ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN KAYU HITAM (Diospyros Celebica Bakh.)

SKRIPSI

YUNI ROMASNI PURBA 140802006

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2019

Universitas Sumatera Utara 2

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN KAYU HITAM (Diospyros Celebica Bakh.)

SKRIPSI

Diajukan untuk melengkapi tugas dan memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Sains

YUNI ROMASNI PURBA 140802006

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN 2019

Universitas Sumatera Utara PERNYATAAN ORISINALITAS

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN DAUN KAYU HITAM (Diospyros celebica Bakh)

SKRIPSI

Saya mengakui bahwa skripsi ini adalah hasil kerja saya sendiri, kecuali beberapa kutipan dan ringkasan yang masing-masing disebutkan sumbernya.

Medan, Januari 2019

YUNI ROMASNI PURBA 140802006

Universitas Sumatera Utara PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN DAUN KAYU HITAM (Diospyros celebica Bakh) Kategori : SKRIPSI Nama Mahasiswa : YUNI ROMASNI PURBA Nomor Induk Mahasiswa : 140802006 Program Studi : SARJANA (S1) KIMIA Departemen : KIMIA Fakultas : MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM (FMIPA) UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

Disetujui di Medan, Januari 2019,

Ketua Departemen Kimia FMIPA USU Pembimbing

Dr. Cut Fatimah Zuhra, M.Si Dr. Helmina Br. Sembiring, M.Si NIP: 1974 0405 1999 032001 NIP. 197602022000122002

Universitas Sumatera Utara ISOLASI DAN IDENTIFIKASI GOLONGAN SENYAWA FENOLIK DARI DAUN TUMBUHAN KAYU HITAM (Diospyros Celebica Bakh.) ABSTRAK

Isolasi senyawa fenolik yang terdapat pada daun tumbuhan kayu hitam (Diospyros celebica Bakh.) (Ebenaceae) telah dilakukan dengan ekstraksi maserasi menggunakan pelarut methanol. Ekstak pekat metanol dilarutkan dengan aquadest dan dipartisi menggunakan pelarut etil asetat lalu dilarutkan dengan pelarut methanol dan dipartisi dengan n-heksana . Kemudian di analisa dengan kromatografi lapis tipis dan dipisahkan dengan kromatografi kolom dengan eluen Kloroform : Metanol (90:10) v/v; (80:20) v/v; (70:30) v/v; (60:40) v/v; (50:50) v/v. Isolat dimurnikan dengan kromtografi lapis tipis preparative dan di kristalisasi , diperoleh kristal berwarna kuning sebanyak 7,5 mg, dengan harga Rf = 0.45. Uji kemurnian senyawa yang diperoleh dilakukan dengan kromatografi lapis tipis menunjukkan noda tunggal menggunakan eluen kloroform : etil asetat ( 50:50) v/v, n-heksana : etil asetat (80:20) v/v , selanjutnya senyawa yang diperoleh dianalisis dengan Spektofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah (FT-IR), dan Spektrofotometer resonansi magnetik inti proton (1H-NMR). Dari interpretasi data spektroskopi, diduga bahwa senyawa hasil isolasi yang diperoleh adalah senyawa fenolik metil galat golongan asam fenolat.

Kata Kunci : Daun Kayu Hitam (diospyros delebica Bakh.), Fenolik, Metil Galat,

iii

Universitas Sumatera Utara ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM KAYU HITAM LEAVES (Diospyros celebica Bakh.)

ABSTRACT

Isolation of phenolic compounds from kayu hitam leaves (Diospyros Celebica Bakh.) has been done by maceration technique with methanol solvent.The concentrated exstract of methanol dissolved with aquadest and partition exstrakted with ethylacetate. The concentrated extract of ethyl acetate dissolved with methanol solvent, and partition with n-hexane. Then Thin layer chromatograpy was analyzed before coloumn chromatography and the eluen obtained that is suitable for separation is chloroform : methanol 90:10, 80:20, 70:30,60:40,50:50 (v/v) as mobile phase.The compounds was purified with a thin layer preparative and cristalitation yielding yellow pasta with weigh 7,5 mg with Rf = 0,45. The test purity of compounds is done by thin layer chromathography show sigle spot with eluen chloroform : ethyl acetate (50:50) v/v ang n-hexane : ethyl acetate ( 80:20) v/v . the next,compound was further indified by Spectrophotometer ultraviolet Visible (UV-Vis), Fourier Transform Infra Red Spectrophotometer (FT-IR) and Proton Nuclear Magnetic Resonancy Spectrophotometer (1H-NMR) was estimated as a phenolic methyl gallate. As fenolat acid.

Keywords : Kayu Hitam (Diospyros Celebica Bakh.), Methyl Gallate, Phenolic,

Universitas Sumatera Utara PENGHARGAAN

Puji syukur penulis panjatkan kehadiran Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan karunia yang begitu luar biasa karena melalui penyertaanNya skripsi ini dapat diselesaikan dalam waktu yang telah ditetapkanNya. Penulis juga mengucapkan terima kasih yang luar biasa kepada : Ibu Dr. Helmina Br. Sembiring, M.Si selaku dosen pembimbing penulis yang telah banyak membantu segenap kegiatan penelitian dan penulisan skripsi penulis dan juga selaku Kepala laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati FMIPA USU. Terimakasih juga kepada, Ibu Dr. Cut Fatimah Zuhra selaku ketua program studi kimia FMIPA USU, Ibu Dr. Sovia Lenny, S.Si, M.Si selaku sekretaris program studi Kimia FMIPA USU, Bapak Dr. Kerista Sebayang, MS selaku Dekan FMIPA USU, Bapak Drs. Albert Pasaribu, M.Sc, Ketua Bidang Laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati FMIPA USU serta memberikan arahan dan nasehat, dan seluruh Staff pengajar di Laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati FMIPA USU, Bapak Prof. Dr. Harlem Marpaung selaku dosen pembimbing akademik yang telah memberikan waktunya untuk memberikan pengarahan dalam menyelesaikan studi selama perkuliahan dan penelitian berlangsung,Bapak Drs. Lamek Marpaung M.Phill Ph.D atas bantuan, ajaran, nasehat serta waktu yang boleh diberikan selama kegiatan penelitian berlangsung. Ucapan terima kasih secara khusus penulis sampaikan dengan segala kerendahan hati kepada kedua orang tua tercinta penulis, alm. Aliansen Purba dan Ibu Rumina Sinaga atas doa, dukungan dan kasihnya kepada penulis sejak mulai terlahir kedunia sampai pada seorang Sarjana dan sampai selama-lamanya, serta abang - abang saya Budi Purba, Jeni Purba, Jhon Liharman Purba atas bantuan, dukungan dan doa seta bantuan dana yang tak henti-hentinya kepada penulis. ucapkan terima kasih yang tulus juga penulis sampaikan kepada sahabat- sahabat terbaik penulis ; terima kasih juga penulis sampaikan kepada rekan-rekan assisten Lab Kimia Organik Bahan Alam Hayati, dan kepada teman-teman yang mendukung penulis dalam penelitian dan juga penulisan skripsi penulis. Akhir kata penulis berharap semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penelitian dan kemajuan ilmu pengetahuan. Kiranya Tuhan selalu mencurahkan Damai Sukacita dan Perlindungan kepada kita semua.Tuhan memberkati kita semua.

Medan, Januari 2018

Yuni Romasni Purba

Universitas Sumatera Utara DAFTAR ISI

Halaman

PERNYATAAN ORISINALITAS i PENGESAHAN SKRIPSI ii ABSTRAK iii ABSTRACT iv PENGHARGAAN v DAFTAR ISI vi DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR ix DAFTAR LAMPIRAN x

Bab 1 Pendahuluan 1.1 Latar Belakang 1 1.2 Permasalahan 2 1.3 Tujuan Penelitian 2 1.4 Manfaat Penelitian 2 1.5 Metodologi Penelitian 3

Bab 2 Tinjauan Pustaka 2.1 Tumbuhan Bisbul 4 2.2 Senyawa Bahan Alam 5 2.3 Senyawa Fenolik 6 2.3.1 Klasifikasi Senyawa Fenolik 7 2.4 Skrining Fitokimia 11 2.5 Metode Pemisahan 13 2.5.1 Ekstraksi 13 2.5.2 Partisi 14 2.5.3 Kromatografi 15 2.5.3.1 Kromatografi Lapis Tipis 15 2.5.3.2 Kromatografi Kolom 16 2.5.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif 17 2.6 Teknik Spektroskopi 17 2.6.1 Spektroskopi Ultra Violet (UV-Vis) 18 2.6.2 Spektroskopi Infra Merah (FT-IR) 18 2.6.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) 19

