На правах рукописи
ГАРДИНЕР Анастасия Анатаяьевна
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ФИЛОГЕНИЯ БОКОГШОДНЫХ МХОВ (BRYOPSIDA, MUSCI) ПО РЕЗУЛЬТАТАМ АНАЛИЗА ЯДЕРНЫХ И ХЛОРОПЛАСТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДНК
03.00.03 — молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2004 г. Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико- химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ
Научный руководитель: доктор биологических наук Троицкий Алексей Викторович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич кандидат биологических наук Спирина Ульяна Николаевна
Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгарда РАН
Защита диссертации состоится л-"^ ноября 2004 г. в '' часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. Л.В. Ломоносова
Автореферат разослан <2.л. октября 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук /^^.^.е-с^^(*:ч^г~,___ 1Салинина Н.О. \G€bS
Общая характеристика работы Актуальность проблемы Отдел листостебельные мхи (Bryophyta, Musci) представляет собой одну из древнейших rpjom наземных растений, представители которой распространены на всех континентах и являются важной составляющей экосистем. Имея общего с сосудистыми растениями предка, существовавшего около 400 миллионов лет назад, мхи сформировали обособленную группу растений, отличительной чертой которой является преобладание в жизненном цикле гаплоидной фазы (гаметофита) над диплоидной (спорофитом) Самым многочисленным классом отдела является класс Bryopsida, включающий до 10000 видов. Еще в 1819 году Bridel предложил деление этого класса по характеру ветвления стебля и расположению гаметангиев на верхоплодные и бокоплодные мхи Сложившиеся с тех пор системы бокоплодных мхов, основанные на результатах сравнительно-морфологического анализа признаков гаметофита и спорофита (Brotherus 1924, 1925; Vitt 1984; Buck & Vitt 1986; Buck & Goffinet 2000), обнаруживают много противоречий, касающихся как взаимоотношений порядков, так и таксонов более низкого ранга Неразрешенными остаются вопросы филогенетических связей и таксономических границ многих семейств и родов бокоплодных мхов Причины обнаруживающихся разногласий в разных классификациях кроются в нескольких особенностях строения мхов Наряду с небольшими размерами мхи характеризуются однотипным планом строения гаметофита и спорофита, слабой дифференцировкой тканей. Поэтому число морфологических признаков, которые могут быть положены в основу системы, невелико Так, до последнего времени мкогие классификации строились на основании признаков перистома, - аппарата спорофита, участвующего в рассеивании спор. Однако среди бокоплодных мхов часто происходит редукция перистома, в частности при переходе мхов в экстремальные для них условия местообитания (например, эпифитные), что ставит под сомнение весомость признаков перистома при построении филогенетической системы В ряде работ последних лет по филогении бокоплодных мхов показана перспективность использования методов геносистематики, в первую очередь сравнение нуклеотидных последовательностей разньк участков генома (Buck et al 2000а, 2000b; Buck & Goffinet 2000 и проч ) Данные этих исследований позволяют
»-ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ j БИБЛИОТеКЛ ] не только усовершенствовать систему и проверить существующие филогенетические гипотезы, но и провести переоценку значимости отдельных морфологических признаков, традиционно считающихся ключевыми при построении системы. Нами проведен анализ филогенетических связей некоторых проблематичных и ранее не изучавшихся таксонов бокоплодных мхов на основании сравнения как ядерной, так и хлоропластнои ДНК, причем не только их первичных, но и вторичных структур.
Цель и задачи исследования Целью работы была оценка возможностей использования последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS1, ITS2) ядерного рибосомного оперона (яд-рДНК) и участка tniL-tmV хлоропластнои ДНК (хпДНК) для уточнения филогенетических связей некоторых семейств бокоплодных мхов и ряда таксономических групп, систематический статус которых на основании морфологических данных трактуется неоднозначно. Нами были поставлены следующие задачи: 1. Определить хлоропластные и ядерные последовательности ДНК бокоплодных мхов, данные по которым отсутствуют, особенно для видов с неясным систематическим положением: Habrodon perpusillus, Leptopterigynandrum austro- alpinum, Myrinia rotundifolia, Neodolichomitra yunnanensis и др. 2, Построить филогенетические деревья на основании полученных и имеющихся в международных базах данных гомологичных последовательностей ДНК для максимального количества таксонов бокоплодных мхов. 3.Проанализировать информативность исследуемых участков ядерной и хлоропластнои ДНК для реконструкции филогенетических взаимоотношений бокоплодных мхов. 4. Сравнить топологии деревьев, построенных разными методами. 5. Оценить соответствие полученных результатов с существующими системами бокоплодных мхов и сопоставить полз'ченные результаты с данными морфологических и других молекулярных исследований. 6. Проанализировать вторичную структуру внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) яд-рДНК и интрояа гена тРНК лейцина хпДНК для поиска синапоморфных маркеров для вьмвленных монофилетических групп бокоплодных мхов. 7. На основании полученных данных предложить изменения принятой в настоящее время классификации бокоплодных мхов. Научная новизна и практическая ценность работы Произведена оценка информативности последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров 1 и 2 яд-рДТЖ и участка trriL-tmV хпДНК, включающего интрон и 3'- экзон гена тРНК лейцина и спейсер между генами тРНПС лейцина и фенилаланина, для исследования филогенетических отношений бокоплодных мхов. Определены и включены в международную базу данных GenBank нуклеотидные последовательности ITS1 для 55 и ITS2 для 57 видов бокоплодных мхов, а также последовательности trnL-tmV участка 66 видов бокоплодных мхов. Проведен филогенетический анализ по имеющимся на момент выполнения работы данным по ITS и tmL-tmV последовательностям всех основных групп бокоплодных мхов, причем особое внимание было уделено ранее неизученным группам. На основе проведенного исследования рассмотрены филогенетические связи 134 видов бокоплодных мхов, являющихся представителями 17 семейств и более 40 родов. Проведено сравнение полученных в исследовании данных с традиционными представлениями о филогении бокоплодных мхов, основанными на результатах анализа морфологических признаков; сделаны конкретные предложения по модификации существующей системы бокоплодных мхов. По результатам анализа нуклеотидпых последовательностей ядерной и хлоропластной ДНК показано, что такие крупные семейства бокоплодных мхов, как Нурпассас, Leskeaceae, Anomodontaceae, а также род Hygrohypnum являются полифилетичными таксонами. По-новому трактуются филогенетические связи и таксономический статус родов Habrodon, Lescuraea, Hygrohypnum, вида Myrinia rotundifolia. Показана перспективность использования анализа вторичной структуры интрояа гена тРНК лейщта и участка ITS2 как источника дополнительной информации при изучении филогении бокогшодных мхов. Апробация работы Результаты исследования были представлены на XI международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2004» (Москва, 12-15 апреля, 2004 г), Vni молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге (Санкт-Петербург, 17-21 мая, 2004 г), Ш съезде ВОГис «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва 6-12 июня, 2004 г) и международном симпозиуме "Р1еигосафои5 mosses- Systematics and Evolution" (Кардифф, Великобритания, 6-8 сентября, 2004 г.) По результатам работы был сделан доклад на совместном семинаре отдела эволюционной биохимии Института физико-химической биологии им АН Белозерского и кафедры молекулярной биологии биологического факультета МГУ Публикации По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ Структура и объем работы Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения Работа содержит 9 таблиц, 1 диаграмму и 32 рисунка Список литературы включает 288 наименований цитированных работ.
