UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU

POLIETISMO ETÁRIO E PRODUÇÃO DE MACHOS EM COLÔNIA

SEM RAINHA DA FORMIGA CORTADEIRA, subterraneus

brunneus FOREL, 1911 (: FORMICIDAE)

ROBERTO DA SILVA CAMARGO

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas)

BOTUCATU – SP Dezembro - 2007

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS CÂMPUS DE BOTUCATU

POLIETISMO ETÁRIO E PRODUÇÃO DE MACHOS EM COLÔNIA

SEM RAINHA DA FORMIGA CORTADEIRA, Acromyrmex subterraneus

brunneus FOREL, 1911 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)

ROBERTO DA SILVA CAMARGO

Orientador: Prof. Dr. Luiz Carlos Forti

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da Unesp – Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Proteção de Plantas)

BOTUCATU – SP Dezembro – 2007

I

AGRADECIMENTOS

Á FAPESP (Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo), pela concessão da bolsa de estudo de doutorado (Processo: 03/09464-8) e pelo Auxílio a Pesquisa (Processo: 04/08606-6). Aos pesquisadores que colaboraram na realização deste trabalho: Dr. Luiz Carlos Forti (orientação), Dra. Juliane Floriano Lopes Santos, Dr. Carlos Alberto O. de Matos, Dra. Ana Paula P. Andrade, Dr. Angelo L.T. Ottati, Dra. Sandra S. Verza, Dr. Carlos G. Raetano e Dra. Cristina G. Mendonça e Ms. Newton C. Noronha.

II

SUMÁRIO

Página 1. RESUMO ...... 01

2. SUMMARY...... 03 3. INTRODUÇÃO...... 05 CAPÍTULOS...... 18 I Polietismo etário na formiga cortadeira Acromyrmex subterraneus brunneus 18 Forel, 1911 (Hymenoptera: Formicidae)...... 1. Introdução...... 19 2. Material e Métodos ...... 22 2.1. Colônias de estudo ...... 22 2.2. Marcação das operárias ...... 22 2.3. Isolamento das pupas ...... 22 2.4. Polietismo etário ...... 23 2.5. Análise dos dados ...... 24 3. Resultados e Discussão...... 25 4. Referências...... 30 II Oviposição das operárias na formiga cortadeira, Acromyrmex subterraneus brunneus (Formicidae, Attini)...... 42 1. Introdução...... 43 2. Material e Métodos ...... 44 2.1. Colônias de estudo ...... 44 2.2. Preparação das subcolônias ...... 45 2.3. Influência da rainha na postura das operárias ...... 45 2.4. Influência da idade das operárias ...... 45 2.4.1. Marcação de operárias ...... 45 2.4.2. Obtenção das operárias jovens ...... 46

2.4.3. Avaliação dos ovários ...... 46

III

3. Resultados ...... 46 4. Discussão...... 47 5. Referências...... 51 III Respostas comportamentais das operárias em relação às larvas de machos produzidas pelas operárias e larvas de operárias produzidas pela rainha em Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae) ...... 59 1. Introdução...... 60 2. Material e Métodos ...... 61 2.1. Colônias de estudo ...... 61 2.2. Ingestão do alimento tingido ...... 62 2.3. Cuidado com as larvas ...... 62 2.4. Analise estatística ...... 63 3. Resultados ...... 63 4. Discussão...... 63 5. Referências...... 69 IV Cuidado com a prole e comportamento dos machos em colônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hymenoptera: Formicidae) sob condições laboratoriais...... 71 1. Introdução...... 72 2. Material e Métodos ...... 72 3. Resultados e Discussão...... 73 4. Referências...... 84 V Morfometria das formas sexuais de Acromyrmex subterraneus brunneus Forel (Hymenoptera, Formicidae) em colônias com e sem rainha sob condições laboratoriais...... 86 1. Introdução...... 87 2. Material e Métodos ...... 87 3. Resultados e Discussão...... 91 4. Referências...... 93

VI O papel das operárias na transferência de substâncias da rainha e as IV diferenças entre as castas na formiga cortadeira, Acromyrmex subterraneus 100 brunneus (Hymenoptera: Formicidae)...... 1. Introdução...... 101 2. Material e Métodos ...... 102 2.1. Colônias de estudo ...... 102 2.2. Preparação das subcolônias e isolamento da rainha ...... 102 2.3. Concentração de corante externo e interno na casta operária ...... 103 2.4. Freqüência de indivíduos marcados internamente na casta operária ...... 104 2.5. Delineamento experimental ...... 105 3. Resultados e Discussão...... 105 4. Referências...... 111 4. CONCLUSÕES...... 113

1

1. RESUMO O objetivo da presente pesquisa foi estudar o polietismo etário, bem como, a produção de machos em colônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus . Primeiramente, um estudo comportamental foi efetuado desde a emergência das operárias até a sua morte. Durante o estudo, 29 atos comportamentais foram registrados durante 19 semanas de observação. Os indivíduos quando jovens desempenharam tarefas no interior do ninho, relacionados ao cuidado com a prole e jardim de fungo e quando mais velhos desempenharam atividades no exterior do ninho, como forrageamento e atividades na arena de lixo. Posteirormente, estudou-se a produção de machos em colônias sem rainha, com diferentes abordagens experimentais, sendo elas: A) Oviposição das operárias: Estudou-se o processo de produção da prole em colônias sem rainha, e o desenvolvimento ovariano das operárias em função de sua idade. As avaliações revelaram a oviposição e desenvolvimento da prole de machos proveniente das operárias. B) Respostas comportamentais das operárias em relação às larvas de machos produzidas pelas operárias e larvas de operárias produzidas pela rainha: verificou-se que as operárias comportam-se 2 diferentemente de acordo com a origem da larva, ou seja, ao lamber o corpo das larvas e inserir tufos de hifas no corpo da larva. As diferenças observadas indicaram a habilidade das operárias em discriminar entre as larvas, provavelmente devido as suas diferenças nas necessidades individuais. C) Cuidado com a prole e comportamento dos machos em colônias sem rainha: efetuou-se a descrição e quantificação das atividades dos membros de uma colônia em uma situação de perda da casta fértil. D) Morfometria das formas sexuais em colônias com e sem rainha: estudou-se os alados provenientes de colônias com e sem rainha, ou seja, oviposição por operárias e rainha. Uma análise de agrupamento evidenciou a ampla distribuição de tamanho dos indivíduos produzidos em colônias sem rainha em relação às colônias com rainha, sugerindo que um grande grupo destas operárias estavam hábeis para reprodução, produzindo ovos não fertilizados. Através destes resultados torna- se possível conjecturar que machos produzidos por colônias sem rainhas possam ser hábeis ao acasalamento, pois os machos menores e maiores apresentaram genitálias idênticas, variando somente em tamanho, e conseqüentemente, apresenta uma rota alternativa de reprodução nesta espécie. E) O papel das operárias na transferência de substâncias da rainha e as diferenças entre as castas: estudou-se a relação entre a rainha e as operárias mediada pela transferência de possíveis substâncias provenientes da casta fértil para a estéril. Os resultados indicaram uma comunicação e uma provável transferência de substâncias da rainha para as operárias, bem como, uma transferência de substâncias entre as operárias.

Palavras-chave: Acromyrmex subterraneus brunneus , comportamento, reprodução de operárias, formigas cortadeiras. 3

AGE POLYETHISM AND MALE PRODUCTION IN QUEENLESS COLONIES OF LEAF-CUTTING Acromyrmex subterraneus brunneus FOREL, 1911 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE). Botucatu, 2007, 103 p. Tese (Doutorado em Agronomia/Proteção de Plantas) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista. Author: ROBERTO DA SILVA CAMARGO Advisor: LUIZ CARLOS FORTI

2. SUMMARY The objective of the present research was to study the age polyethism and male production in queenless colonies of leaf-cutting ant, Acromyrmex subterraneus brunneus . First, a behavioral study was made from worker emergence to their death. Twenty-nine behavioral acts were recorded during the 19-week observation period. Young individuals performed tasks inside the nest related to brood care and care for the fungus garden, whereas older individuals performed activities outside the nest such as foraging and activities in the waste chamber. On second step, it was studied the male production in queenless colonies, using different experimental approaches: A) Worker 4 laying: it was studied the process of offspring production in queenless colonies and the ovary development of workers as a function of their age. The evaluations showed the oviposition and development of males originating from worker-laid eggs. B) Behavioural responses of workers towards worker-produced male larvae and queen-produced worker larvae: it was verified that workers behaved differently depending on larval origin, i.e., licking the larval body, transporting larvae and inserting hyphae of the symbiontic fungus on the larval body. Observed differences denote the ability of workers in discriminating among larvae, probably because of their different individual needs. C) Brood care and male behavior in queenless colonies: it was reported the description and quantification of the activities performed by the members of a colony in a situation of the loss of the fertile caste. D) Morphometry of the sexual forms in the queenright and queenless colonies: it was studies the males obtained from queenright and queenless colonies, i.e., they were produced by either queen or the workers. Cluster analysis revealed a wide distribution in the size of the sexual forms produced in queenless colonies compared with queenright colonies. However, it wasn’t found indication that the males produced in queenless colonies are unable to mate, as smaller and larger males had identical genitalia that varied only in size, and therefore probably represent and alternative route of reproduction in this . E) The role of workers in transfering queen substances and the differences between worker castes in the leaf-cutting ant: it was studied the relationship between the queen and workers mediated but the possible transfer of substance from the fertile to the sterile caste. The finding indicates the communication and probable transfer of substance from the queen to the workers as well as a substance transfer between workers.

Keywords: Acromyrmex subterraneus brunneus , behavior, worker reproduction, leaf cutting . 5

3. INTRODUÇÃO 3.1 As formigas cortadeiras As formigas cortadeiras, denominadas também de saúvas ( Atta spp.) e quenquéns ( Acromyrmex spp.), pertencem à tribo Attini, são cultivadoras de fungos, e assim, consideradas pragas de diversas plantas cultivadas, porque utilizam partes de vegetais para o cultivo do fungo simbionte, fonte primária de alimento para os indivíduos das colônias. As saúvas e quenquéns, de modo geral, utilizam-se de muitas espécies vegetais como substrato para fungo, apresentando, porém, certas preferências (Garcia, 1997). Na bibliografia, a ocorrência de trabalhos com as espécies de Atta spp. são mais freqüentes do que os relacionados com Acromyrmex spp., embora estas também causem danos. As formigas do gênero Acromyrmex utilizam monocotiledôneas, dicotiledôneas (Fowler et al. , 1986, 1989; 1990), e encontram-se distribuídas em 21 espécies e 11 subespécies (Gonçalves, 1961, 1967, 1982; Fowler et al. , 1986; Fowler, 1988), ou 20 espécies e 9 subespécies taxonômicas, de acordo com Della-Lucia (1993). Dentre as espécies, Acromyrmex subterraneus é a de maior importância florestal. 6

A subespécie Acromyrmex subterraneus brunneus , destaca-se por construir grandes ninhos a pouca profundidade (aproximadamente 15 cm), geralmente protegido por folhas secas e gravetos entrelaçados, ou pelas raízes das árvores (Camargo, 2004). As colônias desta espécie são populosas variando de 2036 a 51260 indivíduos, com um acentuado polimorfismo (Andrade 2002). Este polimorfismo permite uma marcada divisão de trabalho entre as operárias, em especial, durante o processamento do material forrageado (Camargo, 2004). Além disso, notificou-se que na ausência da rainha, as operárias são hábeis a ovipositar, produzindo machos (Andrade, A.P.P., comunicação pessoal).

3.2 Polietismo etário em formiga cortadeira Dois padrões de divisão de trabalho são reconhecidos em insetos sociais, sendo o polietismo etário, relacionado com a idade do indivíduo, e o polimorfismo morfológico que está relacionado ao tamanho ou forma do indivíduo no desempenho de uma tarefa. O polietismo temporal é amplamente encontrado nos insetos sociais, com operárias jovens executando tarefas no interior do ninho e as operárias velhas executando tarefas no exterior, tais como forrageamento e defesa (Robinson, 1992). O polimorfismo morfológico é encontrado em térmitas e em espécies de formigas com distintas subcastas dentro da casta operária (Oster & Wilson, 1978). Este é variável, mas quando mais extremo for a subcasta, ou seja, em tamanho ou morfologia, esta apresenta um comportamento mais especializado e repertórios menores. A especialização mais comum é encontrada no forrageamento e defesa. Outros papéis de operárias morfologicamente especializadas incluem o processamento e armazenamento de alimento (Hölldobler & Wilson, 1990). Em formigas cortadeiras, o cultivo do fungo simbionte com folhas conduziu a uma grande especialização dos atos comportamentais em função do seu tamanho. Em Atta , o polimorfismo das operárias conduz a uma distinta divisão de trabalho entre subcastas físicas , nas quais as maiores operárias são especializadas para a defesa da colônia, operárias médias forrageiam as espécies vegetais e as operárias menores são especializadas para trabalharem dentro do jardim de fungo. Wilson (1980) verificou que em Atta sexdens as tarefas são divididas entre as operárias em 4 subcastas físicas, das quais 3 são subdivididas dentro de 3 subcastas temporais, perfazendo pelo menos um total de 7 7 subcastas. Mas para o gênero Acromyrmex , pouco se sabe sobre a relação entre as subcastas físicas e etárias, bem como, sobre o calendário do polietismo etário. No capítulo I é discutido os padrões de polietismo etário, bem como os modelos que se adequam para a espécie em estudo.

3.3 Produção de machos em colônias de formiga cortadeira

3.3.1 Sistema de determinação sexual e reprodução das operárias de formiga

As formigas são insetos sociais que vivem freqüentemente em populosas colônias, no qual a rainha controla a postura de ovos fertilizados e não fertilizados. Tal sociedade está apoiada em um sistema haplodiplóide de determinação sexual (Hamilton, 1964 a, b), gerando uma estrutura familiar variável, a qual conduz a uma grande diversidade de expressão, tais como conflitos inter e intraespecíficos. Assim, a seleção parental explica claramente a evolução do comportamento altruísta e da casta operária em Hymenoptera, prognosticando a existência de um conflito reprodutivo entre as fêmeas do ninho sobre a maternidade dos machos (Hamilton, 1972 citado por Heinze et al. , 1997). Em colônias monogínicas e monândricas, o conflito reprodutivo a respeito da produção de machos entre a rainha e as operárias torna-se maximizado. As operárias preferem criar seus próprios filhos ou aqueles produzidos por outras operárias, com os quais elas têm um maior grau de parentesco (r=0,375) do que seus irmãos, machos produzidos pela rainha. A rainha, entretanto, tem um maior parentesco (r=0,5) com seus próprios filhos do que com filhos produzidos pelas operárias (r=0,25), assim preferindo seus filhos aos seus netos (Trivers & Hare, 1976; Ratnieks, 1988). Quando a rainha de uma colônia é poliandrica, ou seja, acasala com 2 ou mais machos, o conflito reprodutivo sobre a produção de machos é reduzido (Ratnieks, 1988), pois o parentesco das operárias com os filhos das meias irmãs (r=0,125) é menor do que o parentesco com os irmãos. Porém, apesar de aumentar o controle da hierarquia reprodutiva dentro da colônia, a poliândria pode ser considerada como um comportamento de risco para 8 as rainhas, pois estas são expostas a uma alta pressão de predação, quando procuram machos adicionais para acasalar. Várias hipóteses já foram formuladas para explicar a evolução da poliandria nos insetos sociais (Page, 1986). As principais hipóteses são: a) A poliandria permite aumento do tamanho efetivo da população, de modo a favorecer a longevidade da população como um todo (Wilson, 1962); b) A poliandria favorece o aumento da variação genética dentro da prole e da colônia, pois resulta em rainhas mais variáveis que fornecem uma base para aumentar a variabilidade na determinação de castas e/ou uma maior mistura de genótipos nas operárias (Wilson, 1962; Walker, 1980); c) A poliandria é energeticamente econômica, pois as rainhas acasalam apenas uma única vez em sua vida (Parker, 1970; Alcock et al. 1978); d) A poliandria é necessária em espécies que tenham colônias populosas, pois a rainha armazena uma grande quantidade de espermatozóides, suficiente para passar a sua vida realizando oviposição (Parker, 1970; Trivers, 1976; Cole, 1983; Eberhard, 1985). Em formigas cortadeiras, a poliandria tem sido documentada em diversos graus, tais como: 3 pais por colônia em Acromyrmex versicolor (Reichardt & Wheeler, 1996), 4-6 pais por colônia em Acromyrmex octospinosus (Boomsma et al. , 1999), 1-5 pais por colônia em Atta colombica (Fjerdingstad et al. , 1998), > 3 pais por colônia em Atta laevigata (Corso, 1981), > 1 pai por colônia em Atta. texana (Moser, 1967) e 3-8 pais por colônia em Atta sexdens (Kerr, 1961). Assim, em concordância com as hipóteses listadas, as formigas cortadeiras asseguram uma ampla variabilidade genética, indispensável para a sustentabilidade de uma complexa sociedade que se constitui de uma população de milhares de indivíduos. Uma outra estratégia reprodutiva, para manter e potencializar a variabilidade de genótipos na colônia é através da haplometrose e pleometrose. A haplometrose consiste na fundação da colônia por uma única fêmea recém fecundada, originando colônias monogínicas; a pleometrose consiste na fundação da colônia por 2 ou mais rainhas, originando colônias poligínicas (Hölldobler & Wilson, 1990). Indubitavelmente, a poligínia promove uma maior variabilidade genética nos insetos sociais, principalmente em rainhas que sejam monandricas, como no caso dos Attini basais. De acordo com Strassmann (2001), seis espécies de Attini 9 apresentam um número efetivo de acasalamento próximo a 1, ocasionando uma monandria com uma paternidade de 1 para Apterostigma collare (Villesen et al. , 1999), 1,09 para Apterostigma mayri (Murakami et al. , 2000), 1,04 para Cyphomyrmex costatus (Murakami et al. , 2000), 1 para Cyphomyrmex longiscapus (Villesen et al. , 1999), 1,14 para C. rimosus (Murakami et al. , 2000) e de 1 para Myrmicocrypta ednaella (Villesen et al. , 1999). Por outro lado, colônias com rainhas poliandricas também apresentam poligínia, embora poucos relatos tenham sido registrados para as formigas cortadeiras, tais como Atta texana (Moser & Lewis, 1981; Mintzer & Vinson, 1985; Mintzer, 1987), Acromyrmex subterraneus subterraneus (Della Lucia & Vilela, 1986), Acromyrmex versicolor (Rissing et al. , 1986; 1989; Rissing & Pollock, 1986) e Acromyrmex subterraneus brunneus (Delabie, 1989) e Acromyrmex subterraneus molestans (Souza et al. , 2005). Boomsma et al. (1999) verificaram a existência de 2 a 3 rainhas em colônias de Acromyrmex octospinosus , durante a escavação de ninhos na estação de produção de alados. De acordo com os autores, estas rainhas adicionais são ignoradas enquanto a rainha mãe é coberta e escondida pelas operárias quando o ninho é perturbado. Camargo R. S., observação pessoal (2002) observou fêmeas virgens de Acromyrmex rugosus forrageando substratos vegetais juntamente com as operárias. Tais fatos promovem evidências sobre a complexidade da hierarquia reprodutiva em formigas cortadeiras, a qual é pouco estudada sobre um enfoque comportamental dos indivíduos dentro da colônia. Em outras espécies de formigas, como por exemplo Formica fusca , a poliginia conduz a um comportamento de nepotismo das operárias, indicando que as mesmas são capazes de detectar o grau de parentesco da prole (Hannomen & Sundström, 2003). O favoritismo dentro da colônia aumenta, quando as operárias são capazes de realizar postura de ovos haplóides, que se desenvolverão em machos (Bourke & Franks, 1995). Quando isto ocorre, o desempenho da rainha decresce pois os netos são criados ao invés dos filhos. Como um conjunto, as operárias também detectam o parentesco da prole de machos. Isto é verificado quando a freqüência de acasalamento é menor que 2, as operárias removem os ovos de outras operárias através de um comportamento de policiamento (Ratnieks, 1988). O policiamento das operárias reduzirá ou eliminará a auto- 10 reprodução como uma conseqüência da inibição reprodutiva mútua pelas operárias (Cole, 1983 citado por Ratnieks, 1988). Deste modo, como a assimetria do parentesco declina, o interesse das operárias começa a coincidir com o interesse da rainha e o conflito rainha- operária sobre o parentesco dos machos desaparece (Sundström & Boomsma, 2001). Entretanto, se as operárias ainda favorecerem seus próprios filhos ou filhos de outras operárias, o conflito rainha-operária é substituído pelo conflito entre várias operárias. O conflito sobre o parentesco dos machos pode ser expresso diferencialmente quando a freqüência de acasalamento da rainha varia na população. Em abelhas e vespas, as larvas se desenvolvem em células especiais confinadas a seções específicas nos ninhos, nas quais torna-se fácil à discriminação do parentesco da prole (Keller et al. , 1996; Sundström et al. , 1996). As operárias que criam a prole podem controlar a sua taxa de alimentação e assim o seu destino dentro da colônia (Bourke & Ratnieks, 1999). Como a maioria dos insetos sociais, as formigas cortadeiras não podem substituir uma rainha morta por uma nova, então, a colônia órfã está condenada pela morte das operárias e a sua não substituição. As operárias podem alcançar a reprodução por duas estratégias: a) criar as larvas de fêmeas derivadas da rainha (originalmente destinadas a se tornarem operárias), tornando-se rainhas, as quais podem dispersar, acasalar e fundar novas colônias; b) efetuarem a postura para produzir machos (Dijkstra & Boomsma, 2006). A reprodução das operárias já foi notificada em Acromyrmex echinatior , Acromyrmex octospinosus (Dijkstra et al. , 2005; Febvay & Ogier, 1984), Acromyrmex rugosus rugosus , Acromyrmex lobicornis , e Acromyrmex subterraneus brunneus (Fowler, 1978; Weber, 1972; Camargo et al., 2005). Adicionalmente, sabe-se que os filhos das operárias apresentam uma maior variação fenotípica quando comparada à prole de colônias com rainha, já notificado em Acromyrmex rugosus rugosus , Acromyrmex subterraneus brunneus , Acromyrmex echinatior por Fowler, 1978, Camargo et al. 2005 e Djikstra & Boomsma, 2007, respectivamente. Recentemente, Dijkstra & Boomsma (2006), verificaram que operárias de Atta sexdens , Atta cephalotes e Atta colombica não são completamente estéreis, pois são capazes de produzir machos sem a presença da rainha, sugerindo sua participação ativa em uma tarefa adicional. Esta hipótese é altamente plausível se considerarmos que o parentesco com seus filhos é mais alta que com seus irmãos (filhos da 11 rainha). Os autores argumentaram que a fertilidade das operárias de Atta é baixa quando comparado ao gênero Acromyrmex , onde as operárias rotineiramente produzem machos após a perda da rainha. Porém é desconhecido se todas as espécies dos gêneros Atta e Acromyrmex spp. seriam capazes de produzir machos na ausência da rainha. Nos capítulos II, III, IV e V e discutida a produção de macho em colônias sem rainha, bem como, a provável função deste comportamento.

