Atividade De Etoxiresorufina-O-Desetilase, Freqüência De Micronúcleos, Níveis De Metais, Índice Hepático E Fator De Condi

FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ ESCOLA NACIONAL DE SAÚDE PÚBLICA SÉRGIO AROUCA MESTRADO EM SAÚDE PÚBLICA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: TOXICOLOGIA AMBIENTAL OCUPACIONAL

Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase, freqüência de micronúcleos, níveis de metais, índice hepático e fator de condição em peixes provenientes da bacia do rio Paraíba do Sul

Laísa Maria Freire dos Santos

Rio de Janeiro 2004

FICHA CATALOGRÁFICA Santos, Laísa Maria Freire dos Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase, freqüência de micronúcleos, níveis de metais, índice hepático e fator de condição em peixes provenientes da bacia do rio Paraíba do Sul / Laísa Maria Freire dos Santos – 2004 167p.; il, tab, graf, map, Orientador: Isabella Fernandes Delgado Segundo Orientador: Francisco José Roma Paumgartten Dissertação (Mestrado) – Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública. 1. Poluição. 2. Biomarcadores. I. Isabella Fernandes Delagado II. Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase, freqüência de micronúcleos, níveis de metais, índice hepático e fator de condição em peixes provenientes da bacia do rio Paraíba do Sul

ii FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ ESCOLA NACIONAL DE SAÚDE PÚBLICA SÉRGIO AROUCA MESTRADO EM SAÚDE PÚBLICA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: TOXICOLOGIA AMBIENTAL OCUPACIONAL

Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase, freqüência de micronúcleos, níveis de metais, índice hepático e fator de condição em peixes provenientes da bacia do rio Paraíba do Sul

Laísa Maria Freire dos Santos

Dissertação Apresentada à Escola Nacional de Saúde Públi ca – Fundação Oswaldo Cruz para Obtenção do Grau de Mestre em Saúde Pública Sérgio Arouca – Área de Concentração em Toxicologia.

Rio de Janeiro 2004

iii FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ ESCOLA NACIONAL DE SAÚDE PÚBLICA SÉRGIO AROUCA MESTRADO EM SAÚDE PÚBLICA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: TOXICOLOGIA AMBIENTAL OCUPACIONAL

Atividade de etoxiresorufina-O-desetilase, freqüência de micronúcleos, níveis de metais, índice hepático e fator de condição em peixes provenientes da bacia do rio Paraíba do Sul Laísa Maria Freire dos Santos

Orientadora: Isabella Fernandes Delgado Segundo orientador: Francisco José Roma Paumgartten

Aprovada em ______de Abril de 2004 pela banca examinadora:

Prof. Dr. ______Francisco Gerson Araújo Prof. Dr. ______João Paulo Machado Torres Profª. Drª. ______Isabella Fernandes Delgado

Suplentes: Prof. Dr. ______Jean Remy Daveé Guimarães Prof. Dr. ______Odir Clécio da Cruz Roque

Rio de Janeiro 2004

Tudo na vida deve ser feito com amor... Ao mesmo tempo em que o amor nos deixa sensíveis, nos torna mais fortes... Dedico essa dissertação ao meu grande amor!

Agradecimentos

Ao final desta etapa de trabalho recordo de muitos que me ajudaram, pessoas que cruzaram meu caminho e que deixaram marcas. Cada um de vocês é um pouco da minha história... Sem vocês seria muito mais difícil a realização desta dissertação. Por isto gostaria de agradecer profundamente a todos:

Agradeço ao meu marido Paulo pela nossa cumplicidade e carinho, pelo apoio incondicional dedicado a mim, pelo incentivo e paciência e principalmente por dar mais sentido à minha vida fazendo com que eu perceba que se quisermos podemos fazer de cada dia um dia mais feliz...;

Aos meus familiares, Maria da Conceição minha mãe, Carlos Alberto meu pai e Leila e João meus irmãos agradeço pela força que sempre me deram, pelos conselhos e exemplos de postura e união. Minha gratidão não cabe aqui;

À amiga Barbara que desde os tempos de colégio foi sempre companheira. Agradeço por passarmos juntas as dificuldades e alegrias que permearam este período. E também pelas leituras prévias da dissertação.

À amiga Dayse Aline que partilha já a alguns anos dos estudos em grupo, das dificuldades e alegrias;

Agradeço especialmente ao professor Dr. Gerson Araújo pela oportunidade de colaboração, pela realização da estatística e identificação das espécies. Agradeço à equipe de campo do laboratório de ecologia de Peixes da UFRRJ que soube superar as dificuldades e contribuiu com muita garra para que os trabalhos saíssem. São eles: Benjamin, Tatiana, Bianca, Eduardo, Daniel, Paulo, Erasmo, Irene, Charles, José Dias e Fabiano .

Ao professor Dr. João Paulo pelo elo de cooperação entre laboratórios. Agradeço ao apoio recebido de alguns membros do laboratório de Radioisótopos do Instituto de Biofísica da UFRJ. São eles: Cláudio Eduardo, Antônio, Ricardo, Elisa, Rodrigo, Paulo, Elizabete, Michele, Dona Madalena, entre outros . Um agradecimento especial é para Marcela que com sua simpatia e responsabilidade me ajudou muito!!! Você tem uma grande carreira pela frente!

Agradeço à amiga Iranaia pela ajuda no processamento de algumas amostras.

Agradeço ao Victor Wagner pela ajuda na realização das fotos de micronúcleo.

Agradeço ao Setor de Transportes representado por Robson e Tadeu, e principalmente aos motoristas da FIOCRUZ Sr. Deni e Sr. Wandic que nos levaram ao campo participando das coletas com muito profissionalismo, boa vontade e animação;

Agradeço a todos os companheiros que encontramos nas atividades de campo, pessoas que talvez nem saibam a real importância de um trabalho de pesquisa, mas que não hesitaram em emprestar suas casas ou terrenos para que ficássemos alojados. Eu também aprendi com vocês!

Aos agentes da Policial Florestal de São Paulo que nos alojaram em suas dependências assim como o Secretário de Agricultura de Santo Antônio de Pádua (Sr. José) e o Secretário de Agricultura de Italva Sr. Marconi.

Ao pesquisador Carlos Castro da Coppe que me estimulou a continuar na academia e que me auxiliou nas atividades em campo.

Faço um agradecimento especial para o meu cúmplice de jornada, meu ajudante teimoso e incansável, que gosta de bater records de número de amostras feitas por dia e de ficar mais de 12 horas no laboratório (quando não tem aulas)... A você Thiago meus profundos agradecimentos. Sentirei saudades... VALEU!

À minha orientadora Isabella Delgado que por demonstrar confiança no meu trabalho e devido a tantas complicações no meio curso aceitou me orientar mesmo de longe. Ao Francisco Paumgartten, que me orientou também, agradeço pelas idéias, interesse e respeito à minha vontade quando quis trabalhar nesta área.

A todos os integrantes do laboratório de Toxicologia, ainda não citados, sobretudo à Regina com sua ansiedade e críticas, Ana Cecilia com sua prudência e atenção, Rosangela com sua boa vontade e carinho, à mestranda Valéria pelas leituras prévias da dissertação, ao mestrando Igor tentativa de dosagem de proteínas no final da parte experimental, a todos os estagiários que tornaram mais alegre o trabalho no laboratório e principalmente ao técnico Jayme que mesmo recém chegado ao laboratório dissecou os peixes para análise de metais.

Aos estatísticos Dr. Takume e Dr. Ana Goedel pela análise dos dados e decisão da estatística.

Agradeço ao “Grupo Saúde e Espaço nas grandes cidades” – CICT/SIG/FIOCRUZ Laboratório de Geoprocessamento e à ANA (Agência Nacional de Águas) pelo fornecimento e edição dos mapas. Agradeço principalmente ao estagiário deste laboratório Alejandro Sebastian A. Alferii do curso de Engenharia Cartográfica pela edição do mapa e paciência nas seis horas de trabalho sem descanso. Pelo pouco que o conheci demonstrou muito profissionalismo e domínio de conhecimentos;

Agradeço ao Nelson do Laboratório de Hidrologia da COPPE pelo mapa da bacia do rio Paraíba cedido.

Agradeço à ENSP pela oportunidade de um espaço de discussão, reflexão e pesquisa na área de Saúde Pública e à FIOCRUZ por proporcionar oportunidade de me formar numa instituição de referência Nacional.

Agradeço também a Deus que por ser a inteligência que tudo rege, me deu a oportunidade de encontrar nesta vida pessoas maravilhosas com as quais muito aprendi!

vii

“A religião cósmica é o móvel mais poderoso e mais generoso da pesquisa científica (...). É sentida por uma minoria de pessoas que vê, no Universo, algo mais do que um simples mecanismo sem ressonâncias transcendentes. Trata-se de uma convicção bem comparável ao sentimento religioso, porque aceita um mundo baseado na razão, um mundo inteligível! (...) Esta convicção, ligada ao sentimento profundo de uma razão superior desvendando-se no mundo da experiência, traduz para mim a idéia de Deus”. Albert Einstein (1879-1955)

viii

Água que nasce na fonte serena do mundo e que abre o profundo grotão

Água que faz inocente riacho e deságua na corrente do ribeirão

Águas escuras dos rios que levam a fertilidade ao sertão

Águas que banham aldeias e matam a sede da população

Águas que caem das pedras no véu das cascatas, ronco de trovão

E depois dormem tranqüilas, no leito dos lagos, no leito dos lagos

Água dos igarapés onde Iara mãe d’água é misteriosa canção

Água que o sol evapora pro céu vai embora virar nuvens de algodão

Gotas de água da chuva alegre arco-íris sobre a plantação

Gotas de água da chuva tão tristes são lágrimas na inundação

Águas que movem moinhos são as mesmas águas que encharcam o chão

E sempre voltam humildes pro fundo da terra, pro fundo da terra,

Terra planeta água... terra planeta água.

Planeta Água

Guilherme Arantes ix Resumo Neste estudo avaliamos a freqüência de micronúcleos no sangue periférico, a atividade da etoxiresorufina-O-desetilase - EROD (marcador da atividade enzimática da subfamília CYP1A) no fígado, e os níveis de metais no músculo de peixes acarás (Geophagus brasiliensis ) e cascudos ( Hypostomus affinis e Hypostomus luetkeni ) coletados na bacia do rio Paraíba do Sul. Biomarcadores inespecíficos como Fator de Condição e Índice Hepático também foram utilizados. Os peixes foram capturados nos trechos superior, médio-superior, médio-inferior e inferior da bacia do rio Paraíba do Sul em dois períodos distintos (chuva e estiagem). Dentre as espécies estudadas, G. brasiliensis foi a que coletamos com maior freqüência ao longo de toda a bacia. G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni apresentaram uma tendência de aumento dos fatores de condição no período de chuvas quando comparamos aos valores obtidos no período de estiagem. Volta Redonda foi a região em que se coletou G. brasiliensis com os maiores valores de índice hepático. A freqüência de micronúcleos nos eritrócitos do sangue periférico das três espécies foi muito baixa (0,00-2,00‰) evidenciando ausência de dano genotóxico. A atividade de EROD em G. brasiliensis foi maior do que a das outras duas espécies em todos os locais de coleta. Na região de Levy Gasparian, onde foi possível capturar um grande número de peixes, a atividade de EROD em G. brasiliensis machos foi maior do que em fêmeas. A atividade de EROD de G. brasiliensis variou entre os locais de coleta, sendo os maiores valores registrados nos peixes de São Luiz do Paraitinga, Barra Mansa, Levy Gasparian, Três Rios e Sapucaia e os menores nos peixes de Paraibuna, Italva, Rio das Flores, Santo Antônio de Pádua e Campos. Os níveis de metais foram baixos nas três espécies em todas as regiões e no caso de chumbo e mercúrio, inferiores aos valores máximos permitidos pela regulamentação brasileira de alimentos (ANVISA). Estudos devem ser realizados para investigar as diferenças de EROD entre G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni. As regiões de São Luiz do Paraitinga, Barra Mansa, Três Rios, Levy Gasparian e Sapucaia devem ser melhor investigadas quanto a poluentes indutores de CYP1A, uma vez que os peixes coletados nestes locais apresentaram as mais elevadas atividades de EROD.

Palavras-chave : Biomarcadores, Atividade de EROD, freqüência de micronúcleo, G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni .

Abstract

In this study we evaluated the frequency of micronucleated erythrocytes in peripheral blood, metal concentrations and the activity of ethoxyresorufin-O-dealkylase (EROD) in the liver of pearl cichlid ( Geophagus brasiliensis ) and catfish ( Hypostomus affinis and Hypostomus luetkeni ). Physiological features, including condition factor and liver somatic index were calculated to assess fish condition. Fishes were caught at Paraiba do Sul river and tributaries in the rainny and dry season. Geophagus brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni presented higher condition factor at the rainny season than at the dry season. G. brasiliensis caught from Volta Redonda presented the highest hepatic index. The frequency of micronucleated erythrocytes in three species was quite reduced (0.00-2.00‰) revealing the absence of genotoxic damage. EROD activity in G. brasiliensis was higher than in catfish. In Levy Gasparian city we caught 21 specimens and it was possible to evaluate differences in EROD activity between males and females. Males G. brasiliensis EROD activity was higher than in females. This activity in G. brasiliensis varied among the sampling sites and the highest values were registered in fish from São Luiz do Paraitinga, Barra Mansa, Levy Gasparian, Três Rios and Sapucaia. Lowest values were registered in fish from Paraibuna, Italva, Rio das Flores, Santo Antônio de Pádua and Campos. Metal levels were low in muscles of the three species at all sampling sites. G. brasiliensis was most sensitive to EROD activity than catfish . The mooxigenases activity in fish should be used as a monitoring tool to detect contamination of water bodies by cytochrome P- 450-indicing agents. Metal levels found in fish muscles did not represent a risk to population health. This study did not demonstrated genotoxicity damage in the fish caught because it we did not observe a high frequency of micronuclei in peripheral blood erythrocytes.

Keywords : biomarkers, EROD activity, micronuclei frequencies, G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni .

xi Sumário

Dedicatória...... v Agradecimentos ...... vi Epígrafe ...... viii Resumo ...... x Abstract...... xi Sumário...... xii Lista de Tabelas ...... xv Lista de Figuras...... xviii Lista de Quadros...... xx Lista de Siglas e Abreviaturas ...... xxi

1. Introdução ...... 24 1.1 Biomarcadores ...... 24 1.2 Índice hepático e Fator de condição ...... 30 1.2.1 Índice Hepático (IH) ...... 30 1.2.2 Fator de condição (FC) ...... 30 1.3 Determinação da freqüência do micronúcleo no monitoramento da poluição ambiental...... 32 1.3.1 Divisão celular e formação de micronúcleos...... 32 1.3.2 Determinação da freqüência de micronúcleos (MN) em peixes...... 33 1.4 Determinação da atividade enzimática – EROD (Etoxiresorufina–O-desetilase) como biomarcador de susceptibilidade da poluição ambiental...... 35 1.4.1 Biotransformação...... 35 1.4.2 Citocromo P450...... 35 1.4.2.1 Indução do citocromo P450 - CYP1A1...... 36 1.4.3 Atividade de EROD em peixes...... 38 1.5 Metais ...... 39 1.6 Ictiofauna ...... 40 1.6.1 Teleósteos de água doce ...... 40 1.6.1.1 Cichlidae...... 41 1.6.2.1 Loricariidae...... 42 1.7 Bacia do rio Paraíba do Sul ...... 43

xii 1.7.1 Usos da Bacia do rio Paraíba do Sul...... 43 1.7.2 Área de Estudo...... 44 2. Objetivos...... 53 3. Metodologia...... 54 3.1 Locais de coleta ...... 54 3.2 Atividades em campo: Coleta, processamento de peixes e medidas das variáveis físico-químicas...... 56 3.3 Índice hepático e fator de condição ...... 58 3.4 Determinação da freqüência de Micronúcleo ...... 59 3.5 Determinação da Atividade Enzimática – EROD ...... 59 3.5.1 Preparo da fração citosólica (S9) hepática...... 59 3.5.2 Determinação da concentração de proteínas na fração S9...... 60 3.5.3 Determinação da Atividade enzimática – EROD ...... 61 3.6 Análise de metais...... 62 3.6.1 Análise das concentrações totais de cromo, cobre, zinco, chumbo, níquel e manganês...... 62 3.6.2 Análise de mercúrio total...... 63 3.7 Análises Estatísticas ...... 64 3.8 Reagentes, Soluções, Padrões, Substratos, cofatores e outras substâncias utilizadas ...... 64 3.8.1 Preparo do esfregaço do sangue periférico, coloração e contagem das lâminas ...... 65 3.8.2 Preparação da fração citosólica (S9) hepática ...... 66 3.8.3 Determinação da concentração de proteínas na fração S9...... 67 3.8.4 Determinação da Atividade enzimática – EROD ...... 68 3.8.5 Análise de cromo, cobre, zinco, manganês, chumbo e níquel...... 70 3.8.6 Análise de mercúrio total...... 70 4. Resultados ...... 73 4.1 Peixes coletados...... 73 4.2 Medidas das variáveis físicas e físico-químicas ...... 73 4.3 Índice hepático e fator de condição ...... 79 4.3.1 Índice Hepático...... 79 4.3.2 Fator de Condição...... 85 4.4 Determinação da freqüência de micronúcleos...... 92

xiii 4.5 Determinação da Atividade de Etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) na fração S9 hepática ...... 96 4.6 Quantificação de Metais ...... 104 5. Discussão ...... 107 5.1 Medidas das variáveis físicas e físico-químicas ...... 107 5.2 Índice hepático e fator de condição ...... 108 5.2.1 Índice Hepático...... 108 5.2.2 Fator de Condição...... 110 5.3 Determinação da freqüência de micronúcleos...... 113 5.4 Determinação da Atividade Etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) na fração S9 hepática ...... 117 5.4.1 Diferenças interespecíficas na atividade de EROD ...... 122 5.4.2 Diferenças entre machos e fêmeas na atividade de EROD...... 123 5.4.3 Inibição da atividade de EROD ...... 123 5.5 Quantificação de Metais ...... 125 6. Conclusões ...... 127 7. Recomendações ...... 128 8. Referências Bibliográficas ...... 129 9. Anexos...... 140 9.1 Anexo 1 ...... 140 9.2 Anexo 2 ...... 153 9.3 Anexo 3 ...... 167

xiv Lista de Tabelas

Tabela 1 : Avaliação de biomarcadores em peixes utilizando critérios propostos por Stegman (1992)...... 29 Tabela 2: Distribuição dos locais de coleta por unidade geográfica da bacia do rPS...... 55 Tabela 3 : Localização geográfica (Latitude e longitude) dos locais em que foram realizadas as coletas do estudo...... 56 Tabela 4 : Número de peixes ( G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni ) coletados nos períodos de chuvas e estiagem nas diferentes regiões estudadas da bacia do rio Paraíba do Sul...... 74 Tabela 5 : Variáveis físicas e físico-químicas da água medidos em diferentes pontos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 76 Tabela 6 : Variáveis físicas e físico-químicas da água medidas em diferentes pontos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem...... 77 Tabela 7 : Classificação dos valores de IHs médios de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões e períodos ...... 80 Tabela 8 : Classificação dos valores de IHs médios de H. affinis coletados em diferentes regiões e períodos ...... 81 Tabela 9 : Classificação dos valores de IHs médios de H. luetkeni coletados em diferentes regiões e períodos...... 81 Tabela 10 : Índices Hepáticos de G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 83 Tabela 11 : Índices Hepáticos de G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem...... 84 Tabela 12 : Valores do Fator de Condição isométrico de G. brasiliensis, coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 88 Tabela 13 : Valores do Fator de Condição isométrico de H. affinis, coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 89 Tabela 14 : Valores do Fator de Condição isométrico de H. luetkeni,, coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 90

xv Tabela 15 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuva e estiagem...... 92 Tabela 16 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 94 Tabela 17 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem...... 95 Tabela 18 : Enquadramento das regiões de coleta, nos períodos de chuva e estiagem, segundo faixas crescentes de atividade de EROD em fração S9 hepática de G. brasiliensis. Para classificação foram utilizados os valores da mediana de cada região (representada pelos códigos)...... 98 Tabela 19 : Concentração de metais no músculo de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA)...... 104 Tabela 20 : Concentração de metais no músculo de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA)...... 105 Tabela 21 : Concentração de metais no músculo de H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA)...... 106 Tabela 22 : Concentração de metais no músculo de H. affinis e H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA)...... 106 Tabela 23 : Comparação das freqüências de micronúcleos em eritrócitos de peixes em diferentes estudos...... 115

Anexos Anexo 1

Tabela 1a : Parâmetros morfométricos de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 141

xvi Tabela 2a : Parâmetros morfométricos de H. affinis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 142 Tabela 3a : Parâmetros morfométricos de H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 143 Tabela 4a : Parâmetros morfométricos de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época de estiagem...... 144 Tabela 5a : Parâmetros morfométricos de H. affinis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época da estiagem...... 145 Tabela 6a : Parâmetros morfométricos de H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época da estiagem...... 146 Tabela 7a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 147 Tabela 8a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. affinis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 148 Tabela 9a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 149 Tabela 10a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem ...... 150 Tabela 11a : Valores da atividade de EROD na fração S9 hepática de H. affinis coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 151 Tabela 12a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem...... 152

Anexo 2

Tabela 1b : Variáveis físicas e físico-químicas medidas na margem e calha central do rio Pomba em S.A.Pádua e no tanque de cultivo de peixes da Secretaria Municipal de Agricultura...... 158 Tabela 2b : Comparação entre os resultados dos parâmetros morfométricos de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus em experimento in situ realizado no rio Pomba...... 159 Tabela 3b : Comparação entre Valores da atividade de EROD em S9 hepática de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus em experimento in situ...... 160 xvii

Lista de Figuras

Figura 1 : Esquema de respostas biológicas decorrentes de exposição a poluentes...... 27 Figura 2 :Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleo em células eucarióticas. [Adaptado de Al-Sabti, 1995]...... 33 Figura 3 : Estrutura da protoporfirina férrica do grupo prostético do CYP450...... 36 Figura 4 : Esquema da Indução mediada por receptor Ah do citocromo P4501A1. Adaptado de Okey, 1990...... 37 Figura 5: Localização geográfica da Bacia Hidrográfica do rio Paraíba do Sul abrangendo os Estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro...... 45 Figura 6 : Perfil longitudinal do rio Paraíba do Sul, com a indicação das unidades geográficas adaptado de Bizerril (2001)...... 50 Figura 7: Comparação entre Índice Hepático de G. brasiliensis coletado em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 80 Figura 8 : Comparação entre Índices Hepáticos de H.affinis e H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul, nos períodos de chuvas e estiagem...... 82 Figura 9 : Distribuição dos Fatores de Condição (*10 –5 ) de todos os G. brasiliensis coletados nas regiões estudadas nos períodos de chuva e estiagem...... 85 Figura 10 : Fator de Condição (média ±desvio padrão) de G. brasiliensis coletados nos períodos de chuvas e estiagem.* - p<0,05...... 86 Figura 11 : Fatores de condição de G. brasiliensis coletado em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 86 Figura 12 : Fatores de Condição de H.affinis e H. luetkeni coletados em diferentes regiões ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem...... 91 Figura 13 : Distribuição dos valores de atividade de EROD (pmol de resorufina/min/mg de proteína) em G. brasiliensis utilizados neste estudo nas diferentes regiões da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem ...... 97 Figura 14 : Atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas...... 98 Figura 15 : Atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis coletados em diferentes regiões da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem...... 99

xviii Figura 16 : Comparação das atividades de EROD em G. brasiliensis entre os períodos de chuva e estiagem...... 100 Figura 17 : Atividade de EROD entre machos e fêmeas de G. brasiliensis coletados no rio Paraibuna-mineiro na cidade de Levy Gasparian (Região 8). * - P=0,047 ...... 101 Figura 18 : Atividade de EROD entre fêmeas e fêmeas ovadas de G. brasiliensis coletados no rio Paraibuna-mineiro na cidade de Levy Gasparian (Região 8)...... 101 Figura 19 : Comparação da atividade de EROD em S9 hepática em H. affinis e H. luetkeni coletados nas regiões de coleta no período de chuvas(média ± desvio padrão).. ..103

Figura 20 : Comparação da atividade de EROD em S9 hepática em H . affinis e H. luetkeni coletados nas regiões de coleta no período de estiagem (média ± desvio padrão)...... 103 Figura 21 : Correlação entre atividade de EROD e Índice Hepático de G brasiliensis coletados no período de chuvas e estiagem...... 109

Anexos Anexo 2 Figura 1b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental da Oreochromis niloticus ...... 161 Figura 2b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental de Hypophthalmichthys molitrix ...... 161 Figura 3b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental de Prochilodus lineatus ...... 162

Anexo 3 Figura 1c :Foto de Geophagus brasiliensis coletado no rio Paraíba do Sul em Três Rios .166 Figura 2c : Foto de H. affinis coletado no rio Paraíba do Sul em Três Rios ...... 166 Figura 3c : Fêmea ovada de H. affinis ...... 166 Figura 4c : Fígado de G. brasiliensis ...... 167 Figura 5c : Eritrócitos do sangue periférico de H. luetkeni coletado no rio Preto em Rio das Flores. Em destaque está a célula com micronúcleo...... 167

xix Lista de Quadros

Quadro 1 : Características gerais dos principais rios da bacia do rio Paraíba do Sul. Adaptado de Bizerril (1999)...... 48

Lista de Esquemas

Esquema 1 : Relação entre matriz do peixe e o tipo de análise realizada e os processos realizados em campo e laboratório...... 72

xx Lista de Siglas e Abreviaturas

ACHE – Acetilcolina Ah - receptor Ah - “aryl hydrocarbon” ALT - alanina transaminase ANA – Agência Nacional de Águas ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária AST – aspartato trasnsaminase ATSDR – Agency for Toxic Substances and Disease Registry Bile FAC - metabólitos fluorescentes de HPA na bile CAT – Catalase c.a. – cerca de CEDAE - Companhia de Águas e Esgotos do Estado do Rio de Janeiro CETESB – Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental CO - monóxido de carbono CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente Cr – cromo Cu – cobre CYP1A- Citocromos P450-1A (subfamília) CYP1A1 - Citocromo P450-1A1 (isoforma) CYP450 - citrocomo P450 DDT – dicloro-difenil-tricloroetano DMSO – dimetil sufóxido DNA – ácido dexorribonucleico DNA add – adutos de DNA DNA dam - danos ao DNA DO - densidade ótica EDTA - Ácido etilenotetraamino ENSP – Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca EROD - Etoxiresorufina –O-desetilase FAO – “Food and Agriculture Organization of the United Nations” - Organização das Nações Unidas para Alimentos e Agricultura FC – Fator de condição FEEMA - Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente

xxi FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz GPS - Sistema de Georreferenciamento por Satélite GST - Glutationa-S-tranferase ha - hectares Hg – mercúrio HPAs - hidrocarbonetos aromáticos policíclicos HSP - proteínas de choque térmico IB/UFRRJ – Instituto de Biologia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IDA – Ingestão Diária Aceitável IH – Índice Hepático Leuc – Leucócitos LIGHT – Serviços de Eletricidade S/A Linf - Linfócitos MG – Estado de Minas Gerais Mn – manganês MN - Micronúcleo mRNA – Ácido ribonucléico mensageiro MT –Metalotioneínas MXR – resistência a multixenobióticos Ni - níquel NRC - National Research Council

O2 - oxigênio molecular ºC – grau Celsius OD - oxigênio dissolvido PA – para análise Pb – chumbo PCBs – Bifenilas policloradas PCDDs - dibenzo-p-dioxinas policloradas PCDFs - dibenzofuranos policlorados pH – Potencial de hidrogenação PR- Paraná qsp – quantidade suficiente para rPS – Rio Paraíba do Sul

xxii SIG – Sistema de Informações Geográficas SOD - Superóxido dismutase TBT - tributil de estanho TPT - trifenil de estanho UDPGT – Glucuronil transferases UFRJ – Universidade Federal do Rio de Janeiro VTG - vitelogenina WHO – “World Health Organization” - Organização Mundial de Saúde Zn – zinco ZRP – Proteínas da zona radiata

xxiii 1. Introdução A aceleração do processo de urbanização e industrialização, ocorrido principalmente após a Segunda Guerra Mundial, resultou no aumento da poluição hídrica. Cada vez mais a contaminação/ poluição das águas se torna um problema maior e mais complexo em nossa sociedade. Em virtude deste fato cresce a preocupação de diversos setores, inclusive do setor de saúde, em relação à escassez de água potável em algumas comunidades; à contaminação da população por poluentes encontrados na água e/ou biota; às doenças veiculadas pelas águas, e a outros problemas que refletem um desenvolvimento não sustentado. Tradicionalmente, o impacto de descargas de poluentes em ecossistemas aquáticos tem sido avaliado no meio abiótico (água ou sedimento) por meio da quantificação das substâncias químicas. Esta abordagem, apesar de fornecer informações úteis, tem algumas limitações ( e.g. não fornece informações sobre a biodisponibilidade da substância química). Inferências sobre o impacto da contaminação ambiental na biota requerem um conhecimento prévio dos possíveis efeitos adversos induzidos por poluentes nos organismos. Tais efeitos podem aparecer em vários níveis organizacionais de complexidade, desde o molecular, celular, individual, até o nível de comunidade. Atualmente observa-se nos trabalhos de pesquisa científica uma tendência em se utilizar um conjunto de marcadores de poluição para detectar alterações induzidas por xenobióticos sobre os organismos. Neste sentido, uma ampla gama de biomarcadores tem sido proposta para detecção de respostas a poluentes químicos na biota e para o monitoramento da contaminação de ecossistemas aquáticos.

1.1 Biomarcadores Apesar do emprego de alguns biomarcadores apresentar longa história na medicina e saúde pública, o desenvolvimento sistemático, a validação e a aplicação de biomarcadores é um campo relativamente novo (Shugart, 1992). Biomarcadores podem servir como um elemento comum em estudos com diferentes abordagens, tais como estudos epidemiológicos, estudos experimentais e estudos em campo com plantas ou animais (Anderson, 1994). Muitas definições têm sido propostas para o termo “biomarcador”. Este termo pode ser usado, de forma geral, para qualquer medida que reflita uma interação entre um sistema biológico e um dano potencial, que pode ser químico, físico ou biológico (Van der Oost, 24 2003). Outra definição é dada pela Academia Nacional de Ciências dos Estados Unidos que define biomarcador (marcador biológico) como uma alteração induzida por xenobiótico em componentes ou processos, estruturas ou funções celulares ou bioquímicas que podem ser medidas em um sistema biológico ou amostra. De acordo com NRC (National Research Council) (1987), WHO (1993) (Organização Mundial de Saúde), os biomarcadores podem ser subdivididos em três categorias, i.e. marcadores de exposição, efeitos e suscetibilidade. A presença de uma substância exógena, seu metabólito ou o produto da interação entre um agente xenobiótico e uma molécula-alvo (ou célula), que possa ser medida num compartimento de um organismo pode ser classificada como um biomarcador de exposição . Biomarcadores de exposição podem ser usados para avaliar ou confirmar a exposição de indivíduos (ou populações) a uma dada substância (ou grupo de substâncias) fornecendo informações sobre a relação existente entre exposição e dose interna. Biomarcadores de efeito são definidos como qualquer alteração de medida bioquímica, fisiológica, comportamental num organismo que, dependendo de sua magnitude, pode ser reconhecida como dano à saúde ou mesmo doença. Em alguns casos observa-se alta especificidade entre a natureza do poluente e o tipo de efeito como, por exemplo, a inibição da colinesterase decorrente da exposição a inseticidas organofosforados . Já outros biomarcadores de efeito não apresentam relação intrínseca com determinado poluente, mas são muito utilizados no biomonitoramento da poluição. Os biomarcadores de suscetibilidade são definidos como indicadores de resposta relacionados a uma determinada habilidade inata ou adquirida do organismo que pode resultar em alteração na suscetibilidade do indivíduo a uma dada substância. Pode-se incluir nesta categoria fatores genéticos e alterações na expressão de receptores. Esta subdivisão é algumas vezes ambígua, mas serve para agrupar biomarcadores (Hemminki, 2001). Outros termos relevantes na área de Ecotoxicologia foram aqueles definidos por Van Gestel (1996) [ apud Van der Oost, 2003], i.e. “biomarcador”, “bioindicador” e “indicador ecológico” considerando-se o aspecto de níveis organizacionais. Assim biomarcador pode ser considerado como qualquer resposta biológica a um poluente ambiental no nível subindividual, medida dentro do organismo ou em seus produtos (urina, fezes, cabelo etc.), indicando um desvio da homeostase que ainda não pode ser identificado no organismo intacto. Um bioindicador é definido como um organismo que fornece informação sobre 25 condições ambientais do seu habitat por meio da sua presença ou ausência, ou pelo seu comportamento. Já o termo indicador ecológico considera o parâmetro do ecossistema, descrevendo sua estrutura e o funcionamento ( e.g. estudo da dinâmica de populações afetadas por determinadas mudanças no habitat ). A bioacumulação de certos poluentes ambientais persistentes em tecidos animais pode ser considerada como um biomarcador de exposição a estas substâncias, como definido anteriormente (NRC, 1987; WHO,1993). No entanto, de acordo com as definições dadas por Van Gestel (1996) [ apud Van der Oost, 2003], estes indicadores químicos- analíticos não são considerados biomarcadores e sim marcadores de bioacumulação. Van der Oost (2003) considera os indicadores químicos-analíticos como marcadores de bioacumulação, por que estes não fornecem informações sobre desvios da homeostase, enquanto que todos os indicadores biológicos (bioquímicos, fisiológicos, histológicos e morfológicos) fornecem ( figura 1 ). A abordagem empregando biomarcadores pode ser útil na avaliação da saúde do organismo através da identificação de sinais de alerta precoces de riscos ambientais (Payne, 1987). Quando um organismo está em contato com um poluente, as primeiras alterações da homeostase só podem ser observadas através de estudos em níveis subindividuais. Estes sinais (resposta precoce ao poluente) são observados mesmo abaixo de um limiar para o aparecimento de efeitos adversos, mas com o aumento do nível de exposição (dose/tempo) há um aumento (intensidade e/ou natureza) de resposta que pode ser observado em níveis hierárquicos superiores (indivíduos, população etc). Esta situação pode ser visualizada abaixo (figura 1) em um esquema adaptado de Van der Oost, 2003:

Figura 1: Esquema de respostas biológicas decorrentes de exposição a poluentes.

A aplicação ou interpretação errônea de respostas de biomarcadores pode levar a falsas conclusões sobre a qualidade ambiental. Certas respostas estabelecidas para uma espécie, podem não ser válidas para outras (Van der Oost, 2003). Além disto, é fundamental o entendimento temporal e espacial de mudanças na qualidade da água, concentração do agente tóxico e de como isto influencia no desfecho ( endpoint ) estudado. O trabalho de revisão de Van der Oost (2003) avaliou uma série de biomarcadores de acordo com critérios propostos por Stegmam et al. (1992) [ apud Van der Oost, 2003]. Estes critérios são: 1. A quantificação do biomarcador deve ser confiável, preferencialmente barata e fácil de ser realizada; 2. A resposta ao biomarcador deve ser sensível à exposição e/ou ao efeito do poluente a fim de servir como um parâmetro precoce de dano (alerta); 3. A base de dados do biomarcador deve ser bem definida para ser possível distinguir entre variações naturais e resposta induzida por poluentes; 4. Os impactos dos fatores de confundimento nos biomarcadores devem ser bem estabelecidos; 5. A relação entre a resposta do biomarcador e a exposição ao poluente (tempo e dosagem) deve ser conhecida;

27 6. O significado toxicológico do biomarcador, ou seja, as relações entre a resposta e o impacto a longo prazo no organismo devem ser estabelecidas. O uso de biomarcadores em peixes pode ser útil no processo de avaliação de risco e no monitoramento da qualidade ambiental de ecossistemas aquáticos. A tabela abaixo (tabela 1 ) foi proposta por Van der Oost (2003) e correlaciona alguns biomarcadores com os critérios citados acima.

