Ministério Da Educação Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Pró-Reitoria De Pós-Graduação

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO

UNIDADE ACADÊMICA ESPECIALIZADA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS - UECIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FLORESTAIS

DISSERTAÇÃO

MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO

JÉSSICA RITCHELE MOURA DOS SANTOS

Macaíba-RN 2017 2

JÉSSICA RITCHELE MOURA DOS SANTOS

MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO E DIVERSIDADE GENÉTICA DE Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICAÇÕES PARA A CONSERVAÇÃO

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós -Graduação em Ciências Florestais da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como pré-requisito para obtenção do título de Mestre.

Orientador: Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira

Macaíba-RN 2017

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial da Escola Agrícola Jundiaí - EAJ

Santos, Jéssica Ritchele Moura dos. Modelagem de nicho ecológico e diversidade genética de Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (Arecaceae): implicações para a conservação / Jéssica Ritchele Moura dos Santos. - Macaíba/RN, 2017. 56f.: il.

Dissertação (Mestre) Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias Campus Macaíba, Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais. Orientador: Prof. Dr. Fábio de Almeida Vieira.

1. Carnaúba - Dissertação. 2. Gargalo genético - Dissertação. 3. ISSR - Dissertação. 4. Predição de habitat - Dissertação. I. Vieira, Fábio de Almeida. II. Título.

RN/UF/BSPRH CDU 633.9

DEDICO

A minha avó, Maria Araújo de Moura - In Memoriam

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela oportunidade de iniciar e concluir o mestrado e por me guiar em todos os momentos da minha vida.

Aos meus pais Marilene e Sérgio, e ao meu irmão Jefferson pelo incentivo e por acreditarem em mim.

Aos meus avós, Antônio e Conceição (in memoriam), Roselita e Zequinha, por construírem a base da minha família.

A todos os familiares que acompanharam minha caminhada e que torceram por minha vitória.

Ao meu orientador, professor Dr. Fábio de Almeida Vieira, pela paciência e atenção.

A professora Drª Cristiane, pelo apoio em minha graduação e mestrado.

Aos meus queridos amigos, Anny e Richeliel por toda amizade e companheirismo em mais uma etapa da minha formação.

A todos os amigos do Laboratório de Genética e Melhoramento Florestal (LabGeM) – UAECIA/UFRN por me acolher e proporcionar bons momentos de aprendizado e descontração.

E a todos que de forma direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.

Meus sinceros agradecimentos!

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO ...... 10 RESUMO...... 11 ABSTRACT ...... 12 INTRODUÇÃO ...... 13 REFERÊNCIAS ...... 14 Capítulo 1: DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA PALMEIRA Copernicia prunifera (Miller) H. E. Moore COM BASE EM MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO ...... 16 RESUMO...... 16 ABSTRACT ...... 16 INTRODUÇÃO ...... 17 MATERIAL E MÉTODOS ...... 19 RESULTADOS E DISCUSSÃO...... 20 CONCLUSÕES ...... 22 AGRADECIMENTOS ...... 22 REFERÊNCIAS...... 23 ANEXO I...... 27 Capítulo 2: GENETIC DIVERSITY OF Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICATIONS FOR CONSERVATION…………………….…...... 30 ABSTRACT...... 30 INTRODUCTION………………………………………………………………………………..30 MATERIAL AND METHODS……………………………………………………….…...... 32 RESULTS………………………………………………………………………………………...37 DISCUSSION…………………………………………...……………………………………...... 45 IMPLICATIONS FOR CONSERVATION……………………………………………………...48 ACKNOWLEDGMENTS…………………………………………………………………...... 49 REFERENCES…………………………………………………………………………………...49 CONCLUSÕES ...... 56

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO 1: Figura 1. Representação da adequabilidade do habitat de Copernicia prunifera no Brasil com base em Maxent. Cores quentes (amarelo ao vermelho) representam valores maiores de probabilidade e cores frias (verde a azul) menores valores de probabilidade de potencial de ocorrência do nicho ecológico da espécie. Quadros brancos representam os registros de presença usados para treinamento e quadros roxos para testes...... 21

CAPÍTULO 2: Figure 1. Geographic location of the sampled populations of Copernicia prunifera in Rio Grande do Norte and Ceará States, Brazil……………………………………………...…………………33

Figure 2. Pattern of ISSR amplification fragments resulting from UBC primer 857 for 12 Copernicia prunifera individuals from the Apodi population, Rio Grande do Norte. L = Ladder 1 kb...... 37

Figure 3. Relationship between the genetic and geographic distances between Copernicia prunifera populations…...... 40

Figure 4. UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic identity between the 11 studied Copernicia prunifera populations……...... 41

Figure 5. Principal component analysis of the studied Copernicia prunifera populations, based on Nei’s genetic distance……...... 42

Figure 6. Plot of the mean values of LnP (D) of the Bayesian analysis (solid line) and ΔK analysis (dotted line). The bars indicate standard deviations of LnP (D) values...... 43

Figure 7. Bayesian analysis of Copernicia prunifera with the proportion of genotypes in the sampled populations. The dark vertical lines delimit populations...... 43 9

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO 1: Tabela 1. Variáveis utilizadas na modelação da área de distribuição potencial de Copernicia prunifera e sua contribuição percentual utilizadas na construção do modelo com Maxent. Fonte: WorldClim (2016) ...... 26

CAPÍTULO 2: Table 1. Location of sampled Copernicia prunifera populations, population code, geographic coordinates, number of individuals, and region of occurrence. RN - Rio Grande do Norte; CE – Ceará……...... 34

Table 2. Nucleotide sequence of ISSR primers, number of loci, and PIC value of each primer...37

Table 3. Genetic diversity parameters of Copernicia prunifera natural populations………...….38

Table 4. Estimates of genetic distance (Nei, 1978) below the diagonal, and geographic distance (km) above the diagonal, between populations of Copernicia prunifera. Minimum and maximum values are shown in bold...... 39

Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) between and within Copernicia prunifera populations……………………………...... 39

Table 6. Matrix of historical gene flow values among pairs of Copernicia prunifera populations. Minimum and maximum values are shown in bold...... 41

Table 7. Tests of equilibrium between mutation and genetic drift for the studied Copernicia prunifera populations based on IAM and SMM models………………..………………………..44

APRESENTAÇÃO

A presente dissertação está organizada em dois capítulos constituídos de artigos elaborados a partir de estudos realizados com a espécie Copernicia prunifera (Miller) H. E Moore. O primeiro capítulo “Distribuição geográfica da palmeira Copernicia prunifera com base em modelagem de nicho ecológico” tem como objetivo estudar a distribuição geográfica de Copernicia prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição, usando como ferramenta a modelagem de nicho ecológico. Foi submetido a revista Pesquisa Agropecuária Brasileira. O segundo capítulo se refere ao artigo “Genetic diversity of Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (Arecaceae): implications for conservation” e objetivou analisar a diversidade genética entre populações naturais de Copernicia prunifera. Será submetido ao periódico Biodiversity and Conservation.

RESUMO Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore é uma palmeira nativa do nordeste do Brasil, possui múltiplas formas de uso, sendo seu principal produto o pó cerífero. Devido ao extrativismo realizado ao longo dos anos nas populações naturais da espécie, estudos sobre a distribuição geográfica e diversidade genética de suas populações são cada vez mais necessários. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivos estudar a distribuição geográfica de Copernicia prunifera como base em modelagem de nicho ecológico (MNE) e analisar a diversidade genética entre populações naturais da espécie. Os modelos de nicho ecológico foram construídos baseados em 80 pontos de ocorrência da espécie e em 19 variáveis ambientais. Os resultados gerados sugerem que o modelo de distribuição potencial da Copernicia prunifera se concentrou nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, sudoeste de Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São Francisco, norte e sudoeste do Piauí e norte do Maranhão. A variável ambiental que mais contribuiu com a MNE foi a precipitação do trimestre mais seco. No estudo de diversidade genética foram amostrados 180 indivíduos distribuídos em 11 populações naturais nos estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Sete iniciadores ISSR foram utilizados e forneceram 100 locos com 99,09% de polimorfismo. O Conteúdo de informação polimórfica (PIC) de cada iniciador foi considerado mediamente informativo. A diversidade genética de Nei (He) variou de 0,071 a 0,288 e o Índice de Shannon (I) de 0,103 a 0,418. A AMOVA indicou maior variação genética entre indivíduos dentro das populações (58,11%) do que entre as populações (41,89%). O teste de Mantel revelou correlação positiva e significativa (r = 0,423; P = 0,006) entre as distâncias genéticas e geográficas, sugerindo isolamento pela distância. O maior valor de fluxo gênico ocorreu entre as populações de AR1 e AR2 (Nm = 29), assim como a maior semelhança genética. A análise bayesiana revelou que os genótipos foram divididos em três grupos distintos (K=3). A maioria das populações apresentaram gargalo genético populacionais. Os resultados obtidos sugerem que as populações de Copernicia prunifera estão perdendo sua diversidade genética, sendo necessárias medidas de conservação de suas populações a fim de minimizar a perda de alelos importantes, contribuindo para manutenção da espécie.

