Masarykova univerzita Přírodov ědecká fakulta Ústav botaniky a zoologie

Korelace velikosti pr ůduch ů a genomických parametr ů kapra ďorost ů

Bakalá řská práce

Michaela Burešová Brno 2011 Vedoucí bakalá řské práce: Mgr. Petr Šmarda, Ph.D.

2

Prohlášení

„Souhlasím s uložením této bakalá řské práce v knihovn ě Ústavu botaniky a zoologie P řF MU v Brn ě, p řípadn ě v jiné knihovn ě MU, s jejím ve řejným p ůjčováním a využitím pro vědecké, vzd ělávací nebo jiné ve řejn ě prosp ěšné ú čely, a to za p ředpokladu, že p řevzaté informace budou řádn ě citovány a nebudou využívány komer čně.“

3

4

Pod ěkování

Na prvním míst ě pat ří jist ě mé velké pod ěkování panu Dr. Petru Šmardovi 1) , vedoucímu této bakalá řské práce, za to, že mi velmi ochotn ě poskytoval časté odborné konzultace a trp ěliv ě mi vše vysv ětloval; nemalý dík pat ří také mému otci, panu doc. Petru Burešovi 1) , který mi byl p ři této práci inspirací a velkou duševní oporou; ob ěma jsem zavázána za přečtení celé práce ve finální fázi a za množství kritických p řipomínek, které mi usnadnily zejména interpretaci a diskuzi získaných výsledk ů. Za cytometrická m ěř ení, p ředcházející této studii, vd ěč ím Mgr. Lucii Horové 1) a Mgr. Klá ře Helánové 1) , bez t ěchto základních dat by nebylo možné studii v tomto rozsahu uskute čnit. Rovn ěž d ěkuji sb ěratel ům analyzovaných vzork ů, kterými jsou krom ě výše jmenovaných Dr. Lubomír Adamec 2) , doc. Vít Grulich 1) , Mgr. Ivana Hralová 1) a Dr. Olga Rotreklová 1) . Za determinaci a revizi ur čení dokladového materiálu d ěkuji panu Hermannu Esserovi 3) a doc. Vladimíru Řeho řkovi 1) . Finan ční zázemí práce tvo řily projekty LC06073 a MSM0021622416 poskytnuté Ministerstvem školství, mládeže a t ělovýchovy; p řístrojové vybavení a software poskytly laborato ř pr ůtokové cytometrie rostlin a karyologická laborato ř rostlin Ústavu botaniky a zoologie Přírodov ědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brn ě; rostlinný materiál z v ětší části poskytly botanické zahrady Masarykovy univerzity v Brn ě, Mendelovy univerzity v Brn ě, Univerzity ve Vídni, Univerzity v Regensburgu, dále botanické zahrady ve Vídni- Schönbrunnu, Mnichov ě-Nymphenburgu, v Bormiu, Praze-Tróji a také Sbírka vodních a mok řadních rostlin Botanického ústavu AV ČR v T řeboni. Za finan ční, p řístrojové i materiálové zázemí všem t ěmto institucím d ěkuji.

1) Ústav botaniky a zoologie, P řírodov ědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brn ě 2) Botanický ústav Akademie v ěd České republiky v Pr ůhonicích, pracovišt ě T řebo ň 3) Pteridologické odd ělení skleníku botanické zahrady Mnichov (München, Nymphenburg)

5

6

Abstrakt

V této práci se zabývám vztahem mezi obsahem DNA, genomickým obsahem GC bazí a délkou sv ěracích bun ěk pr ůduch ů u recentních kapra ďorost ů ( Monilophyta ). Tento vztah byl zatím studován p ředevším u semenných rostlin, kde byla zjišt ěna pozitivní korelace mezi obsahem DNA a velikostí pr ůduch ů. U kapra ďorost ů toto ješt ě zkoumáno nebylo. Mikroreliéfovou metodou byla analyzována velikost pr ůduch ů u celkem 115 druh ů kapra ďorost ů se známým obsahem DNA a GC bazí. Výb ěr druhů pokrývá většinu hlavních fylogenetických linií recentních kapra ďorost ů. Vzájemné vztahy genomických a anatomických znak ů byly testovány b ěžnými statistickými metodami a pomocí fylogeneticky nezávislých kontrast ů. Kapra ďorosty mají velkou variabilitu jak v obsahu DNA, tak ve velikosti pr ůduch ů. Pr ůměrné hodnoty t ěchto dvou znak ů jsou u kapra ďorost ů vyšší než u krytosemenných rostlin. Podíl GC bazí v genomu kapra ďorost ů je podobný hodnotám zjišt ěným u ostatních skupin vyšších rostlin. Mezi obsahem DNA a velikostí pr ůduch ů byla pomocí fylogeneticky nezávislých kontrast ů prokázána pozitivní korelace; ostatní vztahy mezi zkoumanými parametry žádnou korelaci nevykazovaly. Vztah mezi obsahem DNA a velikostí pr ůduch ů u kapra ďorost ů má tedy stejný trend jako u nahosemenných a krytosemenných rostlin. Je proto možné, že jak u krytosemenných rostlin, tak u kapradin by vývoj velikosti genomu v prehistorických dobách mohl být zkoumán pomocí m ěř ení pr ůduch ů u fosilních doklad ů vym řelých druh ů.

Klí čová slova: fylogeneticky nezávislé kontrasty, genomický obsah GC, kapradiny, kapra ďorosty, Monilophyta , obsah DNA, pr ůduchy, velikost genomu, velikost pr ůduch ů

7

Abstract

Correlation of stomatal size and genomic parameters in Monilophytes

In this thesis I studied relationship between DNA content, genomic GC content and guard cell length in extant ferns ( Monilophyta ). This relationship has been studied particularly in seed plants where positive correlation between DNA content and stomatal length was documented. However, this relationship has never been tested in ferns. Stomatal length of 115 species with previously known genome size and GC content was measured using microrelief reprints of epidermal surface. The sampling representatively covers the complete phylogenetic tree of extant ferns. The relationships of investigated features were tested using common statistic methods and phylogenetically independent contrasts. Ferns show high variation in DNA content and guard cell length; mean values of these traits are higher than in angiosperms. GC content in fern genomes is similar to other groups of vascular plants. Both correlation analysis and analysis of phylogenetically independent contrasts revealed that DNA content in ferns is positively correlated with guard cell length. No other significant correlations were found between other studied traits. Therefore the relationship between DNA content and guard cell length seems universal both in ferns and in angiosperms. This finding indicates that both in ferns and angiosperms, early evolution of plant genome size might be studied based on the measurement of stomatal size in fossil species.

Key words: DNA amount, ferns, genome size, genomic GC content, guard cells, Monilophyta , phylogenetically independent contrasts, pteridophytes, stomatal size

8

Obsah

1. Úvod ...... 11 2. Kapra ďorosty: fylogenetické postavení, životní cyklus a polyploidie ...... 13 2.1. Fylogenetické postavení a hlavní vývojové linie ...... 13 2.2. Životní cyklus ...... 14 2.3. Polyploidie u kapra ďorost ů ...... 15 3. Pr ůduchy ...... 21 4. Velikost genomu ...... 27 5. Pom ěr AT/GC ...... 31 6. Charakteristika analyzovaných druh ů a vyšších taxon ů ...... 33 6.1. Ophioglossales, Ophioglossaceae ...... 33 6.2. Psilotales , Psilotaceae ...... 33 6.3. Equisetales , Equisetaceae ...... 33 6.4. Marattiales , Marattiaceae ...... 35 6.5. Osmundales , Osmundaceae ...... 35 6.6. Gleicheniales , Gleicheniaceae ...... 36 6.7. Schizaeales , Lygodiaceae ...... 36 6.8. Schizaeaeles , Anemiaceae ...... 36 6.9. Salviniales , Marsileaceae ...... 37 6.10. Salviniales , Salviniaceae ...... 37 6.11. Cyatheales , Cibotaceae ...... 37 6.12. Cyatheales , Cyatheaceae ...... 38 6.13. Cyatheales , Dicksoniaceae ...... 38 6.14. Polypodiales , Lindsaeaceae ...... 38 6.15. Polypodiales , Dennstaedtiaceae ...... 38 6.16. Polypodiales , Pteridaceae ...... 38 6.17. Polypodiales , Aspleniaceae ...... 39 6.18. Polypodiales , Thelypteridaceae ...... 39 6.19. Polypodiales , Woodsiaceae ...... 40 6.20. Polypodiales , Blechnaceae ...... 40 6.21. Polypodiales , Onocleaceae ...... 40 6.22. Polypodiales , Dryopteridaceae ...... 41 6.23. Polypodiales , Lomariopsidaceae ...... 41 6.24. Polypodiales , Tectariaceae ...... 41 6.25. Polypodiales , Davalliaceae ...... 41 6.26. Polypodiales , Polypodiaceae ...... 42 7. Materiál a metody ...... 45 7.1. Materiál ...... 45 7.2. Mikroreliéfová metoda ...... 45 7.3. Cell-F a m ěř ení velikosti pr ůduch ů ...... 46 7.4. Newick formát, TreeView X a TreeGraph ...... 48 7.5. Hodnoty obsahu DNA a podílu GC ...... 49 7.6. Program Phylocom ...... 49 8. Výsledky ...... 53 9. Diskuze ...... 59 10. Literatura ...... 67 11. Přílohová část ...... 79

9

10

1. Úvod

Cílem této práce bylo prozkoumat vztahy mezi obsahem DNA, obsahem GC bazí a velikostí pr ůduchových bun ěk u kapra ďorost ů. Vztah velikosti genomu k velikosti pr ůduch ů byl dosud studován podrobn ěji pouze u nahosemenných a krytosemenných rostlin, kde se mezi ob ěma parametry ukazuje pom ěrn ě silná pozitivní korelace (nap ř. Beaulieu et al. 2008, Hodgson et al. 2010). U kapraďorost ů však taková souhrnn ější studie zatím nebyla realizována. Recentní kapra ďorosty mají p řes 10 tisíc druh ů a jejich fylogeneze je pom ěrn ě dob ře prozkoumaná; v sou časném pojetí zahrnuje 4 t řídy (Psilotopsida, Marattiopsida, Equisetopsida a Polypodiopsida; Smith et al. 2006). Genomický pom ěr AT a GC bazí je u kapra ďorost ů dosud znám pouze u jediného druhu, a to u Dryopteris dilatata , u n ěhož byl tento stanoven cytometricky: AT 59%, GC 41% (Marie & Brown 1993). Celogenomové sekvence, které by mohly informaci o zastoupení bazí rovn ěž poskytnout, nejsou dosud u kapra ďorost ů k dispozici. Databáze sekvena čních projekt ů v Národním centru pro biotechnologické informace (NCBI)1, obsahuje v p řípad ě kapra ďorost ů pouze odkazy na sekvenování plastomu (DNA obsažené v chloroplastech) u druh ů Adiantum capillus-veneris , Alsophila spinulosa , Angiopteris evecta , Equisetum arvense , Psilotum nudum , Pteridium aquilinum subsp. aquilinum. Přehled znalostí o genomovém pom ěru bazí a velikosti genomu u hlavních vývojových linií cévnatých rostlin shrnují níže tabulky (tab. 1., tab. 2.).

Tab. 1. Stav znalostí o genomovém pom ěru bazí v rámci hlavních linií cévnatých rostlin (podle tabulkových hodnot v Meister & Barow, 2007). Po čty čeledí stanoveny podle: Watson & Dallwitz (2008), The Angiosperm Phylogeny Group (2009), Smith et al. (2006).

vývojová linie po čet druh ů se známým po čet pokrytých procento pokrytých genomickým pom ěrem čeledí/po čet všech čeledí bazí čeledí Plavun ě 0 0/4 0,0% Kapra ďorosty 1 1/37 2,7% Nahosemenné 14 2/15 13,3% Krytosemenné 192 30/415 7,2%

1 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?cmd=Search&db=genomeprj&term=%22Embryophyta%22%5 BOrganism%5D

11

Tab. 2. Stav znalostí o velikosti genomu v rámci hlavních linií cévnatých rostlin (podle Muray et al. 2010, Bennett & Leitch 2010). Po čty čeledí stanoveny podle: Watson & Dallwitz (2008), The Angiosperm Phylogeny Group (2009), Smith et al. (2006).

vývojová linie po čet druh ů se známou po čet pokrytých procento pokrytých velikostí genomu čeledí/po čet všech čeledí čeledí Plavun ě 15 4/4 100,0% Kapra ďorosty 67 21/37 56,8% Nahosemenné 204 15/15 100,0% Krytosemenné 6287 239/415 57,6%

Pro analýzy v této studii byly použity již zm ěř ené hodnoty velikosti genomu a genomického zastoupení GC bazí u r ůzných druh ů kapra ďorost ů (nepublikovaná data z laborato ře pr ůtokové cytometrie na mate řském pracovišti), pokrývajících reprezentativn ě fylogenetickou diverzitu této skupiny. Na herbá řovém materiálu vzork ů, použitých původn ě k cytometrickým analýzám, jsem dom ěř ila velikosti pr ůduchových bun ěk. P ři analýze bylo t řeba p řihlédnout k potenciální fylogenetické závislosti studovaných znak ů, a proto byl použit program Phylocom, který umož ňuje efekt této závislosti korigovat. Vedle výše zmín ěné analytické hlavní části práce bylo v její obecné části rešeršním zp ůsobem pojednáno sou časné fylogenetické člen ění kapra ďorost ů, hlavní rysy jejich životního cyklu, p řítomnost polyploidie a p řehled hlavních typ ů pr ůduch ů u rostlin obecn ě. Dále byly na základ ě studia literatury dopln ěny charakteristiky hlavních studovaných linií (čeledí), popisující jejich druhovou diverzitu, celkové rozší ření, pop ř. zastoupení v naší fló ře, p řevládající životní formy a hlavní typy pr ůduch ů. Do této obecné části bylo připojeno i stru čné vymezení a obecná charakteristika studovaných genomických parametr ů, tj. velikosti genomu a genomického obsahu GC bazí. V metodické části práce je pojednán p ůvod materiálu, preparace vzork ů, zpracování preparát ů, technika m ěř ení pr ůduch ů, tvorba fylogenetických strom ů a p řehled metod statistického hodnocení.

12

2. Kapra ďorosty: fylogenetické postavení, životní cyklus a polyploidie

2.1. Fylogenetické postavení a hlavní vývojové linie U cévnatých rostlin 2 ( Tracheophyta ) rozlišujeme dv ě hlavní sesterské linie: mikrofylní 3 linii Lycopodiophyta (plavun ě) a megafylní 4 linii Euphyllophyta (ostatní cévnaté rostliny), jak uvádí nap ř. Kenrick & Crane (1997). Euphyllophyta , která vznikla p řed 380 miliony let (Schneider et al. 2004c), tvo ří dv ě sesterské monofyletické skupiny (Pryer et al. 2001) – Spermatophyta – semenné rostliny, vzniklé p řed 310 miliony let (Schneider et al. 2004c), a Monilophyta – kapra ďorosty, vzniklé p řed 354 miliony let (Schneider et al. 2004c). Používání českého termínu kapra ďorosty může zp ůsobovat ur čité problémy, protože jeho význam lze chápat dv ěma zp ůsoby: v sou časném užším pojetí zahrnuje monofyletickou linii Monilophyta , zatímco ve starší literatu ře kapra ďorosty ( Pteridophyta ) byly chápány jako všechny výtrusné cévnaté rostliny, tedy ob ě linie Monilophyta a Lycopodiophyta , viz nap ř. Domin (1929). Recentní druhy skupiny Monilophyta , zahrnující 9–11 tisíc druh ů5, tvo ří p ět hlavních linií: (1) řády Psilotales (prutníky) a (2) Ophioglossales (hadilkotvaré), zahrnované spole čně do t řídy Psilotopsida , p ředstavují bazální a evolu čně nejstarší klád mezi recentními kapra ďorosty s celkovým po čtem druh ů o n ěco vyšším než 120 6, (3) Equisetopsida (p řesli čky) s celkem asi 16 druhy (Hassler & Swale 2001), (4) Marattiopsida s více než 150 druhy 7, (5) Polypodiopsida (leptosporangiátní 8 kapradiny), nejodvozen ější skupina s celkem asi 10 000 druhy9. Bazální linie leptosporangiátních kapradin tvo ří řády Osmundales , Hymenophyllales , Schizaeales a Gleicheniales . Hlavními liniemi jsou pak Salviniales , Cyatheales a Polypodiales (sem pat ří zhruba 80% recentních druh ů kapradin).

2 Tracheophyta = vývojová linie, zahrnující všechny recentní vyšší rostliny krom ě mechorost ů. 3 Mikrofyly = listy s jedinou žilkou vzniklé z jediného telomu 4 Megafyly = listy odvozené od bo čních v ětvených, zplošt ělých a srostlých telom ů, zpravidla mnohožilné 5 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 9301–10688 druh ů. 6 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 121–124 druh ů. 7 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 154–183 druh ů. 8 Leptosporangiátní kapradiny mají sporangia s tenkou st ěnou, tvo řenou jedinou vrstvou bun ěk; tato sporangia se zakládají z jediné pokožkové bu ňky a najdeme je pouze ve t říd ě Polypodiopsida . Naproti tomu eusporangiátní kapradiny mají sporangia se st ěnou tlustou, vícevrstevnou a na jejich vzniku se podílí skupina pokožkových a podpokožkových bun ěk. 9 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 9010–10365 druh ů.

13

Fylogenetické vztahy čeledí kapra ďorost ů zachycuje strom na obr. 1.

Ophioglossaceae Psilotaceae Psilotopsida Monilophyta Equisetaceae Equisetopsida Marattiaceae Marattiotopsida Osmundaceae a Hymenophyllaceae Gleicheniaceae Dipteridaceae Matoniaceae Lygodiaceae Anemiaceae Schizaeaceae Marsileaceae Salviniaceae Thyrsopteridaceae Loxomataceae Culcitaceae Plagiogyriaceae Cibotiaceae Cyatheaceae Dicksoniaceae Polypodiopsida Metaxyaceae Lindsaeaceae Saccolomataceae Dennstaedtiaceae Pteridaceae Aspleniaceae Osmundales Woodsiaceae Hymenophyllales Thelypteridaceae Gleicheniales Blechnaceae s Onocleaceae Schizaeales Dryopteridaceae Salviniales Lomariopsidaceae s Tectariaceae Cyatheales Oleandraceae Polypodiales Davalliaceae Polypodiaceae

Obr. 1. Fylogenetický strom kapra ďorost ů podle Smith et al. (2006); te čkované linie mají bootstrapovou podporu nižší než 70%.