Universitas Sumatera Utara Bab 3 Metode Penelitian 3.1 Waktu dan Tempat 21 3.2 Alat – alat 21 3.3 Bahan – bahan 21 3.4. Penyediaan Sampel 21 3.5 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Bisbul 22 3.6 Ekstraksi Daun Tumbuhan Bisbul 22 3.7 Analisis Kromatografi Lapis Tipis 22 3.8 .Pemisahan Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom 23 3.9 .Pemurnian 24 3.10 .Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis 24 3.11 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 24 3.11.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UltravioletVisible (UV-Vis) 25 3.11.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer (FT-IR) 25 3.11.3 Identifikasi dengan Spektrometer Magnetik 25 Inti Proton (1H-NMR) 3.12 Bagan Penelitian 26 3.12.1 Bagan Uji Ekstrak Metanol 26 3.12.3 Bagan Isolasi 27

Bab 4 Hasil dan Pembahasan 4.1. Uji Pendahuluan dan Isolasi senyawa Fenolik 28 4.2 Hasil Identifikasi Senyawa Hasil isolasi

Bab 5 Kesimpulan dan Saran 5.1 Kesimpulan 35 5.2 Saran 35

DAFTAR PUSTAKA 36 LAMPIRAN 38

vii

Universitas Sumatera Utara DAFTAR TABEL

Nomor Tabel Judul Halaman

2.1 Uji Standar Senyawa Kimia 12 2.2 Frekuensi Vibrasi Ikatan 18 4.1 Panjang Gelombang UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi 30 4.2 Hasil Analisis Spektrun FT-IR Senyawa Hasil Isolasi 32 4.3 Pergeseran Kimia dan Jenis Peak 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 33

viii

Universitas Sumatera Utara DAFTAR GAMBAR

Nomor Gambar Judul Halaman

2.1 Tumbuhan Daun Kayu Hitam 6 2.2 Struktur dasar fenolik 8 2.3 Struktur Floroglukinol 9 2.4 Struktur dari asam galat 10 2.5 Struktur Hidroksi asetofenon 10 2.6 Struktur asam p-kumarat 11 2.7 Struktur plumbagin 11 2.8 Struktur Xanton 12 2.9 Struktur trans-resveratrol 12 2.10 Struktur Flavon 13 2.11 Struktur aril naftokuinon 13 2.12 Struktur Amentolflavon 14 4.1 senyawa Hasil Isolasi 36 4.2 Spektrum UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi 37 4.2 Spektrum Infra Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi 38 4.3 Spektrum 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi 40 4.4 Struktur Senyawa Hasil Isolasi 41

Universitas Sumatera Utara DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman Lampiran

1 Hasil Determinasi Daun Tumbuhan kayu hitam 46 (Diospyros Celebica Bakh )

Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat Daun 47 2 Tumbuhan kayu hitam (Diospyros Celebica Bakh ) sebelum kromatografi kolom

3 Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat Daun 48 Tumbuhan kayu hitam (Diospyros Celebica Bakh ) penggabungan fraksi

Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat Daun 49 4 Tumbuhan kayu hitam (Diospyros Celebica Bakh ) sebelum KLT Preparatif

5 Kromatogram lapis tipis senyawa Murni hasil isolasi Spektrum FT-IR dari hasil Isolasi 50

1 6 Spektrum H-NMR Senyawa Pembanding 51

Universitas Sumatera Utara BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Senyawa metabolit sekunder terbagi menjadi beberapa bagian, diantaranya adalah senyawa fenolik. Istilah fenol meliputi aneka ragam senyawa yang berasal dari tumbuhan, yang mempunyai ciri sama yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua subtituen hidroksil. Senyawa fenol merupakan senyawa metabolit sekunder terbesar persebarannya dalam tanaman (Cheynier et al,2013). Sebagian besar senyawa organik bahan alam adalah senyawa aromatik, sebagian besar dari senyawa aromatik ini mengandung cincin karoaromatik, yaitu cincin aromatic yang terdiri atas atom karbon dan hydrogen. Cincin karboaromatik ini lazimnya terdistribusi oleh satu atau lebih gugus hidroksil atau gugus lain yang lebih ekivalen ditinjau dari segi biogenetik. Oleh Karena itu,senyawa bahn alam aromatic ini sering kali disebut senyawa fenol, Senyawa fenol ini mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri atas cincin benzene ( C6) yang terikat pada ujung rantai karbon propane (C3),Kelompok senyawa fenol ini banyak ditemukan didalam Tumbuhan tingkat tinggi ( Kristanti,dkk, 2002 ). Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida. Fenol adalah senyawa yang ditandai dengan lekatnya gugus hidroksil langsung pada cincin aromatiknya (Harborne, 1987). Aktivitas fisiologi senyawa fenolik tumbuhan banyak dan beragam,sekurang kurangnya ada dugaan bahwa beberapa senyawa mempunyai fungsi penting pada fisiologi dalam dari tumbuhan pembuatnya (Robinson,T, 1995 ). Pengetahuan tentang khasiat dan keamanan tanaman obat di Indonesia biasanya hanya berdasarkan pengalaman empiris yang diwariskan secara turun temurun dan belum teruji secara ilmiah. Obat tradisional dari bahan alam dapat menjadi salah satu alternatif pengobatan yang memungkinkan efektivitas pengobatan yang lebih baik dan diharapkan mempunyai efek samping minimal. Salah satunya daun kayu hitam (Diospyros celebica Bakh). digunakan dengan cara merebus sebanyak 7-9 lembar daun kayu hitam dengan air 200 ml. Daun kayu hitam diminum 2 kali sehari pada saat pagi hari dan malam hari sebelum tidur (Syam, 2016).

Universitas Sumatera Utara 2

Peneliti sebelumnya Syam,A. ( 2016 ) melakukan uji toksisitas akut ekstrak etanol kayu hitam (Diospyros celebica Bakh) terhadap mencit jantan (Mus musculus) yang memperoleh Nilai LDSO dengan toksisitas akut yaitu sebesar 5,168 mg/Kg BB. Kemudian Alwi, dkk ( 2010 ) melakukan Uji Fungisida Terhadap Phytophthora palmivora Butler dari ekstrak gergaji Kayu Hitam. pada konsentrasi 1% sampai 5% memiliki potensi sebagai penghambat pertumbuhan jamur Phytophthora palmivora. Berdasarkan hasil Skrining Fitokimia menunjukan bahwa ekstrak limbah serbuk gergaji kayu eboni mengandung beberapa senyawa metabolit sekunder . yang menyebabkan ekstrak serbuk kayu eboni dapat berfungsi sebagai fungisida terhadap Phytophthora palmivora Butler ( Alwi,M. 2010 ) . Namun, hingga saat ini belum ada penelitian menegenai isolasi senyawa fenolik dari tumbuhan kayu hitam. maka peneliti tertarik untuk melakukan penelitian terhadap daun tumbuhan kayu hitam, khususnya mengenai isolasi dan identifikasi senyawa fenolik yang terkandung di dalam daun tumbuhan daun kayu hitam.

1.2 Permasalahan 1. Bagaimana cara mengisolasi senyawa fenolik dari daun kayu hitam? 2. Golongan senyawa fenolik apakah yang terdapat pada tumbuhan daun kayu hitam?

1.3 Tujuan Penelitian 1. Untuk mengetahui cara mengisolasi senyawa fenolik dari daun tumbuhan kayu hitam. 2. Untuk mengetahui golongan senyawa fenolik yang terdapat dalam daun tumbuhan kayu hitam.

1.4 Manfaat Penelitian Dari hasil penelitian diharapkan dapat memberikan sumber informasi ilmiah pada bidang Kimia Bahan Alam Hayati khususnya tentang senyawa fenolik yang terkandung dalam tumbuhan daun kayu hitam.

Universitas Sumatera Utara 3

1.5 Metodologi Penelitian Dalam penelitian ini, isolasi senyawa fenolik dilakukan terhadap daun tumbuhan kayu hitam berupa serbuk kering dan halus. Pada tahap awal dilakukan uji skrining fitokimia untuk senyawa fenolik yaitu dengan merendam daun tumbuhan kayu hitam menggunakan pelarut metanol dan etilasetat dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% . Isolasi Senyawa fenolik dilakukan dengan beberapa tahap yaitu : Ekstraksi Maserasi, Pemisahan Tanin, Ekstraksi Partisi, Analisis kromatografi Lapis Tipis, Analisis kromatografi Kolom, dan Rekristalisasi, Analisis Kristal Hasil Isolasi. Kemudian hasil isolasi yang dilakukan di analisin dengan beberapa Tahap yaitu: Analisis Kromatografi Lapis Tipis, Pengukuran titik lebur dan Identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer UV-Visibel, Infra Merah (FT-IR), Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR).

