MONITOREO Y DETECCIÓN DE EPINOTIA (Crocidosema Aporema, Lepidoptera:Tortricidae) CON TRAMPAS DE FEROMONAS

Monitoreo y detección de epinotia 1

MONITOREO Y DETECCIÓN DE EPINOTIA (Crocidosema aporema, Lepidoptera:Tortricidae) CON TRAMPAS DE FEROMONAS

Proyecto FPTA- 208 Desarrollo de una tecnología basada en feromonas para el monitoreo de Epinotia aporema en cultivos de oleaginosas y pasturas: caracterización química de la feromona sexual; implementación y evaluación en campo de trampas de monitoreo

Editores: Paula Altesor* Andrés González**

Equipo de trabajo: Paula Altesor, Andrés González, Carmen Rossini, Paola Liberati. Laboratorio de Ecología Química, Facultad de Química.

Horacio Silva, Enrique Castiglioni. Depto. de Protección Vegetal, Facultad de Agronomía (EEMAC).

Daniela Gamenara, Leticia Alves, David González, Juan Ramos, Ignacio Carrera. Gustavo Seoane. Laboratorio de Síntesis Orgánica, Facultad de Química.

* Lic. MSc. Laboratorio de Ecología Química, Facultad de Química, Universidad de la República. **Dr. PhD. Laboratorio de Ecología Química, Facultad de Química, Universidad de la República. 2 Monitoreo y detección de epinotia

Título: MONITOREO Y DETECCIÓN DE EPINOTIA (Crocidosema aporema, Lepidoptera: Tortricidae) CON TRAMPAS DE FEROMONAS

Editores: Paula Altesor Andrés González

Equipo de trabajo: Paula Altesor; Andrés González Carmen Rossini; Paola Liberati; Horacio Silva; Enrique Castiglioni; Daniela Gamenara; Leticia Alves; David González; Juan Ramos; Ignacio Carrera; Gustavo Seoane

Serie: FPTA N° 46

Foto de tapa: Macho de Crocidosema (=Epinotia) aporema atraído por la feromona sexual de la hembra liberada desde un septo de goma. La feromona fue químicamente caracterizada y sintetizada en este proyecto, con el fin de producir trampas de monitoreo para este insecto plaga de leguminosas.

Editado por la Unidad de Comunicación y Transferencia del Tecnología del INIA

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Impreso en Editorial Hemisferio Sur S.R.L. Buenos Aires 335 Montevideo - Uruguay

Depósito Legal 362-134/13 Monitoreo y detección de epinotia 3

Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria

Integración de la Junta Directiva

Ing. Agr., MSc., PhD. Álvaro Roel - Presidente

D.M.T. V., PhD. José Luis Repetto - Vicepresidente

D.M.V. Álvaro Bentancur

D.M.V., MSc. Pablo Zerbino

Ing. Agr. Joaquín Mangado

Ing. Agr. Pablo Gorriti 4 Monitoreo y detección de epinotia Monitoreo y detección de epinotia 5 FONDO DE PROMOCIÓN DE TECNOLOGÍA AGROPECUARIA

El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA) fue instituido por el artículo 18º de la ley 16.065 (ley de creación del INIA), con el destino de financiar proyectos especiales de investigación tecnológica relativos al sector agropecuario del Uruguay, no previstos en los planes del Instituto. El FPTA se integra con la afectación preceptiva del 10% de los recursos del INIA provenientes del financiamiento básico (adicional del 4o/oo del Impuesto a la Enaje- nación de Bienes Agropecuarios y contrapartida del Estado), con aportes voluntarios que efectúen los productores u otras instituciones, y con los fondos provenientes de financiamiento externo con tal fin. EL FPTA es un instrumento para financiar la ejecución de proyectos de investiga- ción en forma conjunta entre INIA y otras organizaciones nacionales o internacionales, y una herramienta para coordinar las políticas tecnológicas nacionales para el agro. Los proyectos a ser financiados por el FPTA pueden surgir de propuestas presentadas por: a) los productores agropecuarios, beneficiarios finales de la investigación, o por sus instituciones. b) por instituciones nacionales o internacionales ejecutoras de la investigación, de acuerdo a temas definidos por sí o en acuerdo con INIA. c) por consultoras privadas, organizaciones no gubernamentales o cualquier otro organismo con capacidad para ejecutar la investigación propuesta. En todos los casos, la Junta Directiva del INIA decide la aplicación de recursos del FPTA para financiar proyectos, de acuerdo a su potencial contribución al desarrollo del sector agropecuario nacional y del acervo científico y tecnológico relativo a la investigación agropecuaria. El INIA a través de su Junta Directiva y de sus técnicos especializados en las diferentes áreas de investigación, asesora y facilita la presentación de proyectos a los potenciales interesados. Las políticas y procedimientos para la presentación de proyectos son fijados periódicamente y hechos públicos a través de una amplia gama de medios de comunicación. El FPTA es un instrumento para profundizar las vinculaciones tecnológicas con instituciones públicas y privadas, a los efectos de llevar a cabo proyectos conjuntos. De esta manera, se busca potenciar el uso de capacidades técnicas y de infraestruc- tura instalada, lo que resulta en un mejor aprovechamiento de los recursos nacionales para resolver problemas tecnológicos del sector agropecuario. El Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria contribuye de esta manera a la consolidación de un sistema integrado de investigación agropecuaria para el Uruguay. A través del Fondo de Promoción de Tecnología Agropecuaria (FPTA), INIA ha financiado numerosos proyectos de investigación agropecuaria a distintas instituciones nacionales e internacionales. Muchos de estos proyectos han producido resultados que se integran a las recomendaciones tecnológicas que realiza la institución por sus medios habituales. En esta serie de publicaciones, se han seleccionado los proyectos cuyos resultados se considera contribuyen al desarrollo del sector agropecuario nacional. Su relevancia, el potencial impacto de sus conclusiones y recomendaciones, y su aporte al conocimiento científico y tecnológico nacional e internacional, hacen necesaria la amplia difusión de estos resultados, objetivo al cual se pretende contribuir con esta publicación. 6 Monitoreo y detección de epinotia Monitoreo y detección de epinotia 7

CONTENIDO

Página

Capítulo 1 Introducción: el uso de feromonas en el manejo de lepidópteros plaga ...... 9

Capítulo 2 Crocidosema (=Epinotia) aporema: biología e importancia ...... 13

Capítulo 3 Estrategia experimental ...... 17

Capítulo 4 Comportamiento reproductivo de epinotia...... 23

Capítulo 5 Identificación de la feromona sexual de epinotia ...... 25

Capítulo 6 Ensayos con feromona sintética en laboratorio y campo...... 29

Capítulo 7 Discusión, conclusiones y perspectivas...... 33

Bibliografía ...... 35 8 Monitoreo y detección de epinotia Monitoreo y detección de epinotia 9

Paula Altesor* Carmen Rossini* CAPÍTULO 1. Andrés González* Introducción: el uso de feromonas en el *Laboratorio de Ecología Química, Facultad de Química. manejo de lepidópteros plaga

