Mémoire Contribution À L'étude Des Polysaccharides Hydrosolubles De Quelques Plantes De La Famille Des Apiaceae Récoltées

UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE

UNIVERSITE KASDI ET DE LA VIE MERBAH-OUARGLA

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES Mémoire

En vue de l'obtention du Diplôme de

MAGISTER

en Biologie

Option : Biochimie et Analyse des Bio-produits

Par Melle YOUMBAI Asma

THÈME

Contribution à l’étude des polysaccharides hydrosolubles de quelques plantes de la famille des Apiaceae récoltées dans la

région de Ghardaïa (Sahara septentrional Algérien)

Soutenu publiquement le 17/11/2015.

Devant le jury :

Président BISSATI Samia Prof Univ. Ouargla

Encadreur OULD EL HADJ Mohamed Didi Prof Univ. Ouargla

Examinateur OULD EL HADJ-KHELIL Aminata Prof Univ. Ouargla

Examinateur SALHI Nessrine MC Univ. Ouargla

Année universitaire 2014/2015

Dédicace

Je souhaite exprimer mes remerciements les plus sincères et ma reconnaissance intégrale:

 Au Docteur Cheikh Sidi Mohamed Laid TIDJANI en tant que guide spirituel et représentant de la famille.  A la mémoire de mon grand-père Cheikh sidi Ahmaida YOUMBAI notre éducateur spirituel, je prie le Dieu qu’il vous accorde la miséricorde et vous offre le paradis;

 A ma mère, ma mère, ma mère qui joue le double rôle en tant que mère et père Lalla Rayhana qui a été avec sa tendresse, son suivi et son sacrifice, la source de mes motivations et de ma persévérance;  Au défunt, Feu mon père sidi Mahmoud, celui qui ne cesse de vivre au plus profond de mon cœur, à mes grands parents vénérés, Sidi Hamma, Lalla Aicha, Lalla Khdija;  A mes frères et sœurs bien aimés, dont la présence à mes côtés m'a été d'un soutien solide durant mon parcours: Mebarka et Mohamed Nacer Eddine, Salima, Sidi hamma, et Mahmoud.

Je dois, par ailleurs, présenter mes remerciements:

 A mon fiancé Abdelmohaimen TIDJANI pour son appui moral et son aide tout le long de ce travail.  A tous mes oncles et mes tentes et leurs enfants.  A l'oncle Mahmoud SOLTANI, ami dévoué de la famille, pour son appui moral.  A toute la famille «YOUMBAI» et «TIDJANI»

«Ce Mémoire à vous tous»

YOMBAI Asma

Remerciements

A ce stade de ma vie estudiantine, et à l'occasion de la présentation de mon mémoire de magister, j'ai l'honneur et le devoir d'exprimer mes louanges absolues à ALLAH, mon créateur généreux et omnipotent, tout puissant, maitre des cieux et de la terre, qui nous a permis de mener à bien ce travail, pour tous ses dons et ses faveurs.

J’exprime mes profonds remercîments à Monsieur OULD EL HADJ Mohamed Didi, Professeur au Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, pour avoir accepté d’encadrer ce mémoire dans le cadre d’un axe de recherche, pour votre présence et votre disponibilité permanente, pour vos conseils et votre soutien et pour l'aide que vous m’avez apporté et pour l'intérêt constant que vous n'avez cessé d'accorder pour l'orientation de ce travail.

Ma profonde reconnaissance est adressée à mon Co-encadreur Monsieur BOUAL Zakaria, maître de conférences B au Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, pour votre aide et vos conseils incessants, vos suggestions, vos orientations tout au long de ce travail, et pour toutes les connaissances que vous m’avez fait bénéficié au laboratoire.

J’exprime mes profondes reconnaissances à Madame BISSATI-BOUAFIA Samia. Professeur au Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, d’avoir accepté de présider le jury de ce mémoire et pour ses encouragements incessants.

Je présente mes remerciements les plus sincères à madame OULD EL HADJ-KHELIL Aminata, Professeur au Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla, et Melle SALHI Nessrine, Maître de conférences A au Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla. Je suis honoré pour avoir accepté de juger ce travail. Je tiens à remercier le Laboratoire de protection des écosystèmes en zones arides et semi arides, pour m’avoir fourni les moyens matériels nécessaires à l’expérimentation, ayant permis la réalisation du présent travail.

J’exprime ma profonde gratitude au responsable des laboratoires pédagogiques du Département des Sciences biologiques à la Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie de l’Université Kasdi Merbah-Ouargla Monsieur BEGARI pour son aide.

Je remercie le laboratoire d’analyse médical «IBN ROCHD» Ghardaïa, et en particulier son Directeur, Dr. AMMI SAÏD Mustapha de nous avoir accueilli au sein du Laboratoire.

Enfin, un grand merci à tous mes enseignants, mes professeurs mes amis (es) et mes collègues du laboratoire et de notre promotion et surtout monsieur Laid TLILI, au département des sciences de la nature et de la vie. A l'université KASDI MERBAH OUARGLA. Et à tous ceux et celles qui avaient contribué à mon instruction, et a participé à façonner, dans le bon sens, ma vie et mes ambitions, ne serait-ce que par l'invocation, l'imploration, et les souhaits.

Merci

Liste des photos

N° Titre page

01 Ferula communisL.(Apiaceae) del’Oued Nechou de la région deGhardaïa 17

02 Inflorescence de l’Ammodaucus leucotrichus Coss. Dur.de larégion de Ghardaia 18

03 Gommes-résines séchées de Ferula communis L. 20

04 Inflorescences séchées d’Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur. Séchées 20

05 Extrait brut des polysaccharides hydrosolubles d’A. leucotrichus 45

06 Extrait brut des polysaccharides hydrosolubles de F. communis FC1 et FC2. 45

07 Observation microscopique des Candida albicans (x 1000) (Photo Originale) 62

08 Observation microscopique du la phagocytose des Candida albicans en présence des 62 polysaccharidiques FC1, FC2, AL (x 1000) (Photo Originale)

Liste des figures

N° Titre Page

01 Différentes étapes expérimentales 16

02 Schéma général des différentes étapes d’extraction des polysaccharides 27 hydrosolubles. 03 Différentes étapes expérimentales de la phagocytose 43

04 Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides 51

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 4 heures à 100°C (premier système) 05 Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides 52

hydrosolubles des fractions FC1, FC2, et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 4 heures à 100°C, (deuxième système). 06 Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides 52

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 6 heures à 100°C, (premier système) 07 Caractérisation par CCM des hydrolysats des extraits de polysaccharides 53

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL, par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 6 heures à 100°C, (deuxième système). 08 Temps (seconde) de céphaline activée (TCA) pour de chacun des trois fractions 55

FC1, FC2, et AL, pour une concentration de 100 µg/10µl. 09 Suivi de l’activité anticoagulante de l’extrait brut des polysaccharides 56 hydrosolubles des inflorescences d’A. leucotrichus (AL).

10 Capacité de la phagocytose des trois fractions FC1, FC2, et AL. 60

11 Activité phagocytaire des trois fractions FC1, FC2, et AL 60

Liste des tableaux

N° Titre Page

01 Origines et caractéristiques physico-chimiques des produits utilisés au cours de 22 l’expérimentation 02 Origines et types d’appareils utilisés au cours de l’expérimentation 24

03 Le rendement d’extraction et teneurs en oses totaux, oses neutres, oses acides, et 48 protéines dans les extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles 04 Valeurs des normalités des différents dosages des extraits bruts obtenus 50

05 Composition en monosaccharides des extraits de polysaccharides hydrosolubles des 54 trois fractions de différentes plantes échantillonnées, dans les deux systèmes de phase mobile 1 et 2 en CCM (FC1, FC2, AL) 06 Résultats de test TP pour l’activité anticoagulante à différentes concentrations de la 56 fraction AL (A. leucotrichus).

07 Activité antioxydante des fractions FC1, FC2 et AL à la concentration 100 µg/ml 57 pour les tests (DPPH, ABTS et FRAP). 08 Matrice de corrélation (R: rendement massique, OT: oses totaux, ON: oses neutres, 63 PBr: protéines Bradford, TCA: test de céphaline activée, AP: activité hagocytaire, DPPH: test 2,2-diphenyle-1-picrylhydrazyle, ABTS: test à l’acide 2,2’-azinobis-3- éthylbenzothiazoline-6-sulphonique, FRAP: test de Test de Ferric Reducing Antioxydant Power, PL: protéines lowry).

Sommaire Introduction 1 Chapitre I: Partie bibliographique I. Aperçu sur les polysaccharides et études phytochimiques antérieures sur les espèces végétales 3 investies I.1. - Généralités sur les polysaccharides 3 I.1.1.- Xylanes 4 I.1.1.1.- Arabino-xylanes 4 I.1.1.2.- Xyloglucanes 6 I.1.2.- Mannane 6 I.1.2.1.- Glucomannanes 6 I.1.2.2.- Galactomannanes 7 I.1.3.- Glucanes (type β) 8 I.1.4.- Arabinogalactanes 8 I.2.-Etudes antérieures de quelques polysaccharides extraits à partir des plantes et leurs activités 8 biologiques I.3.- Généralité sur la famille des Apiaceae 11 I.3.1.- Présentation du genre Ferula 12 1.3.1.1.- Sécrétion des gommes-résines 12 I.3.1.2.- Etudes phytochimiques antérieures du genre Ferula 12 1.3.1.3.- Utilisation traditionnelle 14 I.3.2.- Présentation d’ Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur 14 I.3.2.1.- Etudes phytochimiques antérieures sur Ammodaucus leucotrichus 14 I.3.2.2.- Utilisation traditionnelle d’ Ammodaucus leucotrichus 15 II- Matériel et Méthodes II.1.- Principe adopté 16 II.2.-Matériel 17 II.2.1.-Matériel biologique 17 II.2.1.1.- Choix des plantes 17 II.2.1.1.1.- Ferula communis L 17 II.2.1.1.2.-Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur. 18 II.2.1.2.- Collecte du matériel végétal 19 II.2.1.3.- Technique de séchage des inflorescences d’A. leuchotricus 19 II.2.1.4.- Broyage 20 II.2.2.- Produits chimiques et appareillages 20

II.3.-Etude des polysaccharides 20 II.3.1.- Extraction des polysaccharides hydrosolubles 20 II.3.1.1.- Extraction des polysaccharides des gommes-résines de F. communis 20 II.3.1.2.- Extraction des polysaccharides des inflorescences d’A. leucotrichus 26 II.3.2- Composition des extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles 28 II.3.2.1.- Dosages des oses totaux 28 II.3.2.2.- Dosages des oses neutres et des oses acides 28 II.3.2.3.- Dosage des protéines 30 II.3.3.- Caractérisation des polysaccharides 32 II.3.3.1.- Hydrolyse des liaisons glycosidiques 32 II.3.3.2.-Chromatographie sur couche mince 33 II.4- Activités biologiques des extraits bruts polysaccharidiques 34 II.4.1.-Activité anticoagulante 34 II.4.2.-Activité antioxydante 35 II.4.3.-Activité phagocytaire 38 II.5.- Analyse statistique 44 III- Résultats et discussions III.1.- Caractérisation des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles 45 III.1.1.- Rendement des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles 46 III.1.2.- Composition de l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles 49 III.1.3.- Hydrolyse des liaisons glycosidiques de polysaccharides hydrosolubles 50 III.2.- Activités biologiques des extraits bruts polysaccharidiques 54 III.2.1.- Activité anticoagulante 54 III.2.2.- Activité antioxydante 57 III.2.3.-Activité phagocytaire 59 Conclusion et perspectives 64 Références bibliographiques 65

Introduction

Les polysaccharides sont les macromolécules les plus répandus dans la nature (végétaux, animaux et même chez les microorganismes) (WARRAND, 2004). Chez les végétaux il existe des polysaccharides de structure, de réserves et les fibres alimentaires (solubles et insolubles). Plusieurs espèces végétales appartiennent à des familles botaniques caractéristiques, comportant des cellules spécialisées, dites cellules mucilagineuses ou cellules à mucilages sécrétrices de polysaccharides. Ces cellules sont présentes dans différents organes végétaux (WARRAND, 2004). Le mucilage est déposé dans des couches concentrées de compartiments extra cytoplasmiques. Les rôles des mucilages sont très divers, notamment l'exposition des cellules à mucilage à la surface des organes végétaux, semblent indiquer leurs rôles protecteurs, en outre, leurs caractéristiques hygroscopiques et épaississants recouvrent toutes les autres fonctions (MATTHEWS et ENDRESS, 2006).

L'intérêt important d’utilisation des polysaccharides végétaux, et notamment dans le cas des gommes (exsudats) végétales est dû à leurs diverses propriétés structurelles et fonctions dans les produits alimentaires, les produits pharmaceutiques, les cosmétiques, les textiles et les produits biomédicaux (HAMED et AMID, 2012).

La majorité de la population surtout en Afrique utilise les remèdes décrits par les tradipraticiens, grâce aux espaces vertes existantes un peu partout dans le monde, apparaît comme une alternative à la médecine chimique, ce qui résout un grand problème socio- économique (ANGONE et al., 2010). Cependant, la flore spontanée à caractère médicinal du Sahara Septentrional Est algérien, ainsi que les relations entre l'homme dans cette bande aride, et les espèces végétales méritent une attention particulière dans cette zone saharienne (OULD EL HADJ et al., 2003).

Les plantes médicinales renferment de nombreux principes actifs où certains sont issus du métabolisme secondaire. A cet effet, les métabolites secondaires font l’objet de nombreuses études (DJERIDANE, 2008). Parmi ces composés on retrouve, les coumarines, les alcaloïdes, les acides phénoliques, les tannins, les terpènes et les flavonoïdes (BAHROUN et al., 1996). Des métabolites primaires aussi peuvent jouer le rôle de principes actifs notamment dans le cas des polysaccharides végétaux qui sont largement utilisés en pharmacopée traditionnelle (BRUDIEUX, 2007; WAARAND, 2004).

L’identification, la caractérisation et l’évaluation de nouveaux polysaccharides des plantes médicinales africaines sont devenues un défi. Il est essentiel d’obtenir des informations détaillées sur la structure chimique de telles molécules avant n’importe quelle recherche sur leurs activités biologiques (ANGONE et al., 2010).

À l’heure actuelle les travaux de recherche sont orientés vers l’étude des activités biologiques des polysaccharides. L’analyse de la littérature met en lumière des polysaccharides hydrosolubles extraits des plantes médicinales comme des composés multifonctionnels (DETERS et al., 2005). Les polysaccharides hydrosolubles sont connus pour leurs effets

Introduction biologiques essentiellement immunomodulateurs (ZHANG et al., 2014). Les vertus stimulantes et immunomodulatrice des phytopolysaccharides sont déjà utilisées de façon empirique par la pharmacopée traditionnelle (FLANDROY, 1996; SRIVASTAVA et KULSHRESHTHA, 1989).

Les maladies cardiovasculaires présentent l’une des premières causes de décès dans le monde, de nombreux malades prennent des médicaments thrombolytiques, des anticoagulants à vie (SOUZA et al., 2015). Parmi ces médicaments le Sintrom c’est un coumarine, et l’héparine est un polysaccharides sulfatés généralement extrait à partir des intestins de porc (ROGER, 2002). L’héparine d’origine porcine cause un grand problème pour nous en tant que musulmans, en recherchant plus des principes actifs d’origine végétales par conséquence la valorisation des plantes spontanées.

Cependant, aucune étude n’a été signalée sur les polysaccharides et leurs effets biologiques issus des gommes-résines de Ferula communis et des mucilages d’Ammodaucus leucotrichus qui sont deux plantes médicinales de la famille des Apiaceae du Sahara septentrional.

Le décocté des fruits de l’Ammodaucus leucotrichus est utilisé traditionnellement dans le cas d’indigestion, de diarrhées, d’anorexies, d’allergies, et de vomissements (OULD EL HADJ et al., 2003). Les gommes-résines de Ferula communis, ont un effet sédatif et possède une activité antidiabétique.

Face à ce constat, la présente étude recherche les polysaccharides hydrosolubles de deux plantes spontanées à caractère médicinal connues dans le Sahara septentrional pour leurs effets officinaux. Il s’agit de Ferula communis L. et d’Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur. L’étude porte sur la caractérisation partielle des polysaccharides hydrosolubles et leurs effets anticoagulant, antioxydant et immunomodulateur.

Le travail est structuré en trois chapitres. Le premier chapitre est consacré à une synthèse bibliographique, rappelant des généralités sur les polysaccharides et quelques exemples de familles chimiques de polysaccharides, suivis d’études antérieures sur les polysaccharides extraits de plantes et leurs activités biologiques. Le second chapitre porte essentiellement sur la méthodologie de travail sur l’étude des polysaccharides hydrosolubles à partir des gommes- résines de F. communis et des inflorescences d’A. leucotrichus. Le troisième chapitre présente les principaux résultats obtenus suivis de discussion. Une conclusion générale et des perspectives qui sont un ensemble de réflexions achèvent ce travail.

Chapitre I. Partie bibliographique

Chapitre I.- Partie bibliographique

I.- Aperçu sur les polysaccharides et études phytochimiques antérieures sur les espèces végétales investies

Ce chapitre traite des généralités sur les polysaccharides portant sur des définitions et des descriptions de quelques types de polysaccharides, des études antérieures de quelques polysaccharides extraits à partir de plantes et leurs activités biologiques. De même, des études phytochimiques antérieures et l’utilisation traditionnelle des espèces végétales investies, sont développées.

I.1. - Généralités sur les polysaccharides

Les polysaccharides sont des polymères biologiques constitués d’un ou plusieurs types de molécules monosaccharidiques. Les polysaccharides constitués de mêmes types d’oses sont nommés les glycanes. Chaque polysaccharide est caractérisé par un degré de polymérisation bien déterminé et un type de liaison entre les monomères. Le glucose, le fructose, le galactose sont parmi les monomères constitutifs. Il existe aussi du mannose, de l’arabinose, du xylose et du rhamnose (AYALA et al., 2008; IGNAT, 2012).

Les polysaccharides sont présents chez tous les êtres vivants, dans les végétaux comme l’amidon, la cellulose, les hémicelluloses et les pectines; dans les animaux comme le glycogène et l’acide hyaluronique, la chitine existe aussi chez les insectes et les crustacés; et dans les microorganismes (bactéries, champignons, algues) comme le xanthane, β-glucanes, les carraghénanes (RUFF, 2008).

Les sources de polysaccharides végétaux sont multiples. Ainsi, on distingue les polysaccharides de structure (cellulose, pectines), les polysaccharides de réserve (amidon), les gommes et les exsudats comme (gomme arabique), et enfin les mucilages. Ces deux dernières classes ou catégories, sont des mélanges de polysaccharides hétérogènes qui forment en contact de l’eau des gels. Elles sont très proches et difficilement dissociables (WARRAND, 2004; STEPHEN et CHURMS, 1995).

Les polymères constitutifs des mucilages sont en général des xylanes ou des dérivés pectiques et renferment le plus souvent des oses neutres (xylose, arabinose, galactose, rhamnose,...) et des acides uroniques (acide galacturonique, acide glucuronique) (DELATTRE, 2005; CARPITA et GIBEAUT, 1993).

Les propriétés des polysaccharides, sont largement exploitées dans différents secteurs industriels, aussi bien en industrie agro-alimentaire (comme agents texturants) que dans le domaine pharmaceutique (substances biocompatibles, thérapeutiques). En effet, les interactions polysaccharides-protéines ont un rôle primordial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques (thrombose, inflammation, métastases, stérilité…) (ROGER, 2002). Parmi les propriétés rhéologiques, il existe des hydrogels et des cryogels obtenus à partir de mélanges entre une protéine et un polysaccharide, qui permettent leur manipulation dans des conditions de 3

Chapitre I.- Partie bibliographique techniques de culture cellulaire. Les hydrogels et les cryogels ne présentent pas de cytotoxicité. Ils assurent la viabilité cellulaire dans des milieux de culture standards, le hyaluronate de sodium (NaHyal) et le gellane comme exemple (IGNAT, 2012).

L’analyse de la littérature met en lumière trois groupes principaux de polysaccharides naturels d’origine végétale biologiquement actifs (BONNIN et al., 1997; RALET et al., 2002). - Les homoglycanes neutres, composés exclusivement d’enchaînement de glucose; sont essentiellement des β-1,3 glucanes linéaires, - Les pectines et leurs dérivés tel que l’acide polygalacturonique constitué exclusivement d’acide galacturonique, du rhamnogalacturonane constitué principalement de rhamnose et d’acide galacturonique, des hétéroglycanes neutres tel que l’arabinogalactane formé exclusivement d’arabinose et de galactose et enfin des structures mixtes tels que les arabinogalactanes acides, composés de galactose, d’arabinose, de rhamnose et d’acide galacturonique. - Les hémicelluloses et leurs dérivés: il s’agit essentiellement du 4-O-méthylglucurono- arabinoxylane et des xyloglucanes (BRUDIEUX, 2007).

Les propriétés biologiques des polysaccharides ont beaucoup attiré l'attention des phytothérapeutes, par la richesse des plantes à caractère médicinal utilisées dans la médecine traditionnelle. Plusieurs polysaccharides isolés à partir des plantes supérieures sont des molécules bioactives reconnues pour leurs effets thérapeutiques. Ils sont principalement reconnus pour leurs propriétés immunomodulatrices (SCHEPETKIN et QUINN, 2006; ANGONE, 2010; ANGONE et al., 2010), et anticancérigènes (CHEN et al., 2010), mais également pour leurs propriétés antibactériennes et anti-inflammatoires.

Divers polysaccharides ont d’autres activités biologiques qui ont été signalés, parmi les quelles l’activité antioxydante (WU et al., 2014; ZHAO et al.,2013; KARDOSOVA et MACHOVA, 2006), l’activité anticoagulante (YOON et al., 2002), l’activité antifatigue (ZHANG et al.,2009), antifongique (ROSCA-CASIAN et al., 2007) et l’activité antivirale (SONG et al.,2013).

I.1.1.- Xylanes

Les xylanes représentent les principaux composés hémicellulosiques de la paroi secondaire, et le second biopolymère le plus abondant dans le règne végétal. Ils sont des polymères hétérogènes, qui sont classés et nommés en fonction des principaux oses qui les constituent (ZHANG, 2012). Les xylanes sont considérés parmi les fractions polysaccharidiques (cellulose, galactomannanes, xylanes, xyloglucans, et lignines) insolubles dans l’eau (CAPRITA et al., 2010; JOHNSON, 2001). Ils se retrouvent dans des Monocotylédones (graminées) ou dans des Dicotylédones (herbacées), mais aussi dans quelques familles d'algues rouges et vertes (EBRINGEROVA, 1999). Ils sont prédominants chez les angiospermes (LOPEZ, 2007).

I.1.1.1.- Arabino-xylanes

Le terme générique hétéroxylanes désigne les xylanes substitués par différents résidus 4

Chapitre I.- Partie bibliographique osidiques, tandis que le terme arabinoxylanes concerne spécifiquement les xylanes ayant pour unique substituant osidique l’arabinose (YING, 2012). Les arabino-xylanes sont hydrosolubles (YING, 2012; CAPRITA et al., 2010).

La viscosité des solutions d'arabino-xylanes, est 10 à 50 fois plus forte que celles des solutions de gomme arabique. Les pentosanes ont des activités et des effets surtout dans les pâtes de la farine (BERGER et DUCROO, 2004).

Les arabino-xylanes représentent le type de xylane le plus étudié à ce jour (WARRAND, 2004). Ils sont des hétéropolymères constitués d’une longue chaine linéaire de D-xylopyranoses associés entre eux par des liaisons β (1- 4), sur lesquels sont greffées des molécules α-L- arabinofuranose. L’arabinose reste néanmoins le substituant majeur. Il peut être trouvé en position O-2 ou O-3 du xylose (YING, 2012).

Le taux de substitution ou de branchement (nombre d’arabinoses pour 100 molécules de xylose) est compris entre 0,5 et 1 selon les variétés et l’origine histologique des produits. Les molécules d’arabinoses ne sont pas également réparties sur la chaine formée par les molécules de xylose. Il existe des régions très ramifiées et des zones intermédiaires linéaires. Les ramifications influent sur la conformation des chaines et donc sur les propriétés chimiques et technologiques des pentoses. L’insolubilité des arabino-xylanes s’explique par l’enchevêtrement de ses molécules et leur pontage par l’intermédiaire de l’acide férulique. Les arabinoxylanes sont les hémicelluloses majoritaires dans les parois primaires des Monocotylédones (LOPEZ, 2007).

Le blé, le seigle, l'orge, l'avoine, le riz, le maïs, le sorgho contiennent généralement des hémicelluloses qui sont les principaux constituants de la farine des fibres alimentaires (BERGER et DUCROO, 2004).

I.1.1.2.- Xyloglucanes

Les xyloglucanes sont des types d’hémicellulose constitutive de la paroi cellulaire végétale primaire de type I. La paroi primaire de type I, est composée principalement de cellulose, de xyloglucanes, de pectines et d’extensine (BRUDIEUX, 2007). Des xyloglucanes constituent un nouvel exemple d'oligosaccharines naturels exerçant une activité d'hormones végétales (WOTOVIC, 1989).

Les xyloglucanes sont construits à partir d’une chaîne de glucose, substitué par des unités xylose. Ils forment des liaisons covalentes avec les autres polymères non cellulosiques constituants la paroi végétale (pectines, arabinogalactanes) pour former un réseau (BRUDIEUX, 2007).

Des xyloglucanes sont utilisés comme des épaississants, des stabilisants et des gélifiants dans les aliments, les textiles de dimensionnement et de tissage, comme adhésive ou un agent collant. Les exemples d’agents collant sont les xyloglucanes extraits des graines de tamarin (BORDENAVE, 2009). Les xyloglucanes extraits des grains de tamarin ont plusieurs activités 5

Chapitre I.- Partie bibliographique biologiques tels que l’effet inhibiteur sur les virus de la famille des Polyomavirus et sur l’activité immunomodulatrice. Ils ont aussi des activités biologiques sur la prolifération des cytokines dans différentes lignées des cellules de la peau (ANGONE et al., 2010).

La structure des xyloglucanes des graines, est constituée principalement d’une chaine β- D(1-4) glucane liée à des branchements d’α (1-6) D-xylopyranosyle, ou des résidus de β-D- galactopyranosyle (1-2)-D-xylopyranosyle (BUCKERIDGE et al., 2000). Les xyloglucanes sont des hémicelluloses majoritaires dans les parois primaires des Dicotylédones, l’extraction séquentielle de la paroi permet l’obtention de ce type de polysaccharide (LOPEZ, 2007).

