CONNAISSANCE ET PROTECTION DU PATRIMOINE NATUREL INVENTAIRE DES LIMACES DE LA RÉSERVE NATURELLE INTÉGRALE DU LAUVITEL (BOURG D'OISANS, ISÈRE)

Parc National des Écrins Mars 2018 Rapport final mission

INVENTAIRE DES LIMACES DE LA RÉSERVE NATURELLE INTÉGRALE DU LAUVITEL (BOURG D'OISANS, ISÈRE) Connaissance et Protection du Patrimoine Naturel Association loi 1901 Déclaration de création n°0911004034 38, promenade de Guinette 91150 Étampes, France Tel : 33 1 40 79 31 02 - Fax : 33 1 40 79 57 71 [email protected]

Terrain et rédaction du rapport :

Xavier Cucherat, 10 rue Louis Aragon, 59147 Gondecourt, [email protected]

Analyses génétiques, alignements des séquences, production des arbres phylogénétiques :

Annie Guiller, Université de Picardie, EDYSAN UMR CNRS 7058 – UPJV, 33 rue St Leu, 80000 Amiens, France, Tel. : 33 (0)3 22 82 75 56, annie.guiller@u- picardie.fr

Parc National des Écrins

Domaine de Charance

Gap 05000

Contact : Damien Combrisson, [email protected] Inventaire des limaces de la Réserve Naturelle Intégrale du Lauvitel (Bourg d'Oisans, Hautes-Alpes) Parc National des Écrins – Rapport final

Table des matières Introduction...... 1 Objectif...... 1 Méthodes ...... 2 Recherche des limaces ...... 2 Méthodes d’analyse moléculaire ...... 3 Extraction de l’ADN ...... 3

Amplification par PCR et séquençage ...... 3

Analyse phylogénétique...... 3

Résultats...... 4 Effort d’observation ...... 4 Liste des espèces de limaces observées...... 4 Agriolimacidae...... 4

Arionidae ...... 5

Limacidae...... 6

Milacidae ...... 9

Autres espèces de mollusques observées...... 12 Discussion...... 13 Conclusion ...... 14 Références bibliographiques...... 15

Inventaire des limaces de la Réserve Naturelle Intégrale du Lauvitel (Bourg d'Oisans, Hautes-Alpes) Parc National des Écrins – Rapport final

Introduction La Réserve Naturelle Intégrale (RNI) du Lauvitel est située sur la commune de Bourg- d'Oisans en Isère et inscrite dans le Parc national des Écrins (PNE). C’est un lieu désigné pour la réalisation d’un inventaire biologique généralisé de la biodiversité. Les Mollusques continentaux (escargots terrestres et dulçaquicoles, limaces et moules d’eau douce) font partie des organismes animaux étudiés dans le cadre de cet inventaire. Des premières connaissances ont été acquises sur les escargots terrestres (mission O. Gargominy du 11 et 12 septembre 2014, puis mission de D. Combrisson du 16 au 17 juin). Au cours des différents autres inventaires dans la RNI, des limaces ont été récoltées par les chargés d’études du PNE, en particulier lors des piégeages de la méiofaune du sol. Les spécimens récoltés ont été conditionnés et étudiés (Cucherat 2016). Étant donné l’état de conservation des spécimens récoltés lors de ces piégeages, il n’avait pas été possible de réaliser des déterminations précises jusqu’à l’espèce. Ainsi, dans l’objectif de dresser la liste des espèces de limaces de la RNI, une campagne de récoltes spécifiques a été initiée pour obtenir du matériel vivant ; ce matériel devant servir de support à la réalisation d’iconographies, d’analyses moléculaires et anatomiques. L’objet du présent rapport est de présenter les résultats des prospections effectuées en juin et juillet 2017.

Objectif L’objectif est de dresser la liste des espèces de limace de la RNI du Lauvitel, à l’issue de récoltes spécifiques effectuées dans le périmètre du site, sur la base d’identification anatomiques et moléculaires.

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Méthodes Recherche des limaces Les limaces ont été recherchées de jour et de nuit. Les prospections diurnes ont été réalisées les 30 juin 2017, 01 et 02 juillet 2017. Les prospections nocturnes ont été effectuées entre le 30 juin 2017 et le 01 juillet 2017. Les recherches se sont focalisées sur la périmètre de la RNI et sur des abords (cf. résultats). Les conditions météorologiques étaient particulièrement humides, mais favorables à l’activité des limaces. Les limaces ont été recherchées sous les rémanents (pierres, morceaux de bois, etc.). Les troncs ont été inspectés de jour pour détecter les éventuelles placettes d’accouplement des grandes limaces du genre Limax. Chaque lieu de recherche (= station) a fait l’objet d’un pointage GPS (Garmin Etrex), la surface prospectée autour des rémanents n’excédait pas 4 m². Un maximum de trois-quatre individus de chaque espèce rencontrée dans les stations a été récolté (dans la mesure du possible), dans des boites en poly-éthylène où le numéro de la station était reporté sur le couvercle au marqueur indélébile (Figure 1).

