Transplante Interespecífico De Espermatogônias De Brycon

Transplante interespecífico de espermatogônias de Brycon

orbignyanus em Astyanax altiparanae (Characiformes, Characida e)

Diógenes Henrique de Siqueira Silva

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

2015

Câmpus de São José do Rio Preto

Diógenes Henrique de Siqueira Silva

Transplante interespecífico de espermatogônias-tronco de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (TELEOSTEI, CHARACIDAE).

São José do Rio Preto 2015

Diógenes Henrique de Siqueira Silva

Transplante interespecífico de espermatogônias-tronco de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (TELEOSTEI, CHARACIDAE).

Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.

Orientador: Prof°. Dr°. Alexandre Ninhaus Silveira Co-Orientadora: Profa. Dra. Rosicleire Veríssimo Silveira

São José do Rio Preto 2015

Silva, Diógenes Henrique de Siqueira. Transplante interespecífico de espermatogônias-tronco de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (TELEOSTEI: CHARACIDAE)/ Diógenes Henrique de Siqueira Silva. - São José do Rio Preto, 2015 127 f. : il.

Orientador: Alexandre Ninhaus Silveira Coorientador: Rosicleire Veríssimo Silveira Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas

1. Citologia. 2. Peixe de água doce - Reprodução. 3. Espermatogênese em animais. 4. Células germinativas. 5. Células – Separação. 6. Quimerismo. I. Silveira, Alexandre Ninhuas. II. Silveira, Rosicleire Veríssimo. III. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título

CDU - 597

Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE UNESP - Câmpus de São José do Rio Preto

Diógenes Henrique de Siqueira Silva

Transplante interespecífico de espermatogônias-tronco de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (TELEOSTEI, CHARACIDAE). Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biologia Animal, junto ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto.

Comissão Examinadora

Prof. Dr. Alexandre Ninhaus Silveira UNESP – Ilha Solteira Orientador

Prof. Dr. George Shigueki Yasui USP - Pirassununga

Profa. Dra. Maria Angélica Spadella FAMEMA - Marília

Prof. Dr. Rafael Henrique Nóbrega UNESP – Botucatu

Prof. Dr. Carlos Alberto Vicentini UNESP – Bauru

São José do Rio Preto 06 de março de 2015

Dedico

As Marias de minha vida, que sempre me apoiaram e me incentivaram a batalhar e correr atrás dos meus sonhos. Vocês são o maior presente que Deus pôde me conceder. Amo vocês Maria Sônia de Siqueira Silva e Maria Lima dos Santos!

Agradecimentos

A Deus, por compreender meus anseios me encorajar a atingir meus objetivos.

Aos meus orientadores Profa. Dra. Rosicleire Veríssimo Silveira, Prof° Dr° Alexandre Ninhaus Silveira por compartilhar humildemente seus conhecimentos, que sem dúvida foram imprescindíveis para a realização deste trabalho. Por sua paciência e dedicação ao longo de todos os anos de minha formação. E, por sua indispensável amizade e conselhos!

Aos professores Dr° Edson Guilherme Vieira e Dr° Igor Paiva Ramos por suas preciosas sugestões e ensinamentos durante o exame de qualificação.

Aos professores Dr° George Shigueki Yasui, Dra Maria Angélica Spadella, Dr° Rafael Henrique Nóbrega, Dr° Carlos Alberto Vicentini, Dra Yara Aiko Tabata, Dra Elizabeth Romagosa, Dr° Edson Guilherme Vieira, por me inspirar como profissionais e cientistas e por aceitar fazer parte deste momento tão especial em minha vida.

Aos cientistas Dr° Taiju Saito e Dr° Martin Pšenička, que me abriram as portas de seu laboratório e humildemente compartilharam seu conhecimento.

Ao Prof° Dr° Francisco Langeani Neto pelo auxílio na identificação das espécies e prontidão com que respondeu aos nossos chamados.

À coordenação do Programa de Pós Graduação em Biologia Animal do IBILCE – UNESP, pela confiança e oportunidade de formação profissional.

À todos os professores do Programa de Pós Graduação em Biologia Animal do IBILCE – UNESP, por seus ensinamentos, exemplo de profissionalismo e amizade.

À Meiri, Cleusa e Zeneide, secretárias do Departamento de Biologia e Zootecnia da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, pela amizade, pelas muitas risadas e grande auxílio no decorrer do trabalho.

À Silvia Emiko Kazama, Silvia Mara Vicentini, Rosemar Rosa de Carvalho Brena, Alex Antonio dos Santos, Mauro Miasaki, Felipe Ferreira, Victor Rufino, Luis Otávio Rodrigues funcionários da seção técnica de pós-graduação do IBILCE, UNESP, pelo excelente trabalho desenvolvido e auxílio durante o trabalho.

À todos os funcionários do ICMBIO – CEPTA, em especial ao prof° Dr° José Auguto Senhorini, pela ajuda durante o desenvolvimento deste trabalho.

À Usina Hidrelétrica de Jupiá - Companhia Energética de São Paulo (CESP) pelo fornecimento dos exemplares de A. altiparanae.

Ao técnico Sidval do Laboratório de Bromatologia do Depto. de Biologia e Zootecnia da FE, UNESP, pela amizade e colaboração no trabalho.

À CNPq pela concessão de bolsa de estudos sob o número 160860/2011-3.

À CAPES pela concessão de bolsa de doutorado sanduiche (PDSE).

Aos amigos do Laboratório de Ictiologia Neotropical (L.I.NEO), FE, UNESP, Ilha Solteira, Amanda, Giovana, Raphael, Jumma, Douglas, Aline, Cristiane, Pricila, Patrícia, Maira, Laiza, Fabrício pela convivência, amizade, e churrascos. Em especial a Giovana Branco, Jumma Miranda, Aline Zonatto, Patrícia Postíngel, Pricila Viana e Laiza Silva pelo auxílio nos experimentos e coletas.

Aos amigos da Republica JANELAS de S. J. do Rio Preto por todos os momentos de alegria, amizade e companheirismo.

Aos amigos da República Law pela convivência, amizade e “drs”.

Ao time de Futsal Vera Cruz pela amizade e conquistas.

Aos amigos do Centro de Ensino FISK de Ilha Solteira.

Agradecimentos especiais

Aos meus pais Maria Sônia e Antônio Olívio (In memorian) que com amor e dedicação não foram apenas pais, mas amigos e companheiros mesmo nas horas em que meus ideais pareciam distantes e inatingíveis.

Ao meus irmãos Diemison e Jéssica que, mesmo involuntariamente, me motivam a continuar lutando por meus ideais.

Aos meus “pais postiços” Maria Lima dos Santos (Dona Nega) e José Pereira dos Santos (Seu Zé), exemplos de superação, trabalho e dedicação, os quais levarei para sempre em meu coração.

À minha namorada Amanda, pelo amor, carinho, paciência, companheirismo e auxílio científico ao longo dessa árdua jornada. Te amo!

À Nivaldo Avanso Urzulin por todos os ensinamentos, pela convivência, que com toda a certeza me inspirou a nunca desistir, e encarar os obstáculos diários com alegria e pensamento positivo. Muito obrigado Mestre!

Ao Biólogo Douglas Castro Ribeiro pela construção do sistema de tanques utilizado durante todos os experimentos.

À minha Co-orientada Maira da Silva Rodrigues por sua preciosa ajuda e por me deixar fazer parte de sua vida acadêmica. Obrigado por me aguentar.

À professora Wilma Starke Buzzeti por permitir o uso do microscópio de fluorescência e aos seus alunos Diogo, Maria Luana, e Marina pela disponibilidade e ajuda.

Enfim, a todos, que de uma maneira, ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho e torceram pelo meu sucesso.

“No meio de qualquer dificuldade encontra-se a oportunidade.”

Albert Eistein

“A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.”

Arthur Schopenhauer

Sumário

Resumo ...... 4 Abstract ...... 5 Introdução e Justificativa ...... 6 Morfologia Testicular ...... 7 Transplante de células germinativas ...... 9 As espécies modelo ...... 14 Objetivos específicos ...... 17 Referências Bibliográficas ...... 18 Capítulo 1 Análise espermatogênica e estereológica dos testículos do lambari Astyanax altiparanae (Characiformes: Characidae)...... 27 Resumo ...... 28 Abstract ...... 29 Introdução ...... 30 Material e Métodos ...... 32 Resultados ...... 34 Discussão ...... 38 Figuras e Tabela ...... 41 Referências Bibliográficas ...... 44 Capítulo 2 The effects of temperature and busulfan (Myleran) on yellowtail tetra Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) spermatogenesis ...... 49 Abstract ...... 50 Introduction ...... 51 Material and Methods ...... 52 Results ...... 55 Discussion ...... 57 Figures ...... 60 References ...... 67 Capítulo 3 Morphology of the urogenital papilla and its component ducts in the freshwater tetra Astyanax altiparanae (Characiformes: Characidae)...... 72 Abstract ...... 73 Resumo ...... 74 Introduction ...... 75 Material and Methods ...... 76 Results ...... 77 Discussion ...... 79 Figures ...... 82

Literature cited ...... 86 Capítulo 4 Isolamento e transplante de espermatogônias de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (Characiformes:Characidae)...... 93 Resumo ...... 94 Abstract ...... 95 Introdução ...... 96 Material e Métodos ...... 97 Resultados ...... 101 Discussão ...... 102 Figuras ...... 105 Referências ...... 110 Perspectivas e Conclusões ...... 113 Anexos 1. Spermatogenesis in the tetra Astyanax altiparanae: a histological analyses with emphasis to spermatogonial and spermatid types” trabalho submetido à publicação no periódico Boletim do

Instituto de Pesca ...... 116

2. Induction of sterility in fish with emphasis on the implication of germ cell transplantation for aquaculture: an overview” - trabalho submetido ao periódico Aquaculture...... 117

RESUMO

O transplante de células germinativas é uma recente abordagem experimental que envolve a remoção de células germinativas indiferenciadas das gônadas de um animal doador, e transplante nas gônadas de um receptor originando espermatozoides com características genéticas do doador. Apesar de ser promissora em estudos que envolvem a biologia das células germinativas iniciais, preservação de espécies ameaçadas, biologia da reprodução e muitas outras abordagens biotecnológicas, a aplicação desta metodologia em peixes ainda é limitada. Deste modo, o transplante de células espermatogoniais de duas espécies filogeneticamente relacionadas, a piracanjuba Brycon orbignyanus em lambaris Astyanax altiparanae foi estudada. Para isto, a espermatogênese e a papila urogenital (via do transplante) da espécie receptora foram histologicamente analisadas, evidenciando a presença de nove gerações espermatogoniais e que a cada célula de Sertoli suporta o desenvolvimento de cerca de 140 espermátides. Além disso, a papila urogenital difere entre os sexos. Para o transplante, os testículos das piracanjuba foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias foram purificadas por um gradiente de densidade (Percoll), marcadas com PKH26, e injetadas, via papila urogenital, nos testículos dos lambaris, cuja espermatogênese endógena foi previamente suprimida por administração de busulfan (Myleran) associado com água quente (35°C) ou por sua manutenção nesta temperatura por um período maior. Cerca de 66,7% e 84,6% dos receptores tratados com busulfan + temperatura e somente temperatura, respectivamente, apresentaram cistos de células germinativas doadoras em seu epitélio. O transplante espermatogonial envolvendo B. orbignyanus e A. altiparanae foi realizado com sucesso e pode ser aplicado em pisciculturas auxiliando no aumento da produção e preservação da piracanjuba (criticamente ameaçada de extinção), pois espermatozoides do doador podem ser obtidos em até três semanas pós-transplante.

Palavras Chave: barriga de aluguel; esterilização; marcação celular; quimerismo; reprodução de peixes; separação celular.

ABSTRACT

Germ cell transplantation is a recent approach which involves removal of undifferentiated germ cells from the donor gonads and transplantation into the gonads of a host, giving origin to sperm with genetic characteristics from the donor. Despite this methodology promising in studies involving initial germ cell biology, preservation of threatened species, reproductive biology and many other biotechnological approaches, the application of such a methodology in fish is still limited. Thus, the transplantation of spermatogonial cells from two phylogenetically related species “piracanjuba” Brycon orbignyanus into “lambaris” Astyanax altiparanae testis was histologically studied. Host spermatogenesis and urogenital papilla (transplantation via) were analyzed, highlighting nine spermatogonial generations and that each Sertoli cell supports the development of about 140 spermatids. Moreover, urogenital papilla is different between the sexes. For transplantation, piracanjuba’s testes were enzymatic digested and spermatogonia were purified by a density gradient (Percoll), labeled with PKH26 and injected, through urogenital papilla, into “lambaris” testes, whose endogenous spermatogenesis had been previously suppressed by administration of busulfan (Myleran) associated with warm water (35°C) or by their maintenance at this temperature for longer time. About 66.67% and 84.6% of the host animals treated with busulfan + temperature and only temperature, respectively, presented cysts of donor germ cells into their epithelium. Spermatogonial transplantation involving B. orbignyanus and A. altiparanae was successfully performed and it can be applied in fish farms helping production increase and preservation of donor species “piracanjuba” (critically endangered), since donor spermatozoon can be obtained up to three weeks after transplantation process

Key words: cell isolation; chimerism; fish reproduction; germ cell labeling; sterilization; surrogate production.

INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

 MORFOLOGIA TESTICULAR

Os teleósteos representam aproximadamente 96% de todas as espécies de peixes

conhecidas, tendo alcançado sucesso nos mais diversos ambientes aquáticos, cujas condições

bióticas, como disponibilidade de alimento e pressão de predação, e abióticas, como

temperatura, fotoperiodo, oxigênio disponível, dentre outras, variam amplamente no espaço e

no tempo (NAGAHAMA, 1983; VAZZOLER, 1996). As adaptações que habilitam estes

organismos a viverem harmonicamente nos diferentes ambientes, se relacionam,

principalmente, às inúmeras estratégias reprodutivas desenvolvidas por eles, por sua vez estas

estratégias refletem diretamente na morfologia ovariana e testicular das diferentes espécies.

(VAZZOLER, 1996).

Os testículos em peixes são formados por dois compartimentos distintos: o

compartimento intersticial, que contém as células de Leydig (produtoras de esteroides), vasos

linfáticos e sanguíneos, macrófagos e mastócitos, além de elementos do tecido neural e

conjuntivo e; o compartimento germinativo, que abriga as células germinativas, responsáveis

pela produção espermática, e as células somáticas de Sertoli, que em conjunto formam o

epitélio seminífero testicular (SCHULZ & NÓBREGA, 2011a), cuja morfologia tem sido

utilizada como base para a classificação dos testículos de peixes em lobular ou tubular

anastomosado. O testículo do tipo lobular é caracterizado pela presença de um epitélio

germinativo confinado em compartimentos que terminam em fundo cego na periferia do

testículo, enquanto que o tubular anastomosado consiste de compartimentos germinativos

altamente interconectados, formando ramificações que não apresentam região de início ou

término (GRIER, 1993; PARENTI & GRIER, 2004).

O epitélio germinativo testicular dos teleósteos também pode ser diferenciado em epitélio germinativo contínuo e descontínuo (GRIER & TAYLOR, 1998). O primeiro é constituído por uma população contínua de células de Sertoli e células germinativas que se estendem ao longo de todo o comprimento dos túbulos seminíferos. Já o epitélio germinativo descontínuo é caracterizado pela presença de regiões contendo células germinativas combinadas com células de Sertoli, alternando regiões formadas exclusivamente por células de Sertoli, o que se deve a abertura dos cistos espermatogênicos para a liberação dos espermatozoides (GRIER & TAYLOR, 1998; GRIER & LO NOSTRO, 2000; BROWN-

PETERSON et al., 2002).

Assim, as mudanças do epitélio germinativo (contínuo e descontínuo) associadas aos estágios das células germinativas presentes nos testículos dos teleósteos, têm sido utilizadas para identificar as fases de maturação gonadal, auxiliando na compreensão da dinâmica da atividade reprodutiva das espécies (GRIER & TAYLOR, 1998; GRIER & LO NOSTRO,

2000; BROWN-PETERSON et al., 2002; VERÍSSIMO-SILVEIRA, 2003, SIQUEIRA-

SILVA et al., 2013), e complementando a tradicional escala proposta por Vazzoler (1981), que se baseia apenas em aspectos macroscópicos.

A espermatogênese em peixes ocorre no interior de unidades funcionais, denominadas cistos, que são formados por células germinativas em desenvolvimento sincrônico, envolvidas por células de Sertoli (GRIER et al., 1980; GRIER, 1992; GRIER & TAYLOR, 1998;

NÓBREGA, et al., 2009; SCHULZ et al., 2010). Além do suporte mecânico, hormonal e nutricional fornecido às células germinativas espermatogênicas, as células de Sertoli desempenham as funções de fagocitose de corpos residuais, resultantes dos processos biológicos inerentes as células deste tecido, tais como morte celular programada e eliminação de citoplasma durante a formação espermática (BILLARD, 1970; SCHULZ & NÓBREGA,

2011b).

As primeiras células da linhagem espermatogênica são conhecidas como espermatogônias indiferenciadas. Estas células podem distribuir-se em três padrões diferentes ao longo do epitélio germinativo das espécies. O primeiro tipo, denominado espermatogonial restrito, descrito para as ordens Atheriniformes, Cyprinodontiformes e Beloniformes, caracteriza-se pela restrição das espermatogônias indiferenciadas à porção distal dos lóbulos;

O tipo espermatogonial irrestrito, descrito em Salmoniformes, Cipryniformes e Perciformes, apresenta espermatogônias indiferenciadas distribuídas ao longo de todo o comprimento dos compartimentos germinativos (GRIER et al., 1980; PARENTI & GRIER, 2004) e; o terceiro tipo, cuja recente caracterização o classifica como “intermediário” entre os dois tipos acima descritos, visto que as espermatogônias indiferenciadas mostram uma localização preferencial próxima a túnica albugínea, sendo porém, encontradas ao longo de todo epitélio germinativo

(SCHULZ et al. 2010). O terceiro tipo de distribuição espermatogonial foi encontrado na tilápia do Nilo Oreochromis niloticus (VILELA et al., 2003) e no tucunaré amarelo Cichla kelberi (SIQUEIRA-SILVA et al., 2013).

Apesar de sua eficiência para a determinação das fases de maturação testicular em peixes, as análises histológicas das gônadas dos teleósteos são por si só insuficientes para a compreensão do processo espermatogênico e função testicular em peixes. Isso se deve a capacidade limitada de estudo que esta ferramenta fornece, já que não possibilita a análise em três dimensões de uma estrutura ou órgão. Deste modo, as investigações estereológicas, que abrangem um conjunto de procedimentos baseados em geometria e probabilidade que, a partir de medições ou contagens de elementos de uma imagem plana de uma estrutura tridimensional, produz informações sobre as características da estrutura original, têm sido cada vez mais utilizada pelos pesquisadores para o estudo funcional das gônadas. Este tipo de análise possibilita uma melhor interpretação das interações existentes entre células somáticas, células germinativas e elementos intersticiais presentes no compartimento testicular dos

teleósteos, auxiliando para uma melhor compreensão dos eventos que ocorrem neste órgão,

durante o ciclo reprodutivo de uma dada espécie (DE ALVARENGA & FRANÇA, 2009;

NÓBREGA et al., 2010; HUSZNO & KLAG, 2012; CAMPOS-JUNIOR et al., 2013).

Apesar do elevado número de trabalhos envolvidos na avaliação e análise dos

componentes estruturais e funcionais dos testículos, poucos estudos estão voltados para a

investigação detalhada dos demais componentes do sistema reprodutor masculino em peixes.

Entretanto, uma vez que cada estrutura deste sistema atua de forma integrada para garantir a

melhor produção espermática, o conhecimento de cada um de seus processos, tais como a

maturação dos espermatozoides, formação do fluído seminal, liberação dos espermatozoides

para o ambiente, dentre outros parâmetros, é de extrema importância para o melhor

entendimento do funcionamento gonadal como um todo (RASOTTO & SHAPIRO, 1998;

LAHNSTEINER, 2003). Dentre as estruturas do sistema reprodutor masculino, cujos

conhecimentos morfológicos e fisiológicos são ainda incipientes, destaca-se a papila

urogenital. Apesar de situar-se na região de transição entre gônadas, ductos genitais e meio

externo e desempenhar importantes funções biológicas, tais como o controle da liberação dos

espermatozoides ou órgão copulador durante o evento reprodutivo, visando maximizar o

sucesso reprodutivo das espécies, pouco se conhece à respeito de sua real função (RASOTTO

& SHAPIRO, 1998; MENEZES et al., 2009).

 TRANSPLANTE DE CÉLULAS GERMINATIVAS

Atualmente, dentre as ferramentas com potencial para a investigação da função

testicular em teleósteos, o transplante de células germinativas é uma das abordagens

experimentais com maior destaque. Sua aplicação permite uma análise in vivo do

comportamento e interação das células que participam ativamente da espermatogênese, tais

como as células espermatogoniais tronco e as células somáticas de Sertoli (TAKEUCHI et al.,

2003; DOBRINSKI, 2005). Além disso, esta técnica é uma grande aliada para o aumento da produção aquícola, visando a mitigação de possíveis problemas futuros, tais como a ameaça de escassez alimentar, devido ao contínuo crescimento da população mundial, cujas projeções estimam atingir 9 bilhões de pessoas em 2050 (COHEN, 2003).