28 Tabela 1 : Avaliação de biomarcadores em peixes utilizando critérios propostos por Stegman (1992). Critérios Biomarcadores Enzimas Enzimas Enzimas Produtos de Proteínas Transaminases Parâmetros Parâmetros Parâmetros Parâmetros Parâmetros Parâmetros de Fase de Fase Antioxidantes Biotansformação do soro imunológicos reprodutivos neurotóxicos genotóxicos histopatológicos morfológicos I II EROD GST SOD Bile FAC HSP AST Leuc. VTG ZRP ACHE DNA add Tecido IH CYP1A UDPGT CAT MT ALT Linfoc. DNA dam FC MXR - Confiabilidade + + + + + + ± + + - ± + e facilidade do ensaio - Sensibilidade à + ± - + ± ± ± + ± + - - poluição - Base de dados + ± ± + - ± ± ± ± + + + conhecida - Fatores de ± ± ± ± - ± ± ± - ± ± ± confundimento - Mecanismos de + ± - + ± - - + ± + ± ± resposta - Significado ± + ± ± ± + + ± ± + + ± toxicológico TOTAL 5,0 + 4,0 + 2,5 + 5,0 + 2,5 + 3,5 + 3,0 + 4,5 + 3,0 + 4,5 + 3,5 + 3,5 + Símbolos : +: bom; ± razoável’; - pobre. Abreviações : EROD - Etoxiresorufina –O-desetilase, CYP1A- Citocromos P450-1A; GST - Glutationa-S-tranferase;UDPGT – Glucuronil transferases,; SOD - Superóxido dismutase, CAT - Catalase; Bile FAC – metabólitos fluorescentes de HPA na bile ;HSP - proteínas de choque térmico, MT –Metalotioneínas, MXR – resistência a multixenobióticos; AST – aspartato trasnsaminase, ALT - alanina transaminase; Leuc – Leucócitos, Linf - Linfócitos ;VTG – vitelogenina , ZRP – Proteínas da zona radiata; ACHE – Acetilcolina; DNA add – adutos de DNA, DNA dam - danos ao DNA, IH – Índice Hepático, FC – Fator de condição. Soma dos pontos: + = 1; ± = 0,5 ; - = 0.

1.2 Índice hepático e Fator de condição A partir de parâmetros morfométricos, pode-se obter índices que indicam o estado geral de saúde de peixes. Estes índices, i.e. fator de condição e índice hepático, são marcadores inespecíficos de mudanças ambientais, incluindo a poluição aquática.

1.2.1 Índice Hepático (IH) O índice hepático é obtido calculando-se a razão entre o peso do fígado e o peso total do animal, razão esta expressa em porcentagem. O IH pode ser afetado pela dieta e determinados estados patológicos. Durante exposições crônicas a agentes químicos o aumento do IH está geralmente relacionado à presença de lesões no órgão, em geral a densidade ou massa do fígado encontra-se aumentada em resposta a condições preneoplásicas ou neoplásicas. O aumento do IH pode ser causado também pela indução de oxidases de função mista (CYP450) que metabolizam determinados tipos de poluentes. Este índice pode estar altamente correlacionado à atividade do citocromo P4501A1 ou à reação de EROD que marca a atividade de isoenzimas da subfamília CYP-1A em peixes. Muitos autores especulam que há uma relação direta entre o aumento do IH e a exposição a poluentes químicos (Van der Oost, 2003). Após análises bioquímicas e histológicas, Slooff (1983) concluiu que o aumento do fígado em Abramis brama (tanto machos quanto fêmeas) coletados em áreas poluídas era causado principalmente por hipertrofia (aumento no tamanho das células). Em estudo realizado por Poels (1980), por outro lado, o resultado do aumento do peso do fígado resultou claramente de hiperplasia (aumento do número de células).

1.2.2 Fator de condição (FC) A relação entre o peso e o comprimento corporal é usada para calcular um índice denominado ‘fator de condição’. O fator de condição (Le Cren, 1951) seria um indicador quantitativo do grau de bem estar do peixe, refletindo condições alimentares recentes e/ou gastos de reservas em atividades cíclicas. O fator de condição possibilita estabelecer relações entre condições ambientais e aspectos comportamentais da espécie (Vazzoler, 1996). Este fator refletiria o bem estar do peixe, partindo-se do princípio que indivíduos do mesmo comprimento, mas com maiores pesos corpóreos estariam vivendo sob melhores condições ambientais. Este é um índice padrão no estudo da

30 ecologia de peixes (Bolger, 1989) e pode ser usado para monitorar a influência intrapopulações de mudanças ambientais ao longo do tempo (Ney (1993) [ apud Godinho, 1997]). É importante ressaltar que a relação peso/comprimento pode variar entre sexos, locais e período de coleta. O fator de condição pode ser estimado de 2 modos: • Fator de condição de Fulton - assume que a relação peso/comprimento é isométrica e o valor de b (coeficiente angular da regressão peso/comprimento) é igual a 3 e é calculado através da razão entre o peso do peixe e o comprimento elevado ao cubo; • Fator de condição alométrico – considera que as várias espécies de peixes podem ter relações diferentes de peso/comprimento. É calculado estimando-se inicialmente o coeficiente de alometria (b), derivado da regressão entre peso/comprimento dos indivíduos coletados. Após, esta estimativa, o FC é calculado pela da razão entre o peso do peixe e o comprimento elevado ao coeficiente de alometria;

31 1.3 Determinação da freqüência de micronúcleos (MNs) no monitoramento da poluição ambiental

1.3.1 Divisão celular e formação de micronúcleos A mitose é o processo de divisão do núcleo da célula eucariótica em que ocorre a condensação do DNA em dois conjuntos cromossômicos visíveis. A mitose pode ser dividida esquematicamente em quatro fases: prófase, metáfase, anáfase e telófase. Estes estágios serão relatados segundo Tortora (2000): Durante o início da prófase, a cromatina condensa-se e encurta-se até os cromossomos tornarem-se visíveis. Uma vez que a replicação do DNA ocorre durante a interfase, cada cromossomo na prófase consiste de um par de moléculas idênticas de DNA em dupla hélice, chamadas de cromátides. Cada par de cromátides é unido pelo centrômero. Ainda na prófase ocorre o desaparecimento dos nucléolos e o envoltório nuclear se desintegra sendo absorvido no citossol. Nesta fase cada um dos centrossomos e seus centríolos, move-se para extremidades opostas da célula. À medida que eles se deslocam, os centrossomos iniciam a formação do fuso mitótico. O fuso é um local de fixação dos cromossomos e é fundamental para a distribuição dos cromossomos para pólos opostos da célula. Nesta fase os cromossomos ainda não estão presos ao fuso mitótico Durante a metáfase, os centrômeros dos pares das cromátides se alinham exatamente no centro do fuso mitótico, formando o que se chama de plano equatorial. A anáfase é caracterizada pela quebra e separação dos centrômeros, e pelo movimento das duas cromátides irmãs de cada par, em direção a pólos opostos da célula. Uma vez separadas, as cromátides irmãs são chamadas de cromossomos filhos. À medida que estes cromossomos se movem durante a anáfase, eles aparecem em forma de V, já que os centrômeros movem-se à frente e parecem puxar as partes dos cromossomos que ficam para trás em direção a pólos opostos da célula. O estágio final, que é a telófase, inicia-se quando a movimentação dos cromossomos cessa. Durante a telófase, os conjuntos cromossômicos idênticos, presentes nos pólos opostos da célula, desespiralizam-se e retornam ao aspecto filiforme da cromatina. Os microtúbulos desaparecem e um novo envoltório nuclear é formado ao redor de cada massa de cromatina; novos nucléolos reaparecem nos núcleos filhos e eventualmente o fuso mitótico se desintegra.

32 Os micronúcleos são formações de material nuclear que aparecem no citoplasma como pequenos núcleos satélites do núcleo principal. Os MNs são formados por fragmentos de cromossomos ou cromossomos acêntricos que não são incorporados no núcleo principal das células filhas ( figura 2 ). A formação de micronúcleos reflete, portanto dano genotóxico, ou melhor, clastogênico. O esquema abaixo ilustra o mecanismo de formação de micronúcleo em células mononucleadas.

Figura 2: Ilustração esquemática do mecanismo de formação de micronúcleo em células eucarióticas. [Adaptado de Al-Sabti, 1995].

1.3.2 Determinação da freqüência de micronúcleos em peixes O ensaio do micronúcleo foi originalmente desenvolvido em mamíferos e tem sido amplamente utilizado para testar atividade genotóxica em substâncias químicas (Heddle et al., 1983). Estudos de correlação entre o aparecimento de micronúcleos e a exposição a determinadas substâncias são atualmente realizados em várias espécies, inclusive de peixes, para detectar a presença de substâncias químicas genotóxicas no ambiente aquático. Segundo Klingerman, 1982 e Landolt, 1983 [ apud Gustavino, 2001], os peixes teleósteos estão se tornando os organismos teste de escolha no campo da mutagênese ambiental. Isto porque, além de serem sensíveis a baixas concentrações de agentes genotóxicos, os peixes teleósteos podem ocupar diferentes níveis na cadeia trófica. Al- Sabti (1995) tem salientado também que, como os peixes freqüentemente respondem de modo similar a outros vertebrados, testes com estas espécies podem ser utilizados na 33 triagem de substâncias com potenciais efeitos teratogênicos e carcinogênicos no homem. Entretanto, a principal aplicação de modelos em peixes é determinar a presença e os efeitos tóxicos de poluentes químicos no ambiente aquático. Após exposição a diferentes poluentes genotóxicos, clastogênicos, sob condições de laboratório, eritrócitos do sangue periférico de peixes apresentam alta freqüência de MN (Al-Sabti, 1994). Metcalfe (1998) observou que Ictalurs nebulosus exposto, por via intraperitonial, a 5, 25 e 50 µg/g de benzo[a]-pireno exibiu aumento significativo da freqüência de MN. Al-Sabti, (1986) em estudo realizado em Cyprinus carpio demonstrou que ocorre um aumento na incidência de MN após exposição a diferentes doses de PCB - Aroclor 1254. Uma avaliação mais direta do que ocorre no ambiente é fornecida pelos estudos in situ (De Flora, 1993) e pelos estudos em campo. Nos estudos em campo se faz uma análise dos MNs nos peixes capturados em ambientes poluídos e compara-se a freqüência de MNs em peixes da mesma espécie e características, capturados em uma área de referência. Em estudo realizado em diferentes regiões dos rios Gafo e Trubia, Ayllón (2000) encontrou um aumento significativo da freqüência de MN em trutas ( Salmo trutta ) coletadas à jusante de uma fábrica de armamentos. Hose (1987) em estudo realizado em peixes marinhos ( Genyonemus lineatus e Paralabrax calthratus ), observou um aumento da freqüência de MN em áreas poluídas por DDT (dicloro-difenil-tricloroetano) e PCBs (bifenilas policloradas). Apesar de haver muitos estudos a este respeito, os mecanismos pelos quais poluentes induzem a formação de micronúcleos em células de peixes não são completamente entendidos. Segundo Al-Sabti (1995) é provável que muitos poluentes não-genotóxicos, em outros ensaios, como PCBs e DDT, induzam a formação de MN em peixes através de um mecanismo de inativação das fibras do fuso. Em ensaios de MN em peixes realizados em estudos in situ recomenda-se que (Al-Sabti, 1995): i) haja um tamanho ou classe etária padrão de peixes em todos os pontos de amostragem; ii ) os peixes dos diferentes pontos de amostragem sejam coletados aproximadamente na mesma data; iii ) a freqüência de micronúcleo seja calculada separadamente para cada espécie; iiii ) seja coletado o maior número de peixes possível em cada ponto (10-20), sabendo-se que a exposição de peixes a substâncias químicas poderá variar de acordo com a espécie, dieta, variações individuais no metabolismo etc. Apesar do teste de MN em eritrócitos de peixes ser simples, confiável e sensível (Al-Sabti, 1995), os estudos realizados com peixes tropicais são escassos. Neste sentido,

34 o presente estudo certamente contribuirá para que se conheça melhor a resposta deste biomarcador em espécies representativas dos ecossistemas brasileiros.

1.4 Determinação da atividade enzimática – EROD (Etoxiresorufina –O- desetilase)– como biomarcador de susceptibilidade da poluição ambiental

1.4.1 Biotransformação A eliminação de xenobióticos lipofílicos depende da conversão deste compostos em metabólitos mais hidrofílicos o que favorece a excreção pela urina ou fezes. O principal órgão envolvido na biotransformação de xenobióticos é o fígado. Este órgão recebe as substâncias químicas absorvidas pelo trato gastrointestinal antes que elas sejam distribuídas para outros tecidos. A biotransformação pode ser dividida em 2 fases: Fase I que envolve reações de oxidação, redução e hidrólise; e Fase II que consiste em reações de conjugação. A Fase

I expõe ou introduz grupos funcionais ( -OH, -SH, NH 2, -COOH ) à molécula do xenobiótico fazendo com que esta se torne mais polar; ou permitindo as reações de conjugação na Fase II. Na Fase II, ocorre a conjugação do xenobiótico não transformado ou dos metabólitos oriundos da Fase I, com substratos endógenos (sulfatos inorgânicos, aminoácidos, ácido gucurônico e glutationa). A conjugação confere ao xenobiótico (ou metabólito da Fase I) maior solubilidade em água o que facilita a excreção. As enzimas de biotransformação podem ser induzíveis (xenobióticos induzem o aumento da síntese ou atividade das enzimas, i.e. indução enzimática) ou constitutivas (sintetizadas independentemente de estímulo externo).

1.4.2 Citocromo P450 As enzimas citrocromo P450 (CYP450) são importantes no metabolismo de uma grande variedade de compostos endógenos tais como esteróides, ácidos graxos, prostaglandinas, leucotrienos e outros. Estas enzimas tem papel importante na metabolização de xenobióticos, incluindo fármacos, poluentes ambientais, produtos naturais e outros. (Nelson, 1993). Os citocromos P450 podem ser encontrados em diversos organismos, incluindo bactérias, plantas, fungos e animais invertebrados e vertebrados (Snyder, 2000) . As enzimas CYP450 são proteínas que contém a protoporfirina férrica no grupo prostético (figura 3). O ferro do heme do CYP450

35 geralmente está no estado oxidado - Fe +3 . Quando há redução do átomo de ferro (Fe +2 ), o CYP450 pode se ligar ao oxigênio molecular (O 2) ou ao monóxido de carbono (CO). O complexo formado entre o CYP450 ferroso e o CO tem sua absorbância máxima a 450nm devido à ligação cisteína-tiolato. A absorbância máxima do CYP450 não é comum entre as hemeproteínas que se ligam ao CO, pois as demais proteínas apresentam absorbância máxima em aproximadamente 420nm.

Figura 3: Estrutura da protoporfirina férrica do grupo prostético do CYP450.

1.4.2.1 Indução do citocromo P450 - CYP1A1 O mecanismo de indução do citocromo P450 não é ainda completamente entendido, apesar de muitos estudos terem sido realizados para esclarecê-lo. (Gibson & Skett, 1994). A indução do CYP450 pode ser decorrente do aumento da síntese (aumento da transcrição, aumento da estabilidade do mRNA) ou da inibição da degradação, pelo do aumento da estabilidade da proteína. O mecanismo de indução de CYP1A1 é bem estudado (figura 4) e é geralmente associado a um receptor citosólico, referido como receptor Ah (“aryl hydrocarbon”) . O processo de indução de CYP1A1 no fígado ocorre como descrito a seguir: O agente indutor se combina com o receptor específico (Ah) da proteína. O complexo indutor-receptor é translocado para o núcleo do hepatócito. No núcleo, o receptor ativado se liga ao regulador do gene CYP1A1 e forma um complexo heterodímero com o receptor Ah. Este complexo se liga a seqüências regulatórias e aumenta a transcrição do gene CYP1A1.

36 O mRNA é translocado para o citoplasma, traduzido nos ribossomos onde as apoproteínas são sintetizadas. Os grupos prostéticos – heme – são sintetizados nas mitocôndrias . As novas enzimas sintetizadas são incorporadas à membrana do retículo endoplasmático de hepatócitos. Este processo resulta no considerável aumento do metabolismo de certos fármacos e xenobióticos como a O-desetilação da etoxiresorufina (Gibson & Skett,1994). Na ausência do indutor, a transcrição do gene de CYP1A1 é suprimida por uma proteína repressora e os níveis desta isoforma voltam aos seus valores basais (Casarett,1991). Entre os indutores mais potentes de CYP 1A1 estão os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), as dibenzo-p-dioxinas (PCDDs) e os dibenzofuranos (PCDFs) policlorados, azobenzenos e azoxibenzenos, as bifenilas policloradas e os naftalenos (Scholz e Segner, 1999, Casarett, 1991). Em geral, compostos altamente clorados são resistentes a biotransformação e causam prolongada indução do citocromo P450 e de outras enzimas (Casarett, 1991). Certas linhagens de roedores, caracterizadas pela ausência do receptor Ah citosólico, não respondem a substâncias sabidamente indutoras (Gibson & Skett, 1994).

Figura 4: Esquema da Indução mediada por receptor Ah do citocromo P4501A1. Adaptado de Okey, 1990.

1.4.3 Atividade de EROD em peixes O aumento da atividade das enzimas citocromo P450 pode ser um dos sinais biológicos mais precoces da presença de poluentes indutores destas enzimas no ambiente aquático (Payne, 1976). A atividade das CYP450 pode variar muito entre espécies, ou até mesmo entre indivíduos de uma mesma espécie. Essa variação pode ser influenciada pelo sexo, idade, estado de saúde, dieta e exposição a diferentes substâncias, com indutoras ou inibidoras de CYP450s. A indução de CYP1A1 pode ser evidenciada pelo aumento da atividade de EROD (etoxiresorufina-O-desetilase), já que a extoxiresorufina parece ser um substrato preferencial para CYP1A1 em tecido hepático de diferentes espécies, inclusive de peixes. A indução do citocromo P4501A1 em fígado de peixes é geralmente reconhecida como um biomarcador útil em relação a exposição a diferentes tipos de poluentes ( e.g. hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, PCBs, TCDD, entre outros) não sendo portanto composto-específico (Casarett, 1991). 1.5 Metais A quantificação de metais em organismos aquáticos também tem possibilitado avaliar e monitorar a poluição de corpos hídricos. Elementos-traço como zinco, ferro, cobre, manganês, níquel e cromo, entre outros apresentam importantes funções bioquímicas no organismo e são essenciais à vida. Embora essenciais, quando provenientes de rejeitos e em concentrações excessivas nos corpos hídricos, podem causar sérios danos aos ecossistemas aquáticos e à saúde humana. Mercúrio e chumbo são metais não essenciais com alta toxicidade intrínseca. A classificação dos metais em essenciais e não essenciais não é rígida, já que os dois grupos não são independentes e todos dependendo da concentração e biodisponibilidade, podem causar efeitos adversos. O mercúrio pode ser introduzido no meio ambiente como resultado do uso industrial e agrícola. Na indústria o mercúrio é utilizado na produção eletrolítica de soda e cloro, fabricação de produtos farmacêuticos, pinturas, catalizadores, produção de fungicidas, herbicidas, pesticidas, explosivos e outros (CETESB, 1978). Além da sua ocorrência natural, o chumbo e seus compostos podem contaminar o ambiente durante a extração, fundição, processamento e uso (CETESB, 1978).

38 O cromo é raramente encontrado em águas naturais e tem vários estados de oxidação, de Cr -2 a Cr +6 , sendo a forma trivalente a mais comum na natureza (CETESB, 1978). Desde épocas remotas, o cobre tem sido extraído e utilizado pelo homem numa variedade de produtos que hoje incluem os equipamentos elétricos e a fabricação de moedas. Os óxidos e sulfatos de cobre são utilizados na fabricação de pesticidas e fungicidas. O cobre nos níveis encontrados naturalmente em ambientes aquáticos não causam efeitos negativos ao homem e aos ecossistemas. Entretanto, quantidades excessivas deste metal são hepatotóxicas (CETESB, 1978). O zinco é um metal amplamente utilizado e está presente em tubos galvanizados, tanques de água quente e ligas de bronze e latão. Está presente ainda em alguns aditivos preventivos de corrosão e em rejeitos industriais. A solubilidade do zinco é variável, dependendo do pH e alcalinidade. Assim, a toxicidade do zinco para organismos aquáticos pode ser modificada dependendo também do oxigênio dissolvido e da temperatura (CETESB, 1978). Os níveis máximos permitidos desses metais em alimentos foram estabelecidos pela portaria 685/98 da ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e por agências Internacionais como ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry) e FDA (Food and Drug Administration).

1.6 Ictiofauna Os peixes representam aproximadamente 50% dos vertebrados, englobando cerca de 24000 espécies que ocupam os mais diversos ambientes aquáticos, desde grandes altitudes até profundezas marinhas, em temperaturas que vão de 40ºC, em lagos da África oriental, até abaixo de 0ºC nos Oceanos Ártico e Antártico (Vazzoler,1996). Aproximadamente 40-41% de todos os peixes ósseos, o maior táxon de vertebrados, vive exclusivamente na água doce (Pough, 1999; Vazzoler,1996), apesar de rios e lagos serem habitats com histórias relativamente recentes na escala de tempo geológico. Atualmente os ambientes aquáticos fornecem mais habitats para a maioria das espécies de vertebrados do que qualquer outro ambiente (Pough, 1999). Os peixes destacam-se entre os vertebrados, não só pela quantidade de espécies, mas também por serem importante fonte de proteínas para várias comunidades humanas. De acordo com a Organização das Nações Unidas para Alimentos e

39 Agricultura (FAO), 15% de toda a proteína animal consumida no mundo vêm de pescados (marinho e de água doce). Devido a impactos antrópicos, 40% das espécies de peixes que vivem na água doce estão ameaçadas, apesar do seu valor econômico. (Pough, 1999). Estudos da ictiofauna são freqüentemente realizados para se estabelecer uma relação entre a biota e o ambiente. A escolha da ictiofauna para estudos este tipo deve- se ao fato deste possuir grande representatividade nos ecossistemas aquáticos, por abranger vários níveis tróficos, e por ser utilizada para consumo humano desempenhando importante papel econômico em muitas regiões. Como mencionado anteriormente, há vários estudos na literatura internacional que utilizam peixes para diagnosticar a qualidade de ambientes aquáticos, mas estes estudos são, de modo geral, realizados com peixes de climas temperados. Assim, é necessário conhecer melhor os peixes de água doce do Brasil e a potencialidade do uso deles como bioindicadores de poluição. A utilização de populações de peixes para identificação de poluição em estudos de campo apresenta vantagens e desvantagens por causa da mobilidade dos peixes no ambiente. Uma vantagem é que, por mais que haja mobilidade, os peixes de determinada população permanecem numa mesma região (exceto no caso de espécies migratórias). Entretanto para que se estabeleça a real área de influência sobre os indicadores é necessário conhecer a movimentação dos peixes, quantos metros eles nadam por dia, regiões com mais oferta de alimento, entre outros. Outra vantagem da utilização de peixes em investigações de campo é que estes podem estar em diferentes níveis da cadeia trófica e assim serem utilizados em estudos sobre bioconcentração (relação entre a concentração que está no organismo e a que está no meio que o cerca) e biomagnificação (progressivo aumento do contaminante à medida que se avança um nível trófico) de poluentes. A principal desvantagem seria a de que não permitem diagnosticar fontes pontuais de contaminação. Para este tipo de estudo se recomenda o uso de espécies sésseis ou que se saiba apresentarem pouca mobilidade.

1.6.1 Teleósteos de água doce A maioria dos atuais peixes de água-doce são Teleostei e apresentam muitas variações na estrutura caudal e craniana em relação a outros grupos. Os Teleostei

40 utilizados neste estudo foram: Geophagus brasiliensis, Hypostomus affinis e Hypostomus luetkeni.

1.6.1.1 Cichlidae Os peixes desta família se distribuem por toda a região neotropical e África Equatorial. Todos possuem nadadeira dorsal e anal com espinhos pungentes e linha lateral fragmentada em duas regiões. Muitos ciclídeos cuidam dos ovos e da prole, às vezes abrigando os filhotes na boca (Britski, 1972). O gênero Geophagus possui 3 espinhos na nadadeira anal e uma característica peculiar: um lóbulo na parte superior do primeiro arco branquial (Britski, 1972). Geophagus brasiliensis é uma espécie encontrada em muitos rios do estado do Rio de Janeiro e São Paulo. Seu nome popular é cará ou acará, palavra originária do tupi- guarani (aça + rá) que significa peixe escamoso, áspero. Os acarás apresentam corpo coberto com escamas que se destacam com dificuldade, olhos grandes e boca protátil. São capazes de nadar em espaços reduzidos e recuar com facilidade devido à grande mobilidade de suas nadadeiras. Alimentam-se de algas, insetos aquáticos e de outros pequenos invertebrados. Seu hábito alimentar tem sido apontado como onívoro (Bizerril, 2001). O acará mais comum do sudeste brasileiro é Geophagus brasiliensis (Quoy e Gaimard, 1824), que vive nos mais diversos ambientes com pouca correnteza, desde remansos em grandes rios até riachos que recebem influência das marés. Possui ampla distribuição na área de estudo. Sua classificação taxonômica segundo Nelson (1994) é: Reino: Animalia Filo: Chordata Subfilo: Vertebrata Superclasse: Gnasthotomata Classe: Actinopterygii Subclasse: Neopterygii Infraclasse: Halecostomi Divisão: Teleostei Subdivisão: Euteleostei Superordem: Acanthopterygii Ordem: Perciformes Família: Cichlidae

41 Subfamília: Geophaginae Gênero: Geophagus Espécie: Geophagus brasiliensis (Quoy e Gaimard, 1824)

1.6.1.2 Loricariidae Os cascudos apresentam o corpo coberto por placas ósseas. O nome científico da família ( lorica) significa armadura em latim. Os olhos dos cascudos são pequenos, relacionados à sua atividade principalmente noturna e estão em posição dorsal na cabeça, indicando seus hábitos bentônicos. A boca em posição inferior também indica o hábito bentônico, e os lábios expandidos estão relacionados ao hábito de permanecer em trechos de correnteza a ao tipo de alimentação. Os cascudos têm a capacidade de absorver oxigênio pelo intestino, após engolir ar. Este tipo de respiração aérea torna os cascudos muito resistentes fora d´água, uma característica bem conhecida por pescadores. Os ovos dos cascudos são relativamente grandes e, em diversas espécies, o macho cuida da desova aderida ao substrato e abrigada em tocas e frestas. Os cascudos ( Hypostomus affinis e Hypostomus luetkeni ) são espécies nativas, de valor comercial, e fazem parte do gênero mais amplamente distribuído no estado (Bizerril, 2001). Eles podem ser encontrados em sistemas aquáticos de grande e pequeno porte, no fundo rochoso ou arenoso-rochoso. Os espécimens novos habitam a vegetação riparia ao longo daqueles habitats . Em ambas as espécies, machos e fêmeas atingem a primeira maturação sexual com comprimentos (C) similares, sendo C 50 (comprimento de 50% da população) igual

144,9 mm, em machos, e 144 mm, em fêmeas, em H. affinis e C 50 = 168 mm, em machos, e 163 mm, em fêmeas, em H. luetkeni (Mazzoni ,1997). Os cascudos utilizados neste estudo apresentam a seguinte classificação segundo Nelson (1994): Reino: Animalia Filo: Chordata Subfilo: Vertebrata Superclasse: Gnasthotomata Classe: Actinopterygii

42 Subclasse: Neopterygii Infraclasse: Halecostomi Divisão: Teleostei Subdivisão: Euteleostei Superordem: Ostariophhysi Ordem: Siluriformes Família: Loricaridae Subfamília: Hypostominae Gênero: Hypostomus Espécie: Hypostomus affinis (Steindachner, 1876) Hypostomus luetkeni (Lacépède, 1803)

1.7 Bacia do rio Paraíba do Sul

1.7.1 Usos da água da Bacia do rio Paraíba do Sul Ao longo dos últimos anos, o rio Paraíba do Sul tem sido alvo de inúmeros estudos, face à importância de sua bacia hidrográfica, situada em áreas urbanas e industriais próximas a grandes centros populacionais localizados no eixo Rio – São Paulo. A bacia do rio Paraíba do Sul é de grande importância para a região Sudeste. Suas águas são utilizadas para abastecimento público em diversos municípios do Vale do Paraíba e da cidade do Rio de Janeiro (através do sistema Lages-Guandu). Suas águas são também utilizadas como fonte de irrigação na agricultura e para geração de energia elétrica. Apesar destes usos, o rio Paraíba do Sul serve como corpo receptor de efluentes industriais e domésticos, pois sua bacia foi ocupada no decorrer dos anos por inúmeras indústrias em conseqüência do processo de expansão demográfica. No vale Paulista, curso-médio superior, nas cidades de Jacareí, Pindamonhangaba, São José dos Campos, Taubaté, Guaratinguetá, Caçapava, Aparecida e Cruzeiro, predominam

43 indústrias dos ramos químico, metalúrgico, alimentício, de papel, têxtil e de calçados (CETESB-FEEMA, 1994). O trecho médio inferior do Paraíba, no Estado do Rio de Janeiro, que atravessa as cidades de Barra Mansa, Volta Redonda, Pinheiral e Barra do Piraí, é classificado como o mais poluído, de acordo com critérios da Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente (FEEMA), como consta nos relatórios do Programa Estadual de Investimentos da Bacia do rio Paraíba do Sul. O rio atravessa o complexo industrial de Volta Redonda e, um pouco mais à jusante, situa-se o local de abstração da água para produção de energia pela LIGHT – Serviços de Eletricidade S/A. Após serem utilizadas nas usinas, parte desta água é tratada pela CEDAE (Companhia de Águas e Esgotos do Estado do Rio de Janeiro) e distribuída para grande parte da população do município do Rio de Janeiro e adjacências. Este trecho apresenta indústrias de grande porte dos ramos químico e metalúrgico. Mais à jusante, nos arredores da cidade de Três Rios, situa-se o vale do Paraibuna ( figura 5 ), um dos maiores tributários do Paraíba do Sul que, antes de desaguar no Paraíba, passa pela cidade de Juiz de Fora – MG (Minas Gerais), onde se concentram indústrias metalúrgicas, químicas, têxteis, papeleira e alimentícia. Na região do norte fluminense, curso inferior do rio, as atividades industriais são bastante distintas das encontradas em outras regiões, merecendo destaque as usinas de álcool, açúcar e bebidas, atividades estas derivadas do cultivo da cana-de-açúcar na região. 1.7.2 Área de estudo O nome do rio Paraíba do Sul tem origem na língua tupi em que “Paraíba” significa “escabroso, pedregoso, áspero”, provavelmente porque suas águas são barrentas, encachoeiradas, com bancos de areia e outros obstáculos que tornam difícil a navegação neste rio. O rio Paraíba do Sul é formado pela confluência dos rios Paraibuna (que atualmente está represado e pouco contribui para a formação do rio) e Paraitinga, na serra da Bocaina, Estado de São Paulo, quase na divisa com o estado do Rio de Janeiro (Bizerril, 2001, CETESB-FEEMA,1994) ( Figura 5 ). Suas nascentes estão numa altitude aproximada de 1.800 m. A área de drenagem da bacia hidrográfica do rio Paraíba do Sul é de aproximadamente 55.400 km 2 (CETESB-FEEMA,1994). Pode-se afirmar que o rio está situado entre os paralelos 20º26’ e 23º38’ sul e os meridianos 41º00’ e 46º30’ oeste (Bizerril, 2001) e a extensão do seu curso d’água é de 1.137 km

44 (CETESB-FEEMA,1994) abrangendo parte dos Estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro passando por 168 municípios. A calha principal do rio, em sua parte inicial, flui na direção sudoeste. Todavia ao encontrar os maciços de granito da serra da Mantiqueira, próximo à cidade de Guararema (SP), o leito do rio sofre uma inclinação de 180° à direita e segue na direção nordeste. Esta direção é mantida na maior parte do percurso médio, exceto em um curto trecho compreendido entre Cachoeira Paulista e Barra do Piraí, onde o rio corre para leste ( Figura 5 ).

Figura 5 - Localização geográfica da Bacia Hidrográfica do rio Paraíba do Sul abrangendo os Estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro.

46 47 A divisão de águas ao norte da bacia do Paraíba do Sul se faz entre este e os rio Grande (bacia do Paraná) e Doce (sistema do leste brasileiro), por intermédio da Serra da Mantiqueira. Ao sul, a Serra do Mar separa a bacia do Paraíba do Sul em diversos pequenos rios que fluem diretamente para o Oceano Atlântico (Bizerril, 2001). Na região leste o isolamento da bacia do Paraíba do Sul se faz por meio de relevos montanhosos, localizados entre a Serra da Mantiqueira e a Serra do Mar que separa este sistema do rio Itabapoana. A oeste o Paraíba do Sul apresenta divisores de água com o rio Tietê (bacia do Paraná), do qual é separado por meio de diversas ramificações dos maciços da Serra do Mar e da Serra da Mantiqueira (Bizzeril, 2001). Nos últimos 80 km do curso inferior, o rio Paraíba do Sul, após receber carga do rio Pomba, deixa as formações cristalinas e segue, em inúmeros meandros, para leste, atingindo a sua foz no Oceano Atlântico ( figura 5 ). Pelo porte e complexidade ambiental consideram-se os seguintes rios como os principais afluentes do Paraíba do Sul: pela margem esquerda, o Paraibuna, Pomba e Muriaé e, pela margem direita, o Piraí, Piabanha e Dois Rios. No quadro abaixo (Quadro 1 ) pode-se observar a extensão destes afluentes e dos formadores do rio Paraíba (Paraibuna e Paraitinga), área e estado da nascente dos rios. O rio Preto é um rio que faz parte da sub-bacia do Paraibuna mineiro.

Quadro 1 : Características gerais dos principais rios da bacia do rio Paraíba do Sul. Adaptado de Bizerril (1999). Rios Extensão (KM) Área (KM 2) Nascentes Paraitinga 200 2,436 SP Paraibuna 140 276 SP Paraibuna mineiro 160 8,470 MG Piabanha 75 501 RJ Pomba 265 9,180 MG Dois Rios 170 3,529 RJ Muriaé 187,7 7,962 MG

A região da bacia do rio Paraíba comporta-se topograficamente e 48 morfologicamente como um corredor climático, entre áreas planálticas sujeitas a clima úmido. Quatro unidades geográficas da bacia do Paraíba do Sul foram descritas por Ab’Saber e Bernardes (1958) [ apud Bizerril, 2001] e têm sido as mais comumente mencionadas na literatura ( Figura 6 ): - Alto Vale (Curso Superior): 280 km a partir da nascente; limitado a jusante pela cidade de Guararema, correndo sobre terrenos antigos, abrangendo uma superfície drenada de 5.270 km 2. A altitude varia entre 1.800 e 572 metros; - Médio Vale : - Curso Médio-Superior: Desenvolve-se em um traçado sinuoso por cerca de 300 km, limitado à jusante pela cidade de Cachoeira Paulista. Suas águas passam por terrenos sedimentares de idade terciária, totalizando uma superfície drenada de 6.676 km 2. A altitude varia entre 572 e 515 metros; - Curso Médio-Inferior: Possui comprimento aproximado de 430 km, limitado a jusante pela cidade de São Fidélis, correndo sobre terrenos sedimentares de origem antiga, estendendo-se em uma superfície drenada de 33.663 km 2. A altitude varia entre 515 e 20 metros; - Baixo Vale (Curso Inferior): A área do baixo Paraíba se desenvolve de São Fidélis até a foz, num percurso de 90 km atravessando a região denominada Planície dos Goytacazes. Suas águas desembocam no Oceano Atlântico, passando por terrenos sedimentares de origem fluvial e correspondendo a uma superfície drenada de 9.690 km 2.

