Identification De Facteurs De Régulation Du VIH-1 Chez Les Macrophages Humains

Identification de facteurs de régulation du VIH-1 chez les macrophages humains

Mémoire

Yann Breton

Maîtrise en microbiologie-immunologie Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Identification de facteurs de régulation du VIH-1 chez les macrophages humains

Mémoire

Yann Breton

Sous la direction de :

Michel J. Tremblay, directeur de recherche

Résumé

Lors d'une exposition au VIH-1, bien qu'une seule petite proportion des macrophages soit infectée, il est proposé que ces cellules jouent un rôle important dans l'infection et la propagation du VIH-1. Pour approfondir nos connaissances dans ce domaine, des analyses transcriptomiques et protéomiques ont été effectuées afin de comparer les MDMs (Macrophages Dérivés de Monocytes) infectés aux non infectés. Ces analyses ont mené à la sélection de 50 gènes dont l'expression est modulée chez les cellules infectées pour effectuer un criblage par siRNA pour leurs rôles fonctionnels dans le cycle viral. Huit cibles ont été identifiées comme des régulateurs de l'infection chez les MDMs, mais seulement le gène MDM2 agissait comme un facteur de susceptibilité. Ce gène a donc été l'objet d'études plus approfondies. L'inhibition de l'expression de MDM2 induit une diminution de moitié de l'expression virale. Nos résultats indiquent que la résistance accrue au VIH-1 associée à l’interférence de MDM2 est maintenue même si le niveau d'ARNm est rétabli, suggérant que cette protéine serait impliquée indirectement dans l'infection par le VIH-1. L'identification des cofacteurs viraux régulés par MDM2 mènera à une compréhension des évènements signalétiques contrôlant la réplication du VIH-1 dans les macrophages.

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Abstract

Upon exposure to HIV-1, only a small proportion of macrophages are infected whereas most remain uninfected. It is proposed that these cells play an important role in the establishment and propagation of HIV-1 infection. To further our knowledge in this field, transcriptomic and proteomic comparative analyses of uninfected and HIV-1-infected MDMs (Monocyte-derived macrophages) were performed. These analyses led to the selection of 50 genes that were tested for their functional roles in HIV-1 replication by siRNA screen. Eight genes were identified as regulators of HIV-1 infection in MDMs, but only MDM2 acted as a susceptibility factor. The knockdown of MDM2 decreased HIV-1 expression by two folds. Our results indicate that the resistance to HIV-1 upon MDM2 silencing is maintained in MDMs even if MDM2 mRNA level is restored, thus suggesting that this protein might be indirectly involved in HIV-1 infection. Identification of viral cofactors regulated by MDM2 will bring a new understanding of signaling events controlling HIV-1 replication in macrophages.

Table des matières

Résumé ...... iii Abstract ...... iv Table des matières ...... v Liste des tableaux ...... viii Liste des figures ...... ix Liste des abréviations ...... x Remerciements ...... xiii Chapitre 1: Introduction ...... 1 1.1. Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1 ...... 1 1.1.1. Historique et état actuel de l'épidémie ...... 1 1.1.2. Le génome ...... 2 1.1.3. Structure du virion ...... 3 1.1.4. Cycle de réplication du VIH-1 ...... 4 1.1.4.1. Évènements précoces ...... 4 1.1.4.2. Évènements de biosynthèse ...... 5 1.1.4.3. Évènements tardifs ...... 6 1.1.5. Immunopathogenèse du VIH-1 ...... 8 1.1.5.1. Transmission du virus ...... 8 1.1.5.2. Phases de l'infection ...... 9 1.1.5.3. Les réservoirs viraux ...... 11 1.1.6. Les antirétroviraux ...... 12 1.2. Les macrophages ...... 13 1.2.1. Les macrophages tissulaires ...... 13 1.2.2. Les macrophages dérivés de monocytes ...... 14 1.2.3. La polarisation des macrophages ...... 15 1.3. L'infection des macrophages par le VIH-1 ...... 17 1.3.1. Caractéristiques du cycle viral chez les monocytes et macrophages ...... 17 1.3.2. Polarisation des macrophages et VIH-1 ...... 19 1.3.3. Impacts du virus sur les fonctions cellulaires ...... 20 1.3.4. Les facteurs de restriction virale ...... 20 Chapitre 2: Hypothèse et objectifs de recherche ...... 24 Chapitre 3: Matériels et Méthodes...... 25

3.1. Production de particules virales ...... 25 3.1.1. Modèles viraux ...... 25 3.1.2. Culture de la lignée cellulaire 293T ...... 26 3.1.3. Transfection au calcium-phosphate ...... 27 3.1.4. Récolte et conservation de la production virale...... 27 3.1.5. Caractérisation de la production virale ...... 28 3.1.5.1. ELISA de la protéine de capside p24 ...... 28 3.1.5.2. Culture de la lignée cellulaire TZM-bl et TCID50 des particules virales ...... 29 3.2. Isolement et culture de MDMs à partir de sang périphérique de donneurs sains 30 3.3. Criblage de petits ARN interférents chez les MDMs ...... 32 3.3.1. Transfection des siRNAs ...... 32 3.3.2. Infection des MDMs et analyse de l'infection ...... 33 3.4. Validation des cibles potentielles ...... 34 3.4.1. Cytométrie de flux ...... 34 3.4.2. Extraction d'ARN et PCR quantitative ...... 35 3.4.3. Immunobuvardage ...... 36 3.4.4. Cinétique de production virale ...... 37 3.5. Analyses statistiques ...... 37 Chapitre 4: Résultats ...... 38 4.1. Identification de protéines régulatrices du VIH-1 chez les macrophages humains ...... 38 4.1.1. Criblage de petits ARN interférents ...... 38 4.1.2. Efficacité des petits ARN interférents ...... 40 4.2. Validation de MDM2 comme facteur de régulation du VIH-1 ...... 42 4.2.1. Le gène MDM2 est surexprimé dans les macrophages infectés ...... 42 4.2.2. La transfection des siRNAs contre MDM2 diminue l'infection par le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA ...... 43 4.2.3. La diminution du niveau de MDM2 n'induit pas de mort cellulaire ...... 44 4.2.4. Vérification de l'expression de MDM2 suite à la transfection ...... 45 4.2.5. Modulation de la production virale par les ARNs interférents ...... 47 Chapitre 5: Discussion ...... 50 5.1. Identification de facteurs de régulation potentiel du VIH-1 ...... 50 5.2. Identification de MDM2 comme régulateur positif de l'infection ...... 54 5.2.1. Modulation de l'infection médiée par MDM2 ...... 54

5.2.2. Régulation induite par la voie p53-dépendante ...... 56 5.2.3. Régulation induite par la voie p53-indépendante ...... 57 Chapitre 6: Conclusion et perspectives ...... 59 Bibliographie ...... 61

vii

Liste des tableaux

Tableau 1: Gènes modulant l'infection par le VIH-1 ...... 40

viii

Liste des figures

Figure 1: Prévalence du VIH chez les adultes (15-49 ans), 2014 par région du WHO ...... 2 Figure 2: Le génome du VIH-1 et le rôle des protéines virales ...... 3 Figure 3: Structure du VIH-1 ...... 4 Figure 4: Cycle de réplication viral et les facteurs de restriction ...... 8 Figure 5: Les stades de l'infection et leurs marqueurs immunologiques ...... 9 Figure 6: Pathogénèse du VIH-1 ...... 11 Figure 7: Classification actuelle des macrophages polarisés ...... 16 Figure 8: Représentation schématique du plasmide NL4-3-IRES-HSA ...... 26 Figure 9: Séparation des cellules présentes dans le sang périphérique ...... 30 Figure 10: Criblage de petits ARN interférents des gènes modulés par le VIH-1 révèle de nouveaux régulateurs de la réplication virale chez les macrophages ...... 39 Figure 11: Efficacité des siRNAs sur le niveau d'ARNm ...... 41 Figure 12: Modulation de l'infection par le siMDM2 ...... 42 Figure 13: Le gène MDM2 est surexprimé chez les cellules infectées par le VIH-1 ...... 43 Figure 14: La réduction de l'expression de MDM2 induit une diminution de l'infection ... 44 Figure 15: Des essais de viabilité ne montrent aucune toxicité apparente causée par l'interférence par ARN du gène MDM2 ...... 45 Figure 16: Les siRNAs MDM2 diminuent efficacement le niveau d'ARNm ...... 46 Figure 17: L'interférence par ARN du gène MDM2 réduit son expression protéique ...... 47 Figure 18: Modulation de la production virale et du métabolisme des MDMs par la transfection de petits ARN interférents ...... 49

Liste des abréviations

AB-HS De l'anglais AB-human serum

ADN Acide désoxyribonucléique

ARN Acide ribonucléique

ARNm Acide ribonucléique messager

BSA De l'anglais Bovine Serum Albumin

CA Capside

CD Cluster de différenciation

DC De l'anglais Dendritic cell

DPBS De l'anglais Dulbecco's phosphate-buffered saline dNTP Désoxyribonucléotides dpi De l'anglais days post-infection

DSB De l'anglais Double strand break

ELISA De l'anglais Enzyme-linked immunosorbent assay

Env Enveloppe

FDA De l'anglais Food and Drug Administration

F-Luc De l'anglais Firefly luciferase

Gag De l'anglais Group-specific antigen

GALT De l'anglais Gut-associated lymphoid tissue

GFP De l'anglais Green fluorescent protein

HBS De l'anglais Hepes buffered saline

HBSS De l'anglais Hanks' Balanced Salt Solution hpi De l'anglais hours post-infection

HRP De l'anglais Horseradish peroxydase

HSA De l'anglais Heat stable antigen

IFN Interféron

IL Interleukine

IN Intégrase

LC De l'anglais Langerans cell

LPS Lipopolysaccharide

LTR De l'anglais Long terminal repeat ly T CD4+ Lymphocytes T CD4+

M-CSF De l'anglais Macrophage colony-stimulating factor

MA Matrice

MDM Macrophage dérivé de monocyte

MOI De l'anglais Multiplicity of infection

NC Nucléocapside

Nef De l'anglais Negative factor

NTP Nucléoside triphosphate p24 Protéine de capside virale

PBMC De l'anglais Peripheral blood mononuclear cells

PBL De l'anglais Peripheral blood lymphocytes

PBS De l'anglais Phosphate-buffered saline

PCR De l'anglais Polymerase chain reaction

PE Phycoérythrine

PIC De l'anglais Pre-integration complex

Pol Polymérase

PR Protéase

Rev De l'anglais Regulator of viral gene expression

RPMI De l'anglais Roswell Park Memorial Institute

RT De l'anglais Reverse Transcriptase

RT-PCR De l'anglais Reverse transcription polymerase chain reaction

SIDA Syndrome de l'immunodéficience acquise siRNA De l'anglais Small interfering ribonucleic acid

Tat De l'anglais Transactivator of transcription

TCID50 De l'anglais 50% Tissue culture Infective Dose

TLR De l'anglais Toll-like receptor

TNF De l'anglais Tumor necrosis factor

Vif De l'anglais Viral infectivity factor

Vpu De l'anglais Viral protein U

Vpr De l'anglais Viral protein R

VIH-1 Virus de l'immunodéficience humaine de type 1

VIS Virus d'immunodéficience simienne

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Remerciements

Tout d'abord, je voudrais remercier le Dr Michel J. Tremblay d'avoir accepté de superviser le stage de recherche d'un jeune étudiant en microbiologie, puis ses études de maîtrise et prochainement ses études doctorales. Merci beaucoup Michel d'être un superviseur exemplaire, toujours prêt à écouter nos questions et nos inquiétudes, autant sur le plan personnel que professionnel et à nous encourager lors des bons moments, mais aussi dans les moins bons. J'aimerais aussi remercier mon comité d'évaluation pour le temps consacré à mon mémoire.

Merci à tous les membres de l'équipe MJT, passés et présents, d'être aussi fous tout en faisant « de la bonne science ». Vous rendez les longues journées dans le NC3 bien plus plaisantes que les bruits de l'autoclave! Un merci tout spécial à Alizé et Jean-François pour tous les petits moments de décompression. Je garderai de nombreux souvenirs de nos discussions parfois trop intenses. Merci aussi à Alexandre et Michel Ouellet pour le temps consacré à ma formation et à l'élaboration de ce projet.

Je n'aurai pas pu me rendre aussi loin dans mes études sans le soutien de ma famille. Malgré les quelque 800 km qui me séparent de mon Abitibi natal, sans oublier mes proches en Gaspésie (l'autre extrémité du Québec), j'ai toujours pu compter sur votre aide et votre support tout au long de mes études. Vous m'avez laissé partir en sachant bien que je ne pourrai pas travailler en région, mais vous m'avez soutenu dans toutes mes décisions et vous avez toujours cru en moi. Sachez que je vous en suis grandement reconnaissant!

Merci au Consortium canadien de recherche sur la guérison du VIH (CanCURE) pour le financement. C'est d'ailleurs très encourageant et motivant de voir une collaboration si importante entre des équipes de recherche partageant le même but.

Finalement, un grand merci à mon conjoint Frédéric d'être présent dans ma vie. Je peux toujours compter sur toi pour me remettre dans le bon chemin pour atteindre mon but lorsque je commence à douter de moi-même. Merci pour ton écoute lorsque je te parle de ma journée et des multiples techniques et appareils qui ne te disent absolument rien! Tu as rendu ces deux dernières années beaucoup plus faciles, en espérant que tu es prêt pour m'accompagner dans celles à venir!

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Chapitre 1: Introduction

1.1. Le virus de l'immunodéficience humaine de type 1

1.1.1. Historique et état actuel de l'épidémie

Entre 1979 et 1981, plusieurs cas de pneumonie causée par Pneumocystis carinii font surface dans une communauté homosexuelle, montrant tous les signes d'une immunosuppression [1]. En réponse aux cas de plus en plus fréquents dans plusieurs pays, le terme SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise) fut adopté pour ce phénomène. C'est en France en 1983 que l'agent causal fut isolé pour la première fois. L'équipe du Dr Luc Montagnier, de l'institut Pasteur de Paris, a isolé un virus inconnu à partir d'un ganglion lymphatique d'un patient homosexuel, identifié comme un membre de la famille des HTLV (human T-cell leukemia virus). Cette particule virale a montré la capacité de se propager dans une culture de lymphocytes T provenant d'un donneur sain. Ce virus sera nommé LAV pour lymphadenopathy-associated virus [2]. En 1984, l'équipe du Dr Robert C. Gallot, située aux États-Unis, découvrit aussi un virus aux mêmes propriétés qu'ils nommèrent HTLV-III [3]. Des études génétiques ont montré qu'il s'agissant de deux variants d'un même virus, recevant officiellement en 1986 son nom actuel par une décision du International Committee on Taxonomy of Viruses: le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) [4, 5].

Actuellement, selon le dernier rapport d'ONUSIDA de 2015, 36.9 millions de personnes vivaient avec le VIH. Le nombre de nouvelles infections est de 2 millions/année, alors que 1.2 million/an de personnes infectées au VIH-1 décèdent de maladies associées au SIDA. Cependant, le nombre de nouvelles infections a diminué de 35% depuis 2000 et le nombre de décès de 42%. C'est en Afrique que la prévalence est la plus forte (voir Figure 1 pour les données de 2014). Même si ces nombres sont toujours trop élevés, la tendance montre que la prévention et les thérapies antivirales sont efficaces. En juin 2015, il a d'ailleurs été calculé que 15.8 millions de personnes vivantes avec le VIH avaient accès aux thérapies antirétrovirales. Le but d'ONUSIDA est de mettre fin à l'épidémie d'ici 2030 et a élaboré le plan 90-90-90: que 90% des personnes infectées connaissent leur statut, que 90% des personnes séropositives aient accès au traitement antirétroviral et que 90% des personnes sous médication voient leur charge virale supprimée [6].

Figure 1: Prévalence du VIH chez les adultes (15-49 ans), 2014 par région du WHO Prévalence mondiale du VIH-1 chez les adultes en 2014. Figure issue du site internet du World Health Organisation (WHO) [7].

1.1.2. Le génome

Le VIH-1 est un rétrovirus du genre Lentivirus ayant un génome petit, mais complexe. La particule virale renferme deux copies d'un même ARN simple brin de polarité positive et d'une longueur de 9200 nucléotides. Cet ARN code pour trois polyprotéines (gag, pol et env) et six protéines régulatrices et accessoires (voir Figure 2 pour le rôle de chacune). Le génome viral est flanqué de séquences non traduites (LTR) à chacune de ses extrémités. Ces séquences terminales longues répétées sont impliquées dans la régulation de la transcription des gènes viraux, dans la transcription inverse et dans l'intégration du génome viral dans celui de la cellule hôte [8, 9].

Figure 2: Le génome du VIH-1 et le rôle des protéines virales Représentation du génome viral et description des diverses protéines virales codées par chacun des gènes. Figure issue de Greene, W.C. et Peterlin, B.M., 2002 [10].

