ENZYMATISCHE TRANSFORMATION VERSCHIEDENER FLAVONOIDE DURCH DAS EXTRAZELLULÄRE PILZENZYM AGROCYBE-AEGERITA-PEROXYGENASE

Vom Institutsrat des Internationalen Hochschulinstitutes Zittau und der Fakultät Mathematik und Naturwissenschaften der Technischen Universität Dresden genehmigte

DISSERTATION

zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt

von Diplom-Chemikerin (FH) Kateřina Barková (geb. Linhartová) geboren am 16. April 1983 in Liberec (Tschechische Republik)

Gutachter: Herr Prof. Dr. Martin Hofrichter, TU Dresden - IHI Zittau Frau Prof. Dr. Annett Fuchs, Hochschule Zittau/Görlitz Herr Prof. Dr. Frieder Schauer, Universität Greifswald

Zittau, den 19. Juli 2013 I Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis ...... IV Tabellenverzeichnis...... V Abkürzungsverzeichnis ...... VII Zusammenfassung...... XI Summary ...... XIII Shrnutí ...... XV 1 Einleitung - Zielsetzung ...... 1 1.1 Schwerpunkt 1: Enzymatische Synthese...... 1 1.2 Schwerpunkt 2: Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymbildung...... 4 1.3 Vorgehensweise und Methoden...... 4 2 Stand der Forschung...... 5 2.1 Flavonoide als kosmetisch und pharmazeutisch relevante Wirkstoffe ...... 5 2.1.1 Vorkommen...... 6 2.1.2 Eigenschaften und Wirkungen...... 7 2.1.3 Flavonoide und die menschliche Gesundheit ...... 9 2.1.3.1 Antioxidative Wirkung ...... 10 2.1.3.2 Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen ...... 13 2.1.3.3 Immunmodulatorische Wirkung ...... 14 2.1.3.4 Antimikrobielle Wirkung...... 14 2.1.4 Biosynthese von Flavonoiden...... 15 2.1.5 Bioverfügbarkeit und Verstoffwechselung...... 19 2.1.6 Gewinnung von Flavonoiden und Oxyfunktionalisierung...... 20 2.1.6.1 Isolierung aus biologischen Materialien ...... 20 2.1.6.2 Hydroxylierung – chemisch...... 20 2.1.6.3 Hydroxylierung – biotechnologisch...... 22 2.2 Flavonoidreiche Pflanzen – Begründung der Auswahl...... 23 2.2.1 Aronia melanocarpa...... 24 2.2.2 Trifolium pratense ...... 24 2.2.3 Bellis perennis ...... 25 2.2.4 Fragaria ananassa ...... 25 2.3 Enzymatische Transformationen der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) ...... 25 2.3.1 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Aufbau und Katalysemechanismus ...... 26 2.3.2 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Hydroxylierung / Oxygenierung...... 30 2.3.3 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Funktion...... 31

II Inhaltsverzeichnis

3 Material und Methoden ...... 32 3.1 Geräte und Chemikalien...... 32 3.2 Versuchsorganismen ...... 32 3.3 Kulturmedien ...... 32 3.3.1 Agar-Medien...... 32 3.3.2 Flüssigmedien...... 32 3.3.2.1 Sojabohnenmehl-Medium...... 32 3.3.2.2 Kirk-Acetat-Medium...... 32 3.4 AaeAPO - Enzymgewinnung und Reinigung ...... 33 3.5 Bestimmung der Proteinkonzentration...... 33 3.6 Bestimmung enzymatischer Aktivitäten ...... 34 3.6.1 Laccase (Lacc, EC 1.10.3.2)...... 34 3.6.2 Agrocybe aegerita (AaeAPO, EC 1.11.2.1)...... 34 3.6.3 Mangan-Peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13)...... 35 3.7 Extraktionsmethoden ...... 35 3.7.1 Aronia melanocarpa...... 35 3.7.1.1 Mikrowellenextraktion...... 35 3.7.1.2 Ultraschallextraktion...... 35 3.7.2 Fragaria ananassa ...... 36 3.7.3 Trifolium pratense, Bellis perennis...... 36 3.7.4 Festphasenextraktion (SPE)...... 36 3.8 Analysenmethoden...... 37 3.8.1 HPLC (high performance liquid chromatography)...... 37 3.8.1.1 HPLC-MS (Methoden 1, 2) ...... 37 3.8.1.2 HPLC-DAD (Methoden 3, 4) ...... 37 3.8.1.3 Präparative HPLC-DAD ...... 38 3.8.2 NMR...... 39 4 Ergebnisse und Diskussion...... 40 4.1 Enzymgewinnung ...... 40 4.2 Enzymatische Transformationen ausgewählter Flavonoide mittels AaeAPO...... 40 4.2.1 Orientierende Vorversuche...... 40 4.2.2 Variation der Reaktionsbedingungen der enzymatischen Transformationen ...... 47 4.2.2.1 Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe und Durchführung von Langzeitversuchen ...... 48 4.2.2.2 Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe ...... 51 4.2.2.3 Kontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe (Spritzenpumpenversuche)...... 52 4.2.3 Enzymatische Versuche zu weiteren Flavonoiden ...... 55

III Inhaltsverzeichnis

4.2.3.1 Enzymatische Transformation von Flavanonen...... 56 4.2.3.2 Enzymatische Transformation von Flavonen ...... 61 4.2.3.3 Enzymatische Transformation von Flavonolen ...... 66 4.2.3.4 Enzymatische Transformation von Isoflavonen ...... 69 4.2.4 Strukturaufklärung...... 73 4.2.4.1 Referenzverbindungen ...... 73 4.2.4.2 Ergebnisse der NMR-Analysen ...... 74 4.2.5 Vergleichende Diskussion der untersuchten Substanzklassen...... 88 4.2.6 Enzymatische Transformation – Intermediäre Epoxidbildung...... 90 4.2.7 Enzymatische Transformation - Herkunft des Sauerstoffs...... 92 4.2.8 Enzymatische Transformation - Kinetik...... 93 4.3 Untersuchung flavonoidhaltiger Pflanzenextrakte...... 95 4.3.1 Extraktherstellung...... 95 4.3.1.1 Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE)...... 95 4.3.1.2 Mikrowellenextraktion...... 95 4.3.1.3 Ultraschallextraktion...... 96 4.3.2 Identifizierung der Inhaltsstoffe ...... 96 4.3.2.1 Aroniabeeren-Extrakte...... 96 4.3.2.2 Erdbeerblätter-Extrakte...... 100 4.3.2.3 Gänseblümchen-Extrakte...... 101 4.3.2.4 Rotklee-Extrakte ...... 103 4.4 Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte auf die Enzymproduktion ...... 105 4.4.1 Agrocybe aegerita...... 105 4.4.1.1 Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) ...... 108 4.4.2 Bjerkandera adusta...... 109 4.4.2.1 Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) ...... 111 4.4.3 Vergleichende Diskussion der Induktionsversuche...... 112 5 Ausblick ...... 114 6 Quellenverzeichnis ...... 116 Anhang ...... 135

IV Abbildungs-/Tabellenverzeichnis

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Strukturelle Klassifikation der Flavonoide ...... 5 Abbildung 2: Derivate des 2-Phenylchromans – Einteilung nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3 und 4 des Chromanrings (links) und Beispiel für O-Glykosid (rechts)...... 6 Abbildung 3: Vorgeschlagener Flavonoidtransportmechanismus (Transport: I direkt, II vesikulär); modifiziert nach [Kitamura, 2006]...... 6 Abbildung 4: Intramolekulare Wasserstoffbrücken beim 3, 5-Dihydroxyflavon, die zur Zyklisierung in zwei Ringen (α, β) und zu einer geringeren Polarität der Verbindung führen...... 7 Abbildung 5: Mögliche Eisen(II)-Quercetinchelate (1:1), Stabilität: IIIa>IIa>Ia [Leopoldini et al., 2006] ...... 8 Abbildung 6: Termination der Flavonoidradikalkette über Wasserstoffabstraktion von der benachbarten Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit positiver Spindichte gebunden ist [Seyoum et al., 2006]. ... 12 Abbildung 7: 3D-Darstellung der Spindichte im Luteolinradikal-4' (OH•)...... 12 Abbildung 8: weist eine besonders starke antioxidative Wirkung auf...... 13 Abbildung 9: Die häufigsten Hydroxylierungs- (einfacher Pfeil) bzw. Glykosylierungsstellen (doppelter Pfeil) an Flavonen sowie Flavonolen (a) und Isoflavonen (b) [Stobiecki & Kachlicki, 2006]...... 13 Abbildung 10: Biosynthese der Flavonoide – schematische Darstellung mit enzymatischen Schritten, die zur Bildung der Hauptverbindungsklassen der Flavonoide führen [Winkel, 2006]...... 16 Abbildung 11: Glykosylierung von Apigenin durch die UF7GT (UDP-Glucose:Flavonoid-7- Glukosyltransferase)...... 17 Abbildung 12: Bildung von Hydroxybenzoesäuren ausgehend von Hydroxyzimtsäuren in Pflanzen. : 1. CoA- (Synthetase + ATP), Enoyl-CoA-Hydratase, 2. Dehydrogenase (NAD+ / FAD), 3. β- Ketothiolase) ...... 18 Abbildung 13: Umsetzung von Dihydromyricetin zum violetten Delphinidin in einem transgenen Dianthus. (Dianthus caryophyllus; copyright 2003-2006 by John Sangwon Lee, M. D. FAAP)...... 19 Abbildung 14: Kristalle der (a) AaeAPO II (bei pH 8,5; Länge 1,2 mm), (b) AaeAPO II (bei pH 5,6) und (c) AaeAPO II (bei pH 4,6), (d) orthorombisch flächenzentriertes Kristallgitter [Piontek et al., 2010]...... 27 Abbildung 15: Häm (Fe markiert) (rechts) und seine nähere Umgebung an der proximalen Seite der AaeAPO bestehend aus einem helikalen Segment, das ein Cystein (R1) beinhaltet...... 28 Abbildung 16: Extra- versus intrazelluläre Hydroxylierung von Naphthalin – AaeAPO versus CYP450 Monooxygenase [modifiziert nach Ullrich & Hofrichter, 2005]...... 29 Abbildung 17: Hypothetischer katalytischer Zyklus der AaeAPO am Beispiel der Naphthalinhydroxylierung... 29 Abbildung 18: HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO in Gegenwart (b) und Abwesenheit (c) von ; Kontrolle ohne Enzym (a): ...... 44 Abbildung 19: Hypothetische Wege Peroxygenase-katalysierter Reaktionen mit Apigenin als phenolisches Substrat...... 45 Abbildung 20: Flavonoid-Redoxzyklus...... 46 Abbildung 21: Hemmung der AaeAPO-Aktivität durch DMF und DMSO...... 47 Abbildung 22: Vergleich der Daidzeiumsetzungen mittels AaeAPO im Kurzzeitversuch (b) und Langzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 - Daidzein...... 50 Abbildung 23: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin in Abhängigkeit von der H2O2-Dosierung; 1x - einmalige H2O2-Zugabe (1 mM); 10x - zehnmalige H2O2-Zugabe (portionsweise ad 1 mM)...... 52 Abbildung 24: Vergleich der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO im Spritzenpumpenversuch über 8 h (b) und im Lanzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein...... 55 Abbildung 25: Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (durchgängige Linie) mit dem gefundenen monohydroxylierten Isorhamnetin (gestrichelte Linie)...... 68 Abbildung 26: Auf Basis von Referenzsubstanzen identifizierte Wege der Oxidation von Flavonoiden durch die AaeAPO...... 73 Abbildung 27: Enzymatische Umsetzungen (inklusive Folgereaktionen) für die Isoflavone Formononetin und Biochanin A...... 74 Abbildung 28: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin unter semikontinuierlicher Versuchsführung... 76 Abbildung 29: Chromatogramm zur präparativen Trennung von Apigenin (2) und seinem Hydroxylierungsprodukt (1) mittels HPLC unter Angabe verschiedener Sammelfraktionen (Vials 1-3).... 79 Abbildung 30: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Apigenins...... 80 Abbildung 31: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyapigenins (Scutellarein)...... 81 Abbildung 32: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavanons ...... 81 Abbildung 33: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavanons...... 82 Abbildung 34: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyflavons...... 83

V Abbildungs-/Tabellenverzeichnis

Abbildung 35: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 5, 6-Dihydroxyflavons...... 84 Abbildung 36: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavons...... 85 Abbildung 37: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavons...... 85 Abbildung 38: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Luteolins...... 87 Abbildung 39: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyluteolins...... 87 Abbildung 40: Veranschaulichung der „störenden“ Gruppen, die die AaeAPO-Katalyse erschweren...... 88 Abbildung 41: HPLC-Chromatogramme der Flavon-Umsetzung durch die AaeAPO mit eingefügten UV-Vis- Spektren der Edukte und Produkte:...... 91 Abbildung 42: Reaktionsmechanismus der Flavonhydroxylierung mittels AaeAPO...... 91 Abbildung 43: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm der Flavanon-Umsetzung durch die AaeAPO: ...... 92 Abbildung 44: HPLC-Chromatogramme der Daidzein-Umsetzung (b, c) durch AaeAPO in Gegenwart von 16 18 H2 O2 (b) und H2 O2 (c) mit eingefügten MS-Spektren der Produkte; a – Kontrolle ohne Enzym: ...... 92 Abbildung 45: Apparente Michaelis-Menten-Kinetik für Apigenin (Wasserstoffperoxidkonzentration 2,0 mM); x-Achse: Substatkonzentration, y-Achse: Reaktionsgeschwindigkeit...... 94 Abbildung 46: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Mikrowellenextraktion, 50 ºC)...... 97 Abbildung 47: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US4)...... 98 Abbildung 48: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US5)...... 98 Abbildung 49: Erdbeerblätterextrakt: (ethanolisch):...... 100 Abbildung 50: Erdbeerblätterextrakt: (Wasser/ethanolisch):...... 101 Abbildung 51: Gänseblümchenextrakt (Wasser/ethanolisch): ...... 102 Abbildung 52: Gänseblümchen-Extrakt (ethanolisch):...... 103 Abbildung 53: Rotklee-Extrakt (Wasser/ethanolisch): ...... 104 Abbildung 54: Rotklee-Extrakt (ethanolisch): ...... 105 Abbildung 55: AaeAPO-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an unterschiedlichen Kulturtagen) ...... 108 Abbildung 56: Laccase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an unterschiedlichen Kulturtagen) ...... 109

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Fallstudien Ressourceneinsparung- und Umweltentlastungspotenziale biotechnologischer Verfahren [OECD, 2001] (~…gleich, ?...keine Angaben; 7-ACA… 7-aminocephalosporanic acid)...... 3 Tabelle 2: Antioxidative Schutzmechanismen zur Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies ...... 10 Tabelle 3: Berechnete Differenzen der Bildungswärme im Zuge der Entstehung möglicher Radikale ausgewählter Flavonoide [Seyoum et al., 2006]...... 12 Tabelle 4: Fraktionssammler – stoffspezifische Sammelzeiten und Wellenlängen für 6-Hydroxyflavon, 7- Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon und Luteolin...... 39 Tabelle 5: Ausgewählte Eigenschaften der in den Vorvesuchen untersuchten Flavonoide. LM – Lösungsmittel, MeOH – Methanol, DMF – N,N-Dimethylformamid. Bemerkung: Spektraldaten sind dem jeweiligen Stoffzertifikat des Herstellers entnommen...... 40 Tabelle 6: Versuchsreihe 1 zum Flavon (ohne Zusatz von DMF) ...... 41 Tabelle 7: Versuchsreihe 2 in 21 % (v/v) DMF; für alle Testverbindungen ...... 41 Tabelle 8: Versuchsreihe 3 in 21 % (v/v) DMF und Gegenwart von Vitamin C; für alle Testverbindungen; 3b mit 18 18 H2 O2; 3c für Flavon (57 μl bzw. 58 μl H2O, 0 μl DMF); 3d entspricht 3c mit H2 O2...... 42 Tabelle 9: Umsetzung verschiedener Flavonoide durch AaeAPO (orientierende Vorversuche)...... 42 Tabelle 10: Versuchsschema 4 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF), Bsp. 1,9 U/l AaeAPO...... 48 Tabelle 11: Ergebnisse der Versuche unter einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe, Reaktionszeit 2 min, TC – total conversion...... 48 Tabelle 12: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche ...... 50 Tabelle 13: Versuchsschema 5 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF)...... 51 Tabelle 14: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche unter mehrmaliger Zugabe des Cosubstrates (H2O2)...... 51 Tabelle 15: Notwendige Mindestmenge an Wasserstoffperoxid für die AaeAPO-katalysierte Umsetzung ausgewählter Flavonoide...... 52 Tabelle 16: Versuchsschema 6 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF)...... 53 Tabelle 17: Übersicht zu den Ergebnissen der Spritzenpumpenversuche...... 53 Tabelle 18: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavanone ...... 56

VI Abbildungs-/Tabellenverzeichnis

Tabelle 19: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavanonen durch die AaeAPO (TC – total conversion) ...... 56 Tabelle 20: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavone ...... 61 Tabelle 21: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonen durch die AaeAPO (TC – total conversion) ...... 62 Tabelle 22: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavonole ...... 66 Tabelle 23: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonolen durch die AaeAPO (TC – total conversion) ...... 67 Tabelle 24: Einige Stoffeigenschaften der Isoflavone...... 70 Tabelle 25: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die AaeAPO (TC – total conversion)...... 70 Tabelle 26: Versuchsschema zum Spritzenpumpenversuch unter semikontinuierlicher Zudosierung von Substrat und Vitamin C (in 21 % v/v DMF) ...... 75 Tabelle 27: Versuchsschema: semikontinuierliche Langzeitversuche (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) ...... 76 Tabelle 28: Getestete SPE-Kartuschen ...... 77 Tabelle 29: SPE-Kartuschenauswahl in Bezug auf die Wiederfindung der ausgewählten Flavonoide (die Kontrollen representieren die Anfangskonzentration; K1-K6 SPE-Kartuschen laut Tabelle 28) ...... 78 Tabelle 30: Präparation monohydroxylierter Flavonoidprodukte von ihren Substraten durch SPE-Vorbehandlung, Trennung mittels präparativer HPLC und SPE-Nachbehandlung...... 79 Tabelle 31: Die apparenten kinetische Konstanten der AaeAPO für Apigenin...... 93 Tabelle 32: Katalytische Konstanten verschiedener AaeAPO-katalysierter Substrat-Umsetzungen im Vergleich zur Apigenin-Umsetzung ...... 94 Tabelle 33: Konstante Parameter der ASE-Extraktion...... 95 Tabelle 34: Variierte Parameter der Mikrowellenextraktion...... 96 Tabelle 35: Variierte Parameter der Ultraschallextraktion...... 96 Tabelle 36: Gradientenmethode – Anthocyane...... 96 Tabelle 37: Analytische Daten zu den Aronia-Extrakten;...... 99 Tabelle 38: Aronia-Extrakte - Konzentration der häufigsten Polyphenole...... 99 Tabelle 39: Analytische Daten der Erdbeerblätter-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR - Retentionszeit...... 100 Tabelle 40: Analytische Daten der Bellis-perennis-Extrakte. ; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR - Retentionszeit...... 101 Tabelle 41: Analytische Daten der Rotklee-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, sh – Schulter im UV-Vis-Spektrum ...... 103 Tabelle 42: Verwendete Phytoextrakte* ...... 106 Tabelle 43: Maximale Enzymaktivitäten (AaeAPO, Laccase) nach Kulturtagen. (Probenzusammensetzung siehe vorherige Tabelle) ...... 107 Tabelle 44: Verwendete Phytoextrakte (Erklärungen s. Tabelle 41)...... 110 Tabelle 45: Maximale MnP-Aktivitäten an unterschiedlichen Kulturtagen...... 111 Tabelle 46: Maximale Aktivität der MnP nach unterschiedlichen Kulturtagen ...... 112 Tabelle 47: Übersicht zur Wirkung der Phytoextrakte und des Lösungsmittels Ethanol auf die Enzymbildung (AaeAPO, Laccase, MnP) ...... 112

VII Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

7-ACA 7-AminoCephalosporanic Acid 4CL 4-Cumaroyl-CoA-Ligase 2-ODD 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase α-KG α-Ketoglutarat AaeAPO Agrocybe-aegerita- aromatic peroxygenase Ab Ausbeute ABTS 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonat) ACT Acetyl- ADP Adenosindiphosphat AG Aktiengesellschaft ANR Anthocyanidin-Reduktase ANS Anthocyanidin-Synthase API-ES Atmospheric Pressure Electrospray Ionisation APO Aromaten-Peroxygenase (Aromatic PerOxygenase) APT Attached Proton Test AsA Ascorbinsäure ASE Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (Accelerated Solvent Extraction) ATP Adenosintriphosphat BE Mikrowellen-Extrakt aus Gänseblümchen BSA Rinder-Serum-Albumin C4H Zimtsäure-4-Hydroxylase CBG Cytosolic beta-glucosidase cDHA-R cytosolische Dehydroascorbinsäure-Reduktase CfuCPO Chloroperoxidase vom Caldariomyces fumago CHI Chalcon- CHR Chalcon-Reduktase CHS Chalcon-Synthase CraAPO Aromaten-Peroxygenase aus Coprinellus radians CYP Cytochrom P450; P ∼ Pigment; 450 ∼ Lage der Soret-Bande des Komplexes mit Kohlenmonoxid bei 450 nm DAD Diodenarray Detektor DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DFR Dihydroflavonol-4-Reduktase DHA Dehydroascorbinsäure

VIII Abkürzungsverzeichnis

DHK Dihydrokämpferol DHM Dihydromyricetin DiOH-MeOFA Dihydroxy-Methoxyflavanon DMD Dimethyldioxiran

DMF-d7 Heptadeutero-N, N-dimethylformamide (DCON(CD3)2, M = 80.14 g/mol) DMID 2',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase

DMSO-d6 Hexadeutero-Dimethylsulfoxid ((CD3)2SO, M = 84.17 g/mol) DNA DeoxyriboNucleic Acid DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl E ethanolisch ER endoplasmatisches Retikulum ESI Elektrospray-Ionisation F2H Flavanon-2-Hydroxylase F3H (FHT) Flavanon-3-Hydroxylase F6H Flavonoid -6-Hydroxylase F8H Flavonoid -8-Hydroxylase F3'5'H Flavonoid -3',5'-Hydroxylase F3'H Flavonoid -3'-Hydroxylase F4'H Flavonoid -4'-Hydroxylase Fl-OH (Flav) Flavonoid FLS Flavonol-Synthase FNS (FS) Flavon-Synthase FPLC Fast Protein Liquid Chromatography GC Gaschromatographie gCOSY 2D COrrelation SpectroscopY gHMBC 2D Heteronuclear Multiple Bond Correlation gHSQC 2D Heteronuclear Single Quantum Correlation experiment oder Coherence Glu Glutamat GPx Guajakol-Typ Peroxidase GSH Glutathion GST Glutathion-S-Transferase GT Glycosyl-Transferase HDL High-Density Lipoprotein

ΔHf Änderung der Bildungswärme 18 H2 O2 isotopenmarkiertes Wasserstoffperoxid HPLC High Performance Liquid Chromatography HRMS High-Resolution Mass Spectrometry

IX Abkürzungsverzeichnis

I2'H Isoflavon-2'-Hydroxylase IBX Iodoxybenzoesäure IF2'3'H Isoflavon -2',3'-Hydroxylase IFR Isoflavon-Reduktase IFS Isoflavon-Synthase in vitro lat. „im Glas“; außerhalb eines lebenden Organismus in vivo lat. „im Lebendigen“; im lebenden Organismus IOMT Isoflavon-O-methyl-Transferase kcat Wechselzahl kcat/Km katalytische Effizienz

Km-Wert Michaelis-Menten-Konstante Kt. Kulturtag Lacc Laccase LAR Leucoanthocyanidin-Reduktase LiP Lignin-Peroxidase LDL Low-Density Lipoprotein LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion (Liquid-Liquid Extraction) LM Lösungsmittel LPH Lactase-phlorizin LRET Long-Range Electron Transfer MAE Mikrowellenunterstützte Extraktion MDA Monodehydroascorbinsäure MeOF Methoxyflavon MeOFA Methoxyflavanon MeOH Methanol MnP Mangan-Peroxidase MP-8 Microperoxidase-8 MS Massenspektrometrie (Mass Spectrometry) MW Mikrowelle NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat NMR Kernspinresonanz (Nuclear Magnetic Resonance) ODS Octadecylsilan OECD die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (Organisation for Economic Co-operation and Development) OH-Gruppe Hydroxygruppe OMT O-Methyl-Transferase PAL Phenylalanin-Ammoniak-

X Abkürzungsverzeichnis

PcCYP Cytochrom P450 vom Phanerochaete chrysosporium PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) PEG Polyethylenglycol prepIEF präparative isoelektrische Fokussierung qRT-PCR quantitative Echtzeit – PCR (quantitative Real Time - Polymerase Chain Reaction) ROS hoch reaktive Sauerstoffspezies sEtOH saures Ethanol (0,1 Vol.-% H3PO4) sh Schulter im UV-Vis-Spektrum (shoulder in the spectrum) SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction) TC Total Conversion TCA Trichloressigsäure (TriChloroacetic Acid) TE Troloxequivalent TM Trockenmasse tR Retentionszeit TriMeOFA Trimethoxyflavanon UF7GT UDP-Glucose: Flavonoid-7-Glukosyltransferase UPO unspezifische Peroxygenase (Unspecific PerOxygenase) Us Umsatz (bezogen auf das Substrat) US Ultraschallextrakt USAE Ultraschallextraktion UV-Vis -Spektroskopie UltraViolet–Visible spectroscopy Veratrylalkohol 3,4-Dimethoxybenzylalkohol vmax max. Reaktionsgeschwindigkeit bei Substratsättigung VP Versatile Peroxidase VR Vestiton-Reduktase WE Wasser-ethanolisch

λmax Wellenlänge maximaler Intensität

XI Zusammenfassung

Zusammenfassung

Die vorliegende Dissertation zum Thema Enzymatische Transformation verschiedener Flavonoide durch das extrazelluläre Pilzenzym Agrocybe-aegerita-Peroxygenase befasst sich mit folgenden Teilaufgaben: 1) Enzymproduktion: Herstellung und Reinigung der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO); 2) Enzymatische Synthese von Flavonoiden und deren Derivaten ausgehend von Standardsubstanzen; 3) Analytische und spektroskopische Untersuchung der synthetisierten Verbindungen; 4) Enzymatische Synthese und Reinigung (scale-up ≥ 5 mg) von Apigenin-, Luteolin-, 6- Hydroxyflavon-, 7-Hydroxyflavanon- sowie 7-Hydroxyflavonderivaten für die NMR-Analyse; 5) NMR-spektroskopische Analyse der gereinigten Flavonoide; 6) Extraktion von Flavonoiden aus ausgewählten Pflanzen: Aronia melanocarpa (Apfelbeere), Fragaria ananassa (Gartenerdbeere), Bellis perennis (Gänseblümchen) und Trifolium pratense (Rotklee) sowie analytische Untersuchung der Extrakte; 7) Untersuchungen zum Einfluss der Flavonoidextrakte auf die Enzymbildung durch Agrocybe aegerita und Bjerkandera adusta; 8) Chemische Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon als Standardverbindung für die HPLC.

Die enzymatische Transformation von Flavonoidstandardverbindungen wurde mit einem neuen Enzymtyp – der unspezifischen Peroxygenase des Lamellenpilzes Agrocybe aegerita (Südlicher Ackerling) – durchgeführt; als Cosubstrat wurde Wasserstoffperoxid verwendet. Die Untersuchungen haben gezeigt, dass das Enzym (AaeAPO) insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide (57) verfügt. Folgende Standardsubstanzen wurden untersucht: Flavone – Acacetin, Amentoflavon, Apigenin, Apigenintrimethylether, Baicalein, Baicalein-7-methylether, Chrysin, Chrysindimethylether, Flavon, 5-, 6-, 7-Hydroxyflavon, 6,7-Dihydroxyflavon, 2',6- Dihydroxyflavon, 4',6-Dihydroxyflavon, Luteolin, 5-Methoxyflavon, 4'-Methoxyflavon, 6- Methoxyluteolin, Tangeretin und Tectochrysin; Isoflavone – Biochanin A, Daidzein, Demethyltexasin, Formononetin, Genistein, Genistein-4',7-dimethylether, Glycitein und 5-Methyl-7- methoxyisoflavon; Flavanone – Eriodictyol, Flavanon, Hesperetin, 2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-Hydroxy- flavanon, 4',6-Dihydroxyflavanon, Isosakuranetin, 4'-, 5-, 6-Methoxyflavanon, Naringenin und Pinocembrin; Flavonole – 3-Hydroxyflavon, 3,6-Dihydroxyflavon, Isorhamnetin, Kämpferol, Myricetin, Quercetagetin, Quercetin und Quercetinpentamethylether; Flavonoidmonoglykoside - Apigetrin, Genistin, Naringenin-7-O-glukosid und Orientin sowie das Flavonoiddiglykosid Rutin. Hiervon konnten alle Verbindungen mit Ausnahme des Diglykosids Rutin, des Dimers Amentoflavon,

XII Zusammenfassung des 3-Hydroxyflavon sowie den Flavonoid-Derivaten mit besetzter C6-Position (Baicalein, Baicalein- 7-methylether, Demethyltexasin, 6,7-Dihydroxyflavon, 6-Methoxyluteolin, Quercetagetin) durch die AaeAPO umgesetzt werden. Dabei entstanden ein oder mehrere monohydroxylierte, dihydroxylierte, demethylierte oder anders derivatisierte Produkte, die anhand ihrer Massen- und UV-Vis-Spektren in Verbindung mit den chromatographischen Retentionszeiten (HPLC) und entsprechender Referenzsubstanzen identifiziert wurden. Darüber hinaus wurden ausgewählte Produkte mittels NMR-Spektroskopie strukturell aufgeklärt. Die Ergebnisse belegen, dass Flavonoide durch die AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert werden. Die Untersuchungen mit 18 isotopenmarkiertem Wasserstoffperoxid (H2 O2) ergaben, dass der im Zuge der Hydroxylierungen eingefügte Sauerstoff dem Peroxid entstammt (echte Peroxygenase-Reaktion). Weiterhin wurde am Beispiel von Flavon nachgewiesen, dass die AaeAPO-katalysierte Hydroxylierung von Flavonoiden über eine Epoxidzwischenstufe verläuft. Gemische verschiedener Flavonoide wurden aus den einheimischen Pflanzen A. melanocarpa, F. ananassa, T. pratense und B. perennis extrahiert und analytisch charakterisiert. Es kamen dabei die Mikrowellenextraktion, Ultraschallextraktion sowie die beschleunigte Lösungsmittelextraktion (accelerated solvent extraction, ASE) unter Verwendung von Ethanol, Ethanol-Wasser- oder Glycerin-Wasser-Gemischen zum Einsatz. Die analytische Untersuchung der Extrakte erfolgte mittels HPLC-DAD und HPLC-MS. Weiterhin wurde der Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymbildung durch A. aegerita und Bjerkandera adusta (Rauchporling) untersucht. Die Extrakte von Apfelbeere, Gänseblümchen und Rotklee stimulierten die Laccase-Produktion, während die AaeAPO-Aktivität im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen abnahm. Ähnlich wirkten Erdbeerblätter-Extrakte, wobei die Effekte hier weniger deutlich ausgeprägt waren (möglicherweise aufgrund einer insgesamt niedrigeren Flavonoidkonzentration in den mittels ASE gewonnenen Extrakten). Im Fall von B. adusta konnte eine moderate Stimulierung der Mangan-Peroxidase-Bildung nach Zugabe der Extrakte beobachtet werden. Außerdem zeigte sich, dass das Lösungsmittel Ethanol allein eine gewisse Stimulierung der Laccase-Produktion in A. aegerita bewirkte und die AaeAPO wiederum gehemmt wurde. Die beobachteten Effekte der Extrakte auf die Enzymproduktion sind deshalb sowohl auf die Flavonoide als auch auf das Ethanol zurückzuführen.

XIII Summary

Summary

The dissertation thesis entitled “Enzymatic transformation of diverse flavonoids by the extracellular fungal enzyme Agrocybe aegerita peroxygenase” deals with following subtasks: 1) Enzyme preparation: production and purification of Agrocybe aegerita peroxygenase (AaeAPO); 2) Enzymatic synthesis of flavonoids and their derivatives starting from standard substances; 3) Analytical and spectroscopic characterization of the synthesized compounds; 4) Enzymatic synthesis and purification (scale-up ≥ 5 mg) of apigenin, luteolin, 6- hydroxyflavone, 7-hydroxyflavanone and 7-hydroxyflavone derivatives for NMR analysis; 5) NMR-spectroscopic analysis of purified flavonoids; 6) Extraction of flavonoids from selected plants: Aronia melanocarpa (Aronia), Fragaria ananassa (Strawberry), Bellis perennis (Common daisy) und Trifolium pratense (Red clover), and analytical characterization of the extracts; 7) Evaluation of the influence of flavonoid extracts on the enzyme production by Agrocybe aegerita and Bjerkandera adusta 8) Chemical synthesis of 4',6-dihydroxyflavanone as reference compound for HPLC analysis.

The enzymatic transformation of flavonoid standard compounds was carried out with a novel enzyme type – the unspecific peroxygenase of the agaric fungus Agrocybe aegerita (Black poplar mushroom); hydrogen peroxide served as cosubstrat. The investigations have shown that the enzyme (AaeAPO) posseses a generally broad spectrum with respect to flavonoids (57). Following standard substances were studied: Flavones – acacetin, amentoflavon, apigenin, apigenin trimethylether, baicalein, baicalein 7-methylether, chrysin, chrysindimethylether, flavone, 5-, 6-, 7- hydroxyflavones, 6,7-dihydroxyflavone, 2',6-dihydroxyflavone, 4',6-dihydroxyflavone, luteolin, 5- methoxyflavone, 4'-methoxyflavone, 6-methoxyluteolin, tangeretin and tectochrysin; isoflavones – biochanin A, daidzein, demethyltexasin, formononetin, genistein, genistein 4',7-dimethylether, glycitein and 5-methyl 7-methoxyisoflavone; flavanones – eriodictyol, flavanone, hesperetin, 2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-hydroxyflavanones, 4',6-dihydroxyflavanone, isosakuranetin, 4'-, 5-, 6- methoxyflavanones, naringenin, and pinocembrin; flavonoles – 3-hydroxyflavone, 3,6- dihydroxyflavone, isorhamnetin, kaempferol, myricetin, quercetagetin, quercetin and quercetin pentamethylether; flavonoid monoglycosides - apigetrin, genistin, naringenin 7-O-glucoside and orientin as well as the flavonoid glycoside rutin. Most of these compounds could be converted by AaeAPO with following exceptions: the diglycoside rutin and the dimer amentoflavone as well as 3- hydroxyflavone and its derivatives substituted at the C6 position (baicalein, baicalein 7-methylether, demethyltexasin, 6,7-dihydroxyflavone, 6-methoxyluteolin, quercetagetin). In the course of the

XIV Summary reactions, one or several monohydroxylated, dihydroxylated, demethylated or otherwise derivatized products, which were identified by means of their mass and UV-Vis spectra along with the chromatographic retention times (HPLC) and respective reference substances. Furthermore, some products were structurally determined by NMR spektroscopy. The results demonstrate that flavonoids are regioselectively hydroxylated by AaeAPO at the 6-position. The use of isotope-labeled hydrogen 18 peroxide (H2 O2) revealed that the oxygen introduced into the substrates came from the peroxide (true peroxygenase reaction). Furthermore, the example of flavone showed that the AaeAPO- catalyzed hydroxylation of flavonoids proceeds via an epoxide intermediate. Mixtures of different flavonoids were extracted from the domestic plants A. melanocarpa, F. ananassa, T. pratense und B. perennis and analytically characterized. To this end, microwave and ultrasonic-wave assisted extraction as well as accelerated solvent extraction (ASE) were used along with ethanol, ethanol-water or glycerin-water mixtures as solvents. The extracts were analyzed by HPLC-DAD und HPLC-MS. Furthermore, the influence of flavonoids was studied on the enzyme production by A. aegerita and Bjerkandera adusta. The extracts from Aronia, Common daisy and Red clover stimulated the production of laccase, while the AaeAPO activity decreased compared to respective controls. The same phenomenon though less pronounced was observed for the Strawberry extracts (probably due to a lower overall concentration of flavoids in the extracts obtained with ASE). In the case of B. adusta, a moderate stimulation of manganese peroxidase activity was observed after addition of plant extracts. In this context, it turned out that the solvent ethanol as such has a stimulating effect on the production of laccasse in A. aegerita while the activity of AaeAPO was again inhibited. Thus, the observed effects of the extracts on the enzyme production can be attributed both to the flavonoids and ethanol.

XV Shrnutí

Shrnutí

Tato disertační práce na téma: „Enzymatická transformace různých flavonoidů pomocí Agrocybe aegerita peroxygenázy“, zpracovává následující dílčí kapitoly: 1) Získání enzymu (Tvorba a čištění Agrocybe aegerita peroxygenázy, AaeAPO) 2) Enzymatická syntéza flavonoidů a jejich derivátů (eduktem jsou standardy) 3) Stanovení analytických a spektroskopických vlastností vyrobených látek 4) Enzymatická syntéza (scale-up, ≥ 5 mg) a čištění monohydroxylových derivátů apigeninu, luteolinu, 6-hydroxyflavonu, 7-hydroxyflavanonu a 7-hydroxyflavonu na analýzu pomocí NMR spektroskopie 5) Analýza pomocí NMR spektroskopie 6) Extrakce flavonoidů z následujících rostlin: Aronia melanocarpa (Temnoplodec černý, aronie), Fragaria ananassa (Jahodník zahradní), Bellis perennis (Sedmikráska chudobka), Trifolium pratense (Jetel luční); analýza získaných extraktů 7) Výzkumy zabývající se vlivem extraktů obsahujících flavonoidy na tvorbu vybraných enzymů houbami Agrocybe aegerita a Bjerkandera adusta 8) Chemická syntéza standardu pro HPLC - 4´,6-dihydroxyflavanonu.

Enzymatické transformace byly provedeny pomocí nového typu enzymu – houbové peroxygenázy z Polničky topolové (Agrocybe aegerita). Jako kosubstrát zde působí peroxid vodíku. Výzkumy ukázaly, že daný enzym (AaeAPO) disponuje širokým spektrem substrátů z řad flavonoidů. Ze zkoumaných standardů (flavony – acacetin, amentoflavon, apigenin, apigenintrimethylether, baicalein, baicalein 7-methylether, chrysin, chrysindimethylether, flavon, 5-, 6-, 7-hydroxyflavon, 6,7- dihydroxyflavon, 2',6-dihydroxyflavon, 4',6-dihydroxyflavon, luteolin, 5-methoxyflavon, 4'- methoxyflavon, 6-methoxyluteolin, tangeretin, tectochrysin ; isoflavony – biochanin A, daidzein, demethyltexasin, formononetin, genistein, genistein-4',7-dimethylether, glycitein, 5-methyl-7- methoxyisoflavon; flavanony – eriodictyol, flavanon, hesperetin, 2'-, 3'-, 4'-, 6-, 7-hydroxyflavanon, 4',6-dihydroxyflavanon, isosakuranetin, 4'-, 5-, 6-methoxyflavanon, naringenin, pinocembrin; flavonoly – 3-hydroxyflavon, 3,6-dihydroxyflavon, isorhamnetin, kaempferol, myricetin, quercetagetin, quercetin, quercetinpentamethylether; monoglykosidy flavonoidů - apigetrin, genistin, naringenin 7-O-glukosid, orientin; diglykosid flavonolu – rutin) se podařilo enzymaticky přeměnit všechny sloučeniny s výjimkou diglykosidu rutinu, dimeru amentoflavonu, 3-hydroxyflavonu a následujících látek s obsazenou pozicí C6 (baicalein, baicalein-7-methylether, demethyltexasin, 6,7- dihydroxyflavon, 6-methoxyluteolin, quercetagetin). Výsledkem byly jeden potažmo více monohydroxylovaných, dihydroxylovaných, demethylovaných či jinak derivovaných produktů, které byly identifikovány pomocí hmotnostních spekter, spekter UV-Vis i retenčních časů. Spektrum

XVI Shrnutí produktů bylo objasňováno buď za pomoci referenčních látek a nebo NMR spektroskopií. Z výsledků enzymatických přeměn vyplývá, že AaeAPO regioselektivně hydroxyluje flavonoidy do pozice C6. Výzkumy s těžkým peroxidem vodíku ukázaly, že kyslík vložený při hydroxylaci pochází z peroxidu vodíku (důkaz reakce peroxygenázy). Dále bylo prokázáno, že u flavonoidů probíhá reakční mechanismus hydroxylace pomocí AaeAPO přes epoxid. S ohledem na zadání byly flavonoidy extrahovány z tuzemských rostlin Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense a Bellis perennis. Extrakty byly poté analyticky stanoveny. Na vyluhování bobulí arónie, květů jetele lučního a květů sedmikrásek byla použita mikrovlnná extrakce, pro arónii dodatečně ještě extrakce za pomoci ultrazvuku, a ke získání výluhu z listů jahodníku sloužila zrychlená extrakce rozpouštědlem (ASE). Následuje výčet použitých extrakčních činidel: etanol, směsi etanolu s vodou a glycerinu s vodou. Analytické stanovení extraktů proběhlo pomocí HPLC-DAD a HPLC-MS.

V neposlední řadě byl zkoumán vliv flavonoidů ve formě výluhů na tvorbu enzymů. V houbě Agrocybe aegerita přispěly extrakty z arónie, sedmikrásky a jetele k pozitivní stimulaci při tvorbě lakázy, na druhé straně došlo k výraznému poklesu aktivity AaeAPO. Podobně působily také výluhy z listů jahodníku, jen byl celkový efekt méně patrný (pravděpodobně z důvodu celkově nižší koncentrace flavonoidů v ASE-extraktech). V houbě Bjerkandera adusta (Šedopórka osmahlá) došlo po přidání extraktů k mírné stimulaci tvorby manganové peroxidázy (MnP). Samotné rouzpouštědlo etanol působilo pozitivně na tvorbu lakázy v Polničce topolové. Aktivita enzymu AaeAPO byla naproti tomu utlumena (výjimečně stimulována). Tvorbu enzymů ovlivňují tudíž, ať už pozitivně či negativně, jak flavonoidy tak i obsažený etanol.

1 Einleitung

1 Einleitung - Zielsetzung

Die Dissertation beschäftigt sich mit der enzymatischen Transformation von Flavonoiden. Sie ist thematisch in zwei Schwerpunkte, „Enzymatische Synthese“ und „Einfluss auf die Enzymbildung“, gegliedert, wobei der Fokus auf dem ersten Schwerpunkt liegt. Die einzelnen Themenfelder werden in der folgenden Graphik zusammengefasst.

Enzymatische Transformationen verschiedener Flavonoide durch das extrazelluläre Pilzenzym Agrocybe-aegerita-Peroxygenase

1. Schwerpunkt 2. Schwerpunkt

Enzymatische Synthese Einfluss von Flavonoiden (in Form oxyfunktionalisierter Flavonoide flavonoidreicher Pflanzenextrakte) auf die ausgehend von Standardverbindungen Enzymbildung durch Pilze

1.1 Schwerpunkt 1: Enzymatische Synthese

Die heilende Wirkung von Naturstoffen, die auch als nachwachsende Rohstoffe aufgefasst werden können, ist der Menschheit schon seit Jahrhunderten bekannt. In der jüngsten Zeit ist dieses Thema wieder besonders aktuell geworden und wird derzeit breit in der Gesellschaft diskutiert. So zielen neue Trends in der kosmetischen und pharmazeutischen Industrie darauf ab, verstärkt nachwachsende Rohstoffe in kosmetischen und pharmazeutischen Produkten zu verwenden. Ein spezielles Ziel in der Produktentwicklung ist dabei die Verbesserung der Schutzfunktion des Organismus gegenüber freien Radikalen. Freie Radikale sind chemische Spezies mit hoher Reaktivität, die zur Zerstörung biologischer Moleküle wie Proteinen, Lipoproteinen, Desoxyribonucleinsäuren, Kohlenhydraten und ungesättigten Fettsäuren führen [Pincemail, 1995]. Vor allem hoch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) [ Stevens & Miranda, 2002] beeinflussen und schädigen die Zelle sowohl durch direkte cytotoxische Effekte (Membrandestruktion durch Induktion radikalischer Kettenreaktionen, Mutationen nukleärer und mitochondrialer DNA etc.) als auch indirekt durch Modifikation intrazellulärer Signaltransduktionskaskaden, die entzündliche und proliferative Prozesse regulieren. Das endogene antioxidative System gewährleistet im gesunden Menschen ein natürliches Gleichgewicht zwischen den intrazellulär vorhandenen Radikalen und deren Entgiftung durch enzymatische und nicht enzymatische Radikalfänger.

