N° d’ordre : 68/2012-M/S.B. République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediène

Faculté des Sciences Biologiques

Mémoire présenté par ZIZI Madjid

En vue de l’obtention du diplôme de

Magister

en Sciences Biologiques Spécialité : Ecologie Forestière

Sujet

Les légumineuses ligneuses d’Algérie Description, distribution et statut symbiotique

Soutenu publiquement le 24 juin 2012 devant le jury composé de

Mme Bouguedoura N. Professeur.à USTHB Président

Mr Amrani S. Maître de Conférences A à l’USTHB Directeur de thèse

Mlle Aïd F. Professeur.à USTHB Examinateur

Mr Hanifi N. Maître de Conférences A à l’USTHB Examinateur Résumé

Quarante neuf (49) légumineuses ligneuses ont été introduites, acclimatées avec succès et propagées à plus ou moins grande échelle en Algérie. Ces légumineuses ligneuses représentées par ordre d’importance par des arbres et des arbustes grimpants ou non, sont représentées par 12 Caesalpinieae, 26 Mimosoideae et 11 Papilionaceae qui présentent une intérêt horticole ou forestier. Des prospections portant sur 61 sites et 16 pépinières indiquent que la plupart de ces espèces de légumineuses ligneuses introduites peuvent être rencontrées aujourd’hui en Algérie. Quelques unes qui ne sont que faiblement représentées. D’autres sont devenues des composantes essentielles de la flore ligneuse Algérienne tout au moins au nord du pays où elles sont implantées en grand nombre pour la protection des pentes (routes, autoroutes, barrages…) ou pour des opérations de boisement et de reboisement. L’étude de la diversité phénotypique de 36 souches de rhizobia associées au niveau de quelques pépinières aux espèces d’acacias introduites les plus fréquentes en Algérie a permis de mettre en évidence leur grande diversité sur le plan de leur spectre d’hôte et de leur profil phénotypique. Elles sont représentées par des souches à croissance lente apparentées à Bradyrhizobium japonicum et des souches à croissance rapide qui ont été affiliées à Sinorhizobium meliloti et Rhizobium leguminosarum. En raison de la pauvreté de la flore algérienne en légumineuses ligneuses autochtones, celles introduites devraient faire l’objet d’une attention particulière car en tant qu’espèces acclimatées elles font partie intégrante de la diversité floristique algérienne et méritent d’être promues, valorisées et conservées au même titre que les espèces autochtones. Liste des tableaux

Tableau I : Liste des principaux organismes fixateurs d’azote et de leur symbiote végétal dans le cas des fixateurs symbiotiques (compilation à partir de sources multiples)...... 7

Tableau II : Distribution actuelle des bactéries nodulant les légumineuses au sein des classes de proéobactéries ...... 15

Tableau III : Liste des espèces de légumineuses ligneuses introduites référencées par Maire (1987). Les espèces signalées par une étoile au niveau de la dernière colonne ont subi des changements nomenclaturaux et/ou systématiques...... 45

Tableau IV : Taxons de légumineuses ligneuses introduites ayant été affectés par des changements nomenclaturaux ou systématiques par rapport aux données de la flore de Maire (1987)...... 47

Tableau V : liste des 6 espèces de légumineuses ligneuses non référencées par Maire (1987) que nous avons rencontré lors de nos campagnes de prospection...... 48

Tableau VI : Prévalence des légumineuses ligneuses introduites au niveau des 61 sites prospectés. La colonne présence donne le nombre de sites au niveau desquels une espèce donnée a été rencontrée...... 50

Tableau VII: Production des légumineuses ligneuses introduites au niveau du panel des 16 pépinières retenues. Les espèces massivement produites sont surlignées en gris...... 54

Tableau VIII : Prévalence de la symbiose à rhizobia et de la fixation symbiotique de l’azote chez les légumineuses ligneuses produites en pépinières...... 57

Tableau IX : Caractères des nodules observés sur le système racinaire des légumineuses ligneuses produites en pépinières ...... 59

Tableau X : Nombre de jours d’incubation à 25°C nécessaires aux 36 souches associées aux acacias pour former des colonies visibles à l’œil nu sur milieu YEMA-RC réparti en boîtes de Petri...... 61

Tableau XII : Comportement symbiotique des 36 souches de rhizobia associées à Acacia saligna vis-à-vis de 5 autres espèces du genre Acacia ...... 63

Tableau XI: Résultats des tests de nodulation réalisés pour authentifier les isolats nodulaires obtenus à partir des 6 espèces d’acacias retenues ...... 66 Liste des figures

Figure 1 - Mécanisme de réduction de l’azote moléculaire (N2) en ammoniac (NH4) par la nitrogénase...... 5

Figure 2: Diversité des symbiose fixatrices d’azote. Exemples de symbioses non- nodulaires : symbiose Azolla-Anabeana et lichens fixateurs d’azote...... 9

Figure 3: Diversité des symbiose fixatrices d’azote. Exemples de symbioses nodulaires : symbiose actinobactéries (Frankia)-Plantes actinorhiziennes et rhizobia-légumineuses...... 10

Figure 4: Diversité morphologique des bactéries nodulant les légumineuses...... 14

Figure 5: Diversité de la morphologie de la gousse (légume) chez les légumineuses ...... 17

Figure 6 : Diversité de l’inflorescence chez les légumineuses...... 18

Figure 7: Photographies montrant des représentants des nouvelles subdivisions génériques des acacias telles qu'entérinées par l'IBC (International Botanical Congress) sur proposition de Orchard et Maslin (2003)...... 20

Figure 8: Représentants autochtones du genre Acacia sensu lato en Algérie. Pour compléter l’aperçu Faidherbia albida longtemps connu sous le nom d’Acacia albida a été représenté sur la planche...... 22

Figure 9 : Comparaison entre les deux voies d’invasion de la racine par les bactéries...... 24

Figure 10 : Structure des nodules chez les légumineuses...... 25

Figure 11 : Cycle Glutamine Synthétase/Glutamine – Oxoglutarate Aminotransférase (GS-GOGAT) qui permet l’incorporation de l’azote fixé par les nodules à rhizobia dans le métabolisme de la cellule végétale...... 28

Figure 12: Archives et flores utilisées pour l’inventaire et la détermination des légumineuses ligneuses arborées ou arborescentes introduites en Algérie...... 34

Figure 13 : Plaque de microtitration utilisée pour la détermination des caractères phénétiques des souches de rhizobia associées à quelques espéces d'acacias...... 39

Figure 15 : Dendrogramme montrant les relations existant entre les différentes souches de rhizobia en fonction de leur spectre d’hôte...... 67

Figure 16 : Dendrogramme montrant les relations existant entre les différentes souches de rhizobia en fonction du degré de sililitude de leur profil phénotypique...... 69 Sommaire

Introduction ...... 01

Rappels Bibliographiques ...... 05 1- La fixation biologique de l'azote et les organismes fixateurs d’azote...... 05 1-1 La fixation biologique de l’azote...... 05 1-2 Les organismes fixateurs d’azote ...... 07 2- Les symbioses fixatrices d’azote chez les plantes...... 09 3- La symbiose rhizobia-légumineuses...... 13 3-2- Le partenaire végétal : Les légumineuses...... 14 3-3 Le genre Acacia...... 20 3-3-1. - Le genre Acacia en Algérie ...... 20 3-4- Établissement de la symbiose...... 22 3-4-1 Infection de la racine...... 24 A- Infection intracellulaire...... 24 B- Infection intercellulaire ou entrée par fissure (= "crack entry" )...... 24 3-4-2. Mécanismes de reconnaissance et nodulines précoces...... 25 3.4.3. Formation du nodule...... 26 3-4-4 Structure et développement du nodule...... 27 3-4-5 Fonctionnement des nodules...... 28 3-5. Particularités de la symbiose chez les espèces ligneuses ...... 30

Matériel et Méthodes...... 33 1 - Matériel...... 33 1–2 Matériel biologique...... 33 1-2-1 Plants et graines de légumineuses...... 33 1-2-2- Souches bactériennes...... 33 1-2 Milieux de culture ...... 34 2 - Méthodes...... 35 2-1 Inventaire «théorique» des légumineuses ligneuses introduites en Algérie...... 35 2-2 Prospections...... 35 2-3 Identification des légumineuses...... 35 2-4 Extraction, isolement et purification des souches ...... 35 2-4-1 Collecte des nodules de légumineuse...... 35 2-4-2 Extraction ...... 37 2-4-3 Isolement et purification ...... 37 2-4-4 Conservation des souches ...... 37 2- 5 Authentification des isolats et détermination de leur spectre d'hôte...... 37 2-5-1 Production de plants d’acacias au laboratoire ...... 38 Scarification des semences ...... 38 Désinfection superficielle des semences ...... 38 Substrat utilisé pour la culture des acacias ...... 38 Conditions de culture ...... 38 Inoculation des plantules...... 39 2-5-2 Tests de nodulation ...... 39 2-6 Détermination des caractéristiques des souches de rhizobia ...... 40 2-6-1 Le système micro-galerie ...... 40 2-6-2 Tests retenus pour la caractérisation phénotypique des souches : ...... 42 2-7 Traitement numérique des profils phénotypiques des souches ...... 43 2-7-1 La taxonomie numérique : Définition et principe...... 43 2-7-2 La similitude et l’indice de similitude ...... 45 2-7-3 Représentation graphique (Clustering) : ...... 45 2-7-4 La méthode UPGMA ...... 45 2-7-5 Les étapes de la méthode ...... 45 2-8 Logiciels ...... 45

Résultats et Discussion...... 47 1- Les légumineuses ligneuses introduites en Algérie d’après Maire (1987) ...... 47 2- Les légumineuses ligneuses introduites rencontrèes aujourd’hui en Algérie...... 52 3 – Les légumineuses ligneuses introduites en Algérie et produites en pépinières ...... 55 4 – Prévalence de la symbiose à rhizobia chez les légumineuses ligneuses introduites produites en pépinières ...... 58 5 – Etude de la diversité de quelques souches de rhizobia associés à des espèces du genre Acacia...63 5-1 Extraction et authentification des isolats nodulaires ...... 63 5-2 Authentification des isolats nodulaires ...... 65 5-3 Caractéristiques symbiotiques des souches...... 67 6 – Diversité phénotypique des souches de rhizobia associées à des espèces d’acacias introduits...... 69

Conclusion...... 70

Références Bibliographiques ...... 71

Annexes ...... 84

Annexe 1 : Liste des sites de prospection visités pour dresser l’inventaire des légumineuses ligneuses introduites présentes aujourd’hui en Algérie...... 84 Annexe 2 : Liste des caractères physiologiques, biochimiques et de résistance utilisés pour la caractérisation des souches de rhizobia associées aux espèces d’acacias introduits les plus fréquents en Algérie...... 86 Introduction Dans les sols, les formes d'azote assimilables par les plantes sont souvent très faiblement représentées (1g/kg de terre pour les sols les plus riches) ce qui fait que cet élément, est après l’eau, le principal facteur limitant la croissance des végétaux (Vance, 2001). L’élément azote est pourtant très abondant dans la biosphère puisque près de 80% de l'atmosphère est constituée d’azote moléculaire (N2). Ce paradoxe résulte du fait que la quasi-totalité des organismes de la biosphère est incapable d’utiliser l’azote sous sa forme moléculaire. Les seuls organismes capables d’utiliser l’azote sous cette forme sont représentés par un infime groupe de bactéries qualifiées de fixatrices d’azote ou diazotrophes qui possèdent tous une nitrogénase, un complexe enzymatique qui permet de réduire l’azote moléculaire en ammoniac (NH4).

Cette propriété rare, qui serait, en fait, un mode de respiration ancestral (Boyd et al., 2010), fait des diazotrophes un groupe bactérien fondamental pour le fonctionnement de la biosphère puisque, c’est uniquement par leur biais que la biosphère peut s’enrichir en azote ou tout au moins compenser les pertes d'azote combiné organique ou minéral occasionnées par la dénitrification.

Les végétaux ont appris au cours de l’évolution à profiter du potentiel de fixation d’azote des diazotrophes pour améliorer leur nutrition azotée en utilisant l’ammoniac résultant de l’activité de la nitrogénasique des diazotrophes présents dans sa rhizosphère ou sa phyllosphère (Kneip et al., 2007). En raison du fait que le coût énergétique de la fixation d’azote est très élevé et qu’il est difficile aux diazotrophes de l’assumer tous seuls en réduisant des quantités consistantes d’azote moléculaire (Vitousek et al., 2002), les plantes et les bactéries fixatrices d’azote ont convergé vers des associations plus ou moins étroites tendant à mettre en commun leurs capacités métaboliques respectives pour un bénéfice réciproque (Gitig, 2010). Quand cette association est très étroite et qu’elle se traduit par la formation d’un organe spécialisé hébergeant les bactéries, le nodule ou nodosité, on parle de symbiose ou d’endosymbiose fixatrice d’azote.

Deux groupes importants de végétaux forment des symbioses nodulaires avec des bactéries diazotrophes : les légumineuses qui s'associent aux rhizobia et les plantes actinorhiziennes qui s’associent avec les bactéries du genre Frankia (Dawson, 2007). Dans les deux cas, la symbiose avec les bactéries aboutit à la formation d'un organe nouveau au niveau des racines ou plus rarement au niveau des tiges, le nodule fixateur d'azote. Dans les nodules, les bactéries protégées et nourries par la plante lui fournissent en échange de l'azote fixé. Ces symbioses constituent en fait un couplage métabolique entre le pouvoir photosynthétique de la plante et la diazotrophie de la bactérie qui peut ainsi s’exprimer

1 pleinement puisque les besoins énergétiques considérables requis pour réduire l’azote moléculaire sont satisfaits (Minchin, 2005). Parmi les symbioses fixatrices d’azote, la symbiose rhizobia-légumineuses est de loin le système biologique fixateur d'azote le plus efficient puisqu'on considère que sur les 200 millions de tonnes d'azote fixées annuellement par voie biologique, 150 à 175 millions de tonnes seraient uniquement le fait de cette symbiose (Postgate, 1982).

L'intérêt agronomique de la symbiose rhizobia-légumineuses est connu depuis longtemps par le biais des rotations et des cultures mixtes car elle permet d'augmenter ou tout ou moins de maintenir le niveau de fertilité des sols. Un champ de luzerne ou de trèfle peut fixer par exemple jusqu'à 400 kg d'azote par hectare et par an dont 200 kg demeurent dans le sol après la récolte (Newton, 2007 ; Stacey, 2007). La quantité d'azote laissée au sol par les cultures de légumineuse peut couvrir les besoins des cultures qui nécessitent beaucoup d'azote comme c'est le cas pour le blé (Stacey, 2007).

Dans l’optique de l’utilisation de cette symbiose pour restaurer, maintenir ou améliorer la fertilité azotés des agrosystèmes et des milieux naturels dégradés ou appauvris nous nous sommes intéressés dans le cadre de ce travail aux légumineuses arborées ou arborescentes dont l’utilisation pour maintenir, restaurer ou augmenter le niveau de fertilité des sols présente, comme nous l’exposerons plus loin, un certain nombre d’avantages par rapport aux espèces herbacées.

Les légumineuses arborées ou arborescentes que l’on rencontre en Algérie sont représentées par une quarantaine d’espèces. On rencontre aujourd'hui dans la flore forestière, urbaine et suburbaine (Forêts aménagées, parcs, jardins, avenues…) du Nord de d’Algérie une quarantaine d'espèces de légumineuses ligneuses représentées par des arbres, des arbustes, des arbrisseaux ou des lianes.

A l’exception de trois caesalpiniées : Ceratonia siliqua (caroubier), Senna alexandrina et Bauhinia rufescens et de sept (07) mimosoïdées représentants les genres Acacia, Faidherbia et Prosopis, ces légumineuses ligneuses sont exotiques c'est-à-dire qu'elles ont été introduites à partir d'autres régions du monde et acclimatées (Maire 1989).

Ces légumineuses ligneuses sont essentiellement représentées par des espèces introduites lors de la colonisation française de notre pays comme plantes d'ornement ou d’espèces forestières et certaines, qui ont été propagées à grande échelle comme c’est le cas de certains acacias, surtout australiens (Acacia saligna (= A. cyanophylla), Acacia longifolia, Acacia melanoxylon) ou encore d’autres espèces comme Leucaena leucocephala, Robinia pseudoacacia..., sont devenues des composantes importantes de la flore algérienne.

Malgré l’importance de ces espèces en horticulture, en foresterie et en aménagement du territoire, leur statut symbiotique, c'est-à-dire leur aptitude à contracter une symbiose fixatrice d’azote avec la flore rhizobienne des sols d’Algérie est dans la plupart des cas 2 inconnu alors que cette propriété est très importante puisqu'elle confère aux représentants de ce groupe végétal la capacité de se développer sur des sols carencés en azote qu'elles enrichissent par la suite en cet élément. C’est pour cette raison que nous avons jugé pertinent de réaliser cette étude préliminaire sur la prévalence de la symbiose à rhizobia au niveau de la flore des légumineuses ligneuses introduites en Algérie. Les objectifs assignés à cette étude préliminaire sont : - de dresser l’inventaire des espèces de légumineuses ligneuses qui ont été introduites et acclimatées en Algérie et vérifier si elles sont toujours présentes - d’évaluer dans la mesure du possible leur distribution actuelle sur le terrain et l’importance de leur production au niveau des pépinières. - de déterminer sur les espèces pour lesquelles nous disposons de jeunes plants si celles-ci sont capables d’établir une symbiose fixatrice d’azote avec les rhizobia des sols d’Algérie. - de constituer une collection de souches de rhizobia qui sont associées aux légumineuses ligneuses introduites les mieux représentées - de caractériser ces souches sur le plan phénotypique afin d'appréhender leur diversité voire déterminer au niveau générique leur identité. Nos résultats permettront d’une part d’évaluer le potentiel fertilisant que représentent ce groupe de plantes et d’autre part d’orienter les travaux des membres de l’équipe légumineuses ligneuses du laboratoire de biologie et physiologie des organismes vers les espèces les plus répandues et les plus massivement produites en pépinières qui sont à même de contribuer le plus significativement à l’amélioration du niveau de fertilité azotée des sols cultivés, des espaces naturels ou encore des sites revégétalisés en Algérie.

3 Rappels bibliographiques 1- La fixation biologique de l'azote et les organismes fixateurs d’azote

1-1 La fixation biologique de l’azote Après l'eau, l'azote est l’élément qui limite le plus la croissance végétale, ce qui est en apparente contradiction avec les très larges quantités d'azote existant sur terre, dans les roches, les sédiments et dans l'atmosphère. En fait la plupart de cet azote est difficilement accessible pour les plantes car elles ne peuvent absorber cet élément que sous des formes combinées comme les nitrate (NO3-) ou l’ammoniac (NH4+). Or les sols contiennent des quantités relativement limitées d'azote assimilable (1,1 à 1,4 1016g) par rapport aux besoins des végétaux dont la biomasse représente environ 1,6 1016g d'azote. De plus, la nitrification et la dénitrification réalisée par des bactéries du sol consomment continuellement une partie de cet azote disponible et le transforment en azote moléculaire

(N2 ou diazote gazeux). Par conséquent, des apports continus en azote sous forme combinée (nitrate et ammonium) sont donc nécessaires pour compenser la dénitrification et assurer les besoins des végétaux (Postgate 1980). La fixation biologique de l'azote atmosphérique constitue le principal mécanisme d'incorporation d'azote fixé dans la biosphère, elle incorpore tous les ans 1-2 1014g d'azote. À titre de comparaison, seulement la moitié de cette quantité est fixée industriellement par le biais du procédé Haber-Bosch de réduction de l’azote méléculaire en ammonicac (Postgate 1980). La fixation biologique de l'azote atmosphérique est catalysée par un complexe enzymatique appellé nitrogénase ou complexe nitrogénasique (EC 1.18.6.1). Cette enzyme qui n’a été mise en évidence uniquement chez des procaryotes (Eubactéries et Archaebactéries) est capable de catalyser la réduction de l’azote moléculaire selon la réaction suivante :

N2 + (6+2n)H+ +(6+2n)e- + p(6+2n)ATP  2 NH3 + nH2 +p(6+2n)ADP +p(6+2n)P (n = nombre de môles d’hydrogène ; p = nombre de môles d’ATP)

Le complexe nitrogénase peut également réduire les protons en dihydrogène. La quantité d'ATP nécessaire étant variable suivant les conditions, la stoechiométrie exacte de la réaction reste encore aujourd'hui inconnue. Dans le modèle standard, on considère cependant qu'une mole de dihydrogène est nécessaire pour réduire une mole de diazote et que ceci nécessite l'hydrolyse de 2 moles d'ATP (p=2 et n=1), ce qui donne :

N2 + 8 H+ +8e- + 16 ATP  2 NH3 + H2 +16 ADP +16 Pi Le complexe nitrogénase le plus étudié comprend deux composantes metalloprotéiques : une ferroprotéine (protéine Fe) et une ferro-molybdoprotéine (protéine FeMo). Les gènes qui codent ces deux protéines et les autres protéines nécessaires à la réaction ou à sa régulation sont groupés dans un même opéron appelé nif (pour Nitrogen Fixation). La protéine FeMo est un tétramère de 230 kDa codé par les gènes nifD et nifK; elle contient le site réducteur du substrat. La protéine Fe est un homodimère de 64 kDa codé par le gène nifH, c'est le composant donneur d'électrons, il contient le site de liaison de l’ATP (Halbleib et Ludden, 2000). 4 Le mécanisme réactionnel, basé sur des études réalisées sur Clostridium, Klebsiella et Azotobacter fait intervenir des transferts d'électrons entre la protéine Fe et la protéine FeMo (Fig. 1).

Figure 1 - Mécanisme de réduction de l’azote moléculaire (N2) en ammoniac (NH4) par la nitrogénase.

Le cycle de fonctionnement de la nitrogénase commence avec la liaison d'une molécule d'ATP à la protéine Fe réduite, ce qui provoque un changement conformationnel et permet le transfert d'un électron de la protéine Fe à la protéine FeMo. L'hydrolyse d'un ATP est couplée à ce transfert. Le complexe se dissocie ensuite, la protéine Fe est alors réduite par un donneur d'électrons (ferrédoxine ou flavodoxine) et l’ADP est échangé contre un l'ATP. Le cycle est répété jusqu'à ce que suffisamment d'électrons soient transmis à la protéine FeMo ce qui lui permet, par l'intermédiaire du molybdène de les transférer au diazote ce qui produit de l'ammoniac (Halbleib et Ludden, 2000).

Le complexe nitrogénase est sensible au dioxygène (O2) qui l'inactive de manière irréversible. Des mécanismes biologiques existent pour protéger l'enzyme de l'oxygène. La fixation de l'azote est un processus très coûteux en énergie ce qui impose une régulation. La transcription des gènes nif est réprimée par l'ammonium, et aussi par le dioxygène, qui rend la fixation impossible en inactivant la nitrogénase. Certains diazotrophes régulent également la fixation au niveau post-traductionnel en inactivant le complexe enzymatique dès que des quantités suffisantes d'ammonium sont présentes ou quand la quantité d'ATP

5 disponible devient insuffisante (Halbleib et Ludden, 2000).