1.1.3. Structure du virion

La particule virale est sphérique et son diamètre est d'environ 120 nm [9]. Elle est enveloppée d'une bicouche lipidique provenant de la cellule hôte lors du bourgeonnement du virion. Cette enveloppe comporte les trimères de gp120 et gp41 ainsi que plusieurs molécules de l'hôte telles que HLA-DR et ICAM-1, impliquées respectivement dans la présentation d'antigène et l'adhésion cellulaire [11]. Sous l'enveloppe virale se retrouve une structure formée par la protéine de matrice (MA, p17) qui confère la forme sphérique au virus (voir Figure 3). À l'intérieur du virion se trouve la capside virale, un assemblage conique d'environ 1500 copies de la protéine de capside (CA, p24). La capside est définie comme étant le cœur du virus. Elle contient les deux copies de l'ARN viral stabilisées par la nucléocapside (NC). On y retrouve aussi les enzymes nécessaires au cycle viral, soit la

transcriptase inverse (RT), l'intégrase (IN) et la protéase (PR), ainsi que les protéines régulatrices conférant le pouvoir infectieux du virus (Vif, Vpr et Nef) [12].

Figure 3: Structure du VIH-1 Coupe transversale d'un virion mature. Figure issue de Robinson, H.L., 2002 [13].

1.1.4. Cycle de réplication du VIH-1

1.1.4.1. Évènements précoces

Le virus possède à sa surface des trimères de glycoprotéines. Ceux-ci sont composés des glycoprotéines gp120 et gp41 dont les noms proviennent de leur taille respective de 120 et 41 kilodaltons. Ces deux glycoprotéines résultent du clivage de la polyprotéine gp160, aussi nommée en fonction de sa taille, par des protéases cellulaires [14, 15]. Les deux sous-unités forment ensuite un hétéroduplexe où la gp41 est transmembranaire et la gp120 se trouve dans la matrice extracellulaire. Ces hétéroduplexes sont retrouvés sous forme de trimères et seront incorporés chez le virion lors du bourgeonnement [16, 17]. La gp120 est la glycoprotéine qui permet au virus de s'attacher à son récepteur cellulaire, le CD4. La gp120 contient 5 domaines variables (V1 à V5) et 5 domaines conservés (C1 à C5) [18]. Sa structure tridimensionnelle forme une cavité pouvant accueillir le CD4. Cette cavité possède une poche profonde qui reçoit un acide aminé du récepteur CD4 critique pour la

liaison: le phénylalanine-43 [19]. Cet attachement entraîne un changement de conformation de la gp120 et du CD4, rapprochant le virus de la membrane cellulaire pour permettre la liaison au corécepteur. Étant donné que le virus est fortement sujet aux mutations, les séquences des domaines variables risquent d'être modifiées [20]. La région V3, plus précisément, a un rôle à jouer dans le tropisme de la particule virale. Dépendamment de sa séquence, le virus aura un tropisme dit R5 ou X4, chacun reconnaissant respectivement le corécepteur CCR5 ou CXCR4 [21-23]. La liaison à ce corécepteur libère le peptide de fusion situé en position N-terminale de la gp41. Il s'agit d'une séquence d'acides aminés hautement hydrophobique qui s'associe aux lipides membranaires de la cellule et entraîne la fusion de l'enveloppe virale à celle-ci, libérant la capside virale dans le cytoplasme [24].

1.1.4.2. Évènements de biosynthèse

Une fois entrée dans le cytoplasme, la capside virale se désassemble (voir Figure 4). La décapsidation serait causée par la cyclophiline A, une molécule incorporée dans le virion lors de la formation de la capside. Cette molécule stabilise la capside virale et protégerait aussi le génome viral lors de sa migration dans le cytoplasme, permettant d'échapper au système immunitaire. Cependant, lors d'une nouvelle ronde d'infection, la p24 qui n'est pas associée à la cyclophiline A recrute la protéine Nup358, menant à la décapsidation et à la libération de son contenu dans le cytoplasme [25, 26]. L'ARN simple brin et les protéines virales sont libérés et participent à la formation du complexe de réplication. Celui-ci est composé de l'ARN viral, la protéine de matrice (MA), de nucléocapside (NC), la RT, l'intégrase, la protéase, Vpr, l'ARN de transfert Lys 3 ainsi que les histones H1, H2a, H2b, H3 et H4 [10, 27]. La protéine de matrice se retrouve sous forme phosphorylée, ce qui l'empêche d'être associée à la membrane cellulaire et l'amène plutôt à se lier au cytosquelette d'actine, permettant une rétrotranscription efficace de l'ARN viral en ADN double brin [28]. Cependant, la transcriptase inverse du VIH-1 permet plusieurs erreurs. Il a été calculé que celle-ci introduit une mutation par 6000 nucléotides, expliquant la grande variabilité génétique de ce virus [29]. L'ADN nouvellement synthétisé se retrouve sous forme linéaire et est flanqué de région LTR. Il formera ensuite le PIC (complexe de préintégration) avec l'intégrase, la RT, la MA, la Vpr et le HMGI(Y) (high-mobility group

DNA-binding protein) [10, 30]. Le PIC profite du réseau microtubulaire de la cellule pour migrer vers le noyau et y entrer. Ce complexe protéique possède des propriétés caryophiles grâce à ses signaux de localisation nucléaire (NLS, nuclear localization signal) se trouvant sur la MA, la Vpr et l'intégrase. Il sera donc transporté activement au travers de la membrane nucléaire par les importines et karyophérines, expliquant pourquoi le VIH-1 peut infecter des cellules ne se divisant pas et y intégrer son génome [31-33]. Une fois à l'intérieur du noyau cellulaire, l'intégrase clive les extrémités de l'ADN viral pour y enlever deux nucléotides au bout 3' des brins, puis catalyse la réaction d'intégration dans l'ADN cellulaire [30]. Le virus est maintenant présent dans la cellule sous forme de provirus. Le provirus peut être présent sous deux états: latent ou réplicatif [34]. Le virus peut être intégré dans bien des locations sur les divers chromosomes, mais il aura tendance à choisir des régions transcriptionnellement actives, appelées hotspots, et évitera les régions répétées des centromères afin d'assurer sa transcription [35, 36]. Le LTR en position 5' du provirus recrute l'ARN polymérase de type II qui produira seulement de courts transcrits d'ARNm pour les gènes tat, rev et nef. Cependant, lorsque les facteurs de transcription tels que NF- κB et NFAT sont recrutés à un site amplificateur de la transcription en amont du LTR et que la protéine virale Tat est suffisamment présente pour se lier à la région TAR (transactivation response), l'ARN pol II peut effectuer une élongation efficace de l'ARN viral [37]. Des ARNm de diverses tailles seront produits, soit un ARN non épissé d'environ 9 kb (kilobases) codant pour Gag et Gag-Pol, des ARNm d'environ 4 kb produits par épissage unique codant pour Vif, Vpr, Vpu et Env et d'autres ARNm faisant près de 2 kb produits par épissages multiples, résultant en les protéines Tat, Rev et Nef. Les ARNm de 2 kb seront les premiers à quitter le noyau pour être traduits en protéines. Une fois qu'une certaine concentration de Rev est atteinte, cette dernière servira à l'exportation des autres transcrits viraux présents dans le noyau vers le cytoplasme [38].

1.1.4.3. Évènements tardifs

La dernière étape du cycle viral est la production de nouvelles particules virales Gag infectieuses. Le précurseur de la polyprotéine Gag, nommé Pr55 en fonction de son poids de 55 kDa, sera exprimé dans le cytoplasme. Ce précurseur est composé de quatre

domaines correspondant aux protéines MA, CA, NC et p6 [39]. Les Pr55Gag synthétisés s'associent aux radeaux lipidiques présents dans la membrane plasmique via une interaction entre la séquence MA et les lipides membranaires [40-42]. Près de 2000 polyprotéines Gag vont se concentrer à la membrane cellulaire, en plus d'environ 200 polyprotéines Gag-Pol. Deux brins d'ARNs génomiques seront recrutés sous forme de dimère au site d'assemblage par le domaine NC de Gag, grâce à ses propriétés de protéine chaperonne d'acides nucléiques [43, 44] . La glycoprotéine d'enveloppe, quant à elle, est exprimée au niveau du réticulum endoplasmique rugueux (RER) sous forme de polyprotéine nommée gp160, puis transformée par l'appareil de Golgi en trimères de gp120 et gp41. Ces trimères sont transportés à la surface de la cellule et forment des spicules au travers de la membrane cellulaire. La partie cytosolique de gp41 s'associe aux domaines MA de Pr55Gag [45]. Le virus utilise ensuite la machinerie cellulaire du sentier ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) pour remodeler la membrane cellulaire et mener au bourgeonnement du virus [46]. Le domaine p6 de Gag est aussi impliqué dans la production de particule virale, car des mutations dans sa séquence empêchent le bourgeonnement et mènent à une accumulation de particule virale à la membrane plasmique [47]. Lors de la sortie de la particule virale, celle-ci emporte une partie de la membrane plasmique contenant les protéines d'enveloppe et des molécules de l'hôte (voir section 1.1.3.). L'étape finale du cycle viral est la maturation du virus. La protéase virale clive les polyprotéines Gag et Pol, résultant en les protéines de structures (MA, CA, NC) et les enzymes virales (l'intégrase, la protéase et la transcriptase inverse), conférant au virus sa structure finale et son infectivité [48, 49].

Figure 4: Cycle de réplication viral et les facteurs de restriction La réplication du VIH-1 peut être interrompue à plusieurs étapes du cycle par des protéines de la cellule hôte. Figure issue de Barré-Sinoussi, F. et al., 2013 [50].

1.1.5. Immunopathogenèse du VIH-1

1.1.5.1. Transmission du virus

Chez une personne infectée et non traitée, le virus peut être retrouvé dans ses fluides biologiques, dans ses tissus et ses muqueuses. Cependant, le sang, le lait maternel, le sperme et les sécrétions vaginales, contenant tous des particules virales, sont les causes de nouvelles infections via trois modes de transmission possibles. Le premier et le plus fréquent est par relations sexuelles non protégées, qu'elles soient vaginales ou anales. Le deuxième est par les produits sanguins alors que le troisième est la transmission de la mère à l'enfant, aussi appelée transmission verticale, lors de la grossesse, l'accouchement ou encore l'allaitement du nouveau-né [51]. Alors que la transmission sexuelle est la plus fréquente, elle n'est pas la plus efficace (8 infections sur 10 000 expositions chez le récepteur lors d'une relation vaginale et 138 infections sur 10 000 chez le récepteur d'une relation anale). C'est plutôt la transmission sanguine, spécifiquement lors de transfusion de produits sanguins (9250 infections sur 10 000 expositions), suivie de la transmission mère- enfant (2260 infections sur 10 000 expositions) [52].

1.1.5.2. Phases de l'infection

L'infection peut être séparée en 7 phases, dépendamment des marqueurs pouvant être détectés dans le plasma du patient (voir Figure 5). Il y a d'abord une phase éclipse suite à l'infection où le virus ne peut être détecté par la méthode la plus sensible, soit la PCR de l'ARN viral. Celui-ci est détectable à partir du 10e jour suivant l'infection et marque le début de la phase 1. Le nombre de copies d'ARN viral grimpe de manière exponentielle à partir de cette phase. La phase 2 est marquée par la présence de l'antigène p24 et la phase 3 par la présence d'anticorps dirigés contre le VIH-1. La phase 3 représente donc la séroconversion du patient. Une fois la phase 4 débutée, la virémie commence à décliner et un certain patron de protéines est détectable par immunobuvardage, sans que celui-ci réponde aux critères de la Food and Drug Administration (FDA). L'étape 5 consiste en la fin de la phase aiguë de l'infection et la présence d'un patron spécifique pour les protéines virales, sauf pour la polyprotéine Pol (p31). Le début de la phase chronique de l'infection, la phase 6 représente une virémie stable et la présence de Pol [53].

Figure 5: Les stades de l'infection et leurs marqueurs immunologiques Chaque stade de l'infection par le VIH-1 est accompagné d'antigènes ou d'anticorps spécifiques pouvant être détectés dans le plasma du patient. Figure issue de McMichael, A.J. et al., 2010 [54].

Lors de l'entrée des virions dans la lamina propria des muqueuses, ceux-ci se retrouvent devant un bassin de lymphocytes T CD4+ (lyT CD4+), macrophages et cellules dendritiques (DC), naturellement présents afin de prévenir les infections. Ici débute la séroconversion, c'est-à-dire l'activation de l'immunité humorale, où il y aura une production d'anticorps dirigés contre les protéines virales. Les premières cellules à être infectées sont les lyT CD4+ et les cellules de Langerhans (LC) [55]. DC-SIGN, une lectine de type C présente chez les DC, permet aussi à ces cellules de capter les particules virales en liant les gp120. DC-SIGN n'agit pas en tant que récepteur du VIH, mais permet plutôt de favoriser l'infection des lyT CD4+ ou d'autres cellules sujettes à l'infection [56]. Dans les 3 à 6 jours suivant l'infection, les cellules infectées et les DC ayant capté des virus, migrent vers les ganglions lymphatiques, principalement le GALT (gut-associated lymphoid tissue), où il y aura une réplication massive du virus. Cette expansion virale induira une déplétion dans le nombre de lyT CD4+ dans les ganglions lymphatiques, puis systémiques (voir Figure 6). [57] La diminution des lyT CD4+ dans le GALT mène aussi à de la translocation bactérienne, activant le système immunitaire et favorisant la réplication virale [58].

L'infection entraînera une réponse de l'immunité innée. Un phénomène appelé cytokine storm se produit dans la phase aiguë de l'infection, où il y a une forte augmentation d'IFN-α et d'IL-15 comme réponse antivirale et de la chimiokine IP-10. S'ensuit une production de TNF et de MCP-1 qui sera soutenue lors de l'établissement de l'infection. Cette vague de cytokine est produite principalement par les DC, mais les autres cellules de l'immunité innée (monocytes/macrophages, cellules NK) participent aussi à cette réponse [59, 60]. Ces cytokines activent constamment les lyT CD4+ et est l'un des facteurs menant à leur déplétion. Les cellules NK peuvent aussi éliminer les cellules infectées par le virus [61].

La réponse adaptative du système immunitaire, quant à elle, est inefficace pour contrôler l'infection. Les premiers anticorps, dirigés contre la gp41, sont produits par les lymphocytes B 8 jours après que le virus soit détectable dans le sang, retrouvés sous forme de complexes immuns avec les virions, et après 13 jours pour des anticorps libres. Les anticorps contre la gp120, eux, n'apparaissent qu'autour du 28e jour suivant la détection du virus. Les IgG et IgM ainsi produits n'ont que peu d'impacts sur la réplication virale et l'établissement de l'infection [62]. Les premiers anticorps neutralisants apparaissent plus tard, soit à partir du 3e mois suivant l'infection. Ces anticorps sont spécifiques aux protéines d'enveloppe, mais

ceci mène à la sélection de virus pouvant évader la réponse adaptative grâce au fort taux de mutations lors de la réplication virale [63]. L'activité cytotoxique des lyT CD8+ débute lors du pic de virémie dans le plasma. Ces lymphocytes détruisent les cellules présentant les peptides dérivés de Nef, puis évoluent de manière à répondre à ceux provenant de Gag, Pol et Env [64]. Cette adaptation assure que le virus échappe de moins en moins au système immunitaire et finit par assurer un certain contrôle de la virémie.

Figure 6: Pathogénèse du VIH-1 Évolution de la virémie lors de l'infection jusqu'à la phase SIDA et son impact sur le nombre de lyT CD4+. Figure issue de Pantaleo, G. et al., 1993 [65].

1.1.5.3. Les réservoirs viraux

Les patients sous traitement sont en mesure de conserver leur charge virale sous le seuil de détection. Malgré ce contrôle, des cellules infectées persistent de manière latente, c'est-à- dire qu'elles contiennent l'ADN viral, mais ne produisent pas de nouvelles particules infectieuses. Cette latence virale peut être soit pré ou post-intégration [66]. Ces cellules peuvent être réactivées afin de sortir le virus de sa phase latente et mener à la production de nouveaux virions [67]. L'établissement de ces réservoirs viraux semble se produire dès la phase éclipse de l'infection [68]. Lorsqu'un patient arrête sa thérapie, la charge virale se

rétablit dans le plasma dans les 3 semaines suivant l'interruption, l'obligeant à être sous médication à vie [69].

Les réservoirs viraux sont formés par plusieurs types cellulaires. Le plus étudié est le lyT CD4+ mémoire. Ces réservoirs sont maintenus lors de la thérapie par la prolifération des lymphocytes, mais la proportion de cellules portant le virus latent diminue avec le temps, si la thérapie est maintenue [70, 71]. Les lyT CD4+ effecteurs, soit les Th1 et Th17, contribuent aussi au maintien de la persistance virale lors de la thérapie [72]. Les cellules de l'immunité innée forment d'autres réservoirs viraux. Les monocytes, microglies, astrocytes, macrophages intestinaux et macrophages alvéolaires sont tous rapportés pour contenir l'ADN viral intégré [73-76]. Ces cellules devront toutes être éliminées afin d'éradiquer le VIH-1 chez un patient.

Un problème dans l'élimination de ces cellules est qu'elles sont présentes dans des sanctuaires pharmacologiques, c'est-à-dire des tissus difficiles d'accès pour les drogues antivirales. Le GALT, le RALT (rectal-associated lymphoid tissue), les ganglions lymphatiques, le système nerveux central et le tractus génital (mâle et femelle) sont considérés comme des sanctuaires. Les macrophages sont aussi considérés comme des sanctuaires dus à leur expression de transporteurs à efflux, rendant difficile de garder une concentration intracellulaire efficace pour les drogues antivirales [77].