O transplante de células germinativas consiste na remoção de células da linhagem germinativa (células primordiais germinativas (PGCs), espermatogônias ou oogônias iniciais) da gônada de um animal doador e sua posterior transplante em um animal receptor. Ao atingir as gônadas do receptor, as células transplantadas poderão colonizar o compartimento germinativo e se desenvolver, formando gametas com características genéticas do doador

(IZADYAR et al., 2000; MCLEAN, 2005; LACERDA, 2006; NOBREGA et al., 2009). Esta técnica foi inicialmente estudada por Brinster & Avarbock (1994) em camundongos, e vem sendo realizada em mamíferos de médio e grande porte, como gatos, coelhos, suínos, caprinos, bovinos, macacos e até mesmo em humanos, através do transplante intraespecífico, também conhecido como transplante singênico, e interespecífico, processo denominado por transplante xenogênico (NAGANO et al., 1999; OGAWA et al., 1999; OGAWA, 2001;

BRINSTER, 2002; SHINOHARA et al., 2002; HONARAMOOZ et al., 2003; DOBRINSKI,

2005; ORWIG & SCHLATT, 2005; HILL & DOBRINSKI, 2006).

Sua importância maior está nas possibilidades de estudos para se investigar a biologia das células tronco germinativas, pois o transplante celular proporciona uma análise da espermatogênese/oogênese, principalmente nos estágios iniciais do desenvolvimento celular, assim como da relação entre células germinativas e as células somáticas que compõem o epitélio germinativo. Além disso, esta técnica pode auxiliar em práticas, como a preservação de espécies ameaçadas de extinção, na medicina reprodutiva e na produção de animais transgênicos (NÓBREGA et al., 2009).

A eficiência desta metodologia, depende do sucesso de colonização e desenvolvimento das células doadoras nos túbulos seminíferos do animal receptor, sendo que o animal considerado “ideal” para o recebimento destas células, é aquele cujo compartimento germinativo possui apenas células somáticas normais, garantindo o acesso das células germinativas doadoras aos nichos disponíveis nos túbulos seminíferos receptores, sem a necessidade de competição com as células germinativas endógenas (SHINOHARA et al.,

2002; BRINSTER et al., 2003; LACERDA, 2006). Para esta finalidade Okutsu et al. (2007) utilizaram como receptores, embriões triploides estéreis do salmão Oncorhynchus masou.

Entretanto, apesar de não apresentarem gametogênese endógena, constituindo-se, portanto em um receptor “ideal”, esta espécie somente atinge a maturidade sexual por volta dos dois anos de idade, além de reproduzir-se apenas uma vez ao ano, características que podem significar um empecilho ao desenvolvimento desta prática, pois demanda um longo tempo para obtenção de resultados práticos.

Deste modo, muitos pesquisadores têm utilizado como receptores animais que atingem precocemente a maturidade reprodutiva e se reproduzem mais de uma vez ao longo do ano.

Porém, as espécies adotadas como receptoras, são, geralmente, providas de gametogênese normal, necessitando, portanto, serem submetidas a algum tratamento artificial para eliminação de suas células germinativas. Para tal, a droga quimioterápica busulfan tem sido largamente utilizada, pois elimina a linhagem germinativa, sem prejudicar as células somáticas, que são imprescindíveis a gametogênese (LACERDA, 2006; LACERDA et al.,

2008, 2010; MAJHI et al., 2009; NÓBREGA et al., 2010). Os efeitos citotóxicos do busulfan

(1,4-dimetano sulfonoxi butano) devem-se, principalmente, a promoção de ligações cruzadas no DNA através da transferência de radicais alquil aos nucleotídeos, levando à morte celular em tecidos com alto índice de proliferação, como é o caso do epitélio dos túbulos seminíferos

(BISHOP & WASSOM, 1986).

Após a supressão da gametogênese endógena dos animais receptores, o próximo passo para o transplante celular, envolve o isolamento das células germinativas do doador por meio da digestão gonadal. Depois de isoladas, as células germinativas passam por um processo de purificação, com o objetivo de concentrar o maior número possível de células para o transplante. Este passo, tende a aumentar o sucesso do procedimento e pode ser conduzido por diferentes metodologias, tais como a purificação por gradiente descontínuo de densidade, por plaqueamento diferencial, citometria de fluxo, dentre outros. (KOH et al., 2004; YANO et al.,

2008; LACERDA et al., 2010; PANDA et al., 2011).

Antes de sua introdução nos espécimes receptores, as células germinativas doadoras necessitam ser marcadas, para sua rastreabilidade durante a colonização, proliferação e diferenciação no epitélio germinativo gonadal do animal receptor. Dentre os protocolos conhecidos para este fim, a utilização de animais transgênicos portando o gene vasa GFP, a injeção da própria proteína fluorescente verde (GFP) e da molécula de fluoresceína FITC-

DEXTRAN, estão entre os mais utilizados (KOBAYASHI et al., 2007; SAITO et al., 2008;

LEE et al., 2013; SAITO et al., 2014). Devido a facilidade para sua aplicação e de seu reduzido valor de custo, atualmente, um dos marcadores mais utilizados é o kit corante fluorescente PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker – Sigma-Aldrich) (HONARAMOOZ et al.,

2002; TAKEUCHI et al., 2009; LACERDA et al., 2010; HIGUSHI et al., 2011; MORITA et al., 2012). Este marcador é uma molécula alifática conjugada ao fluorocromo TRITC que se intercala na bicamada lipídica da membrana celular, emitindo um espectro de cor vermelha, possibilitando a identificação das células germinativas doadoras no testículo receptor por alguns meses (LACERDA et al., 2006, 2008, 2010; NÓBREGA et al., 2010).

Apesar do transplante de células germinativas em teleósteos despontar como uma técnica bastante promissora, possibilitando estudos que vão desde uma avaliação mais aprofundada da gametogênese até a preservação do material genético de espécies em perigo

de extinção para formação de bancos genéticos (TAKEUCHI et al., 2003; LACERDA, 2006;

OKUTSU et al., 2006), sua aplicação e estudos envolvendo o grupo dos peixes, que é o maior grupo dentre os vertebrados, abrangendo aproximadamente 33.000 espécies distribuídos em ambientes de água doce e marinha (NELSON, 2006), são ainda bastante escassos.

Neste reduzido acervo de trabalhos, muitos se referem ao transplante de células germinativas primordiais (PGCs) e espermatogônias tronco diretamente na cavidade intraperitoneal de embriões e larvas recém-eclodidas (TAKEUSHI et al., 2003; OKUTSU et al., 2006; OKUTSU et al., 2007; SAITO et al., 2008; TAKEUSHI et al., 2009; PŠENIČKA et al., 2014). Algumas metodologias distintas foram empregadas com sucesso. Nagler et al.

(2001) e Majhi et al. (2009), por exemplo, realizaram o transplante das células germinativas primordiais diretamente nos testículos de truta arco-íris Oncorhynchus mykiss e do peixe rei

Odontesthes hatcheri, respectivamente, através de intervenção cirúrgica, com incisão abdominal do animal receptor, injeção das células germinativas em suas gônadas e, posterior sutura. Outra abordagem, um pouco mais recente, propõe o transplante de espermatogônias primárias via papila urogenital, injetando as células doadoras diretamente no ducto espermático comum de animais sexualmente maduros (LACERDA, 2006; LACERDA et al.,

2008, 2010; NÓBREGA et al., 2010).

Em comum, os diferentes protocolos empregados até o momento para o transplante de células germinativas em peixes, evidenciam a necessidade de conhecimento prévio, assim como um maior aprofundamento nos estudos acerca da morfologia do sistema reprodutivo neste grupo de vertebrados, principalmente das gônadas, pois só assim será possível o desenvolvimento de metodologias que levarão ao sucesso total desta abordagem.

● AS ESPÉCIES MODELO

As espécies escolhidas para o presente estudo, Brycon orbignyanus e Astyanax altiparanae, pertencem a uma das maiores ordens dos peixes de água doce, abrigando pelo menos 1674 espécies, que se dividem em 18 famílias e cerca de 270 gêneros, distribuídos nas

Américas e na África (NELSON, 2006). Dentre as famílias desta ordem, a família Characidae, composta por aproximadamente 600 espécies, merece destaque, sendo considerada a mais diversificada família de peixes da região Neotropical, com representantes distribuídos por toda a América do Sul, México e na região do Texas nos Estados Unidos (NELSON, 2006;

BUCKUP et al., 2007). Graças a este grande número de espécies e à natureza heterogênea de suas formas, os representantes da família Characidae estão agrupados em subfamílias, que abrigam desde indivíduos de pequeno porte, como é o caso dos representantes do gênero

Priocharax, com tamanho máximo de 17 mm, aos de grande porte como é o caso dos Brycon, que podem alcançar até 70 cm de comprimento padrão (REIS et al., 2003).

Os representantes do gênero Brycon fazem parte de uma das principais subfamílias dos caracídeos, os Bryconinae cujos representantes somam 40 espécies de peixes de médio a grande porte, que habitam águas lóticas e bem oxigenadas, possuem hábito alimentar onívoro, com preferência por frutos e sementes (GANECO, 2003; REIS et al., 2003). Entre os principais representantes de Bryconinae, destaca-se a espécie Brycon orbignyanus.

Popularmente conhecida por piracanjuba, esta espécie apresenta corpo fusiforme e comprimido de cor prateada, sua cabeça é pequena e apresenta boca com posição terminal, mas a característica que a distingue dos outros briconídeos é a coloração vinho ou vermelha de sua nadadeira caudal. Com grande destaque na piscicultura nacional, a piracanjuba é considerada um dos mais apreciados peixes de água doce, além de ser muito apreciada para a pesca esportiva e cultivo, já que apresenta comportamento agressivo durante a captura e rápido crescimento em cativeiro. Esta espécie distribui-se nos rios Paraná, Uruguai, Paraguai,

na Bolívia e Bacia Amazônica, onde realiza migrações reprodutivas. Entretanto, seus estoques vêm sofrendo uma drástica redução devido à sua exploração, desmatamento das matas ciliares e poluição ambiental, que reduzem a disponibilidade de sua alimentação natural, além do represamento dos rios e diminuição de lagoas marginais, em decorrência da construção de usinas hidrelétricas, formando barreiras intransponíveis à sua migração reprodutiva obrigatória (VAZ et al., 2000; BORBA, 2003; GANECO, 2003). Por este motivo, desde 1996

B. orbignyanus encontra-se na lista do Conselho Estadual de Política Ambiental (COPAM) de espécies ameaçadas de extinção e de acordo com o “Livro Vermelho da Fauna Brasileira

Ameaçada de Extinção” atualmente está criticamente ameaçada, com alto risco de extinção na natureza em futuro próximo (ROSA & LIMA, 2008). Os fatores acima citados aliados às boas características zootécnicas deste peixe têm estimulado os esforços para sua criação em cativeiro, seja para fins comerciais ou para repovoamento do ambiente natural (BORBA,

2003).

Assim como a piracanjuba, os lambaris, como são conhecidos os representantes do gênero Astyanax, também são representantes da família Characidae. Entretanto, eles formam um grupo altamente complexo do ponto de vista taxonômico (GARUTTI & BRITISKI,

2000), pois apesar de muitos autores incluírem este gênero na subfamília Tetragonopterinae,

Lima et al. (2003) e Buckup et al. (2007) considerando a falta de evidências que suportem a monofilía do grupo, que compreende mais de 100 espécies e subespécies de peixes da ictiofauna dos rios Neotropicais, preferem não adotar esta classificação, sendo eles listados como Incertae sedis, ou seja, cujo gênero não apresenta uma posição taxonômica definida.

Dentre seus representantes, Astyanax altiparanae, também conhecido por lambari-do-rabo- amarelo, piaba ou tambiú, é um peixe de pequeno porte (podendo atingir comprimentos totais máximos de 20 cm), que se distribuí pela bacia do alto Paraná, Paranapanema, Tibagi e

Iguaçu, em ambientes lóticos e lênticos, nos quais representa significante parte da dieta dos

peixes de maior porte, além de ser altamente consumido pelos humanos (GARUTTI &

BRITISKI, 2000; ORSI et al., 2002; DE BEM, 2009). Esta espécie caracteriza-se por apresentar corpo prateado, com a região ventral esbranquiçada e a região dorsal acinzentada.

As nadadeiras caudal, anal e pélvica são amareladas enquanto as demais são hialinas ou levemente amareladas. Na nadadeira caudal, há uma faixa mediana negra estendida à extremidade dos raios medianos, separando os lobos superior e inferior (GARUTTI &

BRITISKI, 2000). Suas características zootécnicas e reprodutivas, que incluem três a quatro desovas ao longo de um ano, com prole numerosa, além da facilidade de manejo tanto em laboratório quanto no campo, fazem desta espécie um excelente modelo experimental para investigação da biologia reprodutiva dos peixes teleósteos, além de possibilitar a aplicação de metodologias experimentais específicas, como técnicas de melhoramento genético, manipulação cromossômica, reversão sexual, transgênese e técnicas de transplante celular

(CASTILHO-ALMEIDA, 2007; YASUI et al., 2014).

Dado o exposto, o presente trabalho teve por objetivo geral, o transplante de espermatogônias indiferenciadas provenientes de B. orbignyanus nos testículos de A. altiparanae. Para isso, inicialmente fizemos um estudo histológico e estereológico da espermatogênese da espécie receptora (CAPÍTULO I), a fim de conhecer um pouco mais sobre o comportamento das células germinativas desta espécie, visto que as mesmas seriam submetidas à depleção por sua exposição à droga quimioterápica busulfan associada a diferentes temperaturas (CAPÍTULO II). Após estabelecido o protocolo para supressão da espermatogênese endógena da espécie receptora, iniciamos os estudos dos ductos genitais desta mesma espécie, pois as células doadoras seriam injetadas diretamente no ducto espermático comum, via papila urogenital (CAPÍTULO III). Por fim, trabalhamos no isolamento, purificação e marcação das espermatogônias de B. orbignyanus, que posteriormente foram transplantadas nos testículos de A. altiparanae (CAPÍTULO IV).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Descrição histológica e estereológica da espermatogênese de A. altiparanae;

 Supressão da espermatogênese endógena dos animais receptores da espécie A. altiparanae, habilitando-os a receber as células germinativas doadoras;

 Análise da papila urogenital e ductos componentes, a fim de definir a via do transplante celular;

 Padronizar as técnicas de dissociação enzimática dos testículos da piracanjuba B. orbignyanus e isolar as espermatogônias primárias, por meio de um gradiente de densidade;

 Marcação das espermatogônias primárias utilizando o Kit marcador PKH26, a fim de localizá-las posteriormente nos testículos dos animais receptores.

 Transplante das células germinativas de B. orbignyanus em A. altiparanae, através do ducto espermático comum que se abre na papila urogenital;

 Análise dos testículos dos animais receptores, através de microscopia de fluorescência, para verificação da presença de células germinativas doadoras.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BILLARD R. 1970 La spermatogènese de Pecilia reticulata. IV. La espermiogênese. Etude ultrastructurale. Ann. Biol. Anim. Biochim. Byophys, v.10, p.493-510.

BISHOP J.B.; WASSOM J.S. 1986 Toxicological review of busulfan (Myleran). Mutat Res-Rev

Genet , v.168, p.15-45.

BORBA, M. R. Exigência energética e relação carboidrato: lipídio para alevinos de piracanjuba (Brycon orbignyanus). 2003 Tese (Doutorado) – UNIVERSIDADE ESTADUAL

PAULISTA

BRINSTER RL. 2002 Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science, v. 296, p. 2174- 75.

BRINSTER R. L.; AVARBOCK M. R. 1994 Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proceedings of National and Academic Science, v. 91, p.11303-07.

BRINSTER C.J.; RYU B-Y; AVARBOCK M.R., KARAGENC L.; BRINSTER R.L.; ORWIG K.E. 2003 Restoration of fertility by germ cell transplantation requires effective recipient preparation. Biology of Reproduction, v. 69, p.412-20.

BROWN-PETERSON N.J.; GRIER H.J.; OVESTREET R.M. 2002 Annual changes in germinal epithelium determine male reproductive classes of the cobia. Journal of Fish Biology, v.60, p. 178- 202.

BUCKUP P. A.; MENEZES N. A.; GHAZZI M. S. 2007 Catálogo das espécies de peixes de água doce do Brasil. Museu Nacional, Rio de Janeiro, pp. 195.

CAMPOS-JUNIOR P. H. A.; COSTA G. M. J.; DE AVELAR G. F.; SEGATELLI T. M.; LACERDA S. M. S. N.; APONTE P. M.; DE FRANÇA, L. R. 2013 Morphometric evaluation of the spermatogonial stem cell distribution and niche in vertebrates. In Stem Cell Niche, p. 35-42. Humana Press.

CASTILHO-ALMEIDA R. B. Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) como modelo biológico de espécie de peixe para exploração zootécnica e biomanipulação. 2007 Tese (Doutorado) – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA UNESP – INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU

COHEN J.E. 2003 Human Population: The Next Half Century. Science, v. 302(5648), p. 1172-75.

DE ALVARENGA E. R.; FRANÇA L. R. 2009 Effects of Different Temperatures on Testis Structure and Function, with Emphasis on Somatic Cells, in Sexually Mature Nile Tilapias (Oreochromis niloticus). Biology of Reproduction, v. 80, p. 537-44.

DE BEM, J. C. 2009 Desenvolvimento gonadal inicial e reversão sexual em Astyanax altiparanae (Teleostei, Characidae). 2009. xi, 96 f. Dissertação (mestrado) - UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE RIO CLARO.

DOBRINSKI I. 2005 Germ cell transplantation and testis tissue xenografting in domestic animals. Animal Reproduction Science, v. 89, p.137-45.

GANECO L. N. Análise dos ovos de piracanjuba, Brycon orbignyanus (Valenciennes, 1849), durante a fertilização e o desenvolvimento embrionário, sob condições de reprodução induzida. 2003 Dissertação (Mestrado) – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA.

GARUTTI V.; BRITSKI H.A. 2000 Descrição de uma espécie nova de Astyanax (Teleostei: Characidae) da bacia do alto Rio Paraná e considerações gerais sobre as demais espécies do gênero na bacia. Comum Mus Ciênc Tecnol PUCRS Série Zoologia. v.13, p.65-88.

GRIER H.J.; LINTON J.R.; LEATHERLAND,J.F.; DE VLAMING V.L. 1980 Structural evidence for two different testicular types in teleost fishes. Am. J. Anat., v.159, p.331-45.

GRIER H.J. 1992 Chordate Testis: The Extracellular Matrix Hypothesis. Journal of Experimental. Zoology, v.261, p.151-60.

GRIER H.J. 1993 Comparative organization of Sertoli cells including the Sertoli cell barrier. In: RUSSELL, L.D., GRISWOLD, M.D. (Eds) The Sertoli Cell. Clearwater, FL: Cache River Press, p.704-39.

GRIER H.J.; TAYLOR R.G. 1998 Testicular maturation and regression in the common snook. Journal of Fish Biology, v.53, p. 521-42.

GRIER H.J.; LO NOSTRO F. The teleost germinal epithelium: a unifying concept 2000 In: NORBERG B.; KJESBU O.S.; TARANGER G.L.; ANDERSSON E.; STEFANSSON S.O. (Eds) Proceedings of the Sixth International Symposium on the Reproductive Physiology of Fish, Begen: University of Bergen Press. p. 233-36.

HIGUCHI K.; TAKEUCHI Y.; MIWA M.; YAMAMOTO Y.; TSUNEMOTO K.; YOSHIZAKI G. 2011 Colonization, proliferation, and survival of intraperitoneally transplanted yellowtail Seriola quinqueradiata spermatogonia in nibe croaker Nibea mitsukurii recipient. Fisheries science, v.77(1), p. 69-77.

HILL J.R.; DOBRINSKI I. 2006 Male germ cell transplantation in livestock. Reproduction, Fertility and Development, v. 18, p.13-18.

HONARAMOZZ A.; MEGEE S.O.; DOBRINSKI I. 2002 Germ cell transplantation in pigs. Biology of Reproduction, v. 66, p. 21-28.

HONARAMOOZ A.; BEHBOODI E.; MEGEE S. O.; OVERTON S. A.; GALANTINO-HOMER H.; ECHELARD Y.; DOBRINSKI I. 2003 Fertility and Germline Transmission of Donor Haplotype Following Germ Cell Transplantation in Immune competent Goats. Biology of Reproduction. v.69, p.1260-64.

HUSZNO J.; KLAG J. 2012 The reproductive cycle in the male gonads of Danio rerio (Teleostei, Cyprinidae). Stereological analysis. Micron, v. 43(5), p. 666-72.

IZADYAR F.; CREEMERS L.B.; DISSEL-EMILIANI M.F.; PELT A. M. M.; ROOIJ D. G. 2000 Spermatogonial stem cell transplantation. Molecular and Cellular Endocrinology, v.169, p. 21-26.

KOBAYASHI T.; TAKEUCHI Y.; TAKEUCHI T.; & YOSHIZAKI G. 2007 Generation of viable fish from cryopreserved primordial germ cells. Molecular reproduction and development, v. 74(2), p. 207-13.