La réduction de l'azote atmosphérique (N2, gaz inerte composant 78% de l'atmosphère) en ammonium (NH4+), forme assimilable par les plantes et un grand nombre de bactéries, constitue avec la photosynthèse, l’une des deux voies métaboliques les plus importantes pour le fonctionnement de la biosphère. En effet, elle constitue le seul mécanisme biologique permettant à la biosphère de compenser les pertes d'azote combiné organique ou minéral occasionnées par la dénitrification.

La fixation de l'azote étant un processus très coûteux en énergie, les diazotrophes pratiquent une régulation stricte de son activité. La transcription des gènes nif est réprimée par l'ammonium et par l'oxygène rendant la fixation impossible en inactivant la nitrogénase (Oldroyd et Downie, 2008). Certains diazotrophes régulent également la fixation au niveau post-traductionnel en inactivant le complexe enzymatique dès que des quantités suffisantes d'ammonium sont présentes dans le milieu ou encore quand la quantité d'ATP disponible devient insuffisante pour réduire l'azote moléculaire (Halbleib et Ludden, 2000 ; Oldroyd et Downie, 2008).

La fixation biologique de l'azote est loin d'être une activité accessoire dans la biosphère. Elle serait responsable de la fixation d'au moins 200 millions de tonnes d'azote par an. A titre de comparaison, l'industrie mondiale des engrais azotés n'en réduit que la moitié environ annuellement (Newton, 2007; Stacey, 2007). Ces apports considérables d’azote par voie biologique ont suscité très tôt l’intérêt des scientifiques et des agronomes qui y voient la seule alternative pour assurer de manière durable et écologique le maintien du niveau de fertilité des agrosystèmes dans un monde aux ressources déclinantes (Vance, 2001).

1-2 Les organismes fixateurs d’azote La capacité à fixer l'azote atmosphérique qui est indissociable de la possession de la nitrogénase se retrouve exclusivement chez certains procaryotes (bactéries et archées) qualifiés de bactéries fixatrices d’azote ou de diazotrophes (Tableau I). Les bactéries fixatrices d’azote se rencontrent dans des genres phylogénétiquement très éloignés (bactéries photosynthétiques sulfureuses, Firmibacteria, actinomycètes, cyanobactéries, de nombreuses subdivisions des protéobactéries et les archées méthanogènes). Elle concerne des organismes très diversifiés sur le plan métabolique puisqu’on y trouve des hétérotrophes aérobies stricts (Azotobacter...), anaérobies facultatifs (Klebsiella... ), anaérobies stricts (Clostridium...), des organismes photosynthétiques anoxygéniques (Rhodobacter...) ou oxygéniques (Anabaena...) et des chimiolithotrophes (comme Leptospirillum ferrooxidans). Ils diffèrent également par leur morphologie (bacilles, coccis, vibrions, spirilles) ou par leur biotope préférentiel puisqu’ils sont capables de coloniser des habitats différents sous forme libre (sols, eau, air...) ou en interaction avec des organismes eucaryotes, par simple association (notamment dans la spermosphère, la rhizosphère 6 (rhizocoenoses) ou la phyllosphère (phyllocoenoses)) ou en symbiose (Dixon and Kahn, 2004 ; Dixon and Wheeler, 1986).

Tableau I : Liste des principaux organismes fixateurs d’azote et de leur symbiote végétal dans le cas des fixateurs symbiotiques (compilation à partir de sources multiples)

Fixateurs libres

Microorganismes Principaux représentants Symbiote végétal Archaebactéries Methanosarcina, Methanococcus ------Eubactéries Anaérobies Clostridium, Desulfovibrio ------Anaérobies facultatives Klebsiella, Erwinia, Enterobacter ------Microaérobies Azospirillum, Aquaspirillum ------Aérobies Azotobacter, Beijerinckia, Derxia ------

Photosynthétiques Rhodopseudomonas, Rhodospirillum ------Cyanobactéries Nostoc, Anabaena, Calothrix ------

Fixateurs symbiotiques

Bactéries nodulant les Rhizobium, Bradyrhizobium, Légumineuses légumineuses (rhizobia) Sinorhizobium, Mesorhizobium Plantes actinorhiziennes Bactéries actinorhiziennes Frankia (Casuarina, Alnus…) Cyanobactéries Angiospermes (Gunnera) Gymnospermes Nostoc (Agathis, Cycas, Macrozamia) Anabaena Ptéridophytes Calothrix (Azolla) Phormidium Bryophytes (Anthoceros, Blasia, Caricula)

Lichens (Collema, Lichina, Peltigera)

7 2- Les symbioses fixatrices d’azote chez les plantes

Au cours de l’évolution, certaines plantes ont mis en place des associations symbiotiques avec les micro-organismes diazotrophes de façon à pallier la faible disponibilité de l’azote dans les sols. Il existe plusieurs types de symbioses fixatrices d’azote (Fig. 2) dont certaines impliquent des cyanobactéries. Ces bactéries à Gram-négatif photosynthétiques et diazotrophes qui vivent en colonies filamenteuses (trichomes) et qui peuvent interagir avec des plantes de différents embranchements tels que des ptéridophytes (symbiose entre la fougère aquatique Azolla et la cyanobactérie Anabaena), des gymnospermes tropicaux de la famille des cycadales (symbiose Cycas – Nostoc), ou des angiospermes (symbiose Gunnera – Nostoc) (Dixon et Wheeler, 1986 ; Duhoux et Nicole, 2004). Les cyanobactéries sont également impliquées dans des symbioses avec des champignons ascomycètes ou basidiomycètes pour former les Lichens (Fig. 2).

D’autres, nettement plus évoluées car elles sont plus spécifiques et se traduisent par la formation de nodules ou nodosités qui sont de véritables organes symbiotiques , impliquent des bactéries appartenant à deux classes d’eubactéries (protéobactéries et actinobactéries) et un très grand nombre d’angiospermes du clade des Rosidées I (légumineuses et plantes actinorhiziennes) qui présentent une importance écologique et/ou économiqueme considérable.

Ces symbioses nodulaires (Fig. 3) sont représentées par :

 la symbiose actinorhizienne (actinomycères-plantes actinorhiziennes) qui implique des bactéries filamenteuses du genre Frankia et des plantes qualifiées d’actinorhiziennes (Fig. 3) qui sont toutes des dicotylédones appartenant à 8 familles du clade des Rosidées I (Betulaceae, Casuarinaceae, Myricaceae, Rhamnaceae, Elaeagnaceae , Rosaceae, Coriariaceae et Datiscaceae) réparties sur 25 genres et totalisant près de 250 espèces.  La symbiose rhizobia–légumineuses qui implique les rhizobia, un groupe paraphylétique de protéobactéries et les plantes à fleurs de la grande famille des fabacées (Fig. 3). Cette relation symbiotique est nettement plus exclusive que la précédente car en dehors des légumineuses, les rhizobia ne sont capables de noduler que quelques espèces de non-légumineuses appartenant au petit genre tropical Parasponia de la famille des Ulmaceae (Trinick, 1980).

Ces deux symbioses sont caractérisées par la formation d’un nouvel organe au niveau des racines, le nodule ou nodosité (Fig.3), à l’intérieur duquel certaines cellules sont envahies par les bactéries fixatrices d’azote sequestrées dans des structures membranaires d’origine végétale formant un organite propre aux symbioses rhizobia-légumineuses et Frankia- plantes actinorhiziennes, le symbiosome (Parniske, 2000 ; Markmann et Parniske, 2009).

8 Symbiose Azolla sp.-Anabeana sp. – Symbiose fixatrice d’azote non nodulaire

Plant adulte d’Azolla sp. Détail d’une feuille d’Azolla montrant la cavité foliaire hébergeant les (ptéridophyte) filaments d’Anabeana

Anabaena azollae La symbiose Azolla anabeana est utilisée à grande échelle pour la (Cyanobactérie) fertilisation des cultures de riz

Les lichens diazotrophes – Symbiose fixatrice d’azote non nodulaire

Collema sp. (en noir) un lichen Détail de Collema sp. Les Détail de filaments de Nostoc sp., commun aux zones arides et filaments mycelliens et cyanobactérie fixatrice d’azote capable de fixer d’azote en raison cyanobactériens sont mélangés fréquement associée à des de son association avec la au niveau de la matrice (Lichen champignons lichéniques et aux cyanobactérie Nostoc sp. non stratifié). plantes

Figure 2: Diversité des symbiose fixatrices d’azote. Exemples de symbioses non-nodulaires : symbiose Azolla-Anabeana et lichens fixateurs d’azote. 9 Symbioses actinobactéries (Frankia)– Plantes actinorhiziennes – Symbiose nodulaire

Nodules fixateur d'azote chez l'aulne Nodules fixateur d'azote chez le Filao glutineux (Alnus glutinosa) (Casuarina equisetetifolia)

Symbiose rhizobia – Légumineuses – Symbiose nodulaire

Nodules de type indéterminé sur le Nodules de type déterminé sur le système système racinaire d’un jeune plant d’Acacia racinaire d’un jeune robinier (Robinia saligna produit en pépinière pseudoacacia) produit en pépinière

Figure 3: Diversité des symbiose fixatrices d’azote. Exemples de symbioses nodulaires : symbiose actinobactéries (Frankia)-Plantes actinorhiziennes et rhizobia-légumineuses.

10 Le nodule des symbioses nodulaires fixatrices d’azote est un véritable organe, hautement intégré à la plante et dont le rôle et l’origine est exclusivement symbiotique. La mise en place de cet organe, développé de novo et facultatif pour la survie de la plante, requiert un programme d’organogenèse, très complexe et finement régulé, induit par la présence du micro-symbiote (Markmann et Parniske, 2009, Oldroyd et al., 2009).

Bien que ces deux symbioses mutualistiques, soient des interactions hautement adaptées et régulées, il ne s’agit pas d’interactions obligatoires ou permanentes. Les deux partenaires peuvent vivre indépendamment et de manière autonome et chaque nouvelle génération de plante doit être infectée par de nouvelles bactéries. Il est intéressant de noter à ce niveau, que contrairement aux fixateurs libres, les rhizobia ne peuvent en général fixer l'azote que lorsqu'ils s'associent avec les légumineuses (Kneip et al., 2007).

Ces interactions symbiotiques ont joué et continuent de joué un rôle écologique fondamental au niveau de la biosphère. En effet, les endosymbioses racinaires fixatrices d’azote sont impliquées dans la colonisation des sols pauvres par les plantes dites pionnières et édificatrices. En améliorant l’approvisionnement en minéraux, elles procurent un avantage compétitif aux plantes concernées. Ainsi, la composition de la microflore tellurique influe sur la diversité des végétaux en surface (van der Heijden, et al., 1998 ; Rillig et Mummey, 2006).

D’un point de vue évolutif, ces endosymbioses racinaires ont vraisemblablement joué un rôle crucial dans la colonisation des terres en mettant à la disposition des plantes l’azote indispensable à leur croissance et peu disponible dans les sols primitifs pauvres (Sapp, 2004). Un rôle qu’elles continuent d’assumer de nos jours en assurant la maintenance du niveau de fertilité azotée des milieux naturels terrestres et que l’on est obligés d’étendre aux terres cultivées et aux agrosystèmes dans le cadre d’une agriculture durable (Vance, 2001).

Les endosymbioses fixatrices d'azote seraient apparues il y 65 millions d'années. L’ancêtre commun à toutes les plantes fixatrices d’azote aurait développé une endosymbiose bactérienne, grâce à une certaine prédisposition à l’organogénèse nodulaire (la formation de nodules étant un détournement du programme génétique de formation des racines secondaires). Il est probable que la capacité à former des nodosités soit apparue plusieurs fois et indépendamment au cours de l'évolution. Cette aptitude a aussi été perdue plusieurs fois, par exemple pour l’adaptation à des sols plus fertiles. Cela permet d'expliquer la présence de plantes sans nodules à l'intérieur du clade des plantes à nodules c'est-à-dire le clade des Rosidées I ou Fabidées.

11 3- La symbiose rhizobia-légumineuses

Parmi les symbioses fixatrices d'azote, la symbiose rhizobia-légumineuse est de loin la plus importante, la mieux étudiée et la plus intéressante pour l'homme. Cette endosymbiose mutalistique concerne les légumineuses, un groupe de plantes largement cultivé et d'importance économique considérable dont les espèces spontanées sont de surcroît très répandues dans les milieux naturels. Ces légumineuses, connues depuis l'antiquité pour leurs effets fertilisants sur les sols, sont en effet capables de contracter une symbiose fixatrice d'azote avec les rhizobia ou Bactéries Nodulant les Légumineuses (BNL), un groupement fonctionnel de bactéries diverses communes du sol, regroupées uniquement sur la base de leur propriété d'interagir spécifiquement avec les légumineuses et d'induire chez ces dernières la formation de nodules ou nodosités racinaires fixateurs d'azote. Le pouvoir de fixer l'azote conféré aux légumineuses par ses microsymbiotes leur permet d'assurer la couverture de leurs besoins en azote sans dépendre du niveau de fertilité azoté du sol leur permettant de mener un "train de vie azote" supérieur à celui de tous les autres végétaux. "Train de vie azote" qui les place presque au niveau des produits animaux (viandes, poissons, œufs…) en ce qui concerne leur richesse en protéines et en acides aminés. De plus, le fait qu'elles puissent se passer de l'azote du sol fait qu'elles sont très compétitives pour l'occupation des sols pauvres ou dégradés sur lesquels elles jouent le rôle d'espèce pionnières favorisant la succession écologique. La symbiose rhizobia-légumineuses serait apparue il y’a de cela 60 millions d’années (Sprent, 2008) presque simultanément à l’apparition des légumineuses (Lavin et al., 2005). Les biologistes avancent deux théories pour expliquer l'origine évolutive de l'association symbiotique entre les rhizobia et les légumineuses:

 L’association symbiotique aurait évolué à partir de bactéries diazotrophes du sol qui se seraient associées aux plantes en exploitant partiellement le programme de la mycorhization est, si l’on se réfère au registre fossile, beaucoup plus ancienne (). L'existence chez les plantes de certains mutants incapables d'entrer en symbiose avec des rhizobia et avec des champignons endomycorhiziens corrobore cette hypothèse (Hirsch et al., 2001 ; Szczyglowski et Amyot 2003 ; Sprent et James, 2007).

 Les ancêtres des bactéries symbiotiques auraient été des bactéries phytopathogènes (Parniske, 2000; Markman et Parniske, 2009). Cette hypothèse est avancée en raison d'une part, de la proximité phylogénétique entre les rhizobia et de nombreuses bactéries phytopathogènes comme Agrobacterium et d'autre part, de l'existence d'homologies locales entre les plasmides Vir et Sym ainsi que la présence de composants provoquant une réaction hypersensible (HR) des plantes chez les rhizobia (Terefework et al., 2000). 12 3-1- Le partenaire bactérien: les rhizobia ou bactéries nodulant les légumineuses Rhizobia ou Bactéries Nodulant les Légumineuses (BNL) est le nom commun qui est aujourd'hui communément attribué aux bactéries fixatrices d’azote associées aux légumineuses pour éviter l'utilisation du nom de genre Rhizobium dont les représentants ne constituent aujourd’hui qu'une fraction des rhizobia ou BNL. Il s'agit d'un groupement bactérien fonctionnel, paraphylétique et très diversifié (Fig. 4) qui reste cependant cantonné au domaine des Eubacteria et au sein de ce dernier au seul phyllum des Proteobacteria. Par ailleurs, ce groupe bactérien reste très spécifique aux légumineuses même si des souches de BNL apparentés aux Bradyrhizobium sont capables d'induire la nodulation chez quelques ulmacées du genre Parasponia (Trinick 1980). La symbiose rhizobia-légumineuses est le fruit d'une longue coévolution entre les deux symbiontes et à de rares exceptions près, seuls les rhizobia différenciées sous leur forme nodulaire de bactéroïdes fixent l’azote moléculaire (Kneip et al., 2007). L’histoire des rhizobia commence au 19ème siècle, quand Beijerinck (1888) et Frank (1889) regroupent toutes les bactéries isolées de nodosités de racines de légumineuses dans le genre Rhizobium et posent comme fondement de leur classement la nature de la plante hôte. Caractérisées ensuite par leur vitesse de croissance, des souches à croissance rapide du genre Rhizobium sont différenciées de souches à croissance lente du genre Bradyrhizobium. Plus tard, le genre Rhizobium sera lui-même subdivisé sur la base du spectre d'hôte et des caractères phénotypiques de ses souches en 3 genres : Rhizobium, Ensifer (=Sinorhizobium) et Mesorhizobium. Depuis, l'avènement des techniques moléculaires et l'extension des travaux à des légumineuses et à des régions géographiques jusqu'ici inexplorées ont permis de décrire de nouveaux genres et de nouvelles espèces de rhizobia, repoussant ainsi largement les frontières taxonomiques, phylogénétiques et mêmes fonctionnelles de ce groupe de bactéries. En effet, la généralisation des techniques d'identification moléculaire à l'étude des populations microbiennes du sol a permis la mise en évidence de nombreuses espèces de rhizobia incapables de s'associer avec les légumineuses et qui ont jusqu’ici échappé aux investigations classiques qui portent uniquement sur des isolats provenant de nodosités de légumineuses. C’est le cas par exemple de Rhizobium selenidurans et de R. soli (Rivas et al., 2009) dont les souches, directement isolées du sol, se sont révélées incapables de noduler les légumineuses en raison de l’absence des gènes de nodulation et de fixation symbiotique de l’azote au sein de leur génome. C’est également le cas pour deux espèces non nodulantes de Bradyrhizobium : B. betae (Rivas et al., 2004) et B. iriomotense (Islam et al., 2008). Ces deux espèces, responsables de la formation de tumeurs sur les tubercules ou les racines des plantes dont elles ont été isolées, auraient certainement été affiliées au genre Agrobacterium ou à de nouvelles espèces de protéobactéries en l’absence des outils de caractérisation moléculaire des bactéries et plus particulièrement le gène de l’ARN 16S (Rivas et al., 2009).

13 Bradyrhizobium japonicum Rhizobium trifolii http://www.genome.jgi-psf.org/bra_b/bra_b.home.html (Photo F. Dazzo)

Ochrobactrum lupini Blastobacter denitrificans (Trujillo et al., 2005) (van Berkum et Eardly, 2002)

Cupriavidus taiwensis Burkholderia phymatum http://web2.yzu.edu.tw/e_news/562/user-image/image002.jpg http://genome.jgi-psf.org/burps/burps.home.html

Figure 4: Diversité morphologique des bactéries nodulant les légumineuses.

14 L'ensemble des espèces de rhizobia connues à ce jour et répertoriées, sur les bases de données de séquences de l’ADN ribosomique 16S (ADNr 16S) se répartissent dans trois classes d'eubactéries (α, β et δ Proteobacteria), 4 ordres (Rhizobiales, Burkholderiales, Rhodocyclales et Pseudomonadales), 10 familles et 14 genres répartis comme suit (Tab. II):

Tableau II : Distribution actuelle des bactéries nodulant les légumineuses au sein des classes de proéobactéries

Classes Ordres Familles Genres

Rhizobium*, Ensifer*, Rhizobiaceae Sinorhizobium* Bradyrhizobiaceae Bradyrhizobium* Mesorhizobium*, Phyllobacteriaceae Phyllobacterium Alpha Rhizobiales Xanthobacteraceae Azorhizobium* protéobactéries Methylobacteriaceae Methylobacterium Brucellaceae Ochrobactrum Hyphomicrobiaceae Devosia Bêta Burkholderiales Burkholderiaceae Burkholderia, Cupriavidus protéobactéries Rhodocyclales Rhodocyclaceae Shinella Gamma Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas protéobactéries * Genres renfermant exclusivement ou essentiellement des espèces nodulantes

3-2- Le partenaire végétal : Les légumineuses Les Légumineuses ou Fabaceae sont classées parmi les Angiospermes, Eudicotylédones, Core Eudicotylédones, Rosides, Eurosides I (Fabidées), Fabales. Elles sont sœurs de la famille des Polygalaceae, voisines des familles Quillajaceae et Surianaceae avec qui elles composent l'ordre des Fabales (Doyle et al., 2000). Il s’agit de la troisième plus grande famille d’Angiospermes en nombre d'espèces (après les Orchidaceae et les Asteraceae) avec ses plus de 18.000 espèces classées en 750 genres environ (Sprent, 2009). C’est un des plus importants groupes de plantes pour l’homme, servant de cultures, de fourrages, d’engrais verts et produisant un grand nombre de composés utiles comme des médicaments, des poisons, des teintures ou des parfums. Les Légumineuses sont représentées dans presque tous les milieux terrestres (excepté en Antarctique). Certaines vivent dans l’eau mais il n’existe pas d’espèces marines. Les espèces vont des herbes naines de l’arctique et des montagnes aux grands arbres de la forêt tropicale. La caractéristique fondamentale unifiant ces espèces est leur fruit, qui est une gousse ou légume modifié de diverses façons pour faciliter son transport par le vent, l’eau et les animaux (Fig. 4).

15 La famille des Fabaceae est classiquement divisée en trois sous-familles : Caesalpinioideae, Mimosoideae et Papilionoideae, parfois considérées comme trois familles séparées et qui se distinguent essentiellement par la structure de leurs fleurs (Fig. 5). . Les Caesalpinioideae considérées comme les plus primitives des légumineuses sont majoritairement des arbres ou arbustes tropicaux ou subtropicaux à feuilles généralement composées. Leur fleur irrégulière, légèrement zygomorphe (parfois presque papilionacée) possède 5 pétales non différenciés et des étamines visibles extérieurement (Fig. 5). Cette sous famille de légumineuses est, au contraire des deux autres, paraphylétique et est appelée, de ce fait, à subir de profonds remaniements taxonomiques (Cannon, 2009). La flore d'Algérie ne renferme que trois espèces de Caesalpinioideae autochtones: Ceratonia siliqua (le caroubier), Senna alexandrina et Bauhinia rufescens. Les autres espèces que l’on rencontre fréquemment comme Parkinsonia aculeata, Gleditsia triacanthos (févier d’Amérique) ou encore Cercis siliquastrum (arbre de Judée) sont toutes des espèces introduites. . Les Mimosoideae sont elles aussi pour la plupart des arbres ou arbustes tropicaux. Leurs fleurs petites, sont régulières et groupées en inflorescences actinomorphes (Fig. 5). Les étamines souvent en nombre indéfini sont les parties les plus visibles de la fleur. Leurs feuilles sont généralement doublement composées, ou réduites dans certains cas à des pétioles dilatés (phyllodes). La flore d'Algérie comporte moins d'une dizaine d'espèces autochtones réparties dans les genres Acacia (Vachellia) et Prosopis ; un nombre inférieur à la trentaine d'espèces introduites et représentées par les genres Acacia [s.s.] (essentiellement australiennes), Albizzia, Prosopis, Enterolobium, Leucaena… . Les Papilionoideae constituent la plus large sous-famille des légumineuses (environ 2/3 des genres) et la plus répandue. La grande majorité d’entre elles sont des espèces herbacées des régions tempérées. Leur fleur est irrégulière, composée de 5 pétales : un étendard, deux ailes et deux pétales partiellement fusionnés en une carène et ébauchant la forme d’un papillon d’où le nom de la sous famille (Fig. 5). La majorité des légumineuses d’intérêt économique appartient aux Papilionoideae que l’on subdivise généralement en deux groupes : les légumineuses dites Phaséolides (Phaseolus, Vigna, Glycine, Cajanus...) principalement des zones tropicales, et les légumineuses dites Galégoïdes (Trifolium, Medicago, Pisum, Lens...) principalement des zones tempérées. Les 3 sous-familles de légumineuses ne sont pas égales sur le plan de leur capacité de former une symbiose avec les rhizobia. En effet, si 97% des Papilionoideae et 90% des Mimosoideae examinées à ce jour sont nodulées par les rhizobia, cette proportion n’est que de 23% chez les Caesalpinioideae, ce qui laisse indiquer que la capacité à onduler aurait pu être soit acquise à plusieurs reprises au cours de l’évolution soit perdue à plusieurs reprises à partir d’un ancêtre commun modulent (Doyle, 1998, Sprent 2008).

