Identificación Computacional y Corroboración Experimental de Nuevos Compuestos Líderes con Actividad Analgésica Trabajo de Diploma Autora: Leyanis Domínguez Martínez Tutores: Dr. Yovani Marrero Ponce Dr. Gerardo Casañola Martín MSc. Arelys Lopez Sacerio Asesor: Dr. Juan Alberto Castillo Garit . 2009 Pensamiento Vale más sabiduría que piedras preciosas; ¡ni lo más deseable se le puede comparar! Proverbios 8.11 Dedico este trabajo: A mi madre porque mis resultados son el fruto de años de esfuerzo y sacrificio suyo sin los cuales no hubiese llegado hasta aquí. Por ayudarme a diario con todas sus fuerzas y por su consagración durante toda mi carrera. A mi padre por mostrarme el camino de la superación y por ser un ejemplo para mí como profesional. Quiero agradecer: A mis tutores Arelis Lopez Sacerio y Gerardo M. Casañola Martín por su apoyo y dirección durante el desarrollo de este trabajo. A Juan Alberto Castillo Garit por su especial atención y asesoría durante el transcurso de este trabajo. A mis profesores gracias por transmitirme sus conocimientos con paciencia y dedicación durante estos cinco cursos. A mis compañeros de aula y a todos mis amigos. A mi madre y a mi padre por darme la vida, a mis tías Miriam y Vilma por apoyarme en todo y a toda mi familia. A mis tíos Lídice y Rubén por quererme sin medida y con voluntad. Y a todos aquellos que de una forma u otra me brindaron su ayuda durante este largo camino hasta mi meta final, mi carrera. A todos mis más sinceros agradecimientos Resumen El tratamiento del dolor asociado a patologías como el cáncer, infarto agudo del miocardio y enfermedades músculo-esqueléticas continúa siendo unos de los más importantes problemas de salud. En este trabajo el objetivo fundamental es identificar computacionalmente y luego corroborar experimentalmente nuevos candidatos analgésicos a través del programa TOMOCOMD-CARDD. En este sentido, primero se recolecta una base de datos de la literatura de compuestos a los que se le ha reportado la actividad analgésica para acceder al análisis y modelación confiable de la data. Luego de la selección de variables se emplean los índices cuadráticos estocásticos y no estocásticos basados en relaciones de enlace para la obtención de modelos QSAR-ADL. El mejor de los modelos obtenidos se seleccionó para demostrar el cumplimiento de los cinco principios de la Organización Europea para la Cooperación y el Desarrollo (OECD) dentro de los cuales resulta muy importante realizar un proceso de validación y evaluar el Dominio de Aplicación. Para demostrar la robustez de los modelos obtenidos se realiza una validación interna utilizando los métodos de Validación Cruzada (VC) y Y-Aleatoria. Además se desarrolla el estudio del Dominio de Aplicación demostrándose el poder predictivo de los mismos. Se aplicaron los modelos obtenidos al tamizaje virtual mediante el cual se identificaron varios fármacos utilizados en la terapéutica actual con otros usos farmacológicos y compuestos sintetizados por diferentes laboratorios como posibles analgésicos. Finalmente se evaluaron 6 compuestos de síntesis mediante Técnicas ELISA para IL-6 y todos ellos mostraron buena inhibición de dicha interleuquina proinflamatoria asociada al dolor neuropático. De forma general podemos concluir que el método TOMOCOMD-CARDD y el desarrollo de los modelos QSAR-ADL propuestos en este trabajo permiten la identificación/selección de nuevos compuestos líderes con actividad analgésica. Glosario…………………………………………………………………………………………..……….. Glosario λ Lambda de Wilks ΔP% Porcentaje de Clasificación AINEs Antiinflamatorios no esteroides ADL Análisis Discrimintante Lineal ADME Absorción, Distribución, Metabolismo y Excreción ADT Antidepresivos Tricíclicos AC Análisis de Cluster COX Ciclooxigenasa CV Cribado Virtual CARDD Computed-Aided ‘Rational’ Drug Design D2 Distancia de Mahalanobis DMs Descriptores Moleculares F Fisher FC Función de Clasificación FD Función Discriminante IL-6 Interleuquina 6 k-MCA Análisis de cluster de k-medias NA Noradrenalina OMS Organización Mundial de la Salud OFQ Orfalina FQ OECD Organización Europea para la Cooperación y el Desarrollo PGs Prostaglandinas PAG Periacueducto gris QSAR Quantitative Structure Activity Relationship SE Serie de Entrenamiento SP Serie de Predicción SNC Sistema Nerviosa Central SG Sustancia gris TOMOCOMD TOpological MOlecular COMputer Design VC Validación Cruzada Leyanis Domínguez: Identificacion Computacional y Corroboración Experimental…………….. Glosario…………………………………………………………………………………………..……….. Leyanis Domínguez: Identificacion Computacional y Corroboración Experimental…………….. INDICE Pág. RESUMEN GLOSARIO INTRODUCCIÓN 1 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA 1.1 Dolor. 4 1.2 Tipos de Dolor. 4 1.3 Fisiología del Dolor. 6 1.3. 1 Mediadores químicos. 10 1. 