Phylogenetische Analyse Der 18S Rrna Identifiziert Den

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Zoologisch-Botanische Datenbank/Zoological-Botanical Database

Digitale Literatur/Digital Literature

Zeitschrift/Journal: Denisia

Jahr/Year: 2004

Band/Volume: 0013

Autor(en)/Author(s): Wylezich Claudia, Radek Renate, Schlegel Martin

Artikel/Article: Phylogenetische Analyse der 18S rRNA identifiziert den parasitschen Protisten Nephridiophaga blattellae (Nephridiophagidae) als Vertreter der Zygomycota (Fungi) 435-442 © Biologiezentrum Linz/Austria; download unter www.biologiezentrum.at

Denisia 13 | 17.09.2004 | 435-442

Phylogenetische Analyse der 18S rRNA identifiziert den parasitischen Protisten Nephridiophaga blattet I ae (Nephridiophagidae) als Vertreter der Zygomycota (Fungi)1

C. WYLEZICH, R. RADEK £t M. SCHLEGEL

Abstract: Phylogenetic analysis of 18S rRNA identifies the parasitic protist Nephridiophaga blattellae (Nephrid- iophagidae) as a member of fungi. — The taxonomic affiliation of the spore-forming, unicellular nephridiophagids that thrive in the Malpighian tubules of insects is still completely unresolved. Their morphological and ultrastructural characters do not closely resemble any known taxon of spore-forming protists. Some authors classed them with the Haplosporidia but proof is poor; e.g. the typical haplosporosomes are missing in nephridiophagids. In the present examination, the 18S rRNA of Nephridiophaga blatiellae (from the German cockroach Blauella germanica) was amplified and sequenced in order to reconstruct the phylogenetic relationships of that group. Results exclude a close rela- tion to haplosporidia. Data rather support their classification within the fungi. Morphological findings such as the presence of chitin also argue in favour of this hypothesis. According to our analysis the exact position of nephridiophagids seems to be near to the Zygomycota, as it is also reported for microsporidia.

Key words: Nephridiophagidae, phylogeny, Zygomycota, Microsporidia, 18S rRNA.

Einleitung STORCH 2000, die kürzlich erstmals aus der Totenkopf- schabe Blaberus craniifer BURMEISTER 1838 (Blabera) be- Die Nephridiophagidae SPRAGUE 1970 sind mikro- schrieben wurde. Nach RADEK & HERTH (1999) gehören skopisch kleine, einzellige, Sporen formende, heterotro- wie bereits von LANGE (1993) vorgeschlagen drei weite- phe Organismen, die in den Malpighischen Gefäßen von re Gattungen zu den Nephridiophagidae: Coleospora Insekten leben (z. B. RADEK & HERTH 1999), aber relativ GlBBS 1959, Oryctospora PURRINI & WEISER 1990 und harmlos sind. Im Entwicklungszyklus finden sich ver- Peltomyces LEGER 1909, welche ausschließlich in Käfern schiedene Lebensstadien. Die vielkernigen, vegetativen (Coleoptera) vorkommen. Dieses Taxon scheint eine Plasmodien kommen extrazellulär - oder bei einigen Ar- monophyletische Gruppe zu sein. Über ihre nächsten ten auch intrazellulär - im Lumen der Malpighischen Verwandten herrscht hingegen vollkommene Unklarheit Gefäße vor. Sporogonie findet ebenfalls im Wesentlichen (z. B. LANGE 1993; RADEK & HERTH 1999). Einige Auto- dort statt, wobei durch eine innere Abgrenzung in den ren (z. B. KOWALJOWA & ISSI 1973) beschrieben Mitglie- Sporen bildenden Plasmodien etwa 10-35 flache, ovale der der Nephridiophagidae lichtmikroskopisch als Mi- Sporen entstehen. Junge Sporoblasten mit zwei oder vier crosporidia. Ultrastrukturelle Untersuchungen zeigten Kernen kommen vor; reife Sporoblasten sind dagegen jedoch, dass den Nephridiophagidae ein Polfaden sowie fast immer einkernig (siehe Abbildungen 1-3). die charakteristische, posterior lokalisierte Vakuole der Aus Schaben sind bislang vier relativ wirtsspezifische Microsporidia fehlen. Andere Autoren (z. B. SPRAGUE Arten der Gattung Nephridiophaga bekannt: N. blattetiae 1970) stellten sie hingegen - teilweise ohne Angabe von CRAWLEY 1905 {Coebsporidium) aus Blattella germanica Gründen - zu den Haplosporidia (Alveolata). Die Ne- LINNAEUS 1767 (Blatta) (CRAWLEY 1905; WOOLEVER phridiophagidae weisen allerdings keine Haplosporoso- 1966; RADEK & HERTH 1999), N. periplanetae LUTZ & men auf; die Sporenwandbildung unterscheidet sich SPLENDORE 1903 (Plistophora) aus Blatta orientalis LlN- ebenfalls deutlich bei beiden Gruppen. Vielmehr zeigte NAEUS 1758, Periplaneta americana LlNNAEUS 1758 (Blat- die Einbeziehung der Elektronenmikroskopie deutlich, ta) und P. brunnea BURMEISTER 1838 (LUTZ & SPLENDO- RE 1903; LANGE 1993), N. (Coelosporidiwn) tangae PUR- ' Wir widmen diese Studie unserem hochverehrten Kollegen Herrn Univ.-Prof. Dr. Horst Aspöck anlässlich seines 65. Geburtstages in An- RINI, WEISER & KOHRING 1988 aus Blatta sp. (PURRINI et erkennung seiner hohen, überaus umfangreichen und breit gefächerten al. 1988; LANGE 1993) sowie N. blaberi (FABEL, RADEK & wissenschaftlichen Verdienste.