2 Einleitung

Zu den nicht enzymatischen bzw. niedermolekularen Antioxidantien zählen lipophile Verbindungen wie β-Carotin (Provitamin A), Tocopherole (Vitamin E) und Ubichinone sowie die hydrophilen Substanzen L-Ascorbinsäure (Vitamin C), Glutathion und Harnsäure. Diese Moleküle übernehmen die ungepaarten Elektronen radikalischer Verbindungen und werden auf diese Weise selbst zu Radikalen. Im Unterschied zu den ursprünglich sehr reaktiven Radikalen sind die sekundär gebildeten Radikale wesentlich stabiler, was zur Unterbrechung der Oxidationsketten führt [Hansen, 1998]. In ähnlicher Weise übernehmen auch Polyphenole (z. B. Flavonoide) die ungepaarten Elektronen der ROS und bilden dabei stabile Radikale. Dadurch können sie, in Kombination mit ihrer Neigung zur Komplexbildung, Metall-Ionen binden und schädigende radikalchemische Prozesse wie die Lipid- Peroxidation verhindern oder unterbrechen. Die aus Pflanzen isolierbaren polyphenolischen Verbindungen sowie modifizierte Strukturen dieses Typs sind in den letzten Jahren verstärkt in den Fokus der medizinischen Forschung gelangt. In der Fachliteratur finden sich zahlreiche Publikationen zur Wirkung von Flavonoiden und verwandten Stoffen auf biologische Systeme, wobei das Hydroxylierungsmuster eine große Rolle spielt [Benavente-Garcia et al, 2000]. Hieraus lässt sich ein steigender Bedarf an diesen Verbindungen für die Zukunft ableiten, der nicht allein durch Extraktion pflanzlicher Materialien zu decken sein wird. Es ist allgemein bekannt, dass die direkte und selektive Einführung von Sauerstoff-Funktionen in nicht aktivierte aromatische oder aliphatische Kohlenwasserstoffe ein Problem für die chemische Synthese darstellt. Die Prozesse der chemischen Hydroxylierung erfordern meist aufwendige mehrstufige Syntheseschritte, wie z. B. beim Cumolhydroperoxid-Verfahren oder der Diazotierung, die zur Herstellung von Phenolen aus Benzol und Benzolderivaten eingesetzt werden. Die Weiße Biotechnologie, zu der auch klassische industrielle Prozesse wie die fermentative Ethanolherstellung gezählt werden, besitzt ein enormes ökonomisches Potential, insbesondere auch für den chemischen Sektor. Im Zentrum steht die Biokatalyse, d. h. die Nutzung von Enzymen oder mikrobiellen Zellen zur Produktion von Industrie- und Feinchemikalien, wobei Flavonoide zu den Letzteren gerechnet werden [Struhalla & Fietz, 2005]. Feinchemikalien sind meist hoch funktionalisiert, d. h. sie besitzen mehrere chemische Reaktionszentren, die häufig auch chiral sind. Bei der oft komplexen und mehrstufigen Synthese dieser Strukturen erlaubt der Einsatz von Biokatalysatoren - vor allem von Enzymen, die aufgrund ihrer eigenen Chiralität in der Lage sind, Produktsynthesen mit hoher Enantioselektivität zu katalysieren [Struhalla & Fietz, 2005] - einen geringeren Materialverbrauch, niedrigere Investitions- und Entsorgungskosten sowie einen kleineren Energieverbrauch gegenüber klassischen chemischen Verfahren [Garthoff, 2006]. Fallstudien zu biotechnologischen Verfahren, die die Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) 2001 veröffentlicht hat, belegen diese umweltentlastenden Effekte:

3 Einleitung

Tabelle 1: Fallstudien Ressourceneinsparung- und Umweltentlastungspotenziale biotechnologischer Verfahren [OECD, 2001] (~…gleich, ?...keine Angaben; 7-ACA… 7-aminocephalosporanic acid) Verbindung Verbrauch Emission in Betriebskosten Energie Rohstoffe Luft Wasser Vitamin B2 ~ Ø -75 % fossile Rohstoffe Ø -50 % Ø -66 % Ø -50 % 7-ACA ? ? Ø -90 % Ø -33 % Ø -90 % Cephalexin × Strom ? Ø -80 % Ø -80 % Ø Ø Dampf Acrylsäure ? Ø Ø Ø Ø -54 %

Für die Darstellung substituierter Flavonoide bieten sich Sauerstofffunktionen einführende Biotransformationen, die auf der Aktivität von Oxidoreduktasen beruhen, als umweltschonende Alternative an. Derzeit beruhen solche Biotransformationen in erster Linie auf der Aktivität intrazellulärer Oxidoreduktasen (z. B. vom Cytochrom P450-Typ), die komplexe Cosubstrate und akzessorische Proteine benötigen. Die vorliegende Arbeit verfolgt den Ansatz, eine extrazelluläre Oxidoreduktase, die unspezifischen Peroxygenase [IUBMB, 2012] aus dem agarikalen Basidiomyceten Agrocybe aegerita (EC 1.11.2.1), als Biokatalysator zur Transformation von Flavonoiden einzusetzen [Ullrich&Hofrichter, 2007]. Im Unterschied zu intrazellulären Oxidoreduktasen benötigt dieses Enzym lediglich Wasserstoffperoxid als Cofaktor, das zu Wasser umgesetzt wird. Gleichzeitig verlaufen die katalysierten Reaktionen unter schonenden Reaktionsbedingungen und erfordern, anders als chemische Synthesen, keine aggressiven und umweltbelastenden Chemikalien. Somit werden auch geringe Ansprüche an Regelungs- und Sicherheitstechniken gestellt. Für die zukünftige Anwendung ist somit aus Sicht der Anlagensicherheit mit einem risikoentlastenden Potenzial zu rechnen [Rhein et al., 2002]. Zusammenfassend ergibt sich aus dem avisierten Einsatz einer Peroxygenase zur Flavonoidtransformation ein vielversprechender umweltschonender Ansatz.

Innerhalb des Schwerpunktes 1 des Dissertationsvorhabens sollten hydroxylierte Derivate von Flavonoiden mit Hilfe der Agrocybe-aegerita-Peroxygenase synthetisiert werden.

Dieses Enzym verfügt insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum und arbeitet, in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und vom Substrat, dennoch regio- und enantioselektiv. Die Agrocybe- aegerita- Peroxygenase (AaeAPO = Agrocybe aegerita aromatic peroxygenase) vereint verschiedene Enzymaktivitäten in sich und verfügt gleichzeitig, als extrazelluläres Enzym, über eine hohe Stabilität. Nicht zuletzt handelt es sich um das erste beschriebene extrazelluläre Enzym, das aromatische Ringe zu hydroxylieren vermag.

4 Einleitung

1.2 Schwerpunkt 2: Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymbildung

In der Dissertationsschrift von R. Ullrich [Ullrich, 2005, S. 76-7] wurde vermutet, dass die Bildung der AaeAPO durch die im Sojabohnenmehlmedium enthaltenen Flavonoide (Isoflavone) [Aussenac et al., 1998] induziert werden könnte. Deshalb wurde im zweiten Schwerpunkt der Dissertation der Einfluss von flavonoidreichen Pflanzenextrakten auf die Enzymproduktion untersucht, um diese Hypothese zu bestätigen oder zu widerlegen. Die zu variierenden Parameter waren dabei Herkunft, Zusammensetzung und Konzentration der getesteten Inhaltsstoffe (aus den pflanzlichen Extrakten).

1.3 Vorgehensweise und Methoden

Entsprechend der Zielsetzung wurde zunächst Agrocybe aegerita in Schüttelkulturen und Bioreaktoren kultiviert, um das gewünschte extrazelluläre Enzym (unspezifische Peroxygenase) zu gewinnen. Das Zielprotein wurde nach Konzentrierung (tangentiale Ultrafiltration, 10 kDa cut off) stufenweise mittels FPLC (fast protein liquid chromatography) und prepIEF (präparative isoelektrische Fokusierung) gereinigt. Diese mikrobiologischen und biochemischen Arbeiten wurden am Internationalen Hochschulinstitut (IHI) Zittau im Arbeitskreis von Martin Hofrichter durchgeführt. Zur Bearbeitung des ersten Schwerpunkts wurde das gereinigte Enzym in Untersuchungen zur enzymatischen Transformation von Standardverbindungen verwendet. Im Zentrum der Arbeiten standen Hydroxylierungsreaktionen von Flavanonen, Flavonen, Isoflavonen und Flavonolen, die als unsubstituierte Grundkörper, teilhydroxylierte oder teilmethoxylierte Verbindungen sowie als Glykoside vorlagen. Die Umsetzungen der Flavonoide wurden mit den nachfolgenden analytischen Verfahren verfolgt: HPLC-DAD und HPLC-MS. Fünf Produkte wurden in größeren Mengen synthetisiert (Hochschule Zittau/Görlitz), um mittels NMR (1H-NMR, 13C-NMR, APT, gCOSY, gHMBC, gHSQC) eindeutig indentifiziert werden zu können. Die letzten drei Untersuchungstechniken wurden in Zusammenarbeit mit Lothar Hennig (Universität Leipzig) durchgeführt. Im zweiten Schwerpunkt der Dissertation sollte der Einfluss von Flavonoiden auf die Enzymproduktion (Peroxygenase, Laccase, MnP) untersucht werden. Dazu wurden mit Flavonoiden angereicherte Pflanzenextrakte aus Aronia melanocarpa (Apfelbeere), Trifolium pratense (Rotklee), Bellis perennis (Gänseblümchen) und Fragaria ananassa (Gartenerdbeere) den Pilzkulturen zugesetzt. Die enzymatischen Aktivitäten in den Pilzkulturen wurden mittels Standard-Assays (u. a. Veratrylalkohol- und ABTS-Oxidation) bestimmt. Die analytische Charakterisierung der Extrakte erfolgte mittels HPLC-DAD. Diese Arbeiten erfolgten am Internationalen Hochschulinstitut Zittau (Kultivierungen, Enzymassays, HPLC-MS, Fraktionierung) sowie an der Hochschule Zittau/Görlitz (Extraktionen, UV-Vis-Spektroskopie, HPLC-DAD).

5 Stand der Forschung

2 Stand der Forschung

2.1 Flavonoide als kosmetisch und pharmazeutisch relevante Wirkstoffe

Als kosmetisch und pharmazeutisch relevante Wirkstoffe werden zunehmend „multiaktive Wirkstoffe“ betrachtet. Es handelt sich dabei um chemisch definierte Substanzen, die den Grund- und Hilfsstoffen eines Kosmetikums zugesetzt werden, um danach durch objektive Messmethoden mehrere kosmetisch erwünschte Effekte nachweisen zu können. Eine wichtige Gruppe dieser Verbindungen sind die Flavonoide [Eggensperger, 2000]. Sie gehören zu den verbreitetsten sekundären Pflanzeninhaltsstoffen. Schätzungsweise werden zwei Prozent des gesamten Kohlenstoffs (ca. 109 Tonnen pro Jahr), der durch die Photosynthese in den Pflanzen fixiert wird, zu Flavonoiden und deren Derivaten wie den Anthocyanen umgesetzt [Habermehl, 2002]. 2` 3` 1 4` Flavonoide umfassen verschiedene Substanzklassen, die entweder frei oder 8 1` B 7 O 5` als Methoxy- sowie Zuckerderivate vorkommen können. Sie bestehen A C 2 6` 6 3 grundsätzlich aus drei Kohlenstoffringen mit zwei aromatischen (A und B) 5 4 Flavan und einem O-heterocyklischen Ring (C) [Eggensperger, 2000] (Ausnahme bilden die „einfachen Flavonoide“ Aurone und Chalkone) [Marais et al., 2006]. Flavonoide werden der Struktur nach in fünf Hauptgruppen eingeteilt, und zwar in Derivate des 2- Phenylchromans und –chromons, Derivate des 3-Phenylchromans und -chromons (Isoflavonoide), Derivate des 4- Phenylchromens und 4-Phenylcumarins (Neoflavonoide) [Marais et al., 2006; Habermehl et al., 2002], Biflavonoide sowie „einfache Flavonoide“ [Marais et al., 2006].

O O OH O O O O OH O O OH 2-Phenylchroman 2-Phenylchromon 3-Phenylchroman 3-Phenylchromon HO HO O O OO O O OH O O Amentoflavon (3', 8 - Biapigenin) 4-Phenylchromen 4-Phenylcumarin Auron Chalkon

Abbildung 1: Strukturelle Klassifikation der Flavonoide Nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3 und 4 des Chromanrings erfolgt die Einteilung der Derivate des 2-Phenylchromans und –chromons in Flavane, Flavanone, Flavanole, Flavandiole, Flavone, Flavonole, Dihydroflavonole (auch Flavanonole genannt) [Marais et al., 2006; Habermehl et

6 Stand der Forschung al., 2002] und Anthocyanidine [Habermehl et al., 2002]. Die meisten dieser Verbindungen liegen in der Pflanze als O-Glycoside vor; als Zucker treten vor allem Glucose, Galaktose, Xylose, Rhamnose und Zuckersäuren auf.

O O O O OH O OH OH O O OO Flavan Flavanon Flavan-3-ol Flavan-4-ol H HO OH OH OH O O O O O+ Apigenin-7-O-glukosid OH OH OH O O O

Flavanonol Flavon Flavonol Anthocyanidin

Abbildung 2: Derivate des 2-Phenylchromans – Einteilung nach dem Oxidationsgrad der C-Atome 2, 3 und 4 des Chromanrings (links) und Beispiel für O-Glykosid (rechts).

2.1.1 Vorkommen Flavonoide kommen in allen Pflanzenteilen wie Blättern, Blüten, Wurzeln und Früchten vor [Rovellini et al., 1997]. Da sie der Pflanze Schutz vor äußeren schädigenden Einflüssen bieten (z. B. UV- Strahlung, Insekten- oder Pilzbefall), finden sich die höchsten Konzentrationen in den äußeren Blättern (z. B. bei Salaten) oder in Schalen von Obst und Gemüse [Watzl et al., 2001]. Flavonoide werden meist in den Vakuolen akkumuliert [Koes et al., 1994; Kitamura, 2006] (Ausnahme das Arabidopsis-Zytoplasma) [Buer et al., 2004]. Um von der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums (ER, Ort der Synthese) zum Speicherort zu gelangen, werden sie wahrscheinlich als Glutathionkonjugate mit Hilfe von Glutathion-S-Transferasen transportiert (siehe Abbildung 3).

Abbildung 3: Vorgeschlagener Flavonoidtransportmechanismus (Transport: I direkt, II vesikulär); modifiziert nach [Kitamura, 2006]

7 Stand der Forschung

Dieses Carrier-Protein (GST) kann die Flavonoide ebenfalls zum endoplasmatischen Retikulum transportieren, da es nahe dem ER lokalisiert ist und die Orte der Flavonoidbiosynthese und des Flavonoidimports benachbart sind [Kitamura, 2006]. Als Transporter für Anthocyane dienen wahrscheinlich die Anthocyanoplaste, kleine rötlich gefärbte, vesikelähnliche Strukturen, die sie von der Oberfläche des endoplasmatischen Retikulums zur Vakuole führen [Nozzolillo et al., 1988; Nozue et al., 1993]. Der vesikuläre Transportmechanismus sowie die Speicherung der Flavonoide in Vakuolen hängt mit dem Schutz des Zytosols vor potentiell toxischen Sekundärmetaboliten zusammen [Kitamura, 2006]. Die einzelnen Pflanzenarten nutzen unterschiedliche Transportmechanismen, wobei stets das GST beteiligt ist [Mueller & Walbot, 2001; Grotewold et al., 2001]. Eine Art kann aber auch unterschiedliche Transportmechanismen für verschiedene Flavonoide verwenden [Winkel-Shirley et al., 2002]. Pflanzen verfügen über Vakuolen unterschiedlicher Struktur und Funktion [Marty, 1999], wobei noch unklar ist, in welchen Vakuolen Flavonoide tatsächlich gespeichert werden und ob etwa Proanthocyanidine im gleichen Vakuolentyp wie Anthocyanidine vorkommen [Grubber et al., 1999]. Die meisten Flavonoide kommen in der Natur als Glykoside vor [Stobiecki & Kachlicki, 2006]. Mehr als 80 verschiedene Zucker sind bisher in Flavonoidglykosiden nachgewiesen worden; allein vom Quercetin sind 179 verschiedene Glykoside bekannt [Watzl et al., 2001]. Die meisten Flavonoide sind an Glukose oder Rhamnose gebunden. Die Bindung der Zucker an Flavonole erfolgt meist O- glykosidisch in Position 3, bei Flavanonen [Harborne & Baxter, 1999b] und Flavonen O-glykosidisch in Position 7, bei Flavonen häufig auch C-glykosidisch in den Positionen 6 und 8 [Harborne & Baxter, 1999] (vgl. Abbildung 9, S. 13). Bei Insektenbefall oder Pilzinfektionen werden die Flavonoide durch Spaltung der glykosidischen Bindung als Aglykone freigesetzt, da sie in dieser Form für die Organismen toxischer sind als die Glycoside [Rovellini et al., 1997; Arcas et al., 2000; del Rio et al., 2004].

2.1.2 Eigenschaften und Wirkungen Phenole reagieren wegen der Dissoziierbarkeit ihrer OH-Gruppe (Hydroxygruppe) sauer. Es sind reaktive Substanzen, die, sofern keine sterische Hinderung durch zusätzliche Seitenketten besteht, Wasserstoffbrücken ausbilden. So findet man bei vielen Flavonoiden nichtkovalente intramolekulare Verknüpfungen (siehe Abbildung 4) [Wang et al., 2007].

O OH OOH α β

Abbildung 4: Intramolekulare Wasserstoffbrücken beim 3, 5-Dihydroxyflavon, die zur Zyklisierung in zwei Ringen (α, β) und zu einer geringeren Polarität der Verbindung führen. Eine zweite wichtige Eigenschaft ist ihre Fähigkeit, mit Metallen Chelatkomplexe einzugehen [Rovellini et al, 1997]. Ferrali et al. haben nachgewiesen, dass die Eisenchelatisierung mit Quercetin

8 Stand der Forschung

(siehe Abbildung 5) in Mäusen die Erythrocyten vor oxidativer Zerstörung schützt [Ferrali at al.; 1997]. Die metallvermittelte Radikalbildung wird durch Chelatbildung verhindert [Fernandez et al., 2002], wobei in vielen Studien bestätigt wurde, dass die Chelate bessere Antioxidantien als die „freien Flavonoide“ sind. [Anafas'ev et al., 2001; Moridani et al., 2003; De Souza et al., 2004]

Abbildung 5: Mögliche Eisen(II)-Quercetinchelate (1:1), Stabilität: IIIa>IIa>Ia [Leopoldini et al., 2006] Flavonoide sind somit in der Lage, die Bioverfügbarkeit der Metalle herabzusetzen. Diese Eigenschaft wird bei der Behandlung neurologischer Erkrankungen (Al(III)-Komplexe) [Deng et al., 2000] sowie von Vergiftungen mit Schwermetallen (als Antidot) genutzt [Wang et al., 1992]. Weiterhin können bei der Krebsbehandlung Lanthanoid(III)-Quercetinchelate durch Bindung an die DNA der Krebszelle die Transkription unterbinden und somit ihr Wachstum verringern [Zhou et al., 2001]. Flavonoide inhibieren zudem die Xanthin-Oxidase, indem sie an ihrem aktiven Zentrum binden [Cos et al., 1998]. Sie sind leicht oxidierbar und bilden dabei dunkel gefärbte Polymer-Aggregate. Weiterhin sind Flavonoide, vor allem Flavone und Flavonole, z. B. in der Lage, durch Absorption der gefährlichen UV-B Strahlung (280 bis 315 nm) die photosynthetisch aktiven Gewebe der Pflanzen vor Zerstörung zu schützen [Haslam, 1998]. Eine wichtige physiologische Rolle der Flavonoide besteht deshalb im Schutz der DNA vor UV-Strahlung und ROS [Feucht et al., 2004] sowie in der Kontrolle der Gentranskription während des Wachstums [Buer et al., 2004]. Eine weitere Funktion ist der Fraßschutz vor Insekten sowie anderen herbivoren Tieren aufgrund ihres bitteren Geschmacks [Lahtinen et al., 2004; Fukami & Nakajima, 1971]. Flavonoide sind nicht zuletzt in der Lage, die Pflanze vor mikrobiellen Angriffen zu schützen [Mustafa et al.; 2003; Fernando et al., 1999; Spinelli et al., 2006]. Aufgrund dieser Tatsache und der Erkenntnis, dass sich die Bildung von Flavonoiden durch gezielte Induktion mit Prohexadion-Calcium [Römmelt et al., 1999] steigern lässt,

9 Stand der Forschung wurde ein neues effektives Verfahren zur Bekämpfung des Feuerbrandes (Erwinia amylovora) im Obstanbau (Äpfel) entwickelt [Römmelt et al., 2000]. Auf der anderen Seite gehören Anthocyanine zu den wichtigsten Insektenattraktanten, die aufgrund charakteristischer Blütenfarben Insekten als Bestäuber anlocken [Clegg et al.; 2000; Jones & Reithel, 2001]. 2.1.3 Flavonoide und die menschliche Gesundheit Die Flavonoide wurden in den 1930er Jahren durch den Nobelpreisträger Albert von Szent-Györgyi Nagyrapolt entdeckt und zunächst als Vitamin P beschrieben [Szent-Györgyi, 1937; Hollmann et al.; 1997; Eggensperger, 2000]. Viele Heilpflanzen verdanken ihre Wirkung den enthaltenen Flavonoiden (z. B. Aronia, Erdbeerblätter, Gänseblümchen, Ginko, Kamille, Rotklee, um nur einige zu nennen). Flavonoide neutralisieren zellschädigendes Wasserstoffperoxid, aggressiven Singulett-Sauerstoff sowie zelltoxische Aldehyde (z. B. Formaldehyd). Sie fördern das Redoxrecycling von Vitamin C, Vitamin E [Hirano et al., 2001; Heim et al., 2002] und Gluthation. Sie gelten als antioxidative Schutzstoffe wasserreicher Körperbereiche wie des Blutes, der Interzellulärflüssigkeit, des Gehirns und der Rückenmarksflüssigkeit; weiterhin schützen sie Hornhaut, Linse und Glaskörper des Auges sowie die Knochen und Bindegewebe vor oxidativem Stress [Grotewold et al., 2006]. Die chemische Diversität der Flavonoide ist eine Ursache für die Vielzahl pharmakologischer Wirkungen, die für Vertreter dieser Stoffgruppe sowohl in vitro als auch in vivo nachgewiesen wurde [Spilková et al., 1988]. Ihre Wirkung auf den Menschen ist von den einzelnen Inhaltsstoffen abhängig, die sich wie folgt ausprägen: wachstumshemmend auf Bakterien und Viren (Grapefruitkern-Extrakte), Schutz vor Gefäßleiden (Weinlaub), vor Herz-Kreislauf-Leiden (Rotwein, Crataegus sp., Rotklee) [Spilková et al., 1988; Bradley, 1992; Ness & Powles; 1997; Zerykier, 2003], antikanzerogen (Olivenblätter, Aronia) [Meirinhos et al., 2005; Malik et al., 2003], schmerz- und entzündungshemmend (Kamillenblüten, Aronia, Gänseblümchen) [Rovellini et al., 1997; Ohgami et al., 2005; Bielenberg & Wilhelm, 1993], hypotensiv (Aronia) [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001], diuretisch (Erdbeerblätter) [Diener, 1954], schweißtreibend (Lindenblüten), spasmolytisch (Gänseblümchen) [Nazuruk et. al, 2001], LDL-oxidationshemmend (Cholesterinspiegel normalisierend, Aronia) [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001; Schütz et al., 2004] oder antioxidativ (Olivenblätter, Aronia, Rotklee) [Meirinhos et al., 2005; Kintlerova et al., 1998; Zerykier, 2003]. Einige Flavonoide können auch immunmodulatorisch [Kintlerova et al., 1998], antihepatotoxisch [Reuster et al., 1975], antiallergisch [Kubo et al., 1981], antimutagen [Meirinhos et al., 2005], blutreinigend (Gänseblümchen) [Nazuruk et. al, 2001] oder antifungal wirken [Ferrari et al., 1983] [Królicky et al., 1984] sowie Schutz vor UV- und ionisierender Strahlung gewähren oder die Gerinnungsparameter des Blutes verbessern [Rovellini et al., 1997] [Schünke et al., 1993]. Den Isoflavonoiden werden zudem hormonähnliche (östrogene) Wirkungen zugeschrieben. [Braden & McDonald, 1970].

10 Stand der Forschung

Die all diesen Wirkungen zugrunde liegenden Mechanismen sind äußerst vielfältig; hervorzuheben sind folgende (bio)chemischen Eigenschaften: ™ Hemmung von Enzymen (, Proteinkinase C, Lipoxygenase) ™ Hemmung der Freisetzung von endogener Mediatorsubstanzen (z. B. der Histaminfreisetzung) ™ das Abfangen von chemischen Radikalen. Auf diese Weise beeinflussen Flavonoide den Metabolismus von Karzinogenen und Fremdstoffen durch die Hemmung von Phase-I-Enzymen und die Induktion von Phase-II-Enzymen. Außerdem wurde die Inhibierung von Enzymen nachgewiesen, die bei Entzündungsprozessen, der chemischen Signalübertragung, dem Hormon-Metabolismus und Zellwachstum sowie der DNA-Synthese eine Rolle spielen. Weitere protektive Eigenschaften beruhen auf der Fähigkeit, geschädigte Zellen durch das Einleiten der Apoptose zum Absterben zu bringen oder Zelldifferenzierungsprozesse zu aktivieren [Watzl et al., 2001].

2.1.3.1 Antioxidative Wirkung Im Zuge vieler biochemischer Prozesse in der Zelle (einschl. des menschlichen Organismus) entstehen aus dem lebensnotwendigen Sauerstoff aggressive Spezies (z. B. ROS), die den Organismus schädigen und daher rasch beseitigt werden müssen [Bors & Saran, 1987]. Die aerobe Zelle hat effiziente Mechanismen zur Zerstörung und Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies entwickelt. Diese antioxidativen Schutzmechanismen lassen sich in enzymatische und nicht enzymatische Entgiftungssysteme einteilen (siehe Tabelle 2 ) [Horn et al., 2005]. Sie kooperieren miteinander und ergänzen sich, wobei Flavonoide z. B. in der Lage sind, die antioxidativen Enzyme auf genetischer Ebene zu aktivieren [Elliot et al., 1992].

Tabelle 2: Antioxidative Schutzmechanismen zur Eliminierung aggressiver Sauerstoffspezies Antioxidativ wirksame chemische Antioxidativ wirksame Enzyme Substanzen Superoxid-Dismutase β−Carotin (Provitamin A), Carotinoide Katalase Vitamin C (L-Ascorbinsäure) Peroxidasen Vitamin E (Tocopherole) Glutathion-Peroxidase Glutathion Enzymatische Reparaturmechanismen Harnsäure Flavonoide Phenolcarbonsäuren Andere Phenole Chlorophyllderivate

Kommt es zu einem Ungleichgewicht zwischen der Bildung von aggressiven Sauerstoffspezies und den körpereigenen Abwehrmechanismen während des Metabolismus, kann sogenannter „oxidativer

11 Stand der Forschung

Stress“ entstehen [Bors & Saran, 1987]. Nach [Ferrari & Torres, 2003] erhöhen sich Zellschädigungen im Alter durch eine verminderte Produktion antioxidativer Enzyme (Superoxid-Dismutase, Katalase) und Glutathion (Tripeptid mit antioxidativer Wirkung); gleichzeitig ist die Effektivität immunologischer Reaktionen reduziert. Die aggressiven Sauerstoffspezies [Stevens & Miranda, 2002], hauptsächlich verschiedene Sauerstoffradikale, werden auf diese Weise, u. a. durch die oxidative Schädigung von Lipoproteinen [Castelluccio et al.; 1995], Desoxyribonukleinsäuren [Castelluccio et al.; 1995; Kawanishi et al., 2001], Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten, zur Ursache von Krankheiten [Bors & Saran, 1987; Hansen, 1998]. Beispielsweise gilt die Oxidation von LDL durch aggressive Sauerstoffspezies als erste Stufe der Entstehung der Arteriosklerose [Torrel et al., 1986; Picemail et al., 1985]. Die Fähigkeit der Flavonoide, unter Abstraktion von Wasserstoff aus den phenolischen Hydroxygruppen, reaktive Sauerstoff- (z. B. Superoxid, Hydroxylradikal) und Stickstoffverbindungen (z. B. Peroxynitrit) abzufangen, bildet den Schwerpunkt ihrer antioxidativen Aktivitäten [Watzl et al., 2001; Meirinhos, 2005].

Die Aktivität der Flavonoide (Fl-OH) als Radikalfänger wird häufig am Beispiel des DPPH-Radikals (2,2-Diphenyl-1-pikrylhydrazyl-Radikal) mit nachfolgender Reaktion erklärt [van Acker et al., 1996; Cotelle, 2001; Amić et al., 2003]:

Fl-OH + DPPH• → Fl-O• + DPPH2 Die primär gebildeten Flavonoidradikale können sich auf drei verschiedenen Wegen stabilisieren: 1. Dimerisierung: Fl-O• + Fl-O• → Fl-O-O-Fl [Pannala et al., 2001; Amić et al., 2003] 2. Reaktion des Flavonoidradikals mit dem DPPH-Radikal: Fl-O• + DPPH• → Fl-O + DPPH [Pannala et al., 2001; Amić et al., 2003] 3. Chinonbildung: Fl-O• (Semichinon) → Fl=O (Chinon) + H+ +e- [Cotelle, 2001; Pannala et al., 2001; Yang et al., 2001]

Die dritte Variante – Chinonbildung – ist dabei der wahrscheinlichste Mechanismus der zur Termination der Radikalkette führt; er verläuft über eine weitere H-Abstraktion vom Flavonoidradikal (siehe Abbildung 6). Chinone werden ebenfalls bei der Disprortionierung gebildet: 2 Fl-O• => Fl=O (Chinon) + Fl-OH.

12 Stand der Forschung

Abbildung 6: Termination der Flavonoidradikalkette über Wasserstoffabstraktion von der benachbarten Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit positiver Spindichte gebunden ist [Seyoum et al., 2006]. Im Fall effizienter Radikalfänger muss deshalb die H-Abstraktion leicht möglich sein. Dies kann anhand der Änderung der Bildungswärme der Flavonoidradikale (ΔHf) bewertet werden [van Acker et al., 1996]. Zu stabilen Flavonoidradikalen werden Strukturen gezählt, bei denen die Änderung der Bildungswärme < 35,4 kcal/mol ist, wie z. B. im Fall des Luteolins für die Atome C4' und C3' (siehe Tabelle 3)

Tabelle 3: Berechnete Differenzen der Bildungswärme im Zuge der Entstehung möglicher Radikale ausgewählter Flavonoide [Seyoum et al., 2006]

Flavonoid ΔHf [kcal/mol] C3 C5 C7 C2' C3' C4' Apigenin - 47,72 44,59 - - 39,35 Kämpferol 30,91 47,92 46,58 - - 38,22 Luteolin - 47,83 45,01 - 33,48 33,39 Quercetin 31,17 46,97 45,67 - 33,49 33,27

Die Termination des Luteolinradikals-4'•OH verläuft dann in Anlehnung an Abbildung 6 durch eine weitere H-Abstraktion von der Hydroxygruppe, die am Kohlenstoffatom mit der positiven Spindichte – C3' gebunden ist (siehe Abbildung 7) [Dangles et al., 1999; Cotelle, 2001; Pannala et al., 2001].

Abbildung 7: 3D-Darstellung der Spindichte im Luteolinradikal-4' (OH•). (rot – positiv ~höhere Aufenthaltswahrscheinlichkeit der ungepaarten Elektronen, blau – negativ, geringe Aufenthaltswahrscheinlichkeit) [Seyoum et al., 2006]

13 Stand der Forschung

Besonders stark ist die antioxidative Wirkung der Flavonoide, wenn sie ein oder mehrere der folgenden Strukturelemente aufweisen: eine ortho-Dihydroxystruktur im Ring B [Pinelli et al., 2000; von Gadow et al., 1997], eine Doppelbindung zwischen C2 und C3 in Kombination mit einer Ketogruppe am C4 und Hydroxygruppen in Positionen C3, C5 sowie C7 [Benavente-Garcia et al., 2000]. OH OOH OH OH OH O Quercetin

Abbildung 8: Quercetin weist eine besonders starke antioxidative Wirkung auf. Die ortho-Stellung der Hydroxygruppen bietet dem entstehenden Aroxylradikal hohe Stabilität (und kann einfach in ein o-Chinon übergehen) [Pinelli et al., 2000]. Der Ring C kann von C2 bis zum C4 als α,β-ungesättigte Carbonylverbindung aufgefasst werden. Durch diese Anordnung steigert sie die Eigenschaft des Flavonoids, die ungepaarten Elektronen zu delokalisieren und damit das entstehende Radikal zu stabilisieren. Zusätzliche Hydroxygruppen unterstützen das Abfangen von Radikalen. Die Glykosilierung (z. B. am C7) dagegen erschwert die Delokalisierung des Elektrons [Benavente- Garcia et al., 2000]. Strukturbedingt gibt es deshalb große Unterschiede im antioxidativen Potenzial von Flavonoiden [von Gadow et al., 1997]. Interessanterweise entsprechen die „günstigsten“ Hydroxylierungsmuster den mit größter Häufigkeit in natürlichen Flavonoiden vorkommenden Substituierungen (siehe Abbildung 9) [Stobiecki & Kachlicki, 2006].

3' 8 2' 4' 7 O 2 8 1' 3 2' 7 O 5' 6 2 6' 5 4 1' 3' 6 3 O 6' 4' 4 5' 5 O

(a) (b)

Abbildung 9: Die häufigsten Hydroxylierungs- (einfacher Pfeil) bzw. Glykosylierungsstellen (doppelter Pfeil) an Flavonen sowie Flavonolen (a) und Isoflavonen (b) [Stobiecki & Kachlicki, 2006] Synergistische Effekte von Polyphenolen mit den antioxidativen Vitaminen C (L-Ascorbinsäure) und E (α-Tocopherol) sowie Provitamin A (β-Carotin) werden ebenfalls angenommen [Zloch & Šídlová, 1977; Vinson & Bose, 1983]. Nicht zuletzt aufgrund dieser Synergieeffekte werden in der Kosmetikindustrie vermehrt Pflanzenauszüge in Antifalten- oder Sonnencremes eingesetzt [Ziolkowsky, 2006]. 2.1.3.2 Schutz vor Herz-Kreislauf-Erkrankungen Die kardiostimulierende Wirkung der Flavonoide (Quercetin, Rutin) wurde bereits im Jahre 1929 erstmals beschrieben [Akamatsu et al., 1929] und später mehrfach bestätigt [Jeney & Czimmer, 1936]

14 Stand der Forschung

[Zemánková-Kunzová et al., 1949]. Kämpferol [Chou Cheng Jen et al., 1982] sowie Luteolin wirken nachweislich blutdrucksenkend [Jung-Xian et al., 1981]. Flavonoide können über eine Hemmung des Arachidonsäurestoffwechsels die Blutgerinnung beeinflussen. Die Endprodukte des Arachidonsäurestoffwechsels, die Prostaglandine und Thromboxane, fördern die Thrombozytenaggregation und die Vasokonstriktion [Watzl et al., 2001]. Flavonoide, vor allem Luteolin [Schütz et al., 2004], Quercetin [Basarkar & Hatwalne, 1975] und Biochanin A [Kazakov et al., 1980], schützen LDL-Lipoproteine vor Oxidation und können dadurch den Blutcholesterinspiegel senken, jedoch ohne das nützliche HDL-Cholesterin zu beeinflussen. 2.1.3.3 Immunmodulatorische Wirkung Viele in-vitro-Versuche sowie Beobachtungen in vivo deuten auf eine immunmodulatorische Wirkung der Flavonoide hin. Meist äußert sich dies in einer Immunsuppression. Als zentrale Angriffspunkte der Flavonoide im Immunsystem werden Protein- und Proteintyrosin-Kinasen angesehen. Diese für die Zellaktivierung wichtigen Enzymsysteme werden durch bestimmte Flavonoide direkt gehemmt. So verhindern Quercetin, Myricetin oder Kämpferol die Freisetzung von Histamin aus aktivierten Mastzellen und basophilen Granulozyten [Watzl et al., 2001]; eine antiallergische Wirkung wird ebenfalls von Baicalein hervorgerufen [Kubo et al., 1981]. Hinzu kommt eine Hemmung der Aktivität von Lipoxygenasen, z. B. durch 7-Hydroxyethylquercetin [Spilková et al., 1988]. Diese Enzyme katalysieren die Synthese von Leukotrienen, die Mediatoren von Entzündungsreaktionen und allergischen Reaktionen sind [Watzl et al., 2001]. In vitro kann die Metabolisierung von Arachidonsäure durch Flavonoide mit ortho-Hydroxygruppen als Sauerstoffradikalakzeptoren unterdrückt werden (entzündungshemmende Wirkung) [Spilková et al., 1988]. Flavonoide beeinflussen darüber hinaus das Schmerzempfinden, indem sie die Bildung von Prostaglandinen durch Hemmung des Cyclooxygenase-Systems herabsetzen [Watzl et al., 2001]. 2.1.3.4 Antimikrobielle Wirkung Die antibakteriellen, antifungalen und antiviralen Wirkungen von Flavonoiden beruhen auf der Änderung der Permeabilität der Zellmembran und auf der Bindung und Denaturierung von Schlüsselenzymen [Rovellini et al., 1997]. Eine antibakterielle Aktivität gegen grampositive Bakterien wurde für Baicalein [Kubo et al., 1981] und Sigmoidin A nachgewiesen [Fommum et al., 1983]. Quercetin und Myricetin erhöhen die Resistenz der Magenschleimhaut und wirken somit antiphlogistisch bei Magengeschwüren, die vom gramnegativen Bakterium Helicobacter pylori hervorgerufen werden [Barnaulov et al., 1984]. Eine antivirale Aktivität wurde in vitro z. B. für Quercetin gegenüber dem Herpes simplex-Virus Typ 1 gefunden [Beladi et al., 1981]. Die gleiche Verbindung ergab in vivo eine schwach protektive Wirkung gegenüber dem Tollwuterreger [Watzl et al., 2001]. Ebenso wurde eine gewisse schützende Wirkung verschiedener Flavonoide (u. a. Hesperidin, Quercitrin) bei Befall mit Grippeviren beobachtet [Wacker & Eilmes, 1978].

15 Stand der Forschung

2.1.4 Biosynthese von Flavonoiden Die Biosynthese aromatischer Verbindungen in Pflanzen basiert auf drei aufeinanderfolgenden Reaktionswegen: dem Shikimisäureweg, der die Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan bildet, dem Phenylpropanoidweg, der zur Entstehung von Hydroxyzimtsäurederivaten führt - den Präkursoren für von Flavonoiden und dem Zellwandpolymer Lignin sowie dem Flavonoidweg, in dem die eigentlichen Flavonoide synthetisiert werden. In die Flavonoidbiosynthese ist eine breite Palette an Enzymen eingebunden, angefangen von Cytochrom-P450-Monooxygenasen über 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenasen (2-ODD) bis hin zu Glukosyl-Transferasen (GT), O-Methyl-Transferasen (OMT) sowie der kurzkettigen Dehydrogenase / Reduktase (SDR) [Stafford, 1991]. Alle Präkursoren der Biosynthese der Polyphenole entstammen dem Kohlenhydrat-Stoffwechsel (Erythrose, Pyruvat, Acetyl-CoA). Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat werden in mehreren Schritten über den Shikimisäureweg (siehe Anhang A) in Phenylalanin umgewandelt. Der größte Teil des Phenylalanins wird von den Pflanzen für die Proteinsynthese verwendet. Der Rest wird durch das Enzym Phenylalaninammonium-Lyase (PAL, EC 4. 3. 1. 5, stereospezifische Eliminierung des Amoniaks) in trans-Zimtsäure umgewandelt. An der Schnittstelle des Primär- und Sekundärmetabolismus spielt die PAL daher eine entscheidende Rolle [Boudet, 2007]. Durch das Enzym Zimtsäure-4-Hydroxylase (eine P450-Monooxygenase) wird die Zimtsäure zu Cumarsäure hydroxyliert. Diese wird mit Acetyl-CoA und dem Enzym 4-Cumaryl-CoA-Ligase in Cumaryl-CoA umgewandelt [Austin et al.; 2003]. Cumaryl-CoA stellt die erste Schnittstelle in der Biosynthese unterschiedlicher Präkursoren der Phenylpropanoide dar; hierzu gehören Monolignole, Stilbene, Cumarine, Xanthone, phenolische Ester, Benzoesäurederivate, Flavonoide usw. [Boudet, 2007]. Insgesamt sind an diesen Stoffwechselwegen mehr als 16 Cytochrom-P450-abhängige Monooxygenasen beteiligt, die ausgeprägt exotherme und deshalb irreversible Reaktionen katalysieren. Dies führt zur strikten Diversifikation in spezielle Synthesewege [Ehlting et al., 2006]. Der Übersichtlichkeit halber wird hier in erster Linie die Biosynthese der Flavonoide betrachtet. Ein Teil des Acetyl-CoA der Pflanzenzelle wird mit ATP und einem Hydrogencarbonatanion in Malonyl-CoA, ADP und H+ umgewandelt. Drei der Malonyl-CoA-Moleküle reagieren mit dem Cumaryl-CoA. Bereits an dieser Stelle spaltet sich die Biosynthese in zwei Richtungen, je nach dem, welche Enzyme die Reaktion katalysieren. So kann durch eine von der Chalkon-Synthase katalysierten Reaktion das p-Cumarsäure-CoA zum Naringeninchalkon (2',4',6', 4-Tetrahydroxychalkon) reagieren, während bei Einwirkung von Chalkon-Synthase und Chalkon-Reduktase (CHR) aus p-Cumarsäure- CoA und Malonyl-CoA Trihydroxychalkone synthetisiert werden [Austin et al., 2003]. Die Umsetzungen der CHR bieten somit den evolutionären Vorteil (z. B. im Fall der Leguminosen), gezielt unikate Polyphenole (Deoxychalkone, Deoxyflavanonen) entstehen zu lassen, die exklusiv vor einem Angriff durch Pflanzenpathogene schützen [Bomati et al., 2005] (vgl. Fraßschutz S. 8).

16 Stand der Forschung

Phenylalanin PAL C4H 4CL 4-Cumaroyl-CoA + Malonyl-CoA CHS / CHR CHS Trihydroxychalcone Naringeninchalcon (Tetrahydroxychalcon) Flavan-4-ole CHI DFR Aurone CHI Liquiritigenin Naringenin F3'H Eriodictyol IFS IFS F3H FNSI, FNSII Isoflavon F3'H Flavone IOMT F3'5'H I2H 3-Hydroxyflavanone FLS IFR (Dihydroflavonole) Flavonole VR DFR DMID Flavan-3,4-diole LAR Isoflavonoide (Leucoanthocyanidine) 2,3-trans-2R,3S-Flavan-3-ole ANS 3-Hydroxyanthocyanidine OMTs ANR GTs 2,3-cis-2R,3R-Flavan-3-ole ACTs Anthocyanine Proanthocyanidine

Abbildung 10: Biosynthese der Flavonoide – schematische Darstellung mit enzymatischen Schritten, die zur Bildung der Hauptverbindungsklassen der Flavonoide führen [Winkel, 2006]. Abküzungen: ACTs, Acetyl-Transferasen; ANR, Anthocyanidin-Reduktase; ANS, Anthocyanidin- Synthase; C4H, Zimtsäure-4-Hydroxylase; CHI, Chalkon-Isomerase; CHR, Chalkon-Reduktase; CHS, Chalkon-Synthase; 4CL, 4-Cumaryl-CoA-Ligase; DFR, Dihydroflavonol-4-Reduktase; DMID, 2',7- Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase; F3H, Flavanon-3-Hydroxylase; FNSI und FNSII, Flavon- Synthase I und II; F3'H und F3'5'H, Flavonoid-3'- und Flavonoid-3',5'-Hydroxylase; GTs, Glukosyl- Transferasen; IOMT, Isoflavon-O-methyl-Transferase; IFR, Isoflavon-Reduktase; I2'H, Isoflavon-2'- Hydroxylase; IFS, Isoflavon-Synthase; LAR, Leukoanthocyanidin-Reduktase; OMTs, O-Methyl- Transferase; PAL, Phenylalaninammonium-Lyase; VR, Vestiton-Reduktase. Die beiden Gruppen von Zwischenprodukten (Trihydroxychalkone, Tetrahydroxychalkone) werden wiederum auf verschiedenen Wegen weiter umgesetzt. Durch einen noch ungeklärten Mechanismus können beide Substanzgruppen zu Auronen reagieren. Der zweite bzw. dritte Reaktionweg wird durch die Chalkon-Isomerase II / Chalkon-Isomerase I unter Entstehung von Liquiritigenin bzw. Naringenin (Flavanon) katalysiert. Die Chalkon-Isomerase I setzt nur Tetrahydroxychalkone um [Yan et al., 2007]. Unter Vermittlung der Isoflavon-Synthase werden Isoflavone gebildet. Diese können wiederum mittels verschiedener Enzyme (Isoflavon-O-Methyl-Transferase, Isoflavon-2'-Hydroxylase, Isoflavon- Reduktase, Vestiton-Reduktase, 2',7-Dihydroxy-4'-methoxyisoflavanol-Dehydratase) in verschiedene Isoflavonoide umgewandelt werden [Winkel, 2006]. Vom farblosen Flavanon Naringenin, leiten sich die Flavone (z. B. Apigenin), Isoflavone (z. B. Genistein), Flavan-4-ole und Dihydroflavonole (z. B. Dihydrokämpferol, DHK) ab. Dabei spielen v. a. die Enzyme Flavonoid-3'- und 3',5'-Hydroxylase eine zentrale Rolle [Forkmann & Martens, 2001]. Naringenin wird durch die Enzyme Flavonoid-3'-Hydroxylase und Dihydroflavonol-4-Reduktase in

17 Stand der Forschung

Flavan-4-ol umgewadelt. Wenn anstelle von DFR die Flavon-Synthasen I und II wirksam sind, entsteht das Flavon Apigenin. Dihydrokaempferol (auch Aromadendrin genannt [Habermehl et al., 2002]) entsteht ausgehend vom Naringenin unter Beteiligung folgender Enzyme: Flavanon-3-Hydroxylase, Flavonoid-3'- und 3',5'- Hydroxylase [Winkel, 2006]. Es wird anschließend durch eine Flavonol-Synthase, die eine Doppelbindung zwischen dem C2- und C3-Atom schafft, in ein Flavonol (Kämpferol), umgewandelt oder durch katalytische Reduktion mittels Dihydroflavonol-4-Reduktase zu einem Flavan-3,4-diol, Leucoanthocyanidin (Leucopelargonidin) umgesetzt [Habermehl et al., 2002]. Die Flavan-3,4-diole werden als kurzlebige Vorstufen der Anthocyane und Flavan-3-ole sowie deren Kondensationsprodukten, den Proanthocyanidinen, angesehen. Die Leucoanthocyanidin-Dioxygenase (Anthocyanidin-Synthase) überführt die Flavan-3,4-diole in Anthocyanidine. Diese dienen wiederum als Ausgangsstoffe für a) Anthocyanine, wobei nachfolgende Enzyme einwirken: O-Methyl- Transferasen, Glucosyl-Transferasen, Acetyl-Transferasen; und b) für 2,3-cis-2R, 3R-Flavan-3-ole (verantwortliches Enzym: Anthocyanidin-Reduktase). Flavan-3-ole entstehen ebenfalls aus Flavan-3,4- diolen. Der Unterschied ergibt sich zum einen aus der Stereochemie (2,3-trans-2R, 3S-Flavan-3-ole) und zum anderen aus dem einwirkenden Enzym (Leukoanthocyanidin-Reduktase) [Grotewold, 2006]. Die Synthese der Proanthocyanidine ist bisher im Detail noch nicht geklärt (Mechanismus der Polymerisation, Transport zur Vakuole; siehe Anhang B) [Dixon et al., 2005]. Ein Zusammenspiel verschiedener Enzyme ist wahrscheinlich. Wenn das reduzierende Cosubstrat (z. B. NADPH) limitiert ist, kann das Kation mit Flavan-3-olen zu Dimeren, Oligomeren und Polymeren, den Proanthocyanidinen, reagieren [Xie & Dixon, 2005]. Eine weitere Möglichkeit besteht in der Kopplung von Flavan-3,4-diolen mit Flavan-3-olen [Forkmann & Martens, 2001]. Die Bildung von Glykosiden erfolgt in der Pflanze meist sekundär unter Beteiligung von Glykosyl- Transferasen [Boudet, 2007]. OH OH H OO UF7GT HO O OO HO OH OH O OH OH O Apigenin Apigenin-7-O-glukosid

Abbildung 11: Glykosylierung von Apigenin durch die UF7GT (UDP-Glucose:Flavonoid-7- Glukosyltransferase). Hydroxybenzoesäuren werden in Pflanzen aus den entsprechenden Hydroxyzimtsäuren gebildet, indem ein Acetatrest nach Oxidation der Seitenkette der Hydroxyzimtsäuren entfernt wird [Ritter, 1994].

