Universidade Federal De Santa Catarina Centro De Ciências Biológicas Departamento De Botânica Curso De Licenciatura Em Ciências Biológicas

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA CURSO DE LICENCIATURA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

Kathleen Terhaag

EFEITO DE TIPOS DE EXPLANTES E DE AUXINAS NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM CULTURAS CELULARES DE Passiflora setacea BRS Pérola do Cerrado (PASSIFLORACEAE)

Florianópolis 2019

Kathleen Terhaag

EFEITO DE TIPOS DE EXPLANTES E DE AUXINAS NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM CULTURAS CELULARES DE Passiflora setacea BRS Pérola do Cerrado (PASSIFLORACEAE)

Trabalho Conclusão do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Licenciado em Ciências Biológicas Orientador: Profª. Dra. Ana Maria Viana Coorientador: Dra. Daiane Fiuza Montagner

Florianópolis 2019

Terhaag, Kathleen EFEITO DE TIPOS DE EXPLANTES E DE AUXINAS NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM CULTURAS CELULARES DE Passiflora setacea BRS Pérola do Cerrado (PASSIFLORACEAE) / Kathleen Terhaag ; orientadora, Ana Maria Viana, coorientadora, Daiane Fiuza Montagner, 2019. 128 p.

Trabalho de Conclusão de Curso (graduação) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Graduação em Ciências Biológicas, Florianópolis, 2019.

Inclui referências.

1. Ciências Biológicas. 2. Passiflora setacea. 3. Auxinas. 4. Fenólicos. 5. Atividade antioxidante. I. Viana, Ana Maria . II. Fiuza Montagner, Daiane . III. Universidade Federal de Santa Catarina. Graduação em Ciências Biológicas. IV. Título.

Kathleen Terhaag EFEITO DE TIPOS DE EXPLANTES E DE AUXINAS NO CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM CULTURAS CELULARES DE Passiflora setacea BRS Pérola do Cerrado (PASSIFLORACEAE)

Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de “Licenciado em Ciências Biológicas” e aprovado em sua forma final pelo Curso de Licenciatura em Ciências Biológicas

Florianópolis, 20 de janeiro de 2020.

Prof. Dr. Carlos Roberto Zanetti Coordenador do Curso

Banca Examinadora:

Profª. Dr.(a) Ana Maria Viana Orientador(a) BOT/CCB/UFSC

Prof.(a) Dr. João de Deus Medeiros Avaliador BOT/CCB/UFSC

Dr. Tiago Tizziani Avaliador QMC/CFM/UFSC

Dedico este trabalho aos meus pais, Rudolf e Berenice, por serem os principais responsáveis por todas as conquistas que atingi em minha vida. Minha eterna e profunda gratidão!

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, dedico meus agradecimentos à Universidade Federal de Santa Catarina, que não somente possibilitou a minha formação através do ensino público e de excelência, mas também me proporcionou vivências únicas que modificaram a minha visão e percepção de mundo, meu caráter e minha construção enquanto cidadã. Agradeço à minha orientadora, professora Dra. Ana Maria Viana pelo acolhimento no Laboratório de Biotecnologia Vegetal, pelas pacientes orientações durante o desenvolvimento do trabalho e por confiar em mim para realizá-lo, pelos valiosos ensinamentos transmitidos e, principalmente, por ter me introduzido ao magnífico mundo da Biotecnologia Vegetal, pelo qual sou completamente apaixonada. Meus agradecimentos também são dedicados à minha coorientadora e amiga Dra. Daiane Fiuza Montagner. Obrigada pelos ensinamentos de bancada, de análise e de escrita, e por dedicar seu tempo e energia para me coorientar. Jamais esquecerei as nossas conversas, os conselhos recebidos, as risadas e momentos que dividimos e, até mesmo, os fins de semana no departamento de química e noites em que ficamos até tarde na botânica realizando nossos experimentos. O seu amparo e presença tornou todo o processo mais leve e divertido. Hoje sou uma cientista melhor, graças a você e à professora Ana. Agradeço também aos professores Dra. Ines Maria Costa Brighente e Dr. Valdir Rosa Correia pela confiança e por disponibilizar o Laboratório de Química dos Produtos Naturais (LQPN) para que eu pudesse realizar os meus experimentos. Aos companheiros de laboratório, Tiago Tizziani e Ana Paula Ruani, obrigada pelas conversas, pelos ótimos cafés divididos, pelas sugestões ao longo do desenvolvimento dos experimentos e por me ajudarem sem hesitar quando precisei de auxílio. Aos meus pais, dedico os mais sinceros agradecimentos, pois me ensinaram o valor do estudo, da persistência e da dedicação. Obrigada por nunca medir esforços para que eu atinja meus objetivos e conquiste os meus sonhos e obrigada por todo o amor que recebo e sinto diariamente de vocês, mesmo apesar da distância, que nunca nos separou. Vocês são meu espelho de justiça, de humildade, integridade e, acima de tudo, amor. Vocês estão

presentes em cada conquista que atingi em minha vida, e são plenamente tão responsáveis por elas quanto eu. Espero que ao longo da minha vida eu possa retribuir o orgulho que vocês me proporcionam. Às minhas irmãs, Cynthia e Evelyn, obrigada de todo o meu coração, pelos abraços, palavras de conforto e encorajamento, pela paciência nos dias difíceis, pela companhia e companheirismo diário, pelas risadas dividas, pela amizade incondicional e por sempre estarem ao meu lado. À Evy também agradeço pelas valiosas ajudas relacionadas à química no desenvolvimento do meu trabalho, desejo boa sorte e sucesso para você no trilhar incrível dessa ciência. Agradeço também às minhas queridas amigas Anna Luiza e Larissa. A amizade, compreensão, abraços e palavras de apoio de vocês foram fundamentais no desenvolvimento desse trabalho e também durante toda a graduação. Vou guardar todos os nossos momentos no fundo da memória e no coração. Aos inúmeros amigos conquistados ao longo da graduação – são tantos que não posso citá-los. Obrigada por tornarem essa experiência mais leve e divertida. Essa foi a época mais divertida que vivi até o momento e vocês são responsáveis por tornar essa vivência memorável.

RESUMO

Passiflora setacea D.C. (Passifloraceae) é uma espécie endêmica do Brasil, encontrada em biomas vulneráveis como o Cerrado, Mata Atlântica e Caatinga. Por apresentar importantes propriedades bioquímicas, toxicológicas e medicinais, o programa de melhoramento genético da Embrapa Cerrados desenvolveu a variedade BRS Pérola do Cerrado com o intuito avaliar o uso funcional de passifloras silvestres. O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de tipos de explantes e diferentes concentrações das auxinas ácido α-naftalenoacético (ANA) e ácido 2,4 diclorofenoxiacético (2,4-D) sobre o crescimento, teores de compostos fenólicos totais, flavonoides, clorofilas, carotenoides e na atividade antioxidante de extratos de culturas de calos de P. setacea. Os calos obtidos através da cultura in vitro de segmentos de nó cotiledonar e cotilédone de plantas axênicas de P. setacea foram mantidos em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 2,5, 5 ou 10 μM de 2,4-D ou ANA e 0,2% (m/V) de Phytagel. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada 25 ± 2ºC, sob fotoperíodo de 16/8 horas de luz/escuro e umidade relativa de 70%. Após 30 dias de cultivo, os calos foram coletados, secos em estufa a 60°C por 24h e submetidos à extração hidroalcoólica por maceração. Os teores de fenólicos totais e flavonoides foram determinados através dos métodos colorimétricos de Folin-Ciocalteu e do cloreto de alumínio, respectivamente, e a avaliação da atividade antioxidante dos extratos mensurada a partir do ensaio do poder redutor e da capacidade de sequestro do radical livre DPPH. O ANA na concentração de 10 μM otimizou a biossíntese de fenólicos totais e a atividade antioxidante medida pelo poder redutor e captura do DPPH em calos de nó cotiledonar, além de ter promovido o maior incremento em biomassa seca. A aplicação de 2,5 μM de 2,4-D estimulou a maior biossíntese de flavonoides, clorofilas e carotenoides em calos de cotilédone. Os resultados indicaram a relevante influência do tipo de explante de origem dos calos e das concentrações das diferentes auxinas na produção de compostos fenólicos, clorofilas, carotenoides e atividade antioxidante dos extratos de calos de P. setacea, possibilitando a otimização de parâmetros para potencializar o desenvolvimento de bioprocessos in vitro para a produção de biomoléculas de interesse.

Palavras-chave: Passiflora setacea, calogênese, tipos de explantes, auxinas, fenólicos, clorofilas, carotenoides, atividade antioxidante.

ABSTRACT

Passiflora setacea D.C. (Passifloraceae) is a native species from the brazilian biomes Cerrado, Atlantic Forest and Caatinga. Due to its important biochemical, toxicological and medicinal properties, Embrapa Cerrados breeding program developed the BRS Pérola do Cerrado variety in order to evaluate the functional use of wild passifloras. The objective of this work was to evaluate the effects of explant types and auxins, α-naphthalenoacetic acid (ANA) and 2-4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) at different concentrations on growth, content of total phenolics, flavonoids, chlorophylls, carotenoids and antioxidant activity from callus extracts of P. setacea. Calluses obtained from in vitro culture of cotyledon and cotyledonary node segments of P. setacea axenic plants were maintained in Murashige & Skoog culture medium, supplemented with 88.5 mM sucrose, 2.5, 5 or 10 μM of either 2,4- D or ANA and 0.2% (w/v) Phytagel. The cultures were kept in a growth room with controlled temperature 25 ± 2ºC, under photoperiod of 16/8 hours of light/dark and relative humidity of 70%. After 30 days of cultivation the calluses were collected oven dried at 60°C for 24h and submitted to the hydroalchoolic extraction. The extracts were analysed by Folin Ciocalteu (total phenolics) and aluminium chloride (flavonoids) colorimetric methods and the antioxidant activity was measured by the DPPH free radical scavenging capacity and by de reducing power (ferric ion reduction). ANA at a concentration of 10 μM optimized the total phenolic biosynthesis and the levels of antioxidant activity measured by the reducing power and DPPH capture in cotyledonary node derived calluses and promoted the best increase in dry biomass. The application of 2.5 μM 2,4-D stimulated the highest flavonoids, chlorophylls and carotenoids contents in cotyledon derived calluses. These results indicated the relevant influence of the explant type and different auxin concentrations on the production of phenolic compounds, chlorophylls, carotenoids and antioxidant activity of of P. setacea calluses extracts and allowed the parameters optimization for the development of in vitro bioprocesses to produce biomolecules of interest.

Keywords: Passiflora setacea, calluses culture, explant type, auxins, phenolics, chlorophylls, carotenoids, antioxisant activity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Passiflora setacea. A – Flor de P. setacea. B – Frutos de P. setacea ...... 28 Figura 2 – Visão simplificada das principais rotas de biossíntese de metabólitos secundários e suas interrelações com o metabolismo primário ...... 29 Figura 3 – Estrutura molecular básica dos compostos fenólicos...... 31 Figura 4 – Fluxograma da biossíntese dos compostos fenólicos a partir da via do ácido chiquímico...... 32 Figura 5 – Estrutura molecular de flavonoides...... 34

Figura 6 – Estrutura molecular da clorofila a (substituinte CH3) e clorofila b (substituinte CHO)...... 38 Figura 7 – Rotas metabólicas do 2,4-D… ...... 57 Figura 8 – Fluxograma geral das metodologias utilizadas no desenvolvimento do trabalho. O processo tem início na obtenção da P. setacea BRS-PC, germinação das sementes e excisão dos segmentos de nó cotiledonar e cotilédone das plântulas para a indução da calogênese. Os calos são então tratados com as diferentes concentrações dos reguladores de crescimento 2,4- D e ANA e coletados após o período de crescimento de 30 dias. Todos os tratamentos testados totalizaram 14 amostras. Todas as amostras passaram então pelo processo de secagem, fragmentação mecânica e extração em solvente EtOH P.A para então realizar os testes fitoquímicos. Para as quantificações de clorofilas, a extração foi realizada com material fresco em solvente acetona 80% ...... 61

Figura 9 – Calos de Passiflora setacea originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone, cultivados com as concentrações de 2,5, 5 e 10 µM da auxina ácido naftalenoacético (ANA) em comparação com calos originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone cultivados sem a adição de auxinas (controle) aos 30 dias de cultivo...... 69 Figura 10 - Calos de Passiflora setacea originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone, cultivados com as concentrações de 2,5, 5 e 10 µM da auxina 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D) em comparação com calos originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone cultivados sem a adição de auxinas (controle) aos 30 dias de cultivo...... 69

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Principais agentes de defesa antioxidante enzimáticos e não enzimáticos… .... 36 Tabela 2 – Exemplos de carotenoides, sua coloração e fontes produtoras… ...... 41 Tabela 3 – Meios de cultura utilizados para cultura vegetal in vitro ...... 49 Tabela 4 – Elicitores biológicos, químicos e físicos mais utilizados na indução de metabólitos secundários em culturas in vitro ...... 50 Tabela 5 – Principais reguladores de crescimento utilizados nos últimos dez anos em pesquisas relacionadas ao aumento da produção de metabólitos secundários a partir de culturas in vitro ...... 52 Tabela 6 – Efeitos de auxinas na massa fresca, massa seca, razão massa seca/massa fresca, teor de água e coeficiente de correlação linear de calos de segmentos de nó cotiledonar de P. setacea, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 2,5, 5 ou 10 µM de 2,4-D, ANA e 0,2% de Phytagel...... 73

Tabela 7 – Valores de coeficientes de correlação linear simples entre as concentrações de 2,4-D e ANA e biomassa seca, teor de biomassa seca, carotenoides, clorofila, fenólicos totais, flavonoides, poder redutor e atividade antioxidante pelo DPPH de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel...... 74

Tabela 8 – Efeitos de tipos de explante e de auxinas nos teores de fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante, determinada pelos testes do poder redutor e do sequestro do radical livre DPPH de extratos de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel...... 80

Tabela 9 – Efeitos interativos de tipos de explante e de auxinas nas porcentagens de flavonoides em relação aos fenólicos totais de extratos de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel ...... 81

Tabela 10 – Efeitos de tipos de explante e de auxinas nos conteúdos de clorofilas e carotenoides, de extratos de calos de P. setacea, originado de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel...... 85

Tabela 11 – Valores de coeficientes de correlação linear simples entre clorofila total, carotenoides, fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante de extratos de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel...... 88

LISTAS DE ABREVIATURAS E SIGLAS

[Fe(CN)6]3 – ferricianeto

[Fe(CN)6]4 – ferrocianeto °C – graus Celsius µM – micromolar μg – micrograma μmol – micromol 2,4-D – ácido 2-4-diclorofenoxiacético AA% – porcentagem atividade antioxidante ABA – ácido abscísico ABI – ácido indol-3-butírico Abs – absorbância Acetil-CoA – Acetil Coenzima A ALB – biorreator de transporte aéreo

AlCl3 – cloreto de alumínio ANA – ácido naftalenoacético AS – ácido salicílico ATP – trifosfato de adenosina

AUX – proteína responsiva à auxina B5 – meio de Gamborg B5 BCB – biorreator de coluna de bolha BRS-PC – BRS Pérola do Cerrado CA – ácido cafeico

CaCl2 – cloreto de cálcio CE50 – concentração efetiva 50% Chl a – clorofila a Chl b – clorofila b Chl c – clorofila c Chl d – clorofila d cm – centímetros

CO2 – dióxido de carbono

Cot – cotilédone Cu – cobre DMA – dimetilamina

DMAPP – dimetilatil difosfato DNA – ácido desoxirribonucleico DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazil EAA – ácido ascórbico EHE – éster 2-etilhexil

EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária ERO – espécie reativa de oxigênio Fe – ferro g – grama g/L – gramas por litro g/m2 – grama por metro quadrado GMP – Boas Práticas de Fabricação

H3PMo12O40 – ácido fosfomolíbdico

H3PW12O4 – ácido fosfotúngstico HCl – ácido clorídrico HMG-COA – 3-hidróxi-3-metil-glutaril-CoA

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística IPP – isopentil difosfato KCl – cloreto de potássio

Kgf/cm3 – quilograma força por centímetro cúbico KIN – cinetina LAX – proteína adaptadora associada à membrana LS – meio de Linsmaier & Skoog M – molar m/V – massa por volume m-2. s-1 – metro quadrado por segundo MEP – metileritriotol fosfato mf – massa fresca

Mg – magnésio mg – miligrama MJ – metil jasmonato mL – mililitro mm – milímetro MO – molibdênio ms – massa seca MS – meio Murashige & Skoog

Na2CO3 – carbonato de sódio NADPH – fosfato de dinucleótido de nicotinamida e adenina Nc – nó cotiledonar nm – nanômetro

PAL – fenilalanina amônia liase

PAR –Photosynthetical Active Radiation

PEP – fosfoenolpiruvato carboxilase Pf – peso final pH – potencial hidrogeniônico Pi – peso inicial PIN – proteína integral de membrana rpm – rotações por minuto Sac – sacarose

SH – meio de Schenk & Hildebrandt STR – biorreator de tanque agitado

TDZ – thidiazuron TIB – biorreator de imersão temporária

UFSC – Universidade Federal de Santa Catarina

UV – ultravioleta W – tungstênio W – watt WAT1 – Walls Are Thin 1

WPM – Wood Plant Medium

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO...... 19 2 OBJETIVOS...... 22 2.1 Objetivos Gerais...... 22 2.2 Objetivos Específicos...... 22 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...... 23 3.1 Família Passifloraceae e o gênero Passiflora...... 23 3.2 Importância econômica, nutricional e farmacológica de passifloras...... 24 3.3 Importância das espécies silvestres de Passiflora e da Passiflora setacea...... 26 3.4 Metabólitos secundários...... 28 3.4.1 Compostos Fenólicos...... 31 3.4.1.1 Flavonoides...... 33 3.5 Antioxidantes...... 35 3.6 Clorofilas e Carotenoides...... 36 3.6.1 Clorofilas...... 37 3.6.2 Carotenoides...... 39 3.7 Estratégias biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários em plantas...... 42 3.7.1 Cultivo in vitro de calos...... 45 3.7.2 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários por culturas in vitro decalos...... 48 3.7.2.1 Meio de cultura e elicitores...... 48 3.7.2.2 Reguladores decrescimento...... 51 3.7.2.2.1 Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) ...... 53 3.7.2.2.2Ácido naftalenoacético (ANA)...... 58 4 MATERIAL E MÉTODOS...... 60 4.1 Material vegetal ...... 60 4.2 Métodos...... 61 4.2.1 Fluxograma geral dos métodos utilizados para a obtenção dos resultados demonstrados no trabalho...... 61 4.2.2 Manutenção das culturas in vitro de calos...... 61

4.2.3 Procedimentos de preparação dos meios de cultura, montagem dos experimentos com 2,4D e ANA e condições de crescimento das culturas...... 61 4.2.4 Determinação das biomassas fresca e seca, teor de biomassa seca em relação à biomassa fresca e do teor de água...... 62 4.2.5 Análises fitoquímicas...... 63 4.2.5.1 Procedimento de extração hidroalcoólica das culturas de calos...... 62 4.2.5.2 Determinação do teor de compostos fenólicos totais...... 64 4.2.5.3 Determinação do teor de flavonoides...... 64 4.2.5.4 Determinação da atividade antioxidante pela ação sequestradora do radical livre DPPH.....65 4.2.5.5 Determinação da atividade antioxidante pelo ensaio do poder redutor...... 66 4.2.5.6 Análise do teor de clorofila e carotenoides...... 67 4.2.6 Análises estatísticas...... 67 5 RESULTADOS...... 68 5.1 Efeito dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido naftalenoacético (ANA) no crescimento em calos de P. setacea...... 68 5.2 Efeito dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido naftalenoacético (ANA) na produção de fenólicos e na atividade antioxidante em calos de P. setacea...... 75 5.3 Efeitos dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido naftalenoacético (ANA) na quantificação de clorofilas e carotenoides em calos de P. setacea...... 82

5.4 Análise de correlação linear simples entre atividade antioxidante (CE50 e poder redutor) e os níveis de fenólicos totais, flavonoides, clorofilas e carotenoides em extratos de calos de P. setacea...... 86 6 DISCUSSÃO...... 89 6.1 Efeito dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido naftalenoacético (ANA) no crescimento em calos de P. setacea...... 89 6.2 Efeito dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido naftalenoacético (ANA) na produção de fenólicos e na atividade antioxidante em calos de P. setacea...... 94 6.3 Efeitos dos explantes e concentrações do 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e do ácido

naftalenoacético (ANA) na quantificação de clorofilas e carotenoides em calos de P. setacea...... 98

7 CONCLUSÃO...... 101 8 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPERCTIVAS FUTURAS...... 102 9 REFERÊNCIAS...... 103 APÊNDICE A...... 131 APÊNCIE B...... 132 APÊNDICE C...... 133

1 INTRODUÇÃO

Mais de 500 espécies são conhecidas no gênero Passiflora, o qual é o maior e mais diverso dentro da família Passifloracea (JOSHEE et al., 2019). De acordo com Joshee et al. (2019), apesar de alguns registros de espécies de passifloras encontradas em países como Índia, China e ilhas do Oceano Pacífico, o gênero é majoritariamente distribuído em regiões tropicais. O Brasil é um dos países mais ricos em diversidade do gênero, possuindo 140 do número total de espécies, das quais 84 são endêmicas deste país (KROSNICK et al., 2013; BERNACCI et al., 2014). Apesar da grande diversidade, somente as espécies Passiflora edulis, Passiflora edulis v. flavicarpa e Passiflora alata estão economicamente inseridas no mercado nacional (SOUZA & MELETTI, 1997), sendo as espécies silvestres pouco exploradas. As Passifloras têm sido utilizadas em todo o mundo em sistemas terapêuticos tradicionais devido às suas propriedades medicinais, além da comercialização através de produtos alimentícios. Portanto, as espécies do gênero Passiflora são consideradas de grande interesse pela indústria farmacêutica, uma vez que são ricas em substâncias bioativas, as quais são exploradas e utilizadas para a produção de medicamentos fitoterápicos consumidos em diversos países (DHAWAN et al., 2004; FIEBICH et al., 2011; OZAROWSKI & THIEM, 2013; OZAROWSKI et al., 2018). Os efeitos sedativos, ansiolíticos, tranquilizantes, analgésicos, antiespasmódicos e narcóticos foram previamente identificados em P. edulis, P. alata e P. incarnata (TEIXEIRA et al., 1997; BRAGA & JUNQUEIRA, 2000; LORENZI & MATOS, 2008). Além disso, segundo Hollman et al. (1996), Cook & Samman (1996), Hollman & Katan (1997) e Zeraik et al. (2010), a ação antioxidante, caracterizada pela captura de radicais livres em organismos vivos tem sido largamente estudada como atividade biológica importante de passifloras. Além disso, esse grupo de plantas apresenta outros benefícios, como propriedades analgésicas, diuréticas, vermífugas e antitumorais, além de serem recomendadas no tratamento de dependência química, obesidade, controle de tremores e distúrbios nervosos diversos (DHAWAN et al., 2004; COSTA et al., 2005; ZERAIK et al., 2010).

Estudos têm demonstrado que as propriedades medicinais de interesse presentes em passifloras são devidas às atividades de moléculas produzidas a partir do metabolismo secundário das plantas. No entanto, de acordo com Buchanan et al. (2015), há poucos estudos relacionados ao perfil metabólico de passifloras, sendo que somente 46 espécies do

21 gênero foram estudadas, de forma que se conhece muito pouco acerca da composição química dessas

plantas. Os compostos fenólicos, sobretudo, os flavonoides, são os principais fitoconstituintes observados em passifloras. Dessa forma, conforme Buchanan et al. (2015), há grande interesse nos metabólitos secundários devido às suas inúmeras utilidades práticas e, principalmente, aplicação nas indústrias farmacêutica e agroquímica. As passifloras nativas encontram-se, majoritariamente, distribuídas em biomas vulneráveis como é o caso do Cerrado brasileiro (MILWARD-DE-AZEVEDO, 2007), que sofre demasiadamente com os danos causados pela ação antrópica, culminando em desmatamentos e em processos erosivos. Ainda, segundo Meletti et al. (2005), essas espécies apresentam dificuldades de reprodução, posto que possuem baixas taxas germinativas, sendo que suas sementes entram em dormência e apresentam baixa tolerância ao armazenamento e à desidratação. Além disso, apresentam características importantes como resistência à algumas doenças e altas concentrações de metabólitos de importância medicinal, o que estimula os estudos sobre o seu potencial a ser explorado. Visando explorar novos recursos genéticos, espécies silvestres de passifloras vêm sendo estudadas como alternativa às espécies convencionais (WONDRACEK, 2009). Neste contexto, destaca-se a Passiflora setacea, espécie nativa dos biomas semi-áridos vulneráveis Cerrado e Caatinga, que demonstrou alto potencial para aplicação industrial advindas de suas propriedades bioquímicas, medicinais e toxicológicas derivadas de seus metabólitos secundários (QUISEN & ANGELO, 2008). Assim, vários estudos têm sido conduzidos com P. setacea com o objetivo de explorar a variabilidade genética, promover a conservação e a inserção dessa espécie na cadeia produtiva. A variedade P. setacea BRS PC foi obtida através do programa de melhoramento genético da Embrapa Cerrados, para melhorar a produtividade e os tamanhos dos frutos. Os efeitos imunomodulatórios de suco de frutos de P. setacea foram avaliados por Duarte (2015) e Gomes et al. (2017) constataram que a ação protetora foi atribuída aos compostos antioxidantes incluindo os flavonoides orientina, isoorientina, vitexina e isovitexina. Estudos também têm sido conduzidos no sentido de desenvolver abordagens biotecnológicas para micropropagação e avaliar o potencial de produção de metabólitos secundários por sistemas de cultura in vitro.