3.3.2.2 Comunicação rainha - operária Interesses individuais e coletivos podem ser alcançados através de ações químicas e físicas. Em sociedades pequenas, o dimorfismo da casta operária e reprodutiva é freqüentemente menos pronunciado do que em grandes sociedades e as interações são diretamente manifestadas através da supressão física (Wilson, 1971; Alexander et al. , 1991; Bourke, 1999). Em sociedades maiores, o dimorfismo da casta é mais pronunciado e a comunicação é comumente mediada através de substâncias químicas (Bourke & Ratnieks, 1999). Entretanto, operárias ignoram sinais químicos produzidos pela rainha, quando o interesse reprodutivo da coletividade coincide com o seu interesse próprio (Keller & Nonacs, 1993). Assim, as rainhas têm um pequeno poder sobre as operárias em sociedades maiores, enquanto o oposto pode ser verdadeiro em sociedades pequenas. As operárias de Formica fusca são capazes de associar pistas químicas com a capacidade de oviposição entres as rainhas da colônia (Hannonen et al. , 2002). Segundo os autores, a fecundidade das rainhas esta no seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares e atua como um feromônio para as operárias, as quais respondem aos sinais através da discriminação entre as rainhas. L.C. Forti (2003, comunicação pessoal) observou inúmeras vezes que o exoesqueleto de rainhas mortas de formigas cortadeiras permanece por várias semanas dentro da câmara do jardim de fungo de colônias de laboratório, antes de ser descartada no lixo. Tal fato, sugere que a comunicação entre rainha-operária e reconhecimento da rainha em formigas cortadeiras também possa ser mediado através de sinais químicos ou percepção física. No capítulo VI é discutido a comunicação e o papel das operárias na transferência de substância da rainha para as operárias e entre elas.

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3. 4. Referências

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Capítulo I

POLIETISMO ETÁRIO NA FORMIGA CORTADEIRA Acromyrmex subterraneus brunneus FOREL, 1911 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)

Resumo Este estudo descreve e quantifica os atos comportamentais de 2 colônias de laboratório de Acromyrmex subterraneus brunneus , em função do polietismo etário das operárias. Vinte e nove atos comportamentais foram registrados durante 19 semanas de observação. Os indivíduos quando jovens desempenharam tarefas no interior do ninho, relacionados ao cuidado com a prole e jardim de fungo e quando mais velhos desempenharam atividades no exterior do ninho, como forrageamento e atividades na arena de lixo. A longevidade média foi de 108,21 ± 3,30, 109,15 ± 1,92 e 122,71 ± 1,55 para as operárias grande, média e pequena respectivamente. A classe de tamanho pequeno apresentou uma maior probabilidade de alcançar uma maior longevidade do que operárias de tamanho grande e médio. Este estudo descreve sucintamente as etapas do polietismo etário e o estabelecimento de subcastas físicas e temporais.

Palavras Chave : Atos comportamentais, formiga cortadeira, subcasta temporal.

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1 Introdução A maioria dos adultos de insetos sociais sofre mudanças comportamentais durante seu envelhecimento, conduzindo a mudanças de papéis na sociedade. Cada espécie possui seu próprio padrão de polietismo etário, acompanhado por mudanças padronizadas nas atividades glandulares do indivíduo (Hölldobler & Wilson 1990). Desta forma, as operárias mais jovens tendem a desempenhar tarefas no interior do ninho, enquanto as operárias mais velhas se encarregam de tarefas no exterior do ninho, como o forrageamento (Wilson 1971). O polietismo etário está relacionado a um aumento no risco da mortalidade durante atividades no exterior do ninho, tais como o forrageamento, e um aumento na expectativa de vida das operárias, quando elas estão envolvidas em atividades no interior do ninho (Wakano et al. 1998). Além disso, as operárias amplificam seu repertório comportamental sem a exclusão de comportamento que elas exibiram anteriormente em suas vidas (Bourke & Franks 1995). Calabi et al. (1983) estudaram o polietismo etário em Pheidole hortensis e observaram que as operárias mais velhas continuaram a exibir atos comportamentais de operárias mais jovens. Jaisson et al. (1988), citado por Bourke & Franks (1995), argumentam que este comportamento é muito mais típico do que atípico na organização social das formigas. O aumento da variabilidade comportamental dos indivíduos mais velhos é explicado por ser um acúmulo de experiência sobre os itens e tarefas encontradas em seu ambiente. Em Odontomachus troglodytes , operárias da mesma idade freqüentemente desenvolvem diferentes subespecialidades e algumas continuam a desempenhar o mesmo papel durante toda a sua vida (Dejean & Lachaud 1991). Operárias de Acromyrmex versicolor , já foi constatado a especialização individual em relação a determinadas funções dentro do ninho (Julian & Cahan 1999). Os autores sugerem que esta especialização é controlada por diferenças internas entre as operárias. Provavelmente, esta especialização aumenta a eficiência de uma operária, conseqüentemente, da colônia em geral. Sendova- Franks & Franks (1993) observaram a existência de operárias generalistas e especialistas. Estudando o envelhecimento de operárias de Leptothorax unifasciatus , os autores encontraram que determinadas operárias jovens (“callows’’) tornaram-se rapidamente forrageiras, enquanto algumas operárias velhas ( ± 1 ano de idade) tornaram-se especialistas no cuidado com a prole enquanto outras estavam dedicadas ao forrageamento. 20

Esta flexibilidade comportamental e variabilidade de papéis dentro da organização social, conduziram Sendova-Franks & Franks (1993) a postular a hipótese “foraging-for- work”. Esta hipótese sugere que operárias jovens e velhas procuram ativamente trabalho onde elas possam encontrá-lo, provavelmente pela rotação de papéis que não são completamente ocupados pelas operárias mais velhas ou com mais experiência. Assim, o polietismo etário não está casualmente relacionado ao tamanho ou idade da operária de formiga, ou seja, “foraging-for-work” pode teoricamente gerar um polietismo temporal nos quais operárias novas recém emergidas da pilha de prole procuram atividades nesta área. O afluxo de operárias jovens impulsiona as operárias mais velhas a se mover centrifugamente para encontrar tarefas. Quando estas operárias morrem, um declínio na taxa de execução de algumas tarefas ocorre nas áreas onde elas estavam alocadas, sendo necessário sua substituição (Tofts 1993 citado por Beshers & Fewell 2001). Obviamente, nem todas as operárias que encontraram uma oportunidade de desempenhar uma tarefa responderão igualmente. Julian & Cahan (1999) alocaram cadáveres de operárias dentro do ninho de formigas cortadeiras ( A. versicolor ) e verificaram que, apesar de 80 % das operárias encontrarem cadáveres em seu caminho, unicamente uma pequena porcentagem das operárias respondeu, carregando estas para o exterior do ninho. Neste caso, operárias que removeram os cadáveres mais freqüentemente também completaram a tarefa mais rápido, sugerindo uma ligação entre a especialização e a eficiência da colônia (Beshers & Fewell 2001). Robinson et al. (1994) afirmam que a divisão do trabalho em insetos sociais pode ser mais bem entendida por meio de uma abordagem que combina a teoria da “self- organization” com uma avaliação do polietismo temporal como um processo de desenvolvimento com determinantes fisiológicos e genéticos. Por exemplo, no caso da abelha européia Apis mellifera , nas primeiras semanas de vida as operárias permanecem limpando células e criando a prole, na terceira semana processam néctar e constroem favos, e finalmente, saem para forragear quando estão com aproximadamente 25-30 dias de idade (Seeley 1995). Estas respostas comportamentais estão associadas à atividade glandular e as concentrações de hormônio juvenil nos indivíduos, ou seja, baixas concentrações estão associadas aos comportamentos dentro do ninho, durante as 3 primeiras semanas de vida da abelha adulta, e concentrações mais altas são alcançadas após a 3 a semana de idade e está 21 relacionada ao forrageamento (Robinson 1992). O genótipo das operárias também influencia o polietismo etário nas formigas. Julian & Fewell (2004) observaram diferenças entre operárias de Acromyrmex versicolor na mudança de tarefas dentro do ninho ao forrageamento. De acordo com suas matrilinhagens, algumas operárias desempenham mais tarefas na câmara de lixo e forrageamento, enquanto outras, estão mais envolvidas no cuidado com o fungo e prole. Em espécies polimórficas, adicionalmente a grupos etários, diferenciação morfológica ocorre entre as operárias, um fato que conduz a sobreposição de papéis com uma mistura de subcastas físicas e temporais (Wilson 1980). Em formigas cortadeiras tais como Atta , o polimorfismo das operárias conduz a uma distinta divisão de trabalho entre subcastas físicas , nas quais as maiores operárias são especializadas para a defesa da colônia, operárias médias forrageiam as espécies vegetais e as operárias menores são especializadas para trabalharem dentro do jardim de fungo. Wilson (1980) verificou em Atta sexdens as tarefas são divididas entre as operárias em 4 subcastas físicas, das quais 3 são subdivididas dentro de 3 subcastas temporais, perfazendo pelo menos um total de 7 subcastas. Mas para o gênero Acromyrmex , pouco se sabe sobre a relação entre as subcastas físicas e etárias, bem como, sobre o calendário do polietismo etário. A existência de 3 a 4 subcastas físicas foi sugerido para Acromyrmex subterraneus brunneus em um estudo comportamental das operárias durante o forrageamento, cultivo do jardim de fungo e a devolução do material forrageado (Camargo 2004). Entretanto, o estudo da divisão de trabalho para esta espécie não foi completo, o autor separou as operárias dentro de 4 classes de tamanho de acordo com a largura da cabeça. A primeira subcasta foi composta de operárias com largura cefálica de 1,7 a 2,0 mm, as quais foram responsáveis pelo forrageamento e atos comportamentais relacionados ao início do processamento vegetal, atos que necessitam de menor precisão para a sua execução. A classe de tamanho média (largura da cabeça: 1,2-1,6 mm) foi considerada como uma segunda subcasta devido serem responsáveis pelo ato comportamental de fragmentação do material forrageado, juntamente com a execução dos atos comportamentais da primeira subcasta. A terceira e quarta subcastas consistem de operárias pequenas (largura cefálica: 0,9 a 1,1 mm) e muito pequenas (largura cefálica: 0,7 a 0,8 mm), as quais desempenham atos comportamentais relacionados ao final do processo de incorporação do material 22 forrageado, tais como, lamber a superfície do material recém-incorporado e deposição de tufos de hifas no substrato incorporado. O objetivo foi estudar o repertório comportamental e a freqüência de cada ato comportamental durante a vida das operárias Acromyrmex subterraneus brunneus na sua colônia.

2 Material e Métodos 2.1 Colônias de estudo

Duas colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus foram coletadas no parque da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queirós, ESALQ/USP, Piracicaba, transportadas e mantidas no Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil. As colônias foram acondicionadas em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 °C±2, com uma umidade relativa de 70%±20. As colônias foram diariamente alimentadas com Ligustrum spp. e Acalypha spp., durante a execução do experimento.

2.2 Marcação de operárias

A marcação das operárias foi realizada com as canetas de marcação permamente (Marca EDDING®), devido a sua ótima aderência, secagem rápida e boa visibilidade. Esta técnica foi amplamente utilizada para formigas cortadeiras por Camargo et al. (2003). As formigas foram recolhidas nas colônias com auxílio de pinças. Com um pincel de ponta fina, o pronoto foi marcado com um pequeno ponto de tinta. Após a marcação, as operárias permaneceram por 2 horas acondicionadas em copos plásticos com as bordas untadas com Fluon (resina de fluoretileno), produto que impossibilita a fuga das formigas, e em seguida, foram soltas em suas respectivas colônias.

2.3 Isolamento das pupas As pupas foram retiradas de duas colônias adultas e subseqüentemente isoladas em um recipiente para esperar a emergência dos adultos, possibilitando registrar o momento 23 em que inicia as atividades. As pupas isoladas permaneceram em recipientes plásticos contendo 1 cm de gesso no fundo, para manter umidade do jardim de fungo. Junto com as pupas foram colocadas cerca de 150 operárias adultas foram retiradas de cada uma das respectivas colônias de origem, marcadas e isoladas, para prover o cuidado durante o desenvolvimento e auxiliar na emergência do adulto. Uma porção da cultura de fungo foi colocada para fornecer alimento às operárias isoladas junto às pupas. Estas pupas permaneceram isoladas por um período de 15 dias, pois esta espécie apresenta uma fase pupal de 20 a 23 dias (Andrade 2002). As operárias recém emergidas foram separadas por classes de tamanho (pequena, média e grande), através de medidas da cápsula cefálica (Camargo et al. 2003). Posteriormente, foi realizada a marcação do pronoto de todos os indivíduos de cada classe de tamanho, assim diferenciados por cores. Foram introduzidas 50 operárias da classe de tamanho grande (largura cefálica entre 2,0 e 1,7 mm), 148 da classe de tamanho médio (largura cefálica entre 1,6 e 1,2 mm) e 147 da classe de tamanho pequena (largura cefálica entre 1,1 e 0,7 mm). Desta forma, foi possível acompanhar os atos comportamentais destas operárias por um longo período de tempo, visando estudar o polietismo etário. Para colônia Na colônia 1 foram introduzidas 45 operárias grandes 102 operárias de tamanho médio e 95 pequenas; e na colônia 2 foram introduzidas 5 grandes, 46 médias e 52 pequenas.

2.4 Polietismo etário As operárias recém emergidas marcadas e introduzidas em suas respectivas colônias de origem permitiram o estudo do calendário do polietismo etário durante a sua vida na colônia. O acompanhamento do repertório comportamental foi realizado através de observações sob microscópio esteroscópico (Marca Zeiss, Stemi 1000) e um iluminador de luz fria (Marca Nikon, NI 150). As colônias de origem, com aproximadamente 1000 operárias cada, foram acondicionadas em caixas de vidro (comprimento: 20 cm; largura: 10 cm e altura: 2,5 cm), com 0,5 cm de gesso no fundo, interligadas por uma arena de forragem e a uma câmara de lixo nas extremidades opostas. Cada colônia foi observada 3 vezes ao dia, durante 3 dias da semana, e todas as demais 19 semanas subseqüentes, até que as formigas perdessem suas marcas ou aparecessem mortas no lixo. Cada observação tinha a duração de 30 minutos, no qual o 24 observador percorria a colônia e registrava as tarefas desempenhadas de todas as formigas introduzidas e marcadas que estavam visíveis. Este sistema de observações foi embasado e adaptado do utilizado para estudar o polietismo etário por Acromyrmex versicolor de Julian & Fewell (2004). Os registros foram feitos por meio de observações ad libitum das operárias que estavam na superfície do jardim de fungo. Durante cada observação, o comportamento de cada formiga foi registrado, exceto para as que estavam caminhando ou imóveis (imobilidade não foi considerada um ato comportamental). Em cada semana, duas observações foram realizadas sem o oferecimento de folhas, para acompanhar atividades como cuidado e manutenção do jardim de fungo, cuidado e limpeza da prole, transporte de alimento, limpeza das operárias e tarefas na arena de lixo. Na terceira observação, folhas de Ligustrum spp. foram oferecidas para estudar o polietismo etário durante o cultivo do jardim de fungo e forrageamento. As colônias foram apoiadas em pequenas mesas de acrílico (comprimento: 50 cm; largura: 15 cm e altura: 5 cm), para que o observador deslocasse a lupa durante a varredura, evitando a movimentação e perturbação da colônia durante as observações.

2.5 Análise dos Dados Os atos comportamentais foram agrupados em categorias comportamentais, sendo elas: cuidado e manutenção do jardim de fungo, cultivo do jardim de fungo, cuidado e limpeza da prole, limpeza das operárias, atos no exterior do ninho e tarefas na câmara de lixo. A freqüência de cada ato comportamental foi à soma dentro de cada tarefa por categoria de tamanho. Os dados foram submetidos à ANOVA (esquema fatorial: a x b x c ), com a = idade (19 semanas), b = categoria de tamanho (3) e c = categorias comportamentais (6), ao nível 5% de significância. As operárias mortas marcadas encontradas na câmara de lixo foram contadas semanalmente, uma função da distribuição da sobrevivência foi calculada para o período de observação e as diferenças na função de sobrevivência foram analisadas pelo Mantel-Cox log-rank test.

