Μελέτη Της Προθυμοσίνης Α Με Τη Χρήση Ειδικών Ραδιοεπισημασμένων Παραγώγων Του Μορίου Σε in Vitro Και in Vivo Τεχνικές

ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ

ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ

ΤΜΗΜΑ ΧΗΜΕΙΑΣ

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

Μελέτη της Προθυμοσίνης α με τη χρήση ειδικών ραδιοεπισημασμένων παραγώγων του μορίου σε in vitro και in vivo τεχνικές

ΚΑΡΑΧΑΛΙΟΥ ΧΡΥΣΟΥΛΑ-ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ M.Sc. Βιοχημείας

ΑΘΗΝΑ

ΑΠΡΙΛΙΟΣ 2015

ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ

ΧΡΥΣΟΥΛΑ-ΕΥΑΓΓΕΛΙΑ ΚΑΡΑΧΑΛΙΟΥ

Α.Μ.: 001028

ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: Ντία Γαλανοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΠΑΡΑΚΟΛΟΥΘΗΣΗΣ:

Ντία Γαλανοπούλου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Χημείας ΕΚΠΑ Ουρανία Τσιτσιλώνη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Βιολογίας ΕΚΠΑ Ευαγγελία Λιβανίου, Διευθύντρια Ερευνών Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος»

ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

Ντία Γαλανοπούλου Αναπ. Καθηγήτρια

Ουρανία Τσιτσιλώνη Αναπ. Καθηγήτρια

Δημήτρης Γεωργιάδης Επικ. Καθηγητής

Δημήτρης Στραβοπόδης Επικ. Καθηγητής

Ευαγγελία Λιβανίου Ερευνήτρια Α΄

Μηνάς Παπαδόπουλος Ερευνητής Α΄

Ιωάννης Πιρμεττής Ερευνητής Α΄

ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΕΞΕΤΑΣΗΣ 29/04/2015

ΠΕΡΙΛΗΨΗ

Η Προθυμοσίνη α (ΠροΤα) αποτελεί ένα εξελικτικά συντηρημένο πολυπεπτίδιο των θηλαστικών (μήκους 109 αμινοξέων στον άνθρωπο), το οποίο εμφανίζει πλειοτροπική ανοσοενισχυτική δράση. Το αμινο(Ν)-τελικό θραύσμα [1-28] του μορίου, το οποίο ταυτίζεται με το ανοσοενισχυτικό πεπτίδιο Θυμοσίνη α1 (Τα1) θεωρήθηκε αρχικά ως η ανοσοδραστική περιοχή του πολυπεπτιδίου. Πρόσφατα όμως δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΠροΤα ασκεί μια διακριτή ανοσοεπαγωγική δράση μέσω του καρβοξυ(C)-τελικού της θραύσματος [100-109] ή της κεντρικής περιοχής [51-89], στοχεύοντας τον υποδοχέα τύπου Toll 4 (Toll Like Receptor 4, TLR4). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής, αναπτύχθηκε ένα εξειδικευμένο παράγωγο της C-τελικής περιοχής ΠροΤα[100-109] (ΠροΤα-D1), ικανό να ραδιοεπισημανθεί με τεχνήτιο-99m (99mTc). Η ανοσοδραστικότητα του συμπλόκου του νέου παραγώγου με μη ραδιενεργό ρήνιο (185/187Re) ([185/187Re]ΠροΤα- D1), δομικά όμοιο με το [99mTc]ΠροΤα-D1, αξιολογήθηκε in vitro σε κατάλληλη ανοσοδοκιμασία και σε δοκιμασία κινητικής μελέτης της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, συγκριτικά πάντα με την αντίστοιχη δραστικότητα του ακέραιου μορίου της ΠροΤα, διαφόρων πεπτιδικών ΠροΤα-παραγώγων αλλά και κατάλληλων αρνητικών μαρτύρων. Μελέτες κυτταρικής δέσμευσης που ακολούθησαν αποκάλυψαν εξειδικευμένη πρόσδεση του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, η οποία είναι χρονο-εξαρτώμενη, υπόκειται σε κορεσμό και αναστέλλεται από την παρουσία του ακέραιου μορίου της ΠροΤα, του θραύσματος ΠροΤα[100-109] και του λιποπολυσακχαρίτη LPS, αλλά όχι από την Τα1, το κεντρικό θραύσμα ΠροΤα[51-89] και τους αρνητικούς μάρτυρες. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ύπαρξη ειδικών θέσεων πρόσδεσης της ΠροΤα σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, οι οποίες αναγνωρίζουν την C-τελική περιοχή ΠροΤα[100-109] και πιθανότατα εμπλέκουν τον υποδοχέα TLR4. Χάρη στις ιδιότητες του ραδιοϊσοτόπου που χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση του παραγώγου, το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1 αξιολογήθηκε περαιτέρω σε in vivo μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης σε μοντέλο φλεγμονής σε ποντίκια. Οι μελέτες αυτές έδωσαν σημαντικές πληροφορίες φαρμακοκινητικής φύσεως αλλά κυρίως κατέδειξαν την ικανότητα του [99mTc]ΠροΤα-D1 για εκλεκτική στόχευση εστιών φλεγμονής. Η στρατολόγηση του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε τόπους φλεγμονής, με βάση και τα αποτελέσματα κατάλληλου αρνητικού μάρτυρα, είναι ειδική και οφείλεται στην παρουσία της C-τελικής περιοχής ΠροΤα[100-109]. Συνολικά, η παρούσα διατριβή συνέβαλλε στη συλλογή σημαντικών πληροφοριών για την αποσαφήνιση του εξωκυτταρικού ρόλου της ΠροΤα, οι οποίες θα διευκολύνουν την πιθανή μελλοντική αξιοποίηση του πολυπεπτιδίου ή και του μικρότερου C-τελικού δεκαπεπτιδίου ΠροΤα[100- 109] στην κλινική πράξη.

Θεματική περιοχή: Βιοχημεία-Ανοσοχημεία-Ανοσολογία

Λέξεις-κλειδιά: προθυμοσίνη α (ΠροΤα), επισήμανση πεπτιδίων με 99mTc, ανθρώπινα ουδετερόφιλα, in vitro μελέτες κυτταρικής δέσμευσης, in vivo μελέτες βιοκατανομής και απεικόνισης.

ABSTRACT

Prothymosin alpha (ProTα) is a conserved mammalian polypeptide (human sequence 109 amino acid-long) exerting a pleiotropic immunoenhancing activity. The N-terminal fragment [1-28] of the molecule, which is identical with the immunostimulating peptide thymosin α1 (Tα1), was earlier considered as the immunoactive region of the polypeptide; however, recent data suggest that ProTα may exert a discrete immunomodulating action through its C-terminal decapeptide [100-109] or its central region [51-89], via targeting Toll-like receptor- 4 (TLR4). In the frame of this work, a derivative of the C-terminal fragment ProTα[100-109] (ProTα-D1) that can be radiolabeled with 99mTc was developed. The biological activity of the non-radioactive 185/187rhenium-complex of this derivative ([Re]ProTα-D1, structurally similar with [99mTc]ProTα-D1) was evaluated in suitable in vitro bioassays and in assays correlated with TLR4 surface expression using human neutrophils, in comparison with intact ProTα, various synthetic ProTα fragments/derivatives and negative control peptides. Subsequent cell-binding studies revealed specific, time-dependent and saturable binding of [99mTc]ProTα-D1 on neutrophils, which was inhibited by intact ProTα and the synthetic ProTα[100-109], as well as by a “prototype” TLR4-ligand (lipopolysaccharide from Escherichia coli, LPS), but not by synthetic Τα1, the central ProTα region and negative control peptides. Our results support the existence of ProTα-binding sites on human neutrophils, recognizing the C-terminal region [100-109], which might involve TLR4. Due to the properties of the radioisotope used for the labeling, [99mTc]ProTα-D1 was further evaluated in in vivo biodistribution and whole body imaging studies in mice bearing an inflammation model. These studies provided important information related to the pharmacokinetic profile of [99mTc]ProTα-D1 but above all revealed the capacity of [99mTc]ProTα-D1 to selectively target inflammatory loci in vivo. The accumulation of [99mTc]ProTα-D1 in inflammatory sites is specific and due to the presence of the C-terminal decapeptide ProTα[100-109]. Overall, the present thesis significantly contributed to the enrichment of our basic knowledge on the extracellular mode of action of ProTα, both in vitro and in vivo. Additionally, such data will facilitate future exploitation of the polypeptide or a smaller active fragment thereof, such as ProTα[100-109], in the clinical setting.

SUBJECT AREA: Biochemistry-Immunochemistry-Immunology

KEYWORDS: prothymosin α (PrοΤα), 99mTc radiolabeling, human neutrophils, in vitro cell binding studies, in vivo biodistribution and imaging studies.

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

ΠΡΟΛΟΓΟΣ 23

Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 25

1. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1: ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 27

1.1 Φυσική και επίκτητη ανοσία 28

1.2 Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος 29

1.3 Όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος 31

1.4 Ανοσοποιητικό σύστημα και Φλεγμονή 33

1.5 Ουδετερόφιλα 38

1.5.1 Μετανάστευση των ουδετερόφιλων σε εστίες φλεγμονής/Mηχανισμοί 39

εξάλειψης βλαπτικών παραγόντων

2. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2: ΘΥΜΟΣΙΝΕΣ 43

2.1 Θυμοσινικό κλάσμα 5-Θυμοσίνες 43

2.2 α-θυμοσίνες 45

2.3 Προθυμοσίνη α 46

2.3.1 Δομή της προθυμοσίνης α 47

2.3.2 Κυτταρικός εντοπισμός της προθυμοσίνης α 49

2.3.3 Υποκυτταρικός εντοπισμός της προθυμοσίνης α 50

2.4 Βιολογικός ρόλος της προθυμοσίνης α 51

2.4.1 Εξωκυτταρικός ρόλος της προθυμοσίνης α 53

2.4.2 Πιθανοί υποδοχείς της προθυμοσίνης α 57

3. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3: ΡΑΔΙΟΪΣΟΤΟΠΑ ΤΕΧΝΗΤΙΟΥ και ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΑ ΡΑΔΙΟΦΑΡΜΑΚΑ ΓΙΑ ΤΗΝ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΦΛΕΓΜΟΝΗΣ 61

3.1. Γενικά στοιχεία για Τεχνήτιο-Ρήνιο 61

3.1.1 Τεχνήτιο 61

3.1.2 Ρήνιο 65

3.2. Μέθοδοι παρασκευής συμπλόκων του τεχνητίου-99m 65

3.3. Ραδιοεπισημασμένες ενώσεις για την διάγνωση της φλεγμονής 68

ΣΚΟΠΟΣ 71

Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 73

4. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4: ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 75

4.1. Σύνθεση, καθαρισμός και ταυτοποίηση πεπτιδίων 75

4.1.1 Συνθετικά πεπτίδια και βιολογικές εφαρμογές 75

4.1.2 Πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης 76

4.1.3 Καθαρισμός και ανάλυση πεπτιδίων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) 87

4.2 Σύμπλεξη των πεπτιδικών παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με ψυχρό

185/187 Re και ταυτοποίησή τους 91

4.2.1 Σύμπλεξη πεπτιδίων με ψυχρό 185/187 Re 91

4.2.2 Καθαρισμός και ανάλυση μη ραδιενεργών συμπλόκων με υγρή

χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) 92

4.3 Αξιολόγηση του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 σε κυτταρικό σύστημα

ανθρώπινων ουδετερόφιλων 93

4.3.1 Απομόνωση ουδετερόφιλων από ανθρώπινο περιφερικό αίμα 93

4.3.2 Μελέτη της επίδρασης του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 στην ενδοκυτταρική

παραγωγή ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα 96

4.3.3 Επίδραση του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 στην επιφανειακή έκφραση του

υποδοχέα TLR4 103

4.4 Ραδιοεπισήμανση των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με 99m Tc/

Ραδιοχημική ανάλυση 105

4.5. Μελέτες αξιολόγησης των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα 107

4.5.1 Μελέτες σταθερότητας των συμπλόκων του τεχνητίου 107

4.5.1.1 Μελέτες σταθερότητας στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από

απομόνωση με radio-HPLC 107

4.5.1.2 Μελέτες σταθερότητας παρουσία περίσσειας κυστεΐνης 108

4.5.1.3 Μελέτες σταθερότητας παρουσία ανθρώπινου πλάσματος 108

4.5.2 In vitro μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσης του συμπλόκου

[99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα 109

4.5.2.1 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών στις μελέτες κυτταρικής δέσμευσης

του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα 110

4.5.2.2 Μελέτες κορεσμού θέσεων δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1

στην επιφάνεια ανθρώπινων ουδετερόφιλων 111

4.5.2.3 Μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης 113

4.5.3 In vivo μελέτες σε πειραματόζωα 114

4.5.3.1 Εγκαθίδρυση μοντέλου φλεγμονής 114

4.5.3.2 Μελέτες βιοκατανομής 116

4.5.3.3 Μελέτη μεταβολικού "αποτυπώματος" των

ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα σε ούρα ποντικού 118

4.5.3.4 Σπινθηρογραφικές μελέτες των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων

της ΠροΤα με γ-κάμερα σε ποντικούς με πειραματικώς

προκληθείσα φλεγμονή 118

5. ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5: ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 121

5.1 Σύνθεση, καθαρισμός και ταυτοποίηση πεπτιδικών τμημάτων της ΠρoTα 121

5.2 Σύμπλεξη των παραγώγων της ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με ψυχρό 185/187Re,

καθαρισμός και ταυτοποίηση των συμπλόκων 126

5.3 Αξιολόγηση της ανοσοενισχυτικής δραστικότητας του παραγώγου

[Re]ΠροΤα-D1 σε σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων 128

5.3.1 Μελέτη της επίδρασης του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 στην ενδοκυτταρική

παραγωγή ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα 128 15

5.3.2 Μελέτη της επίδρασης του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 στην κινητική

της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα 131

5.4 Ραδιοεπισήμανση των παραγώγων της Προτα-D1 και Προτα-D2 με

Τεχνήτιο-99m (99mTc)/Ραδιοχημικός έλεγχος 133

5.5. Μελέτες σταθερότητας των επισημασμένων συμπλόκων 136

5.5.1 Σταθερότητα των συμπλόκων στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά

από απομόνωση με radio-HPLC 136

5.5.2 Σταθερότητα των συμπλόκων παρουσία περίσσειας κυστεΐνης 137

5.5.3 Σταθερότητα των συμπλόκων παρουσία ανθρώπινου πλάσματος 138

5.6. Μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα

ουδετερόφιλα 138

5.7. In vivo μελέτες σε πειραματόζωα 143

5.7.1 Μελέτες βιοκατανομής σε πειραματόζωα με πειραματικώς προκληθείσα

φλεγμονή 143

5.7.2 Μελέτη μεταβολικής σταθερότητας των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και

[99mTc]ΠροΤα-D2 σε δείγμα ούρων ποντικιών με πειραματικώς

προκληθείσα φλεγμονή 146

5.7.3 Σπινθηρογραφικές μελέτες των παραγώγων [99mTc]ΠροΤα-D1 και

[99mTc]ΠροΤα-D2 σε πειραματόζωα με πειραματικώς προκληθείσα

φλεγμονή 148

Γ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 151

Δ. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 159

Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 163

Ζ. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I 175

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΣΧΗΜΑΤΩΝ

Σχήμα 1.1: Αιμοποίηση 29

Σχήμα 1.2: Το λεμφικό σύστημα του ανθρώπου 32

Σχήμα 1.3: Πηγή και ρόλος της IL-1 στην οξεία άσηπτη φλεγμονή 36

Σχήμα 1.4: Διαγραμματική απεικόνιση της τυπικής μορφολογίας των ουδετερόφιλων 38

Σχήμα 1.5: Ο «αναβαθμισμένος» κλασικός καταρράκτης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων από την συστηματική κυκλοφορία στους ιστούς 40

Σχήμα 1.6: Μηχανισμοί θανάτωσης παθογόνων μικροοργανισμών από τα ουδετερόφιλα 41

Σχήμα 2.1: Πρωτοταγείς δομές μορίων ΠρoTα από διάφορα ζωικά είδη 47

Σχήμα 2 .2: Σχηματική αναπαράσταση του προτεινόμενου μοντέλου όσον αφορά

στον τρόπο δράσης της ΠρoTα σε μονοπύρηνα περιφερικού αίματος 57

Σχήμα 3.1: Τρόπος παραγωγής του 99mTc από το 99Mo 62

Σχήμα 3.2: Σχηματική απεικόνιση γεννήτριας 99Mo-99mTc 63

Σχήμα 3.3: Σχηματική απεικόνιση συνερμογής του 99mTc με τον χηλικό συμπλέκτη

dmGly-Ser-Cys 68

Σχήμα 4.1: Σχηματική απεικόνιση της μεθοδολογίας πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση 70

Σχήμα 4.2: Αντίδραση νινυδρίνης με ελεύθερη αμινομάδα 84

Σχήμα 4.3: Διαχωρισμός κυττάρων περιφερικού αίματος έπειτα από φυγοκέντρηση σε κλίση Ficoll-Histopaque 95

Σχήμα 4.4: Θετικά και αρνητικά ουδετερόφιλα για την δοκιμασία αναγωγής του NBT 99

Σχήμα 4.5: Δομή της χρωστικής CM-H2DCFDA 100

Σχήμα 4.6: Σχηματική αναπαράσταση της πορείας που ακολουθήθηκε για τις μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 στην επιφάνεια ανθρώπινων ουδετερόφιλων 111

Σχήμα 4.7: Σχηματική απεικόνιση της πορείας των in vivo μελετών 115

Σχήμα 4.8: Απεικονιστική διάταξη πειραματικής γ-κάμερας 119

Σχήμα 5.1: Πρωτοταγής δομή της ανθρώπινης ΠροΤα 121

Σχήμα 5.2: Χρωματογράφημα αναλυτικής RP-HPLC για το συνθετικό παράγωγο

ΠροΤα-D1 μετά τον καθαρισμό του 124

Σχήμα 5.3: Χρωματογράφημα αναλυτικής RP-HPLC για το συνθετικό παράγωγο

ΠροΤα-D2 μετά τον καθαρισμό του 124

Σχήμα 5.4: Συγκεντρωτικά αποτελέσματα από την δοκιμασία αναγωγής του ΝΒΤ

σε ουδετερόφιλα 10 δοτών, εκφρασμένα ως % ποσοστό θετικών κυττάρων 129

Σχήμα 5.5: Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα μελετών ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα ενός υγιούς δότη από τους συνολικά 3 που ελέγχθησαν 130

Σχήμα 5.6: Κινητική μελέτη επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα 132

Σχήμα 5.7: Χρωματογραφική ανάλυση του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 εφαρμόζοντας τα gradients I και II 134

Σχήμα 5.8: Χρωματογραφική ανάλυση του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D2 εφαρμόζοντας τα gradients I και II 134

Σχήμα 5.9: Συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση των συμπλόκων [Re]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D1 136

Σχήμα 5.10: Σταθερότητα των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 παρουσία περίσσειας κυστεΐνης 137

Σχήμα 5.11: Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα-Καμπύλη κορεσμού 140

Σχήμα 5.12: Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα- Καμπύλες εκτόπισης της ειδικής δέσμευσης παρουσία ψυχρών πιθανών ανταγωνιστών 141

Σχήμα 5.13: Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα- Καμπύλη εκτόπισης της ειδικής δέσμευσης παρουσία ψυχρού LPS 142 Σχήμα 5.14: Radio-HPLC χρωματογράφημα του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1: Α) στο μίγμα της επισήμανσής του και, Β) σε δείγμα ούρων ποντικού, έπειτα από ενδοφλέβια χορήγησή του και παραμονή 30 min in vivo 147 Σχήμα 5.15: Χαρακτηριστικές στατικές λήψεις πειραματικής γ-κάμερας από σπινθηρογραφικές απεικονίσεις των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 σε ποντίκια που έφεραν παθολογικό πρότυπο φλεγμονής 149

ΚΑΤΑΛΟΓΟΣ ΠΙΝΑΚΩΝ

Πίνακας 4.1: Αμινοξική αλληλουχία των πεπτιδικών μορίων που συνετέθησαν 81

Πίνακας 4.2: Επιμήκυνση της αλυσίδας των πεπτιδικών τμημάτων της ΠρoTα

μετά την αγκυροβόληση του πρώτου αμινοξέος πάνω στην ρητίνη 85

Πίνακας 4.3: Σύσταση των μιγμάτων αποκοπής των πεπτιδικών παραγώγων 86

Πίνακας 4.4: Συνθήκες ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC για κάθε συνθετικό πεπτιδικό παράγωγο 90

Πίνακας 4.5: Συνθήκες αναλυτικής RP-HPLC για κάθε συνθετικό πεπτιδικό παράγωγο 90

Πίνακας 4.6: Συνθήκες ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC για τα σύμπλοκα [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2 92

Πίνακας 4.7: Συνθήκες αναλυτικής RP-HPLC για τα σύμπλοκα [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2 92

Πίνακας 4.8: Προσθήκη αντιδραστηρίων ανά ομάδα σωλήνων eppendorf κατά

την δοκιμασία αναγωγής του NBT 98

Πίνακας 4.9: Συνθήκες αναλυτικής radio-RP-HPLC για τα ραδιενεργά σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 106

Πίνακας 4.10: Μη ραδιοεπισημασμένες ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ως πιθανοί αναστολής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα 113

Πίνακας 4.11: Πρωτόκολλο μελέτης βιοκατανομής των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα 117

Πίνακας 5.1: Αμινοξική αλληλουχία των πεπτιδικών τμημάτων/παραγώγων της ΠροΤα που συνετέθησαν και οι συνολικές αποδόσεις σύνθεσής τους 122

Πίνακας 5.2: Πειραματικές και θεωρητικές μοριακές μάζες των συνθετικών παραγώγων/πεπτιδίων 125

Πίνακας 5.3: Συνθήκες σύμπλεξης, απόδοση αντίδρασης και χρόνοι έκλουσης για τα δύο σύμπλοκα των παραγώγων της ΠροΤα με 185/187Re 126

Πίνακας 5.4: Συνθήκες επισήμανσης, απόδοση αντίδρασης και χρόνοι έκλουσης για τα ραδιενεργά σύμπλοκα 133

Πίνακας 5.5: Χρόνοι έκλουσης των συμπλόκων του 185/187Re και του 99mTc κατά την ταυτόχρονη συγκριτική χρωματογραφική ανάλυσή τους 135

Πίνακας 5.6: Σταθερότητα των συμπλόκων της ΠροΤα με 99mTc στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από απομόνωση με radio-HPLC 137

Πίνακας 5.7: Δέσμευση των 99mTc-συμπλόκων της ΠροΤα στις πρωτεΐνες ανθρώπινου πλάσματος 138

Πίνακας 5.8: Βέλτιστες συνθήκες διεξαγωγής των in vitro μελετών κυτταρικής δέσμευσης 139

Πίνακας 5.9: Τιμές IC50 για τους ψυχρούς ανταγωνιστές υπολογισμένες μέσω του GraphPad Prism 6 142

Πίνακας 5.10: Αποτελέσματα βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ποντικούς Swiss albino με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή, εκφρασμένα ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά όργανο και ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά γραμμάριο ιστού 144

Πίνακας 5.11: Αποτελέσματα βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D2 σε ποντικούς Swiss albino με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή, εκφρασμένα ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά όργανο και ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά γραμμάριο ιστού 145

Πίνακας I.1: Συντομογραφίες των πρωτεϊνικών αμινοξέων 175

ΠΡΟΛΟΓΟΣ

Η παρούσα διατριβή εκπονήθηκε κατά τα έτη 2011-2015 στο εργαστήριο Ανοσοχημείας- Ανοσοπεπτιδικής Χημείας του Ινστιτούτου Πυρηνικών & Ραδιολογικών Επιστημών & Τεχνολογίας, Ενέργειας & Ασφάλειας (Ι.Π.Ρ.Ε.Τ.Ε.Α.) του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος», υπό την επίβλεψη της Δρ. Ε. Λιβανίου (υπεύθυνη εργαστηρίου), σε συνεργασία με το εργαστήριο Βιοχημείας του Τμήματος Χημείας του Πανεπιστημίου Αθηνών, υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κας Ν. Γαλανοπούλου.

Θα ήθελα να ευχαριστήσω το Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος» τόσο για την παροχή υποτροφίας (4 έτη) όσο και για την διάθεση της υλικοτεχνικής υποδομής για την πραγματοποίηση της παρούσας διατριβής.

Ευχαριστώ πολύ την Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Χημείας του Ε.Κ.Π.Α. κα Ντία Γαλανοπούλου για τις συμβουλές και τις διορθώσεις της κατά την διάρκεια εκπόνησης της παρούσας εργασίας.

Ευχαριστώ από καρδιάς την επιβλέπουσά μου Δρ. Ευαγγελία Λιβανίου για την ανάθεση του θέματος της ερευνητικής μου εργασίας, τη συνεχή καθοδήγηση, την υποστήριξη και την αγάπη της κατά τη διάρκεια εκπόνησης και συγγραφής της παρούσας διατριβής.

Στην κα Ουρανία Τσιτσιλώνη, Αναπληρώρια Καθηγήτρια και υπεύθυνη του εργαστηρίου Ανοσολογίας του Τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α., ανήκει ένα πολύ μεγάλο ευχαριστώ για την αμέριστη βοήθεια, πίστη και αγάπη της από τα προπτυχιακά μου χρόνια μέχρι και σήμερα. Ευχαριστώ επίσης την μεταδιδακτορική της συνεργάτη Δρ. Πηνελόπη Σαμαρά για την απλόχερη βοήθεια και φιλοξενία στο εργαστήριό τους.

Θερμές ευχαριστίες θα ήθελα να εκφράσω στους Δρ. Ιωάννη Πιρμεττή και Δρ. Μηνά Παπαδόπουλο από την ομάδα της Ραδιοφαρμακευτικής του Δημοκρίτου για την πολύτιμη και καθοριστική βοήθειά τους αλλά και τις συμβουλές τους κατά τη διεξαγωγή της παρούσας διατριβής.

Ευχαριστώ επίσης τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του Ε.Κ.Π.Α. κο Δημήτρη Στραβοπόδη αλλά και τον Επίκουρο Καθηγητή του Τμήματος Χημείας του Ε.Κ.Π.Α. κο Δημήτρη Γεωργιάδη, ως μέλη της επταμελούς εξεταστικής μου επιτροπής, για τις εύστοχες παρατηρήσεις τους .

Προς τον Δρ. Χρήστο Ζήκο εκφράζω θερμές ευχαριστίες για την συνεχή επίβλεψη και καθοδήγησή του στο κομμάτι της οργανικής σύνθεσης πεπτιδίων, καθόλη τη διάρκεια της διδακτορικής μου διατριβής.

Ευχαριστώ επίσης θερμά τους συνεργάτες μας από το Τμήμα Βιοχημείας του πανεπιστημίου του Tuebingen στη Γερμανία, τον Καθηγητή Wolfgang Voelter και τον Δρ. Hubert Kalbacher, για την απλόχερη βοήθειά τους όλα αυτά τα χρόνια.

Ένα ευχαριστώ από καρδιάς ανήκει στους συναδέλφους και φίλους μου από το εργαστήριο Βυρωνία Βασιλακοπούλου, Γεωργία Γούρμα, Χρήστο Λιόλιο, Μυρτώ Κωστομοίρη, Έφη Νικολάκη, Χάρη Τριάντη, Αντώνη Σεγκάνι, Χρήστο Κυρίτση, Αφροδίτη Παπασάββα, Σοφία Κοντογεωργάκη και Λάζαρο Παλαμάρη για την συνεργασία τους και τις υπέροχες στιγμές που μου έχουν χαρίσει σε επαγγελματικό αλλά και προσωπικό επίπεδο.

Ένα τεράστιο ευχαριστώ ανήκει στην οικογένειά μου, στους δικούς μου ανθρώπους που στέκονται δίπλα μου τόσα χρόνια και με στηρίζουν σε κάθε μου βήμα.

Τέλος, ευχαριστώ πολύ τον Γιώργο μου για την αγάπη του και την ουσιαστική παρουσία του στη ζωή μου, η οποία με γέμισε με αισιοδοξία και δύναμη ώστε να ξεπεράσω όλα τα εμπόδια εκπληρώνοντας τελικά τους στόχους μου.

Α. ΘΕΩΡΗΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1

ΤΟ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ

Το Ανοσοποιητικό Σύστημα είναι ένα σύστημα άμυνας που αναπτύχθηκε στα σπονδυλωτά για να τα προστατεύει από εισβάλλοντες παθογόνους μικροοργανισμούς. Είναι αρμόδιο να παράγει μία τεράστια ποικιλία κυττάρων και μορίων, ικανών για την ειδική αναγνώριση ποικιλίας ξένων εισβολέων. Αυτά τα κύτταρα και μόρια δρουν μαζί σε ένα εξαιρετικά προσαρμοστικό δυναμικό δίκτυο, του οποίου η πολυπλοκότητα συναγωνίζεται εκείνη του Νευρικού Συστήματος. Λειτουργικά, μια ανοσολογική απόκριση μπορεί να διαιρεθεί σε δύο σχετιζόμενες δραστηριότητες: την αναγνώριση και την απόκριση. Η ανοσολογική αναγνώριση είναι αξιοσημείωτη για την εξειδίκευσή της. Το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ικανό να αναγνωρίζει λεπτές διαφορές, οι οποίες διακρίνουν ένα παθογόνο από ένα άλλο. Επιπλέον, το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να διακρίνει τα ξένα κύτταρα και μόρια από τα κύτταρα και τα μόρια του σώματος. Μόλις αναγνωριστεί ένας ξένος μικροοργανισμός, το ανοσοποιητικό σύστημα στρατολογεί ένα πλήθος κυττάρων και μορίων για να οργανώσει μια σωστή απόκριση, που ονομάζεται δραστική απόκριση, και να εξαλείψει ή να εξουδετερώσει το μικροοργανισμό. Με αυτό τον τρόπο, το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ικανό να μετατρέπει την αρχική αναγνώριση σε διαφορετικές δραστικές αποκρίσεις, κάθε μία από τις οποίες είναι μοναδικά σχεδιασμένη για την εξάλειψη ενός συγκεκριμένου τύπου παθογόνου. Επόμενη έκθεση στον ίδιο ξένο μικροοργανισμό επάγει την αναμνηστική απόκριση, που χαρακτηρίζεται από μια πολύ πιο γρήγορη και ισχυρότερη ανοσολογική αντίδραση, η οποία βοηθά στην αμεσότερη εξάλειψη του παθογόνου και την αποφυγή της νόσησης.

1.1 Φυσική και επίκτητη ανοσία

Η ανοσία, δηλαδή η προστασία από μολυσματικές ασθένειες, διαθέτει εξίσου μη ειδικά και ειδικά συστατικά γνωρίσματα. Το μη ειδικό σκέλος, η φυσική/έμφυτη ανοσία, αποτελεί την πρώτη γραμμή άμυνας ενάντια στις μολύνσεις. Τα περισσότερα συστατικά της έμφυτης ανοσίας υπάρχουν πριν την έναρξη της μόλυνσης και συνιστούν μια ομάδα μηχανισμών αντοχής στις ασθένειες. Οι μηχανισμοί αυτοί δεν είναι ειδικοί για ένα συγκεκριμένο παθογόνο, αλλά περιλαμβάνουν κυτταρικά και μοριακά συστατικά τα οποία αναγνωρίζουν τάξεις μορίων, που μοιάζουν με τα συνήθη παθογόνα. Η φυσική ανοσία περιλαμβάνει τέσσερις τύπους αμυντικών φραγμών: ανατομικούς (δέρμα, βλεννογόνοι), φυσιολογικούς (θερμοκρασία, pH, χημικοί μεσολαβητές), φαγοκυτταρικούς (μονοκύτταρα του αίματος, μακροφάγα των ιστών, ουδετερόφιλα) και φλεγμονώδεις. Αντίθετα, το ειδικό σκέλος, η επίκτητη/προσαρμοστική ανοσία, δεν συμμετέχει μέχρις ότου επαχθεί αντιγονική επίθεση στον οργανισμό. Η προσαρμοστική ανοσία είναι ικανή να αναγνωρίζει και να εξαλείφει ειδικά συγκεκριμένους ξένους μικροοργανισμούς και μόρια (π.χ. ξένα αντιγόνα). Αντιθέτως με τις έμφυτες αποκρίσεις, οι προσαρμοστικές δεν είναι ίδιες για όλα τα μέλη ενός είδους, αλλά αποτελούν αντιδράσεις σε ειδικές αντιγονικές προκλήσεις διαθέτοντας 4 χαρακτηριστικά: αντιγονική εξειδίκευση, ποικιλομορφία, ανοσολογική μνήμη και αναγνώριση εαυτού/μη εαυτού. Οι βασικοί κυτταρικοί παράγοντες της επίκτητης ανοσίας είναι τα λεμφοκύτταρα, τα αντισώματα και πλήθος άλλων μορίων που παράγονται. Η φυσική ανοσία δεν είναι ανεξάρτητη της επίκτητης. Μέσω μιας αυστηρά ελεγχόμενης αλληλεπίδρασης, τα δύο αυτά συστήματα συνεργάζονται συντονισμένα για να περιορίσουν τον ξένο εισβολέα.

1.2 Κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος

Το ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από ένα μεγάλο αριθμό κυττάρων, τα οποία εντοπίζονται τόσο στο αίμα όσο και στους ιστούς σε ολόκληρο το σώμα.

Σχήμα 1.1 Αιμοποίηση. Αυτομάτως ανανεούμενα αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα δίνουν γένεση σε λεμφοειδή και μυελοειδή προγονικά κύτταρα και αυτά με τη σειρά τους σε λεμφοειδή και μυελοειδή κύτταρα, αντίστοιχα.

Ανεξάρτητα από τη λειτουργία τους, όλα τα κύτταρα του αίματος προέρχονται από έναν τύπο κυττάρων που ονομάζονται αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (Hematopoietic Stem Cells, HST) (Σχήμα 1.1). Τα αρχέγονα κύτταρα έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται σε διάφορους άλλους τύπους κυττάρων, να ανανεώνονται αυτόματα και να διατηρούν σταθερά τα πληθυσμιακά τους επίπεδα, μέσω συνεχών κυτταρικών διαιρέσεων. Στον άνθρωπο, η αιμοποίηση, δηλαδή η παραγωγή και η ανάπτυξη των ερυθρών και των λευκών αιμοσφαιρίων, ξεκινά στον εμβρυϊκό λεκιθικό σάκο κατά τις πρώτες εβδομάδες της ανάπτυξης. Στα αρχικά στάδια της αιμοποίησης, ένα πολυδύναμο αρχέγονο κύτταρο μπορεί να ακολουθήσει δύο διαφορετικά μονοπάτια διαφοροποίησης, δίνοντας γένεση είτε σε ένα κοινό λεμφοειδές προγονικό κύτταρο, είτε σε ένα κοινό μυελοειδές προγονικό κύτταρο. Η διαδικασία διαφοροποίησης ενός συγκεκριμένου αρχέγονου ή προγονικού κυττάρου, ελέγχεται από τον τύπο και τις ποσότητες των αυξητικών παραγόντων που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του. Κατά την διάρκεια ανάπτυξης της λεμφικής και της μυελικής σειράς, τα αρχέγονα κύτταρα διαφοροποιούνται σε προγονικά κύτταρα, τα οποία χάνουν την ικανότητα αυτόματης ανανέωσης και ανήκουν πλέον σε μία από τις παραπάνω σειρές. Τα κοινά λεμφοειδή προγονικά κύτταρα δίνουν γένεση στα Β λεμφοκύτταρα, στα Τ λεμφοκύτταρα, στα φυσικά φονικά (Natural Killer, ΝΚ) κύτταρα και σε μερικά δενδριτικά κύτταρα. Από την άλλη μεριά, τα μυελοειδή αρχέγονα κύτταρα δημιουργούν προγονικά κύτταρα των ερυθρών αιμοσφαιρίων, πολλών λευκών αιμοσφαιρίων (ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα, μονοκύτταρα/μακροφάγα, ιστιοκύτταρα, δενδριτικά) και των αιμοπεταλίων. Η κατεύθυνση διαφοροποίησης που θα ακολουθήσουν τα προγονικά κύτταρα εξαρτάται από την ευαισθησία που αποκτούν σε συγκεκριμένους αυξητικούς παράγοντες και κυτταροκίνες.

1.3 Όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος

Το ανοσοποιητικό σύστημα αποτελείται από πολλούς διαφορετικούς ιστούς και όργανα, που βρίσκονται σχεδόν σε κάθε σημείο του σώματος. Λειτουργικά, τα όργανα του ανοσοποιητικού συστήματος διακρίνονται σε πρωτογενή και δευτερογενή. Ο θύμος αδένας και ο μυελός των οστών είναι τα πρωτογενή ή κεντρικά λεμφικά όργανα, στα οποία λαμβάνει χώρα η ωρίμανση των Τ- και Β- λεμφοκυττάρων, αντίστοιχα. Οι λεμφαδένες, ο σπλήνας και διάφοροι λεμφικοί ιστοί που σχετίζονται με τους βλεννογόνους είναι τα δευτερογενή ή περιφερικά λεμφικά όργανα, τα οποία εγκλωβίζουν τα αντιγόνα και παρέχουν στα ώριμα λεμφοκύτταρα το κατάλληλο περιβάλλον για να αλληλεπιδράσουν με αυτά τα αντιγόνα. Επιπρόσθετα, υπάρχουν και οι τριτογενείς λεμφικοί ιστοί, οι οποίοι, σε φυσιολογικές συνθήκες, περιέχουν λιγότερα λεμφοειδή κύτταρα από τα δευτερογενή λεμφικά όργανα, αλλά μπορούν να φιλοξενήσουν λεμφοειδή κύτταρα κατά τη διάρκεια μιας φλεγμονώδους απόκρισης. Οι πιο σημαντικοί από αυτούς είναι οι λεμφικοί ιστοί που σχετίζονται με το δέρμα. Από τη στιγμή που τα ώριμα λεμφοκύτταρα έχουν δημιουργηθεί στα πρωτογενή λεμφικά όργανα, εξέρχονται στην κυκλοφορία του αίματος και στο λεμφικό σύστημα, ένα δίκτυο αγγείων συλλογής του υγρού που διαφεύγει από τα τριχοειδή στους ιστούς εξασφαλίζοντας έτσι την επιστροφή του στο αίμα (Σχήμα 1.2).

Σχήμα 1.2 Το λεμφικό σύστημα του ανθρώπου. Τα πρωτογενή λεμφικά όργανα (μυελός των οστών και θύμος αδένας) φαίνονται με κόκκινο, ενώ τα δευτερογενή όργανα και ιστοί με μπλε χρώμα. Αυτά τα ανατομικά και λειτουργικά διακριτά όργανα και ιστοί συνδέονται μεταξύ τους με τη μεσολάβηση των αιμοφόρων αγγείων (δεν φαίνονται) και των λεμφικών αγγείων (κυανέρυθρο), διαμέσου των οποίων κυκλοφορούν τα λεμφοκύτταρα.

1.4 Ανοσοποιητικό σύστημα και Φλεγμονή

Φλεγμονή καλείται το οργανωμένο σύνολο των τοπικών και συστηματικών μηχανισμών που ενεργοποιεί ο οργανισμός ως αντίδραση μετά από την επίδραση σε αυτόν διάφορων βλαπτικών παραγόντων, με τελικό σκοπό την διατήρηση ή αποκατάσταση της ιστικής του ακεραιότητας. Με κριτήριο την χρονική διάρκεια εκδήλωσής τους, οι φλεγμονές διακρίνονται σε οξείες (διάρκειας λίγων λεπτών, ωρών ή ημερών) και σε χρόνιες (μεγαλύτερης διάρκειας). Επιπλέον, ανάλογα με την φύση του βλαπτικού παράγοντα οι φλεγμονές διακρίνονται σε άσηπτες ή στείρες (μπορούν να πυροδοτηθούν από φυσικά, χημικά, μηχανικά ή μεταβολικά βλαπτικά ερεθίσματα) και σε σηπτικές (πυροδοτούνται από την παρουσία κάποιου παθογόνου μικροοργανισμού). Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής θα εστιάσουμε το ενδιαφέρον μας στην περίπτωση της άσηπτης οξείας φλεγμονής. Στον μηχανισμό της φλεγμονής εμπλέκονται αφενός μεν πολλά κύτταρα τα οποία ήδη υπάρχουν ή συσσωρεύονται στην περιοχή της φλεγμονής μέσω της κυκλοφορίας του αίματος, και αφετέρου πολλές ουσίες με συγκεκριμένες βιολογικές δράσεις και οι οποίες παράγονται από τα κύτταρα της φλεγμονής.