Os sistemas de cultura in vitro de calos são considerados ferramentas importantes para a produção de metabólitos secundários de várias espécies de plantas, pela possibilidade de produção em condições controladas e pela facilidade de manipulação de vários fatores que podem criar condições mais favoráveis para a produção dos compostos de interesse (EFFERTH, 2019). De acordo com Murthy et al. (2014) e Ochoa-Villarreal et al. (2016) a biossíntese de metabólitos secundários a partir da cultura de calos pode ser afetada por diferentes fatores como, por exemplo, o tipo de explante, a composição salina do meio de cultura, reguladores de crescimento, fontes de carbono e intensidade luminosa. Em culturas de calos de P. setacea, vários estudos foram conduzidos para otimizar todos esses fatores, exceto os reguladores de crescimento (SOZO, 2014; PERDOMO, 2016; MONTAGNER, 2018; FORMOLO, 2019). Portanto, o presente trabalho pretende estudar a influência de diferentes explantes e diferentes tipos e concentrações de auxinas nos teores de compostos fenólicos, flavonoides, atividade antioxidante, clorofilas e carotenoides totais, contribuindo para otimizar o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários dessa espécie.

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Este trabalho tem como objetivo avaliar, em diferentes condições de cultivo, a produção de compostos fenólicos e a atividade antioxidante em extratos de culturas de calos de P. setacea, originadas a partir do cultivo in vitro de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone.

2.2 Objetivos Específicos

i. Avaliar a interação entre o tipo de calo e as concentrações (2,5; 5 e 10 µM) dos reguladores de crescimento ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e ácido naftalenoacético (ANA), utilizados isoladamente, na biomassa seca e nos níveis de compostos fenólicos, flavonoides e atividade antioxidante, avaliada pelo ensaio do poder redutor e captura de radicais livres pelo DPPH das culturas de calos de P. setacea;

ii. Avaliar a interação entre o tipo de calo e as concentrações (2,5; 5 e 10 µM) dos reguladores de crescimento ácido 2-4-diclorofenoxiacético (2,4-D) e ácido naftalenoacético (ANA), utilizados isoladamente, nos níveis de clorofilas e carotenoides totais das culturas de calos de P. setacea.

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Família Passifloraceae e o gênero Passiflora

A família Passifloraceae é dividida em 25 gêneros e possui cerca de 700 espécies. Sua distribuição é essencialmente pantropical, com algumas espécies ocorrendo em regiões subtropicais setentrionais como o leste do Estados Unidos e Ásia (FEUILLET & MACDOUGAL, 2007). Quatro gêneros ocorrem na região neotropical: Dilkea Mast. (6 espécies); Mitostemma Mast. (3); Ancistrothyrsus Harms (3); e Passiflora L. (560), sendo este último presente também na África, Ásia e Austrália (CERVI, 1997; ULMER & MACDOUGAL, 2004). Dentro da família Passifloraceae destaca-se o gênero Passiflora, considerado o grupo mais relevante visto que é o mais diversificado. Ele compreende cerca de 560 espécies, sendo o Brasil um dos países mais ricos em diversidade deste gênero, possuindo 140 (20%) do número total de espécies, das quais 84 (60%) são endêmicas deste país (KROSNICK et al., 2013; BERNACCI et al., 2014). Esse gênero é distribuído, majoritariamente, do norte da Argentina até o sul do Estados Unidos, ocorrendo ainda cerca de 20 espécies no sudeste da Ásia, Austrália e Nova Zelândia (HANSEN et al., 2006). No Brasil, espécies do gênero Passiflora são popularmente conhecidas como maracujá. A etimologia da palavra vem da cultura do grupo indígena Tupi Guarani, derivando do termo marakuia, que significa ‘alimento em formato de cuia’ (SOUZA & MELETTI, 1997). Ainda sobre a origem da palavra tem-se que, devido às suas características morfológicas, esses frutos também são conhecidos como passion fruit (frutos-da-paixão), remetendo à Paixão de Cristo, onde os cinco filetes-estames representariam as cinco chagas, a corona-verticilos seria a coroa de espinhos e os três estiletes-estigmas fariam alusão à Santíssima Trindade (HOEHNE, 1937). A maioria das espécies de Passiflora apresenta-se como trepadeiras ou lianas, mas podem também apresentar-se como arbustos, árvores e herbáceas perenes e anuais. No Brasil, o maracujazeiro é uma planta trepadeira, vastamente distribuída pelo território e cultivada em diferentes tipos de solos e condições ambientais, apresentando variações

25 comportamentais por este motivo (CARVALHO-OKANO & VIEIRA, 2001; ULMER et al., 2004).

3.2 Importância econômica, nutricional e farmacológica de passifloras

O início do cultivo de maracujá em terras brasileiras deu-se no final da década de 1960, quando os primeiros pomares paulistas foram instalados através da iniciativa de cafeicultores que, num dos períodos de baixa deste cultivo, viram na fruticultura uma opção técnica e economicamente viável possibilitando elevado retorno financeiro devido à sua rápida produção, sendo compatível com a necessidade de renda imediata dos produtores (MELETTI, 2011). Atualmente o Brasil é o principal produtor e consumidor de maracujá, possuindo 97% das áreas de plantio e tendo, no ano de 2017, produzido mais de 554 toneladas do fruto em uma área de, aproximadamente, 40 mil hectares. Deste total, os principais estados produtores estão localizados na região Nordeste, sendo a Bahia responsável por aproximadamente 31% da produção e o Ceará por aproximadamente 17% (FERRAZ & LOT, 2007; IBGE, 2019). Oriundos dessa cultura, os produtos são comercializados, sobretudo, como frutos in natura, mas podem ser destinados ao consumo em forma de sucos, doces, néctares, licores e preparados lácteos. Ainda, o maracujá é considerado produto de interesse, visto que apresenta baixo teor de açúcares e de fenilalanina, além de não conter glúten e ser livre de gorduras (EPAMIG, 2000; KANUFRE et al. 2010, ZERAIK et al., 2010). Sua polpa é rica em ß- caroteno, riboflavinas, niacina (vitamina B3), cálcio, fósforo e ácido ascórbico, enquanto que sua casca é rica em potássio, fibras e pectina, além de apresentar baixo valor calórico, características apreciadas na produção de farinhas funcionais (PAIVA, 1998; JÚNIOR et al. 2000; CAZARIN et al., 2014; CORRÊA et al., 2016). No campo nutricional, o gênero Passiflora vêm destacando-se, dados recentes demonstram que a adição de farinha de casca de maracujá amarelo (Passiflora edulis v. flavicarpa) em uma massa alimentícia fresca sem glúten aumentou em 3,25% o teor de fibras e reduziu a porcentagem de carboidratos em 41,19%, aumentando assim valores nutricionais da massa, sendo considerada uma alternativa para atender uma demanda crescente do mercado que busca escolhas alimentares mais saudáveis (RIBEIRO et al., 2018).

Além da comercialização dos produtos alimentícios, as espécies do gênero Passiflora são consideradas de grande interesse das indústrias farmacêuticas, uma vez que são ricas em substâncias bioativas provenientes do metabólito secundário, as quais são exploradas e utilizadas para a produção de medicamentos fitoterápicos consumidos em diversos países (DHAWAN et al., 2004; FIEBICH et al., 2011; OZAROWSKI & THIEM, 2013).

Segundo Lorenzi & Matos (2008), Passiflora edulis apresenta efeito sedativo através do suco de seus frutos, Passiflora alata é utilizada como planta ornamental e medicinal, devido à presença de passiflorina, substância tranquilizante extraída de suas folhas, e da maracugina presente nas flores e frutos (TEIXEIRA et al., 1997; BRAGA & JUNQUEIRA, 2000) e, segundo Dhawan et al. (2004), Passiflora incarnata pode ser utilizada como sedativo, analgésico, antiespasmódico e narcótico. Além disso, segundo Hollman et al. (1996), Cook & Samman (1996), Hollman & Katan (1997) e Zeraik et al. (2010), a ação antioxidante, caracterizada pela captura de radicais livres em organismos vivos – a qual é conferida aos polifenóis, principalmente flavonoides (WANG et al., 1996; BRAVO, 1998; MARTINEZ-VALVERDE et al., 2000; KAUR & KAPOOR, 2002) –, tem sido largamente estudada como atividade biológica importante de passifloras. Ademais, esse grupo de plantas apresenta outros benefícios, como propriedades analgésicas, diuréticas, vermífugas e antitumorais, além de serem recomendadas no tratamento de dependência química, obesidade, controle de tremores e distúrbios nervosos diversos (DHAWAN et al., 2004; COSTA et al., 2005; ZERAIK et al., 2010). Nos estudos de Oliveira et al. (2016) foram encontrados antioxidantes promissores e propriedades antibacterianas em ácidos graxos e compostos fenólicos provenientes de extratos das sementes de P. subpeltata. Efeitos neuroprotetivos foram demonstrados a partir de extratos de P. edulis, também foram verificadas atividades antioxidante, anti-diabética e antimicrobiana em extratos de polpa de P. ligularis (SARAVANAN & PARIMELAZHAGAN, 2014; QUEIROZ et al., 2012). Além disso, os estudos de Mazon- Suastegui et al. (2019) demonstraram que, um tratamento homeopático constituído por porções iguais de Passiflora incarnata, Valeriana officinalis, Zincum valerianicum e Ignatia amara aumentou a taxa de sobrevivência de camarões (Litopenaeus vannamei) infectados com a bactéria Vibrio parahaemolyticus.

3.3 Importância das espécies silvestres de Passiflora e da Passiflora setacea

O uso de passifloras em sistemas terapêuticos tradicionais é popularmente conhecido e, apesar da grande biodiversidade do gênero constatada no Brasil, somente as espécies Passiflora alata Curtis (maracujá-doce), Passiflora edulis v. flavicarpa (maracujá-amarelo ou maracujá-azedo), e a Passiflora incarnata (não comestível, mas com valor farmacológico e medicinal) são economicamente exploradas e estão inseridas no mercado nacional (SOZO, 2014; GOMES et al., 2017). Além disso, de acordo com Milward-de-Azevedo (2007), espécies do gênero Passiflora encontram-se distribuídas em biomas vulneráveis às secas, queimadas e ação antrópica que culmina em desmatamento de áreas de cultivo e em processos erosivos. A partir disso, como alternativa às espécies convencionais, tem-se explorado cada vez mais espécies silvestres de passifloras. Isso deve-se ao fato de que espécies silvestres possuem adaptações às condições extremas dos ambientes onde estão inseridas, demonstrando alto potencial de defesa contra processos oxidativos e com alto teor de compostos bioativos como fenólicos e vitamina C (CARVALHO et al., 2018), características apreciadas em aplicações biotecnológicas que objetivam a produção de biocompostos de interesse. Além disso, essas espécies silvestres desempenham interesse para programas de melhoramento genético, uma vez que são fontes de resistência a doenças e patógenos, além de possuírem as propriedades nutricionais e terapêuticas já citadas (PERDOMO, 2016). Passiflora setacea D.C é uma espécie silvestre pertencente ao subgênero Passiflora e foi descrita em 1828 (Figura 1). São plantas que crescem sobre rochas calcárias, em beira de mata e capoeiras, e que florescem e frutificam de setembro a maio. Seus frutos são ovoides e globosos possuindo, aproximadamente, 5 cm de comprimento e 4 cm de largura, a casca é verde-amarelada mesmo quando maduros e a polpa apresenta coloração amarelo- perolada e sabor acidulado (CERVI, 1997; COSTA, 2013). P. setacea habita biomas como o Cerrado, Mata Atlântica e a Restinga, sendo que sua distribuição geográfica se dá nos estados do Alagoas, Bahia, Espírito Santo, Goiás, Mato Grosso, Minas Gerais, Rio de Janeiro, bem como no Distrito Federal (CERVI, 1997; MILWARDE-DE-AZEVEDO, 2007). O nome “setacea” deriva-se do latim, cujo significado remete à “forma de seta” de suas folhas.

No Brasil, P. setacea é conhecida popularmente como maracujá-sururuca (PIO- CÔRREA, 1984) ou maracujá do sono, pois apresenta propriedades de modulação do sono (BOMTEMPO et al., 2016). Segundo Duarte (2015) o consumo de suco de frutos de P. setacea provocou efeito imunomodulador e aumentou a fagocitose de patógenos, devido à grande eficiência de ação sobre o sistema imune contra danos celulares. Segundo Carvalho et al. (2018) essa ação protetora poderia ser atribuída à componentes antioxidantes, incluindo flavonoides como orientina e isoorientina, vitexina e isovitexina detectados por Gomes (2013). Devido às suas propriedades físico-químicos, essa espécie destaca-se por diversas características de interesse, às quais atendem à demanda da indústria alimentícia (a polpa é utilizada na produção de sucos e doces e o fruto in natura é direcionado ao consumo) e a indústria farmacêutica (é utilizada em suplementos, cosméticos, fármacos e fitoterápicos). Além disso, sendo P. setacea uma espécie silvestre do gênero Passiflora, apresenta importantes genes de resistência a doenças e patógenos, como por exemplo, viroses, bacterioses, antracnoses e verrugoses, o que torna essa espécie promissora em relação a aplicações de cunho biotecnológico (JUNQUEIRA et al., 2005; PAULA, 2006). Devido ao fato dessa espécie apresentar características agrobiológicas e comerciais importantes para os programas de melhoramento genético, foram conduzidos, por Pereira et al. (2015), estudos moleculares para a análise da diversidade genética de populações naturais de P. setacea. A unidade da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária localizada no Distrito Federal (Embrapa Cerrados) também realizou estudos genéticos em P. setacea, que resultaram em uma nova variedade desta espécie, a P. setacea BRS Pérola do Cerrado, que está disponível para cultivo desde 2013 (COSTA, 2013; SOZO, 2014). O processo de policruzamentos de plantas selecionadas teve por finalidade o aumento da produtividade e tamanho dos frutos. Vários estudos como os conduzidos por Vieira (2013), Gomes et al. (2013 e 2017) demonstraram o potencial funcional de P. setacea BRS Pérola do Cerrado quanto à produção de compostos fenólicos e atividade antioxidante detectados em sementes, frutos e folhas e mais recentemente Carvalho et al. (2018) comprovaram a influência das condições climáticas nos teores de fenólicos totais, flavonoides (orientina, isovitexina e hesperetina) e na atividade antioxidante dos extratos de frutos de P. setacea.

Figura 1 – Passiflora setacea. A – Flor de P. setacea. B – Frutos de P. setacea. Fonte: EMBRAPA CERRADOS.

3.4 Metabólitos secundários

As plantas produzem, através de seu metabolismo, uma grande variedade de compostos orgânicos e, quando se fala de células vegetais, o metabolismo costuma ser dividido em metabólitos primários e secundários. De acordo com Raven et al. (2014), metabólitos primários são os compostos produzidos pelas plantas que estão diretamente relacionados aos seus mecanismos de crescimento e desenvolvimento, desempenhando função essencial e possuindo distribuição universal. Desse modo, estão inclusos: açúcares, aminoácidos, ácidos graxos, lipídeos e nucleotídeos, tal como moléculas mais complexas, as quais são sintetizadas a partir destes, como proteínas, polissacarídeos, membranas, DNA e RNA (TAIZ & ZEIGER, 2013). Os metabólitos secundários são assim chamados pois, ao contrário dos primários, não participam do processo de formação de protoplastos e geração de energia, não desempenhando, portanto, funções essenciais ao crescimento e desenvolvimento vegetal (WINK, 1997). Durante muito tempo, acreditou-se que esses compostos eram produzidos sem uma função específica, sendo caracterizados como produtos sem valor ou, ainda, como apenas resíduos do metabolismo primário das plantas. Entretanto, a partir da década de 1950, com o gradual aumento do conhecimento e da descoberta da diversidade de metabólitos, ficou claro o importante papel desempenhado por essas substâncias (TAIZ & ZEIGER, 2013). Os

metabólitos secundários – também chamados de metabólitos especializados – têm importante papel na adaptação das plantas ao ambiente onde estão inseridas (AERTS et al., 1991; HARBORNE, 1988). Isso ocorre, pois, esses compostos são responsáveis por diversas atividades biológicas que têm a finalidade de contribuir para que as plantas possam ter uma boa interação e sobreviver nos diferentes ecossistemas. Metabólitos secundários são divididos em três grupos quimicamente distintos: terpenos, compostos nitrogenados e compostos fenólicos (TIWARI & RANA, 2015). Conforme Gouvea et al. (2012) e Katerova et al. (2012), os precursores dos metabólitos secundários são formados a partir dos processos relacionados à glicólise, ao ciclo de Krebs e à via das pentoses-fosfato. Uma visão simplificada das suas rotas de biossíntese pode ser verificada na Figura 2.

Figura 2 - Visão simplificada das principais rotas de biossíntese de metabólitos secundários e suas interrelações com o metabolismo primário. Fonte: (TAIZ & ZEIGER, 2013).

De acordo com Croteau et al. (2000), os metabólitos secundários podem, por exemplo, atuar como antibióticos, antifúngicos e antivirais para proteger as plantas de patógenos (fitoalexinas), atuar como agentes nas simbioses plantas- microorganismos, apresentar atividades antigerminativas ou tóxicas para outras plantas, inibindo o crescimento de competidores (ação alelopática) e, também, alguns destes metabólitos constituem importantes compostos que absorvem a luz ultravioleta (UV), evitando que as folhas sejam danificadas Além disso, metabólitos secundários são extremamente espécie- específicos e alguns estão envolvidos na síntese de biomoléculas responsáveis por odor, sabor e coloração agradáveis, servindo assim como atrativos para animais polinizadores e dispersores de sementes (TIWARI & RANA, 2015; TAIZ & ZEIGER, 2013). Dessa forma, conforme Buchanan et al. (2015), há grande interesse nos metabólitos secundários devido às suas inúmeras utilidades práticas como corantes, polímeros, fibras, colas, ceras, sabores, fragrâncias, fármacos, inseticidas e herbicidas. Espécies silvestres de maracujá têm sido investigadas quanto aos seus metabólitos secundários, visto que, como afirmam Dhawan et al. (2004), já foi constatada no gênero Passiflora a existência de fitoconstituintes de interesse biotecnológico. Flavonoides O e C- glicosídeos foram encontrados em P. tripartita (SIMIRGIOTIS et al., 2013), flavonoides e glicosídeos cianogênicos em P. edulis (SEIGLER et al., 2002), flavonoides em P. edulis v. flavicarpa (ZERAIK et al., 2010), compostos fenólicos, saponinas e alcaloides em P. alata (REGINATTO et al., 2004; MACHADO et al., 2010; LUGATO et al., 2014), compostos fenólicos em P. garckei (FRACCAROLI et al., 2008), flavonoides e glicosídeos cianogênicos em P. quadrangularis (ANTOGNONI et al., 2007) e alcaloides em P. incarnata (GRICE et al., 2001). Glicosídeos cianogênicos também foram encontrados em P. foetida, P. morifolia e P. guatemalensis (JAROSZEWSKI et al., 1996; ANDERSEN et al., 1998; JAROSZEWSKI et al., 2002).

3.4.1 Compostos Fenólicos

Compostos fenólicos são uma classe de metabólitos secundários que possuem um grupo hidroxila funcional ligado a um anel aromático (Figura 3) e formam um grupo quimicamente heterogêneo que contém, aproximadamente, 10 mil compostos que variam em relação ao tamanho, complexidade, solubilidade e função. Alguns são solúveis apenas em solventes orgânicos, outros são solúveis em água (ácidos carboxílicos e glicosídeos) e há aqueles que são grandes polímeros insolúveis (BUCHANAN et al., 2015; TAIZ & ZEIGER, 2013). Devido à diversidade química do grupo, estes compostos apresentam uma variedade de funções nos vegetais: agem na defesa contra herbívoros e patógenos, na proteção contra UV, no suporte mecânico, possuem ação alelopática e são antioxidantes. Além disso, alguns têm função como atração de polinizadores e dispersores de frutos (POURCEL et al., 2007; TAIZ & ZEIGER, 2013; KESSLER & KALSKE, 2018).

Figura 3 - Estrutura molecular básica dos compostos fenólicos.

As principais subclasses de fenóis incluem as antocianinas, antraquinonas, cumarinas e furanocumarinas, estilbenos, isoflavonas, lignanas, monolignóis e naftaquinonas (Buchanan et al., 2015), substâncias que são sintetizadas por duas rotas metabólicas básicas: a rota do ácido chiquímico e a rota do ácido malônico. A rota do ácido chiquímico é a principal via de biossíntese destes compostos, que derivam do aminoácido aromático fenilalanina, precursor originado da via do ácido chiquímico.

A enzima fenilalanina amônia liase (PAL) atua provocando a eliminação de uma molécula de amônia da fenilalanina originando o ácido cinâmico que, por sua vez, é hidroxilado a ácido- p-cumárico. Os fenilpropanoides e os acetato-fenilpropanoides são formados a partir do 4- cumaroil-CoA, que é a etapa posterior à conversão do ácido p- cumárico. VERMERRIS & NICHOLSON, 2009; TAIZ & ZEIGER, 2013) (Figura 4).

Figura 4 - Fluxograma da biossíntese dos compostos fenólicos a partir da via do ácido chiquímico. Fonte: Adaptação (BUCHANAN et al., 2015).

Muitos compostos fenólicos simples apresentam importantes funções nos vegetais, agindo como defesa contra insetos, herbívoros e fungos. A título de exemplo, cita-se a fitotoxicidade das furanocumarinas (abundantes em membros da família Apiaceae), que são ativadas pela luz solar – na faixa do ultravioleta A (UV-A; 320 - 400 nm) –, elevando-se a um estado eletrônico de alta energia tornando-as tóxicas e agindo, portanto, contra herbivoria e patógenos (KESSLER & KALSKE, 2018).

Os fenilpropanoides simples e derivados do ácido benzóico são citados como limitantes do crescimento de outras plantas, conferindo ação alelopática a esses compostos, como o ácido cafeico e o ácido ferúlico, que inibem a germinação e o crescimento de muitas plantas (INDERJIT et al., 1995; TAIZ & ZEIGER, 2013). Também é citada a lignina, polímero de grupos fenilpropanoides altamente ramificado que, além de ser a substância mais abundante em plantas (depois da celulose), é encontrada nas paredes celulares de vários tipos de tecidos de sustentação e vascular e desempenha funções primárias e secundárias. A lignina fortalece os caules e o tecido vascular, devido à sua rigidez mecânica, permitindo o crescimento ascendente e possibilitando o transporte de água e sais minerais pelo xilema mesmo sob pressão negativa, sem haver colapso do tecido. Sendo a lignina componente essencial do tecido de transporte de água, a capacidade de produzi-la é tido como uma das adaptações evolutivas mais importantes, permitindo que as plantas colonizassem o ambiente terrestre (TAIZ & ZEIGER, 2013; RAVEN et al., 2014). Além das funções ecológicas exercidas nos vegetais, vários efeitos benéficos à saúde têm sido atribuídos aos compostos fenólicos. Estudos epidemiológicos, clínicos e in vitro mostram efeitos biológicos destes compostos, tais como atividade anti-inflamatória, antimicrobiana, anticancerígena e antioxidante, sendo esta última atribuída como potente ação dos flavonoides (BEER et al., 2003; HASSIMOTO et al., 2005, DELMAS et al., 2005; CANTOS et al., 2002).

