Gpr30, Un Receptor De Estrógeno No Canónico

GPR30, UN RECEPTOR DE ESTRÓGENO NO CANÓNICO, INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK ERK1/2 y p38, Y LA MOVILIZACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR, AUMENTANDO LA PROLIFERACIÓN Y MIGRACIÓN, EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA ERα POSITIVAS

TESIS DOCTORAL

LUIS ALBERTO MOLINA CALISTRO

VALDIVIA – CHILE

2018

Tesis presentada a la Facultad de Ciencias de la Universidad Austral de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias Veterinarias

por

LUIS ALBERTO MOLINA CALISTRO

VALDIVIA – CHILE

2018

DECLARACIÓN DE AUTORÍA

Yo, LUIS ALBERTO MOLINA CALISTRO, declaro que soy el autor del presente trabajo, que lo he realizado en su totalidad y no lo he publicado para obtener otros grados o títulos.

Valdivia, octubre de 2018.

AGRADECIMIENTOS

A CONICYT (beca 21130902) y a la Escuela de Graduados, Facultad de Ciencias Veterinarias.

ÍNDICE DE CONTENIDOS

ÍNDICE DE CONTENIDOS ...... I ÍNDICE DE FIGURAS…………...... V ÍNDICE DE TABLAS…………...... VIII ÍNDICE DE ABREVIACIONES………………...... IX RESUMEN ...... XI ABSTRACT...... XII INTRODUCCIÓN…...... 1 1.1. EL CÁNCER DE MAMA EN LA ANTIGÜEDAD ...... 1 1.2. LA CÉLULA CANCEROSA ...... 2 1.3. ALGUNOS ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DEL CÁNCER DE MAMA ...... 4 1.4. LOS ESTRÓGENOS Y SU ROL FISIOPATOLÓGICO...... 5 1.5. RECEPTORES DE ESTRÓGENO CLÁSICOS...... 6 1.6. GPR30/GPER-1: UN NUEVO RECEPTOR DE ESTRÓGENO...... 8 1.7. SEÑALIZACIÓN DE GPR30 Y CÁNCER DE MAMA...... 10 1.8. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS...... 14 2. MATERIALES Y MÉTODOS...... 16

2.1 MATERIALES...... 16 2.1.1 Infraestructura...... 16 2.1.2 Equipos...... 16 2.2 MÉTODOS...... 17

2.2.1. Cultivo de líneas celulares de cáncer de mama ...... 17

2.2.2. Inmunovisualización de GPR30 en células MCF-7 ...... 18

2.2.3. Extracción y cuantificación de proteínas ...... 18 2.2.3.1. Determinación de los niveles proteicos de GPR30 en células de cáncer de mama ...... 19 2.2.3.2. Efecto del tratamiento crónico de las células MCF-7 con tamoxifeno...... 20 2.2.3.3. Silenciamiento de GPR30 ...... 21 2.2.3.4. Efecto de 17-estradiol y G1 sobre la fosforilación de MAPK ERK1/2 y p38 ...... 21 2.2.4. Separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) ...... 22 2.2.5. Electrotransferencia de proteínas a membranas de Inmobilon P...... 23

2.2.6. Inmunotinción de electrotransferidos e identificación de GPR30 y de las MAPK ERK1/2 y p- 38 fosforiladas ...... 24

2.2.7. Viabilidad celular ...... 26

2.2.7.1. Tratamiento agudo de las células MCF-7 y MDA-MB-231 con diferentes concentraciones de tamoxifeno…...... 26 2.2.7.1.1. Reducción de MTT ...... 26 2.2.7.1.2. Incorporación de azul tripano ...... 27 2.2.7.2. Proliferación celular: Generalidades de la técnica ...... 28 2.2.7.3. Controles y cuantificación de los resultados ...... 29 2.2.7.3.1. Efecto de G1 y 17-estradiol sobre las células MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB- 231...... 29 2.2.7.3.2. Efecto del pretratamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles con diferentes concentraciones de tamoxifeno o 4-OH- tamoxifeno...... 31

2.2.7.3.3. Efecto del pretratamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles con inhibidores de EGFR y de las vías ERK1/2 y p38 ...... 32 2.2.8. Medición de la actividad de MMP-9 y MMP-2 mediante zimografía...... 32 2.2.9. Mediciones de calcio intracelular ...... 33 2.2.10. Ensayo del “cierre de la herida en monocapa” ...... 35 2.2.11. Análisis de datos y gráficos ...... 36

3. RESULTADOS ...... 37

3.1. EXPRESIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DE GPR30 EN LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER DE MAMA ...... 37

3.2. 17β-ESTRADIOL Y EL AGONISTA FARMACOLÓGICO DE GPR30 (G1) INDUCEN LA LIBERACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES ...... 40

3.3. GPR30 CONTRIBUYE A LA MOVILIZACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR INDUCIDA POR 17- ESTRADIOL ...... 45

3.4. LOS INHIBIDORES SELECTIVOS DE ESTRÓGENO (TAMOXIFENO Y 4-HIDROXITAMOXIFENO) NO REDUCEN LA LIBERACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR DEPENDIENTE DE GPR30 EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES………...... 48

3.5. GPR30 INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK ERK1/2 Y p38 EN LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES ...... 54

3.6. LA ESTIMULACIÓN DE GPR30 INCREMENTA LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES ...... 57

III

3.7. TAMOXIFENO Y 4-HIDROXITAMOXIFENO NO REDUCEN LA PROLIFERACIÓN CELULAR DEPENDIENTE DE GPR30 EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES ...... 60

3.8. GPR30 INDUCE LA MIGRACIÓN CELULAR Y LA LIBERACIÓN DE MMP-9 Y MMP-2 EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES, ESTIMULADAS CON 17β-ESTRADIOL ...... 64

3.9. LA INHIBICIÓN DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE EGFR, ERK1/2 Y p38 REDUCEN LA PROLIFERACIÓN Y LA MIGRACIÓN CELULARES EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES ...... 68

4. DISCUSIÓN ...... 71

4.1. GPR30: UN RECEPTOR DE ESTRÓGENO NO CONVENCIONAL...... 71 4.2. GPR30 GATILLA UNA RESPUESTA RÁPIDA DE MAPK ...... 75 4.3. GPR30 INDUCE LA MOVILIZACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR...... 79 4.4. GPR30 PROMUEVE LA PROLIFERACIÓN Y LA MIGRACIÓN CELULAR ...... 83 4.5. ¿ESTÁ GPR30 RELACIONADO CON LOS FENÓMENOS DE RESISTENCIA FARMACOLÓGICA, EN EL CÁNCER DE MAMA SENSIBLE A ESTRÓGENO? ...... 85 5. CONCLUSIONES ...... 88 6. BIBLIOGRAFÍA ...... 89

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Niveles proteicos de GPR30 en líneas celulares de cáncer de mama...... 38 Figura 2. Inmunovisualización de GPR30 en células MCF-7...... 39 Figura 3. Efecto de adenosín trifosfato (ATP) sobre la movilización de calcio intracelular en tres líneas celulares de cáncer de mama...... 41 Figura 4. Efecto de diferentes concentraciones de G1 (agonista de GPR30) sobre la liberación de calcio intracelular en dos líneas celulares de cáncer de mama estrógeno sensibles...... 43 Figura 5. Efecto de diferentes concentraciones de 17β-estradiol (E2) sobre la liberación de calcio intracelular en tres líneas celulares de cáncer de mama...... 44 Figura 6. Efecto de G1 sobre la liberación de calcio intracelular en las células de cáncer de mama estrógeno sensibles, pretratadas o no con G15, un antagonista específico de GPR30...... 46 Figura 7. Efecto de 17β-estradiol (E2) sobre la liberación de calcio intracelular en células de cáncer de mama estrógeno sensibles, pretratadas o no con el antagonista de GPR30 (G15) ...... 47 Figura 8. Efecto del tratamiento de las células MCF-7 (estrógeno sensible) y MDA-MB-231 (estrógeno insensible) con diferentes concentraciones de tamoxifeno (TX)...... 49 Figura 9. Tamoxifeno o 4-OHtamoxifeno a una concentración similar a la existente en el plasma de pacientes bajo tratamiento farmacológico, no reducen la liberación de calcio intracelular gatillada por 17β-estradiol, en células de cáncer de mama estrógeno sensibles...... 50 Figura 10. Tamoxifeno y 4-OHtamoxifeno a concentraciones similares a las presentes en el tejido de pacientes tratadas farmacológicamente, reducen significativamente la liberación de calcio intracelular gatillada por 17β-estradiol, en células MCF- 7...... 51

Figura 11. Tamoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno a concentraciones similares a las presentes en el tejido de pacientes tratadas farmacológicamente, no reducen la liberación de calcio intracelular gatillada por el agonista G1, en células MCF- 7...... 52 Figura 12. El tratamiento crónico con tamoxifeno induce un incremento en la expresión proteica de GPR30 en células MCF-7, estimuladas a diferentes tiempos con tamoxifeno 1000 nM...... 53 Figura 13. Tanto 17β-estradiol como el agonista farmacológico de GPR30 inducen la fosforilación de MAPK ERK 1/2 en células MCF-7...... 55 Figura 14. La estimulación de GPR30 induce la fosforilación de MAPK p38 en células MCF- 7...... 56 Figura 15. Efecto de las diferentes dosis del agonista y antagonista de GPR30 sobre la proliferación celular, en tres líneas de cáncer de mama...... 58 Figura 16. La estimulación de GPR30 produce un aumento de la proliferación celular, y contribuye hasta en un 50% en la respuesta proliferativa desencadenada por 17β-estradiol, en las células de cáncer de mama estrógeno sensibles...... 59 Figura 17. Tamoxifeno o 4-OHtamoxifeno a una concentración similar a la del plasma o a la del tejido de pacientes con tratamiento farmacológico, no reducen la proliferación celular gatillada por G1, en células de cáncer de mama sensibles a estrógeno...... 61 Figura 18. Tamoxifeno induce la fosforilación de MAPK ERK1/2 en células MCF- 7...... 62 Figura 19. Tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno a una concentración similar a la detectada en el tejido de pacientes con tratamiento farmacológico, reducen la proliferación celular gatillada por 17β- estradiol en células de cáncer de mama sensibles a estrógeno...... 63 Figura 20. Efecto de 17β-estradiol sobre la migración de células de cáncer de mama sensibles a estrógeno...... 65 Figura 21. G1 incrementa la migración celular en las células de cáncer de mama sensibles a estrógeno...... 66 Figura 22. 17β-estradiol y G1 aumentan la secreción de MMP-9 y MMP-2 en células MCF- 7...... 67

Figura 23. Participación de EGFR y MAPK ERK1/2 y p38 en la señalización gatillada por G1 o 17β- estradiol...... 69 Figura 24. Participación de EGFR y MAPK ERK1/2 y p38 en la migración celular promovida por G1...... 70 Figura 25. Distribución subcelular de los diferentes receptores de estrógeno...... 72 Figura 26. Posibles mecanismos de interacción entre GPR30 y ERα en células de cáncer de mama...... 77 Figura 27. Mecanismo de resistencia de las células de cáncer de mama sensibles a estrógeno, a la terapia con tamoxifeno...... 87

VII

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Factores que influyen en la respuesta celular a los estrógenos...... 74

VIII

ÍNDICE DE ABREVIACIONES

4-OHTX 4-hidroxitamoxifeno AF Funciones activadoras de la transcripción AG1478 Inhibidor específico de EGFR Akt Transformante de cepa AK AMP Adenosín monofosfato, AMPc Adenosín monofosfato cíclico AMPK Proteína quinasa activada por AMP ATP Trifosfato de adenosina BRCA1 Breast cancer (cáncer de mama 1) BRCA2 Breast cancer (cáncer de mama 2) BrdU 5-bromo-2`-deoxi-uridina BSA Albúmina sérica de bovino CAF Fibroblastos asociados al cáncer DMEM Medio mínimo esencial de Eagle DMSO Dimetilsulfóxido DO Densidad óptica E2 Estrógeno (17β-estradiol) EGF Factor de crecimiento epidérmico EGFR Receptor del factor de crecimiento epidérmico EGTA Ácido etilenglicol tetracético ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas ERK1/2 Quinasas reguladas por señales extracelulares ERα Receptor de estrógeno alfa ERα36 Isoforma de ERα ERα46 Isoforma de ERα ERβ Receptor de estrógeno beta G1 Agonista sintético específico de GPR30 G15 Antagonista de GPR30 GAPDH Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa GPCR Receptor acoplado a proteína G

GPR30 Receptor 30 acoplado a proteína G HB-EGF Factor de crecimiento epidérmico unido a heparina HBSS Solución Salina Equilibrada HANKS HEPES Ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1-iletanosulfónico HER-1 Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 1 HER-2 Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano tipo 2 Indo-1 AM Indicador de Ca2 + fluorescente radiométrico JNK Quinasa c-Jun N-terminal kDa kiloDalton LBD Dominio de unión al ligando MCF-7 Michigan Cancer Foundation-7 (línea de cáncer de mama) MDA-MB-231 Línea de cáncer de mama triple negativo MDCK Células de riñón canino Madin Darby MMP Metaloproteinasas de la matriz mRNA Ácido ribonucleico mensajero MTT Bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)2,5 difeniltetrazolio NF-kB Factor nuclear kB NTD Dominio amino terminal PBS Tampón fosfato salino PD98059 Inhibidor específico de ERK1/2 PI3K Fosfoinositol 3-quinasa PKA Proteína quinasa A RTK Receptores tirosina quinasa SB203538 Inhibidor específico de p38 SDS Dodecil sulfato de Sodio SERMs Moduladores selectivos de estrógeno SKBR3 Línea de cáncer de mama SOCE Entrada capacitativa de calcio SRF Factores de transcripción como el factor de respuesta sérica TEMED Tetramethylethylenediamine TX Tamoxifeno TX-100 Detergente no iónico tritón X-100 ZR75-1 Línea de cáncer de mama estrógeno sensible

RESUMEN

La activación del receptor de estrógeno alfa (ERα) por estrógeno (E2) se ha asociado al origen y mantención del cáncer de mama. Sin embargo, los numerosos casos de resistencia al tratamiento con tamoxifeno, han impulsado la búsqueda de nuevas moléculas que tengan incidencia en esta patología. Entre ellas, destaca GPR30 (receptor 30 acoplado a proteína G), implicado en respuestas citoplasmáticas rápidas y en la transactivación de EGFR. Un alto porcentaje de los tumores de mama son ERα/GPR30 positivos, lo que ha generado divergencias acerca del papel pro- o anticancerígeno de GPR30. Por lo tanto, me propuse investigar la contribución efectiva de GPR30 en el comportamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles. Mis modelos fueron las células MCF-7 y ZR75-1 (ERα/GPR30 positivas); mientras que las células MDA-MB-231 (ERα/GPR30 negativas) se usaron como un control negativo natural. Observé una clara presencia de GPR30 en la membrana plasmática de células MCF-7 incubadas a 4°C, con un anticuerpo dirigido contra un dominio extracelular. Determiné por inmunoblot, que G1 (100 nM) activa, a los 5 min, las vías de MAPK ERK1/2 y p38. Es destacable que el tratamiento agudo con tamoxifeno (2000 nM) indujo la activación de ERK1/2, y que el tratamiento crónico con este fármaco, generó una sobreexpresión de GPR30. A su vez, E2 10 nM y G1 100 nM gatillan la movilización de calcio intracelular (evaluada por fluorometría). El pretratamiento con G15 1000 nM mostró que aproximadamente 60% de esta actividad es atribuible a GPR30. Tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno 2000 nM redujeron un 30% la movilización de calcio intracelular inducida por E2, pero aumentaron por sí solas la incorporación de BrdU en las células estrógeno sensibles. E2 y G1, aumentaron en MCF- 7 y ZR75-1 la proliferación y migración celular (ensayo de la herida). El uso de un inhibidor de la actividad tirosina quinasa de EGFR, o de inhibidores de ERK1/2 o p38, redujeron estas respuestas. El pretratamiento con G15 o con un siRNA para GPR30, muestran que un 50% de la proliferación y migración generadas por E2, dependen de GPR30. La zimografía, demuestra que la activación de GPR30 induce una significativa liberación de MMP-2 y MMP-9. Mi tesis determinó la contribución de GPR30 en la activación de MAPKs y en la movilización del calcio intracelular. También señala que este receptor contribuye al menos en un 50% de la proliferación y migración de las células de cáncer de mama estrógeno sensible. Sugiere, además, que GPR30 contribuye a la generación de resistencia farmacológica al tratamiento con tamoxifeno.

Palabras claves: Cáncer de mama, GPR30, ERα.

ABSTRACT

The activation of estrogen receptor alpha (ERα) by estrogen (E2) has been associated with the origin and maintenance of breast cancer. However, the numerous cases of tamoxifen resistance have driven the search for new molecules that may have an impact on this neoplasia. Among them, GPR30 (receptor 30 coupled to G protein) stands out in rapid cytoplasmic responses and in transactivation of EGFR. A high percentage of breast tumors are ERα/GPR30 positive, an observation that has generated divergences for a pro or anticancer role of GPR30. Therefore, I set out to investigate the real contribution of GPR30 in the behavior of estrogen-sensitive breast cancer cells. My models were MCF-7 and ZR75-1 cells (ERα/GPR30 positive), whereas MDA-MB-231 cells (ERα/GPR30 negative) were used as a natural negative control. A strong immunofluorescent labeling of GPR30 in the cell membrane of MCF-7 cells incubated at 4 ° C was observed when an antibody directed against an extracellular domain of the receptor was used. Immunoblotting showed that 100 nM G1 activates, at 5 min, the MAPK pathways ERK1/2 and p38. It is noteworthy that an acute treatment with 2000 nM tamoxifen also induced the activation of ERK1/2, whereas a chronic exposure to this drug over-expressed GPR30. Furthermore, 10 nM E2 and 100 nM G1 trigger intracellular calcium mobilization (evaluated by fluorometry) and pretreatment of cells with 1000 nM G15 showed that approximately 60% of this activity was attributable to GPR30. Tamoxifen or 4-hydroxytamoxifen (2000 nM) reduced the intracellular calcium mobilization induced by E2 by 30%, but they increased BrdU incorporation in the estrogen sensitive cells. E2 and G1 increased cell proliferation and cell migration (wound assay) in the same cells. The use of an inhibitor of EGFR tyrosine kinase, or inhibitors of ERK1 1/2 or p38, reduced these responses. Pretreatment of cells with G15 or with a GPR30 siRNA, showed that 50% of cell proliferation and migration induced by E2, depended on GPR30 activity. Zymography demonstrated that activation of GPR30 also induces a significant release of MMP-2 and MMP-9. My thesis determined the relative contribution of GPR30 to activation of intracellular signals such as MAPKs and intracellular calcium mobilization. It also points out that contribution of GPR30 to proliferation and migration of estrogen-sensitive breast cancer cells is at least 50%. It also suggests that GPR30 may have an important role in the generation of drug resistance.

