TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Genetik Evolution der Detoxifizierung und Bioaktivierung von Benzoxazinoid Sekundärmetaboliten Regina Dick Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ. Prof. Dr. K. Schneitz Prüfer der Dissertation: 1. Univ. Prof. Dr. A. Gierl 2. Univ. Prof. Dr. E. Grill 3. Univ. Prof. Dr. W. Schwab Die Dissertation wurde am 07.07.2010 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 09.09.2010 angenommen. Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ...... I
Abkürzungsverzeichnis ...... V
1 Einleitung ...... 1
1.1 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe ...... 1
1.1.1 Funktion von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen ...... 1
1.1.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe als Abwehrsubstanzen ...... 1
1.2 Detoxifizierung und Bioaktivierung von Phytoantizipinen: UGTs und β Glucosidasen des Sekundärstoffwechsels ...... 4
1.2.1 UDP abhängige Glycosyltransferasen (UGTs) der Familie 1 ...... 5
1.2.2 β Glucosidasen der Familie 1 (GH1) ...... 8
1.3 Benzoxazinoid Glucoside als Modellsystem der Phytoantizipin Biosynthese ...... 12
1.3.1 Biosynthese und Bioaktivierung in Gräsern ...... 14
1.3.2 Biosynthese in den dikotylen Pflanzen C. orientalis und L. galeobdolon ...... 15
1.3.3 Untersuchungen zur Evolution der Benzoxazinoid Biosynthese in monokotylen und dikotylen Pflanzen ...... 16
1.4 Ziel der Arbeit ...... 17
2 Material und Methoden ...... 18
2.1 Materialien ...... 18
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien ...... 18
2.1.2 Phagenbanken ...... 18
2.1.3 Plasmide ...... 19
2.1.4 Bakterienstämme ...... 19
2.1.5 Oligonukleotide ...... 19
2.1.6 Pflanzenmaterial und Anzucht ...... 23
2.2 Molekularbiologische Methoden ...... 24
2.2.1 DNA Isolierung ...... 24
2.2.2 RNA Isolierung und cDNA Synthese ...... 24
2.2.3 Analyse der RNA durch Formaldehyd Agarosegel Elektrophorese ...... 24 Inhaltsverzeichnis II
2.2.4 Allgemeine DNA Klonierungstechniken ...... 24
2.2.5 Design und Klonierung von amiRNA Konstrukten ...... 25
2.2.6 PCR Verfahren ...... 25
2.2.7 Verfahren zur Isolierung von 5´ und 3´ cDNA Enden ...... 26
2.2.8 Isolierung von UDPG:Glycosyltransferase Kandidatenteilsequenzen aus L. galeobdolon ...... 27
2.2.9 DNA Sequenzierung ...... 27
2.2.10 Sequenzierung des C. orientalis Transkriptoms ...... 27
2.2.11 Screening von cDNA Bibliotheken durch Phagenhybridisierung ...... 28
2.3 Proteinbiochemische Methoden ...... 29
2.3.1 Reinigung von Co BX8 und Lg BX8 aus C. orientalis bzw. L. galeobdolon ...... 29
2.3.2 Proteinfällung...... 31
2.3.3 SDS Polyacrylamid Elektrophorese (SDS PAGE) ...... 31
2.3.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford ...... 31
2.3.5 Heterologe Proteinexpression in E. coli und Reinigung über Nickel Affinitätschromatographie ...... 31
2.4 Isolierung von Naturstoffen ...... 32
2.4.1 Isolierung von DIBOA aus L. galeobdolon bzw. DIMBOA aus Z. mays ...... 32
2.4.2 Isolierung von GDIBOA aus L. galeobdolon ...... 33
2.4.3 Isolierung von GDIMBOA aus Z. mays ...... 33
2.5 Analyse von Naturstoffen ...... 33
2.5.1 Hoch Durchsatz Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ...... 33
2.6 Enzymtests ...... 36
2.6.1 Tests auf Glucosyltransferase Aktivität ...... 36
2.6.2 Tests auf β Glucosidase Aktivität ...... 37
2.7 Elektroporation von Agrobakterien ...... 39
2.8 Transiente Proteinexpression in N. benthamiana ...... 39
2.8.1 Agroinfiltration ...... 40
2.8.2 Proteinextraktion aus N. benthamiana ...... 40
2.9 Erzeugung und Analyse von transgenen A. thaliana Pflanzen ...... 41 Inhaltsverzeichnis III
2.9.1 Elektroporation von Agrobakterien und Transformation von A. thaliana mit A. tumefaciens ...... 41
2.9.2 Analyse der transgenen A. thaliana-Pflanzen ...... 41
2.10 Expression von amiRNA Konstrukten in Z. mays ...... 41
2.10.1 Analyse transgener Z. mays Pflanzen ...... 42
3 Ergebnisse ...... 43 3.1 Isolierung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen und Flavonoid Glucosyl transferasen aus C. orientalis und L. galeobdolon ...... 43
3.1.1 Reinigung von Co BX8 und p Lg BX8 ...... 44
3.1.2 Identifizierung der CoBx8-, p LgBx8-, CoGT- und Lg GT- Gensequenzen ...... 47
3.2 Charakterisierung der heterolog exprimierten Proteine Co BX8, Co GT und Lg GT .. 53
3.2.1 Expression und Reinigung von Co BX8, p Lg BX8, Co GT und Lg GT ...... 53
3.2.2 Substratspezifität von Co GT und Lg GT ...... 53
3.2.3 Kinetische Daten von Co BX8 ...... 54
3.2.4 Substratspezifität von Co BX8 ...... 56
3.2.5 Vergleich der Co BX8 und p Lg BX8 Proteinsequenzen mit anderen Glycosyltransferasen ...... 57
3.2.6 Genexpressionsanalyse von CoBx8 ...... 58
3.3 Funktion von Co BX8 in planta ...... 59
3.3.1 Enzymatische Aktivität von Co BX8 in Arabidopsis Pflanzen ...... 59
3.3.2 Resistenztests der transgenen Arabidopsis Pflanzen ...... 60
3.4 Isolierung der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus C. orientalis ...... 61
3.4.1 Identifizierung von Benzoxazinoid Glucoisd β Glucosidase Kandidaten Gensequenzen ...... 61
3.4.2 Transgene Expression der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase Kandidaten in N. benthamiana ...... 62
3.5 Charakterisierung von Co GLU1 und Co GLU2 ...... 64
3.5.1 Kinetische Daten von Co GLU1 ...... 64
3.5.2 Substratspezifität von Co GLU1 und Co GLU2 ...... 65
3.5.3 Vergleich der Co GLU1 und Co GLU2 Proteinsequenzen mit anderen Glycosid Hydrolasen der Familie 1 ...... 67 Inhaltsverzeichnis IV
3.5.4 Genexpressionsanalyse von CoGlu1 ...... 68
3.5.5 Lokalisationsvorhersage für Co GLU1 ...... 68
4 Diskussion ...... 70
4.1 UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen von monokotylen und dikotylen Pflanzen ...... 71
4.1.1 Substratspezifität gegenüber Benzoxazinoiden und Funktion ...... 71
4.1.2 Evolution von UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen ...... 74
4.2 Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen von monokotylen und dikotylen Pflanzen ...... 78
4.2.1 Substratspezifität gegenüber Benzoxazinoid Glucosiden ...... 78
4.2.2 Substratspezifität außerhalb der Benzoxazinoid Glucoside ...... 78
4.2.3 Funktion von Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen ...... 80
4.2.4 Evolution von β Glucosidasen ...... 81
4.3 Evolution der DIBOA Glucosid Biosynthese in Angiospermen ...... 85
5 Zusammenfassung ...... 87
6 Literaturverzeichnis ...... 89
7 Anhang ...... 101 Abkürzungsverzeichnis V
Abkürzungsverzeichnis Neben SI Einheiten, Elementsymbolen und dem Ein oder Dreibuchstabencode für Aminosäuren wurden folgende Abkürzungen verwendet: Å Ångström A. sativa (As) Avena sativa A. squarrosa (As) Aphelandra squarrosa A. thaliana (At) Arabidopsis thaliana A. tumefaciens (At) Agrobacterium tumefaciens ABC Transporter ATP-binding cassette Transporter AC Affinitätschromatographie AE Anionenaustauscherchromatographie amiRNA artifizielle micro RNA AMP 2 Amino 2 methyl 1 propanol AS Aminosäure AS Fällung Ammoniumsulfat Fällung ATP Adenosintriphosphat B. napus (Bn) Brassica napus BASTA formuliertes Herbizid mit dem Wirkstoff Phosphinotricin, eingetragenes Warenzeichen der Firma Hoechst BME β Mercaptoethanol BOA 1,3 benzoxazol 2(3H) one BOA 6 OH 6 hydroxy 1,3 benzoxazol 2(3H) one bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin C. orientalis (Co) Consolida orientalis ca. circa CaMV Cauliflower Mosaikvirus CAZY Carbohydrate-Active enZYmes Database cDNA komplementäre DNA Ci Curie Col 0 Columbia 0 C Terminus Carboxy Terminus Da Dalton dATP Desoxyadenosintriphosphat dCTP Desoxycytidintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat dGTP Desoxyguanosintriphosphat DIBOA 2,4 Dihydroxy 2H 1,4 benzoxazin 3( 4H ) on DIMBOA 2,4 Dihydroxy 7 methoxy 2H 1,4 benzoxazin 3( 4H ) on DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxynukleotid dTTP Desoxythymidintriphosphat E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamin N N N` N` Tetraacetat ER Endoplasmatische Retikulum FG Frischgewicht FPLC Fast protein liquid chromatography GAPDH Glycerinaldehydphosphat Dehydrogenase GDIBOA 2 O glucosyl l,4(2H) benzoxazin 3 one Abkürzungsverzeichnis VI
GDIMBOA 2 O glucosyl 7 methoxy l,4(2H) benzoxazin 3 one 2 O glucosyl 7 methoxy GF Gelfiltration GFP green fluorescent protein GH Glycosid Hydrolase GT Glycosyltransferase H. lechleri (Hl) Hordeum lechleri H. vulgare (Hv) Hordeum vulgare HBOA 2 Hydroxy 2H 1,4 benzoxazin 3( 4H ) on HCN Blausäure HEPES 2 (4 (2 Hydroxyethyl) 1 piperazinyl) ethansulfonsäure HIC Hydrophobe Interaktionschromatographie HMBOA 2 hydroxy 7 methoxy 2H 1,4, benzoxazzin 3(4H) one HPLC High Performance Liquid Chromatography IAA Indol 3 Essigsäure IGL Indol 3 Glycerinphosphatlyase IPTG Isopropyl β D thiogalactopyranosid K3G Kinetin 3 β Glucosid kb Kilobasenpaare kcat katalytische Konstante kDa Kilo Dalton
Km Michaelis Menten Konstante L. galeobdolon (Lg) Lamium galeobdolon M. truncatula (Mt) Medicago truncatul a Mb Megabasen MBOA benzoxazinoid 6 methoxybenzoxazolin 2 one MES 2 (N Morpholino) Ethansulfonsäure MOPS 3 (N Morpholino) Propansulfonsäure MP Movementprotein MS Massenspektroskopie MS Medium Murashige und Skoog Medium N. benthamiana (Nb) Nicotiana benthamiana nb nicht bestimmt nn nicht nachweisbar N Terminus Amino Terminus O. sativa (Os) Oryza sativa OD Optische Dichte PCR Polymerase Ketten Reaktion PEG Polyetylenglycol pfu plaque forming units PMSF Phenylmethansulfonylfluorid pNPG p Nitrophenyl β D glucopyranosid PSPG Plant Secondary Product- Glucosyltransferase PVP Poly Vinyl Pyrrolidon RACE Rapid Amplification of cDNA Ends RdRp RNA abhängige RNA Polymerase RNA Ribonukleinsäure RP Reversed Phase RT Raumtemperatur RT PCR Reverse Transkriptase PCR RuBisCO Ribulose 1,5 bisphosphat carboxylase/ oxygenase S Swedberg Einheit S. alba (Sa) Sinapis alba S. bicolor (Sb) Sorghum bicolor Abkürzungsverzeichnis VII
S. cereale (Sc) Secale cereale SDS Natriumdodecylsulfat SDS PAGE Natriumdodecylsulfat Polyacrylamide Gelelektrophorese SSPE Standard Saline Phosphate/EDTA Puffer T. aestivum (Ta) Triticum aestivum T. repens (Tr) Trifolium repens Taq Polymerase Thermus aquaticus DNA Polymerase TB Terrific Broth TCA Trichloressigsäure T DNA Transfer DNA TE Tris EDTA Puffer TEMED N N Nk Nk Tetramethylendiamin TIM barrel Triosephosphat Isomerase barrel TMV Tabakmosaikvirus Tris Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan TSA α Untereinheit der Tryptophansynthase tZOG trans Zeatin O Glucosid UDP Uracildiphosphat UDPG Uracildiphosphatglucose UGT UDP abhängige Glycosyltransferase UV ultraviolett vmax Maximalgeschwindigkeit Vol Volumen Z. mays (Zm) Zea mays ZOGR Zeatin O β Glucosid Ribosid ε Extinktionskoeffizient Einleitung 1
1 Einleitung
1.1 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe
1.1.1 Funktion von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen
Pflanzen produzieren ein riesiges Spektrum an Sekundärmetaboliten. Im Gegensatz zu primären Metaboliten, die von allen Pflanzenspezies gleichermaßen produziert werden, folgt die Biosynthese von sekundären Inhaltsstoffen oft phylogenetischen Beziehungen. Manche Sekundärmetabolite werden in einzelnen Arten, andere wiederum in Gruppen nah verwandter Arten synthetisiert. In der Regel dominiert in einem Taxon ein charakteristischer Sekundärmetabolit. Sekundärmetabolite sind als Signalstoffe für die Reproduktion (Terpene als flüchtige Duftstoffe; Anthocyanidine als Blüttenblätter und Samenfarbstoffe) und als Abwehrsubstanzen für das Überleben von Pflanzen im Ökosystem von großer Bedeutung. Abwehrsubstanzen (z.B. Benzoxazinone, cyanogene Glycoside, Glucosinolate und Saponine) schützen die Pflanze vor Viren, Bakterien, Pilzen, konkurrierenden Pflanzen und vor allem gegen Fraßfeinde. Flavonoide nehmen unter den Sekundärmetaboliten bezüglich ihres Vorkommens eine Sonderstellung ein. Man findet sie nicht auf bestimmte Taxons beschränkt, sondern weit verbreitet im Pflanzenreich. Flavonoide sind Sekundärmetabolite mit vielfältigen Funktionen, sie dienen als Signalstoffe der Reproduktion (Anthocyanidine), als Abwehrstoffe gegen Pilze (Skadhauge et al ., 1997) und Insekten (Mallikarjuna et al ., 2004), schützen Pflanzen aufgrund ihrer Funktion als Antioxidantien vor UV Licht (Wink, 2003) und sind für die Pollenfertilität von Bedeutung (Flavonole; Napoli et al ., 1990; Taylor und Jorgensen, 1992).
1.1.2 Sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe als Abwehrsubstanzen
Abwehrsubstanzen des Sekundärmetabolismus, die infolge einer Verwundung oder Infektion de novo synthetisiert werden, bezeichnet man als Phytoalexine (Vanetten et al ., 1994). Zu ihnen zählen beispielsweise Phenylpropane, Terpene und Fettsäurederivate (Ebel, 1986). Abwehrsubstanzen, die die gesunde Pflanze konstitutiv synthetisiert, werden als Phytoantizipine bezeichnet (Vanetten et al ., 1994). Ihre Freisetzung hängt vom Grad der Gewebezerstörung ab, der durch das Pathogen verursacht wird (Osbourn, 1999). Phyto antizipine können in der Pflanze in ihrer biologisch aktiven Form vorliegen (z.B. Alkaloide, Gerbstoffe) und werden in speziellen Zellen oder in die Zellwand eingelagert, um eine Selbstschädigung der Pflanzen zu vermeiden. In den meisten Fällen werden sie aber zur Einleitung 2
Reduktion der Autotoxizität glycosyliert und als aktivierbare Vorläufersubstanzen in der Vakuole akkumuliert (Detoxifizierung; Osbourn, 1996). Im intakten Pflanzengewebe sind spezifische β Glucosidasen in einem anderen Kompartiment gelagert. Die Zerstörung der Zellintegrität z.B. durch einen Fraßfeind oder ein Pathogen bringt die glycosylierte Abwehrsubstanz mit spezifischen β Glucosidasen in Kontakt, woraufhin das toxische Aglucon gebildet wird (Bioaktivierung). Solche Zweikomponentensysteme aus glycosylierter Abwehrsubstanz und spezifischer β Glucosidase sind besonders gut für cyanogene Glycoside, Glucosinolate, Saponine und Benzoxazinoid Glucoside (Abbildung 1) untersucht.
A OH OH HO OH HO OH H CO O O O O 3 OH O O OH
N O N O OH OH DIMBOA Glucosid DIBOA Glucosid
B HO OH OH HO OH HO OH O O OH O O OH CN CN
Dhurrin Linamarin
OH OH C HO OH HO OH S O S O OH OH NOSO3 NOSO3
Glucotropaeolin (Benzylglucosinolat) Sinigrin
OH D HO OH O O O OH
O Glc Glc Glc Rha O Avenacosid B
Abbildung 1: Beispielsubstanzen für die Abwehrsysteme Benzoxazinoid Glucoside, cyanogene Glycoside, Glucosinolate und Saponine. A: die Glucoside der Benzoxazinoide DIBOA (2,4 Dihydroxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4H) one) und DIMBOA (2,4 Dihydroxy 7 Methoxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4H) one); B: die cyanogenen Glycoside Dhurrin und Linamarin; C: die Glucosinolate Glucotropaeolin und Sinigrin und D: das Saponin Avenacosid B (der Glucoserest, der zur Bioaktivierung abgespalten wird, ist mit einem Pfeil markiert). Glc: Glucosid; Rha: Rhamnosid. Einleitung 3
Cyanogene Glycoside sind Phytoantizipine die aus den Aminosäuren Valin, Isoleucin, Leucin, Phenylalanin, Tyrosin und der nicht proteinogenen Aminosäure 2 Cyclopentenyl Glycin synthetisiert werden. Sie werden in mehr als 2650 verschiedenen Pflanzenspezies, von Farnen und Gymnospermen bis hin zu monokotylen und dikotylen Angiospermen synthetisiert (Bak et al ., 2006). Aus Hirse (Sorghum bicolor ) wird das cyanogene Glycosid Dhurrin isoliert, das in der Spitze etiolierter Keimlinge bis zu 30% des Trockengewichts ausmacht (Saunders et al ., 1977; Halkier und Møller, 1989). Der vollständige Biosynthese weg eines cyanogenen Glycosids konnte exemplarisch für Dhurrin in S. bicolor aufgeklärt werden . Dhurrin wird aus der Aminosäure Tyrosin durch zwei Hydroxylierungen und einer Glucosylierung durch die UDP abhängige Glucosyltransferase (UGT) Sb HMNGT gebildet (Halkier und Møller, 1990; Sibbesen et al ., 1994; Halkier et al ., 1995; Bak et al ., 1998a; Jones et al ., 1999; Hansen et al ., 2003). Bei der Hydrolyse cyanogener Glycoside durch spezifische β Glucosidasen wird ein unstabiles Aglucon freigesetzt, das spontan, oder enzymatisch katalysiert, in ein Keton oder Aldehyd und Blausäure (HCN) zerfällt (Conn, 1980; Morant et al ., 2003). Aus monokotylen und dikotylen Spezies konnten β Glucosidasen isoliert werden, die cyanogene Glycoside hydrolysieren, so z.B. aus S. bicolor (Dhurrin, Dhurrinasen Sb DH1 und Sb DH2; Hosel et al ., 1987; Verdoucq et al ., 2004), aus dem weißen Klee ( Trifolium repens; Linamarin, Linamarase Tr CBG; Oxtoby et al ., 1991; Barrett et al ., 1995) und Maniok ( Manihot esculenta ; Linamarin, Linamarase Me LIN; Hughes et al ., 1992).
Glucosinolate konnten unter anderem aus weißem Senf ( Sinapis alba ), Raps ( Brassica napus ), sowie aus der Modellpflanze Acker Schmalwand ( Arabidopsis thaliana) isoliert werden. Ihr Vorkommen ist fast ausschließlich auf die Familie der Kreuzblütengewächse (Brassicaceae; Fahey et al ., 2001) beschränkt. Die ersten Biosyntheseschritte der Glucosinolate und cyanogenen Glycoside sind analog (Ettlinger und Kjær, 1968; Bak et al ., 1998b; Halkier und Gershenzon, 2006). Bei der Glucosinolat Biosynthese schließen sich verschiedene Modifikationsreaktionen an, die zu deren strukturellen Vielfalt führen. Es wird angenommen, dass Glucosinolate von den cyanogenen Glycosiden evolviert sind (Poulton und Møller, 1993; Bak et al ., 1998b; Rask et al ., 2000; Halkier und Gershenzon, 2006). Die für Glucosinolate charakteristische S β glycosidische Bindung wird durch eine Subgruppe von β Glucosidasen, den Myrosinasen, hydrolysiert. Durch die Hydrolyse wird ein unstabiles Aglucon freigesetzt, dessen Zerfallsprodukte Insekten und Fraßfeinde gegenüber eine starke Toxizität aufweisen (z.B. Isothiocyanate (Senföle); Lambrix et al ., 2001; Lazzeri et al ., 2004).
Saponine sind wie cyanogene Glycoside weit verbreitete Abwehrsubstanzen in Pflanzen. Das Saponin Abwehrsystem ist am besten für Hafer ( Avena sativa ) untersucht, der die Saponine Avenacosid A und B synthetisiert. Die Biosynthese der Avenacoside in A. sativa ist bisher nur teilweise aufgeklärt (Haralampidis et al ., 2001; Qi et al ., 2006; Mugford et al ., Einleitung 4
2009). Avenacoside liegen in Blättern als biologisch inaktive Glycoside vor und werden erst bei Zellverletzung durch die beiden spezifischen β Glucosidasen As GLU1 und As GLU2 aktiviert (Lüning und Schlösser, 1975; Nisius, 1988; Gusmayer et al ., 1994; Kim et al ., 2000). Bei diesem Vorgang entstehen die biologisch hochaktiven 26 Desgluco Avenacoside, die aufgrund ihrer Steroid ähnlichen Grundstruktur mit den Sterolen der Plasmamembranen von Schädlingen interagieren, und so zu Porenbildung und Membranzerstörung führen (Morrissey und Osbourn, 1999).
Die Benzoxazinoide DIBOA (2,4 Dihydroxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4H) one) und DIMBOA (2,4 Dihydroxy 7 Methoxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4H) one) kommen vor allem in der Familie der Gräser (Poaceae; Sicker et al ., 2000) vor. Sie schützen Pflanzen vor einem breiten Spektrum an Insekten, pathogenen Pilzen und Bakterien (zusammengefasst in Niemeyer, 2009). Sie vermitteln Resistenz gegen verschiedene Insekten, wie z.B. gegen den europäischen Maiszünsler ( Ostrinia nubilalis ) und verschiedene Blattläuse ( Rhopolasiphum maydis, Metopolophium dirhodum, Sitobion avenae ). Des weiteren verstärken Benzoxazinoide die Widerstandsfähigkeit der Pflanzen gegen bakterielle Erkrankungen (Erwinia spp.: Nassfäule) und Pilz Erkrankungen ( Helminthosprium turcicum : Blattflecken krankheit und Diplodia maydis : Stängelfäule). Es wurde beschrieben, dass Benzoxazinoide Agrobakterium tumefaciens im Wachstum hemmen (Sahi et al ., 1990). Neben der insektiziden und pestiziden Wirkung haben Benzoxazinone auch signifikante allelopathische Effekte, indem sie das Wachstum und Entwicklung innerhalb der Pflanzengesellschaft beeinflussen. DIBOA und dessen Abbauprodukt BOA reduzieren das Wurzel und Sprosswachstum, sowie die Keimung umgebender Pflanzen (Barnes und Putnam, 1987; Burgos et al ., 2004).
Die toxische Wirkung der Benzoxazinoide entsteht durch die Inhibition wichtiger Enzyme der Schädlinge, wie z.B. α Chymotrypsin (Cuevas et al ., 1990), Cholinesterase (Cuevas und Niemeyer, 1993), Papain (Pérez und Niemeyer, 1989a) und der Plasmamembran H + ATPase konkurrierender Pflanzen (Friebe et al ., 1997), durch deren Reaktion mit nukleophilen
Aminosäure Resten (NH 2 Gruppe von Lysin oder SH Gruppe von Cystein) der jeweiligen Proteine (Pérez und Niemeyer, 1989b).
1.2 Detoxifizierung und Bioaktivierung von Phytoantizipinen: UGTs und β Glucosidasen des Sekundärstoffwechsels
Die Funktion der Phytoantizipine hängt meist von einem System zweier komplementärer Enzyme ab. Eine spezifische UDP abhängige Glycosyltransferase (UGT) detoxifiziert das für Einleitung 5 die Pflanze autotoxische Phytoantizipin durch die Übertragung eines Zucker Moleküls. Im Falle der Zerstörung der Zellintegrität durch Pathogene katalysiert die spezifische β Glucosidase die Bioaktivierung des Aglucons.
1.2.1 UDP abhängige Glycosyltransferasen (UGTs) der Familie 1
Einteilung
Glycosylierungen sind ubiquitäre Modifikations Reaktionen. Schätzungen zufolge codieren ca. 1% aller offenen Leserahmen eines jeden Genoms für Glycosyltransferasen (GTs; Coutinho et al ., 2003). GTs werden basierend auf deren Aminosäureidentität in aktuell (April 2010) 92 Familien unterteilt (CAZY Datenbank, Carbohydrate-Active enZYmes Database; http://www.cazy.org/; Campbell et al ., 1997; Coutinho et al ., 2003). Die Familien 1 und 4 der GTs enthalten Glycosyltransferasen, die als Zucker Donor einen UDP (Uridindiphosphat) aktivierten Zucker nutzen und daher als UDP abhängige Glycosyltransferasen oder UGTs bezeichnet werden (Lim und Bowles 2004; Mackenzie et al ., 1997). Die meisten UGT Sequenzen sind der Familie 1 zugeordnet (Coutinho et al ., 2003). Die Aminosäuresequenz von UGTs der Familie 1 enthält ein hochkonserviertes Motiv am C Terminus ( Prosite UGT Konsensus Sequenz, Mackenzie et al ., 1997; Abbildung 2). UGTs können schließlich in tierische und pflanzliche Enzyme unterteilt werden. Die pflanzlichen UGTs der Familie 1 sind durch ein 44 Aminosäuren langes hochkonserviertes Motiv am C Terminus charakterisiert (Plant Secondary Product Glycosyltransferase motif , PSPG Motiv), das eine N terminale Erweiterung der allgemeinen Prosite UGT Konsensus Sequenz darstellt (Hughes und Hughes, 1994; Paquette et al ., 2003; Gachon et al ., 2005). Wie die Bezeichnung des konservierten Motivs bereits andeutet, sind pflanzliche UGTs der Familie 1 in den Metabolismus von Pflanzensekundärmetaboliten eingebunden.
Abbildung 2: Die Plant Secondary Product Glycosyltransferase box (PSPG-box ) der pflanzlichen UDP abhängigen Glycosyltransferasen der Familie 1 (Aminosäuren 1 44). Zusätzlich dargestellt ist die allgemeine Konsensus Sequenz von UDP abhängigen Glycosyltransferasen der Familie 1 (Amino säuren 19 44, Mackenzie et al ., 1997). Die Buchstabengröße ist ein Maß, wie stark die jeweilige Aminosäure konserviert ist (Hughes und Hughes, 1994; Paquette et al ., 2003; Gachon et al ., 2005). Die Abbildung ist aus Gachon et al ., 2005 entnommen. Einleitung 6
Pflanzliche UGTs der Familie 1 stellen große Genfamilien dar. Die Genome der Modell pflanzen A. thaliana und des gestutzten Schneckenklees ( Medicago truncatula) enthalten 112 (Paquette et al ., 2003) bzw. 165 UGT Gene (Modolo et al ., 2007) während in der monokotylen Kulturpflanze Reis ( Oryza sativa ) eine Anzahl von 193 UGT Genen identifiziert wird (Ko et al ., 2006).
Reaktion und Eigenschaften
Pflanzliche UGTs der Familie 1 katalysieren die Übertragung eines aktivierten Zuckers auf verschiedene niedermolekulare Akzeptoren (Aglucon), wie z.B. Pflanzenhormone, Flavonoide, und andere Sekundärmetabolite. Die Ausbildung der glycosidischen Bindung verläuft bei der pflanzlichen UGTs unter Inversion der anomeren Konfiguration des Donors (Coutinho et al ., 2003). In der Regel weisen pflanzliche UGTs in vitro eine hohe Spezifität für den Zucker Donor auf. In den meisten Fällen wird UDP Glucose als Substrat bevorzugt (Vogt und Jones, 2000). Es wurden aber auch Enzyme beschrieben, welche UDP Galaktose (Miller et al ., 1999), UDP Rhamnose (Jones et al ., 2003), UDP Xylose (Martin et al ., 1999a) oder UDP Glucuronsäure (Sawada et al ., 2005) als Substrat akzeptieren. Für das Akzeptor Substrat von pflanzlichen UGTs wurde eher eine Regiospezifität als eine Substratspezifität vorgeschlagen (Vogt et al ., 1997). Viele heterolog exprimierte UGTs zeigen in vitro eine breite Akzeptor Substratspezifität auf (z.B. Hansen et al ., 2003; Hefner et al ., 2002), doch wurden auch UGTs mit einer engeren Akzeptor Substratspezifität isoliert (Ford et al ., 1998; Miller et al ., 1999). Aufgrund der Regulation der Genexpression und der unterschiedlichen Verfügbarkeit von Substraten in planta kann eine in vitro gezeigte breite Substratspezifität jedoch keinen unmittelbaren Rückschluss auf die Funktion der UGT in der Pflanze geben (Ross et al ., 2001).
Pflanzliche UGTs der Familie 1 sind Proteine mit molekularen Massen zwischen 45 kDa und 60 kDa (Vogt und Jones, 2000) und weisen in ihrer Aminosäuresequenz keine Signalpeptide oder Membranbindestellen auf (Li et al ., 2001). UGTs liegen als Monomere vor und werden in der Regel in der cytosolischen Fraktion nachgewiesen (Vogt und Jones, 2000). Die Sequenzhomologie von pflanzlichen UGTs der Familie 1 ist außerhalb des konservierten PSPG Motivs mit ca. 10% gering (Vogt und Jones, 2000). In der PSPG Box werden Aminosäureidentitäten von 60 80% gemessen. Innerhalb der Box treten mit Aminosäureidentitäten von 95% zwei besonders konservierte Motive auf (WAPQV und HCGWNS; Abbildung 2). Einzelne Aminosäuren dieser Motive sind zu 100% konserviert (unterstrichen; Vogt und Jones, 2000). Einleitung 7
Struktur
Seit 2005 konnten die Kristallstrukturen von vier pflanzlichen UGTs der Familie 1 aufgeklärt werden: Mt UGT71G1 (Shao et al ., 2005), Vv GT1 (Offen et al ., 2006), Mt UGT85H2 (Li et al ., 2007) und At UGT72B1 (Brazier Hicks et al ., 2007). Trotz der relativ geringen Aminosäure identität von 25 30% sind die Sekundär und Tertiärstrukturen der untersuchten UGTs stark konserviert (Brazier Hicks et al ., 2007; Osmani et al ., 2009). Die Proteine sind aus einer N terminalen und einer C terminalen Domäne aufgebaut, die beide eine sogenannte Rossmann Faltung (α β α Faltung) zeigen. Die beiden Domänen bilden einen engen Spalt aus, der die Substratbindetasche darstellt. Die Kristallstrukturen belegen die Hypothese, dass sich die Domänen über eine Linkerregion bewegen, um die Aufnahme des Substrats möglich zu machen (Shao et al ., 2005; Offen et al ., 2006; Li et al ., 2007; Brazier Hicks et al ., 2007). Die Interaktionen mit dem Zuckerdonor finden vorwiegend über Aminosäuren des PSPG Box des C Terminus statt, während die Akzeptor Bindetasche fast ausschließlich von Aminosäureresten der weniger konservierten N terminalen Domäne ausgebildet wird. Die Aufklärung der Kristallstrukturen von pflanzlichen UGTs ermöglicht eine Strukturvorhersage weiterer pflanzlicher UGTs mittels Homologiemodellierung ( homolgy modelling) . Bisher konnten auf diese Weise die Strukturvoraussetzungen identifiziert werden, die für die Spezifität der Glycosylierung eines bereits glycosylierten Substrats (Zucker Zucker Glycosylierung), als auch für die Glycosylierung mit UDP Glucuronsäure als Zuckerdonor ausschlaggebend sind (Masada et al ., 2009; Osmani et al ., 2008).
Funktionen von UGTs
Die Glycosylierung durch UGTs stabilisiert und detoxifiziert vormals reaktive und oft toxische Moleküle. Durch die Übertragung eines polaren Zuckermoleküls erhöht sich ferner die Wasserlöslichkeit des gebildeten Glycosids (Jones und Vogt, 2001). Die Glycosylierung findet in der Regel im Cytosol statt, und stellt oft die Voraussetzung für den Transport der Glycoside in die Vakuole dar. Bisher wurde sowohl der Transport der Glycoside über Protonen Antiport Transporter (Flavonoid Glycoside, Klein et al ., 1996) als auch über ABC (ATP-binding cassette ) Transporter (Herbizide, Frangne et al ., 2002) beschrieben.
Die Hauptfunktion der Glycosylierung von Sekundärmetaboliten der Abwehr liegt in der Solubilisierung und Detoxifizierung (z.B. Grubb et al ., 2004, Jones et al ., 1999; von Rad et al ., 2001). UGTs der Familie 1 glycosylieren neben Phytoantizipinen auch Flavonoide und Phytohormone. Hier ist die Glycosylierung vor allem für die Funktionalisierung und Stabilisierung der Substrate bedeutend: Einleitung 8
In der Biosynthese der Flavonoide wird in der Regel zunächst die 3 OH Position des Flavonoid Grundgerüsts glucosyliert. Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen sind daher in den Angiospermen ubiquitär vorkommende und gut untersuchte Enzyme und konnten bisher aus einer Vielzahl an monokotylen und dikotylen Pflanzen isoliert werden. Die Glucosylierung ist für die Stabilisierung des aromatischen Rings entscheidend (Gachon et al ., 2005). Weitere Glycosylierungen und andere Modifikation des Grundgerüsts führen zu der großen Vielfalt der Flavonoide. So kennt man allein für das Flavonol Quercitin über 300 verschiedene Glycoside (Harborne et al ., 1999).
Die Bedeutung der Glycosylierung von Pflanzenhormonen ist in der Regulation der Bioaktiviät zu sehen. Mit der Ausnahme von Ethylen konnten in planta von allen klassischen Pflanzenhormonen Glycoside nachgewiesen werden. Die Zucker Konjugation ist abhängig vom Hormon reversibel oder irreversibel. Bei der reversiblen Glycosylierung stellen die Hormon Glycoside Lagerformen der Hormone dar, die durch β Glucosidasen wieder mobilisiert werden können. Bei der irreversiblen Glycosylierung werden die Hormon Glycoside dem Katabolismus zugeführt (Bowles et al ., 2006). Gut untersucht ist Zeatin. Dieses kommt in der cis- und trans-Konfiguration vor und wurde als erstes aus Mais ( Zea mays) isoliert. Aus mehreren Spezies konnten bisher Zeatin Glycosyltransferasen isoliert werden, eine trans-Zeatin O Glycosyltransferase aus der Gartenbohne ( Phaseolus vulgaris; Martin et al ., 1999a ) und der Limabohne ( Phaseolus lunatus ; Martin et al ., 1999b) und zwei cis-Zeatin O Glycosyltransferasen aus Z. mays (Martin et al ., 2001; Veach et al ., 2003). Ein Screening der UGTs von A. thaliana resultierte in der Isolation von Cytokinin O und Cytokinin N Glycosyltransferasen (Hou et al ., 2004).
1.2.2 β Glucosidasen der Familie 1 (GH1)
Einteilung
Glycosidasen, oder auch Glycosidhydrolasen (GH) sind eine weit verbreitete Enzymklasse, welche die Spaltung von glycosidischen Bindungen katalysiert. Sie werden, wie die Glycosyltransferasen, entsprechend ihrer Aminosäureidentität in Familien unterteilt. Aktuell (April 2010) sind in der CAZY Datenbank, (http://www.cazy.org/) 115 Glycosidase Familien aufgeführt (Henrissat, 1991; Henrissat und Davies, 1997). β Glucosidasen spalten β glucosidische Bindungen und kommen ubiquitär in Prokaryoten und Eukaryoten vor. Sie gehören u.a. zu den Glycosidase Familien 1, 3, 5 und 9 (GH1, GH3, GH5 und GH9). In höheren Pflanzen sind β Glucosidasen an verschiedenen physiologischen Prozessen, wie der Lignifizierung (Dharmawardhana et al ., 1995), der Hydrolyse von Zellwand Oligosacchariden während der Keimung (Leah et al ., 1995), der Regulation der Bioaktivität Einleitung 9 von Pflanzenhormonen (Brzobohatý et al ., 1993; Falk und Rask, 1995) und der Bioaktivierung von Abwehrstoffen (Niemeyer, 2009) beteiligt.
β Glucosidasen der Familie 1 (GH1) katalysieren vor allem die Hydrolyse von Abwehrsubstanzen des Sekundärmetabolismus, wie z.B. Benzoxazinoid Glucoside, cyanogene Glycoside, Glucosinolate und Saponine. Zudem sind in dieser Familie Zeatin β Glucosidasen, β Mannosidasen und Monolignol β Glucosidasen vorzufinden. Mit 40 funktionellen β Glucosidasen aus A. thaliana und 34 funktionellen β Glucosidasen aus O. sativa b ilden GH1 Enzyme in höheren Pflanzen eine größere Genfamilie (Xu et al ., 2004; Opassiri et al ., 2006).
Reaktion und Eigenschaften
β Glucosidasen der Familie 1 (GH1) katalysieren die Hydrolyse von β glucosidischen Bindungen zwischen zwei Zuckermolekülen oder zwischen einem Zuckermolekül und einem Agluconrest. Die meisten pflanzlichen GH1 Enzyme sind β O Glucosidasen, doch auch β S Glucosidasen, die sogenannten Myrosinasen, sind in dieser Familie zu finden. Die Hydrolyse findet in zwei Schritten statt, der Glucosylierung und der Deglucosylierung des Enzyms. Dabei wird die anomere Konfiguration der Glucose beibehalten. Die Spaltung der β glucosi dischen Bindungen wird bei GH1 Enzymen durch zwei Glutaminsäurereste katalysiert, die in stark konservierten Aminosäuremotiven (I/VTENG: Nukleophil und NEP: Säure Base Katalyse) eingebettet liegen (Withers et al ., 1990, Wang et al ., 1995). Der Glutaminsäurerest in dem I/VTENG Motiv führt einen nukleophilen Angriff auf das anomere C Atom der Glucose aus, wodurch ein Enzym Zucker Intermediat gebildet wird (Glucosylierung). Der Glutamin säure Säure Basen Katalysator aktiviert in einem zweiten Schritt ein Wassermolekül, so dass dieses wiederum als Nukleophil für die Hydrolyse der glycosidischen Bindung zwischen Enzym und Zucker dienen kann (Deglucosylierung; Davies und Henrissat 1995). Interessanterweise haben Myrosinasen (β S Glucosidasen) im Gegensatz zu anderen GH1 Enzymen kein NEP Motiv und damit keinen Aminosäurerest, der als Säure Base Katalysator fungiert. Sie haben stattdessen ein homologes Motiv, in dem Glutaminsäure durch Glutamin ersetzt ist (NQL). Nach Burmeister et al . (1997) benötigen Myrosinasen keinen Säure Katalysator, da die Glucosinolat Aglucone eine hervorragende Abgangsgruppe darstellen. Der Basen Katalysator wird bei Myrosinasen durch den exogenen Cofaktor Ascorbinsäure ersetzt (Burmeister et al ., 1997). Einleitung 10
Kompartimentierung und Proteinglycosylierung
Die schnelle Reaktion auf Pathogene oder Herbivoren durch Phytoantizipine wird durch spezifische β Glucosidasen ermöglicht. Diese sind in einem anderen Zellkompartiment gespeichert als das Phytoantizipin (Kelly et al ., 1998; Thangstad et al ., 1991; Höglund et al ., 1992) und werden durch die Zerstörung der Zellintegrität durch das Pathogen oder das Herbivor freigesetzt. Die β Glucosidase hydrolysiert das glycosylierte Phytoantizipin und setzt damit das toxische Aglucon frei. Die Freisetzung des Benzoxazinoids DIMBOA (2,4 Dihydroxy 7 Methoxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4H) one) ist in Z. mays z.B. nach 30 min abgeschlossen (Sicker et al ., 2000).
Die Phytoantizipin Glycoside der cyanogenen Glycoside (Saunders et al ., 1977; Saunders und Conn, 1978, Gruhnert et al ., 1994), der Glucosinolate (Kelly et al ., 1998) und der Saponine (Kesselmeier und Urban, 1983) sind sowohl in monokotylen als auch in dikotylen Pflanzen in der Vakuole gespeichert. Die subzelluläre Lokalisation der spezifischen β Glucosidasen unterscheidet sich aber in monokotylen und dikotylen Pflanzen. Monokotyle β Glucosidasen tragen ein Chloroplast Transitpeptid. Die Lokalisation im Chloroplasten wurde z.B. für die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus Z. mays (Esen und Stetler, 1993), die Dhurrin β Glucosidase aus S. bicolor (Thayer und Conn, 1981) und die Avenacosid β Glucosidase aus A. sativa (Nisius, 1988; Gusmayer et al ., 1994) gezeigt. Dikotyle β Glucosidasen dagegen weisen ein N terminales Signalpeptid aus, das den Transport der Enzyme in den apoplastischen Raum (Linamarase aus dem Kautschukbaum (Hevea brasiliens); Gruhnert et al ., 1994) oder bei den β Glucosidasen von Glucosinolaten (Myrosinase) in Proteinkörper ( Protein bodies) von spezialisierten Zelltypen, den sogenannten Myrosin Zellen, zur Folge hat (Höglund et al . 1992, Thangstad et al ., 2004).
Mit der unterschiedlichen Lokalisation der monokotylen und dikotylen β Glucosidasen gehen unterschiedliche Modifikationen der Enzyme einher. Im Gegensatz zu monokotylen β Glucosidasen werden dikotyle β Glucosidasen über den sekretorischen Weg zu ihrem Bestimmungsort geführt. Während der Translokation durch das Endoplasmatische Retikulum werden die β Glucosidasen dabei cotranslational glycosyliert. Dies konnte z.B. für die Linamarase aus T. repens durch Polypeptid Sequenzierung gezeigt werden (Barrett et al ., 1995). Bei der Myrosinase aus S. alba ist die starke Glycosylierung der β Glucosidase an 11 Positionen aus der Kristallstruktur zu ersehen (Burmeister et al ., 1997). Monokotyle β Glucosidasen werden dagegen posttranslational in den Chloroplasten transportiert, bisher konnte für diese Enzyme keine Glycosylierung gezeigt werden (Esen und Stetler, 1993). Die Glycosylierung der β Glucosidasen aus dikotylen Pflanzen ist meist für deren Enzymaktivität erforderlich. Es wird angenommen, dass die Glycosylierung für die Stabilisierung der Enzyme nötig ist (Morant et al ., 2008a). Für die funktionelle Expression der Enzyme werden Einleitung 11 diese daher stabil in A. thaliana (Morant et al ., 2008b), in der Hefespezies Pichia pastoris (Zhou et al ., 2002), transient in der Tabakspezies Nicotiana benthamiana (diese Arbeit), oder nach der Fusion an ein stabilisierendes Protein in Escherichia coli (Keresztessy et al ., 1996; Suzuki et al ., 2006) exprimiert.
Enzymstruktur
Die Strukturen der Benzoxazinoid Glucosid hydrolysierenden β Glucosidasen Zm GLU1 und Ta GLU1a aus Z. mays und Weizen ( Triticum aestivum ; Czjzek et al ., 2000, 2001; Sue et al ., 2006), der Dhurrinase Sb Dh1 aus S. bicolor , (Verdoucq et al ., 2004), der Linamarase Tr CBG aus T. repens (Barrett et al ., 1995), sowie der Myrosinase aus S. alba (Burmeister et al ., 1997) sind aufgeklärt. Die zentrale Domäne der GH1 besitzt eine α/β Barrel Struktur (TIM barrel ), die nach dem heutigen Kenntnisstand das am weitesten verbreitete Proteinfaltungs motiv darstellt. Die Sekundärstruktur des linearen Proteinstrangs besteht aus je 8 α Helices und 8 β Faltblättern, die in alternierender Reihenfolge vorkommen. Die dreidimensionale Fass artige Struktur entsteht durch die parallele, kreisförmige Anordnung der β Faltblätter, welche außen von α Helices umgeben sind. Aminosäurereste, die für die enzymatische Aktivität und die Substrat Spezifität verantwortlich sind, sind am C terminalen Ende der einzelnen α Helices und β Faltblättern lokalisiert und bilden eine enge Substratbindetasche aus (Czjzek et al ., 2000, 2001; Sue et al ., 2006).
Die Quartärstruktur von pflanzlichen β Glucosidasen der Familie 1 ist im Gegensatz zur konservierten Tertiärstruktur der Enzyme sehr vielfältig. Die quartären Strukturen reichen von aktiven Monomeren (Amygdalin und Prunasin β Glucosidase; Kuroki und Poulton, 1986; Li et al ., 1992) über Dimere und Tetramere bis hin zu Dekameren (Linamarase; Fan und Conn, 1985). Die Oligomerisierung hat nicht immer einen Einfluss auf die Enzymaktivität: Die S. bicolor Dhurrinase 1 ( Sb DHR1) existiert in planta als Tetramer, doch weisen die Sb DHR1 Dimere keine veränderten Enzymaktivitäten auf (Hosel et al ., 1987). Die Benzoxazinoid β Glucosidasen Ta GLU1a Ta GLU1b, sowie die Saponin β Glucosidasen As GLU1 und As GLU2 bilden sowohl Homo als auch Heteromultimere (Sue et al ., 2006; Kim und Kim, 1998; Kim et al ., 2000). Bisher gibt es keine Erkenntnisse, ob die verschiedenen Kombinationen der Isoenzym Monomere unterschiedliche Substratspezifitäten oder Enzymaktivitäten zur Folge haben.
