Filogenia de Markea Rich. (Solanaceae: Juanulloeae) con base en datos de secuencias de ADN nuclear y del cloroplasto
Andrés Orejuela Ramírez
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Bogotá D.C., Colombia Marzo 2016
Filogenia de Markea Rich. (Solanaceae: Juanulloeae) con base en datos de secuencias de ADN nuclear y del cloroplasto
Andrés Orejuela Ramírez
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de: Magister en Ciencias-Biología
Directora: Dra. Clara Inés Orozco
Línea de Investigación: Sistemática
Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Bogotá D.C., Colombia Marzo 2016
A la memoria de mi padre. A mi madre y mi hijo. Agradecimientos Agradezco muy especialmente a la profesora Clara Inés Orozco por sus enseñanzas, apoyo y constante guía durante todos mis años como estudiante, su paciencia y confianza a pesar de los altibajos me han permitido mejorar cada vez y aprender de errores y problemas. Quiero agradecer a la Universidad Nacional de Colombia y especialmente al Instituto de Ciencias Naturales y a todos sus profesores por el apoyo brindado. A la dirección de investigación, sede Bogotá de la Universidad Nacional (DIB), proyecto 13574, al programa Jóvenes investigadores e innovadores de COLCIENCIAS y al programa de estímulos a la investigación Thomas van der Hammen del Jardín Botánico de Bogotá por la financiación. A los curadores de los herbarios visitados, a las personas que me acompañaron en campo y a quienes facilitaron sus valiosas muestras para los estudios moleculares y fotografías en vivo de las especies que acompañan este documento. Agradezco especialmente a la Dra. Lynn Bohs y al Dr. Gregory Wahlert durante mi estadía en Utah, lugar en el que fue desarrollado la totalidad del trabajo de laboratorio, a Greg un gran agradecimiento por las enseñanzas y la ayuda con la secuenciación del gen GBSSI y de algunas otras secuencias de difícil amplificación. A la Dra. Gloria Barboza por apoyar este proyecto y por su hospitalidad durante mi visita a Córdoba, Argentina y a la Dra. Carmen Benítez de Rojas por sus sabias palabras y por ayudarme gentilmente con algunas muestras de Venezuela. Quiero agradecer también a quienes fueron mis compañeros del grupo de Solanáceas de Colombia durante varios años, Duban Canal, Jorge Mario Vélez, Angélica Alba y Gabriel Beltrán, gracias por su compañerismo durante numerosos congresos, cursos y salidas de campo. Agradezco de manera especial a mi padre, quien siempre me inculcó el valor del estudio, su reciente muerte ha sido un duro golpe para mí, a mi madre que ha sido un apoyo constante en todos los aspectos, a Rocio y a mi hijo Esteban, él me dio un norte y una razón para luchar. Igualmente, quiero agradecer a Jhoana Castillo, quien me ha brindado su amor y apoyo constante e incondicional, sin ella no habría sido posible la finalización de este trabajo. A mis compañeros del Jardín Botánico de Bogotá, Marcela Celis, Carlos Vargas, Janice Valencia, Diego Moreno, Angela Rodriguez y José Muñoz. Finalmente, quiero agradecer a todos mis amigos y a aquellas personas que de una u otra forma han sido participes de mi vida, a todas muchas gracias. Resumen 7
Resumen Markea (Solanaceae, Juanulloeae) es un género neotropical de lianas o arbustos epífitos, con aproximadamente 20 especies. La circunscripción actual del género es controversial y se basa en taxonomía tradicional y en estudios filogenéticos morfológicos. Para resolver las dudas sobre la monofilia de Markea se realizó un análisis filogenético bajo máxima parsimonia (MP) e inferencia bayesiana (IB) con información de dos marcadores nucleares (ITS y GBSSI) y dos del cloroplasto, (trnT–trnF y rps16–trnK). Se incluyeron en los análisis 18 especies de Markea y representantes de todos los géneros de la tribu Juanulloeae y de otros géneros de Solanaceae como Atropa, Lycium y Nicandra. Los resultados indicaron que Markea como ha sido circunscrito en el pasado no es monofilético, solo las especies M. coccinea, M. costanensis, M. formicarum y M. sessiliflora pertenecerían a Markea. Estas especies se distribuyen en el Escudo Guayanés, la Amazonía y la cordillera de la Costa de Venezuela. Las especies restantes, la mayoría de ellas distribuidas en los Andes, se agruparon en otros géneros de la tribu Juanulloeae. Se discuten los resultados del presente trabajo y sus implicaciones en la circunscripción de Markea, de los demás géneros de Juanulloeae y de la tribu en general. Por último, se caracterizan morfológicamente los clados obtenidos y se presentan algunas novedades taxonómicas.
Palabras clave: filogenia, Hawkesiophyton, Juanulloeae, Markea, Solanaceae. Abstract 8
Abstract Markea (Juanulloeae, Solanaceae) is a Neotropical genus of epiphytic shrubs or vines, with ca. 20 species. Current circumscription of the genus is controversial and is based on traditional taxonomy or morphological phylogenetic studies. To resolve the doubtful monophyly of Markea, one phylogenetic analysis was performed using two nuclear markers (ITS and GBSSI) and two chloroplast regions (trnT–trnF and rps16–trnK) and analyzing the sequences obtained under Maximum parsimony and Bayesian inference. 18 species of Markea and species of all genera of the tribe Juanulloeae and other genera of Solanaceae as Atropa, Lycium and Nicandra were included in this study. It was found that genus Markea as has been previously defined is not monophyletic and only M. coccinea, M. costanensis, M. formicarum and M. sessiliflora must be kept in Markea, all species distributed in the Guiana Shield, the Amazonian basin or the Venezuelan Coastal Ranges System. The remaining species, most of them Andeans in distribution were grouped into different clades along the phylogeny of the tribe. The results and their implications for the circumscription of Markea, the remaining genera of Juanulloeae and the all tribe are discussed. Additionally, the clades obtained are morphologically characterized and some taxonomic novelties are presented.
Keywords: Hawkesiophyton, Juanulloeae, Markea, molecular phylogeny, Solanaceae. Contenido 9
CONTENIDO Pág.
INTRODUCCIÓN ...... 18 Reconocimiento morfológico de Markea...... 20 Problema de investigación ...... 20 Objetivos ...... 22 Objetivos específicos...... 22
1. MATERIALES Y MÉTODOS...... 23 Estudio de las especies: trabajo de herbario y campo ...... 23 Análisis filogenético ...... 24 1.2.1 Representación de taxones...... 24 1.2.2 Elección de marcadores moleculares...... 27 1.2.3 Extracción, amplificación y secuenciación de ADN...... 30 1.2.4 Construcción de la matriz de secuencias, alineamiento y combinación de las fuentes de información...... 33 1.2.5 Análisis de datos ...... 36
2. RESULTADOS ...... 38 2.1 Máxima parsimonia (MP) ...... 38 2.1.1 Análisis de MP para el marcador ITS ...... 40 2.1.2 Análisis de MP para el marcador GBSSI ...... 41 2.1.3 Análisis de MP para el marcador trnT–trnF ...... 43 2.1.4 Análisis de MP para el marcador rps16–trnK...... 44 2.1.5 Análisis de MP para la combinación de los marcadores nucleares...... 46 2.1.6 Análisis de MP para la combinación de los marcadores de cloroplasto...... 47 2.1.7 Análisis de MP para la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto……………………………………………………………………………………...49 2.2 Inferencia bayesiana (IB) ...... 51 2.2.1 Análisis de IB para el marcador ITS ...... 51 2.2.2 Análisis de IB para el marcador GBSSI...... 52 2.2.3 Análisis de IB para el marcador trnT–trnF ...... 54 2.2.4 Análisis de IB para el marcador rps16–trnK ...... 55 2.2.5 Análisis de IB para la combinación de los marcadores nucleares...... 57 2.2.6 Análisis de IB para la combinación de los marcadores del cloroplasto ...... 58 Contenido 10
2.2.7 Análisis de IB para la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto……………………………………………………………………………………...60 2.3 Resultado general de los análisis filogenéticos...... 62 2.4 Resumen de las relaciones encontradas con énfasis en las especies de Markea 65
3. DISCUSIÓN...... 68 3.1 El clado Markea lopezii y la ubicación genérica de Markea epifita, Markea huilensis y Markea lopezii ...... 68 3.2 El clado Schultesianthus s.l. y la ubicación genérica de Markea crosbiana ...... 69 3.3 El clado Markea antioquiensis y la ubicación genérica de Markea pilosa y Markea antioquiensis...... 71 3.4 El clado núcleo de Juanulloeae ...... 72 3.4.1 El clado Markea...... 72 3.4.2 El clado Hawkesiophyton y la ubicación genérica de Markea panamensis, Markea ulei y Markea harlingiana...... 73 3.4.3 El clado Dyssochroma y la ubicación genérica de Markea atlantica ...... 75 3.4.4 El clado Poortmannia y la ubicación genérica de Markea fosbergii...... 75 3.4.5 El clado Markea sturmii y la ubicación genérica de Markea sturmii y Markea hunzikeri...... 76 3.4.6 Markea purpurea “incertae sedis” ...... 76 3.5 Implicaciones para la circunscripción de la tribu y de otros géneros de Juanulloeae.77
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ...... 78 4.1 Conclusiones...... 78 4.2 Recomendaciones...... 79
5. BIBLIOGRAFÍA...... 80
6. ANEXOS...... 89 6.1 Anexo A. Three new species of Markea (Solanaceae, Juanulloeae) from Colombia………………………………………………………………………………………….89 6.2 Anexo B. Fotografías en vivo de las especies de Markea y géneros afines que conforman los clados encontrados en los análisis filogenéticos...... 105 Contenido 11
Lista de figuras Pág. Figura 1. Detalle del marcador ITS, tomado de Baldwin et al. (1995)...... 28 Figura 2. Esquema de la estructura del marcador molecular GBSSI (tomado de Levin et al. (2005)...... 28 Figura 3. Estructura del marcador trnT–trnF (Tomado de Taberlet et al. 1991)...... 29 Figura 4. Locus trnQ(UUG)–5’trnK(UUU) resaltando el espaciador intergénico 3'rps16– 5'trnK(UUU) en el tabaco (Nicotiana tabacum L.) (adaptado de Shaw et al. 2007)...... 30 Figura 5. Super-red filogenética obtenida de la combinación de los árboles de ITS, GBSSI, trnT–trnF y rps16–trnK bajo MP (La super-red filogenética no muestra un modelo de evolución, en lugar de ello es una gráfica de consenso que resume múltiples filogenias no enraizadas). Las especies en rojo son aquellas sobre las que se enfoca este estudio... 35 Figura 6. A. Árbol de consenso estricto de los 57 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador ITS (L= 811 pasos, IC=0.52 e IR=0.68). B. Árbol de consenso estricto de los 432 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador GBSSI (L= 660 pasos, IC=0.82 e IR=0.79). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio. .. 42 Figura 7. A. Árbol de consenso estricto de los 423663 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador trnT–trnF (L= 337 pasos, IC=0.81 e IR=0.89). B. Árbol de consenso estricto de los 173767 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador rps16–trnK (L= 240 pasos, IC=0.77 e IR=0.87). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio...... 45 Figura 8. A. Árbol de consenso estricto de los 8 árboles más parsimoniosos de la combinación de los marcadores ITS+GBSSI (L= 1530 pasos, IC=0.63 e IR=0.69) B. Árbol de consenso estricto de los 157.284 árboles más parsimoniosos de la combinación de los marcadores trnF+rps16–trnK (L= 580 pasos, IC=0.79 e IR=0.88). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio...... 48 Figura 9. Árbol de consenso estricto de los 60 árboles más parsimoniosos producto de la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto (ITS+GBSSI+trnT– trnF+rps16–trnK) (L= 2143 pasos, IC=0.66 e IR=0.74). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio...... 50 Figura 10. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferidos en los análisis de IB para el marcador ITS. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los Contenido 12
análisis de IB para el marcador GBSSI. Los números sobre las ramas son PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio...... 53 Figura 11. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB para el marcador trnT–trnF. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB para el marcador rps16–trnK. Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio...... 56 Figura 12. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de la combinación de los marcadores ITS+GBSSI. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de la combinación de los marcadores trnT– trnF+rps16–trnK. Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio...... 59 Figura 13. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de los cuatro marcadores combinados (ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16–trnK). Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio...... 61 Figura 14. Árbol de consenso estricto inferido del análisis de MP para la combinación de todos los marcadores (ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16–trnK). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS y PP. Las especies subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio. En color verde se destacan las especies relacionadas con la especie tipo M. coccinea en el clado Markea y en rojo aquellas que se anidaron en otros clados dentro de Juanulloeae...... 64 Figura 15. Especies del clado Markea lopezii. A. E. M. lopezii. B. D. M. huilensis. C. M. epifita (Fotografías: A: Eduardo Calderón; B, D, E: Andrés Orejuela C: Álvaro Pérez)..106 Figura 16. Especies del clado Schultesianthus s.l. A. Sch. leucanthus. B. Sch. odoriferus. C. Sch. aff. megalandrus. D. J. globifera. E. J. wardiana. F. J. speciosa. G., H. M. crosbiana. (Fotografías: A: Jorge Vélez; B, C: Andrés Orejuela; D: Saúl Hoyos; E: Rodolfo Flores; F: Duban Canal; G, H: Melisa Ayala)...... 107 Figura 17. Especies del clado Markea antioquiensis. A. B. M. antioquiensis. C. D. M. pilosa (Fotografías: A: Julio Betancur; B: Sandra Urbano; C: Nils Koster; D: Andreas Kay). ...108 Figura 18. Especies del clado Markea. A. M. coccinea. B. M. plowmanii. C. M. formicarum. D. M. costanensis. E. M. longiflora. (Fotografías: A, C: Robin Foster; B: Antonio Peña; D: Günter Gerlach; E: Hervé Galliffet)...... 109 Contenido 13
Figura 19. Especies del clado Hawkesiophyton. A. M. panamensis. B. M. ulei. C. Markea sp. nov. D. J. ochracea (Fotografías: A, D: Andrés Orejuela; B. María F. González; C: Robin Foster)...... 110 Figura 20. Especies del clado Dyssochroma A. D. viridiflora. B. M. atlantica. C. D. D. longipes. (Fotografías: A: Gloria Barboza; B. Ludovic Kollman; C: Eduardo Giehl; D: Eduardo Damasceno Lozano)...... 111 Figura 21. Especies del clado Poortmannia A. B. M. fosbergii. C. D. T. speciosa. (Fotografías: A, B: Rocio Deanna; C, D: Andrés Orejuela)...... 112 Figura 22. Especies del clado Markea sturmii A. B. C. M. hunzikeri, D. E. M. sturmii (Fotografías: A-E: Andrés Orejuela)...... 113 Figura 23. Markea purpurea y especie afín. A. B. M. purpurea. C. Markea sp. nov. (Fotografías: A: Thomas Andres; B: Jhoana Castillo; C: Ulli Schmith) ...... 114 Contenido 14
Lista de tablas Pág. Tabla 1. Conceptos taxonómicos y distribución de Markea. El guion (—) indica que la especie no fue tratada en Knapp et al. (1997), Knapp (1998) o Hunziker (1997, 2001)...19 Tabla 2. Salidas de campo realizadas ...... 23 Tabla 3. Accesiones incluidas en los análisis moleculares. Los números en paréntesis indican que se incluyó más de una accesión de una especie dada. El guion (—) indica que no se encontró información sobre el espécimen de referencia o el herbario donde fue depositado dicho espécimen...... 25 Tabla 4. Detalle de los primers usados durante el proceso de amplificación y secuenciación de las regiones de ADN estudiadas. * Primers usados solamente para la secuenciación. ** Primers internos usados para la amplificación y secuenciación del material problemático. Modificado de Tepe et al. (2011)...... 31 Tabla 5. Estadística descriptiva para cada marcador molecular y para las distintas combinaciones realizadas en los análisis de MP...... 39 Tabla 6. Ubicación de las especies de Markea en los diferentes clados obtenidos en el análisis de MP en comparación con los análisis de IB. Los clados donde hubo variación en la ubicación entre los análisis de MP e IB, se separaron mediante barra inclinada (MP/IB). No asignada hace referencia a una especie que no se anidó en ningún clado. No incluida se refiere a una especie para la cual no se obtuvieron secuencias para un marcador determinado...... 67 Contenido 15
Lista de Símbolos y abreviaturas Símbolos Símbolo Término Unidad M Metro Longitud °C Grados Celsius Temperatura µl Microlitro Volumen Ng Nanogramo Masa Mm Milimolar Concentración molar
Abreviaturas Abreviatura Término A. Atropa ADN Ácido desoxirribonucleico BS Bootstrap BSA Bovine Serum Albumin CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide D. Dyssochroma DMSO dimetil sulfóxido dNTPs Deoxynucleotide triphosphates GBSSI Granule-bound starch synthase IB Inferencia bayesiana ILD Incongruence Length Difference ITS Internal transcribed spacer J. Juanulloa L. Lycium L Longitud LB En el texto se cita para hacer referencia a los nombres de los aislados de ADN que siguen un consecutivo de la Dra. Lynn Bohs. LSC Large single copy N. Nicandra M. Markea Mer. Merinthopodium MP Máxima parsimonia Contenido 16
pb Pares de bases PCR Polymerase chain reaction rps16–trnK Marcador molecular no codificante del cloroplasto S. Solandra Sch. Schultesianthus T. Trianaea TBR Tree bisection reconection trnT– trnF Marcador molecular no codificante del cloroplasto s.l. Sensu lato Contenido 17
Acrónimos Acrónimos Término CAUP Herbario de la Universidad del Cauca COAH Herbario Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas SINCHI COL Herbario Nacional Colombiano, Universidad Nacional de Colombia CORD Herbario IMBIV-Museo Botánico - Córdoba, Argentina. CUVC Herbario Universidad del Valle F Herbario Field Museum of Natural History - Chicago, Illinois, U.S.A. FMB Herbario Instituto Alexander von Humboldt HECASA Herbario Catatumbo-Sarare- Universidad de Pamplona HUA Herbario Universidad de Antioquia HUAZ Herbario Universidad de la Amazonía HUQ Herbario Universidad del Quindío JAUM Herbario Jardín Botánico de Medellín Joaquín Antonio Uribe JBB Herbario Jardín Botánico de Bogotá José Celestino Mutis JBGP Herbario Jardín Botánico Guillermo Piñeres LLANOS Herbario Universidad de los Llanos MEDEL Herbario Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín MO Herbario Missouri Botanical Garden - Saint Louis, Missouri, U.S.A. PSO Herbario Universidad de Nariño QCA Herbario Pontificia Universidad Católica del Ecuador QCNE Herbario Museo Ecuatoriano de Ciencias Naturales TOLI Herbario Universidad del Tolima UDBC Herbario Universidad Distrital Francisco José de Caldas UIS Herbario Universidad Industrial de Santander UTMC Herbario Universidad del Magdalena VALLE Herbario Universidad Nacional de Colombia - Sede Palmira Introducción 18
Introducción
Markea Rich. (Solanaceae) es un género neotropical perteneciente a la subfamilia Solanoideae, tribu Juanulloeae Hunz. (Hunziker 1977, 1979, 1997; Knapp et al. 1997; Knapp 1998, Orejuela et al. 2014). Las especies de Markea son arbustos, lianas epífitas o hemiepífitas distribuidas desde Panamá a Bolivia y sur de Brasil (Hunziker 1997, 2001; Knapp et al. 1997). Muchas de las especies de Markea crecen en bosques primarios o poco intervenidos que van desde el nivel del mar hasta aproximadamente los 3000 m, con preferencia por los bosques nublados andinos, en altitudes medias de 1500 a 2500 m. Algunas pocas especies como Markea coccinea Rich. y Markea formicarum Dammer, se encuentran restringidas a tierras bajas de la región Amazónica y del Escudo Guayanés. Markea longiflora Miers ha sido registrada en la isla de Trinidad y Tobago (Hunziker 1997) y Markea atlantica Stehmann & Giacomin se distribuye en la mata atlántica brasileña (Stehmann & Giacomin 2012). La mayor concentración de especies se encuentra en los Andes de Colombia y Ecuador, siendo Colombia el país más diverso con 13 especies de las 20 especies actualmente reconocidas (Orejuela et al. 2014). Las especies de Markea son presumiblemente polinizadas por colibríes (Hunziker 1997; Knapp et al. 1997; Knapp 2010) o por insectos (Knapp 2010). Algunas de las especies amazónicas de Markea se encuentran asociadas con hormigas de los géneros Azteca y Camponotus (Ducke 1915, 1922).