Σε γενικές γραμμές οι φλεγμονώδεις αποκρίσεις ως απάντηση σε ένα άσηπτο ερέθισμα ομοιάζουν με εκείνες που παρατηρούνται κατά την διάρκεια μιας μικροβιακής εισβολής. Υπάρχουν πολλές κατηγορίες κυτταρικών υποδοχέων οι οποίοι είναι πολύ σημαντικοί για την αναγνώριση παθογόνων μικροοργανισμών και την επακόλουθη επαγωγή φλεγμονωδών αποκρίσεων [1]. Αυτοί οι υποδοχείς συλλογικά καλούνται υποδοχείς αναγνώρισης προτύπου (PRRs, Pattern Recognition Receptors) και αναγνωρίζουν διατηρημένα (εξελικτικά) δομικά μοτίβα που εμφανίζονται σε μικροοργανισμούς, τα οποία συχνά καλούνται και μοριακά πρότυπα σχετιζόμενα με παθογόνα (PAMPs, Pathogen Associated Molecular Patterns). Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί πέντε κύριες κατηγορίες PRRs:

i) οι υποδοχείς τύπου Toll (TLRs, Toll-Like Receptors), οι οποίοι αποτελούν διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που εδράζονται στην κυτταρική επιφάνεια ή σε ενδοσώματα ii) οι υποδοχείς τύπου NOD (NLRs, Nod-Like Receptors), οι οποίοι εδράζονται στο κυτταρόπλασμα iii) οι υποδοχείς τύπου RIG (RLRs, Rig-Like Receptors), οι οποίοι επίσης εδράζονται ενδοκυτταρικά και εμπλέκονται κατ’εξοχήν σε αντι- ιικές αποκρίσεις iv) οι υποδοχείς λεκτίνης τύπου C ( CLRs, C-type Lectin Receptors), οι οποίοι είναι διαμεμβρανικοί και χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός δομικού μοτίβου πρόσδεσης υδατανθράκων, και v) οι απόντες από το μελάνωμα 2 τύπου υποδοχείς (AIM2LR, Absence in Melanoma 2 Like Receptors), οι οποίοι χαρακτηρίζονται από την παρουσία μιας περιοχής πυρίνης (pyrin) και μιας περιοχής πρόσδεσης DNA, η οποία εμπλέκεται στην ανίχνευση ενδοκυτταρικού μικροβιακού DNA.

Μόλις πραγματοποιηθεί η αναγνώριση του κατάλληλου προσδέτη (ligand) ή κυτταρική ρήξη, αυτοί οι υποδοχείς ενεργοποιούν καταρροϊκά σηματοδοτικά μονοπάτια όπως αυτά του NF-kΒ, της κινάσης MAP και των ιντερφερονών τύπου I (IFN-I), που ως τελικό στόχο έχουν την ενεργοποίηση προ- φλεγμονωδών κυτταροκινών και χημειοκινών που είναι απαραίτητες για την φλεγμονώδη απόκριση (βλ. παρακάτω). Τα τελευταία χρόνια έχει καταστεί σαφές ότι οι υποδοχείς PRRs αναγνωρίζουν εξίσου καλά μη μολυσματικούς παράγοντες οι οποίοι μπορούν να προκαλέσουν ιστική βλάβη αλλά και ενδογενή μόρια τα οποία ελευθερώνονται εξωκυτταρικά κατά την διάρκεια τραυματισμού ή νέκρωσης των κυττάρων. Αυτά τα ενδογενή μόρια αναφέρονται ως μοριακά πρότυπα που σχετίζονται με βλάβη (DAMPs, Damage-Associated Molecular Patterns), απελευθερώνονται μετά από τραυματισμό ιστών ή κυτταρικό θάνατο και έχουν παρόμοιες ιδιότητες με τα PAMPs όσον αφορά στην ικανότητά τους να ενεργοποιούν προφλεγμονώδη σηματοδοτικά μονοπάτια. Κοινό χαρακτηριστικό των DAMPs είναι ότι αποτελούν ενδογενείς παράγοντες που υπό φυσιολογικές συνθήκες εντοπίζονται ενδοκυτταρικά και επομένως 34

στερούνται αναγνώρισης από το ανοσοποιητικό σύστημα. Ωστόσο, κάτω από συνθήκες κυτταρικού τραυματισμού, στρες ή θανάτου αυτά τα μόρια απελευθερώνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον των παθολογικών κυττάρων και πυροδοτούν φλεγμονή κάτω από στείρες συνθήκες.

Η οξεία φλεγμονή πυροδοτείται μερικά δευτερόλεπτα ή λεπτά μετά τον τραυματισμό του ιστού και χαρακτηρίζεται από τρία βασικά γνωρίσματα:  Αυξημένη αιματική ροή, λόγω διάτασης των αιμοφόρων αγγείων που τροφοδοτούν την προσβεβλημένη περιοχή  Αυξημένη αγγειακή διαπερατότητα των τριχοειδών, η οποία επιτρέπει την διαφυγή υγρού και πρωτεϊνών του αίματος προς τον διάμεσο εξωαγγειακό χώρο  Μετανάστευση των ουδετερόφιλων (και δευτερευόντως των μονοκυττάρων) από το αίμα διαμέσου των επιθηλιακών κυττάρων των τριχοειδών προς τον διάμεσο εξωαγγειακό χώρο.

Τα χαρακτηριστικά αυτά γεγονότα κατά την διάρκεια μιας οξείας φλεγμονής οφείλονται στην απελευθέρωση ρυθμιστικών μορίων τα οποία δρουν παρακρινώς. Στα ρυθμιστικά αυτά μόρια συγκαταλέγονται κυτταροκίνες, χημειοκίνες, παράγωγα του αραχιδονικού οξέος (προσταγλανδίνες και λευκοτριένια), συστατικά του συμπληρώματος, παράγωγα των αιμοπεταλίων (π.χ. PAF), κινίνες, οξείδια του αζώτου και πολλά άλλα. Ας σταθούμε λίγο παραπάνω στις κυτταροκίνες. Οι κυτταροκίνες είναι σηματοδοτικές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες, οι οποίες εμπλέκονται στην κυτταρική επικοινωνία. Παράγονται από μια μεγάλη ποικιλία κυττάρων και τυπικά διακρίνονται σε δύο κατηγορίες: στις τύπου Th1 ή προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες και στις τύπου Th2 ή αντι-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες. Οι προ- φλεγμονώδεις κυτταροκίνες προάγουν την φλεγμονή έχοντας ως στόχο την επικοινωνία των διαφόρων κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος μεταξύ τους. Οι πιο γνωστές από αυτές είναι η ιντερλευκίνη-1 (IL-1), ο παράγοντας νέκρωσης των όγκων (TNF-α), η ιντερλευκίνη-2 (IL-2) και η ιντερλευκίνη-6 (IL-6).

Σχήμα 1.3 Πηγή και ρόλος της IL-1 στην οξεία άσηπτη φλεγμονή (προσαρμοσμένο από [2]).

Η IL-1 αποτελεί την βάση για την έναρξη της άσηπτης φλεγμονώδους διαδικασίας, δρώντας μέσω του υποδοχέα της, IL-R1. Η IL-1 περιλαμβάνει τα προϊόντα δύο διακριτών γονιδίων, την IL-1α και την IL-1β οι οποίες εμφανίζουν 25% ομολογία στην πρωτοταγή τους αλληλουχία. Η IL-1α παράγεται κατά κύριο λόγο από τα εαυτά τραυματισμένα κύτταρα ενώ η IL-1β αποτελεί πολύ ισχυρή προ-φλεγμονώδη κυτταροκίνη η οποία παράγεται κυρίως από τα ιστικά μακροφάγα. Και οι δύο μορφές στοχεύουν στην ενεργοποίηση μορίων κυτταρικής προσκόλλησης των επιθηλιακών κυττάρων που διαμεσολαβούν την στρατολόγηση ουδετερόφιλων και μονοκυττάρων (βλ. κεφάλαιο 1.5.1) αλλά και την παραγωγή επιπρόσθετων φλεγμονωδών διαμεσολαβητών. Στο Σχήμα 1.3 παρουσιάζεται συνοπτικά και απλοποιημένα ο ρόλος της IL-1 στην άσηπτη οξεία φλεγμονή.

Όπως φαίνεται στην παραπάνω εικόνα, ένα νεκρωτικό ή τραυματισμένο κύτταρο μπορεί να απελευθερώσει IL-1α η οποία ενεργοποιεί απευθείας τα παρακείμενα υγιή παρεγχυματικά κύτταρα μέσω πρόσδεσής της στον υποδοχέα της, IL-R1. Παράλληλα, το ίδιο κύτταρο απελευθερώνει DAMPs τα οποία αναγνωρίζονται από υποδοχείς των ιστικών μακροφάγων, τα οποία με τη σειρά τους παράγουν IL-1α και κυρίως IL-1β με σκοπό την διέγερση των παρεγχυματικών κυττάρων. Τα διεγερμένα από IL-1 παρεγχυματικά κύτταρα εκκρίνουν μια σειρά χημειοκινών με σκοπό την στρατολόγηση των ουδετερόφιλων από τη συστηματική κυκλοφορία στον φλεγμαίνοντα/πάσχοντα ιστό.

Ιδανικά, η φλεγμονώδης απόκριση διαρκεί όσο υπάρχει το βλαπτικό ερέθισμα στην πάσχουσα περιοχή. Μόλις το ερέθισμα αυτό απομακρυνθεί, η περιοχή επιστρέφει σε φυσιολογική κατάσταση. Ο τερματισμός της φλεγμονής είναι μία πολύπλοκη ενεργός βιοχημική διαδικασία, αυστηρά ελεγχόμενη προκειμένου να εξασφαλιστεί η προστασία του οργανισμού αφενός από υπέρμετρη ιστική βλάβη και αφετέρου από μετατροπή μίας οξείας φλεγμονώδους απόκρισης σε χρόνια κατάσταση.

1.5 Ουδετερόφιλα

Τα ουδετερόφιλα ανήκουν στα λευκά αιμοσφαίρια του αίματος, όπου και αποτελούν το 50-70% αυτών. Μαζί με τα ηωσινόφιλα και τα βασεόφιλα συνιστούν την ομάδα των κοκκιοκυττάρων, λόγω των χαρακτηριστικών κοκκίων που περιέχουν στο κυτταρόπλασμά τους. Τα ουδετερόφιλα (Σχήμα 1.4) αποτελούν τον πολυπληθέστερο υποπληθυσμό των κοκκιοκυττάρων, διαθέτουν έντονα κοκκιώδες κυτταρόπλασμα και πυρήνα με πολλούς λοβούς, γι’ αυτό και συχνά καλούνται και πολυμορφοπύρηνα λευκοκύτταρα.

Σχήμα 1.4 Διαγραμματική απεικόνιση της τυπικής μορφολογίας των ουδετερόφιλων. Διακρίνονται χαρακτηριστικά ο πολυλοβωτός πυρήνας και τα πρωτογενή και δευτερογενή κοκκία τους.

Με κριτήριο την λειτουργία και το ενζυμικό τους περιεχόμενο, τα κοκκία των ουδετερόφιλων διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: στα πρωτογενή ή αζουροφιλικά κοκκία, στα δευτερογενή ή ειδικά κοκκία και στα τριτογενή ή κοκκία ζελατινάσης. Τα κοκκία αυτά περικλείουν αντιμικροβιακούς ή κυτταροτοξικούς παράγοντες, πρωτεϊνάσες, υδρολάσες και μια ευρεία «δεξαμενή» κυτταροπλασματικών μεμβρανικών υποδοχέων.

Τα ουδετερόφιλα παράγονται κατά τη διάρκεια της αιμοποίησης στον μυελό των οστών και εν συνεχεία απελευθερώνονται στην συστηματική κυκλοφορία έχοντας ως χρόνο ημιζωής στο αίμα 4-10 ώρες, μέχρι τελικά να αποσυρθούν διαμέσου των αιμοφόρων αγγείων σε ιστούς όπου και επιζούν για 1 με 2 επιπλέον ημέρες. Στο τέλος, οδηγούνται σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο-απόπτωση και απομακρύνονται “αθόρυβα” από τον οργανισμό.

Βασικές τους λειτουργίες είναι να φαγοκυτταρώνουν ξένα σωματίδια και να απελευθερώνουν χημικές ουσίες που εμπλέκονται στην φλεγμονή.

1.5.1 Μετανάστευση των ουδετερόφιλων σε εστίες φλεγμονής

Όπως αναφέρθηκε και σε προηγούμενο κεφάλαιο, τα ουδετερόφιλα αποτελούν τα πρώτα κύτταρα που συρρέουν στους τραυματισμένους ιστούς κατά τη διάρκεια μιας οξείας φλεγμονής. Η μετανάστευση αυτή των ουδετερόφιλων από το αίμα στους φλεγμαίνοντες ιστούς, διαδικασία γνωστή και ως διαπίδυση, πραγματοποιείται χάρη στην συντονισμένη έκφραση ειδικών επιφανειακών μορίων κυτταρικής προσκόλλησης ή CAMs (Cell- Adhension Molecules) τόσο στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων όσο και στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων των αιμοφόρων αγγείων που περιβάλλουν τον φλεγμαίνοντα ιστό.

Τα περισσότερα από αυτά τα CAMs ανήκουν σε τέσσερις οικογένειες πρωτεϊνών: την οικογένεια των σελεκτινών, την οικογένεια των μουκινών, την οικογένεια των ιντεγκρινών και την υπεροικογένεια των ανοσοσφαιρινών.

Η διαδικασία της διαπίδυσης είναι αρκετά πολύπλοκη και χωρίζεται σε 4 βασικά διαδοχικά στάδια: στην κύλιση (rolling), την προσκόλληση (adhension), το σύρσιμο (crawling) και την μετανάστευση διαμέσου του ενδοθηλίου (transmigration). Αυτά τα 4 στάδια περιλαμβάνουν με την σειρά τους επιμέρους στάδια, τα οποία φαίνονται αναλυτικά στο Σχήμα 1.5 [3].

Σχήμα 1.5. Ο «αναβαθμισμένος» κλασικός καταρράκτης μετανάστευσης των ουδετερόφιλων από την συστηματική κυκλοφορία στους ιστούς [3].

Από την στιγμή που τα ουδετερόφιλα εξέρχονται των αιμοφόρων αγγείων, καταφέρνουν και προσεγγίζουν τον τραυματισμένο ιστό χημειοτακτικά, με τη βοήθεια χημειοκινών που παράγονται από τα υγιή παρεγχυματικά κύτταρα πλησίον του φλεγμαίνοντος ιστού.

Τα ουδετερόφιλα διαθέτουν ποικίλους μηχανισμούς εξάλειψης βλαπτικών παραγόντων (εξωγενή αντιγόνα, στα οποία συμπεριλαμβάνονται ολόκληροι μικροοργανισμοί και αδιάλυτα σωματίδια, αλλά και στοιχεία ενδογενούς προέλευσης όπως τραυματισμένα ή νεκρά εαυτά κύτταρα και κυτταρικά υπολείμματα) από τον οργανισμό, τόσο σε ενδοκυτταρικό όσο και σε εξωκυτταρικό επίπεδο (Σχήμα 1.6) [3].

Πιο συγκεκριμένα, όταν τα ουδετερόφιλα συναντούν στην πορεία τους στους ιστούς μικροοργανισμούς/βλαπτικούς παράγοντες τους φαγοκυτταρώνουν. Αφού τους αιχμαλωτίσουν στα φαγοσώματα, τα ουδετερόφιλα σκοτώνουν τους «εισβολείς» χρησιμοποιώντας είτε μηχανισμούς που εξαρτώνται από το οξυγόνο (ενεργές ρίζες οξυγόνου) είτε μέσω αντιμικροβιακών πρωτεϊνών (καθεψίνες, αμυντίνες, λακτοφερρίνη, λυσοζύμη). Οι αντιμικροβιακές αυτές πρωτεΐνες απελευθερώνονται από τα ουδετεροφιλικά κοκκία εντός των φαγοσωμάτων (ενδοκυτταρικός χώρος). Εναλλακτικά, τα ουδετεροφιλικά κοκκία μπορούν να απελευθερώσουν το περιεχόμενό τους και εκτός κυττάρου, επιδρώντας κατά αυτό τον τρόπο σε εξωκυτταρικά σωμάτια που δεν έχουν ακόμα συλληφθεί από το ουδετερόφιλο. Επιπλέον, ουδετερόφιλα ενεργοποιημένα σε υψηλό βαθμό δύνανται να εξαλείψουν μικροοργανισμούς και βλαπτικά σωμάτια εξωκυτταρικά απελευθερώνοντας ειδικές εξωκυτταρικές παγίδες (NETs, Neutrophil Extracellular Traps). Τα ΝΕΤs αποτελούνται κατά βάση από DNA πάνω στο οποίο προσκολλώνται ιστόνες, πρωτεΐνες (π.χ. λακτοφερρίνες και καθεψίνες) και ένζυμα (π.χ. μεταλλοπρωτεϊνάσες και ελαστάση). Οι παγίδες αυτές ακινητοποιούν τα παθογόνα/βλαπτικά ερεθίσματα, αποτρέποντάς έτσι την εξάπλωσή τους και διευκολύνοντας παράλληλα και μια επακόλουθη φαγοκυττάρωσή τους.

Σχήμα 1.6 Μηχανισμοί θανάτωσης παθογόνων μικροοργανισμών από τα ουδετερόφιλα.

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2

ΘΥΜΟΣΙΝΕΣ

2.1 Θυμοσινικό κλάσμα 5-Θυμοσίνες

Ο θύμος αδένας (Σχήμα 1.2) αποτελεί ένα πρωτογενές λεμφικό όργανο το οποίο διαδραματίζει πολύ σημαντικό ρόλο στην εύρυθμη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Πιο συγκεκριμένα, ο θύμος αδένας αποτελεί τον τόπο στον οποίο τα ανώριμα Τ λεμφοκύτταρα, που δημιουργούνται κατά τη διάρκεια της αιμοποίησης, ωριμάζουν και αποκτούν μια συγκεκριμένη αντιγονική εξειδίκευση. Ο ουσιώδης αυτός ρόλος του θύμου αδένα οδήγησε σε εντατική έρευνα προκειμένου να απομονωθούν και να ταυτοποιηθούν βιολογικά ενεργοί θυμικοί παράγοντες, οι οποίοι θα έχουν την ικανότητα να αντικαθιστούν την δράση του ακέραιου, λειτουργικού, θύμου αδένα σε άτομα με θυμικές ανεπάρκειες ή να ενισχύουν την ανοσολογική απόκριση σε φυσιολογικά άτομα. Έτσι, στα μέσα της δεκαετίας του 1960, η ομάδα των Goldstein και συνεργατών παρουσίασε και τυποποίησε μια διαδικασία εκχύλισης και στη συνέχεια κλασμάτωσης του θύμου αδένα μοσχαριού [4]. Η διαδικασία αυτή οδήγησε στην παραλαβή του επονομαζόμενου θυμοσινικού κλάσματος 5 (Τhymosin Fraction 5, TF5), μέσω μιας διαδικασίας 5 σταδίων: (1) εκχύλιση του θύμου αδένα σε ισότονο διάλυμα NaCl, (2) αποδιάταξη των πρωτεϊνών του εκχυλίσματος με σταδιακή θέρμανση από τους 0 οC στους 80 oC μέσα σε 25 min, (3) κατακρήμνιση των πρωτεϊνών με ακετόνη, (4) καταβύθιση με θειϊκό αμμώνιο και (5) υπερδιήθηση.

Αρχικά, το TF5 θεωρήθηκε από τους ερευνητές που το παρέλαβαν ότι περιείχε ένα και μόνο πολυπεπτίδιο, μεγέθους 12,6 kDa [5]. Μια δεκαετία αργότερα, κάτω από διαφορετικές συνθήκες καταβύθισης με θειϊκό αμμώνιο, αποδείχθηκε ότι το TF5 δεν περιέχει ένα μοναδικό βιοδραστικό πολυπεπτίδιο, αλλά αντιθέτως, ένα μίγμα μικρών πολυπεπτιδίων, των οποίων το μέγεθος κυμαίνεται από 1000 μέχρι 15000 Da [6]. Σήμερα, είναι γνωστό ότι το TF5 αποτελείται από 30-40 διακριτά πολυπεπτίδια, ενώ έχει πολύ μικρή

περιεκτικότητα σε υδατάνθρακες και άλλο μη πρωτεϊνικό υλικό. Προκειμένου να διευκολυνθεί η ταξινόμηση των πεπτιδίων του TF5, τα οποία ονομάσθηκαν γενικά θυμοσίνες, προτάθηκε ένα σύστημα ονοματολογίας το οποίο βασίζεται στο ισοηλεκτρικό σημείο (pI) των πεπτιδίων [7]. Σύμφωνα με αυτό το σύστημα, ως α-θυμοσίνες ορίζονται τα πολυπεπτίδια με pI<5, ως β-θυμοσίνες τα πολυπεπτίδια με pI μεταξύ 5 και 7 και τέλος ως γ-θυμοσίνες πολυπεπτίδια με pI>7. Να σημειωθεί ότι μέχρι σήμερα δεν έχει χαρακτηρισθεί καμία γ- θυμοσίνη.

Κανένα από τα απομονωμένα πεπτίδια δεν είναι στην πραγματικότητα θυμική ορμόνη, ωστόσο αποτελούν σημαντικά βιολογικά πεπτίδια με πολλές και διάφορες ενδοκυτταρικές και εξωκυτταρικές λειτουργίες, η μελέτη των οποίων βρίσκεται ακόμη και σήμερα σε εξέλιξη. Πράγματι, στην αρχή αποδόθηκε στις θυμοσίνες ορμονική δράση, η οποία σχετιζόταν κυρίως με το ανοσοποιητικό σύστημα, γι’αυτό και οι μελέτες εστιάζονταν στο ρόλο των θυμοσινών στη λειτουργία του θύμου αδένα. Αργότερα, διαπιστώθηκε ότι οι θυμοσίνες εμφανίζονται και σε άλλα όργανα πέραν του θύμου αδένα, όπως σπλήνα, ήπαρ, πνεύμονες κ.λπ., και μάλιστα σε μια μεγάλη ποικιλία οργανισμών με πολύ σημαντικό βαθμό συντηρητικότητας της πρωτοταγούς δομής. Μετά από αυτή την πολύ ενδιαφέρουσα παρατήρηση, άρχισε να μελετάται το ενδεχόμενο οι θυμοσίνες να επιτελούν μια γενικότερη λειτουργία στον οργανισμό, η οποία δεν περιορίζεται στον θύμο αδένα.

Μελέτες χαρακτηρισμού των θυμοσινών κατέδειξαν ότι οι δύο κατηγορίες των α- και β-θυμοσινών παρουσιάζουν μεταξύ τους ουσιαστικές διαφορές, τόσο ως προς το μέγεθος και την πρωτοταγή αλληλουχία των πολυπεπτιδίων που τις απαρτίζουν, όσο και ως προς τις βιολογικές τους ιδιότητες. Αντιθέτως, τα πεπτίδια που ανήκουν στη ίδια ομάδα εμφανίζουν σημαντικές ομοιότητες.

2.2 α-θυμοσίνες

Ο πρώτος και πιο χαρακτηριστικός εκπρόσωπος των α-θυμοσινών που πρωτοαπομονώθηκε από το TF5 και αλληλουχήθηκε ήταν ένα πολύ όξινο πεπτίδιο (pI 4.2), το οποίο πήρε το όνομα θυμοσίνη α1 (Τα1) [7,8]. Η Τα1 αποτελείται από 28 αμινοξέα και το μοριακό της βάρος είναι 3.108 Da. Το αμινοτελικό αμινοξύ σερίνη είναι ακετυλιωμένο και από την πρωτοταγή δομή απουσιάζουν αρωματικά αμινοξέα. Αργότερα, δύο ακόμη πεπτίδια που σχετίζονται δομικά με την Τα1 απομονώθηκαν από το TF5 μοσχαριού, με τη μέθοδο της υγρής χρωματογραφίας αντίστροφης φάσης (RP-HPLC). Το ένα από αυτά είχε τέσσερα αμινοξέα λιγότερα στο καρβοξυτελικό του άκρο, γι’αυτό και ονομάστηκε des-(25-28)-Tα1. Το δεύτερο, περιείχε επτά επιπλέον αμινοξέα στο καρβοξυτελικό του άκρο και πήρε το όνομα θυμοσίνη α11 (Τα11). Αμφότερα εμφάνισαν παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες με την Τα1, ενώ η Τα11 αποδείχθηκε εξίσου ενεργή με την Τα1 στην προστασία ποντικών έναντι ευκαιριακών λοιμώξεων από Candida albicans [8]. Tο γεγονός ότι, πέραν της Τα1, βρέθηκαν και άλλα πεπτίδια τα οποία σχετίζονται δομικά με αυτήν, οδήγησε τους ερευνητές στη σκέψη ότι μεταξύ των πεπτιδίων του TF5 ενδεχομένως να βρίσκεται ένα μεγαλύτερο πρόδρομο μόριο. Έτσι, κάτω από προσεκτικότερες συνθήκες απομόνωσης που αποτρέπουν την πρωτεόλυση, έγινε δυνατή η απομόνωση ενός μεγαλύτερου πολυπεπτιδίου μήκους 111 αμινοξέων από θύμο αδένα αρουραίου [9]. Στο αμινοτελικό άκρο αυτού του πολυπεπτιδίου εντοπίστηκε η αλληλουχία της Τα1 και των άλλων πεπτιδίων που σχετίζονται με αυτήν. Γι’αυτό το λόγο το νέο πολυπεπτίδιο θεωρήθηκε αρχικά ως πρόδρομο μόριο αυτών των πεπτιδίων και έτσι πήρε το όνομα προθυμοσίνη α (ΠρoTα). Ωστόσο, ακόμα και σήμερα δεν έχει απολύτως διευκρινιστεί εάν η Τα1 παράγεται εξ ολοκλήρου λόγω πρωτεόλυσης της ΠρoTα κατά τη διάρκεια παρασκευής του TF5 ή εάν αποτελεί προϊόν φυσικής πρωτεόλυσης της ΠρoTα σε κάποιους ιστούς.

2.3 Προθυμοσίνη α

Όπως ήδη αναφέρθηκε, η ΠρoTα πρωτοαπομονώθηκε το 1984 από θύμο αδένα αρουραίου. Την ίδια περίοδο, ωστόσο, αναφέρθηκε η παρουσία της ΠρoTα και σε άλλους, εξω-θυμικούς, ιστούς του αρουραίου [10], καθώς επίσης και σε ιστούς του ανθρώπου [11], [12], του ποντικού [11], του χοίρου [13] και της αίγας [14]. Επιπλέον, η βιβλιογραφία αναφέρεται και σε πολυπεπτίδια που ομοιάζουν στην ΠρoTα και τα οποία είναι παρόντα σε άλλα σπονδυλωτά, όπως το κοτόπουλο και η πέστροφα [15], ενώ έχει αναφερθεί ακόμα και η παρουσία ενός πιθανού ομολόγου της ΠρoTα στη ζύμη [16] και την Escherichia coli [17]. Η υποτιθέμενη αυτή υψηλή εξελικτική διατήρηση της ΠρoTα ήταν ένα ισχυρό επιχείρημα υπέρ του σημαντικού και πρωταρχικού ρόλου που διαδραματίζει στα ευκαρυωτικά και προκαρυωτικά κύτταρα. Αργότερα, υποστηρίχθηκε ότι η παρουσία της ΠρoTα ή του γονιδίου της σε οργανισμούς πέραν των θηλαστικών ήταν απίθανη [18]. Ωστόσο, την τελευταία δεκαετία, κλώνοι cDNA που κωδικοποιούν πολυπεπτίδια ομόλογα της ΠρoΤα των θηλαστικών αναγνωρίστηκαν στους οργανισμούς Rana esculenta [19] και το Brachydonio rerio (zebrafish) [20].

Η ανθρώπινη ΠρoTα αποτελείται από 109 αμινοξέα και έχει μοριακό βάρος 12,6 kDa. Σε μια βιβλιοθήκη cDNA, η οποία κατασκευάστηκε από mRNA ανθρώπινου σπλήνα, απομονώθηκε ένας κλώνος, ο οποίος περιείχε ένα θραύσμα 503 ζευγών βάσεων (base pair, bp) που περιελάμβανε όλη την κωδικοποιούσα αλληλουχία της ΠρoTα. Η παρουσία ενός κωδικονίου έναρξης αμέσως πριν από το κωδικόνιο για το αμινοτελικό κατάλοιπο σερίνης, καθώς και η παρουσία ενός κωδικονίου λήξης αμέσως μετά το κωδικόνιο για το καρβοξυτελικό ασπαρτικό οξύ(Asp)-109, υποδηλώνουν ότι η ΠρoΤα συντίθεται χωρίς το σχηματισμό ενός μεγαλύτερου πρόδρομου μορίου. Σύμφωνα με μελέτη σε ανθρώπινες βιβλιοθήκες cDNA, το γονίδιο της ΠρoTα βρέθηκε ανάμεσα στα πιο άφθονα εκφραζόμενα γονίδια, μαζί με την πρωτεΐνη θερμικού σοκ 90, την ελαφριά αλυσίδα της μυοσίνης και τις ριβοσωμικές πρωτεΐνες [21].

2.3.1 Δομή της προθυμοσίνης α

Η πρωτοταγής δομή της ΠρoTα έχει ταυτοποιηθέι τόσο από την αλληλούχιση της ίδιας της πρωτεΐνης όσο και του cDNA της. Η πρώτη αλληλουχία που αναφέρθηκε βιβλιογραφικά ήταν εκείνη της ΠρoTα από θύμο αδένα αρουραίου [22]. Κατόπιν, ακολούθησαν οι αλληλουχίες του ανθρώπου [23], του μοσχαριού [24], του χοίρου [13], του ποντικού [25] και της αίγας [14]. Την ίδια περίοδο, η ΠρoTα κλωνοποιήθηκε από άνθρωπο [11][26], αρουραίο [27], ποντικό [28], χοίρο [29] και βάτραχο [19], και προσδιορίστηκε η αλληλουχία των cDNA τους. Πρωτοταγείς δομές της ΠρoTα από διάφορες πηγές συνοψίζονται στο Σχήμα 2.1, στο οποίο φαίνεται καθαρά ότι η ΠρoTα είναι μια πρωτεΐνη με υψηλή περιεκτικότητα σε όξινα αμινοξέα και με πολύ υψηλά συντηρημένη αλληλουχία.

Σχήμα 2.1 Πρωτοταγείς δομές μορίων ΠρoΤα από διάφορα ζωικά είδη. Ο συνολικός αριθμός αμινοξέων φαίνεται στο καρβοξυτελικό άκρο κάθε αλληλουχίας. Με (–) σημειώνονται τα αμινοξικά κατάλοιπα που λείπουν.

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της ΠρoTα είναι η παρουσία της αλληλουχίας της θυμοσίνης Tα1 (αμινοξέα 1-28) στο αμινοτελικό της άκρο. Κατά δεύτερον, από την αλληλουχία της ΠρoTα απουσιάζουν εντελώς θειούχα και αρωματικά αμινοξέα, κάτι που έχει σαν συνέπεια η ΠρoΤα να μην απορροφά την ακτινοβολία στα 280 nm. Ένα άλλο εμφανές και ασυνήθιστο χαρακτηριστικό της ΠρoΤα είναι η ύπαρξη μιας μεγάλης σε έκταση όξινης περιοχής, η οποία αποτελείται από κατάλοιπα γλουταμινικού και ασπαρτικού οξέος, τα οποία καταλαμβάνουν περίπου το 50% της συνολικής πρωτοταγούς αλληλουχίας της. Σαν αποτέλεσμα αυτού, η ΠρoTα έχοντας ισοηλεκτρικό σημείο ίσο με 3,55, θεωρείται ίσως η πιο όξινη πρωτεΐνη που είναι μέχρι σήμερα γνωστή στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Δύο ακόμα χαρακτηριστικά γνωρίσματα της ΠρoTα είναι η παρουσία ενός διμερούς σήματος πυρηνικού εντοπισμού (Nuclear Localization Signal, NLS) στο καρβοξυτελικό της άκρο (θέσεις 87KR88 και 101KKQK104) [30][31][32], καθώς επίσης και η παρουσία 3 θέσεων φωσφορυλίωσης για ένζυμα της οικογένειας της κινάσης-2 της καζεΐνης [33].

Η πρωτοταγής δομή της ΠρoTα προϊδεάζει για δευτεροταγή δομή με α-έλικες και β-φύλλα. Ωστόσο, κανένα είδος δευτεροταγούς δομής της ΠρoTα δεν έχει παρατηρηθεί υπό φυσιολογικές συνθήκες [34], καθότι το μόριο υιοθετεί τυχαία διαμόρφωση. Αντιθέτως με το τι συμβαίνει σε ουδέτερο pH, σε χαμηλό pH (~ 3) η ΠρoTα είναι ικανή να σχηματίζει επιμήκη ινίδια (αμυλοειδή) [35]. Το χαμηλό pH πιθανότατα μειώνει τις απωστικές δυνάμεις που προκαλούνται από το υψηλά αρνητικό φορτίο της πρωτεΐνης σε ουδέτερο pH, επάγοντας έτσι την μερική αναδίπλωση του μορίου. Ακόμα, όμως, παραμένει άγνωστο το εάν και κατά πόσο αυτή η διαμορφωτική αλλαγή μπορεί να προκύψει και in vivo, κάτω από φυσιολογικές ή παθολογικές συνθήκες. Διάφορες αναλύσεις της δομής της ΠρoTα σε διάλυμα δείχνουν ότι, υπό φυσιολογικές συνθήκες, η πρωτεΐνη συμπεριφέρεται ως μονομερές. Ωστόσο, σε τεχνική μοριακής διήθησης σε pH 2,8 , έχει αναφερθεί ότι η ΠρoTα εκλούεται ως πρωτεΐνη με φαινόμενο μοριακό βάρος ~ 33 kDa [9].

2.3.2 Κυτταρικός εντοπισμός της προθυμοσίνης α

Η συγκέντρωση της ΠρoΤα έχει προσδιοριστεί σε διάφορους ιστούς θηλαστικών κυρίως με τη βοήθεια ανοσοαναλύσεων, καθώς επίσης και με προσδιορισμό της απομονωμένης πρωτεΐνης με χρωματογραφικές τεχνικές. Να αναφερθεί σε αυτό το σημείο ότι έχουν παρατηρηθεί αξιοσημείωτες διακυμάνσεις, ακόμα και μεταξύ μελετών στις οποίες χρησιμοποιήθηκαν οι ίδιες μεθοδολογίες.

Όσον αφορά στον ποσοτικό προσδιορισμό της ΠρoTα με μεθόδους ανοσοανάλυσης, το μεγάλο πρόβλημα αποτελεί η πολύ χαμηλή ανοσογονικότητα του μορίου, η οποία συνεπάγεται και δυσκολία παραλαβής αντισωμάτων με υψηλό τίτλο και υψηλή χημική συγγένεια για την ΠρoΤα. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι μπορούν να αναπτυχθούν ευαίσθητα αντισώματα έναντι συγκεκριμένων τμημάτων της ΠρoTα, όπως οι περιοχές 1- 10, 20-28, 1-28 (Τα1) και 101-109 [36]. Σαν αποτέλεσμα, αντισώματα εναντίον αυτών των πεπτιδίων έχουν χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της ΠρoTα. Παρόλ’ αυτά, παραμένουν αξιοσημείωτες διακυμάνσεις στις τιμές των επιπέδων της ΠρoTα που προσδιορίζονται από τις ανοσοαναλύσεις. Επιπλέον, τα αντισώματα εναντίον της Τα1 δεν είναι ικανά να διακρίνουν την ΠρoTα από την Τα1, η οποία σύμφωνα με κάποιους ερευνητές είναι παρούσα στα κύτταρα σε συγκεντρώσεις παρόμοιες με εκείνες της ΠρoTα (80-100 μg/g) [37]. Έτσι, λοιπόν, όταν χρησιμοποιούνται αντισώματα εναντίον της Τα1 ή των υπόλοιπων αμινοτελικών τμημάτων της ΠρoTα , είναι πιθανόν τα επίπεδα της ΠρoTα στα κυτταρικά εκχυλίσματα να υπερεκτιμώνται. Επίσης, πιθανός λόγος υπερεκτίμησης των επιπέδων της ΠροΤα είναι η ποιότητα και η καθαρότητα των παρασκευασμάτων του πολυπεπτιδίου που χρησιμοποιήθηκαν για την παρασκευή των πρότυπων διαλυμάτων.

Παρά τις επιμέρους διαφορές, ωστόσο, είναι εμφανές, ότι η ΠρoTα αφθονεί στους ιστούς των θηλαστικών, και δη στα λεμφοειδή όργανα. Η συγκέντρωσή της, η οποία κυμαίνεται μεταξύ 0,1 και 0,3 pg/κύτταρο, είναι της ίδια τάξης με αυτή των ιστονών.

2.3.3 Υποκυτταρικός εντοπισμός της προθυμοσίνης α

Η καταφανής απουσία κάποιου σήματος έκκρισης στο μόριο της ΠρoTα έθεσε τα πρώτα ερωτήματα σχετικά με το επίμαχο θέμα του υποκυτταρικού εντοπισμού της. Παρόλο που δεν έχει μέχρι στιγμής περιγραφεί κάποιο εκκριτικό μονοπάτι για την ΠρoTα, αυτή έχει ανιχνευτεί σε ανθρώπινο ορό σε ποσότητα που αντιπροσωπεύει το 10% της συνολικής ΠρoTα στο αίμα [38], ενώ έχει ανακτηθεί και από το υπερκείμενο καλλιέργειας θυμοκυττάρων βοός και αρουραίου [37].

Επιπλέον, η κατανομή του μορίου της ΠρoTα σε υποκυτταρικό επίπεδο είναι ακόμα ασαφής. Υπάρχει ένα σύνολο πειραματικών μελετών, οι οποίες υποστηρίζουν τον πυρηνικό εντοπισμό του μορίου της ΠρoTα. Με τη χρήση ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και ανοσοσήμανσης με χρήση αντισωμάτων επισημασμένων με κολλοειδή χρυσό, η ΠρoTα ανιχνεύτηκε στην περιοχή του κυτταρικού πυρήνα και, σε πολύ μικρότερη έκταση, στο κυτταρόπλασμα [39]. Αντίστοιχα αποτελέσματα ελήφθησαν με ανοσοκυτταρολογία φθορισμού σε μια πληθώρα καρκινικών σειρών, καρκινικών ιστών αλλά και φυσιολογικών κυττάρων, με την χρήση ευαίσθητων αντισωμάτων έναντι της περιοχής ΠροΤα[101-109] [36]. Λαμβάνοντας υπόψη και το γεγονός ότι η ΠρoTα δεν περιέχει κάποιο σήμα έκκρισης στην αμινοξική της αλληλουχία, ενώ αντίθετα περιέχει το διμερές NLS, ενισχύεται η άποψη που υποστηρίζει τον πυρηνικό εντοπισμό της. Περαιτέρω ενδείξεις για τον πυρηνικό εντοπισμό της πρωτεΐνης αποτελεί η πολύ όξινη φύση της και η δομική της ομοιότητα με άλλες πυρηνικές πρωτεΐνες, όπως η νουκλεολίνη, η νουκλεοπλασμίνη, οι πρωτεΐνες HMG (High-Mobility Group) και οι μεταγραφικοί παράγοντες GAL4 και GCN4 στη ζύμη. Από την άλλη μεριά, υπάρχει και ο αντίποδας, δηλαδή αρκετές μελέτες που υποστηρίζουν τον κυτταροπλασματικό εντοπισμό της ΠρoTα. Μετά από ραδιοανοσοανάλυση έναντι της Τα1, τα επίπεδα των προϊόντων διασταυρούμενης αντίδρασης στον πυρήνα ήταν λιγότερο από το 1% όσων υπήρχαν στο κυτταρόπλασμα, τόσο στον θύμο αδένα όσο και στο ήπαρ μοσχαριού [40]. Τα αποτελέσματα αυτά βρίσκονται σε συμφωνία με την ανίχνευση, με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων έναντι της Τα1 και ανοσοκυτταροχημικών τεχνικών, ανοσοδραστικών ουσιών παρόμοιων με την

Τα1 στο κυτταρόπλασμα ή/και σε κενοτόπια δικτυοεπιθηλιακών κυττάρων [41][42]. Επιπλέον, έχει δειχθεί ότι, κατά τη μίτωση, η ενδοκυτταρική κατανομή της ΠρoTα αλλάζει. Πιο συγκεκριμένα, κατά τη φάση της μετάφασης και ανάφασης η ΠρoTα εντοπίζεται στην μιτωτική άτρακτο μαζί με την α- τουμπουλίνη, ενώ κατά την κυτταροκίνηση εντοπίζεται στο μεσόσωμα. Σε μεσοφασικά κύτταρα, ΠρoΤα έχει εντοπιστεί στα κεντροσωμάτια [43].

Πολλές πειραματικές ενδείξεις υποστηρίζουν την κινητικότητα της ΠρoTα μεταξύ πυρήνα-κυτταροπλάσματος. Κατά πρώτον, όπως έχει ήδη αναφερθεί, η ΠρoTα φέρει στο καρβοξυτελικό της άκρο ένα διμερές σήμα πυρηνικού εντοπισμού, το οποίο έχει αποδειχθεί ότι συμμετέχει στην μεταφορά της ΠρoΤα στον πυρήνα [31][34][44]. Κατά δεύτερον, πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι η ΠρoTα αλληλεπιδρά με πρωτεΐνες που συμμετέχουν στην εισαγωγή μορίων στον πυρήνα, όπως είναι η καρυοφερίνη-β, η Rch-1, η Ran και η RCC1 [45], καθώς επίσης και με άλλες πρωτεΐνες οι οποίες συμμετέχουν στην έξοδο μορίων από τον πυρήνα, όπως είναι το σύμπλεγμα Rev/Rex [46].