Palavras-chave: Carnaúba; Gargalo genético; ISSR; Predição de habitat.

ABSTRACT Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore is a native palm tree from northeastern Brazil, it has multiple forms of use, its main product being the ceriferous powder. Due to the extractivism carried out over the years in the natural populations of the species, studies on the geographical distribution and genetic diversity of their populations are increasingly necessary. The present study aimed to study the geographic distribution of Copernicia prunifera as a basis in ecological niche modeling (MNE) and to analyze the genetic diversity among natural populations of the species. The ecological niche models were constructed based on 80 species occurrence points and on 19 environmental variables. The results suggest that the potential distribution model of Copernicia prunifera was concentrated in the states of Ceará, Rio Grande do Norte, southwest of Pernambuco, north of Bahia and the valley of the São Francisco River, north and southwest of Piauí and north of Maranhão. The environmental variable that contributed most to the MNE was the rainfall of the driest quarter. In the study of genetic diversity 180 individuals were sampled in 11 natural populations in the states of Rio Grande do Norte and Ceará. Seven ISSR primers were used and provided 100 locus with 99.09% polymorphism. The Polymorphic Information Content (PIC) of each primer was considered to be medium to informative. The genetic diversity of Nei (He) ranged from 0.071 to 0.288 and the Shannon Index (I) ranged from 0.103 to 0.418. AMOVA indicated greater genetic variation among individuals within populations (58.11%) than among populations (41.89%). The Mantel test revealed a positive and significant correlation (r = 0.423; P = 0.006) between the genetic and geographic distances, suggesting isolation by distance. The highest value of gene flow occurred among the populations of AR1 and AR2 (Nm = 29), as well as the greatest genetic similarity. Bayesian analysis revealed that the genotypes were divided into three distinct groups (K = 3). Most populations presented genetic bottleneck populations. Most populations presented genetic bottleneck populations. The results suggest that the populations of Copernicia prunifera are losing their genetic diversity, being necessary measures of conservation of their populations in order to minimize the loss of important alleles, contributing to the maintenance of the species.

Key words: Carnauba; Bottleneck; Habitat prediction; ISSR.

INTRODUÇÃO

A palmeira Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore é uma espécie nativa do Nordeste do Brasil, pertencente à família Arecaceae. Conhecida popularmente por carnaúba, pode ser encontrada principalmente nos estados do Piauí, Ceará e Rio Grande do Norte. A espécie é conhecida como árvore da vida, pois oferece ao homem uma infinidade de usos dos produtos dela extraídos, com produtos bem aceitos no mercado e valor econômico agregado (GOMES et al., 2009). As práticas extrativistas da espécie vêm mantendo a várias décadas grande importância econômica no Nordeste brasileiro, principalmente em períodos de estiagem com o corte das folhas dos carnaubais. A extensa exploração das populações naturais de Copernicia prunifera pode ocasionar fragmentação florestal que resulta na redução da diversidade genética (CARDOSO et al., 2000). Ademais, as práticas extrativistas de forma desordenada favorecem a redução do tamanho efetivo populacional, compromete a taxa de cruzamento entre os indivíduos e o comportamento dos dispersores e polinizadores afetando a estrutura genética das populações, assim, contribuindo com o aumento dos níveis de endogamia e na redução da heterozigosidade (YOUNG et al., 1996). De fato, segundo Vieira et al. (2016), a extração mensal das folhas imaturas da Coperncia prunifera a 50% e 75%, ocasionou a redução da produção de folhas, flores, frutos e sementes, assim, tais autores sugerem que a taxa de extração mensal das folhas não exceda 25% e que haja um pousio preferencialmente durante o período de maturação dos frutos, para minimizar os danos no desenvolvimento da espécie. Para se compreender como a diversidade genética é distribuída estudos de diversidade e estrutura genética são necessários (NYBOM; BARTISH, 2000) aliado aos marcadores moleculares que podem ser utilizados como ferramentas para avaliar a diversidade genética entre indivíduos (CHAGAS et al., 2015) e dentro e entre populações (SANTOS et al., 2015). Com isso, conhecer a diversidade genética de populações naturais é importante na geração de informações úteis para definir estratégias de conservação e manejo das espécies (DUARTE et al., 2015). Além disso, conhecer a distribuição geográfica de uma espécie é também fundamental para elaboração de programas de conservação. Para isso, estudos de modelagem de nicho ecológico são amplamente utilizados para estimar a relação entre as espécies e seus locais de ocorrência, predizendo áreas que uma espécie pode potencialmente se estabelecer (ELITH et al., 2011). Para tais estudos o software Maxent tem sido bastante empregado, necessitando apenas 14

dados de presença da espécie e de variáveis ambientais para gerar modelos de nicho ecológico e tem frequentemente demonstrado melhor desempenho que outros algoritmos (ELITH et al., 2006; PHILLIPS et al., 2006; PETERSON et al., 2007). Neste contexto, o trabalho teve como objetivos: • Estudar a distribuição geográfica de Copernicia prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição; • Analisar a diversidade genética entre populações naturais de Copernicia prunifera. • Verificar se há correlação entre distância genética e distância geográfica nas populações amostradas; • Estimar o fluxo gênico histórico entre as populações de Copernicia prunifera; • Avaliar a similaridade genética entre as populações estudadas; • Observar a ocorrência de possíveis gargalos genéticos populacionais; • Definir populações prioritárias para conservação.

REFERÊNCIAS CARDOSO, S. R. S.; ELOY, N. B.; PROVAN, J.; CARDOSO, M. A.; FERREIRA, P. C. G. Genetic differentiation of Euterpe edulis Mart. populations estimated by AFLP analysis. Molecular Ecology, n. 9, p. 1753–1760, 2000.

CHAGAS, K. P. T.; SOUSA, R. F.; FAJARDO, C. G.; VIEIRA, F. A. Seleção de marcadores ISSR e diversidade genética em uma população de Elaeis guineenses. Agrária, v.10, n.1, p.147- 152, 2015.

DUARTE, J. F.; CARVALHO, D.; VIEIRA, F. A. Genetic conservation of Ficus bonijesulapensis R.M. Castro in a dry forest on limestone outcrops. Biochemical Systematics and Ecology, v. 59, p. 54-62, 2015.

ELITH, J.; PHILLIPS, S. J.; HASTIE, T., DUDIK, M.; CHEE, Y.; YATES, C. J. A statistical explanation of MaxEnt for ecologists. Diversity and Distributions, n 17, p. 43–57. 2011.

PEREIRA, R.; SCHAPIRE, R.E.; SOBERÓN, J.; WILLIAMS, S.; WISZ, M.S.; ZIMMERMANN, N.E. Novel methods improve prediction of species distributions from occurrence data. Ecography, v. 29, p. 129-151, 2006.

GOMES, J.A.F.; LEITE, E.R.; CAVALCANTE, A.C.R.; CÂNDIDO, M.J.D.; LEMPP, B.; BOMFIM, M.A.D.; ROGÉRIO, M.C.P. Resíduo agroindustrial da carnaúba como fonte de volumoso para a terminação de ovinos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.44, n.1, p.58- 67, 2009.

NYBOM, H.; BARTISH, I. V. Effects of life history traits and sampling strategies on genetic diversity estimates obtained with RAPD markers in plants. Perspectives in Plant Ecology, Evolution and Systematics, Zurich, v. 3, n. 2, p. 93-114, 2000.

PETERSON, T.; PAPES, M.; EATON, M. Transferability and model evaluation in ecological niche modeling: a comparison of GARP and Maxent. Ecography, v. 30, p. 550-560. 2007.

PHILLIPS, S. J.; ANDERSON, R. P.; SCHAPIRE, R. E. Maximum entropy modeling of species geographic distributions. Ecological Modelling, v. 190, p. 231-259. 2006.

SANTOS, R. R. M.; CAVALLARI, M. M.; PIMENTA, M. A. S.; ABREU, A. G.; COSTA, M. R.; GUEDES, M. L. Population genetic structure of Attalea vitrivir Zona (Arecaceae) in fragmented areas of southeast Brazil. Genetics and Molecular Research, v.14, p. 6472-6481, 2015.

VIEIRA, I. R.; OLIVEIRA, J. S.; LOIOLA, M. I. B. Effects of harvesting on leaf production and reproductive performance of Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore. Revista Árvore, Viçosa-MG, v.40, n.1, p.117-123, 2016.

YOUNG, A.; BOYLE, T.; BROWN, T. The population genetic consequences of habitat fragmentation for plants. Trends Ecology Evolutionary, Oxford, v. 11, n. 10, p. 413-418, Oct. 1996.

CAPÍTULO 1: DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA DA PALMEIRA Copernicia prunifera COM BASE EM MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO

RESUMO – Estudos de modelagem de nicho ecológico são ferramentas importantes para prever áreas de potencial ocorrência para espécies, auxiliando programas de conservação. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi estudar a distribuição geográfica da palmeira Copernicia prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição. Através da modelagem de nicho ecológico (MNE) utilizando o algoritmo de máxima entropia (Maxent) com base em 80 pontos de ocorrência conhecidos, foram gerados mapas preditivos da distribuição potencial da espécie. A ocorrência potencial da Copernicia prunifera se concentrou nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, sudoeste de Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São Francisco, norte e sudoeste do Piauí e norte do Maranhão. A variável ambiental que mais contribuiu para o modelo foi a precipitação do trimestre mais seco. Este é o primeiro estudo utilizando a modelagem de nicho ecológico para prever a distribuição da Copernicia prunifera no Brasil. Tais informações serão úteis para estudos de filogeografia e distribuição geográfica, contribuindo com informações para o estabelecimento de estratégias de conservação da espécie.

