadu anthokyanové reakce a tím ke ztrátě barvy, případně k tvorbě glyoxylové kyseliny či žlutého pigmentu (xanthylium) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Mikrooxidace je technika, kdy se do vína přidává malé množství kyslíku. Používá se především ke stabilizaci barvy u červených vín, protože malá dávka kyslíku pomáhá polymerizační reakci mezi anthokyany a tříslovinami. Obecně se celkové množství anthokyanů sníží, ale to co se vytvoří v kombinaci s taniny, vede k produktu s intenzivnější a stabilnější barvou než na začátku (Polo, Moreno-Arribas, 2008). V mikrooxidaci se mohou nastavit přesné dávky rozpuštěného plynu. Ten pak zajistí správný vývoj barvy a její stabilizaci (Graf 2) (Michlovský, 2015).

*) OD 420/OD 520; OD 420 a OD 520 = optická hustota v 1 mm tloušťky při 520 a 420 nm

Graf 2: Vývoj obsahu fenolů a barvy červeného vína Madiran po 6 měsících mikrooxidace (Michlovský, 2015).

Citlivost anthokyanů na oxidaci je ovlivněna přítomností ortho-difenolů na kruhu B. Sousední hydroxylové skupiny o-difenolů jsou citlivé na enzymatické

24 a neenzymatické oxidace. S výjimkou lakázy, nejvíce oxidaci polyfenolů ovlivňuje pouze o-difenol poloha. Protože malvidin ani peonidin nemají hydroxylové skupiny situovány na ortho-pozici, jsou poměrně odolné vůči oxidaci. Odolnost proti oxidaci je taktéž ovlivněna konjugací s cukernou složkou či jinými sloučeninami. Hydratované (hemiketalové nebo karbinolové) formy anthokyanů ochotně reagují s o-dichinony generovanými oxidací. Reakční produkt je bezbarvý a chemicky nestabilní (Jackson, 2008). Jestliže dochází k přímé reakci mezi červenými anthokyany, které se nacházejí ve formě pozitivního kationu flavylia, a molekulou flavanolu (katechinu), vzniká bezbarvá sloučenina flaven. Jeho oxidací se pak tvoří červený pigment (Michlovský, 2015).

3.3.3 Vliv teploty

Teplota zpracování a skladování má na rychlost rozkladu anthokyanů velmi významný vliv (Balík, 2010). Zahřívání hroznů nebo moštu (termovinifikace) sice vede ke zlepšení extrakce barviva, ale destabilizuje autoasociaci anthokyanů. To může vést k vážné ztrátě barvy během zrání vína, jestliže se nedostatečně extrahují taniny ze slupek. Taniny totiž upřednostňují tvorbu anthokyano-tříslovinových polymerů (Jackson, 2008).

*) OD 420/OD 520; OD 420 a OD 520 = optická hustota v 1 mm tloušťky při 520 a 420 nm Graf 3: Vývoj anthokyanů a barevné intenzity po ohřevu rmutu a lisování během alkoholové fermentace v porovnání s klasickou vinifikací (Michlovský, 2015). 25

Přestože existuje několik variant postupů termovinifikace, základní typ obnáší zahřátí slupek na teplotu 60-70 ˚C na velmi krátkou dobu, společná extrakce s moštem, lisování a zchlazení před začátkem fermentace. Tepelné poškození hypodermální buněčné membrány uvolňuje anthokyany a denaturuje polyfenoloxidázy, což brání proti hnědnutí moštu. (Sacchi, Bisson a Adams, 2005) Nicméně termovinifikace může ovlivnit kvalitu budoucího vína (El Darra et al., 2016). Zatímco ochlazování má na obsah celkových polyfenolů v budoucím víně pouze malý efekt, zmrazení hroznů před následnou fermentací má efekt mnohem větší. Zmrazení totiž způsobuje praskání buněk v bobulích, lámání buněčné membrány a tím následné uvolnění anthokyanů (Sacchi, Bisson a Adams, 2005).

3.3.4 Vliv světla

Světlo ovlivňuje anthokyany dvěma různými způsoby. Je nezbytné pro biosyntézu anthokyanů, ale také urychluje jejich degradaci. Anthokyany si svou barvu udrží mnohem lépe v prostředí bez světla. U anthokyanů, na které působilo světlo a u anthokyanů uložených ve tmě, obojí při pokojové teplotě, byl rozdíl pozorován již během 24 hodin (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011). Světlo má také negativní význam pro stabilitu anthokyanů během skladování, jestliže je přítomen i cukr (Amr and Al-Tamimi, 2007).

3.3.5 Vliv enzymů

Pektolytické enzymy jsou běžně používány pro zvýšení barvy červeného vína. Umožňují rozklad buněčné stěny slupek a tím uvolňování pigmentů. Ovšem čistota enzymového preparátu je velmi důležitá, protože přítomnost ß-glukosidáz může anthokyany převést na méně stabilní aglykony, což má za následek ztrátu barvy (Sacchi, Bisson a Adams, 2005). Polyfenoloxidázy jsou enzymy způsobující hnědnutí moštu za přítomnosti kyslíku. Díky těmto enzymům, které působí hlavně na aglykony anthokyanů a esterů fenolových kyselin, dochází k přeměně na chinony. Další enzymy představují některé hydrolázy, jako například glukosidáza. Ta odštěpuje cukry z anthokyanů. Ve víně se pak nachází pouze jejich aglykony (Michlovský, 2014).

26

3.3.6 Vliv oxidu siřičitého

Siřičitany přidávané v potravinářství způsobují odbarvení anthokyanů. Děje se tak díky adici siřičitanového aniontu na molekulu anthokyanu v polohách 2 nebo 4 za vzniku bezbarvých derivátů síry. Reakce je vratná, barva může být generována okyselením či ohřevem. Ovšem koncentrace siřičitanů vyšší než 10 g.l-1 způsobuje nevratné zničení anthokyanů (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011). Přídavek oxidu siřičitého na rmut má velmi pozitivní účinky, protože zabraňuje ztrátám barviv. Děje se tak na základě zpětné redukce oxidačně labilních složek. Oxid siřičitý dále zpomaluje či dokonce inaktivuje účinky polyfenoloxidáz a vyvazuje anthokyany do bezbarvých sloučenin, ze kterých se posléze uvolňují (Balík, 2010). Oxid siřičitý také sice zvyšuje extrakci fenolických látek a to včetně anthokyanů, nicméně právě anthokyany vázající se na oxid siřičitý pak nejsou schopny polymerizovat s prokyanidiny. To může nepříznivě ovlivnit dlouhodobou stabilitu barvy (Jackson, 2008). U Odrůdy ‚Zweigeltrebe‘ došlo po 77 dnech skladování a po přídavku oxidu -1 siřičitého v množství 40 mg.l k poklesu volných, polymerizovaných a kondenzovaných anthokyanů o 13 %. Celkové množství anthokyanů se snížilo o 27 % (Datzberger et al., 1992).

3.3.7 Vliv kyseliny L-askorbové

Přídavek kyseliny L-askorbové do různých šťáv je běžnou praxí v potravinářském průmyslu. Přidává se zejména jako ochrana proti oxidaci. Nicméně kombinace kyseliny L-askorbové a anthokyanů může být v přítomnosti kyslíku vzájemně destruktivní (Talcott et al., 2003). U odrůdy ‚Zweigeltrebe‘ po 77 dnech skladování způsobil přídavek kyseliny L- askorbové v množství 150 mg.l-1 změny v celkovém složení anthokyanů. Došlo k poklesu celkových a volných anthokyanů o 20 %. Obsah anthokyanidinových chloridů se snížil o 37 %. Ke změně malvidin chloridu nedošlo na základě nejvyšší stability tohoto anthokyanu v červeném víně. Peonidin a petunidin chlorid poklesl o 10 % (Datzberger et al., 1992).

3.3.8 Vliv cukru

Vliv přídavku cukru na stabilitu anthokyanů závisí jak na jejich struktuře, tak také na jejich koncentraci, ale i na typu cukru. Obecně je však známo, že cukry,

27 stejně jako jejich degradační produkty, snižují stabilitu anthokyanů (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011).

3.3.9 Kondenzační reakce

Anthokyany se ve slupkách nacházejí v monomerním stavu, čili pouze jako jednotlivé molekuly, které jsou velmi reaktivní, nestabilní a zodpovědné za barvu mladých červených vín (Balík, 2010). Jakmile dojde k podrcení hroznů, začnou se tvořit polymerizované pigmenty a jejich množství se postupně s časem zvyšuje (Sacchi, Bisson a Adams, 2005). Polymerizace je jev, kdy se několik jednotlivých malých molekul sloučí a vytvoří velké molekuly a teprve díky tomu je barva vína stabilní. Některé odrůdy obsahují pouze monomerní anhtokyany a u jiných dochází k polymerizaci už ve slupce. ‚Rulandské modré‘ je typickým příkladem odrůdy obsahující pouze monomerní anthokyany, díky tomu není jeho barva příliš stabilní (Steidl, 2006). Do konce prvního roku 50-70 % barviva reaguje do polymerizovaných forem. Ty jsou důležité pro dlouhodobou barevnou stálost vína, protože jsou méně citlivé na změnu pH a jsou také odolnější vůči odbarvovacím účinkům oxidu siřičitého. Mezi postfermentační faktory, které se podílejí na polymerizaci pigmentů, patří především čas, vyšší skladovací teplota a nízký obsah oxidu siřičitého (Sacchi, Bisson a Adams, 2005). U starších červených vín se mohou tvořit vysokomolekulární nerozpustné kondenzační produkty mající hnědočervenou barvu, které vytváří sedimenty nazývané flobafeny. Kromě flavonoidů se na jejich vzniku mohou podílet i jiné složky vína jako např. kyselina askorbová, proteiny, ionty kovů nebo redukující cukry (Velíšek, 2002).

3.3.10 Vliv kopigmentace

Kopigmentace je jev, při kterém pigmenty a jiné nebarevné organické složky tvoří molekulární komplexy či sdružení. To obecně vede ke zvýšení absorbance a v některých případech také k posunu ve vlnové délce maximální absorbance pigmentu (Boulton, 2001). Obsah volných anthokyanů je v mladém víně nejvyšší a každým rokem se tento počet během zrání vína snižuje na polovinu. Barva přesto zůstává zachována a to proto, že zde vznikají velmi stabilní tanino-anthokyanové komplexy, které jejich funkci převezmou (Steidl, 2006).

28

Spojení mezi pigmenty a kopigmentačními kofaktory (označované také jako kopigmenty), se týká anthokyanových glykosidů, určitých fenolových kyselin, flavonoidů a zejména derivátů flavonolů a flavonových podskupin. To představuje téměř polovinu pozorované barvy u mladých červených vín (Boulton, 2001). Kopigmentace neboli kopigmentační efekt se dělí na intermolekulární a intramolekulární. Intramolekulární kopigmentace je více účinná jako ochrana proti nukleofilní adici vody, která vede ke ztrátě barvy (Brouillard, Chassaing a Fougerousse, 2003). Propojují-li se navzájem jednotlivé části molekul anthokyanu, pak se jedná právě o intramolekulární kopigmentaci. To co navzájem propojuje anthokyany a kopigmenty jsou s největší pravděpodobností vodíkové můstky. O intramolekulární kopigmentaci se hovoří v případě, že jsou anthokyany acylované deriváty hydroxyskořicových kyselin (Balík, 2010). Kopigmentaci ovlivňuje i hodnota pH. Čím je pH vyšší, tím bývá kopigmentace výraznější (Czibulya et al., 2015). Při nízkém pH zahrnuje kopigmentace především anthokyany ve flavyliovém stavu. Zdá se, že autoasociace anthokyanů je důležitá pro barvu hroznů, zatímco kopigmentace je důležitější pro purpurové zbarvení mladých červených vín (Jackson, 2008). Tyto kopigmentační komplexy přijímají „sendvičovou“ konfiguraci, která chrání flavyliový chromofor před nukleofilní adicí vody, čímž se alespoň částečně zabrání tvorbě bezbarvého hemiketalu a chalkonu. Anthokyany tak vykazují intenzivnější barvu, v závislosti na hodnotě pH (Polo, Moreno-Arribas, 2008). Rozdílné mechanismy zapojující se do kondenzace anthokyanů a tříslovin mohou produkovat sloučeniny s různými vlastnostmi, a to podle typu vazby. Přímá kondenzační reakce: anthokyan tanin (A-T) Anthokyany, které jsou ve formě kationtu (A+) reagují s nukleofilními místy (6 nebo 8) prokyanidinů a vznikají tak bezbarvé flaveny (A-P). V přítomnosti kyslíku nebo v oxidativním médiu se pak zbarvují. Formy AO-P a A+-P jsou v rovnováze (Obr. 5) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Při této reakci vznikají velmi stabilní, ovšem malé kondenzační molekuly. Vznik těchto molekul probíhá pomalu a především v reduktivních podmínkách (Steidl, 2006). Jestliže reakce probíhá právě v těchto podmínkách, při teplotě vyšší než 20 ˚C a v přítomnosti flavanolů, dochází ke snížení barvy, která se díky provzdušňování může navrátit (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Po dehydratační reakci mezi hydroxylovými skupinami v poloze C-5 kruhu A

29 anthokyanu a v poloze C-8 kruhu A flavan-3-olu vzniká nový heterocyklický pyranový kruh, vytvořený mezi dvěma mateřskými kruhy, tzv. pigment xanthylium. Ten je zodpovědný za žluto-oranžové zbarvení (He et al., 2012).

Glukóza

Anthokyan ve formě flavyliového + kationtu (A 1 )

Glukóza

+ Anthokyan ve formě flavyliového kationtu (A4 ) Tanin (R= více či méně polymerizovaný flavanol)

Glukóza

Bezbarvý flaven (A-P)

Glukóza Glukóza

+ Červená forma (A -P) Nafialovělá forma (AO-P)

Obr. 5: Schéma přímé kondenzační reakce (A-T) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

30

Kondenzace tanin anthokyan (T-A) Protonací molekuly prokyanidinů vzniká karbokationt reagující s nukleofilními místy (6 a 8) molekul anthokyanů nacházejících se ve formě neutrálních karbinolových bází (Obr. 6). Takhle vytvořený komplex je bezbarvý a po dehydrataci mění barvu na oranžovo-červenou. Probíhá v reduktivním prostředí. Udržování vína v lahvích či vzduchotěsných nádobách poskytuje příznivé podmínky pro tento typ kondenzace (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

Glukóza

Karbokationt (R= více či méně Anthokyan ve formě karbinolové báze polymerizovaný flavanol) (Prokyanidin P)

Glukóza

T-AOH komplex (bezbarvý)

Glukóza

T-A komplex (červený)

Obr. 6: Schéma přímé (T-A) kondenzace prokyanidinů a anthokyanů (Ribéreau- Gayon, Traduction, 2005).

Pro výslednou barevnost vína je důležitý poměr mezi anthokyany a taniny. Jestliže je obsah taninů vyšší, pak kondenzace probíhá intenzivně. Třísloviny reagují i navzájem mezi sebou a tím dochází k oranžové až hnědé barvě vína. Naopak jestliže

31 je obsah taninů nízký, pak kondenzace probíhá pouze omezeně. Velké množství anthokyanů tak zůstane v monomerní formě a tím dochází k nestabilitě a nižší barvě. Dokonalý stav by byl, jestliže by reagovala pouze jedna molekula anthokyanu s jednou molekulou fenolu, avšak vyhovující je poměr mezi anthokyany a taniny 5:1 (Steidl, 2010). Třetí typ představuje nepřímé reakce a to kondenzace prostřednictvím ethyldienového můstku. Acetaldehyd tvoří v kyselém médiu karbokationt, který reaguje nejprve s nukleofilními místy (4 a 8) flavanolů (katechiny, prokyanidiny) a následně s anthokyany, které jsou ve formě neutrální karbinolové báze (AOH). Mezi uhlíky C-8 se tvoří vazebný můstek přednostně (Obr. 7) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

Glukóza

Malvidin-3-glukosid

Katechin

Glukóza

Obr. 7: Schéma reakce mezi katechinem a malvidin-3-glukosidem v kyselém médiu v přítomnosti acetaldehydu (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

32

Právě proto, že je acetaldehyd produktem oxidačně-redukčních reakcí během zrání vína v podmínkách mikrooxidace, stává se tak vazebným prostředníkem mezi flavonoidy původně nebarevnými (např. katechiny) a anthokyany (Balík, 2010). Celý průběh reakce však závisí na pH média a také na poměru množství reagujících flavanolů a anthokyanů. Pokud se v médiu s obsahem (+)- katechinem a to při pH 3,1, zvyšuje molární poměr mezi katechinem a malvidinem od 1 do 10, dochází současně ke změně barvy z červeno-fialové do oranžové. Barva je více oranžová s dimerním prokyanidinem B-3, reaguje-li však (-)- epikatechin s monoglukosidem malvidinu, pak barva přechází do více purpurové (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005).