2.4 Βιολογικός ρόλος της προθυμοσίνης α

Όπως έχει ήδη αναφερθεί, αρχικά είχε θεωρηθεί ότι η ΠρoTα έχει ορμονική λειτουργία, γεγονός το οποίο βρισκόταν σε πλήρη συμφωνία με το ρόλο που είχε αποδοθεί στις α-θυμοσίνες. Συγκεκριμένα, από το 1984 και μετά, έχουν αναφερθεί δεδομένα που υποστηρίζουν τις ανοσοενισχυτικές δράσεις της ΠρoTα, παρόλο που δεν έχουν διασαφηνιστεί οι βιοχημικοί μηχανισμοί με τους οποίους μπορεί αυτή να δρα. Παράλληλα ωστόσο, πειραματικά δεδομένα έδειξαν ότι πολλά από τα χαρακτηριστικά της ΠρoTα δεν συνάδουν με αυτά μιας ορμονικής πρωτεΐνης. Ένα τέτοιο εύρημα ήταν το ότι η ΠρoTα συντίθεται σε ελεύθερα ριβοσώματα [47] και ότι δεν εμφανίζει στην αλληλουχία της κάποιο εκκριτικό σήμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι έχει ενδοκυτταρική θέση δράσης ή, εναλλακτικά, ότι η έξοδός της από το κύτταρο πραγματοποιείται μέσω ενός μη συμβατικού μηχανισμού έκκρισης. Με άλλα

λόγια, ο βιολογικός ρόλος που διαδραματίζει η ΠρoTα στην φυσιολογική, και όχι μόνο, λειτουργία του οργανισμού έχει αποτελέσει αντικείμενο μελέτης πολλών ερευνητικών εργαστηρίων.

Πριν αρχίσουμε να αναλύουμε, όμως, αυτό τον ρόλο θα πρέπει να επισημανθεί ότι η ΠρoTα είναι μια πολύ δύσκολη στο χειρισμό πρωτεΐνη. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, ένα σημαντικό πρόβλημα αποτελεί η πολύ χαμηλή ανοσογονικότητα του μορίου, με αποτέλεσμα οι περισσότερες ανοσοαναλυτικές τεχνικές –είτε σε εκχυλίσματα κυττάρων είτε σε άθικτα κύτταρα- να εμφανίζουν χαμηλότερη της απαιτούμενης ευαισθησία. Κατά δεύτερον, η ΠρoTα αλληλεπιδρά πολύ δύσκολα και υπό πολύ συγκεκριμένες συνθήκες με τις μεμβράνες που χρησιμοποιούνται συνήθως σε πειράματα ανοσοαποτύπωσης (Western blotting) π.χ. μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Κατά τρίτον, η ΠρoTα αναστέλλει την ανάπτυξη κυττάρων ζύμης [48], με αποτέλεσμα να μην είναι βιώσιμη η χρήση του συστήματος των δύο υβριδίων για τον χαρακτηρισμό in vivo αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Όλα αυτά τα προβλήματα, χωρίς αμφιβολία, έχουν συντελέσει στην πολύ αργή πρόοδο που έχει σημειωθεί στην έρευνα για την λειτουργία της ΠρoTα, παρόλο που το μόριο ταυτοποιήθηκε πριν από περίπου 30 χρόνια.

Από τα μέχρι τώρα δεδομένα, ωστόσο, φαίνεται ότι η ΠρoTα έχει δισυπόστατο ρόλο: έναν ενδοκυτταρικό, με την εμπλοκή της στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, την ενεργοποίηση της χρωματίνης και την αναστολή της απόπτωσης, και έναν εξωκυτταρικό, με την συμμετοχή της σε φαινόμενα κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας. Στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής το ενδιαφέρον μας μονοπώλησε ο εξωκυτταρικός ρόλος της ΠρoTα.

2.4.1 Εξωκυτταρικός ρόλος της προθυμοσίνης α

Ο εξωκυτταρικός βιολογικός ρόλος της ΠρoTα μελετήθηκε αμέσως μετά την πρώτη απομόνωση και ταυτοποίησή της το 1984 [9] και σχετίζεται με την ενίσχυση της κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας. Αυτός ο ανοσορυθμιστικός ρόλος της ΠρoTα, αν και έχει επικριθεί από ερευνητές που υποστηρίζουν μόνο την ενδοκυτταρική της δράση, έχει τεκμηριωθεί από μια πληθώρα πειραμάτων και φαίνεται να προσδίδει ιδιαίτερο ενδιαφέρον όσον αφορά στην πιθανή χρήση του πολυπεπτιδίου στη θεραπεία σε κλινικό επίπεδο.

Από πολύ νωρίς μετά την απομόνωσή της αποκαλύφθηκε ο ρόλος της ΠρoTα σε in vivo πειραματικά μοντέλα. Πιο συγκεκριμένα, ερευνητές ανακάλυψαν ότι η ΠρoTα του ποντικού έχει τη δυνατότητα να ασκεί προστατευτική δράση σε φυσιολογικούς και ανοσοκατεσταλμένους ποντικούς έναντι ευκαιριακών λοιμώξεων από Candida albicans, σε πολύ χαμηλότερη δοσολογία από αυτή που απαιτείται όταν χορηγηθούν η Τα1 ή ολόκληρο το θυμοσινικό κλάσμα 5 [22]. Επιπλέον, σε πειράματα που πραγματοποιήθηκαν σε ποντικούς της φυλής RF/J, οι οποίοι παρουσιάζουν ανεπάρκειες σε ορισμένες απαντήσεις της κυτταρομεσολαβητικής ανοσίας και είναι ευαίσθητοι σε μολύνσεις, φάνηκε ότι ο συνδυασμός δίαιτας πλούσιας σε ψευδάργυρο και καθημερινού ενοφθαλμισμού με ΠρoTα οδήγησε σε αύξηση της παραγωγής αντισωμάτων από τα σπληνοκύτταρα έναντι Τ-εξαρτώμενων αντιγόνων [49].

Ένα από τα πιο σημαντικά πειραματικά μοντέλα μελέτης της in vivo αντικαρκινικής δράσης του πολυπεπτιδίου της ΠρoTα έχει πραγματοποιηθεί σε ποντικούς της φυλής DBA/2. Οι ποντικοί αυτοί όταν ενοφθαλμιστούν ενδοπεριτοναϊκά με συγγενικά L1210 λευχαιμικά κύτταρα αναπτύσσουν ασκίτη μέσα σε χρονικό διάστημα 7-9 ημερών και πεθαίνουν 10-11 μέρες αργότερα. Το μοντέλο αυτό είναι κατάλληλο για μελέτη μορίων που θα μπορούσαν να διαθέτουν αντικαρκινική δράση, καθότι υπάρχει 100% θνησιμότητα σε μικρό χρονικό διάστημα. Πράγματι, ενέσεις στους ποντικούς αυτούς με ΠρoTα, πριν ή κατά τη διάρκεια του ενοφθαλμισμού τους με τα λευχαιμικά L1210 κύτταρα, κατέληξαν σε ολική επιβίωση του 20% των ποντικών και σε σημαντική παράταση του χρόνου επιβίωσης (> 50 ημέρες)

του 50-60% των ποντικών. Από διάφορες πειραματικές προσεγγίσεις που έγιναν με τη χρήση αυτού του προστατευτικού μοντέλου, αποκαλύφθηκε ότι η ΠρoTα ασκεί τη δράση της με πολλούς τρόπους. Αρχικά, βρέθηκε ότι η ΠρoTα μπορεί να επάγει την κυτταρομεσολαβητική απάντηση των σπληνικών λεμφοκυττάρων, ενισχύοντας την λυτική ικανότητα των NK κυττάρων και των ενεργοποιημένων από λεμφοκίνες (Lymphokine Activated Killers, LAK) λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, προσδιορίστηκε ότι η παρατηρούμενη αναστολή του σχηματισμού ασκίτη οφείλεται, σε σημαντικό βαθμό, στην επιλεκτική έκπτυξη των κυτταροτοξικών CD8+ T-λεμφοκυττάρων, τα οποία αναγνωρίζουν τα συγγενικά L1210 κύτταρα, ενώ τα βοηθητικά CD4+ λεμφοκύτταρα πιστεύεται ότι αναλαμβάνουν την παροχή βοήθειας στα κυτταροτοξικά T- λεμφοκύτταρα. Επιπροσθέτως, η ΠρoTα έχει την δυνατότητα να επάγει την αντικαρκινική ενεργότητα των μακροφάγων της περιτοναϊκής κοιλότητας και να ενισχύει την in vivo παραγωγή της IL-2 και του TNF-α [50][51].

Όλα αυτά τα πειραματικά ευρήματα είχαν ως αποτέλεσμα την περαιτέρω επέκταση της μελέτης όσον αφορά στην ανοσορυθμιστική δράση της ΠρoTα και σε in vitro επίπεδο. Έτσι λοιπόν, αποδείχθηκε ότι η ΠρoTα μπορεί και επάγει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό των ανθρώπινων Τ-λεμφοκυττάρων έναντι διαλυτών αντιγόνων και ότι σε αυτό το γεγονός κομβικό ρόλο διαδραματίζουν τα μονοκύτταρα, μέσω ενίσχυσης της αντιγονοπαρουσιαστικής τους ικανότητας και μέσω αύξησης του επαγόμενου από μονοκύτταρα πολλαπλασιασμού των T-λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των T-λεμφοκυττάρων σε αυτόλογη μικτή λεμφοκυτταρική απόκριση (autoMLR), η οποία προκαλείται από το υπερκείμενο που προκύπτει από την επίδραση της ΠρoTα στα μονοκύτταρα. Αυτό το υπερκείμενο αυξάνει άμεσα τον πολλαπλασιασμό των T-λεμφοκυττάρων, μέσω ενίσχυσης της παραγωγής IL-2 και των ειδικών γι’ αυτήν υποδοχέων στα ενεργοποιημένα T-λεμφοκύτταρα [52]. Παρόμοια αποτελέσματα λαμβάνονται και κατά τον πολλαπλασιασμό μονοπύρηνων περιφερικού αίματος (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMC), έπειτα από την επίδραση μιτογόνων, όπως η φυτοαιμαγλουτινίνη [53].

Η ανοσορυθμιστική δράση της ΠρoTα έχει καταδειχθεί και σε περιπτώσεις αυτοάνοσων νοσημάτων, όπως είναι η σκλήρυνση κατά πλάκας (MS) και ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (SLR). Σε τέτοιες περιπτώσεις εμφανίζεται μειωμένη απόκριση σε πειράματα αυτόλογης και ετερόλογης MLR. Διαπιστώθηκε, λοιπόν, ότι συγκαλλιέργεια PBMC τέτοιων ασθενών με ΠρoΤα επαναφέρει σε φυσιολογικά επίπεδα την αυτόλογη και ετερόλογη MLR, αποκαθιστώντας την λειτουργικότητα των PBMC [54][55]. Επιπλέον, σε ασθενείς με σκλήρυνση κατά πλάκας, η ΠρoTα αυξάνει την έκφραση των μορίων MHC τάξης II (HLA-DR), παρέχοντας κατά αυτό τον τρόπο περισσότερες δυνατότητες ικανοποιητικής αντιγονοπαρουσιαστικής λειτουργίας.

Αρχικές μελέτες της ομάδας των Mosoian και συνεργατών έδειξαν ότι η ΠρoTα είναι ένας ισχυρός αναστολέας της, διαμεσολαβούμενης από τον LTR (Long Terminal Repeat) υποκινητή, έκφρασης των γονιδίων του ιού HIV-1 στα μακροφάγα. Η ΠρoTα καταστέλλει την αντιγραφή του ιού HIV-1 και αυτή η αναστολή συμβαίνει στο επίπεδο μετά την αντίστροφη μεταγραφή και την ενσωμάτωση του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή. Η Τα1 δεν φάνηκε να έχει την ίδια αντι-HIV-1 δράση [56].

Πέραν όμως από τις μελέτες σε ασθενείς με αυτοάνοσα νοσήματα και HIV, οι ανοσοενισχυτικές δράσεις της ΠρoTα οδήγησαν σε επέκταση των μελετών σε ασθενείς με καρκίνο, οι οποίοι επίσης παρουσιάζουν εκτεταμένες ανεπάρκειες στο ανοσοποιητικό τους σύστημα. Παρατηρήθηκε ότι τα T-λεμφοκύτταρα των καρκινοπαθών παρουσιάζουν μειωμένες απαντήσεις σε πειράματα MLR¸ οι οποίες in vitro σχεδόν επανέρχονται στα φυσιολογικά τους επίπεδα παρουσία ΠρoTα. Ακόμη, παρατηρήθηκε αποκατάσταση της ΝΚ κυτταροτοξικότητας, η οποία εμφανίζεται μειωμένη στους καρκινοπαθείς εξαιτίας της αυξημένης παραγωγής προσταγλανδίνης E2 (PGE2) και της μειωμένης παραγωγής IL-2. Η ΠρoTα φαίνεται να συμμετέχει στη ρύθμιση της παραγωγής των δύο τελευταίων μορίων, καθότι παρουσία της παρατηρήθηκε επαναφορά των επιπέδων της PGE2 και της IL-2 στα φυσιολογικά επίπεδα [57].

Πρόσφατα πάλι, διερευνήθηκαν οι ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που αυξάνονται σε μονοπύρηνα υγιών δοτών και καρκινοπαθών, μετά από ενεργοποίηση με ΠρoTα, με απώτερο σκοπό να προσδιοριστούν τα ενδοκυτταρικά μονοπάτια

σηματοδότησης που αυτή διεγείρει. Προτάθηκε μάλιστα το εξής μοντέλο, ως προς τον ανοσολογικό τρόπο δράσης της ΠρoTα (Σχήμα 2.2) : την ημέρα 1, η ΠρoTα διεγείρει την ενεργοποίηση των μονοκυττάρων, μέσω των υποδοχέων τύπου Toll (TLRs), ενισχύοντας έτσι την αντιγονοπαρουσιαστική ικανότητα τους και την επακόλουθη ανοσολογική τους σύναψη με τα T-κύτταρα. Την ημέρα 2, τα μονοκύτταρα παράγουν IL-1, ενώ τα T-κύτταρα παράγουν IL-2 και πολλαπλασιάζονται. Τελικά, την ημέρα 3, τα ενεργοποιημένα με την ΠρoTα μονοπύρηνα εκφράζουν σε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνες που σχετίζονται με την προσκόλληση και την κυτταροτοξικότητα, οδηγώντας σε αύξηση της λυτικής τους ικανότητας [58].

Επιπλέον, in vitro, η ΠρoΤα διεγείρει την χημειοταξία των ουδετερόφιλων από ασθενείς με μελάνωμα, καρκίνο του εντέρου και του μαστού, ενισχύει την κυτταροτοξικότητά τους έναντι καρκινικών κυττάρων-στόχων και αυξάνει τις οξειδωτικές τους απαντήσεις [59,60].

Τέλος, πρόσφατα πάλι δεδομένα έδειξαν ότι η ανοσοδραστική περιοχή του μορίου της ΠρoTα εντοπίζεται στο καρβοξυτελικό άκρο του πολυπεπτιδίου, και συγκεκριμένα μεταξύ των αμινοξικών καταλοίπων 100-109. Το καρβοξυτελικό αυτό θραύσμα της ΠρoΤα έχει την ικανότητα να αυξάνει in vitro τον T-κυτταρικό πολλαπλασιασμό και να ενισχύει την ΝΚ και LAK κυτταροτοξικότητα υγιών ατόμων και καρκινοπαθών [61], καθώς επίσης και να ενισχύει τις απαντήσεις ουδετερόφιλων υγιών και καρκινοπαθών [60], σε επίπεδα σχεδόν όμοια με εκείνα που προκαλεί το ακέραιο μόριο της ΠρoΤα.

Σχήμα 2.2 Σχηματική αναπαράσταση του προτεινόμενου μοντέλου όσον αφορά στον τρόπο δράσης της ΠρoTα σε μονοπύρηνα περιφερικού αίματος.

2.4.2 Πιθανοί κυτταρικοί υποδοχείς για την προθυμοσίνη α

Πολύ σημαντικό βήμα για την αποσαφήνιση του μηχανισμού δράσης της ΠρoTα και της κατανομής της, είναι η ταυτοποίηση ειδικών υποδοχέων, στους οποίους μπορεί να προσδένεται για να εκδηλώσει τη δράση της. Τα μέχρι σήμερα δεδομένα προτείνουν πιθανές θέσεις πρόσδεσης της ΠρoTα, καθώς ακόμη δεν έχουν ταυτοποιηθεί ειδικοί για αυτήν υποδοχείς.

Στα μέσα της δεκαετίας του ’90 έκαναν την εμφάνισή τους στην διεθνή βιβλιογραφία οι πρώτες μελέτες για την εύρεση ειδικών θέσεων δέσμευσης για την ΠροΤα, χωρίς βέβαια να δίνουν απάντηση ως προς την ακριβή τους ταυτότητα. Χρησιμοποιώντας ΠρoTα μοσχαριού σημασμένη με ραδιενεργό ιώδιο (125I-ΠρoTα), χαρακτηρίστηκαν σε ανθρώπινα μονοπύρηνα περιφερικού αίματος δύο τύποι σχετιζόμενων υποδοχέων: ένας υψηλής (250 pM) και ένας

χαμηλής συγγένειας (15 nM) [62]. Κατόπιν, διερευνήθηκαν δύο λεμφοκυτταρικοί πληθυσμοί στους οποίους η ΠρoTα έχει βιολογική δράση, λεμφοβλάστες ενεργοποιημένοι με φυτοαιμαγλουτινίνη και ΥΤ κύτταρα. Στους λεμφοβλάστες βρέθηκαν μία υψηλής και μία χαμηλής συγγένειας περιοχές δέσμευσης της ΠρoTα, ενώ στα ΥΤ κύτταρα μόνο υποδοχείς υψηλής συγγένειας. Η εξειδικευμένη πρόσδεση αναστέλλεται από μη σημασμένη ΠρoTα και από αυτοαντισώματα ασθενών με συστηματικό ερυθηματώδη λύκο, τα οποία δεν αναγνωρίζουν την Τα1. Ωστόσο, παρουσία Τα1 και κυτταροκινών, οι οποίες αποτελούν τους κύριους διαμεσολαβητές της βιολογικής δράσης των λεμφοκυττάρων (π.χ IL-2, IFN-γ, IFN-α, IL-1β), δεν επηρεάστηκε η ειδική αυτή δέσμευση. Τα δεδομένα αυτά υποδηλώνουν ίσως ότι οι θέσεις δέσμευσης που προαναφέρθηκαν είναι ειδικές για την ΠρoTα και ότι η έκφρασή τους υπόκειται σε κυτταρική ρύθμιση [63].

Ακολούθησε σχεδόν μια δεκαετία απουσίας δημοσιεύσεων πάνω σε αυτό το πεδίο, ώσπου το 2007 εμφανίστηκε στην βιβλιογραφία η πρώτη μελέτη που έκανε λόγο για ενεργοποίηση ανθρώπινων PBMC από την ΠροΤα μέσω υποδοχέων TLR. Να σημειωθεί ότι λίγα χρόνια πριν είχε προηγηθεί μελέτη που συσχέτιζε την δράση της Τα1 με άμεση ενεργοποίηση υποδοχέων τύπου Toll και συγκεκριμένα του TLR9 [64].

Η βιβλιογραφική μελέτη όμως που έδωσε για πρώτη φορά πιο συγκεκριμένες πληροφορίες γύρω από την ταυτότητα του πιθανού υποδοχέα για την ΠροΤα εμφανίστηκε πολύ πρόσφατα, το 2010, όταν η ερευνητική ομάδα της Mosoian μελετώντας το προφίλ των κυτταροκινών που εκκρίνονται από μακροφάγα ποντικού έπειτα από επώασή τους με ΠροΤα έδειξε ότι η εξωγενώς χορηγούμενη ΠρoTα λειτουργεί ως προσδέτης σε υποδοχείς τύπου Toll-4 (TLR4) και κατά αυτό τον τρόπο επάγει την παραγωγή IFN-I. Αυτή μάλιστα η δράση επάγεται με τη χορήγηση τόσο φυσικής όσο και ανασυνδυασμένης ΠρoTα και καταργείται απουσία υποδοχέων TLR4 [65]. Η κατανόηση του μηχανισμoύ επαγωγής των IFN-I από την ΠρoTα ίσως δώσει στο μέλλον ελπίδες για την θεραπευτική αντιμετώπιση λοιμώξεων από ιούς ευαίσθητους στις ιντερφερόνες.

Ακολούθησε μία ακόμα μελέτη το 2013, της Ioannou και συνεργατών, αυτή την φορά σε δενδριτικά κύτταρα [66]. Και πάλι μελετώντας τα επίπεδα των κυτταροκινών που παράγονται από δενδριτικά κύτταρα έπειτα από επώασή τους με ΠροΤα, και συγκρίνοντάς τα με το προφίλ των κυτταροκινών έπειτα από επώαση των ίδιων κυττάρων με τον LPS-τον «πρότυπο» προσδέτη του TLR4- φάνηκε ότι πιθανότατα η ΠροΤα ασκεί την δράση της στα δενδριτικά κύτταρα σηματοδοτώντας μέσω του TLR4.

Οι μελέτες αυτές των τελευταίων χρόνων είναι λίγες στον αριθμό τους και από τα αποτελέσματά τους δεν μπορούμε να μιλήσουμε ακόμα με σιγουριά για τον υποδοχέα της ΠροΤα καθολικά σε όλα τα κύτταρα που αυτή έχει αποδεδειγμένα δράση. Μπορούμε μόνο να μιλάμε για πιθανό υποδοχέα της ΠροΤα πάνω σε συγκεκριμένους κυτταρικούς πληθυσμούς. Επομένως, περαιτέρω έρευνα πάνω σε αυτό το πεδίο καθίσταται επιτακτική, ούτως ώστε να γίνει σαφής η ύπαρξη ή όχι ειδικού υποδοχέα (ή υποδοχέων), οι μοριακοί μηχανισμοί που επάγουν την έκφρασή του, καθώς επίσης και η πορεία μεταγωγής σήματος που ακολουθείται, για να καταλήξουμε στην κατανόηση της πλήρους δράσης του πολυπεπτιδίου και των ενδεχόμενων θεραπευτικών εφαρμογών του.

Στην προσπάθεια αυτή, η ανάπτυξη ειδικών, ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠρoTα, ικανών να χρησιμοποιηθούν σε κατάλληλες in vitro και in vivo βιολογικές δοκιμασίες αναμένεται να δώσει νέα ώθηση στην έρευνα που σχετίζεται με το σημαντικό αυτό πολυπεπτίδιο. Η ομάδα μας ήταν αυτή που προχώρησε πριν λίγα χρόνια για πρώτη φορά στην επισήμανση πεπτιδικού τμήματος της ΠροΤα/Τα1 (ΠροΤα/Τα1[1-14]) με τεχνήτιο-99m [67]. Το ραδιοεπισημασμένο αυτό παράγωγο μελετήθηκε κυρίως δομικά, συνδυαστικά με μια προκαταρκτική in vivo αξιολόγησή του [68]. Η εμπειρία της ομάδας μας από αυτό το εγχείρημα στάθηκε πολύτιμη για τον σχεδιασμό και την περάτωση της παρούσας διατριβής.

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3

Ραδιοϊσότοπα ΤΕΧΝΗΤΙΟΥ και Διαγνωστικά ραδιοφάρμακα για την ανίχνευση φλεγμονής

Ραδιοϊσότοπο ή ραδιονουκλίδιο καλείται κάθε ισότοπο (ίδιος ατομικός αριθμός, διαφορετικός μαζικός αριθμός) ενός χημικού στοιχείου, το οποίο χαρακτηρίζεται από ασταθή πυρήνα και οδηγείται σε ραδιενεργό διάσπαση εκπέμποντας ραδιενέργεια (σωματίδια α, σωματίδια β, ακτινοβολία γ). Ραδιοϊσότοπα απαντώνται στη φύση αλλά τα περισσότερα παράγονται τεχνητά από τον άνθρωπο. Τα ραδιοϊσότοπα που χρησιμοποιούνται στην Πυρηνική Ιατρική εκπέμπουν είτε ακτινοβολία γ, είτε ακτινοβολία β, είτε και τα δύο ταυτόχρονα. Στις διαγνωστικές εφαρμογές χρησιμοποιούνται ραδιοϊσότοπα που εκπέμπουν ακτινοβολία γ ή β+, ενώ στις θεραπευτικές εφαρμογές εκείνα που εκπέμπουν σωματίδια β- ή α.

3.1. Γενικά στοιχεία για Τεχνήτιο-Ρήνιο

3.1.1. Τεχνήτιο

Το Τεχνήτιο (Tc) ανήκει στα στοιχεία μετάπτωσης, στην 7η ομάδα του Περιοδικού Πίνακα, και έχει ατομικό αριθμό 43. Είναι το πρώτο στοιχείο που παρασκευάστηκε τεχνητά από τον άνθρωπο γι’ αυτό και ονομάστηκε έτσι. Τεχνήτιο δεν βρίσκεται ελεύθερο στην φύση. Παρασκευάζεται κατά κύριο λόγο με βομβαρδισμό του Μολυβδαινίου (Μο) με νετρόνια.

To 99Tc είναι ένα από τα ισότοπα του Τεχνητίου, το οποίο διασπάται με χρόνο ημιζωής(t½) ίσο με 211.000 χρόνια προς Ρουθένιο-99 (Ruthenium-99, 99Ru) (Σχήμα 3.1). Εξαιτίας του μεγάλου χρόνου ημιζωής του αποτελεί σημαντικό πυρηνικό απόβλητο και ακατάλληλο να χρησιμοποιηθεί στην Πυρηνική Ιατρική. Αντίθετα, το βραχύβιο μετασταθερό ισότοπό του, το 99mTc, είναι ιδανικό για χρήση στην διαγνωστική Πυρηνική Ιατρική. Παράγεται από γεννήτριες που περιέχουν 99Mo (t½ = 2,75 μέρες), που αποτελεί το μητρικό νουκλίδιο γι’ αυτό το ισότοπο.

Σχήμα 3.1 Τρόπος παραγωγής του 99mTc από το 99Mo.

Σε μία τέτοια διάταξη (Σχήμα 3.2), το μητρικό ραδιονουκλίδιο 99Mo προσροφάται υπό μορφή μολυβδαινικών ιόντων σε μικρή χρωματογραφική

στήλη, η οποία φέρει οξείδιο του αργιλίου (Al2O3). Το προσροφητικό μέσο έχει προηγουμένως κατεργαστεί ώστε να επιτυγχάνεται ισχυρή προσρόφηση των 99 2- μολυβδαινικών ιόντων ( MoO4 ). Κατά την διάσπαση των μολυβδαινικών 99m - ιόντων παράγονται συνεχώς υπερτεχνητικά ιόντα ( TcO4 ), τα οποία έχουν διαφορετικές χημικές ιδιότητες από τα πρώτα, με αποτέλεσμα να μην συνδέονται στο προσροφητικό υλικό της στήλης και να διαχωρίζονται εύκολα από τα μολυβδαινικά ιόντα κατόπιν έκλουσης της στήλης. Η έκλουση της στήλης επιτυγχάνεται με στείρο διάλυμα φυσιολογικού ορού (NaCl 0,9 %), το οποίο φέρεται σε ορισμένο όγκο σε γυάλινους περιέκτες. Το όλο σύστημα της γεννήτριας φέρει θωράκιση από μόλυβδο, για ισχυρή προστασία έναντι της ακτινοβολίας. Με αυτό τον τρόπο είναι δυνατή η παραγωγή στείρου ενέσιμου διαλύματος υπερτεχνητικού νατρίου, κατάλληλου για ιατρικές εφαρμογές.

Σχήμα 3.2 Σχηματική απεικόνιση γεννήτριας 99Mo-99mTc.

Σχεδόν το 80% των διαγνωστικών εξετάσεων στην κλινική πράξη πραγματοποιούνται σήμερα με ραδιοφάρμακα (ραδιοφάρμακο καλείται κάθε μόριο που είναι επισημασμένο με ένα ή περισσότερα ραδιονουκλίδια και έτοιμο προς χρήση για ιατρικούς σκοπούς) του 99mTc. Τα ραδιοφάρμακα του 99mTc βρίσκουν εφαρμογή στην απεικόνιση της μορφολογίας και παθοφυσιολογίας των οργάνων και των συστημάτων του ανθρώπινου σώματος [69]. Αυτή η εκτεταμένη χρήση του 99mTc οφείλεται στις σχεδόν άριστες φυσικές του ιδιότητες. Αυτές είναι οι εξής:

 Το 99mTc έχει t½ = 6,01 ώρες, χρονικό διάστημα το οποίο είναι μεν αρκετό για να εξεταστούν οι μεταβολικές διαδικασίες στον οργανισμό, αλλά ταυτόχρονα και μικρό ώστε να ελαχιστοποιηθεί η δόση ακτινοβολίας που δέχεται ο ασθενής

 Το 99mTc διασπάται με μια διαδικασία που ονομάζεται ισομερής μετάπτωση, κατά την οποία εκπέμπεται μονοενεργητική γ-ακτινοβολία (140 keV) και χαμηλής ενέργειας ηλεκτρόνια. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει εκπομπή υψηλής ενέργειας ακτινοβολίας, η δόση ακτινοβολίας που δέχεται ο ασθενής είναι χαμηλή.  Η χαμηλής ενέργειας γ-ακτινοβολία που εκπέμπεται επιτρέπει την επακόλουθη εύκολη και επακριβή ανίχνευσή της από μία γ-κάμερα  Τέλος, η χημεία του 99mTc είναι τόσο «ευέλικτη» που επιτρέπει τον σχεδιασμό και την παραγωγή διαφόρων ιχνηθετημένων ενώσεων, με ενσωμάτωση του 99mTc σε μια μεγάλη ποικιλία βιολογικά ενεργών ουσιών, εξασφαλίζοντας έτσι την στοχευμένη μεταφορά του 99mTc σε εξειδικευμένα όργανα και ιστούς κατά περίπτωση.

Σε επίπεδο καθημερινής κλινικής πράξης, η ανιχνευτική διάταξη που εφαρμόζεται κατά βάση για τα διαγνωστικά ραδιοφάρμακα είναι η γ-κάμερα. Μια απλή γ-κάμερα αποτελεί ένα σύστημα που ανιχνεύει γ-ακτινοβολία που εκπέμπεται από ραδιοϊσότοπα τα οποία εισάγονται για αυτό τον σκοπό στο ανθρώπινο σώμα, και εν συνεχεία επιτρέπει την απεικόνιση της κατανομής των φωτονίων και κατ’επέκταση του ραδιοφαρμάκου σε δύο διαστάσεις (PS, Planar Scintigraphy) [70]. Οι ολοένα αυξανόμενες απαιτήσεις της Πυρηνικής Ιατρικής για λήψη ευκρινέστερων απεικονίσεων οδήγησε στην δημιουργία μιας εξελιγμένης εκδοχής της απλής επίπεδης σπινθηρογραφικής απεικόνισης, στην υπολογιστική τομογραφία εκπομπής μονού φωτονίου (SPECT, Single Photon Emission Tomography) [71]. Το σύστημα SPECT απαρτίζεται από μια κλασική γ-κάμερα με 1 έως 4 ανιχνευτικές διατάξεις (κεφαλές) οι οποίες δύνανται να περιστρέφονται γύρω από το σώμα του εξεταζόμενου, παρέχοντας έτσι την δυνατότητα τρισδιάστατης τομογραφικής απεικόνισης. Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί ακόμη πιο εξελιγμένα, υβριδικά συστήματα για την ταυτόχρονη συλλογή ανατομικών και λειτουργικών πληροφοριών (SPECT/CT).

3.1.2. Ρήνιο

Το Ρήνιο (Re) με ατομικό αριθμό 75, ανήκει και αυτό στα στοιχεία μετάπτωσης, στην ίδια ομάδα (7η) του περιοδικού πίνακα με το Τεχνήτιο. Στην φύση είναι αρκετά σπάνιο και απαντάται ως μίγμα του μοναδικού σταθερού ισότοπου 185Re και του ψευδοσταθερού ισότοπου 187Re (εκπέμπει ασθενή - 11 ακτινοβολία β, β max=0.003 MeV, t½ = 10 y) σε αναλογία 37,4 % προς 62,6 %, αντίστοιχα. Αυτό το φαινόμενο, το σταθερό δηλαδή ισότοπο να εμφανίζεται σε μικρότερο ποσοστό από το ψευδοσταθερό συναντάται σε δύο ακόμα στοιχεία, το Ίνδιο (In) και το Τελλούριο (Te). Τεχνήτιο και Ρήνιο εμφανίζουν παρόμοιες φυσικοχημικές ιδιότητες και συνήθως σχηματίζουν ανάλογα σύμπλοκα με τους ίδιους χημικούς περιφερειακούς υποκαταστάτες. Δεδομένης αυτής της ομοιότητας αλλά και του γεγονότος ότι το 185/187Re είναι πρακτικά μη ραδιενεργό άρα και πιο εύκολο στον χειρισμό από κοινά εργαστήρια χημείας, η μελέτη της δομής και των ιδιοτήτων των συμπλόκων του 99mTc πραγματοποιείται εμμέσως μελετώντας τα αντίστοιχα σύμπλοκα με 185/187Re.

3.2 Μέθοδοι παρασκευής συμπλόκων του τεχνητίου-99m

Το τεχνήτιο, όπως και τα περισσότερα στοιχεία μετάπτωσης, σχηματίζει ενώσεις συναρμογής με διάφορους συναρμοτές, οι οποίοι σταθεροποιούν το μέταλλο σε διαφορετικές βαθμίδες οξείδωσης. Μέχρι σήμερα, έχουν παρασκευαστεί και χαρακτηριστεί σταθερά σύμπλοκα του τεχνητίου με αριθμούς συναρμογής από 4 έως 9, όπου το μέταλλο βρίσκεται σε βαθμίδα οξείδωσης από (-I) έως (VII).

Ως συναρμοτές του τεχνητίου έχουν χρησιμοποιηθεί τόσο ανόργανα μονοδραστικά μόρια ή ιόντα, όσο και πολυδραστικές οργανικές ενώσεις οι οποίες διαθέτουν άτομα δότες ηλεκτρονίων σε κατάλληλη διάταξη στο μόριο, όπως αλκοόλες, θειόλες, αμίνες, καρβοξυλικά οξέα, φωσφίνες κ.α.

Πολλές μέθοδοι έχουν αναφερθεί όσον αφορά στη σύνθεση συμπλόκων του τεχνητίου, δεδομένου ότι το μέταλλο αυτό έχει την «ευελιξία» σχηματισμού ποικιλίας συμπλόκων σε διάφορες οξειδωτικές καταστάσεις και με διάφορους

συναρμοτές. Σχεδόν σε όλες τις μεθόδους σύνθεσης συμπλόκων του - τεχνητίου, ως πρώτη ύλη χρησιμοποιούνται τα υπερτεχνητικά ιόντα TcO4 [το μέταλλο βρίσκεται σε οξειδωτική βαθμίδα (VII)], επειδή είναι εύκολα διαθέσιμα μέσω γεννητριών μολυβδαινίου-τεχνητίου. Γενικά, για τη σύνθεση συμπλόκων του τεχνητίου απαιτείται η αναγωγή των υπερτεχνητικών ιόντων σε χαμηλότερη οξειδωτική βαθμίδα και ταυτόχρονα η συναρμογή του ανηγμένου μεταλλικού κέντρου με τον κατάλληλο συναρμοτή ο οποίος και σταθεροποιεί το μέταλλο. Τα δύο αυτά στάδια μπορούν να λάβουν χώρα ταυτόχρονα ή ξεχωριστά. Δύο γενικές μέθοδοι χρησιμοποιούνται σήμερα για την σύνθεση συμπλόκων του τεχνητίου: η «αναγωγική μέθοδος» και η «μέθοδος με αντικατάσταση». Στη «αναγωγική μέθοδο», ο σχηματισμός των συμπλόκων γίνεται με αναγωγή των υπερτεχνητικών ανιόντων και ταυτόχρονη συναρμογή του συναρμοτή με το αναχθέν μέταλλο. Αντιθέτως, στην «μέθοδο με αντικατάσταση», αρχικά σχηματίζεται ένα ενδιάμεσο ασταθές σύμπλοκο του μετάλλου σε καθορισμένη οξειδωτική βαθμίδα, το οποίο στη συνέχεια δίνει αντίδραση αντικατάστασης με επίδραση κατάλληλου συναρμοτή∙ από αυτή την αντίδραση σχηματίζεται το τελικό επιθυμητό σύμπλοκο στο οποίο η οξειδωτική κατάσταση του μετάλλου παραμένει αμετάβλητη. Η τελευταία μέθοδος υπερτερεί και προτιμάται έναντι της πρώτης, δεδομένου ότι οδηγεί στην δημιουργία λιγότερων παραπροϊόντων, με αποτέλεσμα την πιο εύκολη απομόνωση των συμπλόκων σε καθαρή μορφή.

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον παρουσιάζουν τα σύμπλοκα του τεχνητίου-99m στην κατάσταση οξείδωσης (V), διότι υπάρχει μεγάλος αριθμός συναρμοτών με άτομα-δότες ηλεκτρονίων (S,N,O,P) που σταθεροποιούν το τεχνήτιο (V). Πολλά από τα σύμπλοκα του τεχνητίου-99m (V), που αποτελούν και την περισσότερο μελετημένη ομάδα των συμπλόκων του τεχνητίου-99m, χρησιμοποιούνται ευρέως ως ραδιοφάρμακα.

Ανάμεσα στις πολλές κατηγορίες ενώσεων του τεχνητίου που μπορούν να δώσουν αντιδράσεις αντικατάστασης για τον σχηματισμό τελικών συμπλόκων του τεχνητίου σε βαθμίδα οξείδωσης (V), αποτελούν τα σύμπλοκά του με διάφορα υδροξυοξέα, όπως το γλυκονικό, το γλυκοεπτονικό κ.α. Τα σύμπλοκα αυτά παρασκευάζονται εύκολα σε υδατικά διαλύματα με αναγωγή

των υπερτεχνητικών ανιόντων από χλωριούχο κασσίτερο (SnCl2), παρουσία 66

περίσσειας του υδροξυοξέος ή του μετά ασβεστίου ή νατρίου άλατός του, όπως φαίνεται στην παρακάτω αντίδραση:

- [TcO4 ] + περίσσεια γλυκοεπτονικού ασβεστίου  [Tc(V)-γλυκοεπτονικό]

Εν συνεχεία, τα παραγόμενα σύμπλοκα Tc(V)-γλυκοεπτονικού αντιδρούν με μεγάλο αριθμό συναρμοτών με αποτέλεσμα τον σχηματισμό οξοσυμπλόκων του τεχνητίου (V) :

[Tc(V)-γλυκοεπτονικό] + συναρμοτής  [Tc(V)-σύμπλοκο] + γλυκοεπτονικό οξύ

Μετά την αντίδραση αναγωγής των υπερτεχνητικών ανιόντων μία μόνο οξοομάδα παραμένει συνδεδεμένη με το μέταλλο, με τις υπόλοιπες να πρωτονιώνονται και να απομακρύνονται υπό την μορφή νερού. Η οξοομάδα παραμένει συνδεδεμένη με το μέταλλο προκειμένου να εξουδετερώνει την μεγάλη έλλειψη ηλετρονιακού του φορτίου, ενώ οι υπόλοιπες κενές θέσεις οι οποίες προκύπτουν στην συναρμογή του μετάλλου καλύπτονται από άτομα δότες του συναρμοτή.

Η ερευνητική μας ομάδα προχώρησε πριν λίγα χρόνια στην επισήμανση για πρώτη φορά πεπτιδικού τμήματος της ΠροΤα/Τα1 με τεχνήτιο-99m [67]. Το ρόλο του τελικού συναρμοτή του μετάλλου σε αυτή την περίπτωση κατείχε ένα πεπτιδικό παράγωγο που περιελάμβανε την αμινοξική αλληλουχία ΠροΤα/Τα1[1-14], το οποίο έφερε ομοιοπολικά προσδεδεμένο έναν χηλικό παράγοντα πεπτιδικής δομής, συγκεκριμένα ένα τριπεπτίδιο-την dmGlySerCys- το οποίο έχει την ικανότητα να συμπλέκει επιτυχώς το τεχνήτιο στην οξειδωτική βαθμίδα (V) [72] (Σχήμα 3.3).

Σχήμα 3.3 Σχηματική απεικόνιση συνερμογής του 99mTc με τον χηλικό συμπλέκτη dmGly-Ser-Cys.

Αυτή η προσέγγιση σύμπλεξης του τεχνητίου-99m ακολουθήθηκε και στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής, όπως θα αναλυθεί στο κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι.