KOH K-B; KOMIYAMA M.; TOYAMA Y.; ADACHI T.; MORI C. 2004 Percoll fractionation of adult mouse spermatogonia improves germ cell transplantation. Asian journal of Andrology, v. 6 p. 63- 98.

LACERDA S. M. S. N. 2006 Transplante de espermatogônias: A Tilápia-Nilótica (Oreochromis niloticus) como modelo experimental. Dissertação (Mestrado) – UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS.

LACERDA S.M.; BATLOUNI S.R.; SILVA S.B.G.; HOMEM C.S.P.; FRANÇA L.R. 2006 Germ cells transplantation in fish: the Nile-tilapia model. Animal Reproduction, v. 2, p. 146–59.

LACERDA S. M. S. N.; BATLOUNI S.R.; ASSIS L.H.C.; RESENDE F.M.; CAMPOS-SILVA S.M.; SILVA R.C.; SEGATELLI T.M.; FRANÇA L.R. 2008 Germ cell transplantation in tilapias (Oreochromis niloticus). Cybium (Paris), v. 32, p. 115-18.

LACERDA S. M. S. N.; BATLOUNI S. R.; COSTA G. M. J.; SEGATELLI T. M. QUIRINO B. R.; QUEIROZ B. M.; KALAPOTHAKIS E.; FRANÇA L. R. 2010 A New and Fast Technique to Generate off spring after Germ Cells Transplantation in Adult Fish: The NileTilapia (Oreochromis niloticus) Model. PLosONE. v. 5, e10740.

LAHNSTEINER FRANZ. 2003 Morphology, fine structure, biochemistry, and function of the spermatic ducts in marine fish. Tissue and Cell, v.35(5), p. 363-73.

LEE S.; IWASAKI Y.; SHIKINA S.; & YOSHIZAKI G. 2013 Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 110(5), p. 1640-45.

LIMA F. C. T.; MALABARBA L. R.; BUCKUP P. A.; SILVA J. F. P.; VARI R. P. HAROLD. A & LUCINDA P. 2003 Genera incertae sedis in Characidae. In: REIS R. E.; KULLANDER S. O. & FERRARIS C. J. (eds): Check List of the Freshwater Fishes of South and Central America, Edipucrs, Porto Alegre. p. 106–169.

MCLEAN D. J. 2005 Spermatogonial stem cell transplantation and testicular function. Cell Tissue Research., v. 322, p.21-31.

MAJHI S. K.; HATTORI R.S.; YOKOTA M.; WATANABE S.; STRÜSSMANN C. A. 2009 Germ Cell Transplantation Using Sexually Competent Fish: An Approach for Rapid Propagation of Endangered and Valuable Germlines. PlosOne, v.4, e6132.

MENEZES NAERCIO A.; KATIANE M. FERREIRA and ANDRÉ LUIZ NETTO-FERREIRA. 2009 A new genus and species of inseminating characid fish from the rio Xingu basin (Characiformes: Characidae). Zootaxa, v.2167, p. 47-58.

MORITA T.; KUMAKURA N.; MORISHIMA K.; MITSUBOSHI T.; ISHIDA M.; HARA T.; KUDO S.; MIWA M.; IHARA S.; HIGUCHI K.; TAKEUCHI Y.; YOSHIZAKI G. 2012 Production of donor-derived offspring by allogeneic transplantation of spermatogonia in the yellowtail (Seriola quinqueradiata). Biology of Reproduction, v.86, p. 176.

NAGAHAMA Y. 1983 The functional morphology of teleost gonads. In: Hoar, W. S., Randall, D.J. and Donaldson, E.M. (eds) Fish Physiology, New York: Academic Press. p. 223-76.

NAGANO M.; AVARBOCK M. R.; BRINSTER R. L. 1999 Pattern and Knetics of Mouse Donor Spermatogonial Stem Cell Colonization in Recipient Testes. Biology of Reproduction, v.60, p.1429- 36.

NAGLER J. J.; CLOUD J. G.; WHEELER P. A.; THORGAARD G. H. 2001 Testis transplantation in male rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Biology of reproduction, v.64(2), p.644-646.

NELSON J.S. 2006 Fishes of the world 4th ed. Wiley – Interscience, New York. 624p.

NÓBREGA R.N.; BATLOUNI S.R.; FRANÇA L.R 2009. An overview of functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation in fish. Fish Physiology and Biochemistry. v.35, p. 197-206.

NÓBREGA R.H.; GREEBE C.D.; VAN DE KANT H.; BOGERD J.; FRANÇA L. R. 2010 Spermatogonial Stem Cell Niche and Spermatogonial Stem Transplantation in Zebrafish. PLos ONE, v. 5, e12808.

OGAWA T.; DOBRINSKI I.; AVARBOCK M. R.; BRINSTER R. L. 1999 Xenogeneic Spermatogenesis Following Transplantation of Hamster Germ Cells to Mouse Testes. Biology of Reproduction, v.60, p.515-521.

OGAWA T. 2001 Spermatogonial transplantation: the principle and possible applications. J. Mol. Med, v.79, p.368-74.

OKUTSU T., SUZUKI K., TAKEUCHI Y., TAKEUCHI T., YOSHIZAKI G. 2006 Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proceedings of National Academic Science USA, v.103, p. 2725–2729.

OKUTSU T.; SHIKINA S.; KANNO M.; TAKEUCHI Y.; YOSHIZAKI G. 2007 Production of trout off spring from triploid salmon parents. Science, v.14: 317 (5844): 1517.

ORSI M. L.; SHIBATTA O. A. & SILVA-SOUZA A. T. 2002 Caracterização biológica de populações de peixes do rio Tibagi, localidade de Sertanópolis. In: MEDRI M. E.; BIANCHINI E.; SHIBATTA O. A. & PIMENTA J. A. eds. A bacia do rio Tibagi. Londrina, Universidade Estadual de Londrina. p.425-432.

ORWING K. E.; SCHLATT S. 2005 Cryopreservation and Transplantation of Spermatogonia and Testicular Tissue for Preservation of Male Fertility. Journal of the National Institute Monographs.

PANDA R.P.; BARMAN H.K.; MOHAPATRA C. 2011 Isolation of enriched carp spermatogonial stem cells from Labeo rohita testis for in vitro propagation. Theriogenology, v.76, p.241–251.

PARENTI R. L.; GRIER H. J. 2004 Evolution and phylogeny of gonad morphology in bony fishes. Integrative and Comparative Biology, v.44, p.333–348.

PŠENIČKA M.; SAITO T.; LINHARTOVÁ Z.; GAZO I. 2014 Isolation and transplantation of sturgeon early-stage germ cells. Theriogenology. (In press).

RASOTTO, M. B.; SHAPIRO, D. Y. 1998 Morphology of gonoducts and male genital papilla, in the bluehead wrasse: implications and correlates on the control of gamete release. Journal of Fish

Biology, v. 52(4), p. 716-725.

REIS R. E.; KULLANDER S. O.; FERRARIS J.R; C. J. 2003 Check list of the freshwater fishes of south and Central America. Edipucrs. Porto Alegre. 742p.

ROSA, R. S. & LIMA, F. C. 2008. Os Peixes Brasileiros Ameaçados de Extinção In: MACHADO, A. B. M., DRUMMOND, G. M., PAGLIA, A. P. Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção. ed. Ministério do Meio Ambiente, Brasília, Vol. II, 278p.

SAITO T.; GOTO-KAZETO R.; ARAI K.; YAMAHA E. 2008 Xenogenesis in teleost fish through generation of germ-line chimeras by single primordial germ cell transplantation. Biology of Reproduction. 78, 159–166.

SAITO T.; PŠENIČKA M.; GOTO R.; ADACHI S.; INOUE K.; ARAI K.; YAMAHA E. 2014 The origin and migration of primordial germ cells in sturgeons. PloS One, 9(2), e86861.

SCHULZ R.W.; FRANÇA L.R.; LAREYRE J.J.; LEGAC F.; CHIARINI-GARCIA H.; NOBREGA R.H.; MIURA T. 2010 Spermatogenesis in fish. General and Comparative Endocrinology. v.165, p.390-411.

SCHULZ R. W. & NOÓBREGA R. H. 2011a Anatomy and Histology of Fish Testis. In: Farrell A.P., (ed.), Encyclopedia of Fish Physiology: From Genome to Environment, San Diego: Academic Press v.1, p. 616–626.

SCHULZ R. W. & NOÓBREGA R. H. 2011b Regulation of Spermatogenesis. In: Farrell A.P., (ed.), Encyclopedia of Fish Physiology: From Genome to Environment, San Diego: Academic Press v.1, p. 627–634.

SHINOHARA T.; ORWIG K.E.; AVARBOCK M.R.; BRINSTER R.L. 2002 Germ line stem cell competition in postnatal mouse testes. Biology of Reproduction, v. 66, p.1491-97.

SIQUEIRA-SILVA D. H. D.; VICENTINI C. A.; NINHAUS-SILVEIRA A. & VERISSIMO- SILVEIRA R. 2013 Reproductive cycle of the Neotropical cichlid yellow peacock bass Cichla kelberi: A novel pattern of testicular development. Neotropical Ichthyology, v.11 (3), p. 587-596.

TAKEUCHI Y.; YOSHIZAKI G.; TAKEUCHI T. 2003 Generation of Live Fry from Intraperitoneally Transplanted Primordial Germ Cells in Rainbow Trout. Biology of Reproduction, v.69, p.1142-1149.

TAKEUCHI Y.; HIGUCHI K.; YATABE T. MIWA M.; YOSHIZAKI G. 2009 Development of Spermatogonial Cell Transplantation in Nibe Croacker, Nibea mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae). Biology of Reproduction, v. 81, p.1055-63.

VAZ M. M.; TORQUATO V. C.; BARBOSA N. D. C. 2000 Guia ilustrado de peixes da bacia do Rio Grande. Belo Horizonte: CEMIG/CETEC. 144p.

VAZZOLER A.E.A.DE M. 1981 Manual de métodos para estudos biológicos de populações de peixes; reprodução e crescimento. Brasília, CNPq. Programa Nacional de Zoologia, 108p.

VAZZOLER A.E.A.DE M. 1996 Biologia da reprodução de peixes teleósteos: teoria e prática. Maringá, EDUEM/SBI/CNPq/Nupélia.

VERÍSSIMO-SILVEIRA R. 2003 Ciclo reprodutivo e cinética da espermatogênese do dourado (Salminus maxillosus Valenciennes, 1894). Tese (mestrado). Centro de Aqüicultura, Universidade Estadual Paulista, 60p.

VILELA D.A.R.; SILVA S.G.B.; PEIXOTO M.T.D.; GODINHO H.P.; FRANÇA L.R. 2003 Spermatogenesis in teleost: insights from the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) model. Fish Physiol. Biochem, v.28, p.187–90.

YANO A.; SUZUKI K.; YOSHIZAKI G. 2008 Flow-cytometric isolation of testicular germ cells from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) carrying the green fluorescent protein gene driven by trout vasa regulatory regions. Biology of Reproduction, v. 78(1), p.151-158.

YASUI, G.S.; SANTOS, M. P.; NAKAGHI, L. S. O.; SENHORINI, J. A.; ARIAS-RODRIGUEZ, L.;

FUJIMOTO, T.; SHIMODA, E.; SILVA, L. A. 2014 Improvement of gamete quality and its short-

term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal (Cambridge. Print), v.9(3), p.

1-7.

CAPÍTULO 1

Fonte: http://www.turmadobigua.com.br

Análise espermatogênica e estereológica dos testículos do lambari Astyanax altiparanae (Characiformes, Characidae)

Maira da Silva RODRIGUES1, Diógenes Henrique de SIQUEIRA-SILVA2, Alexandre NINHAUS-SILVEIRA3, RosicleireVERÍSSIMO-SILVEIRA3.

1Estudante de Ciências Biológicas - UNESP – Univ. Estadual Paulista, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical. Av: Brasil, Centro, N° 56. Ilha Solteira, CEP: 15385000, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]

2UNESP – Univ. Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto, Programa de Pós- Graduação em Biologia Animal, Departamento de Biologia e Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical. Rua Cristóvão Colombo, N° 2265, Jardim Nazareth, CEP: 15054-000 - São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]

3Professor assistente Doutor - UNESP – Univ. Estadual Paulista, Campus de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical, Av: Brasil, Centro, N° 56. Ilha Solteira, CEP: 15385000, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected] e [email protected] = autor correspondente.

RESUMO

O presente estudo teve como objetivo a descrição histológica detalhada e a análise estereológica das linhagens celulares germinativas e do número de células de Sertoli encontradas por cisto nos testículos de Astyanax altiparanae durante a espermatogênese. Os testículos de 25 espécimes de machos adultos foram processados para as técnicas usuais para microscopia de luz. Baseado no formato nuclear, condensação da cromatina, quantidade de nucléolos e tamanho celular nós estimamos quatro tipos de espermatogônias: indiferenciadas do tipo A (Aind.*), indiferenciadas do tipo A (Aind.), diferenciadas do tipo A (Adif.), e espermatogônia do tipo B. Estas células passam por ao menos nove divisões mitóticas antes de formar os espermatócitos primários. Espermatócitos foram observados em diferentes estágios da meiose (leptóteno/zigóteno, paquíteno e diplóteno), metáfase I e II e espermatócitos secundários, sendo distinguidos principalmente pela organização dos cromossomos nos núcleos. Também foram identificadas três diferentes tipos de espermátides, que foram nomeadas como iniciais, intermediárias e finais, e se diferenciam pelo aumento da compactação nuclear e espaçamento entre as células no cisto, pelo possível surgimento do flagelo, e pelo diâmetro nuclear. Houve uma perda de 40% do número de células germinativas esperadas ao final da espermatogênese e a capacidade de suporte das células de Sertoli aumentou gradativamente com o desenvolvimento do processo espermatogênico. De nosso conhecimento esta é apenas a quinta espécie cuja espermatogênese foi avaliada por estereologia, muito pouco se consideradas as vantagens proporcionadas por esta avaliação, tais como o melhor entendimento da espermatogênese, caracterização da função testicular e regulação da espermatogênese nesta e nas demais espécies de peixes.

Palavras-chave: capacidade de suporte das células de Sertoli; células germinativas; estereologia; espermiogênese; morfologia testicular; reprodução em peixes.

ABSTRACT

This study aimed to describe a detailed histological and stereological analyses of the germ cell lines and the number of Sertoli cells per cysts found in Astyanax altiparanae testes during spermatogenesis. Testes from 25 adult male specimens of A. altiparanae were sampled and processed for light microscopy. Based on nuclear shape, chromatin condensation, nucleoli quantity and cell size we estimated four spermatogonial types: type A undifferentiated (Aund.*), type A undifferentiated (Aund.), type A differentiated (Adif.), and type

B spermatogonia. These cells undergo at least nine mitotic divisions before giving rise to primary spermatocytes. Spermatocytes were observed in different stages of meiosis,

(leptotene/zygotene/pachytene and diplotene), metaphase I and II and secondary spermatocytes, being distinguished mainly by the nuclear chromosomal organization inside the nucleus. We also identified three different types of spermatids, which were named as initial, intermediate and final, and can be differentiated by an increase in nuclear compression, spacing within cells inside the cysts, possibly by flagella arise and nuclear diameter. A decrease of 40% of germ cells numbers expected to the end of spermatogenesis was reported, and Sertoli cell support capacity gradually increased with spermatogenesis progress. To the best of our knowledge this is only the fifth species which spermatogenesis was analyzed by stereology, this is incipient if we consider the advantages provided by this kind of study, such as better spermatogenesis knowledge, characterization of testicular function and spermatogenesis regulation in this and other fish species.

Key words: fish reproduction; germ cells; spermiogenesis; Sertoli cell support capacity; stereology; testis morphology.

INTRODUÇÃO

Os teleósteos representam o grupo mais abundante e diversificado dentre os vertebrados, abrigando cerca de 96% de todas as espécies de peixes existentes. O sucesso do grupo é atribuído a uma série de adaptações, refletindo na grande diversidade morfológica, padrões de ciclo de vida, e principalmente, no tipo de reprodução, caracterizadas por variadas estratégias reprodutivas, que incluem o ritmo de desova, fecundidade, início da maturação reprodutiva, ciclo reprodutivo anual, dentre outros, que influem diretamente na gametogênese das espécies (ALEXANDRINO et al., 1985; REIS et al., 1993; VAZZOLER, 1996;

NÓBREGA, 2003; NÓBREGA, 2006; GRIER & ARANZÁBAL, 2009).

Nos machos, a gametogênese ou espermatogênese, inicia-se a partir da proliferação mitótica das células diploides, chamadas espermatogônias tronco. Além de se auto-renovarem após cada evento reprodutivo, estas células iniciam a formação dos espermatozoides, passando por processos de diferenciação e sucessivas divisões mitóticas, que determinam a quantidade máxima de espermatozoides a serem formados por cisto. O número de divisões é geneticamente determinado e parece seguir um padrão filogenético, sendo bastante similar entre espécies da mesma ordem (SCHULZ & NÓBREGA, 2011b). Ao final das divisões mitóticas, as células espermatogênicas (espermatócitos) entram em meiose e por fim passam por processos de diferenciação (espermiogênese), culminando com a formação de espermatozoides haploides (GRIER et al., 1980; NÓBREGA et al., 2009; SCHULZ et al.,

2010; SIQUEIRA-SILVA et al., 2012).

Diferentemente dos vertebrados superiores (amniotas), em peixes e demais anamniotas, a espermatogênese se desenvolve no interior de cistos, que são formados por células de Sertoli envolvendo células germinativas em desenvolvimento ligeiramente assincrônico (SIQUEIRA-SILVA et al., 2013). Visto que a sobrevivência das células germinativas depende do contato com as células de Sertoli, a eficiência da produção

espermática dependerá do número de células de Sertoli presentes em cada cisto.

Diferentemente, do que ocorre em mamíferos, cuja quantidade de células de Sertoli após a puberdade é fixa, em peixes sua proliferação é constante, inclusive em indivíduos sexualmente maduros (FRANÇA & RUSSELL, 1998; VILELA et al., 2003). Deste modo, esta relação, conhecida como capacidade de suporte das células de Sertoli é de suma importância para o desenvolvimento da espermatogênese, assim como para a melhor compreensão da função testicular em peixes (SCHULZ & NÓBREGA, 2011b).

Entretanto, estudos que exploraram o potencial desta relação são raros. De nosso conhecimento, a capacidade de suporte das células de Sertoli somente foi investigada para quatro espécies de peixe até o momento: Poecilia reticulata (BILLARD, 1969), Danio rerio

(LEAL et al., 2009), Oreochromis niloticus (VILELA et al., 2003) e Hoplias malabaricus

(BIZZOTTO & GODINHO, 2007), dentre as quais apenas a última tem origem brasileira.

Deste modo, objetivou-se com o presente trabalho descrever as características morfológicas e estereológicas da espermatogênese de Astyanax altiparanae, popularmente conhecido por “lambari-do-rabo-amarelo”, com ênfase para as linhagens espermatogoniais e capacidade de suporte das células de Sertoli.

Esta espécie é conhecida por suas boas características zootécnicas e reprodutivas que a habilitam como um excelente modelo experimental para a investigação da biologia dos teleósteos. Dentre elas, enfatiza-se sua precocidade reprodutiva (4 meses); alta prolificidade

(que inclui de três a quatro reproduções ao longo de um ano); prole numerosa; tamanho reduzido; resistência ao manejo; dentre outras, possibilitando aplicação de metodologias experimentais específicas, como técnicas de melhoramento genético, manipulação cromossômica, reversão sexual, transgênese e técnicas de transplante celular (CASTILHO-

ALMEIDA, 2007; YASUI et al., 2014).

MATERIAL E MÉTODOS

Os procedimentos experimentais foram realizados em estrita conformidade com os protocolos para cuidados e uso de animais de laboratório da Universidade Estadual Paulista

(UNESP-Ilha Solteira). O comitê de ética em pesquisa da UNESP aprovou os protocolos

(Permit Número: 006/2012 / CONCEA). Todos os procedimento cirúrgicos foram realizados após eutanásia dos indivíduos submetidos a anestesia com 0,5 g de benzocaína em 5,0 mL de etanol absoluto. Os exemplares foram identificados e um grupo de vouchers foi depositado na coleção de peixes do DZSJRP do Laboratório de Ictiologia, pertencente ao Departamento de

Zoologia e Botânica IBILCE / UNESP sob o número de registro DZSJRP008999.

Animais

Vinte e cinco espécimes machos sexualmente maduros de A. altiparanae, provenientes de tanques escavados da Estação de Hidrobiologia Engenheiro Souza Dias (CESP), foram selecionados para este estudo. Os animais apresentavam espículas na nadadeira anal e comprimento padrão variando entre 12 e 15 cm.

Amostragem e análise morfológica

Os testículos foram dissecados, cortados em secções transversais e longitudinais, fixados em solução de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em tampão fosfato de

Sorensen, pH 7,4, durante um período mínimo de 24 horas. Em seguida, as amostras foram desidratadas em concentrações crescentes de etanol e foram infiltrados com metacrilato de glicol (Technovit 7100 / historesina; HeraeusKulzer, Wehrheim, Alemanha). Finalmente, as amostras foram seccionadas a uma espessura de 3,0 μm e 2,0 m utilizando micrótomo

(LEICA RM 2145; Leica Instruments GmbH, Nussloch Heidelberg, Alemanha) equipado com lâmina de vidro e coradas com Hematoxilina/Eosina e Metanil-yellow/PAS/Hematoxilina de

Harrys. O foto-processamento e as análises histológicas foram concluídas com um microscópio óptico Zeiss equipado com câmera AxioCam-MRC5 (Carl Zeiss Microimaging

GmbH, Göttingen, Alemanha).