Universitas Sumatera Utara BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1.Tumbuhan Tumbuhan Kayu Hitam (Diospyros celebica Bakh) Pohon tumbuhan daun kayu hitam batang lurus dan tegak dengan tinggi sampai dengan 40 m. Diameter batang bagian bawah dapat mencapai 1 m, akar papan besar. Kulit batangnya beralur, mengelupas kecil-kecil dan berwarna coklat hitam. Pepagannya berwarna coklat muda dan di bagian dalamnya berwarna putih kekuning-kuningan. Daun tunggal, tersusun berseling, berbentuk jorong memanjang, dengan ujung meruncing, permukaan atasnya mengkilap, seperti kulit dan berwarna hijau tua, permukaan bawahnya berbulu dan berwarna hijau abu-abu (Tjitrosoepomo, 2013). Kayunya berwarna coklat kemerah-merahan, putih kekuning - kuningan atau merah muda dan mempunyai batas yang jelas dengan kayu teras ( Prayitno, 2016). Bunganya mengelompok pada ketika daun, berwarna putih. Buahnya bulat telur, berbulu dan berwarna merah kuning sampai coklat bila tua. Daging buahnya yang berwarna keputihan kerap dimakan monyet, bajing atau kelelawar; yang dengan demikian bertindak sebagai agen pemencar biji. Bijinya berbentuk seperti baji yang memanjang, coklat kehitaman (Tjitrosoepomo, 2013). Diospyrous celebica Bakh ini harus ditanam pada tipe hutan dihutan seperti hutan campuran dan hutan dataran tinggi ( Gusmiaty,et al, 2017).

Gambar 2.1 Daun tumbuhan kayu hitam ( Diospyros Celebica Bakh).

Universitas Sumatera Utara 5

Sistematika dari Kayu Hitam ( Diospyros Celebica Bakh) Kingdom :Plantae Divisi : Spermatophyta Class : Dicotyledonae Ordo : Ericales Famili : Ebeneceae Genus : Diospyros Spesies : Diospyros celebica Bakh. Nama lokal : Kayu Hitam

2.2 Senyawa Bahan Alam Kimia bahan alam merupakan pengetahuan yang telah dikenal sejak peradaban manusia tumbuh. Contoh yang dapat segera diketahui adalah pembuatan bahan makanan, pewarnaan benda, obat-obatan atau stimulan, dan sebagainya (Sastrohamidjojo, 1996). Senyawa bahan alam adalah senyawa organik yang merupakan hasil dari proses metabolisme dalam organisme hidup yang dapat juga disebut sebagai metabolit (hasil dari metabolisme). Ada 2 jenis metabolit yaitu 1. Metabolit Primer Merupakan hasil dari metabolisme primer dan merupakan bahan utama untuk kelangsungan hidup dari suatu organisme tersebut. Contohnya adalah polisakarida, protein, lemak dan asam – asam nukleat. 2. Metabolit Sekunder Merupakan hasil dari metabolisme sekunder yang disebut sebagai bahan kedua atau bahan yang esensinya tidak sepenting metabolit primer sebagai bahan utama. Metabolit sekunder biasanya berperan dalam pertahanan kehidupan dari organisme. Sebagai contoh, flavonoida, alkaloid, terpenoid/steroid. Dengan meningkatnya jenis dan tipe senyawa yang ditemukan di dalam berbagai bahan alam, berkembang juga sistem klasifikasi senyawa yang berasal dari bahan alam, tetapi biasanya ada 4 jenis klasifikasi yang digunakan untuk membahasnya (Nakanishi et al, 1974).

Universitas Sumatera Utara 6

Ciri metabolit sekunder - Tidak terlibat langsung dalam metabolisme/kehidupan dasar : pertumbuhan, perkembangan reproduksi. - Tidak esensial, ketiadaan jangka pendek tidak berakibat kematian. Ketiadaan jangka panjang mengakibatkan kelemahan dalam pertahanan diri, survival, estetika, menarik serangga. - Golongan metabolit sekunder distribusi hanya pada spesies pada filogenetik/familia tertentu. - Sering kali berperan di dalam pertahanan terhadap musuh. - Senyawa organik dengan berat molekul 50-1500 Dalton. Sehingga disebut mikro molekul. - Penggolongan utama : terpenoid, fenil propanoid, poliketida, dan alkaloid aladah metabolit sekunder. - Pemanfaatan oleh manusia : ontuk obat, parfum, aroma, bumbu, bahan rekreasi dan relaksasi (Saifudin, 2014).

2.3 Senyawa Fenolik Senyawa fenolik seringkali disebut begitu mirip dengan senyawa alkohol rantai terbuka (alifatis) karena letak gugus hidroksil yang terletak pada kerangka karbonnya. Senyawa fenolik dengan gugus hidroksil dipengaruhi oleh cincin aromatiknya karena hidrogen dalam struktur fenol bersifat labil dan membuat senyawa fenol bersifat labil (Vermeris,2006). Senyawa fenol cenderung mudah larut dalam air karena umumnya berikatan dengan gula sebagai glikosida (Harbone, 1987). Fenol adalah senyawa yang ditandai dengan lekatnya gugus hidroksil langsung pada cincin aromatik.Berikut struktur fenol terdapat pada gambar 2.2 yaitu: OH

Gambar 2.2 Struktur Fenol

Universitas Sumatera Utara 7

Senyawa fenolik merupakan kelompok terbesar metabolit sekunder pada tanaman. Senyawa ini termasuk dalam alcohol aromatic karena gugus hidroksilnya selalu melekat pada cincin benzen. Senyawa fenolik secara umum memiliki potensi sebagai bakterisidal, antiseptic, antioksidan, dan sebagainya (Pangelly, 2006)

2.3.1 Klasifikasi Senyawa Fenolik a. C6 : Fenolik Sederhana Secara umum senyawa fenolik mempunyai sifat sebagai bakterisidal, antiseptic, dan antihelmintik (Pengelly, 2004). Senyawa dari gugus ini merupakan hasil substitusi dari gugus fenol, dimana substituennya dapat berupa substitusi dalam posisi orto,meta atau para (Vermerris, 2006). Berikut gambar yang menunjukkan struktur dari contoh asam fenolik sederhana Floroglukinol.

OH OH

Gambar 2.3 Struktur Floroglukinol

b. C6-C1 : Asam Fenolat Senyawa fenolik dari golongan asam fenolat adalh fenol yang tersubstitusi oleh gugus karboksil. Contohnya adalah asam galat, yang merupakan trifenol yang biasa terdapat dalam daun teh. Berikut gambar yang menunjukkan contoh dari asam fenolat yaitu asam galat.

Universitas Sumatera Utara 8

O 0H

OH OH

OH Gambar 2.4 Struktur dari asam galat

c. C6-C2 : Asetofenon dan asam Fenilasetat Asetofenon dan asam Fenilasetat jarang ditemukan dialam. Asetofenon dikenali dengan adanya gugus karboksil, tetapi berbeda dengan asam fenolat, dimana gugus karboksil dari asetofenon tidak berikatan langsung dengan cincin aromatiknya (Vermerris, 2006).

Gambar 2.5 Struktur Hidroksi Asetofenon

d. C6-C3 : Asam hidroksisinamat, Fenil propanoid, Kumarin Hidroksi sinamat dan kumarin telah banyak diketahui dalam ilmu sains yang terdapat sebagai fenil propanadan kromon. Tetapi fenil propanoid yang paling penting adalah asam hidroksi sinamat (Nollet, 2015).

Gambar 2.6 Struktur Asam p-Kumarat

Universitas Sumatera Utara 9

e. C6-C4 : Naftokuinon Naftokuinon adalah senyawa fenolik yang tersebar luas dalam tanaman, jamur dan bakteri. Contoh dari naftokuinon adalah plumbagin, Lawson dan alkanin. Naftokuinon di biosintesis melalui jalur yang berbeda, yaitu melalui jalur asetat dan mevalonate yang dipadukan dengan jalur sikimat (Nollet, 2015)

Gambar 2.7 Struktur Plumbagin

f. C6-C1-C6 : Xanton Xanton merupakan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam tanaman, jamur dan lumut. Kerangka dasar dari xanton C6-C1-C6 yang mengandung dua buah cincin aromatik yang terikat oleh atom O (Nollet, 2015).

O Gambar 2.8 Struktur Xanton

g. C6-C2-C6 : Stilben dan Antrakuinon Stilben dan antrakuinon merupakan senyawa fenolik dengan kerangka dasar

C6-C2-C6 dengan dua buah cincin aromatik yang terhubung oleh jembatan etilen (Nollet, 2015).