I.1.2.- Mannane

Les mannanes sont, l’un des groupes types des hémicelluloses les plus connus. Ils sont constitués essentiellement par la condensation de mannose par des liaisons β (1-4). La famille des mannanes représente une famille chimique renfermant le mannane pur, les glucomannanes et les galactomannanes (BUCKERIDGE, 2010).

I.1.2.1.- Glucomannanes

Les glucomannanes sont des polysaccharides composés d'une chaîne linéaire de β (1 - 4) D-mannose et d'unités de D-glucose dans un rapport de 1,6:1 avec une petite quantité de ramification (8%) à travers β-liaisons (1- 6)-glucosyle (KATSURAYA et al., 2003). Les glucomannanes sont prédominants chez les gymnospermes et ont un poids moléculaire élevé (200-2000 kDa), et une viscosité élevée en solution aqueuse. Grâce à leurs propriétés émulsifiantes et épaississantes, ils sont beaucoup utilisés en industrie agro-alimentaire comme additif, et ils sont également consommés sous forme de compléments alimentaires (BRAHAM, 2014). Les glucomannanes sont utilisés en cosmétologie pour leur pouvoir gélifiant, pour leurs actions hydratante et adoucissante, et leurs actions lissantes de la peau et des cheveux (ISERIN, 2001).

Des études effectuées sur les glucomannanes confirment que ce polysaccharide a des effets sur la perte de poids, et sur le cholestérol. Les glucomannanes sont un type de fibre soluble dans l'eau, et non digestible dans l'intestin grêle par les enzymes humaines, mais ils sont fermentés par la flore colique. Leur mode d’action pourrait être celui des fibres alimentaires solubles. La plante Amorphophallus konjac (Araceae) riche en glucomannanes, utilisée dans la cuisine japonaise, a fait l’objet de nombreuses études (BRAHAM, 2014).

I.1.2.2.- Galactomannanes

Les galactomannanes ont la structure d'une chaîne polysaccharidique neutre, constituée d'un squelette linéaire composé d'unités de D-mannoses β (1-4), et de branchements latéraux courts formés d'unités de D-galactose α (1-6) (BUCKERIDJE et al., 2000).

Les galactomannanes sont les principaux polysaccharides de l’endosperme de 6

Chapitre I.- Partie bibliographique légumineuses. Ils sont considérés comme source d’énergie participant dans le processus de la germination (BUCKERIDJE et al., 2000).

Chaque galactomannane est caractérisé par le rapport taux de mannose / taux de galactose (M/G). Les rapports M/G du galactomannane des différentes légumineuses varient de 1 pour le trèfle à 4 pour la caroube. En moyenne, la valeur obtenue pour le galactomannane de guar Cyamopsis tetragonoloba L (Fabaceae), se situe à 1.68 (BOURRET EVELYNE, 2001). La quantité de résidus du galactose influe sur la solubilité, la viscosité et les interactions avec les autres polysaccharides (BORDENAVE, 2009). Les galactomannanes sont des polysaccharides hydrosolubles et neutres (PATRICK et al., 2010).

La gomme de caroube est majoritairement composée de galactomannanes constituée d’une chaine principale de résidus D-mannopyranoses liés en β (1-4) sur laquelle se greffent des résidus D-galactopyranoses uniques en α (1-6) (GILLETet al., 2013). Les galactomannanes extraites de Prosopis glandulosa (Fabaceae), ont un grand potentiel comme additif alimentaire surtout comme un agent émulsifiant (MARTINEZ-AVILA et al., 2013). Les espèces les plus étudiées sont le guar Cyamopsis tetragonolobus , le fenugreek Trigonellafoenum graecum et la caroube Ceratonia siliqua (BUCKERIDGE et al., 2000).

En 2003, DICKINSON a classé les galactomannanes parmi les hydrocolloïdes tensioactifs à côté de la gomme arabique et des pectines (PATRICK et al, 2010).

La teneur en galactose contrôle le mécanisme des interactions qui influencent les caractéristiques macromoléculaires (masse molaire et viscosité intrinsèque apparentes) et les propriétés physico-chimiques et fonctionnelles (solubilité, viscosité, viscoélasticité, agent de surface, effet synergique) des galactomannanes (PATRICK et al., 2010).

Les galactomannanes extraits du fenugreek (Trigonellafoenum-graecum L), présentent des activités immunostimulantes (ANGONE et al., 2010).

Les galactomannanes extraits de Punica granatum (Punicaceae) ont une activité anticancéreuse très puissante (MANU et al., 2013). Actuellement, Astragalus armatus (Fabaceae) est considéré comme source de galactomannanes bioactive (BOUAL et al., 2014).

I.1.3.- Glucanes (type β)

Les β-glucanes sont des polysaccharides de D-glucose reliés par des liaisons β (1-3) et Β (1-4). Les β-glucanes sont présents chez les Poales, groupe taxonomique qui inclus les céréales. Ils sont situés dans les couches sub-aleuronique et endospermique des parois cellulaires (EBRINGEROVA et al., 2005).

Les β-glucanes sont les principales molécules qui peuvent s’associer avec des microfibrilles de cellulose au cours de la croissance des cellules (BORDENAVE, 2009). L’avoine et l’orge contiennent 3 à 12% de β-glucanes selon le cultivar (EBRINGEROVA, 2005). 7

Chapitre I.- Partie bibliographique

Les β glucanes forment des agrégats même dans des solutions diluées, et ils sont bénéfiques pour la santé dont la diminution du taux de cholestérol. Ils régulent le taux de glucose sérique. Ils ont des activités immunomodulatrices (BORDENAVE, 2009).

I.1.4.- Arabinogalactanes

Les arabinogalactanes sont des hétéroxylanes neutres composés d’arabinose et de galactose. Les unités de galactose β-D-galactopyranose forment un squelette associé par des liaisons β (1-3), sur lesquels des ramifications sont greffées par l’arabinose (α-L- arabinofuranose). Ils sont des molécules solubles dans l’eau et hautement branchées. Il existe deux types d’arabinogalactanes, des arabinogalactanes neutres et des arabinogalactanes acides constitués de galactose, d’arabinose, de rhamnose et d’acide galacturonique. Ces deux types d’arabinogalactanes sont des dérivés de pectines biologiquement actives (BRUDIEUX, 2007).

Des études éffectuées sur les arabinogalactanes, signalent qu’ils ont des activités immunomodulatrices, surtout ceux qui sont extraits de Juniperus scopolorum (Cupressaceae) présentent une activité immunomodulatrice très puissante (SCHEPETKIN et QUINN, 2006). Les arabinogalactanes solubles dans l’eau comprenant des lipides (hydrosolubles), peuvent être utilisés par exemple pour inhiber l'adhésion cellulaire et pour inhiber l'infection ou l'inflammation (GEOFFREY, 1998). La gomme arabique est constituée essentiellement de ce type de polysaccharide, sa structure est composée d’une chaine principale β-D-galactane (1-3) avec des branchements (1-6) β-D-galactopyranosyl (1-6) qui contiennent des résidus L- rhamnose, L-arabinose et acide D-galacturonique (RIEDACKER et al.,1993).

En 2006, THUDE a effectué une étude in vitro sur les macrophages humains en testant l’effet des arabinogalactanes qui augmentent la sécrétion de TNFα. L’arabinogalactane stimule la prolifération des lymphocytes et augmente la production d’IgM. Il se fixe sur la membrane des leucocytes (THUDE, 2006).

Pour THUDE et al. (2006), l’arabinogalactane d’Echinacea purpurea (Asteraceae) active également le complément. Le complément ainsi activé peut déclencher la réponse inflammatoire.

Les arabinogalactanes et les rhamnogalacturonanes sont reconnus pour leurs propriétés d’activation des composantes du système immunitaire. C’est pourquoi l’utilisation traditionnelle des espèces végétales contenant ces types de polysaccharides dans la cicatrisation des plaies (TOGOLA et al., 2007).

I.2.-Etudes antérieures de quelques polysaccharides extraits à partir des plantes et leurs activités biologiques

Des tests in vitro et in vivo montrent que des polysaccharides hydrosolubles d’Aconitum kusnezoffii Reichb (Ranunculaceae) peuvent être explorés en tant que de nouveaux antioxydants naturels et agents immunostimulants pour l'utilisation dans des aliments fonctionnels ou de médicaments. Ces polysaccharides d’Aconitum kusnezoffii Reichb probablement des arabinanes, 8

Chapitre I.- Partie bibliographique des galactanes et/ou des arabinogalactanes, sont associés à des chaines de rhamnogalacturonane par des liaison non covalentes (GAO et al., 2011).

Une fraction polysaccharidique de type pectique contenant un mélange de galactane (galacturonane et rhamnogalacturonane) extraite des bulbes d’oignon, est un composant actif sur le suc gastrique. Cette fraction diminue l'absorption de l'ovalbumine (OVA) dans le sang à partir de la lumière intestinale (GOLOVCHENKO et al., 2012).

Une étude faite sur l’activité antiulcéreuse des deux fractions polysaccharidiques extraits à partir des racines de Vernonia kotschyana, plante médicinale de la famille des Asteraceae. Une fraction majeur de type inuline à 85%, et l’autre pectique à 15% de type arabinogalactane. L'inuline est sans doute une partie responsable de l’activité antiulcéreuse gastrique. De même, il est possible que les polysaccharides hydrosolubles constitués majoritairement par l’inuline ont un effet indirect sur la santé générale (AUSTARHEIM et al., 2012) AUSTARHEIM et al. (2012), rapportent que l'écorce et les feuilles de Cola cordifolia (Malvaceae) contiennent un type polysaccharidique probablement un rhamnogalacturonane type I qui a une forte activité de fixation du complément in vitro.

Des polysaccharides extraits à partir les feuilles de Ziziphus mauritiana (Rhamnaceae), sont constitués de glucose, des acides galacturonique et glucuronique, de rhamnose et de galactose. Ils ont une activité antidiabétique (DIALLO et al., 2004). Autres polysaccharides extraits des écorces de Geoffroea spinosa (Fabaceae) sont composés d'arabinose, de rhamnose, d'acide hexuronique, de petites quantités de galactose, ont une activité anticoagulante, antiplaquettaire et des effets anti-thrombotiques, mais sans interférence dans le saignement (SOUZA et al., 2015).

Des fractions polysaccharidiques hydrosolubles extraits à partir des feuilles de Morus alba L. (Moraceae) de structure complexes. Ces fractions polysaccharidiques sont composés de mannose, de rhamnose, d’acide glucoronique, d’acide galacturonique, de glucose, de galactose, et d’arabinose avec des rations différentes, peuvent être explorées comme antioxydants naturels (YUAN et al., 2015).

Les études de LI et al. (2015) sur les polysaccharides de Prunella vulgaris (Lamiaceae), signalent qu’ils peuvent être utilisés en tant que antioxydants puissants et agents immunomodulateurs pour la médecine complémentaire ou les aliments fonctionnels.

Des polysaccharides de types arabinogalactane I et arabinogalactane II, sont extraits à partir des racines, des tiges et des feuilles de Terminalia macroptera Guill. et Perr. (Combretaceae). C’est une plante médicinale connue comme une bonne source de fractions contenant des polysaccharides bioactifs. Les deux types de fractions polysaccharidiques extraits, ont une activité sur la fixation de complément (ZOU et al., 2015).

Un nouveau β-glucane contenant des liaisons (1-3) et des branchements (1-6) extrait à partir de Phellinus ribis (Schumach.) Quél. (Hymenochaetaceae), présente une activité 9

Chapitre I.- Partie bibliographique neurotrophique, qui a favorisé de façon significative la croissance des cellules nerveuses immatures, ce qui suggère qu'il pourrait être un candidat potentiel pour le traitement des maladies neurodégénératives (LIU et al., 2015). Deux dérivés sulfatés de β-Glucanes de P. ribis présentent des propriétés anti-angiogéniques et anti-tumorales marquées (LIU et al., 2014).

De nombreuses études suggèrent que des polysaccharides peuvent inhiber la croissance tumorale par des mécanismes communs telle que la prévention de l'oncogenèse par la consommation orale de préparations actives; l’activité anticancéreuse directe telle que l'induction de l'apoptose des cellules tumorales; l’activité immunomodulatrice associée à une chimiothérapie et l’inhibition de la métastase tumorale. Parmi les espèces végétales qui ont cette activité, sont signalés Aconitum coreanum (Runanculaceae), Actinidia eriantha (Acitinidiaceae), inuline des tubercules de Dahlia (Asteraceae), Prunella vulgaris L. (Laminaceae), les fleurs et les graines du thé, Zizyphus jujuba (Rhamnaceae), Curcuma kwangsiensis (Zingiberaceae), (ZONG et al., 2012).

Un polysaccharide isolé à partir de la paroi du corps de Sipunculus nudus L., active les macrophages. Il a une activité immunostimulante puissante. Sa composition en monosaccharides est déterminée avec 28% de rhamnose, 16% de fucose et 56% du galactose. Sa masse moléculaire est de 350 kDa (ZHANG et DAI, 2011).

Des xylo-oligosaccharides sont extraits à partir de la biomasse lignocellulosique des déchets agricoles tels que les déchets de la paille. De nos jours, plusieurs résidus agricoles et sous-produits sont évalués pour extraire du xylane par différents procédés. La plupart des xylanes sont constitués de squelette principal de xylose lié par des liaisons β(1,4) xylo osidiques et substitué par de l'arabinose, l'acide glucuronique, un groupe acétyle ou des groupes méthyles (SAMANTHA et al., 2013).

Le produit d'hydrolyse de xylane, est un substrat pour la population bactérienne commensale colique, agissant en tant que prébiotiques puissants. La fermentation des hydrolysats donne des acides gras à courte chaîne qui améliorent la physiologie des cellules épithéliales intestinales et régulent les processus métaboliques. Ces oligosaccharides possèdent des composés phénoliques liés par l'acide férulique, l’acide coumarique, conférant ainsi un effet antioxydant supplémentaires et une activité immunomodulatrice (SINGH et al., 2015).

Des polysaccharides hydrosolubles des feuilles de Lessertia frutescens, plante médicinale de la famille des Fabaceae, utilisée traditionnellement pour la stimulation du système immunitaire), ont des propriétés immunomodulatrices. Ce sont des polysaccharides de types pectiques. Ils représentent les parties majeures responsables de l’activité biologique. Les régions riches en galactose dans les fractions AGI et AGII ont des activités élevées. Les fragments riches en xylose également donnent une activité plus élevée que celles dépourvues de xylose (ZHANG et al., 2014).

L’activité antivirale des polysaccharides d’origine végétale est l’un des sujets d’actualité. Une étude in vitro sur des polysaccharides sulfatés extraits de Chuanminshen violaceum 10

Chapitre I.- Partie bibliographique

(PSCVs) contre le virus de canard entérite montre que cette fraction PSCVs est très efficace comme agent antiviral (SONG et al., 2013). SONG et al., (2015) signalent que cette fraction est un inhibiteur puissant de la maladie de Newcastle appelée aussi «pseudopeste aviaire» (NDV) causée par un virus appartenant à la sous-famille des Paramyxovirus. C’est l'un des agents pathogènes les plus dévastateurs chez les oiseaux. L'examen histopathologique a montré que PSCVs peut atténuer les lésions tissulaires provoquées par l'infection NDV. Quatre extraits polysaccharidiques (BRP-1, BRP-2, BRP-3 et BRP-4) sont isolés à partir de la partie aérienne de Basella rubra L. (Basellaceae). L’analyse par méthylation des deux fractions BRP-2 et BRP-4 BRP-2, et BRP-4 révèle qu’ils ont des types de pectines natives contenant une partie majeur de homogalacturonanes ramifiés par des rhamnogalacturonanes type I et des branchements de types arabinogalactanes II avec une chaine latérale neutre. Une activité antivirale testée in vivo chez des souris contre le virus d’herpès simplex type 2 et contre le virus grippal A, confirme que la fraction a une activité thérapeutique efficace (DONG et al., 2011).

CHEN et al. (2015) notent deux fractions de polysaccharides (PSA et BSRPS) isolés respectivement d’Astragalus sp. et des racines de Bush Sophora, que la sulfatation des polysaccharides peuvent renforcer la capacité antivirale des polysaccharides. Les fractions BSRPS et BSRPS sulfatés possèdent des activités antivirales plus efficaces que celles de PSA et de PSA sulfatés.

Des polysaccharides extraits à partir Salvia chinensis Benth (Lamiaceae) ont une activité immunostimulante et une activité antitumorale (SHU et al., 2015).

Deux fractions polysaccharidiques RP1 et RP2 extraits à partir de Colza Brassica napus L (Brassicaceae), par WANG et al. (2015), peuvent être exploités comme de nouveaux prébiotiques puissants.

Les prébiotiques composés de fibres solubles tels que les oligosaccharides, ont la propriété de stimuler sélectivement la croissance et l’activité de bactéries coliques bénéfiques.

Une étude in vivo est faite chez les souris ayant une insuffisance rénale chronique par KOPPE et al. (2011). Ils signalent que les prébiotiques des oligosaccharides de types arabinoxylanes semblent être une option thérapeutique intéressante pour améliorer des paramètres métaboliques (taux sériques de cholestérol total, de triglycérides et de glucose).

I.3.- Généralité sur la famille des Apiaceae

Les Apiaceae (Ombellifères) regroupent des plantes appartenant à la classe des Dicotylédones. Ils comprennent environ 3.000 espèces réparties dans toutes les régions tempérées mais surtout dans l’hémisphère Nord. C’est une famille très homogène facile à reconnaître grâce à son inflorescence typique ombelle. Paradoxalement, les espèces de cette famille sont assez difficiles à différencier les unes des autres (CHIBANI, 2013; FILIAT, 2012).

Il s’agit de plantes herbacées, annuelles, bisannuelles ou vivaces, parfois arbustives. Les 11

Chapitre I.- Partie bibliographique feuilles sont alternes, composées, rarement simples. Souvent, les pétioles sont élargis à leur base, engainant la tige. La tige est souvent creuse. Les fleurs sont réunies en ombelles simples ou composées, munies de bractées appelées involucelles à la base. Elles comptent 5 pétales et 5 étamines et un ovaire à deux loges. Les fruits sont formés de deux méricarpes accolés à un axe central, le carpophore se séparant à maturité (CHIBANI, 2013).

Les Apiaceae renferment des plantes alimentaires (la carotte, Daucus carota L.), des condiments et des épices (le cumin, Cuminum cyminum), des plantes médicinales (la khella, Ammi visnaga et le fenouil, Foeniculum vulgare) ainsi que des plantes toxiques (la grande ciguë Conium maculatum) (BRUNETON, 2009).

I.3.1.- Présentation du genre Ferula

Le genre Ferula comporte près de 180 espèces poussant à travers le Monde, principalement dans les régions arides. Cent trente espèces sont communes au bassin méditerranéen et à l’Asie centrale (PIMENOV et al., 2004).

1.3.1.1.- Sécrétion des gommes-résines

De nombreuses espèces du genre Ferula sont connues depuis l'antiquité en tant que sources de gommes-oléorésines (des sécrétions obtenues par entailles répétées de la partie supérieure des racines) surtout le galbanum et l’ase fétide (ALKHATIB, 2010).

Le F. communis très gommifère, se développe dans une ambiance bioclimatique sub- humide inférieure à semi-aride supérieure par exemple les Monts de Tlemcen (Algérie) (BOUAZZA et al., 2001), au milieu de l’Halfa. Cette espèce se trouve aussi à Ain Safra; à Naama, et à Bechar. Dans toutes les montagnes du Sud oranais, sous l'influence de la piqûre des insectes ou d'une blessure quelconque, F. communis sécrète de grosses larmes de gomme résine. C’est un fait qui ne se présente jamais dans le Tell. C'est peut-être la source du Fushog (fassoukh) ou gomme-ammoniaque du Maroc (BATTANDIER et TRABUT, 1888).

VELU et GARDAS (1924) ont signalé par ailleurs que cette résine est, aux dires de GATTEFOSSÉ (1921), l'exsudation pathologique des racines. Dans l’Ouest les tiges vertes une fois piquées par un charançon (Lixus umbellatarum) laissent exsuder en grande quantité une gomme rappelant la gomme ammoniaque: ilk el kelakh ou fessoukh (TRABUT, 1935).

La gomme résine «alkkelakh» ou «fassoukh» s’écoule des lésions naturelles ou provoquées. C’est une sécrétion laiteuse et gluante qui brunit en s’épaississant jusqu’à former des concrétions solides d’odeur aromatique agréable (HAMMICHE et al., 2013).

I.3.1.2.- Etudes phytochimiques antérieures du genre Ferula

Le genre Ferula est étudié depuis plusieurs années. De nombreuses études ont été réalisées sur les métabolites secondaires synthétisés par les différentes parties des espèces 12

Chapitre I.- Partie bibliographique appartenant à ce genre (ERJON et al., 2012; FILIPPO et al., 2009; CHIBANI, 2013; BAGHERI et al., 2014 ).

Les huiles essentielles extraites à partir des feuilles, des fleurs, des racines et des fruits de F. glauca (sub-espèce de F. communis) ont une activité antimicrobienne (FILIPPO et al., 2009). Les huiles essentielles de cette espèce sont constituées par 3 composants majoritaires: le myrcène (52.5%), l’α-pinène (20.90%) et le β-phellandrène (7.70%) (CHIBANI, 2013). En 2012, POLYCARPOS étudiant la production de bioéthanol à partir des tiges et des feuilles, signale que cette espèce peut être considérée comme une usine de production d’énergie dans les régions arides.

La coumarine prénylé (dérivée de coumarines) extraite de F. communis, a une action toxique. La présence de cette molécule est une indication de toxicité (ERJON et al, 2012). Le fenouil géant est une espèce existante au Maroc et à la Sardaigne (Italie) contient un chimiotype toxique responsable d'un syndrome d’hémorragie connue par le férulisme chez les bétails. Les hydroxycoumarines ont une activité antivitamine K. Ce sont des molécules responsables de la toxicité (VALLE et al., 1987; ARAGNO et al., 1988, FLESH, 2005).

Certains esters-daucane sont extraits de F. communis. En Sardinian (Italie) possèdent une activité antiproléfirative des cellules de cancer du colon inférieur chez l’homme (POLI et al., 2005). Des antimycobactériens peuvent être produites par des sesquiterpènes synthétisés par cette espèce. Toutefois leur ingestion peut poser des problèmes toxicologiques et aussi écotoxicologiques (CHIBANI, 2013).

ALKHATIB. (2010) signale que certains composés isolés d’espèces de ce genre considérés comme agents chimiopréventifs, ainsi que pour surmonter la résistance aux anticancéreux en agissant sur la pompe d’efflux de la glycoprotéine P. Il a été suggéré que acétophénone o-phénylé,acétophénone 2- (3-méthylbut-2- enyloxy), extrait des racines de F. communis, induit l'activité analgésique et l’activité anti-inflammatoire (BAGHERI et al., 2014).

La gomme purifiée à partir F. gumosa a réduit la tension de surface et la tension superficielle des émulsions. Des tests sur l'écrémage ont confirmé une bonne stabilité relativement globale sur une période de deux mois. Les mesures rhéologiques ont montré la force d'éclaircir le cisaillement de la nature des émulsions préparés avec la gomme (MOHAMMADZADEH MILANI et al., 2007) . MILANI et al. (2007) ont constaté que le pH et la température influent sur le rendement d'extraction et sur la viscosité des suspensions de la gomme de F. galbaniflua. L’analyse des extraits obtenus révèle la présence de galactose et d’arabinose en proportion 6:1.

Une étude sur l’effet antinociceptive contre les douleurs des gommes oléo-résines de Ferula assa-foetida est réalisée. Cette étude note l’activité analgésique de l’asafoetide qui est en accord avec l'utilisation en médecine traditionnelle de cet extrait comme analgésique et anti- inflammatoire. Toutefois, ses composants actifs et leur mécanisme d'actions doivent être élucidé 13

Chapitre I.- Partie bibliographique par d'autres études (BAGHERI et al., 2014). Une étude sur les polysaccharides hydrosolubles des graines de quelques plantes de la famille des Apiaceae de ZHAUYNBAEVA et al. (2010), rapporte que les principaux constituants des oses après l’hydrolyse sont le rhamnose, l’arabinose, le glucose et le galactose. Les résultats indiquent que les polysaccharides fractionnés peuvent être des rhamnoarabinogalactanes, des rhamnoxylogalactanes, des glucanes et des rhamnoglucanes. D’autres graines des espèces dont Angelica ternata, Coriandrum sativum, Heraclim lehmannianum, Ferula tsehimganica, Ferula diversivittata, Foeniculum vulgare, Mediasia macrophylla, contiennent des polysaccharides de type mannane, cependant aucune étude n’a été signalé sur des polysaccharides issus des gommes résines de l’espèce de F. communis.

I.3.1.3.- Utilisation traditionnelle

La décoction des fruits de Ferula vesceritensis est utilisée pour traiter les maux de tête, la fièvre et les infections de la gorge (AHMED et al., 2007). F. communis est utilisée pour traiter l’hystérie et la dysenterie (HEYWOOD, 1971). RUBIOLO et al. (2006) signalent que la variété communis de F. communis est utilisée pour son latex pour traiter les infections de la peau, alors que la variété breviedia est considérée comme une plante toxique pour les animaux et l'homme. LABBE (1950) signale qu'on en tire également une gomme résine. Il s'agit très probablement de cette résine désignée par VELU et GARDAS, (1924), sous le nom vernaculaire en arabe «fassoukh» et dont les pays musulmans, sont des gros consommateurs.

La gomme, qui suinte de la férule à la suite de la piqûre d'un charançon (fassoukh) est utilisée au Maroc, comme dépilatoire et pour le traitement des ophtalmies (GATTEFOSSÉ, 1921). Cette gomme est aussi signalée par d'autres auteurs sous le nom de «résine» ou «gomme résine» (HAMMICHE et al., 2013).

Les jeunes feuilles du cœur encore blanche sont mangées par les indigènes. Les tiges sèches sont utilisées pour la vannerie et la confection des ruches d’abeilles (TRABUT, 1953). F. communis est connu au Yemen sous le nom «Chemer ou Chemar». Il est utilisé en médecine traditionnelle pour éliminer les sels des urines (AHMED ELKHOLAIDI, 2002).

I.3.2.- Présentation d’ Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur

Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur, est nommé aussi cumin de Sahara (TRABUT, 1935). C’est une plante à très forte odeur d’anis. L’A leucotrichus pousse dans des pâturages désertiques et dans les sables (QUEZEL et SANTA, 1963, OZENDA, 1977).