Содержание работы Материалы и методы исследования
Исходный материал и выделение ДНК Для выделения ДНК были использованы образцы растений из гербариев Главного ботанического сада им Н.В Цицина РАН (Москва) и Биологического факультета МГУ им М В. Ломоносова Для ряда видов данные о нуклеотидных последовательностях ITS1, ITS2 и tmL-lrnV участка бьши взяты из международной базы данных GenBank. Препараты ДНК получали с использованием двух методов, стандартной методики выделения ДНК с применением цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) (Doyle & Doyle 1987) или с помощью набора для экстракции растительной ДНК - Nucleospin Plant Extraction Kit ("Machery-Nagel", Германия) Выход ДНК составил от 5 до 100 мкг на 0,1 г растительного материала. Амплификация и секвенирование ДНК Для амплификации внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного • оперена ядДНК использовали пару внешних праймеров L и 4 (White et al. 1990). Получали амплификат, состоящий из 5 - 8 последних нуклеотидов гена 18S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1), гена 5,8S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) и 10 - 15 первых нуклеотидов гена 26S рРНК. При секвенировании ITSl и TTS2 использовали наряду с внеишими праймерами пару внутренних праймеров: 2 и 3 (White et al. 1990) (рисунок 1). L^ 2 ш hfsT-1Ж1 mi i 26S 3 ^4 Рисунок 1. Расположение и направление отжига прай.меров при амплификации участка ITS1-5,8S-ITS2 рДНК. Для амплификации участка tmh- tmV были использованы праймеры (С и F), позволяющие получить полные последовательности интрона и 3' экзона гена tmh, а также спейсер, располагающийся между генами тРНК лейцина и фенилаланина (Taberletetal. 1991). Таблица 1. Последовательности использованных в работе праймеров. Название Последовательность праймера Длина праймера L 5 '-TCGTAAC AAGGTTTCCGTAGGTG-3' 23 н. 4 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGT-3' 20 н. 2 5 '-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3' 20 и. 3 5 '-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3' 20 и. С 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3' 20 н. F 5'-ATTTGAACTGGTG ACACGAG-3' 20 н.
Реакционная смесь содержала около 20 нг ДНК, 60 мМ трис-НС1 (рН 8,5), 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCb, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритон Х-100, 200 мкМ каждого dNTP, 12,5 пМ каждого праймера и 2,5 ед. Taq ДНК - полимеразы ("Сибэнзим"). Продукты реакции анализировали электрофорезом в 1% агарозном геле в IxTAE (Sambrook et al. 1989) Для очистки амплификата использовали набор GFX PCR Purification Kit ("Amersham Pharmacia", США).. Амплификацию проводили по следующей схеме: начальная денатурация - 94°С, 3 минуты; денатурация - 94°С 50 секунд; отжиг праймеров - 58°С 40 секунд; "" 30 циклов элонгация - 72°С 1 минута; денатурация - 94''С 50 секунд;
отжиг праймеров - 58°С 40 секунд; заключительный цикл элонгация - 72°С 3 минуты. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit в Центре общего пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В.А Энгельгарда). Филогенетический анализ Выравнивание последовательностей осуществлялось с помощью программы SED из пакета «Восторг» (Zharkikh et al. 1990). Филогенетические деревья были построенные несколькими методами. Для построения филогенетических деревьев методом ближайшего связывания (neighbour-joining, NJ) использовалась программа TREECON I.3b (Van de Peer & De Wachter 1997). При построении матрицы различий использовали р-расстояния и двухпараметрическую модель фиксации нуклеотидных замен (Kimura 1980). В качестве статистической поддержки индивидуальных узлов при построении филогенетических деревьев применялся метод бутстрепа (Felscnstein 1985). Байесовская реконструкция филогении (MB) с использованием в качестве критерия функции максимального правдоподобия была проведена с помощью программы MrBayes ver. 3.0В4 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). При байесовской реконструкции филогении использовалась GTR+1+Г модель нуклеотидных замен, было задано 2000000 генераадй. Полученная нами матрица данных была проанализирована методом максимальной экономии (maximum parsimony, MP) с помощью программы POY (Gladstein & Wheeler 2001), использующей метод прямой оптимизации без предварительного выравнивания. Анализ бьш проведен S. Huttunen на восьмипроцессорном компьютере «Silicon GrapMcs Origin 2000/128» в научно- вычислительном центе «Espoo», Финляндия. Полученное с помощью программы ЮУ выравнивание было также использовано для анализа методом MP с помощью программ NONA (Goloboff 1994) и WINCLADA (Nixon 1999). Анализ вторичных структур Интрон гена тРНК лейцина хпДНК является интроном I группы, его вторичная структура бьша построена согласно модели, предложенной для интронов этой группы в 1994 году Т. Cech (Cech et al. 1994). Поиск консервативных участков интрона осуществлялся путем сравнения нуклеотидных последовательностей как среди бокоплодных мхов, так и с опубликованными данными о последовательностях шпрона tmL у антоцеротовых мохообразных (Stech et al. 2003) и ряда водорослей (Evrard et al. 1988; Paquin et al. 1997). Для анализа вторичной структуры ITS2 мы использовали уже опубликованную ранее для зеленых водорослей и цветковых растений модель ITS2, - так называемую модель «четырехпальцевой ладони», предложенную Mai и Coleman (1997). Вторичная структура вариабельных участков интрона и спейсера предсказывалась с помощью интерактивной программы RNA mfold Version 2.3 (http://bioinfo.math.фi.edlJ/пlfold/ma/foгml.cgi). использовали критерии построения, задаваемые программой по умолчанию (Zuker 2003). Вторичная структура исследуемых участков генома была построена также с помощью программ DSCE (De Rijk 1993) и RNA-viz 2.0 (De Rijk & De Wachter 1997). Результаты и обсуждение Характеристика исследованных в работе участков генома Методом секвенирования ДНК нами были получены полные последовательности спейсеров ITS1 и ITS2, такясе частичные последовательности генов 5,8S рРНК и 26S рРНК. Для получения максимального количества информативных сайтов при филогенетическом анализе выровненные последовательности ITS, включая частичные последовательности генов 5,8S и 26S рРНК, были объединены с полученными последовательностями tmh-trnV хпДНК. Для некоторых видов данные о первичной структуре ITS1, 2 и trriL-imV были взяты из международной базы данных GenBank. Наш анализ 0С1Юван, главным образом, на выборке, включающей в себя 124 вида бокоплодных мхов. Длина выравнивания для выборки из 124 видов составила 1766 п.н., данные о длине выравнивания,
нуклеотидном составе и количестве вариабельных позиций в каждом исследуемом
участке генома приведены в таблице 2.
Таблица 2. Характеристики выравнивания.