Universitas Sumatera Utara 10

Gambar 2.9 Trans-Resveratrol

h. C6-C3-C6 : Flavonoid dan Isoflavonoid

Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C6-C3 (fenil propana) yang bersumber dari asam sikimat (via fenilalanin) dan unit C6 yang diturunkan dari jalur poliketida. Fragmen poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-KoA yang bergabung dengan unit C6-C3 (sebagai KoA tioester) untuk membentuk unit awal triketida. Oleh karena itu, flavonoid yang berasal dari biosintesis gabungan terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan jalur poliketida (Robinson, 1995).

Gambar 2.10 Struktur Flavon

g. (C6-C3)2 : Lignan dan Neolignan Lignan merupakan dimer atau oligomer dari monolignol. Dimana monolignol yang dimaksud adalah p-kumarin alcohol, koniferil alkohol, dan sinapsil alkohol (Vermerris, 2006).

Universitas Sumatera Utara 11

Gambar 2.11 Struktur Aril Naftokuinon.

h. (C6-C3-C6)2 : Biflavonoid Biflavonoid adalah flavonoid dimer, walau pun prosianidin dimer (satuan dasarnya katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini. Flavonoid yang biasanya terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola oksigenasi yang sederhana 5,7,4’ (atau kadang-kadang 5,7,3’,4’) dan ikatan antar-flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau kadang-kadang ikatan eter. Biflavonoid jarang ditemukan sebagai glikosida, dan penyebarannya terbatas, terdapat terutama pada gimnospermae (Markham, 1988).

Gambar 2.12 Struktur Amentolflavon

2.4 Skrining Fitokimia Uji Kimia di identifikasi dengan didasarkan kepada teknik standar. Dimana hasilnya akan memberikan informasi awal yang berisi informasi dan orientasi untuk tahap berikutnya. Seperti beberapa teknik standar dalam mendeteksi suatu kelompok senyawa kimia berikut.

Universitas Sumatera Utara 12

Tabel 2.1 Uji Standar Senyawa Kimia Kelompok Senyawa kimia Uji Standar

Alkaloid Mayer, Wagner, Draggendorff , Hager

Karbohidrat Mollisch, Benedict, Fehling

Glikosida Borntrager

Saponin Froth, Tes busa

Phytosterol Salkowski, Liberman Buchard

Phenol besi klorida

Tannin Uji gelatin

Flavonoid Alkaline reagent , Uji timbal asetat

Protein dan asam amino Xanthoproteic, uji Ninhydrin, Bradford

Diterpen Copper acetate

(Alvarez, 2014) Selain uji standar senyawa kimia yang telah disebutkan, banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid, meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa digunakan adalah : a. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel dan beberapa tetes HCl pekat.

b. H2SO4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning pekat. Kalkon dan auron menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiru-biruan. Flavanon memberikan warna orange sampai merah (Cannell, 1998). c. NaOH 10% , menghasilkan larutan biru violet

d. FeCl3 5% telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongan

Universitas Sumatera Utara 13

flavonoid. Pereaksi ini memberi warna kehi jauan, warna biru, dan warna hitam-biru (Robinson, 1995).

2.5 Metode Pemisahan Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen - komponen lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan: a. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan. b. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaan-perbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam satu golongan (Muldja, 1995). Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik kromatografi atau gabungan teknik tersebut, antara lain kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian dari senyawa yang akan dipisah. (Harbone,1987).

2.5.1 Ekstraksi Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan substansi dari campuran dengan menggunakan pelarut yang sesuai. Berdasarkan bentuk campuran yang di ekstraksi dapat dibedakan menjadi dua ekstraksi yaitu : 1. Ekstraksi padat – cair : jika substansi yang dieksraksi terdapat di dalam campurannya yang berbentuk padat. Proses ini paling banyak ditemui dalam usaha mengisolasi suatu substansi yang terkandung di dalm suatu bahan alam. 2. Ekstraksi Cair – cair : jika substansi yang diekstraksi terdapat didalam campuran yang berbentuk cair. Berdasarkan proses pelaksanaan nya, ekstraksi dapat dibedakan sebagai berikut :

Universitas Sumatera Utara 14

1. Ekstraksi yang berkesinambungan ( continuous extraction ) dalam ekstraksi ini pelarut dipakai berulang ulang sampai proses ekstraksi selesai. 2. Ekstraksi bertahap ( bath extraction ) dalam ekstraksi ini pada tiap tahap selalu dipakai pelarut yang baru sampai proses ekstraksi selesai ( Kristanti, 2002 ). Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin (dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi. Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah proses isolasi. Ekstraksi dingin memungkinkan banyak senyawa terekstraksi, meskipun beberapa senyawa memiliki kelarutan terbatas dalam pelarut ekstraksi pada suhu kamar (Heinrich,dkk., 2009). Ketika tidak ditemukan sebuah petunjuk mengenai komposisi kimia dari suatu golongan, dibutuhkan suatu proses ekstraksi dalam suatu sistem pelarut yang berbeda. Dimana tahap fraksinasi diikuti oleh tahap identifikasi dari masing- masing fraksi pada senyawa kimia yang bersangkutan (Alvarez, 2014).

2.5.2 Partisi Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap: a. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik. b. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah

Universitas Sumatera Utara 15

dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich,dkk.,2009).

2.5.3 Kromatografi Istilah kromatografi sekarang meliputi beberapa teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara fase gerak (zat cair atau gas) dan fase diam (zat cair atau zat padat). Pada tahun 1903, Tswett (Rusia) menemukan teknik kromatografi dengan memisahkan klorofil dari daun dengan kolom yang terbuat dari kapur. Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam system yang terdiri atas dua fase atau lebih (Harmita,2009). Saat ini kromatografi merupakan teknik pemisahan ang paling sering digunakan dan seringkali digunakan salam bidang kimia analisis serta dimanfaatkan untuk analisis, baik secara kualitatif maupun kuantitatif bahkan untuk analisis preparatif. Teknik kromatografi telah berkembang dan digunakan untu memisahkan dan mengkuantifikasi komponen-komponen yang kompleks, baik organic maupun anorganik (Sudjadi,2009). Pemisahan pada kromatografi planar pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Nilai faktor retardasi solut (Rf) dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan dalam persamaan: arak yang dite uh s ut f arak yang dite uh fase gerak Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini tera mati jika solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam (Rohman,2009).

2.5.3.1 Kromatografi Lapis Tipis Proses KLT adalah terjadi berdasarkan prinsip adsorpsi. Setelah sampel ditotolkan diatas fase diam, senyawa- senyawa dalam sampel akan terelusi dengan kecepatan yang sangat bergantung pada sifat senyawa-senyawa,sifat fasa diam dan

Universitas Sumatera Utara 16

sifat fasa gerak. Pada KLT, secara umum senyawa yang memiliki kepolaran rendah akan terelusi lebih cepat daripada senyawa- senyawa polar karena senyawa senyawa polar terikat lebih kuat bahan silika yang silanol ( SiOH2 ) yang pada dasarnya memiliki afinitas yang kuat terhadap senyawa polar.KLT banyak digunakan untuk melihat kemurnian senyawa organik.KLT juga merupakan suatu cara yang umum dilakukan untuk memilih pelarut yang sesuai sebelum dilakukan pemisahan menggunakan kromatografi Kolom. Jadi secara singkat KLT terutama berguna untuk tujuan berikut: a.Mencari pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom b. Analisis fraksi- fraksi yang diperoleh kromatografii kolom c. Memonitor jalannya suatu reaksi kimia d. Identifikasi senyawa ( uji kemurnian ) ( Kristanti,dkk.,2002 ). Dalam pemilihan pelarut yang perlu diperhatikan adalah : 1. pelarut harus murni jika perlu harus di suling kembali. 2. campuran pelarut hanya boleh dilakukan maksimum diua atau tiga kali 3. Komposisi Campuran dapat berubah karena penyerapan ataupun penguapan 4. Komponen – komponen campuran dapat bereaksi antara satu sama lain 5. Eter atau kloroform yang digunakan mengandung 0,5% - 1% etanol sebagai stabilosator nya

2.5.3.2 Kromatografi Kolom Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan mungkin saja sampai 100 kalinya. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai ditentukan oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan. Untuk pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata memadai jika pemisahan tidak terlalu sukar. Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih besar daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah dipakai untuk

Universitas Sumatera Utara 17

kolom, alumina dan silika gel adalah penjerap yang paling berguna dan mudah didapat. Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama (diperiksa dengan KLT) atau tampaknya berasal dari satu puncak (memakai pendeteksian sinambung) digabungkan, dan pelarutnya diuapkan, lebih baik dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penjerap murni. Maka fraksi-fraksi pun murni (Gritter,dkk., 1991).