Olmstead et al. (2008), Särkinen et al. (2013) y Ng & Smith (2016), reconocen a la tribu Juanulloeae como un grupo natural; sin embargo, la circunscripción de la tribu ha sido históricamente controversial, específicamente en lo que respecta a la inclusión de Solandra Sw. (Knapp et al. 1997; Hunziker 2001, Olmstead et al. 2008) y de Schultesianthus Hunz. (Olmstead et al. 2008). Del mismo modo, diferentes conceptos han sido formulados sobre el estatus de Ectozoma Miers, Hawkesiophyton Hunz. y Rahowardiana D'Arcy, como géneros independientes (Hunziker 2001) o como sinónimos de otros géneros en Juanulloeae (Knapp et al. 1997). En el caso de Markea, la información morfológica y molecular disponible a la fecha corrobora su inclusión en la tribu Juanulloeae (Knapp et al. 1997; Hunziker 1997, 2001; Olmstead et al. 2008, Särkinen et al. 2013; Ng & Smith 2016); no obstante, no existe un acuerdo en relación con su circunscripción (Tabla 1). Knapp et al. (1997), sinonimizaron a Hawkesiophyton bajo Markea, consideraron a la especie Markea lopezii Hunz. como "incertae sedis" y corroboraron la transferencia de tres Introducción 19
especies mesoamericanas, Markea uniflora Lundell, Markea crosbiana DʹArcy y Markea venosa Standl. & C. V. Morton a Schultesianthus, las cuales previamente habían sido transferidas por Knapp (1995). De manera alternativa, Hunziker (1997, 2001), propuso a Hawkesiophyton como un género independiente y consideró a las tres especies mesoamericanas y a M. lopezii como parte de Markea.
Tabla 1. Conceptos taxonómicos y distribución de Markea. El guion (—) indica que la especie no fue tratada en Knapp et al. (1997), Knapp (1998) o Hunziker (1997, 2001).
Conceptos taxonómicos
Especie Según Knapp et al. Según Hunziker Distribución Geográfica (1997), Knapp (1997, 2001) (1998) Markea antioquiensis S.Knapp Markea — Colombia Markea atlantica Stehmann & — — Brasil Giacomin Bolivia, Brasil, Colombia, Guayana Markea coccinea Rich. Markea Markea Francesa, Guyana, Perú y Surinam sinónimo de M. Markea costanensis Steyerm. Markea Venezuela sessiliflora Markea crosbiana DʹArcy Schultesianthus Markea Costa Rica y Panamá
Markea epifita S.Knapp Markea — Ecuador Bolivia, Brasil, Colombia, Guayana Markea formicarum Dammer Markea Markea Francesa, Guyana, Perú y Surinam Markea fosbergii Hunz. — Markea Ecuador
Markea harlingiana Hunz. — Markea Colombia y Ecuador Markea huilensis A. Orejuela & J. — — Colombia M. Vélez Markea hunzikeri A. Orejuela & — — Colombia C.I. Orozco Guayana Francesa, Guyana, Brasil, Markea longiflora Miers Markea Markea Trinidad y Tobago y Venezuela
Markea lopezii Hunz. incertae sedis Markea Colombia
Markea panamensis Standl. Markea Hawkesiophyton Colombia y Panamá
Markea pilosa S.Knapp Markea — Colombia y Ecuador
Markea plowmanii Hunz. — Markea Colombia Markea purpurea A. Orejuela & — — Colombia C.I. Orozco
Markea sessiliflora Ducke Markea Markea Brasil, Guyana, Surinam y Venezuela.
Markea spruceana Hunz. Markea Markea Ecuador
Markea sturmii Cuatrec. Markea Markea Colombia Introducción 20
Brasil, Colombia, Ecuador, Guyana, Markea ulei (Dammer) Cuatrec. Markea Hawkesiophyton Perú y Surinam Markea uniflora Lundell Schultesianthus Markea México
Markea vasquezii E. Rodr. — — Perú Markea venosa Standl. & C. V. Schultesianthus Markea Costa Rica y Panamá Morton
Reconocimiento morfológico de Markea
Markea ha sido definido morfológicamente con base en una combinación de caracteres que incluye inflorescencias cimosas, cortas a largamente pedunculadas y con pocas a numerosas flores o reducidas a una flor, lóbulos del cáliz profundamente divididos, prefloración corolina imbricada, corola infundibuliforme, raramente tubular-campanulada o hipocrateriforme y anteras basifijas (Knapp et al. 1997; Hunziker 1997, 2001). Sin embargo, algunos de estos caracteres son variables (Knapp 1998), o incluso pueden encontrarse en otros géneros de Juanulloeae (Orejuela, obs. pers.). Knapp et al. (1997), señaló que el fruto de Markea con exocarpo delgado y traslúcido y semillas pálidas cafés a naranjas, con células de la testa rectangulares y alargadas podría ser útil en el reconocimiento del género; no obstante, los frutos de varias especies son desconocidos o se conocen de muy pocas colecciones, por lo cual el valor real de estos caracteres no ha sido correctamente evaluado y requiere mayores estudios. En este contexto, Markea permanece pobremente definido y como fue mencionado por Knapp (1998), Stehmann & Giacomin (2012) y Orejuela et al. (2014), es evidente que el género requiere de una revisión basada en un extensivo trabajo de campo que incluya aproximaciones en sistemática molecular.
Problema de investigación
Las colecciones de Markea en los herbarios colombianos y extranjeros son escasas. Muchas de las especies son difíciles de recolectar debido a su hábito epífito, usualmente presentes en el dosel del bosque, con poblaciones de pocos individuos y de floración ocasional (Orejuela obs. pers.). Gran parte de las especies crecen en bosques inhóspitos e inaccesibles, los cuales en su gran mayoría presentan deficiencias en el muestreo botánico. Por estas razones, muchas de las especies del género han sido descritas con base en escaso material (Cuatrecasas 1958, 1959; Hunziker 1985, 1997; Knapp 1998; Orejuela et al. 2014). Introducción 21
Los estudios sistemáticos en Markea con base en caracteres morfológicos han presentado históricamente el limitante anteriormente mencionado, por esta razón, se ha sugerido que cualquier intento racional de investigación en el grupo requiere de una fase amplia de campo y herbario, que permita obtener material representativo de las especies (Knapp et al. 1997). Es evidente que aproximaciones en sistemática molecular podrían ser una alternativa para resolver los problemas presentes en el grupo (Knapp 1998). En ese sentido, la obtención de nuevas colecciones y de pequeñas muestras foliares frescas, permitiría trascender los limitantes existentes y emprender un estudio filogenético con base en datos moleculares.
El alto número de especies de Markea distribuidas en Colombia con más del 60% de la diversidad de especies, con un número apreciable de taxones endémicos, constituye una ventaja para emprender la investigación desde Colombia. Adicional a esto, un estudio con datos moleculares se enmarca dentro del contexto actual de la investigación internacional de la familia Solanaceae, que busca fortalecer los estudios moleculares en grupos poco representados en las filogenias actualmente disponibles (Olmstead & Bohs 2007; Olmstead et al. 2008; Särkinen et al. 2013; Ng & Smith 2016). Dos de los trabajos recientes que presentan filogenias moleculares a gran escala para la familia Solanaceae, Olmstead et al. (2008) y Särkinen et al. (2013), trataron solamente dos especies de Markea, M. panamensis y M. ulei, ambas pertenecientes al género Hawkesiophyton de acuerdo a Hunziker (1977, 1979, 2001). Un estudio más reciente por Ng & Smith (2016), incluyó además de las dos especies mencionadas, a M. lopezii y Markea spruceana Hunz. y encontró que las especies de Markea estudiadas no se anidaron en un mismo clado. Sin embargo, estos estudios moleculares no proporcionan respuestas concluyentes sobre la monofilia del género debido a que la representatividad de las especies de Markea fue baja y no se incluyó la especie tipo M. coccinea.
El problema de investigación se fundamenta en que los estudios realizados hasta la fecha con base en taxonomía tradicional y en las hipótesis filogenéticas morfológicas o moleculares, aún no responden a los interrogantes sobre la monofilia de Markea. Persiste la duda si las especies previamente tratadas bajo Hawkesiophyton por Hunziker (1977, 1979, 2001), son especies de Markea como fue sugerido por Knapp et al. (1997). Por otro lado, se duda de la posición genérica de tres especies mesoamericanas tratadas por Hunziker (1997) como pertenecientes a Markea y transferidas a Schultesianthus por Knapp (1995). Finalmente se desconoce la ubicación genérica de M. lopezii (Knapp et al. 1997) y Introducción 22
de las especies no incluidas previamente bajo ninguna hipótesis filogenética como M. antioquiensis, M. atlantica, M. epifita, M. fosbergii, M. harlingiana, M. huilensis, M. hunzikeri, M. pilosa, M. plowmanii, M. purpurea y M. vasquezii.
Objetivos
• Proponer una hipótesis filogenética para el género Markea con base en datos moleculares del genoma nuclear y del cloroplasto.
Objetivos específicos
• Evaluar la monofilia de Markea y las relaciones filogenéticas de sus especies.
• Proponer una hipótesis de ubicación genérica para las especies de Markea tradicionalmente asignadas a Hawkesiophyton.
• Inferir de los resultados la posición de M. lopezii, de las tres especies mesoamericanas, M. uniflora M. crosbiana y M. venosa y de otras especies de Markea no evaluadas en anteriores estudios.
• Caracterizar morfológicamente los clados obtenidos en el estudio filogenético de Markea. Materiales y métodos 23
1. Materiales y métodos
Estudio de las especies: trabajo de herbario y campo
Con el propósito de reconocer las especies de Markea y definir las localidades donde efectuar las salidas de campo se realizó un extenso trabajo de herbario. Estas labores se enfocaron en los principales herbarios colombianos, visitando un total de 20 herbarios (CAUP, COAH, COL, CUVC, FMB, HECASA, HUA, HUAZ, HUQ, JAUM, JBB, JBGP, LLANOS, MEDEL, PSO, TOLI, UDBC, UIS, UTMC y VALLE). También se consultaron los herbarios CORD en Argentina, QCA y QCNE en Ecuador y MO y F en Estados Unidos (Acrónimos de acuerdo al Index herbariorum, http://sweetgum.nybg.org/ih/). Los herbarios extranjeros se visitaron con la finalidad de estudiar algunas colecciones tipo de especies de Markea y géneros relacionados.
Posteriormente, se efectuó el trabajo de campo, realizando alrededor de 20 exploraciones, la mayoría de ellas en Colombia, con una salida a Ecuador (Tabla 2). Como producto de este trabajo fue posible hacer importantes observaciones de las plantas vivas, recolectar especímenes de herbario de especies poco colectadas de Markea y de otros géneros de Juanulloeae y obtener muestras frescas de hojas conservadas en silica-gel para los estudios moleculares. Como resultado de este trabajo se elaboró una clave para facilitar la identificación de las especies de Markea y se describieron tres especies nuevas para la ciencia (Anexo A). Adicional a esto, se compiló un extenso registro de fotografías en vivo de las especies de Markea y géneros relacionados (Anexo B).
Tabla 2. Salidas de campo realizadas
País Localidad Fecha Colombia Huila, La Plata, Finca Meremberg Julio 2010
Colombia Antioquia, Urrao, Parque Nacional Natural “Las Orquídeas” Abril 2011
Colombia Nariño, Reserva Natural Ñambi- Reserva La Planada Julio 2011 Colombia Cauca, Parque Nacional Natural Munchique Agosto 2011
Colombia Boyacá, Arcabuco-Moniquira Octubre 2011
Ecuador Provincias de Pichincha, Cotopaxi, Pastaza y Loja Noviembre 2011 Colombia Magdalena, Parque Nacional Natural Sierra Nevada de Santa Marta Febrero 2012
Colombia Cundinamarca, Ubalá Febrero 2012
Colombia Antioquia, Carepa, Apartado, San Luis Marzo 2012 Materiales y métodos 24
Colombia Guaviare, Calamar Agosto 2012
Colombia Cundinamarca, San Francisco-Supatá Septiembre 2012
Colombia Chocó, Tutunendo Enero 2013
Colombia Caquetá, Florencia, El Caraño Febrero 2010, Febrero 2014 Colombia Valle del Cauca, Colombia, Cali, Pance, Hato Viejo Noviembre 2011, Diciembre 2011, Enero 2013 Colombia Valle del Cauca, Vía Cali-Buenaventura, Finca Zíngara-Finca el Refugio Noviembre 2011, Febrero 2014
Colombia Tolima, Ibagué, Cañón del Combeima Febrero 2014
Análisis filogenético
1.2.1 Representación de taxones
En los análisis se incluyeron 18 especies de Markea, incluyendo a M. crosbiana, considerada por algunos autores como perteneciente a Schultesianthus (Knapp 1995; Knapp et al. 1997) y a M. costanensis, tratada como sinónimo de M. sessiliflora por Hunziker (1997). Adicional a las dos especies mencionadas arriba, fueron incluidas 16 especies de Markea de las 20 especies reconocidas por Orejuela et al. (2014). Entre las especies que se incluyeron se encuentra la especie tipo, M. coccinea y algunos otros taxones que en estudios previos se identificaron con posición controversial en el género, como M. lopezii, M. ulei, M. panamensis y M. crosbiana (Hunziker 1997, 2001; Knapp et al. 1997). Debido a la dudosa monofilia de Markea, con la posibilidad de que algunas especies pertenecieran a otros géneros de Juanulloeae (Knapp et al. 1997, Knapp 1998, Orejuela et al. 2014), se amplió la representación para incluir especies de todos los géneros que en el pasado fueron asignados a la tribu Juanulloeae. En total se incluyeron 59 accesiones pertenecientes a 41 especies y 10 géneros (Tabla 3), lo que representa la densidad de muestreo más grande para la tribu Juanulloeae realizada hasta la fecha. Se incluyeron especies de Dyssochroma Miers (2 de 2 especies), Juanulloa Ruiz & Pav. (7 de 11 especies, incluyendo representantes de los géneros sinonimizados Ectozoma y Rahowardiana), Merinthopodium Donn. Sm. (2 de 3 especies), Schultesianthus (4 de 5 especies), Trianaea Planch. & Linden (3 de 5 especies) y Solandra (2 de 10 especies). Como grupos externos se usaron representantes de los géneros Atropa L., Lycium L. y Nicandra Adans., decisión tomada de acuerdo a los estudios filogenéticos más recientes para la familia Solanaceae con base en datos moleculares de Olmstead et al. (2008) y Särkinen et al. (2013). Materiales y métodos 25
Con excepción de Lycium cestroides Schltdl. y Atropa belladona L., cuyas secuencias se tomaron de la base de datos online GenBank (Benson et al. 2013), todas las secuencias restantes se generaron en el presente estudio. Algunas especies se incluyeron con más de una accesión, dada la disponibilidad o facilidades para obtener dichas secuencias. Las especies Dyssochroma viridiflora Miers, Juanulloa mexicana (Schltdl.) Miers, Juanulloa ochracea Cuatrec., M. coccinea, M. crosbiana, M. lopezii, M. panamensis, Merinthopodium vogelii (Cuatrec.) Castillo & R.E. Schult., Schultesianthus coriaceus (Kuntze) Hunz., Schultesianthus leucanthus (Donn. Sm.) Hunz. y Trianaea aff. nobilis Planch. & Linden fueron incluidas con dos accesiones. Excepcionalmente, Juanulloa parasitica Hook. incluyó tres accesiones. Se procuró que las diferentes accesiones incluidas para una especie, representaran variaciones morfológicas de la misma o localidades distintas de la distribución general de los taxones.
Tabla 3. Accesiones incluidas en los análisis moleculares. Los números en paréntesis indican que se incluyó más de una accesión de una especie dada. El guion (—) indica que no se encontró información sobre el espécimen de referencia o el herbario donde fue depositado dicho espécimen.