Участок Длина Нуклеотидный состав, % Количество позиций генома выравнивания, (в скобках мин. вариа инфор и мак., без бельных мативных пробелов), п. н. т С А G поли. ITS1 578 19,5 33,1 18,3 29,1 329 216 (220-316) част. 5,8S 101 24,0 27,3 21,8 26,9 13 3 (92-101) поли. ITS2 567 19,1 31,9 14,7 34,2 285 177 (245-294) част. 26S 20 15,2 26,7 39,1 19,1 10 3 (20) traL интрон 341 32,8 11,5 39Д 16,4 99 60 (233-296) 3' -экзон tmL 52 27,4 29,4 21,6 21,6 2 2 ПОЛИ. (51-52) tmL-F 85 36,4 11,0 39,4 13,2 27 21 спейсер.полн. (41-66) экзон tmF 22 10,6 18,6 48,6 22,9 8 5 част. (13-22) Весь участок 1766 24^ 25,2 25,0 25,6 773 487
В целом, набор из 124 выровненных последовательностей яд-рДНК и trriL-trnV
включает 789 консервативных и 773 вариабельных позиций, из которых 487
являются информативными. Наиболее вариабельные участки локализованы в ITS1 и
ITS2 Наблюдаемая вариабельность, связана, главным образом, с большим числом
инделей. Вставки локализованы в основном в «горячих точках» и часто
представляют собой тандемные дупликации участков из 2-4 п.н., возникновение
которых, вероятно, связано с механизмом «проскальзывания» при репликации.
Другой тип обнаруженных вставок - это вставки олигонуклеотидных участков, не
сходных с прилегающими последовательностями. При этом были отмечены
вставки, характерные для представителей определенных таксономических групп.
Так, у представителей семейства Amblystcgiaceae гомологичные вставки бьши обнаружены на участках ITS1 и ITS2. У видов Fabronia ciliaris, Habrodon perpusillus и представителей Plagiotheciaceae в ITS2 отмечена гомологичная вставка размером 25 П.Н., отсутствующая у других изученных нами таксонов. Филогенетические деревья, построенные тремя основными методами анализа (NJ, MP и MB), очень близки по топологии. Большинство группировок сохраняются неизменными на разных деревьях и хорошо поддержаны (бутстреп для многих превышает 90%). Мы приводим в автореферате только NJ филогенетическое дерево (рис. 2).
Филогения семейства Нурпасеае Одно из самых крупных семейств бокоплодных мхов Нурпасеае объединяет около 40 родов, распространенных главным образом в умеренных широтах (Vitt 1984). По признанию большинства систематиков Нурпасеае является сборной группой, поэтому проблемы классификации семейства и его филогенетических связей являются предметом частых дискуссий (Nishimma et al. 1984; Ando 1986, 1995; Buck & Vitt 1986; Hedenas 1990; Tsubota et al. 2002). Согласно Vitt (1984), в состав семейства входят такие роды, как Platygyrium, Pylaisia, Callicladium, Calliergonella, Cariobaeohypnum, Eurohypnum, Homomallium, Hypnum, Ptilium и ряд др. Включенные в наш анализ представители этих родов заняли разные позиции на филогенетическом дереве, что свидетельствует о полифилетичности не только семейства Нурпасеае, но и рода Нурпит. Представители рода Нурпит были обнаружены в нескольких монофилетичиых группах. Тем не менее, 5 видов рода Нурпит (Я. revolutum, Н. plicatulum, Н. vaucheri, Н. procerrimum, Н. plumaeforme) сформировали монофилетичное ядро, сестринское родам Pylaisia и НототаШит. Однако типовой вид рода Нурпит (Н. cupressiforme) оказывается на дереве далек от этой монофилетичной группы и формирует ветвь с родом Eurohypnum. Близкими к этой ветви являются Cariobaeohypnum и Platygyrium. В целом, результаты нашего анализа подтверждают и дополняют данные Vanderpoorten et al. (2002а) и Tsubota et al. (1999, 2002) о полифилетичности семейства Нурпасеае и рода Нурпит и показывают необходимость его основательной ревизии. - Hypniun vaacheri — Hygrohypnum eugyrium Hypnum plumaeforme Pylaisia polyantha Hypnaccae _JML! Hypdum plicatulum Jflur— Hypniun revolutum "- Hypnam procerrJmnm Hvpnui ouUeacena Entodon bevrichii Hypnaceae Tbuidium delicatulum Thuidium pbflibertii*
Hapiocladium angustifoUiim - Mamillariella genicalata Lindbergia cf. Duthie - Uodbcrg^ brachypteni Pseodpkskeopsis imbrtcata Leskeaceae Rhyttdium ragosuml Pseudolnkeella tectoniRhytidhim m rug 10 ЬвктсашаЫЛк ЬаааышткЫя ' Ftycbodmm рКмйпв • LocmniMudi Leskeaceae - Rigja^ailclpbttnbiitn Hypnaceae Calliergonaceae &шиМд|Ц|ш<Й1|У ^^ |{|-—CnKmupiliWnaf ^ ' '¥ , -Wr^-Cmmm^m^mmt f'.t "• ■,- —Г '^sgasa^vfp*'"^; в^ив^^^;;'" I^iyMtbAii * ■ ftdfewlftn— trmHnm ^'^ ^ ^■-—■■ НурмястргWCTpiwwwи e I Hypnaceae * Pt^jranuniun Qiferne - Kabrodoii рйрвШшв _ш Plagiotheciaceae HenopeSasel^ri ' Hookeria lucens Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное методом ближайшего связывания (NJ) для выборки из 124 видов мхов по последовательностям яд-рДНК и tmL-tmF хпДНК. II Филогения семейств Leskeaceae и Thuidiaceae Наше исследование является первой попыткой рассмотреть филогенетические отношения семейств Leskeaceae и Thuidiaceae на основании молекулярных данных. В рамках традиционной систематики вопросы филогенетических взаимосвязей и систематических границ этих семейств являются дискуссионными. Так, Grout (1940), описывая бриофлору Северной Америки, объединял представителей TJiuidium, Leskea, а также Tbelia и Anomoddn в одно семейство Leskeaceae. В свою очередь, Noguchi (1972) на основании признаков гаметофита и, позднее. Cram & Anderson (1981) на основании признаков спорофита разграничивали семейства Leskeaceae и Thuidiaceae. Объемы этих семейств пересматривались разными исследователями неоднократно. Особенно проблематичными оказались такие роды, как Haplocladium, Anomodon, Claopodium, Pseudoleskeella и др. Нами были проанализированы ядерные и хлоропластные последовательности 38 видов из 19 родов семейств Leskeaceae и Thuidiaceae. Данные нашего анализа свидетельствуют о полифилетичности семейства Leskeaceae (sensu Buck & Crum 1990). Семейство распалось на несколько клад, занявших обособленное друг от друга положение на филогенетическом дереве. Общую монофилетичную группу формируют представители родов Lescuraea и Ptychodium, а также восточно-азиатский Rigodiadelphus robusta, который первоначально был описан Линдбергом (Lindberg 1872) как вид рода Lescuraea ( L. robidsta). Полученные нами данные согласуются с предложением об исключении рода Lescuraea из Leskeaceae