3.3 Ραδιοεπισημασμένες ενώσεις για την διάγνωση της φλεγμονής

Η Πυρηνική Ιατρική σήμερα παρέχει πανίσχυρες μη επεμβατικές τεχνικές για την οπτικοποίηση φλεγμονωδών διεργασιών στο ανθρώπινο σώμα και κατ’ επέκταση τη διάγνωση φλεγμονωδών διαταραχών. Χρησιμοποιώντας ολόσωμη απεικόνιση καθίσταται εφικτός ο προσδιορισμός τόσο της ακριβούς θέσης μιας φλεγμονής όσο και η ύπαρξη περισσότερων της μίας εστιών φλεγμονής. Αυτή την στιγμή υπάρχει διαθέσιμη μια ευρεία σειρά προσεγγίσεων για την απεικόνιση των επιμέρους σταδίων μιας φλεγμονώδους απόκρισης. Αυτές οι προσεγγίσεις περιλαμβάνουν τόσο μη εξειδικευμένη όσο και εξειδικευμένη στόχευση. Μη εξειδικευμένες ραδιοεπισημασμένες ενώσεις όπως κιτρικό οξύ επισημασμένο με γάλλιο 67 (67Ga-citrate) ή επισημασμένες ανθρώπινες ανοσοσφαιρίνες συσσωρεύονται στους τόπους της φλεγμονής λόγω αυξημένης τοπικά αγγειακής διαπερατότητας [73]. Στον αντίποδα, εξειδικευμένη συσσώρευση ραδιοεπισημασμένων ενώσεων σε εστίες φλεγμονής μπορεί να είναι αποτέλεσμα:

i) πρόσδεσής τους στο ενεργοποιημένο ενδοθήλιο, π.χ. ραδιοεπισημασμένα αντισώματα για τις Ε-σελεκτίνες [74].

ii) αυξημένης τοπικής εισροής λευκοκυττάρων, π.χ. ραδιοεπισημασμένα αυτόλογα λευκοκύτταρα [75], ραδιοεπισημασμένα αντισώματα έναντι των ουδετερόφιλων [76,77] και ραδιοεπισημασμένες κυτταροκίνες [78].

iii) αυξημένης πρόσληψης γλυκόζης από τα ενεργοποιημένα λευκοκύτταρα (επισημασμένη με φθόριο-18 φθοροδεoξυγλυκόζη, 18F- FDG [79]) ή

iv) άμεσης πρόσδεσής τους στην επιφάνεια μικροοργανισμών (σε περιπτώσεις σηπτικής φλεγμονής/λοίμωξης), π.χ. ραδιοεπισημασμένα αντιβιοτικά (π.χ. 99mTc-ciprofloxacin [80]) και ραδιοεπισημασμένα αντιμικροβιακά πεπτίδια [81].

Η σπινθηρογραφική απεικόνιση με τη χρήση αυτόλογων λευκοκυττάρων, επισημασμένων είτε με τεχνήτιο-99m είτε με ίνδιο-111, παραμένει μέχρι στιγμής η νούμερο ένα προσέγγιση της Πυρηνικής Ιατρικής για την απεικόνιση της φλεγμονής. Ωστόσο, η λίστα των διαθέσιμων επισημασμένων ενώσεων για αυτή την ένδειξη ολοένα και διευρύνεται.

Εξελίξεις στον τομέα των ραδιοεπισημασμένων πεπτιδίων αναμένεται να οδηγήσουν στην ανάπτυξη και διάθεση ενώσεων υψηλής ειδικής ραδιενέργειας και σχετικά μικρού μοριακού βάρους, με επιθυμητές φαρμακοκινητικές ιδιότητες και υψηλή εξειδίκευση στόχευσης, οι οποίες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν στην διάγνωση της φλεγμονής.

Σκοπός

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η ανάπτυξη ειδικών παραγώγων της ανθρώπινης Προθυμοσίνης α (ΠρoTα), ικανών να επισημανθούν με το ραδιοϊσότοπο του τεχνητίου, τεχνήτιο-99m (99mTc), και η επακόλουθη αξιοποίησή τους σε in vitro και in vivo βιολογικές μελέτες ώστε να συλλεγούν πληροφορίες οι οποίες θα συμβάλλουν: i) σε επίπεδο βασικής έρευνας, στην κατανόηση του μέχρι στιγμής αδιευκρίνιστου μηχανισμού εξωκυτταρίας δράσης της ΠροΤα και ii) σε πρακτικό επίπεδο, θα διευκολύνουν την πιθανή εισαγωγή του μορίου της ΠροΤα ή και κάποιου μικρότερου πεπτιδικού της θραύσματος, εξίσου βιοδραστικού, στην κλινική πράξη.

Πιο λεπτομερώς, στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής πραγματοποιήθηκε, εν αρχή, σύνθεση 2 εξειδικευμένων παραγώγων της ΠρoTα τα οποία θα περιέχουν στην αλληλουχία τους το τριπεπτίδιο dmGly-Ser-Cys, το οποίο αποτελεί άριστο χηλικό συμπλέκτη μετάλλων όπως το Τεχνήτιο και το Ρήνιο. Το ένα από τα δύο αυτά παράγωγα περιέχει το βιολογικά δραστικό C-τελικό δεκαπεπτίδιο της ΠροΤα, ΠροΤα[100-109], ενώ το άλλο περιέχει ένα πεπτίδιο με τα ίδια ακριβώς αμινοξέα όπως το ΠροΤα[100-109] αλλά σε διαφορετική πρωτοδιάταξη- «αναδομημένο» πεπτίδιο (scrambled), το οποίο σχεδιάστηκε για να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας συγκριτικά με το πρώτο στις μελέτες μας. Παράλληλα, πραγματοποιήθηκε σύνθεση 5 πεπτιδικών τμημάτων της ΠροΤα, τα οποία καλύπτουν την N-τελική (1-14 και 1-28), την κεντρική (51-89) και την C-τελική (100-109) περιοχή του πολυπεπτιδίου και τα οποία σύμφωνα με την βιβλιογραφία εμφανίζουν ανοσοδραστικότητα, ώστε να χρησιμοποιηθούν στις in vitro μελέτες μας, συγκριτικά πάντα με τα εξειδικευμένα παράγωγα της ΠροΤα.

Τα δύο εξειδικευμένα παράγωγα της ΠρoTα συμπλέχθηκαν με μη ραδιενεργό ρήνιο (185/187Re), ώστε να αξιολογηθούν βιολογικά in vitro αντί των αντίστοιχων, ραδιοεπισημασμένων 99mTc-συμπλόκων, κατά πάγια τακτική η οποία ακολουθείται στην βιβλιογραφία. Η in vitro αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικό σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων υγιών

δοτών και περιελάμβανε τόσο μελέτη της βιοδραστικότητας των παραγώγων όσον αφορά στην επαγωγή ενδοκυτταρικής παραγωγής ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS) από τα ουδετερόφιλα, όσο και έλεγχο της επίδρασης των παραγώγων στην έκφραση του υποδοχέα TLR4 στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων.

Εν συνεχεία, τα δύο εξειδικευμένα παράγωγα της ΠροΤα συμπλέχθηκαν με ραδιενεργό τεχνητιο 99mTc και διενεργήθηκαν οι απαραίτητοι έλεγχοι ώστε να διασφαλιστεί η παραλαβή σταθερών συμπλόκων, με υψηλή ειδική ραδιενέργεια τα οποία εγγυήθηκαν την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν εφαρμόζοντάς τα. Τα ραδιοεπισημασμένα παράγωγα της ΠροΤα χρησιμοποιήθηκαν σε in vitro μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσης και πάλι σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα, οι οποίες συνίσταντο τόσο σε μελέτες κορεσμού σήματος (Saturation binding studies) που έδωσαν πληροφορίες για την ύπαρξη εξειδικευμένων θέσεων αναγνώρισης και πρόσδεσης των παραγώγων της ΠροΤα στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων, όσο και σε μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης (Inhibition binding studies), οι οποίες έδωσαν πληροφορίες για την ταυτότητα αυτών των θέσεων δέσμευσης.

Τέλος, πραγματοποιήθηκε in vivo αξιολόγηση των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα προκειμένου να «αποκαλυφθεί» η in vivo πορεία που αυτά ακολουθούν χορηγούμενα σε έναν ζωντανό οργανισμό. Η in vivo αξιολόγηση περιελάμβανε τόσο μελέτες βιοκατανομής σε ποντικούς Swiss albino με πειραματικά εγκατασταθείσα φλεγμονή, όσο και σπινθηρογραφικές ολόσωμες απεικονίσεις τους, με χρήση απεικονιστικής διάταξης ειδικά σχεδιασμένης για μικρά ζώα.

Β. ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4

ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

4.1 Σύνθεση, καθαρισμός και ταυτοποίηση πεπτιδίων

4.1.1 Συνθετικά πεπτίδια και βιολογικές εφαρμογές

Η απομόνωση πεπτιδίων από φυσικές πηγές (θηλαστικά, αμφίβια, έντομα, ερπετά, θαλάσσιοι οργανισμοί) είναι συνήθως διαδικασία επίπονη, υψηλού κόστους και σε μερικές περιπτώσεις πρακτικά ανέφικτη. Η Βιοτεχνολογία επιτρέπει την «πρόσβαση» σε μεγάλα πεπτίδια και πρωτεΐνες, μέσω της τεχνικής του ανασυνδυασμένου DNΑ, διαδικασία όμως επίσης υψηλού κόστους. Αντιθέτως, η χημική σύνθεση πεπτιδίων πλεονεκτεί όσον αφορά στην ποικιλία και την επιλογή των μεθόδων, το κόστος, την ποσότητα και την ποιότητα του προϊόντος. Πράγματι, σήμερα υπάρχει η δυνατότητα εύκολης παραγωγής συνθετικών πεπτιδίων με μικρό κόστος, σε ικανοποιητικές ποσότητες και βέβαια με υψηλή καθαρότητα, δεδομένου ότι τα πεπτίδια παραλαμβάνονται απαλλαγμένα από προσμίξεις με άλλα πρωτεϊνικά ή μη μόρια. Η χημική σύνθεση πεπτιδίων αποτελεί επίσης τη μόνη μέθοδο παραλαβής νέων-τροποποιημένων παραγώγων τα οποία αποτελούνται από μη πρωτεϊνικά φυσικά αμινοξέα ή/και άλλα οργανικά μόρια.

Έτσι, τα τελευταία χρόνια, η χημική σύνθεση πεπτιδίων έναντι της απομόνωσης φυσικών πεπτιδίων και ολόκληρων πρωτεϊνών κερδίζει συνεχώς έδαφος σε πολλά ερευνητικά πεδία.

Με τη μαζική παραγωγή συνθετικών πεπτιδίων είναι δυνατή η δημιουργία πεπτιδικών βιβλιοθηκών αναφοράς, οι οποίες θα απαρτίζονται από πεπτίδια ταυτοποιημένα όσον αφορά στη μάζα αλλά και στη δομή τους, και έτσι θα είναι δυνατή η σύγκρισή τους με νεοανακαλυφθέντα υπό μελέτη πεπτίδια. Εξάλλου, η χρήση συνθετικών πεπτιδίων επιτρέπει την διεξαγωγή πειραμάτων αλληλοσυσχέτισης δομής και λειτουργίας βιολογικά ενεργών

πεπτιδίων. Τέτοια πεπτίδια περιλαμβάνουν ορμόνες καθώς επίσης και έναν μεγάλο αριθμό τοξινών. Εν συνεχεία, είναι καθολικά αποδεκτό ότι η δυνατότητα παραγωγής και χρήσης συνθετικών πεπτιδίων έχει κυριολεκτικά «λύσει τα χέρια» στους ερευνητές που ασχολούνται με την παραγωγή αντισωμάτων. Πλέον, δεν χρειάζεται κανείς να κοπιάσει για να απομονώσει και να καθαρίσει μια πρωτεΐνη, η οποία στη συνέχεια θα χρησιμοποιηθεί ως αντιγόνο προς ανοσοποίηση. Αρκεί να συντεθεί κατάλληλο πεπτιδικό θραύσμα της ακέραιης πρωτεΐνης (πεπτιδικός «επίτοπος») και, αφού προσδεθεί σε κατάλληλο φορέα, να ενεθεί σε ένα πειραματόζωο (π.χ. κουνέλι) με σκοπό την in vivo παραγωγή αντισωμάτων και την μετέπειτα παραλαβή τους από το ζώο. Ένας πολύ ενεργός τομέας της έρευνας πάνω στα συνθετικά πεπτίδια περιλαμβάνει το σχεδιασμό και την ανάπτυξη καινούριων εμβολίων, δεδομένου ότι μπορούν να κατασκευαστούν βιβλιοθήκες πεπτιδίων τα οποία μπορούν να αξιολογούνται ως προς τις βιολογικές τους ιδιότητες. Τέλος, μεγάλο ενδιαφέρον παρουσιάζουν πεπτίδια τα οποία έχουν την ικανότητα να διεισδύουν εύκολα σε ιστούς και κύτταρα, λειτουργώντας έτσι ως «φορείς ή οχήματα» διαφόρων παραγόντων όπως είναι αντιμικροβιακά πεπτίδια, φαρμακολογικώς δραστικά μόρια, DNA και άλλα.

4.1.2 Πεπτιδική σύνθεση στερεάς φάσης

Το 1902 διατυπώθηκε ταυτόχρονα από τους Emil Fischer και Franz Hofmeister ότι οι πρωτεΐνες και τα πεπτίδια αποτελούνται από αμινοξέα, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με πεπτιδικό δεσμό. Αμέσως μετά άρχισε η προσπάθεια σύνθεσης πεπτιδίων που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την μελέτη των ιδιοτήτων των πρωτεϊνών και την διερεύνηση βιοχημικών διεργασιών.

Παρότι τα επιτεύγματα της κλασικής πεπτιδοχημείας ήταν επαναστατικά για την εποχή τους, η μεθοδολογία που εφαρμοζόταν είχε σημαντικούς περιορισμούς διότι αφενός η εφαρμογή της απαιτούσε πολύ χρόνο, αφετέρου η απομόνωση των ενδιάμεσων προϊόντων μετά από κάθε στάδιο μιας

συνθετικής πορείας παρουσίαζε μεγάλη δυσκολία. Γι’ αυτό το λόγο, η εισαγωγή της μεθοδολογίας της πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση (solid- phase peptide synthesis, SPPS) από τον Bruce Merrifield το 1963 ήταν αυτή που τελικά άνοιξε τον δρόμο προς την ευρεία παρασκευή και χρήση συνθετικών πεπτιδίων.

Η αρχή της μεθόδου σύνθεσης πεπτιδίων σε στερεά φάση συνοψίζεται ως εξής (Σχήμα 4.1): Το καρβοξυτελικό αμινοξύ του πεπτιδίου που πρόκειται να συντεθεί προσδένεται ομοιοπολικά μέσω της τελικής α-καρβοξυλομάδας του σε ένα αδιάλυτο πολυμερές και στη συνέχεια το πεπτίδιο αναπτύσσεται σταδιακά πάνω στο αδιάλυτο πολυμερές. Το αναπτυσσόμενο πεπτίδιο μένει προσδεδεμένο στο πολυμερές υπόστρωμα και διαχωρίζεται από τα αντιδραστήρια που προστίθενται σε κάθε στάδιο με μια απλή διήθηση. Έτσι, ξεπερνιέται το πρόβλημα καθαρισμού και απομόνωσης σε καθαρή μορφή των ενδιάμεσων προϊόντων της σύνθεσης και ελαττώνεται το πρόβλημα διαλυτότητας των ενδιάμεσων προϊόντων στους διαλύτες της σύνθεσης. Στο τέλος, το πεπτίδιο αποσπάται από το πολυμερές υπόστρωμα με προσθήκη ενός μίγματος αντιδραστηρίων που προκαλεί διάσπαση του ομοιοπολικού δεσμού που συνδέει το καρβοξυτελικό αμινοξύ με το πολυμερές. Μεγάλο πλεονέκτημα της μεθόδου είναι το γεγονός ότι η όλη σύνθεση μπορεί να αυτοματοποιηθεί πλήρως.

Ως στερεό υπόστρωμα χρησιμοποιούνται ρητίνες με επαρκή μηχανική σταθερότητα και επιθυμητές φυσικοχημικές ιδιότητες (π.χ. επιθυμητός βαθμός διόγκωσής τους στους διαλύτες της πεπτιδικής σύνθεσης). Οι πιο διαδεδομένες για τον σκοπό αυτό είναι οι υποκατεστημένες πολυστυρολικές ρητίνες και πιο συγκεκριμένα το πολυστυρόλιο συμπολυμερισμένο με 1% 1,3- διβινυλοβενζόλιο (διασταυρωμένο πολυστυρόλιο, cross-linked polystyrene), οι συμπολυμερισμένες ρητίνες του πολυστυρολίου με πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG-PS) καθώς επίσης και ρητίνες από πολυαιθυλενογλυκόλη (ChemMatrix).

Σχήμα 4.1 Σχηματική απεικόνιση της μεθοδολογίας πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση.

Κατά την σύνθεση πεπτιδίων σε στερεά φάση είναι απαραίτητη η παροδική προστασία της α-αμινομάδας του προστιθέμενου αμινοξέος, καθώς και η «μόνιμη» προστασία των πλευρικών χαρακτηριστικών ομάδων του, έτσι ώστε να αποφευχθούν τα προβλήματα πολυμερισμού ή δημιουργίας διακλαδισμένων προϊόντων. Για την παροδική προστασία της α-αμινομάδας των αμινοξέων, πρέπει η χρησιμοποιούμενη προστατευτική ομάδα να μπορεί 78

να απομακρύνεται εύκολα και ποσοτικά μετά την ολοκλήρωση του σταδίου της προσθήκης του αμινοξέος στην αμινοξική αλυσίδα που έχει σχηματισθεί επάνω στην ρητίνη, έτσι ώστε η α-αμινομάδα να είναι έτοιμη να αντιδράσει με την α-καρβοξυλομάδα του επόμενου αμινοξέος. Αντίθετα, οι πλευρικές προστατευτικές ομάδες πρέπει να είναι σταθερές («μόνιμη» προστασία) σε όλους τους επαναλαμβανόμενους κύκλους αποπροστασίας των α- αμινομάδων. Το σύστημα όπου κάθε τάξη προστατευτικών ομάδων μπορεί να απομακρυνθεί παρουσία των υπολοίπων, με διαφορετικών ειδών αντιδράσεις, ονομάζεται «ορθογωνικό».

Το ορθογωνικό σύστημα προστασίας που χρησιμοποιήθηκε κατά την σύνθεση των πεπτιδικών τμημάτων της ΠρoTα ήταν ο συνδυασμός της 9- φλουορενυλομεθοξυκαρβονυλομάδας (ομάδα Fmoc) για την παροδική προστασία της α-αμινομάδας των αμινοξέων και των παραγώγων της τριτοταγούς βουτυλομάδας (tBu) ή της τριτυλομάδας (trt) για την μόνιμη προστασία των πλευρικών ομάδων. Η Fmoc ομάδα απομακρύνεται σε ασθενώς βασικές συνθήκες, ενώ οι tBu/trt ομάδες απαιτούν όξινες συνθήκες και απομακρύνονται μετά το τέλος της πεπτιδικής σύνθεσης, συνήθως κατά την αποκοπή του πεπτιδίου από την ρητίνη.

Eπιγραμματικά, η μεθοδολογία της πεπτιδικής σύνθεσης στερεάς φάσης με την ομάδα παροδικής προστασίας Fmoc, περιλαμβάνει τα στάδια που ακολουθούν:

1. Την πρόσδεση μέσω ομοιοπολικού δεσμού (anchoring) του αμινοξέος που βρίσκεται στο καρβοξυ-τελικό άκρο του πεπτιδίου που πρόκειται να συντεθεί στη ρητίνη μέσω ενός ενδιάμεσου μορίου-συνδέτη (linker). Το αμινοξύ έχει την πλευρική του ομάδα καθώς και την α-αμινομάδα του προστατευμένες. Ο ομοιοπολικός δεσμός που δημιουργείται μεταξύ του πρώτου αμινοξέος και της ρητίνης παραμένει σταθερός καθόλη τη διάρκεια της σύνθεσης.

2. Την αποπροστασία της α-αμινομάδας υπό συνθήκες στις οποίες η προστασία των πλευρικών ομάδων παραμένει σταθερή (μόνιμη προστασία). Συγκεκριμένα, η ομάδα παροδικής προστασίας Fmoc απομακρύνεται γρήγορα με δευτεροταγείς αμίνες διαλυμένες σε κάποιον πολικό διαλύτη,

συνήθως DMF [82]. Έτσι, η απομάκρυνση της ομάδας Fmoc γίνεται συνήθως με διάλυμα πιπεριδίνης 20 % σε DMF.

3. Την κατάλληλη ενεργοποίηση της καρβοξυλικής ομάδας του επόμενου αμινοξέος της αλληλουχίας και τη σύζευξη αυτού στην ελεύθερη αμινομάδα του προηγούμενου αμινοξέος, μέσω του σχηματισμού ενός πεπτιδικού δεσμού.

4. Την τελική αποκοπή του πεπτιδίου από την ρητίνη χρησιμοποιώντας διαλύματα του τριφθοροξικού οξέος που περιέχουν κατάλληλα ειδικά αντιδραστήρια (scavengers). Τα αντιδραστήρια αυτά δεσμεύουν δραστικές ομάδες (π.χ. καρβοκατιόντα) που απελευθερώνονται κατά την απομάκρυνση των διαφόρων προστατευτικών ομάδων.

Στα πλαίσια της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε η σύνθεση 5 πεπτιδικών τμημάτων της ανθρώπινης ΠρoTα και επιπλέον 2 ειδικών πεπτιδικών παραγώγων της ανθρώπινης ΠρoΤα, ικανών να επισημανθούν με το ραδιοϊσότοπο 99mTc.

Πιο συγκεκριμένα, αρχικά έγινε η επιλογή βιολογικώς δραστικών, σύμφωνα με την βιβλιογραφία, τμημάτων της ΠρoTα, από το καρβοξυτελικό της άκρο (αμινοξέα 100-109) [61], από το αμινοτελικό της άκρο (αμινοξέα 1-14 και 1- 28) [83,84] και από το κεντρικό της τμήμα (αμινοξέα 51-89) [65]. Στη συνέχεια, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν τα 7 συνολικά πεπτιδικά μόρια της ΠρoTα, η αμινοξική αλληλουχία των οποίων παρατίθεται στον πίνακα που ακολουθεί (Πίνακας 4.1). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4.1, τα συνθετικά παράγωγα ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 περιέχουν στο αμινοτελικό τους άκρο την αλληλουχία διμεθυλογλυκίνη-σερίνη-κυστεΐνη (dmGSC), η οποία σύμφωνα με την βιβλιογραφία έχει την ικανότητα να συμπλέκει σταθερά τα μέταλλα τεχνήτιο και ρήνιο [85]. Το παράγωγο ΠροΤα-D1 περιέχει το βιολογικώς δραστικό τμήμα ΠρoTα[100-109], στο οποίο εστιάσαμε κυρίως το ενδιαφέρον μας ενώ το παράγωγο ΠροΤα-D2 περιέχει ένα «αναδομημένο» πεπτίδιο, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας του πρώτου.

Επιπλέον, τα παράγωγα αυτά φέρουν ένα τμήμα που συνδέει την αλληλουχία του χηλικού συμπλέκτη (dmGSC) με το βιολογικώς δραστικό τμήμα ΠρoTα[100-109]. Το τμήμα αυτό (spacer arm, linker) αποτελείται από αμινοκαπροΐκό οξύ.

Πίνακας 4.1: Αμινοξική αλληλουχία των πεπτιδικών μορίων που συνετέθησαν.

Συνθετικό παράγωγο της Αμινοξική αλληλουχία ΠρoTα (κώδικας ενός γράμματος) #1. ΠρoTα-D1 dmGSC-Aca-T100KKQKTDEDD109 #2. ΠρoTα-D2 dmGSC-Aca- KETDKDKTDQ #3. ΠρoTα[100-109] T100KKQKTDEDD109 #4. NCP («αναδομημένο» KETDKDKTDQ ΠρoTα[100-109]) #5. ΠρoTα[1-28]/Tα1 AcS1DAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN28 #6. ΠρoTα[1-14] AcS1DAAVDTSSEITTK14 #7. ΠρoTα[51-89] * E51VDEEEEEGGEEEEEEEEGDDGDEDE EAESATGKR89

dmG: διμεθυλογλυκίνη, AcS: σερίνη με ακετυλιωμένη την Να-αμινομάδα, Aca: αμινοκαπροϊκό οξύ (6-αμινο-εξανοϊκό οξύ)

* Οι αριθμοί αντιστοιχούν στην ισομορφή 1 της ΠροΤα [Homo sapiens] (NCBI Reference Sequence: NP_001092755.1).

Τα πεπτιδικά παράγωγα #5, #6 και #7, συντέθηκαν όπως ακριβώς περιγράφεται στην βιβλιογραφία [67,86] και για αυτό τον λόγο δεν θα αναλυθεί η σύνθεσή τους στην παρούσα εργασία, ενώ τα παράγωγα #3 και #4 καθώς και τα ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 συνετέθησαν για πρώτη φορά στα πλαίσια της παρούσας εργασίας. Το πεπτιδικό παράγωγο #7 συνετέθηκε στην Γερμανία, με αυτόματη οργανολογία, στο πλαίσιο συνεργασίας με το Πανεπιστήμιο του Tuebingen.

Το «αναδομημένο» (scrambled) ΠροΤα[100-109] πεπτίδιο, NCP, έχει την ίδια αμινοξική σύσταση με το πεπτίδιο ΠροΤα[100-109], αλλά με διαφορετική πρωτοδιάταξη (KETDKDKTDQ έναντι T100KKQKTDEDD109), που προέκυψε

μετά από κατάργηση της πολικότητας στα άκρα του ΠροΤα[100-109] καθώς και του σήματος NLS (T100KKQKT105). Η χρήση αυτού του πεπτιδίου έγινε προκειμένου να επιβεβαιωθεί ότι η δράση του ΠροΤα[100-109] είναι ειδική για την αλληλουχία του.

Ακολουθούν αναλυτικά τα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης στερεάς φάσης, όπως πραγματοποιήθηκαν για την σύνθεση των πεπτιδικών παραγώγων.

Υλικά και Όργανα

Σε όλα τα στάδια της πεπτιδικής σύνθεσης χρησιμοποιήθηκαν αντιδραστήρια και διαλύτες-προϊόντα των εταιριών Sigma-Aldrich, Merck και Novabiochem. Τα Fmoc αμινοξέα ήταν προμήθεια από τα Χημικά και Βιοφαρμακευτικά Εργαστήρια Πατρών. Η μέτρηση της οπτικής απορρόφησης των διαλυμάτων πιπεριδίνης πραγματοποιήθηκε σε φασματοφωτόμετρο Shimadzu, UV-160-A.

Αποπροστασία της ρητίνης και μέτρηση του βαθμού υποκατάστασής της (Capacity, C)

Η σύνθεση των πεπτιδικών παραγώγων της ΠρoΤα πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας την ρητίνη 4-(2',4'-διμεθοξυφαινυλο-Fmoc-αμινομεθυλο)- φαινοξυπολυστυρόλιο. Η ρητίνη αυτή είναι Fmoc προστατευμένη, επομένως, πριν την προσθήκη του 1ου αμινοξέος πρέπει να γίνει η απομάκρυνση της Fmoc ομάδας και ο ακριβής προσδιορισμός της περιεκτικότητας της ρητίνης σε αμινομάδες (Fmoc capacity).

Προσδιορισμός της περιεκτικότητας της ρητίνης σε Fmoc αμινομάδες

Για τον προσδιορισμό της περιεκτικότητας της ρητίνης σε Fmoc-αμινομάδες ακολουθείται η εξής διαδικασία: Σε δοχείο όγκου 15 mL προστίθεται ποσότητα Fmoc-προστατευμένης ρητίνης 2-4 mg την οποία έχουμε ξηράνει επαρκώς σε ξηραντήρα κενού. Στη συνέχεια προσθέτουμε 10 mL διαλύματος πιπεριδίνης 20% (v/v) σε DMF και αφήνουμε το σύστημα να αντιδράσει για 30 min αναδεύοντάς το περιοδικά.

Στη συνέχεια, φωτομετρούμε το υπερκείμενο διάλυμα στα 301 nm (μήκος κύματος στο οποίο απορροφούν τα Fmoc/ppiperidine adducts) και προσδιορίζουμε την αρχική περιεκτικότητα της ρητίνης σε Fmoc αμινομάδες χρησιμοποιώντας τον πιο κάτω τύπο (Διδακτορική διατριβή Χ. Ζήκου, Tμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Αθηνών, Αθήνα 2000):

όπου C: υποκατάσταση (mmol Fmoc/g ρητίνης), Α: απορρόφηση δείγματος στα 301 nm, Mρητίνης: μάζα δείγματος ρητίνης (mg).

Με βάση την τιμή της υποκατάστασης C της ρητίνης, υπολογίζονται οι ποσότητες των Fmoc αμινοξέων που θα προστεθούν κατά την διάρκεια της SPPS καθώς και οι ποσότητες των υπόλοιπων αντιδραστηρίων.

Απομάκρυνση της Fmoc ομάδας από τη ρητίνη

Σε κατάλληλη σύριγγα εφοδιασμένη με ηθμό ζυγίζεται ποσότητα ρητίνης (500 mg). Για την επαρκή διόγκωση της ρητίνης, διαβιβάζεται αρχικά στη ρητίνη (5 mL/500 mg ρητίνης) CH2Cl2 (3 x 1 min). H ποσότητα του CH2Cl2 διηθείται κάθε φορά και στη συνέχεια διαβιβάζεται (5 mL/500 mg ρητίνης) DMF (5 x 1 min). Μετά από κάθε προσθήκη ακολουθεί διήθηση του DMF και στη συνέχεια προστίθεται διάλυμα πιπεριδίνης (5 mL/500 mg ρητίνης) 20% (v/v) σε DMF (3 x10 min). Μετά την παρέλευση του συνολικού χρόνου αποπροστασίας (30 min), η ρητίνη διηθείται και εκπλένεται 10 φορές με DMF (10 x 1 min), ώστε να είναι κατάλληλη για την αγκυροβόληση του πρώτου Fmoc-αμινοξέος.

Αγκυροβόληση του πρώτου αμινοξέος

Για την αγκυροβόληση του πρώτου αμινοξέος, περίσσεια Fmoc προστατευμένου αμινοξέος (4 eq) και αντιδραστηρίου oxyma (4 eq) διαλύονται σε DMF (τελική συγκέντρωση έκαστου 0,25 Μ στον συνολικό όγκο

του τελικού διαλύματος) και το διάλυμα παραμένει σε πάγο (10 min). Στη συνέχεια, προστίθενται 4 eq DIC, το νέο διάλυμα παραμένει στον πάγο (3 min) και κατόπιν προστίθεται στην σύριγγα που περιέχει την αποπροστατευμένη ρητίνη. Το σύστημα αφήνεται να αντιδράσει (2 h) υπό ανάδευση και ακολούθως διηθείται και εκπλένεται με DMF (5 x 1 min).

Ο έλεγχος της ολοκλήρωσης της σύζευξης γίνεται με βάση τη δοκιμασία νινυδρίνης (Kaiser test) [87]. Για την εφαρμογή της δοκιμασίας νινυδρίνης παρασκευάζονται τριών ειδών αντιδραστήρια, τα Kaiser 1, 2 και 3.

 Kaiser 1: 500 mg καθαρής νινυδρίνης σε 10 mL απόλυτης αιθανόλης,

 Kaiser 2: 80 g καθαρής φαινόλης σε 20 mL απόλυτης αιθανόλης,

 Kaiser 3: 2 mL υδατικού διαλύματος 0,001 Μ KCN σε 98 mL πυριδίνης.

Σε δοκιμαστικό σωλήνα εισάγεται μία πολύ μικρή ποσότητα της ρητίνης (~0,5 mg) και προστίθενται με τη σειρά 2, 4 και 2 σταγόνες από τα διαλύματα Kaiser 1, 2 και 3, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, το μίγμα θερμαίνεται για 5 min σε αμμόλουτρο, θερμοκρασίας 100 oC. Αν δεν υπάρχουν ελεύθερες αμινομάδες (αρνητικό Kaiser test), το διάλυμα παραμένει κίτρινο και το χρώμα των κόκκων της ρητίνης δεν μεταβάλλεται. Στην περίπτωση που οι κόκκοι της ρητίνης και το διάλυμα χρωματιστούν μπλε ή μωβ, τότε στην πεπτιδική αλυσίδα υπάρχουν ελεύθερες αμινομάδες (Σχήμα 4.2).

Σχήμα 4.2 Αντίδραση νινυδρίνης με ελεύθερη αμινομάδα.

Στις περιπτώσεις όπου η δοκιμασία είναι έντονα θετική, η σύζευξη επαναλαμβάνεται (double coupling). Αντίθετα, στις περιπτώσεις όπου η δοκιμασία είναι αμυδρά θετική γίνεται ακετυλίωση (capping) των ελεύθερων

αμινομάδων. Η ακετυλίωση πραγματοποιείται με προσθήκη μίγματος οξικού ανυδρίτη/DMF/DIEA, 1:1:1 (v/v) στη ρητίνη και ανάδευση για 30 min.

Την αγκυροβόληση του 1ου Fmoc αμινοξέος ακολουθεί το στάδιο της αποπροστασίας, για την απομάκρυνση της Fmoc ομάδας ώστε να είναι δυνατή η σύζευξη του επόμενου αμινοξέος. Το στάδιο της αποπροστασίας είναι το ίδιο με αυτό που ακολουθείται για την αρχική αποπροστασία της ρητίνης.

Επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας

Η πορεία που ακολουθείται για την επιμήκυνση της πεπτιδικής αλυσίδας φαίνεται συνοπτικά στον Πίνακα 4.2 και είναι ίδια με αυτή της αγκυροβόλησης του 1ου αμινοξέος, με την διαφορά ότι δημιουργείται πεπτιδικός δεσμός μεταξύ του προστιθέμενου αμινοξέος και του προηγούμενου, από αυτό, αμινοξέος, αντί της ρητίνης.

Πίνακας 4.2: Επιμήκυνση της αλυσίδας των πεπτιδικών τμημάτων της ΠρoTα μετά την αγκυροβόληση του πρώτου αμινοξέος πάνω στην ρητίνη.

Στάδιο Πορείας Αντιδραστήρια-διαλύτες Διάρκεια (επαναλήψεις x min) 1 DMF-πιπεριδίνη 20 % 4 x 5

2 DMF-έκπλυση 10 x 1

3 Fmoc-AA-OH/oxyma/DIC (4 eq)

σε DMF α (0,25 Μ) 1 x 120

4 DMF-έκπλυση 6 x 1

α Η σύζευξη γίνεται μετά από προενεργοποίηση του αμινοξέος.

Ειδικότερα, η σύζευξη του τελευταίου αμινοξέος της dmGly-OH, στα παράγωγα ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2, πραγματοποιείται μέσω ουρονικών αλάτων. Πιο συγκεκριμένα, 3 eq αμινοξέος και HATU διαλύονται σε DMF, και στη συνέχεια προστίθεται DIEA (9 eq). Το μίγμα αναδεύεται για περίπου 2 min και στη συνέχεια προστίθεται στην ρητίνη. Το σύστημα αφήνεται να αντιδράσει για 2 h υπό ανάδευση.

Μετά την προσθήκη και την αποπροστασία και του τελευταίου αμινοξέος (εξαίρεση η dmGly, η οποία δεν απαιτεί αποπροστασία), ακολουθεί το στάδιο της ξήρανσης. Πραγματοποιούνται 10 εκπλύσεις (1 min/ έκπλυση) με DMF, 6 εκπλύσεις (1 min/ έκπλυση) με DCM και 3 εκπλύσεις (1 min/ έκπλυση) με πετρελαϊκό αιθέρα. Η ξήρανση γίνεται σε ξηραντήρα υψηλού κενού πάνω από

P2O5 για 24 h.

Απομάκρυνση των πλευρικών προστατευτικών ομάδων και αποκοπή των πεπτιδίων από τη ρητίνη

Η επιλογή του μίγματος κοπής γίνεται βάσει της αμινοξικής αλληλουχίας του κάθε πεπτιδίου. Το μίγμα αποκοπής (20 mL μίγματος/g ρητίνης) για κάθε πεπτίδιο παρασκευάζεται σύμφωνα με τον Πίνακα 4.3.

Πίνακας 4.3: Σύσταση των μιγμάτων αποκοπής των πεπτιδικών παραγώγων.

Πεπτιδικό παράγωγο Μίγμα αποκοπής

1: #3 και #4 TFA / TIS / H2O, 95/2,5/2,5 (v/v)

2: #1 και #2 TFA / TIS / EDT/ H2O, 95/2,5/2,5/2 (v/v)

Το μίγμα αποκοπής προστίθεται στη ρητίνη με το κάθε πεπτίδιο και το σύστημα αφήνεται να αντιδράσει για 2 h. Μετά το πέρας των 2 h, η ρητίνη διηθείται και το μίγμα της αντίδρασης διοχετεύεται σε διαιθυλαιθέρα (100 mL/g ρητίνης). Στη συνέχεια, η ρητίνη εκπλένεται με μικρή ποσότητα (5 mL/g) μίγματος κοπής (2 x) και τα εκπλύματα συλλέγονται στον διαιθυλαιθέρα. Το συνολικό διήθημα αφήνεται μερικά λεπτά στον πάγο προς ποσοτική

καταβύθιση του πεπτιδίου και ακολουθεί μια σειρά 4 φυγοκεντρήσεων από όπου το ακατέργαστο πεπτίδιο παραλαμβάνεται ως ίζημα από τον διαιθυλαιθέρα.

Το ακατέργαστο στερεό πεπτίδιο ξηραίνεται σε ξηραντήρα υψηλού κενού

πάνω από P2O5 για 18 h. Ακολουθεί καθαρισμός του πεπτιδίου σε ημιπαρασκευαστική RP-HPLC και λυοφιλοποίηση των κλασμάτων που περιέχουν το καθαρό πεπτίδιο.

4.1.3 Καθαρισμός και ανάλυση πεπτιδίων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC)

Υλικά και Όργανα

o Όλοι οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν υψηλής καθαρότητας (HPLC-grade), προϊόντα του οίκου Sigma-Aldrich. Το υπερκάθαρο νερό ήταν της εταιρείας Merck-Millipore.

o Το σύστημα ημιπαρασκευαστικής υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC) ήταν της εταιρείας Waters, αποτελούμενο από αντλία Model 600 και ανιχνευτή υπεριώδους- ορατού (UV/Vis) Model 486. Η στήλη στην οποία πραγματοποιήθηκε ο καθαρισμός ήταν τύπου 10 Nucleosil 7 C18 (250 x 12,7 mm ID), Macherey-Nagel.

o Το σύστημα αναλυτικής υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης, αντίστροφης φάσης ήταν της Waters, αποτελούμενο από αντλία Model 600E και ανιχνευτή τύπου 991 PDA. Η στήλη στην οποία πραγματοποιήθηκε η ανάλυση ήταν τύπου LiChrospher RP C18 (250 x 4,6 mm ID), Merck.

Η υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) θεωρείται σήμερα η καλύτερη μέθοδος υγρής χρωματογραφίας και αποτελεί βασικό εργαλείο καθαρισμού και ανάλυσης πληθώρας ενώσεων, συμπεριλαμβανομένων μικρών πρωτεϊνών και πεπτιδίων.

Ένα σύστημα HPLC αποτελείται γενικά από τα εξής μέρη:

1. Δύο δοχεία αποθήκευσης διαλυτών (Α και Β), τα οποία είναι συνήθως συνδεδεμένα με απαερωτή, για την απομάκρυνση του διαλυμένου αέρα, ο οποίος επηρεάζει την ανάλυση.

2. Βαλβίδα ανάμιξης διαλυτών. Συντελεί στην ανάμιξη των διαλυτών πριν αυτοί εισέλθουν στο θάλαμο διαχωρισμού και περάσουν από τη στήλη.

3. Αντλίες. Η υψηλή πίεση, που πρέπει να εφαρμοστεί στην υγρή κινητή φάση για να διέλθει από τη στήλη με ικανοποιητική ταχύτητα, επιτυγχάνεται με τις αντλίες. Η κατασκευή των αντλιών γίνεται από υψηλής ποιότητας ανοξείδωτο χάλυβα ή από αδρανή πολυμερή, όπως το πολυτετραφθοροαιθυλένιο, ώστε να αντιστέκονται στην προσβολή από οποιαδήποτε κινητή φάση.

4. Βαλβίδα εισαγωγής δείγματος. Περιέχει ένα βαθμονομημένο βρόγχο, ώστε να εισάγεται σταθερός και επαναλήψιμος όγκος δείγματος κάθε φορά ή περιέχει βρόγχο μεγάλης περιεκτικότητας και ο όγκος δείγματος υπολογίζεται με σύριγγα. Έπειτα, γίνεται έγχυση του δείγματος στην κινητή φάση, συνήθως χειροκίνητα.

5. Προστήλη. Η προστήλη έχει ακριβώς τα ίδια υλικά με τη στήλη και δρα ως χημικό φίλτρο απομακρύνοντας ισχυρώς κατακρατούμενες ενώσεις που είναι δυνατό να κορέσουν την αναλυτική στήλη και να ελαττώσουν τη διάρκεια ζωής της.

6. Στήλη. Ως υλικά πλήρωσης των στηλών έχουν χρησιμοποιηθεί πολλά συστατικά (άνθρακας, οργανικά πολυμερή, κ.α.), ενώ η επιλογή τους καθορίζει και το φυσικοχημικό φαινόμενο που λαμβάνει χώρα στους διαχωρισμούς και συνεπώς το είδος της χρωματογραφίας. Το οξείδιο του πυριτίου (Silica) είναι το πιο διαδεδομένο υλικό πλήρωσης.

7. Ανιχνευτές. Χρησιμοποιείται πληθώρα ανιχνευτών και όλοι παράγουν ένα ενισχυμένο σήμα ανάλογο της ποσότητας της ουσίας που εκλούεται κάθε στιγμή. Στην HPLC οι σημαντικότεροι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται είναι: α) φασματοφωτομετρικοί (UV ή IR), β) φθορισμομετρικοί, γ) ανιχνευτές δείκτη διάθλασης, δ) ιονισμού φλόγας,

ε) φάσματος μαζών, στ) ραδιενέργειας, ζ) χημικοί ανιχνευτές, η) ηλεκτροχημικοί ανιχνευτές.