I.3.2.1.- Etudes phytochimiques antérieures sur Ammodaucus leucotrichus

A. leucotrichus est une espèce peu étudiée. Toutefois, nous pouvons signaler quelques études antérieures sur les huiles essentielles de cette espèce végétale ayant une très forte activité antimicrobienne sur Escherichia coli, une espèce pathogène responsable de plusieurs infections. Ces huiles peuvent être considérées comme des nouvelles sources de médicaments antibactériens 14

Chapitre I.- Partie bibliographique

(GHERRAF et al., 2013). A. leucotrichus offre, en plus de monoterpénoïdes communes, une nouvelle guaianolide ammolactone-A, identifiés par MUCKENSTRUM et al., (1997). Aucune étude n’a été signalée sur les polysaccharides extraits à partir d’A. leucotrichus.

I.3.2.2.- Utilisation en médecine traditionnelle d’Ammodaucus leucotrichus

A. leucotrichus est une plante (éphémère) utilisée en médecine traditionnelle. Le mode d’usage thérapeutique des fruits dans la région de Ouargla est la décoction. Ils sont indiqués dans l’indigestion, l’anorexie, les allergies, les palpitations, la diarrhée et les vomissements (OULD EL HADJ et al., 2003). Ainsi des différentes parties des feuilles, des fleurs et des fruits écrasés sous forme de poudre sont ajoutés dans des repas pour aromatiser (HELLIS, 2005).

Le genre Ammodaucus est parmi les genres les plus utilisés en pharmacopée traditionnelle (FLEURNTIN et al., 2002). Les fruits en infusion, sont très employés dans diverses maladies infantiles de l’appareil digestif: nausées, dysenteries et vomissements (LAHSISSENE et al., 2009). Le cumin laineux est carminatif, diurétique et stimulant digestif (SAIDI, 1999).

A. leucotrichus est une plante considéré comme épice ou condiment (BELLAKHDAR et YOUNOS, 1993). En association avec d’autres plantes, les graines d’A. leucotrichus découpées servent à traiter la lithiase rénale dans la région de Tan Tan au Maroc (GHOURRI et al., 2013).

Chapitre II.

Matériel et méthodes

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Dans le présent chapitre, il est traité le principe adopté, les matériaux utilisés, la méthode d’étude des extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles et leurs activités biologiques. Chacune des parties, est structurée selon les objectifs recherchés.

II.1.- Principe adopté

L'intérêt porté aux plantes spontanées médicinales comme sources naturelles de nombreux principes actifs, a sensiblement augmenté au cours des 20 dernières années. De plus, une attention particulière, est donnée aux polysaccharides. Ce sont composants de différentes drogues traditionnelles européennes et asiatiques (EBRINGEROVA et al. 2003).

Le présent travail s'oriente sur l'étude des polysaccharides potentiellement actifs de plantes spontanées à caractère médicinal du Sahara septentrional Est Algérien. C’est une contribution à élargir le spectre des composés biologiques actifs, pouvant devenir des substituts de drogues synthétiques.

Il s’agit de l’extraction des polysaccharides hydrosolubles à partir des gommes-résines et des inflorescences. Des analyses qualitative et quantitative des hydrolysats de résidus glycosidiques sont effectuées. La chromatographie sur couche mince est l’étape préliminaire pour la caractérisation des lyophilisats de polysaccharides hydrosolubles bruts obtenus. Les activités biologiques des polysaccharides, à savoir l’activité anticoagulante, l’activité antioxydante et l’activité immunomodulatrice sont testées in vitro (figure 1).

Choix des plantes, collecte, séchage et broyage du matériel végétal (30 g de poudre fine sèche)

Extraction des polysaccharides hydrosolubles

Extrait brut

Activités biologiques des Etude de la composition Caractérisation des extraits brut s extraits bruts

Dosages des oses totaux Hydrolyse acide des Activité anticoagulante Dosages des oses neutres liaisons glycosidiques . Activité anti-oxydante Dosages des oses acides  Chromatographie sur Activité immuno-  Dosages des protéines couche mince (CCM) modulatrice

Figure 1.- Différentes étapes expérimentales

ChapitreII.- Matériel et méthodes

II.2.- Matériel

Le matériel d’étude est constitué de matériel biologique, de produits chimiques et d’appareillages utilisés au cours de l’expérimentation.

II.2.1.- Matériel biologique

Le matériel biologique regroupe deux espèces des plantes spontanées, du sang humain et des levures (Candida albicans).

II.2.1.1.- Choix des plantes

Le choix des plantes est effectué en fonction de critères botanique, chimiotaxonomique, utilisation des plantes en médecine traditionnelle et une origine géographique commune (HOUEL, 2011). Deux espèces de la famille des Apiaceae dont Ferula communis L., d’Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur., sont retenues pour la présente étude.

II.2.1.1.1.- Ferula communis L. Ferula communis est une plante méditerranéenne, un arbrisseau vivace pouvant atteindre deux mètres de haut, à croissance très rapide (quelques semaines). Les feuilles plus petites à segments larges de 1-3mm, longs de 1-2cm. Les méricarpes à 3 bandelettes par vallécule. C’est une plante du Tell littoral. Les fruits sont à pédicelles très courtes. F. communis (photo1) se caractérise par une inflorescence très denses, multiflores, épis hauts de 10-15 cm à corolles longues de 15-20mm. Les écailles des tiges sont petites, ovales et obustes (QUEZEL et SANTA, 1963). La totalité de l’appareil végétatif est parcouru de canaux sécréteurs contenant un mélange d’essence et de résines (FILLIAT, 2012).

Photo 1.- Ferula communis L. (Apiaceae) à l’Oued Nechou de la région de Ghardaïa.

ChapitreII.- Matériel et méthodes

II.2.1.1.1.1.- Répartition géographique

Le genre Ferula comporte près de 180 espèces poussant à travers le Monde, principalement dans les régions arides. Cent trente espèces sont communes au bassin méditerranéen et en Asie centrale (PIMENOV et al., 2004). Cette espèce pousse en Italie, en Iran et au Yémen. Dans le Nord d’Afrique, Ferula communis se trouve surtout au Maroc et en Algérie. Sa distribution en Algérie est très large. Elle se trouve sur les Monts de Tlemcen à Ain Safra; à Naama, à Ghardaïa et à Bechar (BOUAZZA et al., 2001; BATTANDIER et TRABUT, 1888)

II.2.1.1.1.2- Position botanique

Selon QUEZEL et SANTA (1963), la position systématique de Ferula communis L. est donnée comme suit: Embranchement Angiospermes Classe Dicotylédones Ordre Apiales Famille Apiaceae Genre Ferula Espèce Ferula communis L

II.2.1.1.2.- Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur.

Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur. (photo 2), est nommé aussi cumin de Sahara (TRABUT, 1935). A. leucotrichus est plante annuelle glabre à tiges peu élevées, à feuilles très divisées en lanières étroites, un peu charnues. Les Méricarpes allongés à cotés secondaires couvertes de longs poils soyeux très denses. Les fruits très velus, portant de longs poils crépus, jaune-roux à la base, puis blancs et longs. C’est une plante à très forte odeur d’anis. A leucotrichus pousse dans des pâturages désertiques et dans les sables (QUEZEL et SANTA, 1963, OZENDA, 1977).

Photo 2.- Inflorescence de l’Ammodaucus leucotrichus Coss. Dur (Apiaceae) à l’Oued Nechou dans la région de Ghardaïa. 18

ChapitreII.- Matériel et méthodes

II.2.1.1.2.1.- Répartition géographique

A. leucotrichus se retrouve au Nord de l’Afrique en Algérie, au Maroc, en Tunisie, en Libye. Sa distribution s’étend jusqu’en l’Egypte et en Afrique tropicale. A. leucotrichus est assez commun dans les pâturages désertiques, les secteurs du Sahara septentrional et occidental. Il est rare dans le secteur du Sahara central (BELTRAN, 1983). Cette espèce se retrouve à Oued Souf, à Ouargla et à Ghardaïa.

II.2.1.1.2.2.- Position botanique

Selon QUEZEL et SANTA (1963), OZENDA (1977) la position systématique d’Ammodaucus leucotrichus Coss. et Dur, est comme suit: Embranchement Angiospermes Classe Dicotylédones Ordre Apiales Famille Apiaceae Genre Ammodaucus Espèce Ammodaucus leucotrichus Coss.Dur.

II.2.1.2.- Collecte du matériel végétal

Les échantillons sont récoltés à partir des zones caractérisées par un climat désertique, et transportés dans des papiers ou sont notées toutes les informations concernant les plantes. Pour la présente étude un échantillonnage aléatoire est adapté (OULD EL HADJ et al., 2003).

Pour une bonne réussite de l’échantillonnage, la saison où le développement et la diversité floristique sont maxima, notamment pour les espèces annuelles, est retenue. La floraison des espèces pérennes facilite leur identification (OZENDA, 1983).

Les gommes de F. communis (photo 3) sont collectées en été 2014 dans la région de Bechar, et les inflorescences d’A leucotrichus (photo 4) sont récoltées dans la région de Ghardaïa au printemps 2014. Les plantes après la récolte sont transportées au laboratoire pour analyse dans des sacs en papier kraft où sont notées toutes les informations concernant les plantes (OZENDA, 1977).

II.2.1.3.- Technique de séchage des inflorescences d’A. leuchotricus

Les inflorescences d’A. leucotrichus , une fois séparée des parties aériennes, sont séchées à l'abri de la lumière à l'air libre à la température ambiante durant trois semaines jusqu’à l’obtention d’un poids sec (DIALLO et al., 2004). Les inflorescences séchées sont conservées dans des sachets en papier kraft dans un milieu sec à l'abri de la lumière jusqu'à leur analyse.

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Photo3.- Gommes-résines séchées de F. communis Photo 4.-Inflorescences séchées d’A. leucotrichus L. Coss et Dur.

II.2.1.4.- Broyage

Les gommes et les inflorescences sont broyées pour obtenir une poudre fine (ZHU et al ., 2014), puis séchées à l’étuve jusqu’à fixation du poids sec qui servira pour la préparation des extraits polysaccharidiques.

II.2.2.- Produits chimiques et appareillages

Les produits chimiques et les appareillages utilisés au cours de l’expérimentation, sont consignés dans les tableaux 1 et 2.

II.3.- Méthodologie de travail

II.3.1- Etude des polysaccharides

L’étude des polysaccharides concerne l’extraction et le dosage des différents constituants en oses totaux, en oses neutres, en oses acides et en protéines, mais aussi l’hydrolyse et la caractérisation par CCM des extraits bruts polysaccharidiques.

II.3.1.1- Extraction des polysaccharides hydrosolubles

Les différentes étapes d’extraction des polysaccharides hydrosolubles à partir des gommes-résines de F. communis et des inflorescences d’A. leucotrichus, sont décrites sur la figure 2. II.3.1.1.1.- Extraction des polysaccharides des gommes-résines de F. communis

Trente (30) grammes de poudre sèche de gommes-résines sont prétraités sous agitation douce par 2 volumes d’éther de pétrole pendant 24 heures (WANG et al., 2013) afin d’éliminer

ChapitreII.- Matériel et méthodes les composés lipidiques. Après une filtration, le résidu est séché à la température ambiante à l'abri de la lumière.

Les gommes ainsi séchés sont macérées dans 100ml d’eau distillée (CHIDOUH et al., 2014) pendant 2 heures à 80°C sous agitation. Une centrifugation (SIGMA. 15PK, 14000 RPM) à 4000rpm pendant 15mn (CHEN et al., 2010) est effectuée. Le culot est macéré une deuxième fois par 50ml d’eau distillée dans les mêmes conditions. Une troisième extraction par macération à froid est faite pour le deuxième culot dans 50ml d’eau distillée à température ambiante durant une nuit, puis les trois surnageant sont réunis. Les polysaccharides de l’extrait concentré sont précipités à l’aide de 3 volumes d’isopropanol (95%) (IBANEZ et FERRERO, 2003) pendant 24 heures à 4°C. Après une centrifugation à 4000 rpm pendant 15 mn, le culot est récupéré puis lavé trois fois par l’acétone (ZHAUYNBAEVA et al., 2010) et lyophilisé par un lyophilisateur de type CHRIST ALPHA 1-2LD. 101021.230V, 50HZ, 0.7. KW à -65°C pendant 24 heures (He et al., 2014 ). Le lyophilisat ainsi obtenu, représente l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles (première fraction).

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Tableau 1.- Origines et caractéristiques physico-chimiques des produits utilisés au cours de l’expérimentation.

Caractéristiques Massse Produit Formule Densité Pureté Forme molaire Chimique (g/cm3) (%) (g/mol)

Acétone Liquide C3H6O 58.08 0.792 100

Acideacétique Liquide CH3COOH 60,05 1.048-1.051 99.5 Acidechloro- hydrique Liquide HCl 36.46 1.19 37

Acideortho-phosphorique Liquide H3PO4 98 1,69 85-88

Acideorthophosphorique Liquide H3PO4 / 85

Acétone Liquide C3H6O 58.08 / 99.5

Aniline Liquide C8H7N 93.13 / 99

Acideacétique Liquide CH3COOH 60,05 / 99.5

Acetate de Na Poudre CH3 COONa 82,03 / /

Acideacétique Liquide CH3 COOH 60,04 1,0480-1,051 99,5 Acidechlorhydrique Liquide HCl 36,5 1,178 35-37

Chlorure de calcium Poudre CaCl2 110.98 2.15 99.9

Chlorure de magnesium Poudre MgCl2 95.21 2.32 98 Chlorure de potassium Poudre KCl 74.55 1.98 99 Chlorure de sodium Poudre NaCl 58.44 2.16 99.5

Diphénylamine Liquide C12H11N 169.23 52.5-54.5 98 Hydroxyde de sodium Poudre NaOH 39.997 2.13 99

Méthanol Liquide CH3OH 32.04 0.79 99.9

Phosphate de potassium dibasique Poudre KH2Po4 136.09 2.338 99

Ethanol Liquide C2H6O 46.07 99.5 Ether de pétrole Liquide / / / 95

Isopropanol Liquide C4H8O 60.10 0.803-0.805 99.5

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Phénol Liquide C6 H6 O 94.11 / 90 SérumAlbumine Bovine (BSA) Solide / 96

Pentahydrate de sulfate de cuivre (II) Solide CuSO4, 5H2O 249.68 / /

Méthanol Liquide CH4O 32.04 / 99

Pyridine Liquide C5H5N 79.10 / 99.5

Acétated’éthyle Liquide C4H8O2 88.11 /

1-butanol Liquide C4H10O 74.12 0.807-0.812 99.5

Chloroforme Liquide CHCl3 119.38 / 99

ABTS (2,2’-azino-bis-3- Poudre C18H24N6 O6 548 / 98

éthylbenzothiazoline-6-sulphonique) S4 TPTZ (2,4,6-tris (2-pyridyl)- -s- Poudre C19H12N6 312,33 / 99 triazine)

DPPH (2,2-Diphenyl-1- Poudre C18H12N5 O6 394 / / picrylhydrazyl)

FeCl3 (Fer (III) chlorurehexahydraté) Poudre Cl3 Fe.6H2O 270,30 / /

persulfate de potassium Poudre K2S2O8 270,31 / /

Méthanol Liquide CH4O 32,04 / 99,7

Ethanol Liquide C2H6O 46,07 0,805-0,811 95

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Tableau 2.- Origines et types d’appareils utilisés au cours de l’expérimentation

Appareil Type Lieu de fabrication Agitateur magnétique F20520162 EUROPE Bain marie MEMMERTGMBH. WB 7. NENNTEMP ; 1000C GERMANY Balance DISOVERY DV 215CD OHAUS. USA. Centrifugeuse SIGMA. 15PK, 14000 RPM. GERMANY Distillateur D30-BURGWEDL, 2108 GERMANY Etuve MELAG815.220V, 50HZ, 12.3A, 2700w. GERMANY Hotte TELSTAR AV-100. MODELE50/60 HZ, 0.6KW. SPAIN Lyophilisateur CHRIST.ALPHA 1-2LD. 101021.230V, 50HZ, 0.7. KW. GERMANY Micropipette ACURA 821. 200-1000ΜL SWIS Spectrophotomètre UV-MINI-1240.UV-VIS SPECTROPHOTOMETRE CHINA Spectrophotomètre UV Visible type LNICAMYEAR, 2000 JAPAN Mixeur R11 CHINE Centrifugeuse 6-15, N° série 121047 ALLEMAGNE Lyophilisateur ALPHA 1-2 LD, N° série 9855 ALLEMAGNE Bain Marie BAE-4, N° série 66513 Cє pH mètre INOLAB pH 720, N° série 08090760 ALLEMAGNE Agitateur magnétique KM2, N° série 166113MW00600 ALLEMAGNE Balance EX324, N° série B240381179 SWITZERLAND

ChapitreII.- Matériel et méthodes

Etuve D-6072 ALLEMAGNE Spectrophotomètre UV mini-1240, N° série A109345 JAPAN Applicateur SUPER Z, N° série 4084 USA Autoclave 0178107 3707G3, N° série 028717 Cє Micropipette ACURA 825 (autoclavable) 20-200 μl, N° série 24021951 SWISS Macropipette ACURA 835 (autoclavable) 0,5-5 ml, N° série 24011259 SWISS Bain marie J-BA08, N° série 1004-04 CHINE Balance ALS220-4N, N° série WL085590 ALLEMAGNE Spectrophotomètre 6315, N° série 1130 UK pH mètre AD8000, N° 1138644 ROUMANIE

Chapitre II.- Matériel et méthodes

Le culot de la troisième extraction est macéré par l’eau distillé à 90°C pendant 1 heure, puis précipité par 80ml d’isopropanol absolu pendant 24 heures à 4°C. Après une centrifugation le culot est récupéré et lavé trois fois par l’acétone et lyophilisé à -65°C pendant 24 heures. Le lyophilisat obtenu représente la deuxième fraction de l’extrait brut des polysaccharides hydrosolubles.

II.3.1.1.2.- Extraction des polysaccharides des inflorescences d’A. leucotrichus

Trente (30) grammes de poudre sont prétraités quatre fois par 2 volumes d’éther de pétrole (WANG et al., 2013) pour éliminer les lipides pendant 5 heures à la température ambiante avec une agitation constante et douce. Les résidus sont séchés après filtration à l'abri de la lumière et à la température ambiante.

Les inflorescences ainsi séchées sont macérées dans l’eau distillée (CHIDOUH et al., 2014) pendant 2 heures à 80°C et sous agitation constante. L’extraction est répétée trois fois. Après une centrifugation à 4000 rpm pendant 15mn (CHEN et al., 2010), les trois surnageants sont réunis et concentrés.

Les polysaccharides de l’extrait concentré, sont précipités à l’aide de 3 volumes d’isopropanol (95%) (IBANEZ et FERRERO, 2003; BOUAL, 2015) pendant 24 heures à 4°C. Après une centrifugation à 4000rpm pendant 15mn, le culot est récupéré puis lavé trois fois par l’acétone (YAN et al., 2008) et lyophilisé pendant 24 heures (He et al., 2014). Le lyophilisat représente l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles (He et al., 2014).

- Calcul du rendement des polysaccharides (extraits bruts)

Le rendement massique, est un rapport entre la masse de l’extrait brut obtenu et la masse de la matière de départ. Il se calcule comme suit (DIALLO et al., 2004):

R (%) = (poids de l’extrait brut des polysaccharides hydrosolubles/ poids de la matière végétal sec) ×100

Chapitre II.- Matériel et méthodes

Matière végétale 30g de broyat sec

Traitement par 2vol l’éther de pétrole Elimination des lipides pendant 24h

Macération de résidu séché par l’eau distillé /2h avec agitation/ 3 fois / 80 C

Centrifugation 4000rpm, 15 min surnageant

Précipitation des polysaccharides par 3 vol d’Isopropanol (95%) / 4 C pendant 24h

Centrifugation 4000rpm, 15 min culot

lavage par l’acétone 3 fois

Extrait brut Lyophilisation

Figure 2.- Schéma général des différentes étapes d’extraction des polysaccharides hydrosolubles (YAN et al., 2008; CHEN et al., 2010; WANG et al., 2013; BOUAL, 2014; CHIDOUH et al., 2014; He et al., 2014; ZHAUYNBAEVA et al., 2010; ZHU et al ., 2014).

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.1.2.- Composition des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles

Une solution mère de 1g/l soit 0,1% est préparée à partir de chaque extrait brut de polysaccharides à analyser. Cette solution est diluée à 1/10 pour obtenir une solution de 0,01% utilisée pour les différents dosages.

II.3.1.2.1.- Dosages des oses totaux

Pour déterminer la concentration des oses totaux dans les extraits bruts, la quantification se fait selon la méthode de DUBOIS (1956).

II.3.1.2.1.1.- Principe

En milieu acide et à chaud, les liaisons glycosidiques sont hydrolysées. La déshydratation des unités osidiques conduit à la formation de dérivés furfuriques qui interagissent avec le phénol pour former des composés de coloration orange-jaune absorbant à 492 nm. Une gamme étalon de glucose est réalisée avec des concentrations comprises entre 0,1 et 1 g/l.

II.3.1.2.1.2.- Réactif

La solution de réactif de phénol à 5% est préparée par l’ajout de 100ml d’eau distillée à 5g de phénol. La solution mère d’étalon est préparée par l’ajout de 0,1g de glucose dans 100ml d’eau distillée.

II.3.1.2.1.3.- Mode opératoire

Dans des tubes en verres placer un mélange de 200μl d’échantillon et 200μl de phénol

5%. Après homogéinisation, 1ml d’acide sulfurique H2SO4 (96%), est rapidement introduit dans le milieu réactionnel. Les tubes sont ensuite incubés à 100°C pendant 5 mn, puis ils sont laissés 30 mn à température ambiante et à l’abri de la lumière. L’absorbance est mesurée à 492 nm (BRUDIEUX, 2007; RUIZ, 2005; GENESTIE, 2006).

II.3.1.2.2.- Dosage des oses neutres et acides

Pour la détermination des concentrations des oses neutres et des oses acides dans les extraits bruts, il est fait appel aux méthodes de MONSIGNY et al. (1988) et de BLUMENKRANTZ et ASOBOE-HANSES (1973).

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.1.2.2.1.- Principe

Le dosage des oses constitutifs des polysaccharides repose sur la réaction des dérivés furfuraliques obtenus par action à chaud, d’un acide concentré comme l’acide sulfurique

(H2SO4), pour divers composés aromatiques tels que le résorcinol pour le dosage des oses neutres (MONSIGNY et al., 1988) et le méta-hydroxy-diphényle pour le dosage des acides uroniques (BLUMENKRANTZ et ASOBOE-HANSES, 1973). La concentration en oses neutres est obtenue par référence à une gamme étalon de glucose et celle des oses acides avec une gamme étalon d'acide uronique. Les gammes d’étalonnages sont réalisées avec des concentrations en glucose et en acide glucuronique comprises entre 0,01 et 0,1 g/l.

II.3.1.2.2.2.- Mode opératoire

Le mode opératoire des dosages des oses neutres et des oses acides débute par la préparation des réactifs suivie de la description des modes opératoires de chaque type d’oses.

II.3.1.2.2.2.1.- Réactif

Résorcinol: 0,6g de résorcinol est additionné dans 100ml d’eau distillée, conservé à 4°C à l’obscurité (WARRAND, 2004),

Borax (NaH3BO4) 120mM: 0,12M Borax: A 0,95 g, il est additionné 1ml H2O puis complété à

100ml par H2SO4 (96%). MHDP 0,15% est préparé par l’ajout de 0,075 g métahydroxydiphénylamine (MHDP) dans 50ml NaOH 0,5%. La solution mère des étalons, est préparée par l’ajout de 0,1g de glucose ou de l’acide glucuronique dans 100ml d’eau distillée (annexe 1).

II.3.1.2.2.2.2.- Oses neutres

Deux cent (200) microlitres de solution à doser sont mis dans des tubes en verre; 200 µl de solution résorcinol sont ajoutés, puis 1 ml d’H2SO4 à 96% est rapidement introduit dans le milieu réactionnel. Après agitation les tubes sont incubés à l’étuve à 90°C, pendant 30 mn jusqu’à l’apparition d’une couleur jaune brun. Après refroidissement dans un bain de glace pendant 30 mn et à l’abri de la lumière, l’absorbance est mesurée à 480 nm (MONSIGNY et al., 1988).

II.3.1.2.2.2.3.- Oses acides A 200μl de solution à doser, il est ajouté 1,2 ml de solution de tétraborate de sodium (borax) dans un bain de glace. Le mélange est agité et chauffé à 100°C pendant 5mn dans un bain Marie. Après refroidissement dans un bain de glace, 20μl de solution de méta-hydroxy- diphényle (MHDP) sont additionnés au mélange, à l’exception 20μl du NaOH (0,5%) sont ajoutés au blanc au lieu du MHDP.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

L’absorbance est lue à 520nm après 5mn, la couleur violacée indique la présence des oses acides (BLUMENKRANTZ et ASBOE-HANSEN, 1973).

II.3.1.2.2.2.4.- Calcul des concentrations en oses neutres et acides

Les concentrations en oses neutres et en acides uroniques des extraits de polysaccharides, sont déterminées par la méthode de correction développée par MONTREUIL et al. (1963). Il est alors possible de corriger les interférences des acides uroniques dans le dosage des oses neutres et réciproquement. L'analyse spectrophotomètrique des solutions témoins d’oses neutres (Glc) et d’acides uroniques (Glc A.) permet de tracer les droites d'étalonnages du dosage. La pente de chaque droite d’étalon est ensuite mesurée.

Dosage au résorcinol: Pente = α pour le Glc et Pente = β pour le Glc A

Dosage au MHDP : Pente = α’ pour le Glc et Pente = β’ pour le Glc A

A partir des calculs des pentes et en fonction des densités optiques (DO) mesurées lors des dosages, les concentrations en acides uroniques (AU) et en oses neutres (ON), sont déterminées grâces aux expressions suivantes:

DO résorcinol = α [ON] + β [AU], DO MHDP = α’ [ON] + β’ [AU]

On a alors: [ON] = DO résorcinol - β [AU] / α [AU] = α [DO MHDP - α’DO résorcinol/ α β’-α’ β].

II.3.1.2.3.- Dosage des protéines

Deux méthodes dont celle de LOWRY(1951) et celle de BRADFORD (1976) ont servi à quantifier la concentration de protéines dans les extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles obtenus. Sachant que chaque méthode a une sensibilité bien déterminée, les deux méthodes sont utilisées pour confirmer les résultats.

II.3.1.2.3.1.- Méthode de LOWRY

La méthode de LOWRY, est colorimétrique. Elle est utilisée pour le dosage et la détection des protéines dans les extraits bruts de polysaccharides obtenus.