Análise estereológica

Os diâmetros dos núcleos celulares foram mensurados utilizando-se o programa

Motic Images Plus 2.0. Cem núcleos foram medidos para cada tipo de espermatogônia e espermatozoides, e 4500 núcleos para cada tipo de espermatócito e espermátide. O número mínimo de núcleos medidos para cada tipo celular foi relativo à frequência que eram observados no epitélio seminífero.

Para a contagem do número de células presentes nos cistos espermatogênicos de cada tipo celular, as amostras foram submetidas a aproximadamente 24 cortes seriados de 3,0 μm para espermatogônias e espermatócitos, e de 2,0 μm para as espermátides. A definição da espessura dos cortes teve por base a medida nuclear de cada tipo celular. Assim, como as maiores células entre espermatócitos e espermatogônias, em cisto, apresentaram tamanho nuclear médio de 5,33 m para os espermatócitos em paquíteno, os cortes de 3 m pegariam somente uma vez a região central do núcleo e com o objetivo de contar cada célula uma única vez, somente os núcleos evidentes eram contabilizados, ou seja quando a região central do núcleo estava na imagem. Deste modo, a região final do núcleo (núcleo pouco evidente) não era contada (Figura 1). O mesmo procedimento foi adotado para as espermátides.

Todo o material foi submetido as técnicas usuais para microscopia de luz. Os cistos analisados foram aqueles que continham espermatogônias A diferenciadas e B, espermatócitos primários (leptóteno/zigóteno e paquíteno) e espermátides iniciais, intermediárias e finais. Contou-se cinco cistos por animal, para cada um dos tipos celulares mencionados, totalizando, portanto, vinte e cinco cistos por animal para cada tipo celular

(NÓBREGA 2003). Os cistos selecionados foram aqueles que apresentaram uma clara delimitação pelas células de Sertoli. O número de células de Sertoli por cisto também foi contabilizado. As análises foram conduzidas em microscópio óptico com a utilização do programa Motic Images Plus 2.0.

As análises estatísticas foram conduzidas com ANOVA: um critério seguido pelo teste de

Tukey (P<0.05).

RESULTADOS

A análise espermatogênica de A. altiparanae possibilitou a identificação de quatro linhagens espermatogoniais, que passam por, no mínimo, nove divisões mitóticas antes de originar a linhagem espermatocitária (ESPG B; Tabela 1). Os espermatócitos, por sua vez, passam por duas divisões meióticas para formar as espermátides, que nesta espécie, se diferencia em três tipos. Ao final da espermatogênese, os cistos espermáticos continham em média 888 espermátides finais, o que representa uma perda de aproximadamente 43% das células germinativas esperadas ao final do processo. Nestes cistos, a capacidade de suporte das células de Sertoli atingiu cerca de 140 espermátides por célula (Tabela 1).

As características morfológicas das células espermatogênicas de A. altiparanae estão descritas a seguir:

Linhagens espermatogoniais ou fase mitótica

As linhagens espermatogoniais nesta espécie foram diferenciadas de acordo com o formato nuclear, condensação da cromatina, quantidade de nucléolos e tamanho da célula, e foram divididas em:

 Espermatogônias indiferenciadas tipo A (Aind.*)

Estas células estão isoladas e dispersas ao longo do epitélio germinativo dos testículos de A. altiparanae (Fig. 2). Possuem núcleo irregular, pouco basofílico e heterocromático, e mais de um nucléolo está evidente. Com diâmetro nuclear de aproximadamente 7,67 ± 0,63

m, estas são as maiores células da linhagem germinativa nesta espécie (Fig. 3A; Tabela 1).

 Espermatogônias indiferenciadas tipo A (Aind.)

Estas células também são observadas isoladamente e distribuídas ao longo do epitélio germinativo. Apresentam tamanho reduzido em relação as células anteriores (6,12 ± 1,16 m de diâmetro nuclear) além de um núcleo mais alongado e cromatina um pouco mais condensada. Seus nucléolos são pouco evidentes (Fig. 3B; Tabela 1).

 Espermatogônias diferenciadas tipo A (Adif.)

As espermatogônias diferenciadas tipo A estão agrupadas em cistos de duas ou quatro células, unidas por pontes citoplasmáticas. Seus núcleos são menores (diâmetro = 4,55 ± 2,16

m), mais arredondados/ovais, contendo cromatina mais condensada do que das células anteriores. Nestas células somente um nucléolo está evidente (Fig. 3C; Tabela 1).

 Espermatogônias tipo B

As espermatogônias do tipo B são a última geração de espermatogônias a sofrer divisões mitóticas. Antes da última divisão, os cistos de espermatogônia B têm em média 470 células germinativas e aproximadamente sete células de Sertoli envolvendo cada cisto. Os núcleos dessas células são mais arredondados e possuem tamanho similar ao das espermatogônias A diferenciadas 4,83 ± 0,54 m, apresentam material heterocromático mais evidente e nucléolos pouco evidentes em relação às células anteriores (Fig. 3D; Tabela 1).

Fase meiótica ou espermatocitária

Os espermatócitos nas diferentes fases da meiose foram distinguidos por suas características nucleares, tais como o tamanho, condensação e arranjo cromossômico:

 Espermatócitos leptóteno/zigóteno, paquíteno, diplóteno e espermatócitos secundários.

Espermatócitos leptóteno/zigóteno apresentam núcleo arredondado e a cromatina apresenta alguns pontos heterocromáticos subjacentes ao envoltório nuclear. Seu diâmetro é maior em relação as espermatogônias B (5,16 ± 0,84 m), mas o número de células por cisto reduz de aproximadamente 470 para 300 células de um estágio para o outro. Já o número de células de Sertoli por cisto aumenta para 9,25 ± 0,50 m (Fig. 4A; Tabela 1).

As células em paquíteno possuem núcleo com diâmetro similar ao das células anteriores (5,33 ± 0,43 m), sendo, porém, mais densos, e apresentando cromossomos mais condensados do que as mesmas. A disposição dos cromossomos para formação dos complexos sinaptonêmicos confere ao núcleo destas células a aparência de estrias. Neste estágio o número de células de Sertoli por cisto atinge seu maior valor, são quase dez células de Sertoli (9,71 ± 0,47 m) envolvendo cada cisto de espermatócito em paquíteno (Fig. 4B;

Tabela 1).

Os espermatócitos em diplóteno são encontrados em conjunto com células em metáfase I. Nesse estágio celular, os cromossomos alcançam o máximo da condensação nuclear durante a fase meiótica (Fig. 4C; Tabela 1).

Os espermatócitos secundários apresentam núcleo arredondado e cromatina densa

(Fig. 4D; Tabela 1).

Espermiogênese e formação de espermatozoides

Os três tipos de espermátides distinguidos durante a espermiogênese de A. altiparanae, foram diferenciadas em espermátides iniciais, intermediárias e finais, baseado no aumento da compactação nuclear e espaçamento entre as células no interior dos cistos. Apesar de diminuir em quantidade, a capacidade de suporte das células de Sertoli aumenta em quatro vezes em comparação à fase anterior (Tabela 1; Figura 6).

As espermátides iniciais são menores do que as células espermatogoniais e espermatocitárias e estão comprimidas dentro dos cistos. Seu núcleo é reduzido (2,54 ± 0,42

m) e mais condensado, quando comparado com as células de fases anteriores (Fig. 5A;

Tabela 1). Os cistos de espermátides apresentam o maior número de células dentre todos os cistos espermatogênicos (910,8 ± 20,47 m). Este número se mantém praticamente constante até o final da espermiogênese (Tabela 1).

Espermátides intermediárias são menores do que as anteriores (1,38 ± 0,53 m). Seus núcleos são mais compactos, arredondados e o volume citoplasmático é visivelmente menor

(Fig. 5B; Tabela 1).

As espermátides finais reduzem o diâmetro do núcleo, que estão totalmente condensados, em relação as espermátides intermediárias (1,38 ± 0,53 m). Além disso, há um aumento na distância entre as células no interior dos cistos (Fig. 5C; Tabela 1). Neste estágio as células de Sertoli atingem sua capacidade máxima de suporte na espermatogênese de A. altiparanae. Em média, cada célula de Sertoli suporta a diferenciação de 140,411 espermátides finais (Tabela 1).

Ao final da espermatogênese os espermatozoides são formados e liberados dos cistos.

Eles são as menores células da linhagem espermática (1,02 ± 0,16 µm), sendo encontradas apenas no lúmen tubular (Fig. 5D; Tabela 1).

DISCUSSÃO

Atualmente existem inúmeros estudos avaliando a espermatogênese em diversas espécies de peixes (SIQUEIRA-SILVA et al., 2013; CHAKRABARTI & BANERJEE, 2015).

Entretanto, a maioria deles aborda apenas os aspectos morfológicos deste processo, impossibilitando uma análise mais aprofundada dos mecanismos que regem seu desenvolvimento. O presente estudo é um dos raros trabalhos (apenas a quinta espécie estudada) a descrever de forma mais detalhada eventos como o número de divisões mitóticas espermatogoniais, permitindo inferir sobre o número de espermatozoides por cisto ao final da espermatogênese; a relação entre células germinativas e células de Sertoli, ou seja a capacidade que estas células têm em suportar as células germinativas em desenvolvimento; além dos mecanismos de morte celular programada, evidenciando em qual estágio as células germinativas sofrem maior redução. Assim, visto que A. altiparanae é uma espécie com alto potencial para a experimentação laboratorial e para a aquicultura de um modo geral, graças a suas características zootécnicas, anteriormente ressaltadas, este estudo fornece dados valiosos para futuros trabalhos experimentais e para a piscicultura.

Um exemplo disso é a definição das linhagens e gerações espermatogoniais, pois além de se auto-renovarem a cada ciclo reprodutivo, estas células desempenham outras funções primordiais durante a espermatogênese (MORENA et al., 1996, DE ROOIJ & RUSSELL,

2000; NÓBREGA et al, 2010; SCHULZ et al, 2010). As espermatogônias chamadas tronco por exemplo, podem transmitir caracteres herdados, possibilitando a criação de transgênicos por manipulação de seu genoma e posterior transplante em espécimes receptores. Além disso, estas células também podem ser utilizadas para a criação de bancos genéticos, visto que elas podem ser facilmente criopreservadas por longos períodos, e em seguida transplantadas, e devido a sua plasticidade genética, estas células podem diferenciar em espermatozoides ou

oócitos, dependendo do ambiente somático em que se desenvolvem (OKUTSU et al., 2006;

LEE et al., 2013).

Já a definição do número de gerações espermatogoniais pode ser utilizada para estimar a produção espermática, pois conhecendo-se o número de células a entrar em meiose, ou seja, após quantas divisões as espermatogônias se diferenciam em espermatócitos e sabendo que cada uma destas células teoricamente originará quatro novas células ao final da meiose é possível calcular a produção espermática esperada. Apesar da importância, as gerações espermatogoniais somente foram definidas para cinco espécies. Em D. rerio, por exemplo,

Leal et al. (2009) estimaram nove gerações de espermatogônias, sendo uma geração de espermatogônia indiferenciada tipo A, três gerações de espermatogônias do tipo A diferenciadas e cinco gerações de espermatogônias do tipo B. O mesmo número de gerações espermatogoniais foi observado em A. altiparanae, porém diferentemente de D. rerio observou-se seis gerações de espermatogônias B, somente duas de espermatogônias A diferenciadas e uma de espermatogônias A indiferenciada. Vilela et al. (2003) estimaram oito gerações espermatogoniais para a tilápia do Nilo Oreochromis niloticus e Bizzotto & Godinho

(2007), acreditam que a traíra Hoplias malabaricus apresente entre oito e dez gerações.

As células de Sertoli também têm papel fundamental para a espermatogênese nos peixes, pois além do suporte nutritivo e hormonal, seu número regula a quantidade de células germinativas durante o processo, limitando o tamanho testicular, bem como a produção espermática (SHARPE et al., 2003; PETERSEN, 2006). Como em O. niloticus (VILELA et al., 2003) o número de células de Sertoli por cisto em A. altiparanae aumentou gradualmente desde o momento em que envolvia uma única espermatogônia até o estágio de espermatócito em leptóteno/zigóteno, quando atingiu as maiores quantidades. Em Poecilia reticulata e D. rerio, o aumento continuou até o início da espermiogênese (BILLARD, 1969; LEAL et al.,

2009). Acreditamos que o motivo para o maior número de células de Sertoli serem

encontradas na fase meiótica se relaciona à complexidade deste evento, visto que durante os estágios meióticos as células passam por inúmeros processos, tais como a divisão nuclear, recombinação genética, além da morte celular programada, obrigando as células de Sertoli a absorverem os restos celulares resultantes dos processos apoptóticos (ALBERTS et al., 2010;

SCHULZ & NÓBREGA, 2011b).

Em conclusão, o presente estudo fornece ferramentas importantes para o melhor entendimento da espermatogênese em teleósteos. Além disso, visto que até o presente ainda não há uma espécie Neotropical padrão para os estudos biotecnológicos, a compreensão qualitativa e quantitativa dos eventos espermatogênicos desta espécie, a credenciam, como um importante modelo biológico para futuros estudos em abordagens tais como a esterilização gonadal em peixes, produção de transgênicos, o transplante de células germinativas, dentre outros, bem como tornou-se tão comum em zebrafish.

FIGURAS E TABELA

Figura 1– Diagrama exemplificando a análise estereológica das células germinativas e células de Sertoli por cisto. Cada quadrado numerado simboliza um corte seriado e as imagens ampliadas dos cortes 12, 13 e 14 representam o mesmo cisto em profundidades diferentes. As células germinativas somente eram contadas quando bem definidas.

Figura 2- Testículo de A. altiparanae. A: Distribuição das espermatogônias (setas) no epitélio germinativo (EG). Seta descontínua = interstício. Coloração: Metanil-yellow/PAS/Hematoxilina de Harrys. Escala: 20 μm.

Figura 3- Tipos espermatogoniais em A. altiparanae. A: Espermatogônias indiferenciadas Tipo A (Aind. *); B: Espermatogônias indiferenciadas Tipo A (Aind.); C: Espermatogônias diferenciadas Tipo A (Adif.); D: Cisto de espermatogônias Tipo B. CS: Célula de Sertoli. Coloração: A-C = Metanil-yellow/PAS/Hematoxilina de Harrys D = HE. Escala: 10 um.

Figura 4- Fase meiótica em A. altiparanae. A: L/Z = Cisto de espermatócitos leptóteno / zigóteno; B: P = Cisto de espermatócitos em paquíteno; C: Cisto de espermatócitos em diplóteno (D) e metáfases I (M); D: Cisto de espermatócitos secundários (Espc2). CS: Célula de Sertoli. Coloração: A, D = HE; B, C = Metanil- yellow/PAS/Hematoxilina de Harrys. Escala: 10 um.

Figure 5: Espermiogênese em A. altiparanae. A: E1 = cisto de espermátides iniciais; B: E2 = Cisto de espermátides intermediárias; C: E3 = cisto de espermátides finais; D: Detalhe de espermatozoides (Sz) no lúmen (Lu) dos túbulos seminíferos. CS: Célula de Sertoli. Coloração: A = Metanil-yellow/PAS/Hematoxilina de Harrys; B-D = HE. Escala: 10 um.

Tabela 1. Estereologia dos diferentes tipos de células germinativas em Astyanax altiparanae Células Células de Capacidade de Tipo de célula Diâmetro germinativas por Sertoli por suporte das germinativa nuclear ( m) cisto (n) cisto (n)  células de Sertoli ESPG Aind.* 1,0 ± 0a 1,41 ± 0.51 a 7,67 ± 0,63 a 0,709a ESPG Aind. 1,0 ± 0a 1,44 ± 0.49 a 6,12 ± 1,16b 0,694ª ESPG Adif. 2,4 ± 0,75 a 2,13 ± 0.40 a 4,55 ± 2,16c 0,939ab ESPG B 469,2 ± 9,92b [512] 7,31 ± 0.49 bc 4,83 ± 0,54c 64,186d ESPC L/Z 300,6 ± 6,97c [512] 9,25 ± 0.50 d 5,16 ± 0,84c 32,497bc ESPC P 298,4 ± 6,99c 9,71 ± 0.47 d 5,33 ± 0,43d 30,731cd E1 910,8 ± 20,47b[2048] 7,22 ± 0.55 c 2,54 ± 0,42e 126,149e E2 898,0 ± 12,78b[2048] 6,41 ± 0.50 b 1,38 ± 0,53f 140,094f E3 888,8 ± 18,98b[2048] 6,33 ± 0.49 b 1,31 ± 0,19g 140,411f SZ ------1,02 ± 0,16g ------ESPG Aind. * - espermatogônia A indiferenciada*; ESPG Aind. - espermatogônia A indiferenciada; ESPG Adif - espermatogônia A diferenciada; ESPG B - espermatogônia B; ESPC L/Z – espermatócitos em leptóteno/zigóteno; ESPC P – espermatócitos em paquíteno; E1 – espermátides iniciais; E2 – espermátides intermediárias; E3 – espermátides finais; SZ – espermatozoides. a-g Letras diferentes indicam que os valores médios diferem significantemente (p < 0,05).

Figura 6: Gráfico comparativo do número total de células germinativas e células de Sertoli por cisto. Aind. * - espermatogônia A indiferenciada*; Aind. - espermatogônia A indiferenciada; Adif - espermatogônia A diferenciada; B - espermatogônia B; L/Z – espermatócitos em leptóteno/zigóteno; P – espermatócitos em paquíteno; E1 – espermátides iniciais; E2 – espermátides intermediárias; E3 – espermátides finais.

REFERÊNCIAS

ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. 2010 Biologia Molecular da Célula. Ed. Artmed. 5ª ed. 928p. ISBN: 8536320664

ALEXANDRINO A.C.; PHAN M.T.; PINHEIRO E.F.G. 1985 Caracterização macroscópica e microscópica das gônadas do curimbatá, Prochilodus scrofa (Steindachner, 1881), durante o ciclo reprodutivo. Boletim de Zoologia, 9:159-75.

BILLARD, R. 1969 La spermatogenèse de Poecilia reticilata. IEstimation du nombre de génerations goniales et rendement de la spermatogenése. Ann. Biol. Bioch. Biophys. 9: 251–271.

BIZZOTTO, P.M.; GODINHO, H.P. 2007 Morphometric evaluation of the spermatogenesis in traira Hoplias malabaricus (Bloch) (Characiformes, Erythrinidae). Revista. Brasileira de Zoologia, 24(3): 541-4.

CHAKRABARTI, P., BANERJEE, A. S. 2015 Histological findings and seasonal distribution of different germ cells in the testicles of freshwater needle fish, Xenentodon cancila (Hamilton). International Journal of Fisheries and Aquatic Studies, 2(3): 74-80.

DE ROOIJ, D.G., RUSSELL, L. D. 2000 All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. Journal of Andrology, 21: 776–798.

FRANÇA, L.R.; RUSSELL, L.D. 1998 The testis of domestic animals. In: Male reproduction: a multidisciplary overview. pp. 198– 219. Edited by F. Martínez-García and J. Regadera, Churchill Communications, Madrid.

GRIER, H.J.; LINTON, J. R.; LEATHERLAND, J. F.; VLAMING, V. L. 1980 Structural evidence for two different testicular types in Teleost fishes. The American Journal of Anatomy, 331-345.

LEAL, M. C.; CARDOSO, E. R.; NOBREGA, R. H.; BATLOUNI, S. R.; BOGERD, J.;FRANÇA, L. R.; SCHULZ, R. W. 2009 Histological and stereological evaluation of zebrafish (Danio rerio) spermatogenesis with an emphasis on spermatogonial generations. Biology of Reproduction, 81:77- 187.

LEE S.; IWASAKI Y.; SHIKINA S.; & YOSHIZAKI G. 2013 Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 110(5), p. 1640-45.

MORENA, A.R.; BOITANI, C.; PESCE, M.; FELICI, M.; STEFANINI M. 1996 Isolation of Highly Purified Type A Spermatogonia From Prepubertal Rat Testis. Journal of Andrology, 17:708-717.

NOBREGA, R. H. 2003 Capacidade suporte das células de Sertoli e alterações do epitélio germinativo masculino e do tecido intersticial durante o ciclo reprodutivo de peixes neotropicais. Monografia. Universidade Estadual Paulista, Botucatu, Brasil.

NÓBREGA, R.H.; LO NOSTRO, F.L.; GRIER, HARRY J.; QUAGIO-GRASSIOTTO, I. 2006 Cellular proliferation in fish male germinal epithelium. In: International Symposium on Animal Biology of Reproduction - From sex differentiation to reproductive biotechnology. Animal Reproduction, 3:199.

NOBREGA, R. H.; BATLOUNI, S. R.; FRANÇA, L. R. 2009 An overview of functional and stereological evaluation of spermatogenesis and germ cell transplantation in fish. Fish Physiology Biochemistry 35: 197-206.