1.1.6. Les antirétroviraux

La découverte de molécules inhibitrices de la protéase virale et de la transcriptase inverse dans les années 90 a ouvert la porte à une monothérapie, qui rapidement a évolué en une thérapie combinatoire de 2 médicaments antirétroviraux pour finalement en ajouter un troisième, formant un cocktail mieux connu sous le nom de trithérapie. En combinant plusieurs antirétroviraux, les personnes séropositives sont en mesure de conserver leur charge virale sous le seuil de détection, étant maintenant de moins de 50 copies d'ARN viral par ml de sang [78, 79]. Les médicaments disponibles actuellement inhibent le cycle viral à diverses étapes et sont séparés en 4 catégories: (1) les inhibiteurs d'entrée, soit les inhibiteurs de fusion ou les antagonistes de CCR5 ou CXCR4; (2) les inhibiteurs de la transcriptase inverse, constitués par les NRTIs (nucleoside/nucleotide reverse transcriptase

inhibitors) et les NNRTIs (non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors); (3) les inhibiteurs d'intégrase et (4) les inhibiteurs de la protéase [79].

1.2. Les macrophages

Les phagocytes mononuclés, aussi appelés macrophages, sont des cellules ayant une grande capacité de phagocytose. Leur rôle est de patrouiller l'organisme et de se débarrasser des corps étrangers, tels que les bactéries, moisissures, ou encore les cellules endommagées. Les macrophages sont séparés en deux classes: (1) les macrophages tissulaires, résidents permanents des tissus sujets à des dommages et invasion par des microorganismes et (2) les macrophages dérivés de monocytes, principalement impliqués dans l'inflammation [80].

1.2.1. Les macrophages tissulaires

Les macrophages tissulaires forment une population hétérogène répartie dans la majorité des tissus, chacun ayant une niche spécifique. On y retrouve entre autres les macrophages alvéolaires dans les poumons, les cellules de Langerhans dans l'épiderme et les microglies du système nerveux central. Beaucoup de ces cellules ont longtemps été considérées comme des cellules dendritiques, mais l'importance du récepteur du M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) pour ces cellules fait d'elles des membres de la famille des macrophages [81]. Le M-CSF est une cytokine permettant la différenciation des cellules myéloïdes en macrophages de phénotype M2, c'est-à-dire des macrophages anti- inflammatoires, bien que des études récentes ont montré que ces cellules ont une grande plasticité au niveau de leur polarisation [82]. Ces macrophages produisent donc du M-CSF constitutivement et il a été montré in vitro que cette cytokine améliore leur viabilité, aide à leur prolifération et leur permet de conserver un phénotype M2-like [83, 84]. Pour certains tissus, c'est plutôt l'interleukine-34 (IL-34) qui va lier le récepteur du M-CSF, le CSF1R, et entraîner la différenciation des macrophages [85].

Les macrophages résidents des tissus sont présents souvent dès le stade embryonnaire. Par exemple, les précurseurs des cellules de Langerhans proviennent tout d'abord de la vésicule vitelline, puis sont remplacés majoritairement par les monocytes du foie fœtal pendant

l'embryogenèse [86]. Les microglies, quant à elles, proviennent de macrophages primitifs s'étant différenciés dans la vésicule vitelline avant de migrer vers le tissu cérébral de l'embryon [87]. Ces cellules sont maintenues tout au long de la vie de l'organisme majoritairement par prolifération. Contrairement au modèle proposé par les Drs van Furth et Cohn, les macrophages tissulaires ne proviennent pas tous des monocytes circulants et ne sont pas maintenus dans le temps par une infiltration de monocytes dans le tissu, mais sont plutôt des macrophages présents dès le stade embryonnaire et sont maintenus par prolifération locale [80, 88].

Le rôle de ces macrophages tissulaires est de prévenir les infections microbiennes et de résoudre l'inflammation pour contrôler les dommages. Suite à la reconnaissance d'un pathogène ou d'un signal de danger, les macrophages tissulaires sécrètent des cytokines afin de déclencher l'inflammation et le recrutement de neutrophiles et de monocytes [89, 90]. Une fois le pathogène détruit, les macrophages résidents amorcent la résolution de l'inflammation. La phagocytose des cellules apoptotiques est restreinte aux cellules exprimant la 15-lipoxygénase, une enzyme présente chez les macrophages résidents et les cellules stimulées par l'IL-4, donc ayant un phénotype anti-inflammatoire [91].

1.2.2. Les macrophages dérivés de monocytes

Les monocytes représentent 10% des leucocytes chez l'homme. Ces cellules résultent de la différenciation de cellules souches hématopoïétique dans la moelle osseuse et patrouillent l'organisme grâce à la circulation sanguine, où ils y restent sur une période de 1 à 2 jours avant d'être éliminé ou de simplement mourir [92]. Les monocytes sont entreposés dans la rate et peuvent être déployés en cas d'inflammation [93]. Les monocytes sont classés en 3 sous-populations selon leurs clusters de différenciation (CD): (1) les classiques (85% des monocytes du sang), soit CD14++ et CD16-; (2) les intermédiaires (5% des monocytes) CD14++ CD16+ et (3) les non-classiques (10% des monocytes) CD14+ CD16++ [92, 94]. Les monocytes classiques sont principalement impliqués dans la phagocytose et la sécrétion de cytokines inflammatoires comme l'IL-6 et l'IL-8 tandis que la population intermédiaire sécrète fortement le TNF (tumor necrosis factor) en réponse aux lipopolysaccharides

(LPS). Les monocytes non classiques, eux, sont plutôt impliqués dans la réponse aux virus via leur TLR (toll-like receptor) 7 et 8 [95, 96].

Lors de l'inflammation, les monocytes seront attirés dans le tissu par la présence de chimiokines de la famille des MCPs (monocyte chemoattractant protein) dont MCP-1 (aussi connu sous le nom de CCL2), des ligands du récepteur CCR2 [97]. Une fois dans l'environnement tissulaire, les monocytes seront en présence de multiples cytokines et deviendront des macrophages dérivés de monocytes (MDMs).

1.2.3. La polarisation des macrophages

Le système actuel pour classer les macrophages est celui des phénotypes M1 (pro- inflammatoire) et M2 (anti-inflammatoire) (voir Figure 7). Cette nomenclature, à la base, servait à reproduire celle des lymphocytes T auxiliaires (helper), soit les Th1 et les Th2, car les macrophages M1 semblent induits par les cytokines des Th1, tandis que les M2 par celles des Th2 [98]. En réponse à l'interféron-γ (IFN-γ), une cytokine produite en réponse aux microorganismes, les macrophages adoptent un phénotype M1, pouvant être renforcé par d'autres cytokines comme le TNF et le LPS. Pour les monocytes, l'exposition au GM- CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) les tend vers un phénotype M1 lors de la différenciation en macrophages. Ces cellules produisent fortement des dérivés réactifs d'oxygène (ROS) et des cytokines inflammatoires comme le TNF, l'IL-6 et l'IL-12 pour agir dans la réponse inflammatoire [98]. Les macrophages stimulés par les cytokines produites par les Th2 et les Treg adoptent un phénotype différent, appelé alternatif ou M2. Ces macrophages ont un niveau beaucoup plus élevé de récepteurs de mannose que les M1, une lectine de type C servant à reconnaître certains pathogènes et l'exposition au M-CSF oriente les monocytes/macrophages vers ce phénotype. L'état alternatif des macrophages peut être représenté en 3 sous-groupes: (1) les M2a, suite à une stimulation par l'IL-4 ou l'IL-13; (2) les M2b suite à la reconnaissance d'un complexe immun et (3) les M2c, aussi appelés macrophages désactivés, lorsqu'ils sont exposés à l'IL-10 [99-102]. Ces sous- populations, à l'exception des M2b, produisent moins de cytokines pro-inflammatoires et ont peu d'activités microbicides. Les M2a ont une activité phagocytaire nettement moindre que les macrophages non stimulés, tandis que les M2c phagocytent beaucoup plus, sans

toutefois tuer les pathogènes [103, 104]. Les M2a sécrètent de l'Il-10 et l'antagoniste du récepteur de l'IL-1 (Il-1ra) tandis que les M2c produisent de l'Il-10 et du TGF-β (Transforming growth factor beta). Les M2b, eux, conservent leur sécrétion élevée de cytokines pro-inflammatoires, mais participent à la différenciation des lymphocytes T en Th2 [105].

Figure 7: Classification actuelle des macrophages polarisés Spectre d'activation des macrophages en réponse aux stimuli. Figure issue de Mantovani, A. et al., 2004 [105].

Bien que la classification des macrophages soit bien établie, de récentes études ont montré que les phénotypes ne sont pas fixés à la dualité M1 ou M2. L'exposition des monocytes au GM-CSF ou au M-CSF est connue pour induire leur différenciation en macrophages de type M1 ou M2 respectivement. Or, il a été montré que des macrophages dérivés de monocytes via le M-CSF qui sont ensuite exposés à du LPS et de l'IFN-γ se retrouve avec un profil transcriptomique semblable à celui des monocytes différenciés avec le GM-CSF, puis stimulés avec le LPS et l'IFN-γ [106]. La différenciation préparerait plutôt les macrophages à adopter un état et la stimulation serait responsable du changement de phénotype.

Une deuxième étude montre que la polarisation est beaucoup plus large que seulement deux phénotypes. Des MDMs différenciés avec du GM-CSF ou M-CSF ont été mis en présence de 28 combinaisons de stimuli différents pour en définir leur profil transcriptomique. Suite à des analyses bio-informatiques, cette étude révèle que la polarisation des macrophages est représentée par un spectre d'activation plutôt que le système M1/M2 [82]. Il y a donc une grande plasticité au sein de l'activation des macrophages qui doit être prise en compte lors de l'étude de leur réponse face à un pathogène.

1.3. L'infection des macrophages par le VIH-1

Plusieurs types cellulaires de l'immunité peuvent être infectés par le VIH-1, le plus étudié étant les lymphocytes T CD4+. Cependant, l'importance des autres lignées cellulaires dans l'établissement de l'infection et la formation de réservoirs viraux ne doit pas être sous- estimée. Parmi ces cellules, les monocytes et les macrophages sont permissifs au VIH-1 et sont des réservoirs viraux importants, en raison de leur présence dans les tissus où les antirétroviraux ont difficilement accès. L'ADN viral peut être retrouvé dans les monocytes et les macrophages en plus des microglies et des macrophages périvasculaires du système nerveux central chez une personne infectée, même lorsque sous thérapie [73, 76, 107]. Les macrophages ont une longue durée de vie et sont grandement résistants à l'effet cytopathogène du virus. Ceci fait d'eux de grands producteurs de particules virales dont il est primordial de se débarrasser pour éventuellement guérir une personne du VIH-1.

1.3.1. Caractéristiques du cycle viral chez les monocytes et macrophages

Les monocytes peuvent être classés en trois groupes selon leur expression du CD16 (voir section 1.1.2.). Or, le taux d'infection est différent selon le type de monocytes. Les monocytes CD16+ sont plus permissifs au VIH-1 R5-tropique que la population CD16-. Deux raisons expliquent ce phénomène. Tout d'abord, l'expression de CD16 corrèle avec une expression plus élevée du corécepteur CCR5. Ensuite, les monocytes CD16+ expriment la forme inactive d'APOBEC3G, un facteur de restriction du VIH-1, tandis que les CD16- expriment la forme active. La combinaison de ces deux facteurs facilite l'entrée du virus et

l'infection des monocytes CD16+ résultant en une réplication virale accrue une fois l'infection établie [108].

Les macrophages expriment à la fois le corécepteur CXCR4 et CCR5. La plupart des souches X4 et R5 sont capables d'infecter les macrophages, mais l'utilisation de CCR5 semble privilégiée et plus efficace. Lors d'une faible présence de CD4 à la surface d'une cellule, ce qui est le cas chez les macrophages, l'utilisation de CCR5 au lieu de CXCR4 faciliterait l'entrée du virus [109]. L'utilisation de virus R5 facilite donc l'infection des macrophages lors d'études in vitro. Bien que l'entrée du virus par attachement à la surface soit la voie typique d'infection, la grande activité phagocytaire des macrophages permet une autre voie d'entrée. La macropinocytose permet l'internalisation de molécules indépendamment des récepteurs cellulaires. Ainsi, les macrophages peuvent internaliser le virus dans des vésicules intracellulaires. Certaines particules résisteront à la dégradation et seront en mesure de fusionner à la membrane vésiculaire, libérant la capside dans le cytosol [110].

Ensuite, le VIH-1 peut infecter productivement les macrophages alors que ceux-ci sont des cellules différenciées ne se divisant pas, tandis que les lymphocytes T nécessitent une activation et une prolifération. L'intégration du génome est possible sans que le cycle cellulaire se produise [111]. Le mécanisme précis derrière cette capacité spécifique aux Lentivirus reste à élucider pour mieux comprendre comment le PIC peut traverser une membrane nucléaire intacte.

Une autre caractéristique du cycle viral chez le macrophage est l'assemblage des particules virales. Alors que les virions s'assemblent à la membrane cellulaire chez la plupart des types cellulaires, cette étape se passe différemment chez les macrophages. Les virions se forment majoritairement à la membrane des endosomes tardifs ou des corps multivésiculaires (MVB, multivesicular body) et bourgeonnent à l'intérieur de ceux-ci. Le virus acquiert dans son enveloppe certaines molécules de l'hôte spécifiques aux endosomes comme le CD63 et peu de molécules de surface comme ceux produits chez le lymphocyte T CD4+. Les virus sont ensuite relâchés dans l'espace extracellulaire par la fusion de la vésicule avec la membrane cellulaire [112]. Le mécanisme par lequel le virus s'assemble

dans les endosomes tardifs au lieu de la surface cellulaire chez le macrophage reste à élucider.

1.3.2. Polarisation des macrophages et VIH-1

La polarisation des macrophages induit des changements dans l'activité cellulaire (voir section 1.2.3.) et modifie ainsi la susceptibilité des cellules à l'infection. Suite à la stimulation de MDMs avec du TNF et de l'IFN-γ (M1) ou de l'IL-4 (M2a), ces cellules deviennent réfractaires au VIH-1. La réplication virale dans les cellules M1 et M2a, mesurée par l'activité de la RT, est diminuée de plus de 50% pour les M1 et d'au moins 25% chez les macrophages M2a. Cette résistance à l'infection n'est cependant pas permanente et perd de l'efficacité dans le temps, surtout pour les M1. Cet effet s'explique par la modulation de l'expression des récepteurs et corécepteurs à la surface de la cellule. Le nombre de cellules exprimant le CD4 diminue significativement chez les macrophages M1 avec un effet moindre chez les M2a. Le corécepteur CXCR4 diminue aussi, mais pas le CCR5. La polarisation joue donc un rôle à des étapes différentes, soit aux étapes préintégration pour les M1 et les évènements tardifs pour les M2a. Finalement, les cytokines sécrétées diffèrent aussi selon le phénotype. Les M1 sécrètent fortement CXCL10, une chimiokine augmentant la réplication virale chez les cellules infectées, mais ne semblant pas avoir d'impact chez les M1 à cause de la restriction au niveau de l'intégration de virus. Les M2a, eux, produisent beaucoup de CCL22, une chimiokine inhibant la réplication virale au niveau des étapes tardives [113-116].

Pour les macrophages non stimulés, l'infection par le VIH-1 induit une polarisation. Ceux- ci se dirigent vers un phénotype pro-inflammatoire suite à l'infection. Il y a une diminution du récepteur éboueur (scavenger receptor) pour l'hémoglobine et l'haptoglobine (CD163) et le récepteur du mannose (CD206), deux récepteurs utilisés pour décrire le phénotype M2 des macrophages. Les cellules adoptent donc une polarisation M1 suite à la rencontre du virus [116].

1.3.3. Impacts du virus sur les fonctions cellulaires

Lorsqu'un macrophage est infecté par le VIH-1, ses fonctions cellulaires sont affectées par le virus. Tout d'abord, la fonction principale des macrophages, la phagocytose, est altérée par l'infection virale. Les macrophages infectés se retrouvent avec un niveau élevé d'AMP cycliques (AMPc), ce qui diminue leur capacité à phagocyter les pathogènes opsonisés par les molécules du complément [117]. La phagocytose induite par la liaison de pathogènes aux récepteurs FcγR est aussi plus faible [118]. Dans les deux cas, le VIH-1 n'induit pas une diminution du nombre de récepteurs de surface, mais interfère plutôt avec la transduction du signal suite à la reconnaissance d'un pathogène, menant habituellement à la phagocytose de celui-ci. Cependant, l'infection peut aussi mener à une augmentation de l'internalisation de certains pathogènes, comme le parasite de la Leishmania qui infectera le macrophage à son tour [119]. Ces facteurs influencent donc l'élimination des microorganismes par les macrophages menant à des infections opportunistes, souvent présentes chez les personnes atteintes du SIDA.