18 Stand der Forschung

O H2O H OO OO O CoASH SCoA Ox. SCoA H2O OH HO OH HO HO HO - O Hydroxyzimtsäure aktivierte 3-Hydroxy- aktivierte SCoA Hydroxy- 3-(hydroxyphenyl)- 3-(Hydroxyphenyl)- benzoesäure propionsäure 3-oxopropionsäure

Abbildung 12: Bildung von Hydroxybenzoesäuren ausgehend von Hydroxyzimtsäuren in Pflanzen. Enzyme: 1. CoA-Ligase (Synthetase + ATP), Enoyl-CoA-Hydratase, 2. Dehydrogenase (NAD+ / FAD), 3. β-Ketothiolase) Bei einigen Enzymen der Biosynthese überlappen sich mehrere katalytische Aktivitäten; z. B. verfügt die FLS von Arabidopsis zusätzlich über eine F3H-Aktivität [Prescott et al., 2002]. Weiterhin ist es interessant, die Flavonoidbiosynthese parallel in verschiedenen Pflanzen zu verfolgen, da hierbei die gleiche Reaktion durch verschiedene Enzymunterklassen (EC 1.13./1.14.) katalysiert werden kann. So gehört die F6H von Chrysosplenium americanum den 2-ODDs an [Anzellotti & Ibrahim, 2000], während die F6H von Tagetes sp. eine P450-Monooxygenase ist. Unterschiede sind lediglich in der Substratspezifität zu finden, wobei das Enzym aus Tagetes keine methylierten Subtrate akzeptiert [Halbwirth et al., 2004]. Ein ähnliches Phänomen ist bezüglich der Flavon-Synthasen zu beobachten – die FNSI ist eine 2-ODD, die FNSII wiederum eine P450-Monooxygenase [Britsch, 1990; Martens & Forkmann, 1999]. Erste Erkenntnisse zur Regulation der Biosynthese der Flavonoide gehen auf das Jahr 1987 zurück [Meyer et al., 1987]. Seitdem sind umfangreiche Befunde zu den verantwortlichen Genen hinzugekommen. So ist heute bekannt, dass Strukturgene einzelne Biosynthese-Schritte kontrollieren und regulatorische Gene den gesamten Syntheseweg oder Teile davon an- oder abschalten können. Weitere Gene, im Zusammenhang mit Flavonoiden, sind für den pH-Wert in den Vakuolen, die Wechselwirkung mit Metallionen oder die Kopigmentierung verantwortlich [Forkmann & Martens, 2001]. Die differentielle Genexpression bietet verschiedene Vorteile – sie kann „erwünschte“ Reaktionen fördern (z. B. Isoflavonoid- und Flavanolbildung zur Erhöhung der Pflanzenresistenz; verstärkte Pigmentsynthese in Form von Flavonolen und Anthocyanen als UV-Schutz), und unerwünschte Reaktionen vermeiden (z. B. Unterdrückung der CHS in Petunia, was eine männliche Sterilität bedingt, die wiederum für die Entwicklung von pflanzlichen Hybriden notwendig ist) [Taylor et al., 1992]. Beispiele für die erfolgreiche Anwendung molekularbiologischer Prinzipien im Zusammenhang mit der Flavonoid-Synthese finden sich in der Zierpflanzenzucht. Ziel hierbei ist es oftmals, die Blütenfarbe gezielt zu ändern, indem neue Gene eingefügt werden oder die Flavonoidbiosynthese in Mutanten partiell unterdrückt wird [Tanaka et al., 1998; Mol, 1999; Davies, 2000]. So erhielt beispielsweise ein Kultivar der weißen Nelke (Dianthus sp.), die nur DHK bildete, durch Einfügen zweier zusätzlicher Gene (kodierend für DFR und F3'5'H aus Petunia) die Fähigkeit, DHM (Dihydromyricetin) zu Leucodelphinidin und weiter zu Delphinidin umzusetzen, so dass eine transgene Nelke mit violetten Blüten enstand [Holton, 1996].

19 Stand der Forschung

OH OH OH OH OH OH + H OO H OO HO O OH DFR OH ANS OH OH OH OH OH O OH OH OH Dihydromyricetin Leucodelphinidin Delphinidin

Abbildung 13: Umsetzung vo n Dihydromyricetin zum violetten Delphinidin in einem transgenen Dianthus. (Dianthus caryophyllus; copyright 2003-2006 by John Sangwon Lee, M. D. FAAP) Nicht nur auf genetischer Ebene lässt sich die Biosynthese von Flavonoiden beeinflussen. Werden Pflanzen stärker belichtet, hat dies i.d.R. eine verstärkte Photosynthese zur Folge. Aufgrund dessen wird mehr Acetyl-CoA gebildet, wodurch die Biosynthese der Flavonoide stimuliert wird, was wiederum die Pflanzen farbiger erscheinen lässt (phänotypische Anpassung). Somit wirken sich die Jahreszeit und der Erntezeitpunkt der Pflanzen auf den Flavonoidgehalt aus. Beispielsweise enthält Kopfsalat im August geerntet 3- bis 5-mal mehr Flavonoide als im April [Watzl et al., 2001]. 2.1.5 Bioverfügbarkeit und Verstoffwechselung In der Nahrung liegen bis auf die Flavan-3-ole alle Flavonoide glykosidisch gebunden vor [Scalbert & Williamson; 2000]. Lange Zeit wurde angenommen, dass nur Aglykone durch das Verdauungssystem aufgenommen werden [Kühnau, 1976; Griffiths, 1982]. Neuere Studien scheinen aber zu belegen, dass beispielsweise Quercetinglukoside ebenso und sogar besser als das entsprechende Aglykon resorbiert werden [Hollman et al., 1995]. Die Flavonoidaglykone werden im Dünndarm durch die Darmschleimhaut resorbiert, in der Leber glukuroniert (UDP-Glucuronyltransferasen), sulfatiert (Sulfotransferasen) oder methyliert (O-Methyltransferasen), bevor sie mit dem Urin oder Stuhl wieder ausgeschieden werden [Crespy et al., 1999]. Der Anteil der nichtderivatisierten Ausgangsflavonoide liegt unter zwei Prozent, was auf eine intensive Metabolisierung im menschlichen Körper hindeutet [Donovan et al., 1999]. Die Hälfte der Flavanole aus grünem und schwarzem Tee war z. B. nach einer Verweilzeit von ein bis sechs Stunden wieder aus dem Körper verschwunden [Watzl et al., 2001]. Flavanololigomere können durch die Magensäure zu Epicatechinmonomeren und -dimeren gespalten werden und somit anschließend im Dünndarm resorbiert werden [Hollman & Katan, 1997]. Im Fall der Flavonoidglykoside blieb lange das Problem der schwierig zu spaltenden β-glykosidischen Bindung, die gegen Hydrolyse durch Salzsäure [Hertog et al., 1992] oder pankreatische Enzyme beständig ist, ungelöst. Der Nachweis von Quercetin-4'-glukosid im Blutplasma in 20-fach höherer Konzentration als Quercetin-3-rutinosid [Aziz et al., 1998; Hollman et al., 1999] führte jedoch zur Annahme, dass die Absorption des Monoglukosides im Dünndarm möglich sein muss. Hollman et al. haben deshalb postuliert, dass Quercetin-4'-glukosid durch einen intestinalen Na+-Glukose- Kotransporter, ähnlich wie Naphthol-β-D-glukosid oder Phenyl-β-D-galaktosid in Ratten [Mizuma et al., 1992; 1994], aktiv aufgenommen wird [Hollman et al.; 1995]. Erst Németh et al. konnten nachweisen, dass die Deglykosylierung der Flavonoidglykoside im Dünndarm durch β-Glucosidasen (LPH, CBG) des Epithels erfolgt [Németh et al.; 2003]. Eine Beeinflussung der Flavonoidaufnahme

20 Stand der Forschung durch Bindung an Proteine in der Nahrung konnte für Quercetin und Kämpferol aus Tee, der mit oder ohne Milch getrunken wurde, nicht nachgewiesen werden [Hollman et al., 2001]. Neben den Flavonolen und deren Glykoside werden auch Flavanole [Lee et al., 1995], Flavanone [Fuhr & Kummert, 1995], Flavone [Shimoia et al., 1998], Isoflavone [Watanabe et al., 1998] und Anthocyanine [Lapidot et al., 1998] im Menschen mit der Nahrung resorbiert. 2.1.6 Gewinnung von Flavonoiden und Oxyfunktionalisierung 2.1.6.1 Isolierung aus biologischen Materialien Die Isolierung von Flavonoiden erfolgt meist aus Pflanzenmaterial, wobei mehrere Aspekte zu beachten sind. Grundsätzlich finden sich im getrockneten Pflanzenmaterial weniger Flavonoidkonjugate (v. a. acylierte Flavonoidglykoside) als im Rohmaterial, da sie ausgesprochen temperaturempfindlich sind. Die Gewinnung der Flavonoide aus Pflanzenmaterial erfolgt in mehreren Schritten – Extraktion, Konzentration und Reinigung (LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion, SPE Festphasenextraktion). Die Polarität des verwendeten Lösungsmittels muss der zu extrahierenden Substanz angepasst werden. Flavonoidaglykone werden folglich mit Lösungsmitteln mittlerer Polarität (Methylenchlorid, Ethylether, Ethylacetat) extrahiert, polare Glykoside hingegen mit Ethanol, Methanol, Wasser oder Gemischen genannter Lösungsmittel. Es können unterschiedliche Methoden für die Extraktion im Labor verwendet werden: Mazeration (Kaltextraktion), Digestion (Heißextraktion), Perkolation (Verdrängungsverfahren) [Bell, 2006], Soxhlett-Extraktion [Stobiecki & Kachlicki, 2006], Mikrowellen unterstützte Extraktion [Kaufmann & Christen, 2002], Ultraschall-Extraktion [Herrera et al., 2004; Rostagno et al., 2003], beschleunigte Lösemittelextraktion [Rostagno et al., 2004] oder superkritische Extraktion mit Kohlendioxid [Kaiser et al., 2004]. Industriell werden Extrakte und Öle durch Mazeration, Digestion, Perkolation mit Lösungsmitteln (evtl. nach enzymatischem Aufschluss), Hochdruckextraktion, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Wasserdampfdestillation und fraktionierte Destillation gewonnen. Diese Extrakte können anschließend durch Membranfiltration (z. B. Ultrafiltration, Umkehrosmose) konzentriert oder mit chromatographischen Methoden aufgetrennt werden [Blum, 1999]. In der Regel wird die Extraktion eher zur Gewinnung von Substanzgemischen (z. B. Flavonoidaglykone) als zur Gewinnung einzelner Verbindungen eingesetzt. 2.1.6.2 Hydroxylierung – chemisch Die bekannten Verfahren der chemischen Hydroxylierung von Phenolderivaten erfordern meist aufwendige mehrstufige Synthesen [Li et al., 2006] und haben eine komplizierte Produktgewinnung zur Folge (z. B. bei der Herstellung von Katecholderivaten). Die Ausgangsverbindungen müssen als Ether- oder Esterderivate vorliegen, deren Schutzgruppen nach der Reaktion abgespalten werden – oft geschieht dies nur unvollständig, wodurch die Ausbeuten erheblich sinken und die Produktisolierung erschwert wird [Allan & Robinson; 1924; Heap & Robinson, 1926; Baker et al.; 1933; Saxena et al.; 1985; Hoshino & Takeno; 1987; Varma et al.; 1998; Ganguly et al.; 2005; Kabalba et al., 2005].

21 Stand der Forschung

Methoxyflavanone werden ziemlich selektiv durch das Peroxid Dimethyldioxiran (DMD) in Position C6 (5-Methoxyflavanon, 5-MeOFA; 4',5,7-Trimethoxyflavanon, 4',5,7-TriMeOFA) bei Raumtemperatur hydroxyliert. In saurem Milieu konnten die genanten Flavonoide mehrfach hydroxyliert werden (5-MeOFA→6,8-DiOH-5-MeOFA; 4',5,7-TriMeOFA→6,8-DiOH-4',5,7- TriMeOFA→3',6,8-TriOH-4',5,7TriMeOFA) ; 4'-Methoxyflavanon wurde einfach hydroxyliert und zum 3'-Hydroxy-4'-methoxyflavanon umgesetzt. Unter neutralen Bedingungen wurde 4'- Methoxyflavanon zum 4'-Methoxyflavon dehydriert. Die Ausbeute der Dimethyldioxiran-katalysierten Reaktionen betrugen 35-40 % [Bernini et al., 2000]. Die Schwächen dieser Methode bestehen in der „stoffabhängigen“ Hydroxylierungsposition und dem nicht einheitlichen pH-abhängigen Verhalten der Flavonoide (Hydroxylierung, Dehydrierung, Demethylierung). Im Jahre 2009 untersuchten Li et al. die Hydroxylierung von Polymethoxyflavonen durch DMD und fanden eine Regioselektivität am C3 für 3',4',5,6,7,8-Hexamethoxyflavon (unter neutralen Bedingungen). Weitere Arbeiten der gleichen Arbeitsgruppe zu diesem Substrat ergaben eine regioselektive Demethylierung der Methoxygruppe am C5 in Anwesenheit von Salzsäure oder Trifluoressigsäure [Li et al., 2006, 2007]. Aktuelle Synthesen zielen auf die Verwendung neuartiger Katalysatoren, wie z. B. Iodoxybenzoesäure (IBX), ab, die mit hoher Selektivität zur oxidativen Demethylierung phenolischer Methylarylether [Quideau et al., 2008] oder zur Hydroxylierung von der Phenolderivaten geeignet ist (Phenol [Magdziak et al., 2002], Naringenin [Selenski et al., 2006]). IBX erlaubt es ebenfalls, wenig substituierte Flavonoide (C6→C5,6; C7→C7,8; C4',5,7→C3',4',5,7) in zwei Schritten (1. Oxidation zum Chinon, 2. reduktive Aufarbeitung mittels Natriumdithionit) in ortho-Position zu hydroxylieren. Die Reaktionen laufen bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur (60 ºC, 80 ºC) bei C7- hydroxylierten Flavonoiden ab und ergeben in Reaktionszeiten von 1-24 Stunden Ausbeuten von 72- 98% [Barontini et al., 2010]. Die Methode ist allerdings nicht geeignet, um 5-Hydroxyflavanon oder 5-Hydroxyflavon zu hydroxylieren (aufgrund der intramolekularen Wasserstoffbrücken [Exarchou et al., 2002; siehe auch Abbildung 4, S. 7] wird die Ausbildung eines notwendigen Intermediats (Iodanylkomplexes) gestört [Barontini et al., 2010]). Ein weiteres Beispiel für einen selektiven chemischen Katalysator stellt Methyltrioxorhenium in Kombination mit Wasserstoffperoxid dar. Obgleich Flavanone zu unerwünschten p-Benzochinon- [Bernini et al., 2001, 2003, 2005] oder Benzodioxepinderivaten umgesetzt werden [Bernini et al., 2001, 2003], gehen Flavone, in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster, in 3-Hydroxy-2- methoxyflavanonderivate (ausgehend vom Flavon; Ausbeute 62 %) oder in C6- oder C8- hydroxylierte Derivate (ausgehend von 5,7-Dimethoxyflavon, Ausbeute 35 %) über. Das C8- hydroxylierte Produkt wird dabei zwischenzeitlich partiell demethyliert (ca. 60 % am C5), in den weiteren Schritten aber wieder methyliert, was inklusive der neu eingeführten Hydroxygruppe zum 5,7,8-Trimethoxyflavon führt. Auch das 6-Hydroxy-5,7-dimethoxyflavon unterliegt einer weiteren Methylierung, so dass es in Baicaleintrimethylether übergeht [Bernini et al., 2008]. Die Schwächen dieser Methode liegen in der nicht stattfindenden Flavanon-Hydroxylierung bzw. -Methylierung, der

22 Stand der Forschung niedrigen Ausbeute im Vergleich zur IBX-Katalyse und den entstehenden Produktgemischen (abgesehen von der Tatsache, dass am Ende die Zielprodukte in methoxylierter Form vorliegen). Jüngere Untersuchungen haben ebenfalls gezeigt, dass Flavonoide in Gegenwart von Luftsauerstoff durch γ−Strahlung hydroxyliert werden können (z. B. Naringenin→Eriodictyol, bis 150 Gy; danach erfolgen Polymerisation oder Disproportionierung) [Nagy et al., 2008] oder elektrochemisch an einer Platinelektrode, bevorzugt am B-Ring, oxidierbar sind [Masek et al., 2011]. Ausbeuten wurden in diesen Studien nicht angegeben. 2.1.6.3 Hydroxylierung – biotechnologisch Mit fast 600 Unternehmen nimmt Deutschland heute in Europa eine führende Position im Biotechnologie-Bereich ein. Der Umsatz der reinen Biotechnologie-Unternehmen (ca. 500) ist zwischen 2005 und 2008 um 42 % auf über 2,2 Milliarden Euro gestiegen. Über 40 % der Firmen befassen sich mit Produkten für die Gesundheit (Rote Biotechnologie), knapp 8 % widmen sich der Weißen Biotechnologie [BMBF, 2012]. Die Weiße Biotechnologie besitzt ein enormes ökonomisches Potenzial, insbesondere im Bereich der (bio)chemischen Synthese. In ihrem Zentrum steht die Biokatalyse, d. h. die Nutzung von Enzymen oder mikrobiellen Zellen zur Produktion von Spezial- oder Feinchemikalien (z. B. Flavonoiden) [Struhalla & Fietz, 2005]. Flavonoide können mit Hilfe von Polyphenol-Oxidasen (EC 1.10.x), Peroxidasen (1.11.1.x), Peroxygenasen (1.11.2.x), Dioxygenasen (EC 1.13.x) oder Monooxygenasen (EC 1.14.x) oxidiert werden. Unter Einwirkung von Polyphenol-Oxidasen oder „klassischen“ Peroxidasen entstehen meist Chinonderivate (vgl. enzymatische Bräunung), Dimere und Oligomere oder Spaltprodukte wie polyphenolische Säuren [Schreier et l., 1985]. Für enzymatische Hydroxylierungen kommen somit nur Peroxygenasen, Monooxygenasen und Dioxygenasen in Frage. Bei den meisten Monooxygenasen handelt es sich um Cytochrom-P450-abhängige Enzyme, die NAD(P)H und Sauerstoff sowie Elektronentransport-Proteine und Flavin-Reduktasen für ihre katalytische Aktivität benötigen. Sie spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Oxidation der Flavanoide zu den Flavonoiden (FSII - Flavonsynthase II [Stich & Forkmann, 1987], F2H - Flavanon- 2-Hydroxylase, IFS - Isoflavonsynthase) als auch bei der Hydroxylierung der aromatischen Ringe A und B [Ibrahim & Anzellotti, 2003]. Der Ring B wird durch Flavonoid-3'-Hydroxylasen (F3'H, pflanzlich: [Vaughan et al., 1969; Stotz et al., 1985; Stich & Forkmann, 1987], bakteriell: [Pandey et al., 2011]), die Flavonoid-4'-Hydroxylase (F4'H, [Ortiz de Montellano & de Voss, 2005; Sono et al., 1996]), die Flavonoid-3'5'-Hydroxylase (F3'5'H, [Forkmann & Martens, 2001; de Vetten et al., 1999]) und die Isoflavon-2'3'-Hydroxylase (IF2'3'H, [Hinderer et al., 1987; Gunia et al., 1991]) derivatisiert. Die Flavonoid-A-Ring-Hydroxylasen greifen hingegen die Positionen C6 oder C8 an (F8H - Flavonoid-8-Hydroxylase, pflanzlich: keine Isoflavon-Umsetzung [Halbwirth et al., 2004; Halbwirth & Stich 2006], bakteriell: Isoflavon-Umsetzung [Klus & Barz, 1998; Halbwirth et al., 1998; Latunde- Dada et al., 2001]).

23 Stand der Forschung

Dioxygenasen übertragen beide Atome eines Sauerstoffmoleküls (O2) auf ein Substrat. Dabei werden Cosubstrate / Cofaktoren wie Fe2+, 2-Oxoglutarat, Askorbat, NAD(P)H und Flavine benötigt [Ibrahim & Anzellotti, 2003]. Sie spielen eine wichtige Rolle sowohl bei der Oxidation der Flavanoide zu Flavonoiden (FSI - Flavon-Synthase I [Britsch, 1990; Martens et al., 2001]; FLS - Flavonol-Synthase [Britsch et al., 1981]) als auch bei der Hydroxylierung der Ringe A und C (F6H - Flavonoid-6- Hydroxylase [Anzellotti & Ibrahim, 2000], FHT - Flavanon-3-Hydroxylase [Forkmann & Heller, 1999; Wimmer et al., 1998]). Es wurde gezeigt, dass eine Hydroxylase des Zygomyceten Absidia blakesleeana in der Lage ist, die C4'-Position von Flavanon und Isoflavanon anzugreifen [Abul-Hajj et al., 1991]; nähere Information zu diesem Enzym gibt es allerdings nicht. Pflanzlichen Peroxygenasen [EC 1.11.2.3] führen laut BRENDA lediglich Epoxidierungen [Lequeu et al., 2003; Hanano et al., 2006] und Sulfoxidationen durch; Flavonoide sind nicht unter ihren Substraten [Hamberg & Hamberg, 1996]. Pilzliche Peroxygenasen [EC 1.11.2.1], z. B. aus Agrocybe aegerita oder Coprinellus radians, epoxidieren/hydroxylieren verschiedene Aromaten, darunter Toluol, Naphthalin [Ullrich & Hofrichter, 2005, Anh et al., 2007; Kluge et al., 2007] und Anthracen [Aranda et al., 2010]; über eine Oxyfunktionalisierung von Flavonoiden durch diese Enzyme war bis zum Beginn des vorliegenden Promotionsvorhabens nichts bekannt.

2.2 Flavonoidreiche Pflanzen – Begründung der Auswahl

Im Zuge der Entwicklung innovativer kosmetischer und pharmazeutischer Produkte wird nach dem „idealen Pflanzenextrakt“ gesucht. Dieser sollte einerseits definierte, chemisch stabile Substanzen mit günstigen galenischen Eigenschaften (gleichbleibende Zusammensetzung) und andererseits keine bekannten Allergene enthalten [Schempp 2007]; außerdem sollten seine Inhaltsstoffe hautberuhigend wirken (d. h. Hemmstoffe des Signalmoleküls Interleukin-1-alfa, das von Stresszellen ausgeschüttet wird [Axterer et al. 2006]). Nicht zulezt sollten die verwendeten Pflanzen aus dem kontrollierten, ökologischen Anbau stammen und die Extraktherstellung umweltfreundlich ablaufen [Schempp 2007]. Unter dieser Prämisse wurden Früchte/Blüten/Blätter folgender Pflanzen als besonders geeignet für die vorliegende Arbeit ausgewählt: Aronia melanocarpa (Apfelbeere; Beeren), Trifolium pratense (Rotklee oder Wiesenklee; Blüten), Bellis perennis (Gänseblümchen, Blüten), Fragaria ananassa (Gartenerdbeere; Blätter). Die Auswahl der Pflanzen erfolgte dabei auch nach folgenden Kriterien: Anteil potentieller Wirkstoffe (Flavonoide), die Bekanntheit der Pflanze (positive Assoziationen mit der Pflanze, Marketingstrategien) und mögliche Anbauflächen in Deutschland.

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2.2.1 Aronia melanocarpa Die auch als Apfelbeere bekannte Pflanze gehört zur Familie der Rosengewächse (Rosaceae). Die Früchte der Aronia sind für ihren hohen Gehalt an Anthocyaninen (Cyanidinglykoside) [Bermudez-Soto, 2004], Vitamin E, K, β-Carotin sowie Vitamin B2, B9, C, PP, Eisen und Iod, Kalzium, Mangan, Kupfer, Kalium, Phosphor, Zink [Strigl et al., 1995] bekannt. Untersuchungen von [Slimestad et. al, 2005] belegen zudem einen hohen Gehalt an Chlorogen- und Neochlorogensäure; der Gehalt an Flavonolen (Quercetinglykoside) ist allerdings vergleichweise niedrig [Kaczmarowicz et al., 2004; Oszmiánski et al., 2005]. Der insgesamt hohe Flavonoidgehalt wird für die positiven antioxidativen und immunmodulatorischen Eigenschaften der Beeren verantwortlich gemacht [Kintlerova et al., 1998]. So tragen die Anthocyanine nachweislich zur Erniedrigung des Blutdrucks und Cholesterolspiegels im Blut bei [Cyr et al., 2006; Nosreti, 2001]. Die Aronia wird ebenso als Heilpflanze bei Darm- und Hauterkrankungen sowie bei Harnwegsinfektionen angewendet. Ohgami et al. [Ohgami et al., 2005] berichteten über eine erhöhte entzündungshemmende Wirkung der Aroniaextrakte im Vergleich zu einzelnen Flavonoiden bzw. Anthocyanidinen (synergistische Effekte im Extrakt). Nicht zuletzt wurde festgestellt, dass die anthocyaninreichen Extrakte der Aronia das Wachstum von menschlichen HT-29 Darmkrebszellen in vitro bis zu 90 % inhibieren (die normalen Darmzellen NCM 460 wurden in ihrem Wachstum nur zu < 10 % inhibiert) [Malik et al., 2003]. Es kann davon ausgegangen werden, dass die positiven Wirkungen der Pflanze insgesamt auf der hohen antioxidativen Kapazität und den guten Radikalfängereigenschaften der Inhaltsstoffe beruhen [Gasiorowski et al., 1997]. 2.2.2 Trifolium pratense Der Rot- oder Wiesenklee gehört zur Familie der Hülsenfrüchtler (Fabaceae). Die Pflanze zeichnet sich durch einen besonders hohen Gehalt an den Isoflavonoiden (Genistein und Daidzein) aus. Es gibt Hinweise darauf, dass diese Isoflavonoide eine östrogenähnliche Wirkung besitzen und bei der Behandlung altersbedingter oder hormonabhängiger Krankheiten (z. B. menopausale Symptome, Osteoporose, Herz-Kreislauf-Erkrankungen) hilfreich sind [Bradley, 1992; Zerykier, 2003]. Es sind aus der Literatur einige analytische Untersuchungen zu Rotklee-Extrakten bekannt [z. B. Polasek et al., 2007], die jedoch keine Quantifizierung der Inhaltstoffe vorgenommen haben (identifizierte Isoflavonoide: Daidzein, Daidzin, Genistein, Genistin, Formononetin, Ononin, Biochanin A, Sissotrin, Trifoside, Calycosin, Pectolinaringenin, Pratensein, Pseudobaptigenin; identifizierte Flavonoide: Quercetin, Isoquercetin, Hyperosid). In der Kosmetik werden dem Rotklee Anti-Aging-Eigenschaften zugeschrieben, da er die Haut reinigt und den Zellstoffwechsel der Haut aktiviert [CTFA, 2007]. Der Inhaltsstoff Genistein blockiert die α-Reduktase und beugt damit Akne und Haarausfall vor [He et al., 1996]. Die flavonoiden Inhaltsstoffe des Rotklees gehören zu den guten Radikalfängern [Zerykier, 2003].

25 Stand der Forschung

2.2.3 Bellis perennis Die umgangsprachlich als Gänseblümchen bezeichnete Pflanze gehört zur Familie der Korbblütengewächse (Asteraceae) und zählt zu den bekanntesten Pflanzenarten Mitteleuropas, die auch als Heilkraut und Futterpflanze von Bedeutung ist. In der Medizin werden Gänseblümchen wegen der diuretischen, entzündungshemmenden, schleimlösenden, krampfstillenden, und blutreinigenden Wirkung angewendet [Bielenberg & Wilhelm, 1993; Nazuruk et. al, 2001]. Auch im Bereich der Kosmetik könnte die reinigende Wirkung Anwendung finden, um etwa die Hautoberfläche sauber zu halten. Untersuchungen von Nazuruk et al. haben gezeigt, dass Extrakte von Gänseblümchen sich durch einen besonders hohen Gehalt an Flavonoiden auszeichnen. Es wurden dabei vier Flavonoidstrukturen, die z. T. glykosyliert vorlagen, identifiziert (Apigenin, Apigeninglykoside, Kämpferol, Kämpferol- glykoside, Isorhamnetinglykoside, Quercetin); weitere Strukturen sind zu erwarten. Die Blüten von B. perennis enthalten neben Flavonoiden auch Saponine, ätherische Öle, Bitterstoffe, Schleime, Gerbstoffe, phenolische Säuren, Vitamine und Minerale [Nazuruk et. al, 2001; Hagenmeyer et al., 2006]. 2.2.4 Fragaria ananassa Erdbeeren gehören zur Familie der Rosengewächse (Rosaceae). Die Blätter der Gartenerdbeere werden seit langem als Tee verwendet und haben in der Volksmedizin aufgrund ihrer diuretischen, adstringierenden und blutreinigenden Wirkung einen festen Platz [Diener, 1954]. Untersuchungen von Creasy et al. zeigten, dass in den Blättern ein interessantes Spektrum an Flavonoiden (zwei Quercetinglycoside, zwei Kämpferolglycoside, Cyanidin-3-glucosid, D-Catechin, Leucoanthocyanine) enthalten ist [Creasy et al., 1964]. Es bestünde folglich die Möglichkeit, einen weiteren Teil der Pflanze (Blätter) einer Wertschöpfung zugänglich und damit den Anbau von Erdbeeren noch attraktiver zu machen. Die Blätter wären nach der dreijährigen Fruchtperiode der Pflanze sinvoll weiterverwendbar (Extraktgewinnung) und müssten nicht länger kompostiert oder verbrannt werden. 2.3 Enzymatische Transformationen der Agrocybe-aegerita- Peroxygenase (AaeAPO)

Zu den Biokatalysatoren, die im Sinne der Weißen Biotechnologie Verwendung finden, gehören neben Enzymproteinen auch stoffwechselaktive, ganze Zellen (vorzugsweise Mikroorganismen → Ganzzellbiokatalyse). Aufgrund ihrer herausragenden Stoffwechselleistungen und vielfältigen Enzymausstattung werden Mikroorganismen (v. a. Bakterien, Hefen, Schimmelpilze) schon seit Jahrhunderten in industriellen Produktionsverfahren effektiv eingesetzt [Heiden et al., 2001]. Viele Enzyme sind als katalytisch aktive Proteine auch in der Lage, komplexe biochemische Reaktionen

26 Stand der Forschung außerhalb der lebenden Zelle durchzuführen. Sie spielen eine Rolle bei der Herstellung bestimmter Spezial- und Feinchemikalien, aber auch in verschiedenen großtechnischen und Breitanwendungen [BMBF, 2012; Braun et al., 2006; Ruttloff, 1994]. Die Haupteinsatzgebiete für Enzyme sind heute Waschmittel (32 %), technische Prozesse (20 %) sowie die Herstellung von Lebensmitteln (33 %) und Futtermitteln (11 %). Die Mehrzahl der in industriellen Prozessen eingesetzten Enzyme gehört zu den Hydrolasen (z. B. Amylasen) und Isomerasen (Xylose-Isomerase), daneben finden auch vereinzelt Oxidoreduktasen, Lyasen und Transferasen technische Anwendung [Festel et al., 2004]. Für die Herstellung hydroxylierter Flavonoidderivate kommen (wie bereits im Kapitel 2.1.6.3 beschrieben) lediglich Oxidoreduktasen aus den Gruppen der Peroxygenasen, Monooxygenasen und Dioxygenasen in Frage. Die intrazellulären Monooxygenasen und Dioxygenasen benötigen für ihre katalytische Aktivität komplexe und teure Cosubstrate / Cofaktoren [Ibrahim & Anzellotti, 2003]. Pilzliche Peroxygenasen kommen hingegen mit kostengünstigem Wasserstoffperoxid aus und sind zudem als extrazelluläre Enzyme sehr stabil [Ullrich et al., 2004]. Daher wurden im Rahmen dieser Dissertation hydroxylierte Derivate von Flavonoiden mit Hilfe einer gutuntersuchten, pilzlichen Peroxygenase synthetisiert. 2.3.1 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Aufbau und Katalysemechanismus Der Südliche Ackerling (Agrocybe aegerita) gehört zur Familie der Bolbitiaecae (Mistpilzartige) und wächst im Holz und auf der Borke toter oder kranker Laubbäume (vorzugsweise Pappeln) sowie auf mulchähnlichen Materialien [Ullrich & Hofrichter, 2005]. Es handelt sich um einen essbaren Lamellenpilz (Agaricales), der zur großen Gruppe der Basidiomyceten (Ständerpilze) gehört [Ullrich et al., 2004]. Ein neuartiges peroxidabhängiges Enzym des Pilzes wurde erstmals als Haloperoxidase (aufgrund der

Bromierung von Phenolen in Gegenwart von Bromid und H2O2) [Ullrich et al., 2004] beschrieben, später jedoch als echte Peroxygenase erkannt [Kluge et al., 2008, Hofrichter et al. 2010]. Es stellt einen funktionellen Hybriden aus Peroxidase und Cytochrom-P450-abhängiger Monooxygenase dar. Das Enzym ist aufgrund seiner Peroxygenase-Eigenschaften (effiziente Übertragung von peroxidbürtigem Sauerstoff) und seiner katalytischen „Vielseitigkeit“ einer neuen Peroxidase- Subklasse (EC 1.11.2) zugeordnet worden und bildet als unspezifische Peroxygenase (EC 1.11.2.1) deren Leitenzym [IUBMB Enzyme nomenclature; Peter et al., 2011]. Neben der offiziellen Bezeichnung unspecific peroxygenase (UPO; unspezifische Peroxygenase) wird in der Literatur auch häufig die Abkürzung APO verwendet; diese steht für aromatic peroxygenase (Aromaten- Peroxygenase) und reflektiert die besondere Eigenschaft des Enzyms, aromatische Ringe zu epoxidieren/hydroxylieren [Hofrichter et al. 2010]. Das Kürzel UPO oder APO wird i.d.R. durch den ersten Buchstaben des Gattungsnamens und den beiden ersten Buchstaben des artspezifischen Epithetons des jeweiligen Pilzes ergänzt (z. B. AaeAPO – Agrocybe aegerita aromatic peroxygenase).

27 Stand der Forschung

Eine Peroxygenase ist eine peroxidabhängige Oxidoreduktase, die den direkten Transfer eines

Sauerstoffatoms aus einem Peroxid (O-Donor, Elektronenakzeptor; vorzugsweise H2O2) auf ein Substrat, das dabei oxidiert wird, vermittelt [Hanano et al., 2006].

R-H + H2O2 → R-OH + H2O Die AaeAPO kristallisiert in einem orthorhombischen Gitter (siehe Abbildung 14) [Piontek et al., 2010]; die charakteristische Färbung der Kristalle geht auf das als prosthetische Gruppe enthaltene Häm zurück [Ullrich et al. 2004].

Abbildung 14: Kristalle der (a) AaeAPO II (bei pH 8,5; Länge 1,2 mm), (b) AaeAPO II (bei pH 5,6) und (c) AaeAPO II (bei pH 4,6), (d) orthorombisch flächenzentriertes Kristallgitter [Piontek et al., 2010] Die Molmasse des glykosylierten Enzyms beträgt 44-46 kDa, nach Deglykosylierung 37 kDa, d. h. bis zu 20 % des fertigen Enzyms bestehen aus Zuckerderivaten [Piontek et al. 2010]. Untersuchungen zu den Isoformen der AaeAPO ergaben, dass sechs chromatographisch unterscheibare Isoformen durch den Pilz sekretiert werden [Ullrich & Hofrichter, 2005], von denen drei mit Hilfe der Chromatofokussierung isoliert (pI 5,2; 5,6; 6,1) und hinsichtlich ihrer katalytische Aktivität untersucht wurden [Ullrich et al., 2009]. Das Fehlen signifikanter Unterschiede im Substratspektrum deutete dabei auf unterschiedlich glykosylierte Formen desselben Proteins hin. Allerdings haben molekulargenetische Studien zur AaeAPO gezeigt, dass der Pilz über verschiedene Peroxygenasegene verfügt; inwieweit diese allerdings exprimiert werden, ist unklar [Pecyna et al. 2009]. 29 % der N-terminalen Sequenz und 27 % der gesamten Proteinsequenz der AaeAPO sind mit der CfuCPO (Chlorperoxidase des Pilzes Caldariomyces fumago) identisch; zu P450-Enzymen besteht keine nennenswerte Sequenzhomologie [Ullrich et al. 2004, Pecyna et al. 2009]. Eine hohe Homologie wurde für verschiedene APOs agarikaler Pilze untereinander gefunden (z. B. 65 % Identität und 75 % Ähnlichkeit der AaeAPO zur CraAPO, Aromaten-Peroxygenase aus Coprinellus radians). Peroxygenasen sind mittlerweile in verschiedenen Pilzgruppen genetisch nachgewiesen und einige auch auf Proteinebene isoliert und charakterisiert worden [Anh et al. 2007, Pecyna et al., 2009, Hofrichter et al. 2010, Gröbe et al. 2011]. Als Häm-Thiolat-Protein [Häm – Typ b; Eisen-Protoporphyrin IX (siehe Abbildung 15), das nicht kovalent gebunden ist] besitzt die AaeAPO im aktiven Zentrum ein Eisen, dass equatorial durch vier

28 Stand der Forschung

Porphyrin-Stickstoffatome und axial durch ein proximales Cystein (Cys36) sowie einen distalen Liganden koordiniert wird [Pecyna et al., 2009]. Die distale Stelle dient als katalytisches Zentrum

(variiert im Laufe des katalytischen Zykluses) und wird durch Phenylalanine (Phe121 und Phe199) eingegrenzt [Cirino & Arnold, 2002; Pecyna et al., 2009].

CH2

HC CH3 4 6 H C CH 3 A B N 1 N CH2 R 9 1 21 22 Fe 24 23 2 19 R NN 11 D C H3C CH3 16 14

H2C CH2

H2C CH2 COOH COOH

Abbildung 15: Häm (Fe markiert) (rechts) und seine nähere Umgebung an der proximalen Seite der AaeAPO bestehend aus einem helikalen Segment, das ein Cystein (R1) beinhaltet. Darstellung der Elektronendichte der AaeAPO bei einer Auflösung von 2,52 Ǻ, gerechnet nach Dichtemodifikation in autoSHARP [Piontek et al., 2010] (links) Betrachtet man das UV-Vis-Spektrum der gereinigten AaeAPO im Grundzustand, so ergeben sich nahezu die gleichen spektrometrischen Charakteristika wie für P450-Enzyme (während zur CfuCPO deutliche Unterschiede bestehen) [Segall et al., 1997; Ullrich & Hofrichter, 2005; Anh et al., 2007]. Das aktive Zentrum der AaeAPO zeichnet sich laut Röntgenstrukturanalyse durch einen relativ breiteren Eingang aus, den auch größere Moleküle (z. B. Pyren oder Lignin-Dimere) passieren können [Aranda et al., 2010; Kinne et al. 2011]. Im Fall der Umsetzung von monohalogenierten Pyridinen zu den entsprechenden N-Oxiden wurde kein negativer Effekt eines sich vergrößernden Atomradius festgestellt, im Gegenteil die Aktivität des Enzyms verhielt sich umgekehrt zur Elektronegativität der

Halogensubstituenten (I > Br > Cl > F) [Ullrich et al., 2008]. Phenylalanin (Phe204) ist in Kontakt mit dem Häm und es existiert ein Pfad über weitere Phenylalanine bis zur Oberfläche des Enzyms (zum

Phe232) [Piontek et al., 2009]. Dies deutet auf einen sogenannten LRET (long-range electron transfer) hin, der eine Oxidation polarer Substrate (ohne Sauerstoff-Transfer) an der Oberfläche ermöglicht (z.B. ABTS → ABTS+•). Ein durch mehrere Carboxylgruppen (Glutamat, Häm-Propionat) in der Struktur fixiertes Magnesium (Mg2+) verleiht der AaeAPO gemeinsam mit dem hohen Glykosylierungsgrad eine hohe Stabilität sowie eine gute Wasserlösslichkeit [Pecyna et al., 2009]. Um einen Sauerstoff-Transfer vom Häm zum Substrat zu gewährleisten muss eine kritische Entfernung von 2,5 Ǻ bis 3,5 Ǻ erreicht werden [Harris & Loew, 1998]. Aufgrund des relativ weiten Hämkanals (ca. 7 Å) ist dies für viele Substrate der AaeAPO gegeben [Piontek et al., 2009]. Die meisten Hämproteine verfügen über Kreuzreaktivitäten (d. h. sie katalysieren auch Reaktionen, die für andere Enzymgruppen typisch sind) [Cirino & Arnold, 2002; Guengerich et al., 2001; Zámocký et al., 2008]. Auch die AaeAPO vereint mehrere katalytische Fähigkeiten in sich. Sie verhält sich wie

29 Stand der Forschung eine klassische Peroxidase im Fall der Phenoloxidation (Bildung von p-Benzochinonen und Kopplungsprodukten) oder sie agiert als Häm-Thiolat-Haloperoxidase (wenn z. B. Phenol bromiert wird) [Ullrich & Hofrichter, 2005], als Katalase (wenn Wasserstoffperoxid in Abwesenheit eines zweiten Substrates unter Sauerstoff-Freisetzung zersetzt wird) [Ullrich et al., 2004; Bernroitner et al., 2009], als Etherase (O-Dealkylierung) [Kinne, 2010]) und nicht zuletzt als Mono[per] analog Cytochrom-P450-Enzymen (z. B. Oxidation von Naphthalin zum 1-Naphthol und 2-Naphthol; siehe Abbildung 16) [Kluge et al., 2008, Ullrich & Hofrichter, 2005].

ZelleZelle Zelle NAD(P)H+H+ CYP450 NAD(P)+

OH O2 H2O

AaeAPO

OH H2O2 H2O

Abbildung 16: Extra- versus intrazelluläre Hydroxylierung von Naphthalin – AaeAPO versus CYP450 Monooxygenase [modifiziert nach Ullrich & Hofrichter, 2005]. Die AaeAPO stellt das erste beschriebene extrazelluläre Enzym dar, das eine direkte aromatische

Oxygenierung mit Hilfe von H2O2 als Cosubstrat katalysiert.

Abbildung 17: Hypothetischer katalytischer Zyklus der AaeAPO am Beispiel der Naphthalinhydroxylierung. (1) natives Enzym, (2) Eisen (III)-Peroxidkomplex (Komponente 0 – CYP450), (3) Häm – Oxyferryl- Radikalkation-komplex (Komponente I - Peroxidasen), (4) gedachter Übergangszustand protonierter Komponente I/II-Substratkomplex. [Kinne, 2010]

30 Stand der Forschung

Die Reaktion läuft über einen Weg ab, der dem sogenannten peroxidase shunt einiger P450-Enzyme ähnelt (siehe Abbildung 17) [Isin & Guengerich, 2007; Ullrich & Hofrichter, 2007]. Dieser alternative Weg umgeht einen Teil des „natürlichen“ P450-Zyklus‘, inklusive des geschwindigkeitsbestimmenden Schritts [Cirino & Arnold, 2002]. Über die genannten Reaktionen hinaus katalysiert die AaeAPO auch die N-Dealkylierung sekundärer Amine (N-Methylanilin, [Kinne, 2010]).

2.3.2 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Hydroxylierung / Oxygenierung Bisher sind zahlreiche biotechnologisch relevante Oxidationen bekannt geworden, die durch die AaeAPO katalysiert werden, zum Beispiel Hydroxylierungen, Epoxidierungen, Alkohol- und Aldehydoxidationen sowie Etherspaltungen. Das Enzym arbeitet dabei in einem pH-Bereich von 2,5 bis 9, wobei in den meisten Fällen ein Optimum um pH 7 beobachtet wurde. Die Reaktionen laufen oft regio-, einige auch stereoselektiv ab; letzteres bevorzugt unter Bildung der (R)-Enantiomere (Substrate: z. B. n-Heptan, n-Oktan [Peter et al., 2011], Ethylbenzol [Kluge et al., 2007], Propranolol [Kinne et al., 2009b], 2-Phenoxypropionsäure [Kinne et al., 2008]). Als Substrate der AaeAPO, die erfolgreich oxygeniert/ hydroxyliert wurden, seien weiterhin folgende Beispiele genannt: Veratrylalkohol, Bezylalkohol, Anisalkohol [Ullrich, 2004], Toluol und Naphthalin [Ullrich & Hofrichter, 2005], Ethylbenzol bis Pentylbenzol [Kluge et al., 2007], Pyridin (inkl. 3- Methyl- und 3,5-Dimethylpyridin) [Ullrich et al., 2008], Tetrahydrofuran, Diethylether [Kinne et al., 2009], Dibenzothiophen [Aranda et al., 2009], 1-Methylnaphthalin, 2-Methylnaphthalin, Dibenzofuran, Fluoren, Anthracen, Phenanthren, Pyren [Aranda et al., 2010], 4-Nitrophenol [Peng et al., 2010], 4-Nitrotoluol [Kinne et al., 2010], Propan bis n-Hexadekan, Cyclopentan bis Cyclooktan, Norcaran, Isobutan [Peter et al., 2011] sowie Diclofenac, Acetanilid, Carbamazepin, Ibuprofen, Tolbutamid, etc. [Poraj-Kobielska et al., 2011]. Ein katalytisches Limit erreicht das Enzym im Fall großer Moleküle (z. B. Perylen [Aranda et al., 2010], 17-α-Ethinylestradiol [Poraj-Kobielska et al., 2011], oligomerer PEG-Ether [Kinne et al., 2009]), bei Verbindungen ohne abstrahierbaren Wasserstoff (Diphenylether [Kinne, 2010]), stark verzweigten Substanzen (2,2,4,4-Tetramethylpentan [Peter et al., 2011]) und hochpolaren Verbindungen (di- oder perchlorierte Pyridine, Nikotinsäure [Ullrich et al., 2008]). In den meisten Fällen dürfte der fehlende direkte Kontakt des Substrates zum Ferryl-Sauerstoff der Komponente I für die Inaktivität verantwortlich sein [Hofrichter & Ullrich, 2006, Isin & Guengerich, 2008]. Hinzu kommt die relativ hohe Peroxidaseaktivität der AaeAPO (z. B. gegenüber Phenolen), die oftmals den Einsatz von Radikalfängern notwendig macht [Ullrich et al., 2009; Piontek et al., 2010].

Die Umsetzung der genannten Verbindungen lässt vermuten, dass auch die Mehrringsysteme der Flavonoide einer Oxygenierung oder anderweitigen oxidativen Modifikation durch die

31 Stand der Forschung

AaeAPO zugänglich sind. Alles in allem stellt das Enzym einen besonders versatilen Biokatalysator mit großem Synthesepotenzial dar [Hofrichter & Ullrich, 2006; Manoj & Hager, 2008].