PALAVRAS-CHAVE: Arecaceae, Caatinga, Carnaúba, Maxent, Predição de habitat.

GEOGRAPHICAL DISTRIBUTION OF THE PALM Copernicia prunifera BASED ON ECOLOGICAL NICHE MODELING

ABSTRACT – Ecological niche modeling studies are important tools for predicting areas of potential occurrence for species, supporting conservation programs. Thus, the objective of this work was to study the geographical distribution of the palm tree Copernicia prunifera known as carnauba and identify environmental variables that influence on their distribution. Through ecological niche modeling (MNE) using the Maximo entropy algorithm (Maxent) based on 80 known occurrence points, predictive maps of the potential distribution of the species were generated. The potential occurrence of Copernicia prunifera was concentrated in the states of Ceará, Rio Grande do Norte, southwest of Pernambuco, north of Bahia and the valley of the São Francisco River, north and southwest of Piauí and north of Maranhão. The environmental variable that contributed most to the model was the precipitation of the driest quarter. This is the 17

first study using ecological niche modeling to predict the distribution of Copernicia prunifera in Brazil. Such information will be useful for studies of phylogeography and geographic distribution, contributing with information for the establishment of conservation strategies of the species.

KEYWORDS: Arecaceae, Caatinga, Carnauba, Maxent, Habitat prediction.

INTRODUÇÃO O bioma Caatinga ocupa uma área de aproximadamente 844.453 km², que equivale a cerca de 11% do território brasileiro tornando-se presente nos estados do Maranhão (1%), Piauí (63%), Ceará (100%), Bahia (54%), Rio Grande do Norte (95%), Paraíba (92%), Pernambuco (83%), Alagoas (48%), Sergipe (49%) e o norte de Minas Gerais (2%) (MMA, 2011). Diante da escassez de água, as plantas que integram a Caatinga são xerófilas, espécies que se adaptam a essas condições (BARBOSA, 2009; MMA, 2011). A precipitação média anual varia entre 240 mm e 1.500 mm, no entanto, grande parte da região recebe menos de 500 mm (PRADO, 2003). A Caatinga possui um considerável número de espécies endêmicas que devem ser consideradas como um patrimônio biológico de alto valor (KILL, 2002). São escassos os estudos na Caatinga que relacionam a ocorrência de espécies florestais com o ambiente como o de Vieira et al. (2015) em estudo de filogeografia e modelagem de nicho com Ficus bonijesulapensis, uma espécie endêmica brasileira e restrita de afloramentos de rocha calcária, e o de Rodrigues et al. (2015) que avaliaram a modelagem de nicho ecológico para as espécies Anadenanthera colubrina, Aspidosperma pyrifolium e Myracrodruon urundeuva de florestas tropicais secas. Tais autores tiveram como resultados que as áreas mais adequadas para a ocorrência das espécies em estudo estão concentradas na região nordeste do Brasil. Para espécies como Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (Arecaceae), é importante conhecer a sua distribuição geográfica e compreender as condições ecológicas que influenciam na sua distribuição (PRIMACK; RODRIGUES, 2001). Silva et al. (2014), em estudo sobre distribuição espacial em microescala da Copernicia prunifera, concluíram que os indivíduos apresentam um padrão de distribuição espacial agregado até 10 metros que pode ser devido a dispersão restrita ao parental. Segundo os autores, por ser uma espécie bastante utilizada por extrativistas, foi observado uma diminuição na densidade populacional, sugerindo maior aleatoriedade entre indivíduos com distâncias maiores a 10 metros do indivíduo focal. Tais fatos 18

podem contribuir para a divergência genética entre populações da espécie, associando-se a fragmentação das populações, o que pode comprometer a distribuição geográfica da espécie. Entretanto não há estudos avaliando a distribuição geográfica de Copernicia prunifera em macro- escala espacial. A distribuição geográfica potencial de uma espécie se relaciona ao conceito de nicho ecológico proposto por Hutchinson (1957), no qual uma espécie pode ocorrer quando as condições ambientais e recursos necessários são adequados para sua sobrevivência. Assim, os modelos de nicho ecológico (MNE) são cada vez mais utilizados como ferramentas para prever a distribuição geográfica de espécies (PHILLIPS et al., 2006; ELITH et al., 2010). Tais modelos baseiam-se nas informações de ocorrências de espécies, como por exemplo de listas florísticas e de herbários, com dados de variáveis ambientais para identificar ambientes propícios para a ocorrência e manutenção das populações (PEARSON, 2007). Vários algoritmos têm sido utilizados para modelagem de nichos ecológicos, como GAM (Generalised Additive Models), GARP (Genetic Algorithm for Rule Set Production), GLM (Generalised Linear Models), ENFA (Ecological-Niche Factor Analysis), BIOCLIM (Bioclimatic variables) e Maxent (Maximum Entropy Modeling) (PHILLIPS et al., 2006). O modelo de Máxima Entropia (Maxent) tem sido bastante utilizado, por ser de simples manuseio e apresentar bom desempenho em relação aos outros (ELITH et al., 2006). Este modelo utiliza dados de variáveis ambientais e dados de presença de espécies, sem nenhuma abordagem quantitativa. A modelagem é feita através do software Maxent, que organiza as coordenadas geográficas da espécie estudada em mapas que indicam sua distribuição potencial (PHILIPS et al., 2006). É crescente o interesse por essa ferramenta, devido a possibilidade de obter informações consistentes e rápidas para conduzir práticas conservacionistas, contribuindo para a manutenção da biodiversidade (GIANNINI, 2012). Estudos de modelagem de nicho auxiliam na previsão dos efeitos da mudança climática na distribuição das espécies (RODRIGUES et al., 2015), para definir locais favoráveis para adaptação das espécies visando plantio comercial ou conservação ex-situ (MEDINA et al., 2010), para prever áreas susceptíveis a espécies invasoras (FABRICANTE et al., 2015), na compreensão da história evolutiva da espécie, quando associada aos estudos de filogeografia (VIEIRA et al., 2015), 19

Assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a distribuição geográfica da Copernicia prunifera e identificar as variáveis ambientais que influenciam na sua distribuição, com o intuito de gerar subsídios para o estabelecimento de estratégias de conservação e manutenção da espécie.

MATERIAL E MÉTODOS A espécie alvo do estudo é a Copernicia prunifera conhecida popularmente como carnaúba, nativa do Nordeste brasileiro, representante da família Arecaceae. O extrativismo das folhas dos carnaubais vem mantendo há várias décadas grande importância econômica no Nordeste brasileiro, principalmente em períodos de estiagem. A atividade de produção de cera a partir da palha de carnaúba representa a principal atividade extrativista (D’ALVA, 2007). A distribuição da Copernicia prunifera ocorre principalmente nos estados do Ceará (MORO et al., 2011), Piauí (FILHO et al., 2015) e Rio Grande do Norte (SOUSA et al., 2015), podendo ser encontrada na Paraíba (GUERRA et al., 2012), Bahia, Alagoas, Sergipe, Maranhão, Pernambuco, Mato Grosso e Tocantins (LEITMAN et al., 2015). Os registros de ocorrência da Copernicia prunifera foram obtidos através do site Species Link (http://splink.cria.org.br/), que é um sistema distribuído de informação que integra em tempo real, dados primários de coleções científicas em ambiente computacional de acesso gratuito (SPECIES LINK, 2012). Além disso, expedições foram realizadas pelos estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Os MNE foram construídos baseados em 80 pontos de ocorrência para a palmeira Copernicia prunifera (Anexo 1). As variáveis climáticas foram obtidas a partir da base de dados Worldclim (HIJMANS et al., 2005), disponível em: http://www.worldclim.org/bioclim, em uma resolução de 1 km (30 arco-segundos). Foram consideradas no total 19 variáveis ambientais denominadas de ”Bio” na base de dados (Tabela 1). Foi utilizado o algoritmo de máxima entropia do software Maxent versão 3.3.3k (PHILLIPS; DUDIK, 2008) para construção dos modelos de nicho ecológico. O Maxent se baseia apenas nos dados de presença e variáveis ambientais para gerar modelos de nicho ecológico. O Maxent calcula o índice AUC (area under the curve of receiver-operator characteristic) para medir o nível de ajuste do modelo. Dessa forma, os valores da AUC próximos a 1 indicam que o modelo é de alta precisão em prever a ocorrência da espécie enquanto que valores próximos ou menores que 0,5 indicam que o modelo não é melhor em prever a ocorrência da espécie (PHILLIPS et al., 2006). 20