L'infection par le VIH influence aussi les cytokines sécrétées par les macrophages. Pour la famille des interleukines, plusieurs sont régulés à la hausse suite à l'infection. Les MDMs infectés sécrètent plus d'IL-1, d'IL-6, d'IL-8, d'IL-10 et d'IL-12. La production d'IL-1, IL-6 et IL-8 devient même constitutive. Pour les interférons, il y a une baisse de production d'IFN-α chez les macrophages infectés, alors que la sécrétion d'IFN-β est augmentée. Du côté des colony-stimulating factor, le VIH-1 induit une hausse de production pour le M- CSF et une diminution pour le GM-CSF. Finalement, la production des chimiokines MIP- 1α et MIP-1β est régulée à la hausse, induisant la chimiotaxie des lymphocytes T non- activés, ainsi que CCL5 (RANTES), un autre chimioattractant pour les lymphocytes T [120].

1.3.4. Les facteurs de restriction virale

Le macrophage, comme d'autres cellules ciblées par le VIH-1, possède des protéines capables de lutter contre l'infection. Ces protéines sont appelées des facteurs de restriction virale et agissent contre des propriétés du virus ne pouvant être sujet à des mutations, telles que les lipides de l'enveloppe ou la structure des bases nucléiques. Afin de mériter ce titre,

une protéine doit répondre à 4 critères. Premièrement, son expression doit montrer une activité antivirale qui doit être causée directement par la protéine et dont la restriction doit être causée majoritairement par celle-ci. Une protéine régulant un autre peptide qui interagit avec le VIH-1 ne peut être considérée comme un facteur de restriction. Deuxièmement, le virus doit posséder un mécanisme de défense contre l'activité antivirale de la protéine cellulaire. Une souche actuelle doit contenir ce mécanisme qu'elle a obtenu au cours de son évolution. Troisièmement, le facteur de restriction doit avoir été sujet à une sélection positive lors de l'évolution de l'homme. Cette pression mène à des substitutions d'acides aminés qui ont été conservés et ont mené à une évolution rapide. En comparant la séquence de la protéine avec celle d'une autre espèce animale proche de l'homme, il est possible de voir cette évolution rapide de la protéine. Cependant, la sélection positive des mutations ne doit pas être obligatoirement causée par le VIH-1 ou une de ses souches ancestrales. Elle peut être le résultat d'une exposition à un pathogène autre que le virus. Finalement, le quatrième critère est l'induction de l'expression du facteur de restriction. La protéine doit être fortement exprimée suite à la réponse immunitaire innée. Après la rencontre d'un pathogène, les cellules de l'immunité innée sécrètent de l'interféron. La liaison de l'interféron à son récepteur chez une cellule doit mener à l'expression de la protéine ayant la propriété antivirale. Donc, en résumé, les 4 critères pour qu'une protéine cellulaire soit considérée comme un facteur de restriction sont: (1) la forte activité antivirale; (2) un mécanisme viral pour la contrer la restriction; (3) une sélection positive lors de l'évolution et (4) une induction par la réponse interféron [121].

Un facteur de restriction bien connu dans le contexte du VIH-1 est SAMHD1 (SAM domain and HD domain-containing protein 1). Cette protéine est fortement exprimée chez les cellules ne se divisant pas, soit les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques et les lymphocytes T CD4+ non activés, mais est aussi retrouvée à un niveau basal dans les cellules de divers tissus [122-125]. Le gène codant pour SAMHD1 est induit préférentiellement par l'interféron de type 1 (IFN-α ou IFN-β) [126]. Cette enzyme réduit grandement l'infectivité du virus lors de la rétrotranscription de l'ARN viral en ADN. SAMHD1 est un déoxynucléoside triphosphate triphosphohydrolase, c'est-à-dire qu'elle clive le groupement triphosphate du nucléotide. Le bassin de dNTPs (désoxyribonucléotides) cytoplasmique se retrouve grandement diminué, impactant

directement la synthèse d'ADN [127]. Par contre, une protéine virale peut prévenir l'action de SAMHD1. Le gène de la protéine accessoire Vpx est présent dans le génome du VIH-2 et du VIS, mais pas dans celui du VIH-1, permettant à ces souches virales d'infecter plus efficacement les cellules qui sont habituellement réfractaires à l'infection. Lors du cycle viral, Vpx est incorporé dans le virion en interagissant avec le domaine p6 de la protéine Gag et sera relâché dans le cytoplasme lors d'un nouveau cycle viral [128]. Vpx s'associe à l'E3 ubiquitin ligase CRL4DCAF1 pour ubiquitiner SAMHD1 et mener à sa dégradation par le protéasome [122].

D'autres facteurs de restriction sont les protéines de la famille des APOBEC (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like), des cytidine déaminases. Cette famille comporte 11 membres dont certains sont connus pour posséder une activité antivirale contre le VIH-1 [129]. L'emphase sera mise ici sur le membre le plus étudié, APOBEC3G (A3G). Cette protéine est exprimée dans une variété de cellules, dont les cellules myéloïdes, les lymphocytes B et les lymphocytes T. La stimulation des cellules myéloïdes avec l'IFN-α induit l'expression de ce facteur de restriction [130]. Cette protéine possède une activité cytidine déaminase. Lors de la synthèse du premier brin d'ADN complémentaire à l'ARN viral, A3G désamine le groupement cytidine, le transformant en uridine. Cette modification entraîne des hypermutations de guanoside (G) en adénosine (A) dans l'ADN viral, diminuant ainsi le pouvoir infectieux des virions qui seront produits [131, 132]. Lors de la formation de nouveaux virions, A3G peut être incorporé par des interactions avec la protéine virale NC et avec l'ARN [133]. Cependant, le VIH-1 possède une protéine accessoire pour prévenir l'action des protéines APOBEC. La protéine virale Vif, codée par le gène vif, est exprimée tardivement dans le cycle viral et est incorporée dans les virions produits [134]. Lorsque présente, Vif peut interagir avec A3G soit en recrutant une E3 ubiquitin ligase, entraînant la dégradation d'A3G par le protéasome, soit en formant un complexe empêchant l'incorporation d'A3G dans les virions produits [135, 136].

Un troisième facteur de restriction bien étudié est la tetherin, aussi appelée BST2, désignée comme étant le CD317 et codée par le gène BST2. La tetherin est une protéine transmembranaire pouvant être exprimée à la surface des cellules et dans les compartiments intracellulaires. Elle est exprimée chez plusieurs cellules immunitaires dont les

macrophages et son expression est induite par la réponse à l'interféron de type 1 ou 2 [137, 138]. Cette protéine forme un lien entre la membrane cellulaire et l'enveloppe de la particule virale, empêchant le relâchement des nouveaux virus [139]. Chez les macrophages, où les virus bourgeonnent dans des compartiments intracellulaires, une forte concentration de theterin est retrouvée à la surface de ces vésicules et serait nécessaire à la formation de ces compartiments [138]. Pour inhiber l'effet de la tetherin, le VIH-1 exprime la protéine accessoire Vpu. Cette protéine virale est aussi transmembranaire et se retrouve colocalisée à la tetherin [140]. Vpu interagit avec la tetherin nouvellement synthétisée grâce à leur domaine transmembranaire, l'internalise et entraîne sa dégradation, nuisant ainsi au renouvellement de la protéine à la surface cellulaire [141]. Certaines études montrent que la voie des protéasomes est utilisée, tandis que d'autres montrent que c'est plutôt celle des lysosomes [142, 143].

La protéine TRIM5α (Tripartite motif-containing 5 isoform-a) montre aussi une restriction de l'infection par le VIH-1. Cette restriction n'est cependant possible que par le TRIM5α exprimé chez le singe rhésus, alors que l'orthologue humain ne montre aucune inhibition de l'infection [144]. Cette protéine interagit avec la capside et perturbe la décapsidation du virus suite à son entrée dans le cytoplasme [145].

Finalement, des protéines découvertes récemment, SERINC3 et SERINC5 (serine incorporator) sont des facteurs de restriction potentiels. Ces protéines transmembranaires sont exprimées à la surface des cellules susceptibles à l'infection et sont incorporées lors du bourgeonnement des virions. L'incorporation de ces protéines dans les particules virales interfère avec la fusion de l'enveloppe virale à celle d'une cellule lors d'une nouvelle infection. La protéine virale Nef empêche l'incorporation des protéines SERINC lors de la formation des nouveaux virus [146, 147].

Chapitre 2: Hypothèse et objectifs de recherche

Les médicaments antirétroviraux ont grandement évolué depuis leur découverte. Les personnes infectées par le VIH-1 ont maintenant l'opportunité d'avoir accès à divers médicaments dépendamment de leur état et peuvent aussi être suivies par PCR afin d'adapter le traitement en fonction de l'évolution du virus. Cependant, même s'il est possible de contrôler la charge virale chez un individu, nous devons trouver le moyen d'éliminer le virus d'une personne infectée afin de parvenir à une guérison complète. Pour y arriver, les réservoirs viraux devront être éradiqués. Ces cellules, dont les macrophages font partie, rétabliront la charge virale chez un patient dès que celui-ci arrêtera son traitement.

Le rôle des macrophages dans le contexte d'infection par le VIH-1 est de plus en plus étudié. Avec leur grande résistance à l'effet cytopathogène du virus et leur large dissémination dans l'organisme, l'impact de ces cellules dans la pathogenèse et l'établissement des réservoirs n'est pas à sous-estimer. Il est donc important de mieux comprendre les interactions du virus avec les molécules de l'hôte qui pourraient agir comme facteur de régulation de l'infection au sein des macrophages. Plusieurs protéines sont déjà connues pour jouer un rôle dans l'infection, mais nous estimons qu'il en reste une panoplie à découvrir. Une analyse transcriptomique a d'ailleurs été effectuée pour comparer le profil des cellules infectées avec celui de la population bystander, c'est à dire qui ne montre pas d'infection productive. Comme prévu, environ 5000 gènes sont régulés à la hausse ou à la baisse chez les cellules infectées (résultats en cours de publication).

Avec ces résultats, nous avons émis comme hypothèse que le taux d'infection des macrophages in vitro sera modulé par l'absence de ces protéines. Ceci mettra en lumière de nouveaux sentiers signalétiques qui pourront être la cible de nouvelles thérapies pour venir à l'élimination du virus chez les macrophages et ainsi éliminer l'un des réservoirs viraux. Les objectifs de ce projet sont donc les suivants:

1. Réaliser un criblage moléculaire sur les MDMs en utilisant des ARN interférents dirigés contre des gènes sous/surexprimés chez les macrophages infectés.

2. Identifier et valider de nouveaux facteurs de restriction ou de susceptibilité potentiels chez le macrophage humain.

Chapitre 3: Matériels et Méthodes

Pour atteindre nos objectifs, le projet s'est déroulé en deux étapes. Tout d'abord, un criblage d'ARN interférents a été effectué sur les MDMs pour tester l'importance des gènes correspondants sur l'infection par le VIH-1. Ceci nous permettra de rapidement mettre en évidence plusieurs gènes potentiellement impliqués dans le cycle viral. Cependant, un criblage n'est pas la méthode la plus précise. Il sera fait sur un petit nombre de cellules et nécessitera beaucoup de pipetages en chaîne. Le taux d'erreur est donc un peu plus élevé. C'est pourquoi la deuxième étape consiste à étudier les cibles dont les résultats seront plus significatifs avec des techniques plus précises, dans le but de confirmer la fiabilité du criblage et ainsi identifier de nouveaux régulateurs du VIH-1.

3.1. Production de particules virales

Ce projet utilisera plusieurs clones moléculaires du VIH-1. L'utilisation de clones au lieu de souches retrouvés chez les patients fait en sorte que nous contrôlons l'accumulation de mutations, contrairement à une souche cumulant plusieurs années d'évolution. En utilisant un plasmide, nos productions virales possèdent le même génome, évitant que les résultats diffèrent avec l'utilisation d'un nouveau stock viral. Il est évident que le virus va quand même muter suite à l'infection lors des expérimentations, mais le nombre de mutations sera limité.

3.1.1. Modèles viraux

Plusieurs virus ont été utilisés dans ce projet. Le premier est le NL4-3-Bal-IRES-HSA. Le plasmide NL4-3 est un clone moléculaire du VIH-1, contenant tous ses gènes et est pleinement infectieux [5]. Ce clone a ensuite été modifié afin d'y ajouter le gène rapporteur HSA (Heat Stable Antigen) murin, qui va être exprimé à la surface des cellules productivement infectées (voir Figure 8) [148]. Cependant, ce virus est X4-tropique et a donc été modifié afin d'y ajouter l'enveloppe de la souche Bal, de tropisme R5, afin d'infecter les macrophages.

Figure 8: Représentation schématique du plasmide NL4-3-IRES-HSA Le plasmide NL4-3-IRES-HSA est de tropisme X4 et contient le gène rapporteur HSA. L'enveloppe a été remplacée par l'enveloppe de tropisme R5 Bal, provenant du plasmide NL4-3balenv [149]. Figure issue de Imbeault, M. et al., 2009 [148].

Le plasmide NL4-3-Bal-IRES-HSA a ensuite été dérivé en deux autres plasmides, le NL4- 3-Bal-IRES-eGFP contenant le gène rapporteur de la enhanced green fluorescent protein (eGFP) et le NL4-3-Bal-IRES-FLuc contenant la firefly luciferase (FLuc) au lieu du gène HSA.

Finalement, une production appelée « Mock » est préparée pour le contrôle de cellules non infectées. Le mock est le surnageant ultracentrifugé de cellules transfectées avec un plasmide «vide», donc sans production de particules virales.

3.1.2. Culture de la lignée cellulaire 293T

La lignée cellulaire 293T (aimablement fourni par le Dr. Warner C. Greene du J. Gladstone Institutes, San Francisco, CA) est dérivée des cellules embryonnaires de rein HEK293. Ces cellules ont un taux de transfection très élevé et permettent d'avoir des productions virales efficaces.

Les 293T sont conservées dans l'azote liquide et doivent tout d'abord être décongelées. Ils sont ensuite maintenus dans le milieu de culture Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM) (Corning, New York, NY) supplémenté de 10% de Fetal Bovine Serum (FBS) (Wisent, St-Bruno, QC) préalablement inactivé à la chaleur. Les 293T sont placés dans un flacon de 75 cc (Corning) et incubées à 37°C sous 5% de CO2. Les cellules sont en culture jusqu'à l'atteinte d'environ 75% de confluence. Lorsque ceci est atteint, le milieu est retiré et le flacon est lavé avec 10 ml de PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X, puis 1 ml de trypsine 1X contenant 0.5% d'EDTA (acide éthylène diamine tétracétique) (Thermo Fisher

Scientific, Waltham, MA). Dans le but de faire une transfection au calcium-phosphate, les cellules sont remises en culture en déposant 3 millions de cellules dans 10 ml de DMEM-

10% FBS par flasque T75. Celles-ci sont incubées 24h à 37°C sous 5% de CO2, puis transfectées.

3.1.3. Transfection au calcium-phosphate

La transfection au calcium-phosphate permet de faire entrer de l'ADN exogène à l'intérieur de cellules eucaryotes. C'est un protocole relativement simple et efficace se basant sur la formation d'un petit précipité liant l'ADN grâce aux ions phosphate et au chlorure de calcium et qui sera facilement incorporé par la lignée cellulaire 293T.

Le mélange de transfection est préparé en mélangeant 30 µg d'ADN du virus que l'on veut produire avec 62.5µL de CaCl2 2M et de l'eau Milli-Q filtrée 0.22 µm (Millipore, Darmstadt, Allemagne) pour obtenir un volume total de 500 µL. Ce mélange est ensuite déposé doucement dans 500 µL de HBS 2X (hepes buffered saline) et incubé 30 minutes à température pièce, pour être ensuite mis goutte par goutte dans le flacon de 293T. Les cellules sont incubées pendant 16 heures à 37°C sous 5% de CO2, puis lavées avec 10 ml de PBS 1X. Du milieu de culture frais est mis dans le flacon afin de poursuivre l'incubation pour 24h.

3.1.4. Récolte et conservation de la production virale

Le surnageant des cellules est entièrement récolté, car il contiendra les particules virales produites par les 293T transfectées. Celui-ci est centrifugé à 300 G et filtré à 0.22 µm afin de se débarrasser des débris cellulaires. Afin d'avoir une production virale plus concentrée, le surnageant filtré est ultracentrifugé à 28 000 RPM à 4°C pendant 45 minutes, en prenant soin de mettre l'accélération au maximum et la décélération au minimum pour préserver le culot (modèle Optima L90-K, Beckman-Coulter). Suite à cette centrifugation, le surnageant est retiré des tubes et les culots sont resuspendus dans un petit volume de RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Corning) supplémenté de L-glutamine et de 0.5% de BSA (Bovine Serum Albumin) (Wisent) avant d'être congelés à -80°C.

3.1.5. Caractérisation de la production virale

Les virus sont caractérisés de deux façons. Tout d'abord, il est important de savoir la concentration de virus par millilitre. Pour ce faire, la protéine de capside p24 est dosée par ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) via un protocole maison. Ensuite, il est utile de savoir l'infectivité des particules produites. Ce sera la TCID50 (50% Tissue culture Infective Dose) qui nous donnera cette information, soit la dose virale nécessaire pour induire un effet cytopathique chez 50% de la culture cellulaire.