Especie Identificador Espécimen de Procedencia Herbario del aislado referencia de ADN A. belladona AY028129 — GenBank — AY028147, DQ069253, NC_004561.1 Dyssochroma longipes LB3470 A. Korte 4329 Brasil, Santa Catarina, FURB Miers Gramado, Taió D. viridiflora (1) LB3191 Agra 7333 Brasil, Minas Gerais JPB D. viridiflora (2) LB3327 Barboza & Cosa 2524 Brasil, Sao Paulo, Santo André, CORD Paranapiacaba Juanulloa globifera (S. LB3282 Betancur, Pedraza, A. Colombia, Antioquia, Las COL Knapp & D'Arcy) S. Orejuela, Vélez-Puerta y Orquídeas Knapp Duque 15149
J. mexicana (1) LB3472 Jardín Botánico de Alemania (Planta en — Múnich, accesión invernadero) 10/2130 J. mexicana (2) LB1282 Bohs 3295 Holanda, Nijmegen, accesión UT A14750191 (Planta en invernadero) J. ochracea (1) LB3274 A. Orejuela & Colombia, Boyacá, Santa María COL Estudiantes Curso taxonomía de Angiospermas II Semestre 2010 130 J. ochracea (2) LB3323 A. Orejuela, Trujillo & Colombia, Caquetá, Florencia HUAZ Checa 80 J.parasitica (1) LB3479 Fuentes et al. 5445 Bolivia, La Paz, Madidi MO
J. parasitica (2) LB3480 Cayola et al. 2097 Bolivia, La Paz, Franz Tamayo, MO Madidi Materiales y métodos 26
J. parasitica (3) LB3483 R. Seidel 9230 Bolivia, La Paz, Abel Iturralde MO
Juanulloa pavonii LB3416 A. Pérez & Ceballos Ecuador QCNE (Miers) Benth. & Hook. 5635 Juanulloa speciosa LB3214 Orozco et al. 3814 Colombia, Cauca, Munchique COL (Miers) Dunal Juanulloa verrucosa LB273 Bohs 2774 Bolivia UT (Rusby) Hunz. & Subils L. cestroides DQ124623, — GenBank — DQ124513, FJ189707, DQ124451.1, DQ124574.1 M. antioquiensis LB3263 Pedraza et al. 2169 Colombia, Antioquia, Urrao, Las COL Orquídeas M. aff. antioquiensis LB3297 Vélez-Puerta y A. Colombia, Nariño, La Planada MEDEL Orejuela 4152 M. atlantica LB3337 Giacomin 1225 Brasil BHCB M. coccinea (1) LB3501 S. Altamirano & H. Bolivia, Pando, Gral. Federico MO Ramos 4138 Roman M. coccinea (2) LB3469 P. Gaucher s.n French Guiana, Nouragues CAY Station M. costanensis LB3473 Jardín Botánico de Alemania (Planta de M Múnich accesión 10/910 invernadero), origen Venezuela M. crosbiana (1) LB3328 Santamaría et al 9254 Costa Rica BM
M. crosbiana (2) LB3294 Santamaría & Monro Costa Rica BM 9105 M. epifita LB3264 Orozco, Barboza, A. Ecuador, Pastaza, Mera COL, Orejuela & Leyva 3876 QCA M. formicarum LB3259 Betancur et al. 13569 Colombia, Vaupés COL, COAH M. fosbergii LB3265 Orozco, Barboza, A. Ecuador, vía Zamora-Loja COL, Orejuela & Leyva 3929 QCA M. harlingiana LB3318 Gorky Villa & Alvia 3038 Ecuador, Francisco de Orellana, QCA Yasuní M. huilensis LB3284 A. Orejuela & Vélez- Colombia, Huila, La Plata, Finca COL Puerta 112 Meremberg M. hunzikeri LB3275 Betancur, Pedraza, A. Colombia, Antioquia, Urrao, COL Orejuela, Vélez-Puerta y Las Orquídeas Duque 15234 M. lopezii (1) LB3262 A. Orejuela & Calderón Colombia, Valle del Cauca, km COL 169 23 vía Buenaventura, El Refugio M.lopezii (2) LB3447 A. Orejuela 59 Colombia, Valle del Cauca, Km COL 18, vía Buenaventura, Finca Zingara M. panamensis (1) LB3260 A. Orejuela & Isaza 230 Colombia, Antioquia, San Luis, COL Reserva Rio Claro M. panamensis (2) LB3334 Hammel 26276 Panamá, Colon, Donoso MO M. pilosa LB3261 Orozco, Barboza, A. Ecuador, Cotopaxi-Pichincha, COL, Orejuela & Leyva 3984 Reserva Otonga QCA M. purpurea LB3283 Vélez-Puerta y A. Colombia, Nariño, Reserva Río MEDEL Orejuela 4122 Ñambí M. sessiliflora LB3468 Benítez de Rojas & Venezuela, Aragua, Mario MY Granada 7212 Briceño Iragorri M.sturmii LB3258 A. Orejuela & Vélez- Colombia, Huila, La Plata, Finca COL Puerta 111 Meremberg Markea ulei LB3320 M.F. González 1065 Colombia, Amazonas, COL Amacayacu Markea cf. ulei LB800 Bohs 3051 Estados Unidos, planta en UT invernadero (origen Perú?) Merinthopodium LB182 Bohs 2490 Costa Rica UT neuranthum (Hemsl.) Donn. Sm. Mer. vogelii (1) LB3266 Parra-Osorio 687 Colombia, Cundinamarca, COL Soacha Materiales y métodos 27
Mer. vogelii (2) LB3333 A. Orejuela & Fajardo Colombia, Boyacá, Arcabuco COL 165 Nicandra physalodes LB815 Bohs 3022 Bolivia UT (L.) Gaertn. Sch. coriaceus (1) LB3415 A. Orejuela et al. 245 Colombia, Cundinamarca, San JBB Francisco
Sch.coriaceus (2) LB3326 Betancur et al.12686 Colombia, Antioquia, Alto COL Caicedo Sch.leucanthus (1) LB184 Bohs 2503 Costa Rica, Monte Verde UT Sch. leucanthus (2) LB3271 Betancur, Pedraza, A. Colombia, Antioquia, Urrao, Las COL Orejuela, Vélez-Puerta y Orquídeas Duque 15192 Schultesianthus LB3285 A. Orejuela & Vélez- Colombia, Magdalena, Sierra COL megalandrus (Dunal) Puerta 213 Nevada de Santa Marta Hunz. Sch. aff. megalandrus LB3296 A. Orejuela & Fajardo Colombia, Cundinamarca, COL 227 Ubala Schultesianthus LB3272 A. Orejuela & Vélez- Colombia, Huila, La Plata, Finca COL odoriferus (Cuatrec.) Puerta 103 Meremberg Hunz. Solandra grandiflora Sw. LB3295 A. Orejuela 183 Colombia, Valle del Cauca, Cali COL Solandra maxima LB3273 A. Orejuela & Beltrán 66 Colombia, Santander, Mesa de COL (Sessé & Moc.) P.S. los Santos Green Trianaea neovisae LB3267 A. Orejuela, Vélez- Colombia, Magdalena, Sierra COL Romero Puerta & Canal 199 Nevada de Santa Marta Trianaea nobilis Planch. LB3268 Vélez-Puerta y A. Colombia, Nariño, Reserva Río MEDEL & Linden Orejuela 4092 Ñambí T. aff. nobilis (1) LB3324 Orozco, Barboza, A. Ecuador, Cotopaxi-Pichincha, COL, Orejuela & Leyva 3991 Reserva Otonga QCA T. aff. nobilis (2) LB3299 Orozco, Barboza, A. Ecuador, Cotopaxi-Pichincha, COL, Orejuela & Leyva 3982 Reserva Otonga QCA Trianaea speciosa LB3269 A. Orejuela 186 Colombia, Valle del Cauca, Cali, COL (Drake) Soler. Pance, Hato Viejo Trianaea aff. speciosa LB3300 Orozco, Barboza, A. Ecuador, Pastaza, Mera COL, Orejuela & Leyva 3885 QCA
1.2.2 Elección de marcadores moleculares
Se seleccionaron cuatro regiones de ADN, dos nucleares y dos del cloroplasto para ser incluidas en los análisis, las cuales se presentan a continuación:
ITS. Los espaciadores transcribibles internos o ITS, corresponden a una región no codificante ubicada en el cistrón 18S–5.8S–26S del ADN ribosomal, se encuentra conformada por los espaciadores ITS1, el gen 5.8S y el espaciador ITS2 (Fig. 1). Los espaciadores ITS1 e ITS2 son pequeños, cada uno con cerca de 300 pares de bases y altamente variables entre especies debido a mutaciones puntuales y en menor proporción a inserciones y delecciones (Baldwin et al. 1995). La herencia biparental y la facilidad de amplificación con la existencia de primers universales, ha incidido en la última década en el mayor uso de la región ITS para resolver relaciones filogenéticas a diferentes niveles taxonómicos, en particular a nivel genérico e infragenérico (Álvarez & Wendel 2003). Al Materiales y métodos 28
igual que en muchas otras familias de plantas, el marcador ITS es uno de las regiones más usadas en la familia Solanaceae para dilucidar relaciones a diferentes niveles (Olmstead & Bohs 2007).
Figura 1. Detalle del marcador ITS, tomado de Baldwin et al. (1995).
GBSSI. La región GBSSI (también conocida como waxy), es una región de copia única que hace parte del ADN nuclear. En análisis filogenéticos en la familia Solanaceae ha sido utilizado un segmento de 8 intrones que se extiende desde la región 5' del exón 2 (181F), a través de la región 3' al final del exón 10 (2R) (Levin et al. 2005) (Fig. 2). Los intrones tienen una tasa alta de cambios entre especies lo que representa una ventaja para resolver relaciones de parentesco a niveles taxonómicos bajos, particularmente entre géneros y especies cercanas. A niveles más altos las secuencias pueden divergir demasiado y la alineación resulta difícil (Mason-Gamer et al. 1998). En la familia Solanaceae, la región GBSSI ha sido usado para resolver relaciones en clados complejos dentro del género Capsicum L. (Walsh & Hoot 2001), Lycium L. (Levin & Miller 2005), Physalis L. (Whitson & Manos 2005) y Solanum L. (Peralta & Spooner 2001; Levin et al. 2005; Martine et al. 2006; Tepe et al. 2011).
Figura 2. Esquema de la estructura del marcador molecular GBSSI (tomado de Levin et al. (2005). Materiales y métodos 29
trnT–trnF. La región trnT–trnF se encuentra ubicada en la gran región de copia única del cloroplasto y se compone de tres segmentos no codificantes (Fig. 3); el espaciador intergénico trnT–trnL (entre el gen trnT (UGU) y el exon trnL (UAA) 5'), el intrón trnL (entre el exón trnL (UAA) 5' y el exón trnL (UAA) 3') y el espaciador trnL–trnF (entre el exón trnL (UAA) 3' y el gen trnF) (Taberlet et al. 1991). La región trnT– trnF no presenta rearreglos notables en los genes que la conforman entre diferentes grupos de plantas, lo cual permite que pueda ser usada en estudios en un amplio rango taxonómico. Por otro lado, las regiones codificantes que flanquean los tres segmentos no codificantes que componen el marcador trnT–trnF se encuentran altamente conservadas, facilitando su amplificación mediante la utilización de primers universales (Taberlet et al. 1991). Desde que Taberlet et al. (1991) introdujo estos primers, la región trnT–trnF ha sido una de los marcadores moleculares más usados para realizar análisis filogenéticos en plantas, con aproximadamente el 77% de los estudios publicados hasta el 2005 incluyendo algún segmento de esta región (Borsch et al. 2003; Shaw et al. 2005).
Figura 3. Estructura del marcador trnT–trnF (Tomado de Taberlet et al. 1991).
3'rps16–5'trnK(UUU). Este marcador no codificante corresponde a un espaciador intergénico ubicado en la gran región de copia única del cloroplasto (Wakasugi et al. 1998), específicamente, en el locus trnQ(UUG)–5’trnK(UUU) junto con el intron rps16 y el espaciador intergénico trnQ–5’rps16 (Downie et al. 2010) (Fig. 4). Este marcador varía entre 529 y 1008 pb., con un promedio de 786 pb. (Shaw et al. 2007). A pesar de que su uso ha sido poco explorado, existen algunos antecedentes sobre su utilidad. En Shaw et al. (2007) se demostró que esta región junto con otras poco exploradas del genoma del cloroplasto, contiene sitios variables que pueden ser informativos en análisis filogenéticos de angiospermas a bajos niveles taxonómicos. El marcador rps16–trnK ha sido empleado en algunos otros estudios como los de Takahashi et al. (2005) y Spalik et al. (2009), obteniendo resultados satisfactorios. Entre las regiones seleccionadas en el presente Materiales y métodos 30
estudio, es el marcador menos usado en la familia Solanaceae, con algunos estudios como los de Daniell et al. (2006) y Miller et al. (2009), quienes implementaron dicho marcador. En el trabajo de Miller et al. (2009), se encontró una limitada utilidad del marcador para resolver relaciones en la tribu Lyciae (Solanaceae). Las facilidades para la amplificación del marcador rps16–trnK, con la obtención rápida de secuencias se consideraron como una razón práctica para su uso en el presente trabajo.
Figura 4. Locus trnQ(UUG)–5’trnK(UUU) resaltando el espaciador intergénico 3'rps16–5'trnK(UUU) en el tabaco (Nicotiana tabacum L.) (adaptado de Shaw et al. 2007).
1.2.3 Extracción, amplificación y secuenciación de ADN
Los procesos de extracción, amplificación y secuenciación de ADN fueron llevados a cabo en el laboratorio de biología molecular de la Dra. Lynn Bohs de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Estados Unidos (http://biologylabs.utah.edu/bohs/index.html). Este laboratorio se enfoca en estudiar la taxonomía y relaciones evolutivas de la familia Solanaceae.
Extracción
El ADN se obtuvo en su mayoría de material fresco, particularmente de hojas jóvenes que se conservaron en silica-gel al momento de la colecta. En algunos casos excepcionales se obtuvieron secuencias de especímenes de herbario. El proceso de extracción fue realizado usando el DNEasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, California, Estados Unidos) y excepcionalmente el método de extracción con CTAB (Doyle & Doyle 1987).
Amplificación
Los segmentos ITS1 e ITS2 de la región nuclear ITS se amplificaron como un solo fragmento usando los pares de primers ITS4 + Leu1, o en dos fragmentos usando los pares de primers ITS3 + ITS4 y Leu1 + 2C (White et al. 1990). El marcador molecular GBSSI Materiales y métodos 31
conteniendo los exones 2 hasta el 10, incluido 8 intrones se amplificaron en dos segmentos usando los pares de primers waxyF + 1171R y 1058F + 2R, o en cuatro segmentos usando los pares de primers waxyF + Ex4R, Ex4F + 1171R, 1058F + 3'N, y 3F + 2R (Levin et al. 2005). La región trnT–trnF se amplificó en tres fragmentos usando los primers Tab A + Tab B, Tab C + Tab D, y Tab E + Tab F (Taberlet et al. 1991). La región rps16–trnK se amplificó como un fragmento único usando los primers citados en Shaw et al. (2007). Para la región ITS y ante secuencias de difícil amplificación se implementó la amplificación en dos segmentos. Para las regiones GBSSI y trnT–trnF fue común usar la amplificación en tres o cuatro fragmentos debido a la mayor longitud de estos marcadores. Todos los primers empleados en la amplificación y en la secuenciación son detallados en la tabla 4.
Tabla 4. Detalle de los primers usados durante el proceso de amplificación y secuenciación de las regiones de ADN estudiadas. * Primers usados solamente para la secuenciación. ** Primers internos usados para la amplificación y secuenciación del material problemático. Modificado de Tepe et al. (2011).
Marcador Primer en sentido (5´–3´) Primer en antisentido (3´–5´) Referencia
ITS ITS5*: GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC White et al. 1990
ITS ITS2**: GCTGCGTTCTTCATCGATGC ITS3** : GCATCGATGAAGAACGCAGC White et al. 1990
ITS– ITS Vargas et al. 1998 leu1:GTCCACTGAACCTTATCATTTAG
GBSSI waxyF: CGGGTAATGACAATATCCCC waxy2r: GTTCCATATCGCATAGCATG Levin et al. 2006
GBSSI Ex4F: CTATGGCCCCAAAGCTGGAC Ex4R: CACAACCTGAACCTAAG Stern et al. 2010
GBSSI 1171R: TCATACCCATCAATGAAATC Walsh & Hoot 2001
GBSSI 1058F:ATTCCCTGCTACTTGAAGTC Levin et al. 2006
GBSSI waxy3F:GATACCCAAGAGTGGAACCC Miller & Spooner 1999
Peralta & Spooner GBSSI waxy3nr:GCCATTCACAATCCCAGTTATGC 2001 trnT–trnF TabA: CATTACAAATGCGATGCTCT TabB: TCTACCGATTTCGCCATATC Taberlet et al. 1991 trnT–trnF TabC: CGAAATCGGTAGACGCTACG TabD: GGGGATAGAGGGACTTGAAC Taberlet et al. 1991 trnT–trnF tabE: GGTTCAAGTCCCTCTATCCC TabF: ATTTGAACTGGTGACACGAG Taberlet et al. 1991 rps16–trnK rpS16x2F2: AAGTGGGTTTTTATGATCC trnK (UUU)x1:TTAAAAGCCGAGTACTCTACC Shaw et al. 2007
La amplificación se realizó por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en un termociclador Applied Biosystems® 2720. Los componentes y condiciones de reacción para cada uno de los marcadores moleculares empleados fueron ligeramente diferentes y se describen a continuación. Materiales y métodos 32
Para ITS se preparó una mezcla para PCR de 25 μl por reacción en un tubo que contenía 1 μl del extracto de ADN (10-100 ng), y 24 μl de una mezcla de 0.13 μl de Taq DNA Polymerase (NEW ENGLAND BIOLABS®.), 2.5 μl de buffer a 10× (ThermoPol® Reaction Buffer) 0.5 μl a 10 mM de dNTPs, 1.0 μl de DMSO, 1.0 μl de BSA, 1.0 μl de glicerol, 0.63 μl de cada uno de los dos primers necesarios y se alcanzó los 25 μl con agua para PCR (16.61 μl). Los parámetros para la PCR en el termociclador se ajustaron a aquellos usados por Levin et al. (2006) y Bohs & Omstead (2001), y consistieron en un ciclo inicial a una temperatura de 94°C por 4 minutos; seguido de 40 ciclos (94°C, 45 segundos; 50°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), con una extensión final a 72°C por 7 minutos.