2.2. Životní cyklus (upraveno podle Yatskievych 2003) Životní cyklus kapra ďorost ů má podobn ě jako u ostatních vyšších rostlin dv ě fáze: gametofyt a sporofyt. Na rozdíl od mech ů u kapra ďorost ů p řevažuje v rodozm ěně sporofyt, který tém ěř vždy žije déle než gametofyt, jenž u kapra ďorost ů zpravidla nazýváme prokel (protálium); sporofyt kapra ďorost ů se vyvíjí samostatn ě, a je proto na gametofytu výživou nezávislý 10 . Gametofyt kapra ďorost ů bývá velmi malý, v ětšinou do 1 cm, a žije zpravidla krátkou dobu; u eusporangiátních kapra ďorost ů však může prod ělávat i pom ěrn ě dlouhý

10 S výjimkou nejran ějších stádií vývoje bezprost ředn ě po vzniku zygoty.

14

vývoj, trvající až n ěkolik let. Semenné rostliny, které jsou sesterskou skupinou kapra ďorost ů, mají oproti nim gametofyt ješt ě siln ěji redukován a jeho vývoj se již nikdy neuskute čň uje samostatn ě. U krytosemenných je jeho rozsah omezen již jen na pylovou lá čku a na zárode čný vak vají čka. Umíst ění sporangií na sporofytu je v rámci odd ělení Monilophyta r ůznorodé: u prutník ů (Psilotales ) jsou srostlá v troj četná nebo dvou četná synangia nacházející se v paždí (Psilotum ) nebo na ploše list ů ( Tmesipteris ), u hadilkotvarých ( Ophioglossales ) pokrývají fertilní část listu, u p řesli ček ( Equisetopsida ) jsou na spodní stran ě deštníkovitých sporangiofor ů (sporofyl ů), u třídy Marattiopsida jsou stejn ě jako u leptosporandiátních kapradin (Polypodiopsida ) na spodní stran ě list ů; zatímco u Marattiopsid sr ůstají po mnoha do synangií zpravidla elipsoidního tvaru, u leptosporangiátních kapradin jsou uspo řádaná v kupkách (sori), u vodních kapradin ( Salviniales ) pak tyto kupky mohou být uzav řeny ve specializovaných sporofylech – sporokarpech 11 . Uvnit ř sporangií jsou produkovány haploidní spory, pomocí kterých se kapra ďorosty rozši řují. Ze spor vzniká gametofyt, na kterém se vytvá řejí antheridia a archegonia. Aktivním pohybem ve vodním prost ředí na povrchu protália a jeho okolí se mohou spermatozoidy vzniklé v antheridiu dostat k vaje čné bu ňce (oosfé ře), nacházející se uvnit ř archegonia. Po splynutí spermatozoidu a oosféry vzniká diploidní zygota, ze které vyr ůstá nový sporofyt.

2.3. Polyploidie u kapra ďorost ů Ve srovnání s krytosemennými rostlinami mají kapra ďorosty po čet chromosom ů výrazn ě vyšší; Klekowski & Baker (1966) uvád ějí pr ůměrný haploidní po čet chromosom ů u izosporických 12 kapra ďorost ů 57,05, zatímco u krytosemenných rostlin jen 15,99. Mezi kapra ďorosty dokonce najdeme druh Ophioglossum reticulatum , který má nejvíce chromosom ů mezi všemi žijícími organismy (nej čast ěji uvád ěno 2n = 1260 chromosom ů, podle n ěkterých pramen ů dokonce až 1440 chromosom ů - Khandelwal 1990). Najdeme zde však i druhy s nízkým po čtem chromosom ů, nap ř. Salvinia natans , 2n = 18 (Yatskievych 2003). Pro sou časná data získaná z databáze v Kew (Bennett & Leitch 2010) a dopln ěná o některé druhy kapradin z této bakalá řské práce (zde jsem po čty chromosom ů získala z databáze po čtů chromosom ů u rostlin IPCN; Goldblatt & Johnson 2010) vyšly tyto pr ůměry pon ěkud odlišn ě, nicmén ě na skute čnosti, že kapra ďorosty mají chromosom ů obvykle

11 Sporokarp (sporocarpium) pon ěkud p řipomíná plod, nebo ť vývoj gametofytu se odehrává uvnit ř tohoto útvaru až do vzniku nové generace sporofytu, která z n ěj „vyklí čí“. 12 Izosporické kapra ďorosty = všechny kapra ďorosty ( Monilophyta ) mimo vodní kapradiny ( Salviniales ).

15

mnohem více než semenné rostliny, se tím nic nem ění (viz obr. 2.). Je více teorií, které se snaží vysv ětlit, pro č mají kapra ďorosty vyšší po čty chromosom ů. Jedno z možných vysv ětlení, které uvádí Yatskievych (2003), p ředpokládá, že kapra ďorosty prod ělaly ve své fylogenezi vícenásobnou polyploidizaci a tento paleopolyploidní stav z ůstal zachován i u sou časných druh ů, aniž by došlo k redukci po čtu chromosom ů v procesu tzv. diploidizace, který se b ěžn ě vyskytuje u krytosemenných rostlin nebo obratlovc ů (Wolfe 2001). Vysoké chromosomové po čty u recentních kapra ďorost ů však nemohou být pouze paleopolyploidního p ůvodu, nebo ť s polyploidií se u mnoha zástupc ů této skupiny velmi často setkáváme i dnes, a to jak s autopolyploidií, tak s allopolyploidií (viz nap ř. Bureš et al. 2003, Smith et al. 2006, Ekrt 2008, Ekrt et al. 2009).

Obr. 2. Krabicový graf haploidních po čtů chromosom ů u kapra ďorost ů a krytosemenných rostlin (osa y je logaritmická; po čty chromosom ů získány z http://www.kew.org/cvalues/ a http://www.tropicos.org ).

Při allopolyploidii dochází k násobnému zv ětšení po čtu chromosom ů a absolutní velikosti genomu v d ůsledku mezidruhové hybridizace, která zpravidla vede u primárního hybrida k neschopnosti tvo řit fertilní gamety, protože chromosomy r ůzných druh ů nejsou schopny párovat se v meióze správným zp ůsobem. Stejn ě jako u semenných rostlin představuje únik z této situace zdvojení chromosomového po čtu prost řednictvím

16

neredukovaných gamet, což zajistí, aby každý chromosom m ěl práv ě jednoho svého homologa. P ři autopolyploidii dochází k násobnému zmnožení chromosom ů bez mezidruhové hybridizace; tj. dojde k ní v rámci daného druhu, zpravidla splynutím neredukovaných gamet, pop ř. chybou v mitóze. Také v p řípad ě autopolyploidie je udržení správného párování chromosom ů v meióze kritickým momentem, nebo ť jednotlivé chromosomy jsou zde tentokrát zastoupeny pro zm ěnu vícekrát než u diploida, což vede k tvorb ě multivalent ů a sesterské chromosomy nemusejí pak segregovat do gamet rovnom ěrn ě. Tento stav se zpravidla dlouhodob ě upravuje prost řednictvím nereciprokých vým ěn p ři crossing-overu b ěhem dalších generací (Briggs & Walters 1997). Ur čitý rozdíl v po čtu chromosom ů je mezi izosporickými a heterosporickými kapradinami. Zatímco heterosporické kapradiny mají chromosomové po čty pom ěrn ě nízké, izosporické mají naopak chromosomové po čty vysoké. Klekowski & Baker (1966) toto vysv ětlují tak, že u izosporických kapra ďorost ů může zřejm ě často docházet k samooplození v rámci oboupohlavných protálií, zatímco u heterosporických kapra ďorost ů by samooplození mělo být vzácn ější. Nežádoucí inbrední deprese, podmín ěná rostoucí homozygozitou v d ůsledku častého samooplození, m ůže být u izosporických kapra ďorostů kompenzována allopolyploidií, která naopak p řináší fixovanou heterozygozitu. Pozd ější studie v 80. a 90. letech minulého století (nap ř. Gastony & Gottlieb 1985) však opakovan ě ukázaly, že frekvence samooplození u oboupohlavných protálií homosporických kapradin je pom ěrn ě nízká. Proto má rozdíl v po čtu chromosom ů mezi izosporickými a heterosporickými kapradinami pravd ěpodobn ě jinou p říčinu, než se domnívali Klekowski & Baker (1966). Isozymové studie (nap ř. Gastony & Gottlieb 1982) prokázaly, že druhy s nejmenšími po čty chromosom ů vykazovaly v rámci rod ů takové isozymové patterny, jako by šlo o diploidní druhy, p řestože jejich chromosomové po čty byly vysoké, jako by šlo o polyploidy. Tato skute čnost pak vedla Hauflera (Haufler 1987) k názoru, že diploidní charakter t ěchto polyploid ů vznikl selektivním uml čováním gen ů (gene-silencing), aniž by došlo k eliminaci chromosom ů, což bylo potvrzeno následnými studiemi polymorfismu délky restrik čních fragment ů, které ukázaly přítomnost stejných gen ů u diploidních i tetraploidních druh ů ( Ceratopteris richardii, C. thalictroides; McGrath et al. 1994). Následné studie (FISH 13 , studium metylace gen ů, eliminace paralog ů) potvrdily, že polyploidizace druh ů s nejnižšími po čty chromosom ů jsou v rámci stejného rodu dávného

13 Fluorescen ční in situ hybridizace je technika, p ři níž se zna čená sonda ( část molekuly DNA) váže speciální technikou (denaturace a hybridizace jedno řet ězcové DNA) do míst chromosom ů, s nimiž je tato sonda homologní; tím dojde p ři následném zviditeln ění sondy ke zviditeln ění pouze t ěch pozic na chromosomech, které jsou homologní s danou sondou (http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence_in_situ_hybridization).

17

data a k jejich „diploidizaci“ došlo bez eliminace DNA (Nakazato et al. 2008). Studium genových map na modelu Ceratopteris richardii (čel. Pteridaceae ) také ukázalo zajímavý fakt, že zde ke crossing-overu dochází zhruba dvakrát mén ě často než je tomu u krytosemenných rostlin. To m ůže nazna čovat, že vyšší chromosomový po čet u kapradin, podmi ňující v ětší množství kombinací chromosom ů v gametách, kompenzuje práv ě nižší rekombina ční možnosti crossing-overu v meióze (Nakazato et al. 2008). Vztahem mezi polyploidií a velikostí pr ůduch ů u kapra ďorost ů se zabývala studie Barrington et al. (1986), kde bylo zjišt ěno, že velikost pr ůduch ů koreluje se stupn ěm ploidie. Srovnáme-li vztah mezi ploidií a obsahem DNA v rámci krytosemenných rostlin a v rámci kapra ďorost ů (obr. 3., obr. 4.), tento vztah se jeví jako pozitivní pouze v p řípad ě kapra ďorost ů (obr. 4.). Tuto rozdílnou závislost velikosti genomu a chromosomového po čtu u krytosemenných a kapra ďorost ů vysv ětlují Nakazato et al. (2008) jako možný d ůsledek rozdílnosti v aktivit ě transpozon ů v rámci obou t ěchto skupin; tj. že u polyploid ů krytosemenných rostlin m ůže docházet aktivitou transpozon ů k p řípadným fúzím chromosom ů a následným ztrátám částí molekul DNA, čímž se postupn ě m ůže zmenšovat jak po čet chromosom ů, tak obsah DNA. Exaktní test této hypotézy na základ ě genomických dat však zatím chybí.

18

Obr. 3. Vztah mezi polyploidií a obsahem DNA u krytosemenných rostlin (podle dat Bennett & Leitch 2010). Graf ukazuje, že u krytosemenných rostlin není mezi po čtem chromosomů a velikostí genomu žádný p římý vztah (neparametrická Spearmanova korelace R = -0,018; p = 0,189; bez fylogenetické korekce) a že za hlavní zm ěny ve velikosti genomu zde mohou jiné mechanismy než polyploidie.

160

140

120

100

80

60

40 y = 0,1482x + 4,8085 2

velikostgenomu (2C, pg) R = 0,8139 20

0 0 200 400 600 800 1000 1200 po čet chromosom ů (2n)

Obr. 4. Vztah mezi polyploidií a obsahem DNA u kapra ďorost ů (podle dat Bennett & Leitch 2010) ukazující silnou vazbu mezi ob ěma parametry (Spearmanovým testem vyšlo R = 0,654; p = 0,000001; bez fylogenetické korekce).

19

20

3. Pr ůduchy

Pr ůduch je tvo řen dv ěma sv ěracími bu ňkami (guard cells) obvykle ledvinitého, pop ř. činkovitého tvaru, mezi nimiž se nachází pr ůduchová št ěrbina. Okolním bu ňkám pr ůduchu říkáme sousední. V p řípad ě, že se liší od ostatních epidermálních bun ěk, nazýváme je vedlejší (subsidiary cells). U cévnatých rostlin najdeme průduchy jak na listových čepelích, tak na řapících, stoncích a u n ěkterých druh ů i na částech kv ětu. Jsou však i rostliny, u kterých pr ůduchy mohou chyb ět - nap ř. mezi kapra ďorosty jsou to epifyti čtí zástupci čeledi Hymenophyllaceae (Cotthem 1970). Většinou se pr ůduchy nachází p římo v epidermis, tedy na stejné úrovni jako ostatní epidermální bu ňky. U n ěkterých rostlin mohou být však pr ůduchy hluboce zano řené, s čímž se setkáváme p ředevším u xerofyt ů. I mezi kapradinami najdeme zástupce se zano řenými pr ůduchy, např. některé druhy rodu Pyrrosia (P. lanceolata, P. longifolia ; Hovenkamp 1986), u kterých jsou pr ůduchy tak hluboce zano řené, že p ři běžném po řízení otisku povrchu listu nejsou rozeznatelné. Podle výskytu vedlejších bun ěk d ělíme pr ůduchy na: (i) acyklické - jsou obklopeny pouze sousedními bu ňkami, (ii) hemicyklické - jedna ze sv ěracích bun ěk je obklopena půlkruhem vedlejších bun ěk, (iii) monocyklické - pr ůduch je celý obklopen vedlejšími bu ňkami, (iv) amficyklické - pr ůduch je obklopen dv ěma nebo více prstenci vedlejších bun ěk (Cotthem 1970). Člen ění pr ůduch ů podle jejich tvaru rozlišuje celkem 12 typ ů (Cotthem 1970):

• anomocytické: pr ůduchy jsou obklopeny omezeným po čtem bun ěk, které jsou stejné (velikostí i tvarem) jako ostatní bu ňky epidermis (obr. 5. a), • anisocytické: pr ůduch je obklopen t řemi bu ňkami, z nichž jedna je výrazn ě menší než zbylé dv ě (obr. 5. b), • diacytické: pr ůduch je uzav řen mezi dv ě vedlejší bu ňky, jejichž dotýkající se st ěny jsou v pravém úhlu ke sv ěracím bu ňkám (obr. 5. c), • paracytické: po stranách pr ůduchu je vždy jedna nebo více vedlejších bun ěk rovnoběžných s pr ůduchovou št ěrbinou (obr. 5. d), • aktinocytické: pr ůduch je dokola obklopen menšími bu ňkami (obr. 5. e), • cyklocytické: čty ři nebo více vedlejších bun ěk je uspo řádáno do prstence okolo pr ůduchu, (obr. 5. f),

21

• tetracytické: okolo pr ůduchu jsou čty ři bu ňky (dv ě lateráln ě a dv ě polárn ě; obr. 5. g), • hypocytické: dv ě vedlejší bu ňky mají otvor v antiklinální st ěně, nad kterým leží sv ěrací bu ňky v diacytické pozici (obr. 6. a), • pericytické: pr ůduch je obklopen jedinou vedlejší bu ňkou (obr. 6. b), • desmocytické: podobné p ředchozímu typu, ale vedlejší bu ňka má st ěnou kolmou k sv ěracím bu ňkám (obr. 6. c), • polocytické: vedlejší bu ňka, která obklopuje pr ůduch, má tvar podkovy (obr. 6. d) • staurocytické: obvykle čty ři vedlejší bu ňky, jejichž radiální st ěny (st ěny „vycházející“ sm ěrem od sv ěracích bun ěk pr ůduchu) tvo ří okolo sv ěracích bun ěk k říž (obr. 6. e).

Obr. 5. Typy pr ůduch ů (podle Cotthem 1970): a) anomocytické, b) anisocytické, c) diacytické, d) paracytické, e) aktinocytické, f) cyklocytické, g) tetracytické.

22

Obr. 6. Typy pr ůduch ů (podle Cotthem 1970): a) hypocytické, b) pericytické, c) desmocytické, d) polocytické, e) staurocytické.

Listy rostlin m ůžeme podle rozmíst ění pr ůduch ů d ělit na (Cotthem 1970): epistomatické (pr ůduchy jsou na svrchní stran ě listu), hypostomatické (pr ůduchy na spodní stran ě listu) a amfistomatické (pr ůduchy na obou stranách listu). Rozmíst ění pr ůduch ů bývá u v ětšiny rostlin na listech zpravidla rovnom ěrné, m ůže se však stát, že n ěkolik pr ůduch ů vytvo ří skupinku - dvojice, trojice, apod. Různými zp ůsoby vzniku pr ůduch ů se poprvé zabývali již Hildebrand (1866) a Strasburger (1866). Práv ě r ůzné zp ůsoby vzniku, a tedy i r ůzné tvary pr ůduch ů a vedlejších bun ěk, se ukázaly být u kapra ďorost ů jedním z taxonomicky, pop ř. fylogeneticky významných znaků (Kondo 1962). Obecn ě lze říci, že u vývojov ě primitivn ějších skupin kapra ďorost ů (nap ř. Ophioglossaceae , Marattiaceae , Osmundaceae ) se vyskytují pr ůduchy vzniklé jediným d ělením bu ňky (obr. 7. a, b), zatímco u vysp ělejších skupin vznikají pr ůduchy spolu s jejich vedlejšími bu ňkami dvojím (nap ř. Gleicheniaceae , Schizaeaceae ; viz obr. 8. a, b) nebo dokonce trojím (nap ř. Polypodiaceae ; viz obr. 9.) dělením (Thurston 1969).

23

Obr. 7. Pr ůduchy kapra ďorost ů vzniklé jediným d ělením bu ňky; a) Ophioglossum vulgatum (čel. Ophioglossaceae ), b) Angiopteris angustifolia (čel. Marattiaceae ); m ěř ítko 100 m.

Obr. 8. Pr ůduchy kapra ďorost ů vzniklé dvojím d ělením bu ňky; a) Gleichenia microphylla (čel. Gleicheniaceae ), b) Microlepia platyphylla (čel. Dennstaedtiaceae ); m ěř ítko 100 m.