RESULTADOS E DISCUSSÃO O valor da AUC foi de 0,986, considerado alto, próximo a 1,0. O teste AUC foi 0,940 com desvio padrão de 0,026. Resultado semelhante foi encontrado por Vieira et al. (2015) com Ficus bonijesulapensis, cujo valor da AUC foi 0,991. Visto que o valor máximo que este teste pode assumir é inferior a 1,0 e que a AUC varia com a amplitude natural do nicho das espécies (PHILLIPS et al., 2006), os indicadores avaliados sugerem que o modelo é satisfatório na estimação da distribuição da adequabilidade do habitat potencial da Copernicia prunifera, pois o valor da AUC foi superior a 0,9, ou seja, a acurácia do modelo foi considerada alta (SWETS, 1988). A precipitação do trimestre mais seco foi a variável que mais contribuiu para o modelo (39,4%), seguida da temperatura mínima do mês mais frio (17,5%), temperatura média anual (12,1%). Estas variáveis têm uma contribuição mais forte (69%) do que as demais (Tabela 1). Rodrigues et al. (2015) em estudo de modelagem de nicho ecológico para as espécies Anadenanthera colubrina, Aspidosperma pyrifolium e Myracrodruon urundeuva de florestas tropicais secas a variável “Precipitação do trimestre mais seco” teve pouca participação na modelagem de nicho com 1,2% de contribuição, diferindo do presente trabalho. Os modelos sugerem que são adequados para Copernicia prunifera os locais com variação nas precipitações no trimestre mais seco (bio17), sugerindo que a espécie se adaptada bem a ambientes estressantes quanto ao déficit hídrico temporal. De fato, indivíduos de Copernicia prunifera podem ser encontrados nos vales de rios sazonais nordestinos, nos tabuleiros litorâneos e em áreas alagadas intermitentes, demonstrando resistência tanto à ausência prolongada de água como à inundação (D’ALVA, 2007). A distribuição da adequabilidade do habitat da Copernicia prunifera desenvolvido com o Maxent é mostrado no mapa da Figura 1. A imagem usa cores para indicar a probabilidade de que as condições do ambiente são adequadas para a ocorrência da espécie. 21

Figura 1. Representação da adequabilidade do habitat de Copernicia prunifera no Brasil com base em Maxent. Cores quentes (amarelo ao vermelho) representam valores maiores de probabilidade e cores frias (verde a azul) menores valores de probabilidade de potencial de ocorrência do nicho ecológico da espécie. Quadros brancos representam os registros de presença usados para treinamento e quadros roxos para testes.

A ocorrência potencial da Copernicia prunifera se concentrou na região Nordeste, com baixa probabilidade de ocorrência nas regiões centro-oeste e norte do Brasil. Na região nordeste, as condições ambientais adequadas e consideradas como altamente provável para a ocorrência de Copernicia prunifera é predominante nos estados do Ceará, Rio Grande do Norte, sudoeste de 22

Pernambuco, norte da Bahia e vale do Rio São Francisco, norte e sudoeste do Piauí e norte do Maranhão. Dessa forma, essas áreas podem ser consideradas prioritárias para conservação da espécie. O modelo de distribuição da Copernicia prunifera foi similar à distribuição conhecida da espécie em regiões da Caatinga e Cerrado (LEITMAN et al., 2015). Todavia, a região norte do estado de Roraima também se mostrou com condições típicas dos locais de ocorrência da espécie. A vegetação norte do estado de Roraima é caracterizada por savanas, com espécies adaptadas para resistir ao estresse hídrico causado tanto pela falta de água no período seco, quanto pelo excesso de água no período chuvoso (BARBOSA; MIRANDA, 2005; BARBOSA et al., 2007). Há também a presença buritizais (Mauritia flexuosa L.) que acompanham pequenos cursos d’agua (BARBOSA; MIRANDA, 2005). Segundo Leitman et al. (2015) a Copernicia prunifera também pode ser encontrada no estado do Tocantins. O presente estudo não avaliou os aspectos biológicos da espécie e as características do solo, porém, são fatores importantes na ocupação potencial das espécies de plantas em relação às mudanças climáticas, conforme estabelece Colombo e Joly (2010). Segundo Peterson et al. (2001), a espécie pode dispersar, aclimatar, adaptar-se ou extinguir-se em resposta às alterações climáticas. Sendo assim, torna-se necessários estudos complementares, como filogeografia das populações naturais da Copernicia prunifera, para compreensão da história evolutiva e dos padrões de dispersão geográfica, além de prever possíveis consequências frente às alterações climáticas e gerar implicações para a conservação das populações naturais.

CONCLUSÕES Os resultados obtidos sugerem, com base no modelo de nicho ecológico (MNE), que a distribuição geográfica potencial para a ocorrência da Copernicia prunifera se concentra na região nordeste do Brasil. A variável ambiental que mais contribui com o MNE foi a precipitação do trimestre mais seco (bio17), sugerindo que Copernicia prunifera se adaptada bem a ambientes estressantes ao déficit hídrico sazonal.

AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo auxílio financeiro concedido, processo de n° 471099/2012-0. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa de estudo (Mestrado). 23

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Tabela 1. Variáveis utilizadas na modelação da área de distribuição potencial de Copernicia prunifera e sua contribuição percentual utilizadas na construção do modelo com Maxent. Fonte: WorldClim (2016).

Variáveis Contribuição percentual bio17: Precipitação do trimestre mais seco (mm) 39,4 bio6: Temperatura mínima do mês mais frio (°C) 17,5 bio1: Temperatura média anual (ºC) 12,1 bio12: Precipitação anual (mm) 9,4 bio9: Temperatura média do trimestre mais seco (°C) 3,4 bio4: Sazonalidade da temperatura (desvio padrão *100) 3,2 bio18: Precipitação do trimestre mais quente (mm) 2,8 bio11: Temperatura média do trimestre mais frio (°C) 2,2 bio3: Isotermalidade (bio2/bio7) (*100) 1,9 bio2: Amplitude diurna média (ºC) 1,8 bio8: Temperatura média do trimestre mais úmido (°C) 1,5 bio5: Temperatura máxima do mês mais quente (°C) 1,3 bio7: Amplitude térmica anual (BIO5-BIO6) (°C) 1,1 bio19: Precipitação do trimestre mais frio (mm) 1 bio10: Temperatura média do trimestre mais quente (°C) 0,5 bio14: Precipitação do mês mais seco (mm) 0,3 bio15: Sazonalidade da precipitação (coeficiente de variação) 0,3 bio13: Precipitação do mês mais úmido (mm) 0,1 bio16: Precipitação do trimestre mais úmido (mm) 0 27

Anexo 1 - Localização geográfica das populações de Copernicia prunifera, coordenada geográfica e Estado de ocorrência (SPECIES LINK, 2012). Espécie Longitude Latitude Estado 1 Copernicia prunifera -43,233 -11,683 Bahia 2 Copernicia prunifera -44,476 -11,619 Bahia 3 Copernicia prunifera -43,833 -11,333 Bahia 4 Copernicia prunifera -43,133 -11,083 Bahia 5 Copernicia prunifera -42,767 -11,017 Bahia 6 Copernicia prunifera -42,700 -10,833 Bahia 7 Copernicia prunifera -39,000 -10,500 Bahia 8 Copernicia prunifera -42,504 -10,003 Bahia 9 Copernicia prunifera -40,591 -9,692 Bahia 10 Copernicia prunifera -41,279 -9,614 Bahia 11 Copernicia prunifera -40,653 -9,562 Bahia 12 Copernicia prunifera -42,188 -9,527 Bahia 13 Copernicia prunifera -40,598 -9,472 Bahia 14 Copernicia prunifera -40,498 -9,412 Bahia 15 Copernicia prunifera -40,499 -9,412 Bahia 16 Copernicia prunifera -38,998 -7,701 Ceará 17 Copernicia prunifera -39,015 -4,971 Ceará 18 Copernicia prunifera -38,637 -4,040 Ceará 19 Copernicia prunifera -38,486 -3,799 Ceará 20 Copernicia prunifera -38,543 -3,717 Ceará 21 Copernicia prunifera -38,792 -3,657 Ceará 22 Copernicia prunifera -38,968 -3,607 Ceará 23 Copernicia prunifera -37,354 -4,715 Ceará 24 Copernicia prunifera -37,915 -4,924 Ceará 25 Copernicia prunifera -37,734 -4,571 Ceará 26 Copernicia prunifera -37,456 -4,864 Ceará 27 Copernicia prunifera -40,000 -5,000 Ceará 28