Para el gen GBSSI se preparó una mezcla para PCR de 25 μl por reacción en un tubo que contenía 1 μl del extracto de ADN (10-100 ng), y 24 μl de una mezcla de 0.14 μl de Taq DNA Polymerase (NEW ENGLAND BIOLABS®.), 2.5 μl de buffer a 10× (ThermoPol®
Reaction Buffer), 0.5 μl a 10 mM de dNTPs, 2.5 μl de MgCl2, 1.25 μl de cada uno de los dos primers necesarios y se alcanzó los 25 μl con 16 μl de agua para PCR. Las condiciones para la PCR en el termociclador se ajustaron a aquellas usadas por Levin et al. (2005), y consistieron en un ciclo inicial a una temperatura de 94°C por 4 minutos; seguido de 2 ciclos (94°C, 30 segundos; 55°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), 2 ciclos (94°C, 30 segundos; 54°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), 2 ciclos (94°C, 30 segundos; 53°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), 2 ciclos (94°C, 30 segundos; 52°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), 2 ciclos (94°C, 30 segundos; 51°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), 30 ciclos (94°C, 30 segundos; 50°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), con una extensión final a 72°C por 10 minutos.
Para trnT–trnF se preparó una mezcla para PCR de 25 μl por reacción en un tubo que contenía 1 μl del extracto de ADN (10-100 ng), y 24 μl de una mezcla de 0.14 μl de AmpliTaq Gold polymerase (Applied Biosystems, Foster City, California, Estados Unidos), 2.5 μl de buffer a 10× (ThermoPol® Reaction Buffer), 0.25 μl a 10 mM de dNTPs, 2.5 μl de MgCl2, 1.25 μl de cada uno de los dos primers necesarios y se alcanzó los 25 μl con 16.11 μl de agua para PCR. Las condiciones para la PCR en el termociclador se ajustaron a aquellas usadas por Taberlet et al. (1991) y Bohs & Olmstead (2001), y consistieron en un ciclo inicial de 94°C por 4 minutos; 40 ciclos (94°C, 1 minuto; 48°C, 1 minuto; 72°C, 2 minutos), con una extensión final a 72°C por 7 minutos.
Finalmente para el gen rps16–trnK los componentes y cantidades de la reacción fueron similares a los empleados para el gen trnT–trnF, exceptuando la utilización de DMSO en Materiales y métodos 33
algunas reacciones. Los parámetros de la PCR fueron idénticos a los empleados para el gen trnT–trnF.
Para todos los genes y ante accesiones de difícil amplificación se hicieron ensayos con diferentes niveles de dilución del ADN (1:10, 1:20,1:50, 1:100), y según el caso, se agregó o eliminó el DMSO con el fin de lograr la amplificación.
Los productos del proceso de amplificación se visualizaron con una tintura fluorescente EZ-Vision® (Amresco, Solon, Ohio, Estados Unidos), mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.3%. Las muestras donde se encontró suficiente ADN, se purificaron posteriormente con el kit de purificación Promega Wizard® PCR Clean-Up System (Promega Corp., Madison, Wisconsin, Estados Unidos).
Secuenciación
La secuenciación se realizó usando en su mayoría los mismos primers empleados para la amplificación, con excepción del primer ITS5 usado para secuenciar la cadena en sentido del marcador ITS (Tabla 4). Para secuenciar los productos se realizó la siguiente mezcla: 1.5 μl del producto PCR (la muestra de ADN purificada), 5.0 μl a 1 Mm del primer (uno por reacción, primer en sentido y antisentido en diferentes reacciones) y 3.5 μl de agua. El proceso de secuenciación se llevó a cabo en un analizador de ADN Applied Biosystems 3730® en el Core Research Facility de la Universidad de Utah, Salt Lake City, Estados Unidos.
1.2.4 Construcción de la matriz de secuencias, alineamiento y combinación de las fuentes de información
Las secuencias obtenidas (Sequence trace files) se visualizaron, editaron y ensamblaron en secuencias de consenso en el software Sequencher versión 5.0 (Gene Codes Corp., Ann Arbor, Michigan, Estados Unidos). Las secuencias de consenso se agregaron en una matriz por cada marcador molecular usando el software Se-Al versión 2.0 (Rambaut 1996), posteriormente se alinearon automáticamente e inspeccionaron visualmente usando el software BioEdit versión 7.2.5 (Hall 2007). Los gaps en el alineamiento a causa de inserciones o delecciones se codificaron como “missing data”. Materiales y métodos 34
Previo a combinar las secuencias se implementó una prueba para el cálculo del índice de incongruencia (ILD) (Farris et al. 1994). La posibilidad de combinar el conjunto de marcadores nucleares (ITS y GBSSI) y del cloroplasto (trnT–trnF y rps16–trnK), se evaluó por pares, primero comparando entre marcadores nucleares, luego entre marcadores del cloroplasto y luego entre las dos regiones nucleares combinadas y los dos marcadores del cloroplasto combinados. La prueba de ILD se implementó en PAUP versión 4.0b10 (Swofford 2002), usando 100 réplicas, cada una con 10 réplicas “random addition” bajo el algoritmo “Tree bisection reconection (TBR) branch swapping”.
Los resultados de la prueba indicaron un valor no significativo cuando se evaluó la incongruencia y la posibilidad de combinar los marcadores del cloroplasto trnT–trnF y rps16–trnK (p= 0.64), lo que indicaría que son regiones congruentes y no existen problemas para combinarlos en un análisis. Sin embargo, al examinar la incongruencia entre los marcadores nucleares ITS y GBSSI esta fue significativa (p= 0.01). El mismo caso ocurrió al analizar la incongruencia entre el par de conjunto de datos formado por los marcadores nucleares combinados y los del cloroplasto combinados (p= 0.01). Estos resultados sugieren que probablemente existan conflictos entre las señales filogenéticas de estos marcadores y combinaciones. Por otro lado, numerosos estudios han sugerido que la prueba de ILD no es una herramienta adecuada para evaluar la incongruencia entre marcadores moleculares (Graham et al. 1998; Dolphin et al. 2000; Yoder et al. 2001; Barker y Lutzoni 2002; Darlu y Lecointre 2002), debido a que dicha prueba pueda estar sesgada por errores tipo 1, producto de la disparidad en los niveles de homoplasia entre las diferentes fuentes de información.
Las incongruencias filogenéticas pueden afectar notablemente las inferencias taxonómicas, biogeográficas, de evolución de caracteres, diversidad filogenética entre otros análisis derivados de las hipótesis filogenéticas incongruentes (Zhang et al. 2015). Como precaución y para visualizar la posible incongruencia, fueron obtenidos mediante un análisis de MP los árboles de consenso estricto de los genes individuales (ITS, GBSSI, trnT–trnF y rps16–trnK) y resumidos en una super-red filogenética con el software Splitstree versión 4.13.1 built 16 (Huson & Bryant 2006) usando el algoritmo z-closure y las opciones “supernetwork” y “ConsensusNetwork” (Huson et al. 2004) (Fig. 5). Materiales y métodos 35
Figura 5. Super-red filogenética obtenida de la combinación de los árboles de ITS, GBSSI, trnT– trnF y rps16–trnK bajo MP (La super-red filogenética no muestra un modelo de evolución, en lugar de ello es una gráfica de consenso que resume múltiples filogenias no enraizadas). Las especies en rojo son aquellas sobre las que se enfoca este estudio.
M_crosbiana_1
M_crosbiana_2
En la super-red obtenida se evidencian algunas regiones reticuladas que indicaron algún grado de incongruencia entre los datos analizados. Sin embargo, la gran mayoría de la red se encontró bifurcada y las reticulaciones se presentaron solamente en algunas zonas. De acuerdo a Holland et al. (2004), estos resultados indican que existen más señales filogenéticas comunes en los grupos de datos a combinar.
En conclusión, la incongruencia detectada fue baja y solo se presentó en algunas partes del árbol por lo que aquí no se considera la prueba ILD como una evidencia definitiva que prevenga combinar las fuentes de información. De acuerdo a lo anterior, se procedió a combinar el conjunto de datos en tres matrices, una matriz de los marcadores nucleares, otra de los marcadores del cloroplasto y una matriz combinada de todos los marcadores usando el software Mesquite versión 3.04 (Maddison & Maddison 2015). Adicional a esto, en el apartado de resultados, cada marcador molecular y las diferentes combinaciones realizadas fueron analizados individualmente de acuerdo a lo recomendado por Wiens (1998). Materiales y métodos 36
1.2.5 Análisis de datos
Máxima parsimonia (MP)
Se realizó un análisis de MP con las matrices individuales, la matriz combinada de los marcadores nucleares, la matriz combinada de los marcadores del cloroplasto y la matriz combinada de todos los marcadores usando el software PAUP* versión 4.0b10 (Swofford 2002). Se usó una estrategia de búsqueda heurística realizando 1000 réplicas, con el algoritmo “branch swapping Tree bisection reconection (TBR)”. El árbol o árboles iniciales se obtuvieron vía “stepwise addition” y los árboles se adicionaron en una secuencia al azar, con la opción “steepest descent” desactivada y la opción “MULTREES” activada. Todos los caracteres se trataron como de tipo desordenado y se les asignó igual peso, los gaps se trataron como datos faltantes o “missing data”. El soporte interno de las ramas de los árboles filogenéticos obtenidos en cada análisis, se estimó realizando un análisis de Bootstrap (BS) (Felsenstein 1985).
Debido al excesivo consumo en tiempo de los análisis de BS, se implementaron algunas pruebas con limitaciones al análisis BS usado tradicionalmente. Algunos autores como Stern et al. (2011) y Vorontsova et al. (2013), implementaron un límite al número de rearreglos por cada réplica en el análisis de BS, con la finalidad de reducir el tiempo de cálculo de los análisis. Otros autores como DeBry & Olmstead (2000) y Olmstead et al. (2008), implementaron el análisis de BS usando desactivada la función “MULTREES” en el software PAUP, la cual limita a uno el número de árboles guardado en cada réplica. Estas dos formas de constreñir los análisis de BS serán llamadas en adelante “fast Bootstrap”.
Con base en lo anterior, se experimentó con un mismo conjunto de datos un análisis de BS completo, un análisis limitado a un millón de rearreglos por replica y un análisis con la opción “MULTREES” desactivada (datos no mostrados). En las dos alternativas de “fast Bootstrap” se obtuvieron valores de soporte similares a los obtenidos con el análisis de BS completo. De acuerdo a estos resultados, se optó por usar la opción de limitar el número de rearreglos por réplica y disminuir así el tiempo de cómputo de los análisis. En concordancia con lo anterior, se realizó un análisis de BS con 1000 réplicas usando una búsqueda heurística con el algoritmo “branch swapping tree bisection reconection (TBR)”, limitando la búsqueda a un millón de rearreglos por réplica, el árbol o árboles iniciales se Materiales y métodos 37
obtuvieron vía “stepwise addition” y los árboles se adicionaron en una secuencia al azar con la opción “MULTREES” activada. De acuerdo a Zhang et al. (2015), se definieron los intervalos de soporte de BP como bajo (<69% BS), moderado (70-89% BS) y alto (>90% BS), para describir los niveles de soporte de los clados obtenidos en los análisis de MP.
Los árboles obtenidos se visualizaron y editaron en el software Treegraph versión 2 (Stöver & Müller 2010).
Inferencia bayesiana (IB)
Antes de realizar los análisis de IB, se calculó el modelo evolutivo de tasas de sustitución nucleotídica para cada uno de los conjuntos de datos analizados, usando el software Jmodeltest versión 2 (Darriba et al. 2012). El modelo óptimo de sustitución nucleotídica seleccionado bajo el criterio de información de Akaike para todas las particiones fue el GTR+I+G. El análisis de IB se realizó con cada uno de las matrices individuales, la matriz combinada de los marcadores nucleares, la matriz combinada de los marcadores del cloroplasto y con la matriz combinada total. El análisis se realizó en el software MrBayes versión 3.2.2 (Ronquist et al. 2012). Se llevaron a cabo cuatro análisis separados (nruns=4), cada uno con dos millones de generaciones y cuatro cadenas usando el algoritmo de Markov Monte Carlo. Los árboles se guardaron cada 5000 generaciones y la zona de “burn in” se fijó con la opción por defecto del software, la cual remueve los primeros 25% de los árboles, los demás árboles se resumieron en un árbol de 50% de regla de consenso de mayoría con probabilidades posteriores (PP). Con el fin de evaluar si los análisis alcanzaron a ser estacionarios al remover la zona de “burn in” se verificó en el software tracer versión 1.6 la gráfica “trace” (Rambaut & Drummond 2007). Se inspeccionó visualmente entre corridas, la tendencia a cero del valor de “Average standard deviation of split frequencies”, la tendencia a uno del valor promedio del “Potencial Scale Reduction Factor (PSRF)” y si las cifras del valor mínimo y promedio del “Estimated Sample Size (ESS)”, eran mayores a 100. Estos estadísticos obtenidos con el software MrBayes versión 3.2.2 se recomiendan como indicadores de que los análisis alcanzaron su fase estacionaria y el número de generaciones ha sido suficiente para concluir la búsqueda (Ronquist et al. 2011). Resultados 38
2. Resultados
La matriz alineada y combinada de todos los marcadores empleados en este estudio fue de 4.883 pb con 8.2% de datos faltantes o “missing data”, este último porcentaje es el resultado de algunas secuencias que no pudieron ser amplificadas para algunas especies a pesar de los diferentes esfuerzos realizados. Específicamente, no se pudieron obtener secuencias de la región GBSSI para D. longipes, M. coccinea (1), M. lopezii (1), M. epifita, Sch. coriaceus (1), Sch. leucanthus (1), S. maxima, T. aff. nobilis (2) y T. nobilis, y del marcador rps16–trnK para M. coccinea (1), Sch. leucanthus (2), T. nobilis y T. aff. nobilis (2).
A continuación, se presentan los resultados de los análisis de máxima parsimonia (MP) e inferencia bayesiana (IB). Primero, son descritos los resultados de los análisis de MP para los marcadores nucleares ITS y GBSSI, los marcadores del cloroplasto trnT–trnF y rps16– trnK y las combinaciones realizadas. Posteriormente, son descritos los resultados obtenidos en los análisis de IB para las mismas fuentes de información. Finalmente, se comparan entre si los resultados obtenidos y se resumen las relaciones encontradas.
2.1 Máxima parsimonia (MP)
En la tabla 5 se presenta un resumen de las estadísticas para cada uno de los marcadores y las combinaciones realizadas en los análisis bajo MP.
Se estudiaron siete grupos de datos con los análisis de MP, cuatro correspondientes a los marcadores individuales, dos a las combinaciones de los marcadores nucleares y del cloroplasto y finalmente, uno a la combinación de todos los marcadores. Para cada conjunto de datos se obtuvo un árbol de consenso estricto que resumió los árboles más parsimoniosos encontrados, cada rama en los árboles fue soportada con valores de BS mayores al 50%, las ramas con BS menores fueron colapsadas.
De los marcadores estudiados y en proporción a su tamaño, la región ITS fue la que presentó más caracteres informativos en los análisis de MP (26%), seguida del marcador rps16–trnK (12.7%), de la región GBSSI (10.5%) y del marcador trnT–trnF (7.12%). Sin embargo, los marcadores ITS y GBSSI fueron las regiones que más caracteres informativos aportaron a la matriz combinada con 193 y 180 caracteres respectivamente. En contraste, los dos marcadores del cloroplasto fueron los que menos caracteres informativos aportaron, Resultados 39
la región trnT–trnF, un marcador de similar longitud que GBSSI, aportó 121 caracteres y rps16–trnK fue el marcador que menos caracteres informativos aportó a la matriz combinada con 93 caracteres.
Tabla 5. Estadística descriptiva para cada marcador molecular y para las distintas combinaciones realizadas en los análisis de MP.
Caracteres Longitud de Longitud informativos Caracteres Índice de Índice de Árboles más los árboles en Marcador secuencia bajo constantes Consisten Retención parsimoniosos números de alineada parsimonia (%) cia (IC) (IR) pasos (CI) (%) ITS 743 193 (26%) 461 (62%) 57 811 0.5203 0.6890 1240 GBSSI 1708 180 (10.5%) 432 660 0.8212 0.7997 (72.6%) 1443 trnT–trnF 1699 121 (7.12%) 423663 337 0.8190 0.8961 (84.9%) rps16– 733 93 (12.7%) 575 (78.4%) 173767 240 0.779 0.874 trnK ITS+GBS 1701 2451 373 (15.2%) 8 1530 0.6301 0.6924 SI (69.4%) trnT– 2018 trnF+rps1 2432 214 (8.79%) 157284 580 0.7983 0.8840 (82.9%) 6–trnK Combina 3719 4883 587 (12%) 60 2143 0.6659 0.7487 do (76.1%)
Por otro lado, la matriz combinada de los marcadores nucleares, tuvo muchos más caracteres informativos con 373 sitios informativos (15.3%), en comparación con la matriz de los marcadores del cloroplasto que presentó 214 sitios informativos (8.79%). Finalmente, la matriz combinada de todos los marcadores presentó 587 caracteres informativos en los análisis de MP, es decir el 12% de todos los caracteres obtenidos fueron informativos.