3.3.11 Autoasociace anthokyanů

O autosociaci anthokyanů hovoříme, jestliže dojde ke spojení dvou a více molekul anthokyanů (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011). Komplexy autoasociace jsou tvořeny vertikální výstavbou molekul anthokyanů a jsou stabilizovány především prostřednictvím hydrofobní interakce, odehrávající se mezi jejich aromatickými jádry. Bylo zjištěno, že čím vyšší stupeň metoxylace anthokyanového kruhu B, tím je větší rozsah této autoasociace (Gonzalez-Manzano et al., 2008).

3.3.12 Proanthokyanidiny

Proanthokyanidiny neboli kondenzované taniny jsou oligomerní a polymerní flavan-3-oly (Labarbe et al., 1999). Patří do skupiny flavonoidů. Výraz proanthokyanidiny odkazuje na reaktivitu těchto molekul, které uvolňují červené anthokyanidinové pigmenty při zahřátí v kyselém prostředí (Robinson, 2006). Proanthokyanidiny přispívají k dlouhodobé stálosti barvy vína díky jejich kombinaci s anthokyany (Canals et al., 2005).

3.3.13 Tvorba kovových komplexů

Pouze kyanidin, delfinidin a petunidin, které mají více než jednu volnou hydroxylovou skupinu v chromanovém kruhu, jsou schopné kovové chelatace. Nejčastějšími kovy, tvořící komplexy s anthokyany, jsou cín, měď, železo, hliník, hořčík a draslík. Oxidační stav iontů železa hraje klíčovou roli v tvorbě kopigmentačních komplexů (Cavalcanti, Santos a Meireles, 2011).

33

3.4 ZMĚNY ANTHOKYANŮ V PRŮBĚHU VINIFIKACE

Anthokyany se extrahují již při maceraci rmutu a zejména hned na začátku alkoholového kvašení. Pokud obsah alkoholu dosáhne určité úrovně, je pozorováno snížení těchto molekul (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). Maximální množství anthokyanů je pouze několik dní po fermentaci a obsah anthokyanů klesá v důsledku jejich adsorpce na buněčné stěny kvasinek, shluky ve formě koloidního materiálu s vinnými solemi a následném odstranění při filtraci a krášlení vína. Hydrolytické reakce stejně jako kondenzační reakce s jinými fenoly během výroby také změní anthokyanové složení vín. I přes všechny tyto změny, se anthokyanový profil vína používá jako chemotaxonomická kritéria pro zjištění rozdílů mezi jednotlivými odrůdami, lokalizací vinohradů a výnosů, ročníků a vinařské technologie (Polo, Moreno-Arribas, 2008). Během tradičního způsobu výroby vína, je pouze asi 40 % anthokyanů z hroznů přeneseno do vína. Takto omezená extrakce je především z důvodu nedostatečné propustnosti buněčných stěn a cytoplazmatických membrán (El Darra et al., 2016).

3.4.1 Karbonická macerace

Mnoho studií ukázalo, že karbonická macerace způsobuje rozdíly ve fenolickém profilu ve srovnání s ostatními mladými víny, vyrobenými různými vinifikačními postupy. U vín vyrobených karbonickou macerací je typický nízký obsah taninů. Dále je zde zaručena správná extrakce anthokyanů ze slupek. Extrahovatelnost anthokyanů se však obecně zvyšuje během zrání hroznů, v důsledku degradace buněčné stěny slupky pektolytickými enzymy, změny v polysacharidovém složení, obsahu celulózy a stupni metylace pektinů. Vína vyráběná karbonickou macerací se také vyznačují vysokým obsahem vitisinu B, vyplývající z vysoké koncentrace acetaldehydu, který je produkován anaerobním metabolismem. Nicméně byl pozorován nízký obsah celkových a monomerních anthokyanů (Pace et al., 2014). U vína vyrobeného z odrůdy ‚Cascade‘ karbonickou macerací, byl po čtyřech měsících stárnutí zjištěn nižší obsah anthokyanů a také polymerizovaných pigmentů, než u vína probíhajícího klasickou fermentací na slupkách (Sacchi, Bisson a Adams, 2005).

34

3.4.2 Vliv kvasinek

Různé kvasinkové metabolické interakce s fenolickými látkami hroznů, zahrnující několik vinylových a karbonylových metabolitů, mohou mít vliv na barvu a trpkost červeného vína. Acetaldehyd, kyselina pyrohroznová, kyselina ketoglutarová a vinylfenoly mohou reagovat s anthokyany za vzniku pyranoanthokyanů. Kromě polysacharidů hroznů, také polysacharidy kvasinek mohou reagovat s anthokyany a zlepšovat tak barevnou stálost vína. Ovšem některé kvasinky mohou vývoj barvy ve víně ovlivnit negativně, a to vazbou anthokyanů do buněčné stěny (2-6 % z celkového množství anthokyanů) nebo produkcí anthokyanin-D-glukosidázy či exoglukanázy, které uvolňují odpovídající, avšak nestabilní anthokyanidiny (Polo, Moreno-Arribas, 2008). Odlišné kmeny kvasinek významně ovlivňují celkový fenolický profil vína a tím i jeho výslednou barvu. Je to způsobeno adsorpcí barviva buňkami kvasinek. Hlavní látky, které jsou obsaženy ve stěnách buněk vinných kvasinek, se nazývají glukany a mannany. Na vnější straně stěny se nacházejí mannoproteiny (Balík, 2010). Adsorbční proces má významné důsledky pro kvalitu vína, protože značné množství hroznových pigmentů zůstává na povrchu buněčných stěn kvasinek v množství větší než 10m2.l-1 (Caridi, 2013).

Graf 4: Bilance ztrát anthokyanů do 1. stočení mladého vína (Balík, 2010).

35

Stejně jako struktura anthokyanů tak i fyzikálně-chemické vlastnosti velmi ovlivňují adsorpční schopnost kvasinek. Velkou roli zde hraje právě i hodnota pH. Na základě snížení její hodnoty dochází ke zvýšení adsorpce. Také anthokyany s více volnými hydroxylovými skupinami (polárnější anthokyany) jsou u adsorpce více preferovány. Důležitou roli ve výsledné barvě vína hraje také ß-glukosidázová aktivita vinných kvasinek. Jestliže byl při kvašení použit kmen s nízkou ß-glukosidázovou aktivitou, ztráta barviva byla nižší. Avšak monoglukosidy petunidinu, malvidinu a delfinidinu vykazovaly vyšší stabilitu než monoglukosidy peonidinu a kyanidinu (Balík, 2010).

3.4.3 Vliv malolaktické fermentace

Vývoj barvy červeného vína pokračuje po alkoholové fermentaci působením bakterií Oenococcus Oeni při jablečno-mléčném kvašení. Nedávné studie prokázaly, že malolaktická fermentace ovlivňuje barvu červeného vína nezávisle na změně pH a že ztráta barvy může být spojena se snížením koncentrace polymerního pigmentu. I když je známo, že acetaldehyd a kyselina pyrohroznová můžou hrát roli při tvorbě polymerních pigmentů, následky degradace těchto sloučenin bakteriemi Oenococcus Oeni na barvu červeného vína nejsou známi. Navíc ani není známo, jestli u těchto bakterií probíhá adsorpce anthokyanů na jejich buněčné stěny, jako je tomu u kvasinek (Burns a Osborne, 2015) . Ovšem (Polo, Moreno-Arribas, 2008) tvrdí, že změna barvy červených vín po malolaktické fermentaci koresponduje se snížením intenzity modré barvy. Je to právě zejména z důvodu adsorpce anthokyanů, zvláště metoxylovaných, na buněčnou stěnu bakterií. Studie prováděná u odrůd ‚Rulandské modré‘ a ‚Merlot‘ ukazuje, že zpoždění malolaktické fermentace po dobu až tří měsíců má za následek podobnou koncentraci polymerních pigmentů a monomerních anthokyanů jako u vína, ve kterém malolaktická fermentace neproběhla. Tato vína, s opožděným jablečno-mléčným kvašením, však stále vykazovala ztrátu barvy při 520 nm ve srovnání s kontrolou. Přídavek acetaldehydu, který byl během malolaktické fermentace metabolizován bakteriemi Oenococcus Oeni, obnovil přibližně polovinu barvy a polymerních pigmentů ztracených během jablečno-mléčného kvašení. Naopak po přidání kyseliny pyrohroznové nebylo žádné zlepšení v barvě nalezeno. Výběr Oenococcus Oeni kmenů, které nemetabolizují

36 acetaldehyd, také mohou minimalizovat barevnou ztrátu během malolaktické fermentace (Burns, Osborne a Edwards, 2011).

3.4.4 Vliv čiřících prostředků

Různé čiřící prostředky jako je želatina či albumin mohou ovlivnit barvu u mladých červených vín. Děje se tak v důsledku srážení pigmentů. Rozdíly v chování jednotlivých vín jsou v důsledku odlišného profilu fenolických látek. Anthokyany a třísloviny jsou molekuly obsahující benzenová jádra s přilehlými hydroxylovými skupinami. Tyto skupiny jsou považovány za hlavní zdroj vodíkových vazeb v tvorbě komplexu mezi želatinou a anthokyany ve víně (Gonzalez-Neves, Favre a Gil, 2014). Například u odrůdy ‚Vinhao‘, kde se sledoval vliv různých čiřících prostředků, bylo zaznamenáno nejvýznamnější snížení množství anhtokyanů při použití PVPP (polyvinylpolypyrrolidonu) a kaseinu (Castillo-Sanchez et al., 2008). V případě dalších čiřidel, jako je bentonit, bylo taktéž pozorováno snížení intenzity barvy (Gonzalez-Neves, Favre a Gil, 2014). Kromě toho, že je bentonit vhodný prostředek pro srážení termolabilních bílkovin, mimo jiné ve větším množství adsorbuje anthokyany. Bylo zjištěno, že v případě čiření červeného vína sodnovápenatými bentonity byly ztráty barviva nižší než v případě použití vápenatých bentonitů. Díky tomu, že červená vína mohou přirozeně bílkoviny stabilizovat vlastními tříslovinami a bentonity dokážou barvu vína negativně ovlivnit, používání tohoto čiřícího prostředku se u těchto vín příliš nedoporučuje (Balík, 2010).

3.4.5 Vliv filtrace

Mikrofiltrace má vliv na snížení intenzity barvy u červených vín. Například u odrůdy ‚Pinotage‘ bylo po 3,5 měsících po filtraci zjištěno snížení celkové koncentrace barvy o 11 % ve srovnání s vínem nefiltrovaným. Redukce barvy u filtrovaného vzorku může být způsobena zadržováním fenolických sloučenin, jako jsou taniny, membránou filtru (Buffon, Heymann a Block, 2014).

3.4.6 Bâtonnage a její vliv

Ihned po fermentaci jsou některá vína stočena z kalů a jiná na nich ještě po dobu 3-8 měsíců zůstávají. Tato metoda se nazývá bâtonnage. Během této doby sice mohou buněčné stěny kvasinek dobře absorbovat anthokyany, avšak mrtvé kvasinkové buňky mohou uvolňovat některé sloučeniny, které by mohly přispívat pro stabilizaci

37 barvy. Z některých studií také vyplývá, že zrání na kvasničních kalech má také ochranný účinek na obsah celkových monomerních anthokyanů (He et al., 2012). Děje se tak na základě uvolňování polysacharidů a mannoproteinů během autolýzy, které pak vytváří ochranný efekt právě pro monomerní anthokyany. Červeno-modrá barva, za kterou jsou tyto anthokyany zodpovědné, tak trvá déle (Palomero et al., 2007).

3.4.7 Rozpad anthokyanů

K odbourávání neboli rozpadu anthokyanů dochází velmi snadno a způsobuje ztrátu barvy vína. Všechny reakce vedoucí k rozpadu anthokyanů jsou nevratné. Proto je dobré napomáhat kondenzaci mezi tříslovinami a anthokyany. Odbourávání anthokyanů se děje na základě působení světla, určité teploty či oxidace (Michlovský, 2014).

Pomocí záření

Jestliže jsou anthokyany vystaveny působení ultrafialového, viditelného či ionizujícího záření, dochází k jejich nestabilitě. Pak dochází k rozkladu, který probíhá především jako fotooxidace. K fotochemickému rozkladu jsou citlivější anthokyany, které jsou substituované na C-5 hydroxylovou skupinou a fluoreskují, v porovnání s anthokyany nesubstituovanými v poloze C-5 (Velíšek, 2002).

Pomocí teploty

Ohřev anthokyanů přes 100 ˚C způsobuje blednutí barvy, které se stává výraznější až v průběhu času. Děje se tak díky posunu v rovnováze vůči chalkonu a bezbarvé formy. Jakmile bylo zahřátí jednou provedeno, původní barva se již nikdy nevrátí bez ohledu na následující podmínky (teplota, čas, tma, atd.) (Ribéreau-Gayon, Traduction, 2005). (Danisman, Arslan a Toklucu, 2015) uvádí, že barva hroznového moštu je během zahřátí vážně narušena, ovšem je to nejčastěji používaný způsob pro prodloužení trvanlivosti hroznového moštu. Během zahřívání anthokyany v důsledku své vysoké reaktivity degradují. U hroznového moštu z rodu Muscadine bylo během tepelné pasterizace při 75 ˚C po dobu 15 sekund pozorována degradace 24 % anthokyanů.

38

Pomocí peroxidu vodíku

Kyselina askorbová může způsobit destrukci anthokyanů a to nepřímo pomocí peroxidu vodíku, který vzniká oxidací právě kyseliny askorbové. Z malvidin-3,5- diglukosidu může díky oxidaci peroxidem vodíku vzniknout malvon, který je bezbarvý (Velíšek, 2002).

3.5 EXTRAKCE ANTHOKYANŮ A MĚŘENÍ BAREVNÝCH PARAMETRŮ

3.5.1 Extrakční metody anthokyanů

Při získávání barviva z rostlinného materiálu je důležité jeho mechanické zpracování. Rozrušení buněk zahajuje sled aktivních biochemických a fyzikálních procesů probíhající až do tvorby koncentrační rovnováhy pigmentů ve fázi tuhé a kapalné. A právě jak mechanický pohyb tak také určitý stupeň rozmělnění rostlinného materiálu rozhoduje o rychlosti k dosažení rovnováhy a koncentraci barvy ve fázi kapalné. Aby však mohlo dojít k získání pigmentů z rostlinného materiálu, je dobré znát jejich rozpustnost v odlišných rozpouštědlech. Rozpustnost anthokyanů je možná jak v metanolu, v etanolu tak i ve vodě (Balík, 2010). Extrakce pomocí metanolu je o 20 % účinnější než pomocí etanolu a o 73 % efektivnější než voda (Ju a Howard, 2003). Jestliže je však do vody přidán etanol, metanol, kyselina chlorovodíková či kyselina siřičitá pak se extrahovatelnost a její rychlost z rostlinného materiálu zvýší. K rozpuštění anthokyanů však nedochází v chloroformu, dietyleteru a v absolutním acetonu (Balík, 2010).