NÓBREGA, R.H.; GREEBE, C.; DE KANT, H.V.; BOGERD J.; FRANÇA, L.R.; SCHULZ,R.W. 2010 Spermatogonial Stem Cell Niche and Spermatogonial Stem Cell Transplantation in zebrafish. PlosOne, 5: e12808.

OKUTSU, T.; SUZUKI K.; TAKEUCHI, Y.; TAKEUCHI, T.; YOSHIZAKI, G. 2006 Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proceedings of National Academic Science USA, v.103, p. 2725–2729.

REIS, R. E.; KULLANDER, S. O.; FERRARIS, JR, C. J. 2003 Check list of the freshwater fishes of South and Central America. Porto Alegre: Ed. da PUCRS, 742p.

SCHULZ, R. W.; FRANÇA, L. R.; LAREYRE, J. J.; LEGAC, F. CHIARINI-GARCIA, H.; NOBREGA, R. H.; MIURA, T. 2010 Spermatogenesis in fish. General and Comparative Endocrinology, 165: 390-411.

SCHULZ, R. W. ; NÓBREGA, R. H. 2011 Regulation of Spermatogenesis. In: Anthony P. Farrell. (Org.). Encyclopedia of Fish Physiology - From Genome to Environment.

SHARPE R. M.; MCKINNELL C.; KIVLIN C.; FISHER J. S. Proliferation and functional maturation of Sertoli cells, and their relevance to disorders of testis function in adulthood 2003. Reproduction. 125: 769–784.

SIQUEIRA-SILVA, D. H.; DA SILVA COSTA, R.; NINHAUS-SILVEIRA, A.; VICENTINI, C. A.; VERÍSSIMO-SILVEIRA, R. 2012 Ultrastructural analysis of spermiogenesis in the neotropical cichlid Kullander & Ferreira, 2006 (Perciformes: Cichlidae). Journal of Applied Ichthyology, 28: 878-882.

SIQUEIRA-SILVA, D. H. D.; VICENTINI, C. A.; NINHAUS-SILVEIRA, A.; VERISSIMO- SILVEIRA, R. 2013 Reproductive cycle of the Neotropical cichlid yellow peacock bass Cichla kelberi: A novel pattern of testicular development. Neotropical Ichthyology, 11: 587-596.

PETERSEN C.W. 2006 Sexual selection and reproductive success in hermaphroditic seabasses. Jounal of Integrative and Comparative Biology. 46:439-448.

VAZZOLER, A. E A. M. Biologia da reprodução de peixes teleósteos: teoria e prática. 1996. Eduem. Maringá, 169p.

VILELA, D. A. R.; SILVA, S. G. B.; PEIXOTO, M. T. D.; GODINHO, H.P.; FRANÇA, L. R. 2003 Spermatogenesis in teleost: insights from the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) model. Fish Physiology and Biochemistry, 28:187-190.

YASUI, G.S.; SANTOS, M. P.; NAKAGHI, L. S. O.; SENHORINI, J. A.; ARIAS-RODRIGUEZ, L.;

FUJIMOTO, T.; SHIMODA, E.; SILVA, L. A. 2014 Improvement of gamete quality and its short- term storage: an approach for biotechnology in laboratory fish. Animal (Cambridge. Print), v.9(3), p.

1-7.

CAPÍTULO 2

Submetido ao periódico: Theriogenology

Fonte: http://www.turmadobigua.com.br

The effects of temperature and busulfan (Myleran) on yellowtail tetra Astyanax altiparanae (Pisces, Characiformes) spermatogenesis

Diógenes Henrique de Siqueira-Silvaa,b, Amanda Pereira dos Santos Silvaa, Alexandre

Ninhaus-Silveiraa,b, Rosicleire Veríssimo-Silveiraa

aUNESP –Univ. Estadual Paulista, Campus de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e

Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical, São Paulo, Brazil bUNESP –Univ. Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto, Programa de Pós-

Graduação em Biologia Animal, São Paulo, Brazil

Abstract

We aimed to standardize a protocol to suppress spermatogenesis in the characiform fish

Astyanax altiparanae, for future use as a host in germ cell transplant research, opening opportunities for a range of studies, such as spermatogenesis analyses and transgenesis, since this species presents livestock characteristics to be used as a biological model. The effects of the chemotherapeutic busulfan (formulated as Myleran), which is used as medicine, therefore not as toxic to humans manipulation as analytical grade busulfan

(Fluka) used in previous studies, was evaluated at physiological temperature of 28°C, ideal for growth and reproduction of A. altiparanae, and also at increased temperature

35°C. The temperature groups were divided into three treatment groups: busulfan,

DMSO only, and an untreated control. Macroscopic, histological, stereological, and ultrastructure analysis showed that, at 28°C, busulfan did not cause depletion of germ cells in A. altiparanae. However, at 35°C, sterilization was observed three weeks after the initial application. Similar results were obtained with maintenance of fish at 35°C for a longer period with no accompanying Myleran treatment. The results show sterilization in A. altiparanae can be achieved both by Myleran injection along with warm temperature or just by incubation of the individuals at 35°C. This procedure allows reduction in stress and lower mortality resulting from manipulation during busulfan injection and is also suitable for mass treatment, since large numbers of fish can be incubated in warm water.

Keywords: biotechnology; fish sterilization; germ cell transplantation; gonadal morphology; spermatogenesis suppression; yellowtail tetra.

1. Introduction

Germ cell transplantation is an interesting novel reproductive technology applied to fish [1]. The method is based on spermatogonia or primordial germ cell (PGC) transplantation from a donor specimen into a host, from the same or different species, whose gonads can sustain their development. The main objective of such technique is the production of offspring with genotypic characteristics of the donor species. The most common method of transplantation is insertion of germ cells directly into the intraperitoneal cavity of newly hatched larvae [2-11]. However, the efficiency of this procedure is limited by the time required for the host species to reach reproductive maturity and produce gametes with donor genetic characteristics. In addition, it is impractical for practical aquaculture because it involves micromanipulation procedures that are expensive and time consuming.

Lacerda et al. [12] developed a process to transplant spermatogonia stem cells directly into the testes of sexually mature specimens, which promptly matured the transplanted cells and produces spermatozoa. In contrast to the earlier technique, the success of such method depends on the availability of a host lacking endogenous spermatogenesis, since the donor cells require adequate condition to colonize and develop without competition with host germ cells. Thus, as spermatogenesis in a sexually mature individual is active, the elimination of endogenous germ cells in host species before cellular transplantation is required. This has been accomplished through the use of the alkylating agent butane-1,4-diyl dimethanesulfonate (busulfan) in conjunction with specific water temperatures [1,13-15]. Busulfan is widely employed in the treatment of human chronic myelocytic or granulocytic leukemia [16] and was chosen because of its cytotoxic effects in tissue with a high proliferative index, such as the germinal epithelium, in which germ cells exhibit constant division. Furthermore,

Vilela et al. [17] have demonstrated that increased temperature accelerates spermatogenesis in teleosts, which could increase the effects of busulfan on germ cells, since it alkylates the dividing cells.

In spite of the promising combination of busulfan and temperature to suppress teleost spermatogenesis, a protocol for total and definitive gonad sterilization in this group of species has not been established. This can be attributed to the lack of knowledge of the optimal busulfan concentration and number of doses as well as the ideal temperature, since these factors seem to be species-specific [1, 13-15]. Billard [18] failed in an attempt for sterilization of rainbow trout Oncorhynchus mykiss, while other researchers have achieved partial success using various combinations of these treatments but obtained only transient depletion of endogenous germ cells in the tested species [1, 12-15, 19, 20].

The goal of the present study was the development of a protocol for suppression of endogenous spermatogenesis in the characid species the yellowtail tetra Astyanax altiparanae using the cytostatic agent busulfan in combination with elevated water temperature. The choice of species was motivated by its characteristics, such as ease of handling, small size, early sexual maturity at 4 months of age, and intertidal spawning

[21]. Moreover, it is the most appropriate model for the development of methodologies involving other Neotropical fish, such as cell transplantation, transgenesis, chromosome manipulation, etc.

2. Materials and Methods

2.1 Animals and rearing protocols

Sexually mature male A. altiparanae presenting hooks in anal fin with standard size ranging from 9 to 15 cm were stocked in three plastic 200 L aquariums at density of

3.78 g fish/m3 and a constant photoperiod (12L:12D). Firstly, fish were acclimated for two weeks at 28°C, which is ideal for growth and reproduction in this species.

The experiment consisted of two trials, E1 at water temperature of 28°C and E2 at temperature of 35°C. For E2 the water temperature was elevated 1°C day until reaching the experimental temperature.

Both groups of fish were fed a commercial pellet twice a day and condition was monitored every 3 hr. Experimental procedures were carried out in strict accordance with the guide for care and use of laboratory animals of the University Estadual Paulista

(UNESP). The research ethics committee of UNESP approved the protocols (Permit

Number: 006/2012/CONCEA). All surgical procedures were performed under anesthesia with 0.1 g/mL of benzocaine in absolute ethanol, and fish were euthanized just after present totally miss of reaction to the stimulus. All efforts were made to minimize suffering.

2.2 Experimental procedures

One-hundred-thirty-nine specimens of A. altiparanae were used in E1 [44

(busulfan), 55 (DMSO), and 45 (control)] and 82 for E2 [35 (busulfan), 38 (DMSO), and 19 (control)], respectively. Number of fish by treatment fluctuated, because some individuals died during acclimation period. Each temperature group was further divided into 3 treatments: 1) Busulfan: A. altiparanae individuals received intraperitoneal injections of busulfan twice at an interval of 14 days. Each fish was injected with 0.3 mL solution prepared from a Myleran (GlaxoSmithKline) pill, diluted in 0.15 mL dimethyl sulfoxide (DMSO; carrier solvent) and 0.15 mL distilled water. Myleran was dissolved according to fish averaged weight; 18 mg/kg and 15 mg/kg fish first and second doses, respectively [1]; 2) Solvent Control: DMSO diluted in distilled water 1:1

was injected following the same protocol as for busulfan treatment. 3) Control: Fish were kept at a constant water temperature, with no additional treatment.

2.3 Sampling and analyses

Prior to treatment, testes of five specimens from E1 and three from E2 were examined to verify spermatogenic status and for comparison with individuals sampled post-treatment [Baseline Group (BG)].

From the 21st of treatment (7 days after the second injection), fish were sampled weekly. In E1, five fish per treatment were collected through week 5 after the initial injection, and, in E2, three individuals per treatment were collected through week 7.

Specimens were anesthetized in order to obtain total length, standard length; body weight (Wb, g); and gonad weight (Wg, g). Gonadosomatic index was calculated with the formula: GSI = (Wg/Wb)*100.

For light microscopy, testes were removed, cut into transverse and longitudinal sections and fixed in 4% paraformaldehyde and 2% glutaraldehyde in Sorensen phosphate buffer (0.1 M pH 7.4) for at least 24 hr. Samples were dehydrated in alcohol solution in increasing concentrations, embedded in glycol-methacrylate historesin

(Technovit 7100), sectioned at 3.0 µm on a microtome equipped with a glass blade

(LEICA RM 2245), and stained with hematoxylin and eosin. All material was examined microscopically (ZEISS – Scope.A1; Germany), photographed using both, the camera

AxioCam MRc 5 and software AxioVision rel. 4.8 (Germany).

Samples for scanning electron microscopy (SEM) were fixed with 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M phosphate buffer for 48 hr at 4°C, post-fixed for 2 hr at 4°C in

4% osmium tetroxide, and dehydrated through an acetone series. They were subsequently dehydrated in a critical point dryer Pelco CPD 2 (Ted Pella, Redding,

CA). Samples were coated with gold under vacuum with a SEM Coating Unit E5100

(Polaron Equipment, Watford, Hertfordshire, UK) and evaluated for morphological parameters using a JSM 6300 scanning electron microscope (JEOL, Akishima, Tokyo,

Japan) at the Biology Centre, Academy of Sciences Laboratory of Electron Microscopy,

Ceské Budejovice, Czech Republic.

Stereological analyses used a 588 intersection grid (Motic Image Plus 2.0.) on a section from the mid testis region. Each grid was considered a field, and 10 fields (5880 points) were randomly selected and examined under 400x magnification, for each fish.

Spermatogonia, spermatocytes, spermatid, spermatozoa, interstitial tissue, sertoli cells

(when alone), pyknotic nuclei, and lumen without cells were counted.

Statistical analyses were performed with one-way ANOVA followed by Tukey test

(P<0.05).

3. Results

3.1. Macroscopic analysis of testis and gonadosomatic index

There was no significant difference in GSI values among the treatments in E1, or in the same treatment over the course of the trial. Several individuals of the E1 busulfan and DMSO treatments showed changes in gonad size (Fig. 1).

Many E2 fish showed markedly reduced testis size (Fig. 2), reflected in the decreased GSI in the three treatments (Fig. 3). On week 5, busulfan and DMSO groups showed the GSI significantly lower than controls (Fig. 3b). On week 6, the GSI of the control group was lower than previous weeks (Fig. 3b).

3.2. Histology, ultrastructure, and stereological analyses of testis

3.2.1. E1

On week 3, only two individuals of busulfan-treated group showed a degree of spermatogenesis suppression. One presented sparse spermatogenic cysts and occasional spermatogonia throughout the epithelium, and spermatozoon in the lumen. On the second, seminiferous epithelium was devoid of germ cells and lumen occupied a large area of the testis (Fig. 4, week 3). Among specimens sampled week 4, one from the busulfan treatment and one from the control showed signs of germ cell depletion (Figs.

4, week 4). On week 5, no depletion sign was observed in the sampled fish from the control, DMSO or busulfan treatments (Fig. 4).

3.2.2. E2

On week 3, all individuals treated with busulfan showed degree of gonadal depletion, with significant reduction in numbers of spermatogonia, spermatocytes, and spermatids compared to the BG and in numbers of spermatogonia and spermatocytes of controls, despite an increase in testicular lumen area (Fig. 8). Animals treated with

DMSO presented similar characteristics; however many spermatogenic cysts were observed in the germinal epithelium. Control animals showed normal spermatogenesis

(Figs. 5, 6 and 8). On week 4, control animals also showed signs of gonad depletion.

The testicular area occupied by lumen was significantly greater than in BG fish (Figs. 5 and 8). The DMSO and busulfan groups showed dramatic reduction in germ cell numbers and spermatozoa in the tubular compartment, despite an increase of lumen area to >80% of the total testicular area (Figs 5 and 8). On week 5, with the exception of a single fish from the DMSO treatment, all gonads showed depletion, although the testes of fish treated with busulfan showed a reduction of the lumen area and an increase in

area occupied by interstitium and single Sertoli cells. In the control, the testes showed a significantly higher percent of luminal area than in BG, DMSO and busulfan groups, in spite of a decrease in germ cell numbers in comparison to control fish sampled in previous weeks (Fig. 5). The three E2 treatment groups kept gonadal suppression over weeks 6 and 7. However, fish treated with busulfan, collected in week 7 exhibited significantly greater numbers of spermatogonia than found in the control, DMSO or BG

(Fig. 8).

4. Discussion

Efficacy of germ cell depletion in fish using the chemotherapy agent busulfan combined with warm water temperature has been demonstrated in other species, such as Oreochromis niloticus, Odontesthes hatcheri, Danio rerio [1,12,13,15,20]; however, this is the first study to demonstrate its effects in a characiform species. In contrast to previous studies, which used analytical grade busulfan (Fluka), which, according to the manufacturer, is extremely toxic to humans and may be lethal, whereas the form used in the present study, Myleran, is reported to be safe to humans according to

GlaxoSmithKline. The present study also showed, for the first time, that only high temperature can be effective as a sterilization procedure in a sexually mature freshwater fish. This was previously shown only for fish incubated at high temperatures from the larval phase or as juveniles [22-24].

High temperature appears to have an effect on germ cell depletion in fish [1, 12, 13,

15, 19, 20], since Billard [18], similar to 28°C experiment in this study, did not obtain germ cell depletion when using busulfan in rainbow trout, and stated that busulfan did not show promise as antifertility agent in adult fish. However, information on the morphological and physiological effects of temperature on teleost testes remains

scarce. De Alvarenga and De França [25], studying Nile tilapia Oreochromis niloticus, obtained results contrasting with this study and most published data, as, in tilapia, lower temperatures led to increased apoptosis in testicular germ cells.

Further studies on the effects of temperature on fish gonads are necessary, since the observed alterations in A. altiparanae testis demonstrate potential harmful effects of high temperatures. Similar to findings of Billard [18] in rainbow trout treated with busulfan at optimal growth temperature, the GSI of A. altiparanae at 28°C did not show significant alteration. Similar to findings in Patagonian pejerrey Odonthestes hatcheri

[13], fish in the present study showed a significant reduction in GSI when submitted to high temperatures.

In contrast to previous works in teleosts, effects of busulfan on rodent testis were seen at ambient temperatures [26-28]. Wardhaugh [29] found that Myleran resulted in lethal mutations in stem cells, which were transferred to offspring. Further studies involving this drug must be conducted in teleosts, since the appropriate dose could extend the duration of sterility in individuals or negate the necessity of elevated temperature [15].

The present study provided important tools for germ cell transplantation procedure using A. altiparanae as host, since this species can be prepared to receive donor cells following busulfan (Myleran) administration along with 35°C temperature or possibly by maintenance at this temperature alone. Similar to other studies [1, 12,13,15, 18,

19,20], some mortality was registered for all treatments during the experiment, most of them seemed to be related to fights among the specimens, since this species show a territorials behavior.

The chemotherapy agent busulfan at 35°C water temperature may be considered an effective sterilization agent in A. altiparanae. For suppression of adult A. altiparanae

spermatogenesis, maintaining water temperature at 35°C alone is efective, and, although its action requires a longer time, results in lower stress to fish. This procedure can be employed in mass sterilization, since large numbers of fish can be incubated in warm water.

Figures

Figure 1. Photographs of Astyanax altiparanae testes at varying times post-treatment. Experiment 1 (28°C) a) 3 weeks; b) 4 weeks; c) 5 weeks .Scale bar = 1 cm

Figure 2. Photographs of Astyanax altiparanae testes at varying times post-treatment. Experiment 2 (35°C). a) 3 weeks; b) 4 weeks; c) 5 weeks; d) 6 weeks; e) 7 weeks. Scale bar = 1 cm

Figure 3. Treatment effects of busulfan, DMSO and untreated controls on gonadosomatic index of Astyanax altiparanae. (a) at 28°C and (b) at 35°C. Different uppercase letters indicate within-treatment differences over the course of the experiment; Values followed by different lowercase letter do not differ in the same week among the treatments (P<0.05). Arrow = transplantation week.

Figure 4. Histological sections of A. altiparanae testis after treatment with busulfan and DMSO alone, and of untreated controls at 28°C. On 3 and 4 weeks of busulfan treatment, the sections are of individuals showing signs of spermatogenesis suppression. I = interstitium; L = testicular lumen; Sg = spermatogonia; Spc = spermatocyte; Sz = spermatozoa; Arrow = Sertoli cell alone.

Figure 5. Histological sections of A. altiparanae testis after treatment with busulfan and DMSO alone, and of untreated controls at 35°C. I = interstitium; L = testicular lumen; Spc = spermatocyte; arrow = pyknotic cells.

Figure 6. Scanning electron micrographs of A. altiparanae testis after treatment at 35°C. Images are of testes in week 3 post- treatment.

Figure 7. Stereological analysis of A. altiparanae testis at 28°C. Spermatogenesis was not altered among trials and along the treatment week. No statistical difference was observed among the treatments on the same week (p>0,05).

Figure 8. Stereological analysis of A. altiparanae testis at 35°C. Different asterisks show significant differences of the number of cells between Control and Busulfan treatment on the same week (p>0,05). Arrow = transplantation week; Dashed arrow shows spermatogonia recovery after busulfan treatment;

References

[1] Lacerda SMSN, Batlouni SR, Costa GM, Segatelli TM, Quirino BR, et al. A new and fast

technique to generate offspring after germ cells transplantation in adult fish: the Nile tilapia

(Oreochromis niloticus) model. Plos One 2010;5: e10740.

[2] Takeuchi Y, Yoshizaki G, Takeuchi T. Generation of live fry from intraperitoneally transplanted

primordial germ cells in rainbow trout. Biol Reprod 2003;69:1142-9.

[3] Okutsu T, Suzuki K, Takeuchi Y, Takeuchi T, Yoshizaki G. Testicular germ cells can colonize

sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. P Natl Acad Sci Usa

2006a;103:2725-9.

[4] Okutsu T, Shikina S, Kanno M, Takeuchi Y, Yoshizaki G. Production of trout offspring from

triploid salmon parents. Science 2007;317:1517.

[5] Takeuchi Y, Higuchi K, Yatabe T, Miwa M, Yoshizaki G. Development of spermatogonial cell

transplantation in Nibe croaker, Nibea mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae. Biol Reprod

2009;81:1055-63.

[6] Yazawa R, Takeuchi Y, Higuchi K, Yatabe T, Kabeya N, et al. Chub mackerel gonads support

colonization, survival, and proliferation of intraperitoneally transplanted xenogenic germ cells. Biol

Reprod 2010;82:896-904.

[7] Higuchi K, Takeuchi Y, Miwa M, Yamamoto Y, Tsunemoto K, et al. Colonization, proliferation,

and survival of intraperitoneally transplanted yellowtail Seriola quinqueradiata spermatogonia in

nibe croaker Nibea mitsukurii recipient. Fisheries Sci 2011;77:69-77.