3.4.1.1 Flavonoides

Os flavonoides são o maior grupo dentre os fenólicos, são mais de 5 mil compostos identificados (HEIM et al., 2002; BUCHANAN et al., 2015). Em geral, sua estrutura possui ao menos dois anéis aromáticos ligados por uma cadeia de três átomos de carbono (Figura 5), que é modificada para gerar as suas subclasses, as quais são classificadas pelo grau de oxidação da cadeia de três carbonos: os isoflavonoides (atuam no sistema de defesa e sinalização celular), as antocianinas (pigmentos vermelho, rosa, roxo e azul), as flavonas e flavonóis (são agentes anti-inflamatórios em animais e atuam na proteção celular vegetal contra excesso de radiação UV-B). Variações de substituições como hidroxilação, hidrogenação, metilação, sulfatação, malonilação e glicolisação alteram a atividade

35 bioquímica de flavonoides, gerando assim diversidade estrutural e funcional. Sua origem provém da via acetato-fenilpropanoide, resultante da via do ácido chiquímico e ácido malônico, a qual é encontrada em plantas primitivas e algas, sendo citada como importante agente na superação do primeiro desafio imposto às plantas na conquista do ambiente terrestre: a radiação ultravioleta (TAIZ & ZEIGER, 2013). Flavonoides e saponinas foram os principais compostos químicos relatados em extratos de folhas de espécies de passifloras (ZUCOLOTTO et al., 2012; GAZOLA et al., 2015), sendo os flavonoides considerados os componentes majoritários dentro dos compostos ativos dessas plantas, exercendo efeitos benéficos à saúde. Os principais flavonoides descritos para o gênero Passiflora são: vitexina, isovitexina, orientina, quercetina, kaempferol, catequina e epicatequina (COSTA et al., 2016; FIGUEIREDO et al., 2015), que, segundo estudos recentes, estão envolvidos em atividades neurofarmacológicas (COLETA et al., 2006; SENA et al., 2009; GOMES et al., 2017). Estes compostos merecem importante destaque principalmente pelo seu potencial terapêutico, atividades anti-inflamatórias e antioxidades (MACHADO et al., 2008). Diversos estudos têm indicado a atividade antioxidante, in vivo e in vitro, dos extratos de espécies de passifloras relacionando-os à presença de compostos fenólicos, sobretudo flavonoides (ZERAIK et al., 2010; COLOMEU et al., 2013, SILVA et al., 2013; SHANMUGAM et al., 2016). Os extratos de sementes de P. setacea e P. tenuifila foram consideradas, através dos estudos comparativos de extratos de quatro diferentes espécies de passifloras, conduzidos por Vieira (2013), potenciais antioxidantes naturais, visto que apresentaram os maiores teores de compostos fenólicos. Além disso, Rudinicki et al. (2007) atribuíram a atividade antioxidante dos extratos de P. alata e P. edulis à presença de polifenóis, enquanto que os resultados obtidos por Shanmugam et al. (2016) mostraram que o extrato em acetona das folhas de P. leschenaultii também é rico em compostos fenólicos e flavonoides, correlacionando a presença destes com potencial antioxidante.

Figura 5 - Estrutura molecular de flavonoides.

3.5 Antioxidantes

Radicais livres são átomos ou moléculas que possuem um ou mais elétrons não pareados, tornando suas estruturas instáveis, com meia-vida curta e muito reativas quimicamente (ANDERSON, 1996; POMPELLA, 1997; DESIKAN et al., 2005). De acordo com Halliwell & Gutteridge (2007) e Yanishlieva-Maslarova et al. (2001), antioxidantes são substâncias utilizadas que possuem a finalidade de estabilizar e, até mesmo, desativar a ação de radicais livres através da sua capacidade de retardar, prevenir ou inibir a oxidação de diversas moléculas-alvo, conforme asseguram. Com isso, a partir da presença de radicais livres nos organismos, muitas atividades fisiológicas podem ser afetadas, principalmente as relacionadas a lipídeos, carboidratos, DNA e proteínas (CASSELLS & CURRY, 2001; DESIKAN et al., 2005).

Evidências têm indicado radicais livres como principais responsáveis pelos processos de envelhecimento e também têm sido associados a doenças degenerativas como câncer, declínio do sistema imune e doenças cardiovasculares (SOUSA et al., 2007). Dessa forma, a aplicação de antioxidantes para retardar processos degenerativos é de grande valia. O uso de antioxidantes tem reduzido o risco de doenças degenerativas e crônicas, além de serem amplamente aplicados na indústria alimentícia e de biocombustíveis, com o intuito de retardar a deterioração de alimentos e atuar como estabilizadores para manter a qualidade do biodiesel durante seu armazenamento (JOHN et al., 2002; RAMALHO & JORGE, 2006; BORSATO et al., 2012). Na indústria farmacêutica e de cosméticos, os antioxidantes são aplicados em formulações que contribuem na prevenção de doenças e para amenizar os efeitos do envelhecimento, conforme afirmam Ferreira & Matsubara (1997) e Scotti et al. (2007). Os radicais livres formados pelas plantas são produzidos através do metabolismo normal das células, nos cloroplastos, mitocôndrias, membranas plasmáticas, peroxissomas, apoplasto, retículo endoplasmático e paredes celulares ou em resposta ao estresse provocado pelas condições ambientais desfavoráveis (SHARMA & SINGH, 2012). O controle das espécies reativas de oxigênio (EROs) nas plantas (Tabela 1) é realizado pelos sistemas de defesas antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos, sendo os açúcares, compostos fenólicos e carotenoides eficientes compostos antioxidantes do grupo dos não- enzimáticos (AHMAD et al. 2008; GILL & TUTEJA, 2010;

KARUPPANAPANDIAN et al., 2011). Dessa forma, buscando alternativa aos antioxidantes sintéticos e com a crescente busca por produtos naturais, tem-se buscado compostos que possuem atividade antioxidante extraído de vegetais, animais e microorganismos (MASTRO-DURÁN, 1993; SOARES, 2002; TIVERON et al., 2012).

Tabela 1 - Principais agentes de defesa antioxidante enzimáticos e não enzimáticos.

Não Enzimáticos Enzimáticos ß-caroteno Superóxido dismutase Alpha-tocoferol (Vitamina E) Catalase Ácido ascórbico (Vitamina C) NADPH-quinona oxidorredutase Selênio Glutationa peroxidase Clorofilina Ascorbato peroxidase L-cisteína Curcumina Fonte: Adaptado (SIES, 1993).

3.6 Clorofilas e Carotenoides

A fotossíntese é o principal processo produtor de matéria orgânica e oxigênio na Terra. A partir de seu surgimento, a atmosfera terrestre tornou-se oxidante, impondo um novo ritmo à evolução, permitindo o processo de respiração e a formação da camada de ozônio (HOHMANN-MARRIOT & BLANKESHIP, 2010). De uma forma geral, a fotossíntese oxigênica consiste em um processo biológico no qual a energia luminosa, dita fotossinteticamente ativa (PAR - Photosynthetical Active Radiation) – com comprimento de onda entre 400 e 700 nm –, é absorvida e transformada em energia química através de estruturas formadas por complexos proteínas-pigmentos chamados de fotossistemas (Blankenship, 2002). Os fotossistemas são constituídos por um complexo antena e um centro de reação, onde o primeiro é formado pelos pigmentos fotossintetizantes que absorvem a luz e, posteriormente, transferem a energia coletada para o centro de reação, onde as reações químicas de oxidação e redução – que levam ao armazenamento de energia a longo prazo – acontecem. Os pigmentos fotossintéticos presentes em organismos fotossintetizantes e a sua abundância variam de acordo com a espécie (TAIZ & ZEIGER, 2013).

Conforme registros nos trabalhos publicados pelo Laboratório de Biotecnologia Vegetal (BOT/CCB/UFSC) e em outros importantes trabalhos envolvendo a cultura de calos, tem-se que os calos podem assumir coloração esverdeada, deferindo, portanto, a presença de pigmentos fotossintetizantes. Por exemplo, Montagner (2018) e Formolo (2019) demonstraram a coloração verde em calos oriundos de diferentes explantes de P. tenuifila e P. setacea, os calos de Brucea mollis cultivados a partir de folhas e internós também demonstraram coloração verde durante seu desenvolvimento (DAS et al., 2018), a mesma coloração pôde ser observada em calos de Spirodela polyrhiza (YANG et al., 2018). No entanto, segundo Efferth (2019), células de calos cultivadas assemelham-se às células meristemáticas não diferenciadas, revelando apenas pequenos vacúolos e carecendo de cloroplastos para fotossíntese e, conforme Creche et al. (1994), a fotossíntese de células vegetais cultivadas in vitro pode ser severamente afetada pelas condições de cultura, aspecto não avaliado nos calos de P. setacea, nos experimentos prévios conduzidos. O aparato fotossintético parece ser negativamente afetado, especialmente, pelo 2,4-D (BERLYN & ZELITCH, 1975; YAMADA & SATO, 1978) e açúcares metabolizáveis (fontes de carbono), como por exemplo a sacarose que, segundo Dalton & Street (1977) e LaRosa et al. (1984), inibe o acúmulo de clorofila e diminui a fixação do carbono inorgânico por meio da inibição da atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) e, predominantemente, do ciclo de Calvin (NEUMANN & BENDER, 1987).

3.6.1 Clorofilas

A clorofila a (Chl a) está presente em todos os organismos que realizam fotossíntese oxigênica e é este o pigmento utilizado para realizar o primeiro estágio do processo fotossintético – fase fotoquímica –, enquanto que os demais pigmentos, como os carotenoides, auxiliam na absorção de luz e na transferência da energia radiante para os centros de reação, sendo assim chamados de pigmentos acessórios. Os principais pigmentos acessórios também incluem outros tipos de clorofilas: clorofila b (Chl b), presente em vegetais superiores, algas verdes e algumas bactérias; clorofila c (Chl c), em feófitas e diatomáceas; e clorofila d (Chl d), em algas vermelhas. As bactérias fotossintetizantes são desprovidas de Chl a e possuem em seu lugar a bacterioclorofila como pigmento fotossintético (TAIZ & ZEIGER, 2013).

As clorofilas são formadas por complexos derivados da porfirina, que formam uma complexa estrutura em anel, tendo como átomo central o magnésio (Mg), e possuem uma longa cauda de hidrocarbonetos que está ligada à estrutura do anel. Essa cauda ancora a clorofila à porção hidrofóbica de seu ambiente – membrana tilacoidal dos cloroplastos – enquanto que a estrutura em anel é a parte da molécula envolvida na transição de elétrons e nas reações redox (redução-oxidação). As diversas clorofilas diferem, principalmente, nos substituintes ao redor dos anéis e nos padrões de duplas ligações (Figura 6) (TAIZ & ZEIGER, 2013).

Figura 6 - Estrutura molecular da clorofila a (substituinte CH3) e clorofila b (substituinte CHO). Fonte: Taiz & Zeiger, 2013.

Conforme Vieira (1996), a concentração de carotenoides e clorofilas são indicadores da suscetibilidade da planta à intensidade da luz. Tratando-se de intensidade luminosa, tem- se que altas irradiações podem inibir a fotossíntese através da foto-inibição do fotossistema – causando danos aos centros de reação – e da foto-oxidação de clorofilas (STREIT et al., 2005). De forma geral, as clorofilas são instáveis e sensíveis à luz, aquecimento, oxigênio e à degradação química (SCHOEFS, 2002).

As clorofilas podem ser utilizadas como corantes naturais e como antioxidantes em produtos enriquecidos e suplementos alimentares (STREIT et al., 2005). Para tal, os pigmentos podem ser quimicamente modificados antes de serem incorporados aos alimentos como, por exemplo, substituindo o Mg2+ por Cu2+ na clorofila – essa substituição, chamada de clorofilina cúprica, é mais estável do que a molécula pura de clorofila e pode ser utilizada em formulações hidro ou lipossolúveis. Precursores e derivados das clorofilas também são usados na medicina para tratamentos fotodinâmicos (BRITTON et al., 1995; SCHOEFS, 2002; FURTADO, 2004). De acordo com Streit et al. (2005), as ligações não-covalentes entre as moléculas de clorofilas são muito frágeis, de forma que ao macerar o tecido em solventes orgânicos, elas rompem-se com facilidade. Portanto, o caráter hidrofóbico ou hidrofílico de uma substância influi diretamente na escolha do melhor solvente para a sua extração. Os solventes polares como a acetona, o etanol, o metanol, o acetato de etila, a dimetilformamida e a piridina são os mais eficazes para a extração completa das clorofilas. Os solventes apolares como o hexano e o éter de petróleo são os menos eficazes. Sobre a quantificação de Chl a em amostras, Barroso (1998) diz que o feoforbídeo a e a feofitina a – os dois produtos da degradação desse pigmento – podem interferir na determinação dessa clorofila ao absorverem luz e fluorescem na mesma região do espectro. Se esses feopigmentos estiverem presentes na amostra, poderão ocorrer erros significativos na concentração de Chl a.

3.6.2 Carotenoides

Carotenoides são metabólitos secundários da classe dos terpenos com uma variedade de características fisiológicas, sendo benéficas à saúde humana e passíveis de aplicações industriais (HANNOUFA & HOSSAIN, 2012). Eles agem como pigmentos acessórios na fotossíntese (absorvendo a luz nos espectros violeta e azul-esverdeado), protegem os tecidos fotossintéticos contra a fotoxidação e álcoois politerpênicos (dolicóis) e funcionam como transportadores de açúcares na parede celular e na síntese de glicoproteínas (RAVEN et al., 2014; TAIZ & ZEIGER, 2013).

Dentre os terpenos, destaca-se os carotenoides devido ao aumento de sua utilização na indústria de alimentos, farmacêutica, nutracêutica e de cosméticos (MARTÍN et al., 2007). Eles formam um grupo de pigmentos naturais com aproximadamente 700 representantes que apresentam coloração amarela, laranja ou vermelha, com exceção dos carotenoides fitoeno e fitoflueno, que são incolores (FONTANA et al., 2000; ERNEST, 2002; SIES & STAHL, 2004). A sua ocorrência na natureza é abrangente, algumas espécies de algas, fungos, bactérias e plantas superiores são capazes de produzir este composto, enquanto que em animais como crustáceos, aves e peixes esses pigmentos são acumulados no organismo através da alimentação (Tabela 2) (GORDON et al., 1982; BRITTON et al., 1995; VALDUGA et al., 2009). Os carotenoides são formados a partir de unidades de IPP e DMAPP, cada um contendo cinco átomos de carbono, e são divididos em basicamente duas classes: carotenos e xantofilas. A primeira caracteriza-se pela presença de uma cadeia hidrocarbônica linear ou cíclica em, pelo menos, um dos terminais da molécula, enquanto que as xantofilas compreendem os derivados oxigenados dos carotenos cujos grupos compreendem a hidroxila (β-criptoxantina), ceto (cantaxantina), epóxido (violaxantina) e aldeído (β-citraurina). Além da atuação primária em plantas, como citado anteriormente, carotenoides possuem atividades biológicas relevantes. Eles são precursores da Vitamina A que, conforme Ramalho (2010), tem importante papel no desenvolvimento embrionário, protege o organismo contra estresse oxidativo, auxilia no funcionamento da visão e do sistema imune, exercem efeitos protetores contra doenças cardiovasculares, certos tipos de câncer e doenças relacionadas ao envelhecimento (COLLINS, 1999; HADLEY et al., 2002; BEATTY et al., 2004; MISAWA, 2009). Além disso, são utilizados na indústria alimentícia e nutricional uma vez que são corantes naturais e, muitas vezes, apresentam propriedades funcionais como, por exemplo, as betalaínas e antocianinas que podem atuar na proteção do DNA e como agentes hipoglicêmicos e antioxidantes (GRACE et al., 2009; ESATBEYOGLU et al., 2014; RODRIGEZ-AMAYA, 2016). Ainda, conforme Hencken (1992), xantofilas são utilizadas como aditivos na alimentação de aves, com o objetivo de prover a coloração às gemas dos ovos, já que essas substâncias são absorvidas e acumuladas no organismo. Astaxantina e cantaxantina também são adicionados à alimentação de peixes e crustáceos criados em cativeiro com o propósito de intensificar a coloração da carne (BJERKENG, 2008).

Carotenoides também promovem benefícios à saúde: conforme Fiedor et al. (2014) essa classe de pigmentos naturais pode prevenir doenças causadas por espécies reativas de oxigênio como distúrbios de fotossensibilidade, doenças cardiovasculares, diabetes, distúrbios de visão e neurológicos, câncer e doenças do sistema imunológico. Ademais, o β- caroteno é utilizado como intensificador e prolongador do bronzeado devido ao seu acúmulo no tecido hipodérmico, o que confere coloração dourada à pele. Os carotenoides disponíveis no mercado podem ser obtidos através de síntese química, extração a partir de fontes vegetais e a partir de ferramentas biotecnológicas. De acordo com Mesquita et al. (2017), há uma crescente demanda por alimentos naturais, estimulando o mercado de carotenoides naturais, o que ocasionará a redução da participação dos sintéticos. A produção de carotenoides naturais por via biotecnológica já é utilizada em diversos países (Israel, Austrália, Alemanha, Estados Unidos, Suécia e Índia), utilizando, majoritariamente, algas como microrganismo produtor. O cenário econômico brasileiro de carotenoides é marcado, sobretudo, por importações, indicando que a produção desses compostos no país não é suficiente para suprir demandas internas.

Tabela 2 - Exemplos de carotenoides, sua coloração e fontes produtoras.

Carotenoide Coloração Exemplos de fontes produtoras Luteína Amarela Chlorella sorokiniana (microalga) Cucurbita moschata (abóbora goianinha) Zeaxantina Amarela a laranja Dunaliella salina (microalga) Zea mays (milho-verde)

ß-caroteno Laranja Rhodotorula rubra (levedura) Malpighia glabra (acerola) Daucus carota (cenoura) Bixina Laranja Bixa orellana (urucum)

Norbixina Laranja Bixa orellana (urucum) Cantaxantina Laranja a vermelho Haematococcus pluvialis (microalga) Rhodococcus maris (bactéria) Astaxantina Vermelha Xanthophyllomyces dendrorhous (levedura) Chlorella zofingiensis (microalga) Fonte: (MESQUITA et al., 2017).

3.7 Estratégias biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários em plantas

De forma geral, muitos autores concordam que a cultura de tecidos, células e órgão vegetais consistem em uma ferramenta bem estabelecida para obtenção de biomoléculas de interesse, sobretudo, produtos naturais aplicáveis às diferentes indústrias previamente citadas (OCHOA-VILLARREAL et al., 2016). Ainda, diz-se que toda planta é passível de aplicação à cultura in vitro desde que o seu genoma apresente o pool genético necessário para manter as funções do vegetal, aqui incluem-se o metabolismo secundário e a totipotência, que é a capacidade que as células possuem, sob estímulos apropriados, de se organizarem e originarem um novo indivíduo multicelular (DIAS et al., 2016). Embora as plantas produzam naturalmente metabólitos secundários, em geral, quando submetidas a culturas in vitro, essa produção é muito baixa. Isso ocorre porque plantas cultivadas através desse sistema exibem uma curta fase estacionária, onde ocorre a inibição de enzimas, as quais estão normalmente presentes na planta madura. Por este motivo, estratégias vêm sendo desenvolvidas a fim de otimizar as culturas vegetais in vitro e, como consequência, proporcionar o acúmulo de biomassa e aumentar a produção de metabólitos secundários. Essas estratégias são: melhoramento genético de determinadas linhagens celulares, otimização do meio de cultura, elicitação, determinação de substratos e fornecimento de nutrientes, além da utilização de métodos de permeabilização, imobilização e biotransformação (OCHOA-VILLARREAL et al., 2016; EFFERTH, 2019). As técnicas de culturas vegetais são ferramentas biotecnológicas que visam o estabelecimento in vitro de células, tecidos e órgãos de plantas sendo amplamente utilizadas na produção de culturas axênicas e contribui, em especial, para a conservação de germoplasma, micropropagação, melhoramento genético e produção de compostos bioativos (RAO & RAVISHANKAR, 2002; TERMIGNONI, 2005), além de favorecer a conservação sustentável e utilização racional da biodiversidade de espécies (KARUPPUSAMY, 2009; DIAS et al., 2016). Essas técnicas in vitro são de extrema importância para a ciência básica e para aplicações comerciais. Segundo Efferth (2019), ainda hoje metade da população mundial depende de produtos oriundos de vegetais. Como exemplo, tem-se que dois terços dos fármacos utilizados no tratamento de câncer e de processos infecciosos são provenientes de plantas

(KOLEWE et al., 2008). Além disso, a extração de metabólitos secundários, em cultivos no campo é muito dispendiosa e apresenta baixo rendimento. Com isso, a biotecnologia vegetal surge como complemento à agricultura tradicional em escala industrial (RAO & RAVISHANKAR, 2002). Dessa maneira, devido à alta demanda de produtos oriundos de matrizes naturais direcionados ao consumo, em especial à exploração de metabólitos secundários, plataformas e ferramentas experimentais desenvolvidas em laboratório avançaram para processos de escala industrial comercialmente viáveis através de biorreatores desenvolvidos para vencer os obstáculos inerentes ao scaling-up laboratório-indústria no cultivo de células e tecidos vegetais (GEORGIEV et al., 2009; FISCHER et al., 2015). Esses biorreatores são industrialmente projetados para maximizar a biossíntese de compostos, aumentando significativamente a escala em relação ao crescimento de culturas geradas a partir da formação bem-sucedida de calos e posteriormente, após adição de um meio de cultura líquido, da geração de suspensões celulares, por exemplo (HUANG & McDONALD, 2012). Dessa forma, a micropropagação em biorreatores têm possibilitado a propagação em massa de plantas saudáveis regeneradas (ZIV, 2000; DA SILVA, 2003; DA SILVA et al., 2007; NHUT et al., 2007). A micropropagação via organogênese ou embriogênese somática automatizadas em biorreatores tem sido aplicada em vista de uma possível redução de custos (PAEK et al., 2005). Como exemplo, tem-se que o uso de sistemas de imersão temporário automatizou o método industrial para propagação clonal de espécies de passifloras (OZAROWSKI & THIEM, 2013). Revathi et al. (2018), buscaram otimizar os fatores que afetam a regeneração in vitro, floração, enraizamento ex vitro e estudos micromorfológicos foliares de Oldenlandia corymbosa L., planta estudada devido às suas atividades farmacológicas de interesse, mas que apresentam diversas dificuldades relativas à sua germinação, além de serem coletadas indiscriminadamente e de forma insustentável devido às suas propriedades etnomedicinais. O cultivo em biorreatores através de suspensões celulares de raízes adventícias de Ginseng também pode ser citado como exemplo referente à biotecnologia de plantas aplicada à produção de metabólitos secundários. Esse cultivo possui a finalidade de produzir compostos de interesse, sobretudo ginsenosídeos, além de se buscar uma produção de biomassa para fins comerciais (CHOI et al., 2000; THANH et al.,2014). A utilização de

biorreatores também se mostra eficiente para a obtenção de metabólitos secundários terapeuticamente relevantes como, por exemplo, a droga paclitaxel, que apresenta um grande potencial anticancerígeno (GEORGIEV et al., 2009). Corroborando com isto, podemos citar o estudo de Yang et al. (2010), em que os metabólitos secundários de cana-de-açúcar produzidos em biorreatores de imersão temporária ricos em CO2 (TIBs) induziram a resistência do tomateiro (Solanum lycopersicum) contra a murcha bacteriana (Ralstonia solanacearum). Um biorreator de coluna de bolhas (BCB) também foi utilizado para a produção em larga escala de metabólitos secundários originados a partir da elicitação e adsorção de culturas líquidas de fragmento de raiz adventícia de Tripterygium wilfordii Hook. f. (MIAO et al., 2013). Boruta & Bizukojc (2015) investigaram o efeito da diversificação das condições de processo e dos meios de crescimento nas rotas de biossíntese de metabólitos secundários de Aspergillus terreus ATCC-20542 cultivados em um biorreator de tanque agitado (STR), com o propósito de fornecer insights sobre o bioprocesso relacionado às capacidades metabólicas desse fungo. Um biorreator de transporte aéreo (ALB) foi utilizado para o scaling-up de culturas de raízes adventícias de Echinacea angustifolia para a produção de biomassa e derivados de ácido cafeico, além disso, a cinética do crescimento das raízes adventícias e o acúmulo de metabólitos secundários também foram estudados (CUI et al., 2013). Cui et al. (2011) também possibilitaram, a nível industrial, a produção de biomassa de raízes adventícias e compostos bioativos (sobretudo flavonoides, compostos fenólicos, naftodiantronas e floroglucinol) de Hypericum perforatum através de culturas em grande escala em biorreatores. Além dos biorreatores já citados, outros projetos de cultura celular vegetal mais recentes utilizaram outras variedades, como biorreatores de ondas, biorreatores de membrana, biorreatores de fibra oca e reatores de tambor rotativo. De forma geral, o biorreator mais amplamente explorado em técnicas de biotecnologia vegetal é o SRT, pois proporciona um dimensionamento relativamente fácil, boa mistura de fluidos e capacidade de transferência de oxigênio e compatibilidade relativamente fácil com as Boas Práticas de Fabricação atuais (GMP). (OCHOA-VILLAREAL et al., 2016). Diante deste cenário, Ochoa-Villarreal et al. (2016), relataram que o número de patentes relacionadas a produtos originados a partir de cultura vegetal in vitro subiu para um

total de 28 mil e a quantidade de empresas que utilizam esse sistema ou tecnologias de raízes pilosas para a produção de produtos naturais associadas às indústrias cosmética, alimentícia e farmacêutica, continua expandindo rapidamente.