8. Καταγραφέας. Περιέχει ψηφιακό ολοκληρωτή που μετατρέπει το ηλεκτρικό σήμα του ανιχνευτή σε αριθμητικά δεδομένα που καταγράφονται σε εκτυπωτή ως διάγραμμα απόκρισης-χρόνου.

Ανάλογα με τον τύπο του διαχωρισμού, οι μέθοδοι HPLC μπορούν να διακριθούν σε διάφορες κατηγορίες, όπως σε μεθόδους διαπερατότητας πηκτής (gel-permeation chromatography), μεθόδους προσρόφησης (absorption chromatography) ή μεθόδους κανονικής φάσης (normal-phase chromatography, NP-HPLC), μεθόδους κατανομής (partition chromatography), μεθόδους ιοντοανταλλαγής (ion-exchange chromatography) και μεθόδους αντίστροφης φάσης (reversed-phase chromatography, RP-HPLC). Οι μέθοδοι υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης είναι οι ευρύτερα χρησιμοποιούμενες μέθοδοι HPLC, λόγω του ότι χαρακτηρίζονται από μεγάλο εύρος δυνητικών εφαρμογών. Η στατική φάση που χρησιμοποιείται στις μεθόδους RP-HPLC είναι το οξείδιο του πυριτίου. Η στατική φάση, μετά από κατάλληλη χημική επεξεργασία, φέρει στην επιφάνειά

της αλκυλο-πυριτικές ομάδες, συνήθως δεκαοκτυλο-πυριτικές (C18), που της προσδίδουν υδρόφοβο χαρακτήρα. Η κατακράτηση στη στήλη των προς καθαρισμό ή ανάλυση ουσιών οφείλεται κυρίως στην ανάπτυξη υδρόφοβων αλληλεπιδράσεων μεταξύ αυτών και της επιφάνειας της στατικής φάσης. Για την έκλουση των ουσιών χρησιμοποιείται κυρίως μία πολική κινητή φάση,

αποτελούμενη συνήθως από H2O και CH3CN ή κάποιον άλλον οργανικό

διαλύτη αναμίξιμο με H2Ο. Οι διάφορες ουσίες εκλούονται κατά σειρά αύξουσας υδροφοβικότητας [88].

Έπειτα από την απομάκρυνση των πεπτιδίων από τη ρητίνη, τα ακατέργαστα

πεπτίδια ξηραίνονται για 18 h σε ξηραντήρα υψηλού κενού πάνω από P2O5. Ακολουθεί ο καθαρισμός των πεπτιδίων με ημιπαρασκευαστική RP-HPLC και το πεπτίδιο ανιχνεύεται με ανιχνευτή οπτικής απορρόφησης στα 220 nm. Για την έκλουση των πεπτιδίων από τη στήλη, χρησιμοποιείται σύστημα έκλουσης γραμμικής βαθμίδωσης δύο διαλυτών Α και Β. Ο διαλύτης Α είναι συνήθως

0,05% TFA σε H2O και ο διαλύτης Β είναι συνήθως CH3CN 60% σε διαλύτη Α.

Η τελική περιεκτικότητα του διαλύτη έκλουσης σε CH3CN ρυθμίζεται με βάση την πολικότητα του κάθε πεπτίδιου.

Μετά τον καθαρισμό τα κλάσματα που περιέχουν το πεπτίδιο λυοφιλοποιούνται και αποθηκεύονται στους -35 oC.

Στον Πίνακα 4.4 παρουσιάζονται οι συνθήκες ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC που χρησιμοποιήθηκαν κατά τον καθαρισμό των πεπτιδικών μας παραγώγων ΠροΤα-D1, ΠροΤα-D2, ΠροΤα #3 και ΠροΤα #4, ενώ στον Πίνακα 4.5 οι συνθήκες της αναλυτικής RP-HPLC που εφαρμόστηκαν μετά τον καθαρισμό των παραγώγων, για τον προσδιορισμό της καθαρότητάς τους.

Πίνακας 4.4 Συνθήκες ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC για κάθε συνθετικό πεπτιδικό παράγωγο.

Ταχύτητα Μεταβολή UV Συνθετικό Διαλύτες Στήλη ροής σύστασης μέσου ανίχνευση πεπτίδιο Έκλουσης (mL/min) έκλουσης (nm)

10 Nucleosil 7 Α:0,05% TFA #3 και #4 C18 σε Η 0 0% Β → 50% Β, #1 και #2 2 3 220 (250 x 12,7 mm Β:60% CH CN 47 min 3 ID) σε Α

Πίνακας 4.5 Συνθήκες αναλυτικής RP-HPLC για κάθε συνθετικό πεπτιδικό παράγωγο.

Ταχύτητα Μεταβολή UV Συνθετικό Διαλύτες Στήλη ροής σύστασης μέσου ανίχνευση πεπτίδιο έκλουσης (mL/min) έκλουσης (nm)

Α:0,05% TFA LiChrospher #3 και #4 σε Η 0 RPC18 2 0% Β → 80% Β, #1 και #2 1 220 (250 x 4,6 23 min Β:90% CH CN mm ID) 3 σε A

4.2 Σύμπλεξη των πεπτιδικών παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με ψυχρό 185/187Re, καθαρισμός και ταυτοποίησή τους

Αμέσως μετά την παραλαβή των καθαρισμένων και ταυτοποιημένων πεπτιδικών παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2, ακολούθησε η σύμπλεξή τους με ψυχρό ρήνιο (185/187Re). Τα σύμπλοκα αυτά είναι διαθέσιμα για να χαρακτηριστούν δομικά και επίσης θα αξιολογηθούν βιολογικά, ως προς την ανοσοενισχυτική τους ενεργότητα αντί των αντίστοιχων ραδιοεπισημασμένων 99mTc-συμπλόκων, κατά πάγια τακτική της βιβλιογραφίας.

4.2.1 Σύμπλεξη πεπτιδίων με ψυχρό 185/187Re

Υλικά και Όργανα

o CH3OH, Merck

185/187 o [BuN][ ReOCl4]

Για την σύμπλεξη των πεπτιδικών παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με το ψυχρό ρήνιο, μεθανολικό διάλυμα του αντίστοιχου παραγώγου (3-6 μmol) 185/187 αναμιγνύεται με το αντιδραστήριο [BuN][ ReOCl4], σε μοριακή αναλογία 1:1.5, αντίστοιχα. Το μείγμα ανακινείται και αφήνεται να αντιδράσει για 20 min, σε θερμοκρασία δωματίου.

Τα ακατέργαστα σύμπλοκα στη συνέχεια καθαρίζονται με ημιπαρασκευαστική RP-HPLC και τα κλάσματα που αντιστοιχούν στην κύρια κορυφή του χρωματογραφήματος, για κάθε σύμπλοκο, συλλέγονται και λυοφιλοποιούνται, όπως περιγράφεται στη συνέχεια. Η καθαρότητα των συμπλόκων μετά τον καθαρισμό τους ελέγχεται με αναλυτική RP-HPLC, όπως περιγράφεται στη συνέχεια και τα σύμπλοκα ταυτοποιούνται με τη μέθοδο της φασματομετρίας μαζών ESI-MS.

4.2.2 Καθαρισμός και ανάλυση μη ραδιενεργών συμπλόκων με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης αντίστροφης φάσης (RP-HPLC)

Ο καθαρισμός και η ανάλυση των πεπτιδικών συμπλόκων [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2 πραγματοποιήθηκε όπως ακριβώς και στην περίπτωση των πεπτιδικών παραγώγων (παράγραφος 4.1.2). Στον Πίνακα 4.6 που ακολουθεί αναγράφονται οι συνθήκες της ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC που χρησιμοποιήθηκαν κατά τον καθαρισμό των δύο συμπλόκων, ενώ στον Πίνακα 4.7 παρατίθενται οι συνθήκες της αναλυτικής RP-HPLC που εφαρμόστηκαν για την ανάλυση των καθαρισμένων πεπτιδικών συμπλόκων.

Πίνακας 4.6 Συνθήκες ημιπαρασκευαστικής RP-HPLC για τα σύμπλοκα [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2.

Ταχύτητα Μεταβολή UV Διαλύτες Σύμπλοκο Στήλη ροής σύστασης ανίχνευση έκλουσης (mL/min) μέσου έκλουσης (nm)

Nucleosil 7 Α:0,05% TFA C18 [Re]ΠροΤα-D1 σε H O 0% Β → 50% Β, 2 3 220 [Re]ΠροΤα-D2 Β:60% CH CN 50 min (250 x 12,7 3 σε Α mm ID)

Πίνακας 4.7 Συνθήκες αναλυτικής RP-HPLC για τα σύμπλοκα [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2. Ταχύτητα Μεταβολή UV Διαλύτες Σύμπλοκο Στήλη ροής σύστασης μέσου ανίχνευση έκλουσης (mL/min) έκλουσης (nm)

Α:0,05% LiChrospher TFA σε H O [Re]ΠροΤα-D1 RPC18 2 0% Β → 20% Β, 1 220 [Re]ΠροΤα-D2 (250 x 4,6 mm 23 min Β:90% ID) CH3CN σε A

4.3 Αξιολόγηση του συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1 σε κυτταρικό σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων

4.3.1 Απομόνωση ουδετερόφιλων από περιφερικό αίμα

Υλικά και Όργανα

o ανθρώπινο αίμα υγιούς δότη

o διάλυμα Ficoll-Histopaque, Sigma

o διάλυμα λύσης ερυθροκυττάρων:

1:10 αραίωση του αρχικού διαλύματος: 0.37% w/v EDTA, 8.02% w/v

NH4Cl, 0.84% w/v NaHCO3 (όλα διαλυμένα σε δις απεσταγμένο νερό)

o εξισορροπημένο, αλατούχο διάλυμα Hank’s (HBSS), Lonza

o ηπαρινωμένα σωληνάρια αιμοδοσίας, όγκου 10 mL, BD

o πλαστικοί σωλήνες κωνικού πυθμένα (falcon), όγκου 50 mL, Greiner bio-one

o πιπέττες 1,2,5 και 10 ml, Greiner bio-one

o φυγόκεντρος BR 4i Jouan με κεφαλή ΑΒ 2,14 (epp) και S 40 (falcon)

o αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Bright-Line, Sigma

o ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Axiovert 25, Zeiss

Η μέθοδος βασίζεται στην τοποθέτηση ηπαρηνισμένου περιφερικού αίματος πάνω σε στρώμα διαλύματος Ficoll-Histopaque, που είναι ένα υδατικό διάλυμα πολυσακχαρίτη. Δημιουργείται έτσι μια κλίση πυκνότητας όπου μετά από φυγοκέντρηση τα ερυθροκύτταρα με τα κοκκιοκύτταρα, ως πιο βαριά, διαπερνούν το διάλυμα και τελικά καθιζάνουν. Τα μονοπύρηνα, ως ελαφρύτερα, παραμένουν υψηλότερα, σχηματίζοντας μια ξεχωριστή στιβάδα. Τελικά παρατηρούμε, μετά το τέλος της φυγοκέντρησης, την δημιουργία των ακόλουθων τεσσάρων στιβάδων με φορά από πάνω προς τα κάτω: πλάσμα,

μονοπύρηνα, διάλυμα Ficoll και τέλος, ερυθρά αιμοσφαίρια και κοκκιοκύτταρα. Για την απομόνωση των ουδετερόφιλων, απορρίπτονται οι τρεις πρώτες στιβάδες και στην συνέχεια προκαλείται λύση ερυθρών, στην τελευταία στιβάδα, με χρήση του αντίστοιχου διαλύματος [89].

Αναλυτικά η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής:

1. Το δείγμα του αίματος συλλέγεται σε σωληνάρια αιμοδοσίας, όγκου 10 mL. Τα σωληνάρια είναι ηπαρινωμένα ώστε να αποφεύγεται η πήξη του αίματος. 2. Για κάθε δείγμα αίματος όγκου 10 mL απαιτείται η μισή, περίπου, ποσότητα διαλύματος Ficoll-Histopaque, δηλαδή 5 mL. Σε σωληνάριο falcon, χωρητικότητας 15 ή 50 mL, εισάγεται αρχικά η ποσότητα του διαλύματος Ficoll-Histopaque και στην συνέχεια, με σχηματισμό δύο αυλακιών στα τοιχώματα του σωληναρίου, προστίθεται η ποσότητα του αίματος αργά και σταθερά, ώστε να αποφευχθεί η ανάμειξη. 3. Ακολουθεί φυγοκέντρηση του σωλήνα για 20 min, σε θερμοκρασία δωματίου, στις 2000 στροφές το λεπτό. 4. Μετά την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης έχουν δημιουργηθεί τέσσερις στιβάδες, οι οποίες, από πάνω προς τα κάτω, είναι οι εξής:

 στιβάδα πλάσματος  στιβάδα μονοπύρηνων κυττάρων  στιβάδα Ficoll-Histopaque και τέλος  στιβάδα ερυθρών αιμοσφαιρίων και κοκκιοκυττάρων (Σχήμα 4.3)

5. Οι τρεις πρώτες στιβάδες απορρίπτονται 6. Για την λύση των ερυθροκυττάρων επιδρούμε με το αντίστοιχο διάλυμα λύσης. Συγκεκριμένα, σε δύο σωληνάρια falcon (50 mL) τοποθετούνται 50 mL διαλύματος λύσης και στην συνέχεια 2 mL από την στιβάδα των ερυθρών και κοκκιοκυττάρων

Σχήμα 4.3 : Διαχωρισμός κυττάρων περιφερικού αίματος έπειτα από φυγοκέντρηση σε κλίση Ficoll-Histopaque.

7. Ανακινούμε τα σωληνάρια για 10 min σε θερμοκρασία δωματίου 8. Φυγοκεντρούμε στις 1100 στροφές ανά λεπτό, στους 4 οC, για 10 min 9. Απορρίπτουμε το υπερκείμενο και επαναδιαλύουμε το ίζημα και στους 2 σωλήνες σε HBSS 10. Ενώνουμε το περιεχόμενο των δύο σωλήνων, ξεπλένoντας το περιεχόμενο του ενός σωλήνα στον άλλο, χρησιμοποιώντας κρύο διάλυμα HBSS, σε τελικό όγκο 10 mL 11. Φυγοκεντρούμε ξανά και επαναιωρούμε τα κύτταρα σε HBSS για 2 επιπλέον φορές, επαναλαμβάνοντας τα βήματα 8-11 12. Επαναιωρούμε το ίζημα της τελευταίας φυγοκέντρησης σε 2 mL HBSS 13. Σε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer μετράμε τον πληθυσμό των ουδετερόφιλων και παρατηρούμε πόσα έχουν μείνει ζωντανά, με την χρήση της χρωστικής trypan blue (χρώζονται μόνο τα νεκρά κύτταρα).

Συνολικά, για τις ανάγκες των πειραμάτων μας χρησιμοποιήθηκε αίμα από 45 υγιείς εθελοντές (με τη σύμφωνη γραπτή συγκατάθεσή τους).

4.3.2 Μελέτη της επίδρασης του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1 στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Το σύμπλοκο [Re]ΠρoTα-D1 καθώς επίσης και όλα τα συνθετικά τμήματα/παράγωγα της ΠρoTα αξιολογήθηκαν in vitro ως προς την ανοσοενισχυτική τους δραστικότητα, συγκριτικά πάντα με εκείνη του ακέραιου πολυπεπτιδίου της ΠρoTα. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκαν, ως κυτταρικό σύστημα, τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος υγιών δοτών, στα οποία μελετήθηκε η επίδραση των παραγώγων μας στην ενδοκυτταρική παραγωγή ελευθέρων ριζών οξυγόνου (ROS). Ως θετικός μάρτυρας της δοκιμασίας χρησιμοποιήθηκε το fMLP, ένα φορμυλιωμένο τριπεπτίδιο βακτηριακής προέλευσης ιδιαίτερα ανοσογονικό ως προς τα ανθρώπινα κύτταρα [90].

H μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας δύο διαφορετικές μεθοδολογίες: i) την δοκιμασία αναγωγής του NBT (Nitroblue Tetrazolium Reduction Assay), μέτρηση σε οπτικό μικροσκόπιο και ii) την δοκιμασία

αναγωγής της χρωστικής CM-H2DCFDA, μέτρηση με οργανολογία κυτταρομετρίας ροής (FC, Flow cytometry).

i) Μελέτη ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS με την μέθοδο αναγωγής του NBT

Υλικά και Όργανα

o Ανθρώπινα ουδετερόφιλα υγιών δοτών

o Ρυθμιστικό διάλυμα HBSS-gelatin : εξισορροπημένο, αλατούχο διάλυμα Hank’s-HBSS (Lonza) εμπλουτισμένο με 0.1% ζελατίνη από δέρμα μόσχου (Sigma)

o Διάλυμα κυανού του τετραζολίου: κυανού του τετραζολίου (ΝΒΤ) (Sigma) διαλυμένο σε HBSS-gelatin, με τελική συγκέντρωση 2 mg/mL

o Διάλυμα παραφορμαλδεΰδης (PFA): PFA (Applichem) διαλυμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών PBS (Lonza) με τελική συγκέντρωση 4%

o πλαστικοί σωλήνες (eppendorf), όγκου 1.5 mL, Greiner bio-one

o επωαστικός κλίβανος, SANYO

o φυγόκεντρος BR 4i Jouan με κεφαλή ΑΒ 2,14 (eppendorf) και S 40 (falcon)

o αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Bright-Line, Sigma

o ανάστροφο οπτικό μικροσκόπιο Axiovert 25, Zeiss

Ο προσδιορισμός της ποσότητας του υπεροξειδικού ανιόντος που παράγεται ενδοκυτταρικά στα ουδετερόφιλα πραγματοποιήθηκε εν αρχή με την δοκιμασία αναγωγής του ΝΒΤ (Nitro Blue Tetrazolium reduction test) [91].

H ενδοκυτταρική παραγωγή υπεροξειδικού ανιόντος είναι μέρος της διαδικασίας που καλείται αναπνευστική έκρηξη. Το NBT είναι μια υδατοδιαλυτή χρωστική η οποία στην μη ανηγμένη της μορφή έχει κίτρινο χρώμα, είναι ισχυρός δέκτης ηλεκτρονίων και επομένως, ικανή να αντιδρά με ανιόντα υπεροξειδίου εντός του κυττάρου προς σχηματισμό ενώσεων φορμαζανίου. Οι τελευταίες αυτές ενώσεις έχουν έντονο μπλε χρώμα και είναι ευδιάκριτες σε οπτικό μικροσκόπιο. Επομένως, είναι εύκολος ο προσδιορισμός της % αναλογίας των θετικών κυττάρων για την δοκιμασία αυτή, δηλαδή των κυττάρων στα οποία έχει πραγματοποιηθεί αναπνευστική έκρηξη.

Αναλυτικά η διαδικασία που ακολουθείται είναι η εξής:

Πίνακας 4.8 Προσθήκη αντιδραστηρίων ανά ομάδα σωλήνων eppendorf κατά την δοκιμασία αναγωγής του NBT.

Ομάδες w/o fMLP Ακέραιη Πεπτίδια- (θετικός ΠρoΤα Σύμπλοκα μάρτυρας) Αντιδραστήρια

HBSS-g (0.1%) 25 μl 20 μl 15 μl 15 μl fMLP (5μΜ) - 5 μl - - Ακέραιη ΠρoΤα - - 10 μl - (200 ng/mL) Πεπτίδια-Σύμπλοκα - - - 10 μl (25 ng/mL) Τα1 (50 ng/mL) ΠροΤα[51-89] (100 ng/mL) ΝΒΤ (500 μg/mL) 25 μl 25 μl 25 μl 25 μl Κυτταρικό εναιώρημα 50 μl 50 μl 50 μl 50 μl (2x106 κυτ/mL)

3. Οι σωλήνες επωάζονται στους 370 C για 10 min 4. Ακολουθεί επώαση για άλλα 10 min σε θερμοκρασία δωματίου 5. Mετά το τέλος της επώασης προστίθενται σε κάθε eppendorf 20 μL 4% PFA 6. Ακολουθεί επώαση 10 min στους 40 C

7. Φυγοκέντρηση στις 1600 στροφές ανά λεπτό/ 250 g, για 5 min (40 C) 8. Απόρριψη 80 μL από κάθε δείγμα και προσθήκη 50 μL HBSS-g 9. Τα δείγματα μονιμοποιούνται με τα βήματα 6-9 και ακολουθεί η παρατήρησή τους σε οπτικό μικροσκόπιο. Κατά την παρατήρηση μετρώνται τουλάχιστον 100 κύτταρα και στην συνέχεια προσδιορίζεται η % αναλογία των θετικών κυττάρων. Ως θετικά θεωρούνται τα κύτταρα που έχουν πάρει μπλε χρώμα, λόγω της ενδοκυτταρικής παραγωγής υπεροξειδικού ανιόντος και της επακόλουθης αναγωγής του ΝΒΤ (Σχήμα 4.4)

Σχήμα 4.4 Θετικά και αρνητικά ουδετερόφιλα για την δοκιμασία αναγωγής του NBT.

Συνολικά αναλύθηκαν ουδετερόφιλα από 10 υγιείς δότες.

ii) Μελέτη ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS με την αναγωγή της χρωστικής

CM-H2DCFDA σε οργανολογία FC

Υλικά και Όργανα

o ανθρώπινα ουδετερόφιλα υγιών δοτών

o χρωστική γενικού οξειδωτικού στρες CM-H2DCFDA (5-(and-6)- chloromethyl-2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester, Life Technologies, CA, USA)

o εξισορροπημένο, αλατούχο διάλυμα Hank’s (HBSS), Lonza

o Eppendorf σωληνάκια 1,5 mL, Greiner bio-one

o FACS σωληνάρια, BD

o Διάλυμα FACS: 0,05% BSA (Bovine serum albumin) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών

o Κυτταρόμετρο ροής FACSCanto II (BD Biosciences, Erembodegen, Belgium)

Η μελέτη ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS με οργανολογία κυτταρομετρίας ροής, πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ως δείκτη ενδοκυτταρικής

οξείδωσης την χρωστική CM-H2DCFDA (Σχήμα 4.5)

Σχήμα 4.5 Δομή της χρωστικής CM-H2DCFDA.

100

Η χρωστική CM-H2DCFDA διαχέεται παθητικά εντός των ζωντανών κυττάρων, όπου εκεί οι οξικές της εστερομάδες υδρολύονται από ενδοκυτταρικές εστεράσες και παράλληλα, η χλωρομεθυλική ομάδα αντιδρά με την ενδοκυτταρική γλουταθειόνη αλλά και άλλες θειόλες. Εν συνεχεία, το υπεροξείδιο του υδρογόνου που παράγεται κατά την διάρκεια της αναπνευστικής έκρηξης των ουδετερόφιλων οξειδώνει την χρωστική προς παραγωγή έντονα φθορίζουσας χρωστικής, το οποία παγιδεύεται εντός των κυττάρων, επιτρέποντας την διεξαγωγή κυτταρικών μελετών. Η φθορίζουσα χρωστική DCF ανιχνεύεται στα 530 nm έπειτα από κατάλληλη διέγερση των ουδετερόφιλων στα 488 nm.

Η κυτταρομετρία ροής είναι μια τεχνική η οποία σχεδιάστηκε για την αυτοματοποίηση της ανάλυσης ή/και του διαχωρισμού κυττάρων σημασμένων με φθορίζοντα μόρια. Η οργανολογία που χρησιμοποιείται, δηλαδή ο κυτταρομετρητής ροής, αποτελείται από 2 βασικά τμήματα: μια δέσμη λευκού φωτός, συνήθως laser, και έναν ανιχνευτή φωτός σε ευθεία διάταξη με το laser. Το δείγμα, το οποίο είναι πάντοτε υπό την μορφή κυτταρικού εναιωρήματος, εισέρχεται στο μηχάνημα και προωθείται προς τον θάλαμο ροής μέσα στον οποίο τα κύτταρα στοιχίζονται προκειμένου να περάσουν ένα ένα μπροστά από το laser. Κάθε φορά που ένα κύτταρο διέρχεται από την δέσμη, το φως ανακλάται και η διακοπή αυτή της δέσμης καταγράφεται από τον ανιχνευτή. Τα κύτταρα τα οποία φέρουν κάποιο φθορίζον μόριο, είτε ενδοκυτταρικά π.χ. την φθορίζουσα χρωστική DCF, είτε στην επιφάνειά τους π.χ. ένα αντίσωμα συζευγμένο με φθοριόχρωμα έναντι κάποιου αντιγόνου της επιφάνειας του κυττάρων, διεγείρονται από το laser και εκπέμουν φθορισμό, ο οποίος καταγράφεται από ένα 2ο σύστημα ανίχνευσης που βρίσκεται σε γωνία σε σχέση με την δέσμη laser. Έτσι λοιπόν στην απλούστερη μορφή, το μηχάνημα μετρά ένα ένα τα κύτταρα του δείγματος και καταγράφει τα επίπεδα του εκπεμπόμενου φθορισμού. Ένα συνδεδεμένο σύστημα υπολογιστή, παράγει στην συνέχεια μια γραφική παράσταση του αριθμού των κυττάρων που μετρώνται συναρτήσει της έντασης φθορισμού τους.

101

Πιο αναλυτικά, τα βήματα που ακολουθούνται σε αυτή την δοκιμασία είναι τα εξής:

2. Τα κύτταρα προ-επωάζονται με την χρωστική CM-H2DCFDA για 20 min στους 37 oC, υπό ήπια οριζόντια ανάδευση, στο σκοτάδι. Υπολογίζεται ότι 5 μL χρωστικής (C = 1,1 mg/mL) προστίθενται σε 1 mL κυτταρικού εναιωρήματος. 3. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 5 min στις 1250 rpm/ 190 g, το υπερκείμενο απορρίπτεται (περιέχει την περίσσεια της χρωστικής που δεν ενδοκυτταρώθηκε) και το κυτταρικό ίζημα επαναιωρείται σε HBSS (2 x 106 κύτταρα/mL). 4. Σε σωληνάκια τύπου Eppendorfs προστίθενται 90 μL κυτταρικού εναιωρήματος και 10 μL των προς έλεγχο πεπτιδίων/παραγόντων, σε τελικές συγκεντρώσεις ως εξής: fMLP (5 μM), ΠρoTα (προϊόν της Τhymoorgan) (200 ng/mL), όλα τα πεπτίδια/σύμπλοκα με Re (25 ng/mL) εκτός από την Τα1 (50 ng/mL) και το κεντρικό πεπτίδιο ΠρoTα[51-89] (100 ng/mL). Οι συγκεντρώσεις αυτές προέκυψαν έπειτα από προκαταρκτικές μελέτες τιτλοδότησης όλων των παραγόντων/πεπτιδίων. Ακολουθεί επώαση για 10 min στους 37 oC, στο σκοτάδι. 5. Με το πέρας της επώασης τα σωληνάκια τοποθετούνται αμέσως σε πάγο. 6. Σε όλα τα σωληνάκια προστίθενται 300 μL διαλύματος FACS, το περιεχόμενό τους μεταφέρεται σε σωληνάκια FACS και ακολουθεί αμέσως μέτρηση των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής. Μετρώνται 105 κύτταρα και τα δεδομένα αναλύονται μέσω του λογισμικού FACS Diva, από όπου λαμβάνονται χαρακτηριστικά ιστογράμματα.

102

Όλα τα πεπτιδικά ανάλογα της ΠροΤα, προτού χρησιμοποιηθούν στις μελέτες ενεργοποίησης των ουδετερόφιλων, ελέγχθηκαν για τα επίπεδα ενδοτοξινών που ενδεχομένως έφεραν ως πρόσμιξη και θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα, χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο kit (LAL chromogenic Endotoxin Quantitation kit, Pierce Biotechnology, IL, USA).

Συνολικά αναλύθηκαν ουδετερόφιλα από 3 υγιείς δότες.

4.3.3 Επίδραση του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1 στην επιφανειακή έκφραση του υποδοχέα TLR4

Υλικά και Όργανα

o ανθρώπινα ουδετερόφιλα υγιών δοτών

o μονοκλωνικά αντισώματα έναντι του ανθρώπινου TLR4 συζευγμένα με την χρωστική φυκοερυθρίνη (human mAbs/PE, BioLegend, San Diego, CA, USA)

o εξισορροπημένο, αλατούχο διάλυμα Hank’s (HBSS), Lonza

o Eppendorf σωληνάκια 1,5 mL, Greiner bio-one

o FACS σωληνάρια, BD

o Διάλυμα FACS: 0,05% BSA (Bovine serum albumin) σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών

o Κυτταρόμετρο ροής FACSCanto II (BD Biosciences, Erembodegen, Belgium)

Για την μελέτη της επίδρασης του [Re]ΠρoTα-D1 στην κινητική της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4, ανθρώπινα ουδετερόφιλα επωάστηκαν παρουσία του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1, oλόκληρης της ΠρoTα, του καρβοξυτελικού πεπτιδίου ΠρoTα[100-109], της Τα1 και του 103

κεντρικού τμήματος ΠρoTα[51-89] για χρονικό διάστημα 0-90 min. Ως θετικός μάρτυρας σε αυτή την δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε ο λιποπολυσακχαρίτης LPS, ως ο «πρότυπος» προσδέτης του υποδοχέα TLR4 [92].

Πιο αναλυτικά, τα βήματα που ακολουθούνται σε αυτή την δοκιμασία είναι τα εξής:

1. Ανθρώπινα ουδετερόφιλα υγιών δοτών απομονώνονται από το περιφερικό τους αίμα, προσδιορίζεται το % ποσοστό των ζωντανών κυττάρων ( > 90%) και η συγκέντρωσή τους ρυθμίζεται σε 2 x 106 κύτταρα/mL HBSS. 2. Σε σωληνάκια τύπου Eppendorf προστίθενται 90 μL κυτταρικού εναιωρήματος και 10 μL των προς έλεγχο πεπτιδίων/παραγόντων, σε τελικές συγκεντρώσεις ως εξής: LPS (1 μg/mL), ΠρoTα (200 ng/mL), όλα τα πεπτίδια/σύμπλοκα (25 ng/mL) εκτός από την Τα1 (50 ng/mL) και το κεντρικό πεπτίδιο ΠρoTα[51-89] (100 ng/mL). Ακολουθεί επώαση στους 37 oC για χρονικά διαστήματα 15 min, 30 min, 60 min και 90 min. 3. Μετά το πέρας της επώασης για το εκάστοτε χρονικό διαστήμα, ακολουθεί σύντομη φυγοκέντρηση των σωλήνων (5 min στις 1250 rpm/ 190 g). Το υπερκείμενο απορρίπτεται (ώστε να απομακρυνθεί ο παράγοντας διέγερσης των κυττάρων) και το ίζημα των κυττάρων επαναιωρείται σε 50 μL διαλύματος FACS. 4. Τα κύτταρα επισημαίνονται με μονοκλωνικό αντίσωμα (συζευγμένο με φθορίζουσα χρωστική) έναντι του ανθρώπινου υποδοχέα TLR4 (15 min παραμονή στο σκοτάδι, σε θερμοκρασία δωματίου) 5. Σε κάθε σωληνάκι προστίθενται 300 μL διαλύματος FACS, το περιεχόμενο των σωλήνων μεταφέρεται σε σωληνάκια FACS και ακολουθεί αμέσως μέτρηση των δειγμάτων σε κυτταρομετρητή ροής. Μετρώνται 105 κύτταρα και τα δεδομένα αναλύονται μέσω του λογισμικού FACS Diva, από όπου λαμβάνονται χαρακτηριστικά ιστογράμματα.

Συνολικά αναλύθηκαν ουδετερόφιλα από 3 υγιείς δότες.

104

4.4 Ραδιοεπισήμανση των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με 99mTc / Ραδιοχημική ανάλυση

Υλικά και Όργανα

o Kit Gluco/Demoscan

o Διάλυμα [99mTc]-υπερτεχνητικών ιόντων από έκλουση γεννήτριας 99Mo- 99mTc της εταιρείας Mallinckdrodt Medical BV σε φυσιολογικό ορό (0,9% NaCl)

Πιο λεπτομερώς, τυποποιημένη συσκευασία Gluco/Demoscan (50 mg

γλυκοεπτονικό ασβέστιο, 5 μg SnCl2) ανασυστάθηκε με 1mL διαλύματος φυσιολογικού ορού και στην συνέχεια κλάσμα 80 μL αναμείχθηκε με 0,5-1,0 mL διαλύματος [99mTc]υπερτεχνητικών (5-20 mCi) και 50 μg του προς επισήμανση παραγώγου, ΠροΤα-D1 ή ΠροΤα-D2. Το μείγμα ανακινήθηκε σε κυκλοαναδευτήρα και αφέθηκε να αντιδράσει επί 30 min σε κλίβανο 37 oC.

Το προϊόν της εκάστοτε ραδιοεπισήμανσης ([99mTc]ΠροΤα-D1, [99mTc]ΠροΤα- D2) ελέγχθηκε σε αναλυτική RP-HPLC με τα εξής χαρακτηριστικά: i) αντλία τύπου 600 της εταιρείας Waters, ii) αναλυτική στήλη αντίστροφης φάσης τύπου Nucleodur 100-C18 ec διαστάσεων 4.6 mm x 250 mm και μεγέθους πόρων 10 μm, iii) ανιχνευτή UV-Vis τύπου 2487 της Waters (στα 254 nm), iv) ανιχνευτή γ ακτινοβολίας GABI-Raytest.

H χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας δύο διαφορετικά μίγματα διαλυτών κλιμακωτά μεταβαλλόμενης σύστασης, Gradient I και II (Πίνακας 4.9).

Η ταυτοποίηση των ενώσεων του 99mTc πραγματοποιήθηκε με συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση, χρησιμοποιώντας ως πρότυπα τα ανάλογα σύμπλοκα του ρηνίου 185/187Re.

105

Ψυχρά και ραδιενεργά σύμπλοκα ενέονται ταυτόχρονα στην αναλυτική radio- HPLC και οι παρόμοιοι χρόνοι έκλουσης των δύο ενώσεων αποτελούν ισχυρή ένδειξη ότι το σύμπλοκο του 99mTc έχει παρόμοια δομή με το χαρακτηρισμένο (μέσω ESI-MS) σύμπλοκο του 185/187Re.

Πίνακας 4.9 Συνθήκες αναλυτικής radio-RP-HPLC για τα ραδιενεργά σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2.

Χρόνος Ταχύτητα ροής % Διαλύτης Α % Διαλύτης B (min) (mL/min) (0,05 % TFA σε (0,05 % TFA σε

H2O) MeOH)

Gradient I

0.00 1 100 0

1.00 1 100 0

25.00 1 20 80

Gradient IΙ

0.00 1 100 0

3.00 1 100 0

40.00 1 65 35

106

4.5. Μελέτες αξιολόγησης των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα

Η αξιολόγηση των ραδιοεπισημασμένων με 99mTc παραγώγων της ΠροΤα πραγματοποιήθηκε σε τρία επίπεδα. Αρχικά, διεξήχθηκαν οι απαραίτητες in vitro μελέτες σταθερότητας των παραγώγων προκειμένου να διαπιστωθεί ότι αυτά είναι επαρκώς σταθερά ώστε να υποβληθούν σε περαιτέρω βιολογικές μελέτες. Σε δεύτερο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν στοχευμένες in vitro μελέτες κυτταρικής δέσμευσης σε ανθρώπινα κύτταρα-ουδετερόφιλα, με σκοπό την εύρεση και το χαρακτηρισμό ειδικών θέσεων πρόσδεσης της ΠροΤα στην επιφάνειά τους.

Τέλος, πραγματοποιήθηκαν in vivo μελέτες βιοκατανομής και σπινθηρογραφικής απεικόνισης των συμπλόκων σε πειραματόζωα, παράλληλα με ex vivo μελέτη του μεταβολικού τους «αποτυπώματος» σε βιολογικά δείγματα (ούρα).

4.5.1 Μελέτες σταθερότητας των συμπλόκων του τεχνητίου

4.5.1.1 Μελέτες σταθερότητας στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από απομόνωση με radio-HPLC

Τα δύο επισημασμένα σύμπλοκα των παραγώγων της ΠροΤα με τεχνήτιο, [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2, μελετήθηκαν ως προς την σταθερότητά τους με την πάροδο έως και 24 ωρών από την επισήμανσή τους. Σε αυτές τις μελέτες υποβλήθηκαν τόσο το μίγμα επισήμανσης όσο και το εκάστοτε απομονωμένο σύμπλοκο. Όλα τα διαλύματα παρέμειναν σε θερμοκρασία δωματίου για τα απαιτούμενα χρονικά διαστήματα (6 h ή/και 24 h) μέχρι να ενεθούν προς έλεγχο στην HPLC (Gradient I, σελ.106).

107

4.5.1.2 Μελέτες σταθερότητας παρουσία περίσσειας κυστεΐνης

Η σταθερότητα των δύο ραδιοεπισημασμένων συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 μελετήθηκε παρουσία περίσσειας κυστεΐνης, η οποία αποτελεί πρότυπο ανταγωνιστή σύμπλεξης του τεχνητίου (Cysteine challenge test) [93].

Για τον σκοπό αυτό παρασκευάζεται φρέσκο διάλυμα κυστεΐνης (10-3 Μ) σε φυσιολογικό ορό (0,9% NaCl). Στη συνέχεια, σε 0,1 mL του διαλύματος κυστεΐνης προστίθεται 0,9 mL του εκάστοτε διαλύματος επισήμανσης, το μίγμα παραμένει σε θερμοκρασία 37 oC για χρονικό διάστημα 1 h και τέλος ελέγχεται η σταθερότητα του ραδιοεπισημασμένου συμπλόκου με radio-HPLC (Gradient I, σελ.106).

4.5.1.3 Μελέτες σταθερότητας παρουσία ανθρώπινου πλάσματος

Τα σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 επωάστηκαν παρουσία ανθρώπινου πλάσματος προκειμένου να ελεγχθεί το πόσο σταθερά παραμένουν τα σύμπλοκα παρουσία ενός βιολογικού δείγματος άφθονου σε πεπτιδάσες. Επιπλέον, με την παραπάνω πειραματική διαδικασία ελέγχεται επίσης η τάση πρόσδεσης των συμπλόκων στις πρωτεΐνες του πλάσματος.

Για το σκοπό αυτό, λαμβάνεται περιφερικό αίμα υγιών εθελοντών σε ηπαρινωμένα σωληνάκια αιμοδοσίας και ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 2000 στροφές για 10 min, από όπου και συλλέγεται το υπερκείμενο, δηλαδή το πλάσμα. Εν συνεχεία, σε 900 μL ανθρώπινου πλάσματος προστίθενται 100 μL διαλύματος επισήμανσης του εκάστοτε συμπλόκου. Το μίγμα επωάζεται στους 37 oC για 2 min ή για 30 min. Στα δύο αυτά χρονικά διαστήματα λαμβάνονται 500 μL από το μίγμα και αναμιγνύονται με 1 mL απόλυτης αιθανόλης προκειμένου να καταβυθιστούν οι μεγαλομοριακές πρωτεΐνες του πλάσματος. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 14000 στροφές για 30 min, από την οποία λαμβάνεται χωριστά το υπερκείμενο και το ίζημα. Το υπερκείμενο

108

διαβιβάζεται επιπλέον σε φίλτρο 0,22 μm για να διασφαλιστεί η απομάκρυνση τυχόν συσσωματωμάτων πρωτεϊνών που δεν καταβυθίστηκαν με την αιθανόλη. Στη συνέχεια, μετράται η ραδιενέργεια του υπερκείμενου, του ιζήματος και του φίλτρου και υπολογίζεται το ποσοστό δέσμευσης του συμπλόκου στις πρωτεΐνες του πλάσματος από την παρακάτω σχέση:

Η σταθερότητα των συμπλόκων ελέγχεται με διαβίβαση του υπερκείμενου σε radio-HPLC.

4.5.2 In vitro μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσης του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Στη συνέχεια, η πορεία που ακολουθήθηκε επικεντρώθηκε στην προσπάθεια εντοπισμού πιθανών θέσεων δέσμευσης/πιθανών υποδοχέων των παραγώγων μας, αλλά και κατ’επέκταση του μητρικού μορίου της ΠροΤα, στην επιφάνεια κυττάρων-στόχων. Για να ελεγχθεί αυτή η πιθανότητα, σχεδιάστηκαν στοχευμένες μελέτες κυτταρικής δέσμευσης με χρήση ραδιοεπισημασμένων ιχνηθετών, μια πάγια και αξιόπιστη τακτική της διεθνούς βιβλιογραφίας για την μελέτη αλληλεπίδρασης πιθανών υποψήφιων ζευγών προσδέτη (ligand)/κυτταρικού υποδοχέα.

Πιο συγκεκριμένα, για να πραγματοποιηθούν οι μελέτες αυτές απαιτούνται δύο βασικοί παράγοντες: ένα κυτταρικό σύστημα το οποίο θα εκφράζει τον προς μελέτη υποδοχέα και ένας ραδιοεπισημασμένος ιχνηθέτης που θα αποτελεί μόριο «στόχευσης» του προς μελέτη υποδοχέα. Όσον αφορά στο βιολογικό κυτταρικό σύστημα, επιλέχθηκαν τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα

109

περιφερικού αίματος υγιών δοτών, ένας πληθυσμός του ανοσοποιητικού συστήματος στον οποίο αφενός τα παράγωγα της ΠροΤα έχουν αποδεδειγμένα δραστικότητα και αφετέρου, εκφράζουν μεταξύ άλλων τον πιθανολογούμενο ειδικό για την ΠρoTα υποδοχέα TLR4 [94] .