[8] Yoshizaki G, Fujinuma K, Iwasaki Y, Okutsu T, Shikina S, et al. Spermatogonial transplantation

in fish: a novel method for the preservation of genetic resources. Comp Biochem Phys D 2011;6:55-

61.

[9] Morita T, Kumakura N, Morishima K, Mitsuboshi T, Ishida M, et al. Production of donor-

derived offspring by allogeneic transplantation of spermatogonia in the yellowtail (Seriola

quinqueradiata). Biol Reprod 2012;86:176.

[10] Pacchiarini T, Sarasquete C, Cabrita E. Development of interspecies testicular germ-cell transplantation in flatfish. Reprod Fert Develop 2013;26:690-702.

[11] Farlora R, Hattori-Ihara S, Takeuchi Y, Hayashi M, Octavera A, et al. Intraperitoneal Germ

Cell Transplantation in the Nile Intraperitoneal Germ Cell Transplantation in the Nile Tilapia

Oreochromis niloticus. Mar Biotechnol 2014;16:309-20.

[12] Lacerda SMSN, Batlouni SR, Silva SBG, Homem CSP, França LR. erm cells transplantation in fish: the Nile-tilapia model. Anim Reprod 2006;3:146-59.

[13] Majhi SK, Hattori RS, Yokota M, Watanabe S, Strüssmann CA. Germ cell transplantation using sexually competent fish: an approach for rapid propagation of endangered and valuable germlines.

PLoS ONE 2009a;4:e6132.

[14] Majhi SK, Hattori RS, Rahman SM, Strüssmann CA. Surrogate production of eggs and sperm by intrapapillary transplantation of germ cells in cytoablated adult fish. PLoS ONE 2014;9:e95294.

[15] Nóbrega RH, Greebe CD, Van de Kant H, Bogerd J, De França LR, et al. Spermatogonial stem cell niche and spermatogonial stem cell transplantation in zebrafish PLoS One 2010;5:e12808.

[16] Bishop JB, Wassom JS.Toxicological review of busulfan (Myleran). Mutat Res-Rev

Genet 1986;168:15-45.

[17] Vilela DAR, Silva SGB, Peixoto MTD, Godinho HP, França LR. Spermatogenesis in teleost: insights from the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) model. Fish Physiol Biochem 2013;28:187-90.

[18] Billard R. Attempts to inhibit testicular growth in rainbow trout with antiandrogens

(cyproterone, cyproterone acetate, oxymetholone) and busulfan given during the period of spermatogenesis. Gen Comp Endocr 1982;48:33-8.

[19] Lacerda SMSN, Batlouni SR, Assis LH, Resende FM, Campos-Silva SM, et al. Germ cell transplantation in tilapia (Oreochromis niloticus). Cybium 2008;32:115-18.

[20] Majhi SK, Hattori RS, Rahman SM, Suzuki T, Strüssmann CA. Experimentally induced depletion of germ cells in sub-adult Patagonian pejerrey Odontesthes hatcheri. Theriogenology

2009;71:1162-72.

[21] Orsi ML, Carvalho ED, Foresti F. Biologia populacional de Astyanax altiparanae Garutti &

Britski (Teleostei, Characidae) do médio rio Paranapanema, Paraná, Brasil. Rev Bras Zool 2004; 21:

207-18.

[22] Strüssmann CA, Saito T, Takashima F. Heat-induced Germ Cell Deficiency in the Teleosts

Odontesthes bonariensis and Patagonina hatcheri. Comp Biochem Phys A 1998;119:637-44.

[23] Ito LS, Yamashita M, Strüssmann CA. Histological process and dynamics of germ cell degeneration in pejerrey Odontesthes bonariensis larvae and juveniles during exposure to warm water. J Exp Zool 2003;297:169-79.

[24] Ito LS, Takahashi C, Yamashita M, Strüssmann CA. Warm water induces apoptosis, gonadal degeneration, and germ cell loss in subadult pejerrey Odontesthes bonariensis (Pisces,

Atheriniformes). Physiol Biochem Zool 2008;81:762-74.

[25] De Alvarenga ÉR, De França LR. Effects of different temperatures on testis structure and function, with emphasis on somatic cells, in sexually mature Nile tilapias (Oreochromis niloticus). Biol Reprod 2009;80:537-44.

[26] Jiang FX. Behaviour of spermatogonia following recovery from busulfan treatment in the rat. Anat Embryol 1998;198:53-61.

[27] Moisan AE, Foster RA, Betteridge KJ, Hahnel AC. Dose-response of RAG2-/-/gammac-/-mice to busulfan in preparation for spermatogonial transplantation. Reproduction 2003;126:205-16.

[28] Anjamrooz SH, Movahedin M, Mowla SJ, Pour SB. Assessment of morphological and functional changes in the mouse testis and epididymal sperms following busulfan treatment. Iran

Biomed J 2007;11:15-22.

[29] Wardhaugh AA. Dominant lethal mutations in Tilapia mossambica (Peters) elicited by myleran. Mut Res-Genet Tox 1981;88:191-6.

CAPÍTULO 3

Manuscrito aceito para publicação no periódico Neotropical Ichthyology

Fonte:http://www.turmadobigua.com.br

Morphology of the urogenital papilla and its component ducts in the freshwater tetra Astyanax altiparanae (Characiformes: Characidae).

Diógenes Henrique de Siqueira-Silva1, Amanda Pereira dos Santos Silva2, Alexandre Ninhaus-Silveira2, Rosicleire Veríssimo-Silveira2*

1UNESP – Univ. Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto, Programa de

Pós-Graduação em Biologia Animal. Rua Cristóvão Colombo, N° 2265, Jardim

Nazareth, Zip code: 15054-000 - São José do Rio Preto, São Paulo, Brazil. E-mail: [email protected]

2UNESP – Univ. Estadual Paulista, Campus de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical, Av: Brasil, Centro, N°

56. Ilha Solteira, Zip code: 15385000, São Paulo, Brazil. E-mail: [email protected], [email protected] and [email protected]

Abstract

The histological description of the urogenital papilla is an important tool to comprehension of the reproductive mechanisms in fish, as well as a pre-requisite to germ cell transplantation in adult fish, besides to be a good biological indicator to environmental changes. Here, it was performed the histological description of the urogenital papilla and its component ducts in the tetra Astyanax altiparanae. The genital and urinary ducts pass separately throughout most part of its extension, joining in a single duct before opening. In males this opening is asymmetric and seems to have double origin, being completely surrounded by striated muscle fibers, while in females it is symmetric and the muscle fibers does not surround it totally. Spermatic duct and oviduct undergo changes throughout their extension, mainly in the morphology of the surrounding epithelium. In the spermatic duct, squamous epithelial cells change to columnar and cuboid with possible secretory activity, close to testes. In the oviduct, anteriorly epithelial cells are also squamous, however, close to ovary there are lamellae composed by a pseudostratified epithelium with columnar and cuboid cells. The urinary duct is highly similar for both sexes presenting globoid cells, which description is known in mammals, however, rare in fish.

Key words: fish reproduction; histological analysis; oviduct; sperm duct; urinary duct.

Resumo

A descrição histológica da papila urogenital é uma importante ferramenta para a compreensão dos mecanismos reprodutivos em peixes, assim como um pré-requisito para a realização do transplante de células germinativas em peixes adultos, além de um bom indicador biológico de possíveis alterações ambientais. Neste estudo, foi realizada a investigação histológica da papila urogenital e seus ductos constituintes no lambari

Astyanax altiparanae. Em A. altiparnae os ductos genital e urinário ocorrem separadamente ao longo de maior parte de sua extensão, entretanto, unem-se em um ducto simples antes de abrir para o meio externo. Nos machos esta abertura é assimétrica e parece ter dupla origem, sendo completamente envolvida por fibras musculares estriadas, enquanto nas fêmeas ela é simétrica e as fibras musculares não a envolve totalmente. O ducto espermático e oviduto sofrem alterações ao longo de sua extensão, principalmente na morfologia do epitélio que os envolve. No ducto espermático as células epiteliais passam de pavimentosas a colunares e cuboides, com possível atividade secretora, à medida que se aproxima dos testículos. No oviduto, anteriormente as células também são epiteliais pavimentosas, entretanto, próximo aos ovários, formam-se lamelas compostas por um epitélio pseudoestratificado composto por células cuboides e colunares. O ducto urinário é bastante similar em ambos os sexos apresentando células globosas, cuja descrição é conhecida em mamíferos, porém rara em peixes.

Palavras chave: reprodução em peixes; análises histológicas; oviduto; ducto espermático; ducto urinário.

Introduction

The fish adaptability in distinct aquatic habitats reflects the numerous reproductive strategies adopted by these animals (Vazzoler, 1996). As result fish show considerable anatomical, morphological and physiological differences in their reproductive systems, both in the gonads and in the genital ducts (Lopes et al., 2004; Batlouni et al., 2006;

Muñoz et al., 2011). Therefore, examining the reproductive aspects of fish including sexual dimorphism, fecundity, gonadal morphology and gametogenesis, is important for understanding how the species have maximised their reproductive success in particular environments (Grier & Taylor, 1998; Brown‐Peterson et al., 2002; Cassel et al., 2013;

Siqueira-Silva et al., 2013; Wildner et al., 2013).

However, apart from general knowledge about the fish reproductive system, little is known about the morphology of their genital ducts, particularly the histological details of the urogenital papilla of freshwater fish. Most studies only describe its macroscopic morphology and anatomical position for use identifying the sex of individuals, in fish farming and for toxicological and ecological studies (Ferreira et al.,

2010; Kruger et al., 2013). Moreover, most past histological studies were focused on marine fish species (Ross, 1984; Hastings & Petersen, 1986; Kott et al., 1988; Rasotto

& Shapiro, 1998; Suzuki & Shibata, 2004; Kobayashi et al., 2012).

Furthermore, histological descriptions of the urogenital papilla in freshwater fish could be valuable for biotechnological studies, such as germ cell transplantation in adult fish, whose researchers can use the studied specie as host such as Lacerda et al. (2010), that injected spermatogonial stem cell though Oreochomis niloticus urogenital papilla, after the description of this organ; it description can be also useful in systematic reviews, as an additional feature to be considered, as well as was already used by some

authors (Kott et al., 1988; Hoshino et al., 2004); and in toxicological studies, since this organ can be very sensitive to environmental changes. (Rodrigues et al., 2006)

Thus, the Characidae species Astyanax altiparanae, a typical fish from the upper

Paraná River Basin, Brazil (Garutti & Britski, 2000), seems to be a great candidate for this kind of morphological description, since it shows a great potential to be used as a host species in germ cell transplantation studies owing its reduced size, early maturation, prolificacy and management resistance (Orsi et al., 2004).

Moreover, this species belongs to the Astyanax genus assigned as Incertae sedis, being a frequent target of systematic studies (Orsi et al., 2004; Reis et al., 2003; Kantek et al., 2009; Martinez et al., 2012).Thus, one more described structure could be valuable in attempt to solve this philogenetically question, and since A. altiparanae shows a great phenotypic plasticity, it could be useful as bio-indicator as some studies have already shown this organ can suffer changes under certain environmental conditions (Kirby et al., 2003; Larsen et al., 2009).

The present study aimed to provide a histological description of the urogenital papilla, the components ducts and the surrounding musculature in A. altiparanae.

Material and Methods

Animals

Ten sexually mature male and 10 sexually mature female of A. altiparanae of standard size ranging from 12 to 15 cm were used in this study. As already mentioned, the choice of species was motivated by characteristics such as ease of handling, small size, sexual maturity at 4 months of age, and ability to reproduction 3 to 4 times in a year, that are considered appropriate for the development of distinct studies in laboratory conditions. Experimental procedures were carried out in strict accordance

with the guide for care and use of laboratory animals of the University Estadual Paulista

(UNESP). The research ethics committee of UNESP approved the protocols (Permit

Number: 006/2012/CONCEA). All surgical procedures were performed under anesthesia with 0.5 g of benzocaine in 5 ml of absolute ethanol, and all efforts were made to minimize suffering.Fish were identified and a group of voucher individuals was deposited in the collection of fishes of DZSJRP Laboratório de Ictiologia Departamento de Zoologia e Botânica IBILCE/UNESP under the register number DZSJRP008999.

Sampling and analyses

The posterior part of the specimens’ abdomen that contained the urogenital papilla and the distal portion of the gonads, gut and urinary duct were dissected. These samples were fixed in 4% paraformaldehyde with 2% glutaraldehyde solution in

Sorensen phosphate buffer, pH 7.4, for a minimum period of 24 hours. Then, the samples were dehydrated in ethanolic solutions at increasing concentrations and were impregnated in glycol methacrylate (Technovit 7100/historesin; Heraeus Kulzer,

Wehrheim, Germany). Finally, the samples were sectioned to a thickness of 3.0 μm using a microtome (LEICA RM 2145; Leica Instruments GmbH, Heidelberg Nussloch,

Germany) equipped with a glass blade and stained with Haematoxylin and Eosin,

Toluidine Blueand Metanil-Yellow/PAS/Harrys Haematoxylin. The photo-processing and analyses were completed with a Zeiss optical microscope equipped with an

AXIOCAM-MRc5 camera (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Göttingen, Germany).

Results

General macroscopic organization of A. altiparanae urogenital papilla were identical between the sexes (data not shown).Microscopy similarities between males

and females, such as the single and folded opening and the skin that was comprised by a squamous stratified epithelial tissue covering the urogenital papilla in both sexes were also observed (Figs. 1a; 2b).

However, there were significant differences in the morphology of this organ between males and females, mainly in the epithelium that borders the terminal portion of the urogenital opening (Figs. 1a; 3a; 4). In males, this epithelium was formed from the union of the epithelia stemming from both the genital and urinary ducts (Figs. 1a, c;

4b). The epithelium region formed from the genital duct was simple and composed by squamous cells (Fig. 1c; 4b), while the epithelium region formed from the urinary duct epithelium showed columnar and cuboid cells, many of which containing clusters of neutral polysaccharides in their cytoplasm beyond one brush border in their top (Fig. 2a;

4b). Mucus-producing cells were dispersed throughout the epithelium (Figs. 2a). In females, the epithelium bordering the urogenital duct opening has similar characteristics to the epithelium coming from the urinary duct described in males (Fig. 4c).

In males, the urogenital ducts were completely surrounded by a loose connective tissue containing numerous striated muscle fibers and blood vessels (Figs 1a, 2b). In females, this tissue did not involve totally the urogenital papilla, since there were no muscle fibers in the region between the anal and urogenital openings (Fig. 3a).

Posteriorly, the urogenital duct splits between the genital (positioned posterior to the rectum) and the urinary duct (caudally positioned in relation to the genital duct)

(Figs. 1b-e; 3a-c; 4f). In males, the genital duct (sperm duct) maintained a single, squamous epithelium until the efferent ducts, which also had a single epithelium but with cuboid and columnar secretory cells with possible apocrine activity (Figs.2c-d).

Seminal fluid was also present in this region (Figs. 2c-d; 4b). In females, a single, squamous epithelium was also observed at the beginning of the genital duct (oviduct)

(Fig. 3b; 4c). However, close to the ovaries, the epithelium of the oviduct became pseudostratified with cuboid and columnar cells, forming lamellae from the tissue septa projected in the direction of the lumen (Fig.3d; 4c). In the oviduct lumen no fluid was observed (Figs.3a-d).

The urinary duct in both sexes had portions with both, single and stratified epithelia contained squamous, cuboid and columnar cells, many of which presented clusters of neutral polysaccharides in their cytoplasm beyond a brush border in their top

(Figs. 3e-f ). Furthermore, globoid cells, some of them binucleate, were observed among the epithelial cells (Fig. 3f). Smooth muscle fibers surrounded this epithelium

(Fig. 3e).

Discussion

Unlike some fish species (e.g., Kirby et al., 2003; Rodrigues et al., 2006; Larsen et al., 2009; Dumont et al., 2011; Kornis et al., 2012), the sex of A. altiparanae cannot be identified by macroscopic examination of the urogenital papilla. However, histological analyses showed significant differences in this organ between the sexes, most likely correlated to reproductive events. These differences were only observed between the genital ducts and in the epithelium that encloses the common urogenital opening. In males, this epithelium has a double origin.

The structure of the urogenital opening is variable among teleost species and it can be different between two species from the same order, as in Cypriniformes whose the common carp Cyprinius carpio (L. 1753), as in A. altiparanae, has a single opening, while the goldfish Carassius auratus (L. 1758) has ducts opening separately on the papillary surface (Uematsu & Hibiya, 1983). Furthermore, the structure can be different between the sexes of species from the same genus, as in the inseminating genus

Astroblepus in which the females show separate openings while males have only one opening (Spadella et al., 2012).

Similarities in this structure can be found among evolutionarily distinct groups, such as the Neoteleostei bluehead wrasse Thalassoma bifasciatum (Bloch, 1791)

(Labriniformes) and the Euteleostei chum salmon Onchorhynkus keta (Walbaum, 1792)

(Salmoniforms), whose divergence time was more than 290 million years ago and both of them show the genital and urinary ducts opening independently on the papillary surface (Uematsu & Hibiya, 1983; Ross, 1984; Hastings & Petersen, 1986; Rasotto &

Shapiro, 1998; Ortí & Li, 2009; Kobayashi et al., 2012).

The arrangement of the muscle tissue fibers in A. altiparanae, may be involved in controlling gamete release during the reproductive act, working as a sphincter

(Uematsu & Hibiya, 1983; Hastings & Petersen, 1986; Muñoz et al., 2002). This mechanism may be a strategy to ensure a more efficient fertilization, since only the males have the muscle fibers running circularly around the entire urogenital papilla, making them able to control the timing of sperm release. Other sphincter-like musculature structure was described in T. bifasciatum. This ligament muscle, as the authors named it, was hypothesized to prevent water reflux into the genital and urinary ducts during the swimming movement (Rasotto & Shapiro, 1998).

Another important difference observed between A. altiparanae males and females is in the genital ducts and it can be assigned to the functional and physiological necessities of sexes. For example, the lamellae formation by the oviduct epithelium may be related to oocyte transportation to the urogenital opening (Kobayashi et al.,

2012). This mechanism would be similar to the peristaltic movements of the uterine tube in mammals. et al., 2012; Spadella et al., 2012), and according to Lahnsteiner et al. (1998), feeds the spermatozoa and keeps them motionless.

The epithelium that covers the urinary duct of the urogenital papilla, in tetra and in the marine species T. bifasciatum has a similarstructure (Rasotto & Shapiro, 1998).

Besides this, the urinary system of mammals also presents some similarities, since like in the tetra A. altiparanae it also has cells with voluminous cytoplasm, known as globoid cells, showing that this system has probably been preserved among the vertebrates (Carneiro & Junqueira, 2011).

Figures

Figure 1. Histological characteristics of the urogenital opening in male A. altiparanae. a) Urogenital opening (uo); b) Sperm duct (sd) and urinary duct (ud) split; c-e) Sequence showing the urogenital duct splitting in the sperm duct (sd) and urinary duct (ud). Abbreviations and symbols: ao = anal opening; ge = squamous genital epithelium formed from the genital tunic; sm = striated skeletal muscle surrounding the urogenital opening; ue = urogenital epithelium formed from the urinary duct; arrowhead = epithelial separation forming the sperm and urinary duct. Label: (a) = Toluidine Blue; (b-e) = Haematoxylin/Eosin. Minimum reduction: 11 x 6 cm.

Figure 2. Histological characteristics of the genital duct in male A. altiparanae. a) Urogenital opening (uo) highlighting the clusters of neutral polysaccharides (white arrow), the mucous-producing cells and the brush border (thin arrow); b) detail of the striated muscle (sm) that surround the urogenital opening and the stratified skin (ept) that involve the urogenital papilla; c) sperm duct (sd) highlighting the pavimentous epithelial cells (pec) and seminal fluid labelled in orange; d) efferent duct (ed) with secretory cells with possible apocrine activity (as). Abbreviations and symbols: bv = blood vessel; ept = squamous stratified epithelium; ud = urinary duct. Label: a, c-d = Metanil-Yellow/PAS/Harris Haematoxylin; b = Toluidine Blue. Minimum reduction: 12 x 8 cm.

Figure 3. Histological characteristics of the urogenital papilla in female and urinary duct in A. altiparanae. a) General view of the urogenital opening (uo) and its position in relation to the anal opening (ao). See the absence of muscle fibers (sm) between these two openings (sma); b) The beginning of the urogenital duct separation in genital (go) and urinary ducts (uro); c) The beginning of lamellae formation in the oviduct (od); d) Oviduct lamellae (L) Insert = highlight of the epithelial cells that composes the oviduct lamellae ; e) Urinary duct highlighting the globoid cells (cg), mucus-producing cells (thin arrow) and smooth muscle fibers (asterisk) surrounding it; f) In detail, a binucleated globoid cell (bcg). Abbreviations and symbols: sm = striated skeletal muscle fibers; Label: a- c, e-f = Toluidine Blue; d = Metanil-Yellow/PAS/Harris Haematoxylin. Minimum reduction: 12 x 13.5 cm.