Figura 6: Perfil longitudinal do rio Paraíba do Sul, com a indicação das altitudes e unidades geográficas adaptado de Bizerril (2001).

Através da avaliação da paisagem de cada uma das grandes divisões descritas anteriormente e interagindo as variações longitudinais com o aspecto dos diferentes trechos, é possível identificar a existência de subunidades ambientais inseridas dentro dos grandes domínios geográficos. Estas unidades foram ao longo dos estudos de Bizerril denominadas de domínios e serão descritas a seguir segundo Bizerril, 1998 e 2001: Domínio (D) das Serras e planaltos, D. dos Meandros, D. dos Meandros estruturais, D. das Corredeiras, D. das Ilhas, D. dos Depósitos Fluviais e D. dos Corpos Lagunares.

Domínio (D) das Serras e planaltos Nessa região, o elemento mais marcante é a expressiva rede de drenagem. A variação de declividade é particularmente marcante e determina o caráter dinâmico do sistema fluvial nesse setor. A partir de Guararema o leito do rio gradualmente vai sendo modificado.

D. dos Meandros 50 O elemento mais marcante na paisagem é a presença de inúmeros meandros, associados a ampla faixa marginal, na qual se localizam diversos braços que forma convertidos em lagoas. A concentração dos meandros é particularmente elevada nas cotas mais altas, perdendo densidade progressivamente e, em seguida, desaparecendo à proporção que alguns morros tornam-se mais próximos do canal fluvial. Esta paisagem permanece até Barra do Piraí.

D. dos Meandros estruturais Entre Barra do Piraí e Andrade Pinto estabelece-se o domínio geoambiental marcado pela presença de um canal fluvial sinuoso, com meandros pequenos e aproximados. Nesse domínio as áreas de deposição são comuns, o que torna os problemas de assoreamento particularmente relevantes.

D. das Corredeiras No trecho a jusante de Andrade Pinto e a montante de São Sebastiaão do Paraíba, o rio Paraíba passa a apresentar aspecto predominantemente retilíneo, sem formação de meandros na maior parte do seu curso. No domínio das corredeiras nota-se afluentes de maior porte, incluindo os rios Paraibuna-mineiro e Piabanha. A interação entre aspectos de declividade, afluentes de maior porte e forma do canal central do rio confere forte hidrodinamismo ao trecho.

D. das Ilhas No trecho entre a cidade de São Sebastião do Paraíba e a foz do rio Dois Rios, o Paraíba do Sul apresenta marcada dominância de ilhas fluviais, caracterizando um novo domínio. A presença de ilhas gera situações diferenciadas de hidrodinamismo e de batimetria. Além das ilhas, ocorrem afloramentos e corredeiras, notadamente no trecho entre Porto Marinho e Portela. Neste domínio, a maior parte da rede de drenagem é formada por rios de baixa ordem. O rio Pomba é o único com dimensões maiores, sendo em termos de relevância ambiental relativa, o principal ambiente fluvial associado a este domínio.

D. dos Depósitos Fluviais A partir do encontro do rio Paraíba do Sul com o rio Muriaé, observa-se o

51 progressivo aumento da planície aluvial sem haver, no entanto, grandes lagoas e brejos. O canal fluvial de aspecto sinuoso com curvas alongadas e sem meandros bem marcados corre em área de pequena declividade apresentando profundidade elevada e algumas ilhas. Adominância dos processo de deposição caracteriza esta área delimitada a jusante pela foz do rio Muriaé e a montante pela foz do rio Dois Rios.

D. dos Corpos Lagunares Esta região se estende desde a confluência com o rio Muriaé até a foz do rio Paraíba do Sul e é marcada pelo alargamento da planície aluvial (planície dos Goytacases). Nesta área destaca-se a presença de inúmeras lagoas associadas, direta ou indiretamente, ao rio principal. A definição de uma área de influencia do rio Paraíba sobre os complexos lacustres da região é um processo pouco preciso, visto que áreas aparentemente isoladas estabelecem comunicações entre si e com o rio durante o período de cheias. Das lagoas que integram a rede de corpos lacustres que interagem diretamente com Paraíba, a lagoa Feia destaca-se como a de maior porte.

52 2. Objetivo 2.1 Objetivo Geral O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da poluição aquática sobre a biota da bacia do rio Paraíba do Sul utilizando um conjunto de biomarcadores em três espécies de peixes - G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni .

2.2 Objetivos Específicos Objetivos específicos do trabalho foram: - comparar diferentes locais ao longo da Bacia do rio Paraíba do Sul e identificar áreas mais críticas em relação a outras; - avaliar espacialmente o comportamento dos seguintes biomarcadores: i. índice hepático e fator de condição de peixes em diferentes pontos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul, ii. a freqüência de micronúcleos no sangue periférico dos peixes coletados, iii. a indução de CYP1A1 (EROD) em fração S9 hepática; - verificar se há diferença entre o período de chuvas e estiagem quanto à indução de CYP1A1, à freqüência de micronúcleos no sangue periférico, e outros marcadores morfológicos; - comparar as atividades de CYP1A1 (EROD) e freqüência de micronúcleos nas três espécies de peixes; - determinar os níveis de metais no tecido muscular de peixes da bacia do rio Paraíba do Sul.

53 3. Metodologia

3.1 Locais de coleta Os locais de coleta (área de estudo propriamente dita) estão relacionados na tabela abaixo ( tabela 2 ) comparando-se as unidades geográficas e as cidades onde os locais estão inseridos. Houve uma tentativa de captura na cidade de Guaratinguetá, mas não se coletou nenhumas das 3 espécies alvo, razão pela qual o curso médio-superior ficou com apenas uma região de estudo. O termo local foi usado neste estudo para definir as áreas da superfície do rio, com cerca de 800 metros de extensão, onde foram armadas as redes de coleta e realizadas as medições das variáveis físicas e físico-químicas.

54 Tabela 2 : Distribuição dos locais de coleta por unidade geográfica da bacia do rPS

Unidades geográficas da Rio Código dos Locais de coletas (cidades) bacia do Rps locais

Curso superior Paraitinga 1 São Luiz do Paraitinga, SP

rPS 2 Paraibuna, SP

Curso Médio-Superior rPS 3 São José dos Campos, SP

Curso Médio-Inferior rPS 4 Barra Mansa, RJ

rPS 5 Volta Redonda, RJ

Preto 6 Rio das Flores*, RJ

Paraibuna 8 Levy Gasparian*, RJ

Piabanha 9 Petrópolis*, RJ

rPS 7 , 10 Três Rios, RJ

rPS 11 Além Paraíba, MG-RJ

rPS 12 , 13 Sapucaia, RJ

Pomba 14 Santo A. de Pádua*, RJ

Curso Inferior rPS 15 São Fidélis, RJ

Dois Rios 16 São Fidélis*, RJ

Muriaé 17 Italva*, RJ

rPS 18 Campos, RJ

rPS 19 São João da Barrra, RJ * afluentes do rPS

A tabela 3 relaciona as diferentes latitudes e longitudes ao longo dos trechos da bacia estudados. Como as coletas não foram feitas em um só ponto, há uma variação de latitude e longitude numa mesma região de coleta. As coordenadas abaixo estão representadas na forma geográfica em graus e minutos.

55 Tabela 3 : Localização geográfica (Latitude e longitude) dos locais em que foram realizadas as coletas do estudo. Locais Latitude Longitude 1 23º 21,249’ 23º 21,618’ 45º 12,183’ 45º 12,424’ 2 23º 21,899’ 23º 22,913’ 45º 39,833’ 45º 40,035’ 3 23º 09,915’ 23º 10,303’ 45º 54,350’ 45º 54,651’ 4 22º 29,039’ 44º 14,373’ 5 22º 29,165’ 22º 29,605’ 44º 05,005’ 44º 05,487’ 6 22º 03,454’ 43º 26,421’ 7 22º 06. 577’ 22º 06. 657’ 43º 08. 046’ 43º 08. 972’ 8 43º 12”* 22º 1”* 9 22º 17,439’ 43º 07,584’ 10 22º 05. 191’ 22 º 05. 410’ 43 º 03. 627’ 43 º 03. 896’ 11 22º 29,144’ 44º 14,638’ 12 22º 01. 923’ 22º 02. 161’ 42º 59.898’ 43º 00.097’ 13 21º 54.809’ 21º 55. 005’ 42º 45.135’ 42º 45.694’ 14 21º 32,219’ 21º 32,510’ 42º 09,420’ 42º 09,803’ 15 21º 38,744’ 21º 38,895’ 41º 44,343’ 41º 44,685’ 16 21º 37.202’ 21º 37,383’ 41º 49,625’ 41º 49,859’ 17 21º 24,708’ 21º 25,206’ 41º 41,598’ 41º 41,837’ 18 21º 43,470’ 21º 43,741’ 41º 20,953’ 41º 21,504’ 19 21º 43,015’ 21º 43,048’ 41º 10,068’ 41º 10,366’ * – latitude e longitude da cidade de Levy Gasparian. Valores únicos de latitude ou longitude indicam que se coletou próximo a esta coordenada. 2 valores de latitude ou longitude indicam que se coletou entre as coordenadas .

3.2 Atividades em campo: Coleta, processamento de peixes e medidas das variáveis físico-químicas Foram realizadas excursões mensais ao rio para as amostragens, nos meses de janeiro, fevereiro, março e abril do ano de 2003, definido como o período de cheias do rio e em setembro, outubro e início de novembro do mesmo ano, definido como período de secas. Os locais de coleta foram selecionados em conjunto com a equipe de campo do laboratório de Ecologia de Peixes do IB/UFRRJ. Os locais de coleta foram previamente definidos com auxílio de mapas do IBGE (escala 1:50000). Na chegada à cidade 56 selecionada para a coleta era definido o local de mais fácil acesso ao rio para o barco de alumínio (6 m de comprimento) com motor de popa de 25HP (Yamaha) do Laboratório de Ecologia de Peixes do IB/UFRRJ. A partir do ponto de entrada no rio definiu-se uma extensão de cerca de 800 km amostrado. Informações sobre latitude e longitude e altitude foram obtidas por meio de Georreferenciamento por Satélite (GPS - Garmin 12). Foram realizadas medidas de pH, condutividade, temperatura e oxigênio dissolvido (OD) em diferentes regiões ao longo da área amostrada com auxílio de multisensores providos com eletrodos tipo HORIBA U-10 e YSI-85. Estas medidas foram feitas apenas na superfície. Na primeira etapa de coletas (época das cheias) se aferiu estas variáveis no máximo em três pontos ao longo da região amostrada. Já na segunda etapa (período de estiagem) foram realizadas 11 amostragens de cada variável física e físico-química, exceto na região de Barra Mansa, e em 2 horários diferentes. Os horários foram definidos como 1: tarde/noite – 14:00 às 22:00h 2: manhã – 7:00 às 12:00h. Os valores foram comparados com os da legislação vigente para esta bacia de classe II (CONAMA 20) e com valores propostos por CEPIS, OPS/OMS, 1963/64, Galli & Torloni (1982) e Pádua et al . [apud Martos & Maia,1997]. As capturas dos peixes foram realizadas utilizando-se as seguintes artes de pesca: tarrafa (diâmetro de 3 m e malha 2 cm) e redes de espera (22 redes com variáveis - 2,5 a 7,5 cm entrenós opostos, comprimento de 30 m e altura de 2,5 m). O esforço de pesca com tarrafa foi de 3 séries (época das cheias) e 5 séries (época de estiagem) de 20 tarrafadas em diferentes pontos do rio ao longo da região amostrada. As redes de espera eram colocadas no rio no final da tarde cobrindo cerca de 800 km de extensão do rio na região amostrada (exceto quando havia barreiras intransponíveis como pedras e trechos encachoeirados) e ficavam no rio de um dia para outro. No período da manhã os peixes eram coletados das redes. Os peixes coletados foram colocados vivos num galão com aeração de bomba de aquário até a dissecção, que foi realizada em campo. Os animais foram retirados do galão e colocados numa bandeja com gelo onde foi realizado o sacrifício, através de secção cervical, e a dissecção com auxílio de material cirúrgico. Os peixes foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-600 ou VI-200, os comprimentos medidos em centímetros com régua determinando-se o comprimento total do corpo do animal. A medida dos peixes foi feita considerando-se desde a ponta do focinho à maior extremidade da nadadeira caudal levemente distendida como descrito em Vazzoler,

57 1996. O sexo dos animais foi determinado através de inspeção das gônodas, após incisão da cavidade celomática. Os testículos foram identificados por sua coloração esbranquiçada e forma alongada. Sendo que nas fases iniciais do desenvolvimento apresentam formas tubulares e nas seguintes fases são lobulados com a extremidade cefálica achatada. Os ovários foram identificados por apresentarem forma alongada- tubular, sendo translúcidos e roliços nas fases iniciais (Vazzoler, 1996). Os ovócitos são visíveis a olho nu o que possibilitou a identificação das fêmeas ovadas. Os dados foram registrados assim como possíveis anomalias observadas no peixe (e.g. intestino cortado, com gordura, coloração alterada etc.). No momento da dissecção dos peixes, fez-se o esfregaço das lâminas, em seguida os órgãos da cavidade abdominal foram retirados e o fígado de cada animal foi isolado. Os fígados foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-200. Após a pesagem, embalou-se cada fígado em papel laminado identificado com os códigos de cada animal.Durante o procedimento os fígados foram mantidos no gelo. Todos os fígados isolados foram armazenados em galão portátil de nitrogênio líquido (cerca de -196ºC) até a chegada ao laboratório. Exemplares coletados em determinadas regiões foram embalados em papel laminado, identificados com os códigos estabelecidos e armazenados em isopor com gelo até a chegada ao laboratório para retirada do tecido muscular. Os espécimes coletados foram identificados pelo Dr. Francisco Gerson Araújo (Laboratório de Ecologia de Peixes IB/UFRRJ). Parte do material identificado foi fixado em formol a 10% e após 48 h (tempo mínimo) foi transferido para galões com álcool 70% e depositado na coleção de referência do Laboratório de Ecologia de Peixes da UFRRJ.

3.3 Índice hepático e fator de condição A partir dos parâmetros morfométricos dos peixes coletados, o estado geral de saúde dos peixes foi numericamente estimado através de indicadores inespecíficos de poluição aquática. Estes foram: índice hepático e fator de condição. O índice hepático (IH) foi obtido calculando-se a proporção entre o peso do fígado e o peso total do animal, expresso em porcentagem.

IH = Peso do fígado (g)/ peso do peixe (g) * 100

O fator de condição isométrico foi obtido através da proporção entre o peso e o comprimento total elevado a “3”. .

FC = peso do peixe (g) / (comprimento do peixe (mm)) 3

3.4 Determinação da freqüência de Micronúcleo No momento da dissecção dos peixes adicionou-se uma gota de sangue periférico (esquema 1 ) de cada animal em lâminas para microscopia devidamente identificadas e fez-se o esfregaço sanguíneo. As lâminas foram mantidas em estantes a temperatura ambiente até que estivessem secas e posteriormente as amostras foram fixadas com etanol PA. por 20 minutos e novamente secas à temperatura ambiente. Em laboratório, a coloração das lâminas foi feita com Giemsa por 6 minutos. As lâminas foram lavadas em água corrente até o excesso de corante ser retirado completamente. Após a secagem das lâminas, os eritrócitos dos peixes foram observados ao microscópio óptico Olympus BX 45 no aumento final de 1000 vezes (imersão). Foram examinadas 1000 células em cada lâmina.

3.5 Determinação da Atividade Enzimática – EROD

3.5.1 Preparo da fração citosólica (S9) hepática A preparação da fração citosólica hepática foi realizada em laboratório ( esquema 1). Para o preparo da fração S9, os fígados foram colocados em placa de Petri e descongelados em banho de gelo. Os fígados foram homogeneizados à temperatura de 4ºC - em homogeneizadores de vidro do tipo Potter-Elvejhem com pistilo de teflon - em solução pH 7,8 contendo TRIS 50mM, sacarose 250mM, EDTA 100mM e glicerol 20% num volume correspondente a 4 vezes o peso de cada fígado, a uma velocidade angular de 1200 rpm. A homogeneização foi feita através de movimentos ascendentes e descendentes do homogeneizador. A partir do momento em que foi constatada visualmente a homogeneização do tecido, foram realizados mais 10 ciclos de movimentos ascendentes e descendentes para todas as amostras. O homogeneizado foi

59 então, centrifugado em centrífuga refrigerada ( Eppendorf ®5804R), a 4 ºC, a 9000 g durante 30 minutos. Após a centrifugação, as amostras foram filtradas com gaze e transferidas para 5 tubos criogênicos devidamente identificados. As amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido ou no freezer -80ºC até o momento da quantificação das proteínas e determinação da atividade enzimática.

3.5.2 Determinação da concentração de proteínas na fração S9 A fração S9 de cada animal foi utilizada para dosagem de proteínas totais pelo método colorimétrico descrito por Bradford et al., (1976), adaptado para microplaca, utilizando o corante Azul de Coomassie G-250 e leitura de densidade ótica (DO) a 595 nm (espectrofotômetro de microplaca Molecular Devices - Spectra Max Plus 384). As curvas de calibração foram realizadas com albumina sérica bovina – BSA

60 Cada valor de DO obtido é convertido em concentração de proteína, empregando- se a curva padrão. Após fazer as correções para cada fator de diluição, as concentrações de proteína na fração S9 foram calculadas como a média obtida (média final) a partir das médias de cada triplicata e expressas como mg de proteína / ml de S9. As determinações foram realizadas em triplicata com aceitação de um coeficiente de variação máximo de 10%.

3.5.3 Determinação da Atividade enzimática - EROD A velocidade de desalquilação do éster da fenoxazona – etoxi-resorufina – foi realizada através do registro fluorimétrico do acúmulo da resorufina, substância fluorescente, produto final da reação. Este método foi incialmente descrito por Burke (1985). A reação ocorreu como descrito a seguir:

Inicialmente, adicionou-se à cubeta 1890 µl solução tampão K 2HPO 4 100 mM para análise de S9 de acarás e 1840 µl solução tampão K 2HPO 4 100 mM para análise de S9 de cascudos. Em seguida incubou-se à temperatura de 30ºC durante 5 minutos e adicionou-se 50 µl (acarás) ou 100 µl (cascudos) da fração S9 e 10 µl do substrato específico (etoxiresorufina 1mM diluído em DMSO). Após mais 1 minuto de incubação, a reação foi iniciada com a adição de 50 µl de ETS - sistema regenerador de NADPH (doador de elétrons para a reação). Contendo 35 µl de Glicose-6-fosfato desidrogenase, 35 µl cloreto de magnésio, 140 µl de β-NADP e 140 µl de Glicose-6- fosfato. No início de cada semana de determinação da atividade enzimática, realizou-se uma curva padrão nas seguintes quantidades: 0; 10; 20; 50; 100 e 200 pmoles de resorufina (solução 1 µM em tampão K 2HPO 4 100 mM). O acúmulo de resorufina foi determinado em espectroflourímetro Shimadzu – RF - 5000 (excitação: 550 nm, emissão: 582 nm, abertura de fenda: 5nm). Por meio dos valores de inclinação da reta obtidos a partir de registros gráfico e sua correspondência com a intensidade de fluorescência (RTU) e através da quantificação de resorufina da curva padrão, pode-se calcular a velocidade da reação enzimática (pmoles/min/mg de proteína). 61 Todas as determinações foram realizadas em triplicata para cada alíquota de S9 com aceitação de um coeficiente de variação máximo de 10%.

3.6 Análise de metais A retirada do tecido muscular dos peixes para análise de metais foi realizada segundo protocolo adaptado da FAO (1983). Inicialmente os peixes foram retirados do freezer e com auxílio de material cirúrgico foram separados cerca de 5-8g de tecido muscular do dorso lateral destinado a análise de metais ( esquema 1 ). O tecido foi pesado em balança Gehaka – BG – 2000, armazenado em plástico, novamente congelado e transportado em isopor com gelo ao Laboratório de Radioisótopos do Instituto de Biofísica da UFRJ para realização das análises.

3.6.1 Análise das concentrações totais de cromo, cobre, zinco, chumbo, níquel e manganês Para o preparo das duplicatas, cada amostra foi pesada em balança analítica (Mettler Toledo – AB 204) e separada em quantidades de aproximadamente 2,5 – 3g (para análise de cromo, cobre, zinco, chumbo e níquel). Assim obteve-se a massa úmida de músculo a ser analisado. Paralelamente a todo o processo foram analisados amostras de padrão certificado. Em seguida as amostras foram secas na estufa (Fanem – Retilínea), 80ºC, durante 24 horas e ao final deste processo as amostras foram novamente pesadas para obtenção da massa seca. A seguir, as amostras foram calcinadas em forno mufla T. Milley – Termotécnica a 450ºC até a calcinação total. Colocou-se vidro de relógio para tampar os bechers e evitar contaminação. As amostras permaneceram nesta etapa durante 48horas. O processo de chegada à temperatura de 450ºC foi gradativo aumentando-se 100ºC a cada 20 minutos. Ao término da calcinação, as amostras foram pesadas e levadas à placa quente a 100ºC, dentro de uma capela, onde iniciou-se a digestão ácida com adição de 5 mL da solução de água régia (ácido nítrico e ácido clorídrico - 3:1). Após evaporação da solução ácida, ressuspendeu-se o analito com 5 mL de ácido clorídrico fumegante concentrado (PA). Após evaporação desta solução, ressuspendeu-se o analito com uma solução de ácido clorídrico 0,1N em volume preciso (10 mL). As amostras foram armazenadas em geladeira até o momento de análise.

62 A leitura foi realizada no espectrofotômetro de absorção atômica – Método de chama Varian – AA - 1475. Para a determinação de cada um dos metais foi realizada uma curva-padrão (µg/mL): Chumbo: 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 1,5 e 2,0 ; Cobre, Cromo, Manganês e Níquel: 1 ; 2 ; 3 e 4 ; Zinco: 0,4 ; 0,8 ; 1,2 e 1,6 . Os padrões para curva foram diluídos em HCL 1N a partir de uma solução padrão estoque de 1000 µg/L da Merck.

3.6.2 Análise de mercúrio total Para análise de mercúrio total foram pesados 0,4 g de tecido fresco em balança analítica (Mettler Toledo – AB 204) em tubos de ensaio apropriados e etiquetados. Paralelamente ao processo foram analisadas amostras de padrão certificado. Os tubos com as amostras foram colocados em estantes e em banho-maria à 60ºC e em seguida adicionou-se 1mL de água oxigenada. Após 15 minutos adicionou-se 3 mL de solução de ácido sulfúrico e ácido nítrico (1:1) para a total mineralização das amostras. Esperou-se por cerca de 1 hora até a completa digestão. A solução resultante deve ficar transparente e sem pedaços de tecido. Após a solução esfriar adcionou-se 5 mL de permanganato de potássio à 5% e aqueceu-se novamente durante 15 minutos. Esta solução, onde todo o mercúrio presente deve estar sob a forma de Hg+2 , permaneceu em repouso por uma noite. No dia seguinte, a esta solução foi adcionado 1 mL de solução de cloridrato de hidroxilamina (12%) para se iniciar o processo de redução dos reagentes oxidantes. Logo após as amostras foram colocadas em balões volumétricos de 25mL e completou-se o volume com água Milli-Q. A curva padrão foi realizada com uma solução mãe contendo: ácido nítrico 5%, dicromato de potássio 0,01% e solução estoque de mercúrio 1000 µg/mL. A curva foi construída a partir das seguintes concentrações: 10 ; 20 ; 30 ppb. A leitura foi feita no espectrofotômetro de absorção atômica Varian – AA - 1475 com Gerador de vapor frio – Varian VGA – 76. No espectrofotômetro, o mercúrio inorgânico Hg +2 é reduzido a Hg 0, onde o agente redutor é uma solução de borohidreto de sódio (0,3%) e hidróxido de sódio (0,5%), que circula pelo gerador de vapor frio.

63 foram realizadas com o software Minitab®. Nos casos em que se analisou estatisticamente os resultados de EROD, estes foram comparados pelo teste t Student para hipóteses unidirecionais (controle versus experimental, H a Exp>C - anexo 2) e bidirecionais nos demais casos . O teste de Andrews foi utilizado para testar a distribuição normal dos resultados de Fator de Condição e de atividade de EROD.

3.8 Reagentes, Soluções, Padrões, Substratos, cofatores e outras substâncias utilizadas

3.8.1 - Preparo do esfregaço do sangue periférico, coloração e contagem das lâminas - Reagentes

Azul-eosina-azul de metileno (Giemsa) Art. 9203 Merck Ind. Químicas Etanol PA Merck Ind. Químicas

Fosfato de sódio dibásico heptahidratado Na 2HPO 4 . 7H 2O 10098 - Reagen Quimibrás Ind. Químicas

Fosfato de sódio monobásico dihidratado NaH 2PO 4 . 2H 2O 106.345 - Merck Ind. Químicas Glicerina P.A. 104094.1000 - Merck Ind. Químicas Metanol UN 1170 - Merck Ind. Químicas

- Preparo de soluções

Solução Tampão fosfato pH 6,8

Na 2HPO 4 . 2H 2O 8,9 g

NaH 2PO 4 . 2H 2O 7,3 Água milli-Q qsp 1000 mL Ajustar o pH para 6,8

Solução Giemsa

Azul-eosina-azul de metileno 2 g Glicerina 108 mL

64 Dissolver em banho-maria a 60ºC 2 horas Metanol 168 mL Deixar descansar por uma semana Filtrar a solução estoque em papel de filtro armazenar em frasco âmbar e manter em geladeira No momento de usar: Solução estoque 4 mL Tampão fosfato pH 6,8 130 mL

3.8.2 - Preparação da fração citosólica (S9) hepática

- Regentes

Ácido Clorídrico 1789 - Merck Ind. Químicas Ácido etilenotetraamino (EDTA) 25,404-5 - Aldrich Glicerol 10103 - Reagen – Quimibrás Ind. Químicas Sacarose C 0980,08 – Qeel

TRIS ( H 2NC(CH 2OH) 3 ) UN 8382 – Merck Ind. Químicas Lote:K27994582030

- Preparo de soluções Solução Tampão Tris/Sacarose em pH 7,4

Tris 50mM 6,05 g Sacarose 250mM 8,56 g EDTA 100mM 1 mL Glicerol 20% 20 mL Água milli-Q qsp 100 mL Ajustar o pH para 7,4 com HCl

3.8.3 - Determinação da concentração de proteínas na fração S9

- Regentes

BSA A-7906 – Sigma Chemical Co, St Lous, MO, USA Cloreto de sódio P.A 310 - Isofar Fosfato de potássio monobásico 4873 - Merck Ind. Químicas Hidróxido de potássio 5033 - Merck Ind. Químicas Reagente de Bradford – B-6916 – Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA

- Preparo de soluções

Solução Tampão KH 2PO 4 50mM / NaCl 150mM pH 7,2

KH 2PO 4 0,680 g NaCl 0,876 g Dissolver em 60 mL de água Milli-Q Ajustar o pH para 7,2 com KOH% p/v Água milli-Q qsp 100 mL

- Padrões

Solução de Albumina Sérica Bovina (BSA) 1,40mg/mL

BSA 1,98 mg

Solução Tampão KH 2PO 4 50mM / NaCl 150mM pH 7,2 1,40 mL Manter a 4ºC pelo período de 60 dias ou a – 20ºC distribuído em alíquotas

3.8.4 - Determinação da Atividade enzimática - EROD

- Regentes

Ácido etilenotetraamino (EDTA) 25,404-5 - Aldrich Cloreto de Magnésio 21561- Merck Ind. Químicas

66 Dimetil Sulfóxido 802912 - Merck Ind. Químicas D-glicose-6-fosfato G 7250 - Si gma Chemical Co, St Louis, MO, USA Etoxiresorufina 1004611– Boehringer Mannhein GmbH, Germany Fosfato de potássio dibásico 105.101- Merck Ind. Químicas Fosfato de potássio monobásico 4873 - Merck Ind. Químicas Glicose-6-fosfato desidrogenase 250U, 6378 - Si gma Chemical Co, St Louis, MO, USA Resorufina, 23,015-4, Aldrich

- Preparo de soluções

Solução Tampão K 2HPO 4 1M

K2HPO 4 52,25 g Água milli-Q qsp 300 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução Tampão KH 2PO 4 1M

KH 2PO 4 52,25 g Água milli-Q qsp 300 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução K 2HPO 4 100mM pH 7,8 Solução A

K2HPO 4 1M 20 mL Água milli-Q qsp 200 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução B

KH 2PO 4 1M 10 mL

67 Água milli-Q qsp 100 mL OBS: Manter a 4ºC Na hora do uso, ajustar o pH da solução A com a solução B para 7,8

- Padrões

Solução de Resorufina 1mM (solução mãe)

Resorufina 47 mg Água milli-Q qsp 200 mL Manter ao abrigo da luz

Solução de Resorufina 1 µµµM

Solução de Resorufina 1mM 100 µL

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 qsp 100 mL Manter ao abrigo da luz

- Substratos

Solução de etoxiresorufina

1 – Pesar 3 a 5 mg de etoxiresorufina 2 – Adicionar 2 mL de clorofórmio 3 – Distribuir alíquotas de modo a obter 0,5 mol de substrato por tubo 4 – Aguardar a evaporação do clorofórmio em capela química 5 – Manter a temperatura ambiente e ao abrigo da luz 6 – No momento de uso, adicionar 250 µL de DMSO para obter uma solução 1mM

- Sistema regenerador de NADPH

Solução de MgCl 2 1M

MgCl 2 1,015 g

68 Água milli-Q qsp 5 mL Manter a 4ºC

Solução de Glicose-6-fosfato 500mM

Glicose-6-fosfato 0,30g

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

Solução de βββ-NADP 25mM

β-NADP 0,037 g

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

Solução de Glicose-6-fosfato desigrogenase 1U /10 µµµL

Glicose-6-fosfato desigrogenase 250 U (um frasco)

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2,5 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

O sistema regenerador de NADPH é preparado como uma solução única. No momento de uso, as soluções de β-NADP 25mM (140 µL), glicose-6-fosfato 500mM (140 µL) e glicose-6-fosfato desidrogenase1U /10 µL (35 µL), são degeladas em banho de gelo e adicionadas juntamente com a solução de MgCl 2 1M (35 µL), a um tubo tipo eppendorf .

3.8.5 - Análise de cromo, cobre, zinco, chumbo, manganês e níquel

- Regentes Ácido nítrico P.A 65% QM 12160.1000 – Divisão QM Reagentes Ácido Clorídrico P.A 37% QM 12090.1000 - Divisão QM Reagentes 69 Padrão de Cobre 1.02630.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Manganês 1.02600.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Zinco 1.02670.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Chumbo (Tritisol) Art. 9969- Merck Ind. Químicas Padrão de Níquel 1.02640.0100- Merck Ind. Químicas Padrão de Cromo (Tritisol) Art. 9948- Merck Ind. Químicas

3.8.6 - Análise de mercúrio total

- Regentes Ácido nítrico P.A 65% QM 12160.1000 – Divisão QM Reagentes Ácido sulfúrico P.A 96% QM 12210.1000 - Divisão QM Reagentes Borohidreto de sódio 106371.0100 - Merck Ind. Químicas Cloreto de sódio QM 14570.1000 - Divisão QM Reagentes Cloridrato de hidroxilamina 104616.0250 - Merck Ind. Químicas Dicromato de potássio P.A. ACS1199 – Ecibra Hidróxido de sódio 1.06498.1000 - Merck Ind. Químicas Peróxido de hidrogênio 32% QM 113640.1000 - Divisão QM Reagentes Permanganato de potássio 1.05082.1000 - Merck Ind. Químicas Padrão de mercúrio 1.19795.0500 - Merck Ind. Químicas

- Preparo de soluções Solução de Dicromato de potássio 5%

Dicromato de potássio 50 g Água milli-Q qsp 1 L

Solução de Permanganato de potássio 5%

Permanganato de potássio 50 g Água milli-Q qsp 1 L

70 Deixar no agitador sem aquecimento cerca de 12 h. Deixar a solução em repouso per noite. Filtrar a solução em filtro Millipore (filtro de fibra de vidro – Gelman Instrument)

Solução de Ácido clorídrico 0,1M

Ácido clorídrico 0,3 mL (??) Água milli-Q qsp 1 L

Solução de borohidreto de sódio 0,3% / hidróxido de sódio 0,5%

Hidróxido de sódio 2,5 g Borohidreto de sódio 1,5 g Água milli-Q qsp 500 mL

Solução de hidroxilamina 12%

Cloridroto de hidroxilamina 120 g Cloreto de sódio 120 g Água milli-Q qsp 1 L

- Padrões Solução mãe de Padrão de Mercúrio

Ácido nítrico 19,2 mL Dicromato de potássio (de solução 5%) 500 µL Padrão de mercúrio (1000 µg/L) 250 µL Água milli-Q qsp 250 mL

71 Esquema 1: Relação entre matriz do peixe e o tipo de análise realizada e os processos realizados em campo e laboratório

Peixes:

G. brasiliensis H. affinis H. luetkeni

Sangue periférico Fígado Tecido muscular

Em campo

Isolamento, Fixação das pesagem e Congelamento dos células em etanol congelamento peixes

Em laboratór io

Coloração das Preparo da fração Separação e pesagem de lâminas com S9, quantificação 1g de tecido muscular Giemsa de proteínas para Hg e de c.a. de 6g para os demais

Detrminação da

Contagem de atividade de Zn, Cu, Mn Pb, Hg

Micronúcleo EROD Cr, Ni

Mineralização Secagem, pesagem, calcinagem, pesagem

Digestão ácida Reações de oxi-redução

Quantificação Quantificação de Metais de mercúrio 72 2. Objetivo 2.1 Objetivo Geral O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto da poluição aquática sobre a biota da bacia do rio Paraíba do Sul utilizando um conjunto de biomarcadores em três espécies de peixes - G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni .

52 3. Metodologia

53 Tabela 2 : Distribuição dos locais de coleta por unidade geográfica da bacia do rPS

Unidades geográficas da Rio Código dos Locais de coletas (cidades) bacia do Rps locais

Curso superior Paraitinga 1 São Luiz do Paraitinga, SP

rPS 2 Paraibuna, SP

Curso Médio-Superior rPS 3 São José dos Campos, SP

Curso Médio-Inferior rPS 4 Barra Mansa, RJ

rPS 5 Volta Redonda, RJ

Preto 6 Rio das Flores*, RJ

Paraibuna 8 Levy Gasparian*, RJ

Piabanha 9 Petrópolis*, RJ

rPS 7 , 10 Três Rios, RJ

rPS 11 Além Paraíba, MG-RJ

rPS 12 , 13 Sapucaia, RJ

Pomba 14 Santo A. de Pádua*, RJ

Curso Inferior rPS 15 São Fidélis, RJ

Dois Rios 16 São Fidélis*, RJ

Muriaé 17 Italva*, RJ

rPS 18 Campos, RJ

rPS 19 São João da Barrra, RJ * afluentes do rPS

54 Tabela 3 : Localização geográfica (Latitude e longitude) dos locais em que foram realizadas as coletas do estudo. Locais Latitude Longitude 1 23º 21,249’ 23º 21,618’ 45º 12,183’ 45º 12,424’ 2 23º 21,899’ 23º 22,913’ 45º 39,833’ 45º 40,035’ 3 23º 09,915’ 23º 10,303’ 45º 54,350’ 45º 54,651’ 4 22º 29,039’ 44º 14,373’ 5 22º 29,165’ 22º 29,605’ 44º 05,005’ 44º 05,487’ 6 22º 03,454’ 43º 26,421’ 7 22º 06. 577’ 22º 06. 657’ 43º 08. 046’ 43º 08. 972’ 8 43º 12”* 22º 1”* 9 22º 17,439’ 43º 07,584’ 10 22º 05. 191’ 22 º 05. 410’ 43 º 03. 627’ 43 º 03. 896’ 11 22º 29,144’ 44º 14,638’ 12 22º 01. 923’ 22º 02. 161’ 42º 59.898’ 43º 00.097’ 13 21º 54.809’ 21º 55. 005’ 42º 45.135’ 42º 45.694’ 14 21º 32,219’ 21º 32,510’ 42º 09,420’ 42º 09,803’ 15 21º 38,744’ 21º 38,895’ 41º 44,343’ 41º 44,685’ 16 21º 37.202’ 21º 37,383’ 41º 49,625’ 41º 49,859’ 17 21º 24,708’ 21º 25,206’ 41º 41,598’ 41º 41,837’ 18 21º 43,470’ 21º 43,741’ 41º 20,953’ 41º 21,504’ 19 21º 43,015’ 21º 43,048’ 41º 10,068’ 41º 10,366’ * – latitude e longitude da cidade de Levy Gasparian. Valores únicos de latitude ou longitude indicam que se coletou próximo a esta coordenada. 2 valores de latitude ou longitude indicam que se coletou entre as coordenadas .

