ire/,, So(. Cat. Biol., Vol, 40 (1989) 47-70

POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIU DE CEL•LULES VEGETALS PER A L'OBTENCIO DE PRODUCTES FARMACEUTICS

CARLES CODINA, FRANCESC VILADOMAT, JAUME BASTIDA l JOSEP MANEL LLABRES

Departament de Fisiologia Vegetal. Facultat de Farmacia. L'nirersitat de Barcelona.

Rebut 17 goner 1986

SUMMIART

Plants produce a peculiar group of natural products, particular to the plant kingdom, the secondary metabolites, which are very numerous and structurally diverse. Provided that plant cells can grow "in vitro", their culture offers the possibility of producing some of these compounds of pharmaceutical interest in large quantities. Alkaloids, steroids, cardiotonic glycosides, quinones and terpens, for example. are produced by either cell suspension cultures or immobilized cells; somctines at a higher rate than in the whole plant. These systems are also used to yield several substances by means of a given biotransformation reaction which cannot be achieved in any other way. The use of cell cultures in pharmaceutical industry is just one of the many sides of plant biotechnology, which is proving to become an indispensable technique soon in the future.

INTRODUCCIO les dificultats per a aconseguir un submi- nistrament eficac de plantes medicinals, Les plantes superiors, a mes de consti- degut en molts casos a la seva localitzacio tuir una font abundant de productes natu- geografica, al baix rendiment del principi rals indispensables per ]'home. corn ara actiu, subjecte a variacions estacionals, a additius alimentaris, fustes, fibres i olis, la drastica disminucio dels recursos vege- son tambe els productors mes importants tals corn a consequencia del trastocament de productes farmaceutics i de materials de I'entorn natural per part de ]'home, i a de diagnosi. Aixo no obstant, l'augment de ]'augment dels problemes tecnics i/o 48 (ARLES CODLVA. FR1NCESC' l7LADO,ifAT. JAL'ME BASTIDA I JOSEP .MANEL LL.1 BRES

TAULA I Enzims del metabolisme secundari aillats i purificats a partir de cultius de cel • lules vegetals En_im Font Reterrncia cafeoil-Coa: quinat cafeoil transferasa Stevia rebaudiana 202 calcona isomerasa Phaseolus vulgaris 45 calcona sintasa Petroselinum hortense 98 cinamoil CoA reductasa i cinamil alcohol: NADP' deshidrogenasa Glvcine max 112 fenilalanina amoni liasa Petroselinum hortense 225 hidroxicinamoil CoA ligasa Petroselinum hortense 92 strictosidina glucosidasa Catharanthus roseus 75 strictosidina sintasa Catharanthus roseus 198