2.5.3.3 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Sebagian besar pemakaian kromatografi lapis tipis preparatif hanya dalam jumlah miligram. Kromatografi lapis tipis preparatif bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka, dijumpai sebagian besar dalam isolasi bahan alam. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun campuran senyawa hidrofil. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran tingkat KLT. Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluorosensi yang membantu mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat dengan spatula atau pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut yang paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap). Harus diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan penguraian (Hostettmann,dkk., 1995).

2.6 Teknik Spektroskopi Spektroskopi adalah alat analisis yang menggunakan radiasi (sinar) sebagai sumber energi. Spektroskopi digunakan untuk menganalisis senyawa organik secara kualitatif, kuantitatif dan yang paling penting adalah pelacakan atau elusidasi struktur (Sitorus, 2009). Spektroskopi molekuler adalah ilmu yang mempelajari interaksi antara gelombang elektromagnetik dan benda. Gelombanvg elektromagnetik atau sering pula disebut radiasi elektromagnetik (REM) adalah sejenis energi yang disebarkan oleh suatu sumber cahaya dan bergerak lurus kedepan (kecuali jika dibiaskan atau dipantulkan) dengan kecepatan yang sangat tinggi. Gelombang elektromagnetik

Universitas Sumatera Utara 18

dapat berupa cahaya tampak, panas radiasi, sinar X, sinar UV, gelombang mikro dan gelombang radio. REM merupakan partikel bertenaga yang disebut foton. Besarnya energi foton berbanding lurus dengan frekuensi REM yang bersangkutan. Molekul dapat memiliki berbagai jenis energi, antara lain sebagai berikut. a. Energi rotasi (energi putaran). Energi ini disebabkan oleh perputaran molekul pada pusat gaya berat molekul tersebut. b. Energi vibrasi (energi getaran). Energi ini disebabkan oleh perpindahan periodik atom-atom molekul tersebut dari posisi keseimbangan. c. Energi elektronik. Energi ini disebabkan elektron-elektron yang berhubungan dengan masing-masing atom atau ikatan selalu dalam keadaan bergerak. d. Energi Translasi. Energi translansi adalah energi kinetik atom atau molekul

yang dimiliki untuk bergerak dari satu tempat ke tempat lain (Harmita,2009).

2.6.1 Spektroskopi Ultraviolet (UV-Vis) Spektrum UV-visibel merupakan hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik (REM) dan molekul. REM merupakan bentuk energy radiasi yang mempunyai sifat gelombang dan partikel (foton). Spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur besarnya energi yang diadsorpsi atau diteruskan (Harmita,2009). Saat ini penggunaan Spektroskopi UV-Visible paling sering digunakan dalam aplikasi untuk analisa kuantitatif, dan nilai dari metode ini dapat mengurangi perbandingan informasi yang banyak dari teknik spektroskopi yang lainnya seperti NMR dan MS (Andersen, 2006).

2.6.2 Spektroskopi Inframerah (FT-IR) Dua molekul senyawa yang memiliki struktur kimia yang berbeda akan memiliki spectrum inframerah yang berbeda pula, karena kedua molekul tersebut memiliki jenis ikatan dan vibrasi yang berbeda. Walaupun memiliki jenis ikatan yang sama, ikatan-ikatan tersebut berada dalam dua senyawa yang berbeda sehingga mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda (karena kedua ikatan yang sama tersebut berada daam lingkungan yang berbeda).Tabel 2.2 menunjukkan daerah vibrasi ulur beberapa gugus fungsional.

Universitas Sumatera Utara 19

Tabel 2.2. Frekuensi Vibrasi Berbagai Ikatan Frekuensi 4000 2500 2000 1800 1650 1550

(cm-1) 650

Ikatan O-H C=C Hampir C=O C=N C-Cl tidak C-H C=N C=C C-O Ada C=H X=C=Y N=O C-N pita N-H C,N,O,S C-C adsorbs CH C-C

N=O

(Harmita,2009) Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul: a. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan. b. Bending (vibrasi lentur/tekuk): vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O-H itu. Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm-1, energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara vibrasi fundamental (Supratman, 2010).

2.6.3 Spektrospkopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) Spektroskopi resonansi magnet inti proton dapat digunakan untuk menentukan jenis lingkungan atom yang berbeda yang ada dalam molekul, jumlah

Universitas Sumatera Utara 20

atom hidrogen pada masing-masing jenis lingkungan hidrogen, dan jumlah atom hidrogen pada atom karbon tetangga (Harmita,2009). Semua proton dalam molekul yasng identik dalam lingkungan kimia akan memiliki pergerseran kimia yang sama. Dengan demikian, semua proton dari TMS atau semua proton dalam benzena, siklopentana, atau aseton memiliki nilai resonansi yang berdekatan ada ni ai δ. Masing-masing komponen akan memiliki penyerapan yang tunggal dalam spektrum nmr. Proton ini dikatakan sama secara kimia. Pada kenyataannya, spektrum tidak dapat hanya dibedakan dari berapa banyak tipe proton yang berbeda pada molekul tersebut, tetapi dapat memperlihatkan berapa banyak jenis perbedaan yang ada dalam molekul tersebut. Dalam spektrum 1H-NMR, daerah dibawah masing-masing peak adalah proporsional dengan jumlah dari hidrogen yang ada pada peak tersebut (Pavia, 2009). Untuk 1H-NMR, standar pembanding yang direkomendasikan adalah tetra 13 metilsilan [(CH3)4Si/TMS)]. TMS juga dapat digunakan untuk C-NMR. Berikut adalah alasan mengapa TMS digunakan sebagai pembanding. a. Stabil secara kimia, simetris, dan beresonansi pada medan atas (upper field). b. Proton pada gugus metil senyawa ini lebih terperisai dibandingkan proton senyawa lain. c. TMS memberikan sinal yang tajam (singlet), 12 proton. d. Bersifat inert. e. Titik didih rendah sehingga mudah dihilangkan. f. Larut dalam sebagian besar pelarut organik.

g. Tidak larut dalam air atau D2O (Harmita,2009).

Universitas Sumatera Utara BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Sampel yang digunakan dikumpulkan pada bulan Februari 2018 dan diperoleh dari lingkungan Biro Rektor Universitas Sumatera Utara, Medan, Sumatera Utara. Proses Penelitian dilakukan pada bulan Maret 2018 sampai Agustus 2018 di Laboratorium Kimia Bahan Alam Hayati FMIPA Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Pascasarjana Kimia Universitas Sumatera Utara. Analisa Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR), analisis Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometer UV-Visible dilakukan pada bulan September 2018 sampai Oktober 2018 di Laboratorium Kimia Organik Institute Teknologi Bandung jl.Genesha 10 Bandung 40132.

3.2 Alat – alat Spektrofotometer 1H-NMR (Agilent 2NMR 500MHz), Spektrofotometer FT-IR (Shimadzu), Spektrofotometer UV-Vis (Hewlett Packard agilent), Kolom Kromatografi (pyrex), Rotarievaporator ( Heidolph ), Lampu UV ( 254nm/356nm), UVGL5 8), Neraca Analitis (Mettler AE 200), Chamber, Ekstraktor, Alat Destilasi, Corong pisah ( Pyrex ), Corong kaca, Beaker glass, Erlenmeyer, Penangas Air, Gelas Ukur, Pipa Kapiler, statif dan klem, botol vial.

3.3 Bahan Serbuk tumbuhan daun kayu hitam (1800gr), Metanol (Teknis), Eil asetat (Teknis),

Aquadest, n-heksan (Teknis), Silika Gel ( 70 – 230 mesh, E-merck.kgA ), FeCl3 5%,

NaOH 10%, Serbuk Mg, HCl(p) , H2SO4(p), kapas, kloroform (p.a E.Merck), Plat KLT silika gel 60 F254 (E.Merck.Art 554 ), Plat KLT Preparatif 60 F254, Benzene ( P.a Merck ), Aseton ( P.a Merck ).

3.4 Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Kayu Hitam yang dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk sebanyak 1800 g.

Universitas Sumatera Utara 22

3.5 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Kayu Hitam Serbuk kering halus daun tumbuhan kayu hitam dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan uji skrining fitokimia, dengan cara dimasukkan 10 gram serbuk daun tumbuhan kayu hitam yang telah dikeringkan ke dalam gelas Erlenmeyer kemudian ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas erlenmeyer, didiamkan selama 1 malam dimasukkan ekstrak sampel 10 ml ke dalam tabung reaksi.Ditambahkan pereaksi : dengan FeCl3 5% sebanyak 3 tetes menghasilkan larutan berwarna hitam.