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Abb. 1-3: Stadien im Lebenszyklus von Nephridiophaga blattellae. (1) Reife Sporen üherschichtet. Der Reaktionsansatz wurde 5 min bei 95 im Sporenplasmodium (Interferenzkontrast, Maßstab lOum); (2) Sporoblast °C vorgeheizt und weiterhin für 35 Zyklen (92 °C 60 s, innerhalb eines Sporenplasmodiums (pi; n: Nucleus, mi: Mitochondrien, er: Endoplasmatisches Reticulum, sw: Sporenhülle; TEM, Maßstab 1um); (3) 40 °C 90 s, 72 °C 120 s) sowie abschließend eine Stunde Malpighischer Tubulus (Mt) mit mehreren Parasitenstadien: einkernige Merozoiten bei 72 °C inkubiert. Das PCR Produkt wurde gereinigt (me), vegetative Plasmodien (vpl), Sporenplasmodien (spl) mit Sporen (s; mi: (Microcon-30, AM1CON, Witten, Deutschland) und in Mitochondrien, n: Nuclei, mv: Microvilli; TEM, Maßstab lOum). den pGEM-T-Vektor (PROMEGA, Mannheim, dass die Sporen der Nephridiophagidae keine typischen Deutschland) ligiert. Mit den erhaltenen Plasmiden wur- Charakteristika anderer Sporen bildenden Taxa aufwei- den kompetente E. coli (JM 109) transformiert. Rekom- sen (z. B. LANUE 1993; RAOEK & HERTH 1999; siehe hier- binante Plasmide wurden mit einer Thermo Sequenase zu auch Tabelle 1). (AMERSHAM, Braunschweig, Deutschland) sequenziert und die DNA-Fragmente in einem automatischen Um nun die phylogenetischen Beziehungen der Ne- Sequenzierer (Ll-COR, MWG-Biotech, Ebersberg, phridiophagidae zu anderen Einzellern :u untersuchen, Deutschland) aufgetrennt. Beide Stränge wurden kom- wurde das 18S rRNA-Gen von Nephridiophaga blattellae plett in überlappender Weise mit markierten Ml3- und sequenziert und phylogenetisch analysiert. internen Primern (WYLEZICH et al. 2002) sequenziert.

Material und Methoden Die mit den verschiedenen Primern erhaltenen Se- quenzfragmente wurden mit dem Programm DNASIS, Sporen von Nephridiophaga blattellae wurden aus Kul- Version 7.0 (HITACHI Software / Pharmacia) ver- turen der Deutschen Schabe Blattella germanica gewon- knüpft. Die ermittelte Sequenz wurde mit Hilfe von nen (Herkunft: Umweltbundesamt Berlin). Um die Spo- ClustalX, Version 1.81 (THOMPSON et al. 1999) zu Se- ren zu erhalten, wurde der Darm aus den dekapitierten quenzen verschiedener Eukaryoten-Taxa einschließlich Schaben gezogen und die Malpighischen Gefäße auf Ob- der Fungi aligniert. Die Datensätze wurden auf konser- jektträgern in destilliertem Wasser zerzupft. Sporen wur- vierte, gut homologisierbare Bereiche reduziert (1274 den unter mikroskopischer Kontrolle (inverses Zeiss Positionen im Eukaryoten-Aligment, 1600 Positionen Mikroskop) mittels einer feinen Glaspipette gesammelt im Fungi-Alignment). Phylogenetische Stammbäume und in 80 % Ethanol bis zur weiteren Bearbeitung aufbe- wurden unter Anwendung der Maximum-Likelihood- wahrt. Ebenso wurden Sporen von Nephridiophaga blähen Methode (Tree-Puzzle, Version 5.0, STRIMMER & VON aus der Totenkopfschabe Blaberus aaniifer isoliert. HAESELER 1996) nach dem Modell HKY85 (HASEGAWA Der Alkohol wurde entfernt und die genomische et al. 1985) rekonstruiert. Weiterhin wurden die Distanz- DNA nach dem Protokoll von KAVENOFF & ZiMM (1973, Matrix- und Minimum-Evolution-Methode (Mega, Ver- modifiziert nach STEINBRUCH & SCHLEGEL 1983) isoliert. sion 2.1 KUMAR et al. 2001) mit jeweils 1000 Bootstrap- Das 18S rRNA-Gen wurde mittels PCR amplifiziert. Da- Replikationen angewandt (Kimura-2-Parameter-Modell, zu wurden 1-20 ng DNA mit je 0,1 uM der Eukaryoten- KlMURA 1980). Dabei wurden verschiedene Taxa als spezifischen Primer (MEHLIN et al. 1988), 200 uM dNTPs Außengruppenvertreter verwendet. Zusätzlich wurden sowie Ix PCR-Puffer und 1 unit Taq-DNA Polymerase verschiedene alternative Stammbaumtopologien anhand (SIGMA, München, Deutschland) gemischt. Das End- des im Programm Puzzle enthaltenen Kishino-Hasegawa- volumen von 50 ul wurde mit einem Volumen Mineralöl Tests (KlSHlNO & HASEGAWA 1989) untersucht.