Obr. 9. Pr ůduchy kapra ďorost ů vzniklé trojím d ělením bu ňky; Aglaomorpha coronans (čel. Polypodiaceae ); měř ítko 200 m.

24

Velikost pr ůduch ů může rovněž odrážet celkové morfologické vlastnosti nebo ekologické preference daného druhu. Je známo, že nejmenší pr ůduchy mají d řeviny, v ětší pak byliny a nejv ětší mají jarní geofyty (Hodgson et al. 2010; Veselý in litt.). Malé pr ůduchy jsou také lépe schopny hospoda řit s vodou, proto se objevují u druh ů suchých stanoviš ť (Aasamaa et al. 2001, Hetherington & Woodward 2003); klí čovou roli p ři vodní bilanci však vedle samotné velikosti hraje také hustota pr ůduch ů, jejich zano ření nebo umíst ění (na spodní či svrchní stran ě list ů), od ění listu, přítomnost dv ůrk ů tvo řených kutikulárními vosky apod. (Willmer & Fricker 1996). Krom ě tvaru a rozmíst ění pr ůduch ů bývají často zkoumány i jejich funk ční vlastnosti nebo jejich reakce na r ůzné sv ětelné nebo vlhkostní podmínky či koncentrace CO 2 (Heath

& Russell 1954). Hlavní funkce pr ůduch ů jsou dv ě: (i) vým ěna plyn ů (p ředevším CO 2 a O 2) mezi rostlinou a prost ředím, (ii) transpirace vody. Oba tyto procesy jsou regulovány otvíráním a zavíráním pr ůduchové št ěrbiny, p řičemž z hlediska metabolické bilance rostliny je nejvýhodn ější co nejv ětší p říjem CO 2 při co nejmenším výdeji vody (Brodribb et al. 2009). Ve stejné studii (Brodribb et al. 2009) bylo zjišt ěno, že pr ůduchy kapra ďorost ů reagují na zm ěny v koncentraci CO 2 ve srovnání se semennými rostlinami mnohem pomaleji nebo tém ěř v ůbec. Tato pomalejší regulace pr ůduch ů u kapra ďorost ů se týká i jejich reakce na zm ěny ve sv ětelné intenzit ě (Brodribb et al. 2009). Obecn ě je rychlost zavírání a otvírání pr ůduch ů podmín ěna hlavn ě jejich velikostí, tj. velké pr ůduchy se otvírají pomaleji než malé (Hetherington & Woodward 2003). Proto se také nacházejí v ětší pr ůduchy obvykle u rostlin žijících ve stinném a vlhkém prost ředí, kde pomalejší reakce na zm ěnu vlhkosti nep ředstavuje riziko vyschnutí tak, jako na suchých otev řených stanovištích. Velikost pr ůduch ů mohla být během evoluce ovlivn ěna také m ěnící se koncentrací oxidu uhli čitého v atmosfé ře. Nap říklad v obdobích chudých na CO 2, jakými byly karbon a perm, mohly mít rostliny pr ůduchy spíše menší a ve v ětší hustot ě, jak dokazují Franks & Beerling (2009). Typy pr ůduch ů u jednotlivých čeledí kapra ďorost ů budou zmín ěny v kapitole č. 6, kde se v ěnuji charakteristice taxon ů použitých v analýzách této práce.

25

26

4. Velikost genomu

Vzhledem k ur čité nejednotnosti v používání termín ů, týkajících se velikosti genomu, je vhodné vymezení významu n ěkterých pojm ů tak, jak jsou chápány v rámci této studie.

(1) Obsahem jaderné DNA se rozumí hmotnost DNA v jád ře somatických bun ěk daného organismu, která se vyjad řuje v pikogramech (pg) nebo v párech bazí (resp. mega párech bazí - Mbp), bez ohledu na to, zda je daný organismus diploid či polyploid. Obsah jaderné DNA v somatické bu ňce pak ozna čujeme 2C-value (Greilhuber et al. 2007).

(2) Velikostí genomu (angl. genome size) se rozumí velikost holoploidního genomu (holoploid genome size), tedy hmotnost DNA obsažené v jádrech gamet daného organismu čili polovina obsahu jaderné DNA; ozna čuje se jako C-value (poprvé použil Swift 1950, písmeno C znamená constant ).

(3) Monoploidní velikost genomu znamená hmotnost DNA odpovídající monoploidní sad ě, tj. obsah jaderné DNA d ělený p říslušným stupn ěm ploidie (u diploida 2, u tetraploida 4 atd.); pro monoploidní genom se používá ozna čení Cx-value; u polyploid ů je tedy tato hodnota odlišná od C-value, zatímco u diploidních jedinc ů jsou tyto dv ě hodnoty stejné.

Nap říč rostlinami se setkáme až s tisícinásobnými rozdíly v množství jaderné DNA (Leitch et al. 2005). Nejmenší velikost rostlinného genomu byla zatím nam ěř ena u zelené řasy Ostreococcus tauri (Prasinophyceae , Mamiellales ; C = 0,01 pg; Derelle et al. 2004), u krytosemenných rostlin pak u druhu Genlisea margaretae (C = 0,065 pg; Greilhuber et al. 2006) z čeledi Lentibulariaceae ; naopak doposud nejv ětší zm ěř enou velikost genomu u rostlin má krytosemenná rostlina Paris japonica (C = 152,2 pg; Pellicer et al. 2010) z čeledi Melanthiaceae . Jak už bylo řečeno, v ětšina kapra ďorost ů má ve srovnání se semennými rostlinami mnohem v ětší po čet chromosomů, přesto nejv ětší genomy kapradin nejsou v ětší než nejv ětší genomy u krytosemenných; st řední velikost genomu je u kapradin mnohem vyšší než u krytosemenných rostlin (Nakazato et al. 2008). Jak bylo uvedeno v kapitole o polyploidii u kapra ďorost ů, koreluje u nich pozitivn ě po čet chromosom ů s velikostí genomu (obr. 4.), u krytosemenných rostlin taková korelace není p řítomna (obr. 3.). Také ostatní hlavní vývojové linie rostlin vykazují zna čné rozdíly v rozsahu a velikosti genomu (obr. 10.; tab. 3.). Řasy nebo mechorosty mají podle dosavadních znalostí genomy pom ěrn ě malé v řádu max. jednotek pikogram ů (obr. 10.), naopak nejv ětší genomy mají nahosemenné rostliny a kapra ďorosty (obr. 10.); malá hodnota mediánu a zárove ň v ětší rozsah velikosti genomu u plavuní jsou dány p ředevším tím, že zatímco vlastní plavun ě a

27

šídlatky (t řídy Lycopodiopsida a Isoetopsida ) mají genomy st ředních velikostí, vrane čky (Selaginellopsida ) mají genomy extrémn ě malé (Bennett & Leitch 2010).

Obr. 10. Krabicový graf znázor ňující rozsahy a variabilitu velikosti genomu v rámci hlavních vývojových linií rostlin (škála na ose y je logaritmická, skupiny se signifikantní rozdílností ozna čeny r ůznými písmeny – a, b, c – pr ůkaznost rozdíl ů viz tab. 3.); řasy (po čet druh ů N = 253), mechorosty (N = 232), plavun ě (N = 15), kapra ďorosty (N = 67), nahosemenné (N = 204), krytosemenné (N = 6287); Bennett & Leitch (2010).

Tab. 3. Tabulka statistické pr ůkaznosti rozdíl ů ve velikosti genomu mezi jednotlivými liniemi rostlin (Kruskal-Wallisova ANOVA, mnohonásobné porovnání p hodnot), červen ě ozna čené hodnoty ozna čují skupiny, které se od sebe liší na hladin ě významnosti α < 0,05.

Řasy Mechorosty Plavun ě Kapra ďorosty Nahosemenné Krytosemenné

Řasy 1,000000 1,000000 0,000000 0,000000 0,000000 Mechorosty 1,000000 1,000000 0,000000 0,000000 0,000000 Plavun ě 1,000000 1,000000 0,000000 0,000000 0,000732 Kapra ďorosty 0,000000 0,000000 0,000000 0,463416 0,000000 Nahosemenné 0,000000 0,000000 0,000000 0,463416 0,000000 Krytosemenné 0,000000 0,000000 0,000732 0,000000 0,000000

28

Vztah mezi velikostí genomu a r ůznými morfologickými, fyziologickými či jinými biologickými parametry byl již n ěkolikrát zkoumán v r ůzných skupinách, zejména živo čich ů. Bylo zjišt ěno, že velikost genomu pozitivn ě koreluje nap ř. s velikostí jádra a velikostí bun ěk a negativn ě s délkou bun ěč ného cyklu (Mirsky & Ris 1951, Van’t Hof & Sparrow 1963, Commoner 1964, Baetcke et al. 1967, Evans et al. 1972). Silná pozitivní korelace s velikostí genomu byla zjišt ěna u krevních bun ěk obojživelník ů (Horner & Macgregor 1983) a ryb (Hardie & Hebert 2003). Vztahem velikosti genomu k r ůzným strukturním parametr ům krytosemenných rostlin se zabývají studie Beaulieu et al. (2008) a Hodgson et al. (2010), které mj. prokázaly pozitivní korelaci mezi velikostí genomu a délkou svěracích bun ěk pr ůduch ů (viz obr. 11.) a negativní korelaci s hustotou pr ůduch ů (Beaulieu et al. 2008). Přestože výše popsané korelace jsou samy o sob ě zajímavé, mnohem důležit ější, avšak obtížn ě prokazatelná, je jejich fyziologická či ekologická podmín ěnost, kterou se snaží definovat nukleoskeletární (Cavalier-Smith 2005), resp. nukleotypová teorie (Bennett 1972), které za primární ur čující kriterium velikosti genomu považují velikost bun ěk, resp. rychlost bun ěč ného d ělení.

Obr. 11. Závislost mezi obsahem DNA a velikostí sv ěracích bun ěk u krytosemenných rostlin (A - 101 druh ů, Beaulieu et al. 2008; B - 446 druh ů, Hodgson et al. 2010).

U výtrusných vyšších rostlin byl zkoumán nap říklad vztah mezi velikostí genomu a typem spermatozoid ů (Bennett & Leitch 2001) a bylo zjišt ěno, že druhy s biciliátními spermatozoidy (a vícemén ě i tendencí k tvorb ě jednopohlavných gametofyt ů, tj. mnohé mechy, játrovky a vrane čky) mají menší C-value než druhy s polyciliátními spermatozoidy (šídlatky, kapra ďorosty), pop ř. i než druhy se spermatozoidy sice biciliátními, avšak s

29

oboupohlavnými protálii (vlastní plavun ě - Lycopodiopsida ); vysv ětlením by mohla být vyšší mobilita „leh čích“ spermatozoid ů; m ůže to však být spíše fylogenetický artefakt (který je z řejmý, pokud se podíváme na obr. 10.). V jiné studii je prezentován fakt, že vodní (heterosporické leptosporangiátní) kapradiny mají menší genom oproti ostatním leptosporangiátním izosporickým kapradinám (Leitch et al. 2005). Databázi dosud publikovaných údaj ů o velikostech genomu shromaž ďuje M. D. Bennett a I. J. Leitch z Jodrell Laboratory, Royal Botanic Gardens Kew. V sou časné dob ě databáze obsahuje údaje k 7058 druh ům rostlin (řasy - 253 druh ů, mechorosty - 232 druh ů14 , plavun ě - 15 druh ů15 , kapra ďorosty - 67 druh ů, nahosemenné rostliny - 204 druh ů a krytosemenné rostliny - 6287 druh ů) a je dostupná ve řejn ě na adrese http://data.kew.org/cvalues/ . Přestože se po čty známých velikostí genomu mohou zdát vysoké, pokrývá tato databáze zatím jen zlomek celkové diverzity rostlinných organism ů; nap ř. u krytosemenných rostlin je zm ěř en obsah DNA pouze asi u 2,5% všech druh ů, u kapra ďorost ů je to dokonce jen u 0,7% všech druh ů. Zatím nejmenší velikost genomu u kapra ďorost ů byla nam ěř ena u druhu Azolla microphylla z čeledi Marsileaceae (C = 0,77 pg; Obermayer et al. 2002). Nejv ětší uvád ěnou velikost genomu mezi kapra ďorosty má druh Psilotum nudum z čeledi Psilotaceae , jehož velikost genomu je C = 72,68 pg (Obermayer et al. 2002).

14 Pouze mechy a játrovky. 15 V četn ě šídlatek a vrane čků.

30

5. Pom ěr AT/GC

Tímto údajem (angl. AT/GC ratio) rozumíme pom ěr mezi obsahem pár ů bazí adeninu+ thyminu (AT) a pár ů bazí guaninu+cytosinu (GC) v DNA. Čast ěji se však setkáme s procentuálním vyjád řením obsahu GC, p řípadn ě AT. Podobn ě jako po čet chromosom ů nebo velikost genomu p ředstavuje tento parametr další druhov ě specifickou vlastnost genomu. V review-kapitole o genomickém obsahu bazí (Meister & Barow 2007) byl tento obsah sumarizován na základ ě d řív ějších dat u 192 druh ů krytosemenných rostlin, 14 druh ů nahosemenných rostlin, 10 druh ů řas a jednoho druhu ze skupiny kapra ďorost ů (viz tab. 1. v úvodní kapitole). Obsah AT u rostlin 16 se podle tohoto review pohybuje zhruba v rozp ětí 47–70%; u semenných rostlin je toto rozp ětí užší, asi 52,8 17 –65,3 18 %. U kapra ďorost ů obsah AT (resp. GC) bazí v podstat ě ješt ě tém ěř nikdo nezkoumal, proto nelze prozatím rozhodnout, zda se v tomto sm ěru liší od semenných rostlin. Vztah mezi pom ěrem AT/GC a velikostí genomu byl v minulosti n ěkolikrát zkoumán. U rostlin byla pozitivní korelace zjišt ěna u rodu Allium (Narayan 1988). V podrobné studii erytrocyt ů obratlovc ů byla rovn ěž zjišt ěna pozitivní korelace (Vinogradov 1994); tentýž autor p ři diskuzi výsledk ů použil data pro 6 druh ů krytosemenných rostlin s tehdy známým GC obsahem a velikostí genomu a zjistil, že v rámci tohoto omezeného souboru je vztah zmín ěných parametr ů rovn ěž pozitivní. Negativní korelaci zjistil Koopman (2002) u druh ů rodu Lactuca . V návaznosti na studie obratlovc ů provedené Vinogradovem (Vinogradov 1994) se také Barow & Meister (2002) snažili testovat p řítomnost korelace v rámci 54 druh ů ze 17 čeledí semenných rostlin, nicmén ě nenašli žádný signifikantní vztah (vykazoval však spíše pozitivní trend), dokonce ani v jednotlivých zkoumaných čeledích.

16 V četn ě řas. 17 Zea mays ; Barow & Meister (2002). 18 Allium cepa , Ginkgo biloba ; Barow & Meister (2002).

31

32

6. Charakteristika analyzovaných druh ů a vyšších taxon ů

Uspo řádání jednotlivých čeledí odpovídá po řadí na fylogenetickém stromu (obr. 1.); fylogenetický strom se všemi druhy použitými v analýzách je znázorn ěn na obr. 13. Uvedené taxony jsou monofyletické, pokud není uvedeno jinak. Detailn ější komentá ře k morfologii nebo ekologii jsou zam ěř eny p ředevším na m ěř ené druhy nebo rody. Stru čně bylo v rámci jednotlivých čeledí zmín ěno jejich zastoupení ve fló ře České republiky.

6.1. Ophioglossales , Ophioglossaceae Sestává pouze ze čty ř rod ů: Botrychium , Ophioglossum , Helminthostachys a Mankyua a asi 80 druh ů (Smith et al. 2006) 19 . Jde o rostliny terestrické, n ěkdy epifytické (Domin 1929). Sporangia jsou izosporická, eusporangiátní, jednotlivá nebo zano řená ve fertilní části listu. Listová čepel má heteromorfní stavbu, je složena z fertilní a sterilní části (Simpson 2006). Gametofyt je vytrvalý. Pr ůduchy jsou v této čeledi anomocytické nebo cyklocytické, jsou zano řené a obvykle na obou stranách listu (Cotthem 1970). Mezi kosmopolitní zástupce této čeledi pat ří druhy Botrychium lunaria a Ophiglossum vulgatum (Domin 1929), které jsou zastoupeny i v naší fló ře (spolu s dalšími t řemi velmi vzácnými druhy rodu Botrychium ; Chrtková 1988).

6.2. Psilotales , Psilotaceae Jde o čele ď s 12 druhy rozd ělenými do dvou rod ů - Tmesipteris a Psilotum (Smith et al. 2006) 20 . Jejich eusporangiátní izosporická sporangia sr ůstají bu ď po dvou ( Tmesipteris ) nebo po t řech (Psilotum ) v synangia. Gametofyt je dlouhov ěký. Zástupce této čeledi najdeme v tropech a subtropech (Domin 1929); v Evrop ě nalezeno pouze ojedin ěle Psilotum nudum v jižním Špan ělsku. U rodu Psilotum , jehož listy jsou nepatrné, šupinovité, bezžilné a vícemén ě blanité, se pr ůduchy nachází na zeleném asimilujícím stonku a jsou zano řené.

6.3. Equisetales , Equisetaceae Je zde pouze jediný rod Equisetum s dv ěma podrody - Equisetum a Hippochaete . Jde o taxon s celkem 15 druhy (Smith et al. 2006) 21 , které mají typické p řeslenité v ětvení stonku

19 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 107–109 druh ů. 20 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 14–15 druh ů. 21 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 16 druh ů.