Die Regionen, über die die β Glucosidase Monomere oligomerisieren, zeigen kein gemeinsames Muster auf. Ciczek et al . konnten bei einem Vergleich dieser Regionen der Benzoxazinoid β Glucosidase Zm GLU1, der cyanogenen β Glucosidase Tr CBGLU und der Myrosinase Sa MYR keine Ähnlichkeiten feststellen (Czjzek et al ., 2001). Auch die Einleitung 12
Orientierung der Monomere innerhalb eines Dimers unterscheidet sich (Burmeister et al ., 1997). Das Auftreten diverser Oligomerisierungsformen der β Glucosidasen der Familie 1, trotz deren stark konservierten Tertiärstruktur, deutet darauf hin, dass die Quartärstruktur nach der Spezialisierung der Enzyme evolviert ist (Morant et al ., 2008a).
1.3 Benzoxazinoid Glucoside als Modellsystem der Phytoantizipin Biosynthese
Benzoxazinoid Glucoside sind charakteristische Phytoantizipine der Familie der Gräser (Poaceae, Monocotyledoneae). Hier findet man Benzoxazinoide in den bedeutenden Kulturpflanzen Roggen ( Secale cereale ), T. aestivum , und Z. mays . Die systematische Analyse verschiedener Gerstearten ergab, dass die Wildgersten Hordeum brachyantherum, Hordeum flexuosum, Hordeum lechleri und Hordeum roshevitzii DIBOA synthetisieren, während die Kulturgerste Hordeum vulgare kein DIBOA bildet (Grün et al ., 2005). Während in S. cereale und den Wildgersten das Benzoxazinoid DIBOA vorkommt, ist in Z. mays und T. aestivum das Haupt Benzoxazinoid DIMBOA. Außerhalb der Gräser findet man Benzoxazinone in zwei phylogenetisch weit entfernten Ordnungen der dikotylen Pflanzen, in den Ranunculales und den Lamiales.
In der Ordnung Ranunculales produziert ausschließlich eine Spezies der Familie Ranunculaceae (Rittersporn; Consolida orientalis ) Benzoxazinoide. In der Odnung Lamiales synthetisiert jeweils eine Spezies der Familien Lamiaceae (Goldnessel; Lamium galeobdolon ) und Plantaginaceae (süßer Besenginster; Scoparia dulcis ) Benzoxazinoide (Sicker et al ., 2000; Özden et al ., 1992; Alipieva et al ., 2003), während in der Familie Acanthaceae Benzoxazinoide aus mehreren Spezies ( Acanthus mollis , Aphelandra tetragona , Aphelandra squarrosa , Blepharis edulis, Crossandra infundibuliformis, Crossandra pungens ) isoliert werden konnten (Sicker et al ., 2000; Pratt et al ., 1995; Abbildung 3). In dieser Arbeit werden die beiden dikotylen Spezies C. orientalis und L. galeobdolon untersucht. Beide sind nach bisherigen Untersuchungen die einzige Benzoxazinoid syntheti sierende Spezies der jeweiligen Pflanzenfamilie und beide synthetisieren Benzoxazinoide in ähnlich hohen Konzentrationen wie sie bei Z. mays gefunden werden (bis zu 19 mM; Schullehner et al ., 2008). C. orientalis und L. galeobdolon bilden das Benzoxazinoid DIBOA (Sicker et al ., 2000). Einleitung 13
Z. mays, T. aestivum, H. vulgaris, S. cereale, A. repens, C. lachryma jobi und weitere
Poaceae
Ranunculace ae C. orientalis
Lamiaceae L. galeobdolon
Plantaginaceae S. dulcis
Acanthace A. mollis, A. tetragona, B. edulis, A. squarrosa, C. infundibuliformis, C. pungens
Abbildung 3: Phylogenie der Pflanzenordnungen der Angiospermen ( the Angiosperm Phylogeny group , 2003). Pflanzenfamilien mit Spezies, die Benzoxazinoide produzieren sind rot dargestellt. Spezies dieser Familien, aus denen Benzoxazinoide isoliert werden konnten, sind aufgelistet; die in dieser Arbeit untersuchten Spezies sind fett gedruckt. Benzoxazinoid produzierende Spezies sind Zea mays (Z. mays ), Hordeum vulgare (H. vulgare ), Triticum aestivum (T. aestivum ), Secale cereale (S. cereale ), Agropyron repens (A. repens ), Coix lachryma jobi (C. lachryma jobi ), Consolida orientalis (C. orientalis ), Lamium galeobdolon (L. galeobdolon ), Scoparia dulcis (S. dulcis ), Acanthus mollis (A. mollis ), Aphelandra tetragona (A. tetragona ), A. squarrosa (A. squarrosa ), Blepharis edulis (B. edulis ),Crossandra infundibuliformis (C. infundibuliformis ) und Crossandra pungen (C. pungens ). Einleitung 14
1.3.1 Biosynthese und Bioaktivierung in Gräsern
In Z. mays ist eine Serie von fünf Enzymen für die DIBOA Biosynthese ausreichend (Frey et al ., 1997, 2003; Glawischnig et al ., 1999; von Rad et al ., 2001; Jonczyk et al ., 2008; Abbildung 4): Die Abzweigung vom Primärmetabolismus durch die Spaltung von Indol 3 Glycerinphosphat in freies Indol und Glycerinaldehyd 3 Phosphat wird durch Zm BX1 katalysiert. Vier Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen ( Zm BX2 Zm BX5) führen konsekutiv vier Sauerstoffatome in das Indolmolekül ein. Die Reaktionsschritte der DIBOA Biosynthese sind in den Gräsern Z. mays , T. aestivum , H. lechleri und S. cereale identisch. Orthologe BX1 BX5 Enzyme konnten aus T. aestivum (Nomura et al ., 2002, 2003, 2005), S. cereale (Nomura et al ., 2003) und H. lechleri (Grün et al ., 2005) isoliert werden. Die DIBOA Biosynthese Gene haben in diesen Gräsern einen monophyletischer Ursprung (Grün et al ., 2005; Frey et al ., 2009).
Die Reaktivität von DIBOA wird durch dessen Glucosylierung reduziert. Die Z. mays Glucosyltransferasen Zm BX8 und Zm BX9 katalysieren die Bildung eines D Glucosids aus dem toxischen Aglucon. Aus T. aestivum konnte eine homologe Gensequenz zu ZmBx8 und ZmBx9 identifiziert werden ( TaBx8 ). Ta BX8 wurde in seiner Funktion als Benzoxazinoid Glucosyltransferase bestätigt (Luzak, 2010; Hillenmeyer, 2010). Es kann daher in den Gräsern auch für die Benzoxazinoid Glucosyltransferase von einer monophyletischen Evolution ausgegangen werden.
Über eine Hydroxylierung durch die 2 Oxoglutarat abhängige Dioxygenase Zm BX6 und eine anschließende Methylierung durch die O Methyltransferase Zm BX7 wird DIBOA Glucosid (GDIBOA) weiter in sein 7 Methoxy Analog DIMBOA Glucosid (GDIMBOA) überführt. Dieses wird in der Vakuole gelagert. Für T. aestivum sind diese Gene der Biosynthese nicht bekannt, durch Inhibitorexperimente ist lediglich belegt, dass die Hydroxylierung am C7 Atom ebenfalls durch eine 2 Oxoglutarat abhängige Dioxygenase katalysiert wird (Frey et al ., 2003).
Bei Zerstörung der Zellintegrität wird das Glucosid durch die zwei im Chloroplasten lokalisierten spezifischen β Glucosidasen Zm GLU1 und Zm GLU2 in das toxische Aglucon überführt (Bioaktivierung; Esen, 1992; Cuevas et al ., 1992; Bandaranayake und Esen, 1996; Cicek und Esen, 1999). Es konnten weiterhin eine β Glucosidase aus S. cereale (Sc GLU; Nikus et al ., 2003) und 3 Isoenzyme aus T. aestivum (Ta GLU1a Ta GLU1c; Sue et al ., 2006) isoliert werden. Die phylogenetische Analyse von GH1 β Glucosidasen verschiedener Abwehrsysteme (Bioaktivierungsfunktionen; Morant et al ., 2008a) weist auf einen gemeinsamen Vorläufer für β Glucosidasen der Abwehrsysteme Benzoxazinoid Glucoside, cyanogene Glycoside (Dhurrin) und Saponine in monokotylen Pflanzen hin. Einleitung 15
HO OH Zm BX1 Zm BX2 ZmBX3 Zm BX4 Zm BX5 O OH 2 OPO3 N N O H OH Indol 3 Glycerinphosphat DIBOA
Zm BX8 Zm BX9
H3CO O O Glc Zm BX7 HO O O Glc Zm BX6 O O Glc
N O N O N O OH OH OH DIMBOA Glc TRIBOA Glc DIBOA Glc
Zm GLU1 Zm GLU1 Zm GLU2 Zm GLU2
H3CO O OH O OH
N O N O OH OH DIMBOA DIBOA
Abbildung 4: Enzyme und Intermediate der Benzoxazinoid Biosynthese und Bioaktivierung in Z. mays. Ein homologes Enzym der Tryptophan Synthase α (TSA), Zm BX1 und Cytochrom P450 abhängige Monooxygenasen, Zm BX2 Zm BX5 katalysieren die Biosynthese von DIBOA aus Indol 3 Glycerinphosphat. Die Benzoxazinoid Glucosyltransferasen Zm BX8 und Zm BX9 glucosylieren DIBOA. DIBOA Glucosid (GDIBOA), wird durch eine Hydroxylierung (2 Oxoglutarat abhängige Dioxygenase, Zm BX6) und Methylierung (O Methyltransferase, Zm BX7) zu DIMBOA Glucosid (GDIMBOA) umgesetzt. GDIBOA und GDIMBOA werden durch 2 spezifische β Glucosidasen, Zm GLU1 und Zm GLU2 hydrolysiert und bioaktiviert. Glc: Glucosid.
1.3.2 Biosynthese in den dikotylen Pflanzen C. orientalis und L. galeobdolon
In C. orientalis und L. galeobdolon wird das Benzoxazinoid DIBOA gebildet. Im Unterschied zu Z. mays , in dem die Biosynthese auf den Keimling und junge Pflanzen beschränkt ist, findet man DIBOA in C. orientalis und L. galeobdolon unabhängig vom Entwicklungsstadium in allen oberirdischen Pflanzenorganen. Die gemessenen Benzoxazinoid Konzentrationen sind in derselben Größenordnung ( L. galeobdolon , bis zu 19 mM) oder übersteigen (C. orientalis ; bis zu 36 mM) sogar die Konzentrationen von bis zu 19 mM, die man in Z. mays nachweist (Schullehner et al ., 2008). Mit Hilfe von Fütterungsversuchen konnte festgestellt werden, dass auch in C. orientalis und L. galeobdolon Indol das erste Intermediat der Benzoxazinoid Biosynthese darstellt. Aus C. orientalis und L. galeobdolon konnten mehrere Indol 3 Glycerinphosphatlyasen (IGLs) isoliert und charakterisiert werden, die Indol Einleitung 16
3 Glycerinphosphat zu Indol umsetzen. Für jede Spezies wurde dabei ein Enzym gefunden, welches mit einer hohen Effizienz Indol synthetisiert und daher den ersten spezifischen Schritt der Benzoxazinoid Biosynthese katalysieren könnte. Die isolierte IGL aus C. orientalis (Co BX1) weist Enzymeigenschaften auf, die denen der BX1 Enzyme von Z. mays und T. aestivum entsprechen (Schullehner et al ., 2008). Auch korreliert die Genexpression von CoBx1 mit der DIBOA Neusyntheserate in unterschiedlichen Pflanzengeweben. CoBX1 stellt daher mit großer Wahrscheinlichkeit das Branchpoint Enzym des DIBOA Biosynthesewegs dar, welches Indol für die DIBOA Biosynthese bereitstellt (Schullehner et al ., 2008).
1.3.3 Untersuchungen zur Evolution der Benzoxazinoid Biosynthese in monokotylen und dikotylen Pflanzen
Die vollständige Aufklärung ihrer Biosynthese in Z. mays machen Benzoxazinoid Glucoside zu einem guten Modellsystem für die Untersuchung der Evolution von Phytoantizipinen. Die für die Biosynthese von Phytoantizipinen charakteristische Unterteilung in die vier funktio nellen Einheiten, Abzweigung vom Primärmetabolismus, Funktionalisierung, Detoxifizierung und Bioaktivierung trifft auch für die Benzoxazinoid Biosynthese zu.
Besonders das Vorkommen der Benzoxazinoide in vielen Spezies der monokotylen Gräser einerseits, und in einzelnen Spezies von phylogenetisch weit entfernten Familien der dikotylen Pflanzen wirft die Fragestellung nach der Evolution der Benzoxazinoid Biosynthese in monokotylen und dikotylen Pflanzen auf. Bisher wurde einzig die Indol 3 Glycerinphosphatlyase aus C. orientalis (Co BX1) isoliert (Schullehner et al ., 2008). Für das Branchpoint Enzym Co BX1 konnte eine unabhängige Evolution von Z. mays Zm BX1 gezeigt werden; beide Enzyme können auf die Duplikation und Funktionalisierung der α Untereinheit der Tryptophan Synthase (TSA) des Primärstoffwechsels zurückgeführt werden (Gierl und Frey, 2001; Schullehner et al ., 2008). Die Phylogenie der Gene der Funktionalisierung (Bx2 5), Detoxifizierung ( Bx8 bzw. Bx9) und Bioaktivierung ( Glu ) in monokotylen und dikotylen Pflanzen wurde bisher nicht analysiert.
Einleitung 17
1.4 Ziel der Arbeit
Das Benzoxazinoid Abwehrsystem stellt ein gutes Modellsystem für die Untersuchung der Evolution von Phytoantizipinen in Pflanzen dar. Phylogentische Untersuchungen werden in dieser Arbeit aufklären, ob in monokotylen und dikotylen Pflanzen unterschiedliche Vorläufer der UGT und β Glucosidase Genfamilien für die Detoxifizierung und Bioaktivierung von Benzoxazinoiden rekrutiert wurden. Dazu werden die UDP abhängigen Glucosyltransferasen Co BX8 und Lg BX8 aus C. orientalis und L. galeobdolon isoliert, die das toxische Aglucon DIBOA detoxifizieren. Zudem soll die spezifische GDIBOA β Glucosidase aus C. orientalis isoliert werden, die das GDIBOA bei Schädigung der Pflanze, z.B. durch ein Pathogen, bioaktiviert.
Durch eine phylogenetische Analyse soll die Evolution dieser Enzymfunktionen in monokotylen und dikotylen Pflanzen analysiert werden. Die dikotylen Enzyme sollen bezüglich ihrer kinetischen Parameter, ihrer Substratspezifität und ihres Expressionsmusters mit den Enzymen aus den Gräsern verglichen werden. Die Ergebnisse sollen einen Einblick in die Evolution der Benzoxazinoid Biosynthese geben. Material und Methoden 18
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Reagenzien
Die in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien (analytischer Reinheitsgrad) wurden, sofern nicht anders angegeben, von den Firmen Bio Rad® (USA), Boehringer (Mannheim), Fluka (Schweiz), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) und Sigma Aldrich (USA) bezogen.
DNA Restriktionsenzyme und DNA modifizierende Enzyme wurden bei den Firmen Roche (Schweiz), New England Biolabs (USA), Promega (USA) und Qiagen (Hilden) bezogen. Oligonukleotide wurden von biomers (Ulm) und Eurofins MWG Operon (Ebersberg) im Auftrag synthetisiert.
Die Substrate DIBOA und DIMBOA wurden von Prof. Dr. Sicker, Universität Leipzig freundlicherweise zu Verfügung gestellt. DIBOA wurde außerdem aus L. galeobdolon isoliert, DIMBOA aus Z. mays Keimlingen. GDIBOA und GDIMBOA wurden aus L. galeobdolon bzw. Z. mays Keimlingen isoliert (siehe 2.4.2 und 2.4.3). Die Flavonoide Kaempferol, Quercetin, Myricetin, Pelargonidin und Delphinidin wurden von Prof. Dr. Schwab, TUM freundlicher weise zu Verfügung gestellt. Die Cytokinine trans Zeatin und Zeatin Ribosid wurden von Duchefa Biochemie B.V (Haarlem, Niederlande) und das Cytokinin trans Zeatin O Glucosid (tZOG) wurde von OlChemIm Ltd. (Olomouc, Tschechien) erworben. Dhurrin wurde von Roth (Karlsruhe) bezogen.
Der Proteinstandard peqGOLD Protein Marker wurde von PEQLAB (Erlangen) erworben. Als DNA bzw. RNA Längenstandard wurden der 1 kb Plus DNA Marker bzw. der 0,5 10 kb RNA Marker von Invitrogen eingesetzt.
2.1.2 Phagenbanken
Es wurden Phagenbanken von C. orientalis (zwei Wochen alte Keimlinge) und L. galeobdolon (junge Blätter) im Vektor λ ZAP (Stratagene, USA) verwendet (Schullehner et al ., 2008). Material und Methoden 19
2.1.3 Plasmide
Tabelle 1: eingesetzte Plasmide.
Plasmid Resistenzmarker Hersteller/Literaturnachweis pBluescript II KS Ampicillin Stratagene pBluescript SK Ampicillin Stratagene pGEM ® T Easy Ampicillin Promega pET28a His Kanamycin Novagen pET3a Ampicillin Novagen pET 32a Trx Ampicillin Novagen pICH31070 Kanamycin Icon Genetics pICH7410 Carbenicillin Icon Genetics pICH20111 Carbenicillin Icon Genetics pICH20115 Carbenicillin Icon Genetics pICH14011 Carbenicillin Icon Genetics pGPTV BarB Kanamycin, BASTA Becker et al ., 1992 pUbicasC2Intron/ Sal Ampicillin Reinhold Brettschneider, Biozentrum Klein Flottbek TF 101.1 Spectinomycin Kan Wang, Iowa State University
2.1.4 Bakterienstämme
Tabelle 2: eingesetzte Bakterienstämme von E. coli und A. tumefaciens.
Bakterienstamm Resistenzmarker Hersteller/Literaturnachweis
E. coli XL1 Blue Bullock, et al ., 1978 XL1 Blue MRF´ Tetracyclin Stratagene, USA SOLR TM Kanamycin Stratagene, USA K803 Wood, 1966 BL21 (DE3) Sudier und Mofat, 1986 Origami TM (DE3) Kanamycin Novagen Lemo21 (DE3) Chloramphenicol New England Biolabs A. tumefaciens GV3101 Rifampicin van Larebeke et al ., 1974 GV3101 pMP90:RK Rifampicin, Gentamycin, Koncz und Schell, 1986 Kanamycin
2.1.5 Oligonukleotide
Tabelle 3: PCR Primer für die Amplifikation von Sonden für das Phagenscreening.
Name Sequenz Gen fwd44993 ATA GTT CTT CAG ATG TAC CTC C CoBx8 rev44993 CCC ACT TGT TAC AGA TAT AGA A CoBx8 LamAnthSfwd CTT AGA TAA GAA TCC GTC GCC LgGt LamAnthSrev CTT CCT TGT GGT TCA ACT GC LgGt Material und Methoden 20
Tabelle 4: Oligonukleotide, die für die Amplifikation von UDPG Glycosyltransferasen Kandidatenteil sequenzen aus L. galeobdolon verwendet wurden.
Name Sequenz Gen/Vektor
LamGT3a GAG ANG ART TCC ANC CRC A LgUGTs LamGT3b GAG ANG ART TCC ANC CRC ART G Lg UGTs T3 AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG pBluescript SK M13rev GGA AAC AGC TAT GAC CAT GA pBluescript SK LamGT1 GAG ACA YTG YGG NTG GAA Y Lg UGTs LamGT2a GAG ACA YTG YGG NTG GAA YTC Lg UGTs T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG pBluescript SK M1320 GTA AAA CGA CGG CCA GTG pBluescript SK Oligo d(T) anchor GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA CTT TTT TTT PolyA primer TTT TTT TTV PCR anchor primer GAC CAC GCG TAT CGA TGT CGA C Oligo d(T) anchor
Tabelle 5: Primer zur Erstellung von amiRNA Konstrukten.
Name Sequenz Gen
1Bx8 I miR s AGT AGT GGG TGA AGA AGC CGC CGC AGG AGA ZmBx8 TTC AGT TTG A 1Bx8 II miR a TGC GGC GGC TTC TTC ACC CAC TAC TGC TGC ZmBx8 TGC TAC AGCC 1Bx8 III miR*s CTC GGC GCC TTG TTC ACC CAC TAT TCC TGC ZmBx8 TGC TAG GCT G 1Bx8 IV miR*a AAT AGT GGG TGA ACA AGG CGC CGA GAG AGG ZmBx8 CAA AAG TGA A 5Bx8 I miR s AGT CCT TGT CGA CCA AGG TGC GGC AGG AGA ZmBx8 TTC AGT TTG A 5Bx8 II miR a TGC CGC ACC TTG GTC GAC AAG GAC TGC TGC ZmBx8 TGC TAC AGC C 5Bx8 III miR*s CTC CGC AGC TTC GTC GAC AAG GAT TCC TGC ZmBx8 TGC TAG GCT G 5Bx8 IV miR*a AAT CCT TGT CGA CGA AGC TGC GGA GAG AGG ZmBx8 CAA AAG TGA A 6Bx9 I miR s AGT CCT TGT CGA TCA AGG TGC GGC AGG AGA ZmBx9 TTC AGT TTG A 6Bx9 II miR a TGC CGC ACC TTG ATC GAC AAG GAC TGC TGC ZmBx9 TGC TAC AGC C 6Bx9 III miR*s CTC CGC AGC TTC ATC GAC AAG GAT TCC TGC ZmBx9 TGC TAG GCT G 6Bx9 IV miR*a AAT CCT TGT CGA TGA AGC TGC GGA GAG AGG ZmBx9 CAA AAG TGA A 20Bx9 I miR s AGT AGG AAG ACA AGT CGA GCA CGC AGG AGA ZmBx9 TTC AGT TTG A 20Bx9II miR a TGC GTG CTC GAC TTG TCT TCC TAC TGC TGC ZmBx9 TGC TAC AGC C 20Bx9III miR*s CTC GTG CAC GAG TTG TCT TCC TAT TCC TGC ZmBx9 TGC TAG GCT G 20Bx9IV miR*a AAT AGG AAG ACA ACT CGT GCA CGA GAG AGG ZmBx9 CAA AAG TGA A G 4368 CTG CAA GGC GAT TAA GTT GGG TAA C ZmBx8/ZmBx9 G 4369 GCG GAT AAC AAT TTC ACA CAG GAA ACA G ZmBx8/ZmBx9 G 11491 TCG GAT CCC AGC AGC AGC CAC AGC AAA ZmBx8/ZmBx9 Material und Methoden 21
Tabelle 6: Primer für die Amplifikation des Bar Gens.
Name Sequenz Gen
BarTransf2 ACG GAC GAC CTC GTC CGT CT Bar BarTransr2 AGA TCT CGG TGA CGG GCA GGA Bar
Tabelle 7: PCR Primer für die Isolierung von fehlenden 5´ und 3´ cDNA Enden.
Name Sequenz Gen/Vektor
530Contig40372 CAA TGG AGA AGG TAC GAG CAG CoGt 560Contig40372 CAG ATG AGA TCC TTA AGG GAA CoGt 905Contig40372 TAC CAT TTC TGT GGT CAC TCA AGG A CoGt LamAnthfwd1 CCA ATC GCA GAC GAC AAA TC LgGt LamAnthfwd2 CTT TCT GTG GTC GCT GAA AG LgGt LamAnthrev1 TAG GTC TGG TTT GCT TTC CC LgGt LamAnthfwd2 ATC GAA GGT CCG ATG TTG AG LgGt LamGTKand11rev1 CCT TCA CAT ACG GTC TTT GC pLgBx8 LamGTKand11rev2 ATC CCA CTT CCA TCA CCA TC pLgBx8 LamGTKand11rev1a CCT TCA ATC TCA TTG CAT TTG C pLgBx8 LgGTK11rev3 TCT CCT CCG GAT TGG AAG AA pLgBx8 LgGTK11rev4 CTT TCA ACG ATT CAG GCA T pLgBx8 LgGTK11rev5 CTT CAA CTT CTT AAA GGG AT pLgBx8 477Contig39263fwd GAT GAA CTC GTG TCA AAA GGT CoGlu2 516Contig39263fwd CTG TTT CAT TGG GAT GTA CCT CoGlu2 320Contig39263fwd GTA TCA GGG TGA TCA AAA TGG CoGlu2 361Contig39263fwd GTT TGG ATG GTG CCT TTC TCT G CoGlu2 T3 lang Primer CGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG pBluescript SK SK Primer CGC TCT AGA ACT AGT GGA TCC C pBluescript SK Adaptor Primer CAG GAA TTC GGC ACG AGG ZAP cDNA® T3 AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG pBluescript SK M13rev GGA AAC AGC TAT GAC CAT GA pBluescript SK T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG pBluescript SK M1320 GTA AAA CGA CGG CCA GTG pBluescript SK
Tabelle 8: Primer zur Sequenzierung.
Name Sequenz Gen/Vektor
T3 AAT TAA CCC TCA CTA AAG GG pBluescript KS M13rev GGA AAC AGC TAT GAC CAT GA pBluescript KS T7 TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG pBluescript KS M1320 GTA AAA CGA CGG CCA GTG pBluescript KS 44993seq GAT AGA GCT TCA GGG ATA GTT CoBx8 LgGTK11fwd2 AGT GGC AGG CCC AGC TCA A pLgBx8 LgGTK11rev7 CTC ATC TTT ATC CCA AGC TGG T pLgBx8 LgGTK11fwd3 TCG ATT CTG GAA GGT TTG AGT A pLgBx8 LgGTK11rev8 GAC CAT TTG TAC TAT GTT ATC C pLgBx8 LgGTK11rev9 AGC GTC ACC TTA AGG CCG T pLgBx8 Material und Methoden 22
Tabelle 9: Primer für die quantitative RT PCR.
Name Sequenz Gen
GAPDHdicotfwd ATC AAG ATC GCA ATC AAC GG CoGAPDH GAPDHdicotfwd GCA CTT TTC CAA CAG CCT TG CoGAPDH rev44993 CCC ACT TGT TAC AGA TAT AGA A CoBx8 44993seq GAT AGA GCT TCA GGG ATA GTT CoBx8 GT2_qua2f TCG TCA CGG CGC TCA ACG CCG C ZmBx8 GT2_Lc1r GAC TGC GTC GTC CTT GCG CTC ZmBx8 GT1LC1RUTA GGA TCC TCC TTG CGC TCC TCT TTC ZmBx9 BX9A TCG TCA CCA CGC TGA ACG CCA G ZmBx9 GAPCR TAG CCC CAC TCG TTG TCG TAC CA ZmGAPDH GAPCF GCT AGC TGC ACC ACA AAC TGC CT ZmGAPDH CoGludaseQuF ATG GAG ATG TAG CGA ATG ATC A CoGlu1 CoGludaseQuRev GGC AAG AAT TTG GTG GTG AGT A CoGlu1
Tabelle 10: ( Mismatch )Primer für die Klonierung in die Expressionsvektoren pET28a, pET3a und pICH31070. Die jeweiligen Schnittstellen sind unterstrichen.
Name Sequenz Gen (Vektor)
44993seqfwd GAG AGA CAT ATG GCA TCT TCA TCT CCC AAA CoBx8 (pET28a) ACA CCT CAT ATA G 44993seqrev GGA CCA AGT TCT TCG GAG ACC CoBx8 (pET28a) 905Contig40372 TAC CAT TTC TGT GGT CAC TCA AGG A CoGt (pET28a) 40372NdeIStart GAG AGA CAT ATG GGG CAG AGC AAG AGC GAG CoGt (pET28a) AGC GAG GCA 1105Contig40372 GTA CAC TAT CGG CAC AGC ACC CA CoGt (pET28a) 40372BamHIStop GAG AGA GGA TCC TTA GTT GCG AGC GGT TAC CoGt (pET28a) TAT CTT AnthANdeIfwd GAG AGA CAT ATG GTG TTT GAG TCT CA LgGt (pET28a) AnthArev GAG TGC CTG TAG TAT TTC ATG LgGt (pET28a) AnthBfwd TCT GCT TCC TGC TCT CTC TC LgGt (pET28a) AnthBBamHIrev CTT AAG GAT CC T AAA GCA GCT CAA LgGt (pET28a) LgGTK11NdeIStart GAG ACA TAT G GA GGC AAA AAA TGG CAG AAA pLgBx8 (pET28a) AGC LgGTK11BamHIStop1 GAG AGG ATC C TC ATT TTC TAA GAT AAT CAA pLgBx8 (pET28a) TGA ATC TC LgGTK11rev6 GGT CTC ACA ACC CAC AGA A pLgBx8 (pET28a) LgGTK11fwd1 CCG TTG TCT CTC AGC AAC A pLgBx8 (pET28a) LgGTK11BsaIStart GAG AGG TCT C GA GGT ATG GAG GCA AAA AAT pLgBx8 (pICH31070) GGC AGA AAA G LgGTK11rev4 CTT TCA ACG ATT CAG GCA T pLgBx8 (pICH31070) LgGTK11BsaIStop GAG AGG TCT C GA AGC TCA TTT TCT AAG ATA pLgBx8 (pICH31070) ATC AAT GAA TCT LgGTK11fwd1 CCG TTG TCT CTC AGC AAC A pLgBx8 (pICH31070) LgGTK11BamHIStop2 GAG AGG ATC CTC ATT TTC TAA GAT AAT CAA pLgBx8 (pET3a) TGA ATC TC LgGTK11fwd1 CCG TTG TCT CTC AGC AAC A pLgBx8 (pET3a) Gludase 1 Bsa FWD GGT CTC GAG GTA TGG GTG TCC CAT TTC AT CoGlu1 (pICH31070) Gludase 1 Bsa REV GGT CTC GAA GCT TAG TGT AAG AGA AAC TTC CoGlu1 (pICH31070) TTG AA Gludase 2 Bsa FWD GGT CTC GAG GTA TGA GTG TTG TGA AGA TAG CoGlu2 (pICH31070) TTC A Gludase 2 Bsa REV GGT CTC GAA GCT TCA TCA CTG AAC GAG GAA CoGlu2 (pICH31070) CT Material und Methoden 23
2.1.6 Pflanzenmaterial und Anzucht
C. orientalis Saatgut wurde von PD Dr. Margot Schultz freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Die Samen wurden auf einem 2:1 Gemisch aus Erde (Einheitserde, TypT) und Quarzsand ausgestreut und mit Erde bedeckt. Zur Keimung wurden die Samen zunächst für 3 4 Tage einer Vernalisation bei 4 °C ausgesetzt, woraufhin die Samen für 3 4 Tage in Pflanzenkammern (Heraeus Vötsch, 19 °C, 40% relativer Luftfeuchtigkeit, Tag: 12 h Licht, Nacht: 12 h Dunkelheit) kultiviert wurden. Nach einer erneuten Vernalisation verblieben die Samen in der Pflanzenkammer.
L. galeobdolon wurde vom Staudengarten Weihenstephan, Freising zur Verfügung gestellt. Zur Vermehrung wurden abgeschnittene Triebe in Rhizopon getaucht und ca. eine Woche zur Wurzelbildung in Quarzsand gestellt. Die Pflanzen wurden in Heraeus Vötsch Pflanzenkammern 16 h bei Licht (22 °C) und 8 h bei Dunkelheit (18 °C) gezogen. Nach der Wurzelbildung wurden die Pflanzen auf ein 2:1 Gemisch aus Erde (Einheitserde, TypT) und Quarzsand umgesetzt.
Es wurde A. thaliana des Ökotyps Columbia verwendet. Samen wurden entweder auf Erde oder zur Selektion BASTA resistenter Pflanzen auf ½ MS Platten (2,2 g/l MS Medium, 20 g/l Saccharose, 9 g/l Agar, pH 5,8) mit dem Herbizid Phospinotrizin (D+L, 25 g/ l) ausgestreut. Die Samen wurden für zwei Tage einer Vernalisation bei 4 °C im Dunkeln ausgesetzt und in der Pflanzenkammer (Heraeus Vötsch, 19 °C, Tag: 12 h Licht, Nacht: 12 h Dunkelheit) bis zum Alter von 10 14 Tagen angezogen. Die Pflanzen wurden vereinzelt bzw. auf Erde umgesetzt und bis zur Reife der Samen in der Pflanzenkammer belassen.
Samen von N. benthamiana wurden vom Lehrstuhl für Genetik der Ludwig Maximilian Universität in München zur Verfügung gestellt. Die Samen wurden auf einem 3:2 Gemisch aus Erde (Einheitserde TypT) und Quarzsand ausgestreut und in Heraeus Vötsch Pflanzenkammern 16 h bei Licht (22 °C) und 8 h bei Dunkelheit (18 °C) angezogen. 7 14 Tage alte Keimlinge wurden vereinzelt, in ein 3:2 Gemisch aus Erde (ED73) und Quarzsand umgetopft und in Heraeus Vötsch Pflanzenkammern bei 19 °C und 12 h Licht und 12 h Dunkelheit angezogen. Für die Infiltration wurden 5 6 Wochen alte Pflanzen verwendet. Material und Methoden 24
2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.1 DNA Isolierung
Plasmid DNA aus E. coli wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Birnboim und Doly, 1979) präpariert. Plasmid DNA aus A. tumefaciens wurde ebenfalls mittels alkalischer Lyse (Plant Transformation Workshop, 2003) isoliert. Die Isolierung genomischer DNA aus L. galeobdolon wurde nach Dellaporta et al ., 1983 durchgeführt.
2.2.2 RNA Isolierung und cDNA Synthese
Gesamt RNA wurde mit dem NucleoSpin®RNA Plant Kit (Machery Nagel, Düren) nach Angaben des Herstellers aus ca. 100 mg Pflanzenmaterial isoliert. Alle Lösungen wurden mit DEPC Wasser angesetzt. cDNA wurde aus ca. 500 ng Gesamt RNA mit dem TaqMan Kit (Roche, Schweiz) nach Angaben des Herstellers synthetisiert.
2.2.3 Analyse der RNA durch Formaldehyd Agarosegel Elektrophorese
Zur Analyse der RNA Qualität wurde die RNA Lösung (ca. 500 ng) mit 4 Vol. RNA Proben puffer (60% deionisiertes Formamid, 8% Formaldehyd, 0,03% Bromphenolblau in 1,2x Northern Puffer) versetzt und 15 min bei 68 °C denaturiert. Anschließend wurde der Ansatz sofort auf Eis gestellt und die Probe auf ein Formaldehyd Agarose Gel aufgetragen (1,2% Agarose in 7% Formaldehyd und 1x Northern Puffer). Die Elektrophorese erfolgte in 1x Northern Puffer (20 mM MOPS, 5 mM Natrium Acetat, 2 mM EDTA, pH7) bei ca. 65 V. Das Formaldehyd Gel wurde für 10 min mit 0,1% Toluidinblau gefärbt und mit 10% Ethanol entfärbt. Die RNA wurde als intakt bewertet, wenn die 18S und die 28S ribosomale RNA Bande klar sichtbar waren und die 28S RNA Bande eine höhere Intensität aufwies.
2.2.4 Allgemeine DNA Klonierungstechniken
Allgemeine Klonierungstechniken, wie Agarosegelelektrophorese, die Modifikation von DNA mit Restriktionsendonukleasen, T4 DNA Polymerase, alkalischer Phosphatase und T4 DNA Ligase, sowie die Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen und die Hitzeschock transformation von E. coli wurden nach Standardprotokollen (Sambrook et al ., 1989) oder nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Material und Methoden 25
2.2.5 Design und Klonierung von amiRNA Konstrukten amiRNA Sequenzen für ZmBx8 und ZmBx9 wurden mit Hilfe der WMD3 Platform (Web MicroRNA Designer ; http://wmd3.weigelworld.org) basierend auf der Z. mays EST Zm Gl 18.0 (GeneIndex) Datenbank designt. Es wurden jeweils 2 amiRNA Sequenzen ausgewählt, welche an je unterschiedlichen Positionen des Zielgens spezifisch binden. Die amiRNA Konstrukte wurden entsprechend den Angaben in den O. sativa precursor pNW55 osaMIR528 kloniert. Die verschiedenen amiRNA Konstrukte wurden anschließend vor den Nos Terminator und hinter den Ubiquitin Promotor kloniert, indem das C2Intron des pUbicasC2Intron/ Sal Vektors durch die verschiedenen pNW55 osaMIR528 precursor ersetzt wurde. Die so erzeugten Promotor amiRNA Precursor Terminator Kassetten wurde in den A. tumefaciens Transformationsvektor TF 101.1 kloniert.
2.2.6 PCR Verfahren
Standard PCR
Für Standard PCR Reaktionen wurde die GoTaq Polymerase (Promega, USA) verwendet. Für die Amplifikation von Genfragmenten für die Proteinexpression wurde die ProofStart Polymerase (Qiagen, Hilden) genutzt. Restriktionsschnittstellen wurden durch Mismatch Primer eingeführt (Tabelle 10). Es wurde der Thermoblock UNO (Biometra, Göttingen) verwendet.
Quantitative RT PCR
Die quantitative Bestimmung von Transkriptmengen wurde am Light Cycler®480 (Roche) durchgeführt. Zur Normierung wurde parallel die Transkriptmenge des house-keeping Gens Glycerinaldehyd 3 phosphat Dehydrogenase (GAPDH) bestimmt. Für CoBx8, CoGlu1 und CoGAPDH wurde der Light Cycler®480 SYBR Green I Mastermix (Roche) und für ZmBx8, ZmBx9 und ZmGAPDH wurde der Mesa Green qPCR TM Mastermix Plus (Eurogentech) verwendet. Die Spezifität der PCR wurde durch eine Schmelzkurvenanalyse und durch Agarosegelelektrophorese bestätigt. Die PCR Bedingungen für die durchgeführten quantitativen PCR Reaktionen sind in Tabelle 11 aufgezeigt, die Primer in Tabelle 9. Material und Methoden 26
Tabelle 11: Bedingungen der quantitativen RT PCR. *: die MgCl 2 Konzentration des Light Cycler®480 SYBR Green I Mastermix (Roche) ist nicht angegeben, für die RT PCRs wurde kein zusätzliches
MgCl 2 eingesetzt.
Gen MgCl 2 Annealingtemperatur DMSO [%] Extensionszeit [s] Messung bei [mM] [°C] [°C]
CoGAPDH * 50 26 82 CoBx8 * 58 12 72 CoGlu1 * 63 23 72 ZmGAPDH 4 65 27 72 ZmBx8 4 63 5 17 72 ZmBx9 4 68 30 72
2.2.7 Verfahren zur Isolierung von 5´ und 3´ cDNA Enden
5´ RACE
5´ cDNA Enden wurden durch das 5´ RACE Verfahren mit dem 5´/3´ RACE Kit, 2nd Generation, (Roche) nach Angaben des Herstellers isoliert.
Nested PCR
5´ und 3 ´ cDNA Enden wurden weiterhin aus Phagenbanken (ZAP cDNA) mittels einem Nested PCR Ansatz isoliert. Die cDNA Sequenzen sind in diesen Banken über einen Adaptor in den pBluescript SK Vektor kloniert. Es wurden in den verschiedenen Ansätzen (Tabelle 12) 2 3 Nested PCRs mit jeweils einem genspezifischen Primer und einem Vektor oder adaptorspezifischen Primer durchgeführt.
Tabelle 12: Vektor bzw. Adaptor spezifische Primer für die Nested PCR Reaktionen.
Verlängerungsrichtung Vektor bzw. Adaptor spezifischen Primer
3´ Richtung M13 20 (PCR1) und T7 (PCR2) 5´ Richtung M13 rev (PCR1) und T3 (PCR2) oder: T3 lang Primer (PCR1), SK Primer (PCR2) und Adaptor Primer (PCR3)
AIMS
Zur Verlängerung von fehlenden 3 ´ cDNA Enden wurde darüber hinaus eine modifizierte Form der AIMS Methode ( Amplification of insertion mutagenised sites ; Frey et al ., 1998) durchgeführt. 1 g genomische DNA wurde mit dem Restriktionsenzym BfaI geschnitten. Nach Adaptorligation (5 ´ gaccacgcgtatcgatgtcgacgagatgagtcctgag 3´; 5´ tactcaggatccactcat Material und Methoden 27
3´) wurden eine PCR und Nested PCR Reaktion mit Adaptor (5 ´ gaccacgcgtatcgatgtcgac 3´; 5´ gaccacgcgtatcgatgtcgacgag 3´) und genspezifischen Primern durchgeführt.
2.2.8 Isolierung von UDPG:Glycosyltransferase Kandidatenteilsequenzen aus L. galeobdolon
UDPG:Glycosyltransferase Kandidatenteilsequenzen aus L. galeobdolon wurden in zwei verschiedenen Verfahren isoliert:
In einem ersten Verfahren wurde eine Nested PCR auf einer L. galeobdolon ZAP cDNA Phagenbank durchgeführt. Als spezifischer Primer für UDPG Glycosyltransferase wurden degenerierte Primer für das Aminosäuremotiv HCGWNS des konservierten PSPG Motivs verwendet. Diese wurden kombiniert mit den vektorspezifischen Primern M13 rev (PCR1) und T3 (PCR2; 5´ Teilsequenz) bzw. M13 20 (PCR1) und T7 (PCR2; 3´ Teilsequenz). Die erhaltenen PCR Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Bei der Isolierung von Glycosyltransferasen Teilsequenzen in 3´ Richtung des konservierten Motivs war bei den sequenzierten Kandidatensequenzen ein Kandidat (Kandidat 1) stark überrepräsentiert. Diese Kandidatenteilsequenz enthält eine DdeI Restriktionsschnittstelle. Um diese Teilsequenz in weiteren Analysen auszuschließen wurden die PCR Fragmente mit DdeI geschnitten. Die Kandidat 1 Sequenz kann danach nicht in den Vektor ligiert werden.
In dem zweiten eingesetzten Verfahren wurde aus L. galeobdolon RNA Oligo d(T) Anchor (5´/3´ RACE Kit, 2nd Generation, Roche) geprimte cDNA hergestellt. Diese wurde verwendet, um in einer Nested PCR UDPG:Glycosyltransferase Kandidatenteilsequenzen aus L. galeobdolon zu isolieren. Dazu wurden degenerierte Primer für das Aminosäuremotiv HCGWNS des konservierten PSPG Motivs, sowie der PCR Anchor Primer eingesetzt.
2.2.9 DNA Sequenzierung
DNA Sequenzierungen wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg) im Auftrag durchgeführt. Plasmid DNA wurde zuvor durch Fällung mit Polyethylenglykol (PEG, Sambrook et al ., 1989) gereinigt. PCR Produkte wurden mit dem GFXTM DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare) aufgereinigt.
2.2.10 Sequenzierung des C. orientalis Transkriptoms
Für die Sequenzierung des C. orientalis Transkriptoms wurde zunächst Gesamt RNA aus dem oberirdischen Teil von 7 10 Tage alten C. orientalis Keimlingen isoliert. Die Präparation Material und Methoden 28 von zufallsgeprimter und normalisierter cDNA Synthese wurde von der Vertis Biotechnologie AG (Freising) durchgeführt: Die Erststrangsynthese erfolgte mit einem N6 Zufallsprimer und die Zweitstrangsynthese wurde nach Gubler und Hoffman (1983) synthetisiert. An die doppelsträngige cDNA wurden schließlich Adaptoren für die 454 Sequenzierung ligiert. Für die Normalisierung der cDNA wurde diese einem Denaturierungs und Rehybridisierungs zyklus unterzogen. Die hybridisierte doppelsträngige cDNA wurde über eine Hydroxyapatit Chromatographie abgetrennt. Die einzelsträngigen cDNAs wurden amplifiziert und cDNAs zwischen 30 600 bp wurden präparativ gereinigt. Die so generierten cDNAs wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg) mit einem 454 GS FLX Sequencer mit einem adaptorspezifischen Primer sequenziert.
2.2.11 Screening von cDNA Bibliotheken durch Phagenhybridisierung
Die vollständige cDNA Sequenz von CoBx8 und LgGt wurde durch das Screening von cDNA Bibliotheken durch Phagenhybridisierung isoliert. Die Analyse der cDNA Bibliotheken von C. orientalis und L. galeobdolon wurde nach den Vorschriften von Sambrook et al . (1989) durchgeführt. Als Sonden für CoBx8 und LgGt wurden PCR Produkte (Tabelle 3) eingesetzt, die in einer Klenow Reaktion mit 32 P α dCTP, (BioTrend) radioaktiv markiert wurden. Die Auswertung erfolgte am Phospho-Imager (Molecular Dynamics Storm 860 Phosphoimager, GE Healthcare) mittels ImageQuant TM (Molecular Dynamics, Krefeld).
Isolierung von DNA aus Bakteriophagen
Die Bakterienzellen in den Phagenkulturen (5 ml) wurden durch Zugabe von 500 l Chloroform lysiert. Bakterienzellbruchstücke von 1,5 ml Phagenkultur wurden durch Zentrifugation bei 17500 g entfernt. 1 ml des Überstands wurde mit DNAse I und RNAse A (je 10 g/ l; 30 min 37 °C) behandelt. Es wurden 25 mM EDTA, pH 8 und 20 g/ l Proteinase K zugegeben und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Der Ansatz wurde mit Phenol/Chloroform ausgeschüttelt. Die Bakteriophagen DNA wurde gefällt und in TE (10 mM Tris/HCl, 0,5 mM EDTA, pH 8) aufgenommen.
Southern Transfer (Southern, 1975)
Restriktionsensverdaute DNA wurde auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend über Nacht auf eine positiv geladene Nylonmembran (Biodyne B Transfer Membran, Pall) transferiert (Sambrook et al ., 1989). Material und Methoden 29
In vivo-Excision von Plasmid DNA pBluescript SK Phagemide mit den cDNA Fragmenten wurden aus den Phagen entsprechend dem Protokoll des Herstellers isoliert (ZAP cDNA®Synthesekit, Stratagene).
2.3 Proteinbiochemische Methoden
2.3.1 Reinigung von Co BX8 und Lg BX8 aus C. orientalis bzw. L. galeobdolon
Co BX8 und Lg BX8 wurden aus Proteinrohextrakten durch eine Ammoniumsulfatfällung und vier aufeinanderfolgende Säulenchromatographien gereinigt.