Key words: Breast cancer, GPR30, ERα.

XII

1. INTRODUCCIÓN

1.1. EL CÁNCER DE MAMA EN LA ANTIGÜEDAD

Varios hallazgos de lesiones compatibles con diferentes tipos de cáncer en humanos, han sido fechados con unos 150.000 años de antigüedad (Capasso, 2005). Con el desarrollo de las primeras culturas, aparecen también las primeras manifestaciones artísticas y los escritos referentes a una serie de lesiones ulcerosas “que no sanan” asimilables a distintas formas de cáncer (David y Zimmerman, 2010). Sin embargo, es en el antiguo Egipto (1600 a. C), donde encontramos la primera referencia médica que describe el cáncer de mama y además las posibles alternativas de tratamiento (Ebbel, 1937). Milenios más tarde, en el siglo IV a.C., en la obra Corpus Hippocraticum (atribuida a Hipócrates) hallamos la descripción de lesiones ulcerosas crónicas, a veces endurecidas, de curso progresivo y capaz de expandirse sin control “simulando las patas de un cangrejo”, razón por la cual se las denominó genéricamente con la palabra griega “karkinos” (cangrejo). Además, Hipócrates hizo especial mención a una patología de muy difícil tratamiento a la que describió como un “karkinoma de mama avanzado”. De allí, el término Karkinos pasó al latín como “cancrum” es decir, “cáncer” tomando con el tiempo básicamente ambas acepciones: el de cangrejo y el de patología maligna o cáncer en el sentido médico (Salaverry, 2013).

Sin embargo, a pesar de la relativa abundancia de lesiones neoplásicas documentadas hasta el momento y lo descrito por las primeras civilizaciones, se estima que el cáncer en estas sociedades era menos frecuente comparado con las sociedades modernas (David y Zimmerman, 2010). Esta brecha probablemente comenzó a gestarse con la domesticación de los animales y el desarrollo de la agricultura.

En perspectiva, comparando los datos de la paleontología con las actuales investigaciones, es factible relacionar los diversos tipos de cáncer, como el de mama y su prevalencia en las poblaciones antiguas y modernas, lo cual puede ser clave para comprender los patrones de la evolución del cáncer en los seres humanos.

1.2. LA CÉLULA CANCEROSA

En 1858 Rudolph Virchow sugirió, derivado de su concepto “omnis cellula e cellula”, que las células cancerosas procedían de otras células previamente alteradas (Koonin, 2014). Efectivamente, se ha establecido que los diferentes tipos de cáncer, se desarrollan a partir de una célula maligna que presenta una serie de transformaciones genéticas (mutaciones puntuales y/o alteraciones cromosomales), las que le confieren una mayor capacidad de angiogénesis, de inmortalización, de proliferación y migración sostenidas (Hanahan y Weinberg, 2011), en relación a cualquier otra célula o tejido normal de nuestro organismo.

El análisis patológico de los órganos afectados revela pasos intermedios a través de los cuales el tejido pasa desde diversos estados de evolución cancerígenos a un cáncer más agresivo y de tipo invasivo (Foulds, 1954). Es más, se ha observado que los tejidos neoplásicos contienen poblaciones celulares con diferente morfología y comportamiento dentro del mismo tumor de mama. Lo anterior, se ve reflejado en la tasa de mutaciones y expresión proteica distintas, evaluadas en diferentes regiones de la misma lesión tumoral (Hanahan y Weinberg, 2011; Bussey et al., 2017).

Para explicar estas variaciones génicas y fenotípicas de la enfermedad, se han elaborado varias teorías. Una de ellas es la de Julius Cohnheim quien, en el siglo XIX, propuso que las células cancerosas pueden retener ciertas características de las células embrionarias, como la alta tasa de división celular y el crecimiento sin restricciones (Maehle, 2011). Más tarde, Theodor Bovery (1914), afirmó que la célula neoplásica es capaz de recapitular fenotípicamente estados celulares ancestrales. En sintonía con lo expresado, actualmente, se han identificado en el tejido canceroso diversos grados de malignidad originadas a partir de un foco de células des-diferenciadas, similares a las células madre (stem cells) que originan a las células especializadas de los tejidos normales, denominadas cancer stem cells. Estas células han sido recientemente aisladas, a partir de un carcinoma de mama (Bozorgi et al., 2015). Otra teoría complementaria a la anterior, es la expuesta por el grupo del físico Paul Davies, según la cual, el cáncer podría ser un mecanismo ancestral de supervivencia celular, capaz de activar respuestas muy eficaces de evasión y defensa ante presiones medio ambientales. Estas estrategias fueron necesarias, cuando conjuntos separados de células debían sobrevivir, generando respuestas coordinadas frente a las cambiantes exigencias del entorno, lo que desembocaría con el tiempo en la vida pluricelular (Bussey et al., 2017).

Los fenómenos descritos explican en parte, el por qué el cáncer de mama se manifiesta de una manera heterogénea, y en los casos más agresivos de la enfermedad, con una capacidad variable de invadir los tejidos adyacentes y/o distantes, propiciando además una mayor resistencia a los tratamientos farmacológicos convencionales (Sahai, 2005; Yamaguchi et al., 2005).

1.3. ALGUNOS ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DEL CÁNCER DE MAMA

El cáncer mamario es una de las patologías crónicas y de origen multifactorial de mayor incidencia en la población femenina actual (Jemal et al., 2010). Se ha observado una asociación entre los factores genéticos (como las mutaciones en los genes BCRA1 y BCRA2) (Antoniou et al., 2007) con una serie de factores medioambientales (Parkin y Fernandez, 2006). Es importante mencionar que aproximadamente un 5% de los carcinomas de la mama se producen por mutaciones en estos genes mientras que el 95% restante corresponden a carcinomas espontáneos sin base genética. Se ha estimado que las variaciones en el cáncer, pueden ocurrir en intervalos de tiempo relativamente cortos en las poblaciones, de acuerdo a sus características socio-culturales. A día de hoy, esta neoplasia presenta altas tasas de incidencia y mortalidad en varios países de Europa del este y de Sudamérica, fenómeno muy similar a lo que previamente se produjo en los países desarrollados a mediados de la década de los noventa (Bosetti et al., 2005).

Particularmente, nuestro país ha experimentado una rápida transición epidemiológica, con una tendencia a la baja natalidad y aumento en las expectativas de vida, lo que ha dado lugar a la aparición de problemas de salud crónicos, dentro de ellos el cáncer. Estos factores, han determinado que el cáncer de mama ocupe el primer lugar en la mortalidad por cáncer en la mujer en Chile, relegando al cáncer de vesícula biliar al segundo lugar (Prieto, 2011).

1.4. LOS ESTRÓGENOS Y SU ROL FISIOPATOLÓGICO

La familia de estrógenos comprende estrona, estradiol y estriol. Estrona se considera una forma más débil de estrógeno. En esencia, los estrógenos se producen a través de las vías metabólicas de los esteroides en los ovarios y la placenta, en particular durante el embarazo y también en la corteza suprarrenal (Rosselli y Dubey, 2006). Fisiológicamente, la mayoría de los estrógenos corresponden a estriol o estrona. Estriol es producido principalmente durante el embarazo, ya sea a partir de sulfato de 16-hidroxidodehidroepiandrosterona, 17β-estradiol o estradiol (E2) es formado a partir de la aromatización de la testosterona, mientras que la estrona se deriva de la aromatización de androstenediona (Yaghjyan y Graham, 2011)

Los estrógenos, son cruciales para el crecimiento y la diferenciación celular y el desarrollo de características sexuales secundarias. Estos incluyen mamas, endometrio y regulación del ciclo menstrual. En los hombres, el estrógeno ayuda a la maduración de los espermatozoides y mantenimiento de un impulso sexual saludable. Además, estradiol tiene importantes efectos en los órganos reproductores y en tejidos no reproductivos, como el esqueleto, sistema cardiovascular y nervioso. En particular, el estradiol tiene un impacto importante en la diferenciación del cerebro humano durante la vida neonatal (Auger, 2000) y, en consecuencia, presenta una fuerte influencia en la fisiología humana, particularmente en la mujer (Jensen et al., 2010). La disrupción en la homeostasis de los estrógenos se ha asociado a una serie de enfermedades, entre ellas el cáncer de mama. El reconocimiento del nexo entre la producción de estrógenos y el desarrollo de esta patología ocurrió tempranamente, al observarse que la extirpación quirúrgica de los ovarios de mujeres premenopáusicas con cáncer mamario metastásico, puede inducir una regresión del tumor en aproximadamente un tercio de las pacientes (Beatson, 1896). Sin embargo, gran parte de la comprensión molecular de éste fenómeno sería establecida mucho más tarde, a partir del estudio de los receptores de estrógeno.

1.5. RECEPTORES DE ESTRÓGENO CLÁSICOS

A principios de los años sesenta, Jensen y Jacobson, usando estradiol marcado con tritio, demostraron, en los ovarios, la presencia de una proteína intracelular que se unía específicamente al estrógeno (Jensen et al., 2010). A este receptor se le denominó receptor de estrógeno alfa (ERα). Para explicar la función de este receptor, Jensen et al. (1968) propusieron un ingenioso mecanismo denominado la "teoría de los dos pasos" en el cual estrógeno se une al receptor citoplasmático formando un complejo receptor-hormona (paso uno). Este complejo se difunde pasivamente a través de las membranas nucleares regulando la expresión génica (paso dos).

Inicialmente ERα se consideró como la principal proteína receptora que regula las acciones de estrógeno. Sin embargo, diez años después, un equipo dirigido por Gustafsson, examinando un receptor de andrógenos en el tejido prostático de roedores, detectaron una proteína que tenía las características de un receptor de estrógeno, al que designaron como receptor de estrógeno beta (ERβ) (Kuiper et al., 1996) Ambos receptores son hoy conocidos como los receptores de estrógeno clásicos, miembros de la familia de receptores nucleares, ya que los podemos detectar principalmente en el núcleo en lugar de la membrana plasmática o el citoplasma.

El receptor ERα (denominado también ERα66) se expresa principalmente en el útero, ovario, mama, riñón, hueso, tejido adiposo blanco e hígado (Kuiper et al., 1996), mientras que ERβ (también llamado ERβ1) está presente predominantemente en el ovario, sistema nervioso central, sistema cardiovascular, pulmón, órganos reproductores masculinos, próstata, colon, riñón y en las células del sistema inmune (Kuiper et al., 1996). El gen de ERα está localizado en el cromosoma 6q24-27, y el de ERβ está ubicado en el cromosoma 14q21-228.

Ambos receptores presentan una estructura base en común muy similar, que consiste en un dominio carboxi-terminal de unión al ligando (LBD), una región localizada en el centro de la

estructura capaz de unir ADN (DBD) y un dominio amino-terminal (NTD) requerido para la completa actividad transcripcional del receptor. Además, presentan dos funciones activadoras de la transcripción (AF): AF-1 en el dominio NTD y AF-2 en el dominio LBD, siendo AF-2 hormono-dependiente. Las regiones LBD y DBD se encuentran altamente conservadas entre los diferentes receptores, mientras que la región NTD es más variable tanto en su secuencia primaria como en su longitud (Higa y Fell, 2013).

ERα está relacionado con proliferación y supervivencia celular, mientras que ERβ modula a ERα, cuando ambos receptores se co-expresan en el tejido normal y en líneas celulares de cáncer de mama (Higa y Fell, 2013). Se ha propuesto que ERβ puede formar heterodímeros con ERα disminuyendo la actividad transcripcional relacionada con la proliferación celular (Haldosén et al., 2014). Se han descrito otras variantes de ERβ, pero la forma más notable en el contexto del cáncer de mama parece ser ERβ2 puesto que, al igual que la forma ERβ, su expresión se asocia con una mayor sobrevida de las pacientes con cáncer de mama (Liu et al., 2016).

ERα está presente en aproximadamente el 70% de los carcinomas mamarios y se ha constituido en un biomarcador utilizado tanto para el diagnóstico y pronóstico como blanco terapéutico para inhibir las acciones celulares y moleculares del estrógeno. En el tejido mamario normal o canceroso cuando el estradiol se une al receptor de estrógeno, el complejo hormona-receptor se une a otro complejo equivalente para formar homodímeros que se desplazan al núcleo promoviendo o inhibiendo la transcripción de genes relacionados con la proliferación celular, la supervivencia y la migración (Musgrove y Sutherland, 2009). Este proceso se llama "respuesta genómica". Los estrógenos también pueden desencadenar una "respuesta no genómica o rápida". Este concepto fue formulado después del estudio de la formación de cAMP in vivo, por células MCF-7, lo cual ocurría dentro de unos segundos luego de la estimulación con estradiol (Szego y Davi, 1967). También se ha observado mayor flujo de calcio intracelular, la migración de vesículas secretoras y la activación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) ERK1/2 (Merlin et al., 2013; Molina et al., 2009).

Alrededor del 70% de los carcinomas mamarios dependen del estrógeno para crecer y, en consecuencia, se clasifican como “cáncer sensible a hormonas” o ERα-positivo. Hasta ahora, el bloqueo del receptor de estrógeno o la supresión de la síntesis de estrógenos endógenos se ha considerado un importante enfoque terapéutico para disminuir la progresión del cáncer de mama (Musgrove y Sutherland, 2009). Sin embargo, la heterogeneidad molecular del cáncer de mama junto con la existencia de formas agresivas de la enfermedad y la resistencia a la terapia hormonal indican que otros factores aún no considerados en los mecanismos de señalización gatillados por estrógenos podrían influir en la patogénesis y evolución del cáncer de mama. Entre estos factores, se encuentra un nuevo tipo de receptor de estrógeno, que difiere significativamente de los receptores clásicos.

1.6. GPR30 / GPER-1: UN NUEVO RECEPTOR DE ESTRÓGENO

Inicialmente, GPR30 fue identificado como una proteína no-nuclear asociada con el retículo endoplásmico, y catalogada como un "receptor huérfano" (Filardo et al., 2000). Uno de los primeros signos de su presencia en los tejidos provino de la evaluación de dos líneas celulares de cáncer de mama humano. En células MCF-7 (ERα-positivas), se observó que la producción de AMPc estimulada por estrógenos, no se producía en células MDA-MB-231 (ERα-negativas). Esta respuesta se atribuyó, en primera instancia, sólo a la activación de ERα. Actualmente se sabe que las células MCF-7 expresan GPR30, además de Erα, mientras que las células MDA-MB-231 no lo expresan (Filardo et al., 2002). Estos autores, además, determinaron que en la línea celular de cáncer de mama SKBR3 (ERα- negativa), estrógeno induce la activación de la vía de señalización MAPK ERK1/2. Estos hallazgos y el hecho de que estas células expresan niveles indetectables a moderados de ERβ (Vladusic et al., 2000)

sugirieron que las respuestas de estrógeno eran mediadas por un receptor de estrógeno distinto de ERα, muy factiblemente GPR30.

Basado en su capacidad para unir estradiol, GPR30 fue renombrado como GPER-1. Más tarde, al transfectar células MDA-MB-231 con GPR30, observaron que las respuestas normales inducidas por estradiol eran atribuibles a GPR30 (Filardo et al., 2002). Sin embargo, solo el 2005 Revankar et al. establecieron que GPR30 era un nuevo receptor de estrógeno y que su ligando natural era 17β-estradiol.

En general, se reconoce que aproximadamente el 20% de los cánceres humanos están relacionados con alguna alteración en los receptores acoplados a proteína G. GPR30 es un miembro de esta familia y en humanos, su gen está ubicado en el cromosoma 7p22.3, codifica una proteína que contiene 375 aminoácidos con una masa molecular teórica de 41 kDa y una homología del 87% con su equivalente murino. Al igual que otros receptores acoplados a proteína G, el extremo N-terminal es extracelular y el extremo carboxilo es intracelular. GPR30 se une a 17β-estradiol con alta afinidad, lo que conduce a una rápida pero transitoria activación de muchas vías de señalización intracelular. Cuando estrógeno activa a este receptor induce un aumento de la producción de AMPc, de calcio intracelular y la síntesis de fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato, junto con la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la subsecuente activación río abajo de vías de señalización tales como PI3K-Akt y MAPK ERK1/2. En resumen, GPR30 juega un papel importante en los eventos rápidos de señalización no genómica observados después de la estimulación de las células con estradiol.

La evidencia actual indica una variedad de posibles funciones para GPR30. Este receptor está altamente expresado en múltiples tejidos, incluidos los tejidos nervioso y adiposo, hígado y sistema circulatorio e inmunitario. Además, está involucrado en enfermedades dependientes de estrógenos, incluidos los cánceres de sistema reproductivo, fertilidad masculina, obesidad, osteoporosis, hipertensión, aterosclerosis y enfermedades autoinmunes (Prossnitz y Barton, 2015). También se

expresa, al igual que ERα, en mama y tejidos reproductivos y en varias líneas celulares de cáncer de mama humano (Ahola et al., 2002).

La distribución ubicua de GPR30 explica las funciones clave atribuidas hasta ahora a este receptor de estrógeno en los tejidos reproductivos, sistema cardiovascular y sistema nervioso central. Sin embargo, su actividad funcional en el contexto celular es aún foco de debate. Con base a la evidencia, es probable que la mayoría de los efectos atribuidos hasta ahora a los dos receptores de estrógeno clásicos se deban, al menos en parte, a la activación de GPR30. De hecho, muchos de los efectos beneficiosos de los estrógenos están ausentes en los ratones con deficiencia de GPR30 y pueden ser imitados por compuestos activadores de GPR30 (Haas et al., 2009; Henic et al., 2009).