33

a listy redukované, bo čně srostlé a tvo řící zubaté pochvy na hlavním stonku i bo čních větvích. Eusporangiátní sporangia jsou uspo řádána po obvodu spodní strany deštníkovitých sporofyl ů, tvo řících výtrusný klas (šištici, strobillus). Spóry mají čty ři haptery, velikostí a tvarem jsou spóry stejné, tvo ří však protália r ůzného pohlaví. Pr ůduchy se zna čně liší od ostatních kapra ďorost ů. Pr ůduchový aparát je obvykle tvo řen dv ěma páry bun ěk, p řičemž dv ě bu ňky, které tvo ří pr ůduchovou št ěrbinu, nejsou pravé sv ěrací bu ňky, ale bu ňky vedlejší, které mohou mít funkci sv ěracích bun ěk (Page 1972). Pod tímto párem vedlejších bun ěk jsou pak ukryté pravé sv ěrací bu ňky (Hauke 1957). Někdy však horní pár vedlejších bun ěk chybí, takže pravé sv ěrací bu ňky sice nejsou zakryté, ale i p řesto jsou špatn ě viditelné, nebo ť jsou hluboce zano řené. Pokožka a pr ůduchy jsou pokryté exkrecemi oxidu křemi čitého (obr. 12.), což m ůže zna čně komplikovat po řizování lakových otisk ů. U podrodu Equisetum jsou pr ůduchy v jedné rovin ě s epidermis a jsou bu ď rozptýleny, nebo ve skupinách po stranách žlábk ů stonku. Podrod Hippochaete má pr ůduchy zano řené a uspo řádané do n ěkolika linií. Vnit řní st ěna pr ůduchových bun ěk je ztlušt ělá (Hauke 1957). Gametofyt je krátkov ěký. Na našem území jsou p řesli čky pouze byliny do dvou metr ů vzr ůstu ( E. telmateia ).V Jižní a St řední Americe se setkáme i s několikametrovými druhy tém ěř stromového vzr ůstu ( E. giganteum ) a druhy s dřevnatými lodyhami, nap ř. E. xylochaetum rostoucí v Jižní Americe (Domin 1929). P řesli čky jsou hojn ě rozší řeny po celém sv ětě, nerostou však v Austrálii, tropické Africe a Antarktid ě; u nás jsou p ůvodní 3 druhy podrodu Hippochaete a 6 druh ů typového podrodu (Hrouda 1988). Nároky na ekologii jsou r ůzné, najdeme zde druhy vlhkomilné i druhy rostoucí na suchých stanovištích (Domin 1929).

34

Obr. 12. Pr ůduchy Equisetum arvense pokryté exkrecemi oxidu k řemičitého na snímku z elektronového rastrovacího mikroskopu; p řevzato z práce Dines (2002).

6.4. Marattiales , Marattiaceae Sestává ze čty ř rod ů: Angiopteris , Christensenia , Danaea , Marattia a zhruba 150 druh ů (Smith et al. 2006) 22 . Lze sem zahrnout i fosilní stromovité zástupce, především rodu Psaronia , pocházející z karbonu (Collinson 1996). Jde o vytrvalé tropické kapradiny pom ěrn ě velkých rozm ěrů, které rostou bu ď v trsu, nebo vytvá ří nízký kmen (Domin 1929). Listy mohou být jednou až t řikrát zpe řené (Simpson 2006), nápadné jsou zejména mohutnými řapíky, na jejichž bázi se nachází pár velkých mušlovitých aflébií; jsou obvykle hypostomatické. Pr ůduchy jsou cyklocytického typu (Cotthem 1970). Gametofyt je vytrvalý. Zástupce najdeme hlavn ě v jihovýchodní Asii. Rod Marattia je pantropický, rod Danaea se objevuje v Jižní a St řední Americe (Hill et Camus 1986) a rod Angiopteris je paleotropický - nachází se hlavn ě ve V a JV Asii, Austrálii a Polynésii, na Madagaskaru a Papui - Nové Guineji (Domin 1929, Smith et al. 2006, Collinson 2001).

6.5. Osmundales , Osmundaceae Pat ří sem pouze t ři rody: Leptopteris , Osmunda a Todea , zahrnující asi 20 druh ů (Smith et al. 2006) 23 . Listy jsou dvojtvaré, někdy se sterilní a fertilní částí, vzdálen ě p řipomínající zástupce čel. Ophioglossaceae , nebo jsou rozlišené na trofofyly a sporofyly. U rod ů

22 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 154–183 druh ů. 23 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 24 druh ů.

35

Osmunda a Todea jsou listy hypostomatické s anomocytickými pr ůduchy, u rodu Leptopteris pr ůduchy chybí (Cotthem 1970). Gametofyt je vytrvalý. Rod podez řeň (Osmunda ) byl kdysi zastoupen i v naší fló ře druhem p. královská ( O. regalis ; Šourková 1988); tento druh má jinak tém ěř kosmopolitní rozší ření. Rod Todea je strome čkovitého vzr ůstu a zahrnuje pouze dva druhy: T. papuana (endemit ostrova Papua -Nová Guinea) a T. barbara, která roste v jižní Africe, východní Austrálii a na Novém Zélandu; na ostrovech v Tichém oceánu se sekáme i se zástupci posledního rodu Leptopteris (Domin 1929).

6.6. Gleicheniales , Gleicheniaceae Rozlišujeme šest rod ů: Dicranopteris , Diplopterygium , Gleichenella , Gleichenia, Sticherus , Stromatopteris a asi 125 druh ů (Smith et al. 2006) 24 . Nejstarší fosílie pocházejí z období křídy (Smith et al. 2006). Jde o pozemní vytrvalé byliny. Listy mají rozeklanou čepel a jsou hypostomatické s anomocytickými nebo diacytickými pr ůduchy (Cotthem 1970). Rod Gleichenia je rozší řen hlavn ě v tropech a jižním mírném podnebném pásu (Domin 1929) - tedy p ředevším v Africe, Indo čín ě, Malajsii, Austrálii a na Novém Zélandu (Collinson 2001).

6.7. Schizaeales , Lygodiaceae Je zde jediný rod Lygodium s 25 druhy (Smith et al. 2006) 25 . Jde o rostliny liánovitého vzr ůstu s pantropickým rozší řením (Smith et al. 2006). Druh Lygodium scandens nalezneme v Africe, Indii, Čín ě, Austrálii a Polynésii (Collinson 2001). Pr ůduchy jsou u rodu Lygodium bu ď diacytické, nebo anomocytické (Cotthem 1970).

6.8. Schizaeaeles , Anemiaceae Op ět je zde pouze jediný rod Anemia s více než 100 druhy (Smith et al. 2006) 26 . Rostliny jsou terestrické, rostoucí hlavn ě v Novém Sv ětě; n ěkolik druh ů roste i v Africe a Indii (Smith et al. 2006). Nacházíme zde více typ ů pr ůduch ů - pericytické, desmocytické a polocytické (Cotthem 1970).

24 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 124–130 druh ů. 25 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 30 druh ů. 26 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 110–115 druh ů.

36

6.9. Salviniales , Marsileaceae Jsou zde zastoupeny t ři rody: Marsilea , Pilularia , Regnellidium a asi 75 druh ů (Smith et al. 2006) 27 . Jde o vytrvalé byliny s oddenkem rostoucím v bahně, proto je najdeme nej čast ěji v bažinách nebo p římo ve vod ě. Rod Marsilea má listy s dlouhým řapíkem a čty řč etnou čepelí (Domin 1929). Listy rodu Regnellidium jsou pouze dvou četné, rod Pilularia má listy tence čárkovité (Domin 1929). Zástupci této čeledi mají amfistomatické listy s anomocytickými pr ůduchy (Cotthem 1970). U n ěkterých druh ů rodu Marsilea najdeme pr ůduchy jen na svrchní stran ě listu. Zástupce této čeledi najdeme v mírném pásu i v tropech. Nejrozší řen ějším druhem je M. quadrifolia , která roste v Evrop ě (vzácn ě v okolních zemích - Rakousku, Ma ďarsku a na Slovensku, u nás nebyl p ůvodní výskyt zaznamenán), Asii a vzácn ě i v Severní Americe. Rod Pilularia je rozší řen v Evrop ě ( P. globulifera vzácn ě i u nás; K řísa 1988a), Austrálii, Novém Zélandu a v Jižní a Severní Americe. Jediný druh rodu Regnellidium (R. diphyllum ) roste pouze v Brazílii (Domin 1929).

6.10. Salviniales , Salviniaceae Tato čele ď vodních kapradin sestává ze dvou rod ů - Azolla a Salvinia , které zahrnují celkem 16 druh ů (Smith et al. 2006) 28 . Plovoucí listy rodu Salvinia jsou epistomatické, u rodu Azolla jsou amfistomatické (Cotthem 1970). Oba rody mají anomocytické pr ůduchy. Rod Salvinia má pr ůduchy velmi malé, u rodu Azolla se setkáváme se zvláštními pr ůduchy, které mají jedinou kruhovou sv ěrací bu ňku s dv ěma jádry (Sen 1983). Se zástupci této čeledi se setkáme p ředevším v tropech Asie a Jižní Ameriky ( Salvinia ), druhý rod ( Azolla ) má pantropické rozší ření. S jediným mimotropickým druhem Salvinia natans se vzácn ě setkáme ve stojatých vodách i na našem území (Domin 1929); Azolla caroliniana oblíbená akvaristy u nás pouze ojedin ěle zpla ňuje (K řísa 1988b).

6.11. Cyatheales , Cibotaceae Zde je pouze jeden rod Cibotium s 11 druhy (Korall et al. 2006). Podle fosilních nález ů byl v t řetihorách tento rod sou částí boreotropické flory v Evrop ě, Severní Americe a východní Asii (Barrington 1993). V sou časnosti roste hlavn ě ve V Asii, Malajsii, na Hawaii, v J Mexiku a St řední Americe (Smith et al. 2006). Jde o stromové kapradiny. Listy jsou hypostomatické s paracytickými pr ůduchy (Cotthem 1970).

27 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 61–66 druh ů. 28 Hassler & Swale (2001) uvád ějí odhad 17–19 druh ů.

37

6.12. Cyatheales , Cyatheaceae Představují p ět rod ů: Alsophila , Cyathea , Gymnosphaera , Hymenophyllopsis , Sphaeropteris a více než 600 druh ů (Korall et al. 2006). Jde p ředevším o stromové kapradiny pantropického rozší ření. Fosilní záznamy pochází z jury až k řídy (Smith et al. 2006). Listy jsou hypostomatické s r ůznými typy pr ůduch ů (paracytické, polocytické, anomocytické; Cotthem 1970).

6.13. Cyatheales , Dicksoniaceae Sestává ze t ří rod ů: Calochlaena , Dicksonia , Lophosoria (Smith et al. 2006), které zahrnují celkem p řibližn ě 30 druh ů (Korall et al. 2006). Tyto stromové kapradiny rostou hlavn ě v tropech Starého i Nového sv ěta. Listy jsou hypostomatické s paracytickými pr ůduchy (Cotthem 1970).

6.14. Polypodiales , Lindsaeaceae Zahrnuje osm rod ů: Cystodium , Lindsaea , Lonchitis , Odontosoria , Ormoloma , Sphenomeris , Tapeinidium , Xyropteris ; celkov ě je zde asi 200 druh ů. Rod Lonchitis byl tradi čně p řiřazován k čeledi Dennstaedtiaceae (hlavn ě díky morfologickým znak ům), ale molekulární analýzy ukázaly, že pat ří do čeledi Lindsaeaeceae (Smith et. al 2006). Pantropické rozší ření má rod Odontosoria , v afrických a amerických tropech najdeme rody Lindsaea a Lonchitis , v Asii a ostrovech západního Pacifiku rostou druhy rod ů Tapeinidium a Xyropteris , ve st řední Americe a v Karibiku se vyskytuje rod Ormoloma (Hassler & Swale 2001). Pr ůduchy jsou polocytické nebo anomocytické.

6.15. Polypodiales , Dennstaedtiaceae Zahrnuje 11 rod ů: Blotiella , Coptodipteris , Dennstaedtia , Histiopteris , Hypolepis , Leptolepia , Microlepia , Monachosorum , Oenotrichia , Paesia , Pteridium . Druh ů je zde asi 170 (Pryer et al. 2004). V ětšinou jde o druhy s pantropickým rozší řením; v naší fló ře je zastoupen pouze kosmopolitn ě rozší řený druh hasivka orli čí ( Pteridium aquilinum ; Dvo řáková 1988). Pr ůduchy jsou polocytické ( Dennstaedtia ) nebo anomocytické (Histiopteris, Hypolepis, Leptolepia, Paesia, Pteridium ), jak uvádí Cotthem (1970).

6.16. Polypodiales , Pteridaceae Tato čele ď zahrnuje 50 rod ů a 950 druh ů. Rody z této čeledi, které se objevují i v analýzách této práce jsou: Actiniopteris , Adiantum , Cheilanthes, Gymnopteris , Hemionitis , Onychium ,

38

Pellaea , Pityrogramma , Pteris . V rámci této čeledi m ůžeme rozlišit ješt ě p ět monofyletických podčeledí (nebo čeledí v užším pojetí): Parkerioideae , Adiantoideae , „Cryptogrammaceae “ (zde je k dispozici pouze jméno čeledi), Cheilanthoideae , Pteridoideae (Smith et al. 2006). V ětšina druh ů roste v tropických oblastech Ameriky. Druhov ě nejpo četn ější je rod Pteris (asi 200 druh ů rozší řených po celém sv ětě), další významné rody jsou rovn ěž široce rozší řený Cheilanthes a dále v tropické Americe rostoucí Adiantum a Pityrogramma (Domin 1929). Z naší flóry pat ří do této čeledi pouze dva velmi vzácné druhy: Cryptogramma crispa , rostoucí na Šumav ě, Novohradských horách a v Krkonoších (Kovanda 1988), a Notholaena marantae , známá donedávna pouze z hadcové stepi u Mohelna (Smejkal 1988a) a nedávno objevená i v Českém krasu (Špry ňar 2004). Podle Cotthem (1970) jsou listy zástupc ů této čeledi v ětšinou hypostomatické a objevují se zde t ři typy pr ůduch ů: polocytické (p ř. Pteris ), anomocytické (p ř. Adiantum, Pteris ) a hypocytické (p ř. Actiniopteris ).

6.17. Polypodiales , Aspleniaceae V závislosti na pojetí moderních molekulárních prací (Murakami et al. 1999, Gastony & Johnson 2001, Pinter et al. 2002, van den Heede et al. 2003, Schneider et al. 2004a) se v čeledi rozlišuje jeden široký ( Asplenium ) až 10 drobn ějších rod ů ( Camptosorus, Loxoscaphe, Diellia, Pleurosorus, Phyllitis, Ceterach, Thamnopteris a n ěkolik dalších malých rod ů). Celkov ě je v této čeledi zastoupeno asi 700 druh ů (Murakami & Schaal 1994, Hasebe et al. 1995, Murakami et al. 1999, Gastony & Johnson 2001, van den Heede et al. 2003, Schneider et al. 2004a, 2005, Perrie & Brownsey 2005). U nás se vyskytují druhy rodu Asplenium , Phyllitis a Ceretach (Domin 1929), které však podle moderních molekulárních analýz bývají řazeny do spole čného velkého rodu Asplenium , který je tedy u nás zastoupen celkem 7 druhy, k n ěmuž p řistupují dva vzácné druhy Phyllitis scolopendrium a Ceterach officinarum (viz Tomšovic & K řísa 1988). Listy této čeledi jsou hypostomatické, výjimku tvo ří druh Camptosorus rhizophyllus s amfistomatickými listy. Pr ůduchy jsou r ůzných typ ů - polocytické, anomocytické, staurocytické i paracytické (Cotthem 1970).

6.18. Polypodiales , Thelypteridaceae Zde je zastoupeno 5-30 rod ů, záleží na taxonomickém pojetí, a 950 druh ů (Smith et al. 2006). Listy jsou hypostomatické (Cotthem 1970). V analýzách této práce se objevují rody Stegnogramma, Phegopteris a Oreopteris rostoucí hlavn ě v tropech, ojedin ěle zasahují až

39

do mírného pásma (Smith et al. 2006); poslední dva jmenované rody a rod Thelypteris jsou zastoupeny po jednom druhu i v naší fló ře (Smejkal 1988b).

6.19. Polypodiales , Woodsiaceae V této čeledi je asi 15 rod ů a 700 druh ů, v ětšina z nich pat ří ke dv ěma nejpo četn ějším rod ům - Athyrium a Diplazium (Smith et al. 2006), ty jsou z řejm ě oba parafyletické (Wang et al. 2003) stejn ě jako celá čele ď. Z dalších rod ů se v analýzách objevuje rod Cystopteris . Rod Diplazium roste p ředevším v tropech a subtropech (Domin 1929, Kramer & Green 1990); v naší fló ře jsou zastoupeny rody Athyrium , Cystopteris , Woodsia a Gymnocarpium (Chrtek & Slavík 1988, Chrtek 1988). Listy zástupc ů této čeledi jsou hypostomatické s polocytickými nebo anomocytickými pr ůduchy (Cotthem 1970).

6.20. Polypodiales , Blechnaceae Čele ď tvo ří dev ět rod ů: Blechnum s.l., Brainea , Doodia , Pteridoblechnum , Sadleria , Salpichlaena , Steenisioblechnum , Stenochlaena , Woodwardia a je zde p řibližn ě 200 druh ů (Smith et al. 2006). Rod Woodwardia se z řejm ě odd ělil jako jeden z prvních v této čeledi (Cranfill & Kato 2003). Listy jsou bu ď nerozlišené nebo rozlišené na trofofyly a sporofyly (Smith et al. 2006). Na hypostomatických listech nacházíme v ětšinou polocytické pr ůduchy (Cotthem 1970). Druhy rostou p řevážn ě v tropech (Domin 1929), ale najdeme zde i rody kosmopolitní jako je Blechnum , který roste spíše v jižním mírném podnebném pásu (u nás jediný horský druh B. spicant ; Čvan čara 1988a), nebo rod Woodwardia , který dává naopak přednost spíše severnímu mírnému pásu (Collinson 2001).

6.21. Polypodiales , Onocleaceae Jsou zde čty ři rody ( Matteuccia , Onoclea , Onocleopsis , Pentarhizidium ) a p ět druh ů. Listy jsou hypostomatické. U rod ů Onoclea a Matteucia jsou pr ůduchy polocytické i anomocytické (Cotthem 1970). Zástupce najdeme hlavně v severním mírném podnebném pásu. Druh Onoclea sensibilis najdeme ve st řední a východní Asii a také ve východní části Severní Ameriky (Collinson 2001), podle fosilních záznam ů z období k řídy rostl ve všech zalesn ěných částech severní polokoule (Barrington 1993); u nás je pouze jediný druh Matteuccia struthiopteris (Chrtek & Slavík 1988). Listy jsou rozlišené na trofofyly a sporofyly (Smith et al. 2006).

40

6.22. Polypodiales , Dryopteridaceae Jde o velkou čele ď obsahující 40-45 rod ů. Nejpo četn ějšími rody jsou Ctenitis , Dryopteris , Elaphoglossum a Polystichum , které zahrnují 70% ze 1700 druh ů zastoupených v této čeledi (Smith et al. 2006). Další rody z této čeledi, které se objevují v analýzách, jsou Arachniodes , Cyrtomium , Didymochlaena , Leucostegia a Rumohra . Listy jsou op ět hypostomatické s polocytickými i staurocytickými průduchy (Rumohra, Dryopteris, Polystichum ; Cotthem 1970). Díky velkému po čtu druh ů najdeme v této čeledi jak zástupce pantropické, tak i kosmopolitní rostoucí v mírném pásu (Smith et al. 2006), jsou zde druhy epifytické, terestrické i epipetrické; u nás zastoupeny rody Dryopteris a Polystichum (Chrtek 1988). Jde o čele ď monofyletickou, pokud do ní nezahrneme rody Didymochlaena , Hypodematium a Leucostegia (Hasebe et al. 1995, Tsutsumi & Kato 2006).