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Taxon Den Nephidiophagidae Wirtsspektrum Chitin Referenzen für Zuordnung der fehlende Merkmale Nephridiophagidae zu entsprechendem Taxon Apicomplexa Apikaikomplex, Pellicula Invertebraten (Arthropoda), Keine Vertebrata Haplosporidia Haplosporosomen, Sporenwand- Invertebraten (Mollusken) PURRINI & WEISER 1990 bildung durch umwachsendes SPRAGUE 1970 Episporen-Cytoplasma WOOLEVER 1966 Microsporidia Polfaden, Polaroplast, posteriore Invertebraten, Vertebrata + KOWAUOWA & Issi 1973 Vakuole PERRIN 1905 Myxozoa Polkapseln, mehrzellige Sporen Vertebrata / Anneliden + Keine Zygomycota (Fungi) Hyphen, Haustorien, asexuelle (teilweise) Invertebraten, + Keine (Sporangiosporen) und sexuelle Fungi 1 Sporen (Zygosporen) i Tab 1: Charakterisierung der Sporen formenden Taxa (Sporen meist unbeweglich, Ergebnisse parasitisch lebend), zu denen die Nephridiophagidae möglicherweise in Von Nephridiophaga blaberi konnte keine 18S rRNA- verwandtschaftlicher Beziehung stehen könnten. Sequenz ermittelt werden, da alle sequenzierten Plasmi- de nur die 18S rRNA-Gensequenz des Wirtes B. craniifer Hypothese LogL Differenz Standardfehler Signifikant schlechter? enthielten, wie eine Genbank-Recherche im Internet [1] -15554.03 Bester Stammbaum (Blast-Suche) ergab. Dies ist vermutlich auf die niedrige [2] -15592.50 38.47 20.74 Nein Infektionsrate der Schaben zurückzuführen. [3] -15639.67 85.64 31.14 Ja [4] -15650.14 85.64 32.55 Ja Die ermittelte Gensequenz von Nephridiophaga Hat- [5] -15619.50 65.46 30.79 Ja tellae (Genbank-Zugangsnummer: AY 603958) weist eine Länge von 1807 bp auf. Der G/C-Gehalt beträgt 48,1 %. Tab 2: Ergebnis des Kishino-Hasegawa-Tests. Hypothese [1] entspricht dem Eine Genbank-Recherche ergab die größte Übereinstim- Stammbaum in Abbildung 5. Folgende weitere Stammbaumhypothesen zur phylogenetischen Position von Nephridiophaga blattellae innerhalb der Eukaryoten mung der ermittelten Gensequenz mit 18S rRNA-Se- wurden untersucht: quenzen von Pilz-Vertretern. In Abbildung 4 ist ein [2] N. blattellae an der Basis aller Fungi Neighbor-Joining-Stammbaum zur Phylogenie von N. [3] N. blattellae als Schwestertaxon der Haplosporidia blattellae innerhalb der Eukaryoten dargestellt. Die Ver- [4] W. blattellae (+ Haplosporidia) als Schwestergruppe der Alveolata zweigung des Minimum-Evolution-Stammbaumes [5] N. blattellae (+ Haplosporidia) als Schwestergruppe der Fungi stimmt im Wesentlichen mit dem in Abbildung 4 gezeig- Hypothese LogL Differenz Standardfehler Signifikant schlechter? ten Stammbaum überein. Wie schon die Genbank-Re- [1] -11465.44 Bester Stammbaum cherche vermuten lässt, steht N. blattellae hier innerhalb [2] -11495.29 29.85 10.86 Ja der Fungi, Nephridiophaga blattellae zweigt in einer Multi- [3] -11473.97 8.53 8.77 Nein furkation mit den meisten Fungi-Vertretern ab. Um die Tab 3: Ergebnis des Kishino-Hasegawa-Tests. Hypothese [1] entspricht dem genaue Position zu untersuchen, wurden mittels eines Stammbaum in Abbildung 6. Folgende weitere Stammbaumhypothesen zur Kishino-Hasegawa-Tests verschiedene Hypothesen über- phylogenetischen Position von Nephridiophaga blattellae innerhalb der Fungi prüft. Abbildung 5 zeigt den besten Stammbaum, der mit wurden untersucht: Hilfe dieses Tests gefunden werden konnte (entspricht [2] N. blattellae mit .uncultured rhizosphere zygomycete1 als Schwestergruppe der Hypothese [1] in Tabelle 2). Nephridiophaga blattellae bil- Entomophthorales [3] N. blattellae mit .uncultured rhizosphere zygomycete' als Schwestergruppe der det hier das Schwestertaxon des .uncultured rhizosphere Zoopagales zygomycete'-Isolates innerhalb der Zygomycota-Vertreter (S. depressa, R. variabilis, M. racemosus). Weiterhin wur- lutionsgeschwindigkeit aufweisen und kaum Überein- den folgende Hypothesen untersucht: [2] N. blattellae stimmungen zu anderen eukaryotischen 18S rRNA-Ge- zweigt an der Basis aller Fungi ab; [3] N. blattellae stellt nen aufweisen (z. B. VOSSBRINCK et al. 1987). das Schwestertaxon der Haplosporidia dar; [4] N. blattet- Um die genauere Position von N. blattellae innerhalb lae (+ Haplosporidia) ist die Schwestergruppe der Alveo- der Pilze zu untersuchen, wurden Stammbäume aus- lata; [5] N. blattellae (+ Haplosporidia) ist die Schwester- schließlich mit Fungi- (ohne Abbildung), bzw. Zygomy- gruppe der Fungi. Wie in Tabelle 2 zu sehen ist, wird da- cota-Sequenzen durchgeführt. Hierzu wurden ebenfalls bei einzig Hypothese [2] als nicht signifikant schlechter verschiedene Hypothesen untersucht. In Abbildung 6 bewertet. Alle Hypothesen, in denen N. blattellae bei den (ausschließlich Zygomycota-Vertreter) ist der beste ge- Haplosporidia steht, werden dagegen immer als signifi- fundene Stammbaum abgebildet (entspricht Hypothese kant schlechter bewertet. Eine mögliche nähere Ver- [1] in Tabelle 3). Hier zweigt N. blattellae - wiederum zu- wandtschaft der Nephridiophagidae zu den Microspori- sammen mit dem .uncultured rhizosphere zygomycete'- dia kann anhand der 18S rRNA nicht nachgewiesen Isolat - als Schwestergruppe zur Entomophthorales-Mu- werden, da deren 18S rRNA-Gene eine sehr hohe Evo- corales-Gruppierung ab. Mittels eines Kishino-Hasega-