3.7.1 Cultivo in vitro de calos

Em conformidade com Perdomo (2016), têm-se que a indução de calogênese é um importante passo para o estabelecimento de culturas in vitro aplicadas em processos industriais. Calogênese pode ser descrita como o desenvolvimento de uma massa amorfa, a qual pode ser compacta ou friável, e que pode conter coloração variando de tons de verde – dependendo do tipo de pigmento acumulado – ou pode, ainda, ser incolor. Essa massa amorfa pode desenvolver-se a partir de explantes (segmentos como raiz, folha, caule, semente, cotilédone, entre outros) retirados do tecido vegetal e inseridos in vitro para crescimento. (VERPOORTE & MARASCHIN, 2001; MACHADO et al., 2008; FIGUEIREDO et al., 2015). De acordo com Efferth (2019), as culturas de calos podem ser embriogênicas e não embriogênicas e ambas pode ser utilizadas para a produção de metabólitos secundários. As culturas de calos embriogênica apresentam a capacidade de produzirem embriões somáticos, que germinam e produzem plantas inteiras. Além disso, através de processos de repicagem regular, as células das culturas de calos podem ser mantidas in vitro por tempo indefinido. Dependendo do estágio bioquímico, fisiológico e morfológico dos explantes, as células dos calos podem rediferenciar-se em plantas inteiras, que podem ser multiplicadas através da micropropagação (EFFERTH, 2019). Usualmente, as culturas de calos são mantidas em meio sólido suplementado com hormônios de crescimento, vitaminas, sais minerais e nutrientes específicos, no entanto, conforme Ochoa-Villarreal et al. (2016), as condições de cultivo para culturas de calos diferem de espécie para espécie, de forma que precisam ser desenvolvidas em cada caso individualmente e de acordo com o produto objetivado. A cultura de calos também atende à demanda de indústrias uma vez que possibilita o cultivo em massa através das suspensões

celulares – culturas celulares que são mantidas em meio líquido, sob lenta agitação – cultivadas em biorreatores especialmente projetados. Como exemplo, Pandey et al. (2019) estabeleceram suspensões celulares, a partir de cultura de calos de Ocimum basilicum, objetivando o aumento da produção de triterpenoides através de elicitação e do cultivo em biorreatores. Os resultados demonstraram que o cultivo aplicado aumentou os níveis de ácido oleanólico, ácido ursólico e ácido rosmarínico em 3,25, 2,89 e 1,79 vezes, respectivamente, quando em comparação com cultivos estabelecidos in vivo, concluindo que o cultivo em biorreator em combinação com a elicitação através de metil jasmonato e agitação lenta melhoraram a produção cumulativa de metabólitos secundários de interesse, sendo esse método eficiente na produção de bioativos em larga escala, visando atender à demanda crescente de recursos naturais. Através do cultivo de calos de Carthamus tinctorius foi possível evidenciar que a elicitação através de ácido salicílico (50 e 100 mg L-1) é bastante eficiente na promoção do aumento de síntese de metabólitos secundários (especialmente fenólicos totais e flavonoides) dessa planta, que possui importantes propriedades medicinais (GOLKAR et al., 2019). Também foram estabelecidos calos a partir da casca de Punica granatum com o intuito de promover o aumento da produção de compostos bioativos de alto valor. Após o estabelecimento de um protocolo satisfatório para o desenvolvimento dos calos, mostrou-se que esses calos, quando expostos à luz e a altos níveis de sacarose, elevaram os níveis de metabólitos secundários (como antocianinas, ácido elágico, punicalagina e ácido gálico) em 205 vezes quando em comparação com o controle (RUBINOVICH et al., 2019). Em calos de Carthamus tinctorius verificou-se a presença de α-tocoferol (CHAVAN et al., 2011) e em de Chrysanthemum cinerariefolium houve produção de quercetina (PURWIANINGSIH et al., 2016). Em calos de Psoralea corylifolia, uma isoflavona com alta atividade antioxidante foi isolada (SHINDE et al., 2010). Prihatna et al. (2019) estudaram, a partir de calos de Lycopersicon lycopersicum v. Rio Grande, a otimização de parâmetros de regeneração com o intuito de aumentar a eficiência de transformação genética dessa variedade de tomate rasteiro. Ainda nessa linha de pesquisa, Swartwood & Van Eck (2019) estabeleceram a regeneração de Physalis pruinosa, a partir de calos oriundos de explantes de cotilédone e hipocótilo, e aplicaram uma metodologia de melhoramento genético mediado por

Agrobacterium tumefaciens com o intuito de modificar características dessa planta que são desfavoráveis ao seu cultivo em larga escala. Em passifloras, poucos estudos sobre culturas de calos e produção de metabólitos secundários foram desenvolvidos. Antognoni et al. (2007) utilizaram culturas de calos de P. quadrangularis para avaliar a influência da radiação UV-B e elicitação com metil jasmonato na produção de flavonoides, demonstrando os efeitos promotores desses fatores. Fraccaroli et al. (2008), através de suspensões celulares de P. garkei foi avaliada a produção de compostos aromáticos. Lugato et al. (2014) analisaram as concentrações de compostos fenólicos e atividades em extratos de hidroalcoólicos calos e de suspensões celulares e compararam com extratos de folhas de plantas produzidas in vivo e in vitro e em folhas de plantas aclimatadas. Os resultados indicaram maior atividade antioxidante e teores fenólicos em extratos de folhas e sementes de plantas in vivo do que nas as culturas de calos e suspensões celulares produzidas in vitro. Sozo et al. (2016) relataram a biossíntese de fenólicos e flavonoides a partir de calos de P. tenuifila e P. setacea. Tecnologias baseadas em culturas de calos também são muito úteis para fins agrícolas: são utilizadas como ferramenta da bioengenharia, desempenhando um importante papel na geração de plantas transgênicas com características melhoradas (como a resistência à seca, alta temperatura e salinidade, ao ataque microbiológico entre outros estresses) e nas produções de plantas com propriedades nutricionais e não nutricionais, como o tabaco (Nicotiana tabacum) e o algodão (Gossypium hirsutum), respectivamente. Além disso, como demonstrado, a técnica de cultura de calos é bastante útil para a produção sustentável e em larga escala de metabólitos secundários, em diversas indústrias (BOURGIN et al., 1979; DAVIDONIS & HAMILTON, 1983). Neste contexto, o Laboratório de Biotecnologia Vegetal do departamento de Botânica da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) em colaboração com a EMBRAPA Cerrados vem desenvolvendo, sob orientação da Profª. Dra. Ana Maria Viana, ao longo dos últimos 10 anos, estudos pioneiros relacionados à germinação e desenvolvimento de sistemas de culturas de calos visando monitorar a biossíntese de metabólitos secundários da espécie silvestre P. setacea. Foram conduzidos estudos visando avaliar o efeito de vários fatores sobre a produção de fenólicos totais, flavonoides, carotenoides, atividades antioxidante e biológica de culturas in vitro de calos e que mostraram o potencial das culturas de células

para a produção de compostos fenólicos e atividade antioxidante (SOZO, 2014; PERDOMO, 2016; MONTAGNER, 2018; FORMOLO, 2019).

3.7.2 Fatores que podem influenciar a produção de metabólitos secundários por culturas in vitro de calos

Vários fatores podem ser manipulados com o propósito de determinar as condições ideais de cultivo de calos e produção de metabólitos secundários in vitro. Essa manipulação permite não somente o aumento da produção de compostos de interesse, mas também o incremento em biomassa das culturas celulares, etapa essencial no processo de otimização da produção de biomoléculas, uma vez que a síntese de compostos secundários ocorre a partir dessa biomassa. Diante disso, é indispensável o estabelecimento de um meio de cultura que permita um bom crescimento celular e que garanta uma síntese satisfatória de metabólitos secundários (EFFERTH, 2019). Além dos fatores ambientais e a otimização dos componentes do meio de cultura há vários outros parâmetros que podem ser, da mesma forma, investigados em laboratório para que, posteriormente, possa-se passar para cultivos em larga escala (MURTHY et al., 2014).

3.7.2.1 Meios de cultura e elicitores

Meios de cultura já consagrados para o cultivo celular in vitro (Tabela 3) fornecem o necessário para o crescimento e manutenção de células vegetais, no entanto não são suficientes para aumentar a síntese de compostos de interesse, para isto, a elicitação dessas culturas é necessária (DIAS et al., 2016).

Tabela 3 - Meios de cultura utilizados para cultura vegetal in vitro.

Meio de cultura Referência MS MURASHIGE & SKOOG, 1962 SH SCHENK & HILDEBRANDT, 1972 B5 GAMBORG et al., 1968 LS LINSMAIER & SKOOG, 1965 WPM LLOYD & McCOWN, 1980 White WHITE,1943

Elicitores geralmente referem-se aos compostos de sinal extracelular de células vegetais que iniciam ou desencadeiam respostas de defesa da planta e a síntese de fitoalexinas (EBEL & COSIO, 1994). Eles modulam a expressão gênica em resposta a estímulos químicos e fisiológicos, além de induzir a síntese de enzimas, promovendo assim a formação de numerosos metabólitos secundários, como flavonóides, alcalóides, terpenóides, tioninas, fenilpropanóides e polipeptídeos (FRITZ et al. 2010; KUMAR, 2010). Há diferentes tipos de elicitação biótica e abiótica que podem, por sua vez, ser divididos em biológicos, físicos ou químicos – sendo a elicitação química a mais comumente utilizada, principalmente com a adição de precursores do metabolismo secundários e reguladores de crescimento. A combinação de diferentes tipos de elicitores (Tabela 4) também é empregada objetivando uma maior produção de compostos secundários de interesse.

Tabela 4 - Elicitores biológicos, químicos e físicos mais utilizados na indução de metabólitos secundários em culturas in vitro. Elicitor Origem Pectina e celulose Biológico Quitina, quitosana, glucana e alginato Biológico Ácido salicílico e metil jasmonato Biológico Glicose e sacarose Biológico 2,4-D e ANA Químico Sais inorgânicos Químico Metais pesados Químico pH do meio de cultura Químico Temperatura e pressão Físico Fontes de luz e radiação ultravioleta Físico Fonte: (AOYAGI, 2011; GIRI & ZAHEER, 2016; KHAN et al., 2018).

Além destes, outros compostos foram relatados como elicitores eficientes em cultivos vegetais in vitro. Segundo Hegazi & El-Lamey (2012), a caseína e a L-fenilalanina promoveram a produção de compostos fenólicos em calos de Ephedra alata, apontando altos teores de rutina, quercetina, catequina, ácido clorogênico e ácido cumárico. Outros compostos que normalmente possuem função herbicida e também os próprios fenólicos podem ser utilizados como elicitores (EFFERTH, 2019). Conforme Ulanov et al. (2009), o glifosato aplicado em culturas de calos de Zea mays promoveu o acúmulo de ácido chiquímico e quínico, aumentando o nível de fenólicos nas culturas. Já em cultura de calos de Larrea divaricata, foram adicionados, exogenamente, precursores e intermediários de compostos fenólicos, como os ácidos cinâmico, ferúlico e sinápico, onde observou-se a indução e aumento de compostos de interesse (PALACIO et al., 2011). Conforme Wang & Wu (2013), os principais fatores que determinam o efeito positivo de elicitores sobre a produção de metabólitos secundários são o tipo de elicitor utilizado, a concentração e as condições de tratamento empregadas nas culturas.

3.7.2.2 Reguladores de crescimento

As plantas percebem os sinais ambientais e utilizam os seus hormônios – moléculas- sinal encontrados em pequenas quantidades nos vegetais – para a regulação do crescimento e desenvolvimento de órgãos através da mediação desses hormônios, que são muito eficientes mesmo em baixas concentrações (NAMBARA & MARION, 2005; TEALE et al., 2006; YAMAGUCHI et al., 2010). Inúmeros processos fisiológicos vegetais são mediados por esses fitormônios como, por exemplo, a dominância apical, tropismo, fitoalexia, alongamento de raízes e galhos, indução e divisão celular. Dentre as classes de hormônios vegetais, destacam-se as auxinas, as citocininas, o etileno, o ácido jasmônico, o ácido abscísico e as giberelinas (BUCHANAN et al., 2015) Segundo Basra (2000), desde 1940 os reguladores de crescimento – que incluem os hormônios de ocorrência natural nas plantas e os seus análogos sintéticos – têm sido utilizados na agricultura para controlar processos do desenvolvimento como germinação, crescimento, reprodução vegetativa, maturação, senescência e pós-colheita. A partir disso, e do desenvolvimento e inovação em técnicas de biotecnologia vegetal, os reguladores de crescimento têm sido amplamente utilizados no estabelecimento de culturas in vitro de células, órgãos e tecidos, a fim de se otimizar as condições para produção de metabólitos secundários. A reação das plantas aos reguladores de crescimento pode variar de acordo com a espécie, idade da planta, variedade, condições ambientais, estágio de desenvolvimento, estado nutricional e fisiológico e equilíbrio hormonal endógeno (AFTAB et al., 2010; NAEEM et al., 2011; IDREES et al., 2012). Diversos estudos in vitro foram realizados em uma vasta variedade de plantas a fim de confirmar o efeito positivo de reguladores de crescimento sobre a produção de metabólitos secundários. Os principais reguladores de crescimento utilizados nesse tipo de pesquisa nos últimos 10 anos podem ser observados na Tabela 5.

Tabela 5 - Principais reguladores de crescimento utilizados nos últimos dez anos em pesquisas relacionadas ao aumento da produção de metabólitos secundários a partir de culturas in vitro. Regulador de Espécie utilizada Metabólitos secundários Referência crescimento afetados

MeJA + AS Ziziphora persica Eicosano e tridecano ZARE-HASSANI et al., 2019

2,4-D Cnidium officinale Fenólicos totais e flavonoides ADIL et al., 2018

CA + MeJA Rubia tinctorum Antraquinona, alizarina, BICER et al., 2017 purpurina e fenólicos totais

MeJA Silybum marianum Silimarinas GABR et al., 2016

AS Petunia hybrida Clorofila a, clorofilas totais SABERI et al., 2015 e carotenoides

KIN + 2,4-D Genista tinctoria Isoflavona LUCZKIEWIC et al., 2014

ANA Glycine max Isoflavona DOWNEY et al., 2013

KIN + ANA Aloe arborescens Iridoides, fenólicos, AMOO et al., 2012 flavonoides e taninos condensados.

ABA Vitis rotundifolia Antocianina SANDHU et al., 2011

KIN + ABI + Morinda citrifolia Antraquinona, fenólicos BAQUE et al., 2010 TDZ e flavonoides.

ANA + TDZ Myristica fragrans α-pineno, sabineno e IYER et al., 2009 β -pineno

MJ (metil jasmonato); AS (ácido salicílico); 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético); CA (ácido cafeico); KIN (cinetina); ANA (ácido 1-naftalenoacético); ABA (ácido abscísico); ABI (ácido indol- 3-butírico); TDZ (thidiazuron)

3.7.2.2.1 Ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

O ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) é uma auxina sintética que apresenta propriedades herbicidas e é amplamente utilizado na agricultura para o controle do crescimento de plantas indesejadas (WHO, 2003). Segundo Islam et al. (2018), o 2,4- D é um dos herbicidas mais utilizados no mundo devido ao seu baixo custo, seletividade, eficácia e amplo espectro de controle a ervas daninhas. Além disso, as formulações comerciais desse herbicida são facilmente solúveis em água, resultando em uma rápida absorção pelas folhas e raízes. Na sua forma pura, o 2,4-D é uma substância relativamente sólida, cristalina, seca e não volátil (Gervais et al., 2008). Suas formulações incluem ésteres, ácidos e diferentes sais que variam em suas propriedades químicas, comportamento ambiental e, em menor grau, toxicidade (RED, 2005). O sal de dimetilamina (DMA) e o éster 2-etilhexil (EHE) são as formulações mais usadas, responsáveis por aproximadamente 90 a 95% do uso total em todo o mundo. Além disso, mais de 1500 produtos herbicidas contêm 2,4-D como ingrediente ativo (ISLAM et al., 2018). As propriedades do 2,4-D foram reportadas por Zimmerman & Hitchcock (1942): ao entrar em contato com a planta, esse composto é rapidamente absorvido e distribuído para outras partes do organismo atuando, sobretudo, nos tecidos meristemáticos. Além disso, esse agente tóxico afeta vários processos, como a fotossíntese, a respiração, a absorção de íons, o metabolismo de carboidratos, e a síntese de metabólitos tóxicos (ALTERMAN & NEPTUNE, 1997). Conforme Devine & Hall (1990), em geral, o movimento de herbicidas pelo floema ocorre de locais de síntese de carboidratos para regiões de armazenamento ou utilização imediata pela planta. Ainda, herbicidas e solutos podem ser transportados apoplasticamente (espaço entre as células) ou simplasticamente (diretamente entre as células), resultando em diferentes taxas de translocação e distribuição. Nos estudos conduzidos por Martin & Edgington (1981), o 2,4-D exibiu um forte movimento simplástico na soja (Glycine max) e foi encontrado predominantemente em áreas de trânsito como o caule. De acordo com Rieders (2005), o 2,4-D é transportado no floema através da captura de íons, e ácidos fracos, como o 2,4-D, ficam presos no floema por causa dos diferentes níveis

de pH entre o floema e o xilema/apoplastos. O floema é mais básico do que o apoplasto, o que causa a desprotonação do ácido fraco para íon negativo, impedindo que ele atravesse a membrana celular e prenda a forma iônica no floema. Dessa maneira, a translocação do 2,4- D é similar a outros herbicidas sistêmicos, mas a presença de portadores específicos de auxinas diferencia o movimento do 2,4-D. O movimento do 2,4-D é predominantemente ditado pelo influxo de auxina – mecanismo que inclui proteínas integrais de membrana (PIN) e trifosfato de adenosina (ATP) - e transportadores de efluxo – que inclui proteínas transportadoras de auxinas, como a proteína responsiva à auxina (AUX) e proteína adaptadora associada à membrana (LAX) (ENDERS & STRADER 2015; GRONES & FRIML, 2015). Dentro das células, a concentração do herbicida pode ser regulada através do transporte do 2,4-D para o vacúolo através das proteínas “parede” (WAT1) dos tonoplastos (GRONES & FRIML, 2015). Conforme Peterson et al. (2016), fatores ambientais inerentes à planta e à aplicação podem influenciar na captação e translocação do 2,4-D pela planta. Uma maior intensidade luminosa parece afetar positivamente esses dois aspectos, uma vez que controla a fotossíntese, o transporte de fotoassimilados e características da cutícula da planta (SCHULTZ & BURNSIDE, 1970). Temperaturas altas também resultam em maior atividade fotossintética, maior atividade enzimática e transporte pelo floema, aumentando potencialmente a translocação do composto. A temperatura pode alterar a abertura estomática da planta, influenciando na absorção de herbicidas (KIRKWOOD, 1999). A umidade relativa do ar durante a aplicação do 2,4-D afeta a captação do herbicida, pois acomete o tempo de secagem das gotículas sobre as folhas e a abertura estomática. No entanto, a translocação parece não ser afetada por esse fator. Da mesma forma, plantas sob estresse hídrico apresentam captação e translocação reduzidos devido ao espessamento da cutícula, regulação da abertura estomática nas folhas e baixa produção e transporte de fotoassimilados (PETERSON et al., 2016). O estágio de desenvolvimento e idade das plantas também parece afetar essas duas características, onde quanto mais jovem for a folha, maiores são as suas taxas de captação e translocação. A resistência ao 2,4-D em muitos casos depende do metabolismo das plantas. As plantas geralmente metabolizam herbicidas por processos que convertem a molécula parental em produtos mais polares e resíduos insolúveis (HATZIOS et al. 2005). Segundo Peterson

et al. (2016), embora espécies sensíveis ao 2,4-D, em alguns casos, possam metabolizar esse composto mais rapidamente que espécies tolerantes, os metabólitos produzidos podem ser facilmente convertidos de volta ao ácido original. Por outro lado, espécies tolerantes geralmente produzem metabólitos, a partir do 2,4-D, que não são fitotóxicos e são irreversíveis. Por exemplo, o 2,4-D é transformado em metabólitos reversíveis e temporários em dicotiledôneas a partir da modificação do grupo ácido carboxílico, que pode ser convertido novamente em formas ativas através de desesterificação (DAVIDONIS et al. 1980). Entretanto, a resistência ao 2,4-D em monocotiledôneas está principalmente relacionada à formação e seqüestro de metabólitos não tóxicos e permanentes, através de modificações do anel fenil ou heterocíclico (FEUNG et al. 1975). O metabolismo do 2,4-D em plantas superiores ocorre de três diferentes formas: por conjugação direta, hidroxilação do anel aromático e clivagem de cadeira lateral (Figura 7). A conjugação direta é mais comum em plantas sensíveis a este herbicida. Ela acontece através da conjugação de aminoácidos – principalmente o glutamato e o aspartato – e da glicose com o grupo ácido carboxílico do 2,4-D para formar conjugados de aminoácidos ou ésteres de 2,4-D-glicose. As plantas resistentes, por sua vez, metabolizam o 2,4-D predominantemente através de uma reação de hidroxilação do anel. Essa hidroxilação ocorre através de uma reação com as enzimas do citocromo P450 (HATZIOS et al., 2005), uma família de enzimas envolvidas no metabolismo e desintoxicação de vários herbicidas. Os produtos desse metabolismo são mais hidrofílicos, não fitotóxicos e polares se comparados com os produtos gerados pela conjugação direta (COBB & READE, 2010). A clivagem da cadeia lateral do 2,4- D é observada em várias plantas, no entanto desempenha papel importante no metabolismo em uma quantidade limitada de espécies (LOOS, 1969). A degradação da cadeia lateral ocorre através de uma única oxidação para produzir ácido glicólico e 2,4-diclorofenol (PILLMOOR & GAUNT, 1981). Tratando-se da toxicidade relativa ao herbicida, conforme Chinalia & Killham (2006), o 2,4-D é aplicado diretamente no solo ou pulverizado sobre as culturas e, a partir daí, frequentemente atinge águas superficiais e sedimentos. Devido aos baixos coeficientes de adsorção e alta solubilidade na água, o 2,4-D tem sido frequentemente detectado nas águas superficiais e subterrâneas, o que significa um importante problema ambiental e risco à saúde, visto que os organismos podem acumular 2,4-D em um período muito curto de tempo

(FONSECA et al., 2008; KILJANEK et al., 2016). A contaminação por este composto pode causar a morte de espécies não-alvo, incluindo plantas, animais e microorganismos, além de reduzir as taxas de crescimento, induzir problemas reprodutivos e produzir mudanças na aparência ou no comportamento (GAULTIER et al., 2008; SHAREEF & SHAW, 2008; KEARNS et al., 2014). De acordo com Islam et al. (2018), 7.3 milhões de kg de 2,4-D – 34% do uso total nos Estados Unidos – foi aplicado em áreas não agrícolas do país, incluindo gramados comerciais e residenciais, campos de jogos e parques públicos. Esse dado causa grande preocupação relacionada à saúde pública e aos efeitos tóxicos desse herbicida em seres humanos. Segundo os mesmos autores, a exposição ao 2,4-D pode induzir respostas inflamatórias e também afetar o sistema nervoso via inibição da defesa antioxidante induzida por espécies reativas de oxigênio (EROs), ou produzir genotoxicidade que pode afetar o funcionamento normal das organelas, induzir autofagia e carcinogênese a nível celular. O 2,4-D também interfere no funcionamento normal do sistema endócrino, modulando a produção de hormônios da tireóide e a expressão de hormônios esteróides sexuais, mesmo em baixas concentrações (PATTANASUPONG et al., 2004).

Figura 7 - Rotas metabólicas do 2,4-D. Fonte: Adaptado de Peterson et al. (2016)

Dessa forma, em concordância com Ribnicky et al. (1996), devido às propriedades inerentes às auxinas tais como divisão e alongamento celular, dominância apical, crescimento de raízes, fototropismo e proliferação de calos, além do baixo custo e alta eficácia, o 2,4-D tem sido bastante explorado como um potencial regulador de crescimento em sistemas de cultura in vitro de calos de diversas espécies vegetais, tais como: Brachypodium distachyon (DRAPER et al., 2001; VOGEL et al., 2006; PĂCURAR et al., 2008; VOGEL & HILL, 2008; ALVES et al., 2009; ZOMBORI et al., 2011; LEE et al., 2011; MAMEDES-RODRIGUES et al., 2018), Holarrhena antidysenterica (KUMAR et al., 2017), Ocimum basilicum, Ocimum kilimandscharicum, Ocimum sanctum, Ocimum grattisimum (PANDEY et al., 2014; PANDEY et al. 2019), Stevia rebaudiana (JAVED et al., 2017), Orthosiphon stamineus (LIM et al., 2013), Phlomis armeniaca (KARAKAS & TURKER, 2016), além de espécies de passifloras como P. quadrangularis (ANTOGNONI et al., 2007), P. alata Curtis (LUGATO et al., 2014) e P. alata (MACHADO et al., 2010).