3.1.5.1. ELISA de la protéine de capside p24

Tout d'abord, l’anticorps 183.H12.5C (NIH AIDS Research and Reference Program, Germantown, MD), spécifique pour la protéine de capside, est mis dans une plaque de 96 puits conçue pour les ELISA (Thermo Fisher Scientific). La plaque est mise à 4°C jusqu'au lendemain pour laisser l'anticorps adhérer à la paroi des puits. Après l'incubation, la plaque est lavée 3 fois au PBST (PBS 1X contenant 0.05% de Tween-20 (Thermo Fisher Scientific)) à l'aide d'un laveur de plaques automatisé (modèle ELx405, Bio-Tek Instrument inc.). S'ensuit l'étape de blocage où du PBST contant 0.5% de BSA (Fitzgerald Industries International, Acton, MA) est mis dans chaque puits et la plaque est incubée 1 heure à température pièce sur un agitateur de plaques afin d'éliminer les liaisons non spécifiques de la p24 ou des prochains anticorps qui seront utilisés. Pendant cette incubation, le virus sera lysé à l'aide d'un tampon de lyse (PBS comprenant 0.05% de Tween-20, 2.5% de Triton- X100 et 2% de bleu de trypan) et dilué séquentiellement dans du PBST+0.5% BSA pour le dosage. Une courbe standard est aussi préparée avec 7 dilutions d'un standard de p24 (généreusement fourni par Chiron Corporation, Emeryville, CA), soit 2000 pg/ml, 1000 pg/ml, 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125.5 pg/ml, 62.5 pg/ml et 31.25 pg/ml, en plus d'un puits contenant seulement le PBST+0.5% BSA. Le tampon de blocage est enlevé de la plaque et lavé 3 fois au PBST pour être remplacé par les dilutions de la production virale et de la courbe standard, puis du tampon de lyse est ajouté dans tous les puits pour s'assurer d'une lyse efficace du virus. La plaque est incubée 1 heure à température pièce avec agitation, puis lavée trois au PBST. S'ensuit l'ajout de l'anticorps 31-90-25 biotinylé (ATCC,

Manassas, VA) dirigé contre la p24 à une concentration de 0.5 µg/ml et d'une incubation d'une heure, toujours à température pièce sous agitation. Suite à une quatrième étape de lavage, de la streptavidine couplé à la HRP (horseradish peroxydase) (Thermo Fisher Scientific) est déposée dans chaque puits, suivi d'une incubation de 20 min à température pièce sous agitation. La plaque est lavée une dernière fois et le substrat TMB-S (3,3′,5,5′- Tetramethylbenzidine) (enhanced K-Blue® TMB Substrate, Neogen, Lexington KY), préalablement chauffé à 37°C, est ajouté. Une réaction colorimétrique donne une couleur bleue au puits. La vitesse de réaction est proportionnelle à la quantité de p24 présente. La réaction est arrêtée avant la saturation de la courbe standard grâce à l'ajout d'acide phosphorique 1 M. La plaque est agitée pour assurer l'arrêt de la réaction, puis l'absorbance est lue à 450 nm par un lecteur d'absorbance (modèle ELx808, Bio-Tek Instrument inc.).

3.1.5.2. Culture de la lignée cellulaire TZM-bl et TCID50 des particules virales

La TCID50 est importante à calculer, car celle-ci nous indique le pouvoir infectieux de la production virale. Pour ce faire, la lignée cellulaire TZM-bl est utilisée (obtenue par les Drs John C. Kappes et Xiaoyun Wu ainsi que Tranzyme Inc. via le AIDS Research Reagent Program). Ces cellules sont dérivées de la lignée HeLa, originaire de carcinome cervical humain. Cette lignée a été modifiée afin d'y intégrer le gène de la luciférase et de la β- galactosidase, les deux sous le contrôle d'un promoteur activé par le VIH-1. Donc, lorsqu'infectées, les cellules TZM-bl produiront de la luciférase, permettant de mesurer l'infection. La culture de TZM-bl se déroule comme pour la lignée 293T (voir section 3.1.2.). Lorsque les cellules sont à confluence, le flacon de cellules est lavé une fois au PBS 1X, puis les cellules sont mises dans 1 ml de trypsine 1X contenant 0.5% d'EDTA et incubée à 37°C sous 5% de CO2. Malgré cette incubation, ces cellules sont très adhérentes et nécessitent que le flacon soit tapé fortement pour que les cellules se détachent de la paroi. Les TZM-bl sont récoltées et la trypsine est inactivée via un lavage au DMEM-10% FBS. Le virus est ensuite dilué séquentiellement dans une plaque de 96 puits et 10 000

TZM-bl sont ajoutés dans chacun des puits. La plaque est mise à 37°C sous 5% de CO2 pour une incubation d'une durée de 48h. Le milieu est retiré en partie et remplacé par du tampon de lyse pour luciférase (50% de glycérol et 5% de Triton X-100 auquel du DTT et

du Tris ont été ajouté), suivi d'une agitation et d'une congélation pour avoir une lyse efficace des cellules. Pour la lecture, une partie du lysat est transférée dans une plaque blanche de 96 puits (Corning) pour être analysée dans un lecteur de bioluminescence (Varioskan Flash, Thermo Fisher Scientific). Celui-ci injectera un tampon de luciférine (tampon comprenant de la tricine, de l'EDTA, de la coenzyme A, de la luciférine, de l'ATP et du DTT) et prendra une lecture de la bioluminescence. La TCID50 sera ensuite calculée avec la formule de Spearman-Karber nous permettant d'infecter nos cellules avec une MOI (multiplicity of infection) adéquate.

3.2. Isolement et culture de MDMs à partir de sang périphérique de donneurs sains

Pour obtenir un grand nombre de MDMs, nous utilisons une poche de sang périphérique d'un donneur sain (environ 350 ml), prélevé juste avant l'isolation. Le sang est réparti dans 16 tubes Falcon de 50 ml contenant 15 ml de Lymphocyte Separation Medium (Corning). Les tubes sont ensuite centrifugés à une vitesse de 2000 RPM pendant 30 minutes. Suite à cette centrifugation, quatre phases seront présentes dans le tube (voir Figure 9). Tout au fond des tubes se trouve une phase rouge, contenant les érythrocytes, neutrophiles et éosinophiles. Sur le dessus se trouve la phase de Ficoll, puis un mince anneau opaque contenant les PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells). Les PBMCs sont composés des monocytes et des lymphocytes. Finalement, sur l'anneau se trouvera le sérum, contenant les plaquettes.

Figure 9: Séparation des cellules présentes dans le sang périphérique Représentation des différentes phases et leur contenu suite à une centrifugation de sang sur Ficoll-Hypaque. Figure issue de Munoz, N.M. et al., 2006 [150].

Les anneaux de PBMCs sont récoltés et transférés deux par deux dans des tubes contenant du HBSS 1X (Hanks' Balanced Salt Solution) (Corning) et centrifugés à 900 rpm afin de se débarrasser des plaquettes résiduelles, qui elles resteront dans le surnageant. S'ensuivent les étapes de lavages, où les tubes seront groupés deux par deux après chaque centrifugation. Les culots seront lavés une autre fois avec du HBSS 1X, puis une dernière fois, mais cette fois avec du RPMI 1640 supplémenté de L-glutamine. Au final, nous avons un tube de RPMI 1640 contenant tous les PMBCs provenant de 16 tubes de sang. En moyenne, 600 millions de PBMCs sont obtenus avec une poche de sang. Ceux-ci sont répartis dans des pétris de 150 mm par 20 mm (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne), soit 150 millions de cellules par pétris, puis incubées à 37°C sous 5% de CO2 pendant 2h. Ceci permet aux monocytes d'adhérer au plastique. Après l'incubation, les pétris sont lavés 2 fois avec 10 ml de DPBS 1X (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline) (Corning). Les PBLs (Peripheral Blood Lymphocytes) sont ainsi enlevés de la culture et peuvent être récupérés au besoin pour en isoler les lymphocytes. Les monocytes adhérés sont mis dans 20 ml de RPMI 1640 avec L-glutamine, cette fois comprenant 10% de sérum humain AB (AB-HS, Valley Biomedical, Winchester, VA), de pénicilline/streptomycine 1X (Thermo Fisher Scientific) et de M-CSF (macrophage colony-stimulating factor) recombinant humain (Novus Biologicals, Littleton, CO) à une concentration de 25 ng/ml pour stimuler la différenciation en macrophages dérivés de monocytes (MDMs). Les monocytes sont ensuite remis à 37°C sous 5% de CO2 pendant 3 jours.

Les cellules sont lavées à nouveau 2 fois avec 10 ml de DPBS 1X pour se débarrasser des cellules contaminantes (érythrocytes, plaquettes et lymphocytes). Les monocytes en différenciation sont ensuite mis dans 15 ml de RPMI 1640 comprenant 10% de sérum humain AB et pénicilline/streptomycine 1X et incubés à 37°C sous 5% de CO2. L'exposition au M-CSF induit la production de cette cytokine par les monocytes/macrophages, donc il n'est pas nécessaire d'en ajouter à nouveau à cette étape.

Après 6 jours cumulatifs de différenciation, les MDMs sont prêts à être décollés. Les MDMs sont lavés une fois au DPBS 1X, puis mis dans de l'Accutase (eBioscience Inc., San

Diego, CA) et incubés 1h à 37°C avec 5% de CO2, ce qui va rendre leur détachement du plastique beaucoup plus facile. Après cette incubation, les MDMs ont une forme arrondie, signifiant qu'ils sont prêts à être décollés. Le plastique est frotté avec un grattoir stérile

(Sarstedt), puis les cellules sont récoltées. Les pétris sont lavés deux fois au DPBS 1X afin de récolter un maximum de cellules. La viabilité cellulaire est vérifiée lors du compte au bleu de Trypan 0.2% (Thermo Fisher Scientific) et se situe habituellement autour de 95% de cellules viables. Les MDMs sont maintenant prêts à être utilisés pour une expérience.

3.3. Criblage de petits ARN interférents chez les MDMs

3.3.1. Transfection des siRNAs

La transfection d'un siRNA (small interfering RNA) est une technique permettant de mettre en sourdine un gène précis en dégradant ses ARNm. Les siRNAs sont de petits ARNs double brins qui, une fois dans le cytoplasme, vont être pris en charge par le complexe RISC (RNA-induced Silencing Complex). RISC est composé des protéines Ago-2, Dicer et TRBP. Le complexe RISC clive le brin sens du siRNA grâce à l'activité de Ago-2 et conserve le brin anti-sens comme guide. Lorsque cet ARN est complémentaire à un ARNm présent dans la cellule, celui-ci est clivé et dégradé. Ce processus induit donc une baisse de l'ARNm visé par le siRNA, ce qui devrait normalement avoir un impact au niveau protéique. Le siRNA est éventuellement dégradé, donc son effet n'est pas permanent [151].

Le protocole de transfection des macrophages humains a été mis au point avec la lipofectamine® RNAimax (Thermo Fisher Scientific). Ce réactif forme des liposomes pour contenir les siRNAs et leur faire traverser la membrane cellulaire. Le protocole est inspiré de celui fourni par le fabricant, avec quelques modifications pour s'assurer d'une transfection efficace dans les MDMs.

Tout d'abord, les siRNAs (Silencer® Select, Thermo Fisher Scientific) sont resuspendus dans de l'eau stérile exempte de nucléase (Thermo Fisher Scientific) à une concentration de 20 µM. Les siRNAs sont vortexés et laissés 30 minutes à 4°C. Un aliquot est ensuite dilué à 1 µM dans une plaque 96 puits, cette fois dans du RPMI. Les étapes se déroulent sur glace et se font avec du RPMI sans sérum, afin d'éviter que les lipides interfèrent avec la formation de liposomes, ni antibiotiques qui pourraient entrer en concentration trop élevée dans les cellules, ce qui pourrait avoir une certaine toxicité. Le reste du tube de 20 µM est congelé à -80°C. Lorsque la transfection est prête à être effectuée, un aliquot des siRNAs à 1 µM est de nouveau dilué à 100 nM dans du RPMI. Un mélange de lipofectamine

RNAimax est préparé en parallèle en mélangeant 0.35 µL de lipofectamine à 25 µL de RPMI pour chacun des puits. Le siRNA est dilué à nouveau à 50 nM en le mélangeant avec la lipofectamine dans un ratio 1:1, puis homogénéisé doucement à la pipette et laissé à température pièce pendant 15 minutes. Finalement, 50 µL de RPMI contenant 50 000 MDMs préalablement décollés (voir section 3.2) sont mis dans les puits, permettant d'atteindre une concentration finale de siRNA de 25 nM. La plaque est mise à 37°C sous

5% de CO2 pendant 2 heures pour laisser le temps aux liposomes de pénétrer les cellules, puis 100 µL de RPMI contenant 20% de sérum humain AB est mis dans les puits pour avoir un total de 200 µL de RPMI avec 10% de sérum. Les MDMs sont remis à 37°C sous 5% de

CO2 pour un temps de transfection de 72h ou 96h avant de procéder à l'infection des cellules.

Pour ce projet, 100 siRNAs ont été utilisés, soit deux séquences différentes par gène testé. Plusieurs contrôles ont aussi été utilisés, soit des siRNAs contre SAMHD1, augmentant l'infection chez les MDMs (contrôle de facteur de restriction), et CD4, diminuant l'infection (contrôle de facteur de susceptibilité). Finalement, 2 siRNAs scramble ont été utilisés, c'est- à-dire des siRNAs non spécifiques à un gène. Il s'agit donc d'un contrôle pour voir l'effet de la transfection seule sur l'infection des MDMs. Tous les siRNAs utilisés proviennent de la branche Ambion® de Thermo Fisher Scientific.

3.3.2. Infection des MDMs et analyse de l'infection

Suite à une transfection de 72 ou 96h, le milieu est retiré et les cellules sont lavées une fois au DPBS 1X avant d'être infectées. 200 µL de RPMI contenant 10% de sérum humain AB et le virus GFP, F-Luc ou le mock (pour les puits non infectés) sont mis par puits. La MOI utilisée ici est de 0.1. Une fois le virus mis dans la plaque, celle-ci est mise à 37°C sous 5% de CO2 pendant 3 ou 6 jours. Dans le cas de l'infection avec le virus NL4-3-Bal-IRES-GFP, la plaque a été retirée de l'incubateur après 3 jours d'infection et le milieu a été remplacé par 200 µL de DPBS 1X. Celle-ci a été recouverte d'un film scellant pour conserver la stérilité de la plaque, puis la fluorescence a été lue avec un lecteur de plaque Varioskan. Suite à la lecture, le DPBS a été remplacé par du milieu frais et la plaque fut remise dans l'incubateur pour 3 jours supplémentaires, où la lecture a été prise à nouveau.

Pour une infection avec le virus NL4-3-Bal-IRES-FLuc, les puits sont lavés une fois au DPBS après 3 jours d'infection, puis mis dans 125 µL de tampon de lyse pour la luciférase. La plaque a ensuite été congelée, puis la lecture s'est faite de la même manière que pour les lysats de TZM-bl (voir section 3.1.5.2.). Étant donné que les cellules doivent être lysées, les transfections ont été faites en double afin qu'une plaque soit lysée à 3 jours et l'autre à 6 jours d'infection, et ce pour chaque temps de transfection.

3.4. Validation des cibles potentielles

Suite au criblage des macrophages humain, plusieurs protéines ont causé une modulation de l'infection virale, soit à la hausse ou à la baisse. Étant donné qu'un criblage privilégie la quantité à la qualité des résultats, ceux ayant eu un effet significatif ont été validés par diverses méthodes. Tout d'abord, la cytométrie de flux est beaucoup plus sensible que le lecteur de plaque et permet aussi d'avoir la fluorescence cellule par cellule et de voir la proportion de cellules infectée au lieu de la fluorescence moyenne d'un puits. La viabilité cellulaire va aussi être analysée pour les siRNAs ayant diminué l'infection afin de s'assurer que cette baisse est bien causée par l'ARN interférent et non par une mort cellulaire. L'efficacité des siRNAs sera aussi vérifiée sur la quantité d'ARNm dans la cellule et l'expression des protéines pour pouvoir associer la modulation de l'infection à l'absence de la protéine.

3.4.1. Cytométrie de flux

Pour vérifier le taux d'infection par cytométrie de flux, les MDMs ont été transfectés cette fois dans des plaques 24 puits hydrophobiques (Sarstedt) pour faciliter le détachement des cellules et éviter de les abîmer. Le protocole de transfection est semblable à celui de la section 3.3.1, à l'exception que la concentration finale des siRNAs est de 20 nM et que 200 000 cellules sont transfectées par puits.

Suite à une infection de 6 jours avec le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA, les cellules sont mises dans 1 ml de PBS comprenant 5 mM d'EDTA et 1% de BSA. Suite à une incubation de 60 minutes à 37°C sous 5% de CO2, les MDMs sont prêts à être détachés. Un petit grattoir

stérile est utilisé pour décoller les cellules. Celles-ci ont été transférées dans des tubes pour cytométrie (Thermo Fisher Scientific). Après 2 lavages de PBS 1X- EDTA 5 mM, les cellules sont marquées avec le Fixable Viability Dye eFluor®780 (eBioscience) pendant 30 minutes à 4°C, puis lavées 2 fois. Ceci permettra de distinguer les cellules vivantes des cellules mortes au cytomètre de flux. Les récepteurs Fc, fortement présents à la surface des MDMs, sont bloqués pendant 30 minutes à 4°C avec un tampon de blocage contenant du DPBS 1X, 5 mM d'EDTA, 1% de BSA, 20% de NGS (Normal Goat Serum) (Fitzgerald Industries International,) et 10% de sérum humain AB ayant été filtré à 0.22 µm. L'anticorps dirigé contre le HSA (CD24) murin couplé au fluorophore PE (eBioscience) a été utilisé pour marquer les cellules infectées productivement, soit 0.5 µL d'anticorps par tube dans un total de 150 µL de tampon de blocage. Les cellules ont été incubées avec l'anticorps pendant 15 minutes à 4°C, puis lavées 2 fois au PBS-EDTA-BSA. Finalement, les MDMs ont été fixés avec une solution de 4% de paraformaldéhyde pendant 30 minutes à 4°C, lavés 2 fois et résuspendus dans du PBS-EDTA. Les cellules sont fixées afin d'inactiver les particules virales et ainsi pouvoir sortir les tubes du NC3 pour la cytométrie de flux.