1.7. SEÑALIZACIÓN DE GPR30 Y CÁNCER DE MAMA

El papel de GPR30 en la patogénesis del cáncer de mama es aún materia de estudio. Curiosamente, los cánceres de mama negativos denominados “triples negativos” (negativos para ER, PR y HER-2) frecuentemente sobre-expresan EGFR y GPR30. Posiblemente, el crecimiento de estos tumores es estimulado por 17β-estradiol a través de GPR30 (Girgert et al., 2017). Además, la evidencia creciente revela que la activación de GPR30 desencadena la expresión de genes implicados en importantes efectos biológicos como la proliferación celular y la migración de diversas células cancerosas, así como de los fibroblastos asociado al cáncer (CAF) (Pisano et al., 2017). La activación de GPR30 por 17β-estradiol ha sido corroborada por ensayos de unión a estradiol, inmunofluorescencia, y el uso del agonista sintético conocido como G1 y su antagonista farmacológico, G15 en tejidos normales y cancerosos y en

diversas líneas celulares que no expresan ERα (Prossnitz et al., 2011). Los compuestos G1, G15 y el nuevo antagonista G36 son derivados de la quinolina, y no muestran afinidad por ERα y ERβ por lo que son considerados ligandos específicos de GPR30 (Dennis et al., 2011).

Se ha determinado en varios cánceres humanos, incluyendo el de mama (Ma et al., 2012) que una vez activado GPR30 por estradiol, la señalización intracelular se produce principalmente a través de la activación de proteínas G del tipo Gs y Gi/o, causando un aumento de AMPc, activación de la integrina α5β1, liberación de metaloproteinasas intracelulares y del factor de crecimiento epidérmico unido a heparina (HB-EGF). HB-EGF produce la transactivación de EGFR (Filardo et al., 2005; Jacenik et al., 2016) que subsecuentemente lleva a la activación de las rutas MAPK ERK1/2 y Akt (Filardo et al., 2005).

Además, la señalización GPR30/EGFR media la expresión de genes reguladores del ciclo celular en CAF (fibroblastos asociados al cáncer) derivados de pacientes con cáncer de mama, lo que sugiere una interacción funcional entre las células neoplásicas y CAF. Estas últimas pueden ser generadas a través de la participación de GPR30, receptor que además promueve la inflamación en el microambiente tumoral (Pisano et al., 2017).

En células SKBR3 (ERα-negativas/GPR30-positivas), estradiol induce la expresión de c-Fos (factor de transcripción involucrado en la proliferación celular, diferenciación y supervivencia) a través de la activación de cascadas de señalización GPR30/EGFR/MAPK (Maggiolini et al., 2004). MAPK pueden activar factores de transcripción como el factor de respuesta sérica (SRF) y el aumento de AMPc producido a través de la señalización GPR30 puede activar CREB (Prossnitz et al., 2008). Estos factores a su vez activan la expresión de factores de transcripción como c-Fos, FosB, c-Jun, Egr1, ATF3, C / EBPd y NR4A2 (Nurr1) (Maggiolini et al., 2004).

También se ha verificado, una correlación significativa entre la expresión de GPR30 y MMP-9 en células epiteliales de cáncer de ovario provenientes de muestras de pacientes en relación al tejido

ovárico normal (Wang et al., 2013). Sin embargo, hasta el momento muy pocos estudios han relacionado a GPR30 con la generación de metaloproteinasas en el cáncer de mama.

Recientemente, se ha establecido que tamoxifeno y 4-OH tamoxifeno (principal metabolito generado por tamoxifeno), dos antagonistas de ERα y considerados actualmente como moduladores selectivos de estrógeno (SERMs), activan GPR30 (Pandey et al., 2009; Filardo et al., 2006). Similar situación ocurre con otro SERMs llamado ICI 182,780 (conocido comercialmente como Fulvestrant), fármaco que se utiliza como terapia de segunda línea en pacientes posmenopáusicas con cáncer mamario metastásico. Se ha determinado que impide la traslocación de ERα desde el citoplasma al núcleo (Gee et al., 2001) y que es capaz de inhibir el crecimiento celular y además la expresión proteica y el mensajero del ERα en la línea celular MCF-7 (Sjöström et al., 2014). Sin embargo, y a pesar de sus efectos inhibitorios sobre Erα, puede actuar como agonista de GPR30, promoviendo la adhesividad de las células de cáncer de mama (Chen et al., 2014). GPR30 es también expresado por CAFs y su activación por 4-OH tamoxifeno también estimula la expresión de factor de crecimiento del tejido conjuntivo (CTGF), lo cual puede estar relacionado con el comportamiento más agresivo de algunos tumores de mama (Ren et al., 2015).

Debido a que estradiol mantiene la supervivencia de las células tumorales, promoviendo la proliferación celular y la metástasis, tamoxifeno constituye la terapia de elección en los casos de cáncer de mama clínicamente clasificados como tumor ERα-positivos, a causa de sus acciones antagónicas sobre éste receptor. Sin embargo, un número significativo de tumores invasores ERα-positivos y de rápido crecimiento, no responden y/o se hacen resistentes a la terapia con tamoxifeno (Ariazi et al., 2006). En general, se estima que los mecanismos de resistencia se relacionan a las mutaciones que surgen dentro de los intermediarios que forman parte de las vías de señalización desencadenadas por el estradiol o sus metabolitos, promoviendo así la supervivencia y la proliferación de las células tumorales (Hanahan et al., 2011). En este sentido, los estudios clínicos también han vinculado la

fosforilación de MAPK ERK1/2 con una baja supervivencia y una mala respuesta al tratamiento farmacológico convencional (Gee et al., 2001).

Los experimentos que han utilizado células MCF-7 resistentes a tamoxifeno (un modelo celular que busca emular las condiciones terapéuticas), estimuladas con estradiol apuntan a una sobre- expresión de GPR30 (Ignatov et al., 2010), un efecto ratificado estimulando estas células con G1 o bloqueando GPR30 con su antagonista G15. En este sentido, es interesante un estudio realizado en carcinomas ductales invasores de mama que reveló sobre-expresión de GPR30, en comparación con el tejido normal adyacente (Zhou et al., 2015). Clínicamente, se ha estimado que pacientes con cáncer de mama ERα/GPR30-positivos tienen una tasa de supervivencia menor en comparación con pacientes que tienen tumores de mama ERα-positivos/GPR30-negativos (Ignatov et al., 2011). Por analogía, la expresión de GPR30 está asociada con un mal pronóstico en pacientes con tumores HER2-positivos, de mayor tamaño y que generan metástasis (Filardo et al., 2006).

Vivacqua et al. (2009) han determinado que EGF y TGF-α regulan la expresión del mRNA y proteína de GPR30 en células de cáncer de endometrio y cáncer de mama resistente a tamoxifeno. Además, mayores niveles de GPR30 han sido identificados en el cáncer de mama inflamatorio, una forma más agresiva del cáncer de mama (Ohshiro et al., 2012).

No obstante, hay importantes líneas de investigación que cuestionan la probable relación de GPR30 con la génesis y desarrollo tumoral (Ignatov et al., 2010; Mo et al., 2013). Una de ellas se centra en la capacidad de este receptor para activar efectivamente MAPK ERK1/2 ó generar AMPc (Maehle et al., 2011), atribuyéndose esta capacidad únicamente a la presencia de ER en las células o en los tejidos que se han evaluado (Chen et al., 2014). Es más, algunas investigaciones han señalado que es únicamente el receptor clásico ER el que se une de manera específica a estrógeno y no GPR30 (Pedram et al., 2009).

Otra vertiente, ha relacionado la presencia del GPR30 en células MCF-7 con un efecto inhibitorio de la proliferación celular (Ahola et al., 2002). También se ha indicado que GPR30 es capaz

de producir un arresto del ciclo celular en las fases G0/G1 en presencia o ausencia de E2 en el medio de cultivo (Ahola et al., 2002). Complementando lo anterior, una investigación reciente relaciona la presencia de GPR30 en células MCF-7 con una inducción a la apoptosis de la célula tumoral, y en las pacientes con cáncer de mamas ER positivo, con una mayor sobrevida (Broselid et al., 2013). En perspectiva, estos resultados atribuyen a GPR30 un rol inhibitorio de la progesión tumoral y no de una promoción y/o exacerbación cáncer mamario.

1.8. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

En consecuencia, mi hipótesis fue que: “La activación de GPR30 favorece la progesión tumoral promoviendo la proliferación y migración de las células de cáncer mamario ER positivas”.

Esta hipótesis consideró los siguientes Objetivos Generales i) Evaluar in vitro la participación de GPR30 en el aumento de la proliferación y migración de las células de cáncer mamario estrógeno-sensibles ii) Evaluar si estos procesos están relacionados con la activación de MAPK ERK1/2, p38 y aumento del calcio intracelular, inducidas por GPR30, en células de cáncer mamario estrógeno-sensibles.

Objetivos Específicos

1. Caracterizar la localización de GPR30 y la respuesta de las células de cáncer de mama ER- positivas, a estrógeno y a G1 a través de la medición de liberación de calcio intracelular.

2. Determinar, en células de cáncer de mama ER-positivas, que proporción del efecto proliferativo producido por estrógeno es debido a la activación de GPR30.

3. Determinar si la activación de MAPKs ERK1/2 y p38 participan en el aumento de la proliferación celular gatillada por los receptores GPR30 y ER.

4. Evaluar la capacidad de migración de las células de cáncer de mama en respuesta a la estimulación de GPR30 y ER.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. MATERIALES

2.1.1. Infraestructura

Esta Tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de Patología Celular del Instituto de Anatomía, Histología y Patología.

2.1.2. Equipos

Cámara de flujo laminar Factomet, con gabinete de seguridad biológica, pH-metro WTW PH 521, Estufa termorregulada Memmert, Estufa de cultivo Binder, Baño termorregulado Haake E12, Centrífuga de aceleración programable Sigma 4K-10, Microcentrífuga Biofuge 15 Heraeus, Vortex Scientific Instruments, Microsocopio invertido Nikon, Microscopio óptico Zeiss, Cámara Neubauer Hawksley, Balanza analítica electrónica Precisa 120, Horno de microondas Samsung, Lector de ELISA Metertech 960, Espectrofotómetro Shimadzu de doble haz en el rango UV-visible, Fuentes de poder para electroforesis, Freezers -20°C y -80°C, Sonicador Cole-Parmer Instruments Co 4710. Espectrómetro de luminiscencia Perkin Elmer LS50B (Laboratorio de Fisiología), Microscopio Confocal bio/mat, Zeiss LSM700 (Laboratorio de Productos Forestales).

2.2. MÉTODOS

2.2.1. Cultivo de líneas celulares de cáncer de mama

Las células neoplásicas MCF-7 (receptor de estrógeno -positivas, derivadas de una metástasis de cáncer mamario) y ZR75-1 (receptor de estrógeno -positivas, derivadas de un carcinoma ductal) fueron cultivadas y crecidas en Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) y en Roswell Park Memorial Institute medium-1640 (RPMI-1640) respectivamente; 10% de suero fetal bovino (SFB), glutamina 2 mM y penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml de penicilina G sódica y 10.000 g/ml de sulfato de estreptomicina; GIBCO BRL, Life Technologies) y 250 g/ml fungizona. Estos mismos reactivos, a las mismas concentraciones fueron utilizados para suplementar el medio DMEM/F12 (1:1) para el cultivo de las células insensibles a estrógeno, MDA-MB-231 (línea celular representante del cáncer de mama triple negativo, derivadas de una efusión pleural de cáncer de mama).

Las células fueron cultivadas y crecidas a 37ºC en atmósfera humedecida a 5% de CO2 y aire. Las células fueron expandidas con dos a tres pasajes y congeladas en Cell culture freezing medium-DMSO (GIBCO BRL, Life Technologies) usando crioviales, para ser finalmente guardadas en nitrógeno líquido hasta su utilización.

2.2.2. Inmunovisualización de GPR30 en células MCF-7

La localización celular de GPR30 se determinó mediante marcaje por inmunofluorescencia indirecta de células MCF-7. Las células se cultivaron en medio DMEM-10% SFB y antibióticos (Medio Completo) hasta alcanzar un 80% de confluencia sobre cubreobjetos de vidrio de 12 mm pretratados con poli-L lisina para mejorar la adhesión celular. Posteriormente, las células se incubaron a 4ºC durante 3 h con un anticuerpo comercial dirigido contra 16 aminoácidos del tercer dominio extracelular del receptor (IgG policlonal de conejo; Abcam 188790), a una dilución de 1:50. Luego de tres lavados de 5 min cada uno con PBS, las células fueron fijadas con 4% paraformaldehído por 15 min a 4ºC. Luego de lavado extenso con PBS las células fueron incubadas durante 1 h con un anticuerpo secundario acoplado a Alexa-488 (Thermo Fisher, 1:50). El control negativo consistió en el reemplazo del primer anticuerpo por suero no inmune. Se usó medio de montaje para fluorescencia DAKO. La inmunofluorescencia fue analizada por microscopía confocal.

2.2.3. Extracción y cuantificación de proteínas

Las células MCF-7 o ZR75-1 fueron sembradas en un número de 400.000 células por placa de cultivo (30 mm de diámetro) o 300.000 en el caso de las células MDA-MB-231, en medio completo por aproximadamente 24 h hasta alcanzar un 80% de confluencia. Luego, se removió el medio y se realizó un lavado con solución de Hanks’s estéril y se agregó 2,5 ml de medio carente de rojo fenol y SFB (medio base). Las células estuvieron en este medio por 48 h, en atmósfera humedecida a 5% de CO2 y aire, para alcanzar la sincronización (bajo estas condiciones, la mayor parte de las células se sincronizan en la fase G1).

Luego se retiró el medio base y las células se lavaron con Hank`s estéril por una vez y se detuvo la reacción colocando las placas sobre hielo y agregandoles 1 ml de PBS suplementado con inhibidores

(PMSF 1 mM y Na3VO4 1 mM y aprotinina, leupeptina y pepstatina 1 g/ml cada una; Sigma Chemical Co.). A continuación se retiró esta solución y se agregó 80 l de buffer modificado de radioinmunoprecipitación (RIPA) más inhibidores Tris-HCl 50 mM, pH 7.4; NaCl 150 mM; Nonidet P-40 1%; EDTA 1 mM; EGTA 1 mM; 250 g/ml p-nitrofenilfosfato; PMSF 1 mM; aprotinina, leupeptina y pepstatina 1 g/ml; Na3VO4 1 mM. Las células fueron raspadas con una espátula de teflón (Police Man de 15 cm, Chemeware®) y transferidas a tubos de 1.5 ml (Axygen®) para ser sonicadas en hielo durante 10 a 15 seg. Finalmente, se midieron las proteínas totales según el método de Bradford (1976) en un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 595 nm después de lo cual las muestras se alicuotaron y almacenaron a -80ºC, hasta su uso. Como muestra blanco para la medición de proteínas se utilizaron 10 l de Buffer RIPA más 1 ml del reactivo Bradford.

2.2.3.1. Determinación de los niveles proteicos de GPR30 en células de cáncer de mama

Las células MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB-231 fueron crecidas hasta alcanzar 80% de subconfluencia, y después sincronizadas por 48 h en medio base (sin rojo fenol y sin suero). Posteriormente, las proteínas fueron extraídas y cuantificadas para cada tipo celular (el experimento fue hecho en duplicado). Los extractos celulares, fueron guardados según lo descrito en el punto 2.2.3.

2.2.3.2. Efecto del tratamiento crónico de las células MCF-7 con tamoxifeno

Las células MCF-7 fueron crecidas y expandidas durante 7 días en medio DMEM suplementado con 10% SFB (Medio Completo), pero suplementado con tamoxifeno 1000 nM. Cada 48 h se retiró el medio, y se reemplazó por medio fresco con tamoxifeno. De esta forma, se dispuso de una población de células MCF-7 expuestas crónicamente a tamoxifeno, que fueron posteriormente congeladas en Cell culture Freezing Medium-DMSO (Dimetil sulfoxido; GIBCO BRL, Life Technologies) hasta el momento de su uso. Cuando fue requerido, estas células fueron despertadas y crecidas nuevamente en medio completo suplementado con tamoxifeno 1000 nM. De manera paralela, se despertaron viales de células no expuestas al fármaco, las cuales fueron crecidas de la manera habitual en medio completo. Una vez alcanzada una confluencia del 80%, tanto las células tratadas crónicamente con tamoxifeno como las no tratadas, fueron mantenidas durante 24 h en medio base (sin rojo fenol, y sin SBF). Una vez sincronizadas, las células expuestas de forma crónica al fármaco fueron nuevamente tratadas con tamoxifeno 1000 nM por 24, 48 y 72 h. Se dispuso de controles, correspondientes de células MCF-7 no crecidas ni tratadas con tamoxifeno.

Estos experimentos se realizaron con el fin de determinar si el tratamiento crónico de las células de cáncer de mama con tamoxifeno, modificaba los niveles proteicos de GPR30.

2.2.3.3. Silenciamiento de GPR30

Células MCF-7 y ZR75-1 sincronizadas en medio sin rojo fenol y sin suero, por 2 h, fueron incubadas con un siRNA específico para GPR30 a una concentración de 100 nM (Producto Nº sc-60743; Santa Cruz Biotechnology). Para este procedimiento se utilizó Lipofectamina 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se mantuvieron durante 24, 48 o 72 h en medio de cultivo libre de suero y de antibióticos. Se dispuso de células control tratadas sólo con lipofectamina (mock), para cada uno de los tiempos de los tratamientos, además, de células MDA-MB-231 que se usaron como control negativo. La eficacia del silenciamiento de GPR30 se determinó mediante inmunoblot.