28 Copernicia prunifera -42,800 -2,750 Maranhão 29 Copernicia prunifera -44,054 -2,473 Maranhão 30 Copernicia prunifera -51,750 -11,283 Mato Grosso 31 Copernicia prunifera -50,669 -11,222 Mato Grosso 32 Copernicia prunifera -35,333 -7,329 Paraíba 33 Copernicia prunifera -38,435 -7,164 Paraíba 34 Copernicia prunifera -38,211 -6,997 Paraíba 35 Copernicia prunifera -38,141 -6,981 Paraíba 36 Copernicia prunifera -38,228 -6,759 Paraíba 37 Copernicia prunifera -38,228 -6,759 Paraíba 38 Copernicia prunifera -40,674 -9,459 Pernambuco 39 Copernicia prunifera -40,729 -9,434 Pernambuco 40 Copernicia prunifera -40,387 -9,362 Pernambuco 41 Copernicia prunifera -40,334 -9,274 Pernambuco 42 Copernicia prunifera -40,334 -9,274 Pernambuco 43 Copernicia prunifera -39,310 -8,514 Pernambuco 44 Copernicia prunifera -39,330 -8,307 Pernambuco 45 Copernicia prunifera -39,330 -8,307 Pernambuco 46 Copernicia prunifera -39,368 -8,193 Pernambuco 47 Copernicia prunifera -39,368 -8,193 Pernambuco 48 Copernicia prunifera -38,593 -8,012 Pernambuco 49 Copernicia prunifera -34,855 -8,009 Pernambuco 50 Copernicia prunifera -34,845 -7,884 Pernambuco 51 Copernicia prunifera -38,760 -7,861 Pernambuco 52 Copernicia prunifera -42,131 -7,025 Piauí 53 Copernicia prunifera -42,608 -5,564 Piauí 54 Copernicia prunifera -41,520 -3,458 Piauí 55 Copernicia prunifera -41,867 -3,175 Piauí 56 Copernicia prunifera -41,779 -2,934 Piauí 57 Copernicia prunifera -41,336 -2,928 Piauí 29

58 Copernicia prunifera -41,463 -2,921 Piauí 59 Copernicia prunifera -41,716 -2,898 Piauí 60 Copernicia prunifera -41,717 -2,886 Piauí 61 Copernicia prunifera -41,724 -2,884 Piauí 62 Copernicia prunifera -41,667 -2,879 Piauí 63 Copernicia prunifera -41,821 -2,858 Piauí 64 Copernicia prunifera -38,255 -6,371 Rio Grande do Norte 65 Copernicia prunifera -38,316 -6,263 Rio Grande do Norte 66 Copernicia prunifera -37,919 -6,096 Rio Grande do Norte 67 Copernicia prunifera -37,020 -6,034 Rio Grande do Norte 68 Copernicia prunifera -37,783 -5,650 Rio Grande do Norte 69 Copernicia prunifera -37,783 -5,650 Rio Grande do Norte 70 Copernicia prunifera -37,344 -5,188 Rio Grande do Norte 71 Copernicia prunifera -37,155 -4,980 Rio Grande do Norte 72 Copernicia prunifera -35,384 -5,897 Rio Grande do Norte 73 Copernicia prunifera -35,505 -5,985 Rio Grande do Norte 74 Copernicia prunifera -35,485 -6,243 Rio Grande do Norte 75 Copernicia prunifera -35,461 6,209 Rio Grande do Norte 76 Copernicia prunifera -36,805 -5,530 Rio Grande do Norte 77 Copernicia prunifera -35,683 -5,108 Rio Grande do Norte 78 Copernicia prunifera -37,743 -5,726 Rio Grande do Norte 79 Copernicia prunifera -37,052 -6,068 Rio Grande do Norte 80 Copernicia prunifera -37,312 -5,195 Rio Grande do Norte

Capítulo 2: GENETIC DIVERSITY OF Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore (ARECACEAE): IMPLICATIONS FOR CONSERVATION

ABSTRACT - The palm tree Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore is a natural resource that suffers intense exploitation as it is economically important in extractive communities. The objective of this study was analyze the genetic diversity among natural populations of Copernicia prunifera. We sampled 180 individuals distributed across 11 natural populations in the states of Rio Grande do Norte and Ceará, Brazil. Seven ISSR primers were used, providing 100 loci with 99.09% polymorphism. The polymorphic information content (PIC) of each primer is considered to be moderately informative. Nei’s genetic diversity (He) ranged from 0.071 to 0.288 and the Shannon Index (Ho) ranged from 0.103 to 0.418. The results from AMOVA indicate greater genetic variation within populations (58.11%) than among populations (41.89%). Mantel’s test revealed positive and significant correlation (r = 0.423; P = 0.006) between genetic and geographic distances, suggesting isolation by distance. The greatest value for gene flow occurred between the populations AR1 and AR2 (Nm = 29), which is consistent with the dendrogram (UPGMA) of Nei's genetic identity, indicating genetic similarity between these two populations. According to a Bayesian analysis, genotypes can be divided into three distinct groups (K = 3). Only populations AR2 and SMG show balance between mutation and drift, while the others present evidence of genetic bottleneck. Thus, conservation of Copernicia prunifera populations is necessary to minimize the loss of important alleles and contribute to the maintenance of the species.

KEYWORDS: Bottleneck; Carnauba; Genetic differentiation; ISSR; Palms.

INTRODUCTION Indiscriminate exploitation of natural forest resources has significantly decreased the size of natural populations, resulting in fragmented areas and population isolation (COTA et al., 2011; MELO JÚNIOR et al., 2012). Furthermore, fragmentation can significantly limit the movement of animals, pollen, and seeds, making the remaining populations susceptible to changes in gene pool patterns, which can change the genetic structure of populations (FUCHS; HAMRICK, 2010). The reduced size of natural areas and fragmentation may also lead to a loss of the genetic 31

diversity contained within and among populations (YOUNG et al., 1996). Previous studies have demonstrated the impact of population reduction on genetic diversity in natural populations (GAIERO et al., 2011; SANTOS et al., 2015). As such, studies of genetic structure and diversity in natural populations are needed to understand how diversity is distributed, and the factors that affect this distribution, as well as to quantify and evaluate the genetic diversity distributed between and within populations (NYBOM; BARTISH, 2000). Factors that may influence the distribution of genetic diversity include the effective population size (JABEEN et al., 2015), geographical occurrence of the species (SANTOS et al., 2015), and reproduction mode and breeding systems (ABREU et al., 2012). Gene flow (SILVA et al., 2011) also has an impact on genetic diversity, which is influenced not only by the ability of dispersers and pollinators to reach other populations, but also by geographical barriers that may exist between populations (BAWA, 1992). Studies of genetic diversity are useful in defining conservation strategies and developing management and genetic improvement programs for a species (LOUSADA et al., 2011; BRANDÃO et al., 2015; DUARTE et al., 2015). To estimate genetic diversity, the use of molecular markers based on the amplification of the DNA sequence is necessary, providing a useful tool to study genetic structure and diversity between individuals (CHAGAS et al., 2015) and within and between populations (SANTOS et al., 2015). Although several genetic studies of palm tree populations have been published (LOUSADA et al., 2011; GAIERO et al., 2011; SILVA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012; SHAPCOTT et al., 2012), few studies use ISSR (inter-simple sequence repeat) markers for palm tree species. Using ISSR markers is a quick and simple method to effectively analyze the genetic diversity of natural populations: such markers generate a large number of polymorphic bands; the method does not require prior information of the genome; and it is low cost. Although ISSR markers cannot differentiate heterozygous from homozygous individuals as they are dominant markers, analyzes multiple loci on a single reaction (REDDY et al., 2002; WOLFE, 2005). For species that have undergone extensive exploitation and are located in fragmented areas, such as the palm Copernicia prunifera (Miller) H.E. Moore, greater genetic diversity is expected between populations than within populations (GITZENDANNER; SOLTIS, 2000). In addition, due to the impacts of anthropogenic activities on Copernicia prunifera populations, genetic bottlenecks are expected to occur in natural populations (TANG et al., 2014). Thus, the 32

objective of this study is to analyze the genetic diversity among natural populations of Copernicia prunifera to provide information that may be useful in defining strategies for the maintenance and conservation of the species.

MATERIAL AND METHODS Target species Copernicia prunifera, commonly known as carnauba, is native to the semi-arid region in northeastern Brazil. Copernicia prunifera individuals can be found in river valleys and in flooded areas, where they generally form monodominant populations known as carnaubais. The species is highly resistant to the prolonged absence of water and permanent floods (D'ALVA, 2007). The main product extracted from the species is a wax produced from the leaves which is used in cosmetics, pharmaceutical capsules, electronics, food products, polishing waxes, and coatings (CAVALCANTE; DINIZ, 2005; SILVA et al., 2009). The species presents multiple inflorescences, which are made up of yellowish, hermaphroditic flowers (SILVA et al., 2014a). The flowers are composed of three sepals, three petals, six stamen, and three carpels. The species is pollinated by insects like the irapuá bee (Trigona spinipes Fabricius) and the maribondo-caboclo wasp (Polistes canadensis Linnaeus) (SILVA, 2014a); the likely dispersers of the fruits are the Palm Tanager (sanhaçu-do-coqueiro; Tangara palmarum Wied) (SILVA et al., 2014a) and bats (SOUSA et al., 2015).

Study locations and sampling The study was conducted in 11 natural populations of Copernicia prunifera located in Rio Grande do Norte and Ceará States, Brazil (Figure 1), from which 180 individuals were sampled (Table 1).

Target species (Copernicia prunifera)

Figure 1. Geographic location of the sampled populations of Copernicia prunifera in Rio Grande do Norte and Ceará States, Brazil.

The populations SER and LGP are the closest geographically, with a distance of 4.6 km, and LGP and AR1 are separated by the greatest distance, at 310.4 km.

