Esquizofrenia, Alucinaciones Auditivas Y Lenguaje
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DEPARTAMENT DE GENÈTICA GEN FOXP2: ESQUIZOFRENIA, ALUCINACIONES AUDITIVAS Y LENGUAJE. Mª AMPARO TOLOSA MONTERO UNIVERSITAT DE VALÈNCIA Servei de Publicacions 2009 Aquesta Tesi Doctoral va ser presentada a València el dia 7 de juliol de 2009 davant un tribunal format per: - Dra. Roser González Duarte - Dr. Jordi Obiols Llandrich - Dr. Javier Costas Costas - Dr. Antonio Benítez Burraco - Dra. Mª Dolores Moltó Ruiz Va ser dirigida per: Dra. Rosa de Frutos Illán Dr. Julio Sanjuán Arias ©Copyright: Servei de Publicacions Mª Amparo Tolosa Montero Dipòsit legal: V-4185-2010 I.S.B.N.: 978-84-370-7708-6 Edita: Universitat de València Servei de Publicacions C/ Arts Gràfiques, 13 baix 46010 València Spain Telèfon:(0034)963864115 Facultad de Ciencias Biológicas Departamento de Genética Gen FOXP2 : esquizofrenia, alucinaciones auditivas y lenguaje Tesis Doctoral Mª Amparo Tolosa Montero 2009 La Dra Rosa de Frutos Illán, Catedrática de Genética del Departamento de Genética, Facultad de Biología, Universidad de Valencia y el Dr. Julio Sanjuán Arias, Profesor Titular del Departamento de Medicina y Psiquiatría, Facultad de Medicina, Universidad de Valencia CERTIFICAN: Que la memoria titulada “Gen FOXP2 : esquizofrenia, alucinaciones auditivas y lenguaje” ha sido realizada bajo su codirección en el Departamento de Genética, Facultad de Biología por la Licenciada Mª Amparo Tolosa Montero. Y para que así conste, en cumplimiento de la legislación vigente, firman el presente certificado en Valencia, a 27 de Abril del 2009. Dra. Rosa de Frutos Illán Dr. Julio Sanjuán Arias Para todos los que vieron el largo camino y encontraron fuerzas para acabarlo, y especialmente para mi padre, mi madre y mi hermana. El desarrollo de esta tesis ha constituido una importante parte de mi vida. Han sido años de alegrías y tristezas científicas, trabajo, y sobre todo, de aprendizaje constante. Durante este tiempo, muchas personas se han cruzado en mi camino o han recorrido parte conmigo y a muchas de ellas tengo que agradecer el poder llevar a cabo esta tesis. En primer lugar, quiero hacer una mención especial a todas las personas que voluntaria y desinteresadamente han participado en los diferentes estudios. Todo el trabajo realizado no hubiera sido posible sin ellos. Me gustaría agradecer a mis directores de tesis, Rosa de Frutos y Julio Sanjuán la oportunidad y confianza depositadas en mí, así como el hecho de iniciarme en el terreno de la investigación. Son algunos ya los años desde que empecé y aunque siempre jefes y directores, hace tiempo que descubrí que además de grandes profesionales son grandes personas. También quiero agradecer al resto de profesores de la línea, Loli, MªJosé, Carmen, Lluís, su contribución, bajo la forma de consejos o sugerencias, a este trabajo. Así como a todo el personal del Departament de Medicina de la Universitat de València, por su participación en la parte clínica del estudio. El trabajo diario en el laboratorio nunca hubiera sido posible sin la inestimable presencia y ayuda, a veces de la forma menos seria posible, de los Moleculares. Ellos han hecho de éste mi segundo hogar. Tres personas marcaron el inicio de mi trayectoria en el laboratorio: Isabel, mi gran maestra, Josep que siempre ha estado ahí para cualquier cosa y no dudo que seguirá estando y Juan Antonio, que me mandó la primera digestión, a la cual se me olvidó añadir DNA…A Olga, Ivette y José Luís que han sido sufridores de línea conmigo tengo que agradecerles la infinita paciencia, los comentarios y los consejos. Olga, empezamos al mismo tiempo y parece que acabaremos también casi a la vez. Muchas gracias por ser el magnífico apoyo que siempre has sido. José Luís, la estadística no sería lo mismo sin ti. A Sirena, gracias por su ayuda en trabajo y por los momentos de esparcimiento. A Laura, por las tertulias. A Javi, por sus monólogos. Y a todos los colaboradores que han intervenido en algún paso de la investigación (Ana, Ángels, Jero, Noe…). A todos los moleculares, presentes y pasados, agradezco la ayuda, la amistad y los karaokes improvisados. Ha sido un placer trabajar con ellos. No puedo olvidarme del resto de personas con las que día a día he convivido en el departamento: los GMDses, los bioquímicos…A todos ellos muchas gracias por los consejos y por las sobremesas. Agradezco también la ayuda de todo el personal PAS del departamento, Carmen, José Carlos, Fede, Javi, Nuria y Begoña por su ayuda en mis dudas de protocolos y paciencia en tareas administrativas. Quiero agradecer también la ayuda prestada por otros laboratorios bien de la Universitat de Valencia, o bien del Hospital la Fe de Valencia por permitirme utilizar determinados aparatos o ayudarme con experimentos. Sin duda una de las experiencias que más