Herstellung eines Proteinrohextrakts aus C. orientalis bzw. L. galeobdolon
Zur Herstellung eines Proteinrohextrakts aus C. orientalis bzw. L. galeobdolon wurde das jeweilige Pflanzenmaterial ( C. orientalis : oberirdischer Teil von 7 10 Tagen alten Keimlingen bzw. L. galeobdolon : junge Blätter) auf Eis geerntet und mit Seesand, Extraktionspuffer (50 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, pH 7,5) und 0,3 g Polyclar pro g Pflanzenmaterial in einer gekühlten Reibeschale fein zermörsert. Die Suspension wurde 30 min bei 30000 g und 4 °C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 1 mM Phenyl methansulfonylfluoride (PMSF) versetzt und für die Ammoniumsulfatfällung eingesetzt.
Fraktionierte Ammoniumsulfatfällung
Das Proteinrohextrakt wurde durch langsames Zugeben von fein gemörsertem Ammoniumsulfat auf 45%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat gebracht. Nach 1 h Rühren bei 4 °C erfolgte eine Zentrifugation bei 4 °C und 30000 g für 30 min. Der Überstand wurde auf 65%ige Sättigung mit Ammoniumsulfat gebracht und die Lösung wurde erneut 1 h bei 4 °C gerührt und bei 4 °C und 30000 g für 30 min zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde in Reinigungspuffer (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, pH 7,5) resuspendiert.
Chromatographische Aufreinigung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase aus C. orientalis bzw. L. galeobdolon
Die weiteren Reinigungsschritte beruhten auf chromatographischen Techniken, die an einer FPLC ( Fast protein liquid chromatography ; Äkta Explorer 10S, GE Healthcare) durchgeführt wurden. Die Auswertung erfolgte mit der Software Unicorn 4.12. Der Verlauf der Material und Methoden 30
Chromatographie wurde anhand der UV Absorption bei 280 nm und der Leitfähigkeit verfolgt. Die Fraktionen wurden auf ihre UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität getestet (siehe 2.6.1) und die Proteinzusammensetzung wurde mittels denaturierender Gelelektrophorese festgestellt (siehe 2.3.3). Soweit nicht anders angegeben wurden die Chromatographien bei 4 °C durchgeführt. Proteinlösungen wurden mit Ultrafiltrationssäulen (Vivaspin, Vivascience) konzentriert und mit NAP Säulen (GE Healthcare) nach Angaben des Herstellers umgepuffert.
Die Fraktion mit 45 65%iger Ammoniumsulfatsättigung wurde für die Hydrophobe Interaktionschromatographie in Puffer A (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20%
Glycerin, 1 M (NH 4)2SO 4, pH 7,5) überführt und auf zwei gekoppelte, mit Puffer A äquilibirierte, HiTrap™ Butyl FF Säulen (2,5 cm x 1,6 cm, 5 ml, GE Healthcare) aufgetragen. Die Säulen wurden mit 8 Säulenvolumen Puffer A gewaschen (0,5 ml/min). Die Elution erfolgte mit Reinigungspuffer mit einem linearen Gradienten von 25 Säulenvolumen (0,5 ml/min). Fraktionen mit hoher UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität wurden vereinigt, konzentriert und in Puffer B (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, 0,1 M KCl, pH 7,5) überführt.
Die Gelfiltration wurde bei 20 °C mit Puffer B bei einer Flussrate von 0,5 ml/min durchgeführt. Die Proteinprobe wurde auf die mit zwei Säulenvolumen äquilibrierte Säule (HiLoad™ 16/60 Superdex™ 200 prep grade, 60 cm x 1,6 cm, 120 ml, GE Healthcare) aufgetragen, und mit einem Säulenvolumen eluiert. Fraktionen mit hohen UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivitäten wurden vereinigt, konzentriert und in Puffer C (50 mM MES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, pH 6,0) umgepuffert.
Die Proteinprobe wurde für die Affinitätschromatographie auf die mit Puffer C äquilibrierte HiTrap™ Blue HP Säule (2,5 cm x 0,7 cm, 1 ml, GE Healthcare, 0,3 ml/min) aufgetragen. Die Säule wurde mit 6 Säulenvolumen Puffer C gewaschen und gebundene Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 15 Säulenvolumen Puffer D (50 mM MES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, 1 M KCl, pH 6,0) eluiert. Die Fraktionen wurden unmittelbar nach der Chromatographie mit 2 M HEPES, pH 8,0 neutralisiert. Der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivitäts Peak wurde konzentriert und in Reinigungspuffer übergeführt.
Die weitere Reinigung verlief über eine Anionenaustauscherchromatographie, die mit der in Reinigungspuffer äquilibrierten Chromatographiesäule Mono Q, (5,0 cm x 0,5 cm, 1 ml, GE Healthcare) durchgeführt wurde. Nach Waschen der Säule mit 12 Säulenvolumen Reinigungspuffer erfolgte die Elution mit Puffer E (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, 1 M KCl, pH 7,5) über einen zweistufigen Gradienten (1.Stufe: 45% Puffer E in 26 Säulenvolumen, 2.Stufe: 100% Puffer E in 5 Säulenvolumen) bei einer Material und Methoden 31
Flussrate von 0,5 ml/min. Fraktionen mit UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität wurden mittels SDS PAGE auf ihre Proteinzusammensetzung untersucht. Fraktionen, die die gereinigte UDPG:DIBOA Glucosyltransferase enthielten, wurden vereinigt, in Aufbe wahrungspuffer (20 mM HEPES, 10 mM BME, pH 7,5) umgepuffert und konzentriert. Die Proteinlösung wurde entweder direkt für die Sequenzierung durch Massenspektroskopie (MS) eingesetzt oder die Proteinlösung wurde mit 1D SDS PAGE aufgetrennt und die ausgeschnittene Glucosyltransferase Bande sequenziert (Prof. Küster bzw. Dr. Haslbeck).
2.3.2 Proteinfällung
Proteine wurden mit Trichloressigsäure (TCA) gefällt. Ein Vol. TCA wurden mit 9 Vol. der Proteinprobe gemischt und über Nacht auf Eis inkubiert. Die Lösung wurde bei 4 °C und 17500 g für 30 min zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde zweimal mit eiskaltem Aceton gewaschen, getrocknet, und in 1x Lämmli Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 6.8, 5% BME, 2% (w/v) SDS, 0,001% (w/v) Bromphenolblau, 10% (w/v) Glycerin) resuspendiert.
2.3.3 SDS Polyacrylamid Elektrophorese (SDS PAGE)
Zur Auftrennung denaturierter Proteine nach ihrem Molekulargewicht wurde eine Tris Glycin SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese (Lämmli, 1970) durchgeführt. Die Proteine wurden mit Coomassieblau (1 g/l Coomassie Brilliant Blue R 250, 50% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Eisessig) gefärbt und mit Entfärbelösung (10% (v/v) Essigsäure, 30% (v/v) Methanol) entfärbt. Für eine sensitivere Färbung wurde die Bio Safe TM Coomassie G 250 Färbelösung (Bio Rad) nach Angaben des Herstellers eingesetzt.
2.3.4 Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde der Bio Rad® Protein Assay nach Bradford (1976) angewandt.
2.3.5 Heterologe Proteinexpression in E. coli und Reinigung über Nickel Affinitätschromatographie
Die Proteine Co BX8, Lg GT und Co GT wurden in E. coli heterolog exprimiert: Die amplifizierten cDNAs wurden zunächst blunt-end in pBluescript KS+ subkloniert und sequenziert. Die cDNAs wurden anschließend in frame mit der aminoterminalen 6xHisTag in den Expressionsvektor pET28a (Novagen) umkloniert. Ausgehend von einer Einzelkolonie Material und Methoden 32 wurden die Bakterien in Terrific Broth (TB) Medium (Tartoff und Hobbs, 1987) mit 1%
Glucose und 50 g/ml Kanamycin bis zu einer OD 600nm von 0,3 0,5 angezogen, auf Eis abgekühlt und die Expression mit 1 mM Isopropyl β D thiogalactopyranosid (IPTG) für 2 3 Tage bei 18 °C induziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3900 g, 4 °C, 20 min) geerntet und das Zellpellet bei 70 °C eingefroren.
Das Zellpellet wurde auf Eis aufgetaut und in 3 ml Lysepuffer (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 10 mM BME, pH 8,0) pro g Zellpellet resuspendiert. Es wurden 1 mg/ml Lysozym zu den Zellen gegeben und die Zellen für 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung (5 min, 10 s Puls, 20 s Pause, Amplitude 60%) aufgebrochen. Das Lysat wurde mit 10 g/ml RNAse und 10 g/ml DNAse versetzt und für 15 min auf Eis inkubiert. Das Lysat wurde zur Abtrennung unlöslicher Bestandteile für 10 min bei 10000 g und 4 °C für 10 min zentrifugiert.
Zu dem Bakterien Rohextrakt wurde die 50%ige Ni Agarose Suspension (Qiagen) im Verhältnis 1:4 zugegeben. Die Suspension wurde 1 h bei 4 °C geschüttelt und in eine Säule gepackt. Die Säule wurde mit Waschpuffer (50 mM NaH2PO 4, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 mM BME, pH 8,0) gewaschen und die His Tag Proteine wurden mit
Elutionspuffer (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 150 mM Imidazol, 10 mM BME, pH 8,0) eluiert. Die Reinheit der Elutionsfraktionen wurde mittels SDS PAGE (siehe 2.3.3) analysiert und ihre Proteinkonzentration (siehe 2.3.4) bestimmt. Fraktionen mit dem höchster Reinheit und Gehalt wurden vereinigt und mit NAP Säulen (GE Healthcare) in Reinigungspuffer (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 20% Glycerin, pH 7,5) umgepuffert. Die Proteinlösung wurde anschließend in Aliquots bei 70 °C gelagert.
2.4 Isolierung von Naturstoffen
2.4.1 Isolierung von DIBOA aus L. galeobdolon bzw. DIMBOA aus Z. mays
Für die Gewinnung von DIBOA bzw. DIMBOA wurde das jeweilige Pflanzenmaterial (junge Blätter von L. galeobdolon bzw. 4 Tage alte etiolierte Z. mays Sprossen) mit destilliertem Wasser (ca. 10x Frischgewicht) im Polytron PT 3000 (Kinematic AG) zerkleinert und 1 h bei RT inkubiert. Die Suspension wurde über einen Faltenfilter filtriert und mit 1 M HCl auf einen pH Wert von 2 3 angesäuert. Die Suspension wurde dreimal mit Ethylacetat extrahiert und die vereinigten organischen Phasen erneut über einen Faltenfilter filtriert. Die organische Phase wurde durch Zugabe von Natriumsulfat getrocknet und im Rotationsverdampfer vollständig eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und über Material und Methoden 33 präparative HPLC aufgereinigt. Die Quantifizierung von DIBOA und DIMBOA erfolgte 1 1 photometrisch nach Bailey und Larson (1989) (ε 254 (DIMBOA)= 8500 cm M , ε 262 (DIBOA)= 10000 cm 1 M 1).
2.4.2 Isolierung von GDIBOA aus L. galeobdolon
GDIBOA wurde aus jungen L. galeobdolon Blättern extrahiert. Dazu wurde das Pflanzenmaterial mit flüssigem Stickstoff gefroren, grob zerkleinert und in destilliertem Wasser (ca. 10 fach Frischgewicht) aufgekocht. Das Pflanzenmaterial wurde anschließend im Polytron PT 3000 (Kinematic AG) zerkleinert und bei 10000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde über einen Faltenfilter filtriert und dreimal mit n Butanol ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde erneut filtriert und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und über präparative HPLC gereinigt. Die Quantifizierung des gereinigten GDIBOAs wurde mit Hilfe des DIBOA Extinktionskoeffizienten (ε 262 (DIBOA)= 10000 cm 1 M 1, Bailey und Larson (1989)) durchgeführt.
2.4.3 Isolierung von GDIMBOA aus Z. mays
GDIMBOA wurde aus 4 Tage alten etiolierten Z. mays Sprossen isoliert. Das Pflanzenmaterial wurde mit flüssigem Stickstoff gemörsert und in Aceton suspendiert. Die Suspension wurde zweimal bei 26000 g für 20 min zentrifugiert und der Überstand einrotiert bis eine gelbe Suspension in Wasser zurückgeblieben war. Diese wurde mit Wasser verdünnt und mit 1 M HCl auf einen pH Wert von 3 angesäuert. Es folgte eine dreimalige Extraktion mit 1 Vol. Ethylacetat. Die Phasentrennung wurde jeweils durch eine 5 minütige Zentrifugation bei 12000 g erreicht. Die wässrige Phase wurde eingedampft, der Rückstand in Methanol resuspendiert und präparativ über HPLC aufgereinigt. Gereinigtes GDIMBOA 1 1 wurde über den Extinktionskoeffizienten von DIMBOA (ε 262 (DIMBOA)= 8500 cm M , Bailey und Larson (1989)) quantifiziert.
2.5 Analyse von Naturstoffen
2.5.1 Hoch Durchsatz Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
Für HPLC Trennungen wurde die HPLC Ultimate 3000 (Dionex), mit dem Diodendetektor PDA 100 (Dionex), und der Bedienungs und Auswertungssoftware Chromeleon verwendet. Die Trennungen wurden nach dem reversed phase Prinzip mit LiChrospher ® 100 RP 18 bzw. Material und Methoden 34
LiChrospher ® 100 RP 18e Säulen (analytisch: Ø = 5 m, Fluss = 1 ml/min, präparativ: Ø = 10 m, Fluss = 5 ml/min) durchgeführt.
Analytische Trennungen
Für die analytische Trennung enzymatischer Umsetzungen von DIBOA, DIMBOA, GDIBOA und GDIMBOA wurde ein 18 minütiger Gradient von 35 50% Methanol in 0,3%iger Ameisensäure gefahren (Tabelle 13).
Tabelle 13: Spektrum und Retentionszeiten der Benzoxazinoide DIBOA, DIMBOA und ihrer Glucoside bei einem 18 minütigen Gradienten von 35 50% Methanol in 0,3%iger Ameisensäure mit der LiChrospher ® 100 RP 18e Säule.
Maximum Schulter Retentionszeit Quantifizierung [nm] [nm] [min] [nm]
DIBOA 255 281 7,4 254 GDIBOA 255 280 6,3 254 DIMBOA 264 295 8,7 263 GDIMBOA 266 295 6,0 263
Für die Analyse der Substratspezifität von CoBX8 wurden die getesteten Benzoxazinoide DIBOA, DIMBOA, HBOA, HMBOA, BOA, BOA 6 OH und OH Indolinon und ihre Glucoside mittels einem 15 minütigen Gradient von 10 40% Acetonitril in 0,3%iger Ameisensäure analytisch aufgetrennt (Tabelle 14). Tabelle 14: Spektrum und Retentionszeiten der Benzoxazinoide DIBOA, DIMBOA, HBOA, HMBOA, BOA und BOA 6 OH und ihrer Glucoside bei einem 15 minütigen Gradienten von 10 40% Acetonitril in 0,3%iger Ameisensäure mit der LiChrospher ® 100 RP 18 Säule.
Maximum Schulter Retentionszeit Quantifizierung [nm] [nm] [min] [nm]
DIBOA 255 281 6,5 254 GDIBOA 255 280 4,7 254 DIMBOA 264 295 7,9 263 GDIMBOA 266 295 6,5 263 HBOA 251 278 6,6 254 GHBOA 252 280 3,8 254 HMBOA 261 290 7,8 263 GHMBOA 263 290 6,3 263 OH Indolinon 255 290 5,5 254 BOA 272 9,7 272 BOA 6 OH 289 3,1 280 Material und Methoden 35
Die Umsetzung von Zeatin Ribosid wurde mit einem 15 minütigen Gradienten von 10 65% Methanol in 0,3%iger Ameisensäure mit der RP 18e Säule analysiert. Zeatin Glucosid weist dann eine Retentionszeit von 8,6 min auf, das Aglucon Zeatin eluiert bei einer Retentionszeit von 6,0 min. Die Hydrolyse von trans Zeatin O Glucosid (tZOG) bzw. die Glucosylierung von Zeatin wurde mit einem 15 minütigen Gradienten von 10 45% Methanol in 0,3%iger Ameisensäure mit der RP 18e Säule verfolgt. Zeatin weist bei diesen Analysenbedingungen eine Retentionszeit von 7,8 min auf, tZOG von 6,5 min. Beide Substanzen weisen ein Maximum bei 274 nm auf und wurden bei einer Wellenlänge von 280 nm quantifiziert.
Für die Analyse der Glucosylierung von IAA wurde ein 25 minütiger Gradient von 0 55% Methanol gefahren (Lösungsmittel A = 0,3% Ameisensäure in Wasser, Lösungsmittel B = Methanol). IAA eluiert unter diesen Bedingungen mit einer Retentionszeit von 21 min. Die Detektion von IAA erfolgte bei 230 nm.
Präparative Trennungen
Bei der Isolierung der Benzoxazinoide DIBOA, DIMBOA, GDIBOA und GDIMBOA (siehe 2.4.1, 2.4.2 und 2.4.3) wurden die jeweiligen Substanzgemische (siehe 2.5.1) präparativ (RP 18e Säule) aufgetrennt. Als Lösungsmittel A wird 0,3%ige Ameisensäure eingesetzt. Nach den präparativen Trennungen (Tabelle 15) wurden, die das Produkt enthaltenen Fraktionen, vereinigt und einrotiert. Der Rückstand wurde in Methanol aufgenommen und über analytische HPLC quantifiziert.
Tabelle 15: HPLC Programme und Retentionszeiten für präparative Trennungen bei der Isolierung der Benzoxazinoide DIBOA, DIMBOA, GDIBOA und GDIMBOA.
Lösungs Gradient Retentionszeit mittel B von bis in [min] DIBOA Acetonitril 10% B 50% B 9 min 8,5 DIMBOA Acetonitril 10% B 50% B 9 min 4,0 GDIBOA Methanol 23% B 37% B 12 min 0,7 GDIMBOA Methanol 22% B 22,5% B 109 min 2,9 Material und Methoden 36
2.6 Enzymtests
2.6.1 Tests auf Glucosyltransferase Aktivität
Benzoxazinoid Enzymtests
Der Enzymaktivitätstest für die Reinigung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen aus C. orientalis und L. galeobdolon erfolgte in abgewandelter Form nach Bailey und Larson (1998): Zu den zu testenden Proteinen in 190 l Assaypuffer (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 1 mM UDPG, pH 8,2) wurden 10 l DIBOA bzw. DIMBOA (15 mM in Ethanol) gegeben. Der Ansatz wurde 30 min bei 37 °C inkubiert und die Reaktion durch Zugabe von 800 l Folchlösung (Chloroform:Methanol (2:1, v/v), 1% HCl) gestoppt. Der Reaktionsansatz wurde 5 min bei 17500 g zentrifugiert und 100 l der oberen Phase über HPLC analysiert. Die gebildete GDIBOA bzw. GDIMBOA Stoffmenge wurde über eine DIBOA bzw. DIMBOA Eichkurve ermittelt. Als Kontrolle wurde hitzeinaktiviertes Enzym (5 min, 100 °C) eingesetzt.
Für die Bestimmung der Enzymkinetik von Co BX8 wurde zunächst eine Kombination aus Enzymmenge und Inkubationsdauer bestimmt, bei dem der Umsatz des eingesetzten Substrats im linearen Bereich liegt: 1,5 g Co BX8 wurde mit den jeweiligen Substraten 4 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Akzeptor Substrats gestartet. UDPG wurde als Glucose Donor eingesetzt, und DIBOA oder DIMBOA als Akzeptor Substrate. Für die Bestimmung der Enzymkinetik für die Substrate DIBOA und DIMBOA wurde 2 mM UDPG eingesetzt, und die Akzeptorsubstratkonzentration von 0,175 mM bis 21 mM (DIBOA) bzw. 0,175 mM bis 10,5 mM (DIMBOA) variiert. Zur Bestimmung der Enzymkinetik für den Glucose Donor UDPG wurde 5,25 mM DIBOA eingesetzt und die UDPG Konzentration von 0,175 mM bis 21 mM variiert. Für jede Substratkonzentration wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Enzymparameter KM und vmax wurden durch das Programm Graph Pad Prism Version 4.03 über nichtlineare Regression berechnet.
Für die Bestimmung des pH Optimums von Co BX8 für die Glucosylierung von DIBOA wurden 1,5 g Co BX8 mit 2,5 mM DIBOA und 4 mM UDPG 4 min in unterschiedlichen Puffersystemen bei 37 °C inkubiert. Für die pH Werte 4,0 bis 7,5 enthielt der Enzymassaypuffer (14 mM BME, 0,5 mM EDTA) zusätzlich McIllvaine Puffer, für die pH Werte 7,0, bis 8,0 HEPES Puffer, für die pH Werte 7,5, bis 9,0 Bicin Puffer und für die pH Werte 9,0 und 10,5 AMP HCl Puffer (jeweils 100 mM). Für jeden untersuchten pH Wert wurden Doppelbestimmungen durchgeführt. Für die Analyse der Substratspezifität von Co BX8 wurden die Benzoxazinoid Aglucone DIBOA, DIMBOA, HBOA, HMBOA, BOA, BOA 6 OH und OH Indolin 2 on in einer Konzentration von 500 M eingesetzt: 1,5 g Material und Methoden 37
Co BX8 wurde mit 4 mM UDPG und dem entsprechenden Akzeptor Substrat in Dreifachbestimmungen 4 min bei 37 °C inkubiert.
Flavonoid Enzymtests
Die Glucosylierung der Flavonole Kaempferol, Quercetin und Myricetin, sowie der Anthocyanidine Pelargonidin und Delphinidin durch Co BX8, Co GT und Lg GT wurde in einem Reaktionsvolumen von 250 l gemessen: 5 l des zu testenden Substrates (10 mM in Ethanol) wurden zu 1 g gereinigtem Protein in 245 l Assaypuffer (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 5 mM UDPG, pH 8,2) gegeben und für 30 min bei 30 °C inkubiert. Die Glucosylierung der Flavonole wurde durch Zugabe von 200 l 5% HCl gestoppt, zu den Reaktionsansätzen mit den Anthocyanidin Substraten wurden 50 l Essigsäure gegeben. Die Ansätze wurden 5 min bei 17500 g zentrifugiert und der Überstand für eine LC MS Analyse (Prof. Schwab, TUM) eingesetzt.
IAA Enzymtests
Die Glucosylierung von Indol 3 Essigsäure (IAA) wurde nach der Vorschrift von Jackson et al ., 2001 untersucht. 0,4 bzw. 4 g Co BX8 wurde in Assaypuffer (20 mM HEPES, 14 mM BME, 0,5 mM EDTA, 4 mM UDPG, pH 8,2) mit 1 mM IAA versetzt und für 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 l TCA gestoppt. Der Reaktionsansatz wurde 5 min bei 17500 g zentrifugiert und 100 l der oberen Phase über HPLC analysiert.
Zeatin Enzymtests
Die Analyse der Glucosylierung des Cytokinins trans Zeatin erfolgte nach Hou et al ., 2004. 1,5 bzw. 15 g Co BX8, Zm Bx8 und Zm BX9 wurden mit 500 M trans Zeatin, 2,5 mM UDPG und 0,5 mM ATP in 200 l in Assaypuffer (100 mM MES, 50 mM MgSO 4, pH 7) 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,1 Vol. TCA abgestoppt und 10 min bei 17500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde für die HPLC Analyse eingesetzt.
2.6.2 Tests auf β Glucosidase Aktivität pNPG Enzymtests
Die Umsetzung des allgemeinen Substrats p Nitrophenyl β D glucopyranosid (pNPG) durch Co GLU1 und Co GLU2 wurde in einem Reaktionsvolumen von 400 l spektrometrisch gemessen. 0,15 g Co GLU1 und 0,17 g Co GLU2 wurden mit 66400 M pNPG für 2 min in Material und Methoden 38
Citratpuffer (0,1 M Natrium Phosphat/Citrat, pH 5,5) bei 37 °C inkubiert. Es wurden Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2% Natriumcarbonat gestoppt und die Stoffmenge des gebildeten p Nitrophenols photometrisch gemessen. Der molare Extinktionskoeffizient für p Nitrophenol bei 405 nm beträgt 18300 l/mol cm. Für den Vergleich der pNPG Umsetzung durch Co GLU1 mit anderen Substraten wurden 72 g Co GLU1 mit 500 M pNPG bei 30 °C inkubiert.
Benzoxazinoid Glucosid Enzymtests
Die Deglucosylierung der Benzoxazinoid Glucoside GDIBOA und GDIMBOA durch Co GLU1 wurde in einem Reaktionsvolumen von 200 l in Citratpuffer gemessen. 0,45 g Co GLU1 (GDIBOA) bzw. 4,5 g Co GLU1 (GDIMBOA) wurden mit 500 M des Glucosids 4 min bei 30 °C inkubiert. Für die Analyse der GDIBOA Hydrolyse durch Co GLU2 wurden 4,2 g Protein 15 min mit 500 M des Glucosids bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Substrats in 10 l Ethanol gestartet. Der Substratumsatz wurde über die Bildung des Aglucons (HPLC Analyse) als auch über die Bildung von Glucose (Glucose Oxidase Assay) bestimmt. Für die Quantifizierung des Aglucons über HPLC wurde die Reaktion durch Ausschütteln mit 800 l Folchlösung (Chloroform:Methanol (2:1, v/v), 1% HCl) abgestoppt. Die obere wässrige Phase wurde über die HPLC analysiert. Die Quantifizierung der gebildeten Glucose erfolgte ohne ein Abstoppen der Reaktion im unmittelbaren Anschluss an den Enzymtest mit dem Glucose Oxidase Assay Kit (Sigma) nach Angaben des Herstellers.
Die Bestimmung der enzymatischen Parameter für Co GLU1 für die Substrate GDIBOA und GDIMBOA erfolgte mit einer Enzymmenge und Inkubationsdauer, bei der die Produktbildung im linearen Bereich liegt. Für das Substrat GDIBOA wurden 1,8 g Co GLU1 mit Substratkonzentrationen von 0,175 mM bis 10,5 mM 4 min bei 30 °C inkubiert. Für das Substrat GDIMBOA wurden 14,4 g Co GLU1 eingesetzt und die Substratkonzentration von 0,175 mM bis 17,5 mM variiert. Für jede Substratkonzentration wurden drei Bestimmungen durchgeführt. Die Enzymparameter KM und vmax wurden durch das Programm Graph Pad Prism Version 4.03 über nichtlineare Regression berechnet.
Die Inhibitionskonstanten K i1 und K i2 für die Inhibition der GDIBOA Umsetzung durch Dhurrin wurden über Lineweaver-Burk-Plots bestimmt. Für verschiedene Inhibitorkonzentrationen (0 mM, 0,02 mM, 0,05 mM, 0,2 mM und 0,5 mM Dhurrin) wurden Enzymtests mit GDIBOA Konzentration von 0,35 mM bis 21 mM durchgeführt. 1,8 g Co GLU1 in Citratpuffer wurden dazu zunächst für 5 min bei 30 °C mit dem Inhibitor inkubiert, anschließend wurde die Enzymreaktion (4 min, 37 °C) durch Zugabe des Substrats gestartet. Die Reaktion wurde mit 800 l Folchlösung abgestoppt und die GDIBOA Umsetzung über HPLC analysiert. Material und Methoden 39
Dhurrin Enzymtests
Für die Bestimmung der Umsetzung des cyanogenen Glycosids Dhurrin durch Co GLU1 und CoGLU2 wurden 0,45 g Co GLU1 bzw. 0,35 g Co GLU2 mit 500 M Dhurrin in 200 l Citratpuffer 4 min bei 30 °C inkubiert. Die Umsetzung wurde unmittelbar nach dem Enzymtest mit dem Glucose (GO) Assay Kit (Sigma) nach Angaben des Herstellers gemessen.
Zeatin Ribosid Enzymtest
Für die Untersuchung der Umsetzung von Zeatin Ribosid wurden 4,5 und 45 g Co GLU1 bzw. 3,5 und 35 g CoGLU2 mit 500 M Zeatin Ribosid in 200 l Citratpuffer 30 min bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 Vol. Methanol abgestoppt und 10 min bei 17500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde eingedampft und das Pellet in 200 l Wasser resuspendiert. 100 l wurden für die Analyse der Umsetzung über HPLC eingesetzt. trans Zeatin O Glucosid (tZOG) Enzymtest
Für die Untersuchung der Umsetzung von trans Zeatin O Glucosid (tZOG) wurden 4,5 und 45 g Co GLU1 bzw. 3,5 und 35 g COGLU2 mit 500 M tZOG in 200 l Citratpuffer 60 min bei 30 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 Vol. Methanol abgestoppt und 10 min bei 17500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde für die HPLC Analyse eingesetzt.
2.7 Elektroporation von Agrobakterien
Elektrokompetente A. tumefaciens Zellen wurden nach der Methode von Walkerpeach und Velten, 1994 hergestellt. Die Elektroporation der kompetenten Agrobakterien mit dem jeweiligen Vektor erfolgte mit dem Gene-Transfection-Pulser (BioRad, USA) in 2 mm Küvetten (Thermo Scientific) bei 2,5 kV, 400 und 25 F mit 50 100 ng DNA. Die Selektion erfolgte auf YEP Platten (5g/l Hefeextrakt, 10g/l Pepton, 5 g/l NaCl, 15 g/l Agar, pH 6,8) mit einem Resistenzmarker des eingesetzten A. tumefaciens Stamms (Tabelle 2) und dem Selektionsmarker des eingesetzten Plasmids.
2.8 Transiente Proteinexpression in N. benthamiana
Die Co GLUKandidaten 1 und 2 wurden mit Hilfe einer Agroinfiltration mit TMV (Tabak Mosaik Virus) basierenden viralen Vektoren (Marillonnet et al ., 2005) transient in N. benthamiana exprimiert: Dabei wird eine Kombination aus drei verschiedenen Material und Methoden 40
Provektoren in die Pflanze eingebracht. Die 5´ Provektoren (pICH20111 und pICH20115) beinhalten virale Komponenten, wie z.B. die RNA abhängige RNA Polymerase (RdRp) und das Movementprotein (MP), das eine Ausbreitung des Systems von Zelle zu Zelle vermittelt. Zudem vermitteln diese Vektoren die zelluläre Lokalisation des exprimierten Proteins (pICH20111: Cytoplasma; pICH20115: Apoplast). Der 3´ Provektor (pICH31070) enthält das zu exprimierende Gen. Der dritte Provektor (pICH140111) enthält eine spezifische Integrase, welche die 5´ und 3´ Provektoren in der Pflanze rekombiniert. Als Positivkontrolle wurde der 3´ Provektor pICH7410 eingesetzt, der die GFP ( Green fluorescent protein ) Gensequenz enthält. Für die transiente Expression in N. benthamiana wurde die Co GLUKandidaten cDNAs daher zunächst mit der Golden Gate Klonierungstechnik (Engler et al ., 2008) in den 3` Provektor pICH31070 kloniert und sequenziert. A. tumefaciens des Stammes GV3101 wurde mit den Provektoren tranformiert (siehe 2.7).
2.8.1 Agroinfiltration
Es wurden Übernacht Kulturen der transformierten Agrobakterien vewendet. Die Kulturen wurden bei 4 °C und 3900 g 20 min zentrifugiert und die Pellets in 10 ml Infiltrationspuffer (10 mM MES NaOH, 10 mM MgSO 4, pH 5,5) resuspendiert. Die mit den verschiedenen Vektoren transformierten Agrobakterien wurden in verschiedenen Kombinationen (Tabelle 16) gemischt und 1:40 bzw. 1:200 mit Infiltrationspuffer auf ein Gesamtvolumen von 400 ml verdünnt. Die zu infiltrierende Pflanze wurde in die Lösung getaucht und anschließend wurde zweimal für 1 2 min ein Vakuum angelegt.
Tabelle 16: eingesetzte Kombinationen unterschiedlicher Provektoren für die transiente Expression der Co GLUKandidaten 1 und 2, sowie von GFP in N. benthamiana . *: Die Lokalisation in den Apoplast resultiert aus dem Apoplast Signal der CoGlu Kandidaten Gene.
Provektoren Kombination exprimiertes Protein Lokalisation pICH31070 mit CoGluKandidat 1 ; pICH14011; pICH20111 Co GLUKandidat 1 Apoplast* pICH31070 mit CoGluKandidat 2 ; pICH14011; pICH20111 Co GLUKandidat 2 Apoplast* pICH7410; pICH14011; pICH20111 GFP Cytoplasma pICH7410; pICH14011; pICH20155 GFP Apoplast
2.8.2 Proteinextraktion aus N. benthamiana
4 10 Tage nach der Agroinfiltration wurde aus einzelnen Blättern von infiltrierten N. benthamiana Pflanzen ein Proteinextrakt hergestellt. Das Blatt wurde dazu mit Seesand, 0,3 g Polyclar und 3 ml Extraktionspuffer (50 mM Na Phosphatpuffer, 5 mM BME, 10 mM EDTA, 0,1% Triton, pH 7,0) pro g Pflanzenmaterial in einer gekühlten Reibeschale auf Eis Material und Methoden 41 fein zerrieben. Die Suspension wurde anschließend bei 4 °C und 17500 g für 5 10 min zentrifugiert. Das Proteinextrakt wurde mit 20% Glycerin versetzt und in Aliquots bei 80 °C eingefroren.
2.9 Erzeugung und Analyse von transgenen A. thaliana Pflanzen
2.9.1 Elektroporation von Agrobakterien und Transformation von A. thaliana mit A. tumefaciens
Es wurde eine Fusion der CoBx8 cDNA mit dem CaMV 35S Promoter/Terminator hergestellt und in den binären Vektor pGPTV BarB kloniert. A. tumefaciens des Stammes GV3101 wurde wie in 2.7 aufgeführt mit dem Vektor transformiert. Die Transformation von A. thaliana mit A. tumefaciens erfolgte mit der floral-dip Methode (Clough und Bent, 1998). Transgene T0 Pflanzen wurden über die BASTA Resistenz selektioniert.
2.9.2 Analyse der transgenen A. thaliana-Pflanzen
Homozygote A. thaliana-Samen der T2 Generation wurden sterilisiert und für drei Tage einer Vernalisation bei 4 °C unterzogen. Die Pflanzen wurden für neun Tage bei 18 °C und 24 h Licht in Heraeus Vötsch Pflanzenkammern auf ½ MS Medium angezogen. Einzelne Pflanzen wurden in Mikrotiterplattenkavitäten transferiert, welche flüssiges ½ MS Medium mit DIBOA bzw. DIMBOA Konzentrationen von 0 2 mM enthielten. Das Medium wurde täglich gewechselt, da DIBOA und DIMBOA in wässriger Lösung unstabil sind und die Benzoxazinone benzoxazolin 2(3H) one (BOA) und 6 methoxybenzoxazolin 2(3H) one (MBOA) entstehen. Nach vier Tagen Inkubation in den Mikrotiterplatten wurden die Pflanzen bonitiert.
2.10 Expression von amiRNA Konstrukten in Z. mays
Für die Expression von amiRNA Konstrukten für die Z. mays Gene ZmBx8 und ZmBx9 wurde die Promotor amiRNA Precursor Terminator Kassette in den A. tumefaciens Transfor mationsvektor TF 101.1 kloniert. A. tumefaciens des Stammes GV3101 pMP90:RK wurde mit diesem Vektor transformiert (siehe 2.7). Mittels Gewebekultur (Peter Dobos) wurden transgene Z. mays Pflanzen erzeugt. Material und Methoden 42
2.10.1 Analyse transgener Z. mays Pflanzen
10 15 transformierte T1 Z. mays Pflanzen einer Linie wurden zunächst einem BASTA Test unterzogen. Linien, die die erwartete Aufspaltung von resistenten und nicht resistenten Pflanzen zeigten wurden analysiert. Von 10 15 transformierten T1 Pflanzen dieser Linien wurde RNA isoliert und cDNA synthetisiert. Für BX8 amiRNA Konstrukte wurde die RNA aus 4 Tage alten etiolierten Keimlingen isoliert, für die BX9 amiRNA Konstrukte wurde von 8 12 Tagen alten Pflanzen derjenige Stängelbereich verwendet, welcher die Nodien für Kronwurzeln und Blattnodien enthält (ca. 6 7 cm des Stengels, die äußeren Schaftblätter wurden entfernt). Mittels einer Standard PCR für das bar Gen wurde untersucht, welche Nachkommen die T DNA Insertion tragen. Die ZmBx8- und ZmBx9-Transkriptmengen wurden über quantitative PCR bestimmt. Als Kontrolle dienten Wildtyp T1 Pflanzen. Ergebnisse 43
3 Ergebnisse
In dieser Arbeit soll die Evolution der Entgiftungsfunktion (Glycosyltransferase) und der Bioaktivierungsfunktion (β Glucosidase) der Benzoxazinoid Biosynthese in monokotylen und dikotylen Pflanzen vergleichend untersucht werden. Dazu werden die UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen und Flavonoid Glucosyltransferasen aus C. orientalis und L. galeobdolon , sowie die GDIBOA β Glucosidase aus C. orientalis isoliert und deren Phylogenie analysiert.
3.1 Isolierung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen und Flavonoid Glucosyltransferasen aus C. orientalis und L. galeobdolon
Aus der monokotylen Pflanze Z. mays wurden bereits die UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen Zm BX8 und Zm BX9 isoliert (von Rad et al ., 2001). Für einen Vergleich der codierenden Sequenzen von UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen von monokotylen und dikotylen Pflanzen, sowie für eine vergleichende Charakterisierung der codierten Enzyme sollen die entsprechenden Gensequenzen aus den dikotylen Pflanzen C. orientalis und L. galeobdolon isoliert werden. Die Isolierung der Glucosyltransferasen mit Hilfe einer, auf Sequenzhomologien zu Zm BX8 und Zm BX9 basierenden PCR Strategie kam nicht in Frage, weil dieser gerichtete Ansatz eine relativ enge Verwandtschaft vorausgesetzt hätte. Deshalb wurde für die Isolation der Glucosyltransferase aus C. orientalis und L. galeobdolon der klassische Weg über eine Enzymreinigung gewählt.
Für Vergleichszwecke sollten aus C. orientalis und L. galeobdolon Flavonoid Glucosyltransferasen isoliert werden, weil für diese Enzyme bereits ein klarer mono phyletischer Ursprung in monokotylen und dikotylen Pflanzen gezeigt wurde. In diesem Fall wurden für die Isolierung Sequenzhomologien zu bereits isolierten und funktionell charakterisierten Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen als Kriterium herangezogen. Die Flavonoid 3 O Glucosyltransferase aus Z. mays Bz1 (bronze1) wurde bereits 1977 isoliert (Dooner und Nelson, 1977). Des Weiteren sind Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen aus einer weiteren monokotylen Pflanze (Iris hollandica (Yoshihara, et al ., 2005) und aus einer Vielzahl von dikotylen Pflanzen veröffentlicht (z.B. Gentiana triflora (Tanaka et al ., 1996), Fragaria ananassa (Griesser et al ., 2008), Vitis vinifera (Offen et al ., 2006), A. thaliana (Tohge et al ., 2005)). Das resultierende Sequenzdatenset kann in die phylogenetische Analyse der Evolution der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase mit einbezogen werden. Die Ergebnisse 44 parallele Betrachtung einer anderen UGT Funktion kann helfen, die Evolution von Benzoxazinoid UGTs einzuschätzen.
3.1.1 Reinigung von Co BX8 und p Lg BX8
Die UDPG:DIBOA Glucosyltransferasen aus C. orientalis (Co BX8) und L. galeobdolon (Lg BX8) wurden über deren Funktion gereinigt. Nach jedem Reinigungsschritt wurden die erhaltenen Fraktionen auf ihre UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität getestet. Frak tionen mit der höchsten Aktivität wurden vereinigt und für den folgenden Reinigungsschritt eingesetzt.
Als Pflanzenmaterial für die Proteinreinigung wurde bei C. orientalis von 125 g des oberirdischen Teils von 7 10 Tage alten Keimlingen ausgegangen. Dieses Entwicklungs stadiums wurde ausgewählt, da die oberirdischen Pflanzenorgane von C. orientalis hohe DIBOA Gehalte aufweisen und die höchste DIBOA Neusynthese von ca. 1,4 g/g Frisch gewicht in 14 Tage alten Keimlingen gemessen wurde (Schullehner et al ., 2008). Für die Reinigung von Lg BX8 wurden 312 g junge Blätter eingesetzt. Bei L. galeobdolon konnte der höchste DIBOA Gehalt für junge und alte Blätter gemessen werden. Die DIBOA Neu syntheserate ist für die untersuchten oberirdischen Gewebe Knospe, Blüte, sowie junge und alte Blätter in etwa gleich hoch (ca. 0,2 – 0,4 g/g Frischgewicht; Schullehner et al ., 2008).
Co BX8 und Lg BX8 wurden mit dem gleichen Verfahren aufgereinigt. Die Herstellung des Proteinrohextrakts und die Ammoniumsulfat Fällung (AS Fällung) wurden nach Bailey und Larson (1989) durchgeführt. Jedoch wurde der Enzymaktivitätspeak enger auf die Fraktion zwischen 45 und 65%iger Sättigung mit Ammoniumsulfat eingegrenzt. Analog zu der Reinigung von Zm BX8 und Zm BX9 (von Rad et al ., 2001) wurde zunächst eine Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) durchgeführt. Die UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivitäten aus dem C. orientalis und L. galeobdolon Proteinrohextrakt wiesen dabei ein unterschiedliches Elutionsverhalten auf. Co BX8 eluierte zwischen 550 und 850 mM Ammoniumsulfat, wohingegen Lg BX8 bereits mit 250 450 mM Ammoniumsulfat von der Säule eluiert werden konnte. Mit diesem Reinigungsschritt konnte die große Untereinheit der Ribulose 1,5 bisphosphat carboxylase/ oxygenase (RuBisCO, ca. 55 kDa) – dem mengen mäßig häufigsten Protein in Pflanzen aus den Proteinrohextrakten entfernt werden.
Ergebnisse 45
Die Proteinproben wurden anschließend über eine Gelfiltrationssäule nach ihrer Größe aufgetrennt. Sowohl Co BX8 als auch Lg BX8 konnten bei einem Elutionsvolumen von 77 82 ml detektiert werden. Anhand einer Protein Kalibrierkurve kann die Größe beider Proteine auf 40 58 kDa eingegrenzt werden. Da für Glycosyltransferasen des Pflanzen Sekundärmetabolismus molekularen Massen von 45 60 kDa gefunden werden, (Vogt und Jones, 2000) konnte gezeigt werden, dass Co BX8 als auch Lg BX8 als Monomer vorliegen.
Für die weitere Aufreinigung wurde eine Affinitätschromatographie (AC) mit der HiTrap™ Blue HP Säule durchgeführt. Co BX8 eluierte mit 390 – 590 mM KCl von der Affinitätssäule, für die Elution von Lg BX8 waren höhere KCl Konzentrationen (590 mM bis 740 mM) notwendig. Beide Enzymaktivitäten banden nur unter sauren Bedingungen (pH 6) an die Affinitätssäule. Im Unterschied zu der Reinigung von Zm BX8 und Zm BX9 (von Rad et al ., 2001) konnte bei neutralem pH Wert (pH 7,5) keine Bindung der Enzymaktivität an die Affinitätssäule festgestellt werden. Unter neutralen Bedingungen war ebenfalls keine Bindung der Enzymaktivitäten an die Reactive Yellow 3 Agarose Säule und die UDP Glucuronsäure Agarose Säule zu beobachten, zwei typischerweise für die Reinigung von Glucosyltransferasen des Pflanzen Sekundärmetabolismus verwendete Affinitätssäulen (z.B. Jones et al ., 1999; Wetzel und Sandermann, 1994). Die UDPG:DIBOA Glycosyltransferase Aktivität aus C. orientalis und L. galeobdolon wurde mit einem KCl Gradienten eluiert. Eine Elution mit den Substraten DIBOA oder UDPG war nicht möglich. Im Unterschied dazu konnten Zm BX8 und Zm BX9 durch Zugabe des Substrats UDPG von der Säule eluiert werden, wohingegen eine Elution der aktiven Enzyme durch einen Salzgradienten nicht gelang (von Rad et al ., 2001).
Als Polishing Schritt wurde schließlich eine Anionenaustauscherchromatographie (AE) durchgeführt. Die Co BX8 und Lg BX8 Enzymaktivitätspeaks eluierten jeweils bei einer Salzkonzentration von ca. 200 mM KCl von der Chromatographiesäule. Im Anschluss waren sowohl Co BX8 als auch Lg BX8 nahezu zur Homogenität gereinigt (Abbildung 5). Werden die aktiven Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie einzeln über SDS PAGE analysiert, so korreliert die Intensität der Hauptbande mit der gemessenen relativen Enzymaktivität (Abbildung 6). Ergebnisse 46
Abbildung 5: SDS PAGE Analyse der verschiedenen Schritte der Reinigung der UDPG:DIBOA Gluco syltransferase aus C. orientalis (A) und L. galeobdolon (B). 1: Proteinrohextrakt, 2: Ammoniumsulfat fällung, 3: Hydrophobe Interaktionschromatographie, 4: Gelfiltration, 5: Affinitätschromatographie, 6: Anionenaustauscherchromatographie. Das gereinigte Protein ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Abbildung 6: Korrelation der Intensität der Proteinbande und der relativen Enzymaktivität einzelner Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie bei der Reinigung der UDPG:DIBOA Glucosyl transferase aus C. orientalis (A) und L. galeobdolon (B). Oben: Die relative Enzymaktivität einzelner Fraktionen der Anionenaustauscherchromatographie, unten: die zugehörige SDS PAGE Analyse der Fraktion. Die gereinigte Glucosyltransferase ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Bei einer typischen Reinigung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase aus C. orientalis konnten aus 125 g Pflanzenmaterial ca. 2 g Co BX8 gereinigt werden. Das entspricht einer 29000 fachen Reinigung (Tabelle 17). Die UDPG:DIBOA Glucosyltransferase aus L. galeobdolon wurde ca. 23000 fach angereinigt. Aus 312 g Pflanzenmaterial konnten ca. 24 g des Proteins gereinigt werden (Tabelle 18). Ergebnisse 47
Tabelle 17: Reinigung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Co BX8 aus C. orientalis. AS Fällung: Ammoniumsulfatfällung; HIC: Hydrophobe Interaktionschromatographie; GF: Gelfiltration; AC: Affinitätschromatographie; AE: Anionenaustauscherchromatographie. Als Pflanzenmaterial wurden 125 g des oberirdischen Teils von 7 10 Tage alten Keimlingen eingesetzt.
