BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

BẠCH NGỌC MINH

NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Tp. Hồ Chí Minh - 2020

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ------

Bạch Ngọc Minh

NGHIÊN CỨU, THU NHẬN PROTEIN TỪ SINH KHỐI RONG NƯỚC LỢ (Chaetomorpha sp.) ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã sỗ: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Hoàng Kim Anh 2. PGS.TSKH Ngô Kế Sương

Tp. Hồ Chí Minh - 2020 i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học độc lập của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Hoàng Kim Anh và PGS.TSKH Ngô Kế Sương. Các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên cứu trong luận án do tôi tự bố trí thí nghiệm, phân tích số liệu một cách trung thực, khách quan. Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác. Nghiên cứu sinh

Bạch Ngọc Minh

ii

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án tiến sĩ này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Hoàng Kim Anh và PGS.TSKH Ngô Kế Sương đã tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu thực nghiệm và quá trình chỉnh sửa nội dung của luận án. Tôi chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và các đồng nghiệp tại Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi để giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi đặc biệt cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo và các bạn trong Phòng Quản lý Tổng hợp đã hỗ trợ tôi trong các thủ tục hành chính dể hoàn thành quá trinhg học tập và thực hiện luận án này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Học viện Khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ tôi về mặt hành chính và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận án tại Học viện. Tôi cũng xin cảm ơn các đồng nghiệp trong Phòng Công nghệ Biến đổi Sinh học, nơi tôi công tác, đã hộ trợ tôi hết mình trong công việc và tạo nhiều điều kiện thuận lợi để tôi có thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi chân thành gửi lời cảm ơn đến các đơn vị hợp tác: Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.Hồ Chí Minh, Bệnh viện 115, Trung tâm phân tích Kỹ thuật cao Sài Gòn, Viện Công nghệ Nano, Trung tâm Sâm và Dược liệu đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, đã luôn bên cạnh và là nguồn động viên to lớn cho tôi để hoàn thành quá trình học tập và nghiên cứu. Trân trọng Bạch Ngọc Minh

iii

MỤC LỤC

Trang LỜI CAM ĐOAN ...... i LỜI CẢM ƠN ...... ii MỤC LỤC ...... iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ...... vii DANH MỤC CÁC BẢNG ...... viii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ...... x MỞ ĐẦU ...... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...... 3 1.1. Tổng quan về rong ...... 3 1.1.1. Tổng quan về rong biển ...... 3 1.1.2. Rong lục ...... 5 1.1.3. Rong Chaetomorpha ...... 7 1.2. Protein thu nhận từ rong ...... 8 1.2.1. Đặc điểm protein thu nhận từ rong ...... 8 1.2.2. Thành phần acid amin trong rong ...... 10 1.2.3. Protein có hoạt tính sinh học ...... 11 1.2.4. Khả năng tiêu hoá của protein ...... 12 1.3. Kỹ thuật thu nhận protein ...... 13 1.3.1. Kỹ thuật trích ly protein ...... 13 1.3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein ...... 15 1.3.2.1. Phương pháp kết tủa ...... 15 1.3.2.2. Phương pháp thẩm tích ...... 17 1.3.2.3. Phương pháp sắc kí ...... 18 1.3.2.4. Phương pháp lọc membrane ...... 18 1.4. Phân tích tính chất của chế phẩm protein concentrate ...... 19 1.4.1. Tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate ...... 19 1.4.2. Tính chất chức năng của chế phẩm protein concentrate ...... 20 1.4.2.1. Khả năng hòa tan của protein ...... 21 iv

1.4.2.2. Khả năng hấp thu nước của protein ...... 21 1.4.2.3. Khả năng tạo gel ...... 21 1.4.2.4. Khả năng tạo bọt ...... 22 1.4.2.5. Khả năng tạo và làm bền nhũ tương ...... 22 1.4.3. Giá trị dinh dưỡng của chế phẩm protein concentrate ...... 23 1.4.3.1. Tiêu hóa protein và hấp thu protein ...... 23 1.4.3.2. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vitro ...... 24 1.4.2.3. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo ...... 24 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...... 27 2.1. Vật liệu nghiên cứu ...... 27 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...... 27 2.1.2. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất ...... 27 2.2. Sơ đồ nghiên cứu ...... 28 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ...... 30 2.3.1. Xác định các nhóm protein trong rong ...... 30 2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein .... 31 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein tan trong nước có sự hỗ trợ của enzyme cellulase ...... 31 2.3.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein tan trong kiềm có sự hỗ trợ của enzyme ...... 33 2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ...... 34 2.3.6. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ...... 34 2.3.7. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein ...... 35 2.3.7.1. Khảo sát quá trình kết tủa đẳng điện ...... 35 2.3.7.2. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng ethanol ...... 35

2.3.7.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 ...... 36 2.3.7.4. Nâng cao hàm lượng protein bằng phương pháp thẩm tích ...... 36 2.3.8. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein từ rong ...... 36 2.3.9. Xác định tính chất sinh học của các chế phẩm protein concentrate ...... 37 2.3.9.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ...... 37 2.3.9.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hoá ...... 37 v

2.3.10. Xác định tính chất chức năng của protein ...... 38 2.3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro ...... 38 2.3.11.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) ...... 38 2.3.11.2. Chỉ số AAS – Amino acid score ...... 39 2.3.11.3. Chỉ số PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring) ... 39 2.3.12. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo ...... 39 2.4. Phương pháp phân tích ...... 40 2.5. Phương pháp xử lý số liệu ...... 41 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...... 42 3.1. Thành phần protein trong rong ...... 42 3.1.1. Xác định thành phần sinh hóa của rong ...... 42 3.1.2. Xác định các nhóm protein trong rong ...... 44 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein ...... 46 3.3. Quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của cellulase...... 47 3.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein với sự hỗ trợ của cellulase ..... 47 3.3.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước ...... 52 3.4. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ...... 55 3.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly protein bằng NaOH ...... 55 3.4.2. Tối ưu hoá quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm...... 58 3.5. Đánh giá hiệu quả trích ly protein bằng các phương pháp ...... 61 3.6. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein ...... 64 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa đẳng điện...... 64 3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa protein bằng ethanol ...... 66

3.6.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 ...... 67 3.6.4. So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa protein ...... 70 3.7. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate ...... 72 3.7.1. Thành phần protein của chế phẩm protein concentrate ...... 72 3.7.2. Thành phần acid amin trong các chế phẩm protein ...... 72 3.7.3. Hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein concentrate ...... 74 3.8. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate ...... 81 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn ...... 81 vi

3.8.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ rong ...... 83 3.8.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH ...... 83 3.8.2.2. Khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ ...... 85 3.8.2.3. Đánh giá khả năng kết hợp với ion Fe2+ ...... 86 3.8.2.4. Đánh giá hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào (thử nghiệm MDA) ...... 87 3.9. Xác định tính chất chức năng của protein ...... 89 3.9.1. Khả năng hòa tan ...... 89 3.9.2. Khả năng hấp thu nước ...... 90 3.9.3. Khả năng tạo bọt và ổn định hệ bọt thực phẩm ...... 92 3.9.4. Khả năng tạo gel ...... 93 3.9.5. Khả năng tạo nhũ ...... 94 3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro ...... 96 3.10.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) ...... 96 3.10.2. Chỉ số AAS và PDCAAS...... 97 3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của chế phẩm APC-K trong điều kiện in vivo ...... 99 3.11.1. Nhóm sử dụng thức ăn không chứa protein ...... 100 3.11.2. Nhóm sử dụng thức ăn chứa protein ...... 100 3.11.3. Hệ số tăng trọng (PER) và tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) ...... 102 3.11.4. Giá trị sinh học (Biological value – BV) ...... 103 3.11.5. Các chỉ số máu chuột thí nghiệm ...... 105 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...... 106 Kết luận ...... 106 Đề nghị ...... 107 DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ...... 108 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...... 109 PHỤ LỤC ...... 123

vii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

APC algae protein concentrate protein cô đặc từ rong PC protein concentrate protein cô đặc PI protein isolate protein cô lập

SFE supercritical fluid extraction trích ly bằng CO2 siêu tới hạn PLE pressurized liquid extraction trích ly bằng dung môi lỏng SEM scanning electron microscope kính hiển vi điện tử quét MF micro filtration vi lọc NF nano filtration lọc nano UF ultra filtration siêu lọc RO reverse osmosis thẩm thấu ngược BV biological value giá trị sinh học PER protein efficiency ratio hệ số tăng trọng lượng NPR Net Protein Ratio tỉ lệ hấp thu protein tịnh AAS amino acid score điểm acid amin PDCAAS Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin ATCC American Type Culture Collection Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Trang

Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm cho quá trình tiền xử lý nguyên liệu ...... 31 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát quá trình trích ly protein có sự hỗ trợ của enzyme

...... 32

Bảng 2.3. Mô hình tối ưu hóa 3 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm...... 33 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình trích ly protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH ...... 34

Bảng 2.5. Mô hình tối ưu hóa 2 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm...... 35 Bảng 2.6. Thành phần thức ăn được thiết kế theo AIN 93 dành cho chuột trưởng thành

[101]...... 40

Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần sinh hóa của rong ...... 43

Bảng 3.2. Kết quả phân tích các nhóm protein rong Chaetomorpha sp...... 45 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước

...... 48 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nồng độ enzyme đến hàm lượng

Phycocyanin và protein tan trong nước ...... 49 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước ...... 50 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước

...... 51 Bảng 3.7. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước dưới sự hỗ trợ enzyme ...... 53

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein ...... 54 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ và tỷ lệ dung môi đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm ...... 56 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm

...... 57 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm

...... 58 ix

Bảng 3.12. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly khi thay

đổi 2 yếu tố nồng độ NaOH và thời gian trích ly ...... 59 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các biến độc lập (nồng độ NaOH và thời gian trích ly) đến hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích ...... 59

Bảng 3.14. Độ tinh sạch của protein trước và sau thẩm tích ...... 69

Bảng 3.15. Hiệu quả tủa protein bằng pH đẳng điện, ethanol, (NH4)2SO4 ...... 70

Bảng 3.16. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein concentrate ...... 72

Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein ...... 73

Bảng 3.18. Giá trị IC50 của chế phẩm protein và đối chứng vitamin C ...... 84

Bảng 3.19. Độ hòa tan (%) của các loại protein ...... 90

Bảng 3.20. Khả năng hấp thu nước (%) của các loại protein ...... 90

Bảng 3.21. Công suất tạo bọt (FC) của các protein và độ bền bọt (FS) của hệ...... 92

Bảng 3.22. Khảo sát khả năng tạo gel của protein ...... 93

Bảng 3.23. Chỉ số EAI (m2/g) và chỉ số ESI (phút) của các chế phẩm protein...... 95 Bảng 3.24. Khả năng tiêu hóa in vitro của chế phẩm protein thu được từ rong

Chaetomorpha sp...... 96 Bảng 3.25. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của người trưởng thành (*): WHO (2007) ...... 98 Bảng 3.26. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của trẻ em

(*): WHO (2007) ...... 99

Bảng 3.27. Trọng lượng chuột sau 10 ngày sử dụng thức ăn không chứa protein ... 100 Bảng 3.28. Thành phần sinh hóa của các chế phẩm protein APC.K và protein concentrate từ đậu nành ...... 101

Bảng 3.29. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn do viện Pasteur cung cấp ...... 101

Bảng 3.30. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi với thức ăn chứa protein ...... 101

Bảng 3.31. Chỉ số PER và NPR của các nguồn protein khác nhau ...... 103

Bảng 3.32. Giá trị sinh học của các nguồn protein dùng trong thử nghiệm ...... 104

x

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Trang

Hình 1.1. Hình thái rong Chaetomorpha aerea và Chaetomorpha linum...... 7

Hình 1.2a. Hàm lượng protein trong 18 loại rong thu nhận ...... 8 tại bờ biển Okha, Ấn Độ ...... 8

Hình 1.2b. Hàm lượng protein trong 15 loại rong thu nhận ...... 9 tại bờ biển Sabah, Malaysia ...... 9

Hình 1.3. Sự biến đổi hàm lượng protein theo mùa trong rong ...... 10

Palmaria palmate (Fleurence,1999) ...... 10

Hình 2.1. (a) Rong Chaetomorpha sp.; ...... 27

(b) Mẫu đã được sấy khô; (c) Mẫu được nghiền thành bột...... 27 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm Protein concentrate (PC) tan trong nước và tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp...... 29

Hình 2.3. Chuột thí nghiệm trong điều kiện in vivo ...... 40

Hình 3.1. Thu hoạch rong mền tại thực địa ...... 43

Hình 3.2. Phơi rong sau thu hoạch...... 43 Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến hàm lượng protein thu được...... 55 Hình 3.4. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian trích ly

đến hàm lượng protein thu được...... 60 Hình 3.5. Hiệu quả trích ly 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm bằng các phương pháp khác nhau ...... 61 Hình 3.6. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 500x và 1000x, thang

đo 50µm) của rong Chaetomorpha sp...... 63 Hình 3.7. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) của bã rong Chaetomorpha sp. sau khi trích ly protein ...... 63

Hình 3.8. Chế phẩm protein APC-K ...... 72 Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng

đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm...... 75

Hình 3.10. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong nước ...... 76 xi

Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong kiềm ...... 76

Hình 3.12. Kết quả điện di ...... 77

Hình 3.13. Kết quả điện di protein không qua sắc ký...... 77

Hình 3.14. Sắc ký đồ của chế phẩm protein APC-N khi phân tích LC-MS/MS ...... 79

Hình 3.15. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N ...... 80

Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-K ...... 80 Hình 3.17. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng

đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm...... 81

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-N .... 83

Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K .... 84

Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế ABTS của chế phẩm APC-N ...... 86

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn khả năng liên kết với Fe2+ của chế phẩm APC-N ...... 86

Hình 3.22. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào của chế phẩm APC-N ... 87

Hình 3.23. Các chỉ số máu của chuột thí nghiệm ...... 105 1

MỞ ĐẦU

Hiện nay một số loài rong (như Chaetomorpha sp.,) đang mọc tự nhiên trong các ao nuôi tôm nước lợ ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Sau khi thu hoạch tôm, một lượng lớn sinh khối rong được nông dân vớt ra khỏi ao và để thành đống thối rữa trên bờ, vừa lãng phí vừa gây ô nhiễm môi trường. Nhiều nghiên cứu cho thấy, các thành phần trong rong có giá trị cao về mặt dinh dưỡng. Việc nghiên cứu và thu nhận các sản phẩm từ các loài rong trên sẽ tận dụng nguyên liệu sẵn có để tạo ra các sản phẩm có giá trị đồng thời giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường hiện nay tại địa phương. Trong khuôn khổ của Dự án “Nhiên liệu sinh học từ sinh khối thủy sinh Việt Nam” do Viện Sinh học Nhiệt đới chủ trì, thành phần carbohydrate từ rong Chaetomorpha đã được sử dụng để lên men sản xuất nhiên liệu sinh học. Tuy nhiên, protein trong rong có thành phần acid amin cân đối và hàm lượng các acid amin thiết yếu khá cao lại chưa được nghiên cứu sử dụng. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài là thu nhận protein từ sinh khối rong nước lợ (Chaetomorpha sp.), tạo ra nguồn protein concentrate mới từ thực vật để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm. Đề tài cũng nghiên cứu các đặc điểm của protein từ rong nước lợ, là nguồn nguyên liệu chưa được khai thác trong nước và trên thế giới. Trong nghiên cứu này, một loại cellulase đặc biệt được sử dụng để thủy phân carbohydrate trong thành tế bào rong Chaetomorpha. Khác với các enzyme cellulase thông thường (có pH tối ưu trong vùng acid), enzyme này có khả năng hoạt động trong vùng pH trung tính hoặc kiềm nhẹ (là điều kiện pH thuận lợi của quá trình trích ly protein) và vì thế sẽ hỗ trợ hiệu quả quá trình trích ly protein từ rong. Ngoài ra, kỹ thuật siêu âm cũng sẽ được sử dụng với mục đích tăng cường khả năng trích ly protein từ sinh khối rong nước lợ Chaetomorpha sp. Chế phẩm protein concentrate tạo ra cũng sẽ được nghiên cứu đánh giá cấu trúc và tính chất chức năng; khả năng kháng khuẩn cũng như khả năng bắt gốc tự do; thử nghiệm lâm sàng để đánh giá về giá trị sinh học cũng như khả năng tiêu hóa của protein từ rong trong điều kiện invitro và invivo. 2

Việc trích ly và thu nhận thành phần protein có giá trị của rong để ứng dụng trong ngành thực phẩm cũng mang tính thực tiễn cao. Ngoài ra, việc nghiên cứu thu nhận các sản phẩm có giá trị từ một nguồn sinh khối hiện dư thừa và gây ô nhiễm môi trường sẽ là cơ sở để tiến hành khai thác tự nhiên hoặc nuôi trồng kết hợp các loại rong nước lợ với các loại thủy hải sản khác để mang lại lợi ích cao hơn.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về rong 1.1.1. Tổng quan về rong biển Giới thiệu chung Rong (rong biển hay rong nước lợ) là loại rong dạng sợi dài kết thành khối lớn trôi nổi trong thủy vực có thể dễ dàng khai thác và sử dụng, các loại rong này còn được gọi là rong lớn (macroalgae) để phân biệt với một số loại rong nhỏ (vi tảo: microalgae). Về mặt phân loại, rong rất khó để phân loại một cách chính xác bởi sự phức tạp trong cấu trúc, đa số loài rong gần với thực vật nhưng một số lại được xem như vi sinh vật (vi khuẩn lam hay tảo lam). Trong số các loại rong trong tự nhiên thì rong biển được sử dụng rộng rãi nhất vì đa dạng về chủng loại và năng suất thu hoạch cao. Rong biển được sử dụng trong các ngành thực phẩm, y học và các hợp chất trích ly từ chúng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. Các loại rong nước ngọt được ứng dụng ít hơn rong biển do sự giới hạn diện tích của thủy vực nước ngọt, việc nghiên cứu và ứng dụng rong nước ngọt chỉ phát triển mạnh trong những năm của thế kỷ 20 cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học do đa số trong chúng là các loại vi tảo. Hiện nay, giống Spirulina spp. được sử dụng nhiều nhất bởi chúng hình thành cấu trúc sợi lớn nên dễ khai thác và có nhiều giá trị đặc biệt trong thực phẩm và y học. Gần đây, các nhà khoa học trên thế giới quan tâm đến nhóm rong sống trong vùng nước lợ. Nhóm rong này sống ở vùng thủy vực ở các cửa sông hoặc các vùng nước mặn nhân tạo bên trong vùng châu thổ để nuôi thủy hải sản. Do sự giao thoa giữa hai vùng nước nên rong sống trong khu vực này có những đặc điểm khác biệt với các loại rong sống trong hai vùng nước riêng biệt. Các loại rong nước lợ phần lớn di chuyển từ biển vào và thích nghi dần với độ mặn thấp hơn của vùng nước này. Tuy nhiên việc nghiên cứu và ứng dụng các loại rong này chưa nhiều. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau: − Ngành rong Lục (Chlorophyta) − Ngành rong Trần (Englenophyta) 4

− Ngành rong Giáp (Pyrophyta) − Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta) − Ngành rong Kim (Chrysophyta) − Ngành rong Vàng (Xantophyta) − Ngành rong Nâu (Phaecophyta) − Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) − Ngành rong Lam (Cyanophyta) Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong Nâu, rong Đỏ. Ứng dụng của rong biển Từ lâu, rong đã được sử dụng rộng rãi trong khẩu phần ăn của người, đặc biệt là ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc. Những loài rong thường được sử dụng trong thực phẩm như rong mứt (Porphyra sp.), rong dẹt (Laminaria japonica), rong nâu Wakame (Undaria pinnatifida) hoặc Hiziki (Hizika fusiforme), rong nho Caulerpa lentifera… Ngoài ra rong đỏ Palmaria cũng được sử dụng từ lâu đời tại Châu Âu và Bắc Mỹ, hay rong lục Ulva được dùng trong thực phẩm ở đảo Hawai [1, 2]. Ở góc độ dinh dưỡng, rong là loại thực phẩm năng lượng thấp, ít lipid, giàu khoáng chất và protein. Rong là nguồn cung cấp các loại vitamin như A, B C, D, E và các loại khoáng như calcium, phosphorus, sodium, potassium. Rong cũng chứa một lượng lớn polysaccharide, thường là polysaccharide cấu trúc của thành tế bào. Các thành phần polysaccharide của rong như agar, carrageenan, ulvans, fucoidan không được thủy phân bởi amylase trong hệ tiêu hóa của người và động vật, vì thế đây là một nguồn chất xơ và prebiotic có triển vọng để sử dụng trong thực phẩm chức năng. Sự lên men có chọn lọc các chất xơ prebiotic bởi hệ vi khuẩn có ích trong đường ruột sẽ giúp ức chế hoạt động của các vi khuẩn có hại, cải thiện sức khỏe của hệ tiêu hóa và tăng cường khả năng miễn dịch của người sử dụng. Việc sử dụng rong thường xuyên trong khẩu phần ăn đã được chứng minh là mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe của con người. Tại Hàn Quốc, sử dụng khẩu phần ăn hàng ngày chứa Porphyra sp. giúp giảm đáng kể nguy cơ ung thư vú và giảm nguy cơ tiểu đường [3]. Đối với thức ăn chăn nuôi, đặc biệt trong ngành thủy sản rong được sử dụng để thay thế một phần nguồn thức ăn hoặc thay thế hoàn toàn. Kalla và cộng sự nhận thấy 5 việc bổ sung Porphyra spp. vào khẩu phần ăn của cá vền (Seabream) hoặc Valente và cộng sự cũng nhận thấy việc thay thế 5-10% bột cá trong thức ăn của cá vược châu Âu bằng Gracilaria busra-pastonis sẽ làm tăng tốc độ tăng trưởng riêng. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc sử dụng rong dạng phụ gia bổ sung vào khẩu phần ăn của thủy sản ngoài việc làm gia tăng thể trọng còn góp phần cải thiện các hoạt động sinh lý, đáp ứng stress, sức nhịn đói, kháng bệnh và chất lượng thịt của cá nuôi [4, 5]. Đối với lĩnh vực y học, rong thường được sử dụng như một vị thuốc trong Đông y (Côn bố). Tác động hỗ trợ điều trị bệnh của rong phần lớn do các thành phần dinh dưỡng có giá trị cao như protein, vitamin… như Spirulina. Gần đây nhiều công trình nghiên cứu đã phát hiện thấy một số tác động đặc biệt của một số thành phần hóa học của rong, ví dụ Sheih và cộng sự đã phát hiện thấy một số đoạn peptide từ protein của Chlorella vulgaris có khả năng kháng ung thư cũng như khả năng kháng oxi hóa. Zbakh và cộng sự đã trích ly được một số hợp chất có khả năng kháng vi sinh vật từ một số loại rong ở tầng đáy của Địa Trung Hải hay Lordan và cộng sự đã khảo sát một số loại rong có tiềm năng giảm bớt nguy cơ mắc một số bệnh mãn tính [6-9]. Trong công nghiệp, rong được xem như nguồn thu nhận các hợp chất có giá trị cao như: agar, carageenan, alginate…các hợp chất này được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp và chế biến. Chúng đều có chung đặc tính tạo cấu trúc cho nhiều sản phẩm công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm. 1.1.2. Rong lục Rong lục là các sinh vật nhân thật, có hệ thống quang hợp là các phân tử chlorophyll a và b, bên cạnh đó trong tế bào còn chứa các sắc tố phụ như beta carotene và xanthophylls. Rong có dạng tế bào đơn giản hoặc phức tạp, nhiều tế bào dạng hình phiến hay dạng sợi, chia nhánh hoặc không chia nhánh. Dựa trên dữ liệu phân tử cho thấy tổ tiên chung gần đây nhất của tất cả các loài rong lục có thể đã tồn tại 1100-1200 triệu năm trước [10]. Việc phân loại rong lục rất phức tạp. Trước đây, việc phân loại rong lục dựa vào nhiều tiêu chí khác nhau như hình thái, siêu âm, phân tử. Sự phát triển của kính hiển vi điện tử vào những năm 70 của thế kỷ trước đã tiết lộ nhiều đặc điểm tế bào quan trọng để phân loại rong lục. Mattox và Stewart đã đề xuất một cách phân loại mới, trong đó sự khác biệt trong các tế bào roi (flagellated cells) và cytokinesis trong quá trình nguyên 6 phân là hai đặc tính quan trọng nhất. Trong 20 năm qua, sự ra đời của sinh học phân tử đã tạo ra một cuộc cách mạng để phân loại nhiều loài và rong là một trong những loài bị ảnh hưởng nhiều nhất. Dữ liệu trình tự DNA được sử dụng để phân loại rong đã chỉ ra rằng sự khác biệt về đặc điểm hình thái ở rong lục thường không tương quan với sự phát sinh loài [11-15]. Hiện tại người ta đã xác định rằng rong lục thuộc về một ngành riêng gọi Viridiplantae. Viridiplantae (thực vật xanh) là một nhánh bao gồm tảo lục và thực vật trên cạn. Trong một số hệ thống phân loại nhánh này được coi như là một giới dưới các tên gọi khác nhau, như Viridiplantae, Chlorobionta hay đơn giản chỉ là Plantae. Adl và cộng sự đã đưa ra một phân loại cho toàn bộ thực vật nhân chuẩn vào năm 2005, cũng đã đề xuất tên gọi Chloroplastida cho nhóm này, để chỉ nhóm sinh vật có các lục lạp với diệp lục chủ yếu là màu xanh. Các nhóm đơn ngành Chlorophyta và Streptophyta được phân loại là thuộc về Viridiplantae. Tổng cộng có trên 350.000 loài sinh vật thuộc về Viridiplantae. Có khoảng 8.000 loài rong lục, với nhiều dạng sống khác nhau, từ dạng sống tế bào đơn lẻ, trong khi một số các loài khác hình thành coenobia (khuẩn lạc), các sợi dài hoặc các sợi rong biển lớn gồm rất nhiều tế bào. Rong lục là sinh vật nhân chuẩn sinh sản theo chu kỳ xen kẽ các thế hệ. Sinh sản thay đổi từ sự hợp nhất của các tế bào giống hệt nhau (isogamy) đến sự thụ tinh của một tế bào không di động lớn bằng một tế bào nhỏ hơn (oogamy). Tuy nhiên, cũng có một số biến thể, đáng chú ý nhất là quá trình liên hợp thường xảy ra ở các loài rong lục, tiêu biểu là ở Spirogyra. Các tế bào tảo đơn bội (chỉ chứa một bản sao DNA của chúng) có thể hợp nhất với các tế bào đơn bội khác để tạo thành hợp tử lưỡng bội. Khi các sợi rong làm điều này, chúng tạo thành cầu nối giữa các tế bào, hợp nhất vào một tế bào và để lại các thành tế bào trống phía sau có thể dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi quanh học. Các loài rong Ulva có khả năng sinh sản đẳng giao, giai đoạn sinh dưỡng lưỡng bội là nơi sinh sôi và giải phóng các bào tử đơn bội, nảy mầm và phát triển tạo ra một pha đơn bội xen kẽ với giai đoạn sinh dưỡng. Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam. Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, 7

Myanmar, Bồ Đào Nha, Thái Lan… Xét về sản lượng thì rong lục chủ yếu là của Nhật Bản khoảng 4.000 tấn rong khô / năm với các chi như Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong đó nuôi trồng khoảng 2.500 tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippin khoảng 800 tấn chi Caulerpa, gần như toàn bộ do nuôi trồng. 1.1.3. Rong Chaetomorpha Rong lục thuộc chi Chaetomorpha là các cơ thể đa bào được tạo thành bởi các tế bào hình trụ. Chi này được đặc trưng bởi các sợi không phân nhánh, làm cho nó đặc biệt. Họ hàng gần nhất của nó là các loài phân nhánh của chi Cladophora. Ngành : Chlorophyta Lớp : Ulvophyceae Bộ : Cladophorales Họ : Cladophoraceae Chi : Chaetomorpha

Hình 1.1. Hình thái rong Chaetomorpha aerea và Chaetomorpha linum.

Có khoảng 50 loài Chaetomorpha hiện được công nhận dựa trên một số đặc điểm hình thái, chẳng hạn như hình thức tăng trưởng, kích thước tế bào và hình dạng của các tế bào đính kèm [16]. 8

1.2. Protein thu nhận từ rong 1.2.1. Đặc điểm protein thu nhận từ rong Các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng rong biển chứa nhiều nguồn dinh dưỡng có lợi như carbohydrate, protein, các khoáng chất và vitamin. Protein trong rong biển được xem là chứa các thành phần acid amin tương đối phù hợp cho sử dụng làm thức ăn cho con người hay trong chăn nuôi. Hàm lượng protein trong rong biển có sự khác nhau tùy theo loài. Kết quả khảo sát của Kumar trên 18 loài rong biển khác nhau thuộc 3 ngành Chlorophyta, Phaeophyta, Rhodophyta tại Ấn Độ cho thấy hàm lượng protein thay đổi từ 10 – 35% (Hình 1.2a). Mohd Rosni và cộng sự, đã tiến hành khảo sát trên 15 loại rong tại Semporna, Sabah, Malaysia. Kết quả cho thấy hàm lượng protein có sự khác nhau giữa các loài và dao động từ 3,99 đến 13,18 % (Hình 1.2b) [17-20].

Hình 1.2a. Hàm lượng protein trong 18 loại rong thu nhận tại bờ biển Okha, Ấn Độ (C: Chlorophyta, P: Phaeophyta, R: Rhodophyta ) 9

Hình 1.2b. Hàm lượng protein trong 15 loại rong thu nhận tại bờ biển Sabah, Malaysia (A) Caulerpa lentillifera, (B) Caulerpa racemosa, (C) Sargassum polycystum, (D) Hormophysa cuneiformis, (E) Padina gymnospora , (F) Turbinaria conoides, (G) Kappaphycus alvarezii, (H) Kappaphycus alvarezii, (I) Kappaphycus striatum, (J) Kappaphycus striatum, (K) Kappaphycus striatum, (L)Eucheuma denticulatum, (M) Gracilaria verrucos, (N) Laurencia sp. and (O) Laurencia sp. Hàm lượng protein trong rong biển còn bị ảnh hưởng bởi chu kỳ mùa trong năm. Tác giả Fleurence đã chỉ ra sự thay đổi hàm lượng protein từ 9 – 25%, theo mùa trên Palmaria palmate thu nhận tại biển Atlanic, với lượng protein cao nhất trong các tháng mùa xuân và mùa đông (Hình 1.3). Ở rong lục Ulva lactuca tháng thu nhận protein cao nhất là tháng tám với 32,7% protein trên trọng lượng khô. Ở một số loài rong nâu khác cũng có sự thay đổi hàm lượng protein theo mùa [21-24]. 10

Hình 1.3. Sự biến đổi hàm lượng protein theo mùa trong rong Palmaria palmate (Fleurence,1999) Tác giả Hanan M. Khairy và cộng sự, đã thu thập các mẫu rong thuộc ba loài Ulva lactuca, Jania rubens và Pterocladia capillacea tại vịnh Abu Qir, Ai Cập. Kết quả cho thấy có sự khác nhau về hàm lượng protein cũng như thành phần các acid amin của ba loài rong này giữa các mùa trong năm. Hàm lượng protein trong ba loài rong này dao động từ 10 – 23%, và có sự khác biệt theo mùa. Vào mùa xuân hàm lượng protein trong cả ba loài rong này cao hơn vào mùa hè và mùa thu [25]. 1.2.2. Thành phần acid amin trong rong Nhìn chung không có nhiều nghiên cứu liên quan cấu trúc và các tính chất sinh học của protein từ rong, nhưng các công bố liên quan đến thành phần acid amin của rong thì khá nhiều. Hầu hết protein từ rong đều chứa đầy đủ các thành phần acid amin thiết yếu với tỷ lệ cân đối hơn nhiều so với các loại protein từ thực vật trên cạn. Protein từ rong cũng rất giàu acid aspartic và acid glutamic [26]. Theo Meital Kazir và cộng sự, thành phần acid amin thiết yếu trong protein concentrate của rong Ulva cao nhất là Lysine (6,34% ± 1,16), tiếp theo là Threonine (4,35% ± 0,51), Leucine (4,31% ± 0,73) và Isoleucine (3,60% ± 0,40) . Đối với protein concentrate của rong Gracilaria, thành phần acid amin thiết yếu nhiều nhất là Leucine (8,34% ± 0,10), tiếp theo là Valine (7,18% ± 0,17), Lysine (6,20% ± 0,21) và Isoleucine (4,65% ± 0,12). Đáng chú ý là Lysine được biết đến có hàm lượng tương đối thấp trong 11 các nguồn protein từ thực vật, tuy nhiên lại có hàm lượng cao trong protein của rong. Các dữ liệu trên cho thấy protein từ rong có thể xem là một nguồn dinh dưỡng có giá trị trong chế độ ăn uốngcủa con người [27]. Các loại rong lớn (macroalgae), đặc biệt là rong đỏ chứa nhiều taurin, một loại non-protein acid amin có khả năng làm giảm huyết áp, giảm cholesterol máu và có khả năng kháng oxy hóa. Những acid amin có giá trị khác từ rong bao gồm laminine, kainoid và mycosporine-like acid amin. Laminine tách từ rong có khả năng làm giảm hiện tượng co cơ và giảm huyết áp tạm thời. Các loại kainoid (bao gồm cả domoic acid) có khả năng diệt côn trùng, giun sán. Domoic acid và kainoid thu nhận chủ yếu từ rong đỏ Digenea simplex được sử dụng trong các nghiên cứu về sinh lý học thần kinh do chúng có liên quan đến các hoạt động của dây thần kinh phản xạ. Mycosporine từ Porphyra umbilicalis đã được sử dụng trong một số sản phẩm kem chống nắng thương mại do chúng có khả năng kháng oxy hóa và chống lại tác hại của tia tử ngoại [2, 26, 28-31]. 1.2.3. Protein có hoạt tính sinh học Các loại protein có giá trị thu nhận từ rong đã được đề cập đến trong nhiều nghiên cứu bao gồm lectin và phycobiliprotein. Lectin là một glycoprotein có vai trò quan trọng trong việc giúp một tế bào bình thường nhận biết các tế bào lạ như tế bào ung thư. Kết quả của một số nghiên cứu cho thấy lectin từ rong Eucheuma serra có cấu tạo gần giống lectin từ các loại thực vật khác và có khả năng kháng khuẩn và chống ung thư. Lectin thu được từ một số loại rong đỏ Rhodophyta có khả năng kháng viêm, chống lại virus HIV-1, chống kết tập tiểu cầu và kháng vi khuẩn gây sâu răng [32, 33]. Phycobiliprotein có ba nhóm chính là phycocyanins, allophycocyanins và phycoerythrins, trong đó nhóm phycocyanin thường gặp trong các loài rong tảo có màu xanh lục. Phycocyanin được cho là có nhiều công dụng trong việc tăng cường hệ thống miễn dịch, chống oxi hóa và chống viêm. Tuy nhiên, các nghiên cứu hiện nay phần lớn tập trung vào thu nhận phycocyanin từ Spirulina, chưa mở rộng đến các đối tượng rong khác. Suvega và cộng sự đã phân tích một số thành phần sinh hóa cơ bản trên rong đỏ và rong lục ở Ấn Độ, các tác giả đã chỉ ra thành phần phycocyanin trong rong lục Chaetomorpha linum là 0,04 mg/g rong tươi (0,59mg/g rong khô). Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh khả năng bảo vệ gan, chống viêm và chất chống oxy hoá của phycocyanin. Các tác giả đã chỉ ra hiệu quả chống oxy hóa, chống viêm, bảo vệ gan và 12 bảo vệ não của phycocyanin từ Spirulina có được do khả năng phá hủy các gốc alkoxyl, hydroxyl và peroxyl. Ngoài ra, phycocyanin còn gây ức chế quá trình oxy hóa lipid được thí nghiệm trên chuột. Kết quả được đánh giá qua 12 thí nghiệm và hiệu quả chống viêm của C - PC được thể hiện rõ. Hiệu quả chống oxy hóa có được nhờ khả năng phá hủy các gốc oxy hóa và ức chế hoạt động của enzyme COX-2 [34-38]. Ngoài hai thành phần protein là lectin và phycobiliprotein vừa đề cập ở trên, các chế phẩm protein concentrate (PC) và protein isolate (PI) từ rong cũng có triển vọng sử dụng trong thực phẩm chức năng do có khả năng làm giảm nguy cơ bệnh tim mạch. Các thí nghiệm lâm sàng trên động vật (thỏ) và người đã chứng minh các loại protein thực vật như protein từ đậu nành, rong tảo, ngũ cốc khi được dùng thay thế cho protein động vật (như casein) trong khẩu phần ăn đã giúp kiểm soát quá trình chuyển hóa mỡ và làm giảm đáng kể cholesterol và triglyceride trong máu. Cơ chế giảm mỡ máu có thể liên quan đến thành phần các acid amin trong protein thực vật. Chế độ ăn giàu protein thực vật làm giảm đáng kể nồng độ lysine và arginine trong máu, dẫn đến hạn chế tổng hợp apoprotein E có vai trò trong việc gắn kết và vận chuyển cholesterol. Kết quả một số nghiên cứu khác cũng cho thấy sử dụng các loại protein thực vật làm giảm sự tổng hợp một loại hormone là glucagon dẫn đến giảm tổng hợp cholesterol và triglyceride trong máu [39] . 1.2.4. Khả năng tiêu hoá của protein Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa có thể gây khó khăn cho nghiên cứu in vitro, bao gồm thành phần dinh dưỡng đa lượng, độ đặc hiệu của enzyme, yếu tố kháng dinh dưỡng, chất xơ và khả năng hấp thụ khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong đường tiêu hóa. Tuy nhiên, các nghiên cứu in vitro đóng vai trò là một công cụ sàng lọc sơ bộ để xác định các điều kiện và phương pháp chế biến sử dụng trong chế biến thực phẩm. Khả năng tiêu hoá của protein trong nghiên cứu in vitro thường được thực hiện bằng cách đo lường các acid amin tự do được giải phóng từ protein trong chế độ ăn uống sau khi thủy phân bằng các enzyme tiêu hóa dưới pH và nhiệt độ riêng biệt. Phương pháp này có ưu điểm là dễ thực hiện, chi phí thấp [40-42]. Các nghiên cứu về khả năng tiêu hoá in vitro của protein từ rong đều được thực hiện ở các phân đoạn protein trích ly trong môi trường kiềm. Khả năng tiêu hoá in vitro được kiểm tra dựa trên ba loại enzyme là pepsin, pancreatin và pronase với cơ chất 13 casein. Khả năng tiêu hoá của các protein kiềm từ Porphyra và Ulva pertusa đạt 70% đến 95% khi thuỷ phân bằng pronase. Một số nghiên cứu khác cho thấy, các phân đoạn protein tan trong nước hay tan trong dung dịch ionic từ Palmaria palmata và Ulva Armoricana nhạy cảm với trypsin trong khi các phân đoạn protein từ Ulva nhạy cảm với các enzyme trong dịch tiêu hoá của người [21, 43]. Một nghiên cứu ở Nhật Bản trong điều kiện in vivo trên đối tượng protein thu nhận từ rong P. tenera và U. pinnatifida cho thấy chất xơ trong rong có ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tiêu hoá protein ở chuột Wistar. Tương tự, ở rong L. japonica chất xơ cũng được báo cáo là làm giảm tỷ lệ tiêu hóa protein ở chuột, mặc dù chuột đã được nuôi để thích nghi với chế độ ăn nhiều chất xơ trong 3 tuần. Các tác giả cho rằng phlorotannin và hàm lượng polysaccharides cao là những yếu tố chính ảnh hưởng tiêu cực đến khả năng tiêu hóa của protein rong [42, 44-46]. 1.3. Kỹ thuật thu nhận protein 1.3.1. Kỹ thuật trích ly protein Các phương pháp trích ly và tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan… của protein cần thu nhận. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc trích ly các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể tức là protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó, cần sử dụng các biện pháp khác nhau. Các tác nhân thường sử dụng trong quá trình trích ly và thu nhận protein đó là sự thay đổi nhiệt độ, nồng độ proton (pH) và sử dụng các dung môi hóa học. Ngoài ra, các tác động khác như cơ học, sóng siêu âm... có ảnh hưởng đến quá trình tách chiết protein. Tác nhân chủ yếu được sử dụng để trích ly protein trong rong là dung môi kiềm. Fleurence chỉ ra rằng việc trích ly protein qua hai giai đoạn, lần đầu bằng nước khử ion và lần thứ hai bằng dung môi NaOH 0,1M và 2-mercaptoethanol cho hiệu suất trích ly protein cao nhất trên hai loài rong Ulva rigida và Ulva rotundata. Barbarino và Lourenço đã nghiên cứu quá trình trích ly protein từ 15 loại rong khác nhau và đưa ra một quy trình trích ly và thu nhận protein từ rong. Tác giả đã chỉ ra rằng sử dụng dung dịch NaOH 0,1N với sự hỗ trợ của quá trình đồng hóa trên rong được lạnh đông sẽ cho hiệu suất trích ly tốt nhất [18, 47]. 14

Tuy nhiên, việc trích ly protein bị hạn chế bởi các thành phần polysaccharides trong thành tế bào như alginates trong Phaeophyta hoặc các carrageenans trong Rhodophyta. Số lượng lớn polysaccharides trung tính (như xylans và cellulose) trong một số loài rong đỏ và rong lục cũng có thể ảnh hưởng đến việc trích ly các protein[48]. Các hợp chất phenolic cũng đóng một vai trò quan trọng trong việc hạn chế hiệu quả của quá trình trích ly protein. Để cải thiện khả năng hòa tan của protein rong biển, người ta sử dụng các chất phụ gia như chất tẩy rửa hoặc sử dụng phương án hỗ trợ xử lý kiềm trong các phương pháp cổ điển. Việc loại bỏ polysaccharide trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ giúp tăng hiệu quả thu nhận protein. Một phương án thường được lựa chọn là sử dụng hệ enzyme phân hủy thành tế bào. Amano và Noda đề xuất việc sử dụng các enzyme phá vỡ thành tế bào rong Porphyra yezoensis tạo điều kiện thuận lợi cho việc trích ly và nghiên cứu protein. Một nghiên cứu đã được thực hiện trên các loài rong đỏ Chondrus Crispus, Gracilaria verrucosa và Palmaria palmate sử dụng các enzyme khác nhau, kết quả cho thấy hoạt động của các/ carrageenase và cellulase đã giúp hiệu quả thu nhận protein tăng 10 lần [21, 47-50]. Trong số các phương pháp trích ly mới hiện nay đang được áp dụng, có thể kể đến phương pháp SFE (supercritical fluid extraction) sử dụng CO2 siêu tới hạn để trích ly polysaccharide có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng ung thư từ rong Sargassum pallidum. Phương pháp PLE (pressurized liquid extraction - sử dụng dung môi lỏng để trích ly ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao) được coi là thân thiện với môi trường vì giảm lượng dung môi sử dụng, nhanh và giúp giữ được tính chất của các chất có hoạt tính sinh học do quá trình trích ly được thực hiện trong điều kiện không có oxy và ánh sáng. PLE cũng được đã ứng dụng để tách các chất có khả năng kháng khuẩn và kháng oxi hóa từ rong nâu Himanthalia elongate [3]. Một phương pháp mới khác cũng được sử dụng để trích ly các thành phần protein, carbohydrate… từ rong là sử dụng sóng siêu âm. Sóng siêu âm có vùng tần số 20-40kHz ngày càng được ứng dụng nhiều trong công nghệ thực phẩm dựa trên các tác động hóa học và cơ học của sự sủi bong bóng. Hiện tượng xâm thực khí (sự hình thành và phá vỡ các bọt khí) sẽ tạo ra một sóng năng lượng có lực cắt lớn và tạo ra sự hỗn loạn trong vùng sủi bong bóng. Kết quả là sự đảo trộn và tốc độ truyền khối trong quá trình trích ly sẽ được tăng cường, thành tế bào bị phá vỡ, nguyên liệu rắn bị giảm kích thước và 15 diện tích tiếp xúc giữa bề mặt nguyên liệu và dung môi sẽ tăng lên đáng kể. Siêu âm đã được sử dụng trong các quá trình trích ly để thu nhận các chất có hoạt tính sinh học từ rong nâu Sargassum pallidum và thu nhận protein từ rong đỏ Palmaria palmate [3, 51, 52]. 1.3.2. Kỹ thuật tinh sạch protein Sau khi nhận được dịch chiết protein thô, các phương pháp khác nhau đã được sử dụng để tinh sạch protein. Trong nhóm các phương pháp truyền thống có phương pháp kết tủa bằng các tác nhân khác nhau như dung môi hữu cơ, muối trung tính, polymer, chất đa điện phân, kết tủa tại điểm đẳng điện, kết tủa bằng ion kim loại... Nhóm phương pháp này có đặc điểm dễ thực hiện, tác nhân tủa dễ kiếm, phổ biến. Tuy nhiên hiệu quả tinh sạch không cao so với nhóm các phương pháp hiện đại. Các phương pháp hiện đại hơn được sử dụng khá phổ biến để tinh sạch protein bao gồm thẩm tích, lọc màng, sắc kí lọc gel, sắc kí trao đổi ion, sắc kí ái lực. Ưu điểm của nhóm này cho phép thu nhận protein mục tiêu với hiệu quả cao hơn. 1.3.2.1. Phương pháp kết tủa Tủa là một trong những phương pháp tách và phân đoạn protein cổ điển nhất những vẫn được sử dụng rộng rãi cho đến ngày nay. Có nhiều phương pháp tủa protein khác nhau nhưng về cơ bản là thông qua quá trình biến đổi tính chất có hệ thống như nhiệt độ, lực ion, độ pH, các đặc tính điện môi để tủa protein. Phương pháp tủa protein cũng được sử dụng trong công nghiệp mặc dù có một số hạn chế liên quan đến thiết bị và quy trình công nghệ. Tuy nhiên, ngay cả trong điều kiện tốt nhất vẫn không tránh khỏi sự tủa của hỗn hợp protein kèm theo các tạp chất khác. Do vậy, để thu được protein tinh sạch thì sau khi tủa, việc chiết tách và tinh sạch protein vẫn phải tiếp tục nhờ các kỹ thuật đặc hiệu hơn. Phương pháp này được ứng dụng khá phổ biến trong phòng thí nghiệm và công nghiệp để thu nhận các hợp chất có giá trị trong rong biển như thu nhận enzyme protease, thu nhận lectin, thu nhận protein R-phycoerythrin, thu nhận C-phycocyanin từ Spirulina [53-55]. Kết tủa protein bằng muối trung tính Bản chất của quá trình là tạo tủa protein nhờ bổ sung vào dịch protein muối trung hòa ở nồng độ cao. Để tủa protein người ta sử dụng một số muối khác nhau, nhưng 16 thông dụng hơn cả là muối sulfate, citrate, phosphate và chloride. Trong thực tiễn phòng thí nghiệm, muối (NH4)2SO4 được sử dụng nhiều nhất vì nó hòa tan tốt và không đắt tiền. Tuy vậy, việc sử dụng muối này ở quy mô sản xuất lớn lại bị hạn chế vì phế thải và protein lẫn tạp nhiều muối. Trong phòng thí nghiệm thường phải tiến hành lọc gel hay thẩm tích để tách muối ra khỏi protein.