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3 Resultados e Discussão Os resultados sobre o polietismo etário estão resumidos na Figura 1. Acromyrmex subterraneus brunneus apresenta um padrão típico de polietismo etário já encontrado em insetos sociais , no qual as operárias jovens permanecem no interior do ninho, e as mais velhas desempenham atividades no exterior do ninho. Inicialmente, quase todas as operárias das três classes de tamanho foram observadas cuidando do jardim de fungo (Fig. 2, D e E), cultivando o jardim de fungo (Fig. 3 e 4), cuidando e limpando a prole (Fig. 2) e transportando alimento. Após a 4 ª semana de idade, iniciou-se a participação de operárias marcadas em atividades fora do ninho (Fig. 5), aumentando nas últimas semanas de avaliação (Fig. 1). ANOVA indicou interação significativa entre a idade e as categorias comportamentais (F= 3,3105, g.l.=90, P <0,05). Estes resultados corroboram com aqueles obtidos por Julian & Fewell (2004) para a formiga cortadeira do deserto Acromyrmex versicolor , cujo padrão do calendário etário foi muito similar, pois nas três primeiras semanas a maior parte das operárias foi observada atendendo o fungo e residindo no interior do ninho, e após a 4ª e 5ª semanas de observação, o número de indivíduos atuando como forrageiras começou a aumentar. Os autores verificaram que operárias de diferentes matrilinhagens (prole de rainhas diferentes) variam temporalmente na transição de tarefas no interior do ninho para o exterior. Este padrão de polietismo etário é típico em formigas, no entanto, a transição de tarefas do interior para o exterior do ninho é extremamente variável. Gordon et al. (2005) observaram uma fraca trajetória de operárias de Pogonomyrmex barbatus na mudança de tarefas do interior para o exterior do ninho. Esta variabilidade no comportamento das operárias depende da necessidade da colônia, as quais são influenciadas pelas mudanças nas condições externas e pela reação da colônia a estas condições (Gordon et al. 2005). Em condições de campo, as operárias mostram uma interação direta com o habitat, contrastando com o que é observado sob condições laboratoriais (Gordon et al. 2005). Em laboratório, um aumento no repertório comportamental conduz a observação do fluxo de atividade e a distribuição de tarefas espacialmente, indicando que as operárias mudam de tarefas no interior para o exterior de acordo com o envelhecimento. Uma transição de tarefas desempenhadas nas atividades do interior para o exterior do ninho (atividades na arena de forragem e câmara de lixo) foi observado no presente estudo, provavelmente 26 devido ao arranjo espacial da colônia sob condições laboratoriais. No campo, as operárias de formigas cortadeiras têm que procurar, selecionar e forragear das fontes vegetais para o cultivo do fungo simbionte. Atividades no exterior do ninho, tais como a procura de itens alimentares, são de alto risco, devido a predadores, competidores e doenças (Fowler et al. 1991). As operárias forrageiras são mais velhas, pois elas precisam de maior experiência e flexibilidade comportamental para sobreviver no exterior do ninho. Entretanto, um estudo conduzido em condições ambientais sugere que as formigas se movem rapidamente das tarefas internas para externas em situações especiais, demonstrando que fatores extrínsecos podem exercer uma alta influência na alocação etária das tarefas. Se o calendário etário de atividades das operárias for fixo e imutável, isto conduziria a perdas no desenvolvimento da colônia. Assim, a flexibilidade comportamental e a variabilidade conferem uma vantagem adaptativa a este grupo. A hipótese “Foraging-for-work” (Tofts 1993) prediz que a tomada de decisão individual sobre qual a tarefa que deve ser executada depende se o indivíduo está no local onde a tarefa é necessária. A hipótese Robinson & Page (1995) está baseada nas diferenças genotípicas, as quais atuam na determinação do limiar de estímulo para o desempenho de uma tarefa. Adicionalmente, Pacala et al. (1996) propuseram um modelo em que a decisão individual sobre uma tarefa a ser feita depende de pistas ambientais e suas interações prévias. Entretanto, pode-se dizer que poucas hipóteses foram experimentalmente comprovadas, devido à complexidade de tais interações. Indubitavelmente, aspectos temporais afetam a probabilidade de uma determinada operária responder a tarefas especificas, mas a probabilidade de determinada operária em fazer algo é inversamente proporcional ao seu tamanho. A quantidade de atividade desempenhada por unidade de tempo de observação decresce com o aumento do tamanho da operária, ou seja, operárias menores são mais ativas que operárias maiores (Wilson 1980). Em Atta sexdens , por exemplo, operárias menores (largura cefálica: 0,6-1,0 mm) são ativas e laboriosas, enquanto operárias de tamanho médio e grande são menos ativas (largura cefálica > 2.6 mm). O nível de atividade do tamanho intermediário está entre os dois extremos mencionados acima (Wilson 1980). No entanto, as operárias menores predominam na distribuição de tamanho de colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus (Andrade 2002) e desempenham tarefas 27 especificas tais como depositar tufos de hifas no substrato recém incorporado e cuidado com a prole (Tabela 1). Por outro lado, tarefas específicas, tal como o corte das folhas, foram observadas nas subcastas grande e média. De acordo com Wetterer (1999), a variação no polimorfismo entre as espécies de formigas cortadeiras, está relacionada em parte com as diferenças na sua ecologia de forrageamento. Por exemplo, as espécies Acromyrmex octospinosus e Acromyrmex volcanus , basicamente forrageiam folhas caídas, frutas e flores, bem como plantas de pequeno porte, o que requer operárias grandes (forrageiras monomórficas) para a coleta deste material e operárias pequenas para as atividades no interior do ninho, com uma população obedecendo a uma distribuição bimodal de tamanho (Wetterer 1999). A especificidade da tarefa poderia também estar relacionada a sua complexidade, em outras palavras, algumas tarefas requerem uma maior ou menor cooperação entre os companheiros do ninho (Anderson et al. 2001). A limpeza das operárias foi observada em todas as semanas (fig. 1), pois são atos comportamentais essenciais para sua assepsia. O comportamento de limpeza, provavelmente, tem diferentes funções individuais e coletivas. A primeira, atua na limpeza do corpo para remover microorganismos deletérios e parasitos do tegumento (Kermarrec et al. 1986; Jaccoud et al. 1999; Hughes et al. 2002), enquanto sua função coletiva está relacionada para a manutenção da homeóstase do odor colonial (Lenoir et al. 1999). Nenhuma interação foi observada entre as categorias etárias e de tamanho (ANOVA, F= 1,3853, g.l.= 36, p > 0,05), demonstrando que as operárias, independente do seu tamanho, comportam-se similarmente quando são jovens. Acromyrmex subterraneus brunneus apresenta um rico repertório comportamental, com 29 atos comportamentais registrados (Tabela 1). Este repertório comportamental já foi estudado para outras espécies de formigas cortadeiras, como Atta sexdens um total de 29 atos comportamentais foram identificados e Atta texana , com 37 tarefas distintas (Fowler 1983). Acromyrmex subterraneus brunneus realiza atos comportamentais peculiares como depositar tufos de hifas no tegumento da prole (larvas e pupas), deixando sua prole embutida no jardim de fungo, com a largura cefálica proeminente e peças bucais livres para receber alimentação das operárias (Weber 1972). A deposição de tufos de hifas no tegumento da prole já foi notificado por Lopes (2005), para as espécies Acromyrmex 28 crassispinus , Acromyrmex rugosus rugosus , Acromyrmex landolti balzani , embora pouco se saiba sobre o significado biológico e funcional deste comportamento. A longevidade média foi de 108,21 ± 3,30, 109,15 ± 1,92 e 122,71 ± 1,55 dias para as operárias grande, média e pequena, respectivamente. Em outras espécies do complexo Acromyrmex subterraneus , operárias pequenas também tiveram uma maior longevidade na colônia. Andrade (2002) observou 5 operárias da categoria de tamanho muito pequena (largura cefálica: 0,7 – 0,8 mm) com uma longevidade de 330-367 dias. As funções de sobrevivência diferiram significativamente entre as operárias menores e maiores (log-rank test, χ2= 49,6, g.l.= 1, p <0,001), e entre as operárias pequenas e médias (log-rank test , χ2=68,6, g.l.= 1, p <0,001). Assim, as operárias pequenas têm uma alta probabilidade de alcançar idade mais avançada do que as operárias de tamanho médio e grande (fig. 7 a, b). Este padrão já havia sido detectado na formiga tecelã, Oecophylla smaragdina , com operárias pequenas mostrando uma maior probabilidade de sobrevivência do que as operárias maiores (Chapuisat & Keller 2002). De acordo com estes autores, num ambiente protegido as operárias menores vivem mais do que as maiores, demonstrando que o risco de mortalidade extrínseco pode afetar a taxas de envelhecimento, quando a teoria evolutiva do envelhecimento é usada como um modelo. Esta teoria prediz que as operárias maiores envelhecem mais rapidamente, morrem antes e tem uma duração de vida intrínseca menor, pois estes indivíduos enfrentam maiores riscos de mortalidade extrínsecos, do que as operárias menores. As operárias maiores são responsáveis pelo forrageamento e defesa da colônia, e as menores permanecem dentro do ninho, onde cuidam da prole (Hölldobler & Wilson, 1990). Entretanto, o presente estudo, vem acrescentar a observação de que várias operárias pequenas estavam na câmara de lixo, especialmente na 16 a, 17 a e 18 a semana (Figura 1). Hart & Ratnieks (2001) estudaram a partição de tarefas no lixo de Atta cephalotes , e observaram um aumento no nível de agressão às operárias que trabalham a câmara de lixo pelas operárias que estão envolvidas no trabalho do jardim de fungo, para que elas permaneçam no local em questão. Os autores sugerem que as operárias no monte de lixo têm uma baixa expectativa de vida, e desta forma, estas operárias mais velhas desempenham estas tarefas no final de suas vidas. O polimorfismo, como observado para Acromyrmex subterraneus brunneus (Tabela 1), afeta a longevidade das operárias, conduzindo a uma sobrevivência mais baixa das 29 operárias de tamanho médio e grande quando comparada às operárias de tamanho menor (Figura 2). Sumarizando, a análise do repertório comportamental de Acromyrmex subterraneus brunneus mostra uma clara divisão de trabalho entre as castas etárias e físicas. Considerando a casta física, operárias menores (largura cefálica: 0,7-1,1 mm) participam em 53,75 % (7254) das observações, em que as operárias médias (largura cefálica: 1,2 a 1,6 mm) e operárias grandes (largura cefálica: 1,7 a 2,0 mm) desempenham 29,16 % (3935) e 17,09 % (2307) dos atos comportamentais registrados, respectivamente (Tabela 1). Existiu uma interação entre as categorias de tamanho e comportamental (ANOVA, F= 43,5399, g.l.= 10, p <0,05), indicando que operárias de diferentes tamanhos desempenham diferentes tarefas. Em Acromyrmex volcanus e Acromyrmex octospinosus , a divisão de trabalho está baseada em uma distribuição bimodal do tamanho da população na colônia, com operárias pequenas permanecendo dentro do ninho cuidando do jardim de fungo e prole, enquanto as maiores deixam o ninho para forragear (Wetterer 1999). Acromyrmex subterraneus brunneus apresenta um aloetismo similar ao registrado para Acromyrmex volcanus e Acromyrmex octospinosus . Andrade (2002) registrou que operárias muito pequena e pequena (largura cefálica: 0,7-1,0) contam com mais de 50 % da população, com a população restante pertencente aos tamanhos médio (largura cefálica: 1,1-1,5 mm) e grande (largura cefálica: 1,6-2,1 mm). A respeito do aloetismo desta espécie, a especialização de alguns atos comportamentais em relação ao tamanho do corpo é observado durante o cultivo do fungo simbionte, ou seja, operárias de tamanho médio e grande lambem as folhas, seguram fragmentos foliares na superfície do jardim de fungo, repicam as folhas e posteriormente mordem ou pregueiam as bordas dos fragmentos foliares. As operárias muito pequenas e pequenas são responsáveis para a incorporação dos fragmentos foliares no jardim de fungo e subseqüentemente deposição de tufos de hifas nos fragmentos recém incorporados (Andrade 2002). Entretanto, foi observado que as operárias pequenas lambem (41,6 %), mastigam e pregueiam fragmentos foliares (52% dos atos comportamentais observados) mais ativamente, contrariando o estudo de Andrade (2002). Esse estudo demonstra a sobreposição de tarefas quando consideramos a morfologia e idade das operárias, comprovando a existência de subcastas físicas e temporal.

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Figura 1. Freqüência relativa (%) dos atos comportamentais realizados pelas operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus em 2 colônias de laboratório, durante 19 semanas de observação .

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Tabela 1. Etograma de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus .

Atos comportamentais Largura cefálica (mm) 2,0-1,7 1,6-1,2 1,1-0,7 Cuidado e Manutenção do Jardim de fungo 1 Lamber o jardim de fungo 268*(9,9) 440 (16,2) 2003 (73,9) 2 Reconstruir / rearranjar fragmentos de fungo 12 (13,3) 31 (34,4) 47 (52,2) no jardim de fungo Cultivo do Jardim de Fungo 3 Lamber fragmento foliar 276 (21,7) 468 (36,8) 529 (41,6) 4 Segurar fragmento foliar na superfície do 14 (28,6) 28 (57,1) 7 (14,3) fungo 5 Repicar o fragmento foliar 39 (25,8) 79 (52,3) 33 (21,9) 6 Morder ou Preguear fragmentos foliares 89 (12,9) 242 (35,1) 359 (52,0) repicados 7 Incorporar fragmentos foliares mordidos 20 (6,0) 70 (20,8) 246 (73,2) /repicados 8 Lamber superfície recém incorporada 7 (5,0) 29 (20,9) 103 (74,1) 9 Depositar fluido fecal na superfície recém 2 (4,4) 20 (44,4) 23 (51,1) incorporada 10 Depositar tufos de hifas no substrato 0 (0,00) 0 (0,00) 157 (100,0) Cuidado e Limpeza da Prole 11 Lamber/ limpeza da larva 32 (6,4) 80 (15,9) 391 (77,7) 12 Lamber pupa 10 (4,8) 30 (14,5) 167 (80,7) 13 Transporte de ovos 0 (0,0) 0 (0,0) 11 (100,0) 14 Transporte de larvas 17 (14,4) 26 (22,0) 75 (63,6) 15 Transporte de pupas 15 (15,2) 35 (35,4) 49 (49,5) 16 Depositar tufos de hifas nas larvas 0 (0,0) 11 (8,1) 125 (91,9) 17 Depositar tufos de hifas nas pupas 0 (0,0) 0 (0,0) 85 (100,0) 18 Auxílio durante a emergencia do adulto 3 (10,0) 11 (36,7) 16 (53,3) 19 Alimentar larvas 11 (5,0) 42 (19,2) 166 (75,8) 35

20 Mastigar/Manipular tufos de hifas ou 62 (14,9) 91 (21,9) 263 (63,2) estafilos Transporte de Alimento 21 Transporte de tufos de hifas e estáfilos 13 (3,3) 65 (16,7) 312 (80,0) Limpeza das operárias 22 Limpeza Mútua 27 (11,7) 50 (21,6) 154 (66,7) 23 Auto Limpeza 711 (21,9) 987 (30,3) 1556 (47,8) Atos no exterior do ninho 24 Explorar arena de forragem 115 (35,1) 149 (45,4) 64 (19,5) 25 Presença na arena de forragem 118 (37,7) 154 (49,2) 41 (13,1) 26 Lamber as folhas na arena de forragem 241 (29,8) 411 (50,7) 158 (19,5) 27 Corte da folha 50 (29,6) 116 (68,6) 3 (1,8) 28 Carregar fragmentos foliares 59 (31,9) 123 (66,5) 3 (1,6) 29 Tarefas na câmara de lixo 96 (27,4) 147 (41,9) 108 (30,8) Total 2307 (17,1) 3935 (29,2) 7254 (53,7) * Número absoluto para as 2 colônias, para um total de 19 semanas. Freqüência absoluta e relativa (%) em parênteses.

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Fig. 2. Atos comportamentais de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus , nas colônias de laboratório. Limpeza das operárias: Limpeza mútua (A), Auto limpeza (B e C), Cuidado e Manutenção do Jardim de fungo: Lamber o jardim de fungo (D) e Reconstruir / rearranjar fragmentos de fungo no jardim de fungo (E).

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Fig. 3. Atos comportamentais de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus , nas colônias de laboratório. Cuidado e limpeza da prole : Lamber/ limpeza da larva (A), Transporte de larvas (B), Mastigar/Manipular tufos de hifas ou estáfilas (C), Lamber pupa (D), Alimentar larvas (A e E) e Transporte de pupas (F). 38

Fig. 4. Atos comportamentais de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus , nas colônias de laboratório. Cultivo do Jardim de Fungo: Lamber fragmento foliar (A, B e D), Segurar fragmento foliar na superfície do fungo (A), Repicar o fragmento foliar (C). 39

Fig. 5. Atos comportamentais de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus , nas colônias de laboratório. Cultivo do Jardim de Fungo: Morder ou preguear fragmentos foliares repicados (A, B e C), Incorporar fragmentos foliares mordidos/repicados (D) e Lamber superfície recém incorporada (E).

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Fig. 6. Atos comportamentais de operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus , nas colônias de laboratório. Atos no exterior do ninho: Corte da folha (A e B), Carregar fragmentos foliares (C e D) e Tarefas na câmara de lixo (E).

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Fig. 2. Função da distribuição de sobrevivência das operárias pequenas (linha azul, a e b), média (linha vermelha, b) e grande (linha vermelha, a) para as duas colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus .

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Capítulo II

OVIPOSIÇÃO DAS OPERÁRIAS NA FORMIGA CORTADEIRA, Acromyrmex subterraneus brunneus (FORMICIDAE, ATTINI)

Resumo Nós estudamos o processo de produção da prole em colônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus , e particularmente avaliamos o desenvolvimento ovariano das operárias em função de sua idade. Para tanto, subcolônias foram montadas e avaliadas em diferentes períodos de isolamento do convívio com a rainha (2, 4 e 6 meses), além de grupos etários foram individualmente marcados. As subcolônias foram avaliadas de acordo com a prole produzida e ovários contendo ovócitos ou não. As avaliações revelaram a oviposição e desenvolvimento da prole de machos proveniente das operárias. Em 2 meses, na ausência da rainha, encontraram-se ovos e larvas, sendo os ovos em maior proporção que as larvas. Após 4 meses, a proporção de ovos reduziu enquanto a de larvas aumentou, e uma pupa foi encontrada em uma subcôlonia. Aos 6 meses, além de aumentar a proporção de larvas, foram encontrados 1 pupa e um adulto de macho. A dissecção das operárias revelou indivíduos com ovários contendo ovócitos durante os períodos de avaliação. Apenas uma parcela do grupo de operárias médias e grandes, 23,3 %, 20,9% e 37,5% da população de cada período de avaliação em subcolônias sem rainha, apresentava ovócitos desenvolvidos no ovário. O mesmo foi observado nas colônias com rainha, com 17,6%, 19,6% e 7,8% do grupo de operárias dissecadas. Em relação à idade das operárias, observamos, através da dissecção, que a maior porcentagem de indivíduos com ovaríolos contendo ovócitos ocorreu aos 45 dias de vida (6 semanas) até os 90 dias (12 semanas). Estes resultados provavelmente estão associados à dinâmica da reprodução das operárias e a postura de ovos reprodutivos e tróficos em colônias com e sem rainha, nas quais os ovos terão funções distintas em cada situação.

Palavras chave: formiga cortadeira, colônias sem rainha, conflito reprodutivo, oviposição da operária, reprodução da operária.