в самостоятельное семейство Pseudoleskeaceae, описанное еще Шимпером в 1860 году (Schimper 1860). Филогенетически далекую от Lescuraea ветвь формирует род Leskea, объединившийся в одну кладу с Haplocladium. В рамках традиционной систематики чаще всего Haplocladium ассоциировался исследователями с семейством Thuidiaceae; из-за различий в строении спорофита Leskea и Haplocladium как родственные группы не рассматривались, хотя морфологически роды Leskea и Haplocladium объединяет тип парафиллий и характер папиллозности клеток листьев. Результаты нашего исследования свидетельствуют о монофилии группы Leskea -^ Haplocladium и филогенетической близости этих родов к Thuidiaceae. Результаты исследования подтверждают компактность семейства Thuidiaceae, 12 включающего роды Thuiditim, Helodium, Abletinella и Rauielli, и правомерность исключения из Thuidiaceae таких родов, как Heterocladium и Claopodium. Согласно нашим данным, род Heterocladium близок к Neckeraceae, а Claopodium формирует монофилетичную группу, в состав которой входит Anomodon rostratum. На филогенетическом дереве представители рода Anomodon не формируют компактной группы. Этот род включает, в основном, эпифитные виды, перистом которых сильно редуцирован, вследствии чего род часто помещался систематиками в разные семейства, содержащие таксоны с редущ1рованным перистомом. Бак и Витг (Buck & Vitt 1986) выделили Anomodon в самостоятельное семейство Anomodontaceae и перенесли его из порядка Hypnales в порядок Leucodontales. Результаты проведенного нами филогенетического аналюа показывают полифилетичность рода Anomodon, некоторые представители которого занимают базальное положение по отношению к семейству Neckeraceae, а Anomodon rostratum объединяется с представителями Claopodium. Возвращаясь к обсуждению семейства Leskeaceae, следует отметить, что некоторые представители семейства являются редкими для России видами, занесенными в Красную Книгу России. Это такие виды, как Lindbergia brachyptera и L. duthiei, Leptopterigynandrum austro-alpinum, Mamillariella geniculata, последний вид, a также род Mamillariella являются эвдемиком России. Результаты нашего исследования показали, что Mamillariella geniculata является близким родственником Lindbergia. В базальном положении по отношению к этой группе находится Pseudoleskeopsis imbricata. Образованная этими таксонами монофилетичная ветвь занимает обособленное положение по опюшению к другим родам Leskeaceae. Представители рода Pseudoleskeella, неодаюкратно исключаемого разными исследователями из семейства Leskeaceae, образовали хорошо статистически поддержанную (100%) монофилетичную кладу. Таким образом, объединяемые ранее в Leskeaceae такие таксоны, как Lindbergia, Lescuraea, Ptychodium, Pseudoleskeella и др., формируют четко обособленные друг от друга монофилетичные группы, из которых лишь Haplocladium является близким Leskea. Положение родов Iwatsuldella и Leptopterigynandrum остается неопределенным и требует дальнейшего изучения. 13 Филогенетические связи рода Hygrohypnum Род Hygrohypnum традиционно относили к семейству Amblystegiaceae, представители которого распространены, главным образом, во влажных местах обитания и в водоемах. Филогенетический анализ молекулярных данных, выполненный Vanderpoorten с соавторами (2002а, 2002b), показал, что Amblystegiaceae является полифилетичной группой. В этой же работе были получены важные данные, свидетельствующие о полифилетичности рода Hygrohypnum. Исследователями в анализ были включены только 4 представителя рода, из которых лишь Hygrohypnum luridum вошел в состав Amblystegiaceae. Для изучения филогенетических связей рода Hygrohypnum мы включили в анализ 10 представителей рода, что составляет более половины его видового разнообразия. Согласно полученным нами данным род Hygrohypnum является полифилетичным. Род разделился на четыре обособленные друг от друга эволюционные линии. Hygrohypnum luridum сохраняет свое положение в пределах Amblystegiaceae, а Hygrohypnum subeugyrium располагается в монофилетичной группе, сформированной Pylaisla polyantha и некоторыми видами Нурпит. Оставшиеся представители Hygrohypnum разделились на две клады. Так, монофилетичная группа сформирована видами Hygrohypnum smithii, Н. alpestre, Н. norvegicum, Н. cochlearifolium, Н. montanum, а также примкнувшими к ним Campylophyllum halleri и Tomentypnum, последний род ранее относили к Brachytheciaceae (Brotherus 1925; Vitt 1984). Вторая монофилетичная клада включает виды Hygrohypnum polare, Н. duriusculum и Н. ochraceum, а также относимые ранее к Amblystegiaceae роды Scorpidium и Sanionia. Сестринское положение к этой группе занимает род Hamatocaulis. Филогенетические связи и систематическое положение вида Myrinia rotundifoUa Myrinia rotundifoUa - узколокальный эндемик арктической Сибири, это редкий вид, включенный в Красную Книгу Якутии и в готовящееся второе издание Красной Кншж России. На протяжении долгого времени проблема систематического положения этого вида оставалась неразрешенной. Первоначально он был описан Лрнеллом (Amell) как Helicodontium rotundifoUa 14 (см. Абрамова, Абрамов 1968), впоследствии он был перенесен в род Myrinia (Brotherus 1925), а затем в род Myuroclada сем. Brachytheciaccae (Абрамов, Абрамова 1968). Проводя ревизию последнего семейства, Игнатов и Хуттунен (Ignatov & Huttunen 2002) не подтвердили его принадлежности к Brachytheciaccae. Результаты нашего анализа подтверждают принадлежность Myrinia rotundifolia роду Myrinia. На филогенетических деревьях, построенных разными методами (NJ, MP, MB), Myrinia rotundifolia неизменно формирует монофилетичную ветвь с другим представителем рода - Myrinia pulvinata (рис. 2). Обособленное положение монофилетичной клады, сформированной видами Myrinia, соответствует принятому в настоящее время в систематике мхов статусу самостоятельного семейства Myriniaceae. Mydnt\fl/rtnl..al rotuAilifolI'tl^lkftlflfttlrUJ [Mjrinia рцЫяа»» Myriniaceae Iwatsukidia Iciicolricha Pl'tygyrliim rcpcni Calliergon согДГоЦцш ilclociidonlium capillarc - Okmuraca