Proyecto FPTA 208 Período de Ejecución: Ene. 2007-Dic. 2009

La comunicación química en insectos mos. Por otro lado, el control de plagas ha sido mayormente investigada en pla- basado en feromonas puede eliminar o gas agrícolas y forestales con el objetivo reducir en forma muy importante la nece- de desarrollar estrategias de manejo al- sidad de control químico, y es utilizado ternativas al uso de insecticidas, de modo con éxito para aproximadamente una de racionalizar su empleo y mitigar sus decena de especies, aunque su poten- efectos nocivos para la salud y el medio- cial es significativamente mayor (Witz- ambiente. Los semioquímicos (señales gall et al., 2010). químicas) que se han utilizado con más éxito en este contexto son indudable- I) DETECCIÓN Y MONITOREO mente las feromonas sexuales de lepi- dópteros (Witzgall et al., 2010). Otros La aplicación más extendida de fero- semioquímicos importantes e intensa- monas sexuales consiste en su uso para mente estudiados en los últimos años, detección y monitoreo de insectos plaga. como los atrayentes volátiles de plantas Las feromonas sintéticas se cargan en y los volátiles que median interacciones septos de goma en cantidades que osci- tritróficas, presentan un futuro promiso- lan entre 0,1 y 1 mg, y se colocan dentro rio en la búsqueda de aplicaciones para de trampas que retienen a los machos el control de plagas. atraídos. Los datos de capturas de ma- El empleo de semioquímicos respec- chos permiten determinar cuándo y dón- to a los plaguicidas convencionales tiene de la plaga está presente, y además la ventaja de no dejar residuos tóxicos, estimar su dinámica poblacional, esta- afectar únicamente a la especie diana, y bleciendo así los momentos precisos de requerir pequeñas cantidades de produc- aplicación de estrategias de control. En tos volátiles e inocuos (Howse et al., algunas especies se ha desarrollado una 1998; Witzgall et al., 2010). El uso sos- correlación precisa entre las capturas de tenido de semioquímicos incrementa su machos y la población de larvas espera- propia efectividad, ya que se estabilizan das para la generación siguiente. Esto las poblaciones de organismos benéfi- permite la utilización de umbrales de cos como depredadores y parasitoides, capturas que disparen medidas de con- los que potencialmente controlan el sur- trol, lo cual requiere que los datos de gimiento de plagas secundarias. capturas sean confiables en términos Las feromonas de lepidópteros se uti- absolutos, remarcando la necesidad del lizan para la detección y monitoreo po- uso de trampas estandarizadas para ase- blacional de plagas, así como para el gurar la constancia de los mismos (Arn et control de las mismas. El monitoreo es- al., 1997; Witzgall et al., 2010). pacial y temporal de plagas permite un Las trampas de feromonas son lo uso informado de estrategias de control suficientemente sensibles y específicas químico, lo cual disminuye significativa- para detectar bajas densidades de una mente las aplicaciones de insecticidas especie. Esto posibilita la detección de respecto al uso preventivo de los mis- especies invasoras que puedan conside- 10 Monitoreo y detección de epinotia rarse plagas cuarentenarias, el segui- esta última ha sido y continúa siendo la miento de una especie exótica ya esta- más importante, tanto a nivel de investi- blecida, así como el éxito en la introduc- gación como de aplicación (Witzgall et ción de una especie benéfica (Cossé et al., 2010), en los últimos años ha aumen- al., 2005) o un programa de erradicación tado la importancia relativa de los estu- (El-Sayed et al., 2006; Kean y Suckling dios de atracticidas, probablemente por 2005). En tiempos de intensos movi- la posibilidad de disminuir los costos de mientos de plagas importantes, como la aplicación al reducir la cantidad de fero- principal plaga de viña en Europa Lobesia mona necesaria. botrana, el uso de trampas de feromonas El trampeo masivo y el uso de atrac- para la detección preventiva y temprana ticidas comparten el concepto de atraer y es una herramienta poderosa para plani- eliminar una proporción importante de ficar estrategias de erradicación cuando insectos en un área, de modo de mante- el insecto aún se encuentra en una etapa ner sus poblaciones por debajo del um- de instalación, por ende más vulnerable. bral de daño. La diferencia entre ellas La información sobre variaciones po- radica en la forma de eliminación, me- blacionales de una plaga, en combina- diante trampas (trampeo masivo) o in- ción con el conocimiento del desarrollo secticidas (atracticidas). Si se utilizan del insecto y su relación con la tempera- atrayentes para ambos sexos, por ejem- tura, son extremadamente importantes plo feromonas de agregación o cebos cuando se emplean medidas de control alimenticios, se reducen las poblaciones cuya efectividad depende de una ventana de machos y hembras, con mayor proba- estrecha de tiempo. Por ejemplo, el uso bilidad de éxito en el control de la plaga. de productos específicos para ciertos Sin embargo, si se emplean feromonas estadios inmaduros del insecto, o la libe- sexuales, como es el caso en lepidópte- ración de agentes biológicos de control, ros, se reduce únicamente la población se ven facilitados por una precisa infor- de machos, con la intención, no siempre mación espacio-temporal de la presen- realista, de que esta reducción tenga una cia de la plaga objetivo. incidencia significativa en la probabilidad Las feromonas de unas 600 especies de que las hembras copulen. Ambos de lepidópteros se han caracterizado métodos requieren menor cantidad de químicamente (El-Sayed 2011), y en la feromonas que la confusión sexual, lo actualidad decenas de especies plaga cual puede reducir significativamente los son rutinariamente monitoreadas median- costos de utilización (Witzgall et al., te septos de feromonas comercializados 2010). por distintas empresas regionales o in- La técnica de confusión sexual, por ternacionales. Se estima que unos 20 su parte, consiste en sobrecargar el millones de septos de feromona son pro- ambiente con grandes cantidades de fe- ducidos cada año, en su mayoría para romona sexual, de manera de alterar el especies de lepidópteros (Witzgall et comportamiento del macho. Esta técni- al.,, 2010). Una perspectiva a futuro es la ca causa desorientación e interrupción combinación de programas regionales de la comunicación entre los sexos, y de monitoreo con sistemas de informa- por lo tanto retrasa, reduce o previene la ción geográfica, los que permitirán una fertilización de las hembras. A diferencia concentración de medidas de control en de las técnicas descritas anteriormente, zonas focales de la especie plaga (Tobin en confusión sexual no es necesario el et al., 2007). empleo de la mezcla natural que compo- ne la feromona sexual, ya que el efecto de confusión puede ocurrir con mezclas II) CONTROL simplificadas o simplemente con el componente mayoritario, con importantes Aunque el objetivo central de este ventajas en cuanto al costo del método proyecto FPTA fue el desarrollo de tram- (Stelinski et al., 2008). pas de monitoreo, cabe hacer mención a las estrategias de control basadas en En forma general, se requiere la apli- feromonas: el trampeo masivo, los atrac- cación de 10 a 100 gramos de feromona ticidas y la confusión sexual. Aunque por hectárea y por temporada para lograr Monitoreo y detección de epinotia 11 la interrupción de la comunicación sexual con otros métodos para el control de (Witzgall et al., 2010). Por lo tanto, el plagas secundarias. Asimismo, cada desarrollo de esta estrategia de control especie requiere liberadores específicos, en escala comercial requiere que la fero- y la síntesis de feromonas en la escala mona necesaria sea sintetizada en una necesaria para confusión sexual es eco- escala del orden de cientos a miles de nómicamente factible únicamente para kilogramos, lo cual representa una limi- algunas especies, dependiendo de la tante importante en la aplicación masiva estructura química, la distribución de la de esta técnica. especie plaga, y la propia demanda por La permeación eficiente del aire en un métodos de control basados en feromo- cultivo es un aspecto fundamental para el nas. Indudablemente, muchas especies éxito de la confusión sexual, por lo que la podrían ser controladas por este método, tecnología asociada al desarrollo de libe- más allá de la decena para las cuales se radores ha jugado un papel importante en utiliza, de existir la disponibilidad de el avance de esta técnica. Se han desa- productos comerciales para un universo rrollado una gran variedad de liberadores mayor de especies. Finalmente, al ser un de feromona, incluyendo algunos asper- tratamiento inocuo, es totalmente inútil jables como microcápsulas o fibras hue- en situaciones en la cuales pueden in- cas, y otros de aplicación manual, que gresar hembras copuladas al predio tra- son los más utilizados. Entre éstos, los tado con feromonas (Witzgall et al., 2008). más comunes son los liberadores de La ecuación de costos de manejo de alambre forrados en polietileno (rope dis- plagas es otro aspecto importante, y pensers), los que se pueden moldear ésta depende de muchos factores. En para asegurarlos en ramas u otras es- países donde una variedad de insectici- tructuras. Éstos se aplican en cantida- das de amplio espectro como organofos- des entre 500 y 1000 por hectárea, y forados y carbamatos son aun permiti- cada uno emite aproximadamente 1000 dos, el bajo costo de éstos generalmente veces más feromona que una hembra limita la competitividad de la confusión (Witzgall et al., 2008). sexual, la cual a su vez es altamente La confusión sexual es más efectiva dependiente del alto costo de las feromo- en grandes áreas, debido en parte a que nas sintéticas. Es aquí que la tecnología se reduce el impacto de hembras copula- de liberadores «inteligentes» podría ser das que migran al área tratada, además fundamental, ya que se lograría disminuir que se facilita una permeación homogé- en forma muy importante la cantidad de nea del aire por el aumento de la relación feromona necesaria. Las regulaciones área/borde. Por lo tanto, en cultivos y públicas sobre el uso de insecticidas, la regiones donde la producción se realiza demanda de los consumidores, así como en forma fragmentada, es esencial la las barreras impuestas por algunos mer- coordinación de productores para aplicar cados en base a residuos de plaguicidas, la técnica simultáneamente. forman un conjunto de condiciones que afectan la motivación del productor por El uso de confusión sexual como es- demandar y utilizar estrategias alternati- trategia de control tiene inconvenientes, vas de control de plagas, aunque las que explican en parte lo limitado de su mismas sean más caras o complejas en aplicación. La especificidad e inocuidad su aplicación. Esta motivación es un de las feromonas, aspectos destacados factor importante para explicar la sustan- como positivos, pueden también ser su cial diferencia a nivel regional en la apli- principal problema. Los cultivos afecta- cación de confusión sexual para espe- dos por una diversidad de plagas requie- cies como C. pomonella, cuya eficacia ren el desarrollo de estrategias de confu- ha sido sólidamente comprobada sión en paralelo, o la combinación de (Witzgall 2001). confusión sexual para la plaga principal 12 Monitoreo y detección de epinotia Monitoreo y detección de epinotia 13 Paula Altesor* Carmen Rossini* CAPÍTULO 2. Andrés González* Crocidosema (=Epinotia) aporema: *Laboratorio de Ecología Química, Facultad de Química. biología e importancia