ha enriquecido la etapa de realización de mi tesis fue la estancia que realicé en el Prince of Wales International Centre de Oxford, bajo la dirección de Tim Crow. A este ilustre psiquiatra tengo que agradecer el gran ejemplo de profesionalidad, trabajo y amabilidad que mostró en todo momento. Agradezco también al resto de investigadores y colaboradores que me ayudaron a sentirme como en casa: Norman, Steven, James, Enrica, Manaan, Pillerin, Rosana y especialmente, a Tom, por su continua asistencia, Pablo por sus ánimos y a Adam, por, cómo él dice, enseñarme tantas cosas de la ciencia y la vida. Un grupo muy especial al que tengo que agradecer gran parte de las fuerzas para seguir adelante es el de las Superbiologistas : Almu, Ana, Encarna, Fran, Marián, MJ, Montse, Olga, Rosario. Gracias a las comidas de los martes y jueves, las excursiones, cenas, meriendas, comidas y situaciones de crisis en las que he podido contar con ellos para animarme o animarlos. Es un gusto saber que están y comprenden, sin importar la distancia. También tengo que agradecer especialmente a Anna y Beatriz, por tener la paciencia suficiente como para escucharme en los malos días y aguantarme los días buenos. Beatriz, siento mucho hablar tanto de la tesis, ya va a pasar… y Anna, gracias por todo. Y por último, agradecer a los luchadores de todos los días. Los que siempre han estado conmigo, me han ofrecido su asistencia, me han empujado cuando lo necesitaba, y me han dado su apoyo incondicional y absoluto, aunque no supieran muchas veces de lo que estaba hablando. A mi padre, mi madre y mi hermana les agradezco y dedico esta tesis. Índice Índice INTRODUCCIÓN 1 I. Esquizofrenia 1 I.1 Bases genéticas de la esquizofrenia 4 I.1.1 Estudios de ligamiento 6 I.1.2 Estudios de asociación caso-control 7 I.1.3 Epigenética y esquizofrenia 10 II. Alucinaciones auditivas como fenotipo alternativo 12 de la esquizofrenia II.1 Endofenotipos y fenotipos alternativos en el estudio 12 de la esquizofrenia II.2 Alucinaciones auditivas 13 II.2.1 Estudios de neuroimagen en alucinaciones auditivas 15 II.2.2 Estudios genéticos sobre las alucinaciones auditivas 15 II.2.3 Modelos de alucinaciones auditivas 16 III. Lenguaje 18 IV. El gen FOXP2 22 IV.1 Descubrimiento 22 IV.2 Estructura del gen FOXP2 24 IV.3 Variabilidad en el gen FOXP2 29 IV.4 Genes diana de FOXP2 30 IV.5 Expresión del gen FOXP2 31 IV.5.1 Expresión en mamíferos 31 IV.5.2 Expresión en no mamíferos 33 IV.5.3 Animales knockout 34 IV.6 Estudios de neuroimagen de la familia KE 34 IV.7 Función de la proteína FOXP2 35 V. Selección positiva en el genoma humano 36 V.1 Detección de la selección positiva 36 V.2 Selección positiva en regiones codificantes 37 V.3 Evolución en regiones no codificantes 38 V.4 Estudios comparativos de expresión 38 V.5 Selección positiva y esquizofrenia 39 V.6 Evolución del gen FOXP2 como ejemplo de selección 40 positiva en el linaje humano V.7 RNA no codificante: HAR1A 43 V.7.1 Expresión de HAR1A y HAR1R 44 V.7.2 Función del gen HAR1A 44 I Índice HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 45 MATERIAL Y MÉTODOS 47 I. Material biológico 47 I.1 Material biológico humano 47 I.1.1 Muestras utilizadas en el estudio de asociación 47 I.1.1.1 Pacientes 47 I.1.1.1.1 Diagnóstico 47 I.1.1.1.2 Características demográficas 48 I.1.1.1.3 Variables clínicas analizadas 48 I.1.1.1.4 Escalas clínicas Manchester y PSYRATs 49 I.1.1.2 Controles 50 I.1.2 Muestra con Trastorno Específico del Lenguaje (TEL) 51 I.1.3 Muestras de tejido postmortem humano 51 I.2 Muestras de Primates 51 I.3 Cepas bacterianas 52 I.4 Células eucarióticas 52 II. Métodos moleculares 53 II.1 Técnicas básicas comunes 53 II.1.1 Extracción de ácidos nucleicos 53 II.1.2 Cuantificación de ácidos nucleicos 53 II.1.3 PCR 54 II.1.3.1 PCR de colonia 56 II.1.4 Electroforesis 57 II.1.4.1 Electroforesis en gel de agarosa 57 II.1.4.2 Electroforesis en gel de acrilamida 57 II.1.5 Purificación de ácidos nucleicos 58 II.1.5.1 Productos de PCR 58 II.1.5.2 Productos de la digestión con enzimas de restricción 58 II.1.5.3 Purificación a partir de geles de agarosa 59 II.1.6 Secuenciación 59 II.1.7 Clonación 60 II.1.7.1 Ligación 61 II.1.7.2 Transformación 62 II.2 Genotipación 64 II.2.1 Selección de SNPs 64 II.2.2 Métodos de genotipación utilizados 64 II Índice II.2.3 Genotipación por RFLPs 66 II.2.3.1 Diseño de cebadores 66 II.2.3.2 Establecimiento de las condiciones de amplificación para cada 67 polimorfismo II.2.3.3 Digestión de los productos de PCR 68 II.3 Búsqueda de mutaciones descritas en región 70 codificante II.4 Búsqueda de variación en el número de repeticiones 71 de trinucleótidos mediante electroforesis capilar II.5 Análisis de la secuencia de la región promotora del gen 72 FOXP2 en niños con TEL II.6 Análisis de la región promotora del gen FOXP2 en 74 primates II.7 Análisis funcional de la región