Figure 1 : Aperçu du dispositif de conservation des limaces utilisés dans le cadre du présent inventaire (© X. Cucherat 2017). Les autres espèces de gastéropode observées lors des recherches ont été notées et/ou récoltées pour identification ultérieure sous loupe binoculaire. Les spécimens récoltés ont été photographiés en mouvement sur un support blanc. Des prises de vues du patron chromatique de la sole pédieuse sur une vitre ont également été prises. Ensuite les spécimens ont été noyés dans un récipient permettant l’élimination des bulles d’air, pendant 8h-24h. Lorsque les animaux étaient détendus et ne montraient plus de signe de vie, ils ont été rincés à l’eau claire. Puis, de l’alcool non dénaturé à 90° a été injecté dans la cavité de l’animal à l’aide d’une seringue. Les spécimens ont été stockés à l’horizontal dans des grands récipients remplis d’alcool à 90° non dénaturé. Au bout de trois jours, l’alcool a été changé pour améliorer la conservation des spécimens. Les spécimens récoltés ont été disséqués selon les recommandations de Wiktor (2000), en préalable des séquençages moléculaires. Pour ces derniers, un morceau de manteau ou de tissu épidermique (pour les Arionidae) de tous les spécimens récoltés lors de la campagne de terrain a été découpé. Le morceau a ensuite été mis dans un aliquote rempli d’alcool 90° non dénaturé.

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Méthodes d’analyse moléculaire Extraction de l’ADN L’extraction de l’ADN génomique total des limaces est fondée sur le protocole proposé par Estoup (1996). Le morceau de manteau ou de tissu épidermique a été placé dans un tube Eppendorf contenant 500 µL de Chelex 10 % et 15 µl de protéinase K nécessaire à la digestion des tissus. Le mélange est incubé une nuit à 55°C, puis placé deux fois 15 minutes dans un bain à 100°C. Les échantillons sont conservés à -20°C. Amplification par PCR et séquençage Les marqueurs mitochondriaux utilisés dans cette étude sont localisés au niveau des gènes ARNr 16S et cytochrome oxidase I (COI). Le fragment du gène 16S (447 bp) est amplifié au moyen des amorces 16SL (5-CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3) et 16SH (5- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG-3), celui du gène COI (669 bp) en utilisant le couple d’amorces FCOI (5’-ACTCAACGAATCATAAAGATATTGG-3’) et RCOI 5’- TATACTTCAGGATGACCAAAAAATCA-3’ (Palumbi et al. 1991 ; Ansart et al. 2014). Chaque amplification est réalisée dans un volume réactionnel de 20 µl comprenant (i) 10 µl de MyTaq Mix DNA Polymerase (Taq polymerase, dinucléotides, MgCl2 et tampon) (Eurobio Abcys), (ii) 0,5 µl de chaque amorce, (iii) 1,25-3 µl d’ADN extrait. Les programmes de PCR se déclinent en une phase initiale de dénaturation à 94°C (5 min), d’une phase de 35 cycles caractérisés par une étape de dénaturation à 94°C (30s pour 16S e 45s pour COI), une étape de fixation des amorces à 50°C et 47°C (30s) pour les gènes 16S et COI respectivement, une étape d’élongation à 72°C (45s) ; une phase finale d’élongation à 72°C (10min) boucle l’amplification des fragments considérées. La qualité des fragments amplifiés est vérifiée par migration de 5µl de chaque amplicon sur gels d’électrophorèse (agarose 2%). La purification et le séquençage double-brin sont pris en charge par la plateforme de séquençage de l’IDGR à l’université de Rennes 1 (coll. S. Dréano, Institut de Génétique & Développement de Rennes, UMR CNRS 6061). Analyse phylogénétique Les séquences des deux régions mitochondriales sont corrigées et alignées en utilisant le logiciel CodonCode Aligner v3.5 (CodonCode Corporation, Dedham, Massachusetts). Les relations phylogénétiques entre individus sont estimées au moyen d’une méthode d’inférence bayésienne (BI). Le modèle optimal de substitutions nucléotidiques est sélectionné parmi 24 modèles différents sur la base du critère d’information d’Akaike (AIC) calculé par le logiciel MrAIC v1.4.2 (Nylander et al. 2004). Les modèles retenus, en l’occurrence GTR+G pour l’ARNr 16S et HKY+G pour le COI, sont utilisés dans la construction d’arbres selon l’approche bayésienne implémentée dans le logiciel MrBayes v3.1.1 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Les probabilités postérieures des arbres et les paramètres sont approximés à l’aide de la méthode de Monte-Carlo par chaînes de Markov (MCMC). Deux chaînes simultanément ont été utilisées. Les deux gènes sont analysés séparément puis simultanément, avec 2 000 000 générations et un arbre échantillonné toutes les 100 générations. Les probabilités postérieures, qui rendent compte de la fréquence avec laquelle les différents nœuds apparaissent dans les arbres visités, sont obtenues à partir des consensus des arbres échantillonnés suivant une règle de majorité de 50%.