Extrakce anthokyanů za pomoci ultrazvuku, hydrostatického tlaku a v elektrickém pulzním poli

U této metody extrakce byla porovnávána šedesátiminutová extrakce slupek modrých odrůd hroznů a to při teplotě 70 ˚C, za působení vysokého hydrostatického tlaku (600 MPa), ultrazvukem (35 kHz) a v elektrickém pulzním poli (3kV.cm-1). U všech výše jmenovaných druhů technologie bylo po 1 hodině zjištěno o 50 % vyšší množství všech fenolických látek vzhledem k extrakci ve vodě. Nejvyšší množství anthokyanů bylo však pozorováno při použití technologie extrakce v elektrickém pulzním poli (Corrales et al., 2008).

39

Tlaková kapalinová extrakce

Tlaková kapalinová extrakce představuje rychlou, efektivní a k životnímu prostředí šetrnou extrakci anthokyanů z modrých hroznů (Hohnová, Štavíková a Karásek, 2008). U této metody extrakce došlo k získání anthokyanů ze sušených slupek modrých hroznů právě pomocí tlakové kapalinové extrakce. S okyselenou vodou při teplotě 80- 100 ˚C bylo dosaženo výsledků podobných jako při použití 60 % okyseleného metanolu či v kombinaci s acetonem. Tlak použití při této metodě odpovídal hodnotě 10,1 MPa (Ju a Howard, 2003). Při extrakci anthokyanů pomocí patnáctiminutové statické kapalinové extrakce ze sušených slupek odrůdy ‚Alibernet‘ bylo pozorováno u koncentrovaného metanolu při teplotě 40 ˚C nejvyšší množství monoglukosidických anthokyanů. Se zvyšující se teplotou došlo ke snížení obsahu anthokyanů (Hohnová, Šťavíková a Karásek, 2008).

Extrakce vodným roztokem oxidu siřičitého

(Cacace a Mazza, 2002) dosáhli nejvyšší extrakce anthokyanů z bobulí černého rybízu při použití vodného roztoku oxidu siřičitého (1,1 g.l-1) a to při teplotě 35 ˚C v extrakčním poměru 19:1.

Extrakce anthokyanů pomocí mikrovln

(Liazid et al., 2011) využili při extrakci anthokyanů z hroznů mikrovlnnou troubu. Bylo použito rozpouštědlo (50-80 % MeOH ve vodě), magnetické míchání, teplota (50-100 ˚C), čas (5-20 min), mikrovlnná trouba o výkonu (100 až 500 W), objem rozpouštědla (25-50 ml).

3.5.2 Měření barevných parametrů

Spektrofotometrické metody analýzy anthokyanů

(Fuleki a Francis, 1968) celkový obsah anthokyanů měřili spektrofotometrickou metodou, která je založená na měření rozdílů v hodnotách absorbance extraktů anthokyanů získaného v pufru s pH 1 (0,2 mol.l-1 chloridu draselného a 0,2 mol.l1 kyseliny chlorovodíkové (v poměru 25:67)) a pH 4,5 (1,0 mol.l-1 octanu sodného a 1,0 mol.l-1 kyseliny chlorovodíkové a deionizované vody (v poměru 100:60:90)) při 520 nm

40

(spektrofotometrem Helios β/Unicam). Koncentrace celkového množství anthokyanů byla vyjádřena na základě obsahu malvidin-3-glukosidu s použitím hodnot molární absorptivity (28 000 l mol-1 cm-1) a molekulové hmotnosti (562,5 g.mol-1). Získané hodnoty byly konvertovány na hodnoty vyjadřující obsah anthokyanů v čerstvých -1 hroznech v g.kg .

Chromatografické metody stanovení anthokyanů

Principem metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (neboli HPLC- High performance liquid chromatography) je pohyb látky (vzorku) v systému dvou fází (mobilní a stacionární). Mobilní fázi představuje kapalina a fází stacionární je buď pevná látka, nebo i kapalina, která však musí být zakotvena na vhodném pevném nosiči a nesmí být s kapalnou látkou mobilní fáze mísitelná. Fáze stacionární má umístění v koloně, kterou za stálého tlaku prochází fáze mobilní. Stanovovaná látka je nanášena na kolonu a během migrace stále rozdělena na dvě fáze. Z této látky se jedna část pohybuje s mobilní fází a zbylá část se sorbuje na stacionární fázi. Následně je vzorek rozdělen na určitý počet zón, které představují jednotlivé složky. U těchto zón dochází ke snímání detektorem a k převádění na zapisovač pomocí píků. V chromatografu pak poloha píku znázorňuje kvalitu a plocha množství složky, která je zkoumána (Goldmann, 1999). Vysoce účinná kapalinová chromatografie je schopná stanovením jednotlivých anthokyanů; kondenzovaných a oligomerních produktů barviv, identifikovat složení barviv červených vín (Naczk a Shahidi, 2004). Chromatografie s reverzní fází (RP-HPLC) zahrnuje jakoukoliv chromatografickou metodu, která využívá hydrofobní (nepolární) stacionární fázi a mobilní polární fázi. Jedná se o nejpoužívanější HPLC metodu v praxi. Silikagel představuje nejčastější nosič stacionární fáze. Na jeho povrchové hydroxylové skupiny je navázán vhodný ligand- oktadecylový uhlíkový řetězec (-C18), oktylový uhlíkový řetězec (-C8) či fenylový aromatický cyklus (Phe). Mobilní fázi nejčastěji představují směsi vody nebo pufru s polárními organickými rozpouštědly (hlavně acetonitril nebo metanol). Výsledkem je, že hydrofobní molekuly v polární mobilní fázi mají tendenci se adsorbovat na hydrofobní stacionární fázi a hydrofilní molekuly v mobilní fázi prochází kolonou a jsou eluovány nejdříve. (Molnar a Horvath, 1976)

41

Mikroseparační techniky jako kapilární zónová elektroforéza (CZE) či kapilární kapalinová chromatografie (CLC) jsou používány pro pokročilejší separace monomerních anthokyanů (Bednář et al., 2005). K identifikaci separovaných anthokyanů pomocí chromatografie se využívají jak jednoduché UV/VIS detektory, tak také detektory typu diodového pole (HPLC/DAD) pomocí měření ve viditelné části spektra (Balík, 2010).

42

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

4.1 MATERIÁL A METODY

4.1.1 Použitý materiál

Celkový obsah anthokyanů a jejich profil byl stanoven u 23 odrůd Vitis vinifera L.: ‚Acolon‘, ‚Agni‘, ‚Alibernet‘, ‚André‘, ‚Ariana‘, ‚Cabernet Cubin‘, ‚Cabernet Dorio‘, ‚Cabernet Dorsa‘, ‚Cabernet Franc‘, ‚Cabernet Mitos‘, ‚Cabernet Moravia‘, ‚Cabernet Sauvignon‘, ‚Carménère‘, ‚Dornfelder‘, ‚Frankovka‘, ‚Merlot‘, ‚Modrý Portugal‘, ‚Nitranka‘, ‚Neronet‘, ‚Rulandské modré‘, ‚Svatovavřinecké‘, ‚Váh‘, ‚Zweigeltrebe‘ a u 9 mezidruhových kříženců: ‚Cerason‘, ‚Golubok‘, ‚Kofranka‘, ‚Laurot‘, ‚MI-5-70‘, ‚MI-5-114‘, ‚Marlen‘, ‚Nativa‘ a ‚Regent‘ v jejich technologické zralosti. Dále bylo u těchto odrůd provedeno měření základních analytických parametrů, stanovení celkových flavanolů, fenolických látek a antiradikálové aktivity, stanovení jednotlivých kyselin a obsah glukózy a fruktózy pomocí HPLC metody. Sběr hroznů probíhal od 2.9.2015 do 20.10.2015.

Charakteristika vinice

Hrozny použité v pokusu této diplomové práce pocházejí z vinice na Mendeleu z areálu Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Lednici, z Mikulovské vinařské podoblasti. Vinohrady se nacházejí v nadmořské výšce 176 m n. m. Průměrná roční teplota zde dosahuje 9 °C a průměrný roční úhrn srážek se pohybuje kolem 516 mm. Pozemek je mírně svažitý a orientovaný na jihozápad. Půdní druh je hlinitopísčitý a nachází se v něm 20-24 % jílových částic. Hloubka humusového horizontu se pohybuje od 0,4 – 0,6 mm.

43

Tab. 1: Přehled použitých odrůd

Odrůda Druh Barvířka

‚Acolon‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Agni‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Alibernet‘ Vitis vinifera L. Ano ‚André‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Ariana‘ Vitis vinifera L. Ne

‚Cabernet Cubin‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cabernet Dorio‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cabernet Dorsa‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cabernet Franc‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cabernet Mitos‘ Vitis vinifera L. Ano

‚Cabernet Moravia‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cabernet Sauvignon‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Carménère‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Dornfelder‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Frankovka‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Merlot‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Modrý Portugal‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Nitranka‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Neronet‘ Vitis vinifera L. Ano ‚Rulandské modré‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Svatovavřinecké‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Váh‘ Vitis vinifera L. Ne

‚Zweigeltrebe‘ Vitis vinifera L. Ne ‚Cerason‘ Interspecifická Ne ‚Golubok‘ Interspecifická Ano ‚Kofranka‘ Interspecifická Ne ‚Laurot‘ Interspecifická Ne

‚MI-5-70‘ Interspecifická Ne ‚MI-5-114‘ Interspecifická Ne ‚Marlen‘ Interspecifická Ne ‚Nativa‘ Interspecifická Ne ‚Regent‘ Interspecifická Ne

44

Tab. 2: Křížení a původ použitých odrůd

Odrůda Křížení Původ ‚Acolon‘ ‚Frankovka‘ X ‚Dornfelder‘ Německo ‚Agni‘ ‚André‘ X ‚Irsai Oliver‘ ČR ‚Alibernet‘ ‚Alicante Bouschet‘ X ‚Cabernet Sauvignon‘ Ukrajina ‚André‘ ‚Frankovka‘ X ‚Svatovavřinecké‘ ČR ‚Ariana‘ (‚Ryzlink Rýnský‘ X ‚Svatovavřinecké‘) X ‚Zweigeltrebe‘ ČR ‚Cabernet Cubin‘ ‚Frankovka‘ X ‚Cabernet Sauvignon‘ Německo ‚Cabernet Dorio‘ ‚Frankovka‘ X ‚Dornfelder‘ Německo ‚Cabernet Dorsa‘ ‚Frankovka‘ X ‚Dornfelder‘ Německo ‚Cabernet Franc‘ — Francie ‚Cabernet Mitos‘ ‚Frankovka‘ X ‚Teinturier du Cher‘ Německo ‚Cabernet Moravia‘ ‚Cabernet Franc‘ X ‚Zweigeltrebe‘ ČR ‚Cabernet Sauvignon‘ ‚Cabernet Franc‘ X ‚Sauvignon Blanc‘ Francie ‚Carménère‘ — Francie ‚Dornfelder‘ ‚Helfensteiner‘ X ‚Heroldrebe‘ Německo ‚Frankovka‘ — — ‚Merlot‘ ‚Magdeleine Noire des Charentes‘ X ‚Cabernet Franc‘ Francie ‚Modrý Portugal‘ — — ‚Nitranka‘ ‚Castets‘ X ‚Abouriou‘ SR ‚Neronet‘ (‚Svatovavřinecké‘ X ‚Modrý Portugal‘) X ‚Alibernet‘ ČR ‚Rulandské modré‘ — Francie ‚Svatovavřinecké‘ — — ‚Váh‘ ‚Castets‘ X ‚Abouriou‘ SR ‚Zweigeltrebe‘ ‚Svatovavřinecké‘ X ‚Frankovka‘ Rakousko Careson Merlan X Fratava ČR ‚Golubok‘ ‚Severnyj‘ X(‚Alicante Bouschet‘ X‚Cabernet Sauvignon‘) Ukrajina ‚Kofranka‘ ‚Merlan‘ X ‚Fratava‘ ČR ‚Laurot‘ ‚Merlan‘ X ‚Fratava‘ ČR ‚MI-5-70‘ ‚Merlan‘ X ‚Fratava‘ ČR ‚MI-5-114‘ ‚Merlan‘ X ‚Fratava‘ ČR ‚Marlen‘ ‚Merlan‘ X ‚Fratava‘ ČR ‚Nativa‘ ‚Fratava‘ X ‚Merlan‘ ČR ‚Regent‘ (‚Sylvánské zelené‘ X ‚Müller Thurgau‘) X ‚Chambourcin‘ Německo

(Johnson, Robinson, 2009, Pavloušek, 2007, Schultz, Stoll, 2012, Sotolář, 2007, Sotolář, 2016)

4.1.2 Použité metody měření

U všech výše zmiňovaných odrůd byly i hned po sběru stanoveny základní analytické parametry: cukernatost, pH, titrovatelné kyseliny a asimilovatelný dusík. Tyto parametry byly měřeny u každé odrůdy v moštu z ručně rozdrcených bobulí.

45

Stanovení cukernatosti

Cukernatost moštu byla stanovena pomocí digitálního refraktometru ATAGO – PAL 1 na základě měření indexu lomu světla. Přístroj výsledky uvádí ve stupních Brix (ºBx), proto byly naměřené hodnoty převedeny na stupně normalizovaného moštoměru (ºNM).

Stanovení pH

Hodnota pH představuje záporný dekadický logaritmus aktivity vodíkových kationtů ať už v moště či víně. Tuto hodnotu stanovujeme na základě měření potenciálu skleněné elektrody, závisející od aktivity vodíkových kationtů, vzhledem k referenční kalomelové elektrodě vhodným milivoltmetrem (pH-metrem), který je kalibrovaný tlumivými roztoky o známém pH.

Stanovení veškerých titrovatelných kyselin

Obsah veškerých kyselin byl stanoven potenciometrickou titrací 0,1 mol.l-1 NaOH do pH 8 na automatickém titrátoru TitroLine Easy. Postup práce: Pomocí nedělené pipety bylo k analýze odebráno 10 ml vína do 50 ml kádinky. Poté bylo ke vzorku přidáno 10 ml destilované vody. Titrace vzorku probíhala 0,1 mol.l-1 roztokem NaOH do hodnoty pH 8 a promíchávání vzorku bylo zajištěno pomocí elektromagnetického míchadla. Při pH 8 byla titrace sama automaticky ukončena.

Výpočet: x= a · f · 0,75 x ˗ obsah veškerých titrovatelných kyselin g.l-1 a ˗ ml spotřebovaného 0,1 mol.l-1 roztoku NaOH f ˗ faktor 0,1 mol.l-1 roztoku NaOH

Stanovení asimilovatelného dusíku

Asimilovatelný dusík byl taktéž změřen pomocí automatického titrátoru TitroLine Easy a to tak, že po ukončení měření veškerých titrovatelných kyselin bylo ke vzorku přidáno 5 ml formaldehydu, který byl předem upraven pomocí NaOH na pH

46

8. Následně došlo k poklesu pH a opět začala titrace stejným roztokem 0,1 mol.l-1 NaOH. Titrace byla taktéž automaticky sama ukončena při pH 8.

Výpočet: x= a · f · 140 x ˗ množství asimilovatelného dusíku mg.l-1 a ˗ ml spotřebovaného 0,1 mol.l-1 roztoku NaOH f ˗ faktor 0,1 mol.l-1 roztoku NaOH (Balík, 2011)

Úprava vzorku

Do 50 ml uzavíratelné vialky bylo odváženo cca 25 g čerstvých celých bobulí a zalito čistým metanolem v poměru 1ml metanolu na 1g bobulí. Do vialky bylo přidáno -1 20 µl koncentrovaného roztoku hydrogensiřičitanu amoného (400 g.l SO2 ). Takto připravené vzorky byly extrahovány v temnu, za laboratorní teploty, do doby analýzy (cca 5 měsíců). Před analýzou bylo provedeno mechanické narušení bobulí skleněnou tyčinkou. Poté bylo odebráno 2 ml kapalného podílu, zbytky pevných částí odstředěny (3000 x g; 6 min) a čirý roztok použit k stanovení jednotlivých parametrů. Pro spektrofotometrické stanovení byl vzorek ředěn. (1:10 ředicím pufrem o složení:

40 mM kyselina vinná, 30 mM Na2HPO4).