Nồng độ (NH4)2SO4 thường sử dụng nằm trong khoảng 40-80% độ bão hòa. Ahmad và cộng sự (2014) sử dụng muối amonium sulfat để nghiên cứu thu nhận các protein có hoạt tính sinh học từ rong lục Halimeda macrobola. Sử dụng nồng độ muối 60-80% độ bão hòa kết tủa được hiệu quả nhất protein có hoạt tính sinh học. Để thu nhận enzyme Phosphoenolpyruvate carboxylase từ rong lục Selenastrum minutum, và enzyme Tryptophan synthase từ rong Euglena gracilis thì có thể tinh sạch kết tủa bằng lọc gel. Bele và cộng sự sử dụng tủa muối trước khi lọc gel để thu nhận lipase và protease từ rong biển. Oliveira và cộng sự cũng sử dụng muối (NH4)2SO4 80% độ bão hòa để kết tủa lectin trước khi tinh sạch bằng sắc kí ái lực [56-59]. Kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ Tủa bằng dung môi hữu cơ có mặt trong nhiều quy trình sản xuất. Tuy nhiên, dung môi hữu cơ có khả năng làm biến tính protein ngay cả ở nhiệt độ thường. Do vậy, quá trình tủa protein bằng dung môi hữu cơ phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp 0-50C và chọn lựa dung môi thích hợp. Các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu để kết tủa whey protein và sấy khô để thu protein concentrate. Ethanol là dung môi an toàn hơn hai dung môi còn lại. Methanol và n-propanol cho whey protein concentrate ít tan hơn so với protein concentrate kết tủa từ ethanol trong khi n-butanol cho whey protein concentrate chứa nhiều béo và lactose nên gần như không tan trong nước. Phương pháp kết hợp TCA/aceton được ứng dụng để thu nhận proteomics từ rong đỏ Gracilaria changii và rong Alexandrium sp. cho kết quả tốt [60, 61]. Kết tủa protein tại điểm đẳng điện Điểm đẳng điện xuất hiện khi tổng điện tích của protein bằng 0, lực tương tác tĩnh điện thấp nhất là nguyên nhân dẫn đến các phân tử tập hợp lại với nhau. Ở điểm đẳng điện, độ hydrate hóa của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein dẫn đến tạo tủa. Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có giá trị pH đẳng 17

điện giới hạn. Vì điểm đẳng điện của dịch trích thô bao gồm của rất nhiều protein khác nhau, có thể có cả phức hợp protein và acid nucleic. Phương pháp này đạt hiệu quả không cao nhưng thường áp dụng kết hợp với các phương pháp khác. Garba và Kaur đã kết tủa protein ở điểm đẳng điện để thu nhận protein từ đậu nành và cho thấy pH = 4,2 cho lượng kết tủa lớn nhất, sau đó mới tiến hành lọc membrane để nâng cao độ tinh sạch của protein. Cách làm tương tự cũng được tiến hành trên đối tượng là vi tảo Chlorella vulgaris. Phycobiliprotein từ Porphyra yezoensis cũng được thu nhận bằng cách kết hợp tủa ở điểm đẳng điện với ammonium sulfat [62-64]. Kết tủa bằng các tác nhân khác - Tủa bằng polymer: Các loại polymer sử dụng bao gồm: polyacrylic acid, polysaccharide, polyphosphate. Ưu điểm của phương pháp là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, dễ thu hồi polymer, hiệu suất tạo kết tủa cao. Chi phí cho phương pháp này cao. - Tủa bằng chất đa điện phân: Thường dùng polyethylene glycol có phân tử lượng 6.000 và 20.000 để tủa protein. Có thể sử dụng với lượng chất này rất nhỏ, hiệu suất tạo kết tủa cao. Nhược điểm của phương pháp này là rất đắt tiền và dễ gây biến tính protein [65]. 1.3.2.2. Phương pháp thẩm tích Thẩm tích là sự khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm đối với những chất keo hòa tan (protein, một số các polysaccharide) nhưng thấm đối với các dạng dung dịch của các tinh thể. Các tinh thể có thể khuếch tán qua màng theo định luật Fick [66]. Trong quá trình tách chiết và tinh sạch protein, để loại bỏ muối amonium sulfate ra khỏi dung dịch protein, thường cho dung dịch protein vào các túi đặc hiệu làm bằng nguyên lệu bán thấm (thường dùng là màng cellophane). Protein là những đại phân tử không thể vượt qua túi thẩm tích và được giữ lại trong túi. Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa có thể tẩy sạch muối ra khỏi protein. Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy khuấy cơ học hay máy khuấy từ hoặc là quay chậm túi nhờ dao động cơ không lớn. Khi thẩm tích các protein thường người ta tiến hành tất cả ở môi trường lạnh. Thẩm tích thường được dùng kết hợp sau một phương pháp tinh sạch ban đầu, phổ biến nhất là sau phương pháp kết tủa với muối amonium sulfat. Sau khi thẩm tích, tùy 18 yêu cầu mức độ tinh sạch của chế phẩm mà người ta sẽ dừng lại hoặc tiếp tục với các phương pháp tinh sạch khác như sắc kí hay lọc màng. 1.3.2.3. Phương pháp sắc kí Sắc ký lọc gel Sắc ký lọc gel là một trong những kỹ thuật sắc ký cột được dùng phổ biến trong tách chiết và tinh sạch protein. Kỹ thuật này cho phép phân tách các loại protein trên cở sở đặc điểm khác nhau của các loại protein về hình dạng và kích thước và phân tử lượng của protein có trong hỗn hợp. Lọc gel là phương pháp phổ biến được dùng để thu nhận protein có giá trị cao trong rong như phycocyanin, lectin. Sau khi tinh sạch sơ bộ bằng muối amonium sulfat trong chế phẩm protein vẫn còn sót muối và các tạp chất khác, để nâng cao độ tinh sạch và ứng dụng của chúng, người ta sử dụng lọc gel để đạt được mục đích này [61, 67, 68]. Sắc ký trao đổi ion Phương pháp sắc ký trao đổi ion được dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhân trao đổi ion. Tác nhân trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhóm sinh ion hoặc là chất ionit. Đây là những chất mang trơ, không tan trong nước, có bản chất là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc là chất nhựa polistirol. Thu nhận C-Phycocyanin được thực hiện từ ba loại tảo Spirulina sp., Phormidium sp. và Lyngbya sp. qua nhiều công đoạn, trước hết dịch trích được kết tủa với muối ammonium sulfat, sau đó tiếp tục qua sắc kí trao đổi ion trên cột DEAE–Sepharose CL- 6B. Độ tinh khiết của C-phycocyanin (A620/A280) thu được tăng lần lượt là 4,42; 4,43; và 4,59 lần (Anamika Patel và cộng sự, 2005). Với độ tinh sạch cao (tăng >4,0 lần) chế phẩm C-PC có thể ứng dụng được trong công nghiệp dược phẩm. Lectin từ rong đỏ nước mặn được tinh sạch bằng phương pháp tủa với muối amonium sulfat 60% trước khi qua thiết bị lọc trao đổi ion sử dụng cột lọc DEAE-cellulose, độ tinh sạch của lectin tăng 16,5 lần [69, 70]. 1.3.2.4. Phương pháp lọc membrane Membrane là loại màng đặc biệt có thể phân riêng một cách chọn lọc các cấu tử có kích thước khác nhau, từ những hợp chất cao phân tử như tinh bột, protein cho đến các chất có kích thước phân tử thấp như ion hóa trị một. Các phương pháp membrane 19

được phân loại theo đường kính mao dẫn gồm vi lọc – MF, lọc nano – NF, siêu lọc – UF và thẩm thấu ngược – RO. Trích ly, tinh sạch các hợp chất từ thực vật bằng kỹ thuật membrane được nhiều nhà khoa học nghiên cứu. Ưu điểm vượt trội của phương pháp membrane bao gồm sự cải thiện về chất lượng sản phẩm, chi phí năng lượng thấp. Đối với protein từ thực vật sử dụng màng lọc UF hoặc kết hợp với các phương pháp khác cho chất lượng sản phẩm cô đặc cao hơn so với phương pháp truyền thống, nhưng vẫn giữ được các tính chất công nghệ của sản phẩm. Sử dụng membrane với các hệ thống màng MF, NF, UF, RO liên tiếp cho phép thu được các hợp chất polyphenol với các phân tử lượng khác nhau từ thấp đến cao, hiệu quả trích ly cũng cao hơn so với sử dụng dung môi truyền thống [71]. Sử dụng siêu lọc để thu nhận protein là mục tiêu của nhiều nghiên cứu hiện nay để có thể tìm được quy trình tối ưu ứng dụng vào thực tiễn sản xuất. Đặc biệt hiện nay người ta sử dụng phương pháp này để thu các loại protein từ rong như Protein isolate từ rong tảo [72-74]. 1.4. Phân tích tính chất của chế phẩm protein concentrate

1.4.1. Tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate

Protein trích ly từ rong ngày càng được quan tâm do thành phần độc đáo và khả năng ứng dụng công nghiệp rộng rãi của chúng. Các kỹ thuật trích ly khác nhau được sử dụng như trích ly có hỗ trợ enzyme, sử dụng sóng siêu âm, dung môi siêu tới hạn… cho phép trích ly được các hợp chất có hoạt tính sinh học mà không bị phân hủy. Hoạt tính sinh học của chế phẩm protein concentrate từ rong bao gồm khả năng chống oxy hóa của các acid amin, protein và phycobilins (phycocyanin, phycoerythrin), hay các đặc tính kháng khuẩn, kháng vi-rút, chống nấm [75]. Sheih và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận peptide khi thuỷ phân protein từ rong Chlorella vulgaris. Hoạt tính chống oxi hóa lipid của peptide được đánh giá bằng phương pháp ORAC. Hoạt động chống oxi hóa của các peptide ở nồng độ 7,6 ng/mL mạnh hơn khoảng 26 lần so với của Trolox [76]. Các peptide thu nhận từ protein của rong Palmaria palmate và Undaria pinnatifida hoạt động mạnh trên các gốc DPPH và hydroxyl [77, 78]. Peptide thu nhận từ rong Ulva fasciata còn cho thấy khả năng chống 20 lại các phản ứng gây stress tế bào bởi bức xạ UVB. Trong nghiên cứu của Shiu và Lee (2005), các tác giả đã giải thích khả năng này có liên quan đến chu trình glutathione ascorbate với các enzyme hoạt động như một hệ thống phòng thủ chống oxi hóa [79]. Nghiên cứu của Beaulieu và cộng sự đã cho thấy, dịch chiết protein và các peptide thu được khi thuỷ phân protein từ rong Sacarina longicruris có khả năng kháng khuẩn, có thể được sử dụng trong việc giảm hư hỏng thực phẩm. Sử dụng kỹ thuật khối phổ (LC-MS/MS) có thể phân tích các peptide từ các tiền chất protein như ubiquitin, histones, các đoạn protein giàu leucine và protein ribosome ở rong S. longicruris. Chúng có khả năng kháng cao với vi khuẩn Staphylococcus aureus [80]. Khả năng kháng khuẩn của nhiều loài rong lục như Ulva, Cladophora, Halimeda, Enteromorpha và Acetabularia cũng đã được ghi nhận [81, 82]. 1.4.2. Tính chất chức năng của chế phẩm protein concentrate

Protein có thể có mặt trong thực phẩm ở trạng thái rắn hoặc lỏng, dạng thuần nhất hoặc hỗn hợp. Nó là hợp phần có sẵn hoặc đưa vào để tạo giá trị dinh dưỡng, tạo hình và tạo kết cấu đặc trưng cho thực phẩm. Trong các điều kiện công nghệ nhất định, protein có thể tương tác với nhau, với nước, glucid, lipid để tạo độ đặc, độ dẻo, độ trong, tạo bọt, tạo độ xốp cho sản phẩm. Các tính chất chức năng của protein chính là các tính chất hóa lý tạo nên các đặc tính mong muốn cho sản phẩm chứa protein [83]. Các tính chất chức năng của protein được chia làm ba nhóm: - Hydrate hóa (phụ thuộc vào liên kết protein – nước) như khả năng hút ẩm, giữ nước, trương nở, dẻo dính, phân tán, hòa tan, tạo độ nhớt… - Các tính chất do liên kết giữa protein – protein như là khả năng đông tụ, tạo gel, kết tủa và tạo các cấu trúc khác (như tạo sợi, tạo màng, tạo bột nhão…). - Các tính chất bề mặt liên quan đến sức căng bề mặt như khả năng tạo nhũ tương, tạo bọt… Để đánh giá khả năng ứng dụng của protein từ sinh khối rong – một loại protein mới - trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm, ngoài giá trị dinh dưỡng, cần đánh giá các tính chất chức năng công nghệ của protein. Các tính chất này bao gồm khả năng hydrate hóa, khả năng tạo nhũ, tạo bọt, tạo gel. Các khả năng tạo tính chất chức năng này phụ thuộc vào thành phần cấu tạo, cấu trúc của bản thân protein từ rong và của các yếu tố tác động 21 bên ngoài như pH môi trường, sự hiện diện của các thành phần phi protein. Đồng thời, các yếu tố bên ngoài này phản ánh sự phù hợp của protein từ rong so với các nhóm sản phẩm thực phẩm sẽ được ứng dụng trong tương lai [84]. 1.4.2.1. Khả năng hòa tan của protein Đây là một chỉ số có giá trị khi đánh giá tính chất chức năng của một loại protein cụ thể. Tính chất hóa lý này sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt, khả năng tạo nhũ, tạo bọt, tạo gel của protein. Khả năng hòa tan của protein nói chung và protein từ sinh khối rong nói riêng trước tiên phụ thuộc vào thành phần acid amin trên bề mặt của phân tử protein. Ngoài ra, khả năng này còn phụ thuộc nhiều vào giá trị pH, nồng độ muối và nhiệt độ của môi trường [83]. Thông thường, các loại protein tan kém trong môi trường trung tính và acid nhẹ. Độ hòa tan của protein tăng mạnh khi pH dưới giá trị 2-3 và trên 8-9. Tại điều kiện pH này, để hòa tan tốt, protein cần có một mạng lưới các nhóm chức tích điện âm và điện dương để tạo lực đẩy giữa các phân tử. Nồng độ muối làm thay đổi tương tác giữa các protein nên làm thay đổi khả năng hòa tan. Nhiệt độ thay đổi, cấu trúc không gian của phân tử protein có thể bị ảnh hưởng. Sự thay đổi này có thể tạo ra một trong 2 hiệu ứng trái ngược nhau là tăng cường hoặc làm giảm tương tác giữa các phân tử protein gây ra sự thay đổi khả năng hòa tan của protein. 1.4.2.2. Khả năng hấp thu nước của protein Khả năng hấp thu nước ảnh hưởng nhiều đến tính chất cảm quan của thực phẩm như duy trì độ ẩm, độ tươi mới cho thực phẩm đóng gói, ảnh hưởng tới độ nhớt của các sản phẩm soup, custard. Tương tự như các loại protein khác từ đậu nành và các hạt có dầu, khả năng hấp thu nước của protein thu nhận từ sinh khối rong phụ thuộc vào thành phần acid amin. Khả năng này cũng thay đổi tùy thuộc vào số lượng các nhóm chức tích điện, mức độ kỵ nước và cấu trúc của phân tử protein cũng như các yếu tố nhiệt độ, pH và lực ion trong môi trường [84-86]. 1.4.2.3. Khả năng tạo gel Dung dịch keo protein sẽ chuyển thành dạng gel khi có sự gia tăng tương tác giữa các phân tử protein. Khi mối tương tác này đạt đến một giới hạn nhất định, một mạng lưới liên tục sẽ được hình thành. Khi tính mềm dẻo có thể thấy được bằng mắt thường 22 thì hệ thống đó chính là gel. Cấu trúc của khối gel có ảnh hưởng tới cấu trúc của nhiều loại thực phẩm như phô mai, đậu hũ [84] . Khả năng tạo gel của protein thu nhận từ sinh khối rong bao gồm các yếu tố xác định việc hình thành gel và các tính chất vật lý của gel. Các yếu tố xác định việc hình thành gel bao gồm nồng độ protein, các thành phần làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, sự tương tác với các polymer khác, sự tương tác giữa các phân tử protein dẫn đến hình thành các phase đơn. Các yếu này được quyết định bởi kích thước, hình dạng, điểm đẳng điện, loại tương tác, sự phân bố các nhóm chức trên phân tử protein thu nhận từ các loại rong tảo [83, 85]. 1.4.2.4. Khả năng tạo bọt Quá trình hình thành hệ bọt thực phẩm gồm có 3 giai đoạn: hình thành, giữ bền và sử dụng. Protein sẽ nhanh chóng hấp thu lên bề mặt của bọt khí vừa hình thành, tại bề mặt phân chia pha khí/nước, làm giảm sức căng bề mặt và thay đổi độ nhớt của pha liên tục. Protein từ rong có khả năng tạo ra lớp màng bền giữa các bọt khí, hạn chế hiện tượng khuếch tán không khí giữa các bọt khí và giữ bền hệ bọt khá tốt [83, 85]. 1.4.2.5. Khả năng tạo và làm bền nhũ tương Khả năng làm bền nhũ tương không chỉ thể hiện qua kích thước của của các hạt dầu của pha phân tán mà còn thể hiện ở độ bền của hệ nhũ. Đối với hệ nhũ tương, protein đóng vai trò ổn định bề mặt phân cắt giữa pha nước và pha dầu vì chúng sẽ hấp thu lên bề mặt các giọt dầu vừa được hình thành sau quá trình đồng hóa và làm bền lớp màng này. Protein giúp làm giảm sức căng bề mặt tác động lên các giọt dầu hoặc tạo ra lực đẩy giữa các giọt dầu, ngăn cản hiện tượng hợp giọt. Một số nghiên cứu về tính chất chức năng của protein concentrate và protein isolate từ đậu nành, quả óc chó (walnut), hạt đậu đũa… cho thấy, sau khi hấp thu lên bề mặt phân chia 2 pha, protein sẽ có các biến đổi nhất định về phân tử. Lúc này, một phần protein sẽ được bao quanh bởi nước còn phần còn lại sẽ được dầu bao bọc. Trong môi trường này, sau một khoảng thời gian nhất định, protein sẽ thay đổi cấu trúc trên bề mặt phân tử và có thể hình thành một bề mặt khó phá vỡ, từ đó hạn chế hiện tượng hợp giọt, là nguyên nhân phá vỡ hệ nhũ tương [84, 87, 88]. Khả năng nhũ hóa của protein thu nhận từ sinh khối rong phụ thuộc vào bề mặt kị nước, tỷ lệ các nhóm ưa nước và cấu hình của phân tử protein, cũng như các yếu tố môi 23 trường có ảnh hưởng đến kích thước hạt phân tán như nhiệt độ, pH, lực ion. Trong thực tế sản xuất, khả năng này của protein còn phụ thuộc sự hiện diện của các polymer sinh học, các chất hoạt động bề mặt và điều kiện chế biến và bảo quản nguyên liệu như như gia nhiệt, làm lạnh, đồng hóa, khuấy cơ học [83]. 1.4.3. Giá trị dinh dưỡng của chế phẩm protein concentrate

1.4.3.1. Tiêu hóa protein và hấp thu protein Sự tiêu hóa protein bắt đầu trong dạ dày và kết thúc trong ruột non. Tại dạ dày, pepsin sẽ tiêu hóa protein. Tuy nhiên, pepsine không thể thủy phân toàn bộ protein thành amino acid mà chỉ cắt các liên kết peptide giữa một số amino acid chuyên biệt làm cho chuỗi polypeptid dài bị cắt thành nhiều sợi ngắn hơn. Tại ruột non, tụy tạng phóng thích các trypsin và chymotrypsin, tuy nhiên 2 enzyme này cũng chỉ cắt đứt các liên kết peptid giữa một số acid amin chuyên biệt và chưa tạo ra các acid amin tự do. Một nhóm enzyme khác là exopeptidase, xúc tác sự tách các amino acid từ các đầu tận cùng của chuỗi, nhờ đó hoàn tất quá trình tiêu hóa. Các sản phẩm của sự tiêu hóa protein là các acid amin tự do, các dipeptide và các tripeptid được hấp thu qua màng tế bào ruột bằng cách vận chuyển tích cực với năng lượng do ATP cung cấp. Các dipeptide và tripepetide được thủy phân thành acid amin tự do trong các tế bào ruột. Chỉ có các acid amin tự do được chuyên chở vào các mao mạch [89, 90]. Sản phẩm tiêu hóa protein là các acid amin, được hấp thu vào máu tới gan. Ở gan, một phần acid amin được giữ lại và được tổng hợp thành protein huyết tương như albumin, globulin và fibrinogen. Phần lớn các acid amin được chuyển tới tế bào để tổng hợp các protein đặc trưng như hemoglobin, các hormon của tuyến nội tiết, protein của các mô cơ, của các kháng thể và các enzyme [91]. Các yếu tố ảnh hưởng đến hấp thu protein Nồng độ acid amin: khi nồng độ acid amin trong ruột tương đương với nồng độ acid amin trong máu thì tốc độ hấp thu cao nhất. Ngoài ra, cơ thể hấp thu protein tốt khi các acid amin có tỷ lệ cân đối, theo một tương quan số lượng nhất định giữa các loại acid amin. Loại acid amin nào vượt quá mức tương quan đó thì cơ thể không hấp thu và 24 thải ra ngoài. Điều này có ý nghĩa khi phối chế thức ăn tổng hợp cần đảm bảo tỷ lệ cân đối các acid amin. Tính chọn lọc trong hấp thu: do sự điều tiết của thần kinh và nội tiết. Những acid amin hấp thu vào cơ thể tham gia trao đổi ngay thì hấp thu nhanh. Ảnh hưởng các thành phần dinh dưỡng khác như của vitamin, đường. B1, B6 cần thiết cho quá trình trao đổi chất của các trung tâm gắn nối và vận chuyển. Khi thiếu vitamin thì sự hấp thu acid amin bị trở ngại. Khi hấp thu galatose, glucose thì ức chế hấp thu leucine 1.4.3.2. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vitro Giá trị dinh dưỡng của protein thể hiện ở thành phần acid amin, tỉ lệ các acid amin thiết yếu, khả năng tiêu hóa của protein và khả năng hấp thu, sử dụng các acid amin sau quá trình tiêu hóa của cơ thể. Đánh giá khả năng tiêu hóa in vitro là đánh giá trong điều kiện mô phỏng theo quá trình tiêu hóa protein xảy ra trong đường tiêu hóa của người bằng các enzyme phân cắt protein. Các enzyme dùng mô phỏng là hệ thống pepsine- pancreatin hoặc papain. Khả năng tiêu hóa được đánh giá thông qua tỉ lệ protein được phân cắt. Phương pháp này có ưu điểm là ít tốn thời gian, lượng mẫu cần ít, rất phù hợp với việc dự đoán giá trị dinh dưỡng của các loại protein mới. Kết quả thu được từ phương pháp này có độ tương đồng cao với phương pháp in vivo trên nhiều loại protein động vật lẫn thực vật [92]. 1.4.2.3. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo Phương pháp đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo được dùng để chỉ những thí nghiệm dùng các mô sống hay toàn bộ cơ thể còn sống làm đối tượng thử nghiệm. Giá trị của phương pháp in vivo thể hiện rất thực tế. Một hợp chất nào đó biểu hiện được hoạt tính khi được thử nghiệm ngoài cơ thể sống (in vitro) nhưng chưa chắc đã có hoạt tính mong muốn khi thử nghiệm trên cơ thể sống. Chính vì vậy thử nghiệm in vivo vẫn được coi là bước thử nghiệm cần thiết. Để đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo, các chỉ số sau đây được tính toán dựa trên các số liệu thu được từ các thử nghiệm trên động vật. Chỉ số BV (Biological value) Thể hiện hiệu quả sử dụng protein đối với cơ thể. Khi protein được hấp thu qua đường tiêu hóa sẽ được cơ thể sử dụng để chuyển thành protein trong mô. Thành phần 25 protein trong thực phẩm chứa đầy đủ 9 loại amino acid thiết yếu sẽ giúp cơ thể sử dụng hiệu quả nguồn protein này và chuyển hóa thành protein cơ thể. Giá trị BV phụ thuộc vào mức độ phù hợp giữa thành phần acid amin của protein thức ăn với protein cơ thể. Khi thành phần acid amin trong thực phẩm khác xa với thành phần acid amin trong cơ thể thì chúng không thể chuyển hóa thành protein cơ thể. Nhóm nitơ của các acid amin này sẽ được thải ra bên ngoài qua đường tiết niệu dưới dạng urea. Khi lượng nitơ được cơ thể giữ lại không nhiều sẽ làm tỉ lệ nitơ do được giữ lại và nito hấp thu qua đường tiêu hóa thấp [93]. Mức độ tiêu hóa Mức độ tiêu hóa protein ảnh hưởng lên giá trị dinh dưỡng của protein. Protein động vật có mức độ tiêu hóa cao hơn protein thực vật vì các enzyme tiêu hóa khó hoặc không thể tấn công vào tế bào thực vật do tế bào được bao quanh bởi vách cellulose và các thành phần hóa gỗ. Lượng nitơ (N) thải ra trong phân thường chiếm khoảng 10- 25% lượng N ăn vào. Chỉ một phần N thải ra này được thải trực tiếp từ N đã hấp thu vào cơ thể, ngoài ra còn có N thải ra từ đường tiêu hóa và N của các vi khuẩn sinh sống trong phân. Khả năng tiêu hóa được xác định bằng cách đo N thải ra trong phân của các cá thể thử nghiệm trừ đi N trong phân khi sử dụng khẩu phần ăn không có chứa protein sau đó lấy lượng N ăn vào trừ đi kết quả thu được này [94, 95]. Các cá thể vật thử nghiệm được nuôi bằng khẩu phần ăn không có protein sẽ được sử dụng khẩu phần ăn có các thành phần còn lại giống hệt như các cá thể ăn khẩu phần có chứa protein. Kết quả tính được chính là khả năng tiêu hóa thực và được biểu diễn bằng tỉ lệ protein N hấp thu. Tỉ lệ này cần phải phù hợp với nhu cầu duy trì và phát triển cơ thể. Khả năng tiêu hóa thường được so sánh, đối chiếu với protein trứng, thịt hoặc cá thì các loại protein này thường có khả năng tiêu hóa đạt 100. Mức độ tiêu hóa thường khác nhau ở các protein thực phẩm nguồn gốc tự nhiên vì các thành phần phi protein trong thực phẩm có thể ảnh hưởng tới mức độ tiêu hóa như thành phần chất xơ và các polyphenol. Các phản ứng hóa học xảy ra cũng làm thay đổi việc giải phóng các acid amin từ protein sau khi protein được enzyme phân cắt [94]. Hệ số tăng trọng lượng (PER - Protein efficiency ratio) PER là một chỉ số dùng để đo lường chất lượng protein. PER giúp so sánh khối lượng tăng trọng của cơ thể chuột sau ít nhất 10 ngày được nuôi bằng thức ăn chứa protein 26 so với lượng protein ăn vào. PER phản ánh giá trị sinh học vì chỉ số này đo lượng protein được giữ lại trong mô cơ thể. Protein thực vật thường có giá trị PER thấp trong khi protein động vật thường có chỉ số PER trên 2.0 [93]. Tỉ lệ hấp thu protein tịnh (NPR – Net Protein Ratio) NPR được tính toán tương tự như PER nhưng ngoài việc dựa trên trọng lượng tăng thêm khi động vật thí nghiệm được cho ăn thức ăn có chứa protein, NPR còn tính thêm trọng lượng giảm đi khi động vật thí nghiệm này sử dụng khẩu phần ăn không chứa protein. Với công thức tính như thế, giá trị NPR của một loại protein cụ thể luôn cao hơn PER. Sự chênh lệnh giá trị của 2 chỉ số này nhiều hay ít tùy thuộc vào loại protein. Ví dụ, độ chênh lệch 2 chỉ số này ở thịt bò nạc là 88% trong khi ở bột mì thấp hơn. Như vậy giá trị NPR không chỉ thể hiện rằng protein cần cho phát triển cơ thể mà còn cần cho duy trì sự sống của sinh vật. Độ chênh lệch của NPR so với PER càng lớn thì protein đang nghiên cứu được sử dụng nhiều cho mục đích duy trì sự sống [95].

27

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Rong mền Chaetomorpha sp. được thu nhận sau 15 – 20 ngày phát triển tùy thuộc vào điều kiện thời tiết, được thu tại các ao nuôi tôm quảng canh tại huyện Giá Rai, Bạc Liêu. Rong được vận chuyển trong thùng xốp trong ngày đến phòng thí nghiệm (tại Viện sinh học nhiệt đới). Tại phòng thí nghiệm, rong được rửa để loại tạp chất, sau đó phơi khô, xay nhỏ và sấy tới độ ẩm 5%, bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng.

a b c

Hình 2.1. (a) Rong Chaetomorpha sp.; (b) Mẫu đã được sấy khô; (c) Mẫu được nghiền thành bột.

2.1.2. Dụng cụ, thiết bị, hoá chất Dụng cụ và thiết bị Dụng cụ: Các dụng cụ thí nghiệm phổ biến trong phòng thí nghiệm sinh hóa như: ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác, micropipet… Thiết bị: Các thiết bị phổ biến trong phòng thí nghiệm sinh hóa: máy đo pH, cân phân tích, tủ sấy, máy ly tâm, máy xay, máy quang phổ, bồn siêu âm… Enzyme Cellulase của hãng Genecor (Mỹ) với tên thương mại là Crestone Conc. Đây là một loại enzyme endo-1,4-β-D-glucanase ( EC 3.2.1.4) được Genecor phát triển, có khả năng hoạt động tốt trong vùng pH trung tính từ 6,0 – 7,5, nhiệt độ từ 450C – 550C; có hoạt tính 1.100 UI/ml. Chủng vi sinh vật 28

Các chủng vi sinh vật gây bệnh do ATCC (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Mỹ) cung cấp. − Staphylococcus aureus (ATCC 13709) − Escherichia coli (ATCC 25922) − Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) Chuột thí nghiệm Chuột thí nghiệm có tên thường gọi là chuột bạch hay nhắt trắng, tên khoa học là Mus musculus. Phân loại khoa học − Giới: Animalia − Ngành: Chordata − Lớp: Mammalia − Bộ: Rodentia − Họ: Muridae − Phân họ: Murinae − Chi: Mus − Phân chi: Mus − Loài: M. musculus Chuột được mua tại Viện Pasteur (167 Pasteur, Phường 8, Quận 3, TP. Hồ Chí Minh). Chuột được nuôi khoảng 5- 6 tuần tuổi, có trọng lượng khoảng 16- 20g, sức khỏe bình thường và không có bệnh tật. 2.2. Sơ đồ nghiên cứu

29

Rong nguyên Khảo sát quá trình xử lý nguyên liệu Sấy khô, xay nhỏ Khảo sát và tối ưu hóa quá Enzyme trình trích ly nhóm protein tan trong nước Xử lý enzyme Dịch trích protein

Bã Khảo sát và tối ưu hóa quá Dung môi kiềm trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm Trích ly protein

Dịch trích protein

Khảo sát điều kiện kết tủa protein Kết tủa protein

Thẩm tích loại muối

Sấy đông khô

Hình thái, cấu trúc Chế phẩm PC tan Tính chất chức năng trong nước và tan Tính chất sinh học trong kiềm Giá trị dinh dưỡng

Hình 2.2. Sơ đồ quy trình thu nhận chế phẩm Protein concentrate (PC) tan trong nước và tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp.

30

Thuyết minh quy trình Sau khi thu nhận, rong mền được rửa sạch để loại bỏ tạp chất. Tiến hành khảo sát các điều kiện của quá trình tiền xử lý rong bao gồm nhiệt độ sấy, kích thước nguyên liệu sau khi xay nhỏ để chuẩn bị điều kiện tốt nhất cho quá trình trích ly. Rong nguyên liệu (bột mịn) được sử dụng để trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của siêu âm (sử dụng bể siêu âm với tần số 35 kHz) và enzyme cellulase. Trong quá trình này, đề tài sẽ khảo sát các điều kiện tối ưu của quá trình trích ly có sự hỗ trợ của enzyme: loại dung dịch đệm (sử dụng làm dung môi trích ly), tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm, pH môi trường, nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ trích ly. Sau khi trích ly, phần dịch nổi sẽ được sử dụng trong các nghiên cứu tiếp theo về nhóm protein tan trong nước. Phần bã rong sẽ được sử dụng để tiếp tục trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH. Quá trình trích ly cũng được khảo sát để xác định các điều kiện trích ly tốt nhất: tỷ lệ cơ chất và dung môi, nồng độ dung môi (pH), nhiệt độ và thời gian trích ly. Sau khi trích ly, phần dịch nổi sẽ được thu nhận để tiến hành tinh sạch protein thông qua quá trình kết tủa bằng muối (NH4)2SO4 và thẩm tích. Quá trình kết tủa protein được khảo sát ở các điều kiện gồm tỷ lệ dung dịch muối bão hòa, nồng độ muối bão hòa và thời gian kết tủa. Hai chế phẩm Protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. (nhóm tan trong nước và tan trong kiềm) thu được sau khi sấy đông khô sẽ được kiểm tra hình thái cấu trúc, xác định thành phần sinh hóa, kích thước phân tử, các tính chất chức năng, tính chất sinh học và giá trị dinh dưỡng, nhằm định hướng ứng dụng trong các lĩnh vực công nghệ thực phẩm. 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm

2.3.1. Xác định các nhóm protein trong rong

Phương pháp của Hu và Esen được sử dụng để xác định tỷ lệ bốn nhóm lớn của protein trong rong dựa vào khả năng hòa tan của chúng trong các dung môi khác nhau. [96, 97]. Rong sẽ được xử lý lần lượt bằng nước cất (30ml:1g mẫu), NaCl 0,5M (30ml:1g mẫu), ethanol 70% (20ml:1g mẫu) và NaOH 0,1M (25ml:1g mẫu). Sau mỗi lần trích ly, mẫu sẽ được ly tâm 14.000 rcf/10 phút. Phần dịch nổi sẽ được giữ lại để xác định protein, phần rắn được sử dụng để trích ly với dung môi tiếp theo. 31

2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein

Mục tiêu của khảo sát là đưa ra các thông số kỹ thuật cho quá trình tiền xử lý nguyên liệu trước khi tiến hành trích ly protein. Các yếu tố được khảo sát bao gồm ảnh hưởng của nhiệt độ sấy rong và kích thước rong sau khi xay. Quá trình trích ly được tiến hành tương tự như mô tả ở Hình 2.2. Sau khi trích ly, tiến hành ly tâm thu dịch trích, xác định hàm lượng protein trong dịch trích bằng phương pháp Lowry và Kjeldahl. Thí nghiệm được bố trí như trong Bảng 2.1. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm cho quá trình tiền xử lý nguyên liệu

Bước tiền xử lý nguyên liệu

Đề mục Nhiệt độ Kích thước Thông số cố định cho quá trình trích ly sấy rong rong sau khi (oC) xay (mm) 40 Lượng rong 3g 60 Tỷ lệ cơ chất và dd đệm 1:10 2.3.2.1 80 0,25 Trích ly protein tan trong nước Nồng độ enzyme 100UI/g 105 Thời gian trích ly 60 phút Nhiệt độ trích ly 50oC Trích ly protein tan trong kiềm Nhiệt độ sấy 1,0 Nồng độ NaOH 1% rong được 2.3.2.2 0,5 Tỷ lệ cơ chất và dd NaOH 1:10 lựa chọn từ 0,25 Thời gian trích ly 60 phút 2.3.2.1 0,1 Nhiệt độ trích ly 50oC 2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein tan trong nước có sự hỗ trợ của enzyme cellulase

Mục tiêu của khảo sát là đưa ra các thông số kỹ thuật cho quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước từ rong Chaetomorpha sp. với sự hỗ trợ của enzyme. Các yếu tố được khảo sát gồm loại dung dịch đệm (dung môi trích ly), pH, tỷ lệ nguyên liệu và dung dịch đệm, nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian trích ly. Các nghiệm thức thí nghiệm được trình bày ở Bảng 2.2. 32

Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát quá trình trích ly protein có sự hỗ trợ của enzyme Tỷ nguyên Nồng độ Nhiệt độ Thời gian Dung môi trích Đề mục pH liệu và đệm enzyme trích ly trích ly ly (w/v) (UI/g) (oC) (phút) Nước cất Citrate 0,1M 2.3.2.1 7,0 1:10 100 50 60 Phosphate 0,1M MES 0,1M 5,0 5,5 Dung dịch đệm 6,0 2.3.2.2 đã chọn từ 6,5 1:10 100 50 60 2.3.2.1 7,0 7,5 8,0 1:5 pH đã 1:10 Dung dịch đệm chọn 1:15 2.3.2.3 đã chọn từ 100 50 60 từ 1:20 2.3.2.1 2.3.2.2 1:25 1:30 50 pH đã Tỷ lệ cơ Dung dịch đệm 75 chọn chất:dd đệm 2.3.2.4 đã chọn từ 100 50 60 từ đã chọn từ 2.3.2.1 125 2.3.2.2 2.3.2.3 150 Nồng độ 30 pH đã Tỷ lệ cơ Dung dịch đệm enzyme 40 chọn chất: dung 2.3.2.5 đã chọn từ đã chọn 50 60 từ môi đã chọn 2.3.2.1 từ 60 2.3.2.2 từ 2.3.2.3 2.3.2.4 70 60 Nồng độ pH đã Tỷ lệ cơ Nhiệt độ 120 Dung dịch đệm enzyme chọn chất: dung ủ enzyme 180 2.3.2.6 đã chọn từ đã chọn từ môi đã chọn đã chọn 240 2.3.2.1 từ 2.3.2.2 từ 2.3.2.3 từ 2.3.2.5 360 2.3.2.4 480 Ngoài nhóm protein tan trong nước, đề tài cũng quan tâm đến một loại protein đặc biệt trong phân đoạn này là Phycocyanin. Đây là một loại protein tan trong nước chiếm 33 tỷ lệ thấp nhưng lại thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quan trọng. Vì vậy, hàm mục tiêu của nghiên cứu này ngoài hàm lượng protein hòa tan còn có cả hàm lượng Phycocyanin. 2.3.4. Tối ưu hóa quá trình trích ly protein tan trong kiềm có sự hỗ trợ của enzyme

Quá trình tối ưu hóa được thực hiện dựa trên mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Moddle 5.0. Bảng 2.3. Mô hình tối ưu hóa 3 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm

STT Yếu tố (X1) Yếu tố (X2) Yếu tố (X3) 1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 3 -1 1 -1 4 1 1 -1 5 -1 -1 1 6 1 -1 1 7 -1 1 1 8 1 1 1 9 -1,682 0 0 10 1,682 0 0 11 0 -1,682 0 12 0 1,682 0 13 0 0 -1,682 14 0 0 1,682 15 0 0 0 16 0 0 0 17 0 0 0

Mô hình được thiết lập với 3 thông số biến đổi được lựa chọn từ kết quả khảo sát

đơn yếu tố, gồm X1, X2, X3. Hàm mục tiêu (Y) được lựa chọn là hiệu suất trích ly protein. Phương trình hồi quy của hàm mục tiêu Y theo biến X được biểu diễn dưới dạng sau: 2 푌 = 푎0 + 푎1푋1 + 푎2푋2 + 푎3푋3 + 푎12푋1푋2 + 푎13푋1푋3 + 푎23푋2푋3 + 푎11푋1 2 2 + 푎22푋2 + 푎33푋3 34

2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH

Bã rong sau khi trích ly nhóm protein tan trong nước sẽ được sử dụng để tiếp tục trích ly nhóm protein tan trong kiềm. Các yếu tố được khảo sát trong quá trình trích ly protein bằng dung môi NaOH gồm tỷ lệ dung môi và cơ chất, nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian trích ly. Thí nghiệm được bố trí như trong Bảng 2.4. Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu quá trình trích ly protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH Tỷ lệ cơ chất: Nồng độ dung Nhiệt độ trích Thời gian trích Đề mục dung môi môi (%) ly (oC) ly (Phút) 1:10 1:15 2.3.4.1 1:20 1,00 40 60 1:25 1:30 0,25 0,50 Tỷ lệ cơ chất: 0,75 2.3.4.2 dung môi đã 40 60 1,00 chọn từ 2.3.4.1 1,25 1,50 30 Tỷ lệ cơ chất: Nồng độ dung 40 2.3.4.3 dung môi đã môi đã chọn từ 50 60 chọn từ 2.3.4.1 2.3.4.2 60 70 30 Tỷ lệ cơ chất: Nồng độ dung Nhiệt độ trích ly 45 2.3.4.4 dung môi đã môi đã chọn từ đã chọn từ 60 chọn từ 2.3.4.1 2.3.4.2 2.3.4.3 75 90

2.3.6. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH

Quá trình tối ưu hóa được thực hiện dựa trên mô hình quy hoạch thực nghiệm bậc 2 với sự hỗ trợ của phần mềm Moddle 5.0. 35

Mô hình được thiết lập với 2 thông số biến đổi được lựa chọn từ kết quả khảo sát

đơn yếu tố, gồm X4, X5. Hàm mục tiêu (Y) được lựa chọn là hiệu suất trích ly protein. Phương trình hồi quy của hàm mục tiêu Y theo biến X được biểu diễn dưới dạng: 2 2 푌 = 푎0 + 푎4푋4 + 푎5푋5 + 푎45푋4푋5 + 푎44푋4 + 푎55푋5 Bảng 2.5. Mô hình tối ưu hóa 2 yếu tố với 3 thí nghiệm tại tâm

STT Yếu tố (X4) Yếu tố (X5) 1 -1 -1 2 -1 1 3 1 -1 4 1 1 5 -1,682 0 6 1,682 0 7 0 -1,682 8 0 1,682 9 0 0 10 0 0 11 0 0

2.3.7. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein 2.3.7.1. Khảo sát quá trình kết tủa đẳng điện Mục tiêu của khảo sát là tìm ra giá trị pI đẳng điện của protein thu nhận từ rong Chaetomorpha sp. Dịch trích protein tan trong nước và trong kiềm thu được từ thí nghiệm 2.3.4 và 2.3.6 được sử dụng để kết tủa protein tại các giá trị pH khác nhau (từ pH 1,0 đến 5,0). Sau thời gian tủa từ 30-120 phút ở nhiệt độ phòng, hỗn hợp được ly tâm thu kết tủa và xác định hàm lượng protein để đánh giá mức độ tinh sạch. 2.3.7.2. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng ethanol Trong các dung môi tan trong nước như methanol, ethanol, n-butanol đã được nghiên cứu sử dụng để kết tủa protein, chúng tôi lựa chọn ethanol để kết tủa protein từ rong Chaetomorpha sp. vì dung môi này tương đối an toàn. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa được khảo sát bao gồm: Nồng độ ethanol từ 60-99 (% v/v), tỷ lệ dịch trích:dung môi từ 2:1 đến 6:1 (v/v), thời gian tủa từ 10-60 phút. Hàm mục tiêu là hàm lượng protein thu được trong kết tủa (hay độ tinh sạch của protein). 36

2.3.7.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 Mục tiêu của khảo sát là đưa ra các thông số kỹ thuật cho quá trình kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4. Dịch trích thu được từ quá trình trích ly được sử dụng để kết bằng muối (NH4)2SO4 ở các tỷ lệ dịch trích:dung dịch muối khác nhau (1:1; 1,5:1; 2:1; 2,5:1; 3:1 v/v), nồng độ muối bão hòa 40-80% (phần trăm bão hòa được pha theo hướng dẫn ở phụ lục A1), thời gian kết tủa từ 0-60 phút. Hàm mục tiêu là hàm lượng protein thu được trong kết tủa (hay độ tinh sạch của protein). 2.3.7.4. Nâng cao hàm lượng protein bằng phương pháp thẩm tích

Kết tủa protein thu được sau khi xử lý dịch trích với muối (NH4)2SO4 cần được thẩm tích để loại muối, nhằm nâng cao độ tinh sạch của protein. Hòa tan lại kết tủa protein đệm phosphate 0,1M pH 7,0 rồi cho vào túi thẩm tích cellophane 14kDa (không quá 2/3 thể tích túi). Cho thuốc sát trùng hoặc toluene để bảo quản protein. Buộc túi vào cá từ, sau đó đặt cả túi vào bình chứa một lượng dung dịch đệm phosphate 0,1M pH 7. Sử dụng máy khuấy từ để tăng tốc độ thẩm tích. Tiến hành thẩm tích trong 24 giờ. Cách 3 giờ thay đổi dung dịch đệm một lần. Sau quá trình thẩm tích loại muối, protein được sấy đông khô trong 24 giờ để đạt độ ẩm dưới 10% và bảo quản trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Mẫu chế phẩm dạng bột sau sấy đông khô sẽ được sử dụng để xác định hàm lượng protein. 2.3.8. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein từ rong Chế phẩm protein concentrate tan trong nước và tan trong kiềm từ sinh khối rong đầu tiên sẽ được xác định sơ bộ đặc điểm hình thái bằng kính hiển vi điện tử. Đặc điểm hình thái là thông tin quan trọng để đánh giá các tính chất chức năng của chế phẩm protein. Chế phẩm protein concentrate từ rong cũng có thể chứa nhiều phân đoạn protein, vì vậy để xác định kích thước phân tử và nghiên cứu các đặc điểm cấu trúc, cần tách riêng các phân đoạn protein này. Để tách các phân đoạn protein trong chế phẩm protein concentrate, đề tài sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel với cột 50x1,5 và hạt Biogel P – 100. Hạt gel sử dụng có kích thước 100 – 200 mesh (10 – 40µm). Phương pháp chuẩn bị gel, đổ cột và chạy mẫu được trình bày ở phụ lục A2. Dịch ra khỏi cột được đo OD ở bước sóng 280 nm; độ hấp thu được thể hiện dưới dạng sắc ký đồ. Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn protein thuộc cùng một peak sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein. 37