Crocidosema (=Epinotia) aporema (Le- anterior y los flancos claros en la región pidoptera: Tortricidae), comúnmente de- posterior; en los machos el dorso es nominada «lagarta o barrenador de los claro y los flancos son oscuros (Figura brotes», o simplemente «epinotia», es 1). Las hembras ponen entre 130 y 200 una especie regional que se alimenta de huevos a lo largo de su vida. Estos miden leguminosas, siendo por lo tanto una menos de 1 mm y se depositan de forma plaga relevante tanto en cultivos de in- aislada sobre el follaje. Las larvas recién vierno (leguminosas forrajeras) como de nacidas miden 1 mm, pasan por 5 esta- verano (soja). Su distribución abarca el dios y en su estadio final llegan a medir sur de EE.UU. hasta Chile, Argentina y 1 cm. Las pupas miden unos 7 mm, son Uruguay. Los adultos miden 1 cm aproxi- de color castaño-rojizo, pudiéndose dife- madamente, los sexos se diferencian por renciar hembras de machos por el núme- la coloración del cuerpo, presentando las ro de segmentos abdominales (Bentan- hembras el dorso oscuro en la región court y Scatoni 2006) (Figura 2).

Figura 1. Adultos de Crocidosema aporema. Izquierda: hembra; derecha: macho. 14 Monitoreo y detección de epinotia

A B

Figura 2. A: huevo, B: larva de primer estadio (señalada con una flecha), C: larva de 5 estadio, D: pupas hembra y macho de epinotia.

La temperatura es una de las varia- bles ambientales con mayor incidencia D en la duración del ciclo vital de los insectos. Para una temperatura de 21-23 °C, el ciclo total de epinotia se completa en 33- genos Zoophthora radicans (Zigomycete) y 46 días, teniendo la etapa de huevo una el virus de la granulosis (Baculoviridae) duración de 4-5 días, la larva de 21-25 (Alzugaray et al., 1999, Alzugaray y Ribei- días, la pupa de 11-15 días y el adulto de ro 2000, Bentancourt y Scatoni 2006). 10-25 días. Presenta de 5 a 6 generaciones por año, permaneciendo activa en el Con el aumento significativo del culti- invierno dada la presencia de legumino- vo de soja en Uruguay (Figura 3), se ha sas en ese período (lotus, trébol, alfalfa, registrado un crecimiento notorio en la entre otras) (Bentancourt y Scatoni 1999). importación de insecticidas (Figura 4). Los enemigos naturales que posee son Entre los insecticidas que más se utili- escasos; como depredadores se desta- zan en el control de lepidópteros se can Geocoris sp. (Lygaeidae) y Orius sp. encuentra el clorpirifós, organofosforado (Anthocoridae); el parasitoide Itoplectis moderadamente tóxico para humanos, y niobe (Hymenoptera) y los entomopató- la cipermetrina, piretroide moderadamen- Monitoreo y detección de epinotia 15

1000 900 ) 800 700 600 500 400 300 200

Área sembrada (ha x 1000 100 0

2008/09 2000/01 2001/02 2002/03 2003/04 2004/05 2005/06 2006/07 2007/08 2009/10 2010/11

Figura 3. Evolución del área sembrada de soja en Uruguay. Fuente: DIEA/MGAP.

2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Toneladas de principio activo 200 0 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1998 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Figura 4. Evolución de la importación de insecticidas en Uruguay. Fuente: MGAP, Dirección General de Servicios Agrícolas. te peligroso, según clasificación de la insecticidas por la presencia de poliniza- Organización Mundial de la Salud (OMS) dores. (Blum et al., 2008). Dado que las larvas de epinotia tienen Epinotia es generalmente la primer hábitos endofíticos, el control químico plaga que aparece en la soja, alimentán- resulta generalmente ineficiente, tenien- dose fundamentalmente de los brotes do que reforzarse las aplicaciones para foliares, florales y chauchas. El manejo reducir las poblaciones de la plaga que se define para esta plaga incide en el (Bentancourt y Scatoni 2001). Buscar posterior manejo del cultivo, ya que las alternativas al uso de insecticidas, como aplicaciones tempranas de insecticidas puede ser la utilización de la feromona de tienen un efecto negativo en el control de epinotia en el monitoreo del insecto, es las plagas que suceden a epinotia, como por lo tanto de vital importancia en el son las lagartas defoliadoras, que a dife- caso de esta especie de difícil manejo. rencia de epinotia, poseen un sistema La feromona de epinotia no había sido eficiente de controladores biológicos aún estudiada químicamente, por lo que (Bentancourt y Scatoni 2001). En legu- el objetivo central del proyecto aquí pre- minosas forrajeras epinotia tiene impor- sentado fue la caracterización química tancia especial ya que el daño se produ- de la feromona sexual de Crocidosema ce en el momento de la floración, período (=Epinotia) aporema, y el desarrollo de en el cual es muy dificultoso aplicar una tecnología basada en feromonas para 16 Monitoreo y detección de epinotia el monitoreo de esta plaga en legumino- síntesis de los componentes identifica- sas forrajeras y soja. Para alcanzar este dos; y la determinación de una formula- objetivo, se realizaron actividades ten- ción óptima para la utilización de la fero- dientes a la identificación de los compo- mona en trampas de monitoreo en culti- nentes químicos de la feromona de epi- vos de oleaginosas y pasturas. notia y sus proporciones relativas; la Monitoreo y detección de epinotia 17 Paula Altesor* Andrés González* CAPÍTULO 3. Estrategia *Laboratorio de Ecología Química, Experimental Facultad de Química.