Los marcadores individuales y las combinaciones realizadas fueron analizados bajo el método de MP, a continuación, se describen los resultados obtenidos. Resultados 40
2.1.1 Análisis de MP para el marcador ITS
En los análisis de MP para el marcador ITS se recuperaron 57 árboles más parsimoniosos con una longitud de 811 pasos (IC=0.52 e IR=0.68). En la Fig. 6A. se presenta el árbol de consenso estricto de estos árboles. En la parte más externa del árbol se ubicó A. belladona y un clado conformado por S. grandiflora y S. maxima (100% BS). Más interno en el árbol se encontraron las especies L. cestroides y N. physalodes en una politomía (82% BS), con un gran clado donde se ubicaron las demás especies estudiadas. Las relaciones dentro del gran clado estuvieron pobremente resueltas y los clados encontrados y especies no anidadas se ubicaron en una gran politomía (97% BS). Al interior de la politomía, algunas especies de Markea se relacionaron entre sí y formaron algunos clados diferenciados, dos accesiones de M. coccinea, la especie tipo del género Markea se anidaron con las especies M. sessiliflora y M. costanensis para formar un clado de soporte bajo (62%, BS). Del mismo modo, dos accesiones de M. lopezii y M. epifita y M. huilensis se anidaron con soporte bajo (61%, BS). Las especies M. antioquiensis y M. pilosa formaron otro pequeño clado altamente soportado (100%, BS). Por otro lado, varias especies de Markea se relacionaron con especies de otros géneros de la tribu Juanulloeae. Dos accesiones de M. panamensis y M. ulei, se anidaron junto con dos accesiones de J. ochracea en un clado de soporte moderado (74%, BS). M. atlantica se anidó con dos accesiones de D. viridiflora y la especie D. longipes con un soporte moderado (73%, BS) y M. fosbergii se anidó con T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae con un soporte bajo (68%, BS). Finalmente, entre las especies no anidadas en ningún clado se encuentran M. crosbiana, M. formicarum, M. harlingiana, M. hunzikeri, M. purpurea, M. sturmii y M. cf. ulei. Resultados 41
2.1.2 Análisis de MP para el marcador GBSSI
En los análisis de MP para el marcador GBSSI se recuperaron 432 árboles más parsimoniosos con una longitud de 660 pasos (IC=0.82 e IR=0.79). El árbol de consenso estricto de estos árboles es presentado en la Fig. 6B. En el cladograma encontrado, los grupos externos N. physalodes y el clado conformado por A. belladona y L. cestroides (91% BS), se ubicaron en la parte más externa del árbol. Más interno en el árbol y como especie hermana al resto de las especies estudiadas de la tribu Juanulloeae, se ubicó S. grandiflora (100% BS). Se observa en el árbol, un clado compuesto por especies de Schultesianthus, J. speciosa, J. globifera y dos accesiones de M. crosbiana (91% BS), más interno a la especie de Solandra y como grupo hermano al resto de la tribu. Más al interior, se situaron M. lopezii y M. huilensis formando un pequeño clado altamente soportado (97% BS), hermano a una gran politomía donde se ubicaron las demás especies muestreadas. Dentro de la politomía, se encontró un clado de soporte bajo (69% BS), donde se ubicó un clado compuesto por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. ulei y M. cf. ulei (94% BS) y un clado compuesto por especies de Juanulloa (90% BS) y M. harlingiana no relacionada con ningún clado. Posteriormente, a este clado se encuentra el clado conformado por las especies M. sturmii, M. hunzikeri y M. purpurea, anidadas con soporte bajo con especies de Juanulloa, Merinthopodium y Trianaea (58%, BS). Dentro de este último clado, M. sturmii y M. hunzikeri se relacionaron entre sí con soporte alto (95% BS). Por otro lado, M. atlantica se anidó con dos accesiones de D. viridiflora (92%, BS). Con un soporte también alto se encontró a M. formicarum relacionada con las especies M. coccinea, M. sessiliflora y M. costanensis en un clado altamente soportado (94% BS). Finalmente, M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa formaron un clado de soporte moderado (75% BS). Las especies M. fosbergii y T. aff. nobilis no se anidaron a ningún clado. Resultados 42
Figura 6. A. Árbol de consenso estricto de los 57 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador ITS (L= 811 pasos, IC=0.52 e IR=0.68). B. Árbol de consenso estricto de los 432 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador GBSSI (L= 660 pasos, IC=0.82 e IR=0.79). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio.
A B Resultados 43
2.1.3 Análisis de MP para el marcador trnT–trnF
En los análisis de MP para el marcador trnT–trnF se recuperaron 423663 árboles más parsimoniosos con una longitud de 337 pasos (IC=0.81 e IR=0.89). En la Fig. 7A se presenta el árbol de consenso estricto de estos árboles. En la parte más externa del árbol se ubicaron los grupos externos L. cestroides y A. belladona. Más interno en el árbol, se anidaron las especies muestreadas para la tribu con un soporte moderado (73% BS). En un clado politómico, cercano a los grupos externos, se ubicaron algunas especies no anidadas a ningún clado, como J. globifera, J. speciosa y N. physalodes. También se encontró el clado altamente soportado compuesto por S. grandiflora y S. maxima (98% BS), el clado altamente soportado conformado por T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (97% BS), el clado conformado por dos accesiones de M. lopezii y las especies M. epifita y M. huilensis (100% BS). Del mismo modo, dos accesiones de M. crosbiana se localizaron al interior de un clado de soporte bajo (59% BS), compuesto por especies de Schultesianthus. También se encontró un gran clado donde se ubicaron el resto de las especies estudiadas. En la parte externa de este clado se encontraron las especies M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa formando un pequeño clado altamente soportado (98% BS), que se ubicó como grupo hermano (100% BS), al clado politómico con las restantes especies (97% BS). Al interior de esta última parte del árbol se recuperó un clado de soporte bajo (64% BS), compuesto por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. ulei, M. cf. ulei. También se encontró un clado conformado por dos accesiones de M. coccinea y las especies M. sessiliflora y M. costanensis (98% BS) y un clado con soporte moderado (85% BS), en el que se anidó M. atlantica con dos accesiones de D. viridiflora y D. longipes. La especie M. harlingiana se anidó con soporte bajo (59% BS), a dos accesiones de Mer. vogelii. M. hunzikeri y M. fosbergii se anidaron entre sí con soporte bajo (68% BS). Finalmente, M. sturmii, M. formicarum y M. purpurea no se anidaron a ningún clado. Resultados 44
2.1.4 Análisis de MP para el marcador rps16–trnK
En los análisis de MP para el marcador rps16–trnK se recuperaron 173767 árboles más parsimoniosos con una longitud de 240 pasos (IC=0.77 e IR=0.87). El árbol de consenso estricto de estos árboles es presentado en la Fig. 7B. En la parte más externa del árbol se ubicaron las especies L. cestroides y A. belladona. Más al interior del árbol se encontró una politomía de soporte moderado (79% BS), donde se ubicó un clado conformado por S. grandiflora y S. maxima (72% BS), un clado compuesto por N. physalodes, dos accesiones de M. lopezii y las especies M. epifita y M. huilensis (58% BS) y un clado donde se anidaron las restantes especies de la tribu. En la parte externa de dicho clado, se encontró a T. aff. nobilis, dos accesiones de M. crosbiana, J. speciosa, J. globifera y especies de Schultesianthus en un clado de soporte moderado (89% BS), que se ubicó como grupo hermano (56% BS) al resto de la tribu. Más al interior, se encontró un clado conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (92% BS), que se situó como grupo hermano (87% BS), a un clado politómico donde se ubicaron las demás especies muestreadas con soporte bajo (57% BS). En esta parte del árbol fue recuperado un clado compuesto por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea, M. ulei, y M. cf. ulei (99% BS), un clado compuesto por especies de Juanulloa (59% BS), un clado contituido por T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (70% BS), un clado conformado por M. coccinea, M. costanensis y M. sessiliflora (91% BS), un clado donde M. atlantica se anidó con dos accesiones de D. viridiflora y la especie D. longipes (87% BS). Por último, las especies J. pavonii, M. formicarum, M. fosbergii, M. harlingiana, M. hunzikeri, M. purpurea, M. sturmii, Mer. neuranthum y Mer. vogelii no se anidaron en ningún clado. Resultados 45
Figura 7. A. Árbol de consenso estricto de los 423663 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador trnT–trnF (L= 337 pasos, IC=0.81 e IR=0.89). B. Árbol de consenso estricto de los 173767 árboles más parsimoniosos obtenidos con el marcador rps16–trnK (L= 240 pasos, IC=0.77 e IR=0.87). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio.
A B Resultados 46
2.1.5 Análisis de MP para la combinación de los marcadores nucleares
En los análisis de MP para la combinación de los marcadores ITS+GBSSI se recuperaron 8 árboles más parsimoniosos con una longitud de 1530 pasos (IC=0.63 e IR=0.69). El árbol de consenso estricto de estos árboles es presentado en la Fig. 8A. En la parte más externa del árbol se ubicó la especie N. physalodes, en una politomía con un pequeño clado conformado por A. belladona y L. cestroides (79% BS). Al interior se ubicaron las especies S. grandiflora y S. maxima en un clado altamente soportado (100% BS), hermano al resto de la tribu Juanulloeae (95% BS). Más interno en el árbol se ubicaron dos accesiones de M. crosbiana como especies hermanas al resto de la tribu (100% BS). Seguidamente, se encontró un clado hermano de las restantes especies (53% BS), conformado por las especies de Schultesianthus con un soporte moderado (83% BS) y las especies no anidadas J. speciosa y J. globifera. Las demás especies de la tribu, con excepción de las dos accesiones de Merinthopodium, se anidaron en pequeños clados, no resueltos, conformando una gran politomía (65% BS). Dentro de esta politomía, se encontró un clado donde M. harlingiana se ubicó con soporte bajo (61% BS), como especie hermana a un clado compuesto por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea, M. ulei y M. cf. ulei (77% BS). Este clado se relacionó como grupo hermano (75% BS), a uno conformado por especies de Juanulloa (100% BS). Adicional a esto, dos accesiones de M. coccinea y las especies M. sessiliflora, M. costanensis y M. formicarum formaron un clado escasamente soportado (52% BS). También se encontró el clado constituido por dos accesiones de M. lopezii, M. huilensis y M. epifita (54% BS), el conformado por M. fosbergii, T. speciosa y T. neovisae con bajo soporte (69% BS), y otro clado constituido por la especie M. atlantica, D. longipes y dos accesiones de D. viridiflora (97% BS). Adicional a esto, dentro de la gran politomía, se encontró un clado pobremente soportado compuesto por M. purpurea, M. sturmii, M. hunzikeri y J. pavonii (60% BS) y otro clado conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (100% BS). Resultados 47
2.1.6 Análisis de MP para la combinación de los marcadores de cloroplasto
En los análisis de MP para la combinación de los marcadores trnT–trnF+rps16–trnK, se recuperaron 157.284 árboles más parsimoniosos con una longitud de 580 pasos (IC=0.79 e IR=0.88). El árbol de consenso estricto es presentado en la Fig. 8B. En la parte más externa del árbol se ubicaron las especies L. cestroides y A. belladona. Al interior y en una politomía (91% BS), se ubicó la especie N. physalodes, no anidada a ninguna rama, un clado conformado por S. grandiflora y S. maxima (99% BS), un clado constituido por dos accesiones de M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita (100% BS) y un clado dividido en cuatro subclados en donde se ubicaron las restantes especies estudiadas (60% BS). El subclado conformado por T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (97% BS), se ubicó como grupo hermano (75% BS), al conformado por J. globifera, J. speciosa, dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (87% BS). El clado anterior, se posicionó como grupo hermano a las restantes especies de la tribu, con una relación baja (60% BS). Posteriormente, otro subclado conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (100% BS), se ubicó como hermano al resto de Juanulloeae (100% BS). Más internamente en el árbol, y en una politomía se hallaron las especies M. purpurea y J. pavonii anidadas a las restantes especies de la tribu con soporte alto (99% BS). Seguidamente, se encontró el clado de soporte bajo (64% BS), conformado por M. formicarum, en politomía con las especies M. atlantica, anidada con las especies de Dysochroma (98% BS), y también en politomía con M. coccinea anidada con M. sessiflora y M. costanensis (99 BS). En la parte mas interna del árbol se ubicaron las restantes especies en un clado compuesto por varios clados menores en una politomía (60% BS): un clado de especies de Juanulloa (90% BS), un clado conformado por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. ulei y M. cf. ulei (100% BS), un clado compuesto por la especie M. harlingiana y dos accesiones de Mer. vogelii (62% BS), un clado de T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (68% BS), un clado de las especies M. hunzikeri y M. fosbergii (68% BS). Finalmente, la especies M. sturmii y Mer. neuranthum no se anidaron en ningún clado. Resultados 48
Figura 8. A. Árbol de consenso estricto de los 8 árboles más parsimoniosos de la combinación de los marcadores ITS+GBSSI (L= 1530 pasos, IC=0.63 e IR=0.69) B. Árbol de consenso estricto de los 157.284 árboles más parsimoniosos de la combinación de los marcadores trnF+rps16–trnK (L= 580 pasos, IC=0.79 e IR=0.88). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio.
A B Resultados 49
2.1.7 Análisis de MP para la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto
En los análisis de MP para la combinación de los marcadores ITS+GBSSI+trnT– trnF+rps16–trnK, se recuperaron 60 árboles más parsimoniosos con una longitud de 2143 pasos (IC=0.66 e IR=0.74). El árbol de consenso estricto es presentado en la Fig. 9. En la parte más externa del árbol se ubicaron en una politomía los grupos externos N. physalodes y un clado conformado por A. belladona y L. cestroides (93% BS). Más interno en el árbol se ubicaron las especies S. grandiflora y S. maxima (100% BS), como grupo hermano al resto de la tribu Juanulloeae (98% BS). Posteriormente, se encontró el clado conformado por M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita. (100% BS), como grupo hermano a las restantes especies estudiadas (100% BS). A continuación, se halló el clado de soporte alto (90% BS), constituido por las especies de Schultesianthus, J. globifera, J. speciosa y M. crosbiana, ubicado como grupo hermano a las restantes especies de la tribu, relación pobremente soportada (57% BS). En una posición interna al clado de Schultesianthus, M. crosbiana, J. globifera y J. speciosa, se encuentra un pequeño clado con soporte alto (100% BS), conformado por T. nobilis y T. aff. nobilis, que se ubicó con soporte bajo (53% BS), como grupo hermano de las restantes especies de la tribu. Más interno en el árbol, se encontró el clado de soporte alto (100% BS), conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa, como grupo hermano a una politomía de varios clados donde se ubicaron las demás especies (100% BS). Al interior de dicha politomía, se encontró el clado constituido por M. harlingiana, M. panamensis, M. ulei, M. cf. ulei y J. ochracea (76%, BS), como grupo hermano (86% BS), a un clado conformado por algunas especies de Juanulloa (100% BS). También se encontró el clado compuesto por las dos accesiones de M. coccinea y las especies M. sessiliflora, M. costanensis y M. formicarum (87% BS), el clado compuesto por M. fosbergii, T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (75%, BS), el clado de M. atlantica, D. longipes y dos accesiones de D. viridiflora (100% BS) y el pequeño clado conformado por M. hunzikeri y M. sturmii (96%, BS). La única especie de Markea estudiada que no se anidó en ninguno de los clados fue M. purpurea. Resultados 50
Figura 9. Árbol de consenso estricto de los 60 árboles más parsimoniosos producto de la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto (ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16–trnK) (L= 2143 pasos, IC=0.66 e IR=0.74). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio. Resultados 51
2.2 Inferencia bayesiana (IB)
En los análisis de IB se encontraron relaciones muy similares a las halladas con MP y salvo contadas excepciones, las especies de Markea se anidaron en los mismos clados obtenidos en los análisis de MP. Los resultados de los análisis de IB para los marcadores individuales y las combinaciones realizadas son tratados con detalle a continuación.
2.2.1 Análisis de IB para el marcador ITS
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB para el marcador ITS es presentado en la Fig. 10A. En la parte más externa del árbol se ubicaron las especies de S. grandiflora y S. maxima, formando una politomía. Un poco más al interior se posicionó A. belladona como hermana al resto de especies incluidas en los análisis (1.00 PP). Más al interior, se encontró un clado conformado por L. cestroides y N. physalodes (0.99 PP), como grupo hermano al resto de la tribu. A continuación, un clado altamente soportado (1.00 PP), conformado por las dos accesiones de M. lopezii y la especie M. huilensis se posicionó como grupo hermano a las restantes especies estudiadas (1.00 PP). Seguidamente, se ubicaron en una politomía con soporte bajo (0.50 PP), tres clados y la especie M. epifita, la cual no se anidó con ningún clado. Un primer clado estuvo conformado por las especies T. nobilis y dos accesiones de T. aff nobilis (1.00 PP). Un segundo clado estuvo compuesto por J. speciosa, J. globifera, dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (1.00 PP). Por su parte, el tercer clado estuvo constituido por las restantes especies de Juanulloeae. Al interior de este último clado se encontraron dos agrupamientos que se relacionaron con soporte moderado (0.89 PP), un primer clado de soporte bajo (0.73 PP), conformado por especies de Merinthopodium y Markea que incluyó en su interior un pequeño clado de soporte alto (1.00 PP), compuesto por dos accesiones de M. coccinea y las especies M. sessiliflora y M. costanensis. El siguiente y más grande clado en esta parte del árbol presentó una gran politomía donde se anidaron varios pequeños clados que incluyeron especies de Markea (0.89 PP). En uno de estos clados se ubicaron en una politomía (0.76 PP), el clado conformado por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. ulei, M. cf ulei (0.70 PP), un clado conformado por especies de Juanulloa (1.00 PP) y M. harlingiana que no se anidó a ninguno de los clados anteriores. Otro clado que se recuperó al interior de la gran politomía fue el conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (1.00 PP). La Resultados 52
especie M. purpurea se anidó con soporte bajo (0.60 PP), en la parte externa del anterior clado. Posteriormente, M. fosbergii se anidó con T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (1.00 PP) y M. hunzikeri se relacionó con M. sturmii (0.89 PP). Finalmente, M. formicarum no se anidó en ningún clado.
2.2.2 Análisis de IB para el marcador GBSSI
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para el marcador GBSSI es presentado en la Fig. 10B. Los grupos externos A. belladona y L. cestroides se ubicaron en una politomía en la parte más externa del árbol. Por su parte, N. physalodes se ubicó como hermana al resto de las especies estudiadas (1.00 PP). Más interno en el árbol, se ubicó S. grandiflora como hermana a las restantes especies de la tribu. A continuación, el clado altamente soportado (1.00 PP), compuesto por J. speciosa, J. globifera, dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus se ubicó como hermano al resto de las especies muestreadas (1.00 PP). Más interno en el árbol, se halló un clado conformado por M. lopezii y M. huilensis (1.00 PP), que se relacionó como grupo hermano al resto de la tribu (1.00 PP). Posteriormente, se encontró una politomía altamente soportada (0.97 PP), donde se ubicó la especie M. fosbergii anidada con muy bajo soporte con Trianaea aff. nobilis (0.61 PP), un clado conformado con M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (1.00 PP), un clado compuesto por especies de Juanulloa, Markea, Merinthopodium y Trianaea (1.00 PP). Al interior de este último clado, se ubicó un pequeño clado conformado por M. sturmi, M. hunzikeri, M. purpurea y J. pavonii (0.97 PP). En la misma politomía, se encontró otro clado donde se ubicaron las restantes especies. En la parte externa de dicho clado se encontró un clado compuesto por M. coccinea, M. costanensis, M sessiliflora y M. formicarum (1.00 PP), que se ubicó como grupo hermano al resto del clado (1.00 PP). A continuación, las dos accesiones de D. viridiflora y las especies M. atlantica y Mer. neuranthum formaron un clado de alto soporte (1.00 PP), que se ubicó como grupo hermano (0.98 PP), a las demás especies muestreadas. En la última parte del árbol, se halló un clado de soporte alto (1.00 PP), donde en una politomía se encontró un clado conformado por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. cf. ulei y M. ulei (1.00 PP) y un clado constituido por especies de Juanulloa (1.00 PP). La especie M. harlingiana se anidó con los dos clados anteriores, pero no se incluyó en ninguno. Resultados 53
Figura 10. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferidos en los análisis de IB para el marcador ITS. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para el marcador GBSSI. Los números sobre las ramas son PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio.