llral:h^•dicfion Brachjihcciaccac .Myurncuaa maibnowiceii Hypnum cuprcisifonne Eunibypnum leptothallum Plerigyiuiiidrum fllifirmc Pylaisia polyantba 99 Lcskccla Qcrvosa Pseudolcukcclla tcctonim 9S[— Hygroajnhlyslcgium tciia\ 8ft, ' HygroamblysregiuDi fluvialile - Riiytidium nigoium Amblystcgium terpen» Lcekea sracilcscens J TbuidiuRi dclicatulum I Tfauidium tamariscinum ■ Haplocladium an^^ufttToUum Lnkca polycarpa Rauiciti rujisana Fabronia cUiaris Hoakeria lucetu Рис. 3. NJ дерево no последовательностям tmL-tmF хпДЬЖ для выборки из 26 видов бокоплодных мхов. Для определения положения Myrinia rotundifolia на филогенетическом дереве относительно представителей родов Helicodontium и Myuroclada нами были проанализированы последовательности trnL-trnF хпДЬЖ для выборки из 26 видов мхов. В базе последовательностей GenBank нам не удалось найти данные о первичной структуре ITS яд-рДНК для представителей Helicodontium и Myuroclada, однако там содержатся последовательности tmL-trhP хпДНК для 15 видов Helicodontium capillare и Myuroclada maximowiczii. Филогенетический анализ хлоропластных последовательностей позволил показать информативность tmL-tmV для изучения взаимосвязей листостебельных мхов на родовом и видовом уровне (рис. 3). В результате анализа нами показано, что представители Helicodontium и Myuroclada располагаются на филогенетическом дереве отдельно от монофилетичной ветви Myrinia и, в часпюсти, от Myrinia rotundifolia, что позволяет нам подтвердить предложение Бротеруса о родовой принадлежности этого вида и опровергнуть точку зрения Абрамовых о положении Myrinia rotundifolia в роде Myuroclada (Абрамова, Абрамов 1968). Филогенетические связи и систематическое положение рода Habrodon Систематическое положение монотипного рода Habrodon трактовалось разными исследователями крайне неоднозначно, его относили к Habrodontaceae (Schimper 1860), Fabroniaceae (Brotheras 1924, 1925), Leskeaceae (Buck & Crum 1978), Myriniaceae (Buck 1977). Интересную концепцию выдвинули в 1990 году Buck и Crum, объединив роды Pterigynandrum, Heterocladium, Habrodon, Iwatsukiella и Myurella, имеюише редуцированный перистом, обладающие некоторыми общими морфологическими чертами гаметофита и сходным географическим распространением в семейство Pterigynandraceae (Buck & Crum 1990). Для определения филогенетических связей и систематического положения рода Habrodon мы провели анализ последовательностей ITSl, ГГ82 и imL-tmF 29 видов бокоплодных мхов, являющихся представителями 14 семейств, которые в рамках традиционной систематики рассматриваются как родственные группы роду Habrodon. Филогенетические деревья, построенные разными методами (NJ, MP, MB), имеют очень сходную топологию, поэтому в автореферате мы приведем только МБ дерево (рис. 4). Результаты нашего анализа опровергают предположения о филогенетической близости Habrodon с семействами Myriniaceae и Leskeaceae. Согласно полученным данным, мы подтверждаем правильность выделения японского вида Н. leucotrichus из рода Habrodon в самостоятельный род Iwatsukiella (Buck & Crum 1978). Сам же Habrodon perpusillus на деревьях 16 оказывается в пределах парафилетичной группы, включающей представителей семейства Plagiotheciaceae, роды Fabronia и Pterigynandrum. Основываясь на довольно обособленном положении Habrodon в системе бокоплодных мхов, мы придерживаемся мнения о выделении этого рода в самостоятельное семейство Habrodontaceae, что было предложено еще Шимпером в 1860 (Schimper I860). Описанное в 1990 году Баком и Крамом семейство Pterigynandraceae, включающее роды Pterigynandrum, Heterodadium, Habrodon, Iwatsukiella и Myurella (Buck & Crum 1990), является, no нашим данным, искусственной группировкой. Leskeela nervosa Rhyt!dium rugoftuiTi Pylalsia po]yantha Myrfnia pulvinata TEielia aaperella Neckera pennata «ft — H«tttroeIadium heteropterua 3P - IvyateuKialla Igucotricha P I -" ' '■-■'' I_aptopterigynancirum austro-aIplnum r, - Calllergon cordifolium и Platygyrium repens - Entodon eeductrix 100 I Amblyeteglum humilo t ^-rr ' Ambtysteglurrt fluviatile AmblyetagiuHapfocladiumm aarpan vlrginlanu» m Г ~ L-eske' a ргасПавссп— Thuidiumа dalicatulum Haplocfadium angustifolium - I-attkaa polycarpa - Hypnum cupressiforme Pterigynandrum fjlifirme j» ■ Fabronia cHiaria ——TfaSrodpn pa^rp_usjllusr ]P laoptarygiopsis muellaHana I Plagiothacium danttculatum 'o!— Myurella ap. P — Platydictya jungermannioides Hookeria lucens Рис. 4. MB дерево, построенное по последовательностям TTS\-2+tmL-trnV 29 видов мхов. Р - роды, включаемые в семейство Pterigynandraceae (Buck & Crum 1990). Анализ вторичных структур Дополнительными маркерами той или иной эволюционной линии организмов могут служи1ъ признаки вторичной структуры макромолекул (Петров, Алешин 2002). Для поиска синапоморфных маркеров, выявленных нами 17 в результате филогенетического анализа монофилетичных групп бокоплодных мхов, мы проанализировали вторичную структуру интрона гена тРНК лейцина хпДНК и внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ГГ82) яд-рДНК. Анализ вторичной структуры интрона гена trnL хпДНК Интрон гена tniLuAA является интроном первой группы и занимает консервативное положение в аитикодоне. Вторичная структура интрона trnL была построена нами в соответствии с моделью, предложенной Cech et al. (1994) (рис. 5). Нами были выделены характерные для интронов I группы консервативные элементы вторичной структуры (Р1-Р9), а также консервативные последовательности (Р, Q, R, S) (табл. 3). О Р9 Р5 Р1 10S_ О "'Г Р7 iiiAii. R Sy'-l: РЗ Р6 J^ = Р2 Р8а Lesksa gracilescetw 11оокспг11!сепч liywo'iypr.ummomanur. I- ti у. ?