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Résultats Effort d’observation Le tableau 1 reprend l’ensemble des stations prospectées lors de l’inventaire de la RNI du Lauvitel. À l’exception des stations étudiées le 02/07/2017, toutes ont été prospectées dans le périmètre de la RNI. Les stations prospectées le 02/07/2017 ont été effectuées sur les communes d’Entraigues et de Périer, dans le département de l’Isère, pour compléter l’inventaire (non exhaustif) des limaces du PNE. Tableau 1 : Liste des stations prospectées lors de la présente étude (* = stations périphériques).

NOM COMMUNE DEPARTEMENT LONGITUDE LATITUDE ALTITUDE DATE RECOLTEUR 20160630_RNILAUVITEL_64 Bourg-d'Oisans Isère 6.064759819 44.965324653 1508 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_65 Bourg-d'Oisans Isère 6.064448347 44.964951491 1518 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_66 Bourg-d'Oisans Isère 6.063769246 44.96457221 1518 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_67 Bourg-d'Oisans Isère 6.063488619 44.964270042 1544 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_68 Bourg-d'Oisans Isère 6.063122917 44.964268701 1547 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_69 Bourg-d'Oisans Isère 6.062998446 44.964456288 1549 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_70 Bourg-d'Oisans Isère 6.062470805 44.964355119 1567 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_71 Bourg-d'Oisans Isère 6.062223036 44.964260487 1560 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_72 Bourg-d'Oisans Isère 6.06207082 44.964103494 1593 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_73 Bourg-d'Oisans Isère 6.065466497 44.963930156 1568 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_74 Bourg-d'Oisans Isère 6.066082567 44.963311907 1568 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_75 Bourg-d'Oisans Isère 6.065873187 44.963380219 1545 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_76 Bourg-d'Oisans Isère 6.065150499 44.963693619 1562 30/06/2017 X.Cucherat 20160630_RNILAUVITEL_77 Bourg-d'Oisans Isère 6.06560966 44.964845711 1561 30/06/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_78 Bourg-d'Oisans Isère 6.061014617 44.956308827 1667 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_79 Bourg-d'Oisans Isère 6.059951037 44.951696768 1723 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_80 Bourg-d'Oisans Isère 6.05837306 44.948291872 1845 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_81 Bourg-d'Oisans Isère 6.05826946 44.946998041 1921 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_82 Bourg-d'Oisans Isère 6.057241 44.944913294 2026 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_83 Bourg-d'Oisans Isère 6.060818229 44.948959239 2019 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_87 Bourg-d'Oisans Isère 6.061069518 44.955094373 1669 01/07/2017 X.Cucherat 20170701_RNILAUVITEL_88 Bourg-d'Oisans Isère 6.060834741 44.955486562 1666 01/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_89* Périer Isère 5.957411528 44.923224282 932 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_90* Périer Isère 5.957906563 44.921303904 897 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_91* Entraigues Isère 5.97167627 44.886918152 927 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_92* Entraigues Isère 5.971349208 44.887208836 888 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_93* Entraigues Isère 5.953876376 44.887505723 1052 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_94* Entraigues Isère 5.952621689 44.887165921 1053 02/07/2017 X.Cucherat 20170702_RNILAUVITEL_95* Entraigues Isère 5.951968152 44.886866603 1053 02/07/2017 X.Cucherat Liste des espèces de limaces observées Sur la base des dissections et des résultats des analyses moléculaires, les espèces suivantes ont été observées dans le périmètre de la RNI et dans les stations périphériques : Agriolimacidae Deroceras sp. Un spécimen juvénile de Deroceras a été récolté à la station 20170701_RNILAUVITEL_88. Toutefois cet individu n’a pu être maintenu en élevage et son identité spécifique n’a pu être déterminée.