2.2.3.4. Efecto de 17-estradiol y G1 sobre la fosforilación de MAPK ERK1/2 y p38

Se sembraron células MCF-7 en un número de 400.000 células por placa de cultivo (30 mm de diámetro), en medio DMEM-10% SFB y antibióticos (medio completo) por aproximadamente 24 h hasta alcanzar un 80% de confluencia. Luego, se removió el medio completo y se realizó un lavado con Hanks’s estéril para eliminar cualquier residuo del medio y se agregó 2,5 ml de medio base para alcanzar la sincronización. Las células estuvieron en este medio por 24 h, en atmósfera humedecida a 5% de CO2 y aire.

Posteriormente, el medio base fue retirado y las células se estimularon con 17-estradiol (E2) 10 nM o G1 100 nM durante 2, 5, 10, 15 y 30 min. Se incluyeron células sin estimular como controles negativos.

Estos experimentos se realizaron para evaluar la fosforilación de MAPK ERK1/2 ante la estimulación del receptor de estrógeno, canónico (ER) y de membrana (GPR30).

En otros experimentos, con el fin de explorar la vía de MAPK p38 (la cual no había sido evaluada hasta el momento en el contexto de la activación de GPR30) las células MCF-7 se estimularon con diferentes concentraciones (1, 10, y 100 nM) del agonista farmacológico de GPR30, G1 durante 5 min. Se realizaron, además, controles con células no estimuladas, o estimuladas con 17-estradiol 10 nM.

En otro set experimental, las células fueron pre-tratadas con G15 1000 nM (antagonista farmacológico de GPR30) durante 30 min antes de ser estimuladas con G1 10 nM por 5 min. También se realizaron controles con células MCF-7 no estimuladas, o estimuladas sólo con 17-estradiol 10 nM. El objetivo fue determinar la posible fosforilación de MAPK ERK1/2 y p38 producida por la estimulación de GPR30.

2.2.4. Separación de proteínas por electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Todas las electroforesis se realizaron según el método de Laemmli (1970) con algunas modificaciones. Cada una de las muestras se mantuvo a –20ºC en igual volumen de buffer de muestra 2x [Tris 0.06 M; glicerol 10% p/v (Merck); 2-mercaptoetanol 0.5% v/v (Sigma Chemical Co.) y SDS 4.6% p/v (Merck), luego se tomó un volumen de muestra correspondiente a la cantidad de proteínas necesaria para cada ensayo. Las muestras fueron hervidas por 3 min junto con el estándar preteñido de proteínas de peso molecular conocido (Winkler); se dejaron enfriar y se colocaron en los respectivos surcos del gel (aproximadamente 50 g de proteínas totales por surco) y fueron separadas mediante electroforesis en

geles de poliacrilamida al 12.5 % en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS) y 2β-mercaptoetanol. Los geles de poliacrilamida fueron preparados de acuerdo a las siguientes proporciones:

Gel Separador (12.5%): Para preparar este gel se usaron 3.6 ml de buffer inferior (Tris-HCl 1.5 M pH 8.3; SDS 0.4%); 6.12 ml de solución de acrilamida al 30% (acrilamida 29.2% y bisacrilamida 0.8%; GIBCO BRL, Life Technologies); 4.68 ml de agua destilada; 37.5 µl de persulfato de amonio al 10% (Sigma Chemical Co.) y 30 µl de Temed (GIBCO BRL; Life Technologies).

Gel Espaciador: Se preparó mezclando 0.94 ml de buffer superior (Tris-HCl 0.5 M pH 6.8; SDS 0.4%); 0.6 ml de solución de acrilamida al 30%; 2.22 ml de agua destilada; 20 µl de persulfato de amonio al 10% y 10 µl de TEMED.

La gelificación se realizó entre dos placas de vidrio con espaciadores de teflón de 1.5 mm. Las dimensiones del gel separador fueron: ancho 100 mm y alto 65 mm. Sobre este se colocó el gel espaciador que tenía una altura aproximada de 10 mm midiendo desde la parte baja de los surcos hasta el gel separador. Para realizar la electroforesis se usó un buffer de corrida que contenía Tris 0.02 M, glicina 0.05 M y SDS 0.1%. Una vez cargadas las muestras, se realizó la electroforesis a un voltaje constante de 100 V por aproximadamente 3 h.

2.2.5. Electrotransferencia de proteínas a membranas de Inmobilon P

La transferencia se llevó a cabo utilizando el método de Towbin y col. (1979) con algunas modificaciones. Una vez hecha la electroforesis se colocó sobre el gel una membrana de Inmobilon P ® que fue previamente sumergida en metanol absoluto por 15 seg y luego equilibrada en tampón de transferencia [Tris 0,02 M, glicina 0,15 M, y metanol al 20%] por al menos 5 min. Estando la membrana sobre el gel, se cubrió con papel filtro y esponja por ambos lados, los que habían sido

previamente humedecidos en tampón de transferencia. Luego se colocaron en una cámara de electrotransferencia húmeda, orientando la membrana hacia el polo positivo del circuito. La transferencia se realizó a 50 mA por 15 h usando el buffer antes señalado. A continuación, la membrana fue desprendida del gel y lavada para su posterior incubación con los anticuerpos respectivos.

El gel se fijó por 1 h en una solución que contenía: isopropanol al 25% y ácido acético al 5% (Winkler). Las proteínas se tiñeron por 20 min con una solución de azul de Coomassie R250 al 0.1% (p/v) en metanol al 50% y ácido acético al 5%. El colorante no unido a las proteínas se eliminó agitando el gel en una solución de ácido acético al 7,5% y metanol al 5% por 3 h. Este último procedimiento tuvo por objeto verificar una migración homogénea de las proteínas y la eficiencia de su transferencia a la membrana de inmobilon.

2.2.6. Inmunotinción de electrotransferidos e identificación de GPR30 y de las MAPK ERK1/2 y p-38 fosforiladas

Cada membrana de inmobilon se dejó secar por 15 min en una estufa a 25ºC y se incubó durante la noche en agitación constante a temperatura ambiente con el anticuerpo primario respectivo, diluido en Tween-20 y 5% BSA-libre de inmunoglobulinas.

Para la inmunodetección de GPR30 en las líneas celulares de cáncer de mama se incubaron las correspondientes membranas usando anticuerpos comerciales dirigidos contra un dominio extracelular (Abcam 188790) e intracelular (Abcam 39742) del receptor. Ambos anticuerpos corresponden a una IgG policlonal de conejo y fueron usados a una dilución 1:2000. Su unión a la membrana fue detectada incubando por 1 h con un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa y evidenciando la actividad enzimática mediante un kit de quimioluminicencia (Pierce).

El patrón de fosforilación de MAPKs fue analizado usando un anticuerpo anti-fosfoMAPKs, monoclonal hecho en ratón, que reconoce específicamente p44mapk y p42mapk fosforiladas (Cell Signaling) y un anticuerpo policlonal que reconoce de manera específica las formas fosforiladas de p38 (Cell Signaling). Ambos anticuerpos fueron usados a una dilución de 1:2000. La detección del anticuerpo unido a la membrana se realizó como ya fue descrito.

Las bandas inmunoreactivas fueron detectadas usando película fotográfica Kodak BioMax ML. Como control de la cantidad de proteína colocada en cada surco las membranas fueron incubadas con una solución que contiene Tris-HCl 62.5 mM a pH 7.4, 2-mercaptoetanol 100 mM y SDS al 2% por 30 min a 50ºC. Este tratamiento removió los anticuerpos adheridos durante la primera inmunodetección. Posteriormente la misma membrana fue incubada con un anticuerpo policlonal anti-GAPDH (gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa) a una dilución de 1:2000. En este caso se usó como segundo anticuerpo una anti-IgG de conejo conjugada a peroxidasa y luego quimioluminiscencia como fue descrito previamente.

2.2.7. Viabilidad celular

2.2.7.1. Tratamiento agudo de las células MCF-7 y MDA-MB-231 con diferentes concentraciones de tamoxifeno

Las células fueron sembradas en placas de seis pocillos (700.000 células/pocillo), crecidas hasta 80% de confluencia en medio completo y sincronizadas por 48 h en medio base carente de rojo fenol y sin SBF antes de ser tratadas por 30 min con tamoxifeno 2, 5 y 20 µM. Estas concentraciones de tamoxifeno han sido ampliamente utilizadas en los experimentos que buscan evaluar los efectos in vitro del fármaco sobre las células de cáncer de mama ER-positivas. Posteriormente, las células fueron tratadas durante 24 h con 17-estradiol 10 nM. Paralelamente, se dispuso de células sin tratar (mantenidas en medio base sin rojo fenol y sin SBF) que se usaron como controles negativos.

2.2.7.1.1. Reducción de MTT

Luego de tratar las células con tamoxifeno, se retiró el medio base y fueron suavemente tripsinizadas; se detuvo la tripsinización y se realizó un lavado con PBS. A continuación, las células fueron tratadas con el reactivo bromuro de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)2,5 difeniltetrazolio (MTT), el cual al ser metabolizado (reducido) en las mitocondrias forma una especie insoluble en agua de color azul intenso denominada formazán. Las células que recibieron alguna injuria, producto del tratamiento con distintas dosis de tamoxifeno, redujeron su metabolismo mitocondrial, produciendo una menor concentración de formazán.

Por medio de esta técnica se evaluó el posible efecto citotóxico agudo de tamoxifeno, sobre las líneas de cáncer de mama estrógeno-sensibles o -insensibles.

La lectura de la densidad óptica (DO) se realizó en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm. Los resultados se graficaron de acuerdo a las absorbancias obtenidas para cada tratamiento en particular.

2.2.7.1.2. Incorporación de azul tripano

Esta técnica se aplicó como metodología complementaria, para estimar la viabilidad celular. Luego de los tratamientos descritos en el punto 2.2.7.1.1, las células fueron lavadas con PBS y resuspendidas en medio Hank´s estéril. A cada alícuota en particular, se le aplicó un colorante de carácter aniónico denominado azul de tripano en una proporción de 1:1 durante 1 min. Este colorante se introduce en las células que presentan algún daño en la membrana celular indicando el número de células muertas presentes en la muestra. Las células que incorporaron el colorante se observaban de color azul bajo el microscopio óptico, mientras que las células vivas permanecían incoloras.

Se usó una cámara de Neubauer, para contar el número de células a un volumen estandarizado. Los resultados se graficaron como porcentaje de células muertas versus sus respectivos tratamientos.

2.2.7.2. Proliferación celular: Generalidades de la técnica

Se utilizó un inmunoensayo colorimétrico, que constituye una alternativa no radiactiva para la cuantificación de la proliferación celular. Esta prueba tiene una sensibilidad comparable a la que usa timidina tritiada y se basa en la incorporación de BrdU (5-bromo-2`-deoxi-uridina), un análogo de timidina en células que alcanzan la fase S del ciclo celular. Se agregó BrdU 10 µM a cada uno de los pocillos con células y se incubó por 2 h. Luego de remover el medio de cultivo, las células se fijaron y el DNA fue denaturado a temperatura ambiente por 30 min con la solución Fix-Denat. Posteriormente, se detectó la incorporación de BrdU al DNA, incubando en un baño termorregulado a 22ºC por 1.5 h con un anticuerpo F(ab)2 anti-BrdU-peroxidasa (1:200) (Roche). Luego de lavar con un buffer comercial preparado para tal fin, la peroxidasa fue revelada utilizando el sustrato tetrametil-benzidina, reacción que fue detenida aproximadamente a los 5 min mediante la adición de ácido sulfúrico 1 M. El color desarrollado fue cuantificado a una longitud de onda fija de 450 nm en un lector de ELISA.

La detección se realizó en microplacas de 96 pocillos y la BrdU es parte de un kit que mide proliferación celular, siendo directamente proporcional la relación entre absorbancia y cantidad de DNA sintetizado.

2.2.7.3. Controles y cuantificación de los resultados

En todos los experimentos se realizaron controles positivos, correspondiente a células tratadas con medio completo en que los factores de crecimiento presentes en el SFB al 10% produjeron la máxima estimulación de las células. Los controles negativos o basales, correspondieron a células no estimuladas, incubadas sólo con medio base (sin rojo fenol y sin SFB). Además, realizamos controles propios de la técnica cuyo procedimiento fue siempre el mismo en cada uno de los experimentos: controles de células sin marcar con BrdU y controles de pocillos sin células, pero tratados paso a paso con todos los reactivos del inmunoensayo; razón por la cual los consignaremos sólo en éste punto y no en cada uno de los experimentos.

A cada una de las lecturas arrojadas por el lector de ELISA, se les restó la absorbancia promedio de los controles de la técnica con el fin de eliminar el background, es decir, pocillos tratados con todos los reactivos, pero sin células, y pocillos con células, pero no tratadas con reactivos. Los valores obtenidos se promediaron, y se estimó el correspondiente error estándar.

2.2.7.3.1. Efecto de G1 y 17-estradiol sobre las células MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB-231

Las células MCF-7 y ZR75-1 fueron cultivadas en las condiciones descritas previamente (20.000 células/200 µl de medio completo por pocillo, hasta alcanzar 80% de confluencia). Las células de cada pocillo se lavaron con Hank`s estéril, se le colocó 200 µl de DMEM carente de rojo fenol y de SFB; luego de 24 h se retiró el medio base y las células fueron estimuladas con diferentes concentraciones de G1 (0,1, 1, 10, 100, 500 y 1000 nM) por 24 h. También se evaluó el efecto de G15 (1, 1000 y 10000 nM) sobre la actividad proliferativa (incubación durante 30 min). Se lavaron las células con PBS para

eliminar cualquier tipo de residuo, y se incubaron en medio base por 24 h. Adicionalmente, las células estrógeno sensibles fueron preincubadas durante 30 min con G15 (1, 1000 y 10000 nM) y luego fueron estimuladas con G1 100 nM o 17β-estradiol 10 nM durante 24 horas. Cada estímulo se diluyó en medio base, a un volumen final de 100 µl por pocillo. Los controles negativos se realizaron incubando las células con DMEM carente de rojo fenol y SFB por 24 h.

En otro grupo experimental, las células MDA-MB-231 fueron cultivadas (10.000/200 µl de medio completo por pocillo) y se estimularon con G1 100 nM, G15 1000 nM o con 17-β-estradiol 10 nM en las mismas condiciones ya descritas. Se dispuso de células no estimuladas (control negativo) o mantenidas en medio completo con suero bovino fetal 5% (control positivo) por 24 h.

Estos experimentos se realizaron para determinar la concentración de G1 o de 17-β-estradiol capaz de inducir una proliferación significativa de las células sensibles a estrógenos; y evaluar un posible efecto proliferativo sobre las células estrógeno insensibles, MDA-MB-231.

2.2.7.3.2. Efecto del pretratamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles con diferentes concentraciones de tamoxifeno o 4-OH-tamoxifeno.

Las células MCF-7 y ZR75-1 una vez crecidas y sincronizadas, fueron pre-tratadas durante 30 min con 20 nM tamoxifeno o 4-OH-tamoxifeno en medio base carente de rojo fenol y sin SBF; concentraciones equivalentes a las encontradas en el plasma de las pacientes con terapia farmacológica. En otro set experimental, las células fueron pretratadas con 2000 nM de tamoxifeno o 4-OH-tamoxifeno en medio base; una concentración similar a la encontrada en el tejido de las pacientes tratadas farmacológicamente. A continuación, las células se estimularon o no con 10 nM de E2 ó con 100 nM de G1 por 24 h, como se describió anteriormente. También se dispuso de células sin tratar (controles negativos). Todos los experimentos se realizaron a un volumen final de 100 µl de medio base carente de rojo fenol por pocillo.

El objetivo de estos experimentos fue determinar el efecto del pretratamiento con tamoxifeno o de 4- OH-tamoxifeno sobre la proliferación inducida por G1 o 17β-estradiol en las células estrógeno sensibles.

2.2.7.3.3. Efecto del pretratamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles con inhibidores de EGFR y de las vías ERK1/2 y p38

Las células MCF-7 y ZR75-1 fueron pretratadas por 30 min con 10 µM de AG1478 un inhibidor de EGFR. En otro set experimental fueron pre-tratadas durante 30 min con el inhibidor de la vía de la MAPK ERK1/2, PD98059 (10 µM), o con SB203538 (10 µM), un inhibidor de la vía MAPK p38. Luego, se procedió a la estimulación con 100 nM de G1 o 10 nM de 17-β-estradiol a un volumen final de 100 µl por pocillo por 24 h. Se controló el efecto de cada inhibidor preincubando las células por 30 min con cada uno de ellos y luego dejándolas en medio base durante las 24 h que duró la incubación con los estímulos. Se incluyeron controles en que las células fueron estimuladas directamente con 100 nM de G1 o 10 nM de 17-β-estradiol por 24 h, y células sin tratamientos (controles negativos).

2.2.8. Medición de la actividad de MMP-9 y MMP-2 mediante zimografía

Las células MCF-7 fueron sembradas en un número de 400.000 células por placa de cultivo (30 mm de diámetro), fueron crecidas hasta 80% de confluencia en medio completo. Luego, fueron sincronizadas por 48 h en medio base sin rojo fenol y sin SBF. Se pretrataron con 10 µM de G15 por 30 min; se descartó el medio base con el antagonista, y se realizó un lavado con PBS. A continuación, las células fueron estimuladas con G1 100 nM o de 17-estradiol 10 nM. Los controles negativos consistieron en células mantenidas en medio base, sin estimular. Luego de 24 h, el medio con los tratamientos fue rescatado de las monocapas celulares y centrifugado a 4 °C para eliminar cualquier contaminación célular. Luego, las gelatinasas de las muestras se concentraron incubando los sobrenadantes con perlas de agarosa-gelatina (Sigma). Después de agitación por una noche a 4 ° C, la mezcla se centrifugó y se

eluyeron con tampón de muestra. Las proteínas se separaron inmediatamente en un gel de SDS-PAGE al 7,5% que contenía 1 mg/ml de gelatina. Después de la electroforesis, el gel se lavó durante 1 h en un tampón que contiene 2,5% de Triton X-100 y luego se incubó durante la noche en un tampón de digestión que contenía calcio y zinc a 37 °C con agitación constante. Después de teñir el gel con azul brillante Coomassie R-250, la aparición de bandas claras fue indicativa de actividad gelatinasa. Los geles se visualizaron utilizando un transiluminador, fueron escaneados y las bandas comparadas con el peso molecular de MMP-2 (73 kDa) y de MMP-9 (92 kDa). Finalment, las bandas fueron cuantificadas por densitometría.