Các phân đoạn protein thu được sau đó sẽ được sử dụng để xác định kích thước phân tử. 2.3.9. Xác định tính chất sinh học của các chế phẩm protein concentrate 2.3.9.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Những chủng vi khuẩn và nấm kiểm định gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: − Staphylococcus aureus (ATCC 13709): cầu khuẩn gram (+), gây mủ các vết thương, vết bỏng, gây viêm họng, nhiễm trùng có mủ trên da và các cơ quan nội tạng. − Escherichia coli (ATCC 25922): gram (-), gây một số bệnh về đường tiêu hoá như viêm dạ dày, viêm đại tràng, viêm ruột, viêm lỵ trực khuẩn. − Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442): gram (-), trực khuẩn mủ xanh, gây nhiễm trùng huyết, các nhiễm trùng ở da và niêm mạc, gây viêm đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim, viêm ruột. Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch dinh dưỡng cơ bản LB (cách tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục A4) được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm protein. Mẫu đối chứng được sử dụng là kháng sinh Kanamycin 10µg/ml. 2.3.9.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hoá Khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein concentrate được đánh giá dựa trên nhiều cơ chế khác nhau, cụ thể như sau: a. Phương pháp thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do DPPH. Hoạt tính kháng oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của gốc tự do DPPH, được xác định bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm. Phương pháp thí nghiệm được trình bày ở phụ lục A5. b. Phương pháp thử nghiệm khả năng bắt gốc tự do ABTS•+. Hoạt tính kháng oxy hóa thể hiện qua sự thay đổi màu sắc của thuốc thử. Dung dịch ABTS•+ có màu lục đến xanh ngọc, có độ hấp thu cực đại tại bước sóng đặc trưng là 734 nm. Khi các hợp chất có tính oxy hóa cao tác dụng với dung dịch chứa ABTS•+, ABTS•+ bị khử chuyển thành dạng không màu ABTS-R+. Phương pháp thí nghiệm được trình bày ở phụ lục A6. 38

c. Phương pháp đánh giá khả năng tương tác với ion Fe2+. Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác các phản ứng oxy hóa sinh ra gốc tự do. Hoạt tính kháng oxy hóa của một hợp chất có thể được đánh giá thông qua khả năng phòng ngừa sự hình thành các gốc tự do nhờ khả năng chuyển các ion kim loại thành dạng phức. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên sự tạo phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử ferrozine. Khi ion sắt chuyển từ trạng thái tự do sang trạng thái phức với chất chống oxy hóa, cường độ màu của hỗn hợp phản ứng giảm. Phương pháp thí nghiệm được trình bày ở phụ lục A7. d. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào in vivo (thử nghiệm MDA). Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phương pháp thí nghiệm được trình bày ở phụ lục A8. 2.3.10. Xác định tính chất chức năng của protein Tiến hành xác định tính chất chức năng của các chế phẩm protein tan trong nước, protein tan trong kiềm từ rong nước lợ Chaetomorpha sp. và so sánh với protein concentrate từ đậu nành, casein theo các phương pháp mô tả bởi Anja S. (2014). Protein concentrate từ đậu nành là sản phẩm SPC60 của DKSH, Thuỵ Điển có hàm lượng protein trên 60%. Casein được mua của hãng Merck. Phương pháp tiến hành được trình bày cụ thể ở phụ lục A9-A13. 2.3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro 2.3.11.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) Khả năng tiêu hóa in vitro của protein là một giá trị quan trọng cần được đánh giá nhằm giúp dự đoán quá trình tiêu hóa protein trong đường ruột, khả năng hấp thu protein vào trong cơ thể, cũng như hiệu quả sử dụng protein của cơ thể. Khả năng tiêu hóa in vitro của chế phẩm protein được đánh giá theo phương pháp của Akeson và Stahmann (1964), đã được Almeid (2015) cải tiến. Trong đó, enzyme dùng để mô phỏng quá trình tiêu hóa protein là hệ thống pepsine-pancreatin. Khả năng tiêu hóa được đánh giá thông qua tỉ lệ protein được phân cắt bằng phương pháp Kjeldahl [98, 99]. Phương pháp tiến hành được trình bày chi tiết ở phụ lục A14. 39

2.3.11.2. Chỉ số AAS – Amino acid score Giá trị AAS thể hiện hiệu quả sử dụng của protein mục tiêu sau khi protein được hấp thụ. AAS được tính toán bằng cách so sánh thành phần acid amin của protein với nhu cầu acid amin của từng lứa tuổi cụ thể. Đây là một chỉ số được WHO sử dụng rộng rãi, có thể thay thế chỉ số PER khi đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo. 퐴 퐴퐴푆 = 푁 A: Hàm lượng amino acid trong protein (mg/g) N: Nhu cầu amino acid cần thiết của cơ thể theo khuyến nghị (mg/g) (WHO/FAO/UNU,2007) 2.3.11.3. Chỉ số PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring) PDCAAS là giá trị được tính toán dựa trên kết quả dự đoán khả năng tiêu hóa protein và AAS của các acid amin có trong protein. PDCAAS dùng để đánh giá các loại thực phẩm đành cho trẻ em và người lớn (trừ thai phụ). PDCAAS được tính bằng cách xác định AAS và nhân với mức độ tiêu hóa protein IVPD [100]. 퐴퐴푆×퐼푉푃퐷 푃퐷퐶퐴퐴푆 = 100 AAS: Amino acid score của các loại amino acid thiết yếu của protein IVPD: Khả năng tiêu hóa của protein trong điều kiện in vitro 2.3.12. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo

Mô hình in vivo được thực hiện trên đối tượng chuột bạch (Musmusculus), khoảng 5-6 tuần tuổi, trọng lượng 16 – 20g. Các cá thể chuột được cân trọng lượng và chia thành 4 nhóm với 4 chế độ ăn riêng biệt. Nhóm 1: Chế độ ăn không chứa protein Nhóm 2: Chế độ ăn thường (thức ăn Viện Pasteur cung cấp) Nhóm 3: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein APC từ rong Chaetomorpha sp. Nhóm 4: Chế độ ăn AIN 93 có chứa protein từ đậu nành Các chỉ tiêu được được khảo sát là hệ số tăng trọng trọng (PER), tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR), giá trị sinh học BV được thực hiện theo phương pháp được trình bày ở phụ lục A15-A17. Bên cạnh đó các chỉ số glucose, triglyceride, HDL-C và LDL- 40

C trong máu chuột cũng được đo lường để đánh giá tình trạng sức khỏe của chuột trong thời điểm thu mẫu máu. Bảng 2.6. Thành phần thức ăn được thiết kế theo AIN 93 dành cho chuột trưởng thành [101]. Thành phần Hàm lượng (g/kg thức ăn) Tinh bột ngô 465,692 Casein (protein) 140,000 Maltodextrin 155,000 Sucrose 100,000 Dầu đậu nành 40,000 Chất xơ (cellulose) 50,000 Hỗn hợp khoáng chất 35,000 Hỗn hợp vitamin 10,000 L-Cystine 1,800 Choline bitartrate 2,500 Tert- 0,008 butylhydroquinone

Hình 2.3. Chuột thí nghiệm trong điều kiện in vivo

2.4. Phương pháp phân tích

- Các thành phần hóa sinh của rong được xác định theo phương pháp LAPS (Standard compositional laboratory analytical procedure) được mô tả bởi Dien và cộng sự, 2010. Theo đó, hàm lượng protein thô được xác định bằng phương pháp Kjeldahl, lipid được xác định bằng phương pháp Soxhlet; các chỉ tiêu carbohydrate tổng, đường tổng, tinh bột, chất xơ (dietar fiber), hàm lượng tro và ẩm được xác định theo các phương pháp của FAO và AOAC. 41

- Hàm lượng protein hòa tan thu được sau các quá trình trích ly được xác định bằng phương pháp Lowry. Ngoài ra, đề tài cũng quan tâm đến một loại protein đặc biệt trong phân đoạn protein tan trong nước từ rong là Phycocyanin. Thành phần protein này được xác định bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis (phương pháp trình bày ở phụ lục A3). - Hàm lượng protein trong các mẫu dịch trích, kết tủa và chế phẩm protein concentrate cũng được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. - Cấu trúc của rong nguyên liệu, bã rong sau khi xử lý enzyme và siêu âm, chế phẩm protein concentrate được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét - Scanning Electron Microscope (SEM). - Thành phần acid amin trong các chế phẩm protein thu nhận từ sinh khối rong được phân tích bằng phương pháp HPLC sử dụng thiết bị của hãng Waters, cột Aminex của Biorad và đầu dò RI tại trung tâm Phân tích Kỹ thuật cao Sài Gòn. - MW của protein thu nhận từ rong được xác định bằng phương pháp điện di SDS PAGE và bằng phương pháp LC-MS/MS tại Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP.HCM. - Các chỉ tiêu kháng oxi hoá được phân tích tại phòng thí nghiệm Trung tâm Sâm và Dược liệu. - Các chỉ số đường glucose, triglyceride, HDL-C và LDL-C trong máu chuột được phân tích tại Bệnh viện 115. 2.5. Phương pháp xử lý số liệu

Tất cả các thí nghiệm được thực hiện 3 lần lặp lại. Kết quả được xử lý thống kê bằng phần mềm Statghraphics, đánh giá sự khác biệt giữa các kết quả thu được ở mức ý nghĩa α=0,05. Số liệu tối ưu hóa quá trình trích ly bằng quy hoạch thực nghiệm bậc 2 được xử lý bằng phần mềm Moodle 5.0.

42

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Thành phần protein trong rong 3.1.1. Xác định thành phần sinh hóa của rong Theo kết quả khảo sát của Dự án “Nhiên liệu sinh học từ sinh khối thủy sinh Việt Nam” do Viện Sinh học nhiệt đới chủ trì, các loài rong nước lợ phân bố tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long gồm Chaetomorpha sp., Enteromorpha sp., Cladophora sp. Cả ba loài rong này đều thuộc ngành rong lục mọc tự nhiên trong các ao nuôi tôm nước lợ quảng canh và các kênh mương tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả khảo sát cho thấy, trong 3 loại rong này, rong Chaetomorpha sp. là loài rong xuất hiện chủ yếu trong ao nuôi tôm. Sự xuất hiện với mật độ vừa phải của loài rong này sẽ giúp cải thiện môi trường ao nuôi, làm thức ăn cho tôm và tăng năng suất tôm nuôi. Kết quả thu mẫu tại hiện trường và đánh giá sản lượng rong cũng cho thấy rong Chaetomorpha sp. đạt sinh khối trung bình trong một số ao nuôi tôm quảng canh là 6.430 kg/ha, cao nhất đến 19.056 kg/ha, khả năng nuôi trồng rong thu sinh khối lớn là rất khả thi. Dựa vào các kết quả của dự án, rong Chaetomorpha sp. được sử dụng làm đối tượng cho quá trình nghiên cứu thu nhận protein. Rong được thu nhận sau 15 – 20 ngày thả rong giống, thời gian thu nhận rong tùy thuộc vào điều kiện thời tiết. Tuy nhiên, rong được thu nhận vào cuối giai đoạn ổn định, khi rong chưa chuyển sang giai đoạn suy thoái. Rong Chaetomorpha sp. có thể phát triển trên nền đáy cát bùn ở độ sâu 1,5m cho tới sát mặt nước ở độ sâu 0,2m. Rong phát triển trong nước thành từng sợi rất dài từ 2 – 4m. Hình 3.1 cho thấy hình ảnh các cọng rong dài sau khi được vớt lên. Khi thu hoạch rong mền, dựa vào màu sắc bên ngoài, có thể thấy rong thường phân thành 3 lớp như hình 3.2. - Lớp trên: là lớp rong mọc gần mặt nước, có màu xanh nhạt chuyển sang vàng. - Lớp giữa: là lớp rong mọc ở giữa, có màu xanh lá non chuyển sang xanh đậm. - Lớp dưới: là lớp rong mọc ở sâu gần lớp cát bùn, có màu xanh sẫm và chuyển sang nâu. Lớp rong này khi vớt lên thường bị lẫn nhiều bùn. Tuy nhiên, sự phân biệt rong thành các lớp chỉ bằng mắt thường rất khó chính xác và không khách quan. Do đó mà khi thu hoạch, rong được thu toàn bộ, rửa sạch để làm nguyên liệu cho các thí nghiệm. 43

Hình 3.1. Thu hoạch rong mền tại thực địa

Hình 3.2. Phơi rong sau thu hoạch Rong sau khi thu hoạch, phơi sấy và xay mịn sẽ được đem phân tích các thành phần sinh hóa. Các thành phần sinh hóa cơ bản của nguyên liệu rong được trình bày trong Bảng 3.1. Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần sinh hóa của rong Thành phần sinh hóa (%) Các thành Lipid Tro Protein Carbohydrate phần khác (2,03 ± 0,015)a (27,44 ± 0,633)d (12,68 ± 0,551)c (47,19 ± 0,955)e (10,66 ± 0,241)b * Trong cùng một hàng, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α = 0,05). 44

Kết quả cho thấy, hàm lượng carbohydrate chiếm tỷ lệ cao trong thành phần sinh khối rong Chaetomorpha (47,19%). Với tỷ lệ carbohydrate cao này, rong Chaetomorpha đã được Dự án “Nhiên liệu sinh học từ sinh khối thủy sinh Việt Nam” sử dụng làm nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa sinh khối thành đường và lên men ethanol. Hàm lượng lipid của rong Chaetomorpha sp. tương đối thấp chỉ khoảng 2%. Hàm lượng protein trong rong đạt 12,68%, hàm lượng này nằm trong khoảng trung bình khi so sánh với hàm lượng protein của một số loài rong lục như Ulva, Cladophora, và Enteromorpha [102]. Kết quả phân tích thành phần sinh hóa của rong sử dụng trong thí nghiệm là phù hợp với một số nghiên cứu đã có của nhiều tác giả về thành phần sinh hóa của rong biển nhiệt đới của nhiều tác giả đã thực hiện như Kumar và cộng sự, 2010; Barbarino và Lourenço, 2005; Neveux và cộng sự, 2015 [18, 19, 103]. Hàm lượng protein trong rong Chaetomorpha sp. không cao khi so sánh với hàm lượng protein trong đậu nành là nguồn nguyên liệu thực vật thường được sử dụng để thu nhận các chế phẩm protein concentrate và isolate. Tuy nhiên việc tách chiết protein từ rong, theo sau đó là sử dụng bã rong sau khi tách protein để sản xuất ethanol sinh học và phân bón vi sinh sẽ tạo ra chuỗi giá trị khép kín của nguyên liệu với nhiều sản phẩm đa dạng, tạo công ăn việc làm cho người nông dân, mở ra hướng phát triển bền vững cho nguồn nguyên liệu hiện đang bị bỏ phí này. 3.1.2. Xác định các nhóm protein trong rong

Dựa theo Damodaran, protein được chia thành bốn nhóm chính dựa trên độ hòa tan của chúng. Những nhóm này bao gồm các loại albumin hòa tan trong nước, globulin hòa tan trong muối, glutelin có thể hòa tan trong acid loãng hoặc kiềm và prolamin có thể hòa tan trong ethanol 70%. Với phương pháp của Hu và Esen, rong sẽ được xử lý lần lượt bằng nước cất; NaCl 0,5M; ethanol 70% và NaOH 0,1M để xác định các nhóm protein. Kết quả phân tích các nhóm protein trong rong được thể hiện trong Bảng 3.2 [96, 104]. Trong nghiên cứu này, hàm lượng protein hoà tan được đo bằng phương pháp Lowry sử dụng albumine huyết thanh bò làm tiêu chuẩn. Kết quả này được tham khảo từ nghiên cứu của tác giả Barbarino và cộng sự khi đánh giá các phương pháp định lượng protein từ các loại rong lớn và vi tảo [18]. 45

Kết quả đo hàm lượng protein được trích ly lần lượt bằng từng loại dung môi nước, muối, ethanol và kiềm cho thấy, protein từ rong Chaetomorpha sp. có tỷ lệ protein tan trong kiềm cao nhất 55,27 %, nhóm tan trong nước chiếm 34,33 % so với tổng số protein trích được. Hai nhóm protein tan trong muối và ethanol có tỷ lệ thấp lần lượt 6,07 % và 4,32 %. Tỷ lệ từng nhóm protein sẽ thay đổi tùy thuộc vào từng đối tượng nguyên liệu, chẳng hạn trên đối tượng là hạt hướng dương, bốn nhóm protein có tỷ lệ lần lượt globulin (55 – 60%), albumin (17 – 23%), glutelin (11 – 17%) và prolamin (1 – 4%) so với tổng số protein thô (Jitendra và cộng sự). Ngoài ra, hàm lượng protein trong nguyên liệu còn biến động tùy thuộc vào mùa vụ, vị trí địa lý. Trong các loại protein thì albumin và globulin là các protein có vai trò dự trữ về mặt dinh dưỡng, trong khi glutelin đóng vai trò trong việc tạo ra các tính chất chức năng cho protein [84, 105, 106]. Bảng 3.2. Kết quả phân tích các nhóm protein rong Chaetomorpha sp. Hiệu suất trích ly Hàm lượng % so với tổng hàm % so với tổng hàm Nhóm protein protein lượng protein trong lượng protein trích (mg/g rong khô) rong khô ly được Nhóm tan trong nước (20,02 ± 1,662)b 15,79 34,33 Nhóm tan trong dung (3,54 ± 0,176)a 2,79 6,07 dịch NaCl 0,5M Nhóm tan trong (2,52 ± 0,191)a 1,99 4,32 ethanol 70% Nhóm tan trong dung (32,24 ± 2,009)c 25,42 55,27 dịch NaOH 0,1M Protein có trong rong 126,8 ± 0,551 -- Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Kết quả kiểm tra hàm lượng protein có trong rong Chaetomorpha sp. cho thấy sự tương đồng với các kết quả từ những nghiên cứu trước của các tác giả Barbarino và Lourenço (2005) trên một số loại rong lục. Tuy nhiên, do phương pháp của Hu và Esen (1981) là phương pháp được áp dụng trên đối tượng ngô, nên hiệu suất thu nhận protein theo phương pháp này chỉ thu được khoảng 46% so với tổng lượng protein trong rong thô. Như vậy, phương pháp trích ly protein trên đối tượng rong Chaetomorpha sp. cần phải được khảo sát tối ưu ở các điều kiện cần thiết để đạt được hiệu quả trích ly tốt nhất [18, 96]. 46

Kết quả phân tích các nhóm protein trong rong là cơ sở cho việc lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình trích ly protein. Từ kết quả trên, rong Chaetomorpha sp. được sử dụng làm nguyên liệu để trích ly hai nhóm protein có hàm lượng cao là nhóm protein tan trong nước và nhóm protein tan trong kiềm. Nhóm protein tan trong nước được trích ly bằng dung môi thích hợp ở pH trung tính. Với nhóm protein tan trong kiềm, dung môi NaOH được lựa chọn cho quá trình trích ly protein. Ngoài ra, sóng siêu sâm và enzyme cellulase cũng được sử dụng để hỗ trợ tăng hiệu quả trích ly. Việc nghiên cứu về protein trong rong biển vẫn còn khá mới và chưa có nhiều nghiên cứu liên quan đến vấn đề này. Vì thế, chúng tôi không tìm được các nghiên cứu có liên quan đến việc phân loại protein theo khả năng hòa tan trên đối tượng rong biển để làm cơ sở so sánh. Tuy nhiên, ở phương diện khác, kết quả thí nghiệm cũng cho thấy việc lựa chọn NaOH làm dung môi trích ly là phù hợp với một số nghiên cứu của tác giả Barbarino và Lourenço , Field và cộng sự về việc trích ly và thu nhận protein từ một số loài rong biển nhiệt đới [18, 107]. 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly protein Rong sau khi thu hoạch được sấy khô ở các nhiệt độ khác nhau về độ ẩm dưới 10% và được xay mịn. Nguyên liệu sau khi tiền xử lý được sử dụng để trích ly protein tan trong nước với sự hỗ trợ của enzyme cellulase trong dung dịch đệm phosphate pH 7, nồng độ enzyme 100 UI/g cơ chất, nồng độ cơ chất 10% w/v trong thời gian 60 phút, ở nhiệt độ 500C. Sau khi kết thúc quá trình trích ly, hỗn hợp được ly tâm 14.000 rcf trong 10 phút và thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan. Phần bã rắn còn lại sau khi tách protein tan trong nước sẽ được tiếp tục sử dụng để tách chiết protein tan trong dung môi kiềm với nồng độ NaOH 1% w/v, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20, ở nhiệt độ 500C trong 60 phút. Sau khi trích ly, ly tâm thu phần dịch nổi để xác định hàm lượng protein hòa tan. Kết quả thể hiện sự ảnh hưởng của nhiệt độ sấy và kích thước rong sau khi xay được thể hiện ở Phụ lục B3 và B4. Sinh khối rong sau khi thu hoạch cần được phơi sấy để có thể bảo quản trong thời gian dài, đồng thời nhiệt độ sấy phải thích hợp để rong được xử lý nhanh chóng, tránh bị hư hỏng đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xay rong. Tuy nhiên, nhiệt độ sấy quá cao có thể làm biến tính protein và ảnh hưởng đến thành phần acid amin. Trong thí 47 nghiệm này, rong lục Chaetomorpha sp. được sấy khô ở nhiệt độ 600C và xay nhỏ về kích thước nhỏ hơn hay bằng 0,1mm cho kết quả trích ly protein tốt nhất. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Fudholi, nhiệt độ sấy ở 600C tạo ra rong biển có độ ẩm tương đối 10% w/w và chất lượng tốt nhất [108]. Kích thước nguyên liệu có ảnh hưởng lớn đến quá trình trích ly protein. Khi kích thước rong sau khi xay càng nhỏ thì diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi càng lớn, do đó tăng hiệu quả trích ly. Trong thí nghiệm này, rong được xay nhỏ bằng máy xay Retsch ZM200 (Đức), và xác định độ mịn trong cùng nhờ các rây dạng vòng có cỡ lỗ sàng thay đổi từ 1mm đến 0,1mm. Hiệu suất trích ly cao nhất đạt được với mẫu rong sau khi xay có kích thước 0,1mm. Như vậy, hiệu suất trích ly protein trong rong có giá trị tỷ lệ nghịch so với kích thước nguyên liệu. Kết quả thu được cho thấy có sự tương đồng với các kết quả của Norra và cộng sự khi nghiên cứu về ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đối với quá trình trích ly [109, 110]. 3.3. Quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước với sự hỗ trợ của cellulase 3.3.1. Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly protein với sự hỗ trợ của cellulase Để tăng hiệu quả trích ly nhóm protein tan trong nước, quá trình trích ly sẽ được thực hiện trong bể siêu âm. Ở các tế bào thực vật thành tế bào cấu tạo từ cellulose rất chắc chắn, do đó để việc phá vỡ tế bào có hiệu quả, ngoài sự hỗ trợ của các tác động vật lý như sóng siêu âm, enzyme cellulase cũng được sử dụng để cắt đứt các liên kết của thành tế bào và giải phóng protein. Nhìn chung, các cellulase thương mại phổ biến trên thị trường thường hoạt động trong vùng pH acid nhẹ từ 4 đến 6. Tuy nhiên, theo các kết quả khảo sát thì protein của rong Chaetomorpha chủ yếu là 2 nhóm có khả năng tan trong nước và tan trong kiềm. Ngoài ra, giá trị pI đẳng điện của protein từ rong lại nằm trong khoảng pH 3-4. Do đó nếu sử dụng các chế phẩm cellulase thông thường sẽ không hiệu quả trong việc hỗ trợ trích ly protein. Vì thế, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng một loại cellulase mới của hãng Genecor, có pH hoạt động từ 6 đến 7,5 để hỗ trợ quá trình trích ly protein từ rong Chaetomorpha. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly được lựa chọn khảo sát là loại dung dịch đệm thích hợp để vừa sử dụng làm dung môi trích ly vừa tạo pH thích hợp cho hoạt 48

động của cellulase, tỷ lệ nguyên liệu (cơ chất) và dung môi, nồng độ enzyme sử dụng, nhiệt độ và thời gian trích ly. Trong nhóm protein tan trong nước, đề tài cũng quan tâm đến một loại protein đặc biệt trong phân đoạn này là Phycocyanin. Đây là một loại protein chiếm tỷ lệ thấp nhưng lại thể hiện nhiều hoạt tính sinh học quan trọng. Vì vậy, trong nghiên cứu này hàm mục tiêu bao gồm hàm lượng protein hòa tan và hàm lượng Phycocyanin. Ảnh hưởng của dung dịch đệm và giá trị pH Trong bốn loại dung môi khảo sát là nước, đệm citrate 0,1M, đệm phosphate 0,1M, đệm MES 0,1M, hiệu suất trích ly protein thu được đạt cao nhất là 32,8 mg/g rong khô khi sử dụng dung dịch đệm phosphate 0,1M ở pH 7 (xem phụ lục B5). Kết quả thí nghiệm cũng cho thấy việc sử dụng dung dịch đệm sẽ có tác động hỗ trợ cho hoạt động của enzyme nhiều hơn so với chỉ dùng nước cất. Dung dịch đệm có vai trò ổn định pH cho hoạt động của enzyme, giữ vai trò quan trọng trong các quá trình có sự tham gia của enzyme. Dung dịch đệm này cũng thích hợp để trích ly nhóm protein tan trong nước, không gây biến tính và kết tủa protein [111]. Enzyme rất nhạy cảm đối với pH của môi trường và mỗi enzym có vùng pH hoạt động tối ưu riêng. Do enzyme có nguồn gốc protein nên khi pH thay đổi sẽ ảnh hưởng tới cấu hình không gian, độ phân ly các nhóm chức cấu tạo nên trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó làm thay đổi và có thể ức chế hoạt động của enzyme. Ngoài vai trò đối với hoạt động của enzyme cellulase, pH còn là yếu tố quan trọng trong quá trình trích ly protein tan trong nước. pH làm ảnh hưởng tới điện tích bề mặt của phân tử protein và có thể ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của protein [112-115]. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước pH dung dịch Hàm lượng Phycocyanin Hàm lượng protein (mg/g rong đệm (mg/g rong) khô) 5,0 (0,127 ± 0,0051)a (19,89 ± 0,75)a 5,5 (0,157 ± 0,0033)b (21,76 ± 0,56)ab 6,0 (0,179 ± 0,0059)c (22,87 ± 1,66)b 6,5 (0,209 ± 0,0063)d (28,59 ± 1,24)c 7,0 (0,226 ± 0,0115)e (33,85 ± 1,23)e 7,5 (0,207 ± 0,0121)d (30,91 ± 0,94)d 8,0 (0,187 ± 0,0042)c (28,04 ± 11,86)c 49

Trong thí nghiệm này, pH tối ưu cho hoạt động của enzyme cellulase và quá trình trích ly protein tan trong nước là pH 7, tại đó hàm lượng Phycocyanin và protein hòa tan thu được là cao nhất. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu:dung môi và nồng độ enzyme Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi và nồng độ enzyme đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước Tỷ lệ nguyên Hàm lượng Hàm lượng Nồng độ Hàm lượng Hàm lượng liệu và dung Phycocyanin protein (mg/g enzyme Phycocyanin protein (mg/g dịch đệm (w/v) (mg/g rong) rong khô) (UI/g) (mg/g rong) rong khô) 1:5 (0,142 ± 0,0056)a (21,88 ± 0,83)a 50 (0,169 ± 0,0053)a (22,11 ± 0,86)a 1:10 (0,172 ± 0,0096)b (23,93 ± 0,61)b 75 (0,251 ± 0,0269)b (28,34 ± 1,08)b 1:15 (0,178 ± 0,0033)b (25,15 ± 1,82)b 100 (0,333 ± 0,0226)c (36,15 ± 0,86)c 1:20 (0,224 ± 0,0168)d (34,38 ± 0,33)c 125 (0,348 ± 0,0081)c (37,18 ± 1,74)c 1:25 (0,207 ± 0,0208)cd (34,66 ± 0,94)c 150 (0,352 ± 0,0191)c (38,00 ± 2,17)c 1:30 (0,192 ± 0,0021)cb (34,74 ± 1,07)c Về nguyên tắc, với cùng một khối lượng nguyên liệu, khi tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly tăng do tăng sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi. Tuy nhiên, nếu sử dụng lượng dung môi quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích, đồng thời hiệu suất trích ly cũng không gia tăng đáng kể. Theo kết quả ở bảng 3.4, hiệu suất trích ly protein và hàm lượng Phycocyanin thu được cao nhất ở tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20.

Trong thí nghiệm này, tỷ lệ nguyên liệu dung môi cũng quyết định nồng độ cơ chất trong phản ứng của enzyme cellulase. Về mặt lý thuyết, khi tăng nồng độ cơ chất (hay giảm tỷ lệ nguyên liệu:dung môi) trong hỗn hợp thì tốc độ thủy phân thành tế bào rong của enzyme tăng và lượng protein trích ly được sẽ nhiều hơn. Tuy nhiên, quá trình thủy phân thành tế bào rong bằng enzyme cellulase là một quá trình xúc tác dị thể, trong đó enzyme hòa tan trong nước và nằm ở pha lỏng còn cơ chất cellulose lại ở dạng rắn. Vì thế khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất là một yếu tố hết sức quan trọng. Nồng độ cơ chất quá cao có thể làm tăng độ nhớt môi trường và gây cản trở cho hoạt động của enzyme. Điều đó lý giải cho việc khả năng thủy phân thành tế bào rong của enzyme cellulase để hỗ trợ trích ly protein đạt hiệu quả cao ở vùng nồng độ cơ chất thấp, hay ở tỷ lệ nguyên liệu:dung môi 1:20 [116]. 50

Với một lượng cơ chất xác định, khi nồng độ enzyme càng tăng thì hiệu suất của phản ứng enzyme càng tăng. Hiệu suất trích ly protein đạt mức tối ưu là 36,15 mg/g rong khô, hàm lượng Phycocyanin đạt cao nhất 0,333 mg/g rong khô khi nồng độ enzyme là 100 UI/g cơ chất. Tuy nhiên, nếu lượng enyme tăng cao quá so với lượng cơ chất có sẵn thì hiệu suất phản ứng sẽ không tăng nữa. Do lượng enzyme dư thừa so với lượng cơ chất có sẵn nên không đủ cơ chất cho enzyme hoạt động. Ngoài ra, trong hệ phản ứng enzyme dị thể, khả năng tiếp xúc không tốt giữa enzyme trong pha lỏng và cơ chất ở dạng rắn cũng là một yếu tố hạn chế hoạt tính của enzyme, kể cả khi sử dụng ở nồng độ cao. Nồng độ enzyme 100UI/g cơ chất cũng được sử dụng khi nghiên cứu trên rong P. palmate [117-120]. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly Nhiệt độ phản ứng là điều kiện cần thiết cho một phản ứng có sự xúc tác của enzyme và mỗi loại enzyme sẽ có một nhiệt độ phù hợp để hoạt động tốt nhất. Đối với quá trình trích ly nhiệt độ tăng cũng làm các cấu tử chuyển động nhanh hơn, do đó sự hòa tan và khả năng khuếch tán của các cấu tử từ nguyên liệu vào trong dung môi sẽ tăng. Ngoài ra, khi nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi sẽ giảm, dung môi sẽ dễ dàng xuyên qua lớp nguyên liệu, làm cho diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi càng lớn và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình trích ly. Tuy nhiên, sự gia tăng nhiệt độ quá mức cũng có thể làm biến tính protein, gây biến đổi trung tâm hoạt động của enzyme, khiến phản ứng được xúc tác bởi enzyme không thực hiện được nữa. Trong thí nghiệm này, ở nhiệt độ 500C, hiệu suất trích ly protein và Phycocyanin là tối ưu nhất. Kết quả thu được có sự tương đồng với kết quả của những nghiên cứu khác liên quan đến khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của cellulase [114, 121, 122]. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước Nhiệt độ trích ly Hàm lượng Phycocyanin Hàm lượng protein (mg/g (oC) (mg/g rong) rong khô) 30 (0,169 ± 0,003)a (20,97 ± 0.69)a 40 (0,313 ± 0,007)c (31,33 ± 0,90)b 50 (0,357 ± 0,005)d (39,36 ± 1,63)d 60 (0,357 ± 0,007)d (40,21 ± 0,21)d 70 (0,222 ± 0,010)b (34,06 ± 0.35)c 51

Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của enzyme cũng như trích ly protein. Trong khoảng 120 phút đầu tiên của quá trình trích ly, gia tăng thời gian sẽ giúp enzyme có điều kiện thủy phân thành tế bào, tạo điều kiện giải phóng protein từ nguyên liệu vào dung môi, do đó làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, việc kéo dài thời gian trích ly khi sử dụng enzyme cũng không làm tăng được hàm lượng chất trích trong dung dịch. Với các quá trình trích ly ở nhiệt độ cao thì việc kéo dài thời gian trích ly có thể làm biến đổi các phân tử protein làm ảnh hưởng đến khả năng hoà tan của protein, đồng thời gây biến tính enzyme và làm giảm hiệu quả của cả quá trình. Trong thí nghiệm này, thời gian trích ly cho kết quả thu nhận protein và Phycocyanin cao nhất là 120 phút (2 giờ), hàm lượng protein và Phycocyanin thu được tương ứng là 40,61 mg/g và 0,386 mg/g rong khô. Với thời gian trích ly 60 phút thì hàm lượng protein thu được là 38,36 mg/g rong khô, khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với lượng protein hòa tan thu được khi trích ly trong thời gian 120 phút; tuy nhiên hàm lượng Phycocyanin trích ly được ở thời điểm này thì lại thấp hơn đáng kể. Kết quả thu được cũng có sự tương đồng với nghiên cứu sử dụng cellulase để thu nhận protein từ rong đỏ Gelidium sesquipendale [123-125]. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng Phycocyanin và protein tan trong nước Thời gian ủ enzyme Hàm lượng protein (mg/g Hàm lượng PC (mg/g rong) (phút) rong khô) 60 (0,227 ± 0,0167)a (38,36 ± 1,40)b 120 (0,386 ± 0,0104)e (40,61 ± 1,21)bc 180 (0,377 ± 0,0135)de (40,05 ± 1,75)bc 240 (0,370 ± 0,0157)d (40,89 ± 1,28)c 360 (0,353 ± 0,0144)c (40,25 ± 1,02)bc 480 (0,339 ± 0,0169)b (35,47 ± 1,09)a Như vậy các thông số tối ưu cho quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước là: sử dụng dung dich đệm phosphate 0,1M ở pH 7 với tỷ lệ nguyên liệu:dung dịch đệm 1:20; nồng độ enzyme sử dụng là 100UI/g rong khô; nhiệt độ và thời gian trích ly lần lượt là 500C trong 60-120 phút. Các điều kiện này cũng là điều kiện thích hợp để thu nhận Phycocyanin. Hàm lượng Phycocyanin thu được cao nhất là 0,39 mg/g rong khô, chiếm khoảng 1% so với 52 tổng hàm lượng của nhóm protein tan trong nước (40,61 mg/g rong khô). Kết quả này cũng phù hợp với một số nghiên cứu của các tác giả khác về hàm lượng Phycocyanin trong rong Chaetomorpha [126, 127]. 3.3.2. Tối ưu hóa quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước Các nghiên cứu trong mục 3.3.1 cho thấy, trong các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein có sự hỗ trợ của enzyme, sử dụng đệm phosphate có pH 7 là thích hợp vì pH 7 vừa là giá trị tối ưu cho hoạt động của enzyme (theo khuyến cáo của nhà sản xuất), vừa thuận lợi cho quá trình trích ly protein tan trong nước. Vì vậy yếu tố này sẽ được giữ không đổi trong thí nghiệm tối ưu hóa. Thủy phân sinh khối rong bằng enzyme là một phản ứng trong hệ dị thể, vì vậy khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất là vấn đề quan trọng. Tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung dịch đệm cao sẽ làm tăng độ nhớt môi trường, giảm khả năng khuấy của thiết bị, hạn chế khả năng truyền khối trong hệ. Ngược lại, sử dụng nồng độ cơ chất thấp sẽ làm loãng dịch trích và gây khó khăn trong quá trình trích ly tiếp theo bằng dung môi kiềm. Vì vậy, trong thí nghiệm này ngoài pH, tỷ lệ nguyên liệu/cơ chất:dung môi cũng là một yếu tố được giữ cố định ở mức 1:20. Trong nghiên cứu tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm, nồng độ enzyme, nhiệt độ và thời gian trích ly được lựa chọn để khảo sát. Đây là các thông số công nghệ có ảnh hưởng lớn tới quá trình trích ly protein với sự hỗ trợ của enzyme, tuy nhiên các ảnh hưởng riêng lẻ và đặc biệt là ảnh hưởng tương hỗ của chúng tới hiệu quả trích ly protein chưa được xác định rõ ràng khi tiến hành bố trí thí nghiệm đơn yếu tố. Quá trình tối ưu hóa được thiết lập với 3 thông số biến đổi là nồng độ enzyme

(X1), nhiệt độ (X2) và thời gian trích ly (X3). Mức tối thiểu và tối đa của các yếu tố biến đổi lần lượt là 50 UI/g và 150 UI/g; 300C và 700C; 30 phút và 90 phút. Quá trình tối ưu hóa được thực hiện theo mô hình tối ưu hóa ba yếu tố trực giao cấp 2 có tâm xoay với 3 thí nghiệm ở tâm. Phần mềm Modde 5.0 được sử dụng để thiết kế và xử lý số liệu thực nghiệm. Kết quả trong nghiên cứu 3.3.1 cho thấy, quy luật ảnh hưởng của các thông số công nghệ tới hiệu suất của quá trình trình trích ly protein hòa tan trong nước cũng có thể áp dụng tương tự cho quá trình trích ly Phycocyanin từ sinh khối rong Chaetomorpha. Vì 53 vậy trong nghiên cứu tối ưu hóa, chúng tôi chỉ lựa chọn hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein và kết quả thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 3.7 và 3.8. Sau khi phân tích dữ liệu bằng phần mềm Modde 5.0, phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: 2 2 Y1 = 37,024 + 3,452 X1 + 2,322 X3 – 3,137 X1 – 1,417 X3

Trong đó: Y1, X1, X3 lần lượt là hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích (mg/g rong khô), nồng độ enzyme (UI/g) và thời gian trích ly (phút). Bảng 3.7. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước dưới sự hỗ trợ enzyme Hàm mục STT Biến mã hoá Biến thực tiêu Hàm lượng Enzyme Nhiệt độ Thời gian X X X protein 1 2 3 (UI/g) (0C) (phút) (mg/g) 1 -1 -1 1 50 40 30 27,36 2 1 -1 1 150 40 30 32,12 3 -1 1 1 50 60 30 28,72 4 1 1 1 150 60 30 34,16 5 -1 1 1 50 40 90 33,12 6 1 -1 1 150 40 90 36,04 7 -1 1 1 50 60 90 30,88 8 1 1 1 150 60 90 37,38 9 −√2 0 0 16 50 60 20,26 10 √2 0 0 184 50 60 36,63 11 0 −√2 0 100 33 60 37,08 12 0 √2 0 100 67 60 38,76 13 0 0 −√2 100 50 10 28,36 14 0 0 √2 100 50 110 38,26 15 0 0 0 100 50 60 37,04 16 0 0 0 100 50 60 35,75 17 0 0 0 100 50 60 38,18

Ảnh hưởng của mỗi biến số trong mô hình hồi quy được thể hiện trong Bảng 3.8 với mức ý nghĩa 95%. Kết quả cho thấy nồng độ enzyme, thời gian và nhiệt độ trích ly đều có ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly protein, tuy nhiên sự tương tác của các yếu tố này lại không có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng protein thu được trong dịch trích 54

(p>0.05). Các biến số X1, X3 có ảnh hưởng dương đến giá trị Y1, trong khi đó các biến 2 2 số X1 , X3 có ảnh hưởng âm đến giá trị Y1.

Dựa vào Bảng 3.8, có thể thấy biến có hiệu ứng lớn nhất là X1 (nồng độ enzyme), tiếp theo đó là giá trị bậc 2 của X1, giá trị bậc 2 của X3 có ảnh hưởng ít nhất đến hàm lượng protein thu được. Hệ số biến thiên thực R2 của mô hình hồi qui là 0,931 và giá trị biến thiên ảo Q2 là 0,509. Giá trị cuả hai hệ số R2 và Q2 càng tiến đến 1 thì độ tin cậy của mô hình hồi qui càng cao. Theo Gabrielsson và cộng sự, mô hình thí nghiệm đáng tin cậy khi giá trị biến thiên ảo Q2 phải lớn hơn 0,5 và R2 nằm trong khoảng 0,80 – 0,97; khi các giá trị R2 và Q2 càng gần giá trị 1 thì hàm hồi quy càng mô tả tốt và chính xác các kết quả thí nghiệm. Như vậy, kết quả của thí nghiệm thu được là hoàn toàn phù hợp với những tiêu chí mà tác giả này đã đưa ra khi tiến hành quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm Modde 5.0 [128]. Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein Hàm lượng Coeff. SC Std. Err. P Conf. int (±) protein Constant 37,0237 1,15324 7,35717e-009 2,7270

X1 3,45245 0,54153 0,00037 1,2805

X2 0,38992 0,54153 0,49483 1,2805

X3 2,32180 0,54153 0,00362 1,2805

X1* X1 -3,13687 0,59597 0,00116 1,4092

X2* X2 0,21221 0,59597 0,73226 1,4092

X3* X3 -1,41726 0,59597 0,04902 1,4092

X1* X2 0,53250 0,70758 0,47625 1,6732

X1* X3 -0,09749 0,70758 0,89428 1,6732

X2* X3 -0,53750 0,70758 0,47228 1,6732 N = 17 Q2 = 0,509 Cond. no. = 4,9932 DF = 7 R2 = 0,931 Y-miss = 0 R2 Adj. = 0,842 RSD = 2,0014 Conf. lev. = 0,95

Phương trình hồi quy được biểu diễn trên trục tọa độ không gian 3 chiều như Hình 3.3. Điều kiện tối ưu của quá trình trích ly tính toán theo phương trình hồi quy như sau: nồng độ enzyme 121 UI/g cơ chất, nhiệt độ trích ly là 400C và thời gian trích ly 90 phút, 55 trong dung dịch đệm phosphate 0,1M ở pH 7. Hàm lượng protein hòa tan dự đoán theo phương trình hồi quy là 38,921 mg/g rong khô.

Hình 3.3. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ enzyme và thời gian đến hàm lượng protein thu được.