El desarrollo del proyecto se basó en fase oscura. Las hembras, mantenidas tres etapas fundamentales: estudios de durante la fase clara en incubadora, fue- comportamiento reproductivo en el labo- ron colocadas para su aclimatación una ratorio, identificación y síntesis de los hora antes del experimento en la cámara componentes de la feromona, y ensayos de observación (26-28 oC, 50-60 % de con feromona sintética en laboratorio y humedad relativa). Se utilizó luz roja para campo. En este capítulo se detallan los las observaciones, ya que los insectos aspectos metodológicos utilizados en no ven en el rango de frecuencia corres- dichas etapas, mientras que los resulta- pondiente a ese color (Figura 1). dos se describen en los tres capítulos La proporción de hembras llamando subsecuentes. se analizó mediante un ANOVA de dos factores para la evaluación del efecto de ESTUDIOS DE la edad de las hembras y las horas de la COMPORTAMIENTO fase oscura en el comportamiento de llamada (datos transformados según ar- REPRODUCTIVO EN EL coseno √p). Para la comparación de las LABORATORIO medias se utilizó el test de Tukey, P< 0,05. El estudio químico de las feromonas de un insecto requiere como primer paso el estudio del patrón temporal de la emi- sión de feromona. Con este objetivo, se mantuvo una cría de epinotia sobre dieta artificial, renovando la población con larvas recolectadas en campo (INIA–La Estan- zuela). Todos los estadios se mantuvieron en incubadora a 22 ± 1 oC, 60-70 % de humedad relativa y fotoperiodo de 14: 10 (luz: oscuridad). Las larvas fueron ali- mentadas con una dieta artificial están- dar para la cría de tortrícidos (Shorey y Hale 1965). Las pupas se separaron por sexo, de modo de tener adultos vírgenes Figura 1. Hembras en recipientes individuales durante para los experimentos. Estos últimos la fase oscura, iluminadas con luz roja para fueron alimentados ad libitum con una el registro del comportamiento de llamada. dieta basada en agua y miel. Los estudios de comportamiento de llamada se realizaron por observación IDENTIFICACIÓN Y SÍNTESIS directa de hembras vírgenes en cautive- DE LOS COMPONENTES DE rio (N = 25), colocadas individualmente LA FEROMONA en recipientes cilindros de plástico (7 cm diámetro x 10 cm altura). Se registró Una vez conocido el comportamiento cada 15 minutos el comportamiento de reproductivo de la especie, y en particu- las hembras desde el día de la emergen- lar sus aspectos temporales, se trabajó cia hasta el séptimo día a lo largo de la en la identificación de los componentes 18 Monitoreo y detección de epinotia químicos de la feromona sexual y sus cantidad de feromona producida por las proporciones relativas, determinando en hembras. Finalmente se obtuvo un extrac- bioensayos de laboratorio la formulación to de 83 glándulas con el que se efectuó el más atrayente de los componentes de la estudio de identificación química. feromona. Análisis químico de la feromona Disección y extracción de glándulas de feromonas El análisis químico del extracto fue realizado por cromatografía gaseosa aco- La disección de glándulas de hem- plada a electroantenografía (GC-EAD) bras se realizó en el pico de llamada (Figura 3) y cromatografía gaseosa aco- identificado en el estudio de comporta- plada a espectrometría de masas (GC- miento (5-7 h de la fase oscura), utilizan- MS). El GC-EAD consiste en un acople do hembras de 2-6 días de emergidas, entre un cromatógrafo de gases y un mantenidas en las mismas condiciones sistema de electrodos/amplificador que ya descritas. Observando a través de una registra la respuesta nerviosa (eléctrica) lupa, fueron escindidas las glándulas pre- de una antena, la cual se fija sobre los sionando con pinzas la región final del electrodos mediante un gel conductor abdomen (Figura 2). Se acumularon glán- (Figura 3, derecha abajo) (Bjostad 1998). dulas en un vial cónico (0,2 mL) a -15 °C, Una solución de n-alcanos co-in- hasta su extracción con 100 µL de hexa- yectada con el extracto de glándulas no por 20 min. El extracto fue separado en GC-EAD permitió utilizar el tiempo de las glándulas y concentrado con N2 de retención como un criterio adicional para obtener un equivalente de hembra de identificación de los compuestos, (el contenido de una glándula) por µL de mediante el cálculo de índices de re- solución. Se realizaron extracciones du- tención (IR ) (Adams 2007). rante varias generaciones, mejorando la x técnica de escisión de las glándulas y Para la corroboración de los com- aumentando su número dada la poca puestos de la feromona, los mismos estudios en GC-EAD y GC-MS con el extracto se efectuaron con estándares sin- téticos. La metodología de síntesis no se incluye en este reporte por ser informa- ción técnica muy específica, la misma está disponible en el informe técnico del proyecto, y en una publicación científica (González et al., 2012).

ENSAYOS CON FEROMONA SINTÉTICA EN LABORATORIO Y CAMPO

Una vez identificados químicamente los componentes de la feromona, se pro- cedió a comprobar que éstos eran activos comportamentalmente; esto es, si los machos de epinotia volaban hacia cebos de feromona sintética, tanto en el laboratorio como en ensayos de campo.

Ensayos en túnel de viento

Figura 2. Disección de la glándula productora de feromona. El túnel de viento utilizado en este En el extremo del abdomen se visualiza la trabajo consistió en un cilindro de acríli- glándula y el ovipositor, que fueron escindidos co transparente de 150 cm de largo y con una pinza. 40 cm de diámetro, con una base que Monitoreo y detección de epinotia 19

A B

Figura 3. A: Equipo de GC-EAD. B: Ubicación de los electrodos conectados a un amplificador, a la salida de los efluentes del GC. C: Antena sobre electrodos, con gel conductor para establecer contacto. incluye un patrón de forma y color que sirve al insecto como marco de referen- cia en su vuelo orientado (Figura 4 ). Por el túnel de viento se hizo pasar aire con flujo laminar a 0,3 m/s, mediante una bomba suctora ubicada al final del mismo. El aire fue filtrado previo al pasaje por el túnel mediante filtros de carbón activa- C do acoplados en la entrada. El aire utilizado salió de la pieza a través de un tubo para no contaminar el sitio de experimen- diversas proporciones de sus dos com- tación (Hare 1998). La temperatura y ponentes. Con las hembras vírgenes se humedad relativa fue de 20-25 °C y 50- evaluaron 28 machos, y con el resto de 70%, respectivamente. Se utilizó luz roja los tratamientos 10 machos en cada uno. para las observaciones, y las pruebas se En el caso de feromona sintética, se iniciaron 3-4 h después del inicio de la mantuvo un total de 1,6 µg de feromona fase oscura, y hasta 2 h antes de la fase clara. Los individuos utilizados se ubicaron en la pieza 4 h antes del inicio del experimento para su aclimatación. Los machos vírgenes (1-5 días) fueron coloca- dos individualmente en cilindros de vidrio (8 cm largo x 4,5 cm diámetro) y las hembras vírgenes (2-5 días) en grupos de 5 en cilindros de vidrio (10 cm largo x 8 cm diámetro), ambos cerrados con tul. Los diferentes estímulos (hembras llamando y feromona) se dispusieron en la entrada del túnel, y los machos a observar al final del mismo, ambos colgando en el centro del túnel.