2.2.9. Mediciones de calcio intracelular

Las tres líneas celulares fueron crecidas y sincronizadas en medio base (sin rojo fenol y sin suero) y carente de antibióticos, durante 48 h. Luego, fueron tripsinizadas suavemente, lavadas con PBS e incubadas en oscuridad con la sonda fluorescente radiométrica Indo-1 AM, 5 mM (Life Technologies) en HBSS a una concentración de 5 x 106 células/ml durante 30 min a 37 °C. Las células se lavaron con PBS, se resuspendieron en tampón que contenía (mM): 25 Hepes, 125 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 0,5 MgCl2, 1 NaH2PO4, 0,1% de albúmina de suero bovino y 0,1% de glucosa (pH 7,4).

Las células MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB-231 fueron estimuladas con ATP 1, 10 o 100 nM. El objetivo de estos ensayos fue determinar la capacidad fisiológica de las líneas de cáncer de mama, para movilizar calcio intracelular. Consecuentemente, se estableció como protocolo, estimular a las células con ATP 10 nM previo a la realización de cada uno de los experimentos que a continuación se detallan.

Las células MCF-7 fueron estimuladas con diferentes concantraciones de 17-estradiol (0.1, 1 y 10 nM) ó G1 (1, 10 y 100 nM) para determinar la concentración de agonista capaz de inducir una mayor

movilización de calcio intracelular. Posteriormente, las células MCF-7 y ZR75-1 fueron estimuladas con 17-estradiol 10 nM ó G1 100 nM; con el fin de evaluar las diferencias en la magnitud de movilización de calcio intracelular desencadenadas por los agonistas y comparar dicha respuesta entre ambas líneas celulares. Estos mismos tratamientos, fueron realizados en las células estrógeno- insensibles MDA-MB-231. Adicionalmente, las células fueron pretratadas durante 5 minutos con el antagonista G15 (1000 nM) y luego estimuladas con 17-estradiol 10 nM o G1 100 nM.

Dada la importancia de tamoxifeno y su principal metabolito 4-hidroxitamoxifeno en el tratamiento del cáncer de mama estrógeno-sensible, se realizaron nuevos ensayos preincubando durante 5 min a las células MCF-7 o ZR75-1 a concentraciones similares a las encontradas en el plasma de las pacientes tratadas con tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno 20 nM. En otro set experimental, las células fueron preincubadas con estos fármacos a concentraciones similares a las encontradas en el tejido de las pacientes (2000 nM). A continuación, las células fueron estimuladas con 17-estradiol 10 nM o con G1 100 nM. El objetivo de estos ensayos, fue investigar si estos moduladores selectivos de estrógeno tenían algún efecto sobre la liberación de calcio intracelular desencadenada por GPR30.

Todas Las mediciones se llevaron a cabo en un compartimiento de cubeta termostatizado bajo agitación continua, en un espectrofluorímetro LS55 (Perkin Elmer) usando una longitud de onda de excitación de 330 nm, y se recogieron las emisiones de 405 nm y 480 nm. Los datos se expresaron usando la relación de forma radiométrica entre la absorbancia a 405 nm y el punto isosbéstico (480 nm).

2.2.10. Ensayo del “cierre de la herida en monocapa”

Las células MCF-7 y ZR75-1 fueron sembradas en un número de 700.000 células por condición (en placas de seis pocillos, previamente tratadas con 0,1 mg/ml de colágeno), crecidas hasta confluencia en medio completo y luego sincronizadas por 48 h en medio sin rojo fenol y SBF. A continuación, fueron tratadas con mitomicina (5 g/ml) por 90 min, en un medio de cultivo suplementado con 2% SBF. Posteriormente, se realizó una “herida” en la monocapa celular con una punta de micropipeta de 20 a 200 l estéril, se retiró el medio suplementado con SFB, y se lavó con PBS para descartar todos los restos celulares. Se tomó fotografía considerando este momento como el tiempo 0. Luego, las células fueron pretratadas por 30 min con G15 1000 nM (antagonista de GPR30) y 10 µM de PD98059 o de SB203538, inhibidores de las vías de MAPK ERK1/2 y p38, respectivamente. En otro set experimental, las células fueron preincubadas por 30 min con AG1478 10 µM, inhibidor de la tirosina quinasa intrínseca de EGFR. Adicionalmente, verificamos el efecto del silenciamiento de GPR30, en células tratadas durante 24 h con un siRNA comercial. Todas las diluciones se realizaron en medio base carente de rojo fenol y SFB. Se descartó el medio con el antagonista o con los inhibidores, se hizo un lavado con PBS y se procedió a la estimulación con G1 100 nM o 17β-estradiol 10 nM por 48 h. Igualmente se incluyeron controles en que las células fueron estimuladas directamente con G1 o 17β- estradiol y células sin tratamiento mantenidas por 48 h en medio base sin rojo fenol y SBF (control negativo). Transcurridas 48 h se realizaron nuevas capturas fotográficas.

Posteriormente, se calculó el área de la herida para cada caso con ayuda del Software Image J y se realizó el cálculo de cierre de la herida (expresada como porcentaje) para cada tratamiento y tiempo correspondiente.

2.2.11. Análisis de datos y gráficos

Se efectuaron a lo menos dos experimentos independientes por triplicado (es decir, un experimento o una misma condición experimental realizada por tres veces). Posteriormente, se realizó un test de significancia (t-student), donde un valor de P< 0.05 fue considerado como estadísticamente significativo, y consignado por medio de un asterisco (*).

3. RESULTADOS

3.1. EXPRESIÓN Y VISUALIZACIÓN DE LA PROTEÍNA DE GPR30 EN LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER DE MAMA

Se ha estimado que un alto porcentaje de los tumores de mama que son ERα-positivos, son también GPR30-positivos. En consecuencia, un modelo celular que imite en parte lo que ocurre en estos tumores, correspondería a líneas celulares que expresen ambos tipos de receptores de estrógeno. Por ello en mis experimentos utilicé la línea celular MCF-7 y también las células ZR75-1, ambas clasificadas como “sensibles a estrógeno”, es decir, que responden a 17β-estradiol. El primer paso fue medir en ellas los niveles de GPR30. Como contraparte, a modo de control negativo natural (puesto que no expresa ERα ni GPR30) utilicé las células MDA-MB-231. La determinación de los niveles proteicos de GPR30 fue realizada mediante western blotting y usando dos anticuerpos, uno contra un segmento peptídico intracelular y otro dirigido contra un dominio extracelular. Ambos anticuerpos revelaron la presencia de una banda de 55 kDa en las dos líneas celulares sensibles a estrógeno que como era de esperar no fue detectada en las células MDA-MB-231 (Figura 1B).

También determiné in vivo la localización del receptor, en células MCF-7. Para esto, las células en cultivo fueron incubadas con el anticuerpo dirigido contra el segmento peptídico extracelular a 4ºC y luego fueron fijadas con paraformaldehído. La visualización del anticuerpo unido fue realizada mediante incubación con un anticuerpo secundario fluorescente. Esta estrategia mostró claramente que existe una presencia importante de GPR30 en la membrana celular de las células de cáncer de mama MCF-7 (Figura 2).

Figura 1. Niveles proteicos de GPR30 en líneas celulares de cáncer de mama. (A) Para la realización de los diferentes ensayos, las tres líneas celulares fueron cultivadas hasta subconfluencia (20X). Se señala el estatus para ambos receptores de estrógeno para cada tipo celular. (B) Uso de anticuerpos comerciales (Abcam) dirigidos contra el tercer dominio extracelular e intracelular de GPR30. La imagen es representativa de al menos 3 experimentos distintos en duplicado.

Figura 2. Inmunovisualización de GPR30 en células MCF-7. Las células vivas se incubaron a 4ºC con un anticuerpo comercial dirigido contra el tercer dominio extracelular de GPER-1. Una vez fijadas las células con p-formaldehído al 4%, se incubaron con un segundo anticuerpo fluorescente. La inmunofluorescencia se analizó mediante microscopía confocal. (A) Las flechas indican GPR30 inmunomarcado en la membrana celular. (B) Imagen control correspondientes a células en las que el primer anticuerpo fue reemplazado por suero no inmune. (adaptado de Molina et al., 2017).

3.2. 17β-ESTRADIOL Y EL AGONISTA FARMACOLÓGICO DE GPR30 (G1) INDUCEN LA LIBERACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES

Uno de los eventos cruciales para muchas respuestas celulares, corresponde a la liberación de calcio intracelular. No obstante, muy pocos trabajos abordan este tópico en el contexto del cáncer de mama. A su vez, se ha establecido que las células de cáncer de mama sensibles a 17β-estradiol, movilizan calcio intracelular cuando son estimuladas con esta hormona. Sin embargo, permanecen aún muchos puntos no esclarecidos acerca de los mecanismos que gatillan esta respuesta intracelular, así como el rol de los receptores de estrógeno en la ocurrencia de esta respuesta.

Utilizando las líneas de cáncer de mama MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB-231 evalué primero la liberación de calcio intracelular luego de estimular las células con adenosín trifosfato (ATP). Ello con el fin de establecer las respuestas homeostáticas de movilización de calcio intracelular en las tres líneas celulares mencionadas. Como era de esperar, en las tres líneas celulares ATP produjo aumento del calcio intracelular (Figura 3). Cada una de las líneas celulares evaluadas responden fuertemente al estímulo con ATP, y de una manera dosis-dependiente. Naturalmente, ATP es capaz de movilizar calcio intracelular, mediante mecanismos que no involucran directamente a los receptores de estrógeno, hecho que será abordado con mayor detalle en la Discusión. Además, en cada uno de los experimentos, se usó el detergente no iónico tritón X-100 (TX-100) como agente permeabilizante de la membrana celular, y se finalizó cada medición aplicando el agente quelante EGTA [(etilenglicol-bis (β- aminoetiléter)-N,N,N', ácido N'-tetraacético]. Estos tratamientos se incluyeron de manera habitual en todos los experimentos de movilización de calcio, pero se consignarán solamente en este punto (Figura 3).

En otros experimentos, las células fueron sometidas a un pulso o estímulo con diferentes concentraciones de G1, el agonista específico de GPR30 (Figura 4) o se estimularon con diferentes dosis de 17β-estradiol (Figura 5). Estos experimentos buscaron determinar la movilización de calcio intracelular inducidas por GPR30 (estimulado por G1) y por los receptores de estrógeno en su conjunto (estimulados con 17β-estradiol.) Se observa que tanto G1 como 17β-estradiol fueron capaces de inducir un incremento dosis-dependiente del calcio intracelular en ambas líneas celulares sensibles a estrógeno (Figuras 4 y 5), alcanzándose los mayores niveles de movilización de calcio intracelulares con G1 100 nM y con estrógeno 10 nM. Simultáneamente, se evaluó la respuesta de las células MDA- MB-231 frente a los mismos estímulos, o sea G1, 17β-estradiol y G15 (antagonista de GPR30) (Figura 5, recuadro arriba a la derecha). En este caso y como era de esperar, dada la ausencia de los receptores de estrógeno nucleares y de membrana en este tipo celular, ninguno de los estímulos aumentó los niveles de calcio intracelular, ratificando la ausencia de los receptores de estrógeno en esta línea celular de cáncer de mama.

Figura 3. Efecto de adenosín trifosfato (ATP) sobre la movilización de calcio intracelular en tres líneas celulares de cáncer de mama. Las células MCF-7, ZR75-1 y MDA-MB-231 fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Cada tipo celular fue estimulado con ATP 1, 10 y 100 nM. En cada experimento, las células fueron sometidas al efecto permeabilizador de tritón X-100 y a continuación al quelante de calcio, EGTA. La imagen es representativa de al menos 3 experimentos distintos.

Figura 4. Efecto de diferentes concentraciones de G1 (agonista de GPR30) sobre la liberación de calcio intracelular en dos líneas celulares de cáncer de mama estrógeno sensibles. Las células MCF-7 y ZR75-1 fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Posteriormente, fueron estimuladas con G1 1, 10 y 100 nM. Vehículo corresponde a DMSO 0,01%. La imagen es representativa de al menos 3 experimentos distintos.

Figura 5. Efecto de diferentes concentraciones de 17β-estradiol (E2) sobre la liberación de calcio intracelular en tres líneas celulares de cáncer de mama. Las células MCF-7 y ZR75-1 (ambas, estrógeno sensible) fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/ Ca2+. Posteriormente, fueron estimuladas con 17β- estradiol 0,1, 1 ó 10 nM. Vehículo: DMSO 0,01%. Recuadro: células MDA-MB-231 estimuladas con E2 10 nM, G1 100 nM y G15 (antagonista de GPR30) 1000 nM. Se muestran experimentos representativos provenientes de al menos 3 experimentos independientes.

3.3. GPR30 CONTRIBUYE A LA MOVILIZACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR INDUCIDA POR 17- ESTRADIOL

Una vez establecidas las concentraciones óptimas capaces de generar una movilización de calcio intracelular significativa en respuesta a la estimulación con 17β-estradiol y G1 en las líneas celulares MCF-7 y ZR75-1 (Figura 5), me propuse determinar si efectivamente, la respuesta de las células cuando eran estimuladas con G1 ocurría específicamente a través de GPR30. Para ello, las células fueron pretratadas durante 5 minutos con G15 1000 nM, un antagonista farmacológico de GPR30 y luego fueron estimuladas con G1 100 nM. Dicho procedimiento, logró inhibir el aumento intracelular de calcio producido por G1, reduciéndolo prácticamente a niveles comparables a las de las células tratadas sólo con vehículo (Figura 6). Sin embargo, la inhibición resultó ser parcial cuando las células, pretratadas con el antagonista G15, recibieron un pulso con 17β-estradiol (Figura 7). El promedio de la cuantificación del área bajo la curva de estos últimos tratamientos (Figura 7), permite determinar una inhibición de la respuesta gatillada por 17β-estradiol de un 70% aproximadamente. Dicho porcentaje, puede ser atribuible a la contribución específica de GPR30 en la movilización de calcio intracelular gatillada por estrógeno, dado que las células, previo al estímulo con esta hormona, fueron pretratadas con el antagonista farmacológico, G15.

Figura 6. Efecto de G1 sobre la liberación de calcio intracelular en dos líneas celulares de cáncer de mama, pretratadas o no con G15, un antagonista específico de GPR30. Las células fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Posteriormente, fueron pretratadas o no durante 5 min con G15 1000 nM, y luego estimuladas con G1 100 nM (agonista específico de GPR30). Vehículo: DMSO 0,01%. Las barras indican la media del área bajo la curva durante 300 segundos y error estándar de 10 experimentos; todos los demás experimentos que se continúan fueron cuantificados de la misma forma. ** P <0.01, respecto al vehículo o a G1, respectivamente.

Figura 7. Efecto de 17β-estradiol (E2) sobre la liberación de calcio intracelular en células de cáncer de mama estrógeno sensibles, pretratadas o no con el antagonista de GPR30 (G15). Las células fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Luego, fueron pretratadas o no por 5 min con G15 1000 nM y estimuladas con 17β- estradiol 10 nM. Vehículo: DMSO 0,01%. Las barras indican la media del área bajo la curva y error estándar de 10 experimentos. **P <0.01 respecto a E2, ***P<0.001 respecto al vehículo. Recuadro: Porcentaje de inhibición de la respuesta de las células MCF-7 y ZR75-1 a 17β-estradiol, luego del pretratamiento con G15 1000 nM, en un experimento representativo.

Tamoxifeno es el fármaco de primera línea para el tratamiento del cáncer de mama clasificado como estrógeno sensible (ERα-positivo). Adicionalmente, se ha establecido que gran parte de los efectos de tamoxifeno, son propiciados por 4-hidroxitamoxifeno, uno de sus principales metabolitos.

Antes de utilizar estos fármacos y considerando la diversidad de concentraciones utilizadas por otros autores in vitro, determiné en las líneas celulares MCF-7 (estrógeno sensible) y MDA-MB-231 (estrógeno insensible), un eventual efecto citotóxico de tamoxifeno. Sólo cuando tamoxifeno se usó a la concentración de 20 M se observó una disminución de la viabilidad, evidenciada por dos métodos independientes (Figura 8).

Algunos estudios han mostrado que las concentraciones de tamoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno alcanzadas en el tejido de las pacientes con cáncer de mama ERα-positivo, son muy superiores (en el orden de hasta unas 100 veces) a las alcanzadas en el plasma (Végvári et al., 2016). Por ello, evalué el efecto del pretratamiento de las células estrógeno sensibles con concentraciones de tamoxifeno o de 4- hidroxitamoxifeno equivalentes a las halladas tanto en plasma como en el tejido de las pacientes con tratamiento farmacológico, para luego estimular con 17β-estradiol o con G1 (Figuras 9-11).

Debido a que la terapia con tamoxifeno se extiende en el tiempo, también determiné el efecto del fármaco sobre los niveles de GPR30 en las células MCF-7 tratadas de manera crónica con tamoxifeno 1000 nM (Figura 12). Estos últimos experimentos, tuvieron como objetivo buscar una relación plausible de GPR30 con la resistencia del tumor de mama sensible a estrógeno tratado con tamoxifeno.

Figura 8. Efecto del tratamiento de las células MCF-7 (estrógeno sensible) y MDA-MB-231 (estrógeno insensible) con diferentes concentraciones de tamoxifeno (TX). Las células fueron pretratadas durante 30 min con tamoxifeno 2, 5 ó 20 µM, y luego estimuladas o no durante 24 h con 17β-estradiol (E2) 10 nM. A continuación, se evaluó la viabilidad celular por medio del ensayo de reducción de 3-(4,5 dimetiltiazol-2-il)2,5 difeniltetrazolio (MTT) y mediante la tinción vital con azul tripano (detalles en Materiales y Métodos) (expresada en porcentaje de células muertas). Los gráficos de barras indican el error estándar de 3 experimentos independientes. ** P <0.01, ***P<0.001 respecto a las células basales tratadas sólo con el vehículo (DMS0 0,01%).