La lecture de la fluorescence a été faite avec un appareil FACS Canto (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) et l'analyse des résultats avec le logiciel FlowJo (FlowJo, LLC, Ashland, OR). Un tube non infecté, mais marqué avec l'anticorps contre HSA a été utilisé pour mesurer le bruit de fond et les résultats pour les divers siRNAs utilisés ont été comparés à la moyenne des siRNAs contrôles.

3.4.2. Extraction d'ARN et PCR quantitative

Pour vérifier le niveau d'ARNm d'un gène précis suite à son interférence par ARN, 200 000 MDMs ont été transfectés avec le siRNA d'intérêt pendant 24 ou 72 heures, puis les cellules ont été lavées une fois au DPBS et mises dans 1 ml de TRIzol (Thermo Fisher Scientific) pour lyser les cellules. Le lysat a été centrifugé dans un tube phase-lock (5 Prime GmbH, Hilden, Allemagne) suite à l'ajout de 1-bromo-3-chloropropane (Sigma-Aldrich, Saint- Louis, MO) pour isoler la phase contenant les ARN totaux. L'ARN a ensuite été extrait de cette phase avec l'ensemble d'extraction Nucleospin (Macherey-Nagel, Düren, Allemagne).

De l'ADN complémentaire (cDNA) a été synthétisé avec une RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) à partir de 500 ng d'ARNm. La RT-PCR a été faite en utilisant la transcriptase inverse provenant du virus de la leucémie murine (M-MLV RT, Promega, Madison, WI) et des random primers (Sigma) pour obtenir une banque d'ADN complémentaire complète dans un même tube. Ces cDNA ont ensuite été testés par PCR quantitative (qPCR) (modèle ABI 7500, Thermo Fisher Scientific) en utilisant le Power SYBR® Green (Thermo Fisher Scientific) et une dilution appropriée de cDNA, habituellement 1/20. Les gènes testés ont tous été normalisés sur le 18S comme contrôle interne.

3.4.3. Immunobuvardage

Afin d'avoir un nombre élevé de protéines, 800 000 MDMs ont été transfectés avec les siRNAs contrôles ou spécifiques aux cibles potentielles dans des plaques 6 puits. Suite à une incubation de 24 ou 72h, les cellules ont été lysées dans 150 µL de tampon de lyse T8 (Urée 7M, Thio-urée 2M, 3% de détergent CHAPS, DTT 20 mM, TCEP 5mM, 0,5% IPG pH 4-7 et 0,25% IPG pH 3-10) auquel du Tris a été ajouté pour une concentration finale de 50 mM ainsi que des inhibiteurs de protéases. Pour certaines protéines, les cellules ont été prétraitées avant la lyse avec du MG132 à une concentration de 10 µM, un inhibiteur des protéasomes, pendant 6h. Le lysat a été centrifugé 5 minutes à 17 000 G et le surnageant a été transféré dans un nouveau tube pour éliminer les débris cellulaires, puis congelés à - 80°C.

Pour effectuer l'immunobuvardage, 30 µg de protéines contenant du Laemmli 1X (Bio-Rad, Hercules, CA) auquel du β-mercaptoéthanol a préalablement été ajouté ont été mis par puits d'un gel de polyacrylamide. Suite à la migration, les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF (Millipore), qui a ensuite été bloquée dans du TBS 1X (Tris-buffered saline) comprenant du Tween-20 et 5% de protéines de lait. La membrane a été marquée avec l'anticorps anti-MDM2 (clone 2A10, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) et anti-actine (clone I19, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX), puis avec un anticorps secondaire couplé à la peroxydase (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., West Grove, PA et Santa Cruz Biotechnology, Inc.). La membrane a été incubée avec de l'ECL (Western

Lightning Plus, Perkin Elmer, Waltham, MA) pendant 1 minute avant l'exposition sur un film.

3.4.4. Cinétique de production virale

Pour mesurer l'impact des siRNAs sur la production de nouvelles particules virales, 200 000 MDMs ont été transfectés dans une plaque de 24 puits pendant 24 ou 72h. Les MDMs ont ensuite été infectés avec le virus NL4-3-Bal à une MOI de 0.1 pendant 2h à

37°C sous 5% de CO2. Après l'incubation, les puits ont été lavés 2 fois avec du DPBS pour retirer le virus et le remplacer par 1ml de RPMI-10% AB-HS, question de ne pas doser le virus que nous avons utilisé pour l'infection. Les cellules ont été incubées sur une période de 12 jours et la moitié du surnageant a été récolté à tous les trois jours suivant l'infection et le même volume de milieu frais a été ajouté après chaque prélèvement. Au 12e jour, un test de PMS-MTS (CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) a été effectué sur les cellules pour mesurer leur métabolisme. Ce test colorimétrique nous permet de vérifier s'il y a une différence dans le métabolisme des cellules, ce qui pourrait influencer la production de p24. Les surnageants ont tous été congelés à -20°C jusqu'au dosage par ELISA p24, tel qu'indiqué à la section 3.1.5.1.

3.5. Analyses statistiques

Les moyennes des données brutes ont été comparées en utilisant l'ANOVA bilatérale avec test de comparaison multiples de Sidak (two-way ANOVA with Sidak’s multiple comparison tests) ou le test de Student avec ratios pairés (ratio paired t-test), dépendamment de l'expérience. Le niveau de confiance a été fixé à 95%. Les calculs ont été effectués avec le logiciel GraphPad Prism version 6.02 pour Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Chapitre 4: Résultats

4.1. Identification de protéines régulatrices du VIH-1 chez les macrophages humains

4.1.1. Criblage de petits ARN interférents

Suite à l'analyse des profils protéomiques et transcriptomiques de macrophages infectés et de la population réfractaire au VIH-1 (bystander), plusieurs gènes ont été sélectionnés pour un criblage de petits ARN interférents. Les cibles ont été choisies parmi les résultats les plus significatifs et reproductibles, en prenant soins de représenter plusieurs catégories de fonctions du macrophage. Ces gènes sont régulés à la hausse ou à la baisse chez les cellules infectées, montrant une certaine importance pour le cycle viral. Nous voulions donc vérifier si la protéine correspondante était importante pour l'établissement de l'infection chez les macrophages. L'interférence par ARN semblait donc un moyen rapide et efficace pour diminuer spécifiquement l'expression d'un gène et vérifier son importance dans le cycle viral.

Les MDMs de 6 donneurs ont été transfectés avec un siRNA contrôle (similarité limitée avec des séquences humaines) ou dirigé contre l'un des 50 gènes sélectionnés, puis infectés avec le virus NL4-3-BAL-IRES-eGFP ou NL4-3-BAL-IRES-FireflyLuc pendant 3 ou 6 jours avant de lire le signal de fluorescence ou de bioluminescence (voir Figure 10). Les contrôles de régulation positive et négative ont bien modulé le signal, soit une augmentation d'au moins 50% pour le siSAMHD1 et une diminution de 80% pour le siCD4. Plusieurs cibles ont montré une modulation de l'intensité du signal. La majorité des cibles ont rendu les MDMs plus susceptibles aux VIH-1 et sont donc des régulateurs négatifs de l'infection, tandis que quelques cibles semblent être des régulateurs positifs. Parmi les gènes testés, 8 montrent une modulation importante pour les 2 séquences de siRNAs utilisés tout en étant reproductibles d'un donneur à l'autre (voir Tableau 1). Ces gènes ont ensuite été analysés pour vérifier que l'interférence par ARN induit bel et bien une diminution du niveau d'ARNm dans les MDMs au moment de l'infection.

Figure 10: Criblage de petits ARN interférents des gènes modulés par le VIH-1 révèle de nouveaux régulateurs de la réplication virale chez les macrophages Les MDMs ont été transfectés avec un siRNA contrôle ou dirigé vers l'un des 50 gènes criblés, puis infectés avec le virus NL4-3-Bal-IRES-eGFP (MOI: 0.1). L'intensité de la fluorescence a été mesurée dans un lecteur de plaques 96 puits. Les données sont normalisées sur la fluorescence moyenne des siRNAs contrôles. Chaque point correspond à la fluorescence moyenne normalisée de 6 donneurs différents. Les points bleus représentent le siRNA CD4 (contrôle de facteur de susceptibilité) et les points rouges sont le siRNA SAMHD1 (contrôle de facteur de restriction). Chaque point représente la transfection des MDMs par un siRNA spécifique. Les points orange sont les cibles ayant eu les résultats les plus significatifs et reproductibles. Une expérience similaire a été effectuée avec le virus codant pour la Firefly-Luc, montrant des résultats semblables.

Tableau 1: Gènes modulant l'infection par le VIH-1 Informations provenant du site internet de GeneCards [152].

Gène Protéine Fonction Édite les adénosines en inosines ADAR1 Adenosine Deaminase, RNA-Specific sur un ARN double brin Apolipoptrotein B mRNA Editing Enzyme Induis des hypermutations G→A APOBEC3B Catalytic Subunit 3B sur l'ADN viral Senseur de dommages à l'ADN, ATM ATM Serine/Threonine Kinase régule le cycle cellulaire FABP9 Fatty Acid Binding Protein 9 Inconnue GGH Gamma-Glutamyl Hydrolase Métabolisme de l'acide folique Oxyde les amines de différents LOXL3 Lysyl Oxidase Like 3 collagènes E3 ubiquitin ligase régulant MDM2 MDM2 Proto-Oncogene plusieurs protéines dont p53 Active la RNase L en réponse à OAS1 2'-5'-Oligoadenylate Synthetase 1 l'ARN viral double brin

4.1.2. Efficacité des petits ARN interférents

La transfection de certains siRNAs a modulé le taux d'infection des MDMs. Cependant, nous devons nous assurer que cette modulation est causée par le siRNA. Le niveau d'ARNm pour le gène correspondant au siRNA a donc été vérifié pour les 8 cibles suite à la transfection. Des MDMs ont été transfectés soit avec le siRNA contrôle ou le siRNA spécifique pendant 72h, puis l'ARN a été extrait des cellules. L'ARN a été quantifié à l'aide d'une RT-PCR quantitative pour l'ARN ribosomique 18S et le gène ciblé par le siRNA. La quantité d'ARNm pour le gène testé est normalisée sur celle du 18S, un gène dont l'expression est stable dans les cellules. Ceci assure que les modulations ne soient pas causées par un nombre de cellules légèrement différent dans les 2 conditions comparées. Le temps de transfection a été fixé à 72h pour vérifier si l'expression du gène est toujours affectée chez les MDMs au moment où les cellules étaient infectées lors du criblage. L'expression des gènes ADAR1, APOBEC3B, ATM, GGH, LOXL3 et OAS1 est toujours basse lors de l'ajout du virus (voir Figure 11). Par contre, le niveau basal de transcrits pour FABP9 est faible et les valeurs obtenues sont très variables. Pour MDM2, il n'y a pas de

baisse significative de l'expression à 72h post-transfection, mais des temps plus courts ont montré une diminution efficace à 24h post-transfection (voir Figure 16).

Figure 11: Efficacité des siRNAs sur le niveau d'ARNm Les MDMs ont été transfectés avec le siRNA (20 nM) pendant 72h, puis l'ARN a été extrait et analysé en triplicata par RT-PCR quantitative. Le niveau d'ARNm pour le gène est d'abord normalisé sur celui du 18S, puis sur la moyenne des siRNAs contrôles. La diminution de l'ARN est significative pour ADAR1, APOBEC3B, ATM, GGH, LOXL3 et OAS1, mais pas pour FABP9 et MDM2 (two-way ANOVA with Sidak’s multiple comparison tests, **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; NS: non significatif).

4.2. Validation de MDM2 comme facteur de régulation du VIH-1

Le criblage de protéines susceptibles de jouer un rôle dans l'infection par le VIH-1 chez les macrophages a mis de l'avant plusieurs gènes régulant négativement le virus. Cependant, seulement le gène MDM2 agissait comme un régulateur positif important. Le projet s'est donc centré sur cette protéine. Deux séquences de siRNAs avaient été utilisées et le siRNA #1 est le plus efficace pour diminuer l'infection lors du criblage (voir Figure 12). Pour les 2 modèles viraux utilisés, le siRNA #1 a diminué de moitié le signal de fluorescence (GFP) ou de bioluminescence (F-Luc). Pour le siRNA #2, seulement le virus GFP a subi une modulation de l'infection.

Figure 12: Modulation de l'infection par le siMDM2 L'interférence par ARN du gène MDM2 a diminué de 50% la fluorescence émise par les macrophages infectés pendant 3 jours pour chacun des siRNAs utilisés, tandis que seulement le siMDM2 #1 a diminué de moitié la bioluminescence. La ligne pointillée représente la moyenne des siRNAs contrôle (moyenne et écart-type de 3 donneurs, ratio paired t-test, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001; NS: non significatif).

4.2.1. Le gène MDM2 est surexprimé dans les macrophages infectés

Pour vérifier les résultats de l'analyse transcriptomique, des MDMs ont été infectés pendant 36 heures ou 6 jours avec le mock ou le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA, pour ensuite être triés par immunocapture magnétique avec un anticorps contre HSA. L'ARN a été extrait des 3 fractions (mock, bystander et HSA+) et testé pour l'ARNm du 18S et de MDM2 à l'aide d'une RT-PCR quantitative. Les résultats ont été analysés par la méthode du 2-ΔΔCT. Après une exposition au virus de 36h, les MDMs infectés productivement expriment 2 fois plus le

gène MDM2 que les non infectés (mock) ou la fraction ayant résisté à l'infection (bystander) (voir Figure 13). Après 6 jours d'infection, les MDMs infectés expriment en moyenne 4 fois plus de transcrits que la population Mock, et il y a une faible augmentation de l'expression chez les cellules Bystander. La protéine MDM2 semble donc être impliquée dans le cycle de vie du VIH-1, au sain des macrophages.

Figure 13: Le gène MDM2 est surexprimé chez les cellules infectées par le VIH-1 Les MDMs de 2 donneurs ont été infectés avec le Mock ou le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA (MOI: 0.1) pendant A) 36 heures ou B) 6 jours, puis triés par immunocapture. L'ARN total a été extrait et testé pour le gène MDM2. Les cellules infectées (HSA+) montrent une plus grande expression de MDM2 que les non infectées (Bystander) pour les 2 temps testés. Les données sont analysées par la méthode du 2-ΔΔCT, normalisées sur la fraction Mock.

4.2.2. La transfection des siRNAs contre MDM2 diminue l'infection par le virus NL4- 3-Bal-IRES-HSA

La lecture de l'infection par le virus codant pour la GFP ou la F-Luc était effectuée par un lecteur de plaque, donc nous n'avons qu'un aperçu de l'ensemble des cellules. Afin d'avoir des résultats beaucoup plus précis, des MDMs de 3 donneurs ont été transfectés avec les divers siRNAs (contrôle, MDM2, SAMHD1 et CD4) pendant 3 jours, puis ils ont été infectés avec le virus NL4-3-Bal-IRES-HSA pendant 3 jours à une MOI de 0.1 (voir Figure 14). Les cellules ont ensuite été décollées et l'infection a été vérifiée par cytométrie de flux avec un anticorps dirigé contre la protéine HSA. Le gène rapporteur HSA est petit comparativement à la GFP ou la F-Luc, donc la taille du génome est plus près du génome original. Nous avons donc un virus beaucoup plus infectieux que les autres modèles

utilisés. La cytométrie de flux nous donne aussi directement la proportion de cellules infectées au lieu d'une intensité de fluorescence moyenne. Pour ces donneurs, la diminution de l'infection était un peu moins importante, mais toujours présente.

Figure 14: La réduction de l'expression de MDM2 induit une diminution de l'infection Les MDMs de 3 donneurs ont été transfectés avec le siRNA contrôle, MDM2, SAMHD1 ou CD4 pendant 3 jours, puis infectés pour 3 autres jours avec le virus NL4-3-Bal-IRES- HSA (MOI: 0.1). La cytométrie de flux montre une diminution de l'infection chez les MDMs transfectés avec les siRNAs MDM2 comparativement au siRNA contrôle, représenté par la ligne pointillée (moyenne et écart-type de 3 donneurs, ratio paired t-test, *p<0.05; ***p < 0.001).