6.23. Polypodiales , Lomariopsidaceae Zde jsou zastoupeny 4 rody: Cyclopeltis , Lomariopsis , Nephrolepis a Thysanosoria , které obsahují celkem asi 70 druh ů, zpravidla pantropického rozší ření, monotypický rod Thysanosoria je endemitem Nové Guineje ( T. pteridiformis ; Hassler & Swale 2001). Monofylie tohoto taxonu není zcela jistá (Smith et al. 2006). Pr ůduchy u rodu Nephrolepis jsou staurocytické, rod Lomariopsis má pr ůduchy desmocytické (Cotthem 1970). Zvláštností tropického druhu Nephrolepis cordifolia je, že na oddenkových výb ěžcích vytvá ří hlízy, které n ěkte ří domorodci konzumují (Domin 1929).

6.24. Polypodiales , Tectariaceae V této čeledi je rozlišováno 8-15 rod ů: Aenigmopteris , Arthropteris , Heterogonium , Hypoderris , Pleocnemia , Psammiosorus , Psomiocarpa , Pteridrys , Tectaria s.l. (zahrnující nap ř. Fadyenia a Quercifilix ) a Triplophyllum . V ětšina z 230 druh ů je zahrnuta v pantropicky rozšířeném rod ě Tectaria s.l. (Hassler & Swale 2001; Smith et al. 2006). Rod Tectaria má listy hypostomatické s r ůznými typy pr ůduch ů (polocytické, anomocytické, staurocytické), jak uvádí Cotthem (1970).

6.25. Polypodiales , Davalliaceae Najdeme zde 4 rody: Araiostegia , Davallia (v širším pojetí zahrnující rody Humata, Parasorus, Scyphularia ), Davallodes , Pachypleuria . Celkem je zde 65 druh ů (Smith et al. 2006). Zástupce nacházíme hlavn ě v tropech a subtropech Starého sv ěta (Domin 1929; Hassler & Swale 2001). Listy jsou hypostomatické s polocytickými pr ůduchy. U rod ů

41

Davallia a Humata najdeme pr ůduchy pouze okolo laterálních žilek na listu (Cotthem 1970).

6.26. Polypodiales , Polypodiaceae Je to bohatá čele ď, zahrnující zhruba 56 rod ů a 1200 druh ů. V ětšina z nich je pantropických, n ěkteré rostou i v mírném podnebí. V analýzách se z této čeledi objevují rody: Aglaomorpha , Drynaria , Microsorum , Microgramma , Phlebodium , Phymatosorus , Platycerium , Polypodium a Pyrrosia . Jde o čele ď parafyletickou, protože je z ní vy člen ěna čele ď Grammitidaceae (Ranker et al. 2004, Schneider et al. 2004b). Hranice mezi rody jsou někdy nejasné a nap ř. rody Polypodium a Microsorum jsou polyfyletické (Schneider et al. 2004b). V této čeledi nacházíme jak paleotropické, tak neotropické klády (Schneider et al. 2004b). V ětšina druh ů je epifytických nebo epipetrických. V naší fló ře je zastoupen jediný rod Polypodium , a to dv ěma druhy: P. vulgare a P. interjectum ( Čvan čara 1988b, Bureš et al. 2003). Pr ůduchy jsou polocytické ( Platycerium, Polypodium, Microgramma, Phlebodium, Microsorum, Drynaria ), u n ěkterých zástupc ů najdeme i pr ůduchy pericytické nebo anomocytické, jak uvádí Cotthem (1970). Zajímavostí u rodu Pyrrosia je, že pr ůduchy n ěkterých druh ů ( P. lanceolata, P. longifolia, aj.) jsou hluboko zano řené (Hovenkamp 1986), a tudíž jsou použitou mikroreliéfovou metodou nem ěř itelné (v analýzách se tedy tyto druhy neobjevují).

42

Pteris vittata Asplenium cuneifolium Botrychium lunaria Asplenium dimorphum Ophioglossum vulgatum Asplenium ruta-muraria Psilotum nudum Asplenium scolopendrium Equisetum giganteum Asplenium septentrionale Equisetum hyemale Ceterach officinarum Angiopteris angustifolia Cystopteris fragilis Angiopteris evecta Diplazium bantamense Angiopteris australis Diplazium esculentum Diplazium maximum Marattia fraxinea Marattia laevis Diplazium proliferum Osmunda regalis Oreopteris limbosperma Todea barbara Phegopteris connectilis Gleichenia microphylla Stegnogramma wilfordii Lygodium flexuosum Blechnum australe Lygodium japonicum Blechnum brasiliense Blechnum gibbum Lygodium volubile Anemia phyllitidis Blechnum occidentale Anemia rotundifolia Blechnum penna-marina Marsilea quadrifolia Blechnum spicant Marsilea drummondii Blechnum tabulare Pilularia globulifera Doodia aspera Regnellidium diphyllum Doodia dives Salvinia molesta Stenochlaena tenuifolia Cibotium chamissoi Woodwardia orientalis Cibotium regale Woodwardia radicans Cyathea capensis Onoclea sensibilis Sphaeropteris cooperi Arachniodes aristata Dicksonia antarctica Cyrtomium falcatum Dicksonia fibrosia Cyrtomium fortunei Dicksonia youngiae Cyrtomium macrophyllum Lonchitis sinuata Didymochlaena truncatula Dennstaedtia bipinnata Dryopteris dilatata Hypolepis millefolium Dryopteris filix-mas Microlepia platyphylla Dryopteris sieboldii Microlepia speluncae Elaphoglossum crinitum Pteridium aquilinum Elaphoglossum longifolium Actiniopteris semiflabellata Leucostegia pallida Adiantum hispidulum Polystichum aculeatum Adiantum raddianum Polystichum aristatum Cheilanthes concolor Polystichum lonchitis Gymnopteris tomentosa Rumohra adiantiformis Hemionitis arifolia Nephrolepis cordifolia Onychium japonicum Nephrolepis sp. "philippinensis" Pellaea rotundifolia Fadyenia prolifera Pellaea viridis Tectaria incisa Pityrogramma argentea Tectaria heracleifolia Pteris biaurita Tectaria zeylanica Pteris cretica Davallia canariensis Pteris dentata Davallia pyxidata Pteris vittata Humata tyermannii Asplenium cuneifolium Aglaomorpha coronans Asplenium dimorphum Drynaria quercifolia Asplenium ruta-muraria Microsorum punctatum Asplenium scolopendrium Microsorum thailandicum Asplenium septentrionale Microgramma piloselloides Ceterach officinarum Microgramma lycopodioides Cystopteris fragilis Phlebodium aureum Phymatosorus parksii Platycerium alcicorne Platycerium grande Platycerium madagascariense Platycerium sp. "vassei" Polypodium crassifolium Pyrrosia piloselloides

Obr. 13. Fylogenetický strom analyzovaných druh ů; zobrazeno pomocí programu TreeViewX.

43

44

7. Materiál a metody

7.1. Materiál Pro analýzy velikosti pr ůduch ů byly použity herbá řové položky celkem 115 druh ů z 26 čeledí kapra ďorost ů (70% z celkového po čtu 37 čeledí), p ředstavující doklady k cytometrickým m ěř ením obsahu DNA ve vzorcích sbíraných L. Adamcem, P. Burešem, V. Grulichem, K. Helánovou, L. Horovou, I. Hralovou, O. Rotreklovou a P. Šmardou ve sklenících botanických zahrad Masarykovy univerzity a Mendelovy univerzity v Brn ě a botanických zahrad ve Vídni (na Víde ňské univerzit ě a v Schönbrunnu), Mnichov ě- Nymphenburgu a Regensburgu (Univerzitní botanická zahrada), ojedin ělé vzorky pocházejí také z botanické zahrady v Bormiu, skleníku botanické zahrady v Praze-Tróji a také ze Sbírky vodních a mok řadních rostlin Botanického ústavu AV ČR v T řeboni; v n ěkolika případech se jednalo také o materiál sbíraný p římo v terénu K. Helánovou, P. Burešem, O. Rotreklovou nebo V. Grulichem v roce 2007. V sou časnosti jsou tyto doklady uloženy v herbá ři Ústavu botaniky a zoologie P řírodov ědecké fakulty Masarykovy univerzity v Brn ě (BRNU). Dokladový materiál revidoval v roce 2008 doc. V. Řeho řek; vzorky pocházející z botanické zahrady v Mnichov ě-Nymphenburgu byly při sb ěru determinovány zkušeným amatérským pteridologem Hermannem Esserem. Krom ě herbá řových doklad ů jsou vzorky doloženy také fotografiemi (viz p řiložené CD). Přehled vzork ů a jejich původu obsahuje tabulka P1 v p říloze.

7.2. Mikroreliéfová metoda Tato metoda se používá p ři pozorování povrchu nepr ůhledných objekt ů (tedy nap ř. povrchu listu). P ři této metod ě se využívá toho, že povrch listu není rovný - bu ňky jsou uprost řed vystouplé. Díky tomu m ůžeme nap ř. nanesením vrstvi čky pr ůhledného laku a po zaschnutí jejím sejmutím získat v ěrný otisk povrchu listu. V n ěkterých p řípadech je vhodné ud ělat několikanásobný otisk na stejném míst ě listu, protože první stržení otisku může ú činn ě odstranit z povrchu listu r ůzné ne čistoty, p řípadn ě i trichomy nebo vylou čený kutikulární vosk. Po řízený otisk už pak m ůžeme pozorovat klasickým mikroskopem v procházejícím sv ětle. Pro dobrý obraz v mikroskopu je vhodné siln ější zaclon ění, p řípadn ě lze i snížit kondenzor. Hlavními výhodami této metody jsou její jednoduchost a rychlost, avšak jsou ur čité p řípady, kdy se tato metoda p říliš nehodí, nap ř. u list ů se silnou vrstvou kutikuly, která vypl ňuje nerovnosti na povrchu epidermis.

45

Mikroreliéfovou metodu zavedl u nás J. Pazourek (1963) 29 . P ůvodn ě sloužila ke studiu transpirace (Buscalioni & Pollacci 1902), pozd ěji pak ke zkoumání povrchu fosilií (Long & Clements 1934) a kone čně i živých rostlin. Pro účely léka řské histologie byla mikroreliéfová metoda modifikována J. Wolfem 30 , který za čal pro snímání otisku používat lepicí pásku, což tuto metodu zna čně zjednodušilo. Ke zhotovování otisk ů bylo používáno množství r ůzných hmot, jako nap ř. kolodium, celoidin nebo celuloid. Pazourek (1963) píše, že nejvíce se mu osv ědčil bezbarvý lak na nehty, který se také dnes nej čast ěji využívá hlavn ě díky jeho snadné dostupnosti, dále lak na výpln ě (methylester kys. metakrylové) a polyvinylacetát v etanolu. Již od dob vzniku této metody je její využití v botanice sm ěř ováno nej čast ěji ke studiu pr ůduch ů. Velice vhodný je tento zp ůsob i p ři zkoumání tvaru či velikosti epidermálních bun ěk a také zjiš ťování kvantitativních parametr ů (p ředevším hustoty r ůzných epidermálních struktur). I p řes nesporné výhody mikroreliéfové metody vznikly p ři po řizování otisk ů epidermis analyzovaných vzork ů v rámci bakalá řské práce jisté problémy. Některé druhy kapra ďorost ů m ěly p říliš jemné listy, které se v herbá ři staly ješt ě křeh čími, a proto p ři pokusu ud ělat otisk listu došlo k rozdrobení listu (nap ř. Salvinia natans ); preparát pak bylo nutno p řipravovat postupným odškrabáváním zbytk ů p řilepených k řehkých pletiv. Z toho důvodu musely být n ěkteré druhy dokonce z analýzy vy řazeny. U n ěkterých druh ů byly listy hust ě pokryty trichomy, což znemož ňovalo vytvo řit kvalitní otisk, pokud trichomy nebyly p ředem „oholeny“ žiletkou ( Salvinia molesta , spodní strana list ů Ceterach officinarum ); podobn ě bylo t řeba postupovat pokud pr ůduchy byly na spodní stran ě drobných list ů mezi sporangii (nap ř. Asplenium septentrionale ). Druhy, u nichž byly pr ůduchy částe čně zano řené, byly rad ěji analyzovány na dostupném živém materiálu p římo z pokožky ( Psilotum nudum ).

7.3. Cell-F a m ěř ení velikosti pr ůduch ů Program Cell-F od spole čnosti Olympus je ur čen pro zobrazování a následné analýzy zobrazovaných biologických objekt ů. Software Cell-F slouží hlavn ě k vícebarevnému fluorescen čnímu zobrazování a zpracování. V této studii byl využit k po řízení snímk ů pr ůduch ů pozorovaných v mikroskopu a k m ěř ení jejich délek.

29 (1923–1999) profesor anatomie a fyziologie rostlin na Karlov ě univerzit ě [http://www.csebr.cz/soubory/bulletin/podzim2008/9_10.pdf] 30 (1894–1977) profesor histologie a embryologie na Karlov ě univerzit ě, zakladatel nového oboru plastické histologie [http://www.ceses.cuni.cz/IFORUM-3688.html]

46

Sv ěrací bu ňky pr ůduch ů byly vybrány pro tuto studii proto, že jsou to vždy diploidní bu ňky a nedochází u nich k endopolyploidii, která by vedla ke zv ětšení bu ňky (Barow 2003). Navíc se jedná o bu ňky, které jsou vždy pom ěrn ě lehce rozpoznatelné. Jako reprezentativní rozm ěr pr ůduch ů jsem vybrala jejich délku, protože n ěkdy rovn ěž používaná plocha pr ůduchu je více ovlivn ěna mírou otev ření pr ůduchu (Wilmer & Fricker 1996). Za délku pr ůduchu jsem vždy považovala délku jedné ze 2 sv ěracích buněk zm ěř enou rovnob ěžn ě s pr ůduchovou št ěrbinou (obr. 14.). U každého druhu bylo zm ěř eno p řibližn ě sto pr ůduch ů a poté byl z nam ěř ených hodnot vypo čítán aritmetický pr ůměr. Mírné nep řesnosti v m ěř ení délek pr ůduch ů mohly vzniknout kv ůli neostrým hranicím pr ůduchových bun ěk, p řípadn ě nedokonalým otisk ům povrchu list ů. V p řípad ě pochybností (u odlehlých hodnot) byla m ěř ení provád ěna znovu, pop ř. p ři podez ření, že jedinci použití k cytometrickým analýzám jsou atypicky vyvinuté rostliny, byla nezávislá kontrola m ěř ení provedena s využitím náhodn ě vybraného dokladu p říslušného druhu z herbá ře Ústavu botaniky a zoologie (BRNU).

Obr. 14. Zp ůsob m ěř ení délky pr ůduchu.

47

7.4. Newick formát, TreeView X a TreeGraph Newick je formát sloužící k zápisu fylogenetických strom ů včetn ě názv ů uzl ů a délek v ětví do textového souboru. Zp ůsob zápisu ve formátu Newick je vid ět na obrázku níže (obr. 15.).

0,1 Angiopteris angustifolia

0,2 Angiopteris

0,2 Angiopteris evecta

Marattiaceae 0,2 Marattia fraxinea

0,1 Marattia

0,3 Marattia laevis 0.1 Obr. 15. P říklad fylogenetického stromu vytvo řeného programem TreeView X.

Zápis stromu na obr. 15. ve formátu Newick : ((Angiopteris_angustifolia:0.1,Angiopteris_evecta:0.2)Angiopteris:0.2,(Marattia_fraxinea:0 .2,Marattia_laevis:0.3)Marattia:0.1)Marattiaceae;

Pro zobrazení fylogenetických strom ů (obr. 1., obr. 13.) v programu TreeView X byla jejich struktura vyjád řena ve formátu Newick. Tento voln ě dostupný program (lze stáhnout nap ř. zde: http://treeview-x.en.softonic.com/ ) slouží k zobrazování fylogenetických strom ů ve formátu NEXUS a Newick, vytvo řil ho Roderic Page v programovacím jazyku C++ (Page 1996). Podobné funkce má i program TreeGraph 2, který ale navíc umož ňuje znázornit graficky ve fylogenetickém stromu hodnoty r ůzných znak ů na koncových v ětvích stromu. Proto byl využit pro vytvo ření strom ů (obr. 17.) v kapitole Výsledky, kde jsou znázorn ěny velikosti genomu a velikosti pr ůduch ů jednotlivých zkoumaných druh ů. Program vytvo řili Ben Stöver a Kai Müller (Stöver & Müller 2010). Jde op ět o voln ě dostupný software, který lze stáhnout zde: http://treegraph.bioinfweb.info/ .

48

7.5. Hodnoty obsahu DNA a podílu GC Obsah DNA a genomový pom ěr bazí byly zjiš ťovány ze vzork ů živého materiálu (viz 7.1. Materiál) pomocí pr ůtokové cytometrie v letech 2007 a 2008. M ěř ení provád ěly Klára Helánová (menší část vzork ů) a Lucie Horová (v ětší část vzork ů) na pr ůtokových cytometrech Partec PA1 a Partec CyFlow SL (PARTEC GmbH) za pomoci AT- specifického fluorochromu DAPI, resp. interkalárního fluorochromu propidium iodid dvoukrokovou metodou s využitím pufr ů OTTO1 a OTTO2 (Otto 1990; Doležel & Göhde 1995). Vlastní obsah GC bazí byl vypo čítán pomocí Spreadsheetu vytvo řeného P. Šmardou (Šmarda et al. 2008)31 . Pro výpo čet byl použit tzv. DF DAPI faktor, tj. pom ěr fluorescence vzorek/standard p ři barvení DAPI ku pom ěru vzorek/standard p ři barvení propidium iodidem; parametr vazebné délky (binding length) byl nastaven na 4 nukleotidy pro AT- selektivní DAPI. Jednotlivá m ěř ení, provád ěná za pomoci standard ( Solanum lycopersicum ‘Stupické polní ty čkové rané’, Vicia faba ssp. faba var. equina ‘Inovec’, Pisum sativum ‘Ctirad’, Glycine max ‘Polanka’), byla p řed vlastním výpo čtem p řevedena jednotn ě na pom ěr ke standardu Pisum sativum ‘Ctirad’, pro n ějž byla jako výchozí hodnota pro obsah AT bazí zvolena 61,5% (Barow & Meister 2002). V p řípad ě, že bylo zm ěř eno více vzork ů stejného druhu z jiných lokalit (nap ř. Hemionitis arifolia , další druhy viz p řílohu tab. P1), byl vypo čítán aritmetický pr ůměr nam ěř ených hodnot (tj. obsahu DNA, velikosti pr ůduch ů a obsahu GC). V p řípad ě, že byli od jednoho druhu změř eni dva zástupci r ůzného stupn ě ploidie ( Cyrtomium falcatum ), byl pro další analýzy použit vzorek s nejnižším ploidním stupn ěm (tedy v tomto p řípad ě hexaploid).