Jednotlivá spektrofotometrická stanovení byla provedena na automatickém biochemickém analyzátoru MIURA ONE (I.S.E. S.r.l.; Guidonia (RM) – Itálie). Jednotlivé metody byly uzpůsobeny použitému analyzátoru, kdy inkubace probíhá při 37 °C. Inkubační doby je třeba přizpůsobit pracovním cyklům přístroje.

Stanovení celkových anthokyanů

Měření bylo provedeno SO2 metodou. Bylo použito diferenciální měření mezi dvěma činidly. Objem vzorku 30 µl, objem činidla 220 µl. Činidlo 1 představovalo

1,1 M HCl. Činidlo 2 pak 0,1M K2S2O5 s 0,2M kyselinou citronovou (SO2). Po 600 sekundách inkubace byly změřeny absorbance při 520 nm (Somers, Evans, 1977), (Zoecklein et. al., 1990).

47

-1 Výpočty: Celkové anthokyany (mg.l ) = 166,7 *[A(HCl)520 – (5/3)*A(SO2)520]

Získané hodnoty byly konvertovány na hodnoty vyjadřující obsah anthokyanů v čerstvých hroznech v g.kg-1.

Stanovení celkových flavanolů

Koncentrace celkových flavanolů byla stanovena metodou založenou na reakci s p-dimethylaminocinnamaldehydu (DMACA). Při této metodě, oproti široce používané reakci s vanilinem, nedochází k interferenci s anthokyany. Navíc poskytuje vyšší citlivost a selektivnost. K 240 μl činidla (0,1% DMACA a 300 mM HCl v MeOH) bylo přidáno 10 μl vzorku. Doba reakce byla 600 sekund. Poté byla změřena absorbance při 620 nm. Koncentrace celkových flavanolů byla stanovena na základě kalibrační křivky za použití epikatechinu jako standardu (10-200 mg.l-1). Výsledky jsou vyjádřeny ve formě mg.l-1 ekvivalentů katechinu. Získané hodnoty byly konvertovány na hodnoty vyjadřující obsah katechinu v čerstvých hroznech v g.kg-1 (Li, Tanner, Larkin, 1996).

Stanovení celkových fenolů

Celkový obsah fenolů byl stanoven modifikovanou Folin-Ciocalteuovou metodou. K 198 μl vody bylo přidáno 12 μl vzorku a 10 μl Folin-Ciocalteuova činidla. Po 36 sekundách bylo přidáno 30 μl roztoku dekahydrátu uhličitanu sodného (20%). Po 600 sekundách byla měřena absorbance při 700 nm. Koncentrace celkových fenolů byla stanovena na základě kalibrační křivky za použití kyseliny gallové jako standardu (25-1000 mg.l-1). Výsledky jsou vyjádřeny ve formě mg.l-1 ekvivalentů kyseliny gallové. Získané hodnoty byly konvertovány na hodnoty vyjadřující obsah kyseliny gallové v čerstvých hroznech v g.kg-1 (Waterman, Mole, 1994).

Stanovení antiradikálové aktivity

Tato metoda je založena na deaktivaci komerčně dostupného 2,2-difenyl-β- pikrylhydrazylového radikálu (DPPH), který se projevuje úbytkem absorbance

48 při 520 nm. K 268 μl roztoku DPPH v metanolu (300 μM) bylo přidáno 12 μl vzorku, absorbance při 520 nm byla změřena po 360 sekundách a následně odečtena od absorbance měřené v čase 0. Antiradikálová aktivita byla stanovena na základě kalibrační křivky, za použití kyseliny gallové (10-300 mg.l-1) jako standardu. Výsledky jsou vyjádřeny ve formě mg.l-1 ekvivalentů kyseliny gallové. Získané hodnoty byly konvertovány na hodnoty vyjadřující obsah kyseliny gallové v čerstvých hroznech v g.kg-1 (Arnous, Makris, Kefalas, 2001).

HPLC stanovení jednotlivých anthokyanů

Jednotlivé anthokyany byly identifikované podle pořadí píků jak uvádí (Núñez, Monagas, et. al., 2004) Koncentrace jednotlivých anthokyanů byla stanovena metodou s přímým nástřikem vzorku. Odstředěný extrakt (3000 x g; 6 min) byl 10x zředěn

100 mM HClO4 a přímo použit k HPLC analýze.

Instrumentace:

 Binární vysokotlaký systém Shimadzu LC-10A  Systém controler: SCL-10Avp  2 pumpy: LC-10ADvp  Kolonový termostat s manuálním nástřikovým ventilem Rheodyne: CTO- 10ACvp  DAD detektor: SPD-M10Avp  Software: LCsolution

Podmínky separace:  Kolona: Alltech Alltima HP C18 3 μm; 3 x 150 mm  Teplota separace: 50 °C  Objem nástřiku vzorku: 20 μl  Průtok mobilní fáze: 0.75 ml.min-1

 Mobilní fáze A: 15 mM HClO4

 Mobilní fáze B: 15 mM HClO4, 80% Acetonitril

49

Gradientový program:

0,00 min – 5 % B, 5,00 min - 5 % B, 15,00 min – 25 % B, 20,00 min – 40 % B, 25,00 min – 60 % B, 28,00 min – 100 % B, 28,01 min – 0 % B, 29,99 min – 0 % B, 30,00 min - 5 % B, 35,00 min - 5% B

Celková doba mezi dvěma vzorky činila 35 minut. Data v rozmezí 200-520 nm byla zaznamenávána 31 minut.

U všech anthokyanů byly porovnávány plochy píků a malvidin-3,5-diglukosid byl kalibrovaný na standard.

HPLC stanovení kyselin a cukrů

Vzorky moštu byly ředěny 10x demineralizovanou vodou Instrumentace:  Binární vysokotlaký systém Shimadzu LC-10A  Systém controler: SCL-10Avp  2 pumpy: LC-10ADvp  Kolonový termostat s manuálním nástřikovým ventilem Rheodyne: CTO- 10ACvp  DAD detektor: SPD-M10Avp  Software: LCsolution

Podmínky separace:  Kolona: Watrex Polymer IEX H form 10μm; 250x8 mm + 10x8mm  Teplota separace: 60 °C  Objem nástřiku vzorku: 20 μl  Průtok mobilní fáze: 0.75 ml.min-1  Isokratická eluce

 Mobilní fáze: 2 mM H2SO4 (Kumšta, 2016)

50

4.1.3 Použité statistické metody

Statistické analýzy byly provedeny pomocí programu STATISTICA 12. Pro zjištění vzájemné korelace mezi základními analytickými parametry a celkovým obsahem anthokyanů, flavanolů, fenolických látek a antiradikálové aktivity byly použity korelační matice. Dále byl použit t-test, nezávislý, dle skupin pro zjištění rozdílu v obsahu celkových anthokyanů a profilu anthokyanů mezi odrůdami Vitis vinifera L. a interspecifickými. Chyba měření nikde nepřesahuje 3 % (Kumšta, 2016).

51

4.2 VÝSLEDKY

U všech 32 odrůd byly ihned po sběru v moštu nejprve změřeny základní analytické parametry a to pomocí ručního digitálního refraktometru, pH metru a automatického titrátoru. Tabulka 3 uvádí základní analytické parametry moštu: cukernatost, pH, obsah titrovatelných kyselin a obsah asimilovatelného dusíku.

Tab. 3: Základní analytické parametry moštu z hroznů sbíraných v jejich technologické zralosti.

Titr. kys. Asimil. dusík Datum Cukernatost sběru Odrůda (°NM) pH (g.l-1) (mg.l-1) 24.9.2015 ‚Acolon‘ 13,9 2,98 7,21 316 2.9.2015 ‚Agni‘ 16,5 3,08 8,5 213 20.10.2015 ‚Alibernet‘ 20,4 3,18 6,8 84 19.10.2015 ‚André‘ 21,8 2,95 9,97 71 24.9.2015 ‚Ariana‘ 18 2,76 10,76 221 29.9.2015 ‚Cabernet Cubin‘ 19,2 3,08 11 92 14.10.2015 ‚Cabernet Dorio‘ 27,6 3,18 6,29 231 29.9.2015 ‚Cabernet Dorsa‘ 21,6 3,18 6,86 241 20.10.2015 ‚Cabernet Franc‘ 13,2 2,93 8,32 23 14.10.2015 ‚Cabernet Mitos‘ 27,2 3,21 7,76 191 19.10.2015 ‚Cabernet Moravia‘ 14,3 3,02 5,02 74 19.10.2015 ‚Cabernet Sauvignon‘ 24,2 2,95 9,78 56 20.10.2015 ‚Carménère‘ 14 3,26 5,31 211 23.9.2015 ‚Dornfelder‘ 21,6 3,41 3,85 114 19.10.2015 ‚Frankovka‘ 19,6 3,04 8,48 179 19.10.2015 ‚Merlot‘ 21,6 3,22 8,03 129 24.9.2015 ‚Modrý Portugal‘ 18,3 2,94 5,43 49 19.10.2015 ‚Nitranka‘ 20,9 3,18 6,06 104 13.10.2015 ‚Neronet‘ 24,7 3,55 5,91 181 24.9.2015 ‚Rulandské modré‘ 20,2 3,04 10,39 177 29.9.2015 ‚Svatovavřinecké‘ 18,8 3,2 8,65 73 19.10.2015 ‚Váh‘ 23,1 3,24 4,94 113 19.10.2015 ‚Zweigeltrebe‘ 21,4 3,07 6,66 103 19.10.2015 ‚Cerason‘ 21,4 2,99 8,9 105 2.9.2015 ‚Golubok‘ 18,7 3,24 6,68 156 19.10.2015 ‚Kofranka‘ 21,1 2,91 10,02 107 19.10.2015 ‚Laurot‘ 23,4 3,06 8,79 150 14.10.2015 ‚MI-5-70‘ 22,4 3,18 8,72 64 13.10.2015 ‚MI-5-114‘ 19,5 3 8,79 283 19.10.2015 ‚Marlen‘ 24,5 3,18 7,21 120 13.10.2015 ‚Nativa‘ 17,9 3,24 7,35 197 13.10.2015 ‚Regent‘ 25,4 3,4 6,46 188

52

Poté bylo pomocí HPLC metody v moštu všech odrůd stanoven obsah celkových kyselin, dále kyseliny vinné, jablečné a celkový obsah glukózy + fruktózy. Naměřené hodnoty uvádí tab. 4.

Tab. 4: Obsah celkových kyselin, kyseliny vinné, jablečné a glukózy + fruktózy.

Celkové kys. Kys. vinná Kys. jabl. Gluk.+fruk. Odrůda (g.l-1) (g-l-1) (g.l-1) (g.l-1) ‚Acolon‘ 9,6 6,41 2,66 147,1 ‚Agni‘ 11,5 10,45 0,85 177,3 ‚Alibernet‘ 9 6,84 1,81 183,2 ‚André‘ 12,7 9,62 2,56 211,9 ‚Ariana‘ 13,1 10,12 2,45 143,7 ‚Cabernet Cubin‘ 15,2 8,52 5,84 186,6 ‚Cabernet Dorio‘ 9,1 7,78 1,04 264,6 ‚Cabernet Dorsa‘ 9,4 7,52 1,49 217,6 ‚Cabernet Franc‘ 10,2 7,95 1,86 134,1

‚Cabernet Mitos‘ 13,7 11,86 1,51 250,4 ‚Cabernet Moravia‘ 6,9 5,57 1,1 147,8 ‚Cabernet Sauvignon‘ 12,7 8,25 3,81 232,9

‚Carménère‘ 8,4 6,01 1,92 159 ‚Dornfelder‘ 5,9 4,13 1,52 217,1 ‚Frankovka‘ 11,4 9,58 1,5 193,6

‚Merlot‘ 11 7,65 2,82 215,5 ‚Modrý Portugal‘ 7,7 5,7 1,64 192,1 ‚Nitranka‘ 8,5 5,9 2,02 212,7

‚Neronet‘ 7,9 6,43 1,28 217,9 ‚Rulandské modré‘ 13,4 10,89 1,97 212 ‚Svatovavřinecké‘ 10,5 6,82 3,06 189,6

‚Váh‘ 8,3 6,39 1,6 203,7 ‚Zweigeltrebe‘ 9,3 7,79 1,26 214,5 ‚Cerason‘ 10,4 8,07 1,94 193,8 ‚Golubok‘ 10 7,99 1,67 190,7 ‚Kofranka‘ 12,7 10,26 2,09 206,9 ‚Laurot‘ 11,9 10,65 1,13 222 ‚MI-5-70‘ 13 8,37 3,96 227 ‚MI-5-114‘ 11,3 7,76 2,92 197,1

‚Marlen‘ 10,4 7,69 2,32 208,4 ‚Nativa‘ 10,9 8,72 1,78 177,5 ‚Regent‘ 9,7 7,16 2,14 245,2

53

Graf 5 uvádí hodnoty celkového množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1). Nejvyšší obsah anthokyanů (7,63 g.kg-1) byl zjištěn u odrůdy ‚Cabernet Mitos‘. Tento výsledek není nijak překvapující, jelikož se jedná o barvířku. Také ostatní barvířky dosahují vysokého množství anthokyanů: ‚Golubok‘ (4,67 g.kg-1), ‚Neronet‘ (4,41 g.kg1) a ‚Alibernet‘ (2,97 g.kg-1). Vyšší hodnoty vykazují také tři interspecifické odrůdy a to ‚Cerason‘ (3,94 g.kg-1), ‚Regent‘ (3,20 g.kg-1) a ‚Kofranka‘ (3,17 g.kg-1). Nejnižší hodnota byla zjištěna u odrůdy ‚Cabernet Franc‘ (0,57 g.kg-1). Nízké množství anthokyanů pravděpodobně souvisí s nízkou vyzrálostí hroznů. Nižší hodnoty dále byly zjištěny u odrůd ‚Ariana‘ (0,68 g.kg-1), ‚Merlot‘ (0,72 g.kg-1), ‚Frankovka‘ (1,04 g.kg-1) a ‚Rulandské modré‘ (1,13 g.kg-1). Celkové množství anthokyanů (nezahrnující odrůdy tzv. barvířky) se u odrůd Vitis vinifera L. pohybuje od 0,57 g.kg-1 do 2,65 g.kg-1 a u odrůd interspecifických od 1,47 g.kg-1 do 3,94 g.kg-1.

54

Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) 9,00

8,00

7,00

6,00

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00

Graf 5: Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1).

55

Graf 6 zobrazuje celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1). Nejvyšší obsah flavanolů má odrůda ‚Cabernet Mitos‘ (3,32 g.kg-1), dále ‚Rulandské modré‘ (2,67 g.kg-1) a ‚Cabernet Cubin‘ (2,40 g.kg-1). Naopak nejnižší množství obsahuje odrůda ‚Dornfelder‘ (0,47 g.kg-1), po ní následuje ‚Cabernet Moravia‘ (0,61 g.kg-1) a ‚Carménère‘ (0,69 g.kg-1). Množství flavanolů se u odrůd Vitis vinifera L. pohybuje od 0,47 g.kg-1 do 3,32 g.kg-1. U interspecifických odrůd je tento obsah od 0,82 g.kg-1 do 1,92 g.kg-1.

56

Celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) 3,50

3,00

2,50

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00

Graf 6: Celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1).

57

Graf 7 znázorňuje celkové množství fenolických látek v hroznech (g.kg-1) měřených Folin-Ciocalteuovou metodou. Nejvyšší obsah se nachází v odrůdě ‚Cabernet Mitos‘ (13 g.kg-1). Následuje ‚Neronet‘ (8,93 g.kg-1) a ‚Cabernet Cubin‘ (7,08 g.kg-1). Nejméně fenolických látek obsahuje odrůda ‚Carménère‘ (3,03 g.kg-1). Nízký obsah těchto látek je také patrný u odrůd ‚Marlen‘ (3,11 g.kg-1) a ‚Dornfelder‘ (3,19 g.kg-1). U odrůd Vitis vinifera L. se množství fenolických látek pohybuje od 3,03 g.kg-1 do 13 g.kg-1 a u odrůd interspecifických od 3,11 g.kg-1 do 6,81 g.kg-1.