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Arionidae Arion distinctus Mabille, 1868, loche glandue La loche glandue a été observée dans deux stations périphériques de la RNI du Lauvitel, sur la commune d’Entraigues et de Perrier (stations 20170702_RNILAUVITEL_88 et 20170702_RNILAUVITEL_95). L’identification a été confirmée par dissection, mais les analyses moléculaires n’ont pas donné de résultats satisfaisants. Arion fuscus (O. F. Müller, 1774), loche rousse La loche rousse (Figures 2 et 3) a principalement été observée dans les parties boisées de la RNI. Tous les stades de développement ont été récoltés. Les adultes présentent une anatomie caractéristique de l’espèce par comparaison avec les travaux de Pinceel et al. (2004). Les spécimens mâtures ont une glande hermaphrodite petite et foncées, logée dans les circonvolutions de l’intestin et de la glande digestive. Les analyses moléculaires confirment l’appartenance aux Arion fuscus de plaine.

Figure 2 : Vue de profil droit d’un adulte de la loche Figure 3 : Vue de la sole pédieuse d’un adulte de la loche rousse (station 20160630_RNILAUVITEL_67) (© X. rousse (station 20160630_RNILAUVITEL_67) (© X. Cucherat 2017). Cucherat 2017). Arion fasciatus (Nilsson, 1823), Loche grisâtre (identifiée comme Arion silvaticus Lohmander, 1937) Un seul spécimen de cette espèce a été récolté dans la partie boisée de la RNI (Figure 4). On soulignera ici que l’individu récolté était sub-adulte et présentait la forme silvaticus, c’est-à-dire que le manteau était unicolore, sans tâches, avec des flancs clairs. Les analyses moléculaires confirment l’appartenance de l’individu à cette espèce.

Figure 4 : Vue de dessus d’un sub-adulte de la loche grise (station 20160630_RNILAUVITEL_71) (© X. Cucherat 2017). Arion rufus (Linnaeus, 1758), grande loche L’espèce a été observée en dehors du périmètre de la RNI (Figures 5 et 6), au niveau du chemin d’accès de la RNI à la sortie du village. Les analyses moléculaires confirment l’identité spécifique de l’espèce. Cette grande limace est souvent confondue avec d’autres grands Arion (e.g. Arion vulgaris J. Mabille, 1868).

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Figure 6 : Vue de dessous d’un adulte de la grande loche (station 20170702_PNE_digue_lauvitel) (© X. Cucherat 2017).

Figure 5 : Vue de profil droit d’un adulte de la grande loche (station 20170702_PNE_digue_lauvitel) (© X. Cucherat 2017). Limacidae Genre Lehmannia Heynemann, 1863 Lehmannia marginata (O.F. Müller, 1774), limace des bois Cette limace arboricole et/ou rupicole a été observée aussi bien dans les parties boisées que dans les parties les plus élevées et dénudées de la RNI (Figures 7 et 8). Les formes présentes dans le périmètre de la RNI sont regroupées génétiquement avec les spécimens provenant de forêts de plaine (spécimens provenant de forêts des Hauts-de- France). On soulignera que les individus de la limace des bois dans le périmètre de la RNI sont presque unicolores et ne présentent pas de motifs en bandes longitudinales, comme ceux de plaine. Cette différence chromatique est très certainement liée à l’altitude et ne constitue pas un critère diagnostique pour distinguer cette espèce avec d’éventuelles espèces de Lehmannia alpines (e.g. Lehmannia rupicola Lessona & Pollonera, 1882, limace des montagnes). La dissection est donc indispensable.

Figure 7 : Vue de profil droit d’un adulte de la limace des Figure 8 : Vue de dessus d’un adulte de la limace des bois bois (station 20160630_RNILAUVITEL_68) (© X. Cucherat (station 20160630_RNILAUVITEL_68) (© X. Cucherat 2017) 2017). Genre Limax Linnaeus, 1758 Les premiers spécimens récoltés par O. Garmoniny et disséqués montraient un pénis long avec un diamètre constant sur toute sa longueur. L’anatomie de ces spécimens montraient des similitudes avec les spécimens récoltés et disséqués par De Winter (1990), qu’il nommait Limax erythrus Bourguignat, 1864. Pour l’étude des spécimens du Lauvitel, j’ai inclu, dans l’analyse anatomique et moléculaire, des spécimens récoltés par moi-même en août 2016 à la localité-type de Limax erythrus, à quelques centaines de mètres au nord du monastère de la Grande Chartreuse, dans le département de l’Isère. En incluant des spécimens de la localité-type, l’objectif était d’en mesurer la proximité avec ceux des individus de la RNI du Lauvitel. Par ailleurs, le genre Limax ayant récemment fait l’objet d’un travail d’analyse moléculaire et anatomique (Nitz 2013), tous les spécimens de Limax récoltés dans le cadre de la présente étude, avec quelques autres provenant du territoire du PNE, ont été ajoutés aux séquences déposées sur