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1 Introdução Na maioria dos Hymenoptera eusociais, sabe-se que para as formigas cortadeiras, a rainha é a única responsável pela oviposição de ovos reprodutivos, originando fêmeas, ou ovos não fertilizados, originando machos. No entanto, na fundação da colônia, a rainha é capaz de produzir dois tipos de ovos: ovos de alimentação ou tróficos, sendo maiores e flácidos, e ovos reprodutivos ou normais, menores e rígidos (Autuori, 1940; Bazire- Benazet, 1957), embora para Acromyrmex , não foi demonstrado que as rainhas podem colocar ovos tróficos. O ovo trófico é consumido pela rainha, ou pode ser fornecido para as larvas, enquanto que os ovos reprodutivos não são comidos (ingeridos) por ela nem pelas larvas. Se, como ocasionalmente acontece, os ovos de alimentação não forem ingeridos, eles permanecem abandonados sobre o jardim de fungo e são provavelmente colonizados pelo fungo simbionte (Bazire-Benazet, 1957). Os ovos de alimentação não são apenas produzidos pelas rainhas jovens, mas também por operárias. Bazire-Benazet (1970) descreve a postura de ovos tróficos pelas operárias médias e jovens de Atta laevigata (comprimento do corpo 4 a 8 mm). Estas operárias permanecem próximas a rainha e se deslocam com ela pelo jardim de fungo, ofertando seus ovos tróficos a rainha ou, provavelmente, às larvas. Mas no gênero Acromyrmex , as operárias além de serem capazes de produzir ovos de alimentação, também produzem ovos reprodutivos, que dão origem aos machos. Weber (1972) verificou que operárias mínimas e máximas de A. lobicornis produzem ovos dentro de um período de dois meses de isolamento da rainha. As operárias são capazes de reprodução em Acromyrmex echinatior , Acromyrmex octospinosus (Dijkstra et al. , 2005; Febvay & Ogier, 1984), Acromyrmex rugosus rugosus , Acromyrmex lobicornis , e Acromyrmex subterraneus brunneus (Fowler, 1978; Weber, 1972; Camargo et al., 2005). Além disso, os filhos das operárias apresentam uma maior variação fenotípica quando comparada à prole de colônias com rainha, já notificado em Acromyrmex rugosus rugosus , Acromyrmex subterraneus brunneus , Acromyrmex echinatior por Fowler (1978), Camargo et al. (2005) e Djikstra & Boomsma (2007), respectivamente. Recentemente, Dijkstra & Boomsma (2006), verificaram que operárias de Atta sexdens , Atta cephalotes e Atta colombica não são completamente estéreis, pois são capazes 44 de produzir machos sem a presença da rainha, sugerindo sua participação ativa em uma tarefa adicional (reprodução). Esta hipótese é altamente plausível se considerarmos que a taxa de parentesco com seus filhos é mais alta que com seus irmãos (filhos da rainha). Os autores argumentaram que a fertilidade das operárias de Atta é baixa quando comparado ao gênero Acromyrmex , onde as operárias rotineiramente produzem machos após a perda da rainha. Porém é desconhecido se todas as espécies dos gêneros Atta e Acromyrmex spp., seriam capazes de produzir machos na ausência da rainha. O objetivo do presente estudo foi determinar a freqüência de operárias com ovários contendo ovócitos em subcolônias com e sem rainha, bem como a produção de prole em diferentes fases de isolamento das subcolônias.

2 Material e métodos 2.1 Colônias de estudo Este estudo foi realizado sob condições laboratoriais em 5 colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus com quatro anos de idade, coletadas na cidade de Piracicaba, São Paulo. As colônias foram acondicionadas individualmente em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 oC ± 2, com uma umidade relativa de 70% ± 20. As colônias foram abastecidas diariamente com folhas de Ligustrum spp. e Acalypha spp., durante a execução dos experimentos.

2.2 Preparação das subcolônias A partir das cinco colônias, foram montadas 15 subcolônias com 200 operárias cada, sendo 120 operárias pequenas (largura cefálica 0,7-1,1 mm) e 80 operárias médias e grandes (largura cefálica acima de 1,2 mm), e uma porção de fungo simbionte (3,91 ± 0,71 g). A massa fúngica foi examinada em microscópio esteroscópico para retirada da prole (ovo, larva e pupa). Estas foram acondicionadas em recipientes cilíndricos de acrílico (altura: 10,5 cm e diâmetro: 10,5 cm) com 0,5 cm de gesso no fundo, interligadas a arena de forrageio e a uma câmara de lixo nas extremidades opostas, ambos eram recipientes cilíndricos de acrílico (altura: 6 cm e diâmetro: 9,5 cm). As subcolônias foram montadas 14 45 dias antes de iniciar o experimento, sendo supridas diariamente com folhas de Ligustrum spp. e Acalypha spp.

2.3 Influência da rainha na postura das operárias As 15 subcolônias foram separadas em grupos de cinco, sendo que cada grupo foi avaliado em diferentes períodos de tempo após o isolamento da rainha. A primeira avaliação ocorreu aos dois meses de isolamento, a segunda aos quatro meses e a última aos seis. Após o período de isolamento as operárias foram separadas, contadas e dissecadas na subcolônias sem rainha e o mesmo número foi retirado ao acaso das colônias com rainha. Em cada avaliação, contabilizou-se o número de operárias médias e grandes, e a prole existente. Desta forma, foi possível avaliar a dinâmica de oviposição das operárias, bem como o desenvolvimento dos machos. A cada avaliação, as operárias foram mortas e armazenadas a aproximadamente - 20 °C para posterior dissecação. De acordo com Dijkstra et al. (2005), o congelamento não tem efeitos sobre os ovaríolos e ovócitos. Para a dissecação, utilizou-se uma solução salina para insetos (SSI; 7,5 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,278 g CaCl 2 2H 2O, em 1 L de água destilada), na qual o gáster permanece submerso ventralmente, possibilitando a retirada dos esternitos com tesouras e pinças entomológicas. O ovário foi retirado e acomodado em uma lâmina de microscopia com uma gota de SSI, e subseqüentemente examinado e fotografado sob microscópio esteroscópico. Posteriormente, categorizou-se em ovários com ou sem ovócitos.

2.4 Influência da idade das operárias 2.4.1 Marcação de operárias A marcação das operárias foi realizada com canetas de marcação permanente (Marca EDDING 751), em diversas cores, devido a sua ótima aderência, secagem rápida e boa visibilidade. As formigas foram recolhidas nas colônias com auxílio de pinças. Com um pincel de ponta fina, o pronoto foi marcado com um pequeno ponto de tinta. Após a marcação, as operárias permaneceram por 2 horas acondicionadas em copos plásticos com as bordas untadas com Fluon (resina de fluoretileno), produto que impossibilita a fuga das formigas, e em seguida, devolvidas em suas respectivas colônias. 46

2.4.2 Obtenção das operárias jovens Cento e setenta e cinco pupas (largura cefálica acima de 1,2 mm) foram retiradas de cinco colônias adultas e subseqüentemente isoladas em um recipiente (contendo 1 cm de gesso no fundo) para aguardar a emergência dos adultos, possibilitando registrar o início de sua vida adulta. Adicionalmente, 100 operárias adultas de todas classes de tamanho (largura cefálica 0,7 a 2,0 mm) foram retiradas de cada uma das cinco colônias de origem, marcadas e inseridas junto às pupas, para prover o cuidado durante o desenvolvimento e auxiliar na emergência do adulto. Fungo simbionte foi oferecido para fornecer alimento às operárias da colônia. Estas pupas permaneceram isoladas por um período de 20 dias, pois esta espécie apresenta uma fase pupal de 20 a 23 dias (Andrade, 2002). As 50 operárias recém emergidas foram marcadas no pronoto, e introduzidas em cada subcolônias.

2.4.3 Avaliação dos ovários As operárias recém-emergidas foram introduzidas nas cinco subcolônias, sendo estas sem rainha. As operárias foram marcadas de acordo coma sua data de emergncia, utilizando-se da permutação de cores para designar a real idade das operárias. Os ovários foram avaliados por meio de dissecação das operárias no 1º, 15º, 30º, 45º, 60º, 75º e 90º dias de vida. Posteriormente, categorizou-se em ovários com ou sem ovócitos (Figura 1).

3 Resultados As avaliações nos períodos de 2, 4 e 6 meses após o isolamento, evidenciaram a oviposição e desenvolvimento da prole de machos proveniente de operárias, mantidas em subcolônias sem prole (ovos, larvas e pupas) e sem rainha (Tabela 1). A dissecação das operárias revelou indivíduos com ovários contendo ovócitos durante os períodos de avaliação (Tabela 2). Para cada período de avaliação, registrou-se, respectivamente, que apenas 23.3%, 20.9%, e 37.5% da população de operárias médias e grandes (largura cefálica acima de 1,2 mm) apresentavam ovócitos em seus ovaríolos (Tabela 2). O mesmo foi observado para as colônias com rainha, com 17,6%, 19,6% e 7,8%, respectivamente do grupo de operárias dissecadas, apresentando ovaríolos desenvolvidos e com ovócitos (Tabela 3). A média do número de operárias com ovócitos e 47 sem ovócitos não diferiu estatisticamente aos 2 meses (P=0,1947, d.f.=1, Student’s t Test) e aos 4 meses (P=0,5198, d.f.=1, Student’s t Test), diferindo apenas aos 6 meses (P=0,0071, d.f.=1, Student’s t Test). Este resultado conduz a conjecturar que deva existir um grupo de operárias responsáveis pela oviposição, dentro da subcasta média e grande, ou ainda que um grupo de operárias dentro da população mantém durante algum período de tempo sua capacidade reprodutiva, que pode ser ou não ativada em função de algum distúrbio na organização da colônia. O destino dos ovos reprodutivos seria a produção de machos ou alimentação (Dijkstra & Boomsma, 2006). Foi observado que a maior porcentagem de indivíduos dissecados contendo ovócitos dentre os grupos etários ocorreu dos 45 dias (6 semanas) até aos 90 dias de vida (12 semanas) (Fig. 2). Quando o número de indivíduos com e sem ovócitos são analisados pelo teste t de Student, uma diferença estatística é encontrada no período de 15 dias (t=3,85, g.l.= 4, p= 0,0185, α=0,05), enquanto aos 0 dias (t=1,22, g.l.= 4, p= 0,2909, α=0,05), 30 dias (t=1,34, g.l.= 4, p= 0,2500, α=0,05), 45 dias (t=0,70, g.l.= 4, p= 0, 5236, α=0,05), 60 dias (t=1,34, g.l.= 4, p= 0,2500, α=0,05), 75 dias (t=1,48, g.l.= 4, p= 0,2119, α=0,05), e 90 dias (t=2,53, g.l.= 4, p= 0,0645, α=0,05) nenhuma diferença foi encontrada. Na fase inicial da vida (90 primeiros dias), os ovos produzidos por elas podem ser utilizados para a alimentação das larvas.

4 Discussão Na tabela 1, verifica-se que após 2 meses na ausência da rainha, encontrou-se ovos e larvas, sendo os ovos em maior proporção que as larvas. Os ovos estavam agrupados e cobertos por micélios do fungo simbionte (Figura 2 – A), enquanto algumas larvas estavam cobertas por micélios e outras não (Figura 2 – B). A deposição de hifas sobre a prole é notório no gênero Acromyrmex spp. como descrito por Weber (1972), devido as operárias aplicarem ativamente tufos de hifas sobre as larvas (Lopes et al. 2005; Camargo et al. 2006 A) e nas pupas (Camargo et al. 2006 B). Após 4 meses, a proporção de ovos reduziu enquanto a de larvas aumentou, e uma pupa foi encontrada em uma subcôlonia (Tabela 1). A pupa estava coberta com micélio e apresentava asas e genitália de macho (Figura 2 – C). Na avaliação de 6 meses, além de haver um aumento na proporção de larvas, foram encontrados 1 pupa e um macho adulto 48

(Figura 2 – D). O macho tinha uma morfologia normal, incluindo genitália, ocelos, asas e proporções corporais, quando comparados com dados de machos provenientes de colônias com rainhas (Camargo et al. 2005). Em colônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus e Acromyrmex rugosus , alguns machos apresentam pequenas alterações de tamanho embora aparentem estar aptos a acasalar (Camargo et al . 2005; Fowler, 1978). No entanto, em colônias sem rainha de Atta colombica , as operárias produzem machos de tamanho reduzido, incapazes de obter sucesso no acasalamento, devido ao pequeno tamanho da genitália e asas rudimentares (Dijkstra & Boomsma, 2006). Em colônias com rainha, formas sexuais diminutas também foram encontradas, como microgine em Atta cephalotes por Jutsum & Cherrett (1977) e machos diminutos em Atta sexdens rubropilosa por Bueno et al. (2002). A deposição de larvas no lixo também foi observado durante o decorrer dos 6 meses, em algumas subcolônias. Como observado, mas não quantificado, as larvas estavam debilitadas e provavelmente mortas (Figura 4, A e B). Dijkstra & Boomsma (2006) afirmam que colônias órfãs de Acromyrmex em laboratório podem falhar para produzir filhos de operárias se o jardim de fungo for extremamente pequeno, resultando na inanição das larvas nos últimos ínstares. De acordo com os autores, as larvas não são utilizadas para a alimentação pelas operárias, mas são depositadas na pilha de lixo fora do ninho. No presente estudo, não se quantificou a deposição exata de larvas no lixo, mas verificou-se que poucos imaturos chegaram à vida adulta (Tabela 1). Provavelmente deva existir uma correlação entre a disponibilidade de alimento na colônia (estáfilas do fungo simbionte) e o número de operárias para realizar o cuidado com a prole, pois uma redução no número de operárias pode comprometer o desenvolvimento e a vida das larvas recém-eclodidas, assim como o cuidado com o jardim de fungo. Neste estudo, a não reposição de operárias ocasionou em uma redução no contingente operário e desta forma, um comprometimento do cuidado com a prole gerada e com o jardim de fungo. A não reposição das operárias permitiu que as subcolônias, mantivesse um número exato de operárias como se fosse uma situação de perda natural da rainha. Embora não tenha sido observado a alimentação das larvas com ovos tróficos ou reprodutivos nas situações com e sem rainha (Camargo et al. 2007; Camargo et al. 2006 B), este comportamento foi observado em colônias iniciais de Atta sexdens rubropilosa durante 49 o período claustral da rainha, no qual “ovos de alimentação” (tróficos) são oferecidos às larvas (Autuori, 1940; Autuori, 1942). Também há o registro da utilização de ovos tróficos na alimentação de larvas para colônias adultas desta espécie (Schneider, 2003). Entretanto, a maioria das operárias de Atta possui um ovário rudimentar que não produz ovos, e apenas poucas são capazes de pôr ovos tróficos para o consumo da rainha (Dijkstra et al. 2005). De acordo com os autores, estes ovos são grandes, flácidos e sem vitelo quando comparados com os ovos colocados pela rainha. Em contraposição, os ovos colocados pelas operárias de Acromyrmex são similares aos ovos da rainha, mas com uma reduzida quantidade de vitelo, aparentando ser uma importante fonte alimentar para as larvas em Acromyrmex (especialmente em Ac. echinatior ), mas não em Atta (Dijkstra et al. 2005). A dieta das larvas de Acromyrmex spp. é uma questão em aberto que necessita de estudos direcionados que evidenciem a contribuição destes ovos tróficos ou reprodutivos no desenvolvimento larval. Sabe-se que os ovos tróficos são ricos em proteína concentrada, as quais são especialmente necessárias para o crescimento larval (Wheeler 1994). Andrade (2002) observou que nem todos os ovos derivados da rainha são viáveis e que nem todas as larvas eclodidas se desenvolvem em pequenos potes contendo fungo e operárias pequenas, porém isoladas da colônia de origem, nas subespécies de Acromyrmex subterraneus . A autora também observou que as operárias isoladas alimentam-se tanto de ovos quanto de larvas. Cabe inferir, que a rainha de Acromyrmex subterraneus põe ovos viáveis e não viáveis, os quais provavelmente são utilizados para a alimentação das larvas e operárias. Adiciona-se ainda, que na ausência de ovos tróficos, há comprometimento do desenvolvimento larval. Em outra Myrmicinae, Acanthomyrmex ferox , com diminutas colônias, a rainha põe ovos reprodutivos e tróficos contribuindo com 17 % dos ovos tróficos para a colônia, enquanto as operárias maiores e menores põem apenas ovos tróficos na presença da rainha, contribuindo com 42 e 41 % dos ovos tróficos, respectivamente (Gobin & Ito, 2000). Os autores argúem que os nutrientes são ingeridos e estocados no tecido gorduroso das operárias para posterior redistribuição via ovos tróficos e desta forma, otimizando a utilização de recursos na colônia. Um fato interessante, é que operárias maiores de Acromyrmex freqüentemente contem maior número de ovos tróficos do que as operárias menores, indicando que as 50 operárias maiores é a principal fonte de ovos tróficos (Dijkstra et al. 2005). Entretanto, no presente estudo, não foi realizado a dissecação das operárias pequenas (largura cefálica 0,7- 1,1 mm), embora estas operárias também devam ser estudadas. As operárias maiores de Acromyrmex subterraneus brunneus também participam de atividades relacionadas aos cuidados com a prole no início de sua vida (até 13 semanas), embora alguns indivíduos comecem as atividades no exterior do ninho a partir da 4 a semana (Camargo et al. 2007). No entanto, operárias pequenas (largura cefálica 0,7-1,1 mm), subcasta não estudada no presente trabalho, também possam contribuir para esta dieta. Se estas contribuem na produção de ovos de alimentação, tornam-se essenciais em espécies com distribuição bimodal de tamanho, tais como Acromyrmex octospinosus e Acromyrmex volcanus . Nestas espécies, as operárias mínimas (largura cefálica 0,8-0,9 mm) permanecem no interior do ninho, assistindo ao jardim de fungo e a prole, enquanto as operárias máximas relativamente monomórficas (largura cefálica 2,3-2,5 mm em Acromyrmex octospinosus ; 2,8-3,3 mm em Acromyrmex volcanus ) saem do ninho para forragear (Wetterer, 1999). Provavelmente, estas espécies também apresentam um polietismo etário como já relatado para este gênero, ( Acromyrmex versicolor por Julian & Fewell (2004) e Acromyrmex subterraneus brunneus por Camargo et al. (2007), em que as operárias de maior tamanho estão engajadas no cuidado com a prole, enquanto ainda jovens. A mistura das subcastas físicas e etárias no interior do ninho, promove a interação entre os grupos e a possível transferência de energia para as larvas, através da alimentação por meio do fungo simbionte (via estáfilas) e de ovos tróficos. De acordo com Perry & Roitberg (2006), duas possíveis funções adaptativas são atribuídas à postura de ovos tróficos: provisão a prole ou redução do canibalismo de irmãos. Ambas as funções são esperadas em contextos de ambientes contrastantes que a prole pode enfrentar. Em ambientes com alto risco de inanição, a provisão da prole é a função plausível, e com risco de inanição intermediário, a redução do canibalismo é mais provável (Perry & Roitberg, 2005). Assim, a postura de ovos tróficos assume um caráter adaptativo em ambientes com alto e baixo risco de inanição, assumindo diferentes funções em cada contexto. Em colônias com rainha, servirão para a alimentação dentro da colônia e em colônias sem rainha será permitido o seu desenvolvimento em machos.

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5 Referências Andrade, A.P.P. (2002) Biologia e taxonomia comparada das subespécies de Acromyrmex subterraneus Forel, 1893 (Hymenoptera, Formicidae) e contaminação das operárias por iscas tóxicas. Tese de Doutorado. Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 168 p. Autuori, M. (1940) Algumas observações sobre formigas cultivadoras de fungo (Hym. Formicidae). Revista de Entomologia , 11 (1-2), 215-226. Autuori, M. (1942) Contribuição para o conhecimento da saúva ( Atta spp. – Hymenoptera – Formicidae) II – o sauveiro inicial ( Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908). Arquivos do Instituto Biológico , 13, 67-86. Bazire-Benazet M. (1957) Sur la formation de l’oeuf alimentaire chez Atta sexdens rubropilosa, Forel, 1908 (Hym., Formicidae). Comptes Rendus de l’Académie des Sciences , 244, 1277-1280. Bazire-Benazet M. (1970) La ponte des ouvrières d’ Atta laevigata Fred. Smith 1858 (Hym. Form.). Comptes Rendus de l’Académie des Sciences , 270, 1614-1615. Bueno, O.C., Hebling, M.J.A., Schneider, M.O., Pagnocca, F.C., Bacci, M. (2002) Occurrence of winged forms of Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera: Formicidae) in laboratory colonies. Neotropical Entomology , 31, 469-473. Camargo, R.S., Forti, L.C., Andrade, A.P.P., Matos, C.A.O., Lopes, J.F.S. (2005) Morphometry of the sexuals forms of Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae) in queenright and queenless laboratory colonies. Journal of Applied Entomology , 129 (6), 347-351. Camargo, R.S., Lopes, J.F.S., Forti, L.C. (2006a). Behavioural responses of workers towards worker-produced male larvae and queen-produced worker larvae in Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae). Journal of Applied Entomology , 130(1), 56-60. Camargo, R.S., Forti, L.C., Lopes, J.F.S., Andrade, A.P.P. (2006b). Brood care and male behavior in queenless Acromyrmex subterraneus brunneus (Hymenoptera, Formicidae) colonies under laboratory conditions. Sociobiology , 48(3), 717-726. 52

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Tabela 1. Número médio da prole encontrada em 15 subcolônias de Acromyrmex subterraneus brunneus , durante os meses de isolamento da rainha. Freqüência relativa (%) em parênteses.