7.6. Program Phylocom (p řevzato z manuálu dostupného na http://www.phylodiversity.net/phylocom/ )

Tento software slouží k fylogenetickým a ekologickým analýzám (Webb et al. 2008). Program Phylocom umož ňuje pracovat s dichotomickými i polytomickými fylogenetickými stromy a také se stromy, u kterých nejsou známy délky jednotlivých v ětví (ty jsou pak automaticky programem nastaveny na hodnotu 1). Co se tý če analyzovaných znak ů, je třeba, aby byly binárního nebo kontinuálního typu (s ordinálními znaky se zde zatím pracuje jako s kontinuálními).

31 http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/download/Festuca/ATGCFlow.xls

49

Phylocom také umož ňuje testovat fylogenetický signál daných znak ů. Fylogenetický signál ukazuje, jak siln ě se hodnota ur čitého znaku p řenáší do dalších p říbuzných taxon ů. Jestliže vyjde p ři analýze fylogenetický signál nepr ůkazný, pak to znamená, že daný znak se m ěnil nezávisle na evoluci. Pokud naopak vyjde pro jistý znak fylogenetický signál velmi silný, pak m ůže být takový znak užite čný pro fylogenetickou klasifikaci. Korelace znak ů jsou zde testovány pomocí standardizovaných fylogeneticky nezávislých kontrast ů, odstra ňujících efekt fylogenetické p říbuznosti druh ů. Blízce p říbuzné druhy mají obvykle podobné hodnoty jistého znaku (nap ř. velikost genomu apod.), tudíž nem ůžeme takové hodnoty považovat za zcela nezávislé, jak to vyžadují klasické statistické testy. Výpo čet fylogeneticky nezávislých kontrast ů zavedl jako první Felsenstein (1985; viz obr. 16.). Pro dichotomické uzly se v programu Phylocom standardizovaný kontrast daného uzlu spo čítá jako rozdíl dvou hodnot znak ů na dce řiných uzlech pod ělený druhou odmocninou celkové délky v ětví mezi dv ěma uzly. U polytomických uzl ů používá tento program metodu, kterou navrhl Pagel (1992). P ři ní jsou hodnoty dce řiných uzl ů se řazeny podle velikosti a rozd ěleny pomocí mediánu na dv ě skupiny - skupinu nižších hodnot a skupinu vyšších hodnot (pokud je po čet dce řiných uzl ů lichý, je hodnota mediánu p řiřazena ke skupin ě nižších hodnot, jestliže je medián nižší než pr ůměr všech hodnot, resp. je p řiřazena ke skupin ě vyšších hodnot, jestliže je medián vyšší než pr ůměr všech hodnot). Pro každou skupinu je pak vypo čítán harmonický pr ůměr délek v ětví a kontrasty jsou poté po čítány stejn ě jako v p řípad ě dichotomických uzl ů (Moles et al. 2005). Hodnoty znak ů na jednotlivých uzlech se přitom po čítají tzv. node-based metodou, tj. jako aritmetický pr ůměr hodnot znak ů na dce řiných uzlech.

Obr. 16. Výpo čet nezávislých kontrast ů podle Felsenstein (1985).

50

Výpo čet kontrast ů uzl ů na obr. 16. (podle Felsenstein 1985) : a) kontrast znaku 1 na uzlu A je roven 5 - 3 = 2; b) kontrast znaku 1 na uzlu B je roven 7 - 4 = 3; c) pro výpo čet kontrastu na uzlu C je t řeba nejd říve spo čítat aritmetický pr ůměr hodnot znaku 1 pro uzel A (tj. 4) a pro uzel B (tj. 5,5), odtud pak kontrast znaku 1 na uzlu C je roven 5,5 - 4 = 1,5.

Při výpo čtu fylogenetických kontrast ů program Phylocom po čítá kontrasty pro první znak tak, aby vždy vyšly kladn ě. Pro následující znaky jsou kontrasty po čítány ode čtením hodnot uzl ů ve stejném po řadí jako v případ ě prvního znaku, hodnoty kontrast ů zde proto mohou nabývat jak kladných, tak záporných hodnot. Pro správné vyhodnocení analýz je t řeba, aby kontrasty nekorelovaly s délkou v ětví (Garland et al. 1992). Pokud by se tak stalo, je možné sáhnout k transformacím znak ů nebo i délek v ětví (obvyklou transformací znak ů je nap ř. dekadický logaritmus). P řípadn ě lze ješt ě p ři analýze vypnout standardizaci kontrast ů. Dále Phylocom umož ňuje spo čítat tzv. kontribu ční index uzl ů v analyzovaném fylogenetickém strom ě. Kontribu ční index udává míru významnosti daného uzlu v evoluci zkoumaného znaku (Moles et al. 2005). Vysoký kontribu ční index zna čí, že se jedná o uzel, na kterém došlo k velkému rozr ůzn ění daného znaku. Pro výpo čet kontribu čního indexu jsou pot řebné délky v ětví. Tedy u strom ů, kde délky v ětví neznáme a Phylocom arbitrárn ě dosazuje délku rovnou 1, nemá smysl kontribu ční index po čítat.

51

52

8. Výsledky

Z již nam ěř ených hodnot 2C-value a genomického pom ěru bazí byly použity v této práci údaje pro 115 druh ů z 26 čeledí, pokrývajících tedy 70% z celkového po čtu 37 recentn ě rozlišovaných čeledí kapra ďorost ů; kompletní p řehled výsledk ů zachycují tabulky P1 - P4 v příloze. Při testování vykazuje velikost genomu silný fylogenetický signál (p < 0,001; viz tab. P4 v p říloze), to znamená, že p říbuzn ější linie se v tomto znaku vzájemn ě více podobají. Nejv ětší obsah DNA v datovém souboru má Psilotum nudum , čel. Psilotaceae (2C-value = 141,29 pg; viz tab. P1 v p říloze), nejmenší obsah pak má Pilularia globulifera , čel. Marsileaceae (2C-value = 1,73 pg; viz tab. P1 v p říloze). Hodnoty 2C-value všech zkoumaných druh ů jsou znázorn ěny na fylogenetickém strom ě (obr. 17.). P ři pohledu na fylogenetický strom vidíme, že nejv ětší genomy byly zjišt ěny u bazálních fylogenetických větví eusporangiátních kapra ďorost ů pat řících do t řídy Psilotopsida , tj. rody Psilotum, Ophioglossum a Botrychium . Naopak malé genomy vykazovala skupina heterosporických vodních kapradin řádu Salviniales . Pom ěrn ě velké genomy mají také zástupci další eusporangiátní v ětve zahrnující p řesli čky ( Equisetopsida ). U další linie vzr ůstem gigantických tropických eusporangiátních kapra ďorost ů t řídy Marattiopsida jsou genomy v rámci kapra ďorost ů relativn ě malé (10,8–18,0 pg; viz tab. P1 v p říloze). Mezi leptosporangiátními kapradinami t řídy Polypodiopsida jsou velké genomy charakteristické pro čele ď Tectariaceae (27,5–75,8 pg; viz tab. P1 v p říloze).

53

Obr. 17. Fylogenetický strom studovaných druh ů kapra ďorost ů se znázorn ěným obsahem DNA (modrá- černá) a délkou pr ůduch ů (zelená-černá); hodnoty znázorn ěny barevn ě a ší řkou koncových v ětví.

54

Nam ěř ené hodnoty genomického obsahu GC bazí nevykazují příliš velké extrémy. Nejv ětší podíl GC bazí byl naměř en u druhu Gleichenia microphylla (čel. Gleicheniaceae , GC 46,5%; viz tab. P1 v p říloze), nejmenší pak u druhu Platycerium madagascariense (čel. Polypodiaceae , GC 32,7%; viz tab. P1 v p říloze); tyto hodnoty vycházejí z GC obsahu referen ční standardy ( Pisum sativum ), jejíž GC obsah byl vypo čten z porovnání s lidskými lymfocyty na hodnotu 38,5% (Barow & Meister 2002). Vzhledem k tomu, že některé nam ěř ené hodnoty jsou pom ěrn ě odlehlé, bylo by vhodné m ěř ení t ěchto extrémních druh ů v budoucnu ješt ě zopakovat. Programem Phylocom byl také v p řípad ě GC obsahu zjišt ěn silný fylogenetický signál (p < 0,002; viz tab. P4 v p říloze). Celkem bylo p ři analýzách v této studii zm ěř eno 12 719 sv ěracích bun ěk. Velikost pr ůduch ů měla fylogenetický signál menší než zbylé dva zkoumané znaky (p < 0,012; viz tab. P4 v p říloze). Mezi všemi analyzovanými druhy má nejdelší pr ůduchy Fadyenia prolifera z čeledi Tectariaceae (pr ůměrná délka sv ěrací bu ňky 83,15 m; viz tab. P1 v příloze), nejmenší pr ůduchy jsem nam ěř ila u druhu Marsilea drummondii z čeledi Marsileaceae (pr ůměrná délka sv ěrací bu ňky 15,27 m; viz tab. P1 v p říloze). Ve fylogenetickém strom ě (obr. 17.) vidíme, že velké pr ůduchy mají zástupci bazálních tříd Psilotopsida (41,62–77,82 m; viz tab. P1 v p říloze) a Equisetopsida (46,37–50,54 m; viz tab. P1 v p říloze), dále pak n ěkolik rod ů čeledi Pteridaceae (konkrétn ě rody Cheilanthes 61,84 m, Gymnopteris 48,92 m a Hemionitis 60,23 m; viz tab. P1 v p říloze) a n ěkteré druhy rodu Blechnum (B. occidentale 62,34 m, B. penna-marina 61,03 m, B. spicant 50,38 m a B. tabulare 51,53 m; viz tab. P1 v p říloze) z čeledi Blechnaceae . V čeledi Polypodiaceae nacházíme velké pr ůduchy u rodu Microsorum (56,84–57,79 m; viz tab. P1 v p říloze). Naopak malé pr ůduchy mají zástupci vodních kapradin z řádu Salviniales (15,27–33,08 m; viz tab. P1 v p říloze) a dále zástupci rodu Diplazium (27,24–37,81 m; viz tab. P1 v p říloze) z čeledi Woodsiaceae . Programem Phylocom byly analyzovány vzájemné vztahy mezi t řemi zkoumanými znaky – obsah DNA, podíl GC bazí a velikost pr ůduch ů. Byla zjišt ěna pozitivní korelace mezi obsahem DNA a velikostí pr ůduch ů (obr. 18. b, e; tab. 4.). Mezi obsahem DNA a obsahem GC bazí, ani mezi velikostí pr ůduch ů a obsahem GC bazí nebyla žádná signifikantní korelace nalezena (obr. 18. a, c, d, f; tab. 4.). U čty ř čeledí s nejv ětším po čtem zkoumaných druh ů ( Blechnaceae - 12 druh ů, Dryopteridaceae - 16 druh ů, Polypodiaceae - 14 druh ů, Pteridaceae - 14 druh ů) byl neparametrickým testem prov ěř ován p řípadný vztah mezi velikostí genomu a genomickým obsahem bazí. Ve všech t ěchto p řípadech byl trend

55

negativní, tj. druhy s v ětšími genomy m ěly mén ě GC bazí, v žádném z p řípad ů však nebyl tento vztah statisticky signifikantní.

Obr. 18. Bodové grafy znázor ňující regresi standardizovaných fylogeneticky nezávislých kontrast ů pro zkoumané znaky, regresní p římka je vedena p řes po čátek (a–c); bodové grafy znázor ňující regresi zkoumaných znak ů bez použití fylogenetické korekce (d–f); log2C = dekadický logaritmus obsahu DNA v pg, GC = podíl GC bazí v %, logStom = dekadický logaritmus délky pr ůduch ů v m. Statistická pr ůkaznost korelací viz tabulku 4.

56

Tab. 4. Výsledky korelace mezi zkoumanými parametry (obsah DNA - 2C-value, podíl GC bazí a délka pr ůduch ů); *regrese bez fylogenetické korekce, ** regrese standardizovaných fylogeneticky nezávislých kontrast ů p řes po čátek.

regrese* nezávislé kontrasty** R2 p síla testu p síla testu

2C-value (pg, log) vs. 0,3055 <0,000001 1,0000 0,000007 0,9979 délka pr ůduch ů ( m, log)

2C-value (pg, log) vs. 0,0262 0,082630 0,4116 0,319286 0,1672 podíl GC bazí (%)

podíl GC bazí (%) vs. 0,0014 0,687363 0,0685 0,375344 0,1421 délka pr ůduch ů ( m, log)

57

58

9. Diskuze

Variabilita obsahu DNA u kapra ďorost ů nam ěř ená v rámci této studie koresponduje dob ře s daty uvád ěnými pro kapra ďorosty v rámci databáze v Kew (Bennett & Leitch 2010). Nov ě byly velikosti genomu v této studii (cytometrické analýzy provád ěny L. Horovou a K. Helánovou) zjišt ěny pro čeledi Anemiaceae, Blechnaceae, Gleicheniaceae, Lindsaeaceae, Onocleaceae, Salviniaceae, Tectariaceae, Thelypteridaceae . Ve srovnání s dosavadními znalostmi o velikostech genomu u kapra ďorost ů (67 druh ů; Bennett & Leitch 2010) zahrnuje nov ě nam ěř ený soubor data pro 99 druh ů, u nichž dosud velikost genomu nebyla známa. Celkový fylogenetický pattern variability velikosti genomu u kapra ďorost ů se však na základ ě p řidání nových dat už p říliš nem ění, zejména extrémní postavení bazální linie (tř. Psilotopsida ) s nejv ětšími genomy a linie vodních kapradin (řád Salviniales ) s genomy nejmenšími z ůstává zachováno; nicmén ě dopln ění nových dat umož ňuje objektivizovat lépe diverzitu velikosti genomu v rámci v ětšiny ostatních čeledí (obr. 17.). V rámci leptosporangiátních izosporických kapradin ( Polypodiopsida ) je pom ěrn ě nápadná svou velikostí genomu čele ď Tectariaceae , kde však v rámci rodu Tectaria je nápadn ě menší druh T. zeylanica , což by mohlo podporovat jeho vy člen ění do samostatného rodu Quercifilix . Při posuzování evoluce velikosti genomu, tzn. zjiš ťování obsahu DNA metodou pr ůtokové cytometrie a následné analýze výsledk ů pomocí programu Phylocom, m ůže být tato analýza zatížena ur čitou chybou spo čívající v tom, že bohužel nejsme schopni od sebe odlišovat neopolyploidii a paleopolyploidii. U kapra ďorost ů je p řitom známa řada p řípad ů, kde vnitrodruhová ploidní variabilita (tj. pravd ěpodobn ě neopolyploidního typu) m ůže být pom ěrn ě častá, nap ř. u druhu Psilotum nudum jsou známy t ři ploidní úrovn ě (2n = 104, 156, 208; Soltis & Soltis 1988) nebo u druhu Asplenium trichomanes jsou rovn ěž t ři ploidní úrovn ě (2n = 72, 144, 216; Ekrt 2008); řadu dalších p řípad ů najdeme v databázi chromosomových po čtů rostlin (Goldblatt & Johnson 2010). V mnoha p řípadech m ůže příčinou této vnitrodruhové variability být mezidruhová hybridizace, která podmi ňuje následnou (allo)polyploidizaci, jak je to dokumentováno nap ř. v rámci Polypodium vulgare agg. nebo Dryopteris affinis agg. (Bureš et al. 2003, Ekrt et al. 2009). Eliminovat tento problém by bylo možné použitím monoploidní velikosti genomu (Cx-value) ve fylogenetické analýze na místo prostého obsahu DNA (2C-value, pop ř. 1C-value). To by však vyžadovalo bu ď cytometrická m ěř ení relativn ě velkých reprezentativních (geograficky, morfologicky, ekologicky, ...) souborů jedinc ů téhož druhu a konfrontaci

59

výsledk ů se známou ploidní variabilitou; druhou ješt ě spolehliv ější cestou by bylo v každém cytometricky analyzovaném vzorku spo čítat také chromosomy, nap ř. klasickou roztlakovou metodou, jak tomu bylo v pilotní studii o genomové velikosti kapra ďorost ů (Obermeyer et al. 2002). Vzhledem ke zna čné náro čnosti a omezené dostupnosti materiálu nebylo bohužel možné žádný z t ěchto dvou krok ů v cytometrických analýzách předcházejících bakalá řské práci realizovat. P řesto i p ři minimálním opakování m ěř ení s různými jedinci téhož druhu byla zjišt ěna p řítomnost r ůzných ploidních úrovní v rámci Psilotum nudum nebo Cyrtomium falcatum , což jen podtrhuje výše uvedenou skute čnost. Z důvod ů časté vnitrodruhové ploidní variability bylo nakonec upušt ěno od plánované excerpce dat o po čtech chromosom ů pro jednotlivé studované druhy z databáze Index to Plant Chromosome Numbers (Goldblatt & Johnson 2010), které m ěly umožnit bu ď stanovení monoploidní velikosti genomu, nebo případn ě pr ůměrné velikosti chromosom ů. Přesto lze i na základ ě relativn ě kusých údaj ů o po čtech chromosom ů tam, kde je to spolehlivé, konstatovat, že i variabilita pr ůměrné velikosti chromosom ů bude u kapra ďorost ů dosti velká, nap ř. v čeledi Osmundaceae u druhu Todea barbara je pom ěrn ě spolehliv ě vícekrát doložen chromosomový po čet 2n = 44 (Goldblatt & Johnson 2010). Když tímto po čtem pod ělíme obsah jaderné DNA (v Mbp) získáme pr ůměrnou velikost chromosomu u tohoto druhu v hodnot ě 882,4 Mbp (p ři p řepo čtu 1 pg = 978 Mbp; Doležel et al. 2003). Tato velikost bude z řejm ě v tuto chvíli nejv ětší známou velikostí chromosom ů u kapra ďorost ů. K relativn ě vysokým hodnotám bychom analogickou cestou dosp ěli také u druhého zástupce této čeledi Osmunda regalis (2n = 44; Golgblatt & Johnson 2010), kde by pr ůměrná velikost chromosomu činila 651,3 Mbp. Opa čný extrém, tj. nejmenší chromosomy v rámci kapradin, bychom m ěli hledat v rodu Azolla , kde se jejich pr ůměrná velikost pohybuje kolem 30 Mbp (viz Obermayer et al. 2002, Bennett & Leitch 2010). Rozsah velikosti chromosom ů kapradin je tedy 29,4násobný. Z dosavadních znalostí o po čtu chromosom ů a velikosti genomu u krytosemenných m ůžeme zjistit, že největší chromosomy jsou u druhu Trillium grandiflorum z čeledi Melanthiaceae (2n = 10, pr ůmětná velikost chromosomu je 8897,6 Mbp, Bennett & Leitch 2010) a nejmenší chromosomy u druhu Carex nubigera z čeledi Cyperaceae (2n = 112, pr ůměrná velikost chromosomu je 2,6 Mbp, Bennett & Leitch 2010). Rozsah velikosti chromosom ů je tedy u krytosemenných podstatn ě v ětší než u kapra ďorost ů (3500 vs. 29,4násobný). V kapitole 2.3. je zmín ěn pozitivní vztah mezi velikostí genomu a po čtem chromosom ů u kapra ďorost ů (obr. 4.) na základ ě hodnot v Plant DNA C-value databázi (Bennett & Leitch 2010). Po p řidání dat o velikosti genomu n ěkterých druh ů použitých v této studii

60

dopln ěných o po čty chromosom ů podle IPCN (Goldblatt & Johnson 2010; vybrány pouze druhy s jednozna čným po čtem chromosom ů) se graf tohoto vztahu nezm ění, čímž se potvrzuje, že výše zmín ěná pozitivní korelace mezi po čtem chromosom ů a obsahem DNA u kapra ďorost ů (viz obr. 19.) je p řítomna i p ři reprezentativn ějším pokrytí diverzity této skupiny; fylogenetické analýzy tohoto vztahu jsou plánovány v rámci diplomové práce.