II.3.1.2.3.1.1.- Principe

Les échantillons sont préalablement traités avec un réactif cuivrique alcalin de Lowry avant de réagir avec le réactif de Folin. Ce réactif permet la réduction des acides aminés aromatiques (tyrosine et tryptophane), conduisant à la formation d’un complexe coloré bleu foncé dont l’absorbance est mesurée à 750 nm (LOWRY, 1951). 30

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.1.2.3.1.2.- Réactifs

Pour le réactif de Lowry (C), deux solutions A et B sont préparées séparément puis mélangées avant utilisation avec un ratio, solutions A:B de 50: 1.

Solution A : deux grammes (2g) de Na2CO3 est ajouté à 100 ml d’eau distillée, puis mélangé avec 100 ml d’une solution NaOH (0,1N).

Solution B: CuSO4, 5H2O (0,142 g) est dissout dans de l’eau ultra pure 10 ml, 0,285g de

C4H4Na2O6.2H2O est dissout dans 10ml l’eau ultra pure; mélanger une solution de CuSO4 (5%) dans une solution de tartrate de sodium (1%). Solution C: 50 ml solution A avec 1 ml solution B.

Le réactif de Folin est préparé juste avant utilisation en diluant 5 ml de réactif dans 6ml d’eau ultra pure. La gamme d’étalonnage est réalisée par des concentrations en sérum albumine bovine (SAB) comprises entre 0,01 à 0,1%.

Solution mère des étalons: dissoudre 0,1g de SAB dans 100ml d’eau distillée (annexe 2).

II.3.1.2.3.1.3.- Mode opératoire

Quatre cents (400) microlitres d’échantillon sont mélangés à 2ml de réactif de Lowry puis incubés 20mn à la température ambiante et à l’obscurité. Au terme des 20mn, 200μl de réactif de Folin dilué, sont ajoutés au mélange réactionnel avant de laisser les tubes incuber à l’obscurité pendant 30mn à la température ambiante. L’aborbance est mesurée à 750 nm au spectrophotomètre UV-Visible type SHIMADZU UV mini-1240, N° série A109345.

II.3.1.2.3.2.- Méthode de BRADFORD (Micro-assay) La teneur en protéines dans les extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles est déterminée par la méthode de BRADFORD (1976).

II.3.1.2.3.2.1.- Principe

En milieu acide, le réactif de Coomassie de coloration marron se lie aux protéines provoquant la formation d'un complexe de coloration bleue qui absorbe entre 465 et 595 nm. Une courbe d’étalonnage est tracée en utilisant du sérum albumine bovine (SAB) comme référence standard (WARRAND, 2004). II.3.1.2.3.2.2.- Réactif de Bleu de Coomassie

À 50mg de Bleu de coomassie sont ajoutés 25ml d’éthanol (95%), puis agités pendant 2h, après filtration sur papier Whatman N°1, 50ml d’acide phosphorique 85% sont ajoutés. Le réactif est dilué jusqu’à 500ml par l’eau distillé. Le réactif est stocké à l’obscurité et à la température ambiante.

La solution mère d’étalon est préparée par l’ajout de 0,01g de SAB à 100ml d’eau distillée (annexe 03) 31

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.1.2.3.2.3.- Mode opératoire

Dans des tubes en verre, il est additionné un volume 400ul de solution à doser, puis 2ml de réactif de coomassie. Le mélange est homogénéisé pendant 30 secondes. L’absorbance est mesurée à 595 nm après 2mn. La coloration est stable pendant une heure (BRADFORD, 1976).

II.3.1.3.- Caractérisation des polysaccharides

La détermination de la composition monosaccharidique de l’extrait polysaccharidique brut se fait par une hydrolyse acide suivie par chromatographie sur couche mince (DELATTRE, 2005).

II.3.1.3.1.- Hydrolyse acide des liaisons glycosidiques

Pour la caractérisation des résidus glycosidiques, une déstructuration importante des polymères s’avère nécessaire, sans toutefois en altérer irréversiblement la structure des oses constitutifs.

II.3.1.3.1.1.- Principe

L’hydrolyse consiste à couper les liaisons osidiques, à pour but de dépolymériser les polysaccharides à analyser par un acide. La dépolymérisation peut être conduite avec des acides forts à de concentrations variables sous diverses conditions opératoires (température, temps de réaction, concentration de l’acide), selon la nature et la structure du polysaccharide.

Des acides minéraux forts peuvent être employés à chaud pour l’étude des polysaccharides tels que l’acide chlorhydrique (HCl), l’acide sulfurique (H2SO4), l’acide trifluoroacétique (TFA), l’acide formique ou encore l’acide nitrique (DELATTRE, 2005). Mais, en raison des dégradations non spécifiques due à la force de l’acide, l’acide trifluoroacétique est préféré. Il présente de plus l’avantage d’être éliminé facilement par coévaporation avec du méthanol (BRUDIEUX, 2007).

II.3.1.3.1.2.- Réactif

L’acide trifluoroacétique (TFA) à 2M est préparé à partir l’acide trifluoroacétique pure.

II.3.1.3.1.3.- Mode opératoire

Vingt cinq (25) milligrammes de chaque extrait brut de polysaccharides hydrosolubles lyophilisé sont hydrolysés par 1ml d'acide trifluoroacétique 2M, à 100°C pendant 4 heures, dans des tubes fermés. Après refroidissement dans un bain de glace, l’hydrolysat est récupéré. L'acide est coévaporé par l’ajout de quelques gouttes de méthanol. Les hydrolysats sont déposés dans un dessiccateur sous hotte pendant 24 heures jusqu’à évaporation complète (ATHUKORALA et al., 2006). 32

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.1.3.2.- Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince est une technique d’analyse qualitative et quantitative utilisée dans la présente étude pour l’identification des différents oses constitutifs des polysaccharides hydrosolubles. II.3.1.3.2.1.- Principe

La chromatographie sur couche mince (CCM) est une méthode d’analyse couramment utilisée pour l’identification de composés organiques et, permet un contrôle aisé et rapide de la pureté des produits analysés (AUTRAN, 1991). L'identification est rendue possible grâce à des témoins, solutions de sucres connus déposés dans les mêmes conditions que le mélange à analyser. Chaque sucre est caractérisé par son Rf, rapport de la distance de migration du spot à la distance de migration du front du solvant (AUDIGIE et al., 1980).

De plus, étant donné que la CCM indique le nombre de composants d’un mélange, semble employer pour suivre la progression d’une réaction comme, c’est le cas de l'hydrolyse de polysaccharides (DELATTRE, 2005).

Après migration, les spots sont révélés par une réaction colorée le Nigrum, basée sur les réactions furfuraliques des sucres. Après chauffage à l'étuve à 105°C pendant 10 à 15mn les aldohexoses donnent une coloration bleuâtre, les aldopentoses donnent une coloration verdâtre, les cétoses donnent une coloration rougeâtre (PAULSEN et al., 2002). II.3.1.3.2.2.- Révélateur

Le révélateur utilisé est le Nigrum. Ce dernier se compose de deux solutions A et B selon PAULSEN et al. (2002): - Solution A: 4g de diphénylamine dans 100 ml d'acétone, - Solution B: 96 ml d'acétone complété jusqu'à 100 ml par l'aniline. Après mélangé les deux solutions A et B, 20 ml d'acide ortho-phosphorique (85%), sont ajoutés.

II.3.1.3.2.3.- Mode opératoire

Les plaques sont préparées par le traçage d’une ligne fine de dépôt à 1,5cm du bord inferieur, puis activée dans l’étuve à 100°C pendant 10 mn. Après activation, les plaques sont prêtes au dépôt des échantillons à l’aide d’un applicateur.

Les cuves sont préparés selon la technique inspirée de AUDIGIE et al. ( 1995). La saturation des cuves se fait par l’ajout de la phase mobile et de la fermeture pendant 24 heures. Deux systèmes de séparation 1 et 2 sont utilisés.

Pour le système 1: la phase mobile est constituée d’acétate d’éthyle-méthanol-n-butanol- eau dans les proportions de 16:3:3:1. La phase stationnaire, des plaques en gel de silice de type Silica gel 60 F 254 de 0,25mm d'épaisseur sur feuille d’aluminium, sont utilisées 33

Chapitre II.- Matériel et méthodes

(GHEBREGZABEIER et al., 1976). Pour le système 2: la phase mobile est constituée de chloroforme-n-butanol-méthanol-eau- acide acétique, dans les proportions de 4,5:12,5:5:1,5:1,5. Pour la phase stationnaire, les plaques CCM de gel de silice de type Silica gel 60 F 254 de 0,25mm d'épaisseur de 0,25mm (YANG et al., 2010).

Calcul du rapport frontal des spots

Le rapport frontal est calculé pour chaque spot obtenu des hydrolysats et des étalons, pour but de comparer les Rf, et déterminer les différents types d’oses constitutifs des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles obtenus.

Rf = distance parcourue par l’échantillon ou le témoin/distance parcourue par le solvant (phase mobile) (AUDIGIE et al., 1980)

II.3.2.- Activités biologiques des extraits bruts polysaccharidiques

Les activités biologiques concernent l’activité anticoagulante, l’activité antioxydante et l’activité immunomodulatrice des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles des deux plantes (F. communis et A. leucotrichus).

II.3.2.1.- Activité anticoagulante

L’effet des polysaccharides hydrosolubles sur la coagulation du sang, est évalué par des tests de coagulation qui sont le temps de prothrombine (TP), le temps de céphaline activée (TCA) et le temps de thrombine (TT) à l’aide d’un coagulomètre. Le plasma utilisé est obtenu à partir du sang de sujets sains (25-45ans). Le prélèvement est fait par ponction veineuse. Le sang est mélangé au citrate tri-sodique (3,8%) et centrifugé (2400 g/mn, 20 mn) pour obtenir un plasma pauvre en plaquettes. Le plasma citraté est recueilli et stocké à -80°C jusqu'à utilisation (ZHANG et al., 2010).

- Le temps de céphaline activée (TCA), est un test de la voie intrinsèque (indication des facteurs VIII, IX, XI et XII). - Le temps de prothrombine (TP), est un test de la voie extrinsèque (indication des facteurs V, VII et X, II). - Le temps de thrombine (TT), est un indicateur de la transformation de fibrinogène en fibrine par la thrombine.

Une solution mère de polysaccharides hydrosolubles de 10mg/ml est préparée à l’eau distillée à une concentration de 1% (YOON et al., 2002), puis différentes dilutions sont préparées.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.2.1.1.- Mesure du temps de céphaline activée (TCA)

A 90µl de plasma humain normal citraté sont ajoutés 10μl de solution polysaccharidique, puis 100μl de réactif de TCA est ajouté. Le mélange est incubé 5mn à 37°C. Après l’ajout de

100µl de CaCl2 (0,025 mol/l), le temps de céphaline (kaolin) activée est enregistré (WANG et al., 2013).

II.3.2.1.2.- Mesure du temps de prothrombine (TP)

A 90μl de plasma sont ajoutés 10μl de polysaccharides hydrosolubles et incubés à 37°C pendant 5mn. La réaction est déclenchée par addition de 200 µl de thromboplastine. Le temps de coagulation est mesuré. Les résultats de tests sont exprimés en temps de Quick (TQ) en secondes. Le TQ est converti en taux de prothrombine (%) et en International Normalised Ratio (INR) correspondant à l’aide d’un tableau de conversion (YOON et al., 2002). Calcul de INR = (Temps de Quick échantillon/de Quick moyen normal) ISI II.3.2.1.3.-.Mesure du temps de thrombine (TT)

Pour la mesure du temps de thrombine, 90 µl du plasma non dilué, sont d'abord ajoutés à 10µl de polysaccharides, puis incubés à 37°C pendant 1 mn. Le temps de thrombine est mesuré après addition de 100µl de réactif TT pendant 2mn (ZHANG et al., 2010).

II.3.2.2.- Activité antioxydante

Les antioxydants sont des molécules qui retardent ou stoppent le processus d’oxydation et par conséquence régulent l’équilibre redox cellulaire (ARUOMA, 1996). Les antioxydants les plus connus sont les vitamines, comme l’acide ascorbique (C), le tocophérol (E) et le β carotène (provitamine A). L’évaluation de la capacité antioxydante des extraits bruts dans cette étude, est effectuée suivant trois tests 2,2-diphenyle-1-picrylhydrazyle (DPPH), le test d’acide 2,2’- azinobis-3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique (ABTS) et le test de ferric reducing antioxydant power (FRAP).

II.3.2.2.1.- Mesure du pouvoir anti-radicalaire par le DPPH (2,2-diphenyle-1- picrylhydrazyle)

La mesure du pouvoir anti-radicalaire par le DPPH, est une méthode utilisée pour évaluer l’activité antioxydante in vitro par deux approches d’une part, la détermination de la réduction relative du radical DPPH• à un temps de référence ou la détermination de la quantité d’antioxydant nécessaire pour réduire 50% de DPPH• et d’autre part, le suivi de la cinétique de la réduction (POPOVICI et al., 2009). L’activité est définie par l’indice de la réduction de l’activité anti-radicalaire en pourcentage (pourcentage d’inhibition) Radical Scavenger Activity (RSA), où l’absorbance du mélange réactionnel qui contient le radical libre et l’échantillon de l’antioxydant est reliée avec l’absorbance du mélange sans aucun antioxydant (solution témoin ou contrôle).

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.2.2.1.1.-Principe

Le DPPH est un radical libre stable caractérisé par sa couleur violet foncé qui va disparaitre après la réduction par un antioxydant donneur des protons (Hydrogène), plus la perte de couleur est rapide plus le donneur d’hydrogène considéré comme un antioxydant fort. La perte de couleur peut être suivie par la mesure de l’absorbance au spectrophotomètre à 515nm. Le pourcentage d’inhibition est calculé selon la formule suivante (CHENG et al., 2013):

Calcul de pourcentage d’inhibition

P(%) inhibition = (absorbance de control - absorbance de l’échantillon/absorbance de control) ×100 II.3.2.2.1.2.- Réactif

Il faut dissoudre 25 mg DPPH dans 80ml de méthanol, puis ajouter 20ml d’eau distillée à l’obscurité. Une dilution de solution mère de DPPH est effectuée juste avant le dosage par le méthanol jusqu'à l’obtention d’une absorbance entre 1,1 et 1,2 à 515nm. - Une solution mère de l’échantillon est préparée par l’eau distillée de concentration 0,1%, - Une solution mère de l’acide ascorbique, est préparée de concentration 0,1%, dilué à 1/10 à l’eau distillée servira à la préparation de la courbe d’étalonnage (annexe 4).

II.3.2.2.1.3.- Mode opératoire

Cent (100) microlitres de chaque échantillon ou de l’étalon, sont placés dans des tubes en verre avec 3,9ml de réactif DPPH. Le mélange est agité et incubé à l’obscurité pendant 30mn. L’absorbance est lue à 515nm. Une courbe d’étalonnage est préparée à l’aide de l’acide ascorbique (0,01%) (BOUGANDOURA et BENDIMERAD, 2012).

II.3.2.2.2.- Test à l’acide 2,2’-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-6-sulphonique (ABTS)

L’ABTS est l’un des tests utilisés pour évaluer l’activité antioxydante in vitro.

II.3.2.2.2.1.- Principe

L’ABTS est un radical cation caractérisé par sa couleur bleu vert foncé qui va disparaitre après la réduction par un antioxydant donneur des protons (hydrogène). Ce radical est facilement formé à partir de l’acide correspondant par oxydation en présence de persulfate de potassium. Plus la perte de couleur est rapide plus le donneur d’hydrogène considéré comme un antioxydant fort. La perte de couleur peut être suivie par la mesure de l’absorbance au spectrophotomètre à 734nm.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

Calcul de pourcentage d’inhibition (LI et al., 2015)

Pourcentage inhibition d’ABTS•+ = (1 – Absorbance de l’échantillon/Absorbance de contrôle) ×100 II.3.2.2.2.2.- Réactif

Deux solutions A et B sont préparées et mélangées en proportion égal 1:1, et incubé à 18°C pendant 16 heures, puis une dilution par l’éthanol (95%) jusqu’à l’obtention d’une absorbance à 0,700±0,01 à 734nm juste avant l’utilisation (BARAHONA et al., 2011). Solution A (ABTS 7mM): A 0,383g d’ABTS est ajouté à 100ml d’eau distillée.

Solution B (K2S2O8 2,45mM): A 0,0662g de K2S2O8 100ml d’eau distillée est ajoutée.

II.3.2.2.2.3.- Mode opératoire

Cent (100) microlitres de chaque échantillon ou de l’étalon sont placés dans des tubes en verre avec 3,9ml de réactif d’ABTS. Le mélange est agité et laisser à l’obscurité pendant 6mn. L’absorbance est lue à 734nm. Une gamme d’étalons est préparée par l’acide ascorbique (vitamine C) à différentes concentrations allant de 0,01mg/ml à 0,1mg/ml.

II.3.2.2.3.- Test de Ferric Reducing Antioxydant Power (FRAP)

Le test de Test de Ferric Reducing Antioxydant Power (FRAP) est un procédé utilisé pour l'évaluation du «pouvoir antioxydant» à la réduction de l’ion ferrique en l'ion ferreux à un pH bas, dont il provoque un complexe ferreux de couleur pour former tripyridyltriazine. Le dosage de la FRAP est peu coûteux, les réactifs sont simples à préparer, les résultats sont hautement reproductibles. La procédure est simple et rapide (BENZIE et STRAIN, 1996). II.3.2.2.2.1.- Principe

La méthode correspond à la réduction d’un complexe tripyridyltriazine [Fe(III)-TPTZ]2 en un complexe tripyridyltriazine ferreux [Fe(II)-TPTZ)]2 par un antioxydant (AH), à pH 3,6 pour maintenir la solubilité de fer. L’absorbance est lue à 593 nm.

II.3.2.2.2.2.- Réactif

Trois solutions A, B, et C sont préparées et mélangées dans les proportions: 10V:1V:1V, puis chauffées à 30°C pendant 15mn dans un bain Marie juste avant l’utilisation. Solution A (tampon d’acétate de Na): A 2,46g d’acétate de Na, il est additionné 3,6ml

CH3COOH, puis complété par de l’eau distillée jusqu’à 100ml. Il faut que le pH à 3,6.

L’ajustement du pH se fait par CH3COOH. Solution B: A 0,312g de tripyridyltriazine (TPTZ), 100ml HCl (40mM), est ajouté,

Solution C: dissoudre 0,54g FeCl3 dans 100ml eau distillée.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.2.2.2.3.- Mode opératoire

Une quantité de 2850μl de réactif de FRAP est additionnée à 150μl de l’échantillon. Le mélange est incubé pendant 30mn à l’obscurité. Le blanc est préparé par de l’eau distillée à la place de polysaccharide. Une gamme d’étalons est préparée par l’acide ascorbique (vitamine C) de différentes concentrations (0,01mg/ml-0,1mg/ml).

II.3.2.3.- Activité phagocytaire

L’une des activités biologiques testées in vitro dans cette étude pour évaluer l’effet des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles obtenus, est l’activité phagocytaire.

II.3.2.3.1.- Principe du test

Le test de phagocytose est basé sur l’activation des cellules phagocytaires par les polysaccharides. Il est utilisé pour déterminer l’activité phagocytaire des leucocytes à ingérer les levures Candida albicans après stimulation par des extraits polysaccharidiques (HARUN et al., 2015).

II.3.2.3.2.- Procédure du test

Le sang périphérique est l’un des sources de monocytes chez l’homme. Pour cela il est utilisé dans le présent travail pour évaluer l’activité phagocytaire des C. albicans par les macrophages in vitro. Le teste de phagocytose se fait par l'évaluation globale de la capacité de phagocytose des cellules du sang total comparativement à celle des cellules phagocytaires isolées a partir du sang qui sont des leucocytes stimulés par des particules opsonisées; zymosan (contrôle positif). L’expérience à pour but de tester le pouvoir des polysaccharides à augmenter l’ingestion de particules étrangères (levures) par les leucocytes. Les étapes de l’expérimentation sont le prélèvement de sang en premier lieu, puis la préparation des levures dans des milieux de cultures favorables. Pour cette expérience, il faut préparer des solutions tampons (PBS, Hanks, tampon de lyse) soit pour le lavage ou pour l’arrêt d’une étape ou autre. L’exploration de la phagocytose est réalisée afin de préparer les échantillons à étudier qui sont les extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles obtenus. Après la lyse des érythrocytes, des frottis sont préparées sur des lames, suivies par une double coloration. Enfin la lecture des lames se fait sous microscope optique (G:10×100). Les différentes étapes expérimentales de la phagocytose sont représentées sur la figure 3.

II.3.2.3.2.1.- Prélèvement de sang

Le sang périphérique humain est prélevé par une ponction veineuse aseptique réalisée par un préleveur formé à partir de volontaires sains de sexe masculin, âgé de 25-38 ans (KOKO et al., 2008). Le sang total est recueilli dans un tube vacutainer contenant du sodium héparine (NH) comme anticoagulant (MAQBOOL et al., 2011).

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.2.3.2.2.- Préparation de C. albicans

C. albicans est inoculé dans un milieu liquide de Sabouraud à partir d'une culture mère maintenue sur gélose inclinée (milieu de Sabouraud). Puis, elle est laissée pendant une nuit à 30°C (GHONEUM et GOLLAPUDI, 2004).

La culture est centrifugée à 2000g pendant 10mn et le culot est lavé deux fois avec un tampon phosphate saline (PBS) stérile (TAVANTI et al., 2006), puis incubé pendant 1 h à 90°C pour tuer les levures (GHONEUM et GOLLAPUDI, 2004)

La concentration de cellules dans le PBS est mesurée à 540 nm (DO540 égal à 1,0 correspond à 2,8.106 blastoconidies de C. albicans / ml) (TAVANTI et al., 2006) et la suspension de cellules est ajustée à 1.107 cellules de levure/ml (GHONEUM et GOLLAPUDI, 2004). II.3.2.3.2.3.- Préparation de solutions tampons Les solutions tampons sont préparées selon BURNAT et al., (2013) pour la solution de phosphate buffered saline, et selon HANKS (1975) pour la solution Hanks balancedsalt solution (HBSS).

II.3.2.3.2.3.1.- Mode opératoire pour la préparation de la solution de HANKS

Trois solutions sont préparées et mélangées après stérilisation à l’autoclave.

- Solution A: Dissoudre 1,4g de CaC12 dans 200ml d'eau distillée glacée, dans un deuxième bécher de 1 litre contenant 800ml d'eau distillée glacée, les ingrédients restant sont ajoutés à l’exception du NaHCO3, puis agités jusqu'à dissolution complète. Les deux solutions sont mélangées et de l’eau distillée est ajoutée jusqu’au volume total égale à 1100 ml en fournissant 10% d'excès d'eau pour compenser les pertes durant l’autoclavage.

- Solution B : Le rouge phénol 0,2% est préparé par dissolution de 0,4g de rouge phénol dans 200ml d'eau distillée glacée, ensuite, la solution est autoclavée.

- Solution C: Une solution isotonique de 1,4% de NaHCO3 est préparée par dissolution de 3,5g de NaHCO3 dans 250 ml d'eau distillée glacée puis autoclavée. Cette solution est utilisée pour l’ajustement de pH.

II.3.2.3.2.4.- Préparation des polysaccharides

Une solution mère de chaque fraction polysaccharidique est préparée comme suit: dans une éprouvette à 1g d’extrait brut, il est ajouté jusqu’à 100ml de la solution de Hanks, soit une concentration de 0,1% (NERGARD et al., 2005).

II.3.2.3.2.5.- Préparation de zymosan

Le zymosan est un dérivé de membrane des cellules de Saccharomyces cerevisiae de levure. Il s’agit d’un complexe de protéines et de glucides notamment du β-D glucane, un β-

Chapitre II.- Matériel et méthodes glucane constitué de résidus glucose liés par des liaisons osidiques β-1,3-liens glycosidiques (SATO et al., 2005). EDVARD et al. (1978) ont utilisé le zymosan comme control positif dans l’activité phagocytaire. Une concentration de 100 μg/ml est utilisée pour la comparaison avec les échantillons.

II.3.2.3.2.6.- Exploration de phagocytose et récupération des cellules phagocytaires

Quarante (40) microlitres d’extraits polysaccharidiques sont mélangés avec 200 µl du sang hépariné et incubé dans un bain Marie fermé avec agitation (60 rpm) à 37°C pendant 30 mn. Pour arrêter la réaction, les tubes sont mis sur la glace (HARUN et al., 2015). Les cellules stimulées sont lavées deux fois par le PBS (CHEN et al., 2015) à 4°C et centrifugées à 250 g pendant 5mn à 4°C (ROSSI et al., 2013).

Quarante (40) microlitres de solution de levures C. albicans sont ajoutés au mélange des échantillons à 0°C. Les échantillons sont incubés dans un bain Marie avec agitation à 37°C pendant 10 mn. Tandis que, pour le contrôle négatif les échantillons sont placés sur la glace (HARUN et al., 2015).

Après incubation, la phagocytose est arrêtée par l’addition de 2ml de PBS refroidi et les cellules sont ensuite lavées trois fois du PBS froid (CHENA et al., 2014). Les levure extracellulaires sont éliminées par centrifugation à 100g, pendant 5mn à 4°C (CZUPRYNSKI et al., 1991). II.3.2.3.2.7.- Lyse des érythrocytes

MAQBOOL et al. (2011) ont lysé les érythrocytes par 2ml d’une solution de lyse pour obtenir une population pure de granulocytes.

La lyse des hématies est effectuée une fois pendant 20s (le temps est strictement contrôlé en utilisant un chronomètre) par la solution HSi d’hémolyse et de lavage. Le processus de lyse est arrêté en utilisant 2ml d’un tampon HBSS suivi d’une centrifugation à 400g pendant 10mn et les échantillons sont ensuite lavés par 3ml de PBS (deux fois) (HARUN et al., 2015).

Quelques gouttes de chaque culot cellulaire sont prélevées et disposées à l’extrémité d’une lame de verre (POULETTY, 2010).

II.3.2.3.2.8.- Préparation des frottis sur lame

Les frottis sont préparés pour la lecture des résultats de test de la phagocytose sous microscope optique.

II.3.2.3.2.8.1.- Principe

Une goutte de sang est étalée sur une lame en verre de façon uniforme.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.2.3.2.8.2.- Préparation des lames

- Choisir une lame de verre au bord parfaitement lisse pour l’étalement du sang, - Nettoyer les lames à l’alcool (faces et tranches), les sécher avec du papier absorbant, les déposer sur papier absorbant.