2 meses 4 meses 6 meses (5 subcolônias) (5 subcolônias) (5 subcolônias) Ovos 39 (81.6) 4.4 (14.3) 14 (28.1) Larvas 8.8 (18.4) 26.2 (85.1) 35.4 (71.1) Pupas 0 (0.0) 0.2 (0.6) 0.2 (0.4) Adultos 0 (0.0) 0 (0.0) 0.2 (0.4) Total 47.8 (100.0) 30.8 (100.0) 49.8 (100.0)

Tabela 2. Número médio de operárias dissecadas das 15 subcolônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus , durante os meses de isolamento. Freqüência relativa (%) em parênteses.

2 meses 4 meses 6 meses (5 subcolônias) (5 subcolônias) (5 subcolônias) Com ovócitos 13.4 (26.3) 6.4 (20.9) 4.8 (37.5) Sem ovócitos 29.6 (58.0) 23.80 (77.8) 7.6 (59.4) Perdas durante a dissecção 8 (15.7) 0.40 (1.3) 0.4 (3.1) Total 51 (100.0) 30.6 (100.0) 12.8 (100.0)

Tabela 3. Número médio de operárias dissecadas nas 5 colônias com rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus , durante os meses de isolamento. Freqüência relativa (%) em parênteses.

2 meses 4 meses 6 meses Com ovócitos 9 (17.6) 6 (19.6) 1 (7.8) Sem ovócitos 32.8 (64.3) 24.6 (80.4) 11.8 (92.2) Perdas durante a dissecção 9.2 (18.0) 0 (0.0) 0 (0.0) Total 51 (100.0) 30.6 (100.0) 12.8 (100.0)

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Figura 1. Ovários das operárias médias e grandes de Acromyrmex subterraneus brunneus em colônias A e B – ovaríolos sem a presença de ovócitos; C e D – ovaríolos om ovócitos.

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Figura 2. Estágios de desenvolvimento dos machos de Acromyrmex subterraneus brunneus em subcolônias sem rainha, A) ovos envoltos por micélios; B) larva; C) Pupa; D) adulto recém emergido.

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100 90 80 70

60 Com ovos 50 Sem ovos 40 Morte 30

Freqüenciade Operárias (%) 20 10 0 0 15 30 45 60 75 90 Dias

Figura 1 Porcentagem de operárias dissecadas com e sem ovos em relação a sua idade em 5 subcolônias de Acromyrmex subterraneus brunneus .

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Figura 4. Larvas depositadas pelas operárias na câmara de lixo nas subolônias de Acromyrmex subterraneus brunneus . A) larva morta, com visível redução corporal devido a inanição; B) larva recém depositada na câmara de lixo. 59

Capítulo III

RESPOSTAS COMPORTAMENTAIS DAS OPERÁRIAS EM RELAÇÃO ÀS LARVAS DE MACHOS PRODUZIDAS PELAS OPERÁRIAS E LARVAS DE OPERÁRIAS PRODUZIDAS PELA RAINHA EM Acromyrmex subterraneus brunneus FOREL, 1911 (HYM., FORMICIDAE)

Resumo As operárias de formigas cortadeiras cuidam intensamente das larvas usando um elaborado repertório comportamental para satisfazer as necessidades da prole. Com intuito de estudar a habilidade de discriminação das formigas cortadeiras Acromyrmex subterraneus brunneus , nós comparamos as respostas comportamentais das operárias em relação às larvas de machos produzidas pelas operárias e larvas de operárias produzidas pela rainha, registrando e analisando os seguintes atos comportamentais: lamber o corpo das larvas, transportar larvas, alimentar larvas com hifas, (lamber) raspar as peças bucais das larvas, ingerir fluido fecal excretado pela larva e inserir tufos de hifas no corpo da larva. Nós verificamos que as operárias comportam-se diferentemente de acordo com a origem da larva, ou seja, ao lamber o corpo das larvas e inserir tufos de hifas no corpo da larva. As diferenças observadas indicam a habilidade das operárias em discriminar entre as larvas, provavelmente devido as suas diferenças quantos às necessidades individuais.

Palavras Chave : Acromyrmex subterraneus brunneus ; formigas cortadeiras, reprodução de operárias.

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1 Introdução A forte coesão existente na relação entre as operárias e os imaturos em colônias de formigas é amplamente conhecida e estudada, ocorrendo desde espécies com organizações sociais mais simples, como Nothomyrmecia e Amblyopone , até as que apresentam uma organização mais elaborada (Hölldobler & Wilson, 1990). O cuidado parental é um dos fatores chave da vida social das colônias, pois as operárias são capazes de acessar as necessidades da prole, tais como limpeza e alimentação. Na determinação haplodiplóide do sexo, ovos fertilizados (diplóides) se desenvolvem e dão origem às fêmeas (operárias ou rainha), enquanto os não fertilizados (haplóides) aos machos. Desta forma, em colônias monogínicas e monandricas, as operárias irmãs apresentam um maior parentesco entre si (r=75%), conseqüentemente, compartilhando 50% de seus genes pela descendência comum com seus próprios filhos, e um menor parentesco com os filhos de outras operárias (37,5% se todas as operárias forem irmãs completas, por exemplo, prole de uma rainha fertilizada uma única vez). Os filhos da rainha, ou seja, machos que são os irmãos das operárias, apresentam um parentesco comparativamente distante entre si (r=25%) (Hamilton, 1964 a, b). Entretanto, quando a rainha copula múltiplas vezes (poliandria), o conflito sobre a produção de machos entre a rainha e as operárias é reduzido em colônias em que a rainha está presente (Ratnieks, 1988), e os machos produzidos pelas operárias é observado apenas em colônias sem rainha. Logo, cada operária deveria favorecer a sua própria reprodução do que a reprodução de outras operárias, o que resultaria em um comportamento de nepotismo durante o cuidado com as larvas. A reprodução das operárias é encontrada em colônias órfãs de algumas espécies de Acromyrmex spp., como na ausência ou morte das rainhas, as operárias realizam postura de ovos haplóides (Fowler, 1978, 1982, Febvay & Ogier, 1984). Embora já se saiba que as operárias não realizem postura em colônia com rainha (Villensen & Boosmam, 1999), postula-se que a auto-restrição e a esterilidade das operárias de formigas cortadeiras sejam mantidas através da rainha ou por um mecanismo de policiamento entre as operárias (Dijkstra et al . 2005). O policiamento das operárias, em abelhas européias ocorre através da 61 destruição dos ovos postos pelas operárias (Ratnieks & Visscher, 1989), ou pela agressão em relação às operárias reprodutivas (Visscher & Dukas, 1995). Ratnieks & Vischer (1989) demonstraram que imediatamente após a eclosão larval, as operárias não são capazes de discriminar entre as larvas produzidas pela rainha e daquelas produzidas pelas operárias: 47 das 57 larvas derivadas da rainha (82%) e 24 das 33 larvas derivadas das operárias (73%) permaneceram 24 horas na colônia, após a transferência de larvas de 1 dia de idade de seu favo natal para outra colônia. O oposto é observado quando os ovos de diferentes origens são transferidos. Este comportamento foi observado na formiga carpinteira, Camponotus floridanus , onde as operárias foram capazes de discriminar entre ovos produzidos por operárias dos produzidos pela rainha, em um curto período de tempo (Endler et al . 2004). Entretanto, as formigas cultivadoras de fungo diferem de outros formicídeos, pois a sua prole está acomodada no jardim de fungo e estas estão normalmente cobertas com micélio fúngico (Weber, 1972), um fato que provavelmente dificulta a discriminação. O intuito do presente estudo foi investigar a resposta comportamental das operárias durante o cuidado parental e determinar se o cuidado diferencial ocorre em relação às larvas de macho derivadas das operárias e as larvas de operárias derivadas da rainha para Acromyrmex subterraneus brunneus .

2 Material e Métodos

2.1 Colônias de Estudo Este estudo foi realizado em cinco colônias de 2 anos de idade sob condições laboratoriais de Acromyrmex subterraneus brunneus , coletadas na cidade de Piracicaba, São Paulo, transportadas e mantidas no Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil. As colônias foram acondicionadas em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 °C± 2, com uma umidade relativa de 70%± 20. As colônias foram alimentadas com Ligustrum spp. e Acalypha spp., durante a execução do experimento. 62

As colônias com aproximadamente 6,0 litros de fungo foram divididas em 2 partes iguais, no qual uma permaneceu com a rainha e a outra sem a rainha. Após 4 meses, as colônias sem rainha já continham larvas de machos de diversos tamanhos.

2.2 Ingestão do alimento tingido A transparência do corpo das larvas permite a visualização do alimento ingerido. Neste estudo, o alimento tingido consistiu de hifas do fungo simbionte previamente imerso numa solução de água destilada e 2% (p/v) de corante alimentício (Lopes et al. 2005). As larvas foram retiradas da colônia com o auxílio de pinças e, sob microscópio estereoscópico, foram alimentadas manualmente através do oferecimento da solução corada em pontas de agulhas. Após 24 horas de ingestão do corante, todas as larvas estavam marcadas e prontas para iniciar o experimento de discriminação.

As larvas de machos foram tingidas de vermelho e as larvas de operárias com azul, com grupos de 10 larvas isoladas (em jejum) por 24 horas. Elas foram alocadas em placas de Petri, contendo papel filtro úmido com uma pequena porção de fungo (aproximadamente 0,4 g).

2.3 Cuidado com as larvas

Vinte e quatro horas após a ingestão do corante, 10 operárias da menor classe de tamanho (largura cefálica 0,7 – 1,1 mm), pertencentes às colônias de origem das larvas foram transferidas para as placas e observadas sob microscópio esteroscópico. Operárias mínimas foram escolhidas devido a executarem tarefas relacionadas com o cuidado com a prole (Wilson, 1980) e também a sua habilidade em discriminar eficientemente entre a prole da rainha e a estranha (Souza et al. , 2005). Em cada colônia, 3 replicatas foram feitas com operárias derivadas de colônia com rainha e 3 replicatas com operárias derivadas de colônia sem rainha. Em cada ensaio, 5 larvas de machos e 5 de operárias foram usadas, resultando em 10 larvas por placa. Três observações seqüenciais durando 15 minutos cada, separadas por 30 minutos de intervalo de descanso, foram feitas, totalizando 45 minutos de observação/placa de Petri.

63

2.4 Analise estatística O cuidado com as larvas de machos e operárias foi avaliado através da determinação das freqüências dos atos comportamentais relacionados ao cuidado parental, fundamentado em um repertório comportamental pré-estabelecido (Lopes et al. 2005). O repertório comportamental está brevemente descrito na tabela 1. A freqüência do cuidado com a prole (larvas de macho versus operárias) foi comparada usando um teste para amostras pareadas, ou seja, Wilcoxon signed rank test (P=0,05). A média do comprimento do corpo foi submetido ao teste de Chi-Quadrado (P=0,05) para comparação com as larvas de macho e operária.

3 Resultados Foi registrado que as larvas de machos foram significantemente mais lambidas que as larvas de fêmeas pelas operárias de colônias sem rainha, mas o mesmo não foi observado em operárias de colônias com rainha (P=0,12) (fig. 1). O transporte de larvas foi maior para as larvas de operárias do que as de macho, quando o transporte foi desempenhado pelas operárias provenientes de colônias com rainha (P=0,007). Não existiu diferença significativa na freqüência dos atos comportamentais: alimentar larvas com hifas, (lamber) raspar as peças bucais das larvas, ingerir fluido fecal excretado pela larva em colônias com rainha e sem rainha. Por outro lado, inserir tufos de hifas no corpo da larva foi observado em uma freqüência maior pelas operárias de colônias com rainha (P=0,04), enquanto em colônias sem rainha, não foi possível detectar diferenças na ocorrência destes atos comportamentais entre as larvas de macho e operária (P=0,69). O teste de Chi-Quadrado indicou que o tamanho das larvas de macho e operária não difere 2 significativamente ( χ (4;0,05) =0,198)(tabela 2).

4 Discussão As operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus desempenharam 6 atos comportamentais: lamber o corpo das larvas, transportar larvas, alimentar larvas com hifas, (lamber) raspar as peças bucais das larvas, ingerir fluido fecal excretado pela larva e inserir tufos de hifas no corpo da larva (tabela 1). 64

O ato comportamental mais freqüente foi lamber o corpo da larva de macho e operária. Este ato comportamental também foi observado ser de freqüente ocorrência no cuidado larvas em 3 outras espécies de Acromyrmex (Lopes et al. 2005). Os autores também sugerem que o comportamento pode atuar como uma forma de avaliar a necessidade nutricional das larvas, e também pode ter um importante papel na defesa contra microorganismo pela aplicação de compostos glandulares labiais e mandibulares, com propriedades antibióticas. De acordo com Weber (1972), as larvas são freqüentemente lambidas pelas operárias, pois a “saliva” é adicionada ao tegumento e capacita o crescimento fúngico sobre elas, embora agora existam relatos de que o fungo não cresce espontaneamente sobre as larvas (Lopes et al. 2005). Ainda permanece uma questão aberta à função das hifas do no tegumento das larvas, mas em ninhos de Acromyrmex spp. é comum observar um grande número de larvas e pupas com uma cobertura de micélio. Em relação ao fato das operárias lamberem mais as larvas de machos do que as operárias, pode ser o fato dos machos serem mais robustos e maiores do que as fêmeas, portanto uma maior área corporal para limpeza. Esta interpretação é improvável, pois as larvas não diferiram estatisticamente em tamanho (Tabela 2). Os atos comportamentais ingerir fluido fecal excretado pela larva e inserir tufos de hifas no corpo da larva foram mais freqüentemente observados do que transportar larvas, alimentar larvas com hifas e raspar as peças bucais das larvas. As prováveis funções dos atos comportamentais estão sumarizadas na tabela 1. Entretanto, alta freqüência destes 2 atos pode ser explicada pela sua importância na troca de substâncias químicas entre as operárias e larvas pela trofalaxia anal. A composição química do líquido proctodeal é uma mistura de açucares e aminoácidos, e provavelmente tem um valor nutricional às operárias na colônia (Schneider, 2003). O efeito das hifas sobre o tegumento larval é desconhecido, e torna-se difícil explicar ou até mesmo sugerir a causa deste comportamento. As larvas de Acromyrmex diferem de muitas formigas, pois estão alocadas no jardim de fungo e são normalmente cobertas com micélio do jardim de fungo (Weber, 1972), um fato que provavelmente dificulta a discriminação. Provavelmente, devido a existência de diferentes clones de fungos cultivados, os fungos por si mesmo poderiam produzir compostos que as formigas 65 usam como discriminadores (pistas). Mueller et al. (1998), isolaram 553 cultivares (linhagens) do jardim do fungo das attines mais basais. Um outro ponto a ser discutido são as pistas utilizadas no reconhecimento da prole. A análise química do fungo já revelou uma grande similaridade entre o perfil de hidrocarboneto do fungo e da prole da colônia, como verificado em Acromyrmex subterraneus subterraneus (Viana et al. 2001). Estes autores sugerem que o fungo adquire o odor colonial passivamente, entretanto pode ser possível que a prole adquira o odor colonial ao invés do fungo, e assim a assinatura química pode ser mais importante para operárias do que para os machos. O cuidado com a prole em formigas contrasta ao observado em vespas sociais e abelhas, pois a prole permanece em uma ambiente comunal e não em células individuais. A rainha põe os ovos em grupos e as operárias “babás” são capazes de reconhecer a prole e movimentá-las através do ninho de acordo com o seu desenvolvimento e variações no microclima do ninho (Sudd, 1982). Os ovos de C. floridanus que são produzidas pelas operárias e rainha podem ser discernidos por diferenças nos seus hidrocarbonetos. Endler et al. (2004) demonstraram que a transferência experimental dos hidrocarbonetos forneceu pistas para as operárias da origem dos ovos e são capazes de distinguir entre os ovos das operárias e da rainha. Nós observamos que as operárias exibiram um elaborado repertório comportamental durante o cuidado com a prole com as larvas de macho e operária, e registramos que as operárias comportam-se diferentemente de acordo a origem da larva, ou seja, lamber o corpo da larva, transportar as larvas e inserir hifas do fungo simbionte no corpo da larva. As diferenças indicam a habilidade das operárias para perceber e discriminar entre as larvas de macho e operária, e adicionalmente devido as suas diferenças nas necessidades individuais.

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Tabela 1. Descrição do repertório comportamental e prováveis funções dos atos comportamentais desempenhados pelas operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus no cuidado com as larvas. Atos comportamentais Descrição Provável Função Fonte Consiste em lamber todo o corpo da Limpeza e assepsia Lamber o corpo das larvas larva, Lopes et al. 2005 da larva especialmente a região oral e anal. Manejo das larvas de acordo com as Consiste em condições remover e microclimáticas transportar as larvas Transportar larvas (temperatura) e Bollazzi & Roces 2002 para outras resposta localizações do comportamental a jardim de fungo. perturbação do ninho. Consiste em alimentar a larva com hifas e estáfilas manipuladas Schneider 2003 ; Alimentar larvas com hifas Nutrição da larva (maceradas por Lopes et al . 2005 movimento mandibulares das operárias) Consiste no uso da Limpeza da larva e Raspar as peças bucais das mandíbula para a assepsia Lopes et al. 2005 larvas limpeza da região

oral da larva. Trocas de Consiste em ingerir substâncias através Ingerir fluido fecal excretado gotas de fluído fecal Schneider 2003; da trofalaxia larva- pela larva excretado pelas Lopes et al. 2005 operária. larvas.

Proteger as larvas Lopes et al. 2005 Consiste em contra parasitos ou Weber, 1972; Swartz, Inserir tufos de hifas no corpo depositar tufos de pode atuar como 1998; LaPolla et al. da larva hifas no tegumento camuflagem contra 2002 externo das larvas. predadores 67

Tabela 2. Tamanho médio (mm) e desvio padrão das larvas de macho e operária de Acromyrmex subterraneus brunneus .

Larvas

Macho Operária Colônias (N=30) (N=30) 1 3,34 ±0,42 3,48 ±0,52 2 3,90 ±0,68 3,59 ±0,69 3 4,14 ±0,79 3,70 ±0,85 4 3,92 ±0,78 3,36 ±0,39 5 3,43 ±0,43 2,60 ±0,60 68

Figura 1. Número médio de ocorrência dos atos comportamentais desempenhados pelas operárias de colônias com e sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus .

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4 Referências Bollazzi M, Roces F, 2002: Thermal preference for fungus culturing and brood location by workers of thatching grass-cutting ant Acromyrmex heyeri . Insect Soc 49, 153-157. Dijkstra MB, Nash DR, Boomsma JJ, 2005: Self-restraint and sterility in workers of Acromyrmex and Atta leafcutter ants. Insect Soc 52 , 67-76. Endler A, Liebig J, Schmitt T, Parker JE, Jones GR, Schreier P, Hölldobler B, 2004: Surface hydrocarbons of queen eggs regulate worker reproduction in a social insect. PNAS 101 (9), 2945-2950. Febvay G, Ogier C, 1984 : Observations sur une ponte fertile d’ouvrieres d’ Acromyrmex octospinosus (Reich) (Hymenoptera – Formicidae). Turrialba 34 , 107-108. Fowler HG, 1978: Variacion sexual diferencial en Acromyrmex rugosus rugosus (Hymenoptera-Formicidae-Attini). Neotropica, 24 (72) 141-144. Fowler HG, 1982: Male induction and function of worker’s excitability during swarming in leaf-cutting ants ( Atta and Acromyrmex ) (Hymenoptera, Formicidae). Int J Inver Rep 4, 333-335. Hamilton W, 1964: The genetical evolution of social behaviour. I. J Theor Biol 7 , 1-16. Hamilton W, 1964: The genetical evolution of social behaviour. II. J Theor Biol 7 , 17-52. Hölldobler B, Wilson EO, 1990: The ants. Harvard University Press, Cambridge. LaPolla J.S., Mueller U.G., Seid M. and Cover S.P. 2002. Predation by the army ant Neivamyrmex rugulosus on the fungus-growing ant Trachymyrmex arizonensis . Insect. Soc . 49 : 251–260 Lenoir A, Fresneau D, Errard C, Hefetz A, 1999: Individuality and colonial dentity in ants: the emergence of the social representation concept. In: Information Processing in Social Insects. Ed. by C. Detrain et al. Birkhäuser Verlag, Basel, 219-237. Lopes JFS, Hughes WHO, Camargo RS, Forti LC, 2005: Larval isolation and brood care in Acromyrmex leaf-cutting ants. Insect Soc 53 (2). Mueller UG, Rehner, SA, Schultz TR, 1998: The evolution of agriculture in ants. Science 281 , 2034-2038. Ratnieks FLW, Visscher PK, 1989: Worker policing in the honeybee. Nature 342 , 796-797. 70

Schneider MO, 2003: Comportamento de cuidado da prole da saúva-limão Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (Hymenoptera: Formicidae). Rio Claro. Dissertação, Brazil: Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 80 p. Souza DJ, Della Lucia TMC, Lima ER, 2005: Queen adoption in colonies of leaf-cutting ant Acromyrmex subterraneus molestans (Hymenoptera: Formicidae). Behav Proc 70 , 62- 68. Sudd JH, 1982: Ants: Foraging, nesting, broad behavior, and polyethism. In: Social Insects. Ed. by HR Hermann, vol. IV. 107-148. Swartz M.B. 1998. Predation on an Atta cephalotes colony by an army ant , Nomamyrmex esenbeckii . Biotropica 30 : 682–684 Tschinkel WR, Nierenberg N, 1983: The possible importance of relatedness in the fire ant, Solenopsis invicta. Annals of the Entomological Society of America 76 , 989-991. Viana AMM, Frézard A, Malosse C, Della Lucia TMC, Errard C, Lenoir A, 2001: Colonial recognition of fungus in the fungus-growing ant Acromyrmex subterraneus subterraneus (Hymenoptera: Formicidae). Chemoecology 11 , 29-36. Villesen P, Boomsma JJ, 2003: Patterns of male parentage in the leaf-cutting ants. Behav Ecol Sociobiol 53 , 246-253. Visscher PK, Dukas R, 1995: Honey bees recognise development of nestmates’ ovaries. Anim Behav 49 , 542-544. Weber NA, 1972: Gardening ants: the Attines. Philadelphia: American Philosophical Society. Wilson EO, 1980: Caste and division of labor in leaf-cutter ants (Hymenoptera, Formicidae: Atta ). I: The overall pattern in A. sexdens. Behav Ecol Sociobiol 7, 143-156.

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Capítulo IV

CUIDADO COM A PROLE E COMPORTAMENTO DOS MACHOS EM COLÔNIAS SEM RAINHA DE Acromyrmex subterraneus brunneus FOREL, 1911 (HYMENOPTERA: FORMICIDAE) SOB CONDIÇÕES LABORATORIAIS

Resumo Neste estudo, nós descrevemos e quantificamos o cuidado com a prole realizado pelas operárias em colônias sem rainha da formiga cortadeira, Acromyrmex subterraneus brunneus . Quinze atos comportamentais foram registrados nas 3 colônias estudadas. O repertório comportamental dos alados adultos foi mais limitado, com apenas 4 atos comportamentais, sendo eles: alimentação via operária, coletar estáfilas e se alimentar, limpeza mutua com adulto (operária – alado) e auto limpeza. Os alados são capazes de coletar o alimento (estáfilas ou tufos de hifas) do jardim de fungo e se alimentar, não necessitando das operárias para tal atividade. Este estudo contribui com o conhecimento da biologia das colônias de formigas cortadeiras, com a descrição e quantificação das atividades dos membros de uma colônia em uma situação de perda da casta fértil.

Palavras Chave : formigas cortadeiras, colônia sem rainha, atos comportamentais.

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1 Introdução Existem muitos estudos sobre o cuidado com a prole em formigas cortadeiras, incluindo os estudos de Wilson (1980, 1983) para Atta cephalotes e Atta sexdens , respectivamente, Fowler (1983) para Atta texana , Schneider (2003) e Della Lucia et al. (2003) para Atta sexdens rubropilosa . Nesta organização social, as operárias são responsáveis pelo cuidado cooperativo da prole, desde a alimentação das larvas até o auxílio no momento da emergencia do adulto. A reprodução de operárias é observado em colônias órfãs de algumas espécies de Acromyrmex (Fowler 1978, 1982; Febvay & Ogier 1984; Camargo et al. 2006). Em formigas cortadeiras, colônias órfãs de A. rugosus produzem uma prole de machos por oviposição das operárias (Fowler, 1978). Operárias destas colônias tornam-se altamente agitadas, respondendo agressivamente a rotina laboratorial de manutenção das colônias (Fowler, 1982), demonstrando uma mudança comportamental. No gênero Leptothorax spp. o conflito reprodutivo sobre a produção de machos na colônia, gera interações agressivas entre os indivíduos, conduzindo a sociedade para a formação de uma hierarquia reprodutiva (Heinze et al. 1997). Contudo, a oviposição pelas operárias e a produção de machos ocorre quando a rainha morre na colônia (Heinze et al. 1997). No entanto, as operárias não ovipositam em colônias com rainha (Villesen & Boomsma 2003), sendo postulado que a repressão e a esterilidade das operárias de formigas cortadeiras seja mantida pela rainha ou por um mecanismo de policiamento das operárias (Dijkstra et al. 2005). Entretanto, é desconhecido como as operárias comportam-se com a prole, quando a colônia perde a sua casta fértil. O objetivo do estudo foi descrever e quantificar o cuidado parental realizado pelas operárias em colônias sem rainha da formiga cortadeira, Acromyrmex subterraneus brunneus , ainda pouco estudado para este gênero.

2 Material e Métodos Este estudo foi realizado em colônias de 4 anos de idade sob condições laboratoriais de Acromyrmex subterraneus brunneus , coletadas na cidade de Piracicaba, São Paulo, transportadas e mantidas no Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil. 73

As colônias foram acondicionadas em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 °C± 2, com uma umidade relativa de 70%± 20. As colônias foram alimentadas com Ligustrum spp. e Acalypha spp., durante a execução do experimento. Colônias com aproximadamente 6,0 litros de fungo foram divididas em 2 partes iguais, no qual uma permaneceu com a rainha e a outra sem a rainha. Após 4 meses, as colônias sem rainha já continham larvas de machos de diversos tamanhos (Camargo et al. 2006). Decorrido este período, mini-colônias foram acondicionadas em caixas de vidro (comprimento: 20 cm; largura: 10 cm e altura: 2,5 cm), com 0,5 cm de gesso no fundo, interligadas por uma arena de forragem e a uma câmara de lixo nas extremidades opostas. O acompanhamento do repertório comportamental foi realizado através de observações sob microscópio esteroscópico (Marca Zeiss, Stemi 1000) e um iluminador de luz fria (Marca Nikon, NI 150). Cada colônia foi observada ad libitum em 2 ocasiões consecutivas, cada observação com uma duração de 30 minutos, no qual o observador percorria a colônia e registrava as tarefas desempenhadas de todas as formigas visíveis. Este sistema de observações foi embasado e adaptado do utilizado para estudos comportamentais de Acromyrmex versicolor Julian & Fewell (2004). As colônias foram apoiadas em pequenas mesas de acrílico (comprimento: 50 cm; largura: 15 cm e altura: 5 cm), para que o observador deslocasse a lupa durante a varredura, evitando a movimentação e perturbação da colônia durante as observações. A priori, os atos comportamentais foram reconhecidos e catalogados utilizando as descrições e etogramas dos trabalhos de Wilson (1980; 1983) para Atta cephalotes e Atta sexdens respectivamente, de Fowler (1983) para Atta texana , Schneider (2003) e Della Lucia (2003) para Atta sexdens rubropilosa , que envolveram estudos com formigas cortadeiras desta natureza.

3. Resultados e Discussão Os resultados dos atos comportamentais das operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus estão descritos na tabela 1 e quantificados na tabela 3, e alguns foram documentados nas figuras 1, 2, e 3. Quinze atos comportamentais foram registrados nas 3 74 colônias estudadas, demonstrando que as formigas cortadeiras apresentam um laborioso repertório comportamental no cuidado com a prole. Schneider (2003) descreveu e quantificou 13 atos comportamentais relativos ao cuidado com a prole em Atta sexdens rubropilosa , incluindo atos comportamentais como limpeza da prole, auxiliar a emergência da prole, transportar ovos, larvas e pupas e alimentar larvas com estáfilas, fungo manipulados, hifas intactas e ovos tróficos. Alguns destes atos comportamentais já foram descritos e quantificados anteriormente por Fowler (1983) e Wilson (1983), mas muito do significado funcional é desconhecido. Camargo et al. (2006) discutiram sobre prováveis funções de alguns atos comportamentais desempenhados por operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus durante o cuidado parental com as larvas de macho e fêmea simultaneamente, para detectar indícios de cuidado preferencial. De acordo com os autores, o ato comportamental de lamber a prole está relacionado à limpeza e assepsia das mesmas; o transporte da prole provavelmente esta correlacionado ao manejo das larvas de acordo com as condições microclimáticas (temperatura) (Bollazzi & Roces, 2002) e / ou uma resposta comportamental a perturbação do ninho; alimentação das larvas provê a sua nutrição (Schneider, 2003; Lopes et al. 2005) e ingerir fluido fecal excretado pelas larvas está relacionado a trocas de substâncias através da trofalaxia larva-adulto (Schneider, 2003; Lopes et al. 2005). Em relação aos demais atos comportamentais necessitam de estudos pontuais direcionados a atos comportamentais individualizados, para a possibilidade de descobrir qual seria o valor adaptativo deste comportamento para a espécie. Provavelmente, a produção de machos em colônias sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus possa ter um alto custo para as operárias e a colônia como um todo. Um exemplo é formiga ponerine Pachycondyla obscuricornis , onde a regulação agressiva da reprodução e a formação de uma hierarquia dominante representam um custo energético para a colônia (Gobin et al. 2003). Os autores verificaram que as operárias reduziram as suas atividades imediatamente após a orfandade experimental, dado ao custo adicional para a colônia. O repertório comportamental dos alados adultos foi mais limitado, com apenas 4 atos comportamentais, sendo eles: alimentação via operária, coletar estáfilas e se alimentar, limpeza mutua com adulto (operária – alado) e auto limpeza (Tabela 3 e 4). De acordo com 75

Hölldober & Wilson (1990), dentro do ninho o repertório comportamental dos machos está limitado a auto limpeza e receber alimento das operárias. Nas duas colônias observou-se que os alados também são capazes de coletar o alimento (estáfilas ou tufos de hifas) do jardim de fungo e se alimentar, não necessitando das operárias para tal atividade. Em espécies basais da tribo Attini, os alados machos de Mycetarotes parallelus não recebem muito cuidado por parte das operárias, apenas a limpeza e nunca a alimentação (Diniz et al. 2005). Em Atta cephalotes , adultos reprodutivos aparentemente recebem tratamento diferenciado na colônia pelas operárias (Bass, 1994). A autora verificou que os machos têm que “trabalhar mais pesadamente” (“work harder”) do que as fêmeas para obter estáfilas, embora o número de estáfilas recebidas por fêmeas e machos não seja significativamente diferente. Apesar disto os machos necessitam de uma grande quantidade de carboidratos disponível para consumir durante o vôo nupcial e localização das fêmeas (Jutsum & Quinlan, 1978), visto que após a copula, os machos morrem. Assim, este estudo contribui com o conhecimento da biologia das colônias de formigas cortadeiras, com a descrição e quantificação das atividades dos membros de uma colônia em uma situação de perda da casta fértil.

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Tabela 1. Descrição dos atos comportamentais desempenhados pelas operárias.

Número Atos comportamentais Descrições 1 Transporte de ovos Consiste na remoção da massa de ovos para uma região de maior agregação destes. 2 Transporte de larvas Consiste na remoção das larvas de diversos tamanhos para variáveis regiões do jardim de fungo. 3 Transporte de pupas Consiste na remoção das pupas de diversos tamanhos para variáveis regiões do jardim de fungo. 4 Lamber / limpeza da Consiste em lamber / limpar todo o corpo da larva, larva em especial, as regiões oral e anal provavelmente relacionado ao comportamento de trofalaxia larva - adulto. 5 Lamber pupa Consiste em lamber/ limpar todo o corpo da pupa. 6 Depositar tufos de hifas Consiste na deposição de tufos de hifas no em larva tegumento do corpo das larvas, geralmente as operárias mínimas desempenham esta tarefa. 7 Auxílio durante a Consiste nas operárias auxiliarem na limpeza do emergencia do adulto corpo, com remoção dos micélios e distensão das pernas das operárias jovens. 8 Mastigar / manipular As operárias reduziam o volume do material através tufos de hifas ou deste ato comportamental, e posteriormente o estáfilas material manipulado era oferecido às larvas. Raras vezes, as operárias passavam este material entre elas. 9 Transportar tufos de Consiste no transporte de alimentos até as larvas no hifas ou estáfilas jardim de fungo. Muitas vezes, este alimento era transportado para o interior do jardim de fungo, tornando impossível registrar seu destino final. 10 Alimentar larvas Consiste na alimentação das larvas pelas operárias de todos os tamanhos. As larvas foram alimentadas com 77

tufos de hifas e estáfilas manipuladas, ou seja, maceradas por movimentos mandibulares das operárias. 11 Ingerir fluido fecal das As operárias ingerem a excreta produzida pelas larvas larvas durante a alimentação ou limpeza destas. 12 Transporte de larva ao Consiste na remoção das larvas debilitadas ao lixo, e lixo estas provavelmente já estão mortas. 13 Acomodar larva no Após o transporte das larvas, estas são acomodadas jardim de fungo ao jardim de fungo com a região ventral voltada para cima. 14 Coletar fungo ou estáfila Retirada de fungo ou estafilas pelas operárias, para a alimentação das mesmas, larvas ou alados. 15 Depositar tufos de hifas Consiste na deposição de tufos de hifas no em pupa tegumento do corpo das pupas, geralmente as operárias mínimas desempenham esta tarefa.

Tabela 2. Descrição dos atos comportamentais dos alados.

Número Atos comportamentais Descrições Consiste em receber a alimentação, ou seja, estáfilas ou tufos de hifas já mastigados e macerados 1 Alimentação via operária diretamente das operárias, através de solicitação (freqüentes toques antenais). Retirada de fungo ou estáfilas pelas operárias com as Coletar estáfilas e se 2 mandíbulas, com posterior mastigação ou maceração alimentar para a alimentação. Consiste na limpeza conjunta entre a operária-alado, Limpeza mutua com no qual uma operária realiza ativamente a limpeza 3 adulto (operária – Alado) através do ato de lamber, enquanto o outro alado recebe o cuidado de forma passiva. 4 Auto Limpeza Os alados esfregam seu próprio corpo com as pernas, 78 limpam antenas com o primeiro par de pernas, usando o pente basitarsal. Utilizam o terceiro par de pernas para a limpeza das asas.

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Tabela 3. Etograma para as operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus em 3 colônias de laboratório durante o cuidado com a prole.

Colônia 1 Colônia 2 Colônia 3 Atos Comportamentais Freqüência Freqüência Freqüência Absoluta Relativa Absoluta Relativa Absoluta Relativa Transporte de ovos 15 0,19 4 0,07 11 0,23 Transporte de larva 55 0,69 60 1,09 173 3,61 Transporte de pupa 18 0,23 22 0,40 4 0,08 Lamber larva 2746 34,54 1899 34,53 1861 38,80 Lamber pupa 816 10,26 482 8,77 37 0,77 Mastigar / manipular tufos de hifas ou estáfilas 1436 18,06 877 15,95 1181 24,62 Transportar tufos de hifas ou estáfilas 1221 15,36 941 17,11 914 19,05 Depositar tufos de hifas em larva 135 1,70 83 1,51 21 0,44 Auxílio durante a emersão do adulto 39 0,49 83 1,51 19 0,40 Alimentar larva 484 6,09 347 6,31 457 9,53 Ingerir fluido fecal 133 1,67 74 1,35 49 1,02 Levar larva ao lixo 9 0,11 14 0,25 4 0,08 Acomodar larva no jardim de fungo 7 0,09 8 0,15 32 0,67 Coletar fungo ou estáfila 40 0,50 37 0,67 27 0,56 Depositar tufos de hifas em pupa 790 9,94 564 10,26 4 0,08 Acomodar pupa 6 0,08 4 0,07 3 0,06 Número de atos observados 7950 100,00 5499 100,00 4797 100,00 Tempo de observação (horas) 71 50 42

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Tabela 4. Etograma para os alados de Acromyrmex subterraneus brunneus em 2 colônias de laboratório.

Colônia 1 Colônia 2 Atos Comportamentais Freqüência Freqüência Absoluta Relativa Absoluta Relativa Alimentação via operária 65 7,97 60 14,60 Coletar estáfilas e se alimentar 41 5,02 50 12,17 Limpeza mutua com adulto (operária – Alado) 434 53,19 183 44,53 Auto Limpeza 276 33,82 118 28,71 Número de atos observados 816 100,00 411 100,00 Tempo de observação (horas) 64,5 22,5

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Figura 1. Atos comportamentais realizados pelas operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus: a) Transporte de hifas ou estáfilas; b) Mastigar / manipular tufos de hifas ou estáfilas; c) Alimentar larva; d) Detalhe das hifas no tegumento da larva, demonstrando que as operárias aplicaram hifas nas larvas (Lopes et al. 2005). 82

Figura 2. Atos comportamentais realizados pelas operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus: a) lamber / limpar a larva; b) Ingerir fluido fecal excretado pela larva; c) lamber / limpar a pupa; d) Detalhe do lamber / limpar a pupa.

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Figura 3. Atos comportamentais realizados pelas operárias e machos de Acromyrmex subterraneus brunneus: a) Transporte de pupas; b) Coletar estáfilas e auto-alimentação; c) e d) limpeza mutua (operária – macho), e a operária na asa do macho está coberta pela bactéria simbiôntica especializada (Pseudonocardiaceae) associada com Acromyrmex (Currie et al. 2003) . 84

4 Referências Andrade, A.P.P., L.C. Forti, A.A. Moreira, M.A.C. Boaretto, V.M. Ramos, & C.A.O. Matos 2002. Behavior of Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae) workers during the preparation of the leaf substrate for symbiont fungus culture. Sociobiology 40(2):293- 306. Bass, M .1994. Behaviour of leafcutting ant sexuals (Hym.) in the parental nest. Entomologist’s Monthly Magazine 130: 141-147. Bollazzi, M. & F. Roces 2002.Thermal preference for fungus culturing and brood location by workers of thatching grass-cutting ant Acromyrmex heyeri . Insectes Sociaux 49: 153-157. Camargo, R.S., L.C. Forti, A.P.P .Andrade, C.A.O. Matos & J.F.S. Lopes 2005. Morphometry of the sexual forms of Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae) in queenright and queenless laboratory colonies. Journal of Applied Entomology 129(6): 347-351. Camargo, R.S., J.F.S. Lopes, & L.C. Forti 2006. Behavioral responses of workers towards worker-produced male larvae and queen-produced worker larvae in Acromyrmex subterraneus brunneus Forel, 1911 (Hym., Formicidae). Journal of Applied Entomology 130 (1): 56-60. Currie, C.R., J.Á. Scott, R.C. Summerbell, & D. Malloch 2003. Corrigendum: Fungus-growing ants use antibiotic-producing bacteria to control garden parasites. Nature 423: 461. Della Lucia, T.M.C., E.F.O. Peternelli, F.G. Lacerda, L.A. Peternelli, D.D.O. Moreira 2003. Colony behavior of Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae) in the absence of the queen under laboratory conditions. Behaviour Processes 64: 49-55. Dijkstra, M.B., D.R. Nash, & JJ Boomsma 2005. Self-restraint and sterility in workers of Acromyrmex and Atta leafcutter ants. Insectes Sociaux, 52: 67-76. Diniz, EA, O.C. Bueno,, M.J.A. Hebling, 2005. Comportamento dos indivíduos alados Mycetarotes parallelus (Emery, 1906) (Hymenoptera: Formicidae). In: IUSSI – Brasil – I Simpósio Brasileiro de Insetos Sociais: Insetos sociais e desenvolvimento sustentável. 7 a 9 de dezembro de 2005, Belo Horizonte - MG, Brasil. Febvay, G. & C. Ogier, 1984. Observations sur une ponte fertile d’ouvrieres d’ Acromyrmex octospinosus (Reich) (Hymenoptera – Formicidae). Turrialba 34: 107-108. Fowler, H.G. 1978. Variación sexual diferencial en Acromyrmex rugosus rugosus (Hymenoptera-Formicidae-Attini). Neotropica 24: 141-144.