A B Resultados 54
2.2.3 Análisis de IB para el marcador trnT–trnF
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para el marcador trnT–trnF es presentado en la Fig. 11A. Las especies S. grandiflora y S. maxima se ubicaron en la parte más externa del árbol. Un poco más al interior N. physalodes se encontró como especie hermana a un clado conformado por el resto de especies incluidas en los análisis (1.00 PP). Posteriormente, se ubicaron en una politomía los clados formados por A. belladona y L. cestroides (0.96 PP), un clado compuesto por T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (1.00 PP), un clado conformado por J. globifera, J. speciosa, dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (0.97 PP), y un clado compuesto del resto de especies de la tribu (0.56 PP). Al interior de este último clado, se encontró un agrupamiento, altamente soportado (1.00 PP), compuesto por las dos accesiones de M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita y como grupo hermano al clado conformado por las restantes especies de la tribu Juanulloeae, aunque con escaso soporte (0.55 PP). Más interno en el árbol, se encontró el clado no resuelto, con alto soporte (1.00 PP), conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa y como grupo hermano (1.00 PP), del clado donde se ubicaron las especies restantes. Dentro de este clado, se encontró en politomía, las especies M. purpurea y J. pavonii no anidadas a ningún clado y un clado donde se anidó al resto de especies (0.98 PP). En este clado, se hallaron cuatro clados en politomía, en donde M. formicarum no se anidó a ningún clado, mientras que las especies de Dyssochroma se anidaron con M. atlantica (1.00 PP), y las dos accesiones de M. coccinea se anidaron con M. sessiliflora y M. costanensis (1.00 PP). El cuarto clado en politomía con un alto soporte (0.91 PP), se compusó por varios clados: un clado donde se anidaron las especies de Juanulloa, J. mexicana, J. parasitica y J. verrucosa (1.00 PP), un clado con alto soporte (1.00 PP), donde la especie J. ochracea se anidó con las especies M. ulei y M, panamensis, un pequeño clado compuesto por M. hunzikeri y M. fosbergii (0.95 PP) y un clado de soporte bajo (0.69 PP), compuesto por Mer. vogelii y la especie M. harlingiana. Las especies Mer. neuranthum, M. sturmii, T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae no se anidaron a ningún clado. Resultados 55
2.2.4 Análisis de IB para el marcador rps16–trnK
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para el marcador rps16–trnK es presentado en la Fig. 11B. Las especies S. grandiflora y S. maxima se ubicaron en la parte más externa del árbol. Más interno en el árbol se ubicó un clado en donde las especies L. cestroides y A. belladona (0.97 PP), se ubicaron como grupo hermano (0.70 PP), de N. physalodes y a un clado compuesto por dos accesiones de M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita (0.97 PP). Todo el clado anterior se relacionó como grupo hermano, con soporte alto (1.00 PP), con el resto de especies de la tribu. Más interno en el árbol, se encontró un clado altamente soportado (1.00 PP), donde la especie T. aff. nobilis se posicionó como hermana al clado compuesto por J. globifera, J. speciosa, las dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (1.00 PP). Este último clado, se ubicó con soporte bajo como hermano al clado conformado por el resto de las especies estudiadas (0.79 PP). Más interno en el cladograma se encontró un clado compuesto por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis, y M. pilosa (1.00 PP), como grupo hermano (1.00 PP), a un clado politómico donde se anidaron las restantes especies. En la politomía, escasamente soportada (0.72 PP), se ubicaron las especies J. pavonii, M. formicarum y M. purpurea, no anidadas a ningún clado y los clados en politomía, conformados por M. atlantica, anidada con las especies de Dyssochroma (1.00 PP), el clado compuesto por M. coccinea anidada con M. costanensis y M. sessiliflora (1.00 PP) y el clado en politomía con los anteriores, donde se anidaron las demás especies. En el último agrupamiento, se encontrarón varios clados: el clado constituido por las dos accesiones de M. panamensis, las de J. ochracea y las especies M. ulei y M. cf. ulei (1.00 PP), un clado compuesto por especies de Juanulloa (0.87 PP), otro clado conformado por T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (1.00 PP) y un clado pequeño de soporte bajo formado por M. fosbergii y M. hunzikeri (0.64 PP). Finalmente, las especies M. harlingiana, M. sturmii, Mer. vogelii y Mer. neuranthum no se no se anidaron a ninguno de los clados. Resultados 56
Figura 11. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB para el marcador trnT–trnF. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB para el marcador rps16–trnK. Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio.
A B Resultados 57
2.2.5 Análisis de IB para la combinación de los marcadores nucleares
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para la combinación de los marcadores nucleares ITS+GBSSI es presentado en la Fig. 12A. Las especies S. grandiflora y S. maxima se ubicaron en la parte más externa del árbol. Más interno en el árbol se encontró un clado conformado por las especies de los grupos externos N. physalodes, A. belladona y L. cestroides (1.00 PP), como grupo hermano al clado conformado por el resto de especies estudiadas (1.00 PP). Al interior, se encontró un clado altamente soportado (1.00 PP), compuesto por J. speciosa, J. globifera, las dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (1.00 PP) y como grupo hermano, con alto soporte (1.00 PP), al clado con las restantes especies de la tribu. Más adentro en el árbol, el clado conformado por M. lopezii, M. huilensis y M. epifita (0.84 PP), se ubicó como grupo hermano al clado de las demás especies de la tribu (0.83 PP). Seguidamente, se encontró un clado compuesto por T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (1.00 PP), como grupo hermano al clado remanente. A continuación, se encontró un clado con soporte bajo (0.65 PP), conformado por el clado de las especies M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (1.00 PP), como grupo hermano a una pequeña politomía, compuesta por algunas especies de Juanulloa, Markea, Merinthopodium y Trianaea (0.51 PP). Al interior de esta politomía, se ubicaron dos accesiones de Mer. vogelii no anidadas, un pequeño clado conformado por J. pavonii y las especies de Markea, M. sturmi, M. hunzikeri, M. purpurea y (0.97 PP), y un clado formado por M. fosbergii, T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (0.97 PP). Todo el clado anterior, se ubicó con soporte alto (1.00 PP), como grupo hermano a un clado donde se localizaron las démas especies. Anidado más interno en el árbol, se halló un clado compuesto por las accesiones de M. coccinea y las especies M. costanensis, M sessiliflora y M. formicarum (1.00 PP), hermano (0.96 PP), al clado compuesto por las especies de Dyssochroma, M. atlantica y Mer. neuranthum (0.96 PP) y que a su vez es hermano (0. 92 PP), al clado con soporte alto (1.00 PP), de las especies M. harlingina, M. panamensis y M. ulei y J. ochracea (0.83 PP), en hermandad con el clado de las restantes especies de Juanulloa. Resultados 58
2.2.6 Análisis de IB para la combinación de los marcadores del cloroplasto
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para la combinación de los marcadores trnT–trnF+rps16–trnK es presentado en la Fig. 12B. Las especies S. grandiflora y S. maxima se ubicaron en la parte más externa del árbol. Más interno en el árbol se localizó un clado de soporte bajo (0.51 PP), donde las especies L. cestroides y A. belladona (1.00 PP), se ubicaron como grupo hermano a un grupo pobremente soportado (0.52 PP), compuesto por N. physalodes, dos accesiones de M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita. Todo el clado anterior, se posicionó con soporte alto (1.00 PP), como grupo hermano al resto de la tribu. Más interno en el árbol se halló un clado, donde las especies T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (1.00 PP), se ubicaron con soporte alto (1.00 PP), como hermanas a un clado compuesto por J. globifera, J. speciosa, dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus (1.00 PP). La rama anterior se situó como grupo hermano al resto de las especies estudiadas (0.92 PP). Al interior, se encontró un clado compuesto por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis, y M. pilosa (1.00 PP), que se ubicó como hermano a una politomía donde se anidaron las especies restantes (1.00 PP). En dicha politomía se hallaron J. pavonii y M. purpurea no anidadas a ningún clado, así como un clado donde se ubicaron las demás especies muestreadas. A continuación, se situó en una politomía M. formicarum no anidada, el clado conformado por dos accesiones de D. viridiflora, D. longipes y M. atlantica (1.00 PP), un clado compuesto por dos accesiones de M. coccinea, M. costanensis y M. sessiliflora (1.00 PP) y un clado donde se anidaron las demás especies. En este último clado y en una politomía, se ubicó un clado conformado por especies de Juanulloa (1.00 PP), un clado compuesto por dos accesiones de M. panamensis, dos accesiones de J. ochracea y las especies M. ulei y M. cf. ulei (1.00 PP), un clado escasamente soportado constituido por M. harlingiana y dos accesiones de Mer. vogelii (0.67 PP), otro clado conformado por T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (1.00 PP), un clado pequeño formado por M. fosbergii y M. hunzikeri (1.00 PP). Finalmente, las especies M. sturmii y Mer. neuranthum se incluyeron en el agrupamiento anterior pero no se anidaron en ninguno de los clados. Resultados 59
Figura 12. A. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de la combinación de los marcadores ITS+GBSSI. B. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de la combinación de los marcadores trnT–trnF+rps16–trnK. Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio.
A B Resultados 60
2.2.7 Análisis de IB para la combinación de los marcadores nucleares y del cloroplasto
El árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido en los análisis de IB para la combinación de los marcadores ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16 es presentado en la Fig. 13. En la parte más externa del árbol se ubicaron los grupos externos A. belladona, L. cestroides y N. physalodes (1.00 PP). Más interno en el cladograma, se encontraron las especies S. grandiflora y S. maxima formando un clado altamente soportado (1.00 PP), posicionado con soporte alto (1.00 PP), como grupo hermano al resto de la tribu Juanulloeae. A continuación, se encontró el clado conformado por dos accesiones de M. lopezii y las especies M. huilensis y M. epifita (1.00 PP) y como grupo hermano a las restantes especies con soporte alto (1.00 PP). Posteriormente, se halló el clado de soporte alto (1.00 PP), constituido por J. globifera, J. speciosa, las dos accesiones de M. crosbiana y las especies de Schultesianthus y como grupo hermano con alto soporte (0.97 PP), al clado formado por las restantes especies. Más interno en el árbol, se halló un pequeño clado con soporte alto (1.00 PP), conformado por T. nobilis y las dos accesiones de T. aff. nobilis, como grupo hermano, con soporte bajo (0.68 PP), al resto de especies muestreadas de la tribu. También, se encontró otro clado pequeño, conformado por M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (1.00 PP), como grupo hermano a las demás especies (1.00 PP). Más interno en la topología se halló un clado compuesto por especies de Juanulloa, Markea, Merinthopodium y Trianaea (0.86 PP), completamente resuelto y hermano de otro igualmente resuelto (0.97 PP). En la parte más externa de ese clado, con soporte moderado (0.86 PP), se anidaron las especies J. pavonii y M. purpurea (0.96 PP) y en una posición más interna, se encontraron las especies M. sturmii y M. hunzikeri (1.00 PP), hermanas, con un soporte moderado (0.85 PP), a un clado conformado por las dos accesiones de Mer. vogelii, M. fosbergii, y especies de Trianaea (0.64 PP). Las dos accesiones de M. coccinea y M. costanensis, M sessiliflora y M. formicarum formaron un clado (1.00 PP), ubicado como grupo hermano (0.87 PP), al clado compuesto por especies de Dyssochroma, Juanulloa, Markea, y Merinthopodium. El clado compuesto por las especies de Dyssochroma y M. atlantica (1.00 PP), se posicionó como grupo hermano de las especies restantes (0.87PP). La especie Mer. neuranthum se ubicó con soporte bajo (0.65 PP), como hermana a un clado (1.00 PP), conformado por dos subclados, el de las especies de Juanulloa (1.00 PP) y el compuesto por M. harlingiana (0.82 PP) y las especies M. ulei, M. cf. Ulei, por el subclado (0.72 PP), de las dos accesiones, de M. panamensis, y de J. ochracea. Resultados 61
Figura 13. Árbol de consenso de 50% de regla de mayoría inferido de los análisis de IB de los cuatro marcadores combinados (ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16–trnK). Los números sobre las ramas corresponden a PP. Las especies en negrita y subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca el estudio. Resultados 62
2.3 Resultado general de los análisis filogenéticos
Los árboles obtenidos con los análisis bajo MP tuvieron en la mayoría de los casos valores de soporte de BS más bajos, en comparación con los resultados de los análisis bajo IB en donde se obtuvieron valores de soporte de PP más altos. Varios estudios han notado que el método de reconstrucción filogenética bajo IB, tiene una tendencia a producir probabilidades posteriores (PP) muy altas (Cummings et al. 2003; Douady et al. 2003; Erixon et al. 2003; Simmons et al. 2004; Suzuki et al. 2002), en comparación con los soportes no paramétricos de Bootstrap (BS), para un mismo clado. De acuerdo a lo anterior y debido al carácter más conservador de los análisis bajo MP, el resultado general se presenta en la Fig. 14 como un árbol de consenso estricto derivado de los análisis de MP para la matriz combinada de todos los marcadores. Los valores sobre las ramas del árbol corresponden a valores de soporte BS inferidos de los análisis de MP y a probabilidades posteriores calculadas de los análisis de IB.
En la Fig. 14 también son presentados los nombres informales dados a los clados en concordancia con la tabla 6. Los clados a los que se le asignó un nombre fueron aquellos que se recuperaron reiteradamente en la mayoría de los análisis. Los nombres asignados a los diferentes clados corresponden a géneros tradicionalmente reconocidos, a géneros actualmente en sinonimia o a clados sin nombre genérico publicado. Las especies de Markea que se anidaron con M. coccinea, la especie tipo del género son presentadas en el árbol en color verde, las especies que se anidaron en otros clados a lo largo de la filogenia de la tribu Juanulloeae son presentadas en color rojo.
A continuación, se describe el árbol de consenso estricto, haciendo especial referencia a los nombres dados a los clados y a la ubicación de las especies de Markea incluidas en los análisis.
En la parte más externa del árbol de consenso estricto derivado de los análisis de MP para la matriz combinada de todos los marcadores moleculares, se ubicaron en una politomía los grupos externos N. physalodes y un clado conformado por A. belladona y L. cestroides (93% BS/1.00 PP). Más interno en el árbol, se halló el clado Solandra representado por las especies S. grandiflora y S. maxima que se ubicó como hermano al resto de la tribu Juanulloeae (98% BS/1.00 PP). Posteriormente, se encontró el clado M. lopezii de soporte alto (100% BS/1.00 PP) y conformado por dos accesiones de M. lopezii y las especies M. Resultados 63
huilensis y M. epifita, posicionado como hermano al resto de la tribu (100% BS/1.00 PP). A continuación, y como hermano a las restantes especies de la tribu (57% BS/0.97 PP), se halló el clado Schultesianthus s.l. de soporte alto (90% BS/1.00 PP), constituido por las especies del género Schultesianthus, J. globifera, J. speciosa y dos accesiones de M. crosbiana. Más adentro en el árbol y en una posición interna al clado Schultesianthus s.l. y como grupo hermano al resto de la tribu, se halló un pequeño clado pobremente soportado (53% BS/0.68 PP), llamado Trianaea conformado por T. nobilis y dos accesiones de T. aff. nobilis (100% BS/1.00 PP). Al interior de este, se localizó el clado M. antioquiensis, conformado por las especies M. antioquiensis, M. aff. antioquiensis y M. pilosa (100% BS/1.00 PP), como grupo hermano, con alto soporte (100% BS/1.00 PP), a un clado politomíco llamado aquí núcleo de Juanulloeae, conformado por pequeños subclados bien soportados, en donde se ubicaron las demás especies de la tribu (92% BS/1.00 PP). En esta politomía, se encontró el clado Markea conformado por las especies M. coccinea, M. sessiliflora, M. costanensis y M. formicarum (87% BS/1.00 PP), el clado Poortmannia compuesto por M. fosbergii, T. speciosa, T. aff. speciosa y T. neovisae (75%, BS/1.00 PP), el clado Dyssochroma constituido por las especies M. atlantica, D. longipes y dos accesiones de D. viridiflora (100% BS/1.00 PP), el clado M. sturmii conformado por M. hunzikeri y M. sturmii (96%, BS/1.00 PP) y el clado Hawkesiophyton compuesto por M. harlingiana, M. panamensis, M. ulei, M. cf. ulei y J. ochracea (76%, BS/0.82 PP). La única especie de Markea estudiada que no se anidó en ninguno de los clados fue M. purpurea. Adicional a esto, en esta parte del árbol se encontró un agrupamiento que no incluyó especies de Markea, llamado clado Juanulloa de soporte alto (100% BS/1.00 PP) y representado por tres accesiones de J. parasitica, dos accesiones de J. mexicana y la especie J. verrucosa. También se halló el género Ectozoma, representado por su única especie, J. pavonii y el género Merinthopodium, conformado por la especie tipo M. neuranthum. La otra especie de Merinthopodium incluida en los análisis, Mer. vogelii no se anidó con la especie tipo de Merinthopodium ni con otros clados. Resultados 64
Figura 14. Árbol de consenso estricto inferido del análisis de MP para la combinación de todos los marcadores (ITS+GBSSI+trnT–trnF+rps16–trnK). Los números sobre las ramas corresponden a porcentajes de BS y PP. Las especies subrayadas son aquellas sobre las que se enfoca este estudio. En color verde se destacan las especies relacionadas con la especie tipo M. coccinea en el clado Markea y en rojo aquellas que se anidaron en otros clados dentro de Juanulloeae. Resultados 65
2.4 Resumen de las relaciones encontradas con énfasis en las especies de Markea
En los apartados 2.1 a 2.3 y en las Figs. 6 a 14, se presentaron los resultados obtenidos a partir de los marcadores individuales, la combinación de los marcadores nucleares, del cloroplasto y para la combinación de todas las fuentes de información bajo dos estrategias de análisis: máxima parsimonia (MP) e inferencia bayesiana (IB). A partir de dichos resultados en la tabla 6 se presentan las posiciones en las que se ubicaron las especies de Markea. A continuación, y con base en la tabla 6 y en las Figs. 6 a 14 se resumen las relaciones encontradas para las especies de Markea entre los diferentes análisis realizados.