Tiến hành kiểm tra thực nghiệm quá trình trích ly protein từ rong với các thông số tối ưu thu được từ phương trình hồi quy. Hàm lượng protein hoà tan thu được trong thực nghiệm là 37,651 mg/g cơ chất là rong khô. Sự khác biệt về hàm lượng protein giữa giá trị được dự đoán theo phương trình hồi quy và giá trị thực nghiệm là 3,27%. Như vậy, giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy. Tại các điều kiện tối ưu này, hàm lượng Phycocyanin thu được đạt 0,378 mg/g rong khô, chiếm khoảng 1% trong tổng lượng protein hòa tan trong dịch trích. 3.4. Khảo sát quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH 3.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến quá trình trích ly protein bằng NaOH Dựa trên kết quả xác định các nhóm protein có trong rong, protein tan trong kiềm là nhóm chiếm tỷ lệ cao nhất trong rong Chaetomorpha sp.. Đầu tiên, rong khô được sử dụng để trích ly nhóm protein tan trong nước trong bể siêu âm với sự hỗ trợ của enzyme cellulase theo các điều kiện tối ưu thu được từ thí nghiệm 3.3.2, sau đó ly tâm thu phần dịch trích. Phần bã rong sẽ tiếp tục được sử dụng để trích ly protein bằng dung môi NaOH. Trong nhiều quy trình, dung môi kiềm thường được sử dụng để thu nhận protein từ đậu nành, đậu phộng và rong. Theo Thoo và cộng sự, hiệu quả trích ly bị ảnh hưởng 56 bởi các yếu tố như nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, thời gian và nhiệt độ trích ly [119, 129-132]. Trong nghiên cứu này, các yếu tố được khảo sát bao gồm: tỷ lệ nguyên liệu và dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ và thời gian của quá trình trích ly. Ảnh hưởng của nồng độ và tỷ lệ dung môi Nồng độ dung dịch NaOH được khảo sát ở các giá trị 0,5% đến 1,5% w/v. Hiệu suất trích ly protein tăng khi tăng nồng độ dung môi NaOH (bảng 3.9) và đạt giá trị cao nhất 54,36 mg/g rong khô khi sử dụng NaOH 1,0%, tương ứng với pH của dung dịch NaOH là 9-10. Khi nồng độ NaOH tăng từ 1% đến 1,5% thì hiệu suất trích ly protein thu được không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0.05). Theo kết quả của Mæhre và cộng sự, hiệu suất trích ly protein cũng tăng khi nồng độ NaOH tăng từ 0,01M đến 0,1M (tương ứng 0,4% đến 4%). Tuy nhiên, khi nồng độ kiềm cao cũng có thể dẫn đến biến tính protein cũng như xúc tác quá trình thủy phân protein, làm giảm kích thước phân tử và giảm khả năng hòa tan [120, 133]. Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ và tỷ lệ dung môi đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm Tỷ lệ nguyên liệu Hàm lượng Nồng độ dung Hàm lượng và dung môi protein (mg/g môi (%) protein (mg/g (w/v) rong khô) rong khô) 1:10 (37,14 ± 1.83)a 0,25 (27,66 ± 1,95)a 1:15 (45,18 ± 2,57)b 0,50 (33,94 ± 1,74)b 1:20 (53,97 ± 1,76)c 0,75 (37,08 ± 2,19)c 1:25 (54,56 ± 1,87)c 1,00 (54,36 ± 1,23)d 1:30 (54,06 ± 0,74)c 1,25 (56,09 ± 0,63)de 1,50 (57,16 ± 0,89)d

Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu và dung môi ở bảng 3.9 cho thấy hiệu suất trích ly protein cao nhất và đạt 53,97 mg/g rong khô khi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20. Khi tỷ lệ nguyên liệu và dung môi giảm xuống 1:25 và 1:30, hiệu suất trích ly protein thu được không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Về nguyên tắc, với cùng một khối lượng nguyên liệu, khi tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly tăng do tăng sự chênh lệch gradient nồng độ của cấu tử cần trích ly giữa nguyên liệu và dung môi. Tuy nhiên, nếu sử dụng lượng dung môi quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích, trong 57 khi hiệu suất trích ly tăng không đáng kể. Khi đó, nếu muốn thu nhận sản phẩm trích ly phải thực hiện quá trình cô đặc hay sử dụng các phương pháp để tách bớt dung môi. Vì thế, với mỗi quá trình trích ly, cần xác định tỷ lệ phù hợp giữa nguyên liệu và dung môi để thu được hiệu suất trích ly cao nhất và tiết kiệm chi phí [134-136]. Một số các nghiên cứu khác cũng sử dụng dung môi NaOH ở tỷ lệ 1:20 để trích ly protein từ bột đậu nành, hay ở tỷ lệ 1:15 để trích ly protein từ rong Palmaria palmate. Như vậy, tỷ lệ nguyên liệu và dung môi tối ưu sẽ phụ thuộc vào loại nguyên liệu dùng để thu nhận protein cũng như hàm lượng protein có trong nguyên liệu [137, 138]. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian trích ly Tương tự như khi trích ly nhóm protein tan trong nước, trong quá tình trích ly nhóm protein tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp., nhiệt độ tăng làm các cấu tử chuyển động nhanh hơn, do đó sự hòa tan và khả năng khuếch tán của các cấu tử từ nguyên liệu vào trong dung môi sẽ tăng. Tuy nhiên, sự gia tăng nhiệt độ trong quá trình trích ly có thể tạo ra các phản ứng không mong muốn giữa nguyên liệu và dung môi kiềm và làm ảnh hưởng đến chất lượng của chất chiết. Bên cạnh đó, việc duy trì nhiệt độ cao trong quá trình trích ly cũng làm gia tăng chi phí về năng lượng [139]. Kết quả ở bảng 3.10 và bảng 3.11 cho thấy, nhiệt độ và thời gian tối ưu đối với quá trình trích ly protein trong thí nghiệm này tương ứng là 500C và 60 phút. Mæhre và cộng sự cũng cho rằng, hiệu suất trích ly protein từ tảo bằng dung dịch NaOH 0,05M đạt kết quả tốt nhất ở 600C [120]. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm Nhiệt độ trích ly (oC) Hàm lượng protein (mg/g rong khô) 30 (42,28 ± 0,99)a 40 (53,81 ± 1,48)c 50 (57,93 ± 0,77)d 60 (56,04 ± 0,94)d 70 (48,12 ± 1,25)b

Trên lý thuyết, việc gia tăng thời gian trích ly làm tăng hiệu suất trích ly sản phẩm. Tuy nhiên, khi vượt qua ngưỡng tối ưu thì việc kéo dài thời gian sẽ không làm gia tăng hàm lượng chất trích về mặt thống kê. Khi kéo dài thời gian trích ly sẽ làm tăng thời gian tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, do đó làm tăng quá trình khuếch tán của 58 các phân tử chất trích từ trong nguyên liệu vào trong dung dịch và làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, quá trình trích ly sẽ chậm dần cho đến khi sự chênh lệch nồng độ của chất trích trong nguyên liệu và trong dung dịch đạt trạng thái cân bằng. Khi đó, việc kéo dài thời gian trích ly cũng sẽ không làm tăng được hàm lượng chất trích trong dung dịch. Với các quá trình trích ly ở nhiệt độ cao thì việc kéo dài thời gian trích ly có thể làm biến đổi các phân tử chất trích, do đó có thể làm ảnh hưởng đến chất lượng và làm giảm hàm lượng chất trích [18]. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất trích ly nhóm protein tan trong kiềm Thời gian Hàm lượng protein Thời gian Hàm lượng protein trích ly (phút) (mg/g rong khô) trích ly (phút) (mg/g rong khô) 15 (29,10 ± 1,79)a 75 (58,52 ± 1,20)e 30 (43,60 ± 2,04)b 90 (54,13 ± 1,47)d 45 (48,34 ± 1,89)c 105 (53,71 ± 1,38)d 60 (57,51 ± 1,89)e 120 (52,73 ± 1,13)d

Việc lựa chọn một khoảng thời gian thích hợp cho quá trình trích ly protein là cần thiết để có thể đạt được hiệu quả tốt nhất. Tuy nhiên, thời gian trích ly thích hợp sẽ khác nhau đối với từng loại nguyên liệu được sử dụng, chẳng hạn thời gian trích ly protein từ hạt táo (Feronia limonia L.) là 60 phút, trong khi thời gian tối ưu để trích ly protein từ bột hạt lanh là 35 phút. Trong thử nghiệm này, thời gian trích ly được chọn là 60 phút để thu nhận protein tan trong kiềm từ rong Chaetomorpha sp. [140, 141]. 3.4.2. Tối ưu hoá quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm Thực hiện thí nghiệm tối ưu hóa với 2 yếu tố được khảo sát là nồng độ NaOH và thời gian của quá trình trích ly. Quá trình tối ưu hóa được thực hiện theo mô hình trực giao cấp 2 có tâm xoáy với 3 thí nghiệm tại tâm. Các thông số biến đổi là thời gian trích ly (X4) và nồng độ NaOH (X5). Hàm mục tiêu được lựa chọn là hàm lượng protein hòa tan (mg/g rong khô) thu được sau quá trình trích ly. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả thí nghiệm được trình bày ở Bảng 3.12. Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm bằng phần mềm Modde 5.0, chúng tôi nhận được kết quả trong Bảng 3.13. 59

Sau khi xử lý số liệu, hệ số biến thiên thực R2 của mô hình hồi qui là 0,957 và giá trị biến thiên ảo Q2 là 0,702. Phương trình hồi quy mô tả hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích như sau: 2 Y2 = 65,180 + 6,321 X4 + 10,224 X5 – 5,509 X4 X5 – 8,259 X5

Trong đó: Y2, X4, X5 lần lượt là hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích (mg/g rong khô), thời gian trích ly (phút), nồng độ NaOH (%). Bảng 3.12. Mô hình quy hoạch thực nghiệm và kết quả của quá trình trích ly khi thay đổi 2 yếu tố nồng độ NaOH và thời gian trích ly Biến mã hoá Biến thực Hàm mục tiêu STT Thời gian Nồng độ Hàm lượng X X 4 5 (phút) NaOH (%) protein (mg/g) 1 -1 -1 45 0,5 33,37 2 -1 1 45 1,5 60,52 3 1 -1 90 0,5 60,45 4 1 1 90 1,5 65,57 5 -√2 0 68 0,3 51,67 6 √2 0 68 1,7 64,61 7 0 -√2 36 1,0 30,05 8 0 √2 100 1,0 65,17 9 0 0 68 1,0 63,89 10 0 0 68 1,0 65,15 11 0 0 68 1,0 66,50 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của các biến độc lập (nồng độ NaOH và thời gian trích ly) đến hàm lượng protein hòa tan thu được trong dịch trích Hàm lượng Coeff. SC Std. Err. P Conf. int (±) protein Constant 104,687 3,59561 8,95815e-007 9,24282

X4 10,1519 2,20202 0,005786 5,66048

X5 16,4206 2,20202 0,000684 5,66048

X4* X4 -4,8103 2,62126 0,125932 6,73818

X5* X5 -13,265 2,62126 0,003897 6,73818

X4* X5 -8,848 3,11389 0,036184 8,00452 N = 11 Q2 = 0,702 Cond. no. = 3,6208 DF = 5 R2 = 0,957 Y-miss = 0 R2 Adj. = 0,914 RSD = 6,2278 Conf. lev. = 0,95 60

Ảnh hưởng của mỗi biến số trong mô hình hồi quy được thể hiện ở Bảng 3.15 với mức ý nghĩa 95%. Kết quả cho thấy, nhiệt độ và nồng độ NaOH có ảnh huởng lớn đến hàm lượng protein thu được, đồng thời sự tương tác của hai yếu tố này cũng có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng protein trích ly. Theo phương trình hồi qui, các biến số 2 X4, X5 có ảnh hưởng dương tính đến giá trị của Y2; trong khi đó các biến số X5 và X4X5 có ảnh hưởng âm tính đến giá trị của Y2.

Dựa vào Bảng 3.13, biến X5 (nồng độ NaOH) là biến có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng protein (Y2) ở cả giá trị bậc 1 và giá trị bậc 2. Tiếp đến là ảnh hưởng của biến thời gian trích ly (X4) ở giá trị bậc 1, trong khi đó sự tương tác của hai biến độc lập mang lại hiệu ứng ảnh hưởng thấp nhất đến hàm mục tiêu. Ảnh hưởng tương hỗ của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein thể hiện trên Hình 3.4. Kết quả cho thấy, khi sử dụng nồng độ NaOH thấp sẽ cần nhiều thời gian để quá trình trích ly đạt hiệu suất tối ưu. Ngược lại khi sử dụng NaOH ở nồng độ cao, quá trình trích ly sẽ nhanh chóng đạt tới trạng thái cân bằng và việc kéo dài thời gian không làm tăng đáng kể hiệu suất trích ly.

Hình 3.4. Bề mặt đáp ứng biểu thị ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian trích ly đến hàm lượng protein thu được.

Kết quả xử lý bằng phần mềm Modde 5 cho thấy, các điều kiện tối ưu của quá trình trích ly nhóm protein tan trong kiềm như sau: nồng độ dung môi NaOH là 1,2% w/v và thời gian trích ly là 72 phút. Hàm lượng protein dự đoán theo phương trình hồi quy là 68,651 mg/g rong khô. Thực hiện thí nghiệm kiểm chứng với các thông số tối ưu thu được từ phương trình hồi quy, hàm lượng protein hoà tan trong dịch trích đạt 68,104 mg/g rong khô. Sự khác biệt về hàm lượng protein giữa giá trị được dự đoán và giá trị 61 thực nghiệm là 0,8%. Như vậy, giá trị thực nghiệm thu được là rất gần với giá trị tính toán từ phương trình hồi quy. Với các thông số tối ưu, hàm lượng protein thu được trong dịch trích sau thí nghiệm tối ưu hóa bằng quy hoạch thực nghiệm cũng cao hơn nhiều so với hiệu suất thu protein trong các thí nghiệm đơn yếu tố (57,51 mg/g rong khô). 3.5. Đánh giá hiệu quả trích ly protein bằng các phương pháp Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá hiệu quả khi sử dụng enzyme cellulase và kỹ thuật siêu âm để hỗ trợ quá trình trích ly protein từ rong Chaetomorpha sp.. Quá trình trích ly thu nhận 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm được thực hiện theo quy trình hình 2.2 với các thông số tối ưu thu được từ các thí nghiệm 3.3.3 và 3.4.2, cụ thể như sau: - TN1: Quá trình trích ly thu nhận 2 nhóm protein được thực hiện trong bể ổn nhiệt (không có tác động của sóng siêu âm) và không có sự hỗ trợ của cellulase Crestone Conc. (mẫu đối chứng) - TN2: Quá trình trích ly thu nhận 2 nhóm protein được thực hiện trong bể ổn nhiệt (không có tác động của sóng siêu âm) nhưng có sự hỗ trợ của cellulase - TN3: Quá trình thu nhận 2 nhóm protein được thực hiện trong bể siêu âm (tần số 35 kHz) nhưng không có sự hỗ trợ của cellulase - TN4: Quá trình thu nhận 2 nhóm protein được thực hiện trong bể siêu âm (tần số 35 kHz) và có sự hỗ trợ của cellulase Kết quả thể hiện trên hình 3.5.

Hàm lượng protein (mg/g rong khô) 120 100 80 67.896 60 62.5757 57.897 40 43.342 20 39.77 22.15 30.23 28.46 0 nước cất enzyme siêu âm kết hợp ezyme và siêu âm protein tan trong nước protein tan trong kiềm

Hình 3.5. Hiệu quả trích ly 2 nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm bằng các phương pháp khác nhau

62

Theo kết quả trên Hình 3.5, sử dụng riêng từng kỹ thuật siêu âm hoặc enzyme đều có hiệu quả trong việc phá vỡ thành tế bào rong và cải thiện hiệu suất trích ly. So với đối chứng, siêu âm giúp tăng hiệu quả trích ly protein tan trong nước và tan trong kiềm tương ứng 28,45% và 33,58%. Tương tự, cellulase cũng giúp tăng hàm lượng protein tan trong nước và tan trong kiềm thu được trong dịch trích tương ứng là 36,47% và 44,38%. Như đã đề cập trong những phần nghiên cứu trước, chế phẩm Crestone Conc. là một loại cellulase mới của hãng Genecor, có khả năng hoạt động tốt trong vùng pH trung tính và kiềm nhẹ nên có thể được sử dụng để hỗ trợ trích ly các nhóm protein bằng dung môi nước hoặc kiềm. Tuy nhiên, do cellulose trong thành tế bào thực vật là những vi sợi có cấu trúc tinh thể xen kẽ với những vùng vô định hình. Cellulose cũng liên kết với lignin, hemicellulose, tinh bột, protein và các thành phần khoáng chất khác. Cấu trúc tinh thể phức tạp của cellulose khiến nó bền với các tác động thủy phân. Chính vì vậy, nếu chỉ sử dụng riêng cellulase để phá vỡ thành tế bào rong thì hiệu quả hỗ trợ quá trình trích ly protein chưa thật cao [142, 143]. Khi xử lý siêu âm cường độ cao, quá trình trích ly có thể được cải thiện do sự bẻ gãy các tế bào và các bào quan, cũng như làm mềm thành tế bào do tác động của áp suất. Hiện tượng xâm thực khí tạo ra bởi sóng siêu âm cũng giúp phá vỡ các liên kết giữa lignin và hemicellulose của thành tế bào, tạo thuận lợi cho quá trình trích ly protein. Khi sử dụng kết hợp với cellulase, sóng siêu âm cũng giúp phá vỡ cấu trúc tinh thể của cellulose, tạo điều kiện để enzyme có thể tiếp cận tốt hơn với cơ chất để thủy phân thành tế bào rong một cách hiệu quả. Chính vì vậy, sử dụng kết hợp cả siêu âm và enzyme giúp tăng hiệu suất trích ly protein từ sinh khối rong một cách rõ rệt so với khi chỉ sử dụng một trong hai phương pháp [144]. Trong thí nghiệm này, thiết bị siêu âm được sử dụng là bể siêu âm Elma có tần số sóng cố định là 35kHz và có thể điều chỉnh được nhiệt độ. Việc sử dụng đồng thời quá trình siêu âm và xử lý bằng cellulase có tác dụng hỗ trợ trong cả hai quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước và nhóm protein tan trong kiềm, giúp tăng hiệu suất trích ly tương ứng 79,5% và 56,65% so với đối chứng. Các kết quả tương tự cũng được công bố bởi Wan (2015) trên đối tượng rong Laminaria japonica [145]. 63

Hình thái cấu trúc của rong nguyên liệu và bã rong sau trích ly được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình ảnh quan sát trên kính hiển vi điện tử quét cho thấy rõ cấu trúc tế bào của rong lục Chaetomorpha sp. Trên hình 3.6, có thể thấy cấu trúc tế bào của rong trước khi trích ly còn nguyên các thành phần nội bào, với thành tế bào nguyên vẹn.

Hình 3.6. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 500x và 1000x, thang đo 50µm) của rong Chaetomorpha sp. a b

Hình 3.7. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 250x, thang đo 50µm) của bã rong Chaetomorpha sp. sau khi trích ly protein (a) Không sử dụng siêu âm và enzyme (b) Có sử dụng siêu âm và enzyme

Trong quá trình trích ly protein, với sự hỗ trợ của enzyme và sóng siêu âm, thành tế bào rong bị phá vỡ một phần. Tế bào rong lúc này teo lại, do các thành phần bên trong đã được giải phóng ra bên ngoài (Hình 3.7). Hình 3.7 cũng cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc của bã rong sau khi trích ly protein khi có sử dụng và không sử dụng các phương pháp hỗ trợ là sóng siêu âm và enzyme. Khi không có các biện pháp hỗ trợ, thành tế bào rong bị phá vỡ không hiệu quả, nên nhiều tế bào còn nguyên các thành phần nội bào 64 chưa được trích ly (Hình 3.7a). Ngược lại, với sự hỗ trợ của siêu âm và enzyme, hầu như tất cả các tế bào rong đều teo lại do đã giải phóng triệt để các thành phần nội bào (Hình 3.7b). 3.6. Nghiên cứu quá trình tinh sạch protein Bột rong được sử dụng để trích ly các nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm theo quy trình hình 2.2 với các thông số tối ưu được lựa chọn từ thí nghiệm 3.3.3 và 3.4.2, sau đó ly tâm thu dịch trích. Dịch trích protein từ rong ngoài protein còn có nhiều thành phần tạp chất khác như các loại đường đơn và oligosaccharide tạo ra trong quá trình thủy phân carbohydrate của thành tế bào rong (khi sử dụng enzyme để hỗ trợ quá trình trích ly); các loại khoáng chất, chất màu như chlorophyll (khi trích ly protein trong dung môi kiềm). Với mục tiêu thu nhận chế phẩm protein concentrate có độ tinh khiết trên 70%, cần thực hiện các quá trình tinh sạch protein bằng các phương pháp khác nhau. Biện pháp đầu tiên thường được thực hiện nhằm nâng cao độ tinh sạch của protein là kết tủa protein nhằm tách protein ra khỏi hỗn hợp các tạp chất trong dung dịch sau khi trích ly. Có nhiều phương pháp được sử dụng để kết tủa protein như tủa bằng muối, tủa bằng dung môi hữu cơ, tủa bằng điểm đẳng điện, tủa bằng polymer không mang điện và tủa bằng các chất đa điện phân. Các biện pháp này được lựa chọn dựa trên nhiều tiêu chí khác nhau như bản chất của protein (tan trong nước, tan trong kiềm, tỷ lệ các nhóm ưa nước và kị nước trên bề mặt phân tử protein), các tính chất của protein (enzyme, protein có hoạt tính sinh học...), sự nhạy cảm của protein đối với các điều kiện gây biến tính (như nhiệt độ cao, tác động của dung môi...) trong quá trình kết tủa [146]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ, muối trung tính và kết tủa đẳng điện để tinh sạch protein. 3.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa đẳng điện Điểm đẳng điện (pI) xuất hiện khi tổng điện tích của protein bằng 0, lực tương tác tĩnh điện thấp nhất là nguyên nhân dẫn đến các phân tử tập hợp lại với nhau [147]. Hai nhóm protein có trong rong Chaetomorpha sp. được khảo sát trong nghiên cứu này là nhóm tan trong nước và trong kiềm, nên chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng kết tủa đẳng điện trong vùng pH acid. Chuẩn bị dịch trích protein từ rong, thêm từ từ dung dịch 65

HCl 1% vào dịch trích protein để đạt pH 5, pH 4, pH 3, pH 2, pH 1. Thời gian kết tủa từ 30 phút đến 120 phút. Kết quả thể hiện ở phụ lục B15 đến B17. Kết quả cho thấy, nhóm protein tan trong nước có pI đẳng điện ~3. Hiệu suất thu hồi rất thấp, chỉ 27,37%. Độ tinh sạch của sản phẩm sau khi tủa cũng không cao chỉ đạt 39,72%. Với nhóm protein tan trong kiềm, hiệu suất thu hồi sau khi kết tủa đạt cao nhất là 69,33% ở pH 4. Độ tinh sạch của nhóm protein tan trong kiềm sau kết tủa đạt 47,4%. Khi thay đổi pH về vùng pI đẳng điện, độ hydrate hóa của protein trong rong giảm dần về vùng cực tiểu. Lúc này, các phân tử protein trung hòa về điện, lực đẩy tĩnh điện giữa chúng không còn, nên các protein sẽ hút nhau và tập hợp lại. Thời gian càng kéo dài càng tạo điều kiện cho sự tập hợp của các phân tử protein tại vùng pI đẳng điện và làm tăng lượng protein trong kết tủa. Trong nghiên cứu này, khi kéo dài thời gian tủa thì hiệu suất và độ tinh sạch của chế phẩm protein sau khi tủa có tăng, tuy nhiên không có ý nghĩa về mặt thống kê. Do đó, để tiết kiệm thời gian và chi phí, thời gian kết tủa thích hợp được lựa chọn là 30 phút. Nhìn chung, phương pháp kết tủa bằng cách điều chỉnh pH về điểm đẳng điện thích hợp với nhóm protein tan trong kiềm hơn là nhóm protein tan trong nước. Độ tinh sạch của protein sau tủa của hai nhóm protein tan trong nước và trong kiềm cao hơn trong nguyên liệu tương ứng từ 2,15 đến 3,73 lần. Tuy nhiên trong cả hai trường hợp, độ tinh sạch của protein sau khi tủa đều chưa đạt 50%. Dịch trích thô bao gồm nhiều protein khác nhau, có thể có cả phức hợp protein và các hợp chất khác. Một số protein có pI đẳng điện gần nhau và vì thế cũng có thể bị kết tủa khiến độ tinh sạch của protein không cao. Ngoài ra, một số polysaccharide cũng có thể bị kết tủa khi pH thay đổi trong thời gian dài cũng có thể làm giảm độ tinh sạch của protein [62]. Phương pháp kết tủa đẳng điện cũng được một số tác giả sử dụng. Haiwen và cộng sự đã nghiên cứu trích ly protein đậu phộng bằng NaOH và kết tủa đẳng điện bằng HCl 1,0N ở pH 4,5, kết quả cho hàm lượng protein trong chế phẩm protein concentrate đạt 72,35%. Rodsamran và Sothornvit cũng sử dụng dung dịch HCl 3,0M để kết tủa protein từ dừa ở pH 4,0 trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ phòng. Du và cộng sự cũng sử dụng phương pháp này để kết tủa protein đậu xanh ở pH 4,5 bằng HCl 1,0M [148-150]. 66

3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình kết tủa protein bằng ethanol Để kết tủa protein, dung môi hữu cơ được lựa chọn là ethanol. Quá trình tủa bằng ethanol được tiến hành ở điều kiện nhiệt độ thấp, cả dung môi và dịch trích đều được quản bảo trong tủ lạnh 50C trước khi tiến hành thí nghiệm để tránh biến tính protein. Nồng độ ethanol, tỷ lệ dung dịch ethanol:dịch trích và thời gian kết tủa là 3 yếu tố được khảo sát. Kết quả được trình bày ở phụ lục B18 và B19. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ ethanol 80% v/v cho hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch của chế phẩm protein cao nhất ở cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm. Hiệu suất thu hồi nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm lần lượt là 63,87% và 39,75%. Độ tinh sạch của chế phẩm protein sau tủa lần lượt là 50,03% và 45,14%. Từ kết quả trên có thể thấy, kết tủa bằng ethanol phù hợp với nhóm protein tan trong nước hơn là nhóm protein tan trong kiềm. Hiệu suất thu hồi nhóm protein tan trong nước khi kết tủa bằng ethanol cao hơn 1,6 lần so với hiệu suất thu hồi nhóm tan trong kiềm; độ tinh sạch của nhóm protein tan trong nước cũng cao hơn.

Ethanol với nồng độ cao hơn (99%, 90% v/v) làm tăng hiệu suất kết tủa protein nhưng cũng có thể tủa thêm những thành phần khác trong dịch trích nên kết quả độ tinh sạch không cao. Mặt khác, khi nồng độ cồn sử dụng cao thì khả năng gây biến tính protein trong dung dịch cũng tăng, do đó khối lượng tủa có tăng theo nồng độ cồn nhưng khả năng hòa tan trở lại của kết tủa protein lại giảm.

Bên cạnh đó, xét về mặt màu sắc, do ethanol là tác nhân hòa tan các hợp chất có màu như Chlorophyll hay Phycocyanin nên khi sử dụng ethanol để kết tủa, protein sau khi tủa với ethanol thường bị nhạt màu hay mất màu xanh. Theo tác giả Bártová, sử dụng ethanol tuyệt đối có thể thu nhận protein từ khoai tây với hiệu suất 69%, đồng thời cũng bảo đảm được giá trị dinh dưỡng và hoạt động của enzyme patatin có trong sản phẩm [151]. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi Theo Yoshikawa (2012), các loại dung môi hữu cơ có tác động kết tủa protein do thay đổi hằng số điện môi của dung dịch chứa protein. Tỷ lệ dung môi sử dụng càng cao thì hiệu quả giảm hằng số điện môi càng mạnh, dẫn tới ngăn cản sự phân tán của 67 các phân tử protein trong môi trường và gây kết tủa protein tốt hơn [152]. Trong thí nghiệm này, hiệu suất tủa tốt nhất đối với cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm đạt được lần lượt là 63,95% và 40,37%, ở tỷ lệ dịch trích:dung môi là 1:4. Nếu sử dụng tỷ lệ dung môi lớn hơn, hiệu suất kết tủa có tăng nhẹ nhưng khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê. Độ tinh sạch của hai chế phẩm protein tan trong nước và tan trong kiềm sau khi kết tủa cũng đạt giá trị cao nhất, tương ứng là 50,67% và 46,08% ở tỷ lệ dịch trích:dung môi là 1:4. Tăng tỷ lệ dung môi và dịch trích quá cao lại làm biến tính protein và giảm hiệu suất tủa cũng như độ tinh khiết của sản phẩm, có thể do lượng ethanol nhiều làm kết tủa thêm các thành phần khác không phải protein trong mẫu. N.T.B.Uyên và cộng sự cũng sử dụng dung môi ethanol 90% để kết tủa protein từ rong Chaetomorpha sp. Với tỷ lệ dung môi: dịch trích là 4:1, thời gian kết tủa 50 phút, độ tinh sạch của chế phẩm protein sau tủa là 55,08%, hiệu suất tủa là 59,24% [153, 154]. Ảnh hưởng của thời gian kết tủa Thời gian kết tủa protein với dung môi ethanol được khảo sát từ 10 phút đến 60 phút. Ban đầu thời gian tăng sẽ làm tăng hiệu suất tủa protein. Tuy nhiên từ sau 30 phút trở đi, hiệu suất tủa tăng chậm và không có nhiều khác biệt. Trong thí nghiệm này, để tiết kiệm thời gian và chi phí, chúng tôi lựa chọn thời gian kết tủa 40 phút là tối ưu cho quá trình kết tủa protein bằng dung môi ethanol với cả hai nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm. Hiệu suất kết tủa hai nhóm protein ở 40 phút lần lượt là 69,29% và 48,29%, tương ứng với độ tinh sạch là 53,14% và 48,29%.

3.6.3. Khảo sát quá trình kết tủa protein bằng (NH4)2SO4 Kết tủa protein bằng amonium sulfate là một phương pháp phổ biến được sử dụng để tinh sạch protein. Kết tủa bởi amonium sulfate là kết quả của việc giảm độ hòa tan thay vì biến tính protein, do đó protein kết tủa có thể dễ dàng hòa tan lại trong dung môi thích hợp. Kết tủa bằng amonium sulfate được xem như là phương án thuận tiện và đơn giản để phân đoạn các hỗn hợp protein phức tạp [155].

Muối (NH4)2SO4 là loại muối được sử dụng phổ biến để kết tủa protein trong điều kiện lạnh, giúp loại bỏ các phân tử không phải protein, đây là giai đoạn đầu của quá trình làm giàu hoặc tinh sạch một loại protein cụ thể. Hiệu quả của quá trình kết tủa protein bị ảnh hưởng bởi khả năng hòa tan của protein, và phụ thuộc vào các yếu tố như 68

đặc điểm của protein, nồng độ của các tác nhân tham gia, nhiệt độ và pH của quá trình kết tủa [19, 68]. Kết quả quá trình kết tủa hai nhóm protein trong nước và tan trong kiềm bằng ammonium sulfate thể hiện ở các phụ lục từ B20 đến B22. Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình kết tủa protein Yếu tố được khảo sát đầu tiên trong quá trình kết tủa protein từ rong Chaetomorpha sp. bằng muối amonium sulfate là tỷ lệ dịch trích protein và dung môi.

Theo kết quả ở phụ lục B20, tỷ lệ dịch trích và dung dịch muối (NH4)2SO4 phù hợp nhất là 2:1. Ở tỷ lệ này hiệu suất kết tủa hai nhóm protein tan trong nước và trong kiềm lần lượt là 58,30% và 64,24%, tương ứng với độ tinh sạch là 57,48% và 62,68%.

Khi sử dụng muối (NH4)2SO4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau, hiệu suất thu hồi protein đạt giá trị cao nhất 59,36% với mẫu protein tan trong nước và 63,89% với mẫu protein tan trong kiềm khi nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa ở mức 70%. Độ tinh sạch của hai chế phẩm protein tan trong nước và tan trong kiềm đạt lần lượt là 58,76% và 58,63%. Ở nồng độ muối cao, lớp nước solvate hóa bị phá vỡ, các phân tử protein có xu hướng tập hợp và kết tủa thông qua các tương tác kị nước. Nếu các phân tử protein chứa ít nhóm kị nước trên bề mặt, chúng có thể không bị kết tủa và còn nằm lại ở dạng hòa tan trong dung dịch làm ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa protein (Chuner, 2012). Khi nồng độ muối tăng gần đến trạng thái bão hòa thì độ tinh sạch và hiệu suất kết tủa lại có xu hướng giảm. Nguyên nhân là do một lượng lớn ammonium sulphate đã bị kết tủa theo protein khiến hiệu quả của quá trình giảm [156].

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 được trình bày ở phụ lục B22. Kết quả cho thấy, ảnh hưởng của thời gian kết tủa đến độ tinh sạch của protein và hiệu suất tủa là có ý nghĩa về mặt thống kê tại =0.05. Hiệu suất thu hồi protein tan trong nước tăng khi thời gian kết tủa tăng, tuy nhiên sự gia tăng không có ý nghĩa thống kê từ 30 phút trở đi. Sau 30 phút, hiệu suất tủa và độ tinh sạch của protein đạt tương ứng là 62,86% và 58,77%. Với mẫu protein tan trong kiềm, hiệu suất kết tủa và độ tinh sạch của protein đạt cao nhất sau 40 phút, tương ứng 65,29% và 62,29%. Ở các thời điểm 50 phút và 60 phút, hiệu suất thu hồi không tăng và có xu hướng giảm nhẹ. 69

Một số nghiên cứu gần đây cũng sử dụng muối amonium sulfate trong việc thu nhận protein. Ví dụ, Harrysson và cộng sự đã sử dụng muối amonium sulfate 80%, Kazir và cộng sự sử dụng muối amonium sulfate 85% ở điều kiện 40C để kết tủa protein từ các loại rong tảo [27, 157].

Như vậy, điều kiện thích hợp để kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 như sau: nhiệt độ 40C, nồng độ muối bão hòa 70%, tỷ lệ dịch trích và dung môi là 2:1. Thời gian kết tủa là 30 phút đối với mẫu protein tan trong nước và 40 phút đối với mẫu protein tan trong kiềm. Nâng cao hàm lượng protein bằng phương pháp thẩm tích Khi cho thêm muối vào dịch chiết chứa protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, các ion này sẽ tương tác với các phân tử nước và phá vỡ lớp vỏ nước bao xung quanh phân tử protein, do vậy các phân tử protein có khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại. Quá trình kết tủa bằng muối thường xảy ra ở vùng gần bão hòa, vì vậy cùng với protein trong kết tủa còn thu được một lượng muối khá lớn [158]. Có nhiều phương pháp để tách muối khỏi protein nhưng người ta thường loại muối bằng phương pháp thẩm tích, phương pháp sắc kí lọc gel...[159]. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng phương pháp thẩm tích bằng màng bán thấm cellophane có kích thước lỗ 14kDa để loại bỏ muối. Sau khi tủa với muối (NH4)2SO4, phần tủa được cho vào túi thẩm tích, và tiến hành thẩm tích trong 24 giờ như đã trình bày trong phần phương pháp. Dung dịch protein sau khi thẩm tích được sấy đông khô đến độ ẩm dưới 10%. Hàm lượng của chế phẩm protein được xác định bằng phương pháp Kjeldahl. Bảng 3.14. Độ tinh sạch của protein trước và sau thẩm tích Hiệu suất Độ tinh sạch trước Độ tinh sạch sau

thu hồi (%) thẩm tích (%) thẩm tích (%) Protein tan trong nước 70,81 58,77 72,80 Protein tan trong kiềm 71,08 62,29 75,50 Dựa vào kết quả trong Bảng 3.14 có thể kết luận phương pháp thẩm tích mang lại hiệu quả cao. Sau khi sử dụng phương pháp thẩm tích, độ tinh sạch của chế phẩm protein tan trong nước và tan trong kiềm tăng tương ứng từ 58,77% và 62,29% lên 72,80% và 75,50%. 70

3.6.4. So sánh hiệu quả của các phương pháp kết tủa protein Quá trình kết tủa protein được thực hiện bằng ba phương pháp khác nhau: kết tủa

đẳng điện bằng acid HCl, kết bằng dung môi ethanol và muối (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa được thực hiện với các thông số tối ưu như sau: - Quá trình kết tủa đẳng điện bằng acid HCl 1%: được thực hiện ở nhiệt độ phòng, thời gian 30 phút, ở pH 3,0 với nhóm protein tan trong nước và ở pH 4,0 với nhóm protein tan trong kiềm. - Quá trình kết tủa bằng ethanol 80%: được thực hiện ở nhiệt độ 50C, thời gian 40 phút, tỷ lệ dung dịch ethanol:dịch trích là 4:1.

- Quá trình kết tủa bằng muối (NH4)2SO4: nồng độ muối bão hoà 70%, tỷ lệ dung dịch muối:dịch trích là 1:2, thời gian kết tủa 30 phút với nhóm protein tan trong nước và 40 phút với nhóm protein tan trong kiềm. Sau khi kết tủa, mẫu được thẩm tích để loại muối. Kết quả của các quá trình kết tủa được thể hiện ở Bảng 3.15.

Bảng 3.15. Hiệu quả tủa protein bằng pH đẳng điện, ethanol, (NH4)2SO4 Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm Tác nhân kết tủa Hiệu suất thu Độ tinh khiết Hiệu suất thu Độ tinh khiết hồi (%) (% w/w) hồi (%) (% w/w) pI đẳng điện 27,10 36,49 71,37 47,69 Ethanol 69,29 53,14 48,40 48,29 (NH4)2SO4 62,86 58,77 65,29 62,29 (trước thẩm tích) (NH4)2SO4 44,51 72,80 46,41 75,50 (sau thẩm tích) Trong các phương pháp thì kết tủa nhóm protein tan trong kiềm tại pI đẳng điện cho hiệu suất tủa cao (71,37%). Nguyên nhân là do có nhiều protein trong dịch trích ly có điểm đẳng điện gần vùng pH 4. Đây cũng thường là phương pháp kết tủa được sử dụng để thu protein với hiệu suất cao trong quá trình sản xuất các protein tan trong kiềm từ thực vật như protein đậu nành. Tuy nhiên, so với phương pháp kết tủa bằng muối ammonium kết hợp với thẩm tích loại muối, tủa tại pI đẳng điện cho sản phẩm protein có độ tinh khiết thấp (47,69%) [62]. 71

Ngược lại với kết tủa đẳng điện khá hiệu quả với nhóm protein tan trong kiềm, phương pháp kết tủa bằng dung môi hữu cơ như ethanol lại cho hiệu suất kết tủa cao đối với nhóm protein tan trong nước (69,29%). Trên bề mặt các phân tử protein thuộc nhóm này sẽ có các nhóm chức của các acid amin phân cực và tích điện. Khi sử dụng các dung môi hữu cơ, lớp vỏ nước bao phủ các vùng ưa nước này sẽ bị loại bỏ và phân tử protein sẽ tập hợp lại thông qua tương tác giữa các nhóm chức tích điện trái dấu trên bề mặt phân tử protein [152]. Tuy nhiên, tương tự như kết tủa tại pI đẳng điện, chế phẩm protein tan trong nước thu được sau khi tủa bằng dung môi ethanol có độ tinh sạch không cao (53,14%) .

Sử dụng muối amonium có thể kết tủa khá hiệu quả cả hai nhóm protein tan trong nước và tan trong kiềm. Cơ chế của quá trình kết tủa protein bằng muối là loại bỏ lớp vỏ nước và gây hiện tượng tập hợp các phân tử protein thông qua tương tác của các vùng kị nước trên bề mặt phân tử protein [158]. Tỷ lệ các acid amin kị nước trong protein của rong cao và chúng có thể phân bố trên bề mặt phân tử protein. Tỷ lệ nhóm protein này cao dẫn tới hiệu quả thu tủa bằng muối cao. Ngoài ra, sau quá trình kết tủa, sử dụng màng bán thấm kích thước 14kDa đã loại đi một lượng đáng kể các phân tử có kích thước nhỏ, đặc biệt là muối trong kết tủa protein, nhờ đó làm tăng độ tinh khiết.

Kết quả trong Bảng 3.15 cho thấy việc kết tủa protein bằng muối (NH4)2SO4 và sau đó loại muối bằng thẩm tích cho độ tinh sạch của sản phẩm cao nhất và đạt trên 70%, trong khi sử dụng hai tác nhân tủa là acid và ethanol cho độ tinh sạch của chế phẩm protein thấp và chỉ đạt tối đa 53%. Tuy nhiên, một lượng protein có kích thước nhỏ cũng sẽ bị thất thoát, dẫn đến hiệu suất thu hồi protein sau quá trình thẩm tích không cao, chỉ còn 45-46%. Trong ba tác nhân này, amonium sulfat là hóa chất rẻ tiền, dễ kiếm hơn so với hai tác nhân còn lại. Mặt khác, các tác nhân kết tủa như acid hay ethanol có xu hướng làm biến tính protein. Do vậy, để có thể thu nhận chế phẩm protein concentrate có độ tinh sạch trên 70% để có thể thực hiện các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi chọn tác nhân muối amonium sulfat để làm tác nhân kết tủa protein. Kết quả của chúng tôi cũng khá tương đồng với một số công bố về thu nhận protein từ rong biển, như Phycobiliprotein từ tảo Porphyra yezoensis đã được kết tủa 72 bằng pI đẳng điện và ammonium sulfat. Cách làm tương tự cũng được tiến hành trên đối tượng là vi tảo Chlorella vulgaris [63, 156]. 3.7. Xác định tính chất của chế phẩm protein concentrate 3.7.1. Thành phần protein của chế phẩm protein concentrate Để thu nhận chế phẩm protein concentrate, chúng tôi tiến hành trích ly hai phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm, sau đó kết tủa bằng muối ammonium và thẩm tích loại muối theo các điều kiện tối ưu. Chế phẩm protein sau khi sấy đông khô đến độ ẩm dưới 10% w/w (hình 3.8) được đem kiểm tra hàm lượng protein bằng phương pháp Kjeldahl. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.16. Bảng 3.16. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein concentrate Rong Chế phẩm Chế phẩm

nguyên liệu APC-N APC-K Hàm lượng 12,68 72,8 76,3 protein (%)

Như vậy, với phương pháp trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm và enzyme cellulase, kết tủa bằng muối amonium sulfate và tinh sạch loại muối bằng membrane, chúng tôi đã thu được các phân đoạn protein tan trong nước và tan trong kiềm với hàm lượng protein tương đối cao và nằm trong khoảng 72,8-76,3%. Hàm lượng protein trong các chế phẩm protein thu nhận từ rong cao hơn so với một số sản phẩm protein concentrate từ đậu nành đang bán trên thị trường (SPC60 của DKSH, Thụy Điển có hàm lượng protein >60%); tương đương với chế phẩm SPC của Gushen Group (hàm lượng protein 78%) và thấp hơn so với một số sản phẩm protein isolate từ sữa và đậu nành (Soy protein isolate của DKSH, Milk protein concentrate của Melkweg, Hà Lan Hình 3.8. Chế phẩm chứa trên 80% protein). protein APC-K 3.7.2. Thành phần acid amin trong các chế phẩm protein Chế phẩm protein được gửi sang Trung tâm Phân tích kỹ thuật cao Sài Gòn để phân tích thành phần các acid amin bằng phương pháp HPLC sử dụng cột Aminex HPX 87P, đầu dò RI. Kết quả phân tích được trình bày ở Bảng 3.17. Thành phần và tỷ lệ acid 73 amin thu được tương đối phù hợp với các nghiên cứu về thành phần acid amin của rong biển như: Barbarino và Lourenço, 2005; Lourenço, và cộng sự, 2002 [17, 18]. Bảng 3.17. Thành phần acid amin trong chế phẩm protein

Hàm lượng acid amin trong chế phẩm protein (g/100g protein) Acid amin Chế phẩm APC-N Chế phẩm APC-K

Aspatic acid 11,7 ± 0,2 11,5 ± 0,15 Glutamic acid 16,1 ± 0,09 15,7 ± 0,14 Serine 5,3 ± 0,03 5,1 ± 0,1 Histidine 1,4 ± 0,07 1,7 ± 0,25 Arginine 5,3 ± 0,15 6,2 ± 0,1 Glycine 4,9 ± 0,18 4,9 ± 0,12 Threonine 4,1 ± 0,16 5,1 ± 0,23 Alanine 7,3 ± 0,11 7,8 ± 0,09 Tyrosine 4,5 ± 0,09 4,1 ± 0,06 Methionine 3,6 ± 0,15 3,5 ± 0,15 Valine 5,4 ± 0,18 6,5 ± 0,09 Phenylanine 5,9 ± 0,34 5,9 ± 0,18 Isoleucine 3,5 ± 0,15 4,6 ± 0,01 Leucine 8,3 ± 0,14 8,6 ± 0,09 Lysine 5,1 ± 0,18 5,6 ± 0,07 Cystine 3,0 ± 0,05 1,8 ± 0,09 Proline 4,6 ± 0,09 1,4 ± 0,05 Nhìn chung, hai chế phẩm protein APC-N và APC-K đều có thành phần khá giống nhau, tuy nhiên chế phẩm protein tan trong kiềm có tỷ lệ 2 acid amin là glutamic acid và aspartic acid cao hơn, tỷ lệ lysine và isoleucine thấp hơn so với chế phẩm protein tan trong nước. Chế phẩm protein tan trong nước lại có tỷ lệ 2 acid amin cysteine và proline thấp hơn đáng kể trong khi valine, alanine và arginine lại cao hơn khi so với chế phẩm protein tan trong kiềm. Sự khác nhau trong thành phần acid amin, sự sắp xếp của chúng trong chuỗi polypeptide và cấu trúc không gian là yếu tố quan trọng quyết định các tính chất sinh học, tính chất chức năng cũng như giá trị dinh dưỡng của các loại protein. 74

Trong protein của rong Chaetomorpha sp., aspartic acid và glutamic acid là hai acid amin chiếm tỷ trọng cao nhất. Đây là hai acid amin có tính acid, thuộc nhóm acid amin thay thế được, nhưng lại có vai trò quan trọng với cơ thể sống. Aspartic và acid glutamic có chức năng trong hệ thống thần kinh trung ương như là chất dẫn truyền các kích thích thần kinh. Bên cạnh đó chúng còn có vai trò hỗ trợ việc tổng hợp các acid amin khác và giúp vận chuyển glucose qua hàng rào máu não để cung cấp năng lượng cho các hoạt động của bộ não [160, 161]. Ba acid amin là leucine, isoleucine và valine cũng chiếm tỷ lệ khá cao trong tổng số protein của rong biển. Ba acid amin này được gọi là chuỗi acid amin phân nhánh (BCAA- Branched chain amino acids) do cấu trúc phân tử của chúng. Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. BCAA được chuyển hoá trong mô cơ, do đó các tế bào cơ thực hiện quá trình oxy hóa BCAA để tạo ra nguồn năng lượng tế bào ở dạng ATP. Quá trình chuyển hóa này có thể tạo ra nguồn năng lượng nhanh chóng khi cơ thể cần [162]. Theo Cristine Couto Almeid (2015), so với các protein nguồn gốc động vật, các protein từ thực vật thường thiếu hụt một số các acid amin thiết yếu như methionine, lysine, threonine, histidine. Tuy nhiên, hàm lượng các acid amin thiết yếu trong protein của rong Chaetomorpha sp. chiếm tỷ lệ cao, tổng hàm lượng của 8 acid amin không thay thế trong chế phẩm protein APC-N và APC-K chiếm tương ứng 35,9% và 40,2% so với tổng lượng protein có trong rong. Hàm lượng các acid amin như methionine, lysine và threonine trong các chế phẩm protein từ rong cao hơn so với các protein có nguồn gốc thực vật. Tuy nhiên hàm lượng histidine lại khá thấp và đây có thể là một yếu tố hạn chế trong thành phần acid amin thiết yếu của chế phẩm protein thu nhận từ sinh khối rong [99]. 3.7.3. Hình thái và cấu trúc của chế phẩm protein concentrate 3.7.3.1 Hình thái của chế phẩm protein concentrate Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình 3.9 cho thấy cấu trúc của chế phẩm protein concentrate có dạng tấm. Chế phẩm protein tan trong nước APC-N có cấu trúc tấm phẳng và lớn, trong khi chế phẩm 75 protein tan trong kiềm APC-K có cấu trúc dạng tấm nhỏ hơn, bề mặt gồ ghề và xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ và xốp sẽ có độ hoà tan cao hơn. [163, 164]

a b

c d

Hình 3.9. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K

Kính hiển vi điện tử quét SEM đã và đang được sử dụng phổ biến để quan sát cấu trúc vi mô của các chế phẩm protein concentrate và isolate trong thực phẩm. Kỹ thuật này cũng được các nhà khoa học sử dụng để giải thích các tính chất chức năng của các chế phẩm protein trong lĩnh vực thực phẩm. Akalın và cộng sự đã sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cho sự khác biệt trong việc hình thành hệ gel của các sản phẩm sữa chua. Li và cộng sự cũng sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cấu trúc gel của protein concentrate từ đậu nành và bắp [165, 166]. 3.7.3.2 Phân đoạn protein trong chế phẩm protein từ rong và xác định kích thước phân tử của chúng bằng điện di Chế phẩm protein concentrate từ rong sẽ được phân đoạn bằng sắc ký lọc gel và xác định kích thước phân tử bằng điện di SDS-PAGE. 76

Cột sắc ký với kích thước 50 x 1,5 (cm) và gel Biogel P – 100 được sử dụng để tinh sạch và phân đoạn protein bằng phương pháp sắc ký. Cỡ hạt sử dụng là 100 – 200 mesh (10 – 40µm). Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được hoà tan lại vào đệm phosphate lần lượt ở pH 7,0 và pH 9,0. Kết quả phân đoạn thể hiện trên hai sắc ký đồ ở Hình 3.10 và Hình 3.11.