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Fowler, H.G. 1982. Male induction and function of worker’s excitability during swarming in leaf-cutting ants ( Atta and Acromyrmex ) (Hymenoptera, Formicidae). International Journal of Invertebrate Reproduction 4: 333-335. Fowler, H.G. 1983. Alloethism in a leaf-cutting ant: laboratory studies on Atta texana (Hymenoptera: Formicidae: Attini). Zool Jahrb Abt Allg Zool Physiol tiere 87(4): 529- 538. Gobin, B., J. Heinze, M. Strätz, & F. Roces 2003. The energetic cost of reproductive conflicts in the ant Pachycondyla obscuricornis . Journal of Insect Physiology, 49(8): 747-752. Hölldobler, B. & E.O. Wilson, 1990. The ants. Cambridge: The Belknap Press of Harvard University Press, p. 732. Johnson, R.A. & G.K. Bhattacharyya, 2001. Statistics – Principles and Methods (Fourth Edition New York / USA: John Wiley & Sons, Inc. Julian, G.E. & J.H. Fewell, 2004. Genetic variation and task specialization in the desert leaf- cutter ant, Acromyrmex versicolor. Animal Behaviour, 68: 1-8. Jutsum, A.M. & J. Quinlan, 1978. Flight and substrate utilisation in laboratory-reared males of Atta sexdens . Journal of Insect Physiology, 24: 821-825. Lopes, J.F.S., WHO Hughes, RS Camargo, & LC Forti 2005. Larval isolation and brood care in Acromyrmex leaf-cutting ants. Insectes Sociaux, 53 (2): 333-338. Schneider, M.O. 2003. Comportamento de cuidado com a prole da saúva-limão Atta sexdens rubropilosa Forel, 1908 (Hymenoptera: Formicidae). 2003. 80 f. Dissertação, Instituto de biociências, UNESP, Rio Claro. Villesen, P. & J.J .Boomsma 2003. Patterns of male parentage in the leaf-cutting ants. Behavioral Ecology and Sociobiology 53: 246-253. Wilson, E.O. 1980. Caste and division of labor in leaf-cutter ants (Hymenoptera, Formicidae). I: The overall pattern in A. sexdens . Behavioral Ecology and Sociobiology, 7: 143-56. Wilson, E.O. 1983. Caste and division of labor in leaf-cutter ants (Hymenoptera, Formicidae). IV: Colony ontogeny of Atta cephalotes . Behavioral Ecology and Sociobiology, 14: 55- 60.

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Capítulo V

MORFOMETRIA DAS FORMAS SEXUAIS DE Acromyrmex subterraneus brunneus FOREL (HYMENOPTERA, FORMICIDAE) EM COLÔNIAS COM E SEM RAINHA SOB CONDIÇÕES LABORATORIAIS

Resumo Um estudo morfométrico foi realizado em formas sexuais de Acromyrmex subterraneus brunneus em colônias sob condições laboratoriais. Os alados estudados foram provenientes de colônias com e sem rainha, ou seja, oviposição por operárias e rainha. Uma análise de agrupamento evidenciou a ampla distribuição de tamanho dos indivíduos produzidos em colônias sem rainha em relação às colônias com rainha, sugerindo que um grande grupo destas operárias estavam hábeis para reprodução, produzindo ovos não fertilizados. Através destes resultados torna-se possível conjecturar que machos produzidos por colônias sem rainhas possam estar aptos ao acasalamento, pois os machos menores e maiores apresentam as genitálias idênticas, variando somente em tamanho, e conseqüentemente, indicando uma rota alternativa nesta espécie.

Palavras Chave : Acromyrmex subterraneus brunneus ; formiga cortadeira, formas sexuais.

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1 Introdução Em Hymenoptera sociais, por via de regra, todo o macho normal é haplóide, enquanto que toda a fêmea normal é diplóide podendo diferenciar-se em fêmeas reprodutivas ou operárias, característica dependente de fatores ambientais e genéticos (Wilson, 1953; Crozier, 1977). Um fato amplamente conhecido é que as operárias freqüentemente, mas não universalmente, põem ovos não fertilizados, os quais tambem se desenvolvem em machos (Wilson & Hölldobler, 1990). Esta habilidade reprodutiva é conhecida em muitas espécies de formigas (Peeters & Crewe, 1985; Peeters, 1991; Oliveira & Hölldobler, 1990; Heinze et al. 1996; Walsum et al. 1998), incluindo as cultivadoras de fungo (Fowler, 1978; Febvay & Ogier, 1984; Villensen & Boomsma, 2003). Interessantemente, operárias de Acromyrmex rugosus rugosus tornam-se hábeis para reprodução de machos em colônias órfãs, ou seja, sem rainha (Fowler, 1982). Estas colônias órfãs são capazes de gerar uma distribuição distinta de fenótipos dentre os machos, nos quais características como comprimento do escapo e do gáster são significativamente maiores nos machos de colônias desprovidas de rainhas, do que em colônias com rainha (Fowler, 1978). Embora o dimorfismo sexual seja acentuado nas formigas cortadeiras ( Atta e Acromyrmex ), variações de tamanho dos indivíduos do mesmo sexo já foram relatadas anteriormente para as formas sexuais em colônias com ou sem rainha (Jutsum & Cherrett, 1978; Fowler, 1978; Bueno, 2002). Porém, pouco se conhece sobre a origem desta variação e as possíveis implicações no desempenho reprodutivo da colônia como um todo. Este trabalho buscou avaliar a variação morfométrica encontrada em formas sexuais produzidas em colônias com e sem rainha de Acromyrmex subterraneus brunneus, sob condições laboratoriais. Adicionalmente, foi realizada a morfometria e a descrição da genitália dos machos produzidos em colônias sem rainha para comparação com machos produzidos em colônias com rainha.

2 Material e Métodos Este estudo foi realizado em cinco colônias adultas (2 anos de idade sob condições laboratoriais) de Acromyrmex subterraneus brunneus , coletadas na cidade de Piracicaba, São Paulo, transportadas e mantidas no Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil.

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As colônias foram acondicionadas individualmente em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 °C± 2, com uma umidade relativa de 70%± 20. As rainhas de 4 colônias foram retiradas para que as operárias recebessem um estimulo e conseqüentemente começassem a realizar a oviposição e produzir indivíduos reprodutivos. As formas sexuais foram coletadas e conservadas em álcool 70 %, depois que alcançaram a maturidade. As rainhas foram realocadas com uma pequena quantidade de fungo e operárias em recipientes plásticos com gesso, para permitir o restabelecimento de uma nova colônia. A quinta colônia permaneceu com a sua rainha, produzindo reprodutivos (machos e fêmeas), os quais foram coletados e conservados em álcool 70 % para um estudo posterior. Para estimativa populacional dos ninhos de Acromyrmex subterraneus brunneus , as colônias (jardim de fungo + ovos + larvas + pupas + operárias) foram pesadas individualmente em uma balança semi-analítica, sendo posteriormente retiradas aleatoriamente 5 amostras de 5 gramas cada. Das amostras, efetuou-se a contagem das operárias para o cálculo da população total do ninho (Pereira & Della Lucia, 1998). O estudo morfométrico foi realizado em 100 alados machos provenientes das 4 colônias sem rainha, 100 alados machos e 42 fêmeas provenientes da colônia com rainha, totalizando 242 indivíduos reprodutivos. Estes foram medidos através de um micrômetro ocular do microscópio estereoscópico. As medidas tomadas foram: (1) largura da cabeça entre os olhos (2) largura da cabeça após os olhos (3) largura da cabeça através do occipute; (4) comprimento da cabeça, ou seja, do vertex cefálico até o final da mandíbula; (5) o comprimento do escapo antenal; (6) comprimento do gáster; (7) comprimento do tórax + pecíolo e (8) comprimento do fêmur metatorácico. Os dados da morfometria das formas sexuais foram submetidos a uma análise de agrupamento Método Híbrido de Wong, indicando o número de grupos adequados através do Pseudo F Statistic e Pseudo T-Squared Statistic, sugerindo 3 grupos. Os componentes canônicos 1 e 2 explicam 11% e 87 % da variação, possibilitando um agrupamento ideal dos grupos pelo Método Híbrido de Wong, de acordo com Wong (1982), usando o software SAS (número de série V.6.12). A genitália externa dos machos foi retirada sob microscópio estetoscópio em solução salina (0,9 % NaCl). Os machos das colônias sem rainha foram separados entre pequenos e

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grandes de acordo com a Tabela 2. Posteriormente estes foram fixados em solução Dietrich (álcool 96 %, 30 ml; formol, 10 ml; ácido acético glacial, 10 ml; água destilada, 60 ml) por 24 horas e lavados em água 70 %. Após a fixação e lavagem os exemplares foram processados conforme a seguinte seqüência: a) diafanização em KOH 10 %, à 40º C em estufa, por 10 horas; b) lavagem rápida em água destilada; c) imersão por 1 a 2 minutos em ácido acético glacial 2%; d) desidratação em álcool 70%, álcool absoluto I, álcool absoluto II, por 15 a 30 minutos cada um; e) imersão em fenol, por 12 horas; f) imersão em xilol, por 5 minutos; g) montagem da genitália externa na lâmina em bálsamo do Canadá. Este método de preparação foi utilizado por Andrade (2002). Para sustentar a lamínula foi colocado um pequeno suporte para que o material não fosse deformado. Estas permaneceram em estufa à 40º C, por 10 dias. A volsela (Fig. 1), uma importante estrutura contida na genitália, foi estudada através da morfometria de suas dimensões. Esta estrutura apresenta variações entre as espécies, e sua morfologia foi estudada em algumas espécies do gênero Acromyrmex por Zolessi & Abenante (1973), Zolessi & Gonzáles (1974) e Andrade (2002). As medidas realizadas na volsela foram baseadas no estudo de Clausen (1937/39) para o aparato copulatório dos machos. As seguintes medidas foram realizadas em vista ventral da genitália dos machos, utilizando-se a ocular micrométrica do microscópio esteroscopio: I) comprimento longitudinal da volsela; II) largura da volsela; III) largura do digitus; IV) largura da base da volsela; V) comprimento longitudinal do digitus; VI) Comprimento da volsela desde sua inserção ao gonocoxito até a base (Fig 1 A). Também foi medida a largura da genitália externa (região entre a inserção do gonocoxito e a gonobase (VII) e o comprimento longitudinal do gonocoxito e o gonóstilo (VIII) (Fig. 1B).

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VI

I

II

IV V III

(A)

Gonobase VII

Gonocoxito VIII Volsela

Gonóstilo

(B)

Figura 1. Figura esquemática da genitália de machos de Acromyrmex subterraneus brunneus . A. Volsela; B. Vista ventral da genitália do macho.

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3 Resultados e Discussão A colônia com rainha, com uma população estimada de 6782 operárias, produziu 204 machos e 42 fêmeas, alcançando uma proporção sexual macho/fêmea de 4,9. As populações estimadas das colônias sem rainhas variaram de 2411 a 5942 operárias e produziram apenas machos, não sendo constatada a ocorrência de fêmeas (Tabela 1). Comparativamente, uma colônia sem rainha de A. rugosus com cerca de 500 operárias produziu 94 machos, enquanto uma colônia natural com rainha com uma população de mais de 5 000 operárias produziu 128 machos e uma proporção sexual de 9,85 (Fowler, 1978). Estes resultados demonstram que colônias com rainha produzem um número menor de machos do que colônias sem rainha, na qual operárias estão produzindo ovos não fertilizados. Um estudo recente através de genótipos “microsatellite genotyping” demonstrou que operárias em colônias sem rainha são capazes de produzir machos, mas machos produzidos por operárias não foram encontrados em colônias com rainha em 8 espécies de formigas cultivadoras de fungo (Villensen & Boomsma, 2003). Isto permite predizer que a rainha fértil na colônia é capaz de controlar e monopolizar a produção de machos, e quando ela morre ou removida da colônia, as operárias desempenham este papel reprodutivo. Os 8 caracteres morfológicos possibilitaram agrupar as formas sexuais em 3 grupos distintos (Fig. 2), sendo eles, Agrupamento 1 – composto de 100 machos produzidos em colônias rainha e 79 machos produzidos em colônias sem rainha, totalizando 179 indivíduos, Agrupamento 2 – composto de 42 fêmeas produzidas em colônias com rainha e Agrupamento 3 – 21 composto de machos produzidos em colônias sem rainha. Cada agrupamento tem medidas morfológicas distintas (Tabela 2). As fêmeas (Agrupamento 2) apresentaram comprimentos médios da cabeça e do corpo maiores do que os machos (Agrupamento 1 e 3), demonstrando o forte dimorfismo sexual existente nesta espécie. Os machos do Agrupamento 1 são morfologicamente maiores do que os machos do Agrupamento 3 (Tabela 2). Esta ampla distribuição de tamanho dos indivíduos produzidos em colônias sem rainha em relação às colônias com rainha, evidencia que um grande grupo destas operárias estava produzindo ovos haplóides. Fowler (1978), através da comparação dos fenótipos cefálicos dos machos de colônias sem rainha e com rainha, demonstrou que as colônias sem rainha produziram um número maior de fenótipos que as colônias com rainha. O autor ainda argumenta que a rainha provavelmente controla a oviposição das operárias, devido à redução do número de fenótipos dos machos produzidos em colônias com rainha. Esta observação pode ser evidenciada pela

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divisão em 2 grupos dos filhos das operárias (Fig. 2), enquanto os machos filhos da rainha estão agrupados em um único grupo. Em relação à genitália externa dos machos, observou-se que tanto nos machos de colônias com rainha quanto nos sem rainha não foi verificado diferenças morfológicas em sua composição (Fig. 3). Nas espécies Acromyrmex hispidus e Acromyrmex lobicornis , a genitália do macho é robusta, composta por gonostilos recurvados e largos, a volsela possui um digito largo, e na sua curvatura, um pequeno dente que evidencia a diferença existente entre estas duas espécies (Zolessi & Abenante, 1973 e Zolessi & Gonzáles, 1974). Em Acromyrmex subterraneus brunneus a genitália apresenta o mesmo padrão descrito pelos autores, no entanto, a volsela apresenta poucas cerdas, a base possui uma curvatura angular com inúmeras cerdas distribuídas na margem interna da estrutura (Fig. 3 b, d, f). Esta formação foi observada em todas as laminas observadas, concluindo-se que os machos produzidos em colônias com e sem rainha apresentam os mesmos caracteres específicos da espécie em questão. Através dos dados morfométricos, observou-se que a genitália externa dos machos do Agrupamento 3 foram proporcionalmente menores em relação ao Agrupamento 1, produzidos em colônias com e sem rainha. No entanto, a volsela tem proporções similares, denotando que estes machos possam ser hábeis a copula, como aqueles produzidos em colônias com rainha (Tab. 3). De acordo com Clausen (1937/39) o aparelho copulatório masculino e feminino acoplam-se como uma chave na fechadura, e a integridade das espécies seria preservada devido a sua morfologia. Entretanto, o autor ainda argumenta que a hipótese chave-fechadura “lock- and-key hypothesis” foi parcialmente refutada quando se observou que a morfologia da genitália masculina varia muito em comprimento e forma. A genitália feminina não é composta por partes rígidas quitinosas, mas por uma musculatura que promove contrações que conduz a uma maior segurança na conexão entre os órgãos copulatórios (Clausen, 1937/39). Além disso, os machos são mais variáveis do que as fêmeas dentro da Classe Insecta (Shapiro & Porter, 1989). Em Lepidoptera, existem exemplos de hibridizações interespecificas, intergenéricas e até mesmo interfamiliar para demonstrar a ineficácia da anatomia genital como uma barreira para o acasalamento (Sengün, 1944). Desse modo, conclui-se que os machos de Acromyrmex subterraneus brunneus , de colônias com e sem rainha são anatomicamente hábeis ao acasalamento, entretanto, existem algumas ressalvas para esclarecer tal hipótese. Torna-se imprescindível saber se os machos de Acromyrmex subterraneus brunneus em colônias sem rainha recebem o mesmo cuidado pelas operárias, como os machos que são criados em colônias

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com rainha, permitindo que estes respondam a estímulos do ambiente e que estejam aptos para um bom desempenho durante o vôo nupcial. A capacidade de vôo e de copula são parâmetros importantes para o sucesso reprodutivo das formigas cortadeiras. Nestes insetos, o vôo nupcial é dependente basicamente de condições meteorológicas ideais e de reservas carboidratos como combustível para o vôo (Jutsum & Quinlan, 1978). Em experimentos realizados em simulações de laboratórios, (Jutsum & Quinlan, 1978) verificaram que machos de Atta sexdens produzidos em laboratórios voaram após um período de 9-10 horas de “lights-on” mesmo na ausência de pistas ambientais. Outro resultado interessante foi à utilização de uma grande quantidade de carboidratos utilizados como combustível para o vôo. Além disso, ainda é desconhecida a existência da reprodução de operárias em situações naturais. Hipoteticamente, caso a rainha morra em um ninho adulto na natureza, é possível que as operárias tornem-se hábeis a produzir ovos não fertilizados. A produção destes machos tem que estar sincronizada com outros ninhos que tenham rainha e que estejam em período reprodutivo, ou seja, produzam fêmeas virgens para o acasalamento, e desta forma, perpetuando seus descendentes. Além disso, o significado biológico da reprodução das operárias em formigas cortadeiras é uma questão desconhecida, permitindo apenas conjecturar que estes machos possam ser hábeis ao acasalamento, conduzindo a uma via alternativa na reprodução desta espécie.

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Figura 2. Agrupamentos das formas sexuais de Acromyrmex subterraneus brunneus , Agrupamento 1 – machos produzidos em colônias com e sem rainha, Agrupamento 2 – fêmeas produzidas em colônias com rainha e Agrupamento 3 – machos produzidos em colônias sem rainha.

Tabela 1. Número de formas sexuais e operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus em colônias com e sem rainha sob condições laboratoriais.

Formas Sexuais Número de Colônias Machos Fêmeas operárias Com rainha 204 42 6782 Sem rainha 802 - 3089 Sem rainha 904 - 2411 Sem rainha 277 - 5942 Sem rainha 101 - 5607

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Tabela 2. Medidas (mm) retiradas das formas sexuais (media ± SE) de Acromyrmex subterraneus brunneus nos agrupamentos da análise de agrupamento.

Largura da Largura da Largura da Comprimento Comprimento Comprimento Comprimento Comprimento Agrupamentos cabeça cabeça após cabeça da cabeça do escapo do gáster do tórax + do fêmur entre os os olhos através do antenal pecíolo metatorácico olhos occipute 1 (n = 179) 1,09 ± 0,06 1,65 ± 0,09 0,97 ± 0,06 1,96 ± 0,11 1,54 ± 0,09 3,11 ± 0,25 3,92 ± 0,22 2,11 ± 0,12 2 (n = 42) 2,14 ± 0,05 2,61 ± 0,06 2,23 ± 0,05 3,19 ± 0,06 2,05 ± 0,04 3,27 ± 0,14 4,26 ± 0,13 2,37 ± 0,06 3 (n = 21) 0,86 ± 0,05 1,28 ± 0,08 0,72 ± 0,06 1,51 ± 0,11 1,14 ± 0,13 2,31 ± 0,24 3,04 ± 0,21 1,57 ± 0,09

Agrupamento 1 – Machos produzidos em colônias com e sem rainha, Agrupamento 2 – Fêmeas produzidas em colônias com rainha e Agrupamento 3 – Machos produzidos em colônias sem rainha.

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Figura 3. Vista ventral da genitália de machos de Acromyrmex subterraneus brunneus . A- genitália externa e volsela de um macho produzido em colônias sem rainha pertencentes ao agrupamento 1; B- genitália externa e volsela de um macho produzido em colônias sem rainha pertencentes ao agrupamento 3; C- genitália externa e volsela de um macho produzido em colônias com rainha pertencentes ao agrupamento 1.

