+

Doç. Dr. Serdar Ceylaner

İntergen Genetik Merkezi

Argekent Bilimsel Araştırma Merkezi + Gündem

 Eski yöntemlerde yeni gelişmeler (QF-PCR/FISH)

 Yeni yöntemlerin eski yöntemlere katkısı (Array-CGH ve yeni jenerasyon dizi analizi)

 Maternal serum DNA analizi

 Maternal serum RNA analizi

 Yakın gelecek + Down sendromu- Çözülemeyen derdimiz

 1/800 sıklıkta

 USG ile bulgu vermeme ihtimali var

 İkili ve üçlü tarama %15-40 vakayı görmüyor.

 USG-İkili-üçlü taramayı beraber bile yapsak % 10 kadar vakayı kaçırırız. + Down sendromu- Çözülemeyen derdimiz

 Onkoloğun hastası ölürse herkes ağlar- doktor elinden geleni yapmış olur-herkes teşekkür eder. Kanser ölümcül bir durumdur.

 Gebelik bir hastalık olmadığından ve herkesin bir sevinç yaşamayı beklediği bir durum olduğundan annenin yada bebeğin ölümü yada her ikisinden birinin kalıcı hastalığı meydana geldiğinde kıyamet kopar.

+ Amniyosentez ve koryon villus örneklemesi

 Kitaplara göre 1/100-1/400 gebelik kaynı riskine yol açar.

 Perinatologların yaptığı işlemlerde ise gebelik kaybı neredeyse hiç görülmemektedir.

 İnvaziv işlemden kaçınma

 Maliyet?

+ Eski yöntemlerde yeni gelişmeler

 Hızlı tanı yöntemleri sayesinde gebelik tahliyesi için 3 hafta bekleme ihtiyacı azalmıştır.

 QF-PCR ve FISH ‘teki gelişmeler kromozom analizi kadar güvenilir sonuç elde edilmesini sağlamaktadır.

 Henüz bu yöntemler sadece 5 kromozom ile sınırlıdır ama bu sık görülen hastalıklarda etkinlik yüksek.

 En az iki yöntemle tanıyı koyuyorsanız tahliyeyi yapabilirsiniz.

 Kromozom analizini Down sendromunun tipini ve dolayısıyla tekrarlama riskini tespit etmek için sürdürün. + Eski yöntemlere yeni yöntemlerin katkısı- Array CGH

 Ense kalınlığı artışı ve konjenital anomalilerde kromozomu normal fetüslerin % 5-15’inde gözle görülemeyen kromozom bozuklukları vardır. + Array CGH

+ Açıklanamayan kromozom değişiklikleri – Array CGH

+

+

 Anne baba kromozomu normal

 Fazlalığın nedeni? + Yakında

 Tüm amniyon veya koryon materyallerinden kromozom analizi yanında array CGH yapılacak.

 PEKİ NE ZAMAN?

 Fiyatı 100-200 USD’ye düştüğü zaman

 Şu an 2000-2500 TL + Eski yöntemlere yeni yöntemlerin katkısı- Yeni jenerasyon dizi analizi

 Yeni jenerasyon dizi analizi yüzlerce genin aynı anada analizini sağlar.

 İnsandaki 21000 genin aynı anda analizini sağlar.

 Bir insanın tüm DNA’sının analizini sağlar. + Çoklu gen çalışmaları

 Uzun QT Paneli (KCNQ1, KCNH2, SCN5A, CACNA1C, ANK2, KCNE1, KCNE2, KCNJ2, CAV3, SCN4B, AKAP9, SNTA1 genleri) (12 gen) (Tüm Gen - Dizi Analizi-MISEQ)

 Zellweger sendromu, Peroksizom biosentez bozukluğu Paneli (13 gen) (PEX1, PEX2, PEX3, PEX5, PEX6, PEX10, PEX12, PEX13, PEX14, PEX16, PEX19, PEX26, HSD17B4 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi)

 İlerleyici ailesel intrahepatik kolestaz 1, 2, 3 Paneli (PFIC1, PFIC2, PFIC3) (ATP8B1, ABCB11, ABCB4 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi-MISEQ)

 Hipertrofik kardiyomiyopati Paneli (6 gen) (MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL3 genleri) (Tüm Gen - Dizi Analizi)

+ İnfantil polikistik böbrek hastalığı

 21 haftalık gebe

 Gebelikte USG’de infantil tip polikistik böbrek hastalığı izleniyor.

 Aile erken prenatal tanı ve PGT istediği için mutasyon analizi planlanıyor.