4.2.3. La diminution du niveau de MDM2 n'induit pas de mort cellulaire

Étant donné que le knock-down du gène MDM2 diminue l'infection, nous devions nous assurer que cette baisse n'était pas plutôt causée par une mort cellulaire. Pour ce faire, les cellules des 3 donneurs présentés à la section 4.2.1 (voir Figure 11) ont aussi été marquées avec un colorant pour la viabilité. Celui-ci se fixe aux protéines et est exporté hors des cellules vivantes, permettant de les distinguer des cellules mortes par cytométrie de flux. La transfection des siRNAs dirigés contre MDM2 ne cause pas plus de mortalité que les siRNAs contrôles (voir Figure 15). La viabilité est même meilleure lors de l'infection suite à la transfection des siMDM2. Ces résultats montrent que la diminution de l'infection est bel et bien causée par le siRNA et non par une toxicité cellulaire.

Figure 15: Des essais de viabilité ne montrent aucune toxicité apparente causée par l'interférence par ARN du gène MDM2 Les MDMs provenant de 3 donneurs ont été transfectés pendant 3 jours avec un siRNA spécifique (contrôle ou MDM2), puis infectés pendant 3 jours avec le virus NL4-3-Bal- IRES-HSA (MOI: 0.1). Les cellules ont été marquées au Fixable Viability Dye eFluor 780 et analysées par cytométrie de flux. Les siRNAs dirigés contre MDM2 n'induisent pas de mort cellulaire (moyenne et écart-type de 3 donneurs).

4.2.4. Vérification de l'expression de MDM2 suite à la transfection

Afin de corréler la diminution de l'infection avec la mise en sourdine du gène, nous devions vérifier si le siRNA induit bien une diminution de l'ARNm et qu'il y a un impact sur le niveau de protéines dans les macrophages. Comme il a été montré à la figure 11, aucun changement au niveau de l'ARNm ne peut être perçu après 3 jours de transfection. Cependant, peut-être que ce gène est fortement exprimé et que ceci épuise le siRNA plus rapidement que les autres cibles. Les MDMs de 2 nouveaux donneurs ont donc été transfectés pendant 72h avec les siRNAs (Ctrl et MDM2) avant de lyser les cellules et d'extraire l'ARN. Le niveau de transcrits a été analysé par RT-PCR quantitative, en normalisant sur le nombre de transcrit du 18S. La transfection des siRNAs dirigés contre MDM2 n'a toujours pas diminué l'expression de celui-ci. Les MDMs de deux autres donneurs ont été transfectés pendant 12, 24 ou 36h pour vérifier des temps plus courts. L'interférence par ARN s'est avérée efficace à 24h post-transfection, où une diminution de près de la moitié du nombre de transcrits peut être observée (voir Figure 16).

Figure 16: Les siRNAs MDM2 diminuent efficacement le niveau d'ARNm Des MDMs ont été transfectés pendant 72h, puis l'ARN total a été extrait et testé pour le gène MDM2. La ligne pointillée représente la moyenne des siCtrl #1 et #2 (moyenne et écart-type de 3 réplicas techniques pour chaque donneur). A) Aucun changement pour le niveau d'ARNm de MDM2 n'a pu être observé chez 2 donneurs transfectés pendant 72 h, correspondant au moment de l'infection. B) Des temps plus courts ont été testés et ont montré une diminution efficace de l'ARNm à partir de 24h post-transfection.

Bien qu'il y ait une diminution de l'ARNm, ceci ne veut pas nécessairement dire que c'est aussi le cas au niveau protéique. Afin de s'assurer qu'il y a une diminution de protéines pouvant être associée à la baisse de l'infection, des MDMs ont été transfectés avec les siRNAs pendant 24 ou 72h avant d'être lysés pour en extraire les protéines et les analyser par immunobuvardage. MDM2 peut s'autopolyubiquitiniler afin d'être dégradé par le protéasome. Les cellules ont donc été traitées avec du MG132 (10 µM), un inhibiteur du protéasome, pendant 6h avant de procéder à la lyse. Sans ce traitement, l'anticorps spécifique à MDM2 reconnaît une protéine d'un poids moléculaire beaucoup plus petit que celui attendu de 90 kDa (résultats non présentés). Les membranes ont été incubées avec un anticorps spécifique à MDM2 et pour l'actine, servant de contrôle de chargement des puits. Les résultats représentent bien ce qui a été observé au niveau de l'ARNm. Les siRNAs spécifiques à MDM2 diminuent le niveau de protéines chez les macrophages effectivement à 24h, mais est pratiquement rétabli au moment de l'infection (voir Figure 17).

Figure 17: L'interférence par ARN du gène MDM2 réduit son expression protéique Des MDMs ont été transfectés pendant 24h ou 72h avec un siRNA contrôle ou spécifique. Les cellules ont été mises en présence de MG132 pendant 6h avant l'extraction des protéines. Les siRNAs dirigés contre MDM2 induisent une diminution de la protéine à 24h post-transfection et est partiellement rétabli après 72h de transfection.

4.2.5. Modulation de la production virale par les ARNs interférents

Le rôle de la protéine MDM2 dans la production de nouvelles particules virales a été testé. Pour ce faire, des MDMs de 3 donneurs ont été transfectés avec un siRNA contrôle ou spécifique à MDM2, CD4 ou SAMHD1 pendant 24 ou 72h. Seulement le siRNA #1 a été utilisé dans cette expérience étant donné que c'est celui qui montre une diminution de l'infection virale constante, peu importe le modèle viral utilisé, en plus d'une meilleure interférence du gène. Après l'incubation avec les siRNAs, les macrophages ont été infectés avec le virus NL4-3-BalEnv, ne contenant que les protéines virales sans gène rapporteur, à une MOI de 0.1. Le surnageant a été récolté à 3, 6, 9 et 12 jours post-infection et dosé par ELISA de la capside virale (p24). Comparativement au siRNA contrôle, les cellules transfectées avec le siMDM2 produisent moins de particules virales, se rapprochant du siCD4 (notre contrôle de facteur de susceptibilité) (voir Figure 18). Le siCtrl ne module pas la production de particule virale par rapport aux cellules non traitées. Le siSAMHD1, quant à lui, augmente la production virale tardivement, bien que l'on voit son effet sur les gènes rapporteurs dès le 3e jour suivant l'infection (voir figure 12). Le temps de transfection ne semble pas affecter l'efficacité du siMDM2, qui perdure tout au long de la cinétique. La production de particules virales chez ces macrophages, ainsi que ceux transfectés avec le siCD4, reste au même niveau pendant les 12 jours, contrairement aux non-traités et ceux transfectés avec le siCtrl, où un pic de production se produit autour du 7e jour, ce que l'on

voit habituellement chez les MDMs. Ces résultats étaient reproductibles chez les 3 donneurs testés. Ces résultats montrent que la protéine MDM2 est un régulateur positif de l'infection et confirment peu à peu notre hypothèse que cette protéine aurait un rôle plutôt indirect. Même si le niveau de MDM2 est presque rétabli à 72h post-transfection, la résistance à l'infection est maintenue chez les macrophages. Après la dernière récolte des surnageants, un test de PMS-MTS a été effectué pour vérifier l'activité métabolique de chaque condition. Le réactif a été préparé tel qu'indiqué par le fabricant et les MDMs ont été incubés 20 minutes en présence du PMS-MTS avant de prélever les surnageants pour lire leur densité optique (D.O.) à une longueur d'onde de 490 nm. Les D.O. obtenues ont toutes été normalisées sur celle du siCtrl. Les valeurs obtenues sont semblables pour chacune des conditions, ne descendant jamais sous 95% de l'activité métabolique du siCtrl, peu importe le temps de transfection (voir Figure 18). Étant donné que le métabolisme mesuré sur une période de 20 min est le même pour chaque condition, nous pouvons supposer que la quantité de cellules présentes dans les puits suivant les 12 jours d'infection est la même et que leur viabilité n'est pas affectée par les siRNAs utilisés. La diminution de la production de particules virales pour les siRNAs dirigés contre CD4 et MDM2 n'est donc pas causée par une diminution du nombre de cellules dans le puits ou encore par une baisse de viabilité cellulaire, deux facteurs qui auraient eu un impact sur la mesure du métabolisme. C'est plutôt la mise en sourdine du gène qui a un impact sur le taux d'infection des macrophages humains par le VIH-1.

Figure 18: Modulation de la production virale et du métabolisme des MDMs par la transfection de petits ARN interférents Les MDMs ont été transfectés pendant A) 24h ou B) 72h avec un siRNA contrôle ou spécifique à un gène, puis infectés avec le virus NL4-3-BalEnv (MOI: 0.1). La production virale a été mesurée en dosant la concentration de p24 dans le surnageant sur une période de 12 jours (NT= cellules non transfectées). Le knock-down de MDM2 induit une diminution dans la production virale comparativement au siCtrl, peu importe le temps de transfection. Les résultats obtenus avec ce donneur sont représentatifs d'un ensemble de 3 donneurs. C) Au 12e jour, un test PMS-MTS a été fait pour mesurer l'activité métabolique des différentes conditions. La D.O. a été normalisée sur celle du siCtrl pour chaque condition. Il n'y a pas de modulation significative du métabolisme causant les différences lors de la mesure de production virale. Les résultats obtenus avec ce donneur sont représentatifs d'un ensemble de 3 donneurs.

Chapitre 5: Discussion

5.1. Identification de facteurs de régulation potentiel du VIH-1

Le criblage de petits ARN interférents nous a permis d'identifier plusieurs sentiers signalétiques pouvant jouer un rôle dans l'établissement de l'infection par le VIH-1 chez le macrophage humain. Certaines des protéines étant ressorties du lot sont déjà connues pour réguler l'infection par le VIH-1. Ces protéines sont ADAR1, APOBEC3B, ATM, MDM2 et OAS1. Par contre, elles sont peu étudiées dans l'environnement cellulaire du macrophage. Nous n'avons pas porté beaucoup attention à ces protéines, à l'exception de MDM2.

Tout comme nos résultats, le rôle d'ADAR1 est contradictoire dans la littérature. Le premier siRNA dirigé contre ADAR1 a inhibé l'infection tandis que le deuxième l'a augmentée. Bien que la technique de l'interférence par ARN soit spécifique, il est quand même possible qu'un siRNA puisse aussi reconnaître non spécifiquement d'autres séquences d'ARNm, que ce soit d'un autre membre de la famille des ADAR ou un tout autre gène. C'est peut-être ce qui se produit avec l'une des séquences utilisées, menant à des résultats contradictoires. Chez les ly T CD4+, ADAR1 facilite la réplication virale. Des ly T CD4+ déficients dans le gène ADAR1 montre un blocage dans la traduction des ARNm viraux [153]. ADAR1 est aussi incorporé dans les virions produits par les lyT CD4+ [154]. Dans les macrophages, c'est plutôt une restriction qui est induite par cette protéine via une interférence au niveau post-transcriptionnel [155]. ADAR1 est donc un bon exemple pour illustrer l'importance d'étudier une protéine dans divers types cellulaires. Cette différence peut s'expliquer par le fait que le gène ADAR1 peut être induit en réponse à l'interféron-γ chez les MDMs, mais pas chez les ly T CD4+ [155]. L'activité d'induction d’hypermutations dans l'ARN viral ne se produit peut-être qu'en présence de protéines induites par la réponse interféron.

APOBEC3B (A3B), membre de la famille des protéines APOBEC, est un régulateur négatif de l'infection. L'un des siRNAs dirigés contre ce gène a levé une restriction et augmenté l'infection de moitié, autant après 3 qu'à 6 jours d'infection. Ces résultats vont dans le même sens que ce qui a été rapporté dans la littérature. En effet, comme APOBEC3G, A3B montre une activité antivirale dans les macrophages humains. Dans les études chez les modèles primates non humains, A3B montre aussi une activité antivirale contre le VIS

[156]. La protéine Vif codée par le VIS mène aussi à la dégradation d'A3B, tout comme celle du VIH-1 avec APOBEC3G [157]. Par contre, les études chez les lignées cellulaires humaines montrent des résultats contradictoires sur l'importance de la restriction médiée par A3B [158, 159]. Finalement, des études avec des cellules provenant de donneurs portant des mutations dans le gène APOBEC3B montrent que ces personnes ne sont pas plus à risques d'être infectées avec le VIH-1 et que cette protéine jouerait un rôle mineur dans la défense antivirale [160, 161]. Nos résultats sont préliminaires et nous devons prendre en compte que les séquences sont très conservées entre les divers membres de la famille APOBEC. Nous devons donc prouver que notre siRNA ne diminuait que le niveau d'A3B et que la modulation de l'infection n'est pas le résultat d'une réaction croisée avec une autre protéine APOBEC.

La protéine ATM (ataxia telangiectasia-mutated) montre une restriction virale chez le macrophage. Lorsque son expression est inhibée, l'infection augmente de moitié, et ce pour les 2 séquences de siRNA utilisées. Cependant, ces résultats viennent à l'encontre des études publiées. ATM est une protéine kinase recrutée au site de dommages à l'ADN double brin (DSB, Double Strand Break) et entraînera l'arrêt du cycle cellulaire pour recruter les complexes de réparation de l'ADN. Le VIH-1 est connu pour induire ces bris dans l'ADN par l'action de la protéine virale Vpr [162]. Ces bris auraient un rôle à jouer dans l'intégration du génome viral dans celui de la cellule hôte et la protéine kinase ATM stabiliserait la transduction pour permettre une intégration efficace [163, 164]. Une molécule inhibitrice d'ATM induit aussi une résistance à l'infection, signifiant qu'ATM est un régulateur positif de l'infection, tandis que nos résultats montrent l'inverse [165]. Cependant, ces études ont été faites dans des cellules autres que les MDMs et ces derniers sont des cellules ne se divisant pas, contrairement aux lignées cellulaires. L'absence de divisions cellulaires fait peut-être en sorte qu'ATM induit un autre sentier signalétique, menant à la restriction virale.

La protéine OAS1 (2'-5'-Oligoadenylate Synthetase 1) est aussi connue pour réguler le VIH-1. Les membres de la famille des protéines OAS synthétisent des composés activant les RNase L, des endoribonucléases dégradant les ARNs cellulaires et viraux. Cette protéine a été étudiée chez les cellules myéloïdes et est exprimée en réponse à l'interféron. Par exemple, chez les monocytes isolés de patients ayant une haute charge virale, une étude

montre une surexpression des gènes de la famille OAS [166]. Chez les macrophages, l'IFN- λ3 diminue la réplication virale en induisant l'expression d'OAS1 [167]. Ces résultats vont dans le même sens des nôtres, où l'un de nos siRNA (siOAS#2) a augmenté l'infection de moitié à un temps court d'infection. Cependant, l'autre ARN interférent (siOAS#1) a diminué de moitié l'infection. Le niveau protéique d'OAS1 suite à la transfection des siRNA devra être mesuré pour vérifier si les deux modulations contradictoires auraient un lien avec l'efficacité du siRNA.

Bien que les 4 protéines discutées précédemment ne sont pas nouvelles dans le contexte de l'infection au VIH-1, elles nous ont permis de démontrer que notre criblage pouvait reproduire certains résultats, tout en nous en apprenant un peu plus sur le rôle de ces protéines dans la régulation virale chez le macrophage primaire. D'autres études plus poussées devront être faites pour assurer la véracité de nos résultats, mais le projet s'est plutôt dirigé vers des protéines que nous trouvions plus intéressantes à étudier, soit par leur rôle dans la cellule ou par l'absence d'études dans le contexte du VIH-1.

La première de ces protéines est FABP9 (Fatty Acid Binding Protein 9). La famille des FABP est impliquée dans le métabolisme des lipides et interagit aussi avec eux pour le transport [168]. FABP9, quant à elle, est peu étudiée, mais elle est connue pour jouer un rôle dans l'immunité innée des invertébrés [169]. Nos résultats ont montré que chez les macrophages humains, FABP9 restreint l'infection par le VIH-1. Les 2 siRNAs utilisés ont augmenté l'infection d'au moins de moitié chez les MDMs. L'enveloppe virale étant composée d'une bicouche lipidique provenant de l'hôte, cette protéine cytosolique pourrait interagir avec le virion lors du bourgeonnement, empêchant la sortie du virus ou troublant l'assemblage des protéines virales à la membrane cellulaire. Il est aussi possible que le virus nécessite un composé provenant du métabolisme des acides gras pour compléter l'une des étapes du cycle viral. Malheureusement, nous n'avons pas réussi à montrer l'efficacité de nos ARNs interférents sur ce gène sur la quantité d'ARNm. Nous devrons donc nous assurer que le niveau de protéines diminue bel et bien avant de poursuivre les études.

La deuxième protéine, la Gamma-Glutamyl Hydrolase (GGH), montre aussi une restriction de l'infection. Cette enzyme travaille de concert avec la FPGS (folylpolyglutamate synthase) pour assurer un niveau adéquat de THF-polyglutamate. La FPGS ajoute des

glutamates au THF (5,6,7,8-Tetrahydrofolate) pour former le THF-polyglutamate tandis que GGH les retire. Nos résultats montrent qu'en diminuant le niveau de GGH chez les macrophages, les cellules sont plus sujettes à l'infection (signal 1.5 fois plus élevé chez les cellules transfectées avec le siGGH). L'efficacité des siRNAs sur le niveau d'ARNm a été montrée et devra être confirmée sur les protéines. Un niveau de glutamate élevé est aussi retrouvé dans le liquide cérébro-spinal et le plasma de patients atteints de maladies neurologiques associées au SIDA [170]. Une autre équipe a montré que le niveau de glutamate intracellulaire chez des macrophages infectés diminue tandis que celui extracellulaire augmente, phénomène causé par la protéine virale Vpr [171]. Ces résultats vont dans le même sens que les nôtres. En inhibant l'action de GGH, l'enzyme FPGS utiliserait le glutamate et pourrait causer une diminution du niveau intracellulaire de cette molécule menant à la hausse d'infection productive. Le niveau de glutamate devra être mesuré suite à la transfection pour s'assurer que la diminution de l'expression de GGH a bel et bien un impact notable. Si c'est le cas, nos résultats, ainsi que ceux décrits précédemment, pourraient montrer un certain rôle du glutamate dans la restriction virale chez les macrophages. GGH n'a d'ailleurs jamais été décrit comme étant une protéine régulatrice du VIH-1.