16 Gousses velues associées en étoile Gousses ailées de Tipuana tipu, chez Astragalus sp. - El Goléa. Espèce introduite - Alger.

Gousses contournées épineuses Gousses fraîches chez Acacia chez Scorpiurus muricatus - Tipaza. nilotica subsp. adstringens (=Senegalia). Tamanrasset.

Gousse papyracée chez Acacia Gousses d’Acacia tortilis raddiana laeta (= Senegalia). Tamanrasset. (= Vachellia). Tamanrasset.

Figure 5: Diversité de la morphologie de la gousse (légume) chez les légumineuses.

17 Caesalpinoideae (fleurs irrégulières avec une tendance à la zygomorphie)

Parkinsonia aculeata Ceratonia siliqua (Caroubier) (Station INREF de Tamanrasset) (Arboretum de Baïnem – Alger)

Mimosoideae (Fleurs actinomorphes)

Albizzia (= Paraserianthes) lophanta Leucaena leucocephala (Arboretum de Baïnem – Alger) (Station de Béni Abbès)

Papilionoideae (Fleurs zygomorphes)

Robinia pseudoacacia (Robinier) Erythrina corallodendron (Arboretum de Baïnem – Alger) (Palais des expositions - Alger)

Figure 6 : Diversité de l’inflorescence chez les légumineuses.

18 3-3 Le genre Acacia Bien que cette étude ait concerné toutes les légumineuses arborées ou arborecentes introduites en Algérie, nous avons restreint celle-ci, au niveau de la partie consacrée à l’étude des souches de rhizobia associées, aux représentants les plus fréquents du genre Acacia Miller que nous avons jugé utile de décrire ci-dessous. Le genre Acacia Miller fait partie de la sous famille des Mimosoidées qui en renferme près de 60. Au sein de cette famille, il a été classé dans la tribu des Acacieae qui ne comporte que deux genres, le genre Acacia Miller et le genre Monospécifique Faidherbia. Il s’agit d’un groupe de légumineuses exclusivement ligneuses pouvant se présenter sous la forme d’arbres, d’arbustes, d’arbrisseaux. Considéré dans son sens large, le genre Acacia renferme près de 1500 espèces (Lewis et al., 2005), par ordre d’importance, australiennes, africaines, américaines et asiatiques. Il constitue après le genre Astragalus, le taxon le plus important de la famille des légumineuses. La grande diversité et le nombre considérable d’espèces que le genre Acacia sensu lato renferme ont incités très tôt de nombreux auteurs à scinder celui-ci en unités taxonomiques plus petites. La scission qui a pendant longtemps fait consensus est celle qui a consisté à subdiviser le genre en séries, sections ou en sous genres (Vassal, 1972 ; Pedley, 1978 ; Maslin 2001). Pedley (1978) a ainsi subdivisé le genre en trois sous-genres : sous-genre Acacia (acacias à feuilles composées, non épineux), sous-genre Aculeiferum (acacias à feuilles composées, épineux) et le sous genre Phyllodineae (acacias à phyllodes). Les études récentes concernant la phylogénie du genre Acacia ont permis une meilleure appréhension de ce groupe de légumineuses. Ces études ont montré que le genre Acacia tel que défini jusqu’ici n’est pas monophylétique et qu’il doit, de ce fait, être scindé en plusieurs genres (Maslin et al., 2003 ; Orchard et Maslin, 2003). Lors de sa dernière réunion l’IBC (International Botanical Congress) a entériné la proposition de Orchard et Maslin (2003) de reclassification des acacias avec, fait relativement rare en systématique végétale pour être signalé, la retypification du genre par l’espèce australienne Acacia penninervis Sieber ex DC (Fig. 6) en lieu et place de l’ancienne espèce type du genre à savoir Acacia nilotica (L.) Delile, une espèce africaine. Dans cette nouvelle classification, les représentants du genre Acacia sensu lato sont répartis en 5 genres (Fig. 7) : 1 – Le genre Acacia [s.l.] qui renferme près de 960 espèces à phyllodes, essentiellement d’origine australienne (948 espèces). 2- Le genre Vachellia qui renferme environ 160-180 espèces essentiellement africaines (73 espèces) et américaines (60 espèces). La contribution de l’Asie (36 espèces dont 15 présentes en Afrique) et de l’Australie (7 espèces) à la diversité de ce genre étant beaucoup plus réduite. 3 – Le genre Senegalia qui renferme 203 espèces essentiellement américaines (120 espèces) et africaines (69 espèces). L’Asie n’en comportant que 43 dont 7 sont également africaines et l’Australie comportant quant à elle 2 espèces dont une commune avec l’Asie. 3 – Le genre Aciacella qui ne comporte que 15 espèces exclusivement américaines, surtout mexicaines. 5- Le genre Mariosousa, un genre jusqu’ici sans dénomination générique comporte 13 espèces exclusivement centre américaines (Etats-Unis, Mexique et Costa-Rica).

19 Acacia [s.s.] Senegalia

Acacia penninervis Senegalia (ex. Acacia) senegal (Photo B. Maslin – ANBG) (Bordj Badji Mokhtar)

Acaciella Vachellia

Acaciella angustissima Vachelia (ex. Acacia) horrida (Photo B. Maslin – ANBG) (USTHB)

Mariosousa

Mariosousa coulteri Vachelia (ex. Acacia) farnesiana (Photo B. Maslin – ANBG) (USTHB)

Figure 7: Photographies montrant des représentants des nouvelles subdivisions génériques des acacias telles qu'entérinées par l'IBC (International Botanical Congress) sur proposition de Orchard et Maslin (2003). Les photographies présentées font, Sauf indication contraire, partie de la photothèque du laboratoire. 20 3-3-1. - Le genre Acacia en Algérie Le genre Acacia est représenté en Algérie par 25 espèces parmi lesquelles la grande majorité (18 espèces) a été introduite en grand partie à partir d’Australie (16), d’Afrique du Sud (1) et d’Amérique Centrale (1). Ces espèces, très fréquentes au nord du pays où certaines d’entre-elles (Acacia saligna, A. horrida, A. farnesiana…) sont devenues une composante essentielle de la flore ligneuse en raison de leur croissance rapide et de leur tolérance au déficit hydrique sont bien connues du public sous le nom de « mimosas » bien qu’elles soient très différentes des représentants du genre éponyme (Mimosa – Mimosoideae – Mimosaceae). A l’opposé, les 5 acacias autochtones de la flore d’Algérie sont beaucoup moins connus du public puisque ces derniers sont cantonnés aux régions désertiques, en particulier le Sahara Central. Ces acacias des régions désertiques d’Algérie sont aujourd’hui représentés par cinq taxons (Fig. 8)

 Acacia ehrenbergiana Hayne (=Acacia flava (Forssk.) Schweinf.), une espèce qui n’a été reconnue que tardivement en Algérie en raison de sa confusion avec Acacia Seyal et qui est requalifiée aujourd’hui en Vachelia ehrenbergiana  Acacia laeta Benth., espèce de gommier aujourd’hui désignée par Senegalia laeta.  A. nilotica (L.) Del. subsp. adstringens (Schum. & Thonn.) Roberty (=Acacia arabica (Lam.) Willd.) désigné aujourd’hui par Vachelia nilotica (L.) Del. subsp. adstringens (Schum. & Thonn.) Roberty.  A. seyal Del. (= Acacia fistula Schweinf., Acacia flava (Forssk.) Schweinf. var. seyal (Delile) Roberty, Acacia stenocarpa A. Rich) désigné aujourd’hui par Vachelia seyal  Acacia tortilis (Forsskal) Hayne subsp. raddiana (Savi) Brenan (=Acacia fasciculata Guil. et Perr., Acacia raddiana Savi), le taxon le mieux connu au Sahara et du Sahel et qui a été requalifié dans la nouvelle nomenclature des acacias en Vachelia tortilis (Forsskal) Hayne subsp. raddiana (Savi) Brenan.

Pour les habitués des acacias d’Algérie, il est nécessaire de signaler que le bien connu Acacia albida (Del.) (Fig. 8) dont le nom n’a pas été énuméré ci-dessus, a changé de tribu et de genre passant de la tribu des Acacieae à celle des Ingeae et du genre Acacia au genre Faidherbia en conservant son nom d’espèce (=Faidherbia albida (Del.) A. Chev.). Les espèces d’acacias que l’on peut rencontrer en Algérie se répartissent maintenant, si l’on tient compte de la nouvelle systématique de ce groupe de plantes, en trois genres :

. Le genre Vachellia, qui regroupe la majorité des acacias autochtones des régions désertiques requalifiés en Vachellia (V. ehrenbergiana, V. tortilis subsp. Raddiana, V. seyal, V. nilotica subsp. adstringens) et quelques espèces introduites comme V. farnesiana et V. horrida. . Le genre Senegalia qui comporte un représentant autochtone, à savoir S. laeta, un autre acacia des régions désertiques d’Algérie (Fig. 7). . Le genre Acacia [s.s.] qui est représenté par les espèces australiennes à phyllodes qui constituent la majorité des espèces de légumineuses arborées ou arborescentes introduites en Algérie.

21 Acacia ehrenbergiana Acacia laeta (Parc National du Hoggar) (Parc National du Hoggar)

Acacia nilotica subsp. adstringens Acacia seyal (Parc National du Tassili) (Parc National du Hoggar)

Acacia tortilis subsp. raddiana Faidherbia (ex. Acacia) albida (Parc National du Hoggar) (Parc National du Tassili)

Figure 8: Représentants autochtones du genre Acacia sensu lato en Algérie. Pour compléter l’aperçu Faidherbia albida longtemps connu sous le nom d’Acacia albida a été représenté sur la planche (Photothèque LBS).

22 3-4- Établissement de la symbiose 3-4-1 Infection de la racine A- Infection intracellulaire

Le mode d'infection le plus étudié et le plus courant est l'infection intracellulaire (Fig. 9A) où l'entrée des bactéries dans la plante a lieu à travers des poils absorbants. Dans ce cas, l’interaction se manifeste très rapidement en conditions limitantes en azote : de quelques minutes à quelques heures après la mise en contact des deux partenaires des déformations ont lieu au niveau des poils absorbants. Les bactéries s’attachent au niveau des ces poils absorbants déformés et digèrent partiellement la paroi, le plasmalemme s'invagine et du nouveau matériel pariétal est déposé conduisant à la formation d’une structure tubulaire appelée cordon d’infection qui contient les bactéries et progresse de cellule en cellule en direction du cortex (Dommergues et al. 1999). L'infection d'une cellule par les cordons d'infection est précédée d'un réarrangement du cytosquelette, d'un déplacement du noyau vers le centre de la cellule et de la formation d'une structure similaire à un phragmoplaste (Dommergues et al. 1999). Par la suite, dans les cellules qui seront envahies par les cordons d’infection, la division cellulaire est réactivée mais s'arrête au stade G2 (Dommergues et al. 1999). Dans ces cellules a lieu la formation de ponts cytoplasmiques qui constituent des cordons de pré-infection par où passeront les cordons d’infection. La pénétration des bactéries s'accompagne des divisions cellulaires au niveau du cortex, en face d'un pôle de protoxylème. Ces divisions conduisent à la formation d'un méristème à l'origine d'un primordium nodulaire qui devient ensuite le lobe nodulaire. Les cellules du lobe nodulaire sont alors envahies par les cordons d'infection. Un processus analogue à une endocytose déverse les bactéries dans le cytosol ; les bactéries sont entourées par un espace peribacteroidien (EPB) et une membrane peribacteroidienne (MPB) qui les sépare du cytosol. Elles se différencient alors en leur forme endosymbiotique : les bacteroïdes capables d'initier la fixation d'azote. L'ensemble EPB+MPB+bactéroïde constitue le symbiosome. Chez certaines espèces de Légumineuses les rhizobia restent localisés dans les cordons d'infection (Dommergues et al. 1999).

B- Infection intercellulaire ou entrée par fissure (= "crack entry" ) Chez les espèces comme Sesbania rostrata qui forment des nodules au niveau des tiges, la pénétration des bactéries se fait par des fissures (Fig. 9B); l’infection a lieu au niveau de l’émergence des racines latérales et des racines adventives. Chez certaines Légumineuses, l'entrée se fait à travers la lamelle moyenne entre deux cellules du rhizoderme. Les rhizobia progressent ensuite vers le primordium nodulaire de manière intercellulaire ou deviennent intracellulaires en formant des cordons d'infection (Dommergues et al. 1999).

23 Figure 9 : Comparaison entre les deux voies d’invasion de la racine par les bactéries. RHC, « root hair curling », l’invasion de la racine se fait via les poils absorbants en croissance. Le recourbement du poil permet la constitution d’un cordon d’infection (it, « infection thread ») qui véhicule les bactéries jusqu’au primordium nodulaire (np, « nodule primordium »). Ce mécanisme est le plus courant, on l’observe au niveau des racines (surtout secondaires) enterrées. LRB, « lateral root base invasion » ou « crack entry », l’invasion se fait de manière intercellulaire au niveau de l’épiderme. L’induction de la mort de quelques cellules au point d’entrée permet la formation d’une poche d’infection (ip, « infection pocket »), à partir de laquelle les cordons d’infections emmènent les bactéries jusqu’au primordium nodulaire, plus diffus que dans le processus « RHC ». D’après Dommergues et al. 1999.

3-4-2. Mécanismes de reconnaissance et nodulines précoces L'interaction entre le partenaire végétal et les rhizobia débute par un échange de signaux moléculaires. Dans des conditions limitantes en azote, les exsudats racinaires de la plante contiennent plusieurs substances, principalement des flavonoïdes qui sont capables d'activer la transcription des gènes Nod chez les rhizobia. Le produit du gène NodD, synthétisé de façon constitutive est impliqué dans la reconnaissance de ce signal et dans l’activation de la transcription des autres gènes Nod. La transcription des autres gènes Nod a pour effet la synthèse des facteurs Nod qui sont les molécules bactériennes reconnues à leur tour par la plante (Dommergues et al. 1999). Les facteurs Nod sont des lipo-chito- oligosaccharides qui comprennent généralement un squelette de 3 à 5 N-acetylgluosamines liées en β(1-4) avec une acétylation sur le sucre non réducteur terminal sur lequel est branché un acide gras insaturé de 16 ou 18 atomes de carbone (Dommergues et al. 1999). Selon les espèces de rhizobia, l'acide gras est plus ou moins long, et les sucres comportent différentes décorations. Le (s) type (s) de facteur (s) Nod produit (s) ainsi que leur quantité permettent une reconnaissance spécifique de chaque rhizobia par son partenaire végétal. Leur structure amphiphile leur permet une intégration rapide dans les membranes.

3.4.3. Formation du nodule

24 La pénétration des bactéries s'accompagne de divisions cellulaires au niveau du cortex, en face d'un pôle de protoxylème. Ces divisions conduisent à la formation d'un méristème à l'origine d'un primordium nodulaire qui devient ensuite le lobe nodulaire (Fig. 8). Les cellules du lobe nodulaire sont alors envahies par les cordons d'infection. Un processus analogue à une endocytose déverse les bactéries dans le cytosol ; les bactéries sont entourées par un espace péribacteroïdien (EPB) et une membrane peribacteroidienne (MPB) qui les sépare du cytosol. Elles se différencient alors en leur forme endosymbiotique : les bactéroïdes capables d'initier la fixation d'azote. L'ensemble EPB+MPB+bactéroïde(s) constitue le symbiosome (Fig. 10). Chez certaines légumineuses tropicales il existe un deuxième mode d’infection dit infection intercellulaire ou «crack entry». Dans ce cas, la pénétration des bactéries se fait par des fissures qui existent entre les cellules des tissus racinaires ou à travers la lamelle moyenne entre deux cellules du rhizoderme (Pawlowski et Bisseling, 1996). Les nodules des fabacées présentent une structure similaire à celle d'une tige avec des tissus vasculaires périphériques qui se raccordent à ceux de la racine et une zone centrale infectée par les BNL. Les nodules sont positionnés sur la racine face aux pôles de xylème. Selon le modèle proposé par Vijn et al. (1993), les pôles du xylème stimulent les divisions cellulaires par le biais de l'uridine alors que les pôles du phloème les inhibent en synthétisant de l'éthylène (Heidstra et al., 1997). Ceci donne lieu à l'apparition des primordia nodulaires face aux pôles de xylème.

Figure 10 : Structure des nodules chez les légumineuses. A : Nodule de type indéterminé. B: Nodule de type déterminé. I : zone méristématique ; II : zone d'infection ; II-III : interzone II-III ; IV : zone de sénescence. (D’après Pawlowski et Bisseling, 1996).

25 Le nombre, la masse des nodules, leur localisation ainsi que le type nodulaire sont sous le contrôle exclusif de la plante hôte. Deux types de nodule peuvent être distingués : les nodules à croissance indéterminée (indéfinie), généralement beaucoup plus longs que larges, retrouvés parmi les espèces des climats tempérés (Galégoidées) et les nodules à croissance déterminée (définie), généralement sphériques, caractéristiques des espèces tropicales ou Phaséolidées (Fig. 9A). En dehors de ces deux types majeurs, les nodules peuvent montrer des variations comme par exemple la formation de lobes qui correspondent à des primordium nodulaires initié par des cellules de BNL issues d’une infection ultérieure.

3-4-4 Structure et développement du nodule Les nodules des fabacées présentent une structure similaire à celle d'une tige avec des tissus vasculaires périphériques qui se raccordent à ceux de la racine et une zone centrale infectée par les rhizobia. De la périphérie vers l'intérieur du nodule, on trouve (Figure 10) :

- Le cortex externe constitué en majorité par des cellules parenchymateuses. - Le cortex moyen - Les tissus vasculaires constitués surtout de phloème et entourés par un endoderme et un péricycle. - Le cortex interne formé de une à trois couches de cellules - Le parenchyme central qui contient les cellules infectées par les rhizobia et des cellules non infectées plus petites.

Les nodules sont positionnés sur la racine face aux pôles de xylème. Les pôles du xylème stimulent les divisions cellulaires par le biais de l'uridine alors que les pôles du phloème les inhibent en synthétisant de l'éthylène (Dommergues et al. 1999). Ceci donne lieu à l'apparition des primordia nodulaires face aux pôles de xylème. Le nombre et la masse des nodules sont contrôlés par la plante. Deux types de nodule peuvent être distingués : les nodules à croissance indéfinie, retrouvés parmi les espèces des climats tempérés et les nodules à croissance déterminés caractéristique des espèces des régions tropicales (Figure 10). Chez les espèces à nodules déterminés, les divisions cellulaires à l'origine du primordium nodulaire ont lieu au niveau du cortex externe. La persistance du méristème chez ces espèces est très éphémère et la croissance en longueur du nodule est limitée. Une croissance en épaisseur a lieu par hypertrophie des cellules corticales et par des divisions de cellules qui contiennent déjà des rhizobia. Ce processus se traduit par une forme sphérique et un état de différenciation identique pour toutes les cellules (Figure 10). Chez les espèces à nodules indéterminés, les divisions cellulaires ont lieu au niveau du

26 cortex interne, la zone méristématique qui produit le nodule est persistante. De ce fait, ces nodules ont une croissance indéfinie, ce qui se traduit par une forme allongée. L'infection par les cordons d'infection a lieu à partir de la base du nodule, ce qui établit un gradient de différentiation et plusieurs zones ont pu être définies (Dommergues et al. 1999; Figure 10):

 La zone I ou zone méristématique correspond à l'apex du nodule et contient des cellules dépourvues de bactéries.

 La zone II ou zone de préfixation contient les cellules corticales nouvellement produites par le méristème qui sont envahies par des cordons d'infection rhizobiens. Les bactéries sont déversées dans les cellules, entourées par le MPB et leur différenciation en bactéroïde commence. À ce stade, elles ne fixent pas encore l'azote.

 Dans l'interzone II-III, la différenciation des bactéroïdes se poursuit et la fixation de l'azote commence. Cette zone se caractérise par la présence de nombreux amyloplastes.

 La zone III ou zone de fixation est celle où les bactéroïdes pleinement différenciés fixent activement l'azote.

 Dans des nodules âgés, la zone IV correspond à une zone de sénescence. Chez les espèces à nodules déterminés, le même gradient de différenciation peut être observé dans le temps, au cours du développement du nodule (Dommergues et al. 1999). Certaines phytohormones joueraient un rôle important dans le processus d'organogenèse du nodule. L'application exogène de cytokinines ou d'inhibiteurs de transport d'auxine peut conduire à l'apparition de "pseudonodules", structures ressemblant à des nodules mais ne contenant pas de bactéries. Certains des gènes induits par les facteurs Nod sont également induits en réponse à des traitements par des auxines ou des cytokinines, ce qui suggère que certaines des réponses aux facteurs Nod pourraient faire intervenir des modifications de la balance auxine/cytokinine (Dommergues et al. 1999). 3-4-5 Fonctionnement des nodules Les nodules sont des organes hautement spécialisés où d'importants échanges ont lieu entre la plante et les bactéries. Ces échanges concernent surtout le métabolisme carboné et le métabolisme azoté. L'azote est fixé grâce à la nitrogénase contenue dans les bactéroïdes et serait exporté vers le cytosol végétal sous forme d'ammonium (Fig. 11). Une activité glutamine synthétase cytoplasmique et une glutamate synthase (GOGAT) plastidique très importantes dans les nodules pourraient incorporer rapidement l'ammonium dans des acides aminés (glutamine et glutamate respectivement). Chez certaines espèces, la glutamine est exportée directement vers le reste de la plante (Dommergues et al. 1999).Des études récentes ont

27 cependant montré que c'est plutôt un échange d'acides aminés entre le bactéroïde et le cytoplasme (Glu/Gln ; Asp/Asn) qui permet d'exporter l'azote vers la cellue végétale et le xylème (Dommergues et al. 1999).

Figure 11 : Cycle Glutamine Synthétase/Glutamine – Oxoglutarate Aminotransférase (GS-GOGAT) qui permet l’incorporation de l’azote fixé par les nodules à rhizobia dans le métabolisme de la cellule végétale.