3.6 Ekstraksi Daun Tumbuhan Kayu Hitam Serbuk daun tumbuhan kayu hitam ditimbang sebanyak 1800 g, kemudian dimaserasi dengan 8L metanol dalam maserator dan dibiarkan selama 24 jam.Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator,sehingga diperoleh ekstrak metanol. Ekstrak metanol diuapkan diatas Penangas air hingga pelarut metanol habis menguapdan terbentuk ekstrak pekat methanol berbentuk pasta. Ekstrak pekat methanol dilarutkan dengan menggunakan aquadest, Lalu filtrat aquadest di partisi berulang-ulang dengan menggunakan etil asetat untuk memisahkan tannin hingga lapisan etilasetat negatif ketika diuji dengan pereaksi FeCl3. Fraksi etil asetat kemudian di rotarievaporator hingga semua pelarut etil asetat habis menguap. Kemudian fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan diekstraksi partisi secara berulang-ulang dengan menggunakan n-heksana sampai lapisan n-heksana berwarna bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana kemudian dipekatkan kembali dengan menggunakan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat lapisan metanol.

3.7 Analisis Kromatografi Lapis Tipis Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai didalam analisis kromatografi kolom. developer yang digunakan adalah campuran kloroform: metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). 10 ml larutan fase gerak kloroform: metanol (90:10)

⁄ dimasukkan kedalam bejana kromatografi, kemudian developer dijenuhkan.

Universitas Sumatera Utara 23

Ekstrak pekat metanol ditotolkan pada plat KLT . Plat KLT dimasukkan kedalam bejana yang telah berisi developer yang telah dijenuhkan, lalu ditutup dan dielusi hingga pelarut mencapai batas yang telah ditentukan. Plat KLT dikeluarkan dari bejana setelah developer naik keatas sampai batas atas, lalu dikeringkan dan difiksasi dengan pereaksi FeCl3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v).

3.8 Pemisahan Senyawa Fenolik dengan Kromatografi Kolom Pemisahan senyawa fenolik secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fase diam yang digunakan adalah silika gel 40 G(70-230 mesh) dan fase gerak yaitu kloroform 100%, campuran pelarut kloroform: metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). Alat kromatografi kolom dirangkai dan terlebih dahulu dibuburkan silica gel dengan menggunakan pelarut kloroform, kemudian diaduk hingga homogen dan dimasukkan kedalam kolom kromatografi. Dilakukan elusi dengan menggunakan kloroform 100% pada kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 5 gram ekstrak pekat metanol dengan silica gel menggunakan pelarut metanol, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : metanol 90:10 (v/v) secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fase yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fase gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fase gerak kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). hasil yang diperoleh ditampung ke dalam botol vial setiap 10 ml , lalu di KLT dan digabung setiap fraksi dengan harga Rf yang sama kemudian diuji dengan menggunakan FeCl3. Diuapkan sampai terbentuk pasta.

3.9 Pemurnian Pasta dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan pelarut metanol kemudian dilakukan uji KLT untuk mengetahui kemurnian dari senyawa apakah sudah murni

Universitas Sumatera Utara 24

atau belum sekaligus dilakukan untuk mencari fase gerak yang sesuai dalam KLT preparatif. Diperoleh fase gerak kloroform : etil asetat 50:50 (v/v) yang menunjukkan pemisahan yang baik untuk selanjutnya digunakan sebagai penjenuh bejana KLT preparatif. Pasta yang telah dilarutkan dengan metanol ditotolkan secara perlahan-lahan dan sama rata di sepanjang batas bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Kemudian plat tersebut dimasukkan ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan sebelumnya kemudian ditutup. Setelah plat dielusi, dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan hasil diperiksa melalui sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk untuk kemudian dielusi dengan metanol:etil asetat (1:1) v/v. Lalu hasil elusi diuapkan dan dilakukan rekristalisasi dengan pelarut metanol dan n-heksana sehingga diperoleh Kristal kuning.

3.10 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji kemurnian Kristal dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fase diam silika gel 60 F254 dengan fasa gerak kloroform : etil asetat 50:50 (v/v) dan n-heksan : etil asetat 80:20 (v/v) . Dimasukkan 10 ml larutan fase gerak ke dalam bejana kromatografi, lalu dijenuhkan. Ditotolkan kristal yang sebelumnya telah dilarutkan dengan metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut kedalam bejana kromatografi yang telah jenuh. Setelah developer naik sampai batas atas, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl3 5% dalam metanol akan menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa fenolik dan dihitung harga Rf yang diperoleh.

3.11. Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.11.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis dengan alat Spektrofotometer Ultraviolet-Visible (UV-Vis) diperoleh dari Laboratorium kimia Analitik Institut Tehnologi Bandung jl.Genesha 10 Bandung 40132 dengan menggunakan pelarut metanol. Nama Alat : Spektrosfotometer UV-Visible Spesifikasi : Merk Hewlett Packard agilent technologies,8453 series Materials : Quartz Glass, model : QS 104,

Universitas Sumatera Utara 25

Volume : 3.0 mL. Pathlength : 10m Waktu pengerjaan : 11 Oktober 2018 Teknisi Penanggungjawab : Lanang solakhudin

3.11.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) Analisis dengan alat Spektrofotometer Infra Merah (FT-IR) diperoleh dari Laboratorium kimia organik Institut Tehnologi Bandung jl.Genesha 10 Bandung 40132 menggunakan KBr sebagai pelarut. Nama Alat : Spektrosfotometer Infra Mearh ( FT-IR) Spesifikasi : FT-IR merk FTIR prestige 21 shimadzu, AIM - 880 , Detector : DLATGS ( mid – and far-IR ); MCT ( Hg-Cd-Te ) ( mid-IR) ; In gaAs ( NIR) made in Japan Waktu pengerjaan : 10 Oktober 2018 Teknisi Penanggungjawab : Lanang solakhudin

3.11.3 Identifikasi dengan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) Analisis dengan alat Spektrometer 1H-NMR diperoleh dari Laboratorium kimia organik Institut Tehnologi Bandung jl.Genesha 10 Bandung 40132 dengan menggunakan metanol sebagai pelarut. Nama Alat : Spektrosfotometer NMR Spesifikasi : NMR = ( Agilent 500MHz dengan sitem konsol DD2, Frekuensi 500MHz ( 1H ) dan 125 MHz ( 13C). Waktu pengerjaan : 9 oktober 2018 Teknisi Penanggungjawab : Dr. Elvira Hermawati

Universitas Sumatera Utara 26

3.12 Bagan Penelitian 3.12.1 Bagan Skrining Fitokimia

Serbuk Daun Kayu Hitam (Diospyros celebica Bakh) Dimasera dengan metanol Disaring Dimasukkan kedalm tabung reaksi Diamati warna larutan

Larutan Hijau Tua

ditambahkan

pereaksi FeCl3 5% diamati perubahan warna

Koloid berwarna Hitam

positif fenolik

Universitas Sumatera Utara 27

3.12.2 Bagan Isolasi senyawa Fenolik

1800 g serbuk daun tumbuhan kayu hitam ( Diospyrous celebica Bakh )

dimaserasi dengan metanol hingga terendam didiamkan selama 24 jam diulangi hingga 2 kali disaring

ekstrak metanol ampas dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga metanol menguap ekstrak pekat metanol dilarutkan dengan aquadest disaring