Table 1. Location of sampled Copernicia prunifera populations, population code, geographic coordinates, number of individuals, and region of occurrence. RN - Rio Grande do Norte; CE – Ceará. Population/State Code Latitude/longitude N Region Lagoa de Pedras (RN) LGP 6°12’ S/35°27’ W 15 Mesoregion of Agreste potiguar Serrinha (RN) SER 6°14’ S/35°29’ W 15 Mesoregion of Agreste potiguar Macaíba (RN) MAC 5º59’ S/35º30’ W 15 Mesoregion of east potiguar São Miguel do Gostoso (RN) SMG 5°07’ S/35°41’ W 18 Mesoregion of east potiguar Jucurutu (RN) JUC 6º04’ S/37º03’ W 12 Mesoregion of west potiguar Apodi (RN) APD 5°43' S/37°44' W 12 Mesoregion of west potiguar Mossoró (RN) MOS 5°11' S/37°18' W 22 Mesoregion of west potiguar Icapuí (CE) ICA 4º46’ S/37º17’ W 14 Mesoregion of Jaguaribe Aracati 1 (CE) AR1 4º34’ S/37º44’ W 22 Mesoregion of Jaguaribe Aracati 2 (CE) AR2 4º51’ S/37º27’ W 11 Mesoregion of Jaguaribe Russas (CE) RUS 4°55' S/37°54' W 24 Mesoregion of Jaguaribe

Sampling ranged from 11 to 24 individuals per population, which is consistent with other studies on palm tree genetic diversity using ISSR markers (GAIEIRO et al., 2011; ROSSI et al., 2014; SANTOS et al., 2015). Leaf samples were placed in plastic tubes containing 2 mL CTAB 2X (cationic hexadecyl trimethylammonium bromide), labelled, and stored in a freezer -20°C until DNA extraction.

DNA extraction, PCR, and Electrophoresis DNA extraction was performed using the CTAB method, as described by Doyle and Doyle (1987). We tested 29 ISSR primers and selected seven that best amplified the DNA of Copernicia prunifera. For polymerase chain reaction (PCR), the Veriti automatic thermocycler was used in a volume of 12 μL containing genomic DNA. The PCR mix was composed of buffer -1 (10x), BSA (1.0 mg.mL ), MgCl2 (50 mM), dNTP (2.5 mM), primer (2 μM), Taq polymerase (5.0 U.μL), DNA (diluted 1:50), ISSR primer (2 µM), and ultrapure water. The reaction sequence consisted of denaturation at 94 °C for 2 min followed by 37 cycles of amplification at 94 °C for 15 seconds, 47 °C for 30 seconds, and 72 °C for 1 min. The process was completed with a final step at 72 °C for 7 min and then cooled to 4 °C. The products generated from the amplification 35

were subjected to 1.5% (p/v) agarose gel electrophoresis, stained with GelRed™ in 1 X TAE (Tris-Acetate-EDTA) buffer using a horizontal vessel at a voltage of 100 V, for two and a half hours. The 1 kb molecular weight size marker (Ladder) was used. Subsequently, the gels were photographed in ultraviolet light using the E-Box VX2.

Statistical analyses PIC value Polymorphic information content (PIC) was calculated to test the ability of the ISSR primers to distinguish polymorphism between individuals, with the absence or presence of bands as indicators. According to Botstein et al. (1980), molecular markers with values lower than 0.25 are classified as being slightly informative, values ranging between 0.25 to 0.5 are reasonably informative, and PIC values above 0.5 are satisfactory. For the calculation, we used the formula n 2 proposed by Anderson et al. (1993): PICi = 1 − ∑j=1 Pij , where Pij is the frequency of allele "j" in marker "i".

Genetic diversity For analysis of genetic diversity parameters, we used the POPGENE program version 1.3 (YEH et al., 1997) to assess the total number of alleles observed (Na), number of effective alleles (Ne), Nei's genetic diversity (He), and Shannon index (I) for each population. The genetic distance obtained using POPGENE was classified into three classes based on Nei (1978): low, when the distance is less than < 0.05; average, between 0.05 and 0.15; and high, when > 0.15. To compare the values of Nei’s genetic diversity and Shannon index between populations, analysis of variance (ANOVA) was conducted using the program Assistat 7.7 (SILVA, 2016), with averages subjected to the Tukey test at 5% probability.

Genetic population structure We used the program ALERQUIN 3.1 (EXCOFFIER et al., 2007) for the Analysis of Molecular Variance (AMOVA) of the studied populations. Mantel’s test was performed using the PC-Ord 4.14 program (MCCUNE; MEFFORD, 1999), resampled using the Monte Carlo method (1000 permutations), to verify the existence of a correlation between Nei’s genetic distance (1978) and geographic distance. The NTSYS program (ROHLF, 1993) was used to produce a dendrogram of UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic mean) to simplify the 36

genetic identity of Nei’s (1978) obtained with the POPGENE program. For principal component analysis (PCA), we used the GenAlEx program based on Nei’s genetic distance (PEAKALL; SMOUSE, 2006). Historical gene flow (Nm) was calculated with the formula: Nm = 0.5 (1 - GST) / GST (MCDERMOTT; MCDONALD, 1993), where GST is Nei’s genetic distance.

Bayesian analysis Bayesian analysis was performed using the program Structure v.2.2 (PRITCHARD, 2002) to infer the number of genetic groups (K) that represent the sampled populations. Ten independent runs for each K (ranging from 1 to 13) were conducted, with the estimates of K based on the model of mixed ancestry (admixture) and the frequency of correlated alleles. Each run was comprised of 250.000 simulations via Markov Chain Monte Carlo (MCMC) and a burn- in of 500.000 iterations. The number of K populations was identified according to the method ∆K (EVANNO et al., 2005), as implemented in the Structure Harvester program (EARL; VONHOLDT, 2012).

Detection of genetic bottlenecks Recent reductions in effective population size were analyzed using the Bottleneck program version 1.2 (CORNUET; LUIKART, 1996). The Infinite Allele Model (IAM) and Stepwise Mutation Model (SMM), based on Kimura and Crow (1964) and Kimura and Otha (1978), respectively, were used to infer the presence of genetic bottlenecks. The mutation model of the ISSR loci is intermediary between IAM and SMM (LUIKART et al., 1998), thus we use both models. Signal test was applied (α = 0.05) based on the frequency of alleles to determine the existence of recent significant genetic bottlenecks (CORNUET; LUIKART, 1996).

RESULTS Genetic polymorphism The seven selected primers provided 100 loci with 99.09% polymorphism. The number of loci per primer varied from 13 to 18 with an average of 14.4 (Table 2).

Table 2. Nucleotide sequence of ISSR primers, number of loci, and PIC value of each primer.

ISSR primers Sequence (5’ – 3’) Number of Loci PIC UBC 825 (AC)8-T ACACACACACACACACT 14 0.424 UBC 841 (GA)8-YC GAGAGAGAGAGAGAGAYC 18 0.446 UBC 857 (AC)8-YG ACACACACACACACACYG 14 0.405 UBC 873 (GACA)4 GACAGACAGACAGACA 15 0.431 UBC 880 (GGAGA)3 GGAGAGGAGAGGAGA 13 0.411 UBC 881 (GGGTG)3 GGGTGGGGTGGGGTG 14 0.339 M1 CAA (GA)5 CAAGAGAGAGAGA 13 0.422 Average 14.4 0.418 R = purine (A or G); Y = pyrimidine (C or T); PIC = Polymorphic information content

The PIC of each primer used varied from 0.339 to 0.446, with an average of 0.418. The profile of the loci using UBC primer 857 is shown in Figure 2.

Figure 2. Pattern of ISSR amplification fragments resulting from UBC primer 880 for 12 Copernicia prunifera individuals from the Apodi population, Rio Grande do Norte. L = Ladder 1 kb. 38

Genetic diversity The percentage of polymorphic loci of the populations ranged from 16.83% in SER to 79.21% in SMG. Nei’s genetic diversity (He) for all populations was 0.356 and the Shannon index (Ho) was 0.529 (Table 3).

Table 3. Genetic diversity parameters of Copernicia prunifera natural populations. Code L / %P Na Ne He I LGP (RN) 49/48.51 1.485±0.130 1.353±0.099 0.201±0.055abc 0.293±0.079abc SER (RN) 17/16.83 1.168±0.097 1.125±0.074 0.071±0.041d 0.103±0.059d MAC (RN) 46/45.54 1.455±0.129 1.322±0.100 0.182±0.054bc 0.267±0.077bc SMG (RN) 80/79.21 1.792±0.095 1.490±0.090 0.280±0.045a 0.416±0.062a JUC (RN) 37/36.63 1.366±0.139 1.245±0.104 0.140±0.057cd 0.205±0.082cd APD (RN) 35/34.65 1.346±0.138 1.187±0.089 0.113±0.050cd 0.171±0.073cd MOS (RN) 72/71.29 1.713±0.096 1.518±0.084 0.288±0.044a 0.418±0.062a ICA (CE) 73/72.28 1.723±0.120 1.509±0.108 0.282±0.055a 0.411±0.077a AR1 (CE) 74/73.27 1.733±0.095 1.475±0.082 0.270±0.042ab 0.400±0.059a AR2 (CE) 63/62.38 1.624±0.146 1.407±0.117 0.232±0.063ab 0.342±0.088ab RUS (CE) 70/69.31 1.693±0.094 1.495±0.079 0.280±0.041a 0.408±0.059a Total 100 / 99.09 1.990±0.007 1.613±0.022 0.356±0.030 0.529±0.012 Polymorphic locus (L), percentage of polymorphic loci (% P), number of alleles observed (Na), number of effective alleles (Ne), Nei’s index (He), Shannon index (I). The values represent the mean ± standard error. Data followed by the same letter do not differ statistically at the 5% confidence level based on the Tukey test.