L'exportation de l'azote se fait surtout sous forme d'amides (asparagine surtout, accessoirement glutamine) pour les nodules de Légumineuses des régions tempérées. La synthèse d'asparagine consomme de l'aspartate (ou ses précurseurs, malate et oxaloacétate) qui seraient synthétisés par une PEP carboxylase et une malate déshydrogénase à partir du CO2. 9-30% du CO2 provenant de la respiration serait recyclé par ce mécanisme (Dommergues et al. 1999). Chez les Légumineuses tropicales, les formes prépondérantes de transport de l'azote sont les uréïdes (allantoïne et acide allantoïque) dont la production implique la synthèse de novo de purine (Dommergues et al. 1999). L'exportation de l'azote vers le reste de la plante se fait via le xylème

L'énergie nécessaire à la fixation de l'azote par les bactéroïdes est fournie par la plante sous forme de carbone réduit. La plante fournit du saccharose à travers le phloème. Des fortes activités sucrose synthase et invertase sont présentes dans le cytosol des cellules infectées, permettant l'hydrolyse du saccharose en glucose. Le glucose est ensuite métabolisé en phosphoénol pyruvate, en oxaloacétate, en malate et en succinate. Ces deux derniers composants sont la principale source carbonée des bactéroïdes (Dommergues et al. 1999).

Le fonctionnement de la nitrogénase exige une faible concentration en O2. Or l'ensemble des phénomènes décrits précédemment nécessite de grandes quantités d'O2 pour alimenter les chaînes respiratoires qui fournissent l'ATP. Au niveau du parenchyme

28 nodulaire plusieurs couches de cellules limitent la diffusion de l'oxygène vers l'intérieur du nodule. La forte respiration des bactéroïdes consomme également une grande quantité d'oxygène empêchant des pressions partielles d'O2 (ppO2) trop importantes. La présence dans les nodules de grandes quantités d'hémoglobine (=leghémoglobine) permettrait d'assurer un transport efficace de l'oxygène jusqu'aux chaînes respiratoires mitochondriales tout en maintenant une pression partielle en oxygène compatible avec l'activité nitrogénase (Postgate 1980).

3-5. Particularités de la symbiose chez les espèces ligneuses

Il est largement admis que les arbres, qu'il s'agisse d'arbres fixateurs ou non fixateurs d'azote, exercent un effet favorable sur le maintien ou même l'amélioration de la fertilité des sols en faisant intervenir les particularités et mécanismes principaux suivants

 Leur cycle de vie est beaucoup plus long que celui des espèces herbacées  Leur enracinement profond leur permet une meilleure tolérance au déficit hydrique, de fixer la terre ou le sable, de favoriser l’infiltration de l’eau, d’améliorer les propriétés physiques des sols et la redistribution des éléments nutritifs en leur sein.  ils fournissent une litière et une exsudation racinaire abondantes favorables à l’amélioration quantitative et qualitative de la fraction organique du sol,  Ils procurent de l’ombre et protègent des vents créant ainsi un microclimat et une niche écologique favorables à la biodiversité (microorganismes, plantes, insectes, oiseaux…) et à l’activité biologique des sols. Quant aux arbres fixateurs d'azote, qu’ils soient des légumineuses (espèces associées symbiotiquement avec des rhizobia), ou des plantes actinorhiziennes (espèces associées avec des frankias), ils possèdent, en plus la propriété remarquable de fixer l'azote de l'air. Par ailleurs, comparativement aux légumineuses herbacées, les arbres fixateurs d’azote présentent une longue durée de vie et possèdent des nodules pérennes généralement lignifiés qui sont actifs beaucoup plus longtemps et moins sensibles au manque d’eau que ceux des espèces herbacées ce qui leur permet de contribuer plus durablement à l’amélioration de la qualité, du niveau de ferilité et d’activité biologique des sols. Les arbres fixateurs d’azote peuvent non seulement se suffire en ce qui concerne leurs besoins en azote mais aussi contribuer, au moins partiellement, à la nutrition azotée des pantes voisines qu’elles soient spontanées ou cultivées notamment dans les sols déficients en azote et ainsi contribuer à assurer le maintien du niveau de fertilité azotée du milieu ou l'établissement de pratiques d’agriculture durable. Pour l’ensemble de ces raisons, ils représentent un potentiel considérable aussi bien pour les opérations de boisement ou de reboisement, de réhabilitation des aires naturelles dégradées (carrières, décharges, mines et sites industriels désaffectés) que pour l’agriculture par le biais de l’adoption de pratiques d’agroforesterie c'est-à-dire de systèmes culuraux combinant parallélement ou

29 séquentiellement la culture de plantes herbacées et d’arbres. Cette approche utilisée depuis des siècles au niveau du Sahel par le biais des pratiques comme les parcs à Faidherbia, les jardins de case ou encore la jachère améliorée est aujourd’hui une des préoccupation majeure de l’agriculture en Europe par le biais des incitations financières considérables octroyées aux agriculteurs pour pratiquer l’agroforesterie (culture en couloir), réhabiliter le bocage et les haies vives afin d’améliorer la durabilité de l’activité agricole. C’est dans l’optique de l’utilisation du potentiel biologique considérable que représentent les légumineuses arborées et arborescentes pour l’aménagement environmental et l’agriculture que nous nous sommes intéressés aux légumineuses arborées et arborescentes introduites et acclimatées en Algérie.

30 Matériel et Méthodes 1 - Matériel

1–2 Matériel biologique 1-2-1 Plants et graines de légumineuses

Le matériel végétal utilisé pour mener cette étude a consisté pour l’essentiel en de jeunes plants de légumineuses arborées ou arborescentes âgès de 2 à 3 ans obtenus auprès de pépinières publiques ou privées de la région d'Alger, en particulier celles de l'EDEVAL (Entreprise de développement des espaces verts de la wilaya d'Alger) et de l'INREF (Institut National de la recherche forestières). Ces plants ont été générallement produits en sachets de polyéthylène (15 x 25 cm) perforés dans des pots en plastique ou en fer blanc, sur de la terre végétale prélevée au niveau des pépinières ou aux abords immédiats. Additionnelement, et pour la réalisation des tests de nodulation nécessaire à l’authentification et à la détermination du spectre d’hôte des souches de rhizobia associées à quelques espèces d’acacias introduites nous avons été amenés à produire nous-mêmes des plants au laboratoire à partir de graines fournies par l’Institut National de Recherche Forestière – Arboretum de Bainem - Alger (INRF). Les graines des six espèces d’acacias (A. saligna, A. longifolia, A. melanoxylon, A. dealbata, A. horrida et A. farnesiana) on été triées sur la base de la couleur, de la forme et de la taille. La classe la plus représentative a été retenue pour notre travail. 1-2-2- Souches bactériennes En plus des souches de rhizobia que nous avons isolés par nos soins à partir des plants de quelques espèces d’acacias introduits, nous avons utilisés à titre comparatif, lors de l’analyse par taxonomie numérique des souches de rhizobia associées aux légumineuses ligneuses introduites en Algérie, huit (08) souches de références des genres et espèces de rhizobia les plus communs, à savoir: Sinorhizobium meliloti (USDA 1002), E. medicae (USDA 1037), Mesorhizobium loti (USDA 3471), Mesorhizobium ciceri (USDA 3383), Bradyrhizobium japonicum (USDA 110), Bradyrhizobium elkanii (USDA 76) Rhizobium leguminosarum (USDA 2370), R. trifolii (LMG 8820). Ces souches nous ont été fournies par la collection de rhizobia de l'USDA (United States Department of Agriculture – Arlington Research Station - Rhizobium Germplasm Resource Collection, Beltsville, MD, USA) pour les souches à préfixe USDA et par la collection espagnole IJFM (Instituto Jaime Ferrán de Microbiología, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Madrid, Espagne) pour les deux souches à préfixe LMG. L'ensemble de nos souches a été conservé à +4°C en tubes à essais sur milieu YEMA incliné dans le cas des sous collections de travail, à -20°C en cryotubes pour la collection mère. Dans ce dernier cas, 5mL de culture obtenue sur milieu TY (Tryptone Yeast Extract ; (Beringer, 1974)) sont centrifugés, le culot est remis en suspension dans 2ml de TY neuf dilué au demi auxquels nous ajoutons 2mlde glycérol.

31 1-2-3 Milieux de culture

Pour l’isolement, la purification, la culture routinière et la conservation à court terme de nos souches de Rhizobia, nous avons utilisé le milieu Yeast Extract Mannitol (YEM) (Vincent, 1970) qui est un milieu spécifique aux Rhizobia et dont la composition figure ci-dessous.

Composition du milieu YEMA (Vincent 1970)

Mannitol...... 10,0g

MgSO4-7H2O...... 0,2g

K2HPO4-3H2O...... 0,5g Extrait de levure ...... 0,4g NaCl ...... 0,1g Eau distillée...... 1000ml

Le milieu est ajusté à pH=7 avec KOH ou HCl (1N), si nécessaire additionné de 12 ou 6g d’Agar-agar et de 9 ml/l de rouge Congo à 0,25%, puis stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20min.

Lorsque la version solide ou semi-solide de ce milieu est requise, nous ajoutons à la composition de base respectivement 12 et 6 g/l d’Agar-Agar. Nous désignerons la version liquide par “Milieu YEMB”, la version solide par “Milieu YEMA”. Le milieu YEM est générallement additionné de 9 mL d’une solution de rouge Congo à 0,25%, ce qui permet de détecter d’éventuelles contaminations. En effet, en présence de rouge Congo, les colonies de rhizobia n’absorbant généralement pas ce colorant, forment des colonies blanchâtres, rosées ou orangées alors que les contaminants forment générallement des colonies rouges en raison de la forte absorption de rouge Congo par les cellules (Vincent, 1970). Pour la culture en masse de nos souches (production d’inoculants pour les tests de nodulation) ou leur conservation à long terme nous avons utilisé le milieu Tryptone Yeast extract (TY) préconisé par Beringer (1974) et dont la composition est donnée ci-dessous.

Composition Tryptone Yeast extract (Beringer 1974)

Tryptone ...... 5.0 g Extrait de levure ...... 3.0 g

CaCl2 . H2O...... 0.87 g Eau distillée ...... 1000 ml

Le milieu est ajusté à pH=7 avec KOH ou HCl (1N) puis stérilisé par autoclavage à 120°C pendant 20min. Stériliser une solution de CaCl2 1M à part et ajouter la quantité requise extemporanément au tryptone et à l’extrait de levure. 2 - Méthodes 32 2-1 Inventaire «théorique» des légumineuses ligneuses introduites en Algérie Pour dresser la liste des espèces de légumineuses arborées et arborescentes qui ont été introduites et acclimatées en Algérie, nous nous sommes basés essentiellement sur deux catalogues édités en 1850 et 1865 sous les titres respectifs de « Catalogue des végétaux cultivés à la pépinière centrale du gouvernement à Alger » et de « Catalogue des végétaux et graines disponibles et mis en vente au jardin d'acclimatation au Hamma (près Alger) pendant l'automne 1865 et le printemps 1866 » (GGA 1865) ainsi que sur la flore de Maire (1987) dont l’un des volumes dédiés aux légumineuses (Volume XVI) inclut en plus des espèces autochtones les espèces introduites (Fig. 12).

2-2 Prospections Pour vérifier la présence et évaluer l’abondance des légumineuses ligneuses introduites en Algérie, nous avons menés des prospections sur l’ensemble du territoire national en incluant des arboretum, des parcs, des avenues, des jardins et des aires naturelles reboisées. Ces prospections ont porté sur 61 sites répartis sur 18 wilayas du nord du pays pour la grande majorité d’entre eux (Annexe 1). De même, pour l’évaluation du niveau de production des légumineuses introduites, nous avons mené des prospections/enquêtes au niveau de 16 grandes pépinières publiques ou privées (Jardin botanique du Hamma,Direction des forêts d’Alger (Ben Aknoun), Pépinière EDEVAL (El Alia), EDEVAL (Kouba), Direction des forêts Béjaïa, INREF Bainem, INREF Médéa, INREF Jijel, INREF Tlemcen, INREF El Kala, INREF Ténès, INREF Sétif ainsi que huit pépinières privées (Hamiz, Boufarik, Blida, Bougara, Tipaza, Aïn Defla, Freha, Souk El Tenine). Au niveau de chaque pépinières nous avons évalué par nous-mêmes et sur la base des déclarations des gestionnaires ou employés le volume de production des espèces ciblées et le mode de reproduction.

2-3 Identification des légumineuses Pour l’identification des légumineuses ligneuses rencontrées lors de nos campagnes de prospections, nous avons observé celles-ci à différents stades phénologiques (état végétatif, floraison et fructification) et utilisés les flores écrites de Lapie et Maige (1915) et celle de Maire (1987) pour leur détermination. La position taxonomique et la nomenclature actuelles des taxons a été vérifiée sur les bases de données online, en particulier ILDIS (International Legume Database & Information Service - http://www.ildis.org/).

2-4 Extraction, isolement et purification des souches Pour l’extraction, l’isolement et la purification des souches de rhizobia assocciées aux légumineuses ligneuses introduites en Algérie, nous avons adopté les méthodes préconisées par l’International Biological Program (Vincent 1970).

2-4-1 Collecte des nodules de légumineuse Les nodules des légumineuses sont déterrés en évitant d’endommager leur système racinaire. A cet effet, les pots ou les sachets renfermant celles-ci sont découpés au sécateur, le système racinaire des plants est débarrassé de la terre qui l'entoure par action mécanique et ensuite par action d’un jet d'eau courante.

33 Figure 12: Archives et flores utilisées pour l’inventaire et la détermination des légumineuses ligneuses arborées ou arborescentes introduites en Algérie.

34 Les racines sont ensuite lavées à l’eau courante, rincées à l’eau distillée et épongées sur papier absorbant avant l'examen destiné à déterminer la présence ou non d'une nodulation. Lorsque l'espèce est nodulée, les nodosités de taille et de forme représentatives, ne représentant aucune altération structurale, sont excisées avec un fragment de racine, pour faciliter leur manipulation lors de la procédure d'extraction des rhizobia associés.

2-4-2 Extraction Les bactéroïdes, forme que prennent les rhizobia dans les nodules, sont extraits par écrasement d’un nodule à l’aide d’une tige en verre. Pour éviter des contaminations, cette extraction est réalisées à partir de nodules dont la surface a été préalablement stérilisée par immersion successives durant 30s dans de l’éthanol 95°, 3mn dans une solution d’hypochlorite de calcium (CaCl2O2) à 5,25% (Eau de Javel à 13° chlorométriques). Après rinçage dans 5 bains d’eau physiologique stérile (KCl 0,85%) le nodule est écrasé à l’aide d’une tige en verre pour libérer les bactéroïdes qu’il contient. Lorsque le nodule est trop dur ou trop grand pour être écrasé à l’aide d’une tige de verre, nous découpons celui-ci à l'aide d'une lame stérile et écrasons les fragments obtenus comme décrit précédemment.

2-4-3 Isolement et purification Une aliquote du broyat nodulaire ainsi obtenu est ensuite ensemencée en boîtes de Petri sur milieu YEMA-CR. Après 2 à 9 jours d’incubation à 25°C, les colonies bactériennes présumées appartenir au genre Rhizobium, reconnaissables par leur prédominance, leur non absorption du rouge Congo et à leur aspect gommeux et translucide sont isolées et purifiées par repiquages successifs sur le milieu YMA . La pureté des isolats est vérifiée par observation microscopique des cellules à l’état frais après coloration au bleu de méthylène et sur des frottis colorés selon la technique de Gram (Vincent, 1970).

2-4-4 Conservation des souches Deux méthodes de conservation des souches bactériennes ont été utilisées :  Conservation à court terme à 4°C en tubes à essai contenant le milieu YEM solide incliné. Cette méthode est utilisée dans le cas des sous collections de travail ; avec ce type de conservation pour éviter l’altération et la perte de viabilité, les souches sont remises en circulation au moins une fois par an à partir de cryoconservats.  Conservation à long terme. Cette méthode consiste en une congélation des souches par congélation à –20°C de suspensions cellulaires obtenues sur milieu TY en présence d’un volume égal de glycérol (cryoprotecteur). Dans ces conditions les souches peuvent être conservées environ 5 ans sans avoir à recourir à des remises en activité régulières.

2- 5 Authentification des isolats et détermination de leur spectre d'hôte L’authentification et la détermination du spectre d’hôte des isolats bactériens extraits à partir des nodosités des acacias ont été réalisées au laboratoire par réinoculation des souches à des plantules axéniques de 6 espèces d’acacias introduites (A. saligna, A. longifolia, A. melanoxylon, A. dealbata, A. horrida et A. farnesiana). 2-5-1 Production de plants d’acacias au laboratoire

35 a - Scarification des semences Nous avons procédé à la scarification des graines en pratiquant à l’aide d’une lame à des incisions du tégument, au niveau du côté opposé au micropyle, en évitant de toucher l’embryon et l’albumen de la graine. b - Désinfection superficielle des semences La stérilisation superficielle des semences est assurée par immersion des graines dans de l’éthanol à 90° durant 30s puis dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5,25% durant 5mn. Les semences ainsi traitées sont rincées dans 6 bains d’eau distillée stérile, mises à imbiber dans de l’eau distillée stérile durant 12h et mises à germer en boîte de Pétri sur couche d’agar (agar à 0,75%). Après 2 à 3 jours d’incubation à 25°C et à l’obscurité, les graines dont la radicule est visible sont transférées en pots. Ce traitement vise à éviter tout apport de rhizobia par les graines. c- Substrat utilisé pour la culture des acacias Nous avons utilisé pour la production des plantules d’acacias au niveau du laboratoire un substrat constitué d’un mélange de deux volumes de tourbe brune (Marque Kekkila – Turquie) et d’un volume de sable de rivière. Le mélange est tamisé à 2 mm et stérilisé par autoclave pendant une heure à 120°C, trois fois de suite, entrecoupées par un séjour de 48h à 25°C. Ce traitement est destiné à éliminer la microflore endogène, en particulier les champignons et d’éventuels Rhizobia. Ce substrat est réparti stérilement à raison de 200 mL par pot dans des petits pots en plastique (250 mL) dont le fond comporte des perforations assurant l’aération ainsi que le drainage d’un éventuel excès d’eau. Nous plaçons dans chaque pot 3 germinations et procédons immédiatement à un arrosage avec de l’eau distillée stérile en quantité suffisante pour atteindre 80% du potentiel de rétention en eau du mélange sable tourbe. Les pots ainsi préparés sont alors inoculés à l’aide de suspensions bactériennes renfermant des cellules de chacune des souches testées. d - Conditions de culture Les pots contenant les germinations sont placées à température ambiante sous un éclairement additionnel de 8000 lux avec une photopériode de 16/8 heures de jour/nuit. Après 60 jours de végétation, les plants sont dépotés en prenant soin de ne pas endommager leur système racinaire. Les racines sont lavées à l’eau courante et examinées pour détecter la présence de nodules. S’ils sont présents, les nodules sont dénombrés et un nodule par plant est coupé transversalement pour déterminer s’il est fixateur d’azote par recherche d’une zone rouge ou rose résultant de la production de leghémoglobine. e - Inoculation des plantules

36 L’inoculation des pots a été réalisée par aspersion à la surface du substrat de 5mL de culture âgée de 72h obtenues en milieu TY sous agitation, à 100 tr/mn, et à une température de 25°C et. Dans ces conditions, les cultures atteignent une densité cellulaire de l’ordre de 107-108 cellules mL-1, largement suffisante pour assurer la nodulation des plantules. L’inoculation a été réalisée pour l’ensemble des espèces, 3 jours après le transfert des germinations en pots en utilisant une seringue munie d’une aiguille pour canaliser l’aspersion à la base des plantules. 2-5-2 Tests de nodulation Les tests de nodulation nécessaires à l’authentification des isolats, à la détermination du spectre d’hôte des souches bactériennes et à l’évaluation de leurs performances symbiotiques ont été réalisés dans des pots en plastique de 300 mL. Ces tests se font par inoculation à des plantules axéniques obtenues au laboratoire dans des pots renfermant 250 g d’un mélange de sable de rivière et de tourbe (2/1 ; v/v) stérilisé à 121 °C durant une heure trois fois successives entrecoupées d’un séjour de 48 h à 25°C (Chao et Alexander 1984).

Les graines ont été triées et la classe la plus représentative est retenue. Ces graines sont scarifiées par incision à l’aide d’une lame pour lever la dormance tégumentaire. Une fois que la radicule a pointé, elles sont transférées en pots sur mélange sable/tourbe, porté à 80% de sa capacité de rétention en eau à l’aide d’eau distillée stérile. Après émergence des plantules, les pots sont inoculés par 3 mL d’une culture bactérienne obtenue en milieu TY (Tryptone Yeast Extract), renfermant environ 108 cellules mL-1 et placés à 25 °C en chambre de culture réglée à une photopériode de 16 heures de jour et de 8 heures de nuit. Les pertes en eau résultant de l’évaporation et de l’évapotranspiration sont déterminées toutes les 48 heures par pesée des pots et compensées par l’addition d’une quantité équivalente d’eau distillée stérile.

Douze semaines après inoculation, les plantules sont déterrées et leur système racinaire est lavé à l’eau du robinet et rincé avec de l’eau distillée stérile. Les nodules des plants sont excisés et dénombrés.

L’'efficience des couples symbiotiques obtenus pour les tests d'inoculation et d’inoculation croisée, nous nous sommes contentés de la recherche de traces de léghémoglobine au sein des nodules. A cet effet, nous pratiquons sur trois nodules repésentatifs du cortége nodulaire à des coupes à main levée. En effet, dans ces conditions, les traces de cette hémoprotéine qui n'est produite que par les nodules efficients sont facilement discernables à l'œil nu ou à la loupe car elles confèrent au tissu de la zone centrale des nodules efficients une coloration rose à rouge sombre selon l'état d'oxydation de la léghémoglobine. Ces traces sont à l'inverse absentes des nodules inefficients dont la zone centrale montre alors une coloration blanchâtre ou jaunâtre (Prévost et Antoun, 2006). 2-6 Détermination des caractéristiques des souches de rhizobia

37 Nous avons utilisé pour la détermination du profil phénotypique de nos souches, la méthodologie préconisée par l’American Society for Microbiology (Smibert et Krieg 1984). Cette méthodologie qui est basée, entre autre, sur la qualité de la technique de conservation, le nombre de répétitions et l’utilisation de tests témoins non-inoculés..., permet de déterminer des profils phénotypiques fiables et reproductibles. Pour le choix des tests effectués, leurs modalités de mises en œuvre, la concentration du milieu en substrat carboné; nous nous sommes basés sur les revues de Smibert et Krieg (1984),Lindstrom (1985) et les travaux de Holmes et coll, (1986) et ceux de Novikova (1994).