3.7.2.2 Ácido naftalenoacético (ANA)

O ácido α-naftalenoacético (ANA) é um fitormônio da família das auxinas e é um produto muito utilizado como ingrediente de produtos hortícolas comerciais de pós- colheita, ele também é utilizado para induzir a floração e inibir a queda de frutas na pré- colheita (Crosby & Tang, 1969). É também um agente de enraizamento, além de ser utilizado para propagação vegetativa de plantas a partir de estacas de caule e folhas (SAIFUDDIN et al., 2009). O baixo custo, a alta estabilidade, capacidade de ajuste osmótico e baixa toxicidade tornam o ANA o composto sintético mais adequado para aplicação em produções agrícolas (XING et al., 2016; LI et al., 2020). Conforme Ribnicky et al. (1996) essa auxina está comumente associada à promoção de crescimento, proliferação de calos e indução de enraizamento. O ANA também pode ser utilizado para reduzir o dano oxidativo dos lipídios na membrana e diminuir a toxicidade de metais pesados nos tecidos das plantas (SMALL et al., 2019; AN et al., 2019). De acordo com Dunlap et al. (1986), o ANA é frequentemente utilizado em sistemas de culturas de tecido pois não é fotodestruído ou oxidado no meio antes de entrar no tecido vegetal. Uma vez no tecido, o composto não é oxidado, mas sim conjugado em um éster de glicose e amidas de aminoácidos (ANDREAE, 1967; ZENK, 1962). Andreae (1967) também demonstrou que, ao diminuir o pH do meio em uma cultura de raízes de ervilha (Pisum sativum), as taxas de captação do ANA aumentam consideravelmente. Devido às características promotoras de crescimento e proliferação celular, o ANA é bastante utilizado em estudos que utilizam auxinas para promover aumento de biomassa e a biossíntese de metabólitos secundários em diversas espécies de plantas. Luczkiewicz et al. (2014) testaram o efeito do ANA e de outras nove auxinas (naturais e sintéticas) na biossíntese e perfil de acúmulo de fitoestrogênios em culturas in vitro de Genista tinctoria. Yang et al. (2019) utilizaram ANA e ácido ascórbico como elicitores em culturas de raízes adventícias de Helicteres angustifolia. A elicitação mostrou-se eficiente na biossíntese de metabólitos secundários, especialmente fenólicos e flavonoides. Xing et al. (2016) aplicaram 40 mg L-1 de ANA em folhas de soja (Glycine max) e verificaram que essa auxina sintética auxiliou na tolerância à seca e aumentou significativamente a atividade antioxidante da planta

devido ao retardar o acúmulo de EROs sob estresse hídrico. Gamburg (1978) estudou a influência do ANA no conteúdo de carotenoides em tecido do tabaco (Nicotiana tabacum) cultivados através de cultura de suspensão. Os seus resultados demonstraram que as culturas acrescidas com 2 mg L-1 de ANA tiveram o conteúdo de carotenoides sete vezes maior quando comparados ao controle.

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Material Vegetal

Foram utilizadas, em todos os experimentos, as culturas de calos obtidas segundo a metodologia descrita por Sozo et al. (2016), a partir do cultivo de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone de plântulas axênicas, originadas através da germinação in vitro de sementes de P. setacea variedade BRS Pérola do Cerrado, cedidas pela Embrapa Cerrados Unidade de Planaltina – Brasília.

62 4.2 Métodos

4.2.1 Fluxograma geral dos métodos utilizados para a obtenção dos resultados demonstrados no trabalho

Figura 8 - Fluxograma geral das metodologias utilizadas no desenvolvimento do trabalho. O processo tem início na obtenção da P. setace BRS-PC, germinação das sementes e excisão dos segmentos de nó cotiledonar e cotilédone das plântulas para a indução da calogênese. Os calos são então tratados com as diferentes concentrações dos reguladores de crescimento 2,4-D e ANA e coletados após o período de crescimento de 30 dias. Todos os tratamentos testados totalizaram 14 amostras. Todas as amostras passaram então pelo processo de secagem, fragmentação mecânica e extração em solvente EtOH P.A para então realizar os testes fitoquímicos. Para as quantificações de clorofilas, a extração foi realizada com material fresco em solvente acetona 80%

4.2.2 Manutenção das culturas in vitro de calos

As culturas de calos originadas dos diferentes tipos de explantes e utilizadas nos experimentos foram mantidas em meio de cultura Murashige & Skoog (MS), suplementado com 88,5 µM de sacarose, 2,5 μM de 2,4-D e 0,2 % de Phytagel. As repicagens para manutenção dos calos foram realizadas em períodos de 30 dias. Essas culturas foram utilizadas como fontes de inóculos para todos os experimentos realizados com 2,4-D e ANA.

4.2.3 Procedimentos de preparação dos meios de cultura, montagem dos experimentos com 2,4-D e ANA e condições de crescimento das culturas

O meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962), uma mistura em pó preparada pela Sigma Chemical Co., na concentração de 4,4 g/L, foi suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0,2% (m/V) de Phytagel e concentrações de 2,5; 5 e 10 μM de 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenóxiacético) ou ANA (ácido α-naphtalenoacético), utilizados isoladamente. O controle foi realizado com o mesmo tipo de meio de cultura, mas sem a adição de reguladores de crescimento. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,8, antes da adição do Phytagel, utilizando-se solução de hidróxido de sódio 0,1 M ou de ácido clorídrico 0,1 N. Após a dissolução em placa aquecedora, foi distribuído em tubos de ensaio de 20 x 150 mm (8 mL de meio por tubo). Todos os tubos foram fechados com tampas de polipropileno e autoclavados por 20 minutos a 1,1 Kgf/cm³ e 121°C. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2°C, sob fotoperíodo de 16 horas, provido por lâmpadas fluorescentes Philips TDL (22.3 μmol.m-2 s-1) e umidade relativa de 70%. Foram preparados 60 tubos de ensaio, para cada tratamento. Esses procedimentos de preparação de meio de cultura e as condições de cultivo foram utilizados em todos os experimentos, exceto quando especificado. Após a autoclavagem, os tubos contendo os diferentes meios de cultura foram levados para o fluxo laminar e foram inoculados com fragmentos de cerca de 100 mg de massa fresca dos dois diferentes tipos de calos, por tubo. Foram inoculados 60 tubos de ensaio, para cada tratamento. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 ± 2°C, sob fotoperíodo de 16 horas, provido por lâmpadas fluorescentes Philips TDL (22.3 μmol.m-2 s-1) e umidade relativa de 70% (SOZO et al., 2016). Esses procedimentos de preparação de meio de

cultura e as condições de cultivo foram utilizados em todos os experimentos, exceto quando especificado.

4.2.4 Determinação das biomassas fresca e seca, teor de biomassa seca em relação à biomassa fresca e do teor de água

Após 30 dias de incubação, os calos de nó cotiledonar e cotilédone produzidos em cada tratamento foram removidos dos tubos de ensaio e pesados, individualmente, em balança analítica, para determinação da biomassa fresca. Em seguida, foram colocados em forminhas de papel individualizadas, para cada calo, em mantidos em estufa para secagem por 24 horas à temperatura de 60 ºC. Decorrido esse período, foi feita novamente a pesagem de cada calo isoladamente, para determinação da biomassa seca, teor de biomassa seca e teor de água. O teor de biomassa seca em relação à biomassa fresca, expresso em porcentagem (%) foi calculado da seguinte fórmula: (biomassa seca/biomassa fresca) x 100. O teor de água, expresso em porcentagem (%) da biomassa fresca foi calculado a partir da seguinte fórmula: (biomassa fresca – biomassa seca)/biomassa fresca) x 100.

4.2.5 Análises Fitoquímicas

4.2.5.1 Procedimento de extração hidroalcoólica das culturas de calos

Após a coleta e secagem da biomassa fresca a 60ºC, os calos de P. setacea foram pulverizados manualmente em almofariz e pistilos, e 50 mL de etanol 96% foram adicionados durante sete dias para obtenção dos extratos. Os extratos foram filtrados com papel filtro gramatura 80 g/m2 e concentrados em evaporador rotatório a vácuo (Buchi) a 55 ºC, fazendo com que o solvente evaporado fosse recuperado e, posteriormente, reutilizado para um novo procedimento de extração. O procedimento foi repetido por três vezes, para obtenção de um maior rendimento dos extratos brutos, totalizando-se, assim, um período de 21 dias de extração.

4.2.5.2 Determinação do teor de compostos fenólicos totais

Para determinar a concentração de fenólicos totais presentes nos extratos das culturas de calos foi utilizado o método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu descrito por Moresco et al. (2014). O ensaio baseia-se na redução pelos fenóis, em meio alcalino, a mistura dos

ácidos fosfomolíbdico (H3PMo12O40) e fosfotúngstico (H3PW12O40), que se encontram no estado de oxidação 6+ , formam os chamados molibdênio (MO+5) e tungstênio (W+5), em que a média do estado de oxidação dos metais é entre 5+ e 6+, cuja coloração é azul e permite a determinação do conteúdo de fenóis (substâncias redutoras) presentes nas amostras (SINGLETON & ROSSI, 1965; HUANG et al. 2005). Para a reação foi utilizado 0,5 mL de uma solução da amostra (extrato bruto diluído em etanol na concentração de 1000 μg mL-1), 5 mL de água destilada e 0,25 mL do reativo de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich ®); após

três minutos, foi adicionado 1 mL de solução saturada de carbonato de sódio (Na2CO3). Depois de agitadas, as misturas foram deixadas em repouso, à temperatura ambiente, e protegidas da luz, durante 1 hora. A leitura da absorbância das amostras, a fim de verificar- se a intensidade da reação, foi realizada em espectrofotômetro (Perkin Elmer – modelo Lambda 2S) a 725 nm (n=3). Para o branco, foi utilizada uma solução preparada como descrito acima, no entanto, sem a presença da solução da amostra. Para a curva padrão, foram utilizadas soluções-padrão de ácido gálico (Sigma-Aldrich ®) nas concentrações de 25 a 400 μg mL-1. O resultado foi expresso em mg equivalentes de ácido gálico (EAG) por g de biomassa seca.

4.2.5.3 Determinação do teor de flavonoides

Para a quantificação dos flavonoides nos extratos foi utilizado um reagente

complexante como o cloreto de alumínio - AlCl3 (WOISKY & SALATINO, 1998). O íon Al3+ se complexa com oxigênio vicinais presentes nos flavonoides, proporcionando um deslocamento batocrômico das bandas de absorbância do espectro de UV/VIS para uma região característica (ZUANAZZI & MONTANHA, 2003). Para a reação foi utilizado o método proposto por Moresco et al. (2014) com adaptação para microplaca, no qual, foram homogeneizadas 50 μL de uma solução da

amostra (extrato bruto diluído em etanol na concentração de 1000 μg mL-1 ), 200 μL de etanol

e 50 μL de uma solução de cloreto de alumínio (AlCl3) a 2%. As leituras das absorbâncias foram realizadas após 1 hora de reação em espectrofotômetro de microplaca (Biosystems – modelo Synergy 2) com incubação a 25°C e 415 nm (n=3). Para o branco, foi utilizada uma

solução preparada conforme descrito acima, contudo, sem a adição da solução de AlCl3 a 2%. O indicativo de presença de flavonoides pôde ser observado pela coloração verde- fluorescente nos extratos. Foi elaborada uma curva de padrão para dosar o teor de flavonoides presente em cada amostra, utilizando-se a soluções-padrão de quercetina (Sigma-Aldrich®) nas concentrações de 2,5 a 100 μg mL-1. O resultado foi expresso em mg equivalentes de quercetina (EQ) por g de biomassa seca.

4.2.5.4 Determinação da atividade antioxidante pela ação sequestradora do radical livre DPPH

Para a determinação da atividade antioxidante dos extratos das culturas de calos, foi utilizado o método baseado no sequestro do radical livre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) (Sigma-Aldrich®), conforme descrito por Bouchet et al. (1998) e Cavin et al. (1998) e adaptado por Moresco et al. (2014). O DPPH é um radical livre, orgânico e estável de coloração violácea, e que, através de uma reação de transferência de elétron, ocorre a diminuição da intensidade de sua coloração passando para amarelo quase transparente, permitindo medir, por espectrofotometria, o decréscimo desta absorção (ALAM et al., 2017). Foi utilizado para reação química uma solução etanólica de DPPH na concentração de 4x10-3, que foi preparada momentos antes de montar a reação, e uma solução de 1000 μg mL-1 de extrato bruto vegetal. A partir disso, a reação foi montada em microplacas de 96 poços usando 100 μL da solução de DPPH, 60 μL do extrato bruto e 140 μL de etanol. Para

a correção de cada absorbância, foi realizado o controle de cada amostra (Absbranco), que consiste na mistura da solução do extrato vegetal (60 μL) com o etanol (200 μL), sem a

presença da solução de DPPH. Já para o controle positivo (Abscontrole), foi utilizado 100 μ de DPPH e 200 μL de etanol. A reação ficou incubada à 25 °C no escuro durante 30 minutos em espectrofotômetro de microplacas (Biosystems – modelo Synergy 2) a 517 nm (n=3). A partir da absorbância de cada amostra, foi realizada a conversão em porcentagem de atividade

antioxidante (AA%), com base na seguinte fórmula: AA%= 100 - [(Absamostra -Absbranco)

/(Abscontrole)] x 100. As amostras que atingiram 50% de atividade antioxidante foram submetidas ao

cálculo da concentração efetiva necessária para reduzir o DPPH em 50% (CE50). Para o

cálculo de CE50 foi realizado o mesmo teste descrito acima, porém montando uma curva com diferentes concentrações de extrato (2,5 a 200 μg mL-1). O resultado será expresso em μg mL-1.

4.2.5.5 Determinação da atividade antioxidante pelo ensaio do poder redutor

O teste do potencial redutor baseia-se na reação de redução de íons férricos (Fe+3) a íons ferrosos (Fe+2) pelos compostos doadores de elétrons. Dessa forma, os íons ferricianeto 3- 4- [Fe(CN)6] são reduzidos a ferrocianeto [Fe(CN)6] que, por sua vez, formam um complexo

com os íons ferro III de coloração azul intensa (azul da Prússia - Fe4[Fe(CN)6]3). Para a determinação do poder redutor foi utilizado o método desenvolvido por Price & Butler (1977), proposto por Waterman & Mole (1994) e adaptado por Moresco et al. (2014). Para tal, 5 μL de extrato bruto diluído em etanol, a uma concentração de 1000 μg mL-1, foram adicionados a 195 μL de água deionizada e a 50 μL de solução de cloreto férrico 0,1 M em HCl 0,1 M. Após 3 minutos, foi acrescentado à mistura 50 μL de solução de ferricianeto 0,008 M. As leituras das absorbâncias foram realizadas após 15 minutos em espectrofotômetro de microplacas (Biosystems – modelo Synergy 2) com incubação a 25°C a 720 nm (n=3). Para o branco foi utilizada uma solução conforme citada acima, sem a adição da amostra. Foi realizada uma curva de padrão com soluções-padrão de ácido ascórbico (Sigma- Aldrich®) nas concentrações de 100 a 800 μg mL-1, a fim de comparar e calcular o potencial redutor. Assim, o resultado foi expresso em mg equivalentes de ácido ascórbico (EAA) por g de biomassa seca.

4.2.5.6 Análise do teor de clorofila e carotenoides

Para determinação dos teores dos pigmentos dos calos de P. setacea foi adaptado do

método descrito por Richie (2006) e Wellburn (1994). Após a coleta do material vegetal, foi pesado 2g de biomassa fresca, em seguida macerados manualmente em almofariz e pistilos. O extrato homogeneizado foi transferido para tubos Falcon e foi acrescido 3,0 mL de acetona 80%. Os tubos contendo o extrato foram deixados em repouso, sob refrigeração, e protegido da luz, durante 24 horas. Após esse período de extração, a solução foi centrifugada durante 20 minutos a 4000 rpm. O sobrenadante foi coletado e analisado em cubeta de quartzo em espectrofotômetro a 664 nm e 647 nm, Chl a e Chl b, respectivamente (n=3), e para carotenoides (x + c) a 470 nm (n=3). Os resultados das absorbâncias das leituras foram calculados de acordo com a fórmulas:

Chl a: 12,21 x A663 - 2,81 x A646

Chl b: 20,13 x A646 - 5,03 x A663

Chl x + c: 1000 x (A470 - 3,27 x Chl a - 104 x Chl b) /198 O teor dos pigmentos foi expresso em µg equivalente de pigmento por mL de acetona 80%. Para o branco, a leitura em espectrofotômetro foi realizada somente com acetona 80%.

4.2.6 Análise estatística

Todos os experimentos foram montados de acordo com o delineamento estatístico completamente casualizado. Os resultados foram analisados estatisticamente através da análise de variância (ANOVA) fatorial 2 x 2, para avaliar a interação, dois a dois, dos fatores tipo de explante (nó cotiledonar e cotilédone), tipo de regulador de crescimento (2,4-D e ANA) e concentrações dos reguladores de crescimento (2,5; 5 e 10 µM), com 3 repetições por tratamento. Assim, foram avaliadas, para cada tipo de explante, a interação entre os tipos de reguladores e as concentrações; para cada regulador, a interação entre tipo de explante e concentrações e para cada concentração, a interação entre tipo de explante e tipo de regulador. A separação das médias foi realizada pelo teste de Tukey, ao nível de probabilidade de 95% (p< 0.05). Também foram realizadas as análises de correlação linear simples, para a determinação dos valores de coeficientes de correlação linear (r) (GOMEZ & GOMEZ, 1984). As análises estatísticas foram feitas utilizando-se os softwares de estatística – EXCEL (Microsoft) e PAST (Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis, Hammer et al. (2001).

5 RESULTADOS

5.1 Efeito de tipos de explantes e de auxinas no crescimento de calos de P. setacea

As figuras 9 e 10 mostram o aspecto dos calos de nó cotiledonar e de cotilédone crescidos na ausência de auxinas ou na presença de concentrações de 2,5; 5 e 10 µM de ANA. Em ambas as auxinas houve diferença na textura dos calos sendo que, os calos de nó cotiledonar tenderam a ser mais friáveis e os calos de cotilédone mais compactos. Na Figura 9 verifica-se a diferença na coloração entre os calos do controle com o calos tratados com 2,5, 5 e 10 µM de ANA, em que os calos originados de segmento de nó cotiledonar, de forma geral, apresentaram coloração verde levemente mais intensa do que os calos originados de segmento de cotilédone, exceto os calos controle que não demonstraram diferença na coloração entre os originados a partir de nó cotiledonar e cotilédone. Especialmente, os calos tratados com 10 µM de ANA demonstraram coloração mais intensa quando comparados com os demais tratamentos. Na figura 10 observa-se a diferença na coloração entre os calos oriundos de segmento de nó cotiledonar e cotilédone tratados com 2,5, 5 e 10 µM de 2,4-D e os calos controle. É possível notar que os calos oriundos de segmento de nó cotiledonar demonstraram coloração verde levemente mais escura em comparação com os calos oriundos cotilédone, exceto os calos do controle que não demonstraram diferença na coloração entre os dois tipos de explantes. Dentre os calos cultivados com as diferentes concentrações de 2,4-D, não foi possível perceber destaque relativo à coloração em nenhuma das concentrações utilizadas. Os calos de nó cotiledonar apresentaram, de modo geral, textura mais friável do que os calos de cotilédone. As diferenças entre as colorações dos calos em ambas as auxinas foram confirmadas através das quantificações de clorofilas que será apresentada no item 5.3 abaixo.

Figura 9 - Calos de Passiflora setacea originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone, cultivados com as concentrações de 2,5, 5 e 10 µM da auxina ácido naftalenoacético (ANA) em comparação com calos originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone cultivados sem a adição de auxinas (controle) aos 30 dias de cultivo. Barras = 5mm.

Figura 10 - Calos de Passiflora setacea originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone, cultivados com as concentrações de 2,5, 5 e 10 µM da auxina 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) em comparação com calos originados de segmento de nó cotiledonar e cotilédone cultivados sem a adição de auxinas (controle) aos 30 dias de cultivo. Barras = 5mm.

Os calos de P. setacea, formados a partir de segmentos de nó cotiledonar e cotilédone, quando cultivados com diferentes concentrações de 2,4-D e ANA, apresentaram variações com relação aos parâmetros de crescimento e teor de água analisados. Os resultados da tabela 6 mostram o incremento em biomassa fresca e seca, o teor de biomassa seca acumulada pelos calos, expresso em porcentagem da biomassa fresca, o teor de água dos calos e os coeficientes de correlação entre as biomassas fresca e seca obtidos a partir do cultivo de calos de nó cotiledonar e cotilédone em diferentes concentrações de 2,4- D e ANA. Verifica-se que os maiores valores de biomassa fresca, variando entre 1,92 e 2,12 g e de biomassa seca, variando entre 102,73 e 113,39 mg, foram obtidos para calos de nó cotiledonar cultivados com 10 µM de ANA e, para calos de cotilédone, em 2,4-D e em ANA, nas concentrações de 2,5 e 10 µM. Os resultados mostram que o regulador de crescimento que demonstrou maior eficiência em incremento de biomassa seca dos calos oriundos tanto de segmento de nó cotiledonar (102,73 mg), como cotilédone (113,39 mg) foi o ANA na concentração de 10 µM. Porém, em calos de cotilédone este valor não diferiu significativamente da concentração de 2,5 µM de ANA e nem da concentração de 2,5 µM de 2,4-D. Observa-se que, nos calos oriundos de segmento de nó cotiledonar tratados com 10 µM de ANA provocou um aumento de 15,25% no incremento de biomassa seca, em relação ao mesmo tipo de calo crescido na ausência de auxinas, enquanto o tratamento com 10 µM de 2,4-D inibiu em 24,25% o incremento na biomassa seca em relação ao controle. Nos calos de cotilédone a concentração de 10 µM de ANA provocou incremento na biomassa seca dos calos de 20,32% enquanto o tratamento utilizando-se 10 µM de 2,4-D foi o menos eficiente, provocando uma diminuição de 27,56%, em relação ao controle. Em calos de nó cotiledonar o 2,4-D, em todas as concentrações, demonstrou menor eficiência no incremento em biomassa seca dos calos (entre 67,52 – 74,66 mg), especialmente nas concentrações 5 µM e 10 µM, enquanto que nos calos de cotilédone isso ocorreu apenas na concentração de 10 µM, não havendo diferença significativa entre estes tratamentos. Ao analisar o parâmetro teor de biomassa seca dos calos, em relação à biomassa fresca, observa-se que os calos oriundos de segmento de cotilédone crescidos na ausência de auxinas apresentaram o maior acúmulo de biomassa seca (6,8%) dentre todos os outros tratamentos, com exceção dos calos de nó cotiledonar, tratados com 2,5 µM de ANA (6,5%), não havendo diferença significativa entre os valores.