Protein Gesamt Spezifische Reinigungs Reinigungs Ausbeute menge aktivität Aktivität faktor schritt [%] [mg] [nkat] [nkat/mg] [x fach]
Proteinrohextrakt 949 59,87 0,06 100 AS Fällung 237 35,87 0,15 2,40 60,0 HIC 36,0 16,29 0,45 7,17 27,2 GF 1,65 6,59 4,00 63,32 11,0 AC 0,19 8,45 44,48 704,93 14,1 AE 0,002 3,71 1852,32 29354,77 6,2
Tabelle 18: Reinigung der UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Lg BX8 aus L. galeobdolon. AS Fällung: Ammoniumsulfatfällung; HIC: Hydrophobe Interaktionschromatographie; GF: Gelfiltration; AC: Affinitätschromatographie; AE: Anionenaustauscherchromatographie. Als Ausgangsmaterial für die Reinigung wurden 312 g junge L. galebdolon Blätter verwendet.
Protein Gesamt Spezifische Reinigungs Reinigungs Ausbeute menge aktivität Aktivität faktor schritt [%] [mg] [nkat] [nkat/mg] [x fach]
Proteinrohextrakt 1976 19,14 0,01 66,3 AS Fällung 1406 28,87 0,021 2,12 100 HIC 72,6 25,18 0,35 35,8 87,2 GF 3,20 5,31 1,66 171,3 18,4 AC 0,44 4,86 11,04 1139,88 16,8 AE 0,024 5,45 227,1 23443,0 18,9
Die gereinigten Proteine Co BX8 und Lg BX8 wurden von Dr. Haslbeck (TU München) und Prof. Dr. Küster (TU München) mit Trypsin verdaut und die Spaltpeptide mittels Massenspektroskopie sequenziert.
3.1.2 Identifizierung der CoBx8-, pLgBx8-, CoGT- und Lg GT- Gensequenzen
Die Gensequenzen von CoBx8 und p LgBx8 sollten zunächst über die Peptidsequenzen der gereinigten Proteine isoliert werden. Basierend auf den Peptidsequenzen wurden Primer ausgesucht und zur PCR eingesetzt. Dieser Ansatz war nicht erfolgreich. Daraufhin wurden UGT Kandidatensequenzen aus C. orientalis, und L. galeobdolon mit zwei verschiedenen Strategien isoliert. Für die Isolierung von UGT Kandidatengenen aus C. orientalis wurde das Transkriptom sequenziert (siehe 2.2.10). UGT Kandidatenteilsequenzen von L. galeobdolon wurden durch verschiedene PCR Verfahren isoliert (siehe 2.2.8). Für die Identifizierung der Ergebnisse 48
CoBx8 und p LgBx8 Gene wurden die Peptidsequenzen schließlich mit den Kandidaten sequenzen verglichen.
Die Gensequenzen der Flavonoid Glucosyltransferasen Co GT und Lg GT wurden über Homologievergleiche erhalten. Die UGT Kandidatenteilsequenzen aus C. orientalis und L. galeobdolon wurden dafür mit einem Sequenzdatenset von Flavonoid 3 O Glucosyl transferasen dikotyler Pflanzen verglichen.
Isolierung von UGT Kandidatenteilsequenzen
Das Transkriptom von C. orientalis Keimlingen (oberirdischen Teil, 7 10 Tage alt) wurde mit der 454 Technologie mit einem adaptorspezifischen Primer sequenziert. Vor der Sequenzierung wurden die cDNAs normalisiert, um die Repräsentation einzelner Gene anzugleichen. Die Sequenzierung lieferte ca. 250000 Sequenzen mit einer durchschnittlichen Länge von 253 bp, einschließlich des Adaptors mit 24 bp. Damit beträgt die Rohsequenz Datenmenge 62,6 Megabasen (Mb). Die Adaptorsequenz wurde ausgeklammert und die einzelnen Sequenzen mit Hilfe der Phred Software assembliert (Prof. Dr. Rattei, Universität Wien). Durch die Assemblierung konnte die durchschnittliche Sequenz Länge auf 338 bp erhöht werden. Es blieben 6,8 Mb Sequenzen als Einzelsequenzen (Singlets), die assemblierten Sequenzen (Contigs) machen 15,5 Mb aus.
Für die Isolierung von UGT Kandidatenteilsequenzen aus C. orientalis wurden die Contigs und Singlets des C. orientalis Transkriptoms nach Sequenzen durchsucht, welche die UGT Domäne enthalten (Prof. Dr. Rattei, Universität Wien). Dazu wurde die Pfam (protein families ) Datenbank verwendet, die eine Sammlung von Sequenz Alignments verschiedener Proteinfamilien darstellt. 25 Singlets und 37 Contigs aus dem C. orientalis Transkriptom weisen die UGT Domäne auf (Tabelle 19).
Da für L. galeobdolon keine Transkriptomdaten vorliegen, wurden hier UGT Kandidatenteil sequenzen über zwei verschiedene PCR Strategien isoliert, die das konservierte Amino säuremotiv HCGWNS des PSPG Motivs von UGTs als Bindestelle für degenerierte Primer ausnutzen. In der ersten Strategie wurde eine Nested PCR auf einer L. galeobdolon ZAP cDNA Phagenbank durchgeführt (Ansatz 1). Es wurden bei dieser Strategie sowohl Teil sequenzen 3 ´ als auch 5 ´ des konservierten Motivs isoliert. In der zweiten Strategie wurde Oligo d(T) Anchor (5´/3´ RACE Kit, 2nd Generation, Roche) geprimte cDNA als DNA Template für die Nested PCR eingesetzt (Ansatz 2). Mit beiden Strategien wurden insgesamt 11 Kandidatenteilsequenzen für UGTs aus L. galeobdolon isoliert (Tabelle 20). Die Sequen zierung weiterer Klone ergab keine neuen Kandidaten. Zudem wurden manche Kandidaten Ergebnisse 49 bei beiden Ansätzen isoliert (Tabelle 20). Es wird daher angenommen, dass Teilsequenzen für die in L. galeobdolon am stärksten exprimierten UGTs isoliert werden konnten.
Tabelle 19: Singlets und Contigs des C. orientalis Transkriptoms mit dem UGT Pfam ( Protein families ) Motiv. Es sind die jeweiligen Sequenzlängen, sowie die Anzahl der Sequenzen aus denen der Contig assembliert wurde, angegeben. Contig 3 wurde nachfolgend als CoBx8 Teilsequenz identifiziert.
Anzahl der Contig/ Sequenzlänge assemblierten Singlet [bp] Sequenzen
Singlets 1 25 237 276 1 Contigs 27 37 203 409 2 Contigs 19 26 274 462 3 Contig 18 425 4 Contigs 16 17 415 428 5 Contigs 11 15 252 617 7 Contigs 9 10 449 731 8 Contigs 6 8 457 845 9 Contig 5 756 10 Contig 4 687 14 Contig 3 1174 20 Contig 2 796 29 Contig 1 1570 38
Tabelle 20: Isolierte UGT Teilsequenzen aus L. galeobdolon . Angegeben ist die Position der Teil sequenz bezüglich des konservierten Amoniosäuremotivs, die Länge der Teilsequenz und mit welchem Ansatz diese isoliert wurde. Lg GTKandidat5 wurde nachfolgend als Lg GT identifiziert und Lg GTKandidat11 als pLg BX8.
Position bzgl. des Kandidat Länge [AS] Ansatz 1 Ansatz 2 konservierten Motivs
Lg GTKandidat1 3´ 110 x x Lg GTKandidat2 3´ 83 x Lg GTKandidat3 3´ 75 x x Lg GTKandidat4 5´ 129 x Lg GTKandidat5 5´ 140 x Lg GTKandidat6 5´ 139 x Lg GTKandidat7 3´ 112 x Lg GTKandidat8 3´ 107 x Lg GTKandidat9 3´ 106 x Lg GTKandidat10 3´ 103 x Lg GTKandidat11 3´ 103 x
Isolierung der CoBx8 und pLgBx8 cDNA Klone
Um die cDNA Klone CoBx8 und p LgBx8 zu isolieren, wurden die Peptidsequenzen der gereinigten Proteine mit den Kandidatensequenzen verglichen. Ergebnisse 50
Peptide der gereinigten Co BX8 konnten in der Aminosäuresequenz des Contigs 3 der UGT Sequenzen des C. orientalis Transkriptoms gefunden werden (Tabelle 19). Dieser Contig hat eine Länge von 1174 bp und wurde aus 20 Einzelsequenzen aus der 454 Transkriptom sequenzierung assembliert. Damit gehört dieser Contig zu den am stärksten exprimierten UGTs in dem analysierten C. orientalis Transkriptom. Eine Teilsequenz des Contigs wurde radioaktiv markiert und als Sonde benutzt, um eine C. orientalis cDNA Bibliothek durch Plaquehybridisierung zu screenen. Die vollständige CoBx8 cDNA Sequenz ist 1428 bp lang (Abbildung 7).
1 MASSPKTPHI VCVPAPAQGH INPMFKLAKL FHSRGFYITF VHSEFSYQRL LQASALDHLK 61 GLNNFRFETI PDGLPPENKR GVSDVPELCK SMRNTCADPF RSLILKLNSS SDVPPVTCIV 121 ADVAMDFTLQ VSEELGPPVV LFFTLSGCGV LGYMHYGELL ERGYFPLREE SFLSNGYLDT 181 EIDWIPAMKG IRLKDLPSFL RTTDPDDIMF NCKIIEVNSA FKAKGVILNT FDDLEQEVLD 241 AIKSKIPQLY TIGPLSMLCD HMLQPDSKLC EASLWEEDTS CLEWLQEKDP KSVLYVNIGS 301 LATMTSQQLG EFAWGLANSM CPFLWVIRPD ILDRASGIVS EDYKKEIGGR GLLVSWCQQE 361 KVLKHPSIGG FLTHCGWNST LESLCEGVPM ICWPFFAEQQ TNCFYICNKW GIGMEIDFDV 421 KRVEIGMMVK ELMKGEKGLE MRNKVEDLMS KAIKATTPGG SSHTNFEMLM EDVAKW
Abbildung 7: Aminosäuresequenz von Co BX8. Die Peptidsequenzen der gereinigten Co BX8 sind grau hinterlegt. In roter Farbe ist die Kandidatenteilsequenz dargestellt.
Peptidsequenzen der gereinigten Lg BX8 stimmen mit der Aminosäuresequenz des Lg GTKandidaten11 überein. Die Lg GTKandidat11 Sequenz hat eine Länge von 206 bp und ist 3´ des konservierten Aminosäuremotivs HCGWNS lokalisiert (Tabelle 20). Die Teil sequenz wurde zunächst über eine Nested PCR (siehe 2.2.7) in 5 ´ Richtung verlängert. Damit konnte jedoch nur ein Teil des gesuchten 5 ´ Endes amplifiziert werden. Deshalb wurde das 5 ´ Ende der p LgBx8 Sequenz mit Hilfe der AIMS Methode (siehe 2.2.7) mit neuen genspezifischen Primern isoliert. Aus den erhaltenen Sequenzen wurde die Volllängen sequenz des p LgBx8 zusammengesetzt. Die mit Hilfe der AIMS Methode erhaltene genomische Sequenz verlängert den Leserahmen um 100 Codons. Sie umfasst weitere 11 Nukleotide in denen sich kein weiteres Sartcodon befindet. Die aus den erhaltenen Sequenzen gebildete cDNA codiert ein Protein, das in der Blast Analyse starke Homologie um das Startcodon aufweist (Abbildung 27; Anhang). 5 ´ RACE PCR hat das in der AIMS Analyse gefundene Startcodon bestätigt. Mittels PCR konnte der gesamte, durch Teilsequenzen bekannte, Leserahmen in einem Molekül amplifiziert werden. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass es sich nicht um eine artifizielle Sequenz handelt. In der 5´ verlängerten Aminosäuresequenz konnten zudem weitere Peptidsequenzen der gereinigten Lg BX8 gefunden werden (Abbildung 8). Auf cDNA Ebene ergeben sich für pLg Bx8 8 Allelunterschiede, die an 6 Positionen zu einer Aminosäure Veränderung führen (Abbildung 8). Diese Unterschiede können auf 2 verschiedene Allele zurückgeführt werden. Ergebnisse 51
Es sind Peptidsequenzen vorhanden, die nur für die Allelvariante 1 oder nur für die Allel variante 2 passen. Dies zeigt, dass beide Allele in der isolierten Proteinbande vertreten sind.
1 MEAKNGRKAH VLAVAGPAQG HVKPLMKLCR QIAKHGLKVT LVNLQSVHDK LVGEEDNIVQ 61 MVSIPDVPIE EDKDDPFKKM KNLRKTMPES LKDLIQGINS SSNPEEKIGF VIADVMVEWL 121 MDTAAEMGAE PILFSPTSAA FRAMMSRIPA LLEDGMLDLN GNIEKCEKIT LSDDIPAWDK 181 DEFSWSFPHD PKTQKSFFDL INPDRGKIIQ PKLHLINTCY ELESPACDLR PNLLPVGPLL 241 EMNNSCNFYP EDESCLSWLD TKLPESVIYV SFGSIAVVSQ QQLDELALGL ELSGRAFLWV 301 VRPDLVNGLR AVYPDGFLER VSGIGMIVEW APQERVLFHP SVACFLTHCG WNSILEGLSK 361 GVSFLCWPFF MDQFHNQNYI CDKWEAGLRV DGDGSGIRTR NEIKEKIGMM FCNGDLKANA 421 MRLKEIFAKT VCEGGSSYNN FERFIDYLRK
Abbildung 8: Aminosäuresequenz des Allels 1 von p Lg BX8. Die Peptidsequenzen der gereinigten Lg BX8 sind grau hinterlegt. In roter Farbe ist die Kandidatenteilsequenz dargestellt. Positionen, an denen Allelvarianten vorkommen, die zu einem Aminosäureaustausch führen, sind unterstrichen.
Isolierung der Co GT und Lg GT cDNA Klone
Aus den C. orientalis Transkriptomsequenzen konnte eine 633 bp lange Contigsequenz identifiziert werden, welche eine hohe Homologie zu Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen dikotyler Spezies aufweist (Abbildung 9). Diese Sequenz wurde durch die Suche nach Sequenzen mit der UGT Domäne in der Pfam Datenbank nicht erfasst und ist daher nicht in den UGT Kandidatensequenzen enthalten. Der Grund hierfür ist möglicherweise die Lokalisation der UGT Domäne im 3´ Bereich von UGT Proteinsequenzen, wohingegen die erhaltene Contigsequenz mit dem Startcodon beginnt. Unter den UGT Kandidaten sequenzen von L. galeobdolon konnte eine Sequenz identifiziert werden, welche eine hohe Homologie zu Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen zeigt (Abbildung 10). Diese Lg GTKandidat5 Sequenz codiert 140 AS und liegt im 5 ´ Bereich des konservierten Aminosäuremotivs von UGTs (Abbildung 2).
Die Volllängensequenz des Flavonoid Glucosyltransferase Kandidaten aus C. orientalis wurde durch einen Nested PCR Ansatz isoliert. Die Flavonoid Glucosyltransferase Kandidatensequenz aus L. galeobdolon konnte durch eine Nested PCR in 3´ Richtung vervollständigt werden und in 5´ Richtung erweitert werden. Für die Isolierung des fehlenden 5´ Endes wurde schließlich eine L. galeobdolon Phagenbank durchsucht. Der vollständige offene Leserahmen des Flavonoid Glucosyltransferase Kandidaten aus L. galeobdolon wurde aus den erhaltenen Sequenzen zusammengesetzt (Bechtel, 2009).
Ergebnisse 52
F. ananassa -MAPVSNQVGGHVAVLAFPFSTHAAPLLNIVCRLAAAAPSTLFSFFNTKQSNSSILAGNT 59 V. vinifera ------TTNPHVAVLAFPFSTHAAPLLAVVRRLAAAAPHAVFSFFSTSQSNASIFHDSM 53 A. thaliana MTKPSDPTRDSHVAVLAFPFGTHAAPLLTVTRRLASASPSTVFSFFNTAQSNSSLFSSGD 60 G. triflora ------MSPVSHVAVLAFPFGTHAAPLLTLVNRLAASAPDIIFSFFSTSSSITTIFSPTN 54 C. orientalis -MGQSKSESEAHVAVIAFPFGSHAAQILNLTRRLAASAPEVTFSFFSTAKSNKAVSGSTG 59 ****:****.:*** :* :. ***:::* ****.* .* ::
F. ananassa SVLRYSNVSVCEVADGVPEGYVFVGKPQEDIELFMKAAPDNFRRCLEASVAESGREVSCL 119 V. vinifera HTMQCN-IKSYDISDGVPEGYVFAGRPQEDIELFTRAAPESFRQGMVMAVAETGRPVSCL 112 A. thaliana EADRPANIRVYDIADGVPEGYVFSGRPQEAIELFLQAAPENFRREIAKAETEVGTEVKCL 120 G. triflora LISIGSNIKPYAVWDGSPEGFVFSGNPREPIEYFLNAAPDNFDKAMKKAVEDTGVNISCL 114 C. orientalis ---GAENIKFYDVHHGVPENHSFSGNPLEEIDLFIKATPGNFIEAIHKAVEESDRKITCL 116 : : .* **.. * *.* * *: * .*:* .* . : : : . :.**
F. ananassa VTDAFFWFGVHMADDMGGVPWVPFWTAGPASLSAHVHTDLIRSTT--SGGCHDEKETITV 177 V. vinifera VADAFIWFAADMAAEMG-VAWLPFWTAGPNSLSTHVYIDEIREKIGVSGIQGREDELLNF 171 A. thaliana MTDAFFWFAADMATEIN-ASWIAFWTAGANSLSAHLYTDLIRETIGVKEVGERMEETIGV 179 G. triflora LTDAFLWFAADFSEKIG-VPWIPVWTAASCSLCLHVYTDEIRSRFAEFDIAEKAEKTIDF 173 C. orientalis TNDSFMWMGVDIAQTLQ-VPCVSVWAPGASSLCAHLYTDILRQNIG-VGANAKYDEYLTF 174 *:*:*:...:: : .. :..*:... **. *:: * :*. .: : .
F. ananassa IAGMSKVRPQDLPEGIIFGNLESLFSRMLHQMGQMPPLATAVFINSFEELDPVITNDLKS 237 V. vinifera IPGMSKVRFRDLQEGIVFGNLNSLFSRMLHRMGQVLPKATAVFINSFEELDDSLTNDLKS 231 A. thaliana ISGMEKIRVKDTPEGVVFGNLDSVFSKMLHQMGLALPRATAVFINSFEDLDPTLTNNLRS 239 G. triflora IPGLSAISFSDLPEELIMEDSQSIFALTLHNMGLKLHKATAVAVNSFEEIDPIITNHLRS 233 C. orientalis IPAMEKVRAGDLPDEILKGNLDSLFARLLHKAAQVMP------211 *..:. : * : :: : :*:*: **. .
Abbildung 9: Alignment von Proteinteilsequenzen der Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen aus Fragaria ananassa (F. ananassa ; Q2V6K0), Vitis vinifera (V. vinifera ; P51094), Arabidopsis thaliana (A. thaliana ; Q9LFJ8) und Gentiana triflora (G. triflora ; Q96493) mit der Flavonoid Glucosyltrans ferase Kandidatenteilsequenz aus C. orientalis . *, identische Aminosäure; :, ähnliche Aminosäure.
F. ananassa MLHQMGQMPPLATAVFINSFEELDPVITNDLKSKFKR-FLNVGPLDLLEPPASAATTTPQ 59 V. vinifera ----MGQVLPKATAVFINSFEELDDSLTNDLKSKLKT-YLNIGPFNLITP--PPVVPNTT 53 A. thaliana ----MGLALPRATAVFINSFEDLDPTLTNNLRSRFKR-YLNIGPLGLLSSTLQQLVQDPH 55 G. triflora ----MGLKLHKATAVAVNSFEEIDPIITNHLRSTNQLNILNIGPLQTLSSSIPPEDN--- 53 L. galeobdolon ------HEAHAVILNSFEEIDPIIAKDLKSKFRH-FLNIGPSILPSPIADDKS---- 46 * ** :****::* :::.*:* : **:** .
F. ananassa TAAEAVAGDGCLSWLDEQK-VASVVYVSFGSVTRPSPEELMALAEALEASRVPFLWSLRD 118 V. vinifera ------GCLQWLKERK-PTSVVYISFGTVTTPPPAEVVALSEALEASRVPFIWSLRD 103 A. thaliana ------GCLAWMEKRS-SGSVAYISFGTVMTPPPGELAAIAEGLESSKVPFVWSLKE 105 G. triflora ------ECLKWLQTQK-ESSVVYLSFGTVINPPPNEMAALASTLESRKIPFLWSLRD 103 L. galeobdolon ------GCLSWLGKQTRPKSVVYISFSTVATPPEKELVALAEALEACQFPFLWSLKE 97 ** *: :. **.*:**.:* *. *: *::. **: :.**:***::
F. ananassa NLKNRQLDEFLSKGKLNGMVVPWAPQPQVLAHGSVGAFVTHCGWNSVLESVAGGVPLICR 178 V. vinifera KARVHLPEGFLEKTRGYGMVVPWAPQAEVLAHEAVGAFVTHCGWNSLWESVAGGVPLICR 163 A. thaliana KSLVQLPKGFLDRTREQGIVVPWAPQVELLKHEATGVFVTHCGWNSVLESVSGGVPMICR 165 G. triflora EARKHLPENFIDRTSTFGKIVSWAPQLHVLENPAIGVFVTHCGWNSTLESIFCRVPVIGR 163 L. galeobdolon QARESLPDGFLERTTSFGKIVSWAPQLQVLAHDSVGVFVSHCG------140 : . *:.: * :*.**** .:* : : *.**:***
Abbildung 10: Alignment von Proteinteilsequenzen der Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen aus Fragaria ananassa (F. ananassa ; Q2V6K0), Vitis vinifera (V. vinifera ; P51094), Arabidopsis thaliana (A. thaliana ; Q9LFJ8) und Gentiana triflora (G. triflora ; Q96493) mit der Flavonoid Glucosyltrans ferase Kandidatenteilsequenz aus L. galeobdolon . *, identische Aminosäure; :, ähnliche Aminosäure. Ergebnisse 53
3.2 Charakterisierung der heterolog exprimierten Proteine Co BX8, Co GT und Lg GT
Für die Bestimmung der Enzymfunktion wurden die Proteine Co BX8, pLg BX8, Co GT und Lg GT rekombinant in E. coli mit einem N terminalen His Tag exprimiert. pLg BX8 konnte nicht funktionell exprimiert werden. Co BX8, Co GT und Lg GT wurden bezüglich ihrer Substratspezifität charakterisiert. Für Co BX8 wurden außerdem enzymatische Parameter, das pH Optimum und die Genexpression analysiert.
3.2.1 Expression und Reinigung von Co BX8, pLg BX8, Co GT und Lg GT
Zur biochemischen Charakterisierung wurden die vollständigen offenen Leserahmen der Proteine Co BX8, p Lg BX8, Co GT und Lg GT amplifiziert, sequenziert und in den Expressionsvektor pET28a kloniert. Mit diesem Vektor werden die Proteine mit einem aminoterminalen 6xHisTag exprimiert. Die Expression bei 37 °C für 3 5 Stunden führte bei allen vier Proteinen zu einer starken Überexpression und unlöslichem Protein. Die native Expression der Enzyme Co BX8, Co GT und Lg GT wurde mit Zugabe von IPTG induziert und für 2 3 Tage bei 18 °C durchgeführt. Die Proteine wurden schließlich über Ni Agarose Säulen gereinigt. Die Lagerung bei 4 °C für eine Woche und bei 70 °C für mehrere Monate hatte keinen Einfluss auf die Enzymaktivität der Proteine.
Das Allel 1 von p Lg BX8 konnte bisher nicht in aktiver Form exprimiert werden. Die Induktion bei geringerer Zelldichte (OD=0,3), weniger starke (0,01 0,1M) bis gar keine Induktion mit IPTG und auch der für unlösliche Proteine optimierte Expressionsstamm Lemo21 (DE3; New England Biolabs) bewirkten keine Expression als lösliches, aktives Protein. Die Expression als carboxyterminales 6xHisTag Protein mit dem Expressionsvektor pET3a war ebenfalls nicht erfolgreich. Auch konnte das Allel 1 von pLg BX8 bisher nicht transient in Blättern von N. benthamiana exprimiert werden. Es konnten für beide Allele von p Lg BX8 Peptid sequenzen identifiziert werden, was bedeutet dass beide Allele aus dem Pflanzen proteinextrakt gereinigt wurden. Es besteht also die Möglichkeit, dass Allel 1 exprimiert wird, aber ein Nullallel darstellt, während Allel 2 ein aktives Allel ist. Weitere Experimente betreffen daher die Expression des Allels 2.
3.2.2 Substratspezifität von Co GT und Lg GT
Die Gensequenz der putativen Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen Co GT und Lg GT wurde über Homologievergleiche mit Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen isoliert. Die Funktion von Ergebnisse 54
Co GT und Lg GT in der Glucosylierung von Flavonoiden konnte in vitro bestätigt werden (Prof. Schwab, TU München). Beide Enzyme glucosylieren die Flavonole Kaempferol, Quercetin und Myricetin (Abbildung 26, Anhang). Für die Anthocyanidine Pelargonidin und Delphinidin konnte keine Umsetzung festgestellt werden. Beide Enzyme stellen daher Flavonoid Glucosyltransferasen dar. DIBOA wurde durch beide Enzyme nicht glucosyliert (Daten nicht gezeigt).
3.2.3 Kinetische Daten von Co BX8
Die kinetischen Daten von Co BX8 wurden für die Substrate DIBOA, DIMBOA und UDPG bestimmt. Die Abhängigkeit der Umsatzgeschwindigkeiten von der Substratkonzentration zeigt jeweils eine Michaelis Menten Kinetik (Abbildung 11 Abbildung 13). Für das Akzeptor
Substrat DIBOA, das in C. orientalis vorkommende Benzoxazinoid, wurde ein Km Wert von 1 441 M gemessen, der kcat Wert liegt bei 9,5 s . Auch für das Akzeptor Substrat DIMBOA, das hauptsächlich vorkommende Benzoxazinoid in Z. mays , kann eine Glucosylierung durch
Co BX8 festgestellt werden. Der Km Wert für DIMBOA ist mit 3168 M etwa 10 fach höher als 1 für das Substrat DIBOA. Der kcat Wert wurde mit 17,6 s bestimmt, und liegt damit geringfügig über dem für DIBOA gemessenen Wert. Die kinetischen Daten für das Donor Substrat UDPG liegen in derselben Größenordnung wie für das Substrat DIBOA: Der 1 Km Wert beträgt 743 M, der kcat Wert beträgt 8,5 s (Tabelle 21).
12000 Abbildung 11: Michaelis Menten Enzymkinetik von heterolog exprimiertem Co BX8 für das 9000 Substrat DIBOA.
6000
3000
0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 DIBOA [mM] Ergebnisse 55
Abbildung 12: Michaelis Menten Enzymkinetik 12000 von heterolog exprimiertem Co BX8 für das Substrat DIMBOA. 8000
4000
0 0 2 4 6 DIMBOA [mM]
10000 Abbildung 13: Michaelis Menten Enzymkinetik von heterolog exprimiertem Co BX8 für das 7500 Substrat UDPG.
5000
2500
0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 UDPG [mM]
Tabelle 21: Vergleich der Enzymparameter für die Substrate UDPG, DIBOA, DIMBOA der UDPG: DIBOA Glucosyltransferase Co BX8 mit den Enzymen Zm BX8 und Zm BX9. 1Von Rad et al ., 2001.
UDPG DIBOA DIMBOA
Km kcat kcat /Km Km kcat kcat /Km Km kcat kcat /Km Enzym ( M) (sec 1) (mM 1 sec 1) ( M) (sec 1) (mM 1 sec 1) ( M) (sec 1) (mM 1 sec 1)
Co BX8 743 ± 77 8,5 ± 0,2 11,4 441 ± 47 9,5 ± 0,2 21,5 3168 ± 549 17,6 ± 1,6 5,6 Zm BX8 1 81 22,6 280 61 12,5 205 81 22,7 280 Zm BX9 1 96 22,6 117 1300 12,5 6 71 11,6 163
Der Km Wert der Glucosyltransferase Aktivität aus C. orientalis für das Substrat DIBOA wurde zusätzlich mit dem über Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration partiell gereinigten Pflanzenextrakt bestimmt. Dieser liegt bei dem gereinigten Enzym mit 178 M unter dem mit dem heterolog exprimierten Protein bestimmten Wert von 441 M. Dieser Unterschied kann auf Modifikationen der Benzoxazinoid Glucosyltransferase in planta zurückgeführt werden. Der Vergleich mit den publizierten Enzymparametern von Zm BX8 und Zm BX9 (von Rad et al ., 2001; Tabelle 21) zeigt, dass heterolog exprimiertes Co BX8 für das Substrat DIBOA
sowohl in Bezug auf Affinität als auch bezüglich der katalytischen Effizienz kcat /Km eine Ergebnisse 56
Mittelstellung zwischen Zm BX8 und Zm BX9 einnimmt. Beide Z. mays Enzyme haben signifikant niedrigere Km Werte für DIMBOA bei ähnlichen kcat Werten.
Für die über Ammoniumsulfatfällung und Gelfiltration partiell gereinigte DIBOA:UDPG
Enzymaktivität aus L. galeobdolon wurde ein Km Wert von 119 M bestimmt. Dieser liegt damit in der Größenordnung des Km Werts der partiell gereinigten Co BX8 (178 M).
Die höchste Enzymaktivität von heterolog exprimiertem Co BX8 wurde für einen pH Wert von 7,5 8,0 bestimmt (Abbildung 14). Die relative Enzymaktivität des partiell gereinigten Enzyms ist zwischen einem pH Wert von 7,0 und 7,5 am höchsten.
100 McIllvaine
Bicine 80 HEPES
60 AMP
40
20 relative Enzymaktivität [%]
0 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH Wert Abbildung 14: Relative Enzymaktivität von heterolog exprimiertem Co BX8 bei verschiedenen pH Werten und unterschiedlichen Puffern: Das pH Optimum liegt bei ca. 7,5 8,0.
3.2.4 Substratspezifität von Co BX8
Es wurden verschiedene Akzeptor Substrate auf Glucosylierung durch Co BX8 getestet (Abbildung 15). Für die vier Substrate DIBOA, DIMBOA, HBOA und HMBOA konnte die Umsetzung zum Glucosid gemessen werden (Tabelle 22). Die Umsatzgeschwindigkeit ist für das Substrat DIBOA am höchsten, jedoch konnten ähnliche Umsatzgeschwindigkeiten für DIMBOA, HBOA und HMBOA gemessen werden. Im Unterschied dazu wird DIMBOA durch Zm BX8 und Zm BX9 deutlich schneller umgesetzt als DIBOA, HBOA und HMBOA (von Rad et al ., 2001). Für die Benzoxazinoide BOA, BOA 6 OH und 3 Hydroxy Indolin 2 on konnte kein Umsatz durch Co BX8 festgestellt werden. Es scheint, dass Substrate von Co BX8 zwei kondensierte Sechserringe aufweisen müssen. Substitutionen am C7 Atom bzw. am N1 Atom scheinen bei Co BX8 im Gegensatz zu Zm BX8 und Zm BX9 (von Rad et al ., 2001) nur geringfügige Auswirkungen auf die Umsatzgeschwindigkeit zu haben. Die Phytohormone Ergebnisse 57
Indol 3 Essigsäure und trans Zeatin, sowie alle getesteten Flavonoide wurden von Co BX8 nicht glucosyliert (Tabelle 22). Des Weiteren konnte auch für Zm BX8 und Zm BX9 keine Glucosylierung des Cytokinins trans Zeatin festgestellt werden.
O OH H3CO O OH O OH H3CO O OH
N O N O N O N O H H OH OH
DIBOA DIMBOA HBOA HMBOA
O OH HO O O OH N O N O N O N H H H H
BOA BOA 6 OH 3 Hydroxy Indolin 2 on Indol 3 Essigsäure
Abbildung 15: Strukturformeln verschiedener Benzoxazinoide und Indol 3 Essigsäure, die auf Gluco sylierung durch CoBX8 getestet wurden.
Tabelle 22: Substratspezifität von heterolog exprimierter Co BX8: Umsatzgeschwindigkeiten für verschiedene Benzoxazinoide, Indol 3 Essigsäure, verschiedene Flavonoide und Zeatin. nn: nicht nachweisbar.
Umsatzgeschwindigkeit Umsatzgeschwindigkeit Substrat 1 1 Substrat 1 1 [ mol mg min ] [ mol mg min ]
DIBOA 8,8 ± 0,1 Indol 3 Essigsäure nn DIMBOA 8,1 ± 0,4 trans Zeatin nn HBOA 7,3 ± 0,1 Kaempferol nn HMBOA 6,8 ± 0,1 Quercitin nn BOA nn Myricetin nn BOA 6 OH nn Delphinidin nn 3 Hydroxy Indolin 2 on nn Pelargonidin nn
3.2.5 Vergleich der Co BX8 und pLg BX8 Proteinsequenzen mit anderen Glycosyltransferasen
CoBx8 kodiert für ein Protein mit 476 AS, und p Lgbx8 für ein Protein mit 450 AS. Sie sind zu 33,5% identisch und haben eine Ähnlichkeit von 53,2%. Ein Alignment ihrer Aminosäure sequenzen mit verschiedenen pflanzlichen UGTs der Familie 1 zeigt, dass beide Proteine das hochkonservierte PSPG Motiv aufweisen (Abbildung 27, Anhang). Da zudem beide Proteine die höchste Homologie zu UGTs der Familie 1 haben, können sowohl Co BX8 und pLg BX8 dieser UGT Familie zugeordnet werden. Die höchste Aminosäureidentität zu einem Ergebnisse 58
Protein bekannter Funktion zeigt Co BX8 gegenüber der Cytokinin O Glucosyltransferase 2 aus A. thaliana (At COGT2; 49,3%), und der UDPG p Hydroxymandelonitril Glucosyltrans ferase aus S. bicolor (Sb HMNGT; 42,9%). Während At COGT2 in der Homöostasis von Cytokinin involviert ist, katalysiert Sb HMNGT, wie Co BX8, die Glucosylierung einer Abwehr substanz, des cyanogenen Glycosids Dhurrin. Die Homologie von Co BX8 zu Zm BX8 und Zm BX9, die die gleiche Funktion ausüben wie Co BX8, ist wesentlich geringer (Tabelle 23).
Tabelle 23: AS Identitäten von Co BX8 und p Lg BX8 zu funktionell charakterisierten UGTs der Familie 1. Zm BX8: Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus Z. mays (Q8W2B7), Zm BX9: Benzoxa zinoid Glucosyltransferase aus Z. mays (Q8W2B6), Co BX8: Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus C. orientalis , At COGT2: Cytokinin O Glucosyltransferase 2 aus A. thaliana (Q9SK82), Sb HMNGT: UDPG p Hydroxymandelonitril Glucosyltransferase aus S. bicolor (Q9SBL1), p Lg BX8 1: Allel 1 der putativen Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus L. galeobdolon . Die Berechnung erfolgte mit dem MetGAT Matrix Alignment Tool und der BLOSUM50 Scoring Matrix .
Enzym Funktion AS Identität AS Identität von Co BX8 von pLg BX8 1 in [%] in [%]
At COGT2 Cytokinin O Glucosyltransferase 2 49,3 34,2 Sb HMNGT UDPG p Hydroxymandelonitril Glucosyltransferase 42,9 30,4 Zm BX8 Benzoxazinoid Glucosyltransferase 33,9 29,2 Zm BX9 Benzoxazinoid Glucosyltransferase 32,1 27,8
Die putative DIBOA Glucosyltransferase aus L. galeobdolon pLg BX8 weist im Vergleich zu Co BX8 geringere Homologien zu UGTs bekannter Funktion auf. Die höchste Homologie wird ebenfalls für die Cytokinin O Glucosyltransferase 2 aus A. thaliana (At COGT2) berechnet (Tabelle 23).
3.2.6 Genexpressionsanalyse von CoBx8
Die Genexpression von CoBx8 in unterschiedlichen Pflanzenorganen relativ zur Expression von GAPDH wurde durch quantitative RT PCR bestimmt. CoBx8 ist am stärksten im Keimling exprimiert, die Genexpression liegt hier im Bereich der GAPDH. Die Expressionsstärke nimmt von der Blüte zur Wurzel weiter ab, bleibt aber in allen untersuchten Pflanzenorganen in derselben Größenordnung wie die Genexpression des house-keeping Gens GAPDH (Abbildung 16). Die Expressionsstärke von CoBx8 liegt in derselben Größenordnung wie diejenige von ZmBx8 und ZmBx9 . Die höchste Expression von 0,4 pg/pg GAPDH konnte für ZmBx8 im Spross zwei Tage nach der Keimung gemessen werden (von Rad et al ., 2001). Ergebnisse 59
1.5
1.0
0.5 CoBx8 / CoGAPDH
0.0
Keimling Blüte Wurzel
Abbildung 16: CoBx8 Genexpression in den Pflanzenorganen Keimling, Blüte und Wurzel. Die Messung der Transkriptkonzentration wurde in Duplikaten mit drei biologischen Replikaten durchgeführt.
3.3 Funktion von Co BX8 in planta
Die Benzoxazinoide DIBOA und DIMBOA sind stark toxisch für Pflanzen (Barnes und Putnam, 1987, Sahi et al ., 1990, Sicker et al ., 2000). Ihre Glucosylierung reduziert deren Phytotoxizität (Sicker et al ., 2000). Für die Untersuchung des Entgiftungspotentials von Benzoxazinoid Glucosyltransferasen eignet sich die Expression in A. thaliana . Diese synthetisiert natürlicherweise keine Benzoxazinoide und weist keine spezifische Glucosyl transferase auf. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression von Zm BX8 und Zm BX9 in A. thaliana die Phytotoxizität der Benzoxazinoide DIBOA und DIMBOA für die Pflanze reduziert (von Rad et al ., 2001). Durch die heterologe Expression von Co BX8 in A. thaliana , kann die in vitro gezeigte UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität von Co BX8 bestätigt werden und die Entgiftung der Benzoxazinoide durch Co BX8 nachgewiesen werden.
3.3.1 Enzymatische Aktivität von Co BX8 in Arabidopsis Pflanzen
Die CoBx8 cDNA wurde unter Kontrolle des 35S Promotors ins A. thaliana Genom integriert. 11 Primärtransformanten wurden isoliert, geselbstet und die Nachkommen (T1 Generation) auf BASTA Resistenz selektiert. Pflanzen der T1 Generation von 10 unabhängigen Linien wurden verwendet um die UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität zu messen. Dazu wurde für jede Pflanze aus drei Blättern ein Proteinrohextrakt hergestellt, der direkt für die Enzymaktivitätstests eingesetzt wurde. In neun der zehn getesteten Extrakte konnte Ergebnisse 60
Enzymaktivität festgestellt werden (Tabelle 24), während im Extrakt des Columbia (Col 0) Wildtyps, wie erwartet, keine DIBOA Glucosylierungsaktivität nachgewiesen werden konnte. In den 9 Linien waren allerdings große Aktivitäts Unterschiede zu erkennen. Diese Variation kann durch unterschiedliche Integrationsorte der T DNA im Arabidopsis Genom erklärt werden. Auch der unterschiedliche Genotyp der T1 Pflanzen bezüglich des CoBx8 Gens kann diese Unterschiede verursachen, denn die Pflanzen sind nach der BASTA Selektion zu 1/3 homozygot und zu 2/3 heterozygot. Für die anschließenden Resistenztests wurden homozygote Pflanzen der T2 Generation zweier Linien mit hoher Glucosylierungsaktivität (CoBx8-7 und CoBx8-9) verwendet.
Tabelle 24: Relative UDPG:DIBOA Glucosyltransferase Aktivität in Proteinrohextrakten verschiedener Linien von Co BX8 exprimierenden A. thaliana Pflanzen (T1 Generation). nn: nicht nachweisbar.
relative Enzymaktivität relative Enzymaktivität Linie Linie [%] [%]
CoBx8-1 nn CoBx8-12 7,6 CoBx8-2 9,8 CoBx8-15 19,5 CoBx8-7 100,0 CoBx8-16 15,0 CoBx8-8 37,0 CoBx8-17 3,8 CoBx8-9 31,7 CoBx8-20 6,6 CoBx8-10 nn Col 0 Wildtyp nn
3.3.2 Resistenztests der transgenen Arabidopsis Pflanzen
Homozygote CoBx8 Transformanten der T2 Generation wurden auf ihre Toleranz gegenüber DIBOA und DIMBOA getestet. Die Pflanzen wurden für neun Tage auf ½ MS Medium ange zogen und anschließend in ½ MS Medium mit DIBOA bzw. DIMBOA Konzentrationen von 0 2 mM inkubiert, das täglich gewechselt wurde. Zur Kontrolle wurden ZmBx8- und ZmBx9 Transformanten (von Rad et al ., 2001), sowie Col 0 Wildtyp Pflanzen eingesetzt. Nach vier Tagen Inkubation wurde bonitiert. Wildtyp Kontroll Pflanzen, die auf Medium mit DIBOA und DIMBOA wuchsen, waren mit steigender Benzoxazinoid Konzentration zunehmend geschä digt (Abbildung 17, A und B). Die Keimlinge waren ausgebleicht und im Wachstum gehemmt. Die CoBx8 , ZmBx8-, und ZmBx9 Transformanten zeigten dagegen eine starke Toleranz gegenüber dem phytotoxischen DIBOA auf. Die Keimlinge blieben grün und waren im Vergleich zu den Kontrollpflanzen kaum im Wachstum gehemmt (Abbildung 17, A). Die CoBx8 Transformanten haben auch eine erhöhte Toleranz gegenüber DIMBOA. Im Ver gleich zu den Wildtyp Pflanzen sind die Keimlinge weniger stark geschädigt. Jedoch scheint das Entgiftungspotential der CoBx8 Transformanten gegenüber DIMBOA weniger stark ausgeprägt zu sein, als das der ZmBx8-, und ZmBx9 Transformanten (Abbildung 17, B). Ergebnisse 61
Abbildung 17: Entgiftung der Benzoxazinoide DIBOA und DIMBOA durch heterologe Expression von CoBx8 , ZmBx8 und ZmBx9 in A. thaliana. Homozygote T2 Transformanten wurden 4 Tage in ½ MS Medium inkubiert, welches 0 2 mM DIBOA oder DIMBOA enthielt . CoBx8-, ZmBx8- und ZmBx9- Transformanten waren nach 4 Tagen grün und kaum im Wachstum gehemmt, wohingegen Wildtyp A. thaliana Pflanzen mit zunehmender Benzoxazinoid Konzentration stark geschädigt waren.
3.4 Isolierung der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus C. orientalis
Um die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus C. orientalis (Co GLU1) zu isolieren, wurde das C. orientalis Transkriptom nach Sequenzen durchsucht, die Homologie zu β Glucosidasen des Sekundärmetabolismus aufweisen. Kandidaten wurden transient in N. benthamiana exprimiert und auf die Hydrolyse von GDIBOA analysiert.
3.4.1 Identifizierung von Benzoxazinoid Glucoisd β Glucosidase Kandidaten Gensequenzen
Für die Isolierung der CoGlu1 Gensequenz wurden zunächst die C. orientalis Transkriptom Sequenzen mit einer Blast Suche (Prof. Dr. Rattei, Universität Wien) nach Homologien zu zwei β Glucosidasen des Sekundärmetabolismus durchsucht. Zum einen wurde mit der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase Zm GLU1 aus Z. mays (Esen, 1992; Bandaranayake und Esen, 1996; Cicek und Esen, 1999) die gesuchte Enzymfunktion in der Abfrage eingesetzt. Um auch eine β Glucosidase Sequenz aus einer dikotylen Pflanze zu berücksichtigen, wurde als zweite Suchsequenz die β Glucosidase At TGG1 (Thioglucoside Glucohydrolase 1 bzw. Myrosinase 1; Barth und Jander, 2006) aus A. thaliana ausgesucht. Die erhaltenen Kandidatensequenzen sind entsprechend den Bit-Score Werten der Protein Alignments aufgelistet (Tabelle 25). Das Alignment des Kandidaten 1 mit Zm GLU1 erzielt Ergebnisse 62 den höchsten Bit-Score Wert von 444. Die Bewertung der Alignments (der Bit-Score der Blast Suche) hängt jedoch nicht nur von der Homologie der Sequenzen selbst, sondern auch von der Sequenzlänge der Kandidatensequenzen ab. Längere β Glucosidase Teil sequenzen, die aus einer höheren Anzahl aus Transkriptom Einzelsequenzen des C. orientalis Transkriptoms assembliert wurden, erhalten einen höheren Bit-Score . Damit wurde eine Rangliste der Kandidaten nach Homologie und indirekt auch nach der Expressionsstärke in 7 10 Tage alten C. orientalis Keimlingen erstellt. So weist Kandidat 2 z.B. eine wesentlich höhere Homologie zu Zm GLU1 auf, erhält jedoch geringere Bit-Scores aufgrund der geringeren Sequenzlänge.
Für die Auswahl von Kandidaten wurde davon ausgegangen, dass Co GLU1 eine hohe Expressionsrate aufweist, wie sie für Benzoxazinoid Biosynthesegene aus Z. mays (von Rad et al ., 2001; Jonczyk et al ., 2008) und C. orientalis (Schullehner et al ., 2008; diese Arbeit) gefunden wurden.
Tabelle 25: Blastx Suchergebnisse mit den Zm GLU1 und At TGG1 Sequenzen in den C. orientalis Transkriptomdaten: Die Protein Alignments mit den Co GLUKandidaten 1 4 erhielten die besten Bit- Score Werte.
Sequenz AS Identität Bit-Score AS Identität Bit-Score Contig länge Zm GLU1 Zm GLU1 At TGG1 At TGG1 [bp] [%] [%]
CoGluKandidat 1 1638 45,3 444 44,9 376 CoGluKandidat 2 534 62,8 196 52,5 155 CoGluKandidat 3 519 53,0 155 44,8 130 CoGluKandidat 4 657 39,8 96 51,2 131
Für die funktionelle Analyse wurden die Kandidaten 1 und 2 ausgewählt. Für den Co GluKandidaten 1 war der vollständige offene Leserahmen (1638 bp) vorhanden. Die vollständige Gensequenz des Kandidaten 2 (1541 bp) wurde durch Nested PCRs auf einem C. orientalis cDNA Phagenlysat isoliert (Pham Vu, 2009).