Figure 4. Scheme of the urogenital papilla in A. altiparanae. a) Position of the urogenital papilla in relation to fish body. 1 = urogenital opening; 2 = split of the urogenital duct in genital and urinary duct; 3 = genital duct; 4 = urinary duct. Fish image adapted from: causoeacasodepescador.blogspot.com.br b) Structure of the urogenital papilla and its components ducts in males; c) Structure of the urogenital papilla and its components ducts in females. Abbreviations and symbols: as = cells with possible apocrine activity; bv = blood vessels; ed = efferent ducts; L = oviduct lamellae; ode = epithelial cells of the oviduct lamellae; sd = spermatic duct; ud = urinary duct; large arrow = striated skeletal muscle fibers. Minimum reduction: 12 x 8 cm.

Literature Cited

Batlouni, S. R., E. Romagosa & M. I. Borella. 2006. The reproductive Cycle of male catfish Pseudoplatystoma fasciatum (Teleostei: Pimelodidae) revealed by changes of the germinal epithelium an approach addressed to aquaculture. Animal Reproduction

Science, 96:116-132.

Brown-Peterson, N. J., H. J. Grier & R. M. Overstreet. 2002. Annual changes in germinal epithelium determines male reproductive classes of the cobia. Journal of Fish

Biology, 60: 178-202.

Carneiro, J. & Junqueira, L. C. U. 2011. Histologia Básica: Texto/Atlas. Editora

Guanabara Koogan S/A, pp. 542. ISBN: 9788527714020

Cassel, M., M. Mehanna, L. Mateus & A. Ferreira. 2013. Gametogenesis and reproductive cycle of Melanorivulus aff. punctatus (Boulenger,

1895)(Cyprinodontiformes, Rivulidae) in Chapada dos Guimarães, Mato Grosso,

Brazil. Neotropical Ichthyology, 11(1): 179-192.

Dumont, P., J. D’Amours, S. Thibodeau, N. Dubuc, R. Verdon, S. Garceau & R. Fortin.

2011. Effects of the development of a newly created spawning ground in the Des

Prairies River (Quebec, Canada) on the reproductive success of lake sturgeon

(Acipenser fulvescens). Journal of Applied Ichthyology, 27(2): 394-404.

Ferreira, F., M. M. Santos, M. A. Reis-Henriques, N. M. Vieira & N. M. Monteiro.

2010. Sexing blennies using genital papilla morphology or ano-genital distance. Journal of Fish Biology, 77: 1432–1438.

Grier, H.J. & R.G. Taylor. 1998. Testicular maturation and regression in the common p

Hastings, P. A. & C. W. Petersen. 1986. A novel sexual pattern in serranid fishes: simultaneous hermaphrodites and secondary males in Serranus fasciatus. Environmental Biology of Fishes, 15(1): 59-68.

Hoshino, K., K. Amaoka & T. A. Munroe. 2004. New records of sexual dimorphisms among the Pleuronectiformes exhibited by differences in urogenital papilla structure of

Citharichthys platophrys (Paralichthyidae: Pleuronectiformes). Ichthyologycal

Research, 51: 81–83.

Kantek, D. L. Z., M. R. Vicari, W. A. M. Peres, M. M. Cestari, R. F. Artoni, L. A. C.

Bertollo & O. Moreira‐Filho. 2009. Chromosomal location and distribution of As51 satellite DNA in five species of the genus Astyanax (Teleostei, Characidae, Incertae sedis). Journal of Fish Biology, 75(2): 408-421.

Kirby, M. F., J. Bignell, E. Brown, J. A. Craft, I. Davies, R. A. Dyer, S. W. Feist, G.

Jones, P. Matthiessen, C. Megginson, F. E. Robertson & C. Robinson. 2003. The presence of morphologically intermediate papilla syndrome in United Kingdom populations of sand goby (Pomatoschistus spp.): Endocrine disruption? Environmental

Toxicology and Chemistry, 22: 239-251.

Kobayashi, Y., T. Usami, T. Sunobe, H. Manabe, Y. Nagahama and M. Nakamura.

2012. Histological Observation of the Urogenital Papillae in the Bi-Directional Sex-

Changing Gobiid Fish, Trimma okinawae. Zoological Science, 29: 121-126.

Kornis, M. S., N. Mercado‐Silva & M. J. Vander Zanden. 2012. Twenty years of invasion: a review of round goby Neogobius melanostomus biology, spread and ecological implications. Journal of Fish Biology, 80(2): 235-285.

Kott, E., C. B. Renaud & V. D. Vladykov. 1988. The urogenital papilla in the Holarctic lamprey (Petromyzontidae). Environmental Biology of Fishes, 23: 37-43.

Kruger, T., I. Barnhoorn, J. J. V. Vuren & R. Bornman. 2013. The use of the urogenital papillae of male feral African sharptooth catfish (Clarias gariepinus) as indicator of exposure to estrogenic chemicals in two polluted dams in an urban nature reserve,

Gauteng, South Africa. Ecotoxicology and Environmental Safety, 87: 98-107.

Lacerda, S. M., S. R. Batlouni, G. M.,Costa, T. M. Segatelli, B. R. Quirino, B. M.

Queiroz & L. R. França. 2010. A new and fast technique to generate offspring after germ cells transplantation in adult fish: the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) model. Plos one, 5(5): e10740.

Lahnsteiner, F., B. Berger, T. Weismann & R. A. Patzner. 1998. Determination of semen quality of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture, 163(1): 163-181.

Larsen, G. M. K. Bilberg & E. Baatrup. 2009. Reversibility of estrogenic sex changes in zebrafish (Danio rerio). Enviromental toxicology and Chemistry, 28(8): 1783-1785.

Lopes, D. C. J., N., Bazzoli, M. F. G. Brito, & T. A. Maria. 2004. Male reproductive system in the South American catfish Conorhynchus conirostris. Journal of Fish

Biology, 64: 1419-1424.

Martinez, E. R., A. L. Alves, S. M. Silveira, F. Foresti & Oliveira, C. 2012. Cytogenetic analysis in the incertae sedis species Astyanax altiparanae Garutti and Britzki, 2000 and

Hyphessobrycon eques Steindachner, 1882 (Characiformes, Characidae) from the upper

Paraná River basin. Comparative cytogenetics, 6(1): 41.

Muñoz, M., Y. Koya & M. Casadevall. 2002. Histochemical Analysis of Sperm Storage in Helicolenus dactylopterus dactylopterus (Teleostei: Scorpaenidae). Journal of

Experimental Zoology, 292: 156-164.

Muñoz, M. E., S. R. Batlouni, I. B Franceschini-Vicentini & C. A.Vicentini. 2011.

Testicular structure and description of the seminal pathway in Leporinus macrocephalus

(Anostomidae, Teleostei). Micron. 42: 892-897.

Nóbrega, R. H., C. D. Greebe, H. van de Kant, J. Bogerd, L. R. de França & R. W.

Schulz. 2010. Spermatogonial stem cell niche and spermatogonial stem cell transplantation in zebrafish. PLoS One, 5(9): e12808.

Orsi, M. L., E. D. Carvalho & F. Foresti. 2004. Biologia populacional de Astyanax altiparanae Garutti & Britski (Teleostei, Characidae) do médio rio Paranapanema,

Paraná, Brasil. Revista Brasileira de Zoologia, 21(2): 207-218.

Ortí, G. & C. Li. 2009. Phylogeny and Classification. Pp. 1-24. In Jamieson, B.G.M.

(Ed.). Reproductive Biology and Phylogeny of Fishes (Agnathans and Bony Fishes),

Vol. 8A St. Lucia, Queensland: Science Publishers.

Pinna, M. C., & A. L. Kirovsky 2011. A new species of sand-dwelling catfish, with a phylogenetic diagnosis of Pygidianops Myers (Siluriformes: Trichomycteridae:

Glanapteryginae). Neotropical Ichthyology, 9(3): 493-504.

Rasotto, M. B. & D. Y. Shapiro. 1998. Morphology of gonoducts and male genital papilla, in the bluehead wrasse: implications and correlates on the control of gamete release. Journal of Fish Biology, 52: 716-725.

Rodrigues, P., M. A. Reis-Henriques, J. Campos & M. M. Santos. 2006. Urogenital papilla feminization in male Pomatoschistus minutus from two estuaries in northwestern

Iberian Peninsula. Marine Environmental Research, 62: S258-S262.

Ross, R. M. 1984. Anatomical changes associated with sex reversal in the fish

Thalassoma duperrey (Teleostei: Labridae). Copeia, 1984(1): 245-248.

Setiamarga, D. H., Miya, M., Yamanoue, Y., Azuma, Y., Inoue, J. G., Ishiguro, N. B. and Nishida, M. 2009. Divergence time of the two regional medaka populations in Japan as a new time scale for comparative genomics of vertebrates. Biology letters 5(6): 812-

816.

Siqueira-Silva, D. H. D., C. A. Vicentini, A. Ninhaus-Silveira & Verissimo-Silveira, R.

2013. Reproductive cycle of the Neotropical cichlid yellow peacock bass Cichla kelberi:

A novel pattern of testicular development. Neotropical Ichthyology, 11(3): 587-596.

Spadella, M. A., C. Oliveira, H. Ortega, I. Quagio – Grassiotto & J. R. Burns. 2012.

Male and female reproductive morphology in the inseminating genus Astroblepus

(Ostariophysi: Siluriformes: Astroblepidae). Zoologischer Anzeiger, 251: 38-48.

Suzuki, A. N. & Shibata. 2004. Developmental process of genital ducts in the medaka,

Oryzias latipes. Zoological Science, 21(4): 397-406.

Uematsu, K. & T. Hibiya. 1983. Sphincter-like Musculature Surrounding the Urino- genital Duct of Some Teleosts. Japanese Journal of Ichthyology, 30: 72-76.

Vazzoler, A. E. A M. 1996. Biologia da reprodução de peixes teleósteos: teoria e pratica.

Maringa: EDUEM; São Paulo: SBI. 169p.

Wildner, D. D., H. Grier & I. Quagio-Grassiotto. 2013. Female germ cell renewal during the annual reproductive cycle in Ostariophysians fish. Theriogenology, 79(4): 709-724.

CAPÍTULO 4

Será submetido ao periódico: PLOS ONE

http://www.hodelua.com.br/site/piracanjuba

Isolamento e transplante de espermatogônias de Brycon orbignyanus em Astyanax altiparanae (Characiformes: Characidae).

Diógenes Henrique de Siqueira-Silva1,2, Amanda Pereira dos Santos Silva1, José Augusto Senhorini3, Alexandre Ninhaus-Silveira1,2, Rosicleire Veríssimo-Silveira1

1 UNESP –Univ. Estadual Paulista, Campus de Ilha Solteira, Departamento de Biologia e Zootecnia, L.I.NEO - Laboratório de Ictiologia Neotropical, São Paulo, Brasil.

2 UNESP –Univ. Estadual Paulista, Campus de São José do Rio Preto, Programa de

Pós- Graduação em Biologia Animal, São Paulo, Brasil.

3Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio); IBAMA;

Pirassununga -SP – Brasil.

Resumo

Este estudo objetivou o desenvolvimento do transplante espermatogonial entre os Characiformes Brycon orbignyanus (espécie doadora) e Astyanax altiparanae

(espécie receptora), visando sua simplificação para ser utilizado por produtores aquícolas. Os testículos de B. orbignyanus foram enzimaticamente digeridos e as espermatogônias purificadas por meio de um gradiente descontínuo de densidade. As células espermatogoniais de B. orbignyanus foram marcadas com PKH26 e transplantadas via papila urogenital nos testículos de A. altiparanae. A espermatogênese endógena da espécie receptora foi previamente suprimida com o agente quimioterápico busulfan ou por incubação dos mesmos em alta temperatura (35°C). Vinte e duas horas pós-transplante espermatogônias foram observadas no lúmen tubular. Uma semana depois elas já proliferavam no epitélio e três semanas pós-transplante foi possível observar espermatozoides no lúmen dos túbulos seminíferos. Aproximadamente 67% dos indivíduos tratados com busulfan e 85% dos espécimes incubados a 35°C, apresentaram ao menos uma célula marcada no epitélio germinativo dos receptores.

Este estudo padronizou, por meio de um método simples e acessível ao produtor, o primeiro transplante interespecífico de espermatogônias entre espécies da ordem

Characiformes.

Palavras chave: digestão testicular; transplante celular; piracanjuba; proliferação espermatogonial.

Abstract

This study aimed to develop a protocol for spermatogonial transplantation between Characiforms Brycon orbignyanus (donor species) and Astyanax altiparanae

(host species), in order to simplify transplantation for practical aquaculture. B. orbignyanus testes were enzymatically digested and spermatogonia purified by a discontinuous density gradient. Spermatogonial cells from B. orbignyanus were labeled with PKH26 and transplanted via urogenital papilla into A. altiparanae testes. Host species had endogenous spermatogenesis previously suppressed using the chemotherapy agent busulfan or by their incubation in high temperature (35°C). Twenty-two hours post-transplantation spermatogonia were observed into the tubular lumen. One week later, they were proliferating in the epithelium and three weeks post-transplantation, it was observed sperm in the lumen. Nearly 67% of the individuals treated with busulfan and 85% of the specimens, showed at least one labeled cell into germinal epithelium from hosts. This study standardized, by a simple and very accessible method to farmers, the first interspecific transplantation between species from Characiformes order.

Key words: cellular transplantation; piracanjuba; spermatogonial proliferation; testicular digestion.

Introdução

A piracanjuba Brycon orbignyanus é um peixe de piracema (reofílico) com alto valor para a piscicultura nacional, devido à qualidade de sua carne e comportamento agressivo na pesca esportiva. Entretanto seus estoques naturais, distribuídos pelos rios

Paraná, Uruguai, Paraguai, na Bolívia e Bacia Amazônica, vêm sofrendo forte declínio, devido à fatores diversos, tais como a poluição ambiental (VAZ et al., 2000; BORBA,

2003; GANECO, 2003). Por este motivo, desde 1996 B. orbignyanus encontra-se na lista do Conselho Estadual de Política Ambiental (COPAM) de espécies ameaçadas de extinção e de acordo com o “Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de

Extinção” a espécie está criticamente ameaçada, com alto risco de extinção na natureza no futuro próximo (ROSA & LIMA, 2008).

O transplante de células germinativas, que tem por premissa a produção de quimeras, cujo objetivo principal é a reprodução de uma espécie, a partir da transferência de suas células germinativas primordiais (PGCs) ou de espermatogônias/oogônias nos estágios iniciais do desenvolvimento para um receptor adequado, é uma ferramenta importante na tentativa de reduzir a ameaça de extinção nesta e em outras espécies de peixes.

Desde o início de seu desenvolvimento em peixes (NAGLER et al., 2001), esta abordagem experimental vem sofrendo alterações para sua adequação ao objetivo, material disponível e a espécie utilizada em cada estudo. Deste modo, são encontrados desde estudos mais sofisticados que envolvem o isolamento e transplante de uma única

PGC via cavidade celomática de larvas recém-eclodidas (SAITO et al., 2008), ao transplante de espermatogônias iniciais via papila urogenital (LACERDA et al., 2010), que requer menos tecnologia e habilidade para o desenvolvimento.

Neste estudo estão descritas técnicas práticas para o isolamento, marcação e transplante de espermatogônias de piracanjuba no lambari do rabo amarelo Astyanax altiparanae (Fig. 1). Além de pertencer à mesma família da piracanjuba, as características zootécnicas de A. altiparanae, lhe credenciam como um bom receptor para o transplante espermatogonial entre caracídeos.

Esta é a primeira vez que o transplante de células germinativas é conduzido na família Characidae e, além disso, de nosso conhecimento, este é o único trabalho em que as gônadas da espécie receptora foram incluídas por protocolos rotineiros de inclusão em paraplast, pois usualmente a eficiência do transplante é averiguada por meio do congelamento e secção da gônada recipiente com o auxílio de um criostato. O presente trabalho foi desenvolvido utilizando-se material alternativo e de fácil alcance, tornando a técnica de transplante de células germinativas mais acessível ao produtor.

Material e Métodos

Os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com o guia para cuidados e uso de animais em laboratório da UNIVERSIDADE ESTADUAL

PAULISTA (UNESP-Ilha Solteira). O comitê de ética em pesquisa da UNESP aprovou o protocolo 006/2012/CONCEA.

Animais

As piracanjubas foram mantidas em tanques escavados no ICMBIO (Instituto

Chico Mendes e Conservação da Fauna Silvestre). Dezoito exemplares machos, com peso médio de 489,0g (variando entre 189,6g e 729,2g) e comprimento padrão entre

20,5 e 35 cm foram utilizados para os experimentos de isolamento e transplante celular.

Dissociação enzimática das gônadas

O experimento foi dividido em três ensaios, seguindo os protocolos definidos por Lacerda (2006), Majhi et al. (2009) e Lacerda et al. (2010) para definir o melhor método para a digestão enzimática dos testículos de B. orbignyanus. Com o objetivo de avaliar a idade ideal para o isolamento de espermatogônias dos testículos desta espécie, utilizamos piracanjubas consideradas imaturas com um ano de idade e sexualmente maduras com três e cinco anos de idade. Três espécimes de cada idade foram utilizados.

Todos os ensaios foram conduzidos em temperatura ambiente.

Purificação celular (enriquecimento espermatogonial)

Para a purificação celular, seguimos o protocolo utilizado para o enriquecimento espermatogonial em tilápia nilótica Oreochromis niloticus (LACERDA, 2006). Assim, a solução de Percoll (Sigma-Aldrich) foi diluída em gradientes de densidade de 10%,

25%, 30% e 40%, que foram acondicionados em tubo Falcon de 15ml de forma contínua, do maior (40%) para o menor (10%) gradiente. A solução celular obtida a partir da digestão enzimática testicular foi adicionada em seguida. O tubo contendo os diferentes gradientes de Percoll mais a suspensão celular foi centrifugado por 30 minutos a 800 G. Ao término da centrifugação as bandas celulares visíveis foram coletadas para avaliação da viabilidade e do tipo celular presente em cada uma delas.

Avaliação celular

Após a separação, as células foram submetidas ao teste de viabilidade com o corante vital Azul de Trypan (Sigma-Aldrich), pois ele penetra em células inviáveis, cujas membranas foram danificadas, marcando-as em azul (Inset Fig. 4). Para isto 0,5

L de solução celular de cada banda foi misturada a este corante em uma câmera

hematimétrica de Neubauer e a verificação foi realizada através de microscópio

Olympus CX41.

Em seguida, as bandas foram coletadas individualmente em microtubos de 2,0 mL para a análise citológica de seu conteúdo. A solução celular de cada banda foi fixada em paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em tampão de fosfato de

Sorensen (0,1 M, pH 7,4) por pelo menos 24 horas. As amostras foram desidratadas em soluções de concentrações crescentes de etanol. Antes de serem embebidas em metacrilato de glicol-historesina (Technovit 7100), as bandas foram centrifugadas para a formação de um pellet celular, garantindo a concentração de todo o conteúdo celular em uma única região dos microtubos. Após a solidificação, a resina contendo o pellet celular, foi removida dos tubos e seccionada a 3,0 m em micrótomo equipado com lâmina de vidro (LEICA RM 2245), e coradas com Azul de Toluidina. Todo material foi examinado em microscópio ZEISS – Scope.A1e fotografado com AxioCam MRc 5.

Transplante das células germinativas espermatogoniais

Após a definição do melhor protocolo para digestão e separação celular e quais bandas continham o maior número de espermatogônias viáveis, procedemos com o protocolo para marcação das células a serem transplantadas, utilizando o marcador

PKH26 (Red Fluorescente Cell Linker, Sigma-Aldrich), capaz de marcar a membrana celular por até alguns meses. Todo o protocolo para a marcação celular seguiu orientações do fabricante. À solução celular contendo as células já marcadas, adicionamos uma solução de 1:1 de azul de trypan e solução salina de Hank´s (Sigma-

Aldrich), visando a visualização do conteúdo celular no momento da injeção. Deste modo, esta solução foi aspirada com a utilização de uma ponteira acoplada a uma seringa de insulina (Fig. 2a).

100

Para a melhor visualização da papila urogenital, o transplante celular foi realizado com o auxílio de um estereoscópio microscópio (MOTIC SMZ-168). Antes de receberem a injeção contendo as células doadoras, cada receptor foi induzido à anestesia utilizando-se 100 mg de benzocaína por litro de água, pois nessa concentração a benzocaína induz esta espécie a uma anestesia profunda em aproximadamente 20 segundos. Este estado dura em torno de 30 segundos e resulta em baixa mortalidade

(GIMBO et al., 2008). Após a anestesia, cada receptor, cuja espermatogênese endógena havia sido previamente suprimida com a utilização do busulfan associado a temperatura de 35° (52 animais), ou somente com a utilização da temperatura (26 animais), conforme descrito no capítulo 2, recebeu em média 0,70 mL da solução celular, contendo cerca de 1,4 x 105 células espermatogoniais, via papila urogenital (Fig. 2b-c).

Após o transplante os indivíduos foram devolvidos aos tanques. A diferença do número de indivíduos transplantados entre os tratamentos se deveu a uma mortandade acidental dias antes do procedimento.

Coletas e análises

A primeira coleta foi realizada 22 horas pós-transplante, sendo coletados seis animais do tanque cuja supressão da espermatogênese endógena foi realizada pela associação busulfan + temperatura e três animais suprimidos apenas pela temperatura da

água (35°C). Posteriormente 10 peixes do tanque 1 e 5 peixes do tanque 2 foram semanalmente amostrados até 3 semanas pós-transplante.