Figura 9. Tamoxifeno o 4-OHtamoxifeno a una concentración similar a la existente en el plasma de pacientes bajo tratamiento farmacológico, no reducen la liberación de calcio intracelular gatillada por 17β-estradiol, en células de cáncer de mama estrógeno sensibles. Las células fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Posteriormente, fueron pretratadas o no durante 5 min con tamoxifeno (TX) o 4- hidroxitamoxifeno (4-OHTX) 20 nM, y estimuladas con 17β-estradiol (E2) 10 nM. Vehículo: DMSO 0,01%. Las barras indican la media del área bajo la curva y error estándar de 10 experimentos. **P <0.01 y *** P <0.001 respecto al vehículo, # no significativo respecto a 17β-estradiol.

Figura 10. Tamoxifeno y 4-OHtamoxifeno a concentraciones similares a las presentes en el tejido de pacientes tratadas farmacológicamente, reducen significativamente la liberación de calcio intracelular gatillada por 17β-estradiol, en células MCF-7. Las células fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. (A) Las células fueron pretratadas o no durante 5 min con tamoxifeno (TX) o 4- hidroxitamoxifeno (4-OHTX) 2000 nM, y estimuladas con 17β-estradiol (E2) 10 nM. (B) En el gráfico, las barras indican la media del área bajo la curva y error estándar de 10 experimentos. *P <0.05 respecto a E2, *** P <0.001 respecto al vehículo (DMSO 0,01%). Recuadro: porcentaje de respuesta a 17β-estradiol, atribuible a ERα, en un experimento representativo.

Figura 11. Tamoxifeno y 4-hidroxitamoxifeno a concentraciones similares a las presentes en el tejido de pacientes tratadas farmacológicamente, no reducen la liberación de calcio intracelular gatillada por el agonista G1, en células MCF-7. Las células fueron cargadas con la sonda fluorescente Indo-1 AM y luego resuspendidas en buffer HEPES/Ca2+. Posteriormente, fueron pretratadas o no durante 5 min con tamoxifeno (TX) o 4- hidroxitamoxifeno (4-OHTX) a una concentración de 2000 nM, y luego estimuladas con el agonista específico de GPR30 (G1) 100 nM. Las barras indican la media del área bajo la curva y error estándar de la respuesta a G1 en 10 experimentos independientes. **P <0.01 respecto al vehículo (DMSO 0,01%), tamoxifeno (TX) o 4-hidroxitamaxifeno (4-OHTX), respectivamente.

Figura 12. El tratamiento crónico con tamoxifeno induce un incremento en la expresión proteica de GPR30 en células MCF-7, estimuladas a diferentes tiempos con tamoxifeno 1000 nM. Las células fueron expuestas de manera crónica (siete días) a 1000 nM de tamoxifeno, como se describió en Materiales y Métodos. Luego fueron despertadas, crecidas, sincronizadas, y estimuladas con tamoxifeno 1000 nM durante 24, 48 y 72 h. Paralelamente, se dispuso de células control, no tratadas con tamoxifeno. Para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo comercial dirigido contra un dominio intracelular del receptor. Se realizó un análisis de densitometría. Las barras representan la media y error estándar de la media de 3 experimentos distintos. * P< 0.05, ** P<0,001 en relación a sus respectivos basales.

3.5. GPR30 INDUCE LA ACTIVACIÓN DE MAPK ERK1/2 Y p38 EN LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES

Entre las vías de señalización que explican en parte, los efectos celulares desencadenados por 17β- estradiol en condiciones fisiológicas y también en el cáncer de mama estrógeno sensible, destaca la activación de la vía de señalización MAPK ERK1/2. Esta vía de señalización está asociada tanto a la proliferación como a la diferenciación celular, estando en muchos casos además asociada a la transactivación de receptores tirosina quinasa como EGFR (HER1/ErbB1) una vez que ha ocurrido la activación de un GPCR (por ej. GPR30). Por lo tanto, determiné, en las células MCF-7 el efecto de 17β- estradiol 10 nM o de G1 100 nM, sobre la activación de la vía MAPK ERK1/2 (Figura 13). La estimulación de estas células con 17β-estradiol o con G1 resultó en una clara y rápida fosforilación de ERK1/2 que se extendió por aproximadamente 30 min con ambos estímulos. No obstante, la intensidad de la fosforilación fue mayor luego de aplicar 17β-estradiol. Adicionalmente, se verificó la especificidad del efecto atribuible a GPR30 mediante el pretratamiento de las células con el antagonista G15, procedimiento que como era esperable, inhibió casi en su totalidad la fosforilación causada por G1 (Figura 13). También se exploró una probable activación de la vía MAPK p38 dependiente de GPR30, la cual hasta el momento no había sido descrita tras la estimulación de este receptor (Figura 14).

Figura 13. Tanto 17β-estradiol como el agonista farmacológico de GPR30 inducen la fosforilación de MAPK ERK 1/2 en células MCF-7. (A) Las células fueron tratadas por 2, 5, 10, 15 o 30 min con 17β-estradiol (E2) 10 nM o con G1 (100 nM). (B) Las células fueron preincubadas o no durante 30 min con G15, un antagonista de GPR30 (1000 nM), y luego estimuladas durante 5 min con el agonista G1 100 nM. Se dispuso de células basales (DMSO 0,01%) o estimuladas por 5 min con 17β-estradiol 100 nM. Para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo comercial que reconoce ERK1/2 fosforiladas. Se realizó un análisis densitométrico para estimar el grado de fosforilación. Las barras representan la media y error estándar de la media de 3 experimentos distintos. * P< 0.05 respecto a basal o E2, # no significativo en relación al basal.

Figura 14. La estimulación de GPR30 induce la fosforilación de MAPK p38 en células MCF-7. (A) Las células fueron estimuladas con G1 a concentraciones de 10, 100 y 1000 nM durante 5 min. (B) Las células fueron preincubadas o no durante 30 min con G15 1000 nM y luego estimuladas durante 5 min con G1 100 nM. Se dispuso de células basales (DMSO 0,01%) o estimuladas por 5 min con 17- estradiol 100 nM. Para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo comercial que reconoce las formas fosforiladas de p38. Se cuantificó la intensidad de la fosforilación luego de un análisis densitométrico de las bandas en el blot. Las barras representan la media y error estándar de la media de 3 experimentos distintos. * P< 0.05 respecto al basal, # no significativo en relación al basal.

3.6. LA ESTIMULACIÓN DE GPR30 INCREMENTA LA PROLIFERACIÓN EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES

El aumento en la capacidad proliferativa, es una de las características más conspicuas del cáncer de mama. Por lo tanto, evalué los efectos de diferentes concentraciones del agonista específico de GPR30 sobre la proliferación en las células estrógeno sensibles MCF-7 y ZR75-1 (Figura 15). En ambas líneas celulares se observó que G1 producía un aumento significativo de la proliferación celular en un rango de concentraciones que iba de 0,1 a 100 nM, mientras que concentraciones mayores del agonista (500 a 1000 nM) generaban un aumento, aunque significativo comparado con las células no estimuladas, menor que la concentración de 100 nM. La respuesta obtenida con G1 fue comparable en magnitud con aquella producida por 17β-estradiol 10 nM en las mismas células estrógeno sensibles (Figura 15). Cuando se trató a las células MDA-MB-231 con estas mismas moléculas y además con 17β-estradiol se comprobó que ninguno de estos ligandos era capaz de aumentar la proliferación celular (Recuadro Figura 15). Por su parte, G15, el antagonista sintético de GPR30 no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular aun cuando se usó un amplio rango de concentraciones que iba de 1 a 10000 nM (Figura 15).

Establecidas las condiciones en las cuales se obtuvo una respuesta proliferativa significativa en las células estrógeno sensibles, realicé pretratamientos con G15, y luego estimulé con el agonista G1, para evaluar la especificidad de la respuesta producida por el agonista. A continuación, se evaluó la contribución de GPR30 a la respuesta proliferativa gatillada en las células MCF-7 y ZR75-1 por 17β- estradiol 10 nM (Figura 16). Estos experimentos permitieron concluir que aproximadamente un 50% de la respuesta proliferativa gatillada por 17β-estradiol sería producida por activación de GPR30 mientras que la otra mitad podría ser responsabilidad de la estimulación de ER (Figura 16).

Figura 15. Efecto de las diferentes dosis del agonista y antagonista de GPR30 sobre la proliferación celular, en tres líneas de cáncer de mama. Las células fueron estimuladas con 0.1, 1, 10, 100, 500 y 1000 nM de G1, durante 24 h. En otros experimentos, las células fueron tratadas por 30 min con G15 (antagonista de GPR30) 1, 1000 y 10000 nM. Se dispuso de células en estado basal (DMSO 0,01%) y de células estimuladas por 24 h con 17β- estradiol (E2). Los resultados se graficaron de acuerdo a la incorporación de BrdU. Las barras representan la media y error estándar de la media de 3 experimentos distintos realizados por triplicado. * P< 0.05, respecto a los tratamientos con G1, # no significativo respecto al basal. Recuadro: células MDA-MB-231, estimuladas con E2 10 nM, G1 100 nM, G15 1000 nM, o 5% de suero bobino fetal (SBF).

Figura 16. La estimulación de GPR30 produce un aumento de la proliferación celular, y contribuye hasta en un 50% en la respuesta proliferativa desencadenada por 17β-estradiol, en las células de cáncer de mama estrógeno sensibles. (A) Las células fueron preincubadas durante 30 min con diferentes dosis de G15 y luego estimuladas por 24 h con G1 100 nM. (B) Las células fueron preincubadas por 30 min con G15 1000 nM y luego estimuladas por 24 h con 17β-estradiol (E2) 10 nM. Basal (DMSO 0,01%). Las barras representan la media y error estándar de la media de 3 experimentos distintos realizados por triplicado. **P< 0.01 respecto a E2, *** P< 0.001 respecto a basal, # no significativo en relación al basal. (C) Porcentaje de inhibición de la respuesta a 17β-estradiol para cada tipo celular en un experimento representativo.

3.7. TAMOXIFENO Y 4-HIDROXITAMOXIFENO NO REDUCEN LA PROLIFERACIÓN CELULAR DEPENDIENTE DE GPR30 EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES

El pretratamiento de las células MCF-7 o ZR75-1 con tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno, a una concentración equivalente a la del plasma o tejido de las pacientes tratadas farmacológicamente, no logró reducir la respuesta proliferativa desencadenada por el agonista de GPR30 (Figura 17). Es más, se observó que tamoxifeno y 4-OHTX, a una concentración de 2000 nM, aumentan por si solos la proliferación celular, en las líneas de cáncer de mama sensibles a estrógeno (Figuras 17 y 18). Es interesante constatar, que tamoxifeno, es además capaz de gatillar la fosforilación de MAPK ERK1/2, una vía involucrada con proliferación celular (Figura 18).

No obstante, ambos moduladores selectivos de estrógeno, a esta misma concentración (2000 nM) sí reducen de manera significativa la respuesta proliferativa desencadenada por 17β-estradiol 10 nM (Figura 19).

Figura 17. Tamoxifeno o 4-OHtamoxifeno a una concentración similar a la del plasma o a la del tejido de pacientes con tratamiento farmacológico, no reducen la proliferación celular gatillada por G1, en células de cáncer de mama sensibles a estrógeno. (A) Las células fueron preincubadas por 30 min con tamoxifeno (TX) o 4-hidroxitamoxifeno (4-OHTX) 20 nM (concentración similar a la presente en el plasma de pacientes con cáncer de mama) y luego estimuladas por 24 h con G1 100 nM. (B) Las células fueron preincubadas durante 30 min con tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno 2000 nM (concentración similar a la detectada en el tejido de pacientes con cáncer de mama) y luego estimuladas por 24 h con G1 100 nM. Basal (DMSO 0,01%). Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos, realizados por triplicado. * P< 0.05 respecto al basal, ***P< 0.001 respecto al basal, # no significativo en relación a las células tratadas sólo con G1.

Figura 18. Tamoxifeno induce la fosforilación de MAPK ERK1/2 en células MCF-7. Las células fueron tratadas con tamoxifeno (TX) 2000, 5000 o 20000 nM durante 30 min. Se dispuso de células controles en estado basal tratadas con DMSO 0,01% o estimuladas 24 h con 17β-estradiol 100 nM. Para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo comercial que reconoce las formas fosforiladas de ERK42 y ERK44. Se realizó un análisis de densitometría para estimar la intensidad de la fosforilación. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos. * P< 0.05, ***P< 0.001.

Figura 19. Tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno a una concentración similar a la detectada en el tejido de pacientes con tratamiento farmacológico, reducen la proliferación celular gatillada por 17β- estradiol en células de cáncer de mama sensibles a estrógeno. Las células fueron preincubadas durante 30 min con tamoxifeno (TX) o 4-hidroxitamoxifeno (4- OHTX) 2000 nM y luego estimuladas por 24 h con 17β-estradiol (E2) 10 nM. Las células en estado basal corresponden a células tratadas de la misma manera, pero no estimuladas. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos, realizados por triplicado. * P< 0.05, **P<0.01, ***P< 0.001 en relación a las células en estado basal. *P<0.05 y **P<0.01 entre las células pretratadas con TX o 4-OHTX y aquellas estimuladas sólo con E2.

3.8. GPR30 INDUCE LA MIGRACIÓN CELULAR Y LA LIBERACIÓN DE MMP-9 Y MMP-2 EN CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES, ESTIMULADAS CON 17β-ESTRADIOL

Determiné la capacidad de GPR30 para inducir la migración celular (mediante el ensayo del cierre de la herida) en las células MCF-7 y ZR75-1, las cuales fueron pretratadas con el antagonista G15, o fueron transfectadas con un siRNA específico de GPR30 antes de ser estimuladas con 17β-estradiol o G1 (Figuras 20 y 21). La efectividad de la transfección fue verificada mediante la inmunodetección de la proteína GPR30 por western blot, técnica que evidenció una disminución clara de la proteína de GPR30 en las células transfectadas (Figura 20). Tanto 17β-estradiol (Figura 20) como G1 (Figura 21) aumentaron significativamente la migración de las células de cáncer de mama sensibles a estrógeno, un efecto que se vió claramente disminuido cuando se usaron células transfectadas con el siRNA de GPR30 o cuando fueron tratadas con G15 (Figuras 20 y 21).

Dada la importancia de las metaloproteinasas 9 y 2 durante el proceso de migración celular, un evento clave durante el desarrollo del cáncer de mama, se evaluó su liberación por las células MCF-7 y ZR75- 1, estimuladas con 17β-estradiol o G1. Ambas metaloproteinasas fueron secretadas al medio de incubación en respuesta a la estimulación con 17β-estradiol o G1. Similar a lo observado durante los experimentos de migración celular, la liberación al medio de ambas metaloproteinasas disminuyó cuando las células fueron tratadas con G15 antes de la estimulación con los agonistas (Figura 22).

Figura 20. Efecto de 17β-estradiol sobre la migración de células de cáncer de mama sensibles a estrógeno. Las monocapas celulares fueron sincronizadas y tratadas con mitomicina antes de realizar una “herida” con una punta de micropipeta estéril. Se tomaron fotografías (0 h) y las células fueron preincubadas con G15 1000 nM por 30 min previo a la estimulación con 17β-estradiol (E2) por 48 h. También se dispuso de células tratadas con un siRNA de GPR30, cuya efectividad fue evaluada mediante western blotting para GPR30 (recuadro). Se calculó el área de la herida para cada tratamiento y se expresó en porcentaje. Mock: células control tratadas sólo con lipofectamina. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos. * P< 0.05, **P<0.01, ***P< 0.001.

Figura 21. G1 incrementa la migración celular en las células de cáncer de mama sensibles a estrógeno. Las células fueron crecidas hasta confluencia, tratadas con mitomicina, y luego se realizó una “herida” en cada monocapa celular usando la punta estéril de 200 l. Se tomaron fotografías (0 h) y las células fueron preincubadas durante 30 min con G15 1000 nM. También se usaron células transfectadas con un siRNA de GPR30. Posteriormente, las células fueron estimuladas o no durante 48 h con G1 100 nM, realizándose las correspondientes tomas fotográficas (48 h). Mock: células control tratadas sólo con lipofectamina. Se determinó el área de la herida y al fin del experimento se calculó el porcentaje de cierre. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos. ***P< 0.001 en relación al basal o a las células Mock.

Figura 22. 17β-estradiol y G1 aumentan la secreción de MMP-9 y MMP-2 en células MCF-7. Las células fueron crecidas hasta un 80% de confluencia, sincronizadas, y pretratadas o no durante 30 min con G15 1000 nM. Luego, fueron estimuladas con G1 100 nM o con de 17β-estradiol (E2) 10 nM por 24 h. Basal: DMSO 0,01%. Posteriormente, se rescató el medio de cultivo. La presencia de MMP-9 y MMP-2 fue determinada mediante zimografía. Las bandas fueron comparadas con el peso molecular de MMP-9 y MMP-2, y cuantificadas por densitometría. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos. **P<0.05 y **P< 0.01 en relación a las células estimuladas con G1 o con E2.

3.9. LA INHIBICIÓN DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN DE EGFR, ERK1/2 Y p38 REDUCEN LA PROLIFERACIÓN Y LA MIGRACIÓN CELULARES EN LAS LÍNEAS DE CÁNCER DE MAMA ESTRÓGENO SENSIBLES

Se ha determinado que parte de los efectos de GPR30 dependen de la transactivación de EGFR. Por ello, determinamos el efecto del pretratamiento de las células MCF-7 y ZR75-1 con un inhibidor específico de la tiroquinasa intrínseca del receptor, compuesto que inhibirá toda la mencionada vía río abajo. Del mismo modo se utilizaron inhibidores tradicionalmente utilizados para bloquear la vía MAPK ERK1/2 y p38, y así determinar qué efecto tiene la inhibición particular de cada una de estas vías sobre la proliferación y migración celular promovida por 17β-estradiol o G1 (Figuras 23 y 24).

El uso de estos inhibidores mostró que todas las vías evaluadas participan en el efecto proliferativo producido por G1 o por 17β-estradiol dado que la preincubación de las células con estos inhibidores disminuyó significativamente la respuesta proliferativa inducida por ambos agonistas (Figura 23).