2-6-1 Le système micro-galerie Les tests physiologiquess, biochimiques et de résistance qui ont été retenus pour la caractérsation des souches ont été menés en microgalerie préparées par nos soins au laboratoire de biologie du sol (Fig. ). Ce système consiste en l’utilisation de plaques de microtitration à 96 puits. Nous plaçons dans chacun des puits 0,15ml de milieu YMA semi-solide (3g/l d’agar agar). Les puits sont ensemencés à l’aide de suspensions bactériennes obtenues après centrifugation et remise en suspension, dans de l’eau physiologique stérile, de cultures âgées de 72h. Nous utilisons pour l’ensemencement des cure- dents pour éviter l’apport d’une trop grande quantité d’inoculum. Ne disposant pas d’un lecteur de plaques, nous avons eu recours pour la lecture de nos tests à L’utilisation d’un indicateur de pH, en l’occurrence le Bleu de Bromothymol à 1%. Cet indicateur de pH (6-7,6), vert à la neutralité vire rapidement au jaune ou au bleu en cas d’acidification ou d’alcalinisation du milieu consécutivement à la croissance bactérienne. Tout virage coloré du Bleu de bromothymol, que ce soit vers le jaune ou le bleu est traduit comme réaction positive. L’absence de virage coloré est lue pour sa part comme réaction négative. Pour chaque test, un témoin: non ensemencé est prévu. Celui- ci permet de juger de la stérilité du système microplaque+couvercle mais également de repérer tout changement intempestif de la coloration du milieu qui ne soit pas occasionnée par la croissance bactérienne. Ce système présente de nombreux avantages par apport aux galeries dites classiques (réalisées en tubes à essais): Economie de temps, Economie de réactifs, Economie d’espace notamment pour l’incubation en étuve bactériologique… Ce système s’apparente en fait aux microgaleries commerciales type API ou Biolog dont il diffère par:  le désavantage de renfermer des milieux non-lyophilisés. Contrairement aux galeries commerciales, les microgaleries que nous utilisons ne peuvent pas être conservées puisqu’il faut les utiliser immédiatement (24h) après leur fabrication.  L’avantage de pouvoir choisir, dans le cas de notre système, le milieu le mieux indiqué pour un test et/ou des souches de Rhizobium donnés.

38 Figure 13 : Plaque de microtitration utilisée pour la détermination des caractères phénétiques des souches de rhizobia associées à d'Acacia saligna. Chaque test est réalisé en trois réplicats dans 3 puits contigus. Les puits témoins (non inoculés, en haut à gauche et en bas à droite) sont signalés par des accolades. La croissance des souches se traduit par le virage du milieu du vert vers le jaune ou vers le bleu selon le pH. La plaque présentée renferme le milieu test pour l'utilisation du galactose ensemencé avec 30 souches différentes.

2-6-2 Tests retenus pour la caractérisation phénotypique des souches : Les tests qui ont été réalisés sur nos souches ont consisté en la détermination :

 de la nature acidifiante, alcalinisante ou neutre de la croissance des souches sur milieu YMA additionné de bleu de bromothymol  de la gamme de température (5°C; 10°C; 15°C; 20°C; 25°C; 30°C; 35°C; 40°C; 45°C ) et de pH (pH 4; pH 5; pH 6; pH 7; pH 8; pH 9) permettant la croissance  du niveau de tolérance à la salinité (NaCl 250 mM; NaCl 500 mM; NaCl 750 mM; NaCl 1000 mM; NaCl 1250 mM; NaCl 1500 mM ) et au déficit hydrique (PEG 2,5%; PEG 5%; PEG 7,5%; PEG 10%; PEG 12,5%; PEG 15% et PEG 17,5%)  du spectre d’utilisation des substrats carbonés suivants comme seule source de carbone et d’énergie : adonitol, amidon, arabinose, arabitol, cellobiose, cellulose, dulcitol, érythritol, esculine, fructose, fucose, furanose, galactose, glucose, glycérol, inositol, lactose, maltitol, maltose, mannitol, mannose, mélibiose, mélizitose, raffinose, rhamnose, ribitol, ribose, ribulose, saccharose, sorbitol, sorbose, tagatose, tréhalose, xylitol, xylose et xylulose. Ces composés ont été administrés à raison de 10g/l exception faite de l'esculine qui a été utilisée à raison de 2,5g/l.  du profil de résistance aux antibiotiques et métaux lourds suivants : (Antibiotiques : Acide nalidixique, Chloramphénicol, Gentamycine, Kanamycine, Pénicilline, Rifamycine, Spiramycine, Streptomycine et Tetracycline administrés à une concentration de 100µg/ml exception faite de la tetracycline administrée à 50µg/ml – Métaux lourds : Aluminium

39 (AlSO4) ; Argent (AgSO4); Cadmium (CdSO4); Chrome (CrSO4) ; Cobalt (CoSO4); Cuivre (CuSO4); Magnésium (MgCl2); Manganèse (MnSO4); Plomb (PbSO4); Sélénium (SeS2); Vanadium (V2(SO4)3); Zinc (ZnSO4) administrés à une concentration de 200µg/ml exception faite du ZnSO4 administré à une concentration de 100µg/ml. Le milieux utilisés en microgaleries ont été stérilisés par microfiltration à 0,45µm exception faite de ceux renfermant du PEG6000 qui ont été autoclavés à 120°C pendant 20 mn car en raison de leur grande viscosité ils sont incompatibles avec une stérilisation par microfiltration. En plus des tests réalisés en micro-galeries, nous avons procédé par ailleurs à la détermination en :  Des caractéristiques coloniales des souches (forme des colonies, couleur, aspect, élévation, forme de leur contour, consistance…) réalisée en boîtes de Petri sur milieu YMA additionné de rouge Congo  Du temps de génération des souches en milieu YEM réparti en filoles coniques incubées en agitateur thermostaté réglé à 25°C et à 120 tr/mn en évaluant le temps de doublement de la densité optique des cultures par extrapolation sur des courbes de croissance établies sur des mesures de densité optique effectués à une longueur d’onde de 600nm avec une périodicité de 2 heures.

2-7 Traitement numérique des profils phénotypiques des souches 2-7-1 La taxonomie numérique : Définition et principe

La taxonomie numérique est une méthode de classification et d’étude des relations phénétiques basée sur le principe de la similitude globale d’organismes examinés pour un grand nombre de caractères (Sneath 1974).

De manière schématique, la méthode consiste à étudier, pour chaque souche prise en compte plusieurs caractères morphologiques, biochimiques, physiologiques et à attribuer pour chaque caractère un code numérique binaire (1 : pour la présence du caractère ou 0 : pour l'absence de ce caractère). Les caractères sont alors utilisés pour former des groupes d'individus qui se ressemblent selon des critères prédéfinis et à éliminer ceux qui s'en distinguent et qui pourront former un autre groupe avec leurs semblables. Ces groupes sont appelés taxons. Deux ou plusieurs taxons peuvent être à leur tour groupés en un nouveau taxon d'un niveau hiérarchique supérieur qui comprendra un plus grand nombre d'individus. De regroupements en regroupements, on arrive progressivement à inclure tous les individus dans un même ensemble représenté graphiquement par un dendrogramme.

Plus le nombre de caractères pris en considération est élevé plus l’efficacité du traitement est grande. On considère qu’avec environ une centaine de caractères significatifs et diversifiés on obtient une image du génotype et une classification aussi

40 précises que celles obtenues par les méthodes génomiques souvent restreintes à de faibles portions du génome (Lindstrom 1995, Sneath 1995, Gest 1999).

Les techniques modernes de taxonomie numérique, du type Classification Ascendante Hiérarchique (CAH), Analyse en composantes principales (ACP) et d’autres analyses multi- variées (ACF, ACM...), sont aujourd’hui incontournables pour le traitement de matrices de données composées d’un grand nombre de taxons (souches) et de variables (caractères). Ces techniques combinées aux méthodes de clusterisation sont les seules à pouvoir permettre de visualiser la structure de la variabilité phénotypique ou génotypique à l'aide de diverses techniques graphiques, comme les dendrogrammes ou les projections en deux ou trois dimensions.

2-7-2 La similitude et l’indice de similitude La première phase du traitement numérique des profils phénotypiques est la détermination du coefficient de similitude entre les souches. De nombreuses formules permettent de réaliser cette opération, la plus utilisée en microbiologie est sans conteste celle de Jaccard. Cette formule permet de calculer des indices ou coefficients de similitude entre les souches incluses dans le traitement. Ces indices permettent la construction d’une matrice de similitude qui servira de base pour la représentation graphique de la classification des souches examinées. L'indice de Jaccard (ou coefficient de Jaccard) est le rapport entre la cardinalité (la taille) de l'intersection des ensembles considérés et la cardinalité de l'union des ensembles. Il permet d'évaluer la similarité entre les ensembles. Soit deux ensembles A et B, l'indice est :

Soit deux souches A et B, chacune avec n attributs codés binairement et avec chaque attribut qui ne peut être égal qu’à 0 ou qu’à 1. On a ainsi :

On définit plusieurs quantités qui caractérisent les deux ensembles :

M11 - représente le nombre d'attributs qui valent 1 pour A et pour B M01 - représente le nombre d'attributs qui valent 0 pour A et 1 pour B M10 - représente le nombre d'attributs qui valent 1 pour A et 0 pour B M00 - représente le nombre d'attributs qui valent 0 pour A et pour B Chaque paire d'attributs doit nécessairement appartenir à l'une des quatre catégories, de telle sorte que :

41 L'indice de Jaccard devient :

En utilisant ces deux dernières expressions, on obtient :

Il suffit donc de ne calculer que les nombres d'attributs valant 1 ou 0 pour toutes les souches. La dernière écriture de cette formule, faisant intervenir n, est généralisable pour l'étude de similarité de plusieurs souches (en calculant M00...00 et M11..11 avec autant de 0 et de 1 que d'ensembles).

La distance de Jaccard devient:

Une matrice résumant les valeurs de ces coefficients inter-individus est établie. Les distances taxonomiques entre tous les individus, pris deux à deux, sont alors déduites de la matrice des similitudes selon l'équation : Distance= 1- Similitude.

2-7-3 Représentation graphique (Clustering) :

A partir de la matrice de similitude, les souches sont regroupées selon leurs affinités, opération qui permet de définir des groupes (clusters) ou phénons formés par des souches qui présentrent une grande similarité de caractères. Ces phénons sont ensuite hiérarchisés selon leur niveau de similitude et le résultat de cette hiérarchisation est représenté par un dendrogramme ou arbre comportant des branches et rameaux représentant les souches et une échelle représentant la distance phénotypique entre ces dernières. Il existe plusieurs algorithmes pour la hiérarchisation des phénons (Sneath et Sokal 1973). Le plus utilisé, celui adopté dans cette étude, est sans conteste l’UPGMA (Unweighted Pair Group Using Arithmetic Average) qui attribue à tous les caractères pris en considération la même valeur taxonomique.

2-7-4 La méthode UPGMA La méthode UPGMA utilise un algorithme de clustérisation séquentiel dans lequel les relations sont identifiées dans l'ordre de leur similarité et la reconstruction de l'arbre se fait pas à pas grâce à cet ordre. Il y a d'abord identification des deux individus (OTU) les plus proches et ce groupe est ensuite traité comme un tout, puis on recherche

42 l'individu le plus proche et ainsi de suite jusqu'à ce qu'il n'y ait plus que deux groupes. Cet algorithme permet de calculer un arbre ultra métrique (Luchetta et al. 2005).

2-7-5 Les étapes de la méthode Etape 1: Dans la matrice des distances, trouver les taxons i et j pour lesquelles la

distance dij est la plus petite. On clustérise tout d'abord les deux OTUs avec la distance la plus faible.

Etape 2 : Mettre la racine à égale distance des deux OTU i et j c'est à-dire à dij/ 2. Etape 3 : Créer un nouvel ensemble incluant i et j. Etape 4 : Calculer la distance entre le nouveau groupe (ij) et chaque autre taxon (k), en appliquant la formule suivante : dki+ dkj / 2 Etape 5 : A partir de cette nouvelle matrice, répéter l'opération depuis le début

2-8 Logiciels A tous les niveaux du traitement, la taxonomie numérique requiert un grand nombre de calculs, qu’il est fastidieux de réaliser manuellement. C’est pour cette raison que l’utilisation de cette méthode profite de l’explosion des performance des micro-ordinateurs, aujourd’hui présents dans tous les laboratoires pour connaître un renouveau, perceptible au niveau des publication et de l’édition logicielle de ces dernières années(Gest 1999). Dans notre cas, nous avons utilisé le logiciel MVSP version 3.12D (Multi-Variate Statistical Package de la société Kovach computing).

43 Résultats et Discussion 1- Les légumineuses ligneuses introduites en Algérie d’après Maire (1987) Dans la première partie de cette étude, nous nous sommes efforcés de déterminer quelles sont les légumineuses ligneuses qui ont été introduites en Algérie durant la période coloniale. Pour ce faire, nous nous sommes basés avant tout sur la flore de Maire (1989) dont le volume dédié aux légumineuses (Volume XVI) inclut en plus des espèces autochtones les espèces introduites. En plus de la flore de Maire, nous avons utilisé des archives du Gouvernement Général de l’Algérie (GGA) relatives aux activités du jardin botanique du Hamma à Alger qui a constitué la plaque tournante des essais d’introduction et d’acclimatation des espèces végétales en Algérie et pour le reste de l’Afrique du Nord. Il s’agit surtout de deux catalogues listant les espèces soumises à des essais d’acclimatation (GGA, 1850) ou mises en vente au niveau de ce jardin quinze ans plus tard (GGA, 1865). Ces documents indiquent que plus de 100 légumineuses ligneuses d’utilisation et de provenance diverses ont fait l’objet d’essais d’introduction en Algérie (GGA, 1850) mais qu’une partie seulement d’entre elles se sont révélées capables de survivre et se développer dans le contexte bioclimatique algérien et on été par la suite propagées à plus ou moins grande échelle dans le pays (GGA, 1865). Ce sont seulement les espèces de légumineuses ligneuses qui ont été acclimatées avec succès et puis propagées dans le pays qui ont été consignées, avec quelques oublis notables comme nous le verrons plus loin, dans la flore de Maire (1989) qui a servi de fil conducteur à cette étude. Si l’on se base sur la flore de Maire (1989) 43 légumineuses ligneuses ont été introduites, acclimatées avec succès et propagées à plus ou moins grande échelle en Algérie (Tab.III). Ces légumineuses ligneuses représentées par ordre d’importance par des arbres et des arbustes grimpants ou non, se répartissent entre les 3 sous familles de légumineuses comme suit

. 12 Caesalpinieae, réparties sur 4 tribus (Cassieae, Cercideae, Caesalpinieae et Detarieae) et 8 genres (Bauhinia, Caesalpinia, Cassia, Cercis, Gleditsia, Gymnocladus, Parkinsonia et Schotia). Parmi ces 8 genres, seuls le genre Bauhinia comporte un représentant autochtone à la flore d’Algérie, à savoir : Bauhinia aculeata un arbre épineux des régions désertiques d’Algérie en particulier aux confins du Sud-Ouest où cette espèce abonde. . 25 Mimosoideae réparties sur 3 tribus (Acacieae, Ingeae et Mimoseae) et 6 genres (Acacia, Albizzia, Enterolobium, Leucaena, Mimosa et Prosopis). Parmi ces genres seuls deux comportent des représentants autochtones à l’Algérie et plus exactement à ses régions désertiques : le genre Acacia (A. ehrenbergiana, A. laeta, A. nilotica subsp. adstringens, A. tortilis susp. raddiana et A. seyal) et le genre Prosopis (Prosopis farcta (ex. P. stephaniana). . O6 Papilionaceae réparties sur 3 tribus (Podalyrieae, Sophoreae et Brongniartieae) et 4 genres (Chorizema, Cladrastis, Sophora et Templetonia) ne comportant aucun représentant autochtone.

44 . Tableau III : Liste des espèces de légumineuses ligneuses introduites référencées par Maire (1987). Les espèces signalées par une étoile au niveau de la dernière colonne ont subi des changements nomenclaturaux et/ou systématiques.

Forme Hauteur en Longévité N° Espèce SF Tribu croissance Origine Usage biologique (M) (années) 1 Bauhinia corymbosa* C Cercideae Arbuste G 2-4-6 50-100 LL Asie H 2 Bauhinia grandiflora C Cercideae Arbre 3-5-7 50-100 LL Am. Sud H 3 Caesalpinia pectinata* C Caesalpinieae Arbre 3-4-5 10-20 L Am. Sud H 4 Caesalpinia gilliesii C Caesalpinieae Arbre 3-4-5 10-20 L Am. Sud H 5 Cassia artemisoides* C Caesalpinieae Arbuste NG 3-4-6 30-60 L Australie H 6 Cassia corymbosa* C Cassieae Arbuste NG 1-2-3 10-20 R Am. Sud H 7 Cassia tomentosa* C Cassieae Arbuste NG 3-4-5 25-50 L Am. Sud H 8 Cercis siliquastrum C Cercideae Arbre 3-4-5 80-120 LL Europe H 9 Gleditsia triacanthos C Caesalpinieae Arbre 12-25-45 50-100 R Am. Nord FH 10 Gymnocladus dioicu* C Caesalpinieae Arbre 5-8-10 40-100 LL Am.Nord H 11 Parkinsonia aculeata C Caesalpinieae Arbre 3-5-7 10-20 L Am. Sud FH 13 Acacia armata M Acacieae Arbre 3-4-6 10-20 R Australie H 14 Acacia baileyana M Acacieae Arbre 5-6-8 10-20 R Australie H 15 Acacia cavenia M Acacieae Arbre 3-4-6 10-20 R Australie H 16 Acacia cultriformis M Acacieae Arbre 2-3-5 10-20 R Australie H 17 Acacia cyanophylla* M Acacieae Arbre 5-7-10 10-25 RR Australie FH 18 Acacia cyclops M Acacieae Arbre 3-5-6 10-20 R Australie H 19 Acacia decurrens M Acacieae Arbre 2-15-30 10-20 R Australie H 20 Acacia farnesiana* M Acacieae Arbre 2-4-6 20-50 R Am. Sud FH 21 Acacia hanburyana M Acacieae Arbre 3-5-6 10-20 Australie H 22 Acacia horrida* M Acacieae Arbre 3-5-6 10-20 R Afr. Sud FH 23 Acacia juniperina M Acacieae Arbre 2-3-3 10-20 R Australie H 24 Acacia longifolia M Acacieae Arbre 5-6-10 10-20 R Australie FH 25 Acacia melanoxylon M Acacieae Arbre 8-35-45 20-40 R Australie FH 26 Acacia podalyrifolia* M Acacieae Arbre 2-3-4 5-8 R Australie H 27 Acacia pycnantha M Acacieae Arbre 4-5-6 10-20 R Australie H 28 Acacia retinodes M Acacieae Arbre 7-8-10 10-20 R Australie H 29 Acacia verticillata M Acacieae Arbre 3-4-5 10-20 R Australie H 30 Albizzia julibrissin M Ingeae Arbre 3-6-12 10-20 L Asie FH 31 Albizzia lebbek M Ingeae Arbre 6-15-20 10-20 L Asie FH 32 Albizzia lophanta* M Ingeae Arbre 4-6-8 10-20 R Australie FH 33 Enterolobium contortisiliquum M Ingeae Arbre 15-20-30 60-120 LL Am. Sud FH 34 Leucaena pulverulenta* M Mimoseae Arbre 3-4-20 10-20 RR Am. Sud FH 35 Mimosa pudica M Mimoseae Arbuste NG 0,5-1-2 10-20 R Am. Sud H 36 Mimosa spegazzini* M Mimoseae Arbuste NG 1-2-3 10-20 R Am. Sud H 37 Prosopis juliflora M Mimoseae Arbre 6-10-15 20-50 R Am. Sud FH 38 Chorizema varium* P Podalyrieae Arbuste NG 2-3-4 5-10 LL Australie H 39 Cladrastis lutea* P Sophoreae Arbre 10-15-20 10-20 LL Am. Nord H 40 Sophora davidii P Sophoreae Arbre 2-4-6 10-20 L Asie FH 41 Sophora japonica* P Sophoreae Arbre 3-5-7 20-60 L Asie FH 42 Sophora secundiflora P Sophoreae Arbre 3-4-5 20-50 L Am. Nord FH 43 Templetonia retusa P Brongniartieae Arbuste NG 3-4-5 5-12 LL Australie H

SF = sous famille: C – Caesalpinieae, M : Mimoseae, P – Papillionaceae - Arbuste G = Arbuste grimpant Arbuste NG = Arbuste non grimpant - Usage = H – Horticole , F – Forestier - Présence = nombre de sites sur les 61 prospectés au niveau desquels l’espèce a été rencontrée - Rév. = L’espèce a t’elle subi un changement de nomenclature ou de systématique par rapport à ceux attribués par Maire (1987).

45 Les 43 espèces de légumineuses ligneuses qui ont été introduites en Algérie, si l’on se base sur la flore de Maire (1987), sont largement dominées par les représentants de la sous famille des Mimosoideae qui constituent à eux seuls plus de la moitié (58%) des espèces introduites.Les Caesalpinieae viennent en deuxième position avec 12 espèces soit 28% des espèces introduites. Les Papilionaceae sont quant à elles la sous-famille dont la contribution est la plus modeste avec seulement 6 espèces soit une proportion de seulement 14%. La prédominance des Mimosoideae et Caesalpinieae sur les Papilionaceae s’explique par le fait que cette dernière sous-famille bien que beaucoup plus diversifiée (≈12.000 espèces) que les premières (≈3.000 espèces chacune) est essentiellement cantonnée au régions tempérée et est par conséquent pauvre en espèces ligneuses arborescentes (Allen et Allen 1981). La prédominance des Mimosoideae sur les Caesalpinieae s’expliquerait quant à elle par des considérations biogéographiques en ce sens que les Caesalpiniées sont des espèces des régions tropicales humides qui s’acclimatent plus difficilement dans une région où prévaut une saison sêche marquée et assez longue. Au contraire des mimosoidées qui sont surtout des espèces pan-tropicales plus adaptées aux périodes sèches comme l’indique leur distribution actuelle dans le monde (Allen et Allen 1981). Il ressort également de cet inventaire des espèces de légumineuses ligneuses qui ont été introduites en Algérie qu’un genre, le genre Acacia, occupe une place particulière avec une contribution de 17 espèces sur les 43 listées soit une proportion de 40%. Tous les autres genres introduits ne sont représentés tout au plus que par trois espèces (Cassia, Albizzia, Sophora), deux espèces (Bauhinia, Caesalpinia, Mimosa) voire par une espèce unique (Cercis, Gymnocladus, Schotia, Leucaena, Prosopis, Chorizema, Cladrastis, Templetonia). Sur les 43 légumineuses ligneuses qui ont été introduites en Algérie les formes arborées sont largement prédominantes avec 35 représentants soit une proportion de près de 82% ce qui indique que les programmes d’introduction ont eu pour objectif de principal l’augmentation de la diversité de la flore arborée du pays. En dehors des arbres, les espèces introduites sont représentées par des arbustes parmi lesquels 7 non-grimpants (16%) et 1 grimpant (2,3%). Dans le cas de ces espèces qui se caractérisent toutes par de belles fleurs ou inflorescences l’introduction répond surtout à des considérations horticoles. En fonction de l’origine biogéographique des espèces de légumineuses ligneuses introduites nous remarquons que la contribution la plus élevée est celle de l’Australie avec 19 espèces soit près de 44% de l’ensemble des espèces introduites. L’amérique du Sud vient en deuxième position avec 12 espèces soit près de 28% des espèces introduites. Les 12 autres espèces introduites proviennent d’Asie (5 espèces – 11,6%), d’Amérique du Nord (4 espèces – 9,6%), d’Afrique (2 espèces – 4,6%) et d’Europe (1 espèce – 2,3%). Ces proportions indiquent que les introducteurs ont été guidé dans leur choix des espèces à introduire par le potentiel d’adaptation de celles-ci à la dessiccation et les températures élevées qui prévalent en Algérie. C’est pour cette raison que la grande majorité de ces

46 espèces proviennent de zones plus ou moins affectées par le déficit hydrique (Australie, Amérique du Sud, Afrique du Sud, Sud de l’Amérique du Nord). Seules les espèces provemant d’Asie (5 espèces), d’Europe (1 espèce), deux des quatre espèces provenant d’Amérique du Nord (Cladrastis lutea, Gymnocladus dioicus) ont échappé à cette règle vraisemblablement en raison de leur qualité horticoles. En fonction de l’usage et si l’on se base sur les indications de la flore de Maire (1987), 27 des 43 espèces listées soit près de 63% ont été introduites avant tout pour leur valeur horticoles. Seules 16 espèces (37%) l’ont été prioritairement pour leur qualités sylvicoles ce qui n’empêche pas qu’elles aient par ailleurs un intérêt horticole. Certaines des 43 espèces introduites référencées par Maire (1987) ont subi des changements nomenclaturaux et/ou systématiques résumés au tableau IV. Les changements les plus importants ont porté sur le transfert du genre Chorizema assigné à la tribu des Podalyrieae à celle des Mirbelieae et sur la réassigantion de Cassia corymbosa et Cassia tomentosa au genre Cassia, d’Acacia farnesiana et Acacia horrida au genre Vachellia, d’Albizzia lophanta au genre Paraserianthes et de Sophora japonica au genre Styphnolobium.