La Lysyl Oxidase Like 3 (LOXL3) est la troisième protéine identifiée comme étant un régulateur négatif de l'infection et n'est pas connue pour interagir avec le VIH-1. La famille des LOX est composée de 5 membres, la Lysyl Oxydase (LOX) et de 4 Lysyl Oxidase Like (LOXL1 à LOXL4). Étudiée principalement en oncologie, la famille LOX est connue pour catalyser les réactions de réticulations (cross-linking) entre les polymères de collagènes dans l'espace extracellulaire [172]. Ces protéines sont localisées soit dans le noyau ou dans l'espace extracellulaire [173]. Des analyses d'immunofluorescence sur nos MDMs ont montré que LOXL3 est bien situé dans le noyau (données non présentées). En diminuant l'expression de LOXL3 avant l'infection, nous avons observé le double d'intensité de fluorescence pour le premier ARN interférent et une hausse variable dépendamment du temps d'infection pour le deuxième siRNA. LOXL3 semble donc être un régulateur négatif du VIH-1. Cette protéine n'est d'ailleurs pas connue pour jouer un rôle dans l'établissement de l'infection. En prenant en compte sa localisation cellulaire, il est probable que LOXL3 agisse au niveau de l'intégration ou l'expression des gènes viraux ou encore qu'il interagisse

avec le virus avant son attachement à la cellule. En oxydant les résidus Lys des protéines virales, LOXL3 affecte peut-être la stabilité de celle-ci, rendant la production de nouveaux virions moins efficace. Il faudra déterminer précisément quelle étape du cycle viral est affectée par ce facteur de restriction potentiel avec des tests d'intégration, d'activité de transcriptase inverse ou encore de production de nouveaux virions avec ou sans la présence de LOXL3.

5.2. Identification de MDM2 comme régulateur positif de l'infection

5.2.1. Modulation de l'infection médiée par MDM2

La protéine MDM2 (MDM2 proto-oncogene) est la dernière protéine régulatrice identifiée dans ce criblage et est celle où nous avons le plus dirigé notre attention. Cette protéine est une E3-ubiquitin ligase et l'un des régulateurs les plus importants de la protéine p53. MDM2 ubiquitine p53, l'envoyant vers sa dégradation par le protéasome. Le rôle de p53 est d'arrêter le cycle cellulaire en réponse aux dommages à l'ADN et d'induire leur réparation ou encore de débuter l'apoptose si la réparation est impossible. La protéine p53 induit aussi l'expression du gène MDM2, montrant une boucle de régulation négative pour assurer une expression adéquate de p53 sans l'arrêt du cycle cellulaire inutile. MDM2 peut aussi s'auto- ubiquitiner pour aider ce contrôle. MDM2 est retrouvée dans le cytoplasme et contient aussi une séquence de localisation nucléaire [174]. Cette protéine semble importante dans l'infection par le VIH-1, car les MDMs infectés surexpriment ce gène (Figure 13).

Suite à l'interférence des ARNm de MDM2, nous avons observé une diminution de moitié du signal d'infection pour la première séquence de siRNA, autant à 3 qu'à 6 jours post- infection, avec le virus GFP ainsi que le virus F-Luc. Le deuxième siRNA mène à une diminution un peu moindre aux deux temps d'infection, mais seulement pour le virus GFP et sans effet pour le virus F-Luc (Figure 12). La présence de MDM2 améliore donc l'infectivité du virus et le siRNA #1 semble plus efficace pour diminuer l'expression de MDM2. Cette modulation a pu être constatée aussi en cytométrie de flux en utilisant le virus codant pour le gène rapporteur HSA (Figure 14) où la diminution du pourcentage de cellules infectées, mais de manière moins importante que les deux autres modèles viraux. La viabilité des cellules a aussi été vérifiée par cytométrie de flux après 3 jours de

transfection suivis de 3 jours d'infection et il n'y a pas de mort cellulaire suivant le traitement (Figure 15). La baisse d'infection remarquée est donc bien causée par un effet de la transfection des siMDM2 et non par une mort des cellules transfectées, ce qui aurait diminué l'intensité de fluorescence lors du criblage.

MDM2 a déjà été étudiée dans l'infection au VIH-1. Une équipe a montré que MDM2 peut interagir avec la protéine virale Vif pour l'ubiquitiner et mener à sa dégradation chez les MDMs, ce qui a pour impact de rétablir la présence du facteur de restriction APOBEC3G [175]. Ceci a pour effet de réguler négativement l'infection. Cependant, cette équipe a aussi utilisé un siRNA dirigé contre MDM2 chez les MDMs, mais leur cinétique de production virale diffère grandement de la nôtre (Figure 18). Alors que nous avons une production virale toujours plus faible que le siRNA contrôle, eux obtiennent une production de p24 plus forte que le contrôle à certains temps et plus faible à d'autres. Les résultats contradictoires peuvent provenir de la technique de transfection différente ou encore de la souche virale utilisée, également différente.

Une autre étude montre que MDM2 polyubiquitine la protéine virale Tat en utilisant les résidus lysine 63 (K63) des molécules d'ubiquitine. Cependant, au lieu de mener à sa dégradation par le protéasome, l'utilisation des K63 stimule plutôt l'activité de Tat, augmentant ainsi la transcription des gènes viraux [176]. Cette étude a été menée chez des lignées cellulaires et pourrait représenter ce que nous voyons chez les MDMs. Par contre, nos résultats semblent plutôt indiquer un rôle indirect de la protéine MDM2 dans la régulation du VIH-1 et non une interaction directe avec l'une des protéines virales. En vérifiant le niveau d'expression du gène suite à la transfection, nous avons remarqué que le niveau d'ARNm était pratiquement rétabli au moment de l'infection des macrophages, correspondant à 72h post-transfection (Figure 16). Le knock-down du gène est à son maximum après 24h de transfection du siRNA contre MDM2. Le même effet a été constaté au niveau des protéines, où il y a une diminution de la quantité de protéines suivant 24h de transfection et l'expression est pratiquement rétablie à 72h (Figure 17). Le siMDM2 #1, celui diminuant le plus le taux d'infection des MDMs, est d'ailleurs celui qui inhibe le plus efficacement l'expression de la protéine, permettant de voir l'importance de MDM2 pour l'établissement de l'infection.

La modulation que nous avons notée lors du criblage serait donc causée par un effet indirect du knock-down, signifiant que MDM2 régule une protéine jouant un rôle majeur dans l'infection. Cet effet a été vérifié au niveau de la production virale en comparant l'infection suite à 24 ou 72h de transfection chez un même donneur (Figure 18). La quantité de p24 produite est sensiblement la même, peu importe le temps de transfection du siRNA. La mesure de l'activité métabolique nous permet d’assumer que la différence notable de production virale sur une période de 12 jours n'est pas causée par une mort cellulaire. Cependant, la diminution de production virale dans le temps est peut-être causée seulement par le faible taux d'infection de base suite à la transfection du siRNA. Une faible proportion de cellules infectées résulte en une production virale plus faible dès le départ, ce qui aura nécessairement un impact sur la réinfection des MDMs au cours des 12 jours de récoltes. La même expérience pourrait être répétée cette fois avec l'ajout d'un inhibiteur de la RT suite à l'infection pour prévenir la réinfection de nouvelles cellules dans tous les puits, nous permettant de mieux voir la production virale par les cellules infectées lors de l'absence de la protéine étudiée seulement.

L'interférence par ARN du gène MDM2 induirait une résistance persistante à l'infection qui devra être étudiée plus profondément. MDM2 interagit avec plusieurs protéines dont l'une pourrait être celle responsable de la résistance accrue à l'infection. Deux voies possibles sont envisagées: la voie p53-dépendante et p53-indépendante.

5.2.2. Régulation induite par la voie p53-dépendante

L'une des causes de la restriction causée par le siMDM2 pourrait être l'accumulation de p53, l'un des liens directs de l'inhibition de l'activité de MDM2. Lorsque p53 est actif, cette protéine induit l'expression de plusieurs gènes, dont celui de p21 (CDKN1A). La protéine p21 est connue pour restreindre l'infection par le VIH-1 chez les macrophages. En temps normal, le facteur de transcription E2F1 induit l'expression de RNR2, une protéine s'associant avec RNR1 pour former le complexe RNR, dont le rôle est de synthétiser des dNTPs à partir de NTPs. Lorsque p21 est exprimée, cette protéine inhibe l'expression de E2F1, menant à un arrêt de synthèse de dNTPs et à une restriction de la rétrotranscription de l'ARN viral [177]. Cette inhibition de l'infection est indépendante de la restriction

médiée par SAMHD1 [178]. En diminuant le niveau de MDM2 chez les macrophages, nous induisons probablement une hausse en p53, menant à l'expression de p21 et la restriction médiée par celui-ci. Le niveau de p53 et p21 a été analysé par immunobuvardage sur les mêmes échantillons testés pour MDM2 (Figure 14) pour vérifier cette théorie, mais il ne semblait pas y avoir de changement selon la présence ou non de MDM2 (données non présentées). Les membranes avaient cependant un bruit de fond rendant l'analyse difficile et le protocole devra être optimisé. L'immunobuvardage a aussi été fait sur des protéines provenant de macrophages non infectés. Il se pourrait que l'infection ou encore l'exposition au virus induise une modulation dans les niveaux de protéines de la chaîne menant à la restriction par p21 que nous ne verrons pas chez les MDMs non infectés. Nous avons d'ailleurs vérifié l'expression de SAMHD1 par immunobuvardage suite à la transfection du siRNA dirigé contre MDM2 pour vérifier si le knock-down induisait une surexpression de SAMHD1 pouvant causer la résistance à l'infection. Son niveau est le même que les cellules transfectées avec le siRNA contrôle données non présentées) et écarte donc cette hypothèse, mais devra aussi être vérifié chez des macrophages transfectés et exposés au virus. Bien que la restriction causée par p21 semble une bonne explication à nos résultats, nos résultats avec MDM2 semblent se diriger vers une autre voie de signalisation.

5.2.3. Régulation induite par la voie p53-indépendante

MDM2 peut aussi réguler positivement l'infection en interagissant avec un autre sentier indépendant de p53: la réparation de cassures double brins. Deux sentiers peuvent être utilisés pour la réparation, soit celui de la recombinaison homologue ou par la jonction d'extrémités non homologues de l'ADN (Non-homologous end joining, NHEJ) [179]. La protéine virale Vpr induit des cassures double brins dans l'ADN de la cellule hôte et le génome viral serait en mesure de s'intégrer dans ces cassures sans avoir recours à l'intégrase [162, 180]. Le virus utiliserait la machinerie de réparation cellulaire pour joindre l'ADN viral à celui de la cellule, plus précisément le complexe MRN. Ce complexe, formé des protéines Mre11, Rad50 et Nbs1, est recruté aux cassures double brin afin de les réparer. MDM2 a été rapporté comme un régulateur de ce complexe. MDM2 peut se lier directement à Nbs1 et retarde la réparation de la cassure [181]. Nos résultats montrent que

MDM2 est un régulateur positif de l'infection. Cependant, si nous inhibons MDM2, le complexe MRN devrait réparer et stabiliser l'intégration plus rapidement, mais nous obtenons plutôt une diminution de l'infection. Une étude montre d'ailleurs que la présence de Nbs1 ou de Mre11 n'influence pas l'infection chez diverses lignées cellulaires [182]. Les trois protéines du complexe MRN n'ont cependant pas été co-exprimées et l'étude n'a pas été menée dans des cellules primaires. Il est aussi possible que le VIH-1 utilise MDM2 pour inhiber l'action du complexe MRN afin d'éviter l'autre sentier de réparation de l'ADN: la recombinaison homologue. Si la cellule détecte les cassures double brins et active ce sentier, la recombinaison homologue va effacer le provirus, étant donné qu'il n'est présent que sur l'un des chromosomes. Ceci expliquerait pourquoi nous voyons une diminution de l'infection avec le siMDM2, car la recombinaison homologue serait favorisée. Le rôle de MDM2, Mre11, Rad50 et Nbs1 dans l'intégration de l'ADN viral devra être étudié plus en profondeur chez les MDMs.

Chapitre 6: Conclusion et perspectives

Ce projet avait comme but principal d'identifier de nouvelles protéines pouvant réguler le VIH-1 chez les macrophages primaires. Étant l'un des réservoirs viraux persistants chez les personnes infectées, il est important d'étudier l'établissement de l'infection chez ce type cellulaire et de trouver de nouvelles protéines pouvant être une cible thérapeutique potentielle.

Le criblage de petits ARN interférents a très bien fonctionné chez les MDMs. Bien que chaque donneur réagit différemment à l'infection, le knock-down de plusieurs gènes a modulé l'infection virale efficacement. Sur les cinquante gènes testés, cinq protéines ont été identifiées comme des régulateurs négatifs de l'infection, dont trois qui n'étaient pas connues pour intervenir dans le cycle infectieux du VIH-1. Une autre protéine testée a été identifiée comme un régulateur positif et deux autres ont eu des résultats contradictoires dépendamment de la séquence de siRNA utilisée. Cette étude a permis de constater que plusieurs voies bien distinctes influencent la réplication virale chez le macrophage humain, que ce soit des protéines impliquées dans le métabolisme des lipides ou dans la réparation de l'ADN. Bien que certaines protéines ayant ressorti du criblage ont déjà été étudiées dans le contexte du VIH-1 (ex. ADAR1, APOBEC3B, ATM, MDM2 et OAS1), celles-ci ne l'étaient pas nécessairement dans l'environnement cellulaire des macrophages.

Notre attention s'est plutôt portée sur les protéines peu étudiées dans l'infection des MDMs. Nous avons sélectionné quatre gènes pour pousser les études plus loin. Tout d'abord, le gène MDM2 est déjà connu pour réguler l'infection, mais la littérature montre des effets positifs et négatifs sur celle-ci. Étant notre seul gène identifié comme régulateur positif de l'infection, nous avons choisi d'enquêter plus en profondeur sur son rôle exact. Nous avons montré que le siRNA n'avait pas de toxicité sur les cellules et que le knock-down de MDM2 diminuait l'infection. L'expérience a été testée avec plusieurs modèles viraux et l'effet a été remarqué autant au niveau de l'expression du gène rapporteur que pour la production de nouvelles particules virales. Comme nous avons remarqué un effet indirect de MDM2 sur la réplication virale, nous dirigerons nos études futures vers l'identification des protéines intermédiaires interagissant avec le VIH-1 et trouver laquelle des étapes du cycle viral est affectée par celle-ci. Il est probable que ce soit au niveau de l'intégration du génome viral

vu l'importance de MDM2 dans le cycle cellulaire, donc l'activité des sentiers de réparation de l'ADN et de régulation du cycle cellulaire en réponse au VIH-1 devra être étudiée plus en détail.

Trois protéines régulant négativement l'infection et qui sont totalement inconnues dans le contexte du VIH-1 vont aussi être les sujets d'études plus poussées. La première est FABP9, une protéine liant les acides gras. Considérant la nature de l'enveloppe virale, il est possible que cette protéine interagisse avec cette composante du virion. La deuxième protéine, GGH, est plutôt impliquée dans le métabolisme de l'acide folique et la disponibilité du glutamate, une molécule présente en grande quantité dans le plasma de patients infectés. Son impact sur la régulation du glutamate sera étudié et possiblement une corrélation avec le taux d'infection sera observée. Finalement, LOXL3 montre aussi une restriction de l'infection. Cette lysyl oxydase pourrait agir à plusieurs étapes du cycle viral et affecte peut-être la stabilité des protéines du VIH-1. Ces trois protéines sont des facteurs de restriction potentiels, mais des études complexes devront être effectuées avant de pouvoir les classer dans cette catégorie, comme prouver que le virus possède une protéine interférant avec l'un de nos facteurs de restriction potentiels ou montrer que l'évolution a favorisé l'activité antivirale du gène.

Ce projet a donc permis de mieux comprendre les facteurs de l'hôte jouant un rôle dans l'infection par le VIH-1 chez les macrophages humains et a réussi son but premier: huit protéines ont été identifiées comme des régulateurs de l'infection et quatre d'entre elles vont être étudiées plus en détail. Par contre, avant d'aller plus loin, il faudra identifier à quelle étape du cycle viral chacune de ces protéines agit pour planifier les expérimentations plus complexes. De plus, chacun de nos gènes testés provient d'une analyse transcriptomique nous ayant montré que ces gènes sont plus ou moins fortement exprimés dans les cellules infectées que dans les cellules ayant résisté à l'infection. Nous devrons donc déterminer si c'est l'infection qui module l'expression du gène ou si le virus infecte préférentiellement les macrophages exprimant un niveau inhabituel de la protéine.

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