Como estímulos se utilizaron hem- Figura 4. Túnel de viento del Laboratorio de Ecología bras vírgenes (al menos una en postura Química (Facultad de Química, UdelaR; en de llamada), y feromona sintética en comodato de INIA). 20 Monitoreo y detección de epinotia por septo, combinando acetato de (Z,Z)- diferentes tratamientos, previa transfor- 7,9-dodecenilo (Z7,Z9-12:Ac) y (Z,Z)-7,9- mación a log (x+1) para normalizar los dodecenol (Z7,Z9-12:OH) en proporcio- datos. Como prueba a posteriori se uso nes 15:1, 1:1 y 1:0. Las diferentes mez- el test de Dunnett que no asume varian- clas se aplicaron a septos de goma natu- zas iguales. El test de Chi Cuadrado se ral que actuaron como dispensadores, utilizó en la comparación del porcentaje apoyados dentro de un cilindro de vidrio de machos que respondió a los diferen- de iguales características que los utiliza- tes estímulos, mediante tablas de Con- dos con las hembras. El control consis- tingencia de 2x2 (P < 0,05). tió en la aplicación de solvente (hexano) en los septos. Se utilizó un nuevo septo Ensayos de campo por cada macho a ensayar, preparándo- se antes del comienzo de los experimen- Una vez conocidos los componentes tos y manteniéndose en frío hasta su de la feromona sexual, sus proporciones utilización, para evitar la evaporación de relativas en la glándula de la hembra, y los compuestos. las proporciones más atractivas en el El experimento comenzó al retirar el laboratorio, se trabajó en la determina- tul al tubo conteniendo el macho, de ción de la formulación más atrayente de modo que pudiera volar libremente por el los componentes de la feromona, me- túnel. Se observó durante 10 min el com- diante ensayos de campo en una chacra portamiento del macho, registrando el experimental de soja en Paysandú. tiempo de inicio de vuelo, la observación Se colocaron trampas de tipo delta de de vuelo en zig-zag característico del plástico corrugado (15 x 15 x 25 cm) con vuelo orientado hacia una fuente de fero- septos de feromona en su interior, en un mona (vuelo en la pluma), la presencia de campo de soja de 2 ha en la Estación aleteos rápidos típicos de una respuesta Experimental «Dr. Mario Cassinoni» a feromona, y la llegada a la fuente de (EEMAC), Facultad de Agronomía, De- estímulo odorífero. partamento de Paysandú (32,5° de lati- Se utilizó un ANOVA para la compara- tud sur y 58° de longitud oeste), durante ción del tiempo de inicio de vuelo de los seis semanas entre marzo y abril de 2009 (Figura 5).

Figura 5. A: Campo de soja con trampas de feromona en la estación experimental Dr. Mario E. Cassinoni, Facultad de Agronomía, Paysandú. B: trampa tipo delta con el septo de feromona en su interior. El septo cuelga cerca del piso engomado de la trampa, de modo que los machos atraídos por la feromona B quedan pegados al ingresar a la trampa. Monitoreo y detección de epinotia 21 Los tratamientos con diferentes pro- A su vez, se realizaron dos muestreos de porciones de los dos componentes de la larvas a lo largo del experimento, revisan- feromona (Z7,Z9-12:OH y Z7,Z9-12:Ac) do 10 plantas al azar dentro de cada fueron la proporción 15:1 (OH:Ac) (pre- bloque. sente en la glándula), 1:1, 1:0 , 0:1, así Dado que en algunos casos se perdie- como el control (igual volumen de hexano ron datos de capturas por caerse las en el septo), utilizándose 0,1 mg de trampas, los datos faltantes fueron esti- feromona por septo. Se dispusieron ocho mados según Snedecor y Cochran (1980), bloques conteniendo cada uno todos los mediante el cálculo iterativo de los valo- tratamientos, con una distancia mínima res hasta que permanecieron incambia- entre bloques de 30 m, y de las trampas dos, estimando el valor inicial del dato dentro de cada bloque de 15 m (Figura 6). faltante y teniendo en cuenta los restan- La altura de las trampas varió según el tes datos y la suma de bloques y trata- tamaño de las plantas, colocándolas mientos. Se realizó un ANOVA multifac- siempre en la parte superior del follaje o torial para comparar medias de trata- sobre ellas. La posición de cada tratamientos, teniendo en cuenta el efecto de miento fue aleatorizada cada día de mues- bloques y días de muestreo. Los datos treo, realizado dos veces por semana. se transformaron previamente a log (x+1) Personal del laboratorio de entomología para normalizarlos. Se utilizó el test de de la EEMAC realizó la identificación y el Tukey para evaluar diferencias entre pa- conteo de las especies atrapadas, reti- res de medias de tratamientos (P < 0,05). rándolas de la trampa en cada muestreo.

SUR

I 3 1 2 4 5 VII VIII 2 5 1 3 4 30 m 4 5 2 1 3 II 4 5 2 3 1

160 m III 1 2 5 3 4

IV 3 2 1 4 5

110 m 60 m

5 1 2 3 4 V

2 3 5 4 1 VI

NORTE

Figura 6. Esquema del campo de soja con la distancia entre los ocho bloques. Cada bloque incluyó los cinco tratamientos, posicionados de forma aleatoria a 15 m entre sí. 22 Monitoreo y detección de epinotia Monitoreo y detección de epinotia 23 Paula Altesor* Andrés González* CAPÍTULO 4. Comportamiento *Laboratorio de Ecología Química, reproductivo de Facultad de Química. epinotia

La postura de llamada de las hembras res para horas, F = 274,06; P < 0,001). El se observó claramente en contraposición primer día de emergidas, la mayoría de a la postura de reposo. Durante el llama- las hembras no realizó postura de llama- do las hembras separaron las alas del da, observándose dicho comportamiento cuerpo, levantando el abdomen y curván- a partir del segundo día (en 88 % de las dolo hacia adentro, permaneciendo in- hembras) y encontrándose del tercero en móviles en esa posición. Se observó asi- adelante una mayor proporción de hem- mismo la extrusión de una estructura bras llamando (test de Tukey, P < 0,05) abdominal que contiene a la glándula (Figura 2). A medida que pasaron los emisora de feromona (Figura 1). días se observó también que las hembras Se encontraron diferencias significati- comenzaron antes a llamar, y el último vas en el comportamiento de llamada de día se registró la disminución en el núme- las hembras tanto en relación a los días ro de hembras llamando (90 %), sugirien- (edad) como a las horas de la fase oscura do el comienzo de la senescencia repro- (ANOVA de dos factores para edad, F = ductiva de las hembras. 339,01; P < 0,001; ANOVA de dos facto-

Figura 1. Hembra de epinotia en postura de llamada. En el extremo del abdomen se observa la glándula emisora de feromona, visible únicamente cuando la hembra está en la postura típica de llamada. 24 Monitoreo y detección de epinotia Proporción de hembras llamando

Figura 2. Proporción de hembras llamando a lo largo de la fase oscura, durante 7 días a partir de la emergencia de los adultos. Distintas letras en los días de la leyenda indican diferencias significativas en comparaciones de pares post- ANOVA de dos factores (P < 0,05; test de Tukey).