160

140

120

100

80

60

40

velikostgenomu (2C, pg) y = 0,1331x + 8,4097 R2 = 0,5818 20

0 0 200 400 600 800 1000 1200 po čet chromosom ů (2n)

Obr. 19. Vztah mezi polyploidií a obsahem DNA u kapra ďorost ů (podle dat Bennett & Leitch 2010; dopln ěno daty z této bakalá řské práce, po čty chromosom ů získány z IPCN - Goldblatt & Johnson 2010) ukazující silnou vazbu mezi ob ěma parametry (Spearmanovým testem vyšlo R = 0,398088, p = 0,000147; bez fylogenetické korekce).

Srovnáme-li velikosti pr ůduch ů u kapra ďorost ů s velikostmi pr ůduch ů u krytosemenných rostlin (obr. 20.), vidíme, že pr ůduchy kapra ďorost ů jsou v ětší než u krytosemenných. Tento rozdíl dob ře odráží skute čnost, že se tyto skupiny výrazn ě liší také ve velikosti genomu (obr. 10.). U mechorost ů, kde se pr ůduchy vyskytují pouze u mech ů a hlevík ů, a to jen na sporofytu, nejsou souhrnná data o variabilit ě velikosti pr ůduch ů k dispozici, nicmén ě n ěkteré práce, nap ř. Egunyomi (1982) nazna čují, že pr ůduchy u t ěchto rostlin jsou pom ěrn ě malé (22–51 m), což by mohlo být rovn ěž podmín ěno skute čností, že mechorosty obecn ě mají obsah DNA pom ěrn ě nízký (obr. 10.). Velmi zajímavé je, že pr ůduchy ryniofyt ů, zjišt ěné na fosilních dokladech (Edwards et al. 1998), byly pom ěrn ě velkých až gigantických rozm ěrů, a to dokonce i ve srovnání s velikostmi, které známe u recentních kapra ďorost ů nebo krytosemenných rostlin. Edwards et al. (1998) uvádí délky pr ůduch ů u Horneophyton lignieri v rozsahu 120–180 m, u Aglaophyton major 120–140

61

m, u Rhynia gwynne-vaughanii 90–100 m a u Nothia aphylla 75–105 m. Tyto hodnoty by mohly nazna čovat, že primitivní terestrické rostliny m ěly velké genomy, dokonce možná ješt ě v ětší než ty, které známe u recentních semenných rostlin a kapra ďorost ů. Tato dedukce však pon ěkud kontrastuje s tím, že řasy a bazální linie vyšších rostlin - mechorosty - mají podle dosavadních znalostí genomy velmi malé (obr. 10.). Pokud jde o fylogenetický signál velikosti pr ůduch ů, který u kapra ďorost ů vyšel menší než v p řípad ě genomických parametr ů, je z řejmé, že velikost pr ůduch ů je ovlivn ěna nejen evolucí, ale i jinými biologickými a ekologickými parametry, jako je např. teplota, vlhkost, intenzita zastín ění, či zp ůsob života (Hetherington & Woodward 2003, Hodgson et al. 2010).

Obr. 20. Krabicový graf znázor ňující rozdíl ve velikosti pr ůduch ů u kapra ďorost ů a krytosemenných rostlin (Mann-Whitney test, p < 0,0000000003; data pro krytosemenné rostliny použita z Beaulieu et al. 2008).

Zjišt ěný pozitivní vztah mezi obsahem DNA a velikostí pr ůduch ů odpovídá o čekávání vycházejícího z existence obdobné korelace u krytosemenných rostlin (Beaulieu et. al 2008, Hodgson et al. 2010). Nicmén ě kapra ďorosty s relativn ě v ětšími genomy než v ětšina krytosemenných rostlin by mohly vykazovat odlišný sklon závislosti. Porovnáme-li ve

62

stejném m ěř ítku výsledky analýz publikované v práci Beaulieu et al. (2008) pro krytosemenné rostliny s analýzou pro kapra ďorosty, vidíme, že trend (sm ěrnice p římky) je relativn ě velmi podobný (obr. 21.).

2

1,9

1,8

1,7 m)

1,6

1,5

1,4 log Stomata ( Stomata log 1,3

1,2

1,1

1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 log 2C-value (pg)

Obr. 21. Kombinace grafu publikovaného v Beaulieu et al. (2008) pro krytosemenné rostliny ( černé puntíky, černá p římka y = 0,1953x + 1,3889: 101 druh ů reprezentativn ě pokrývajících fylogenezi krytosemenných) s grafem pro kapra ďorosty ( červené puntíky, hn ědá p římka y = 0,2069x + 1,3257: 115 druh ů reprezentativn ě pokrývajících fylogenezi kapra ďorost ů) v identickém m ěř ítku os a identické transformaci dat. Test 32 rovnob ěžnosti dvou regresních p římek : t = –0,35 a kritický obor je ( −∞− 97,1; ∪ ;97,1 ∞ ), tzn. hypotézu o rovnob ěžnosti nezamítáme na hladin ě významnosti 0,05 (tj. s pravd ěpodobností aspo ň 95% nejsou p římky různob ěžné).

Ve výjime čných p řípadech nebyly do analýzy zahrnuty druhy, u nichž jsou pr ůduchy zano řené ( Pyrrosia lanceolata, Pyrrosia longifolia ; viz kapitola 3.). Oproti studii u krytosemenných (Beaulieu et al. 2008) je relativní výhodou prezentované analýzy vztahu velikosti genomu a pr ůduch ů u kapra ďorost ů to, že velikost pr ůduch ů byla m ěř ena p římo z rostlin, které byly podrobeny cytometrické analýze; zejména s ohledem na výše zmín ěnou

32 Lze nalézt nap ř. zde: http://www.finman.gzk.cz/Files/AS/AS_mat_CZU_6_kapitola.pdf

63

častou vnitrodruhovou ploidní variabilitu. Celkem zajímavé v grafu znázor ňujícím zmín ěnou korelaci je, že se velmi jasn ě vy čle ňují druhy vodních kapradin a vytvá ří samostatný shluk (obr. 22.). Je tedy vid ět, že druhy řádu Salviniales se opravdu vyzna čují velmi malými genomy i malými pr ůduchy, jak již bylo řečeno v předchozí kapitole 8. Výsledky. Toto zjišt ění dob ře odpovídá i nukleotypové teorii, která považuje za primární kriterium pro velikost genomu rychlost bun ěč ného d ělení (viz kap. 4.), nebo ť vodní kapradiny mají velmi krátký životní cyklus.

Obr. 22. Bodový graf znázor ňující vztah mezi velikostí genomu v pg (transformováno logaritmicky, osa x) a délky pr ůduch ů v m (transformováno logaritmicky, osa y). Větší velikostí a tmavší barvou je zvýrazn ěna skupina vodních kapradin z řádu Salviniales , které se viditeln ě vy čle ňují ze shluku ostatních zkoumaných druh ů.

Vysoký fylogenetický signál genomického obsahu GC bazí ukazuje, že tento parametr může p ředstavovat znak využitelný p ři studiu fylogeneze i p ři klasifikaci obecn ě. Fylogenetický význam tohoto znaku byl již d říve prokázán u n ěkterých skupin krytosemenných (Šmarda et al. 2008). Pro výpo čet obsahu bází byla zvolena publikovaná hodnota referen čního standardu Pisum sativum 38,5% GC (Barow & Meister 2002).

64

Vzhledem k tomu, že by se v budoucnu mohl tento obsah ukázat jako ne zcela p řesný, jsou v p řiložených datech (tab. P2 v p říloze) uvedeny p římo hodnoty tzv. DAPI faktoru (relativní fluorescence vzorek/standard p ři barvení DAPI/relativní fluorescence vzorek/standard p ři barvení propidium iodidem); p řípadný p řepo čet na základ ě korigované hodnoty standardu Pisum sativum lze potom v budoucnu snadno provést; výsledky analýz korelací a ostatních test ů prezentovaných v této práci by se takovou úpravou nijak nezm ěnily. Absence vztahu mezi GC obsahem a velikostí genomu nap říč všemi kapra ďorosty není příliš p řekvapivá, protože ani u semenných rostlin nebyl takový vztah prokázán (Barow & Meister 2002). Na této skute čnosti nic nem ění ani fakt, že oba parametry mají silný fylogenetický signál, tj. že se m ění v pr ůběhu fylogeneze kapra ďorost ů, avšak tato zm ěna se ned ěje souhlasným zp ůsobem (Šmarda in litt.). Pon ěkud p řekvapivá je ale absence korelace uvnit ř nejreprezentativn ěji zastoupených čeledí ( Blechnaceae, Dryopteridaceae, Polypodiaceae, Pteridaceae ), resp. její nikoli signifikantní (s výjimkou čel. Dryopteridaceae ), p řesto ve všech čty řech p řípadech shodný negativní trend (viz tab. 5.), což kontrastuje s pozitivní korelací ob čas doloženou v rámci rod ů nebo čeledí krytosemenných rostlin, kde je potenciální p říčinou dynamika transpozon ů (Bureš et al. 2007, Šmarda et al. 2008). Na druhé stran ě u velkých genom ů m ůže být korelace mezi GC obsahem a velikostí genomu negativní, jak nazna čují n ěkterá dosud nepublikovaná data u rodu Fritillaria (Bureš in litt.) nebo u geofyt ů s velkými genomy obecn ě (Veselý in litt.). Role transpozon ů v evoluci kapradin se sice zdá být pon ěkud jiná než u krytosemenných (Nakazato et al. 2008; viz kapitola 2.3.), avšak považovat ji za p říčinu absence korelace GC obsahu a velikosti genomu v rámci rod ů nebo čeledí by bylo spekulativní a p řed časné.

Tab. 5. Výsledky neparametrických test ů korelace mezi obsahem DNA a podílem GC bazí uvnit ř nejreprezentativn ěji zastoupených čeledí v rámci této studie (použity údaje pro druhy se známou velikostí genomu a podílem GC bazí, viz Tab. P1 v p říloze).

Spearman Rho p

Blechnaceae -0,211273 0,509797 Dryopteridaceae -0,556851 0,031068 Polypodiaceae -0,239286 0,390379 Pteridaceae -0,410714 0,128329

65

Vzhledem k tomu, že hlavním faktorem ovliv ňujícím velikost genomu je u kapradin převážn ě polyploidie, která je u nich velmi častá, nelze o čekávat, že by kombinace velikosti genomu s obsahem GC bazí mohly představovat významný taxonomický znak pro odlišení příbuzenských skupin (rod ů, čeledí, apod.). P řesto v n ěkterých p řípadech mají tyto příbuzenské skupiny tendenci shlukovat se v rámci prostoru vymezeného t ěmito parametry (viz obr. 23.); jedná se o rody Blechnum , Diplazium a čeledi Aspleniaceae a Salviniaceae .

Obr. 23. Bodový graf znázor ňující hodnoty velikosti genomu (pg) a podílu GC bazí (%) v rámci studovaných druh ů (navíc za řazeny druhy, které nebyly analyzovány na velikost pr ůduch ů); barevn ě zvýrazn ěny jsou některé p říbuzenské linie (rody, čeledi), u nichž kombinace t ěchto dvou parametr ů vytvá ří shluky.

66

10. Literatura

AASAMAA K., SOBER A. & RAHI M. (2001). Leaf anatomical characteristics associated with shoot hydraulic conductance, stomatal conductance and stomatal sensitivity to changes of leaf water status in temperate deciduous trees. Australian Journal of Plant Physiology 28: 765–774.

THE ANGIOSPERM PHYLOGENY GROUP (2009). An update of the Angiosperm Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III. Botanical Journal of the Linnean Society 161: 105–121

BAETCKE K. P., SPARROW A. H., NAUMANN C. H. & SCHWEMME S. S. (1967). The relationship of DNA content to nuclear and chromosome volumes and to radiosensitivity (LD50). Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 58: 533–540.

BAROW M. & MEISTER A. (2002): Lack of correlation between AT frequency and genome size in higher plants and the effect of nonrandomness of base sequences on dye binding. Cytometry 47: 1–7.

BAROW M. (2003). Beziehungen zwischen Genomgröße, Basenzusammensetzung und Endopolyploidie bei Samenpflanzen . PhD. thesis, Mathematisch-Naturwissenschaftlich- Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg. [non vid.][http://sundoc.bibliothek.uni-halle.de/diss-online/03/03H141/]

BARRINGTON D. S., PARIS C. A. & RANKER T. A. (1986). Systematic inferences from spore and stomate size in the ferns. American Fern Journal 76: 149–159.

BARRINGTON D. S. (1993). Ecological and historical factors in fern biogeography . Journal of Biogeography 20: 275–279.

BEAULIEU J. M., LEITCH I. J., PATEL S., PENDHARKAR A. & KNIGHT C. A. (2008). Genome size is a strong predictor of cell size and stomatal density in angiosperms. New Phytologist 179: 975–986.

BENNETT M. D. (1972). Nuclear DNA content and minimum generation time in herbaceous plants. Proceedings of the Royal Society of London , Series B, 181: 109–135.

BENNETT M. D. & LEITCH I. J. (2001). Nuclear DNA amounts in Pteridophytes . Annals of Botany 87: 335–345.

67

BENNETT M. D. & LEITCH I. J. (2010). Plant DNA C-values database (release 5.0, Dec. 2010) [http://www.kew.org/cvalues/]

rd BRIGGS D. & WALTERS S. M. (1997). Plant Variation and Evolution (3 ed.). Cambridge, University Press.

BRODRIBB T. J., MCADAM S. A. M., JORDAN G. J. & FEILD T. S. (2009). Evolution of

stomatal responsiveness to CO 2 and optimization of water-use efficiency among land plants. New Phytologist 183: 839–847.

BUREŠ P., TICHÝ L., WANG Y.-F. & BARTOŠ J. (2003). Occurrence of Polypodium ×mantoniae and new localities for P. interjectum in the Czech Republic confirmed using flow cytometry. Preslia 75: 293–310.

BUREŠ P., ŠMARDA P., HRALOVÁ I., FUENTES -SORIANO S., LYSÁK M., ŘEPKA R., HELÁNOVÁ

K., ROTREKLOVÁ O., PROCHÁZKOVÁ J., ÚRADNÍ ČEK L. & KŮROVÁ J. (2007). Correlation between GC content and genome size in plants. Cytometry 71A: 764.

BUSCALIONI L. & POLLACI G. (1902). L’applicazione delle pellicole di collodio allo studio di alcuni processi fisiologici nelle piante ed in particolar modo alla transpirazione. Atti dell'Instituto botanico della Universita di Pavia 2: 83–95, 127–170. [non vid.]

CAVALIER -SMITH T. (2005). Economy, speed and size satter: evolutionary forces driving nuclear genome miniaturization and expansion. Annals of Botany 95: 147–175.

COLLINSON M. E. (1996). “What use are fossil ferns?” – 20 years on: with a review of the fossil history of extant pteridophyte families and genera. In: Camus J. M., Gibby M. & Johns R. J. (eds.), Pteridology in perspective . Royal Botanic Gardens, Kew, pp. 349– 394.

COLLINSON M. E. (2001). Cainozoic ferns and their distribution. Brittonia 53: 173–235.

COMMONER B. (1964). Roles of deoxyribonucleic acid in inheritance. Nature 202: 960–968.

VAN COTTHEM W. (1970). Comparative morphological study of the stomata in the Filicopsida. Bulletin du Jardin botanique national de Belgique/ Bulletin van de Nationale Plantentuin van België 40: 81–151 + figure plates 1–88.

CRANFILL R. B. & KATO M. (2003). Phylogenetics, biogeography and classification of the woodwardioid ferns ( Blechnaceae ). In: Chandra S. & Srivastava M. (eds.), Pteridology in the new millennium . Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 25–48.

68

ČVAN ČARA A. (1988a). Blechnaceae Copel. - žebrovicovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 278–280.

ČVAN ČARA A. (1988b). Polypodiaceae Bercht. et J. Presl - osladi čovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 280– 282.

DERELLE E., FERRAZ C., COOKE R., VAN DE PEER Y., ROMBAUTS S., DELSENY M., PICARD

A., DEMAILLE J. & MOREAU H. (2004). Whole genome sequencing of Ostreococcus tauri : the smallest free-living photosynthetic eukaryote. In: Plant and Animal Genomes XII Conference , January 10 –14, 2004, San Diego. [http://www.intl- pag.org/12/abstracts/P01_PAG12_63.html]

DINES T. D. (2002). A new hybrid horsetail, Equisetum arvense × E. telmateia ( E. × robertsii ) in Britain. Watsonia 24: 145–157.

DOLEŽEL J. & GÖHDE W. (1995). Sex determination in dioecious plants Melandrium album and M. rubrum using high-resolution flow cytometry. Cytometry 19: 103–106.