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dabei als signifikant schlechter bewertet. Hydnum repandum Im Gegensat: dazu ist die Zugehörigkeit zu Laxitextum bicolor den Zoopagales (Hypothese [3] in Tabelle Schizosaccharomyces pombe Rhizomucor variabilis 3) nicht auszuschließen. Mucor racemosus Candida sorbophila Nephridiophaga blattellae FUNGI Diskussion 'uncultured rhizosphere zygomycele' Syncephalis depressa Neocallimaslix sp. Nach dieser ersten hier vorgestellten Spizeltomyces aaiminatits molekularbiologischen Untersuchung Capsaspora oivczarzaki evolvierten die Nephridiophagidae inner- Sphaerothecum destruens Anemonia sulcata METAZOA halb einer Gruppe der Fungi: der Zygomy- Acanthocoepsis unguiculata CHOANOZOA cota (Abbildungen 4-6). Eine nähere ver- Diaphanoeca grandis Hartmannella vermiformis wandtschaftliche Beziehung zu den Ha- Acanlhamoeba castellanii LOBOSA plosporidia, wie sie beispielsweise von Balannithia mandritlahs Oxytriclia granuli/era PURRINI & WEISER (1990) vorgeschlagen Paramecium letraurelia wurde, kann anhand der Sequenzdaten un- Gymnodinium beii AI.VEOI.ATA wahrscheinlich gemacht werden. Wie ein Prorocentrum mexicanum Fucus dislichus Kishino-Hasegawa-Test zeigt, werden dies- STRAMENOPILATA Labyrinlhuloides minuta bezügliche Stammbaumtopologien als sig- Chlorella vulgaris Volvox carteri PLANTAE nifikant schlechter bewertet (Hypothese Chlorarachnion reptans [3], [4] und [5] in Tabelle 2). Die Nephri- Paulinella chromatophora CERCOZOA Euglypa rotunda diophagidae unterscheiden sich von den i'annella anglica Haplosporidia außerdem durch eine Viel- LOBOSA Vunnella sp. zahl von Charakteristika, wie z. B. das Feh- Haplosporidium louisiana Haplosporidium nelsoni ALVEOLATA len von Haplosporosomen, der Art und Haplosporidium costale Weise der Sporenwandbildung, dem Wirts- Enlamoeba moshkovskii Emamoeba gingivalis CONOSA spektrum und Habitat (PURRINI et al. Dictyostelium discoideum 1988; RADEK & HERTH 1999), so dass die- Hexamita inflata ses Resultat nicht überrascht. Weiterhin wurde bei den Nephridiophagidae - wie Abb. 4: Konsensus-Stammbaum (Neighbor-Joining-Methode) zur phylogenetischen Stellung von Nephridiophaga blattellae (fett) innerhalb der Eukaryoten. Der Stammbaum wurde mit dem Programm bei den Microsporidia (z. B. KEELING 2003) Mega (Evolutionsmodell Kimura-2-Parameter) erstellt. Die an den Verzweigungen angegebenen Werte - Chitin in der Sporenwand nachgewiesen entsprechen den Bootstrap-Werten für 1000 Replikationen (in %, NJ/ME). Als Außengruppe wurde (RADEK et al. 2002), während es hierfür bei Hexamita inflata gewählt. Genbankzugangsnummern der verwendeten Arten: Acanthamoeba den Haplosporidia keine Hinweise gibt. castellanii U07413, Acanthocoepsis unguiculata L10823, Anemonio sulcota