3.4.2 Transgene Expression der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase Kandidaten in N. benthamiana
Im Gegensatz zu β Glucosidasen aus monokotylen Pflanzen werden β Glucosidasen dikotyler Pflanzen glycosyliert (Morant et al ., 2008a). Die Glykosylierung ist für die Stabilität der β Glucosidasen von essentieller Bedeutung (Zhou et al ., 2002, Wei et al ., 2004), weshalb Ergebnisse 63 die rekombinante Expression in E. coli oft zu unlöslichem und inaktiven Proteinen führte (Zhou et al ., 2002).
Als Alternative wurden die Co GluKandidaten 1 und 2 mit einer neuen Expressionsstrategie, der sogenannten magnifection (Marillonnet et al ., 2005 und Gleba et al ., 2005), transient in N. benthamiana exprimiert. Mit diesem System werden durch Infiltration mit Agrobakterien auf TMV (Tabak Mosaik Virus) basierende virale Provektoren in die Pflanzen eingebracht. In planta findet die Prozessierung zu aktiven Replikons statt, die innerhalb der Zelle amplifiziert werden und sich von Zelle zu Zelle fortbewegen. Beide Co GLUKandidaten, sowie als Kontrolle das green fluorescent protein (GFP), konnten mit diesem System exprimiert werden (Göpfrich, 2010). Die Expressionsstärke war in allen Fällen vergleichbar mit der Expressionsstärke der großen Untereinheit der RuBisCO (ca. 55 kDa), dem mengenmäßig am Häufigsten vorkommenden Protein in Pflanzen (Abbildung 18).
Abbildung 18: Expression des Co GluKandidaten 1 (B), des Co GluKandidaten 2 (A, Spur 1) sowie des green fluorescent proteins (GFP; A, Spur 2) durch magnifection . Die Pfeile kennzeichnen das exprimierte Zielprotein ( Co GluKandidat 1: 58,7 kDa; Co GluKandidat 2: 58,1 kDa; GFP: 26,9 kDa).
Die funktionelle Expression der beiden heterolog exprimierten Co GLUKandidaten wurde durch Enzymaktivitätstests mit dem artifiziellen Substrat 4 Nitrophenyl b D glucopyranosid (pNPG) untersucht. Dieses wird von einem Großteil der pflanzlichen β Glucosidasen des Sekundärmetabolismus als Substrat akzeptiert. Für den Co GLUKandidaten 1 wurde bei einer Substratkonzentration von 66400 M und Inkubation bei 37 °C eine Umsatzgeschwin digkeit von 6780 nmol min 1 mg 1 gemessen. Kandidat 2 zeigt eine etwa um die Hälfte geringere Umsatzgeschwindigkeit als Kandidat 1 (2820 nmol min 1 mg 1). Die Co GLUKandi daten konnten beide funktionell exprimiert werden. Ergebnisse 64
Der Co GLUKandidat 1 setzt GDIBOA zu dem Aglucon DIBOA um, und wird im Folgenden als Co GLU1 bezeichnet. Für den Kandidaten 2 konnte keine Aktivität gegenüber GDIBOA gezeigt werden. Das Enzym wird künftig als Co GLU2 bezeichnet.
3.5 Charakterisierung von Co GLU1 und Co GLU2
Für die enzymatische Charakterisierung von Co GLU1 und Co GLU2 wurde der Proteinrohextrakt aus N. benthamiana eingesetzt. Die Menge an exprimierter β Glucosidase relativ zum Gesamtprotein wurde mittels SDS PAGE bestimmt. Als Kontrolle wurden Proteinextrakte von untransformierten N. benthamiana Pflanzen eingesetzt.
3.5.1 Kinetische Daten von Co GLU1
Die Umsatzgeschwindigkeit von Co GLU1 in Abhängigkeit der Substratkonzentration von GDIBOA und GDIMBOA zeigt eine Michaelis Menten Kinetik (Abbildung 19 und Abbildung 20). Für die Umsetzung von GDIBOA, das in C. orientalis vorkommende
Benzoxazinoid Glucosid, wurde ein Km Wert von 4,6 mM gemessen, der kcat Wert liegt bei 32,0 s 1. Co GLU1 hydrolysiert aber auch GDIMBOA, das 7 Methoxy Derivat von GDIBOA, welches in C. orientalis nicht synthetisiert wird (Schullehner et al ., 2008). Für dieses Substrat zeigt Co GLU1 jedoch eine etwa 8 fach niedrigere Affinität auf, der Km Wert für GDIMBOA 1 liegt bei 28,4 mM. Der kcat Wert wurde mit 4,2 s bestimmt und ist damit etwa 8 fach niedriger als für das Substrat GDIBOA (Tabelle 26).
20000 Abbildung 19: Michaelis Menten Enzymkinetik von Co GLU1 für das Substrat GDIBOA. 15000
10000
5000
0 0 2 4 6 GDIBOA[mM] Ergebnisse 65
1000 Abbildung 20: Michaelis Menten Enzymkinetik von Co GLU1 für das Substrat GDIMBOA. 750
500
250
0 0 2 4 6 8 10 GDIMBOA [mM]
Tabelle 26: Enzymparameter für heterolog exprimiertes CoGLU1 für die Substrate GDIBOA und GDIMBOA.
GDIBOA GDIMBOA
Km kcat kcat /Km Km kcat kcat /Km Enzym (mM) (sec 1) (sec 1/mM 1) (mM) (sec 1) (sec 1/mM 1)
Co GLU1 4,6 ± 0,4 32,0 ± 1,55 7,0 28,4 ± 4,4 4,2 ± 0,5 0,15
3.6 Substratspezifität von Co GLU1 und Co GLU2
Die Umsatzgeschwindigkeit von Co GLU1 und Co GLU2 für verschiedene Substrate (Abbildung 21) wurde getestet und verglichen (Tabelle 27). Alle Tests wurden bei 30 °C und mit Substratkonzentrationen von 500 M durchgeführt. Die spezifische Aktivität von CoGLU1 für das Substrat pNPG wurde photometrisch gemessen und beträgt 555 nmol min 1 mg 1. Die Messung der Umsetzung von GDIBOA, GDIMBOA und Dhurrin erfolgte über die Messung der freigesetzten Glucose ebenfalls photometrisch. Die Umsatzgeschwindigkeit der Deglucosylierung von GDIBOA und GDIMBOA wurde zusätzlich durch die Quantifizierung des freigesetzten Aglucons über HPLC Analyse bestimmt, dabei wurden Umsatzgeschwin digkeiten derselben Größenordnung bestimmt (GDIBOA: 5803 ± 44 nmol min 1 mg 1; GDIMBOA: 153 ± 12 nmol min 1 mg 1).
Das Substrat GDIBOA wird von Co GLU1 mit der höchsten Umsatzgeschwindigkeit deglucosyliert. Das 7 Methoxy Derivat von GDIBOA, GDIMBOA wird zwar ebenfalls als Substrat akzeptiert, doch wird es mit einer ca. 40 fach reduzierten Umsatzgeschwindigkeit umgesetzt. Interessanterweise wird das cyanogene Glycosid Dhurrin von Co GLU1 fast ebenso schnell hydrolysiert wie GDIBOA. Zusätzlich wirkt Dhurrin als gemischter oder nichtkompetitiver Hemmstoff für die GDIBOA Hydrolyse durch Co GLU1. Bei der sogenannten gemischten Hemmung kann der Inhibitor mit dem Substrat um dessen Ergebnisse 66
Bindungsplatz im aktiven Zentrum des Enzyms konkurrieren (kompetitive Hemmung) und an den Enzym Substrat Komplex binden und dadurch die Umsetzung des Substrats hemmen (unkompetitive Hemmung). Für die beiden Komponenten der gemischten Hemmung wurden
Inhibitionskontanten von 0,213 mM (K i1 ; kompetitiv) und 0,278 mM (K i2 ; unkompetitiv) bestimmt. Das Cytokinin Glucosid trans Zeatin O Glucosid (tZOG) wird ebenfalls von Co GLU1 umgesetzt, die Umsatzgeschwindigkeit ist etwa 60 fach geringer als die Umsatzgeschwindigkeit des Substrats GDIBOA. Das Ribosid von Zeatin wird von Co GLU1 nicht hydrolysiert.
Für Co GLU2 konnte keine Umsetzung von GDIBOA, Zeatin Ribose und trans Zeatin O Glucosid (tZOG) gezeigt werden. Von den getesteten Substraten wird das artifizielle Substrat pNPG und Dhurrin hydrolysiert (963 nmol min 1 mg 1).
Tabelle 27: Substratspezifität von Co GLU1. Die Substrate wurden in einer Konzentration von 500 M eingesetzt. nn: nicht nachweisbar.
spezifische Aktivität Substrat 1 1 (nmol min mg )
GDIBOA 6030 ± 359 GDIMBOA 131 ± 20 Dhurrin 5684 ± 116 pNPG 555 ± 14 trans Zeatin O Glucosid (tZOG) 60,8 ± 1,8 Zeatin Ribosid nn
O O Glc H3CO O O Glc
N O N O OH OH
DIBOA Glucosid DIMBOA Glucosid
OH O Glc HO HN HN N N O Glc N N
CN N N Rib N N H
Dhurrin trans Zeatin Ribosid trans Zeatin O Glucosid
Abbildung 21: Strukturformeln der auf Umsetzung durch Co GLU1 und Co GLU2 untersuchten Substrate. Glc: Glucosid; Rib: Ribosid. Ergebnisse 67
3.6.1 Vergleich der Co GLU1 und Co GLU2 Proteinsequenzen mit anderen Glycosid Hydrolasen der Familie 1
Die Aminosäuresequenz von Co GLU1 und Co GLU2 wurde mit Aminosäuresequenzen von β Glucosidasen der Abwehrsysteme Benzoxazinoide ( Zm GLU1, Sc GLU und TaGLU1a) und cyanogener Glucoside ( Sb DHR1) verglichen (Abbildung 28, Anhang). Für diese β Glucosidasen ist entweder die Kristallstruktur ( Zm GLU1a, Ta GLU1a und Sb DHr1) oder eine durch Homologiemodellierung ermittelte Struktur ( Sc GLU) veröffentlicht. Für die Sequenzvergleiche wurden die experimentell gezeigten oder durch Vorhersageprogramme ermittelten ( Ta GLU1a, Co GLU1 und CoGLU2, siehe 3.6.3) prozessierten Aminosäure sequenzen ohne Transitpeptide herangezogen. Die Aminosäuresequenz von Co GLU1 und Co GLU2 enthalten die für GH1 Enzyme charakteristischen konservierten Motive ITENG und TFNEP und sind damit der Familie 1 der Glycosid Hydrolasen zuzuordnen.
Co GLU1 und Co GLU2 weisen eine Aminosäureidentität von 64,0% auf. Die Aminosäure identität von Co GLU1 zu einem Protein bekannter Funktion ist gegenüber der Exoglucanase aus O. sativa (Os 4bglu12; 59,9%), und den Hydroxynitril Glucosid spaltenden β Glucosi dasen D2 und D4 aus L. japonicus (Lj BGD2 und Lj BGD4; 58,4%) am höchsten (Tabelle 28). Den Benzoxazinoid Glucosid hydrolysierenden β Glucosidasen aus Z. mays , S. cereale und T. aestivum , ( Zm GLU1, Sc GLU und Ta GLU1b), sowie der Dhurrinase aus S. bicolor (Sb DHUR1) gegenüber weist Co GLU1 geringere Aminosäureidentitäten auf. Co GLU2 zeigt ähnliche Verwandtschaftsbeziehungen auf (Tabelle 28).
Tabelle 28: AS Identitäten und AS Ähnlichkeiten von Co GLU1 und Co GLU2 zu funktionell charakteri sierten GH1 β Glucosidasen. Os 4bglu12: Exoglucanase aus O. sativa ( Q7XKV4), Lj BGD2: Hydroxy nitril Glucoside β Glucosidase aus L. japonicus (B2ZUU1), Lj BGD4: Hydroxynitril Glucoside β Glucosidase aus L. japonicus (B2ZUU0), Sb DHR1: Dhurrin β Glucosidase aus S. bicolor (Q41290), Ta GLU1b: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus T. aestivum (Q1XH05) Sc GLU: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus S. cereale (Q9FYS3), Zm GLU1: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus Z. mays (P49235). Die Berechnung erfolgte mit dem MetGAT Matrix Alignment Tool und der BLOSUM50 Scoring Matrix . Für die Sequenzvergleiche wurden die prozessierten Aminosäure sequenzen herangezogen. Glc: Glucosid.
Enzym Funktion AS Identität in [%] AS Ähnlichkeit in [%]
Co GLU1 Co GLU2 Co GLU1 Co GLU2
Os 4bglu12 Exoglucanase 59,9 61,3 77,5 77,5 Lj BGD2 Hydroxynitril Glc β Glucosidase 58,4 61,6 75,9 76,4 Lj BGD4 Hydroxynitril Glc β Glucosidase 58,4 60,1 75,7 75,2 Tr BGLU Linamarase 48,3 49,9 61,5 62,8 Sb DHUR1 Dhurrinase 45,1 42,8 64,8 62,3 Ta GLU1b Benzoxazinoid Glc β Glucosidase 43,2 43,1 62,5 61,5 Sc GLU Benzoxazinoid Glc β Glucosidase 43,1 43,5 62,7 61,8 Zm GLU1 Benzoxazinoid Glc β Glucosidase 42,5 45,1 62,1 61,3 Ergebnisse 68
Für Zm GLU1, Sc GLU, Ta GLU1a und Sb DHR1 sind die Aminosäurereste bekannt, die die Agluconbindetasche ausbilden und an der Substratbindung beteiligt sind (Czjzek et al ., 2000; Nikus et al ., 2003; Sue et al ., 2006; Verdoucq et al ., 2004). Die entsprechenden Co GLU1 und Co GLU2 Reste entsprechen weder den Resten, die die Benzoxazinoid Bindetasche in Zm GLU1, Sc GLU oder Ta GLU1a ausbilden, noch den Resten, die die Dhurrinbindetasche in Sb DHR1 ausbilden (Abbildung 28 , Anhang).
3.6.2 Genexpressionsanalyse von CoGlu1
Mit quantitativer RT PCR wurde die Genexpression von CoGlu1 in verschiedenen C. orientalis Pflanzenorganen bestimmt (Abbildung 22). Zur Normierung wurde parallel die Expression des house-keeping Gens GAPDH gemessen. CoGlu1 ist am stärksten in der Blüte exprimiert. Dort ist CoGlu1 in etwa so stark exprimiert wie GAPDH. Die Expression im Keimling ist ca. 0,5 fach reduziert, und in der Wurzel können nur sehr geringe CoGlu1 Transkriptmengen detektiert werden (0,0058 ± 0,0047 pg/pg GAPDH).
1.5
1.0
0.5 CoGlu1 / CoGAPDH
0.0
Keimling Blüte Wurzel Abbildung 22: CoGlu1 Genexpression in unterschiedlichen Pflanzenorganen. Die Messung der Transkriptkonzentration wurde in Duplikaten mit drei biologischen Replikaten durchgeführt.
3.6.3 Lokalisationsvorhersage für Co GLU1
Die Co GLU1 Aminosäuresequenz wurde mit dem Programm TargetP 1.1 (Emanuelsson et al ., 2000; Nielsen et al ., 1997) analysiert, welches Signalpeptide und den Bestimmungsort von Proteinen vorhersagt. Demzufolge weist Co GLU1 mit hoher Wahrscheinlichkeit ein 18 AS langes Signalpeptid auf, und wird über den sekretorischen Weg transportiert. Die Analyse mit Predotar v. 1.03 bestätigt den Transport über den sekretorischen Weg und sagt einen Transport in das Endoplasmatische Reticulum (ER) vorher (Small et al ., 2004). Umgekehrt Ergebnisse 69 schließen die Chlorplast Signalpeptid und Mitochondrium Signalpeptid Vorhersagepro gramme chlorop v1.1 (Emanuelsson et al ., 1999) und MitoProt II v1.101 (Claros et al ., 1996) den Transport von Co GLU1 in den Chloroplasten oder das Mitochondrium aus. Das bekannteste Aminosäuremotiv (Austin et al ., 2007), das die Retention von Proteinen im ER vermittelt und am C Terminus der Proteine zu finden ist, KDEL, ist in der Co GLU1 Sequenz nicht vorzufinden. Jedoch existieren Variationen dieses Motivs, und in selteneren Fällen wird die Retention im ER auch durch andere Motive vermittelt. Der Zielort der Co GLU1 ausgehend vom ER kann mit aktuellen Vorhersageprogramm nicht vorhergesagt werden und muss, z.B. durch eine immunocytochemische Analyse, experimentell bestimmt werden. Für die Abwehrsysteme cyanogene Glycoside und Glucosinolate wurde eine unterschiedliche Lokalisation der bioaktivierenden β Glucosidase von monokotylen und dikotylen Pflanzen beschrieben. Die Lokalisation der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase Zm GLU1 im Chloroplasten wurde experimentell gezeigt (Esen und Stetler, 1993; Nikus et al ., 2001) und die Lokalisationsvorhersage für Co GLU1 gibt einen Transport über den sekretorischen Weg an. Dieses Muster trifft daher mit hoher Wahrscheinlichkeit auch für das Abwehrsystem der Benzoxazinoid Glucoside zu. Diskussion 70
4 Diskussion
Phytoantizipine sind eine wichtige Komponente der chemischen Grundabwehr der Pflanze. Da diese intrazellulär gebildeten Verbindungen cytotoxisch sind, werden sie in der Regel als weniger reaktive Glycoside in der Vakuole gespeichert. Wird die Zellintegrität zerstört, werden Phytoantizipine durch β Glucosidasen bioaktiviert. β Glucosidasen und Phyto antizipinglycoside werden in verschiedenen zellulären Kompartimenten gelagert. Dies erlaubt der Pflanzenzelle ein Toxin als Schutzmechanismus zu benutzen, ohne selbst davon beeinträchtigt zu werden. Das Paar UGT und β Glucosidase ist daher essentiell mit der Biosynthese von Phytoantizipinen in der Grundabwehr verbunden.
Würden für dasselbe Phytoantizipin in verschiedenen Taxa unterschiedliche Enzyme für die Detoxifizierung und Bioaktivierung gefunden werden, dann wäre dies ein Hinweis auf einen polyphyletischen Ursprung der Detoxifizierungs und Bioaktivierungsenzyme und möglicher weise des gesamten Biosynthesewegs.
Im Folgenden soll anhand eines Vergleichs der Detoxifizierungs und Bioaktivierungsenzyme der Benzoxazinoidbiosynthese in monokotylen und dikotylen Pflanzen diese Fragestellung diskutiert werden. Im Benzoxazinoid Abwehrsystem entgiftet eine spezifische UGT Benzoxazinoide in der Biosynthese und eine β Glucosidase aktiviert die Glucoside durch deren Hydrolyse. In dieser Arbeit wurde die Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus C. orientalis Co BX8 isoliert. Damit sind Benzoxazinoid Glucosyltransferasen aus dikotylen (Co BX8; diese Arbeit) und monokotylen ( Zm BX8 und Zm BX9; von Rad et al ., 2001) Pflanzen beschrieben. Mit Co GLU1 konnte des Weiteren eine Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus C. orientalis isoliert werden. Diese erweitert den bekannten Datensatz an Benzoxazi noid Glucosid β Glucosidasen der monokotylen Pflanzen Z. mays , S. cereale und T. aestivum um die entsprechende β Glucosidase einer dikotylen Pflanze. Mit diesem Enzymset (UGT; β Glucosidase) aus C. orientalis sind UGTs und β Glucosidasen für ein spezifisches Phytoantizipin Substratset (DIBOA und GDIBOA/GDIMBOA) aus monokotylen und dikotylen Pflanzen bekannt. Diskussion 71
4.1 UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen von monokotylen und dikotylen Pflanzen
4.1.1 Substratspezifität gegenüber Benzoxazinoiden und Funktion
Zm BX8, Zm BX9 und Co BX8 akzeptieren nur Benzoxazinoide als Substrate. DIBOA ist das erste toxische Produkt des Benzoxazinoid Biosynthesewegs. In Pflanzen, die GDIBOA bilden, wie z.B. C. orientalis ; H. lechleri , wird DIBOA durch Glucosylierung detoxifiziert. Auch in Z. mays , welches GDIMBOA synthetisiert, wurde DIBOA, das erste toxische Intermediat der Biosynthese, als Substrat für die Glucosyltransferase identifiziert (Abbildung 4; Jonczyk et al ., 2008). Es kann angenommen werden, dass auch in der GDIMBOA Biosynthese in T. aestivum DIBOA glucosyliert wird.
Weder für Benzoxazinoid UGTs aus den monokotylen Spezies Z. mays (Zm BX8 und Zm BX9), T. aestivum und H. lechleri (von Rad et al ., 2001; Leighton et al ., 1994), noch aus dikotylen Spezies (diese Arbeit) wurde eine strikte Substratspezifität für DIBOA gezeigt. Die Glucosyltransferase Aktivitäten der DIMBOA synthetisierenden Spezies Z. mays und T. aestivum katalysieren sowohl die Glucosylierung von DIBOA als auch von DIMBOA (von
Rad et al ., 2001; Leighton et al ., 1994). Zm BX8 hat ähnliche katalytische Effizienzen kcat /Km für DIBOA und DIMBOA und Zm BX9 hat eine höhere katalytische Effizienz für DIMBOA. Die gereinigte Glucosyltransferase Aktivität von T. aestivum weist DIMBOA gegenüber eine höhere Affinität auf, als gegenüber DIBOA (Leighton et al ., 1994). Es wird angenommen, dass die Glucosyltransferasen, zusätzlich zu der Funktion in der Biosynthese, eine Funktion in der Entgiftung von Benzoxazinoiden als Allelochemikalien einnehmen. Die Akzeptanz des Substrats DIMBOA in Z. mays und T. aestivum ist wahrscheinlich durch die Notwendigkeit der Entgiftung von endogenem und exogen exsudiertem DIMBOA entstanden. Benzoxazinoide werden aktiv über die Wurzel in die Rhizosphäre abgegeben oder gelangen über abgefallene Pflanzenteile in den Boden. Dort können sie die Keimung umliegender Samen hemmen und das Wachstum von Keimlingen inhibieren (Sicker et al ., 2000). Die Exsudation von Benzoxazinoiden wurde für die Gräser Z. mays , T. aestivum und S. cereale (Pérez und Ormenoñuñez, 1991; Wu et al ., 2000, 2001; Park et al ., 2004) gezeigt. Das allelopathische Potential von Benzoxazinoiden und ihrer Abbauprodukte zwischen Individuen verschiedener Pflanzenspezies oder derselben Pflanzenspezies ist besonders gut für S. cereale untersucht (Barnes und Putnam, 1987). Hier konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass die getesteten Dikotyledoneae 30% sensitiver gegenüber DIBOA sind, als die getesteten monokotylen Pflanzenspezies. Durch die Glucosylierung der exsudierten Benzoxazinoide und ihrer Abbauprodukte können sich Pflanzen vor den allelopathischen Diskussion 72
Effekten schützen. Das Potential von Zm BX8 und Zm BX9 exogene Benzoxazinoide zu entgiften, wurde durch die transgene Expression in A. thaliana gezeigt (von Rad et al ., 2001).
Die Analyse von Mutanten kann Aufschluss über die Funktion der Benzoxazinoid UGTs Zm BX8 und Zm BX9 in planta geben. Das Vorhandensein von zwei Benzoxazinoid Glucosyl transferasen mit unterschiedlicher Substratspezifität und Genexpression, legt die Vermutung nahe, dass die UGTs in planta unterschiedliche Funktionen ausüben. Zm BX9 zeigt, im Gegensatz zu Zm BX8, DIMBOA gegenüber eine wesentlich höhere katalytische Effizienz auf als gegenüber DIBOA (Tabelle 21). Zm BX9 könnte daher eine Neo Funktionalisierung durchlaufen haben und zusätzlich zu der Funktion in der Biosynthese (der Entgiftung von endogen synthetisiertem DIBOA), eine wesentliche Rolle in der Entgiftung von exsudiertem DIMBOA in der Rhizosphäre haben. Mittlerweile liegt für Zm BX8 eine Transposon Insertions mutante ( loss-of-function ) vor (B. Meeley, Pioneer Hi Bred). Für Zm BX9 wurden in dieser Arbeit amiRNA ( artificial micro-RNA ) knockdown Mutanten generiert. Erste Untersuchungen zeigen für zwei unabhängige T1 Linien eine ca. 10 fache Reduktion der ZmBx9 Genexpression bei unveränderter ZmBx8 Genexpression (Daten nicht gezeigt). Die Analyse des Phänotyps der ZmBx8 und ZmBx9 Mutanten wird Aufschluss über die eventuell unter schiedlichen Funktionen der Z. mays Benzoxazinoid Glucosyltransferasen in planta geben.
H. lechleri synthetisiert ausschließlich DIBOA. Die partiell gereinigte Benzoxazinoid Glucosyltransferase Aktivität aus H. lechleri akzeptiert sowohl DIBOA als auch das Methoxyderivat DIMBOA als Substrat. Für DIMBOA (87 M) wird sogar eine ca. 3 fach höhere Affinität bestimmt als für das endogene Substrat DIBOA (264 M; Leighton et al ., 1994). Die Benzoxazinoid UGTs von Z. mays und T. aestivum weisen einen gemeinsamen Vorläufer auf. Man kann deshalb auch einen gemeinsamen Vorläufer der UGTs von Z. mays , T. aestivum und H. lechleri postulieren. Für die beiden Enzyme, die in Z. mays zur Biosynthese von GDIMBOA eingesetzt werden, die 2 Oxoglutarat abhängige Dioxygenase Zm BX6 und die O Methyltransferase Zm BX7 finden sich in den Datenbanken der Triticeae zurzeit keine homologen Proteine. Es kann daher spekuliert werden, dass dieser Teil der Biosynthese, im Gegensatz zur Core Biosynthese von GDIBOA, unabhängig in den Gräsern entstanden ist. Die Funktion des Benzoxazinoid UGT Vorläufers der Gräser wäre dann zunächst die Detoxifizierung von DIBOA gewesen. Mit einer geringeren Aktivität hätte die Vorläufer UGT wahrscheinlich auch das Methoxyderivat DIMBOA glucosyliert, was zu diesem Zeitpunkt aber noch keine biologische Funktion gehabt hätte. Mit der Ausbildung der DIMBOA Biosynthese in Z. mays und T. aestivum hätte sich die Notwendigkeit der Detoxifizierung des Endprodukts ergeben, so dass die UGTs aus Z. mays und T. aestivum zunehmend auch DIMBOA mit hohen Effizienzen glucosylierten. Da in H. lechleri keine DIMBOA Biosynthese evolviert hat, könnte die DIMBOA Glucosylierungsaktivität auf die Diskussion 73
Enzymeigenschaften der Vorläufer UGT der Gräser zurückgeführt werden. Da H. lechleri zur Gräserkommunität gehört und vergesellschaftet mit anderen GDIMBOA synthetisieren Spezies, wie z.B. der Quecke ( Agropyron repens ) wächst, ergibt sich eine andere Erklärungsmöglichkeit für die starke DIMBOA Glucosylierungsaktivität. Der Selektionsvorteil, deren exsudierte Benzoxazinoide zu entgiften, kann zu der Ausprägung der DIMBOA Glucosylierungsaktivität geführt haben.
Auch C. orientalis synthetisiert nur GDIBOA. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Co BX8 das endogene Substrat DIBOA mit einer höheren Effizienz glucosyliert als dessen Derivat
DIMBOA. Sowohl die Affinität als auch die katalytische Effizienz kcat /Km von Co BX8 ist für DIBOA höher als für DIMBOA (ca. 7 fach bzw. ca. 4 fach). Die Enzymspezifität von Co BX8 ist, anders als die Benzoxazinoid Glucosyltransferase Aktivität aus H. lechleri , auf das endogene Biosyntheseprodukt ausgerichtet. Dieser Unterschied könnte auf eine unab hängige Evolution der UGTs aus monokotylen und dikotylen Pflanzen zurückzuführen sein.
Durch die transgene Expression von Co BX8 in A. thaliana konnte gezeigt werden, dass Co BX8 exogenes DIBOA und DIMBOA durch Glucosylierung entgiften kann. Allerdings ist die Fähigkeit der Keimlinge DIMBOA zu detoxifizieren weniger stark ausgeprägt als die Fähigkeit DIBOA zu detoxifizieren (Abbildung 17). Diese Beobachtung stimmt mit der niedrigeren katalytischen Effizienz, mit der Co BX8 DIMBOA in vitro glucosyliert, überein.
Die Genexpression von CoBx8 deutet auf eine Funktion von Co BX8 in der Biosynthese und in der Entgiftung von Benzoxazinoiden hin. Weder das Expressionsmuster von CoBX8 noch von Zm BX8/BX9 stimmen mit der Expression der jeweiligen Biosynthesegene überein. CoBx8 ist am stärksten im Keimling exprimiert und nimmt von der Blüte zur Wurzel weiter ab (Abbildung 23). Das Verhältnis der CoBx8 Genexpression im Keimling und der Blüte entspricht dem Verhältnis der DIBOA Neusyntheserate von Keimling (ca. 1,4 g/g FG) und Blüte (ca. 0,5 g/g FG; Schullehner et al ., 2008). Die Neusyntheserate in der Wuzel wurde nicht untersucht, jedoch konnte aus der Wurzel kein DIBOA isoliert werden. Auch CoBx1, das Branchpoint Enzym des DIBOA Biosynthesewegs, ist in diesem Gewebe nur schwach exprimiert (Schullehner et al ., 2008). Es kann daher davon ausgegangen werden, dass in der Wurzel keine GDIBOA Biosynthese stattfindet. Die Rolle von Co BX8 in der Wurzel liegt daher wahrscheinlich nicht in der Biosynthese, sondern vor allem in der Entgiftung von Benzoxazinoiden in der Rhizosphäre.
Die Expressionsstärke von CoBx8 liegt in derselben Größenordnung wie diejenige von ZmBx8 und ZmBx9 aus Z. mays . Auch in Z. mays findet man eine ausgeprägte Glucosyl transferase Aktivität in der Wurzel. ZmBx8 und ZmBx9 sind im Keimling im Spross und in der Wurzel exprimiert, während die Expression der Bx Gene ZmBx1-Bx5 dagegen bevorzugt im Diskussion 74
Spross nachweisbar ist (Frey et al ., 1995; von Rad et al ., 2001). Auch für die zusätzlich Glucosyltransferase Aktivität von Zm BX8 und Zm BX9 in der Wurzel wurde eine Funktion in der Entgiftung angenommen (von Rad et al ., 2001)
1.4 CoBx8 CoGlu1 1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
Transk ript / CoGAPDH 0.2
0.0
Keimling Blüte Wurzel Abbildung 23: CoGlu1 und CoBx8 Genexpression in unterschiedlichen Pflanzenorganen von C. orientalis . Die Messung der Transkriptkonzentration wurde in Duplikaten mit drei biologischen Replikaten durchgeführt.
Die UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen aus monokotylen und dikotylen Pflanzen unterscheiden sich also in ihrer Substratspezifität, haben aber eine duale Funktion gemeinsam: Sie katalysieren einen essentieller Biosyntheseschritt in der Benzoxazinoid Biosynthese und detoxifizieren exogene Benzoxazinoide, mit denen sie als Allelochemikalien in Berührung kommen.
4.1.2 Evolution von UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen
UGTs stellen Genfamilien mit mehr als 100 Mitgliedern in A. thaliana , M. truncatula und O. sativa dar. Zur Analyse der pylogenetischen Stellung von Zm BX8, Zm BX9, Ta BX8, Co BX8 und p Lg BX8 wurden pflanzliche UGTs mit experimentell nachgewiesener Funktion und ihnen nah verwandte Enzyme aus anderen Spezies herangezogen. Weiterhin wurden UGTs aus dem Primärstoffwechsel als outgroup miteinbezogen. Die Analyse ergibt 4 große Hauptäste (Abbildung 24). Drei der Hauptäste enthalten ausschließlich UGTs des Primärstoffwechsel, nämlich die Sucrosephosphat Synthasen (Hauptast 1), die Sucrose Synthasen (Hauptast 2) und die UDPG:Protein Transglucosylasen (Hauptast 3). Der vierte Hauptast enthält UGT Sequenzen verschiedener Funktionen des Primär und Sekundärstoffwechsels. Die UGTs verzweigen sich zunächst in die Hauptäste 1 und 2, die Diskussion 75
Transglucosidasen (Zucker Zucker Glycosylierung) sowie in die Hauptäste 3 und 4, die Transferasen (Zucker Protein, oder Zucker Aglucon Glycosylierung).
Abbildung 24: Phylogenetischer Stammbaum von UGTs. Die Maximum-Likelihood Bäume wurden nach dem Alignment der Aminosäuresequenzen mit MUSCLE (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/ 15034147) mit dem Programm RAXML (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ pubmed/16928733) erstellt. Die gefüllten Kreise an den Verzweigungspunkten geben an, bei wie viel Prozent der durchgeführten 1000 Replikate eine Verzweigung existiert ( bootstrap Wert). Werte unter 50% sind nicht gezeigt. Der Abstandsbalken unter dem Baum gibt die Anzahl der Aminosäuresubstitutionen pro Position an. Monokotyle Sequenzen sind durch grüne Äste gekennzeichnet, dikotyle Sequenzen durch rote Äste und Sequenzen aus Gymnospermen durch graue Äste. Die Zuordnung mutmaßlicher Funktionen zu einzelnen Ästen erfolgt basierend auf der experimentell gezeigten Funktion von Ast Mitgliedern. Quadrate bei den Enzymnamen kennzeichnen biochemisch charakterisierte Enzyme. UGTs, die an der Biosynthese von cyanogenen Glycosiden (CG) beteiligt sind, sind schwarz markiert, UGTs, die Benzoxazinoide (BX) glucosylieren, sind in blauer Farbe dargestellt. Für die phylogenetische Analyse der UGTs wurden vor allem UGTs der Familie 1 mit definierter biochemischer Funktion und nahe Verwandte aus anderen Spezies verwendet. Zusätzlich wurden Mitglieder der UGT Familie 4 mit einbezogen, die dem Primärstoffwechsel zuzuordnen sind (Sucrosephosphat Synthase, Sucrose Synthase und UDPG Protein Transglucosylase). Die Sequenzen sind mit den empfohlenen Abkürzungen bezeichnet (Abbildung 29; Anhang). Diskussion 76
In allen Hauptästen sind Sequenzen von monokotylen und dikotylen Pflanzen enthalten, was bedeutet, dass die Trennung der UGTs in die 4 Hauptäste vor der Trennung der Angiospermen in monokotyle und dikotyle Pflanzen stattgefunden hat. Für die Hauptäste ist jeweils ein gemeinsamer Vorläufer zu postulieren. Die Vorläufer der Hauptäste 1 3 durchliefen eine lange Spezialisierung, an die sich nur noch wenige speziesspezifische Modifikationen angeschlossen haben (kurze Astlängen). Die UGTs dieser Familien sind daher stark konserviert.
Der Hauptast 4 enthält viele UGTs, die in der Homöostase der Hormonklassen Auxine und Cytokinine involviert sind. Diese finden sich eingestreut in Äste mit UGTs, die Flavonoide, Hydrochinone, Terpene, cyanogene Glycoside und Benzoxazinoide glycosylieren. Der UGT Vorläufer dieses Asts muss ursprünglich ein breites Substrat Spektrum aufgewiesen haben. Duplikationen und anschließende Spezialisierung resultieren in der großen UGT Genfamilie. Die ursprüngliche Flexibilität der UGTs wird z.B. dadurch deutlich, dass für die Cytokinin Glucosylierung in verschiedenen Spezies, und für unterschiedliche Regiospezifitäten (O bzw. N Glucosylierung) jeweils unterschiedliche UGT Vorläufer rekrutiert wurden. Ein anderes Beispiel für die Flexibilität der UGTs ist die Spezialisierung der A. thaliana Flavonol 3 O Glucosid L Rhamnosyltransferase ( At FORT) aus der A. thaliana Flavonoid 3 O Glucosyltransferase nach der Duplikation des UGT Vorläufers. Der Datensatz von Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen wurde durch die Flavonoid Glucosyltransferasen Co GT und Lg GT aus C. orientalis und L. galeobdolon erweitert. Co GT und Lg GT finden sich zusammen mit Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen und der Flavonol Glucosid Rhamnosyltransferase aus A. thaliana in einem getrennten Ast wieder. Die Regiospezifität von Co GT und Lg GT für die Flavonoid Glucosylierung wurde nicht untersucht, jedoch kann aufgrund der Gruppierung mit Flavonoid 3 O Glucosyltransferasen eine Spezifität für die 3 OH Gruppe angenommen werden. Die Anordnung der Flavonoid Glucosyltransferase Äste der verschiedenen Spezies folgt der Phylogenie der Angiospermen. Der Ast unterteilt sich zunächst – analog zu der Trennung monokotyler und dikotyler Pflanzen – in UGTs dikotyler und monokotyler Pflanzen. Bei den dikotylen UGTs clustern z.B. die UGTs von L. galeobdolon , P. hybrida und G. triflora miteinander. Diese Spezies sind in der Phylogenie der Angiospermen den Ordnungen Lamiales, Solanales und Gentianales zugeordnet, die die Gruppe der Euasteriden I innerhalb den Asteriden bilden (Abbildung 3). Die Flavonoid Glucosyltransferasen weisen daher eine monophyletische Evolution mit einem gemeinsamen UGT Vorläufer von monokotylen und dikotylen Pflanzen auf. Im Vergleich zu den UGTs des Primärstoffwechsels in den Hauptästen 1 3 sind die Flavonoid Glucosyltransferasen weniger stark konserviert.
Im Gegensatz dazu finden sich Co BX8, sowie Zm BX8 und Zm BX9, je in Ästen mit UGTs von monokotylen und dikotylen Pflanzen. Die beiden jeweiligen Vorläufer UGTs müssen also vor Diskussion 77 der Aufspaltung von dikotylen und monokotylen Pflanzen existiert haben. In den Gräsern und in C. orientalis wurde auf distinkte Vorläufer UGTs zurückgegriffen. Die Position von Ta BX8 zeigt dagegen, dass die Benzoxazinoid UGT der Gräser einen monophyletischen Ursprung aufweist.
In beiden BX8 Ästen befinden sich Cytokinin UGTs von A. thaliana . Im Co BX8 Ast ist zusätzlich zur Cytokinin UGT At COGT2 aus A. thaliana die Cyanohydrin UGT Sb HMNGT aus S. bicolor lokalisiert. Auch für die Vorläufer der Benzoxazinoid UGTs aus C. orientalis Co BX8 und der Benzoxazinoid UGTs aus den Gräsern Zm BX8, Zm BX9 und Ta BX8 muss eine große Flexibilität bezüglich des Substratspektrums angenommen werden. Der UGT Vorläufer von Co BX8 wurde für die Glucosylierung von Benzoxazinoiden ( Co BX8), die O Glucosylierung von Cytokininen ( At CoGT2), und für die Glucosylierung von Cyanohydrin in der Dhurrin Biosynthese ( Sb HMNGT) rekrutiert. Der Vorläufer von Zm BX8, Zm BX9 und Ta BX8 evolvierte in die Glucosylierungsfunktion von Benzoxazinoiden ( Zm BX8, Zm BX9 und Ta BX8) und die N Glucosylierungsfunktion von Cytokininen ( At CNGT2 und At CNGT2). Die Benzoxazinoid UGTs haben jedoch keine Enzymaktivität für das Cytokinin Zeatin (diese Arbeit). Aufgrund der Verbindung der Benzoxazinoid Biosynthese und der Tryptophan/Auxin biosynthese kann spekuliert werden, dass die Benzoxazinoid UGTs in die Auxinhomöostase involviert sind. Indol 3 Essigsäure wird jedoch nicht von den Glucosyltransferasen umgesetzt (Co BX8: diese Arbeit; Zm BX8 und Zm BX9: von Rad et al ., 2001). Auch Flavonoide, als weit verbreitete Substrate von UGTs, werden von Co BX8, Zm BX8 und Zm BX9 nicht glucosyliert (diese Arbeit; von Rad et al ., 2001). Die Benzoxazinoid UGTs weisen nach bisherigen Untersuchungen eine strikte Substratspezifität für Benzoxazinoide auf. Sie haben wahr scheinlich im Laufe der Spezialisierung die breitere Substratspezifität des Vorläufers verloren. Die Unterschiede von Co BX8, Zm BX8 und Zm BX9 bezüglich der Substratspezifität gegenüber Benzoxazinoiden können Unterschiede der Ausgangssequenz widerspiegeln.
Über die ursprüngliche Hauptfunktion des UGT Vorläufers kann nur gemutmaßt werden. Da sich Benzoxazinoid UGTs aus C. orientalis und den Gräsern jeweils in einem Ast mit Cytokinin UGTs befinden, kann eine der Funktionen der Vorläufer UGT die Glycosylierung von Phytohormonen gewesen sein. Weitere Phytohormon UGTs finden sich verstreut in verschiedenen Ästen des Stammbaums wieder. Möglicherweise war auch der weiter zurückliegende UGT Vorläufer in die Phytohomon Homöostase involviert.
Die putative Benzoxazinoid UGT aus L. galeobdolon pLg BX8 befindet sich ebenfalls in dem Hauptast 4, doch ist p Lg BX8 auf einen anderen UGT Vorläufer zurückzuführen als die Benzoxazinoid UGTs Co BX8, Zm BX8, Zm BX9 und Ta BX8. Der p Lg BX8 Vorläufer hat sich sehr früh von den anderen UGTs des Hauptasts 4 getrennt. Die Bestätigung der Funktion Diskussion 78 von p Lg BX8 in der Benzoxazinoid Biosynthese kann die unabhängige Evolution der Detoxifizierungsfunktion in monokotylen und dikotylen Pflanzen weiter belegen.
4.2 Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen von monokotylen und dikotylen Pflanzen
4.2.1 Substratspezifität gegenüber Benzoxazinoid Glucosiden
In C. orientalis und S. cereale bildet GDIBOA das Hauptbenzoxazinoid Substrat der
β Glucosidasen Co GLU1 und Sc GLU. Beide Enzyme haben hohe Km Werte (4,6 mM bzw. 0,8 – 2,8 mM; Nikus et al ., 2003). In Anbetracht der hohen GDIBOA Konzentrationen in C. orientalis (z.B. 24 mmol/kg FG in jungen Blättern und 36 mmol/kg FG in der Blüte; Schullehner et al ., 2008) und S. cereale (0,5 bis 6 mmol/kg FG im Keimling und in der Wurzel; Zúñiga et al ., 1983; Pérez und Ormenoñuñez, 1991; Leighton et al ., 1994; Sue et al .,
2000) stehen die relativ hohen Km Werte jedoch nicht mit der Funktion der Enzyme in der Bioaktivierung der Benzoxazinoid Glucoside in Widerspruch.
Von allen Pflanzen, für die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen charakterisiert wurden, ist C. orientalis die einzige, die ausschließlich GDIBOA bildet. Der Affinität von Co GLU1 ist gegenüber GDIBOA ca. 10 fach höher als für GDIMBOA. GDIBOA ist also das von Co GLU1 am effektivsten umgesetzte Substrat. Der kcat Wert für GDIBOA liegt im Bereich von Zm GLU1, die hohen Werte von Ta GLU1a c werden nicht erreicht. Die effizientere Umsetzung des hauptsächlich vorkommenden Benzoxazinoid Glucosids wurde auch für die β Glucosidasen aus T. aestivum Ta GLU1a c gezeigt (Sue et al ., 2006). Die gereinigte β Glucosidase Zm GLU1 aus Z. mays weist GDIMBOA gegenüber eine höhere Affinität auf als GDIBOA gegenüber (Oikawa et al ., 1999). Im Gegensatz dazu wurden für Sc GLU etwa gleich hohe Affinitäten für die Substrate GDIBOA und GDIMBOA beschrieben (Nikus et al ., 2003; Sue et al ., 2006). Damit in Einklang werden aus S. cereale beide Benzoxazinoid Glucoside isoliert. Während in den Blättern ausschließlich GDIBOA vorkommt, werden in der Wurzel beide Benzoxazinoid Glucoside gefunden (Copaja et al ., 2006). Die katalytischen Parameter der β Glucosidasen aus C. orientalis , Z. mays , T. aestivum und S. cereale spiegeln damit das jeweilige Benzoxazinoid Muster wieder.
4.2.2 Substratspezifität außerhalb der Benzoxazinoid Glucoside
In Bezug auf Substrate außerhalb der Benzoxazinoid Biosynthese ist Zm GLU1 am besten untersucht. Zm GLU1 wurde zeitgleich als Zm p60.1 (Campos et al ., 1992; Brzobohatý et al ., Diskussion 79
1993) isoliert. Zm p60.1 hydrolysiert Hormon Glycoside und spielt damit auch eine Rolle in der Pflanzenhormon Homöostase (Brzobohatý et al ., 1993).
Zm GLU1 und Co GLU1 hydrolysieren weitere Substrate, unterschieden sich aber in der Substratspezifität und den kinetischen Parametern (Tabelle 29). Zm GLU1 hydrolysiert, zusätzlich zu Benzoxazinoid Glucosiden, die Cytokinin Glycoside trans Zeatin O Glucosid (tZOG), Zeatin O β Glucosid Ribosid (ZOGR) und Kinetin 3 β Glucosid (K3G; Brzobohatý et al ., 1993). Die Km Werte von Zm GLU1 für tZOG (Kiran et al ., 2006; Mazura et al ., 2006) liegen in derselben Größenordnung wie der Km Wert für GDIMBOA (0,098 ± 0,01 mM; Cicek et al ., 2000). Auch Co GLU1 hydrolysiert das Phytohormon Glucosid tZOG. Dieses wird jedoch mit einer ca. 100 fach geringeren Umsatzgeschwindigkeit hydrolysiert als GDIBOA.
Tabelle 29: Zusammenfassung der veröffentlichten und in dieser Arbeit gemessenen kinetischen Daten und Umsatzgeschwindigkeiten von Zm GLU1 und Co GLU1 für verschiedene Substrate. Für die Bestimmung der Umsatzgeschwindigkeit von GDIBOA, Dhurrin und trans Zeatin O Glucosid wurden die Substrate in einer Konzentration von 500 M eingesetzt.