 PKHD1 geni 67 ekzon- Fiyat 2350 Euro

 Ekzom sekanslama 2000 Euro

 Ekzom kararı verildi. + Glutarik asidüri tip 2 Homozigot ETFDH: c.1198_1201del (p.His401GlnfsX3)

+ Literatürdeki benzer vaka

ETFDH, 1-BP DEL, 36A In an infant with the neonatal-onset form of glutaric acidemia IIC with congenital anomalies (231680), Olsen et al. (2003) found homozygosity for a 1-bp deletion of 36A in the ETFDH gene, causing a frameshift beginning with ala12, introducing a stop codon at amino acid 19. The parents were consanguineous. The child died 1 hour after birth and showed Potter face, enlarged polycystic kidneys, symmetrical warty dysplasia of the cerebral cortex, bile duct hypoplasia, cholestasis, fatty degeneration of the liver, siderosis, lung hypoplasia, and steatosis of the myocardium. A second child in the family presented at birth with similar clinical and morphologic findings. The patient had been previously reported by Lehnert et al. (1982) and Bohm et al. (1982). +

İNVAZİV OLMAYAN PRENATAL TANI

•Maternal kanda fetal hücreler •Maternal serum DNA •Maternal seum RNA + Anne kanında fetal hücreler

 Eski gebeliklerden kalan hücreler

 Zenginleştirme ihtiyacı

 Zenginleştirme sorunları + İŞTE O MUTLU AN Yeni nesil sekanslama

+ Yeni nesil dizi analizi cihazı

+

+ Sözlük Maternal Serum Fetal DNA

 Cell free DNA – cfDNA

 Maternal Plazma Serbest Fetal DNA

 Serum + fibrinojen= Plazma

+ Sözlük Maternal Serum Fetal DNA

 NIFTY - Noninvasive Fetal Trisomy Test

 NIFT - Noninvasive Fetal Trisomy Test

+ Sözlük DNA’daki parmak izi-DNA fingerprinting

 Her insanda diğerlerinden farklı DNA bölgeleri vardır.

 SNP: Single nucleotide polymorphism

AAATAGCTC

AAACAGCTC

 STR: Short Tandem Repeat

ATACATACATACATACATAC + Sözlük Mutasyon

+ Sözlük Polimorfizm

+ Sözlük  Sekanslama-Dizileme?

 AATGAACGATAGCC

 Yeni nesil dizileme

 Sanger dizileme + Yeni nesil sekanslama-dizileme

 DNA’daki bir bölgeyi yüzlerce kere okuyor.

 Bu sayede düşük orandaki değişiklikleri tespit edebiliyor.

 Güvenilir bir oranlama yapabiliyor.

 Kapasitesi çok yüksek. Bir insanın bütün DNA’sını okuyabiliyor. Hatta bir cihaz bir çalışmada 4 insanın bütün DNA’sını okuyabiliyor. + Maternal serumdaki fetal DNA ve özellikleri

 İnsan serumundaki DNA’nın önemli bir kısmı ölen ve apopitoza uğrayan hücrelerden serbest kalan DNA’dır.

 Fetal DNA’nın önemli bir kısmı plasenta kaynaklıdır.

 Küçük fragmanlar halindedir.

 Serumdaki DNA’nın % 5-10’u fetal kaynaklıdır.

 Yarılanma ömrü 16 dk’dır. + Masively paralel sequencing

+ MANTIK Massively Paralel Sequencing Deep Sequencing

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A

 T  T  T  T  T  T  T  T  T  T

 A  A  A  A  A  G  A  A  A  A

 G  G  G  G  G  G  G  G  G  G

 C  C  C  C  C  C  C  C  C  C

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A + Massively Paralel Sequencing Deep Sequencing + MANTIK (oransal olarak 1,5 kat)

 21. Kromozom 1. bölge 6299 tane

 21. Kromozom 2. bölge 6065 tane

 …..

 21. Kromozom 574. bölge 5987 tane

 7. Kromozom 1. bölge 3997 tane

 7. Kromozom 2. bölge 4115 tane

 ….

 7. Kromozom 421. bölge 4005 tane

+ MANTIK – İkiz Gebelik

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A

 T  T  T  T  T  T  T  T  T  T

 A  A  A  T  A  G  A  A  A  A

 G  G  G  G  G  G  G  G  G  G

 C  C  C  C  C  C  C  C  C  C

 A  A  A  A  A  A  A  A  A  A + Yanlış pozitif

 Plasentaya sınırlı mozaisim

 Yanlış pozitif sıklığı % 3

 YANLIŞ NEGATİF YOK’A YAKIN

Pozitif çıkan her hastada invaziv girişim ile teyid gerekir.

+ NIFTY tarama testi midir?

 NIFTY bir tarama testidir. Ana amaç tüm gebe toplumu taramaktır.

 NIFTY sadece bir tarama testi değildir. Tanı koyan bir tarama testidir.