Tableau IV : Taxons de légumineuses ligneuses introduites ayant été affectés par des changements nomenclaturaux ou systématiques par rapport aux données de la flore de Maire (1987).

Maire (1987) ILDIS 2011 N° Espèce SF Tribu Espèce Tribu 2 Bauhinia grandiflora C Cercideae Bauhinia aculeata L. subsp. grandiflora (Juss.) Wunderlin Cercideae 3 Caesalpinia pectinata C Caesalpinieae Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze Caesalpinieae 5 Cassia artemisoides C Caesalpinieae Cassia artemisioides DC. Caesalpinieae 6 Cassia corymbosa C Cassieae Senna corymbosa (Lam.) H.S. Irwin & Barneby Cassieae 7 Cassia tomentosa C Cassieae Senna hirsuta (L.) H.S. Irwin & Barneby Cassieae 10 Gymnocladus dioicus C Caesalpinieae Gymnocladus dioica (L.) K. Koch Caesalpinieae 17 Acacia cyanophylla M Acacieae Acacia saligna (Labill.) Wendl. Acacieae 20 Acacia farnesiana M Acacieae Vachellia farnesiana (L.) Wight. Acacieae Acacia horrida M Acacieae Vachellia horrida (L.) Willd. Acacieae 26 Acacia podalyrifolia M Acacieae Acacia podalyriifolia G. Don Acacieae 32 Albizzia lophanta M Ingeae Paraserianthes lophantha (Willd.) I.C. Nielsen Ingeae 34 Leucaena pulverulenta M Mimoseae Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit Mimoseae 36 Mimosa spegazzini M Mimoseae Mimosa polycarpa Kunth var. spegazzinii Burkart Mimoseae 38 Chorizema varium P Podalyrieae Chorizema varium Mirbelieae 39 Cladrastis lutea P Sophoreae Cladrastis kentukea (Dum. Cours.) Rudd Sophoreae 41 Sophora japonica P Sophoreae Styphnolobium japonicum (L.) Schott Sophoreae Leucaena pulverulenta Erreur d’espèce SF = sous famille: C – Caesalpinieae, M : Mimoseae, P – Papillionaceae ILDIS = International Legume Database & Information Service (http://www.ildis.org)

47 Les campagnes de prospection que nous avons menées sur le territoire national nous ont permis de rencontrer des légumineuses ligneuses qui n’ont pas été référencées par Maire (1989) alors qu’elles ont été indroduites en même temps que les autres espèces (GGA 1850 et 1865) et qu’elles sont aujourd’hui relativement bien répandues en Algérie. Ces espèces au nombre de 6 figurent au tableau L’une des 5 espèces non référencées par Maire (1987) alors qu’elle sont relativement fréquentes en Algérie est Acacia dealbata, une mimosoidée de la tribu des Acacieae qui est connue sous la dénomination de « Mimosa des fleuristes » très apprécié par les membres de ce corps de métier et des particuliers pour sa floraison abondante et ses inflorescences chatoyantes. Les 5 autres espèces non référencées par Maire (1987) et que l’on rencontre fréquemment en Algérie font partie de la famille des Papilionaceae. Elles sont réparties sur 4 tribus (Robinieae, Dalbergieae, Phaseoleae et Millettieae), 5 genres (Robinia, Tipuana, Erythrina, Vigna et Wisteria). Trois d’entre elles Robinia pseudoacacia, Erythrina corralodendron et Tipuana tipu sont des espèces arborées et les deux autres Vigna caracalla et Wisteria sinensis des arbustes grimpants (lianes). Ces espèces omises dans la flore de Maire (1989) peuvent être subdivisées en espèces très répandues (Acacia dealbata, Robinia pseudoacacia) et en espèces moyennement répandues (Vigna caracalla, Tipuana tipu et Erythrina corralodendron). La plupart de ces espéces sont des essences surtout horticoles exception faite de Robinia pseudoacacia et Tipuana tipu qui sont des espèces foresières et horticoles. Elles proviennet pour tois d’entre elles d’Amérique du Sud (Tipuana tipu, Erythrina corallodendron, Vigna caracalla) les autres espèces proviennent pour leur part d’Australie (Acacia dealbata), d’Amérique du Nord (Robinia pseudo-acacia) et d’Asie (Wisteria sinensis). Ces espèces additionelles portent ainsi le nombre de légumineuses ligneuses introduites en Algérie à 49, un nombre loin d’être négligeable dans le cas d’espèces ligneuses.

Tableau V : liste des 6 espèces de légumineuses ligneuses non référencées par Maire (1987) que nous avons rencontré lors de nos campagnes de prospection.

Forme Hauteur Longévité Présence N° Espèce SF Tribu biologiqu Origine Usage (M) (années) e 44 Acacia dealbata M Acacieae Arbuste 8-25-30 20-30 Australie H 43 45 Robinia pseudo-acacia P Robinieae Arbre 25-32-35 50-100 Am. Nord FH 24 46 Tipuana tipu P Dalbergieae Arbre 10-15-25 150-200 Am. Sud FH 09 47 Erythrina corallodendron P Phaseoleae Arbre 12-20-30 80-120 Am. Sud H 07 48 Vigna caracalla P Phaseoleae Arbuste G. 1-2-3 6-12 Am. Sud H 11 49 Wisteria sinensis P Millettieae Arbuste G. 3-6-9 50-100 Asie H 17

2- Les légumineuses ligneuses introduites rencontrèes aujourd’hui en Algérie

48 Pour vérifier la présence actuelle et évaluer l’abondance des légumineuses ligneuses introduites en Algérie, nous avons menés des prospections sur l’ensemble du territoire national en incluant des arboretums, des parcs, des avenues, des jardins et des aires naturelles reboisées. Ces prospections ont porté sur 61 sites répartis sur 18 wilayas du nord du pays pour la grande majorité d’entre eux (Annexe 1). Les résultats de ces campagnes de prospection qui figurent au tableau VI indiquent que la plupart des espèces de légumineuses ligneuses introduites peuvent être rencontrées aujourd’hui en Algérie. En effet, sur les 49 espèces que nous avons listés précédemment, 35 soit une proportion de près de 82% ont été rencontrées lors de nos campagnes de prospection. Ces espèces sont cpendant très inégalement représentées. Certaines d’entre elles comme par exemple Acacia saligna cyanophylla (rencontré sur 54 sites), Leucaena pulverulenta (rencontrées sur 49 sites) sont très répandues et constituent aujourd’hui une composante fondamentale de la flore des légumineuses ligneuses d’Algérie. D’autres, comme par exemple Gleditsia triacanthos, Sophora japonica… bien qu’assez répandues ne peuvent pas être condidérées comme des composantes importantes de la flore des légumineuses ligneuses d’Algérie puisqu’elles n’ont été rencontrées qu’au niveau de moins de la moitié des 61 sites de prospection retenus. A l’opposé, certaines espèces comme Caesalpinia spp., Bauhinia spp. ou encore Acacia podalyriifolia sont très rarement rencontrées et sont aujourd’hui beaucoup plus des «curiosités botaniques» que des composantes de la flore de légumineuses ligneuses introduites. Les résultats de nos campagnes de prospection font ressortir une dernière catégorie de légumineuses ligneuses introduites, celles que nous n’avons jamais rencontré, ce qui nous amène à penser que ces espèces sont aujourd’hui rarissimes ou encore qu’elles n’existeraient plus en Algérie. C’est le cas pour Caesalpinia pectinata, Gymnocladus dioicus, les deux représentants du genre Mimosa (Mimosa pudica et Mimosa spegazzini), Chorizema varium, Cladrastis lutea ou encore pour templetonia retusa. Au dela de la présence ou non d’une espèce donnée au niveau des 61 sites retenus pour nos prospections, nous avons apprécié également l’abondance des différentes espèces de légumineuses ligneuses rencontrées (Tab. VI). Nos résultats indiquent que même sur le plan quantitatif de leur présence ces espèces diffèrent considérablement. Certaines espèces comme Acacia saligna, Leucaena pulverulenta… sont généralement présentes en très grand nombre au niveau des sites prospectés (plus d’une vingtaine d’individus). Le deuxième groupe d’espèces représenté par Cercis siliquastrum, Gleditsia triacanthos… est pour sa part souvent présent dans une proportion de l’ordre de la dizaine d’individus. D’autres espèces comme Acacia baileyana, Acacia cavenia… sont représentées par moins d’une dizaine d’individus. La dernière catégorie d’espèces est représentée par uniquement un ou deux individus, de surcroït très âgés sont des reliques de plantations réalisées durant la période coloniale. Ce dernier groupe d’espèces qui renferme de belles essences horticoles (Bauhinia corymbosa, Caesalpinia gilliesii…) semble menacé de disparition d’Algérie si les services concernés ne prennent pas les mesures de conservation qui s’imposent. Tableau VI : Prévalence des légumineuses ligneuses introduites au niveau des 61 sites prospectés. La colonne présence donne le nombre de sites au niveau desquels une espèce donnée a été rencontrée.

49 u u a a e e v v i i n n u u s s a a e e é é s s r r t t n n n n o o i i o o t t c c c c n n e e e e p p

N° Espèce r N° Espèce r s s é é o o t t r r é é p p a a e e d d e e c c s s è è e e t t p p i i s s s s e e ’ ’ e e e e l l c c d d s s n n l l e e a a e e r r d d u u b b n n q q m o m o s s o b o b e e N d A N d A 1 Bauhinia corymbosa 03 ± 26 Acacia podalyrifolia 08 ± 2 Bauhinia grandiflora 02 ± 27 Acacia pycnantha 05 + 3 Caesalpinia pectinata 00 -- 28 Acacia retinodes 16 + 4 Caesalpinia gilliesii 07 ± 29 Acacia verticillata 08 ± 5 Cassia artemisoides 09 ± 30 Albizzia julibrissin 15 ++ 6 Cassia corymbosa 21 ++ 31 Albizzia lebbek 09 ± 7 Cassia tomentosa 11 ± 32 Albizzia lophanta 16 +++ 8 Cercis siliquastrum 17 ++ 33 Enterolobium contortisiliquum 09 ± 9 Gleditsia triacanthos 14 ++ 34 Leucaena pulverulenta 49 +++ 10 Gymnocladus dioicus 00 -- 35 Mimosa pudica 00 -- 11 Parkinsonia aculeata 16 ++ 36 Mimosa spegazzini 00 -- 12 Schotia latifolia 04 ± 37 Prosopis juliflora 17 + 13 Acacia armata 09 ± 38 Chorizema varium 00 -- 14 Acacia baileyana 13 + 39 Cladrastis lutea 00 -- 15 Acacia cavenia 11 + 40 Sophora davidii 05 ± 16 Acacia cultriformis 16 ++ 41 Sophora japonica 16 ++ 17 Acacia cyanophylla 54 +++ 42 Sophora secundiflora 06 ± 18 Acacia cyclops 13 + 43 Templetonia retusa 00 -- 19 Acacia decurrens 11 + 44 Acacia dealbata 43 +++ 20 Acacia farnesiana 35 +++ 45 Robinia pseudo-acacia 24 +++ 21 Acacia hanburyana 00 -- 46 Tipuana tipu 09 + 22 Acacia horrida 44 +++ 47 Erythrina corallodendron 07 + 23 Acacia juniperina 05 ± 48 Vigna caracalla 11 + 24 Acacia longifolia 39 ++ 49 Wisteria sinensis 17 ++ 25 Templetonia retusa 00 --

Il est intéressant de noter à ce niveau que les légumineuses introduites le plus souvent rencontrées lors de nos campagnes de prospection se sont révélées systématiquement des espèces à croissance rapide voire très rapide généralement tolérante à la dessiccation ce

50 qui laisse indiquer que les critères « vitesse de croissance » et « tolérance à la dessiccation » sont vraisemblablement les critères qui a fait que ces espèces ont été privilégiées par les pépinièristes et par voie de conséquence par leurs clients. De même nous noterons que la grande majorité des espèces qu’il n’a pas été possible de rencontrer sont pour la plupart des espèces à durée de vie courte ou très courte (Mimosa pudica) dont la disparition peut s’expliquer par un désintérêt temporaire des pépinières vis-à-vis de la production de plants de ces espèces, souvent exigeantes et non rustiques, dont le cycle de vie est de surcroît relativement court pour des espèces ligneuses.

Nous ne comptabilisons pas dans notre décompte des espèces de légumineuses ligneuses introduites présentes en Algérie celles qui existent en nombre très limité au niveau de niches botaniques particulières (jardin botanique du Hamma, jardin du Palais du Peuple, parcs de certaines pépinières parmi les plus anciennes d’Algérie…) au niveau desquels ont peut rencontrer des espèces anecdotiques et/ou emblématiques comme Delonix regia, Parkia biglobosa., Afzelia sp., Baikiaea sp., Laburnum sp. Castanospermum australe…).

Dans le cas particulier de l’Algérie, nos prospections indiquent que presque toutes les espèces de légumineuses ligneuses introduites sont incapables de se reproduire d’elles mêmes par semis en milieu naturel. Bien qu’on ait observé fréquemement des rejets de souches ou des drageons chez certaines espèces rustiques comme Acacia cyanophylla et Leucaena pulverulenta la propagation des légumineuses ligneuses introduites est assuré exclusivement par la plantation de plants produits en pépinières à partir de graines. Les seuls exceptions à cette régle sont repésentées par Acacia horrida, Albizzia lophanta et dans une moindre mesure par Robinia pseudoacacia et pour lesquelles on a souvent observé une reproduction par semis naturel. Cette reproduction par semis naturel est problématique dans le cas d’Albizzia lophanta chez qui elle est particulièrement intense rendant l’espèce invasive et dangeureuse pour la biodiversité des milieux qui l’hébergent. Le meilleur exemple d’invasion par Albizzia lophanta et dans une moindre mesure par Robinia pseudoacacia se situe au niveau de l’arboretum de Baïnem où les espèces qui y sont endémiques ou qui y ont été implantées sont supplantées inexorablement par ces espèce prolifiques dont la croissance est particulièrement rapide.

3 – Les légumineuses ligneuses introduites en Algérie et produites en pépinières Le meilleur moyen de s’assurer de l’importance d’une espèce végétale introduite dans une région donnée est de vérifier si celle-ci est disponible sur le marché, c'est-à-dire si elle est produite par les pépinières. En effet, à de rares exceptions les plantes introduites sont

51 incapables de se reproduire par semis-naturel en dehors de leur aire d’origine et leur propagation est alors assurée exclusivement par la dissémination de plants produits en pépinières, générallement à partir de leurs graines. C’est pour cette raison que nous avons menés des campagnes de prospection au niveau d’un panel de 16 pépinières essentiellement forestières pour évaluer l’importance de la production des différentes espèces de légumineuses ligneuses sur le marché Algérien. Les résultats de ces prospections figurent au tableau VII. Ils indiquent que les différentes espèces de légumineuses ligneuses introduites en Algérie ne sont pas toutes produites en pépinières. En effet, sur les 49 espèces introduites seules 32 soit une proportion de 65% ont été produites en pépinière de manière régulière ou épisodique durant la période 2000- 2010. Parmi ces espèces huit (08) sont nettement les plus fréquemment produites puisqu’elles le sont par au moins la moitié des pépinières retenues (Acacia cyanophylla, Leucaena pulverulenta, Acacia dealbata, Acacia horrida, Robinia pseudo-acacia, Acacia farnesiana, Acacia longifolia et Acacia melanoxylon). La majorité des autres espèces produites en pépinières, au nombre de 24, ne le sont que par 1 à 6 des 16 pépinières retenues. Les 17 autres espèces introduites ne sont quant à elles produites par aucune des 16 pépinières retenues ni à notre connaissance par les nombreuses autres pépinières publiques ou privées (37 pépinières) que nous visitons régulièrement dans le cadre des activités du laboratoire. Ces espèces négligées par les pépinières pour de multiples raisons comme par exemple le manque de semences ou encore des difficultés de germination devraient faire l’objet d’une attention particulière car en tant qu’espèces acclimatées elles font partie intégrante de la diversité floristique algérienne et mêritent d’être conservées au même titre que les espèces autochtones. Le volume de production des espèces produites en pépinières s’est également révélé très dissemblable suivant l’espèce considérée. En effet, certaines espèces sont produites massivement avec un niveau de production de l’ordre du millier de plants par pépinières comme c’est le cas pour Acacia saligna, Leucaena pulverulenta des espèces qui sont souvent utilisées pour la protection des pentes au niveau des routes, autoroutes ou encore des barrages. La deuxième catégorie d’espèces sont celles dont le niveau de production est de l’ordre de la centaine de plants comme par exemple . Ces espèces sont surtout représentées par des essences horticoles appréciées par les particuliers pour l’aménagement de leurs jardins. La dernière catégorie est représentée par les espèces dont le niveau de production est de l’ordre de la dizaine de plants comme par exemple . Ce sont des essences surtout horticoles générallement moins rustiques et à croissance plus lente que les précédentes et surtout moins connues du grand public. Il est inréressant de noter à ce niveau, le parallèle qui existe entre l’abondance des espèces sur le terrain et leur fréquence de production au niveau des pépinières puisqu’on retrouve la prédominance des mêmes espèces Acacia saligna, Leucaena pulverulenta très utilisées pour les opérations de boisement, ainsi que trois espèces très appréciées par les

52 particuliers pour leur jardin : Acacia dealbata (mimosa de Nice), Acacia farnesiana et Wisteria sinensis (la glycine de Chine). En ce qui concerne le mode de reproduction adopté par les pépinièristes pour la production de plants, notre enquête indique que la reproduction par semis semble la règle générale. En effet, ce mode de production est celui qui concerne la grande majorité des espèces. Les pépinièristes bien qu’ils reconnaissent que la plupart des espèces peuvent être reproduites par bouturage signalent que le rendement de cette pratique est trop faible et/ou aléatoire. Nous avons relevé en plus de la production par semis au recours fréquent par les pépinièristes au greffage dans le cas des acacias décoratifs (Acacia podalyrifolia, Acacia baileyana et dans une moindre mesure Acacia dealbata). Dans ce cas, le greffage pratiqué sur un porte greffe plus rustique (généralement Acacia saligna) est surtout destiné a conférer une plus grande rusticité à ces espèces relativement exigeantes en qualité de sol et particulièrement sensibles à la dessiccation.

53 Tableau VII: Production des légumineuses ligneuses introduites au niveau du panel des 16 pépinières retenues. Les espèces massivement produites sont surlignées en gris. l l a a b b r r o o l l a a p g p g s s n n n n n n e e o o r r o o o o i i e e i i i i t t è è t t t t c c i i c c

c c N c c è è n n u u i i u u u u N° Espèce p Espèce p d d p p d d d d s s o o

é ° é o o o o e e r r ’ ’ r r r r p p l l p p p p p p t t e e e e r r n n e e e e d d e e a a d d d d r r e e e e s s è è d d i i r r i i u u u u u u b b a a a a n n e e i i d d e e e e d d m m p p o o v v v v o o o i i o i i r é r é N p N p N M N p N p N M

1 Bauhinia corymbosa, 0 -- -- S 26 Acacia podalyrifolia 1 10 10 SG 2 Bauhinia grandiflora 0 -- -- S 27 Acacia pycnantha 2 10 20 S 3 Caesalpinia pectinata 0 -- -- S 28 Acacia retinodes 3 100 300 S 4 Caesalpinia gilliesii 0 -- -- S 29 Acacia verticillata 2 10 20 S 5 Cassia artemisoides 0 -- -- S 30 Albizzia julibrissin 4 10 40 S 6 Cassia corymbosa 4 10 400 S 31 Albizzia lebbek 2 10 20 S 7 Cassia tomentosa 2 10 200 S 32 Albizzia lophanta 5 10 50 S 8 Cercis siliquastrum 4 100 400 S 33 Enterolobium contortisiliquum 1 10 10 S 9 Gleditsia triacanthos 5 100 500 S 34 Leucaena pulverulenta 12 1000 12000 S 10 Gymnocladus dioicus 0 -- -- S 35 Mimosa pudica 0 -- -- S 11 Parkinsonia aculeata 5 100 500 S 36 Mimosa spegazzini 0 -- -- S 12 Schotia latifolia 0 -- -- S 37 Prosopis juliflora 6 100 600 S 13 Acacia armata 0 -- -- S 38 Chorizema varium 0 -- -- S 14 Acacia baileyana 5 10 50 SG 39 Cladrastis lutea 0 -- -- S 15 Acacia cavenia 2 10 20 S 40 Sophora davidii 0 -- S 16 Acacia cultriformis 4 100 400 S 41 Sophora japonica 5 100 500 S 17 Acacia cyanophylla 15 1000 15000 S 42 Sophora secundiflora 0 -- -- S 18 Acacia cyclops 3 100 300 S 43 Templetonia retusa 0 -- -- S 19 Acacia decurrens 2 100 200 S 44 Acacia dealbata 11 100 1100 SG 20 Acacia farnesiana 9 100 900 S 45 Erythrina corallodendron 2 10 20 S 21 Acacia hanburyana 0 -- -- S 46 Robinia pseudo-acacia 10 1000 10000 S 22 Acacia horrida 10 100 1000 S 47 Tipuana tipu 3 100 300 S 23 Acacia juniperina 0 -- -- S 48 Vigna caracalla 4 100 400 S 24 Acacia longifolia 8 1000 8000 S 49 Wisteria sinensis 6 100 600 S 25 Acacia melanoxylon 8 1000 8000 S

54 4 – Prévalence de la symbiose à rhizobia chez les légumineuses ligneuses introduites produites en pépinières Au niveau de chacune des pépinières ou une ou plusieurs des légumineuses ligneuses ciblées sont produites, nous avons procédé à l’évaluation de la prévalence de la symbiose à rhizobia. A cet effet, 5 plants par espèce et par pépinière ont été choisis au hasard et désempotés ou désensachès. Leur système racinaire a été lavé à l’eau courante et examiné pour la recherche de nodosités caractéristiques de la symbiose à rhizobia. Les résultats obtenus figurent au tableau VIII et indiquent que les plants de la majorité des espèces produites en pépinières présentent sur leurs racines les nodules caractéristiques de la symbiose rhizobia légumineuses (Fig. 14). En effet, sur les 32 espèces concernées, 27 soit une proportion de 84% portent sur le système racinaire de leurs plants les nodosités caractéristiques de la symbiose rhizobia légumineuses. Seuls les plants des espèces Cassia corymbosa, Cassia tomentosa, Cercis siliquastrum, Gleditsia triacanthos et Parkinsonia aculeata n’ont pas révélés la présence sur leur système racinaire les nodosités caractéristiques de la symbiose rhizobia légumineuses. Un résultat qui s’explique par le fait que ces quatre espèces appartiennent toutes à la sous-famille des caesalpiniées dont très peu de représentants sont nodulés. Pour les autres espèces pour lesquelles nous avons pu obtenir de jeunes plants, la nodulation semble être systématique puisque la proportion de plants nodulés s’est révélée très élevée avec des fréquences de nodulation des plants variant de 40 à 100% et une moyenne toutes espèces confondues de l’ordre de 75,4%. Seules deux espèces Enterolobium contortisiliquum et Tipuana tipu ont montré des fréquences de nodulation relativement faibles puisqu’elles n’atteignent pas 50% alors que pour toutes les autres espèces nodulées la fréquence de nodulation s’est révélée égale ou supérieure à 70%. Les nodules présents sur le système racinaire des plants examinés ce sont révélés très diversifiés sur le plan morphologique (Fig. 14). Cependant, on peut les subdiviser en deux groupes principaux. Les nodules du premier groupe sont produits par la grande majorité des espèces examinées se présentent sous la forme de lobes beaucoup plus allongés que large (Fig. 14), forme caractéristique des nodules de type indéterminé tel que défini par Corby. Les nodules de ce type se développent à partir des cellules du cortex interne de la racine. Ils sont caractérisés par la présence à l'apex de l'ébauche nodulaire d’un méristème persistant qui permet l'ajout constant de cellules à la partie distale du nodule, lui conférant ainsi une forme allongée et la capacité de fixer l’azote sur une plus grande période de temps (Hirsch, 1992 ; Crespi et Galvez, 2000). Dans certains cas, ces lobes, confluents à la base ou émettant des branches dans leur partie inférieure forment des amas coralloïdes dont le diamètre peut excéder 3 cm. Les nodules du deuxième groupe qui ne sont produits que par les représentant de la tribu des phaseoleae se présentent pour leur part sous une forme plus ou moins sphérique aussi longs que larges et correspondent au type nodulaire déterminé tel que défini par Corby (1981). Ce type de nodule se forme lui à partir du cortex externe. La persistance du méristème chez les espèces à nodules de type déterminé est très éphémère et la croissance en longueur du nodule est limitée. Une croissance en épaisseur a lieu par hypertrophie des cellules corticales et par des divisions de cellules contenant déjà des rhizobia. Ce processus de formation se traduit par une forme sphérique et un état de différenciation identique pour toutes les cellules.