Substratklasse / Enzym Zm GLU1 Co GLU1
Benzoxazinoide GDIMBOA : GDIBOA :
Km = 0,098 ± 0,01 mM Km = 4,6 ± 0,4 mM (Cicek et al ., 2000) v = 6030 ± 359 nmol min 1 mg 1 (diese Arbeit)
Cytokinin Glycoside trans Zeatin O Glucosid: trans Zeatin O Glucosid: 1 1 Km = 0,063 mM v = 60,8 ± 1,8 nmol min mg (Kiran et al ., 2006) (diese Arbeit)
Km = 0,697 ± 0,0413 mM (Mazura et al ., 2006)
Cyanogene Glycoside Dhurrin: Dhurrin: kein Umsatz v = 5684 ± 116 nmol min 1 mg 1 kompetitive Hemmung gemischte Hemmung (Babcock und Esen, 1994) (diese Arbeit)
Zm GLU1 ist nahe verwandt zu der S. bicolor Glucosidase Sb GLU1, die das cyanogene Glycosid Dhurrin hydrolysiert. Zm GLU1 weist gegenüber dem cyanogenen Glycosid Dhurrin von S. bicolor und den cyanogenen Glycosiden Linamarin und Prunasin keine Hydrolyse aktivität auf (Babcock und Esen, 1994). Im Gegensatz dazu wurde für Co GLU1 zusätzlich zu der GDIBOA Umsetzung die Hydrolyse von Dhurrin gemessen. Dieses wird mit einer ähnlichen Umsatzgeschwindigkeit hydrolysiert wie GDIBOA. Auch Co GLU2 hydrolysiert Diskussion 80
Dhurrin. Die Umsatzgeschwindigkeit ist ca. 6 fach geringer als für Co GLU1. Möglicherweise wird Dhurrin häufig von β Glucosidasen als Nebenreaktion hydrolysiert.
Obwohl Zm GLU1 Dhurrin nicht umsetzt, wird die GDIMBOA Hydrolyse durch Dhurrin kompetitiv gehemmt (0,054 ± 0,005 mM; Babcock und Esen, 1994). Von Co GLU1 wird Dhurrin umgesetzt; dieses wirkt zusätzlich als Hemmstoff für die GDIBOA Hydrolyse. Für die Hemmung der Co GLU1 wird im Unterschied zu Zm GLU1 eine gemischte Hemmung gezeigt
(0,213 mM (K i1 ; kompetitiv) und 0,278 mM (K i2 ; unkompetitiv). Die Hemmung der Benzoxazinoid Hydrolyse von Co GLU1 durch Dhurrin ist damit ca. 5 fach geringer ausgeprägt als bei Zm GLU1 und weist einen unterschiedlichen Hemmtypus auf. Die unkompetitive Komponente der gemischten Hemmung der Co GLU1 kann durch den Reaktionsmechanismus von GH1 β Glucosidasen erklärt werden (McCartera und Withersa, 1994; Sinnott, 1990). Der Mechanismus ist durch zwei verschiedene Enzym Substrat Komplexe gekennzeichnet: Zunächst bildet sich ein Enzym Glucosid Enzymkomplex aus, in dem Enzym und Glucosid nicht kovalent aneinander gebunden vorliegen. Nach der Katalyse und der Freisetzung des Aglucons (Glucosylierung) bleibt zunächst ein kovalenter Enzym Glucosyl Komplex, in dem die Bindestelle des Aglucons nun frei für die Bindung eines Hemmstoffes ist. Dieser Komplex wird anschließend in einem zweiten Schritt durch den Angriff eines Wasser Moleküls hydrolysiert (Deglucosylierung).
4.2.3 Funktion von Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen
Zm GLU1 katalysiert in vitro die Hydrolyse von Benzoxazinoid Glucosiden und Cytokinin Glycosiden. Die Isolation als Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase erfolgte durch die Reinigung des Enzyms aus Blättern (Cuevas et al ., 1992) und die Isolation als Cytokinin Glycosid Hydrolase erfolgte durch Photoaffinitätsmarkierung mit einem lichtaktivierbaren IAA Analog (Campos et al ., 1992). Zm GLU1 weist eine starke Homologie zu Ta GLU1a c und Sc GLU auf, die über ihre Funktion, Benzoxazinoid Glucoside in vitro mit hohen Effizienzen zu hydrolysieren, isoliert wurden (Nikus et al ., 2003; Sue et al ., 2006). Zm GLU1 stellt daher wahrscheinlich eine β Glucosidase mit dualer Funktion dar.
Co GLU1 hydrolysiert in vitro Benzoxazinoid Glucoside, das Cytokinin Glycosid tZOG und das cyanogene Glycosid Dhurrin. Co GLU1 wurde durch das Screening von β Glucosidase Kandidaten isoliert. C. orientalis synthetisiert große Mengen an Benzoxazinoiden (Schul lehner et al ., 2008). Dhurrin wird von C. orientalis nach bisherigen Kenntnissen nicht gebildet und stellt daher kein potentielles Substrat für Co GLU1 dar. Da tZOG mit einer 100 fach geringeren Umsatzgeschwindigkeit hydrolysiert wird als GDIBOA, ist die tZOG Hydrolyse als eine Nebenaktivität anzusehen. Die Funktion von Co GLU1 in planta besteht aus diesem Diskussion 81
Grund aller Wahrscheinlichkeit nach in der Bioaktivierung von GDIBOA. Die Genexpression von CoGlu1 in Pflanzenorganen mit hohen GDIBOA Gehalten belegt diese Annahme. CoGlu1 ist stark im Keimling (0,6 pg/pg GAPDH) und in der Blüte (0,9 pg/pg GAPDH) exprimiert (Abbildung 23). Damit in Einklang wird der höchste GDIBOA Gehalt in C. orientalis in der Blüte gemessen (34 mmol/kg FG in der Blüte; Schullehner et al ., 2008). In der Wurzel, aus der kein DIBOA isoliert wird, ist CoGlu1 nur sehr schwach exprimiert.
Eine Funktion von Co GLU1 außerhalb der Benzoxazinoid Biosynthese ist nicht stringent auszuschließen, dazu ist die Analyse von Mutanten notwendig. C. orientalis konnte bisher nicht erfolgreich transformiert werden (Schullehner et al ., 2008). Auch andere in vitro gezeigten Hydrolaseaktivitäten konnten bisher nur in Einzelfällen durch in vivo-Experimente bestätigt werden. Die Funktion einer β Glucosidase des Abwehrsystems cyanogene Glucoside konnte in planta nachgewiesen werden. Die Dhurrinase Aktivität von Sb DHR1 aus S. cereale konnte durch die Expression in H. vulgare verifiziert werden. H. vulgare Keimlinge synthetisieren das cyanogene Glycosid Epiheterodendrin (Ibenthal et al . 1993; Nielsen et al . 2002), enthalten aber keine detektierbare cyanogene Glycosid β Gucosidase Aktivität (Nielsen et al . 2002). Die Expression der S. bicolor Dhurrinase 1 in H. vulgare stellt die Cyanogenese in H. vulgare wieder her, und führte in der Folge zu einer Reduktion der Kolonisationsrate von Blumeria graminis , dem Erreger des echten Mehltaus, um 35 60% (Nielsen et al ., 2006).
4.2.4 Evolution von β Glucosidasen
Für die Analyse der Evolution der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen wurde Co GLU1 in einen Datensatz von veröffentlichten β Glucosidase Sequenzen aus den Abwehrsystemen Benzoxazinoid Glucoside, cyanogenen Glycosiden, Glucosinolaten und Saponinen aufgenommen. Zusätzlich wurden manuell reannotierte β Glucosidasen aus A. thaliana (Xu et al ., 2004) und O. sativa (Opassiri et al ., 2006), sowie weitere β Glucosidase Sequenzen aus der Uniprot Datenbank mit einbezogen. Diskussion 82
Abbildung 25: Phylogenetischer Stammbaum von β Glucosidasen. Die Berechnung und Darstellung des Stammbaums ist analog dem UGT Stammbaum (Abbildung 24). Monokotyle und dikotyle β Glucosidasen weisen unterschiedliche Signalpeptide auf, weswegen diese vor der Analyse entfernt wurden. Quadrate bei den Enzymnamen kennzeichnen biochemisch charakterisierte Enzyme. Enzyme, die cyanogenen Glycosiden (CG) bioaktivieren sind schwarz markiert, Enzyme die Benzoxazinoid Glucosiden (BX) bioaktivieren sind in blauer Farbe dargestellt. Für die phylogenetische Analyse der β Glucosidasen wurden Sequenzen von Enzymen mit veröffentlichter Funktion, und in Uniprot (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19843607) annotierte Enzyme eingesetzt. Die Sequenzen sind mit den empfohlenen Abkürzungen bezeichnet (Abbildung 30; Anhang).
Diskussion 83
Die phylogenetische Analyse ergibt zunächst eine Aufspaltung der zwei β Glucosidasen At SRF2 und Os SRF2 aus A. thaliana und O. sativa und der restlichen untersuchten β Glucosidasen (Abbildung 25). Es wurde gezeigt, dass die sensitive to freezing 2-1 (sfr2 1) Mutation in A. thaliana eine Sensitivität gegenüber Frost verursacht (Thorlby et al ., 2004). At SRF2 und Os SRF2 zeigen höhere Homologie gegenüber β Glucosidasen aus thermophilen Archäen und Bakterien auf, als gegenüber pflanzlichen β Glucosidasen (Thorlby, et al ., 2004). Der Vorläufer der restlichen β Glucosidasen spaltet bootstrap unterstützt weiter in zwei große Hauptäste auf. Der erste Hauptast (Hauptast 1) enthält nach bisherigem Kenntnisstand β Glucosidasen des Primärmetabolismus, während der zweite Hauptast (Hauptast 2) bis auf eine Ausnahme – einer als Exoglucanase beschriebenen β Glucosidase (Opassiri et al ., 2006) – ausschließlich β Glucosidasen des Sekundärmetabolismus enthält.
Der Hauptast 1 spaltet sich in einen Ast, der β Mannosidasen enthält und einen Ast in dem sich β Glucosidasen des Phenylpropan Metabolismus finden. Zu letzterem gehören z.B. die Coniferin β Glucosidase Ps CBG aus Pinus contorta (Küsten Kiefer), die Monolignol Glucosid β Glucosidasen At BGLU45 und At BGLU46 und die Scopolin β Glucosidase Os BGLU21. Die Evolution beider Äste ist durch eine Vielzahl an Duplikationen und Diversifikationen ausgezeichnet. In beiden Ästen sind β Glucosidase Sequenzen aus monokotylen und dikotylen Pflanzen vorzufinden. Die Lignifizierung ist ein sehr alter Prozess in der Pflanzen evolution, der nach der Landnahme der Pflanzen entstanden ist. Da in den Ast der β Glucosidasen des Phenylpropan Metabolismus auch eine β Glucosidase aus Pinus contorta , einer Gymnosperme gruppiert, hat die Spaltung der β Glucosidasen in Vorläufer des Sekundär und Primärmetabolismus zwischen der Landnahme der Pflanzen und der Aufspaltung der Pflanzen in Gymnospermen und Angiospermen stattgefunden. Aus den phylogenetischen Bäumen kann geschlossen werden, dass die β Glucosidase Vorläufer ursprünglich ein sehr breites Substrat Spektrum akzeptierten. Wenige β Glucosidasen waren wahrscheinlich in verschiedenste biologische Prozesse, wie die Phytohormon Homöostase, der Bioaktivierung von Phytoantizipinen und der Lignifizierung involviert. Durch eine Reihe von Duplikationen entstanden in den einzelnen Spezies β Glucosidase Familien von ca. 40 Mitgliedern. Für verschiedene biologische Prozesse des Sekundär und Primärmetabolismus wurden unterschiedliche Vertreter rekrutiert, und im Laufe der Evolution fand eine Spezialisierung der Enzyme für das jeweilige Substrat statt.
Die Spezialisierung von β Glucosidase Vorläufern mit breiter Substratspezifität zu β Glucosi dasen mit spezifischen Funktionen wird z.B. bei der Betrachtung von H. lechleri deutlich. Diese Art synthetisiert das cyanogene Glycosid Epiheterodendrin (s.o.; Ibenthal et al . 1993; Nielsen et al . 2002), kann dieses aber nicht bioaktivieren, da im H. lechleri Proteom keine Diskussion 84 entsprechende β Glucosidase vorliegt (Nielsen et al ., 2006) und andere β Glucosidasen der GH1 Familie in H. lechleri keine ausreichend breite Substratspezifität für diese Reaktion aufweisen.
Der Hauptast 2 mündet in β Glucosidase Sequenzen verschiedenster Funktionen des Sekundärmetabolismus. Glucosinolat bioaktivierende β Glucosidasen (Myrosinasen) bilden einen getrennten Ast, der ausschließlich Sequenzen der Brassicaceaen A. thaliana , S. alba und B. napus enthält. Diese β Glucosidasen scheinen in den Brassicaceaen monophyletisch durch eine Reihe von Duplikationen aus einem Myrosinase Vorläufer Gen entstanden zu sein. Die Lokalisation einer weiteren Myrosinase At PEN2 in einem anderen Unterast des Hauptasts 2 macht die ursprüngliche Flexibilität der β Glucosidasen deutlich, da in A. thaliana unterschiedliche Vorläufer Enzyme für die gleiche Substratspezifität rekrutiert werden konnten. In einem zweiten Ast finden sich ebenfalls nur β Glucosidasen einer Pflanzenfamilie, nämlich der Poaceae. Hier sind jedoch β Glucosidasen verschiedener Funktionen, nämlich der Bioaktivierung von Benzoxazinoiden, cyanogenen Glycosiden und Avenacosiden vertreten. Die Phylogenie der β Glucosidasen in diesem Ast folgt nicht ihrer Funktion, sondern der Phylogenie der Poaceae. So weisen z.B. die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen Zm GLU1 und Zm GLU2 aus Z. mays eine engere phylogentische Verwandtschaft zu den Dhurrinasen Sb DHR1 und Sb DHR2 aus dem näher verwandten S. bicolor auf als zu den Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen Ta GLU1a c aus dem weiter entfernt verwandten T. aestivum .
Cyanogene Glycoside bioaktivierende β Glucosidasen sind in dem Hauptasts 2 sehr stark vertreten. Cyanogene Glycoside sind eine Substanzklasse von Sekundärmetaboliten, die in monokotylen und dikotylen Pflanzen vorkommen. Die Substanzklasse zeichnet sich durch ein Kohlenstoffatom aus, das mit einem Zucker verestert ist, und die charakteristische Nitrilgruppe trägt. Die weiteren funktionellen Gruppen des Kohlenstoffatoms sind familienspezifisch (z.B. Phenol und Wasserstoff Atom bei Dhurrin, zwei Methylgruppen bei Linamarin; Abbildung 1). Die cyanogene Glycoside bioaktivierenden β Glucosidasen in den 4 Ästen gehören entweder zu dikotylen oder zu monokotylen Pflanzen, und könnten daher nach der Trennung der monokotylen und dikotylen Pflanzen evolviert sein.
Benzoxazinoid Glucosid bioaktivierende Enzyme sind die einzigen β Glucosidasen, für die mehrere Vertreter aus monokotylen Pflanzen ( Zm GLU1, Zm GLU2, Sc GLU und Ta GLU1a c) und mit dieser Arbeit nun ein Vertreter aus einer dikotylen Pflanzen ( Co GLU1) bekannt sind. Während sich die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen der Gräser alle in einem klar definierten Ast finden, kann für Co GLU1 aus C. orientalis keine Subfamilie bestimmt werden. Für die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen aus Gräsern und C. orientalis wurden unter Diskussion 85 schiedliche Vorläuferenzyme rekrutiert, denn die jeweiligen Vorläufer Enzyme sind bereits vor der Trennung von monokotylen und dikotylen Pflanzen zu finden. Über die ursprüngliche Hauptfunktion der jeweiligen Vorläufer kann nur spekuliert werden. Da Zm GLU1 und Co GLU1 beide Cytokinin Glycoside hydrolysieren kann auch für den Vorläufer der Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen eine Rolle in der Phytohormon Homöostase angenommen werden.
4.3 Evolution der DIBOA Glucosid Biosynthese in Angiospermen
Die DIBOA Glucosid Biosynthese kann in drei Module unterteilt werden, die Branchpoint Reaktion, die Modifikation hin zu dem toxischen DIBOA und die Detoxifizierung von DIBOA durch Glucosylierung. Für die Funktion der Benzoxazinoide in der Pflanzenabwehr ist weiterhin die Bioaktivierung der Glucoside notwendig.
Das Branchpoint Enzym der Benzoxazinoid Biosynthese, BX1 stellt eine Indol 3 Glycerinphosphatlyase (IGLs) dar, welche die Spaltung von Indol 3 Glycerinphosphat in freies Indol und Glycerinaldehyd 3 Phosphat katalysiert. Indol ist das erste Intermediat der DIBOA Glucosid Biosynthese. Es wird in der Tryptophanbiosynthese durch die α Untereinheit der Tryptophan Synthase (TSA) gebildet und im Tryptophan Synthase Komplex sofort in Tryptophan umgesetzt, ohne dass freies Indol entsteht. In Pflanzen finden sich meist mehrere TSA Homologe. In A. thaliana , C. orientalis , L. galeobdolon , Z. mays , T. aestivum und H. lechleri weisen die TSA Homologen katalytische Eigenschaften auf, die die Bildung von freiem Indol erlauben (Schullehner et al ., 2008; Frey et al ., 2000). Die Indolbiosynthese kann daher als erweiterte Grundausstattung der Pflanzen angesehen werden. Der Vergleich der DIBOA Biosynthese von C. orientalis , L. galeobdolon und der Gräser zeigt, dass jeweils auf andere Igl Gene für die Branchpoint Reaktion zurückgegriffen wurde, das anschließend eine Neofunktionalisierung im Sekundärmetabolismus erfahren hat (Gierl und Frey, 2001). In der Biosynthese von Pyrrolizidinalkaloide findet man ein weiteres Beispiel für die polyphyletische Evolution des Branchpoint Enzyms. Die Homospermidin synthasen (HSS) sind in verschiedenen Familien der Angiospermen unabhängig voneinander durch Genduplikationen der Deoxyhypusinsynthase (DHS) aus dem Primär metabolismus entstanden (Reimann et al ., 2004).
Indol wird anschließend in vier Hydroxylierungsreaktionen in DIBOA umgesetzt. Hydroxylierungen können prinzipiell durch verschiedene Enzymklassen katalysiert werden, wie z.B. den Cytochrom P450 Enzymen und den Dioxygenasen. Die Modifikationsreaktionen in Z. mays werden durch die Cytochrom P450 Enzyme Zm Bx2 bis Zm BX5 katalysiert. Die erste Hydroxylierungsreaktion ist in dikotylen und monokotylen Pflanzen identisch und wird Diskussion 86 gleichermaßen von Cytochrom P450 Enzymen katalysiert. Die weiteren drei chemischen Reaktionen in dikotylen Pflanzen sind unbekannt. Es gibt Hinweise, dass in L. galeobdolon eine Dioxygenase involviert ist (Schullehner et al ., 2008). Dioxygenasen und Cytochrom P450 Enzyme bilden in Pflanzen große Genfamilien. Die Cytochrom P450 Enzyme bilden sogar eine der größten Genfamilien in Pflanzen; es gibt z.B. 273 Mitglieder der Genfamilie in A. thaliana (Xu et al ., 2001). Es wird angenommen, dass die Explosion der Cytochrom P450 Enzyme infolge der Landnahme der Pflanzen stattgefunden hat. (Werck Reichhart et al ., 2002). Dioxygenasen und Cytochrom P450 Enzyme katalysieren ein breites Spektrum an Reaktionen, sie sind vor allem für die Sekundärstoffbiosynthese bedeutend. Die Evolution der Modifikationsreaktionen in monokotylen und dikotylen Pflanzen ausgehend von diesem Reservoir kann erst nach Isolierung und Charakterisierung der entsprechenden Gene aus dikotylen Spezies untersucht werden.
Die Detoxifizierung und Bioaktivierung in monokotylen und dikotylen Pflanzen ist polyphyletisch evolviert. Die gezeigten unterschiedlichen Enzymeigenschaften der entsprechenden Proteine aus den Gräsern und C. orientalis könnten auf unterschiedliche Vorläufer zurückgeführt werden. Die polyphyletische Evolution lässt darauf schließen, dass die “Substratflexibilität“ und das Angebot von UGT und β Glucosidase Vorläufern groß genug war, um eine unabhängige Evolution der gleichen Funktion in unterschiedlichen Taxa zu ermöglichen. Möglicherweise ist die Existenz einer Detoxifizierungs und Bioaktivierungs funktion eine notwendige Voraussetzung für die Evolution eines Biosynthesewegs, der in einem toxischen Endprodukt resultiert.
. Zusammenfassung 87
5 Zusammenfassung
Die Benzoxazinoide DIBOA und DIMBOA sind Phytoantizipine, die in den Gräsern (Poaceae) weit verbreitet sind. Ihre Biosynthese ist für Z. mays vollständig aufgeklärt. Das erste toxische Produkt des Biosynthesewegs, DIBOA, wird von einer UDP abhängigen Glucosyltransferase (UGT) detoxifiziert und in der Vakuole gespeichert. Spezifische Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidasen sind in einem anderen zellulären Kompartimenten gelagert. Bei einem Angriff eines Herbivors oder Pathogens wird die Zellintegrität zerstört, wodurch das Benzoxazinoid Glucosid und die β Glucosidase in Kontakt kommen, und das toxische Aglucon gebildet wird (Bioaktivierung). Außerhalb der Gräser wurden Benzoxazinoide sporadisch aus wenigen Vertretern der dikotylen Pflanzen isoliert. In dieser Arbeit wurde die Detoxifizierungs und Bioaktivierungsfunktion der dikotylen Spezies Consolida orientalis und Lamium galeobdolon untersucht.
Die Benzoxazinoid Glucosyltransferasen aus C. orientalis und L. galeobdolon wurden über ihre Funktion gereinigt. Über Massenspektroskopie wurden Peptidsequenzen bestimmt. Ein Vergleich der Peptidsequenzen mit UGT Kandidatensequenzen ermöglichte die Identifizierung putativer Gensequenzen. Die aus C. orientalis isolierte UGT Co BX8 wurde in ihrer Funktion bestätigt und charakterisiert. Co BX8 glucosyliert spezifisch die Benzoxa zinoide DIBOA, DIMBOA, HBOA und HMBOA. Andere Benzoxazinoide, Flavonoide und Phytohormone werden nicht glucosyliert. Co BX8 glucosyliert das in C. orientalis vorkom mende Benzoxazinoid DIBOA mit einer höheren katalytischen Effizienz als dessen Derivat DIMBOA. Die heterologe Expression von Co BX8 in A. thaliana vermittelt den Pflanzen erhöhte Toleranz gegenüber den phytotoxischen Benzoxazinoiden DIBOA und DIMBOA.
Durch das Screening von β Glucosidase Kandidaten aus C. orientalis konnte die Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase Co GLU1 isoliert werden. Für Co GLU1 konnte ebenfalls eine höhere katalytische Effizienz der Hydrolyse des endogenen Substrats DIBOA Glucosid als für DIMBOA Glucosid gezeigt werden. Co GLU1 hydrolysiert auch Vertreter anderer Substanzklassen, wie z.B. das Phytohormon Glucosid trans Zeatin O Glucosid oder das cyanogene Glycosid Dhurrin.
Die phylogenetische Analyse von UGTs und β Glucosidasen des Primär und Sekundär metabolismus zeigt, dass die Aufspaltung der UGTs und β Glucosidasen vor der Trennung der Angiospermen in monokotyle und dikotyle Pflanzen stattgefunden hat. Aus den phylo genetischen Bäumen kann geschlossen werden, dass die UGT und β Glucosidase Vorläufer ursprünglich ein breites Substrat Spektrum akzeptierten. Für die Detoxifizierung von Benzoxazinoiden und die Bioaktivierung ihrer Glucoside haben monokotyle und dikotyle Zusammenfassung 88
Pflanzen auf unterschiedliche Vorläufer zurückgegriffen. Der Zusammenhang zwischen der Substratspezifität von Co BX8 und Co GLU1 und ihrer Evolution wird diskutiert.
Summary
The benzoxazinoids DIBOA and DIMBOA are phytoanticipines widely distributed in the grasses (Poaceae). The benozoxazinoid biosynthesis is fully elucidated in Z. mays . The first toxic product of the biosynthetic pathway, DIBOA, is detoxified by a UDP dependent glucosyltranferase (UGT) and stored in the vacuole. Specific benzoxazinoid glucoside β glucosidases are located in a different cellular compartment. Upon pathogen or herbivore attack, the cell integrity is destroyed, and the glucosides come into contact with the degrading β glucosidases, resulting in an immediate release of the toxic aglucone (bioactivation). Outside the grasses, benzoxazinoids are isolated sporadically from a few members of the dicotyledonous plants. In this work the detoxification and bioactivation function of the dicots C. orientalis and L. galeobdolon are analyzed.
The benzoxazinoid glucosyltransferases of C. orientalis and L. galeobdolon were purified based upon their function and subsequently peptide sequences were determined by mass spectrocopy. Putative genes were identified by comparing peptide sequences with UGT candidates. The UGT from C. orientalis Co BX8 was confirmed to glucosylate benzoxazinoids and characterized. Co BX8 specifically glucosylates the benzoxazinoids DIBOA, DIMBOA, HBOA and HMBOA, whereas other benzoxazinoids, flavonoids and phytohormons are not accepted as substrates. DIBOA, the main benzoxazinoid in C. orientalis , is glucosylated with a higher catalytic efficiency than its derivate DIMBOA. Co BX8 expression in A. thaliana was shown to reduce the phytotoxicity of DIBOA and DIMBOA.
The benzoxazinoid glucoside β glucosidase Co GLU1 from C. orientalis was isolated by screening β glucosidase candidates. Co GLU1 catalyzes the hydrolysis of the endogenous substrate DIBOA glucoside with a higher efficiency than the conversion of DIMBOA glucoside. It also hydrolyzes members of different substance classes, like the phytohormone glucoside trans zeatin O glucoside or the cyanogenic glycoside Dhurrin.
Phylogenetic analysis of UGTs and β glucosidases of primary and secondary metabolism shows that separation of UGTs and β glucosidases occurred before separation of angiosperms in monocotyledonous and dicotyledonous plants. The trees indicate a broad substrate spectrum of the ancestors of UGTs and β glucosidases. Monocotyledonous and dicotyledonous plants recruited different ancestors for detoxification of benzoxazinoids and bioactivation of benzoxazinoid glucosides. The relationship between evolution and substrate specificity of Co BX8 and Co GLU1 is discussed. Literaturverzeichnis 89
6 Literaturverzeichnis
Alipieva, K. I., Taskova, R. M., Evstatieva, L. N., Handjieva N. V. und Popov, S. S. (2003) Benzoxazinoids and iridoid glucosides from four Lamium species. Phytochemistry 64: 1413 1417.
Angiosperm Phylogeny group (2003) An update oft he Angiosperm Phylogeny Group classification fort he orders and families of flowering plants: APG II. 399 436.
Austin, R. S., Provart, N. J. und Cutler, S. R. (2007) C terminal motif prediction in eukaryotic proteomes using comparative genomics and statistical over representation across protein families. BMC Genomics 8: 191.
Babcock, G. D. und Esen, A. (1994) Substrate specificity of maize β glucosidase. Plant Science Volume 101: 31 39.
Bailey, B. A. und Larson, R. L. (1989) Hydroxamic Acid Glycosyltransferases from Maize Seedlings. Plant Physiol. 90: 1071 1076.
Bak, S., Kahn, R. A., Nielsen, H. L., Møller, B. L. und Halkier B. A. (1998a) Cloning of three A type cytochromes P450, CYP71E1, CYP98, and CYP99 from Sorghum bicolor (L.) Moench by a PCR approach and identification by expression in Escherichia coli of CYP71E1 as a multifunctional cytochrome P450 in the biosynthesis of the cyanogenic glucoside dhurrin. Plant Mol. Biol. 36, 393– 405.
Bak, S., Nielsen, H. L. und Halkier, B. A. (1998b) The presence of CYP79 homologues in glucosinolate producing plants shows evolutionary conservation of the enzymes in the conversion of amino acid to aldoxime in the biosynthesis of cyanogenic glucosides and glucosinolates. Plant Mol. Biol. 38: 725–734.
Bak, S., Paquette, S. M., Morant, M., Rasmussen, A. V., Saito, S., Bjarnholt, N., Zagrobelny, M., Jørgensen, K., Hamann, T., Osmani, S., Simonsen, H. T., Pérez, R. S., van Hesswijck, T. B., Jørgensen, B. und Møller, B. L., (2006) Cyanogenic glycosides: a case study for evolution and application of cytochromes P450. Phytochem. Rev. 5, 309–329.
Bandaranayake, H. und Esen, A. (1996) Nucleotide sequence of a β glucosidase (glu2) cDNA from maize (accession no. U44087). EMBL Data Library.
Barnes, J. P. und Putnam, A. R. (1987) Role of benzoxazinones in allelopathy by rye ( Secale cereale L.). J. Chem. Ecol. 13: 889 906.
Barrett, T., Suresh, C. G., Tolley, S. P., Dodson, E. J. und Hughes M. A. (1995) The crystal structure of a cyanogenic beta glucosidase from white clover, a family 1 glycosyl hydrolase. Structure 3: 951 960.
Barth, C. und Jander, G. (2006) Arabidopsis myrosinases TGG1 and TGG2 have redundant function in glucosinolate breakdown and insect defense. Plant J. 46: 549–562.
Bechtel, N. (2009) Identifizierung und Isolierung von Glycosyltransferaen in Lamium galeobdolon. Bachelorarbeit, Technische Universität München.
Birnboim, H.C., und Doly, J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513 1523.
Bowles, D., Lim, E. K., Poppenberger, B. und Vaistij, F. E. (2006) Glycosyltransferases of lipophilic small molecules. Annu Rev Plant Biol. 57: 567 97.
Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 7: 248 254. Literaturverzeichnis 90
Brazier Hicks, M., Offen, W. A., Gershater, M. C., Revett, T. J., Lim, E. K., Bowles, D. J., Davies, G. J. und Edwards, R. (2007) Characterization and engineering of the bifunctional N and O glucosyltransferase involved in xenobiotic metabolism in plants. Proc Natl Acad Sci. 104(51): 20238 43.
Brzobohatý, B., Moore, I., Kristoffersen, P., Bako, L., Campos, N., Schell, J. und Palme, K. (1993) Release of active cytokinin by a beta glucosidase localized to the maize root meristem. Science 262(5136): 1051 4.
Burgos, N. R., Talbert, R. E., Kim, K. S. und Kuk, Y. I. (2004) Growth inhibition and root ultrastructure of cucumber seedlings exposed to allelochemicals from rye (Secale cereale). J Chem Ecol. 30(3): 671 89.
Burmeister, W. P., Cottaz, S., Driguez, H., Lori R., Palmieri S. und Henrissat B. (1997) The crystal structures of Sinapis alba myrosinase and a covalent glycosyl enzyme intermediate provide insights into the substrate recognition and active site machinery of an S glycosidase. Structure 5: 663 675.
Campbell, J. A., Davies, G. J., Bulone, V. und Henrissat, B. (1997) A classification of nucleotide diphospho sugar glycosyltransferases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 15: 929 939.
Campos, N., Bako, L., Feldwisch, J., Schell, J. und Palme, K. (1992) A protein from maize labeled with azido IAA has novel b glucosidase activity. Plant J 2: 675–684.
Cicek, M. und Esen, A. (1999) Expression of soluble and catalytically active plant (monocot) beta glucosidases in E. coli. Biotechnol Bioeng. 63(4): 392 400.
Cicek, M., Blanchard, D., Bevan, D. R. und Esen, A. (2000) The aglycone specificity determining sites are different in 2, 4 dihydroxy 7 methoxy 1,4 benzoxazin 3 one (DIMBOA) glucosidase (Maize beta glucosidase) and dhurrinase (Sorghum beta glucosidase). J Biol Chem. 275(26): 20002 11.
Claros, M. G. und Vincens, P. (1996) Computational method to predict mitochondrially imported proteins and their targeting sequences. Eur. J. Biochem. 241: 779 786.
Clough, S. J. und Bent, A. F. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium mediated transformation of Arabidopsis thaliana . Plant J. 16: 735 743.
Conn, E. E. (1980) Cyanogenic Compounds. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 31: 433–451.
Copaja, S. V., Villarroel, E., Bravo, H. R., Pizarro, L. und Aragandona, V. H. (2006) Hydroxamic acids in Secale cereale L. and the realationship with their antifeeding and allelopathic properties. Zeitschrift Fur Naturforsch. C: J. Biosci. 61: 670–676.
Coutinho, P. M., Deleury, E., Davies, G. J. und Henrissat, B. (2003) An evolving hierarchical family classification for glycosltransferases. J. Mol. Biol. 328: 307 317.
Cuevas, L. und Niemeyer, H. M. (1993) Effect of hydroxamic acids from cereals on aphid cholinesterases. Phytochemistry 34: 983 985.
Cuevas, L., Niemeyer, H. M. und Jonsson L. M. V. (1992) Partial purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside b D glucosidase from maize. Phytochemistry 31: 2609 2612.
Cuevas, L., Niemeyer, H. M. und Perez, F. J. (1990) Reaction of DIMBOA, a resistance factor from cereals, with α chymotrypsin. Phytochemistry 29: 1429 1432.
Czjzek, M., Cicek, M., Zamboni, V., Bevan, D. R., Henrissat, B. und Esen, A., (2000) The mechanism of substrate (aglycone) specificity in beta glucosidases is revealed by crystal structures of mutant maize beta glucosidase–DIMBOA, –DIMBOAGlc, and –dhurrin complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 13555–13560. Literaturverzeichnis 91
Czjzek, M., Cicek, M., Zamboni, V., Burmeister, W. P., Bevan, D. R., Henrissat, B. und Esen, A. (2001) Crystal structure of a monocotyledon (maize ZMGlu1) betaglucosidase and a model of its complex with p nitrophenyl beta Dthioglucoside. Biochem. J. 354: 37–46.
Davies, G. und Henrissat, B. (1995) Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases. Structure 3: 853 859.
Dellaporta, S. L., Wood, J. und Hicks, J. B. (1983) A plant DNA minipreparation: version II Plant Mol. Bil. Rep 1: 19 21.
Dharmawardhana, D. P., Ellis, B. E. und Carlson, J. E. (1995) A β glucosidase from lodgepole pine xylem specific for the lignin precursor coniferin. Plant Physiol. 107: 331–339.
Dooner, H. und Nelson, O. (1977) Genetic control of UDPglucose: flavonol 3 0 glucosyltransferase in endosperm of maize. Biochem. Genet. 15: 509 519.
Ebel, J. (1986) Phytoalexin synthesis: the biochemical analysis of the induction process. Annu Rev Phytopathol 24:235 204.
Emanuelsson, O., Nielsen, H. und von Heijne, G. (1999) ChloroP, a neural network based method for predicting chloroplast transit peptides and their cleavage sites Protein Science: 8: 978 984.
Emanuelsson, O., Nielsen, H., Brunak, S. und von Heijne, G. (2000) Predicting subcellular localization of proteins based on their N terminal amino acid sequence. J. Mol. Biol., 300: 1005 1016.
Engler, C., Kandzia, R. und Marillonnet, S. (2008) A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Troughput Capability; PLoS ONE; 3:3647.
Esen, A. (1992) Purification and Partial Characterization of Maize (Zea mays L.) beta Glucosidase. Plant Physiol. 98(1):174 182.
Esen, A. und Stetler, D. A. (1993) Subcellular localization of maize ß glucosidase. Maize Genetics Cooperation Newsletter 67: 19–20.
Ettlinger, M. G. und Kjær , A. (1968) Sulfur compounds in plants. In: Mabry, T. J., Alston, R. E. und Runeckles, V. C. (Eds.), Recent Advances in Phytochemistry. Century Crofts, Appleton: 59–144.
Fahey, J. W., Zalcmann, A. T. und Talalay, P. (2001) The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry 56: 5 51.
Falk, A. und Rask, L. (1995) Expression of a zeatin O glucoside degrading β glucohydrolase in Brassica napus. Plant Physiol. 108: 1369–1377.
Fan, T. W. M. und Conn, E. E. (1985) Isolation and characterization of two cyanogenic betaglucosidases from flax seeds. Arch. Biochem. Biophys. 243: 361–373.
Ford, C. M., Boss, P. K. und Hoj, P. B. (1998) Cloning and characterization of Vitis vinifera UDP glucose:flavonoid 3 O glucosyltransferase, a homologue of the enzyme encoded by the maize Bronze-1 locus that may primarily serve to glucosylate anthocyanidins in vivo . J. Biol. Chem . 273: 9224 9233.
Frangne, N., Eggmann, T., Koblischke, C., Weissenböck, G., Martinoia, E. und Klein, M. (2002) Flavone glucoside uptake into barley mesophyll and Arabidopsis cell culture vacuoles. Energization occurs by H(+) antiport and ATP binding cassette type mechanisms. Plant Physiol. 128(2): 726 33.
Frey, M., Chomet, P., Glawischnig, E., Stettner, C., Grün, S., Winklmair, A., Eisenreich, W., Bacher, A., Meeley, R. B., Briggs, S. P., Simcox, K. und Gierl, A. (1997) Analysis of a chemical plant defense mechanism in grasses. Science 277: 696 699. Literaturverzeichnis 92
Frey, M., Huber K., Park, W. J., Sicker, D., Lindberg, P., Meeley, R. B., Simmons, C. R., Yalpani, N. und Gierl, A. (2003) A 2 oxoglutarate dependent dioxygenase is integrated in DIMBOA biosynthesis. Phytochemistry 62: 371 376.
Frey, M., Kliem, R., Saedler, H. und Gierl, A. (1995) Expression of a cytochrome P450 gene family in maize. Mol Gen Genet. 246(1): 100 9.
Frey, M., Schullehner, K., Dick, R., Fiesselmann, A. und Gierl, A. (2009) Benzoxazinoid biosynthesis, a model for evolution of secondary metabolic pathways in plants. Phytochemistry 70: 1645–1651.
Frey, M., Stettner, C. und Gierl, A. (1998) A general method for gene isolation in tagging approaches: amplification of insertion mutagenised sites (AIMS). Plant J. 13: 717 721.
Frey, M., Stettner, C., Pare, P.W., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. und Gierl, A. (2000) An herbivore elicitor activates the gene for indole emission in maize. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 14801–14806.
Friebe, A., Roth, U., Kück, P., Schnabl, H. und Schulz, M. (1997) Effects of 2,4 dihydroxy 1,4 benzoxazin 3 ones on the activity of plasma membrane H + ATPase. Phytochemistry 44: 979 983.
Gachon, C. M. M., Langlois Meurinne, M., und Saindrenan P. (2005) Plant secondary metabolism glycosyltransferases: the emerging functional analysis. TRENDS in Plant Science 10: 542 549.
Gierl, A. und Frey, M. (2001) Evolution of benzoxazinone biosynthesis and indole production in maize. Planta 213(4): 493 8.
Glawischnig, E., Grün, S., Frey, M. und Gierl, A. (1999) Cytochrome P450 monooxygenases of DIBOA biosynthesis: specificity and conservation among grasses. Phytochemistry. 50(6): 925 30.
Gleba, Y., Klimyuk, V. und Marillonnet, S. (2005) Magnifection a new platform for expressing recombinant vaccines in plants. Vaccine. 23(17 18): 2042 8
Göpfrich, I. (2010) Expression von β Glucosidasen aus dikotylen Pflanzen in heterologen Systemen, Bachelorarbeit, Technische Universität München.
Griesser, M., Vitzthum, F., Fink, B., Bellido, M. L., Raasch, C., Munoz Blanco, J. und Schwab, W. (2008) Multi substrate flavonol O glucosyltransferases from strawberry (Fragaria x ananassa) achene and receptacle. J. Exp. Bot. 59: 2611 2625.
Grubb, C. D., Zipp, B. J., Ludwig Müller, J., Masuno M. N., Molinski T. F. und Abel, S. (2004) Arabidopsis glucosyltransferase UGT74B1 functions in glucosinolate biosynthesis and auxin homeostasis. Plant J. 46: 893 908.
Gruhnert, C., Biehl, B. und Selmar, D. (1994) Compartmentation of cyanogenic glucosides and their degrading enzymes. Planta 195: 36 42.
Grün, S., Frey, M. und Gierl, A. (2005) Evolution of the indole alkaloid biosynthesis in the genus Hordeum: distribution of gramine and DIBOA and isolation of the benzoxazinoid biosynthesis genes from Hordeum lechleri. Phytochemistry 66(11): 1264 72.
Gubler, U. und Hoffman, B. J. (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene: 25:263 9.
Gusmayer, S., Brunner, H., Schneiderpoetsch, H. A. W. und Rudiger, W. (1994) Avenacosidase from oat – purification, sequence analysis and biochemical characterization of a new member of the bga family of beta glucosidases. Plant Mol. Biol. 26: 909–921.
Halkier, B. A. und Gershenzon, J. (2006) Biology and biochemistry of glucosinolates. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 303–333. Literaturverzeichnis 93
Halkier, B. A. und Møller, B. L. (1989) Biosynthesis of the Cyanogenic Glucoside Dhurrin in Seedlings of Sorghum bicolor (L.) Moench and Partial Purification of the Enzyme System Involved. Plant Physiol 90: 1552 1559.
Halkier, B. A. und Møller, B. L. (1990) The biosynthesis of cyanogenic glucosides in higher plants – identification of 3 hydroxylation steps in the biosynthesis of dhurrin in Sorghum bicolor (L.) moench and the involvement of 1 aci nitro 2 (phydroxyphenyl) ethane as an intermediate. J. Biol. Chem. 265: 21114–21121.
Halkier, B. A., Nielsen, H. L., Koch, B. und Møller, B. L. (1995) Purification and characterization of recombinant cytochrome P450(Tyr) expressed at high levels in Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 322: 369–377.
Hansen, K. S., Kristensen, C., Tattersall, D. B., Jones, P. R., Olsen, C. E., Bak, S. und Møller, B. L. (2003) The in vitro substrate regiospecificity of recombinant UGT85B1, the cyanohydrin glucosyltransferase from Sorghum bicolor. Phytochemistry 64: 143–151.
Haralampidis, K., Bryan, G., Qi, X., Papadopoulou, K., Bakht, S., Melton, R. und Osbourn, A. (2001) A new class of oxidosqualene cyclases directs synthesis of antimicrobial phytoprotectants in monocots. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 13431–13436.
Harborne, J. B. (1999) Recent advances in chemical ecology. Nat Prod Rep. 16(4): 509 23.
Hefner, T., Arend, J., Warzecha, H., Siems, K. und Stöckigt, J. (2002) Arbutin synthase, a novel member of the NRD1beta glycosyltransferase family, is a unique multifunctional enzyme converting various natural products and xenobiotics. Bioorg Med Chem. 6: 1731 41.
Henrissat, B. (1991) A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 280: 309 316.
Henrissat, B. und Davies, G. (1997) Structural and sequence based classification of glycoside hydrolases. Curr Opin Struct Biol. 7(5): 637 44.
Hillenmeyer, M. (2010) Charakterisierung der UDPG:Benzoxazinoid Glucosyltransferasen von Weizen und Mais. Forschungspraktikum, Technische Universität München.
Höglund, A. S., Lenman, M. und Rask, L. (1992) Myrosinase is localized to the interior of myrosin grains and is not associated to the surrounding tonoplast membrane. Plant Sci. 85: 165–170.
Hosel, W., Tober, I., Eklund, S. H. und Conn, E. E. (1987) Characterization of betaglucosidases with high specificity for the cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor (L) moench seedlings. Arch. Biochem. Biophys. 252: 152–162.
Hou, B., Lim, E. K., Higgins, G. S. und Bowles, D. J. (2004) N glucosylation of cytokinins by glycosyltransferases of Arabidopsis thaliana. J Biol Chem 279(46): 47822 32.
Hughes, J. und Hughes, M. A. (1994) Multiple secondary plant product UDP glucose glucosyltrans ferase genes expressed in cassava (Manihot esculenta Crantz) cotyledons. DNA Seq. 5: 41 49.
Hughes, M. A., Brown, K., Pancoro, A., Murray, B. S., Oxtoby, E. und Hughes, J. (1992) A molecular and biochemical analysis of the structure of the cyanogenic bglucosidase (Linamarase) from cassava (Manihot esculenta Cranz). Arch. Biochem. Biophys. 295: 273–279.
Ibenthal, W D., Pourmohseni, H., Grosskopf, S., Oldenburg, H. und Shafiei Azad, S. (1993) New approaches towards biochemical mechanisms of resistance/susceptibility of Gramineae to powdery mildew (Erysiphe graminis). Angew Bot 67: 97–106.
Jackson, R. G., Lim, E. K., Li, Y., Kowalczyk, M., Sandberg, G., Hoggett, J., Ashford, D. A., und Bowles, D. J. (2001) Identification and biochemical characterization of an Arabidopsis indole 3 acetic acid glucosyltransferase. J Biol Chem. 276(6): 4350 6 Literaturverzeichnis 94
Jonczyk, R., Schmidt, H., Osterrieder, A., Fiesselmann, A., Schullehner, K., Haslbeck, M., Sicker, D., Hofmann, D., Yalpani, N., Simmons, C., Frey, M. und Gierl, A. (2008) Elucidation of the final reactions of DIMBOA glucoside biosynthesis in maize: characterization of Bx6 and Bx7. Plant Physiol. 146: 1053–1063.
Jones, P. R., Møller, B. L., und Høj, P. B. (1999) The UDP glucose:p Hydroxymandelonitrile O Glucosyltransferase that catalyzes the last step in synthesis oft he cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor. The Journal of Biological Chemistry 274: 35483 35491.
Jones, P. und Vogt, T. (2001) Glycosyltransferases in secondary plant metabolism: tranquilizers and stimulant controllers. Planta 213: 164 174.
Jones, P., Messner, B., Nakajima, J., Schäffner, A. R. und Saito K. (2003) UGT73C6 and UGT78D1, glycosyltransferases involved in flavonol glycoside biosynthesis in Arabidopsis thaliana . J. Biol. Chem. 278: 43910 43918.
Kelly, P. J., Bones, A. und Rossiter, J. T. (1998) Sub cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta 206: 370 377.
Keresztessy, Z., Hughes, J., Kiss, L. und Hughes, M. A. (1996) Co purification from Escherichia coli of a plant beta glucosidase glutathione S transferase fusion protein and the bacterial chaperonin GroEL. Biochem. J. 314: 41–47.
Kesselmeier, J. und Urban, B., (1983) Subcellular localization of saponins in green and etiolated leaves and green protoplasts of oat (Avena sativa L.). Protoplasma 114: 133–140.
Kim, Y. W. und Kim, I. S. (1998) Subunit composition and oligomer stability of oat betaglucosidase isozymes. Biochim. Biophys. Acta 1388: 457–464.