2.3.3 Agrocybe-aegerita-Peroxygenase (AaeAPO) – Funktion Bisher kann über die natürliche Funktion der AaeAPO nur spekuliert werden. So wird angenommen, dass das Enzym der Detoxifizierung von Pflanzeninhaltsstoffen dient (analog der Polaritätserhöhung durch Phase-I-Reaktionen [Varazashivili et al., 2001]) oder mit dem Abbau polymerer Naturstoffe im Zusammenhang steht (Lignin, Humus), indem es Sauerstofffunktionalitäten in aromatische Substrate außerhalb der Pilzzelle einbaut [Ullrich & Hofrichter, 2005; Anh et al., 2007]. Die detoxifizierende Funktion ist am wahrscheinlichsten, da Pilze ständig mit potentiell zytotoxischen Verbindungen in ihrer Umgebung konfrontiert sind [Campoy et al., 2009; Kellner et al., 2010]. Ein Beispiel ist die Demethylierung des methoxylierten Phytoalexins Pisatin, in deren Verlauf die Toxizität der Verbindung drastisch sinkt [George et al., 2001; Kinne, 2010]. Außerdem könnte die AaeAPO als „Substratdonator“ für andere phenoloxidierende Enzyme (z. B. Laccasen) fungieren [Kinne, 2010]. Vielversprechende Ansätze für einen praktischen Einsatz der AaeAPO und anderer Peroxygenasen sind aus der Biosensorforschung bekannt geworden, u. a. zur Detektion von 4-Nitrophenol [Peng et al., 2010] oder als Reagenz für chemoluminiszente Immunoassays [Vdovenko et al., 2010].

32 Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Geräte und Chemikalien

Eine Liste der verwendeten Geräte und Chemikalien befindet sich auf beigefügter CD; Datei: Material und Methoden.doc. 3.2 Versuchsorganismen

Agrocybe aegerita (A1K) Bjerkandera adusta (Ud1) 3.3 Kulturmedien

Alle Medien wurden, wenn nicht anders beschrieben, im Autoklaven bei 121 °C und 3 atm für 20 min sterilisiert. 3.3.1 Agar-Medien Die Stammhaltung des Pilzes Agrocybe aegerita erfolgte auf Soja-Agar: Sojamehl 3,0 % (m/v) Agar-Agar 2,0 % (m/v) in dest. Wasser (pH = 6,5) Die Stammhaltung von Bjerkandera adusta erfolgte auf Malzextrakt-Agar: Malzextrakt 2,0 % (m/v) Agar-Agar 2,0 % (m/v) in dest. Wasser (pH = 5,5)

3.3.2 Flüssigmedien 3.3.2.1 Sojabohnenmehl-Medium Zur Kultivierung von Agrocybe aegerita (A1K) in Submerskultur (→AaeAPO-Bildung) diente eine 3%-ige (m/v) Sojabohnenmehl-Suspension in destilliertem Wasser. Der pH-Wert der Suspension betrug 6,5. 3.3.2.2 Kirk-Acetat-Medium Zur Kultivierung von Bjerkandera adusta in Submerskultur (→MnP-Bildung) wurde ein Kirk-Acetat- Medium nachfolgender Zusammensetzung verwendet: Glucose 5,0 g Magnesiumsulfatheptahydrat 0,5 g Hefeextrakt 0,3 g Calciumchlorid 0,1 g Diammoniumtartrat 0,5 g Natriumacetat 2,0 g Kaliumdihydrogenphosphat 2,0 g (Angaben pro Liter Medium)

33 Material und Methoden

Der pH-Wert wurde mit 50 %-iger Essigsäure auf 5,0 eingestellt. Zur Beimpfung der Medien wurden Kolben (200 ml Flüssigmedium) mit 9 ml Homogenisat einer bewachsenen Agarplatte beimpft. Die

Homogenisierung einer Agarplatte erfolgte in 90 ml dest. H2O mittels Ultra-Turax.

3.4 AaeAPO - Enzymgewinnung und Reinigung

Das extrazelluläre Enzym AaeAPO wurde aus der Kulturflüssigkeit (Rohextrakt) des Pilzes A. aegerita gewonnen (siehe Anhang D). Nach Erreichen der maximalen Enzymaktivität (Volumenaktivität) wurde die Pilzbiomasse von der enzymhaltigen Kulturflüssigkeit mittels Sieb abgetrennt. Es folgte das Zentrifugieren und die Glasfaser-Filtration der AaeAPO - haltigen Kulturbrühe. Das Kulturfiltrat wurde anschließend bei 12 °C mittels Ultrafiltration konzentriert (10 kDa-cut-off-Membran). Zur Separation und Reinigung des extrazellulären Enzyms wurde ein ÄKTA-FPLC-System (ÄKTAexplorer, Amersham Biotech) verwendet. Die Detektion der eluierten Proteine erfolgte bei 280 nm (Gesamtprotein), 420 nm (Soret-Bande der AaeAPO) sowie bei 540 nm (weitere Hämabsorption). Für die IEC-FPLC wurde eine XK-16-Säule mit SP-Sepharose FF verwendet. Der starke Kationenaustauscher besteht aus quervernetzter Agarose, die mit Sulfopropyl-Gruppen derivatisiert ist. Als Fließmittel (A) diente 10 mM Natriumacetat (pH 4,5). Eine 2 M NaCl-Lösung in 10 mM Natriumacetat pH 4,5 wurde als Elutionsmittel (B) verwendet. Die Flussrate betrug 13 ml/min bei einer Fraktionsgröße von 7 ml. Nach dem Applizieren der Probe auf die Säule, erfolgte das Spülen der Säule mit Laufmittel A (zweifaches Säulenvolumen), um nicht-gebundene Fremdproteine zu entfernen. Danach wurde ein linearer Gradient (bis 30 % Eluent B) über 42 min gefahren. Die weitere Reinigung erfolgte an einer Anionenaustauschersäule (MonoQ 10/100 GL). Der starke Anionenaustauscher besteht aus MonoBeads (monodisperse, 10μm poröse Beads; stark hydrophil), die mit quartären Ammonium-Gruppen derivatisiert sind. Als Fließmittel (A) diente 10 mM Natriumacetat (pH 6,5). Eine 2 M NaCl-Lösung in 10 mM Natriumacetat pH 6,5 wurde als Elutionsmittel (B) verwendet. Die Flussrate betrug 6 ml/min bei einer Fraktionsgröße von 3 ml. Nach dem Applizieren der Probe auf die Säule, erfolgte das Spülen der Säule mit Laufmittel A (zweifaches Säulenvolumen), um nicht-gebundene Fremdproteine zu entfernen. Danach wurde ein linearer Gradient (bis 30 % Eluent B) über 27 min gefahren.

3.5 Bestimmung der Proteinkonzentration

Zur quantitativen Bestimmung der Proteinmenge wurde eine veränderte Methode nach Bradford verwendet [Bradford, 1976; Zor & Selinger, 1996]. Dabei bildet der Farbstoff Coomassie-Brillantblau G-250 im sauren Milieu mit Proteinen einen blaugefärbten Komplex. Als Folge verschiebt sich das

34 Material und Methoden

Absorptionsmaximum von 450 nm nach 595 nm. Die anschließende photometrische Vermessung erfolgte in Mikrotiterplatten (96 Kavernen) mit dem Roti®-Nanoquant-Test nach einer Vorschrift des

Herstellers (ROTH, Karlsruhe, Deutschland). Als Standard wurde Rinder-Serum-Albumin (BSA) verwendet.

3.6 Bestimmung enzymatischer Aktivitäten

Die photometrische Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgte bei Raumtemperatur in Quarzglasküvetten. Die Enzymaktivitäten sind in U/l angegeben und wurden nach folgender Gleichung berechnet. [A bs/min] Extinktion [Abs/min] mlV ⋅⋅ 10][ 6 Enzymaktivität[U/l] = G = Enzymaktivität[μ ⋅ l]mol/min ε ⋅⋅⋅ mlVcmdcmmoll ][][]/[

3.6.1 Laccase (Lacc, EC 1.10.3.2) Die Messung der Laccase-Aktivität erfolgte mittels ABTS, das über einen Ein-Elektronen-Transfer zum semistabilen, dunkelgrün gefärbten ABTS-Radikalkation oxidiert wird (siehe Anhang C). Die Reaktion wurde durch Zugabe des ABTS-Ammoniumsalzes gestartet und die Extinktionszunahme bei

420 nm (ε420 = 36.000 /mol*cm) über 30-60 s photometrisch verfolgt. Der Inkubationsansatz (1 ml) war wie folgt zusammengesetzt: Natriumcitratpuffer (pH 4,5) 50 mM ABTS 0,3 mM Enzymlösung 5-50 µl

3.6.2 Agrocybe aegerita (AaeAPO, EC 1.11.2.1) Die Messung der AaeAPO-Aktivität erfolgte mittels Veratrylalkohol, das bei pH 7 zu Veratrylaldehyd oxidiert wird (siehe Anhang C). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (100 mM) gestartet und die Extinktionszunahme bei 310 nm (ε310 = 9.300 /mol*cm) über 10 s photometrisch verfolgt. Der Inkubationsansatz (1 ml) war wie folgt zusammengesetzt: Kaliumphosphatpuffer (pH 7) 50 mM Veratrylalkohol 5 mM Wasserstoffperoxid 1 mM Enzymlösung 100 µl

35 Material und Methoden

3.6.3 Mangan-Peroxidase (MnP, EC 1.11.1.13) Zur Messung der MnP-Aktivität wurden die gebildeten Mn3+-Malonat-Komplexe detektiert (siehe Anhang C). Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasserstoffperoxid (10 mM) gestartet und die

Extinktionszunahme bei 270 nm (ε270 = 11590 /mol*cm) über 30 s photometrisch verfolgt. Der Inkubationsansatz (1 ml) war wie folgt zusammengesetzt: Natriummalonatpuffer (pH 4,5) 50 mM Wasserstoffperoxid 0,1 mM Manganchloridtetrahydrat 0,5 mM Enzymlösung 50 µl

3.7 Extraktionsmethoden

3.7.1 Aronia melanocarpa A. melanocarpa wurde in Form gefrorener Früchte von der STOLLE Obst GmbH (Schiringswalde, Deutschland) bezogen und nach dem Auftauen mit Hilfe der Mikrowellenextraktion (offenes System) sowie Ultraschallextraktion extrahiert. 3.7.1.1 Mikrowellenextraktion Die aufgetauten Beeren wurden mittels Küchenstabmixer homogenisiert; 50 g der homogenisierten Beeren wurden mit 84 ml Ethanol und 84 μl Phosphorsäure (65 %) versetzt und einer Normaldruck- Mikrowellenextraktion unter folgenden Bedingungen unterzogen: Phasen Zeit [min] Temperatur [°C] Aufheizphase 0 – 0,5 25 Ö x* Extraktionsphase 0,5 – 10,5 x* Abkühlphase 10,5 – 18 x* Ö RT * für x siehe 4.3.1.2 Anschließend wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter filtriert und einer nochmaligen Extraktion unterzogen. Beide Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.

3.7.1.2 Ultraschallextraktion Die aufgetauten Beeren wurden mittels Küchenstabmixer homogenisiert; 50 g homogenisierte Beeren wurden mit 84 ml Lösungsmittel (siehe 4.3.1.3) und 84 μl Phosphorsäure (65 %) versetzt. Die Extraktion verlief unter gelegentlichem Rühren im Ultraschallbad über 30 min. Zur Vermeidung des Abdampfens von Lösungsmittel bei erhöhter Temperatur wurde ein Rückflusskühler aufgesetzt. Danach wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter abfiltriert und einer nochmaligen Extraktion unterzogen. Die beiden Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.

36 Material und Methoden

3.7.2 Fragaria ananassa Blätter von Fragaria ananassa wurden im Herst 2007 im eigenen Garten (Druzcov, Tschechien) gesammelt, bei Raumtemperatur unter dem Abzug getrocknet und im Papierbeutel durch drücken und zerreiben gründlich zerkleinert. Die so gewonnenen Erdbeerblätter wurden anschließend mittels ASE (beschleunigte Lösungsmittelextraktion) extrahiert. Dafür wurden 1,65 g der zerkleinerten Erdbeerblätter mit etwa 2 g bis 3 g Hydromatrix vermengt (dient zur Aufnahme der Restfeuchte). Beide Komponenten wurden homogenisiert und in die Extraktionszelle gefüllt. Die Extraktion erfolgte mit dem System ASE 200 (siehe Abbildung). Die Extrakte wurden in Extraktionsgläsern gesammelt. Die exakten Bedingungen können dem Abschnitt 4.3.1.1 entnommen werden.

3.7.3 Trifolium pratense, Bellis perennis Gänseblümchen und Rotklee wurden in Form getrockneter Blüten von der Firma Valdemar Grešík NATURA s.r.o. (Tschechien) bezogen und mit einem Messerhomogenisator mechanisch zerkleinert. Die Extraktion erfolgte mittels Mikrowellentechnologie; 5 g der homogenisierten Blüten wurden mit 84 ml Ethanol und 84 μl Phosphorsäure (65 %) versetzt und einer Normaldruck- Mikrowellenextraktion mit folgenden Bedingungen unterzogen: Phasen Zeit [min] Temperatur [°C] Aufheizphase 0 – 0,5 25 Ö 50 Extraktionsphase 0,5 – 10,5 50 Abkühlphase 10,5 – 18 50 Ö RT

Anschließend wurde das Pflanzenmaterial über einen weitporigen Papierfilter filtriert und einer nochmaligen Extraktion unterzogen. Die beiden Filtrate wurden vereinigt und im Vakuum eingeengt.

3.7.4 Festphasenextraktion (SPE) Die Festphasenextraktion (solid phase extraction) wurde zum Konzentrieren bzw. zur Reinigung der Reaktionsgemische bzw. der Eluate der präparativen HPLC genutzt. Die Kartuschen wurden zuerst mit jeweils einer Säulenfüllung Methanol und dest. Wasser konditioniert. Danach erfolgte die Probenaufgabe (Flavonoid-haltige Lösungen) und das Waschen mit einer Säulenfüllung dest. Wasser. Die Kartuschen wurden trockengesaugt (für NMR-Untersuchungen noch mittels Stickstoff getrocknet) und anschließend zweimal mit je einer halben Säulenfüllung Methanol eluiert, wobei sich die Flavonoide von der Kartuschenmatrix lösten.

37 Material und Methoden

3.8 Analysenmethoden

3.8.1 HPLC (high performance liquid chromatography) 3.8.1.1 HPLC-MS (Methoden 1, 2) Die Analyse der Polyphenole/Flavonoide (Vorversuche, einige Langzeitversuche, Spritzenpumpenversuche, Phytoextrakte) erfolgte mit einem HPLC-MS-System der Firma Agilent unter folgenden Bedingungen: Stationäre Phasen: Lichrospher RP 8, 100*4,5 mm, 5 μm Synergi 4u Fusion RP18 80 Ǻ, 250*4,6 mm, 4 μm Eluent A: 0,01 % Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5 Eluent B: Acetonitril Gradient: Lichrospher RP 8 (Methode 1) Synergi Fusion RP 18 (Methode 2) Zeit [min] Eluent A Eluent B Fluss Zeit Eluent A Eluent B Fluss [%] [%] [ml/min] [min] [%] [%] [ml/min] 0 95 5 1 0 95 5 1 5 95 5 1 5 50 50 1 20 0 100 1 20 10 90 1 22 95 5 1 22 95 5 1 25 95 5 1 25 95 5 1 Injektionsvolumen: 10 μl Säulenofentemperatur: 40 °C Detektor: DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm, Datenintervall 4 nm, Wellenlängen 210 nm, 254 nm, 280 nm, 360 nm (oder stoffspezifisch) MS-ESI-Massenbereich 220-630 m/z, Spannung 4000 V; positive ion mode, 70eV 3.8.1.2 HPLC-DAD (Methoden 3, 4) Die Analysen der Langzeitversuche, die Kinetikversuche sowie die Analysen der Phytoextrakte wurden an einer HPLC der Fa. Varian durchgeführt. Es wurde ein Diodenarray-Detektor verwendet. Methode 3 Methode 4 Stationäre Phase: L-Column ODS RP18 120Ǻ, Stationäre Phase: Synergi 4u Fusion RP18 250*4,5 mm, 5 μm 80Ǻ, 250*4,6 mm, 4 μm Eluent A: 8 Vol.-% Acetonitril, Eluent A: 0,01 % Ammoniumformiat-Puffer 0,05 M Phosphat-Puffer pH 2,1 pH 3,5 Eluent B: Acetonitril Eluent B: Acetonitril Säulenofentemperatur: 40 °C Säulenofentemperatur: 40 °C

38 Material und Methoden

Gradient: L-Column ODS RP 18 (Methode 3) Synergi 4u Fusion RP 18 (Methode 4) Zeit [min] Eluent A Eluent B Fluss Zeit Eluent A Eluent B Fluss [%] [%] [ml/min] [min] [%] [%] [ml/min] 0 95 5 1,2 0 95 5 1 7,5 87 13 1,2 5 50 50 1 8,5 84 16 1,2 20 10 90 1 10 85 15 1,2 22 95 5 1 20 75 25 1,2 25 95 5 1 22 95 5 1,2 25 95 5 1,2

Injektionsvolumen: 20 μl Injektionsvolumen: 10 μl Detektor: DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm, Detektor: DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm, Datenintervall 4 nm, Wellenlängen 287 nm, Datenintervall 4 nm, Wellenlängen 210 nm, 326 nm, 370 nm, 528 nm (oder stoffspezifisch) 254 nm, 280 nm, 360 nm (oder stoffspezifisch)

3.8.1.3 Präparative HPLC-DAD Apigenin Die Fraktionierung des Apigenins und seines monohydroxylierten Produktes erfolgte mittels präparativer HPLC (Agilent) und DAD-Detektion unter folgenden Bedingungen: Stationäre Phase: Gemini NX 12 C18 110 Ǻ, 150*21,2 mm AXIA Eluent A: 0,01 % Ammoniumformiat-Puffer pH 3,5 Eluent B: Acetonitril Gradient: Gemini NX 12 C18, AXIA Zeit [min] Eluent A Eluent B Fluss Injektionsvolumen: 800 μl -1200 μl [%] [%] [ml/min] Fraktionssammler-Temperatur: 35 °C 0 95 5 5 Fraktionssammler-Sammelzeit: 40 45 55 5 31,7 min – 34,7 min 60 0 100 5 Detektor: DAD-Scanbereich (200 bis 800) nm, 61 95 5 5 Datenintervall 4 nm, Wellenlängen 284 nm, 71 95 5 5 336 nm

39 Material und Methoden

Luteolin, 6-Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon Die Fraktionierung weiterer Flavonoide und ihrer monohydroxylierten Produkte erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für Apigenin mit Ausnahme von Sammelzeiten und den stoffspezifischen Wellenlängen. Diese sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.

Tabelle 4: Fraktionssammler – stoffspezifische Sammelzeiten und Wellenlängen für 6-Hydroxyflavon, 7- Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon und Luteolin 6-Hydroxyflavon 7-Hydroxyflavanon 7-Hydroxyflavon Luteolin Sammelzeit- 47,2 – 53,0 37,0 – 45,0 36,5 – 41,5 25,75 – 31,50 Interval [min] Wellenlängen [nm] 270, 285, 305 241, 278, 343 250, 267, 313 254, 280, 347

3.8.2 NMR Die 1H- und 13C-NMR spektroskopischen Analysen der ausgewählten Polyphenole Apigenin, 6- Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavanon, 7-Hydroxyflavon, Luteolin und ihrer enzymatisch hergestellten hydroxylierten Derivate erfolgten in DMSO-d6 bei Raumtemperatur mit den NMR-Systemen: 1. GEMINI 200 1H-NMR 199,9850805 MHz (Hochschule Zittau/Görlitz) 13C-NMR 50,2863091 MHz, 2. BRUKER Mercury 300BB 1H-NMR 300,0846964 MHz (Universität Leipzig) 13C-NMR 75,4559885 MHz 3. BRUKER Mercury 400BB 1H-NMR 400,0047477 MHz (Universität Leipzig) 13C-NMR 100,5807333 MHz.

40 Ergebnisse und Diskussion

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Enzymgewinnung

Da die Pilzkultivierung sowie die Enzymherstellung und -reinigung bereits etablierte Methoden darstellten [Ullrich et al., 2004, 2009; Ullrich & Hofrichter, 2005], die lediglich erfolgreich angewandt wurden, finden sich Angaben dazu (zeitlicher Verlauf der Enzymbildung, FPLC-Elutionsprofile, etc.) nur im Anhang D der Dissertation. 4.2 Enzymatische Transformationen ausgewählter Flavonoide mittels AaeAPO

4.2.1 Orientierende Vorversuche Erste Vorversuche zur enzymatischen Transformation von Flavonoiden mittels AaeAPO sollten zeigen, ob diese Verbindungsklasse prinzipiell als Substrat für das Enzym geeignet ist. Als potenzielle Substrate wurden folgende Verbindungen eingesetzt: Apigenin, Flavon, Naringenin, Daidzein, Kämpferol, Luteolin und Rutin. Diese Auswahl repräsentiert breites ein relativ breites Spektrum an Flavonoidgrundstrukturen (Flavone, Flavanone, Isoflavone, Flavonolglykoside). Tabelle 5 listet einige molekulare Eigenschaften der untersuchten Verbindungen auf.

Tabelle 5: Ausgewählte Eigenschaften der in den Vorvesuchen untersuchten Flavonoide. LM – Lösungsmittel, MeOH – Methanol, DMF – N,N-Dimethylformamid. Bemerkung: Spektraldaten sind dem jeweiligen Stoffzertifikat des Herstellers entnommen.

Nr. Flavonoid Summenformel Molmasse [g/mol] UV-Vis- Spektrum [(LM); λmax [nm]]

1 Apigenin C15H10O5 270,24 (MeOH-0,5 % DMF); 335 (DMF); 267, 337

2 Daidzein C15H10O4 254,24 (MeOH); 250, 310 (DMF); 249, 302

3 Flavon C15H10O2 222,24 (MeOH); 252, 294 (DMF); 252, 296

4 Kämpferol C15H10O6 286,24 (MeOH-0,5%DMF); 267, 365 (DMF); 266, 366

5 Luteolin C15H10O6 286,24 (MeOH); 254, 266, 347 (DMF); 253, 266, 348

6 Naringenin C15H12O5 272,25 (MeOH); 288 (DMF); 289

7 Rutin C27H30O16 610,53 (MeOH); 257, 358 (DMF); 256, 355

41 Ergebnisse und Diskussion

Zunächst wurden Stammlösungen (50 mM) der Verbindungen 1-7 in DMF hergestellt. Aufgrund der geringen Löslichkeit der Verbindungen in Wasser (mit Ausnahme von Flavon) musste ein organisches Lösungsmittel verwendet werden. Methanol konnte nicht eingesetzt werden, da es selbst ein Substrat für die AaeAPO darstellt (Umsetzung zu Formaldehyd und Ameisensäure). Die Versuche wurden in HPLC-Vials mit Einsätzen (300 µl inserts) durchgeführt. Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug jeweils 200 μl. Zu jeder Reaktion wurde parallel eine Kontrolle mitgeführt (gleiche Zusammensetzung, aber ohne Enzym). Es wurden drei verschiedene Versuchsreihen durchgeführt (Tabellen 6-8). Die Reaktionen wurden mit Wasserstoffperoxid unter Rühren gestartet. Nach ca. zwei Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl 50 %iger Trichloressigsäure (TCA) gestoppt und die Proben mittels HPLC-MS (Methode 1) vermessen.

Tabelle 6: Versuchsreihe 1 zum Flavon (ohne Zusatz von DMF) Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration

Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 100 50 mM AaeAPO 200 U/ml 1 1 U/ml

H2O2 10 mM 20 1 mM Flavon 50 mM 2 0,5 mM Wasser 100 % 77 (78 control) 99 % (v/v)

Tabelle 7: Versuchsreihe 2 in 21 % (v/v) DMF; für alle Testverbindungen Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration

Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 100 50 mM AaeAPO 200 U/ml 1 1 U/ml

H2O2 10 mM 20 1 mM Flavonoid 50 mM 2 0,5 Wasser 100 % 37 (38 control) 79 % (v/v) DMF 100 % 40 (20+1) % (v/v)

42 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 8: Versuchsreihe 3 in 21 % (v/v) DMF und Gegenwart von Vitamin C; für alle Testverbindungen; 18 18 3b mit H2 O2; 3c für Flavon (57 μl bzw. 58 μl H2O, 0 μl DMF); 3d entspricht 3c mit H2 O2 Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 100 50 mM AaeAPO 200 U/ml 1 1 U/ml

H2O2 10 mM 20 1 mM Flavonoid 50 mM 2 0,5 mM Vitamin C 40 mM 20 4 mM Wasser 100 % 17 (18 control) 79 % (v/v) DMF 100 % 40 (20+1) % (v/v)

Die Ergebnisse der Versuche sind in Tabelle 9 zusammengefasst.

Tabelle 9: Umsetzung verschiedener Flavonoide durch AaeAPO (orientierende Vorversuche) 16 18 Nr. Substrat Produkte: [Molmasse] H2 O2/H2 O2, UV-Vis- Absorptionsmaxima (nm), Name, Versuchsreihe

1 OH [M+H]+ 287/289 H OO λmax = (283, 337) nm Scutellarein OHO Apigenin [M+H]+ 271 Versuche 3, 3b 2 OOH [M+H]+ 271/273

λmax = (256, 323) nm O OH Demethyltexasin + Daidzein [M+H] 255 Versuche 3, 3b 3 [M+H]+ 239/241 O [M+H]+ 239/241* λmax = (269, 306) nm λmax = (256, 321) nm O 6-Hydroxyflavon Versuche 1, 2, 3, 3c, 3d Flavon [M+H]+ 223 Versuche 1, 2, 3, 3c, 3d 4 OH + OOH [M+H] 303/305*

OH λmax = (273, 351) nm OH O Versuche 3, 3b Kämpferol [M+H]+ 287

43 Ergebnisse und Diskussion

5 OH [M+H]+ 303/305* HO O OH λmax = (278, 346) nm H OO Versuche 3, 3b Luteolin [M+H]+ 287 6 [M+H]+ 540* OH

OH O λmax = (289) nm [M+H]+ 289/291* Versuch 2 OH O λmax = (295, 359) nm [M+H]+ 291* Naringenin [M+H]+ 273 Versuche 3, 3b λmax = (294, 358) nm Versuch 3b 7 OH

OH O OH OO keine Umsetzung O O OH O OH OH OH OH OH OH Rutin [M+H]+ 611 * Referenzverbindungen nicht vorhanden

Mit Ausnahme des Flavonoldiglykosids Rutin (7) wurden alle Substrate wenigstens teilweise umgesetzt. In der Versuchsreihe 2 wurde eine vermehrte Polymerisation beobachtet (Dunkelfärbung der Reaktionslösung). Apigenin (1), Daidzein (2), Luteolin (5) und Kämpferol (4) wurden selektiv an einer Position monohydroxyliert. Die Umsetzung von Flavon (3) und Naringenin (6) in Gegenwart von Vitamin C lieferte jeweils zwei monohydroxylierte Produkte. In Abwesenheit von Ascorbinsäure wurde im Fall von Naringenin eine nicht weiter identifizierbare Verbindung (wahrscheinlich ein dimeres Kopplungsprodukt) mit einer Masse von 540 gebildet. Im Ergebnis der Voruntersuchungen wurde festgestellt, dass die Umsetzungen in den Versuchsreihen 3 (3b) am günstigsten verliefen. Die Anwesenheit von Ascorbinsäure in der Reaktionslösung verhinderte die oxidative Polymerisation der Substrate bzw. Produkte [Osman et al., 1996]. Abbildung 18 zeigt bespielhaft die HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mit und ohne Vitamin C. Die Produktzuordnung erfolgte mittels Referenzverbindungen.

44 Ergebnisse und Diskussion

OOH 2500 OH O OH ] OOH U 2000 2 A m [

m O OH 1500 1 2 2 2 1000 ption ption bei 254 n r 200 400 200 400 [nm] [nm] bso 500 1 A c b 0 a 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min]

Abbildung 18: HPLC-Chromatogramme der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO in Gegenwart (b) und Abwesenheit (c) von Vitamin C; Kontrolle ohne Enzym (a): 1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein; die Insets zeigen die UV-Vis-Spektren des Substrats und seines Hydroxylierungsproduktes. Ein Einfluss von Vitamin C auf das Produktspektrum wurde auch für die Microperoxidase-8 (MP-8) beobachtet. Dieses hämhaltige Oligopeptid gehört zu den sogenannten „Minienzymen“ (tryptisches Verdauungsprodukt von Cytochrom c) und nutzt wie die AaeAPO Wasserstoffperoxid als Cosubstrat [Harbury et al., 1965]. Der durch die MP-8 bei der aromatischen Hydroxylierung (z. B. von Anilin) übertragene Sauerstoff stammt ebenfalls aus dem Cosubstrat [Osman et al., 1996]. Es ähneln sogar die

Reaktionsbedingungen (7,5 μM MP8, 2,5 mM H2O2, 10 mM Anilin, 2 mM Vitamin C, 0,1 M Kaliumphosphat-Puffer pH 7,6). In Abwesenheit von Ascorbinsäure arbeitet das Minienzym im sogenannten „peroxidase mode“, wobei durch Ein-Elektron-Oxidation und Wasserstoff-Abstraktion Phenoxyl-/ Flavonoxylradikale gebildet werden, die anschließend di-, oligo- oder polymerisieren [Wang & Van Wart, 1989; Wang et al., 1991; Boersma et al., 2000]. In Anwesenheit von Vitamin C wechselt die MP-8 in den sog. „P450 mode“, wobei aromatische Hydroxylierungen, O- und N- Dealkylierungen oder oxidative Dehalogenierungen katalysiert werden [Osman et al., 1996; Dorovska et al., 1998; Boersma et al., 2000]. Auch die Chlorperoxidase (CfuCPO) kann zwischen diesen beiden Modi sowie einem dritten, sog. „halide oxidation mode“ wechseln, aromatische Verbindungen gehören jedoch nicht zu ihren Oxygenierungssubstraten (Originalzitat zur CPO, Hofrichter & Ullrich, 2006, Hofrichter et al., 2010). Es ist davon auszugehen, dass konkurrierende Reaktionen auch im Verlauf der AaeAPO-Katalyse ablaufen. Das Enzym verfügt über mehrere potentielle Bindungsstellen (mindestens zwei), an denen, nach Entstehung der reaktiven Komponente I, Oxidationen stattfinden können. Je nach Substrateigenschaften und pH werden die eine oder die andere oder beide Bindungsstellen genutzt. Relativ hydrophobe Verbindungen, die in den Hämkanal (d = 7 Ǻ) passen und dabei einen

45 Ergebnisse und Diskussion

Mindestabstand zum Häm-Eisen von 2,3 Ǻ erreichen, werden durch den Ferryl-Sauerstoff oxidiert und gleichzeitig oxygeniert (siehe Abbildung 19, peroxygenierender Weg c). Kleinere hydrophile Verbindungen (Halogenide, Peroxide) können den hydrophilen Kanal nutzen, wobei nach Anlagerung eines Halogenids (im Fall der AaeAPO vorzugsweise Bromid) an den Ferryl-Sauerstoff der Komponente I die hypothetische Komponente X gebildet wird (siehe Abbildung 19, halogenierender Weg a). Letztere zerfällt unter Freisetzung von Hypobromit (z. B. hypobromige Säure), das unspezifisch organische Verbindungen zu halogenieren vermag [Hofrichter & Ullrich, 2006]. Sowohl der Weg c als auch der Weg a sind Zwei-Elektronen-Oxidationen, die mit einem Sauerstoff-Transfer verbunden sind. Es wird davon ausgegangen, dass sich eine weitere Bindungsstelle, die sog. „Phenolbindungsstelle“, an der Enzymoberfläche befindet [Piontek et al, 2010, K. Piontek, persönliche Mitteilung 2012]. Sie wird bevorzugt von größeren hydrophilen Molekülen (z. B. ABTS, Farbstoffe, Phenolate, Polyphenole) besetzt, die nicht in den Hämkanal passen und/oder nur langsam in diesen gelangen. Die Phenolbindungsstelle ist über einen LRET mit dem Häm verbunden, wobei ein „electron hopping“ von einem Phenylalanin zum anderen angenommen wird [Piontek at al. 2010]. Diese Ein-Elektron-Oxidationen an der Enzymoberfläche führen in jedem Fall zur Radikalbildung, obgleich nicht auszuschließen ist, dass auch Ein-Elektron-Oxidationen im Hämkanal stattfinden (siehe Abbildung 19, peroxidativer Weg b) [Hofrichter, 2012].

O OH OH O OH OOH OH O OH O OH OOH OH O

OHO

O OOH O OOH OHO OHO OH OH O HO O O OHO HO OH O O OH OH H OO OH O O HO OHO OH

Br

Abbildung 19: Hypothetische Wege Peroxygenase-katalysierter Reaktionen mit Apigenin als phenolisches Substrat. a) halogenierender Weg (halide oxidation mode), b) peroxidativer Weg (phenol oxidation mode), c) peroxygenierender Weg (peroxygenation or P450 mode) [modifiziert nach Hofrichter et al., 2010, 2012]

46 Ergebnisse und Diskussion

Phenoxyl-/Flavonoxylradikale werden in Anwesenheit von Ascorbinsäure rückreduziert, was ihre Kopplung und Polymerisation unterdrückt [Osman et al., 1996; Pérez & Nilo Mejia, 2002]. Die Abbildung 20 zeigt den Flavonoid-Redoxzyklus in Pflanzen mit und ohne Vitamin C [Pérez & Nilo Mejia, 2002].

Abbildung 20: Flavonoid-Redoxzyklus. (1) mit Ascorbinsäure, (2) ohne Ascorbinsäure; GPx (Guajakol-Typ-Peroxidase), * lichtinduzierte Bildung auf genetischer Ebene, Flav (Flavonoid), Flav • (Flavonoidradikal), AsA (Ascorbinsäure), MDA • (Monodehydroascorbinsäureradikal), DHA (Dehydroascorbinsäure). cDHA-R (cytosolische Dehydroascorbinsäure Reduktase) [Pérez & Nilo Mejia, 2002]

Die enzymatische Transformation (Oxyfunktionalisierung) der Flavonoide durch die AaeAPO verläuft über den Weg c. Gleichzeitig wird auch der Weg b beschritten, der einen Großteil des Wasserstoffperoxids verbraucht, dessen radikalische Produkte jedoch durch Vitamin C in phenolische Flavonoide zurück reduziert werden. Dies führt insgesamt zu vergleichweise langsamen Oxygenierungsreaktionen sowie zu einem niedrigen Umsatz. Das quantitative Verhältnis der Wege b zu c ist substratabhängig. Im Verlauf der orientierenden Vorversuche wurde ein weiteres interessantes Phänomen beobachtet: Bei Abwesenheit von DMF stieg die Ausbeute an Hydroxylierungsprodukt für das Substrat Flavon deutlich an. Es wurde angenommen, dass DMF entweder selbst als Substrat fungiert (Konkurrenz- Reaktion ähnlich wie im Fall von Methanol) oder die Aktivität der AaeAPO hemmt (Inhibitorwirkung). Um diese Frage zu klären, wurden weitere Versuche durchgeführt – diesmal auch mit DMSO als Lösungsmittel. Der Nachweis einer Umsetzung der Lösungsmittel DMF und DMSO verlief negativ (Analytik mittels HPLC-MS), dagegen bestätigte sich die Hemmung der Enzymaktivität (Abbildung 21).

47 Ergebnisse und Diskussion

] 100 DMF 20 U/l 80 DMSO 20 U/l 60 DMF 40 U/l 40 DMSO 40 U/l 20

relative Enzymaktivität [% 0 0 5 10 20 Konzentration des Lösungsmittels [Vol.-%]

Abbildung 21: Hemmung der AaeAPO-Aktivität durch DMF und DMSO

Abbildung 21 zeigt die Hemmung der Enzymaktivität der AaeAPO (gemessen mit Veratrylalkohol) durch unterschiedliche Konzentration an DMF und DMSO (5 %-, 10 %- und 20 %-ige DMF- bzw. DMSO-Lösungen). Die Volumenaktivitäten beziehen sich auf die Reaktionsansätze (Gesamtvolumen 1 ml, Enzymstammlösungen 20 U/ml bzw. 40 U/ml (davon jeweils 1 μl eingesetzt), 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7), 5 mM Veratrylalkohol, 1 mM Wasserstoffperoxid). Mit steigendem Lösungsmittelanteil sank die relative Enzymaktivität sowohl für DMF als auch DMSO. Die Abbildung 21 zeigt, dass die inhibierende Wirkung von DMSO auf die AaeAPO stärker ausgeprägt war als die von DMF, weshalb es nicht als Lösungsmittel-Alternative geeignet war. Eine hemmende Wirkung von DMF und DMSO ist auch für andere Hämenzyme (z. B. CYP2E1 (DMF); CYP2C8/2C9, CYP2C19, CYP2E1 und CYP3A4 (DMSO)) beschrieben worden. [Tolando et al., 2001, Chauret et al., 1998]

4.2.2 Variation der Reaktionsbedingungen der enzymatischen Transformationen In weiteren Versuchen wurde geprüft, welchen Einfluss die Konzentration des Cosubstrats Wasserstoffperoxid auf die Art und Menge der gebildeten Produkte hatte. Die Versuche wurden mit den Verbindungen 1 bis 6 (siehe Tabelle 5) durchgeführt. Die Testbedingungen wurden wie folgt geändert: 1. Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Zugabe von Wasserstoffperoxid und Durchführung von Langzeitversuchen 2. Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe 3. Kontinuierliche Wasserstoffperoxid-Dosierung mittels Spritzenpumpen

48 Ergebnisse und Diskussion

4.2.2.1 Variation der Enzymkonzentration bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe und Durchführung von Langzeitversuchen Die Versuche unter einmaliger Cosubstratzugabe wurden entsprechend dem Versuchsschema 4 durchgeführt. Die Variable stellte die AaeAPO-Endkonzentration dar (0,95 U/ml; 1,9 U/ml; 5,7 U/ml). Dementsprechend wurde die zugegebene Menge an AaeAPO und Wasser in den Reaktionsansätzen verändert. Nach zwei Minuten wurde die Reaktion durch Zugabe von 20 µl 50 %iger Trichloressigsäure gestoppt und die Proben mittels HPLC-MS (Methode 1) vermessen.

Tabelle 10: Versuchsschema 4 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF), Bsp. 1,9 U/l AaeAPO Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 100 50 mM AaeAPO 380 U/ml 1 1,9 U/ml

H2O2 10 mM 20 1 mM Flavonoid 50 mM 2 0,5 mM Vitamin C 40 mM 20 4 mM Wasser 100 % 17 79 % (v/v) DMF 100 % 40 (20+1) % (v/v)

Tabelle 11: Ergebnisse der Versuche unter einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe, Reaktionszeit 2 min, TC – total conversion [Us] Umsatz bezogen auf das Substrat (TC [%]), Quantifiziertes Nr. Substrat [Ab] Ausbeute* [%] Produkt 0,95 U/ml 1,9 U/ml 5,7 U/ml [Us] [Ab] [Us] [Ab] [Us] [Ab] 1 Apigenin Scutellarein 43 35 48 42 41 29 2 Daidzein Demethyltexasin 33 14 23 23 2 2 Flavon in Wasser 6-Hydroxyflavon 19 8 11 11 6 6 3 Flavon in DMF 6-Hydroxyflavon n.b. n.b. 13 0,3 7 0 4 Kämpferol - 29 - 30 - 30 - 5 Luteolin - 23 - 33 - 15 - 6 Naringenin Eriodictyol 56 4 46 4 37 4 * soweit Referenzverbindungen vorhanden waren; n.b. nicht bestimmt

Die Tabelle 11 listet die Ergebnisse dieser Batch-Versuche auf. Der Theorie nach, sollte mit steigender Enzymkonzentration der Umsatz ebenso wachsen. Dies konnte jedoch für keine der sechs getesteten Substanzen beobachtet werden. Die ermittelten Zahlenwerte für die Umsätze erscheinen hingegen

49 Ergebnisse und Diskussion willkürlich bezüglich der eingesetzten Enzymmenge und ohne erkennbaren Zusammenhang. Dies deutet darauf hin, dass andere Faktoren als die Enzymkonzentration bestimmend/limitierend für die Umsetzungen waren. Entscheidend könnte hierbei die ausgeprägte peroxidative Aktivität der AaeAPO sein, die gerade im Fall größerer phenolischer Substrate wie den Flavonoiden, mit der peroxygenierenden Aktivität konkurriert (vgl. Abbildung 19). Die Folge ist, dass eine Erhöhung der Enzymmenge in Anwesenheit von Ascorbinsäure nicht zwangsläufig zu einer Erhöhung der peroxygenierenden Aktivität führen muss, sondern, dass bildlich gesprochen, die bevorzugte peroxidative (phenoloxidierende) Aktivität verstärkt „im Kreis geführt wird“. Eine zusätzliche unproduktive Zersetzung des Cosubstrates (im Sinne der avisierten Flavonoid-Oxygenierung) könnte – insbesondere für Daidzein, Flavon und Naringenin – die Katalase-Aktivität der AaeAPO darstellen. Diese bewirkt, vor allem bei einmaliger Zugabe von Wasserstoffperoxid, dessen partielle Zersetzung zu O2 und H2O [Ullrich & Hofrichter, 2005, Ullrich et al., 2008]. Katalaseähnliche Aktivitäten wurden auch für die Chlorperoxidase [Sun et al., 1994] und pflanzliche Peroxidasen beschrieben [Zámocký et al., 2001]. Als Konsequenz dieser Testreihe kann abgeleitet werden, dass Kurzzeitversuche unter einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe, auch in Gegenwart relativ hoher Enzymmengen, nur wenig geeignet sind, um die Oxygenierung von Flavonoiden durch die AaeAPO zu untersuchen.

In einem weiteren Schritt wurde für alle Testsubstrate der zeitliche Verlauf ihrer Umsetzung untersucht. Dazu wurden Probelösungen mit einem Gesamtvolumen von 1 ml vorbereitet. Die Probenahme erfolgte nach 0 s, 10 s, 30 s, 1 min, 10 min, 30 min, 1 h, 2 h und 4 h, indem jeweils 100 μl Probe in ein mit 10 μl 50 %iger TCA gefülltes Vial überführt wurden. Anschließend wurden die Proben mittels HPLC-DAD vermessen (Methode 4, Injektionsvolumen: 11 μl). In den meisten Fällen war die die Geschwindigkeit der Oxygenierungsreaktionen zu niedrig, um eine angemessene Umsetzung innerhalb von vier Stunden zu erreichen, weswegen Langzeitversuche durchgeführt wurden. Diese erfolgten z. T. über mehrere Tage und führten zu deutlich höheren Produktausbeuten. Die optimale Reaktionszeit bei einer Enzymaktivität von 1,9 U/ml betrug für Apigenin und Daidzein sechs Tage, für Luteolin 56 Stunden, für Kämpferol zwei Tage, für Flavon sieben Stunden und für Naringenin vier Stunden. Die eingesetzte Enzymaktivität von 1,9 U/ml war im Vergleich zu anderen Peroxygenase-katalysierten Reaktionen zwei- bis zehnmal höher [Ullrich et al., 2004; Kluge et al., 2007]. Der Grund hierfür ist wiederum in dem bereits oben beschriebenen, unproduktiven H2O2-Verbrauch zu sehen, der eine insgesamt geringe Reaktionsgeschwindigkeit bedingt. Ähnliches wurde bereits bei der Umsetzung von Propranolol und Diclofenac in Gegenwart von Ascorbinsäure beobachtet [Kinne et al., 2009b].

50 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 12: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche Umsetzung bezogen Quantifiziertes Versuchsdauer Ausbeute* Nr. Substrat auf das Substrat Produkt [h] [%] TC [%] 1 Apigenin Scutellarein 144 91 40 2 Daidzein Demethyltexasin 144 67 67 Flavon in Wasser 6-Hydroxyflavon 7 38 11 3 Flavon in DMF 6-Hydroxyflavon 7 1 <1 4 Kämpferol - 48 83 - 5 Luteolin - 56 84 - 6 Naringenin Eriodictyol 4 76 8 7 Rutin - 144 0 0 * soweit Referenzverbindungen vorhanden waren

Abbildung 22 zeigt drei vergleichende HPLC-Chromatogramme zur Daidzeinumsetzung nach zwei Minuten bzw. sechs Tagen enzymatischer Behandlungsdauer.

OOH 2500 OH O OH

U] 2000 2 OOH A m [

m O n 1500 1 2 OH 2

bei bei 254 2

n 1000 1 ptio r 200 400 200 400 [nm] [nm] bso 500 1

A c b 0 a 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min]

Abbildung 22: Vergleich der Daidzeiumsetzungen mittels AaeAPO im Kurzzeitversuch (b) und Langzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 - Daidzein.

51 Ergebnisse und Diskussion

4.2.2.2 Diskontinuierliche mehrmalige Wasserstoffperoxidzugabe Um die Katalase-Aktivität der AaeAPO möglichst niedrig zu halten, wurde das Cosubstrat in mehreren (zehn) Schritten zugegeben (die Endkonzentration im Ansatz war mit der einmaligen

Wasserstoffperoxidzugabe identisch). Zuerst wurden 150 μl 1 mM H2O2 zudosiert. Die nächsten

Zugaben erfolgten jeweils in 15-μl-Schritten ausgehend von einer 10 mM H2O2-Lösung (im Stundenabstand: Stunde 1 bis 7, weiter nach 27 und 50 Stunden; Analytik: HPLC-DAD, Methode 4).

Tabelle 13: Versuchsschema 5 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 750 50 mM AaeAPO 380 U/ml 7,5 1,9 U/ml

H2O2 1 oder 10 mM 150 / 15 1 mM Flavonoid 50 mM 15 0,5 mM Vitamin C 40 mM 150 4 Wasser 100 % 127,5 79 % (v/v) DMF 100 % 300 (20+1) % (v/v)

Da sich Langzeitversuche bei einmaliger Wasserstoffperoxidzugabe bereits bewährt hatten (bezüglich

Umsatz und Ausbeute), wurde diese Vefahrensweise auch im Fall der mehrmaligen H2O2-Zugabe angewendet.

Tabelle 14: Übersicht zu den Ergebnissen der Langzeitversuche unter mehrmaliger Zugabe des Cosubstrates (H2O2) Umsetzung bezogen Quantifiziertes Versuchsdauer Ausbeute* Nr. Substrat auf Substrat Produkt [h] [%] TC [%] 1 Apigenin Scutellarein 50 97 44 2 Daidzein Demethyltexasin 50 77 58 Flavon in Wasser 6-Hydroxyflavon 50 66 2 3 Flavon in DMF 6-Hydroxyflavon 50 10 <1 4 Kämpferol - 27 (103) 94 (100) - 5 Luteolin - 27 (103) 97 (89) - 6 Naringenin Eriodictyol 50 91 8 * soweit Referenzverbindungen vorhanden waren

52 Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass unter diesen Bedingungen vergleichbare oder höhere Ausbeuten erreicht werden können. Die Umsetzungen verliefen im Vergleich zur einmaligen Cosubstratzugabe „gleichmäßiger“ (siehe Apigenin, Abbildung 23).

0.5 o 0.45 Substrat (1x) 0.4 0.35 Produkt (1x) 0.3 Substrat (10x) 0.25 0.2 Produkt (10x) 0.15 0.1 0.05 Konzentration [mmol/ml] 0 0 102030405060 Ze it [h]

Abbildung 23: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin in Abhängigkeit von der H2O2-Dosierung; 1x - einmalige H2O2-Zugabe (1 mM); 10x - zehnmalige H2O2-Zugabe (portionsweise ad 1 mM). Interessanterweise setzte die Produktbildung erst ein, wenn eine definierte Cosubstratmenge erreicht war (siehe Tabelle 15).