economics en el conreu de les plantes sil- de qualsevol tipus de planta, tropical o vestres, ha induit nombrosos laboratoris a alpina , per produir els seus metabolits es- utilitzar d'altres fonts alternatives a la pro- pecifics, i 4) la reduccio del cost i augment duccio agricola, essent una d'elles el cultiu de la productivitat deguts al control auto- de teixits i cel•lules en suspensio d'origen matitzat del creixement cel•lular i a la re- vegetal (35). gulacio racional dels processos metabolics La metodologia dels cultius de cel•lules (184). vegetals actualment s'esta desenvolupant a Degut a aquestes avantatges , durant la un nivell que permet considerar seriosa- darrera decada han estat estudiades les ca- ment llur potencial per 1'aplicaci6 biotec- pacitats biosintetiques de diversos cultius nologica i la produccio farmaceutica, i son de cel • lules i teixits vegetals , tot obtenint- nombrosos els treballs que s'han publicat se uns resultats que si be no son sempre al respecte (4, 13, 17, 21, 37, 56, 58, 116, satisfactoris quant als nivells de productes 166, 167, 194), alguns dels quals han mos- obtinguts, ofereixen una possibilitat unica trat que un ampli espectre de models ci- per a la detecci6 de nous compostos d'inte- tologics i bioquimics de diferenciacio po- res medicinal no trobats anteriorment en den expressar-se a nivell de cel • lules indife- les plantes intactes , alguns dels quals es renciades en cultius en suspensio (218, podran produir en un futur proxim a nivell 219). industrial (59. 70, 74, 104, 138, 158). Aixi D'entre les principals avantatges que mateix, aquests sistemes experimentals ofereixen els sistemes de cultius de cel.lu- tambe son de gran utilitat a l'hora d'efec- les vegetals respecte als cultius convencio- tuar estudis metabolics , ja que s'evita la nals de plantes senceres , poden destacar- possible manca d'uniformitat entre els in- se: 1) la produccio dels compostos d'inte- dividus quan les experiencies es realitzen res medicinal sota condicions ambientals amb plantes senceres (52, 102, 177). A controlades, i per tant reproduibles, inde- mes, amb aquesta metodologia son diver- pendentment dels canvis climatics i esta- sos els enzims aillats fins ara implicats en cionals o de les conditions del sol ; 2) l'a- la biosintesi de diferents grups de metabo- septicitat d'aquests sistemes experimen- lits secundaris (taula i ). tals, Mures de microorganismes i/o insec- Es ben sabut que els microorganismes tes; 3 ) la facil multiplicacio de les cel•lules han permes la produccio a gran escala de POIENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CL LTIC DE CEL-LLLES VEGETALS PER.4 L'OBTENCIO DE PRODI'CTES E4RAfACEL TICS 49

productes farmaceutics i d'altres productes ment esta augmentant en importancia com naturals d'interes. No obstant aixo, les in- un instrument per a la propagaci6 a gran vestigacions dels darrers anys mitjancant escala de plantes individuals previament cultius de cel • lules vegetals han posat de seleccionades, la recuperaci6 a gran escala relleu les diferencies fonamentals entre de plantes individuals previament selec- aquests cultius i els microbians , les quals cionades, la recuperaci6 de plantes exemp- radiquen en el creixement molt mes rapid tes de malalties especifiques, i la producci6 dels microorganismes i en medis de cultiu d'hibrids somatics (11). Aixi, la recerca menys costosos , la menor sensibilitat d'a- sobre la formaci6 de protoplasts, la recupe- quests essers vius at stress de cisallament raci6 de cel•lules vegetals haploides, i Ilur produIt pets sistemes de fermentaci6 d'agi- manipulacid genetica son, juntament amb taci6 mecanica , i la major facilitat per la la producci6 de substancies d'interes me- selecci6 de les soques interessants (200). dicinal, arees fructiferes en l'aplicacid del Considerant aquests factors , i en vista cultiu de teixits i cel•lules en suspen- de la gran eficacia biotecnoldgica basada sid (68). en tongs i bacteris, aixi com del paper En el present treball s'ha estimat mes decisiu que els factors economics juguen adient exposar alguns temes de recent ac- en tot proces industrial (57, 69), els cultius tualitat, com ara la producci6 de metabd- de cel•lules vegetals tan sots poden ser co- lits secundaris mitjancant cel•lules immo- mercialment competitius quan s'utilitzin bilitzades, o la biotransformacid de subs- per a la producci6 de compostos especifics trats en compostos d'interes medicinal en d'origen vegetal els quals no es poden ob- cultius de cel•lules en suspens16, entre d'al- tenir per altres procediments ( 90, 129). Per tres, en detriment de la descripcid, per raO aixo, els cultius de cel • lules vegetals deu- de la seva extensi6, dell factors tant ex- rien aplicar-se en algun dels seguents as- terns (llum, temperatura, condicions nutri- pectes: 1) per a la producci6 de productes tives, fitohormones, etc.) com interns (es- naturals d'interes medicinal si el cultiu cel- tats de desenvolupament i diferenciaciO, lular proporciona una quantitat significati- estabilitat genetica, etc.), que influeixen en vament major que la planta intacta, o be si la produccio i/o acumulaci6 de consti- no es disposa de suficient quantitat de ma- tuents secundaris en aquests sistemes ex- terial vegetal ; 2) per a la producci6 de perimentals, descrits prou ampliament en constituents vegetals interessants per bio- diverses publicacions (18, 54, 67, 72, 117, transformaciO a partir de precursors de 142, 157). baix cost els quals no poden ser eficacment transformats per metodes quimics o mi- crobians: 3 ) per a la producci6 de nous ALGUNS ASPECTES DE LA compostos , com ara intermediaris biosin- TECNICA DEL CULTIU DE tetics, si mostren noves propietats biol6gi- CEL•LULES ques, i 4) per a la produccio de compostos vegetals especifics, com ara enzims o lecti- El primer pas en 1'establiment dels cul- nes, que tan sols poden aillar-se a partir de tius de cel•lules vegetals es I'obtenciO dels cel•lules vives i no de material vegetal in- cultius de call en un medi nutritiu solid, el tacte. qual cal que contingui tots els nutrients D'altra banda, el cultiu de teixits, em- essencials per tal de mantenir el creixe- prat ja des de fa una trentena d'anys amb ment i la divisid cel•lulars, necessitats que la finalitat d'aplicar- ho a la producci6 de poden variar substancialment d'una espe- substancies medicinals ( 29, 31), actual- cie a una altra. 50 (•IRLLS CODI1, FRI:y(I.S( I/1..MDOSI.IT,JIt.1ILBISIIDI1JOSLP 11IvF LI_1IIRL.