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GenBank lors de cette thèse pour produire un arbre global. L’objectif ici est d’analyser le positionnement des limaces du Lauvitel et alentours dans les arbres construits par Nitz (2013). Limax sp. 1 Il s’agit d’une limace sombre, unicolore, avec également un manteau sombre, sans motifs (Figures 9 et 10) avec une carène dorsale sombre. Anatomiquement cette limace a un pénis mesurant au moins deux fois la longueur de l’adulte (Figure 11). Le pénis est quasi constant en diamètre sur toute sa longueur, mais certains spécimens ont un léger élargissement de l’extrémité. Le muscle rétracteur du pénis et le vas déférent sont contigües, sans espace entre les deux et ne s’insèrent pas à l’extrémité du pénis, laissant un petit diverticule aveugle. Le pénis s’enroule dans la moitié antérieure de l’animal et n’atteint pas la partie postérieure de la cavité ; autrement dit il n’atteint pas la glande hermaphrodite (Figure 12). Cette dernière est plutôt de couleur grisâtre, quoique quelques spécimens en aient une de couleur plutôt rougeâtre. Tous les spécimens récoltés et séquencés dans le périmètre de la RNI (individus n°72, 62, 63, 65, 68 et 64 dans la figure 24) ou sur la digue du lac du Lauvitel (59 et 61) forment un clade distinct par rapport à ceux provenant de la localité-type de Limax erythrus (individus n°15, 16, 17, 29 et 09). Dans ce clade, l’individu 43, récolté à Entraigues, vient se loger avec les spécimens du Lauvitel (cf. discussion).

Figure 9 : Vue de profil droit d’un adulte de la Limax sp. 1 Figure 10 : Vue de dessous d’un adulte de la Limax sp. 1 (station 20170701_RNILAUVITEL_79) (© X. Cucherat 2017). (station 20170701_RNILAUVITEL_79) (© X. Cucherat 2017).

Figure 11 : Vue des parties génitales en phase mâle de Figure 12 : Vue des organes internes en place du spécimen l’individu n°63 – la barre d’échelle est de 1 cm (© X. n°61 – la barre d’échelle est de 1 cm (© X. Cucherat 2018). Cucherat 2018). Limax erythrus Bourguignat, 1864, limace des Alpes Il s’agit d’une limace brun-clair, pouvant être très foncée, avec une carène dorsale claire et une lignée de tubercules dorsaux également clairs, mais qui peut être absente (figures 13 et 14). Le manteau est uniforme, mais avec le pourtour de l’orifice respiratoire et la marge du manteau plus claire. La sole pédieuse est unicolore avec une très légère suffusion de pigment plus foncé sur la périphérie.

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Les spécimens disséqués ont un long pénis, mesurant au moins deux fois et demi la longueur de l’animal. Le pénis s’enroule dans la partie antérieure à médiane de la cavité de l’animal (Figure 13), et dans deux cas, atteint la partie postérieure de la cavité ; autrement dit il atteint la glande hermaphrodite (Figure 14). Le pénis montre un diamètre constant sur les premiers trois quarts de sa longueur, mais s’élargit vers son extrémité. Le muscle rétracteur du pénis et le vas déférent sont très proches, sans espace entre les deux et ne s’insèrent pas à l’extrémité du pénis. Ce dernier se termine par un diverticule aveugle, quoiqu’un individu montrait un muscle rétracteur qui s’insérait à l’extrémité du pénis. Cette dernière est plutôt de couleur grisâtre, mais quelques spécimens en ont une de couleur plutôt rougeâtre. L’individu 71 (Figures 15, 16 et 17), récolté à Entraigues, vient se loger parmi les spécimens provenant de la localité-type de Limax erythrus, limace des Alpes (Figure 24).

Figure 13 : Vue des organes internes en place d’un Figure 14 : Vue des parties génitales en phase mâle d’un spécimen de Limax erythrus provenant de la localité-type spécimen de Limax erythrus provenant de la localité-type (n°09) – la barre d’échelle = 1 cm (© X. Cucherat 2018). (n°09) – la barre d’échelle = 1 cm (© X. Cucherat 2018).

Figure 15 : Vue de profil droit de l’individu n°71 (station Figure 16 : Vue de dessous de l’individu n°71 (station 20170702_RNILAUVITEL_95) (© X. Cucherat 2017). 20170702_RNILAUVITEL_95) (© X. Cucherat 2017).

Figure 17 : Vue des parties génitales en phase femelle de l’individu n°71 – la barre d’échelle = 1 cm (© X. Cucherat 2018).