Tabelle 15: Notwendige Mindestmenge an Wasserstoffperoxid für die AaeAPO-katalysierte Umsetzung ausgewählter Flavonoide. Apigenin Daidzein Flavon Flavon Kämpferol Luteolin Naringenin

DMF H2O

H2O2 [mM] 0,3 0,3 0,1 0,2 0,3 0,9 0,4

Die Ergebnisse dieser Versuche (diskontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe) führten insgesamt zu

ähnlichen Ergebnissen wie die Langzeitversuche unter einmaliger Zugabe von H2O2.

4.2.2.3 Kontinuierliche Wasserstoffperoxidzugabe (Spritzenpumpenversuche) Ähnlich wie im Fall der diskontinuierlichen Wasserstoffperoxidzugabe wurde auch durch kontinuierliche Zudosierung des Cosubstrats versucht, die Katalase-Aktivität der AaeAPO möglichst gering zu halten (die Endkonzentration war wiederum mit der einmaligen Wasserstoffperoxidzugabe identisch, 1 mM). Zunächst wurde der Reaktionsansatz nach dem unten aufgeführten Pipettierschema vorbereitet (Analytik: HPLC-MS, Methode 2).

53 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 16: Versuchsschema 6 (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) Substanz Konzentration Pipettier-Volumen End- (Stammlösung) [μl] Konzentration Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 100 50 mM AaeAPO 380 U/ml 1 1,9 U/ml Flavonoid-Standard 50 mM 2 0,5 mM Vitamin C 40 mM 20 4 mM DMF 100 % 40 (20+1) % (v/v)

Eine 1-ml-Hamiltonspritze wurde blasenfrei mit ca. 250 μl 5,4 mM H2O2 befüllt, mit einer Kapillare versehen und in der Spritzenpumpe (syringe pump) befestigt. Die Kapillare wurde in den Reaktionsansatz getaucht und unter kontinuierlichem Rühren die Reaktion gestartet. Die

Spritzenpumpe dosierte 19 μl 5,4 mM H2O2 pro Stunde, so dass die Gesamtdauer der Reaktion knapp

2 h betrug (Gesamtvolumen von 37 μl 5,4 mM H2O2). Die niedrigen Umsetzungen v. a. im Fall der ansonsten gut reagierenden Substrate Apigenin und Luteolin erforderten die Verlängerung der Reaktionszeit auf 8 h. Die Ergebnisse der Spritzenpumpenversuche fasst die nachfolgende Tabelle 17 zusammen.

Tabelle 17: Übersicht zu den Ergebnissen der Spritzenpumpenversuche Substrat Produkte Nr. (MS / Umsetzung nach 2 h (8 h) [%]) (MS / Ausbeute nach 2 h (8 h) [%],UV-Vis) OH + H OO [M+H] 287 / 43 (100)

1 λmax = (284, 336) nm OH O Scutellarein Apigenin [M+H]+ 271 / 51 (100) OOH [M+H]+ 271 / 1 (89)

2 O λmax = (258, 320) nm OH Demethyltexasin Daidzein [M+H]+ 255 / 73 (89)

[M+H]+ 239* [M+H]+ 239*# [M+H]+ 239 / 4 (3) O λmax = (254, 322) λmax = (266, 293) λmax = (270, 305) 3 O in Wasser nm nm nm Flavon [M+H]+ 223 / 13 (22) P1 P2 6-Hydroxyflavon

54 Ergebnisse und Diskussion

Substrat Produkte Nr. (MS / Umsetzung nach 2 h (8 h) [%]) (MS / Ausbeute nach 2 h (8 h) [%],UV-Vis)

[M+H]+ 239* [M+H]+ 239*# [M+H]+ 239 / 0 O λmax = (254, 321) λmax = (267, 296) λmax = (270, 304)

O in DMF nm nm nm Flavon [M+H]+ 223 / 6 P1 P2 6-Hydroxyflavon OH OOH [M+H]+ 303* 4 OH λ = (275, 349) nm OH O max Kämpferol [M+H]+ 287 / 47 (30) OH HO O OH [M+H]+ 303* 5 λ = (282, 346) nm H OO max Luteolin [M+H]+ 287 / 33 (95)

OH [M+H]+ 289*# [M+H]+ 289* [M+H]+ 289 / 7 (4) OH O λmax = (294, 356) λmax = (294, 358) λmax = (228, 287) 6 nm nm nm OH O P1 P2 Eriodictyol Naringenin [M+H]+ 273 / 77 (98)

OH OH O OH O OO 7 OH O O OH OH OH OH OH OH Rutin [M+H]+ 611 / 10 * Referenzverbindungen nicht vorhanden # neues Produkt Die Versuche führten zu vergleichbaren qualitativen Ergebnissen wie im Fall der Vorversuche mit kumulativer Cosubstratzugabe. Eine Ausnahme bildeten mit jeweils einem zusätzlichen Produkt (#) Flavon und Naringenin. Für Rutin konnte auch bei kontinuierlicher Wasserstoffperoxidzugabe keine Produktbildung beobachtet werden. Der Grund hierfür liegt in der Größe und Hydrophilie des Diglykosids, das nicht in die Enzymtasche passte. Dieses Phänomen korrespondiert mit anderen Studien, die den Einfluss der Substratgröße an Hand oligomerer Ethylenglykole untersuchten und ab einer bestimmten Größe

55 Ergebnisse und Diskussion

(Hexaethyleglykol) keine Umsetzung durch die AaeAPO mehr feststellten [Kinne et al., 2009, Kinne 2010]. Aus quantitativer Sicht war die kontinuierliche Versuchsführung mit Ausnahme von Flavon am effizientesten (2 h bzw. 8 h; vgl. das Beispiel Daidzein in Abbildung 24).

OOH 2500 OH O OH

U] 2000 2 OOH A

m [m O n 1500 1 2 OH 271 255 bei 254 bei

[%] 2 [%]

n 1000 1 1 ptio

r m/z m/z

bso 500

A 2 c b 0 a 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min]

Abbildung 24: Vergleich der Daidzeinumsetzung mittels AaeAPO im Spritzenpumpenversuch über 8 h (b) und im Lanzeitversuch (c), Kontrolle (a). 1 - Demethyltexasin, 2 – Daidzein.

Die UV-Vis und MS-Daten der in den Vorversuchen identifizierten Produkte wurden in den Versuchen unter kontinuierlicher Cosubstratzugabe bestätigt, korrigiert und vervollständigt (Tabelle 17). Zur weiteren Identifizierung einiger Produkte wurden 1H- und 13C-NMR-Untersuchungen durchgeführt.

4.2.3 Enzymatische Versuche zu weiteren Flavonoiden Um das Substratspektrum der AaeAPO bezüglich Flavonoiden genauer zu erfassen, wurde eine repräsentative Auswahl (57 Einzelverbindungen) verschiedener Flavonoidklassen (Flavanone, Flavone, Flavonole, Isoflavone) sowie unterschiedlich hydroxylierte und/oder methoxylierte Flavonoide getestet. Darauf aufbauend wurde die enzymatische Umsetzung in Abhängigkeit von der Flavonoid-Grundstruktur sowie vom Hydroxylierungs-/Substitutionsmuster evaluiert und die Ergebnisse mit entsprechenden Literaturdaten verglichen. Alle Versuche wurden entsprechend dem Pipettierschema 4 (siehe Tabelle 10) unter kontinuierlicher Peroxidzugabe (Spritzenpumpe) und in Anwesenheit von Ascorbinsäure durchgeführt, da sonst die primär gebildeten hydroxylierten Flavonoide zu o-Chinonen und Polymerisationsprodukten oxidiert werden können. Der zeitliche Verlauf der einzelnen Reaktionen wurde genauer betrachtet, wenn Folgereaktionen oder Umsetzungen mit mehreren Produkten auftraten.

56 Ergebnisse und Diskussion

4.2.3.1 Enzymatische Transformation von Flavanonen Der Tabelle 18 sind die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten (lokale Absorptionsmaxima) der untersuchten Flavanone zu entnehmen.

Tabelle 18: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavanone Nr. Flavanon Summenformel Molmasse UV-Vis–Spektrum

[g/mol] (Lösungsmittel); λmax [nm] 1 Eriodictyol C15H12O6 288,24 (DMF); 228, 288

2 Flavanon C15H12O2 224,25 (DMF); 218, 251, 320

3 Hesperetin C16H14O6 302,3 (DMF); 227, 288

4 6-Hydroxyflavanon C15H12O3 240,25 (DMF); 255, 356

5 7-Hydroxyflavanon C15H12O3 240,25 (DMF); 232, 274, 310

6 2'-Hydroxyflavanon C15H12O3 240,25 (DMF);252, 320

7 3'-Hydroxyflavanon C15H12O3 240,25 (DMF); 251,320

8 4'-Hydroxyflavanon C15H12O3 240,25 (DMF); 251, 321

9 4',6-Dihydroxyflavanon C15H12O4 256,25 (DMF); 227, 356

10 Isosakuranetin C16H14O5 286,29 (DMF); 226, 288

11 5-Methoxyflavanon C16H14O3 254,29 (DMF); 213, 269, 331

12 6-Methoxyflavanon C16H14O3 254,29 (DMF); 228, 253, 351

13 4'-Methoxyflavanon C16H14O3 254,29 (DMF); 215, 251, 321

14 Naringenin C15H12O5 272,25 (DMF); 288

15 Naringenin-7-O-glucosid C21H22O10 434,40 (DMF); 229, 283

16 Pinocembrin C15H12O4 256,27 (DMF); 211, 288

Tabelle 19 fasst die Ergebnisse der AaeAPO-katalysierten Flavanon-Umsetzungen zusammen. Sie führt die Substrate in Verbindung mit den entstandenen Produkten sowie die prozentuale Umsetzung (bezogen auf das Substrat) auf. Wenn Referenzverbindungen vorhanden waren, sind auch die Produktausbeuten angegeben.

Tabelle 19: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavanonen durch die AaeAPO (TC – total conversion) Substrat TC Produkte / Ausbeute [%] Nr. (Struktur) [%] (Struktur) und/oder [Masse] OH OH O OH 1 90 [M+H]+ 305* [M+H]+ 305* OH O

57 Ergebnisse und Diskussion

Substrat TC Produkte / Ausbeute [%] Nr. (Struktur) [%] (Struktur) und/oder [Masse] OH O O O 2 43 OH O O O [M+H]+ 241 / 33 [M+H]+ 241 / 4

OCH3 OH O 3 OH 96 [M+H]+ 319*

OH O OH O O + 4 30 OH [M+H] 479* OH O O [M+H]+ 257 / 0,2

OH O OH O 5 95 OH O O [M+H]+ 257n

O 6 70 [M+H]+ 257* [M+H]+ 300* OH O OH O OH O + + 7 OH 70 [M+H] 257* [M+H] 257* HO O O [M+H]+ 273* OH OH O O + 8 27 OH [M+H] 257* O O [M+H]+ 257 / 4 OH OH O O OH 9 2 HO OH O O [M+H]+ 273*

58 Ergebnisse und Diskussion

Substrat TC Produkte / Ausbeute [%] Nr. (Struktur) [%] (Struktur) und/oder [Masse]

OCH3 10 OH O 100 [M+H]+ 303* [M+H]+ 289* [M+H]+ 289*

OH O

O 11 45 [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* [M+H]+ 257*

H3CO O

O O 12 32 OH [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* H3CO O O [M+H]+ 241 / 8 OH OH OCH 3 O O O + 13 77 OH [M+H] 271* O O O [M+H]+ 241 / 8 [M+H]+ 257 / 12 OH OH OH O OH O OH 14 98 [M+H]+ 289* [M+H]+ 439* OH O OH O [M+H]+ 289 / 4 OH O O O 15 HO 8 [M+H]+ 451* OH OH OH OH O

OH O 16 96 [M+H]+ 273*

OH O * Referenzverbindungen nicht vorhanden n Identifizierung mittels NMR

Flavanone sind durch eine gesättigte Bindung zwischen dem C2 und C3 sowie das Vorhandensein eines Phenylsubstituenten in C2-Position (2-Phenylchromane) strukturell charakterisiert. Es wurden unterschiedlich substituierte Flavanone untersucht, die bis zu vier Hydroxygruppen, Methoxygruppen und/oder O-glykosidische Substituenten aufwiesen. Ziel war es, Selektivitätsregeln für die enzymatische Hydroxylierung von Flavanonen durch die AaeAPO zu formulieren. Anhand der Massenspektren der Produkte und den beobachteten Veränderungen im Vergleich zu den Ausgangsverbindungen konnten zwei Reaktionstypen unterschieden werden: Hydroxylierung (m/z +16) und Demethylierung (m/z -14).

59 Ergebnisse und Diskussion

Die Stammverbindung Flavanon (2) wurde mit mittlerem Umsatz [43 %] bevorzugt in C6-Position hydroxyliert, in geringerem Umfang auch in C4'-Position. Eine Substitution der Positionen C6 und C4' im Flavanon beeinflusste dementsprechend die Reaktivität des Enzyms. Bei Anwesenheit einer Hydroxygruppe am C6 oder C4' fand nur eine moderate Umsetzung statt [(4): 30 %; (8): 27 %], wenn beide Positionen hydroxyliert waren, wurden lediglich Spuren des Substrats am C3' oxidiert [(9): 2 %]. Die Hydroxylierungsreaktion wurde hingegen in Anwesenheit einer Methoxygruppe in C4'-Position kaum beeinträchtigt [(3): 96 % und (13): 77 %]. Eine Methoxylierung der Position C6 wirkte wiederum in ähnlicher Weise wie eine entsprechende Hydroxylierung [(12): 32 %]. Zu den weiteren Faktoren, die die Transformationen deutlich negativ beeinflussten oder vollständig verhinderten, zählen die sterische Hinderung durch Carbohydrate ((15): 8 %). Besonders hohe Umsätze wurden dagegen beobachtet, wenn die Position C7 hydroxyliert war ((1), (3), (5), (10), (14), (16): 95 - 98 %). Hydroxygruppen in C2'- oder C3'- Position wirkten sich positiv auf die Umsetzung des Flavanons aus [(6), (7): 70 %]. Eine Methoxygruppe in C5- Position (d. h. in ortho-Stellung zur bevorzugten Hydroxylierungsstelle C6) hatte interessanterweise keinen Einfluss auf die Umsetzung im Vergleich zur Stammverbindung Flavanon [(11): 45 %]. Die meisten gefundenen Produkte stellen die zugehörigen einfach oder zweifach hydroxylierten (z. B. 3'-Hydroxyflavanon (7)) Ausgangsverbindungen dar. Zu jeweils nur einem monohydroxylierten Reaktionsprodukt wurden die Verbindungen Hesperetin (3), 7-Hydroxyflavanon (5), 4',6- Dihydroxyflavanon (9), Naringenin-7-O-glucosid (15) sowie Pinocembrin (16) umgesetzt. Die übrigen Substrate ergaben meist mehrere monohydroxylierte sowie anders derivatisierte Produkte oder Dimere (Tabelle 19). Auf Basis der vorliegenden Untersuchungen kann die C6-Position im heterocyclischen Chromansystems klar als bevorzugte Hydroxylierungsstelle der AaeAPO definiert werden [nachgewiesen für (2), (8) und (13)], gefolgt von der Position C4' im Phenylring [nachgewiesen für (2) und (4)]. Sind beide Positionen mit Hydroxyl- oder Methoxygruppen substituiert, wird wahrscheinlich nur noch die Position C3' in geringem Umfang hydroxyliert [positiver Abgleich der Reaktionsprodukte der Umsetzung von 4',6-Dihydroxyflavanon (9) mit dem Folgereaktionsprodukt der 3'-Hydroxyflavanontransformation]. Verglichen mit der Literatur verhält sich die AaeAPO bei der Hydroxylierung von Flavanon (2) ähnlich wie ganze Zellen/Hyphen von Aspergillus niger oder Penicillium chermesinum, die ebenfalls zwei Hydroxylierungsprodukte in den Positionen C6 und C4' bildeten [Kostrzewa-Suslow et al., 2008]. Da beide Gattungen dieser ascomycetalen Schimmelpilze bekanntermaßen über komplexe Cytochrom-P450-Systeme verfügen und für Ganzzell-Biotransformationen eingesetzt werden [Yildirim et al., 2010, Bartmańska et al., 2005; Xiao et al., 2011], kann davon ausgegangen werden, dass P450-Monooxygenasen die Reaktionen katalysierten. Theoretisch kämen auch Peroxygenasen infrage, da es molekularbiologische Hinweise auf die Existenz dieser Enzyme in beiden Gattungen

60 Ergebnisse und Diskussion gibt [Pecyna et al. 2009, Hofrichter et al. 2010]; der proteinchemische Nachweis ist allerdings noch nicht gelungen. Auch tierische P450-Enzyme (Kaninchen, CYP2B; Maus, CYP2A5) setzten Flavanon (2) zum 4'- Hydroxyflavanon (8) um; beim CYP2A5 entstand zusätzlich 2'-Hydroxyflavanon (6), jedoch kein 6- Hydroxyprodukt [Uno et al., 2008]. Naringenin (14) wurde durch pflanzliche Enzyme (Flavanon-3- Hydroxylase (EC 1.14.11.9, Dioxygenase), Flavonoid-3'-Hydroxylase (EC 1.14.13.21, P450)) zu jeweils einem monohydroxylierten Produkt [Position C3 - Dihydrokämpferol, Position C3'- Eriodictyol (1)] umgesetzt [Amor et al., 2010a, 2010b]. Eriodictyol (1), das auch im Zuge der AaeAPO-Katalyse entstand, wurde durch ganze Zellen des Basidiomyceten Phanerochaete chrysosporium (ebenfall ein P450-reicher Pilz [149 P450s, Syed&Yadav 2012]) und das P450-Enzym CYP1A aus Rattenleber-Mikrosomen gebildet [Nielsen et al., 1998; Kasai et al., 2009]. Mutanten des Bakteriums Streptomyces lividans, die Biphenyl-Dioxygenasegene aus Pseudomonas pseudoalcaligenes enthielten, bevorzugten hingegen die Hydroxylierung in den Positionen C2' oder C3' [Chun et al., 2003], die von der AaeAPO nicht oder nur in geringem Umfang angegriffen wurden.

Die O-Demethylierung von Methoxygruppen (Etherase-Aktivität der AaeAPO) wurde nicht als separate Reaktion beobachtet, sondern fand immer parallel zu den Hydroxylierungsreaktionen statt. Der Umsatz variierte zwischen 32 % und 100 %. Demethylierungsreaktionen wurden an allen hierzu untersuchten Flavanonen beobachtet [Isosakuranetin (10), 5-Methoxyflavanon (11), 6- Methoxyflavanon (12) und 4'-Methoxyflavanon (13)]. Die demethylierten Verbindungen wurden parallel monohydroxyliert [Bsp.: 4'-Methoxyflavanon (13), das zu 4'-Hydroxyflavanon (8) demethyliert und zu 4',6-Dihydroxyflavanon (9) monohydroxyliert wurde]. Aus der Literatur sind einige Beispiele für O-Demethylierungen von Flavanonen bekannt, jedoch nicht in Verbindung mit Hydroxylierungsreaktionen. So wurden Sakuranetin und 7- Methoxyeriodictyol durch eine P450-Monooxygenase des Zygomyceten Cunninghamella elegans gespalten und Hesperetin (3) durch CYP1A1 und CYP1B1 aus der bakteriellen Blinddarmflora des Schweins demethyliert [Labib et al., 2004; Abdel-Rahim et al., 2003]. O-Dealkylierungsreaktionen von Peroxygenasen und P450-Monooxygenasen gehören grundsätzlich auch zu den Hydroxylierungsreaktion [Ortiz de Montellano & Co, 2005, Kinne et al. 2009, Hofrichter & Ullrich 2010]. Es wird davon ausgegangen, dass eine solche Etherspaltung zunächst unter

Hydroxylierung eines dem Ether-Sauerstoff benachbarten C-Atoms (R1-O-CH2-R2) erfolgt, was zur

Entstehung eines instabilen Hemiacetals (R1-O-CHOH-R2) führt. In wässriger Umgebung zerfällt dieses spontan unter Bildung eines Alkohols/Phenols (R1-OH) und eines Aldehyds (R2-CHO); im Fall der Methoxyflavanone sind Hydroxyflavanone und Formaldehyd entstanden. Letzteres wurde nach Derivatisierung mit 2,4-Dinitrophenylhydrazon nachgewiesen.

61 Ergebnisse und Diskussion

4.2.3.2 Enzymatische Transformation von Flavonen Tabelle 20 listet die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten Flavone auf.

Tabelle 20: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavone Nr. Flavon Summenformel Molmasse UV-Vis – Spektrum

[g/mol] [(LM); λmax [nm]] 17 Acacetin C16H12O5 284,28 (DMF); 212, 267, 330

18 Amentoflavon C30H18O10 538,46 (DMF); 231, 267, 324

19 Apigenin C15H10O5 270,25 (DMF); 211, 267, 336

20 Apigenin-7-O-glucosid C21H20O10 432,38 (DMF); 214, 266, 335

21 Apigenin-4',5,7 - C18H16O5 312,33 (DMF); 215, 264, 322 trimethylether

22 Baicalein C15H10O5 270,24 (DMF); 216, 275, 322

23 Baicalein-7-methylether C16H12O5 284,28 (DMF); 278, 320

24 Chrysin C15H10O4 254,24 (DMF); 211, 268, 313

25 Chrysin-5,7- C17H14O4 282,30 (DMF); 263, 306 dimethylether

26 Flavon C15H10O2 222,24 (DMF); 251, 295

27 5-Hydroxyflavon C15H10O3 238,25 (DMF); 268, 334

28 6-Hydroxyflavon C15H10O3 238,25 (DMF); 228, 268, 304

29 7-Hydroxyflavon C15H10O3 238,25 (DMF); 250, 308

30 6,7-Dihydroxyflavon C15H10O4 254,25 (DMF); 265, 313

31 2',6-Dihydroxyflavon C15H10O4 254,25 (DMF); 266, 331

32 4',6-Dihydroxyflavon C15H10O4 254,25 (DMF); 273, 326

33 Luteolin C15H10O6 286,24 (DMF); 253, 266, 347

34 5-Methoxyflavon C16H12O3 252,38 (DMF); 264, 324

35 4'-Methoxyflavon C16H12O3 252,38 (DMF); 219, 253, 317

36 6-Methoxyluteolin C16H12O7 316,28 (DMF); 214, 271, 344

37 Orientin C21H20O11 448,38 (DMF); 212, 255, 348

38 Tangeretin C20H20O7 372,24 (DMF); 272, 322

39 Tectochrysin C16H12O4 268,28 (DMF); 211, 267

Tabelle 21 fasst die Ergebnisse der Biotransformation der Flavone durch die AaeAPO zusammen.

62 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 21: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonen durch die AaeAPO (TC – total conversion) Substrat Produkte / Ausbeute [%] Nr. TC [%] (Struktur) (Struktur) und/oder [Masse]

OCH3 OOH 17 83 [M+H]+ 301*

OH O OH OOH

OH O 18 OH 0 - OOH

O OH OH OH OOH OOH 19 100 OH OH O OH O [M+H]+ 287 / 100n OH O OO 20 OH 6 [M+H]+ 449* [M+H]+ 449* OH OH OH OH O

OCH3 H CO O 21 3 40 [M+H]+ 299*

H3CO O

OOH 22 0 - OH OH O

H CO O 23 3 0 - OH OH O

OOH OOH 24 46 OH OH O OH O [M+H]+ 271 / 46

H3CO O 25 4 [M+H]+ 299* [M+H]+ 299*

H3CO O

63 Ergebnisse und Diskussion

Substrat Produkte / Ausbeute [%] Nr. TC [%] (Struktur) (Struktur) und/oder [Masse] OH O O O + 26 13 OH [M+H] 239* O O O [M+H]+ 239 / 4 [M+H]+ 239*

O O 27 40 HO OH O OH O [M+H]+ 255n

O O + 28 30 HO [M+H] 255* OH OH O O [M+H]+ 255n

OH O OH O 29 43 OH O O [M+H]+ 255 / 43

OH O 30 0 - OH O

O 31 22 [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* OH OH O OH O 32 30 [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* OH O OH OH OH O OH OH O OH 33 95 OH OH O OH O [M+H]+ 303n

64 Ergebnisse und Diskussion

Substrat Produkte / Ausbeute [%] Nr. TC [%] (Struktur) (Struktur) und/oder [Masse]

O 34 5 [M+H]+ 269* [M+H]+ 269* [M+H]+ 269*

3CO OH OH OCH 3 O O 35 47 [M+H]+ 269* [M+H]+ 269* O O [M+H]+ 239* OH OH O 36 OH 0 -

H3CO OH O OH OH OH OH O OH 37 10 - OH O OH

OH O OCH H3CO 3 H CO O 38 3 25 [M+H]+ 359* H3CO 3CO OH

OOH H CO O 39 3 88 OH O OH O [M+H]+ 255 / 1 * Referenzverbindungen nicht vorhanden n Identifizierung mittels NMR

Flavone unterscheiden sich strukturell von Flavanonen durch die Doppelbindung zwischen den Atomen C2 und C3 (2-Phenylchromone). Im Rahmen der Dissertation wurden Verbindungen aus dieser Gruppe untersucht, die mit bis zu fünf Hydroxygruppen substituiert waren. Darunter befanden sich ausschließlich hydroxylierte, O- und C-glykosylierte sowie vollständig oder teilweise methoxylierte Flavone. Auch im Fall der Flavone konnten anhand der Massenspektren zwei Reaktionstypen – Hydroxylierung und Demethylierung – unterschieden werden. Der Umsatz betrug für die Hydroxylierungsreaktionen zwischen 40 % und 100 % (mit Ausnahme des schlecht löslichen Flavons). Die ermittelten Ergebnisse erlauben es wiederum Substitutionsmuster abzuleiten, die die Transformationen positiv oder negativ beeinflussen oder sogar gänzlich verhindern.

65 Ergebnisse und Diskussion

So wurden Verbindungen, die am Chromen-4-on drei Substituenten (C5, C6, C7) trugen [Hydroxy- oder Methoxygruppen, (22), (23), (36), wobei ein Substituent in Position C6 sitzen musste], nicht umgesetzt. Besonders hohe Substratumsätze wurden für Verbindungen registriert, die folgendes Hydroxylierungsmuster aufwiesen: C5, C7 und C4' [(19): 100%, (33): 95%]. Waren die Hydroxygruppen an diesen Positionen methyliert, sank der Substratumsatz [(17): 83%, (21): 40%]; besonders deutlich wurde dieses Phänomän im Fall der Verbindungen [(27): 40 %, (34): 5%]. Die in Tabelle 21 formelmäßig abgebildeten Produkte stellen ausschließlich die zugehörigen monohydroxylierten Produkte dar. Die Substanzen Acacetin (17), Apigenin (19), Chrysin (24), 5- Hydroxyflavon (27), 7-Hydroxyflavon (29) sowie Luteolin (33) wurden jeweils selektiv zu einem C6- hydroxylierten Reaktionsprodukt umgesetzt. Somit kann die Position C6 auch als die bevorzugte Hydroxylierungsstelle der Flavone angenommen werden. Im Zuge der Umsetzung der übrigen Flavon-Substrate entstanden mehrere monohydroxylierte Produkte, deren Struktur in den meisten Fällen allerdings nicht ermittelt werden konnte. Es wird hier aber ebenfalls von einer bevorzugten Hydroxylierung der C6-Position ausgegangen, gefolgt von der Position C4', was anhand der unsubstituierten Grundstruktur des Flavons (26) bestätigt werden konnte. In der Literatur wurden in diesem Zusammenhang nur wenige Biotransformationen von Flavonen in die Hydroxylierungsposition C6 beschrieben. So berichten Androutsopoulos et al. über die selektive Hydroxylierung von Chrysin (24) zu Baicalein (22) durch menschliche P450-Monooxygenasen (CYP1B1 und CYP1A1) [Androutsopoulos et al., 2009; Righi et al., 2010]. Die Mehrzahl der in der Literatur beschriebenen enzymatischen Hydroxylierungsreaktionen führten zu 4'-monohydroxylierten Produkten, wie zum Beispiel die Reaktion von Chrysin zu Apigenin [Griffiths & Smith, 1972], von Baicalein zu Scutellarein [Kostrzewa-Suslow et al., 2007] und von Flavon zu 4'-Hydroxyflavon [Udupa & Chadha, 1978]. Weitere Beispiele finden sich bei [Ibrahim & Abul-Hajj, 1990b] und [Herath et al., 2008]. In der Literatur wurden weiterhin Beispiele für die Hydroxylierung der C3'-Position (Flavon → 3'- Hydroxyflavon, PcCYP142c, PcCYP50c [Kasai et al., 2010], Apigenin → Luteolin, CYP1A [Nielsen et al., 1998]) sowie der C2'-Position (6-Hydroxyflavon → 2',6-Dihydroxyflavon, gemischter Biphenyl-Dioxygenase-Gencluster bphA1(2072)A2A3A4 von Pseudomonas pseudolacaligenes exprimiert in Streptomyces lividans [Chun et al., 2003]) beschrieben. In einigen Fällen wurden auch mehrere Produkte gebildet oder das Substrat mehrfach hydroxyliert [Ibrahim & Abul-Hajj, 1990; Chun et al., 2003; Shindo et al. 2003, Kagami et al., 2008]. In Abhängikeit vom hydroxylierenden Enzym beeinflusst das Substitutionsmuster der Flavone offensichtlich in unterschiedlicher Weise die Aktivität. Der Umsatz von 6-Hydroxyflavon (28) durch die AaeAPO belief sich auf 30 %, ganze Zellen von Streptomyces fulvissimus setzten hingegen unter vergleichbaren Bedingungen 60 % des Substrats um [Ibrahim & Abul-Hajj, 1990b]. Die Umsetzung von Baicalein (22), dessen Positionen C5, C6 und C7 besetzt sind, wurde durch die AaeAPO

66 Ergebnisse und Diskussion vollständig unterbunden, während die Verbindung von Penicillium chrysogenum (zu 5,7-Dihydroxy-6- methoxyflavon und 5,7-Dihydroxy-4',6-dimethoxyflavon) und Chaetomium sp. (zu 5,7-Dihydroxy-6- methoxyflavon) problemlos oxidiert wurde [Kostrzewa-Suslow et al., 2007]. Eine Demethylierung von Methoxygruppen durch die AaeAPO wurde für folgende Verbindungen beobachtet: Apigenintrimethylether (21), Tangeretin (38) und Tectochrysin (39). Der Umsatz variierte zwischen 25 % und 88 % und es wurde jeweils nur eine Methoxygruppe demethyliert; eine gleichzeitige Hydroxylierung der Verbindungen (21), (38) und (39), wie im Fall der Flavanone, fand nicht statt. Ein solches Reaktionsverhalten wurde dagegen für 4'-Methoxyflavon (35) gefunden. Die AaeAPO setzte die Verbindung (35) unter Demethylierung zu 4'-Hydroxyflavon und zwei unterschiedlich monohydroxylierten 4'-Methoxyflavonen um. Aufgrund eines übereinstimmenden UV-Vis-Spektrums [mit 4',6-Dihydroxyflavon (32)] konnte eines dieser Produkte als 4'-Methoxy-6- hydroxyflavon angenommen werden. Laut Literatur können Flavone, die in den Positionen C2', C6 [Gallagher et al., 1953] und C5 [Horie et al., 1997] methoxyliert sind, chemisch selektiv demethyliert werden. Biotechnologisch scheinen die Positionen C4' und C7 durch P450-Enzyme [Nielsen et al., 2000] und die C7-Position durch ganze Zellen von Aspergillus flavus [Herath et al., 2009] bevorzugt zu werden.

4.2.3.3 Enzymatische Transformation von Flavonolen Der Tabelle 22 sind die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten Flavonole zu entnehmen.

Tabelle 22: Ausgewählte Eigenschaften der untersuchten Flavonole

Nr. Flavonol Summenformel Molmasse UV-Vis–Spektrum [(LM); λmax [g/mol] [nm]] 40 3-Hydroxyflavon C15H10O3 238,25 (DMF); 242, 306, 342

41 3,6-Dihydroxyflavon C15H10O4 254,25 (DMF); 232, 328

42 Isorhamnetin C16H12O7 316,28 (DMF); 203, 254, 371

43 Kämpferol C15H10O6 286,25 (DMF); 266, 368

44 Myricetin C15H10O8 318,25 (DMF); 212, 253, 372

45 Quercetagetin C15H10O8 318,25 (DMF); 259, 360

46 Quercetin C15H10O7 302,24 (DMF); 208, 254, 371

47 Quercetin-3',4',3,5,7- C20H20O7 372,38 (DMF); 215, 248, 340 pentamethylether

48 Rutin C27H30O16 610,53 (DMF); 256, 355

Tabelle 23 fasst die Ergebnisse zur AaeAPO-katalysierten Biotransformation von Flavonolen in einer Übersicht zusammen.

67 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 23: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Flavonolen durch die AaeAPO (TC – total conversion) Substrat Produkte / Ausbeute [%] Nr. TC [%] (Struktur) (Struktur) und/oder [Masse]

O 40 0 - OH O

O 41 28 [M+H]+ 271* [M+H]+ 271* HOO H O OH

OOH + 42 OCH3 71 [M+H] 333* OH OH O OH OOH 43 47 [M+H]+ 303* OH OH O OH OH + 44 OOH OH 60 [M+H] 335* OH OH O OH OOH 45 OH 0 - OH OH OH O OH OH OOH OH OOH OH 46 94 OH OH OH OH O OH O [M+H]+ 319 / 20

OCH3

H3CO O + + 47 OCH3 4 [M+H] 359* [M+H] 359* OCH3 H3CO O OH OH O OH 48 O OO 0 OH O O OH OH OH OH OH OH * Referenzverbindungen nicht vorhanden

68 Ergebnisse und Diskussion

Flavonole sind durch die substituierte C3-Position (Hydroxy- oder Methoxygruppen, O-Glykoside) und die Doppelbindung zwischen dem C2- und C3-Atom gekennzeichnet (d. h. es handelt sich um C3- substituierte Flavone). Im Rahmen der Dissertation wurden Vertreter dieser Gruppe von Flavonoiden untersucht, die bis zu sechs Hydroxygruppen im Molekül enthielten, sowie methoxylierte und O-glykosylierte Verbindungen. Auf Basis der Massenspektren der Flavonol-Produkte konnten wie im Fall der Flavanone und Flavone zwei Reaktionstypen unterschieden werden – Hydroxylierung und Demethylierung. Die Umsätze für die Hydroxylierungsreaktionen erreichten, in Abwesenheit störender Einflüsse, Werte zwischen (47 und 94) %; Ausnahme bildete der Grundkörper 3-Hydroxyflavon (40), der nicht umgesetzt wurde. Zu den strukturelle Eigenschaften, die die Transformationen negativ beeinflussten oder vollständig unterbanden, gehörten das Vorhandensein einer Hydroxygruppe in C6-Position [vgl. Quercetagetin (45), 3,6-Dihydroxyflavon (41)] oder die sterische Blockierung durch Zuckerreste [Rutin (48)]. Die Hydroxylierung wurde in Gegenwart einer Methoxygruppe in der Position C3' nicht gestört [siehe Isorhamnetin (42)]. Die identifizierten Produkte stellen ausschliesslich korrespondierende monohydroxylierte Substrate dar. Selektiv wurden dabei die Substanzen Isorhamnetin (42), Kämpferol (43), Myricetin (44) sowie Quercetin (46) zu jeweils einem Reaktionsprodukt umgesetzt. Quercetin (46) wurde durch Hydroxylierung der C6-Position zum Quercetagetin (45) umgesetzt (Ausbeute 20 %). Auch im Fall der drei anderen Verbindungen wird von einer Oxidation der Position C6 ausgegangen, weil diese ähnliche Hydroxylierungsmuster und Umsetzungsraten wie Quercetin (46) aufwiesen. Darüber hinaus ergab der Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (45) und monohydroxyliertem Isorhamnetin (42) eine hohe Ähnlichkeit (Abbildung 25).

A

200 250 300 350 400 450 Wellenlänge[nm]

Abbildung 25: Vergleich der UV-Vis-Spektren von Quercetagetin (durchgängige Linie) mit dem gefundenen monohydroxylierten Isorhamnetin (gestrichelte Linie). Die Umsetzung von 3,6-Dihydroxyflavon (41) durch die AaeAPO ergab zwei monohydroxylierte Produkte unbekannter Struktur; das Pentahydroxyflavonol (45) wurde wahrscheinlich aufgrund der besetzten 6-Position und/oder seiner hohen Polarität nicht umgesetzt. Die Unfähigkeit der AaeAPO

69 Ergebnisse und Diskussion den Flavonol-Grundkörper [3-Hydroxyflavon (40)] anzugreifen, bleibt mysteriös. Inwieweit die Struktur unter Bindung an das Häm-Eisen als Inhibitor wirkt (ähnlich wie DMSO oder Coumarin [Barkova 2009 – nicht veröffentlicht (Kurzzeit&Langzeitversuche); Poraj-Kobielska, 2012]), bleibt in zukünftigen Untersuchungen zu klären. Aus der Literatur sind zahlreiche enzymatische Umsetzungen von Flavonolen bekannt. Morales et al. beschrieben die Umsetzung von Myricetin (44) durch eine hypodermale Peroxidase Isoenzym B5 vom Vitis vinifera; die Identität des Produktes blieb allerding ungeklärt [Morales et al., 1993]. Interessanterweise konnten P450-Enzyme aus Lebermikrosomen von Ratten Isorhamnetin (42), Myricetin (44) und Quercetin (46) in vitro nicht umsetzen (möglicherweise aufgrund der gleichzeitig besetzten Positionen C3' und C4'). Dagegen wurde Kämpferol (43) zu 12 % in Quercetin (46) umgewandelt [Nielsen et al., 1998]. Quercetin wurde als Modellverbindung hinsichtlich möglicher Biotransformationen durch Mikroorganismen und Enzyme besonders intensiv untersucht. Meerrettichperoxidase, z. B., bildete in Gegenwart von Glutathion (GSH) mit Quercetin 6- oder 8-Glutathionylquercetin (in Abwesenheit von GSH entstanden ca. 20 Produkte, darunter aber kein Quercetagetin (45) [Awad, 2000]). Das grampositive Bakterium Streptomyces griseus bewirkte sowohl eine Methylierung (in Position C3' zum Isorhamnetin (42) bzw. am C3'/C4' zum Dillenetin) als auch eine Hydroxylierung des (46) [in Position C5' zum Myricetin (44), in Position C8 zum Gossypetin]. Weiterhin ist die Methylierung von Gossypetin zum 8-Methoxyquercetin bekannt [Hosny, 2001]. Die anaerobe Umsetzung von Quercetin (46), Rutin (48) oder Kämpferol (43) durch Eubacterium ramulus lieferte nach Ringöffnung phenolische Säuren (3,4-Dihydroxyphenylessigsäure aus Quercetin und Rutin, 4- Hydroxyphenylessigsäure aus Kämpferol) [Schneider & Blaut, 2000].

Methoxylierte Flavonole wurden wie andere Methoxyflavonoide (s. oben) durch die AaeAPO demethyliert. So wurde das vollständig methoxylierte Flavonoid Quercetinpentamethylether (47) zu zwei monodemethylierten Produkten umgewandelt (Monohydroxyquercetintetramethylether). Bei der Umsetzung von Isorhamnetin (42) entstand hingegen nur ein Produkt mit einer Masse [M+H]+ von 333. Diese entspricht der Isorhamnetin-Masse [M+H]+ 317 plus 16, was somit auf ein monohydroxyliertes Produkt hindeutet. Wenn Isorhamnetin einfach demethyliert (317 minus 14) und anschließend doppelt hydroxyliert (plus 32) würde, entstünde ein Produkt mit der Masse [M+H]+ 335. Von einer Monodemethylierung von Isorhamnetin kann folglich nicht ausgegangen werden. In der Literatur wurden keine vergleichbaren Reaktionen gefunden.

4.2.3.4 Enzymatische Transformation von Isoflavonen Tabelle 24 listet die Summenformeln, die Molmassen sowie die UV-Vis-Daten der untersuchten Isoflavone auf.

70 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 24: Einige Stoffeigenschaften der Isoflavone Nr. Isoflavon Summenformel Molmasse UV-Vis – Spektrum

[g/mol] [(LM); λmax [nm]] 49 Biochanin A C16H12O5 284,26 (DMF); 261, 325

50 Daidzein C15H10O4 254,24 (DMF); 248, 300

51 Demethyltexasin C15H10O5 270,24 (DMF); 257, 323

52 Formononetin C16H12O4 268,26 (DMF); 249, 300

53 Genistein C15H10O5 270,24 (DMF); 211, 259

54 Genistein-4',7- C17H14O5 298,30 (DMF); 261 dimethylether

55 Genistin C21H20O10 432,38 (DMF); 209, 262, 325

56 Glycitein C16H12O5 284,27 (DMF); 260, 320

57 5-Methyl-7- C17H14O3 266,39 (DMF); 251 methoxyisoflavon

Tabelle 25 fasst die Ergebnisse zur Biotransformation von Isoflavonen durch die AaeAPO zusammen.

Tabelle 25: Übersicht zur enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die AaeAPO (TC – total conversion) Substrat TC Produkte / Ausbeute [%] Nr. (Struktur) [%] (Struktur) und/oder [Masse] OOH OOH [M+H]+ + 49 69 [M+H] 301* OH O OH 287* OH O OCH 3 + [M+H] 271 / 24 OOH OOH OH 50 89 O O OH OH [M+H]+ 271 / 89 OOH 51 OH 0 - O OH OOH OOH OOH + OH [M+H] 52 50 O O O OH OH 285* OCH3 [M+H]+ 255 / 25 [M+H]+ 271 / 3 OOH 53 90 [M+H]+ 287* [M+H]+ 287* OH O OH

71 Ergebnisse und Diskussion

Substrat TC Produkte / Ausbeute [%] Nr. (Struktur) [%] (Struktur) und/oder [Masse] OOH H3CO O [M+H]+ + 54 86 OH O [M+H] 301* OH O OH 285* OCH3 [M+H]+ 271 / 1 OO OH O + 55 OH OH 10 [M+H] 449* OH O OH OH OOH OOH OH 56 35 H3CO O O OH OH [M+H]+ 271/ 14

H3CO O 57 31 [M+H]+ 283* O

* Referenzverbindungen nicht vorhanden

Isoflavone sind einerseits durch einen Phenylring am C3-Atom des bicyclischen Rings und andererseits durch die Doppelbindung zwischen dem C2 und C3 charakterisiert und werden deshalb als 3-Phenylchromone bezeichnet. Im Rahmen der Dissertation wurden Vertreter dieser Gruppe von Flavonoiden untersucht, die bis zu drei Hydroxygruppen und/oder Methoxy-, Methylgruppen oder Zuckerreste enthielten. Auch im Zuge der enzymatischen Umsetzung von Isoflavonen durch die AaeAPO wurden zwei Reaktionstypen beobachtet – Hydroxylierung und Demethylierung. Die Umsätze für die Hydroxylierungsreaktionen betrugen, in Abwesenheit störender Einflüsse, bis zu 90 %. Generell stellen Isoflavone gute bis sehr gute Substrate für die AaeAPO dar; Details sind der Tabelle 25 zu entnehmen. Zu den strukturellen Charakteristika, die die Transformationen negativ beeinflussen, zählen die sterische Hinderung durch Zucker [Genistein-7-O-glucosid (55)] sowie die Anwesenheit einer Methylgruppe in C5-Position, d. h. in ortho-Stellung zur bevorzugten Hydroxylierungsposition C6 [5- Methyl-7-methoxyisoflavon (57)]. Die Hydroxylierung wurde durch das Vorhandensein einer Methoxygruppe in C4'-Position nicht gestört [Biochanin A (49)]. Die identifizierten Produkte stellen ausschliesslich zugehörige monohydroxylierte Verbindungen dar. Selektiv wurden dabei die Substanzen Daidzein (50), Genistin (55) sowie 5-Methyl-7-methoxyisoflavon (57) zu jeweils einem monohydroxylierten Reaktionsprodukt umgesetzt [Daidzein (50) → Demethyltexasin (51); Ausbeute 89 %]. Während der Umsetzung von Genistein (53) wurden zwei monohydroxylierte Produkte beobachtet. Auf Basis von Literaturdaten (UV-Vis-Spektren) [Kulling et al., 2000], wird von einer bevorzugten Hydroxylierung der C6-Position ausgegangen.

72 Ergebnisse und Diskussion

Verglichen mit der Literatur verlief die Hydroxylierung von Isoflavonen durch die grampositiven Bakterien Nocardia farcinica und Streptomyces lincolnensis in ähnlicher Weise und lieferte selektiv in C6-Position hydroxylierte Einzelprodukte [Park et al., 2008]. Im Unterschied hierzu wurden Daidzein (50) und Genistein (53) durch Streptomyces avermitilis oder rekombinante P450-Enzyme (CYP1A1, CYP1A2) regioselektiv in Position C3' [Pandey et al., 2010; Hu et al., 2009] oder durch die Isoflavon- 2'-Hydroxylase (CYP81C1) in Position C2' [Akashi et al., 1998] hydroxyliert. Die AaeAPO war in der Lage, Isoflavone nicht nur zu hydroxylieren, sondern auch Methoxyisoflavone zu demethylieren. Die meisten der untersuchten methoxylierten Isoflavone unterlagen gleichzeitig beiden Reaktionstypen. Die Umsätze variierten zwischen 50 % und 86 %. Die AaeAPO demethylierte die Verbindungen Formononetin (52) und Biochanin A (49) zum Daidzein (50) bzw. Genistein (53) (Ausbeute ca. 25 %), die wiederum monohydroxyliert werden konnten [Demethyltexasin (51): 3 % bzw. 6-Hydroxygenistein]. Gleichzeitig wurden Formononetin (52) und Biochanin A (49) auch zum Texasin [Dyke et al., 1964] bzw. mono-Hydroxybiochanin A umgesetzt [Tolleson et al., 2002]. Genisteindimethylether (54) wurde auf die gleiche Weise wie Formononetin (52) entsprechend der Reaktionsfolge Demethylierung und nachfolgende Hydroxylierung umgesetzt. Anstelle einer paralell erfolgenden Monohydroxylierung wurde aber das erste Reaktionsprodukt nochmals unter Bildung von Genistein (53) demethyliert (Ausbeute 1 %). Die Verbindung Glycitein (56) wurde jedoch nur demethyliert zu Demethyltexasin (51); Ausbeute 14 %. In der Literatur findet sich eine Reihe von Biotransformationen, die Ähnlichkeiten mit der AaeAPO- Umsetzung von Isoflavonen aufweisen. Menschliche Mikrosomen der Leber setzten beispielsweise Formononetin (52) in vitro zu vier Produkten um, wobei Daidzein (50) und 6-Hydroxyformononetin den AaeAPO-Produkten entsprechen [Roberts et al., 2004]. Ähnliches gilt für Biochanin A (49) und seine Produkte Genistein (53) und 6-Hydroxybiochanin A. Die Biotransformation von Glycitein (56) erfolgte in Eubacterium limosum [Hur & Rafii, 2000], Arthrobacter sp., Brevibaterium epidermis sowie Micrococcus luteus [Klus & Barz, 1993; Klus & Barz, 1995] in analoger Weise zur O- Demethylierung durch die AaeAPO (Produkt Demethyltexasin). Generell weist die enzymatische Umsetzung von Isoflavonen viele Gemeinsamkeiten bei Bakterien und Pilzen auf.