55 La forme des nodosités racinaires des légumineuses est déterminée par la plante hôte (Hirsch, 1992 ; Hirsch et al, 2001). Corby (1981) considère que la morphologie des nodules de légumineuses est un critère qui a une grande valeur taxonomique comme cela est rappelé par Sprent (2009) qui considère que le regroupement récent des Lotea [s.s.] (à nodules déterminés) et des Coronilleae [s.s.] (à nodules indéterminés) au sein de la même tribu (Loteae [s.l.]) représenterait l'unique cas d'incongruence du type de nodulaire au sein d'une même tribu de légumineuse. De manière générale, les légumineuses d’origine tropicale (phaséolïdées) comme le haricot (Phaseolus vulgaris) produisent toutes des nodules de type déterminé, généralement non branchés tandis que les légumineuses des régions tempérées (galégoïdées) comme le pois chiche (Cicer arietinum) produisent des nodules de type indéterminé et généralement branchés (Corby, 1981 et 1988, Allen et Allen, 1981). Cependant, certaines légumineuses qui alternent une phase de vie aquatique et une phase de vie terrestre comme Sesbania rostrata peuvent former des nodules des deux types selon les conditions environmentales (Fernandez-Lopez et al., 1998) En dehors de ces traits morphologiques fondamentaux, les nodules observés sur les racines des différentes légumineuses ligneuses nodulées produites en pépinière ont montré uniquement des variations de taille, de couleur et de la texture de la surface du nodule (Fig. 14). Nos résultats indiquent par ailleurs que la plupart des couples symbiotiques examinés sont efficients, c'est-à-dire capable de réduire l’azote moléculaire en ammoniac. En, effet des coupes à main levées réalisées sur des nodules présents sur le système racinaire de la plante hôte ont montré une zone colorée en rose, ou en brun rougeâtre. Cette coloration est due à la présence de léghemoglobine, une hémoprotéine qui n’est produite que par les nodules fixateurs d’azote. La proportion de plants nodulés et efficients s’et révélée relativement élevée pour l’ensemble des espèces examinées. En effet, la majorité des plants examinés a présenté des nodules efficients. Le taux d’efficience des plants varie entre 40 et 100% suivant l’espèce considérée avec une moyenne toutes espèces confondue de l’ordre de 79,6%.

Seules trois espèces : Enterolobium contortisiliquum, Robinia pseudoacacia et Tipuana tipu ont montré une proportion relativement faible de plants nodulés et efficients puisqu’elle n’excède pas 50%. L'inefficience de certains plants nodulés chez les différentes espèces examinées peut s’expliquer par le fait que la symbiose rhizobia légumineuse est un processus à spécificité d’étape et qu’une souche peut être suffisamment compétente pour induire la nodulation et se révéler incapable de réduire l’azote moléculaire au sein des nodosités de l’hôte (Sprent 2009). En effet, après que la nodulation ait eu lieu, la réduction symbiotique de l’azote nécessite l’expression coordonnée d’un très grand nombre de gènes de la plante hôte et de la bactérie et la compatibilité des deux symbiotes peut se révéler insuffisante dans les phases plus avancées de l’interaction.

56 Tableau VIII : Prévalence de la symbiose à rhizobia et de la fixation symbiotique de l’azote chez les légumineuses ligneuses produites en pépinières t t n n a a s s l l t t s s p p n n / / é é s s l l e e s s é é i i u u e e n n c c l l i i d d i i f f u u o o f f n n m m d d n e n e s s a a o o o o e e x x s s s s x x r r n n t t t t e e e e è è a a c c n n n n i i e e t t s s è è a a a a n t n t d d l l l l i i p p

Espèce n Espèce n u u p p p p p n p n s s a a é l e é l e d d e e e e e e ’ ’ y y p p p p l l d d d d ° ° o o t t e e e e n n n n N N n n d d m d d m o o o o a a i i i i t t t t e e e e e e s s r r r r r i r r r i r r o o o o b u b b b u b b p p p p d d m m m m m m o o o o o o o o o o o o r r r r r r N p N P N P N p N P N P

1 Bauhinia corymbosa, 0 0 ------26 Acacia podalyrifolia 1 5 100,0 8 80,0 2 Bauhinia grandiflora 0 0 ------27 Acacia pycnantha 2 10 100,0 11 80,0 3 Caesalpinia pectinata 0 0 ------28 Acacia retinodes 3 15 93,3 15 86,7 4 Caesalpinia gilliesii 0 0 ------29 Acacia verticillata 2 10 70,0 6 50,0 5 Cassia artemisoides 0 0 ------30 Albizzia julibrissin 4 20 95,0 23 95,0 6 Cassia corymbosa 4 20 0 -- -- 31 Albizzia lebbek 2 10 100,0 12 100,0 7 Cassia tomentosa 2 10 0 -- -- 32 Albizzia lophanta 5 25 100,0 44 100,0 8 Cercis siliquastrum 4 20 0 -- -- 33 Enterolobium contortisiliquum 1 5 40,0 6 40,0 9 Gleditsia triacanthos 5 25 0 -- -- 34 Leucaena pulverulenta 12 60 98,3 48 96,7 10 Gymnocladus dioicus 0 0 ------35 Mimosa pudica 0 0 ------11 Parkinsonia aculeata 5 25 0 -- -- 36 Mimosa spegazzini 0 0 ------12 Schotia latifolia 0 0 ------37 Prosopis juliflora 6 30 80,0 25 80,0 13 Acacia armata 0 0 ------38 Chorizema varium 0 0 ------14 Acacia baileyana 5 25 100,0 17 100,0 39 Cladrastis lutea 0 0 ------15 Acacia cavenia 2 10 90,0 11 90,0 40 Sophora davidii 0 0 ------16 Acacia cultriformis 4 20 85,0 8 80,0 41 Sophora japonica 5 25 88,0 13 60,0 17 Acacia cyanophylla 15 75 97,3 28 97,3 42 Sophora secundiflora 0 0 ------18 Acacia cyclops 3 15 93,3 13 93,3 43 Templetonia retusa 0 0 ------19 Acacia decurrens 2 10 100,0 11 100,0 44 Acacia dealbata 11 55 100,0 26 89,1 20 Acacia farnesiana 9 45 97,8 31 97,8 45 Erythrina corallodendron 2 10 80,0 19 60,0 21 Acacia hanburyana 0 0 ------46 Robinia pseudo-acacia 10 50 98,0 53 46,0 22 Acacia horrida 10 50 100,0 28 100,0 47 Tipuana tipu 3 15 46,6 17 40,0 23 Acacia juniperina 0 0 ------48 Vigna caracalla 4 20 85,0 28 55,0 24 Acacia longifolia 8 40 95,0 18 92,5 49 Wisteria sinensis 6 30 96,7 19 60,0 25 Acacia melanoxylon 8 40 82,5 17 80,0

57 Il ressort de cette évaluation de la prévalence de la symbiose à rhizobia et de la fixation d’azote chez les légumineuses ligneuses introduites en Algérie que ce phénomène biologique fondamental pour le fonctionnement de la biosphère est très courant chez ce groupe de plantes. Bien qu’elles soient d’introduction relativement récente ces plantes sont capables de recruter à partir de la microflore rhizobienne autochtone des souches suffisament compétentes pour assurer leur nodulation de manière efficiente. Les légumineuses ligneuses introduites en Algérie repésentent par conséquent un potentiel intéressant pour la gestion du niveau de fertilité azotée des sytèmes agronomiques, agroforestiers ou encore des milieux naturels. De plus, en raison de leur relative indépendance vis-à-vis de l’azote du sol elles peuvent être mises à profit pour la réhabilitation des aires naturelles incultes, dégradées ou polluées dans le cadre de projets de revégétalisation ou de phytoremédiation.

58 Tableau IX : Caractères des nodules observés sur le système racinaire des légumineuses ligneuses produites en pépinières t n s a s l é t s p h n / é s s l c e s é i e u n l e n c l s i a d i u f r u e o f l n d m b d n e s u o a o s o s e d n x s s e x r n e t t e r e o l i s è a c n n i e n u t a s e è a a l n t d l l d i d s p u

Espèce n u p p o e e p n s l e d a n é l e d d e e e u n o ’ y p p l d d e d n n n ° o t d e e o e o n n s t i N n d d m n t e o o a o a i i a c t t e e e e s m r r s r i r r m n i d a l o o b u b b e ’ e e a l p p s d d l m m m c i p o o é o o o o r r r r o y u a N p N P N P L T P o T

14 Acacia baileyana 5 25 100,0 17 100,0 R2-C I + 15 Acacia cavenia 2 10 90,0 11 90,0 R2 I + 16 Acacia cultriformis 4 20 85,0 8 80,0 R2 I + 17 Acacia cyanophylla 15 75 97,3 28 97,3 R2-C I + 18 Acacia cyclops 3 15 93,3 13 93,3 R2 I + 19 Acacia decurrens 2 10 100,0 11 100,0 R2 I + 20 Acacia farnesiana 9 45 97,8 31 97,8 R2 I + 22 Acacia horrida 10 50 100,0 28 100,0 R2 I + 24 Acacia longifolia 8 40 95,0 18 92,5 R2 I + 25 Acacia melanoxylon 8 40 82,5 17 80,0 R2 I + 26 Acacia podalyrifolia 1 5 100,0 8 80,0 R2 I + 27 Acacia pycnantha 2 10 100,0 11 80,0 R2 I + 28 Acacia retinodes 3 15 93,3 15 86,7 R2 I + 29 Acacia verticillata 2 10 70,0 6 50,0 R2 I + 30 Albizzia julibrissin 4 20 95,0 23 95,0 R2 I + 31 Albizzia lebbek 2 10 100,0 12 100,0 R2 I + 32 Albizzia lophanta 5 25 100,0 44 100,0 R2-C I + 33 Enterolobium contortisiliquum 1 5 40,0 6 40,0 R2 I + 34 Leucaena pulverulenta 12 60 98,3 48 96,7 R2 I + 37 Prosopis juliflora 6 30 80,0 25 80,0 R2 I + 41 Sophora japonica 5 25 88,0 13 60,0 R2 I + 44 Acacia dealbata 11 55 100,0 26 89,1 R2 I + 45 Erythrina corallodendron 2 10 80,0 19 60,0 R2 I - 46 Robinia pseudo-acacia 10 50 98,0 53 46,0 R2 D - 47 Tipuana tipu 3 15 46,6 17 40,0 R2 I + 48 Vigna caracalla 4 20 85,0 28 55,0 R2 D - 49 Wisteria sinensis 6 30 96,7 19 60,0 R2 I +

59 5 – Etude de la diversité de quelques souches de rhizobia associés à des espèces du genre Acacia

Dans la dernière partie de ce mémoire, nous nous sommes proposés de caractériser et d’évaluer la diversité des souches de rhizobia associées à certaines espèces d’acacia introduites. Les 6 espèces retenues sont celles qui se sont révélées les plus fréquement produites en pépinières, à savoir : A. saligna, A. longifolia, A. melanoxylon, A. dealbata, A. horrida et A. farnesiana. Pour limiter le nombre de souches nous nous sommes limités uniquement aux plants provenant de 6 pépinières qui assurent toutes la production des 6 espèces retenues (Baïnem, Ben Aknoun, Béjaïa, Ténés, Tlemcen et Jijel).

5-1 Extraction et authentification des isolats nodulaires

L’extraction des souches de rhizobia associées aux six espèces d’acacia a été réalisée pour chaque espèce et chaque pépinière retenues à partir d’un plant efficient et d’un nodule unique choisi comme représentatif du cortége nodulaire.

La procédure d’extraction, d’isolement et de purification du contenu nodulaire a permis l’obtention de 36 isolats bactériens qui ont tous montré une réaction Gram- et présenté les caractéristiques coloniales communes aux rhizobia (aspect mucoïde, non adsorption du rouge Congo…).

Ces 36 isolats nodulaires ont été affublés d’un code comportant comme préfixe les miniscules des 3 premières lettres du nom d’espèce de leur acacia d’origine, d’un tiret et d’un suffixe comportant les 3 premières lettres majuscules de leur pépinière d’origine. Le code dea-JIJ désigne par exemple la souche isolée du plant d’Acacia dealbata retenu pour la pépinière de Jijel.

Lors de la procédure d’extraction, d’isolement et de purification du contenu nodulaire nous avons noté une grande variabilité de la vitesse de croissance des 36 isolats bactériens. Certaines souches se sont révélées capables de former des colonies visibles à l’œil nu après seulement 2 à 4 jours d’incubation tandis que d’autres ne le font qu’après 7 à 11 jours (Tableau X et XI). Cette observation indique que notre souchier comporte des souches de rhizobia à croissance rapide et des souches à croissance lente qui correspondraient aux deux grands groupes de rhizobia définissables sur le plan de la vitesse de croissance : les rhizobia à croissance rapide représentés par les genres Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium… et les rhizobia à croissance lente représentés quant à eux par un genre jusqu’ici unique : le genre Bradyrhizobium).

60 Tableau X : Nombre de jours d’incubation à 25°C nécessaires aux 36 souches associées aux acacias pour former des colonies visibles à l’œil nu sur milieu YEMA-RC réparti en boîtes de Petri.

Nombre de jours Nombre de jours d’incubation Pépinière d’incubation nécessaires Code Pépinière N° Code souche N° nécessaires à d’origine à l’apparition de colonies souche d’origine l’apparition de visibles à l’œil nu colonies visibles à 1 dea-BAI Baïnem 8 19 lon-BAI Baïnem 9

2 dea-BEN Ben Aknoun 9 20 lon-BEN Ben Aknoun 7

3 dea-BEJ Béjaïa 11 21 lon-BEJ Béjaïa 7

4 dea-TEN Ténés 8 22 lon-TEN Ténés 3

5 dea-TLE Tlemcen 7 23 lon-TLE Tlemcen 3

6 dea-JIJ Jijel 11 24 lon-JIJ Jijel 3

7 far-BAI Baïnem 3 25 mel-BAI Baïnem 9

8 far-BEN Ben Aknoun 2 26 mel-BEN Ben Aknoun 7

9 far-BEJ Béjaïa 4 27 mel-BEJ Béjaïa 7

10 far-TEN Ténés 3 28 mel-TEN Ténés 3

11 far-TLE Tlemcen 3 29 mel-TLE Tlemcen 3

12 far-JIJ Jijel 3 30 mel-JIJ Jijel 8

13 hor-BAI Baïnem 3 31 sal-BAI Baïnem 9

14 hor-BEN Ben Aknoun 2 32 sal-BEN Ben Aknoun 7

15 hor-BEJ Béjaïa 4 33 sal-BEJ Béjaïa 7

16 hor-TEN Ténés 3 34 sal-TEN Ténés 3

17 hor-TLE Tlemcen 3 35 sal-TLE Tlemcen 3

18 hor-JIJ Jijel 3 36 sal-JIJ Jijel 3

61 5-2 Authentification des isolats nodulaires

Les rhizobia ne présentant aucune caractéristique phénotypique permettant de les distinguer des autres bactéries Gram- du sol, il est nécessaire de vérifier la nature des isolats issus des nodules de légumineuses en les soumettant au test d’authentification. En effet, il est assez fréquent lors de la procédure d’extraction/purification à partir de nodules de légumineuses, d’isoler des souches non nodulantes (Vincent, 1970 ; Somesegaran et Hobben, 1994). Ces dernières peuvent correspondre à des contaminants de surface ayant échappé à la procédure de stérilisation superficielle du nodule ou encore à des endophytes c'est-à-dire des souches rhizobiennes non symbiotiques ou des souches non rhizobiennes présentes au sein du nodule (Muresu et al., 2008).

Le test d’authentification consiste à inoculer les isolats nodulaires à des plantules axéniques de leur légumineuse d'origine ou a défaut d'une légumineuse taxonomiquement voisine et vérifier qu'ils sont capables de la renoduler. Lorsque le test est positif, la souche est considérée comme étant un rhizobia, dans le cas contraire elle est considérée comme un contaminant ou un endophyte.

Le test de nodulation demeure le moyen absolu pour s'assurer qu'un isolat appartient bien au groupe des rhizobia ou plus exactement au groupe des bactéries nodulant les légumineuses (BNL) dans le sens strictement fonctionnel du terme (Rivas et al., 2009). La découverte, ces dernières années de plusieurs espèces de rhizobia incapables de noduler les légumineuses a beaucoup augmenté la valeur de ce test pour attribuer le statut de BNL à un isolat bactérien provenant de nodules de légumineuses (Zakhia et Lajudie, 2006 ; Rivas et al., 2009).

La réinoculation de nos isolats à des plantules de leur acacia d’origine dans des systèmes de culture dépourvus de rhizobia nous a permis d’authentifier toutes nos souches comme des rhizobia. En effet, elles se sont toutes montrées capables de renoduler en culture pure des plants de leur acacia d’origine obtenus au laboratoire sur un substrat de culture (mélange sable/tourbe stérilisé) ne renfermant pas d’autres rhizobia que ceux apportés par l’inoculation (Tableau VIII).

L’examen de coupes à main levée pratiquées sur les nodules présents sur le système racinaire des plants produits au laboratoire pour les tests d’authentification des souches nous a permis de vérifier par ailleurs qu’ils sont tous efficients c'est-à-dire capable de réduire l’azote moléculaire en ammoniac (Tab. 8). En effet, les coupes des nodules des plants obtenus ont présenté tous une zone centrale rose, rouge, rougeâtre ou brunâtre révélatrice de la présence de léghémoglobine, une hémoprotéine produite uniquement par les nodules fixateurs d’azote (Downie, 2005 ; Ott, 2005).