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Limax sp. 2 Il s’agit d’une limace gris-bleutée, avec une carène dorsale de même couleur (Figures 18 et 19). Les adultes sont mouchetés sur le dos et sur le manteau. Les juvéniles ont un patron chromatique jaunâtre, mais avec des motifs mouchetés identiques aux adultes. Leur mucus est jaunâtre et celui translucide et visqueux chez les adultes. La sole pédieuse est bicolore, gris bleutée en périphérie et blanche au centre. L’extrémité postérieure de l’animal a de particulier qu’elle n’est pas effilée, mais arrondie munie d’un mucron. Le pénis de cette limace est relativement court par rapport à l’animal, et mesure environ 50-60% de l’adulte (Figure 20). Il s’élargie de la base vers son extrémité. Le vas déférent et le muscle rétracteur sont contigües et s’insèrent à son extrémité (Figure 21). Les individus de cette espèce n’ont pas été observés dans le périmètre de la RNI, mais dans les stations périphériques. À ce jour, l’espèce récoltée ne peut être rattachée à aucune espèce actuellement décrite. Les spécimens récoltés (n°41 et 49) et séquencés se logent avec des spécimens récoltés dans la Haute-Vallée de la Durance et qui correspond à la lignée 13 de Nitz (2013) [p 103 : Limax sp. [French South-Western Alps] (lineage 13) was collected in Hautes-Alpes, Valley of Durance] (Figure 24). Pour le moment, cette limace n’a pas encore de nom.

Figure 18 : Vue de profil droit du spécimen n° 41 (station Figure 19 : Vue de dessous du spécimen n°41 (station 20170702_RNILAUVITEL_95) (© X. Cucherat 2017). 20170702_RNILAUVITEL_95) (© X. Cucherat 2017).

Figure 20 : Vue des organes internes en place de l’individu Figure 21 : Vue des parties génitales en phase femelle de n°41 – la barre d’échelle = 1 cm (© X. Cucherat 2018). l’individu n°41 – la barre d’échelle = 1 cm (© X. Cucherat 2018). Milacidae Tandonia rustica (Millet, 1843), pseudolimace chagrinée Cette limace a été observée dans le périmètre de la RNI et dans les stations périphériques (Figures 22 et 23). Les résultats des analyses moléculaires regroupent les spécimens dans un même clade. Toutefois, les analyses n’incluent pas les séquençages de spécimens provenant de la localité-type de l’espèce qui se trouvent dans l’ouest de la France. Pour le moment, l’attribution du nom Tandonia rustica est appliquée aux spécimens de la RNI uniquement sur la base de la description morphologique. L’inclusion

Connaissance et Protection du Patrimoine Naturel 9 Inventaire des limaces de la Réserve Naturelle Intégrale du Lauvitel (Bourg d'Oisans, Hautes-Alpes) Parc National des Écrins – Rapport final de séquençages de spécimens topo-typiques permettraient d’asseoir définitivement d’identification.

Figure 22 : Vue de profil droit d’un adulte de la Figure 23 : Vue de profil dessous d’un adulte de pseudolimace chagrinée (station pseudolimace chagrinée (station 20170702_PNE_digue_lauvitel) (© X. Cucherat 2017). 20170702_PNE_digue_lauvitel) (© X. Cucherat 2017).

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Galba truncatula Tandonia cf. rustica

Limax erythrus

Limax sp Limax sp

Limax sp.1

Limax sp. 2

Limax maximus

Limax sp Limax maximus

Limax brandstetteri

Limax sp

Limax corsicus Limax sp Limax corsicus

Limax sp

Limax senensis

Limax sp

Limax cf. dacampi Limax sp Limax ciminensis

Limax sp

Limax ianninii

Limax cinereoniger

Limax sp

Limax pseudomaximus

Limax pseudocinereoniger

Limax sarmensis

Limax sp

Limax sp marmoraia

Limax sp Limax wolterstorffi Limax wolterstorffi

Limax sp

Limax casamaccioli

Limax sp

Limax flavus Limax sp wohlberedti Limax aff. conemenosi Limax sp balkan

Limax dacampi

Limax sp balkan

Limax cf. graecus sensu

Figure 24 : Relations phylogénétiques entre 187 taxons « Limaces » fondées sur gène COI (F/R) : arbre d’inférence bayésienne construit à l’aide de MrBayes (HKYG = modèle de substitutions nucléotidiques utilisé) - séquences GENBANK (Nitz 2013) + séquences provenant des spécimens de la présente étude (encadrés rouges). Les probabilités postérieures sont indiquées au-dessus des branches, au dessus de 0.5 les probabilités sont considérées comme significatives.

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Autres espèces de mollusques observées Les autres espèces de mollusques qui ont été observées au cours des prospections dans le périmètre de la RNI sont figurées dans le tableau 2. Ces observations viennent compléter les données récoltées lors des inventaires de 2014 et 2016 (Combrisson 2016). Les espèces observées dans les stations périphériques sont dressées dans le tableau 3. Tableau 2 : Liste des autres espèces de mollusques continentaux observées dans le périmètre de la RNI au cours de la présente étude (Code nom selon Tax ref. V10).