73 Ergebnisse und Diskussion

4.2.4 Strukturaufklärung 4.2.4.1 Referenzverbindungen Aufgrund verfügbarer Referenzverbindungen konnte das Produktspektrum der AaeAPO-katalysierten Umsetzungen von Flavonoiden in weiten Teilen ermittelt werden. Die Aufklärung aller Produkte gelang für die Oxidation von Daidzein, Chrysin, Flavanon, Glycitein, Tectochrysin und Quercetin. Nachfolgend sind die entsprechenden Reaktionen formelmäßig dargestellt.

H O HO O 2 2 HO O AaeAPO HO H OO H OO Chrysin Baicalein H O HO O 2 2 HO O AaeAPO HO O OH O OH Daidzein Demethyltexasin OH OH H O HO O 2 2 HO O OH AaeAPO OH HO OH H OO HOO Quercetin Quercetagetin OH H O O 2 2 O O 2 AaeAPO + HO O O O Flavanon 6-Hydroxyflavanon 4`-Hydroxyflavanon H O H CO O 2 2 HO O 3 AaeAPO

H OO HOO Tectochrysin Chrysin H O HO O 2 2 HO O AaeAPO

H3CO HO O OH O OH Glycitein Demethyltexasin

Abbildung 26: Auf Basis von Referenzsubstanzen identifizierte Wege der Oxidation von Flavonoiden durch die AaeAPO

Im Fall der Umsetzung von Formononetin und Biochanin A konnten auf Grundlage von analytischen und Literaturdaten (Ausschlussmethode; MS- u. UV-Vis-Spektren, Retentionszeiten) klare Indizien für die Struktur der unbekannten Produkte und somit für die ablaufenden Reaktionfolgen gefunden werden [Tolleson, 2002; Dyke, 1964; Roberts, 2004].

74 Ergebnisse und Diskussion

H O H O HO O 2 2 HO O 2 2 HO O AaeAPO AaeAPO HO O O O OH OCH3 OH Formononetin Daidzein Demethyltexasin H2O2 AaeAPO HO O HO O OCH3 Texasin H O H O HO O 2 2 HO O 2 2 HO O AaeAPO AaeAPO HO OH O OH O OH O OH OCH3 OH Biochanin A Genistein 6-Hydroxygenistein H2O2 AaeAPO HO O HO OH O OCH3 6-Hydroxybiochanin A

Abbildung 27: Enzymatische Umsetzungen (inklusive Folgereaktionen) für die Isoflavone Formononetin und Biochanin A.

In ähnlicher Weise konnten die Produkte 4'-Hydroxyflavon und 3',4',6-Trihydroxyflavanon deduziert werden. 4'-Hydroxyflavon entstand sowohl im Zuge der Flavonhydroxylierung als auch während der Demethylierung von 4'-Methoxyflavon (gleiche MS- u. UV-Vis-Spektren, Retentionszeiten). 3',4',6-Trihydroxyflavanon wurde jeweils ausgehend von den Substraten 3'-Hydroxyflavanon und 4',6-Dihydroxyflavanon gebildet.

4.2.4.2 Ergebnisse der NMR-Analysen Um die Annahmen zu den von der AaeAPO bevorzugten Hydroxylierungspositionen bei der Flavonoidumsetzung weiter zu stützen, wurden ausgewählte Produkte, die nicht als Standards verfügbar waren, strukturell aufgeklärt. Hierzu wurden NMR-Studien zu den Produkten fünf verschiedener Flavonoid-Oxidationen durchgeführt (Apigenin, Luteolin, 7-Hydroxyflavanon, 6- Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavon). Zunächst mussten die Produkte in ausreichender Menge hergestellt werden. Um dabei den Enzymverbrauch zu minimieren, wurden semikontinuierliche Versuche durchgeführt, in deren Verlauf, neben kontinuierlicher Wasserstoffperoxiddosierung (Spritzenpumpen), eine diskontinuierliche Zugabe von Substrat und Ascorbinsäure erfolgte. Dieser experimentelle Ansatz wurde in einem ersten Schritt in kleinerem Maßstab getestet; nach positivem Verlauf wurde ein Scale- up realisiert. Im zweiten Schritt wurde die Reaktion gezielt unterbrochen, damit das primäre

75 Ergebnisse und Diskussion

Reaktionsprodukt vom Enzym nicht weiter umgesetzt wurde. Dies erfolgte durch Zugabe einer 50 %igen TCA-Lösung (Endkonzentration 5 % TCA). Im dritten Schritt wurde das Produkt von der Reaktionslösung abgetrennt. Zuerst wurde das Produkt- Substrat-Gemisch mittels Festphasenextraktion (SPE) angereichert und in Methanol überführt. Die Produktreinigung erfolgte mittels präparativer HPLC. Die so gewonnenen Produktfraktionen wurden mittels SPE erneut konzentriert, das Produkt wiederum in Methanol überführt und bis zur Trockne eingeengt. Die Festsubstanz wurde in deuteriertem DMSO-d6 gelöst und mittels NMR analysiert.

1) Semikontinuierliche Versuche Die Versuche erfolgten zuerst im kleinen Maßstab sowohl unter einmaliger als auch kontinuierlicher Cosubstratzudosierung.

a) Spritzenpumpenversuche Der Reaktionsansatz nach dem unten aufgeführten Pipettierschema vorbereitet (Analytik: HPLC-MS, Methode 2).

Tabelle 26: Versuchsschema zum Spritzenpumpenversuch unter semikontinuierlicher Zudosierung von Substrat und Vitamin C (in 21 % v/v DMF) Substanz Konzentration Pipettier- (Stammlösung) Volumen [μl] Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 500 AaeAPO 320 U/ml 5 Flavonoid-Standard 50 mM 10 Vitamin C 40 mM 100 DMF 100 % 200

H2O 100 % 25

Die Spritzenpumpe dosierte 20 μl 6,25 mM H2O2 pro Stunde zum Reaktionsansatz. Die Gesamtdauer der Reaktion betrug je nach Substrat-Produkt-Verhältnis 42 h (Luteolin), 79 h (Apigenin), 133 h (7- Hydroxyflavanon), 100 h (7-Hydroxyflavon) und 162 h (6-Hydroxyflavon). Abbildung 28 zeigt beispielhaft den zeitlichen Verlauf der Umsetzung von Apigenin. Der Abbildung 28 sind zwei zeitliche Maxima der Produktbildung zu entnehmen. Das erste Maximum wurde nach 16 Stunden Reaktionszeit [d. h. nach Zudosierung von 10 µl Apigenin-Stammlösung (50 mM) und Erreichen einer Konzentration von 0,47 mM im Ansatz] erreicht. Das zweite Maximum ergab sich nach einer Gesamtzugabe von 40 µl Apigenin (1,05 mM im Ansatz) nach 67 Stunden. Im Fall von Luteolin wurde das Maximum an gebildetem Produkt nach 14 Stunden und einer Gesamtzugabe von 20 μl (0,89 mM im Ansatz) erreicht.

76 Ergebnisse und Diskussion

7 16 6 14 Apigeninzugabe 5 12 10 m 4 Peakfläche 8 Apigenin 3 [AU*s]

[AU*s] 6 2 Volumen [ul] 4 Peakfläche Peakfläche bei 360 nm 1 2 Produkt [AU*s] 0 0 0 20406080100 Zeit [h]

Abbildung 28: Zeitlicher Verlauf der Umsetzung von Apigenin unter semikontinuierlicher Versuchsführung

Die Produktbildung erreichte während der Umsetzung von 7-Hydroxyflavanon nach 34 Stunden (Gesamtzugabe an Substrat 20 μl; 0,75 mM im Ansatz) ein Plateau, das bis zur Stunde 48 anhielt. Parallel wurde der gleiche Versuch unter zusätzlicher diskontinuierlicher Vitamin-C-Zugabe durchgeführt. Nach 64 Stunden (Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,68 mM im Ansatz und 300 μl 40 mM Vitamin C; 5,48 mM im Ansatz) wurde ein Plateau erreicht, das bis zur Stunde 101 (Gesamtzugabe an Substrat 35 μl; 0,61 mM im Ansatz und 400 μl Vitamin C, 5,57 mM im Ansatz) anhielt. Dieses Plateau entsprach wiederum einem Maximum an Produkt. Die Produktausbeute konnte auf diese Weise um 75 % gesteigert werden. Die weiteren Versuche wurden demensprechend unter diskontinuierlicher Vitamin-C-Zugabe durchgeführt. Im Fall der Verbindung 7-Hydroxyflavon wurde das Produktmaximum nach 96 Stunden erreicht (Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,55 mM im Ansatz und 500 μl Vitamin C; 7,37 mM im Ansatz), für 6-Hydroxyflavon nach 160 Stunden (Gesamtzugabe an Substrat 30 μl; 0,39 mM im Ansatz und 550 μl mM Vitamin C; 5,69 mM im Ansatz).

b) Langzeitversuche

Die Versuche unter einmaliger Cosubstratzugabe (H2O2) wurden nach dem folgenden Pipettierschema vorbereitet.

Tabelle 27: Versuchsschema: semikontinuierliche Langzeitversuche (Vitamin C, 21 % (v/v) DMF) Substanz Konzentration Pipettier- End- Stammlösung Volumen [μl] Konzentration Kalium-Phosphat-Puffer, pH=7 100 mM 500 50 mM

77 Ergebnisse und Diskussion

Substanz Konzentration Pipettier- End- Stammlösung Volumen [μl] Konzentration AaeAPO 380 U/ml 5 1,9 U/ml

H2O2 10 mM 100 1 mM Flavonoid-Standard 50 mM 10 0,5 mM Vitamin C 40 mM 100 4 mM Wasser 100 % 85 79 % (v/v) DMF 100 % 200 (20+1) % (v/v)

Eine semikontinuierliche Prozessführung konnte im Fall der Langzeitversuche nicht erfolgreich realisiert werden. Im Vergleich zu den Spritzenpumpenversuchen wurden im Zuge der Umsetzung von Apigenin, Luteolin und 7-Hydroxyflavanon nur 33 %, 50 % bzw. 77 % Ausbeute erzielt. Überdies wurde die optimale Produktbildung für Apigenin und Luteolin bereits nach der erstmaligen Substratzugabe erreicht, so dass keine semikontinuierliche Versuchsführung möglich war. Im Fall von 7-Hydroxyflavanon funktionierte zwar das Konzept, die Produktausbeuten waren aber dennoch geringer als in den Spritzenpumpenversuchen. Aus diesem Grund wurde die Produktbildung für weitere Flavonoide (6-Hydroxyflavon, 7-Hydroxyflavon) nicht in Langzeitversuchen untersucht.

2) SPE – Kartuschenauswahl Zunächst wurde substratspezifisch die geeignetste Festphase ermittelt. Die Tabelle 28 enthält eine Übersicht der untersuchten Festphasen von drei unterschiedlichen Herstellern (Varian, Phenomenex, Macherey-Nagel).

Tabelle 28: Getestete SPE-Kartuschen K1 Varian BOND Elut PPL 50 mg / 1 ml K2 Varian BOND Elut C18 100 mg / 1 ml K3 Varian BOND Elut Plexa 60 mg / 1 ml K4 Phenomenex Strata-X 33u Polymeric Reversed Phase 100 mg / 3 ml K5 Macherey-Nagel Chromabond PA6 500 mg / 15 ml K6 Macherey-Nagel Chromafix PA6 620 mg / x ml

Die Versuchslösungen wurden mit Hilfe gängiger Einsätze (Versuchsschema 5) vorbereitet, um auch die Produktretention/-elution beobachten zu können. Weiterhin wurde sowohl auf den pH (eingestellt mit TCA) als auch auf die DMF-Konzentration geachtet, um die Bedingungen der geplanten Flavonoid-Umsetzungen möglichst versuchsnah nachzustellen. Die Ergebnisse sind der Tabelle 29 zu entnehmen.

78 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 29: SPE-Kartuschenauswahl in Bezug auf die Wiederfindung der ausgewählten Flavonoide (die Kontrollen representieren die Anfangskonzentration; K1-K6 SPE-Kartuschen laut Tabelle 28) Konzentration [mmol/ml] oder Extinktion der Produkte [mAU] Apigenin Monohydroxy- Luteolin Monohydroxy- 7-Hydroxy- Dihydroxy- apigenin luteolin flavanon flavanon (bei 360 nm) (bei 360 nm) (bei 280 nm) Kontrolle 0,50 45 0,31 14 0,36 60 K1Waschen 0 5 0,02 8 0 0 K1 Elution 0,39 33 0,29 0 0,35 41 K2Waschen 0 5 0,10 14 0 0 K2 Elution 0,50 40 0,18 0 0,33 32 K3Waschen 0 5 0,01 11 0 0 K3 Elution 0,42 39 0,30 0 0,33 35 K4Waschen 0 0 0 0 0 0 K4 Elution 0,32 11 0,23 7 (P2 23) 0,3 0 K5Waschen 0 0 0 0 0 0 K5 Elution 0,20 0 0,22 0 (P2 20) 0,32 13 K6Waschen 0 0 0 0 0 0 K6 Elution 0,27 0 0,18 7 (P2 19) 0,30 17

Eine optimale Retention und Elution (d. h. 100 %ige Wiederfindung) für die Probe „Apigenin & Monohydroxyapigenin“ wurde mit der Kartusche 2 erreicht. Die anderen Varian-Kartuschen erwiesen sich als ebenso geeignet. Bei Verwendung der Phenomenex-Kartusche eluierte das Produkt bereits während des Waschschrittes. An den Kartuschen 5 und 6 (Machery-Nagel) blieb das Produkt gebunden und auch Apigenin eluierte nur langsam. Die Probe „Luteolin & Monohydroxyluteolin“ wurde insgesamt schlechter retentiert. Die besten Ergebnisse (75 % Luteolin- und Produkt-Wiederfindung 50 %) wurden mit der Phenomenex- Kartusche erzielt. Im Fall der Varian-Kartuschen eluierte das Produkt (und teilweise auch das Luteolin) schon während des Waschens. Die Kartuschen 5 und 6 ermöglichten eine 71 bzw. 58 %ige Luteolin-Wiederfindung. Ein grundsätzliches Problem ergab sich aus der Umwandlung des monohydroxylierten Produkts in ein Kopplungsprodukt (P2) mit der Retentionszeit 11,25 min. Für die Aufarbeitung der Probe „7-Hydroxyflavanon & 7,x-Dihydroxyflavanon“ eignete sich besonders die Kartusche 1 (97 bzw. 68 % Wiederfindung für 7-Hydroxyflavanon und sein Produkt). Die Kartuschen 2 und 3 erbrachten eine ähnliche Leistung. Im Fall der Kartusche 4 konnte das Produkt nicht eluiert werden. Die Macherey-Nagel Kartuschen ergaben nur eine ca. 25 %ige Wiederfindung für das Produkt und waren deshalb für die Anreicherung kaum geeignet. Für die Proben „7-Hydroxyflavon & 7,x-Dihydroxyflavon“ sowie „6-Hydroxyflavon & 6,x- Dihydroxyflavon“ eignete sich besonders die Kartusche 2 (analog Apigenin).

3) Präparative HPLC Die Gerätebeschreibung sowie die verwendeten Methoden und Bedingungen sind den Abschnitten 3.1 und 3.8.1.3 zu entnehmen. Die Abbildung 29 stellt das Chromatogramm zur präparativen Fraktionierung von Apigenin (2) und seinem monohydroxylierten Produkt (1) dar.

79 Ergebnisse und Diskussion

3000 1 2

] 2500 U

A 1 2 271 2000 287 Vial 1 Vial 2 Vial 3 [%] [%] 1000 m/z m/z ption bei 284nm [m r 500 bso A

0 02530354045 Retentionszeit [min]

Abbildung 29: Chromatogramm zur präparativen Trennung von Apigenin (2) und seinem Hydroxylierungsprodukt (1) mittels HPLC unter Angabe verschiedener Sammelfraktionen (Vials 1-3). Das Gesamtvolumen der gesammelten, produkthaltigen Fraktionen betrug 291 ml. Die Flüssigkeit wurde mittels Rotationsverdampfer eingeengt, um den organischen Lösungsmittelanteil zu verringern (Voraussetzung für die nachfolgende SPE). Der dabei ausgefallene Feststoff (Produkt 2) wurde abfiltriert und gefriergetrocknet. Eine SPE-Kartusche BOND Elut MEGA BE – C18 (1 g / 6 ml) wurde mit 220 ml der filtrierten Probe beladen und nach dem Trocknen unter Stickstoff mit 6 ml Methanol eluiert. Beide Produktpräparate wurden auf ihre Reinheit mittels HPLC-DAD (Methode 4) geprüft. Danach wurde die Lösung (Produkt 1) unter verringertem Druck in der SPE-Apparatur bis zur Trockne eingeengt. Die übrigen vier Substrat-Produkt-Gemische wurden in ähnlicher Weise, mit geringen Abweichungen im Detail, aufgearbeitet. Die Tabelle 30 fasst diese detailierten Informationen für die einzelnen Substrate (und ihre Produkte) zusammen.

Tabelle 30: Präparation monohydroxylierter Flavonoidprodukte von ihren Substraten durch SPE- Vorbehandlung, Trennung mittels präparativer HPLC und SPE-Nachbehandlung. Gesamt- Volumen Masse Masse volumen der nach dem des des Ausbeute Substrat SPE-Kartusche Fraktionen Einengen Substrates Produktes [%] [ml] [ml] [mg] [mg] Apigenin 291 220 MEGA BE C18 27 5 19 (1 g / 6 ml) 7-Hydroxy- 132 100 BOND Elut PPL 24 5 21 flavanon 500 mg / 6 ml 6-Hydroxy- 230 150 MEGA BE C18 35,7 12,5 35 flavon (1 g / 6 ml) 7-Hydroxy- 298 150 MEGA BE C18 35,7 22,6 63 flavon (1 g / 6 ml) Luteolin 185 130 Strata-X33u 28 5 18 Polymeric RP (1 g / 12 ml)

80 Ergebnisse und Diskussion

Die Ausbeuten der enzymatischen Synthesen betrugen 18 % bis 63 %. Die Ausbeute nahm mit steigender eingesetzter Substratmenge zu (die relativen Verluste bei der Aufarbeitung waren geringer).

4) NMR-Analyse der Edukte & Produkte semikontinuierlicher Versuchsführung a) Apigenin & Scutellarein Die Abbildung 30 und 31 zeigen die NMR-Daten für das Edukt Apigenin und das entstandene Hydroxylierungsprodukt, das als 6-Hydroxyapigenin (Scutellarein) identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT und DEPT, durch Vergleich mit Literaturdaten [Markham, 1978; Loo, 1986; Boyong, 1997; Kostrzewa-Suslow, 2007] sowie anhand der von ACD/C+H-NMR Predictor-berechneten Werten. Ein Vergleich der 1H-NMR-Spektren der beiden Verbindungen zeigt, dass im Produktspektrum das Signal bei 6.19 ppm (Proton am C6) nicht mehr vorhanden ist und das Signal für das Proton am C8 im Vergleich zum Apigenin tieffeldverschoben und nur noch als Singulett erscheint. Alle anderen chemischen Verschiebungen haben sich nicht signifikant verändert. In den 13C-NMR-Spektren finden sich Veränderungen in den chemischen Verschiebungen für die Kohlenstoffatome 5, 6 und 7 des A-Rings. Aus dem APT-Spektrum ist erkennbar, dass im Produkt das Kohlenstoffatom C6 nicht mehr als CH-Signal, sondern als quartäres C-Atom erscheint. Somit lässt sich eindeutig das Kohlenstoffatom C6 als Hydroxylierungsposition bestimmen.

[6.92] [10.38] [116.0] OH [7.91] 5` [128.5] 6` 4` [161.2] [6.48] B [10.86] [94.0] 1` [6.92] OH O 3` [157.4] [163.8] 2` 8 1 [121.2] [116.0] 7 2 [164.2] 8a [7.91] AC [128.5] 4a [6.19] 6 3 [6.76] [98.9] 5 4 [102.9] [103.8] [161.5] [181.8]

OH O [12.95]

Abbildung 30: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Apigenins

1 4 4 H-NMR (DMSO-d6, 300,06 MHz): δ 6.19 (d, J = 2,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.48 (d, J = 2.1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.76 (s, 1H, Ring C), 6.92 (d, 3J= 8,4 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 7.91 (d, 3J= 8,4 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.38 (s, 1H, -OH), 10.86 (s, 1H, -OH), 12.95 (s, 1H, - OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 75,45 MHz): δ 94.0 (C8), 98.9 (C6), 102.9 (C3), 103.8 (C4a), 116.0 (C3',5'), 121.2 (C1'), 128.5 (C2',6'), 157.4 (C8a), 161.2 (C4'), 161.5 (C5), 163.8 (C2), 164.2 (C7), 181.8 (C4); High resolution mass spectrum (HRMS, ESI) m/z 271 ([M+H]+).

81 Ergebnisse und Diskussion

[6.92] [116.0] OH [7.90] 5` [128.4] 6` 4` [161.0] [6.57] B [93.9] 1` OH O 3` [6.92] [153.3] [163.6] 2` [116.0] 8 1 [121.5] 7 2 [149.7] 8a [7.90] AC [128.4] 4a [129.2] 6 3 [6.73] 5 4 [104.0] [102.3] OH [147.1] [182.1]

OH O [12.77]

Abbildung 31: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyapigenins (Scutellarein)

1 H-NMR (DMSO-d6, 400,00 MHz): δ 6.57 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.73 (s, 1H, Ring C), 6.92 (d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 7.90 (d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 12.77 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 100,06 MHz): δ 93.9 (C8), 102.3 (C3), 104.0 (C4a), 116.0 (C3',5'), 121.5 (C1'), 128.4 (C2',6'), 129.2 (C6), 147.1 (C5), 149.7 (C7), 153.3 (C8a), 161.0 (C4'), 163.6 (C2), 182.1 (C4); HRMS (ESI) m/z 287 ([M+H]+).

b) 7-Hydroxyflavanon & 6,7-Dihydroxyflavanon Die Abbildung 32 und Abbildung 33 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 7-Hydroxyflavanon und das entstandene Produkt, das als 6,7-Dihydroxyflavanon identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, DEPT, zweidimensionalen NMR- Techniken (gCOSY, gHMBC) und durch Vergleich mit Literaturdaten [Markham, 1978; Loo, 1986; Boyong, 1997; Kostrzewa-Suslow, 2007] sowie anhand der vom ACD/C+H NMR Predictor berechneten Werten.

[7.44] [128.4] [7.53] 5` [7.44] [126.5] 6` 4` [128.5] [6.39] B [10.62] [102.5] [5.59] 1` OH O 3` [7.44] [163.0] [78.9] 2` 8 1 [139.0] [128.4] [164.6] 7 2 8a [7.53] AC [126.5] 4a [6.54] 6 3 [3.13] / [2.71] [110.6] 5 4 [43.2] [113.5] [7.68] [189.8] [128.5] O

Abbildung 32: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavanons

1 3 2 3 H-NMR (DMSO-d6, 199.99 MHz): 2.71 (dd, J= 3,0 Hz, J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 3.13 (dd, J= 12,7 Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 5.59 (dd, 3J= 12.5 Hz, 4J= 2 Hz, 1H, Ring C), 6.39 (s, 1H, Aromaten H,

82 Ergebnisse und Diskussion

Ring A), 6.54 (dd, 3J= 8.8 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.41-7.47 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.53 (d, 3J= 7.0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 7.68 (dd, 3J= 8.8 Hz, 4J= 1.1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 10.62 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 43.2 (C3), 78.9 (C2), 102.5 (C8), 110.6 (C6), 113.5 (C4a), 126.5 (C2',6'), 128.4 (C3',5'), 128.5 (C4', C5), 139.0 (C1'), 163.0 (C8a), 164.6 (C7), 189.8 (C4); HRMS (ESI) m/z 241 ([M+H]+).

Das 1H-NMR-Spektrum des Produkts zeigt keine Kopplung der Signale bei 6.54 ppm und 7.68 ppm, stattdessen nur ein Singulett bei 7.09 ppm. In den 13C-NMR-Spektren erkennt man im Produktspektrum eine deutliche Tieffeldverschiebung für das Atom C6, was auf einen „elektronenziehenden“ Substituenten hinweist. Zudem wechselt dieses Signal im APT seine Orientierung. Zusammengenommen belegt dies eindeutig die Hydroxylierung des Kohlenstoffatoms C6 im Ring A.

[7.41] [129.2] [7.50] 5` [7.38] [127.2] 6` 4` [129.0] [6.39] B [104.0] [5.48] 1` [7.41] OH O 3` [154.8] [79.7] 2` 8 1 [140.0] [129.2] [157.0] 7 2 8a [7.50] AC [127.2] 4a [141.6] 6 3 [3.02] / [2.66] 5 4 [44.0] [113.2] OH [7.09] [190.6] [111.1] O

Abbildung 33: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavanons.

1 3 2 3 H-NMR (DMSO-d6, 300, 08 MHz): δ 2.66 (dd, J= 3,0 Hz, J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 3.02 (dd, J= 12,7 Hz, 2J= 16,8 Hz 1H, Ring C), 5.48 (dd, 4J= 3,0 Hz, 3J= 12,7 Hz 1H, Ring C), 6.39 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.09 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.35-7.44 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.50 (d, 3J= 8,1 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B); 13 C-NMR (DMSO-d6, 75,46 MHz): δ 44.0 (C3), 79.7 (C2), 104.0 (C8), 111.1 (C5), 113.2 (C4a), 127.2 (C2',6'), 129.0 (C4'), 129.2 (C3',5'), 140.0 (C1'), 141.6 (C6), 154.8 (C8a), 157.0 (C7), 190.6 (C4); HRMS (ESI) m/z 257 ([M+H]+).

Die Zuordnung der 1H- und 13C-NMR-Signale zu den Positionen C5 und C8 (Ring A) wurde durch die Anwendung zweidimensionaler NMR-Verfahren ermöglicht. Die gHSQC gehört zu den selektiven heteronuklearen Methoden zur Bestimmung von CH-Kopplungen über eine Bindung. Sie ermöglicht die direkte Zuordnung der 1H-NMR-Signale zu den korrespondierenden 13C-NMR-Signalen; für 6,7- Dihydroxyflavanon ergaben sich folgende Paare: 44.0 x 2.66, 44.0 x 3.02, 79.7 x 5.48, 103.4 x 6.39, 111,1 x 7.09, 127.2 x 7.50, 129.0 x 7.38, 129.2 x 7.41 ppm. Die gHMBC gehört zu den selektiven heteronuklearen Methoden zur Bestimmung der Weitbereichskorrelationen über zwei bis vier Bindungen. Die höchste Signalstärke tritt bei

83 Ergebnisse und Diskussion

Korrelationen über drei Bindungen auf (3J). In den vorliegenden Spektren korrelieren stark (3J) 6.39 ppm mit 113.2 ppm und 141.6 ppm, sowie 7.09 ppm mit 154.8 ppm, 157.0 und 190.6 ppm. Eine schwache Kopplung (4J oder 2J) ergibt sich für die Signale 6.39 ppm mit 111.1 ppm, 154.8 ppm, 157.0 ppm, 190.6 ppm sowie 7.09 ppm mit 141.6 ppm und 104.0 ppm. Daraus kann man entnehmen, dass die 1H-NMR Signale bei 6,39 ppm und 7,09 ppm von Protonen an paraständigen Kohlenstoffatomen am Ring A stammen. Die starke Kopplung des Signals bei 7.09 ppm mit dem Signal bei 190.6 ppm legt die Zuordnung zum Kohlenstoffatom C5 des A-Rings fest.

c) 6-Hydroxyflavon & 5,6-Dihydroxyflavon Die Abbildung 34 und Abbildung 35 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 6-Hydroxyflavon und das entstandene Produkt, das als 5,6-Dihydroxyflavon identifiziert werden konnte. Die eindeutige Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, zweidimensionaler NMR- Techniken (gCOSY, gHMBC) und anhand der vom ACD/C+H-NMR Predictor berechneten Werten. Aus dem Vergleich der Edukt- und Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das Singulett bei 7.37 ppm aus dem Ring A verloren ging. Bereits dies deutet auf eine Hydroxylierung des C5 im Ring A hin. In den 13C-NMR-Spektren erkennt man im Produktspektrum eine starke Tieffeldverschiebung für das Atom C5, was charakteristisch für elektronenziehende Substituenten ist. Zudem wechselt dieses Signal im APT seine Orientierung. Insgesamt kann daraus abgeleitet werden, dass sich die Hydroxylierungsposition am C5 im A-Ring befindet.

[7.64] [129.1] [8.08] 5` [7.64] [126.2] 6` 4` [131.6] [7.70] B [119.8] 1` [7.64] O 3` [7.31] [149.4] 2` 8 1 [131.3] [129.1] [123.2] 7 2 8a [162.3] [8.08] AC [126.2] 4a [154.9] 6 3 [6.96] 5 4 [124.2] [105.8] OH [177.1] [10.20] [7.37] [107.5] O

Abbildung 34: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyflavons.

1 3 H-NMR (DMSO-d6, 199,99 MHz): δ 6.96 (s, 1H, Ring C), 7.31 (d, J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.37 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.61-7.66 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.70 (d, 3J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.08 (d, 3J= 8,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.20 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 105.8 (C3), 107.5 (C5), 119.8 (C8), 123.2 (C7), 124.2 (C4a), 126.2 (C2',6'), 129.1 (C3',5'), 131.3 (C1'), 131.6 (C4'), 149.4 (C8a), 154.9 (C6), 162.3 (C2), 177.1 (C4); HRMS (ESI) m/z 239 ([M+H]+).

84 Ergebnisse und Diskussion

[7.58] [129.9] [8.08] 5` [7.61] [127.2] 6` 4` [132.9] [7.09] B [107.4] 1` [7.58] O 3` [7.26] [146.9] 2` 8 1 [131.5] [129.9] [123.7] 7 2 8a [164.8] [8.08] AC [127.2] 4a [141.6] 6 3 [7.00] 5 4 [105.2] [111.3] OH [149.2] [184.3]

OH O

Abbildung 35: 1H- NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 5, 6-Dihydroxyflavons

1 3 H-NMR (DMSO-d6, 400,00 MHz): δ 7.00 (s, 1H, Ring C), 7.09 (d, J= 9,2 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.26 (d, 3J= 9,2 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.55-7.62 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 8.08 (dd, 4J= 1,6 Hz, 3J= 8,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 13 C-NMR (DMSO-d6, 100,58 MHz): δ 105.2 (C3), 107.4 (C8), 111.3 (C4a), 123.7 (C7), 127.2 (C2',6'), 129.9 (C3',5'), 131.5 (C1'), 132.9 (C4'), 141.6 (C6), 146.9 (C8a), 149.2 (C5), 164.8 (C2), 184.3 (C4); HRMS (ESI) m/z 255 ([M+H]+).

Anhand der APT-Spektren wurden die CHn–Gruppen des Produktes mit gerader (110.7, 130.9, 141.0, 146.3, 148.6, 164.2, 183.8 ppm) und ungerader (104.6, 106.9, 123.1, 126.7, 129.3, 132.3 ppm) Anzahl von H-Atomen unterschieden (d. h. kein oder ein Wasserstoff vorhanden). Die gCOSY-Spektren ermöglichten die Zuordnung der Wasserstoffatome, die miteinander koppeln: 7.09 und 7.26 ppm bzw. 7.58, 7.61 und 8.08 ppm. Somit konnten die aromatischen Ringe A und B unterschieden werden. Mit Hilfe von gHMBC wurden die Ringe A und B eindeutig beschrieben. Im Ring A korrelierten stark (3J): 7.26 ppm mit 146.9 ppm und 149.2 ppm, sowie 7.09 ppm mit 111.3 ppm und 141.6 ppm, und schwach (4J oder 2J): 7.26 ppm mit 141.6 ppm sowie 7.09 ppm mit 149.2 ppm und 123.7 ppm. Da die Verschiebung 111.3 ppm nur dem C4a entsprechen konnte und die 123.7 ppm erfahrungsgemäß auf den direkten nicht mit Sauerstoff substituierten Nachbarn hindeuten, konnten die Kohlenstoffatome 7 und 8 unterschieden werden. Im Ring B korrelierten stark (3J): 8.08 ppm mit 127.2 ppm, 132.9 ppm und mit 164.8 ppm, 7.61 ppm mit 127.2 ppm und 7.58 mit 129.9 ppm und 131.5 ppm, und schwach (4J oder 2J): 7.61 ppm mit 129.9 ppm und 131.5 ppm. Da die genaue Position der Verschiebung 8.08 ppm im Ring B bekannt war und die 164.8 ppm nur einem mit Sauerstoff substituierten Kohlenstoff (C2, Ring C) entsprechen konnte, wurde die molekulare Struktur des B-Rings eindeutig geklärt. Die restliche Verschiebung von 105.2 ppm wurde dem C3 zugeordnet.

85 Ergebnisse und Diskussion

d) 7-Hydroxyflavon & 6,7-Dihydroxyflavon Die Abbildung 36 und Abbildung 37 zeigen die NMR-Daten für das Edukt 7-Hydroxyflavon und das entstandene Produkt, das als 6,7-Dihydroxyflavon identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT, zweidimensionaler NMR-Techniken (gHMBC) und Vergleich der mittels ACD/C+H-NMR Predictor berechneten Werte.

[7.60] [129.1] [8.07] 5` [7.60] [126.1] 6` 4` [131.5] [6.90] B [10.99] [102.5] 1` OH O 3` [7.60] [157.5] 2` 8 1 [131.2] [129.1] [162.8] 7 2 8a [162.1] [8.07] AC [126.1] 4a [7.02] 6 3 [6.95] [115.1] 5 4 [106.5] [116.1] [7.93] [176.5] [126.5] O

Abbildung 36: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 7-Hydroxyflavons.

1 H-NMR (DMSO-d6, 199,99 MHz): δ 6.90 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.95 (s, 1H, Ring C), 7.02 (d, 3J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.60-7.62 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 7.93 (d, 3J= 8,8 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.07 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 10.99 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 50.29 MHz): δ 102.5 (C8), 106.5 (C3), 115.1 (C6), 116.1 (C4a), 126.1 (C2',6'), 126.5 (C5), 129.1 (C3',5'), 131.2 (C1'), 131.5 (C4'), 157.5 (C8a), 162.1 (C2), 162.8 (C7), 176.5 (C4); HRMS (ESI) m/z 239 ([M+H]+).

[7.54] [129.8] [8.00] 5` [7.53] [126.7] 6` 4` [132.0] [7.02] B [106.6] 1` [7.54] OH O 3` [151.7] 2` 8 1 [132.2] [129.8] 7 2 [153.7] 8a [162.1] [8.00] AC [126.7] 4a [145.6] 6 3 [6.80] 5 4 [103.7] [116.5] OH [7.28] [177.0] [108.0] O

Abbildung 37: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6,7-Dihydroxyflavons.

1 H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 6.80 (s, 1H, Ring C), 7.02 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.28 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 7.53-7.54 (m, 3H, Aromaten H, Ring B), 8.00 (d, 3J= 7,0 Hz, 2H, Aromaten H, Ring B), 9.85 (s, 1H, -OH), 10.52 (s, 1H, -OH);

86 Ergebnisse und Diskussion

13 C-NMR (DMSO-d6, 100,58 MHz): δ 103.7 (C3), 106.6 (C8), 108.0 (C5), 116.5 (C4a), 126.7 (C2',6'), 129.8 (C3',5'), 132.0 (C4'), 132.2 (C1'), 145.6 (C6), 151.7 (C8a), 153.7 (C7), 162.1 (C2), 177.0 (C4); HRMS (ESI) m/z 255 ([M+H]+).

Aus dem Vergleich der Edukt- mit den Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das erste Dublettpaar (7.02 ppm, 7.93 ppm) verloren ging und stattdessen ein Singulett bei 7.28 ppm auftritt. In den 13C-NMR-Spektren erkennt man für das Produkt eine ausgeprägte Tieffeldverschiebung für das Atom C6, was Indiz für einen elektronenziehenden Substituenten ist. Zudem wechselt dieses Signal im APT seine Orientierung. In Summe weisen diese Befunde klar auf eine Hydroxylierung des Kohlenstoffatoms C6 im Ring A hin.

In den gHMBC-Spektren des Produktes korrelierten stark (3J): 8.00 ppm (C2') mit 162.1 ppm, 132.0 ppm und 126.7 ppm, und schwach (4J oder 2J): 8.00 ppm mit 129.8 ppm und 132.2 ppm. Die Verschiebungen 162.1, 132.0, 126,7, 129.8 und 132.2 ppm entsprechen somit den Kohlenstoffatomen C2, C4', C6', C3' bzw. C5', und C1'. Dem gHMBC Spektrum kann ebenfalls eine Bestätigung für das C3-Atom entnommen werden, da der Mittelpunkt der Kopplungen bei 103.7 ppm unter 6.80 ppm liegt. Damit war es möglich, die Ringe B und C eindeutig zuzuordnen. Weiterhin korrelierten stark (3J): 6.80 ppm (C3) mit 132.2 ppm (C1') und 116.5 ppm, und schwach (4J oder 2J): 6.80 ppm mit 162.1 ppm (C2), 177.0 ppm (C4) und 108.0 ppm (C5). Die Verschiebung 116.5 ppm steht also für das Kohlenstoffatom C4a und koppelt mit 6.80 ppm sowie mit 7.02 ppm, nicht aber mit 7.28 ppm. Somit können die Verschiebungen 7.28 und 7.02 ppm den Atomern C5 und respektive C8 zugeordnet werden. Im Ring A konnten nur die 13C-NMR-Werte 151.7 ppm und 153.7 ppm nicht eindeutig den Atomen C8a und C7 zugeornet werden; der restliche Shift von 106.6 ppm entsprach allerdings genau dem letzten verbliebenen Kohlenstoff - C5.

e) Luteolin & 6-Hydroxyluteolin Die Abbildung 38 und Abbildung 39 zeigen die NMR-Daten für das Edukt Luteolin und das entstandene Produkt, das als 6-Hydroxyluteolin identifiziert wurde. Die eindeutige Zuordnung der chemischen Verschiebungen erfolgte mittels APT und durch Vergleich mit Literaturdaten [Markham, 1978; Boersma, 2002; Androutsopoulos, 2009] sowie auf Basis der vom ACD/C+H-NMR Predictor berechneten Werte. Aus dem Vergleich der Edukt- mit Produkt-1H-NMR-Spektren ergibt sich, dass das erste Dublettpaar (6.18 ppm, 6.44 ppm) verschwindet und das Signal für das Proton am C8 im Vergleich zum Luteolin tieffeldverschoben als Singulett erscheint. Alle anderen chemischen Verschiebungen änderten sich nicht signifikant. In den 13C-NMR-Spektren finden sich Änderungen in den chemischen Verschiebungen für die Kohlenstoffatome 5, 6 und 7 des A-Rings. Das APT-Spektrum zeigt, dass im Produkt das

87 Ergebnisse und Diskussion

Kohlenstoffatom C6 nicht mehr als CH-Signal, sondern als quartäres C-Atom detektiert wird. Daraus lässt sich eindeutig ableiten, dass das Kohlenstoffatom C6 als Hydroxylierungsposition fungiert.

[6.88] [9.99] [116.1] OH [7.39] 5` [119.0] 6` 4` [149.8] [6.44] B [10.86] [93.9] 1` [145.8] OH O 3` [157.3] [164.0] 2` [9.44] 8 1 [121.6] 7 2 OH [164.2] 8a [7.41] AC [113.4] 4a [6.18] 6 3 [6.66] [98.9] 5 4 [102.9] [103.8] [161.5] [181.7]

OH O [12.96]

Abbildung 38: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des Luteolins.

1 4 4 H-NMR (DMSO-d6, 300,06 MHz): δ 6.18 (d, J = 1,5 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.44 (d, J = 1,5 Hz, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.66 (s, 1H, Ring C), 6.88 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.39 (s, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.41 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 9.43 (s, br, 1H, - OH), 9.99 (s, br, 1H, -OH), 10.86 (s, br, 1H, -OH), 12.96 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (DMSO-d6, 75,45 MHz): δ 93.9 (C8), 98.9 (C6), 102.9 (C3), 103.8 (C4a), 113.4 (C2'), 116.1 (C5'), 119.0 (C6'), 121.6 (C1'), 145.8 (C3'), 149.8 (C4'), 157.3 (C8a), 161.5 (C5), 164.0 (C2), 164.2 (C7), 181.7 (C4); HRMS (ESI) m/z 287 ([M+H]+).

[6.89] [9.89] [116.1] OH [7.38] 5` [118.9] 6` 4` [149.7] [6.55] B [10.54] [93.8] 1` [145.8] OH O 3` [153.3] [163.7] 2` 8 1 [121.9] [9.44] 7 2 OH [149.5] 8a [7.38] AC [113.3] 4a [129.2] 6 3 [6.63] [8.74] 5 4 [102.3] [104.0] OH [147.1] [182.0]

OH O [12.78]

Abbildung 39: 1H-NMR- (fett) und 13C-NMR-Daten des 6-Hydroxyluteolins.

1 H-NMR (DMSO-d6, 400,00 MHz): δ 6.55 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 6.63 (s, 1H, Ring C), 6.89 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.38 (s, 1H, Aromaten H, Ring B), 7.38 (d, 3J= 8,1 Hz, 1H, Aromaten H, Ring B), 8.74 (s, br, 1H, -OH), 9.44 (s, br, 1H, -OH), 9.89 (s, br, 1H, -OH), 10.54 (s, br, 1H, -OH), 12.96 (s, 1H, -OH);

88 Ergebnisse und Diskussion

13 C-NMR (DMSO-d6, 100,06 MHz): δ 93.8 (C8), 102.3 (C3), 104.0 (C4a), 113.3 (C2'), 116.1 (C5'), 118.9 (C6'), 121.9 (C1'), 129.2 (C6), 145.8 (C3'), 147.1 (C5), 149.5 (C7), 149.7 (C4'), 153.3 (C8a), 163.7 (C2), 182.0 (C4); HRMS (ESI) m/z 303 ([M+H]+).

4.2.5 Vergleichende Diskussion der untersuchten Substanzklassen

Enzymatische Reaktionen der AaeAPO mit Flavonoiden Die Biotransformation der Flavonoide verlief insgesamt – wenn „störende“ Substitutionsmuster vermieden wurden – mit guten bis sehr guten Umsatzraten (≥ 40 %). Als störend wirkt sich bei allen Verbindungsklassen eine besetzte C6-Position (TC: 0-30 %) oder eine Substitution durch Zuckerreste (TC: bis 10 %) aus; hinzu kommt im Fall von Isoflavonen und Flavonen eine Methoxygruppe bzw. eine Methylgruppe in C5-Position (TC: 4-31 %). „Ausreiser“ stellen das 4’-Hydroxyflavanon (TC: 27 %; C4' als zweite Vorzugsposition), Flavon (TC: 13 %; schlecht löslich) und 3-Hydroxyflavon (TC: 0 %; „mysteriös“) dar. OH O O HO O OO HO HO OH O OH OH O 3CO OH 6-Hydroxyflavon Apigenin-7-O-glukosid 5-Methoxyflavon

Abbildung 40: Veranschaulichung der „störenden“ Gruppen, die die AaeAPO-Katalyse erschweren.

Im Zuge der AaeAPO-Katalyse entstanden in den meisten Fällen ein oder mehrere monohydroxylierte Produkte; im Fall der Flavanone zudem auch dihydroxylierte oder anders derivatisierte Verbindungen (z. B. Dimere). Die Hydroxylierung erfolgt regioselektiv bevorzugt in C6-Position und in geringerem Umfang in C4‘-Position. In Flavanonen fungiert die C3'-Position als dritte Hydroxylierungsstelle.

O-Demethyliert wurden bevorzugt Methoxygruppen in C4'-Position mit guten bis sehr guten Umsatzraten (≥ 47 % [bei Flavonoiden ohne einer Methoxygruppe in C5-Position]; bei Isoflavonen im begrenzten Umfang auch Methoxygruppen in C6-Position). Im Fall von Isoflavonen und Flavanonen wurden gekoppelte Folgereaktionen beobachtet, wobei sowohl O-Demethylierungen als auch Hydroxylierungen auftraten [TC: (32-100)%]. Diese Ergebnisse weisen Analogien zu Befunden aus Literatur auf. Zum einen können laut Barz et al. Flavonoide erst nach Entfernung glykosidischer Gruppen als Peroxidase-Substrate fungieren [Barz, 1975a, 1975b, 1977, 1981], zum anderen wird von verschiedenen Oxygenasen bevorzugt die C6- Position in Flavonoiden hydroxyliert. Beispielsweise oxidieren eine 2-Oxoglutarat-abhängige Dioxygenase (Flavonol-6-Hydroxylase, F6H) aus dem Milzkraut Chrysosplenium americanum sowie P450-Monooxygenasen vom F6H-Typ aus Tagetes spp. oder der Sojabohne (Glycine max) partiell

89 Ergebnisse und Diskussion methoxylierte bzw. nicht methoxylierte Flavonole oder Isoflavonoide in dieser Weise [Anzellotti & Ibrahim, 2000; Halbwirth et al., 2004; Latunde-Dada et al., 2001]. Ganze Zellen der Bakteriengattung Micrococcus sind in der Lage, die Isoflavone Genistein und Biochanin A in C6-Position zu hydroxylieren [Klus & Barz., 1998].