Sắc ký đồ - mẫu protein tan trong nước 3.5

3

2.5

2

1.5 OD OD 280nm 1

0.5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Phân đoạn

Hình 3.10. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong nước

Sắc ký đồ - mẫu protein tan trong kiềm 4.6

4.1

3.6

3.1

2.6

OD280NM 2.1

1.6

1.1

0.6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516171819202122232425262728293031323334353637383940 PHÂN ĐOẠN

Hình 3.11. Sắc ký đồ phân đoạn mẫu protein tan trong kiềm

Dựa vào sắc ký đồ, chúng tôi thu được các phân đoạn protein dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử như sau: 77

✓ Sắc ký đồ của mẫu protein tan trong nước: thu được 2 peak, peak 1 gồm phân đoạn 3 – 9, peak 2 gồm phân đoạn 14 – 22. ✓ Sắc ký đồ của mẫu protein tan trong kiềm: thu được 2 peak, peak 1 gồm phân đoạn 11 – 17, peak 2 gồm phân đoạn 26 – 34. Các peak thu được sau sắc ký lọc gel được chạy điện di để xác định kích thước của phân tử protein. Kết quả điện di thể hiện ở Hình 3.12.

Hình 3.12. Kết quả điện di L: thang chuẩn; Np2.1, Np2.2 là 2 peak của mẫu protein tan trong nước. Kp1, Kp2 là 2 peak của mẫu protein tan trong kiềm.

Hình 3.13. Kết quả điện di protein không qua sắc ký L: thang chuẩn; các mẫu Np và Kp mẫu protein tan trong nước và protein tan trong kiềm ở các nồng độ khác nhau. Theo kết quả trên hình 3.12, với cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm, chỉ có peak thứ nhất thu được sau quá trình sắc ký lọc gel là thể hiện kết quả phân tích MW của protein trên bảng gel điện di. Hai mẫu đều chứa một loại protein có kích thước giống nhau là 14 kDa khi so sánh với thang chuẩn protein. Peak thứ hai của cả hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm đều không thể hiện kết quả điện di. 78

Kết quả điện di cũng cho thấy, trong peak Np2.1 và Kp1 ngoài một protein ở vị trí kích thước 14 KDa, các phân đoạn protein khác bị dính thành vệt dài không tách ra được. Điều này thể hiện một cách rõ rệt khi chúng tôi tiến hành chạy điện di để xác định kích thước của các phân đoạn protein trong chế phẩm APC-N và APC-K mà không qua giai đoạn tinh sạch bằng sắc ký (Hình 3.13). Các phân tử protein có cấu trúc rất phức tạp. Cấu trúc không gian của protein cũng như khả năng bị biến tính trong môi trường chứa SDS có thể ảnh hưởng đến khả năng di động của protein. Bên cạnh đó, protein còn có thể liên kết với các thành phần phi protein khác và rất khó để có thể tách riêng protein ra khỏi các thành phần này trong các điều kiện chạy điện di SDS-PAGE thông thường. Sự ảnh hưởng của hình dạng và kích thước của các thành phần liên kết phi protein đến tính di động của protein là rất khó dự đoán. Theo nhiều nghiên cứu, các protein trong rong thường có bản chất là các glycoprotein. Glycoprotein là các protein có chứa các oligosaccharide/polysaccharide liên kết cộng hóa trị với các acid amin thích hợp. Các glycoprotein có độ linh động điện di thấp và trọng lượng phân tử cao, do đó tạo ra hiện tượng kéo thành dải trong gel điện di [167, 168]. 3.3.7.3 Xác định khối lượng phân tử của các phân đoạn protein bằng LC/MS/MS Hai mẫu protein tan trong nước và tan trong kiềm được gửi đến phòng thí nghiệm Sinh hoá, trường ĐH Khoa học Tự Nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM để xác định kích thước phân tử bằng phương pháp LC-MS/MS, sử dụng kĩ thuật ion hoá mẫu bằng tia lửa điện (ESI) và xác định khối lượng phân tử bằng QTOF. Sắc ký đồ của hai mẫu protein khi phân tích LC/MS/MS thể hiện ở hình 3.14.

79

Hình 3.14. Sắc ký đồ của chế phẩm protein APC-N khi phân tích LC-MS/MS

Kết quả phân tích khối phổ của các peak này như sau. − Mẫu protein tan trong nước chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 13,6 kDa, 15,4 kDa, 27,2 kDa và 38,6 kDa (Hình 3.15) − Mẫu protein tan trong kiềm chứa các mảnh protein có kích thước lần lượt là 11,4 kDa, 21,1 kDa, 27,2 kDa, 34,1 kDa 40,5 kDa và 63,8 kDa (Hình 3.16). − Phân đoạn protein có kích thước 27,2 kDa có tần suất xuất hiện nhiều lần nhất cả hai mẫu protein. Điều này cho thấy phân đoạn protein này có hàm lượng cao trong chế phẩm protein thu nhận từ rong Chaetomorpha. 80

Hình 3.15. Kết quả phân tích MS mẫu APC-N

Hình 3.16. Kết quả phân tích MS mẫu APC-K

Hình thái cấu trúc của chế phẩm protein concentrate được nghiên cứu bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Hình 3.17 cho thấy cấu trúc của protein concentrate có dạng tấm. Ở chế phẩm APC.N cấu trúc tấm phẳng và lớn hơn ở APC.K. Cấu trúc của protein tan trong kiềm có cấu trúc tấm nhưng nhỏ hơn và trên bề mặt có một số cấu trúc xốp. Thông thường các tấm có cấu trúc nhỏ hơn sẽ có độ hoà tan cao hơn. [163, 164].

81

a b

c d

Hình 3.17. Hình ảnh trên kính hiển vi điện tử quét của protein concentrate ở độ phóng đại 500x, thang đo 50µm và ở độ phóng đại 1000x, thang đo 10µm. (a), (b) chế phẩm APC.N; (c), (d) chế phẩm APC.K

Sử dụng kính hiển vi điện tử quét SEM đã và đang được sử dụng phổ biến để quan sát cấu trúc vi mô của các chế phẩm protein concentrate và isolate trong thực phẩm. Kỹ thuật này cũng được các nhà khoa học sử dụng để giải thích các tính chất chức năng của các chế phẩm protein trong lĩnh vực thực phẩm. Akalın và cộng sự đã sử dụng hình ảnh chụp SEM để giải thích cho sự khác biệt trong hệ gel trong các sản phẩm sữa chua. Li và cộng sự sử dụng hình ảnh chụp gel để giải thích cấu trúc gel của protein concentrate đậu nành và bắp [165, 166]. 3.8. Xác định tính chất sinh học của chế phẩm protein concentrate 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn Những chủng vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm các chủng gây bệnh ở người do ATCC cung cấp: Staphylococcus aureus (ATCC 13709), Escherichia coli (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442) 82

Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch được sử dụng để xác định vùng ức chế của chế phẩm protein đối với sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng kháng khẩn càng mạnh. Các mẫu được ủ ở 370C, đọc kết quả sau 24 giờ. Mẫu đối chứng sử dụng kháng sinh Kanamycin 10µg/ml thay cho dung dịch protein. Kết quả thể hiện ở phụ lục B23. Chế phẩm protein tan trong kiềm APC.K có hiệu quả ức chế vi khuẩn cao hơn chế phẩm protein tan trong nước APC.N. Hiệu quả ức chế của chế phẩm APC.K thể hiện trên cả ba chủng vi khuẩn thử nghiệm. Cụ thể, chế phẩm APC.K thể hiện khả năng ức chế vi khuẩn S. aureus khi sử dụng ở nồng độ 6 mg/ml, ức chế E. coli và P. aeruginosa khi sử dụng ở nồng độ 8 mg/ml. Chế phẩm APC.N không có khả năng ức chế vi khuẩn P. aeruginosa và chỉ có thể ức chế vi khuẩn S. aureus và E. coli khi sử dụng ở nồng độ khảo sát là 10 mg/ml. Khi so sánh với đối chứng là kháng sinh Kanamycin với nồng độ khuyến nghị là 10µg/ml, hiệu quả kháng khuẩn của protein concentrate từ rong là khá tốt đối với vi khuẩn S. aureus và P. aeruginosa (Đường kính vòng kháng khuẩn đối với 2 vi khuẩn này tương ứng là 6 mm và 6,33 mm). Kháng sinh có hiệu quả kháng vi khuẩn E. coli cao hơn gấp đôi so với khi sử dụng protein concentrate từ rong. Tuy nhiên, giá trị MIC (nồng độ thấp nhất tại đó chế phẩm thể hiện hoạt tính kháng khuẩn) của chế phẩm protein từ rong cao hơn nhiều so với đối chứng là kháng sinh Kanamycin. Điều đó cũng cho thấy, hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm protein từ rong còn khá thấp, chưa đủ để có thể đưa vào ứng dụng thực tế. Khả năng kháng khuẩn của rong lục cũng được nhiều nghiên cứu đề cập đến. Pierre và cộng sự đã báo cáo về khả năng kháng một số loại vi khuẩn gram dương, gram âm và nấm của chế phẩm giàu carbohydrate (76,6%) được trích từ rong lục Chaetomorpha aerea. Hiệu quả kháng khuẩn tốt nhất thể hiện trên ba chủng là Bacillus subtilis, Micrococcus luteus và Staphylococcus aureus với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 14mm, 13mm và 11mm. Nghiên cứu của Senthilkumar và Sudha cũng cho thấy dịch trích bằng dung môi methanol của rong lục C. linum có khả năng chống lại các chủng vi khuẩn gây bệnh, bao gồm S. aureus, B. cereus, E. coli, P. mirabilis, K. pneumoniae, và S. typhimurium. Marudhupandi và Kumar cũng ghi nhận dịch trích chứa fucoidan từ rong nâu Sargassum wightii có hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi 83 khuẩn gây bệnh ở người là Vibrio cholera và Salmonella typhi với đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 18,6 mm và 8,6 mm [169-171]. 3.8.2. Thử nghiệm khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein từ rong Khả năng chống oxi hoá của hai chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha được thử nghiệm theo các cơ chế khác nhau. 3.8.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH Gốc tự do DPPH là một gốc tự do bền có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517nm. Khi có mặt chất chống oxi hoá thì gốc tự do DPPH bị trung hoà do nhận một electron từ chất chống oxi hoá. Hai chế phẩm protein tan trong trước APC.N và tan trong kiềm APC.K được pha loãng vào các dung môi thích hợp tới các nồng độ khác nhau. Mẫu APC.K được pha loãng trong nước cất hai lần với mẫu đối chứng âm sử dụng là nước cất hai lần. Mẫu APC.N được pha loãng trong đệm MeOH, với mẫu đối chứng âm sử dụng dung dịch đệm MeOH. Kết quả ghi nhận về tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm protein được thể hiện ở Hình 3.18 và Hình 3.19.

90 80 70 60 50 40 30 20 10

0 Hoạt Hoạt bắt tính gốc DPPH (%) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Nồng độ APC-N (µg/ml)

Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-N 84

60 50 40 30 20 10 0 Hoạt tính bắt bắt Hoạt tính gốc DPPH (%) 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ APC-K (µg/ml) Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K Kết quả ở Hình 3.18 và Hình 3.19 cho thấy, khi tăng nồng độ mẫu thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm protein đều tăng. Điều đó chứng tỏ, khả năng bắt gốc tự do DPPH của các chế phẩm protein tăng tỉ lệ thuận theo chiều tăng nồng độ. Ở cùng một nồng độ, chế phẩm APC.N có hoạt tính bắt gốc tự do DPPH cao hơn hẳn chế phẩm APC.K. Ở cùng nồng độ thử nghiệm là 78,125 µg/ml thì tỉ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của hai mẫu chế phẩm APC.N và APC.K lần lượt là 73,97% và 22,22%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC-K ở nồng độ thử nghiệm 312,55 µg/ml là 55,18%. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N cao hơn có thể là do trong nhóm protein tan trong nước có chứa Phycocyanin là nhóm protein có hoạt tính kháng oxi hoá. Ngoài ra, phân tử protein thu nhận từ rong cũng có thể chứa các thành phần acid amin có khả năng kháng oxy hóa như cysteine (chứa nhóm thiol), các acid amin chứa nhóm phenolic như tyrosin.

Bảng 3.18. Giá trị IC50 của chế phẩm protein và đối chứng vitamin C Nồng độ (µg/ml) Protein APC.N Protein APC.K Vitamin C

IC50 (µg/ml) 19,11 229,02 4,91

Kết quả thu được cho thấy, chế phẩm APC.N có giá trị IC50 thấp hơn nhiều so với chế phẩm APC.K. Giá trị IC50 càng thấp thể hiện khả năng kháng oxi hóa càng cao. Điều này chứng tỏ hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm APC.N là cao hơn so với chế phẩm APC.K nhưng thấp hơn so với Vitamin C tinh khiết (Sigma). 85

Thanigaivel và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng oxi hoá của dịch chiết bằng nước của Chaetomorpha antennina ở Mandapam (Ấn Độ). Kết quả cho thấy hoạt động bắt gốc tự do DPPH của chiết xuất rong biển tăng từ 45,64% lên 94,63% khi lượng dịch chiết tăng từ 10 đến 50 mg/ml. Giá trị IC50 đã được xác định là là 0,5 mg/ml. Nghiên cứu của Wu và cộng sự đã cho thấy, thành phần Phycobiliprotein ở S. platensis chứa hàm lượng cao acid glutamic, acid aspartic, alanine, leucine, arginine, isoleucine, serine, glycine và threonine. Các acid amin này được được báo cáo có liên quan đến khả năng chống oxy hóa cao. Các hoạt động bắt gốc tự do DPPH của Phycocyanin cho giá trị IC50 là 1,86 ± 0,18 mg/ml [172-174]. Sau khi thử nghiệm sơ bộ, hoạt tính kháng oxi hoá của chế phẩm APC-N là cao hơn hẳn so với chế phẩm APC-K. Với mục tiêu đánh giá khả năng ứng dụng chế phẩm APC-N trong thực phẩm chức năng giàu chất chống oxi hóa, APC-N tiếp tục được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn về khả năng chống oxi hoá bằng các cơ chế khác nhau. Các thí nghiệm được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh hoá Trung tâm Sâm và Dược liệu, ĐH Y Dược, Tp HCM. 3.8.2.2. Khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ Phương pháp xác định khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ được dùng để đánh giá khả năng cho nguyên tử hydro của chế phẩm protein [175]. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.20. Hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+ tỷ lệ thuận với nồng độ protein APC-N thử nghiệm. Ở nồng độ APC-N thử nghiệm là 183,3 µg/ml hoạt tính trung hoà gốc tự do •+ ABTS là 69,64%. Giá trị IC50 là 52,24 µg/ml. Mẫu đối chứng được sử dụng để so sánh là vitamin C tinh khiết (Sigma) có giá trị IC50 là 1,49 µg/ml. Theo một số nghiên cứu, các protein mạch ngắn có thể giúp tăng hiệu quả tiếp xúc với gốc tự do ABTS•+ do hạn chế hiệu ứng không gian, nhờ đó tăng hiệu quả trung hoà gốc tự do. Tuy nhiên khả năng chống oxi hoá cũng được phát hiện trên các protein kích thước lớn (28kDa) ở cây họ cà Solanum torvum. Một số acid amin trong phân tử protein như Trp, Tyr, Met và Arg còn có khả năng ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong pha béo nên giúp cải thiện hoạt tính chống oxi hoá.[176-178]. 86

90 80 70 60 50 40 30 20

Hoạt tính ức chế ABTS (%)ABTS ức chế tính Hoạt 10 0 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 Nồng độ APC-N (µg/ml)

Hình 3.20. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế ABTS của chế phẩm APC-N 3.8.2.3. Đánh giá khả năng kết hợp với ion Fe2+ Các ion Fe2+ có khả năng xúc tác các phản ứng Fenton tạo thành các gốc tự do hydroxyl (HO•) và ferryl (FeO2+) [179]. Do đó, các hợp chất có khả năng liên kết với ion Fe2+ và chuyển chúng thành dạng phức có thể giúp ngăn chặn quá trình hình thành các gốc tự do và chống oxy hóa. Kết quả đánh giá khả năng kết hợp với ion Fe2+ của chế phẩm protein APC-N được thể hiện ở Hình 3.21.

90 80 70 60 50 40 30

HTCO (%) HTCO 20 10 0 0.0 50.0 100.0 150.0 Nồng độ APC-N (µg/ml)

Hình 3.21. Đồ thị biểu diễn khả năng liên kết với Fe2+ của chế phẩm APC-N

87

Chế phẩm protein tan trong nước APC-N được pha loãng tới các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng liên kết với ion sắt. Với các nồng độ từ 8,6 µg/ml đến 137,5 µg/ml, khả năng liên kết với Fe2+ của chế phẩm APC-N tăng từ 19,36% đến 80,06%. Thành phần acid amin là một yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính liên kết với ion sắt của protein. Hàm lượng Glu và Asp cao có khả năng cho electron cho ion Fe2+. Các acid amin có nhóm lưu huỳnh như Cys và Met cũng có khả năng cho electron tự do của nhóm sulfhydryl và thioether để liên kết với ion sắt. Các nhóm N-imidazole của His, N- amide của Lys, N-guanidine của Arg cũng có khả năng hình thành các liên kết với ion kim loại [180-182].

Giá trị IC50 của chế phẩm APC-N là 31,46 µg/ml. Mẫu đối chứng được sử dụng

để so sánh là Na2EDTA (Sigma) có giá trị IC50 là 1,93 µM. 3.8.2.4. Đánh giá hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào (thử nghiệm MDA) Sự peroxy hóa lipid hay nói cách khác là phản ứng của oxy với lipid không bão hòa tạo ra một lượng lớn các sản phẩm oxi hóa. Sản phẩm chính của quá trình là sự hình thành nên gốc lipid hydroperoxide (LOOH). Các sản phẩm thứ cấp của quá trình peroxy hóa lipid là các loại aldehyde như là MDA, propanal, hexanal, và 4-hydroxinonenal (4- HNE). Thí nghiệm này xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở  = 532 nm [183, 184]. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.22.

70 60 50 40 30 20 10 0

Hoạt tính peroxy hóa lipid bàotế (%) 0 20 40 60 80 Nồng độ APC-N (µg/ml)

Hình 3.22. Khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào của chế phẩm APC-N 88

Chế phẩm protein tan trong nước APC-N được pha loãng tới các nồng độ khác nhau để khảo sát khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào. Với các nồng độ từ 4,3 µg/ml đến 68,7 µg/ml, khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào của chế phẩm

APC-N tăng tương ứng từ 29,84% đến 65,96%. Giá trị IC50 là 21,52 µg/ml. Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu có giá trị IC50 là 27,88 µg/ml. Khả năng kháng oxi hoá ở rong đã được nhiều tác giả nghiên cứu. Khả năng kháng oxi hoá có thể đến từ các thành phần khác nhau trong rong. Gordon và Magos đã đề xuất rằng các sterol (gramisterol, sitosterol, campesterol và triterpene alcohol ester) trong các loài rong tảo có khả năng ức chế quá trình oxi hoá. Anggadiredja và cộng sự đã nghiên cứu hoạt động chống oxi hóa của các chất chiết khác nhau từ rong Sargassum polycystum và Laminaria obtuse. Kết quả cho thấy các chất chiết xuất từ nguyên liệu tươi có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn là từ nguyên liệu khô, nguyên nhân có thể là do sự hiện diện của carotenoid và triterpene cao hơn trong nguyên liệu còn tươi. Jia và cộng sự chỉ ra các thành phần polysaccharide của rong Sargassum fusiform bao gồm chủ yếu là fucose, galactose và ester sulfate có liên quan đến hoạt động kháng oxi hoá. Weng và Wang đã chỉ ra hợp chất β-sitosterol thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khá mạnh đối với gốc tự do DPPH. Novoa và cộng sự đã nghiên cứu chất chống oxy hóa từ dịch chiết của rong đỏ Bryothamnion triquetrum. Kết quả cho thấy chiết xuất rong biển chứa 8,08 mg polyphenol tổng trên mỗi gram nguyên liệu đông khô có thể ngăn ngừa sự hình thành các chất phản ứng trung gian như acid thiobarbituric trong quá trình tự lipoperoxid hóa não chuột với IC50 là 23,3 µg/ml. Ruberto và cộng sự đã nghiên cứu chiết xuất lipid của tám loại rong thuộc chi Cystoseira; kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa có liên quan đến hợp chất tetraprenyltoluquinols có trong rong. Jimenez và cộng sự cũng đã công bố hợp chất phloroglucinol có trong rong nâu Fucus, Laminariales và rong đỏ Porphyra umbilicalis có tác dụng bắt gốc tự do và khử ion sắt [185-191]. Tóm lại các thí nghiệm đánh giá khả năng kháng oxy hóa của chế phẩm protein tan trong nước từ rong Chaetomorpha sp. cho thấy, APC-N có khả năng kháng oxy hóa bằng nhiều cơ chế khác nhau. Chế phẩm APC-N là protein concentrate với hàm lượng protein 72,8% w/w. Ngoài protein tan trong nước và Phycocyanin, chế phẩm APC-N cũng có thể chứa các thành khác có thể đóng góp vào hoạt tính kháng oxy hóa như các 89 polysaccharide hòa tan, polyphenol thực vật, chlorophyll … Do còn chứa tạp chất, nên hoạt tính kháng oxy hóa của chế phẩm APC-N so với đối chứng là các hóa chất tinh khiết như vitamin C, Na2EDTA của Sigma còn thấp (thấp hơn khoảng 5-20 lần). Tuy nhiên, trong thí nghiệm trên tế bào màng não chuột, APC-N lại thể hiện khả năng ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào tương tự Trolox tinh khiết (Calbiochem Ltd. Co.). Nhìn chung, hoạt tính chống oxi hoá của chế phẩm APC-N theo thứ tự từ mạnh đến yếu dựa trên các cơ chế khả năng bắt gốc tự do DPPH, ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào, khả năng liên kết với ion Fe2+, và khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ với các giá trị IC50 tương ứng là 19,11 µg/ml, 21,52 µg/ml, 31,46 µg/ml và 52,24 µg/ml. Khả năng kháng oxy hóa tốt bằng nhiều cơ chế khác nhau ở nồng độ g/ml cho thấy triển vọng ứng dụng chế phẩm APC-N để kháng oxy hóa trong thực phẩm chức năng. 3.9. Xác định tính chất chức năng của protein Để có thể ứng dụng chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. trong sản xuất thực phẩm, ngoài thành phần dinh dưỡng cần khảo sát các tính chất chức năng của chế phẩm protein. Các tính chất chức năng này có vai trò tạo ra giá trị cảm quan và cấu trúc cho sản phẩm thực phẩm. 3.9.1. Khả năng hòa tan Độ hòa tan là chỉ số quan trọng của protein được sử dụng trong công nghệ đồ uống. Tính chất hóa lý này cũng sẽ ảnh hưởng đến độ nhớt, khả năng tạo nhũ, tạo bọt, tạo gel của protein. Ngoài ra tính tan của protein rất có ích cho quá trình trích ly, tinh chế, tủa phân đoạn protein cũng như định hướng sử dụng các loại protein. Khi pH cao hoặc thấp hơn pI thì protein có thể tích điện âm hoặc dương, khi đó phân tử nước sẽ tương tác với các điện tích này giúp cho protein hòa tan. Ngoài ra những phân tử cùng dấu đẩy nhau dẫn đến phân ly cũng giúp protein dễ hòa tan [83]. Khả năng hòa tan của chế phẩm protein ở các môi trường pH 3, pH 7, pH 10 được trình bày trong Bảng 3.19. Dựa trên kết quả thu được thì casein gần như không tan ở pH trung tính, nhưng tan được trong môi trường kiềm và acid. Protein từ rong có khả năng hòa tan trong môi trường trung tính và kiềm, trong khi protein từ đậu nành có thể tan tốt ở cả môi trường acid, trung tính và kiềm. Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào thành phần acid amin trên bề mặt phân tử protein, phụ thuộc vào giá trị pH, nồng độ muối và nhiệt độ môi trường. Thông 90 thường, protein tan kém trong môi trường trung tính và acid. Độ hòa tan tăng mạnh khi pH ở giá trị trên 8-9 [83]. Bảng 3.19. Độ hòa tan (%) của các loại protein Độ hòa tan Độ hòa tan Độ hòa tan Loại protein (% w/v) ở pH 3 (%) ở pH 7 (%) ở pH 10 APC.N (1,3 ± 0,10)a (12,6 ± 0,32)b (7,9 ± 0,20)a APC.K (2,4 ± 0,35)b (10,3 ± 0,29)c (12,5 ± 0,31)c Casein (6,9 ± 0,15)c (0,3 ± 0,06)a (9,1 ± 0,10)b Protein từ đậu nành (6,8 ± 0,26)c (7,7 ± 0,31)b (13,9 ± 0,26)d Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Protein hòa tan tốt trong nước khi trên phân tử có chứa nhiều vùng tích điện cùng dấu, khiến giữa các phân tử protein có một lực đẩy nhất định và các phân tử này phân tán, không kết dính với nhau. Hiệu ứng này gia tăng khả năng hòa tan của protein. [86]. Chế phẩm APC.N có khả năng hòa tan cao hơn chế phẩm APC.K, nguyên nhân có thể do tỉ lệ các nhóm ưa nước trên bề mặt phân tử protein trong chế phẩm APC.N cao hơn. Schwenzfeier và cộng sự đã thu nhận protein isolate từ vi tảo Tetraselmis sp. và một số loại rong biển. Kết quả cho thấy protein từ Tetraselmis sp. hoà tan hầu như hoàn toàn ở pH 6 đến 8,5. Trong khi đó chế phẩm protein islolate từ rong biển (ASPI), một hỗn hợp gồm protein và polysaccharide, có khả năng hòa tan 100% trong phạm vi pH 6 -7, và tan thấp nhất ở khoảng pH 3 – 4,5, gần với điểm đẳng điện của ASPI [73, 192]. 3.9.2. Khả năng hấp thu nước Khả năng hấp thụ nước (khả năng hydrat hoá) của protein phụ thuộc vào khả năng hình thành liên kết hydro của nhóm ưa nước trong phân tử protein với nước. Khả năng này cũng thay đổi theo số lượng các nhóm chức tích điện, mức độ kỵ nước và cấu trúc của phân tử protein cũng như các yếu tố nhiệt độ, pH và lực ion trong môi trường. Bảng 3.20. Khả năng hấp thu nước (%) của các loại protein Loại protein Khả năng hấp thu nước (%) tại pH7 APC.N (57,8 ± 1,09)d APC.K (18,5 ± 0,17)b Casein (10,5 ± 0,36)a Protein từ đậu nành (49,3 ± 0,81)c Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). 91

Các protein khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau. Điều này có thể là do sự phân bố của các nhóm ưa nước và kị nước trên bề mặt của các chế phẩm protein là khác nhau. Kết quả ở bảng 3.20 cho thấy, khả năng hấp thu nước của chế phẩm protein APC.K khá thấp (18,5%), thấp hơn so với chế phẩm APC.N (57,8%) và chế phẩm protein đậu nành (49,33%), nhưng cao hơn so với casein (10,5%). Chế phẩm APC-K chứa các protein tan trong môi trường kiềm. Tại pH 7, cấu trúc và các vùng tích điện trên bề mặt phân tử protein có thể không thuận lợi cho việc hình thành liên kết giữa protein và nước. Chế phẩm APC.K từ rong cũng có thể có tỷ lệ các nhóm kị nước trên bề mặt phân tử protein cao, do đó hạn chế khả năng hòa tan và giữ nước của protein tại vùng pH trung tính.

Chế phẩm protein APC.N có khả năng giữ nước tốt nhất so với các chế phẩm protein được khảo sát. Phân tử protein trong chế phẩm APC.N có thể có những vùng ưa nước trải rộng hoặc có cấu trúc xoắn cuộn để che giấu các vùng kị nước bên trong. Những vùng ưa nước là nơi sẽ hình thành liên kết hydro với các phân tử nước xung quanh, giúp hấp thu nước lên đại phân tử protein. Benelhadj và cộng sự đã nghiên cứu các tính chất chức năng của protein isolate từ Arthrospira (Spirulina) platensis. Khả năng hấp thu nước cao nhất của chế phẩm đạt 42,8% ở pH 10, ở pH 3 và pH 7 độ hấp thu nước giảm còn khoảng 30%. Nghiên cứu chỉ ra rằng, pH thay đổi có thể ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử protein, dẫn đến việc làm lộ ra hoặc ẩn đi các vị trí liên kết với nước. Sự gia tăng độ phân cực và điện tích của protein isolate chủ yếu là do sự ion hóa của các nhóm acid amin dẫn đến sự gia tăng lượng nước liên kết [193]. Nghiên cứu của Kandasamy và cộng sự cũng cho thấy, khả năng giữ nước của ba loài rong lục Enteromorpha (E. compressiona, E. linza và E. tubulosa) là rất cao, lần lượt là 1,53; 1,22; 1,32g H2O/g protein concentrate. Khả năng hấp thụ nước cao của protein giúp giảm hiện tượng mất ẩm trong các sản phẩm bánh đóng gói. Ngoài ra, nó cũng cần thiết để duy trì độ tươi và độ ẩm trong các thực phẩm nướng [194]. 92

3.9.3. Khả năng tạo bọt và ổn định hệ bọt thực phẩm Khả năng tạo bọt của năm loại chế phẩm protein được so sánh đối chiếu thông qua 2 chỉ tiêu là công suất tạo bọt (Foam Capacity – FC) và độ bền bọt (Foam Stability - FS). Kết quả phân tích được thể hiện trong Bảng 3.21. Bảng 3.21. Công suất tạo bọt (FC) của các protein và độ bền bọt (FS) của hệ. Loại protein FC (%) FS (%) APC.N (43,0 ± 2,6)a (78,0 ± 3,5)b APC.K (40,0 ± 2,0)a (90,0 ± 2,0)c Casein (48,0 ± 3,0)b (40,0 ± 2,0)a Protein từ đậu nành (40,0 ± 3,0)a (75,0 ± 2,0)b Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Kết quả ở bảng 3.21 cho thấy công suất tạo bọt (FC) của protein concentrate được tách chiết từ rong và đậu nành có giá trị tương đương nhau (~40,0%) và thấp hơn so với casein (48%). Tuy nhiên độ bền của hệ bọt (FS) tạo ra bởi chế phẩm APC.K từ rong (90,0%) thì cao hơn so với protein từ đậu nành (75%) và cao hơn hẳn giá trị FS của casein (40,0%). Các hệ bọt thực phẩm hình thành do các bọt khí phân tán bên trong các pha liên tục. Công suất tạo bọt (FC) của protein phụ thuộc vào độ hòa tan, pH, nồng độ protein, hình dạng, kích thước của protein. Protein của rong chứa cả 2 nhóm các acid amin ưa nước và kị nước nên có khả năng hoạt động bề mặt, có thể hấp phụ lên bề mặt phân chia khí-lỏng và làm giảm sức căng bề mặt của các bọt khí. Tại pH 7, cả 2 chế phẩm protein APC.N và APC.K đều tan khá tốt trong nước, có thể khuếch tán tới bề mặt phân chia pha để tạo ra lớp màng mỏng bao bọc các bọt khí, đồng thời làm tăng độ nhớt của pha liên tục là dung dịch protein giúp hạn chế sự hợp bọt, nhờ đó có thể ổn định hệ bọt. Độ bền của hệ bọt được đánh giá bằng lớp màng bao của protein xung quanh các phân tử khí được hình thành trong quá trình khuấy đảo. Khả năng tạo bọt không tỉ lệ thuận với khả năng giữ bền bọt. Bọt chỉ bền khi lớp màng protein bao quanh các bọt khí dai, bền, chịu được sức căng bề mặt tác động lên bề mặt phân chia 2 pha. Khả năng này được quyết định bởi sự hiện diện của các nhóm chức trên các phân tử protein. Các nhóm này quyết định mức độ ưa nước cũng như kị nước của phân tử protein, sự tương tác giữa protein với bề mặt kị nước của bọt khí cũng như khả năng tương tác của những 93

phân tử protein với nhau để hình thành lớp màng có độ bền cao. Vì vậy, chế phẩm protein APC.N và protein concentrate từ đậu nành mặc dù có khả năng tạo bọt tương đương với chế phẩm APC.K do khả năng hòa tan tốt, nhưng có thể do thiếu các nhóm kị nước có thể tương tác tốt với bề mặt phân chia pha nên hệ bọt tạo ra lại có độ bền kém hơn. Kết quả trên cho thấy chế phẩm protein APC.K từ rong Chaetomorpha sp. có khả năng tạo bọt và đặc biệt là làm bền bọt tốt, có tiềm năng ứng dụng trong những thực phẩm cần đến đặc tính tạo bọt như bánh, kem sữa béo, kẹo xốp [195, 196]. Kandasamy và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng tạo bọt và ổn định bọt của các chế phẩm protein từ ba loài rong lục Enteromorpha (E. compressiona, E. linza và E. tubulosa). Kết quả cho thấy, khả năng tạo bọt và độ ổn định của bọt phụ thuộc vào pH và nồng độ muối. Hệ bọt ổn định tốt ở pH acid, nguyên nhân có thể do bề mặt phân tử protein có mật độ điện tích cùng dấu cao, giúp ổn định hệ bọt nhờ tăng lực đẩy tĩnh điện và làm giảm tốc độ kết tụ của các hạt bọt. Công suất tạo bọt tốt nhất của chế phẩm protein từ 3 loài rong này dao động từ 56% đến 68%, độ ổn định bọt dao động từ 36% đến 51%, tuy nhiên độ bền bọt và công suất tạo bọt lại không có tương quan với nhau [194]. 3.9.4. Khả năng tạo gel Khả năng tạo gel của chế phẩm protein được xác định dựa vào nồng độ protein thấp nhất tại đó gel sẽ hình thành (LGC). LGC là nồng độ protein mà tại đó khi úp ngược ống nghiệm, gel sẽ không bị trượt xuống [197]. Kết quả xác định khả năng tạo gel của chế phẩm protein từ rong và các protein đối chứng được trình bày ở Bảng 3.22. Bảng 3.22. Khảo sát khả năng tạo gel của protein Lượng protein (mg/ml) 50 100 150 200

APC.N Không tạo gel Tạo gel Tạo gel Tạo gel

Khả năng APC.K Không tạo gel Tạo gel Tạo gel Tạo gel tạo gel Casein Không tạo gel Gel rất yếu Gel rất yếu Tạo gel (% w/v) Protein từ Không tạo gel Không tạo gel Gel rất yếu Tạo gel yếu đậu nành 94

Khi đun nóng dung dịch, protein bị biến tính dẫn đến các cấu trúc bậc cao bị phá hủy, liên kết giữa các phân tử bị đứt, mạch polypeptide bị giãn ra, gần nhau hơn, tiếp xúc với nhau và liên kết lại với nhau mà ở mỗi vị trí tiếp xúc là một nút, phần còn lại hình thành mạng lưới không gian ba chiều vô định hình, rắn, trong đó có chứa đầy pha phân tán là nước [198]. Khả năng tạo gel có vai trò quan trọng trong việc tạo ra các tính chất của nhiều loại thực phẩm, đặc biệt là tính chất kết cấu. Hiện tượng tạo gel chịu trách nhiệm cho các đặc tính rắn, nhớt của thực phẩm. Gel cũng làm tăng độ nhớt, độ bám dính, và cải thiện liên kết nước và dầu/chất béo [199]. Kết quả cho thấy các chế phẩm protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. có LGC là 10% w/v, tốt hơn so với casein (LGC 20%) và protein đậu nành (LGC > 20%). Khả năng tạo gel của protein phụ thuộc nhiều vào nồng độ protein, pH, sự cân bằng giữa các nhóm tích điện (cation và anion) trong phân tử protein, cùng với khả năng hòa tan của protein đó tại vùng pH cụ thể. Nếu protein có khả năng hòa tan thấp thì số lượng phân tử protein phân tán trong dung dịch sẽ không đủ để hình thành nên mạng lưới gel, đồng thời làm giảm khả năng tương tác giữa protein và nước, đây cũng là một trong những yếu tố đóng vai trò quan trọng trong việc quyết định tính chất của gel [84]. Nồng độ tạo gel tối thiểu của protein concentrate từ rong Chaetomorpha sp. là tương đối tốt so với nhiều loài thực vật khác. Nồng độ tạo gel tối thiểu của protein concentrate từ đậu mèo lông (Mucuna pruriens), hạt dền (Amaranthum), hạt diêm mạch (Chenopodium quinoa Willd) và hạt chia (Salvia hispanica L.) lần lượt là 12%, 10% và 20% là 12% w/v. Bashir và cộng sự đã xác định nồng độ tạo gel tối thiểu của Spirulina platensis và bột Spirulina protein isolate lần lượt là 14% và 18%w/v [200-203]. Những kết quả trên cho thấy khả năng tạo gel của protein từ rong Chaetomorpha sp. là rất tốt. Chế phẩm protein concentrate từ rong có thể được sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm chế biến từ thịt, đậu hũ, surimi (các sản phẩm từ hải sản), bánh pudding. 3.9.5. Khả năng tạo nhũ Khả năng tạo nhũ của các chế phẩm protein được so sánh đối chiếu thông qua 2 chỉ tiêu là Chỉ số hoạt động nhũ tương (EAI – emulsifying activity index) và Chỉ số ổn định nhũ tương (ESI – emulsion stability index). Kết quả phân tích được thể hiện trong Bảng 3.23. 95

Bảng 3.23. Chỉ số EAI (m2/g) và chỉ số ESI (phút) của các chế phẩm protein. Loại protein EAI (m2/g) ESI (phút) APC.N (54,2 ± 0,40)c (34,5 ± 0,17)b APC.K (75,7 ± 0,90)a (45,1 ± 1,02)c Casein (65,7 ± 1,23)b (14,16 ± 0,38)a Protein từ đậu nành (67,0 ± 0,83)b (15,76 ± 2,10)a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Khả năng tạo và làm bền hệ nhũ tương của protein thay đổi khi pH môi trường thay đổi. Ngoài ra, khả năng này của protein còn bị ảnh hưởng bởi lực ion trong môi trường. Tuy nhiên, trong thí nghiệm này chúng tôi cố định các yếu tố này để so sánh khả năng tạo và làm bền nhũ tương của chế phẩm protein rong. Để tạo được nhũ tương, protein phải hấp thu lên bề mặt phân chia nước-dầu. Như vậy protein cần có các vùng ưa nước và kỵ nước trên phân tử. Ngoài ra, khả năng làm bền hệ nhũ của protein được tạo ra nhờ lực đẩy tĩnh điện hình thành giữa các giọt của pha phân tán. Lực đẩy tĩnh điện này được quyết định bởi sự hiện diện của các nhóm chức trên bề mặt protein [198]. Một yếu tố quan trọng để tạo ra khả năng tạo nhũ và làm bền hệ nhũ của protein là sự cân bằng giữa tính kỵ nước và ưa nước của chế phẩm protein. Chế phẩm APC.N có tỉ lệ protein ưa nước cao nên khó đạt được sự cân bằng này, vì thế kết quả nhận được là chế phẩm APC.N có khả năng tạo nhũ và làm bền hệ nhũ kém nhất trong số các chế phẩm protein khảo sát. Chế phẩm APC.K có khả năng tạo nhũ và làm bền hệ nhũ cao. Các nhóm kị nước chiếm tỷ lệ cao trong protein tan trong kiềm sẽ giúp chúng tương tác tốt với pha dầu của các giọt béo, đồng thời tỷ lệ các acid amin như aspartic acid, glutamic acid khá cao trong rong Chaetomorpha có thể giúp tạo nên lực đẩy tĩnh điện giữa các giọt béo và cải thiện khả năng làm bền hệ nhũ tương thực phẩm. Ba và cộng sự đã nghiên cứu khả năng tạo nhũ của protein từ vi tảo Haematococcus pluvialis. Kết quả cho thấy khả năng nhũ hoá (EC) là 534 ml dầu/g protein, chỉ số hoạt động nhũ tương (EAI) tốt nhất ở pH 7 là 80 m2/g, chỉ số ổn định nhũ tương (ES) sau khi giữ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ là 94%. Theo nghiên cứu của Shevkani và cộng sự, khả năng nhũ hóa tốt nhất của protein isolate từ hạt dền thu được 96

ở pH 9 với EAI là 52,7m2/g và ESI nằm trong trong khoảng từ 85,4 đến 149,5 phút tuỳ theo các giống hạt khác nhau [204, 205]. 3.10. Đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro Việc sử dụng protein concentrate từ thực vật (PC) ngày càng được quan tâm với ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là ở các nước đang phát triển. Việc sử dụng PC thực vật trong thực phẩm như là thành phần chức năng, hoặc để cải thiện dinh dưỡng, chất lượng sản phẩm hoặc vì lý do kinh tế. Tuy nhiên, những ứng dụng này trong thực phẩm thương mại hầu như chỉ giới hạn ở protein từ cây họ đậu và ngũ cốc, trong khi các protein thực vật khác ít được sử dụng. Việc sử dụng nguồn protein từ rong tảo là rất khả quan vì thành phần protein trong nhóm này khá cao. Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì việc thu protein từ rong gặp khó khăn do các thành phần cản trở trong thành tế bào. Hiện nay, với sự hỗ trợ của các enzyme hiệu quả trích ly đã cải thiện đáng kể. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vitro của protein concentrate từ rong lục Chaetomorpha sp. để kiểm tra giá trị tiềm năng của chúng như là một nguồn nguồn protein thực vật mới có thể sử dụng trong thực phẩm. 3.10.1. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) Khả năng tiêu hóa (IVDP – In vitro digestibility of Protein) của chế phẩm APC và protein concentrate đậu nành và casein được trình bày ở Bảng 3.24. Bảng 3.24. Khả năng tiêu hóa in vitro của chế phẩm protein thu được từ rong Chaetomorpha sp. Chế phẩm Hàm lượng protein (%) Mức độ tiêu hóa-IVDP (%) APC-N (72,8 ± 1,26)a (79,0 ± 1,6)a APC-K (76,3 ± 0,41)b (83,8 ± 2,1)b Protein đậu nành (73,2 ± 0,98)a (84,2 ± 1,1)b Casein (100,0 ± 0,0)c (91,5 ± 1,6)c Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Protein thu được từ rong có khả năng tiêu hóa tương tự như các loại protein thực vật khác, cụ thể trong thí nghiệm này là protein đậu nành. Protein từ rong và từ đậu nành đều có khả năng tiêu hóa thấp hơn casein, một protein có nguồn gốc động vật. Chaetomorpha là một loài rong nước lợ nên khả năng tiêu hóa protein của rong cũng thấp hơn protein động vật (như casein) và tương tự như các loài rong biển khác đã được 97 nghiên cứu IVDP của Porphyra tenera là 70%, của Ulva pertusa là 67%. Tuy nhiên, mức độ tiêu hóa của protein Chaetomorpha có phần vượt trội hơn protein của các loại rong đã được nghiên cứu này [21]. Khả năng tiêu hóa in vitro của các chế phẩm protein từ rong tăng khi độ tinh sạch tăng. Protein trong rong thô chỉ tiêu hóa được 56% trong khi khả năng tiêu hóa protein concentrate của rong Hypnea japonica và Ulva lactuca đạt rất cao, lần lượt là 89 và 85%. Đối với rong, carbohydrate thường chứa một lượng lớn chất xơ. Ở một số loài như Undaria pinnatifida, Laminaria japoni, các chất xơ này có thể ức chế từ 21% đến 55% khả năng hoạt động của pepsin. Quá trình glycosyl hóa có thể giúp bảo vệ protein khỏi các enzyme tiêu hóa. Chế phẩm APC có độ tinh sạch cao nhờ việc xử lý cellulase để loại bỏ carbohydrate trong quá trình thu nhận chế phẩm. Chế phẩm APC-K có hàm lượng protein 76,3%, hàm lượng carbohydrate thấp 3,81%, có khả năng tiêu hóa tương ứng là 83,8% cao hơn so với chế phẩm APC-N [21, 206, 207]. 3.10.2. Chỉ số AAS và PDCAAS AAS (Amino acid score – điểm acid amin) được tính toán bằng cách so sánh thành phần acid amin của protein với nhu cầu acid amin của từng lứa tuổi cụ thể. Đây là một chỉ số được sử dụng rộng rãi, có thể thay thế chỉ số PER khi đánh giá giá trị dinh dưỡng của protein trong điều kiện in vivo [208]. Chỉ số PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid Scoring – chỉ số tiêu hoá protein dựa theo acid amin) phản ánh chất lượng về mặt dinh dưỡng của protein vì được tính dựa trên chỉ số AAS của 8 loại amino acid thiết yếu nhân với khả năng tiêu hóa [89]. a. So sánh với nhu cầu của người lớn Các giá trị AAS và PDCAAS của các chế phẩm protein từ rong Chaetomorpha được tính dựa theo nhu cầu của người trưởng thành thể hiện ở Bảng 3.25. Giá trị AAS của các acid amin trong protein từ rong Chaetomorpha sp. hầu như lớn hơn 1. Ở mẫu APC-N chỉ có histidine tuy có giá trị AAS thấp hơn 1 nhưng chỉ thiếu hụt ít vào khoảng 0,93. Khi so với nhu cầu của người trưởng thành, các chỉ số acid amin thiết yếu từ protein APC-K có thể đáp ứng nhu cầu của các loại acid amin thiết yếu. Trong khi đó, một số acid amin lại có chỉ số AAS cao, thậm chí gần gấp đôi so với nhu 98

cầu của người trưởng thành như Threonine. Và kết quả này cũng tương đồng với một số công bố của các tác giả khác về giá trị dinh dưỡng của protein [209-211]. Bảng 3.25. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của người trưởng thành (*): WHO (2007)

Loại amino EAA (mg/g) Nhu cầu của AAS PDCAAS acid thiết người trưởng APC-N APC-K APC-N APC-K APC-N APC-K yếu thảnh (*) Isoleucine 35 46 30 1,16 1,53 0,92 1,28 Leucine 83 86 59 1,41 1,46 1,11 1,22 Lysine 51 56 45 1,13 1,24 0,95 1,04 Threonine 41 51 23 1,78 2,22 1,41 1,86 Valine 54 65 39 1,38 1,67 1,09 1,40 Histidine 14 17 15 0,93 1,13 0,73 0,95 Methionine 36 35 22 1,64 1,59 1,30 1,33 Phenylanine 59 59 38 1,55 1,55 1,30 1,30

Chỉ số PDCAAS thể hiện chính xác hơn tính chất dinh dưỡng của protein, do một protein chứa đầy đủ thành phần và hàm lượng cần thiết các acid amin thiết yếu nhưng nếu khả năng tiêu hóa kém thì chỉ số PDCAAS vẫn thấp. Chỉ số này sẽ có giá trị nằm trong khoảng 0-1. Những acid amin có giá trị PDCAAS càng lớn thì khả năng đáp ứng nhu cầu của cơ thể càng cao. Protein động vật như thịt, casein, trứng thường có PDCAAS của các acid amin cao hơn 1. Acid amin của các loại protein thực vật thường có PDCAAS thấp [212, 213]. Với hàm lượng protein đạt 76,3% và khả năng tiêu hóa IVDP tăng lên hơn 83,8%, chế phẩm APC-K có giá trị PDCAAS của các acid amin thiết yếu lớn hơn 1 ngoại trừ histidine. Trong đó lượng histidine chỉ đáp ứng 95% nhu cầu của người trưởng thành theo khuyến cáo của WHO (2007). Trong đó, chế phẩm APC-N có hàm lượng protein đạt 72,8% và khả năng tiêu hóa IVDP là 79% có giá trị PDCAAS của các acid amin thiết yếu bị thiếu hụt ở ba acid amin isoleusine, lysine và histidine. Như vậy, chế phẩm APC-K là phù hợp để sử dụng về mặt dinh dưỡng hơn chế phẩm APC-N. Kết quả này cũng tương đồng với một số công bố của các tác giả khác về giá trị dinh dưỡng của các protein [209-211, 214].