X53498, Bolamuthia mandrillaris AF019071, Candida sorbophila AB018151, Capsaspora owczarzaki AF436889, Die tatsächliche Zugehörigkeit von Chlorarachnion reptans X70809, Chlorella vulgaris XI3688, Diaphanoeca gra/irf/sL 10824, Dictyostelium Protistentaxa zu den Pilzen ist nicht neu: discoideum K02641, Entamoeba gingivalis D28490, Entamoeba moshkovskii W\49906, Euglypha rofunrioAJ418783, Fucus distichus AB0UA23, Gymnodinium be/7U41087, Haplosporidium costale so wie die früher als farblose Grünalgen be- AF387122, Haplosporidium louisiana U47851, Haplosporidium nelsoni U19538, Hartmannella trachtete Gattung Hyaloraphidium PA- vermiformis M95168, Hexamita inflata L07836, Hydnum repandum AFO26641, Labyrinthuloides minuto SCHER & KORSHIKOV 1931 zu den Pilzen L27634, Laxitextum bicolor AF026605, Mucor racemosusX54863, Neocaliimostixsp. M59761 Oxytricha gehört (zu Chytridiomycota, USTINOVA et granuliferaX53486, Paramecium tetraureliaX03772, Paulinella chromatophoraX81811, Prorocentrum mexicanum Y16232, Rhizomucor variabilis AF113435, Schizosaccharomyces pombe X58056, al. 2000), sind auch die Microsporidia ab- Sphaerothecum destruens L29455, Spizellomyces acuminatus M59759, Syncepahils depressa ABO16O11, geleitete Pilze und entwickelten sich ver- Vannella anglica AF099101, Vannella sp. (nicht ve'röff.), Volvox carterikf\83490, .uncultured mutlich aus Vorfahren der Zygomycota (z. rhizosphere zygomycete' AJ506030. Die beiden Vertreter der Mesomycetozoea {Capsaspora owczarzoki B. HIRT et al. 1999, KEELING 2003). Die und Sphaerothecum destruens) werden hier als Fungi bezeichnet; ihre genaue systematische Stellung phylogenetische Zugehörigkeit der Ne- ist bislang jedoch nicht klar. phridiophagidae zu Vertretern der Fungi ist dagegen zunächst unerwartet und wurde wa-Tests wurde eine mögliche Zugehörigkeit zu den pa- bisher nicht in Betracht gezogen, da auf den ersten Blick rasitischen Entomophthorales (Hypothese [2] in Tabelle keine offensichtlichen Ähnlichkeiten zu erkennen sind. 3) und Zoopagales (Hypothese [3] in Tabelle 3) unter- Bei gezielterer Betrachtung können jedoch durchaus sucht. Die ebenfalls parasitischen Dimargaritales wurden morphologische Hinweise für eine Verwandtschaft ge- von einer Analyse ausgeschlossen, da ihre 18S rRNA ei- funden werden. Wie bereits erwähnt, kommt in der Spo- ne beträchtlich höhere Evolutionsgeschwindigkeit als renwand Chitin vor, was allerdings auch bei einigen an- die der anderen Zygomycota aufweist (TANABE et al. deren Protisten zu finden ist (z. B. in der Lorica einiger 2000). Eine mögliche Verwandtschaft von hl. blattellae zu Ciliaten, MULISCH 1993). Die Nephridiophagidae besit- den Entomophthorales (Hypothese [2] in Tabelle 3) wird zen jedoch Vesikel nahe der Sporenwandoberfläche, wel-