Tomando en cuenta únicamente los comienzo de la fase oscura (test de días de mayor número de hembras lla- Tukey, P < 0,05) (Figura 3). El tiempo mando (3 a 7) se encontró que un mayor promedio de llamada de las hembras fue número de hembras se colocó en dicha de 339 ± 25 min (prom. ± EE), con un postura entre las 5 y las 7 h después del rango de 75-585 min (calculado para el día 5). Proporción de hembras llamando

Figura 3. Proporción de hembras llamando durante las horas de la fase oscura entre los días 3 y 7 a partir de la emergencia de la hembra adulta. Las barras de error indican error estándar. Letras distintas sobre las barras muestran diferencias significativas en comparaciones de pares post-ANOVA de dos factores (P < 0,05; test de Tukey). Monitoreo y detección de epinotia 25 Paula Altesor* Andrés González* CAPÍTULO 5. Identificación de la *Laboratorio de Ecología Química, feromona sexual de Facultad de Química. epinotia

El extracto de glándulas de tre los índices de retención de ambos feromonas analizado por GC-EAD compuestos en la fase apolar, permitie- (electroantenograma acoplado a ron suponer que se trataba de una mez- cromatografía de gases) resultó cla alcohol/acetato. Los índices de re- en dos claras señales de las ante- tención en ambas fases se correspondie- nas de machos. Una de estas ron además con los reportados para alco- señales se correspondió con un holes y acetatos dodecadienilos conju- pico muy débil en el detector del gados, por lo que se decidió comparar el GC (FID), mientras que la otra no extracto con dos dodecadienilos reporta- tuvo correlato con un pico en el dos para una especie europea del género FID dada la poca cantidad de este Epinotia (E. tedella; Z7,Z9-12:Ac y Z7,Z9- compuesto en el extracto (Figura 12:OH). 1a). La coinyección en GC-EAD El análisis comparado de dichos es- del extracto con una solución de tándares sintéticos se correspondió en hidrocarburos permitió el cálculo forma exacta, tanto en GC-EAD como en de los índices de retención de los GC-MS, con los compuestos presentes compuestos a los que la antena en el extracto de glándulas (Figuras 1b y fue activa (IR = 1076 e IR = 2155 en 3). Asimismo, una comparación de dis- columna polar, IR = 1529 e IR = tintos isómeros de dodecadienilos conju- 1664 en columna apolar) (Figura gados permitió observar una clara se- 2). Asimismo, el intercambio de paración de los mismos, y una correla- las columnas de fases estaciona- ción entre tiempos de retención del rias distintas, permitió descubrir Z7,Z9-12:OH con el componente ma- que los dos componentes cambia- yoritario EAD-activo del extracto (Figu- ron el orden relativo de elusión de ra 4). Los resultados obtenidos permi- una columna a la otra, con el tieron concluir que la feromona de epi- compuesto mayoritario eluyendo notia está constituida por una mezcla antes en la columna apolar (IR = 15:1 de Z7,Z9-12:OH: Z7,Z9-12:Ac (Fi- 1529) y segundo en la columna gura 5), según la proporción de sus polar (IR = 2159). Esta inversión, y áreas relativas en el cromatograma de la diferencia de 135 unidades en- iones totales del GC-MS. 26 Monitoreo y detección de epinotia

Figura 1. Resultado del análisis por GC-EAD de a) extracto de glándulas de feromonas de hembras de epinotia, y b) una solución 100 ppm de los estándares sintéticos. La parte superior de ambas gráficas muestra la respuesta de la antena del macho (EAD), y la parte inferior la señal del detector del GC (FID). Se observa claramente que los estándares sintéticos coincidieron en tiempo de retención con los compuestos activos del extracto, y produjeron a su vez la misma respuesta electrofisiológica en la antena del macho.

Figura 2. Resultado de la coinyección del extracto de glándulas con una solución de hidrocarburos para el cálculo de índices de retención de los compuestos activos. La parte superior muestra la respuesta de la antena del macho y la inferior la señal simultánea del FID (coinyección del extracto con la solución de hidrocarburos). Monitoreo y detección de epinotia 27

Figura 3. Comparación de los cromatogramas de iones totales obtenidos del análisis del extracto de hembras (a, superior) con los compuestos sintéticos Z7,Z9-12:Ac y Z7,Z9-12-OH (a, inferior). Los espectros de masa de los compuestos naturales (b,d) fueron virtualmente idénticos a los de los compuestos sintéticos (c,e), al igual que sus tiempos de retención. 28 Monitoreo y detección de epinotia

Figura 4. a) Comparación de los tiempos de retención de Z7,Z9-12:OH (rojo) con el compuesto del extracto de glándulas identificado como tal; b) separación cromatográfica de distintos isómeros posicionales de dodecadienoles conjugados en GC-MS.

Figura 5. Estructuras químicas de Z7,Z9-12:OH (1) y Z7,Z9-12:Ac (2), componentes identificados en la feromona sexual de C. aporema (epinotia). Monitoreo y detección de epinotia 29 Paula Altesor*, Horacio Silva** Paola Liberati*, Leticia Alves*** CAPÍTULO 6. Juan Ramos***, Daniela Gamenara***, David González***, Ignacio Carrera*** Gustavo Seoane***, Carmen Rossini* Ensayos con Enrique Castiglioni**, Andrés González* feromona sintética * Laboratorio de Ecología Química, Facultad en laboratorio de Química. ** Departamento de Protección Vegetal. y campo Facultad de Agronomía. ***Laboratorio de Síntesis Orgánica, Facultad de Química.

ENSAYOS EN TÚNEL DE su parte, la proporción 1:1 (OH:Ac) fue la menos atractiva de las 3 proporciones VIENTO ensayadas (20 % de los machos respondieron), siendo diferente significativamen- El tiempo de inicio de vuelo de los te de la proporción más atractiva (15:1) machos en el túnel varió de unos pocos (OH:Ac) (Figura 2). segundos hasta varios minutos. Frente a hembras los machos iniciaron el movi- Respecto a la llegada a la fuente de miento por el túnel rápidamente, siendo olor, una cantidad significativamente este resultado significativamente diferen- mayor de machos probados en el trata- te del control aunque no de los restantes miento 15:1 (OH:Ac) (60 %) llegó a tocar tratamientos con diferentes proporcio- el estímulo en relación a los demás trata- nes de la feromona (Figura 1). mientos, incluyendo las hembras (Figura 3). La mayoría de los machos que se Por su parte, el comportamiento de posaron en la fuente de olor desarrollaron aleteo y vuelo en la pluma de los machos conductas de cortejo, tanto frente a hem- frente a la feromona fue mayor teniendo bras como a los septos de feromona, como estímulo la proporción 15:1 (OH:Ac) exponiendo las estructuras de pelos (co- (70 % de los machos respondieron). Por remata) del final del abdomen (Figura 4).

Figura 1. Tiempo de inicio del vuelo de los machos en túnel de viento frente a los diferentes tratamientos. Las barras indican error estándar. Letras distintas sobre las barras muestran diferencias significativas entre tratamientos (Test de Dunnett, P < 0,05). 30 Monitoreo y detección de epinotia

Figura 2. Porcentaje de machos que respondió con vuelos en la pluma y aleteos frente a los diferentes tratamientos. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas entre tratamientos (Test de Chi Cuadrado, P < 0,05).