Os menores teores de biomassa seca acumulados pelos calos de nó cotiledonar ocorreram nas concentrações de 2,5 µM e 5 µM de 2,4-D (4,6-4,8%) e esses valores não diferiram significativamente dos valores observados para os calos de cotilédone crescidos em todas as concentrações de 2,4-D e em 2,5 µM de ANA. As diferenças entre as porcentagens de acúmulo de biomassa seca pelos calos interferiram também nos teores de água. Assim, os calos que apresentaram os menores valores de acúmulo de biomassa seca, ao redor de 4,6 e 4,8% foram os que apresentaram os maiores teores de água, ao redor de 95%, como os calos de nó cotiledonar cultivados em 2,5 e 5 µM de 2,4-D, enquanto que os que apresentaram maiores porcentagem de acúmulos de biomassa seca apresentaram ao redor de 93% de água. Em calos de nó cotiledonar e cotilédone as concentrações crescentes de 2,4-D reduziram as biomassas secas, os teores de biomassa seca, em relação à biomassa fresca e aumentaram significativamente o teor de água. Já nas concentrações crescentes de ANA, houve incremento de biomassa seca em ambos os tipos de calos, porém houve diferença entre eles com relação ao perfil de variação das porcentagens de biomassa seca e do teor de água; Os valores de coeficientes de correlação linear obtidos para todos os tratamentos foram significativos (p < 0,01), porém os maiores valores, acima de 0,95 foram observados em calos de cotilédone cultivados com 5 µM de ANA e 10 µM de 2,4-D. Esses resultados indicam que nesses casos o incremento na biomassa fresca dos calos esteve fortemente ligado ao incremento na biomassa seca do que ao acúmulo de água. Em calos de cotilédone o menor valor de coeficiente de correlação linear (r = 0,671) foi observado nos calos tratados com 10 µM de ANA. Em calos de nó cotiledonar o menor valor de coeficiente de correlação linear entre as e biomassas fresca e seca (r = 0,724) foi observado nos calos tratados com 2,5 µM de 2,4-D, e o maior coeficiente (r = 0,926) foi observado nos calos que cresceram na ausência de auxinas. As análises de correlação linear entre as variações nas concentrações de 2,4-D e ANA e os valores de biomassa seca e teor de biomassa seca, em relação à biomassa fresca são mostradas na Tabela 7. O coeficiente de correlação linear r mede o grau de associação linear entre as concentrações de auxinas e os parâmetros analisados. Verifica-se que, tanto para os calos de nó cotiledonar como cotilédone cultivados em 2,4-D, as correlações foram negativas, indicando que o aumento na concentração dessa auxina esteve associado à diminuição dos valores de biomassa seca, enquanto que, com ANA, as correlações foram positivas mas

baixas, indicando fraca associação entre as concentrações e a variação na biomassa seca. Contudo, o aumento na concentração 2,4-D esteve mais fortemente associado ao aumento no teor da biomassa seca de ambos os tipos de calos, enquanto que, em ANA a correlação foi forte e negativa, para os calos de nó cotiledonar e fraca e positiva, para os calos de cotilédone. Os efeitos interativos entre os fatores tipo de explante, tipo de auxinas e concentração de auxinas no teor de biomassa seca dos calos, em relação à biomassa fresca e na biomassa seca foram avaliados através de análises fatoriais 2 x 2 e os resultados constam dos Apêndice A, em que são mostrados os valores de F, obtidos nas análises de variância fatoriais e os valores de p. A maioria das análises fatoriais realizadas para verificar, para cada tipo de explante, a interação entre tipo e concentração de auxinas; para cada tipo de auxina, as interação entre tipo de explante e concentração e para cada concentração, a interação entre tipo de auxina e tipo de explante indicaram interações significativas entre os fatores analisados (p < 0,001), tanto para o teor de biomassa seca em relação à biomassa fresca como para a biomassa seca. As interações significativas são importantes pois mostram que a origem do explante utilizado para produzir os calos, o tipo de auxina utilizada e as concentrações podem ter atuado em conjunto influenciando o crescimento. Para biomassa seca os resultados das análises fatoriais, para cada tipo de explante, indicaram interações significativas entre o tipo e a concentração de auxina (F= 19,02***, p=0,001, para nó cotiledonar; F=30,89***, p < 0,001, para cotilédone) e entre tipo de explante e concentração (F= 25,50***, p < 0,001), para 2,4-D. Assim, os efeitos das concentrações estiveram associados ao tipo da auxina e em 2,4-D, ao tipo de explante de origem do calo. Os resultados mostram também que nas concentrações de 2,5 e 5 µM de auxinas, os fatores tipo de explante e tipo de auxina interagiram para influenciar a biomassa seca dos calos (F= 12.57***, p < 0,001; F= 17,96***, p < 0,001, respectivamente). Para o teor de biomassa seca, apenas não foram significativas as interações entre tipo e concentração de auxina, para cotilédone e entre tipo de explante e tipo de auxina, na concentração de 10 µM.

Tabela 6 – Efeito de tipos de explante e de auxinas na massa fresca, massa seca, teor de massa seca, teor de água e coeficiente de correlação linear de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Explante Auxina Massa fresca Massa seca Teor de MS Teor de água Coef. correl. (g) (mg) (%) (%) linear (r) Tipo Conc (µM) bc b b c Nc 2,4-D 0 1,50 ± 0,38 89,14 ±14,84 6,2 ± 0,9 93,85 ± 0,92 0,926** b c cd 2,5 1,57 ± 0,30 74,66 ± 10,24 4,8 ± 0,6 95,17 ± 0,63ab 0,724** bc c d 5 1,53 ± 0,31 69,48 ± 11,36 4,6 ± 0,6 95,39 ± 0,59a 0,806** c c c b 10 1,29 ± 0,29 67,52 ± 12,31 5,3± 0,05 94,71 ± 0,52 0,891** bc b cd ANA 2,5 1,53 ± 0,42 96,70 ± 21,43 6,5 ± 0,7ab 93,55 ± 0,74 0,895** bc b b b 5 1,54 ± 0, 43 87,64 ± 15,25 5,9 ± 1,0 94,08 ± 1,06 0,862** bc b 10 1,92 ± 0,42a 102,73 ± 10,46ab 5,4 ± 0,7 94,58 ± 0,71 0,832** bc b d Cot 2,4-D 0 1,46 ± 0,51 94,24 ± 22,99 6,8 ± 1,3a 93,22 ± 1,33 0,897** c b 2,5 2,12 ± 0,47a 108,40 ± 17,51a 5,2 ± 0,5 94,80 ± 0,50 0,933** b b bc b 5 1,57 ± 0,25 86,57 ± 10,96 5,6 ± 0,5 94,44 ± 0,49 0,868** c c bc b 10 1,24 ± 0,30 68,27 ± 11,81 5,6 ± 0,6 94,39 ± 0,58 0,951** bc b ANA 2,5 2,11 ± 0,51a 110,10 ± 18,43a 5,4 ± 0,7 94,64 ± 0,75 0,867** bc b b c 5 1,48 ± 0,43 89,31 ± 20,68 6,1 ± 0,5 93,86 ± 0,53 0,958** a b b 10 1,97 ± 0,36 113,39 ± 25,69a 5,8 ± 0,9 94,20 ± 0,94 0,671** Médias ± desvio padrão de 50-55 repetições, para nó cotiledonar e cotilédone, seguidas por letras diferentes, na coluna, diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p<0,05). Valores de r computados foram comparados com os valores de r tabulados em Statistical Procedures for Agricultural Research (Gomez & Gomez, 1984). (**) = p<0,01. Nc = nó cotiledonar. Cot = cotilédone. MS = massa seca.

Tabela 7. Valores de coeficientes de correlação linear simples entre as concentrações de 2,4-D e ANA e biomassa seca, teor de biomassa seca, carotenoides, clorofila, fenólicos totais, flavonoides, poder redutor e atividade antioxidante pelo DPPH de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Parâmetros Tipo de explante Nc Cot 2,4-D ANA 2,4-D ANA Conc x biomassa seca -0,903 0,563 -0,971 0,311 Conc x teor massa seca 0,792 -0,978 0,827 0,397 Conc x carotenoides -0,880 0,783 -0,915 -0,033 Conc x clorofila -0,161 0,961 -0,208 0,957 Conc x fenólicos totais -0,938 0,999* -0,708 -0,975 Conc x flavonoides -0,985 -0,047 -0,524 0,537 Conc x poder redutor -0,999* 0,999* -0,406 -0,588 Conc x DPPH -0,944 0,915 -0,766 -0,945

Nc = nó cotiledonar. Cot= cotilédone. Valores de r computados foram comparados com os valores de r- tabulados em Statistical Procedures for Agricultural Research (Gomez & Gomez, 1984) para 3 amostras (n = 3, n-2 = 1 g.l.). (*) = p<0.05.

5.2 Efeito de tipos de explantes e de auxinas na produção de compostos fenólicos e na atividade antioxidante de extratos de calos de P. setacea

A tabela 8 mostra os teores de fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante avaliada através do poder redutor e da concentração efetiva para inibir 50% do DPPH (CE50) de extratos de calos de P. setacea originados de dois tipos de explantes, nó cotiledonar e cotilédone e cultivados em diferentes concentrações de 2,4-D e ANA. As culturas apresentaram diferenças entre os tipos de explantes de origem, tipos de auxinas e das concentrações requeridas para otimizar a produção de compostos fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante.

Observa-se que os calos oriundos de nó cotiledonar apresentaram o maior teor de fenólicos totais (96,58 ± 4,59 mg AG/g extrato seco) e a maior atividade antioxidante, tanto pelo poder redutor (294,67 ± 24,31 mg AA/g extrato seco), como pelo CE50 (67,92 µg/mL ± 0,69) na concentração de 10 µM de ANA. Porém, o maior teor de flavonoides foi observado nos calos originados de cotilédone e cultivados com 2,5 µM de 2,4-D (3,16 ± 0,06 mg Q/g extrato seco), resultados que não diferiu significativamente do obtido para calos de nó cotiledonar cultivados com 5 µM de ANA (2,19 ± 0,07 mg Q/g extrato seco).

Para os calos oriundos de segmento de cotilédone, a concentração de 2,5 µM de ANA se mostrou mais eficiente na produção de compostos fenólicos totais (60,39 ± 6,06 mg AG/g extrato seco), apresentando também a maior taxa de atividade antioxidante, medida pelo ensaio do poder redutor (241,30 ± 9,59 mg AA/g extrato seco) e o maior valor de CE50. Os maiores teores de flavonoides foram produzidos, contudo, nos calos cultivados com 2,5 µM de 2,4-D (3,16 ± 0,06 mg Q/extrato seco). Comparando-se os dois tipos de calos, quanto à eficiência dos tipos e das concentrações de auxinas utilizadas na produção de fenólicos totais , nota-se que o ANA nas concentrações de 5 e 10 µM, em calos de nó cotiledonar e na concentração de 2,5 µM, em calos de cotilédone estimulou significativamente a produção de fenólicos totais, em relação aos demais tratamentos. Nestes casos a produção de fenólicos totais variou entre 62,96 – 96,58 mg AG/g extrato seco, em calos de nó cotiledonar, e foi de cerca de 60,39 mg AG/g extrato seco em calos de cotilédone. Nessas mesmas concentrações de ANA foram detectados os maiores níveis de atividade antioxidante medido pelo poder redutor (entre 225,34 -

294,67 mg AA/g extrato seco, em calos de nó cotiledonar e cerca de 241,30 mg AA/g extrato seco, em calos de cotilédone) e os menores valores de CE50 (entre 67,92 – 70,58 µg/mL, em calos de nó cotiledonar cerca de 101,66 µg/mL, em calos de cotilédone.

Com relação à eficiência dos tipos e concentrações de auxinas na produção de flavonoides os resultados demonstraram que, em calos de cotilédone, o maior nível de flavonoides (3,16 ± 0,06 mg Q/g extrato seco) foi produzido na concentração 2,5 µM de 2,4- D, enquanto que nos calos de nó cotiledonar as concentrações de 2,5 µM de 2,4-D e de 5 µM de ANA foram igualmente eficientes, pois não houve diferença significativa entre os valores obtidos (2,07 e 2,19 mg Q/g extrato seco). Portanto, o 2,4-D, em calos de cotilédone foi o mais eficiente em otimizar a produção de flavonoides dentre todos os tratamentos utilizados.

Em calos de nó cotiledonar houve tendência das concentrações crescentes de 2,4-D estarem relacionadas com a diminuição nos níveis de fenólicos totais, de flavonoides, de poder redutor e de aumento nos valores de CE50. A mesma tendência foi observada nos calos de cotilédone, com o aumento das concentrações de 2,4-D, principalmente com relação aos fenólicos totais, flavonoides CE50. Em ANA, os perfis de variação dos parâmetros entre os tipos e calos foi diferente: em calos de nó cotiledonar, o aumento das concentrações de ANA esteve relacionado com o aumento de fenólicos totais, de poder redutor e diminuição dos valores de CE50, enquanto que em calos de cotilédone houve redução nos níveis de fenólicos totais e de poder redutor, mas aumento nos níveis de flavonoides e nos valores de CE50.

Os calos de nó cotiledonar e cotilédone cultivados em 2,4-D na concentração de 10 µM apresentaram os menores teores de fenólicos totais (36,62 e 32,97 mg AG/g extrato seco, respectivamente) e de atividade antioxidante medida pelo ensaio do poder redutor (139, 86 e 134,81 mg AG/g extrato seco, respectivamente). Além disso, nessa concentração de 2,4-D, as atividades antioxidantes dos extratos, medida pela captura do DPPH não atingiu 50% de atividade antioxidante, de forma que o cálculo do CE50 não foi realizado. Os menores teores de flavonoides (0,59 ± 0,06 mg Q/g extrato seco) foram observados nos calos oriundos de nó cotiledonar em que nenhuma auxina foi utilizada e esses dados não diferiram significativamente dos valores obtidos com 10 µM de 2,4-D e dos valores observados em calos de cotilédone cultivados em 2,5 µM de 2,4-D ou ANA.

Para ambos os tipos de calos, verifica-se a relação entre os parâmetros fenólicos totais, atividade antioxidante, medida pelo ensaio do poder redutor e pela menor concentração efetiva para inibir 50% do DPPH, de forma que os tratamentos que produziram os maiores teores de compostos fenólicos totais também demonstraram os maiores níveis de atividade antioxidante medida por ambos os tipos de ensaio

As análises de correlação linear entre as variações nas concentrações de 2,4-D e ANA e os valores de fenólicos totais, flavonoides, poder redutor e atividade antioxidante pelo DPPH são mostradas na Tabela 7. Observa-se que, tanto para os calos de nó cotiledonar como cotilédone cultivados em 2,4-D, todas as correlações foram altas e negativas, indicando que o aumento na concentração dessa auxina esteve associado à diminuição dos valores dos parâmetros analisados. Para os calos de cotilédone os coeficientes de correlação foram baixos apenas com os flavonoides e com o poder redutor.

Com ANA, em calos de nó cotiledonar, o aumento nas concentrações esteve fortemente associado ao aumento nos fenólicos totais (r= 0,999), poder redutor (r= 0,999) e atividade antioxidante pelo DPPH (r= 0,915), sendo fraca e negativa a correlação com flavonoides, enquanto que, em calos de cotilédone as correlações foram altas e negativas para fenólicos totais (r= -0,975) e atividade antioxidante pelo DPPH (r= -0,945), mas baixas também com os flavonoides e poder redutor. É importante ressaltar que, as correlações entre as concentrações de auxinas e flavonoides foram baixas e negativas, na maioria dos tratamentos, sendo alta e negativa apenas em calos de nó cotiledonar cultivados em 2,4-D (r= -0,985), mostrando que apenas nessa auxina houve forte associação entre o aumento da concentração e a diminuição no teor de flavonoides.

Os efeitos interativos entre os fatores tipos de explante, tipos de auxinas e concentrações de auxinas nos níveis de fenólicos totais, flavonoides, poder redutor e atividade antioxidante avaliada pelo CE 50 foram avaliados através de análises fatoriais 2 x 2 entre os diferentes fatores e os resultados constam dos Apêndice B.

Para fenólicos totais, para cada tipo de explante foram significativas as interações entre tipos e concentrações de auxinas (F= 242,69***, p< 0,001), nó cotiledonar; F= 15,92***, p< 0,001, cotilédone) e, para cada tipo de auxina, as interações entre tipo de explante e concentrações (F= 51,39**, p< 0,01), 2,4-D; F= 127,69***, p< 0,001, ANA). As

interações entre tipo de auxina e tipo de explante também foram significativas para as concentrações de 2,5; 5 e 10 µM (F= 42,51**, p< 0,001; F= 43,42***, p< 0,001; F= 320,68***, p< 0,001). Para poder redutor, todas as interações também foram significativas (p< 0,001, em todos os casos), exceto em 2,5 µM, para a interação entre tipo de auxina e tipo de explante (p< 0,01).

Para os flavonoides, as interações apenas não foram significativas entre tipo de explante e concentrações, em ANA e entre tipo de auxina e tipo de explante, na concentração 10 µM. Em todas as outras análises os resultados mostram interações significativas entre tipo e concentrações de auxinas (p< 0,05, para nó cotiledonar e p< 0,001, para cotilédone); entre tipo de explante e concentrações (p< 0,001, para 2,4-D) e entre tipo de auxina e tipo de explante, para as concentrações de 2,5 e 5 µM (p< 0,01 e p< 0,05).

Para o CE50 em todas as análises fatoriais realizadas para verificar, para cada tipo de auxina, as interações entre tipo de explante e concentrações e para as concentrações de 2,5 e 5 µM, as interações entre tipos de auxinas e tipos de explantes, também foram significativas (p< 0,001, em todos os casos, exceto na interação entre tipo de auxina e tipo de explante, em 5 µM, p< 0,01).

A tabela 9 mostra os valores de porcentagens de flavonoides em relação aos fenólicos totais produzidos pelos calos de P. setacea originados de dois tipos de explantes, nó cotiledonar e cotilédone e cultivados em diferentes concentrações de 2,4-D e ANA. Verifica- se que os tipos de explantes utilizados para originar os calos e os tipos e concentrações de auxinas influenciaram também a razão flavonoides/fenólicos produzidos pelos calos. Os calos de cotilédone cultivados na concentração de 2,5 µM de 2,4-D os flavonoides representaram 7,86% dos fenólicos totais, enquanto que os calos de nó cotiledonar cultivados em 5 µM de 2,4-D, os flavonoides representaram apenas 4,57% dos fenólicos totais, valor 42% menor. Em ambos os tipos de calos, as maiores proporções de flavonoides entre os fenólicos totais foram observadas nos tratamentos com 2,4-D, o que indica a eficiência desse regulador em potencializar a biossíntese de flavonoides, mas apenas em algumas concentrações. Observa-se que, em ambos os tipos de calos as concentrações crescentes de 2,4-D diminuíram a razão flavonoides/fenólicos totais. Com relação ao ANA, em calos de nó cotiledonar

ocorreu o mesmo padrão de variação observado em 2,4-D, mas em calos de cotilédone houve aumento da razão flavonoides/fenólicos com o aumento das concentrações crescentes ANA.

A otimização dos tipos e concentrações de auxinas para cada tipo de calo permitiu aumentar, em calos de nó cotiledonar, 2,24 vezes o teor de fenólicos; 3,71 vezes o teor de flavonoides e 1,72 vezes o poder redutor, enquanto que nos calos de cotilédone, os aumentos foram de 1,27 vezes para fenólicos; 2,92 vezes para flavonoides e 1,31 vezes o poder redutor.

Para o CE50, em calos de nó cotiledonar o valor foi reduzido 2,46 vezes e em calos de cotilédone, 1,82 vezes.

Explante Auxina Conc. Fenólicos Flavonoides Poder redutor DPPH/CE50 (µ퐌) totais (mg Q/g (mg AA/g (µg mL-1) (mg AG/g extrato seco) extrato seco) extrato seco) d d de Nc 2,4-D 0 42,97 ± 0,56 0,59 ± 0,06 171,29 ± 9,59 * cd b de c 2,5 48,65 ± 1,32 2,07 ± 0,07 163,37 ± 5,92 138,5 ± 0,90 d bc de b 5 40,92 ± 0,28 1,87 ± 0,11 155,03 ± 12,13 164,68± 4,82 de cd e 10 36,62 ± 0,34 0,93 ± 0,19 139,86 ± 11,01 * cd cd cd d ANA 2,5 45,36 ± 0,58 1,59 ± 0,37 183,37 ± 16,55 122,08 ± 0,29 b ab bc g 5 62,96 ± 4,26 2,19 ± 0,07 225,34 ± 15,42 70,58 ± 6,24 a c a g 10 96,58 ± 4,59 1,68 ± 0,50 294,67 ± 24,31 67,92 ± 0,69 cd cd cd Cot 2,4-D 0 47,45 ± 2,62 1,08 ± 0,22 183,54 ± 14,11 * de a de c 2,5 40,22 ± 0,25 3,16 ± 0,06 155,79 ± 10,62 139,83± 2,53 cd d bc a 5 45,83 ± 0,61 0,77 ± 0,17 223,80 ± 24,30 184,54± 1,72 e cd e 10 32,97 ± 0,57 1,50 ± 0,07 134,81 ± 10,65 * b d b f ANA 2,5 60,39 ± 6,06 0,84 ± 0,52 241,30 ± 9,59 101,66 ± 2,71 c c d e 5 50,66 ± 1,37 1,63 ± 0,13 172,88 ± 4,85 110,73 ± 2,75 d cd c ef 10 42,06 ± 1,65 1,40 ± 0,52 189,17 ± 1,37 107,82 ± 2,36

Médias ± desvio padrão de três repetições (fenólico, flavonoides, poder redutor, CE50) seguidas por letras diferentes, na coluna, diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p<0.05). Nc = nó cotiledonar. Cot= cotilédone. AG = ácido gálico. Q = quercetina. AA = ácido ascórbico. * = atividade antioxidante < 50%. CE50 = concentração efetiva para inibir 50% do DPPH.

Explante Auxina Conc. Flavonoides (µ퐌) (%) Nc 2,4-D 0 1,36 2,5 4,24 5 4,57 10 2,55 ANA 2,5 3,50 5 3,48 10 1,74 Cot 2,4-D 0 2,28 2,5 7,86 5 1,67 10 4,56 ANA 2,5 1,39 5 3,22 10 3,33 Nc = nó cotiledonar. Cot= cotilédone

5.3 Efeito de tipos de explantes e de auxinas nos níveis de clorofilas e carotenoides em calos de P. setacea

Na tabela 10 são mostrados os níveis de Chl a, Chl b, clorofilas totais (Chl a + Chl b) e carotenoides totais encontrados nos calos de P.setacea oriundos de nó cotiledonar e cotilédone e cultivados com diferentes concentrações de ANA e 2,4-D. É possível observar entre os tratamentos, diferenças quanto aos teores de clorofilas e carotenoides.

As clorofilas totais e carotenoides são expressos de duas formas: em µg/g massa seca e µg/g de massa fresca para comparação, uma vez que, pelos dados de crescimento obtidos, os teores de biomassa seca dos calos variaram de acordo com o tratamento. Assim, as 2 g de massa fresca de calos, padronizada no protocolo utilizado para extração das clorofilas e carotenoides, continha diferentes quantidades de massa seca (que variou entre 92 mg, nos calos de nó cotiledonar crescidos em 2,4-D 5 µM, e 136 mg, nos calos de cotilédone crescidos na ausência de auxina), fator que deve ser levado em consideração na avaliação dos resultados.

Observa-se que os calos oriundos de segmento de nó cotiledonar crescidos em 2,5 µM de 2,4-D apresentaram os maiores teores de Chl a (281,06±7,55 µg/g massa seca), de Chl b (168,60±19,76 µg/g massa seca) e, consequentemente, os maiores teores de clorofilas totais (449,67±27,25 µg/g massa seca). Também apresentaram o maior teor de carotenoides totais (37,25±1,82 µg/g massa seca). Para os calos oriundos de segmento de cotilédone verifica-se que a utilização de 2,5 µM de 2,4-D também gerou os maiores teores de Chl a (239,28±8,24 µg/g massa seca ), Chl b (94,80±7,15 µg/g massa seca), clorofilas totais (334,08±15,38 µg/g massa seca) e carotenoides totais (25,76±0,51 µg/g massa seca).

Nos calos de nó cotiledonar os menores teores de clorofilas totais (142,85 – 148,38 µg /g massa seca) e de carotenoides (12,76 - 15,02 µg /g massa seca) foram obtidos com 2,5 µM e 5 µM de ANA. Para os calos de cotilédone, essas concentrações de ANA também reduziram os teores de clorofilas totais para 193,74 – 196,96 µg/g massa seca e a concentração de 5 µM de ANA, inibiu significativamente a produção de carotenoides pelos calos (16,13 µg /g de massa seca). Em 5 µM de 2,4-D foi observado o menor teor de clorofilas totais (137,31±10,27 µg/g massa seca) em calos de cotilédone.

Em ambos os tipos de calos crescidos na ausência de auxinas a produção de clorofilas totais e carotenoides foi significativamente menor do que os valores máximos obtidos com 2,5 µM de 2,4-D. A utilização dessa auxina fez com que a produção de clorofila pelos calos de nó cotiledonar aumentasse 2,3 vezes e a de carotenoides 2,8 vezes, enquanto que nos calos de cotilédone os aumentos foram de 1,9 vezes, para clorofila total e 2,03 vezes para carotenoides. Em termos de porcentagem, e calos de nó cotiledonar o teor de clorofilas totais aumentou de 132,80% e o de carotenoides de 179,86% quando comparados com os calos controle.

Tanto para os resultados expressos em µg/g de massa seca como naqueles expressos por µg/g de massa fresca a análise estatística indicou o efeito significativo de 2,5 µM de 2,4- D, tanto em calos de nó cotiledonar como em calos de cotilédone. Já a análise estatística para carotenoides totais, dos dados em µg/g de massa fresca variaram, de forma que os teores mais altos em calos de nó cotiledonar e cotilédone foram encontrados naqueles tratados com 10 µM e 5 µM de 2,4-D, respectivamente. Esse fato mostra a necessidade do ajuste da quantidade da biomassa seca a ser utilizada na extração, quando se trata de diferentes tratamentos, para tornar mais preciso os resultados e as comparações.