 Yanlış pozitif ve yanlış negatif olasılığı bir testi tanı testi tasnifinden çıkarmaz.

 Plasenta proteinleri için yapılan indirekt testler “sadece” taramadır. Bu doğrudan bir DNA testidir. + Bugün yapılan Yarın olacak olan

 Bugün parası olan- gazeteden bu konuyu okuyan hanımlar istiyor

 Amaç ikili üçlü tarama yerine bunu uygulamaya koymak

 Ne zaman?

 Test başına maliyet 50-100 TL’ye düştüğü zaman

 3-5 yıl + Testi kimler nerede yapıyor?

 Life Codex (Almanya)

 Panorama

 BGI (Çin)

 ABD’de bir kaç merkez. Türkiye’den gönderen yok.

 Türkiye’de henüz yapan yok

Cihazlar

 Hiseq 2000

 Miseq

 Sequenom + Kaça mal oluyor?

 850-1250 Euro

 Rapor süresi 3 hafta + Materyal

 Özel tüplere alınmış 10-20 cc kan

 Transport 1-4 gün içinde- oda ısısında

 Sonuç verme yüzdesi % 98-99

 Yeniden materyal gerekebilir.

 10. haftadan sonra alınabilir.

 Teknik olarak 6. haftadan itibaren test yapılabilir. + Endikasyon

 Tüm isteyen aileler

 Down sendromu riski olup invaziv işlem istemeyenler

 Down sendromu olup olmadığını bilmek isteyen ama tahliye istemeyenler

 Trizomi 13- Trizomi 18 riski olanlar?

+ Dezavantajlar

 13-18-21 nolu kromozomların sayısal bozuklukları dışındaki diğer kromozom hastalıklarını göstermez.

 Süre hala amniyosentez – koryon villus kadar uzun

 Sonuç anormal gelirse girişimsel işlem gerekli + Strateji

 Uygun endikasyonlarda ve isteyen herkese NIFT YAPMAK

NIFT sonucu anormal geldiğinde QF-PCR ya da FISH ile 1-2 günde tanının teyidini yapmak ve tahliye

 Ultrason anomalilerinde

 Translokasyon gibi yapısal anomali taşıyıcısı ailelerde

 Tek gen hastalıklarında İNVAZİV İŞLEM YAPMAK

 İnvaziv ile alınan materyalden kültür yapmayı sürdürüp mozaik ve translokasyonlu tipleri ayırt edip tekrarlama riski konusundaki danışmanlığı ondan sonra vermek + Strateji

 NIFTY öncesi NT bakılmalıdır. NT yüksekse invaziv önerilmelidir.

 İleride taramalarda da NIFTY + NT + ikinci trimester USG kombinasyonu en olası ideal kombinasyon olacaktır. + Strateji

 Anomalilerin hepsinde invaziv işlem ile örnek almak

 Tahliye bile etsek etiyolojiyi araştırmak

 Etiyoloji için genetik konsültasyon, fetal muayene, fetal örneklerden kromozom ve DNA eldesi

 PRENATAL TANI KOYDUĞUMUZ HASTALARIN ETİYOLOJİSİNİN, SONRAKİ GEBELİK İÇİN GEREKLİ BİLGİLERİNİ, TEKRARMA RİSKİNİ, TEKRARLAMA HALİNDE YAPILACAKLARI ORTAYA KOYMUYORSAK İŞİMİZİ YAPRIM YAPTIK DEMEKTİR. + Maternal Serum DNA toplumsal tarama ihtiyacını karşılıyor mu?

 Sensitivite ve spesifite yüksek olmalı

 Uygulaması kolay olmalı

 İlk trimesterda uygulanabilir olmalı

 Ucuz olmalı

+ MATERNAL SERUM RNA

 DNA ---- RNA ---- PROTEİN

 RNA çok kolay yıkılan bir moleküldür.

 İlginç olarak fetal RNA çok stabildir.

 Bu zaten fetal RNA’nın küçük fragmanlar halinde olmasından ve RNAz enziminin etkisinden kaçabilmesinden kaynaklanmaktadır + MATERNAL SERUM RNA

 RNA DNA gibi diğer bir biyomarkerdır

 Sorun her dokuda ve çeşitli durumlarda farklı genlerin RNA’larının farklı miktarda üretilmesidir.