Las especies M. antioquiensis, M. atlantica, M. coccinea, M. costanensis, M. huilensis, M. lopezii, M. panamensis, M. pilosa, M. sessiliflora y M. ulei tuvieron una posición consistente a lo largo de los análisis y en todos los resultados se anidaron en los mismos clados. Este fue el caso de M. lopezii y M. huilensis que se anidaron en el clado M. lopezii, el de M. antioquiensis y M. pilosa en el clado M. antioquiensis, el de las especies M. coccinea, M. costanensis y M. sessiliflora en el clado Markea y el de las especies M. panamensis y M. ulei en el clado Hawkesiophyton.
Por otro lado, algunas especies como M. crosbiana, M. epifita, M. formicarum y M. sturmii se anidaron en la mayoría de los casos a un clado, aunque dicha posición no fue soportada en algunos resultados donde estas especies no se anidaron a ningún clado. Este fue el caso de la especie M. crosbiana, que se anidó con el clado Schultesianthus s.l., en la mayoría de los resultados, con excepción de la región ITS y la combinación con los marcadores nucleares bajo MP. La especie M. epifita se anidó con el clado M. lopezii en casi todos los resultados obtenidos, pero esto no ocurrió con el marcador ITS bajo IB; por su parte, M. formicarum se anidó al clado Markea, con excepción de los resultados obtenidos bajo ITS y los resultados individuales y combinados del cloroplasto bajo MP e IB. Finalmente, M. sturmii se anidó en el clado M. sturmii, excepto en los resultados de los marcadores nucleares individuales y combinados del cloroplasto bajo MP e IB y de ITS bajo MP.
En contraste, algunas especies como M. fosbergii, M. harlingiana y M. hunzikeri en los resultados del análisis combinado de todos los marcadores bajo MP e IB se anidaron a un clado con soporte moderado a alto; sin embargo, en otros análisis individuales o Resultados 66
combinados, se anidaron a clados diferentes o excepcionalmente no se anidaron a un clado. La especie M. fosbergii se anidó con soporte moderado a alto al clado Poortmannia en los resultados de la región ITS y de la combinación de los marcadores nucleares y combinado de todos los marcadores bajo MP e IB, mientras que en los resultados de los marcadores individuales del cloroplasto y en su combinación se relacionó con soporte bajo (resultados bajo MP) a soporte alto (resultados bajo IB), con M. hunzikeri (excepto con rps16–trnK bajo MP donde no se anidó a ningún clado). Adicional a esto, M. fosbergii no se anidó a ningún clado en los resultados con GBSSI bajo MP; sin embargo, en los resultados para el mismo marcador bajo IB se anidó con el clado Trianaea, aunque con bajo soporte. Del mismo modo, M. harlingiana se anidó en el clado Hawkesiophyton en los resultados de la combinación de los marcadores nucleares y en el combinado de todos los marcadores bajo MP e IB; no obstante, en los resultados de ITS bajo IB y de GBSSI bajo MP e IB se anidó en una politomía con los clados Hawkesiophyton y Juanulloa, en los resultados de trnT–trnF y de la combinación de los marcadores del cloroplasto se relacionó con Mer. vogelii y en los resultados de ITS bajo MP y de rps16–trnK bajo MP e IB no se anidó a ningún clado. Finalmente, M. hunzikeri se anidó con moderado a alto soporte al clado M. sturmii en los resultados de la región GBSSI y de la combinación de los marcadores nucleares y combinado de todos los marcadores bajo MP e IB y de ITS bajo IB, mientras que en los resultados de trnT–trnF y en la combinación de los marcadores del cloroplasto bajo MP e IB y de rps16–trnK bajo IB se relacionó con M. fosbergii. Adicional a esto, M. hunzikeri no se anidó a ningún clado en los resultados con ITS y rps16–trnK bajo MP.
En un caso excepcional, la especie M. purpurea no se anidó a ningún clado en los resultados del análisis combinado de todos los marcadores bajo MP o se anidó con alto soporte a la especie J. pavonii en los resultados bajo IB. También se relacionó con el clado M. antioquiensis en los resultados de ITS bajo IB o con J. pavonii y el clado M. sturmii en los resultados de GBSSI y en la combinación de los marcadores nucleares bajo MP e IB. Finalmente, no se anidó a ningún clado en los resultados de los marcadores del cloroplasto individuales y combinados, bajo MP e IB y de ITS bajo MP. Resultados 67
Tabla 6. Ubicación de las especies de Markea en los diferentes clados obtenidos en el análisis de MP en comparación con los análisis de IB. Los clados donde hubo variación en la ubicación entre los análisis de MP e IB, se separaron mediante barra inclinada (MP/IB). No asignada hace referencia a una especie que no se anidó en ningún clado. No incluida se refiere a una especie para la cual no se obtuvieron secuencias para un marcador determinado.
Especie ITS GBSSI ITS+GBSSI trnT–trnF rps16–trnK trnT–trnF+rps16– Combinado trnK M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis antioquiensis M. atlantica Dyssochroma Dyssochroma Dyssochroma Dyssochroma Dyssochroma Dyssochroma Dyssochroma M. coccinea Markea Markea Markea Markea Markea Markea Markea M. costanensis Markea Markea Markea Markea Markea Markea Markea
M. crosbiana No asignada/Schultesianthus Schultesianthus s.l. No Schultesianthus Schultesianthus s.l. Schultesianthus s.l. Schultesianthus s.l. s.l asignada/Schultesianthus s.l s.l. M. epifita clado M. lopezii/No asignada No incluida clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii M. formicarum No asignado Markea Markea No asignado No asignado No asignado Markea
M. fosbergii Poortmannia No asignada/Trianea Poortmannia Afín a M. hunzikeri No asignado/ Afín a M. Afín a M. hunzikeri Poortmannia hunzikeri M. harlingiana No asignada/ Afín a Afín a Hawkesiophyton Hawkesiophyton Afín Mer. vogelii No asignada Afín Mer. vogelii Hawkesiophyton Hawkesiophyton y Juanulloa y Juanulloa M. huilensis clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii M. hunzikeri No asignada/clado M. sturmii clado M. sturmii clado M. sturmii Afín a M. fosbergii No asignada/ Afín a M. Afín a M. fosbergii clado M. sturmii fosbergii M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii clado M. lopezii
M. panamensis Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton M. pilosa clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis clado M. antioquiensis antioquiensis M. purpurea No asignada/afín al clado M. Afín a J. pavonii y al Afín a J. pavonii y al clado M. No asignada No asignada No asignada No asignada/ Afín a J. antioquiensis clado M. sturmii sturmii pavonii M. sessiliflora Markea Markea Markea Markea Markea Markea Markea
M. sturmii No asignada/clado M. sturmii clado M. sturmii clado M. sturmii No asignada No asignada No asignada clado M. sturmii
M. ulei Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Hawkesiophyton Discusión 68
3. Discusión
Los resultados de los análisis filogenéticos de los marcadores individuales y de los análisis combinados, en la mayoría de los casos recuperaron las mismas relaciones entre las especies de Markea, con algunas excepciones (véase tabla 6 y apartado 2.4). En los apartados 2.1 y 2.2 y en las figuras 6 a 13 se encuentra información relevante de los análisis de MP e IB para los marcadores individuales y las diferentes combinaciones realizadas; sin embargo, la discusión y conclusiones fueron basadas en los resultados de la evidencia total presentada en el apartado 2.3 y en el árbol de la Fig. 14.
Los resultados mostraron de manera concluyente que el género Markea no es monofilético. De las 18 especies incluidas en los análisis solo tres especies se anidaron con la especie tipo M. coccinea. Las demás especies se anidaron en otros clados a lo largo de la hipótesis filogenética propuesta. A continuación, se discuten y caracterizan morfológicamente los clados donde se ubicaron las especies de Markea incluidas en este estudio. Los clados fueron organizados desde aquellos ubicados en la parte más externa del árbol presentado en la Fig. 14 a los localizados en el clado nucleo de Juanulloeae, en la parte más interna.
3.1 El clado Markea lopezii y la ubicación genérica de Markea epifita, Markea huilensis y Markea lopezii
El clado M. lopezii se ubicó en una posición más interna en el árbol con respecto al clado conformado por el género Solandra, y como clado hermano al resto de la tribu Juanulloeae (véase Fig. 14). Este clado fue altamente soportado e incluyó tres especies, M. lopezii (Fig. 15 A, E), M. epifita (Fig. 15 C) y la especie recientemente descrita M. huilensis (Fig. 15 B, D). En la filogenia morfológica de Knapp et al. (1997), se recuperaron dos accesiones de M. lopezii como hermanas a un clado, conteniendo dos accesiones de Solandra, un resultado similar al obtenido aquí. Por otra parte, el estudio morfológico basado en polen presentado por Persson et al. (1994), caracterizó el tipo de polen de M. lopezii, como único en la tribu y diferente del tipo de polen encontrado en Markea. Con base en las anteriores diferencias, Knapp (1998), sugirió que M. lopezii y algunas otras especies afínes, podrían no pertenecer a Markea; sin embargo, la falta de información concluyente postergó su segregación genérica a la espera de estudios más detallados. Discusión 69
Morfológicamente el clado M. lopezii se encuentra bien definido. El hábito de sus tres especies difiere del de otras especies de Markea y se caracteriza por ser lianas epifitas de ramas muy largas que crecen en el dosel del bosque. En contraste, la mayoría de especies de Markea son arbustos epifitos o hemiepífitos con ramas cortas, que generalmente crecen sobre la parte media o baja del tronco del forofito. Las especies del clado M. lopezii se distinguen fácilmente por su indumento no glandular, simple y denso sobre toda la planta y la lámina foliar de textura membranácea. Esta última con el indumento persistente sombre ambas caras. Las inflorescencias son largamente pedunculadas, indumentadas, con tricomas caducos, de base persistente, lo cual da una textura ligeramente rugosa y tuberculada a la superficie del pedúnculo y raquis de la inflorescencia. Las flores son péndulas, el pedicelo es alado distalmente, el cáliz es grande con sépalos largamente acuminados y las corolas son vistosas, de 9 a 12 cm, violetas, amarillentas o anaranjadas. Las tres especies pertenecientes a este clado se distribuyen en los Andes de Colombia y Ecuador entre 1500 y 2000 m.
El clado M. lopezii se encuentra bien diferenciado filogenética y morfológicamente, por ello se propone la descripción de un género nuevo para ubicar las especies que conforman este clado.
3.2 El clado Schultesianthus s.l. y la ubicación genérica de Markea crosbiana
El clado Schultesianthus s.l se ubicó más adentro en el árbol con respecto al clado M. lopezii y más externo al clado Trianaea y el resto de la tribu Juanulloeae (véase Fig. 14). El clado Schultesianthus s.l presentó soporte alto en la mayoría de los resultados obtenidos e incluyó todas las especies del género Schultesianthus y a las especies M. crosbiana, J. speciosa y J. globifera.
El género Schultesianthus incluyó en su circunscripción tradicional cinco especies, Sch. coriaceus, Sch. megalandrus, Sch. leucanthus (Fig. 16 A), Sch. odoriferus (Fig. 16 B) y Schultesianthus dudleyi Bernardello & Hunz. (Bernardello y Hunziker 1991). Sin embargo, Knapp (1995), transfirió tres especies mesoamericanas de Markea, M. crosbiana (Fig. 16 G, H), M. uniflora y M. venosa a Schultesianthus. Esta transferencia fue corroborada por Knapp et al. (1997), con base en una hipótesis filogenética morfológica, donde se encontró Discusión 70
una estrecha relación entre las tres especies de Markea y el género Schultesianthus. La transferencia de dichas especies no fue aceptada por Hunziker (1997, 2001), lo que ha generado dudas sobre su pertenencia genérica. En este estudio se incluyeron dos accesiones de M. crosbiana y de acuerdo a los resultados obtenidos y en concordancia con lo propuesto por Knapp (1995) y Knapp et al. (1997), M. crosbiana se anidó en la mayoría de los resultados obtenidos con las especies de Schultesianthus. Dadas las similitudes morfológicas entre M. crosbiana y las especies M. uniflora y M. venosa (no incluidas en este estudio), muy posiblemente estas especies también pertenezcan al clado Schultesianthus s.l.
Adicional a esto, J. globifera (Fig. 16 D), junto con Juanulloa wardiana (D'Arcy) S. Knapp (Fig. 16 E), fueron descritas inicialmente en Rahowardiana (D'Arcy 1973; Knapp & D'Arcy 1993), considerado un género válido por Hunziker (2001) o reconocido como un sinónimo de Juanulloa por Knapp (1995). En contraposición a las propuestas anteriores, y de acuerdo a los resultados obtenidos, Rahowardiana debe sinonimizarse con el género Schultesianthus. La especie J. wardiana (no incluida en este estudio), es muy afín morfológicamente a J. globifera, por lo que también debe pertenecer a Schultesianthus.
Por su parte, J. speciosa (Fig. 16 F), fue descrita inicialmente como la especie tipo del género Sarcophysa Miers (Miers 1849) y posteriormente transferida a Juanulloa por Dunal (1852). De acuerdo a la hipótesis filogenética encontrada, J. speciosa pertenece al género Schultesianthus, relación que no había sido propuesta antes.
El clado Schultesianthus s.l se caracteriza morfológicamente por ser lianas hemiepífitas de tallos robustos y leñosos, presentando casi siempre una conexión al suelo, aunque pueden ser secundariamente epífitas. Las hojas son coriáceas, con márgenes revolutos, pecíolos cortos y tricomas glandulares peltados y diminutos, que se encuentran inmersos en la lámina foliar. Estos tricomas han sido reconocidos como diagnósticos para el género Schultesianthus y fueron descritos e ilustrados por Bernardello & Hunziker (1991). Este tipo de indumento también se encuentra en las tres especies mesoamericanas de Markea y en J. speciosa (Bernardello & Hunziker 1991; Orejuela obs. pers.); sin embargo, en las especies de Rahowardiana no se ha explorado su presencia. En el clado Schultesianthus s.l, la corola es ligeramente zigomorfa debido a la presencia de estambres inclinados; no obstante, dicho caracter no se presenta en todas las especies del clado, como ocurre en las tres especies mesoamericanas, J. speciosa, la especie aquí incluida como Sch. aff. Discusión 71
megalandrus (Fig. 16 C), Sch. dudleyi y una especie nueva de Antioquia, Colombia, las últimas dos especies no incluidas en el presente estudio.
Con base en los resultados obtenidos, el género Schultesianthus requiere de una revisión taxonómica urgente. El género debe ser redefinido a partir de la visión original de Bernardello y Hunziker (1991), para incluir a las especies M. crosbiana, J. globifera, J. speciosa y muy posiblemente a las especies M. uniflora, M. venosa y J. wardiana. Bajo esta nueva circunscripción, Schultesianthus incluiría cerca de 13 especies distribuidas desde México a Perú, con al menos dos especies nuevas por describir. Cabe anotar que, dada la nueva circunscripción, existirían dos nombres genéricos con prioridad para este clado, Sarcophysa y Rahowardiana, siendo el primero de estos nombres el más antiguo.
3.3 El clado Markea antioquiensis y la ubicación genérica de Markea pilosa y Markea antioquiensis
El clado M. antioquiensis se ubicó más adentro en el árbol con respecto a los clados Trianaea y Schultesianthus s.l. y como clado hermano al núcleo de la tribu Juanulloeae (véase Fig. 14). Este clado fue recuperado con alto soporte e incluyó dos especies, M. antioquiensis (Fig. 17 A, B) y M. pilosa (Fig. 17 C, D). Ambas especies fueron relacionadas con las especies del clado M. lopezii por Knapp (1998), relación que no fue soportada en los resultados encontrados. Sin embargo, al igual que en el caso de las especies del clado M. lopezii, las especies del clado M. antioquiensis no se anidaron con la especie tipo de Markea.
Morfológicamente el clado M. antioquiensis se caracteriza por su hábito. La mayoría de especies de la tribu Juanulloeae son epífitas o hemiepífitas; sin embargo, las dos especies de este clado son comúnmente encontradas como pequeños arbustos del sotobosque y cuando son epífitas crecen usualmente en las partes más bajas del tronco del forofito, en cercanías del suelo (Orejuela, obs. pers.). La planta tiene un tallo principal, usualmente no ramificado, desde el cual se desarrollan las hojas en verticilos de hasta 6 hojas, de cuyo centro surgen las inflorescencias. Las hojas son las más grandes de la tribu Juanulloeae, con la lámina ampliamente ovada, membranácea a cartácea y generalmente con la base truncada y el ápice acuminado. Una de las dos especies de este clado, M. pilosa presenta un indumento denso y persistente sobre toda la planta, que recuerda a las especies del Discusión 72
clado M. lopezii; no obstante, las especies del clado M. antioquiensis se distinguen fácilmente porque las inflorescencias son cortas, no excediendo los 10 cm, corto pedunculadas y presentan brácteas similares a estípulas que subtienden cada flor, el cáliz presenta lóbulos grandes en relación al tamaño de la corola, con el ápice de los lobulos agudo, no acuminado. Las flores de las especies de este clado son variables, cambiando de tamaño y color en la misma especie, los colores del cáliz y la corola varían de verde- amarillento a violáceo o vino tinto. M. spruceana, una especie distribuida en Ecuador y no incluida en el presente análisis, es similar morfológicamente a las especies del clado M. antioquiensis y probablemente deba ser incluida en dicho clado.
Los resultados indicaron que las especies del clado M. antioquiensis no pertenecen a ningún género descrito previamente y por tanto deben ser excluidas de Markea e incluidas en un género nuevo.
3.4 El clado núcleo de Juanulloeae
En este clado se ubicaron en una politomía varios clados que incluyeron especies de Markea. A continuación, son presentados estos clados sin un orden específico debido a que las relaciones entre estos clados no fueron resueltas.
3.4.1 El clado Markea
El género Markea tradicionalmente ha incluido entre 13 y 20 especies de afinidades inciertas (Knapp 1998; Stehmann & Giacomin 2012; Orejuela et al. 2014). Las 24 accesiones de las 18 especies de Markea que se incluyeron en este estudio, se situaron en diferentes ramas a lo largo de los árboles obtenidos. El clado Markea se ubicó en el clado núcleo de Juanulloeae (véase Fig. 14), conformado por un pequeño grupo de especies que incluyó a M. coccinea, la especie tipo del género (Fig. 18 A), M. sessiliflora, M. costanensis (Fig. 18 D), (posiblemente un sinónimo de M. sessiliflora) y M. formicarum (Fig. 18 C).