Kim, Y. W., Kang, K. S., Kim, S. Y. und Kim, I. S. (2000) Formation of fibrillar multimers of oat beta glucosidase isoenzymes is mediated by the As Glu1 monomer. J Mol Biol. 303(5): 831 42.
Kiran, N. S., Polanská, L., Fohlerová, R., Mazura, P., Válková, M., Smeral, M., Zouhar, J., Malbeck, J., Dobrev, P. I., Machácková, I. und Brzobohatý, B. (2006) Ectopic over expression of the maize beta glucosidase Zm p60.1 perturbs cytokinin homeostasis in transgenic tobacco. J Exp Bot. 57(4): 985 96.
Klein, M., Weissenböck, G., Dufaud, A., Gaillard, C., Kreuz, K. und Martinoia, E. (1996) Different energization mechanisms drive the vacuolar uptake of a flavonoid glucoside and a herbicide glucoside. J Biol Chem. 271(47): 29666 71.
Ko, J. H., Kim, B. G., Hur, H. G., Lim, Y. und Ahn, J. H. (2006) Molecular cloning, expression and characterization of a glycosyltransferase from rice. Plant Cell Rep. 25: 741 746.
Koncz, C. und Schell, J. (1986) The promoter of T L DNA gene 5 controls the tissue specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Molecular Genetics and Genomics 204: 383–396.
Kuroki, G. W. und Poulton, J. E. (1986) Comparison of kinetic and molecular properties of two forms of amygdalin hydrolase from black cherry (Prunus serotina Ehrh.) seeds. Arch. Biochem. Biophys. 247: 433–439.
Lambrix, V., Reichelt, M., Mitchell Olds, T., Kliebenstein, D. J. und Gershenzon, J. (2001) The Arabidopsis epithiospecifier protein promotes the hydrolysis of glucosinolates to nitriles and influences Trichoplusia ni herbivory. Plant Cell 13: 2793–2807.
Lämmli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during assembly of the heads of bacteriophage T4. Nature 227: 680 685. Literaturverzeichnis 95
Lazzeri, L., Curto, G., Leoni, O. und Dallavalle, E. (2004) Effects of glucosinolates and their enzymatic hydrolysis products via myrosinase on the root knot nematode Meloidogyne incognita (Kofoid et White) Chitw. J. Agric. Food Chem. 52: 6703–6707.
Leah, R., Kigel, J., Svendsen, I. und Mundy, J. (1995) Biochemical and molecular characterization of a barley seed beta glucosidase. J Biol Chem. 270(26): 15789 97.
Leighton, V., Niemeyer, H. M. und Jonsson, L. M. V. (1994) Substrate specifity of a glycosyltransferase and an N Hydroxylase involved in the biosyntheses of cyclic hydroxamic acids in gramineae. Phytochemistry 36: 887 892.
Li, C. P., Swain, E. und Poulton, J. E. (1992) Prunus serotina amygdalin hydrolase and prunasin hydrolase purification, N terminal sequencing, and antibody production. Plant Physiol. 100: 282–290.
Li, L., Modolo, L. V., Escamilla Trevino, L. L., Achnine, L., Dixon, R.A. und Wang, X. (2007) Crystal structure of Medicago truncatula UGT85H2 insights into the structural basis of a multifunctional (iso)flavonoid glycosyltransferase. J Mol Biol. 370(5): 951 63.
Li, Y., Baldauf, S., Lim, E. K. und Bowles, D. J. (2001) Phylogenetic analysis of the UDP glycosyltransferase multigene family of Arabidopsis thaliana . J. Biol. Chem . 276: 4338 4343.
Lim, E. K. und Bowles, D.J. (2004) A class of plant glycosyltransferases involved in cellular homeostasis. EMBO J 23: 2915–2922.
Lüning, H. U. und Schlosser, E. (1975) Role of saponins in antifungal resistance. V. Enzymatic activation of avenacosides. 2. Pflanzenkr. Pflanzenschutz. 82, 699 703.
Luzak, A. (2010) Isolierung und Charakterisierung der Triticum aestivum DIBOA Glucosyltransferase BX8. Bachelorarbeit, Technische Universität München.
Mackenzie, P. I., Owens, I. S., Burchell, B., Bock, K. W., Bairoch, A., Belanger, A., Fournel Gigleux, S., Green, M., Hum, D. W., Iyanagi, T., Lancet, D., Louisot, P., Magdalou, J., Chowdhury, J. R., Ritter, J. K., Shcachter, H., Tephly, T. R., Tipton, K.F. und Nebert, D. W. (1997) The UDP glycosyltransferase gene superfamily: recommended nomenclature update based on evolutionary divergence. Pharmacogenetics 7: 255 269.
Mallikarjuna N., Kranthi K. R., Jadhav D. R., Kranthi S. und Chandra S. (2004) Influence of foliar chemical compounds on the development of Spodoptera litura (Fab.) in interspecific derivatives of groundnut. J Appl Entomol 128:321–328.
Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V. und Gleba Y. (2005) Systemic Agrobacterium tumefaciens mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nat Biotechnol.23(6): 718 23.
Martin, R. C., Mok, M. C. und Mok, D. W. (1999b) Isolation of a cytokinin gene, ZOG1, encoding zeatin O glucosyltransferase from Phaseolus lunatus. Proc Natl Acad Sci 96(1): 284 9.
Martin, R. C., Mok, M. C. und Mok, D. W. S. (1999a) A gene encoding the cytokinin enzyme zeatin O xylosltransferase of Phaseolus vulgaris . Plant Physiol . 120: 553 557.
Martin, R. C., Mok, M. C., Habben, J. E. und Mok, D. W. (2001) A maize cytokinin gene encoding an O glucosyltransferase specific to cis zeatin. Proc Natl Acad Sci 98(10): 5922 6.
Masada, S., Terasaka, K., Oguchi, Y., Okazaki, S., Mizushima, T. und Mizukami, H. (2009) Functional and structural characterization of a flavonoid glucoside 1,6 glucosyltransferase from Catharanthus roseus. Plant Cell Physiol. 50(8): 1401 15.
Mazura, P., Fohlerová, R., Brzobohatý, B., Kiran, N. S. und Janda, L. (2006) A new, sensitive method for enzyme kinetic studies of scarce glucosides. J Biochem Biophys Methods. 68(1): 55 63. Literaturverzeichnis 96
McCartera, J. D. und Withersa, G. S. (1994) Mechanisms of enzymatic glycoside hydrolysis. Current Opinion in Structural Biology 4: 885 892.
Miller, K. D., Guyon, V., Evans, J.N., Shuttleworth, W.A. und Taylor, L.P. (1999) Purification, cloning, and heterologous expression of a catalytically efficient flavonol 3 O galactosyltransferase expressed in the male gametophyte of Petunia hybrida . J. Biol. Chem . 26: 34011 34019.
Modolo, L. V., Blount, J. W., Achnine, L., Naoumkina, M. A., Wang, X. und Dixon, R. A. (2007) A functional genomics approach to (iso)flavonoid glycosylation in the model legume Medicago truncatula. Plant Mol Biol. 64(5): 499 518.
Morant, A. V., Bjarnholt, N., Kragh, M. E., Kjaergaard, C.H., Jørgensen, K., Paquette, S. M., Piotrowski, M., Imberty, A., Olsen, C. E., Møller, B. L. und Bak, S. (2008b) The beta glucosidases responsible for bioactivation of hydroxynitrile glucosides in Lotus japonicus. Plant Physiol 147(3): 1072 91.
Morant, A. V., Jørgensen, K., Jørgensen, C., Paquette, S. M., Sánchez Pérez, R., Møller, B. L. und Bak, S. (2008a) beta Glucosidases as detonators of plant chemical defense. Phytochemistry 69(9): 1795 813.
Morant, M., Bak, S., Møller, B. L. und Werck Reichhart, D. (2003) Plant cytochromes P450: tools for pharmacology, plant protection and phytoremediation. Curr. Opin. Biotechnol. 14: 151–162.
Morrissey, J. P. und Osbourn, A. E. (1999) Fungal resistance to plant antibiotics as a mechanism of pathogenesis. Microbiol. Mol. Biol. Revs., 63: 708 724.
Mugford, S. T., Qi, X., Bakht, S., Hill, L., Wegel, E., Hughes, R. K., Papadopoulou, K., Melton, R., Philo, M., Sainsbury, F., Lomonossoff, G. P., Roy, A. D., Goss, R. J. und Osbourn, A. (2009) A serine carboxypeptidase like acyltransferase is required for synthesis of antimicrobial compounds and disease resistance in oats. Plant Cell 21(8): 2473 84.
Napoli, C., Lemieux, C. und Jorgensen R. (1990) Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co suppression of homologous genes in trans . Plant Cell 4: 279–289.
Nielsen, H., Engelbrecht, J., Brunak, S. und von Heijne, G. (1997) Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering, 10: 1 6.
Nielsen, K. A., Hrmova, M., Nielsen, J. N., Forslund, K., Ebert, S., Olsen, C. E., Fincher, G. B. und Møller, B. L. (2006) Reconstitution of cyanogenesis in barley (Hordeum vulgare L.) and its implications for resistance against the barley powdery mildew fungus. Planta 223: 1010–1023.
Nielsen, K. A., Olsen, C. E., Pontoppidan, K. und Møller, B. L. (2002) Leucinederived cyano glucosides in barley. Plant Physiol 129: 1066–1075.
Niemeyer, H. M. (2009) Hydroxamic Acids Derived from 2 Hydroxy 2H 1,4 Benzoxazin 3(4 H) one: Key Defense Chemicals of Cereals. J. Agric. Food Chem. 57: 1677–1696.
Nikus, J., Daniel, G. und Jonsson, L. M. (2001) Subcellular localization of beta glucosidase in rye, maize and wheat seedlings. Physiol Plant. 111(4): 466 472.
Nikus, J.,Esen, A. und Jonsson, L. M. V. (2003) Cloning of a plastidic rye (Secale cereale) β glucosidase cDNA and its expression in Escherichia coli Physiologia Plantarum 118: 337 – 345.
Nisius, H. (1988) The stromacentre inAvena plastids: an aggregation of β glucosidase responsible for the activation of oat leaf saponins, Planta 173: 474 481.
Nomura, T., Ishihara, A., Imaishi, H., Endo, T.R., Ohkawa, H., Iwamura, H., (2002) Molecular characterization and chromosomal localization of cytochrome P450 genes involved in the biosynthesis of cyclic hydroxamic acids in hexaploid wheat. Mol. Genet. Genomics 267: 210–217. Literaturverzeichnis 97
Nomura, T., Ishihara, A., Imaishi, H., Ohkawa, H., Endo, T.R. und Iwamura, H., (2003) Rearrangement of the genes for the biosynthesis of benzoxazinones in the evolution of Triticeae species. Planta 217: 776–782.
Nomura, T., Ishihara, A., Yanagita, R.C., Endo, T.R. und Iwamura, H., (2005) Three genomes differentially contribute to the biosynthesis of benzoxazinones in hexaploid wheat. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 16490–16495.
Offen, W., Martinez Fleites, C., Yang, M., Kiat Lim, E., Davis, B. G., Tarlin, C. A., Ford, C. M., Bowles, D. J. und Davies, G. J. (2006). Structure of a flavonoid glucosyltransferase reveals the basis for plant natural product modification. EMBO J. 25: 1396 1405.
Oikawa, A., Ebisui, K., Sue, M., Ishihara, A. und Iwamura, H. (1999) Purification and Characterization of a β Glucosidase specific for 2,4 Dihydroxy 7 methoxy 1,4 benzoxazin 3 one (DIMBOA) Glucoside in Maize. Z. Naturforsch. 54c: 181 185.
Opassiri, R., Pomthong, B., Onkoksoong, T., Akiyama, T., Esen, A. und Ketudat Cairns, J. R. (2006) Analysis of rice glycosyl hydrolase family 1 and expression of Os4bglu12 β glucosidaseBMC Plant Biochem. 6: 33.
Osbourn, A. E. (1996) Preformed antimicrobial compounds and plant defense against fungal attack. Plant Cell 8: 1821 1831.
Osbourn, A. E. (1999) Antimicrobial phytoprotectants and fungal pathogens; A commentary. Fung. Genet. Biol 26: 163 168.
Osmani, S. A., Bak, S. und Møller, B. L. (2009) Substrate specificity of plant UDP dependent glycosyltransferases predicted from crystal structures and homology modeling. Phytochemistry 70(3): 325 47.
Osmani, S. A., Bak, S., Imberty, A., Olsen, C. E. und Møller, B. L. (2008) Catalytic key amino acids and UDP sugar donor specificity of a plant glucuronosyltransferase, UGT94B1: molecular modeling substantiated by site specific mutagenesis and biochemical analyses. Plant Physiol. 148(3): 1295 308.
Oxtoby, E., Dunn, M. A., Pancoro, A. und Hughes, M. A. (1991) Nucleotide and derived amino acid sequence of the cyanogenic beta glucosidase (linamarase) from white clover (Trifolium repens L.). Plant Mol. Biol. 17: 209 219.
Özden, S., Özden, T., Attila, J., Kücükislamoglu, M. und Okatan, A. (1992) Isolation and identification via high performance liquid chromatography and thin layer chromatography of benzoxazolinone precursors from Consolida orientalis flowers. J. Chromatogr. 609: 402 406.
Paquette, S., Moller, B. J. und Bak, S. (2003) On the origin of family 1 plant glycosltransferases. Phytochemistry 62: 399 413.
Park, W. J.; Hochholdinger, F. und Gierl, M. (2004) Release of the benzoxazinoids defense molecules during lateral and crown root emergence in Zea mays . J. Plant Physiol. 161: 981–985.
Pérez, F. J. und Niemeyer, H. M. (1989a) Reaction of DIMBOA, a resistance factor from cereals, with papain. Phytochemistry 28: 1579 1600.
Pérez, F. J. und Niemeyer, H. M. (1989b) Reaction of DIMBOA with amines. Phytochemistry 28: 1831 1834.
Pérez, F. J. und Ormenoñuñez, J. (2001) Difference in hydroxamic acid content in roots and root exudates of wheat ( Triticum aesti vum L.) and rye ( Secale cereale L.): possible role in allelophathy. J. Chem. Ecol. 17: 1037–1043.
Pham Vu, T. T. (2009) Isolierung der DIBOA Glucosid β Glucosidase aus Consolida orientalis, Bachelorarbeit, Technische Universität München. Literaturverzeichnis 98
Plant Transformation Workshop (2003)
Poulton, J. E. und Møller, B. L., (1993) Glucosinolates. Meth. Plant Biochem. 9: 209–237.
Pratt, K., Kumar, P. und Chilton, W. S. (1995) Cyclic hxdroxamic acids in dicotyledonous plants. Biochemical Systematics and Ecology 23: 781 785.
Qi, X., Bakht, S., Qin, B., Leggett, M., Hemmings, A., Mellon, F., Eagles, J., Werck Reichhart, D., Schaller, H., Lesot, A., Melton, R. und Osbourn, A. (2006) A different function for a member of an ancient and highly conserved cytochrome P450 family: from essential sterols to plant defense. Proc Natl Acad Sci 103:18848 53.
Rask, L., Andreasson, E., Ekbom, B., Eriksson, S., Pontoppidan, B. und Meijer, J., (2000) Myrosinase: gene family evolution and herbivore defense in Brassicaceae. Plant Mol. Biol. 42: 93–113.
Reimann, A., Nurhayati, N., Backenköhler, A. und Ober, D. (2004) Repeated evolution of the pyrrolizidine alkaloid mediated defense system in seperated angiosperm lineages. Plant Cell 16: 2772 2784.
Ross, J., Li, Y., Lim, E. und Bowles, D. J. (2001) Higher plant glycosyltransferases. Genome Biol. 2001: 2(2).
Sahi, S. V., Chilton, M. D. und Chilton, W. S. (1990) Corn metabolites affect growth and virulence of Agrobacterium tumefaciens. Proc Natl Acad Sci U S A 87(10): 3879 83.
Sambrook, J. Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York, USA.
Saunders, J. A. und Conn, E. E. (1978) Presence of Cyanogenic Glucoside Dhurrin in Isolated Vacuoles from Sorghum. Plant Physiol 61: 154 157.
Saunders, J. A., Conn, E. E., Lin, C. H. und Stocking, C. R. (1977) Subcellular Localization of Cyanogenic Glucoside of Sorghum by Autoradiography. Plant Physiol 59: 647 652.
Sawada, S., Suzuki, H., Ichimaida, F., Yamaguchi, M. A., Iwashita, T., Fukui, Y., Hemmi, H., Nishino, T. und Nakayama, T. (2005) UDP glucuronic acid:anthocyanin glucuronosyltransferase from red daisy (Bellis perennis ) flowers. Enzymology and phylogenetics of a novel glucuronosyltransferase involved in flower pigment biosynthesis. J. Biol. Chem . 280: 899 906.
Schullehner, K., Dick, R., Vitzthum, F., Schwab, W., Brandt, W., Frey M. und Gierl, A., (2008) Benzoxazinoid biosynthesis in dicot plants. Phytochemistry 69: 2668–2677.
Shao, H., He, X., Achnine, L., Blount, J. W., Dixon, R. A. und Wang, X. (2005) Crystal Structures of a Multifunctional Triterpen/Flavonoid Glycosltransferase from Medicago truncatula . The Plant Cell 17: 3141 3154.
Sibbesen, O., Koch, B., Halkier, B. A. und Moller, B. L. (1994) Isolation of the heme thiolate enzyme cytochrome P 450(Tyr), which catalyzes the committed step in the biosynthesis of the cyanogenic glucoside dhurrin in Sorghum bicolor (L) Moench. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9740–9744.
Sicker, D., Frey, M., Schulz, M. und Gierl, A. (2000) Role of natural benzoxazinones in the survival strategy of plants. Int. Rev. Cytol. 198: 319 346.
Sinnott, M. L. (1990) Catalytic mechanism of enzymic glycosyl transfer Chem. Rev. 90: 1171–1202.
Skadhauge B., Thomsen K. K. und von Wettstein D. (1997) The role of the barley testa layer and its flavonoid content in resistance to Fusarium infections. Hereditas 126: 147 160.
Small, I., Peeters, N., Legeai, F., und Lurin, C. (2004) Predotar: A tool for rapidly screening proteomes for N terminal targeting sequences. Proteomics. 4(6): 1581 90. Literaturverzeichnis 99
Southern, E. (1975) Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98: 503.
Sue, M., Ishihara, A. und Iwamura, H. (2000) Purification and characterization of a betaglucosidase from rye (Secale cereale L.) seedlings. Plant Sci. 155: 67–74.
Sue, M., Yamazaki, K., Yajima, S., Nomura, T., Matsukawa, T., Iwamura, H. und Miyamoto, T. (2006) Molecular and structural characterization of hexameric beta D glucosidases in wheat and rye. Plant Physiol. 141: 1237–1247.
Suzuki, H., Takahashi, S., Watanabe, R., Fukushima, Y., Fujita, N., Noguchi, A., Yokoyama, R., Nishitani, K., Nishino, T. und Nakayama, T. (2006) An isoflavone conjugate hydrolyzing beta glucosidase from the roots of soybean (Glycine max) seedlings – purification, gene cloning, phylogenetics, and cellular localization. J. Biol. Chem. 281: 30251–30259.
Tanaka, Y., Yonekura, K., Fukuchi Mizutani, M., Fukui, Y., Fujiwara, H., Ashikari, T. und Kusumi, T. (1996) Molecular and biochemical characterization of three anthocyanin synthetic enzymes from Gentiana triflora. Plant Cell Physiol. 37: 711 716.
Tartoff, K. und Hobbs, T. (1987) Improved media for growing plasmid and cosmid clones. BRL Focus 9: 12.
Taylor, L. P. und Jorgensen R. (1992) Conditional male fertility in chalcone synthase deficient petunia. J Hered 83: 11–17.
Thangstad, O. P., Evjen, K. und Bones, A. (1991) Immunogold EM localization of myrosinase in brassicaceae. Protoplasma 161: 85–93.
Thangstad, O. P., Gilde, B., Chadchawan, S., Seem, M., Husebye, H., Bradley, D. und Bones, A. M. (2004) Cell specific, cross species expression of myrosinases in Brassica napus, Arabidopsis thaliana and Nicotiana tabacum. Plant Mol Biol. 54(4): 597 611.
Thayer, S. S. und Conn, E. E. (1981) Subcellular localization of dhurrin beta glucosidase and hydroxynitrile lyase in the mesophyll cells of sorghum leaf blades. Plant Physiol. 67: 617–622.
Thorlby, G., Fourrier, N. und Warren, G. (2004) The SENSITIVE TO FREEZING2 gene, required for freezing tolerance in Arabidopsis thaliana, encodes a beta glucosidase. Plant Cell 16(8): 2192 203.
Tohge, T., Nishiyama, Y., Hirai, M. Y., Yano, M., Nakajima, J., Awazuhara, M., Inoue, E., Takahashi, H., Goodenowe, D. B., Kitayama, M., Noji, M., Yamazaki, M. und Saito, K. (2005) Functional genomics by integrated analysis of metabolome and transcriptome of Arabidopsis plants over expressing an MYB transcription factor. Plant J. 42: 218 235. van Larebeke, N., Engler, G., Holsters, M., van den Elsacker, S., Zaenen, J., Schilperoort, R. A. und Schell, J. (1974) Large plasmid in Agrobacterium fumefaciem essential for crown gall inducing ability. Nature 252: 169 170.
Vanetten, H., Mansfield, J. W., Bailey, J. A. und Farmer, E. E. (1994) Two classes of plant antibiotics: Phytoalexins versus phytoanticipins. Plant Cell 6:1191 1192.
Veach, Y. K., Martin, R. C., Mok, D. W., Malbeck, J., Vankova, R. und Mok, M. C. (2003) O glucosylation of cis zeatin in maize. Characterization of genes, enzymes, and endogenous cytokinins. Plant Physiol. 131(3): 1374 80.
Verdoucq, L., Moriniere, J., Bevan, D. R., Esen, A., Vasella, A., Henrissat, B. und Czjzek, M. (2004) Structural determinants of substrate specificity in family 1 betaglucosidases – novel insights from the crystal structure of sorghum dhurrinase 1, a plant beta glucosidase with strict specificity, in complex with its natural substrate. J. Biol. Chem. 279: 31796–31803. Literaturverzeichnis 100
Vogt, T. und Jones, P. (2000) Glycosyltransferases in plant natural product synthesis: characterization of a supergene family. TRENDS in Plant Science 5: 380 386.
Vogt, T., Zimmermann, E., Grimm, R., Meyer, M. und Stack, D. (1997) Are the characteristics of betanidin glucosyltransferases from cell suspension cultures of Dorotheanthus bellidiformis indicative of their phylogenetic relationship with Flavonoid glucosyltransferases? Planta 203: 349 361. von Rad, U., Hüttl, R., Lottspeich, F., Gierl, A. und Frey, M. (2001) Two glycosyltransferases are involved in detoxification of benzoxazinoids in maize. The Plant Journal 28: 633 642.
Walkerpeach, C. R. und Velten, J. (1994) Agrobacterium mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems. In: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant molecular biology manual, 2nd edn. Kluwer, Dordrecht, B1:1–19.
Wang, Q., Trimbur, D., Graham, R., Warren, R. A. und Withers, S. G. (1995) Identification of the acid/base catalyst in Agrobacterium faecalis beta glucosidase by kinetic analysis of mutants. Biochemistry 34(44): 14554 62.
Wei, S., Marton, I., Dekel, M., Shalitin, D., Lewinsohn, E., Bravdo, B.A. und Shoseyov, O. (2004) Manipulating volatile emission in tobacco leaves by expressing Aspergillus niger beta glucosidase in different subcellular compartments. Plant Biotechnol. J. 2: 341–350.
Werck Reichhart, D., Bak, S. und Paquette, S. (2002) Cytochromes P450. In The Arabidopsis Book, C.R. Somerville and E.M. Meyerowitz, eds (Rockville, MD: American Society of Plant Biologists), doi/10.1199/tab.0009.
Wink, M. (2003) Evolution of secondary metabolites from an ecological and molecular phylogenetic perspective. Phytochemistry 64: 3–19.
Withers, S. G., Warren, R. A. J., Street, I. P., Rupitz, K., Kempton, J. B. und Aebersold, R. (1990) Unequivocal demonstration of the involvement of a glutamate residue as a nucleophile in the mechanism of a retaining glycosidase. Journal of the American Chemical Society 112: 5887 5889.
Wu, H. W.; Haig, T.; Pratley, J.; Lemerle, D.; An, M. (2000) Distribution and exudation of allelochemicals in wheat Triticum aesti vum . J. Chem. Ecol. 26: 2141–2154.
Wu, H. W.; Haig, T.; Pratley, J.; Lemerle, D.; An, M. (2001) Allelochemicals in wheat ( Triticum aesti vum L.): Production and exudation of 2,4 dihydroxy 7 methoxy 1,4 benzoxazin 3 one. J. Chem. Ecol. 27: 1691–1700.
Xu, W., Bak, S., Decker, A., Paquette, S. M., Feyereisen, R. und Galbraith, D. W. (2001) Microarray based analysis of gene expression in very large gene families: the cytochrome P450 gene superfamily of Arabidopsis thaliana. Gene 272: 61 74.
Xu, Z., Escamilla Trevino, L. L., Zeng L., Lalgondar, M., Bevan, D. R., Winkel, B. S. J., Mohamed, A., Cheng, C. L., Shih, M. C., Poulton, J. E. und Esen, A. (2004) Functional genomic analysis of Arabidopsis thaliana glycoside hydrolase family 1. Plant Mol. Biol. 55: 343 367.
Yoshihara, N., Imayama, T., Fukuchi Mizutani, M., Okuhara, H., Tanaka, Y., Ino, I. und Yabuya, T. (2005) cDNA cloning and characterization of UDP glucose: Anthocyanidin 3 O glucosyltransferase in Iris hollandica. Plant Sci. 169:496 501
Zhou, J. M., Hartmann, S., Shepherd, B. K. und Poulton, J. E. (2002) Investigation of the microheterogeneity and aglycone specificity conferring residues of black cherry prunasin hydrolases. Plant Physiol. 129: 1252–1264.
Zúñiga, G. E., Argandoña V. H., Niemeyer H. M. und Corcuera, L. J. (1983) Hydroxamic acid content in wild and cultivated Gramineae. Phytochemistry 22: 2665–2668. Anhang 101
7 Anhang
A B Ionenanzahl Ionenanzahl
5 7 x10 Kaempferol Glucosid EIC 447 –All MS x10 Kaempferol Glucosid EIC 447 –All MS
1 1
0 0 5 x10 Quercetin Glucosid EIC 463 –All MS 7 x10 Quercetin Glucosid EIC 463 –All MS 1
1
0 0 4 x10 Myricetin Glucosid EIC 479 –All MS x10 7 Myricetin Glucosid EIC 479 –All MS
1 1
0 0 25 30 35 40 Zeit [min] 26 30 34 38 42 Zeit [min]
Abbildung 26: LC MS Analyse der Glucosylierung der Flavonole Kaempferol, Quercetin und Myricetin durch Co GT (A) und Lg GT (B).
Zm BX8 MAAS------CGGRVVVFPFPFQGHFNPVMRLARALHARGVGITVFHTAG------AR 46 Zm BX9 MASSRTGAGAGAGGRVVVFPFPFQGHFNPVMRLARALHARGLAITVFHSG------50 Co BX8 ------MASSPKTPHIVCVPAPAQGHINPMFKLAKLFHSRGFYITFVHSEFSYQRLLQAS 54 At COGT2 --MGSQIIHNSQKPHVVCVPYPAQGHINPMMRVAKLLHARGFYVTFVNTVYNHNRFLRSR 58 Sb HMNGT --MG-SNAPPPPTPHVVLVPFPGQGHVAPLMQLARLLHARGARVTFVYTQYNYRRLLRAK 57 pLg BX8-1 -----MEAKNGRKAHVLAVAGPAQGHVKPLMKLCRQIAKHGLKVTLVNLQS------46 ::: .. * ***. *::::.: : :* :*..
Zm BX8 APDPADYPAD----YRFVPVPVEVAPELMAS-EDIAAIVTALNAACEAPFRDRLSALLSA 101 Zm BX9 ALDPADYPAD----YRFVPVTVEADPKLLAS-EDIAAIVTTLNASCDAPFRARLSALLAA 105 Co BX8 ALDHLKGLNN----FRFETIPDGLPPENKRGVSDVPELCKSMRNTCADPFRSLILKLN-- 108 At COGT2 GSNALDGLPS----FRFESIADGLPETDMDATQDITALCESTMKNCLAPFRELLQRIN-- 112 Sb HMNGT GEAAVRPPATSSARFRIEVIDDGLSLSVPQ--NDVGGLVDSLRKNCLHPFRALLRRLGQE 115 pLg BX8-1 VHDKLVGEED-----NIVQMVSIPDVPIEEDKDDPFKKMKNLRKTMPESLKDLIQGINSS 101 .: : .* .:: : :
Zm BX8 ADGEAGEAGGRVRCVLTDVSWDAVLSAARGLGVPALGVMTASAATFRVYMAYRTLVDKGY 161 Zm BX9 EGRDS------VRCVFTDVSWNAVLTASSDLGVPALGMMTASAASLRDYMAYRTLIDKGY 159 Co BX8 -SSSDVPP---VTCIVADVAMDFTLQVSEELGPPVVLFFTLSGCGVLGYMHYGELLERGY 164 At COGT2 -AGDNVPP---VSCIVSDGCMSFTLDVAEELGVPEVLFWTTSGCAFLAYLHFYLFIEKGL 168 Sb HMNGT VEGQDAPP---VTCVVGDVVMTFAAAAAREAGIPEVQFFTASACGLLGYLHYGELVERGL 172 pLg BX8-1 SNPEEKIG-----FVIADVMVEWLMDTAAEMGAEPILFSPTSAAFRAMMSRIPALLEDGM 156 . :. * .: * : . . *.. ::: *
Anhang 102
Zm BX8 LPVREE------RKDDAVAELPPYRVKDL--LRHETCDLEEFADLLGRVIAAARLS 209 Zm BX9 LPVKEE------RKEDPVPELPPYRVKDL--LRVDTSDLEEFAELLARTVTAARRA 207 Co BX8 FPLREESFLSNGYLD-TEIDWIPAMKGIRLKDLPSFLRTTDPDDIMFNCKIIEVNSAFKA 223 At COGT2 CPLKDESYLTKEYLEDTVIDFIPTMKNVKLKDIPSFIRTTNPDDVMISFALRETERAKRA 228 Sb HMNGT VPFRDASLLADDDYLDTPLEWVPGMSHMRLRDMPTFCRTTDPDDVMVSATLQQMESAAGS 232 pLg BX8-1 LDLNGN---IEKCEKITLSDDIPAWDKDEFSWS--FPHDPKTQKSFFDLINPDRGKIIQP 211 .. : :. .. : . . : . .
Zm BX8 SGLIFHTFPFIEAGTLGEIRDDMSVPVYAVAPLNKLVPAATASLHG------EVQADRG 262 Zm BX9 SGLIFNTFPLIETDTLAEIHKALSVPVFAVAPLNKLVPTATASLHG------VVQADRG 260 Co BX8 KGVILNTFDDLEQEVLDAIKSKIP-QLYTIGPLSMLCDHMLQPDSKLCEAS--LWEEDTS 280 At COGT2 SAIILNTFDDLEHDVVHAMQSILP-PVYSVGPLHLLANREIEEGSEIGMMSSNLWKEEME 287 Sb HMNGT KALILNTLYELEKDVVDALAAFFP-PIYTVGPLAEVIASSDSASAGLAAMDISIWQEDTR 291 pLg BX8-1 KLHLINTCYELESPACDLRPNLLP-----VGPLLEMNNSCN------FYPEDES 254 . :::* :* . :. :.** : :
Zm BX8 CLRWLDAQRARSVLYVSFGSMAAMDPHEFVELAWGLADAGRPFVWVVRPNLIRGFESGAL 322 Zm BX9 CLQWLDTQQPGSVLYVSFGSMAAMDPHEFVELAWGLADSKRPFVWVVRPNLIRGFESGAL 320 Co BX8 CLEWLQEKDPKSVLYVNIGSLATMTSQQLGEFAWGLANSMCPFLWVIRPDILDRASGIVS 340 At COGT2 CLDWLDTKTQNSVIYINFGSITVLSVKQLVEFAWGLAGSGKEFLWVIRPDLVAGEEAMVP 347 Sb HMNGT CLSWLDGKPAGSVVYVNFGSMAVMTAAQAREFALGLASCGSPFLWVKRPDVVEGEEVLLP 351 pLg BX8-1 CLSWLDTKLPESVIYVSFGSIAVVSQQQLDELALGLELSGRAFLWVVRPDLVNGLRAVYP 314 ** **: : **:*:.:**::.: : *:* ** . *:** **:::
Zm BX8 PDGVEDRVRGRGVVVSWAPQEEVLAHPAVGGFFTHCGWNSTVEAVSEGVPMICHPRHGDQ 382 Zm BX9 PDGVEDEVRGRGIVVTWAPQEEVLAHPAVGGFLTHNGWNSTVEAISEGVPMVCCPRHGDQ 380 Co BX8 EDYKKEIG-GRGLLVSWCQQEKVLKHPSIGGFLTHCGWNSTLESLCEGVPMICWPFFAEQ 399 At COGT2 PDFLMETK-DRSMLASWCPQEKVLSHPAIGGFLTHCGWNSILESLSCGVPMVCWPFFADQ 406 Sb HMNGT EALLDEVARGRGLVVPWCPQAAVLKHAAVGLFVSHCGWNSLLEATAAGQPVLAWPCHGEQ 411 pLg BX8-1 DGFLERVS-GIGMIVEWAPQERVLFHPSVACFLTHCGWNSILEGLSKGVSFLCWPFFMDQ 373 . .::. *. * ** *.::. *.:* **** :*. . * ..:. * . :* Zm BX8 YGNARYVCHVWKVGTEVAGDQLERGEIKAAIDRLMGGSEEGEGIRKRMNELKIAADKGI- 441 Zm BX9 FGNMRYVCDVWKVGTELVGEQLERGQVKAAIDRLFG-TKEGEEIKERMKEFKIAAAKGIG 439 Co BX8 QTNCFYICNKWGIGMEID-FDVKRVEIGMMVKELMK-GEKGLEMRNKVEDLMSKAIKATT 457 At COGT2 QMNCKFCCDEWDVGIEIG-GDVKREEVEAVVRELMD-GEKGKKMREKAVEWQRLAEKATE 464 Sb HMNGT TTNCRQLCEVWGNGAQLP-REVESGAVARLVREMMV-GDLGKEKRAKAAEWKAAAEAAAR 469 pLg BX8-1 FHNQNYICDKWEAGLRVD-GDGSGIRTRNEIKEKIGMMFCNGDLKANAMRLKEIFAKTVC 432 * *. * * .: : . : . : . : .
ZmBX8 -----DESAG--SDLTNLVHLINSY- 459 ZmBX9 IGVDVDETTSPRTDLTDLVDLIKSF- 464 Co BX8 PG--GSSHTNFEMLMEDVAKW----- 476 At COGT2 HKL-GSSVMNFETVVSKFLLGQKSQD 489 Sb HMNGT KG--GASWRNVERVVNDLLLVGGKQ- 492 pLg BX8-1 EG--GSSYNNFERFIDYLRK------450 . . : . Abbildung 27: Alignment von Co BX8 und p Lg BX8 (Allel 1) mit verschiedenen UGTs der Familie 1. Zm BX8: Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus Z. mays (Q8W2B7), Zm BX9: Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus Z. mays (Q8W2B6), Co BX8: Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus C. orientalis , At COGT2: Cytokinin O Glucosyltransferase 2 aus A. thaliana (Q9SK82), Sb HMNGT: UDPG p Hydroxymandelonitril Glucosyltransferase aus S. bicolor (Q9SBL1), p Lg BX8 1: Allel 1 der putativen Benzoxazinoid Glucosyltransferase aus L. galeobdolon . *, identische Aminosäure; :,ähnliche Aminosäure. Das konservierte PSPG Motiv von pflanzlichen UGTs der Familie 1 ist grau hervorgehoben, zwei weitere hoch konservierte Aminosäuren (N: >90%; G: >80%) sind ebenfalls grau hervorgehoben (Hughes und Hughes, 1994; Paquette et al ., 2003; Gachon et al ., 2005).
Anhang 103
ZmGLU1 ----SARVGSQ-NGVQMLSPSEIPQRDWFPSDFTFGAATSAYQIEGAWNEDGKGESNWDH 55 Sb DHUR1 ----AQTISSESAGIHRLSPWEIPRRDWFPPSFLFGAATSAYQIEGAWNEDGKGPSTWDH 56 Sc GLU -GTPSKPSEPIGPVFTKLKPWQIPKRDWFSKDFLFGASTSAYQIEGAWNEDGKGPSTWDH 59 Ta GLU1b AGTPSKPAEPIGPVFTKLKPWQIPKRDWFDKDFLFGASTSAYQIEGAWNEDGKGPSTWDH 60 Co GLU1 ---HSIATESIAIEGADYDFANFN-RSSFPHGFIFGSAGASYQYEGAYNIDGKGPSMWDT 56 Co GLU2 ------DYDDSDLN-RKSFPDGFVFGTASSAYQYEGAYREDGRGLSIWDT 43 . :: *. * .* **:: ::** ***:. **:* * **
Zm GLU1 FCHNHPERILDGSNSDIGANSYHMYKTDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTKEGGIN 115 Sb DHUR1 FCHNFPEWIVDRSNGDVAADSYHMYAEDVRLLKEMGMDAYRFSISWPRILPKGTLAGGIN 116 Sc GLU FCHTYPERISDGTNGDVAANSYHMYEEDVKALKDMGMKVYRFSISWSRILPNGT--GKPN 117 Ta GLU1b FCHTYPERISDMTNGDVAANSYHLYEEDVKALKDMGMKVYRFSISWSRILPDGT--GKVN 118 Co GLU1 WTHQRPEKIADHSNGDVANDQYHHYKEDVKLMKDMGMNAYRFSISWSRVLPNGKLAGGVN 116 Co GLU2 YTHQHPERIVDGKNGDVAVNHYHQYKEDVALMKDMGMDAYRFSISWSRVLPSGKLSGGVN 103 : * ** * * .*.*:. : ** * ** :*:***..*******.*:**.*. * *
Zm GLU1 PDGIKYYRNLINLLLENGIEPYVTIFHWDVPQALEEKYGGFLDKSHKSIVEDYTYFAKVC 175 Sb DHUR1 EKGVEYYNKLIDLLLENGIEPYITIFHWDTPQALVDAYGGFLDEED---YKDYTDFAKVC 173 Sc GLU QKGIDYYNNLINSLIRHGIVPYVTIWHWDTPQALEDKYGGFLDKQI---VNDYKYFAELC 174 Ta GLU1b QAGIDYYNKLINSLIDNDIVPYVTIWHWDTPQALEDKYGGFLNRQI---VDDYKQFAEVC 175 CoGLU1 KMGVQYYNNFINELLAKGLQPYATIFHWDTPQHLEDEYGGFLSRRI---VSDFQDFAELC 173 Co GLU2 RKGIQFYNNLIDELVSKGLQPYVTLFHWDVPQQLEDEYGGFLSSHI---VLDFQDYAELC 160 *:.:*.::*: *: :.: ** *::***.** * : *****. *: :*::*
Zm GLU1 FDNFGDKVKNWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGRCSPGLDCAYPTGNSLVEPYTAGHNIL 235 Sb DHUR1 FEKFGKTVKNWLTFNEPETFCSVSYGTGVLAPGRCSPGVSCAVPTGNSLSEPYIVAHNLL 233 Sc GLU FQSFGDRVKNWFTFNEPHTYCCFSYGEGIHAPGRCSPGLDCAVPEGDSLREPYTAGHHIL 234 Ta GLU1b FKNFGDRVKNWFTFNEPHTYCCFSYGEGIHAPGRCSPGMDCAVPEGDSLREPYTAGHHIL 235 Co GLU1 YKMFGDRVKHWITLNEPWSYTTAGYSSGMFPPNHCSK-WIGKCKGGNSATEPYIITHHQI 232 Co GLU2 YKEFGDRVKYWITINEPLSLSRDAYDEGKNAPGRCSQ-PDGNCTAGNSATEPYITGHNQL 219 :. **. ** *:*:*** : .*. * .*.:** *:* *** *: : Zm GLU1 LAHAEAVDLYNKHY-KRDDTRIGLAFDVMGRVPYGTSFLDKQAEERSWDINLGWFLEPVV 294 Sb DHUR1 RAHAETVDIYNKYH-KGADGRIGLALNVFGRVPYTNTFLDQQAQERSMDKCLGWFLEPVV 292 Sc GLU LAHAEAVELFKAHYNKHGDSKIGMAFDVMGYEPYQDSFLDDQARERSIDYNMGWFLEPVV 294 Ta GLU1b LAHAEAVQLFKARYNMHGDSKIGMAFDVMGYEPYQDSFLDDQARERSIDYNMGWFLEPVV 295 Co GLU1 LAHAAAVKVYKDKYQASQKGMIGITLNGIWMVPYSQARVHRDAAHRALDFMVGWYMEPLT 292 Co GLU2 LAHAAAVKVYKKKYQGDQNGKIGITLSAVWMVPFSEAKIDNEAAQRAIEFSYGWFMDPLT 279 *** :*.::: : . **:::. . *: : :. :* .*: : **:::*:.
Zm GLU1 RGDYPFSMRSLARERLPFFKDEQKEKLAGSYNMLGLNYYTSRFSKNIDISPNYSPVLNTD 354 Sb DHUR1 RGDYPFSMRVSARDRVPYFKEKEQEKLVGSYDMIGINYYTSTFSKHIDLSPNNSPVLNTD 352 Sc GLU RGDYPFSMRSLIGDRLPMFTKEEQEKLGSLCDIMGLNYYTSRFSKHVDISSDYTPTLNTD 354 Ta GLU1b RGDYPFSMRSLIGDRLPMFTKEEQEKLASSCDIMGLNYYTSRFSKHVDMSPDFTPTLNTD 355 Co GLU1 YGYYPKSMQLNVGKRLPKFSQKEVDMVKGSYDFLGFNYYTANYATNVPFSNDIKPSYDAD 352 Co GLU2 HGEYPKIMQSLVGNRLPRFTKSQSDMVKGSYDFLGLNYYTANYAANRNNSIDVQKSYSTD 339 * ** *: .*:* *...: : : . :::*:****: :: : * : .:*
Zm GLU1 DAYASQEVNGPDGKPIGPPMGNPWIYMYPEGLKDLLMIMKNKYGNPPIYITENGIGDVDT 414 Sb DHUR1 DAYASQETKGPDGNAIGPPTGNAWINMYPKGLHDILMTMKNKYGNPPMYITENGMGDIDK 412 Sc GLU DAYASSETTGSDGNEIGPITGTYWIYMYPKGLTDLLLIMKEKYGNPPIFITENGIADVEG 414 Ta GLU1b DAYASSETTGSDGNDIGPITGTYWIYMYPKGLTDLLLIMKEKYGNPPVFITENGIADVEG 415 Co GLU1 ARASLATER--NGVPIGPKSGSSWLFVYPQGMHRCLLYIKKKYQNPVIYITENGIGELNN 410 Co GLU2 CHCQLTKEK--DGVSIGPKTALSWLRVYPIGILNLLKYTKEKYDNPIIYITENGIAEANN 397 :* *** . *: :** *: * *:** ** ::*****:.: :
Anhang 104
Zm GLU1 KETPLPMEAALNDYKRLDYIQRHIATLKESIDLGSNVQGYFAWSLLDNFEWFAGFTERYG 474 Sb DHUR1 GD--LPKPVALEDHTRLDYIQRHLSVLKQSIDLGADVRGYFAWSLLDNFEWSSGYTERFG 470 Sc GLU DP---EMPDPLDDWKRLDYLQRHISAVKDAIDQGADVRGHFTWGLIDNFEWGSGYSSRFG 471 Ta GLU1b DE---SMPDPLDDWKRLDYLQRHISAVKDAIDQGADVRGHFTWGLIDNFEWSLGYSSRFG 472 Co GLU1 DT--LSLKEKLNDHMRVDYHDKHLKSVLRAIKEGVDVRGYFAWSFLDNFEWADGYTVRFG 468 Co GLU2 ST--LSLEEALTDPMRIDYHRRHLSFALRAIKEGVNIKGYFAWSFLDNFEWVDGYTVRFG 455 * * *:** :*: :*. * :::*:*:*.::***** *:: *:*
Zm GLU1 IVYVDRNNNCTRYMKESAKWLKEFN-TAKKP-----SKKILTPA---- 512 Sb DHUR1 IVYVDRENGCERTMKRSARWLQEFNGAAKKVE----NNKILTPAGQLN 514 Sc GLU LVYIDKEDGNKRKLKKSAKWFAKFNSVPKTLLKTTNNNATVTAS-VSV 518 Ta GLU1b LVYIDKNDGNKRKLKKSAKWFSKFNSVPKPLLKTTNNNATMTAASVSV 520 Co GLU1 LNYVGFKT-MRRYPKRSANWFKKFLLH------494 Co GLU2 LNYVDFKT-MKRYPKHASIWFKKFLVQ------481 : *:. : * *.:: *: :*
Abbildung 28: Alignment von Co GLU1 und Co GLU2 mit verschiedenen β Glucosidasen der Familie 1. Zm GLU1: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus Z. mays (P49235), Sb DHR1: Dhurrin β Glucosi dase aus S. bicolor (Q41290), Sc GLU: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus S. cereale (Q9FYS3), Ta GLU1b: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase aus T. aestivum (Q1XH05), Co GLU1: Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase 1 aus C. orientalis . Co GLU2: Benzoxazinoid Glucosid β Glu cosidase 2 aus C. orientalis .*, identische Aminosäure; :, ähnliche Aminosäure. Die in GH1 Enzymen konservierten Motive TFNEP und ITENG sind grau hervorgehoben, die darin enthalten Glutamin säurerest, die die katalytischen Reste darstellen sind dunkelgrau hervorgehoben. Aminosäurereste der Enzyme Zm GLU1, SbDHR1, Sc GLU und Ta GLU1a, die die Aglucon Bindetasche ausbilden sind blau hervorgehoben (Czjzek et al ., 2000; Nikus et al ., 2003; Sue et al ., 2006; Verdoucq et al ., 2004).