58

Celkové množství fenolických látek (g.kg-1) 14,00

12,00

10,00

8,00

6,00

4,00

2,00

0,00

Graf 7: Celkové množství fenolických látek v hroznech (g.kg-1).

59

Graf 8 znázorňuje antiradikálovou aktivitu vyjádřenou v množství kyseliny gallové v hroznech (g.kg-1). Nejvyšší množství je patrné u odrůdy ‚Cabernet Mitos‘ (6,79 g.kg-1), dále u odrůd ‚Kofranka‘ (3,31 g.kg-1) a ‚Neronet‘ (3,24 g.kg-1). Nejnižší množství se nachází v odrůdě ‚Marlen‘ (1,23 g.kg-1). Následují odrůdy ‚Dornfelder‘ (1,29 g.kg-1) a ‚Modrý Portugal‘ (1,35 g.kg-1). U odrůd Vitis vinifera L. se antiradikálová aktivita pohybuje v rozmezí od 1,29 g.kg-1 do 6,79 g.kg-1 a množství u odrůd interspecifických od 1,23 g.kg-1 do 3,31 g-kg-1.

60

Antiradikálová aktivita (g.kg-1)

8,00

7,00

6,00

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

0,00

-1 Graf 8: Antiradikálová aktivita vyjádřená v množství kys. gallové v hroznech (g.kg ).

61

Tab. 5 zobrazuje vzájemnou korelaci mezi cukernatostí hroznů (ºNM), hodnotou pH, množstvím titrovatelných kyselin (g.l-1), celkovým obsahem asimilovatelného dusíku (mg.l-1), celkovým množstvím anthokyanů v hroznech (g.kg-1), celkovým množstvím flavanolů v hroznech (g.kg-1), množstvím fenolických látek v hroznech (g.kg-1) a antiradikálovou aktivitou vyjádřenou v množství kyseliny gallové v hroznech (g.kg-1). Červeně vyznačená čísla značí významné korelace. Velmi významně spolu korelují celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) a celkové množství fenolických látek v hroznech (g.kg-1), antiradikálová aktivita (g.kg-1) a celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1), antiradikálová aktivita a celkové množství fenolických látek hroznech (g.kg-1) a celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) a celkové množství fenolických látek v hroznech (g.kg-1).

62

Korelace Označ. korelace jsou významné na hlad. p < ,05000 N=32 (Celé případy vynechány u ChD)

Průměry Sm.odch. Cukernatost pH Titr. Asimil. dusík Celk. Celk. Celk. množství Antirad. (°NM) kyseliny (mg.l-1) množství množství fenolických aktivita (g.l-1) anthokyanů flavanolů v látek (g.kg-1) (g.kg-1) v hroznech hroznech (g.kg-1) (g.kg-1) Proměnná Cukernatost (°NM) 20,5125 3,65441 1,000000 0,383837 -0,005569 -0,017147 0,426311 0,397871 0,490212 0,377326 pH 3,1203 0,16454 0,383837 1,000000 -0,604625 0,117927 0,405817 0,010809 0,162376 0,039220 Titr. kyseliny (g.l-1) 7,6531 1,83103 -0,005569 -0,604625 1,000000 -0,033268 -0,179322 0,509460 0,279489 0,314911 Asimil. dusík (mg.l-1) 144,2500 71,86322 -0,017147 0,117927 -0,033268 1,000000 0,114401 0,088210 0,023078 0,130685 Celk. množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) 2,1784 1,43193 0,426311 0,405817 -0,179322 0,114401 1,000000 0,541021 0,783167 0,731046 Celk. množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) 1,3578 0,60685 0,397871 0,010809 0,509460 0,088210 0,541021 1,000000 0,902225 0,880799 Celk. množství fenolických látek (g.kg-1) 5,1292 2,01430 0,490212 0,162376 0,279489 0,023078 0,783167 0,902225 1,000000 0,940120 Antirad. aktivita (g.kg-1) 2,3045 1,00079 0,377326 0,039220 0,314911 0,130685 0,731046 0,880799 0,940120 1,000000

Tab. 5: Vzájemná korelace mezi jednotlivými proměnnými.

63

Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) = -1,248 + ,16704 * Cukernatost (°NM) Korelace : r = ,42631, 0,95 int. spolehlivosti

8

7

6

5

4

3

2

1

Celkové množstvíCelkové anthokyanů(g.kg-1) hroznech v 0 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 Cukernatost (°NM)

Graf 9: Bodový graf vyjadřující celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) vs. cukernatost (ºNM).

Celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) = ,85836 + ,22928 * Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1), Korelace : r = ,54102, 0,95 int. spolehlivosti

3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

množstvíCelkové (g.kg-1)flavanolů hroznech v 0,0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)

Graf 10: Bodový graf vyjadřující celkové množství flavanolů v hroznech (g.kg-1) vs. celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1).

64

Celkové množství fenolických látek (g.kg-1) = 2,7292 + 1,1017 * Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) Korelace : r = ,78317, 0,95 int. spolehlivosti

14

12

10

8

6

4

Celk.množství fenol. látek v hroznech (g.kg-1) 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)

Graf 11: Bodový graf vyjadřující celkové množství fenol. látek v hroznech (g.kg-1) vs. celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1).

Antiradikálová aktivita (g.kg-1) = 1,1915 + ,51094 * Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) Korelace : r = ,73105, 0,95 int. spolehlivosti 8

7

6

5

4

3

Antiradikálováaktivita (g.kg-1) 2

1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1)

Graf 12: Bodový graf vyjadřující antiradikálovou aktivitu vyjádřenou v množství kyseliny gallové (g.kg-1) vs. celk. množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1).

65

Z tabulky 6 vyplývá, že t-test indikoval signifikantní rozdíl mezi druhy a to ve prospěch interspecifických, které v průměru dosáhly o 1,13 g.kg-1 vyššího množství anthokyanů než Vitis vinifera L. (Graf 13). V t-testu nebyly zahrnuty barvířky.

t-testy; grupováno: Druh Skup. 1: Vitis vinifera L., Skup. 2: Interspecifické

Průměr (Vitis Průměr t sv p Poč.plat Poč. Sm.odch. Sm.odch. F-poměr p (Rozptyly) vinifera L.) (Interspec.) (Vitis plat. (Vitis vinifera (Interspec.) (Rozptyly) vinifera L.) (Interspec.) L.) Proměnná Celk. množ. anthokyanů 1,464183 2,592653 -4,26332 26 0,000235 20 8 0,557055 0,802974 2,077820 0,194335 v hroznech (g.kg-1)

Legenda: Průměry – aritmetické průměry, t – hodnota testovaného kritéria studentova rozdělení, sv – stupně volnosti, P – minimální hladina statistické významnosti, při které zamítáme nulovou hypotézu, N – četnosti, Sm. odch. – směrodatná odchylka.

-1 Tab. 6: Výsledek t-testu celkového množství anthokyanů v hroznech (g.kg ), nezahrnující odrůdy tzv. barvířky, pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické.

66

Krabicový graf : Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) 3,4

3,2

3,0

2,8

2,6

2,4

2,2 2,0

1,8 1,6 1,4

Celkové množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) hroznech v anthokyanů množství Celkové 1,2

1,0 Prumer Vitis vinifera L. Interspecifické Prumer±SmCh Druh Prumer±1,96*SmCh

Graf 13: Krabicový graf celkového množství anthokyanů v hroznech (g.kg-1) pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické (nezahrnující odrůdy tzv. barvířky)

Graf 14 zobrazuje zastoupení hlavních skupin anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd, a to diglukosidických anthokyanů (zahrnující delfinidin-3,5- diglukosid, kyanidin-3,5-diglukosid, petunidin-3,5-diglukosid, peonidin-3,5-diglukosid a malvidin-3,5-diglukosid), monoglukosidických anthokyanů (zahrnující delfinidin-3- glukosid, kyanidin-3-glukosid, petunidin-3-glukosid, peonidin-3-glukosid a malvidin-3- glukosid), monoglukosidických anthokyanů acylovaných kyselinou octovou (zahrnující delfinid-3-glukosid acyl. kys. octovou, kyanidin-3-glukosid acyl. kys. octovou, petunidin-3-glukosid acyl. kys. octovou, peonidin-3-glukosid acyl. kys. octovou a malvidin-3-glukosid acyl. kys. octovou) a monoglukosidických anthokyanů acylovaných kyselinou p-kumarovou (zahrnující delfinidin-3-glukosid acyl. kys. p- kumarovou, kyanidin-3-glukosid acyl. kys. p-kumarovou, petunidin-3-glukosid acyl. kys. p-kumarovou, peonidin-3-glukosid acyl. kys. p-kumarovou a malvidin-3-glukosid acyl. kys. p-kumarovou).

67

Diglukosidické anthokyany jsou zastoupeny pouze u dvou interspecifických odrůd, a to ‚Regent‘ (28,98 %) a ‚Golubok‘ (47,37 %) a také u jedné odrůdy Vitis vinifera L. – Agni (0,77 %). Protože je však toto zastoupení velmi malé a odrůdy Vitis vinifera L. diglukosidická barviva nesyntetizují, je velmi pravděpodobné, že došlo pouze ke kontaminaci vzorku u dané odrůdy. Všechny odrůdy (až na ‚Golubok‘, který má největší procentuální zastoupení diglukosidických anthokyanů) obsahují ve svém anthokyanovém profilu nejvíce monoglukosidických anthokyanů. Nejvíce jsou obsaženy v odrůdě ‚Rulandské modré‘ (98,94 %), nejméně pak v odrůdě ‚Golubok‘ (40,91 %). Množství monoglukosidických anthokyanů acylovaných kyselinou octovou je nejhojněji zastoupeno u odrůdy ‚Nitranka‘ (32,08 %) a nejméně u odrůdy ‚Rulandské modré‘ (0,34 %). Monoglukosidické anthokyany acylované kyselinou p-kumarovou jsou nejčetnější u odrůdy ‚Agni‘ (34,37 %) a nejméně jsou zastoupeny u odrůdy ‚Rulandské modré‘ (0,72 %). Graf 14 také jasně ukazuje, že anthokyany jsou u testovaných odrůd častěji acylované kyselinou p-kumarovou než kyselinou octovou (u 23 odrůd).

68

Zastoupení hlavních skupin anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Množství diglukosidických Množství monoglukosidických Množství monoglukosidických Množství monoglukosidických anthokyanů (%) anthokyanů (%) anthokyanů acylovaných anthokyanů acylovaných kyselinou octovou (%) kyselinou p-kumarovou (%)

Graf 14: Zastoupení hlavních skupin anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd.

69

Tab. 7 zobrazuje složení anthokyanů v hroznech (%) u zkoumaných odrůd. Identifikováno bylo 20 různých anthokyanů. Z monoglukosidických anthokyanů převládá téměř u všech odrůd malvidin-3- glukosid. Pouze odrůda ‚Cabernet Dorio‘ obsahuje více peonidin-3-glukosidu (44,97 %) než malvidin-3-glukosidu (35,88 %). Nejvyšší zastoupení má malvidin-3-glukosid u odrůdy ‚Acolon‘ (71,65 %) a nejnižší u odrůdy ‚Regent‘ (17,22 %). Z monoglukosidických anthokyanů se nejméně vyskytuje kyanidin-3-glukosid s nejvyšším zastoupením u odrůdy ‚MI-5-70‘ (7,1 %) a nejnižším u odrůdy ‚Modrý Portugal‘ (0,15 %). Diglukosidické anthokyany byly zjištěny pouze u dvou interspecifických odrůd a také u jedné odrůdy Vitis vinifera L., u které velmi pravděpodobně došlo pouze ke kontaminaci vzorku. Nejhojněji je zastoupen malvidin-3,5-diglukosid, u odrůdy ‚Golubok‘ (30,83 %) a u odrůdy ‚Regent‘ (20,37 %), nejméně pak kyanidin-3,5- diglukosid. Z monoglukosidických anthokyanů je kyselinou octovou acylován u všech odrůd nejvíce malvidin-3-glukosid. Nejhojněji u odrůdy ‚Cabernet Franc‘ (16,23 %), v nejnižším množství pak u odrůdy ‚Rulandské modré‘ (0,24 %). Nejméně se acylovaný kyselinou octovou vyskytuje kyanidin-3-glukosid. Kyselinou p-kumarovou je nejvíce acylován malvidin-3-glukosid. Nejčetněji u odrůdy ‚Agni‘ (29,45 %) a nejméně u odrůdy ‚Rulandské modré‘ (0,63 %). U odrůd Vitis vinifera L. je kyselinou p-kumarovou acylován nejméně delfinidin-3-glukosid a u odrůd interspecifických pak kyanidin-3-glukosid. Průměrná množství anthokyanů, vyjádřená v procentuálním zastoupení jak u odrůd Vitis vinifera L., tak u odrůd interspecifických uvádí Tab. 8.