62 Tableau XI: Résultats des tests de nodulation réalisés pour authentifier les isolats nodulaires obtenus à partir des 6 espèces d’acacias retenues. a n a n i o a l l a t i a a y o a s f s n d x i i b e e e l e g o r i g i n r a h l n n n r n i e o c a a a o o l g l l f d h u s i e r . . . . . o . o G A m A A T A A C O S A N F N F N F N F N F N F dea-BAI Baïnem 8 7,4 + + dea-BEN Ben Aknoun 9 8,2 + + dea-BEJ Béjaïa 11 10,3 + + dea-TEN Ténés 8 7,8 + + dea-TLE Tlemcen 7 7,6 + + dea-JIJ Jijel 11 9,8 + + far-BAI Baïnem 3 2,7 + + far-BEN Ben Aknoun 2 2,1 + + far-BEJ Béjaïa 4 3,6 + + far-TEN Ténés 3 2,8 + + far-TLE Tlemcen 3 2,6 + + far-JIJ Jijel 3 3,1 + + hor-BAI Baïnem 3 2,8 + + hor-BEN Ben Aknoun 2 2,4 + + hor-BEJ Béjaïa 4 3,4 + + hor-TEN Ténés 3 2,8 + + hor-TLE Tlemcen 3 2,3 + + hor-JIJ Jijel 3 2,6 + + lon-BAI Baïnem 9 9,7 + + lon-BEN Ben Aknoun 7 6,9 + + lon-BEJ Béjaïa 7 7,3 + + lon-TEN Ténés 3 2,8 + + lon-TLE Tlemcen 3 2,4 + + lon-JIJ Jijel 3 2,6 + + mel-BAI Baïnem 9 8,8 + + mel-BEN Ben Aknoun 7 7,4 + + mel-BEJ Béjaïa 7 7,3 + + mel-TEN Ténés 3 2,4 + + mel-TLE Tlemcen 3 2,5 + + mel-JIJ Jijel 8 8,1 + + sal-BAI Baïnem 9 8,6 + + sal-BEN Ben Aknoun 7 7,8 + + sal-BEJ Béjaïa 7 7,4 + + sal-TEN Ténés 3 2,8 + + sal-TLE Tlemcen 3 2,6 + + sal-JIJ Jijel 3 2,5 + +

63 5-3 Caractéristiques symbiotiques des souches

Pour caractériser sur le plan symbiotique les souches de rhizobia associées à chacune des six espèces d’acacias retenues, nous les avons inoculées également aux cinq autres espèces d'acacias. Cette procédure appelée test d'inoculation croisée permet de déterminer un spectre d'hôte, c'est-à-dire le panel de légumineuses qu'une souche de rhizobia donnée peut noduler. Ce spectre d'hôte qui a été pendant longtemps à la base de la classification des rhizobia n'est plus aujourd'hui qu'un trait phénotypique important pour la caractérisation des rhizobia et l’évaluation de leur diversité. Les résultats de ces tests de nodulation croisée indiquent que le spectre d’hôte de nos souches est très dissemblable. 17 d’entre elles se sont révélées capables de noduler au moins une espèce d’acaa autre que ceelle d’origine. Certaines mjoritires comme ou ont montré un spectre d’hôte large puisqu’elles sont capables de noduler 4 à 5 des acacias testés. D’autres comme montrent un spectre d’hote intermédiare puisqu’elles ne sont capables de noduler que 2 à 3 des 6 espèces d’acacias prises en considération. A l’opposé 11 souches ne nodulent qu’une seule espèce d’acacia, leur hôte d’orgine donc spectre d’hôte très étroit. très variables en ce qui concerne leur pouvoir de noduler les 6 espèces d’acacias (Tableau XII). souches (33%) parmi les 72 étudiées se sont montrées capables de noduler les quatre autres espèces d’acacia testées ; leur spectre d'hôte est relativement large. La majorité des autres souches ont montré un spectre d’hôte plus étroit puisqu’elles ne nodulent qu'une à trois des 4 espèces d’acacia additionnelles. Parmi ces souches 8 (11%) se sont révélées capables d'induire la nodulation chez 3 des 4 espèces d'acacias testées, 35 (49%) chez deux espèces et 4 (5%) chez une seule des 4 espèces. Une seule souche, la souche MED1 s'est montrée incapable d'induire la nodulation chez les 4 espèces additionnelles d’acacia, ce qui laisse indiquer qu'il s'agit d'une souche à spectre d’hôte très restreint ou d'une souche très spécifique à A. saligna. La proportion de couples symbiotiques la plus élevée a été obtenue pour A. longifolia qui est nodulée par 69 des 72 souches testées. A. longifolia est suivie par A. melanoxylon qui est nodulée par 56 des 72 souches examinées. Acacia ehrenbergiana et A. raddiana se sont montrées quant à elles les moins susceptibles au souchier constitué puisqu'elle ne sont nodulée que par 37 et 32 souches respectivement. La compétence des souches associées à A. saligna s'est révélée plus élevée pour les espèces introduites (A. longifolia et A. melanoxylon) qui sont nodulées dans 87% des cas que pour les espèces autochtones (A. ehrenbergiana et A. raddiana) qui le sont seulement dans 48% des cas. Cette différence peut s'expliquer par la grande divergence qui existe entre les deux groupes d'acacia qui sont aujourd'hui rangés dans deux genres différents (Acacia et Vachelia respectivement). Dans ces conditions, les variations du degré de susceptibilité des deux groupes et des 4 espèces d'acacias reflètent vraisemblablement des différences dans la composition ou du spectre des inducteurs de nodulation (flavonoïdes, isoflavonoïdes, bétaïnes…) produits. En effet, chaque plante se caractérise par son spectre d'inducteurs de nodulation et selon sa perception des facteurs de nodulation émis par les

64 rhizobia elle produit en retour une mixture de flavonoïdes qui peut varier de surcroît selon son état physiologique (Subramanian et al. 2007). Dans l'ensemble, les 288 combinaisons souche/plante hôte explorées ont donné lieu à une nodulation dans 194 cas, soit une proportion de 67% (Tableau XII). Pour vérifier l'efficience des couples symbiotiques obtenus pour les tests d'inoculation croisée, nous nous sommes contentés de la recherche de traces de léghémoglobine au sein des nodosités. En effet, les traces de cette hémoprotéine qui n'est produite que par les nodules efficients sont facilement discernables à l'œil nu ou à la loupe car elles confèrent au tissu de la zone centrale des nodules efficients une coloration rose à rouge sombre selon l'état d'oxydation de la léghémoglobine. Ces traces sont à l'inverse absentes des nodules inefficients dont la zone centrale montre alors une coloration blanchâtre ou jaunâtre (Prévost et Antoun, 2006). Des coupes à main levée réalisées sur les nodules des 4 espèces d'acacias indique que les couples symbiotiques obtenus sont dans leur grande majorité efficients. En effet, ces coupes ont montré dans 169/194 cas (87%) une coloration rouge de la zone centrale des nodules. Seuls 25 couples symbiotiques ont produits des nodules dont la zone centrale était blanchâtre ou jaunâtre du fait de l'absence de léghémoglobine qui indique que ces couples symbiotiques sont inefficients vraisemblablement en raison d'une compétence insuffisante des deux symbiontes pour fixer l'azote en symbiose. La proportion élevée de souches capables de noduler et de fixer l’azote avec A. longifolia, A. melanoxylon,A. ehrenbergiana et A. raddiana indique que le souchier constitué à partir de nodosités d'A. saligna est suffisamment compétent avec les quatre autres espèces d'acacias. Cette promiscuité symbiotique entre A. saligna et les 4 autres espèces d'acacias laisse indiquer que les facteurs Nod, signaux moléculaires qui jouent un rôle déterminant dans la spécificité de nodulation, produits par ces rhizobia présentent des structures similaires (Lortet et al., 1996, Lorquin et al., 1997 ; de Lajudie et al., 2003). C’est la similitude de structure des facteurs Nod d’espèces rhizobiennes différentes qui explique qu’elles puissent converger vers la nodulation des mêmes plantes comme cela a déjà été observé pour d’autres légumineuses (Lorquin et al., 1997, Dénarié et al., 1996). Les modalités de cette convergence, par transfert latéral de gènes Nod ou par des processus génétiques parallèles impliquant des mutations, des délétions, des insertions ne sont pas élucidées. De même, le rôle de la pression de sélection de la plante dans la convergence de rhizobia différents à produire les mêmes facteurs Nod reste un domaine inexploré (Limpens et Bisseling 2009). Sur le plan pratique, cette promiscuité symbiotique entre A. saligna et les 4 autres espèces d'acacias permet d’envisager l’utilisation de notre souchier pour la sélection d’inoculants destinés non seulement à A. saligna mais aussi aux autres espèces étudiées.

65 Tableau XII : Comportement symbiotique des 36 souches de rhizobia associées à quelques espèces d’acacias .(NO= nodulation – FI = Fixation d’azote) n o l a y a n i x a l a s t i o a a o a e s e f e n n d i i b i e a l h g r n g l n i n r i a l c e n r o o e a g l a o u i m s l h d f r o o G ...... A A A A T A A C O S N F N F N F N F N F N F Adea1 Baïnem 8 7,4 + + - - - - + + + + + - Adea2 Ben Aknoun 9 8,2 + + - - - - + - - - + + Adea3 Béjaïa 11 10,3 + + - - - - + + + - + + Adea4 Ténés 8 7,8 + + ------+ + Adea5 Tlemcen 7 7,6 + + ------+ + Adea6 Jijel 11 9,8 + + - - - - + + + + + +

Afar1 Baïnem 3 2,7 - - + + + + - - + + + + Afar2 Ben Aknoun 2 2,1 - - + + + + + - + + + + Afar3 Béjaïa 4 3,6 - - + + + + + - + - + + Afar4 Ténés 3 2,8 - - + + + + - - + - + + Afar5 Tlemcen 3 2,6 - - + + + + + + + + + + Afar6 Jijel 3 3,1 - - + + + + + - - - + +

Ahor1 Baïnem 3 2,8 - - - - + + - - - - + + Ahor2 Ben Aknoun 2 2,4 - - + + + + - - + - + + Ahor3 Béjaïa 4 3,4 - - + + + + - - + + + + Ahor4 Ténés 3 2,8 - - + + + + + + + + + + Ahor5 Tlemcen 3 2,3 - - - - + + - - + - + + Ahor6 Jijel 3 2,6 - - + - + + + - - - + +

Alon1 Baïnem 9 9,7 + - - - - - + + + + + + Alon2 Ben Aknoun 7 6,9 - - - - + - + + + + + + Alon3 Béjaïa 7 7,3 ------+ + + - + + Alon4 Ténés 3 2,8 - - + + - - + + - - + + Alon5 Tlemcen 3 2,4 - - + - + + + + + + + + Alon6 Jijel 3 2,6 - - - - + + + + + + + +

Amel1 Baïnem 9 8,8 + + ------+ + + + Amel2 Ben Aknoun 7 7,4 + ------+ + - - Amel3 Béjaïa 7 7,3 + ------+ + + - Amel4 Ténés 3 2,4 - - + + + + + - + + + + Amel5 Tlemcen 3 2,5 ------+ + + + + + Amel6 Jijel 8 8,1 - - - - + + + - + + + +

Asal1 Baïnem 9 8,6 + + - - - - + + + + + + Asal2 Ben Aknoun 7 7,8 + ------+ + Asal3 Béjaïa 7 7,4 + - - - - - + + + - + + Asal4 Ténés 3 2,8 - - + + + + + - + + + + Asal5 Tlemcen 3 2,6 - - + + + + + - + + + + Asal6 Jijel 3 2,5 - - - - + + - - + - + +

66 UPGMA

Ahor1 Alon4 Ahor6 Afar6 Amel6 Alon6 Alon2 Asal6 Ahor5 Asal5 Asal4 Amel4 Alon5 Ahor4 Afar5 Afar3 Afar2 Ahor3 Ahor2 Afar4 Afar1 Amel2 Asal2 Adea5 Adea4 Amel3 Amel1 Amel5 Alon3 Adea2 Asal3 Asal1 Alon1 Adea6 Adea3 Adea1

0,28 0,4 0,52 0,64 0,76 0,88 1

Jaccard's Coefficient

Figure 15 : Dendrogramme montrant les relations existant entre les différentes souches de rhizobia en fonction de leur spectre d’hôte.

67 6 – Diversité phénotypique des souches de rhizobia associées à quelques espèces d’acacias introduits Dans la dernière partie de ce mémoire, nous nous sommes proposés de caractériser et d’évaluer la diversité de 36 souches de rhizobia associées à certaines espèces d’acacia introduites (A. saligna, A. longifolia, A. melanoxylon, A. dealbata, A. horrida et A. farnesiana). Le souchier constitué comporte des souches de rhizobia à croissance rapide et des souches à croissance lente qui correspondraient aux deux grands groupes de rhizobia définissables sur le plan de la vitesse de croissance : les rhizobia à croissance rapide représentés par les genres Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium… et les rhizobia à croissance lente représentés quant à eux par un genre jusqu’ici unique : le genre Bradyrhizobium). Des tests d’inoculation croisée nous ont permis de montrer que nos souches sont capables de noduler en plus de leur plante hôte d’origine une ou plusieurs des autres espèces d’acacias prises en considération (Fig. 15). Ces résultats nous ont permis de subdiviser les 6 espèces d’acacias prises en considération en 3 groupes d’inoculation. Le premier groupe qui ne comporte qu’une seule espèce, à savoir Acacia dealbata, n’est nodulé que par les souches de rhizobia à croissance lente. Le second groupe qui comporte Acacia farnesiana et Acacia horrida n’est nodulé pour sa part que par des souches de rhizobia à croissance rapide. Le troisième et dernier groupe d’inoculation constitué d’Acacia longifolia, A. melanoxylon et A. cyanophylla est plus eccléctique puisqu’il est nodulé aussi bien par les rhizobia à croissance lente que les rhizobia à croissance rapide. L’analyse par taxonomie numérique des profils phénotypique de nos souches (Fig. 16) a permis de mettre en évidence une grande plasticité physiologique et diversité de celles-ci. Leur position relative sur le denrogramme construit en incluant des souches de références nous as permis de rapprocher : - Les souches à croissance lente provenant des nodules d’Acacia dealbata, A. longifolia, A. melanoxylon et A. saligna au genre Bradyrhizobium et plus particulièrement à l’espèce Bradyrhizobium japonicum. - Les souches à croissance rapide associées à Acacia farnesiana et A. horrida au genre sinorhizobium et plus particulièrement Sinorhizobium meliloti - Les souches à croissance rapide associées à Acacia longifolia, A. melanoxylon et A. saligna aux genres Sinorhizobium (S. meliloti) et Rhizobium (R. leguminosarum). Ces rapprochements sont en accord avec les données de la littérature qui rapporte l’association des mêmes espèces de rhizobia avec les différentes espèces d’acacias prises en considération. Sur le plan pratique, la promiscuité symbiotique qui existe entre les six espèces d'acacias prises en considération permet d’envisager l’utilisation de notre souchier pour la sélection d’inoculants destinés à l’ensemble des espèces étudiées..

68 UPGMA

Alon4 Ahor6 Afar6 Afar3 Ahor1 Afar4 Ahor5 Asal6 Alon6 Afar2 Amel6 Ahor2 Ahor4 Afar5 Alon5 Ahor3 Afar1 Amel4 Asal5 Asal4 Amel3 Amel2 Alon3 Asal2 Amel1 Adea5 Adea4 Adea2 Alon2 Alon1 Amel5 Asal3 Adea3 Asal1 Adea6 Adea1 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1

Jaccard's Coefficient

Figure 16 : Dendrogramme montrant les relations existant entre les différentes souches de rhizobia en fonction du degré de sililitude de leur profil phénotypique. Pour mieux situer nos souches, nous avons inclus dans l’analyse numérique les profils des souches de référence des espèces de rhizobia les plus communes

69 Conclusion Quarante neuf (49) légumineuses ligneuses ont été introduites, acclimatées avec succès et propagées à plus ou moins grande échelle en Algérie. Ces légumineuses ligneuses représentées par ordre d’importance par des arbres et des arbustes grimpants ou non, sont représentées par 12 Caesalpinieae, 26 Mimosoideae et 11 Papilionaceae qui présentent une intérêt horticole ou forestier. Des prospections portant sur 61 sites répartis sur 18 wilayas du nord du pays pour la grande majorité d’entre eux indiquent que 35 des 49 espèces de légumineuses ligneuses introduites peuvent être rencontrées aujourd’hui en Algérie. Quelques unes qui ne sont que faiblement représentées sont des reliquats de plantations datant de la période coloniale et semblent menacées pour la plupart de disparaître d’Algérie si elles ne suscitent pas des actions de conservation. D’autres au contraire sont bien représentées en raison de la production massive de leurs plants par les pépinières publiques et privées. Parmi ces espèces massivement produites certaines comme Acacia saligna, Leucaena leucocephala… sont devenues des composantes essentielles de la flore ligneuse Algérienne tout au moins au nord du pays où elles sont implantées en grand nombre pour la protection des pentes (routes, autoroutes, barrages…) ou pour des opérations de boisement et de reboisement. Une enquête menée au niveau de 16 pépinières publiques ou privées nous a permis de vérifier que 35 des 49 espèces introduites ont été produite de manière permanente ou épisodique durant la dernière décennie. Le mode de reproduction adopté par l’ensemble des pépiniéristes est le semis, le bouturage est rarement pratiqué en raison de sa faible efficacité. Pour les espèces d’acacias horticoles jugées fragiles (Acacia podalyrifolia, Acacia baileyana et dans une moindre mesure Acacia dealbata…) la pratique du greffage sur un porte-greffe rustque (Acacia saligna) s’est révélée une pratique assez courante. La majorité des espèces qui sont produites en pépinières. se sont révélées nodulées et fixatrices d'azote et représentent par conséquent un potentiel intéressant pour la gestion du niveau de fertilité azotée des sytèmes agronomiques, agroforestiers ou encore des milieux naturels. L’étude de la diversité phénotypique de 36 souches de rhizobia associées au niveau de quelques pépinières aux espèces d’acacias introduites les plus fréquentes en Algérie a permis de mettre en évidence leur grande diversité sur le plan de leur spectre d’hôte et de leur profil phénotypique. Elles sont représentées par des souches à croissance lente apparentées à Bradyrhizobium japonicum et des souches à croissance rapide qui ont été affiliées à Sinorhizobium meliloti et Rhizobium leguminosarum. En raison de la pauvreté de la flore algérienne en légumineuses ligneuses autochtones, celles introduites devraient faire l’objet d’une attention particulière car en tant qu’espèces acclimatées elles font partie intégrante de la diversité floristique algérienne et mêritent d’être promues, valorisées et conservées au même titre que les espèces autochtones.

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83 Annexes Annexe 1

Liste des sites de prospection visités pour dresser l’inventaire des légumineuses ligneuses introduites présentes aujourd’hui en Algérie.

N° Désignation/Nature Wilaya 1 Parc de Aïn Temouchent Aïn Temouchent 2 Parc de Béni Saf Aïn Témouchent 3 Arboretum de Baïnem Alger 4 Campus de l'Université de Bouzaréah Alger 5 Campus de l'USTHB Alger 6 Caserne militaire de Béni-Messous Alger 7 Caserne Militaire d'El Harrach Alger 8 Cimetière Chrétien de Bab El Oued Alger 9 Cimetière Chrétien d'El Madania Alger 10 Cimetière d'El Alia Alger 11 Foêt/Parc Zoologique de Ben Aknoun Alger 12 Forêt domaniale de Hydra Alger 13 Forêt/Parc de la Présidence de la république Alger 14 Forêt/Parc Olof Palme - Hydra Alger 15 Jardin Botanique de l'Hoter El Djazaïr Alger 16 Jardin Botanique de Rouiba Alger 17 Jardin de la caserne militaire de Rouiba Alger 18 Jardin de l'école militaire de Rouiba Alger 19 Jardin de l'Institut National d'Agronomie Alger 20 Jardin de l'Institut National de la planification Alger 21 Jardin d'Essai du Hamma Alger 22 Jardin du Ministère de la santé Alger 23 Jardin du Ministère de l'hydraulique Alger 24 Jardin du musée national des beaux arts Alger 25 Jardin du Palais du Gouvernement Alger 26 Parc Belgrade Alger 27 Parc Beyrouth Alger 28 Parc de Kouba Alger 29 Parc de Reghaia Alger 30 Parc de Riadh El Fath Alger 31 Parc Tito - Bab Ezzouar Alger 32 Pépinière d'El Alia - El Harrach Alger 33 Arboretum du lac Tonga Annaba

84 34 Parc d'attractions de Sidi-Achour Annaba 35 Parc national d'El Kala Annaba 36 Parc de Batna - Bellezma Batna 37 Parc de Béchar Béchar 38 Parc Landon Biskra 39 Arboretum de Meurdja Blida 40 Jardin de la caserne de gendarmerie des Issers Boumerdès 41 Jardin de l'institut National des Industries Légères Boumerdès 42 Parc de Boumerdès Boumerdès 43 Parc de Boumerdès Boumerdès 44 Parc de Constantine Constantine 45 Parc du Djebel Ouahch Constantine 46 Parc de Djelfa Djelfa 47 Jardin de la Base vie de Ain Amenas Illizi 48 Parc de Médéa Médéa 49 Parc d'arzew Oran 50 Parc de loisirs d'Oran (Ibn Badis) Oran 51 Jardin de la Base vie de Hassi Messaoud Ouargla 52 Parc de Saïda Saïda 53 Parc de Loisirs de Sidi-Bel Abbès Sidi Bel Abbès 54 Parc d'attraction de Sétif Sétif 55 Parc de Skikda Skikda 56 Parc de Cherchell Tipaza 57 Parc de Tipaza Tipaza 58 Réserve de chasse de Zéralda Tipaza 59 Arboretum de Tlemcen Tlemcen 60 Parc de Tlemcen Tlemcen 61 Parc National de Tlemcen Tlemcen

85 Annexe 2 Liste des caractères physiologiques, biochimiques et de résistance utilisés pour la caractérisation des souches de rhizobia associées aux espèces d’acacias introduits les plus fréquents en Algérie.

Tolérance à la salinité (NaCl) 1 NaCl 250 mM 2 NaCl 500 mM 3 NaCl 750 mM 4 NaCl 1000 mM 5 NaCl 1250 mM 6 NaCl 1500 mM Tolérance au déficit hydrique (PEG 6000) 7 PEG 2,5% 8 PEG 5% 9 PEG 7,5% 10 PEG 10% 11 PEG 12,5% 12 PEG 15 13 PEG 17,5 Croissance à différentes températures 14 5°C 15 10°C 16 15°C 17 20°C 18 25°C 19 30°C 20 35°C 21 40°C 22 45°C Utilisation des oses et polyols 23 Adonitol 24 Amidon 25 Arabinose 26 Cellulose 27 Fructose 28 Furanose 29 Glucitol 30 Glucose 31 Glycérol 32 Glycogène 33 Inositol 34 Inuline 35 Lactose 36 Maltitol 37 Maltose 38 Maltose

86 39 Mannitol 40 Mannose 41 Mélibiose 42 Melizitose 43 Méso-erythritol 44 Raffinose 45 Rhamnose 46 Ribose 47 Ribulose 48 Saccharose 49 Sorbose 50 Tagatose 51 Trehalose 52 Xylose Utilisation de différentes sources d’azote 53 Nitrate 54 Nitrites 55 Ammoniac 56 Urée 57 Glutamate 58 Proline 59 Acide aspartique 60 Lysine 61 Tyrosine 62 Valine 63 Glycine 64 Alanine Résistance aux antibiotiques 65 Acide nalidixique 66 Gentamycine 67 Kanamycine 68 Penicilline 69 Rifamycine 70 Spiramycine 71 Streptomycine 72 Tetracycline Résistance aux métaux lourds 73 Zinc Sulfate 74 Cuivre sulfate 75 Magnésium sulfate 76 Manganèse sulfate 77 Plomb acétate 78 Cadmium sulfate 79 Chrome sulfate 80 Vanadium sulfate 81 Argent sulfate 82 Aluminium sulfate 83 Selenium 84 Cobalt sulfate 87

Résumé

Quarante neuf (49) légumineuses ligneuses ont été introduites, acclimatées avec succès et propagées à plus ou moins grande échelle en Algérie. Ces légumineuses ligneuses représentées par ordre d’importance par des arbres et des arbustes grimpants ou non, sont représentées par 12 Caesalpinieae, 26 Mimosoideae et 11 Papilionaceae qui présentent une intérêt horticole ou forestier. Des prospections portant sur 61 sites et 16 pépinières indiquent que la plupart de ces espèces de légumineuses ligneuses introduites peuvent être rencontrées aujourd’hui en Algérie. Quelques unes qui ne sont que faiblement représentées. D’autres sont devenues des composantes essentielles de la flore ligneuse Algérienne tout au moins au nord du pays où elles sont implantées en grand nombre pour la protection des pentes (routes, autoroutes, barrages…) ou pour des opérations de boisement et de reboisement. L’étude de la diversité phénotypique de 36 souches de rhizobia associées au niveau de quelques pépinières aux espèces d’acacias introduites les plus fréquentes en Algérie a permis de mettre en évidence leur grande diversité sur le plan de leur spectre d’hôte et de leur profil phénotypique. Elles sont représentées par des souches à croissance lente apparentées à Bradyrhizobium japonicum et des souches à croissance rapide qui ont été affiliées à Sinorhizobium meliloti et Rhizobium leguminosarum. En raison de la pauvreté de la flore algérienne en légumineuses ligneuses autochtones, celles introduites devraient faire l’objet d’une attention particulière car en tant qu’espèces acclimatées elles font partie intégrante de la diversité floristique algérienne et méritent d’être promues, valorisées et conservées au même titre que les espèces autochtones.