4.5.2.1 Εύρεση βέλτιστων συνθηκών στις μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Δεδομένου ότι στην διεθνή βιβλιογραφία δεν υπάρχει μέχρι στιγμής κάποια αντίστοιχη μελέτη για την ΠροΤα, δηλαδή μελέτη άμεσης δέσμευσης 99mTc- επισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα σε ανθρώπινα κύτταρα ή κυτταρική σειρά, τα πρωτόκολλα έπρεπε να σχεδιαστούν εκ του μηδενός και να ελεγχθούν σταδιακά ανά βήμα. Για τον σκοπό αυτό, στην αρχή, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές μελέτες προκειμένου να βρεθούν οι βέλτιστες παράμετροι που αφορούσαν στις συνθήκες ραδιοεπισήμανσης του παραγώγου ΠροΤα-D1 (βέλτιστη ειδική ραδιενέργεια παραγώγου), στον βέλτιστο αριθμό ουδετερόφιλων για κάθε δοκιμασία και στους βέλτιστους τελικούς όγκους επώασης.

Πιο συγκεκριμένα, ελέγχθησαν τα παρακάτω:

 Ειδική ραδιενέργεια από 4 mCi/50 μg ΠροTα-D1 έως 12 mCi/50 μg ΠροTα-D1

 Αριθμός ουδετερόφιλων από 500.000-1.000.000 ανά δοκιμασία

 Τελικός όγκος επώασης από 0,5-1,5 mL

110

4.5.2.2 Μελέτες κορεσμού θέσεων δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 στην επιφάνεια ανθρώπινων ουδετερόφιλων

Υλικά και όργανα

o Ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (binding buffer): θρεπτικό μέσο RPMI 1640 (Sigma) εμπλουτισμένο με L-Glutamine (Biochrom AG) και αντιβιοτικά pen/strep (Biochrom AG), 25 mM ρυθμιστικό διάλυμα HEPES (Biochrom AG), 1 μg/mL aprotinin (Sigma)

o Κρύο διάλυμα φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl)

o Eppendorf σωληνάκια 1,5 mL

o Υδατόλουτρο (Memmert), ρυθμισμένο σε θερμοκρασία 37 oC

o Ψυχόμενη φυγόκεντρος Biofuge Primo R(Heraeus)

o Μετρητής γ-ακτινοβολίας πολλαπλών δειγμάτων MINAXI 5000 Auto (Packard)

Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν μελέτες δέσμευσης του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1, επωάζοντας ανθρώπινα ουδετερόφιλα παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ραδιενεργού παραγώγου της ΠροΤα, όπως περιγράφεται στο Σχήμα 4.5.

Σχήμα 4.6 Σχηματική αναπαράσταση της πορείας που ακολουθήθηκε για τις μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 στην επιφάνεια ανθρώπινων ουδετερόφιλων.

111

Πιο αναλυτικά, τα πειράματα κυτταρικής δέσμευσης πραγματοποιήθηκαν παρουσία θρεπτικού υλικού RPMI 1640, εμπλουτισμένου με L-γλουταμίνη, ρυθμιστικό διάλυμα HEPES, αντιβιοτικά (πενικιλλίνη/στρεπτομυκίνη) και απροτινίνη, έναν αναστολέα πρωτεασών ευρέος φάσματος. Σε σωληνάκια τύπου Eppendorf προστίθενται τα ουδετερόφιλα (5 x 105 / 1 mL ρυθμιστικού διαλύματος δέσμευσης) και εν συνεχεία το ραδιοεπισημασμένο σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων, από 0,01 έως 30 nM. Τα σωληνάκια τοποθετούνται σε υδατόλουτρο ρυθμισμένο στους 37 oC όπου και επωάζονται για 60 min. Κατά την διάρκεια της επώασης τα σωληνάκια ανακινούνται ελαφρώς χειροκίνητα κάθε 10 min. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης, ακολουθεί φυγοκέντρηση στα 1500 g για 5 min σε θερμοκρασία 4 oC, προκειμένου να καταβυθιστούν τα ουδετερόφιλα. Μετά την φυγοκέντρηση το υπερκείμενο απορρίπτεται και το ίζημα των κυττάρων ξεπλένεται δύο φορές με κρύο διάλυμα φυσιολογικού ορού προκειμένου να διαχωριστεί η ελεύθερη ραδιενέργεια από εκείνη που έχει δεσμευτεί πάνω στα κύτταρα. Εν συνεχεία, τα κύτταρα λύονται με προσθήκη διαλύματος NaOH 2N (5 min σε θερμοκρασία δωματίου) και η ραδιενέργεια των προϊόντων λύσης των κυττάρων (cell lysates) μετράται σε ανιχνευτή γ-ακτινοβολίας (Τιμές ολικά δεσμευμένης ραδιενέργειας). Παράλληλα με τα παραπάνω, μελετάται και μια δεύτερη σειρά σωλήνων στους οποίους επωάζονται τα ουδετερόφιλα και το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1, με ταυτόχρονη παρουσία περίσσειας (x 500- 1000 φορές) μη ραδιενεργού πεπτιδίου ΠροΤα[100-109] (Τιμές μη ειδικά δεσμευμένης ραδιενέργειας). Οι τελικές τιμές ειδικά δεσμευμένης ραδιενέργειας υπολογίζονται αφαιρώντας τις τιμές της μη ειδικά δεσμευμένης ραδιενέργειας από τις αντίστοιχες τιμές ολικά δεσμευμένης ραδιενέργειας.

Οι τιμές εισάγονται στο λογισμικό πρόγραμμα Graphpad Prism 6 (Graphpad software, San Diego, CA, USA) και ακολουθεί επεξεργασία τους.

112

4.5.2.3 Μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης (χάραξη καμπυλών

IC50)

Σε επόμενο στάδιο, προκειμένου να διερευνηθεί εάν το εξειδικευμένο παράγωγο της ΠροΤα προσδένεται στις ίδιες κυτταρικές επιφανειακές θέσεις με το ακέραιο μόριο της ΠροΤα αλλά και τα επιμέρους τμήματα της πρωτεΐνης -το πεπτίδιο ΠροΤα[100-109], το πεπτίδιο ΠροΤα[1-28]/Τα1 και το πεπτίδιο ΠροΤα[51-89]- πραγματοποιήθηκε μια σειρά μελετών, επωάζοντας το ραδιοεπισημασμένο παράγωγο της ΠροΤα (σε σταθερή συγκέντρωση-14 nM) με ουδετερόφιλα, αλλά αυτή την φορά με ταυτόχρονη παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ψυχρών πεπτιδικών τμημάτων του μορίου της ΠροΤα αλλά και της ακέραιης ΠρoTα, σε ένα ευρύ φάσμα συγκεντρώσεων (Πίνακας 4.10).

Πίνακας 4.10 Μη ραδιοεπισημασμένες ενώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ως πιθανοί αναστολείς δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα.

Ψυχρός ανταγωνιστής Συγκεντώσεις ΠροΤα 1 fM-100 nM ΠροΤα[100-109] 1 fM-10 μΜ NCP (scrambled ΠροΤα[100-109]) 1 fM-10 μΜ Τα1 1 fM-10 μΜ ΠροΤα[51-89] 1 fM-10 μΜ LPS 1 pg/mL-10 μg/mL

Όλα τα μη ραδιενεργά πεπτιδικά τμήματα της ΠροΤα, προτού χρησιμοποιηθούν στις μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης, ελέγχθηκαν για τα επίπεδα ενδοτοξινών που ενδεχομένως έφεραν ως πρόσμιξη, χρησιμοποιώντας ένα εμπορικά διαθέσιμο kit (LAL chromogenic Endotoxin Quantitation kit, Pierce Biotechnology, IL, USA).

Τέλος, προκειμένου να συλλέξουμε πληροφορίες για την φύση των θέσεων δέσμευσης στις οποίες προσδένονται τα ανάλογα της ΠροΤα και να συμβάλουμε σε αυτό το καίριο ερώτημα της βιβλιογραφίας, ακολούθησαν πειράματα επώασης του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 με ουδετερόφιλα παρουσία του ψυχρού ανταγωνιστή λιποπολυσακχαρίτη (LPS) βακτηριακής προέλευσης (E.coli), του «πρότυπου» δηλαδή προσδέτη

113

για τον πιθανολογούμενο υποδοχέα στον οποίο προσδένεται η ΠροΤα, τον TLR4 [92]. Ο LPS χρησιμοποιήθηκε σε ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων (1 pg/mL - 10 μg/mL).

Οι τιμές των πειραμάτων ανταγωνιστικής δέσμευσης αναλύθηκαν με την βοήθεια του προγράμματος Graphpad Prism 6 προκειμένου να χαραχθούν

καμπύλες IC50 (Inhibition Concentration 50%).

4.5.3 In vivo μελέτες σε πειραματόζωα

4.5.3.1. Εγκαθίδρυση μοντέλου φλεγμονής

Τα ουδετερόφιλα του περιφερικού αίματος στα οποία πραγματοποιήθηκαν οι μελέτες αξιολόγησης και κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου της ΠροΤα, [99mTc]ΠροΤα-D1, αποτελούν τα πρώτα κύτταρα της σωματικής άμυνας που μεταναστεύουν μέσω της αιματικής κυκλοφορίας σε εστίες οξείας φλεγμονής (άσηπτης ή σηπτικής αιτιολογίας). Προχωρώντας την μελέτη μας ένα βήμα παρακάτω θελήσαμε να μελετήσουμε την συμπεριφορά του ραδιοεπισημασμένου μας παραγώγου in vivo σε πειραματικό μοντέλο φλεγμονής με στόχο την σύνδεση των in vitro και in vivo μελετών μας.

Υποδερμική ή ενδομυϊκή ένεση τερεβινθελαίου σε ποντίκια προκαλεί τοπικά ισχυρό τραυματισμό των ιστών, καταλήγοντας σε εκδήλωση οξείας φλεγμονώδους απόκρισης. Αυτό το πειραματικό μοντέλο είναι καλά μελετημένο και χαρακτηρισμένο και αποτελεί πρότυπο μοντέλο επαγωγής άσηπτης φλεγμονής [95,96]. Η έναρξη της φλεγμονώδους απόκρισης σε αυτή την περίπτωση διαμεσολαβείται κατά βάση από την τοπική παραγωγή IL-1, και συγκεκριμένα IL-1β, η οποία εν συνεχεία επάγει την έκφραση IL-6 και τελικά την εκδήλωση της φλεγμονώδους απόκρισης. Ιστολογική παρατήρηση μικροσκοπικά τομών φλεγμαίνοντος μυός ενός τέτοιου μοντέλου χαρακτηρίζεται από παρουσία πολυπληθών φλεγμονωδών κυττάρων, 114

κυρίαρχα ουδετερόφιλων, περιβαλλόμενων από εκφυλισμένα μυοϊνίδια και νεκρωτικά μυϊκά κύτταρα [95,97].

Στο Σχήμα 4.7 απεικονίζεται σχηματικά η πειραματική πορεία που ακολουθήθηκε για τις in vivo μελέτες.

Σχήμα 4.7 Σχηματική απεικόνιση της πορείας των in vivo μελετών.

Ως πειραματόζωα χρησιμοποιήθηκαν φυσιολογικοί μύες Swiss albino, μέσου βάρους 25-30 g, η προμήθεια των οποίων έγινε από το Εκτροφείο Πειραματοζώων του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «Δημόκριτος». Τα ποντίκια ίδιου φύλου φυλάσσονταν σε κλωβούς ομαδικής στέγασης, υπό ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκρασίας και υγρασίας, ενώ διατρέφονταν με τυποποιημένη τροφή και νερό δικτύου ύδρευσης.

Σε κάθε πειραματόζωο χορηγήθηκε ενδομυϊκά 0,1 mL τερεβινθελαίου. Μετά την παρέλευση 18-20 ωρών, διάστημα αρκετό για την εκδήλωση οξείας φλεγμονώδους απόκρισης στα πειραματόζωα, ορατής ως οίδημα στην περιοχή όπου ενέθηκε το τερεβινθέλαιο, χορηγούνταν κάθε φορά τα επισημασμένα προϊόντα.

115

4.5.3.2 Μελέτες βιοκατανομής

Υλικά και όργανα

o Πλαστικές σύριγγες ινσουλίνης (1 mL) με αποσπώμενη βελόνα

o Eppendorf σωληνάρια 1,5 mL

o Διαιθυλαιθέρας

o Σωληνάκια τύπου RIA

o Τριχοειδή σωληνάκια συλλογής αίματος

o Μετρητής γ-ακτινοβολίας πολλαπλών δειγμάτων MINAXI 5000 Auto (Packard)

Για τις μελέτες βιοκατανομής, κάθε πειραματόζωο ακινητοποιείται σε ειδική διάταξη-«παγίδα» και ακολουθεί ενδοφλέβια χορήγηση του προς μελέτη ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα στην κεντρική φλέβα της ουράς του. Εν συνεχεία, το πειραματόζωο μεταφέρεται σε θάλαμο όπου συλλέγονται τα απεκκρινόμενα ούρα του και εκεί παραμένει για προκαθορισμένα χρονικά διαστήματα. Δύο περίπου λεπτά προτού παρέλθει ο χρόνος μελέτης, το πειραματόζωο μεταφέρεται σε θάλαμο κορεσμένο με ατμούς διαιθυλαιθέρα έως ότου αναισθητοποιηθεί, και ακολούθως θανατώνεται με καρδιεκτομή.

Αμέσως μετά την θανάτωση, συλλέγονται δείγματα αίματος σε προζυγισμένα τριχοειδή σωληνάκια, αφαιρείται η ουρά του ζώου και μετράται το βάρος του. Στη συνέχεια, το πειραματόζωο ανατέμνεται και αφαιρούνται τα βασικά όργανα ενδιαφέροντος, δηλαδή το ήπαρ, η καρδιά, οι νεφροί, το στομάχι, τα έντερα, η σπλήνα, οι πνεύμονες και η ουροδόχος κύστη (όπου είναι εφικτό) και βέβαια λαμβάνονται δείγματα από τον μυ στον οποίο ενέθηκε το τερεβινθέλαιο (αντιπροσωπεύει τον φλεγμαίνοντα μυ) αλλά και από τον μυ του απέναντι άκρου στον οποίο δεν έγινε ένεση τερεβινθελαίου (αντιπροσωπεύει τον υγιή/φυσιολογικό μυ μάρτυρα). Όλοι οι ιστοί και τα δείγματα τοποθετούνται σε προζυγισμένα χαρτιά ζύγισης, σημειώνεται το βάρος τους και τοποθετούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες τύπου RIA.

116

Η ραδιενέργεια των δειγμάτων μετράται σε μετρητή γ ακτινοβολίας τύπου φρέατος, σε σύγκριση με πρότυπο διάλυμα του εκάστοτε ραδιοεπισημασμένου παραγώγου, το οποίο αντιστοιχεί στο 10 % της χορηγούμενης δόσης. Από τις κρούσεις του διαλύματος αφαιρούνται οι κρούσεις της ουράς (ραδιενέργεια που δεν εισήλθε στην αιματική κυκλοφορία) και υπολογίζεται η συγκέντρωση της ραδιενέργειας ανά όργανο και ανά γραμμάριο οργάνου, σύμφωνα με τις παρακάτω σχέσεις:

Για τον υπολογισμό της δόσης στο αίμα και στους μύες λαμβάνεται υπόψη ότι αυτά αποτελούν το 7% και το 43%, αντίστοιχα, του σωματικού βάρους του πειραματοζώου.

Για την μελέτη βιοκατανομής κάθε παραγώγου χρησιμοποιήθηκαν 9-12 πειραματόζωα, σύμφωνα με το οργανόγραμμα/πλάνο (Πίνακας 4.11)

Πίνακας 4.11 Πρωτόκολλο μελέτης βιοκατανομής των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα. Το πρωτόκολλο που παρουσιάζεται εφαρμόστηκε για κάθε ένα παράγωγο, για τρεις τουλάχιστον ανεξάρτητες επαναλήψεις.

Χρονικό διάστημα από Ομάδα Αριθμός Χορηγούμενη Οδός την χορήγηση του ζώων δόση /ζώο χορήγησης παραγώγου έως την θυσία του ζώου 1η 3-4 2 min 0,1 mL Ενδοφλέβια 2η 3-4 1-2 μCi (i.v.) 30 min

3η 3-4 120 min

117

Οι in vivo μελέτες πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με την ευρωπαϊκή νομοθεσία περί διαχείρισης των πειραματοζώων. Τα εφαρμοζόμενα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από τις αρμόδιες Ελληνικές Αρχές.

4.5.3.3 Μελέτη μεταβολικού «αποτυπώματος» των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα σε ούρα ποντικού

Προκειμένου να συλλεχθούν πληροφορίες για την in vivo μεταβολική σταθερότητα των επισημασμένων παραγώγων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2, διεξήχθη έλεγχος σε δείγματα ούρων ποντικών που έφεραν πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν συνολικά έξι πειραματόζωα, χωριζόμενα σε δύο ομάδες των τριών πειραματοζώων. Σε κάθε πειραματόζωο χορηγήθηκε ενδοφλεβίως 0,1 mL των διαλυμάτων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 (2-3 μCi/ζώο) και μετά 30 min έγινε συλλογή των ούρων και έλεγχος με radio-RP-HPLC (Gradient II, σελ 106). Τα ούρα των τριών πειραματοζώων κάθε ομάδας αναμίχθηκαν και η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με το μίγμα αυτών.

4.5.3.4 Σπινθηρογραφικές μελέτες των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων της ΠροΤα με γ-κάμερα σε ποντικούς με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή.

Υλικά

o Υδροχλωρική ξυλαζίνη [20 mg/mL φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl)] (Bayer)

o Υδροχλωρική κεταμίνη [100 mg/mL φυσιολογικού ορού (0,9% NaCl)] (Merial)

o Μίγμα αναισθησίας πειραματοζώων: ξυλαζίνη/κεταμίνη (1/10 v/v)

118

Για τις σπινθηρογραφικές απεικονίσεις χρησιμοποιήθηκαν και πάλι ποντικοί Swiss albino με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή (βλέπε παράγραφος 4.5.3.1). Η χορηγούμενη δόση των ραδιοεπισημασμένων παραγώγων ήταν 30-50 μCi ανά ζώο/0,1 mL. Για κάθε ένα παράγωγο πραγματοποιήθηκε δυναμική απεικόνιση σε δύο πειραματόζωα, για μέγιστο χρονικό διάστημα δύο ωρών μετά την εκάστοτε χορήγηση.

Η σπινθηρογραφική απεικόνιση των μυών πραγματοποιήθηκε με πειραματική γ-κάμερα μικρού πεδίου αλλά υψηλής διακριτικής ικανότητας [98]. Οι διαστάσεις του πεδίου της είναι σχεδιασμένες έτσι ώστε να επιτρέπουν την ολόσωμη απεικόνιση ενός ποντικού και κατ’ επέκταση την πραγματοποίηση δυναμικών μελετών βιοκατανομής σε κάτοψη (Σχήμα 4.8).

Σχήμα 4.8 Απεικονιστική διάταξη πειραματικής γ-κάμερας.

Με την βοήθεια του συγκεκριμένου συστήματος γ-κάμερας λαμβάνονται εικόνες και συλλέγονται πληροφορίες που αφορούν στην συγκέντρωση ή μη του εκάστοτε ραδιοσκευάσματος στις περιοχές ενδιαφέροντος, όπως στην περιοχή της φλεγμονής αλλά και σε ολόκληρο το σώμα του ζώου.

119

Προκειμένου να πραγματοποιηθούν οι σπινθηρογραφικές μελέτες, μετά την ενδοφλέβια χορήγηση του εκάστοτε ραδιοεπισημασμένου συμπλόκου ακολουθεί γενική αναισθητοποίηση του πειραματόζωου με ενδοπεριτοναϊκή χορήγηση του μίγματος αναισθησίας ξυλαζίνης/κεταμίνης.

Μελέτες απεικόνισης πραγματοποιήθηκαν για τα παράγωγα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 και τα αποτελέσματα των σπινθηρογραφικών απεικονίσεων μελετήθηκαν συγκριτικά με τα αποτελέσματα των αντίστοιχων μελετών βιοκατανομής.

120

ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

5.1 Σύνθεση, καθαρισμός και ταυτοποίηση πεπτιδικών τμημάτων της ΠροΤα

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, επιλέχθηκαν να συντεθούν διαφορετικά πεπτιδικά τμήματα του ανθρώπινου πολυπεπτιδίου ΠρoTα. Στο σχήμα 5.1, παρατίθεται η αμινοξική αλληλουχία ολόκληρης της ανθρώπινης ΠρoTα ενώ, παράλληλα επισημαίνονται τα πεπτιδικά τμήματα της επιλογής μας. Η επιλογή των τμημάτων έγινε βάσει της υπάρχουσας βιβλιογραφίας, σύμφωνα με την οποία το καρβοξυτελικό τμήμα της ΠρoΤα- αμινοξέα [100-109], το αμινοτελικό τμήμα της ΠρoTα-αμινοξέα [1-14] και [1-28], και ίσως το κεντρικό τμήμα [51- 89], επιδεικνύουν βιολογική ανοσοενισχυτική δράση.

Σχήμα 5.1 Πρωτοταγής δομή της ανθρώπινης ΠρoTα. Οι αριθμοί αντιστοιχούν στην ισομορφή 2 της ΠροΤα [Homo sapiens] (NCBI Reference Sequence: NP_002814.3). Τα πεπτιδικά τμήματα που επιλέχθηκαν να συντεθούν επισημαίνονται με έγχρωμους χαρακτήρες. Ειδικά το τμήμα ΠροΤα[1-14] επισημαίνεται και με υπογράμμιση.

Στη συνέχεια, εστιάζοντας το ενδιαφέρον της παρούσας μελέτης στην C-τελική περιοχή της ΠρoTα, σχεδιάστηκε και συντέθηκε ένα νέο πεπτιδικό παράγωγο

121

της ΠρoΤα που έφερε το βιολογικά δραστικό τμήμα [100-109], παράλληλα με ένα αντίστοιχο «αναδομημένο» παράγωγο ως αρνητικό μάρτυρα (παράγωγα ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2, αντίστοιχα), και τα δύο ικανά να επισημανθούν με το ραδιοϊσότοπο 99mTc. Oι αλληλουχίες των παραγώγων φαίνονται στον Πίνακα 5.1.

Πίνακας 5.1 Αμινοξική αλληλουχία των πεπτιδικών τμημάτων/παραγώγων της ΠροΤα που συνετέθησαν και οι συνολικές αποδόσεις σύνθεσής τους.

Συνθετικό παράγωγο Αμινοξική αλληλουχία Απόδοση της ΠρoTα (κώδικας ενός γράμματος) σύνθεσης #1. ΠρoTα-D1 dmGSC-Aca-T100KKQKTDEDD109 ~20 % #2. ΠρoTα-D2 dmGSC-Aca- KETDKDKTDQ ~30 % #3. ΠρoTα[100-109] T100KKQKTDEDD109 ~20 % #4. NCP KETDKDKTDQ ~35 % («αναδομημένο» ΠρoTα[100-109]) #5. ΠρoTα[1-28]/Tα1 AcS1DAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEN28 ~10 % #6. ΠρoTα[1-14] AcS1DAAVDTSSEITTK14 ~15 % #7. ΠρoTα[51-89] * E51VDEEEEEGGEEEEEEEEGDDGDEDE ~14 % EAESATGKR89 dmG: διμεθυλογλυκίνη, AcS: σερίνη με ακετυλιωμένη την Να-αμινομάδα, Aca: αμινοκαπροϊκό οξύ (6-αμινο-εξανοϊκό οξύ)

* Οι αριθμοί αντιστοιχούν στην ισομορφή 1 της ΠροΤα [Homo sapiens] (NCBI Reference Sequence: NP_001092755.1).

Η σύνθεση όλων των πεπτιδικών τμημάτων και παραγώγων πραγματοποιήθηκε με την τεχνική της πεπτιδικής σύνθεσης σε στερεά φάση, εφαρμόζοντας την μεθοδολογία Fmoc, η αρχή της οποίας περιγράφεται στην ενότητα Υλικά και Μέθοδοι.

122

Και τα δύο πεπτιδικά παράγωγα ΠροΤα-D1, ΠροΤα-D2 που συντέθηκαν είναι ικανά να ραδιοεπισημανθούν με τεχνήτιο μιας και πάνω στο μόριό τους φέρουν έναν χηλικό παράγοντα πεπτιδικής δομής, το τριπεπτίδιο διμεθυλογλυκίνη-σερίνη-κυστεΐνη, το οποίο σύμφωνα με την βιβλιογραφία είναι ικανό να συμπλέκει σταθερά και με επιτυχία μέταλλα όπως το τεχνήτιο (Tc) και το ρήνιο (Re).

Μετά την αποκοπή τους από την ρητίνη, τα πεπτιδικά τμήματα και παράγωγα της ΠροΤα καθαρίστηκαν με ημιπαρασκευαστική RP-HPLC υπό συνθήκες που παρουσιάζονται στον πίνακα 4.4 του Κεφαλαίου Υλικά και Μέθοδοι. Τα κλάσματα που συλλέχθηκαν κατά τον καθαρισμό των πεπτιδίων, αντιστοιχούσαν στην κύρια κορυφή του χρωματογραφήματος του αντίστοιχου αρχικού ακαθάριστου συνθετικού προϊόντος. Τα κλάσματα αυτά, μετά από έλεγχο της καθαρότητάς τους σε αναλυτική RP-HPLC, συνενώθηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν.

Δεδομένης της ρητίνης που χρησιμοποιήθηκε [4-(2',4'-διμεθοξυφαινυλο-Fmoc- αμινομεθυλο)-φαινοξυπολυστυρόλιο], το C-τελικό άκρο όλων των συνθετικών πεπτιδίων που παραλήφθησαν ήταν υπό την μορφή καρβοξαμιδίου.

Οι συνολικές αποδόσεις σύνθεσης για τα πεπτιδικά τμήματα και τα πεπτιδικά παράγωγα της ΠροΤα κυμάνθηκαν από ~10% (χαμηλές) έως ~35% (πολύ ικανοποιητικές).

Τα καθαρισμένα πεπτίδια ταυτοποιήθηκαν με αναλυτική RP-HPLC στις συνθήκες που περιγράφονται στο Κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι και με φασματομετρία μαζών με την μέθοδο ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI- MS). Ακολουθούν ενδεικτικά τα αναλυτικά χρωματογραφήματα των καθαρισμένων πεπτιδικών παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 (Σχήματα 5.2-5.3) καθώς και πίνακας με τις θεωρητικές και πειραματικές μοριακές μάζες όλων των συνθετικών μορίων (Πίνακας 5.2).

123

Σχήμα 5.2 Χρωματογράφημα αναλυτικής RP-HPLC για το συνθετικό παράγωγο ΠροΤα-D1 μετά τον καθαρισμό του.

Σχήμα 5.3 Χρωματογράφημα αναλυτικής RP-HPLC για το συνθετικό παράγωγο ΠροΤα- D2 μετά τον καθαρισμό του.

124

Πίνακας 5.2 Πειραματικές και θεωρητικές μοριακές μάζες των συνθετικών παραγώγων/πεπτιδίων.

Πεπτιδικό παράγωγο / Πειραματική μοριακή Θεωρητική μοριακή τμήμα της ΠροΤα μάζα [(Μ+3Η)3+] μάζα [(Μ+3Η)3+]

#1. ΠρoTα-D1 532,9 532,9

#2. ΠρoTα-D2 532,8 532,9

#3. ΠρoTα[100-109] 402,9 403,1

#4. NCP 403,3 403,1

#5. ΠρoTα[1-28]/Tα1 1023,1 1022,8

#6. ΠρoTα[1-14] 475,6 475,5

Από τον Πίνακα 5.2 φαίνεται ότι οι τιμές των μοριακών μαζών βάσει των πειραματικών δεδομένων των φασμάτων ESI-MS είναι πρακτικά ταυτόσημες με τις θεωρητικά αναμενόμενες.

Συνολικά, πραγματοποιήθηκε η σύνθεση και ο καθαρισμός πέντε πεπτιδικών τμημάτων της ΠροΤα (#3, #5, #6, #7 και #4, ως αρνητικός μάρτυρας, Πίνακας 5.1) και δύο πεπτιδικών παραγώγων κατάλληλων να ραδιοεπισημανθούν με 99mTc (#1 και #2, ως αρνητικός μάρτυρας, Πίνακας 5.1). Τα μόρια αυτά ταυτοποιήθηκαν με ESI-MS, ενώ η καθαρότητά τους ελέγχθηκε με αναλυτική RP-HPLC και βρέθηκε υψηλότερη από 95%.

125

5.2. Σύμπλεξη των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με 185/187Re, καθαρισμός και ταυτοποίηση των συμπλόκων

Μετά τον καθαρισμό και την ταυτοποίησή τους, το πεπτιδικό παράγωγο της ΠροΤα, ΠροΤα-D1, μαζί με τον αντίστοιχο αρνητικό του μάρτυρα, ΠροΤα-D2, συμπλέχθηκαν με ψυχρό Re. Για να πραγματοποιηθεί αυτό, μεθανολικό διάλυμα κάθε παραγώγου αντέδρασε με ένα πρόδρομο μόριο (precursor) του ρηνίου, για 20 min σε θερμοκρασία δωματίου.

Μετά την εξάτμιση του διαλύτη, τα ακατέργαστα σύμπλοκα παραλήφθηκαν και καθαρίστηκαν με ημιπαρασκευαστική RP-HPLC υπό συνθήκες που παρουσιάζονται στον Πίνακα 4.6 του Κεφαλαίου Υλικά και Μέθοδοι. Τα κλάσματα που συλλέχθηκαν κατά τον καθαρισμό των πεπτιδίων αντιστοιχούσαν στην κύρια κορυφή του αντίστοιχου χρωματογραφήματος. Τα κλάσματα αυτά, μετά από έλεγχο της καθαρότητάς τους σε αναλυτική RP- HPLC, συνενώθηκαν και λυοφιλοποιήθηκαν.

Τα καθαρισμένα πεπτιδικά σύμπλοκα ταυτοποιήθηκαν με αναλυτική RP- HPLC και φασματομετρία μαζών με την μέθοδο ιοντισμού με ηλεκτροψεκασμό (ESI-MS) στις συνθήκες που περιγράφονται στο Κεφάλαιο Υλικά και Μέθοδοι.

Στον Πίνακα 5.3 αναγράφονται οι συνθήκες σύμπλεξης των δύο παραγώγων, οι αποδόσεις των αντιδράσεων και οι χρόνοι έκλουσης των συμπλόκων κατά την ανάλυσή τους σε αναλυτική RP-HLPC.

Πίνακας 5.3 Συνθήκες σύμπλεξης, απόδοση αντίδρασης και χρόνοι έκλουσης για τα δύο σύμπλοκα των παραγώγων της ΠροΤα με 185/187Re.

Σύμπλοκο θ oC Χρόνος Απόδοση (%) tR (min) επώασης (min) [Re]ΠροΤα-D1 25 20 >97% 17,32/17.58 [Re]ΠροΤα-D2 25 20 >97% 17,69/17,90

126

Στα αναλυτικά RP-HPLC χρωματογραφήματα των συμπλόκων [Re]ΠροΤα-D1 και [Re]ΠροΤα-D2 παρατηρούνται δύο κορυφές που αποδίδονται στο σχηματισμό δύο διαστερεοϊσομερών, syn- και anti- κατά την σύμπλεξη των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με ψυχρό Re. Ο σχηματισμός των διαστερεοϊσομερών syn- και anti- έχει αποδειχθεί με μελέτες NMR και CD από την ομάδα μας και δεν θα αναλυθεί περαιτέρω στο πλαίσιο της παρούσας διατριβής [68].

127

5.3 Αξιολόγηση της ανοσοενισχυτικής δραστικότητα του παραγώγου [Re]ΠροΤα-D1 σε σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων

5.3.1 Μελέτη της επίδρασης του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1 στην ενδοκυτταρική παραγωγή ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Η ανοσοενισχυτική δραστικότητα του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1 αξιολογήθηκε in vitro συγκριτικά με την δραστικότητα του ακέραιου πολυπεπτιδίου της ΠροΤα, των συνθετικών τμημάτων ΠροΤα[100-109], ΠροΤα[1-28]/Τα1, ΠροΤα[1-14], ΠροΤα[51-89], του θετικού πεπτιδίου- μάρτυρα της δοκιμασίας, fMLP, και του αρνητικού μάρτυρα, NCP. Η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε με δοκιμασία μέτρησης παραγόμενων ROS ενδοκυτταρικά, τόσο με την δοκιμασία αναγωγής του NBT (μέτρηση σε οπτικό μικροσκόπιο), όσο και με την δοκιμασία αναγωγής της χρωστικής CM- H2DCFDA (μέτρηση με FC). Ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος από 10 και 3 υγιείς δότες, αντίστοιχα, αποτέλεσαν το κυτταρικό σύστημα των παραπάνω ανοσοδοκιμασιών.

Στο Σχήμα 5.4 παρουσιάζονται τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα της δοκιμασίας αναγωγής του ΝΒΤ και για τους 10 δότες, τα ουδετερόφιλα των οποίων εξετάστηκαν. Παρατηρούμε ότι το πεπτίδιο fMLP οδήγησε στην υψηλότερη ενδοκυτταρική παραγωγή ROS συγκριτικά με την ομάδα του μάρτυρα (59,4% vs.13,0%, αντίστοιχα, p < 0,0001), ακολουθούμενο από την ακέραιη ΠροΤα και το δεκαπεπτίδιο ΠροΤα[100-109] (44,5% και 42,6%, αντίστοιχα, p < 0,0001) αλλά και το σύμπλοκο [Re]ΠροΤα-D1, το οποίο οδήγησε σε ποσοστό θετικών κυττάρων 41,0% ( p < 0,0001). Τα αμινοτελικά τμήματα Tα1 και ΠροΤα[1-14] φάνηκαν λιγότερο δραστικά από τους προηγούμενους παράγοντες, οδηγώντας σε ποσοστό θετικών κυττάρων 33,4% ( p < 0,001) και 29,3% ( p < 0,05), αντίστοιχα. Το κεντρικό τμήμα ΠροΤα[51-89] δεν κατάφερε να διεγείρει τα ουδετερόφιλα προς παραγωγή ROS, ενώ όπως αναμενόταν, και οι αρνητικοί μάρτυρες NCP και [Re]ΠροΤα- D2 δεν φάνηκαν δραστικοί.

128

Σχήμα 5.4 Συγκεντρωτικά αποτελέσματα από την δοκιμασία αναγωγής του ΝΒΤ σε ουδετερόφιλα 10 δοτών, εκφρασμένα ως % ποσοστό θετικών κυττάρων. Για κάθε υπό έλεγχο ομάδα, κάθε κύκλος αντιστοιχεί σε διαφορετικό δότη, ενώ η μεγάλη παύλα αντιστοιχεί στον μέσο όρο των τιμών και των 10 δοτών. Οι κόκκινοι κύκλοι αντιστοιχούν σε δότες, ουδετερόφιλα των οποίων χρησιμοποιήθηκαν επιπλέον στην δοκιμασία αναγωγής της χρωστικής CM-H2DCFDA. ****: p<0,0001, ***: p<0,001 και **: p<0,05.

Τα αποτελέσματα από την δοκιμασία αναγωγής του ΝΒΤ επιβεβαιώθηκαν και από την ανάλυση των κυττάρων με οργανολογία FC, χρησιμοποιώντας την

χρωστική CM-H2DCFDA. Στο Σχήμα 5.5 παρουσιάζονται αντιπροσωπευτικά χαρακτηριστικά ιστογράμματα από έναν δότη, μελετώντας την ενδοκυτταρική

παραγωγή ROS μέσω αναγωγής της χρωστικής CM-H2DCFDA. Συγκριτικά με την ομάδα του μάρτυρα (ουδετερόφιλα απουσία οποιουδήποτε παράγοντα διέγερσης), το πεπτίδιο fMLP οδήγησε στην παραγωγή των υψηλότερων επιπέδων ROS (μέση ένταση φθορισμού 6,91), όπως ήταν αναμενόμενο.

129

Ακολούθησαν η ΠροΤα (5,31), το πεπτίδιο ΠροΤα[100-109] (5,15) και το σύμπλοκο [Re]ΠρoTα-D1 (4,86). Σε ελαφρώς χαμηλότερα επίπεδα οδήγησαν η Τα1 (4,19) και το πεπτίδιο ΠροΤα[1-14] (4,11), ενώ το κεντρικό πεπτίδιο ΠροΤα[51-89] και ο αρνητικός μάρτυρας NCP δεν κατάφεραν να διεγείρουν την παραγωγή ROS από τα ουδετερόφιλα, δεδομένου ότι και στις τρεις περιπτώσεις οι καταγραφόμενες τιμές φθορισμού κινήθηκαν στα επίπεδα των μη διεγερμένων κυττάρων.

Σχήμα 5.5 Αντιπροσωπευτικά αποτελέσματα μελετών ενδοκυτταρικής παραγωγής ROS από ανθρώπινα ουδετερόφιλα ενός υγιούς δότη από τους συνολικά 3 που ελέγχθησαν. Οι τιμές κάθε ιστογράμματος αντιστοιχούν στην μέση τιμή έντασης φθορισμού 104 κυττάρων. control, μη διεγερμένα κύτταρα.

Και από τις δύο μεθοδολογίες ελήφθησαν, ποιοτικά, τα ίδια αποτελέσματα ως προς την κατάταξη των πεπτιδικών παραγώγων/τμημάτων της ΠροΤα κατά σειρά αύξουσας ανοσοδραστικότητας.

130

5.3.2 Επίδραση του συμπλόκου [Re]ΠρoTα-D1 στην κινητική της επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Οι Ioannou και συνεργάτες δημοσίευσαν πρόσφατα ότι η ΠροΤα και το πεπτίδιο ΠροΤα[100-109] μπορούν και επηρεάζουν την κινητική της έκφρασης του υποδοχέα TLR4 στην επιφάνεια ανθρώπινων δενδριτικών κυττάρων [66]. Στην παρούσα μελέτη, ανθρώπινα ουδετερόφιλα, αντί δενδριτικών κυττάρων, επωάστηκαν για τα χρονικά διαστήματα των 15 min, 30 min, 60 min και 90 min με το σύμπλοκο [Re]ΠρoTα-D1, το ακέραιο μόριο της ΠροΤα, και τα συνθετικά τμήματα ΠροΤα[100-109], Τα1 και ΠροΤα[51-89]. Το τελευταίο πεπτίδιο έχει αναφερθεί ότι επάγει την παραγωγή ιντερφερονών τύπου Ι σε μακροφάγα ποντικού έπειτα από πρόσδεση στον υποδοχέα TLR4 [65]. Ο λιποπολυσακχαρίτης LPS, που αποτελεί τον «πρότυπο» προσδέτη του υποδοχέα TLR4, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας της δοκιμασίας.

Συνολικά, αναλύθηκαν ουδετερόφιλα από 3 υγιείς δότες. Οι αλλαγές στην έκφραση του υποδοχέα TLR4 (Μ.Ο. τριών δοτών) απεικονίζονται στο διάγραμμα του Σχήματος 5.6-Α, ενώ χαρακτηριστικά ιστογράμματα από έναν αντιπροσωπευτικό δότη παρουσιάζονται στο Σχήμα 5.6-Β. Παρατηρούμε ότι επώαση των ουδετερόφιλων με τον LPS οδήγησε σε μια ταχεία (≤ 15 min) και σημαντική (≥ 90%) αύξηση στο ποσοστό επιφανειακής έκφρασης του TLR4, ενώ μεταξύ 30-90 min επώασης ακολούθησε σταδιακή μείωση, με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα να επανέρχονται σχεδόν στα αρχικά. Το σύμπλοκο [Re]ΠρoTα-D1, η ΠροΤα και το πεπτίδιο ΠροΤα[100-109] φάνηκε να ασκούν αντίστοιχη επίδραση στο ποσοστό έκφρασης του TLR4 συναρτήσει του χρόνου, η οποία όμως ήταν λιγότερο έντονη/ισχυρή από εκείνη του LPS ([Re]ΠρoTα-D1< ΠροΤα[100-109]<ΠροΤα< LPS). Η Τα1 και το κεντρικό τμήμα ΠροΤα[51-89] δεν κατάφεραν να αυξήσουν σημαντικά το ποσοστό έκφρασης του TLR4, σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα στον χρόνο 0 (= επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα απουσία οποιουδήποτε παράγοντα διέγερσης).

131

Σχήμα 5.6 Κινητική μελέτη επιφανειακής έκφρασης του υποδοχέα TLR4 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα. Α. Συνολικά αποτελέσματα από την μελέτη κυττάρων 3 δοτών, εκφρασμένα ως % ποσοστό έκφρασης του TLR4. Οι τυπικές αποκλίσεις έχουν σκοπίμως αφαιρεθεί από το διάγραμμα για λόγους ευκρίνειας, και σε όλες τις περιπτώσεις ήταν μικρότερες από 15%. Β. Αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα από την μελέτη κυττάρων ενός υγιούς δότη. Οι τιμές κάθε ιστογράμματος αντιστοιχούν στην μέση τιμή έντασης φθορισμού 104 κυττάρων.