Resultados similares se obtuvieron cuando los inhibidores fueron usados en experimentos de migración celular (cierre de la herida), donde se observó una acentuada disminución del cierre de la herida post- tratamiento de las células con cada uno de estos inhibidores (Figura 24).

Figura 23. Participación de EGFR y MAPK ERK1/2 y p38 en la señalización gatillada por G1 o 17β- estradiol. Las células fueron preincubadas con inhibidores de las vías ERK1/2 (PD98059), y p38 (SB2035389 o con un inhibidor de la tirosina quinasa intrínseca de EGFR (AG1478) a una concentración de 10 µM. Luego, fueron estimuladas o no por 24 h con G1 100 nM o 17β-estradiol 10 nM. Las células en estado basal (controles negativos) recibieron sólo DMSO 0,01%. Las barras representan la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos, realizados por triplicado. * P< 0.05, entre células pretratadas con inhibidor previo a la estimulación con E2 y G1 y las estimuladas directamente con G1 o E2; ***P< 0.001, entre basal y estimuladas con E2 o G1; # no significativo.

Figura 24. Participación de EGFR y MAPK ERK1/2 y p38 en la migración celular promovida por G1. Las células fueron crecidas hasta confluencia, tratadas con mitomicina, y luego se realizó una “herida” en la monocapa celular con una punta de micropipeta, estéril. A continuación, las células fueron preincubadas con los inhibidores de EGFR (AG1478) y de la vía ERK1/2 (PD98059) y p38 (SB2035389) a una concentración de 10 µM. Posteriormente, las monocapas fueron estimuladas o no durante 48 h con G1 100 nM. Se calculó el área de la herida y se determinó el porcentaje (%) de cierre, para cada tratamiento. Las barras representan a la media y error estándar del promedio de 3 experimentos distintos. ***P< 0.001 entre monocapas en estado basal y aquellas estimuladas con G1 y entre éstas y las pretratadas con inhibidores.

4. DISCUSIÓN

4.1. GPR30: UN RECEPTOR DE ESTRÓGENO NO CONVENCIONAL

Los receptores de estrógeno, han sido considerados históricamente como receptores nucleares que actúan, además, como factores de transcripción. No obstante, investigaciones recientes, dejan en relieve que estrógeno (17β-estradiol) no sólo ejerce sus efectos a través de los receptores nucleares clásicos ERα y ERβ (y sus respectivas isoformas) sino que también a través de GPR30/GPER-1. Este receptor al igual que otros receptores acoplados a proteínas G, presenta un extremo N-terminal que está fuera de la célula y un extremo C-terminal localizado intracelularmente. Al utilizar un anticuerpo comercial dirigido contra los 16 aminoácidos del tercer dominio extracelular y células vivas, se observó un claro delineamiento de la membrana celular, confirmando que su destino final es la membrana plasmática y que las localizaciones intracelulares descritas anteriormente en el retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi, reflejan etapas intermedias presentes durante la síntesis de la proteína. La distribución de los diferentes receptores de estrógeno en el contexto celular, es relevante, dado que está relacionado con las posibles funciones de estos receptores (Figura 25).

Se ha cuestionado fuertemente, si GPR30, es o no un receptor de estrógeno. Dichas interrogantes, se originan en parte, por la propia naturaleza del receptor, el cual pertenece a la enorme familia de receptores acoplados a proteína G, los cuales, dependiendo del tipo, responden a una gran cantidad y variedad de estímulos. Adicionalmente, varios estudios demuestran que GPR30 puede interactuar de manera funcional con una serie de moléculas derivadas de productos químicos de origen antropogénico (xenoestrógenos) o derivados de las plantas (fitoestrógenos), cuyas estructuras y efectos son similares a la hormona 17β-estradiol presente en los mamíferos.

Figura 25. Distribución subcelular de los diferentes receptores de estrógeno. Los receptores de estrógeno pueden estar localizados tanto en la membrana celular (GPR30), como en el citoplasma y núcleo celular, como es el caso de ERα y sus isoformas ERα46 (el cual no transloca hacia el núcleo) y ERα36 (cuya localización nuclear no ha sido demostrada) y ERβ. El repertorio de los receptores de estrógeno es bastante variable, y depende de cada tipo celular y tejido.

Empero, recientemente se ha demostrado interacciones de los xeno y fitoestrógenos con los receptores de estrógeno canónicos, en particular con ERα (Molina et al., 2018) Adicionalmente, tal como he mencionado anteriormente (Introducción), los estrógenos corresponden a una serie de hormonas, de las cuales 17β-estradiol si bien es referencial, debido a que presenta una mayor potencia biológica en el período reproductivo de la mujer, no es la única forma de estrógeno fisiológico (Molina et al., 2017); por ello actualmente, se les denomina en su conjunto a estas hormonas, como estrógenos endógenos. Todas estas moléculas pueden actuar como agonistas sobre los receptores de estrógeno, lo que da cuenta de un grado importante de promiscuidad de estos receptores. Es más, los diversos ligandos que interactúan con los receptores de estrógeno canónicos y con GPR30, corresponden a un elemento central, pero no el único, que determinan las respuestas generadas por los receptores de estrógeno descritos hasta el momento (Tabla 1).

Con todo, mis ensayos demuestran que GPR30 responde de manera efectiva a 17β-estradiol gatillando rápidas respuestas intracelulares (como movilización de calcio intracelular o activación de MAPK ERK1/2 y p38) o promoviendo una respuesta proliferativa y de migración en líneas celulares utilizadas tradicionalmente como modelos de cáncer de mama estrógeno sensible, confirmando que es un receptor de estrógeno. Estos aspectos y otros de mi trabajo doctoral serán discutidos con más detalle a continuación.

Tabla 1. Factores que influyen en la respuesta celular a los estrógenos.

4.2. GPR30 GATILLA UNA RESPUESTA RÁPIDA DE MAPK

Las vías de transducción de señales de proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) se conservan evolutivamente en los eucariotas y son claves en varios procesos biológicos, incluido el crecimiento celular, la diferenciación, la apoptosis, la inflamación y las respuestas al estrés ambiental. Cuando se estimula a las células MCF-7 con 17β-estradiol se observa una rápida fosforilación de MAPK ERK1/2. Fosforilación que es evidente entre los 2 a 15 min de estimulación, y que es más fuerte entre los 5 y 10 min., reduciéndose, aunque no completamente a la media hora de estímulo. Diversas investigaciones muestran este patrón de respuesta a 17β-estradiol en las células de cáncer de mama; atribuyéndose esta respuesta a ERα en su fase de actividad “citoplasmática rápida”. Cuando estimulé a las células MCF-7 con G1 100 nM (agonista específico de GPR30) obtuve una mayor fosforilación de MAPK ERK1/2 a los 5 min de estímulo. Anteriormente, otros autores habían evidenciado esta rápida capacidad de GPR30 para activar MAPK ERK1/2, pero en células MCF-7 resistentes a tamoxifeno (Ignatov et al., 2010; Wang et al., 2013). La activación de ERK1/2 resultó ser específica, puesto que el pretratamiento con G15 (antagonista específico de GPR30), redujo a niveles comparables a los basales, la respuesta gatillada por G1. De manera interesante, si comparamos los niveles de fosforilación de ERK1/2 gatilladas por 17β-estradiol o G1 en el mismo set experimental, observamos que no hay diferencias significativas entre ellas.

Se ha determinado que la ruta MAPK ERK1/2 se activa mediante eventos río arriba y/o por la activación de múltiples eventos de señalización que convergen en este importante punto de intersección (Burotto, 2014). Recientes publicaciones indican que la vía ERK1/2 puede actuar tanto como un supresor tumoral, así como una vía pro-oncogénica (Burotto, 2014; Feng et al., 2017). El efecto predominante dependería, aparentemente, de la intensidad de la señal y del contexto o tejido en el que la señal se activa. Recientemente Zhang et al., (2014) estudiando una isoforma de ERα (ERα36) han

determinado que este receptor citoplasmático también es capaz de activar la vía de ERK1/2 en células MCF-7 transfectadas con ERα36.

Si observamos las vías de señalización intracelular descritas tanto para ERα como para GPR30, determinamos un posible punto de convergencia con la actividad de EGFR, debido a que GPR30 transactiva a este receptor tirosina quinasa. Algunos autores, han señalado el posible rol colaborador de GPR30 en la señalización rápida generada por ERα (Levin, 2009). Mis resultados, indican que más que un rol colaborativo, es muy factible que se desarrollen respuestas conjuntas, si consideramos que ERα puede llegar a ser transactivado por GPR30.

Postulo diversas modalidades de interacción entre GPR30 y ERα en células que presenten ambos tipos de receptores de estrógeno; tomando como base los siguientes eventos cardinales: i) interacción ligando- receptor (lo que supone la activación del receptor), ii) activación de los efectores de la respuesta intracelular (incluyendo las respuestas rápidas, y las respuestas nucleares), y iii) efecto celular final (evidenciada por ejemplo, a través de un aumento de la proliferación o migración celular). Naturalmente, cada uno de estos receptores puede en la célula tumoral, desarrollar una respuesta individual, pero también pueden generar una conversación cruzada entre GPR30 y ERα, según lo comentado más arriba; o incluso un efecto cooperativo entre ambos receptores para potenciar una respuesta celular en común (Figura 26).

Otro de los subgrupos de MAPK, p38, ha sido relacionada con una amplia gama de procesos biológicos complejos, como la proliferación y diferenciación celular, la muerte celular, la migración y la invasión. Esta vía desempeñaría un papel dual regulando tanto la muerte como la supervivencia celular (Koul et al., 2013). No obstante, hasta el momento no se había descrito la activación de p38 dependiente de GPR30. Mis ensayos en las células MCF-7 muestran una fosforilación de p38 a los 5 min postestimulación con G1 100 nM, efecto que tiene una importante disminución luego del pretratamiento de las células con el antagonista G15 1000 nM. El significado de la

Figura 26. Posibles mecanismos de interacción entre GPR30 y ERα en las células de cáncer de mama. Los tumores de mama ERα/GPR30 positivos pueden activar respuestas celulares (a través de las moléculas de señalización o efectoras) de manera autónoma (“Efecto independiente”), o GPR30 transactivar a ERα a través de las moléculas efectoras (“Conversación cruzada”) o bien ambos receptores, una vez activados por sus ligandos, pueden potenciar el efecto de las moléculas efectoras o de las vías de señalización (“Efecto cooperativo”), generando en éste última opción, una respuesta celular más potente en relación a las respuestas inducidas por GPR30 o ERα de manera individual.

activación de MAPK p38 por parte de GPR30 requiere de una profundización mayor. Se ha establecido que la ruta de señalización de p38 se activa en respuesta a diversos estímulos y media su función mediante componentes río abajo de p38. La función específica de MAPK p38 parece depender no solo del tipo celular, y de los estímulos, sino que también de la isoforma asociada a la activación (p38α, p38β, p38γ y p38δ). Un interesante estudio que utilizó células MCF-7 transfectadas con un plásmido que producía un pequeño RNA interferente que inhibe la expresión de p38, demostró un aumento en la expresión de ERα, pero eliminó la expresión de ERβ. Además, la tasa de proliferación se redujo significativamente en comparación con los controles, en cultivos a corto plazo (Mendoza et al., 2011). El análisis de la base de datos de The Cancer Genome Atlas revela que la isoforma p38δ está altamente expresada en prácticamente todos los tipos de cáncer de mama. Recientemente, un estudio que utilizó un conjunto de tejidos de cáncer de mama, confirmaron la elevación de esta proteína en el tejido canceroso, y su mayor expresión está relacionada con un aumento en la progresión y metástasis del cáncer de mama (Wada et al., 2017).

Otro tipo de quinasas activadas por mitógenos relacionadas con el cáncer de mama, corresponden a las quinasas c-Jun N-terminal (JNKs). Esta vía responde a una amplia variedad de estímulos, y participa en la apoptosis, diferenciación y proliferación. Hasta la fecha se han descrito diez isoformas derivadas de 3 genes: jnk1, jnk2 (ubicuas) y jnk3 (principalmente en cerebro). JNK se ha asociado consistentemente con el desarrollo neural y la neuroprotección. Es más, se ha establecido una fuerte expresión de GPR30 en la región CA1 hipocampal y en el giro dentado (Tang et al., 2014). En estas localizaciones, GPR30 gatilla señales de sobrevida a través de la activación de AKT y ERK1/2 y disminuye la activación de JNK, y en consecuencia, las señales proapoptóticas (Tang et al., 2014).

Otros estudios focalizados en el cáncer de mama, reportan en murinos que la deleción de los genes Jnk1 y Jnk2, genera un aumento en la formación de los tumores mamarios (Cellurale et al., 2012). Dicha observación ha sido ratificada recientemente, asociándose la pérdida de estos genes a una mayor inestabilidad genómica y a la rápida formación de tumores en el tejido mamario de los ratones (Girnius et al., 2018). En consecuencia, es factible atribuir a esta vía un rol protector frente a esta neoplasia. Sin

embargo, en el tumor de mama triple negativo, las JNKs promoverían la tumorigénesis a través de la activación de c-Jun (Xie et al., 2017). No obstante, a pesar de la importancia de esta vía de señalización en el desarrollo fisiológico de la mama (Cellurale et al., 2012), y su papel protector o promotor de tumores, hasta el momento no se ha descrito la activación de las JNKs a través de GPR30, ya sea en el tejido de mama normal o en el cáncer de mama, vía que tampoco fue evaluada en esta Tesis.

4.3. GPR30 INDUCE LA MOVILIZACIÓN DE CALCIO INTRACELULAR

Relativamente pocos estudios han abordado la liberación de calcio (Ca2+) intracelular gatillada por GPR30 o por ERα, en células de cáncer de mama. El calcio es un catión con una capacidad multifuncional para actuar como un segundo mensajero, resultando clave en la señalización intracelular y en una miríada de procesos fisiológicos relevantes en las células eucariotas, tales como la fecundación, proliferación celular, diferenciación, migración y apoptosis. Hay tres clases principales de proteínas asociadas a la membrana que están directamente involucradas en la homeostasis del calcio: canales, ATPasas (bombas) e intercambiadores. Los mecanismos moleculares que conducen al desarrollo del cáncer, así como los diferentes fármacos contra el cáncer, pueden alterar la señalización del calcio, y en consecuencia la homeostasis celular. Por ejemplo, alterar la expresión de canales selectivos de Ca2+, bombas o proteínas de unión a calcio, etc., a su vez podría modificar la capacidad del Ca2+ para regular tanto la muerte como la proliferación celular. Estos elementos, dan cuenta acerca de la versatilidad de Ca2+ para modular las respuestas celulares.

GPR30 moviliza Ca2+ intracelular, en las células MCF-7 y ZR75-1 (ERα/GPR30 positivas), cuando se estimulan con 17β-estradiol. Este efecto, fue ratificado mediante la estimulación de estas células con

el agonista farmacológico de GPR30, G1. Dicho resultado es equivalente a lo obtenido por Dennis et al. (2009) en las células SKBr3. Este tipo celular sobreexpresa HER2, pero carece de los receptores de estrógeno canónicos α y β, en consecuencia, ha sido utilizado en estudios que indagan los mecanismos de resistencia a Herceptin (Trastuzumab) en cánceres de mama que sobreexpresan HER2. Sin embargo, presentan de manera endógena GPR30, razón por la cual también se han utilizado como un modelo para determinar la actividad de GPR30 libre de una posible interacción con ERα (Dennis et al., 2009).

Mis resultados muestran que la respuesta a 17β-estradiol se ve en gran parte disminuida (60%-70%) luego de antagonizar a GPR30 mediante el pretratamiento de las células con G15. En consecuencia, es posible afirmar que un alto porcentaje de la movilización de calcio intracelular desencadenada por 17β-estradiol, en las células de cáncer de mama estrógeno sensibles, es gatillado por GPR30 y no puede ser atribuido exclusivamente a ER.

Los mecanismos por los cuales se produce la señalización de calcio intracelular en el cáncer de mama es aún materia de estudio y se encuentra en pleno desarrollo. La vía más frecuente de entrada de Ca2+ en las células no excitables es la denominada entrada capacitativa de calcio llamada también “store operated calcium entry” (SOCE) porque se activa con el vaciado de los depósitos intracelulares de calcio (principalmente en el retículo endoplásmico). Evidencia creciente apunta a que SOCE desempeña papeles críticos en la proliferación de células cancerígenas, la metástasis y la neovascularización tumoral (Casemore and Xing, 2015; Xie et al., 2016). En las células no excitables el incremento de las concentraciones de Ca2+ se realiza predominantemente a través de la vía del inositol 3-fosfato (Casemore and Xing, 2015). Existen dos clases de receptores que conducen a la liberación de inositol 3-fosfato por diferentes vías: los receptores que se acoplan a la proteína G y los receptores con función de tirosina-quinasas (RTK). Precisamente, tal como hemos consignado, GPR30 es un tipo de GPCR con capacidad de transactivar a EGFR, un receptor perteneciente a la familia RTK.

Otro de los mecanismos más estudiados, corresponde al rol de calmodulina para la actividad nuclear de ERα. Calmodulina es una proteína intracelular de baja masa relativa que se expresa en todas las

células eucariotas. Además, actúa como un receptor de calcio debido a que presenta cuatro sitios de unión al ion Ca2+, con una afinidad alta pero reversible. Se ha demostrado que el antagonismo de la función de calmodulina o la generación de construcciones de ERα mutantes en células MCF-7 que son incapaces de unir calmodulina, impiden que 17-estradiol induzca la actividad transcripcional de ERα. Ello sugiere que la asociación de ERα con calmodulina participa en la función de ERα en las células de carcinoma mamario. (Li et al., 2005; Gallo et al., 2008). Divekar et al. (2011) trataron a las células MCF-7 con EGF, ATP, calcio extracelular o cafeína con el fin de aumentar el calcio intracelular; desencadenando un reclutamiento de promotores de ERα que responden a estrógeno y estimulando la expresión de los genes que responden a 17-estradiol.