Filtrat aquadest residu

diuji dengan FeCl3 5% diekstraksi partisi dengan etil asetat

lapisan etil asetat lapisan aquadest diuji dengan FeCl3 5% dipekatkan dengan rotarievaporator diuapkan hingga pelarut etil asetat menguap dilarutkan dengan metanol

ekstrak metanol diekstraksi partisi dengan n-heksan hingga bening

lapisan metanol lapisan n-heksan diuapkan hingga pelarut metanol habis diuji klt dengan eluen kloroform:metanol (90:10;80:20;70:30;60:40;50:50)v/v dikolom kromatografi dengan fase diam silica gel dan fase gerak kloroform:metanol (90:10;80:20;70:30;60:40;50:50)v/v ditampung tiap fraksi sebanyak 10 ml kedalam botol vial diuji klt untuk mengetahui harga Rf yang sama digabungkan fraksi dengan harga Rf yang sama Rf : - Rf : 0.32 Rf : 0,29 Rf : 0,25 Rf: 0,21 Ff : 0

fraksi 93-102 fraksi 102-112 fraksi 113-138 fraksi 1-16 fraksi 17-37 fraksi 38-92 diuji dengan diuji dengan diuji dengan diuji dengan diuji dengan diuji dengan FeCl3 5% FeCl3 5% FeCl 5% FeCl3 5% FeCl3 5% FeCl 5% 3 3 hasil positif hasil positif hasil positif hasil positif hasil negatif hasil positif dianalisis kromatografi lapis tipis dengan eluen kloroform: etil asetat (80:20)(v/v) dipreparatif dengan fase diam silika gel dan fase gerak kloroform: etil asetat (50:50)(v/v) dikeringkan disinari dibawah lampu UV digerus dari plat dilarutkan dengan campuran metanol:etil asetat 1:1 disaring

diuapkan direkristalisasi

senyawa murni dianalisis kromatografi lapis tipis diuapkan dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer Inframerah (FT-IR), spektrofotometer H-NMR

hasil analisis

Universitas Sumatera Utara BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Pendahuluan dan Isolasi senyawa Fenolik Dari hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol daun tumbuhan kayu hitam menggunakan pereaksi FeCl3 5%, menunjukkan bahwa ekstrak methanol daun kayu hitam positif mengandung senyawa fenolik. Dari hasil isolasi senyawa fenolik daun tumbuhan kayu hitam dimulai dari proses ekstraksi maserasi diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 209,63 g kemudian dilarutkan dengan menggunakan pelarut aquadest untuk pemisahan senyawa yang bersifat nonpolar lalu dipartisi dengan menggunakan pelarut etil asetat sehingga diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 32,25 g. ekstrak pekat etil asetat yang diperoleh kemudian dilarutkan dengan methanol lalu dipartisi kembali dengan menggunakan pelarut n-heksan hingga diperoleh 12 g. Dari hasil kromatografi lapis tipis, diketahui bahwa perbandingan pelarut yang baik untuk mengisolasi senyawa fenolik dari daun tumbuhan daun kayu hitam adalah kloroform : metanol 80:20 (v/v) yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari noda yang dihasilkan. Hal ini dibuktikkan dengan analisis KLT yang menunjukkan adanya empat noda dengan jarak pisah antar noda yang baik. Setelah pemisahan dengan kromatografi kolom dengan menggunakan eluen kloroform : methanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v), kemudian dilakukan analisis KLT untuk penggabungan fraksi dan didapatkan 5 fraksi, dimana fraksi yang dilanjutkan adalah fraksi 38 – 92 sebanyak 100 mg lalu dianalisis KLT kembali dengan sistem pelarut kloroform : etil asetat 80:20 (v/v), yang selanjutnya di Kromatografi Lapis Tipis Preparatif dengan sistem pelarut yang cocok adalah kloroform : etil asetat 50:50 (v/v), diamati dengan lampu UV , lalu diambil noda dari batas atas, kemudian silika gel dikerok dan dielusi dengan perbandingan pelarut metanol : etil asetat 1:1 (v/v). Senyawa yang diperoleh kemudian dimurnikan kembali dengan rekristalisasi menggunakan pelarut aseton dan n-heksan, kemudian diuji kemurniannya dengan menggunakan pelarut kloroform : etil asetat 50:50 (v/v) yang menunjukkan satu noda pada senyawa yang dihasilkan dengan

Universitas Sumatera Utara 29

harga Rf sebesar 0,45.Kemudian diuapkan dan didapatkan Kristal berwarna kuning sebanyak 7,5 gr yang ditunjukkan pada gambar 4.1.

Gambar 4.1 senyawa Hasil Isolasi.

4.2 Hasil Identifikasi Senyawa Hasil isolasi Senyawa hasil isolasi di identifikasi dengan UV-Visible dengan menggunakan pelarut metanol untuk menentukan panjang gelombang ditunjukkan oleh Spektrum UV-Visible pada Gambar 4.2.

Gambar 4.2 Spektrum UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi.

Universitas Sumatera Utara 30

Tabel 4.1 Panjang Gelombang UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi Wavelength (nm) Abs 290 nm 0.0735

Berdasarkan Hasil analisis UV-Visible diperoleh spektrum UV-Visible dengan pelarut metanol memberikan panjang Gelombang adalah 290 nm, dimana panjang gelombang ini mendekati panjang gelombang senyawa fenolik dari metil galat secara teori yaitu dengan panjang gelombang 285 nm.

O OCH3

HO OH

Kromofor Induk = 246 nm m OH 2 X 7 = 14 nm p OH = 25 nm ʎ max = 285 nm Berdasarkan hasil perhitungan ʎ max senyawa hasil isolasi sesuai dengan ʎ max senyawa pembanding yaitu asam galat ( Pavia, 2001 ).

Universitas Sumatera Utara 31

Untuk menentukan gugus fungsi dari senyawa tersebut dilihat dari hasil analisis Spektrofotometer FT-IR dengan memberikan pergesaran kimia pada daerah (ppm) seperti Gambar 4.3 :

Gambar 4.3 Spektrum Inframerah Merah (FT-IR) Senyawa Hasil Isolasi.

Hasil Analisis spektrofotometer FT-IR dari Kristal hasil isolasi menghasilkan pita-pita serapan ditunjukkan pada Tabel 4.2 .

Tabel 4.2 Hasil Analisis Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Bilangan Gugus fungsi Bilangan Gelombang Intensitas Gelombang (pavia et all,1979 ) 3468.01 3600-3200 Tajam Vibrasi ulur OH Vibrasi ulur C-H Aromatis 3311,78 3550-3200 Sedang Vibrasi Tekuk C-H 767,6 870 – 675 Tajam Aromatis

2980 – 2800 Tajam Vibrasi ulur C-H alifatis 2953.02

Universitas Sumatera Utara 32

1618,28 1600 – 1475 Tajam Vibrasi ulur C=C aromatis 1313,52 1450 – 1375 Tajam Vibrasi tekuk C-H alifatis 1440,83 1470 – 1350 Tajam Vibrasi Tekuk C – H Alifatis 1251,80 1300 – 1000 Tajam Vibrasi ulur C-O Vibrasi ulur C=O 1695 1800 – 1640 Tajam Karboksil

Berdasarkan hasil analisa FT-IR bahwa didalam senyawa tersebut diperoleh spektrum inframerah pada bilangan gelombang 3468.01 cm-1 dengan puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur O-H, dalam literatur menunjukkan vibrasi ulur O-H adalah lebar namun dalam spekrum ini terlihat tajam hal ini terjadi karena bertumpang tindih dengan vibrasi ulur C-H aromatis, Pada bilangan gelombang 3311,78 menunjukkan vibrasi ulur C-H Aromatis yang didukung oleh vibrasi tekuk C-H aromatis pada bilangan gelombang 767,6. Pada bilangan gelombang 2953,02 dengan puncak tajam menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H Alifatis yang didukung oleh C-H tekuk pada bilangan gelombang 1440,83. Pada bilangan gelombang1618,28 menunjukkan adanya vibrasi ulur C=C Aromatis . Dalam senyawa yang dianalisis juga terdapat gugus C-O alkohol pada bilangan gelombang 1251,80 dengan puncak tajam dan pada bilangan gelombang 1695 dengan puncak tajam menunjukkan gugus C=O karboksil.

Untuk menentukan Jumlah proton dan pergeseran Kimia pada daerah (ppm) dapat dilihat dari Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) pada daerah (ppm) seperti Gambar 4.4

Universitas Sumatera Utara 33

Gambar 4.4 Hasil analisis Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton.

Senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol dan TMS sebagai standar yang memberikan signal-signal pergeseran kimia dengan penjelasan pada Tabel 4.3. Tabel 4.3 Pergeseran Kimia 1H-NMR Senyawa Hasil Isolasi Atom H δ H Senyawa Hasil Isolasi (ppm) δ H Senyawa pembanding(ppm)

H-2, H-6 7,0403 7.0

H dari OCH3 3,8122 3,8

Berdasarakan Hasil analisis Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR) diperoleh Pergeseran kimia ada daerah δ 7,0403 terda at uncak singlet menunjukkan proton dari H-2 dan H-6, Puncak singlet ditunjukkan karena memiliki lingkungan kimia yang sama sehingga memiliki peregesaran kimia yang sama,. proton H dari OCH3 ditunjukkan pada pergeseran kimia pada daerah δ =

3,8122 tedapat puncak Singlet..