№ О А J '1. i у А PS Рис. 5. Вторичная структура интрона trnL вида Rigodiadelphus robusta (Leskeaceae). PI - P9 элементы вторичной структуры интронов I группы. Р, Q, R, S - консервативные последовательности интронов I группы. Стрелками указаны места сплайсинга. IGS - внутренняя ведущая последовательность, участвующая в процессе сплайсинга интрона. IS Таблица 3. Консервативные последовательности интронов I группы Р, Q, R, S. GUUCAGGGAAA AAUCCUGAGC GCAGAGACUCAA AAGAUAGAGUC GUUCAGGGCAAA GCAGAGACUCGA GAGAUAGAOUC AAGAGAGAGUC Последовательности Р, Q, R, S, выделенные в таблице 3 жирным шрифтом, обнаружены у большинства исследованных видов мхов. У ряда видов были найдены нуклеотидные замены (нуклеотиды, выделенные наклонным шрифтом). Консервативными сохранякугся нуклеотидные мотивы (подчеркнутые в табл. 3), участвующие в формировании комплементарных пар во вторичной структуре. Средняя длина интрона fmLuAA У исследованных видов бокоплодных мхов порядка Hypnales составила 275 п.н., интрон наибольшей длины был отмечен у вида Rauielli JUjisana (сем. Thuidiaceae), его длина 282 п.н. Интрон наименьшей длины (242 п.н.) обнаружен у вида Leskea gracilescens (сем. Leskeaecae). Анализ нуклеотидного состава показал, что интрон богат AT нуклеотидами (в среднем 73%). Анализ нуклеотидных замен выявил, что каталитический центр интрона (домены F4, РЗ, Р7) является консервативным, в то время как некоторые участки интрона характеризуются высокой изменчивостью (домены Р8, Р6). Анализ точечных мутаций позволил нам обнаружить ряд синапоморфных замен, характеризующих отдельные эволюционные линии мхов. Так, полученные нами данные о полифилетичности семейства Leskeaceae подтверждаются характером распределения ряда уникальных замен в доменах Р8, Р5, Р9. Виды рода Lescuraea {L. incurvata, L. saxicola, L. patent и др.), Ptychodium plicatulum и Rigodiadelphus robustus обладают общей консервативной заменой аденина на гуайин в домене Р8 (рис. 7). Близость же Leskea к представителям рода Haplocladium и семейству Thuidiaceae (Thuidium dehcalulum, Т. tamariscinum, Abietinella abietina, Rauielli fujisana, Helodium blandowii) подтверждается общими уникальными заменами иуклеотидов в шпильках Р5 и Р9 (рис. 6). Однако, отмеченная для этой группы видов замена в Р5 была найдена и у далеких от клады Haplocladium+Leskea+Tbuidisceae видов, таких как Ptilium crista-castrensis и Hylocomium splendens. 19 I'seudoleikeopsii. zippeii: Pseudo!ebki»ps:s zippelii Hcplocladimr. angu-stifolium wA A-о v,-A Leskea polycaqia O'-A H virginianum G-j Leskea gracibacens U-G P5 Q A G-0 Leskea palyca.-pa AL Rauidl: fujibaiu A. L. gracilescens .. A Ptiham crista-caslrensis ACAAu^'^, ^-A Rajielli fujisana Hylocomiuffi splendens A ^lJGUl-АдА ЗААС-^САЗ' C-G' Abielinella abiefina Helodiuni blandowii Tnuidium delicalulum Thuidum philibeflh P9M; Thuidium l -AAGAAAA3' Рис. 6. Синапоморфные замены (обведены кругом) в шпильках Р9 (А) и Р5 (Б). Монофилетичная группировка видов рода Hygrohypnum (Н, smithii, Н. alpestre, Н. norvegicum, Н. cochlearifolium) и Campylophyllum halleri обладает синапоморфными заменами в шпильках Р2 и Р8 (рис. 8), у Hygrohypnum montanum и исследованных представителей рода Tomentypnum, а также у Hygrohypnum ochraceum, Н. polare, Н. duriusculum подобных замен нет. 3*A-u 5' и А А-и HygroJiypnum sniithii G-C Н alpcsirc 1 а с Н inrvcgicun 5" А и. ,-1 Н (twlilcarifoliuni '' с в-сГ / Netiicfi pasna'ft N cr.sps 3 -.. и -A A и J H>grunypnum smlhu V hCJACll P2 и-A H. alpestre с ® \ (-oispiacLi A-U S-C H norvegicum и-A Campylopliyllum halien I гA- гJ ^ !.«.*. л:агг mtu'vs.a Р8 дЗ(Й1.«—С *u9-•,-А ° ^ "uit-biiift А-и 1. ^xtcola ^AAA L sccynfJd L patecs А с"\ Ri3<4!:ai!c';i r.i« ri>bu4lu« -А ^ Mvgro'ivpmiT smiiha и-А H tochicnnfohum ^,-А И а!рсд1гс u-^ Н, norvegicum U*-"L Campylophyllum holler: Ясогжишп rcvolvciM Ч AAAА Sccff^:ciuin scorp'xndcs Рис. 7. Синапоморфные замены (отмечены кругом) в шпильках Р8 (А) и Р2 (Б). Анализ шпильки Р6 показал, что длина шпильки зависит, главным образом, от числа повторов урацила в терминальной петле. Так, виды, которые по данным нашего филогенетического анализа составили кладу Amblystegiaceae, отличаются от прочих исследованных нами таксонов большей длиной терминальной петли. Ее 20 длина составляет 9-12 нуклеотидов. Длина концевой петли Rhytidium rugosum - представителя монотипного семейства Rhytidiaceae- также равна 9 нуклеотидам. Остальные исследованные нами группы бокоплодных мхов (Leskeaceae, Thuidiaceae, Hypnaceae и проч.) имеют короткую терминальную петлю шпильки Р6 из 3 - 4 нуклеотидов. Анализ вторичной структуры ITS2 яд-рДНК Последовательности ITS2 яд-рДНК складываются в четырехшпилечную вторичную структуру (рис. 8), называемую также «моделью четырехпальцевой ладони» (Mai & Coleman 1997). Нами проанализированы первичная и вторичная структуры ITS2 130 видов бокоплодных мхов. Средняя длина спейсера исследованных видов составила 255 п.н., максимальные и минимальные размеры спейсера, а также нуклеотидный состав показаны в таблице 4. Последовательности ITS2 характеризуются высоким содержанием GC нуклеотидов. Таблица 4. Основные хара1сгеристики 1782. Участок спейсера Сред. Максим. Миним. GC% АТ% длина, и длина, и длина, и состав состав Шпилька I 36 52 23 68% 32% Шпилька II 46 73 33 70% 30% Шпилька III 77 90 73 62% 38% Шпилька IV 24 49 23 92% 8% Весь ITS2 255 293 240 66% 34% На основании сравнения первичной и вторичной структуры ITS2 нами была построена модель спейсера (рис. 8), отражающая консервативный остов молекулы и вариабельные области. Анализ вторичной структуры ITS2 позволил отметить, что консервативные участки спейсера формируют основание шпилек, в то время как терминальные области шпилек вариабельны. 21 галс ^Gmo-ciaii-a^ -с- iiLi = Т . ~ .t-A- *",, ,,Л 111 Рисунок 8. Вторичная структура ITS2 бокоплодных мхов. Вариабельные участки спейсера отмечены точками. Вариабельные области заключены в прямоугольную рамку и указана отмеченная нами длина этих участков. Обведенные в круг нуклеотиды консервативны, но у некоторых видов были отмечены замены. Не обведенные нуклеотиды высоко консервативны. Некоторые признаки вторичной структуры ITS2 (табл. 5) были положены нами в основу бинарной матрицы состояний, позволяющей сравнить сходство и отличие вторичной структуры спейсера между некоторыми видами мхов, принадлежащими как одному роду, так и разным семействам. Полученная в результате анализа вторичной структуры ITS2 37 видов мхов матрица состояний, в которой наличие вьщеленного признака оценивалось как 1 и отсутствие как О, была обработана с помощью программы TREECON 1.3b (Van de Peer & De Wachter 1997). Далее мы сравнили топологию полученной кладограммы с филогенетическим деревом, построенным для той же выборки таксонов методом ближайшего связывания, но по данным о первичной структуре ITS2. 