99

b. So sánh với nhu cầu của trẻ em Kết quả tính toán các giá trị AAS và PDCAAS của các chế phẩm protein từ rong Chaetomorpha dựa theo nhu cầu của trẻ em thể hiện ở Bảng 3.26. So với nhu cầu của trẻ 1-2 tuổi, các acid amin thiết yếu trong protein của rong đều có chỉ số AAS lớn 1, ngoại trừ Lysine và Histidine. Trong các acid amin thiết yếu của chế phẩm, Lysine và Histidine có hàm lượng thấp hơn nhu cầu của trẻ nên giá trị AAS của acid amin này có giá trị nhỏ hơn các acid amin khác. Bảng 3.26. Chỉ tiêu AAS và PDCAAS của protein rong dựa theo nhu cầu của trẻ em (*): WHO (2007)

Loại amino EAA (mg/g) Nhu cầu của AAS PDCAAS acid thiết trẻ em (*) APC-N APC-K APC-N APC-K APC-N APC-K yếu Isoleucine 35 46 31 1,13 1,48 0,89 1,24 Leucine 83 86 63 1,31 1,37 1,04 1,14 Lysine 51 56 52 0,98 1,08 0,82 0,91 Threonine 41 51 27 1,52 1,89 1,20 1,58 Valine 54 65 42 1,28 1,55 1,02 1,30 Histidine 14 17 18 0,78 0,94 0,61 0,79 Methionine 36 35 26 1,38 1,35 1,09 1,13 Phenylanine 59 59 46 1,28 1,28 1,07 1,07

Theo Almeida, so với các protein nguồn gốc động vật, các protein từ thực vật thường thiếu hụt một số các acid amin thiết yếu như methionine, lysine, threonine, histidine. Protein của rong Chaetomorpha có hàm lượng methionine, threonine khá cao, tuy nhiên lysine và histidine được coi là thành phần acid amin thiếu hụt trong protein của rong so với nhu cầu của trẻ 1-2 tuổi. Khi so với nhu cầu acid amin dành cho trẻ 1- 2 tuổi thì giá trị PDCAAS của các acid amin trong chế phẩm protein đều thấp hơn khi so với nhu cầu của người trưởng thành. Trẻ 1-2 tuổi có nhu cầu về các acid amin, đặc biệt là các acid amin bán thiết yếu cao hơn người trưởng thành [99]. 3.11. Đánh giá giá trị dinh dưỡng của chế phẩm APC-K trong điều kiện in vivo Khi so với chế phẩm protein tan trong nước APC.N, chế phẩm protein tan trong kiềm APC.K được tiêu hóa tốt hơn và đáp ứng hầu như đầy đủ nhu cầu acid amin thiết yếu cho người trưởng thành. Chế phẩm APC-K cũng có các tính chất chức năng tốt hơn 100

APC.N, đặc biệt là khả năng tạo gel, tạo nhũ và làm bền hệ bọt thực phẩm. Do đó, chế phẩm APC-K sẽ được tiếp tục đánh giá giá trị dinh dưỡng trong điều kiện in vivo với định hướng sử dụng như phụ gia hoặc các thành phần ingredient bổ sung trong các sản phẩm thực phẩm. Thực hiện các thí nghiệm như đã trình bày trong phần phương pháp. Các kết quả thu được được trình bày trong các nội dung dưới đây. 3.11.1. Nhóm sử dụng thức ăn không chứa protein Trọng lượng của nhóm chuột sử dụng thức ăn không chứa protein trong thời gian thí nghiệm được thể hiện trong Bảng 3.27. Sau 10 ngày được nuôi bằng khẩu phần ăn không có chứa protein, trọng lượng chuột thí nghiệm giảm mạnh, trung bình khoảng 6g mỗi cá thể, hơn 30% trọng lượng ban đầu. Ngoài ra, chuột hoạt động chậm chạp, hoặc nằm im, bộ lông không mượt như lúc ban đầu. Những số liệu thu được trong nhóm thí nghiệm này được sử dụng để tính chỉ số NPR (chỉ số hấp thu protein tịnh), đồng thời khẳng định vai trò của protein đối với cơ thể. Bảng 3.27. Trọng lượng chuột sau 10 ngày sử dụng thức ăn không chứa protein Trọng lượng (g) Cá thể Ban đầu Sau 10 ngày nuôi Mức chênh lệch 1 17,28 11,28 6,00 2 19,32 12,73 6,59 3 18,88 12,52 6,36 4 18,10 12,75 5,35 5 18,20 12,30 5,90 Trung bình 18,36 ± 0,78 12,32 ± 0,61 6,04 ± 0,47 3.11.2. Nhóm sử dụng thức ăn chứa protein Thành phần sinh hóa của 2 chế phẩm protein sử dụng trong nghiên cứu in vivo thể hiện ở bảng 3.28. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn do viện Pasteur cung cấp được thể hiện ở bảng 3.29. Như vậy khẩu phần ăn do viện Pasteur cung cấp chứa gấp đôi lượng protein và chất béo so với khẩu phần ăn đề xuất của AIN 93 (Sarwar, 1996) khi thực hiện các thí nghiệm in vivo trên chuột. Khẩu phần ăn theo AIN 93 ngược lại chứa ít protein, lipid nhưng lại nhiều đường bột và chất xơ. Thành phần của thức ăn sẽ ảnh hưởng tới các kết quả sử dụng protein, tăng trọng lượng cũng như các chỉ số máu của chuột [215]. 101

Bảng 3.28. Thành phần sinh hóa của các chế phẩm protein APC.K và protein concentrate từ đậu nành Hàm lượng (%) (g/100g chất khô) Thành phần Protein APC.K Protein đậu nành Độ ẩm 10,4 ± 0,2 7,2 ± 0,09 Tro 3,45 ± 0,08 3,2 ± 0,05 Lipid + chất màu 4,8 ± 0,13 4,7 ± 0,07 Protein 76,3 ± 0,41 73,2 ± 0,98 Carbohydrate (chất xơ) 3,21 ± 0,2 3,8 ± 0,18

Bảng 3.29. Thành phần dinh dưỡng của thức ăn do viện Pasteur cung cấp Công thức thức ăn do Công thức thức ăn Thành phần (% w/w) Viện Pasteur cung cấp theo AIN 93 Đường bột 58,8 70 Protein 20,4 10 Lipid 19,7 9 Chất xơ 1,1 9 Muối - 2 Ghi chú: Mỗi cá thể chuột nuôi được cung cấp lượng thức ăn là 2g/ngày. Sau cho ăn 24 giờ sẽ thu nhặt thức ăn thừa để xác định lại lượng thức ăn từng cá thể đã sử dụng trong 1 ngày. Ngoài ra, nước uống được bổ sung thêm 0.15 ml hỗn hợp vitamin. Trọng lượng của các nhóm chuột sử dụng thức ăn có bổ sung các loại chế phẩm protein APC.K từ rong, protein concentrate từ đậu nành (theo công thức của AIN 93) và thức ăn thông thường (theo công thức của Viện Pasteur) thể hiện trong Bảng 3.30. Bảng 3.30. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi với thức ăn chứa protein Trọng lượng từng nhóm chuột (g) Thời gian AIN-93 với AIN-93 với APC-K Thức ăn thường protein đậu nành Ban đầu (18,9 ± 0,41)a (18,8 ± 0,66)a (18,8 ± 0,62)a Nuôi 1 tuần (21,7 ± 0,94)b (21,2 ± 0,76)b (21,0 ± 0,67)b Nuôi 2 tuần (23,8 ± 0,40)c (24,7 ± 0,30)c (23,2 ± 0,60)c Nuôi 3 tuần (28,0 ± 0,66)d (28,0 ± 0,58)d (26,1 ± 0,53)d Nuôi 4 tuần (29,8 ± 0,58)e (30,5 ± 1,17)e (29,0 ± 0,84)e Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05).

102

Khi được nuôi bằng thức ăn có đầy đủ các nhóm chất dinh dưỡng theo công thức AIN-93, trọng lượng của các cá thể chuột tăng đáng kể. Sau mỗi tuần, trọng lượng cơ thể có thể tăng 2-3g (10- 15% trọng lượng ban đầu). Sau 4 tuần, mức độ tăng trọng lượng cơ thể của 3 nhóm chuột có sự khác biệt. Nhóm chuột ăn thức ăn chứa protein từ đậu nành và chế phẩm APC.K từ rong Chaetomorpha tăng trọng lượng thêm 60-63%, nhóm chuột ăn thức ăn thường tăng 54%. Chế phẩm protein APC.K từ rong Chaetomorpha và chế phẩm protein concentrate từ đậu nành có thành phần hóa học khá giống nhau, với hàm lượng protein trên 75% và tỷ lệ tạp chất như chất xơ, lipid và tro thấp. Với hàm lượng protein cao, lượng tạp chất phi protein thấp nên hiệu quả sử dụng protein trong chế phẩm APC.N khá tốt. Kết quả cho thấy khi so với nhóm chuột đối chứng sử dụng thức ăn thông thường, sự tăng trọng cao hơn đáng kể ở chuột thí nghiệm sử dụng chế phẩm APC.K, gần bằng nhóm chuột sử dụng protein đậu nành. Các kết quả này khẳng định vai trò xây dựng cơ thể của protein và hiệu quả không giống nhau của các protein có nguồn gốc khác nhau [95]. 3.11.3. Hệ số tăng trọng (PER) và tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) Hệ số tăng trọng (PER) được xác định dựa theo phương pháp được đề xuất bởi Osborne và cộng sự, dựa trên tiêu chuẩn AOAC (1975), với thời gian tăng trưởng của chuột trong 4 tuần [216]. PER là một chỉ số dùng để đo lường chất lượng protein. PER giúp so sánh tỷ lệ tăng trọng của cơ thể chuột sau ít nhất 10 ngày khi được nuôi bằng thức ăn chứa protein so với lượng protein ăn vào. Protein thực vật thường có giá trị PER thấp hơn so với protein động vật (thường > 2.0) Chỉ số PER không thể hiện được mức độ lưu giữ lại protein trong cơ thể vì chỉ được tính toán dựa trên khối lượng tăng thêm của cơ thể chuột thí nghiệm. Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) được xác định nhằm cải thiện sự thiếu sót của PER. NPR thể hiện rằng protein không chỉ cần cho sự phát triển cơ thể mà còn cần để duy trì sự sống của sinh vật. Theo Bender và Doell, sự thiếu sót này có thể khắc phục khi trong mỗi thử nghiệm có thêm một nhóm động vật được cho ăn theo chế độ không có protein [217]. Chỉ số PER và NPR thu được từ các chế độ ăn được thể hiện ở Bảng 3.31.

103

Bảng 3.31. Chỉ số PER và NPR của các nguồn protein khác nhau Nguồn protein PER NPR APC-K (2,12 ± 0,26)b (3,28 ± 0,41)b Protein đậu nành (2,28 ± 0,12)b (3,46 ± 0,12)b Thức ăn thường (0,85 ± 0,07)a (1,35 ± 0,87)a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Giá trị PER của chế phẩm protein APC từ Chaetomorpha đạt tương ứng là 2.12, thấp hơn PER của các protein động vật như 3,9 ở trứng gà, 2,6 ở thịt bò và 3,5 ở cá. Tuy nhiên giá trị này cao hơn nhiều so với PER của một số protein thực vật phổ biến như bột mì (0,6), đậu (1,5), mặc dù kém hơn protein từ gạo (2,2), khoai tây (2,6). Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị PER của protein đậu nành (mẫu đối chứng) là 2,28. Protein trong thức ăn thường dùng cho chuột thí nghiệm có hàm lượng là 20,4% gấp đôi hàm lượng protein trong công thức AIN-93. Như vậy, nhóm chuột ăn thức ăn thường sử dụng gấp đôi lượng protein nhưng trọng lượng cơ thể tăng kém hơn so với các nhóm còn lại. Giá trị PER của protein trong thức ăn thường rất thấp và chỉ đạt 0,85 [95, 218]. Chỉ số NPR được tính toán tương tự như PER nhưng ngoài việc dựa trên trọng lượng tăng thêm khi chuột thí nghiệm ăn thức ăn có chứa protein, NPR còn tính thêm trọng lượng giảm đi khi chuột sử dụng khẩu phần ăn không chứa protein. Vì vậy, giá trị NPR luôn cao hơn PER. Sự chênh lệnh giá trị của 2 chỉ số này nhiều hay ít tùy thuộc vào loại protein. Ví dụ, độ chênh lệch 2 chỉ số này ở thịt bò nạc là 88% trong khi ở bột mì thấp hơn. Như vậy giá trị NPR không chỉ thể hiện rằng protein cần cho phát triển cơ thể mà còn cần cho duy trì sự sống của sinh vật [218]. Trong 3 loại protein thử nghiệm là thức ăn thông thường, đậu nành và APC.K từ Chaetomorpha, mức độ chênh lệch giữa 2 chỉ số PER và NPR lần lượt là 37, 34 và 35%. Mức độ chênh lệnh giữa các nguồn protein cung cấp trong khẩu phần ăn không có sự khác biệt nhiều. Mức độ chênh lệch giữa 2 chỉ số PER và NPR khi sử dụng thức ăn thông thường là cao nhất, cho thấy nguồn thức ăn này đươc sử dụng nhiều cho việc duy trì sự sống hơn là sinh tổng hợp protein cho cơ thể. 3.11.4. Giá trị sinh học (Biological value – BV) Giá trị sinh học của các nguồn protein concentrate từ đậu nành, chế phẩm protein concentrate APC.K từ rong và từ chế độ ăn thông thường được trình bày ở Bảng 3.32. 104

Bảng 3.32. Giá trị sinh học của các nguồn protein dùng trong thử nghiệm Nguồn protein Giá trị sinh học (BV) APC-K (79,32 ± 2,47)c Protein đậu nành (70,25 ± 2,40)b Thức ăn thường (54,21 ± 5,38)a Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị được đánh dấu bởi các chữ cái giống nhau thì sự khác nhau không có ý nghĩa về mặt thống kê theo phân tích ANOVA (α=0,05). Giá trị sinh học (BV) thể hiện hiệu quả sử dụng của protein đối với cơ thể trong quá trình tăng trưởng và duy trì sự sống. BV được định nghĩa là “phần trăm nitơ hấp thụ được giữ lại trong cơ thể”. Khi protein được hấp thu qua đường tiêu hóa sẽ được cơ thể sử dụng để chuyển thành protein trong mô. Nếu thành phần protein trong thực phẩm chứa đầy đủ 8 loại acid amin thiết yếu thì chúng sẽ được chuyển hóa hiệu quả thành protein của cơ thể. Giá trị BV phụ thuộc vào mức độ phù hợp giữa thành phần acid amin của protein thức ăn với protein cơ thể. Khi thành phần acid amin trong thực phẩm khác xa với thành phần acid amin trong cơ thể thì chúng không thể chuyển hóa thành protein trong mô tế bào. Nhóm N của các acid amin này sẽ được thải ra bên ngoài qua đường tiết niệu dưới dạng urea. Khi lượng nitơ được cơ thể giữ lại không nhiều sẽ làm tỉ lệ nitơ được giữ lại và nitơ hấp thu qua đường tiêu hóa (tức là giá trị BV) thấp [93, 219]. BV của chế phẩm APC.K từ rong Chaetomorpha đạt giá trị 79,32, cao hơn chỉ số BV của protein đậu nành và thức ăn thông thường. Chế phẩm APC.K có hàm lượng protein khá cao (76.5%). Hàm lượng protein cao làm giảm các thành phần phi protein trong sản phẩm như chất xơ, lipid và các chất màu như chlorophyll, tro. Các thành phần này ảnh hưởng không có lợi tới khả năng tiêu hóa của protein và làm giảm giá trị BV. Như vậy, chế phẩm có độ tinh sạch càng cao, hiệu quả sử dụng protein càng tăng. Như vậy, với chế phẩm APC có hàm lượng protein 76,3%, khi 100g protein được đưa vào cơ thể chuột, có 79% được cơ thể sử dụng để chuyển thành protein trong mô tế bào hoặc thực hiện các chức năng duy trì sự sống, giúp cơ thể phát triển. Phần còn lại khoảng 31% không được hấp thu hoặc dùng để chuyển hóa sinh ra năng lượng và thải N ra khỏi cơ thể. 105

3.11.5. Các chỉ số máu chuột thí nghiệm Các chỉ số glucose, triglyceride, HDL-C và LDL-C có thể phản ánh được một phần tình trạng sức khỏe của chuột trong thời điểm thu mẫu máu. Kết quả các chỉ số máu của chuột được trình bày ở Hình 3.23.

9

8

7

6 (mM/L) 5

4 lượng 3

Hàm 2

1

0 APC-K Protein đậu nành Thức ăn thường

Hình 3.23. Các chỉ số máu của chuột thí nghiệm

Đậu nành được xem là nguồn protein có giá trị dinh dưỡng cao và góp phần duy trì sức khỏe. So với nhóm chuột sử dụng protein đậu nành, nhóm chuột ăn protein Chaetomorpha có chỉ số đường huyết gần như tương đương trong khi nhóm ăn thức ăn thường có đường huyết cao gần 4 lần. Protein từ rong Chaetomorpha cũng khá hiệu quả trong việc giữ chỉ số triglyceride máu không tăng cao hơn ở nhóm chuột ăn thức ăn thường. LDL-C cũng là một chỉ số không có lợi cho sức khỏe nếu tăng cao. Khẩu phẩn ăn bổ sung protein từ rong Chaetomorpha cho kết quả LDL-C thấp hơn so với protein đậu nành. Như vậy, có thể nói chuột sử dụng khẩu phần ăn có protein từ Chaetomorpha có tình trạng sức khỏe tim mạch ổn định hơn. Chỉ số HDL-C của nhóm chuột ăn protein Chaetomorpha cũng cao hơn nhóm protein đậu nành. Đây nhóm cholesterol cần thiết để duy trì sức khỏe tim mạch. Với 4 chỉ số máu này, có thể kết luận nhóm sử dụng khầu phần ăn chứa protein từ Chaetomorpha có thể duy trì sức khỏe và không có nguy cơ mắc các loại bệnh mãn tính phổ biến hiện nay có liên quan tới chế độ dinh dưỡng như như tim mạch, tiểu đường, béo phì.

106

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kết luận - Rong mền Chaetomorpha sp. có hàm lượng protein dao động trong khoảng 12,68% là nguyên liệu phù hợp để thu nhận chế phẩm protein concentrate. Rong cần được sấy khô đến hàm ẩm dưới 10% và xay nhỏ đến kích thước 0,1mm trước khi sử dụng để trích ly protein. - Quá trình trích ly nhóm protein tan trong nước được thực hiện trong bể siêu âm tần số 35 kHz với sự hỗ trợ của enzyme cellulase ở các điều kiện tối ưu như sau: dung môi trích ly là dung dịch đệm phosphate 0,1M, pH 7, tỷ lệ bột rong và dung dịch đệm 1: 20, nồng độ cellulase 121 UI/g cơ chất, nhiệt độ 400C và thời gian trích ly 90 phút. Hiệu suất trích ly đạt 37,65 mg/g rong khô, hàm lượng Phycocyanin thu được là 0,378 mg/g rong khô Bã rong sau đó được tiếp tục sử dụng để trích ly nhóm protein tan trong kiềm bằng dung môi NaOH 1,2% ở nhiệt độ 500C và thời gian trích ly là 72 phút. Hiệu suất thu nhận protein đạt 68,1 mg/g rong khô. - Sử dụng muối amonium sulphate để kết tủa protein kết hợp với loại muối bằng thẩm tích là phương án cho hiệu quả tinh sạch protein concentrate tốt nhất. Chế phẩm protein concentrate tan trong nước APC.N và tan trong kiềm APC.K thu được có độ tinh sạch tương ứng là 72,8% và 76,3%. – Hai chế phẩm protein concentrate APC.K và APC.N đã được đánh giá hình thái bằng kính hiển vi điện tử quét SEM, xác định thành phần acid amin, xác định kích thước phân tử bằng điện di và LC-MS/MS. - Chế phẩm protein tan trong nước APC.N có hàm lượng protein 72,8%, có tiềm năng sử dụng trong thực phẩm chức năng, do thể hiện khả năng kháng kháng oxi hoá dựa trên các cơ chế ức chế peroxy hóa lipid màng tế bào, khả năng liên kết với ion Fe2+, khả năng trung hoà gốc tự do ABTS•+ và khả năng bắt gốc tự do DPPH với các giá trị

IC50 tương ứng là 21,52 µg/ml, 31,46 µg/ml, 52,24 µg/ml và 19,11 µg/ml. Chế phẩm protein tan trong kiềm APC-K có hàm lượng protein 76,3%, có các tính chất chức năng tốt, đặc biệt là khả năng tạo gel, khả năng nhũ hóa và làm bền bọt. APC.K cũng có khả năng tiêu hoá cao với giá trị IVPD ~80%, thành phần acid amin cân đối và tương đối phù hợp với nhu cầu của người trưởng thành. APC.K có giá trị 107 dinh dưỡng cao, khả năng tiêu hóa in vivo tốt với các giá trị PER, NPR, BV tương ứng là 2,12; 3,28 và 79,32, tương đương với protein concentrate từ đậu nành và cao hơn nhiều nguồn protein thực vật phổ biến. APC.K có nhiều tiềm năng ứng dụng trong các sản phẩm thực phẩm Đề nghị Do một số lý do chủ quan và khách quan đề tài còn một số khía cạnh chưa được tiếp cận và nghiên cứu hoàn thiện. Chế phẩm protein concentrate từ rong có nhiều tiềm năng ứng dụng trong thực phẩm do đó nhóm nghiên cứu có một số đề nghị sau: - Nghiên cứu thêm một số phương án tinh sạch và thu nhận APC để có thể thực hiện trên quy mô lớn. - Khảo sát sâu hơn về cấu tạo của APC để làm cơ sơ giải thích các tính chất của APC. - Kiểm tra khả năng gây độc tế bào của APC để có thể sử dụng cho thực phẩm. - Thử nghiệm bổ sung APC vào một số sản phẩm thực phẩm và đánh giá giá trị dinh dưỡng và cảm quan.

108

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ

1. Nghiên cứu các thành phần hóa học cơ bản của rong nước lợ Chaetomorpha sp. tại khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 52(5A) (2014) 247-254 2. Nghiên cứu trích ly protein từ rong nước lợ Chaetomorpha sp.bằng phương pháp kết hợp enzyme cellulase và dung môi kiềm, Tạp chí Khoa học và Công nghệ 52(5A) (2014) 255-263 3. Ảnh hưởng của dạng nguyên liệu và quá trình xử lý nguyên liệu đến hiệu suất tách protein từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(4A) (2015) 1335-1340 4. Khảo sát các phương pháp trích ly phycocyanin từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3A) (2017) 269-274 5. Đánh giá tính chất chức năng của protein cô đặc từ rong lục Chaetomorpha sp., Tạp chí Công nghệ Sinh học 15(3A) (2017) 275-280 6. Determination of biochemical composition and in vitro digestibility of protein isolate from brackish algae Chaetomorpha sp., The 3rd ICSAF: Food Innovation for Asian Community Development (2018) 88-97 7. Tối ưu hoá quá trình trích ly protein từ sinh khối rong Chaetomorpha sp. bằng phương pháp bề mặt đáp ứng, Tạp chí Phát triển Khoa học và Công nghệ 3(3) (2019) 136-143

109

TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Sahoo, D., X. Tang, and C. Yarish, Porphyra–the economic seaweed as a new experimental system. Current Science, 2002. 83(11): p. 1313-1316. 2. Dawczynski, C., R. Schubert, and G. Jahreis, Amino acids, fatty acids, and dietary fibre in edible seaweed products. Food chemistry, 2007. 103(3): p. 891- 899. 3. Fitzgerald, C., et al., Heart health peptides from macroalgae and their potential use in functional foods. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011. 59(13): p. 6829-6836. 4. Kalla, A., et al., Use of Porphyra spheroplasts as feed additive for red sea bream. Fisheries Science, 2008. 74(1): p. 104-108. 5. Valente, L., et al., Evaluation of three seaweeds Gracilaria bursa-pastoris, Ulva rigida and Gracilaria cornea as dietary ingredients in European sea bass (Dicentrarchus labrax) juveniles. Aquaculture, 2006. 252(1): p. 85-91. 6. Koru, E., Earth food Spirulina (Arthrospira): production and quality standarts. Food additive, 2012: p. 191-203. 7. Sheih, I.-C., T.-K. Wu, and T.J. Fang, Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation systems. Bioresource Technology, 2009. 100(13): p. 3419-3425. 8. Zbakh, H., et al., Antibacterial activity of benthic marine algae extracts from the Mediterranean coast of Morocco. The Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences, 2012. 2(1): p. 219. 9. Lordan, S., R.P. Ross, and C. Stanton, Marine bioactives as functional food ingredients: potential to reduce the incidence of chronic diseases. Marine drugs, 2011. 9(6): p. 1056-1100. 10. Yoon, H.S., et al., Tertiary endosymbiosis driven genome evolution in dinoflagellate algae. Molecular Biology and Evolution, 2005. 22(5): p. 1299- 1308. 11. Lewis, L.A. and R.M. McCourt, Green algae and the origin of land plants. American journal of botany, 2004. 91(10): p. 1535-1556. 12. Proschold, T. and F. Leliaert, Systematics of the green algae: conflict of classic and modern approaches. Systematics Association Special Volume, 2007. 75: p. 123. 13. Mattox, K., Classification of the green algae: a concept based on comparative cytology. Systematics of the green algae, 1984: p. 29-72. 14. Friedl, T. and C. Zeltner, ASSESSING THE RELATIONSHIPS OF SOME COCCOID GREEN LICHEN ALGAE AND THE MICROTHAMNIALES (CHLOROPHYTA) WITH 18S RIBOSOMAL RNA GENE SEQUENCE COMPARISONS 1. Journal of Phycology, 1994. 30(3): p. 500-506. 15. Friedl, T., Inferring taxonomic positions and testing genus level assignments in coccoid green lichen algae: a phylogenetic analysis of 18S ribosomal RNA sequences from Dictyochloropsis reticulata and from members of the genus Myrmecia (Chlorophyta, Trebouxiophyceae cl. nov.). Journal of Phycology, 1995. 31(4): p. 632-639. 110

16. Leliaert, F., et al., Atypical development of Chaetomorpha antennina in culture (Cladophorales, Chlorophyta). Phycological Research, 2011. 59(2): p. 91-97. 17. Lourenço, S.O., et al., Amino acid composition, protein content and calculation of nitrogen‐to‐protein conversion factors for 19 tropical seaweeds. Phycological Research, 2002. 50(3): p. 233-241. 18. Barbarino, E. and S.O. Lourenço, An evaluation of methods for extraction and quantification of protein from marine macro-and microalgae. Journal of Applied Phycology, 2005. 17(5): p. 447-460. 19. Kumar, J., et al., Variation of biochemical composition of eighteen marine macroalgae collected from Okha coast, Gulf of Kutch, India. Electronic Journal of Environmental, Agricultural & Food Chemistry, 2010. 9(2). 20. Rosni, S.M., et al., Crude proteins, total soluble proteins, total phenolic contents and SDS-PAGE profile of fifteen varieties of seaweed from Semporna, Sabah, Malaysia. International Food Research Journal, 2015. 22(4): p. 1483. 21. Fleurence, J., Seaweed proteins: biochemical, nutritional aspects and potential uses. Trends in food science & technology, 1999. 10(1): p. 25-28. 22. Abdel-fattah, A.F. and H.H. Sary, Glycoproteins from Ulva lactuca. Phytochemistry, 1987. 26(5): p. 1447-1448. 23. Dere, S., et al., The determination of total protein, total soluble carbohydrate and pigment contents of some macroalgae collected from Gemlik-Karacaali (Bursa) and Erdek-Ormanli (Balikesir) in the Sea of Marmara, Turkey. Oceanologia, 2003. 45(3). 24. Greenwell, M., C. Bird, and J. McLachlan, Depth-related variation in gross chemical composition of several seaweeds. Aquatic botany, 1984. 20(3-4): p. 297-305. 25. Khairy, H.M. and S.M. El-Shafay, Seasonal variations in the biochemical composition of some common seaweed species from the coast of Abu Qir Bay, Alexandria, Egypt. Oceanologia, 2013. 55(2): p. 435-452. 26. Harnedy, P.A. and R.J. FitzGerald, BIOACTIVE PROTEINS, PEPTIDES, AND AMINO ACIDS FROM MACROALGAE 1. Journal of Phycology, 2011. 47(2): p. 218-232. 27. Kazir, M., et al., Extraction of proteins from two marine macroalgae, Ulva sp. and Gracilaria sp., for food application, and evaluating digestibility, amino acid composition and antioxidant properties of the protein concentrates. Food hydrocolloids, 2019. 87: p. 194-203. 28. Zhang, M., et al., Beneficial effects of taurine on serum lipids in overweight or obese non-diabetic subjects. Amino acids, 2004. 26(3): p. 267-271. 29. Houston, M.C., Nutraceuticals, vitamins, antioxidants, and minerals in the prevention and treatment of hypertension. Progress in cardiovascular diseases, 2005. 47(6): p. 396-449. 30. Smit, A.J., Medicinal and pharmaceutical uses of seaweed natural products: a review. Journal of applied phycology, 2004. 16(4): p. 245-262. 31. Guaratini, T., et al., Metabolites from algae with economical impact. Comparative biochemistry and physiology. Toxicology & pharmacology: CBP, 2015. 111

32. Neves, S., et al., Antinociceptive properties in mice of a lectin isolated from the marine alga Amansia multifida Lamouroux. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, 2007. 40(1): p. 127-134. 33. Teixeira, E., et al., In vitro inhibition of oral streptococci binding to the acquired pellicle by algal lectins. Journal of Applied Microbiology, 2007. 103(4): p. 1001- 1006. 34. Suvega, T. and K. Arunkumar, Antimicrobial activity of bacteria associated with seaweeds against plant pathogens on par with bacteria found in seawater and sediments. British Microbiology Research Journal, 2014. 4(8): p. 841. 35. Romay, C., et al., C-phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti- inflammatory and neuroprotective effects. Current protein and peptide science, 2003. 4(3): p. 207-216. 36. Reddy, M.C., et al., C-Phycocyanin, a selective cyclooxygenase-2 inhibitor, induces apoptosis in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7 macrophages. Biochemical and biophysical research communications, 2003. 304(2): p. 385- 392. 37. Bhat, V.B. and K. Madyastha, Scavenging of peroxynitrite by phycocyanin and phycocyanobilin from Spirulina platensis: protection against oxidative damage to DNA. Biochemical and biophysical research communications, 2001. 285(2): p. 262-266. 38. Estrada, J.P., P.B. Bescós, and A.V. Del Fresno, Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extract. Il farmaco, 2001. 56(5-7): p. 497-500. 39. Þorkelsson, G. and H.G. Kristinsson, Bioactive peptides from marine sources. State of art. Report to the NORA fund. 2009. 40. Boisen, S. and B. Eggum, Critical evaluation of in vitro methods for estimating digestibility in simple-stomach animals. Nutrition research reviews, 1991. 4(1): p. 141-162. 41. Fernández-García, E., I. Carvajal-Lérida, and A. Pérez-Gálvez, In vitro bioaccessibility assessment as a prediction tool of nutritional efficiency. Nutrition research, 2009. 29(11): p. 751-760. 42. Etcheverry, P., M.A. Grusak, and L.E. Fleige, Application of in vitro bioaccessibility and bioavailability methods for calcium, carotenoids, folate, iron, magnesium, polyphenols, zinc, and vitamins B6, B12, D, and E. Frontiers in physiology, 2012. 3: p. 317. 43. Horie, Y., K. Sugase, and K. Horie, Physiological differences of soluble and insoluble dietary fibre fractions of brown algae and mushrooms in pepsin activity in vitro and protein digestibility. Asia Pac J Clin Nutr, 1995. 4(2): p. 251-255. 44. Takeshi Suzuki, K.N., Yumiko Yoshie, Takaaki Shirai, Toshiyuki Hirano, Digestibility of Dietary Fiber in Brown Alga, Kombu, by Rats. Nippon Suisan Gakkaishi, 1993. 59(5): p. 879-884. 45. Wong, K. and P.C. Cheung, Influence of drying treatment on three Sargassum species. Journal of Applied Phycology, 2001. 13(1): p. 43-50. 46. Carbonell‐Capella, J.M., et al., Analytical methods for determining bioavailability and bioaccessibility of bioactive compounds from fruits and 112

vegetables: A review. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2014. 13(2): p. 155-171. 47. Fleurence, J., et al., Comparison of different extractive procedures for proteins from the edible seaweeds Ulva rigida and Ulva rotundata. Journal of Applied Phycology, 1995. 7(6): p. 577-582. 48. Ragan, M.A., Phlorotannins, brown algal polyphenols. Progress in phycological research, 1986. 4: p. 177-241. 49. Jordan, P. and H. Vilter, Extraction of proteins from material rich in anionic mucilages: partition and fractionation of vanadate-dependent bromoperoxidases from the brown algae Laminaria digitata and L. saccharina in aqueous polymer two-phase systems. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- General Subjects, 1991. 1073(1): p. 98-106. 50. Rice, E. and R. Crowden, An improved method for the extraction and electrophoresis of proteins and active enzymes from fucalean macroalgae (Phaeophyta). Phycologia, 1987. 26(2): p. 235-246. 51. Bermúdez-Aguirre, D., T. Mobbs, and G.V. Barbosa-Cánovas, Ultrasound applications in food processing, in Ultrasound technologies for food and bioprocessing. 2011, Springer. p. 65-105. 52. Lee, H. and H. Feng, Effect of power ultrasound on food quality, in Ultrasound technologies for food and bioprocessing. 2011, Springer. p. 559-582. 53. Patil, S.S. and L.J. Rebecca, Isolation and characterization of protease from marine algae. Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res, 2014. 27. 54. Dhuna, V., et al., Purification and characterization of a lectin from Arisaema tortuosum Schott having in-vitro anticancer activity against human cancer cell lines. Journal of biochemistry and molecular biology, 2005. 38(5): p. 526. 55. Antelo, F.S., J.A.V. Costa, and S.J. Kalil, Purification of C-phycocyanin from Spirulina platensis in aqueous two-phase systems using an experimental design. Brazilian Archives of Biology and Technology, 2015. 58(1): p. 1-11. 56. Ahmad, A., et al., Isolation and characterization of bioactive protein from green algae Halimeda macrobola acting as antioxidant and anticancer agent. American Journal of Biomedical and Life Sciences, 2014. 2(5): p. 134-140. 57. Schwarz, T., P. Bartholmes, and M. Kaufmann, Large-scale production of algal biomass for protein purification: tryptophan synthase from Euglena gracilis. Biotechnology and applied biochemistry, 1995. 58. Bele, S.D., et al., Isolation and partial purification of lipase and protease from marine algae. J Chem Pharm Res, 2014. 6: p. 1153-1156. 59. OLIVEIRA, S.R., et al., Purification and characterisation of a lectin from the red marine alga Pterocladiella capillacea (SG Gmel.) Santel. & Hommers. Brazilian Journal of Botany, 2002. 25(4): p. 397-403. 60. Wong, P.F., et al., PROTEOMICS OF THE RED ALGA, GRACILARIA CHANGII (GRACILARIALES, RHODOPHYTA) 1. Journal of Phycology, 2006. 42(1): p. 113-120. 61. Wang, D.-Z., et al., Comparative studies of four protein preparation methods for proteomic study of the dinoflagellate Alexandrium sp. using two-dimensional electrophoresis. Harmful Algae, 2009. 8(5): p. 685-691. 113

62. Garba, U. and S. Kaur, Protein isolates: production, functional properties and application. International Journal of Current Research and Review, 2014. 6(3): p. 35. 63. Ursu, A.-V., et al., Extraction, fractionation and functional properties of proteins from the microalgae Chlorella vulgaris. Bioresource technology, 2014. 157: p. 134-139. 64. Cai, C., et al., Large scale preparation of phycobiliproteins from Porphyra yezoensis using co-precipitation with ammonium sulfate. Natural Science, 2012. 4(08): p. 536-543. 65. Nguyễn Tiến Thắng, N.Đ.H., Giáo trình sinh hóa hiện đại. 1998: Nxb Giáo dục. 66. Craig, L.C., [89] Techniques for the study of peptides and proteins by dialysis and diffusion, in Methods in enzymology. 1967, Elsevier. p. 870-905. 67. Minkova, K., et al., Purification of C-phycocyanin from Spirulina (Arthrospira) fusiformis. Journal of biotechnology, 2003. 102(1): p. 55-59. 68. Kamble, S.P., et al., Extraction and purification of C-phycocyanin from dry Spirulina powder and evaluating its antioxidant, anticoagulation and prevention of DNA damage activity. Journal of Applied Pharmaceutical Science, 2013. 3(8): p. 149. 69. Melo, F.R., et al., Purification and partial characterisation of a lectin from the red marine alga Vidalia obtusiloba C. Agardh. Brazilian Journal of Botany, 2004. 27(2): p. 263-269. 70. Patel, A., et al., Purification and characterization of C-Phycocyanin from cyanobacterial species of marine and freshwater habitat. Protein expression and purification, 2005. 40(2): p. 248-255. 71. Fane, A.T., R. Wang, and Y. Jia, Membrane technology: Past, present and future, in Membrane and Desalination Technologies. 2011, Springer. p. 1-45. 72. Susanto, H., et al., Ultrafiltration of polysaccharide–protein mixtures: elucidation of fouling mechanisms and fouling control by membrane surface modification. Separation and Purification Technology, 2008. 63(3): p. 558-565. 73. Schwenzfeier, A., P.A. Wierenga, and H. Gruppen, Isolation and characterization of soluble protein from the green microalgae Tetraselmis sp. Bioresource technology, 2011. 102(19): p. 9121-9127. 74. Denis, C., et al., Concentration and pre-purification with ultrafiltration of a R- phycoerythrin solution extracted from macro-algae Grateloupia turuturu: process definition and up-scaling. Separation and Purification Technology, 2009. 69(1): p. 37-42. 75. Michalak, I. and K. Chojnacka, Algae as production systems of bioactive compounds. Engineering in Life Sciences, 2015. 15(2): p. 160-176. 76. Sheih, I.-C., et al., Anticancer and antioxidant activities of the peptide fraction from algae protein waste. Journal of agricultural and food chemistry, 2009. 58(2): p. 1202-1207. 77. Wang, T., et al., Enzyme-enhanced extraction of antioxidant ingredients from red algae Palmaria palmata. LWT-Food Science and Technology, 2010. 43(9): p. 1387-1393. 114

78. Je, J.-Y., et al., Antioxidant activity of enzymatic extracts from the brown seaweed Undaria pinnatifida by electron spin resonance spectroscopy. LWT- Food Science and Technology, 2009. 42(4): p. 874-878. 79. Shiu, C.-T. and T.-M. Lee, Ultraviolet-B-induced oxidative stress and responses of the ascorbate–glutathione cycle in a marine macroalga Ulva fasciata. Journal of Experimental Botany, 2005. 56(421): p. 2851-2865. 80. Beaulieu, L., et al., Characterization of antibacterial activity from protein hydrolysates of the macroalga Saccharina longicruris and identification of peptides implied in bioactivity. Journal of Functional Foods, 2015. 17: p. 685- 697. 81. Al-Saif, S.S.A.-l., et al., Antibacterial substances from marine algae isolated from Jeddah coast of Red sea, Saudi Arabia. Saudi journal of biological sciences, 2014. 21(1): p. 57-64. 82. Sivaramakrishnan, T., et al., Analysis of proximate composition and in-vitro antibacterial activity of selected green seweeds from South Andaman Coast of India. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci, 2017. 6(12): p. 1739-1749. 83. Samarakoon, K. and Y.-J. Jeon, Bio-functionalities of proteins derived from marine algae—A review. Food Research International, 2012. 48(2): p. 948-960. 84. Jideani, V., Functional properties of soybean food ingredients in food systems. Soybean-Biochemistry, chemistry and physiology, 2011: p. 345-366. 85. Schwenzfeier, A., et al., Effect of charged polysaccharides on the techno- functional properties of fractions obtained from algae soluble protein isolate. Food hydrocolloids, 2014. 35: p. 9-18. 86. Sharma, G.M., et al., Functional properties of select edible oilseed proteins. Journal of agricultural and food chemistry, 2010. 58(9): p. 5457-5464. 87. Ragab, D.M., E.E. Babiker, and A.H. Eltinay, Fractionation, solubility and functional properties of cowpea (Vigna unguiculata) proteins as affected by pH and/or salt concentration. Food chemistry, 2004. 84(2): p. 207-212. 88. Mao, X. and Y. Hua, Composition, structure and functional properties of protein concentrates and isolates produced from walnut (Juglans regia L.). International journal of molecular sciences, 2012. 13(2): p. 1561-1581. 89. Brody, T., Nutritional biochemistry. 1998: Elsevier. 90. Gleeson, M. and A. Jeukenbrup, Sport nutrition: an introduction to energy production and performance. 2004: Human Kinetics. 91. Hur, S.J., et al., In vitro human digestion models for food applications. Food Chemistry, 2011. 125(1): p. 1-12. 92. Butts, C.A., J.A. Monro, and P.J. Moughan, In vitro determination of dietary protein and amino acid digestibility for humans. British Journal of Nutrition, 2012. 108(S2): p. S282-S287. 93. Tavano, O.L., V.A. Neves, and S.I. da Silva Júnior, In vitro versus in vivo protein digestibility techniques for calculating PDCAAS (protein digestibility-corrected amino acid score) applied to chickpea fractions. Food Research International, 2016. 89: p. 756-763. 94. Khanam, A., R.K. ChikkeGowda, and B. Swamylingappa, Functional and nutritional evaluation of supplementary food formulations. Journal of food science and technology, 2013. 50(2): p. 309-316. 115

95. Campaña-Torres, A., et al., In vivo dry matter and protein digestibility of three plant-derived and four animal-derived feedstuffs and diets for juvenile Australian redclaw, Cherax quadricarinatus. Aquaculture, 2005. 250(3-4): p. 748-754. 96. Hu, B. and A. Esen, Heterogeneity of soybean seed proteins: one-dimensional electrophoretic profiles of six different solubility fractions. Journal of agricultural and food chemistry, 1981. 29(3): p. 497-501. 97. Lowry, O.H., et al., Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of biological chemistry, 1951. 193: p. 265-275. 98. Akeson, W.R. and M.A. Stahmann, A pepsin pancreatin digest index of protein quality evaluation. The Journal of nutrition, 1964. 83(3): p. 257-261. 99. Almeida, C.C., et al., In vitro digestibility of commercial whey protein supplements. LWT-Food Science and Technology, 2015. 61(1): p. 7-11. 100. Schaafsma, G., The protein digestibility–corrected amino acid score. The Journal of nutrition, 2000. 130(7): p. 1865S-1867S. 101. Reeves, P.G., K.L. Rossow, and J. Lindlauf, Development and testing of the AIN- 93 purified diets for rodents: results on growth, kidney calcification and bone mineralization in rats and mice. The Journal of nutrition, 1993. 123(11): p. 1923- 1931. 102. Øverland, M., L.T. Mydland, and A. Skrede, Marine macroalgae as sources of protein and bioactive compounds in feed for monogastric animals. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2019. 99(1): p. 13-24. 103. Neveux, N., et al., Comparing the potential production and value of high‐energy liquid fuels and protein from marine and freshwater macroalgae. Gcb Bioenergy, 2015. 7(4): p. 673-689. 104. Damodaran, S., Amino acids, peptides and proteins. Fennema’s food chemistry, 2008. 4: p. 425-439. 105. Gandhi, K., et al., Extraction, fractionation and characterization of cotton (Gossypium herbaceum L.) seed proteins. Ind J Agri Sci, 2017. 30(1): p. 21. 106. Agboola, S., D. Ng, and D. Mills, Characterisation and functional properties of Australian rice protein isolates. Journal of cereal science, 2005. 41(3): p. 283- 290. 107. Field, L.M., et al., A comparison of protein extraction methods optimizing high protein yields from marine algae and cyanobacteria. Journal of applied phycology, 2017. 29(3): p. 1271-1278. 108. Fudholi, A., et al., The effects of drying air temperature and humidity on drying kinetics of seaweed. Recent Research in Geography, Geology, Energy, Environment and Biomedicine, 2011: p. 129-133. 109. Norra, I., A. Aminah, and R. Suri, Effects of drying methods, solvent extraction and particle size of Malaysian brown seaweed, Sargassum sp. on the total phenolic and free radical scavenging activity. International Food Research Journal, 2016. 23(4): p. 1558. 110. Gião, M.S., et al., Effect of particle size upon the extent of extraction of antioxidant power from the plants Agrimonia eupatoria, Salvia sp. and Satureja montana. Food Chemistry, 2009. 117(3): p. 412-416. 116