Universitas Sumatera Utara 34

Berdasarkan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UV-Visible, Spektrum Inframerah (FT-IR), Spektrum 1H-NMR disimpulkan bahwa besar kemungkinan Senyawa yang diisolasi dari daun tumbuhan kayu hitam adalah senyawa fenolik golongan metil galat seperti pada gambar 4.4 . Hal ini dapat didukung dengan spektrum H-NMR Pembanding ( Lampiran 6 )

O OCH3

1 H 2 H 6 3 5 HO 4 OH

OH Gambar 4.4 senyawa metil galat

Universitas Sumatera Utara BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1. Kesimpulan 1. Senyawa fenolik daun tumbuhan kayu hitam diisolasi dengan cara ekstraksi maserasi dengan metanol, Ekstrak metanol dilarutkan dengan aquadest dan filtrat aquadest dipartisi dengan etil asetat. Ekstrak etil asetat dilarutkan dengan metanol kemudian dipartisi dengan n-heksan. Ekstrak metanol ( Fenolik total ) dipisahkan dengan kromatografi kolom menggunakan eluen kloroform : metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). Senyawa yang diperoleh dimurnikan dengan kromatografi lapis tipis prefaratif, menghasilkan Kristal kuning sebanyak 7,5 mg dengan harga Rf sebesar 0,45. 2. Dari hasil Isolasi daun tumbuhan kayu hitam dan identifikasi senyawa dengan spektrofotometer UV-Visible,Spektrofotometer Inframerah ( FT-IR) dan Spektrofotometer Magnetik Inti Proton ( 1H-NMR ) yang menunjukkan senyawa fenolik yaitu diduga senyawa Metil Galat merupakan golongan asam fenolat.

5.2. Saran Untuk lebih mendukung struktur senyawa fenolik hasil isolasi, maka sebaiknya perlu dilakukan analisis Spektrofotometer Karbon (13C-NMR) dan Spektrofotometer Massa (MS).

Universitas Sumatera Utara DAFTAR PUSTAKA

Agoes G. 2007. Teknologi Bahan Alam. ITB Press ; Bandung Alwi,M. 2010. Ekstrak Serbuk Gergaji Kayu Eboni (Diospyros celebica Bakh.) Sebagai Fungisida Terhadap Phytophthora palmivora Butler.Palu : Universitas Tadulako ( Skripsi )

Andersen, M., Markham, K.R. 2006. Flavonoids. Taylor & Francis Group. New York.

Alvarez, M.2014. Plant Biotechnology for Health. Springer. New York. Cannell, R.J. 1998. Natural Product Isolation. Humana Press Inc. New Jersey Cheynier V, Comte G,Davies KM.2013.Plant Phenolic : Recent Advances on their Biosinthedid,Genetics, and echophiciology. Plant physiology and Biochemis try.71 : 1-20

Gusmiati,et all.2017. High Outcrossing Rate and Pollen Dispersal Distance of Di ospyros celebica Bakh. (ebeneceae), an endemic Tree Spesies In sulawes islan I, Indonesia .universitas Hassanudin, Makasar. ( Journal )

Gritter, R.J., Bobbit,J.M., Schwarting, A.E. 1991. Pengantar Kromatografi. Edisi Kedua. Penerbit ITB. Bandung Harbone,J.B. 1987. Metode Fitokimia. Terbitan Kedua. Penerbit ITB. Bandung Harmita. 2009. Analisis Fisikokimia. Volume 1 dan 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta Hisham,MN.,Lip MJ.,Noh MJ.,Normah A., Nabila MF., 2011. Identification and Isolation Of Methyl Galate As A Polar Chemical Marker For Lobisia Pumila Benth. Heinrinch,M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamson, E.M. 2010. Farmakognosi dan Fitoterapi.Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta Hostettmann, K., Hostettmann, M., Marston, A. 1995. Cara Kromatografi Preparatif, Penggunaan Pada Senyawa Bahan Alam. Penerbit ITB. Bandung Kristanti,A,N,Aminah,N.S, Tanjung.M.,2002, Buku Ajar Fitokimia ,Airlangga university press,Surabaya Manito,P.1981.Biosintesis Produk Alami. Terjemahan Koensoemardiyah. Semarang : IKIP Semarang Press. Markham,K.R.1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoida. Terjemahan Kosasi Padmawinata. Bandung :ITB Press.

Universitas Sumatera Utara 37

Nakanishi, K., Goto, T., Ito, S., Natori, S., Nosoe, S. 1974. Natural Product Chemistry. Volume 1. Kodansha Ltd Academic Press. Tokyo

Nollet,L.M.2015.Handbook of food Analysis,volume 1.CRC Press,Taylor & Francis Group.Fidel Toldra.

Pengelly,W.L.,Vuayaraghavan,S.J.,Sciaky, D. 1986.Neoplastic Progression in Crown gall in Tobacco Without Elevated Auxin Level.Planta.

Pavia, D.L., Lampman, G.M.,Kriz, G.S. 2009. Introduction to Spectroscopy: A Guide for Students of Organic Chemistry. Saunders College. Philadelphia Perry LM, Medicinal Plants of East and South East Asia, Attributed properties and Uses, IT Press, London. 1980. Pp 23-24

PrayitnoT.A., 2016. Sifat Kimia Kayu Eboni pada Perbedaan PolaStri dan Arah Radial (Chemical Properties of Diospyros celebica Bakh.in Different Streaks Pattern and Radial Direction).UGM.Yogyakarta. ( Journal )

Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Edisi Keenam. Penerbit ITB. Bandung. Rohman, A. 2009. Kromatografi untuk Analisis Obat. Graha Ilmu. Yogyakkarta. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Gadjah Mada University Press. Yogyakarta. Sitorus, M. 2009. Spektroskopi. Elusidasi Struktur Molekul Organik. Graha Ilmu. Yogyakarta. Sudjadi, 1986. Metode Pemisahan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Penerbit Widya Padjajaran. Bandung. Sirait,M,2007.,Penuntuk Fitokimia Dalam Farmasi.Bandung : penerbit ITB. Sastrohamidjojo, H. 1996. Sintesis Bahan Alam. Yogyakarta ; Gadjah Mada University Press

Syam,A,K,2007., Uji Toksititas Akut Ekstak Etanol Daun Kayu Hitam (Diospyros celebica B.) Terhadap Mencit (Mus musculus). Samata-Gowa ( Skripsi ) . Tjitrosoepomo, gembong. 2013. Taksonssomi Tumbuhan . Yogyakarta : UGM Vermerris,Wand Nicholson,2006, phenolic Compound Biochemistry,springer, The Netherlands. Voigt R. 1994. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi ke-5. Diterjemahkan oleh: Dr. Soendani Noerono. Yogyakarta ; Gajah Mada University Press

Universitas Sumatera Utara 38

Lampiran 1. Hasil Determinasi daun Tumbuhan Kayu Hitam

Universitas Sumatera Utara 39

Lampiran 2. Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat Daun Tumbuhan Kayu Hitam (Diospyros Celebica Bakh.) sebelum kromatografi kolom dengan eluen kloroform : methanol 80:20

Keterangan :

Fase diam : Kieselgel 60 F254 E : Ekstrak pekat lapisan Metanol Daun Tumbuhan Kayu Hitam No Fase Gerak Jumlah Noda Rf 1 Kloroform : Metanol (80 : 20) v/v 4 0,67 0,43 0,27 0,14

Universitas Sumatera Utara 40

Lampiran 3. Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat daun tumbuhan kayu hitam penggabungan fraksi.

E E E E E

I II III IV V

Keterangan :

Fase diam : Kieselgel 60 F254 E : Fraksi pekat Daun Tumbuhan Kayu Hitam No Fraksi Jumlah Noda Rf I 17-37 1 0,32 II 38-92 1 0,29 III 93-102 1 0,25 IV 103-112 1 0,21 V 113-180 1 0

Universitas Sumatera Utara 41

Lampiran 4. Kromatogram lapis tipis Ekstrak Pekat daun tumbuhan kayu hitam (Diospyros celebica Bakh .) Sebelum Preparatif.

Keterangan :

Fase diam : Kieselgel 60 F254 E : Fraksi III Daun Tumbuhan Kayu Hitam (Diospyros Celebica Bakh) No Fase Gerak Jumlah Noda Rf

1 Kloroform : Etil Asetat (50:50) v/v 3 0,54

Universitas Sumatera Utara 42

Lampiran 5. Kromatogram lapis tipis senyawa Murni hasil isolasi

I II

Keterangan :

Fase diam : Kieselgel 60 F254 E : Fraksi kristal hasil Isolasi No Fase Gerak Jumlah Noda Rf

1 Kloroform : Etil Asetat (50:50) v/v 1 0,45

2 n:heksan : etil asetat 1 0,18

Universitas Sumatera Utara 43

Lampiran 6 . Spektrum 1H-NMR Senyawa Pembanding ( Hisham,et al, 2011 )

O OCH3

H 1 2 H 6 3 5 HO 4 OH OH

Universitas Sumatera Utara