132

5.4 Ραδιοεπισήμανση των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με Τεχνήτιο-99m (99mTc) / Ραδιοχημικός έλεγχος

Η ραδιοεπισήμανση των παραγώγων ΠροΤα-D1 και ΠροΤα-D2 με τεχνήτιο- 99m πραγματοποιήθηκε με προσθήκη υπερτεχνητικών ιόντων στα αντίστοιχα παράγωγα, σε αναγωγικό περιβάλλον χλωριούχου κασσίτερου παρουσία γλυκοεπτονικών αλάτων, και θέρμανση στους 37oC για 30 min. Μετά το πέρας του χρόνου επώασης, ακολούθησε χρωματογραφική ανάλυση των μιγμάτων των δύο συμπλόκων σε αναλυτική radio-HPLC, χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές συνθήκες (gradient I και II).

Στον Πίνακα 5.4 εμφανίζονται οι αποδόσεις σύμπλεξης καθώς επίσης και οι χρόνοι έκλουσης των δύο ραδιενεργών συμπλόκων από την αναλυτική radio- HPLC.

Πίνακας 5.4 Συνθήκες επισήμανσης, απόδοση αντίδρασης και χρόνοι έκλουσης για τα ραδιενεργά σύμπλοκα.

o Σύμπλοκο θ C Χρόνος Απόδοση (%) tRI (min) tRII (min) επώασης (min) [99mTc]ΠροΤα-D1 37 30 >97% 16.9 34.5/35.6 [99mTc]ΠροΤα-D2 37 30 >97% 17.1 35.5/36.4 tRI: χρόνος έκλουσης του συμπλόκου εφαρμόζοντας το gradient I, tRII: χρόνος έκλουσης του συμπλόκου εφαρμόζοντας το gradient II.

Όπως φαίνεται στον Πίνακα 5.4 τα ραδιοεπισημασμένα σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 παρήχθησαν σχεδόν ποσοτικά (>97%) από την αντίδραση των υπερτεχνητικών ιόντων(99mTcO4-) με τα αντίστοιχα πεπτιδικά παράγωγα.

Στα Σχήματα 5.7 και 5.8 φαίνονται τα αναλυτικά ραδιο-χρωματογραφήματα των παραγώγων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 εφαρμόζοντας τα δύο gradients.

133

Σχήμα 5.7 Χρωματογραφική ανάλυση του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 εφαρμόζοντας τα gradients I και II.

Σχήμα 5.8 Χρωματογραφική ανάλυση του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D2 εφαρμόζοντας τα gradients I και II.

Στα αναλυτικά χρωματογραφήματα εφαρμόζοντας το gradient II είναι φανερή η παρουσία δύο κορυφών, οι οποίες αντιστοιχούν στην δημιουργία των δύο διαστερεοϊσομερών syn- και anti-. Το αποτέλεσμα αυτό είναι σε αντιστοιχία με τα αποτελέσματα σύμπλεξης των αντίστοιχων παραγώγων με το ψυχρό ρήνιο (σελ. 126).

134

- Για να εξεταστεί ο σχηματισμός ή όχι κολλοειδών τεχνητίου (TcO2 ) κατά την διάρκεια της σύμπλεξης, τα οποία συνήθως κατακρατούνται στην χρωματογραφική στήλη, πραγματοποιήθηκε επιπλέον HPLC χρωματογραφική ανάλυση για κάθε σύμπλοκο, κατά την οποία συνελέγησαν όλα τα εκλούματα της στήλης, προκειμένου να μετρηθεί η ραδιενέργειά τους και να συγκριθεί με την αρχική ραδιενέργεια του ενιέμενου δείγματος. Σε όλες τις περιπτώσεις η ανάκτηση ήταν ποσοτική (>97%).

Τέλος, τα δύο ραδιενεργά σύμπλοκα ταυτοποιήθηκαν με συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση έπειτα από ταυτόχρονη χορήγηση του συμπλόκου του 99mTc με το χαρακτηρισμένο ανάλογο σύμπλοκο με 185/187Re. Στον Πίνακα 5.5 παρουσιάζονται οι χρόνοι έκλουσης για τα ζεύγη των συμπλόκων Re-Tc (Gradient I, σελ.106).

Πίνακας 5.5 Χρόνοι έκλουσης των συμπλόκων του 185/187Re και του 99mTc κατά την ταυτόχρονη συγκριτική χρωματογραφική ανάλυσή τους.

tR (min)

D1 D2

[Re]ΠροΤα-Dn 16.4 16.9

99m [ Tc]ΠροΤα-Dn 16.8 17.1

Στο Σχήμα 5.9 φαίνεται ενδεικτικά η συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση των συμπλόκων [Re]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D1. Οι παρόμοιοι χρόνοι έκλουσης είναι ενδεικτικοί του σχηματισμού συμπλόκων παρόμοιας δομής.

135

Σχήμα 5.9 Συγκριτική χρωματογραφική ανάλυση των συμπλόκων [Re]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D1.

5.5 Μελέτες σταθερότητας των επισημασμένων συμπλόκων

5.5.1 Σταθερότητα των συμπλόκων στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από απομόνωση με radio-HPLC

Αμέσως μετά την επιτυχημένη ραδιοεπισήμανση των δύο παραγώγων της ΠροΤα, διεξήχθησαν τα απαραίτητα πειράματα ελέγχου σταθερότητας των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2. Αρχικά, αξιολογήθηκε η σταθερότητα των συμπλόκων στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από απομόνωση με radio-HPLC, σε θερμοκρασία περιβάλλοντος και για διάστημα 6 h και 24 h. Στον Πίνακα 5.6 αναφέρονται αναλυτικά τα ποσοστά σταθερότητας των συμπλόκων.

Όπως φαίνεται με σαφήνεια στον Πίνακα 5.6 και τα δύο σύμπλοκα παρέμειναν σταθερά σε πολύ υψηλό ποσοστό, τόσο στο μίγμα της

136

επισήμανσής τους όσο και μετά την απομόνωσή τους από το μίγμα επισήμανσης, μέσω radio-ΗPLC.

Πίνακας 5.6 Σταθερότητα των συμπλόκων της ΠροΤα με 99mTc στο μίγμα της επισήμανσης ή μετά από απομόνωση με radio-HPLC.

Σύμπλοκο Μίγμα επισήμανσης Απομονωμένο σύμπλοκο 6 h 24 h 6 h [99mTc]ΠροΤα-D1 >97% 95% >97% [99mTc]ΠροΤα-D2 >97% 95% >97%

5.5.2 Σταθερότητα των συμπλόκων παρουσία περίσσειας κυστεΐνης

Εν συνεχεία, μελετήθηκε η σταθερότητα των δύο συμπλόκων παρουσία περίσσειας κυστεΐνης (10-4 Μ) σε θερμοκρασία 37 oC για χρονικό διάστημα 1 h. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.10, και τα δύο σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 παρουσία του ισχυρού ανταγωνιστή σύμπλεξης του 99mTc, κυστεΐνης, έδειξαν πολύ ικανοποιητική σταθερότητα, σε ποσοστά που υπερβαίνουν το 85% (σύγκριση του ποσοστού του ακέραιου συμπλόκου αμέσως μετά το πέρας της επισήμανσης και μετά από 1 h επώαση με περίσσεια κυστεΐνης).

Σχήμα 5.10 Σταθερότητα των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 παρουσία περίσσειας κυστεΐνης.

137

5.5.3 Σταθερότητα των συμπλόκων παρουσία ανθρώπινου πλάσματος

Τα σύμπλοκα [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 επωάστηκαν σε θερμοκρασία 37 oC για τα χρονικά διαστήματα των 2 min και 30 min (επιλογή χρονικών διαστημάτων με βάση τους χρόνους μελετών βιοκατανομής) παρουσία ανθρώπινου πλάσματος.

Όπως φαίνεται και στον Πίνακα 5.7, το σύμπλοκο της ΠροΤα [99mTc]ΠροΤα- D1 εμφάνισε πολύ υψηλά ποσοστά δέσμευσης στις πρωτεΐνες του πλάσματος από τα πρώτα κιόλας δύο λεπτά παραμονής του σε αυτό το βιολογικό δείγμα. Ως αποτέλεσμα του υψηλού ποσοστού δέσμευσης στις πρωτεΐνες του πλάσματος δεν κατέστη δυνατή η μελέτη σταθερότητας αυτού του συμπλόκου στο υπερκείμενο υγρό. Τα αποτελέσματα αυτά, συγκρινόμενα με εκείνα του αρνητικού μάρτυρα [99mTc]ΠροΤα-D2, αποτελούν ίσως μια πρώτη ένδειξη ότι το βιολογικά δραστικό τμήμα ΠροΤα[100-109] αλληλεπιδρά άμεσα με πρωτεΐνες του πλάσματος, γεγονός που πιθανόν να προστατεύει το παράγωγο από την δράση πεπτιδασών.

Πίνακας 5.7 Δέσμευση των 99mTc-συμπλόκων της ΠροΤα στις πρωτεΐνες ανθρώπινου πλάσματος.

Σύμπλοκο Επώαση με ανθρώπινο πλάσμα 2 min 30 min Δέσμευση (%) Δέσμευση (%) [99mTc]ΠροΤα-D1 67.7 ± 4.6 69.7 ± 4.0 [99mTc]ΠροΤα-D2 22.0 ± 3.6 21.7 ± 5.3

5.6. Μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα

Αφού εξασφαλίστηκε η σταθερότητα των επισημασμένων συμπλόκων, ακολούθησαν στοχευμένες in vitro μελέτες κυτταρικής δέσμευσης του συμπλόκου της ΠροΤα [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα υγιών δοτών.

138

Αρχικά, πραγματοποιήθηκαν προκαταρκτικές μελέτες προς εύρεση των βέλτιστων συνθηκών που αφορούσαν σε τρεις βασικές παραμέτρους: στην βέλτιστη ειδική ραδιενέργεια του παραγώγου της ΠροΤα, στον βέλτιστο αριθμό κυττάρων ανά σωλήνα και στον τελικό όγκο επώασης των κυττάρων με το ραδιενεργό παράγωγο (Πίνακας 5.8).

Πίνακας 5.8 Βέλτιστες συνθήκες διεξαγωγής των in vitro μελετών κυτταρικής δέσμευσης.

Παράμετρος που μελετήθηκε Εύρος τιμών μελέτης Βέλτιστες συνθήκες Ειδική ραδιενέργεια 4-12 mCi/ 9-10 mCi/ 50 μg ΠροΤα-D1 50 μg ΠροΤα-D1 Αριθμός ουδετερόφιλων 5 x 105-10 x 105 / σωλήνα 7 x 105 / σωλήνα Τελικός όγκος επώασης 0.5 mL- 1.5 mL / σωλήνα 1.0 mL / σωλήνα

Αφού προτυποποιήθηκαν οι βέλτιστες συνθήκες ειδικής ραδιενέργειας, αριθμού κυττάρων και όγκου επώασης, ακολούθησαν τα κύρια πειράματα κυτταρικής δέσμευσης. Σε πρώτο στάδιο, πραγματοποιήθηκαν μελέτες κυτταρικής δέσμευσης επωάζοντας τα ουδετερόφιλα παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων του ραδιενεργού παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1. Από τις μελέτες αυτές προέκυψαν χαρακτηριστικές καμπύλες κορεσμού του ραδιενεργού σήματος (Σχήμα 5.11), δηλαδή της ειδικής πρόσδεσης του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων, γεγονός που κατέδειξε για πρώτη φορά την ύπαρξη ειδικών θέσεων πρόσδεσης/υποδοχέων παραγώγου της ΠροΤα στην επιφάνεια αυτού του τύπου των κυττάρων. Επεξεργασία αυτών των αποτελεσμάτων με κατάλληλο πρόγραμμα (GraphPad Prism 6) έδωσε αξιόπιστες πληροφορίες σχετικές με την πιθανή σταθερά σύνδεσης (Kd) του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 στον ειδικό υποδοχέα, με Kd=3,76 ± 0,41 nM.

139

) 1 0 0 0 0

(

α ι

ε 8 0 0 0

ε ι

δ 6 0 0 0

ν έ

μ 4 0 0 0

ε δ

2 0 0 0

ι Ε 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 Ρ α δ ιο π ρ ο σ δ έτ η ς (n M ) Σχήμα 5.11 Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα-Καμπύλη κορεσμού.

Σε επόμενο στάδιο, προκειμένου να διερευνηθεί εάν το εξειδικευμένο ραδιενεργό παράγωγο της ΠροΤα προσδένεται στις ίδιες κυτταρικές επιφανειακές θέσεις με το ακέραιο μόριο της ΠροΤα αλλά και με τις τρεις περιοχές της πρωτεΐνης που βάσει βιβλιογραφίας εμφανίζουν βιολογική δραστικότητα -το αμινοτελικό πεπτίδιο 1-28, το καρβοξυτελικό άκρο 100-109 και την κεντρική περιοχή 51-89-, πραγματοποιήθηκε μια σειρά μελετών, επωάζοντας το ραδιοεπισημασμένο παράγωγο της ΠροΤα με ουδετερόφιλα αλλά αυτή την φορά με ταυτόχρονη παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων των παραπάνω ψυχρών (μη ραδιενεργών) τμημάτων του μορίου της ΠροΤα. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν (Σχήμα 5.12) κατέδειξαν ότι τόσο η ακέραιη ΠροΤα όσο και το καρβοξυτελικό της πεπτίδιο ΠροΤα[100-109] εκτόπισαν το σήμα δέσμευσης του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα, υποδεικνύοντας ότι τα δύο ψυχρά πεπτίδια και το επισημασμένο παράγωγο ανταγωνίζονται για την πρόσδεση στις ίδιες θέσεις πάνω στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων. Αντιθέτως, τα υπόλοιπα πεπτιδικά τμήματα της πρωτεΐνης από το αμινοτελικό άκρο και την κεντρική περιοχή του μορίου δεν έδειξαν την ίδια συμπεριφορά, αδυνατώντας να εκτοπίσουν έστω και στο ελάχιστο την δεσμευόμενη ραδιενέργεια στην επιφάνεια των κυττάρων. 140

1 0 0

α ι

ε Π ρ o T α

ρ έ

ν Π ρ o T α [1 0 0 -1 0 9 ]

ε ι

δ T α 1

α ρ

N C P

η ν

έ Π ρ ο Τ α [5 1 -8 9 ]

υ ε

μ 5 0

-6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 4 5

lo g [C ] (n M )

Σχήμα 5.12 Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα- Καμπύλες εκτόπισης της ειδικής δέσμευσης παρουσία ψυχρών πιθανών ανταγωνιστών.

Τέλος, προκειμένου να συλλεχθούν πληροφορίες για την ταυτότητα αυτού του υποδοχέα στον οποίο προσδένονται η ΠροΤα και τα καρβοξυτελικά ανάλογά της και να συμβάλουμε σε αυτό το καίριο ερώτημα της βιβλιογραφίας, ακολούθησαν επωάσεις του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα [99mTc]ΠροΤα-D1, με ουδετερόφιλα παρουσία ψυχρού λιποπολυσακχαρίτη (LPS) βακτηριακής προέλευσης (E. coli) σε ένα μεγάλο εύρος συγκεντρώσεων, του «πρότυπου» δηλαδή προσδέτη για τον πιθανολογούμενο υποδοχέα στον οποίο προσδένεται η ΠροΤα, τον TLR4 [92]. Πάλι και σε αυτή την περίπτωση όπως φαίνεται στο Σχήμα 5.13, ελήφθη καμπύλη εκτόπισης του σήματος της ραδιενέργειας, γεγονός που συνηγορεί 141

στο ότι αυτές οι ειδικές θέσεις πρόσδεσης του παραγώγου της ΠροΤα αλλά και του ακέραιου μορίου της ΠροΤα και του καρβοξυτελικού πεπτιδίου της πιθανότατα είναι ή τουλάχιστον σχετίζονται με τον υποδοχέα TLR4.

1 0 0

έ μ

υ 5 0

-2 -1 0 1 2 3 4 5

lo g [L P S ] (n g /m L )

Σχήμα 5.13 Αποτελέσματα μελετών κυτταρικής δέσμευσης του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα- Καμπύλη εκτόπισης της ειδικής δέσμευσης παρουσία ψυχρού LPS.

Επεξεργασία των καμπυλών εκτόπισης σήματος μέσω του προγράμματος

GraphPad Prism 6 έδωσε τιμές IC50 0,056 ± 0,011 nM για την ΠροΤα, 0,91 ± 0,14 nM για το ΠροΤα[100-109] και 1,78 ± 0,52 ng/mL για τον LPS (Πίνακας 5.9).

Πίνακας 5.9 Τιμές IC50 για τους ψυχρούς ανταγωνιστές υπολογισμένες μέσω του GraphPad Prism 6

Ψυχρός ανταγωνιστής Τιμή IC50 ΠροΤα 0.056 ± 0.011 nM ΠροΤα[100-109] 0.91 ± 0.14 nM LPS 1.78 ± 0.52 ng/mL

142

5.7. In vivo μελέτες σε πειραματόζωα

5.7.1 Μελέτες βιοκατανομής σε πειραματόζωα με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή

Η βιολογική κατανομή των επισημασμένων συμπλόκων της ΠροΤα μελετήθηκε σε λευκά ποντίκια Swiss albino, στα οποία προηγουμένως είχε εγκαθιδρυθεί «παθολογικό» πρότυπο σοβαρής άσηπτης φλεγμονής. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε για τα χρονικά διαστήματα των 2 min, 30 min και 120 min έπειτα από ενδοφλέβια χορήγηση του διαλύματος του εκάστοτε συμπλόκου.

Αρχικά μελετήθηκε η βιοκατανομή του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 και με βάση τα αποτελέσματα που ελήφθησαν ακολούθησε για λόγους σύγκρισης η βιοκατανομή του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D2, ως αρνητικού μάρτυρα του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1.

Παρατηρώντας τον Πίνακα 5.10 βλέπουμε ότι το επισημασμένο παράγωγο [99mTc]ΠροΤα-D1 επέδειξε γρήγορη αιματική κάθαρση, η οποία συνοδευόταν από γρήγορη κάθαρσή του και από την καρδιά, τους πνεύμονες και τον φυσιολογικό μυ (απέναντι μηρός). Επιπλέον, δεν ανιχνεύτηκε σημαντικό ποσοστό ραδιενέργειας στο στομάχι (0,23 ± 0,05 % ID/organ στα 120 min p.i), γεγονός που υποδηλώνει ότι το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1 είναι σταθερό και ότι το 99mTc δεν επανοξειδώνεται in vivo σε υπερτεχνητικά ιόντα. Το υψηλό ποσοστό ραδιενέργειας στα ούρα από τα πρώτα κιόλας 30 λεπτά μετά την χορήγηση του παραγώγου (70,68 ± 3,33 % ID/organ), συνδυαστικά με τα χαμηλά ποσοστά ραδιενέργειας σε συκώτι και έντερα, υποδηλώνει ότι το ιχνηθετημένο πεπτίδιο απεκκρίνεται μέσω του ουροποιητικού συστήματος, όπως αναμενόταν λόγω της υψηλής υδροφιλικότητάς του. Το πιο ενδιαφέρον δεδομένο όμως του Πίνακα 5.10 είναι το γεγονός της αργής κάθαρσης της ραδιενέργειας από τον φλεγμαίνοντα ιστό σε σχέση με τον φυσιολογικό μυ αναφοράς, το οποίο οδήγησε σε έναν λόγο διάκρισης φλεγμαίνων μυς/φυσιολογικός μυς περίπου 9, ο οποίος παρέμεινε πρακτικά σταθερός ακόμη και 2 ώρες μετά την χορήγηση του παραγώγου. 143

Πίνακας 5.10 Αποτελέσματα βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ποντικούς Swiss albino με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή, εκφρασμένα ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά όργανο και ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά γραμμάριο ιστού.

% ID ανά όργανο

ΧΡΟΝΟΣ 2 min 30 min 2 h

M.O. STD M.O. STD M.O. STD ΑΙΜΑ 29,59 1,92 1,20 0,19 0,34 0,05 ΣΥΚΩΤΙ 3,92 0,54 1,17 0,30 0,78 0,30 ΚΑΡΔΙΑ 0,48 0,05 0,02 0,00 0,00 0,00 ΝΕΦΡΑ 16,58 1,64 4,01 0,50 1,45 0,04 ΣΤΟΜΑΧΙ 0,55 0,01 0,24 0,06 0,23 0,05 ΕΝΤΕΡΟ 5,09 0,21 5,97 1,94 6,42 0,14

ΣΠΛΗΝΑΣ 0,23 0,01 0,03 0,00 0,02 0,00 ΜΥΣ 27,21 0,95 1,61 0,26 0,88 0,21 ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ 1,06 0,11 0,11 0,02 0,03 0,00 ΦΛΕΓΜΟΝΗ 0,34 0,05 0,26 0,07 0,10 0,02 ΟΥΡΑ 0,00 0,00 70,68 3,33 76,54 4,43

% ID ανά g

ΧΡΟΝΟΣ 2 min 30 min 2 h

M.O. STD M.O. STD M.O. STD ΑΙΜΑ 14,92 1,03 0,58 0,04 0,15 0,02 ΣΥΚΩΤΙ 2,53 0,37 0,70 0,17 0,47 0,18 ΚΑΡΔΙΑ 4,56 0,42 0,19 0,03 0,05 0,00 ΝΕΦΡΑ 44,23 0,98 8,42 1,21 3,26 0,07 ΣΤΟΜΑΧΙ 0,86 0,18 0,41 0,19 0,41 0,04

ΕΝΤΕΡΟ 2,08 0,11 2,54 0,85 2,88 0,24

ΣΠΛΗΝΑΣ 2,29 0,24 0,21 0,01 0,13 0,02 ΜΥΣ 2,23 0,08 0,13 0,02 0,06 0,01 ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ 6,66 1,18 0,57 0,06 0,15 0,00 ΦΛΕΓΜΟΝΗ 1,44 0,07 1,16 0,10 0,49 0,07 ΦΛΕΓΜΟΝΗ/ 0,65 9,13 7,70 ΜΥΣ ΦΛΕΓΜΟΝΗ/ 0,10 2,01 3,25 ΑΙΜΑ Μ.Ο., Μέσος όρος 9 τιμών, STD, τυπική απόκλιση

Εν συνεχεία, προκειμένου να επιβεβαιώσουμε ότι τα πολύ ενδιαφέροντα αποτελέσματα βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 δεν είναι τυχαία αλλά οφείλονται στην ύπαρξη του δραστικού πεπτιδίου ΠροΤα[100- 109] το οποίο στοχεύει την εστία της φλεγμονής, προχωρήσαμε σε συγκριτικές μελέτες βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D2, το οποίο

144

εξ αρχής σχεδιάστηκε έτσι ώστε να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας του παραγώγου ΠροΤα-D1 (το παράγωγο ΠροΤα-D2 αντί του δραστικού καρβοξυτελικού δεκαπεπτιδίου της ΠροΤα περιέχει ένα «αναδομημένο» δεκαπεπτίδιο, το οποίο αποτελείται ποιοτικά από τα ίδια δέκα αμινοξέα με το πρώτο αλλά σε διαφορετική πρωτοδιάταξη).

Παρατηρώντας τα αποτελέσματα βιοκατανομής του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D2 (Πίνακας 5.11) και εστιάζοντας στην ικανότητά του ή όχι να διακρίνει την φλεγμαίνουσα από την υγιή περιοχή τουμυός, βλέπουμε ότι το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D2 έδειξε έναν λόγο διάκρισης φλεγμονής/φυσιολογικού μυ 2,72 και 1,61 στα 30 min και 120 min p.i αντίστοιχα, έναντι των λόγων του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 9,13 και 7,70 στα χρονικά διαστήματα 30 min και 120 min p.i, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αυτά υποστηρίζουν ότι τα αποτελέσματα βιοκατανομής του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 αφορούσαν αποκλειστικά στο βιοδραστικό πεπτίδιο ΠροΤα[100-109].

Πίνακας 5.11 Αποτελέσματα βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D2 σε ποντικούς Swiss albino με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή, εκφρασμένα ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά όργανο και ως % ενιόμενης δόσης (ID) ανά γραμμάριο ιστού.

% ID ανά όργανο

ΧΡΟΝΟΣ 2 min 30 min 2 h

M.O. STD M.O. STD M.O. STD ΑΙΜΑ 31,43 0,82 1,44 0,19 0,71 0,07 ΣΥΚΩΤΙ 4,89 1,14 1,01 0,27 0,98 0,07 ΚΑΡΔΙΑ 0,53 0,05 0,04 0,01 0,02 0,01 ΝΕΦΡΑ 11,78 3,49 3,75 0,46 1,29 0,09 ΣΤΟΜΑΧΙ 0,66 0,06 0,75 0,09 2,39 1,59 ΕΝΤΕΡΟ 5,49 0,17 5,90 0,23 6,01 0,33 ΣΠΛΗΝΑΣ 0,31 0,03 0,03 0,00 0,03 0,01 ΜΥΣ 26,80 2,31 2,15 0,15 1,12 0,10 ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ 1,14 0,13 0,08 0,01 0,07 0,01 ΦΛΕΓΜΟΝΗ 0,71 0,28 0,17 0,01 0,05 0,01 ΟΥΡΑ 0,01 0,00 72,29 2,70 73,52 2,92

Μ.Ο., Μέσος όρος 9 τιμών, STD, τυπική απόκλιση

145

% ID ανά g

ΧΡΟΝΟΣ 2 min 30 min 2 h

M.O. STD M.O. STD M.O. STD ΑΙΜΑ 15,26 0,73 0,75 0,07 0,37 0,03 ΣΥΚΩΤΙ 2,75 0,53 0,66 0,28 0,67 0,08 ΚΑΡΔΙΑ 4,47 0,71 0,30 0,10 0,18 0,06 ΝΕΦΡΑ 22,72 5,77 7,72 1,64 2,72 0,16 ΣΤΟΜΑΧΙ 1,38 0,18 1,60 0,22 5,19 3,07 ΕΝΤΕΡΟ 2,12 0,11 2,75 0,46 3,15 0,27 ΣΠΛΗΝΑΣ 2,14 0,33 0,23 0,00 0,26 0,14 ΜΥΣ 2,11 0,14 0,18 0,02 0,10 0,01 ΠΝΕΥΜΟΝΕΣ 6,63 0,41 0,52 0,09 0,37 0,07 ΦΛΕΓΜΟΝΗ 2,15 0,24 0,50 0,04 0,15 0,03 ΦΛΕΓΜΟΝΗ/ ΜΥΣ 1,02 2,72 1,61 ΦΛΕΓΜΟΝΗ/ ΑΙΜΑ 0,14 0,67 0,42

Μ.Ο., Μέσος όρος 9 τιμών, STD, τυπική απόκλιση

5.7.2 Μελέτη μεταβολικής σταθερότητας των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα- D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 σε δείγμα ούρων ποντικιών με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή

Θέλοντας να έχουμε μια εικόνα όσον αφορά στην σταθερότητα του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1 in vivo, προχωρήσαμε σε χρωματογραφική ανάλυση ούρων ποντικών στους οποίους ενέθηκε ενδοφλεβίως το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1, για το χρονικό διάστημα των 30 min p.i.

Στο Σχήμα 5.14 παρουσιάζεται το HPLC χρωματογράφημα δείγματος ούρων 30 min p.i συγκριτικά με το HPLC χρωματογράφημα του συμπλόκου αμέσως μετά την επισήμανσή του (Gradient II).

146

Σχήμα 5.14 Radio-HPLC χρωματογράφημα του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1: Α) στο μίγμα της επισήμανσής του και, Β) σε δείγμα ούρων ποντικού, έπειτα από ενδοφλέβια χορήγησή του και παραμονή 30 min in vivo.

Παρατηρούμε ότι το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D1 απεκκρίθηκε στα ούρα κατά ~ 20% αυτούσιο (υπολογισμός έπειτα από μαθηματική ολοκλήρωση του χρωματογραφήματος), ενώ το υπόλοιπο απεκκρίθηκε υπό την μορφή μεταβολιτών τόσο υφρόφιλων (κορυφές που εμφανίζονται πιο νωρίς από τον χρόνο έκλουσης του συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1) όσο και υδρόφοβων (κορυφές που εμφανίζονται πιο αργά από τον χρόνο έκλουσης του

147

συμπλόκου [99mTc]ΠροΤα-D1). Το ποσοστό αυτό θεωρείται εξαιρετικά ικανοποιητικό, λαμβάνοντας υπόψη το πόσο ευάλωτα είναι τα πεπτίδια ως μικρά μόρια στο εσωτερικό περιβάλλον ενός ζωντανού οργανισμού που αφθονεί σε πρωτεάσες/πεπτιδάσες.

5.7.3 Σπινθηρογραφικές μελέτες των παραγώγων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 σε πειραματόζωα με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή

Τέλος, πραγματοποιήθηκε in vivo σπινθηρογραφική απεικόνιση με χρήση πειραματικής γ-κάμερας του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠρoTα [99mTc]ΠροΤα-D1. Για λόγους σύγκρισης και το σύμπλοκο [99mTc]ΠροΤα-D2 υποβλήθηκε σε ανάλογες μελέτες. Η επεξεργασία και οπτικοποίηση των δεδομένων από την γ-κάμερα οδήγησαν στην κατασκευή στατικών εικόνων, περαιτέρω επεξεργασία των οποίων με το λογισμικό ImageJ οδήγησε και στην παραγωγή δυναμικών εικόνων-βίντεο. Στο Σχήμα 5.15 παρουσιάζονται τρια χαρακτηριστικά στιγμιότυπα σπινθηρογραφικής απεικόνισης των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 (σε αντίστοιχους χρόνους) σε ποντικούς Swiss albino που έφεραν πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή. Με κόκκινους κύκλους σημειώνονται οι δύο περιοχές ενδιαφέροντος, δηλαδή ο μυς που έφερε την φλεγμονή και ο αντικριστός υγιής μυς-αναφοράς.

Παρατηρούμε ότι η απεικόνιση της φλεγμονής είναι δυνατή από τα πρώτα λεπτά χορήγηγησης του [99mTc]ΠροΤα-D1 μέχρι και το τέλος της μελέτης μας.

148

Σχήμα 5.15 Χαρακτηριστικές στατικές λήψεις πειραματικής γ-κάμερας από σπινθηρογραφικές απεικονίσεις των συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2 σε ποντικούς με πειραματικώς προκληθείσα φλεγμονή. Το βέλος υποδεικνύει τη φλεγμαίνουσα περιοχή, ενώ ο απλός κύκλος την αντίστοιχη περιοχή αναφοράς.

149

150

Γ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Ο θύμος αδένας, ως πρωτογενές λεμφικό όργανο, διαδραματίζει κυρίαρχο ρόλο στην φυσιολογική ανάπτυξη και εύρυθμη λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήματος. Το πρώτο βιολογικά ενεργό εκχύλισμα που απομονώθηκε από θύμο αδένα ήταν στα μέσα της δεκαετίας του 1960, το έκτοτε αποκαλούμενο «θυμοσινικό κλάσμα 5» (TFV) [4]. Η κλασμάτωση του TFV οδήγησε στην απομόνωση και παραλαβή μιας σειράς ανοσοδραστικών πεπτιδίων και πολυπεπτιδίων, που με κριτήριο το ισοηλεκτρικό τους σημείο ονομάστηκαν α-, β- και γ-θυμοσίνες. Η οικογένεια των α-θυμοσινών, με pI < 5, εκπροσωπείται κυρίως από την Θυμοσίνη α1 (Τα1) και την Προθυμοσίνη α (ΠροΤα).

Τόσο η ΠροΤα όσο και το Ν-τελικό 28μερές της πεπτίδιο -ταυτόσημο με την Τα1- έχουν αναμφισβήτητα επιδείξει σημαντική εξωκυτταρική ανοσοενισχυτική δράση σε διάφορα in vitro και in vivo συστήματα. Οι δράσεις αυτές προϋποθέτουν ότι τα (πολυ)πεπτίδια αυτά, με κάποιο τρόπο, έχουν την δυνατότητα να επηρεάζουν τις ενδοκυτταρικές λειτουργίες των κυττάρων- στόχων, π.χ. επάγοντας την επιφανειακή έκφραση υποδοχέων κυτταροκινών, μέσω αλληλεπίδρασης των πεπτιδίων με φορτισμένες μεμβράνες ή μέσω σηματοδότησης έπειτα από πρόσδεσή τους σε κυτταρικούς υποδοχείς π.χ. τους υποδοχείς τύπου Toll.

Την τελευταία δεκαετία, βιβλιογραφικά δεδομένα αναφέρουν ότι η ΠροΤα ασκεί την ανοσοενισχυτική της δράση σε μακροφάγα ποντικού και ανθρώπινα δενδριτικά κύτταρα συσχετιζόμενη με τον υποδοχέα TLR4, σε αντίθεση με την Τα1 η οποία έχει αναφερθεί να ενεργοποιεί μονοπάτια ανοσολογικής αντίστασης ενάντια σε μυκητιασικές μολύνσεις, εμπλέκοντας κυρίως τον υποδοχέα TLR9 [64]. Παρ’ όλες τις μέχρι σήμερα δημοσιευμένες μελέτες, ο μοριακός μηχανισμός της εξωκυτταρικής δράσης της ΠροΤα δεν έχει ακόμα διασαφηνιστεί. Ένα δεύτερο σημείο που παραμένει ακόμα αδιευκρίνιστο είναι η ταυτοποίηση του ή των ανοσοδραστικών τμημάτων που εδράζονται στο μόριο της ΠροΤα. Ως προς το τελευταίο σημείο, ενώ αρχικά η Τα1 θεωρήθηκε ως το ανοσοδραστικό τμήμα του πολυπεπτιδίου [9], πολύ πρόσφατες μελέτες

151

υποστηρίζουν ότι η ΠροΤα ασκεί τον ανοσορυθμιστικό της ρόλο μέσω διαφορετικών τμημάτων του μορίου της, όπως μέσω της πολύ όξινης κεντρικής περιοχής [51-89] [65] ή μέσω του C-τελικού δεκαπεπτιδίου της [100-109] [99].

Ραδιοεπισημασμένοι ιχνηθέτες έχουν χρησιμοποιηθεί κατά παράδοση στην μελέτη πιθανών θέσεων πρόσδεσης των α-θυμοσινών στην επιφάνεια υποπληθυσμών του ανοσοποιητικού συστήματος. Χαρακτηριστικά, στα μέσα της δεκαετίας του 1990, τόσο η ΠροΤα όσο και η Τα1 αλλά και ένα πεπτίδιο που καλύπτει την κοινή τους αλληλουχία [16-23] φάνηκαν να ανταγωνίζονται με ραδιοιωδιωμένη (125Ι) ανθρώπινη ιντερφερόνη α2 για πρόσδεση στις ίδιες θέσεις δέσμευσης στην επιφάνεια θυμοκυττάρων ποντικού [100]. Παράλληλα, την ίδια περίοδο, ραδιοιωδιωμένη (125Ι) ΠροΤα χρησιμοποιήθηκε σε κυτταρικές μελέτες δέσμευσης σε ανθρώπινα μονοπύρηνα περιφερικού αίματος [62] αλλά και σε δύο λεμφοκυτταρικούς πληθυσμούς - σε ανθρώπινους λεμφοβλάστες και σε ΥΤ κύτταρα [101]. Οι μελέτες αυτές αποκάλυψαν δύο τύπους επιφανειακών θέσεων πρόσδεσης για την ΠροΤα, έναν χαμηλής και έναν υψηλής συγγένειας. Αδυναμία ανταγωνισμού μεταξύ ραδιοιωδιωμένης ΠροΤα και μη επισημασμένης Τα1 σε αυτά τα συστήματα ενίσχυσαν την υπόθεση ότι οι συγκεκριμένες θέσεις δέσμευσης είναι ειδικές για την ΠροΤα [63].

Στην παρούσα διατριβή, ένα νέο, ραδιοεπισημασμένο με 99mTc, παράγωγο του C-τελικού δεκαπεπτιδίου της ΠροΤα ([99mTc]ΠροΤα-D1) αναπτύχθηκε και αξιολογήθηκε, εν αρχή έμμεσα, ως προς την ανοσοενισχυτική του δραστικότητα σε κυτταρικό σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων. Πιο συγκεκριμένα, το νέο παράγωγο (ΠροΤα-D1) αφότου συμπλέχθηκε με μη ραδιοενεργό 185/187Re ([Re]ΠροΤα-D1]) κατά πάγια τακτική της βιβλιογραφίας, αξιολογήθηκε in vitro αντί του ραδιοεπισημασμένου αναλόγου του ([99mTc]ΠροΤα-D1) και βρέθηκε να διατηρεί την ανοσοενισχυτική δραστικότητα του καρβοξυτελικού θραύσματος ΠροΤα[100-109]. Το αποτέλεσμα αυτό εξασφάλισε την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που ελήφθησαν με την χρήση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 στις μετέπειτα in vitro μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσης στον ίδιο πληθυσμό κυττάρων του

152

ανοσοποιητικού συστήματος αλλά και in vivo μελέτες βιοκατανομής και μοριακής απεικόνισης.

Τα ανθρώπινα ουδετερόφιλα επιλέχθηκαν ως κυτταρικό σύστημα για την διεξαγωγή τόσο των πειραμάτων βιολογικής αξιολόγησης όσο και για τις μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσης, με βάση προγενέστερο εύρημα σύμφωνα με το οποίο οι λειτουργίες αυτών των κυττάρων επηρεάζονται από εξωγενώς χορηγούμενη ΠροΤα [59,60]. Επιπροσθέτως, τα ουδετερόφιλα εκφράζουν όλους τους υποδοχείς TLRs, συμπεριλαμβανομένου του TLR4, εκτός από τον TLR3 [94]. Τέλος, τα ουδετερόφιλα μπορούν να απομονωθούν εύκολα από ανθρώπινο περιφερικό αίμα και κυρίως σε επαρκείς ποσότητες, στοιχείο απαραίτητο για την διεξαγωγή των πειραμάτων μας.

Το παράγωγο [Re]ΠροΤα-D1 αξιολογήθηκε ανοσολογικά, παράλληλα με το ακέραιο μόριο της ΠροΤα, το καρβοξυτελικό δεκαπεπτίδιο ΠροΤα[100-109], τα δύο αμινοτελικά τμήματα ΠροΤα[1-14] και Τα1 και την κεντρική περιοχή του πολυπεπτιδίου ΠροΤα[51-89]. Από όσο είμαστε σε θέση να γνωρίζουμε, η ταυτόχρονη αξιολόγηση ολόκληρου του μορίου της ΠροΤα, του τμήματος ΠροΤα[100-109], της Τα1 και του κεντρικού τμήματος ΠροΤα[51-89] στην ίδια δοκιμασία πραγματοποιείται για πρώτη φορά. Όπως παρουσιάζεται στα Σχήματα 5.4 και 5.5 και σε συμφωνία με πρόσφατα δημοσιευμένες μελέτες [60], το τμήμα ΠροΤα[100-109] (δοκιμαζόμενο σε συγκέντρωση 25 ng/mL ή ~ 20 nM) βρέθηκε εξίσου δραστικό με το ακέραιο μόριο της ΠροΤα (δοκιμαζόμενο σε συγκέντρωση 200 ng/mL ή ~ 17 nM) ως προς την ικανότητά του να διεγείρει την παραγωγή ενεργών ριζών οξυγόνου (ROS) σε ανθρώπινα ουδετερόφιλα. Η Τα1 (δοκιμαζόμενη σε συγκέντρωση 50 ng/mL ή ~ 16 nM) φάνηκε λιγότερο δραστική από τα προαναφερθέντα πεπτίδια, επάγοντας ωστόσο στατιστικά σημαντική ανοσοενισχυτική δράση στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα. Από την άλλη μεριά, το κεντρικό τμήμα του πολυπεπτιδίου της ΠροΤα δεν έδειξε δραστικότητα, ακόμη και όταν δοκιμάστηκαν πολύ υψηλές συγκεντρώσεις του (800 ng/mL ή ~ 180 nM), αποτέλεσμα το οποίο συμφωνεί με προγενέστερα ευρήματα σύμφωνα με τα οποία επώαση PBMC κυττάρων με το τμήμα ΠροΤα[31-87] -ένα πεπτιδικό θραύσμα που παραλαμβάνεται έπειτα από θρυψινοποίηση της ΠροΤα και που η αλληλουχία του αλληλεπικαλύπτεται κατά το μεγαλύτερο μέρος με αυτήν του συνθετικού μας

153

πεπτιδίου ΠροΤα[51-89] - οριακά ενίσχυσε τις λειτουργίες των κυττάρων αυτών.