3.2 Atividades em campo: Coleta, processamento de peixes e medidas das variáveis físico-químicas Foram realizadas excursões mensais ao rio para as amostragens, nos meses de janeiro, fevereiro, março e abril do ano de 2003, definido como o período de cheias do rio e em setembro, outubro e início de novembro do mesmo ano, definido como período de secas. Os locais de coleta foram selecionados em conjunto com a equipe de campo do laboratório de Ecologia de Peixes do IB/UFRRJ. Os locais de coleta foram previamente definidos com auxílio de mapas do IBGE (escala 1:50000). Na chegada à cidade 55 selecionada para a coleta era definido o local de mais fácil acesso ao rio para o barco de alumínio (6 m de comprimento) com motor de popa de 25HP (Yamaha) do Laboratório de Ecologia de Peixes do IB/UFRRJ. A partir do ponto de entrada no rio definiu-se uma extensão de cerca de 800 km amostrado. Informações sobre latitude e longitude e altitude foram obtidas por meio de Georreferenciamento por Satélite (GPS - Garmin 12). Foram realizadas medidas de pH, condutividade, temperatura e oxigênio dissolvido (OD) em diferentes regiões ao longo da área amostrada com auxílio de multisensores providos com eletrodos tipo HORIBA U-10 e YSI-85. Estas medidas foram feitas apenas na superfície. Na primeira etapa de coletas (época das cheias) se aferiu estas variáveis no máximo em três pontos ao longo da região amostrada. Já na segunda etapa (período de estiagem) foram realizadas 11 amostragens de cada variável física e físico-química, exceto na região de Barra Mansa, e em 2 horários diferentes. Os horários foram definidos como 1: tarde/noite – 14:00 às 22:00h 2: manhã – 7:00 às 12:00h. Os valores foram comparados com os da legislação vigente para esta bacia de classe II (CONAMA 20) e com valores propostos por CEPIS, OPS/OMS, 1963/64, Galli & Torloni (1982) e Pádua et al . [apud Martos & Maia,1997]. As capturas dos peixes foram realizadas utilizando-se as seguintes artes de pesca: tarrafa (diâmetro de 3 m e malha 2 cm) e redes de espera (22 redes com variáveis - 2,5 a 7,5 cm entrenós opostos, comprimento de 30 m e altura de 2,5 m). O esforço de pesca com tarrafa foi de 3 séries (época das cheias) e 5 séries (época de estiagem) de 20 tarrafadas em diferentes pontos do rio ao longo da região amostrada. As redes de espera eram colocadas no rio no final da tarde cobrindo cerca de 800 km de extensão do rio na região amostrada (exceto quando havia barreiras intransponíveis como pedras e trechos encachoeirados) e ficavam no rio de um dia para outro. No período da manhã os peixes eram coletados das redes. Os peixes coletados foram colocados vivos num galão com aeração de bomba de aquário até a dissecção, que foi realizada em campo. Os animais foram retirados do galão e colocados numa bandeja com gelo onde foi realizado o sacrifício, através de secção cervical, e a dissecção com auxílio de material cirúrgico. Os peixes foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-600 ou VI-200, os comprimentos medidos em centímetros com régua determinando-se o comprimento total do corpo do animal. A medida dos peixes foi feita considerando-se desde a ponta do focinho à maior extremidade da nadadeira caudal levemente distendida como descrito em Vazzoler,

56 1996. O sexo dos animais foi determinado através de inspeção das gônodas, após incisão da cavidade celomática. Os testículos foram identificados por sua coloração esbranquiçada e forma alongada. Sendo que nas fases iniciais do desenvolvimento apresentam formas tubulares e nas seguintes fases são lobulados com a extremidade cefálica achatada. Os ovários foram identificados por apresentarem forma alongada- tubular, sendo translúcidos e roliços nas fases iniciais (Vazzoler, 1996). Os ovócitos são visíveis a olho nu o que possibilitou a identificação das fêmeas ovadas. Os dados foram registrados assim como possíveis anomalias observadas no peixe (e.g. intestino cortado, com gordura, coloração alterada etc.). No momento da dissecção dos peixes, fez-se o esfregaço das lâminas, em seguida os órgãos da cavidade abdominal foram retirados e o fígado de cada animal foi isolado. Os fígados foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-200. Após a pesagem, embalou-se cada fígado em papel laminado identificado com os códigos de cada animal.Durante o procedimento os fígados foram mantidos no gelo. Todos os fígados isolados foram armazenados em galão portátil de nitrogênio líquido (cerca de -196ºC) até a chegada ao laboratório. Exemplares coletados em determinadas regiões foram embalados em papel laminado, identificados com os códigos estabelecidos e armazenados em isopor com gelo até a chegada ao laboratório para retirada do tecido muscular. Os espécimes coletados foram identificados pelo Dr. Francisco Gerson Araújo (Laboratório de Ecologia de Peixes IB/UFRRJ). Parte do material identificado foi fixado em formol a 10% e após 48 h (tempo mínimo) foi transferido para galões com álcool 70% e depositado na coleção de referência do Laboratório de Ecologia de Peixes da UFRRJ.

IH = Peso do fígado (g)/ peso do peixe (g) * 100

O fator de condição isométrico foi obtido através da proporção entre o peso e o comprimento total elevado a “3”. .

FC = peso do peixe (g) / (comprimento do peixe (mm)) 3

3.5 Determinação da Atividade Enzimática – EROD

58 então, centrifugado em centrífuga refrigerada ( Eppendorf ®5804R), a 4 ºC, a 9000 g durante 30 minutos. Após a centrifugação, as amostras foram filtradas com gaze e transferidas para 5 tubos criogênicos devidamente identificados. As amostras foram armazenadas em nitrogênio líquido ou no freezer -80ºC até o momento da quantificação das proteínas e determinação da atividade enzimática.

Sigma Chemical Co - 1,4 mg/ml diluída em solução tampão fosfato (KH 2PO 4 50 mM e NaCl 150 mM, pH 7,2) para que se obtivesse as seguintes concentrações: 0; 0,35; 0,7; 1,05; 1,4 mg/ml. Para determinação da concentração de proteínas na fração S9, diluiu-se a amostra 1:30 e colocou-se 5 µl de amostra diluída na microplaca. Em seguida adicionou-se 250 µl do reagente de Bradford (Sigma Chemical Co) em cada poço da microplaca. A formação do complexo proteína-corante é rápida e estável no período de 5 a 60 minutos. Assim, adotou-se um intervalo constante de aproximadamente 30 minutos entre a adição do corante e a leitura da absorbância. Cada valor de DO obtido é convertido em concentração de proteína, empregando- se a curva padrão. Após fazer as correções para cada fator de diluição, as concentrações de proteína na fração S9 foram calculadas como a média obtida (média final) a partir das médias de cada triplicata e expressas como mg de proteína / ml de S9. As determinações foram realizadas em triplicata com aceitação de um coeficiente de variação máximo de 10%.

3.5.3 Determinação da Atividade enzimática - EROD

59 A velocidade de desalquilação do éster da fenoxazona – etoxi-resorufina – foi realizada através do registro fluorimétrico do acúmulo da resorufina, substância fluorescente, produto final da reação. Este método foi incialmente descrito por Burke (1985). A reação ocorreu como descrito a seguir:

Inicialmente, adicionou-se à cubeta 1890 µl solução tampão K 2HPO 4 100 mM para análise de S9 de acarás e 1840 µl solução tampão K 2HPO 4 100 mM para análise de S9 de cascudos. Em seguida incubou-se à temperatura de 30ºC durante 5 minutos e adicionou-se 50 µl (acarás) ou 100 µl (cascudos) da fração S9 e 10 µl do substrato específico (etoxiresorufina 1mM diluído em DMSO). Após mais 1 minuto de incubação, a reação foi iniciada com a adição de 50 µl de ETS - sistema regenerador de NADPH (doador de elétrons para a reação). Contendo 35 µl de Glicose-6-fosfato desidrogenase, 35 µl cloreto de magnésio, 140 µl de β-NADP e 140 µl de Glicose-6- fosfato. No início de cada semana de determinação da atividade enzimática, realizou-se uma curva padrão nas seguintes quantidades: 0; 10; 20; 50; 100 e 200 pmoles de resorufina (solução 1 µM em tampão K 2HPO 4 100 mM). O acúmulo de resorufina foi determinado em espectroflourímetro Shimadzu – RF - 5000 (excitação: 550 nm, emissão: 582 nm, abertura de fenda: 5nm). Por meio dos valores de inclinação da reta obtidos a partir de registros gráfico e sua correspondência com a intensidade de fluorescência (RTU) e através da quantificação de resorufina da curva padrão, pode-se calcular a velocidade da reação enzimática (pmoles/min/mg de proteína). Todas as determinações foram realizadas em triplicata para cada alíquota de S9 com aceitação de um coeficiente de variação máximo de 10%.

60 3.6.1 Análise das concentrações totais de cromo, cobre, zinco, chumbo, níquel e manganês Para o preparo das duplicatas, cada amostra foi pesada em balança analítica (Mettler Toledo – AB 204) e separada em quantidades de aproximadamente 2,5 – 3g (para análise de cromo, cobre, zinco, chumbo e níquel). Assim obteve-se a massa úmida de músculo a ser analisado. Paralelamente a todo o processo foram analisados amostras de padrão certificado. Em seguida as amostras foram secas na estufa (Fanem – Retilínea), 80ºC, durante 24 horas e ao final deste processo as amostras foram novamente pesadas para obtenção da massa seca. A seguir, as amostras foram calcinadas em forno mufla T. Milley – Termotécnica a 450ºC até a calcinação total. Colocou-se vidro de relógio para tampar os bechers e evitar contaminação. As amostras permaneceram nesta etapa durante 48horas. O processo de chegada à temperatura de 450ºC foi gradativo aumentando-se 100ºC a cada 20 minutos. Ao término da calcinação, as amostras foram pesadas e levadas à placa quente a 100ºC, dentro de uma capela, onde iniciou-se a digestão ácida com adição de 5 mL da solução de água régia (ácido nítrico e ácido clorídrico - 3:1). Após evaporação da solução ácida, ressuspendeu-se o analito com 5 mL de ácido clorídrico fumegante concentrado (PA). Após evaporação desta solução, ressuspendeu-se o analito com uma solução de ácido clorídrico 0,1N em volume preciso (10 mL). As amostras foram armazenadas em geladeira até o momento de análise. A leitura foi realizada no espectrofotômetro de absorção atômica – Método de chama Varian – AA - 1475. Para a determinação de cada um dos metais foi realizada uma curva-padrão ( µg/mL): Chumbo: 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 1,5 e 2,0 ; Cobre, Cromo, Manganês e Níquel: 1 ; 2 ; 3 e 4 ; Zinco: 0,4 ; 0,8 ; 1,2 e 1,6 . Os padrões para curva foram diluídos em HCL 1N a partir de uma solução padrão estoque de 1000 µg/L da Merck.

61 amostras. Esperou-se por cerca de 1 hora até a completa digestão. A solução resultante deve ficar transparente e sem pedaços de tecido. Após a solução esfriar adcionou-se 5 mL de permanganato de potássio à 5% e aqueceu-se novamente durante 15 minutos. Esta solução, onde todo o mercúrio presente deve estar sob a forma de Hg+2 , permaneceu em repouso por uma noite. No dia seguinte, a esta solução foi adcionado 1 mL de solução de cloridrato de hidroxilamina (12%) para se iniciar o processo de redução dos reagentes oxidantes. Logo após as amostras foram colocadas em balões volumétricos de 25mL e completou-se o volume com água Milli-Q. A curva padrão foi realizada com uma solução mãe contendo: ácido nítrico 5%, dicromato de potássio 0,01% e solução estoque de mercúrio 1000 µg/mL. A curva foi construída a partir das seguintes concentrações: 10 ; 20 ; 30 ppb. A leitura foi feita no espectrofotômetro de absorção atômica Varian – AA - 1475 com Gerador de vapor frio – Varian VGA – 76. No espectrofotômetro, o mercúrio inorgânico Hg +2 é reduzido a Hg 0, onde o agente redutor é uma solução de borohidreto de sódio (0,3%) e hidróxido de sódio (0,5%), que circula pelo gerador de vapor frio.

3.7 Análises Estatísticas Nos resultados de Fator de condição utilizou-se análise de variância de duas vias. Estas análises foram realizadas com o auxílio do software Statistica . As demais análises foram realizadas com o software Minitab®. Nos casos em que se analisou estatisticamente os resultados de EROD, estes foram comparados pelo teste t Student para hipóteses unidirecionais (controle versus experimental, H a Exp>C - anexo 2) e bidirecionais nos demais casos . O teste de Andrews foi utilizado para testar a distribuição normal dos resultados de Fator de Condição e de atividade de EROD.

3.8 Reagentes, Soluções, Padrões, Substratos, cofatores e outras substâncias utilizadas

3.8.1 - Preparo do esfregaço do sangue periférico, coloração e contagem das lâminas - Reagentes

Azul-eosina-azul de metileno (Giemsa) Art. 9203 Merck Ind. Químicas Etanol PA Merck Ind. Químicas

62 Fosfato de sódio dibásico heptahidratado Na 2HPO 4 . 7H 2O 10098 - Reagen Quimibrás Ind. Químicas

Fosfato de sódio monobásico dihidratado NaH 2PO 4 . 2H 2O 106.345 - Merck Ind. Químicas Glicerina P.A. 104094.1000 - Merck Ind. Químicas Metanol UN 1170 - Merck Ind. Químicas

- Preparo de soluções

Solução Tampão fosfato pH 6,8

Na 2HPO 4 . 2H 2O 8,9 g

NaH 2PO 4 . 2H 2O 7,3 Água milli-Q qsp 1000 mL Ajustar o pH para 6,8

Solução Giemsa

Azul-eosina-azul de metileno 2 g Glicerina 108 mL Dissolver em banho-maria a 60ºC 2 horas Metanol 168 mL Deixar descansar por uma semana Filtrar a solução estoque em papel de filtro armazenar em frasco âmbar e manter em geladeira No momento de usar: Solução estoque 4 mL Tampão fosfato pH 6,8 130 mL

3.8.2 - Preparação da fração citosólica (S9) hepática

- Regentes

Ácido Clorídrico 1789 - Merck Ind. Químicas Ácido etilenotetraamino (EDTA) 25,404-5 - Aldrich

63 Glicerol 10103 - Reagen – Quimibrás Ind. Químicas Sacarose C 0980,08 – Qeel

TRIS ( H 2NC(CH 2OH) 3 ) UN 8382 – Merck Ind. Químicas Lote:K27994582030

- Preparo de soluções Solução Tampão Tris/Sacarose em pH 7,4

Tris 50mM 6,05 g Sacarose 250mM 8,56 g EDTA 100mM 1 mL Glicerol 20% 20 mL Água milli-Q qsp 100 mL Ajustar o pH para 7,4 com HCl

3.8.3 - Determinação da concentração de proteínas na fração S9

- Regentes

- Preparo de soluções

Solução Tampão KH 2PO 4 50mM / NaCl 150mM pH 7,2

KH 2PO 4 0,680 g NaCl 0,876 g Dissolver em 60 mL de água Milli-Q Ajustar o pH para 7,2 com KOH% p/v Água milli-Q qsp 100 mL

64 - Padrões

Solução de Albumina Sérica Bovina (BSA) 1,40mg/mL

BSA 1,98 mg

Solução Tampão KH 2PO 4 50mM / NaCl 150mM pH 7,2 1,40 mL Manter a 4ºC pelo período de 60 dias ou a – 20ºC distribuído em alíquotas

3.8.4 - Determinação da Atividade enzimática - EROD

- Regentes

Ácido etilenotetraamino (EDTA) 25,404-5 - Aldrich Cloreto de Magnésio 21561- Merck Ind. Químicas Dimetil Sulfóxido 802912 - Merck Ind. Químicas D-glicose-6-fosfato G 7250 - Si gma Chemical Co, St Louis, MO, USA Etoxiresorufina 1004611– Boehringer Mannhein GmbH, Germany Fosfato de potássio dibásico 105.101- Merck Ind. Químicas Fosfato de potássio monobásico 4873 - Merck Ind. Químicas Glicose-6-fosfato desidrogenase 250U, 6378 - Si gma Chemical Co, St Louis, MO, USA Resorufina, 23,015-4, Aldrich

- Preparo de soluções

Solução Tampão K 2HPO 4 1M

K2HPO 4 52,25 g Água milli-Q qsp 300 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução Tampão KH 2PO 4 1M

KH 2PO 4 52,25 g

65 Água milli-Q qsp 300 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução K 2HPO 4 100mM pH 7,8 Solução A

K2HPO 4 1M 20 mL Água milli-Q qsp 200 mL OBS: Manter a 4ºC

Solução B

KH 2PO 4 1M 10 mL Água milli-Q qsp 100 mL OBS: Manter a 4ºC Na hora do uso, ajustar o pH da solução A com a solução B para 7,8

- Padrões

Solução de Resorufina 1mM (solução mãe)

Resorufina 47 mg Água milli-Q qsp 200 mL Manter ao abrigo da luz

Solução de Resorufina 1 µµµM

Solução de Resorufina 1mM 100 µL

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 qsp 100 mL Manter ao abrigo da luz

- Substratos

Solução de etoxiresorufina

- Sistema regenerador de NADPH

Solução de MgCl 2 1M

MgCl 2 1,015 g Água milli-Q qsp 5 mL Manter a 4ºC

Solução de Glicose-6-fosfato 500mM

Glicose-6-fosfato 0,30g

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

Solução de βββ-NADP 25mM

β-NADP 0,037 g

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

Solução de Glicose-6-fosfato desigrogenase 1U /10 µµµL

Glicose-6-fosfato desigrogenase 250 U (um frasco)

Tampão K 2HPO 4 100mM pH 7,8 2,5 mL Distribuir alíquotas e manter a -20ºC

67 O sistema regenerador de NADPH é preparado como uma solução única. No momento de uso, as soluções de β-NADP 25mM (140 µL), glicose-6-fosfato 500mM (140 µL) e glicose-6-fosfato desidrogenase1U /10 µL (35 µL), são degeladas em banho de gelo e adicionadas juntamente com a solução de MgCl 2 1M (35 µL), a um tubo tipo eppendorf .

3.8.5 - Análise de cromo, cobre, zinco, chumbo, manganês e níquel

- Regentes Ácido nítrico P.A 65% QM 12160.1000 – Divisão QM Reagentes Ácido Clorídrico P.A 37% QM 12090.1000 - Divisão QM Reagentes Padrão de Cobre 1.02630.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Manganês 1.02600.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Zinco 1.02670.0100 - Merck Ind. Químicas Padrão de Chumbo (Tritisol) Art. 9969- Merck Ind. Químicas Padrão de Níquel 1.02640.0100- Merck Ind. Químicas Padrão de Cromo (Tritisol) Art. 9948- Merck Ind. Químicas

3.8.6 - Análise de mercúrio total

- Preparo de soluções Solução de Dicromato de potássio 5%

Dicromato de potássio 50 g Água milli-Q qsp 1 L

Solução de Permanganato de potássio 5%

Permanganato de potássio 50 g Água milli-Q qsp 1 L Deixar no agitador sem aquecimento cerca de 12 h. Deixar a solução em repouso per noite. Filtrar a solução em filtro Millipore (filtro de fibra de vidro – Gelman Instrument)

Solução de Ácido clorídrico 0,1M

Ácido clorídrico 0,3 mL (??) Água milli-Q qsp 1 L

Solução de borohidreto de sódio 0,3% / hidróxido de sódio 0,5%

Hidróxido de sódio 2,5 g Borohidreto de sódio 1,5 g Água milli-Q qsp 500 mL

Solução de hidroxilamina 12%

Cloridroto de hidroxilamina 120 g Cloreto de sódio 120 g Água milli-Q qsp 1 L

69 - Padrões Solução mãe de Padrão de Mercúrio

Ácido nítrico 19,2 mL Dicromato de potássio (de solução 5%) 500 µL Padrão de mercúrio (1000 µg/L) 250 µL Água milli-Q qsp 250 mL

70 Esquema 1: Relação entre matriz do peixe e o tipo de análise realizada e os processos realizados em campo e laboratório

Peixes:

G. brasiliensis H. affinis H. luetkeni

Sangue periférico Fígado Tecido muscular

Em campo

Isolamento, Fixação das pesagem e Congelamento dos células em etanol congelamento peixes

Em laboratório

Coloração das Preparo da fração Separação e pesagem de lâminas com S9, quantificação 1g de tecido muscular Giemsa de proteínas para Hg e de c.a. de 6g para os demais

Detrminação da

Contagem de atividade de Zn, Cu, Mn Pb, Hg

Micronúcleo EROD Cr, Ni

Mineralização Secagem, pesagem, calcinagem, pesagem

Digestão ácida Reações de oxi-redução

Quantificação Quantificação de Metais de mercúrio total

71 4. Resultados 4. 1 Peixes coletados A tabela 4 mostra o número de peixes coletados em cada período e local estudado. Pode-se observar que a captura de G. brasiliensis foi mais freqüente do que a das outras espécies sendo H. luetkeni a menos coletada. Em alguns locais como Além Paraíba (11), Petrópolis (9) e São João da Barra (19) não foi possível realizar coletas no período de estiagem, enquanto que em São Luiz do Paraitinga (1), Três Rios (7 e 10) e Sapucaia (12 e 13) as capturas foram feitas apenas neste período. Assim, nos locais anteriormente mencionados dispomos de peixes capturados somente no período de chuvas, ou no de estiagem. Os impedimentos de duplicação das coletas nestes locais foram meramente de ordem organizacional/logística ( e.g. limites de recursos e tempo).

73 Tabela 4 : Número de peixes ( G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni ) coletados nos períodos de chuvas e estiagem nas locais estudadas da bacia do rio Paraíba. Locais de Amostragem Rio Número de peixes coletados (município) G. brasiliensis H. affinis H. luetkeni Chuvas estiagem chuvas estiagem chuvas estiagem 1 Paraitinga - 8 - 10 - 0 (São Luiz do Paraitinga) 2 Paraíba do Sul 10 10 5 2 0 0 (Paraibuna) 3 Paraíba do Sul 4 3 0 4 0 0 (S. José dos Campos) 4 Paraíba do Sul 11 6 0 9 10 0 (Barra Mansa) 5 Paraíba do Sul 10 10 3 5 0 2 (Volta Redonda) 6 Preto 2 10 0 0 8 8 (Rio das Flores) 7 Paraíba do Sul - 2 - 2 - 0 (Três Rios) 8 Paraibuna 3 21 10 2 7 8 (Levy Gasparian) 9 Piabanha 12 - 7 - 0 - (Petrópolis) 10 Paraíba do Sul - 6 - 4 - 0 (Três Rios) 11 Paraíba do Sul 4 - 2 - 0 - (Além Paraíba) 12 Paraíba do Sul - 11 - 3 - 2 (Anta-Sapucaia) 13 Paraíba do Sul - 0 - 0 - 7 (Sapucaia) 14 Pomba 2 5 3 0 0 0 (Sto. A. de Pádua) 15 Paraíba do Sul 0 2 0 0 0 0 (São Fidélis) 16 Dois Rios 11 8 0 2 0 0 (São Fidélis) 17 Muriaé 10 10 0 0 0 0 (Italva) 18 Paraíba do Sul 4 4 7 2 0 0 (Campos dos G.) 19 Paraíba do Sul 3 - 3 - 0 - (São João da Barra) 86 116 40 45 25 27 Total de peixes coletados (-) : Local onde não houve esforço de pesca

74 4.2 Medidas das variáveis físicas e físico-químicas A tabela 5 apresenta os valores das variáveis físicas (temperatura) e físico- químicas (pH, OD e condutividade) medidos em todas os locais de coletas no período de chuvas. Pode-se observar que a temperatura da água medida na superfície manteve- se relativamente constante (24,9ºC-28,2ºC) em todas os locais, exceto em Petrópolis, onde foi registrada a menor temperatura (22,7ºC). Os valores de pH situaram-se em torno do pH neutro, variando entre 6,55 e 8,75. Os valores de OD nas locais de São José dos Campos (3) e São Fidélis (16) foram os mais baixos (2,2 ± 0,64 mg/L e 0,48 ± 0,04 mg/L, respectivamente). Os valores de condutividade foram mais elevados na Local de São José dos Campos (3). Os valores das variáveis físicas e físico-químicas, medidos na superfície da água no período de estiagem constam na tabela 6 . Estes valores podem ser considerados como sendo mais representativos da área amostrada, porque representam a média de 10 ou 11 repetições (as realizadas no período de chuvas foram em média 3 ou menos) ao longo da Local em dois horários diferentes (manhã e tarde/noite). No período de estiagem a temperatura da água na superfície apresentou ampla variação ao longo das locais estudadas (15,53ºC – 30,00ºC), sendo o valor mais alto registrado no rio Dois Rios em São Fidélis (16 – T/N) (altitude média: 57,70 metros) e o menor valor medido no rio Paraitinga, em São Luiz do Paraitinga (1), na Serra da Bocaina ( tabela 6 ). Em relação a flutuações entre os horários de medida, apenas no rio Dois Rios (16) foi observada uma diferença de cerca de 3ºC na temperatura média registrada entre o período matutino 8:30-10:00h (dia 2) e vespertino 17:00-18:30h (dia 1). Nas outras locais de coleta a diferença de temperatura entre os dois períodos do dia foi de 1-2ºC. Os valores de pH registrados no período de estiagem variaram de 6,72 a 8,47. Os valores mais baixos de OD foram obtidos na Local de São José dos Campos (3), nos dois horários de medida (4,27 ±0,43 mg/L e 3,77 ±0,25 mg/L). No rio Dois Rios (16), no rio Pomba (14) e na origem do rio Paraíba do Sul, na cidade de Paraibuna (2), os valores de OD medidos pela manhã foram baixos (4,38 ±2,19 mg/L, 3,81 ±1,06 mg/L e 4,97 ± 1,78 mg/L respectivamente). Os valores de condutividade estavam mais elevados na Local de São José dos Campos (3) e Três Rios (7).

75 Tabela 5 : Variáveis físicas e físico-químicas da qualidade da água em diferentes pontos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Variáveis físicas e físico-químicas amostragem (município) Temperatura da pH OD (mg/L) OD (%) Condutividade água (ºC) (mS/cm) 2 Paraíba do Sul 26,20 ± 1,22 6,55 ± 0,41 5,88 ± 0,18 73,30 ± 4,92 0,03 ± 0,001 (Paraibuna) 3 Paraíba do Sul 26,60 ± 1,41 7,20 2,20 ± 0,64* 28,10 ± 7,92 0,11* (S. José dos Campos) 4 Paraíba do Sul 25,20 ± 0,42 8,04 ± 0,97 6,16 ± 0,49 77,55 ± 5,73 0,09 ± 0,001* (Barra Mansa) 5 Paraíba do Sul 26,07 ± 0,12 7,15 ± 0,20 5,34 ± 0,54 66,67 ± 5,77 0,06± 0,004* (Volta Redonda) 6 Preto 25,80 8,35 6,90 82,30 0,02 (Rio das Flores) 8 Paraibuna 26,35 ± 1,63 8,75 ± 0,85 7,16 ± 0,11 89,80 ± 1,7 0,03 ± 0,004 (Levy Gasparian) 9 Piabanha 22,70 8,40 7,04 85,00 0,07* (Petrópolis) 11 Paraíba do Sul 24,90 7,93 6,44 77,80 0,06* (Além Paraíba) 14 Pomba 26,70 ± 0,71 8,35 ± 0,4 6,54 81,00 0,04* (Sto. Antônio de Pádua) 16 Dois Rios 26,20 ± 1,41 8,69 ± 0,21 0,48 ± 0,04* 5,85 ± 0,35 0,06 ± 0,001* (São Fidélis) 17 Muriaé 28,20 ± 0,36 7,62 ± 0,06 6,36 ± 0,53 81,17 ± 6,21 0,05 ± 0,001* (Italva) 18 Paraíba do Sul 27,95 ± 0,35 7,63 ± 1,08 6,16 ± 0,21 76,5± 1,27 0,07 ± 0,005* (Campos dos Goytacases) 19 Paraíba do Sul 27,15 ± 1,2 7,82 ± 0,19 6,37 ± 0,78 79,6 ± 8,63 0,06 ± 0,002* (S. João da Barra) * - Variável fora dos padrões estabelecidos. OD: CONAMA 20 (>5mg/L), Condutividade (0,03 mS/cm ): CEPIS, OPS/OMS, 1963/64 [ apud Martos & Maia, 1997]. Valores: média ± desvio padrão

76 Tabela 6 : Variáveis físicas e físico-químicas da qualidade da água em diferentes pontos ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem.

Locais de Rio Horários Variáveis físicas e físico-químicas amostragem (município) Temperatura da pH OD (mg/L) OD (%) Condutividade água (ºC) (mS/cm)

1 Paraitinga T/N ND ND ND ND ND

(São Luiz do Paraitinga) M 15,53 ± 0,10 7,56 ± 0,38 7,65 ± 1,99 77,65 ± 18,87 0,016 ± 0,001

2 Paraíba do Sul T/N 21,72 ± 0,18 7,70 ± 0,37 6,87 ± 0,96 78,18 ± 10,82 0,028 ± 0,004

(Paraibuna) M 21,39 ± 0,29 7,92 ± 0,07 4,97 ± 1,78* 56,23 ± 19,70 0,029 ± 0,004

3 Paraíba do Sul T/N 23,13 ± 0,19 7,88 ± 0,22 3,77 ± 0,25* 44,25 ± 3,22 0,13 ± 0,001*

(S. J dos Campos). M 22,82 ± 0,65 8,22 ± 0,25 4,27 ± 0,43* 50,42 ± 4,82 0,13 ± 0,001*

4 Paraíba do Sul T/N ND ND ND ND ND

(Barra Mansa) M 19,8 7,35 7,50 81,6 0,086*

5 Paraíba do Sul T/N 23,42 ± 2,02 7,40 ±0,06 6,33 ± 1,17 76,17 ± 3,85 0,089 ± 0,001*

(Volta Redonda) M 22,56 ± 0,46 7,48 ± 0,16 6,50 ± 0,26 74,76 ± 4,76 0,089 ± 0,002*

6 Preto T/N 23, 47 ± 0,13 7,65 ± 0,16 7,90 ± 1,14 91,98 ± 12,91 0,026 ± 0,002

(Rio das Flores) M 21,38 ± 0,67 7,73 ± 0,26 5,94 ± 1,82 65,54 ± 20,09 0,025 ± 0,001

7 Paraíba do Sul T/N 20,88 · 0,41 6,72 ± 0,43 7,18 ± 0,67 80,54 ± 7,53 0,101 ± 0,001*

(Três Rios) M 19,85 ± 0,05 7,14 ± 0,40 6,56 ± 0,89 73,26 ± 8,26 0,100 ± 0,001*

8 Paraibuna T/N 23,48 ± 0,52 7,47 ± 0,19 6,67 ± 1,80 75,23 ± 20,16 0,041 ± 0,001*

(Levy Gasparian) M 22,55 ± 0,79 7,84 ± 0,19 7,38 ± 1,04 83,95 ± 9,67 0,042 ± 0,002*

10 Paraíba do Sul T/N 20,32 ± 0,42 7,33 ± 0,79 6,51 ± 0,64 71,92 ± 7,68 0,063 ± 0,001*

(Três Rios) M ND ND ND ND ND

(continua)

(continuação)

Locais de Rio Horários Variáveis físicas e físico-químicas amostragem (município) Temperatura da pH OD (mg/L) OD (%) Condutividade água (ºC) (mS/cm)

12 Paraíba do Sul T/N ND ND ND ND ND

(Anta-Sapucaia) M 20,43 ± 0,19 7,69 ± 0,14 7,39 ± 1,06 81,20 ± 11,48 0,064 ± 0,001*

13 Paraíba do Sul T/N 20,68 ± 0,53 7,67 ± 0,20 6,74 ± 0,45 74,93 ± 4,95 0,064 ± 0,000*

(Sapucaia) M 20,58 ± 0,54 7,90 ± 0,34 8,49 ±0,86 95,26 ± 7,40 0,064 ± 0,000*

14 Pomba T/N 27,65 ± 2,11 7,86 ± 0,17 5,32 ± 1,56 68,76 ± 20,17 0,057 ± 0,001*

(Sto. A. de Pádua) M 27,35 ± 0,25 8,20 ± 0,10 3,81 ± 1,06* 48,16 ± 13,54 0,057 ± 0,001*

15 Paraíba do Sul T/N 27,79 ± 0,33 8,47 ± 0,09 6,63 ± 1,07 79,94 ± 17,55 0,065 ± 0,003*

(São Fidélis) M 27,70 ± 0,26 8,38 ± 0,17 5,32 ± 1,88 67,27 ± 23,52 0,065 ± 0,003*

16 Dois Rios T/N 30,00 ± 0,18 8,39 ± 0,08 6,65 ± 0,90 88,26 ± 11,96 0,085 ± 0,001*

(São Fidélis) M 26,99 ± 0,09 8,29 ± 0,14 4,38 ± 2,19* 54,64 ± 27,18 0,078 ± 0,001*

17 Muriaé T/N 29,04 ± 1,54 7,81 ± 0,05 6,03 ± 1,16 79,36 ± 15,05 0,064 ± 0,001*

(Italva) M 28,00 ± 0,06 7,89 ± 0,04 5,76 ± 0,85 73,67 ± 10,74 0,064 ± 0,001*

18 Paraíba do Sul T/N 29,55 ± 0,33 7,65 ± 0,24 5,99 ± 1,11 77,97 ± 16,26 0,063 ± 0,003*

(Campos dos G.) M 27,33 ± 0,19 7,94 ± 0,07 7,23 ± 0,75 91,59 ± 9,25 0,061 ± 0,001*

* - Variável fora dos padrões estabelecidos.: OD: CONAMA 20 (>5mg/L) , Condutividade (0,03 mS/cm ): CEPIS, OPS/OMS, 1963/64 [ apud Martos & Maia ,1997].