438 © Biologiezentrum Linz/Austria; download unter www.biologiezentrum.at ehe möglicherweise dem Transport der Syncephalis depressa Chitinsynthetase dienen und den Chitoso- 'uncultured rhizosphere zygomycete' men der Pilze vergleichbar sein könnten Nephridiophaga blattellae (RADEK et al. 2002). Ein Flagellatensta- Rlnzomucor variabilis •{ dium weisen die Nephridiophagidae eben- Mncor racemosus r~ Hydmim repandum so wie die meisten Fungi-Gruppen (mit I *— Laxilexmm bicolor FUNGI Ausnahme der Chytridiomycota, welche Schizosaccharomyces pombe Candida sorbophila ein posteriores Flagellum besitzen) nicht Neocallimastix sp. auf (BEAKES 1998). Den Zygomycota und C Spizellomyces acuminalus anderen Pilzvertretern (ausgenommen ^—^— Capsaspora owczarzaki — Sphaeroiheciim destruens Chytridiomycota) fehlt ein gestapelter Anemonia sulcala METAZOA Golgiapparat (USTINOVA et al. 2000), was I~v4 canlhocoepsis ungiiiculata CHOANOZOA ebenso für die Nephridiophagidae gilt Diaphanoeca grandis Chlorarachnion replans (RADEK & HERTH 1999; FABEL et al. 2000). l'aulinella chwmalophora CERCOZOA Demgegenüber sind etliche Unterschiede Euglypa rotunda Chlorella vulgaris in Lebensweise und Morphologie zwischen PLANTAE Volvox carleri Zygomycota und Nephridiophagidae vor- Fucus distichus handen (siehe Tabelle 1). Auch haben die Labyrinlhuloides minuta STRAMENOPILATA Nephridiophagidae nicht wie die Pilze ab- Gymnodinium beii Prorocentrum mexicamtm ALVEOLATA geflachte, sondern tubuläre Mitochon- Oxytricha granulifera driencristae (RADEK & HERTH 1999). Paramecium lelraurelia A canlhamoeba castellanii Dennoch ist davon auszugehen, dass es Balainulhia mandrillaris Harlmannella vennifomiis LOBOSA sich bei der ermittelten Gensequenz nicht Vannella anglica um eine Pilzkontamination handelt. Zwar Vannella sp. kommen Pilze auch natürlicherweise in Haplosporidium nelsoni Haplospnridinm costale ALVEOLATA den Malpighischen Gefäßen von Insekten ^^~~~~~ Haplosporidium loui.iiana vor, jedoch handelt es sich diesbezüglich - Diayosielium diseoideum CONOSA bei Schaben mehrheitlich um Ascomyco- • Entamoeba moshkovskii ' Enlamoeba gingivalis ta-Vertreter (ROTH & WILLIS 1960). Hexamila inflala Mikroskopisch sind bei der Präparation der 0.1 Sporen keine Hyphen oder andere Stadien von Pilzen (bzw. Parasiten) aufgefallen. Abb. 5: Dargestellt ist der beste Stammbaum des Kishino-Hasegawa-Testes (Puzzle), welcher Hypothese [1] in Tabelle 2 entspricht. Untersucht wurde die phylogenetische Stellung von Eine mögliche nahe Verwandtschaft Nephridiophaga blattellae (fett) innerhalb der Eukaryoten. Als Außengruppe wurde Hexamita inflata zwischen den Nephridiophagidae und den gewählt. Der angegebene Maßstab entspricht 0,1 Substitutionen pro Position, zu den Pilzen gehörenden Microsporidia ist (Genbankzugangsnummern der verwendeten Arten siehe Abb. 4) nicht gänzlich auszuschließen (z. B. KOWAL- JOWA & ISSI 1973). Ähnlichkeiten zwischen Nephridio- Eine nähere Verwandtschaft der Nephridiophagidae phagidae und Microsporidia findet man beispielsweise im zu den Microsporidia kann anhand der 18S rRNA aller- Aufbau der Sporenwand. Die Sporen beider bestehen aus dings nicht nachgewiesen werden. Stattdessen wurde ei- zwei Hauptschichten (Endo- und Exospore), von denen ne eventuelle Verwandtschaft zu den parasitischen Ento- die innere chitinhaltig ist (RADEK et al. 2002; VAVRA mophthorales (Zygomycota) untersucht, in deren Nähe 1976). Die Exospore der Microsporidia besteht größten- auch die Microsporidia stehen (KEELING 2003). Diese teils aus Proteinen; Proteine sind vermutlich auch bei den Hypothese wird allerdings als signifikant schlechter be- Nephridiophagidae Bestandteile der Sporenwand (RADEK wertet (Hypothese [2] in Tabelle 3). Nach den bisherigen et al. 2002). Einen gestapelten Golgiapparat weisen die Analysen muss daher angenommen werden, dass die Ne- Microsporidia ebenso wie die Nephridiophagidae nicht auf phridiophagidae nicht näher mit den Microsporidia ver- (CANNING 1998). Die Microsporidia zeigen eine geschlos- wandt sind. Eine weitere Hypothese, eine mögliche Zu- sene, intranukleäre Pleuromitose (Spindelhälften liegen gehörigkeit von N. blattettae zu den Zoopagales (einer in bestimmtem Winkel zueinander, CANNING 1998) wie ebenfalls parasitisch lebende Gruppe der Zygomycota, auch die Zygomycota und Haplosporidia (RAIKOV 1994). TANABE et al. 2000), ist anhand der bisherigen Sequenz- Eine geschlossene Mitose ist bei Pilzen weit verbreitet (BE- daten nicht auszuschließen (Hypothese [3] in Tabelle 3). AKES 1998). Bei den Nephridiophagidae wurden ebenfalls Mikrotubuli im Inneren des Kerns bei unversehrter Kern- Ein Grund dafür, dass sich die ermittelte Gensequenz hülle beobachtet; die Spindelpolkörper liegen sich jedoch von N. biattetiae nicht eindeutig einer Gruppe der Pilze, gegenüber und inserieren nicht an der Kernhülle (RADEK bzw. Zygomycota zuordnen lässt, könnte der zu geringe & HERTH 1999). phylogenetische Informationsgehalt sein. Sowohl die Mi-