70

Del- Kya- Pet- Peo- Mal- Del- Kya- Pet- Peo- Mal- Del- Kya- Pet- Peo- Mal- Del- Kya- Pet- Peo- Mal- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3,5- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- 3- Odrůda diGl diGl diGl diGl diGl Gl Gl Gl Gl Gl GlAc GlAc GlAc GlAc GlAc GlCoum GlCoum GlCoum GlCoum GlCoum Suma ‚Acolon‘ 0 0 0 0 0 1,3 0,48 3,7 8,94 71,65 0,05 0,05 0,05 0,35 2,12 0,04 0,11 0,6 0,69 9,82 99,99 ‚Agni‘ 0,06 0,01 0,14 0,06 0,5 0,9 0,33 2,2 9,82 41,13 0,03 0,05 0,2 1,44 8,77 0,02 0,21 1,05 3,64 29,45 100 ‚Alibernet‘ 0 0 0 0 0 6,7 2,68 7 21,32 33,45 1,94 0,65 2,18 4,01 8,91 0,08 0,16 1,1 2,55 7,31 100 ‚André‘ 0 0 0 0 0 1,8 0,64 3,7 10,17 58,88 0,37 0,06 0,35 1,47 7,26 0,07 0,29 0,83 1,8 12,26 100,02 ‚Ariana‘ 0 0 0 0 0 1,9 0,37 3,6 5,26 54,37 0,57 0,01 0,43 1,16 9,53 0,05 0,12 0,47 1,17 20,94 100 ‚Cabernet Cubin‘ 0 0 0 0 0 16 2,38 12 3,89 37,91 3,53 0,28 2,72 0,4 8,38 1,94 0,17 2 0,65 7,49 99,99 ‚Cabernet Dorio‘ 0 0 0 0 0 2,3 4,02 3,6 44,97 35,88 0,04 0,11 0,18 1,37 1,63 0,01 0,14 0,21 2,39 3,11 99,99 ‚Cabernet Dorsa‘ 0 0 0 0 0 1,3 0,71 3,4 10,95 60,85 0,46 0,23 0,42 1,52 9,75 0,15 0,28 0,6 1,13 8,18 100 ‚Cabernet Franc‘ 0 0 0 0 0 2,9 0,36 4,2 4,82 48,89 0,87 0,1 1,01 2,43 16,23 0,07 0,24 0,85 1,98 15 99,98 ‚Cabernet Mitos‘ 0 0 0 0 0 4,7 2,23 5,7 20,72 36 0,84 0,18 1,06 3,66 6,58 0,03 0,11 1,67 3,48 13,04 99,98 ‚Cabernet Moravia‘ 0 0 0 0 0 3,7 0,21 5,1 3,1 43,03 0,82 0,28 1,08 1,52 12,34 0,08 0,11 1,99 1,06 25,65 100,01 ‚Cabernet Sauvignon‘ 0 0 0 0 0 11 3,66 8,5 11,23 37,99 2,2 0,75 2,03 2,61 12,01 0,07 0,26 0,72 1,4 5,45 100 ‚Carménère‘ 0 0 0 0 0 8 1,18 8,2 5,26 44,02 1,48 0,12 1,58 2,1 9,68 0,25 0,36 2,11 1,61 14,05 100,01 ‚Dornfelder‘ 0 0 0 0 0 7,4 1,76 9,5 8,93 49,48 1,24 0,17 1,49 1,66 8,45 0,14 0,19 1,31 1,01 7,31 100,01 ‚Frankovka‘ 0 0 0 0 0 1,7 0,9 4 17,92 65,8 0,04 0,03 0,08 0,28 1,47 0,02 0,22 0,35 1,17 6,09 100 ‚Merlot‘ 0 0 0 0 0 11 5,95 10 11,5 36,87 2,35 1,26 2,3 2,59 8,71 0,15 0,27 1,12 1,09 4,74 100 ‚Modrý Portugal‘ 0 0 0 0 0 1,8 0,15 3,3 2,25 48,37 0,03 0,02 0,5 0,78 11,3 0,11 0,13 1,77 0,83 28,67 100,01 ‚Nitranka‘ 0 0 0 0 0 13 3,42 8,2 4,41 22,25 6,2 1,15 4,24 8,67 11,82 0,51 0,3 4,63 1,59 9,25 99,99 ‚Neronet‘ 0 0 0 0 0 3,9 2,23 4,8 31,98 28,17 0,9 0,17 1,09 4 6,06 0,06 0,21 1,31 4,72 10,39 99,99 ‚Rulandské modré‘ 0 0 0 0 0 1,7 1,09 3,5 21,13 71,58 0,04 0,01 0,02 0,03 0,24 0,02 0 0,04 0,03 0,63 100 ‚Svatovavřinecké‘ 0 0 0 0 0 5,6 0,88 7,8 5,42 47,58 1,04 0,13 1,4 1,95 10,01 0,1 0,1 2,1 1,18 14,77 100 ‚Váh‘ 0 0 0 0 0 10 1,43 9,7 5,42 39,19 2,14 0,14 1,83 3,44 8,13 0,14 0,13 3,27 1,46 13,31 100 ‚Zweigeltrebe‘ 0 0 0 0 0 1,8 0,29 3,9 3,91 56,09 0,42 0,08 0,48 0,95 9,6 0,11 0,18 1,26 1 19,91 99,99 ‚Cerason‘ 0 0 0 0 0 19 6,3 14 2,45 21,6 6,11 1,94 4,68 0,84 8,41 3,85 0,06 3,85 0,49 6,76 100 ‚Golubok‘ 1,29 0,45 0,53 14,3 30,83 6,5 1,49 4,8 8,07 20,05 0,64 0,06 0,09 0,23 0,86 0,84 0 1,43 1,23 6,37 100,02 ‚Kofranka‘ 0 0 0 0 0 8,7 0,9 12 2,06 38,99 1,72 0,36 2,39 0,47 9,18 2,53 0,1 4,32 0,55 16,07 99,98 ‚Laurot‘ 0 0 0 0 0 8,3 0,9 11 2,58 42,15 1,9 0,13 2,64 0,3 11,14 1,96 0,08 3,18 0,58 13,11 100 ‚MI-5-70‘ 0 0 0 0 0 18 7,1 18 4,35 36,33 1,09 0,18 0,81 0,45 2,36 2,44 0,1 2,92 0,5 5,38 99,99 ‚MI-5-114‘ 0 0 0 0 0 7,5 1,2 9,4 5,33 51,28 1,37 0,11 1,4 0,26 8,15 1,36 0,16 1,78 0,9 9,84 99,99 ‚Marlen‘ 0 0 0 0 0 2,5 0,8 5,3 7,81 67,6 0,48 0,03 0,25 0,75 2,84 0,12 0,21 1,04 0,98 9,29 100,01 ‚Nativa‘ 0 0 0 0 0 3,6 0,48 5,5 3,92 53,03 0,03 0,01 0,23 1,49 3,59 0,09 0,08 2,76 0,98 24,24 100 ‚Regent‘ 1,64 0,54 2,6 3,83 20,37 11 3,07 9,5 4,55 17,22 0,8 0,33 0,33 0,84 1,45 4,17 0 5,38 1,23 10,73 99,99 Del= Delfinidin, Kya= Kyanidin, Pet= Petunidin, Peo= Peonidin, Mal= Malvidin, Gl= glukosid, diGl= digukosid, Ac= acylace kys. octovou, Coum= acylace kys. p-kumarovou Tab. 7: Složení anthokyanů (%) v hroznech zkoumaných odrůd.

71

Tabulka 8 zobrazuje výsledek t-testu, který zkoumá rozdíl v procentuálním zastoupení jednotlivých anthokyanů mezi interspecifickými a Vitis vinifera L. druhy. Červeně vyznačená čísla značí statisticky významné rozdíly mezi dvěma testovanými skupinami. Statisticky významný rozdíl byl zjištěn u 12 z 20 anthokyanů mezi druhy Vitis vinifera L. a interspecifickými. Rozdíl je u těchto dvou druhů patrný v zastoupení delfinidin-3,5-diglukosidu, kyanidin-3,5-diglukosidu, peonidin-3,5-diglukosidu, malvidin-3,5-diglukosidu, delfinidin-3-glukosidu, peonidin-3-glukosidu, , peonidin-3- glukosidu acylovaného kys. octovou, a peonidin-3-glukosidu acylovaného kys. p- kumarovou a vysoce významný rozdíl je u petunidin-3-glukosidu, delfinidin-3- glukosidu acylovaného kys. p-kumarovou, kyanidin-3-glukosidu acylovaného kys. p- kumarovou a petunidin-3-glukosidu acylovaného kys. p-kumarovou. Statisticky významný rozdíl nebyl shledán u petunidin-3,5-diglukosidu, kyanidin-3-glukosidu, malvidin-3-glukosidu, delfinidin-3-glukosidu acylovaného kys. octovou, kyanidin-3-glukosidu acylovaného kys. octovou, petunidin-3-glukosidu acylovaného kys. octovou, malvidin-3-glukosidu acylovaného kys. octovou a malvidin- 3-glukosidu acylovaného kys. p-kumarovou.

72

t-testy; grupováno: Druh Skup. 1: Vitis vinifera L., Skup. 2: Interspecifické Průměr (Vitis Průměr t sv p Poč.plat (Vitis Poč.plat. Sm.odch. (Vitis Sm.odch. F-poměr p Proměnná vinifera L.) (Interspecifické) vinifera L.) (Interspecifické) vinifera L.) (Interspecifické) (Rozptyly) (Rozptyly) Delfinidin-3,5-diglukosid 0,00261 0,32556 -2,43868 30 * 0,020874 23 9 0,01251 0,65190 2715,1 0,000000 Kyanidin-3,5-diglukosid 0,00043 0,11000 -2,45893 30 * 0,019923 23 9 0,00209 0,21943 11074,5 0,000000 Petunidin-3,5-diglukosid 0,00609 0,34778 -1,94795 30 0,060832 23 9 0,02919 0,86258 873,1 0,000000 Peonidin-3,5-diglukosid 0,00261 2,01111 -2,07454 30 * 0,046705 23 9 0,01251 4,76839 145267,9 0,000000 Malvidin-3,5-diglukosid 0,02174 5,68889 -2,40854 30 * 0,022366 23 9 0,10426 11,58746 12352,8 0,000000 Delfinidin-3-glukosid 5,25739 9,52111 -2,25677 30 * 0,031464 23 9 4,38924 5,79716 1,7 0,287430 Kyanidin-3-glukosid 1,62391 2,47111 -1,17732 30 0,248324 23 9 1,50411 2,51788 2,8 0,052921 Petunidin-3-glukosid 5,91870 9,84222 -3,04774 30 ** 0,004778 23 9 2,81919 4,28319 2,3 0,115140 Peonidin-3-glukosid 11,88348 4,56889 2,06849 30 * 0,047308 23 9 10,41884 2,19520 22,5 0,000112 Malvidin-3-glukosid 46,49696 38,69444 1,38701 30 0,175660 23 9 13,18257 17,02220 1,7 0,325899 Delfinidin-3-gluk. acyl. kys. octovou 1,20000 1,57111 -0,61298 30 0,544510 23 9 1,43178 1,80385 1,6 0,371236 Kyanidin-3-gluk. acyl. kys. octovou 0,26217 0,35000 -0,51385 30 0,611123 23 9 0,35056 0,60885 3,0 0,038157 Petunidin-3-gluk. acyl. kys. octovou 1,16174 1,42444 -0,55655 30 0,581962 23 9 1,04593 1,54803 2,2 0,139132 Peonidin-3-gluk. acyl. kys. octovou 2,10391 0,62556 2,35740 30 * 0,025123 23 9 1,84654 0,40401 20,9 0,000150 Malvidin-3-gluk. acyl kys. octovou 8,21652 5,33111 1,89990 30 0,067097 23 9 3,86420 3,85845 1,0 1,000000 Delfinidin-3-gluk. acyl. kys. p -kumarovou 0,18348 1,92889 -5,31002 30 ** 0,000010 23 9 0,39702 1,47901 13,9 0,000001 Kyanidin-3-gluk. acyl. kys. p -kumarovou 0,18652 0,08778 3,15181 30 ** 0,003666 23 9 0,08359 0,06778 1,5 0,555691 Petunidin-3-gluk. acyl. kys. p -kumarovou 1,36348 2,96222 -3,53256 30 ** 0,001354 23 9 1,03881 1,41456 1,9 0,240274 Peonidin-3-gluk. acyl. kys. p -kumarovou 1,63609 0,82667 2,18129 30 * 0,037133 23 9 1,08683 0,30315 12,9 0,000919 Malvidin-3-gluk. acyl. kys. p -kumarovou 12,47043 10,42111 0,68604 30 0,497957 23 9 7,86978 6,79283 1,3 0,695481 * (0,01˂ p ˂ 0,05) - statisticky významný rozdíl, ** (p ˂ 0,01) - statisticky vysoce významný rozdíl

Tab. 8: Výsledek t-testu složení anthokyanů (%) pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické.

73

Krabicový graf : Peonidin-3-glukosid (%) 18

16

14

12

10

8

Peonidin-3-glukosid (%)Peonidin-3-glukosid

6

4

2 Vitis vinifera L. Interspecifické Prumer Prumer±SmCh Druh Prumer±1,96*SmCh

Graf 15: Krabicový graf zastoupení peonidin-3-glukosidu (%) v hroznech pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické.

Krabicový graf : Delfinidin-3-glukosid acylovaný kys. p-kumarovou (%) 3,5

3,0

2,5

2,0

1,5

1,0

0,5

0,0

Delfinid-3-glukosid kys. acylovaný p-kumarovou (%)

-0,5 Prumer Vitis vinifera L. Interspecifické Prumer±SmCh Druh Prumer±1,96*SmCh

Graf 16: Krabicový graf zastoupení delfinidin-3-glukosidu acylovaného kyselinou p- kumarovou (%) v hroznech pro skupiny Vitis vinifera L. a interspecifické.

74

Graf 17 zobrazuje chromatogram odrůdy ‚Rulandské modré‘. Pro lepší přehlednost a nepřehuštění grafu jsou uvedeny pouze anthokyany delfinid-3-glukosid, kyanidin-3-glukosid, petunidin-3glukosid, peonidin-3-glukosid, malvidin-3-glukosid, malvidin-3-glukosid acylovaný kyselinou octovou a malvidin-3-glukosid acylovaný kyselinou p-kumarovou. Graf 18 pak zobrazuje chromatogram odrůdy ‚Svatovavřinecké‘ a uvedeny jsou ze stejného důvodu obdobné anthokyany jako u Grafu 17. I když je obecně známo, že odrůda ‚Rulandské modré‘ a ‚Svatovavřinecké‘ jsou si geneticky příbuzné, jejich anthokyanový profil je však odlišný. Graf 19 znázorňuje chromatogram odrůdy ‚Laurot‘. Opět jsou zde uvedeny pouze anthokyany již zmíněné u Grafu 17 a taktéž ze stejného důvodu. Také Graf 20, zobrazující chromatogram odrůdy ‚Golubok‘ pro lepší přehlednost uvádí pouze anthokyany delfinidin-3,5-diglukosid, kyanidin-3,5-diglukosid, delfinidin-3-glukosid, peonidin-3,5- diglukosid, malvidin-3,5-diglukosid, malvidin-3-glukosid a malvidin-3-glukosid acylovaný kyselinou p-kumarovou. Odrůdy ‚Laurot‘ a ‚Golubok‘ jsou obě interspecifické, avšak diglukosidické anthokyany syntetizuje pouze ‚Golubok‘ jak je patrné i z Grafu 20.

75

Chromatogram odrůdy ‚Rulandské modré‘

glukosid

- 3

-

Malvidin

kumarovou

-

glukosid

p

-

3 -

Peonidin

glukosid

-

glukosid acy. kys. octovou octovou kys. acy. glukosid kys. acyl. glukosid

3

glukosid

- -

-

-

glukosid 3

3

-

3

- -

-

3

-

din Absorbance 520 při nm

Petuni

Malvidin Malvidin

Delfinidin Kyanidin

Retenční čas (min)

Graf 17: Chromatogram odrůdy ‚Rulandské modré‘.

Chromatogram odrůdy ‚Svatovavřinecké‘

glukosid

-

3

-

kumarovou

-

p Malvidin

octovou kys. acy. glukosid kys. acyl. glukosid

- - 3

3

- -

glukosid

-

3

-

Absorbance 520 při nm

glukosid

-

glukosid -

3

-

3

-

Malvidin Malvidin

glukosid Petunidin

-

3

- Peonidin

Delfinidin Kyanidin

Retenční čas (min)

Graf 18: Chromatogram odrůdy ‚Svatovavřinecké‘.

76

Chromatogram odrůdy ‚Laurot‘

glukosid

-

3 -

kumarovou

- p

Malvidin

glukosid

glukosid acy. kys. octovou octovou kys. acy. glukosid

-

-

3

3

- -

glukosid

glukosid acyl. kys. kys. acyl. glukosid

-

-

3

3

-

-

Malvidin

Petunidin

Absorbance 520 při nm

glukosid

-

Malvidin

Delfinidin

glukosid

3

- -

3 -

Peonidin

yanidin K

Retenční čas (min) Graf 19: Chromatogram odrůdy ‚Laurot‘.

Chromatogram odrůdy ‚Golubok‘

diglukosid

diglukosid

-

-

3,5

3,5

-

-

kumarovou

-

glukosid

-

p

3

- Malvidin

Peonidin

Malvidin

glukosid

-

3

-

glukosid acyl. kys. kys. acyl. glukosid

-

3

-

finidin

diglukosid Absorbance 520 při nm

Del

-

diglukosid

-

Malvidin

3,5

- 3,5

-

Kyanidin Delfinidin

Retenční čas (min)

Graf 20: Chromatogram odrůdy ‚Golubok‘.