Valores: média ± desvio padrão ND – Variável não determinada T/N: tarde/noite M: manhã

4.1 Índice hepático (IH) e fator de condição (FC) 78

4.1.1 Índice Hepático Se os locais de coleta forem agrupados por valores de IH de G. brasiliensis (tabela 7 ), pode-se observar no período de chuvas em S. J. dos Campos (3), Levy Gasparian (8), Santo Antônio de Pádua (14), São Fidélis (16), Campos (18) e São J. da Barra (19) valores menores que 1 ( tabela 7 e 10 ). Já os peixes que foram coletados no período de chuvas em Paraibuna (2), Barra Mansa (4), Rio das Flores (6), Petrópolis (9) e Italva (17) apresentaram IH que variam entre 1 e 2. Volta Redonda (5) foi o único local em que valores de IH de G. brasiliensis foram superiores a 2 ( tabela 7 e 10 e figura 7 ). O valor médio de índice hepático deste local foi cerca de 4 vezes maior que aquele encontrado em São Fidélis (16), no rio Dois Rios (0,62 ±0,18) ( tabela 10 ). Nas tabelas 7 e 11 pode-se observar que no período de estiagem exemplares de G. brasiliensis coletados em Paraibuna (2), Rio das Flores (6), Levy Gasparian (8) e São Fidélis (15 e 16) apresentaram IH que variaram entre 0,65 ±0,17 a 0,96 ±0,41, sendo classificados na faixa inferior. Os G. brasiliensis coletados em São Luiz do Paraitinga (1), S. J. dos Campos (3), Barra Mansa (4), Três Rios (7 e 10), Sapucaia (12), Santo Antônio de Pádua (14), Italva (17) e Campos (18) apresentaram valores médios intermediários, i.e. que variam de 1 a 2. No período de estiagem, assim como no de chuvas, o maior valor obtido (2,05 ± 0,93) foi registrado em Volta Redonda, sendo este o único local classificado na faixa superior, i.e. >2. Os IH dos G. brasiliensis coletados nas locais 4, 5, 8, 16 e 17 mantiveram-se na mesma faixa nos períodos de chuva e estiagem. Já os que foram coletados nas locais 3, 14 e 18 passaram da faixa 1 para a faixa 2 entre os períodos de chuva e estiagem, e os que foram coletados nas locais 2 e 6 passaram da faixa 2 no período de chuvas, para a faixa 1, no período de estiagem ( tabela 7 e figura 7 ).

79 Tabela 7 : Classificação dos valores de IHs médios de G. brasiliensis coletados em diferentes locais e períodos. Faixas Locais Período de Chuvas Período de Estiagem <1 3, 8, 14, 16, 18,19* 2, 6, 8, 15*, 16, 1-2 2, 4, 6, 9*, 17 1, 3, 4, 7*, 10*, 12*, 14, 17,18 >2 5 5 * - Localnão amostrada em um dos períodos

A comparação do IH de G. brasiliensis entre os períodos de coleta e as diferentes faixas de classificação pode ser visualizada na figura 7 .

Geophagus brasiliensis 3,5 Período de Chuvas Período de Estiagem 3

2,5

1,5 Índice Hepático 1

0,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15 16 17 18 19 Regiões de coleta Figura 7: Comparação entre Índice Hepático de G. brasiliensis coletado em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

A classificação de IH por faixas (inferior, intermediária e superior) também foi realizada para H. affinis e H luetkeni ( tabelas 8 e 9 ). Em Petrópolis (9), os H affinis apresentaram, no período de chuvas, IH maiores do que 1 (1,12 ±0,27). Este foi o único dos locais em que se coletou peixes desta espécie que exibiram IH na faixa 1-2. Nas demais locais (2, 5, 8, 14 e 18 – Tabela 8 e 10 ) os IHs de H affinis permaneceram na faixa inferior (< 1). No período de estiagem, somente os H. affinis coletados em Paraibuna-SP (2) apresentaram IHs na faixa

80 inferior. Em todas as outras locais em que se coletou H. affinis no período de estiagem, os IHs foram classificados na faixa intermediária (faixa 1-2). Estes dados sugerem que esta espécie exibe um aumento de IH no período de estiagem ( figura 8 ). Ao contrário do que havia sido observado em G. brasiliensis, os H. affinis coletados em Volta Redonda (5) apresentaram IHs que foram classificados na faixa <1, (tabela 8 ) no período de chuvas (0,93 ±0,29), e na faixa 1-2, no período de estiagem (1,43 ± 0,45) ( tabela 10 e 11 ). Em todas as locais em que se coletou H. luetkeni no período de chuvas os IHs obtidos foram classificados na faixa <1. Já no período de estiagem, em Volta Redonda (5), Rio das Flores (6) e Sapucaia (12), os IHs de H. luetkeni foram classificados na faixa intermediária (faixa 1-2).

Tabela 8 : Classificação dos valores de IHs médios de H. affinis coletados em diferentes locais e períodos. Faixas Locais Período de Chuvas Período de Estiagem <1 2, 5, 8, 14*, 18 2 1-2 9* 1, 3, 4, 5, 7*, 8, 10*, 12*, 16* e 18 >2 - - (-) Não houve IH classificado nesta faixa * - Local não amostrado em um dos períodos

Tabela 9 : Classificação dos valores de IHs médios de H. luetkeni coletados em diferentes locais e períodos. Faixas Locais Período de Chuvas Período de Estiagem <1 4*, 6, 8 e 14 8 e 13* 1-2 - 5*, 6 e 12* >2 - - (-) Não houve IH classificado nesta faixa *- Local não amostrado em um dos períodos

Apesar de haver poucas locais em que se pode observar IH de H. affinis e H. luetkeni tanto no período de chuvas quanto no de estiagem, os dados mostrados na figura 8 sugerem que há uma tendência do IH ser discretamente maior no período de estiagem.

H. affinis H. luetkeni 2 2 Período de chuvas 1,5 Período de estiagem 1,5 1 1 0,5 0,5 Índice Índice Hepático

0 Índice Hepático 1 2 3 4 5 7 8 9 1012141618 0 4 5 6 8 14 12 13 Regiões de Coleta Regiões de Coleta

Figura 8: Comparação entre Índices Hepáticos de H.affinis e H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul, nos períodos de chuvas e estiagem.

82 As tabela 10 e 11 permitem comparar os índices hepáticos entre as três espécies coletadas no período de chuvas e estiagem respectivamente. Tabela 10 : Índices Hepáticos de G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas.

Locais de Rio Índice Hepático * amostragem (município) Geophagus brasiliensis Hypostomus affinis Hypostomus luetkeni Paraíba do Sul 2 1,44 ± 0,68 0,75 ± 0,47 - (Paraibuna) 1,50 (0,49-2,19) 0,76 (0,27-1,46) Paraíba do Sul 3 0,98 ± 0,32 - - (S. José dos Campos) 0,94 (062-1,41) Paraíba do Sul 4 1,83 ± 0,99 - 0,58 ± 0,17 (Barra Mansa) 1,83 (0,65-3,17) 0,59 (0,28-0,80) Paraíba do Sul 5 2,51 ± 0,61 0,93 ± 0,29 - (Volta Redonda) 2,55 (1,24-3,17) 0,89 (0,67-1,24) Preto 6 1,34 ± 0,48 - 0,70 ± 0,15 (Rio das Flores) 1,34 (1,00-1,68) 0,66 (0,57-1,04) Paraibuna 8 0,79 ± 0,07 0,59 ± 0,08 0,46 ± 0,13 (Levy Gasparian) 0,76 (0,73-0,87) 0,58 (0,50-0,73) 0,41 (0,32-0,70)

Piabanha 9 1,74 ± 0,38 1,12 ± 0,27 - (Petrópolis) 1,62 (1,27-2,65) 1,09 (0,80-1,65) Paraíba do Sul 11 ND ND - (Além Paraíba) Pomba 14 0,66 ± 0,04 0,63 ± 0,23 0,28 ± 0,04 (Sto. Antônio de Pádua) 0,66 (0,63-0,69) 0,47 (0,46-0,79) 0,28 (0,25-0,31) Dois Rios 16 0,62 ± 0,18 - - (São Fidélis) 0,58 (0,43-0,88) Muriaé 17 1,02 ± 0,19 - - (Italva) 0,99 (0,74-1,34) Paraíba do Sul 18 0,76 ± 0,24 0,58 ± 0,19 - (Campos dos Goytacases) 0,71 (0,55-1,02) 0,55 (0,40-0,93) Paraíba do Sul 19 0,73 ± 0,12 ND - (S. João da Barra) 0,73 (0,59-0,80) * - Índice hepático - (peso do fígado x 100/peso do peixe) Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo) ND – Parâmetro não determinado

83 Tabela 11 : Índices Hepáticos de G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Locais de Rio Índice Hepático * amostragem (município) Geophagus brasiliensis Hypostomus affinis Hypostomus luetkeni 1 Paraitinga 1,19 ± 0,46 1,03 ± 0,13 - (São L. do Paraitinga) 1,07 (0,83-2,19) 1,07 (0,80-1,18) 2 Paraíba do Sul 0,65 ± 0,17 0,77 ± 0,15 - (Paraibuna) 0,58 (0,49-1,00) 0,77 (0,66-0,87) 3 Paraíba do Sul 1,79 ± 0,48 1,47 ± 0,24 - (S. José dos Campos) 1,66 (1,38-2,32) 1,38 (1,29-1,81) 4 Paraíba do Sul 1,23 ± 0,75 1,03 ± 0,14 - (Barra Mansa) 0,78 (0,67-2,35) 1,00 (0,87-1,23) 5 Paraíba do Sul 2,05 ± 0,93 1,43 ± 0,45 1,11 ± 0,32 (Volta Redonda) 2,01 (0,57-3,73) 1,33 (0,89-2,12) 1,11 (0,88-1,33) 6 Preto 0,72 ± 0,19 - 1,13 ± 0,28 (Rio das Flores) 0,75 (0,44-1,00) 1,07 (0,77-1,65) 7 Paraíba do Sul 1,77 ± 0,28 1,04 ± 0,05 - (Três Rios) 1,77 (1,58-1,97) 1,04 (1,01-1,07) 8 Paraibuna 0,85 ± 0,25 1,21 ± 0,20 0,90 ± 0,26 (Levy Gasparian) 0,82 (0,55-1,37) 1,21 (1,07-1,35) 0,97 (0,55-1,32) 10 Paraíba do Sul 1,27 ± 0,64 1,14 ± 0,15 - (Três Rios) 1,10 (0,73-2,33) 1,17 (0,96-1,27) 12 Paraíba do Sul 1,48 ± 0,47 1,27 ± 0,05 1,05 ± 0,18 (Anta-Sapucaia) 1,48 (0,76-2,19) 1,26 (1,22-1,32) 1,05 (0,92-1,17) 13 Paraíba do Sul - - 0,96 ± 0,27 (Sapucaia ) 0,93 (0,62-1,45) 14 Pomba 1,60 ± 0,42 - - (Sto. Antônio de Pádua) 1,38 (1,22-2,23) 15 Paraíba do Sul 0,85 ± 0,01 - - (São Fidélis) 0,85 (0,84-0,86) 16 Dois Rios 0,96 ± 0,41 1,62 ± 0,25 - (São Fidélis) 0,92 (0,49-1,86) 1,62 (1,44-1,79) 17 Muriaé 1,22 ± 0,40 - - (Italva) 1,21 (0,61-1,93) 18 Paraíba do Sul 1,60 ± 0,47 1,05 ± 0,24 - (Campos dos Goytacases) 1,38 (1,36-2,30) 1,05 (0,88-1,22) * - Índice hepático - (peso do fígado x 100/peso do peixe) Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

4.1.2 Fator de condição A figura 9 mostra a curva de distribuição dos FC de todos os G. brasiliensis analisados neste estudo (período de chuvas e estiagem). A média dos Fatores de Condição dos G. brasiliensis coletados no período de chuvas foi maior ( p=0,0033) do que a média dos peixes desta espécie coletados no período de estiagem (figura 10). Entretanto como observado na figura 11 o aumento do FC no período de chuvas não é observado em todos os locais estudados.

Variáveis: Período de Chuvas e EstiagemDescriptive Statistics

Variable: FC CHEST

Anderson-Darling Normality Test A-Squared: 0.998 p-value: 0.012

Mean 1.920 Std Dev 0.307 Variance 0.094 Skewness 0.815 Kurtosis 1.653 1 2 3 n of data 192.000 Minimum 1.290 1st Quartile 1.690 Median 1.905 3rd Quartile 2.087 Maximum 3.250 95% Confidence Interval for Mu 95% Confidence Interval for Mu 1.876 1.963 1.85 1.90 1.95 95% Confidence Interval for Sigma 0.279 0.341 95% Confidence Interval for Median 95% Confidence Interval for Median 1.850 1.951

Figura 9: Distribuição dos Fatores de Condição ( x10 –5 ) de todos os G. brasiliensis coletados nas locais estudadas nos períodos de chuva e estiagem.

85 G. brasiliensis 2,6 )

-5 2,4 * 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 Fatorde Condição (*10 0 0,5Chuvas 1 1,5Estiagem 2 2,5 Períodos de Coleta

Figura 10: Fator de Condição (média ± desvio padrão) de todos os G. brasiliensis coletados nos períodos de chuvas e estiagem.* - p<0,05 (análise de variância em duas vias).

Geophagus brasiliensis Período de Chuvas Período de Estiagem

) 3 -5 2,5 2 1,5 1 0,5

Fator de condição (*10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 Regiões de coleta

Figura 11: Fatores de Condição de G. brasiliensis coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

A tabela 12 compara os valores obtidos para o Fator de Condição de Fulton (Isométrico) em G. brasiliensis em cada local estudado. No período de chuvas, os

86 resultados apontam uma faixa de variação das médias que vai de 1,47 ±0,12 a 2,45 ±0,36 (x 10 -5) em peixes coletados no rPS nas cidades de Paraibuna (2) e Volta Redonda (5), respectivamente. No período de estiagem, as maiores médias são apresentadas em peixes coletados no rio Pomba (14) (2,25 x 10 -5±0,46) e em Volta Redonda (5) (2,15 x 10 -5±0,28), e os menores valores foram obtidos em peixes da cidade de Paraibuna (2) (1,60 x 10 -5±0,22) e São Luiz do Paraitinga (1) (1,60 x 10 -5±0,13). A tabela 13 compara os valores de Fator de Condição de Fulton obtidos em H. affinis nos períodos de chuva e estiagem. Peixes coletados em Volta Redonda no período de chuvas apresentaram maiores valores de FC (1,30 x 10 -5±0,21) e os menores valores foram obtidos em peixes provenientes das locais de Paraibuna (2), Além Paraíba (11) e Santo Antônio de Pádua (14). No período de estiagem os menores valores obtidos foram registrados em São Fidélis(16), no rio Dois Rios (0,56 x 10 -5±0,16) enquanto em São José dos Campos, rio Paraíba do Sul (3), a média do grupo foi 2 vezes maior (1,21 x 10 -5±0,17).

87 Tabela 12 : Valores do Fator de Condição isométrico de G. brasiliensis coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem. Locais de Rio Fator de condição ISOMÉTRICO (x 10 -5) amostragem (município) N Período de chuvas N Período de estiagem 1 Paraitinga (São Luiz do - - 8 1,60 ± 0,13 Paraitinga) 1,58 (1,40-1,85) 2 Paraíba do Sul 10 1,47 ± 0,12 10 1,60 ± 0,22 (Paraibuna) 1,48 (1,29-1,60) 1,53 (1,32-2,07) 3 Paraíba do Sul 4 1,63 ± 0,14 3 1,97 ± 0,27 (S. José dos Campos) 1,61 (1,48-1,81) 2,00 (1,69-2,23) 4 Paraíba do Sul 11 1,76 ± 0,15 6 1,86 ± 0,20 (Barra Mansa) 1,74 (1,58-1,97) 1,92 (1,55-2,08) 5 Paraíba do Sul 10 2,45 ± 0,36 10 2,15 ± 0,28 (Volta Redonda) 2,47 (1,95-3,25) 2,17 (1,68-2,51) 6 Preto 2 2,32 ± 0,13 9 1,81 ± 0,17 (Rio das Flores) 2,32 (2,22-2,41) 1,62 (2,05-9,22) 7 Paraíba do Sul - - 2 2,01 ± 0,51 (Três Rios) 2,01 (1,65-2,37) 8 Paraibuna 3 2,01 ± 0,12 21 1,83 ± 0,17 (Levy Gasparian) 2,06 (1,87-2,09) 1,80 (1,53-2,15) 9 Piabanha 12 2,13 ± 0,20 - - (Petrópolis) 2,14 (1,73-2,43) 10 Paraíba do Sul - - 6 1,77 ± 0,10 (Três Rios) 1,76 (1,67-1,96) 11 Paraíba do Sul 4 1,72 ± 0,17 - - (Além Paraíba) 1,67 (1,57-1,95) 12 Paraíba do Sul - - 11 1,87 ± 0,14 (Anta-Sapucaia) 1,90 (1,55-2,07) 14 Pomba 2 1,97 ± 0,08 5 2,25 ± 0,46 (Sto. Antônio de Pádua) 1,97 (1,91-2,02) 2,10 (2,07-2,15) 15 Paraíba 0 - 2 2,11 ± 0,06 (São Fidélis) 2,11 (2,07-2,15) 16 Grande 11 1,90 ± 0,14 8 1,76 ± 0,21 (São Fidélis) 1,93 (1,56-2,07) 1,73 (1,47-2,11) 17 Muriaé 10 2,17 ± 0,23 10 1,87 ± 0,20 (Italva) 2,18 (1,85-2,52) 1,92 (1,50-2,12) 18 Paraíba do Sul 4 2,10 ± 0,15 4 1,91 ± 0,18 (Campos dos Goytacases) 2,15 (1,90-2,23) 1,92 (1,69-2,12) 19 Paraíba do Sul 3 1,91 ± 0,06 - - (S. João da Barra) 1,91 (1,86-1,98) Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo) N = - : Não houve esforço de pesca

88 Tabela 13 : Valores do Fator de Condição isométrico de H. affinis coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

Locais de Rio Fator de condição ISOMÉTRICO ( x 10 -5) amostragem (cidade) N Período de chuvas N Período de estiagem

1 Paraitinga (São Luiz do - - 10 1,03 ± 0,13 Paraitinga) 1,07 (0,80-1,18) 2 Paraíba do Sul 5 1,02 ± 0,10 2 0,98 ± 0,13 (Paraibuna) 1,06 (0,87-1,14) 0,98 (0,89-1,08) 3 Paraíba do Sul 0 - 4 1,21 ± 0,17 (S. José dos Campos) 1,15 (1,06-1,45) 4 Paraíba do Sul 0 - 9 1,13 ± 0,05 (Barra Mansa) 1,13 (1,08-1,21) 5 Paraíba do Sul 3 1,30 ± 0,21 5 1,10 ± 0,06 (Volta Redonda) 1,36 (1,07-1,47) 1,08 (1,02-1,19) 7 Paraíba do Sul - - 2 0,93 ± 0,22 (Três Rios) 0,93 (0,77-1,08) 8 Paraibuna 10 1,24 ± 0,19 2 0,83 ± 0,04 (Levy Gasparian) 1,22 (0,92-1,68) 0,83 (0,81-0,86) 9 Piabanha 3 1,11 ± 0,13 - - (Petrópolis) 1,10 (0,92-1,33) 10 Paraíba do Sul - - 4 1,08 ± 0,06 (Três Rios) 1,08 (1,00-1,14) 11 Paraíba do Sul 2 1,01 ± 0,08 - - (Além Paraíba) 1,01 (0,95-1,06) 12 Paraíba do Sul - - 3 1,04 ± 0,05 (Anta-Sapucaia) 1,03 (0,99-1,10) 14 Pomba 3 1,01 ± 0,11 0 - (Sto. Antônio de Pádua) 0,99 (0,91-1,13) 16 Dois Rios 0 - 2 0,56 ± 0,16 (São Fidélis) 0,56 (0,44-0,67) 18 Paraíba do Sul 7 1,13 ± 0,19 2 0,82 ± 0,03 (Campos dos Goytacases) 1,09 (0,94-1,40) 0,82 (0,80-0,84) Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo) N = - : Não houve esforço de pesca

89 Tabela 14 : Valores do Fator de Condição isométrico de H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

Locais de Rio Fator de condição ISOMÉTRICO (x 10 -5) amostragem (município) N Período de chuvas N Período de estiagem

4 Paraíba do Sul 10 0,99 ± 0,09 0 - (Barra Mansa) 0,99 (0,88-1,14) 5 Paraíba do Sul 0 - 2 0,95 ± 0,10 (Volta Redonda) 0,95 (0,88-1,02) 6 Preto 8 1,28 ± 0,09 8 1,06 ± 0,13 (Rio das Flores) 1,28 (1,18-1,45) 1,04 (0,92-1,37) L8 Paraibuna 7 1,27 ± ,031 7 1,10 ± 0,12 (Levy Gasparian) 1,23 (0,66-1,55) 1,11 (0,94-1,11) 14 Pomba 2 1,11 ± 0,06 0 - (Sto. Antônio de Pádua) 1,11 (1,07-1,15) 12 Paraíba do Sul - - 2 1,28 ± 0,03 (Anta-Sapucaia) 1,28 (1,26-1,30) 13 Paraíba do Sul (Sapucaia) - - 7 1,23 ± 0,20 1,09 (1,04-1,57) Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo) N = - : Não houve esforço de pesca

As médias dos fatores de condição dos H. luetkeni coletados, nas diferentes locais, nos períodos de chuvas e de estiagem constam na tabela 14. No período de chuvas as médias dos fatores de condição nas diversas locais estudadas variaram de 0,99x10 - 5±0,09 a 1,28x10 -5±0,09 em peixes coletados Barra Mansa (4) e Rio das Flores (6), respectivamente. No período de estiagem, a média dos FCs variou de 0,95x10-5±0,10 a 1,28x10 -5±0,03, nas cidades de Volta Redonda (5) e Sapucaia (12), respectivamente.

90 H. affinis H. luetkeni Período de chuvas

3,0 Período de Estiagem

) 3,0 -5 )

2,5 -5 2,5 2,0 2,0 1,5 1,5 1,0 1,0 0,5 0,5 Fator de condição (*10 de condição Fator

0,0 (*10 condição de Fator 0,0 1 2 3 4 5 7 8 9 101112141618 4 5 6 8 12 13 14 Regiões de coleta Regiões de coleta

Figura 12: Fatores de Condição de H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

Na figura 12 podem ser visualizados os valores dos Fatores de Condição de cascudos ( H. affinis e H. luetkeni ) nos períodos de chuva e estiagem. Estes dados sugerem que o fator de condição dos cascudos é discretamente maior no período de chuvas do que no período de estiagem.

91 4.4 Determinação da freqüência de micronúcleos Tal como recomendado por Al-Sabti (1995), os peixes analisados quanto à freqüência de MN estavam todos numa faixa padrão de tamanho. O comprimento dos G. brasiliensis variou de 14 a 23,5 cm no período de chuvas, e de 15,5 a 25,5 cm no período de estiagem ( tabelas 1a e 4a ). O comprimento dos H. affinis analisados variou de 19,5 a 33 cm no período de chuvas. No período de estiagem o comprimento dos H. affinis coletados variou de forma mais ampla, destacando-se duas faixas de tamanho, i.e. 17 a 27 cm e 27 a 41 cm ( tabelas 2a e 5a ). O maior número de peixes analisados (60,5%) estava na primeira faixa. O comprimento dos H. luetkeni analisados variou de 21 a 29 cm, no período de chuvas, e de 23,5 a 30 cm, no período de estiagem ( tabelas 3a e 6a ). A tabela 15 mostra a freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de G. brasiliensis coletados nos diferentes locais nos períodos de chuva e estiagem. A frequência de células com micronúcleos no sangue de G. brasiliensis variou de 0,00 a 0,67‰ de acordo com o local de coleta ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul e nos períodos de chuva e estiagem ( tabela 15 ). Já os valores obtidos na análise de sangue de cascudos apontam para freqüências de 0,00 a 2,0‰ ( tabela 16 e 17 ).

92 Tabela 15 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de G. brasiliensis coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuva e estiagem.

Locais de Rio Freqüência de Micronúcleos (‰) amostragem (município) N Período de chuvas N Período de estiagem

1 Paraitinga (S. L. do Paraitinga) - - 8 0,13 ± 0,35 0 (0-1) 2 Paraíba do Sul (Paraibuna) 10 0,10 ± 0,32 10 0,10 ± 0,32 0 (0-1) 0 (0-1)

3 Paraíba do Sul ( S. J. dos Campos ) 4 0,50 ± 1,00 3 0,00 0 (0-2) 4 Paraíba do Sul (Barra Mansa) 9 0,56 ± 1,33 6 0,17 ± 0,41 0 (0-1) 0 (0-1) 5 Paraíba do Sul (Volta Redonda) 6 0,33 ± 0,82 10 0,10 ± 0,32 0 (0-2) 0 (0-1) 6 Preto (R. das Flores) 1 0,00 10 0,20 ± 0,63 0 (0-2) 7 Paraíba do Sul (Três Rios) - - 2 0,50 ± 0,71 0,5 (0-1) 8 Paraibuna (Levy Gasparian) 3 0,00 9 0,22 ± 0,44 0 (0-1) 9 Piabanha (Petrópolis) 10 0,30 ± 0,48 - - 10 Paraíba do Sul (Três Rios) - - 6 0,33 ± 0,52 0 (0-1) 11 Paraíba do Sul (Além Paraíba) 4 0,00 - - 12 Paraíba do Sul (Anta-Sapucaia) - - 11 0,18 ± 0,40 0 (0-1) 14 Pomba (Sto. A. de Pádua) 1 0,00 4 0,00 15 Paraíba do Sul (São Fidélis) - - 2 0,00 16 Dois Rios (São Fidélis) 6 0,00 8 0,00 17 Muriaé (Italva) 5 0,40 ± 0,89 10 0,10 ± 0,32 0 (0-2) 0 (0-1) 18 Paraíba do Sul (Campos dos G.) 4 0,50 ± 0,58 3 0,67 ± 1,15 0,5 (0-1) 0 (0-2) 19 Paraíba do Sul (São J. da Barra) 3 0,67 ± 0,58 - - 1 (0-1) N = número de animais (machos e fêmeas) Valores: Média ± Desvio Padrão Mediana (mínimo-máximo)

93 A tabela 16 mostra a freqüência de eritrócitos com micronúcleos (‰) no sangue de cascudos ( H. affinis e H. luetkeni ) capturados nos diferentes locais no período de chuvas. Apesar do reduzido número de indivíduos, as freqüências de células com micronúcleo foram aparentemente mais elevadas nos cascudos coletados em Além Paraíba (11) no caso do H. affinis e em Levy Gasparian (rio Paraibuna) (8), no caso do H. luetkeni . Na tabela 16 pode-se notar ainda que na Local8, enquanto os H. luetkeni (N=6) tiveram 1,17 ± 0,98 ‰ dos eritrócitos com micronúcleos, os H. affinis (N=10) não apresentaram nenhuma célula vermelha com micronúcleos (0,00 ‰). Apesar do menor número de peixes analisados, ocorreu comportamento semelhante com os H. affinis e H. luetkeni coletados em Volta Redonda no período de estiagem ( tabela 17 ). Os H. affinis (N=2) não apresentaram MN, enquanto os H. luetkeni (N=4) apresentaram freqüências de 0,5 ±0,71‰ eritrócitos com MN.

Tabela 16 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de H. affinis e H. luetkeni coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas.

H. affinis H. luetkeni Locais de Rio amostragem Número de Freqüência de Número de Freqüência de (município) animais * micronúcleos (‰) animais * micronúcleos (‰)

2 Paraíba do Sul (Paraibuna) 2 0,00 - -

4 Paraíba do Sul (Barra Mansa) 1 1,00 - -

5 Paraíba do Sul (Volta Redonda) - - 9 0,00

l6 Preto (Rio das Flores) - - 9 0,25± 0,71 0 (0-2) 8 Paraibuna (Levy Gasparian) 10 0,00 6 1,17 ± 0,98 1 (0-3) 9 Piabanha (Petrópolis) 7 0,57 ± 0,79 - - 0 (0-2) 11 Paraíba do Sul (Além Paraíba) 2 1,50 ± 0,71 - - 1,5 (1-2) 14 Pomba (St. Ant. Pádua) 2 0,17 ± 1,41 - - 1 (0-2) 18 Paraíba do Sul (Campos dos G.) 6 0,17± 0,41 - - 0 (0-1) 19 Paraíba do Sul (S. João da Barra) 3 1,00 ± 1,00 - - 1 (0-2) * - machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo)

94 Tabela 17 : Freqüência de eritrócitos com micronúcleos no sangue de H. affinis e H. luetkeni, coletado em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem.

H. affinis H. luetkeni Locais de Rio amostragem Número de Freqüência de Número de Freqüência de (município) animais * micronúcleos (‰) animais * micronúcleos (‰)

1 Paraitinga (São L. do Paraitinga) 9 0,33 ± 0,71 - - 0 (0-2) 2 Paraíba do Sul (Paraibuna) 2 0,5 ± 0,71 1 0,00 0,5 (0-1) 3 Paraíba do Sul ( São J. Campos ) 4 1,50 ± 1,29 - - 1,5 (0-3) 4 Paraíba do Sul (Barra Mansa) 6 0,33 ± 0,52 - - 0 (0-1) 5 Paraíba do Sul (Volta Redonda) 4 0,00 2 0,5 ± 0,71 0,5 (0-1) 6 Preto (Rio das Flores) - - 6 0,80 ± 0,84 1 (0-2) 7 Paraíba do Sul (Três Rios) 2 0,00 - -

8 Paraibuna (Levy Gasparian) 1 2,00 6 0,00

10 Paraíba do Sul (Três Rios) 4 0,25 ± 0,50 - - 0 (0-1) 12 Paraíba do Sul (Anta-Sapucaia) 2 0,00 2 0,00

13 Paraíba do Sul (Sapucaia) - - 7 0,71 ± 1,11 0 (0-3) 16 Dois Rios (São Fidélis) 2 0,00 - -

18 Paraíba do Sul (Campos dos G.) 2 0,00 - -

* machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo)

A freqüência de eritrócitos com micronúcleos determinada em peixes capturados no período de estiagem é mostrada na tabela 17 . No período de estiagem, a maior freqüência de células com micronúcleo no sangue de H. affinis ocorreu nos indivíduos coletados no rPS no local de São José dos Campos (3). Na local 8 apenas 1 H. affinis foi analisado. As freqüências de células com MN no sangue dos H. luetkeni coletados no período de estiagem variaram de 0,00 a 0,71 ±1,11 ‰.

95 4.5 Determinação da Atividade de Etoxiresorufina-O-desetilase (EROD) na fração S9 hepática

A figura 13 mostra a distribuição dos valores encontrados para atividade de EROD no fígado (fração S9) dos G. brasiliensis coletados neste estudo. Com base nesta distribuição, classificamos os valores de atividade de EROD encontrados nesta espécie (tabela 18 ) em quatro faixas crescentes cujos limites foram os quartis inferior e superior e a mediana ( figura 13 ). Locais em que os peixes apresentaram valores medianos de atividades de EROD menores ou iguais a 16,4 pmol/mim/mg de proteína (resultado observado no primeiro quartil – 25% da população) foram classificadas na faixa 1. Locais em que as medianas eram maiores que 16,4 e inferiores ou iguais a 35,53 pmol/mim/mg de proteína foram classificados na faixa 2. Locais em que os peixes apresentaram medianas de atividade maiores que 35,53 e iguais ou menores que 61,07 pmol/mim/mg de proteína foram classificadas na faixa 3. Os locais em que a mediana dos resultados foi maior que 61,07 foram classificados na faixa 4. Esta classificação foi uma forma de comparar os níveis de atividade de EROD entre os locais.

96 Descriptive Statistics Variáveis: Atividade de EROD em Chuva e Estiagem Variable: CHU/EST

Anderson-Darling Normality Test A-Squared: 12.08 p-value: 0.00

Mean 48.50 Std Dev 48.46 Variance 2348.69 Skewness 1.96 Kurtosis 4.02 0 100 200 300 n of data 197.00 Minimum 1.20 1st Quartile 16.04 Median 35.53 3rd Quartile 61.07 Maximum 257.68 95% Confidence Interval for Mu 95% Confidence Interval for Mu 41.69 55.31 28 38 48 58 95% Confidence Interval for Sigma 44.10 53.79 95% Confidence Interval for Median 95% Confidence Interval for Median 28.12 41.08

Figura 13: Distribuição dos valores de atividade de EROD (pmols de resorufina/min/mg de proteína) em G. brasiliensis utilizados neste estudo nas diferentes locais da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas e estiagem.

Na tabela 18 pode-se observar o enquadramento dos locais de coleta de G. brasiliensis, nos períodos de chuva e estiagem, segundo valores de mediana ( tabela 19 ) da atividade de EROD.

97 Tabela 18 : Enquadramento das locais de coleta, nos períodos de chuva e estiagem, segundo faixas crescentes de atividade de EROD em fração S9 hepática de G. brasiliensis. Para classificação foram utilizados os valores da mediana de cada Local(representada pelos códigos). Faixas Atividade de EROD Locais de coleta

(pmol/min/mg de proteína) Chuvas Estiagem

1 ≤≤≤ 16,4 2, 6 e 17 14, 17, 18 2 16,5 a 35,53 3, 4, 5, 9*, 11*,14, e 18 3, 15*, 16 3 35,54 a 61,07 16 e 19* 2, 5, 6, 10*, 4 ≥≥≥ 61,08 8 1, 4, 7*, 8, 12* * - Local não amostrado em um dos períodos

As médias e respectivos desvios padrão da atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis , ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas pode ser visualizado na figura 14 e na tabela 7a .

Geophagus brasiliensis 2 - Par aibuna 3 - S. J. Campos 250 4 - B. Mansa 5 - V. Redonda 200 6 - R. Flores* 8 - Levy Gasparian 150 9 - Petrópolis* 100 11 - Além Paraíba proteína) 14 - S. A. Pádua* 50 16- S. Fidélis* 17 - Italva*

Atividadede EROD (pmol/min/mg de 0 18 - Campos 2 3 4 5 6 8 9 111416171819 19 - S.João da Barra Regiões de coleta

Figura 14: Atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Valores: Média ± Desvio Padrão ______*No - Afluentes período do de rio chuvas,Paraíba do as Sul locais de Paraibuna (2), Rio das Flores (6) e Italva (17) apresentaram os menores valores de atividade de EROD ( tabelas 18 e 7a; figura 14 ) e foram classificadas na faixa 1. 98 Valores intermediários de atividade de EROD em fígados de G. brasiliensis, classificados na faixa 2, foram obtidos nas locais de São José dos Campos (3), Barra Mansa (4), Volta Redonda (5), Petrópolis (9), Além Paraíba (11), S. A. Pádua (14) e Campos (18) no período de chuvas ( tabela 18 ). São Fidélis (16) e São João da Barra (19) apresentaram medianas maiores do que 35,53 pmol/mim/mg de proteína ( tabela 18 ) e foram classificados na faixa 3. A mais elevada atividade de EROD no período de chuvas ( tabela 18 e 7a; figura 14 ) foi registrada na Localde Levy Gasparian (8), no rio Paraibuna-mineiro, mas apenas três indivíduos foram coletados neste local. Quando se compara as médias dos valores extremos de atividade (locais 8 e 17) observa-se que o valor superior (Local8 – Levy Gasparian) é cerca de 19 vezes (p=0,021) maior que o inferior (Local17, Italva).

G. brasiliensis 1 - São L. do Paraitinga* 2 - Paraibuna

250 Trecho médio-inferior 3 - São J. dos Campos 4 - Barra Mansa 200 5 - Volta Redonda 6 - Rio das Flores* 7 - Três Rios 150 8 - Levy Gasparian* 10 - Três Rios 100 12 - Sapucaia 14 - S. A. Pádua Atividadede EROD 50 15 - São Fidélis 16 - São Fidélis* (pmol/mim/mgde proteína) 0 17 - Italva* 1 2 3 4 5 6 7 8 10 12 14 15 16 17 18 18 - Campos Regiões de Coleta

Figura 15 : A tividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Valores: Média ± Desvio Padrão

Os valores médios da atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis coletados em diferentes locais da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem podem ser visualizados na figura 15 e na tabela 18 e 10a . No período de estiagem, as medianas das atividades de EROD de G. brasiliensis coletados em Santo A. Pádua (14), Italva (17) e Campos (18) foram menores que 16,4 pmol/mim/mg de proteína (faixa 1). No mesmo período valores medianos de atividade

99 de EROD incluídos na faixa 2 (16,5-35,53 pmol/min/mg de proteína) foram obtidos nas locais São José dos Campos (3) e São Fidélis (15 e 16). Os valores medianos de EROD registrados nas locais de Paraibuna (2), Volta Redonda (5), Rio das Flores (6) e Três Rios (10) foram classificados na faixa 3. (35,54 a 61,07 pmol/min/mg de proteína). Os maiores valores de mediana na atividade de EROD em G. brasiliensis (faixa 4, ≥61,07 pmol/min/mg de proteína) foram encontrados nos peixes coletados em São Luiz do Paraitinga (1), Barra Mansa (4), Três Rios (7), Levy Gasparian (8) e Sapucaia (12); todas com exceção da Local1, pertencentes ao trecho médio-inferior da bacia do rio Paraíba do Sul ( figura 15 ).