111. Stoll, V.S. and J.S. Blanchard, [4] Buffers: Principles and practice, in Methods in enzymology. 1990, Elsevier. p. 24-38. 112. Alvarez, T.M., et al., Structure and function of a novel cellulase 5 from sugarcane soil metagenome. PloS one, 2013. 8(12): p. e83635. 113. Serrano Jr, A.E. and R.F. Traifalgar, Ontogeny and induction of digestive enzymes in Scylla serrata larvae fed live or artificial feeds or their combination. Aquaculture, Aquarium, Conservation & Legislation, 2012. 5(3): p. 101-111. 114. Grahame, D., B. Bryksa, and R. Yada, Factors affecting enzyme activity, in Improving and Tailoring Enzymes for Food Quality and Functionality. 2015, Elsevier. p. 11-55. 115. Chaplin, M.F. and C. Bucke, Enzyme technology. 1990: CUP Archive. 116. Joubert, Y. and J. Fleurence, Simultaneous extraction of proteins and DNA by an enzymatic treatment of the cell wall of Palmaria palmata (Rhodophyta). Journal of Applied phycology, 2008. 20(1): p. 55-61. 117. Wang, Y., et al., Aqueous enzymatic extraction of oil and protein hydrolysates from peanut. Food science and technology research, 2008. 14(6): p. 533-533. 118. Guan, X. and H. Yao, Optimization of Viscozyme L-assisted extraction of oat bran protein using response surface methodology. Food chemistry, 2008. 106(1): p. 345-351. 119. Akasha, I.A.M., Extraction and characterisation of protein fraction from date palm (Phoenix dactylifera L.) seeds. 2014, Heriot-Watt University. 120. Mæhre, H., I.-J. Jensen, and K.-E. Eilertsen, Enzymatic pre-treatment increases the protein bioaccessibility and extractability in Dulse (Palmaria palmata). Marine drugs, 2016. 14(11): p. 196. 121. Nataraja, S., D. Chetan, and M. Krishnappa, Effect of temperature on cellulose enzyme activity in crude extracts isolated from solid wastes microbes. International Journal of Microbiology Research, 2010. 2(2): p. 44-47. 122. Fayyaz-ur-Rehman, M., et al., Inhibition studies of cellulolytic activities isolated from Planococcus citri. Open Enz Inhib J, 2009. 2: p. 8-11. 123. da Costa Alves, A.S., Enzymatic deconstruction of cellulosic residual biomass. 2015. 124. Sarker, P.K., et al., Optimization and partial characterization of culture conditions for the production of alkaline protease from Bacillus licheniformis P003. SpringerPlus, 2013. 2(1): p. 506. 125. Deb, P., et al., Production and partial characterization of extracellular amylase enzyme from Bacillus amyloliquefaciens P-001. SpringerPlus, 2013. 2(1): p. 154. 126. Ansari, A.A. and S.M. Ghanem, Seasonal variation in the growth responses of some chlorophytic algal flora of the Red Sea. The Egyptian Journal of Aquatic Research, 2017. 43(2): p. 129-134. 127. Nhơn, H.T.N., BƯỚC ĐẦU THU NHẬN R-PHYCOERYTHRIN TỪ RONG NƯỚC LỢ CHEATOMORPHA SP. ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG. Vietnam Journal of Science and Technology, 2016. 54(2C): p. 432. 128. Gabrielsson, J., N.O. Lindberg, and T. Lundstedt, Multivariate methods in pharmaceutical applications. Journal of Chemometrics: A Journal of the Chemometrics Society, 2002. 16(3): p. 141-160. 117

129. Jain, A., M. Prakash, and C. Radha, Extraction and evaluation of functional properties of groundnut protein concentrate. Journal of food science and technology, 2015. 52(10): p. 6655-6662. 130. Brishti, F.H., et al., Evaluation of the functional properties of mung bean protein isolate for development of textured vegetable protein. International Food Research Journal, 2017. 24(4): p. 1595-1605. 131. Slocombe, S.P., et al., A rapid and general method for measurement of protein in micro-algal biomass. Bioresource technology, 2013. 129: p. 51-57. 132. Thoo, Y.Y., et al., Effects of binary solvent extraction system, extraction time and extraction temperature on phenolic antioxidants and antioxidant capacity from mengkudu (Morinda citrifolia). Food Chemistry, 2010. 120(1): p. 290-295. 133. Van Der Borght, A., et al., Extractability and chromatographic separation of rice endosperm proteins. Journal of Cereal Science, 2006. 44(1): p. 68-74. 134. Cacace, J. and G. Mazza, Mass transfer process during extraction of phenolic compounds from milled berries. Journal of Food Engineering, 2003. 59(4): p. 379-389. 135. Al-Farsi, M.A. and C.Y. Lee, Optimization of phenolics and dietary fibre extraction from date seeds. Food Chemistry, 2008. 108(3): p. 977-985. 136. Sơn, V.H. and H.D. Tư, Nghiên cứu trích li Polyphenoltừ chè xanh vụn. Phần1: Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích li polyphenol. Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 2009. 47(1): p. 81-86. 137. Oomah, B.D., G. Mazza, and W. Cui, Optimization of protein extraction from flaxseed meal. Food Research International, 1994. 27(4): p. 355-361. 138. Harnedy, P.A. and R.J. FitzGerald, Extraction of protein from the macroalga Palmaria palmata. LWT-Food Science and Technology, 2013. 51(1): p. 375- 382. 139. Ranjan, S., et al., Comparative Evaluation of protein extraction methods from few leguminous seeds. Int J Adv Biotechnol Res, 2012. 3: p. 558Ā563. 140. Narsing Rao, G., P. Prabhakara Rao, and D. Govardhana Rao, Preparation of wood apple (Feronia limonia L.) seed protein concentrate and evaluation of its nutritional and functional characteristics. International Food Research Journal, 2011. 18(3): p. 949-955. 141. Dev, D.K. and K.D. Mukherjee, Functional properties of rapeseed protein products with varying phytic acid contents. Journal of agricultural and food chemistry, 1986. 34(5): p. 775-780. 142. Yang, B., et al., Enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass. Biofuels, 2011. 2(4): p. 421-449. 143. Monties, B., Plant cell walls as fibrous lignocellulosic composites: relations with lignin structure and function. Animal Feed Science and Technology, 1991. 32(1-3): p. 159-175. 144. Dalagnol, L.M., et al., Improvement of pectinase, xylanase and cellulase activities by ultrasound: Effects on enzymes and substrates, kinetics and thermodynamic parameters. Process Biochemistry, 2017. 61: p. 80-87. 145. Wan, P., et al., Ultrasonic extraction of polysaccharides from Laminaria japonica and their antioxidative and glycosidase inhibitory activities. Journal of Ocean University of China, 2015. 14(4): p. 651-662. 118

146. Englard, S. and S. Seifter, [22] Precipitation techniques, in Methods in enzymology. 1990, Elsevier. p. 285-300. 147. Novák, P. and V. Havlíček, Protein extraction and precipitation, in Proteomic profiling and analytical chemistry. 2016, Elsevier. p. 51-62. 148. Rodsamran, P. and R. Sothornvit, Physicochemical and functional properties of protein concentrate from by-product of coconut processing. Food chemistry, 2018. 241: p. 364-371. 149. Haiwen, W., W. Qiang, and M. Tiezheng, Effects of preparation methods on functional properties of peanut protein. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering, 2009. 2009(4). 150. Du, M., et al., Extraction, physicochemical characteristics and functional properties of Mung bean protein. Food Hydrocolloids, 2018. 76: p. 131-140. 151. Bártová, V. and J. Bárta, Chemical composition and nutritional value of protein concentrates isolated from potato (Solanum tuberosum L.) fruit juice by precipitation with ethanol or ferric chloride. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009. 57(19): p. 9028-9034. 152. Yoshikawa, H., et al., Mechanistic insights into protein precipitation by alcohol. International journal of biological macromolecules, 2012. 50(3): p. 865-871. 153. Vy, H.T.T., T.T. Trúc, and N.V. Mười, Ảnh hưởng của dung môi và thời gian kết tủa đến hiệu quả tinh sạch sơ bộ enzyme protease trích ly từ thịt đầu tôm. Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2016: p. 9-17. 154. Uyên, N.T.B., et al., Khảo sát quá trình kết tủa protein từ dịch trích ly rong mền Chaetomorpha sp. bằng acid và cồn. Tạp chí Khoa học Công nghệ và Thực phẩm, 2018. 17(1): p. 49-56. 155. Wingfield, P., Protein precipitation using ammonium sulfate. Current protocols in protein science, 1998. 13(1): p. A. 3F. 1-A. 3F. 8. 156. Chuner, C., et al., Large scale preparation of phycobiliproteins from Porphyra yezoensis using co-precipitation with ammonium sulfate. Natural Science, 2012. 2012. 157. Harrysson, H., et al., Production of protein extracts from Swedish red, green, and brown seaweeds, Porphyra umbilicalis Kützing, Ulva lactuca Linnaeus, and Saccharina latissima (Linnaeus) JV Lamouroux using three different methods. Journal of applied phycology, 2018. 30(6): p. 3565-3580. 158. Wingfield, P.T., Protein precipitation using ammonium sulfate. Current protocols in protein science, 2016. 84(1): p. A. 3F. 1-A. 3F. 9. 159. Smith, D.M., Protein separation and characterization procedures, in Food analysis. 2017, Springer. p. 431-453. 160. Gibson, C.J. and R.J. Wurtman, Physiological control of brain catechol synthesis by brain tyrosine concentration. Biochemical pharmacology, 1977. 26(12): p. 1137-1142. 161. Kuramitsu, R., et al., New Usage of Aspartic Acid and Glutamic Acid as Food Materials. 1993, ACS Publications. 162. Rosenthal, N.E., et al., Psychobiological effects of carbohydrate-and protein- rich meals in patients with seasonal affective disorder and normal controls. Biological Psychiatry, 1989. 25(8): p. 1029-1040. 119

163. Hu, H., et al., Effects of ultrasound on structural and physical properties of soy protein isolate (SPI) dispersions. Food Hydrocolloids, 2013. 30(2): p. 647-655. 164. Tang, W., E. Sanville, and G. Henkelman, A grid-based Bader analysis algorithm without lattice bias. Journal of Physics: Condensed Matter, 2009. 21(8): p. 084204. 165. Akalın, A., et al., Microstructural, textural, and sensory characteristics of probiotic yogurts fortified with sodium calcium caseinate or whey protein concentrate. Journal of Dairy Science, 2012. 95(7): p. 3617-3628. 166. Li, J.-Y., A.-I. Yeh, and K.-L. Fan, Gelation characteristics and morphology of corn starch/soy protein concentrate composites during heating. Journal of food engineering, 2007. 78(4): p. 1240-1247. 167. Hughes, E.N., A. Colombatti, and J. August, Murine cell surface glycoproteins. Purification of the polymorphic Pgp-1 antigen and analysis of its expression on macrophages and other myeloid cells. Journal of Biological Chemistry, 1983. 258(2): p. 1014-1021. 168. Rice, K.G., M.K. Rottink, and R.J. Linhardt, Fractionation of heparin-derived oligosaccharides by gradient polyacrylamide-gel electrophoresis. Biochemical Journal, 1987. 244(3): p. 515-522. 169. Pierre, G., et al., Antibacterial activity of a sulfated galactan extracted from the marine alga Chaetomorpha aerea against Staphylococcus aureus. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011. 16(5): p. 937-945. 170. Senthilkumar, P. and S. Sudha, Antioxidant and antibacterial properties of methanolic extract of green seaweed Chaetomorpha linum from Gulf of Mannar: Southeast coast of India. Jundishapur Journal of Microbiology, 2012. 5(2): p. 411. 171. Marudhupandi, T. and T.T.A. Kumar, Antibacterial effect of fucoidan from Sargassum wightii against the chosen human bacterial pathogens. International Current Pharmaceutical Journal, 2013. 2(10): p. 156-158. 172. Xuân Cường, Đ., et al., Nghiên cứu chiết phlorotannin có hoạt tính chống oxy hóa từ rong nâu Sargassum mcclurei bằng phương pháp ngâm chiết có hỗ trợ vi sóng. Tạp chí Khoa học và Công Nghệ, 2014. 52(2): p. 135-141. 173. Thanigaivel, S., et al., Antioxidant and antibacterial activity of Chaetomorpha antennina against shrimp pathogen Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture, 2014. 433: p. 467-475. 174. Wu, H.-L., et al., Stability and antioxidant activity of food-grade phycocyanin isolated from Spirulina platensis. International journal of food properties, 2016. 19(10): p. 2349-2362. 175. Memarpoor-Yazdi, M., H. Mahaki, and H. Zare-Zardini, Antioxidant activity of protein hydrolysates and purified peptides from Zizyphus jujuba fruits. Journal of functional foods, 2013. 5(1): p. 62-70. 176. Tironi, V.A. and M.C. Añón, Amaranth proteins as a source of antioxidant peptides: Effect of proteolysis. Food Research International, 2010. 43(1): p. 315- 322. 177. Sivapriya, M. and S. Leela, Isolation and purification of a novel antioxidant protein from the water extract of Sundakai (Solanum torvum) seeds. Food chemistry, 2007. 104(2): p. 510-517. 120

178. Damgaard, T., R. Lametsch, and J. Otte, Antioxidant capacity of hydrolyzed animal by-products and relation to amino acid composition and peptide size distribution. Journal of Food Science and Technology, 2015. 52(10): p. 6511- 6519. 179. Fenton, R. and C. DK, Fenton reaction-controversy concerning the chemistry. Ecol. Chem. Eng, 2009. 16(3): p. 347-358. 180. Storcksdieck, S., G. Bonsmann, and R. Hurrell, Iron‐binding properties, amino acid composition, and structure of muscle tissue peptides from in vitro digestion of different meat sources. Journal of food science, 2007. 72(1): p. S019-S029. 181. Sóvágó, I., C. Kállay, and K. Várnagy, Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews, 2012. 256(19-20): p. 2225-2233. 182. Kim, S.B., et al., Separation of iron-binding protein from whey through enzymatic hydrolysis. International Dairy Journal, 2007. 17(6): p. 625-631. 183. Cúc, N.T., et al., The antioxidant and in vitro hepatoprotective activities of some chemical fractions from Phyllanthus reticulates Poir. plant. Vietnam Journal of Biotechnology, 2017. 15(2): p. 251-258. 184. Stroev, E. and V. Makarova, Determination of lipid peroxidation rate in tissue homogenate laboratory. Manual in Biochemistry, Moscow, 1989: p. 243-256. 185. Novoa, V., et al., Antioxidant activity related to phenolic acids in the aqueous extract of the marine seaweed Bryothamnion triquetrum (SG Gmelim) Howe. Revista-Brasilerra-deficiencias-Farmaceuticas, 2001: p. 373-382. 186. Ruberto, G., et al., Antioxidant activity of extracts of the marine algal genus Cystoseira in a micellar model system. Journal of Applied Phycology, 2001. 13(5): p. 403-407. 187. Jiménez‐Escrig, A., et al., Antioxidant activity of fresh and processed edible seaweeds. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001. 81(5): p. 530- 534. 188. Gordon, M.H. and P. Magos, The effect of sterols on the oxidation of edible oils. Food Chemistry, 1983. 10(2): p. 141-147. 189. Anggadiredja, J. and R. Andyani, Antioxidant activity of Sargassum polycystum (Phaeophyta) and Laurencia obtusa (Rhodophyta) from Seribu islands. Journal of Applied Phycology, 1997. 9(5): p. 477. 190. Weng, X. and W. Wang, Antioxidant activity of compounds isolated from Salvia plebeia. Food Chemistry, 2000. 71(4): p. 489-493. 191. Jia, Z.-S., et al., Antioxidant synergism of tea polyphenols and α-tocopherol against free radical induced peroxidation of linoleic acid in solution. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions 2, 1998(4): p. 911-916. 192. Schwenzfeier, A., et al., Emulsion properties of algae soluble protein isolate from Tetraselmis sp. Food Hydrocolloids, 2013. 30(1): p. 258-263. 193. Benelhadj, S., et al., Effect of pH on the functional properties of Arthrospira (Spirulina) platensis protein isolate. Food chemistry, 2016. 194: p. 1056-1063. 194. Kandasamy, G., S.K. Karuppiah, and P.V.S. Rao, Salt-and pH-induced functional changes in protein concentrate of edible green seaweed Enteromorpha species. Fisheries science, 2012. 78(1): p. 169-176. 121

195. Adebiyi, A.P. and R.E. Aluko, Functional properties of protein fractions obtained from commercial yellow field pea (Pisum sativum L.) seed protein isolate. Food Chemistry, 2011. 128(4): p. 902-908. 196. Snyder, H. and T. Kwon, Nutritional attributes of soybeans and soybean products. Soybean Utilization, 1987: p. 203. 197. Adebowale, K.O., et al., Functional properties of native, physically and chemically modified breadfruit (Artocarpus artilis) starch. Industrial Crops and Products, 2005. 21(3): p. 343-351. 198. Moongngarm, A., et al., Functional properties of protein concentrate from black cowpea and its application. American Journal of Applied Sciences, 2014. 11(10): p. 1811-1818. 199. Haque, M.A., B. Timilsena, and B. Adhikari, Food proteins, structure, and function. Reference Module in Food Science. Elsevier. http://dx. doi. org/10.1016/B978-0-08-100596-5.03057-2, 2016. 200. Alobo, A.P., Proximate composition and functional properties of Pleurotus tuberregium sclerotia flour and protein concentrate. Plant Foods for Human Nutrition, 2003. 58(3): p. 1-9. 201. Bashir, S., et al., Functional properties and amino acid profile of Spirulina platensis protein isolates. Biological Sciences-PJSIR, 2016. 59(1): p. 12-19. 202. López, D.N., et al., Functional properties of amaranth, quinoa and chia proteins and the biological activities of their hydrolyzates. Food research international, 2019. 116: p. 419-429. 203. Lawal, O., K. Adebowale, and Y. Adebowale, Functional properties of native and chemically modified protein concentrates from bambarra groundnut. Food research international, 2007. 40(8): p. 1003-1011. 204. Ba, F., et al., Haematococcus pluvialis soluble proteins: extraction, characterization, concentration/fractionation and emulsifying properties. Bioresource technology, 2016. 200: p. 147-152. 205. Shevkani, K., et al., Relationship between physicochemical and functional properties of amaranth (A maranthus hypochondriacus) protein isolates. International Journal of Food Science & Technology, 2014. 49(2): p. 541-550. 206. Kim, S.-K., Handbook of marine macroalgae: biotechnology and applied phycology. 2011: John Wiley & Sons. 207. Minh, B.N., et al., Determination of biochemical composition and in vitro digestibility of protein isolate from brackish algae Chaetomorpha sp., in The 3rd ICSAF: Food Innovation for Asian Community Development 2018. p. 88-97. 208. Organization, W.H., Protein Quality Evaluation: Report of the Joint FAO/WHO Expert Consultation, Bethesda, Md., USA, 4-8 December 1989. Vol. 51. 1991: Food & Agriculture Org. 209. Joint, F. and W.H. Organization, Protein and amino acid requirements in human nutrition: report of a joint FAO/WHO/UNU expert consultation. 2007. 210. Mokrane, H., et al., Assessment of Algerian sorghum protein quality [Sorghum bicolor (L.) Moench] using amino acid analysis and in vitro pepsin digestibility. Food chemistry, 2010. 121(3): p. 719-723. 122

211. Hejazi, S.N., et al., Improvement of the in vitro protein digestibility of amaranth grain through optimization of the malting process. Journal of Cereal Science, 2016. 68: p. 59-65. 212. Černá, M., Seaweed proteins and amino acids as nutraceuticals, in Advances in food and nutrition research. 2011, Elsevier. p. 297-312. 213. Kalpanadevi, V. and V. Mohan, Effect of processing on antinutrients and in vitro protein digestibility of the underutilized legume, Vigna unguiculata (L.) Walp subsp. unguiculata. LWT-Food Science and Technology, 2013. 51(2): p. 455- 461. 214. Yang, H., et al., Evaluation of nutritional quality of a novel pea protein. Agro Food Industry Hi-Tech, 2012. 23(8): p. 10. 215. Sarwar, G., The protein digestibility–corrected amino acid score method overestimates quality of proteins containing antinutritional factors and of poorly digestible proteins supplemented with limiting amino acids in rats. The Journal of nutrition, 1997. 127(5): p. 758-764. 216. Osborne, T.B., L.B. Mendel, and E.L. Ferry, A method of expressing numerically the growth-promoting value of proteins. Journal of Biological Chemistry, 1919. 37(2): p. 223-229. 217. Bender, A., Biological methods of evaluating protein quality. Proceedings of the Nutrition Society, 1958. 17(1): p. 85-91. 218. Abdel-Aziz, S., et al., In vivo rat assay for true protein digestibility and protein quality of beef and meat products extended with soy protein. International journal of food sciences and nutrition, 1997. 48(1): p. 51-56. 219. Whitney, E.N. and S.R. Rolfes, Understanding Nutrition. Belmont, CA: West. 1999, Wadsworth Publishing Company. 220. Bennett, A. and L. Bogorad, Complementary chromatic adaptation in a filamentous blue-green alga. The Journal of cell biology, 1973. 58(2): p. 419- 435. 221. Silveira, S., et al., Optimization of phycocyanin extraction from Spirulina platensis using factorial design. Bioresource technology, 2007. 98(8): p. 1629- 1634. 222. PUNGOR, A., S. TÖMÖSKÖZI, and R. LÁSZTITY, INVESTIGATION OF THE FOAMING PROPERTIES OF SOME FOOD PROTEIN PREPARATIONS. Periodica Polytechnica Chemical Engineering, 1992. 36(2): p. 127-135. 223. Wu, W., N. Hettiarachchy, and M. Qi, Hydrophobicity, solubility, and emulsifying properties of soy protein peptides prepared by papain modification and ultrafiltration. Journal of the American Oil Chemists' Society, 1998. 75(7): p. 845-850. 224. Pearce, K.N. and J.E. Kinsella, Emulsifying properties of proteins: evaluation of a turbidimetric technique. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1978. 26(3): p. 716-723. 225. Hegsted, D., Methods of estimating protein quality. Food and Agriculture Organization of the United Nations. 1971. 226. Olu, M. and A.E. Adediran, Protein evaluation of foods. International Journal of Nutrition and Food Sciences, 2015. 4(6): p. 700-706.

PHỤ LỤC PHỤ LỤC A. CÁC PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM A1. Nồng độ cuối cùng của ammonium sulfate: tỷ lệ bảo hòa ở 0oC

A2. Tinh sạch protein bằng phương pháp sắc ký lọc gel Chọn lựa gel Sắc ký dùng để tinh sạch enzyme dùng cột 50 x 1, 5 và Biogel P – 100. Cỡ hạt hay sử dụng 100 – 200 mesh (10 – 40µm) hay 200 – 400 mesh (20 – 80µm). Hạt nhỏ cho kết quả tách tốt hơn, nhưng thời gian thực hiện lại rất dài. Chuẩn bị gel và cột Cân 5g gel Bio – Gel P – 100 khô (chính xác cần dùng 4,4g nhưng vì thể tích gel sẽ bị mất trong suốt quá trình thao tác nên cần cân dư). Cho nước cất vào từ từ, luợng nước cất nhiều gấp 2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho vào trong cột. Cụ thể ít nhất 53 x 2 = 106 ml nước cất. Đối với các gel từ Bio gel P – 30 đến Bio gel P – 100 cần 12 giờ ở 20oC để hydrate hoá hoặc 4 giờ nếu bắt đầu ở 100oC. Sau khi thể huyền phù đồng nhất của các hạt gel hình thành, không cần phải khuấy, để ổn định trong suốt quá trình hydrate hoá. Sau khi quá trình hydrate hoá xảy ra hoàn toàn, gạn lớp nổi trên bề mặt. Chuyển dung dịch vào 1 bình hút chân không có gắn với vòi hút chân không. Khử khí của dung dịch trong khoảng từ 5 – 10 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ bình. Không dùng đũa khuấy vì nó có thể làm hư gel.

Thêm dung dịch đệm khử khí với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền (106 ml) và lắc nhẹ. Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95 % số hạt ổn định. Gạn hoặc loại bỏ lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để tạo các hạt mịn. Lập lại công việc trên 4 lần để loại > 90 % hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel. Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20 % thể tích cột. Rót dung dịch gel vào cột thành 1 dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bẩn gel, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bọt khí. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 – 5 cm, mở khoá đầu ra của cột cho đến khi cột nạp đầy gel. Khi cột đã nạp đầy gel, khoá đầu ra của cột và gắn flow adaptor. Mở khoá đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp 2 lần thể tích lớp nền (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ qua dòng chảy. Đóng đầu ra của cột và điều chỉnh dòng điện xuống lớp nền gel. Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền bằng cách bơm hoặc tiêm mẫu vào trên lớp nền gel qua dòng điện. Nếu tiêm mẫu thì tốc độ dòng tiêm không vượt quá tốc độ dòng tách đề nghị. Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không lẫn các vật rắn), hoàn toàn hoà tan trong dung dịch đệm. Cho mẫu quá nhiều cột làm giảm độ phân tách, ít quá làm mẫu bị loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10 – 20 % tổng thể tích cột. Để phân tích chỉ được phép đưa 1 lượng mẫu nhỏ vào 1/55 tổng thể tích cột (là thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi). Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng chảy tự do. Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8 – 12 ml/cm2 mặt cắt ngang (15 – 25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2 – 5 ml/cm2 (5 – 10 ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén. Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và cho kết quả tốt đối với gel bằng lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng chảy ổn định, nên phải dùng bơm nén. Thông thường là nén theo chiều trọng lực, tuy nhiên cũng có tác giả sử dụng cách nén ngược lên.

Thu và xác định mẫu

Dịch ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm bằng bộ tách sóng trong hệ sắc ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP data view trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector), mỗi phân đoạn 2 ml. Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak sau đó phân tích hàm lượng protein và xác định hoạt tính. A3. Phương pháp xác định hàm lượng phycocyanin Phycocyanin là sắc tố có màu xanh, tan được trong nước, thường gặp trong các loài rong tảo có màu xanh lục. Phycocyanin được cho là có nhiều công dụng trong việc tăng cường hệ thống miễn dịch, chống oxi hóa và chống viêm. Khả năng hấp thu quang phổ mạnh nhất trong khoảng bước sóng 615 – 620 nm, phát quang ở bước sóng 647 – 652 nm. Xác định phycocyanin bằng phương pháp đo quang phổ UV-Vis. Nồng độ phycocyanin (PC) được xác định theo công thức của Bennett và Bogorad) [220].

Hàm lượng PC (mg/ml) = (OD620 – 0,474*OD652) / 5,34 Trong đó: PC là lượng phycocyanin (mg/mL). OD620 độ hấp thụ đo ở bước sóng 615 nm. OD652 độ hấp thụ đo ở bước sóng 652 nm. Hiệu suất trích ly (PC) được xác định theo công thức của Silveira [221]. Hiệu suất (Y) = PC* V / BD Trong đó: Y là hiệu suất trích ly (mg/g). PC là lượng phycocyanin (mg/mL). V là thể tích dịch trích (ml). BD là khối lượng sinh khối khô (g). Độ tinh khiết (EP) được xác định theo công thức: Độ tinh khiết (EP) = OD620 / OD280 Trong đó: EP là độ tinh khiết OD620 độ hấp thụ đo ở bước sóng 620 nm. OD280 độ hấp thụ đo ở bước sóng 280 nm.

A4. Phương pháp kiểm tra khả năng kháng khuẩn trên môi trường thạch

Nguyên tắc của phương pháp là xác định khả năng kháng của chế phẩm protein concentrate từ rong với các chủng vi sinh vật gây bệnh. Dịch chiết protein được bơm vào phần thạch được đục lỗ sẽ khuếch tán vào lớp thạch gây ức chế sự phát triển của vi khuẩn ở xung quanh. Vùng ức chế càng lớn thì tác dụng kháng khuẩn càng mạnh. Phương pháp tiến hành − Dịch vi khuẩn được nuôi trong môi trường dinh dưỡng cơ bản LB (pepton 10g/l, NaCl 10g/l, yeast extract 5g/l) trong 24 giờ. − Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn với nồng độ 108 CFU/ml cấy trang trên môi trường thạch LB. − Khoan lỗ thạch có đường kính 0.8cm, và bổ sung dịch chiết protein vào lỗ thạch. Dịch chiết protein được pha loãng ở các nồng độ từ 1mg/ml đến 10mg/ml. Hút 40µl dịch chiết protein ở các nồng độ vào mỗi lỗ thạch trên đĩa petri đã cấy vi khuẩn. − Ủ ở 370C, đọc kết quả sau 24 giờ. Xác định hiệu quả ức chế Đo đường kính vòng vô khuẩn và thực hiện tính hiệu quả ức chế với công thức: V = (Dvk - D) Trong đó: V: Vùng ức chế vi khuẩn (cm) D: Đường kính lỗ khoan thạch 0,8cm. Dvk: Đường kính vòng vô khuẩn (cm). A5. Phương pháp thử hoạt tính bắt gốc tự do DPPH DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl là chất tạo ra gốc tự do được dùng để sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng 517 nm. Cách tiến hành: − Pha dung dịch DPPH có nồng độ 1 mM trong Methanol (MeOH). − Mẫu thử được pha loãng trong DMSO 100% theo dãy nồng độ là 128 mg/ml; 32mg/ml; 8mg/ml; 2mg/ml; 0,5mg/ml. − Để thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp thụ của DPPH chưa phản ứng ở bước sóng 517 nm. Phần trăm

− % quét gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau: (푂퐷 푚ẫ푢 푡푟ắ푛𝑔 − 푂퐷 푚ẫ푢 푡ℎử) 푆퐶 (%) = 푥 100 푂퐷 푚ẫ푢 푡푟ắ푛𝑔 A6. Phương pháp thử nghiệm bắt gốc tự do ABTS•+ Nguyên tắc: Dung dịch ABTS•+ có màu lục đến xanh ngọc, có độ hấp thu cực đại tại bước sóng đặc trưng là 734 nm. Khi các hợp chất có tính oxy hóa cao tác dụng với dung dịch chứa ABTS•+, ABTS•+ bị khử chuyển thành dạng không màu ABTS-R+. Cách tiến hành: Chuẩn bị dung dịch ABTS•+: dung dịch ABTS•+ 7 mM và K2S2O8 2,4 mM (tỷ lệ 1: 1 v/v), ủ dung dịch trong bóng tối 16 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó, pha loãng dung dịch này bằng methanol (khoảng 30 lần), điều chỉnh độ hấp thu ở 734 nm đến 0,7 ± 0,05. Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu được pha loãng liên tục ½ từ dung dịch huyền phù gốc bằng nước cất hai lần để thu được một dãy bao gồm 5 nồng độ (đơn vị tính theo độ pha loãng). Hỗn hợp phản ứng mẫu thử: 40 μl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau và 1160 μl dung dịch ABTS•+. Ủ hỗn hợp trong 7 phút ở nhiệt độ phòng và đo độ hấp thụ quang ở 734 nm. Mẫu chứng thử: thay dung dịch ABTS•+ bằng methanol. Mẫu chứng: thay mẫu thử bằng dung môi pha mẫu. Mẫu blank: Thay mẫu thử bằng dung môi pha mẫu, thay dung dịch ABTS•+ bằng methanol. Chứng dương: Vitamin C (Sigma). Cách tính toán: Hoạt tính bắt gốc tự do ABTS•+ (ABTS%) được tính theo công thức: ABTS% = [((ODc – ODc0) – (ODt – ODt0)) / (ODc – ODc0)] × 100. Trong đó, ODc, ODc0, ODt và ODt0 lần lượt là độ hấp thụ quang của mẫu chứng, mẫu blank, mẫu thử và mẫu chứng thử. A7. Phương pháp đánh giá khả năng kết hợp ion Fe2+ Nguyên tắc: Ion sắt hoặc đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Đánh giá khả năng phòng ngừa sinh ra các gốc tự do của chất nghiên cứu thể hiện

qua sự khóa các ion kim loại chuyển tiếp vào dạng phức, không để cho tồn tại ở trạng thái tự do, sẽ làm mất khả năng xúc tác gốc. Hoạt tính chống oxy hóa được thể hiện qua việc ngăn chặn sự tạo phức chất có màu giữa ion Fe2+ với thuốc thử ferrozine. Quy trình thí nghiệm tạo phức với Fe2+ FeSO4 50µM Ferrozine 300 Mẫu thử NaCl 0,15M Ống (µl) µM (µl) (µl) (µl) Trắng 100 - - 900 Chứng 100 100 - 800 Thử 100 100 100 700 Đối chiếu 100 100 100 700 (Na2EDTA)

Lắc đều các ống 15 giây, để ổn định ở nhiệt độ phòng 10 phút và đo quang ở bước sóng 562 nm. Na2EDTA được sử dụng làm đối chiếu. Tính toán kết quả: Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO). ODT: Mật độ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của các lần đo khác nhau. A8. Phương pháp xác định hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào (thử nghiệm MDA) Nguyên tắc: Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid của mẫu nghiên cứu qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Cách tiến hành: 0,1 ml mẫu thử ở các nồng độ thử nghiệm được cho phản ứng với 0,5 ml dịch đồng thể não và thêm đệm phosphat 50 mM vừa đủ 2 ml. Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 15 phút và dừng phản ứng bằng 1 ml acid tricloacetic 10%. Sau khi ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1ml acid thiobarbituric 0,8% trong 15 phút ở nhiệt độ 100oC. Làm lạnh và tiến hành đo quang ở bước sóng bước sóng 532nm.

Trolox (Calbiochem Ltd. Co.), đồng phân của vitamin E được sử dụng làm chất đối chiếu. Tính toán kết quả: Công thức tính % hoạt tính chống oxy hóa (HTCO): HTCO% = [(ODC – ODT) / ODC] x 100 ODC: Mật độ quang của chứng dung môi (DMSO). ODT: Mật độ quang của mẫu thử. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của các lần đo khác nhau. A9. Đánh giá khả năng tạo bọt Phương pháp đánh giá khả năng tạo bọt được thực hiện dựa theo Pungor. Hút 5ml dịch protein 1% được hòa tan trong đệm phosphate 0,1M (pH 8,0) vào ống đong 50 ml và dùng máy vortex tốc độ 3.000 vòng/phút. Thời gian tạo bọt là 2 phút bằng máy vortex có tốc độ 3.000 vòng/phút [222]. Công suất tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) dựa trên công thức: FC(%) = (V −V ) /V 100 s tr tr

Vs: thể tích dung dịch sau khi tạo bọt (ml)

Vtr: thể tích dung dịch trước khi tạo bọt (ml) FS (%) = V /V 100 ft f0

푉푓푡: thể tích bọt tại thời điểm t (60 phút) (ml)

푉푓0: thể tích bọt ban đầu (ml) A10. Đánh giá khả năng tạo gel Sự tạo gel được hình thành do protein bị biến tính và tạo thành một mạng lưới có trật tự. Phương pháp xác định khả năng tạo gel được thực hiện dựa theo báo cáo của Adebowale (2005). Cân protein với các khối lượng khác nhau lần lượt là: 50, 100, 150, 200mg, thêm vào 1ml nước cất. Trong thí nghiệm này mạch protein được biến tính bằng cách gia nhiệt đến 900C trong vòng 10 phút, rồi sau đó làm lạnh nhanh giúp mạng lưới gel protein hình thành, để trong tủ lạnh 40C qua đêm [197].

A11. Đánh giá khả năng hoà tan Phương pháp đánh giá khả năng hòa tan của protein được thực hiện theo Wu (1998). Cân 25 mg mẫu protein hòa tan trong 25ml nước cất, điều chỉnh về các pH khác nhau (3,0; 7,0; 10,0) bằng HCl 0.1N và NaOH 0.1N [223]. Tiến hành khuấy bằng máy khuấy từ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút và ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút thu lấy dịch và xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Bradford. Khả năng hòa tan của protein được tính như sau: 퐻à푚 푙ượ푛𝑔 푝푟표푡푒𝑖푛 푡푟표푛𝑔 푑ị푐ℎ 푛ổ𝑖 % 푃푟표푡푒𝑖푛 ℎò푎 푡푎푛 = × 100 푇ổ푛𝑔 푙ượ푛𝑔 푝푟표푡푒𝑖푛 푐ó 푡푟표푛𝑔 푚ẫ푢

A12. Đánh giá khả năng hấp thu nước - Cân 0.02g protein. - Thêm vào 2ml nước. - Để yên trong 30 phút. - Ly tâm lấy dịch nổi để xác định khả năng hấp thu nước của protein. - Khả năng hấp thu nước được tính như sau: 퐾ℎả 푛ă푛𝑔 ℎấ푝 푡ℎ푢 푛ướ푐 푇ℎể 푡í푐ℎ 푑푢푛𝑔 푑ị푐ℎ 푏푎푛 đầ푢 − 푇ℎể 푡í푐ℎ 푛ướ푐 푠푎푢 푙푦 푡â푚 = × 100 푇ℎể 푡í푐ℎ 푑푢푛𝑔 푑ị푐ℎ 푏푎푛 đầ푢

A13. Đánh giá khả năng tạo nhũ Khả năng tạo nhũ được đo đạc theo phương pháp của Pearce và Kinsella (1978). Hút 2ml tinh dầu bắp và 6ml dung dịch protein 0.1% (pH = 7) được đồng hóa trong thiết bị đồng hóa tốc độ cao 6000 vòng/phút và 0.05 ml nhũ tương được hút từ đáy của vật chứa tại thời điểm 0 và 10 phút sau khi đồng hóa. Mỗi phần được pha loãng với 5 ml của dung dịch SDS 0,1% [224]. Dịch nhũ tương pha loãng được đem đi đo quang phổ tại bước sóng 500 nm. Đo độ hấp thu quang phổ tại thời điểm ban đầu lúc 0 phút (A0) và 10 phút (A10) sau khi hình thành hệ nhũ tương. Giá trị OD đo được được sử dụng để tính chỉ số tạo nhũ tương (EAI) và chỉ số ổn định nhũ tương (ESI).

퐴 × 퐻ệ 푠ố 푝ℎ푎 푙표ã푛𝑔 퐸퐴퐼 (푚2⁄𝑔) = 2푇 ( 0 ) 퐶 × Φ × 10000 ∆푡 퐸퐴퐼 (푝ℎú푡) = 퐴 × 0 ∆퐴 Trong đó: T = 2,303

A0: Độ hấp thu quang phổ đo được ngay sau khi nhũ tương hình thành Hệ số pha loãng = 100 C = trọng lượng khối lượng protein/đơn vị (g/ml) pha nước trước khi nhũ tương hình thành Φ = thể tích dầu bắp

Δt = 10 phút; ΔA = A0 – A10 A14. Khả năng tiêu hóa in vitro Khả năng tiêu hóa in vitro được thực hiện theo phương pháp của Akeson và Stahmann (1964) và được Cristine Couto Almeid (2015) cải tiến. Trong đó, enzyme dùng mô phỏng là hệ thống pepsine-pancreatin. Khả năng tiêu hóa được đánh giá thông qua tỉ lệ protein được phân cắt. Cách tiến hành: Cho 250ml dung dịch protein vào 15ml dung dịch HCl 0,1M có chứa 1,5mg/ml pepsin. Ủ hỗn hợp ở 370C trong 3 giờ, sau đó trung hòa bằng dung dịch NaOH 0,5M. Thêm 10ml đệm phosphate 0,2M (pH=8) có chứa 10mg pancreatin và 1ml Natri azide 0,005M để hạn chế vi sinh vật phát triển, sau đó ủ hỗn hợp ở 37oC qua đêm. Sau khi thủy phân bằng pancreatin thêm 1ml dung dịch tricloacetic 10% (w/v) và ly tâm 20 phút với tốc độ 6000 vòng/phút. Thu lấy dịch nổi và xác định nồng độ Nitơ tổng bằng phương pháp Kjeldahl. Khả năng tiêu hóa in vitro được tính theo công thức: 푁 − 푁 퐼푉푃퐷(%) = 푠 푏 × 100 푁푚 IVPD: Khả năng tiêu hóa in vitro

Ns: Nồng độ N trong mẫu sau thủy phân

Nb: Nồng độ N trong mẫu trắng

Nm: Nồng độ N trong mẫu trước thủy phân

A15. Hệ số tăng trọng Hệ số tăng trọng (PER) được tiến hành dựa theo phương pháp được đề xuất bởi Osborne và cộng sự [216]. Tiêu chuẩn AOAC (1975) yêu cầu thời gian tăng trưởng trong 4 tuần. Hệ số tăng trọng được xác định dựa theo công thức: 푊 푃퐸푅 = 푃 W: Trọng lượng tăng thêm của chuột sau thời gian thử nghiệm (g) P: Lượng protein đã sử dụng trong thời gian thử nghiệm (g) A16. Tỷ lệ hấp thu protein tịnh Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) được cải tiến để không chỉ thể hiện rằng protein cần cho phát triển cơ thể mà còn cần cho duy trì sự sống của sinh vật. Tỷ lệ hấp thu protein tịnh được xây dựng nhằm cải thiện sự thiếu sót của PER. Theo Bender và Doell, sự thiếu sót này có thể khắc phục khi trong mỗi thử nghiệm có thêm một nhóm động vật được cho ăn theo chế độ không có protein. Khi đó tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) được tính theo công thức của Hegsted như sau [225]: 푇 + 퐺 푁푃푅 = 푃 T: Trọng lượng tăng bình quân của nhóm ăn protein sau 30 ngày (g) G: Trọng lượng giảm bình quân của nhóm đối chứng không ăn protein sau 10 ngày (g) P: Lượng protein ăn vào (g) A17. Tỷ lệ hấp thu protein tịnh Đo lường giá trị sinh học BV là một phương pháp đánh giá chất lượng protein trong chế độ ăn. Khái niệm “Giá trị sinh học (BV)” được giới thiệu lần đầu bởi Thomas (1909) khi đo lường giá trị này ở người trưởng thành. Sau đó, phương pháp này được cải tiến bởi Mitchel và cộng sự (1945), dùng đối tượng là chuột để đo lường nhu cầu protein cho việc duy trì sự sống và tăng trưởng. Giá trị sinh học BV được định nghĩa là “phần trăm nitơ hấp thụ được giữ lại trong cơ thể”, giá trị này được tính theo biểu thức Thomas – Mitchel như sau [217]: 푁퐼 − (퐹푁 − 퐹푀푁) − (푈푁 − 푈푁푒) 퐵푉 = × 100 푁퐼 − (퐹푁 − 퐹푀푁)

Tuy nhiên theo thực tế, biểu thức Thomas – Mitchel có hai hạn chế nghiêm trọng khi sử dụng. Đó là rất khó để đo nitơ nội sinh trong nước tiểu và mức độ protein trong khẩu phần ăn không làm thay đổi kết quả. Đôi khi, giá trị sinh học BV được tính theo công thức của Olu, M và cộng sự (2015) [226]: 푁퐼 − 퐹푁 − 푈푁 퐵푉(퐴푝푝푎푟푒푛푡 − 퐵푉) = × 100 푁퐼 − 퐹푁

NI: Nitơ tổng (g) FN: Nitơ tổng trong phân (g) FMN: Nitơ chuyển hóa trong phân (chế độ ăn không nitơ) (g) UN: Nitơ tổng trong nước tiểu (g) UNe: Nitơ nội sinh trong nước tiểu (chế độ ăn không nitơ) (g)

PHỤ LỤC B. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM B1. Thành phần sinh hoá của rong Chaetomorpha Thành phần sinh hóa (%) Các thành Lipid Tro Protein Carbohydrate phần khác (2,03 ± 0,015)a (27,44 ± 0,633)d (12,68 ± 0,551)c (47,19 ± 0,955)e (10,66 ± 0,241)b

ANOVA Table thành phần sinh hoá rong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2534.3 4 633.575 1890.33 0.0000 Within groups 3.35167 10 0.335167 Total (Corr.) 2537.65 14 Multiple Range Tests thành phần sinh hoá rong Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Lipid 3 2.03333 X Khác 3 10.6567 X Protein 3 12.6833 X Tro 3 27.4367 X Carbohydrat 3 47.19 X

B2. Các nhóm protein rong Chaetomorpha sp. Hiệu suất trích ly Hàm lượng % so với tổng hàm % so với tổng hàm Nhóm protein protein lượng protein trong lượng protein trích (mg/g rong khô) rong khô ly được Nhóm tan trong nước (20,02 ± 1,662)b 15,79 34,33 Nhóm tan trong dung (3,54 ± 0,176)a 2,79 6,07 dịch NaCl 0,5M Nhóm tan trong (2,52 ± 0,191)a 1,99 4,32 ethanol 70% Nhóm tan trong dung (32,24 ± 2,009)c 25,42 55,27 dịch NaOH 0,1M Protein có trong rong 126,8 ± 0,551

ANOVA Table nhóm protein rong Chaetomorpha sp. Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1825.98 3 608.661 354.52 0.0000 Within groups 13.7347 8 1.71684 Total (Corr.) 1839.72 11

Multiple Range Tests nhóm protein rong Chaetomorpha sp. Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Nhóm tan trong ethanol 70% 3 2.52333 X Nhóm tan trong dung dịch NaCl 0,5M 3 3.54255 X Nhóm tan trong nước 3 20.0248 X Nhóm tan trong dung dịch NaOH 0,1M 3 32.2386 X

B3. Khảo sát nhiệt độ sấy nguyên liệu Nhiệt độ sấy Hàm lượng protein (mg/g rong khô) rong nguyên Protein tan trong Protein tan trong Tổng hàm lượng liệu (oC) nước kiềm protein 40 (29,28 ± 2,32)bc (51,51 ± 5,23)b (80,79 ± 7,18)b 60 (33,54 ± 2,34)c (65,83 ± 3,19)c (99,37 ± 4,02)c 80 (24,90 ± 3,45)b (52,68 ± 5,84)b (77,58 ± 2,52)b 105 (19,04 ± 1,21)a (37,56 ± 1,21)a (56,59 ± 2,42)a Hàm lượng protein tan trong nước ANOVA Table Hàm lượng protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 346.384 3 115.461 19.08 0.0005 Within groups 48.4216 8 6.0527 Total (Corr.) 394.806 11 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1050C 3 19.037 X 800C 3 24.901 X 400C 3 29.284 XX 600C 3 33.543 X Hàm lượng protein tan trong kiềm ANOVA Table Hàm lượng protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1201.45 3 400.483 21.90 0.0003 Within groups 146.288 8 18.286 Total (Corr.) 1347.74 11 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1050C 3 37.5557 X 400C 3 51.5063 X 800C 3 52.679 X 600C 3 65.827 X