II.3.2.3.2.8.3.- Technique

- Prélever, une goutte de sang à l’aide du compte-goutte, -. Déposer la goutte de sang à l’extrémité d’une lame, -. Appliquer une autre lame inclinée à 45° en avant de la goutte de sang de façon à ce que le sang s’étale sous la lame par capillarité. -. Faire glisser la lame inclinée à 45° pour étaler uniformément la goutte, -. Sécher le frottis avec un séchoir, -. Repérer au marqueur, avec une lettre F la face où se trouve le sang.

II.3.2.3.2.8.4.- Résultat

Un bon frottis doit être en bonne taille (½ à ¾ de la lame) et en bonne densité. La goutte étalée doit être en entier. II.3.2.3.2.8.5.- Fixation par le méthanol

La fixation des cellules étalées est faite en versant quelques gouttes de méthanol sur la lame pour une durée de 2mn (NORUM et al., 2005).

II.3.2.3.2.9.- Coloration de MGG

Les cellules sont fixées par le méthanol pendant 2mn avant d'être lavées par de l'eau du robinet. Elles sont colorées par May Grunwald (Sigma) pendant 2mn, puis lavées à l'eau du robinet et colorées au Giemsa (Sigma) (dilution 1:10) pendant 10 mn. Les cellules sont observées à l’aide d’un microscope optique type SHIMADZU, UV Visible type LNICAMYEAR, 2000 (NORUM et al., 2005)

II.3.2.3.2.10.- Calcul de capacité phagocytaire

Une centaine de cellules adhérentes sont comptées pour déterminer le pourcentage de la phagocytose à l’aide d’un microscope optique (G:10×100). Les valeurs de phagocytoses représentent le pourcentage de cellules qui contiennent des particules zymosans ou de levures intériorisées (POPOV et al., 1999; NOSE et al., 1997; ABID et al., 2012)

La capacité phagocytaire est représentée comme suit:

CP% = (Nombre de cellules ingérées /Nombre totale) x 100% - CP: Capacité de phagocytose, 41

Chapitre II.- Matériel et méthodes

- Nombre de cellules ingérées: les macrophages phagocytaires de levures ou zymosans, - Nombre totale: les macrophages choisis pour le calcul.

II.3.2.3.2.11.- Calcul de l’activité phagocytaire

L’activité phagocytaire des polysaccharides et celle du contrôle positif sont calculées selon STEVEN et al. (1984).

PA% = CP test %- CP blanc%

- PA% : activité phagocytaire catalysé par les polysaccharides et le contrôle positif,

- CP test % : capacité de phagocytose en présence de polysaccharides ou bien de contrôle positif,

- CP blanc% : capacité de phagocytose en absence de polysaccharides ou bien de contrôle négatif.

Chapitre II.- Matériel et méthodes

200 µl de sang total mélangé avec 40µl d’échantillon ( zymosan)

Incubation à 37°C/30 mn avec agitation

Lavage par le PBS refroidi /2 fois

Centrifugation

40 µl de Candida albicans

Incubation à 37°C/10 mn, arrêter la phagocytose par 2ml de PBS froidi. Lavage par le PBS froid (3fois), centrifugation (100g/5mn/4°C).

Lyse des érythrocytes par 2 ml d’un tampon de lyse /20s, arrêter la lyse

par solution Hanks, centrifugation , lavage par 3ml de PBS, 2fois.

Préparation des frottis, fixation par le méthanol, coloration par MGG

Lecture sous microscope optique (×1000)

Figure 3.- Différentes étapes expérimentales de la phagocytose (KOKO et al ., 2008; MAQBOOL et al., 2011; GHONEUM et GOLLAPUDI, 2004; TAVANTI et al., 2006; BURNAT et al., 2013; HANKS, 1975; NERGARD et al., 2005; SATO et al., 2005; EDVARD et al.,1978; HARUN et al., 2015; CHEN et al., 2015; ROSSI et al., 2013; CHENA et al., 2014; CZUPRYNSKI et al., 1991; POULETTY, 2010; NORUM et al., 2005; POPOV et al., 1999; NOSE et al., 1997; ABID et al., 2012; STEVEN et al., 1984).

Chapitre II.- Matériel et méthodes

II.3.3.- Analyse statistique

L’analyse statistique des différents dosages et des tests d’évaluation des activités biologiques est effectuée par les logiciels statistiques Excel et le R.

Toutes les représentations graphiques sont dessinées par l’Excel, les tests de normalités et les analyses de la variance aussi la matrice de corrélation sont réalisés à l’aide du logiciel R. Le test de normalité est calculé par un test nommé «Shapiro test » car l’analyse est univariée et les données sont inférieures à 40 puisque les analyses et les dosages sont effectués en triple exemplaires pour les fractions obtenues, l’application des tests paramétriques est faite pour l’analyse de la variance (ANOVA) avec Tukey test pour les résultats normaux, et régression Spearman pour les résultants non normaux.

Chapitre III.

Résultats et discussion

Chapitre III.- Résultats et discussion

Les résultats d’analyses et les activités biologiques testées des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles des gommes-résines de F. communis et des inflorescences d’A. leucotrichus sont développés dans ce chapitre.

III.1.- Caractérisation des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles

Les résultats relatifs portent sur des extraits bruts des trois fractions polysaccharidiques hydrosolubles. Il s’agit d’une première fraction polysaccharidique issue des gommes-résines de

F. communis (FC1) (photo 5), une deuxième fraction des gommes-résines de F. communis (FC2) (photo 5) et une fraction polysaccharidique extraite des inflorescences d’A. leucotrichus (AL) (photo 6). Les trois fractions sont obtenues par macération à chaud dans l’eau distillé et précipitées par l’isopropanol absolu.

Photo 5.-Extrait brut des polysaccharides hydrosolubles après lavage des inflorescences d’A. leucotrichus.

Photo 6.- Extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles des gommes-résines

après lavage de F. communis FC1 et FC2.

Le tableau numéro 3 présente les rendements massiques, les teneurs en oses totaux, en 45

Chapitre III.- Résultats et discussion oses neutres, en oses acides, et les teneurs des protéines des différents extraits bruts obtenus FC1,

FC2, AL. III.1.1.- Rendement des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles

Les rendements lipidiques des gommes-résines de F. communis et des inflorescences d’A. leucotrichus, et ceux massiques des extraits bruts obtenus, sont consignés dans le tableau 3. Il apparait que les rendements massiques des polysaccharides hydrosolubles des gommes-résines de F. communis sont de 43,08% pour la fraction FC1 et de 0,549% pour la deuxième fraction

FC2. Pour les inflorescences d’A. leucotrichus (AL), le rendement massique des polysaccharides hydrosolubles est de 4,051%. Le rendement des gommes-résines de la fraction de F communis

(FC1) est supérieur à celui obtenu par la fraction d’A. leucotrichus (AL). La fraction FC2 représente le rendement (0,549%) le plus faible.

Toutefois, il apparait que le rendement lipidique des gommes-résines de F. communis est de 0,766%. Celle de la fraction AL est de 7,86%. Les inflorescences sont plus riches en matière grasse par apport aux gommes-résines, pour cela l’étape de la dépigmentation est répétées quatre fois pour les inflorescences par contre pour les gommes-résines de F. communis la délipidation est faite une seule fois.

Pour les polysaccharides hydrosolubles des deux fractions FC1 et FC2, les rendements massiques des polysaccharides hydrosolubles est de 43,63%. Il est plus élevé que celui obtenu pour les gommes de Ferula gumosa Boiss qui est de 5% (MOHAMMADZADEH MILANI et al., 2007). Par contre il est inférieur au rendement massique obtenu à partir des gommes oléorésines de Ferula gummosa qui est de 67% (JALALI et al., 2011).

Le pH et la température des milieux d’extraction influent sur le rendement massique d’extraction (EBRINGEROVA et al., 2003). D’après l’étude de MILANI et al. (2007), les variations de pH (4, 7, 10) et de température (50, 70, 90°C) ont un effet sur le rendement d’extraction. Il a été constaté que le rendement massique d'extraction à pH acide (4) et une température ascendante (90°C) est le plus élevé. Il est légèrement supérieur à 5,05%. Par contre à pH alcaline (10) et à la même température (50°C), le rendement massique est le plus bas, il est de 4,95%.

Le rendement massique de la fraction AL est de 4,051%, il est proche des rendements de polysaccharides hydrosolubles extraits à partir des graines de quelques espèces de la famille des Apiaceae. ZHAUYNBAEVA et al. (2010) rapportent un rendement pour Daucus carota L. de 4,45%, pour Anethum graveolens L. de 4,4%, pour Ferula tschimganica Korov. De 4,5%, et 4,39% pour Sphaenolobium tianschanicum Pimenov (Korov.). Le rendement de la fraction AL est supérieur à celui d’Albertia paleaceae Rgl. (3,68%), d’Heraclim lehmannianum Bunge (3,7%) et de Ferula tenuisecta Korov. (3,80%). Toutefois ce rendement est inférieur à celui de Foeniculum vulgare Mill. (5,6%) et de Mediasia macrophylla Rgl. (Pimenov) (5,96%).

Le rendement lipidique des gommes-résines de F. communis est négligeable (0,766%), 46

Chapitre III.- Résultats et discussion celui des inflorescences d’A.leucotrichus est appréciable (7,86%). Ceci peut être interprété par le rôle physiologique des inflorescences qui renferment des fruits et des graines qui sont des organes de réserves. La composition chimique et le rendement varient suivant diverses conditions de l’environnement climatique, la localisation, l’origine géographique et la période de récolte (SVOBODA et HAMPSON ,1999).

Les différences de rendements peuvent être expliquées par l’état physiologique des plantes sachant que les polysaccharides sont des métabolites primaires donc ils sont utilisés comme des précurseurs d’autres métabolites secondaires, comme source d’énergie, la saison et la période de la récolte , ou par les différences des conditions expérimentales au laboratoire type d’extraction (décoction, infusion ou par macération,…), et le degré de pureté d’alcool utilisé dans la précipitation et le volume utilisé (EBRINGEROVA et al., 2003).

Chapitre III.- Résultats et discussion

Tableau 3. – Le rendement d’extraction et teneurs en oses totaux, oses neutres, oses acides, et protéines dans les extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles

Fraction Rendement Rendement Oses (%) Protéines Protéines lipidique d’extraction (%) (%) (%) (%) (LOWRY) (BRADFOR D)

Totaux Neutres Acides

FC1 0.766 43.08 72.60 60.45 14.22 0.737 2.67

0.766 FC2 0.549 42.67 39.21 3.46 0.776 3.072

AL 7.86 4.051 48.31 31.74 8.31 2.284 6.636

Chapitre III.- Résultats et discussion

III.1.2.- Composition de l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles

Au vu du tableau 3, les teneurs en oses totaux varient d’un extrait brut à l’autre. Ils sont de 42.67% pour FC2, 48.31% pour la fraction AL, et 72.60% pour FC1. La couleur diffère d’un extrait à l’autre après le lavage par l’acétone. La première fraction des gommes-résines de F. communis FC1 est apparu avec une couleur blanchâtre, la deuxième fraction des gommes-résines de F. communis FC2, et la fraction des inflorescences d’A. leucotrichus sont apparues avec une couleur brune (photo 5 et 6).

Les oses neutres sont les constituants majeurs des polysaccharides hydrosolubles des trois fractions AL (31.74%), FC2 (39.21%), FC1 (60.45%). Les teneurs en oses acides sont de 3.46%,

8.31%, et 14.22% dans les extraits bruts des trois fractions AL, FC2, et FC1 respectivement

Le rapport entre oses acides et oses neutres est de 8.8% pour FC2, 20% pour FC1 et AL. La teneur en oses totaux représente la somme des oses neutres et des oses acides (WU et al., 2007).

Les teneurs en protéines dans les extraits bruts des polysaccharides hydrosolubles des fractions obtenus par la méthode de BRADFORD (1976) sont de 2.67% dans la fraction FC1, de

3.07% pour la fraction FC2 et de 6.63% dans AL. Pour la méthode de LOWRY (1951), elles sont de 0.737% pour FC1 ; de 0.776% pour FC2 et de 2.284% pour AL. D’après les deux méthodes de dosages des protéines, il apparaît que la teneur en protéines est plus élevée dans les inflorescences d’A. leucotrichus par rapport à celles des fractions des gommes-résines de F. communis (FC1, FC2).

Il est remarqué que l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles de la fraction FC1 des gommes-résines de F. communis, est constitué majoritairement d’oses (72,60%) comparativement aux fractions AL des inflorescences d’A. leucotrichus (48,31%) et FC2 des gommes-résines de F. communis (42,67%) ayant des quantités faibles en oses. Toutefois, une quantité appréciable en protéines est notée dans la fraction AL (6,63%) par rapport aux fractions

FC1 (2,67%) et FC2 (3,072%).

MOHAMMADZADEH MILANI et al. (2007), signalent une teneur en oses totaux des gommes de Ferula gumosa de 83,98%. Cette teneur est supérieure à celle obtenue pour la fraction FC1 des gommes-résines de F. communis (72,60%). De même, MOHAMMADZADEH MILANI et al. (2007) rapportent des teneurs en oses acides des gommes de F. gumosa de 24,3%. JESSENNE et al. (1947) trouvent des teneurs de 22,7% d’acides uroniques pour la même espèce végétale F. gumosa. Il est signalé dans le tableau 3 que la teneur en acides uroniques de FC1 (14,22%) est proche de celui obtenu par JALALI et al. (2011) pour les gommes oléorésines de Ferula gummosa (14%).

Les teneurs en protéines obtenues par JALALI et al. (2011) de 2% sont proches de la fraction FC1 (2,67%). FC2 présente une teneur en protéine de 3,072% proche de celle obtenue par JESSENNE et al. (1947), soit 3.7% pour F. gumosa, mais elles sont différentes et inférieures à 49

Chapitre III.- Résultats et discussion celles obtenues par MILANI et al. (2007), soit une teneur en protéine de 4,3%.

Le pH et la température des milieux d’extraction influent sur la teneur des protéines obtenues. Selon MILANI et al, (2007) l’augmentation de la température (90°C) et l’abaissement du pH (4) réduit la teneur en protéines dans les extraits des gommes de F. gumosa (3,8%), par contre à température (50°C) et à pH alcaline (10) la teneur en protéine est plus élevée (4,4%).

Tableau 4.- Valeurs des normalités des différents dosages des extraits bruts obtenus

Dosages Normalité (p-value) Shapiro-Wilk normality test

Oses totaux 0.3404

Oses neutres 0.4841

Oses acides 0.8915

Protéines (BRADFORD) 0.1665

Protéines (LOWRY) 0.04222

Rendement 0.1418

Les résultats de test de normalité regroupés dans le tableau 4, montrent que tous les dosages ont des probabilités supérieures à 0.05 donc les différences sont significatives, sauf pour le dosage des protéines par la méthode de LOWRY dont la différence n’est pas significative (0.042). Les résultats du test semblent normaux.

Le test d’analyse de la variance réalisé pour les protéines détectées par la méthode de BRADFORD donne des résultats hautement significatives (0.00107 **). Le test de Tukey montre que FC1 et FC2 présentent le même groupe donc la même origine de polysaccharides, mais elles sont différentes de la fraction AL. III.1.3.- Hydrolyse des liaisons glycosidiques de polysaccharides hydrosolubles

Le fractionnement des hydrolysats des trois fractions obtenues (FC1, FC2, AL), est réalisé par chromatographie sur couche mince (CCM).

Dans le premier système (acétate d’éthyle-méthanol-n-butanol- eau), le suivi d’hydrolyse après 4 heures est représenté sur la figure 4. Le profil de CCM montre quatre taches pour la

Chapitre III.- Résultats et discussion

première fraction FC1 avec des Rf de 0,22, 0,45, 0,56, 0,65. Pour la deuxième fraction FC2 cinq taches sont apparues de Rf 0,27, 0,37, 0,49, 0,51, 0,59, dans la troisième fraction AL trois taches sont apparues de Rf suivants 0,47, 0,52, 0,60. Les Rf des étalons sont de 0,520 pour l’arabinose, de 0,458 pour le galactose, de 0,493 pour le glucose, de 0,513 pour le mannose, de 0,595 pour le xylose et de 0,178 pour l’acide glucuronique.

Figure 4.- Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 4 heures à 100°C (premier système)

Dans le deuxième système (chloroforme-n-butanol-méthanol-eau-Acide acétique), le profil de CCM montre des Rf pour les étalons de 0.54 pour l’arabinose, de 0.49 pour le galactose, de 0,52 pour le glucose, de 0,54 pour le mannose, de 0,63 pour le xylose et de 0,22 pour l’acide glucuronique. La figure 5 présente le chromatogramme de suivie d’hydrolyse des trois fractions après 4 heures, trois taches ont apparu dans la première fraction FC1 de Rf 0,32, 0,47, 0,67, et trois taches pour la fraction AL de Rf 0,33, 0,47, 0,57, par contre dans la fraction FC2 cinq taches ont apparu de Rf 0,05, 0,19, 0,38, 0,46, 0,57.

Chapitre III.- Résultats et discussion

Figure 5.- Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides

hydrosolubles des fractions FC1, FC2, et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 4 heures à 100°C, (deuxième système).

Après 6 heures d'hydrolyse des deux fractions FC1 et AL, le profil chromatographique montre trois taches dans le premier système (figure 6). Alors que dans le deuxième système il n’apparait que deux taches pour FC1 et une seule tache dans la fraction AL (figure 7). Le suivi d’hydrolyse dans le temps a laissé remarquer l’apparition de deux taches stables pendant 6 heures, avec augmentation de l’intensité des taches.

Figure 6.- Caractérisation par CCM des hydrolysats d’extraits de polysaccharides

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 6 heures à 100°C, (premier système)

Chapitre III.- Résultats et discussion

Figure 7.- Caractérisation par CCM des hydrolysats des extraits de polysaccharides

hydrosolubles des fractions FC1, FC2 et AL, par l'acide trifluoroacétique à 2 M durant 6 heures à 100°C, (deuxième système).

La migration des étalons de glucose, de galactose et de mannose, est meilleure pour le deuxième système (chloroforme-n-butanol-méthanol-eau-Acide acétique) par rapport au premier système (acétate d’éthyle-méthanol-n-butanol- eau) donc une bonne résolution est notée.

L’acide glucuronique migre dans le premier système par contre dans le deuxième système il reste au dépôt. Ceci peut s’interpréter par la différence de polarité des différents éluants et l’affinité de chaque échantillon aux solvants (AUDIGIE et al.1980). La meilleure séparation des spots des échantillons est effectuée par le premier système.

La détermination de la composition en oses constitutifs des trois fractions FC1, FC2, AL par CCM indique une hétérogénicité et une diversité des oses, surtout pentoses et hexoses.

En comparant les Rf des étalons, la fraction FC1 est constituée de galactose, d’arabinose, et d’un ose avec un Rf très élevé (0,697), FC2 est constitué de glucose, et d’autres oses ou oligosaccharides. La fraction AL est constituée majoritairement de galactose et probablement de glucose, d’arabinose et de xylose (tableau 5). L'hydrolyse par l'acide trifluoroacétique 4 M pendant 4 heures semble être suffisante pour hydrolyser les liaisons osidiques de polysaccharides hydrosolubles de l’inflorescence d’A. leucotrichus.

Des études antérieures montrent qu’après une hydrolyse, les polysaccharides hydrosolubles des graines d’Anethum graveolens L., de Daucus carota L., et de Ferula tschimganica Korov., de quelques plantes de la famille des Apiaceae sont constitués majoritairement de deux à cinq oses dont le rhamnose, le glucose, le galactose et l’arabinose. Le rhamnose est présent presque dans toutes les graines étudiées. Ce qui indique l’existance des fractions de rhamnoarabinogalactane, de rhamnoxylogalactane, de glucane et de rhamnoglucane.

Chez certaines plantes de la famille des Apiaceae dont Angelica ternata Regel,

Chapitre III.- Résultats et discussion

Coriandrum sativum L., Heraclim lehmannianum Bunge. Ferula tsehimganica Korov., Ferula diversivittata Mill., Mediasia macrophylla Rgl., il est signalé l’existence de mannane (ZHAUYNBAEVA et al., 2010).

JALALI et al. (2011) rapportent que le polysaccharide constituant des gommes- oléorésines de F. gummosa est de type arabinogalactane associé à des protéines complexes. Aussi les gommes de F. galbaniflua sont constituées de 65,26% de galactose, de 10,4% arabinose et de 24,3% d’acide glucuronique, lorsque le galactose est prédominant dans ce polysaccharide, donc il s’agit d’un arabinogalactane (MILANI et al., 2007).

Des polysaccharides des gommes d'Acacia, appartiennent à une famille d’arabinogalactane associé par des protéines (AGPs), les oses les composants structurellement liées, sont d-galactose, l-arabinose, l-rhamnose, acide glucuronique et d'acide 4-O-méthyle glucuronique dans des proportions différentes (AL-ASSAF et al., 2006). L’existence de la structure de rhamonogalacturonane type II, est signalé dans la paroi cellulaire de D. carota (PEREZ et al., 2003).

Les extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles des trois fractions FC1, FC2 (F. communis) et AL (A. leucotrichus) renferment des hétéropolysaccharides.

Tableau 5.- Composition en monosaccharides des extraits de polysaccharides hydrosolubles des trois fractions de différentes plantes échantillonnées, dans les deux systèmes de phase mobile 1 et 2 en CCM (FC1, FC2, AL) (Ara : arabinose, Gal : galactose, Glc : glucose, Man : mannose, Xyl : xylose, Ac.gluc : acide glucuronique).

Système 1 Système 2 Fractions/ Ara Gal Glc Man Xyl Ac.gluc Ara Gal Glc Man Xyl Ac.gluc Etalons

FC1 × × × ×

h FC2 × × × × × × × TFA TFA 2M/4 AL × × × × × × ×

FC1 × × ×

h FC2 × × TFA TFA 2M/6 AL × × × ×

III.2.- Activités biologiques des extraits bruts polysaccharidiques

Les résultats obtenus des activités biologiques anticoagulante, antioxydante et l’activité phagocytaire des trois fractions FC1, FC2 et AL sont présentés.

III.2.1.- Activité anticoagulante

La figure 8 laisse apparaître que les valeurs enregistrées de temps de céphaline activé des trois fractions pour une concentration de 100µg/10µl sont de 29.4 s pour la fraction FC1, 27.5 s 54

Chapitre III.- Résultats et discussion

pour la fraction FC2 et 300 s pour la fraction AL.

300 300

250

200

150

100 30,9 29,4 27,5

50 Temps (seconde) Temps 0 control FC1 FC2 AL normal

Activité anticoagulante (TCA)

Figure 8.-Temps (seconde) de céphaline activée (TCA) pour de chacun des trois fractions FC1,

FC2, et AL, pour une concentration de 100 µg/10µl.

L’étude in vitro de l'activité anticoagulante des deux fractions FC1, FC2 montre que les deux fractions n’ont aucun effet sur la voie endogène de la coagulation dans le test TCA par rapport au contrôle normal 30.9 s, par contre la fraction AL prolonge significativement le temps de coagulation du TCA plus de 300s en comparaison avec le contrôle positif. ATHUKORALA et al. (2007) enregistre un temps de TCA de coagulation ≥1500s de l’héparine pour une concentration de 80 µg/ml. TICAR et al. (2015) enregistrent un temps de coagulation des plasmas contenant 25 µg/ml de l’héparine 115s (TCA) et 113s (TP).

Les fractions FC1 et FC2 ne possèdent pas une activité anticoagulante, mais elle diminue le temps de coagulation donc ils ont peut être l’effet inverse.

Pour la fraction AL, une activité anticoagulante plus élevée est remarquée pour le facteur de la voie endogène (TCA) en comparaison avec les deux fractions FC1 et FC2 aussi par rapport au contrôle positif (héparine) et au contrôle normal (test sans ajout de polysaccharide).

La figure 9 montre des valeurs des trois tests (TCA, TP, TT) pour différentes concentrations de l’extrait brut de polysaccharides hydrosolubles des inflorescences d’A. leucotrichus. Pour le test TCA, il est remarqué que les valeurs sont proportionnelles aux concentrations dont les valeurs enregistrées sont 49,2 s, 197 s, 294 s 300 s pour des concentrations de 10 µg/10µl, 25 µg/10µl, 50 µg/10µl, 75 µg/10µl respectivement. Les valeurs

Chapitre III.- Résultats et discussion de temps enregistrées des différentes concentrations de la fraction AL sont de 13,8 s, 14,1 s, 14,2 s, 14,4 s pour 10 µg/10µl, 25 µg/10µl, 50 µg/10µl, 75 µg/10µl respectivement.

Le temps de Quick (TQ) enregistré pour le test TP est de 13,8 s pour le contrôle normal et pour la concentration 10 µg/10µl, 15,7 s (25 µg/10µl), 24,5 s (50 µg/10µl), 40 s (75 µg/10µl), alors que pour la concentration 100µg/10µl il n'y a pas de coagulation. Les valeurs de TQ sont converties en pourcentage et en International Normalised Ratio (INR), et en pourcentage dans le tableau 6.

TCA(s) TP(TQ) TT(s)

1: 10 μg/10μl 294 300 2: 25 μg/10μl 3: 50 μg/10μl 197 4: 75 μg/10μl 13,8 14,1 13,8 14,2 15,7 14,4 49,2 24,5 40

1 2 3 Activités anticoagulantes (TCA, TP, TT). 4

Figure 9.- Suivi de l’activité anticoagulante de l’extrait brut des polysaccharides hydrosolubles des inflorescences d’A. leucotrichus (AL).

Tableau 6.- Résultats de test TP pour l’activité anticoagulante à différentes concentrations de la fraction AL (A. leucotrichus).

Concentration % INR TQ d’échantillon Control normal 0 μg/10μl 100 1,00 12,5 10 μg/10μl 87,2 1,11 13,8 25 μg/10μl 65,7 1,38 15,7 50 μg/10μl 30,8 2,94 24,5 75 μg/10μl 15,7 6,76 40 100 μg/10μl Incoagulable

Chapitre III.- Résultats et discussion

Il est remarqué que l’activité anticoagulante in vitro de la fraction AL prolonge significativement le temps de céphaline activé TCA, et faiblement sur le temps de prothrombine TP en comparaison par le temps normal de 12,5 s. Pour le test TT aucune différence significative dans la modulation du temps de thrombine en comparaison avec le temps normal 13,8 s, n’est observée.

La fraction AL inhibe la voie intrinsèque de la coagulation mais n’a aucun effet sur la voie extrinsèque ou sur la conversion de fibrinogène en fibrine.