As análises de correlação linear entre as variações nas concentrações de 2,4-D e ANA e os valores de clorofilas totais e carotenoides são mostradas na Tabela 7. Verifica-se que, em 2,4-D, as correlações mais baixas verificadas tanto para os calos de nó cotiledonar (r= - 0,161) como de cotilédone (r= -0,208) foram com os teores de clorofila, que diminuíram com o aumento da concentração de 2,4-D. Entretanto, as correlações foram altas e positivas, em ambos os casos, com o ANA (r= 0,961 e r= 0,957, respectivamente), mostrando a forte associação entre o aumento da concentração desse regulador e o aumento na produção desses pigmentos.

Com relação aos carotenoides, a correlação foi alta e positiva, apenas em calos de nó cotiledonar cultivados em ANA (r= 0,783), em todos os outros tratamentos o aumento da concentração de auxinas inibiu a biossíntese desse pigmento ou apresentou fraca associação com o teor do mesmo (r= -0,033), em calos de cotilédone cultivados em ANA.

Os possíveis efeitos interativos entre os fatores tipos de explante, tipos de auxinas e concentrações de auxinas nos teores de clorofilas totais e carotenoides foram avaliados

através de análises fatoriais 2 x 2 entre os diferentes fatores e os resultados constam do Apêndice C.

Tanto para clorofilas totais como para os carotenoides todas as análises fatoriais realizadas para verificar, para cada tipo de explante, as interações entre tipos e concentrações de auxinas; para cada tipo de auxina, as interações entre tipo de explante e concentrações e para cada concentração, as interações entre tipos de auxinas e tipos de explantes indicaram interações significativas entre todos os fatores analisados (p< 0,001).

Tabela 10 – Efeitos de tipos de explante e de auxinas nos conteúdos de clorofilas e carotenoides, de extratos de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Explante Auxina Conc. Clorofila a Clorofila b Clorofila a+b Carotenoide (µM) (µg/g MS) (µg/g MS) s (µg/g MS) (µg/g MF) (µg/g MS) (µg/g MF) cd cd cd c f e Nc 2,4-D 0 117,73±3,29 75,43±2,98 193,16±6,24 11,98±0,39 13,31±0,28 0,83±0,02 a a a a a d 2,5 281,06±7,55 168,60±19,76 449,67±27,25 21,58±1,31 37,25±1,82 1,79±0,09 b cd c c b b 5 193,22±4,67 77,34±18,92 270,56 ±20,95 12,45±0,96 34,41±1,62 3,17±0,15 a b b a c a 10 253,29±7,26 133,71±2,09 387,00±6,74 20,51±0,36 33,58±1,62 3,56±0,17 cd e d e ef e ANA 2,5 110,64±9,49 32,22±1,03 142,85±10,41 4,04±0,29 15,02±1,33 0,98±0,09 cd de d d f f 5 106,05±7,08 42,33±2,95 148,38 ±10,00 8,75±0,59 12,76±0,87 0,75±0,05 bc c c c e e 10 156,23±17,10 80,74±5,93 236,97±22,94 12,80±1,24 19,44±1,55 1,05±0,08 cd cd d c f e Cot 2,4-D 0 110,03±4,06 67,67±7,93 177,70±8,14 12,08±0,55 12,68±0,41 0,86±0,03 a c b b d de 2,5 239,28±8,24 94,80±7,15 334,08±15,38 17,37±0,80 25,76±0,51 1,34±0,03 d de d de de c 5 98.69±1,57 38,62±8,76 137,31±10,27 7,69±0,58 22,82±0,34 2,56±0,04 bc cd c bc de c 10 177,36±32,27 79,39±10,41 256,75±27,77 14,38±1,56 21,55±3,55 2,41±0,40 bc de d e d de ANA 2,5 150,37±7,60 43,37±2,83 193,74 ±10,22 5,47±0,29 24,15±1,59 1,43±0,09 c de d c ef e 5 144,00±3,19 52,96±1,16 196,96±4,36 12,01±0,27 16,13±0,34 0,98±0,02 bc c c b de de 10 182,32±18,66 86,16± 2,39 268,48±20,98 15,57±1,22 22,29±0,21 1,29±0,01 Médias ± desvio padrão de 3 repetições, para nó cotiledonar e cotilédone, seguidas por letras diferentes, na coluna, diferem significativamente entre si de acordo com o teste de Tukey (p<0,05). MS= massa seca. MF= massa fresca.

A tabela 11 mostra os valores de coeficientes de correlação linear calculados entre os níveis de fenólicos totais, flavonoides, clorofilas, carotenoides e atividade antioxidante, avaliada pelo poder redutor e CE50 nos extratos de calos de P. setacea originados de nó cotiledonar e cotilédone e cultivados em diferentes concentrações de 2,4-D e ANA.

Os resultados indicam que, em ANA, nos tratamentos em que foi possível a determinação dos valores de CE50 , as correlações com fenólicos totais foram moderadas (r= - 0,791 e -0,691, respectivamente para calos de nó cotiledonar e cotilédone. Os valores de r negativos indicam que o aumento em uma variável, no caso nos níveis de fenólicos esteve associado a mudanças negativas, ou seja, à diminuição dos valores da variável CE50 e o consequente aumento da atividade antioxidante.

As correlações entre fenólicos totais e poder redutor também foram de moderadas a altas (variando o r entre 0,744 e 0,997), em ambos os tipos de calos e de auxinas, sendo significativa em calos de nó cotiledonar crescidos em ANA (r= 0,997). Esses resultados mostram que o aumento de poder redutor esteve relacionado com o aumento de fenólicos totais, e que o ANA potencializou a produção de fenólicos com maior poder redutor nos calos de nó cotiledonar. No caso do tratamento com r=0,744, pelo menos 55,35% da variação do poder redutor pode ser explicada pela função linear do aumento nos níveis dos fenólicos e no caso do tratamento com r= 0,997, 99,4% da variação no poder redutor foi explicada em função da variação linear nos níveis dos fenólicos.

A correlação entre flavonoides e CE50 foi baixa, em calos de nó cotiledonar (r= -0,584), porém foi alta e significativa (r= 0,999) em calos de cotilédone. Os resultados mostram que em calos de cotilédone, os maiores valores de CE50 estiveram associados aos maiores teores de flavonoides. O mesmo foi constatado nesses calos com relação à correlação entre flavonoides e poder redutor, em ANA, que foi alta, contudo, negativa (r= -0,826), indicando, também, que o aumento de flavonoides esteve fortemente ligado à diminuição dos valores de poder redutor.

Em calos de nó cotiledonar, o valor de correlação entre flavonoides e CE 50 foi baixo (r= - 0,584), indicando fraca correlação entre essas variáveis, apesar de negativa, da mesma forma que a correlação entre flavonoides e poder redutor (r= 0,521). Portanto, os resultados mostram

que a atividade antioxidante dos calos esteve mais ligada ao aumento nos teores de compostos fenólicos do que de flavonoides.

Em calos de nó cotiledonar, apesar de baixas as correlações entre flavonoides com atividade antioxidante, tanto pelo CE50 como para o poder redutor, foi negativa no primeiro caso e positiva no segundo, indicando haver uma fraca tendência do aumento na atividade antioxidante estar ligada ao aumento nos níveis de flavonoides.

Em ANA as correlações entre clorofilas e CE50 foram baixas em ambos os tipos de calos, enquanto a correlação entre clorofilas e poder redutor foi moderada, mas negativa (r= - 0,763), apenas nos calos de nó cotiledonar, indicando que o aumento do poder redutor esteve ligado à diminuição no teor de clorofilas. Já as correlações entre carotenoides e CE 50 foram baixas apenas para nó cotiledonar, sendo alta e negativa para os calos de cotilédone (r= - 0,876), o que mostra que nesse caso o aumento no teor de carotenoides esteve associado à diminuição dos valores de CE50 e, portanto, ao aumento da atividade antioxidante. A mesma tendência foi verificada nas correlações entre carotenoides e poder redutor, para ambos os tipos de calos, que foram altas e positivas (r= 0,752 e r= 0,828), respectivamente para calos de nó cotiledonar e de cotilédone. Esses resultados indicam que os carotenoides parecem estar atuando nos níveis de atividade antioxidante em ambos os tipos de calos.

Os valores de correlação linear entre os teores de fenólicos e flavonoides foram médios ou baixos em ambos os tipos de calos, tanto em 24-D como em ANA, indicando a fraca associação entre essas variáveis e baixa correspondência entre os aumentos nos teores de fenólicos totais e de flavonoides.

Tabela 11 - Valores de coeficientes de correlação linear simples entre clorofila total, carotenoides, fenólicos totais, flavonoides e atividade antioxidante de extratos de calos de P. setacea, originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, com 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Parâmetros Coeficientes de correlação linear (r) Nc Cot 2,4-D ANA 2,4-D ANA Fenólicos totais x CE50 - -0,791 - -0,691 Flavonoides x CE50 - -0,584 - 0,999** Poder redutor x CE50 - -0,813 - -0,996** Clorofilas x CE50 - -0,581 - 0,239 Carotenoides x CE50 - -0,227 - -0,876 Fenólicos totais x poder redutor 0,744 0,997** 0,834 0,769 Flavonoides x poder redutor -0,010 0,521 -0,578 -0.826 Clorofila x poder redutor - -0,763 - -0.327 Carotenoides x poder redutor - 0,752 - 0,828 Fenólicos x flavonodes 0,529 0,458 -0,376 -0,590 Valores de r computados foram comparados com os valores de r- tabulados em Statistical Procedures for Agricultural Research (Gomez & Gomez, 1984) para 4 amostras (n = 4, n-2 = 2 g.l.). (**) = p<0.01.

6 DISCUSSÃO

6.1 Efeito de tipos de explantes e de auxinas no crescimento de calos de P. setacea

O presente estudo compara, pela primeira vez, em culturas in vitro de passifloras, o efeito de diferentes concentrações de 2,4-D e ANA em cultivos de calos de P. setacea, formados a partir de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, no acúmulo de biomassa, teores de compostos fenólicos totais e de flavonoides, na atividade antioxidante e na produção de clorofila e carotenoides. Os resultados indicaram que os diferentes tipos de auxinas afetaram de forma diferenciada o crescimento dos calos de P. setacea, sendo que em ambos os tipos de calos, os maiores incrementos em biomassa seca ocorreram nos tratamentos onde foram utilizadas as concentrações de 2,5 µM e 10 µM de ANA e as menores biomassas secas foram observadas nos tratamentos onde foram utilizadas as concentrações 5 µM e 10 µM de 2,4-D. O 2,4-D e o ANA são reguladores de crescimento da classe das auxinas e o 2,4-D é a auxina mais utilizada nos trabalhos de indução e manutenção do crescimento de calos de várias espécies vegetais. Conforme George et al. (2008), as auxinas são amplamente utilizadas em culturas de tecidos vegetais in vitro, sendo comumente parte integrante do meio de cultura. As auxinas promovem o crescimento de calos, suspensões celulares, além de regular a morfogênese. A nível celular, as auxinas controlam processos básicos como divisão e alongamento celular. Uma vez que são capazes de iniciar a divisão celular, estão envolvidos na formação de meristemas que dão origem a tecidos desorganizados e células indiferenciadas. Os estudos que permitam a escolha dos melhores tipos e das concentrações ótimas dos reguladores de crescimento constituem etapa imprescindível da otimização da produção in vitro de biomassa e de metabólitos secundários de interesse (LEE et al., 2011). Resultados similares aos obtidos para os calos de P. setacea, foram relatados por Wickremesinhe et al. (1993), em que o regulador de crescimento que maximizou a calogênese de Taxus cuspidata e Taxus x var. densiformis também foi o ANA nas concentrações 2 mg L -1 e 5 mg L -1 (equivalentes a 10 µM e 25 µM), demonstrando ser esta auxina a mais eficiente para incremento neste parâmetro quando comparada com as mesmas concentrações do regulador 2,4-D. Kochhar (1980) também demonstrou que as culturas de

calos de tabaco foram incrementadas pela adição de ANA ao meio de cultura, especialmente nas concentrações 0,2 mg L -1 e 2 mg L -1 (o equivalente a 1 µM e 10 µM). Ji et al. (2014) também relatou que o maior incremento em biomassa de calos de Malus sieversii foi obtido a partir da adição de 1,5 mg L -1 de ANA ao meio de cultura. Mais recentemente, Das et al. (2018) compararam o crescimento de calos oriundos de folhas, nós e internós de Brucea mollis utilizando BAP em combinação com ANA e 2,4- D. Os resultados demonstraram que, para os calos de folhas e internós, a combinação de BAP com as concentrações 1,61 µM e 2,68 µM de ANA foram mais eficientes na indução da calogênese se comparados aos tratamentos em que o 2,4-D foi utilizado. A adição de 10 µM de ANA ao meio de cultura de calos oriundos de cotilédone de Cassia alata demonstraram resultados excelentes na indução e crescimento dos calos (SHAH & GEORGE, 2019). Ao analisarmos o efeito do 2,4-D no crescimento de calos de P. setacea, percebemos que, não somente esta auxina foi responsável pela maior resposta inibitória no crescimento dos calos, mas também que, conforme maior a concentração utilizada, maior foi o efeito inibitório nesse parâmetro. Esse efeito foi também relatado em diversos estudos em que diferentes concentrações de 2,4-D foram testadas sobre o incremento em biomassa e indução de calos em diversas espécies vegetais. Artundunga et al. (1988), testaram as concentrações de 1, 3 e 5 mg L-1 de 2,4-D (equivalentes à 4,52; 13,6 e 22,26 µM respectivamente) em culturas de calos de Bothriochloa ischaemum e Cynodon dactylon. Os resultados desse estudo demonstraram que a concentração que maximizou a calogênese em ambas as espécies foi a de 3 mg L-1 de 2,4- D (o equivalente a 13,6 µM), concentração superior à máxima de 10 µM utilizada nos calos de P. setacea. A concentração que demonstrou o menor resultado foi a de 5 mgL-1, concentração muito acima da utilizada no presente trabalho.

Em culturas de calos de Malus sieversii, o aumento em biomassa ocorreu quando adicionados nas concentrações entre 0,05 a 0,15 mg L-1 de 2,4-D (equivalente a 0,23 µM e 0,68 µM), concentrações muito inferiores às utilizadas para P. setacea e, quando adicionadas concentrações superiores a 0,15 mg L-1 (equivalente a 0,68 µM), ocorreu a inibição do crescimento dos calos (JI et al., 2014). Nesse caso, portanto, a inibição ocorreu em concentrações bem inferiores àquelas que inibiram o crescimento dos calos de P. setacea, no

presente estudo. Segatto et al. (2014) igualmente demonstraram que as concentrações de 2 e 2,5 mg L-1 de 2,4-D (equivalente a 9,05 µM e 11,31 µM) foram mais eficientes na indução de calos de Oryza sativa L. do que a concentração de 3 mg L-1(equivalente a 13,6 µM) dessa mesma auxina. Tais estudos mostram que as concentrações de 2,4-D requeridas para causar a inibição do crescimento dos calos variou dependendo da espécie vegetal. Depois de absorvidos pelas células vegetais o ANA e o 2,4-D são comumente convertidos a conjugados, principalmente ésteres glicosídicos. Esses reguladores não são oxidados no meio de cultura (GEORGE et al., 2008), mas uma vez absorvidos pelo tecido da planta a taxa de conjugação é rápida pois não são apenas expostos a fatores físicos, mas também estão sujeitos à conversão enzimática. Consequentemente, os níveis ativos e livres dessas auxinas não são resultados da sua captação, mas sim do seu metabolismo (BARENDSE et al., 1987). O 2,4-D é pouco transportado pelas proteínas de efluxo de auxina e a sua taxa de degradação nos tecidos vegetais é bastante lenta (HANSON & SLIFE, 1969; DELBARRE et al., 1996), o que poderia causar um acúmulo dessa auxina nas células. E, como visto, o 2,4-D é um agente tóxico utilizado como herbicida, quando utilizado em altas concentrações. De acordo com Raven et al. (2014), o mecanismo responsável pela atividade herbicida dessa auxina ainda não é totalmente conhecido, no entanto, muitos estudos apontam os efeitos do 2,4-D na fotossíntese, no metabolismo de carboidratos, na respiração, na absorção e no metabolismo de íons, na produção de compostos tóxicos, entre outros (NORMAN et al., 1950; FERNANDEZ, 1963; ANDREAE, 1967; MORELAND, 1967; ROBERTSON & KIRKWOOD, 1970; GHINEA & CARAMETE 1970). Portanto, o possível acúmulo do 2,4-D, que pode ter ocorrido nas maiores concentrações utilizadas no meio de cultura dos calos de P. setacea e os seus consequentes efeitos tóxicos, considerando-se os diferentes fatores citados acima, podem explicar a resposta inibitória do crescimento dos calos. Diferentemente do 2,4-D, o ANA não possui atividade tóxica relatada sobre células e tecidos vegetais e é rapidamente absorvido pela planta e transportado – através somente do efluxo de auxinas – para outras partes dos vegetais atuando, sobretudo, nos tecidos meristemáticos, raízes em alongamento e folhas jovens (Raven et al., 2014). As características inerentes às auxinas, como a promoção do crescimento e divisão celular,

juntamente com a rápida absorção e distribuição do ANA pelo tecido vegetal, poderiam explicar os resultados observados no presente trabalho com relação ao crescimento dos calos de P. setacea, uma vez que maiores concentrações dessa auxina aplicada às culturas significaram maior quantidade de ANA atuante sobre as células dos calos de Passiflora. É importante observar ainda que os calos podem ter a sua própria produção endógena de auxinas, que certamente interagirá com as auxinas exógenas absorvidas do meio de cultura, contribuindo para tornar o balanço hormonal propício ou não para desencadear os processos de crescimento celular, por divisão e por alongamento celular. Com relação aos efeitos dos diferentes explantes utilizados, observa-se que, tanto os calos oriundos de segmento de nó cotiledonar quanto de cotilédone apresentaram o mesmo perfil de resposta de inibição do crescimento com o aumento da concentração de 2,4-D e de promoção de crescimento, quando da aplicação do ANA. No entanto, é interessante observar que os calos do grupo controle, ou seja, que não foram tratados com adição de auxinas ao meio de cultura, também demonstraram um significativo crescimento, indicando que apresentam um balanço hormonal endógeno favorável ao crescimento. Essa capacidade foi também observada nos estudos de Hamany et al. (2019), em que os calos de Moringa oleífera cultivados sem a adição de reguladores de crescimento também demonstraram alto crescimento. Esse fenômeno é conhecido como habituação (LELJAK-C & MRVKOVÁ, 2016). A habituação é um fenômeno de várias etapas que ocorre gradualmente e pode levar à desdiferenciação completa e irreversível das células (HAGEGE 1996; GASPAR et al., 2000). Embora as causas da habituação ainda não estejam claras, foi proposto que isso deve-se ao aumento de taxa de biossíntese, diminuição da taxa de degradação e/ou sensibilidade das células a hormônios endógenos presentes nas plantas de onde foram removidos os explantes utilizados para a indução das culturas (KEVERS et al., 1996; LISOWSKA & WYSOKINSKA, 2000, LELJAK-C & MRVKOVÁ, 2016). O processo de habituação, com os calos adquirindo a capacidade de produzir seus próprios hormônios, pode ter ocorrido com as células dos calos de P. setacea, uma vez que nos processos originais de indução dos calos a presença de 2,4-D no meio de cultura foi imprescindível para a indução e manutenção dos calos. Algo que vale a pena ser mencionado é que, de acordo com Lo Schiavo et al., (1989), as auxinas – e especialmente o 2,4-D – fazem com que o DNA celular se torne mais metilado do que o habitual e isso pode ocasionar a reprogramação celular de células com potencial de

diferenciação. Isso significa que mecanismos associados à diferenciação celular seriam erradicados por hipermetilação, gerando a proliferação de células indiferenciadas. Devido à essa ação, juntamente com o potencial efeito tóxico, culturas mantidas com 2,4-D podem se tornar geneticamente variáveis e, por este motivo, pesquisadores têm optado por utilizar o ANA em culturas celulares vegetais (GEORGE et al., 2008). De acordo com Morris et al. (2007), o grau relativo da atividade individual das auxinas em diferentes processos de crescimento é muito variável. Difere não apenas de planta para planta, mas também de órgão para órgão, tecido para tecido, célula para célula e, além disso, também com a idade e o estado fisiológico dos tecidos vegetais. Isso poderia explicar as diferenças observadas, no presente trabalho, no metabolismo dos calos de P. setacea originados de segmentos de cotilédone e de nó cotiledonar. Algumas evidências das diferenças no metabolismo dos calos de P. setacea, utilizados no presente trabalho, podem ser observadas quando da análise das variações no teor de biomassa seca acumulada em relação à biomassa fresca e nos valores dos coeficientes de correlação linear entre as biomassas fresca e seca. Algumas condições de cultura propiciaram o maior acúmulo de biomassa seca por unidade de biomassa fresca e diminuição no acúmulo de água pelos calos, como 2,5 µM de ANA, em calos de nó cotiledonar e a ausência de auxinas, em calos de cotilédone. Nesses casos, é possível que as células possam ter permanecido mais indiferenciadas e, portanto, mais na condição meristemática, não sendo vacuoladas o suficiente para acumularem maiores quantidades de água, como deve ter ocorrido com as células dos calos cultivados nas demais condições. É importante salientar que as células vegetais podem crescer por divisão celular e expansão do volume celular, pela entrada de água, sendo que as auxinas podem atuar nesse último caso, no afrouxamento da parede celular, através da ativação da produção das expansinas (TAIZ & ZEIGER, 2013). Isso pode ter ocorrido em especial nos calos de nó cotiledonar de P. setacea cultivados em 2,5 e 5 µM de 2,4-D, que acumularam os maiores teores de água em relação aos cultivados em ANA. O fato dos maiores valores de coeficientes de correlação linear (acima de 0,933) terem ocorrido em calos de cotilédone de P. setacea é indicativo de que, nas respectivas condições de cultivo o aumento da biomassa fresca esteve fortemente associado ao aumento na

biomassa seca e, portanto, mais ao crescimento por divisão celular do que ao acúmulo de água.