Εν συνεχεία, το σύμπλοκο [Re]ΠροΤα-D1 αξιολογήθηκε σε δεύτερο επίπεδο ως προς την επίδραση που ασκεί στην κινητική έκφρασης του υποδοχέα TLR4 -του πιθανολογούμενου για την ΠροΤα υποδοχέα- στην επιφάνεια των ανθρώπινων ουδετερόφιλων, παράλληλα με την ΠροΤα και τα επιμέρους συνθετικά πεπτιδικά της τμήματα, και συγκριτικά με τον «πρότυπο» προσδέτη του υποδοχέα TLR4 - τον λιποπολυσακχαρίτη LPS. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι το ψυχρό παράγωγο [Re]ΠροΤα-D1 αυξάνει τα επίπεδα έκφρασης του υποδοχέα TLR4 στην επιφάνεια ανθρώπινων ουδετερόφιλων, ακολουθώντας παρόμοιο πρότυπο επίδρασης με εκείνο που εγείρει ο LPS, ολόκληρη η ΠροΤα και το C-τελικό πεπτίδιο ΠροΤα[100-109]. Αυτό το εύρημα ενισχύει περαιτέρω την καταλληλότητα του ραδιοεπισημασμένου ανάλογου [99mTc]ΠροΤα-D1, για διεξαγωγή μελετών κυτταρικής δέσμευσης. Όπως ήταν αναμενόμενο, η Τα1 δεν φάνηκε να επηρεάζει την έκφραση του TLR4, συνηγορώντας στις ήδη δημοσιευμένες μελέτες οι οποίες δεν συσχετίζουν την δράση της Τα1 με αυτό τον υποδοχέα. Ενδιαφέρον εύρημα αποτέλεσε το γεγονός ότι το κεντρικό θραύσμα ΠροΤα[51-89] δεν φάνηκε να επηρεάζει καθόλου την έκφραση του TLR4, παρόλο που πολύ πρόσφατα δημοσιευμένη μελέτη συσχέτισε αυτή την περιοχή της ΠροΤα με τον υποδοχέα TLR4 [65].

Μετά την λεπτομερή βιολογική αξιολόγηση του μη ραδιενεργού συμπλόκου [Re]ΠροΤα-D1, ακολούθησε σύμπλεξη του παραγώγου ΠροΤα-D1, και παράλληλα του παραγώγου ΠροΤα-D2, με το ραδιενεργό ισότοπο του τεχνητίου, 99mTc, και η ολοκλήρωση των συμπλέξεων ελέγχθηκε σε αναλυτική radio-HPLC. Οι αντιδράσεις σύμπλεξης και στις δύο περιπτώσεις ήταν ποσοτικές (>95 %), χωρίς να συνοδεύονται από δημιουργία κολλοειδών του τεχνητίου. Ακολούθως, διεξήχθησαν οι απαραίτητες in vitro μελέτες ελέγχου σταθερότητας των ραδιοεπισημασμένων συμπλόκων [99mTc]ΠροΤα-D1 και [99mTc]ΠροΤα-D2, τόσο στο μίγμα της επισήμανσής τους ή μετά από απομόνωσή τους με radio-HPLC συναρτήσει του χρόνου όσο και παρουσία περίσσειας κυστεΐνης, η οποία αποτελεί «πρότυπο» ανταγωνιστή σύμπλεξης του τεχνητίου (V). Από τα πειράματα αυτά φάνηκε ότι η επισήμανση των παραγώγων της ΠροΤα με 99mTc οδήγησε στην παραλαβή

154

ραδιοεπισημασμένων ιχνηθετών σταθερών για τουλάχιστον 24 ώρες στο μίγμα της επισήμανσής τους, με υψηλή ειδική ραδιενέργεια και ικανοποιητικό

χρόνο ημιζωής (t1/2=6.01 h), χαρακτηριστικά που εγγυώνται την καταλληλότητά τους για την διεξαγωγή in vitro μελετών κυτταρικής δέσμευσης αλλά και in vivo μελετών βιοκατανομής και μοριακής απεικόνισης.

Την παραλαβή του ραδιοϊχνηθέτη [99mTc]ΠροΤα-D1 ακολούθησαν in vitro μελέτες άμεσης κυτταρικής δέσμευσής του, χρησιμοποιώντας και πάλι κυτταρικό σύστημα ανθρώπινων ουδετερόφιλων. Κάτω από τις συνθήκες που εφαρμόστηκαν στις παρούσες μελέτες δεν ήταν εφικτή η διάκριση μεταξύ μετρούμενης ραδιενέργειας λόγω πρόσδεσης του ραδιοϊχνηθέτη στην πλασματική μεμβράνη των ουδετερόφιλων και ραδιενέργειας λόγω εσωτερικοποίησης του ραδιοϊχνηθέτη στα κύτταρα. Ωστόσο, μια τέτοια διάκριση ήταν πέραν του σκοπού της παρούσας μελέτης. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν κατέδειξαν εξειδικευμένη και χρονοεξαρτώμενη δέσμευση του παραγώγου της ΠροΤα στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, η οποία υπόκειται σε κορεσμό. Επακόλουθες μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης έδειξαν ότι η πρόσδεση του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα στα ουδετερόφιλα αναστέλλεται παρουσία αυξανόμενων συγκεντρώσεων ψυχρής ΠροΤα και ΠροΤα[100-109], αλλά όχι παρουσία της Τα1 ή του ΠροΤα[51-89] (Σχήμα 5.12). Μάλιστα για ολόκληρη την ΠροΤα υπολογίστηκε χαμηλότερη

τιμή IC50 συγκριτικά με εκείνη του ΠροΤα[100-109], γεγονός το οποίο δηλώνει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης ολόκληρου του πολυπεπτιδίου στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα. Παράλληλες μελέτες ανταγωνιστικής δέσμευσης χρησιμοποιώντας ψυχρό LPS, τον πρότυπο TLR4 προσδέτη, παρεμπόδισαν την πρόσδεση του ραδιενεργού παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 στην επιφάνεια των ουδετερόφιλων. Αποτιμώντας συνολικά τα αποτελέσματα των in vitro μελετών κυτταρικής δέσμευσης, τα ευρήματά μας υποστηρίζουν για πρώτη φορά την ύπαρξη θέσεων πρόσδεσης για την ΠροΤα στα ανθρώπινα ουδετερόφιλα, οι οποίες αναγνωρίζουν το ραδιοεπισημασμένο παράγωγο [99mTc]ΠροΤα-D1 και το C-τελικό δεκαπεπτίδιο ΠροΤα[100-109]. Προτείνουμε ότι αυτές οι θέσεις πρόσδεσης σχετίζονται με τον υποδοχέα TLR4, μέσω του οποίου η ΠροΤα, το ΠροΤα[100-109] και επίσης το ψυχρό σύμπλοκο

155

[Re]ΠροΤα-D1 ασκούν την βιολογική τους δράση, όπως φάνηκε με τις μελέτες in vitro βιολογικής αξιολόγησης που προηγήθηκαν.

Συνδυάζοντας τα αποτελέσματα των in vitro μελετών κυτταρικής δέσμευσης του ραδιοιχνηθέτη [99mTc]ΠροΤα-D1 σε ουδετερόφιλα περιφερικού αίματος με την παγιωμένη πια γνώση ότι τα ουδετερόφιλα αποτελούν τον κυρίαρχο πληθυσμό κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος που ενεργοποιούνται σε περιπτώσεις οξείας φλεγμονής, μεταναστεύουν στις εστίες της φλεγμονής και ενορχηστρώνουν την όλη απόκριση του οργανισμού, τέθηκε ως στόχος η διερεύνηση της ικανότητας του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα [99mTc]ΠροΤα-D1, να εντοπίζει in vivo εστίες φλεγμονής. Για το σκοπό αυτό, σχεδιάστηκαν και πραγματοποιήθηκαν in vivo μελέτες βιοκατανομής του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 σε μοντέλο φλεγμονής. Ως πειραματόζωα επιλέχθησαν νεαροί ποντικοί της φυλής Swiss albino, οι οποίοι έφεραν πειραματικώς προκληθείσα εντοπισμένη φλεγμονή μέσω ενδομυικής χορήγησης τερεβινθελαίου. Τα αποτελέσματα των in vivo μελετών βιοκατανομής έδωσαν πολύ σημαντικές πληροφορίες, όπως χαρακτηριστικά της πορείας που ακολουθεί η ραδιενέργεια μετά την in vivo χορήγηση του παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 και την οδό απέκκρισης από τον οργανισμό, αλλά κυρίως κατεδειξαν την ικανότητα του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου της ΠροΤα να στοχεύει in vivo εστίες φλεγμονής. Προκειμένου να συγκεντρωθούν επιπλέον ενδείξεις ότι η στόχευση αυτή της φλεγμαίνουσας περιοχής είναι ειδική και οφείλεται στο C-τελικό δραστικό δεκαπεπτίδιο της ΠροΤα ΠροΤα[100-109], υποβλήθηκε στις ίδιες μελέτες βιοκατανομής το ραδιοεπισημασμένο παράγωγο [99mTc]ΠροΤα-D2, το οποίο εξ αρχής σχεδιάστηκε ώστε να χρησιμοποιηθεί ως αρνητικός μάρτυρας του [99mTc]ΠροΤα-D1. Πράγματι, η υπόθεση περί εξειδικευμένης στόχευσης της φλεγμονής μέσω του πεπτιδικού τμήματος ΠροΤα[100-109] στηρίζεται πλήρως από τα αποτελέσματα που ελήφθησαν με τον αρνητικό μάρτυρα.

Τέλος, εκμεταλλευόμενοι την ευρεία χρήση του ραδιοϊσοτόπου 99mTc στη Ραδιοφαρμακευτική και την ύπαρξη πληθώρας απεικονιστικών διατάξεων, πραγματοποιήθηκε δυναμική απεικόνιση της in vivo πορείας του ραδιοεπισημασμένου παραγώγου [99mTc]ΠροΤα-D1 στο υπό μελέτη μοντέλο φλεγμονής με χρήση SPECT μικροκάμερας, ειδικά σχεδιασμένης για

156

ολόσωμη απεικόνιση μικρών ζώων. Οι δυναμικές εικόνες που ελήφθησαν επιβεβαίωσαν, με μη επεμβατικό τρόπο, τα αποτελέσματα των βιοκατανομών και έτσι για πρώτη φορά υποδηλώνεται η δυνατότητα του πλέον ανοσοδραστικού τμήματος της ΠροΤα, ΠροΤα[100-109], να αξιοποιηθεί διαγνωστικά ως απεικονιστικός παράγοντας της φλεγμονής.

Όπως προαναφέρθηκε, παλαιότερες μελέτες με χρήση ραδιοεπισημασμένων παραγώγων των α-θυμοσινών αφορούσαν αποκλειστικά σε ιωδιωμένους (125I) ιχνηθέτες. Η ερευνητική μας ομάδα ήταν αυτή που για πρώτη φορά στράφηκε στη χρήση του τεχνητίου-99m, αναπτύσοντας ένα ραδιοεπισημασμένο με 99mTc παράγωγο του Ν-τελικού τμήματος ΠροΤα/Τα1[1-14] και προχωρώντας σε δομικές μελέτες του συμπλόκου αλλά και σε μια προκαταρκτική in vivo βιολογική του αξιολόγηση [68]. Στην παρούσα διατριβή, προχωρήσαμε στον σχεδιασμό και την ανάπτυξη ενός ραδιοεπισημασμένου με 99mTc παραγώγου του C-τελικού δεκαπεπτιδίου της ΠροΤα, ΠροΤα[100-109], το οποίο θεωρείται/είναι πιο ειδικό για την μελέτη της δραστικότητας και του ρόλου του μητρικού πολυπεπτιδίου δεδομένου ότι η αλληλουχία του δεν επικαλύπτεται με εκείνη της Τα1/ΠροΤα[1-28]. Επιπλέον, το θραύσμα ΠροΤα[100-109] έχει αναφερθεί στην βιβλιογραφία ως το πλέον ανοσοδραστικό τμήμα του μορίου της ΠροΤα, εύρημα το οποίο επιβεβαιώνεται και από τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής.

Εν κατακλείδι, τα ευρήματα των μελετών της παρούσας διατριβής πρώτον, αποτελούν αξιόλογη συμβολή στην, εδώ και πολλά χρόνια, προσπάθεια διασαφήνισης του πλειοτροπικού εξωκυτταρικού τρόπου δράσης της ΠροΤα και δεύτερον, θα διευκολύνουν μια μελλοντικά κλινική αξιοποίηση του ακέραιου πολυπεπτιδίου (μήκος 109 αμινοξέα) ή και κάποιου μικρότερου εξίσου δραστικού του τμήματος, όπως το δεκαπεπτίδιο ΠροΤα[100-109] ή συναφές μη πεπτιδικό ανάλογο, τα οποία είναι εύκολο να συντεθούν και τα οποία λόγω του μικρού τους μεγέθους παρουσιάζουν επιθυμητά φαρμακοκινητικά χαρακτηριστικά.

157

158

Δ. ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ

99mTc 99m(metastable) Technetium

AIM2LR Absence in Melanoma 2-Like Receptors

CAMs Cell-Adhension Molecules

CD Circular dichroism

CLRs C-type Lectin Receptors

Da Dalton

DAMPs Damage-Associated Molecular Patterns

DCM Dichloromethane

DIC N,N’-diisopropylcarbodiimide

DIEA Diisopropylethylamine

DMF N,N’-dimethylformamide

EDT Ethanodithiole

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

Eq Equivalent

ESI-MS ElectroSpray Ionization-Mass Spectrometry

FC Flow cytometry fMLP Formylated-Methionine-Leucine-Phenylalanine

Fmoc 9-fluorenylmethoxycarbonyl

HIV Human Immunodeficiency Virus

HLA Human Leukocyte Antigen

HSP90 Heat Shock Protein 90

HST Hematopoietic stem cells

IFN-γ Interferon-gamma

IL-2 Interleukine-2

159

IR Infrared

LAK Lymphokine Activated Killer

LPS Lipopolysaccharide

LTR Long Terminal Repeat

M Molarity mL Millilitre

MLR Mixed Leukocyte Reaction mRNA Messenger RNA

MW Molecular weight

NBT Nitroblue Tetrazolium

NCP Negative control peptide

NETs Neutrophil Extracellular Traps

NK Natural killer

NLRs Nod-Like Receptors

NLS Nuclear localization sequence nM Nanomolar nm nanometres

NMR Nuclear magnetic resonance oxyma Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate

PAMPS Pathogen Associated Molecular Patterns

PBMCs Peripheral Blood Mononuclear Cells

PDA Photodiode array

PEG Polyethylene glycol

PFA Paraformaldheyde pI Point isoelectrical

ProTα Prothymosin α

160

PRRs Pattern Recognition Receptors

PS Polystyrol

RIG Rig-Like Receptors

Reversed-phase high performance liquid RP-HPLC chromatography

ROS Reactive oxygene species

SPPS Solid-phase peptide synthesis

TF5 Thymosin Fraction 5

TFA Trifluroacetic Acid

TIS Triisopropyl-silane

TLRs Toll-like Receptors

TNF-α Tumor Necrosis Factor-α

Tα1 Thymosin α1

UV Ultraviolet

161

162

Ε.ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Γενική βιβλιογραφία

1. Goldsby R, Kindt T, Osborne B, Kuby J. Aνοσολογία (Πέμπτη έκδοση), Ιατρικές Εκδόσεις Π.Χ. Πασχαλίδης, Αθήνα 2007

2. Roit I, Brostoff J, Male D. Immunology (Fourth edition)

3. Roos D. Neutrophils, Encyclopedia of Immunology (1992)

4. Χιωτέλλης Ε. Ραδιοφαρμακευτική Χημεία, Εκδόσεις Πήγασος (2004).

Ειδική βιβλιογραφία

[1] G.Y. Chen, G. Nunez, Sterile inflammation: sensing and reacting to damage, Nat Rev Immunol 10 (2010) 826-837. [2] K.L. Rock, E. Latz, F. Ontiveros, H. Kono, The sterile inflammatory response, Annu Rev Immunol 28 (2010) 321-342. [3] E. Kolaczkowska, P. Kubes, Neutrophil recruitment and function in health and inflammation, Nat Rev Immunol 13 (2013) 159-175. [4] A.L. Goldstein, F.D. Slater, A. White, Preparation, assay, and partial purification of a thymic lymphocytopoietic factor (thymosin), Proc Natl Acad Sci U S A 56 (1966) 1010-1017. [5] A.L. Goldstein, A. Guha, M.M. Zatz, M.A. Hardy, A. White, Purification and biological activity of thymosin, a hormone of the thymus gland, Proc Natl Acad Sci U S A 69 (1972) 1800-1803. [6] T.L. Low, A.L. Goldstein, Thymic hormones: an overview, Methods Enzymol 116 (1985) 213-219. [7] A.L. Goldstein, T.L. Low, M. McAdoo, J. McClure, G.B. Thurman, J. Rossio, C.Y. Lai, D. Chang, S.S. Wang, C. Harvey, A.H. Ramel, J. Meienhofer, Thymosin alpha1: isolation and sequence analysis of an immunologically active thymic polypeptide, Proc Natl Acad Sci U S A 74 (1977) 725-729.

163

[8] J. Caldarella, G.J. Goodall, A.M. Felix, E.P. Heimer, S.B. Salvin, B.L. Horecker, Thymosin alpha 11: a peptide related to thymosin alpha 1 isolated from calf thymosin fraction 5, Proc Natl Acad Sci U S A 80 (1983) 7424-7427. [9] A.A. Haritos, G.J. Goodall, B.L. Horecker, Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus, Proc Natl Acad Sci U S A 81 (1984) 1008-1011. [10] A.A. Haritos, O. Tsolas, B.L. Horecker, Distribution of prothymosin alpha in rat tissues, Proc Natl Acad Sci U S A 81 (1984) 1391-1393. [11] W.H. Eschenfeldt, S.L. Berger, The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA, Proc Natl Acad Sci U S A 83 (1986) 9403-9407. [12] O.E. Tsitsiloni, J. Stiakakis, A. Koutselinis, J. Gogas, C. Markopoulos, P. Yialouris, S. Bekris, D. Panoussopoulos, V. Kiortsis, W. Voelter, et al., Expression of alpha-thymosins in human tissues in normal and abnormal growth, Proc Natl Acad Sci U S A 90 (1993) 9504-9507. [13] M. Economou, K. Seferiadis, M. Frangou-Lazaridis, B.L. Horecker, O. Tsolas, Isolation and partial characterization of prothymosin alpha from porcine tissues, FEBS Lett 233 (1988) 342-346. [14] S. Frillingos, M. Frangou-Lazaridis, K. Seferiadis, J.D. Hulmes, Y.C. Pan, O. Tsolas, Isolation and partial sequence of goat spleen prothymosin alpha, Mol Cell Biochem 108 (1991) 85-94. [15] P.P. Yialouris, G.P. Evangelatos, C. Soteriadis-Vlahos, E.P. Heimer, A.M. Felix, O.E. Tsitsiloni, A.A. Haritos, The identification of prothymosin alpha-like material in vertebrate lymphoid organs by a radioimmunoassay for the N-terminal decapeptide, J Immunol Methods 106 (1988) 267-275. [16] T. Makarova, N. Grebenshikov, C. Egorov, A. Vartapetian, A. Bogdanov, Prothymosin alpha is an evolutionary conserved protein covalently linked to a small RNA, FEBS Lett 257 (1989) 247-250. [17] A. Vartapetian, N. Chichkova, I. Lyakhov, T. Makarova, A. Evstafieva, A. Bogdanov, Segments of Escherichia coli genome similar to the exons of human prothymosin alpha gene, FEBS Lett 313 (1992) 95-97.

164

[18] M.W. Trumbore, R.E. Manrow, S.L. Berger, Prothymosin alpha is not found in yeast, Protein Expr Purif 13 (1998) 383-388. [19] F. Aniello, M. Branno, G. De Rienzo, D. Ferrara, C. Palmiero, S. Minucci, First evidence of prothymosin alpha in a non-mammalian vertebrate and its involvement in the spermatogenesis of the frog Rana esculenta, Mech Dev 110 (2002) 213-217. [20] E. Hannappel, T. Huff, The thymosins. Prothymosin alpha, parathymosin, and beta-thymosins: structure and function, Vitam Horm 66 (2003) 257- 296. [21] M.D. Adams, A.R. Kerlavage, R.D. Fleischmann, R.A. Fuldner, C.J. Bult, N.H. Lee, E.F. Kirkness, K.G. Weinstock, J.D. Gocayne, O. White, et al., Initial assessment of human gene diversity and expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequence, Nature 377 (1995) 3-174. [22] A.A. Haritos, R. Blacher, S. Stein, J. Caldarella, B.L. Horecker, Primary structure of rat thymus prothymosin alpha, Proc Natl Acad Sci U S A 82 (1985) 343-346. [23] L.X. Pan, A.A. Haritos, J. Wideman, T. Komiyama, M. Chang, S. Stein, S.B. Salvin, B.L. Horecker, Human prothymosin alpha: amino acid sequence and immunologic properties, Arch Biochem Biophys 250 (1986) 197-201. [24] C. Panneerselvam, D. Wellner, B.L. Horecker, The amino acid sequence of bovine thymus prothymosin alpha, Arch Biochem Biophys 265 (1988) 454-457. [25] T.L. Low, T.L. Pan, Y.S. Lin, Depression of prothymosin alpha production in murine thymus correlates with staphylococcal enterotoxin-B-induced immunosuppression [corrected], FEBS Lett 273 (1990) 1-5. [26] G.J. Goodall, F. Dominguez, B.L. Horecker, Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha, Proc Natl Acad Sci U S A 83 (1986) 8926-8928. [27] M. Frangou-Lazaridis, M. Clinton, G.J. Goodall, B.L. Horecker, Prothymosin alpha and parathymosin: amino acid sequences deduced from the cloned rat spleen cDNAs, Arch Biochem Biophys 263 (1988) 305-310. 165

[28] G. Schmidt, D. Werner, Nucleotide sequence of the murine prothymosin alpha cDNA and its deduced primary and secondary protein structure, Biochim Biophys Acta 1088 (1991) 442-444. [29] A.K. Wintero, M. Fredholm, W. Davies, Evaluation and characterization of a porcine small intestine cDNA library: analysis of 839 clones, Mamm Genome 7 (1996) 509-517. [30] J. Gomez-Marquez, F. Segade, Prothymosin alpha is a nuclear protein, FEBS Lett 226 (1988) 217-219. [31] R.E. Manrow, A.R. Sburlati, J.A. Hanover, S.L. Berger, Nuclear targeting of prothymosin alpha, J Biol Chem 266 (1991) 3916-3924. [32] Y.P. Rubtsov, A.S. Zolotukhin, I.A. Vorobjev, N.V. Chichkova, N.A. Pavlov, E.M. Karger, A.G. Evstafieva, B.K. Felber, A.B. Vartapetian, Mutational analysis of human prothymosin alpha reveals a bipartite nuclear localization signal, FEBS Lett 413 (1997) 135-141. [33] M.G. Barcia, J.M. Castro, C.D. Jullien, C.G. Gonzalez, M. Freire, Prothymosin alpha is phosphorylated by casein kinase-2, FEBS Lett 312 (1992) 152-156. [34] J.D. Watts, P.D. Cary, P. Sautiere, C. Crane-Robinson, Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins, Eur J Biochem 192 (1990) 643-651. [35] N.A. Pavlov, D.I. Cherny, G. Heim, T.M. Jovin, V. Subramaniam, Amyloid fibrils from the mammalian protein prothymosin alpha, FEBS Lett 517 (2002) 37-40. [36] P. Klimentzou, A. Drougou, B. Fehrenbacher, M. Schaller, W. Voelter, C. Barbatis, M. Paravatou-Petsotas, E. Livaniou, Immunocytological and preliminary immunohistochemical studies of prothymosin alpha, a human cancer-associated polypeptide, with a well-characterized polyclonal antibody, J Histochem Cytochem 56 (2008) 1023-1031. [37] F.J. Franco, C. Diaz, M. Barcia, M. Freire, Thymosin alpha 1 is a native peptide in several tissues, Biochim Biophys Acta 1120 (1992) 43-48. [38] C. Panneerselvam, A.A. Haritos, J. Caldarella, B.L. Horecker, Prothymosin alpha in human blood, Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987) 4465-4469.

166

[39] C.N. Conteas, M.G. Mutchnick, K.C. Palmer, F.E. Weller, G.D. Luk, P.H. Naylor, M.R. Erdos, A.L. Goldstein, C. Panneerselvam, B.L. Horecker, Cellular levels of thymosin immunoreactive peptides are linked to proliferative events: evidence for a nuclear site of action, Proc Natl Acad Sci U S A 87 (1990) 3269-3273. [40] A. Vartapetian, D. Lukashev, I. Lyakhov, A. Belyaeva, N. Chichkova, A. Bogdanov, Mammalian prothymosin alpha links to tRNA in Escherichia coli cells, RNA 3 (1997) 1173-1181. [41] C. Auger, C. Stahli, N. Fabien, J.C. Monier, Intracellular localization of thymosin alpha 1 by immunoelectron microscopy using a monoclonal antibody, J Histochem Cytochem 35 (1987) 181-187. [42] N. Fabien, C. Auger, J.C. Monier, Immunolocalization of thymosin alpha 1, thymopoietin and thymulin in mouse thymic epithelial cells at different stages of culture: a light and electron microscopic study, Immunology 63 (1988) 721-727. [43] K. Vareli, M. Frangou-Lazaridis, Prothymosin alpha is localized in mitotic spindle during mitosis, Biol Cell 96 (2004) 421-428. [44] M. Clinton, L. Graeve, H. el-Dorry, E. Rodriguez-Boulan, B.L. Horecker, Evidence for nuclear targeting of prothymosin and parathymosin synthesized in situ, Proc Natl Acad Sci U S A 88 (1991) 6608-6612. [45] J. Freire, G. Covelo, C. Sarandeses, C. Diaz-Jullien, M. Freire, Identification of nuclear-import and cell-cycle regulatory proteins that bind to prothymosin alpha, Biochem Cell Biol 79 (2001) 123-131. [46] S. Kubota, Y. Adachi, T.D. Copeland, S. Oroszlan, Binding of human prothymosin alpha to the leucine-motif/activation domains of HTLV-I Rex and HIV-1 Rev, Eur J Biochem 233 (1995) 48-54. [47] W.H. Eschenfeldt, R.E. Manrow, M.S. Krug, S.L. Berger, Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family. Evidence against export of the gene products, J Biol Chem 264 (1989) 7546-7555. [48] N. Pavlov, A. Evstafieva, Y. Rubtsov, A. Vartapetian, Human prothymosin alpha inhibits division of yeast Saccharomyces cerevisiae cells, while its mutant lacking nuclear localization signal does not, FEBS Lett 366 (1995) 43-45. 167

[49] S.B. Salvin, B.L. Horecker, L.X. Pan, B.S. Rabin, The effect of dietary zinc and prothymosin alpha on cellular immune responses of RF/J mice, Clin Immunol Immunopathol 43 (1987) 281-288. [50] M. Papanastasiou, C.N. Baxevanis, M. Papamichail, Promotion of murine antitumor activity by prothymosin alpha treatment: I. Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels of tumour necrosis factor alpha, Cancer Immunol Immunother 35 (1992) 145-150. [51] C.N. Baxevanis, A.D. Gritzapis, G.V. Dedoussis, N.G. Papadopoulos, O. Tsolas, M. Papamichail, Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha, Cancer Immunol Immunother 38 (1994) 281-286. [52] C.N. Baxevanis, G.J. Reclos, C. Panneerselvam, M. Papamichail, Enhancement of human T lymphocyte functions by prothymosin alpha. I. Augmentation of mixed lymphocyte culture reactions and soluble protein-induced proliferative responses, Immunopharmacology 15 (1988) 73-84. [53] O.J. Cordero, C.S. Sarandeses, M. Nogueira, Phytohemagglutin- stimulated human T cell: prothymosin alpha as an accessory signal, J Biol Regul Homeost Agents 4 (1990) 7-12. [54] C.N. Baxevanis, G.J. Reclos, M. Papamichail, G.C. Tsokos, Prothymosin alpha restores the depressed autologous and allogeneic mixed lymphocyte responses in patients with systemic lupus erythematosus, Immunopharmacol Immunotoxicol 9 (1987) 429-440. [55] G.J. Reclos, C.N. Baxevanis, C. Sfagos, C. Papageorgiou, G.C. Tsokos, M. Papamichail, Multiple sclerosis: II. Effects of prothymosin alpha on the autologous and allogeneic MLR in patients with multiple sclerosis, Clin Exp Immunol 70 (1987) 336-344. [56] A. Mosoian, A. Teixeira, A.A. High, R.E. Christian, D.F. Hunt, J. Shabanowitz, X. Liu, M. Klotman, Novel function of prothymosin alpha as a potent inhibitor of human immunodeficiency virus type 1 gene expression in primary macrophages, J Virol 80 (2006) 9200-9206.

168

[57] C.N. Baxevanis, G.J. Reclos, M. Papamichail, Prothymosin alpha restores depressed allogeneic cell-mediated lympholysis and natural- killer-cell activity in patients with cancer, Int J Cancer 53 (1993) 264- 268. [58] M. Skopeliti, U. Kratzer, F. Altenberend, G. Panayotou, H. Kalbacher, S. Stevanovic, W. Voelter, O.E. Tsitsilonis, Proteomic exploitation on prothymosin alpha-induced mononuclear cell activation, Proteomics 7 (2007) 1814-1824. [59] H. Heidecke, K. Eckert, K. Schulze-Forster, H.R. Maurer, Prothymosin alpha 1 effects in vitro on chemotaxis, cytotoxicity and oxidative response of neutrophils from melanoma, colorectal and breast tumor patients, Int J Immunopharmacol 19 (1997) 413-420. [60] P. Samara, K. Ioannou, M. Neagu, N. Arnogiannaki, A. Ardavanis, W. Voelter, O. Tsitsilonis, The C-terminal decapeptide of prothymosin alpha is responsible for its stimulatory effect on the functions of human neutrophils in vitro, Int Immunopharmacol 15 (2013) 50-57. [61] M. Skopeliti, V.A. Iconomidou, E. Derhovanessian, G. Pawelec, W. Voelter, H. Kalbacher, S.J. Hamodrakas, O.E. Tsitsilonis, Prothymosin alpha immunoactive carboxyl-terminal peptide TKKQKTDEDD stimulates lymphocyte reactions, induces dendritic cell maturation and adopts a beta-sheet conformation in a sequence-specific manner, Mol Immunol 46 (2009) 784-792. [62] O.J. Cordero, C. Sarandeses, M. Nogueira, Prothymosin alpha receptors on peripheral blood mononuclear cells, FEBS Lett 341 (1994) 23-27. [63] O.J. Cordero, C.S. Sarandeses, M. Nogueira, Binding of 125I- prothymosin alpha to lymphoblasts through the non-thymosin alpha 1 sequence, Life Sci 58 (1996) 1757-1770. [64] L. Romani, F. Bistoni, R. Gaziano, S. Bozza, C. Montagnoli, K. Perruccio, L. Pitzurra, S. Bellocchio, A. Velardi, G. Rasi, P. Di Francesco, E. Garaci, Thymosin alpha 1 activates dendritic cells for antifungal Th1 resistance through toll-like receptor signaling, Blood 103 (2004) 4232- 4239.

169

[65] A. Mosoian, A. Teixeira, C.S. Burns, L.E. Sander, G.L. Gusella, C. He, J.M. Blander, P. Klotman, M.E. Klotman, Prothymosin-alpha inhibits HIV-1 via Toll-like receptor 4-mediated type I interferon induction, Proc Natl Acad Sci U S A 107 (2010) 10178-10183. [66] K. Ioannou, E. Derhovanessian, E. Tsakiri, P. Samara, H. Kalbacher, W. Voelter, I.P. Trougakos, G. Pawelec, O.E. Tsitsilonis, Prothymosin alpha and a prothymosin alpha-derived peptide enhance T(H)1-type immune responses against defined HER-2/neu epitopes, BMC Immunol 14 (2013) 43. [67] P. Klimentzou, A. Beck, A. Varvarigou, O. Tsitsilonis, W. Voelter, I. Pirmettis, M. Papadopoulos, E. Livaniou, C. Zikos, Solid-phase synthesis of a peptide derivative of thymosin alpha1 and initial studies on its (99m)Tc-radiolabelling, Chem Biol Drug Des 70 (2007) 40-46. [68] D. Benaki, C. Zikos, C.E. Karachaliou, O. Tsitsilonis, L. Leondiadis, H. Kalbacher, W. Voelter, M. Papadopoulos, I. Pirmettis, M. Pelecanou, E. Livaniou, Complexes of an alpha thymosin derivative with (1)(8)(5)/(1)(8)(7)Re and ((9)(9)m)Tc: structural analysis and initial biological evaluation, Chem Biol Drug Des 80 (2012) 545-553. [69] S.S. Jurisson, J.D. Lydon, Potential technetium small molecule radiopharmaceuticals, Chem Rev 99 (1999) 2205-2218. [70] E.D. Williams, Radionuclides in diagnosis, Physics Education 24 (1989) 196. [71] M.M. Khalil, J.L. Tremoleda, T.B. Bayomy, W. Gsell, Molecular SPECT Imaging: An Overview, Int J Mol Imaging 2011 (2011) 796025. [72] C.J. Smith, W.A. Volkert, T.J. Hoffman, Gastrin releasing peptide (GRP) receptor targeted radiopharmaceuticals: a concise update, Nucl Med Biol 30 (2003) 861-868. [73] M.F. Tsan, Mechanism of gallium-67 accumulation in inflammatory lesions, J Nucl Med 26 (1985) 88-92. [74] D.J. Hnatowich, Recent developments in the radiolabeling of antibodies with iodine, indium, and technetium, Semin Nucl Med 20 (1990) 80-91. [75] M.L. Thakur, J.P. Lavender, R.N. Arnot, D.J. Silvester, A.W. Segal, Indium-111-labeled autologous leukocytes in man, J Nucl Med 18 (1977) 1014-1021. 170

[76] J.T. Locher, K. Seybold, R.Y. Andres, P.A. Schubiger, J.P. Mach, F. Buchegger, Imaging of inflammatory and infectious lesions after injection of radioiodinated monoclonal anti-granulocytes antibodies, Nucl Med Commun 7 (1986) 659-670. [77] P.D. Mozley, M.L. Thakur, A. Alavi, T. Smith, E.D. Barraclough, P. Wilding, B.A. Rhodes, M. Patel, A. Mathur, P. Li, Effects of a 99mTc- labeled murine immunoglobulin M antibody to CD15 antigens on human granulocyte membranes in healthy volunteers, J Nucl Med 40 (1999) 2107-2114. [78] C.P. Bleeker-Rovers, H.J. Rennen, O.C. Boerman, A.B. Wymenga, E.P. Visser, J.H. Bakker, J.W. van der Meer, F.H. Corstens, W.J. Oyen, 99mTc-labeled interleukin 8 for the scintigraphic detection of infection and inflammation: first clinical evaluation, J Nucl Med 48 (2007) 337- 343. [79] Y.L. Sun, M.L. Jan, P.F. Kao, K.H. Fan, H.T. Hsu, W.C. Chang, Y.C. Shen, T.W. Lee, Coincidence planar imaging for dynamic [18F]FDG uptake in nude mice with tumors and inflammation: correlated with histopathology and micro-autoradiography, Kaohsiung J Med Sci 21 (2005) 258-266. [80] S. Vinjamuri, A.V. Hall, K.K. Solanki, J. Bomanji, Q. Siraj, E. O'Shaughnessy, S.S. Das, K.E. Britton, Comparison of 99mTc infecton imaging with radiolabelled white-cell imaging in the evaluation of bacterial infection, Lancet 347 (1996) 233-235. [81] P.H. Nibbering, M.M. Welling, P.J. van den Broek, K.E. van Wyngaarden, E.K. Pauwels, W. Calame, Radiolabelled antimicrobial peptides for imaging of infections: a review, Nucl Med Commun 19 (1998) 1117- 1121. [82] C.D. Chang, M. Waki, M. Ahmad, J. Meienhofer, E.O. Lundell, J.D. Haug, Preparation and properties of Nalpha-9- fluorenylmethyloxycarbonylamino acids bearing tert.-butyl side chain protection, Int J Pept Protein Res 15 (1980) 59-66. [83] T.W. Moody, M. Fagarasan, F. Zia, M. Cesnjaj, A.L. Goldstein, Thymosin alpha 1 down-regulates the growth of human non-small cell lung cancer cells in vitro and in vivo, Cancer Res 53 (1993) 5214-5218. 171

[84] D. Frasca, L. Adorini, C. Mancini, G. Doria, Reconstitution of T cell functions in aging mice by thymosin alpha 1, Immunopharmacology 11 (1986) 155-163. [85] C.J. Smith, H. Gali, G.L. Sieckman, D.L. Hayes, N.K. Owen, D.G. Mazuru, W.A. Volkert, T.J. Hoffman, Radiochemical investigations of 177Lu-DOTA-8-Aoc-BBN[7-14]NH2: an in vitro/in vivo assessment of the targeting ability of this new radiopharmaceutical for PC-3 human prostate cancer cells, Nucl Med Biol 30 (2003) 101-109. [86] C.L. Wilson, W.B. Monteith, A.S. Danell, C.S. Burns, Purification and characterization of the central segment of prothymosin-alpha: methodology for handling highly acidic peptides, J Pept Sci 12 (2006) 721-725. [87] E. Kaiser, R.L. Colescott, C.D. Bossinger, P.I. Cook, Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides, Anal Biochem 34 (1970) 595-598. [88] K.D. Setchell, M.B. Welsh, C.K. Lim, High-performance liquid chromatographic analysis of phytoestrogens in soy protein preparations with ultraviolet, electrochemical and thermospray mass spectrometric detection, J Chromatogr 386 (1987) 315-323. [89] A. Boyum, Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g, Scand J Clin Lab Invest Suppl 97 (1968) 77-89. [90] S. Wittmann, D. Frohlich, S. Daniels, Characterization of the human fMLP receptor in neutrophils and in Xenopus oocytes, Br J Pharmacol 135 (2002) 1375-1382. [91] J.M. Kremer, R.I. Rynes, L.E. Bartholomew, Severe flare of rheumatoid arthritis after discontinuation of long-term methotrexate therapy. Double-blind study, Am J Med 82 (1987) 781-786. [92] S. Akira, K. Takeda, Toll-like receptor signalling, Nat Rev Immunol 4 (2004) 499-511. [93] D.J. Hnatowich, F. Virzi, M. Fogarasi, M. Rusckowski, P. Winnard, Jr., Can a cysteine challenge assay predict the in vivo behavior of 99mTc- labeled antibodies?, Nucl Med Biol 21 (1994) 1035-1044. 172

[94] F. Hayashi, T.K. Means, A.D. Luster, Toll-like receptors stimulate human neutrophil function, Blood 102 (2003) 2660-2669. [95] H. Zheng, D. Fletcher, W. Kozak, M. Jiang, K.J. Hofmann, C.A. Conn, D. Soszynski, C. Grabiec, M.E. Trumbauer, A. Shaw, et al., Resistance to fever induction and impaired acute-phase response in interleukin-1 beta-deficient mice, Immunity 3 (1995) 9-19. [96] G. Fantuzzi, C.A. Dinarello, The inflammatory response in interleukin-1 beta-deficient mice: comparison with other cytokine-related knock-out mice, J Leukoc Biol 59 (1996) 489-493. [97] D. Pellegrino, A.A. Bonab, S.C. Dragotakes, J.T. Pitman, G. Mariani, E.A. Carter, Inflammation and infection: imaging properties of 18F-FDG- labeled white blood cells versus 18F-FDG, J Nucl Med 46 (2005) 1522- 1530. [98] G. Loudos, S. Majewski, R. Wojcik, A. Weisenberger, N. Sakellios, K. Nikita, N. Uzunoglu, P. Bouziotis, A. Varvarigou, Performance evaluation of a mouse-sized camera for dynamic studies in small animals, Nuclear Instruments & Methods in Physics Research Section a-Accelerators Spectrometers Detectors and Associated Equipment 571 (2007) 48-51. [99] M. Skopeliti, I.F. Voutsas, P. Klimentzou, M.L. Tsiatas, A. Beck, A. Bamias, M. Moraki, E. Livaniou, M. Neagu, W. Voelter, O.E. Tsitsilonis, The immunologically active site of prothymosin alpha is located at the carboxy-terminus of the polypeptide. Evaluation of its in vitro effects in cancer patients, Cancer Immunol Immunother 55 (2006) 1247-1257. [100] V.P. Zav'Yalov, E.V. Navolotskaya, R.N. Vasilenko, V.M. Abramov, E.Y. Volodina, O.A. Roslovtseva, A.N. Prusakov, O.A. Kaurov, The sequence 130-137 of human interferon-alpha 2 is involved in the competition of interferon, prothymosin alpha and cholera toxin B subunit for common receptors on human fibroblasts, Mol Immunol 32 (1995) 425-431. [101] O.J. Cordero, C. Sarandeses, M. Nogueira, Prothymosin alpha receptors on lymphocytes, J Interferon Cytokine Res 15 (1995) 731- 737.

173

174

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I

Πίνακας I.1 Συντομογραφίες των πρωτεϊνικών αμινοξέων.

Συμβολισμός Σύντμηση τριών Αμινοξύ ενός γράμματος γραμμάτων

A Ala Αλανίνη

C Cys Κυστεΐνη

D Asp Ασπαρτικό οξύ

E Glu Γλουταμινικό οξύ

F Phe Φαινυλαλανίνη

G Gly Γλυκίνη

H His Ιστιδίνη

I Ile Ισολευκίνη

K Lys Λυσίνη

L Leu Λευκίνη

M Met Μεθειονίνη

N Asn Ασπαραγίνη

P Pro Προλίνη

Q Gln Γλουταμίνη

R Arg Αργινίνη

S Ser Σερίνη

T Thr Θρεονίνη

V Val Βαλίνη

W Trp Τρυπτοφάνη

Y Tyr Τυροσίνη

175