El clado Markea se encuentra restringido al Escudo Guayanés, la región Amazónica y la cordillera de la Costa en Venezuela. Morfológicamente se encuentra pobremente caracterizado y se requieren mayores estudios para entender la morfología del grupo. Muchas de las especies se encuentran asociadas con hormigas creciendo usualmente Discusión 73
sobre sus nidos (Ducke 1915, 1922). Las especies de este clado son generalmente glabras, exceptuando a M. formicarum que presenta tricomas no glandulares simples en hojas y flores, las hojas son cartáceas a coriáceas con la lámina elíptica y delgada, la inflorescencia es variable en longitud, desde largamente pedunculada en M. coccinea a muy corto pedunculada o con pedúnculo casi inexistente en M. sessiliflora. El cáliz es membranáceo a cartáceo con los lóbulos profundamente divididos y el ápice de cada lóbulo largamente acuminado, la corola es infundibuliforme y de tubo angosto, de color rojo, blanco o con tintes violáceos o vino tinto, con los estambres incluidos en el tubo de la corola. Algunos caracteres morfológicos de la semilla usados por Knapp et al. (1997), para caracterizar el género Markea, como el color amarillo pálido de las semillas y la forma rectangular y alargada de las células de la testa deben ser revisados para la totalidad de la tribu Juanulloeae, con el fin de establecer si existen diferencias entre los agrupamientos encontrados en este estudio.
Basado en la semejanza morfológica con las especies incluidas en el clado Markea, algunas otras especies amazónicas podrían corresponder a este clado. Este es el caso de M. longiflora (Fig. 18 E), M. plowmanii (Fig. 18 B) y una posible especie nueva de Loreto, Perú. Sin embargo, debido a que estas especies no fueron incluidas en los análisis moleculares, su posición aquí es provisional y requiere mayores estudios.
Se sugiere una revisión taxonómica urgente para el clado Markea con el fin de evaluar la heterogeneidad morfológica de sus especies y encontrar caracteres morfológicos que permitan definir el clado.
3.4.2 El clado Hawkesiophyton y la ubicación genérica de Markea panamensis, Markea ulei y Markea harlingiana
El clado Hawkesiophyton se encontró bien soportado dentro de una gran politomía que conforma el clado núcleo de Juanulloeae (véase Fig. 14). Este clado incluyó las especies M. panamensis (Fig. 19 A) y M. ulei (Fig. 19 B), ambas especies de posición controversial en Markea y ubicadas por Hunziker (1977, 1979, 2001), en el género Hawkesiophyton. También se incluyeron en este clado J. ochracea (Fig. 19 D) y M. harlingiana, esta última especie con soporte moderado. Discusión 74
Las especies de Hawkesiophyton fueron sinonimizadas bajo Markea por Knapp et al. (1997), decisión que no es soportada aquí; en lugar de ello, los resultados obtenidos apoyan la visión de Hunziker (1977, 1979, 2001), quién reconoció a Hawkesiophyton como un género independiente. En la hipótesis filogenética obtenida, el clado Hawkesiophyton se encuentra cercanamente relacionado con Juanulloa, relación que no había sido propuesta previamente.
Con base en lo anterior y de acuerdo a los resultados obtenidos, J. ochracea debe ser transferida al género Hawkesiophyton. La inflorescencia de dicha especie es similar a la de M. panamensis y M. ulei, siendo perenne, alargándose progresivamente con la edad y portando las flores en la parte distal de la inflorescencia, el eje es leñoso y nudoso debido a las cicatrices de floraciones anteriores. El cáliz y el fruto también presentan similitudes, el cáliz es cartáceo a coriáceo con los lóbulos separados hasta la base y el fruto ovoide y de color amarillo-anaranjado en la madurez. La principal diferencia entre J. ochracea y las otras especies del clado Hawkesiophyton es la corola, la cual es tubular con los lóbulos corolinos muy cortos y de colores vistosos en J. ochracea. En contraste, la corola en las especies M. panamensis y M. ulei es campanulada, muy pequeña y verdosa con lóbulos corolinos algo más largos y reflexos. Una especie nueva de Perú (Fig. 19 C), que posiblemente pertenezca a este clado, presenta flores pequeñas, verdosas, tubulares y algo intermedias entre las flores de J. ochracea y las de M. panamensis y M. ulei.
Por otra parte, M. harlingiana se anidó en el clado Hawkesiophyton con soporte moderado, por lo cual, su ubicación aquí es dudosa y requiere mayores estudios. Esta especie presenta la inflorescencia perenne, que se alarga progresivamente con la edad, el eje es rígido y nudoso con las flores dispuestas distalmente, características que recuerdan a las otras especies del clado. Sin embargo, se distingue fácilmente por sus flores grandes con el cáliz membranáceo y la corola tubular infundibuliforme de 7 a 9 cm. Algunos especímenes de M. harlingiana colectados recientemente en el Parque Yasuní y depositados en herbarios ecuatorianos y norteamericanos, deben ser examinados minuciosamente con el fin de aclarar la pertenencia genérica de esta especie. Adicional a esto, M. vasquezii y una especie nueva, aún no descrita de Oxapampa, Pasco, Perú, ambas especies no incluidas en este estudio, deben corresponder al clado Hawkesiophyton, de acuerdo a sus características vegetativas y florales; no obstante, aclarar su pertenencia genérica requerirá mayores estudios. Discusión 75
3.4.3 El clado Dyssochroma y la ubicación genérica de Markea atlantica
El clado Dyssochroma se ubicó en una politomía en el clado núcleo de Juanulloeae (véase Fig. 14). Este clado se encuentra bien soportado e incluye las dos especies tradicionalmente ubicadas en el género Dyssochroma, D. viridiflora (Fig. 20 A) y D. longipes (Fig. 20 C, D), y también a M. atlantica (Fig. 20 B), especie descrita recientemente por Stehmann & Giacomin (2012). El clado se caracteriza por su distribución, encontrándose restringido a la mata atlántica del noreste, sudeste y sur de Brasil. Morfológicamente, se distingue por sus inflorescencias muy cortas, paucifloras de hasta 3 flores o generalmente con flores solitarias y pedúnculos cortos y leñosos o ausentes. La corola es grande, verdosa, campanulada y con prefloración valvada y el ovario es 2-locular.
La especie M. atlantica claramente presenta una morfología y distribución similar a las de las especies de Dyssochroma siendo necesaria su transferencia a este último género.
3.4.4 El clado Poortmannia y la ubicación genérica de Markea fosbergii
El clado Poortmannia se ubicó en una politomía en el clado núcleo de Juanulloeae (véase Fig. 14). Este clado estuvo bien soportado e incluyó parte de las especies tradicionalmente adscritas al género Trianaea, particularmente aquellas afines a la especie T. speciosa (Fig. 21 C, D). Estas especies no se anidaron con T. nobilis, la especie tipo de Trianaea, la cual formó otro clado llamado aquí Trianaea y ubicado más afuera en el árbol. La especie M. fosbergii (Fig. 21 A, B), se ubicó con moderado soporte en este clado.
Morfológicamente, M. fosbergii es similar a T. speciosa, compartiendo con dicha especie las inflorescencias corto pedunculadas, paucifloras o de flores solitarias, con el cáliz un poco más corto, igual o excediendo la corola, la corola es campanulada con la parte proximal tubular muy corta y el ovario es multilocular con 4, 8 o hasta 10 lóculos. T. speciosa fue descrita inicialmente en el género Poortmannia y de allí toma el nombre este clado, el cual de acuerdo a los resultados obtenidos debe restablecerse para ubicar estas especies. La especie M. fosbergii debe ser transferida a Poortmannia; sin embargo, la validez de dicho género y su relación con Trianaea debe ser evaluada dada las similitudes Discusión 76
morfológicas entre ambos clados. De igual forma, la taxonomía del grupo debe ser revisada, debido a que la especie T. speciosa es una especie muy variable y posiblemente las especies T. neovisae y Trianaea brevipes (Cuatrec.) S. Knapp sean sinónimos de ésta. Finalmente, es posible que existan especies por describir en Perú y Bolivia.
3.4.5 El clado Markea sturmii y la ubicación genérica de Markea sturmii y Markea hunzikeri
Este pequeño clado al igual que algunos de los anteriores, se ubicó en una gran politomía en el clado núcleo de la tribu Juanulloeae (véase Fig. 14). El clado M. sturmii fue altamente soportado e incluyó dos especies, M. sturmii (Fig. 22 D, E) y la especie recientemente descrita M. hunzikeri (Fig. 22 A-C). Estas especies se caracterizan por ser arbustos epífitos, profusamente ramificados, de tallos delgados, hojas pequeñas y flores pequeñas y verdosas. Las flores son superficialmente similares a las de M. panamensis y M. ulei, aunque ligeramente más grandes de hasta 3 cm. El clado recibe el nombre de la especie M. sturmii, que fue la primera especie descrita de las incluidas en esta agrupación. Mayores estudios son necesarios para dilucidar las relaciones del clado M. sturmii con otros en Juanulloeae y esclarecer la asignación genérica de sus dos especies.
3.4.6 Markea purpurea “incertae sedis”
Esta especie se incluyó en el clado núcleo de Juanulloeae (véase Fig. 14). Sin embargo, su posición no fue clara y en la mayoría de los análisis no se anidó en ninguno de los clados definidos. La especie M. purpurea (Fig. 23 A, B), fue descrita recientemente por Orejuela et al. (2014), quienes mencionaron la incertidumbre sobre las afinidades morfológicas de esta especie con otras especies de Markea. Morfológicamente, M. purpurea es similar a una especie aún no descrita de los Farallones de Cali, Colombia (Fig. 23 C), con la cual comparte la posición extra-axilar de la inflorescencia, inflorescencias corto pedunculadas, pedicelo muy corto o nulo, flores aparentemente sésiles, cáliz adpreso sobre la base de la corola y los lóbulos del cáliz cortos y de ápice agudo. A partir de los resultados obtenidos se ubica a M. purpurea como "incertae sedis". Discusión 77
3.5 Implicaciones para la circunscripción de la tribu y de otros géneros de Juanulloeae
La pertenencia de los géneros Solandra y Schultesianthus a la tribu Juanulloeae ha sido controversial. Knapp et al. (1997), consideró ambos géneros pertenecientes a Juanulloeae. Hunziker (2001), consideró a Schultesianthus como parte de Juanulloeae, pero excluyó a Solandra. Olmstead et al. (2008), sugirieron la exclusión de ambos géneros de la tribu. En contraste, los resultados recientes de Särkinen et al. (2013) y Ng & Smith (2016), mostraron que ambos géneros deben ser incluidos en Juanulloeae. De acuerdo al presente estudio, se corrobora la inclusión de Solandra y Schultesianthus en la tribu. Al incluir el género Solandra, por principio de prioridad, el nombre correcto que debe ser usado para la tribu en adelante es Solandreae Miers.
Por otro lado, y de acuerdo a los resultados obtenidos, la mayoría de los géneros de la tribu Juanulloeae reconocidos tradicionalmente por Hunziker (2001) o Knapp et al. (1997), no son monofiléticos y deben ser redefinidos, entre estos se incluyen Dyssochroma, Juanulloa, Markea, Merinthopodium, Schultesianthus y Trianaea. Del mismo modo, la validez de algunos nombres genéricos que se encuentran en sinonimia como Ectozoma, Hawkesiophyton, Poortmannia, Rahowardiana y Sarcophysa, debe ser reevaluada. Por último, algunos géneros nuevos deben ser descritos para incluir a las especies de los clados M. lopezii y M. antioquiensis y posiblemente M. sturmii. Conclusiones y recomendaciones 78
4. Conclusiones y recomendaciones 4.1 Conclusiones
Con base en las hipótesis filogenéticas presentadas se concluye que el género Markea no es monofilético. De las 20 especies aceptadas actualmente en el género, solo M. coccinea, M. sessiliflora, M. costanensis y M. formicarum deben ser mantenidas en Markea. Presumiblemente, M. longiflora y M. plowmanii también hagan parte de este clado, pero su ubicación genérica debe ser investigada con base en estudios moleculares.
Se corroboró la ubicación de las especies M. panamensis y M. ulei en el género Hawkesiophyton, tal como fue establecido por Hunziker (1977, 1979, 2001). Por tanto, Hawkesiophyton debe ser rehabilitado y excluido de la sinonimia de Markea en contraposición a lo establecido por Knapp et al. (1997). Del mismo modo, se encontraron evidencias que sugieren que J. ochracea y M. harlingiana también pertenecerían a Hawkesiophyton. Finalmente, se encontró que el género Hawkesiophyton se relaciona con Juanulloa y no con Markea como había sido sugerido previamente por Knapp et al. (1997) y Hunziker (2001).
Se corroboró la ubicación de M. crosbiana en Schultesianthus, tal y como fue expresado por Knapp (1995) y Knapp et al. (1997). Posiblemente M. uniflora y M. venosa también pertenezcan a este clado. Los nombres aceptados para estas tres especies mesoamericanas fueron publicados por Knapp (1995) y son Schultesianthus crosbianus (D'Arcy) S. Knapp para M. crosbiana, Schultesianthus venosus (Standley & C. V. Morton) S. Knapp para M. venosa y Schultesianthus uniflorus (Lundell) S. Knapp para M. uniflora.
Markea lopezii tratada como “incertae sedis” por Knapp et al. (1997), debe ser ubicada en su propio género junto con las especies M. epifita y M. huilensis. Este género debe ser descrito como nuevo debido a que no existe ningún nombre genérico publicado previamente para este agrupamiento.
Las especies M. pilosa y M. antioquiensis también deben ser excluidas de Markea y requieren la descripción de un nuevo género para ubicarlas. Al igual que con el clado M. lopezii, no existe ningún nombre genérico publicado previamente para este grupo de especies. Conclusiones y recomendaciones 79
Markea atlantica debe ser excluida de Markea y transferida al género Dyssochroma.
La especie M. fosbergii debe ser excluida de Markea y transferida al género Poortmannia, el cual, debe ser rehabilitado de la sinonimia de Trianaea.
Las especies M. sturmii y M. hunzikeri deben ser excluidas de Markea. Probablemente estas especies corresponden a un género no descrito.
Markea purpurea debe ser excluida de Markea y ubicada como “Incertae sedis” a la espera de estudios más detallados.
4.2 Recomendaciones
Se sugiere iniciar una revisión taxonómica de cada uno de los clados hallados en el presente trabajo y avanzar en la búsqueda de caracteres morfológicos que permitan definir mejor las agrupaciones.
Para resolver la politomía encontrada en el clado núcleo de la tribu Juanulloeae, donde se ubicó una parte considerable de las especies y géneros de la tribu, se recomienda incluir más fuentes de información, tales como nuevos marcadores moleculares mediante el uso de nuevas metodologías de secuenciación o la inclusión de más especies que permitan aumentar la densidad del muestreo.
Se recomienda insistir en la búsqueda de material de algunas especies pobremente representadas en los herbarios visitados y no incluidas en el presente análisis, como las especies M. longiflora, M. plowmanii, M. spruceana, M. vasquezii y las especies nuevas.
Se recomienda la realización de trabajos en la biología del grupo, tales como estudios biogeográficos y ecológicos, campos en los que el conocimiento del género Markea y de otros géneros de la tribu Juanulloeae es mínimo. Bibliografía 80
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6. Anexos
6.1 Anexo A. Three new species of Markea (Solanaceae, Juanulloeae) from Colombia
(Reimpreso con permiso de OREJUELA, A., OROZCO, C. I., BARBOZA, G., 2014. Three new species of Markea (Solanaceae, Juanulloeae) from Colombia. Phytotaxa 167 (2): 151- 165) Anexos 90 Anexos 91 Anexos 92 Anexos 93 Anexos 94 Anexos 95 Anexos 96 Anexos 97 Anexos 98 Anexos 99 Anexos 100 Anexos 101 Anexos 102 Anexos 103 Anexos 104 Anexos 105
6.2 Anexo B. Fotografías en vivo de las especies de Markea y géneros afines que conforman los clados encontrados en los análisis filogenéticos. Anexos 106
Figura 15. Especies del clado Markea lopezii. A. E. M. lopezii. B. D. M. huilensis. C. M. epifita (Fotografías: A: Eduardo Calderón; B, D, E: Andrés Orejuela C: Álvaro Pérez). Anexos 107
Figura 16. Especies del clado Schultesianthus s.l. A. Sch. leucanthus. B. Sch. odoriferus. C. Sch. aff. megalandrus. D. J. globifera. E. J. wardiana. F. J. speciosa. G., H. M. crosbiana. (Fotografías: A: Jorge Vélez; B, C: Andrés Orejuela; D: Saúl Hoyos; E: Rodolfo Flores; F: Duban Canal; G, H: Melisa Ayala). Anexos 108
Figura 17. Especies del clado Markea antioquiensis. A. B. M. antioquiensis. C. D. M. pilosa (Fotografías: A: Julio Betancur; B: Sandra Urbano; C: Nils Koster; D: Andreas Kay). Anexos 109
Figura 18. Especies del clado Markea. A. M. coccinea. B. M. plowmanii. C. M. formicarum. D. M. costanensis. E. M. longiflora. (Fotografías: A, C: Robin Foster; B: Antonio Peña; D: Günter Gerlach; E: Hervé Galliffet). Anexos 110
Figura 19. Especies del clado Hawkesiophyton. A. M. panamensis. B. M. ulei. C. Markea sp. nov. D. J. ochracea (Fotografías: A, D: Andrés Orejuela; B. María F. González; C: Robin Foster). Anexos 111
Figura 20. Especies del clado Dyssochroma A. D. viridiflora. B. M. atlantica. C. D. D. longipes. (Fotografías: A: Gloria Barboza; B. Ludovic Kollman; C: Eduardo Giehl; D: Eduardo Damasceno Lozano). Anexos 112
Figura 21. Especies del clado Poortmannia A. B. M. fosbergii. C. D. T. speciosa. (Fotografías: A, B: Rocio Deanna; C, D: Andrés Orejuela). Anexos 113
Figura 22. Especies del clado Markea sturmii A. B. C. M. hunzikeri, D. E. M. sturmii (Fotografías: A- E: Andrés Orejuela). Anexos 114
Figura 23. Markea purpurea y especie afín. A. B. M. purpurea. C. Markea sp. nov. (Fotografías: A: Thomas Andres; B: Jhoana Castillo; C: Ulli Schmith)