DOLEŽEL J., BARTOŠ J., VOGLMAYR H. & GREILHUBER J. (2003). Nuclear DNA content and genome size of trout and human. Cytometry 51: 127–128.

DOMIN K. (1929). Pteridophyta . Česká akademie v ěd a um ění, Praha.

DVO ŘÁKOVÁ M. (1988). Hypolepidaceae Pichi-Sermolli - hasivkovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 235– 236.

EDWARDS D., KERP H. & HASS H. (1998). Stomata in early land plants: an anatomical and ecophysiological approach. Journal of Experimental Botany 49: 255–278.

EGUYNYOMI A. (1982). On the stomata of some tropical African mosses. Lindbergia 8: 121–124.

EKRT L. (2008). Rozší ření a problematika taxon ů skupiny Asplenium trichomanes v České republice. Zprávy České botanické spole čnosti 43: 17–65.

EKRT L., TRÁVNÍ ČEK P., JAROLÍMOVÁ V., VÍT P. & URFUS T. (2009). Genome size and morphology of the Dryopteris affinis group in Central Europe. Preslia 81: 261–280.

EVANS G. M., REES H., SNELL C. L. & SUN S. (1972). The relationship between nuclear DNA amount and the duration of the mitotic cycle . Chromosomes Today 3: 24–31.

69

FELSENSTEIN J. (1985). Phylogenies and the comparative method. The American Naturalist 125: 1–15.

FRANKS P. J. & BEERLING D. J. (2009). Maximum leaf conductance driven by CO2 effects on stomatal size and density over geologic time. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 106: 10343–10347.

GARLAND T. J., HARVEY P. H. & IVES A. R. (1992). Procedures for the analysis of comparative data using phylogenetically independent contrasts . Systematic Biology 41: 18–32.

GASTONY G. J. & GOTTLIEB L. D. (1982). Evidence for genetic heterozygosity in a homosporous fern. American Journal of Botany 69: 634–637.

GASTONY G. J. & GOTTLIEB L. D. (1985). Genetic variation in the homosporous fern Pellaea andromedifolia . American Journal of Botany 72: 257–267.

GASTONY G. J. & JOHNSON W. P. (2001). Phylogenetic placements of Loxoscaphe thecifera (Aspleniaceae ) and Actiniopteris radiata (Pteridaceae ) based on analysis of rbc L nucleotide sequences. American Fern Journal 91: 197–213.

GOLDBLATT P. & JOHNSON D. E. eds. (2010). Index to Plant Chromosome Numbers 1979- 2003. Missouri Botanical Garden, St. Louis. [http://mobot.mobot.org/W3T/Search/ipcn. html]

GREILHUBER J., BORSCH T., MÜLLER K., WORBERG A., POREMBSKI S. & BARTHLOTT W. (2006). Smallest angiosperm genomes found in Lentibulariaceae with chromosomes of bacterial size. Plant Biology 8: 770–777.

GREILHUBER J., TEMSCH E. M. & LOUREIRO J. C. M. (2007). Nuclear DNA content measurement . In: Doležel J., Greilhuber J. & Suda J. (eds.), Flow cytometry with plant cells . Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 67–101.

HARDIE D. C. & HEBERT P. D. (2003). The nucleotypic effects of cellular DNA content in cartilaginous and ray-finned fishes . Genome 46: 683–706.

HASEBE M., WOLF P. G., PRYER K. M., UEDA K., ITO M., SANO R., GASTONY G. J.,

YOKOYAMA J., MANHART J. R., MURAKAMI N., CRANE E. H., HAUFLER C. H. & HAUK W. D. (1995). Fern phylogeny based on rbcL nucleotide sequences. American Fern Journal 85: 134–181.

70

HASSLER M. & SWALE B. (2001). Checklist of world ferns. (Last updated 7. Oct. 2001) [http://homepages.caverock.net.nz/~bj/fern/list.htm]

HAUFLER C. H. (1987). Electrophoresis is modifying our concepts of evolution in homosporous pteridophytes. American Journal of Botany 74: 953–966.

HAUKE R. L. (1957). The stomatal apparatus of Equisetum . Bulletin of the Torrey Botanical Club 84: 178–181.

HEATH O. V. S. & RUSSELL J. (1954). Studies in stomatal behaviour, VI. An investigation of the light responses of wheat stomata with the attempted elimination of control by the mesophyll. Journal of Experimental Botany 5: 1–15.

VAN DEN HEEDE C. J., VIANE R. L. L. & CHASE M. W. (2003). Phylogenetic analysis of Asplenium subgenus Ceterach (Pteridophyta : Aspleniaceae ) based on plastid and nuclear ribosomal ITS DNA sequences. American Journal of Botany 90: 481–493.

HETHERINGTON A. M. & WOOWARD F. I. (2003). The role of stomata in sensing and driving enviromental change . Nature 424: 901–908.

HILDEBRAND F. (1866). Über die Entwicklung der Farnkrautspaltöffnungen. Botanische Zeitung 24: 245–251. [non vid.]

HILL C. R. & CAMUS J. M. (1986). Evolutionary cladistics of marattialean ferns. Bulletin of the British Museum (Natural History), Botany 14 : 219–300.

HODGSON J. G., SHARAFI M., JALILI A., DÍAZ S., MONTSERRAT -MARTÍ G., PALMER C.,

CERABOLINI B., PIERCE S., HAMZEHEE B., ASRI Y., JAMZAD Z., WILSON P., RAVEN J. A.,

BAND S. R., BASCONELO S., BOGARD A., CARTER G., CHARLES M., CASTRO -DÍEZ P.,

CORNELISSEN J. H. C., FUNES G., JONES G., KHOSHNEVIS M., PÉREZ -HARGUINDEGUY N.,

PÉREZ -RONTOMÉ M. C., SHIRVANY F. A., VENDRAMINI F., YAZDANI S., ABBAS -AZIMI R.,

BOUSTANI S., DEHGHAN M., GUERRERO -CAMPO J., HYND A., KOWSARY E., KAZEMI -

SAEED F., SIAVASH B., VILLAR -SALVADOR P., CRAIGIE R., NAQINEZHAD A., ROMO -DÍEZ

A., DE TORRES ESPUNY L. & SIMMONS E. (2010). Stomatal vs. genome size in angiosperms: the somatic tail wagging the genomic dog? Annals of Botany 105: 573– 584.

HORNER H. A. & MACGREGOR H. C. (1983). C value and cell volume: their significance in the evolution and development of amphibians . Journal of Cell Science 63: 135–146.

71

HOVENKAMP P. (1986). A monograph of the fern genus Pyrrosia ( Polypodiaceae ). Leiden Botanical Series 9: 1–280.

HROUDA L. (1988): Equisetales - p řesli čkotvaré. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 205–223.

CHRTEK J. (1988). Aspidiaceae Frank - kapra ďovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 262–278.

CHRTEK J. & SLAVÍK B. (1988). Athyriaceae Ching - papratkovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 253–262.

CHRTKOVÁ A. (1988). Ophioglossales - hadilkotvaré. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 223–228.

KENRICK P. & CRANE P. R. (1997). The origin and early diversification of land plants: a cladistic study . Smithsonian Press, Washington D.C.

KHANDELWAL S. (1990). Chromosome evolution in the genus Ophioglossum L. Botanical Journal of the Linnean Society 102: 205–217.

KLEKOWSKI E. J., JR. & BAKER H. G. (1966). Evolutionary significance of polyploidy in the Pteridophyta . Science 153: 305–307.

KONDO T. (1962). A contribution to the study of the fern stomata. Research Bulletin of the Faculty of Education of Shizuoka University 13: 239–267.

KOOPMAN W. J. M. (2002). Zooming in on the lettuce genome: species relationships in Lactuca s.l., inferred from chromosomal and molecular characters. Ph.D. thesis, Wageningen University, Wageningen. [non vid.]

KORALL P., PRYER K. M., METZGAR J. S., SCHNEIDER H. & CONANT D. S. (2006). Tree ferns: monophyletic groups and their relationships as revealed by four protein-coding plastid loci. Molecular Phylogenetics and Evolution 39: 830–845.

KOVANDA M. (1988). Cryptogrammaceae Pichi-Sermolli - jino řadcovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 232– 233.

KRAMER K. U. & GREEN P. S. (1990). The families and genera of vascular plants. Vol. 1: Pteridophytes and Gymnosperms. Springer-Verlag, Berlin.

72

KŘÍSA B. (1988a): Marsileales - marsilkotvaré. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 282–284.

KŘÍSA B. (1988b): Salviniales - nepukalkotvaré. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1. Academia, Praha, pp. 284–285.

LEITCH I. J., SOLTIS D. E., SOLTIS P. S. & BENNETT M. D. (2005). Evolution of DNA amounts across land plants ( Embryophyta ). Annals of Botany 95: 207–217.

LONG F. & CLEMENTS F. E. (1934). The method of collodion films for stomata. American Journal of Botany 21: 7–17.

MOLES A. T., ACKERLY D. D., WEBB C. O., TWEDDLE J. C., DICKIE J. B. & WESTOBY M. (2005). A brief history of seed size. Science 307: 576–580.

MARIE D. & BROWN S. C. (1993). A cytometric exercise in plant DNA histograms, with 2C values for 70 species. Biology of the Cell 78: 41–51.

MCGRATH J. M., HICKOK L. G. & PICHERSKY E. (1994). Assessment of gene copy number in the homosporous ferns Ceratopteris thalictroides and C. richardii (Parkeriaceae ) by restriction fragment length polymorphisms. Plant Systematics and Evolution 189: 203– 210.

MEISTER A. & BAROW M. (2007). DNA base composition of plant genomes. In: Doležel J., Greilhuber J. & Suda J. (eds.), Flow cytometry with plant cells . Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, pp. 177–215.

MIRSKY A. E. & RIS H. (1951). The desoxyribonucleic acid content of animal cells and its evolutionary significance. Journal of General Physiology 34: 451–462.

MURAKAMI N. & SCHAAL B. A. (1994). Chloroplast DNA variation and the phylogeny of Asplenium sect. Hymenasplenium (Aspleniaceae ) in the New World tropics. Journal of Plant Research 107: 245–251.

MURAKAMI N., NOGAMI S., WATANABE M. & IWATSUKI K. (1999). Phylogeny of Aspleniaceae inferred from rbcL nucleotide sequences. American Fern Journal 89: 232– 243.

MURRAY B. G., LEITCH I. J. & BENNETT M. D. (2010). Gymnosperm DNA C-values database (release 4.0, Dec. 2010). [http://www.kew.org/cvalues/]

73

NAKAZATO T., BARKER M. S., RIESEBERG L. H. & GASTONY G. J. (2008). Evolution of the nuclear genome of ferns and lycophytes. In: Ranker T. A. & Haufler C. H. (eds.), Biology and evolution of ferns and lycophytes . Cambridge University Press, Cambridge, England, pp. 175–198.

NARAYAN R. K. J. (1988). Constraints upon the organisation and evolution of chromosomes in Allium. Theoretical and Applied Genetics 75: 319–329.

OBERMAYER R., LEITCH I. J., HANSON L. & BENNETT M. D. (2002). Nuclear DNA C-values in 30 species double the familial representation in pteridophytes. Annals of Botany 90: 209–217.

OTTO F. J. (1990). DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. In: Crissman H. A. & Darzynkiewicz Z. (eds.), Methods in cell biology (Vol. 33). Academic Press, New York, pp. 105–110.

PAZOUREK J. (1963). Studium listové epidermis mikroreliéfovou metodou. Preslia 35: 210– 216.

PAGE C. N. (1972). An assessment of the inter-specific relationships in Equisetum subgenus Equisetum . New Phytologist 71: 355–369.

PAGE R. D. M. (1996). TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Applications in the Biosciences 12: 357–358.

PAGEL M. D. (1992). A method for the analysis of comparative data. Journal of Theoretical Biology 156: 431–442.

PELLICER J., FAY M. F. & LEITCH I. J. (2010). The largest eukaryotic genome of them all? Botanical Journal of the Linnean Society 164: 10–15.

PERRIE L. R. & BROWNSEY P. J. (2005). Insights into the biogeography and polyploid evolution of New Zealand Asplenium from chloroplast DNA sequence data. American Fern Journal 95: 1–21.

PINTER I., BAKKER F., BARRETT J., COX C., GIBBY M., HENDERSON S., MORGAN -RICHARDS

M., RUMSEY F., RUSSELL S., TREWICK S., SCHNEIDER H. & VOGEL J. (2002). Phylogenetic and biosystematic relationships in four highly disjunct polyploid complexes in the subgenera Ceterach and Phyllitis in Asplenium (Aspleniaceae ). Organisms Diversity & Evolution 2: 299–311.

74

PRYER K. M., SCHNEIDER H., SMITH A. R., CRANFILL R., WOLF P.G., HUNT J. S. & SLIPES S. D. (2001). Horsetails and ferns are a monophyletic group and the closest living relative to seed plants. Nature 409: 618−622.

PRYER K. M., SCHUETTPELZ E., WOLF P. G., SCHNEIDER H., SMITH A. R. & CRANFILL R. (2004). Phylogeny and evolution of ferns (monilophytes) with a focus on the early leptosporangiate divergences. American Journal of Botany 91: 1582−1598.

RANKER T. A., SMITH A. R., PARRIS B. S., GEIGER J. M. O., HAUFLER C. H., STRAUB S. C. K.

& SCHNEIDER H. (2004). Phylogeny and evolution of grammitid ferns (Grammitidaceae ): a case of rampant morphological homoplasy. Taxon 53: 415–428.

SCHNEIDER H., RUSSELL S. J., COX C. J., BAKKER F., HENDERSON S., GIBBY M. & VOGEL J. C. (2004a). Chloroplast phylogeny of asplenioid ferns based on rbcL and trnL-F spacer sequences ( Polypodiidae , Aspleniaceae ) and its implications for the biogeography. Systematic Botany 29: 260–274.

SCHNEIDER H., SMITH A. R., CRANFILL R., HILDEBRAND T. E., HAUFLER C. H. & RANKER T.

A. (2004b). Unraveling the phylogeny of polygrammoid ferns ( Polypodiaceae and Grammitidaceae ): exploring aspects of the diversification of epiphytic plants. Molecular Phylogenetics and Evolution 31: 1041–1063.

SCHNEIDER H., SCHUETTPELZ E., PRYER K. M., CRANFILL R., MAGALLÓN S. & LUPIA R. (2004c). Ferns diversified in the shadow of angiosperms. Nature 428: 553–557.

SCHNEIDER H., RANKER T. A., RUSSELL S. J., CRANFILL R., GEIGER J. M. O., AGURAIUJA R.,

WOOD K. R., GRUNDMANN M., KLOBERDANZ K. & VOGEL J. C. (2005). Origin of the endemic fern genus Diellia coincides with the renewal of Hawaiian terrestrial life in the Miocene. Proceedings of the Royal Society of London , Series B, 272: 455–460.

SEN U. (1983). Stomatal structure and stomatogenesis in Azolla pinnata R. Brown. Annals of Botany 52: 201−204.

SIMPSON M. G. (2006). Plant systematics . Elsevier Academic Press, London (UK), Burlington (USA), San Diego (USA).

SMEJKAL M. (1988a). Sinopteridaceae Koidzumi - podmrvkovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 234.

75

SMEJKAL M. (1988b). Thelypteridaceae Pichi-Sermolli - kapradiníkovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 236– 241.

SMITH A. R., PRYER K. M., SCHUETTPELZ E., KORALL P., SCHNEIDER H. & WOLF P. G. (2006). A classification for extant ferns. Taxon 55: 705−731.

SOLTIS P. S. & SOLTIS D. E. (1988). Electrophoresic evidence for genetic diploidy in Psilotum nudum . American Journal of Botany 75: 1667−1671.

STÖVER B. C. & MÜLLER K. F. (2010). TreeGraph 2: Combining and visualizing evidence from different phylogenetic analyses. BMC Bioinformatics 11: 7.

STRASBURGER E. (1866). Ein Beitrag zur Entwicklungsgeschichte der Spaltöffnungen. Jahrbücher für wissenschaftliche Botanik 5: 297–335.

SWIFT H. H. (1950). The desoxyribose nucleic acid content of animal nuclei . Physiological zoology 23: 169–198.

ŠMARDA P., BUREŠ P., HOROVÁ L., FOGGI B. & ROSSI G. (2008). Genome size and GC content evolution of Festuca : ancestral expansion and subsequent reduction. Annals of Botany 101: 421–433.

ŠOURKOVÁ M. (1988). Osmundales - podez řeňotvaré. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 229–230.

ŠPRY ŇAR P. (2004). Poznámky k p řekvapivému nálezu podmrvky jižní ( Notholaena marantae ) a sleziníku hadcového ( Asplenium cuneifolium ) na ultrabazickém pikritu v Českém krasu. Zprávy České botanické spole čnosti 39: 321–338.

THURSTON E. L. (1969). Taxonomic significance of stomatal patterns in the ferns. American Fern Journal 59: 68–79.

TOMŠOVIC P. & KŘÍSA B. (1988). Aspleniaceae Frank - sleziníkovité. In: Hejný S. & Slavík B. (eds.), Kv ětena České socialistické republiky 1 . Academia, Praha, pp. 242–252.

TSUTSUMI C. & KATO M. (2006). Evolution of epiphytes in Davalliaceae and related ferns. Botanical Journal of the Linnean Society 151: 495–510.

VAN ’T HOF J. & SPARROW A. H. (1963). A relationship between DNA content, nuclear volume, and minimum mitotic cycle time . Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 49: 897–902.

76

VINOGRADOV A. E. (1994). Measurement by flow cytometry of genomic AT/GC ratio and genome size. Cytometry 16: 34–40.

WANG M.-L., CHEN Z.-D., ZHANG X.-C, LU S.-G. & ZHAO G.-F. (2003). Phylogeny of the Athyriaceae : evidence from chloroplast trnL-F region sequences. Acta Phytotaxonomica Sinica 41: 416–426.

WATSON L. & DALLWITZ M. J. (2008). The families of gymnosperms . Version: 6th November 2009. [http://delta-intkey.com]

WEBB C. O., ACKERLY D. D. & KEMBEL S. W. (2008). Phylocom: software for the analysis of phylogenetic community structure and character evolution. Bioinformatics 24: 2098– 2100.

WILLMER C. M. & FRICKER M. (1996). Stomata . Chapman and Hall, London (UK).

WOLFE K. H. (2001). Yesterday’s polyploids and the mystery of diploidization. Nature Reviews Genetics 2: 333–341.

YATSKIEVYCH G. (2003). Pteridophytes (Ferns). In: Encyclopedia of Life Science . [http://www.els.net/]

77

78