Figura 3. Porcentaje de machos que llegó a la fuente de olor de los distintos tratamientos. Letras distintas sobre las columnas indican diferencias significativas (Test de Chi Cuadrado, P < 0,05). Monitoreo y detección de epinotia 31

Figura 4. Macho de epinotia volando en túnel de viento, atraído por el septo conteniendo la proporción 15:1 de los compuestos de la feromona (A) y una vez posado sobre el septo, intentando cortejarlo (B). Se observan las escamas levantadas y el coremata expuesto (Fotos: A. González).

mente mayores que las de los otros dos ENSAYOS DE CAMPO tratamientos (Test de Tukey, P < 0,05). Las capturas acumuladas se muestran El control y la proporción 0:1 (OH:Ac) en la Figura 6, atrapando el tratamiento no capturaron machos, por lo que no se 1:1 (OH:Ac) un promedio de 47,5 ma- incluyeron en el análisis. Considerando chos, el tratamiento 1:0 (OH:Ac) 27,6 las capturas promedio de los restantes machos y el tratamiento 15:1 (OH:Ac) tratamientos (Figura 5), encontramos un 20,6 machos en los 41 días que duró el pico máximo de capturas alrededor de experimento. los 30 días del experimento. Las capturas promedio del tratamiento con la pro- El muestreo de larvas arrojó un resul- porción 1:1 (OH:Ac) fueron significativa- tado muy bajo de infestación del cultivo, 32 Monitoreo y detección de epinotia encontrándose solamente una larva en este motivo no se pudo correlacionar un total de 2790 brotes revisados. Por capturas de adultos en trampas con la presencia de larvas en las plantas. Machos

Figura 5. Capturas promedio de machos por tratamiento durante el experimento. Letras distintas en la leyenda indica diferencias significativas entre tratamientos (Test de Tukey, P < 0,05). Machos

Figura 6. Capturas acumuladas de machos por tratamiento durante el experimento Monitoreo y detección de epinotia 33 Paula Altesor* Andrés González* CAPÍTULO 7. Discusión, *Laboratorio de Ecología Química, conclusiones y Facultad de Química. perspectivas