Hàm lượng protein tổng ANOVA Table Hàm lượng protein tổng Source Sum of Squares f Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2764.69 3 921.564 46.07 0.0000 Within groups 160.045 8 20.0056 Total (Corr.) 2924.74 1 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tổng Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1050C 3 56.5927 X 800C 3 77.5803 X 400C 3 80.79 X 600C 3 99.3703 X

B4. Khảo sát kích thước nguyên liệu Kích thước Hàm lượng protein (mg/g rong khô) rong nguyên Protein tan trong Protein tan trong Tổng hàm lượng liệu (mm) nước kiềm protein 1,0 (18,11 ± 2,80)a (45,33 ± 2,51)a (63,44 ± 0,67)a 0,5 (26,94 ± 1,72)b (49,78 ± 2,06)b (76,72 ± 3,36b 0,25 (33,17 ± 1,98)c (61,87 ± 2,31)c (95,05 ± 1,20)c 0,1 (37,80 ± 1,54)d (67,68 ± 1,68)d (105,48 ± 0,67)d Hàm lượng protein tan trong nước ANOVA Table Hàm lượng protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 653.139 3 217.713 50.90 0.0000 Within groups 34.2207 8 4.27759 Total (Corr.) 687.359 11 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1,0 mm 3 18.111 X 0,5 mm 3 26.9383 X 0,25 mm 3 33.1727 X 0,1 mm 3 37.8023 X

Hàm lượng protein tan trong kiềm ANOVA Table Hàm lượng protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 969.921 3 323.307 69.12 0.0000 Within groups 37.4211 8 4.67764 Total (Corr.) 1007.34 11 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1,0 mm 3 45.3337 X 0,5 mm 3 49.778 X 0,25 mm 3 61.8767 X 0,1 mm 3 67.679 X Hàm lượng protein tổng ANOVA Table Hàm lượng protein tổng Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3160.84 3 1053.61 308.33 0.0000 Within groups 27.3375 8 3.41718 Total (Corr.) 3188.17 11 Multiple Range Tests Hàm lượng protein tổng Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1,0 mm 3 63.4447 X 0,5 mm 3 76.716 X 0,25 mm 3 95.0493 X 0,1 mm 3 105.481 X

B5. Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến hoạt động của cellulase Loại dung dịch đệm Hàm lượng protein (mg/g rong khô) Nước cất (22,15 ± 0,889)a Đệm citrate 0,1M (29,94 ± 0,468)b Đệm phosphate 0,1M (32,80 ± 1,610)c Đệm MES 0,1M (28,37 ± 0,465)b ANOVA Table Ảnh hưởng của dung dịch đệm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 182.058 3 60.6862 63.53 0.0000 Within groups 7.64219 8 0.955274 Total (Corr.) 189.701 11

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của dung dịch đệm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Nước cất 3 22.1543 X Đệm MES 0,1M 3 28.375 X Đệm citrate 0,1M 3 29.9353 X Đệm phosphate 0,1M 3 32.7987 X

B6. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của cellulase pH dung dịch Hàm lượng PC Hàm lượng protein (mg/g đệm (mg/g rong) rong khô) 5,0 (0,127 ± 0,0051)a (19,89 ± 0,75)a 5,5 (0,157 ± 0,0033)b (21,76 ± 0,56)ab 6,0 (0,179 ± 0,0059)c (22,87 ± 1,66)b 6,5 (0,209 ± 0,0063)d (28,59 ± 1,24)c 7,0 (0,226 ± 0,0115)e (33,85 ± 1,23)e 7,5 (0,207 ± 0,0121)d (30,91 ± 0,94)d 8,0 (0,187 ± 0,0042)c (28,04 ± 11,86)c ANOVA Table Ảnh hưởng của pH Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 478.511 6 79.7519 50.55 0.0000 Within groups 22.0856 14 1.57754 Total (Corr.) 500.597 20 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 5,0 3 19.893 X 5,5 3 21.7582 XX 6,0 3 22.8665 X 8,0 3 28.044 X 6,5 3 28.5918 X 7,5 3 30.913 X 7,0 3 33.8453 X ANOVA Table Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.020826 6 0.003471 59.25 0.0000 Within groups 0.0008202 14 0.0000585857 Total (Corr.) 0.0216462 20

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 5,0 3 0.127133 X 5,5 3 0.157067 X 6,0 3 0.179033 X 8,0 3 0.186933 X 7,5 3 0.207133 X 6,5 3 0.209233 X 7,0 3 0.2262 X

B7. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm đến hoạt động của cellulase Tỷ lệ cơ chất và dung Hàm lượng PC Hàm lượng protein (mg/g dịch đệm (w/v) (mg/g rong) rong khô) 1:5 (0,142 ± 0,0056)a (21,88 ± 0,83)a 1:10 (0,172 ± 0,0096)b (23,93 ± 0,61)b 1:15 (0,178 ± 0,0033)b (25,15 ± 1,82)b 1:20 (0,224 ± 0,0168)d (34,38 ± 0,33)c 1:25 (0,207 ± 0,0208)cd (34,66 ± 0,94)c 1:30 (0,192 ± 0,0021)cb (34,74 ± 1,07)c

ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 555.039 5 111.008 101.88 0.0000 Within groups 13.0746 12 1.08955 Total (Corr.) 568.114 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:5 3 21.8823 X 1:10 3 23.934 X 1:15 3 25.1532 X 1:20 3 34.3844 X 1:25 3 34.6632 X 1:30 3 34.7376 X ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hàm lượng phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.00558419 5 0.00139605 8.47 0.0030 Within groups 0.00164869 12 0.000164869 Total (Corr.) 0.00723287 17

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hàm lượng phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1: 5 3 0.14256 X 1:10 3 0.1718 X 1:15 3 0.177067 X 1:30 3 0.192467 XX 1:25 3 0.206667 XX 1:20 3 0.224333 X B8. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hoạt động của cellulase Nồng độ enzyme Hàm lượng PC Hàm lượng protein (mg/g (UI/g) (mg/g rong) rong khô) 50 (0,169 ± 0,0053)a (22,11 ± 0,86)a 75 (0,251 ± 0,0269)b (28,34 ± 1,08)b 100 (0,333 ± 0,0226)c (36,15 ± 0,86)c 125 (0,348 ± 0,0081)c (37,18 ± 1,74)c 150 (0,352 ± 0,0191)c (38,00 ± 2,17)c ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 572.059 4 143.015 68.84 0.0000 Within groups 20.7741 10 2.07741 Total (Corr.) 592.833 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 50 UI/g 3 22.11 X 75 UI/g 3 28.34 X 100 UI/g 3 36.1533 X 125 UI/g 3 37.1833 X 150 UI/g 3 38.0 X ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.07568 4 0.01892 55.97 0.0000 Within groups 0.00338039 10 0.000338039 Total (Corr.) 0.0790604 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups

50 UI/g 3 0.169067 X 75 UI/g 3 0.250867 X 100 UI/g 3 0.332967 X 125 UI/g 3 0.348333 X 150 UI/g 3 0.351833 X

B9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của cellulase Nhiệt độ ủ enzyme Hàm lượng PC Hàm lượng protein (mg/g (oC) (mg/g rong) rong khô) 30 (0,169 ± 0,003)a (20,97 ± 0.69)a 40 (0,313 ± 0,007)c (31,33 ± 0,90)b 50 (0,357 ± 0,005)d (39,36 ± 1,63)d 60 (0,357 ± 0,007)d (40,21 ± 0,21)d 70 (0,222 ± 0,010)b (34,06 ± 0.35)c ANOVA Table Ảnh hưởng của nhiệt độ Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 722.397 4 180.599 218.33 0.0000 Within groups 8.27175 10 0.827175 Total (Corr.) 730.669 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nhiệt độ Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 300C 3 20.9753 X 400C 3 31.3252 X 700C 3 34.0648 X 500C 3 39.3612 X 600C 3 40.2096 X ANOVA Table Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng phycocyanin đến hàm lượng phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.0854284 4 0.0213571 218.33 0.0000 Within groups 0.000496 10 0.0000496 Total (Corr.) 0.0859244 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 300C 3 0.169 X 700C 3 0.222667 X 400C 3 0.313667 X 600C 3 0.356667 X 500C 3 0.357 X

B10. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của cellulase Thời gian ủ enzyme Hàm lượng protein (mg/g Hàm lượng PC (mg/g rong) (phút) rong khô) 60 (0,227 ± 0,0167)a (38,36 ± 1,40)b 120 (0,386 ± 0,0104)e (40,61 ± 1,21)bc 180 (0,377 ± 0,0135)de (40,05 ± 1,75)bc 240 (0,370 ± 0,0157)d (40,89 ± 1,28)c 360 (0,353 ± 0,0144)c (40,25 ± 1,02)bc 480 (0,339 ± 0,0169)b (35,47 ± 1,09)a ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 63.8368 5 12.7674 7.40 0.0022 Within groups 20.7085 12 1.72571 Total (Corr.) 84.5453 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 480 phút 3 35.4667 X 60 phút 3 38.36 X 180 phút 3 40.0467 XX 360 phút 3 40.25 XX 120 phút 3 40.6067 XX 240 phút 3 40.8933 X ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hàm lượng phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.131752 5 0.0188218 84.62 0.0000 Within groups 0.00355863 12 0.000222415 Total (Corr.) 0.135311 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60 phút 3 0.22721 X 480 phút 3 0.3389 X 360 phút 3 0.35343 X 360 phút 3 0.37021 X 120 phút 3 0.37667 XX 240 phút 3 0.3864 X

B11. Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung môi đến quá trình trích ly protein bằng NaOH Tỷ lệ cơ chất và dung môi (w/v) Hàm lượng protein (mg/g rong khô)

1:10 (37,14 ± 1.83)a 1:15 (45,18 ± 2,57)b 1:20 (53,97 ± 1,76)c 1:25 (54,56 ± 1,87)c 1:30 (54,06 ± 0,74)c ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 668.607 4 167.152 51.86 0.0000 Within groups 32.231 10 3.2231 Total (Corr.) 700.838 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất và dung dịch đệm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:10 3 36.06 X 1:15 3 43.86 X 1:20 3 52.4033 X 1:30 3 52.4833 X 1:25 3 52.9667 X

B12. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến quá trình trích ly protein bằng NaOH Nồng độ dung môi (%) Hàm lượng protein (mg/g rong khô)

0,25 (27,66 ± 1,95)a 0,50 (33,94 ± 1,74)b 0,75 (37,08 ± 2,19)c 1,00 (54,36 ± 1,23)d 1,25 (56,09 ± 0,63)de 1,50 (57,16 ± 0,89)d ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ dung môi Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2526.58 5 505.315 210.95 0.0000 Within groups 28.7456 12 2.39546 Total (Corr.) 2555.32 17

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ dung môi Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Dung dịch NaOH 0,25% 3 27.6605 X Dung dịch NaOH 0,50% 3 33.936 X Dung dịch NaOH 0,75% 3 37.079 X Dung dịch NaOH 1,00% 3 54.3585 X Dung dịch NaOH 1,25% 3 56.0945 XX Dung dịch NaOH 1,50% 3 57.1655 X

B13. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình trích ly protein bằng NaOH Nhiệt độ trích ly (oC) Hàm lượng protein (mg/g rong khô)

30 (42,28 ± 0,99)a 40 (53,81 ± 1,48)c 50 (57,93 ± 0,77)d 60 (56,04 ± 0,94)d 70 (48,12 ± 1,25)b ANOVA Table Ảnh hưởng của nhiệt độ Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 608.131 5 121.626 118.19 0.0000 Within groups 12.3485 12 1.02904 Total (Corr.) 620.479 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nhiệt độ Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 300C 3 39.15 X 700C 3 44.56 X 400C 3 49.82 X 600C 3 51.89 X 500C 3 53.6367 X

B14. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình trích ly protein bằng NaOH Thời gian Hàm lượng protein Thời gian Hàm lượng protein trích ly (phút) (mg/g rong khô) trích ly (phút) (mg/g rong khô) 15 (29,10 ± 1,79)a 75 (58,52 ± 1,20)e 30 (43,60 ± 2,04)b 90 (54,13 ± 1,47)d 45 (48,34 ± 1,89)c 105 (53,71 ± 1,38)d 60 (57,51 ± 1,89)e 120 (52,73 ± 1,13)d

ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1940.7 7 277.242 104.08 0.0000 Within groups 42.619 16 2.66369 Total (Corr.) 1983.31 23 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 15 phút 3 29.104 X 30 phút 3 43.6025 X 45 phút 3 48.339 X 120 phút 3 52.7296 X 105 phút 3 53.7104 X 90 phút 3 54.1349 X 60 phút 3 57.5089 X 75 phút 3 58.5183 X B15. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình kết tủa đẳng điện pH Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm Hiệu suất thu Độ tinh khiết Hiệu suất thu Độ tinh khiết hồi (%) (%) hồi (%) (%) 5.0 (9,56 ± 1,17)a (21,88 ± 2,05)a (22,12 ± 2,19)a (15,55 ± 1,89)a 4.0 (19,14 ± 2,50)c (29,69 ± 2,42)b (69,33 ± 3,18)d (47,40 ± 1,37)c 3.0 (27,37 ± 0,82)d (39,72 ± 1,52)d (62,93 ± 1,38)c (37,82 ± 2,85)b 2.0 (21,49 ± 2,16)c (35,98 ± 1,97)c (61,17 ± 1,23)bc (36,59 ± 1,44)b 1.0 (13,16 ± 0,61)b (28,38 ± 2,05)b (58,39 ± 0,61)b (35,13 ± 1,98)b B15.1. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 587.313 4 146.828 42.23 0.0000 Within groups 34.7653 10 3.47653 Total (Corr.) 622.078 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups pH 5,0 3 9.56271 X pH 1,0 3 13.1587 X pH 4,0 3 19.1383 X pH 2,0 3 21.4894 X pH 3,0 3 27.3689 X

B15.2. Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 576.946 4 144.236 38.01 0.0000 Within groups 37.9481 10 3.79481 Total (Corr.) 614.894 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups pH 5,0 3 21.8873 X pH 1,0 3 28.381 X pH 4,0 3 29.6865 X pH 2,0 3 35.9791 X pH 3,0 3 39.7168 X B15.3. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4195.77 4 1048.94 279.70 0.0000 Within groups 37.5017 10 3.75017 Total (Corr.) 4233.27 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups pH 5,0 3 22.1223 X pH 1,0 3 58.393 X pH 2,0 3 61.1692 XX pH 3,0 3 62.9353 X pH 4,0 3 69.3293 X B15.4. Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1624.22 4 406.056 103.67 0.0000 Within groups 39.1685 10 3.91685 Total (Corr.) 1663.39 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của pH đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups pH 5,0 3 15.5526 X pH 1,0 3 35.1268 X pH 2,0 3 36.5891 X pH 3,0 3 37.852 X pH 4,0 3 47.4 X

B16. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình kết tủa đẳng điện Thời gian Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm tủa Hiệu suất thu Độ tinh khiết Hiệu suất thu Độ tinh khiết (phút) hồi (%) (%) hồi (%) (%) 30 (27,10 ± 1,67)a (36,49 ± 3,74)ab (71,37 ± 2,52)a (47,69 ± 1,67)a 60 (28,29 ± 0,87)a (35,83 ± 2,42)a (74,98 ± 2,39)a (47,54 ± 3,08)a 90 (29,73 ± 1,15)a (40,38 ± 1,62)b (74,71 ± 1,42)a (49,89 ± 1,72)a 120 (28,54 ± 1,89)a (36,76 ± 0,78)ab (74,45 ± 2,62)a (49,78 ± 1,18)a B16.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 10.4549 3 3.48497 1.64 0.2549 Within groups 16.9533 8 2.11917 Total (Corr.) 27.4082 11 Multiple Range Tests Ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 30 phút 3 27.1035 X 60 phút 3 28.291 X 120 phút 3 28.5419 X 90 phút 3 29.7316 X B16.2. Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 37.67 3 12.5567 2.17 0.1690 Within groups 46.2081 8 5.77601 Total (Corr.) 83.8781 11 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60 phút 3 35.8335 X 30 phút 3 36.4999 XX 120 phút 3 36.7589 XX 90 phút 3 40.3809 X

B16.3. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 25.5744 3 8.52481 1.62 0.2589 Within groups 41.9721 8 5.24651 Total (Corr.) 67.5465 11 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 30 phút 3 71.3704 X 120 phút 3 74.4533 X 90 phút 3 74.7101 X 60 phút 3 74.9795 X B16.4. Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14.835 3 4.94502 1.19 0.3740 Within groups 33.3066 8 4.16332 Total (Corr.) 48.1416 11 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60 phút 3 47.5417 X 30 phút 3 47.6897 X 120 phút 3 49.7788 X 90 phút 3 49.8922 X

B17. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình kết tủa Nồng độ Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm ethanol Hiệu suất Độ tinh khiết Hiệu suất Độ tinh khiết (%) thu hồi (%) (%) thu hồi (%) (%) 99% (51,23 ± 2,23)b (36,65 ± 2,69)b (32,59 ± 1,68)a (35,24 ± 2,94)ab 90% (53,27 ± 4,54)b (41,72 ± 1,53)c (33,75 ± 2,96)a (36,84 ± 1,27)ab 80% (63,87 ± 3,19)c (50,03 ± 1,21)d (39,75 ± 1,79)b (45,14 ± 2,02)c 70% (49,86 ± 2,81)b (36,48 ± 1,47)b (38,16 ± 3,30)b (39,62 ± 3,15)b 60% (37,53 ± 3,25)a (27,38 ± 1,37)a (30,15 ± 0,97)a (33,66 ± 2,29)a

B17.1. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1060.82 4 265.205 24.38 0.0000 Within groups 108.774 10 10.8774 Total (Corr.) 1169.59 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60% 3 37.5301 X 70% 3 49.8633 X 99% 3 51.2301 X 90% 3 53.2736 X 80% 3 63.8752 X B17.2. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 823.821 4 205.955 68.19 0.0000 Within groups 30.204 10 3.0204 Total (Corr.) 854.025 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60% 3 27.3793 X 70% 3 36.4855 X 99% 3 36.6515 X 90% 3 41.7254 X 80% 3 50.0356 X B17.3. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 190.348 4 47.587 8.90 0.0025 Within groups 53.462 10 5.3462 Total (Corr.) 243.81 14

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60% 3 30.1515 X 99% 3 32.5914 X 90% 3 33.7548 X 70% 3 38.1665 X 80% 3 39.7571 X B17.4. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 243.98 4 60.9951 10.32 0.0014 Within groups 59.1236 10 5.91236 Total (Corr.) 303.104 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 60% 3 33.658 X 99% 3 35.2403 XX 90% 3 36.8386 XX 70% 3 39.6173 X 80% 3 45.1374 X

B18. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dịch trích và ethanol đến quá trình kết tủa Tỉ lệ dịch Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm trích và Hiệu suất Độ tinh khiết Hiệu suất Độ tinh khiết ethanol thu hồi (%) (%) thu hồi (%) (%) 1:2 (15,86 ± 1,52)a (11,80 ± 0,68)a (24,04 ± 1,13)a (25,71 ± 1,48)a 1:3 (53,31 ± 3,65)b (38,66 ± 0,54)b (35,04 ± 3,16)b (38,24 ± 2,99)b 1:4 (63,95 ± 2,48)c (50,67 ± 4,55)d (40,37 ± 3,10)c (46,08 ± 2,14)cd 1:5 (65,41 ± 3,98)c (49,55 ± 1,76)cd (42,99 ± 1,23)c (44,66 ± 1,08)c 1:6 (60,69 ± 2,86)c (45,41 ± 3,34)c (43,39 ± 1,24)c (48,52 ± 0,97)d

B18.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5117.67 4 1279.42 139.44 0.0000 Within groups 91.7519 10 9.17519 Total (Corr.) 5209.42 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:2 3 15.862 X 1:3 3 53.3077 X 1:6 3 60.6903 X 1:4 3 63.956 X 1:5 3 65.4118 X B18.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích: ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3083.73 4 770.933 107.95 0.0000 Within groups 71.4182 10 7.14182 Total (Corr.) 3155.15 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:2 3 11.8042 X 1:3 3 38.6634 X 1:6 3 45.4052 X 1:4 3 49.5509 XX 1:5 3 50.6652 X B18.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 778.97 4 194.743 40.64 0.0000 Within groups 47.9174 10 4.79174 Total (Corr.) 826.888 14

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:2 3 24.0438 X 1:3 3 35.0365 X 1:4 3 40.3752 X 1:5 3 42.9892 X 1:6 3 43.3885 X B18.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1009.34 4 252.335 70.62 0.0000 Within groups 35.7333 10 3.57333 Total (Corr.) 1045.07 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch trích và ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 1:2 3 25.7106 X 1:3 3 38.2396 X 1:5 3 44.6632 X 1:4 3 46.0766 XX 1:6 3 48.5174 X

B19. Khảo sát ảnh hưởng thời gian tủa ethanol đến quá trình kết tủa Thời Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm gian tủa Hiệu suất Độ tinh khiết Hiệu suất Độ tinh khiết (phút) thu hồi (%) (%) thu hồi (%) (%) 10 (13,26 ± 1,34)a (12,06 ± 1,90)a (18,02 ± 0,52)a (18,88 ± 1,19)a 20 (33,94 ± 3,10)b (27,35 ± 5,36)b (32,26 ± 1,18)b (32,93 ± 1,35)b 30 (64,91 ± 4,47)c (51,76 ± 6,07)c (43,27 ± 3,28)c (46,99 ± 7,09)c 40 (69,29 ± 1,54)cd (53,14 ± 2,89)c (48,40 ± 2,06)d (48,29 ± 1,00)c 50 (69,97 ± 2,86)d (50,71 ±5,98)c (49,13 ± 2,34)d (49,46 ±1,73)c 60 (68,20 ± 1,55)cd (50,51 ± 4,50)c (51,84 ± 1,86)d (51,81 ± 5,16)c

B19.1. Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8606.92 5 1721.38 232.38 0.0000 Within groups 88.8925 12 7.40771 Total (Corr.) 8695.81 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 10 phút 3 13.2576 X 20 phút 3 33.937 X 30 phút 3 64.9107 X 60 phút 3 68.204 XX 40 phút 3 69.2893 XX 50 phút 3 69.9753 X B19.2. Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4415.9 5 883.18 39.61 0.0000 Within groups 267.593 12 22.2995 Total (Corr.) 4683.49 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 10 phút 3 12.0573 X 20 phút 3 27.3477 X 60 phút 3 50.5126 X 50 phút 3 50.7055 X 30 phút 3 51.7644 X 40 phút 3 53.1399 X

B19.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2539.1 5 507.82 118.98 0.0000 Within groups 51.2152 12 4.26794 Total (Corr.) 2590.32 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 10 phút 3 18.0218 X 20 phút 3 32.265 X 30 phút 3 43.2734 X 40 phút 3 48.4038 X 50 phút 3 49.1314 X 60 phút 3 51.8411 X B19.4. Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2492.87 5 498.574 35.57 0.0000 Within groups 168.223 12 14.0185 Total (Corr.) 2661.09 17 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa ethanol đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 10 phút 3 18.8803 X 20 phút 3 32.93 X 30 phút 3 46.9954 X 40 phút 3 48.2911 X 50 phút 3 49.4615 X 60 phút 3 51.8066 X

B20. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi (NH4)2SO4 đến quá trình tủa protein Tỷ lệ dịch Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm trích và dung môi Hiệu suất thu Độ tinh khiết Hiệu suất thu Độ tinh khiết (v/v) hồi (%) (%) hồi (%) (%) 1,0:1 (48,36 ± 5,11)a (42,54 ± 3,10)a (55,43 ± 4,07)c (57,32 ± 3,71)ab 1,5:1 (55,02 ± 1,84)bc (50,75 ± 3,99)bc (60,92 ± 1,25)d (62,01 ± 2,89)bc 2,0:1 (58,30 ± 2,10)c (57,48 ± 4,14)c (64,24 ± 2,01)d (62,68 ± 1,08)c 2,5:1 (50,71 ± 3,39)ab (46,11 ± 6,83)ab (48,31 ± 1,77)b (57,13 ± 3,23)ab 3,0:1 (46,89 ± 3,27)a (41,36 ± 0,94)a (39,36 ± 1,47)a (53,11 ± 2,99)a 20.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 269.284 4 67.321 5.99 0.0100 Within groups 112.303 10 11.2303 Total (Corr.) 381.587 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 3,0:1 3 46.8878 X 1,0:1 3 48.3612 X 2,5:1 3 50.7122 XX 1,5:1 3 55.0177 XX 2,0:1 3 58.3027 X B20.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong nước ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 523.257 4 130.814 7.24 0.0053 Within groups 180.708 10 18.0708 Total (Corr.) 703.965 14

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 3,0:1 3 41.3561 X 1,0:1 3 42.539 X 2,5:1 3 46.1116 XX 1,5:1 3 50.7519 XX 2,0:1 3 57.4833 X B20.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1202.78 4 300.695 54.64 0.0000 Within groups 55.0354 10 5.50354 Total (Corr.) 1257.81 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 3,0:1 3 39.3603 X 2,5:1 3 48.3079 X 1,0:1 3 55.4269 X 1,5:1 3 60.9223 X 2,0:1 3 64.24 X B20.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm ANOVA Table Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 186.189 4 46.5473 5.45 0.0136 Within groups 85.4427 10 8.54427 Total (Corr.) 271.632 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng tỷ lệ dung môi đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 3,0:1 3 53.1109 X 2,5:1 3 57.1349 XX 1,0:1 3 57.3175 XX 1,5:1 3 62.0063 XX 2,0:1 3 62.6807 X

B21. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến quá trình tủa protein Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm Nồng độ muối bão Hiệu suất Độ tinh khiết Hiệu suất Độ tinh khiết hòa (%) thu hồi (%) (%) thu hồi (%) (%) 40 (42,49 ± 1,51)a (37,34 ± 2,61)a (55,43 ± 4,07)b (56,14 ± 3,74)bc 50 (49,36 ± 3,30)b (44,94 ± 2,11)b (58,26 ± 1,97)bc (57,41 ± 2,77)bc 60 (54,64 ± 1,12)c (51,41 ± 3,49)c (61,91 ± 1,08)cd (60,13 ± 2,19)c 70 (59,36 ± 2,94)d (58,76 ± 2,83)d (63,89 ± 1,35)d (58,63 ± 0,22)bc 80 (50,24 ± 1,49)b (46,52 ± 2,28)bc (58,07 ± 2,75)bc (54,14 ± 2,37)b 90 (44,50 ± 2,11)a (38,82 ± 3,02)a (41,92 ± 2,08)a (39,40 ± 2,74)a

B21.1. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước

ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 588.507 5 117.701 23.74 0.0000 Within groups 59.5004 12 4.95836 Total (Corr.) 648.007 17

Multiple Range Tests Ảnh hưng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 40% 3 42.4943 X 90% 3 44.5021 X 50% 3 49.3608 X 80% 3 50.2371 X 60% 3 54.6367 X 70% 3 59.365 X

B21.2. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước

ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 958.682 5 191.736 25.13 0.0000 Within groups 91.5464 12 7.62887 Total (Corr.) 1050.23 17

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 40% 3 37.3378 X 90% 3 38.8167 X 50% 3 44.9403 X 80% 3 46.5181 XX 60% 3 51.4091 X 70% 3 58.7595 X

B21.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm

ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 909.901 5 181.98 30.83 0.0000 Within groups 70.8423 12 5.90352 Total (Corr.) 980.743 17

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 90% 3 41.9165 X 40% 3 55.4269 X 80% 3 58.0667 XX 50% 3 58.2556 XX 60% 3 61.9067 XX 70% 3 63.8985 X

B21.4. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm

ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 863.511 5 172.702 26.13 0.0000 Within groups 79.3269 12 6.61058 Total (Corr.) 942.838 17

Multiple Range Tess Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 90% 3 39.4006 X 80% 3 54.1358 X 40% 3 56.1417 XX 50% 3 57.4088 XX 70% 3 58.66 XX 60% 3 60.135 X B21.5Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết phycocyanin Nồng độ muối Hàm lượng PC Hiệu suất thu STT Tỉ số A /A (%) (mg/g rong) 620 280 hồi (%) 1 40 (0,222±0,017)a (0,95±0,021)a (35,98±2,827)a 2 50 (0,286±0,005)b (1,13±0,040)b (46,22±0,814)b 3 60 (0,371±0,006)c (1,19±0,026)c (60,03±0,901)c 4 70 (0,416±0,008)d (1,24±0,032)cd (67,31±1,284)d 5 80 (0,421±0,009)d (1,27±0,035)d (68,12±1,411)d ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.183373 4 0.0458433 45.84 0.0000 Within groups 0.01 10 0.001 Total (Corr.) 0.193373 14 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ muối đến độ tinh khiết phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 40% 3 0.953333 X 50% 3 1.13 X 60% 3 1.19 X 70% 3 1.23333 XX 80% 3 1.26667 X B21.6 Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi phycocyanin ANOVA Table Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2359.97 4 589.993 225.03 0.0000 Within groups 26.2181 10 2.62181 Total (Corr.) 2386.19 14

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất thu hồi phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 40% 3 35.9763 X 50% 3 46.2244 X 60% 3 60.0324 X 70% 3 67.3139 X 80% 3 68.123 X

B22. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến quá trình tủa protein Protein tan trong nước Protein tan trong kiềm Thời gian tủa Hiệu suất Độ tinh khiết Hiệu suất Độ tinh khiết (phút) thu hồi (%) (%) thu hồi (%) (%) 0 (39,21 ± 2,04)a (34,87 ± 3,62)a (41,59 ± 1,76)a (39,51 ± 3,06)a 10 (48,49 ± 2,42)b (46,06 ± 3,54)b (52,96 ± 1,86)b (52,61 ± 2,28)b 20 (53,11 ± 1,41)c (53,39 ± 4,46)bc (57,92 ± 1,73)c (56,03 ± 2,66)bc 30 (62,86 ± 1,84)d (58,77 ± 3,79)c (61,58 ± 1,32)cd (60,05 ± 1,42)cd 40 (63,47 ± 0,96)d (60,79 ± 4,16)c (65,29 ± 1,57)d (62,29 ± 2,62)d 50 (63,59 ± 4,98)d (59,05 ± 7,25)c (63,62 ± 3,47)d (63,31 ± 4,80)d 60 (64,35 ± 1,67)d (57,59 ± 3,46)c (58,31 ± 2,68)c (62,47 ± 4,01)d

B22.1. Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước

ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1727.0 6 287.833 45.86 0.0000 Within groups 87.8608 14 6.27577 Total (Corr.) 1814.86 20

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 39.2063 X 10 phút 3 48.4918 X 20 phút 3 53.1107 X 30 phút 3 62.865 X 40 phút 3 63.4668 X 50 phút 3 63.5884 X 60 phút 3 64.3551 X

B22.2. Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước

ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1585.52 6 264.253 13.03 0.0001 Within groups 283.893 14 20.2781 Total (Corr.) 1869.41 20

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong nước Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 34.8726 X 10 phút 3 46.0634 X 20 phút 3 53.3929 XX 60 phút 3 57.5922 X 30 phút 3 58.7699 X 50 phút 3 59.0471 X 40 phút 3 60.792 X

B22.3. Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm

ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1167.61 6 194.602 41.26 0.0000 Within groups 66.0347 14 4.71676 Total (Corr.) 1233.65 20

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến hiệu suất thu hồi protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 41.5937 X 10 phút 3 52.9639 X 20 phút 3 57.9176 X 60 phút 3 58.3147 X 30 phút 3 61.5852 XX 50 phút 3 63.6221 X 40 phút 3 65.2986 X

B22.4. Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm

ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1296.07 6 216.011 21.70 0.0000 Within groups 139.369 14 9.95491 Total (Corr.) 1435.44 20 Multiple Range Tets Ảnh hưởng của thời gian tủa muối đến độ tinh khiết protein tan trong kiềm Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 39.5109 X 10 phút 3 52.6115 X 20 phút 3 56.0301 XX 30 phút 3 60.0495 XX 40 phút 3 62.2927 X 60 phút 3 62.4715 X 50 phút 3 63.3063 X B22.5 Ảnh hưởng của thời gian tủa đến độ tinh khiết phycocyanin Thời gian Hàm lượng PC Hiệu suất thu STT Tỉ số A /A tủa (phút) (mg/g rong) 620 280 hồi (%) 1 0 (0,233±0,008)a (0,89±0,031)a (37,70±1,298)a 2 10 (0,256±0,006)b (0,98±0,032)b (41,42±1,010)b 3 20 (0,345±0,007)c (1,17±0,026)c (55,83±1,169)c 4 30 (0,425±0,005)d (1,26±0,029)e (67,64±0,815)d 5 40 (0,427±0,003)d (1,23±0,035)de (68,77±0,494)d 6 50 (0,428±0,005)d (1,20±0,030)cd (69,58±0,762)d 7 60 (0,430±0,003)d (1,24±0,020)de (70,06±0,403)d ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa đến độ tinh khiết phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.366629 6 0.0611048 70.90 0.0000 Within groups 0.0120667 14 0.000861905 Total (Corr.) 0.378695 20

Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa đến độ tinh khiết phycocyanin Method: 95.0 percent LSD

Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 0.893333 X 10 phút 3 0.983333 X 20 phút 3 1.17 X 50 phút 3 1.2 XX 40 phút 3 1.23333 XX 60 phút 3 1.24 XX 30 phút 3 1.25667 X B22.6 Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hiệu suất thu hồi phycocyanin ANOVA Table Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hiệu suất thu hồi phycocyanin Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3574.18 6 595.697 728.36 0.0000 Within groups 11.4501 14 0.817862 Total (Corr.) 3585.63 20 Multiple Range Tests Ảnh hưởng của thời gian tủa đến hiệu suất thu hồi phycocyanin Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 0 phút 3 37.65 X 10 phút 3 41.4233 X 20 phút 3 55.8267 X 30 phút 3 68.7167 X 40 phút 3 69.15 X 50 phút 3 69.31 X 60 phút 3 69.6333 X B23. Kết quả hiệu quả ức chế vi khuẩn của chế phẩm protein

Hàm Vùng ức chế vi khuẩn (cm) lượng S. aureus E. coli P. aeruginosa protein APC.N APC.K APC.N APC.K APC.N APC.K (mg/ml) 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 6 0 0,367 ± 0,057 0 0 0 0 8 0 0,467 ± 0,057 0 0,467 ± 0,115 0 0,533 ± 0,057 10 0,167 ± 0,115 0,600 ± 0,100 0,233 ± 0,057 0,567 ± 0,115 0 0,633 ± 0,115 Kanamycin 0,3 ± 0,1 1,0 ± 0,1 0,67 ± 0,15 10µg/ml

Hình. Vòng vô khuẩn của chế phẩm protein APC.K với ba chủng vi khuẩn S. aureus, E. coli và P. aeruginosa ở nồng độ 10mg/ml. B24. Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein B24.1 Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.N ANOVA Table Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.N Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8101.65 4 2025.41 91.48 0.0000 Within groups 221.404 10 22.1404 Total (Corr.) 8323.05 14 Multiple Range Tests Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.N Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 4.66 µg/ml 3 15.64 X 9.31 µg/ml 3 29.0443 X 19.531 µg/ml 3 64.2804 X 39.063 µg/ml 3 67.3818 XX 78.125 µg/ml 3 73.9742 X B24.2 Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.K ANOVA Table Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.K Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6359.14 4 1589.79 177.35 0.0000 Within groups 89.6418 10 8.96418 Total (Corr.) 6448.78 14

Multiple Range Tests Tỷ lệ % hoạt tính bắt gốc tự do DPPH của chế phẩm protein APC.K Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 19.531 µg/ml 3 5.66533 X 39.063 µg/ml 3 8.263 X 78.125 µg/ml 3 23.2182 X 156.25 µg/ml 3 49.6957 X 312.5 µg/ml 3 55.1767 X

B25. Tỷ lệ % hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+ ANOVA Table Tỷ lệ % hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+của chế phẩm protein APC.N Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 7357.19 4 1839.3 131.94 0.0000 Within groups 139.399 10 13.9399 Total (Corr.) 7496.59 14 Multiple Range Tests Tỷ lệ % hoạt tính trung hoà gốc tự do ABTS•+của chế phẩm protein APC.N Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 11.46 (µg/ml) 3 12.766 X 22.92 (µg/ml) 3 30.8798 X 45.83 (µg/ml) 3 53.9965 X 91.67 (µg/ml) 3 68.4301 X 183.33 (µg/ml) 3 69.6377 X

B26. Tỷ lệ % hoạt tính kết hợp ion Fe2+ ANOVA Table Tỷ lệ % hoạt tính kết hợp ion Fe2+của chế phẩm protein APC.N Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 7179.69 4 1794.92 126.10 0.0000 Within groups 142.337 10 14.2337 Total (Corr.) 7322.03 14 Multiple Range Tests Tỷ lệ % hoạt tính kết hợp ion Fe2+của chế phẩm protein APC.N Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 8.59 (µg/ml) 3 19.3642 X 17.19 (µg/ml) 3 36.7052 X 34.38 (µg/ml) 3 54.3353 X 68.75 (µg/ml) 3 69.3642 X 137.50 (µg/ml) 3 80.0578 X

B27. Tỷ lệ % hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào ANOVA Table Tỷ lệ % hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của chế phẩm protein APC.N Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2910.71 4 727.677 278.48 0.0000 Within groups 26.1299 10 2.61299 Total (Corr.) 2936.84 14 Multiple Range Tests Tỷ lệ % hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid tế bào của chế phẩm protein APC.N Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups 4.30 (µg/ml) 3 29.8447 X 8.59 (µg/ml) 3 33.755 X 17.19 (µg/ml) 3 45.8309 X 34.38 (µg/ml) 3 58.8269 X 68.75 (µg/ml) 3 65.9574 X B28. Công suất tạo bọt (FC) và độ bền bọt (FS) của các protein B28.1 Công suất tạo bọt (FC) của các protein ANOVA Table Công suất tạo bọt (FC) của các protein Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 128.25 3 42.75 7.43 0.0106 Within groups 46.0 8 5.75 Total (Corr.) 174.25 11 Multiple Range Tests Công suất tạo bọt (FC) của các protein Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups APC.K 3 40.0 X Protein từ đậu nành 3 40.0 X APC.N 3 43.0 X Casein 3 48.0 X B28.2 Độ bền bọt (FS) của các protein ANOVA Table Độ bền bọt (FS) của các protein Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4160.25 3 1386.75 346.69 0.0000 Within groups 32.0 8 4.0 Total (Corr.) 4192.25 11 Multiple Range Tests Độ bền bọt (FS) của các protein Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Casein 3 40.0 X Protein từ đậu nành 3 75.0 X APC.N 3 78.0 X APC.K 3 90.0 X

B29. Khả năng hoà tan của các protein B29.1 Khả năng hoà tan của các protein ở pH3.0 ANOVA Table Khả năng hoà tan của các protein ở pH3.0 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 5433.31 3 1811.1 399.54 0.0000 Within groups 36.2641 8 4.53301 Total (Corr.) 5469.57 11 Multiple Range Tests Khả năng hoà tan của các protein ở pH3.0 Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups APC.N 3 1.3 X APC.K 3 2.4 X Protein từ đậu nành 3 6.8 X Casein 3 6.93333 X B29.2 Khả năng hoà tan của các protein ở pH7.0 ANOVA Table Khả năng hoà tan của các protein ở pH7.0 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12234.6 3 4078.21 1357.48 0.0000 Within groups 24.0341 8 3.00426 Total (Corr.) 12258.7 11

Multiple Range Tests Khả năng hoà tan của các protein ở pH7.0 Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Casein 3 0.366667 X Protein từ đậu nành 3 7.66667 X APC.N 3 7.66667 X APC.K 3 10.3333 X B29.3 Khả năng hoà tan của các protein ở pH10.0 ANOVA Table Khả năng hoà tan của các protein ở pH10.0 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12158.4 3 4052.79 1340.50 0.0000 Within groups 24.1867 8 3.02333 Total (Corr.) 12182.5 11 Multiple Range Tests Khả năng hoà tan của các protein ở pH10.0 Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups APC.N 3 7.9 X Casein 3 9.1 X APC.K 3 12.4667 X Protein từ đậu nành 3 13.9 X

B30. Khả năng hấp thu nước của các protein ANOVA Table Khả năng hấp thu nước của các protein Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 4781.83 3 1593.94 932.83 0.0000 Within groups 13.6698 8 1.70873 Total (Corr.) 4795.5 11 Multiple Range Tests Khả năng hấp thu nước của các protein Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Casein 3 10.5 X APC.K 3 18.5 X Protein từ đậu nành 3 49.33 X APC.N 3 57.8 X

B31. Khả năng tạo nhũ của các protein B31.1 Chỉ số hoạt động nhũ tương (EAI) ANOVA Table chỉ số hoạt động nhũ tương (EAI) của các protein Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 701.803 3 233.934 295.92 0.0000 Within groups 6.32427 8 0.790533 Total (Corr.) 708.127 11 Multiple Range Tests chỉ số hoạt động nhũ tương (EAI) của các protein Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups APC.N 3 54.2 X Casein 3 65.7333 X Protein từ đậu nành 3 67.0 X APC.K 3 75.7 X B31.2 Chỉ số ổn định nhũ tương (ESI) ANOVA Table Chỉ số ổn định nhũ tương (ESI) của các protein Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 2023.46 3 674.486 448.03 0.0000 Within groups 12.0436 8 1.50545 Total (Corr.) 2035.5 11 Multiple Range Tests Chỉ số ổn định nhũ tương (ESI) của các protein Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Casein 3 14.16 X Protein từ đậu nành 3 15.76 X APC.N 3 34.5 X APC.K 3 45.1 X

B32. Khả năng tiêu hóa – in vitro protein digestibility (IVPD) ANOVA Table Khả năng tiêu hóa Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 238.82 3 79.6066 29.53 0.0001 Within groups 21.5635 8 2.69544 Total (Corr.) 260.383 11 Multiple Range Tests Khả năng tiêu hóa Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups APC-N 3 79.0133 X APC-K 3 83.8067 X Protein đậu nành 3 84.2 X Casein 3 91.5 X

B33. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein APC ANOVA Table Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein APC Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 404.208 4 101.052 255.47 0.0000 Within groups 7.9112 20 0.39556 Total (Corr.) 412.119 24 Multiple Range Tests Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein APC Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ban đầu 5 18.882 X Nuôi 1 tuần 5 21.656 X Nuôi 2 tuần 5 23.84 X Nuôi 3 tuần 5 28.034 X Nuôi 4 tuần 5 29.818 X B34. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein đậu nành ANOVA Table Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein đậu nành Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 461.841 4 115.46 206.63 0.0000 Within groups 11.1756 20 0.558782 Total (Corr.) 473.017 24 Multiple Range Tests Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn protein đậu nành Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ban đầu 5 18.768 X Nuôi 1 tuần 5 21.198 X Nuôi 2 tuần 5 24.728 X Nuôi 3 tuần 5 28.032 X Nuôi 4 tuần 5 30.516 X

B35. Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn thức ăn thường ANOVA Table Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn thức ăn thường Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 328.979 4 82.2448 187.65 0.0000 Within groups 8.766 20 0.4383 Total (Corr.) 337.745 24 Multiple Range Tests Trọng lượng chuột sau 4 tuần nuôi bằng nguồn thức ăn thường Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Ban đầu 5 18.758 X Nuôi 1 tuần 5 21.0 X Nuôi 2 tuần 5 23.202 X Nuôi 3 tuần 5 26.096 X Nuôi 4 tuần 5 29.004 X

B36. Hệ số tăng trọng (PER) ANOVA Table Hệ số tăng trọng Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 6.11044 2 3.05522 104.18 0.0000 Within groups 0.35192 12 0.0293267 Total (Corr.) 6.46236 14 Multiple Range Tests Hệ số tăng trọng Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups AIN-93 với thức ăn thường 5 0.848 X AIN-93 với APC 5 2.116 X AIN-93 với protein đậu nành 5 2.274 X

B37. Tỷ lệ hấp thu protein tịnh (NPR) ANOVA Table Tỷ lệ hấp thu protein tịnh Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 13.6367 2 6.81833 110.50 0.0000 Within groups 0.74048 12 0.0617067 Total (Corr.) 14.3771 14 Multiple Range Tests Tỷ lệ hấp thu protein tịnh Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups AIN-93 với thức ăn thường 5 1.352 X AIN-93 với APC 5 3.282 X AIN-93 với protein đậu nành 5 3.456 X

B37. Giá trị sinh học (Biological value – BV) ANOVA Table Giá trị sinh học Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1616.54 2 808.268 59.47 0.0000 Within groups 163.099 12 13.5916 Total (Corr.) 1779.64 14 Multiple Range Tests Giá trị sinh học Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups AIN-93 với thức ăn thường 5 54.214 X AIN-93 với protein đậu nành 5 70.254 X AIN-93 với APC 5 79.322 X

B38. Các chỉ số máu chuột thí nghiệm B38.1. Nồng độ glucose ANOVA Table Nồng độ glucose Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 58.5387 2 29.2694 1366.14 0.0000 Within groups 0.128549 6 0.0214249 Total (Corr.) 58.6673 8 Multiple Range Tests Nồng độ glucose Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Protein đậu nành 3 2.2 X APC 3 3.55667 X Thức ăn thường 3 8.15933 X B38.2. Nồng độ Triglyceride ANOVA Table Nồng độ Triglyceride Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.150365 2 0.0751823 38.47 0.0004 Within groups 0.0117273 6 0.00195456 Total (Corr.) 0.162092 8 Multiple Range Tests Nồng độ Triglyceride Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Protein đậu nành 3 1.19033 X APC 3 1.36 X Thức ăn thường 3 1.50667 X

B38.3. Nồng độ HDL-C ANOVA Table Nồng độ HDL-C Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.195489 2 0.0977444 28.65 0.0009 Within groups 0.0204667 6 0.00341111 Total (Corr.) 0.215956 8 Multiple Range Tests Nồng độ HDL-C Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Protein đậu nành 3 1.15 X APC 3 1.30667 X Thức ăn thường 3 1.51 X B38.4. Nồng độ LDL-C ANOVA Table Nồng độ LDL-C Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 1.06416 2 0.532078 107.37 0.0000 Within groups 0.0297333 6 0.00495556 Total (Corr.) 1.09389 8 Multiple Range Tests Nồng độ LDL-C Method: 95.0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups Protein đậu nành 3 1.62667 X APC 3 1.87 X Thức ăn thường 3 2.44667 X