Ammodaucus leuchotricus Coss. et Dur. est une plante connue pour sa richesse en métabolites secondaires dont les polyphénols et les huiles essentielles. Le rendement de cette plante en polysaccharides est très faible et moins pur. Il semble qu’il existe des composés phénoliques qui sont responsables ou qui renforcent cette activité (LI et al., 2014). Des polysaccharides extraits des écorces de Geoffroea spinosa (Fabaceae) sont composés d'arabinose (Ara), de rhamnose (Rha), d'acide hexuronique, de petites quantités de galactose ont une activité anticoagulante, antiplaquettaire et des effets anti-thrombotiques, mais sans interférence dans le saignement (SOUZA et al., 2015).

III.2.2.- Activité antioxydante

Dans le tableau 7, il est noté les résultats des tests de DPPH, d’ABTS et de FRAP, en pourcentage d’inhibition et en μmol/g pour les fractions testées FC1, FC2 et AL à la même concentration chacune de 100 µg/ml.

Tableau 7.- Activité antioxydante des fractions FC1, FC2 et AL à la concentration 100 µg/ml pour les tests (DPPH, ABTS et FRAP).

DPPH ABTS FRAP Inhibition(%) μmol/g Inhibition(%) μmol/g μmol/g

FC1 14.61 55.95 12.91 49.43 6.7

FC2 5.50 0.26 5.68 0.27 0.11 AL 13.46 9.69 10.04 7.23 1.31

Chapitre III.- Résultats et discussion

Les effets anti-radicalaires du DPPH sont respectivement 5,5%, 13,69% et 14,61% exercés par les extraits des trois fractions FC2, AL et FC1. Le test d’ABTS montre que les capacités des trois fractions FC2, AL, et FC1 à réduire le cation sont de 5,68%, de 10,04% et de 12,91% respectivement. Les activités antioxydantes pour les deux tests (DPPH, ABTS), sont proches pour les trois fractions. Elles sont de 0,26 μ.mol/g pour FC2, 9,69 μ.mol/g pour AL et

55,95 μ.mol/g pour FC1pour le test DPPH, et de 0,27 μ.mol/g (FC2) de 7,23 μ.mol/g (AL) et

49,43 μ.mol/g (FC1) pour le test d’ABTS.

La méthode de FRAP confirme les résultats des deux tests (DPPH, ABTS) précédents. La fraction AL a une activité moyennement faible (1,31 μ.mol/g) que celle obtenue pour la fraction

FC1 (6.7 μ.mol/g). Les résultats comparés au contrôle positif (acide ascorbique), montrent que les fractions polysaccharidiques possèdent une activité antioxydante faible. A une concentration de 100 µg/ml, l’acide ascorbique utilisé comme antioxydant standard a un effet inhibiteur de 41,44% envers le radical DPPH et de 47,74% pour l’ABTS. La composition de polysaccharides en monosaccharides et les rapports de monosaccharides pourraient exercer des effet apparent sur leur capacité antioxydante (LIU et al., 2015).

L'effet de piégeage de radical DPPH par la fraction polysaccharidique (DHP 1A constitué de mannose, de glucose et des traces de galactose) extrait de Dendrobium huoshanense Orchidaceae), est rapporté par TIAN et al. ( 2013) in vitro, avec des taux d'inhibition allant de 31,4% à 38,7% en augmentant la concentration en polysaccharides de 0,5 à 2,0 mg /ml. Ces résultats sont supérieurs à celui obtenus pour les trois fractions (FC1, FC2 et AL).

Des fractions polysaccharidiques extraites à partir Epimedium acuminatum Franch. (Berberidaceae), ont des activités de piégeage du radical DPPH, de 83,23%, 65,15%, 71,14% et 77,16% pour des fractions EAP-H, EAP-U, EAP-E, et EAP-M respectivement, pour une concentration de 2mg/ml. Ces fractions pourraient agir comme donneurs d’électrons ou d’hydrogène à piéger les radicaux DPPH. Pour l’ABTS les activités de piégeage sont de 65,68%, 30,36%, 46,49% et 36,63% pour les mêmes fractions EAP-H, EAP-U, EAP-E, et EAP-M, respectivement, pour une concentration de 2mg/ml (CHENG et al., 2013)

Les valeurs d’évaluation de la capacité antioxydante par le test de FRAP des fractions polysaccharidiques pour une concentration de 0,6 mg/ml, sont de 162,76 µmol / l (EAP-H), 136.2 µmol / l (EAP-M), 74.33 µmol / l (EAP-E), et 45.55 µmol / l (EAP-U) (CHENG et al., et al., 2013).

Les extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles obtenus contiennent des quantités de protéines non négligeables. Les fonctions antioxydantes de protéines peuvent être attribuées à leurs acides aminés constitutifs, qui sont capables de donner des protons aux radicaux libres déficients en électrons (MENG et al., 2015).

La méthode d’extraction peut affecter l’activité antioxydante (CHEN et al., 2008). 58

Chapitre III.- Résultats et discussion

L’extraction hydrosoluble à chaud représente la méthode la plus efficace dans la préservation de l’activité antioxydante des polysaccharides (LIU et al., 2015).

La différence des activités antioxydantes entre les trois fraction peut être interpréter par leurs différences dans la composition chimique, le poids moléculaire, la structure chimique ou la conformation spatiale (WANG et al., 2014; ZHANG et al., 2015).

Un hétéro-polysaccharide extrait de Moslachinensis Maxim. cv. Jiangxiangru, plante médicinale chinoise, constituée de glucose, de galactose, d’arabinose, de mannose et de rhamnose, a montré une amélioration dose-dépendante de l’activité antioxydante in vivo (LI et al., 2013).

L’étude in vitro d’un polysaccharide constitué de L-rhamnopyranose, D-arabinofuranose, D- glucopyranose et D-galactopyranose, extrait à partir de Lilium lancifolium Thunb (Liliaceae) a montré une activité de piégeage des radicaux DPPH et hydroxyle. Ce polysaccharide a également eu la puissance réductrice et l’activité chélateur fort sur l’ion ferreux (GAO et al., 2015).

Des fractions polysaccharidiques hydrosolubles de structures complexes, sont extraites à partir des feuilles de Morus alba (Moraceae). Ses polysaccharides sont composés de mannose, de rhamnose, d’acide glucoroniquec, d’acide galacturonique, de glucose, de galactose et d’arabinose avec des rations différentes, pourraient être explorés comme antioxydant naturel (YUAN et al., 2015).

Des études antérieures rapportent que les activités antioxydantes peuvent être étroitement liées aux caractéristiques structurales des polysaccharides. Cependant, ce n’est pas tous les polysaccharides qui possèdent des activités anti-oxydantes. Il a été rapporté que les capacités antioxydantes des polysaccharides dépendent généralement de l’unité d’oses, des liaisons glycosidiques, du degré de ramification et de la conformation du polysaccharide (LI et al., 2013).

III.2.3.- Activité phagocytaire

L’étude in vitro de l’activité phagocytaire des cellules immunitaires issues de sang total, est effectuée sur les levures de C. albicans (photo 7 et 8). Les fractions polysaccharidiques FC1,

FC2, AL sont testées en considérant le zymosan comme contrôle positif.

Chapitre III.- Résultats et discussion

39 46 34 39

28 Pourcentage (%) Pourcentage FC1 FC2 AL Zymozan (control positif) control négatif

capacité phagocytaire

Figure 10.- Capacité de la phagocytose des trois fractions FC1, FC2, et AL.

18 11

6 11 Pourcentage (%) Pourcentage FC1 FC2 AL Zymozan (contrôle positif)

activité phagocytaire

Figure 11.- Activité phagocytaire des trois fractions FC1, FC2, et AL

La figure 10 présente les résultats de la capacité de la phagocytose des trois fractions de contrôle positif et de contrôle négatif pour une concentration de 0.1%. Les valeurs de capacité phagocytaire sont de 34% pour FC1, 39% pour les deux fractions FC2 et AL. Alors que la capacité de contrôle positif (zymozan), est de 46%. Mais le contrôle négatif présente une capacité de 28%.

La figure 11 présente les valeurs des activités phagocytaires des extraits bruts des

Chapitre III.- Résultats et discussion

polysaccharides hydrosolubles des trois fractions obtenues. Elles sont de 6% pour la fraction FC1 et 11% pour les deux fractions FC2 et AL. Les valeurs de ces activités sont inférieures à celles obtenues par le zymozan 18%.

La comparaison des résultats, indique que les deux fractions FC2 des gommes-résines de F. communis (39%), AL des inflorescences d’A. leucotrichus (39 %), ont la même capacité phagocytaire. Cette capacité est supérieure à celle de la fraction FC1 des gommes-résines de F. communis (34 %). Les valeurs de l’activité phagocytaire, montrent que toutes les fractions peuvent améliorer la phagocytose des leucocytes mais le zymozan semble le meilleur

Les résultats montrent que les fractions pourraient sensiblement améliorer la phagocytose des macrophages par la liaison des polysaccharides avec un récepteur spécifique à la surface des macrophages (CHEN et al., 2014).

WANG et al. (2013) ont trouvé que l’indice de la phagocytose des trois fractions PHD-1, PHD-2 et PHD-3 a dépassé 1,0 (100%) et, a augmenté de manière dose-dépendante, indiquant que toutes les trois fractions peuvent améliorer la capacité phagocytaire des macrophages. En basant sur les résultats de l'analyse de la composition en sucres, de nombreux chercheurs suggèrent que les polysaccharides d'origine végétale composés de Rha, de Gal et d'Ara, ont des activités immunostimulantes puissantes (WANG et al., 2013).

GHEDIRA et al. (2008) ont montré des activités phagocytaires allant de 15 à 50% pour les polysaccharides de Plantago major L. et Plantago lanceolata L. (Plantaginaceae) respectivement, et une activité phagocytaire de 16.8% des polysaccharides extraites de d’Astralagus membranaceus (Fabaceae) selon les études de SUN et al. (2008). Ces résultats sont supérieurs à celui des trois fractions FC1 (6%), FC2 (11%) et AL (11 %).

La capacité phagocytaire peut s’influencer par plusieurs facteurs, par le type de corps étranger phagocyté, par la structure et la composition chimique des polysaccarides testés, par la méthode d’extraction. La purification de l’extrait brut peut modifier aussi les résultats.

Des polysaccharides extraites à partir Salviachinensis Benth, ont une activité immunostimulante et une activité antitummorale (SHU et al., 2015)

LI et al. (2015) ont entrepris des études sur les polysaccharides de Prunella vulgaris (Lamiaceae). Ils rapportent que ces polysaccharides peuvent être explorés en tant que antioxydant puissant et des agents immunomodulateurs pour la médecine complémentaire ou les aliments fonctionnels.

Un polysaccharide isolé de la paroi du corps de Sipunculus nudus L. de masse moléculaire de 350 kDa est constitué de rhamnose (28%), de fucose (16%) et de galactose (56%) possède une activité immunostimulante puissante (ZHANG et DAI, 2011)

La capacité phagocytaire est l'un des plus importants indicateurs de l'immunité non 61

Chapitre III.- Résultats et discussion spécifique de l’organisme (CHEN et al., 2014). Les macrophages peuvent phagocyter les bactéries, endommager les cellules et les tissus nécrotiques, la majorité des polysaccharides issus de plantes activent des réponses des macrophages (SCHEPETIKIN et QUINN, 2006).

Photo 7.-Observation microscopique des Candida albicans (x 1000).

Photo 8.- Observation microscopique de la phagocytose de Candida albicans en présence des

fractions (FC1, FC2 et AL) polysaccharidiques (x 1000)

Chapitre III.- Résultats et discussion

Tableau 8.- Matrice de corrélation (R: rendement massique, OT: oses totaux, ON: oses neutres, PBr: protéines Bradford, TCA: test de céphaline activée, AP: activité hagocytaire, DPPH: test 2,2-diphenyle-1-picrylhydrazyle, ABTS: test à l’acide 2,2’-azinobis-3-éthylbenzothiazoline-6- sulphonique, FRAP: test de Test de Ferric Reducing Antioxydant Power, PL: protéines lowry).

R OT ON OA PBr TCA AP DPPH ABTS FRAP PL

R 1.000 0.995 0.947 0.924 -0.515 -0.515 -0.997 -0.089 0.843 0.995 -0.454

OT 0.995 1.000 0.908 0.959 -0.423 -0.333 -0.984 0.015 0.894 1.000 -0.359

ON 0.947 0.908 1.000 0.752 -0.763 -0.697 -0.968 -0.405 0.625 0.911 -0.717

OA 0.924 0.959 0.752 1.000 -0.147 -0.051 -0.893 0.299 0.985 0.957 -0.079

PBr -0.515 -0.423 -0.763 -0.147 1.000 0.995 0.577 0.900 0.027 -0.429 0.998

TCA -0.429 -0.333 -0.697 -0.051 0.995 1.000 0.495 0.938 0.124 -0.339 1.000

Phagocytaire -0.997 -0.984 -0.968 -0.893 0.577 0.495 1.000 0.163 -0.801 -0.985 0.519

DPPH -0.089 0.015 -0.405 0.299 0.900 0.938 0.163 1.000 0.461 0.008 0.928

ABTS 0.843 0.894 0.625 0.985 0.027 0.124 -0.801 0.461 1.000 0.891 0.096

FRAP 0.995 1.000 0.911 0.957 -0.429 -0.339 -0.985 0.008 0.891 1.000 -0.365

PL -0.454 -0.359 -0.717 -0.079 0.998 1.000 0.519 0.928 0.096 -0.365 1.000

D’après la matrice les pourcentages d’oses totaux, d’oses neutres et d’oses acides sont proportionnels entre eux, par contre la matrice de corrélation présente des pourcentages inversement proportionnels entre les teneurs en oses et les teneurs en protéines dans les trois

extraits bruts obtenus (FC1, FC2, et AL). La matrice de corrélation montre que les pourcentages d’oses acides, d’oses totaux et d’oses neutres dans les extraits bruts de polysaccharidiques sont proportionnels à la réduction des radicaux ABTS et FRAP, ce n’est pas le cas pour le DPPH qui est inversement proportionnel. Par contre les pourcentages en protéines dans les extraits bruts polysaccharidiques sont proportionnels à la réduction de DPPH et, inversement proportionnels aux tests d’ABTS et de FRAP. Le coefficient de corrélation entre le test d’ABTS et la teneur en ose acide, aussi entre le test TCA et la teneur en protéine est plus de 0,90. La fraction FC1 présente le pourcentage des oses acides le plus élevé et aussi le pourcentage d’inhibition pour le test d’ABTS (activité antioxydante) le plus élevé. La fraction AL présente la quantité des protéines la plus élevée par rapport aux autres fractions (FC1, FC2) et elle a un effet anticoagulant le plus élevé (TCA)

Conclusion et

perspectives

Conclusion

L’étude des polysaccharides hydrosolubles dedeux espèces végétalesFerula communisL. et AmmodaucusleucotrichusCoss. et Dur. de la famille des Apiaceae débute par une macération à chaud dans l’eau distillé à 80°C.Les extraits bruts des trois fractions polysaccharidiques hydrosolubles obtenues, se composent d’une fraction polysaccharidique issue des gommes- résines de F. communis (FC1), une fraction des gommes-résines de F. communis (FC2) et une fraction polysaccharidique extraite des inflorescences d’A. leucotrichus (AL). Des différences de rendements massiques des extraits polysaccharidiques sont remarquées entre les deux plantes, avec 43.63% (FC1et FC2) et 4.051% (AL). L'étude de la composition des différents extraits bruts depolysaccharides hydrosolubles après lyophilisation, donne des valeurs de 72,60% (FC1), 42,67%(FC2),48,31%(AL) d'oses totaux. Parmi les oses, 60,45%(FC1), 39,21%(FC2), 31,74%(AL)sont des osesneutres et,14,22%(FC1), 3,46%(FC2), 8,31%(AL)sont des oses acides.Les protéines restent le deuxième constituant majoritaire dans les extraits bruts despolysaccharides hydrosolubles. Ellesco- précipitent avec les polysaccharides parl’alcool.Des trois fractions la fraction FC1 présente le rendement le plus élevé. L'analyse qualitative par chromatographie sur couche mince (CCM) de lacomposition en oses des polysaccharides hydrosolublesaprès hydrolyse, montre une hétérogénéité et une diversité d’oses neutres et acides, de pentoseset d’hexoses. En comparant les Rf des étalons et des fractions, FC1est constitué de galactose, d’arabinose et d’un ose, FC2 est constitué de glucose et d’autres oses ou oligosaccharides, AL constitué majoritairement de galactose mais aussi de glucose, d’arabinose et de xylose. L’activité anticoagulante par le test de mesure de temps de céphaline activée (TCA) des extraits bruts de polysaccharides hydrosolubles de la fraction AL est de 300s, de FC1 et de FC2 sont respectivement 29.4s et 27.5 s. Les activités antioxydantespour les tests DPPH et ABTS, sont proches. Elles sont pour le test de DPPH de 14.61% (FC1),5.50% (FC2), 13.46% (AL), et pour le test d’ABTS de 12.91% (FC1), 5.68 %(FC2), 10.04% (AL). Le test FRAP confirme que la fraction FC1 possède l’activité la plus élevée avec des valeurs calculées en μ.mol/g, 6.7 (FC1), 0.11 (FC2), 1.31 (AL). Toutefois, les extraits bruts de polysaccharidesont une activité antioxydante très faible en comparaison avec l’acide ascorbique.

Les activités phagocytaires des trois extraits sont de 6% (FC1) et 11% (FC2, AL). Ces activités sont inférieures à celle obtenu par le zymozan 18%.

Perspectives Il est souhaitable, pour augmenter le rendement d'extraction des polysaccharidespar plante, d’agir au cours de la macération sur la température, le temps d'extraction, letype et le pourcentage d'alcool-eau ajouté au cours de la précipitation despolysaccharides. Une utilisation des techniques de purification des polysaccharides pourl'étude de leurs propriétés rhéologique, demeure en suspens à l'issue de ce travail. De même;l’analyse structurale par spectroscopie est nécessaire, de même l’IR pour identifier les groupements fonctionnels, et l'analyse par chromatographie échangeuse d'anions, de haute performance (HPAEC), pour déterminer la composition en oses constitutifsdes polysaccharides hydrosolubles obtenus.

Références bibliographiques

1. ABID S., KHAJURIA A., PARAVAIZ Q., SIDIQ T., BHATIA A., SINGH S., AHMAD S., RANDHAWA M.K., SATTI N. K., PRAHBU DUTT P., 2012.- Immunomodulatory studies of a bioactive fraction from the fruit of Prunuscerasus in BALB/c mice. International Immunopharmacology, vol.12: 626–634. 2. AHMED A. A., HEGAZY M.-E. F., ZELLAGUI A., RHOUATI S., MOHAMED, T. A., SAYED, A. A., ABDELLA, M. A., OHTA, S., HIRATA, T., 2007.- Ferulsinaic acid, a sesquiterpenecoumarin with a rare carbon skeleton from Ferula species. Phytochemistry, vol. 68:680–686. 3. AL-ASSAF S., PHILLIPS G.O., WILLIAMS P.A., 2006.- Controlling the molecular structure of food hydrocolloids. Food Hydrocolloids, vol. 20 :369–377. 4. ALKHATIB R. 2010.- Etude phytochimique et activité cytotoxique des métabolites secondaires de FerulaelaeochytrisKorovin et FerulalyciaBoiss (Apiacees). Chemical Sciences. Université du Droit et de la Santé - Lille II, France 233p. 5. ANGONE A. S., 2010.-Extraction des polysaccharides hémicellulosiques de la paroi des feuilles de Laporteaaestuans (Fleuryaaestuans) et activité immunostimulante. Institut de Pharmacopée et Médecine traditionnelle. Science du Sud, vol. 3: 1998-0612. 6. ANGONE S. A., NGUEMA-ONA E., DRIOUICI A., 2010.- La thérapie par les plantes en Afrique: activités immunostimulantes des polysaccharides de la paroi végétale. Pharmacognosie, Springer, 8 p. 7. ARAGNO M., TAGLIAPIETRA S., NANO G.M., UGAZIO G., 1988.- Experimental studies on the toxicity of Ferula communis in the rat. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol, vol. 59:399–402. 8. ARUOMA O. L., 1996.- Assessment of potential prooxidant and antioxidant actions. Journal of the American Oil Chemists’ Society, vol. 73:1617-1625. 9. ATHUKORALA Y., JUNG W. K., VASANTHAN T., JEAN Y. J., 2006.- An anticoagulative polysaccharide from an enzymatic hydrolysate of Ecklonia cava. Carbohydrate Polymers, vol. 66: 184–191. 10. AUDIGIE C. L. FIGARELLA J. ZONSZAIN F., 1984.- Manipulation d'analyse biochimique. Ed Doin, Paris, 84p. 11. AUDIGIE C. L., DUPONT G., TONSZAIN F. 1995.- Chromatographie principes des méthodes d’analyses biochimiques. Tome 1,édition Doin. 207p. 12. AUSTARHEIM I., MAHAMANE H., SANOGO R., TOGOLA A., DABADI M. K., VESTRHEIM A.C., INNJERDINGEN K.T., MICHAELSEN T.E., DIALLO D., PAULSEN B. S.,2012.-Anti-ulcer polysaccharidesfrom Cola cordifolia bark andleaves. Journal of Ethnopharmacology, vol.143: 221–227. 13. AUTRAN J. C., 1991.- Techniques d'analyse et de contrôle dans les industries agro- alimentaires. Ed. Tec et Doc, Paris: 115-137. 14. AYALA G G., MALINCONICO M., et LAURIENZO P., 2008.- Marine derived polysaccharides for biomedical a lications: chemical modification a roaches. Molecules, vol.13: 2069-2106. 15. BAGHERI S.M., DASHTI R. M.H., MORSHEDI A., 2014.- Antinociceptive effect of Ferula assa-foetidaoleo-gum-resin in mice. Research in Pharmaceutical Sciences, vol. 9(3): 207-212.

Références bibliographiques

16. BAHROUN T., GRESSIER B., TROTIN F., BRUNET C., DINE T., LUYCKS M., VASSEUR J., CAZIN M., CAZIN J. C. and PINKAS M., 1996.- Oxygen species scavenging activity of phenolic extracts from hawthorn fresh plant organs and pharmaceutical preparations. Arznei. Forschung, vol.46: 1086-1089. 17. BARAHONA T., CHANDIA N. P., ENCINAS M. V., MATSUHIRO B. et ZUNIGA E. A., 2011.- Antioxidant capacity of sulfated polysaccharides from seaweeds. A kinetic a roach. Food Hydrocolloids, vol.25: 529-535. 18. BATTANDIER et TRABUT, 1888.- Excursion botanique dans le Sud de la province d'Oran. Bulletin de la Société Botanique de France, vol. 35: 338-348. 19. BELLAKHDAR J., YOUNOS C., 1993.- La diététique médicale arabo-islamique à travers les traités arabes anciens et la pratique actuelle au Maroc. Actes du 2ième Colloque Européen d’Ethnopharmacologie et de la 11e Conférence internationale d’Ethnomédecine, Heidelberg : 43–51. 20. BELTRÁN TEJERA E. -1983- Un nuevotaxóndelgéneroAmmodaucusCosson &Durieu (Apiaceae) en el Archipiélagocanario. Candollea, vol.38: 131-154. 21. BENZIE I. F. F. et STRAIN J. J., 1996.- The Ferric Reducing Ability of Plasma (FRAP) as a Measure of “Antioxidant Power’’: The FRAP Assay. Analyticalbiochemistry vol.239: 70–76. 22. BERGER M. et DUCROO P., 2004.- Arabinoxylan est arabinoxylanases. Industries des céréales, vol.140: 3-14. 23. BLUMENKRANTZ N., et ASBOE-HANSEN G., 1973.- New method for quantitative determination of uronic acids. Analytical biochemistry, vol. 54: 484 - 489. 24. BONNIN E., RENARD C., THIBAULT J.F., DUCROO P., 1997.-Les enzymes de dégradation des parois végétales : mode d’action et utilisations alimentaires. Dans : Enzymes en agro-alimentaire, V. Larreta-Garde. Editions Lavoisier: 168-193. 25. BRODENAVE N., GERLIER S., COMA V., 2009.- Hydrophobisation and antimicrobial activity of chitosan and paper-based packaging materiam. Biomacromolecules, vol 11: 88-96. 26. BOUAL Z., 2009.- Contribution à l'étude des polysaccharides de quelques plantes spontanées à caractère médicinal de la région de Ghardaïa (Sahara septentrional Est Algérien). Mémoire Magister Biochimie et Analyse des Bioproduits, université KasdiMerbah Ouargla 80p. 27. BOUAL Z., 2014. - Caractérisation physico-chimique des polysaccharides de quelques plantes spontanées à caractère médicinal récoltées dans la région de Ghardaïa (Sahara Septentrional Est algérien): Activité biologique. Thèse de doctorat en Biologie, Université KasdiMerbah Ouargla, 159p. 28. BOUAL Z., PIERRE G., DELATTRE C., BENAOUN F., PETIT E., GARDARIN C., MICHAUD P., OULD ELHADJ M. D., 2015.- Mediterranean semi-arid plant Astragalusarmatus as a source of bioactive galactomannan. Bioactive Carbohydrate and Dietary Fibre, vol.5:10-18. 29. BOUAL Z., KEMASSI A., HAMID OUDJANA A., MICHAUD P. et OULD EL HADJ M. D., 2013.- Caracterisation partielle des polysaccharides hydrosolubles des feuilles de Malvaparviflora L.. (Malvaceae) : activité prébiotique. Lebanese Science Journal, vol. 14: 41- 51.