En la mayoría de los lepidópteros feromona sexual de epinotia, la descrip- nocturnos la emisión de feromonas está ción de su patrón temporal de llamada asociada con una postura estereotipada, fue imprescindible para obtener una ma- determinada generalmente por la separa- yor cantidad de feromona, realizando la ción y vibración de las alas y la extrusión, disección de las glándulas durante el a veces rítmicamente, de la glándula pico de llamada de las hembras (5-7 h de productora de feromona, ubicada al final la fase oscura) y a partir del segundo día del abdomen (Cardé y Haynes 2004). El de emergidas. comportamiento de llamada de las hem- Los compuestos Z7,Z9-12:OH y Z7,Z9- bras de epinotia consiste en el manteni- 12:Ac fueron identificados como consti- miento de una postura inmóvil caracteri- tuyentes de la feromona de epinotia en zada por la separación de las alas res- una proporción de 15:1 (OH:Ac) en las pecto al cuerpo, curvatura hacia adentro glándulas de las hembras. La proporción del abdomen, y extrusión de la glándula de los compuestos presentes en la glán- de feromonas. dula de feromona de epinotia podría no Como también ocurre en la mayoría ser la misma que la efectivamente emiti- de los lepidópteros nocturnos, la activi- da. Sin embargo, la proporción 15:1 de dad sexual de epinotia está regulada por los compuestos Z7,Z9-12:OH: Z7,Z9- el fotoperiodo. A partir del inicio de la fase 12:Ac fue la más atractiva en túnel de oscura se incrementa la actividad de viento. Inclusive, dicha respuesta fue vuelo de ambos sexos, disminuyendo superior a la obtenida frente a hembras con el inicio de la fase clara. El aparea- llamando, lo cual puede deberse a que miento ocurre durante la noche, mayor- las hembras no emiten feromona en for- mente entre las 4 y 6 h de la fase oscura, ma continua, a pesar de mantenerse en estando relacionado con el período de postura de llamada durante todo el expe- mayor cantidad de hembras en postura rimento. de llamada (5-7 h de la fase oscura) La proporción 1:0 (OH:Ac), contenien- (Altesor et al., 2010). A diferencia de dos do únicamente el compuesto mayorita- tortrícidos relacionados, Pandemis pyru- rio, genera una respuesta atractiva de los sana y Argyrotaenia citrana, que son acti- machos, que no obstante no se concreta vos sexualmente desde la primer noche de en el arribo a la fuente. Esto demuestra lo emergidos (Knight 1996, Knight y Turner crucial de la presencia del acetato en la 1998), epinotia no presenta actividad algu- mezcla para producir una respuesta com- na en su primer noche. Sin embargo, la portamental completa en los machos, a mayoría de las hembras llaman a partir pesar de presentarse en pequeña canti- de la segunda noche y se aparean rápida- dad respecto al alcohol. Por su parte, la mente (Altesor et al., 2010). proporción 1:1 (OH:Ac) redunda también La cantidad de feromona producida en una menor respuesta de llegada de los por las hembras de lepidópteros es muy machos a la feromona, debido en este baja (en el orden de nanogramos) aunque caso al exceso del compuesto minorita- suficiente para atraer a los machos des- rio. La especificidad de la respuesta a la de grandes distancias (Cardé y Haynes feromona sexual de lepidópteros reside 2004). Con miras a lograr identificar la no solamente en los componentes de la 34 Monitoreo y detección de epinotia misma, sino también en sus proporcio- puede haber registrado un pico poblaciones relativas, siendo crítico en especies nal del insecto, indicando que las tram- simpátricas que utilizan los mismos com- pas de feromonas para el monitoreo po- puestos para la atracción entre sexos blacional de epinotia tendrían una dura- (Ando et al., 2004). Es así que la deter- ción significativa en campo. A pesar del minación de los compuestos presentes prácticamente nulo nivel de infestación en la feromona de este insecto, y la de larvas, las trampas de feromona fue- mezcla más atractiva de los mismos, ron capaces de capturar adultos, mos- constituye un paso crucial para la imple- trando que son eficientes en la detección mentación de trampas de monitoreo de del insecto aún con cargas muy bajas de epinotia en cultivos. feromona en el septo (0.1 mg/septo), y A diferencia del experimento en túnel en niveles poblacionales bajos. de viento, donde se obtuvo una mayor Epinotia es una plaga considerada llegada de machos al septo con la pro- importante en cultivos de leguminosas, porción presente en la glándula (15:1 aunque ha devenido en menor relevancia OH:Ac) (Altesor et al., 2009), en el expe- en los últimos años, posiblemente por rimento de campo el promedio de captu- efectos climáticos y la ausencia de hos- ras en trampas de feromona fue mayor pederos invernales. En particular, la tem- para la proporción 1:1 (OH:Ac) (Gonzá- porada del experimento de campo (2009) lez et al., 2102). Una posible explicación se caracterizó por una intensa sequía para la diferencia encontrada en túnel de que afectó considerablemente los culti- viento y campo, es que en éste se da la vos de verano, y en particular la soja. En evaporación paulatina y diferencial de los el mismo período del año anterior, un compuestos absorbidos en el septo, trabajo preliminar con trampas cebadas mientras que en el primero cada réplica con la proporción 1:1 (OH:Ac), arrojó un se realiza con un septo nuevo e inmedia- nivel máximo de capturas de 653 ma- tamente después de cargar el mismo con chos, cifra mucho mayor a la obtenida en la mezcla a evaluar. En la evaporación de 2009 (47,5 machos). los compuestos que componen la fero- La síntesis de los componentes de mona incide tanto el peso molecular como la feromona sexual de epinotia es un el grupo funcional presente (Butler y paso esencial para el desarrollo de una McDonough 1979, Butler y Mc Donough herramienta de monitoreo, ya que éstos 1981, Gut 2004). Los compuestos con no están disponibles en el mercado. Los mayor peso molecular tienen menor pre- componentes no resultaron sencillos de sión de vapor, y por tanto se evaporan sintetizar, en particular por la presencia menos que los compuestos con menor de un sistema conjugado de configura- peso molecular. El grupo funcional hi- ción Z,Z. Se logró inicialmente sintetizar droxilo (OH), por su parte, resulta en un una pequeña cantidad que permitió reali- compuesto más polar y por tanto menos zar los experimentos de campo, y más volátil, a diferencia del grupo acetilo (Ac) recientemente se logró la síntesis de (Gut 2004). En este contexto, podría mayores cantidades (González et al., suponerse que en condiciones de campo 2012), lo cual hace viable el desarrollo de el tratamiento con la proporción 15:1 trampas de monitoreo a escala producti- (OH:Ac) de la feromona pasó rápidamen- va. Los detalles técnicos de la síntesis te a ser similar al de la proporción 1:0 desarrollada exceden los objetivos de (OH:Ac), tratamientos que registraron si- esta publicación. milares niveles de captura. Asimismo, el tratamiento con la proporción 1:1 (OH:Ac) Como conclusiones finales, el marco fue enriqueciéndose en el alcohol, acer- de este proyecto se identificó química- cándose durante el correr del experimento mente la feromona sexual de Crocidose- a la proporción presente en la glándula ma (=Epinotia) aporema, siendo éste el (15:1, OH:Ac), y siendo por lo tanto más primer caso de una feromona química- atractiva que los restantes tratamientos mente identificada en Uruguay. La fero- durante la mayor parte del experimento. mona está compuesta por (Z,Z)-7,9-do- decadien-1-ol y acetato de (Z,Z)-7,9-do- El aumento del nivel de capturas en decadienilo. El alcohol es el componente los tratamientos 15:1 (OH:Ac) y 1:0 mayoritario en las glándulas de las hem- (OH:Ac) a los 30 días del experimento bras, sin embargo, la proporción más Monitoreo y detección de epinotia 35 efectiva para el monitoreo de epinotia en y del interés de un mediador comercial, ya campo, y por lo tanto la recomendación que los componentes de la feromona puede uso como resultado de este proyecto, den producirse en Uruguay, y las trampas es la formulación 1:1. Las evaluaciones pueden formularse y confeccionarse a nivel de campo demostraron que aún con nive- local. les mínimos de la feromona en trampas de tipo delta (0,1 mg por trampa, sin reposición), la capacidad de captura de BIBLIOGRAFÍA la feromona alcanza los 40 días. Por lo ADAMS, R. P. 2007. Identification of essential tanto, el uso de trampas de feromonas oil components by Gas Chromatography/ para el monitoreo de poblaciones de epi- Mass Spectrometry. Allured Publishing notia en soja y leguminosas forrajeras es Corporation, Carol Stream, Illinois. viable, tanto por la buena capacidad de ALTESOR, P.; ROSSINI, C.; ZARBIN, P.H.G.; captura observada en nuestros experi- GONZÁLEZ, A. 2009. Sex Pheromone of the mentos, como por la duración de las Bud Borer Epinotia aporema: Chemical trampas. En el caso de cultivos de soja, Identification and Male Behavioral Response. donde las evaluaciones de campo fueron Journal of Chemical Ecology, 35, 349-354. realizadas, las trampas deben ubicarse ALTESOR, P.; HORAS, V. R.; ARCIA, M. P.; inmediatamente sobre la altura del follaje. ROSSINI, C.; ZARBIN, P. H. G.; GONZÁLEZ, A. 2010. Reproductive behaviour of La captura de machos en las trampas Crocidosema (=Epinotia) aporema de feromona fue alta, aún cuando las (Walsingham) (Lepidoptera: Tortricidae): poblaciones de larvas fueron práctica- temporal pattern of female calling and mating. Neotropical Entomology, 39(3), 324-329. mente nulas. De esta manera, no se logró realizar una correlación cuantitativa ALZUGARAY, R.; RIBEIRO, A. 2000. Insectos en entre capturas de machos en trampas y pasturas. INIA Serie Técnica: Manejo de plagas en pasturas y cultivos (eds S. población residente o esperable de lar- Zerbino & A. Ribeiro), pp. 13-30. INIA, vas. Por lo tanto, las trampas de feromo- Montevideo. na de epinotia serían aplicables como ALZUGARAY, R.; ZERBINO, M. S.; STEWART, estrategia de detección del insecto, que- S.; RIBEIRO, A.; EILENBERG, J. 1999. dando pendiente un estudio para estable- Epizootiology of Entomophthoralean fungi. cer umbrales de captura y correlación Use of Zoophthora radicans (Brefeld) Batko captura/daño. (Zygomicotina: Entomophthorales) for the biocontrol of Epinotia aporema (Wals.) La baja en las poblaciones de epino- (Lepidoptera: Tortricidae) in Uruguay. tia es un patrón general que se ha observa- Revista de la Sociedad Entomológica do en los últimos años, y que puede deber- Argentina, 58, 307-311. se a una variedad de razones ecológicas (y ANDO, T.; INOMATA, S.-I. ; YAMAMOTO, M. agro-ecológicas), como la sustitución de 2004. Lepidopteran Sex Pheromones. Topics un sistema tradicional de rotación entre in Current Chemistry, 239, 51-96. pasturas y cultivos de invierno por grandes ARN H.; BRAUCHLI J.; KOCH U.T.; POP L.; extensiones de soja, y una disminución en RAUSCHER S. 1997. The need for standards in pheromone technology. IOBC wprs el área destinada a pasturas. El sistema Bulletin 20:27-34. tradicional de producción proporcionaba hospederos para epinotia durante todo el BENTANCOURT, C.; SCATONI, I. 1999. Guía de insectos y ácaros de importancia agrícola año, situación que ha cambiado en los y forestal en el Uruguay. Hemisferio Sur últimos años. Es de prever, sin embargo, SRL. que los sistemas de producción agrícola- BENTANCOURT, C.; SCATONI, I. 2001. ganadera en Uruguay sean cambiantes, y Enemigos naturales : Manual ilustrado para con ellos, pueden darse las condiciones la agricultura y la forestación. Eds. Facultad para favorecer la vuelta de epinotia como de Agronomía. GTZ. Hemisferio Sur SRL, plaga primaria. En este caso, se dispondrá Montevideo, Uruguay. de una herramienta de monitoreo basada BENTANCOURT, C.; SCATONI, I. 2006. en feromonas como resultado de la ejecu- Lepidópteros de importancia económica. ción de este proyecto. La viabilidad de Reconocimiento, biología y daños de las plagas agrícolas y forestales. Agropecuaria alcanzar la producción nacional y comer- Hemiferio Sur SRL, Montevideo, Uruguay. cialización de trampas de feromonas de BJOSTAD, L. B. 1998. Electrophysiological epinotia depende únicamente del surgi- Methods. Methods in Chemical Ecology. miento de una demanda para las mismas, Chemical Methods. (eds K. F. Haynes & J. 36 Monitoreo y detección de epinotia

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