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^~ Suksenaea vasiformis hand der 18S rRNA-Sequenzvergleiche Syzygiles megalocarpus sind möglicherweise in der hohen Speziali- Rhizomucor variabilis sierung der Microsporidia an die parasiti- Circinomucor circinelloides sche Lebensweise begründet. Es hat sich Hackusella ctenidia gezeigt, dass die 18S rRNA, wie bereits er- Mucorales Ellisomyces anomalus wähnt, bei hoch adaptierten Parasiten un- Mucor racemosus verhältnismäßig schnell evolviert und da- Thermomucor indicae-seudalicae her für eine phylogenetische Einordnung ^^~^^~ Dichotomocladium elegans nur schlecht zu verwenden ist. Diese hohe ^^^~^~^~ Syncephalaslnim monosporum Spezialisierung der Microsporidia zeigt sich Conidiobolus coronalus auch in der Morphologie ihrer Sporen: sie Conidiobohis lamprauges Entomophlhoralcs sind optimal für die Infektion von Wirts- Entomophaga aulicae zellen ausgestattet (intrazelluläre Injektion -'uncultured rhizosphere zygomycete' des infektiösen Sporoplasmas mithilfe von ^—~—— Nephridiophaga blattellae Polfaden, Polaroplast und posteriorer Va- Thamnocephalis sphaerospora kuole). Spezielle Vorrichtungen zum Befall Svncepholis dcpressa von Wirtszellen sind bei den Nephridio- ^^^— Rhopalomyces elegans Zoopagales phagidae nicht vorhanden (zudem meist Piptocephalis corymbifera extrazelluläre Lebensweise). Sie verankern Kuzuhaea moniliformis sich lediglich mittels Pseudopodien zwi-