Ag SUSY: Alnus glutinosa putative Sucrose Synthase (P49034); At CNGT1: A. thaliana Cytokinin N Glucosyltransferase 1 (Q9FI99); At CNGT2: A. thaliana Cytokinin N Glucosyltransferase 2 (Q9FIA0); At CoGT1: A. thaliana Cytokinin O Glucosyltransferase 1 (Q9ZQ99); At CoGT2: A. thaliana Cytokinin O Glucosyltransferase 2 (Q9SK82); At CoGT3: A. thaliana Cytokinin O Glucosyltransferase 3 (Q9ZQ94); At FOGT1: A. thaliana Flavonol 3 O Glycosid 7 O Glucosyltransferase 1 (Q9ZQ95); At FORT: A. thaliana Flavonol 3 O Glucosid L Rhamnosyltransferase (Q9S9P6); At HQGT: A. thaliana putative Hydroquinon Glucosyltransferase (Q9M156); At HTGT: A. thaliana N hydroxythioamide S β Glucosyltransferase (O48676); At IABGT1: A. thaliana Indol 3 Essigsäure β Glucosyltransferase 1 (Q9LR44); At IABGT2: A. thaliana Indol 3 Essigsäure β Glucosyltransferase 2 (Q9ZVY5); At SUS1: A. thaliana putative Sucrose Synthase 1 (P49040); At SUS2: A. thaliana putative Sucrose Synthase 2 (Q00917); At UGAGT: A. thaliana Anthocyanin 5 O Glucosyltransferase (Q0WW21); At UPTP: A. thaliana UDP Glucosyltransferase At1g05670 (P0C7P7); Bv SPS: Beta vulgaris putative Sucrose phosphat Synthase (P49031); Bv SUSY: B. vulgaris putative Sucrose Synthase (Q42652); Co GT: Consolida Flavonoid Glucosyltransferase (HM559224); Co BX8: C. orientalis DIBOA Glucosyltrans ferase (HM559229); Cs SPS1: Craterostigma plantagineum Sucrosephosphat Synthase 1 (O04932); Cs SPS2: C. plantagineum Sucrosephosphat Synthase 2 (O04933); Cu LGT: Citrus unshiu Limonoid UDP Glucosyltransferase (Q9MB73); Cu SPS1: C. unshiu Sucrosephosphat Synthase 1 (O22060); Dc SUS1: Daucus carota Sucrose Synthase Isoform 1 (P49035); Dc SUS2: D. carota putative Sucrose Synthase Isoform 2 (O49845); Fa GT6: Fragaria ananassa Flavonoid 3 O Glucosyltransferase (Q2V6K0); Gm SUSY: Glycine max Sucrose Synthase (P13708); Gt 3GT: Gentiana triflora Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase (Q96493); Gt 3'GT: G. triflora Anthocyanin 3' O β Glucosyltransferase (Q8H0F2); Hv Bz1: H. vulgare putative Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase (P14726); Hv SUS1: H. vulgare Sucrose Synthase 1 (P31922); Hv SUS2: H. vulgare Sucrose Synthase 2 (P31923); Ih 3GT: Iris hollandica Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase (Q5KTF3); Lg GT: L. galebodolon Flavonoid Glucosyltransferase (HM559227); Lg BX8: L. galeobdolon putative DIBOA Glucosyltransferase (HM559228); Ms SUSY: Medicago sativa putative Sucrose Synthase (O65026); Os iSPS: O. sativa subsp. indica putative Sucrosephosphat Synthase (A2WYE9); Os jSPS: O. sativa subsp. japonica putative Sucrosephosphate Synthase (Q0JGK4); Os jSUS1: O. sativa subsp. japonica putative Sucrose Synthase 1: (P31924); Os jSUS2: O. sativa subsp. japonica putative Anhang 105
Sucrose Synthase 2 (P30298); OsjSUS3: O. sativa subsp. japonica putative Sucrose Synthase 3 (Q43009); Pa SUSY: Phaseolus aureus putative Sucrose Synthase (Q01390); Ph PGT8: Petunia hybrida Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase (Q9SBQ3); Pl ZOG: Phaseolus lunatus Zeatin O Glucosyltransferase (Q9ZSK5); Ps SUS2: Pisum sativum putative Sucrose Synthase 2 (O24301); Ps UPTG: P. sativum putative α 1,4 Glucan Protein Synthase (O04300); Rh GT1: Rosa hybrid cultivar Anthocyanidin 5,3 O Glucosyltransferase (Q4R1I9); Rs HQGT: Rauvolfia serpentina Hydroquinone Glucosyltransferase (Q9AR73); Sb CISZOG1: Sorghum bicolor putative cis Zeatin O Glucosyltransferase (Q6JAH0); Sb HMNGT: S. bicolor Cyanohydrin β Glucosyltransferase (Q9SBL1); Sl SUSY: Solanum lycopersicum putative Sucrose Synthase (P49037); So SPS: Spinacia oleracea Sucrosephosphate Synthase (P31928); St SPS: Solanum tuberosum Sucrosephosphat Synthase (Q43845); St SUS1: S. tuberosum putative Sucrose Synthase (P10691); St SUS2: S. tuberosum putative Sucrose Synthase (P49039); St UPTG1: S. tuberosum α 1,4 glucan protein Synthase 1 (Q9SC19); St UPTG2: S. tuberosum α 1,4 glucan protein Synthase 2 (Q8RU27); Ta BX8: Triticum aestivum Benzoxazinoid Glucosyltransferase (HM559230); Tg SUS1: Tulipa gesneriana putative Sucrose Synthase 1 (Q41608); Tg SUS2: T. gesneriana putative Sucrose Synthase 2 (Q41607); UGT78D2: A. thaliana Flavonoid 3 O Glucosyltransferase (Q9LFJ8); Vf SPS: Vicia faba putative Sucrose phosphate Synthase (Q43876); Vf SUSY: V. faba Sucrose Synthase (P31926); Vv GT1: Vitis vinifera Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase 2 (P51094); Zm BX8: Z mays Benzoxazinoid Glucosyl transferase (Q8W2B7); Zm BX9: Z. mays Benzoxazinoid Glucosyltransferase (Q8W2B6); Zm Bz1: Z. mays Anthocyanidin 3 O Glucosyltransferase (P16166); Zm CISZOG1: Z. mays Cis Zeatin O Glucosyltransferase 1 (Q93XP7); Zm CISZOG2: Z. mays Cis Zeatin O Glucosyltransferase 2 (Q8RXA5); Zm IABGT: Z. mays Indol 3 Essigsäure β Glucosyltransferase (Q41819); Zm SPS: Z. mays Sucrosephosphat Synthase (P31927); Zm SUS1: Z. mays Sucrose Synthase 1 (P04712); Zm SUS2: Z. mays Sucrose Synthase 2 (P49036); Zm UPTG: Z. mays α 1,4 Glucan Protein Synthase (P80607).
Abbildung 29: Eingesetzte Sequenzen für den UGT Stammbaum: Abkürzung, Herkunft und Funktion der UGTs.
As GLU1 und As GLU2 : Avena sativa Avenacosid β Glucosidase 1 und 2 (Q38786 und Q9ZP27); At BGL03: A. thaliana β Glucosidase 3 (O65458); At BGL04: A. thaliana β Glucosidase 4 (Q9ZUI3); At BGL07: A. thaliana β Glucosidase 7 (Q9LZJ1); At BGL08: A. thaliana β Glucosidase 8 (Q67XN2); At BGL09: A. thaliana β Glucosidase 9 (Q9STP4); At BGL10: A. thaliana β Glucosidase 10 (Q93ZI4); At BGL11: A. thaliana β Glucosidase 11 (B3H5Q1); At BGL12: A. thaliana β Glucosidase 12 (Q9FH03); At BGLU13: A. thaliana β Glucosidase 13 (Q9LU02); AtBGLU15: A. thaliana β Glucosi dase 15 (O64879); At BGLU16: A. thaliana β Glucosidase 16 (Q9M1D0); At BGLU17: A. thaliana β Glucosidase 17 (O64882); At BGLU18: A. thaliana β Glucosidase 18 (Q9SE50); At BGLU19: A. thaliana β Glucosidase 19 (Q9LIF9); At BGLU20: A. thaliana β Glucosidase 20 (Q84WV2); At BGLU21: A. thaliana β Glucosidase 21 (Q9C525); At BGLU22: A. thaliana β Glucosidase 22 (Q9C8Y9); At BGLU23: A. thaliana β Glucosidase 23 (Q9LKR7); AtBGLU25: A. thaliana β Glucosi dase 25 (O82772); At BGLU27: A. thaliana β Glucosidase 27 (Q9M1D1); At BGLU28: A. thaliana β Glucosidase 28 (Q4V3B3); At BGLU29: A. thaliana β Glucosidase 29 (Q8GXT2); At BGLU30: A. thaliana β Glucosidase 30 (Q9M1C9); At BGLU31: A. thaliana β Glucosidase 31 (Q9FLU9); At BGLU32: A. thaliana β Glucosidase 32 (Q9FLU8); At BGLU33: A. thaliana β Glucosidase 33 (O48779); At BGLU40: A. thaliana β Glucosidase 40 (Q9FZE0); At BGLU41: A. thaliana β Glucosi dase 41 (Q9FIU7); At BGLU42: A. thaliana β Glucosidase 42 (Q9FIW4); AtBGLU44: A. thaliana β Mannosidase (Q9LV33); At BGLU45 und At BGLU46: Monolignol Glucosid β Glucosidasen (O80689 und O80690); At BGLU47: A. thaliana β Glucosidase 47 (Q9SVS1); At Myr1: A. thaliana Myrosinase 1 (TGG1; P37702); At Myr2: A. thaliana Myrosinase 2 (TGG2; Q9C5C2); At Myr4: A. thaliana Myrosinase 4 (TGG4; Q8GRX1); At Myr5: A. thaliana Myrosinase 5 (TGG5; Q3ECS3); At Pen2: A. thaliana β Glucosidase 26 (O64883); At SRF2: A. thaliana β Glucosidase like SFR2 (Q93Y07); Bn MYR1: Brassica napus Myrosinase (Q00326); Co GLU1: C. orientalis DIBOA Glucosid β Glucosidase (HM559225); Dc BGLU1: Dalbergia cochinchinensis Dalcochinin β Glucosidase/β Fucosidase (Q9SPK3); Gm MAN: Glycine max putative β Mannosidase (CAW48598); Hb LIN: Hevea brasiliensis linamarase (Q7Y073); Hv MAN: H. vulgare β Mannosidase (B5A496); Lj BGD2 und Lj BGD4: Lotus japonicus Hydroxynitrile β Glucosidase D2 und D4 (B2ZUU1 und B2ZUU0); Lj BGD7: L. japonicus β Glucosidase D7 (B2ZUU2); Me LIN: Manihot esculenta Linamarase (Q41172); Mt BGLUG2 und Mt BGLUG4: Medicago truncatula β Glucosidase G2 und G4 (A8TVQ5 und A8TVR1); Os BGL01: O. sativa β Glucosidase 1 (Q5QMT0); Os BGL02: O. sativa β Glucosidase 2 (B7F8N7); Os BGL03: O. sativa β Glucosidase 3 (Q8RZL1); Os BGL04: O. sativa β Glucosidase 4 Anhang 106
(Q5N863); Os BGL05: O. sativa β Glucosidase 5 (Q5JK35); Os BGL06: O. sativa β Glucosidase 6 (Q8L7J2); Os BGLU07: O. sativa β Glucosidase 7 (Q42975); Os BGL08: O. sativa β Glucosidase und β D Mannosidase (Q75I94); Os BGL10: O. sativa β Glucosidase 10 (Q7F9K4); OsBGL11: O. sativa β Glucosidase 11 (Q7XKV5); Os 4bglu12: O. sativa Exoglucanase (Q7XKV4); Os BGLU13: O. sativa β Glucosidase 13 (Q7XKV2); Os BGLU14: O. sativa β Glucosidase 14 (Q7XPY7); Os BGLU16: O. sativa β Glucosidase 16 (Q7XSK2); Os BGLU18: O. sativa β Glucosidase 18 (Q7XSK0); Os BGLU19: O. sativa β Glucosidase 19 (Q0DIT2); Os BGLU20: O. sativa β Glucosidase 20 (B9FHH2); Os BGLU21: O. sativa Scopolin β Glucosidase (Q60DY1); Os BGLU22: O. sativa β Glucosidase 22 (Q60DX8); Os BGLU23: O. sativa β Glucosidase 23 (Q6L597); Os BGLU24: O. sativa β Glucosidase 24 (Q5Z9Z0); Os BGLU25: O. sativa β Glucosidase 25 (Q0DA21); Os BGLU26: O. sativa β Glucosidase 26 (A3BMZ5); Os BGLU27: O. sativa β Glucosidase 27 (Q84YK7); Os BGLU28: O. sativa β Glucosidase 28 (Q7EXZ4); Os BGLU29: O. sativa β Glucosidase 29 (A3C053); Os BGLU30: O. sativa β Glucosidase 30 (Q0J0N4); Os BGLU31: O. sativa β Glucosidase 31 (B7F7K7); Os BGLU32: O. sativa β Glucosidase 32 (Q0J0G2); Os BGLU33: O. sativa β Glucosidase 33 (Q0J0G1); Os BGLU34: O. sativa β Glucosidase 34 (Q339X2); Os BGLU35: O. sativa β Glucosidase 35 (Q53NF0); Os BGLU38: O. sativa β Glucosidase 38 (Q2QSR8); Os MAN: O. sativa putative β Mannosidase (EAY74244); Os SRF2: O. sativa β Glucosi dase like SFR2 (Q8L6H7); Pc CBG: Pinus contorta Coniferin β Glucosidase (Q9ZT64); Ps AH1: Prunus serotina Amygdalin β Glucosidase 1 (Q945G7); Ps PH1: P. serotina putative Prunasin Hydro lase (Q9M5X4); Ps PH3: P. serotina Prunasin Hydrolase (Q945N9); Ps PH4: P. serotina Prunasin Hydrolase (Q945I4); Pt MAN: Populus trichocarpa putative β Mannosidase (A9PFR8); Rc MAN: Ricinus communis putative β Mannosidase (B9T4F7); Sa MA1: Sinapis alba Myrosinase MA1 (P29736); Sa MYR: S. alba Myrosinase MB3 (P29092); Sb DHR1 und Sb DHR2: Sorghum bicolor Dhurrinase 1 und 2 (Q41290 und Q93XR2); Sb MAN: S. bicolor putative β Mannosidase (SORBI DRAFT_06g030270); Sc GLU: Secale cereale Benzoxazinoid Glucosid β Glucosidase (Q9FYS3); Sl MAN: Solanum lycopersicum β Mannosidase (Q8VWL8); Ta GLU1a c: Triticum aestivum DIMBOA Glucosid β Glucosidase 1a c (Q1XIR9, Q1XH05 und Q1XH04); Tp BLU: Trifolium repens nicht cyano gene β Glucosidase (P26204); Tr BGLU78: T. repens Linamarase (P26205); Va VH: Vicia angustifolia Vicianin Hydrolase (A2SY66); Vv MAN: Vitis vinifera putative β Mannosidase (A5C932); Zm GLU1: Z. mays DIMBOA Glucosid β Glucosidase 1; Cytokinin Glucosid β Glucosidase (P49235); Zm GLU2: Z. mays DIMBOA Glucosid β Glucosidase 2 (Q41761); Zm MAN: Z. mays putative β Mannosidase (B7ZXH6).
Abbildung 30: Eingesetzten Sequenzen für den β Glucosidase Stammbaum: Abkürzung, Herkunft und Funktion der β Glucosidasen.
Anhang 107
Sequenzen
Co BX8
1 M A S S S P K T P H I V C V P A P A Q G 1 ATGGCATCTTCATCTCCCAAAACACCTCATATAGTTTGCGTTCCAGCACCAGCCCAAGGT
21 H I N P M F K L A K L F H S R G F Y I T 61 CACATAAACCCCATGTTCAAACTAGCAAAACTTTTCCACTCTAGAGGGTTTTACATAACC
41 F V H S E F S Y Q R L L Q A S A L D H L 121 TTTGTCCACAGTGAGTTCAGCTATCAACGTCTTCTACAGGCTAGTGCTCTTGATCATCTT
61 K G L N N F R F E T I P D G L P P E N K 181 AAGGGTCTGAACAATTTTCGATTTGAAACCATCCCTGATGGGTTACCACCAGAAAATAAG
81 R G V S D V P E L C K S M R N T C A D P 241 CGAGGAGTATCCGATGTTCCAGAGTTATGTAAATCGATGAGAAACACTTGCGCCGATCCC
101 F R S L I L K L N S S S D V P P V T C I 301 TTTCGGAGTCTTATATTAAAGCTTAATAGTTCTTCAGATGTACCTCCCGTAACTTGTATA
121 V A D V A M D F T L Q V S E E L G P P V 361 GTGGCAGATGTCGCCATGGACTTCACTTTACAGGTCTCCGAAGAACTTGGTCCGCCTGTA
141 V L F F T L S G C G V L G Y M H Y G E L 421 GTTCTCTTCTTTACACTCAGTGGATGTGGAGTCTTAGGGTATATGCACTATGGGGAGCTT
161 L E R G Y F P L R E E S F L S N G Y L D 481 CTTGAAAGGGGCTACTTTCCGTTACGAGAAGAAAGCTTCTTGAGTAACGGATATCTTGAT
181 T E I D W I P A M K G I R L K D L P S F 541 ACCGAAATCGATTGGATACCTGCAATGAAAGGAATTCGATTGAAGGATCTGCCAAGTTTC
201 L R T T D P D D I M F N C K I I E V N S 601 TTGAGAACAACCGATCCGGATGATATCATGTTCAATTGCAAAATTATTGAAGTAAACAGC
221 A F K A K G V I L N T F D D L E Q E V L 661 GCTTTCAAAGCTAAAGGTGTCATCCTCAACACTTTTGATGATTTGGAACAAGAGGTCTTA
241 D A I K S K I P Q L Y T I G P L S M L C 721 GATGCTATAAAATCTAAGATTCCACAGCTTTATACCATTGGTCCATTATCAATGCTTTGT
261 D H M L Q P D S K L C E A S L W E E D T 781 GATCATATGCTGCAGCCAGACTCGAAGTTATGTGAAGCAAGTTTATGGGAAGAAGATACG
281 S C L E W L Q E K D P K S V L Y V N I G 841 AGTTGTCTAGAATGGCTACAAGAAAAAGATCCCAAGTCAGTTTTGTATGTAAATATTGGT
301 S L A T M T S Q Q L G E F A W G L A N S 901 AGTCTTGCGACGATGACATCCCAACAGCTGGGTGAATTTGCATGGGGACTTGCTAACAGC
321 M C P F L W V I R P D I L D R A S G I V 961 ATGTGTCCTTTTTTATGGGTTATTCGACCTGATATCTTGGATAGAGCTTCAGGGATAGTT
341 S E D Y K K E I G G R G L L V S W C Q Q 1021 TCAGAAGACTACAAGAAAGAGATTGGTGGAAGAGGTCTTCTAGTAAGTTGGTGCCAACAA
361 E K V L K H P S I G G F L T H C G W N S Anhang 108
1081 GAAAAAGTTCTAAAACATCCTTCGATTGGAGGGTTCTTGACACATTGTGGGTGGAATTCT
381 T L E S L C E G V P M I C W P F F A E Q 1141 ACGTTAGAAAGCTTATGCGAGGGGGTGCCTATGATATGTTGGCCTTTCTTTGCAGAGCAA
401 Q T N C F Y I C N K W G I G M E I D F D 1201 CAAACAAATTGTTTCTATATCTGTAACAAGTGGGGGATCGGAATGGAAATTGATTTTGAT
421 V K R V E I G M M V K E L M K G E K G L 1261 GTTAAGAGAGTGGAAATAGGGATGATGGTGAAAGAGTTGATGAAAGGAGAGAAAGGATTG
441 E M R N K V E D L M S K A I K A T T P G 1321 GAAATGAGGAACAAAGTTGAGGATTTGATGAGTAAAGCAATTAAAGCTACAACGCCGGGA
461 G S S H T N F E M L M E D V A K W - 1381 GGGTCTTCTCATACTAATTTTGAAATGTTAATGGAGGATGTAGCAAAATGGTAG
pLg BX8-Allel1
1 M E A K N G R K A H V L A V A G P A Q G 1 ATGGAGGCAAAAAATGGCAGAAAAGCTCATGTTTTGGCAGTGGCAGGCCCAGCTCAAGGC
21 H V K P L M K L C R Q I A K H G L K V T 61 CACGTTAAGCCGTTGATGAAACTGTGTAGGCAAATAGCCAAACACGGCCTTAAGGTGACG
41 L V N L Q S V H D K L V G E E D N I V Q 121 CTTGTTAACTTACAGAGTGTCCATGATAAATTAGTGGGAGAAGAGGATAACATAGTACAA
61 M V S I P D V P I E E D K D D P F K K M 181 ATGGTCTCAATCCCAGATGTGCCAATCGAGGAAGATAAAGATGATCCCTTTAAGAAGATG
81 K N L R K T M P E S L K D L I Q G I N S 241 AAGAATCTGCGTAAAACTATGCCTGAATCGTTGAAAGATTTGATTCAGGGGATTAATAGT
101 S S N P E E K I G F V I A D V M V E W L 301 TCTTCCAATCCGGAGGAGAAAATTGGATTTGTGATTGCTGATGTTATGGTTGAGTGGTTA
121 M D T A A E M G A E P I L F S P T S A A 361 ATGGATACTGCGGCGGAGATGGGAGCGGAGCCGATACTTTTCTCGCCGACGTCCGCCGCC
141 F R A M M S R I P A L L E D G M L D L N 421 TTCCGCGCCATGATGTCTCGGATTCCGGCGCTTCTAGAAGATGGGATGCTTGATCTAAAT
161 G N I E K C E K I T L S D D I P A W D K 481 GGAAATATCGAGAAATGTGAAAAGATTACGTTGTCGGATGATATACCAGCTTGGGATAAA
181 D E F S W S F P H D P K T Q K S F F D L 541 GATGAGTTTTCCTGGAGCTTTCCTCATGACCCAAAAACTCAGAAGTCTTTCTTCGACTTG
201 I N P D R G K I I Q P K L H L I N T C Y 601 ATTAATCCTGACCGAGGAAAAATAATCCAACCCAAGTTGCATCTAATTAACACTTGTTAT
221 E L E S P A C D L R P N L L P V G P L L 661 GAACTTGAATCCCCGGCTTGTGATTTGAGGCCGAATTTACTGCCCGTTGGGCCATTACTT
241 E M N N S C N F Y P E D E S C L S W L D 721 GAGATGAATAATTCTTGCAATTTCTATCCAGAAGATGAATCTTGTTTAAGCTGGTTGGAC
261 T K L P E S V I Y V S F G S I A V V S Q 781 ACTAAACTACCAGAATCTGTGATTTATGTTTCTTTTGGTAGCATAGCAGTTGTCTCTCAG Anhang 109
281 Q Q L D E L A L G L E L S G R A F L W V 841 CAACAACTGGATGAGTTGGCACTCGGGCTCGAGCTCTCGGGCCGGGCTTTTCTGTGGGTC
301 V R P D L V N G L R A V Y P D G F L E R 901 GTGAGACCGGATCTTGTGAACGGGTTGCGGGCCGTGTACCCGGATGGATTCCTGGAGAGG
321 V S G I G M I V E W A P Q E R V L F H P 961 GTGAGTGGGATTGGAATGATCGTCGAATGGGCGCCTCAAGAAAGAGTACTTTTTCATCCG
341 S V A C F L T H C G W N S I L E G L S K 1021 TCTGTGGCGTGTTTTTTAACGCACTGCGGGTGGAACTCGATTCTGGAAGGTTTGAGTAAA
361 G V S F L C W P F F M D Q F H N Q N Y I 1081 GGTGTATCGTTTCTTTGTTGGCCTTTTTTCATGGATCAATTCCATAACCAAAATTACATT
381 C D K W E A G L R V D G D G S G I R T R 1141 TGTGATAAGTGGGAGGCTGGATTAAGGGTTGATGGTGATGGAAGTGGGATTAGAACGAGG
401 N E I K E K I G M M F C N G D L K A N A 1201 AATGAAATTAAGGAAAAAATTGGGATGATGTTTTGTAATGGCGATTTGAAGGCAAATGCA
421 M R L K E I F A K T V C E G G S S Y N N 1261 ATGAGATTGAAGGAAATATTTGCAAAGACCGTATGTGAAGGGGGCTCTTCTTATAATAAT
441 F E R F I D Y L R K - 1321 TTTGAGAGATTCATTGATTATCTTAGAAAATGA
Co GT
1 M G Q S K S E S E A H V A V I A F P F G 1 ATGGGGCAGAGCAAGAGCGAGAGCGAGGCACACGTAGCTGTTATAGCATTCCCCTTCGGC
21 S H A A Q I L N L T R R L A A S A P E V 61 TCACACGCAGCTCAGATCCTCAACCTGACTCGCAGATTGGCTGCTTCTGCCCCGGAAGTG
41 T F S F F S T A K S N K A V S G S T G G 121 ACCTTCTCATTCTTCAGCACTGCCAAGTCCAACAAGGCTGTCTCTGGTTCGACTGGTGGC
61 A E N I K F Y D V H H G V P E N H S F S 181 GCTGAGAATATCAAGTTCTACGACGTCCATCATGGGGTGCCTGAGAATCACTCGTTCTCG
81 G N P L E E I D L F I K A T P G N F I E 241 GGGAATCCCTTGGAAGAGATCGATCTTTTCATCAAAGCCACGCCTGGGAATTTCATCGAG
101 A I H K A V E E S D R K I T C L T N D S 301 GCGATACACAAGGCGGTGGAGGAGAGCGATAGAAAGATTACTTGTTTGACCAATGACTCT
121 F M W M G V D I A Q T L Q V P C V S V W 361 TTTATGTGGATGGGTGTGGATATAGCTCAGACGCTCCAGGTTCCATGTGTTTCTGTTTGG
141 A P G A S S L C A H L Y T D I L R Q N I 421 GCACCAGGTGCTTCTTCACTCTGTGCTCACTTGTATACAGACATTCTCAGACAAAATATT
161 G V G A N A K Y D E Y L T F I P A M E K 481 GGCGTTGGAGCAAATGCAAAGTACGACGAATACCTGACCTTCATTCCGGCAATGGAGAAG
181 V R A G D L P D E I L K G N L D S L F A 541 GTACGAGCAGGTGACTTGCCAGATGAGATCCTTAAGGGAAACTTGGATTCCCTCTTCGCG
Anhang 110
201 R L L H K A A Q V M P Q A D V V V I N S 601 CGCCTGCTACACAAGGCAGCTCAAGTGATGCCCCAAGCTGATGTGGTTGTCATCAACTCT
221 F E E L E Q D I V D H L K T K F Q T C L 661 TTCGAAGAACTAGAGCAAGACATAGTCGACCACTTGAAGACCAAGTTCCAAACATGTCTA
241 T V G P F T I V A P S I S D Q H D P H G 721 ACAGTCGGGCCCTTCACCATCGTGGCACCATCAATATCAGATCAGCACGATCCCCACGGT
261 C L P W L D A Q P K P S S V A Y I S F G 781 TGCCTCCCTTGGCTAGACGCACAGCCCAAACCCTCATCTGTGGCATATATTAGCTTTGGC
281 T M A T P P P Q E L K A L A E G I E A S 841 ACAATGGCTACGCCGCCCCCTCAGGAACTTAAGGCTCTGGCGGAGGGGATCGAAGCAAGT
301 G V P F L W S L K D S V K L H L P H G F 901 GGAGTACCATTTCTGTGGTCACTCAAGGACAGTGTAAAGCTACATCTACCACATGGGTTT
321 L E R T S E R G K V V P W T P Q S R L L 961 TTGGAAAGAACTAGTGAGAGAGGCAAGGTGGTGCCATGGACTCCACAGTCCAGGCTGCTG
341 R H P A V G V I V T H C G W N S I M E S 1021 CGACACCCGGCGGTTGGAGTAATTGTGACACACTGTGGGTGGAATTCAATAATGGAGAGC
361 I M G A V P I V Y R P F F G D H M L I S 1081 ATAATGGGTGCTGTGCCGATAGTGTACCGCCCGTTCTTTGGTGATCATATGTTGATCAGT
381 R F V S D I W K I G V S A G D V V F T K 1141 AGGTTTGTTTCTGATATATGGAAGATTGGTGTCAGTGCTGGGGATGTAGTGTTCACCAAA
401 D G V V N A L D T I L H K E E G K R I R 1201 GATGGTGTTGTGAATGCTCTGGATACAATTTTGCACAAAGAGGAAGGGAAGAGGATTAGA
421 E S V G M W K L K A T Q V V G D S G S T 1261 GAGAGTGTTGGAATGTGGAAACTCAAGGCAACACAAGTTGTGGGGGATTCAGGTAGTACT
441 T H N L D K L L K I V T A R N - 1321 ACTCACAACTTGGACAAGCTACTCAAGATAGTAACCGCTCGCAACTAA
Lg GT
1 M V F E S H I G V V A F P F G T H A A P 1 ATGGTGTTTGAGTCTCACATAGGTGTTGTAGCATTCCCATTCGGCACACACGCTGCGCCC
21 L L D V V Q R I A A S A P G T L F S F F 61 CTACTGGACGTGGTGCAGAGGATCGCAGCCTCGGCGCCCGGAACCCTGTTTTCATTCTTC
41 N T A D S N R K L F N T C A N I R I H E 121 AACACCGCTGATTCAAACAGAAAGCTTTTCAACACGTGCGCCAATATACGGATACACGAG
61 V W D G T P R D Q V F T G S H F E A L G 181 GTGTGGGACGGGACGCCACGTGACCAGGTTTTCACCGGGAGTCATTTCGAGGCCCTCGGT
81 L F L K A C P H N L E K A I G E A E E D 241 TTATTCCTCAAAGCATGTCCTCACAATTTGGAGAAGGCCATCGGAGAAGCGGAAGAGGAC
101 T G L T I C S L I S D A F L W F S C D L 301 ACCGGTTTGACAATCTGCTCCTTGATAAGTGATGCCTTTTTGTGGTTTTCTTGTGATTTA
Anhang 111
121 A E K R G V P W V A L W T S A S C S L S 361 GCTGAGAAAAGAGGGGTACCATGGGTAGCTCTCTGGACCTCTGCTTCCTGCTCTCTCTCT
141 A H M Y T H E I L Q A L E S G V A E R D 421 GCCCATATGTATACTCATGAAATACTACAGGCACTCGAATCTGGTGTTGCGGAAAGGGAT
161 E H D K I Q P L I P G L E M A T F R D L 481 GAACACGACAAGATCCAGCCGTTGATTCCAGGGTTGGAAATGGCGACCTTCCGAGATCTA
181 P P E V F L D K N P S P L A V T I N K A 541 CCGCCGGAAGTTTTCTTAGATAAGAATCCGTCGCCGTTAGCGGTAACGATCAATAAGGCG
201 V E K L P R S H A V I L N S F E E I D P 601 GTGGAAAAGCTACCGAGATCGCACGCGGTAATTCTCAATTCCTTCGAAGAAATCGATCCG
221 I I A K D L K S K F R H F L N I G P S I 661 ATTATCGCCAAGGATCTGAAATCGAAATTCCGCCATTTTCTCAACATCGGACCTTCGATT
241 L P S P I A D D K S G C L S W L G K Q T 721 CTTCCCTCCCCAATCGCAGACGACAAATCAGGGTGCCTATCGTGGCTGGGAAAGCAAACC
261 R P K S V V Y I S F S T V A T P P E K E 781 AGACCTAAATCGGTTGTCTACATCAGCTTCAGCACGGTGGCTACGCCGCCGGAGAAGGAG
281 L V A L A E A L E A C Q F P F L W S L K 841 CTGGTGGCGTTGGCTGAAGCCCTGGAAGCGTGCCAATTCCCCTTTCTGTGGTCGCTGAAA
301 E Q A R E S L P D G F L E R T T S F G K 901 GAGCAGGCGAGGGAATCTCTGCCGGATGGGTTTCTGGAACGGACGACGTCGTTCGGGAAG
321 I V S W A P Q L Q V L A H D S V G V F V 961 ATCGTGTCGTGGGCCCCACAATTGCAGGTTCTGGCGCATGATAGCGTGGGAGTGTTCGTC
341 S H C G W N S I I E S I S S G V P M I C 1021 TCTCACTGTGGATGGAACTCGATCATTGAGAGCATTTCCAGCGGCGTTCCGATGATTTGT
361 R P F F G D Q K L N S R M I Q D S W K I 1081 CGCCCATTTTTTGGGGATCAGAAGCTGAACAGCAGAATGATTCAGGATTCATGGAAGATT
381 G L R I E G G V F S K S G A M E A L N R 1141 GGGTTGAGAATTGAAGGAGGGGTGTTTAGTAAAAGTGGAGCAATGGAGGCGTTGAATCGG
401 I M T G D E G K I I R E N V N V L K E K 1201 ATAATGACTGGCGATGAAGGAAAGATAATAAGGGAAAATGTTAATGTGCTCAAGGAAAAA
421 A T T A V E P Q G S S S K N F Q K L L Q 1261 GCTACGACTGCAGTTGAACCACAAGGAAGTTCATCTAAAAATTTCCAGAAATTGCTACAA
441 I I C I - 1321 ATAATTTGTATTTGA
Co GLU1
1 M G V P F H L V L G L L L L P I L A H S 1 ATGGGTGTCCCATTTCATCTGGTTTTAGGCCTTCTTCTGCTTCCTATTCTTGCTCATTCC
21 I A T E S I A I E G A D Y D F A N F N R 61 ATTGCCACTGAATCCATTGCCATTGAAGGAGCAGATTATGATTTTGCTAACTTCAATCGA
Anhang 112
41 S S F P H G F I F G S A G A S Y Q Y E G 121 AGTAGCTTTCCCCATGGTTTTATATTTGGATCCGCGGGTGCGTCGTACCAGTATGAAGGT
61 A Y N I D G K G P S M W D T W T H Q R P 181 GCATACAATATAGATGGTAAAGGTCCAAGTATGTGGGATACTTGGACACACCAGCGTCCA
81 E K I A D H S N G D V A N D Q Y H H Y K 241 GAGAAAATAGCAGATCATTCAAATGGAGATGTAGCGAATGATCAGTACCATCATTATAAG
101 E D V K L M K D M G M N A Y R F S I S W 301 GAGGATGTAAAACTGATGAAAGACATGGGTATGAATGCTTATAGGTTCTCCATCTCATGG
121 S R V L P N G K L A G G V N K M G V Q Y 361 TCGAGGGTTTTGCCTAATGGGAAGCTAGCTGGAGGGGTGAACAAAATGGGAGTCCAATAT
141 Y N N F I N E L L A K G L Q P Y A T I F 421 TACAACAATTTCATCAACGAGCTCCTAGCAAAAGGTCTGCAACCATATGCGACCATTTTC
161 H W D T P Q H L E D E Y G G F L S R R I 481 CACTGGGATACACCTCAGCACCTTGAAGATGAATATGGTGGCTTTCTGAGTCGGCGTATC
181 V S D F Q D F A E L C Y K M F G D R V K 541 GTATCAGATTTTCAAGATTTTGCAGAGCTTTGCTACAAGATGTTTGGAGATCGCGTGAAA
201 H W I T L N E P W S Y T T A G Y S S G M 601 CACTGGATTACGTTAAACGAACCTTGGAGCTACACCACTGCCGGTTACAGCTCAGGGATG
221 F P P N H C S K W I G K C K G G N S A T 661 TTCCCACCAAATCATTGCTCCAAATGGATTGGAAAATGCAAAGGGGGGAATTCCGCAACA
241 E P Y I I T H H Q I L A H A A A V K V Y 721 GAACCATATATTATTACTCACCACCAAATTCTTGCCCATGCAGCTGCAGTAAAAGTATAC
261 K D K Y Q A S Q K G M I G I T L N G I W 781 AAGGACAAGTACCAGGCTTCACAAAAGGGAATGATTGGAATTACATTAAATGGTATTTGG
281 M V P Y S Q A R V H R D A A H R A L D F 841 ATGGTACCGTACTCTCAAGCCCGAGTTCACAGAGATGCTGCTCACCGAGCTCTGGATTTC
301 M V G W Y M E P L T Y G Y Y P K S M Q L 901 ATGGTTGGATGGTATATGGAACCCTTGACATATGGATACTATCCAAAGAGTATGCAATTA
321 N V G K R L P K F S Q K E V D M V K G S 961 AATGTTGGGAAAAGATTGCCAAAATTCTCTCAAAAGGAAGTTGATATGGTAAAGGGATCA
341 Y D F L G F N Y Y T A N Y A T N V P F S 1021 TACGACTTTCTTGGATTCAATTACTATACTGCAAACTATGCAACAAATGTTCCTTTCTCA
361 N D I K P S Y D A D A R A S L A T E R N 1081 AATGATATTAAACCAAGCTATGACGCTGATGCTCGTGCTAGTCTTGCCACTGAGAGAAAT
381 G V P I G P K S G S S W L F V Y P Q G M 1141 GGAGTCCCAATTGGACCTAAGTCTGGTTCGTCGTGGCTTTTTGTGTACCCACAGGGGATG
401 H R C L L Y I K K K Y Q N P V I Y I T E 1201 CACCGCTGTTTGCTCTACATTAAAAAGAAATATCAAAATCCTGTCATCTACATAACAGAG
421 N G I G E L N N D T L S L K E K L N D H 1261 AATGGTATAGGTGAGCTCAATAATGATACATTGTCTCTCAAGGAGAAATTGAATGATCAT
441 M R V D Y H D K H L K S V L R A I K E G 1321 ATGAGAGTGGACTACCATGATAAACATCTTAAATCTGTGCTAAGAGCAATCAAGGAAGGT Anhang 113
461 V D V R G Y F A W S F L D N F E W A D G 1381 GTAGACGTGAGAGGATACTTTGCATGGTCCTTTCTCGACAATTTTGAATGGGCTGATGGT
481 Y T V R F G L N Y V G F K T M R R Y P K 1441 TACACCGTTCGATTCGGTCTCAATTATGTGGGCTTCAAAACAATGAGAAGATACCCAAAA
501 R S A N W F K K F L L H - 1501 AGATCGGCCAACTGGTTCAAGAAGTTTCTCTTACACTAA
Co GLU2
1 M S V V K I V H L V L D L L L V F N S F 1 ATGAGTGTTGTGAAGATAGTTCATCTGGTTTTAGATCTTCTTCTTGTGTTCAACTCATTT
21 L F N P R A L D Y D D S D L N R K S F P 61 TTGTTCAATCCAAGAGCTCTGGATTACGATGACTCGGATTTAAACCGAAAGAGTTTTCCA
41 D G F V F G T A S S A Y Q Y E G A Y R E 121 GATGGTTTTGTTTTCGGGACGGCTTCATCGGCGTATCAGTATGAAGGTGCATACAGGGAA
61 D G R G L S I W D T Y T H Q H P E R I V 181 GATGGAAGAGGTCTGAGCATTTGGGATACCTACACTCACCAACACCCAGAAAGAATTGTT
81 D G K N G D V A V N H Y H Q Y K E D V A 241 GATGGCAAAAACGGAGATGTAGCTGTTAATCATTATCATCAATACAAGGAAGATGTAGCA
101 L M K D M G M D A Y R F S I S W S R V L 301 CTTATGAAGGATATGGGCATGGATGCTTACCGATTCTCCATCTCATGGTCAAGAGTTTTA
121 P S G K L S G G V N R K G I Q F Y N N L 361 CCATCTGGAAAGTTAAGCGGAGGGGTTAATAGAAAAGGCATTCAATTTTACAATAATCTC
141 I D E L V S K G L Q P Y V T L F H W D V 421 ATCGATGAACTCGTGTCAAAAGGTTTACAACCTTATGTGACCCTGTTTCATTGGGATGTA
161 P Q Q L E D E Y G G F L S S H I V L D F 481 CCTCAACAACTCGAAGATGAATACGGTGGATTTTTGAGTTCACACATTGTACTGGATTTT
181 Q D Y A E L C Y K E F G D R V K Y W I T 541 CAGGACTATGCCGAACTTTGCTACAAGGAATTTGGCGATCGAGTGAAATATTGGATCACA
201 I N E P L S L S R D A Y D E G K N A P G 601 ATAAATGAGCCACTGAGCTTAAGTCGGGACGCATATGACGAGGGAAAAAATGCTCCGGGT
221 R C S Q P D G N C T A G N S A T E P Y I 661 CGATGCTCTCAACCTGATGGGAACTGCACGGCAGGGAATTCTGCAACAGAACCATATATT
241 T G H N Q L L A H A A A V K V Y K K K Y 721 ACAGGTCACAACCAACTTCTTGCTCATGCAGCTGCAGTGAAAGTGTACAAGAAAAAGTAT
261 Q G D Q N G K I G I T L S A V W M V P F 781 CAGGGTGATCAAAATGGAAAAATCGGAATAACACTAAGTGCAGTTTGGATGGTGCCTTTC Anhang 114
281 S E A K I D N E A A Q R A I E F S Y G W 841 TCTGAAGCTAAAATTGATAATGAAGCGGCCCAACGTGCCATTGAATTTAGCTACGGGTGG
301 F M D P L T H G E Y P K I M Q S L V G N 901 TTTATGGATCCTTTGACACACGGCGAGTATCCAAAGATAATGCAATCTCTTGTTGGAAAT
321 R L P R F T K S Q S D M V K G S Y D F L 961 CGTCTACCAAGATTCACCAAGAGTCAGTCTGACATGGTGAAAGGATCATACGATTTCCTT
341 G L N Y Y T A N Y A A N R N N S I D V Q 1021 GGATTAAATTATTATACTGCAAACTATGCAGCAAATCGTAACAACTCCATCGACGTTCAA
361 K S Y S T D C H C Q L T K E K D G V S I 1081 AAAAGTTATAGTACGGATTGTCATTGTCAACTAACCAAGGAGAAAGATGGTGTGTCGATT
381 G P K T A L S W L R V Y P I G I L N L L 1141 GGCCCAAAGACTGCTTTATCTTGGCTTCGAGTCTATCCTATAGGAATTCTAAATCTTTTG
401 K Y T K E K Y D N P I I Y I T E N G I A 1201 AAATACACCAAGGAAAAATATGATAATCCTATTATTTACATAACCGAGAATGGTATTGCT
421 E A N N S T L S L E E A L T D P M R I D 1261 GAGGCTAATAATAGTACATTGTCACTTGAGGAGGCATTAACAGACCCAATGAGAATAGAC
441 Y H R R H L S F A L R A I K E G V N I K 1321 TACCATCGCCGTCATCTTTCGTTTGCTCTGAGAGCTATCAAGGAAGGTGTGAATATAAAA
461 G Y F A W S F L D N F E W V D G Y T V R 1381 GGGTACTTTGCTTGGTCTTTTTTGGATAATTTTGAATGGGTTGATGGTTACACCGTCCGA
481 F G L N Y V D F K T M K R Y P K H A S I 1441 TTTGGTCTTAACTATGTAGACTTCAAAACAATGAAGAGATACCCAAAACACGCGTCCATT
501 W F K K F L V Q - 1501 TGGTTCAAGAAGTTCCTCGTTCAGTGA
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Herrn Prof. Gierl danke ich für die Möglichkeit, diese Arbeit am Lehrstuhl für Genetik anzufertigen, für sein Interesse an meiner Arbeit und seine fachliche Unterstützung.
Mein besonderer Dank gilt Frau Dr. Monika Frey, die immer ein offenes Ohr für meine Arbeit hatte, und mich jederzeit mit konstruktiven Ratschlägen, Hilfestellungen und ihrer Diskussionsbereitschaft unterstützt hat. Vielen Dank für die kontinuierliche wissenschaftliche Betreuung und das entgegengesetzte Vertrauen.
Dr. habil. Erich Glawischnig, Prof. Dr. Ramon Torres Ruiz und Dr. Lilla Römisch Margl für ihre Bereitschaft zur Diskussion und ihr Fachwissen.
Den restlichen Mitarbeitern und Ehemaligen für ihre Hilfsbereitschaft und die angenehme Arbeitsathmosphäre: Dr. Katrin Schullehner, Dr. Verena Kriechbaumer, Dr. Holger Schmidt, Ruohe Yin, Zheng Yu, Martina Hitzenbichler, Ottilie Peiß, Peter Dobos, Regina Hüttl, Dr. Rafał Jończyk, Manisha Choudhary und Linlin Zheng. Ein besonderer Dank geht hierbei an Miriam Zweigardt, Dr. Thomas Rauhut, Andreas Fießelmann, Dr. Birgit Treml und Stefan Lenk für die zahlreichen fachfremden Unternehmungen und ihre vielfältige Unterstützung im Laboralltag.
Der Sekretariatsbesetzung Petra Wick und Carolin Ziegler, für die Hilfe bei jeglichen bürokratischen Angelegenheiten.
Den Studenten Pham Trang , Niklas Bechtel, Thomas Briel, Inge Göpfrich, Agnes Luzak und Miriam Hillenmeyer für ihre engagierte Mitarbeit im Rahmen von Bachelorarbeiten und Forschungspraktika.
Herrn Prof. Rattei gilt mein Dank für die bioinformatische Unterstützung des Projekts durch die Assemblierung der C. orientalis Transkriptomsequenzen und die Berechnung der phylo genetischen Bäume.
Herrn Prof. Schwab und seinen Mitarbeitern für die Messungen an der LC MS und die Bereitstellung der Flavonoid Substrate.
Herrn Prof. Küster und Dr. Haslbeck für die de novo Sequenzierung der gereinigten Glucosyltransferasen.
Der DFG für die Finanzierung meiner Arbeit im Rahmen des Schwerpunktprogramms „Evolution metabolischer Diversität“.
Zuletzt danke ich meinen Eltern und meinen Schwestern Elisabeth und Maria, die immer großes Interesse an meiner Arbeit gezeigt haben und auf deren Unterstützung ich immer zählen konnte.
Regina Dick Finkenstraße 49 Tel: +49 1520 1874196 [email protected]
Lebenslauf Zur Person Geburtsdatum/ ort 31.10.1981 in Forchheim Nationalität deutsch Familienstand ledig Ausbildung 10/07 06/10 Promotion und Fertigstellung der vorliegenden Dissertation am Lehrstuhl für Genetik, Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Technische Universität München 10/02 09/07 Studium der Molekularen Biotechnologie an der TU München 09/07: Abschluss als M. Sc. 08/92 06/01 Justus von Liebig Gymnasium Neusäß 06/01: Allgemeine Hochschulreife