6.2 Efeito de tipos de explantes e de auxinas na produção de compostos fenólicos e na atividade antioxidante de extratos de calos de P. setacea

Nas culturas de calos de P. setacea o maior teor de fenólicos totais e atividade

antioxidante medida pelo ensaio do poder redutor e DPPH (CE 50) foram observados em calos de nó cotiledonar cultivados com 10 µM de ANA ao meio de cultura, enquanto que os maiores teores de flavonoides ocorreram nos calos de cotilédone cultivados com 2,5 µM de 2,4-D. O ANA também demonstrou maior eficiência na otimização dos níveis de fenólicos e

atividade antioxidante pelo poder redutor e CE50 em calos de cotilédone, mas na concentração de 2,5 µM. Com a adição de ANA ao meio de cultura de ambos os calos foram maiores os teores de fenólicos totais e atividade antioxidante, indicando a alta eficiência desse regulador de crescimento na otimização da produção de metabólitos secundários e atividade antioxidante. Resultados similares aos obtidos no presente trabalho foram relatados por Eknamkul & Ellis (1985), em que a adição de ANA (na concentração de 2,7 µM) à cultura celular de A. officinalis incrementou a biossíntese de ácido rosmarínico. Karakas (2019) combinou diferentes reguladores de crescimento ao meio de cultura de calos gerados a partir de diferentes explantes de Lycium barbarum e demonstrou que, dentre todas as combinações, aquelas em que havia a adição de ANA ao meio de cultura (nas concentrações 1,25 µM e 2,5 µM) aumentaram significativamente a biossíntese e o acúmulo de compostos fenólicos como ácido clorogênico, ácido cafeico, ácido gálico e quercetina. O ANA na concentração de 10 µM também se mostrou o mais eficiente na produção e acúmulo de taninos condensados em culturas de calos de Huernia hystrix (AMOO & VAN STADEN, 2012). De acordo com Sakakibara et al. (2006), o papel estimulador do ANA e outros reguladores de crescimento na produção de compostos fenólicos, por espécies vegetais pode estar relacionado à interação deles com determinados transportadores de macronutrientes, levando à expressão ou regulação positiva dos genes envolvidos na via biossintética dos metabólitos secundários. A deficiência ou excesso de nutrientes disponível para a planta é um tipo de estresse abiótico que afeta particularmente a ativação e síntese da PAL, uma

enzima sinalizadora inicial essencial para desencadear a produção de compostos fenólicos em espécies vegetais (KARAKAS et al., 2016; RUIZ, 2003). É interessante notar que os maiores teores de compostos fenólicos totais e atividade antioxidante ocorreram nas concentrações de ANA em que houve o maior incremento em biomassa seca, ou seja, com 10 µM de ANA, nos calos de nó cotiledonar e de 2,5 µM de ANA, nos calos de cotilédone. De acordo com Barz (1977), a taxa natural de formação de alguns compostos fenólicos depende da taxa de crescimento dos tecidos cultivados. Estudos conduzidos com calos oriundos de segmento caulinar de Passiflora tenuifila também constataram que a adição de 2,5 µM de ANA ao meio de cultura mostrou-se mais eficiente na produção de compostos fenólicos totais quando comparado com a mesma concentração de 2,4-D (SOZO et al., 2016). Nas culturas de ambos os tipos de calos de P. setacea o aumento da concentração de 2,4-D diminuiu a produção de fenólicos totais, flavonoides e diminuiu a atividade antioxidante pelo poder redutor (em calos de nó cotiledonar) e pelo DPPH (CE50). Vários são os estudos que mostram o efeito inibitório do 2,4-D na produção de metabólitos secundários. O 2,4-D aplicado em culturas de raízes de Cichorium intybus também se mostrou menos eficiente na promoção e acúmulo de cumarinas, quando comparado com o ANA, ambos aplicados na mesma concentração (2 mg L-1 ) (BAIS et al., 2001). Nos estudos de Ji et al. (2014) o efeito inibitório do 2,4-D na síntese de antocianinas em calos de Malus sieversii foi cerca de dez vezes maior do que o ANA. Hamany et al. (2019) testaram diferentes concentrações de 2,4-D na produção de metabólitos secundários em calos de Moringa oleífera e constataram efeito inibitório semelhante do 2,4-D, pois conforme foram adicionadas concentrações maiores ao meio de cultura, maior foi o efeito inibitório na produção de metabólitos secundários, sendo a concentração mais alta utilizada (9 µM) a que demonstrou os menores teores de fenólicos totais. Estudos prévios conduzidos por Formolo (2019) demonstraram que a concentração de 2,5 µM de 2,4-D aplicada às culturas de calos oriundos de nó cotiledonar e cotilédone de P.setacea, também foi a mais eficiente na otimizacão dos teores de flavonoides, embora o estudo não tenha comparado o 2,4-D com outros reguladores de crescimento. Nos calos de P. setacea quanto maiores foram as concentrações de 2,4-D, maior foi o efeito inibitório na produção de flavonoides e, consequentemente, menores foram as taxas de atividade

antioxidante, exceto para os calos de cotilédone, que também apresentaram ótima produção de flavonoides na presença de 2,5 µM de 2,4-D. O efeito inibitório das concentrações crescentes de 2,4-D na produção de flavonoides observado nos calos de P. setacea pode ser explicado pelo mesmo mecanismo de inibição do crescimento dos calos relatado anteriormente. O acúmulo dessa auxina nas células dos calos de P. setacea pode ter causado ação tóxica, inerente à essa auxina, inibindo a biossíntese de metabólitos secundários. Já a concentração de 2,5 µM nos calos de cotilédone demonstrou efeito contrário, indicando que, de alguma forma, essa concentração de 2,4-D promoveu as vias de biossíntese desses compostos, possivelmente pelo fato da toxicidade ter induzido algum tipo de estresse oxidativo nas células. O ANA, por não apresentar efeito tóxico ao tecido celular, pode ter favorecido a biossíntese de compostos de interesse através dos mecanismos conhecidos e efeitos específicos a partir da resposta fisiológica da planta à aplicação exógena de reguladores de crescimento. Em concordância com Cingöz & Karakas (2016), a deficiência ou excesso de reguladores de crescimento afetam seriamente o crescimento, o desenvolvimento, a produção, a qualidade, a tolerância ao estresse e a produção de metabólitos secundários em espécies vegetais. Ainda, conforme Palacio et al. (2008) e Baskaran et al. (2014), diferentes concentrações e tipos de reguladores de crescimento organizam os estágios do desenvolvimento vegetal e modificam os níveis de produção e acúmulo de metabólitos secundários pelas plantas. Além disso, os tipos e as concentrações ideais dos reguladores de crescimentos tendem a variar entre as espécies, sendo necessário o estudo individualizado para o genótipo de cada espécie ou cultivar, para que seja determinado o tipo de regulador de crescimento e da concentração ideal a ser utilizado (RHODES et al., 1994, PÉREZ- TONERO et al., 2000). A escolha da auxina a ser utilizada e concentração a ser administrada nas culturas deve ser feita a partir da análise dos seguintes fatores: o tipo de crescimento ou desenvolvimento requerido; a taxa de captação e transporte de auxina aplicada ao tecido alvo; a inativação (oxidação e/ou conjugação) da auxina no meio ou dentro do explante; os níveis naturais e a síntese endógena da auxina no explante; a sensibilidade do tecido da planta à auxina e a interação, se houver, entre a auxina aplicada e substâncias endógenas naturais (GEORGE et al., 2008).

No presente estudo foram demonstradas diferenças nos potenciais dos diferentes tipos de calos de P. setacea, na produção dos metabólitos secundários e na atividade antioxidante, o que indica a influência da origem do explante no metabolismo secundário dos calos. Poucos são os estudos conduzidos com esse objetivo. Recentemente Tyunin et al. (2018) estudando a produção de estilbeno em 18 tipos de culturas de células de Vitis amurensis iniciadas a partir de diferentes órgãos da planta, também observaram maior produção nos calos originados de segmentos de caule do que os originados a partir de segmentos de folhas e pecíolos. O fato do ANA ter mostrado maior eficiência na produção de compostos fenólicos e atividade antioxidante nos calos de P. setacea é de extrema importância, pois permite a utilização desse regulador de crescimento ao invés do 2,4-D, que está associado às variações genéticas em culturas de células vegetais (GEORGE et al., 2008), como mencionado acima. Porém, é importante salientar que os dois tipos de reguladores podem estar induzindo diferenças qualitativas no perfil das moléculas do metabolismo secundário que estão sendo produzidas pelos diferentes tipos de calos. As atividades antioxidantes dos extratos de ambos os tipos de calos de P. setacea estiveram mais associadas aos maiores níveis de fenólicos totais, havendo fraca associação com os teores de flavonoides, o que é indicativo de que nos calos de P. setacea, outros grupos de moléculas podem estar contribuindo para a atividade antioxidante, como por exemplo as antraquinonas, cumarinas taninos, lignanas, etc. Um exemplo disso é que os calos de cotilédone, que apresentaram o maior nível de flavonoides não apresentaram a maior atividade antioxidante pelo poder redutor e nem pelo CE50 . Já nos extratos de calos de nó cotiledonar o maior nível de flavonoides correspondeu às maiores atividades antioxidantes pelo CE50 , mas não pelo poder redutor, o que sugere que os diferentes tipos de calos podem estar produzindo moléculas diferentes de flavonoides, com diferente potencial antioxidante.

6.3 Efeitos de tipos de explantes e de auxinas na produção de clorofilas e carotenoides em calos de P. setacea

No presente estudo, o maior potencial de produção de clorofilas e carotenoides foi observado nos calos nó cotiledonar de P. setacea cultivados com 2,5 µM de 2,4-D, concentração que também promoveu a maior biossíntese desses compostos em calos de cotilédone. Poucos são os estudos que avaliam a produção de clorofilas e carotenoides por culturas celulares, apesar, da grande demanda pelos carotenoides, com função antioxidante e precursores da biossíntese do hormônio ácido abscísico (HANNOUFA & HOSSAIN, 2012). O potencial dos calos de P. setacea para a produção de carotenoides, em especial de luteína foi primeiramente demonstrado por Montagner (2018), mas pela primeira vez foram realizados os estudos comparando a eficiência das auxinas na produção de carotenoides pelos mesmos tipos de calos. A luteína, é um tipo de carotenoide requerido pelas indústrias alimentícias e farmacêuticas pela função que desempenha na prevenção de câncer e degeneração da retina (ÁLVAREZ et al., 2015). Estudos posteriores devem ser realizados, portanto, para elucidar os perfis de carotenoides produzidos pelos calos cultivados com 2,4- D e ANA e avaliar a eficiência desses reguladores na produção de luteína. O efeito promotor de auxinas na produção de clorofilas e carotenoides pelos calos está de acordo com os resultados de trabalhos similares desenvolvidos. Su et al. (2015), que analisaram o acúmulo de pigmentos durante o amadurecimento de tomates sob o efeito da aplicação exógena de auxinas, observaram que os tomates cultivados sob aplicação de auxina demonstraram aumento significativo nos teores de clorofilas, enquanto que os carotenoides não demonstraram alteração em relação ao controle. Hildebrandt et al. (1963) quantificaram clorofilas totais em culturas de calos de diferentes espécies de plantas comestíveis e demonstraram que os calos crescidos em meio de cultura com a adição de 2,4-D e ANA apresentaram maior quantidade de clorofilas totais, quando comparados com calos crescidos em meio de cultura onde não foi adicionado nenhuma auxina. Também mostraram que o 2,4-D estimulou a produção de maiores teores de pigmentos do que o ANA. Entretanto, diferentemente dos resultados obtidos em calos de

P. setacea, as menores quantidades de 2,4-D aplicadas às culturas ocasionaram diminuição no teor de pigmentos, que foi aumentando conforme o aumento na concentração da auxina. É interessante notar que, as condições de cultivo dos calos de P. setacea que propiciaram a produção dos maiores teores de pigmentos (2,5 µM de 2,4-D) não foram as mesmas em que ocorreram os maiores incrementos de biomassa seca e os maiores níveis de fenólicos totais e atividade antioxidante (ANA). Apenas em calos de cotilédone, a maior produção de flavonoides coincidiu com a condição de cultivo que produziu os maiores teores de clorofila e carotenoides. Sunderland & Wells (1968) demonstraram que, quanto maior a concentração de auxinas aplicadas ao meio de cultura de calos de Oxalis dispar, menor foi a quantidade verificada de clorofilas totais, enquanto que maiores concentrações de auxinas demonstraram incremento na biomassa seca dos calos. Assim, de acordo com Sunderland (1966), concentrações efetivas de auxinas para indução de crescimento em calos não necessariamente causam proporcional aumento de teores de clorofilas e carotenoides, como foi também observado, no presente estudo, nos calos de P. setacea. Poucos são os trabalhos e estudos conduzidos com objetivo de quantificar e analisar o potencial de fotossíntese de culturas vegetais sob a aplicação de auxinas, de forma que o efeito do do 2,4-D em comparação com o ANA na produção de pigmentos fotossintetizantes e nos níveis de fotossíntese realizada pelas células vegetais, tanto no in vivo como in vitro ainda é pouco conhecido. O que existe de concreto até o momento é que a aplicação exógena de altas concentrações de auxinas em cultivares vegetais afeta diretamente a fotossíntese, uma vez que auxinas inibem o desenvolvimento das membranas dos tilacoides e, portanto, o desenvolvimento dos pigmentos fotossintéticos associados a elas (SUNDERLAND & WELLS, 1968). Ademais, de acordo com Hanson & Slife (1969), auxinas também parecem inibir enzimas, sistemas enzimáticos e a captação de íons pelas células. Apesar de no presente trabalho terem sido detectados pigmentos fotossintetizantes em ambos os calos de P. setacea, estudos posteriores devem ser conduzidos para confirmar se estariam atuando, através da fotossíntese, para a produção dos metabólitos secundários com atividade antioxidante. Algo que vale a pena ser mencionado é que existem três fases de desenvolvimento dos pigmentos à medida que a célula cresce: uma fase lenta, seguida por uma fase relativamente curta na qual as quantidades de pigmentos aumentam rapidamente e, finalmente, uma fase relativamente longa em que os pigmentos aumentam, mas em taxa

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decrescente. Além disso, sabe-se que a taxa de degradação do 2,4-D nos tecidos vegetais é extremamente lenta (HANSON & SLIFE, 1969), gerando acúmulo dessa auxina nas células. Essa combinação de fatores pode explicar os resultados obtidos em calos de P. setacea pois, se a fase intermediária – que corresponde ao aumento rápido de pigmentos na célula – ocorrer ao mesmo tempo em que ocorre o acúmulo e excesso de 2,4-D, os efeitos tóxicos dessa auxina poderão agir diretamente sobre o desenvolvimento majoritário do aparato fotossintético, através dos mecanismos mencionados anteriormente, fazendo com que aplicações mais concentradas de 2,4-D produzam menores teores de pigmentos. Além da constatação de que foi possível a otimização da produção de clorofilas e carotenoides pelos calos, como abordagem alternativa para viabilizar a produção desses pigmentos por processos biotecnológicos, foi importante observar, pelos coeficientes de correlação linear, a forte associação entre os carotenoides e a atividade antioxidante dos extratos de calos, avaliada tanto pelo poder redutor (nos calos de nó cotiledonar e cotilédone, em ANA), como pelo DPPH (calos de cotilédone, em ANA), o que não foi observado para as clorofilas, que mostraram correlação negativa com o poder redutor. O fato das correlações entre atividade antioxidante pelo poder redutor e os carotenoides terem sido maiores do que com os flavonoides, em ambos os tipos de calos e em todos os tipos de auxinas, indica a participação dessas moléculas no mecanismo antioxidante dos extratos de calos de P. setacea.

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7 CONCLUSÃO

Tomando por base os resultados obtidos durante o presente estudo, infere-se que:

➢ Os tipos de calos e as auxinas 2,4-D e ANA em diferentes concentrações interagiram para influenciar os incrementos em biomassa, a produção de compostos fenólicos, flavonoides, atividade antioxidante, clorofilas e carotenoides totais.

➢ Os máximos incrementos em biomassa seca foram similares em ambos os tipos de calos e promovidos pelo ANA, e também pelo 2,4-D, em calos de cotilédone.

➢ Os maiores teores de compostos fenólicos totais, atividade antioxidante (medida tanto pelo poder redutor quanto pela captura do DPPH) ocorreram nos calos oriundos de nó cotiledonar cultivados com 10 µM de ANA.

➢ A concentração de 2,5 µM de 2,4-D, aplicada em calos de cotilédone, foi a mais eficiente em otimizar a biossíntese de flavonoides e a maior produção de clorofilas e carotenoides, em calos de nó cotiledonar.

➢ Em ambos os tipos de calos o ANA induziu os maiores teores de fenólicos totais, poder redutor e a captura do DPPH e o 2,4-D os maiores níveis de clorofilas e carotenoides.

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8 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPERCTIVAS FUTURAS

O presente estudo relata, pela primeira vez, a comparação da influência de diferentes tipos e concentrações de auxinas no crescimento, produção de compostos fenólicos, flavonoides, atividade antioxidante e e de clorofilas e carotenoides em dois tipos de calos de P. setacea, originados de diferentes tipos de explantes, segmento de nó cotiledonar e cotilédone. Os resultados são relevantes, pois permitiram otimizar, em laboratório, a produção de metabólitos secundários de interesse a partir de culturas de calos de P. setacea. Os resultados demonstraram que, quando ajustados, os tipos de explantes e os tipos e concentrações de auxinas foi possível estimular a produção de biomassa seca e dos metabólitos secundários de interesse, além de aumentar o potencial antioxidante dos extratos de calos de P. setacea. A auxina ANA, quando ajustada na concentração ideal, pelo menos do ponto de vista quantitativo, funcionou como um promissor substituto do 2,4-D, em culturas celulares de P. setacea e talvez de outras espécies de passifloras. Estudos posteriores devem ser conduzidos com relação à análise qualitativa dos perfis de compostos fenólicos dos extratos de calos, produzidos com ambos os tipos de reguladores. Além disso, o presente estudo corrobora para o enriquecimento dos conhecimentos acerca de como os reguladores de crescimento podem afetar a dinâmica dos processos fisiológicos que ocorrem em culturas celulares de passifloras. A partir dos resultados promissores obtidos no presente trabalho será possível aprofundar as investigações acerca das interações, em especial, envolvendo as auxinas utilizadas e outras classes de reguladores de crescimento, na produção de metabólitos secundários e nas atividades biológicas desses compostos.

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APÊNDICE A- Resumo dos resultados da ANOVA com fator duplo para analisar os efeitos interativos dos fatores regulador e concentração, para cada tipo de explante; explante e concentração, para cada tipo de regulador e explante e regulador, para cada concentração de regulador no teor de biomassa seca em relação à biomassa fresca e na biomassa seca de calos de P. setacea originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0-10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Variáveis Fonte de variação g.l. Teor de biomassa seca Biomassa seca F p F p NC Regulador (R) 1 89,32436*** 4,01E-19 137,4872*** 3,4E-27 Concentração (C) 3 19,20245*** 1,37E-11 10,6477*** 9,96E-07 R*C 3 26,06471*** 2,61E-15 19,02505*** 1,72E-11 Resíduo 368 Total 375 COT Regulador (R) 1 7,565521** 0,006225 39,5483*** 8,55E-10 Concentração 3 56,63764*** 1,96E-30 24,36432*** 1,78E-14 R*C 3 2,159972 0,092257 30,88878*** 6,05E-18 Resíduo 392 Total 399 24D Explante (E) 1 73,66683*** 2,45E-37 53,76943*** 7,66E-29 Concentração (C) 3 58,1239*** 2,12E-13 84,82782*** 2,52E-18 E*C 3 3,765779* 0,01098 25,50052*** 5,21E-15 Resíduo 368 Total 375 ANA Explante (E) 1 13,5787*** 2,02E-08 20,48665*** 2,68E-12 Concentração (C) 3 2,520382 0,113242 9,726132** 0,00196 E*C 3 18,81637*** 2,24E-11 2,410545 0,066637 Resíduo 16 Total 23 2,5 µM Explante (E) 1 73,97986*** 3,4E-15 23,26014*** 2,96E-06 Regulador (R) 1 8,303877** 0,004427 76,88647*** 1,2E-15 E*R 1 48,86112*** 4,9E-11 12,57491*** 0,000496 Resíduo 184 Total 187 5 µM Explante (E) 1 95,41441*** 2,02E-18 23,79716*** 2,31E-06 Regulador (R) 1 34,01787*** 2,41E-08 16,70936*** 6,5E-05 E*R 1 7,362089** 0,007294 17,95902*** 3,57E-05 Resíduo 184 Total 187 10 µM Explante (E) 1 4,264075* 0,040329 200,4598*** 2,92E-31 Regulador (R) 1 10,55508** 0,001377 4,285413* 0,039837 E*R 1 0,673496 0,412897 3,019384 0,083948 Resíduo 184 Total 187

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APÊNDICE B- Resumo dos resultados da ANOVA com fator duplo para analisar os efeitos interativos dos fatores regulador e concentração, para cada tipo de explante; explante e concentração, para cada tipo de regulador e explante e regulador, para cada concentração de regulador nos níveis de fenólicos totais, flavonoides, poder redutor e EC50 em de extratos de calos de P. setacea originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Variáveis fixas Fonte de variação g.l. Fenólicos Flavonoides Poder redutor EC50 F p F p F p F p NC Regulador (R) 1 441,5120884*** 4,46372E-13 1,534881522 0,233248967 128,160579*** 9,23E-08 Concentração (C) 3 121,5556271*** 3,19064E-11 29,68782922*** 8,98033E-07 12,5571511** 0,001142 R*C 3 241,6992108*** 1,56062E-13 4,780538517* 0,014532968 29,6967803*** 2,25E-05 Resíduo 16 Total 23 COT Regulador (R) 1 62,43028*** 6,51E-07 6,945236193* 0,017997642 17,78*** 0,000655 Concentração 3 27,97248*** 1,34E-06 7,619250388** 0,002195387 10,73671*** 0,000412 R*C 3 15,92107*** 4,62E-05 21,11890268*** 8,25886E-06 32,66062*** 4,71E-07 Resíduo 16 Total 23 24D Explante (E) 1 2,194248 0,157951 15,71813** 0,001112 9,940991** 0,006157 39,57253*** 0,000235 Concentração (C) 3 113,4271*** 5,41E-11 135,1937*** 1,41E-11 17,47624*** 2,65E-05 449,3035*** 2,58E-08 E*C 3 51,39427*** 1,95E-08 50,96349*** 2,07E-08 10,75379*** 0,000409 31,77595*** 0,000489 Resíduo 16 Total 23 ANA Explante (E) 1 76,25922*** 1,75E-07 2,362123 0,143852 15,33044** 0,001233 178,159*** 1,46482E-08 Concentração (C) 3 55,30961*** 1,15E-08 6,73029** 0,003794 23,08241*** 4,69E-06 103,5621*** 2,6974E-08 E*C 3 127,6986*** 2,19E-11 2,379825 0,107905 40,96635*** 9,81E-08 183,0033*** 1,02351E-09 Resíduo 16 Total 23 2,5 µM Explante (E) 1 3,365210277 0,103926 0,584388732 0,466544943 14,80478** 0,004893 76,72757069*** 2,26E-05 Regulador (R) 1 21,97145567*** 0,001567 37,6231141*** 0,000278917 65,0196*** 4,13E-05 617,327463*** 7,36E-09 E*R 1 42,51140886*** 0,000184 16,25476451** 0,003779005 25,06548** 0,001044 95,01315585*** 1,03E-05 Resíduo 8 Total 11 5 µM Explante (E) 1 8,010755* 0,022139 89,09158*** 1,3E-05 0,799471 0,397353 148,9292*** 1,89E-06 Regulador (R) 1 105,7845*** 6,88E-06 45,44651*** 0,000146 1,12836 0,319137 1165,051*** 5,93E-10 E*R 1 43,4161*** 0,000171 9,527796* 0,014964 44,13807*** 0,000162 16,9655** 0,003349 Resíduo 8 Total 11 10 µM Explante (E) 1 419,3743*** 3,38E-08 0,29421505 0,60231 44,38489*** 0,000159 Regulador (R) 1 590,8014*** 8,76E-09 1,46068155 0,261329 158,4445*** 1,49E-06 E*R 1 320,6801*** 9,69E-08 2,55384156 0,148694 36,64529*** 0,000305 Resíduo 8 Total 11

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APÊNDICE C- Resumo dos resultados da ANOVA com fator duplo para analisar os efeitos interativos dos fatores regulador e concentração, para cada tipo de explante; explante e concentração, para cada tipo de regulador e explante e regulador, para cada concentração de regulador nos níveis de clorofila total e carotenoides de extratos de calos de P. setacea originados de segmentos de nó cotiledonar e de cotilédone, cultivados por 30 dias, em meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 88,5 mM de sacarose, 0 – 10 µM de 2,4-D ou ANA e 0,2% de Phytagel.

Variáveis fixas Fonte de variação g.l. Clorofila total Carotenoides F p F p NC Regulador (R) 1 328,7665097*** 4,31528E-12 492,8797913*** 1,90236E-13 Concentração (C) 3 56,62221594*** 9,67398E-09 89,7569849*** 3,18669E-10 R*C 3 62,44068127*** 4,73458E-09 62,74023013*** 4,57121E-09 Resíduo 16 Total 23 COT Regulador (R) 1 5,257081417* 0,035745431 7,146880005* 0,01665534 Concentração 3 48,97518089*** 2,75901E-08 54,60661102*** 1,25866E-08 R*C 3 32,71458247*** 4,65565E-07 5,606878625** 0,008009752 Resíduo 16 Total 23 24D Explante (E) 1 127,310549*** 4,9952E-09 117,1648323*** 9,02603E-09 Concentração (C) 3 126,1789458*** 2,39791E-11 100,8387086*** 1,32293E-10 E*C 3 10,25340848*** 0,00052315 11,28604985*** 0,000317387 Resíduo 16 Total 23 ANA Explante (E) 1 19,00771717*** 0,000486221 55,25780656*** 1,41862E-06 Concentração (C) 3 35,22207858*** 2,80635E-07 60,02050523*** 6,32429E-09 E*C 3 5,404751746** 0,009230741 16,66278409*** 3,5319E-05 Resíduo 16 Total 23 2,5 µM Explante (E) 1 7,024865519* 0,029235552 1,40663215* 0,269643871 Regulador (R) 1 335,4959036*** 8,12116E-08 144,3866239*** 2,12207E-06 E*R 1 46,50187554*** 0,000135149 108,0806437*** 6,34624E-06 Resíduo 8 Total 11 5 µM Explante (E) 1 21,61300291** 0,001646865 37,21608307*** 0,000289312 Regulador (R) 1 11,78972199** 0,008907219 442,0481921*** 2,74975E-08 E * R 1 99,68011048*** 8,5903E-06 123,1734977*** 3,87894E-06 Resíduo 8 Total 11 10 µM Explante (E) 1 10,93436083* 0,010750711 9,541223681* 0,014914677 Regulador (R) 1 21,44841636** 0,001685317 20,33370823** 0,001977663 E*R 1 29,33831122*** 0,000633445 25,07338967** 0,001043229 Resíduo 8 Total 11