77

4.3 DISKUZE

Pro srovnání výsledků této diplomové práce lze využít obdobné výzkumy. Např. (Drdák et. al., 1991) ve své práci uvádějí průměrné množství anthokyanů u interspecifické odrůdy ‚Nativa‘ (4,42 g.kg-1 v hroznech), což je více než u barvířek ‚Golubok‘ a ‚Neronet‘ (3,00 a 3,93 g.kg-1 v hroznech). V této diplomové práci bylo u barvířek ‚Golubok‘ a ‚Neronet‘ (4,67 a 4,41 g.kg-1 v hroznech) naopak zjištěno vyšší množství anthokyanů než u odrůdy ‚Nativa‘ (2,18 g.kg-1 v hroznech). Ovšem interspecifické odrůdy ‚Cerason‘ a ‚Kofranka‘ (3,94 a 3,17 g.kg-1 v hroznech) vykazovaly více anthokyanů než barvířka ‚Alibernet‘ (2,97 g.kg-1 v hroznech). (Balík a Kumšta, 2008) uvádí průměrné množství anthokyanů v hroznech u šesti následujících ročníků (2002-2007). Odrůda ‚Neronet‘ vykazovala vysoké množství anthokyanů v hroznech (3,93 g.kg-1). Tato diplomová práce však uvádí množství barviva u stejné odrůdy vyšší (4,41 g.kg-1). Dále (Balík a Kumšta, 2008) zjistili u hroznů odrůd ‚Svatovavřinecké‘, ‚Cabernet Moravia‘ a ‚Dornfelder‘ obsah anthokyanů od 1,78 do 2,29 g.kg-1. U hroznů odrůd ‚André‘ (1,10 g.kg-1) a ‚Zweigeltrebe‘ (1,32 g.kg-1) nezjistili statisticky významný rozdíl. V této diplomové práci bylo u odrůd ‚ Svatovavřinecké‘, ‚Cabernet Moravia‘ a ‚Dornfelder‘ naměřeno množství anthokyanů od 1,34 do 2,52 g.kg-1 , u odrůdy ‚André‘ pak 1,41 g.kg-1 a u ‚Zweigeltrebe‘ 1,19 g.kg-1. (Mazza, 1995) zjistil u odrůdy ‚Rulandské modré‘ obsah veškerých anthokyanů v čerstvých hroznech 0,33 g.kg-1. V této diplomové práci však bylo u stejné odrůdy zjištěno vyšší množství anthokyanů v hroznech (1,13 g.kg-1). Rozdíly v obsahu anthokyanů u stejných odrůd jsou dány především klimatickými podmínkami, ročníkem apod. (De Rosso et. al., 2012) uvádí, že se obecně množství anthokyanů v mezidruhových křížení pohybuje od 0,48 g.kg-1 až 5,29 g.kg-1. Tato diplomová práce uvádí množství anthokyanů u interspecifických odrůd od 1,47 g.kg-1 až 4,67 g.kg-1 (včetně barvířky ‚Golubok‘). (Kumšta a Balík, 2008) zjistili, že většina sledovaných hroznů odrůd ať už Vitis vinifera L. či mezidruhových kříženců má vyšší výskyt anthokyanů kumarylovaných oproti acetylovaným. U hroznů odrůdy ‚Dornfelder‘ a ‚Cerason‘ byl však tento poměr opačný.

78

V této diplomové práci byl taktéž u hroznů odrůd Vitis vinifera L. tak také u odrůd interspecifických zaznamenán vyšší výskyt anthokyanů kumarylovaných oproti acetylovaným. U 9 odrůd z 32 byl zjištěn hojnější výskyt acetylovaných anthokyanů oproti kumarylovaným. Mezi tyto odrůdy patřil také ‚Dornfelder‘ a ‚Cerason‘, dále ‚Alibernet‘, ‚Cabernet Cubin‘, ‚Cabernet Franc‘, ‚Cabernet Dorsa‘, ‚Cabernet Sauvignon‘, ‚Merlot‘ a ‚Nitranka‘. Také (Garcia-Beneytez et al., 2002) zjistili u hroznů pěstovaných ve Španělsku vyšší poměr acetylovaných anthokyanů k anthokyanům kumarylovaným u odrůd ‚Cabernet Sauvignon‘ (2,89) a ‚Merlot‘ (1,68). (Eder et. al., 1994; Mazza 1995; Marx et. al., 2000) ve svých pracích uvádějí, že v hroznech odrůdy ‚Rulandské modré‘ nejsou obsaženy žádné acylované anthokyany. (Balík a Kumšta, 2008) však u této odrůdy zaznamenali stopové koncentrace acylovaných anthokyanů (0,99 %). Také v této diplomové práci bylo stanoveno velmi malé množství acylovaných anthokyanů u odrůdy ‚Rulandské modré‘ (1,06 %). (Balík a Kumšta, 2008) uvádí u odrůd Vitis vinifera L. průměrně 49,09 % malvidin-3-glukosidu, dále malvidin-3-glukosid acylovaný kyselinou p-kumarovou 11,82 %, 10,17 % peonidin-3-glukosidu, 6,29 % petunidin-3-glukosidu a 5,68 % delfinidin-3-glukosidu. V této diplomové práci byl zjištěn průměrný obsah malvidin-3- glukosidu u odrůd Vitis vinifera L. 46,50 %, 12,47 % malvidin-3-glukosidu acylovaného kyselinou p-kumarovou, 11,88 % peonidin-3-glukosidu, 5,92 % petunidin- 3-glukosidu a 5,26 % delfinidin-3-glukosidu. (Revilla et. al., 1998) uvedli, že rozdíly, u stejných odrůd a získaných různými autory v anthokyanovém profilu hroznů, mohou být způsobeny na základě hydrolytického odštěpení kyselin z acylovaných anthokyanů v průběhu extrakce barviva okyselenými roztoky rozpouštědel, což může vést k chybným chemotaxonomickým závěrům o původu dané odrůdy na základě analýzy právě anthokyanového profilu u daných hroznů. V této diplomové práci byly identifikovány pouze anthokyanidiny glykosidované pouze glukózou. (Mazzuca et. al., 2005) však identifikovali i jeden monopentosid blíže nespecifikovaný. (Balík a Kumšta, 2008) nalezli diglukosidické anthokyany u hroznů interspecifických křížení ‚Golubok‘ (45,46 %), ‚Mo.1‘ ((‚Gamay fréaux‘ X (‚Seperavi‘ X ‚Seyve Villard 23657‘)) (46,21 %), ‚Mo.3‘ (Vitis amurensis X ‚Tramín‘) (52,57 %),

79

‚Regent‘ (25,37 %), ‚Peking‘ (Vitis amurensis) (10,63 %) a ‚Marlen‘ (0,33 %). U odrůdy ‚Marlen‘ bylo zjištěno velmi malé zastoupení diglukosidických anthokyanů, a proto s největší pravděpodobností došlo pouze ke kontaminaci vzorku. U dalších zkoumaných interspecifických odrůd, se diglukosidická barviva nevyskytovala: ‚Mo.2‘ ((‚Seyve Villard 18315‘ X (‚Ceaus rozovyj‘ X ‚Mičurinec‘)), ‚Laurot‘, ‚Merlan‘, ‚Nativa‘. Toto zjištění potvrzuje, že nepřítomnost diglukosidických anthokyanů nemůže být považována za dostatečný důkaz pro určení původu. Také v této diplomové práci nebyla diglukosidická barviva nalezena u všech testovaných interspecifických odrůd. Diglukosidy se vyskytovaly podobně jako v práci (Balíka a Kumšty, 2008) pouze u odrůd ‚Golubok‘ (47,37 %) a ‚Regent‘ (28,98 %). U odrůdy ‚Marlen‘ však diglukosidy nalezeny nebyly. Další interspecifické odrůdy, které diglukosidy nesyntetizovaly, jsou ‚Cerason‘, ‚Kofranka‘, ‚Laurot‘, ‚MI-5-70‘, ‚MI-5-114‘ a ‚Nativa‘. Diglukosidické anthokyany byly však ve velmi malém množství nalezeny i u jedné odrůdy Vitis vinifera L.- u Agni (0,77 %). Protože je zastoupení velmi malé a odrůdy Vitis vinifera L. diglukosidická barviva nesyntetizují, s největší pravděpodobností došlo pouze ke kontaminaci vzorku a to odrůdou ‚Golubok‘, jelikož byly hrozny sbírány ve stejný den. Ke kontaminaci mohlo dojít pomocí pinzety. Protože v této práci nebyla diglukosidická barviva nalezena u všech interspecifických odrůd, potvrzuje se tím domněnka, že nepřítomnost diglukosidických anthokyanů nemůže být považována za dostatečný důkaz pro určení původu. Nepřítomnost diglukosidických anthokyanů u některých interspecifických odrůd vysvětluje (Jackson, 2008) tím, že složité hybridy, které zahrnují jedno nebo více zpětných křížení s Vitis vinifera L., produkují pouze monoglukosidické anthokyany, v případě, že již neobsahují dominantní alelu pro syntézu diglukosidů.

80

5 ZÁVĚR

Kvalitnímu vínu by měla příslušet odpovídající barva, jelikož i tento aspekt je při celkovém hodnocení zahrnován. Výsledný odstín vína se dá regulovat jak při výrobě, tak samozřejmě již ve vinici vhodnými agrotechnickými zásahy. To, co zodpovídá za charakteristické zbarvení hroznů, jsou anthokyany a právě těm byla věnována tato diplomová práce. V literární části byla popsána chemická struktura těchto sekundárních metabolitů, jejich postupné hromadění během zrání a také výskyt v hroznech. Zmiňováno bylo např. i ovlivnění anthokyanů patogeny, výživou révy, vodním režimem révy, teplotou či fytohormony. Dále byly popsány fyzikálně-chemické faktory, které taktéž velmi významně ovlivňují stabilitu anthokyanů. Zmíněny byly také změny anthokyanů v průběhu vinifikace ať díky malolaktické fermentaci, různým čiřícím prostředkům, filtraci nebo zásluhou kvasinek. Avšak celkový obsah anthokyanů v hroznech značně závisí jak na ročníku, klimatických podmínkách tak také především na odrůdě, která má vliv právě i na anthokyanový profil. Praktická část této diplomové práce se zabývala především porovnání obsahu anthokyanů a anthokyanovým profilem jak u 23 odrůd Vitis vinifera L. tak také u 9 odrůd interspecifických. Vysoký obsah anthokyanů byl naměřen hlavně u tzv. barvířek. Statisticky byl zjištěn vyšší obsah anthokyanů u odrůd interspecifických. Co se týče anthokyanového profilu, u 12 z 20 anthokyanů byl patrný statistický rozdíl mezi odrůdami Vitis vinifera L. a interspecifickými. Digukosidická barviva, která syntetizují pouze odrůdy interspecifické, nebyla nalezena u všech těchto mezidruhových kříženců. Toto zjištění tedy potvrzuje, že nepřítomnost diglukosidických anthokyanů nemůže být považována za dostatečný důkaz pro určení původu.

81

6 SHRNUTÍ

Tato diplomová práce se zabývá porovnáním anthokyanů u modrých odrůd. Porovnáváno bylo 23 odrůd Vitis vinifera L. a 9 odrůd interspecifických ročníku 2015. Hrozny pocházely z Mikulovské vinařské podoblasti z vinařské obce Lednice. Literární část se zabývá chemickou strukturou anthokyanů a jejich výskytu v hroznech, dále akumulaci anthokyanů a ovlivňujícím faktorům, fyzikálně-chemickým faktorům mající vliv na stabilitu anthokyanů, změnám anthokyanů v průběhu vinifikace a také extrakci anthokyanů a měření barevných parametrů. Praktická část je zaměřena především na porovnání obsahu anthokyanů a jejich profilu u odrůd Vitis vinifera L. a odrůd interspecifických.

Klíčová slova: barvivo, anthokyanový profil, diglukosidy, odrůdy Vitis vinifera L., interspecifické odrůdy

82

7 SUMMARY

This thesis deals with the comparison of anthocyanins in blue grape varieties. It has been compared 23 varieties of Vitis vinifera L. and 9 interspecific varieties from the harvest 2015. The grapes come from the wine region Mikulov and from the wine village Lednice. Literary part deals with the chemical structure of anthocyanins and their occurrence in grapes, further accumulation of anthocyanins and influencing factors, physico-chemical factors affecting the stability of anthocyanins, change of anthocyanins during the vinification and extraction of anthocyanins and measurement of color parameters. The practical part is especially focused on compare the content of anthocyanins and their profile in varieties of Vitis vinifera L. and interspecific varieties.

Key words: pigment, anthocyanin profile, diglucosides, Vitis vinifera L. varieties, interspecific varieties

83

8 POUŽITÁ LITERATURA

1. AMATI, A., A. PIVA, H. CASTELLARI, AND G. ARFELLI. 1996. 'Preliminary studies on the effect of Oidium tuckeri on the phenolic composition of grapes and wines', Vitis, 35: 149-50.

2. AMR, A., and E. AL-TAMIMI. 2007. 'Stability of the crude extracts of Ranunculus asiaticus anthocyanins and their use as food colourants', International Journal of Food Science and Technology, 42: 985-91.

3. ARNOUS, A.; MAKRIS, D.P.; KEFALAS P. Effect of principal polyphenolic components in relation to antioxidant characteristics of aged red wines. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 5736-5742.

4. BAIANO, A., A. DE GIANNI, M. A. PREVITALI, M. A. DEL NOBILE, V. NOVELLO, and L. DE PALMA. 2015. 'Effects of defoliation on quality attributes of Nero di Troia (Vitis vinifera L.) grape and wine', Food Research International, 75: 260-69.

5. BALÍK, J., KUMŠTA, M., 2008: Evaluation of colour content in grapes originating from South Moravia. Czech Journal of Food Sciences, 26, 18-24.

6. BALÍK, Josef. Anthokyaninová barviva v hroznech a vínech: Anthocyanin pigments in grapes and wines. Vyd. 1. Brno: Mendelova univerzita v Brně, 2010, 108 s. Folia Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelianae Brunensis. ISBN 978-80-7375-412-9.

7. BALÍK, Josef. Vinařství: návody do laboratorních cvičení. Vyd. 3., nezměn. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2011. ISBN 80-7157-933-5.

84

8. BALÍK, J., M. KUMŠTA, AND O. ROP. 2013. 'Comparison of anthocyanins present in grapes of Vitis vinifera L. varieties and interspecific hybrids grown in the Czech Republic', Chemical Papers, 67: 1285-92.

9. BEDNÁŘ, P., B. PAPOUŠKOVÁ, L. MULLER, P. BARTÁK, J. STÁVEK, P. PAVLOUŠEK, and K. LEMR. 2005. 'Utilization of capillary electrophoresis/mass spectrometry (CE/MSn) for the study of anthocyanin dyes', Journal of Separation Science, 28: 1291-99.

10. BOULTON, R. 2001. 'The copigmentation of anthocyanins and its role in the color of red wine: A critical review', American Journal of Enology and Viticulture, 52: 67-87.

11. BROUILLARD, R., S. CHASSAING, and A. FOUGEROUSSE. 2003. 'Why are grape/fresh wine anthocyanins so simple and why is it that red wine color lasts so long?', Phytochemistry, 64: 1179-86.

12. BUENO, J. M., P. SAEZ-PLAZA, F. RAMOS-ESCUDERO, A. M. JIMENEZ, R. FETT, and A. G. ASUERO. 2012. 'Analysis and Antioxidant Capacity of Anthocyanin Pigments. Part II: Chemical Structure, Color, and Intake of Anthocyanins', Critical Reviews in Analytical Chemistry, 42: 126-51.

13. BUFFON, P., H. HEYMANN, and D. E. BLOCK. 2014. 'Sensory and Chemical Effects of Cross-Flow Filtration on White and Red Wines', American Journal of Enology and Viticulture, 65: 305-14.

14. BURNS, T., J. P. OSBORNE, and C. G. EDWARDS. 2011. 'Impact of Malolactic Fermentation on Red Wine Color and Color Stability', American Journal of Enology and Viticulture, 62: 391A-92A.

15. BURNS, T. R., and J. P. OSBORNE. 2015. 'Loss of Pinot noir Wine Color and Polymeric Pigment after Malolactic Fermentation and Potential Causes', American Journal of Enology and Viticulture, 66: 130-37.

85

16. CACACE, J. E., and G. MAZZA. 2002. 'Extraction of anthocyanins and other phenolics from black currants with sulfured water', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50: 5939-46.

17. CANALS, R., M. C. LLAUDY, J. VALLS, J. M. CANALS, and F. ZAMORA. 2005. 'Influence of ethanol concentration on the extraction of color and phenolic compounds from the skin and seeds of tempranillo grapes at different stages of ripening', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 4019-25.

18. CARIDI, A. 2013. 'Improved Screening Method for the Selection of Wine Yeasts Based on Their Pigment Adsorption Activity', Food Technology and Biotechnology, 51: 137-44.

19. CASTANEDA-OVANDO, A., M. D. PACHECO-HERNANDEZ, M. E. PAEZ- HERNANDEZ, J. A. RODRIGUEZ, and C. A. GALAN-VIDAL. 2009. 'Chemical studies of anthocyanins: A review', Food Chemistry, 113: 859-71.