4 Sistema Opioide. 12 1. 4. 1 Péptidos Endógenos. 13 1.4.2 Receptores Opioides. 15 1.5 Fármacos Analgésicos 19 1.5.1 Analgésicos opiáceos. 20 1.5.1.1 Mecanismo de acción 22 1.5.1.2 Propiedades Farmacológicas. 23 1.5.1.3 Reacciones Adversas. 24 1.5.1.4 Relación Estructura Actividad 25 1. 5.2 Antiinflamatorios no esteroideos. 30 1. 5.3 Otros fármacos analgésicos. 31 1.6 Evaluación de la actividad analgésica. 33 1.6.1. Técnicas “in vitro”. 33 1.7 Método computacional y análisis quimiométrico de los datos. 34 1.7.1 Método Computacional 35 Leyanis Domínguez: Identificación Computacional y Corroboración Experimental……….. INDICE 1.7.1.1 Descriptores TOMOCOMD-CARDD basados en relaciones entre 35 enlaces químicos. 36 1.7.1.2 “Background” sobre la matriz de adyacencia entre enlaces del grafo molecular y nuevas relaciones de enlaces: Matriz estocástica de adyacencia entre enlaces químicos 38 1.7.1.3 Definición de los índices cuadráticos, bilineales y lineales basados en relaciones de enlaces químicos 1.8 Análisis Quimiométrico de los datos 39 1.8.1 Métodos de Clasificación 39 1.8.2 Análisis Discriminante Lineal (ADL) para la Predicción de la Actividad. 41 1.8.3 Estimación de los Coeficientes. 41 1.8.4 Matriz de Clasificación. 41 1.8.5 Significación de la Función Discriminante (FD). 42 1.8.6 Criterios de Selección de Variables. 43 1.8.7 Selección del Número Óptimo de Predictores. Principio de la Parsimonia. 43 1.8.8 Análisis de Conglomerados (CA, de sus siglas en inglés, Cluster 43 Analysis) 1.8.9 Validación Estadística de los Modelos QSAR. 44 1.9 Regulaciones de los Métodos QSAR 45 1.10 Métodos de Cribado Virtual Basados en Ligandos 47 MATERIALES Y METODOS 2.1. Ensayos in silico 51 2.1.1 Generalidades 51 2.1.2 Base de datos de los compuestos usados en la obtención de los modelos 51 ADL-QSAR (Análisis Discriminante Lineal - Quantitative Structure Activity Relationship). 2.2 Cálculo de los nuevos descriptores moleculares. TOMOCOMD-CARDD 53 Software. Leyanis Domínguez: Identificación Computacional y Corroboración Experimental……….. INDICE 2.3. Análisis Estadístico de los Datos: Desarrollo de las Funciones 56 Discriminantes (FDs) usando ADL. 2.4 Identificación/Selección “in silico” de compuestos con actividad 57 analgésica. 2.5 Evaluación “in vitro” de interleuquina 6 (IL-6). 58 2.5.1 Cultivo de células, tratamiento e inducción. 58 RESULTADOS Y DISCUSION 3.1. Generalidades 59 3.2Obtención de las series de entrenamiento y predicción. 59 3.3 Desarrollo de Modelos QSAR-ADL 62 3.4 Identificación de Nuevas Entidades Moleculares como Analgésicos 70 utilizando los Modelos in silico: El “Screening” Virtual como una Promisoria Alternativa para la Selección y el Diseño Racional de Fármacos Analgésicos. 3.5 Estudios “in vitro” de la actividad analgésica. 71 CONCLUSIONES 74 RECOMENDACIONES 75 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 76 Leyanis Domínguez: Identificación Computacional y Corroboración Experimental……….. INTRODUCCION El dolor y el sufrimiento en la historia del hombre están tan presentes que puede considerarse como el quinto signo vital y debe ser explorado tal y como se hace con el pulso, la respiración, la temperatura y la tensión arteria (1). El dolor es por tanto un importante problema de salud. En varios países se ha evidenciado que el 18% de la población padece de dolor continuo y algunos autores han señalado una prevalencia cercana al 50%.Además del impacto social de dolor, en la actualidad se tienen conocimientos mas claros acerca de los efectos perjudiciales del dolor en el individuo. Sin embargo, la investigación clínica se ha focalizado en la enfermedad subyacente al dolor, lo que refleja la visión del dolor solo como síntoma inespecífico de la enfermedad (2). El dolor se define como una experiencia displacentera sensorial y emocional asociada con daño tisular real o potencial, o descrita en términos de tal lesión. Muchos autores plantean que el dolor debe considerarse como una entidad independiente pues el mismo más allá de la patología puede autoperpetuarse y hacerse persistente. Es importante entonces considerar al dolor de una manera integral incluyendo factores psicológicos, ambientales y somáticos (2). Existen varios tipos de dolor donde se destaca el dolor agudo y el dolor crónico.(1)Este último, afecta la salud física y psicológica del que lo padece, con repercusiones sobre las actividades diarias, autonomía, el empleo y el bienestar económico. La afectación de la calidad de vida en el dolor crónico de origen osteoarticular degenerativo o inflamatorio es evidente por las limitaciones y repercusiones en los aspectos físicos, psíquicos y sociales(3). La industria farmacéutica provee una amplia variedad de analgésicos para el tratamiento de los diferentes tipos de dolor. La Organización Mundial de la Salud (OMS) establece una escala