Gewinnung spezieller Flavonoide: Chemische Synthese versus biotechnologische Umsetzung versus Extraktion aus Pflanzen Am Beispiel von Apigenin und 6-Hydroxyapigenin (Scutellarein) werden nachfolgend die chemische Synthese, biotechnologische Transformation und Extraktion aus Pflanzenmaterial miteinander verglichen. Die chemische Synthese oxyfunktionalisierter Flavonoide erfordert in der Regel mehrere Stufen – für die Synthese von 6-Hydroxyapigenin werden laut Literatur mindestens sieben Schritte benötigt [Cui et al., 2005; Zemplén et al., 1958; Zemplén et al., 1958b; Farkas et al., 1971]. Neue Möglichkeiten in diesem Bereich haben Barontini et al. aufgezeigt, indem sie Flavonoide einer selektiven zweistufigen Synthese unter Iodobenzoesäure-Katalyse unterwarfen. Die Edukte wurden dabei bevorzugt in ortho- Position hydroxyliert (d. h. Apigenin in Position C3'), so dass Scutellarein nicht gebildet wurde [Barontini et al., 2010]. Alternative Wege eröffnen einstufige Biotransformationen mit P450- Monooxygenasen, wobei auch hier mit “Limitationen“ gerechnet werden muss. So sind die P450- Enzyme CYP1A und CYP3A aus Ratenlebermikrosomen zwar in der Lage, Apigenin zum gewünschten Scutellarein umzuwandeln, allerdings entstehen während der Reaktion aufgrund der mangelnden Selektivität der Enzyme auch andere Produkte (Isoscutellarein = 8-Hydroxyapigenin, Luteolin, 4'-Hydroxyapigenin) [Gradolatto et al., 2004; Nielsen et al., 1998; Kostrzewa-Suslow et al., 2007]. Darüber hinaus sind Mikrosomen nur unter relativ hohem Aufwand zu gewinnen und deshalb für einen Einsatz im größeren Maßstab kaum geeignet. Die Gewinnung von Scutellarein durch Extraktion aus Pflanzenmaterial wird v. a. in China betrieben (Jinan Great Chemical Industry, Qingdao Sunrise Trading). Trotz mehrerer Studien, die den Extraktionsprozess versuchten zu optimieren, können nur (0,7 bis 3,3) mg Scutellarein aus 1 g Trockenmasse der Helmkräuter Scutellaria barbata [Goh et al., 2005] oder S. baicalensis [Zheljazkov et al., 2007] gewonnen werden. Eine neue Extraktionsmethode nach Qian et al. verspricht höhere Gehalte an Scutellarein, da sie das besonders flavonoidreiche Berufkraut Erigeron breviscapus als Ausgangsmaterial nutzt. Da das Scutellarein hier aber vorzugsweise als Glykosid (Scutellarin) vorliegt, muss der Extrakt nachfolgend einer sauren Hydrolyse und Umkristallisation unterzogen werden [Qian et al., 2011]. Auch die verwendeten Extraktionsbedingungen (derzeit 120ºC, 48 h) bedürfen noch einer Optimierung. Für biotechnologische Umsetzungen wird Apigenin als Edukt benötigt, dessen Gewinnung meist durch Extraktion erfolgt. Laut einem US-Patent von Benomelli kann Apigenin aus der Kamille Matricaria chamomilla mit 4,5-6,0 % Ausbeute gewonnen werden [Benomelli, 1982]. Die derzeit

90 Ergebnisse und Diskussion genutzte, industrielle Methode geht von Blättern des Teestrauchgewächses Adinandra nitida aus und liefert ca. 2,5 % Ausbeute [Liu et al., 2008]. Häufig wird Apigenin auch aus dem Sellerie Apium graveolens extrahiert [Han & Row, 2011]. Kombinierte chemisch-biotechnologische/enzymatische Synthesen oder klassische Extraktions- verfahren (zur Eduktgewinnung) mit nachgeschalteter selektiver Hydroxylierung durch die AaeAPO oder andere Peroxygenasen könnten zukünftig die Grundlage für die Entwicklung industrieller Verfahren zur Synthese komplexer Wirkstoffmoleküle auf Flavonoidbasis bilden. Solche Methoden würden in jedem Fall die großtechnische Gewinnung der Peroxygenase-Enzyme voraussetzen.

4.2.6 Enzymatische Transformation – Intermediäre Epoxidbildung Im Rahmen der Dissertation wurden Untersuchungen zum Mechanismus und Ablauf der Hydroxylierung von Flavonoiden durch die AaeAPO durchgeführt. Kluge et al. hatten bereits nachgewiesen, dass die Umsetzung von Naphthalin über eine Epoxid-Zwischenstufe verläuft [Kluge et al., 2008]. Im sauren Reaktionsmedium hydrolysierte dieses Epoxid spontan unter Rearomatisierung und Wasserfreisetzung. Das resultierende Produktgemisch bestand aus zum größeren Teil aus 1- Naphthol (85-95 %) und zu einem kleineren Teil aus 2-Naphthol (5-15 %). Die Untersuchungen hierzu wurden mit den beiden Flavonoid-Grundkörpern Flavon und Flavanon durchgeführt. Ziel war es, mögliche intermediäre Epoxide der Verbindungen zu detektieren. Da solche Epoxide stabiler im Alkalischen sind [Kluge et al., 2008], erfolgten die Versuche in Kaliumphosphatpuffer (100 mM) bei pH 9. Für die analytische Trennung und Charakterisierung der Produkte wurde die Methode 2 wie folgt geändert:

1) analytische Säule: Gemini 3u C6-Phenyl 110 Å column (150 × 2 mm, 3 μm particle size) der Firma Phenomenex mit einer Vorsäule des Typs C6-Phenyl Security Cartridge (4 × 2 mm) 2) Eluent A: 5 mM Ammoniumformiatpuffer (pH 8,0) 3) Fluss: 0,2 ml/min.

Nach der Analyse wurde die Probe mittels TCA (Endkonzentration 5 %) angesäuert und erneuert vermessen. Im Fall der Umsetzung von Flavon konnte das korrespondierende Epoxid auf Grundlage des UV-Vis-Spektrums und der Retentionszeiten nachgewiesen und vom Folgeprodukt 6- Hydroxyflavon unterschieden werden (siehe Abbildung 41, Peaks 2 und 3). Die MS-Spektren beider Verbindungen waren identisch (Molpeaks bei 239 m/z).

91 Ergebnisse und Diskussion

4 2500 23

200 400 200 400 [nm] [nm] 2000 4 O O 500 OH O O 2 O ption bei 254ption nm [mAU] r 3 Abso 1 1 3 b 0 a 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min]

Abbildung 41: HPLC-Chromatogramme der Flavon-Umsetzung durch die AaeAPO mit eingefügten UV- Vis-Spektren der Edukte und Produkte: (1) - 4'-Hydroxyflavon, (2) - Flavonoxid (Epoxid), (3) - 6-Hydroxyflavon, (4) - Flavon; (a) Probe vor dem Ansäuern, (b) Probe nach dem Ansäuern. Abbildung 42 zeigt den postulierten Ablauf der Peroxygenase-katalysierten Flavonhydroxylierung unter intermediärer Epoxidbildung.

+ H O kat. H O 2 2 O O AaeAPO O H2O oder - H O O 2 O O O Flavon 5,6-Epoxy-5,6-dihydroflavon 6,7-Epoxy-6,7-dihydroflavon

+ O O HO O kat. H oder HO HO HO - H O O H OO O 2 5,6-Dihydro-5,6-dihydroxyflavon 6-Hydroxyflavon 6,7-Dihydro-6,7-dihydroxyflavon

Abbildung 42: Reaktionsmechanismus der Flavonhydroxylierung mittels AaeAPO.

Im Fall des Flavanons waren die Unterschiede in den UV-Vis-Spektren und HPLC- Chromatogrammen weniger deutlich ausgeprägt (Abb. 43). Es wird vermutet, dass der Peak bei 15,7 min (4) ein Epoxid darstellt, das sich nach dem Ansäuern langsam unter Bildung von zwei monohydroxylierten Flavanonen (3) und (1) zersetzte. Da eines dieser Produkte als 4'-Hydroxyflavanon (1) identifiziert wurde, kann angenommen werden, dass es sich bei dem intermediären Epoxid um 3',4'-Flavanonoxid handelt.

92 Ergebnisse und Diskussion

345 100 2 5 ]

U 80 A 200 500 200 500 200 500 [nm] [nm] [nm] 60 2

40 1 3 ption bei 254 nm [m nm bei 254 ption r 4 20 bso

A b 4 3 a 0 014151617 Retentionszeit [min]

Abbildung 43: Ausschnitt aus dem HPLC-Chromatogramm der Flavanon-Umsetzung durch die AaeAPO: (1) - 4'-Hydroxyflavanon, (2) - 6-Hydroxyflavanon, (3) - mohohydroxyliertes Flavanon mit unbekannter Position der Hydroxygruppe, (4) – postuliertes Flavanonoxid, (5) – Flavanon; (a) Probe vor dem Ansäuern, (b) Probe nach dem Ansäuern.

4.2.7 Enzymatische Transformation - Herkunft des Sauerstoffs Frühere Studien zur AaeAPO-Katalyse hatten gezeigt, dass der in die Substrate eingeführte Sauerstoff aus dem Cosubstrat Wasserstoffperoxid stammt [Kluge et al., 2008, Kinne et al. 2010]. 2000 2 273 100 50 1600 (%) 0 260 280 m/z 1200

271 100 1 2 800 2 50 1 (%) 0 260 280 400 m/z Absorption bei 254 nm [mAU] bei 254 nm Absorption c b 0 a 0 5 10 15 20 25 Retentionszeit [min]

Abbildung 44: HPLC-Chromatogramme der Daidzein-Umsetzung (b, c) durch AaeAPO in Gegenwart von 16 18 H2 O2 (b) und H2 O2 (c) mit eingefügten MS-Spektren der Produkte; a – Kontrolle ohne Enzym: (1) – Demethyltexasin (6-Hydroxydaidzein), (2) - Daidzein.

93 Ergebnisse und Diskussion

Um diesen Nachweis auch für die Flavonoid-Hydroxylierung zu erbringen, wurden Experimente mit 18 isotopenmarkiertem Wasserstoffperoxid (H2 O2) durchgeführt (siehe Abbildung 44). Der HPLC-MS-Analyse kann man entnehmen, dass im Zuge der AaeAPO-katalysierten 18 18 Daidzeinhydroxylierung in Anwesenheit von H2 O2 (90 Atom%) diese 90 % O in die Hydroxygruppe des Demethyltexasins eingebaut wurden, was zu einer um 2 m/z größeren Masse des zugehörigen Molpeaks (273 m/z) führte (im Vergleich zu Demethyltexasin, das in Gegenwart von 16 H2 O2 gebildet wurde: 271 m/z). Dieses Ergebnis belegt, dass es sich bei der Daidzein-Umsetzung durch die AaeAPO um eine echte Peroxygenase-Reaktion handelt, bei der der übertragene Sauerstoff aus dem Cosubstrat Wasserstoffperoxid stammt.

4.2.8 Enzymatische Transformation - Kinetik Da die Flavonoid-Hydroxylierungen durch AaeAPO grundsätzlich über längere Zeit (Studen bis Tage) verliefen, war es äußerst schwierig, kinetische Untersuchungen durchzuführen. Hinzu kam die Notwendigkeit die Reaktionen in Gegenwart von Vitamin C durchzuführen, um unerwünschte Kopplungsreaktionen zu unterbinden (siehe Abschnitt 4.2.1). Die gewonnenen Daten sind deshalb in doppelter Hinsicht als „scheinbare“ kinetische Konstanten (apparent kinetic constants) zu aufzufassen [vgl. auch Kluge et al 2008, Kinne et al. 2009]. Nichtdestotrotz liefern sie wichtige Hinweise zur Katalyse und erlauben es, die katalytische Effizienz größenordnungsmäßig einzuordnen. Als ein gut umzusetzendes Substrat wurde Apigenin ausgewählt. Die Substratkonzentration wurde zwischen 5 und 500 μM variiert und die Umsetzungen bei drei Wasserstoffperoxid-Konzentrationen (1,8 mM, 2,0 mM, 2,2 mM) betrachtet. Die Substratabnahme wurde mittels HPLC analytisch verfolgt. Die apparenten kinetischen Konstanten wurden mit dem Programm Sigma Plot 11.0 ( 1.3) berechnet und sind der nachfolgenden Tabelle zu entnehmen.

Tabelle 31: Die apparenten kinetische Konstanten der AaeAPO für Apigenin Wasserstoffperoxidkonzentration [mM] 1,8 2,0 2,2

Michaelis-Menten-Konstante (Km-Wert) [μM] 177 290 255

Max. Reaktionsgeschwindigkeit (vmax) [μΜ/s] 6,5 14,8 7,3

Wechselzahl (kcat) [1/s] 12 26 13 3 3 3 Katalytische Effizienz (kcat/Km) [1/Ms] 67,80 × 10 89,66 × 10 50,98 × 10

Trotzdem die ermittelten Werte erheblichen Schwankungen unterliegen, können Durchschnittwerte -1 4 -1 -1 berechnet werden (Km 240 µM, kcat 17 s , kcat/Km 7,0 × 10 M s ), die eine größenordnungsmäßige Einordnung der Apigenin-Umsetzung im Vergleich zu anderen Substraten erlauben. So liegt die katalytische Effizienz der AaeAPO für Apigenin zwischen den Werten für klassische Peroxidase- und 5 -1 -1 Peroxygenase-Substrate wie 2,6-Dimethoxyphenol (DMP; kcat/Km= 3,61 × 10 s M) bzw.

94 Ergebnisse und Diskussion

5 -1 -1 3 -1 -1 Naphthalin (kcat/Km= 5,17 × 10 s M ) und der N-Oxidation von Pyridin (kcat/Km= 3,04 × 10 s M ) [Ullrich et al., 2008, Kluge et al., 2008].

Abbildung 45: Apparente Michaelis-Menten-Kinetik für Apigenin (Wasserstoffperoxidkonzentration 2,0 mM); x-Achse: Substatkonzentration, y-Achse: Reaktionsgeschwindigkeit.

Ein detaillierter Vergleich mit den kinetischen Daten der AaeAPO für verschiedene Substrate ist der Tabelle 32 zu entnehmen.

Tabelle 32: Katalytische Konstanten verschiedener AaeAPO-katalysierter Substrat-Umsetzungen im Vergleich zur Apigenin-Umsetzung

Substrat/Produkt Km [µM] kcat [1/s] kcat/Km [1/M s] Referenz Acetanilid/Acetaminophen 1310 1925 1,5 × 106 Poraj- Kobielska et al., 2011 Ethylbenzol/(R)-1-Phenylethanol 694 409 5,9 × 105 Kluge et al., 2012 Naphthalin/1-Naphthol 320 166 5,2 × 105 Kluge et al., 2007 Methyl-3,4-dimethoxybenzylether/3,4- 1430 720 5,0 × 105 Kinne, Dimethoxybenzaldehyd 2010 Propylbenzol/(R)-1-Phenylpropanol 480 194 4,1 × 105 Kluge et al., 2012 2,6-DMP/Coeruglinon 298 108 3,6 × 105 Ullrich et al., 2004 1,4-Dimethoxybenzol/4-Methoxyphenol 360 106 2,9 × 105 Kinne, 2010 Benzylalkohol/Benzaldehyd, Benzoesäure 1001 269 2,7 × 105 Ullrich et al., 2004 Propranolol/5-Hydroxypropranolol 442 59 1,3 × 105 Poraj- Kobielska et al., 2011

95 Ergebnisse und Diskussion

Substrat/Produkt Km [µM] kcat [1/s] kcat/Km [1/M s] Referenz Apigenin/6-Hydroxyapigenin 240 17 7,0 × 104 hier Veratrylalkohol/Veratrylaldehyd 2367 85 3,6 × 104 Ullrich et al., 2004 Tetrahydrofuran/4-Hydroxybutanal 3226 96 3,0 × 104 Kinne, 2010 Pyridin/Pyridin-N-oxid 69 0,21 3,0 × 103 Ullrich et al., 2008 Cyclohexan/Cyclohexanol 18400 37 2,0 × 103 Peter et al., 2011

Es ist ebenfalls interessant, diese kinetischen Parameter mit denen von funktionell ähnlichen Enzymen zu vergleichen. Einige P450-Enzyme, die Flavonoide hydroxylieren (wie z. B. CYP105D aus

Streptomyces avermitilis), binden diese zwar mit höherer Affinität (Km-Werte um 20 μM), weisen aber -1 4 -1 deutlich kleinere kcat-Werte und geringere katalytische Effizienzen auf (< 1 s bzw. < 1,5 × 10 M s-1) [Pandey et al., 2010; Gradolatto et al., 2004].

4.3 Untersuchung flavonoidhaltiger Pflanzenextrakte

4.3.1 Extraktherstellung 4.3.1.1 Beschleunigte Lösungsmittelextraktion (ASE) Zur Extraktion der pflanzlichen Materialien wurde reines Ethanol oder ein Wasser-Ethanol-Gemisch (50/50 v/v) eingesetzt. Die Extraktionstemperatur wurde zwischen 40 °C und 100 °C variiert. Die statische Phase betrug in den meisten Versuchen 5 Minuten. Bei 60 °C wurde die statische Phase auf 20 Minuten verlängert. Weitere Parameter können der unten aufgeführten Tabelle entnommen werden.

Tabelle 33: Konstante Parameter der ASE-Extraktion Vorheizen 1 min Heizphase 5 min Spülvolumen 120 % Stickstoff-Spülzeit 100 s Zyklen 3 Druck 1500 psi

4.3.1.2 Mikrowellenextraktion Die Mikrowellenextraktion wurde als zweifache Extraktion durchgeführt. Konstante Parameter waren die Einstrahlzeit, die Masse der Probe (50,17 g ± 0,65 g), Volumen und Art des Lösemittels (saures Ethanol, sEtOH), der Druck (Normaldruck), die Anzahl der Wiederholungen (2) und die Rührgeschwindigkeit. Zu den variierten Parametern gehörten Temperatur und Leistung (siehe Tabelle).

96 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 34: Variierte Parameter der Mikrowellenextraktion Temperatur [°C] Leistung [W] 40 360 50 600 60 600 70 600 80 700 90 800 100 905

4.3.1.3 Ultraschallextraktion Die Ultraschallextraktion wurde ebenfalls als zweifache Extraktion durchgeführt. Die konstanten Parameter waren die Beschallungszeit, die Leistung, die Masse der Probe (50,04 g ± 0,11 g), das Volumen des Lösemittels, der Druck (Normaldruck), die Anzahl der Wiederholungen (2) und die Rührgeschwindigkeit. Zu den variierten Parametern gehörten Temperatur und Art des Lösemittels (siehe Tabelle).

Tabelle 35: Variierte Parameter der Ultraschallextraktion. Extraktionsmittel Temperatur [°C] saures EtOH 25 saures EtOH 50 saures EtOH 80 saures EtOH/Glycerin (50/50 v/v) 25 saures EtOH/Glycerin (50/50 v/v) 80

4.3.2 Identifizierung der Inhaltsstoffe Nach der Extraktion (vgl. Kapitel 3.7 sowie 4.3.1) wurden die erhaltenen Phytoextrakte mittels HPLC hinsichtlich ihres Gehalts an polyphenolischen Verbindungen analysiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung möglicher Inhaltsstoffe wurden folgende Standardverbindungen (gelöst in Methanol) verwendet: Idaeinchlorid (0,25 mg/ml), Delphinidinchlorid (0,5 mg/ml), Cyanidinchlorid (1,0 mg/ml), Chlorogensäure (1,0 mg/ml), Quercetin (1,0 mg/ml) und Eriodictyol (1,0 mg/ml). 4.3.2.1 Aroniabeeren-Extrakte Zur Analyse wurde einer L-Column ODS Säule (25 cm, 4,5 mm, 5 μm, 12 nm; Fa. CERI, Japan) bei einer Temperatur von 40 °C verwendet. Als mobile Phase diente ein Eluentengemisch, das unter folgendem Gradienten gefahren wurde (Flussrate: 1,2 ml/min):

Tabelle 36: Gradientenmethode – Anthocyane Eluent A: 8 Vol.-% Acetonitril, 0,05 M Phosphatpuffer (pH 2,1) Eluent B: Acetonitril.

97 Ergebnisse und Diskussion

Zeit [min] Eluent A [%] Eluent B [%] 0 95 5 7,5 87 13 8,5 84 16 10 85 15 20 75 25 22 95 5 25 95 5

Zur Detektion wurde ein Diodenarray-Detektor benutzt (Scanbereich 200 bis 800 nm, Datenintervall 4 nm). Die Absorption (Chromatogramme) wurde bei folgenden Wellenlängen aufgezeichnet: 287 nm (Eriodictyol), 326 nm (Chlorogensäure), 370 nm (Quercetin), 528 nm (Anthocyane). Zusätzlich wurden die Extrakte mittels HPLC-MS (Methode 2) vermessen. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 46 - 48 sowie der Tabelle 37 zu entnehmen.

Abbildung 46: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Mikrowellenextraktion, 50 ºC). Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und bei 528 nm (grüne Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure, (4) Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin.

98 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 47: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US4). Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und 528 nm (grüne Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure, (4) Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin.

Abbildung 48: HPLC-Elutionsprofil des Aronia-Extraktes (Ultraschallextraktion, US5). Absorption bei 287 nm (rote Linie), 326 nm (schwarze Linie), 370 nm (orange Linie) und bei 528 nm (grüne Linie). Peakzuordnung: (1) Idaeinchlorid, (2) Anthocyanidinglykosid, (3) polyphenolische Säure, (4) Delphinidinchlorid, (5) Cyanidinchlorid, (6) Chlorogensäure, (7) Eriodictyol, (8) Quercetin. Wie die Abbildungen 46 - 48 zeigen, konnten in allen Extrakten Idaeinchlorid, Delphinidinchlorid, Cyanidinchlorid, Chlorogensäure, Quercetin und Eriodictyol identifiziert werden.

99 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 37: Analytische Daten zu den Aronia-Extrakten; MW - Mikrowellenextraktion (50 ºC, sEtOH), US4 - Ultraschallextraktion (25 ºC, sEtOH/Glycerin), US5 - Ultraschallextraktion (80 ºC, sEtOH/Glycerin), tR - Retentionszeit

Nr. tR [min] UV–Vis, λmax [nm] Molpeak Methode Verbindung 1 5,5 235, 280, 517 [M-Cl] 449 MW, US4, Idaeinchlorid US5 2 6,7 235, 280, 518 [M-Cl] 419 MW, US4, Anthocyanidinglykosid US5 + 3 7,8 243, 300sh, 326 [M-CH3+H] MW, US4, polyphenolische Säure 419 US5 4 8,1 279, 518 [M-Cl] 303 MW, US4, Delphinidinchlorid US5 5 10,6 236, 275, 525 [M-Cl] 287 MW, US4, Cyanidinchlorid US5 + 6 11,1 242, 300sh, 327 [M-CH3+H] MW, US4, Chlorogensäure 369 US5 7 22,0 228, 288 [M+H]+ 289 MW, US4, Eriodictyol US5 8 22,9 208, 254, 371 [M+H]+ 303 MW, US4, Quercetin US5

Die Peaks Nr. 2 und 3 konnten wegen fehlender Standardverbindungen nicht identifiziert, aber aufgrund der UV-Vis-Spektren, der Molpeaks (MS) sowie der Retentionszeiten bestimmten Stoffgruppen zugeordnet werden. Die quantitative Analyse der Phytoextrakte bezüglich der untersuchten Verbindungen ergab folgendes Ergebnis:

Tabelle 38: Aronia-Extrakte - Konzentration der häufigsten Polyphenole. Ex (Extrakte): 2be – Mikrowellenextrakt aus Aroniabeeren (50 ºC, sEtOH), US4 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren (25 ºC, sEtOH/Glycerin), US5 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren (80 ºC, sEtOH/Glycerin). Konz. Idaein [mg/l] Delphinidin Cyanidin Chlorogensäure Eriodictyol Quercetin Ex [Vol.-%] [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mg/l] [mg/l] 2be 100 1875 43 3,6 293 6,4 14 US4 100 2096 48 29 514 19 49 US5 100 2175 50 39 644 13 52 2be 1 19 0,4 0,0 2,9 0,1 0,1 2be 2 38 0,9 0,1 5,9 0,1 0,3 2be 3 56 1,3 0,1 8,8 0,2 0,4 US4 1 21 0,5 0,3 5,1 0,2 0,5 US4 3 63 1,4 0,9 15 0,6 1,5 US5 1 22 0,5 0,4 6,4 0,1 0,5 US5 3 65 1,5 1,2 19 0,4 1,6

100 Ergebnisse und Diskussion

4.3.2.2 Erdbeerblätter-Extrakte Laut Literatur enthalten Erdbeerblätter (Fragaria spp.) die Wirkstoffe Kämpferol, Quercetin und Cyanidin sowie deren Glykoside, Catechin, Gerbstoffe und Vitamin C [Creasy et al., 1964]. Die Fragaria-Extrakte wurden sowohl mittels HPLC-DAD (Methode 4) als auch mittels HPLC-MS (Methode 2) vermessen. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 49 - 50 (Strukturvorschläge erfolgten auf Grundlage der MS- und UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 39 zu entnehmen.

Tabelle 39: Analytische Daten der Erdbeerblätter-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR - Retentionszeit.

Nr. tR UV –Vis, λmax Molpeak Methode postulierte Verbindung [min] [nm] [M+H]+ 1 6,7 222, 276, 563 318 E, WE Petunidin 2 7,2 251, 296, 358 434 E, WE Pelargonidin-3-O-D-galactosid 3 7,5 242, 372 465 E, WE Quercetin-3-O-D-glucosid 4 8,0 256, 356 479 E Isorhamnetin-3-O-D-galactosid 5 8,3 226, 306, 561 464 E, WE Peonidin-3-O-D-glucosid 6 8,6 222, 266, 560 596 E Cyanidin-3-O-(6''-O-p-Cumaroyl)- glucosid 7 8,9 256, 357 479 E, WE Isorhamnetin-3-O-D-glucosid

Abbildung 49: Erdbeerblätterextrakt: (ethanolisch): 1 - Petunidin, 2 - Pelargonidin-3-O-D-galactosid, 3 - Quercetin-3-O-D-glucosid, 4 - Isorhamnetin-3-O-D- galactosid 5 - Peonidin-3-O-D-glucosid, 6 - Cyanidin-3-O-(6''-O-p-Coumaroyl)-glucosid, 7 Isorhamnetin-3- O-D-glucosid

101 Ergebnisse und Diskussion

Quercetin- und Cyanidinglycoside sowie Hinweise auf andere Derivate konnten in den Extrakten ebenfalls gefunden werden. Desweiteren werden Glycoside anderer Flavonoidaglykone (u. a. Peonidin, Pelargonidin, Isorhamnetin) in den Extrakten vermutet.

Abbildung 50: Erdbeerblätterextrakt: (Wasser/ethanolisch): 1 - Petunidin, 2 - Pelargonidin-3-O-D-galactosid, 3 - Quercetin-3-O-D-glucosid, 4 - Peonidin-3-O-D- glucosid, 5 - Isorhamnetin-3-O-D-glucosid

4.3.2.3 Gänseblümchen-Extrakte Die Analyse erfolgte mittels Methode 2. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 51-52 (Vorschläge anhand der MS- und UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 40 zu entnehmen.

Tabelle 40: Analytische Daten der Bellis-perennis-Extrakte. ; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, tR - Retentionszeit.

Peak- tR UV - Vis Molpeak Methode Verbindung (Vorschlag) Nr. [min] [nm] [M+H]+ 1 7,6 252, 330 625 E, WE Isorhamnetinglucosidrhamnosid 2 7,9 255, 350 479 E, WE Isorhamnetin-3-O-D-galactosid 3 8,2 250, 350 521 E, WE Isorhamnetin-3-O-D-(6''-acetyl)galactosid 4 8,7 255, 353 493 E, WE Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid 5 8,9 254, 340 565 E, WE Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid) 6 9,0 267, 337 447 E, WE Apigenin-7-O-D-glucuronid

102 Ergebnisse und Diskussion

Peak- tR UV - Vis Molpeak Methode Verbindung (Vorschlag) Nr. [min] [nm] [M+H]+ 7 9,5 252, 362 331 WE Quercetin-3,3'-dimethylether 8 10,2 267, 335 489 WE Apigenin-4'-methylether-7-(6''- acetylgalactosid) 9 10,3 268, 335 271 E, WE Apigenin 10 10,4 267, 335 489 WE Apigenin-4'-methylether-7-(6''- acetylglucosid)

Abbildung 51: Gänseblümchenextrakt (Wasser/ethanolisch): 1 - Isorhamnetinglucosidrhamnosid, 2 - Isorhamnetin-3-O-D-galactosid, 3 - Isorhamnetin-3-O-D-(6''- acetyl)galactosid, 4 - Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid, 5 - Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid), 6 - Apigenin-7-O-D-glucuronid, 7 - Quercetin-3,3'-dimethylether, 8 - Apigenin-4'-methylether-7-(6''- acetylgalactosid), 9 - Apigenin, 10 - Apigenin-4'-methylether-7-(6''-acetylglucosid).

In den Extrakten aus Bellis perennis wurden alle in der Literatur [Nazuruk et. al, 2001; Hagenmeyer et al., 2006] beschriebenen Flavonoide identifiziert (Apigenin, Apigeninglykoside, Kämpferolglykoside, Isorhamnetinglykoside, Quercetin).

103 Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 52: Gänseblümchen-Extrakt (ethanolisch): 1 - Isorhamnetinglucosidrhamnosid, 2 - Isorhamnetin-3-O-D-galactosid, 3 - Isorhamnetin-3-O-D-(6''- acetyl)galactosid, 4 - Kämpferol-3',5'-dimethylether-3-glucosid, 5 - Isorhamnetin-3-(6''-malonylglucosid), 6 - Apigenin-7-O-D-glucuronid, 7 - Apigenin

4.3.2.4 Rotklee-Extrakte Die Analyse erfolgte mittels Methode 2. Die Ergebnisse sind den Abbildungen 53-54 (Vorschläge anhand der MS-, UV-Vis-Daten) sowie der Tabelle 41 zu entnehmen.

Tabelle 41: Analytische Daten der Rotklee-Extrakte; WE - Wasser/ethanolisch, E - ethanolisch, sh – Schulter im UV-Vis-Spektrum

Nr. tR UV - Vis Molpeak Methode Verbindung (Vorschlag) [min] [nm] [M+H]+ 1 6,4 218, 278 367 E, WE Kämpferolsulfat 2 6,8 257, 562, 670 433 E, WE Flavonoidglykosid 3 7,1 268, 321 437 WE Epitaxifolin-3-xylosid 4 7,6 255, 354 465 E, WE Hyperosid, Isoquercitrin 5 7,8 264, 346 449 E, WE Kämpferol-3-O-D-glucosid 6 8,2 254, 561 637 WE Irisolon-4'-O-glucosylglucosid 7 8,4 257, 302sh 431 WE Ononin 8 8,6 255, 348 535 WE Isorhamnetin-3-glucuronid-7-sulfat 9 8,8 263, 336 535 E, WE Kämpferol-3-(6''-malonylglycosid) 10 9,1 259, 329sh 447 WE Sissostrin

104 Ergebnisse und Diskussion

Nr. tR UV - Vis Molpeak Methode Verbindung (Vorschlag) [min] [nm] [M+H]+ 11 9,4 262, 328 535 E, WE Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''- acetylglucosid) 12 9,5 259, 310sh 517 E, WE Formononetin-7-O-glucosid-6''-malonat 13 10,1 268, 557 547 WE Afrormonin-7-O-D-(6''-malonylglucosid) 14 10,4 259, 328sh 271 E, WE Genistein 15 10,6 259, 322sh 533 E, WE 4-Hydroxyrottlerin 16 11,4 224, 293, 557 283 WE Pseudobaptigenin 17 11,6 248, 299 269 E, WE Formononetin 18 12,6 220, 269 299 WE 5-O-Methylbiochanin 19 13,5 260, 322sh 285 E, WE Homopterocarpin

Abbildung 53: Rotklee-Extrakt (Wasser/ethanolisch): 1 - Kämpferolsulfat, 2 - Flavonoidglykosid, 3 - Epitaxifolin-3-xylosid, 4 - Hyperosid/Isoquercitrin, 5 - Kämpferol-3-O-D-glucosid, 6 - Irisolon-4'-O-glucosylglucosid, 7 - Ononin, 8 - Isorhamnetin-3-glucuronid- 7-sulfat, 9 Kämpferol-3-(6''-malonylglycosid), 10 - Sissostrin, 11 - Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''- acetylglucosid), 12 - Formononetin-7-O-glucosid-6''-malonat, 13 - Afrormonin-7-O-D-(6''- malonylglucosid), 14 - Genistein, 15 - 4-Hydroxyrottlerin, 16 - Pseudobaptigenin, 17 - Formononetin, 18 - 5-O-Methylbiochanin, 19 - Homopterocarpin

In den Rotkleeextrakten wurden viele der in der Literatur [Polasek et al., 2007] beschriebenen Flavonoide identifiziert (Isoflavonoide: Genistein, Genistin, Formononetin, Ononin, Sissotrin, Pseudobaptigenin; Flavonoide: Quercetin, Hyperosid). Anhand der Analysenergebnisse werden

105 Ergebnisse und Diskussion weitere Inhaltsstoffe vermutet (Epitaxifolin-3-xylosid, Kämpferolderivate, Irisolon-4'-O- glucosylglucosid, Isorhamnetinderivate, Afrormonin-7-O-D-(6''-malonylglucosid), 4-Hydroxyrottlerin, 5-O-Methylbiochanin, Homopterocarpin).

Abbildung 54: Rotklee-Extrakt (ethanolisch): 1 - Kämpferolsulfat, 2 - Genistin, 3 - Hyperosid, 4 - Kämpferol-3-O-D-glucosid, 5 - Kämpferol-3-(6''- malonylglycosid), 6 - Quercetin-7,3'-dimethylether-3-(6''-acetylglucosid), 7 - Formononetin-7-O-glucosid- 6''-malonat, 8 - Genistein, 9 - 4-Hydroxyrottlerin, 10 - Formononetin, 11 – Homopterocarpin

4.4 Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte auf die Enzymproduktion

In diesem Kapitel wird der Einfluss der polyphenolischen Phytoextrakte aus einheimischen Pflanzen auf die Enzymproduktion durch Flüssigkulturen der Pilze Agrocybe aegerita und Bjerkandera adusta untersucht. Dazu wurden Agrocybe aegerita und Bjerkandera adusta in Gegenwart der o. g. Extrakte kultiviert und die Enzymbildung verfolgt.

4.4.1 Agrocybe aegerita A. aegerita wurde im Sojabohnenmehl-Medium (siehe 3.3.2.1, Anhang D) angezogen. Der Versuchsansatz umfasste 15 (18, 10) Standkolben à 500 ml mit jeweils 200 ml Medium.

106 Ergebnisse und Diskussion

Die Phytoextrakte wurden am siebten Kulturtag (nach einsetzender Pelletbildung) nach folgendem Schema zugegeben. Proben- Nr. Aroniabeeren-Extrakte Proben-Nr. übrige Extrakte 1 Kontrolle (Medium ohne Zusatz) 1 Kontrolle (Medium ohne Zusatz) 2 Medium mit 1 % Extrakt 2 Medium mit 1 % Extrakt 3 Medium mit 2 % Extrakt 3 Medium mit 3 % Extrakt 4 Medium mit 3 % Extrakt 4 Medium mit 1 % Extrakt 5 Medium mit 1 % Extrakt 5 Medium mit 3 % Extrakt 6 Medium mit 3 % Extrakt

Tabelle 42: Verwendete Phytoextrakte* Proben- Extrakte Nr. Aroniabeeren Erdbeerblätter Rotklee Gänseblümchen 2 2 ml 2be (MAE, 50 °C, 2 ml 60-64 (ASE, 2 ml TE (MAE, 2 ml BE; MAE, sEtOH) EtOH) 50 °C, sEtOH) 50°C, sEtOH 3 4 ml 2be (MAE, 50 °C, 6 ml 60-64 (ASE, 6 ml TE (MAE, 6 ml BE; MAE, sEtOH) EtOH) 50 °C, sEtOH) 50°C, sEtOH 4 6 ml 2be (MAE, 50 °C, 2 ml 65-69 (ASE, 2 ml Bell, Mac., 2 ml Bell b, Mac.,

sEtOH) EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O) EtOH/H2O 5 2 ml US5 (USAE, 6 ml 65-69 (ASE, 6 ml Bell, Mac., 6 ml Bell b, Mac.,

80°C, sEtOH/Glycerin) EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O) EtOH/H2O 6 6 ml US5 (USAE, 80°C, sEtOH/Glycerin)

* MAE – Mikrowellenextraktion; USAE – Ultraschallextraktion; 2be – Mikrowellenextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei 50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; US4 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei 25 ºC mittels angesäuertem Ethanol/Glycerin-gemisch; US5 – Ultraschallextrakt aus Aroniabeeren, extrahiert bei 80 ºC mittels angesäuertem Ethanol/Glyceringemisch 60-64 – ASE-Extrakt aus Erdbeerblättern, extrahiert bei 40, 60, 80 und 100 ºC mittels Ethanol; 65-69 – ASE-Extrakt aus Erdbeerblättern, extrahiert bei (40, 60, 80 und 100) ºC mittels Ethanol/Wasser TE – Mikrowellen-Extrakt aus Rotkleeblüten, extrahiert bei 50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; Bell – Extrakt aus Rotkleeblüten, extrahiert bei Raumtemperatur (RT) mittels Ethanol/Wasser (Maceration), bezogen von der Firma Bell Flavors & Fragrances BE – Mikrowellen-Extrakt aus Gänseblümchen, extrahiert bei 50 ºC mittels angesäuertem Ethanol; Bell b – Extrakt aus Gänseblümchenblüten, extrahiert bei RT mittels Ethanol/Wasser (Maceration), bezogen von der Firma Bell Flavors & Fragrances.

Um die Enzymproduktion zu verfolgen, wurden in gegebenen Abständen Proben (1 ml) steril entnommen, zentrifugiert und analysiert. A. aegerita produzierte die beiden Enzyme Laccase und

107 Ergebnisse und Diskussion

AaeAPO. Die Abbildungen, die eine stimulierende bzw. hemmende Wirkung der Extrakte auf die Aktivitäten der jeweiligen Enzyme zeigen, sind dem Anhang F zu entnehmen. Aus den Versuchsdaten können folgende Erkenntnisse gewonnen werden: Unabhängig von der Konzentration führt die Extraktzugabe zur Hemmung der AaeAPO-Bildung (im Fall der Fragaria- Proben 2 und 3 besonders stark ausgeprägt) und zu einer Stimulation der Laccase-Produktion. Letzteres kann eindeutig auf die Extrakte zurückgeführt werden, da sich mit steigender Extraktmenge auch die Laccase-Aktivität erhöhte (Aroniabeeren, Trifolium). Tabelle 43 listet die maximalen Enzym- Aktivitäten für die jeweiligen Proben entsprechend der Kulturtage auf.

Tabelle 43: Maximale Enzymaktivitäten (AaeAPO, Laccase) nach Kulturtagen. (Probenzusammensetzung siehe vorherige Tabelle) Proben 1 2 3 4 5 6

ARONIABEEREN-

EXTRAKTE Aktivität am

Kulturtag

Tag (AaeAPOmax) 21 21; 28 14; 24 21; 30 23; 30 23 AaeAPO [U/l] 1.645±214 534±38 257±38 609±159 1.040±74 242±18

Tag (Laccasemax) 11 17 24 28 17 28 Laccase [U/l] 235±19 466±51 607±61 1.270±156 606±18 2.970±1218

ERDBEERBLÄTTER-

EXTRAKTE Aktivität am

Kulturtag

Tag (AaeAPOmax) 33 28; 35 50 33 (26) 33; 35 AaeAPO [U/l] 1.250 534±48 395±21 980±193 659±21

Tag (Laccasemax) 12 14 19; 23 14 14; 16 Laccase [U/l] 552 737 1.119±5 1.229±75 968±112

ROTKLEE-

EXTRAKTE Aktivität am

Kulturtag

Tag (AaeAPOmax) 26; 28 31 (24) 49 28 39; 42 AaeAPO [U/l] 1.758±80 403±20 474±8 739±19 303±30

Tag (Laccasemax) 13; 14 19; 17 19; 17 17 13; 14 Laccase [U/l] 352±68 426±11 2.476±41 906±36 1.411±43

108 Ergebnisse und Diskussion

Proben 1 2 3 4 5 6

GÄNSEBLÜMCHEN-

EXTRAKTE

Aktivität am Kulturtag Tag (AaeAPOmax) 19; 23 14; 16; 19 21; 23 21; 23; 26 21; 23 AaeAPO [U/l] 1.797±108 488±53 560±6 674±28 652±17

Tag (Laccasemax) 19; 21 19 14 (19) 16 19 Laccase [U/l] 196±101 13.700±4269 2.650±86 9.222±273 15.601±3022

In wiederholten Versuchen wurden diese Befunde, d. h. eine Hemmung der AaeAPO-Bildung und eine Stimulation der Laccase-Bildung, bestätigt. Dabei wirkten sich die ethanolischen Extrakte deutlicher auf die AaeAPO-Hemmung aus als die wässrig-ethanolischen Extrakte. Im Fall der Stimulierung der Laccase-Bildung ergaben sich erhebliche Unterschiede zwischen den einzelnen Proben, so dass keine klare Tendenz in Bezug auf den Lösungsmitteleinfluss abgeleitet werden konnte. 4.4.1.1 Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) Im Zuge der Versuche mit dem Südlichem Ackerling (A. aegerita) wurde auch der Einfluss des Lösungsmittels untersucht. Ethanol wurde an verschiedenen Kulturtagen (nach einsetzender Pelletbildung) nach folgendem Schema zugegeben. Proben Nr. 1 Kontrolle (Medium ohne Zusatz) 2 Medium mit 0,5 % EtOH 3 Medium mit 1 % EtOH 4 Medium mit 1,5 % EtOH 5 Medium mit 3 % EtOH

3000

2500 Aktivität (Zugabe- 7.Kt.) 2000 Aktivität (Zugabe- 12.Kt.) 1500 Aktivität (Zugabe- 1000 15.Kt.) APO Aktivität [U/l] Aktivität (Zugabe-

Aae 500 20.Kt.) 0 00.511.53 Ethanolkonzentration [Vol.-%]

Abbildung 55: AaeAPO-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an unterschiedlichen Kulturtagen)

109 Ergebnisse und Diskussion

25000 Aktivität (Zugabe- 20000 7.Kt.)

15000 Aktivität (Zugabe- 12.Kt.)

10000 Aktivität (Zugabe- 15.Kt.)

Lacc Aktivität [U/l] 5000 Aktivität (Zugabe- 20.Kt.) 0 0 0.5 1 1.5 3 Ethanolkonzentration [Vol.-%]

Abbildung 56: Laccase-Aktivität in Abhängigkeit von verschiedenen Ethanol-Konzentrationen (Zugabe an unterschiedlichen Kulturtagen)

Die Abbildungen (55, 56) zeigen die stimulierende bzw. hemmende Wirkung von Ethanol auf die Aktivität des jeweiligen Enzyms. Die Ethanolzugabe führte in den untersuchten Kulturen i.d.R. zu einer Hemmung der AaeAPO- Produktion. Ausnahmen bildeten die vier Kulturen, zu denen das Ethanol relativ spät gegeben wurde (0,5 % EtOH oder 1 % EtOH am 12. Kulturtag sowie 1,5 % oder 3 % EtOH am 20. Tag). Die Laccase- Bildung wurde hingegen durch alle ethanolhaltigen Proben stimuliert. Die größte Wirkung erzielte dabei eine Ethanol-Konzentration von 3 %, die am 12. Kulturtag zugegeben wurde. Wenn man die Wirkung der polyphenolischen Extrakte mit dem Einfluss von Ethanol (Zugabe in beiden Fällen am 7. Kulturtag) vegleicht, erkennt man eine ähnliche Tendenz. Ohne Ethanol in den Extrakten würden die Inhaltsstoffe (inklusive Flavonoide) die Laccase-Bildung im Fall von Aroniabeeren und Gänseblümchenblüten leicht bzw. deutlich fördern und Erdbeerblätter und Rotkleeblüten die Produktion des Enzyms hemmen. Die AaeAPO-Bildung scheint durch Aroniabeeren und Gänseblümchenblüten minimal sowie durch Erdbeerblätter deutlich gefördert zu werden, während Rotkleeblüten die Produktion des Enzyms negativ beeinflussen. Als potentielle Stimulatien (Elizitoren) für die AaeAPO- bzw. Laccase-Bildung böten sich folglich Erdbeerblätter-Extrakte und Bellis-perennis-Inhaltsstoffe an.

4.4.2 Bjerkandera adusta Die Induktionsversuche mit dem Grauen Rauchporling wurden unter Verwendung der gleichen Phytoextrakte wie die Versuche mit dem Südlichem Ackerling durchgeführt. Der Pilz wurde im Kirk-

110 Ergebnisse und Diskussion

Acetat-Medium kultiviert (siehe 3.3.2.2). Der Versuchsansatz umfasste 15 (10) Standkolben à 500 ml mit jeweils 200 ml Medium. Die Extrakte wurden am achten Kulturtag gemeinsam mit jeweils 2 ml 250 mM Mangan(II)chloridlösung (2,5 mM; zur zusätzlichen Stimulation der Mangan-Peroxidase- Bildung) nach einsetzender Pelletbildung entsprechend dem folgenden Schema zugegeben.

Proben-Nr.

1 Kontrolle A (ohne Extraktzusatz, mit MnCl2) 2 Medium mit 1% Extrakt 3 Medium mit 3% Extrakt 4 Medium mit 1% Extrakt 5 Medium mit 3% Extrakt C Kontrolle B (Medium ohne jeglichen Zusatz)

Tabelle 44: Verwendete Phytoextrakte (Erklärungen s. Tabelle 41) Proben- Extrakte Nr. Aroniabeeren Erdbeerblätter Rotklee Gänseblümchen 2 2 ml 2be (MAE, 50 °C, 2 ml 60-64 (ASE, 2 ml TE (MAE, 2 ml BE; MAE, sEtOH) EtOH) 50 °C, sEtOH) 50°C, sEtOH 3 6 ml 2be (MAE, 50 °C, 6 ml 60-64 (ASE, 6 ml TE (MAE, 6 ml BE; MAE, sEtOH) EtOH) 50 °C, sEtOH) 50°C, sEtOH 4 2 ml US5 (USAE, 2 ml 65-69 (ASE, 2 ml Bell, Mac., 2 ml Bell b, Mac.,

80°C, sEtOH/Glycerin) EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O) EtOH/H2O 5 6 ml US5 (USAE, 6 ml 65-69 (ASE, 6 ml Bell, Mac., 6 ml Bell b, Mac.,

80°C, sEtOH/Glycerin) EtOH/H2O 50:50 v/v) EtOH/H2O) EtOH/H2O

Zum Verfolgen der Enzym-Bildung wurden wie im Abschnitt 4.4.1 beschrieben Proben (1 ml) steril aus den Kolben entnommen, zentrifugiert und analysiert. B. adusta bildete im Unterschied zu

A. aegerita das Enzym Mangan-Peroxidase (MnP). In der Kontrolle (ohne Extrakte und MnCl2) wurden MnP-Aktivitäten < 100 U/l gemessen (∅ 23 U/l). Die Abbildungen, die die stimulierende oder hemmende Wirkung der einzelnen Extrakte auf die Aktivität der MnP belegen, sind dem Anhang F zu entnehmen. Die Zugabe von Aroniabeeren-, Erdbeerblätter-, Rotklee- oder Gänseblümchen-Extrakten zum Kirk- Acetat-Medium wirkte sich in fast allen Fällen mäßig positiv (13-336 %) auf die MnP-Bildung aus [mit Ausnahme des 3 %igen ethanolischen (-63 %) und 1 %igen wasserethanolischen (-7 %) Rotklee- Extraktes]. Dieses Ergebnis konnte in Wiederholungsversuchen bestätigt werden. Tabelle 45 listet die maximale Enzymaktivität für die jeweiligen Proben entsprechend der Kulturtage auf.