In Rio Grande do Norte State, the populations MOS and SMG obtained the highest percentage of polymorphic loci, at 71.29% and 79.21%, respectively. LGP, SMG, and MOS populations differed statistically from the others, presenting higher values of Nei’s genetic diversity. In Ceará State, Nei’s genetic diversity indexes (He) did not vary statistically among the four populations. The results of the Shannon index show (I) that the LGP, SMG, MOS, ICA, AR1, AR2, and RUS populations have higher values and differ statistically from the others. According to the matrix of genetic distance and geographic distance (Table 4), we found the 39

greatest genetic distance between SMG and SER (0.581). The populations with the lowest genetic distance were AR1 and AR2 (0.017). The mean genetic distance was 0.261.

LGP SER MAC SMG JUC APD MOS ICA AR1 AR2 RUS LGP 0 4.6 25.5 124.2 176.8 258.3 233.8 257.43 310.4 266.5 306.9 SER 0.180 0 28.4 127.4 174.5 256.5 233.2 257.64 310.3 266.3 306.2 MAC 0.247 0.410 0 98.9 171.5 249.5 218.4 238.8 292.4 249.2 291.7 SMG 0.487 0.581 0.388 0 185.1 238.3 180.8 181.61 235.1 198.4 248.4 JUC 0.284 0.287 0.246 0.254 0 85.4 100.8 146.04 182 140.4 158.6 APD 0.316 0.396 0.274 0.229 0.134 0 75.7 117.42 127.7 100.4 90.7 MOS 0.270 0.272 0.323 0.135 0.175 0.134 0 47.26 83.4 39.9 73.3 ICA 0.301 0.337 0.315 0.110 0.233 0.226 0.122 0 54.38 21.73 71.97 AR1 0.256 0.301 0.249 0.148 0.124 0.072 0.064 0.117 0 44.8 43.9 AR2 0.265 0.289 0.277 0.133 0.104 0.084 0.064 0.102 0.017 0 51.4 RUS 0.238 0.248 0.260 0.147 0.117 0.096 0.035 0.124 0.053 0.048 0

Population genetic structure The analysis of molecular variance (AMOVA) indicates that there is greater genetic variation occurring among individuals within populations (58.11%) than between populations (41.89%) (Table 5).

Table 5. Analysis of molecular variance (AMOVA) between and within Copernicia prunifera populations. Sum of Variance Source of variation d.f % of variance P squares components Between populations 10 544.438 3.08671 41.89 < 0.0001 Within populations 169 723.556 4.28140 58.11 Total 204 1033.073 5.25500 Fixation Index Fst: 0.419 d.f. = degrees of freedom.

The Mantel test revealed the existence of a positive and significant correlation (r = 0.423; P = 0.006) between the genetic and geographic distances between populations (Figure 3).

r= 0.423 0,70.7 P= 0.006 0,60.6

0,50.5

0,40.4

0,30.3

0,20.2

0,10.1 Genetic distance fromNei Geneticdistance

0 0 50 100 150 200 250 300 350 Geographic distance (km)

Figure 3. Relationship between the genetic and geographic distances of Copernicia prunifera populations.

According to the dendrogram, the results show that populations located in geographical proximity to each other tend to have greater genetic similarity. We identified two groups (Figure 4): the first group consists of AR1, AR2, RUS, MOS, APD, JUC, ICA, SMG, and MAC, with MAC being the most divergent of the group; the second group consists of LGP and SER. We note that the greatest genotypic similarity between populations occurred between AR1 and AR2, followed by RUS and MOS. 41

Nei’s genetic identity Figure 4. UPGMA dendrogram based on Nei’s genetic identity between the 11 studied Copernicia prunifera populations.

The highest level of historical gene flow (Nm) was 29 between AR1 and AR2, and the lowest level of gene flow was 0.4 between SER and SMG populations (Table 6). This result corroborates the genetic distance matrix, in which SER and SMG had the highest value and AR1 and AR2 had the lowest (Table 4).

Table 6. Matrix of historical gene flow values among pairs of Copernicia prunifera populations. Minimum and maximum values are shown in bold.

LGP SER MAC SMG JUC APD MOS ICA AR1 AR2 RUS LGP SER 2.3 MAC 1.5 0.7 SMG 0.5 0.4 0.8 JUC 1.2 1.2 1.5 1.5 APD 1.1 0.7 1.3 1.7 3.2 MOS 1.3 1.3 1.0 3.2 2.4 3.2 ICA 1.2 1.0 1.1 4.0 1.6 1.7 3.6 AR1 1.4 1.2 1.5 2.8 3.5 6.4 7.3 3.7 AR2 1.4 1.2 1.3 3.2 4.3 5.4 7.2 4.4 29.0 RUS 1.6 1.5 1.4 2.9 3.7 4.7 13.7 3.5 8.9 9.8 42

PCA revealed that the first and second principal components accounted for the majority of total diversity (PC 1 = 47.73%; PC 2 = 14.66%) (Figure 5).

MAC

APD JUC Axis 2 Axis SMG AR1 LGP AR2 RUS ICA MOS SER

Axis 1

Figure 5. Principal component analysis of the studied Copernicia prunifera populations, based on Nei’s genetic distance.

Bayesian analysis The results obtained by Bayesian analysis using the method described by Evanno et al. (2005) suggest the existence of three genetic groups (K = 3) (Figure 6).

Figure 6. Plot of the mean values of LnP (D) of the Bayesian analysis (solid line) and ΔK analysis (dotted line). The bars indicate standard deviations of LnP (D) values.

We found that the 11 sampled populations can be structured into three distinct groups (Figure 7): the first group is formed by LGP, SER, and MAC; the second by ICA and SMG; and the third is formed by JUC, APD, MOS, AR1, AR2, and RUS.

K = 3

Figure 7. Bayesian analysis of Copernicia prunifera with the proportion of genotypes in the sampled populations. The dark vertical lines delimit populations.

Genetic bottleneck testing Most of the studied populations present a significant genetic bottleneck (Table 7).

Table 7. Tests of equilibrium between mutation and genetic drift for the studied Copernicia prunifera populations based on IAM and SMM models.

IAM SMM Population n Hd/He P n Hd/He P LGP 47.72 54/47 0.483 57.55 54/47* 0.022 SER 47.85 84/17 0.000** 56.48 84/17 0.000** MAC 47.94 63/38 0.029* 56.63 63/38 0.000** SMG 51.36 43/58 0.110 50.80 49/52 0.445 JUC 42.51 69/32 0.020* 53.47 71/30 0.000** APD 42.40 76/25 0.000** 53.44 78/23 0.000** MOS 43.95 36/65 0.000** 53.16 41/60 0.102 ICA 46.26 43/58 0.012* 57.44 45/56 0.423 AR1 44.15 40/61 0.000** 53.42 42/59 0.155 AR2 40.42 55/46 0.151 50.76 57/44 0.106 RUS 45.58 35/66 0.000** 48.92 35/66 0.000** n = expected number of loci with excess heterozygosity under the respective model; Hd / He = number of loci with a deficit of heterozygosity / excess of heterozygosity; P = probability; * and ** = significant at 5% and 1% probability, respectively.

For SER, MAC, JUC, APD, and RUS, the signal test revealed a highly significant deficit in heterozygosity under both IAM and SMM models, thus demonstrating the occurrence of population bottlenecks. MOS, ICA, and AR1 populations show a significant bottleneck based on the IAM model and only the LGP population showed a significant genetic bottleneck based on the SMM model. The populations AR2 and SMG show equilibrium between mutation and drift.

DISCUSSION PIC value The polymorphic information content determines the effectiveness of molecular markers in detecting polymorphism between individuals. From this we can infer the genetic diversity of a population (RESENDE et al., 2009). Thus, according to Botstein et al. (1980), all the PIC values found in the present study are classified as moderately informative, with values ranging from 0.339 to 0.446. Tiwari et al. (2015) and Vieira et al. (2015), using ISSR primers, found PIC values ranging from 0.240 to 0.390 and 0.057 to 0.444, respectively. Thus, the values obtained in the current study are comparable to previous studies.