22 Таблица 5. Признаки ITS2, используемые при составлении матрицы состояний Шпилька I Шпилька и Шпилька Ш Шпилька IV 1/ в основании шпильки 1 9/Вн>'трБННЯЯ]риднновая 19/ В основании шпильки ZS/ Терминальная петля \а с 3* стороны дуплекса петля из двух С41нмет хть нсспаренный 4 иди мшынс нуклеотидсш плодится единичный ураиилов(1) Внутр^шяя ЕДИНИЧНЫЙ нуклсотидс S' :i) ^ридиновая петля кроне неспарснный адснин (1) стороны дуплекса (I) [>яэмср т^№1нналыюй цвух урацилов содержит Аленнна нет (0). Неспаренного нуклсотида ктяи больше 4 нукя. (0) ' цопслкнтсльныс 2/ В осн(»ании шпильки 26/ В шпильке IV есть ауклсотиды (0). вместо ядснина 3(V в основании шпильки анутрснинс петли (1) неспаремиыИ цитознн (1) ктът. сниме т шшячншшне ipcwHHx петель нет_(0) Список KIKOB, у которых выла проштлшнрована вторичная структура ITS2 и составлена бинарная tanprni» состоаиня гфкэн. Неспаренного шпхпина 10/ Пятая от основания яденинж и шятоиша (I). 27/ В шпильке есть Штиька I Штыдька Я Штилка lU lUmabKair нет(0) шпильки П Нет(0) вдинкчные неспаренные Номер признака 2 i 4 S 6 7 8 9 10 11 J2 n 14 IS 16 17 la 19 20 21 22 33 24 25 26 27 3/ Вместо мсспаренных комплсментярнйх шфа А-и 21/ Центр, внутренняя 4уклсотнды(1). Abictinella abietina OlO'O Olio I 1 lO нуклеопгидов в основании (1) Пар* A-U отсутстч'ет петля сзшметр. (I) Ршничиых неспаренных 0 0 li 01 1 0' 111 0 0; 0 AmblyAtegiuni_£luuiatile - шпильки находктсх Петня аснмметрнчиая (0) луклеогадоя нет (0) Iff'^l AmblywUtgiuni чегрепя 0 0 1 0 I I 1 li 1 0' тфныидин богатая Xau.ro;o i-LgJ.9.1 o'oi ro^ii 1 с11а/ Пятая от основания 22/ С7(ед}-Ю1иая за ней - ^Amblyste^um-vanum . 0 0,0,0 0 11ДД V' 9:0 1 ,0 1 1 11 li 1, акутревтга петля (I) [цпилькн II комплеи пара внутренняя петпя r^rvpaii ocleduiV яАа neuR 0 ^0 0, 0 'OLOTl 0 O0 Л\01 '0 II 0-1? 1911 11 Oi ll Bt^ipeiiiielt петлй нет G-C(l) ПарыО-Снет{0) асимметричная (1) CaDirrgon cordifblium 0 1 SLXiX 0 ,9,U Xi X 1' !2L Снимецжчная (0). Calliergon Biganteum p ,0 ni Д 0 0,1 1 1, 1, ll 4/ Вместо кеспаренных 23/ В ва[яи1бе11ыюй эспс Eurohy pnum- Jqitotha Uu tn. Oiiioiii 8 1 I 10 10 I ll Ol ГаЬгошя citiarii) пуклеотндся а основакин 12/Комш1ем параС-С шпильки 4-ая пара I 10 1 0 1 0 Olio 1 1' Ij Habrofion prrpue illus 0 0 11 некоыпяюйяпартА (I). 0 0 0 0 . 010 гнпкльки находится повторяется трижды после JJapJocladium aogu stifoliuE 1 '1 1, ll 0 10 1 '1 0| 1 0 111 пурин богатая петля (I). уридйновой потди (I). Пара комплеиеяпрная (0) Hqilocladium vlrginiBnutn 1 liO, 1 0 'O 1 Oi 0 Внутрен^Л петли нет(0) В повторе встречается 24/ Терминальная петля нэ Helodium blandowu 1 in тгттт^г 0 0 1 1 0 полу ксш пенсаторная 1 или мшьше нуклсот (1). НоЫсег!а lucens 1 '0 1 ,0 0 г 1 0' 0 IjO S/ В центре ишкяьки I Hygrohypnum alpestre l« 0. 1 1 1 ' 1, 1 эдмена С на U (0) Г^рмнкаяьная петля нз 0 0 I.oil 0 0 1 0 0 T0 0 иеспаренйий иктознн (1) Hygrohypnum cochlear] fblium 13/ внутренняя петля более чем 4 кукл (0). 1 'Qll Hyerohypnum duriuscuUim 0 0,1 I'll 0' 0 Цнтозина нет (0) "-8 1 .0 1 to I следует непосредстаенно I lygrcihypnum mcmianum ,^8 0 ,0:1 1 1 0 01 0 Ы В цшпре шпильки I )я тремя парами C-G (1). . HygrobyiwumjKirve^cuni 0 0 1 'o;i 0' 1 0. 0 1 1 0' oi 0 единичный яесларенный Петля сдвинута на одну Mygfohypn\im ocdtntoeum 0 0 10,1 0| 1 0 10 MO ii Hygrohypnuni polare M" 0 0 0 |0,Liu _LLLJL' урацил(1) Д'РУ (0) 1 O' 1 Itypniim cuprosslfonna-^ 0 0 0 1 T 1 0 tnjil- У ранила нет (0), 14/ Эта петля 1Л1мметр. (1) 1 lO, 1 ifl Hypnum procerritnum 0 00 0 11етлк iTOT или аскмиетр. 1 1! 1 T] 0' 0 II Вместо не«этареин<н« HypmiiTkJX№alutum _ 0 0 "\^ SLMI I J11 01 01 0 нухлеотида в ueinpe (0) Isoptetygtopsjs muellcriana i 0 0 1 1 0 i^O^" 1 >0 15/Эта петля асвмист (I) l^oskoB polycarpa 1^0 0" I %m \ 11 1' 0 шпильки 1 находнхся ifAim 1Л Lcskcit graciloacons 1 iQ 0 0 X-lQ0 0- 0,_0^1_1 ^Oj I 1^(T0 Io 0 w~s симые1|Н1чная Пегли нет или симметр (6) 0 1 , 0 0! 0, 0 1 0 0 0 0 0 1 ro 1,10 1 10 111 1 \\\ внутренняя петля (1) 1 lO -l+flI 0- oi 0! 0 16/ Терминалы18я петля j Leacumeii patens f |o 0 0 0_ 0 iriiM 0 ' 1 ]0 0 0 IllO'O Петли нет (0) 0100 1>ог8та пурннаш{ (1) Leacui aea incurvata I |0 |0 0 *1 00 10 1 rO ll l1l lO ,1 100 41 0 0 1 0 VI 8/ Вместо несшфешкмх) Пурины не преобладают а |_ Platydictyajungemumnlatdes 0 10 lO • 0 ,1 iO i 1 0 ,0 1 10 1,1 1 1 0 0 |0 - 0 1 нуклеотмда в центре петле (0) I Pseudo-c^liorgon tii^rtum 0 I r^" 0 0 1 O'O 00 0 1,111 0 0 0 111 1 ,0 .ll 1 ишнльки I находится 17/ Терчиналымя петля L 31гят1ЛЮГ|рта) «raminDunii 0 0 11 1 1 [0 0 Thuidium philtbertii 0 'O 1 с 1 lO'O 0 1 lO' 1 0 '0 11 I 1 асимметричная Зотатв пнримидннвми (I). 0 ,0 0 0 I 1 0,1,1 Hi ^ lltuidium Leskea polycarpa Helodium blandowii Abietinella abietina Haplocladium vir^nianum iHypnum cupressiforme 'Eurohypnum leptothallum Calliergon g^nteum —Cal liergon gi«nteui 1 Calliergonaceae Calliergon coraiiolium Hygrohypnum monlanum iHygrohypnum ' HygrohymiuHygrohypnumm norvegicualpestre m lum iHaplocladii gracilescen'' s I Hypnum procerrimum I Hronum revolilum Hygrohypnum cochlearifolium I Hygrohypnum ochraceum 41 twgrohypnum poiare Hygrohypnum ' ffygrohypnum duriusculum J Lescuraea patens > Lescuraea mcurvata —Thuidium philibertii Thuidium delicatolum Amblystegium fluviatile I—TAmbAmblystegiul legium varium Amblystegium serpens Amblystegiaceae Drepanocladus aduncus V—С Pseudocalliergon trifarium Straminerepn strammeum -TwWarnstorfii a tluitans Calliergonaceae HwWamstorfii a exannulat^-a d -Habrodon usillus - Platydictya jungermanmon EsopterygiopsiC ' ' ■s muelleriana -Fabronia ciliaris -Hookeria lucens Б - Кладограмма, построенная методом ближайшего связывания (NJ) по признакам вторичной структуры ITS2 37 видов мхов. Рисунок 9. 