Références bibliographiques

30. BOUAZZA M., MAHBOUBI A., LOISEL R., et BENABADJI N., 2001.- Bilan de la flore de la région de Tlemcen (Oranie-Algérie). Foret méditerranéenne T.XXII, vol.2: 130- 136. 31. BOUGANDOURA N. et BENDIMERAD N., 2012.- Evaluation de l’activité antioxydante des extraits aqueux et méthanolique de Saturejacalaminthassp. Nepeta (L.) Briq.Revue « Nature & Technologie », B- Sciences Agronomiques et Biologiques, vol.9: 14- 19. 32. BOURRET EVELYNE, 2001- Mucilages et galactomannanes de fenugrec et leur applications. 33. BRADFORD M.M., 1976.- A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteins utilizing the principle of protein-dye binding.. Analytical biochemistry vol.72: 248-254. 34. BRAHAM K., 2014.- Perte de poids à l’officine: intérêts et limites du glucomannane et de l’acide linoléique conjugué. Thèse de doctorat de la faculté de pharmacie deGrenoble,119p. 35. BRUDIEUX V., 2007.- Extraction, modification enzymatique et caractérisation chimique de nouvelles structures pectiques. A lication de la relation structure/activité à la dermocosmétique. Thèse de Doctorat, Université de Limoges, 220p. 36. BRUNETON J., 2009- Pharmacognosie, phytochimie, plantes médicinales. 4ième Ed. Lavoisier, 1268p 37. BUCKERIDGE M. S, SANTOS H. P. D., TINE M. A. S., 2000.- Mobilisation of storage cell wall polysaccharides in seeds. Plant PhysiolBiochem, Elsevier, vol.38 (1/2):141−156. 38. BUCKERIDGE M. S., 2010.- Seed Cell Wall Storage Polysaccharides: Models to Understand Cell Wall Biosynthesis and Degradation.Plant Physiol, vol. 154(3): 1017–1023. 39. BURGER P., 2008- Caractérisation moléculaire de résines végétales archéologiques et actuelles : étude de résines de Dipterocarpaceae. Thèse de doctorat,université Louis Pasteur de Strasbourg.233 p. 40. BURNAT B., WALKOWIAK-PRZYBYŁO M., BŁASZCZYK T., et KLIMEK L., 2013- Corrosion behaviour of polished and sandblasted titanium alloys in PBS solution. Pubmed,vol.15(1): 87-95. 41. CAPRITA R., CAPRITA A., JULEAN C., 2010.- Biochemical Aspects of Non-Starch Polysaccharides. Animal Science and Biotechnologies, vol.43 (1): 368-375. 42. CARPITA N. C., GIBEAUT D. M. 1993.- Structural models of primary cell walls in flowering plants-consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J., vol. 3: 1-30. 43. CHEN H. X., ZHANG M., QU Z., et XIE B., 2008.- Antioxidants activities of different fractions of polysaccharide conjugates from green tea (Camellia sinensis).Food Chemistry, vol. 106 (2): 559-563. 44. CHEN R., LI H., LI S., JIN C., et LU J., 2015.- Extraction optimization, preliminary characterization and immunological activity of polysaccharides from figs. International Journal of Biological Macromolecules, vol. 72: 185–194. 45. CHEN R., MENG F., LIU Z., CHEN R., et ZHANG M., 2010.- Antitumor activities of different fractions of polysaccharide purified from OrnithogalumcaudatumAit. Carbohydrate

Références bibliographiques

Polymers, vol.80: 845–851. 46. CHEN Y., SONG M., WANG Y., XIONG W., ZENG L., ZHANG S., XU M., DU H., LIU J., WANG D., WU Y., HU Y., 2015.- The anti-DHAV activities of Astragalus polysaccharide and its sulfatecompared with those of BSRPS and its sulfate. Carbohydrate Polymers, vol. 117: 339–345. 47. CHEN Z. G., ZHANG D. N., ZHU Q., YANG Q. H., HAN Y. B., 2014.-Purification, preliminary characterization and in vitro immunomodulatory activity of tiger lily polysaccharide. Carbohydrate Polymers, vol.106: 217–222. 48. CHENA M. L., WU S., TSAI T. C., WANG L. K., TSAI F. M., 2014.- Regulation of neutrophil phagocytosis of Escherichia coli by antipsychotic drug. International Immunopharmacology, vol. 23: 550–557. 49. CHENG H., FENG S., JIA X., LI Q., ZHOU Y. and DING C., 2013.-Structural characterization and antioxidant activities of polysaccharides extracted from Epimediumacuminatum. Carbohydrate Polymers, vol. 92: 63– 68. 50. CHIBANI S., 2013.- Etude phytochimique et biologique de six plantes médicinales de l’Est Algerien. Thèse de doctorat, université deConstantine.199 p. 51. CHIDOUH A., AOUADI S., HEYRAUD A., 2014.- Extraction, fractionation and characterization of water-soluble polysaccharide fractions from myrtle (Myrtuscommunis L.) fruit. Food Hydrocolloids, vol.35: 733-739. 52. CZUPRYNSKI C. J., NOEL E. J., et ADLAM C., 1991.- Interaction of bovine alveolar macrophages with PasteurellahaemolyticaA1 in vitro: modulation by purified capsular polysaccharide. Veterinary microbiology, vol. 26: 349-358. 53. DEHAK K. O., LAWTON P., MICHALET S., BAYET C., DARBOUR N., HADJ- MAHAMED M., BADJAH-HADJ-AHMED Y. A., DIHOUX-FRANCAM G., GUILET D., 2008.- Sesquiterpenes from aerial parts of Ferula vesceritensis.Phytochemistry, vol.69, 1933– 1938 54. DELATTRE C., 2005.- Stratégie d'obtention d'oligosaccharides anioniques par dégradation enzymatique de glucuronanes. Thèse de doctorat, université de Picardie jules verne, Valois Santerre, 172p. 55. DETERS A. M., LENGSFELD C. et HENSEL A. 2005- Oligo- and polysaccharides exhibit a structure-dependent bioactivity on human keratinocytes in vitro. Journal of Ethnopharmacology, vol. 102: 391–399. 56. DIALLO D., SANOGO R., YASAMBOU H., TRAORE A., COULIBALY K., MAIGA A., 2004.- Étude des constituants des feuilles de ZiziphusmauritianaLam. (Rhamnaceae), utilisées traditionnellement dans le traitement du diabète au Mali. C. R. Chimie, vol. 7: 1073– 1080. 57. DICKINSONE., 2003.- Hydrocolloids at interfaces and the influence on the properties of dispersed systems. Food Hydrocolloids, vol.17: 25-39. 58. DJERIDANE A., 2008.- Evaluation du pouvoir antioxydant et de l’inhibition d’enzymes (la Carboxylestérase et l’Acylase) par des extraits phénoliques de dix-neuf plantes médicinales locales. Thèse de doctorat en sciences, École Normale Supérieur de Kouba, Alger, 150p. 59. DONG C.X., HAYASHI K., MIZUKOSHI Y., LEE J. B., HAYASHI T., 2011.-

Références bibliographiques

Structures of acidic polysaccharides from Basellarubra L. and their antiviral effects. Carbohydrate Polymers, vol.84: 1084–1092. 60. DUBOIS, M., GILLES, K. A., HAMILTON, J. D., REBERS P. A., SMITH F., 1956.- Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chern., vol. 28: 350-356. 61. EBRINGEROVA A., HROMADKOVA Z., 1999.- Xylans of Industrial and Biomedical Importance. Institue of Chemistry , Slovak Academy of Science, 842 38 Bratislava, Slovak Republic, vol. 14: 325-346. 62. EBRINGEROVA A., KARDOSOVA A., HROMADKOVA Z. et HRIBALOVA V., 2003.- Mitogenic and comitogenic activities of polysaccharides from some European herbaceous plants. Fitoterapia, vol. 74: 52–61. 63. EBRINGEROV A., HORMADJOVA Z., et HEINZE T., 2005.- Hemicellulose. Polysaccharides I. T. Heinze, Springer Berlin / Heidelberg, vol.186: 1-67. 64. EDVARD C I S., HAMMARSTROM L. L. G., et PERSSON U. C. I., 1978- Macrophage Dependence of Mitogen Responsiveness: Macrophages Exposed to Zymosan Enhance the Response to Polyanions. Cellular Immunology, vol.41 (1): 134-149. 65. ERJON MAMOCI., CAVOSKI I., ANDRES M.F., DIAZ C. E., COLOMA A. G., 2012.- Chemical characterization of the aphid antifeedant extracts from Dittrichia viscose and Ferula communis.BiochemicalSystematics and Ecology, vol. 43: 101–107. 66. FILIAT P., 2012.- les plantes de la famille des Apiacées dans les troubles digestifs. These de doctorat en pharmacie faculté de Grenoble 129p. 67. FILIPOM., CECCHINI C., CRESCI A.,COMANM. M., TIRILLINI B., SAGRATINI G., PAPA F., 2009.- Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil fromFerula glauca L. (F. communis L. subsp. glauca) growing in Marche(central Italy).Fitoterapia, vol.80: 68–72. 68. FLANDROY L., 1996. Histoire stimulante des sucres. Biofutur, vol.59: 35–41. 69. FLESH E., 2005- Intoxications d’origine végétale Plant poisoning, EMC-Médecine, vol.2: 532–546. 70. FLEURENTIN J., 1993. Ethnopharmacologie et aliments : introduction au sujet et réflexions sur l'efficacité biologique. ". Médicaments et aliments : la roche ethnopharmacologique. IIème Colloque européen d'Ethnopharmacologie et XXIe Conférence internationale d'Ethnopharmacologie, Heidelberg,24-27 Mars. 71. FLEURENTIN J., PELT J.M., MAZARS G., 2002- Des sources du savoir aux médicaments du futur. 4éme congrès européen d’ethnopharmacologie, Edition IRD. 300p. 72. GAO T., MA S., SONG J., BI H., TAO Y., 2011.- Antioxidant and immunological activities of water-soluble polysaccharides from Aconitum kusnezoffiiReichb.International Journal of BiologicalMacromolecules, vol.49:580– 586. 73. GATTEFOSSE, J. 1921.- Les planrtes dans la thérapeutique indigène du Maroc, in Sur les productions végétales du Maroc.Rappot de la mission PERROT-GENTIL Off. Nat. des Matières Premières Végétales, Larose, Paris. Notice n 10: 73-123. 74. GENESTIE B., 2006.- Optimisation de la production d'arabinoxylo-oligosaccharides d'intérêt biologique à partir de sons de céréales: roches méthodologiques. Thèse de doctorat, 'université de Limoges: 30-50.

Références bibliographiques

75. GEOFFREY N. R., 1998- Arabinogalactane soluble a l'eau comprenant des lipides. 76. GHEBREGZABEIER M., RUFINI S., MONALDIB. and LATO M., THIN, 1976.- Layer chromatography of carbohydrates. Journal of Chromatography, vol.127: 133-162. 77. GHEDIRA K., GOETZ P., LE JEUNE R., 2008.- Plantago major L. et Plantago lanceolata L. (Plantaginaceae). Phytotherapie, vol. 6: 367-371. 78. GHERRAF N., ZELLAGUI A., KABOUCHE A., LAHOUEL M., SALHI R., RHOUATI S., 2013.- Chemical constituents and antimicrobial activity of essential oils of Ammodaucusleucotricus. Arabian Journal of Chemistry. Pp 1-3. 79. GHONEUM M., et GOLLAPUDI S., 2004.- Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention, vol.28: 17–26. 80. GHOURRI M., ZIDANE L. et DOUIRA A.,2013- Catalogue des plantes médicinales utilisées dans le traitement de la lithiase rénale dans la province de Tan-Tan (Maroc saharien) Université Ibn Tofaïl, Maroc. Int. J. Biol. Chem. Sci, vol. 7(4): 1688-1700. 81. GILLET S., SIMON M., PAQUOT M., RICHEL A.2014.- Synthèse bibliographique de l’influence du procédé d’extraction et de purification sur les caractéristiques et les propriétés d’une gomme de caroube. Biotechnol. Agron. Soc. Environ., vol 18(1): 97-107. 82. GOLOVCHENKO V. V, KHARMOVA D.S., OVODOVA R. G., SHASHKOV A. S., OVODOV Y. S., 2012.- Structure of pectic polysaccharides isolated from onion Allium cepa L. using a simulated gastric medium and their effect on intestinal absorption.Food Chemistry, vol.134: 1813–1822. 83. HAMED M., et AMID B. T., 2012.- A review study on chemical composition and molecular structure of newly plant gum exudates and seed gums. Food Research International, vol.46: 387-398. 84. HAMMICHE V., MERAD R., AZZOUZ M., 2013.- Plantes toxiques à usage médicinal du pourtour méditerranéenCollection Phytothérapie pratique: 123-127. 85. HANKS J. H. 1975.- Hanks' balanced salt solution and ph control. Tissue culture association: 3-4. 86. HARUN N. H., SEPTAMA A. W., et JANTAN I., 2015.- Immunomodulatory effects of selected Malaysian plants on the CD18/11a expression and phagocytosis activities of leukocytes. Asian Pac J Trop Biomed, vol. 5(1): 48-53. 87. HE Z., LIANG F., ZHANG Y., et PAN Y., 2014.- Water-soluble polysaccharides from finger citron fruits (Citrus medica L. var. sarcodactylis). Carbohydrate Research, vol. 388: 100-104. 88. HEYWOOD V. H., 1971.- The biology and chemistry of the Umbelliferae.Academic Press, London, 438p. 89. HOUEL E., 2011.- Etude des substances bioactives issues de la flore Amazonienne. Analyse de preparationsphytotherapeutiques à base de Quassia amara L. (Simaroubaceae) et Psidiumacutangulum DC. (Myrtaceae) utilisées en Guyaune Française pour une indication antipaludique. Identification et analyse métabolique d’huiles essentielles à activité antifongique. Thèse de doctorat à Cayenne, Guyane française, 285p. 90. IBANEZ M. C. et FERRERO C., 2003.- Extraction and characterization of the hydrocolloid from Prosopisflexuosa DC seeds. Food Research International, vol. 36: 455–

Références bibliographiques

460. 91. IGNAT C. M., 2012.- Compatibilité et co-structuration dans des systèmes contenant des scléroprotéines et des polysaccharides. Thèse de doctorat en Chimie des polymers de l’université de PAU et des Pays de l’Adour. 79 p. 92. ISERIN P., 2001- Larousse des plantes médicinales, identification, préparation, soins. (ed.). Larousse: pp 15-16. 93. JALALI H. T., EBRAHIMIANB Z. J., EVTUGUINB D. V., NETO C. P., 2011.- Chemical composition of oleo-gum-resin from Ferula gummosa.Industrial Crops and Products, vol.33: 549–553. 94. JESSENNE, M. G., Bezanger- Beaguesne, L., Pinkas, M., Trotin, F., 1974.- Sur les Gommes de deux gommes résines Bdellium et Barijeh. Plantes Medicinales et Phytotherapie, vol.4: p 241. 95. JOHNSON, I. T., 2001.- New food components and gastrointestinal health. Proceedings of the Nutrition Society, vol.60: 481–488. 96. KARDOSOVA A., et MACHOVA E., 2006.- Antioxidant activity of medicinal plant polysaccharides. Fitoterapia, vol.77: 367–373. 97. KATSURAYA K., OKUYAMA K., HATANAKA K., OSHIMA R., SATO T., MATSUZAKI K., 2003.- Constitution of konjacglucomannan: chemical analysis and13C NMR spectroscopy. Carbohydrate Polymers, vol. 53(2): 183–189. 98. KOKO W. S., MESAIK M. A., YOUSAF S., GALAL M., CHOUDHARY M. I., 2008.- In vitro immunomodulating properties of selected Sudanese medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology, vol. 118: 26–34. 99. LABBE, A. 1950.- Plantes spontanées de Tunisie à floraison estivale Bull. Serv. Bot. et agron. de Tunisie: 20-26. 100. LAHSISSENE H., KAHOUADJI A., TIJANE M. et HSEINI S., 2009.- Catalogue des plantes médicinales utilisées dans la région de Zaer (Maroc occidental). Revue de Botanique, 26p. 101. LI C., HUANG Q., FU X., YUE X.J., LIU R. H., YOUL.J., 2015.- Characterization, antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from Prunella vulgaris Linn. International Journal of Biological Macromolecules, vol.75: 298–305. 102. LI J. E., NIE S. P., XIE M. Y., HUANG D. F., WANG Y. T., LI C., 2013.- Chemical composition and antioxidant activities in immumosuressed mice of polysaccharides isolated from MoslachinensisMaxim cv. Jiangxiangru. International Immunopharmacology, vol.17: 267-274. 103. LI Y. J., LIN D. D., JIAO B., XU C. T., QIN J. K., YE G. J., et SU G. F., 2015.- Purification, antioxidant and hepatoprotective activities of polysaccharide from CissuspterocladaHayata. International Journal of Biological Macromolecules, vol. 77: 307– 313. 104. LIU J., WEN X. Y., ZHANG X. Q., PU H. M., KAN J., JIN C. H.,2015.- Extraction, characterizationand in vitro antioxidant activity of polysaccharides from black soybean. Int. J.Biol. Macromol, vol. 72:1182–1190. 105. LOPEZ M., 2007.- Hydrolyse et synthèses chimio-enzymatique appliquées à la répartition de xylogluco-oligosaccharides pour l’étude des intéractionsxyloglucanes-cellulose.

Références bibliographiques

Thèse de doctorat, université Josehp Fourier, Grenoble, 245p. 106. LOWRY H. O., ROSEBROUGH N. J., FARR A. L., et RANDALL R. J., 1951.- Protein measurment with the folinphénol reagent. The journal of Biological Chemistury.:265-275. 107. MANU M., JOSEPHA S. R., ARAVINDA , SURAJ K.GEORGEB, SHEEJA VARGHESEA, SREELEKHAA T. T., 2013.- A galactomannan polysaccharide from Punicagranatumimpartsin vitro and in vivo anticancer activity. Carbohydrate Polymers, vol. 98: 1466– 1475. 108. MAQBOOL M., VIDYADARAN S., GEORGE E., et RAMASAMY R., 2011.- Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils. Med J Malaysia, vol. 66 (4): 296-299. 109. MARTINEZ-AVILA G. C. G., HERNANDEZ-ALMANZA A. Y., SOUSAF D., MOREIRA R., GUTIERREZ-SANHEZ G., AGUILAR C.N., 2013.-Macromolecular and functional properties of galactomannan from mesquite seed (Prosopisglandulosa). Carbohydrate Polymers. 1-4. 110. MATTHEWS M. L. et ENDRESS P. K., 2006- Floral structure and systematics in four orders of rosids, including a broad survey of floral mucilage cells. Plant systematic and evolution, vol. 260: 199–221. 111. MENG L., SUN S., Li R., SHEN Z., WANG P., et JIANG X., 2015.- Antioxidant activity of polysaccharides produced by Hirsutella sp. and relation with their chemical characteristics. Carbohydrate Polymers, vol. 117: 452-457. 112. MILANI J. M., EMAM-DJOMEH Z., REZAEE K., SAFARI M., GANBARZADEH B. et GUNASEKARAN S., 2007.- Extraction and Physicochemical Properties of Barijeh (Ferula galbaniflua) Gum. International Journal of Agriculture and Biology: 80–83. 113. MOHAMMADZADEH MILANI J. M., EMAM-DJOMEH Z., SAFARI M., MOUSAVI M., GANBARZADEH B., PHILIPS GLYN O., 2007.- Physicochemical and Emulsifying Properties of Barijeh (Ferula gumosa) Gum. Iran. J. Chem. Chem. Eng, vol. 26 (3): 81-88. 114. MONSIGNY M., PETIT C., et ROCHE A.C., 1988.- Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acids micromethod. Analytical biochemistry, vol. 175: 525-530. 115. MONTREUIL J., SPIK G., CHOSSON A., SEGARD E., SCHE LER N., 1963.- Methods of study of the structure of glycoproteins. J. Pharm. Bel., vol.18: 529-546. 116. MUCKENSTRUM B., DIYANI F., LE NOUEN D.FKIH-TETOUANI S., REDURON J. P.,1997.- Ammolactone, a guaianolide from a medicinal plant, Ammodaucus leucotrichus.Phytochemistry, vol. 44: 907–910. 117. NERGARD C S., DIALLO D., INNGJERDINGEN K., MICHAELSEN T E., MATSUMOTO T., KIYOHARA H., YAMADA H. et PAULSEN B S., 2005- Medicinal use of Cochlospermumtinctoriumin Mali Anti-ulcer, radical scavenging- and immunomodulating activities of polymers in the aqueous extract of the roots. Journal of ethnopharmacology, vol. 96: 255-269. 118. NORUM M., BOGWALD J. et DALMO R. A., 2005.- Isolation and characterisation of spotted wolfish (Anarhichas minorOlafsen) macrophages. Immunology, vol. 18: 381-391. 119. NOSE M., TERAWAKI K. and OGIHARA Y., 1997.- The role of a crude polysaccharide fraction in the macrophage activation by "Shosaikoto". Phytomedicine, vol. 4 (1): 23- 26.

Références bibliographiques

120. OULD EL HADJ M. D., HADJ-MAHAMMED M. et ZABEIROU H., 2003.- Place des plantes spontanées dans la médecine traditionnelle de la région de Ouargla (Sahara Septentrional Est).Courrier du savoir vol3 : 47-51. 121. OZENDA P., 1977.- Flore du Sahara. Ed. Centre national de la recherche scientifique, 15, quai Anatole-France, Paris: 360-361. 122. OZENDA P., 1983.- Flore du Sahara. Ed. Centre national de la recherche scientifique, Paris, 617 p. 123. PATRICK A. D., BERNARD W., MICHEL P., 2010- Influence de la teneur en galactose sur les interactions moléculaires et sur les propriétés physico-chimiques des galactomannanes en solution. Biotechnol. Agron. Soc. Environ, vol.14(1): 213-223. 124. PAULSEN B. S., OLAFSDOTTIR E. S., et INGOLFSDOTTIR K., 2002.- Chromatography and electrophoresis in separation and characterization of polysaccharides from lichens. Journal of chromatography, vol. 967: 163-171. 125. PEREZ S., RODRIGUEZ-CARVAJAL M. A., COCO T., 2003.- A complex plant cell wall polysaccharide: rhamnogalacturonan II. A structure in quest of a function. Biochimie, vol. 85: 109–121. 126. PIMENOV M. G., et LEONOV M. V., 2004.- The Asian Apiaceae biodiversity database (ASIUM) with particular reference to south-west Asian taxa Turk. J. Bot., vol. 28:139-145. 127. POLI F., APPENDINOG., SACCHETTI G., BALLERO M., MAGGIANO N., RANELLETTI FO., 2005.- Antiproliferative effects of daucane esters from Ferula communis and F. arrigonii on human colon cancer cell lines. Phytother Res, vol. 19 (2): 152-7. 128. POLYCARPOS P., 2012.- Ethanol production from Ferula communis.Biomass and Bioenergy,vol. 36: 289–292. 129. POPOV S. V., POPOVA C. Y., OVODOVA R. G., BUSHNEVA O. A., OVODOV Y. S., 1999.-Effects of polysaccharides from Silene vulgaris on phagocytes. International Journal of Immunopharmacology, vol. 21: 617-624. 130. POPOVICI C., SAYKOVA I., TYLKOWSKI B., 2009.- Evaluation de l’activité antioxydant des composés phénoliques par la réactivité avec le radical libre D H. Revue de génie industriel, vol.4: 25-39. 131. POULETTY N., 2010.- Frottis sanguin: réalisation et examen systématique. Le Point Vétérinaire, vol. 305: 23-24. 132. QUEZEL P., et SANTA S., 1963.- Nouvelle flore de l’Algérie et des régions désertiques méridionales. Ed. Centre national de la recherche scientifique, Paris, 670p. 133. RALET M. C., BONIN E., THIBAULT J. F., 2001.-Chromatographic study of highly methoxylated lime pectins deesterified by different pectin methyl-esterases. Journal ofChromatography B, vol 753: 157–166. 134. RIEDACKER A., DREYER E., PAFADNAM C., JOLY H., BORY G., 1993.- Physiologie des arbres et arbustes en zones arides and semi-arides. Ed. John LibbeyEurotext, Paris.473 p. 135. ROGER O., 2002.- Etude d'oligosaccharides bioactifs issus d'exopolysaccharides bactériens: obtention, caractérisation et relation structure/fonction. Thèse de Doctorat, université de Paris 13. 195p. 136. ROSCA-CASIAN O., PARVU M., VLASE L. et TAMAS M., 2007.- Antifungal activity

Références bibliographiques

of Aloe vera leaves. Fitoterapia, vol. 78: 219–222. 137. ROSSI G., CAPITANI L., CECILIANI F., RESTELLI L., PALTRINIERI S., 2013.- Hyposialylateda1-acid glycoprotein inhibits phagocytosis of feline neutrophils. Research in Veterinary Science, vol. 95: 465-471. 138. RUBIOLO P., MATTEODO M., RICCIIO G., BALLERO M., CHRISTEN P., FLEURY-SOUVERIN S., VEUTHEY J. L. et BICCHI C. J., 2006.- Analytical discrimination of poisonous and nonpoisonous chemotypes of giant fennel (Ferula communis L.) through their biologically active and volatile fractions. J. Agric. Food Chem, vol. 54: 7556-7563. 139. RUFF Y., 2008.- Biopolymers dynamiques: oligo-et polysaccharides. Thèse de doctorat, université Louis Pasteur, Strasbourg, 308 p. 140. RUIZ G., 2005.- Extraction, détermination structurale et valorisation chimique de phycocolloïdes d'algues rouges. Thèse de doctorat, 'université de Limoges, 230p. 141. SAIDI N.1999.- Les plantes diurétiques. Thèse de pharmacie, université de Rabat, 162p. 142. SAMANTHA J. N., KOLTE A. K., SENANI S., SRIDHAR M., SURESH K. P., 2013.- Value addition to sugarane bagasse: Xylan extraction and its process optimization for xylooligosaccharides production. Industrial Crops and Products, vol. 42: 14–24. 143. SATO M., H SANO. et IWAKI D., 2003-Direct binding of Toll-like receptor 2 to zymosan, and zymosan-induced NF-B activation and TNF- secretion are down-regulated by lung collectin surfactant protein A. J. Immunol., vol. 171:417-425. 144. SCHEPETIKIN I. A., et QUINN M. T., 2006.- Botanical polysaccharides: Macrophage immunomodulation and therapeutic potential. International Immunopharmacology, vol. 6: .317– 333. 145. SHU G., ZHAO W., YUE L., SU H., XIANG M., 2015.- Antitumor immunostimulatory activity of polysaccharides from Salvia chinensisBenth . Journal of Ethnopharmacology, vol. 168: 237–247. 146. SINGH R. D., BANERJEE J., ARORA A., 2015.- Prebiotic potential of oligosaccharides: A focus on xylan derived oligosaccharides. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, vol.5: 19-30. 147. SONG X., YIN Z., LI L., CHENG A., JIA R., XU J., WANG Y., YAO X., LV C., ZHAO X., 2013.- Antiviral activity of sulfated Chuanminshenviolaceum polysaccharide against duck enteritis virus in vitro. Antiviral Research, vol.98: 344–351. 148. SONG X., ZHANG Y., YINZ., ZHAO X., LIANG X., HE C., YIN L., LV C., ZHAO L., YE C., SHI F., SHU G., JIA R., 2015.- Antiviral effect of sulfated Chuanmingshenviolaceum polysaccharide in chicken sinfected with virulent Newcastle disease virus. Virology, vol.476: 316–322. 149. SOUZA R. O. S., ASSEREUY A. M. S., MADEIRA J. C., CHAGAS F. D. S., PARREIRAS L. A., SANTOS G. R. C., MOURAO P. A. S., PEREIRA M. G., 2015.-Purified polysaccharides of Geoffroeaspinosa barks have anticoagulant and antithrombotic activities devoid of hemorrhagic risks. Carbohydrate Polymers, vol.124: 208–215. 150. SRIVASTAVA R. et KULSHRESHTHA D. K, 1989.- Bioactive polysaccharides from plants. Phytochemistry, vol. 28: 2877–2883. 151. STEPHEN A. M., CHURMUS S. C., 1995.- Food polysaccharides and their alications. In Food Science and Technology, vol. 67: 377-440.