20. CASTILLO-SANCHEZ, J. X., M. S. GARCIA-FALCON, J. GARRIDO, E. MARTINEZ-CARBALLO, L. R. MARTINS-DIAS, and X. C. MEJUTO. 2008. 'Phenolic compounds and colour stability of vinhao wines: Influence of wine- making protocol and fining agents', Food Chemistry, 106: 18-26.

21. CAVALCANTI, R. N., D. T. SANTOS, and M. A. A. MEIRELES. 2011. 'Non- thermal stabilization mechanisms of anthocyanins in model and food systems- An overview', Food Research International, 44: 499-509.

22. CORRALES, M., S. TOEPFL, P. BUTZ, D. KNORR, and B. TAUSCHER. 2008. 'Extraction of anthocyanins from grape by-products assisted by ultrasonics, high hydrostatic pressure or pulsed electric fields: A comparison', Innovative Food Science & Emerging Technologies, 9: 85-91.

23. CZIBULYA, Z., I. HORVATH, L. KOLLAR, M. P. NIKFARDJAM, and S. KUNSAGI-MATE. 2015. 'The effect of temperature, pH, and ionic strength on color stability of red wine', Tetrahedron, 71: 3027-31.

86

24. DANISMAN, G., E. ARSLAN, and A. K. TOKLUCU. 2015. 'Kinetic Analysis of Anthocyanin Degradation and Polymeric Colour Formation in Grape Juice during Heating', Czech Journal of Food Sciences, 33: 103-08.

25. DATZBERGER, K., I. STEINER, J. WASHUTTL, and G. KROYER. 1992. 'The influence of wine additives on color and color quality of young red wine', Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung, 194: 524-26.

26. DE ROSSO, M., TONIDANDEL, L., LARCHER, R., NICOLINI, G., RUGGERI, V., DALLA VEDOVA, A., DE MARCHI, F., GARDIMAN, M., & FLAMINI, R. (2012). Study of anthocyanic profiles of twentyone hybrid grape varieties by liquid chromatography and precursor-ion mass spectrometry. Analytica Chimica Acta, 732, 120–129. DOI: 10.1016/j.aca.2011.10.045.

27. DRDÁK, M., ALTAMIRANO, R. C., RAJNIAKOVÁ,A., SIMKO, P., MALÍK, F., BALÍK, J., BENKOVSKÁ, D., 1991: Vorkommen von Anthocyan- Farbstoffen in blauen Traubensorten. Mitteilungen Klosterneuburg, 41, 190-193.

28. DU TOIT, W. J., J. MARAIS, I. S. PRETORIUS, and M. DU TOIT. 2006. 'Oxygen in must and wine: A review', South African Journal of Enology and Viticulture, 27: 76-94.

29. EDER, R., WENDELIN, S., BARNA, J., 1994: Klassifizierung von Rotweinsorten mittels Anthocyananalyse. 1. Mitteilung: Anwendung multivariater statistischer Methoden zur Differenzierung von Traubenproben. Mitteilungen Klosterneuburg, 44, 201-212.

30. EL DARRA, NADA, MOHAMMAD F. TURK, MARIE-AGNES DUCASSE, NABIL GRIMI, RICHARD G. MAROUN, NICOLAS LOUKA, and EUGENE VOROBIEV. 2016. 'Changes in polyphenol profiles and color composition of freshly fermented model wine due to pulsed electric field, enzymes and thermovinification pretreatments', Food Chemistry, 194: 944-50.

87

31. FULEKI, T., & FRANCIS, F. J. (1968). Quantitative methods for anthocyanins. 2. Determination of total anthocyanin and degradation index for cranberry juice. Journal of Food Science, 33, 78–83. DOI: 10.1111/j.1365-2621.1968.tb00888.x.

32. GARCIA-BENEYTEZ, E., REVILLA, E., CABELLO, F., 2002: Anthocyanin pattern of several red grape cultivars and wines made from them, European Food Research and Technology, 215 (1), 32-37.

33. GOLDMANN I., Analýza látkových složek vína metodami HPLC, Diplomová práce, Mendelova univerzita v Brně, 1999.

34. GONZALEZ-MANZANO, S., C. SANTOS-BUELGA, M. DUENAS, J. C. RIVAS-GONZALO, and T. ESCRIBANO-BAILON. 2008. 'Colour implications of self-association processes of wine anthocyanins', European Food Research and Technology, 226: 483-90.

35. GONZALEZ-NEVES, G., G. FAVRE, and G. GIL. 2014. 'Effect of fining on the colour and pigment composition of young red wines', Food Chemistry, 157: 385-92.

36. GUAN, L., J. H. LI, P. G. FAN, S. CHEN, J. B. FANG, S. H. LI, and B. H. WU. 2012. 'Anthocyanin Accumulation in Various Organs of a Teinturier Cultivar (Vitis vinifera L.) during the Growing Season', American Journal of Enology and Viticulture, 63: 177-84.

37. HE, F., N. N. LIANG, L. MU, Q. H. PAN, J. WANG, M. J. REEVES, and C. Q. DUAN. 2012. 'Anthocyanins and Their Variation in Red Wines II. Anthocyanin Derived Pigments and Their Color Evolution', Molecules, 17: 1483-519.

88

38. HE, F., L. MU, G. L. YAN, N. N. LIANG, Q. H. PAN, J. WANG, M. J. REEVES, and C. Q. DUAN. 2010. 'Biosynthesis of Anthocyanins and Their Regulation in Colored Grapes', Molecules, 15: 9057-91.

39. HOHNOVÁ, B., L. ŠŤAVÍKOVÁ, and P. KARÁSEK. 2008. 'Determination of Anthocyanins in Red Grape Skin by Pressurised Fluid Extraction and HPLC', Czech Journal of Food Sciences, 26: S39-S42.

40. CHAVES, M. M., O. ZARROUK, R. FRANCISCO, J. M. COSTA, T. SANTOS, A. P. REGALADO, M. L. RODRIGUES, and C. M. LOPES. 2010. 'Grapevine under deficit irrigation: hints from physiological and molecular data', Annals of Botany, 105: 661-76.

41. JACKSON, Ronald S. Wine science: principles and applications. 3rd ed. Amsterdam: Elsevier/Academic Press, 2008. ISBN 978-012-3736-468.

42. JOHNSON, Hugh a Jancis ROBINSON. Světový atlas vína. Vyd. 2., upr., V Euromedia Group 1. Překlad Eva Císlerová. Praha: Knižní klub, 2009. ISBN 978-80-242-2421-3.

43. JU, Z. Y., and L. R. HOWARD. 2003. 'Effects of solvent and temperature on pressurized liquid extraction of anthocyanins and total phenolics from dried red grape skin', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 5207-13.

44. KRAUS, Vilém. Pěstujeme révu vinnou. 1. vyd. Praha: Grada, 2003. Česká zahrada. ISBN 80-247-0562-1.

45. KUMŠTA, M., Ústní sdělení (2016-03-15)

89

46. LABARBE, B., V. CHEYNIER, F. BROSSAUD, J. M. SOUQUET, and M. MOUTOUNET. 1999. 'Quantitative fractionation of grape proanthocyanidins according to their degree of polymerization', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 47: 2719-23.

47. LI, Y.-G.; TANNER, G.; LARKIN, P. The DMACA-HCl protocol and the treshold proanthocyaninidin content for bloat safety in forage legumes. J. Sci. Food Agric. 1996, 70, 89-101.

48. LIAZID, A., R. F. GUERRERO, E. CANTOS, M. PALMA, and C. G. BARROSO. 2011. 'Microwave assisted extraction of anthocyanins from grape skins', Food Chemistry, 124: 1238-43.

49. MARX, R., HOLBACH, B., OTTENEDER, H., 2000: Determination og nine characteristic anthocyanins in wine by HPLC. In: Recueil des Méthodes Internationales d´Analyse des vins et des moûts., Office International de la Vigne et du Vin, Paris, France.

50. MAZZA, G., 1995: Anthocyanins in grapes and grape products. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35 (4), 341-371.

51. MAZZUCA, P., FERRANTI, P., PICARIELLO, G., CHIANESE, L., ADDEO, F., 2005: Mass spectrometry in the study of anthocyanins and their derivatives: differentiation of Vitis vinifera and hybrid grapes by liquid chromatography electrospray ionization mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Journal of Mass Spectrometry, 40 (1), 83-90.

52. MICHLOVSKÝ, Miloš. Lexikon chemického složení vína: příručka praktického vinaře. Vyd. 1. Rakvice: Vinselekt Michlovský, 2014, 262 s. ISBN 978-80- 905319-2-5.

90

53. MICHLOVSKÝ, Miloš. Příprava červených vín. Vydání první. Rakvice: Vinselekt Michlovský, 2015, 329 stran. ISBN 978-80-905319-5-6.

54. MOLNAR, I., and C. HORVATH. 1976. 'Reverse-phase chromatography of polar biological substances - separation of catechol compounds by high- performance liquid-chromatography', Clinical Chemistry, 22: 1497-502.

55. MONAGAS, M., C. GOMEZ-CORDOVES, and B. BARTOLOME. 2005. 'Evolution of polyphenols in red wines from Vitis vinifera L. during aging in the bottle - I. Anthocyanins and pyranoanthocyanins', European Food Research and Technology, 220: 607-14.

56. MORENO, Juan. Enological chemistry. 1st ed. Waltham, MA: Academic Press, 2012, xi, 429 p. ISBN 0123884381.

57. MORI, K., N. GOTO-YAMAMOTO, M. KITAYAMA, and K. HASHIZUME. 2007. 'Loss of anthocyanins in red-wine grape under high temperature', Journal of Experimental Botany, 58: 1935-45.

58. NACZK, M., and F. SHAHIDI. 2004. 'Extraction and analysis of phenolics in food', Journal of Chromatography A, 1054: 95-111.

59. NÚÑEZ, V., M. MONAGAS, M.C. GOMEZ-CORDOVÉS a B. BARTOLOMÉ. Vitis vinifera L. cv. Graciano grapes characterized by its anthocyanin profile. Postharvest Biology and Technology [online]. 2004, 31(1), 69-79 [cit. 2016-04-29]. DOI: 10.1016/S0925-5214(03)00140-6. ISSN 09255214. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0925521403001406

60. PACE, C., S. GIACOSA, F. TORCHIO, S. R. SEGADE, E. CAGNASSO, and L. ROLLE. 2014. 'Extraction kinetics of anthocyanins from skin to pulp during

91

carbonic maceration of winegrape berries with different ripeness levels', Food Chemistry, 165: 77-84.

61. PALOMERO, F., A. MORATA, S. BENITO, M. C. GONZALEZ, and J. A. SUAREZ-LEPE. 2007. 'Conventional and enzyme-assisted autolysis during ageing over lees in red wines: Influence on the release of polysaccharides from yeast cell walls and on wine monomeric anthocyanin content', Food Chemistry, 105: 838-46.

62. PAVLOUŠEK, Pavel. Encyklopedie révy vinné. Vyd. 1. Brno: Computer Press, 2007, 316 s. ISBN 978-80-251-1704-0.

63. PAVLOUŠEK, Pavel , 2009: Anthokyaniny, taniny a kvalita hroznů pro výrobu červených vín, Vinařský obzor, 102, č.10, str. 462-463, ISSN -1212-7884.

64. PAVLOUŠEK, Pavel. Pěstování révy vinné: moderní vinohradnictví. Praha: Grada, c2011, 333 s. ISBN 978-80-247-3314-2.

65. PIERMATTEI, B., A. PIVA, M. CASTELLARI, G. ARFELLI, and A. AMATI. 1999. 'The phenolic composition of red grapes and wines as influenced by Oidium tuckeri development', Vitis, 38: 85-86.

66. POLO, C M. -- MORENO-ARRIBAS, V M. Wine chemistry and biochemistry. 1. vyd. New York: Springer, 2008. 735 s. ISBN 978-0-387-74116- 1.

67. POZO-BAYON, M. A., M. MONAGAS, M. C. POLO, and C. GOMEZ- CORDOVES. 2004. 'Occurrence of pyranoanthocyanins in sparkling wines manufactured with red grape varieties', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52: 1300-06.

92

68. REVILLA, E., RYAN, J. M., MARTON-ORTEGA, G., 1998: Comparsion of several procedures used for the extraction of anthocyanins from red grapes. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46 (11), 4592-4597.

69. RIBÉREAU-GAYON, P. -- BRANCO, J M. a kol. Handbook of enology : The microbiology of wine and vinifications. Volume 1. 2. vyd. Chichester: John Wiley & Sons, 2005. 497 s. ISBN 0-470-01034-7.

70. RIBÉREAU-GAYON, P. -- TRADUCTION, A. a kol. Handbook of enology : The chemistry of wine stabilization and treatments. Volume 2.2. vyd. Chichester: John Wiley & Sons, 2005. 441 s. ISBN 0-470-01037-1

71. ROBINSON, Jancis. The Oxford companion to wine. 3rd ed. New York: Oxford University Press, 2006, xxiv, 813 p. ISBN 9780198609902.

72. ROBY, G., J. F. HARBERTSON, D. A. ADAMS, and M. A. MATTHEWS. 2004. 'Berry size and vine water deficits as factors in winegrape composition: Anthocyanins and tannins', Australian Journal of Grape and Wine Research, 10: 100-07.

73. SACCHI, K. L., L. F. BISSON, and D. O. ADAMS. 2005. 'A review of the effect of winemaking techniques on phenolic extraction in red wines', American Journal of Enology and Viticulture, 56: 197-206.

74. SHI, QIAN-QIAN, LIN ZHOU, KUI LI, and YAN WANG. 2015. 'Transcriptional Regulation Involved in Anthocyanin Biosynthesis in Plants', Forest Research, 28: 570-76. 75. SCHULTZ, H. R., STOLL, M.: Deutsches Weinbaujahrbuch 2013. Stuttgart: Ulmer, E, 2012. ISBN 9783800177837.

93

76. SOMERS, T.C.; EVANS, M.E. Spectral evaluation of young red wines:

anthocyanin equilibria, total phemnolics, free and molecular SO2, “chemical age”. J. Sci. Food Agric. 1977, 28, 279-287.

77. SOTOLÁŘ, Radek. Atlas odrůd - réva: Multimediální atlas podnožových, moštových a stolních odrůd révy [online]. 2007 [cit. 2016-03-15]. Dostupné z: http://tilia.zf.mendelu.cz/ustavy/556/ustav_556/atlas_reva/atlas_reva.pdf

78. SOTOLÁŘ, Radek. Ústní sdělení (2016-03-04).

79. SOUBEYRAND, E., C. BASTEAU, G. HILBERT, C. VAN LEEUWEN, S. DELROT, and E. GOMES. 2014. 'Nitrogen supply affects anthocyanin biosynthetic and regulatory genes in grapevine cv. Cabernet-Sauvignon berries', Phytochemistry, 103: 38-49.

80. STEIDL, Robert a Wolfgang RENNER. Moderní příprava červeného vína. 2. vyd. Valtice: Národní vinařské centrum, 2006, 72 s. ISBN 80-903201-7-1.

81. STEIDL, Robert. Sklepní hospodářství. V českém jazyce vyd. 2., aktualiz. Valtice: Národní vinařské centrum, 2010, 309 s. ISBN 978-80-903201-9-2.

82. TALCOTT, S. T., C. H. BRENES, D. M. PIRES, and D. DEL POZO- INSFRAN. 2003. 'Phytochemical stability and color retention of copigmented and processed muscadine grape juice', Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51: 957-63.

83. VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin 3. 2. vyd. Tábor: OSSIS, 2002, 343 s. ISBN 808665902x.

94

84. WATERMAN, P.G.; MOLE, S. Analysis of Phenolic Plant Metabolites; Blackwell Scientific Publ.: Oxford, 1994; s. 83-91.

85. ZOECKLEIN, B.W.; FUGELSANG, K.C.; GUMP, B.H.; NURY, F.S. Production Wine Analysis; Van Nostrand Reinhold Publ.: New York, 1990; s. 129-168.

95