Los efectos de los moduladores selectivos de estrógeno sobre la movilización del calcio intracelular, han sido poco evaluados, incluso para tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno; sin embargo, un buen punto referencial para su estudio, consiste en saber las concentraciones relativas de estos fármacos en las pacientes bajo tratamiento. Kisanga et al., (2004) observaron niveles hasta 10 veces superiores de las concentraciones de tamoxifeno y su metabolito en el tejido respecto al suero en los sujetos de estudio. Recientemente, se ha encontrado, utilizando espectrometría de masas, que los diferentes compartimentos de los tejidos tumorales del cáncer de mama, contienen altos niveles de tamoxifeno en relación con las células tumorales ER-positivas, en comparación con el estroma de los mismos tejidos. Por su parte, las secciones de tejido provenientes de tumores ER-negativo muestran una menor intensidad de señal para el fármaco (Végvári et al., 2016). Estas investigaciones indican además que las concentraciones de tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno en el suero son bastantes más bajas que las alcanzadas en los tejidos de las pacientes con tratamiento farmacológico. Experimentalmente realicé pretratamientos de células MCF-7 y ZR75-1 con concentraciones de tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno equivalentes a las encontradas en el suero (20 nM) o en el tejido (2000 nM) de las pacientes tratadas. A estas concentraciones, ambos fármacos no reducen ni aumentan la movilización de calcio intracelular desencadenada por G1 en las células sensibles a estrógeno, indicando que esta respuesta es debida específicamente a GPR30. Por otro lado, el pretratamiento de las células con tamoxifeno o 4-

hidroxitamoxifeno 2000 nM reducen de manera significativa (30% aproximadamente) la movilización de calcio intracelular inducida por 17β-estradiol en células MCF-7.

Algunos ensayos muestran un rol dual de tamoxifeno o su metabolito induciendo movilización de Ca2+ intracelular y la muerte, en varios modelos celulares. Sin embargo, esta dualidad, puede deberse a lo menos en parte, a las altas concentraciones del fármaco utilizadas en los experimentos in vitro. Mis resultados indican que tamoxifeno 20 µM reduce de manera significativa la viabilidad celular; a su vez mis ensayos de exclusión de azul tripano muestran un efecto citotóxico no sólo en las células estrógeno sensibles (MCF-7) sino que también en células MDA-MB-231 (ERα/GPR30 negativas). De manera interesante, las investigaciones de Jan et al. (2000), muestran en células de riñón canino Madin Darby (MDCK) que tamoxifeno a concentraciones de 1 y 50 µM induce la movilización de calcio intracelular acompañado de citotoxicidad; sin embargo, el pretratamiento con tamoxifeno 5 µM anuló el aumento de calcio intracelular inducido por tapsigargina (inhibidor no competitivo de la Ca2+ ATPasa del retículo sarcoeplásmico). Otros investigadores han buscado relacionar la reducción de la proliferación celular, con la modificación de la señalización de calcio intracelular en células MCF-7 tratadas con tamoxifeno; sin embargo, tamoxifeno no tuvo efecto sobre la señalización de Ca2+ en estas células y en los cultivos primarios (Charlier et al., 1996; Zhang et al., 2000). Otro estudio, utilizando células humanas de la granulosa, determinó que tamoxifeno a pesar de generar aumentos transitorios en las concentraciones de Ca2+ citoplasmático, inhibió los efectos tanto de 17β-estradiol como de progesterona sobre la movilización de calcio intracelular (Younglai et al., 2005). Mis resultados sugieren que la movilización de calcio intracelular a través de la estimulación específica de GPR30, propicia la proliferación y migración celular en las líneas de cáncer de mama sensibles a estrógeno.

4.4. GPR30 PROMUEVE LA PROLIFERACIÓN Y LA MIGRACIÓN CELULAR

La mayoría de los cánceres de mama muestran las características típicas de las células epiteliales y expresan receptores de estrógeno nuclear (ERα) y/o de membrana (GPR30). En el cáncer de mama, la alta expresión de ERα se asocia estrechamente con la proliferación celular (Molina et al., 2009; Liao et al., 2013). Mis ensayos indican que 17β-estradiol 10 nM induce la proliferación y la migración celular en las líneas celulares MCF-7 y ZR75-1. El pretratamiento con G15, permite estimar que aproximadamente un 50% de la proliferación y migración celular es debido a la activación de GPR30. Estos resultados están en sintonía con la evidencia que indica que GPR30 está involucrado en la regulación de la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de mama (Qian et al., 2016; Molina et al., 2017). Se ha propuesto un mecanismo de acción no genómico para los efectos de los estrógenos en la proliferación de las células tumorales. Estas acciones no genómicas son rápidas e involucran a GPR30 y a la subsecuente activación de varias cascadas de proteína-quinasa (Lappano et al., 2013; Wróbel y Gregoraszczuk, 2013; Molina et al., 2017). La vía no genómica, ha sido analizada en esta tesis, con la fosforilación de MAPK ERK1/2 y p38, también con la liberación de calcio citoplasmático, gatilladas por GPR30 en las células de cáncer mamario sensibles a estrógeno. Mis resultados son concordantes con recientes investigaciones que sugieren que parte de las respuestas inducidas por estrógeno en el cáncer de mama no son dependientes del receptor canónico ERα (Qian et al., 2016).

La inhibición de la vía MAPK ERK1/2 y p38 reduce de manera notable tanto la proliferación celular como la migración desencadenadas por 17β-estradiol o G1 en ambas líneas de cáncer de mama ERα/GPR30 positivas. Estas vías de señalización han sido descritas mediando las respuestas de proliferación celular, pero también de migración celular (Sun et al., 2017; Cuenda and Sanz-Ezquerro, 2017). Una situación equivalente ocurre al utilizar un inhibidor específico de EGFR. Este receptor, ha despertado un interés creciente debido a su rol tanto en los tumores de mama triple negativo, así como

en los sensibles a estrógenos (Kyriakopoulou et al., 2018), y más recientemente por su asociación con GPR30. Es más, algunos autores estiman que la activación de la vía de las MAPK depende de GPR30 al transactivar EGFR (Prossnitz 2017).

Otro aspecto evaluado, relacionado con la capacidad de la célula tumoral para invadir tejidos adyacentes, y lejanos, mediante la degradación de la membrana basal y otros componentes de la matriz extracelular, correspondió a la liberación de metaloproteinasas de la matriz (MMP). Algunos estudios hacen referencia al nexo entre la liberación de MMP-2 y -9 con las hormonas esteroidales en el cáncer de mama (Nilsson et al., 2006). De hecho, se las ha relacionado directamente con procesos metastásicos y angiogénicos en el cáncer de mama (Nilsson et al., 2006). Mis experimentos señalan que 17β- estradiol y G1, inducen una significativa liberación de MMP-2 y -9 a través de la estimulación de GPR30, lo cual fue ratificado antagonizando la respuesta de GPR30 con el antagonista G15. Este resultado, confirma lo publicado recientemente (Chen et al. 2017), quienes demuestran que la estimulación de GPR30 induce la liberación de las metaloproteinasas que precisamente, fueron evaluadas en esta Tesis.

4.5. ¿ESTÁ GPR30 RELACIONADO CON LOS FENÓMENOS DE RESISTENCIA FARMACOLÓGICA, EN EL CÁNCER DE MAMA SENSIBLE A ESTRÓGENO?

El desarrollo de la resistencia farmacológica en el cáncer de mama, es uno de los tópicos más interesantes de estudiar, tanto por sus potenciales aplicaciones para el tratamiento de esta neoplasia, como por el entendimiento de los mecanismos que subyacen en la enfermedad. En mi tesis no abordé esta problemática directamente, sin embargo, obtuve algunos resultados que pueden relacionar a GPR30 con los fenómenos de resistencia a la terapia con tamoxifeno, en las células que expresan ERα, a saber: i) El pretratamiento de las células de cáncer de mama estrógeno sensible, con tamoxifeno y su metabolito 4-hidroxitamoxifeno 2000 nM, inducen una significativa proliferación celular (alrededor del doble respecto a las células no tratadas). No obstante, este efecto, logran reducir la proliferación celular gatillada por 17β-estradiol, pero no la promovida por el agonista de GPR30, G1. Anteriormente, Reddel and Sutherland (1984) y Zhang et al., (2003) han observado resultados similares en relación con la proliferación celular, en diferentes tipos de células de cáncer de mama, entre ellas MCF-7, tratadas farmacológicamente. ii) Tamoxifeno, especialmente a una concentración de 2000 nM, genera una temprana fosforilación de ERK1/2 en células MCF-7. Un estudio previo que refrenda o corrobora este resultado, corresponde al de Wang et al. (2013), quienes se focalizaron en células MCF-7 resistentes a tamoxifeno. iii) El tratamiento crónico de células MCF-7 con tamoxifeno, indujo mayores niveles de GPR30. Recientemente, Mo et al. (2013) han postulado a GPR30 como un iniciador de la resistencia a farmacológica en el cáncer de mama estrógeno sensible, a través de una mayor expresión de GPR30 en las neoplasias tratadas con tamoxifeno.

La resistencia a tamoxifeno es uno de los mayores obstáculos en la terapia endocrina. Esta resistencia puede ocurrir de novo o se adquiere después de la terapia hormonal. Los mecanismos son probablemente multifactoriales y permanecen en su mayoría desconocidos. Considerando la heterogeneidad molecular y celular del cáncer de mama y que los pacientes responden de manera diferente al tratamiento, incorporar el análisis molecular de la actividad de tamoxifeno y su influencia biológica sobre GPR30 podría ampliar los límites de la comprensión de los efectos del fármaco en las células diana. Propongo en un esquema simplificado, un posible mecanismo de resistencia de la célula neoplásica expuesta a tamoxifeno por tiempos prolongados. La figura da cuenta además sobre los principales efectos celulares determinados en mi tesis, que son dependientes de GPR30 (Figura 27).

Ligandos: 17β-estradiol, xenoestróegnos, fitoestrógenos o tamoxifeno (¿a través de GPR30?)

Figura 27. Mecanismo de resistencia de las células de cáncer de mama sensibles a estrógeno, a la terapia con tamoxifeno. La activación específica de GPR30 gatilla el aumento de calcio intracelular, y la fosforilación de las MAPK ERK 1/2 y p38; generando como respuestas, una mayor tasa de proliferación y migración celular, y un aumento de las MMP-2 y -9. Tamoxifeno a su vez, al actuar como ligando de GPR30, induce la activación de MAPK ERK 1/2, la cual transloca al núcleo, regulando hacia el alza la transcripción de GPR30; aumentando en consecuencia, la expresión de éste receptor en la membrana celular.

5. CONCLUSIONES

GPR30 se localiza primordialmente en la membrana de las células de cáncer de mama estrógeno sensibles, MCF-7. GPR30 gatilla a los 5 minutos la fosforilación de las vías de señalización MAPK ERK1/2 y p38, en células MCF-7 estimuladas con G1 (100 nM). La activación de GPR30 por 17β-estradiol (10 nM) o G1 (100 nM), induce la movilización de calcio intracelular en las células de cáncer de mama estrógeno sensibles. El pretratamiento con el antagonista G15 (1000 nM) permiten señalar que gran parte de esta actividad (60-70%) es atribuible de manera específica a GPR30. El pretratamiento con tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno (2000 nM) reducen de manera significativa (30% aproximadamente) la movilización de calcio intracelular inducida por 17β-estradiol, en células MCF-7. 17β-estradiol (10 nM) o G1 (100 nM) inducen la proliferación y la migración celular en las líneas celulares MCF-7 y ZR75-1. El pretratamiento con el antagonista G15 (1000 nM), permite estimar que un 50% de estas respuestas celulares se deben a la activación de GPR30. La inhibición de EGFR o de las vías MAPK ERK1/2 y p38 reducen de manera notable tanto la proliferación celular como la migración desencadenadas por 17β-estradiol o G1 en ambas líneas de cáncer de mama estrógeno sensibles. 17β-estradiol (10 nM) o G1 (100 nM), inducen una significativa liberación de MMP-2 y -9 a través de la estimulación de GPR30, lo cual fue ratificado antagonizando con G15 la respuesta de GPR30. Tamoxifeno o 4-hidroxitamoxifeno (2000 nM), generan una significativa proliferación, en las células estrógeno sensibles. A su vez, tamoxifeno (2000 nM) gatilla una temprana fosforilación de ERK1/2 en las células MCF-7. El tratamiento crónico de las células MCF-7 con tamoxifeno (2000 nM), indujo mayores niveles de GPR30. Estos hechos, apoyan fuertemente un papel de GPR30 en el desarrollo de la resistencia farmacológica en el cáncer de mama ERα positivo.

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Actividades realizadas durante el programa

Presentaciones Congresos Fecha Nombre Congreso Tipo de actividad (oral- poster-participa) Enero, 2018 INTERNATIONAL SYMPOSIUM CANCER AND IMMFLAMATION. Poster Valdivia, Chile. Enero, 2018 IV JORNADAS CIENTIFICAS DE LA FACULTAD DE CIENCIA, Oral UNIVERSIDAD SAN SEBASTIAN. Santiago, Chile. Diciembre, 2017 CELL SYMPOSIA: HALLMARKS OF CANCER. Ghent, Bélgica. Poster Octubre, 2016 PRIMERA JORNADA DE ESTUDIANTES DE POSTGRADO DE LA Oral FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS. Valdivia, Chile. Premiada, mejor presentación Agosto, 2016 XXXIV CONGRESO FARMACOLOGIA DE CHILE. Villarrica, Chile Participa Septiembre, 2016 ACCDiS CANCER SPRING SYMPOSIUM. Olmué, Chile. Poster Enero, 2015 INTERNATIONAL SYMPOSIUM CANCER AND IMMFLAMATION. Poster Valdivia, Chile. Agosto, 2015 VII JORNADAS ESTUDIANTES DE TECNOLOGIA MEDICA. Oral Valdivia, Chile Octubre, 2015 LVIII REUNION ANUAL DE LA SOCIEDAD DE BIOLOGIA DE Oral CHILE. Puerto Varas, Chile. Talleres, Seminarios, etc. Fecha Nombre Nombre organizador Enero, 2016 Curso: CUIDADO Y USO DE ANIMALES DE Bienestar Animal, UACh EXPERIMENTACION, ASPECTOS BIOETICOS Mayo, 2014 Curso: GENETICA HUMANA, APLICACIONES FORENSES Facultad de Ciencias, UACh Junio, 2014 Curso-taller: ESCRITURA DE TRABAJOS CIENTÍFICOS Ciencias Agrarias, UACh Julio-Noviembre, 2013 DIPLOMADO EN DOCENCIA UNIVERSITARIA Universidad de Aconcagua (UAC) Septiembre, 2013 Curso: PROTECCION RADIOLOGICA ACHS-Seremi de Salud, Valdivia

Publicaciones (Revistas ISI o no) Estado Año Autores, Título de la publicación, Nombre Revista (enviada, aceptada, publicada) 2017 Molina L, Figueroa CD, Bhoola KD, Ehrenfeld P. GPER-1/GPR30 a novel estrogen receptor sited in the cell membrane: therapeutic coupling to breast cancer. Expert Opin Publicada Ther Targets. 2017 Aug; 21(8):755-766.

2018 Figueroa CD, Molina L, Bhoola KD, Ehrenfeld P. Overview of tissue kallikrein and kallikrein-related peptidases in breast cancer. Biol Chem. 2018 Sep 25; 399(9):937-957. Publicada

2018 Molina L, Bustamante FA, Bhoola KD, Figueroa CD and Ehrenfeld P. Possible role of phytoestrogens in breast cancer via GPER-1/GPR30 signaling. Clinical Science. 2018 Publicada Dec 13;132(24):2583-2598. doi: 10.1042/CS20180885

2018 Felipe Bustamante, María Paz Miró, Zahady Dafnee Velásquez, Luis Molina, Pamela Ehrenfeld, Luis Federico Batiz. N-cadherin-based adherens junctions and cell polarity Enviada in the pathogenesis of neurodevelopmental disorders: a novel perspective on congenital Zika syndrome. Translational Research.

Actividades relacionadas con docencia Fecha Curso (nombre y código)- horas participación Coordinador

Otras actividades (por ej. Vinculación medio, etc.) Fecha Nombre Coordinador Septiembre 2014, 2015 VM: PARTICIPACION COMO CIENTIFICO-EVALUADOR CONICYT-EXPLORA Ronnie Reyes

Septiembre, 2016 VM: PARTICIPACION EN CONICYT-EXPLORA CON CHARLAS COLEGIO Ronnie Reyes SANTA MARTA, LA UNION (REGION DE LOS RIOS)

2016-2017 VM: Participación Núcleo de Estudio CISNe Pamela Ehrenfeld

Octubre, 2018 VM: “I Jornadas de Cáncer de mama” Pamela Ehrenfeld

______Firma Firma Luis Molina Calistro Carlos Figueroa Valverde

AUTORIZACIÓN

Por la presente declaración, yo Luis Alberto Molina Calistro, cédula nacional de identidad número 12594709-3, domiciliado en Montecarlo # 157, Valdivia, declaro lo siguiente:

PRIMERO: Que en el marco de mis estudios de postgrado adscrito al Programa de Doctorado en Ciencias Veterinarias realicé la tesis denominada “GPR30, un receptor de estrógeno no canónico, induce la activación de MAPK ERK1/2 y p38, y la movilización de calcio intracelular, aumentando la proliferación y migración, en células de cáncer de mama ERα positivas”

SEGUNDO: Que el académico responsable de mi trabajo fue el profesor (a) Dr. Carlos D. Figueroa Valverde.

TERCERO: Que en cumplimiento con lo dispuesto en la Política y Reglamento de Fomento de Propiedad Intelectual de la Universidad Austral de Chile, aprobados por Decretos número 022 y 023 de 2015, por este instrumento autorizo a la Universidad a mantener la tesis resultante del trabajo realizado durante mis estudios de postgrado, en biblioteca para consulta académica, y a publicarla en formato digital, a fin de que ésta cumpla con su misión de tener disponible a la sociedad el conocimiento que se genera en ella. En este mismo acto, autorizo a la Universidad, en caso de ser necesario, a mantener confidencial la tesis, memoria, seminario de título o equivalente realizado durante mis estudios de postgrado, y que contengan información confidencial o secretos industriales relacionados con la investigación sobre las que éstas versen.

Luis Alberto Molina Calistro

Valdivia, octubre 2018