Famille Code nom Nom complet Nom vernaculaire Aciculidae 162699 Acicula lineata lineata (Draparnaud, 1801) Aiguillette bordée Clausiliidae 163077 Balea perversa (Linnaeus, 1758) Balée commune Clausiliidae 64161 Clausilia bidentata (Strøm, 1765) Clausilie commune Clausiliidae 334525 Macrogastra cf. badia (C. Pfeiffer, 1828) Clausiliidae 163055 Macrogastra plicatula plicatula (Draparnaud, 1801) Massue costulée Cochlicopidae 593042 Cochlicopa lubricella (Porro, 1838) Petite brillante Discidae 163097 Discus ruderatus ruderatus (W. Hartmann, 1821) Bouton montagnard Euconulidae 163108 Euconulus cf. fulvus (O.F. Müller, 1774) Conule des bois Gastrodontidae 163148 Aegopinella cf. nitens (Michaud, 1831) Luisantine ample Gastrodontidae 56503 Aegopinella pura (Alder, 1830) Petite luisantine Gastrodontidae 163155 Nesovitrea petronella (L. Pfeiffer, 1853) Luisantine brune Helicidae 163367 Causa holosericea (S. Studer, 1820) Fausse veloutée plane Helicidae 163387 Cepaea nemoralis nemoralis (Linnaeus, 1758) Escargot des haies Helicidae 163359 Chilostoma zonatum flavovirens (Dumont & Mortillet, 1852) Hélicon des granites Helicidae 163350 Helicigona lapicida lapicida (Linnaeus, 1758) Soucoupe commune Helicidae 812086 Macularia sylvatica (Draparnaud, 1801) Escargot des forêts Oxychilidae 163144 Morlina glabra glabra (Rossmässler, 1835) Luisant étroit Pristilomatidae 163101 Vitrea subrimata (Reinhardt, 1871) Cristalline méridionale Punctidae 163093 Punctum pygmaeum (Draparnaud, 1801) Escargotin minuscule Truncatellinidae 199862 Columella columella (G. von Martens, 1830) Columelle alpine Valloniidae 162964 Acanthinula aculeata (O.F. Müller, 1774) Escargotin hérisson Vitrinidae 163169 Eucobresia nivalis (Dumont & Mortillet, 1854) Semilimace des neiges Vitrinidae 163174 Oligolimax annularis (S. Studer, 1820) Semilimace globuleuse Vitrinidae 64197 Vitrina pellucida (O.F. Müller, 1774) Semilimace commune Tableau 3 : Liste des autres espèces de mollusques continentaux observées dans les stations périphériques au cours de la présente étude (Code nom selon Tax ref. V10).

Famille Code nom Nom complet Nom vernaculaire Sphaeriidae 531162 Euglesa casertana (Poli, 1791) Pisidie robuste Clausiliidae 64161 Clausilia bidentata (Strøm, 1765) Clausilie commune Clausiliidae 61729 Cochlodina laminata laminata (Montagu, 1803) Fuseau commun Discidae 163098 Discus rotundatus rotundatus (O.F. Müller, 1774) Bouton commun Gastrodontidae 163148 Aegopinella cf. nitens (Michaud, 1831) Luisantine ample Helicidae 163387 Cepaea nemoralis nemoralis (Linnaeus, 1758) Escargot des haies Helicidae 163350 Helicigona lapicida lapicida (Linnaeus, 1758) Soucoupe commune Helicodontidae 163246 Helicodonta obvoluta obvoluta (O.F. Müller, 1774) Veloutée plane Hygromiidae 163274 Ciliella ciliata (W. Hartmann, 1821) Veloutée ciliée Hygromiidae 416749 Trochulus sericeus (Draparnaud, 1801) Veloutée déprimée Valloniidae 162964 Acanthinula aculeata (O.F. Müller, 1774) Escargotin hérisson Vitrinidae 163172 Phenacolimax major (A. Férussac, 1807) Semilimace des plaines