0.1 mm 1.0 mm (B)

(A)

0.1 mm

1.0 mm (D)

(C)

(B)

0.1 mm

1.0 mm (F)

(E)

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Tabela 3. Medidas morfométricas (mm, média ± SE) da genitália externa das formas sexuais Acromyrmex subterraneus brunneus de acordo com os grupos obtidos pela análise de agrupamento. A- Machos produzidos em colônias sem rainha pertencentes ao agrupamento 1; B- Machos produzidos em colônias sem rainha pertencentes ao agrupamento 3; C- Machos produzidos em colônias com rainha pertencentes ao agrupamento 1.

I II III IV V VI VII VIII

A (n = 15) 0,48 ± 0,03 0,21 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,33 ± 0,02 1,20 ± 0,04 1,45 ± 0,03 B (n = 15) 0,45 ± 0,02 0,18 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,29 ± 0,02 1,04 ± 0,05 1,34 ± 0,03 C (n = 15) 0,50 ± 0,02 0,22 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,10 ± 0,01 0,16 ± 0,01 0,33 ± 0,02 1,39 ± 0,04 1,42 ± 0,03

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Capítulo VI

O PAPEL DAS OPERÁRIAS NA TRANSFERÊNCIA DE SUBSTÂNCIAS DA RAINHA E AS DIFERENÇAS ENTRE AS CASTAS NA FORMIGA CORTADEIRA, Acromyrmex subterraneus brunneus (HYMENOPTERA: FORMICIDAE)

Resumo Este estudo focou na relação entre a rainha e as operárias mediada pela transferência de possíveis substâncias provenientes da casta fértil para a estéril. As rainhas foram submetidas as diferentes situações de limitação física, ou seja, permaneceram isoladas em gaiolas com perfurações que permitiram apenas a entrada das operárias, mas a rainha continuava isolada. Um traçador (corante hidrossolúvel) foi aplicado no pronoto e gaster da rainha, e sua dispersão foi acessada nas operárias. Os resultados demonstraram que a casta pequena (0,7-0,9 mm) passou, via limpeza mútua e autolimpeza, ou transferiu, via trofalaxia, corantes para a casta grande (1,2-2,0 mm), quando estas não estavam em contato diretamente com a rainha. Os resultados indicam uma comunicação e transferência de substâncias da rainha para as operárias, bem como, uma transferência de substâncias entre as operárias.

Palavras Chave : limpeza mútua, autolimpeza, comunicação.

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1 Introdução A divisão de trabalho é fundamental para a organização das colônias de insetos sociais, ocorrendo primariamente uma divisão entre a casta reprodutiva e estéril. A casta reprodutiva está apenas envolvida na reprodução, enquanto a estéril está engajada em trabalhos para satisfazer as necessidades da colônia, conduzindo ao seu crescimento e desenvolvimento (Robinson, 1992). No caso de sociedades de formigas, a rainha reside no ninho junto aos seus filhos (operárias), pois o macho morre após a cópula. Com esta organização social a rainha desempenha, não apenas o papel de reprodutora, mas também mantém a coesão social na colônia. Esta coesão e hierarquia reprodutiva da sociedade podem ser estabelecidas através de ações químicas e físicas. Em sociedades pequenas, o controle da rainha pode ser alcançado pela intimidação física, levando a uma hierarquia reprodutiva entre a rainha e todas as suas subordinadas ou operárias (Wilson, 1971; Keller & Nonacs, 1993). Isto inclui a agressão física e o canibalismo de ovos produzidos pelas operárias. Em sociedades maiores, compostas por milhões de indivíduos, as substâncias químicas liberadas pela rainha substituem a repressão física, forçando as operárias se comportar subordinadamente a ela (Keller & Nonacs, 1993). Provavelmente em formigas cortadeiras o sistema de controle da rainha sobre a casta estéril seja mediado através de feromônios, pois em algumas espécies como Atta laevigata , os ninhos apresentam um intrincado sistema de túneis e câmaras (Moreira et al. , 2004). As operárias de Formica fusca são capazes de associar pistas químicas com a capacidade de oviposição entre as operárias da colônia (Hannonen et al. , 2002). Segundo os autores, a fecundidade das rainhas está no seu perfil de hidrocarbonetos cuticulares e atua como um feromônio para as operárias, as quais respondem aos sinais através da discriminação entre as rainhas. Em um interessante trabalho citado por Wilson (1971), Carr (1962) relatou que quando uma rainha morta de Myrmica é apresentada em intervalos regulares às colônias sem rainha, sua presença inibe o crescimento das larvas, e, portanto, reduz a probabilidade das larvas se desenvolverem em rainhas. O efeito foi removido quando os cadáveres foram separados das larvas e operárias babás por uma barreira de gaze dupla, a qual evitou que elas lambessem e tocassem a rainha morta. O autor conclui que a inibição deve-se a atuação de substâncias não voláteis.

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L.C. Forti (comunicação pessoal) observou inúmeras vezes que o exoesqueleto de rainhas mortas de Atta sexdens rubropilosa permanece por várias semanas dentro da câmara do jardim de fungo em colônias de laboratório, sendo limpa e transportada pelas operárias pelo jardim de fungo, antes de ser descartada no lixo. Tal fato sugere que a comunicação entre rainha-operária e reconhecimento da rainha em formigas cortadeiras também possa ser mediado através de sinais químicos ou percepção física. O presente trabalho buscou estudar a dispersão de substâncias proveniente da rainha para a casta estéril da colônia, apoiado na hipótese de controle da rainha sobre as operárias sobre a hierarquização reprodutiva. Para tanto, colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus tiveram suas rainhas marcadas com traçadores solúveis em água e submetidas a diferentes situações de isolamento às operárias, verificando as concentrações de corante encontradas nas castas, bem como, a parcela de indivíduos marcados em uma população conhecida.

2 Material e Métodos

2.1 Colônias de estudo Este estudo foi realizado em 20 colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus com 2 anos de idade sob condições laboratoriais, coletadas na cidade de Piracicaba, São Paulo, transportadas e mantidas no Laboratório de Insetos Sociais-Praga da Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo, Brasil. As colônias foram acondicionadas individualmente em recipientes plásticos, nos quais havia uma camada de 1 cm de gesso, com a finalidade de manter a umidade da cultura de fungo. A temperatura ambiente foi mantida, aproximadamente, a 24 oC ± 2, com uma umidade relativa de 70% ± 20. As colônias foram mantidas diariamente com folhas de Ligustrum spp. e Acalypha spp., durante a execução do experimento.

2.2 Preparação das subcolônias e isolamento da rainha A partir destas colônias foram montadas 40 subcolônias com 200 operárias, sendo 120 operárias pequenas (largura cefálica 0,7-0,9 mm) e 60 operárias médias e grandes (largura cefálica acima de 1,2 mm) e uma porção de fungo 3,91±0,71 gramas. As rainhas

103 foram liberadas dentro de 20 subcolônias imediatamente após a sua montagem. Em uma segunda etapa do experimento, estas rainhas foram transferidas a outras 20 subcolônias. Estas foram acondicionadas em recipientes cilíndricos de acrílico (altura: 10,5 cm e diâmetro: 10,5 cm) com 0,5 cm de gesso no fundo, interligadas por uma arena de forragem e a uma câmara de lixo nas extremidades opostas, ambos eram recipientes cilíndricos de acrílico (altura: 6 cm e diâmetro: 9,5 cm). As subcolônias foram montadas 14 dias antes de iniciar o experimento. As rainhas sofreram uma limitação física, consistindo de 3 tratamentos: 1) A rainha permaneceu isolada em uma pequena gaiola de acrílico cilíndrica (altura: 6 cm e diâmetro: 3 cm), com o fundo telado, sem contato físico com as operárias. As gaiolas continham orifícios ≤ 2mm de diâmetro, permitindo o contato físico com a menor classe de tamanho de operárias. Apenas operárias pequenas (60% da população) da colônia tiveram contato com a rainha e compostos voláteis e não voláteis. 2) A rainha permaneceu isolada em uma pequena gaiola de acrílico com orifícios ≥ 2 mm de diâmetro, permitindo o contato físico com todas as operárias e restringindo a rainha apenas naquele setor da colônia, portanto, simulando que todas tiveram acesso aos compostos voláteis e não voláteis. 3) A rainha permaneceu solta na colônia, sem a utilização da gaiola e as operárias tiveram contato direto com ela. 4) Um controle foi mantido nas mesmas condições da rainha sem gaiola e sem a aplicação do traçador (corante alimentício e Rodamina B®). Este trabalho avaliou: a) a concentração de corante na casta operária; b) os indivíduos corados na casta operária. O intervalo entre os dois experimentos foi de 3 meses.

2.3 Concentração de corante externo e interno na casta operária Para avaliar a importância de substâncias provindas da rainha e sua dispersão nas subcastas, utilizando um corante alimentar azul (Duas Rodas®) na concentração 50 % (p/p) em água destilada (0,04 g de corante em 0,08 g de água destilada), obtendo uma consistência pastosa que foi aplicada no pronoto e gáster das rainhas (0,0015 g). Vinte e quatro horas após a introdução da rainha nas subcolônias, as operárias foram separadas

104 novamente nas duas categorias de tamanho (largura cefálica 0,7-0,9 mm e acima de 1,2 mm), portanto 2 amostras por subcolônia. A rainha retornou a sua colônia de origem. Estas amostras foram maceradas em cadinho com 50 mL de água destilada e posteriormente coadas para retirar resíduos do tegumento das operárias, e a solução foi submetida ao espectrofotômetro, com absorbância de 610 nm. Uma curva padrão foi estabelecida para estimar a concentração do corante nas operárias, através de leituras das soluções com concentrações conhecidas. A concentração está em função da seguinte equação (Absorbância (nm) =134662,2*Conc (gramas de corante/ mL)).

2.4 Freqüência de indivíduos marcados internamente na casta operária Para estimar o número de indivíduos corados na população, utilizou-se o corante Rodamina B®, na concentração 50 % (p/p) em água destilada (0,04 g de corante em 0,08 g de água destilada), obtendo uma consistência pastosa que foi aplicada no pronoto e gaster das rainhas (0,0015 g). Vinte e quatro horas após a introdução da rainha nas subcolônias, as operárias foram separadas novamente nas duas categorias de tamanho (largura cefálica 0,7- 0,9 mm e acima de 1,2 mm), portanto 2 amostras por subcolônia. A rainha retornou a sua colônia de origem. Estas amostras foram congeladas e o gaster das operárias foi esmagado em intestino de suíno, devido a sua superfície protéica. Esta metodologia foi desenvolvida por Pretto (1996) que verificou a boa fluorescência do corante em superfície protéica sob a luz ultravioleta, mesmo em baixas concentrações. O intestino de suíno foi lavado com detergente para retirar o sal e o excesso de gordura. Um tira de polietileno (comprimento: 30 cm, largura: 3,5 cm) foi introduzida no intestino e permaneceu secando em condições naturais por 24 horas. Posteriormente as operárias congeladas foram lavadas em água destilada e secas em papel absorvente, para que o corante que estivesse no exterior das operárias não corasse o intestino. As operárias foram colocadas sobre as tiras revestidas com o intestino e o gaster foi esmagado com um bastão de vidro. A cada operária esmagada, o bastão de vidro foi lavado em água destilada e posteriormente seca em papel toalha. As tiras revestidas com o intestino foram expostas à luz ultravioleta em uma sala escura e o número de operárias marcadas foi registrado.

105

2.5 Delineamento experimental Para as avaliações da concentração de corante e indivíduos corados na casta operária foram executados 3 tratamentos (gaiola ‹ 2 mm, gaiola ≥ 2 mm, sem gaiola) com 5 repetições cada, ou seja, uma repetição consistiu de 1 subcolônia. Uma análise de variância (ANOVA) foi realizada para os indivíduos corados para a casta pequena e grande, e posteriormente uma comparação de médias através do teste de Tukey-Kramer.

3 Resultados e Discussão A transferência de substâncias oriundas da rainha para as operárias é evidenciada pela aquisição do corante nas duas castas estudadas (Fig. 1). De forma geral, em todos os tratamentos a maior concentração de corante foi encontrada na casta grande, com uma concentração variando de 0,015 a 0,025 mg/ mL de corante/ água destilada (Fig. 1). Entretanto, uma menor concentração do corante foi verificada na casta pequena (variando entre 0,004 e 0,01 mg/mL de corante Fig. 1). Observou-se que as operárias pequenas e grandes lambiam (limpavam) excessivamente o pronoto e gáster da rainha provavelmente em resposta a aplicação do corante nesta região do corpo. Nota-se que o número médio de operárias coradas da casta pequena foi significativamente maior do que quando elas acessaram livremente a rainha, ou seja, sem gaiola (Fig. 2). Um outro aspecto importante observado foi a respostas das operárias as gaiolas alocadas ao lado do seu jardim de fungo, elas tentaram transportar a rainha de volta ao seu jardim de fungo, todavia sem sucesso devido ao pequeno diâmetro dos orifícios (vide metodologia). Provavelmente, durante esta tentativa de transporte da rainha, muitas operárias que estavam executando a limpeza marcaram o seu tegumento com o corante e ao retornarem ao jardim de fungo, elas realizaram contatos ( e.g. limpeza mútua) com operárias que não tiveram contato direto à rainha. O número médio de operárias coradas da subcasta grande, quando acessaram a rainha que estava na gaiola, foi significativamente maior do que os demais tratamentos (Fig. 3), provavelmente devido ao corante adquirido na tentativa de transporte. Esta dinâmica explica uma maior concentração de corante encontrada nas operárias, cujos tratamentos envolviam o uso de gaiolas. Em contrapartida, a menor concentração de

106 corante foi encontrada no tratamento em que a rainha foi marcada e solta no jardim de fungo para ter os cuidados das operárias (Fig. 1). Desta forma, ressalta-se a importância da limpeza mutua com operárias de outra casta para a transferência e aquisição de substâncias dentro da colônia. Este comportamento propiciou a dispersão dos corantes entre as castas, e uma alta concentração de corante alimentar nas operárias grandes no tratamento em que apenas as operárias pequenas acessaram a rainha marcada (0,015 mg/mL de corante Fig. 2). Em Atta sexdens, Wilson (1983), observou que as operárias mínimas (largura cefálica entre 0,8 a 1,0 mm) freqüentemente executam mais limpeza mútua com outras operárias (60 % das observações, N=15), do que com operárias maiores (largura cefálica entre 1,2 a 1,6 mm, 40 % das observações, N=15). A autolimpeza e a limpeza mútua são fundamentais na remoção de microorganismos deletérios do tegumento (Jaccoud et al. 1999), mas este comportamento promove também a homeostase do odor colonial e no sistema de reconhecimento dos companheiros do ninho, através da transferência de hidrocarbonetos cuticulares (Lenoir et al. 1999). De acordo com Wilson (1971) uma das prováveis funções da auto limpeza seria de espalhar as secreções sobre seu próprio corpo. O autor exemplifica esta função em abelha européia, que transfere o ácido 9-ketodecenóico (9-ketodecenoic acid) sobre o seu corpo através do e transfere para as operárias pela limpeza mutua. Naumann (1991) sugeriu que o feromônio é transmitido por um mecanismo ativo em insetos sociais, e que este comportamento de limpeza representa um importante papel na comunicação rainha operária. Em Camponotus floridanus os hidrocarbonetos derivados da rainha informam as operárias à presença e ausência de uma rainha fértil e deste modo regulam a reprodução das operárias (Endler et al. 2004). Segundo os autores, a transmissão da presença e ausência da rainha, é veiculada pelos ovos da rainha que induz as operárias abster-se da reprodução. Em espécies que apresentam altas populações e um sofisticado sistema de nidificação, talvez a comunicação rainha-operária seja através da prole (ovos, larvas ou pupas) como ocorre para Componotus floridanus . Assim, as operárias teriam um importante papel na transferência de substâncias entre as castas, promovendo a comunicação e sinalização da presença ou ausência da rainha dentro da colônia.

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Uma outra possibilidade de transferência de corantes entre as castas estudadas de Acromyrmex subterraneus brunneus seria através da trofalaxia oral, operária-operária. Em Acromyrmex subterraneus subterraneus verificou-se que operárias mínimas cederam alimento para as operárias de mesmo tamanho e maior a elas, provavelmente através de trofalaxia oral (Samuels et al. 2004). As espécies de formigas são altamente variáveis na taxa de trofalaxia, de forma que reflete a sua posição filogenética e hábitos alimentares (Wilson, 1971). Paul & Roces (2003), compararam quantitativamente a taxa de absorção de fluidos em espécies de diferentes hábitos alimentares. Eles verificaram que as operárias de espécies de formigas que se alimentam de néctar e “honeydew” de homópteras, Camponotus rufipes (Formicidae) e Pachycondyla villosa (Ponerinae), coletam fluido com maiores taxas de absorção, enquanto as operárias de formigas cortadeiras Atta sexdens (Myrmicinae) e a formiga predadora do complexo de Rhytidoponera impressa com menores taxas. Considerando os hábitos alimentares, verifica-se que em espécies que coletam fluidos (néctar) durante o forrageamento, como o gênero Camponotus , possuem um papo bem desenvolvido, adaptado a esta estratégia de forrageamento. Quando a forrageira retorna ao ninho com o papo preenchido ela regurgita e distribui o alimento através da trofalaxia oral para os companheiros do ninho (Hölldobler & Wilson, 1990). Enquanto, a baixa taxa de absorção de fluidos reflete outras estratégias de forrageamento. Em Atta sexdens , as operárias coletam folhas para o cultivo do fungo simbionte, ingerem apenas líquidos extravasados no momento do corte e processamento vegetal, e raramente visitam fontes de néctar (Littledyke & Cherrett, 1976). De acordo com estas evidências, nos habilitamos a conjecturar de que a trofalaxia ocorra em baixa freqüência ou até mesmo ausente neste grupo. Andrade et al. (2002) argumentam que a trofalaxia não é o maior agente desencadeador da contaminação das operárias com inseticidas na colônia, e que a intoxicação deva ocorrer através do contato direto com as iscas tóxicas durante o seu processamento e incorporação no jardim de fungo, e também durante a limpeza mútua e auto-limpeza. Desta forma, conclui-se que a trofalaxia oral entre adultos em formigas cortadeiras é uma questão bastante contraditória e uma rota pouco confiável para as trocas de corante e/ou substâncias entre as subcastas deste experimento.

108

A dispersão dos corantes estudados neste trabalho através de trofalaxia oral ainda é uma questão que merece um estudo adicional, bem como, a existência ou não de trofalaxia oral entre as operárias de formigas cortadeiras ( Atta e Acromyrmex ) e sua importância funcional na alimentação e comunicação química deste grupo de insetos. Com a evidente dispersão dos corantes hidrossolúveis nas colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus , e sugere-se que a transferência de corante da rainha para as castas e entre as operárias ocorre através de limpeza mútua e auto-limpeza, e que estas rotas possivelmente são utilizadas para passagens de substâncias oriundas da rainha para toda a colônia.

109

0,00003

0,000025

0,00002 0,7-1,1 mm 0,000015 1,2-2,0 mm

Concentração (g/ml) Concentração 0,00001

0,000005

0 Testemunha Gaiola MENOR Gaiola MAIOR 2 Sem gaiola c/ 2 mm mm corante Tratamentos

Figura 1. Concentrações média (g/mL) do corante alimentar encontrado nas operárias de Acromyrmex subterraneus brunneus, em 20 colônias laboratoriais.

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80 a* 70 ab 60 50 b 40 30 20 10 0 Gaiola ‹ 2 mm Gaiola ≥ 2 mm Sem gaiola

Figura 2. Número médio de indivíduos corados da subcasta pequena em 5 colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus . F=6,204, p=0,0141

80 70 a* 60 50 40 b 30 b 20 10 0 Gaiola ‹ 2 mm Gaiola ≥ 2 mm Sem gaiola

Figura 3. Número médio de indivíduos corados da subcasta grande em 5 colônias de Acromyrmex subterraneus brunneus . F=17,832, p=0,0003

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4. CONCLUSÕES

1) Existência de polietismo etário; 2) Produção de machos pelas operárias; 3) Habilidade das operárias em discriminar entre as larvas; 4) Estabelecimento do repertório comportamental das operárias e machos em colônia sem rainha; 5) Machos produzidos por colônias sem rainhas podem estar aptos ao acasalamento; 6) Transferência de substâncias da rainha para as operárias e entre elas.

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