Références bibliographiques

152. STEVEN M. M., LENNIE S. E., STURROCK R. D., GEMMELL C. G., 1984.- Enhanced bacterial phagocytosis by peripheral blood monocytes in rheumatoid arthritis. Annals of the Rheumatic Diseases, vol. 43: 435-439. 153. SUN Y., JIN L., WANG T., XUE J., LIU G., LI X., YOU J., LI S., XU Y., 2008.- Polysaccharides from Astragalus membranaceus promote phagocytosis and superoxide anion − (O2 ) production by coelomocytes from sea cucumber Apostichopus japonicus in vitro.Comparative biochemistry and physiology part C: toxicology et pharmacology. Vol 147 : 293-298. 154. SVOBODA P. et HAMPSON J. B., 1999.- Bioactivity of essential oils of selected temperate aromatic plants: antibacterial, antioxidant, anti-inflammatory and other related pharmacological activities.Plant biology department.vol.65, 17p. 155. TAVANTI A., CAMPA D., BERTOZZI A., PARDINI G., NAGLIK J. R., BARALE R. et SENESI S., 2006.- Candida albicans isolates with different genomic backgrounds display a differential response to macrophage infection. Microbes and Infection, vol. 8: 791-800. 156. TELLI A., 2009.- Extraction, identification et activité biologique des polyphénols des dattes au cours de différents stades phénologiques (varietéGhars). Thèse de Magister, Université KasdiMerbah-Ouargla, Algérie, 77p. 157. THUDE S., CLASSEN B., BLASCHEK W., BARZ D. et THUDE H., 2006.- Binding studies of an arabinogalactan-protein from Echinacea purpurea to leucocytes. Phytomedicine, vol. 13(6): 425-427. 158. TIAN C. C., ZHA X. Q., PAN L. H., LUO J. P., 2013.- Structural characterization and antioxidant activity of a low-molecular polysaccharide from Dendrobiumhuoshanense. Fitoterapia, vol. 91: 247-255. 159. TICAR B. F., ROHMAH Z., AMBUT C. V., CHOI Y. J., MUSSATTO B. D. C., 2015.- Enzyme-assisted extraction of anticoagulant polysaccharide from Liparistessellatus eggs. International Journal of Biological Macromolecules, vol. 74: 601–607. 160. TOGOLA A., INNGJERDINGEN M., DIALLO D., BARSETT H., ROLSTAD B., MICHAELSEN T. E., PAULSEN B. S., 2007.-Polysaccharides with complement fixing and macrophage stimulation activity from Opiliaceltidifolia, isolation and partial characterization. Journal of Ethnopharmacology, vol. 115: 423-431. 161. TRABUT L., 1935.- Flore du nord de l’Afrique Répertoire des Noms indigènes des plantes spontanées, cultivées et utilisées dans le Nord de l'Afrique. Alger. Imprimeries «La Typo·Litho» et jules carbonelreunies. 355p. 162. VALLE M. G., A ENDINO G., NANO G. M., PICCI, V., 1987.- Prenylatedcoumarins and sesquiterpenoids from Ferula communis. Phytochemistry, vol. 26: 253-256. 163. VELU H. et GARDAS J. 1924.- Le férulisme. Arch. lnst. Pasteur, Alger, vol. 2 (4): 494- 505. 164. WANG M., JIANG C., MA L., ZHANG Z., CAO L., LIU J., ZENG X., 2013.- Preparation, preliminary characterization and immunostimulatory activity of polysaccharide fractions from the peduncles of Hoveniadulcis. Food Chemistry, vol.138 (1): 41–47. 165. WANG Q., KUANG H., SU Y., SUN Y., FENG J., GUO R., CHAN K., 2013.- Naturally derived anti-inflammatory compounds from Chinese medicinal plants. Journal of ethnopharmacology, vol: 146: 9-39.

Références bibliographiques

166. WANG X., HUANG M., SUN H., ZHOU X., GUO Y., WANG X., ZHANG M., 2015.- Rapeseed polysaccharides as prebiotics on growth and acidifyingactivity of probiotics in vitro. Carbohydrate Polymers, vol. 125: 232–240. 167. WANG X., ZHANG Z., YAO Z., ZHAO M., QI H., 2013.- Sulfation, anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algae Enteromorphalinza. International Journal of Biological Macromolecules, vol.58: 225-230. 168. WARRAND J., 2004.- Etude structurale et propriétés en solution des polysaccharides constitutifs de mucilage de lin (Linumusitassimum). Thèse de Doctorat, Université de Picardie jules verne, 238 p. 169. WOTOVIC A., 1989.- Synthèse de fragments de xyloglucane, oligosaccharides végétaux à activité hormonale potentielle. Thèse de doctorat en Chimie université d’Orleans (France); 116p. 170. WU H., ZHU J., DIAO W., et WANG C., 2014.- Ultrasound-assisted enzymatic extraction and antioxidant activity ofpolysaccharides from pumpkin (Cucurbitamoschata). Carbohydrate Polymers, vol. 113: 314–324. 171. WU Y., CUI S. W., TANG J., Wang Q. et GU X., 2007.- Preparation, partial characterization and bioactivity of water-soluble polysaccharides from boat-fruited Sterculia seeds. Carbohydrate polymers, vol. 70: 437–443. 172. XI Z., CHEN W., WU Z., WANG Y., ZENG P., ZHAO G., LI X. et SUN L., 2012.- Anti-complementary activity of flavonoids from Gnaphalium affine D. Don. Food Chemistry, vol. 130: 165-170. 173. YAN H., ZHU D., XU D., WU J., BIAN X., 2008.- A study on Cordycepsmilitaris polysaccharide purification, composition and activity analysis. African Journal of Biotechnology, vol: 7: 4004-4009. 174. YANG C., GUAN J., ZHANG J. S. and LI S. P., 2010.- Use of HPTLC to Differentiate Among the Crude Polysaccharides in Six Traditional Chinese Medicines. Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Macau SAR, China. Journal of Planar Chromatography, vol. 23: 1-46. 175. YING R., 2012.- Rôle des arabinoxylanes et des β-glucanes dans l’assemblage et les propriétés des parois de l’albumen des grains de céréales. Thèse de doctorat, Université de Nantes, 222 p. 176. YOON S.J., PEREIRA M. S., PAVA M. S. G., HWANG J. K., PYUN Y. R., MOURA P. A. S., 2002.- The medicinal plant Poranavolubilis contains polysaccharides with anticoagulant activity mediated by heparin cofactor II. Thrombosis Research, vol. 106: 51– 58. 177. YUAN Q., XIE Y., WANG W., YAN Y., YE H., JABBAR S., ZENG X., 2015.- Extraction optimization, characterization and antioxidant activity in vitro of polysaccharides from mulberry (Morus alba L.) leaves. Carbohydrate Polymers, vol.128: 52-62. 178. ZHANG B., LEUNG W. K., ZOU Y., MABUZELA W., JOHNSON Q., MICHAELSEN T. E., PAULSEN B. S., 2014.- Immunomodulating polysaccharides from Lessertiafrutescens leaves: Isolation, characterization and structure activity relationship. Journal of ethnopharmacology, vol 52: 340–348. 179. ZHANG C. X. et DAI Z. R., 2011.- Immunomodulatory activities on macrophage of a polysaccharide from Sipunculusnudus L.Food and Chemical Toxicology, vol. 9: 2961-2967.

Références bibliographiques

180. ZHANG H. L., LI J., LI G., WANG D. M., ZHU L. P. et YANG D. P., 2009.- Structural characterization and anti-fatigue activity of polysaccharides from the roots of Morindaofficinalis. International Journal of Biological Macromolecules, vol. 44: 257–261. 181. ZHANG Y., 2012.- Etude des relations entre structures etpropriétés de films d'arabinoxylanes isolés deco-produits agricoles. Thèse de doctorat, université de Reims champagne,201 p. 182. ZHANG Y., ZHANG J., MO X., LU X., ZHANG Y. and QIN L., 2010.- Modification, characterization and structure–anticoagulant activity relationships of persimmon polysaccharides. Carbohydrate Polymers, vol. 82: 515–520. 183. ZHAO B., ZHANG J., GUO X., et WANG J., 2013.- Microwave-assisted extraction, chemical characterization of polysaccharides from Liliumdavidii var. unicolor Salisb and its antioxidant activities evaluation. Food Hydrocolloids, vol. 31: 346-356. 184. ZHAUYNBAEVA K. S., RAKHIMOV D. A. et NIGMATULLAEV A. A., 2010.- Polysaccharides from seeds of higher plants. Water soluble polysaccharides from plant seeds of family Apiaceae. Chemistry of Natural Compounds, vol. 46(5): 783-784. 185. ZHU Y., LI Q., MAO G., ZOU Y., FENG W., ZHENG D., WANG W., ZHOU L., ZHANG T., YANG J., YANG L., et WU X., 2014.- Optimization of enzymeassisted extraction and characterization of polysaccharides from Hericiumerinaceus. Carbohydrate Polymers, vol. 101: 606-613. 186. ZONG A., GAO H., WANG F., 2012.- Anticancer polysaccharides from natural resources: A review of recent research. Carbohydrate Polymers, vol. 90: 1395-1410. 187. ZOU Y. F., BARSETT H., HO G. T. T., INNGJERDINGEN K.T., DIALLO D., MICHAELSEN T. E., PAULSEN B. S., 2015.-Immunomodulating pectins from root bark, stem bark, and leaves of the Malian medicinal tree Terminaliamacropterastructure activity relations. Carbohydrate Research, vol.403: 167–173. َببحبث بشٌت يٍ انًٍٍ، وصاسة انسٍبحت AHMED ELKHOLAIDI, 2002.- Wild plants from Yemen .188 .60p وانبٍئت انهٍئت انعبيت نحًبٌت انبٍئت انًىسىعت انُببحٍت نًُطمت سىف .انُببحبث انصحشاوٌت انشبئعت فً يُطمت انعشق انششلً -.HELLIS Y, 2005 .189 .248p انكبٍش نٍىسف حهٍس.

Annexes

Annexe 1 La courbe d’étalonnage d’oses totaux, oses neutres et oses acides, est obtenue à partir une solution de glucose ou d’acide glucuronique (0,1 g/l – 1g/l) (DUBOIS, 1956).

Tableau 9.- Préparation de la courbe d’étalonnage d’oses totaux, d’oses neutres et d’oses acides

Réactifs Blanc 0,001% 0,002% 0,005% 0,008% 0,01%

Eau distillée (ml) 1 0,9 0,8 0,5 0,2 0 Glc ou A.GLc (solution mère 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1 0,01%) (ml) Concentration (g/l) 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1

Mode opératoire

Oses totaux

Dans des tubes en verres placer un mélange de 200μl d’échantillon et 200μl de phénol

Oses neutres

Deux cent (200) microlitres de solution à doser sont mis dans des tubes en verre; 200 µl de solution résorcinol est ajouté, puis 1 ml d’H2SO4 à 96% est rapidement introduit dans le milieu réactionnel. Après agitation les tubes sont incubés à l’étuve à 90°C, pendant 30 mn jusqu’à l’apparition d’une couleur jaune brun. Après refroidissement dans un bain de glace pendant 30 mn et à l’abri de la lumière, l’absorbance est mesurée à 480 nm (MONSIGNY et al., 1988).

Oses acides

A 200μl de solution à doser, il est ajouté 1,2 ml de solution de tétraborate de sodium (borax) dans un bain de glace. Le mélange est agité et chauffé à 100°C pendant 5mn dans un bain Marie. Après refroidissement dans un bain de glace, 20μl de solution de méta-hydroxy- diphényle (MHDP) sont additionnés au mélange, à l’exception 20μl du NaOH (0,5%) sont

Annexes ajoutés au blanc au lieu du MHDP. L’absorbance est lue à 520nm après 5mn, la couleur violacée indique la présence des oses acides (BLUMENKRANTZ et ASBOE-HANSEN, 1973).

0,9 y = 7,567x 0,8 R² = 0,990 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Figure 12.-Courbe d’étalonnage des oses totaux (glucose)

1,4 y = 12,19x 1,2 R² = 0,992 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Figure 13.- Courbe d’étalonnage des oses neutres (glucose)

0,9 0,8 y = 8,177x 0,7 R² = 0,985 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12

Figure 14.- Courbe d’étalonnage des oses acides (ac. glucuronique)

Annexes

Annexe 2

La courbe d’étalonnage des protéines par méthode de LOWRY (1951), est obtenue à partir une solution de sérum albumine bovine (SAB) à différentes concentrations de 0,1 g/l - 1 g/l.

Tableau 10.-Préparation de la courbe d’étalonnage des protéines (LOWRY).

Réactifs (blanc) (0,01%) (0,02%) (0,05%) (0,08%) (0,1%) Eau Distillée 1 0,9 0,8 0,5 0,2 0 BSA 0,1%(ml) 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1 Concentration (g/l) 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1

Mode opératoire

Quatre cents (400) microlitres de chaque tube (T) sont mélangés à 2ml de réactif de Lowry puis incubés 20mn à la température ambiante et à l’obscurité. Après 20mn, 200μl de réactif de Folin dilué, sont ajoutés au mélange réactionnel avant de laisser les tubes incubés à l’obscurité pendant 30mn à la température ambiante. L’absorbance est mesurée à 750 nm au spectrophotomètre.

2 1,8 y = 18,63x 1,6 R² = 0,989 1,4 1,2 1 0,8 Do m Titre de l'axe deTitre 0,6 Linéaire (Do m) 0,4 0,2 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Titre de l'axe

Figure 15.- Courbe d’étalonnage des protéines méthode de LOWRY (BSA)

Annexes

Annexe 3

La courbe d’étalonnage des protéines par la méthode de BRADFORD (1976), est obtenue à partir une solution de sérum albumine bovine (SAB) à différentes concentrations de 0.1g/l – 0.01g/l.

Tableau 11.-Préparation de la courbe d’étalonnage des protéines (BRADFORD).

Réactifs (blanc) (0,001%) (0,002%) (0,005%) (0,008%) (0,01%) Eau Distillée 1 0,9 0,8 0,5 0,2 0 BSA (solution 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1 mère 0,01%) (ml) Concentration 0 0,1 0,2 0,5 0,8 1 (g/l)

Mode opératoire

Dans des tubes en verre, il est additionné un volume 400ul de solution à doser, puis, 2ml de réactif de Coomassie, Le mélange est homogénéisé pendant 30 secondes, L’absorbance est lue 595 nm après 2mn. La coloration est stable pendant une heure (BRADFORD, 1979).

0,3 y = 28,52x 0,25 R² = 0,988

0,2

0,15 Série1

absorbance 0,1 Linéaire (Série1)

0,05

0 0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012 concentration (%)

Figure 16.- Courbe d’étalonnage des protéines (BSA) la méthode de BRADFORD

Annexes

Annexe 4 La courbe d’étalonnage de l’activité antioxydante est obtenue à partir d’une solution d’acide ascorbique à différentes concentrations (0,01mg/ml à 0,1 mg/ml).

Tableau 12.- Préparation de la courbe d’étalonnage de l’activité antioxydante.

Réactif (0,001%) (0,002%) (0,004%) (0,006%) (0,008%) (0,01%) Eau distillée 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0 (ml) A. ascorbique 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 (0,01%) (ml) Concentration 0,01 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 (mg/ml)

Mode opératoire

DPPH : Cent (100) microlitres de chaque échantillon ou de l’étalon, sont placés dans des tubes en verre avec 3,9ml de réactif DPPH. Le mélange est agité et incubé à l’obscurité pendant 30 mn. L’absorbance est lue à 515nm. Une courbe d’étalonnage est préparée à l’aide de l’acide ascorbique (0,01%) (BOUGANDOURA et BENDIMERAD, 2012).

ABTS : Cent (100) microlitres de chaque échantillon ou de l’étalon sont placés dans des tubes en verre avec 3,9ml de réactif d’ABTS. Le mélange est agité et laisser à l’obscurité pendant 6mn. L’absorbance est lue à 734nm. Une gamme étalons est préparée par l’acide ascorbique (vitamine C) à différentes concentrations allant de 0,01mg/ml à 0,1mg/ml.

1,4 1,2 y = -0,083x + 1,259 R² = 0,983 1 0,8 0,6

Absorbance 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Concentration

Figure 17.- Courbe d’étalonnage d’acide ascorbique pour le test de DPPH

Annexes

0,72 0,71 y = -0,593x + 0,714 0,7 R² = 0,883 0,69 0,68

Absorbance 0,67 0,66 0,65 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Concentration

Figure 18.-Courbe d’étalonnage acide ascorbique pour le test d’ABTS

Résumés

Contribution à l'étude des polysaccharides hydrosolubles de quelques plantes de la famille des Apiaceae récoltées dans la région de Ghardaïa (Sahara septentrional Algérien)

Résumé

L’étude des polysaccharides hydrosolubles des gommes-résines de Ferula communis L. et des inflorescences d’Ammodaucus leucortichus Coss et Dur., deux plantes spontanées de la famille des Apiaceae récoltées au Sahara septentrional Est Algérien, a permis s’isoler par macération trois fractions polysaccharidiques hydrosolubles. Elles se composent d’une fraction polysaccharidique des gommes-résines de F. communis (FC1), une des gommes-résines de F. communis (FC2) et une fraction polysaccharidique des inflorescences d’A. leucotrichus. Le rendement massique est de 43.08% pour FC1, de 0.549% pour FC2 et de 4.051% pour AL. L’étude de la composition chimique des extraits bruts, laisse apparaître des taux d’oses totaux de

72.60 % (FC1), de 42.67% (FC2) et de 48.31% (AL). Les oses neutres ont les teneurs les plus

élevées avec 60.45% (FC1), 39.21% (FC2) et 31.74% (AL). Les teneurs en protéines sont de

2,675%, 3,072%, 6,636% pour les trois fractions FC1, FC2 et AL respectivement. L’analyse de la composition en monosaccharides par CCM après un hydrolyse par TFA à 2 M durant 4 heures et 6 heures à 100 °C montre la présence de glucose, de galactose, d’arabinose, de xylose et d’acide glucoronique, la dominance d’arabinose et de xylose et la présence de glucose ou de galactose pour AL. Pour les fractions des gommes-résines de F. communis, il est noté la présence de galactose en dominance, et d’arabinose pour FC1. La mesure de TCA de l’activité anticoagulante, donne pour la fraction AL 300 s. Cette valeur est supérieure à celle du contrôle normal 30.9 s. Les TCA pour les deux fractions FC1 et FC2, sont de 29.4 s, 27.5s. Des effets faibles des fractions sont obtenus pour le TP avec aucune différence significative dans le test TT pour la fraction AL. Les activités antioxydantes testées pour les trois fractions, sont de 14.61%

(FC1), de 5.50% (FC2) et de 13.46% (AL) pour une concentration de 1mg/ml. Les fractions ont des activités phagocytaires de 11% pour FC2 et AL, et de 6% pour FC1. Toutefois, le zymosan utilisé comme contrôle positif présente une activité de 18%.

Mots clés: Polysaccharides, gommes-résines, mucilages, plantes spontanées, activités biologiques, Sahara.

Contribution to the study of water-soluble polysaccharides of some plants of the family Apiaceae harvested in the region of Ghardaïa (northern Sahara Algeria)

Abstract

The study Crude water-soluble polysaccharides were extracted from the spontaneous plants, gums-resins of Ferula communis L. and inflorescences of Ammodaucus leucotrichus Coss et Dur., two species of Apiaceae family. They were collected from the region of Septentrional Est Algerian Sahara helped by maceration isolate three water-soluble polysaccharide fractions.

They consist of a polysaccharide fraction of gum resins of F. communis (FC1), a fraction of gum- resins F. communis (FC2) and a fraction polysaccharide of inflorescences. of Ammodaucus leucotrichus (AL). The mass yield is 43.08% for FC1, 0.549% for FC2, and 4.051% for AL. The study of the chemical composition of crude extracts, reveals total saccharide rate of 72.60%

(FC1), of 42.67% (FC2) and of 48.31% (AL). The neutral monosaccharides have the highest levels with 60.45% (FC1), 39.21% (FC2) and 31.74% (AL). Protein levels are 2.675%, 3.072%,

6.636% for the three fractions FC1, FC2 and AL respectively. The analysis of monosaccharides composition by TLC after hydrolysis by 2 M TFA for 4 hours and 6 hours at 100 ° C shows the presence of glucose, galactose, arabinose, xylose and glucuronic acid, the dominance of arabinose and xylose, and presence of glucose or galactose for AL. In the fractions of gum resins of F. communis, it is noted the presence of galactose in dominance, and arabinose for FC1. The measurement of the APTT anticoagulant activity, provides for the fraction AL 300 s. This value is higher than the normal control 30.9 s. The APTT of two fractions for FC1 and FC2 are 29.4 s, 27.5s. Weak effects fractions are obtained for the PT with no significant difference in the TT test for AL fraction. Antioxidant activities tested for the three fractions are 14.61% (FC1), 5.50%

(FC2) and 13.46% (AL) to a concentration of 1mg / ml. Fractions were phagocytic activity of

11% for FC2 and AL, and 6% for FC1. However, zymosan used as positive control has an activity of 18%.

Key words : polysaccharides, gum-résins, mucilages, spontaneous plants biological activities, Sahara.

مساهمت لذراست السكزياث القابلت للذوبان في الماء لبعض النباتاث مه العائلت الخيميت المحصودة مه منطقت غزدايت )شمال صحزاء الجزائر(

الخالصت

دساست انسكشٌبث انًخعذدة انمببهت نهزوببٌ فً انًبء انًسجخهصت يٍ انُببحبث انخهمبئٍت يٍ صًغ-ساحُش َبخت انفٍشوال )انكهخ( Ferula communis، ويٍ أصهبس َبخت أو دسٌمت Ammodaucus leucotrichus، كال انُبخخٍٍ ٌُخًٍبٌ انى انعبئهت)انخًٍٍت( Apiaceae ، انخً حى لطفهب يٍ يُطمت شًبل ششق صحشاء انضضائش يكُج يٍ انحصىل عهى رالد

يسخخهصبث سكشٌت خبو عٍ غشٌك عًهٍت انُمع وحخأنف يٍ صضٌئخٍٍ سكشٌخٍٍ يٍ صًغ َبخت انفٍشوال FC1و FC2،و صضٌئت

سكشٌت يٍ أصهبس َبخت أو دسٌمت AL. اليشدود الكخهً لذس بُسب يخفبوحت % 43,08 ببنُسبت لنضضٌئت FC1،و %0,549 ببنُسبت

نهضضٌئت FC2، أيب انًشدود انكخهً نهضضٌئت AL فمذ لذس بـ 4.051%. دساست انخشكٍب انكًٍٍبئً نهًسخخشس انخبو أظهش َسب

انسكشٌبث االصًبنٍت FC2 ( %42.67 ، )FC1( %72.6(، و AL( %48.31(، أيب انسكشٌبث انًعخذنت فمذ لذسث ببنُسب

األعهى AL( %31.74 ،)FC2 ( %39.21 ،)FC1(%60.45(. َسب انبشوحٍُبث انًخحصم عهٍهب هً كبنخبنً: %2.675،

3.072%، و 6.636% نكم يٍ انضضٌئبث انزالرت FC2 FC1، و AL عهى انخىانً. أظهش انخحهٍم انكًٍٍبئً نهًشكببث انسكشٌت انبسٍطت بطشٌمت انكشف انكشويبحىغشافً ببسخعًبل الششائح السلٍمت بعذ أيبهخهب وححهههب بحًط TFA 2Mنًذة 4 سبعبث و 6 سبعبث ححج دسصت 100 يئىٌت حىاصذ كم يٍ انضهىكىص ، انضالكخىص،اَسابٍُىص، االكسٍهىص ، و حًط انضهىكىسوٍَك، بحٍذ

ٌىصذ سٍبدة نكم يٍ األسابٍُىص واالكسٍهىص فً انضض ٌئت AL يع حىاصذ لهٍم يٍ انضهىكىص أو انضالكخىص. أيب انضضٌئت FC1 فهً عًىيب ححخىي عهى االسابٍُىص و انضالكخىص بُسب عبنٍت . أظهشث انُخبئش انًخحصم عهٍهب فً حضشبت انى اضد لنخخزش انذو وي أيكبٍَت انًسخخشس ALعهى اغبنت انىلج انًسضم فً حضشبت TCA انى أكزش يٍ 300 ربٍَت يمبسَت يع الولج انًسضم فً انحبنت

انعبدٌت 30.9ربٍَت. أيب كال يٍ انضض ٌئخًٌ FC1و FC2فمذ أظهشث َخبئش ألم يٍ انىلج انعبدي ببنُسبت نُفس انخضشبت TCA 29.4ربٍَت و 27.5 ربٍَت نكم يُهًب عهى انخىانً. حأرٍش ظئٍم نمصضٌئت AL عهى صيٍ انخخزش فً عبيم انخشويبىبالسخٍٍ TP،أيب ببنُسبت نعبيم انفبشٌٍ TT فهى ٌظهش فشق كبٍش ببنُسبت نمصيٍ انطبٍعً.األَشطت انًعبدة نهخأكسذ نكم يٍ انضضٌئبث انزالد

لذسث بُسبFC2(%5.50 ، )FC1( %14.61(، و AL( %13.46(ببنُسبت نهخشكٍض 1يغ/1يم. انضضٌئبث انزالد نهب ايكبٍَت

ححفٍض انببنعبث بُسبت 11% نكم يٍ FC2 و AL. و 6 % ببنُسبت نهضضٌئت FC1، عهى انشغى يٍ أٌ انشبهذ االٌضببً انًسخعًم فً حضشبت ظبهشة انبهعًت zymozan رو َشبغ لذس بـ %18 .

الكلماث المفتاحيت: انسكشٌبث انًخعذدة ، صًغ-ساحُش، انهالو انُببحً، انُببحبث انخهمبئٍت، انُشبغبث انبٍىنىصٍت، انصحشاء.