Geophagus brasiliensis Período de Chuvas

250 Período de Estiagem

200

150

proteína) 100

50 Atividade de EROD (pmol/min/mg de deEROD (pmol/min/mg Atividade

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 15 16 17 18 19 Regiões de coleta Figura 16: Comparação das atividades de EROD em G. brasiliensis entre os períodos de chuva e estiagem. Valores: Média ± Desvio Padrão

Na tabela 18 e figura 16 pode-se verificar que não há uma tendência única com relação a alterações na atividade de EROD entre os períodos de chuva e estiagem. As locais de Italva (17), São José dos Campos (3) e Levy Gasparian (8) destacam-se por permanecerem na mesma faixa de classificação tanto na época de chuvas quanto na de estiagem. Possíveis diferenças entre sexos quanto à atividade de EROD foram investigadas em machos, fêmeas e fêmeas ovadas. Esta comparação deve ser realizada entre peixes coletados na mesmo local e período uma vez que estas variáveis podem estar associadas

100 à concentração de poluentes indutores de EROD (CYP1A1). Por este motivo, e devido a limitações quanto ao número de peixes amostrados, a comparação entre gêneros foi realizada somente com peixes coletados na Local8 (rio Paraibuna-mineiro na cidade de Levy Gasparian), onde se conseguiu capturar maior quantidade de peixes no período de estiagem. Na figura 17 constata-se que a atividade de EROD nas fêmeas de G. brasiliensis foi menor do que nos machos (p<0,05). Não houve diferença estatística entre fêmeas não ovadas e fêmeas ovadas ( figura 18 ).

G. brasiliensis - REGIÃO 8

140

120 *

100

60 proteína) 40

Ativdade de EROD de de Ativdade (pmol/min/mg N = 10 N = 9 Machos Fêmeas

Figura 17: Atividade de EROD em machos e fêmeas de G. brasiliensis coletados no rio Paraibuna-mineiro na cidade de Levy Gasparian (Local8) no período de estiagem. * - P=0,047

G. brasiliensis - REGIÃO 8

140 120 100 80 60 proteína) 40 20 0 N = 9 N = 5 Ativdade de EROD (pmol/min/mg de de EROD (pmol/min/mg de Ativdade Fêmeas Fêmeas ovadas

Figura 18: Atividade de EROD em fêmeas e fêmeas ovadas de G. brasiliensis coletados no rio Paraibuna-mineiro na cidade de Levy Gasparian (Local8) no período de estiagem.

101 As atividades de EROD em S9 hepática nas duas espécies de cascudo (0,36 ±0,18 a 2,63 ±1,70) estudadas foram consistentemente mais baixas do que as atividades de EROD em S9 hepática em G. brasiliensis (8,32 ±6,31 a 157,98 ±37,93) em todas as locais e períodos ( tabelas 7a a 12a ). Entretanto quando compara as duas espécies de cascudos estudadas ( H. luetkeni e H. affinis ) não encontramos diferenças quanto a atividade de EROD ( figuras 19 e 20 ). As atividades de EROD de H. affinis variaram entre locais no período de chuvas de 0,84 ±0,40 a 2,15 ±1,12 ( tabela 8a ). Peixes coletados nas locais de Paraibuna (2) e Petrópolis (9) (que não diferem entre si) apresentaram atividade de EROD menor do que peixes coletados em Campos (18), Volta Redonda (5) e Levy Gasparian (8). As atividades dos H. affinis coletados em Campos foram maiores do que a daqueles coletados em São João da Barra. As atividades de EROD de H. luetkeni variaram entre locais no período de chuvas de 1,35 ±0,56 a 2,63 ±1,70 ( tabela 9a ). A atividade de EROD não diferiu entre as locais de Barra Mansa (4), Rio das Flores (6) e Levy Gasparian (8). No período de estiagem as atividades de EROD variam de 0,41 ±0,07 em Campos (18) a 1,70 ±0,59 em Sapucaia (12), em H. affinis ( tabela 11a ), e de 0,52±0,20 em Rio das Flores (6) a 2,18 ±0,45 em Sapucaia, em H. luetkeni (tabela 12a ), respectivamente. A atividade de EROD em peixes coletados no período de estiagem, em S.L do Paraitinga (1), Barra Mansa (4) e Volta Redonda (5) apresentam os valores mais elevados que diferem estatisticamente dos valores de EROD em peixes coletados em São José dos Campos (3) e Três Rios (10) (p<0,05). Em H. luetkeni , os valores de EROD em peixes coletados no período de estiagem nos locais 8 e 13 não diferem entre si, mas diferem dos da Local6 (p=0,0021 e p=0,01 respectivamente) Assim os H. luetkeni que apresentaram maior atividade de EROD foram os coletados em Levy Gasparian e Sapucaia, resultado similar ao obtido com G. brasiliensis .

102

2 - Paraibuna 4 - Barra Mansa 5 - Volta Redonda 6 - Rio das Flores* 8 - Levy Gasparian* Hypostomus affinis Hypostomus luetkeni 9 - Petrópolis* 11 - Além Paraíba 5 14 - S. A. Pádua 4 5 18 - Campos 3 4 19 - São J. da Barra 3 2

deproteína) 2 1 de proteína) de 1 0 0

Atividadede(pmol/mim/mgEROD 2 5 8 9 11 14 18 19 4 6 8

Regiões de Coleta Atividade (pmol/mim/mgde EROD Regiões de Coleta

Figura 19: Atividade de EROD em S9 hepática de H. affinis e H. luetkeni coletados nas diferentes locais de 1 - São L. do Paraitinga* coleta no período de chuva (Média ± desvio padrão). 2 - Paraibuna 3 - São J. dos Campos 4 - Barra Mansa

5 - Volta Redonda

6 - Rio das Flores* 7 - Três Rios 8 - Levy Gasparian* 10 - Três Rios 12 - Sapucaia Hypostomus affinis Hypostomus luetkeni 13 - Sapucaia 2,50 2,50 16 - São Fidélis* 2,00 2,00 18 - Campos 1,50 1,50

1,00 1,00 proteína)

proteína) 0,50 0,50 (pmol/mim/mg de (pmol/mim/mg de Atividade de EROD Atividade de EROD 0,00 0,00 1 2 3 4 5 7 8 10121618 5 6 8 12 13 Regiões de coleta Regiões de coleta

Figura 20: Atividade de EROD em S9 hepática de H. affinis e H. luetkeni coletados nas diferentes locais de coleta no período de estiagem (Média ± desvio padrão).

______

* - Afluentes do rio Paraíba do Sul

103

4.6 Quantificação de Metais

A tabela 19 mostra as concentrações de cromo, manganês, zinco, cobre, chumbo, níquel e mercúrio no tecido muscular de G. brasiliensis coletados no período de chuvas em diferentes locais da bacia do rio Paraíba do Sul.

Tabela 19 : Concentração de metais no músculo de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA). Locais de Concentração de Metais ( µg/g de peso úmido) coleta Cr Mn Zn Cu Pb Ni Hg 4 1,12 ± 0,11 0,11 ±0,06 3,10 ± 0,65 0,11 ± 0,04 0,10 ± 0,08 0,22 ± 0,12 0,09 ± 0,04 (9) (6) (6) (9) (7) (9) (9) 14 0,24 ± 0,14 0,23 ±0,10 3,15 ±0,50 0,06 ±0,07 0,09 ± 0,13 0,21 ± 0,19 0,09 ± 0,08 (2) (2) (2) (2) (2) (2) (2) 16 0,23 ± 0,12 0,07 ±0,06 3,01 ± 0,28 0,07 ± 0,05 0,10 ± 0,12 0,14 ± 0,04 0,07 ± 0,02 (6) (6) (6) (6) (7) (5) (5) 17 0,10 ± 0,03 0,17 ±0,16 3,15 ± 0,50 0,13 ± 0,07 0,09 ± 0,13 0,19 ± 0,13 0,05 ± 0,01 (2) (2) (2) (2) (2) (3) (3) 18 0,21 0,67 3,65 0,13 0,19 0,32 ± 0,03 0,06 ± 0,01 (1) (1) (1) (1) (1) (2) (2) 19 0,27 0,45 ±0,09 3,86 0,15 0,14 0,11 0,04 ± 0,02 (1) (3) (1) (1) (1) (1) (2) ANVISA - - - - 2,0 - 0,5 Cr-cromo, Mn-manganês, Pb-chumbo, Zn-zinco,Cu-cobre, Ni-níquel e Hg-mercúrio Valores : média ± desvio padrão valor entre parênteses = (número de peixes analisados)

A tabela 20 mostra as concentrações de cromo, manganês, zinco, cobre, chumbo, níquel e mercúrio no tecido muscular de G. brasiliensis coletados na bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem.

104 Tabela 20 : Concentração de metais no músculo de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA). Locais de Concentração de Metais ( µg/g de peso úmido) coleta Cr Mn Pb Zn Cu Hg Ni 2 0,11 ± 0,11 Ndetc ND 3,00 ± 0,44 0,11 ± 0,07 0,12 ± 0,04 0,16 ± 0,14 (5) (5) (4) (5) (5) (5) 5 0,20 ± 0,08 Ndetc 0,18 ± 0,20 4,03 ± 0,85 0,21 ± 0,21 ND 0,04 ± 0,05 (5) (5) (5) (5) (5) (5) 6 0,18 ± 0,09 Ndetc 0,08 ± 0,08 1,96 ± 1,70 0,25 ± 0,20 0,11 ± 0,02 0,03 ± 0,03 (5) (3) (5) (3) (5) (5) (5) 7 0,16 Ndetc 0,18 ± 0,03 3,70 ± 0,01 0,17 ± 0,04 ND 0,01 ± 0,02 (1) (1) (2) (2) (2) (3) 8 0,13 ± 0,13 Ndetc 0,18 ± 0,15 3,36 ± 0,32 0,58 ± 0,90 0,10 ± 0,01 0,22 ± 0,21 (5) (5) (5) (5) (5) (5) 10 0,16 ± 0,04 0,35 ±0,04 0,19 ± 0,22 3,43 ± 0,67 0,30 ± 0,14 ND Ndetc (4) (2) (4) (4) (4) (3) 12 0,15 ± 0,08 0,48 ±0,10 0,53 ± 0,27 2,80 ± 0,34 0,28 ± 0,07 ND 0,02 ± 0,04 (3) (4) (5) (4) (4) (5) 16 ND ND ND ND ND 0,14 ± 0,05 ND (5) ANVISA - - 2,0 - - 0,5 - Cr-cromo, Mn-manganês, Pb-chumbo, Zn-zinco,Cu-cobre, Ni-níquel e Hg-mercúrio Valores : média ± desvio padrão ND – Valor não determinado Ndetc – Valor não detectável valor entre parênteses = (número de peixes analisados)

Como pode ser constatado nas tabelas 19 e 20 , os níveis de Hg e Pb no tecido muscular de G. brasiliensis , coletados na bacia do rio Paraíba do Sul são muito inferiores ao máximo admitido pela legislação da ANVISA. A tabela 21 mostra as concentrações dos metais analisados no músculo de H. luetkeni coletados na bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas.

105 Tabela 21 : Concentração de metais no músculo de H. luetkeni coletados em Barra Mansa do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA). Localde N Concentração de Metais ( µg/g de peso úmido) coleta Cr Mn Pb Zn Cu Ni Hg

4 4 0,30 ± 0,32 0,39 ± 0,11 0,14 ± 0,04 2,41 ± 0,11 0,15 ± 0,03 0,40 ± 0,13 0,04 ± 0,02 ANVISA - - 2,0 - - - 0,5 Cr-cromo, Mn-manganês, Pb-chumbo, Zn-zinco,Cu-cobre, Ni-níquel e Hg-mercúrio Valores : média ± desvio padrão

A tabela 22 compara as concentrações de cromo, manganês, zinco, cobre, chumbo, níquel e mercúrio no tecido muscular de H. affinis e H. luetkeni coletados na bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem.

Tabela 22 : Concentração de metais no músculo de H. affinis e H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Níveis máximos permitidos de acordo com a regulamentação brasileira (ANVISA). Locais de Concentração de Metais ( µg/g de peso úmido) coleta Cr Mn Pb Zn Cu Ni H. affinis 10 ND ND ND 3,56 0,14 0,36 (1) (1) (1) 12 0,09 0,28 0,27 2,81 0,25 ND (1) (1) (1) (1) (1) H. luetkeni 12 0,21 ± 0,16 0,17 0,05 ± 0,04 3,01 ± 0,70 0,20 ± 0,04 0,04 ± 0,06 (2) (1) (2) (2) (2) (2) 13 0,96 ± 1,98 0,18 ± 0,06 0,25 ± 0,24 2,74 ± 0,50 0,14 ± 0,13 0,03 ± 0,04 (5) (5) (5) (5) (5) (5) ANVISA - - 2,0 - - - Cr-cromo, Mn-manganês, Pb-chumbo, Zn-zinco,Cu-cobre e Ni-níquel Valores : média ± desvio padrão valor entre parênteses = (número de peixes analisados)

Como pode ser constatado nas tabelas 21 e 22 , os níveis de Hg e Pb no tecido muscular de cascudos ( H. affinis e H. luetkeni) capturados na bacia do rio Paraíba do Sul estão muito abaixo do máximo permitido pela legislação da ANVISA.

106 5. Discussão 5.1 Medidas das variáveis físicas e físico-químicas No Brasil, a legislação CONAMA 20 (1986) classifica as águas doces, salobras e salinas de acordo com seus níveis de qualidade, avaliados por parâmetros e indicadores específicos, de modo a assegurar seus usos preponderantes. A alteração do pH da água pode afetar a biodisponibilidade das substâncias. Águas com pH alto dificultam a excreção de amônia e isto pode causar a morte de peixes e outros organismos. Neste estudo procuramos verificar se a qualidade das águas, avaliada por meio da medida das variáveis físicas e físico-químicas, estava de acordo com o estabelecido pela legislação (pH entre 6-9 e OD > 5 mg/L). Valores de pH estavam dentro dos limites estabelecidos pela legislação nos dois períodos de captura e em todas as regiões de coleta ( tabela 5 e 6 ). A quantidade de OD em corpos hídricos sofre flutuações diárias e sazonais, como observado em algumas regiões. No nosso estudo verificamos que os valores de OD nas regiões de São José dos Campos (período de chuvas e estiagem) e São Fidélis – rio Dois Rios (período de chuvas) estavam abaixo do mínimo exigido pela legislação. No período de estiagem, e no horário da manhã, os valores de OD medidos nos rios Pomba, Dois Rios e Paraíba do Sul na cidade de Paraibuna-SP encontravam-se abaixo do valor mínimo estabelecido pelo CONAMA. A variação da concentração de oxigênio dissolvido no ambiente aquático pode resultar de fatores químicos (poluentes orgânicos ou inorgânicos que influenciam na demanda de oxigênio da água), físicos (o aumento da temperatura contribui para o aumento da difusão do OD da água para o ar) ou biológicos (por meio da degradação aeróbica da matéria orgânica por bactérias). A medida de condutividade refere-se à capacidade da água em conduzir uma corrente elétrica. Quanto maior for a concentração de íons, maior será a condutividade. Valores de condutividade estavam mais elevados, nos dois períodos de coleta, na região de São José dos Campos e Três Rios, quando comparado com as demais regiões estudadas ( tabelas 5 e 6 ). Entretanto, se levarmos em conta os limites mais rígidos recomendados pela CEPIS, OPS/OMS, 1963/64 [ apud Martos & Maia, 1997] para manutenção de organismos aquáticos dulcícolas, as únicas regiões que estavam com condutividade adequada seriam: São Luiz do Paraitinga, Paraibuna e Rio das Flores. Todas as demais regiões estudadas apresentaram valores acima do limite máximo recomendado (0,03mS/cm).

107 5.2 Índice hepático e fator de condição

5.2.1 Índice Hepático Constatamos que os G. brasiliensis coletados em Volta Redonda apresentavam o fígado com acúmulo visível de gordura. É importante ressaltar que a capacidade do fígado armazenar alguns triglicerídeos e degradar ácidos graxos pode ser alterada pela exposição a determinados compostos químicos. Adams et al. (1996) discutem a possibilidade do fígado aumentar de tamanho após a exposição por compostos organoclorados e atribuem este efeito ao aumento do armazenamento de lipídios neste órgão. Acúmulo de lipídios pode ocorrer devido a modificações do metabolismo ou, de forma indireta, após alterações induzidas na cadeia alimentar por xenobióticos (Adams, 1989). O metabolismo de compostos endógenos e de xenobióticos requer a síntese de enzimas específicas. A indução da atividade enzimática pode resultar da maior quantidade de enzimas no fígado. Este aumento da síntese protéica – se suficientemente intenso – pode levar a aumento do volume dos hepatócitos e hipertrofia do fígado. Apesar do aumento de atividade de EROD ter sido correlacionado a um aumento do peso do fígado em alguns trabalhos, uma relação direta entre a indução de CYP1A e a elevação do IH ainda não foi estabelecida de forma consistente na literatura (Whyte, 2000). A indução de EROD após a exposição ao contaminante é geralmente observada em dias (ver anexo 2) enquanto alterações físicas na estrutura do fígado, quando ocorrem, podem levar semanas (Schank et al., 1997 [ apud Whyte, 2000]). Por esta razão a medida do IH indicaria efeitos de exposição que não é recente. Payne (1987) considera o aumento do peso do fígado como uma lenta resposta adaptativa, enquanto a indução enzimática poderia ser considerada uma resposta adaptativa rápida. A ausência de correlação entre as variáveis IH e atividade de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis é sugerida também neste estudo pela regressão linear mostrada na figura 21 , cujos R 2 foram 0,032, no período de chuvas e 0,017, no de estiagem, respectivamente.

108 G. brasiliensis A B

y = 0,0024x + 1,0442 4,00 y = -0,0043x + 1,5117 4,00 R2 = 0,0175 R2 = 0,0325 3,00 3,00 2,00 2,00 1,00 1,00

ÍndiceHepático 0,00 ÍndiceHepático 0,00 0 100 200 0,00 50,00 100,00 150,00 Atividade de EROD Atividade de EROD

Figura 21: Correlação entre atividade de EROD em S9 e IH em G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul nos períodos de chuvas [A] e estiagem [B].

Whyte (2000) sugere que o aumento do fígado não relacionado à indução de CYP1A poderia ocorrer por hiperplasia. Poels (1980) encontrou aumento do peso de fígado da truta ( Salmo gairdneri ) e o associou à hiperplasia induzida por hidrocarbonetos clorados e policíclicos aromáticos na água do rio Reno. Segundo Poels (1980) não houve mudanças no volume de hepatócitos dos peixes expostos. Em experimento conduzido em laboratório com carpas ( Cyprinus carpio ), Salvo (2002) observou que o inseticida ensdosulfan aumentou o tamanho do núcleo e da quantidade de glicogênio armazenado nos hepatócitos. O significado biológico da elevação do IH durante exposições crônicas pode estar relacionado à presença de lesões no fígado, uma vez que muitas vezes a densidade ou massa afetada encontra-se aumentada em resposta a condições pré-neoplásicas ou neoplásicas. Querol (2002) sugere, entretanto, que o aumento do IH significa o acúmulo de reservas energéticas para o peixe no período de inverno, ou mesmo reservas energéticas de substâncias necessárias para a época de reprodução. Talvez por isso Van der Oost (2003) tenha classificado o IH como biomarcador inespecífico, pois suas alterações não estão relacionadas somente à exposição a xenobióticos. Portanto não se pode correlacionar diretamente o IH elevado com a exposição a poluentes em geral ou a determinados poluentes em particulares. Podemos afirmar, todavia, que os peixes provenientes de algumas regiões (faixas 1-2 e >2) estão com o peso do fígado aumentado em relação aos peixes de outras (faixa <1). Não é claro que estas diferenças reflitam uma situação de maior exposição a determinados xenobióticos. Apesar de haver poucos casos em que se pode comparar numa mesma região os IHs de H. affinis e H. luetkeni entre os períodos de chuvas e estiagem parece haver uma

109 tendência de aumento do IH no período de estiagem. Com os G. brasiliensis, entretanto, não foi observada uma tendência única. Barbiere (1990), em estudos com Loricariidae (R. aspera ), encontrou valores mais altos de IH no período de setembro a novembro (período de estiagem), e valores menores no período de reprodução (período de chuvas), sugerindo que o processo de reprodução leva à depleção as reservas orgânicas.

5.2.2 Fator de Condição Estudos na área de Ecologia e Zoologia voltados para reprodução e alimentação de peixes em geral relacionam o FC aos estágios reprodutivos dos animais, variações sazonais, diferenças entre espécies, disponibilidade de alimento e outros aspectos. Esta relação é feita por que se sabe que a reprodução e o crescimento são processos que competem pelos mesmos recursos. Segundo Lê Cren (1951), o FC pode variar segundo o teor de gordura, condições ambientais e alimentares, idade e desenvolvimento gonadal. Estes trabalhos geralmente empregam o Fator de Condição Alométrico e analisam uma população restrita a determinada localidade. Rocha (1997) relata diferenças entre as diversas formas de se calcular o FC e recomenda, que se utilize o fator alométrico, por considerar que o peixe pode não apresentar um incremento isométrico do peso como função do comprimento. Os trabalhos na área de toxicologia ambiental, por outro lado, quando usam biomarcadores de poluição em peixes [Adams (1996), Sleiderink (1996), Flammarion (1997), Al-Arabi (2002) e Porter (2003)] utilizam o FC de Fulton (isométrico) na tentativa de estabelecer relações entre FC e respostas à exposição a determinados poluentes. Esta escolha se dá porque muitas vezes, são coletados peixes da mesma espécie, porém pertencentes a diferentes populações. No presente estudo empregamos o Fator de Condição de Fulton, levando-se em consideração que, em virtude de barreiras geográficas e físicas, possivelmente se trabalhou com peixes de populações diferentes. Se tivéssemos optado por utilizar o fator de condição alométrico, mais uma variável seria inserida no estudo, e haveria a necessidade de se calcular um coeficiente de alometria para cada população. O Fator de Condição de Fulton calculado para G. brasiliensis variou entre as regiões e entre os períodos de chuva e estiagem ( figura 9 ), sendo de um modo geral mais elevado no período de chuvas. Isto pode estar relacionado à variações deste fator devido a mudanças na disponibilidade de alimentos, habitats , ciclo reprodutivo e outros aspectos, mas pode também estar relacionado ao menor aporte (ou maior diluição) dos

110 poluentes na coluna d’água, ou distribuição destes poluentes em outros compartimentos do ambiente. Como são muitas as variáveis, que influenciam o FC só se pode sugerir hipóteses. O aumento do fator de condição encontrado em G. brasiliensis coletados em regiões de Volta Redonda, Italva e Rio das Flores (no período de chuvas) e em Volta Redonda e S. A. de Pádua (no período de estiagem) pode ser atribuído à uma maior disponibilidade de alimento nestas regiões. Porter (2003), avaliando a condição de Lepomis megalotis (clima temperado) coletados à jusante da região de despejo de uma estação de tratamento de esgotos (ETE), observou que o FC destes peixes era estatisticamente maior do que o de peixes coletados em regiões de referência. Este autor atribui o resultado obtido ao fato de haver na região estudada um aumento no aporte de nutrientes, decorrente da descarga final da ETE [Dados da ETE citada: tratamento secundário – remoção de 92% de DBO (demanda bioquímica de oxigênio), 94% STS (sólidos totais em suspensão) e 89% de remoção de amônia]. Além da relação observada entre efluentes da ETE e FC, Adams et al. (1996) encontraram relação entre fontes de rejeitos industriais e FC em Lepomis auritus (clima tropical). Além disso é importante ressaltar que, outros fatores podem influenciar a disponibilidade de alimentos de uma dada região, e.g. a existência de fontes de despejo doméstico in natura, a presença de áreas de remanso e de plantas aquáticas, o tamanho populacional, a competição interpescífica, entre outros. A maioria dos estudos que associam alterações de FC decorrentes de exposição a xenobióticos foram realizados com peixes de clima temperado. Levesque (2002) encontrou menor fator de condição em Percidae ( Perca flavescens ) coletados em lagos contaminados com metais pesados (Cd, Cu e Zn). Estes dados estão de acordo com os resultados obtidos por Bervoets & Blust (2003), que sugerem que o FC do Cyprinidae Gobio gobio é reduzido após exposição a Cd, Cu, Zn, Ni, Pb e Cr. Na literatura há controvérsias em relação ao método mais adequado para realização do cálculo de FC (utilização do peso total do animal, peso do animal sem as gônadas ou peso do animal eviscerado), uma vez que a influência do peso relativo das gônadas pode variar entre as espécies. Barbieri e Verani (1987) verificaram que Hypostomus aff. plecostomus (Linnaeus, 1758), sinônimo de H. affinis, capturados na represa de Moginho, SP, apresentam valores do fator de condição maiores nos indivíduos adultos e menores nos jovens. Os autores notaram ainda, que o peso dos ovários tem influência na variação do fator de condição, e que este fator pode ser

111 utilizado como indicador do período de desova. No entanto este mesmo autor (Agostinho & Barbieri, 1990) verificou que em Rhinelepis aspera os FC obtidos antes e depois da exclusão das gônadas não diferiram significativamente entre si, validando assim a utilização do peso total no cálculo de FC. Após o estudo com FC pode-se questionar se este fator é de fato um biomarcador. Van der Oost (2003) considera o fator de condição como um biomarcador “pobre” (tabela 1 ), e outros autores, como Adams (1996) e Flammarion (1997), consideram este fator como um biomarcador útil. Talvez estes e outros autores estejam se referindo a uma alteração xenobioticamente induzida em um sistema biológico, enfocando o aspecto morfológico/fisiológico. Entretanto, se a preocupação for em relação a de que biomarcadores, por definição, dizem respeito a alterações ao nível subindividual (Van Gestel, 1996) e que o Fator de Condição é uma medida que determina efeitos ao nível de organismo, como ressaltado por Porter (2003), o FC não deve ser considerado um biomarcador. Modificações decorrentes de mecanismos biológicos, como aspectos reprodutivos e alimentares (utilizados pelos ictiólogos) também limitam o uso do FC como biomarcador.

112 5.3 Determinação da freqüência de micronúcleos Contaminantes orgânicos podem estar aderidos ao sedimento, em partículas em suspensão na água e na biota. Dependendo das características do poluente este pode causar danos citogenéticos e, dentre outros efeitos, induzir por mecanismos ainda não totalmente esclarecidos, a formação de micronúcleos nas células dos organismos expostos. Em relação às recomendações feitas por Al-Sabti (1995) para determinação da freqüência de MN em experimentos in situ , o estudo foi realizado como se segue: i) “que haja um tamanho ou classe de etária padrão de peixes em todos os pontos de amostragem”. - Exceto para H. affinis (período de estiagem), nos outros períodos e espécies os peixes analisados estavam dentro de uma mesma faixa de comprimento (variação de cerca de 10 cm). Não foi realizado nenhum estudo prévio para se estabelecer a faixa adequada, mas os indivíduos analisados eram em sua maioria adultos. ii) “que os peixes dos diferentes pontos de amostragem sejam coletados aproximadamente na mesma data”. - Na impossibilidade de se coletar na mesma data, as coletas foram agrupadas em dois períodos distintos (chuvas e estiagem); iii) “que a freqüência de micronúcleo seja calculada separadamente para cada espécie” - As contagens foram realizadas de forma individual e analisada em separado por espécies; iv) “que seja coletado o maior número de peixes possível em cada ponto (10- 20), sabendo-se que a exposição de peixes a substâncias químicas poderá variar de acordo com a espécie, dieta, variações individuais no metabolismo etc.” - Esta recomendação não foi atendida em todos as regiões de amostragem, apesar do esforço de pesca. O número de peixes não foi adequado para análise por região amostrada (19 regiões no total).

Para a detecção de atividade genotóxica de agentes clastogênicos fracos, Metcalfe (1988) sugere que sejam contados mais de 4000 eritrócitos por peixe. Entretanto este número de células analisadas nos indivíduos não é usual em estudos de determinação da freqüência de micronúcleos. Tendo em vista o desenho experimental do presente estudo isto não foi viável.

113 As freqüências de células com micronúcleos obtida no presente estudo são similares à encontrada em algumas espécies de peixes não-expostas. Sabe-se que há inúmeras diferenças de resposta a um biomarcador entre espécies, mas são pouquíssimos os estudos com micronúcleo nas espécies, ou famílias utilizadas neste estudo [Grisolia (2001), e Lemos (2002)]. De qualquer modo, as freqüências registradas neste estudo podem ser consideradas baixas se comparadas com as que tem sido registradas para outras espécies de peixe não-expostas a agentes clastogênicos ( tabela 23 ). Na tabela 23 observa-se que as freqüências espontâneas de micronúcleo variam entre as espécies estudadas. As freqüências de MN obtidas em peixes de grupos controle variam de 0,07‰, em Umbra pygmaea, a 1,8‰, em Carassius sp. Enquanto Mana & Sadhukhan (1986) [ apud Al-Sabti, 1995] encontram 10‰ nas freqüências de eritrócitos de com MN em sangue periférico de Oreochromis mossambicuis , Cavas (2003) encontra 1,72 ±0,16‰ eritrócitos com micronúcleos em sangue de Oreochromis niloticus e Grisolia (2001) encontra 1,0 ±0,5‰. Estas diferenças podem estar relacionadas à sensibilidade de cada espécie e ao ambiente de origem da espécie. Sabe- se que a freqüência de MN numa população celular é altamente dependente da cinética de proliferação. Esta taxa de proliferação, varia amplamente dependendo da espécie de peixe, do tipo celular analisado, do órgão onde a célula foi isolada (brânquias, rins ou sangue periférico) e das condições ambientais físicas como, e.g. temperatura (Al-Sabti, 1995). O modo de capturar e manter o peixe no aquário durante os experimentos também pode alterar a freqüência de MN.

114 Tabela 23 : Comparação das freqüências de micronúcleos em eritrócitos de peixes de água doce em diferentes estudos. Espécies Clima Experimento Substância N MN‰ N MN‰ Referência (Controle) (Exposto) Salmonidae Oncorhynchus T In situ - 30 0,33 ± 0,49 30 1,1 a De Flora et al., 1993 mykiss Umbridae Umbra pygmaea T Dose (mg/L) Etil 6 0,07 ± 0,04 6 0,4 ± 0,2 Hootfman & De 0;8;40 metanosulfonato 3,7 ± 1,8 Raat, 1982 (6 semanas) Cyprinidae Zacco Platypus ST coleta em rio - 41 0,7 ± 0,9 24 0,8 ± 1,04 Hayashi, M. et al. , 1998 Carassius auratus TR coleta em rio - 37 1,8 ± 1,6 22 2,32 ± 1,70 Hayashi, M. et al. , 1998 Loricariidae

H. affinis TR Coleta em rio - 33 0,41 ± 0,70 (período de chuvas)* Agrupamento dos 38 0,35 ± 0,72 (período de estiagem)* dados no presente estudo H. luetkeni TR Coleta em rio - 24 0,46 ± 0,83 (período de chuvas)* Agrupamento dos 24 0,42 ± 0,78 (período de estiagem)* dados no presente estudo Cichidae Tilapia rendalli TR Coleta em lago - 6 1,0 ± 1,0 161 1,3 ±0,6; 2,2 ±0,9; 2,1 Grisolia, 2001 ± 0,3 Oreochromis TR Coleta em lago - 6 1,0 ± 0,5 151 0,8 ± 0,8; 1,5 ±1,0; Grisolia, 2001 niloticus 1,4 ± 0,5 Oreochromis TR Laboratório (10% e Efluente de 15 1,72 ±0,16 15 6,61 ±0,41 a Cavas, 2003 niloticus 20%) (3 dias) indústria têxtil 11,11 ±0,59 a Geophagus TR Coleta em rio - 66 0,29 ± 0,70 (período de chuvas)* Agrupamento dos brasiliensis 102 0,16 ± 0,42 (período de estiagem)* dados no presente estudo Valores: média ±desvio padrão a - P<0,01 ou P<0,001 * -no presente estudo não foi definido um grupo controle T – temperado ST - Subtropical TR – tropical

115

Grisolia (2001) ao estudar freqüência de MN em T. rendalli e O. niloticus do Lago Paranoá (Brasília) não encontrou diferenças na entre peixes das regiões de coleta, nem diferença em relação a peixes do grupo controle ( tabela 23 ). As freqüências de eritrócitos com MN nestes ciclídeos foram mais elevadas que as que observamos no acará. Hypostomus ancistroides, coletados na primavera de 2001 em cinco regiões do Alto Ribeirão Cambé (Londrina-PR), não apresentaram diferenças quanto a freqüência de eritrócitos com MN, apesar do rio, em algumas destas regiões receber descargas domésticas, industriais e agrícolas (Frederico, 2002). Apesar da freqüência de eritrócitos com MN ser um indicador de dano genotóxico muito utilizado em estudos de campo, ele tem algumas limitações que devem ser consideradas. Metcalfe (1988) afirma que uma das principais limitações do emprego da freqüência de micronúcleos é a falta de sensibilidade deste biomarcador. Assim os resultados dos estudos de Grisolia (2001), Frederico, (2002) e do presente trabalho não indicam a ausência de exposição dos peixes a agentes genotóxicos, mas sim que esta exposição foi inferior ao limite de detecção deste indicador. Além disto, em geral pouco se sabe sobre a taxa de hematopoiese e a produção de eritrócitos nas espécies de peixes utilizadas (Al-Sabti, 1994). O número de eritrócitos no sangue de peixes varia entre 1-3 x 10 6 células/mL (Al-Sabti, 1994). Poluentes como o Arochlor 1254, o benzo[ a]pireno, o cromo hexavalente e trivalente, o metil mercúrio, o DDT e os PCBs, que não são agentes genotóxicos foram relacionados com o aumento da freqüência de micronúcleos (Al-Sabti,1995). Al-Sabti (1995) ressalta que é possível que o metil mercúrio, o DDT e os PCBs induzam MN através da inativação das fibras do fuso acromático, e não por serem genotóxicas. Os resultados obtidos em uma mesma região de coleta - região 8 (rio Paraibuna , cidade de Levy Gasparian) e região 5 (rPS, cidade de Volta Redonda) – sugerem que H. affinis e H. luetkeni diferem quanto a freqüência de eritrócitos com micronúcleo. H. luetkeni (N=10) apresenta freqüências mais elevadas (1,17 ± 0,98‰) de eritrócito com MN do que H. affinis (N=6 e freqüência de MN = 0,00‰). Em virtude do reduzido número de indivíduos coletados não foi possível avaliar esta diferença em outras regiões. Estudos em condições de laboratório devem ser realizados para comparar a sensibilidade das duas espécies a agentes genotóxicos.