Spiromyces aspiralis Kickxcllalcs schen den Mikrovilli der Epithelzellen in Spiromyces minulus den Malpighischen Tubuli (R.ADEK & r Morlierella chlamydospora Monicrcllalcs HERTH 1999). Auch ihre Pathogenität und * Echinosporcmgium transversale die Auswirkungen auf Wirtstiere sind eher • Schizosaccharomyces pombe gering (LANGE et al. 1993; FABEL et al. o.i 2000; PURRINI und WEISER 1990). Mögli-

Abb. 6: Dargestellt ist der beste Stammbaum des Kishino-Hasegawa-Testes (Puzzle), welcher cherweise sind die Nephridiophagidae Hypothese [1] in Tabelle 3 entspricht. Untersucht wurde die phylogenetische Stellung von phylogenetisch jüngere Parasiten (bzw. Nephridiophaga blattellae (fett) innerhalb der Zygomycota. Als Außengruppe wurde Kommensalen) als die Microsporidia. Schizosaccharomyces pombe gewählt. Der angegebene Maßstab entspricht 0,1 Substitutionen pro Position. Genbankzugangsnummern der zusätzlich verwendeten Arten: Backusello ctenidia AF157122, Die exakte phylogenetische Position Conidiobolus coronatus D29947, Conidiobolus lamprauges AF113420, Circinomucor circinelloides von Nephridiophaga blattellae innerhalb der AF157129, Dichotomocladium elegans AF157131, Echinosporangium transversale AF113424, Pilze kann derzeit aufgrund der bisherigen Ellisomyces anomalus AF157134, Entomophaga aulicae U35394, Kuzuhaea moniliformis AB016010, Mortierella chlamydospora AF157143, Piptocephalis corymbifera AB016023, Rhopalomyces elegans Datengrundlage nicht genauer detektiert AB016012, Saksenoea vasiformis AF113442, Spiromyces aspiralis AF007543, Syncephalastrum werden. Hierzu müssten weitere Arten der monosporum AF157161, Syzygites megalocorpus AF157162, Thamnocephalis sphaerospora AB016013, Nephridiophagidae (was auch zur Verifizie- Thermomucor indicoe-seudaticae AF157165. rung der bisher ermittelten Gensequenz von N. blattellae vorteilhaft ist), bzw. Se- crosporidia als auch die Zygomycota (und Chytridiomyco- quenzen anderer Gene in eine solche Untersuchung ein- ta, BULLERWELL et al. 2003) weisen hohe Substitutionsra- bezogen werden. ten auf, wodurch Sättigungseffekte eingetreten sein könn- ten und das phylogenetische Signal zumindest zum Teil Danksagung verrauscht ist. Möglich wäre auch, dass im Datensatz Schlüsselarten fehlen, deren Einbeziehung für die Detek- Wir danken Frau Warun Schier für die hervorragende techni- tion einer solchen Verwandtschaft erforderlich ist. Inner- sche Assistenz bei der Durchführung der Laborarbeiten. halb der Pilze zählen die Zygomycota (und Chytridiomy- cota, BULLERWELL et al. 2003) zu den mit molekularen Zusammenfassung Merkmalen bisher am wenigsten charakterisierten Grup- Die taxonomische Zuordnung der Sporen formenden, einzelli- pen. Zudem erscheinen die Zygomycota häufig polyphyle- gen Nephridiophagidae, die in den Malpighischen Gefäßen von tisch, und eine klare Separation zwischen Zygomycota und Insekten leben, war bislang völlig ungewiss und anhand mor- Chytridiomycota ist oftmals nicht gegeben (JENSEN et al. phologischer und ultrastruktureller Merkmale nicht aufzuklä- 1998; TANABE et al. 2000; VOIGT & WÖSTEMEYER 2001), ren. So zeigen ihre Sporen nicht die typischen Charakteristika was ebenfalls auf die hohe genetische Diversität und den anderer Sporen bildender Einzeller. Einige Autoren stellten sie relativ geringen Probenumfang zurückzuführen ist. zu den Haplosporidia, obwohl auch hierfür keine überzeugen- den Hinweise zu finden sind, beispielsweise fehlen den Nephri- Fehlende Hinweise auf eine mögliche Verwandt- diophagidae die bezeichnenden Haplosporosomen der Haplos- schaft von Microsporidia und Nephridiophagidae an- poridia.

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Um die stammesgeschichtliche Herkunft dieses Taxons zu re- KUMAR S., TAMURA K., JAKOBSEN I.B & M. NEI (2001): MEGA2: Mole- konstruieren, wurde die 18S rRNA von Nephridiophaga blatteUae cular evolutionary genetics analysis software. — Bioinfor- (aus der Deutschen Schabe Blattella germanica) amplifizien und matics 17: 1244-1245. sequenziert. Nach dieser ersten molekularbiologischen Untersu- LANGE C.E. (1993): Unclassified protists of arthropods: the ultra- chung erscheint es sehr unwahrscheinlich, dass die Nephridio- structure of Nephridiophaga periplanetae (LUTZ S SPLENDORE, phagidae näher mit den Haplosporidia verwandt sind. Viel 1903) n.comb., and the affinities of the Nephridiophagidae mehr deuten die Daten daraufhin, dass sie ihren evolutiven Ur- to other protists. — J. Eukaryot. Microbiol. 40: 689-700. sprung innerhalb der Pilze haben. Dies wird auch durch mor- LUTZ A. & SPLENDORE A. (1903): Über Pebrine und verwandte phologische Befunde gestützt: in der Sporenwand ist das Vor- Mikrosporidien. Ein Beitrag zur Kenntnis der brasilianischen kommen von Chitin nachgewiesen. Die genaue Position des Ta- Sporozoen. — Centr. Bakt. Parasitenkd. I. Abt., Orig. 33: xons ist nach den bisherigen Analysen - ähnlich den Micros- 150-157.

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Anschriften der Verfasser: Dr. Claudia WYLEZICH Allgemeine Ökologie und Limnologie der Universität zu Köln Weyertal 119 D-50923 Köln, Germany E-Mail: [email protected]

Dr. Renate R.ADEK AG Protozoologie der Freien Universität Berlin Königin-Luise-Straße 1-3 D-14195 Berlin, Germany E-Mail: [email protected]

Prof. Dr. Martin SCHLEGEL Molekulare Evolution und Systematik der Tiere der Universität Leipzig Brüderstaße 32 D-04103 Leipzig, Germany E-Mail: [email protected]

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