Genetic diversity We found a high percentage of polymorphic loci, which demonstrates that the ISSR primers are effective in identifying the genetic diversity of the studied Copernicia prunifera populations. In a study on Butia Becc. (Arecaceae) using ISSR primers, Gaiero et al. (2011) found similar results to those reported herein with a percentage of polymorphic loci of 96%. The results for Nei’s genetic diversity and Shannon index were also similar to those found in other studies of palm trees using ISSR primers. Rossi et al. (2014), evaluating the distribution of genetic diversity in natural populations of Mauritia flexuosa L. f. (Arecaceae), obtained Nei’s index values ranging from 0.185 to 0.238. While Santos et al. (2015), in a study of the genetic structure of Attalea vitrivir Zona (Arecaceae), found Nei’s genetic diversity index ranging from 0.259 to 0.340 and Shannon index ranging from 0.377 to 0.516, results that are slightly higher than the present study. Furthermore, Chagas et al. (2015), studying a population of Elaeis guineensis Jacq (Arecaceae), obtained a Shannon index value of 0.285. Most populations showed lower genetic diversity for long-lived perennial species (0.250) (NYBOM, 2004). Populations occurring in the northern region of the species geographic distribution, particularly in the Jaguaribe mesoregion, present higher values of genetic diversity that differ statistically from the others. We note that the highest level of gene flow occurs in this region, which may have contributed to greater diversity in the populations of AR1, AR2, RUS, ICA, and MOS. Thus, there is a clear need for further phylogeographic studies in order to determine if the Jaguaribe mesoregion has a diverse lineage, and is thus a probable center of origin, or if it is a center of genetic diversity. The low rates of genetic diversity found in some populations may reflect anthropogenic pressures on Copernicia prunifera populations as shown by the presence of 46

genetic bottlenecks (Table 7). A decrease in effective population size may cause a decrease in gene flow and favor a reduction in genetic diversity in populations (DEFAVARI et al., 2009).

Population genetic structure According to AMOVA, greater genetic variation occurred among individuals within populations than between populations. Other studies on palm trees show similar results, with greater genetic variation occurring among individuals within populations (ROSSI et al., 2014; SANTOS et al., 2015). However, in the present study genetic differentiation among populations was high (Fst = 0.419), suggesting limited gene flow among populations, which may be related to the large geographical distances between populations. According to Lee et al. (2002), historical events and recent evolutionary processes may influence the genetic diversity maintained between and within populations. Thus, isolated populations with limited gene flow tend to have high levels of population genetic differentiation, as found in the current study (TANG et al., 2014). In a study by Cardoso et al. (2000) on the palm Euterpe edulis Mart., their results show 42.6% diversity among populations and 57.4% within populations. The authors suggest that the observed genetic divergence could be due to forest fragmentation. The results obtained by Cardoso et al. (2000) are similar to those found herein, in which extractive exploitation of Copernicia prunifera populations leads to fragmentation, which can result in the reduction of genetic diversity within populations. The Mantel test confirms the genetic divergence between the populations, suggesting that there is isolation by distance between the sampled populations. Similar results were also found by Gaiero et al. (2011) for Butia using ISSR primers. Silva et al. (2014b) suggest that Copernicia prunifera individuals present an aggregate spatial distribution pattern up to 10 meters which may be related to restricted seed and pollen dispersal. In addition, this result corroborates the genetic distance between populations, with an average of 0.260, which is high according to Nei (1978). This high level of divergence may be due to population fragmentation, extensive exploitation of the species, and restricted range of pollinators and dispersers, leading to low levels of gene flow among populations. We found the greatest genetic similarities between populations AR1 and AR2, and RUS and MOS, which are located near to each other geographically. In addition, this similarity can be 47

explained by the high values of gene flow Nm = 29 and 13.7, respectively (Table 6). The MAC population was genetically isolated from the others, therefore its genetic divergence should be considered when developing breeding programs. Despite the large geographic distance between the ICA and SMG populations, they are grouped within the dendrogram. This grouping can be related to the location of the populations near to the coast where the surrounding vegetation may contribute to gene flow of the species. The results of the UPGMA dendrogram are similar to the clusters generated by PCA based on Nei’s genetic distance. According to Wang (2004), Nm values between 1.0 and 10 migrants per generation among populations, can prevent differentiation due to genetic drift. Gene flow values greater than 4.0 migrants per generation may avoid the impacts of breeding among related individuals, which can occur within populations (SLATKIN, 1987). In the current study, low historical gene flow was found among the studied populations, with an average of 2.7. This result may be due to the geographical distances between populations (average of 160.7 km). Other factors that may contribute to low levels of gene flow is the efficiency of dispersers and pollinators in reaching other populations, and geographical barriers between populations (BAWA, 1992). Rossi et al. (2014) evaluated the distribution of genetic diversity in populations of the Mauritia flexuosa palm and observed higher levels of gene flow than our study. This difference may be due to the significantly shorter geographic distance between their studied populations (an average of 40 km), than in the present study. Bayesian analysis revealed that Copernicia prunifera genotypes in the 11 analyzed natural populations belong to three distinct groups (K = 3). Populations in similar geographic regions share genotypes, such as the populations in the western mesoregion (JUC, APD, and MOS) and the Jaguaripe mesoregion (AR1, AR2, and RUS), as well as the populations in the Agreste potiguar (LGP and SER). The ICA and SMG populations share genotypes despite the large geographical distance between them, as is also shown in the UPGMA dendrogram. All other populations show limited genetic structure with higher allele frequencies. The groups formed show a similar pattern to those identified by the UPGMA and PCA, based on Nei’s genetic identity and distance.

Genetic bottleneck In light of the high genetic divergence between the Copernicia prunifera populations and the fragmentation of the areas sampled in this study, it is important to identify populations that have undergone population decline, so as to understand the risks of possible local extinction due to reduced population size (LEE et al., 2002). Most of the populations showed a genetic bottleneck, which is possibly due to the significant anthropogenic pressures in these areas. Although the SMG population indicates equilibrium between mutation and drift, it is affected by extensive anthropization due to the development of wind power plants and the occurrence of fires, which can result in future genetic bottlenecks. The reductions in Copernicia prunifera population size found in the present study may be the result of intense exploitation of the species, due to its wide range of uses in industry and commerce (ARRUDA; CALBO, 2004), which has compromised the genetic diversity of these populations. In a study by Chagas et al. (2015) on Elaeis guineenses Jacq. (Arecaceae), the authors suggest that reductions in the species’ population size could be due to local agricultural activities and the loss of habitats. According to Defavari et al. (2009), a reduction in effective population size may lead to a reduction in gene flow, reducing the number of alleles, and favoring the loss of genetic diversity within populations.

IMPLICATIONS FOR CONSERVATION Based on the results of the present study, we can infer that the studied populations are losing genetic diversity within their populations. This can be observed through the high genetic divergence between populations, suggesting geographic isolation and limited gene flow, possibly due to anthropogenic factors that have reduced population sizes. Thus, conservation measures for natural populations of Copernicia prunifera are necessary in order to minimize the loss of important alleles, which may have consequences for the future of the species. In addition to in situ conservation of natural populations, one strategy would be the creation of germplasm banks for ex situ conservation, with seeds coming from the most diverse populations. For populations with greater genetic diversity, such as those located in the state of Ceará, another strategy could include the preservation of several populations across the geographic distribution of the species. This would contribute to the maintenance of gene flow and the genetic diversity found in these populations. 49

Population genetic bottlenecks were observed in most populations sampled. As such, Luikart et al. (1998) recommend mitigation procedures to manage or introduce immigrants to avoid or minimize the deleterious effects of bottlenecks. Therefore, we suggest that in situ and ex situ conservation of the populations that present genetic bottlenecks is a priority. Copernicia prunifera is not on the list of endangered species, however it has been affected by the expansion of agricultural activities over time (REIS et al., 2011), contributing to reductions in the species’ natural populations. To counteract the effects of this anthropization, there is a need to implement sustainable management of non-timber forest products, such as leaves and waxes, which are the main extraction products of Copernicia prunifera. These activities help limit the advance of livestock and deforestation of these natural areas (WADT et al., 2005), as well as contribute to the income of rural communities (TICKTIN, 2004).

ACKNOWLEDGMENTS The authors acknowledge the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for their financial support (Process 471099/2012-0) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) for a Masters Grant. We also thank Dr. Evelyn R. Nimmo for editing the English language of the manuscript.

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CONCLUSÕES A distribuição potencial da Copernicia prunifera concentra-se na região nordeste do Brasil, sendo a precipitação do trimestre mais seco (bio17) a variável ambiental que mais contribui com o MNE, sugerindo que Copernicia prunifera se adaptada bem a ambientes estressantes ao déficit hídrico sazonal. A maior variação genotípica foi encontrada entre indivíduos dentro das populações. No entanto, foi verificada a existência de correlação positiva e significativa entre as distâncias genéticas e geográficas, sugerindo alta divergência genética entre as populações que pode ser explicada pelo modelo de isolamento por distância. Populações próximas geograficamente apresentaram maior similaridade genética, como por exemplo, as populações AR1 e AR2 que também apresentam elevado fluxo gênico. A análise de gargalo genético apontou que as populações de AR2 e SMG indicaram equilíbrio entre mutação e deriva, no entanto, todas as outras populações estudadas apresentaram redução populacional. As populações AR1, AR2, ICA, RUS e MOS podem ser prioritárias para conservação, devido aos elevados índices de diversidade encontrados nessas áreas, quando comparado com as outras populações. A população de SER apresentou os mais baixos valores de diversidade genética e deve ser urgentemente protegida.