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Discussion La présente étude a permis de dresser une liste composée de 10 espèces de limace, dont neuf dans le périmètre de la RNI du Lauvitel ou très à proximité (cas d’Arion rufus). On peut considérer l’inventaire des limaces sur le Lauvitel saturé en espèces. En l’état actuel des connaissances sur la taxonomie des « limaces », les analyses moléculaires et anatomiques ont permis de confirmer l’identité taxonomique de la plupart des espèces de limace observées sur les stations étudiées. Ainsi, par rapport aux identifications réalisées lors de l’inventaire de 2016 (Combrisson 2016), il est possible de dire que Limax cinereoniger n’est pas présente dans le périmètre de la RNI, mais correspond à une autre espèce qui lui ressemble morphologiquement (cf. ci-après). Par ailleurs, seule Arion fuscus a été observée, sur la base anatomique et moléculaire, ce qui permet de retirer le nom d’Arion subfuscus de la liste des espèces de la RNI. Les analyses moléculaires et anatomiques montrent que les spécimens de Limax sp. 1 récoltés au sein du périmètre de la RNI du Lauvitel forment un clade distinct des Limax erythrus topotypiques, mais en sont proches anatomiquement. À ce stade de l’étude, il est difficile de dire s’il s’agit de deux espèces différentes ou d’une seule et même espèce présentant une structuration génétique liée à l’altitude par exemple. Pour pourvoir étudier les deux hypothèses, il serait nécessaire d’effectuer une campagne d’observations nocturnes des accouplements en période estivale avancée (juillet-août). Étant donné que des spécimens se trouvent également sur la digue de la RNI, il n’est pas forcément nécessaire de faire des prospections au sein du périmètre protégé. À cela s’ajouterait la nécessité de réaliser des élevages pour étudier l’évolution des générations F1 et F2, en croisant les spécimens du Lauvitel avec des Limax erythrus topotypiques. Enfin, l’étude n’a inclu que des spécimens provenant du Lauvitel et d’un nombre restreint de stations étudiées en périphérie. L’élargissement de l’étude à d’autres localités du territoire du PNE permettrait de préciser la spécificité des spécimens de la RNI. On remarquera que le spécimen (n°43), provenant d’une station périphérique éloignée située sur un autre versant, logé parmi les spécimens de la RNI, est très vraisemblablement lié à une pollution du matériel, étant donné que le spécimen n°71 provenant de la même localité est, quant à lui, logé parmi les Limax erythrus topotypiques. Les analyses moléculaires et anatomiques ont permis également de montrer que dans les stations périphériques vit une espèce de Limax sp.2 non nommée. Les spécimens récoltés dans les stations périphériques se logent avec ceux provenant d’autres localités du PNE séquencés à l’occasion de la présente étude (localités situées autour du Lac de Serre-Ponçon) et se logeant avec ceux séquencés par Nitz (2013 : p 103 : Limax sp. [French South-Western Alps]) (lineage 13)]. Ces spécimens ont été collectés dans les Hautes-Alpes, plus particulièrement dans la vallée de la Durance. Il s’agirait d’une espèce ayant une large répartition mais nécessitant des travaux complémentaires (études comportementales, anatomiques, etc.) dont l’aire de distribution serait centrée sur le territoire du PNE.

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Conclusion Les investigations menées en juillet 2017 sur le périmètre de la RNI du Lauvitel et de quelques localités périphériques ont permis de dresser une liste composée de 10 espèces de limace appartenant à quatre familles différentes (Agriolimacidae, Arionidae, Limacidae, Milacidae). Cet inventaire peut être considéré comme à saturation pour la RNI du Lauvitel. Les dix espèces observées ne représentent qu’une partie des espèces et des familles de limace que l’on peut rencontrer sur le territoire du PNE, mais les analyses anatomiques et moléculaires soulignent les particularismes. En effet, il semblerait que sur la RNI du Lauvitel se trouve une unité taxonomique non encore décrite. Il s’agirait d’un Limacidae du genre Limax, pour laquelle des études comportementales et des récoltes en dehors du périmètre de la RNI permettraient de définir le rang spécifique ou populationnel des spécimens observés. Dans les stations périphériques, on montre également la présence d’une espèce non décrite de Limax (Limax sp.2), dont les occurrences seraient centrées sur le territoire du PNE. Dans tous les cas de figure, les analyses moléculaires et anatomiques ont été nécessaires à la description de ces animaux et soulignent qu’il existe une richesse spécifique cryptique de ce pan faunistique du PNE. Les limaces ne sont pas des animaux exubérants et elles ont souvent mauvaise presse auprès du public. Toutefois, par cette courte étude, on montre qu’il existe une richesse spécifique encore méconnue, voire inconnue, pouvant justifier des investigations complémentaires pour mesurer les enjeux de cette partie de la malacofaune du PNE, notamment pour en mesurer la richesse vraie et d’estimer l’importance du territoire du parc pour les espèces endémiques. Sur le plan fonctionnel, cela se traduirait par une campagne élargie de recherche des limaces à l’échelle du parc, en s’appuyant par la formation de relais locaux, qui assureraient la récolte de spécimens, et de prospections ciblées par des malacologues expérimentés dans l’étude des limaces. Ces travaux pourraient s’inscrire dans des programmes de recherches de taxonomie voire d’en être à l’initiative.

Connaissance et Protection du Patrimoine Naturel 14 Inventaire des limaces de la Réserve Naturelle Intégrale du Lauvitel (Bourg d'Oisans, Hautes-Alpes) Parc National des Écrins – Rapport final

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