 Lo tarafından geliştirilen alelik ayrım yöntemi ile PLAC4 geninde yapılan çalışmalarda Down sendromu tanısı başarı ile konulabilmiştir. + Alelik ayrım

 A  A  A  A  A

 A  A  A  A  A

 T  T  T  T  T

 T  A  T  T  A

 G  G  G  G  G

 C  C  C  C  C

 A  A  A  A  A 1:1 2:1 + Alelik ayrım

 Sensitivite %90

 Spesivite %96,5

 Tek marker ile elde edilen bu başarı çoklu markerlara taşınmaya ve çok ucuz bir tarama yöntemi daha geliştirilmeye çalışılmaktadır. + DÖRT BOYUTLU USG

SERDAR CEYLANER İNTERGEN + Holoprozensefali

Kromozom analizi (%25-50 tanı koydurucu)

 Trizomi 13- Trizomi 18- Triploidi

 del13q veya dup13q, del(18p), del(7)(q36), dup(3)(p24-pter), del(2)(p21), del(21)(q22.3)

+ Holoprozensefali

Kromozom analizi normal ise

 Array CGH (CNV- Copy Number Variation)(Kopya sayısı değişikliği) (Özetle delesyon- duplikasyon) (%10-20) (2000- 2500 TL)

+ Holoprozensefali Sendromik tek gen hastalıkları – Ekzom sekanslama (% 18-25) (2000-4000 Euro)

Otosomal Dominant

 Pallister-Hall syndrome  Rubinstein-Taybi syndrome  Kallmann syndrome  Martin syndrome (with clubfoot, spinal anomalies)  Steinfeld syndrome (with congenital heart disease, absent gallbladder, renal dysplasia, radial defects) (OMIM 184705)  Ectrodactyly and ocular hypertelorism

Otosomal Resesif  "Pseudotrisomy 13 syndrome," in which affected individuals have a normal karyotype and polydactyly. Other commonly seen features of trisomy 13, including scalp defects, overlapping fingers, and nail hypoplasia, are not generally observed [Cordero et al 2008].  Smith-Lemli-Opitz syndrome [Kelley et al 1996, Weaver et al 2010]  Meckel syndrome  Genoa syndrome (with craniosynostosis) (OMIM 601370)  Lambotte syndrome (with microcephaly, prenatal growth retardation, ocular hypertelorism) (OMIM 245552)  Hydrolethalus syndrome (with hydrocephalus, polydactyly, and other anomalies) (OMIM 236680)  Facial clefts and brachial amelia (OMIM 601357)

Otosomal dominant vs multifaktoriyel  Microtia-anotia (OMIM 600674) and other anomalies  HPE-agnathia spectrum disorders

+ Holoprozensefali Non- sendromik tek gen hastalıkları – Ekzom sekanslama (% 5-10) (2000-4000 Euro)

SHH 7q36 30%-40% <5% 600725 142945 ZIC2 13q32 5% 2% 603073 609637 SIX3 2p21 1.3% Rare 603714 157170 TGIF1 18p11.3 1.3% Rare 602630 142946 GLI2 2q14 ? ? 610829 165230 PTCH1 9q22.3 ? ? 601309 610828 DISP1 1q42 Rare Rare 607502 FGF8 10q24 Rare Rare 600483 FOXH1 8q24.3 Rare Rare 603621 NODAL 10q22.1 Rare Rare 601265 TDGF1 (CRIPTO) 3p23-p21 Rare Rare 187395 GAS1 9q21.33 are Rare 139185 DLL1 6q27 Rare Rare 606582 CDON 11q24.2 Rare Rare 608707 + Holoprozensefali

Çevresel etkenler

 Diabet

 Alkol

 Retinoik asit

 Hiperkolesterolemi?

 Kolesterol düşürücü ajanlar (Statinler) + Diğer nimetler

 Maternal kanda fetal DNA artışı (preeklempsi-eklempsi)

 Rh grubu tayini (Kan uyuşmazlığı)

 HPA1 tayini (Trombosit grup uyumsuzlukları)

 Fetal cinsiyet tayini (Cinsiyet seçen hastalıklar- 21 hidroksilaz)

 Babadan kalıtılan mutasyonlar + Yeni jenerasyon dizi analizinin nimetleri

 Muayene ile tanı konulamayan hastalarda tanı

 Akraba evliliklerinde her iki eşin birden taşıdığı mutasyonların tespiti

 Çok genli yada büyük genleri olan hastalıkların araştırılması

 Yanlış tanı oranında azalma + Çok yakında serbest fetal DNA’dan

 Tüm kromozomların tüm bölgeleri analize edilebilecek

 21.000 genin tamamı analiz edilebilecek

 Anomaliye ve tek gen hastalıklarına bağlı sorunlar çok azalacak

10 yıl içinde hasta bu işleri evde yapabilecek + Oxford Nanopore Minion

+ Çok yakında serbest fetal DNA sayesinde

 GENETİKÇİ  PERİNATOLOG

PERİNATOLOG USTA

Genetikçi Lazım Olursa  Dr. Serdar Ceylaner [email protected]  05332145337