24 Топологии полученных деревьев А и Б мало сходны, однако выделенные в деревьях клады почти идентичны (рисунок 9). Таким образом, можно утверждать, что сравнительный анализ вторичных структур ITS2 оказывается полезным приемом при анализе филогенетических взаимоотношений у мхов для таксонов на уровне не выше семейств. Ряд уникальных признаков вторичной структуры 1TS2 подтверждает монофилетичность и обособленность семейства Amblystegiaceae. Полученная нами ранее система эволюционных взаимосвязей семейств Fabroniaceae, Plagiotheciaceae и Habrodontaceae повторяется на кладограмме Б, построенной по данным о вторичной структуре ITS2. Однако анализ вторичной структуры показал, что не всегда близкие виды обладают сходной вгоричной структурой спейсера. Так, представители семейства Calliergonaceae (Calliergon, Wamstorfia, Straminergon) на кладограмме Б расходятся в разные участки дерева, хотя анализ нуклеотидных последовательностей ITS2 показал монофилетичность Calliergonaceae. Представители Warnstorfia и Straminergon обладают общими полукомпенсаторными заменами и внутренними петлями, отсутствующими у Calliergon. Ранее мы показали, что род Hygrohypnum полифилетичен. Проведенное нами сравнение вторичной структуры спейсера 2 у видов этого рода показало, что разные представиаели Hygrohypnum обладают разными вариантами вторичной структуры спейсера (кладограмма Б), Анализ вторичной структуры интрона tniL хпДНК и ITS2 яд-рДНК позволил нам обнаружить ряд уникальных признаков в структуре этих молекул, характерных для отдельных эволюционных линий бокоплодных мхов. Полученные в результате филогенетического анализа данные об эволюционных взаимосвязях тех или иных групп мхов и монофилии ряда таксонов нашли подтверждение при анализе распределения консервативных и компенсаторных замен во вторичной структуре интрона tniL и ITS2. Однако, следует отметить высокую вариабельность ITS2, особенно терминальных областей шпилек спейсера, вторичная структура которых может быть отличной даже у близких видов мхов. 25 Выводы 1. Определены и включены в базу данных GenBank последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров яд-рДНК ITS1 для 57 и ITS2 для 55 видов бокоплодных мхов, а также последовательности tmL-tmV участка хпДНК 66 видов бокоплодных мхов. 2. Показана высокая информативность спейсерных участков яд-рДНК и trriL- tm¥ участка хпДНК для филогенетических исследований бокоплодных мхов. 3.Установлено, что семейства Нурпасеае, Pterigynandraceae и Leskeaceae являются полифилетичными таксонами. Показано, что роды Hygrohypnum, Anomodon, Нурпит являются полифилетичными. 4.Монофилетичные и обособленные друг от друга клады формируют Pseudoleskeella, Claopodium + Anomodon rostratum, Lindhergia + Mamillariella + Pseudoleskeopsis imbricata, Lescuraea+ Ptychodium + Rigodiadelphus robustus, Leskea + Haplocladium, ранее относимые в семейство Leskeaceae. Филогенетически близкими семейству Thuidiaceae оказываются только роды Leskea и Haplocladium. 5. Показано, что род Habrodon занимает обособленное положение в системе бокоплодных мхов и заслуживает статуса монотипного семейства Habrodontaceae. Подтверждена правильность исключения из Habrodon рода Iwatsukiella. 6. Установлена систематическая принадлежность редкого вида-эндемика Myrinia rotundifolia (Н. Amel!) Broth, к роду Myrinia. 7 Показана перспективность использования анализа вторичной структуры интрона tmL хпДНК и ITS2 яд-рДНК в филогенетических исследованиях. В ряде случаев были найдены уникальные признаки в структуре этих молекул, характерные для отдельных эволюционных линий бокоплодных мхов. 8. На основании полученных в исследовании данных, а также данных других молекулярно-филогенетических работ показано, что выделенные в рамках традиционной систематики группы бокоплодных мхов часто являются поли- или парафилетичными таксонами; очевидна необходимость переоценки значимости признаков перистома при классификации бокоплодных мхов. ■iji>fr^ 26 Список опубликованных работ: 1. Будякова А.А. (Гардинер А А), Яцентюк С П., Хатгенен С, Милютина И.А., Боброва В К , Игнатов М С, Троицкий А В Предварительные данные по анализу межпопуляционного разнообразия у зеленых мхов Eurhynchium angustirete и Brachythecium salebrosum молекулярными методами// Тезисы XI Международного Совещания по Филогении Растений, Москва, 2003, сгр 27-28 2. Будякова А.А (Гардинер А А ), Игнатов М С, Троицкий А.В Филогения и классификация ряда семейств бокоплодных мхов по последовательностям участков ядерной и хлорогшастной ДНК// Тезисы докладов XI международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», Москва, 12-15 апреля, 2004 г, сгр. 17 3. Будякова А.А (Гардинер А.А), Игнатов М С, Троицкий А.В. Систематическое положение Hahrodon (Habrodontaceae, Bryophyta) на основе анализа ядерной (ITS1, ITS2) и хлоропластной (trnUJJАА) интрон и tmL-trnV спейсер) ДНК // Материалы VTO молодежной конференции ботаников в Санкт- Петербурге, 17-21 мая, 2004 г, стр 242. 4. Будякова А.А. (Гардинер А. А.), Игнатов М С , Троицкий А В , Яцеигпок С П Изучение филогении некоторых семейств бокоплодных мхов на основе молекулярных данных// Тезисы Ш съезда ВОГис «Генетика в XXI веке, современное состояние и перспективы развития», Москва 6-12 июня, 2004 г., стр 157. 5. Gardiner А.А., Ignatov М S , Huttunen S , Troitsky A V The phylogenetic analysis of Leskeaceae (Bryophyta) and presumably related pleurocarpous mosses based on nuclear ITS and chloroplast imL-tmF sequence data// Thesis of the international symposium "Р1еигосафои8 mosses Systematics and Evolution", Cardiff, September 6- 8* 2004. 6. Budyakova A.A., Ignatov M S , Yatsentyuk S P Troitsky A V Systematic position of Hahrodon (Habrodontaceae, Musci) as inferred from nuclear ITSl and ITS2 and chloroplast trnh intron and tmL-lrnV spacer sequence data // Arctoa, 2003, Vol 12, pp 137-150. #.19352 РНБ Русский фонд 2005-4 16535 Подписано в печать 14.10.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 2.0 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 149 Отпечатано в 000 «Соцветие красок» 119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102