111 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 45: Maximale MnP-Aktivitäten an unterschiedlichen Kulturtagen. Proben 1 2 3 4 5

ARONIABEEREN-EXTRAKTE Aktivität am Kulturtag

Tag (MnPmax) 21 25 28 (21) 28 (21) 21 (32) MnP [U/l] 659±86 871±76 985±18 824±28 977±84

ERDBEERBLÄTTER-EXTRAKTE Aktivität am Kulturtag

Tag (MnPmax) 20 (17) 24 34 (30) 24 24 (26) MnP [U/l] 600 868±141 1.492±16 733±87 917±23

ROTKLEE-EXTRAKTE Aktivität am Kulturtag

Tag (MnPmax) 14 17 (24) 26 24 (26) 24 (26) MnP [U/l] 790±68 1.137±45 294±65 739±26 895±53

GÄNSEBLÜMCHEN-EXTRAKTE Aktivität am Kulturtag

Tag (MnPmax) 34; 36 32; 34 55 (46) 27 27 (39) MnP [U/l] 622±40 711±26 1.187±43 2.088±295 1.367±144

Die Erhöhung der Extraktkonzentration von 1 % auf 3 % (Aronia melanocarpa; Fragaria ananassa) führte zu einer Verstärkung des stimulierenden Effekts um jeweils 13 %, 19 %, 72 % und 25 %. Die Gänseblümchen-Extrakte bewirkten unabhängig von der Extraktkonzentration ein verzögertes Erreichen des MnP-Aktivitätsmaximums.

4.4.2.1 Lösungsmitteleinfluss (Ethanol) Auch im Fall des Grauen Rauchporlings wurde der Einfluss des Lösungsmittels Ethanol untersucht. Ethanol wurde am achten Kulturtag (nach beginnender Pelletbildung) laut nachfolgendem Schema zugegeben.

Proben-Nr. 1 Kontrolle (Medium ohne Zusatz) 2 Medium mit 0,5 % EtOH 3 Medium mit 1 % EtOH 4 Medium mit 1,5 % EtOH 5 Medium mit 3 % EtOH

Ethanol beeinflusste die Produktion von Mangan-Peroxidase insgesamt nur geringfügig; höhere Ethanol-Konzentrationen führten zu einem verzögerten Erreichen des MnP-Aktivitätsmaximums.

112 Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 46 listet die maximalen Enzymaktivitäten für die jeweiligen Proben entsprechend der Kulturtage auf.

Tabelle 46: Maximale Aktivität der MnP nach unterschiedlichen Kulturtagen Proben 1 2 3 4 5 Ethanol-Konzentration [Vol.-%] 0,0 0,5 1,0 1,5 3,0 Aktivität am Kulturtag

Tag (MnPmax) 34; 36 32 32 39; 43 55 MnP [U/l] 622±40 806±47 390±23 761±234 873±259

4.4.3 Vergleichende Diskussion der Induktionsversuche Im Rahmen der Dissertation wurde der Einfluss polyphenolischer Phytoextrakte aus einheimischen Pflanzen auf die Enzymproduktion in Flüssigkulturen der Pilze Agrocybe aegerita sowie Bjerkandera adusta untersucht. Die nachfolgende Tabelle fasst die Ergebnise summarisch zusammen.

Tabelle 47: Übersicht zur Wirkung der Phytoextrakte und des Lösungsmittels Ethanol auf die Enzymbildung (AaeAPO, Laccase, MnP) Enzyme Aroniaextrakte Erdbeerbläter- Rotkleeextrakte Gäseblüchen- Ethanol extrakte extakte AaeAPO HEMMUNG mäßige Hem. Laccase STIMULIERUNG MnP MÄßIGE STIMULIERUNG kein Einfluss

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Phytoextrakte die AaeAPO-Bildung hemmen, die Laccase-Produktion deutlich und die MnP-Bildung mäßig stimulieren. Im Fall der AaeAPO und Laccase weisen die Ergebnisse auf eine zusätzliche hemmende bzw. stumulierende Wirkung von Ethanol hin; das Aktivitätsprofil der MnP wird durch Ethanol kaum beeinflusst.

Die Stimulation und Induktion von Laccasen (kupferhaltige Diphenol-Oxidasen; EC 1.10.3.2) ist gut untersucht. Der bekannteste Induktor – Kupfer in Form von Cu2+ – reguliert positiv die Transkription der Gene poxa1b sowie poxc (Phenol-Oxidasen) im Austernseitling (Pleurotus ostreatus), wodurch die Enzymsynthese und -sekretion gesteigert wird [Palmieri et al., 2000]. In ähnlicher Weise verhalten sich andere holzzerstörende Pilze wie Trametes versicolor [Collins et al., 1997], Trametes pubescens (lap2) [Galhaup et al., 2002], Phanerochaete chrysosporium [Dittmer et al., 1997] und Coriolopsis rigida [Saparrat et al., 2002] sowie der phytopathogene Schlauchpilz Botryosphaeria rhodina MAMB- 05 [Dekker et al., 2007]. Für den Porling Trametes trogii wurde gezeigt, dass neben der Laccase- auch die MnP-Bildung durch Zusatz von CuSO4 stimmuliert werden kann [Levin et al., 2002]. Außer Kupfer bewirken auch andere anorganische und organische Substanzen eine Stimulation der Laccase-

113 Ergebnisse und Diskussion

Produktion, u. a.: MnSO4, FeCl3, ZnSO4, Veratrylalkohol, Vanillinsäure, Ferulasäure [Palmieri et al.,

2000], CaCl2 (bei Cryphonectria parasitica, Kalziumschock), LiCl (bei Rhizoctonia solani, als Ca- Ionophor), Koffein [Crove et al., 2001] und andere Verbindungen. Man geht davon aus, dass Laccasen in Pflanzen und Mikroorganismen unspezifisch als Stressantwort auf unterschiedliche externe Stimuli gebildet werden [Baldrian, 2006, Mayer & Staples, 2002]. Auch die Wirkung von Lösungsmitteln kann als Stressfaktor aufgefasst werden; so wirkten Ethanol und Isopropanol stimulierend auf die Laccase-Bildung durch den anamorphen Basidiomyceten Rhizoctonia solani. Es wird angenommen, dass solche Lösungsmittel Membranen und Membranproteine destabilisieren [Ingram & Buttke, 1984], was eine ähnliche zelluläre Reaktion im Pilz wie ein Hitzeschock zur Folge hat [Piper et al., 1995]. Hitzeschock-regulierte Laccase- und Peroxidasegene sind für verschiedene Pilze beschrieben worden [Li et al., 1995; Saloheimo et al., 1991]. Die stimmuliereunde Wirkung von Phenolen und aromatischen Aminen (p-Cresol, o-Toluidin) auf die Laccase-Bildung durch Neurospora crassa wurde auf eine indirekte Beeinflussung der Proteinsynthese zurückgeführt [Froehner & Eriksson, 1974]. Einige phenolische Verbindungen wie 3,5-Dihydroxytoluol oder Guaiacol können sogar das Verhältnis einzelner Laccase-Isoenzyme regulieren (Laccase A, Laccase B in Trametes sp.) [Xiao et al., 2004]. Die hier beobachtete Anregung der Laccase-Sekretion in A. aegerita als Antwort auf die phenolischen Inhaltsstoffe (Flavonoide) der Phytoextrakte passt folglich gut in das bestehende Bild. Eine Induktion der Peroxygenase-Bildung (einschl. AaeAPO) in Pilzen ist bisher nur für Sojabohnen sowie deren Bestandteile und Spaltprodukte (Pepton) beschrieben worden [Ullrich et al., 2004, Anh et al., 2007, Gröbe et al., 2011]. Der physiologische und molekulare Hintergrund dieses Phänomäns ist noch nicht verstanden; Flavonoide (z. B. Genistein) [Mirzaei et al., 2012] scheiden aber offensichtlich als Induktoren aus und führen eher, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, zu einer Hemmung der Peroxygenase-Bildung. Cytochrom-P450-Enzyme reagieren in vielfältiger Weise auf externe chemische Stimuli wie Lösungsmittel oder aromatische Verbindungen [Peters et al., 2009, Hukkanen, 2012]. Im Fall von CYP2B4 wurde nachgewiesen, dass Ethanol und 3-Methylcholanthren als Inhibitoren der enzymatischen Aktivität fungieren [Hlavica & Künzel-Mulas, 1993]. Die MnP-Bildung wurde in dem Weifäulepilz Phanerochaete chrysosporium durch Zugabe von Mn(II)-Salzen [Murayama et al., 2009] sowie die Auswahl einer geeigneten N-Quelle (75 mg/l

NH4NO3, 150 mg/l L-Asparagin) [Krčmář et al., 1994] stimuliert. Polymere Ligninfraktionen erhöhten die MnP-Aktivität in Panus tigrinus 8/18 [Leonťevskii et al., 1991], P. chrysosporium [Murayama et al., 2009] und Dichomitus squalens [Pavko & Novotný, 2008]. Schwermetalle in Form von Kadmium- oder Kobaltsalzen (Cd2+, Co2+) hemmen die MnP-Aktivität auf Proteinebene. Sie wirken dabei als kompetetive Inhibitoren und verhindern die Oxidation der Mn2+-Ionen [Harris et al., 1991, Youngs et al., 2000]. Auch phenolische Substanzen und Pflanzeninhaltsstoffe beeinflussen das Aktivitätsprofil der MnP, wobei sowohl positive als auch negative Befunde publiziert wurden [Hofrichter, 2002].

114 Ausblick

5 Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurden 57 Flavonoide unterschiedlicher Struktur und aus verschiedenen Subklassen hinsichtlich ihrer Umsetzbarkeit durch eine pilzliche Peroxygenase (AaeAPO) untersucht. Dabei wurden funktionelle Gruppen/Substituenten und Positionen identifiziert, die die Umsetzung störten oder vollständig verhinderten. Dieser Ansatz könnte in zukünftigen Studien weiterverfolgt und auf bisher nicht berücksichtigte Strukturen ausgedehnt werden (z. B. Cumarin- und Biphenylderivate). Während der Biotransformationen entstanden z. T. Produkte, die nicht eindeutig identifiziert und lediglich anhand ihrer Retentionszeiten (tR) sowie UV-Vis- und MS-Spektren beschrieben werden konnten. Mittels einer erweiterten Palette an Standardsubstanzen, die speziell synthetisiert werden müssten sowie durch eine verstärkte Nutzung der NMR-Analytik könnte diese Wissenslücke zeitnah geschlossen werden. In diesem Zusammenhang steht die enzymatische Synthese größerer Mengen spezifisch hydroxylierter Flavonoide, die hinsichtlich Umsatz und Ausbeute (einschl. Minimierung der Reinigungsverluste) zu optimieren wäre. Ein Weg dorthin könnte im wiederholten Einsatz des Enzyms liegen (z. B. durch Immobilisierung, Verwendung von Membranmodulen) sowie in der generellen Erhöhung der Raum-Zeit-Ausbeute (u. a. durch Erhöhung der Ausgangsmenge an Substrat). Das Problem der begrenzten Umsetzung von Flavonoidglykosiden könnte zukünftig durch den Einsatz von Enzym-Cocktails, die neben unterschiedlichen Peroxygenasen auch Zucker abspaltende Enzyme (Glykosidasen) enthalten, gelöst werden. Weiterführende Untersuchungen zur Stimulation und Hemmung der Enzymbildung durch Pilze sollte sich auf die Fraktionierung phenolischer und anderer Pflanzeninhaltsstoffe konzentrieren, um die summarischen Effekte der einzelnen Komponenten eingrenzen und besser unterscheiden zu können. Nicht zuletzt sollten solche Untersuchungen auf moderne molekularbiologische Methoden zurückgreifen, die helfen können, die Targets und Pfade der Induktionskaskaden zu identifizieren.

Abschließend möchte ich ein recht ungewöhnliches Gebet erwähnen, auf das ich im Zuge meiner Literaturrecherchen zum Thema „Weiße Biotechnologie“ gestoßen bin:

The Chemist’s Perspective Oh Lord, I fall upon my knees And pray that all my syntheses Will no longer seem inferior To those conducted by bacteria and fungi. Organic Chemist’s Prayer (unknown origin)

Es ist unbestritten, dass die industrielle Biotechnologie dank verbesserter Verfahren dazu beiträgt, „schmutzige“ Prozesse schrittweise zu ersetzen und so die Umwelt zu entlasten. Nur zwei Beispiele

115 Ausblick seien in diesem Zusammenhang genannt: erstens Waschmittel-Enzyme, die bei 40 °C statt 60 °C ihre volle Aktivität entfalten, was einer Ersparnis von einer Million Tonnen Kohlendioxid jährlich allein in Deutschland entspricht [BMBF, 2012], und zweitens das Futtermittelenzym Phytase, das durch Freisetzung von organisch gebundenem Phosphat für eine bessere Verfügbarkeit des natürlich vorhandenen Phosphors im Getreide sorgt (100 g der Enzymformulierung helfen über 6 kg Calciumphosphat zu sparen) [Balkenhohl, 2006]. Die biotechnologischen Verfahren sind aber nicht per se den (klassischen) chemischen Verfahren überlegen - weder wirtschaftlich noch ökologisch. Es ist eher so, dass die Biotechnologie zusätzliche und/oder ergänzende Produktionswege zur herkömmlichen Chemie bietet. In jedem Einzelfall muss deshalb geprüft werden, welches Verfahren hinsichtlich Kosten, Energieverbrauch, Ressourcenschonung und Emissionen das bessere ist und ob es nicht möglich ist, Biotechnologie und Chemie in geeigneter Weise miteinander zu kombinieren [Garthoff, 2006].

Und wer wird das Rennen im Fall der Flavonoide machen? Die Schlüsselfrage hierbei – wie auch in anderen Bereichen der Weißen Biotechnologie – ist: Wird es zukünftig gelingen die avisierten Biokatalysatoren (Enzyme) tatsächlich großtechnisch, d. h. im Tonnen-Maßstab, herzustellen?

116 Quellenverzeichnis

6 Quellenverzeichnis

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135 Anhang

Anhang

Anhang A: Shikimisäureweg

Anhang B: Proanthocyanidin-Biosynthese

Anhang C: Bestimmung enzymatischer Aktivitäten

Anhang D: Enzymgewinnung – AaeAPO

Anhang E: Synthese von 4`,6-Dihydroxyflavanon

Anhang F: Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte auf die Enzymproduktion (Abbildungen)

Danksagung

Versicherung an Eides statt

Thesen

Anhang

Anhang A: Shikimisäureweg

O -OOC O 2- 1 2 HO COO- O3PO HOH HH + + 3 COO- HOH H2O HO H NAD 2- 3- HOH - NADH O OH - H O OPO3 -PO 2 4 HOH 3- OH Erythrose-4- 2- - PO4 Phosphoenol- OPO pyruvat phosphat 3 3-Dehydrochinat 2-Keto-3-desoxy-arabino- heptulosonat-7-phosphat 5 2- COO- 4 COO- COO- O3PO 6 NADPH+H+ ATP COO- + - H O 2- 3- O OH - NADP HO OH 2 O3PO OH - PO OH OH - ADP OH 4 3-Dehydroshikimat Shikimat Shikimat-3-phosphat

COO- COO- -OOC COO- 7 8 O 2- 3- O3PO O COO- - PO O COO- OH 4 OH OH 5-Enoylpyruvat- Chorismat Prephenat shikimat-3-phosphat + 9 10 O NAD - CO2 O - H O COO- NH COO- - NADH 2 2 11 COO- - CO2 NH Glu 12 2 Phenylpyruvat -α-KG OH Glu COO- -α-KG OH 4'-Hydroxyphenyl- pyruvat Tyrosin Phenylalanin

Abbildung: Shikimisäureweg zur Synthese aromatischer Aminosäuren [Lehninger et al., 2001; Akagi et al., 2009]

1) 2-Keto-3-desoxy-arabino-heptulosonat-7- 7) Chorismat-Synthase phosphat-Synthase 8) Chorismat-Mutase 2) 3-Dehydrochinat-Synthase 9) Prephenat-Dehydrogenase 3) 3-Dehydrochinat-Dehydratase 10) Prephenat-Dehydratase 4) Shikimat-Dehydrogenase 11) Tyrosin-Transaminase 5) Shikimat-Kinase 12) Aromatische Aminosäure- 6) 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat- Transaminase Synthase

Anhang

Anhang B: Proanthocyanidin-Biosynthese

O COO- COO- 2- O PO 3 + HOH * COO- HOH 2- O OH OPO HO OH 3 OH OH Phosphoenol- Erythrose-4- - 3-Dehydroshikimat Dehydroshikimat pyruvat phosphat * NH2 COO- COO- COO- 1 2 COO- 3 OH Phenylalanin Cinnamat 4-Cumarat HO OH OH O OH 3 OHOOC Gallat SCoA OH SCoA H OO 5 4 HO OH OH OH O 4-CumaroylCoA Naringenin OH O Naringeninchalcon 6 8 OH 7 O H OH OH OH H OO H OO OH H OO OH H OO OH 9 OH OH OH O OH O OH O OH O 3',4',5',5,7-Pentahydroxy- Dihydrokämpferol Eriodictyol Dihydroquercetin flavanon 11 12 13 10 OH OH OH OH OH H OO H OO OH H OO OH OH 14 OH OH OH OH O OH OH OH OH Dihydromyricetin Leucodelphinidin Leucocyanidin 15 OH 16 OH 17 18 OH OH OH OH HO O+ H OO HO O+ H OO OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH OH (+)-Gallocatechin Delphinidin (+)-Catechin Cyanidin 19 GT ? 21 22 23 24 20 OH GT ? Flavan-3-ol OH Flavan-3-ol OH Glykoside ? Glykoside ? H OO OH 27 H OO OH 25 OH 26 GST ? OH 28 GST ? OH VT OH (-)-Epigallocatechin VT MATE Transporter (-)-Epicatechin Glykosidase? 29CE? Anthocyanine R2 OH und Derivate Anthocyanine H OO und Derivate R1 R2 OR 3 OH OH H OO MATE Transporter R1 Galloyl- ? 30 OR 3 transferase Glykosidase? OH n/2 CE ? Proanthocyanidine VAKUOLE

Abbildung: Biosynthese der Proanthocyanidine [nach Akagi et al., 2009]

Anhang

1) PAL Phenylalanin-Ammoniak-Lyase 18) ANS Anthocyanidin-Synthase 2) C4H Zimtsäure-4-Hydroxylase 19) ? GT Glycosyl-Transferase 3) 4CL 4-Cumaroyl-CoA-Ligase 20) GT, OMT Glycosyl-Transferase, 4) CHS Chalcon-Synthase O-Methyl-Transferase 5) CHI Chalcon-Isomerase 21) ANR Anthocyanidin-Reduktase 6) F3'5'H Flavonoid-3',5'-Hydroxylase 22) ? GT Glycosyl-Transferase 7) F3H Flavanon-3-Hydroxylase 23) ANR Anthocyanidin-Reduktase 8) F3'H Flavonoid -3'-Hydroxylase 24) GT, OMT Glycosyl-Transferase, 9) F3H Flavanon-3-Hydroxylase O-Methyl-Transferase 10) F3H Flavanon-3-Hydroxylase 25) ? GT Glycosyl-Transferase 11) F3'5'H Flavonoid -3',5'-Hydroxylase 26) ? GST Glutathion-S-Transferase 12) F3'H Flavonoid -3'-Hydroxylase 27) ? GT Glycosyl-Transferase 13) DFR Dihydroflavonol-4-Reduktase 28) ? GST Glutathion-S-Transferase 14) DFR Dihydroflavonol-4-Reduktase 29) ? CE Kondensationsenzym (Bildung 15) LAR Leucoanthocyanidin-Reduktase von C-C-Bindungen durch Kondensation) 16) ANS Anthocyanidin-Synthase 30) ? CE Kondensationsenzym 17) LAR Leucoanthocyanidin-Reduktase * siehe Anhang A

CA: (+)-Catechin (R1 –OH, R2 –H)

GC: (+)-Gallocatechin (R1 = R2 –OH)

CG: (+)-Catechin-3-O-Gallat (R1 –OH, R2 –H, R3 –Gallussäure (GA))

GCG: (+)-Gallocatechin-3-O-Gallat (R1 = R2 –OH, R3 –GA)

EC: (-)-Epicatechin (R1 –OH, R2 –H)

ECG: (-)-Epigallocatechin (R1 = R2 –OH)

EGCG: (-)-Epigallocatechin-3-O-Gallat (R1 = R2 –OH, R3 –GA)

MATE Extrusionstransporter für Multidrogen und toxische Verbindungen (lat. extrudere = hinausstoßen, -treiben) [Herrmann, 1995; Dixon et al., 2005; Lepiniec et al., 2006; publiziert in Akagi et al., 2009]

Anhang

Anhang C: Bestimmung enzymatischer Aktivitäten

1. Laccase: Oxidation von ABTS zum semistabilen ABTS-Kationradikal

-O3S S S SO3- N N N N

e- + .

-O3S S S SO3- N N N N

2. AaeAPO: Oxidation von Veratrylalkohol zum Veratrylaldehyd OH O

+ O - 2H O O - 2e- O Veratrylalkohol Veratrylaldehyd

3. MnP: Bildung der Mn3+-Malonat-Komplexe

3+

HOH O O O O 2 + HO OH - 4 HO ONa + 2 Mn + H2O2 2 + 2 OH - 4 NaOH Mn HO OH O O HOH

Anhang

Anhang D: Enzymgewinnung - AaeAPO

1) Fermentation im Rührkesselreaktor

Zur Gewinnung des Enzyms AaeAPO wurde der Pilz Agrocybe aegerita in einem Rührkesselreaktor mit fünf Liter Fassungsvermögen in Sojamehl-Medium kultiviert. Abbildung 1 zeigt den zeitlichen Verlauf der AaeAPO -Aktivität.

Aae APO - Aktivität nach Kulturtagen

2000 8.30 1800 8.20 1600 1400 8.10 1200 8.00 1000 pH 800 7.90 600

APO - Aktivität [U/l] 7.80 400

Aae 7.70 200 0 7.60 10 12 14 16 18 20 22 24 Kulturtage [d]

Abbildung 1: Zeitlicher Verlauf der AaeAPO -Aktivität (gestrichelte Linie: Verlauf des pH-Wertes)

Der Anstieg der Enzymaktivität ging mit einer Farbänderung des Mediums einher (gelb ⇒ anthrazit). Die maximale Enzymaktivität von 1542 U/l wurde am 19. Kulturtag erreicht, das Maximum des pH- Wertes (pH 8,3) am 18. Kulturtag. Am 20. Kulturtag kam es zu einem leichten Abfall der AaeAPO Aktivität auf 1324 U/l sowie des pH-Wertes auf 8,2. Aufgrund dessen wurde die Kultivierung beendet. Während der Fermentation wurde aufgrund einer intensiven Biomassebildung viel Flüssigkeit verbraucht, so dass nur ca. 1 l Kulturfiltrat mit einer Gesamtaktivität von 1351 U AaeAPO geerntet werden konnten.

2) Reinigung der AaeAPO

Der gewonnene Rohextrakt wurde grob durch ein Sieb filtriert und 7 Minuten bei 13.000 rpm zentrifugiert. Weiter wurde die Enzymlösung durch Glasfaserfilter filtriert und mittels Ultrafiltration (10 kDa cut-off-Membran) konzentriert. Das Konzentrat kann bei -20 °C für weitere Reinigungsschritte gelagert werden.

Anhang

Die Reinigung wurde mittels Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung eines FPLC-Systems fortgesetzt. Dafür wurden mehrere Fermentoransätze vereinigt. Zuerst wurde die Probe mit 5 Vol.-% Essigsäure auf pH 4,5 eingestellt, zentrifugiert, über Glasfaserfilter filtriert und mit 10 mM Natriumacetatpuffer versetzt. Danach wurde das Filtrat auf die Kationenaustauschersäule SP Sepharose FF in 2 Portionen (3800 U, 2500 U) geladen und mittels 30 %-igen Salzgradienten (Eluent A: 10 mM NaAc-Puffer pH=4,5; Eluent B: 10 mM NaAc-Puffer pH=4,5 mit 2 M NaCl) das Zielprotein von den noch im Rohextrakt enthaltenen Farbstoffen, anderen Proteinen und Verunreinigungen getrennt.

1000 160

900 140 800 120 700 600 100 [%B] [mAU] [mAU] [mS/cm] [mS/cm] 500 80 tion 400 60 sorp 300 Gradient Ab 40 Leitfähigkeit

Enzymaktivität [100U/l] Enzymaktivität 200 100 20 0 0 0 100 200 300 400 500 600 Elutionsvolumen [ml]

Abbildung 2: FPLC-Elutionsprofil der AaeAPO von A. aegerita an einem Kationenaustauscher (SP- Sepharose, 1. Lauf). Proteinabsorption bei 280 nm (gelb), bei 420 nm (violett), bei 540 nm (schwarz gepunktet), NaCl-Gradient (grün), Leitfähigkeit (blau), AaeAPO - Aktivität (rot gestrichelt)

Die Kurve der AaeAPO - Aktivität bildet einen Peak zwischen 301 ml und 385 ml des eluierten Laufmittels, der mit einem Anstieg der Absorption bei 280 nm (Gesamtprotein), 420 nm (Soret- Bande) sowie 540 nm (Häm) verbunden war. Fraktionen, die AaeAPO -Aktivität enthielten, wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (10 kDa cut-off-Membran) in einer Rührzelle dialysiert (10 mM NaAc-Puffer, pH=6) und auf ein Endvolumen von ca. 11 ml eingeengt. Im letzten Reinigungsschritt erfolgte die Abtrennung des Zielproteins von noch vorhandenen Fremdproteinen mit Hilfe der FPLC an einer Anionenaustauschersäule Mono Q 10 x 100 GL. Die Probe wurde zuerst zentrifugiert und der Überstand mit 10 mM NaAc Puffer auf ca. 40 ml aufgefüllt. Sie wurde wieder in 2 Portionen (2187 U, 2000 U) auf die Säule geladen und mittels eines 30 %-igen Salzgradienten (Eluent A: 10 mM NaAc-Puffer pH=6,5; Eluent B: 10 mM NaAc-Puffer pH=6,5 mit 2 M NaCl) chromatographiert.

Anhang

3500 60

3000 50

2500 40 [100 U/l] [100 [mS/cm] [mS/cm]

[mAU] [mAU] 2000 [%B] [%B] 30 tion 1500 sorp

20 Gradient

Ab 1000 Leitfähigkeit Leitfähigkeit Enzymaktivität Enzymaktivität 500 10

0 0 0 50 100 150 200 Elutionsvolumen [ml]

Abbildung 3: FPLC-Elutionsprofil der AaeAPO von A. aegerita an einer MonoQ-Säule, 2. Lauf). Proteinabsorption bei 280 nm (gelb), bei 420 nm (violett), bei 540 nm (schwarz gepunktet), NaCl-Gradient (grün), Leitfähigkeit (blau), AaeAPO - Aktivität (rot gestrichelt).

Die Kurve der AaeAPO Aktivität bildete einen Peak zwischen 78 ml und 87 ml des eluierten Laufmittels, der mit einem Anstieg der Absorption bei 280 nm (Gesamtprotein), 420 nm (Soret- Bande) sowie 540 nm (Häm) verbunden war. Fraktionen, die AaeAPO -Aktivität enthielten sowie frei von anderen Proteinen (Verunreinigungen) waren, wurden vereinigt und mittels Ultrafiltration (10 kDa cut-off-Membran) in einer Rührzelle dialysiert (10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH=6,5) sowie auf Endvolumen von ca. 6 ml eingeengt. Die Rührzelle wurde mit Puffer gespült und die Enzymlösung sterilfiltriert (Endvolumen ca. 11 ml).

Die spezifische Aktivität des Enzyms betrug nach der Reinigung 62 U/mg. Das gereinigte und konzentrierte Enzym zeigte eine charakteristische rot-braune Farbe, die auf die prosthetische Gruppe (Häm-Thiolat) des Enzyms zurückzuführen ist. Die gesamte Reinigungsprozedur führte zu einem Aktivitätsverlust des Enzyms von ungefähr 33 %.

Anhang

Tabelle: Reinigung der extrazellulären AaeAPO von A. aegerita Reinigungsschritt Protein- Volumen- Aktivität Spezifische Reinigungsfaktor Volumen konzentration aktivität [U] Aktivität [ml] [μg/ml] [U/ml] [U/mg] Rohextrakt nach 234 0,781 4600 3 5890 Zentrifugieren Ultrafiltration 1 1359 3,095 2105 2 1 680 Ultrafiltration 2 3235 5,110 2351 2 460 Zentrifugieren 758 3,588 6300 5 2 1800 1+2 SP Sepharose 1 539 29,166 2655 54 24 91 SP Sepharose 2 494 21,925 1535 44 19 70 Rührzelle (eingeengt, 8270 380,670 4187 46 20 11 dialysiert) MonoQ 1722 116,230 4184 67 30 36 Gereinigtes Enzym 6150 381,800 4200 62 27 11 (sterilfiltriert)

Anhang

Anhang E: Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon

Da 4',6-Dihydroxyflavanon nicht käuflich erhältlich ist, aber als Standard für HPLC benötigt wurde, erfolgte im Rahmen der Dissertation die chemische Synthese von 4',6-Dihydroxyflavanon nach der zweistufigen Chalconmethode [Deodhar et al., 2007]. Die Synthese wurde unter Mikrowellenbedingungen durchgeführt. Die ' Produkte wurden mittels HPLC/MS und NMR auf Identität und Reinheit überprüft.

1) Synthese von 4,2',5'-Trihydroxychalcon

O CHO O OH OH + OH OH OH OH 2',5'-Dihydroxy- 4-Hydroxy- 4,2',5'-Trihydroxychalcon acetophenon benzaldehyd

4,5 mmol 2',5'-Dihydroxyacetophenon und 4,6 mmol 4-Hydroxybenzaldehyd werden in 0,6 ml Ethanol gelöst. Unter Rühren tropft man bei Raumtemperatur 4 ml 60% wässrige Kaliumhydroxidlösung (w/w) zu. Das Reaktionsgemisch wird anschließend der Mikrowellenstrahlung mit folgendem Temperaturprogramm ausgesetzt: Reaktionsmischung auf 100 °C erhitzen (1 min), diese Temperatur 9 Minuten halten und danach folgt eine 10 minütige Abkühlphase. Zur Aufarbeitung gibt man das Reaktionsmischung auf Eiswasser, säuert mit Salzsäure auf pH 5 an und extrahiert das Produkt mit Essigester. Die Produktreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Kieselgel / 70:30 (v/v) Essigester / Petrolether) oder durch Umkristallisation aus 60 %-igem Ethanol (v/v). 42 % Ausbeute (90 % Reinheit).

Die analytischen Daten (NMR, ESI/MS) stimmen mit den Literaturangaben überein. 1 H-NMR (Aceton-d6, 199.9850805 MHz): δ = 6.82-7.13 (m, 4H, Aromaten H), 7.59-8.08 (m, 5H, Aromaten H + CH=CH), 9.03 (s, 1H, -OH), 12.01 (s, 1H, -OH), 12.45 (s, 1H, -OH) 13 C-NMR (Aceton-d6, 50.2863091 MHz): δ = 115.5, 116.9, 118.2, 119.4, 120.8, 125.5, 127.5, 132.0, 146.4, 150.1, 157.9, 161.3, 194.5 HRMS (ESI) m/z = 256 (M+H+).

Anhang

2) Cyclisierung von 4,2',5'-Trihydroxychalcon

O O OH OH

OH O OH OH 4,2',5'-Trihydroxychalcon 4',6-Dihydroxyflavanon

0,86 mmol 4,2',5'-Trihydroxychalcon wurden in 11 ml Methanol gelöst, mit 1,8 ml konz. HCl angesäuert und 48 Stunden unter Rückfluss gekocht. Anschließend wurde das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Wasser versetzt. Das Produkt wurde abgesaugt, getrocknet und aus 90 %-igem Ethanol umkristallisiert. 21 % Ausbeute (Reinheit 88 %).

Die analytischen Daten (NMR, ESI/MS) stimmen mit den Literaturangaben überein. 1 3 H-NMR (Aceton-d6, 199.9850805 MHz): δ = 2.68-3.15 (m, 2H, Ring C), 5.41 (d, J = 13,6 Hz, 1H), 6.88-7.42 (m, 6H, Aromaten H, Ring A, B), 8.28 (s, 1H, Aromaten H, Ring A), 8.46 (s, 1H, -OH), 12.00 (s, 1H, -OH); 13 C-NMR (Aceton-d6, 50.2863091 MHz): δ = 44.9, 80.1, 111.1, 116.0, 119.6, 121.9, 125.0, 128.6, 131.0, 152.3, 156.0, 158.3, 192.3 HRMS (ESI) m/z = 256 (M+H+).

Anhang

Anhang F: Wirkung der polyphenolischen Phytoextrakte auf die Enzymproduktion (Abbildungen)

1) Agrocybe aegerita

2000 Kulturtag 7 Kulturtag 9 Kulturtag 11 1800 Kulturtag 14 Kulturtag 15 Kulturtag 17 1600 Kulturtag 21 Kulturtag 23 Kulturtag 24 1400 Kulturtag 28 Kulturtag 30 Kulturtag 32 Kulturtag 35 Kulturtag 37 Kulturtag 39 1200 Kulturtag 42 Kulturtag 44 Kulturtag 46 1000 Kulturtag 49 800

APO Aktivität [U/l] Aktivität APO 600 400 Aae 200 0 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C 6A 6B 6C Proben

Abbildung 1: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)

10000 Kulturtag 7 Kulturtag 9 Kulturtag 11 9000 Kulturtag 14 Kulturtag 15 Kulturtag 17 8000 Kulturtag 21 Kulturtag 23 Kulturtag 24 7000 Kulturtag 28 Kulturtag 30 Kulturtag 32 Kulturtag 35 Kulturtag 37 Kulturtag 39 6000 Kulturtag 42 Kulturtag 44 Kulturtag 46 5000 Kulturtag 49 4000 3000 Lacc Aktivität [U/l] Aktivität Lacc 2000 1000 0 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C 6A 6B 6C Proben

Abbildung 2: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)

Anhang

Kulturtag 7 1400 Kulturtag 9

] Kulturtag 12 1200 Kulturtag 14 Kulturtag 16 1000 Kulturtag 19 Kulturtag 21 Kulturtag 23 800 Kulturtag 26 Kulturtag 28 600 Kulturtag 30 Kulturtag 33 400

APO Aktivität [U/l Aktivität APO Kulturtag 35 Kulturtag 37 200 Kulturtag 40 Aae Kulturtag 42 0 Kulturtag 44 Kulturtag 47 1A 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B Kulturtag 50 Kulturtag 54 Proben Kulturtag 56

Abbildung 3: AaeAPO -Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)

Kulturtag 7 1400 Kulturtag 9 Kulturtag 12 1200 Kulturtag 14 Kulturtag 16 1000 Kulturtag 19 Kulturtag 21 800 Kulturtag 23 Kulturtag 26 600 Kulturtag 28 Kulturtag 30 Kulturtag 33 400 Kulturtag 35

Lacc Aktivität [U/l] Aktivität Lacc Kulturtag 37 200 Kulturtag 40 Kulturtag 42 0 Kulturtag 44 Kulturtag 47 1A 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B Kulturtag 50 Proben Kulturtag 54 Kulturtag 56

Abbildung 4: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)

Anhang

Kulturtag 11 2000 Kulturtag 13 1800 Kulturtag 14

] Kulturtag 17 1600 Kulturtag 19 1400 Kulturtag 21 Kulturtag 24 1200 Kulturtag 26 1000 Kulturtag 28 Kulturtag 31 800 Kulturtag 33

APO Aktivität [U/l 600 Kulturtag 35 400 Kulturtag 39 Aae Kulturtag 40 200 Kulturtag 42 0 Kulturtag 45 Kulturtag 47 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Kulturtag 49 Proben

Abbildung 5: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten)

Kulturtag 11 3000 Kulturtag 13 Kulturtag 14 2500 Kulturtag 17 Kulturtag 19 2000 Kulturtag 21 Kulturtag 24 Kulturtag 26 1500 Kulturtag 28 Kulturtag 31 1000 Kulturtag 33

Lacc Aktivität [U/l] Kulturtag 35 500 Kulturtag 39 Kulturtag 40 0 Kulturtag 42 Kulturtag 45 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Kulturtag 47 Proben Kulturtag 49

Abbildung 6: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten) (Die Proben 3A, 4C und 5A gehören zu den Ausreisern aufgrund des Bakterienbefalls am 24. Kulturtag.)

Anhang

2000 Kulturtag 12 Kulturtag 14 1800 Kulturtag 16 1600 Kulturtag 19 1400 Kulturtag 21 Kulturtag 23 1200 Kulturtag 26 1000 Kulturtag 28 800 Kulturtag 30 Kulturtag 33

APO Aktivität [U/l] 600 Kulturtag 35 400 Kulturtag 37 Aae Kulturtag 42 200 Kulturtag 44 0 Kulturtag 47 1A 1B 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Proben

Abbildung 7: AaeAPO-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen-Extrakten)

20000 Kulturtag 12 Kulturtag 14 18000 Kulturtag 16 16000 Kulturtag 19 14000 Kulturtag 21 Kulturtag 23 12000 Kulturtag 26 10000 Kulturtag 28 Kulturtag 30 8000 Kulturtag 33 6000 Kulturtag 35 Lacc Aktivität [U/l] 4000 Kulturtag 37 Kulturtag 42 2000 Kulturtag 44 0 Kulturtag 47 1A 1B 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Proben

Abbildung 8: Laccase-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen -Extrakten)

Anhang

2) Bjerkandera adusta

1600 Kulturtag 8 1400 Kulturtag 11 1200 Kulturtag 12 1000 Kulturtag 14 800 Kulturtag 18 600 Kulturtag 21 Kulturtag 25 400 Kulturtag 28 MnP Aktivität [U/l] 200 Kulturtag 32 0 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Proben

Abbildung 9: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Aronia-Extrakten)

1600 Kulturtag 13 1400 Kulturtag 17 1200 Kulturtag 20 1000 Kulturtag 21 800 Kulturtag 23 600 Kulturtag 24 Kulturtag 26 400 Kulturtag 30 MnP Aktivität [U/l] 200 Kulturtag 34 0 1A 1B 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B Proben

Abbildung 10: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Fragaria-Extrakten)

1400 Kulturtag 10 1200 Kulturtag 12 1000 Kulturtag 14 Kulturtag 17 800 Kulturtag 19 Kulturtag 21 600 Kulturtag 24 Kulturtag 26 400 Kulturtag 28 Kulturtag 31 MnP Aktivität [U/l] 200 Kulturtag 33 0 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C C Proben

Abbildung 11: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Trifolium-Extrakten)

Anhang

2500 Kulturtag 6 Kulturtag 13 Kulturtag 19 2000 Kulturtag 22 Kulturtag 25 Kulturtag 27 Kulturtag 29 1500 Kulturtag 32 Kulturtag 34 Kulturtag 36 1000 Kulturtag 39 Kulturtag 41 Kulturtag 43 MnP Aktivität [U/l] MnP Kulturtag 46 500 Kulturtag 48 Kulturtag 51 Kulturtag 53 Kulturtag 55 0 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Proben

Abbildung 12: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Gänseblümchen-Extrakten)

1200 Kulturtag 6 Kulturtag 13 Kulturtag 19 1000 Kulturtag 22 Kulturtag 25 Kulturtag 27 800 Kulturtag 29 Kulturtag 32 Kulturtag 34 600 Kulturtag 36 Kulturtag 39 Kulturtag 41 400 Kulturtag 43

MnP Aktivität [U/l] Aktivität MnP Kulturtag 46 Kulturtag 48 200 Kulturtag 51 Kulturtag 53 0 Kulturtag 55 1A 1B 1C 2A 2B 2C 3A 3B 3C 4A 4B 4C 5A 5B 5C Proben

Abbildung 13: MnP-Aktivität nach Kulturtagen (Ansatz mit Ethanol) (Die Probe 5A stellt einen Ausreisser dar.)

Danksagung

Danksagung

Die vorliegende Dissertation wurde am Internationalen Hochschulinstitut Zittau und an der Hochschule Zittau/Görlitz (FH) durchgeführt. Die Untersuchungen wurden sowohl in Laboren der Biochemie, der Organischen Chemie und der Molekülspektroskopie an der Hochschule Zittau/Görlitz (FH) als auch in Laboren des IHI Zittau gemacht. Frau Prof. Dr. rer. nat. Annett Fuchs, Herrn Univ.- Prof. Dr. rer. nat. habil. Martin Hofrichter und Herrn Prof. Dr. rer. nat. habil. Dieter Greif danke ich für die perfekte Betreuung, zahlreiche interessante Diskussionen und Anregungen sowie für die sprachliche Korrektur der Dissertation. Mein Dank gehört ebenfalls Herrn Dr. rer. nat. René Ullrich für die Aufsicht bei der AaeAPO- Gewinnung und Reinigung. Herrn Dr. rer. nat. Matthias Kinne danke ich für die Einführung in die HPLC-MS, ins Hantieren mit den Enzymen, in den graphischen Programm Grapher 6 sowie für fruchtbare Diskussionen. Herrn Dr. Lothar Hennig aus Leipzig gehört mein Dank für die Aufnahme der NMR-Spektren in hoher Auflösung sowie mit den 2D-NMR-Techniken. Für die freundliche Begleitung bei PCR-Versuchen bedanke ich mich bei Frau Dipl.-Ing. Britta Bittner und Herrn Dipl.-Biol. Marek Pecyna. Bei Monika Brandt, Ulrike Schneider, Heike Heidenreich, Gerlinde Liepelt, Dipl.-Ing. Sebastian Peter, Dipl.-Ing. Marzena Poraj-Kobielska und dem ganzen IHI-Team möchte ich mich für ihre Hilfsbereitschaft, Freundlichkeit sowie Geduld bedanken. Frau Evelin Bürger, Frau Corina Lorenz, Herrn Prof. Ramm sowie allen anderen Mitarbeitern und Lehrkräften der Hochschule Zittau/Görlitz (FH) danke ich für die freundliche Hilfsbereitschaft.

Der Deutschen Bundesstiftung Umwelt danke ich für die finanzielle Unterstützung meines Dissertationsprojektes - namentlich danke ich der Frau Dr. Hedda Schlegel-Starmann für ihre Geduld.

Nicht zuletzt bedanke ich mich bei meinem Mann für seine Toleranz und der ganzen Familie, die mit der Betreuung meiner kleinen Tochter Andrea mitgeholfen hat.

Versicherung an Eides statt

Versicherung an Eides statt

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich keine Unterstützungsleistungen erhalten.

Weitere Personen waren an der Abfassung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Die Hilfe eines Promotionsberaters habe ich nicht in Anspruch genommen. Weitere Personen haben von mir keine geldwerten Leistungen für Arbeit erhalten, die nicht als solche kenntlich gemacht worden sind.

Die Arbeit wurde bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.

Zittau, den 14. Dezember 2012 Kateřina Barková

Thesen

Thesen zur Promotion „Enzymatische Transformation verschiedener Flavonoide durch das extrazelluläre Pilzenzym Agrocybe-aegerita-Peroxygenase“ von Diplom-Chemikerin (FH) Kateřina Barková (eingereicht am 14. Dezember 2012)

1) Die pilzliche Peroxygenase AaeAPO aus Agrocybe aegerita verfügt insgesamt über ein sehr breites Substratspektrum bezüglich der Flavonoide. Von den untersuchten Standardsubstanzen (Flavone – Acacetin, Amentoflavon, Apigenin, Apigenintrimethylether, Baicalein, Baicalein 7-Methylether, Chrysin, Chrysindimethylether, Flavon, 5-, 6-, 7-Hydroxyflavon, 6,7-Dihydroxyflavon, 6,2´-Dihydroxyflavon, 6,4´- Dihydroxyflavon, Luteolin, 5-Methoxyflavon, 4´-Methoxyflavon, 6-Methoxyluteolin, Tangeretin, Tectochrysin ; Isoflavone – Biochanin A, Daidzein, Demethyltexasin, Formononetin, Genistein, Genistein-7, 4´-dimethylether, Glycitein, 5-Methyl-7- Methoxyisoflavon; Flavanone –Eriodictyol, Flavanon, Hesperetin, 6-, 7-, 2`-, 3`-, 4`- Hydroxyflavanon, 6,4´-Dihydroxyflavanon, Isosakuranetin, 5-, 6-, 4´-Methoxyflavanon, Naringenin, Pinocembrin; Flavonole – 3-Hydroxyflavon, 3,6-Dihydroxyflavon, Isorhamnetin, Kämpferol, Myricetin, Quercetagetin, Quercetin, Quercetinpentamethylether; Flavonoidmonoglykoside - Apigetrin, Genistin, Naringenin 7-O-glukosid, Orientin; Flavonoldiglykosid – Rutin) konnten mit Ausnahme des Diglykosids Rutin, des Dimeres Amentoflavon, des 3-Hydroxyflavons und der nachfolgenden Verbindungen mit der besetzten C6-Position (Baicalein, Baicalein-7-Methylether, Demethyltexasin, 6,7- Dihydroxyflavon, 6-Methoxyluteolin, Quercetagetin) alle Verbindungen umgesetzt werden. 2) Die Flavonoide werden mittels AaeAPO regioselektiv in 6-Position hydroxyliert. 3) Der Reaktionsmechanismus der AaeAPO läuft bei Flavonoiden über eine Epoxidstufe ab. 4) Der eingefügte Sauerstoff bei Hydroxylierungen entstammt dem Wasserstoffperoxid (Hinweis auf eine echte Peroxygenase-Reaktion). 5) Die AaeAPO ist in der Lage, Flavonoide zu demethylieren (Apigenin-5,7,4`- trimethylether, Biochanin A, Formononetin, Genistein-7,4`-dimethylether, Glycitein, Isosakuranetin, 5-Methoxyflavanon, 6-Methoxyflavanon, 4`-Methoxyflavanon, , 4`- Methoxyflavon, Quercetinpentamethylether, Tangeretin, Tectochrysin).

Thesen

6) Es ist möglich, ein scale-up (≥ 5 mg) in der enzymatischen Synthese durch semikontinuierliche Versuchsführung zu realisieren. (nachgewiesen für Apigenin-, Luteolin-, 6-Hydroxyflavon-, 7-Hydroxyflavanon- bzw. 7-Hydroxyflavonderivat) 7) Die Enzymproduktion der Agrocybe aegerita wird durch den Extraktzusatz (aus jeweils Aronia melanocarpa, Fragaria ananassa, Trifolium pratense und Bellis perennis) im Fall der Laccase stimuliert. Die AaeAPO -Aktivität wird dagegen gehemmt. 8) Für Bjerkandera adusta kann eine moderate Stimulierung der MnP-Bildung nach der Extraktzugabe beobachtet werden. 9) Die Zugabe von Ethanol bewirkte, dass die Laccase-Produktion in Agrocybe aegerita stimuliert, die AaeAPO-Aktivität dagegen gehemmt wurde (betrachte Ausnahmefälle). Im Gegensatz dazu beeinflusste es die Produktion der Mangan-Peroxidase nur geringfügig. 10) Die stimulierende bzw. hemmende Wirkung auf die Enzymproduktion ist bei der Agrocybe aegerita sowohl auf Flavonoide als auch auf Ethanol zurückzuführen.