116

5.4 Determinação da Atividade de EROD em fração S9 hepática Há muitos trabalhos que determinam a atividade de EROD na fração microssomal hepática. A fração microssomal é mais purificada do que a fração S9 que, além das membranas do retículo endoplasmático, contém também o citosol. Neste estudo, entretanto, as atividades de EROD foram medidas na fração S9 hepática dos peixes. Segundo O'Hare et al . (1995) e Whyte (2000) a atividade de EROD na fração S9 é menor do que a registrada na fração microssomal, mas ela é perfeitamente mensurável e o fator de indução encontrado é comparável ao determinado usando os microssomas. A vantagem de utilizar a S9 para fins de biomonitoramento, é que ela é mais simples, barata e rápida, em comparação a fração microssomal, e fornece essencialmente, a mesma informação (nível de indução). Não há dados de literatura sobre a temperatura ótima para determinação de EROD em fígado de G. brasiliensis, H. affinis ou H. luetkeni . A temperatura selecionada (30ºC) neste estudo foi definida em testes piloto realizados em nosso laboratório, em que verificamos que a reação foi linear durante o tempo de registro. Whyte (2000) comenta que amplas variações de EROD são comuns em investigações em campo, o que não ocorre em estudos de laboratório. Entre as razões apresentadas por este autor para esta variação destacam-se fatores como a mobilidade, diferenças individuais na fisiologia, no estado nutricional, reprodutivo e na quantidade de poluentes acumulados ao longo da vida do animal. Desta forma, os altos coeficientes de variação da atividade média de EROD obtidos neste trabalho foram de certa forma esperados porque os peixes coletados numa dada região podem não formar um grupo uniforme. Alguns estudos como o de Flamarion (1997) chegam a obter um coeficiente de variação, dentro de um mesmo grupo de peixes, de cerca de 100% ou mais. As atividades de EROD em S9 hepática de G. brasiliensis, coletados em diferentes regiões da bacia do rio Paraíba do Sul, nos períodos de chuva e estiagem, sugerem que há diferenças entre as regiões estudadas. Estas diferenças podem estar relacionadas ao tipo de poluente a que os peixes foram expostos nos diversos locais da bacia do rio Paraíba do Sul. Italva destaca-se como a única região em que os peixes coletados apresentaram baixos valores de EROD no período de chuvas e estiagem. Não se pode afirmar, entretanto, que os níveis basais (constitutivos, não induzidos) da atividade de EROD

117 sejam os que foram encontrados nestas regiões. Para que estes níveis basais sejam determinados são necessários experimentos em condições controladas. Apesar de não se poder afirmar que os níveis de EROD nos G. brasiliensis de Italva sejam os “basais”, eles provavelmente estão muito próximos dos níveis constitutivos e foram considerados operacionalmente como limite inferior, ou referência, para estimar a indução da atividade de EROD em outras regiões. No período de chuvas valores de EROD compreendidos na faixa 2 foram obtidos na maioria das regiões ( tabela 18 ). Os valores de EROD situados nesta faixa são cerca de 2 a 3,5 vezes maiores do que aqueles encontrados em peixes cuja atividade estava na faixa 1 (atividades menores do que 16,4 pmol/min/mg de proteína). Na região de São Fidélis, representada pelo rio Dois Rios e São João da Barra, as atividades de EROD de G. brasiliensis estavam na faixa 3 no período de chuvas correspondendo a um aumento de mais de 3 vezes em relação às atividades classificadas na faixa 1. As atividades de EROD em peixes das regiões de São José dos Campos (3) e São Fidélis (15 e 16) foram classificadas na faixa 2 ( tabela 18 ) no período de estiagem. Nas regiões de Paraibuna (2), Volta Redonda (5), Rio das Flores (6), e Três Rios (10) as atividades foram classificadas na faixa 3 ( tabela 18 ) no período de estiagem. Segundo Gibson & Skett (1994) pode-se considerar que há uma expressiva indução de EROD quando há aumento de atividade de 8 a 16 vezes, mas outros autores como Al-Arabi (2002) e Gravato (2002), valorizaram aumentos estatisticamente significativos da atividade de EROD 8 ou menos vezes os níveis do controle, em experimentos conduzidos em laboratório com poluentes e fármacos. A amplitude do aumento da atividade depende, entre outros fatores, do tempo de exposição e do poluente em questão. São Fidélis, Campos e São João da Barra pertencem ao trecho inferior da bacia e, nestas regiões, de acordo com dados da literatura, as principais atividades com potencial de impacto no leito do rio são relacionadas às indústrias de álcool, açúcar e bebidas derivadas do cultivo da cana-de-açúcar. Alguns piretróides e pesticidas organoclorados têm se mostrado potenciais indutores da atividade de EROD em peixes (Jansen et al ., 1991). Jansen et al . (1991) demonstraram que trutas ( Oncorhynchus mykiss ) expostas ao inseticida endosulfan exibiram fraca, porém significativa, indução de EROD, após 24h, quando comparadas ao controle. Deér (1996) verificou que a deltametrina aumentou a atividade de EROD em carpas ( Cyprinus carpio ) após 72h de exposição a este inseticida piretróide na água.

118 Assim, a maior atividade de EROD em peixes coletados em algumas regiões pode dever-se à exposição a pesticidas utilizados em atividades agrícolas. Sabe-se que algumas regiões estudadas têm vários hectares destinados a agricultura, inclusive Petrópolis com cerca de 551,60 há de área plantada com olerícolas (EMATER-RIO, 1995 [ apud Relatório Hidro-UFRJ]). De acordo com informações do Relatório Hidro- UFRJ, o município de Santo A Pádua tem extensas áreas destinadas ao cultivo de tomate. Em Campos há também grandes áreas destinadas ao cultivo da cana de açúcar. Segundo dados da EMATER-RIO (1995) [ apud Relatório Hidro-UFRJ], a agricultura da porção fluminense da bacia do rio Paraíba do Sul abrangeu cerca de 220,5 mil ha, correspondendo aproximadamente a dois terços da área agrícola total do estado, em 1995. As atividades de EROD em peixes coletados em outra regiões como Volta Redonda, Barra Mansa, São José dos Campos, Petrópolis e Além Paraíba foram classificadas na faixa 2 no período de chuvas. Relatórios da FEEMA (1989) informaram que foram detectados na água do rio Paraíba do Sul, em Volta Redonda e Barra Mansa, indutores de EROD como benzo[ a]pireno. Segundo dados do Programa Estadual de Investimentos da Bacia do Rio Paraíba do Sul, Petrópolis além de ter áreas destinadas à agricultura possui 123 indústrias. Isto pode indicar que, em termos de indutores de EROD, os peixes desta região podem estar expostos a complexas misturas. A maior atividade de EROD obtida no período de chuvas ( figura 8 ) foi registrada na região de Levy Gasparian. Nesta região houve um aumento de EROD de cerca de 19 vezes em relação ao registrado em peixes coletados no rio Muriaé. É possível que em Levy Gasparian haja influência da poluição industrial proveniente das cidades à montante do rio Paraibuna. Este rio passa pela cidade de Juiz de Fora onde estão localizadas indústrias metalúrgicas, químicas, têxteis, papeleira e alimentícia. A degradação da qualidade das águas do rio Paraibuna parece ter-se acentuado a partir da década de 70. Ocorreram desde então alguns acidentes com indústrias metalúrgicas comprometendo a comunidade de peixes e outros organismos. A Companhia Paraibuna de Metais (em Juiz de Fora) entrou em operação em 1980 e, no mesmo ano de sua inauguração, ocorreu grande mortandade de peixes no rio Paraibuna, causada por rejeitos contendo cádmio. Na cidade de Levy Gasparian, RJ, muitos fazendeiros perderam animais de grande porte por fornecerem a eles a água do rio para beber. Em 1982, a ruptura da barragem de contenção de uma lagoa de rejeitos desta mesma indústria resultou, dentre outras perdas ambientais, na interrupção da captação

119 de água para o consumo público em Levy Gasparian, Três Rios e outras cidades. Estes relatos de Torres (1992) sugerem que Levy Gasparian é uma cidade pela poluição gerada em Juiz e Fora que tem um histórico de impactos industriais no rio Paraibuna. Apesar da atividade de EROD estar claramente induzida nos G. brasiliensis coletados em Levy Gasparian, é importante ressaltar que apenas três indivíduos foram coletados nesta região no período de chuvas. As atividades de EROD em G. brasiliensis no período de estiagem ( figura 9 ) foram mais elevadas nos indivíduos capturados nas regiões de São Luiz do Paraitinga (1), Barra Mansa (4), Três Rios (7), Levy Gasparian (8) e Sapucaia (12). No relatório de qualidade das águas da FEEMA (1989) houve indicação de altas concentrações de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos à jusante da CSN (Volta Redonda) sendo estas concentrações elevadas ainda no trecho de Três Rios a Sapucaia. Atualmente são relacionadas no Programa Estadual de Investimentos da Bacia do Rio Paraíba do Sul, cinco indústrias na região de Sapucaia, trinta e cinco indústrias na região de Três Rios, oitenta duas indústrias na região de Barra Mansa entre outras localidades. O trecho médio-inferior da bacia é conhecido por estudos ecológicos, químicos e geográficos, como sendo a região mais impactada da bacia, pois é nesta região que se concentram muitas indústrias. Neste estudo encontramos neste trecho da bacia os valores mais altos de EROD ( figura 15 ). O relatório do Programa Estadual de Investimentos da Bacia do Rio Paraíba do Sul mostra que 50% das indústrias que utilizam esta bacia estão localizadas na região do médio inferior, e atribui a este fato a degradação deste trecho. Entretanto valores elevados de EROD foram obtidos também na região 1. O município de São Luiz do Paraitinga (1) é uma estância turística localizado na Serra da Bocaina, que abriga o núcleo Santa Virgínia do Parque Estadual da Serra do Mar. Em torno da cidade estão quase 5 mil hectares de Mata Atlântica. A região é bastante acidentada com muitas cachoeiras, quedas d´água e riachos. Apesar da região ser geograficamente protegida de impactos industriais, em São Luiz do Paraitinga foram observados níveis de EROD comparáveis aos de regiões aparentemente mais impactadas como Três Rios e Sapucaia. É conhecido que produtos naturais podem também aumentar a atividade de EROD em peixes. Vindimian et al. (1991) notaram um aumento da atividade de EROD em Chondrostoma nasus, um peixe herbívoro, coletado em local não poluído. A atividade basal dos carnívoros Barbus barbus e Leusciscus cephalus coletados no mesmo local

120 era menor quando comparada ao Chondrostoma nasus . Este autor sugere que a dieta do herbívoro pode conter substâncias naturais indutoras de CYP1A como o indole-3- carbinol. Outros estudos demonstram que um metabólito derivado do indole-3-carbinol, o 3,3’-diindolmentano, é de fato indutor de EROD (Whyte, 2000). Estas informações nos permitem afirmar que, mesmo não havendo fontes pontuais de poluição em São Luiz do Paraitinga, é possível que os G. brasiliensis analisados tenham sido expostos a substâncias naturais indutoras de EROD. Lovett, (1994) [ apud Whyte, 2000] ressalta ainda a possibilidade de haver transporte atmosférico de determinados poluentes indutores de EROD, deposição em regiões de altitude elevada, e contaminação de regiões até então não impactadas. Não é possível, todavia avaliar até que ponto produtos naturais, ou o transporte atmosférico de poluentes teriam influenciado os níveis de EROD nos peixes de São Luiz do Paraitinga. Van der Oost et al. (2003) classifica uma série de poluentes como forte inibidores, inibidores, indutores, forte indutores e os que não causam alterações na atividade de EROD. Esta classificação foi realizada a partir da análise de muitos trabalhos incluindo estudos de campo e de laboratório. Entretanto esta classificação proposta por Van der Oost et al. (2003) não considera o nível de exposição, a dose ou a concentração do poluente no ambiente. Apesar disto foi feita uma comparação entre os dados obtidos no presente estudo e a classificação utilizada por Van der Oost et al. (2003). Verificou-se que em G. brasiliensis em algumas regiões, houve um aumento na atividade de EROD de mais de 500% em relação a uma região de referência como é característico da indução causada por potentes indutores como PCBs, HPAs, dibenzo-p-dioxinas policloradas e dibenzofuranos policlorados (Van der Oost et al. , 2003). As atividades de EROD em peixes destas regiões foram classificadas na faixa 4 ( tabela 18 ). No rio Guandu, sistema recentemente estudado em relação às respostas a indutores de EROD, os peixes coletados ( G. brasiliensis) apresentaram 91,79 ± 62,21 pmol de resorufina/min/mg de proteína (Parente et al , 2004a). Estes valores são comparáveis aos obtidos no presente estudo nas regiões de São Luiz do Paraitinga (região 1) e Três Rios (região 10). Estes valores indicam um aumento de mais de 500% em relação à atividade de EROD dos peixes coletados no rio Muriaé e em outros locais. Valores encontrados em peixes coletados em Levy Gasparian e em Sapucaia ( tabela 10a ), são maiores do que os obtidos no Guandu. Sabe-se que o rio Guandu é um sistema altamente poluído por indutores de EROD (Parente et al , 2004). Estes autores encontraram também um

121 aumento da atividade de EROD em O. niloticus (Cichlidae) e observaram que quando se compara O. niloticus e G. brasiliensis verifica-se que as atividades absolutas são diferentes, mas o aumento observado (fator de indução) é similar (Parente, 2004a). Nas regiões de Paraibuna (2) e Volta Redonda (5) houve aumento da atividade de EROD no período de estiagem. Já nas regiões de Barra Mansa (4) e São Fidélis (16) não houve diferença estatística entre os dois períodos. É importante ressaltar que as coletas realizadas em Barra Mansa foram muito próximas, pois a coleta de Barra Mansa do período de chuvas foi a última a ser realizada, no final das cheias, e a do período de estiagem foi a primeira a ser realizada, no início das secas. É possível que esta proximidade temporal entre as duas coletas nesta região tenha atenuado eventuais diferenças entre os dois períodos.

5.4.1 Diferenças interespecíficas na atividade de EROD Diferenças interespecíficas na atividade de EROD ocorrem tanto nos níveis basais de atividade quanto na extensão da indução da atividade após exposição ao contaminante (Whyte, 2000). As atividades de EROD em G. brasiliensis e Hypostomus sp são bem diferentes indicando escalas diferentes de resposta. Esta acentuada diferença entre espécies e suas causas devem ser melhor exploradas em estudos futuros. Tais diferenças podem estar relacionadas à biologia das espécies e/ou ao ambiente físico. Fatores fisiológicos, como taxa de metabolização e excreção do poluente, o tamanho corporal, a quantidade de gordura e o tempo de vida da espécie influenciam no modo como ela responde a exposição ao ligante do receptor Ah (Bucheli & Fent, 1995 [apud Whyte, 2000]). Shailaja (2003) discute que diferenças de respostas de indução de EROD entre espécies podem ocorrer devido a variações intrínsecas na afinidade do receptor aryl-hydrocarbon a hidrocarbonetos com baixo peso molecular. Além disto, diferenças de respostas entre espécies em relação à EROD podem estar relacionadas a outros aspectos biológicos, como modo de forrageio do peixe, período reprodutivo e aspectos físicos da movimentação do poluente no corpo receptor. Assim, o conhecimento do tipo de alimentação das espécies estudadas e do comportamento do poluente no ambiente são importantes para se ter uma idéia da sua biodisponibilidade. Reações bióticas e abióticas podem ocorrer e modificar características do poluente tais como estado de oxidação, lipofilicidade e volatilidade

122 (Casarett,1991) e alterar sua biodisponibilidade. Alguns indutores de EROD pouco solúveis em água ficam aderidos ao sedimento e a partículas em suspensão na água. Como já relatado, os peixes estudados apresentam hábitos alimentares distintos. Os Hypostomus são conhecidos por ingerir substrato onde são encontrados os alimentos procurados, no caso, detritos (de fauna nectônica, plantônica ou bentônica sedimentados ou detritos outros orgânicos). Os Geophagus são onívoros, pois ingerem alimento de origem vegetal ou animal, aproveitando uma grande variedade de alimentos disponíveis em diversos locais na coluna d’água.

5.4.2 Diferenças entre machos e fêmeas na atividade de EROD

Um dos fatores que afetam a atividade de EROD mais investigados pela comunidade científica é a diferença entre machos e fêmeas durante o período de atividade reprodutiva (Whyte, 2000). De modo geral a atividade de EROD é maior em machos reprodutivamente ativos, decresce um pouco em machos reprodutivamente inativos e mais ainda em fêmeas reprodutivamente inativas, sendo os menores níveis de atividade de EROD observados em fêmeas reprodutivamente ativas (Whyte, 2000). Peixes coletados na região 8 (rio Paraibuna na cidade de Levy Gasparian) foram avaliados quanto a diferenças de EROD entre machos e fêmeas ( figura 16 ). Neste estudo observamos menor atividade de EROD em fêmeas. Resultados similares são encontrados nos estudos de Flamarion (1997) com outras espécies de peixes ( Barbus barbus, Leuciscus cephalus e Gobio gobio ). Flamarion (1997) comparou estas diferenças entre períodos de coleta (primavera e outono) e observou que as atividades de EROD em fêmeas podem não diferir das em machos dependendo do período de coleta. Isto pode estar correlacionado ao período da maturação gonadal (época de reprodução ou não). No presente estudo esta comparação levando em consideração o período de coleta não pôde ser realizada uma vez que a comparação entre machos e fêmeas só pôde ser feita com peixes coletados durante o período de estiagem.

5.4.3 Inibição da atividade de EROD Como discutido até agora, sabe-se que muitos compostos são capazes de induzir a atividade de EROD em peixes. Entretanto há poucos trabalhos que relatam sobre a capacidade que alguns compostos de inibirem a atividade de EROD sob determinadas condições. Muitos compostos que induzem a atividade de EROD quando em concentrações muito altas, ou na presença de outros compostos indutores, ou mesmo 123 com o tempo de exposição, podem também agir como inibidores desta atividade enzimática (Celander, 1996 e Whyte, 2000). A inibição da atividade de EROD pode ser decorrente de ligação competitiva de determinada substância ao receptor Ah ou de alteração alostérica da estrutura do receptor e/ou da enzima. (Whyte, 2000). Newsted et al. (1995) [ apud Whyte, 2000] atribuiram respostas menos elevadas do que as esperadas, a uma fraca afinidade entre o receptor Ah e alguns congêneres de PCBs. Esta fraca afinidade não ativa propriamente o receptor e assim não ocorre a translocação ao núcleo celular. Elevadas doses ou combinações específicas de PCDDs e PCDFs podem resultar em atividade de EROD abaixo do nível de indução esperado, mas em geral as concentrações de congêneres de PCBs como o PCB 126 não são altas o suficiente no ambiente a ponto de causar um efeito inibitório (Whyte, 2000). Em contraste, o PCB77 (congênere planar que também tem o potencial de inibir a atividade de EROD) tem sido detectado em altas concentrações em amostras de tecido de peixes (Whyte, 1998). A causa mais comum da inibição da atividade de EROD pode ser a presença de agonistas parciais como PCB 156 (Whyte, 2000). Além da concentração, o tempo de exposição pode afetar a modulação da atividade de EROD. Cascudos ( Ancistrus sp .) após 96 horas de exposição intracelomática ao endosulfano (4mg/kg- dose subletal) apresentaram inibição da expressão da isoforma CYP1A1 e diminuição da concentração total de CYP450 (Klemz, 2002). De modo geral os metais não apresentam as características estruturais necessárias para se ligarem ao receptor Ah e por isto não funcionam como indutores diretos da atividade de EROD. Entretanto, alguns estudos observaram a interação entre metais e compostos orgânicos afetando a modulação de CYP1A (Whyte, 2000). Metais pesados como cobre e mercúrio são conhecidos inibidores da atividade de EROD em peixes. Alguns autores sugerem que estes metais reduzem a indução de EROD em situação de exposição simultânea a compostos indutores, inibindo a atividade catalítica de EROD através da ligação a grupos sulfidrila expostos em CYP1A1 (Viarengo, 1997). O entendimento das classes de contaminantes que podem inibir a indução da atividade de EROD em peixes expostos a misturas químicas complexas é importante na interpretação dos resultados obtidos. Assim, neste estudo, em peixes de determinadas regiões com diversas indústrias a atividade de EROD pode estar sendo afetada por misturas de poluentes que causam efeitos antagônicos. Whyte (2000) ressalta que quando há suspeita de inibição da atividade de EROD, a medida da proteína CYP1A1

124 ou do RNAm pode permitir melhor estimativa da exposição ao contaminante. Todavia estes métodos são mais caros e demorados em relação a média da atividade catalítica de CYP1A. Estudos realizados em campo não levam em conta a possibilidade de inibição. Isso foi verificado no trabalho de Van der Oost (2003), em que não houve relato de inibição da atividade de EROD em vários trabalhos realizados em campo (total de 67 espécies de peixes avaliadas). Já os resultados dos estudos realizados em laboratório associam o comportamento inibitório da atividade de EROD a determinados poluentes classificados por Van der Oost (2003) como inibidores tais como o TBT (tributil de estanho), e o TPT (trifenil de estanho).

5.5 Quantificação de Metais

Segundo a OMS as principais dificuldades na definição das concentrações máximas recomendáveis são as discrepâncias na relevância, validez e aceitabilidade dos dados científicos disponíveis, os problemas na extrapolação de dados de animais para o homem, e as incertezas existentes acerca das proporções de ingestão total dos poluentes por vias como água, alimentos e outros fatores (WHO,1984 [ apud Azcue,1987]. Os limites máximos estabelecidos nas regulamentações vigentes, sejam nacionais ou internacionais, parecem não considerar possíveis interações entre as substâncias químicas. Por exemplo, sabe-se que dimercaprol tem afinidade com metais como arsênico, mercúrio e chumbo e quando estas duas substâncias estão juntas há uma reação (quelação) que resulta num decréscimo de toxicidade. Este processo é conhecido como antagonismo químico (Casarret, 1991). Assim como ocorre antagonismo, efeitos sinérgicos podem também ocorrer. Apesar destas críticas, os limites máximos permitidos estabelecidos na legislação foram utilizados neste estudo para a comparação dos valores de metais obtidos no músculo dos peixes estudados. A portaria 685/98 da ANVISA estabelece níveis máximos de contaminantes em alimentos que não devem ser ultrapassados sob a pena de constituir riscos à saúde humana. Esta portaria foi feita tendo por base informações de regulamentos técnicos que definem níveis máximos de contaminantes em alimentos no âmbito regional e/ou internacional e dados sobre incidência do contaminante, antecedentes do problema detectado, dados analíticos e indicações sobre os possíveis problemas para a saúde, relação dos alimentos de maior importância comercial e dados ou informações 125 toxicológicas. Os limites máximos são estabelecidos de modo que a ingestão diária aceitável (IDA) não seja ultrapassada. Entretanto a portaria da ANVISA não estabelece os níveis máximos para todos os metais analisados. Entre os metais analisados só há valores máximos estabelecidos para Pb (2,0mg/kg) e Hg (0,5 mg/kg). Outros metais de interesse toxicológico como Cr (exposição humana é associada a efeitos hepatotóxico, renais dentre outros) e Fe (inibidor da atividade de EROD (Whyte, 2000)) não constam nesta portaria. O cobre consta na portaria, mas não para análise de peixes. Os resultados obtidos neste estudo em G. brasiliensis, H. affinis e H. luetkeni estão abaixo desses níveis, em todas as regiões, tanto no período de chuvas quanto no de estiagem. Em 1981 e 1982, a FEEMA realizou estudos de metais em peixes coletados no trecho entre o reservatório do Funil e Santa Cecília. As espécies analisadas foram : Astyanax fasciatus parahibas, Hoplias malabaricus, Leporinus copelandii, e Hypostomus punctatus. Músculo e vísceras (coração, fígado, baço e rim) foram analisados. Os resultados das análises de mercúrio em tecido muscular de traíras (Hoplias malabaricus ) apresentaram níveis mais elevados do que o permitido pela OMS para consumo humano. Cobre e níquel foram encontrados preferencialmente em vísceras de cascudos ( Hypostomus punctatus) . Manganês e zinco apresentaram concentrações menos significativas, crescentes ao longo do rio, com exceção do zinco que, na espécie de lambari utilizada (Astyanax fasciatus parahibas) , apresentou os valores mais altos no Funil, confirmando os dados de qualidade da água no trecho estudado. Cromo e cádmio estavam abaixo dos limites de detecção em todos os peixes analisados no trecho. Já os resultados de Azcue (1987) indicam que o local de maior acúmulo de metais (Cu, Ni, Cr, Pb, Cd, Fe, Mn e Al) em peixes ( Astyanax fasciatus, Leporinus capelandi e Lheringchtys labrasus ) coletados na bacia do rio Paraíba do Sul- Guandu é no intestino, mas estes valores também não excederam aos limites máximos.

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6. Conclusões 1. G. brasiliensis capturados em Volta Redonda, apresentam os valores de IH mais elevados. Não foi observada uma tendência consistente de alteração de IH em função dos períodos de chuva ou estiagem. 2. Os fatores de condição das três espécies estudadas foram discretamente maiores no período de chuvas do que no período de estiagem. 3. A freqüência de micronúcleo em eritrócitos do sangue periférico dos peixes capturados foi consistentemente baixa independente do período de chuvas e estiagem e do local de coleta ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul. Estes resultados sugerem que os peixes não sofreram dano genotóxico. Os dados sugerem também que, um mesmo local e período, as freqüências de MN em G. brasiliensis tendem a ser menores do que as observadas em H. luetkeni e H. affinis. 4. Os G. brasiliensis coletados em de Barra Mansa, Levy Gasparian, Sapucaia e Três Rios, médio-inferior, e em São Luiz do Paraitinga, no trecho superior, apresentaram os valores mais elevados de atividade de EROD indicando que estes locais devem ser investigados quanto à presença de poluentes indutores de CYP1A. A atividade de EROD foi de um modo geral mais baixa, nos peixes coletados à jusante do médio-inferior. Os resultados mostraram também que EROD, nos mesmos locais e períodos foi consistentemente mais elevada em G. brasiliensis do que em H. affinis e H. luetkeni sugerindo uma diferença entre espécies quanto aos níveis constitutivos, ou quanto a inducibilidade de CYP1A. 5. Não encontramos correlação entre atividade de EROD e IH, o que contrasta com alguns outros trabalhos da literatura. 6. Os níveis de Cr, Mn, Pb, Zn, Cu, Hg e Ni no tecido muscular dos peixes foram consistentemente baixos independente da espécie, período e local de coleta na bacia do rio Paraíba do Sul. Em relação ao Pb e Hg, os níveis encontrados foram inferiores aos valores máximos permitidos em alimentos pela regulamentação brasileira (ANVISA).

127 7. Recomendações

Este estudo permitiu uma visão panorâmica e inicial da bacia do rio Paraíba do Sul do ponto de vista dos biomarcadores e espécies de peixes selecionadas. Algumas recomendações de continuidade deste trabalho são feitas a seguir: 1. A partir desta percepção inicial, é interessante realizar estudos que se concentrem em determinadas regiões da bacia fim de se coletar maior número de peixes. 2. Estudos em laboratório devem ser realizados com substâncias que sabidamente induzam MN e/ou atividade de EROD a fim de se estudar os níveis de respostas a estes poluentes com os peixes da bacia do rio Paraíba. A interferência de possíveis inibidores da atividade de EROD deve ser também investigada em laboratório. 3. Estudos mais detalhados devem ser realizados a fim de observar diferenças de susceptibilidade de G. brasiliensis , H. affinis e H. luetkeni quanto à formação de micronúcleo. 4. As regiões de São Luiz do Paraitinga, Barra Mansa, Três Rios, Levy Gasparian e Sapucaia devem ser melhor estudadas do ponto de vista toxicológico uma vez que os peixes coletados nestes locais apresentaram os valores mais elevados de atividade de EROD.

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129 8. Referências Bibliográficas

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139 139 9. Anexos

9.1 ANEXO 1 Tabelas de parâmetros morfométricos e atividades de EROD

140 Tabela 1a : Parâmetros morfométricos de Geophagus brasiliensis coletados em diferentes locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número Peso (g) Comprimento (cm) Peso do fígado (g) Sexo amostragem (cidade) (f[fo]/m)**

Local 2 Paraíba do Sul 10 65,51 ± 9,44 16,45 ± 1,14 0,92 ± 0,41 (7[4]/3) (Paraibuna) (52,90-83,64) (15-18) (0,35-1,47) Local 3 Paraíba do Sul 4 123,46 ± 38,81 19,5 ± 2,08 1,24 ± 0,74 (3[0]/0)* (S. José dos Campos) (81,65-166,23) (17-22) (0,76-2,34) Local 4 Paraíba do Sul 11 120,17 ± 41,29 18,77 ± 1,82 2,08 ± 1,11 (5[5]/6) (Barra Mansa) (85,59-208,95) (17-22,5) (0,65-4,29) Local 5 Paraíba do Sul 10 205,60 ± 71,83 20,15 ± 2,75 4,96 ± 1,66 (5[5]/5) (Volta Redonda) (112-308) (16,5-23,5) (2,82-7,18) Local 6 Preto 2 167,5 ± 54,45 19,25 ± 2,47 2,12 ± 0,07 (1[1]/1) (Rio das Flores) (129-206) (15,5-21) (2,07-2,17) Local 8 Paraibuna 3 83,08 ± 34,66 15,83 ± 2,02 0,65 ± 0,25 (1[0]/1)* (Levy Gasparian) (51,24-120) (14-18) (0,39-0,88) Local 9 Piabanha 12 124,83 ± 60,23 17,63 ± 2,61 2,21 ± 1,21 (8[7]/4) (Petrópolis) (59-260) (14-23) (0,75-5,15) Local 11 Paraíba do Sul 4 87,5 ± 33,37 17 ± 1,63 ND (2[2]/2) (Além Paraíba) (55-134) (15-19) Local 14 Pomba 2 134 ± 56,57 18,75 ± 2,47 0,88 ± 0,32 (1[1]/1) (Sto. Antônio de Pádua) (94-174) (17-20,5) (0,65-1,10) Local 16 Grande 11 102,27 ± 37,93 17,32 ± 2,25 0,59 ± 0,24 (5[5]/6) (São Fidélis) (50,171) (13,5-21) (0,29-0,99) Local 17 Muriaé 10 188,90 ± 72,52 20,40 ± 2,85 1,95 ± 1,03 (4[4]/6) (Italva) (125-364) (17,5-27) (4,69-1,16) Local 18 Paraíba do Sul 4 127,25 ± 55,30 17,88 ± 2,53 1,18 ± 0,60 (1[1]/2)* (Campos dos Goytacases) (64-178) (15-19) (?-173) Local 19 Paraíba do Sul 3 139,43 ± 27,13 19,33 ± 1,15 1,00 ± 0,19 (1[1]/2) (S. João da Barra) (108-158) (18-20) (0,86-1,22) ** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho; * - um dos indivíduos capturados não foi identificado Valores: média ± desvio padrão (mínimo-máximo) ND – Parâmetro não determinado

141 Tabela 2a : Parâmetros morfométricos de Hypostomus affinis coletados em diferentes Locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número Peso (g) Comprimento (cm) Peso do fígado (g) Sexo amostragem (f[fo]/m)**

Local 2 Paraíba do Sul 5 192,43 ± 81,98 26,20 ± 4,34 1,23 ± 0,66 (4[4]/1) (84,84-284,85) (19,5-30) (0,62-2,3) Local 5 Paraíba do Sul 3 360,67 ± 156,21 30,17 ± 5,92 3,13 ± 0,66 (2[2]/1) (267-541) (26,5-37) (2,37-3,61) Local 8 Paraibuna 10 263,90 ± 65,51 27,65 ± 3,10 1,53 ± 0,38 (3[1]/7) (176-350) (23,5-32) (1,02-2,17) Local 9 Piabanha 7 293,00 ± 72,5 29,71 ± 3,20 3,29 ± 1,30 (2[2]/5) (204-376) (26-33,5) (2,30-6,13) Local 11 Paraíba do Sul 2 133,50 ± 45,96 23,50 ± 2,12 ND (1[1]/1) (101-166) (22-25) Local 14 Pomba 3 137,00 ± 24,04 23,50 ± 2,12 0,89 ± 0,47 (1[1]/2) (120-154) (22-25) (0,56-1,22) Local 18 Paraíba do Sul 7 152,57 ± 39,02 23,79 ± 2,69 0,86 ± 0,28 (1[1]/6) (94-193) (20,5-27) (0,58-1,30) Local 19 Paraíba do Sul 3 ND 27,50 ± 1,73 1,66 ± 0,72 (2[1]/1) (25,5-28,5) (0,84-2,16) ** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho Valores: média ± desvio padrão (mínimo-máximo) ND – parâmetro que não foi determinado

142 Tabela 3a : Parâmetros morfométricos de Hypostomus luetkeni coletados em diferentes Locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número Peso (g) Comprimento Peso do fígado (g) Sexo amostragem (cidade) (cm) (f[fo]/m)**

Local 4 Paraíba do Sul 10 176,40 ± 39,80 26,00 ± 1,76 1,02 ± 0,35 (8[5]/1)* (Barra Mansa) (112,22-234,11) (23-28) (0,41-1,50) Local 6 Preto 8 215,13 ± 50,22 25,50 ± 2,22 0,46 ± 1,52 (2[1]/6) (Rio das Flores) (154-311) (22-29) (0,88-2,19) Local 8 Paraibuna 7 183,93 ± 58,73 24,36 ± 2,36 0,81 ± 0,26 (3[3]/4) (Levy Gasparian) (95,5-242) (20-27) (0,50-1,28) Local 14 Pomba 2 95,5 ± 4,95 20,50 ± 0,71 0,27 ± 0,06 (2[2]0) (Sto. A. de Pádua) (92-99) (20-21) (0,23-0,31) ** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho; * - um dos indivíduos capturados não foi identificado Valores: média ± desvio padrão (mínimo-máximo)

143 Tabela 4a : Resultados dos parâmetros morfométricos de Geophagus brasiliensis, coletado em diferentes Locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época de estiagem. Locais de Rio Número Peso do peixe (g) Comprimento do Peso do fígado (g) Sexo amostragem (cidade) de peixe (cm) (f[fo]/m)** animais

Local 1 Paraitinga (São Luiz do 8 69,13 ± 19,32 16,19 ± 1,53 0,78 ± 0,22 (3[3]/5) Paraitinga) 68 (44-95) 16,5 (14-18) 0,74 (0,53-1,25) Local 2 Paraíba do Sul 10 79,20 ± 27,51 16,9 ± 1,73 0,52 ± 0,24 (6[6]/4) (Paraibuna) 72,5 (51-129) 16,25 (15-20) 0,48 (0,28-1,10) Local 3 Paraíba do Sul 3 153,67 ± 21,73 20 ± 1,73 2,77 ± 0,68 (2[2]/0)* (S. José dos Campos) 153 (137-180) 19 (19-22) 2,49 (2,27-3,55)

Local 4 Paraíba do Sul 6 155,17 ± 53,24 20,08 ± 2,54 2,03 ± 1,53 (1[1]/4)* (Barra Mansa) 170 (85-223) 21 (16-22,5) 1,52 (0,65-4,11) Local 5 Paraíba do Sul 10 223,0 ± 78,57 21,55 ± 3,02 4,86 ± 3,20 (4[4]/6) (Volta Redonda) 238 (81-325) 22,5 (15-25) 4,30 (1,17-9,96) Local 6 Preto 10 208,30 ± 77,58 22,56 ± 3,27 1,49 ± 0,64 (3[2]/7) (Rio das Flores) 223,5 (67-298) 23,5 (15-26) 1,45 (0,44-2,38) Local 7 Paraíba do Sul 2 189 ± 66,47 21 ± 0,71 3,26 ± 0,65 (1[1]/1) (Três Rios) 189 (142-236) 21 (20,5-21,5) 3,26 (2,80-3,72) Local 8 Paraibuna 21 113,95 ± 62,82 17,86 ± 3,41 0,90 ± 0,43 (9[5]/11)* (Levy Gasparian) 99 (39-251) 17 (13-24,5) 0,89 (0,30-2,06) Local 10 Paraíba do Sul 6 76 ± 32,11 16 ± 2,47 0,82 ± 0,19 (4[4]/2) (Três Rios) 71,5 (43-121) 16 (13-19) 0,83 (0,54-1,05) Local 12 Paraíba do Sul 11 91,73 ± 29,05 16,86 ± 2,12 1,33 ± 0,53 (2[2]/9) (Anta-Sapucaia) 83 (58-144) 16 (14,5-21) 1,36 (0,62-2,38) Local 14 Pomba 5 67,6 ± 12,70 14,5 ± 1,46 1,06 ± 0,18 * (Sto. Antônio de Pádua) 64 (52-86) 15 (12-15,5) 1,16 (0,77-1,19) Local 15 Paraíba 2 131 ± 96,17 17,75 ± 4,60 1,11 ± 0,81 (1[1]/0) (São Fidélis) 131 (63-199) 17,75 (14,5-21) 1,11 (0,54-1,68) Local 16 Grande 8 110,50 ± 45,57 18,19 ± 3,17 1,06 ± 0,51 (7[5]/1) (São Fidélis) 116,5 (43-179) 18,5 (14-23) 1,09 (0,21-1,73) Local 17 Muriaé 10 141,90 ± 31,26 19,60 ± 1,73 1,71 ± 0,67 (7[5]/2) (Italva) 144,5(101-189) 19-25 (17-22) 1,74 (0,94-3,22) Local 18 Paraíba do Sul 4 118,75 ± 15,37 18,38 ± 0,95 1,94 ± 0,77 (4[3]/0) (Campos dos G.) 119 (104-133) 18,75 (17-19) 1,62 (1,45-3,06)

** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho; * - alguns indivíduos capturados não foram identificados Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

144 Tabela 5a : Resultados dos parâmetros morfométricos de Hypostomus affinis coletados em diferentes Locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época da estiagem. Locais de Rio Número Peso do peixe (g) Comprimento do Peso do fígado (g) Sexo amostragem de peixe (cm) (f[fo]/m)** animais

Local 1 Paraitinga (São L. do 10 144,10 ± 51,85 23,85 ± 3,21 2,05 ± 0,99 (6[5]/2)* Paraitinga) 142,5 (62-212) 23,5 (18-28,5) 1,72 (0,5-3,9) Local 2 Paraíba do Sul 2 175,50 ± 126,57 25,5 ± 7,78 1,26 ± 0,71 (1[1]/1) (Paraibuna) 175,50 (86-265) 25,5 (20-31) 1,26 (0,75-1,76) Local 3 Paraíba do Sul 4 243,50 ± 90,22 27 ± 3,56 3,45 ± 0,92 (0[0]/4) (S. José dos Campos) 231 (147-365) 26 (24-32) 3,20 (2,66-4,73) Local 4 Paraíba do Sul 9 335,89 ± 92,05 30,78 ± 2,95 3,41 ± 0,81 (1[1]/8) (Barra Mansa) 325 (212-527) 31 (26-36) 3,36 (2,18-4,72) Local 5 Paraíba do Sul 5 357,60 ± 178,93 31,10 ± 5,47 5,36 ± 4,04 (4[3]/1) (Volta Redonda) 390 (150-567) 32 (24,5-37) 4,28 (1,99-12,04) Local 7 Paraíba do Sul 2 411,00 ± 168,29 35,5 ± 7,78 4,24 ± 1,56 (0[0]/1)* (Três Rios) 411 (292-530) 35,5 (30-41) 4,24 (3,13-5,34) Local 8 Paraibuna 2 369,50 ± 94,05 35,25 ± 2,47 4,56 ± 1,87 (0[0]/1) (L. Gasparian) 369,50 (303-436) 35,25 (33,5-37) 4,56 (3,23-5,88) Local 10 Paraíba do Sul 4 186,25 ± 66,47 25,63 ± 2,87 2,17 ± 0,96 (2[1]/0)* (Três Rios) 166,5 (130-282) 25 (23-29,5) 1,96 (1,25-3,52) Local 16 Grande 2 197,50 ± 94,05 32,5 ± 2,12 3,08 ± 1,03 (2[2]/0) (São Fidélis) 197,50 (131-264) 32,5 (31-34) 3,08 (2,35-3,8) Local 18 Paraíba do Sul 2 270,00 ± 45,25 32 ± 1,41 2,79 ± 0,17 (2[2]/0) (Campos dos 270 (238-302) 32 (31-33) 2,79 (2,67-2,91) Goytacases) ** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho; * - um dos indivíduos capturados não foi identificado Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo)

145 Tabela 6a : Resultados dos parâmetros morfométricos de Hypostomus luetkeni coletados em diferentes Locais ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul na época da estiagem. Locais de Rio Número de Peso do peixe (g) Comprimento do Peso do fígado (g) Sexo amostragem animais peixe (cm) (f[fo]/m)**

Local 5 Paraíba do Sul 2 144,00 ± 8,49 24,75 ± 0,35 1,61 ± 0,56 (1[1]/1) (Volta Redonda) 144 (138-150) 24,75 (24,5-25) 1,61 (1,21-2) Local 6 Preto 8 177,13 ± 56,41 25,63 ± 3,08 2,01 ± 0,66 (2[1]/4)* (Rio das Flores) 183 (75-269) 26,5 (19,5-30) 2,20 (0,58-2,65) Local 8 Paraibuna 8 210,00 ± 27,58 26,5 ± 1,63 1,85 ± 0,71 (4[1]/3)* (Levy Gasparian) 218 (175-246) 26,75 (24-29) 1,60 (1,15-3,25) Local 12 Paraíba do Sul 2 166 ± 4,24 23,5 ± 0,00 1,74 ± 0,34 (1[1]1) (Anta-Sapucaia) 166 (163-169) 1,74 (1,50-1,98) Local 13 Paraíba do Sul 7 208,14 ± 57,25 25,71 ± 3,29 1,89 ± 0,22 (2[2]/5) (Sapucaia) 186 (145-295) 25 (21-30) 1,82 (1,67-2,23) ** - f: fêmea; fo: fêmea ovada; m: macho; * - um dos indivíduos capturados não foi identificado Valores: média ± desvio padrão Mediana (mínimo-máximo)

146 Tabela 7a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de G. brasiliensis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD (pmols/min/mg amostragem (cidade) animais * de proteína) Local 2 Paraíba do Sul 8 19,27 ± 15,88 (Paraibuna) 11,59 (7,17-51,17) Local 3 Paraíba do Sul 4 25,05 ± 24,44 (S. José dos Campos) 17,56 (4,60-60,47) Local 4 Paraíba do Sul 11 25,88 ± 15,23 (Barra Mansa) 28,68 (3,56-53,64) Local 5 Paraíba do Sul 10 24,69 ± 13,55 (Volta Redonda) 23,74 (5,51-49,29) Local 6 Preto 2 12,12 ± 8,26 (Rio das Flores) 12,12 (6,28-17,96) Local 8 Paraibuna 3 157,98 ± 37,93 (Levy Gasparian) 178,84 (114,20-180,90) Local 9 Piabanha 12 39,42 ± 35,56 (Petrópolis) 22,01 (7,86-114,78) Local 11 Paraíba do Sul 4 31,66 ± 17,39 (Além Paraíba) 24,16 (20,81-57,51) Local 14 Pomba 2 24,03 ± 1,12 (Sto. Antônio de Pádua) 24,03 (23,24-24,82) Local 16 Dois Rios 11 31,75 ± 15,14 (São Fidélis) 35,60 (2,88-51,84) Local 17 Muriaé 10 8,32 ± 6,31 (Italva) 6,45 (1,23-18,87) Local 18 Paraíba do Sul 4 28,33 ± 11,20 (Campos dos Goytacases) 25,00 (18,81-44,50) Local 19 Paraíba do Sul 3 38,81 ± 14,08 (S. João da Barra) 45,93 (22,60-47,91) * machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

147 Tabela 8a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. affinis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD amostragem (cidade) animais * (pmols/min/mg de proteína) Local 2 Paraíba do Sul 5 0,84 ± 0,40 (Paraibuna) 0,89 (0,45-1,44) Local 4 Paraíba do Sul 2 1,01 ± 0,44 (Além Paraíba) 1,01 (0,70-1,32) Local 5 Paraíba do Sul 3 1,47 ± 0,14 (Volta Redonda) 1,50 (1,31-1,59) Local 8 Paraibuna 10 1,59 ± 0,41 (Levy Gasparian) 1,66 (0,98-2,23) Local 9 Piabanha 7 1,03 ± 0,27 (Petrópolis) 1,13 (0,65-1,31) Local 14 Pomba 3 2,15 ± 1,12 (Sto. Antônio de Pádua) 2,00 (1,11-3,34) Local 18 Paraíba do Sul 7 1,63 ± 0,42 (Campos dos Goytacases) 1,56 (1,04-2,36) Local 19 Paraíba do Sul 3 0,36 ± 0,18 (S. João da Barra) 0,40 (0,16-0,52) * machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

Tabela 9a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de chuvas. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD amostragem (cidade) animais * (pmols/min/mg de proteína) Local 4 Paraíba do Sul 10 1,39 ± 0,59 (Barra Mansa) 1,38 (0,49-2,27) Local 6 Preto 8 2,63 ± 1,70 (Rio das Flores) 2,39 (0,95-5,39) Local 8 Paraibuna 7 1,35 ± 0,56 (Levy Gasparian) 1,39 (0,67-2,35) * machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo) 148 Tabela 10a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de G. brasiliensis, coletado ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD amostragem (cidade) animais * (pmols/min/mg de proteína)

Local 1 Paraitinga 8 98,21 ± 57,80 (São Luiz do Paraitinga) 75,14 (53,81-225,39) Local 2 Paraíba do Sul 10 66,07 ± 58,62 (Paraibuna) 50,98 (9,51-182,97) Local 3 Paraíba do Sul 3 33,82 ± 36,06 (S. José dos Campos) 19,86 (6,82-74,77) Local 4 Paraíba do Sul 6 72,12 ± 48,83 (Barra Mansa) 62,17 (15,18-147,12) Local 5 Paraíba do Sul 10 56,70 ± 32,85 (Volta Redonda) 50,20 (19,11-113,62) Local 6 Preto 10 45,14 ± 12,66 (Rio das Flores) 43,62 (26,78-63,97) Local 7 Paraíba do Sul 2 63,93 ± 14,34 (Três Rios) 63,93 (53,79-74,07) Local 8 Paraibuna 20 70,51 ± 46,41 (Levy Gasparian) 65,47 (6,02-203,72) Local 10 Paraíba do Sul 6 98,50 ± 81,60 (Três Rios) 48,75 (41,61-208,40) Local 12 Paraíba do Sul 11 126,70 ± 65,87 (Sapucaia) 103,43 (60,44-257,68) Local 14 Pomba 5 10,67 ± 3,71 (Sto. Antônio de Pádua) 10,76 (5,12-15,12) Local 15 Paraíba do Sul 2 26,70 ± 32,00 (São Fidélis) 26,70 (4,07-49,32) Local 16 Dois Rios 8 26,04 ± 18,28 (São Fidélis) 25,34 (2,65-51,25) Local 17 Muriaé 9 16,95 ± 12,52 (Italva) 14,12 (3,98-36,72) Local 18 Paraíba do Sul 4 11,70 ± 14,07 (Campos dos Goytacases) 7,17 (1,20-31,24) * - machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

149 Tabela 11a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. affinis coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD amostragem (cidade) animais * (pmols/min/mg de proteína)

Local 1 Paraitinga 10 1,08 ± 0,57 (São Luiz do Paraitinga) 0,79 (0,55-20,5) Local 2 Paraíba do Sul 2 1,13 ± 0,29 (Paraibuna) 1,13 (0,92-1,33) Local 3 Paraíba do Sul 4 0,59 ± 0,04 (S. José dos Campos) 0,60 (0,54-0,63) Local 4 Paraíba do Sul 9 1,38 ± 0,42 (Barra Mansa) 1,33 (0,93-2,07) Local 5 Paraíba do Sul 4 1,07 ± 0,12 (Volta Redonda) 1,10 (0,89-1,18) Local 7 Paraíba do Sul 2 0,60± 0,15 (Três Rios) 0,60 (0,49-0,70) Local 8 Paraibuna 2 0,60 ± 0,17 (Levy Gasparian) 0,60 (0,48-0,72) Local 10 Paraíba do Sul 4 0,57 ± 0,16 (Três Rios) 0,51 (0,45-0,80) Local 12 Paraíba do Sul 3 1,70 ± 0,59 (Sapucaia) 1,93 (1,03-2,13) Local 16 Dois Rios 2 0,42 ± 0,11 (São Fidélis) 0,42 (0,34-0,49) Local 18 Paraíba do Sul 2 0,41 ± 0,07 (Campos dos Goytacases) 0,41 (0,36-0,46) * - machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

150 Tabela 12a : Atividade de EROD na fração S9 hepática de H. luetkeni coletados ao longo da bacia do rio Paraíba do Sul no período de estiagem. Locais de Rio Número de Atividade Enzimática – EROD amostragem (cidade) animais * (pmols/min/mg de proteína)

Local 5 Paraíba do Sul 2 1,00 ± 0,16 (Volta Redonda) 1,00 (0,89-1,11) Local 6 Preto 9 0,52 ± 0,20 (Rio das Flores) 0,56 (0,23-0,78) Local 8 Paraibuna 8 0,91 ± 0,23 (Levy Gasparian) 0,86 (0,68-1,39) Local 12 Paraíba do Sul 2 2,18 ± 0,45 (Sapucaia) 2,18 (1,86-2,49) Local 13 Paraíba do Sul 7 0,93 ± 0,30 (Sapucaia) 0,87 (0,60-1,40) * - machos e fêmeas Valores: média ± desvio padrão mediana (mínimo-máximo)

151 9.2 ANEXO 2 Investigação da presença de contaminantes indutores de EROD nas águas do rio Pomba, 13 dias após o acidente na Cataguases de Papel e Celulose S.A . (Cataguases - MG). Estudo in situ com Oreochromis niloticus, Hypophthalmichthys molitrix, Procholodus lineatus

152 I – Introdução

A atividade de mooxigenases hepáticas em peixes tem sido útil para o monitoramento da poluição aquática. A subfa mília 1A do citocromo P450 (CPY450), por exemplo, é induzida por uma variedade de poluentes entre os quais os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAH), as bifenilas policloradas (PCBs) e as dibenzodioxinas policloradas. Estes poluentes têm origem em ampla gama de atividades industriais e podem atingir os ecossistemas aquáticos. De acordo com Smith (1991), há evidências de que populações de peixes em seus habitats tem sido expostas a níveis de PAHs que vão de 50 a 410 mg/L de PAH totais. Uma importante limitação do emprego de biomarcadores em estudos de campo é que, em geral, eles respondem a uma diversidade de contaminantes sendo portanto difícil atribuir uma resposta a uma fonte específica de poluição (Adams, 1996). Relações entre a carga de contaminantes e determinados efeitos biológicos devem ser investigadas em estudos controlados, ou de laboratório, nos quais são avaliadas substâncias isoladamente (Oikari and Nakari, 1982). Estudos em laboratório, entretanto, não refletem as condições reais nas quais o organismo é exposto. Uma alternativa, entre os experimentos conduzidos em laboratório, e os estudos de campo empregando biomarcadores, é o estudo in situ , pois esta abordagem permite ter situações mais controladas do que as de coletas em campo. Os estudos in situ empregando biomarcadores são realizados no próprio ambiente poluído que é comparado com um ambiente de referência.

O acidente na Cataguases

No dia 27 de março de dois mil e três uma barragem de contenção de rejeitos da Indústria Cataguases de Papel e Celulose S.A., rompeu acarretando o vazamento de aproximadamente 1,2 bilhões de litros de rejeitos. O acidente ocorreu na cidade de Cataguases a 311Km de Belo Horizonte e a 35 km da divisa com o estado do Rio de Janeiro. Os rejeitos, incluindo sulfeto de sódio e hipoclorito de cálcio, entre outros, atingiram os rio Pomba e em seguida o Paraíba do Sul, passaram por várias cidades às suas margens e, após percorrer cerca de 180 km em cinco dias, chegaram ao município de São João da Barra, onde o rio Paraíba deságua no mar. Ao atingir o mar, parte da mancha de rejeitos invadiu os manguezais de São Francisco de Itabapoana. A mancha

153 de rejeitos dispersou-se pelo mar alcançando ao norte, Marataízes no Espírito Santo, e cerca de 50 km ao sul de São João da Barra. Como efeitos imediatos da poluição houve redução do oxigênio dissolvido e aumento do pH da água, o que levou à mortandade de peixes e outros organismos. O impacto deste acidente ainda não foi completamente avaliado e é possível que muitos poluentes possam estar acumulados no sedimento do rio e na biota e terem acumulado em lençóis freáticos. Nas cidades mais atingidas, como Santo Antônio de Pádua e São Fidélis, o abastecimento de água foi interrompido e decretado estado de emergência. Carros-pipa foram providenciados, e autorizada a perfuração de poço artesianos para abastecer a população atingida com água potável. As escolas foram fechadas e atividades indústriais e agropecuárias prejudicadas. Outros municípios como Aperibé, Cambuci, Portela, distrito de Itaocara, e Miracema também foram atingidos e ficaram sem água até que fossem providenciados carros-pipa, perfuração de poços e, retomado o abastecimento. No dia 8 de abril a CEDAE e a Águas do Paraíba voltaram a captar águas dos rios Pomba e Muriaé, mas a retomada do abastecimento só ocorreu após envio do laudo da ANA. A empresa Cataguazes de Papéis foi fechada pelo governo mineiro. A empresa recebeu várias multas dos órgãos ambientais de Minas Gerais, do Batalhão de Polícia Florestal e de Meio Ambiente do Rio, mas o caso até hoje ainda está em andamento.

O Experimento

Com o apoio da Secretaria de Agricultura do município de Santo Antônio de Pádua e do Laboratório de Ecologia de Peixes da Universidade Federal do Rio de Janeiro, foi conduzido um experimento in situ, utilizando peixes cultivados, para verificar a presença de substâncias indutoras de CYP1A nos rejeitos que poluíram os rios Pomba e Paraíba do Sul.

II – Objetivos

Verificar se as águas do rio Pomba, 13 dias após o acidente ocorrido na Indústria Cataguazes, continham níveis expressivos de contaminantes indutores de EROD (CYP1A) em peixes.

154

III – Metodologia

Os peixes destinados ao experimento foram obtidos de tanques de cultivo da Secretaria de Agricultura do município de Santo Antônio de Pádua. Foram armados dois tanques-rede: um no rio Pomba na cidade de Santo Antônio de Pádua 13 dias após o acidente ocorrido na indústria Cataguazes em Minas Gerais (malha: 3mm, comprimento: 4m, largura: 1m) e o outro no próprio tanque de cultivo do centro de psicultura (malha: 2mm, comprimento: 4m, largura:1m). O tanque de cultivo controle tinha água do rio Pomba antes do acidente. Os peixes foram destinados aleatoriamente aos tanques controle e experimental. O experimento começou no dia 10/04/03 (dia 0) e foi concluído no dia 14/04/03 (dia 4). Os peixes foram observados diariamente, e anotado o número de mortos. Foram utilizados peixes de três espécies diferentes: - Oreochromis niloticus (Linneaeus, 1758) linhagem tailandesa. Nome comum: tilápia. Peixe exótico, a linhagem foi desenvolvida no Japão, melhorada na Tailândia e introduzida no Brasil em 1996.

- Hypophthalmichthys molitrix (Valenciennes, 1844) – Nome comum: carpa. Ocorre naturalmente em águas doces temperadas da China. Foi introduzida para cultivo na Ásia, Europa, Estados Unidos e Brasil. Realiza migrações para reprodução.

- Prochilodus lineatus (Valenciennes, 1947) Nome comum: Curimatã - Espécie nativa. Apresenta coloração prateada e boca protrátil, em forma de ventosa, com lábios carnosos, sobre os quais estão implantados numerosos dentes diminutos dispostos em fileira. Alimenta-se de matéria orgânica e microorganismos associados à lama do fundo de lagos e margens de rios. Realiza longas migrações para reprodução.

Ao final do experimento, os peixes foram coletados e colocados num galão com aeração fornecida por bomba de aquário até o momento da dissecção. Os animais foram retirados do galão e postos numa bandeja com gelo onde foram mortos por secção cervical.

155 Os peixes foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-600 ou VI- 200, e o comprimento total do corpo do animal foi medido com régua graduada em centímetros. O comprimento foi medido da ponta do focinho à maior extremidade da nadadeira caudal levemente distendida, como descrito em Vazzoler, 1996. Os fígados foram pesados em balança eletrônica portátil Acculab VI-200. Após a pesagem, embalou-se cada fígado em papel laminado identificado com os códigos de cada animal. Durante o procedimento, os fígados foram mantidos no gelo. Todos os fígados foram armazenados em galão portátil de nitrogênio líquido (cerca de -196ºC) até serem descongelados , homogeneizados e centrifugados a 9000g para preparação da fração S9 hepática, como descrito anteriormente no corpo principal desta dissertação (metodologia). A ffração S9 foi armazenada em criotubos mantidos em congelador – 80ºC até a determinação da concentração de proteína e da atividade da etoxiresorufina- O-desetilase tal como descrito em detalhes no corpo principal desta dissertação. Após a remoção dos fígados, os peixes foram congelados e transportados ao laboratório para confirmação da identificação das espécies pelo Dr. Francisco Gerson Araújo (UFRRJ).

III – Resultados

A tabela 1b mostra os valores das variáveis físicas (temperatura) e físico- químicas (pH, OD e condutividade) medidos na margem e calha central do rio Pomba em S.A. de Pádua, no local onde foi realizado o experimento (ver latitude e longitude da Local 14 desta dissertação) e no tanque de cultivo de peixes da Secretaria Municipal de Agricultura. Os valores de pH e OD foram comparados aos estabelecidos na regulamentação CONAMA 20 - águas de classe II. De acordo com esta regulamentação o pH deve estar entre 6-9 e os níveis de OD devem ser maiores do que 5 mg/L. Os valores de condutividade obtidos foram comparados àqueles recomendados pela CEPIS, OPS/OMS, 1963/64 [ apud Martos & Maia ,1997] para manutenção de organismos aquáticos dulcícolas (limite de 0,03mS/cm). Os valores de pH medidos no dia 09-04 na margem, encontraram-se acima do limite, mas no dia do início do experimento o pH estava na faixa aceitável. Todos os valores de condutividade, entretanto, encontraram-se acima do limite máximo recomendado. Todos os valores de OD estão de acordo com os níveis recomendados.

156 Não houve morte de peixes durante o experimento. A tabela 2b permite comparar os parâmetros morfométricos de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus avaliados no dia 4 do experimento in situ . Pode-se observar que o grupo controle de Oreochromis niloticus , apresenta peixes maiores, quando comparado ao grupo experimental. Entre os outros peixes não se observa diferenças de tamanho entre os grupos controle e experimentais.

Tabela 1b : Variáveis físicas e físico-químicas medidas na margem e na calha central do rio Pomba em S.A. de Pádua, e no tanque de cultivo de peixes da Secretaria Municipal de Agricultura

Variáveis físicas e físico-químicas Data Locais Horários Temperatura pH OD (mg/L) Condutividade

da água (ºC) (mS/cm) 09-04-03 Margem 16:35 26,6 9,3* 6,81 0,047* 17:45 26,3 9,4* 6,99 0,047* 10-04-03 Margem 7:30 26 8,84 6,10 0,044* 9:50 26,3 8,32 6,5 0,044* 11:40 26,9 7,15 6,85 0,049* Calha Central 9:40 26,4 7,86 7,1 0,043* 14-04-03 Margem 8:25 25,7 8,16 7,59 0,047* Calha Central 8:35 25,7 7,62 7,22 0,047* Tanque de cutltivo 8:15 26,5 7,3 5,41 0,005* * - Variável fora dos padrões estabelecidos.: pH: CONAMA 20, Condutividade: CEPIS, OPS/OMS, 1963/64 [ apud Martos & Maia ,1997].

157 Tabela 2b : Comparação entre os parâmetros morfométricos de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus em experimento in situ realizado no rio Pomba.

Espécies Parâmetros morfométricos

Número de animais (N) Peso do peixe (g) Comprimento do peixe (cm) Peso fígado (g)

Controle Experimental Controle Experimental Controle Experimental Controle Experimental

Oreochromis niloticus 7 5 119,86± 42,83 75,26 ± 22,44 19,29 ± 2,61 16,5 ± 1,87 1,22 ± 0,50 0,63 ± 0,15

124 (59-169) 77 (50,3-101) 20 (15,5-22) 15,5 (15-19) 1,20(0,57-1,93) 0,65 (0,45-0,78)

Hypophthalmichthys 6 7 139,67 ± 43,43 140,14 ± 44,38 21,33 ± 2,44 21,86 ± 2,61 0,94 ± 0,29 1,18 ± 0,42

molitrix 132,5 (94-200) 127 (71-200) 21,5 (18,50-24) 22 (17-25) 1,00 (0,52-1,34) 1,24 (0,45-1,8)

Prochilodus lineatus 3 4 42,43 ± 6,05 53,25 ± 26,96 14,13 ± 1,03 14,87 ± 2,78 0,35 ± 0,05 0,43 ± 0,27

43,30 (36-48) 42 (36-93) 14 (13-15,5) 13,75 (13-19) 0,36 (0,30-0,40) 0,40 (0,18-0,74)

Valores: média ± desvio padrão

Mediana (mínimo-máximo)

158 A tabela 3b mostra as atividades de EROD em S9 hepática de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus em peixes exposto à água do rio Pomba antes (controle) e após o acidente (experimental) de Cataguazes.

Tabela 3b : Comparação entre Valores da atividade de EROD em S9 hepática de Hypophthalmichthys molitrix , Oreochromis niloticus e Prochilodus lineatus no experimento in situ no rio Pomba.

Atividade de EROD (pmols de resorufina/min/mg de proteína)

Espécie Controle – tanque de cultivo Experimental – rio Pomba (número de animais) controle experimental Oreochromis niloticus 35,18 ± 9,46 191,85 ± 129,25 a (7) (5) 33,30 (23,27-54,46) 182,92 (40,79-385,95) Hypophthalmichthys molitrix 4,43 ± 2,66 8,60 ± 4,87 (6) (7) 4,00 (0,86-7,78) 9,70 (1,78-14,42) Prochilodus lineatus 2,44 ±1,31 3,17 ± 2,94 (3) (4) 2,46 (1,13-3,74) 2,79 (0,55-6,53) Valores: Média±Desvio Padrão Mediana (mínimo-Máximo) a = p<0,05 A figura 1b mostra as atividades de EROD nos grupos controle e experimental da Oreochromis niloticus . A atividade encontrada no grupo controle foi de 36,07 ±9,18 pmol/min/mg de proteína, enquanto que a determinada no grupo experimental foi de 194,39 ±128,10 pmol/min/mg de proteína. Em relação à média do grupo controle, a do experimental teve um aumento de atividade de 5,4 vezes. A diferença entre os dois grupos foi estatisticamente significativa no limite de p (p=0,051) considerando-se a hipótese unidirecional (atividade de EROD aumentada nos peixes do grupo experimental).

159 Controle 350 * 300 Experimental 250 200 150 100 50 Atividade de EROD Atividade 0

(pmol/mim/mg de proteína) Tilápia tailandesa

Figura 1b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental da Oreochromis niloticus

A figura 2b mostra as atividades de EROD nos grupos controle e experimental de Hypophthalmichthys molitrix . A atividade encontrada no grupo controle foi de 4,43 ±2,66 pmol/min/mg de proteína, enquanto que a determinada no grupo experimental foi de 8,60 ±4,87 pmol/min/mg de proteína. A razão entre as médias do grupo controle e experimental indica um aumento de atividade no grupo experimental de 1,9 vezes, mas a diferença entre os dois grupos não foi estatisticamente significativa (p=0,083).

16 Controle 14 Experimental 12 10 8 6

deproteína) 4 2 0

Atividadede EROD (pmol/mim/mg Carpa

Figura 2b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental de Hypophthalmichthys molitrix

A figura 3b mostra as atividades de EROD nos grupos controle e experimental de Prochilodus lineatus . A atividade encontrada no grupo controle foi de 2,44 ±1,31 pmol/min/mg de proteína, enquanto que a determinada no grupo experimental foi de

160 3,17 ±2,94 pmol/min/mg de proteína. A comparação estatística entre as médias do grupo controle e experimental indica que não houve aumento da atividade (p=0,68).

16 Controle 14 Experimental 12 10 8 6 4

Atividade de Atividade EROD 2 0 (pmol/min/mg de proteína) curimatã

Figura 3b : Comparação da atividade de EROD entre os grupos controle e experimental de Prochilodus lineatus IV - Discussão

Al-Arabi (2002) constatou um aumento de 3,1 vezes na atividade de EROD do peixe tropical Rita rita após 3 dias de exposição intraperitoneal ao PCB, mistura Clorofen A50. A atividade de EROD aumentou 4,6 vezes no décimo dia de exposição. Este mesmo trabalho relata uma diminuição de 16% na atividade de EROD, em relação ao controle, quando esta espécie é exposta ao cloreto de cádmio. De Flora (1993) realizou um experimento in situ no rio Pó (Itália) com trutas ( Oncorhynchus mykiss ) e comparou atividades de EROD na fração microssomal, e outros biomarcadores, entre estações à montante e à jusante de uma fonte pontual de poluição. O autor observou um aumento de 4 vezes na atividade de EROD dos peixes provenientes dos tanques situados à jusante do foco de poluição, após 7 dias de exposição, quando comparados ao controle. No presente estudo observou-se um aumento de atividade de EROD em 5,4 vezes quando se compara as médias dos grupos controle e experimental de O. niloticus (linhagem tailandesa). Kosmala (1998) observou que a atividade de EROD nos Cyprinidae ( Cyprinus carpio ) (N= 10), provenientes de tanques experimentais com rejeitos de estação de tratamento de esgotos, aumentou significativamente em 4 e 8 dias de exposição, e decresceu no 16º dia. No Salmonidade de clima temperado, Oncorhynchus mykiss, houve uma indução de EROD que permaneceu até o final do experimento. Assim, além de outras informações geradas no estudo, Kosmala concluiu que 4 dias de exposição é

161 tempo suficiente para medir um efeito significante em relação à indução de EROD nas espécies estudadas. No presente estudo com o Cyprinidae ( Hypophthalmichthys molitrix ) (N=6-7) não foram encontradas diferenças entre controles e expostos quanto a atividade de EROD ( P=0,082). O experimento foi realizado in situ simulando a exposição real dos peixes nas águas do rio Pomba, cerca de 71Km à jusante da fonte de despejo, e 13 dias após o acidente, e não como o de Kosmala em que o rejeito da estação de tratamento foi colocado diretamente no tanque experimental. Whyte (2000) ressalta que diferenças de atividade de EROD em peixes em relação ao controle são observadas geralmente em menos de 48h, e uma indução máxima de EROD por agonistas do receptor Ah são atingidas em 1 semana ou menos. Quando os níveis de indução entre as espécies são comparados pode-se observar uma diferença de resposta. A espécie que respondeu melhor ao biomarcador foi a O. niloticus , que níveis basais mais altos do que os de outros peixes grupos, e exibiu um marcante aumento de atividade no grupo experimental. Os valores de atividade de EROD nas outras duas espécies não diferiram entre os grupos controle e experimental. Analisando-se os valores dos grupos controles a espécie O. niloticus (linhagem tailandesa) apresentou as mais elevadas atividades de EROD (36,07 ±9,18 pmol/min/mg de proteína). Controles de Hypophthalmichthys molitrix (4,43 ±2,66) e Prochilodus lineatus (2,44 ±1,31) mostraram atividades bem mais baixas quando comparados aos valores obtidos para Oreochromis niloticus . Estas atividades, entretanto são mais altas do que as obtidas para H. affinis (coletado no mesmo local antes do acidente) como no anexo 1 ( tabelas 8a ). O que se pode observar com este experimento é uma mudança (ou não) do biomarcador nas duas situações (antes e depois do acidente), mas não se pode afirmar que os peixes do rio Pomba antes do acidente não estivessem expostos a indutores de EROD. Em estudo realizado por Parente (2003) foi observado que a atividade de EROD em S9 hepática da Oreochromis niloticus coletada em locais de referência foi de 16,70 ±3,84, em determinação realizada a 37ºC. No presente estudo (também com S9 hepática) foram medidos no grupo controle para a espécie O. niloticus (linhagem tailandesa) valores de 36,07 ±9,18 pmol/min/mg de proteína na atividade de EROD, determinada a 30ºC. As atividades basais de EROD variam consideravelmente entre as espécies de peixes. Whyte (2000) afirma que a atividade basal de CYP1A é tão importante como o grau de resposta do animal. Espécies que mostram elevada indução na atividade de

162 EROD, podem não ser as mais adequadas para estudos de biomonitoramento. Um claro conhecimento da dos níveis basais de indivíduos não expostos é essencial para a correta interpretação da indução de EROD. O conhecimento da atividade basal de EROD de determinadas espécies coletadas em áreas de referência ou não poluídas tem ajudado no entendimento de diferenças intra e interespecíficas (Whyte, 2000). O fato de não ter havido nenhum peixe morto ao final do experimento, pode indicar ausência de efeito agudo, uma vez a exposição ocorreu 13 dias após o acidente.

163 V – Conclusões Este estudo sugere que as espécies estudadas diferem quanto à inducibilidade de EROD, sendo O. niloticus a espécie mais suscetível à indução. Embora não tenham ocorridos efeitos agudos visíveis (morte), a exposição, 13 dias após o acidente de Cataguazes, parece ter induzido EROD em pelo menos uma das espécies ( O. niloticus ). Esta indução sugere a presença de substâncias indutoras de EROD entre os contaminantes que atingiram o rio. A análise dos sedimentos poderá confirmar esta hipótese já que os contaminantes indutores de EROD ( e.g. PBCs, PCDDs, PCDFs) são pouco solúveis em água e tendem a se depositar no fundo dos rios.

164 VI - Referências bibliográficas

ADAMS, S.M.; HAM K.D.; GREELEY, R.F.; LEHEW, D.E.; HINTO AND SAYLOR C.F.(1996) Downstream gradientes in bioindicator responses: point source contaminat effects on fish health. Canadian Journal of Fish Aquactic Science . 53: 2177-2187. AL-ARABI, S.A.M.; GOKSOYR, A. (2002) Cytochome P4501A responses in two tropical fish species, riverine catfish ( Rita rita ) and marine mudfish ( Apocryptes bato ). Comparative Biochenistry and Physiology Part C 131: 61-71.

GRAVATO, C. AND SANTOS, M. A. (2002) Juvenile Sea Bass Liver P450, EROD induction, adn Erythocytic genotoxic Resonses to PAH and PAH-like Compuonds. Ecotoxicology and Environmental Safety 51: 115-127. OIKARI, A.O.J. AND NAKARI, T. (1982) Kraft pulp mill efluent components cause liver dysfuncion in trout. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology . 28:266-270. SCHOLZ S. AND SEGNER H., 1999. Inducion of CYP1A in primary cultures of rainbow trout (Oncorhyncus mykiss) liver cells: Concentration-response relationships of four model substances. Ecotoxicological Environmental Safety, 43: 252-260. SMITH, J. D. BAGG, J. AND WRIGLEY, I. (1991) Extractable polycyclic hydrocarbons in water from river in sutheastern Australia. Water Research . 25:1145-1150.

Fontes de pesquisa ARAÚJO, P. R. 2003, Abastecimento de água em Campos é suspenso. O Globo Rio de Janeiro. 2 abril, p11. JORNAL DO BRASIL. Desastre atinge 6 municípios e empresa é multada - JB on line. ARAÚJO, P. R PESSOA, F. & BRANDÃO, TÚLIIO. Desastre ecológico em Cataguases pode ter sido o maior do país. O Globo on line.

165 ANEXO 3 - Fotos

Foto: Thiago Parente

Figura 1c: Foto de Geophagus brasiliensis coletado no rio Paraíba do Sul em Três Rios

Foto: Thiago Parente

Figura 2 c: Foto de H. affinis coletado no rio Paraíba do Sul em Três Rios

Foto: Thiago Parente

166 Figura 3c: Fêmea ovada de H. affinis

Foto: Thiago Parente

Figura 4 c: Fígado de G. brasiliensis

Foto: Victor Lopes

Figura 5c: Eritrócitos do sangue periférico de H. luetkeni coletado no rio Preto em Rio das Flores. Em destaque está a célula com micronúcleo.

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