Os exemplares transplantados tiveram seus testículos removidos, cortados em secções transversais e longitudinais e fixadas em paraformaldeído (Sigma-Aldrich) a

10% em tampão de fosfato de Sorensen (0,1 M, pH 7,4) por pelo menos 24 horas. As amostras foram desidratadas em solução com concentrações crescentes de etanol,

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embebidos em paraplast (Sigma-Aldrich), seccionados em 7,0 m num micrótomo equipado com lâmina aço (LEICA RM 2145). Todo o material foi examinado em microscópio de fluorescência (Olympus BX51) e fotografado com câmera Olympus

DP7Z.

Resultados

Dissociação enzimática gonadal e purificação celular

A maior eficiência para digestão enzimática dos testículos de piracanjuba foi alcançada com o protocolo desenvolvido por Lacerda (2006) e os animais com 3 anos de idade apresentaram o maior número de espermatogônias após os procedimentos de separação celular.

Quando os testículos destes animais foram utilizados para a separação celular, três diferentes bandas, mais um pellet, foram visualizadas entre as interfaces dos gradientes de Percoll (Fig. 3). As análises destas bandas mostraram que a primeira banda continha apenas restos celulares (Fig. 4). A segunda banda foi onde se concentrou o maior número de espermatogônias, mais de 90% delas viáveis (Fig. 4). Na terceira banda havia poucas espermatogônias em meio a espermátides e espermatozoides, e o pellet continha restos teciduais não digeridos, células sanguíneas e somáticas (Fig. 4).

Deste modo, as bandas 2 e 3 foram selecionadas para o transplante. A contagem das espermatogônias presentes nestas bandas somaram mais de um milhão (106), sendo que cada peixe recebeu aproximadamente 140000 células doadoras.

Transplante

Após a marcação, o pool de espermatogônias (bandas 2 e 3) extraídas dos testículos de B. orbignyanus (Fig. 5), foram injetadas via papila urogenital nos testículos

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dos lambaris receptores (Figs. 1; 2b-c; 6). O transplante espermatogonial foi avaliado como eficiente, quando células marcadas eram encontradas no epitélio dos receptores.

Deste modo, a eficiência do transplante foi de 66,67% nos animais cuja espermatogênese endógena foi suprimida com a utilização do busulfan associado a temperatura de 35°, e de 84,6% nos animais que foram apenas incubados nesta temperatura (Tabela 1).

Vinte e duas horas pós-transplante, espermatogônias foram encontradas no lúmen do compartimento seminífero (Fig. 7a-d). Na semana seguinte ao transplante, espermatogônias marcadas foram encontradas colonizando o epitélio (Fig. 7e-f), e proliferando para a formação de cistos com aproximadamente 4 células (Fig. 7g-h).

Duas semanas pós-transplante foram observados cistos com várias células germinativas marcadas (Fig. 7i). Na terceira semana, em meio aos espermatozoides endógenos, havia espermatozoides positivamente marcados para PKH26. (Fig. 7j-k).

Discussão

Apesar de sua eficiência, as técnicas comumente utilizadas para o transplante de células germinativas em peixes, somente podem ser conduzidas em grandes centros de pesquisa, pois sua realização depende de equipamentos sofisticados e caros, além de grande habilidade humana. Por isso, o transplante celular via papila urogenital em espécimes sexualmente maduros é visto como uma técnica mais acessível. Neste estudo, provamos que esta técnica pode ser aplicada por produtores que tenham mínima habilidade no manejo com peixes e mínima estrutura, utilizando material de baixo custo. Além disso, é o primeiro trabalho a demonstrar a eficácia do transplante de células germinativas em espécies da ordem Characiformes, que tem grande importância para a aquicultura mundial.

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O sucesso do transplante celular está diretamente relacionado à eficiência com que cada passo é realizado durante o processo. Deste modo, inúmeros protocolos são utilizados para isolar, purificar e marcar as células que serão transplantadas e a escolha do mais adequado para cada estudo está atrelada a espécie utilizada, objetivos específicos e as facilidades que cada pesquisador dispõe (TAKEUCHI et al., 2003;

YANO et al., 2008; PANDA et al., 2011).

O isolamento das células alvo, por meio de digestão enzimática das gônadas dos animais doadores é quase unânime entre os pesquisadores (TAKEUCHI et al., 2009;

PACCHIARINI et al., 2013; PŠENIČKA et al., 2014). Entretanto, os protocolos variam desde a enzima utilizada, até o método mais viável para purificação das células requeridas. Saito et al. (2008), incubaram embriões de 10 a 15 somitos em solução contendo colagenase e tripsina, até sua completa digestão, ao ponto que as PGCs pudessem ser coletadas uma a uma para o transplante. Já Nobrega et al. (2010), tiveram por objetivo o isolamento de espermatogônias do tipo A das gônadas de zebrafish. Para isso, os testículos dos exemplares foram inicialmente digeridos pelas enzimas dispase e colagenase e a purificação foi realizada utilizando FACS, ou seja, por meio de um classificador que separa células que expressem altos níveis de fluorescência. Lacerda et al. (2010) e Pšenička et al. (2104) utilizaram métodos bastante parecidos para o isolamento e, principalmente, para a purificação celular, que em semelhança ao presente estudo, foi realizada utilizando-se um gradiente descontínuo de densidade. Este protocolo apresenta resultados satisfatórios e não requer grande habilidade para seu desenvolvimento.

A marcação das células alvo também pode ser conduzida por diferentes protocolos, que podem ser realizados in vivo ou in vitro (LACERDA et al., 2008;

SAITO et al., 2008; HIGUCHI et al., 2011; MAJHI et al., 2014). Este passo é

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fundamental para o transplante, pois permite a localização e acompanhamento dos processos de migração, colonização e proliferação das células doadoras nas gônadas dos animais receptores. Muitos são os trabalhos cujos pesquisadores estabeleceram uma linhagem transgênica de doadores, nos quais as células germinativas expressavam a proteína fluorescente verde (GFP), entretanto, a falta de aceitação social dificulta a indução de tais linhagens transgênicas em algumas espécies (YAMAHA et al., 2007;

YAMAHA et al., 2008; OKUTSU et al., 2006; YOSHIZAKI et al., 2010). Uma das alternativas é a injeção de RNAm-GFP artificial (SAITO et al., 2008; SAITO et al.,

2010) ou a utilização de marcadores como o DAPI ou PKH26, após o isolamento das células dos animais doadores, que a exemplo do presente estudo tem se mostrado bastante eficiente e de fácil aplicação (NÓBREGA et al., 2010; YZAWA et al., 2010;

HIGUCHI et al., 2011; MORITA et al., 2012; PACCHIARINI et al., 2013; PŠENIČKA et al., 2014).

Por fim, uma vez que a injeção das células doadoras pode ser feita utilizando-se uma seringa de insulina, a técnica de transplante de células germinativas via papila urogenital (LACERDA et al., 2006, NOBREGA et al., 2010), pode ser introduzida em qualquer piscicultura, pois este procedimento é de fácil execução, representa baixos custos e apresenta grandes possibilidades experimentais e aplicadas, tais como a conservação genética de espécies ameaçadas de extinção, a exemplo da piracanjuba.

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Figuras

Figura 1. Esquema representando os passos desenvolvidos durante o transplante espermatogonial entre A. altiparanae e B. orbignyanus. As imagens de A. altiparanae e B. orbignyanus foram adaptadas a partir de http://www.turmadobigua.com.br e http://www.hodelua.com.br/site/piracanjuba, respectivamente.

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Figura 2. a) Seringa de insulina adaptada para o transplante celular; b) Injeção das espermatogônias via papila urogenital de A. altiparanae; c) Magnificação da região contornada na imagem b, destacando a abertura urogenital (seta tracejada), local de introdução da seringa para o transplante. Papila urogenital = pu; ânus = ao. Barra de escala figuras a- b = 1 cm.

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Figura 3. Separação celular em gradiente de Percoll acondicionado em microtubo de 2 mL. Banda 1 – Restos celulares; Banda 2 – Pool de espermatogônias; Banda 3 – Espermatogônias, espermátides e espermatozoides; Pellet – Restos teciduais.

Figura 4. Análise citológica das bandas celulares após a purificação. a) Banda 1; b) Banda 2; c) Banda 3, Inset = diferença entre uma espermatogônia viável (seta) e outra inviável (*), cujo corante azul de trypan penetrou a membrana; d) Banda 4. Escalas = 10m.

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Figura 5. Espermatogônias marcadas com PKH26. a) Escala = 50m; b) Escala = 10m.

Figura 6. Testículos de A. altiparanae. a) Testículo controle; b) Testículo pós- transplante, mostrando que a solução celular foi corretamente injetada no compartimento do animal receptor. Escala = 0,5 cm.

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Figura 7. Avaliação do transplante celular. a) Testículo controle, cuja espermatogênese endógena foi suprimida, mas não realizou-se o transplante celular, evidenciando interstício (seta) e lúmen (L); b) Presença de espermatogônias (cabeça de seta) no lúmen dos testículos transplantados; c, d) Destaque para uma espermatogônia no lúmen testicular; e, f) Espermatogônia doadora após colonização do epitélio. Notar a presença de espermatogônias endógenas (seta vazada), que não apresentam marcação; g, h) Proliferação das células doadoras, formando cistos germinativos; i) Cisto de células germinativas bastante desenvolvido; j, k) Espermatozoides provenientes das células doadoras transplantadas (seta dupla) entremeados aos espermatozoides endógenos (z). As imagens a, b, c, e, g, i, j foram analisadas com filtro fluorescente para o marcador PKH26. As imagens d, f, h, k foram analisadas em campo claro. Escalas: 50 m.

Tabela 1. Eficiência do transplante espermatogonial de B. orbignyanus em A. altiparanae Taxa de sobrevivência dos Eficiência do IGS Tratamentos animais transplantados transplante (%) (%) (%) Busulfan 71,2 1,71 ± 0,18 66,67 Temperatura 51,7 1,70 ± 0,27 84,6 * Busulfan = Busulfan + 35°C; Temperatura = Incubação dos animais à 35°C **A eficiência foi analisada em relação aos animais sobreviventes

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Referencias

BORBA, M. R. Exigência energética e relação carboidrato: lipídio para alevinos de piracanjuba (Brycon orbignyanus). 2003 Tese (Doutorado) – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

GIMBO, R. Y., SAITA, M. V., GONÇALVES, A. F. N. & TAKAHASHI, L. S. (2008). Diferentes concentrações de benzocaína na indução anestésica do lambari-do-rabo-amarelo (" Astyanax altiparanae"). Revista Brasileira de Saúde e Produção Animal, 9(2).

HIGUCHI, K., TAKEUCHI, Y., MIWA, M., YAMAMOTO, Y., TSUNEMOTO, K., & YOSHIZAKI, G. (2011). Colonization, proliferation, and survival of intraperitoneally transplanted yellowtail Seriola quinqueradiata spermatogonia in nibe croaker Nibea mitsukurii recipient. Fisheries science, 77(1), 69-77.

LACERDA, S. M. S. N. Transplante de espermatogônias: A Tilápia-Nilótica (Oreochromis niloticus) como modelo experimental. 2006 Dissertação (Mestrado) – UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS.

LACERDA, S. M. S. N., BATLOUNI, S. R., ASSIS, L. H., RESENDE, F. M., CAMPOS- SILVA, S. M., CAMPOS-SILVA, R., ... & FRANCA, L. R. (2008). Germ cell transplantation in tilapia (Oreochromis niloticus). Cybium, 32(2), 115-118.

LACERDA, S. M., BATLOUNI, S. R., COSTA, G. M., SEGATELLI, T. M., QUIRINO, B. R., QUEIROZ, B. M., KALAPOTHAKIS, E. & FRANÇA, L. R. (2010). A new and fast technique to generate offspring after germ cells transplantation in adult fish: the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) model. PLoS One, 5(5), e10740.

LACERDA, S. M. S. N., BATLOUNI, S. R., SILVA, S. B. G., HOMEM, C. S. P. & FRANÇA, L. R. (2006). Germ cells transplantation in fish: the Nile-tilapia model. Animal Reproduction, 3(2), 146-159.

MAJHI, S. K., HATTORI, R. S., RAHMAN, S. M. & STRÜSSMANN, C. A. (2014). Surrogate Production of Eggs and Sperm by Intrapapillary Transplantation of Germ Cells in Cytoablated Adult Fish. PloS One, 9(4), e95294.

111

MORITA, T., KUMAKURA, N., MORISHIMA, K., MITSUBOSHI, T., ISHIDA, M., HARA, T., KUDO S., MIWA M., IHARA S., HIGUCHI K., TAKEUCHI I. & YOSHIZAKI, G. (2012). Production of donor-derived offspring by allogeneic transplantation of spermatogonia in the yellowtail (Seriola quinqueradiata).Biology of reproduction, 86(6), 176-176.

NAGLER, J. J., CLOUD, J. G., WHEELER, P. A. & THORGAARD, G. H. (2001). Testis transplantation in male rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Biology of reproduction, 64(2), 644-646.

NÓBREGA, R. H., GREEBE, C. D., VAN DE KANT, H., BOGERD, J., DE FRANÇA, L. R., & SCHULZ, R. W. (2010). Spermatogonial stem cell niche and spermatogonial stem cell transplantation in zebrafish. PLoS One, 5(9), e12808.

OKUTSU, T., SUZUKI, K., TAKEUCHI, Y., TAKEUCHI, T., & YOSHIZAKI, G. (2006). Testicular germ cells can colonize sexually undifferentiated embryonic gonad and produce functional eggs in fish. Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America, 103(8), 2725-2729.

SAITO, T., GOTO-KAZETO, R., ARAI, K. & YAMAHA, E. (2008). Xenogenesis in teleost fish through generation of germ-line chimeras by single primordial germ cell transplantation. Biology of reproduction, 78(1), 159-166.

TAKEUCHI, Y., HIGUCHI, K., YATABE, T., MIWA, M., & YOSHIZAKI, G. (2009). Development of spermatogonial cell transplantation in Nibe croaker, Nibea mitsukurii (Perciformes, Sciaenidae). Biology of reproduction, 81(6), 1055-1063.

YAZAWA, R., TAKEUCHI, Y., HIGUCHI, K., YATABE, T., KABEYA, N. & YOSHIZAKI, G. (2010). Chub mackerel gonads support colonization, survival, and proliferation of intraperitoneally transplanted xenogenic germ cells. Biology of reproduction, 82(5), 896-904.

PANDA, R. P., BARMAN, H. K., & MOHAPATRA, C. (2011). Isolation of enriched carp spermatogonial stem cells from Labeo rohita testis for in vitro propagation. Theriogenology, 76(2), 241-251.

PŠENIČKA, M., SAITO, T., LINHARTOVÁ, Z. & GAZO, I. (2014). Isolation and transplantation of sturgeon early-stage germ cells. Theriogenology. (In press).

112

TAKEUCHI, Y., YOSHIZAKI, G. & TAKEUCHI, T. (2003). Generation of live fry from intraperitoneally transplanted primordial germ cells in rainbow trout. Biology of Reproduction, 69(4), 1142-1149.

LACERDA, S. M. S. N. Transplante de espermatogônias: A Tilápia-Nilótica (Oreochromis niloticus) como modelo experimental. 2006 Dissertação (Mestrado) – UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS.

VAZ, M. M.; TORQUATO, V. C. & BARBOSA, N. D. C. (2000). Guia ilustrado de peixes da bacia do Rio Grande. Belo Horizonte: CEMIG/CETEC. 144p.

YAMAHA, E., SAITO, T., GOTO-KAZETO, R. & ARAI, K. (2007). Developmental biotechnology for aquaculture, with special reference to surrogate production in teleost fishes. Journal of Sea Research, 58(1), 8-22.

YANO, A., SUZUKI, K. & YOSHIZAKI, G. (2008). Flow-cytometric isolation of testicular germ cells from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) carrying the green fluorescent protein gene driven by trout vasa regulatory regions. Biology of reproduction, 78(1), 151-158.

YOSHIZAKI, G., ICHIKAWA, M., HAYASHI, M., IWASAKI, Y., MIWA, M., SHIKINA, S. & OKUTSU, T. (2010). Sexual plasticity of ovarian germ cells in rainbow trout. Development, 137(8), 1227-1230.

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PERSPECTIVAS E CONCLUSÕES

O presente estudo traz uma nova visão para o transplante de células germinativas em peixes. Pois, diferentemente dos trabalhos anteriores, cuja aplicação envolvia equipamentos sofisticados e alta demanda experimental, neste estudo conduzimos o transplante celular, entre duas espécies de characiformes, de forma simples e prática, mostrando que esta abordagem metodológica pode ser desenvolvido em qualquer propriedade piscícola.

Dentre os protocolos desenvolvidos, a esterilização de espécimes machos sexualmente maduros do lambari-do-rabo-amarelo Astyanax altiparanae por incubação em alta temperatura (35°C) merece especial atenção. Uma vez que a reprodução desta espécie é dominada, esta espécie poderá ser preparada como receptora para receber células germinativas de diferentes espécies desta ordem cuja reprodução não é conhecida ou é difícil de ser realizada em cativeiro.

Ademais, esta estratégia deve ser testada para outras espécies, pois além de tornar os indivíduos incapazes de reproduzir com as espécies nativas, minimizando os riscos ambientais de contaminação genética dos rios e mares por liberação acidental das espécies cultivadas, os peixes inférteis terão crescimento maior, visto que a energia normalmente direcionada à formação e desenvolvimento gonadal e a reprodução, é utilizada para o crescimento somático. Além disso, a esterilização também evita o escoamento de linhagens específicas dos criadores

A simplificação do transplante de células germinativas de peixes é um grande avanço em direção à mitigação de problemas sociais, tais como a escassez alimentar que devido ao contínuo crescimento da população mundial, torna-se cada vez mais ameaçador. Utilizando-se esta abordagem é possível acelerar a produção do pescado, utilizando como receptores espécies que apresentem rápidos e sucessivos eventos

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reprodutivos. Deste modo, espécies que se reproduzem uma única vez ao longo de um ano, poderiam ser reproduzidas várias vezes por meio do transplante de suas células germinativas em espécies mais prolíficas.

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ANEXOS

I. Spermatogenesis in the tetra Astyanax altiparanae: A histological analyses with emphasis to spermatogonial and spermatid types. Manuscrito submetido ao periódico Boletim do Instituto de Pesca.

II. Induction of sterility in fish with emphasis on the implication of germ cell transplantation for aquaculture: an overview. Manuscrito submetido ao periódico Aquaculture

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ANEXO I

Spermatogenesis in the tetra Astyanax altiparanae: A histological analyses with emphasis to spermatogonial and spermatid types.

Maira da Silva RODRIGUES1, Diógenes Henrique de SIQUEIRA-SILVA2, Alexandre NINHAUS-SILVEIRA3, RosicleireVERÍSSIMO-SILVEIRA3.

ABSTRACT This study aimed a detailed description of the characteristics of the different germ cell types found in Astyanax altiparanae during spermatogenesis. In this purpose, testes from twenty-five adult male specimens of A. altiparanae were sampled and submitted to the usual techniques for light microscopy. Based on nuclear shape, chromatin condensation, nucleoli quantity and cell size we estimated four spermatogonial types: type A undifferentiated (Aund.*), type A undifferentiated (Aund.), type A differentiated

(Adif.), and type B spermatogonia. Spermatocytes were observed in different phases of meiosis, (leptotene/zygotene/pachytene and diplotene), metaphase I and II and secondary spermatocytes, being distinguish mainly by their chromosomal organization inside the nucleus. We also identified three different types of spermatids, which were named as initial, intermediate and final, and can be differentiated by increase in nuclear compression, spacing among cells inside the cysts, possibly by flagella arise and nuclear diameter. Thus, this study contribute to a better understand of spermatogenesis in this and other fish species.

Keywords: fish reproduction; germ cells; spermiogenesis; testis morphology.

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ANEXO II

Induction of sterility in fish with emphasis on the implication of germ cell transplantation for aquaculture: an overview

Amin G. Dehsaria*, Diógenes H. de Siqueira-Silvab, Mohammad A. M. Siddiquea, Martin Pšeničkaa

ABSTRACT The use of non-reproduction technology in hatchery production has direct benefits to fisheries and can aid in the conservation of wild fish populations. Interest in reproductively sterile fish in aquaculture has prompted research into their production.

Although conventional approaches such as irradiation, surgery, hormone treatments, and ploidy manipulation are available for inducing sterility, these techniques have not been developed for large-scale operations. There are few studies of sterilization of fish by conventional methods in reproductive biotechnology and aquaculture. Novel approaches, including disruption of gonadotropin releasing hormone signaling and genetic ablation of germ cells, have been developed to generate infertile fish. Although these methods are effective in producing infertile fish, they have the disadvantage of not being 100% reliable or are impractical for large-scale aquaculture. Knowledge of the implications of these approaches in germ cell transplantation in fish remains incomplete, imposing considerable limitations. We review currently used technologies and recent advances in induction sterility in fish, especially those intended for use in germ cell transplantation.

Keywords: Sterility, reproductive containment, germ cell, biotechnological tools

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Autorizo a reprodução xerográfica para fins de pesquisa.

São José do Rio Preto, 16/04/2015

______Assinatura