Un call es caracteritza per ser una asso- casos. D'altra banda, quant a la font prin- ciaci6 mes o menys lliure de cel • lules en la cipal de carboni i energia, la qual general- qual no s'observa teixit diferenciat, pero ment consisteix en un 2-3 % de sacarosa, degut fonamentalment at sell creixement glucosa o fructosa, tambe ban estat em- lent, la naturalesa relativament homogenia prats amb exit pel creixement de cultius de les cel • lules cultivades i la possible for- cel•lulars d'altres sucres, com ara la malto- maci6 de centres de diferenciacio , com ara sa, trealosa, rafinosa o estaquiosa, i fns i traqueides , aquests cultius no poden ser tot s'han assajat substrats mes barats com, utilitzats directament amb finalitats bio- per exemple, molases o d'altres residus del tecnologiques (91, 217). Aixo no obstant, processament de la bledarave o de la canya tambe han estat descrits nombrosos tre- de sucre (187). balls amb cultius de call respecte a 1'a- Aixo no obstant, per tat d'aconseguir cumulaci6 de constituents vegetals molt una adequada combinacio de maxim crei- diversos com , per exemple, acids xement i optima expressi6 de models par- grasos ( 164), alcaloides ( 136), amino- ticulars de diferenciacio citologics o bio- acids ( 1 10), diosgenina (165), L-DOPA quimics, dos tipus de fitohormones, fona- (22), ginsenosids ( 64), glicirricina (1 90), mentalment auxines i citoquinines, son de oils volatils ( 39), proteines ( 138), etc. Tots gran importancia per als cultius en suspen- aquests compostos son d'us medicinal i/o sio de cel•lules vegetals, si be no n'han farmaceutic , encara que la produccio, establert normes definitives quant a la igualment mitjancant la tecnica del cultiu composicio qualitativa i quantitativa en de teixits , d'insenticides, condiments, per- que han d'esser presents en el medi. Degut fums i agents colorants , tambe han estat a que la promoc16 de creixement i 1'acu- objecte d'una atencio especial. mulaci6 de productes secundaris poden re- Els cultius de cel•lules en suspensio re- querir diferents dosis de fitohormones, al- presenten 1'aplicaci6 biotecnol6gica mes guns autors suggereixen de fer creixer pre- avantatjosa dels cultius cel • lulars d'origen viament la biomassa necessaria en un vegetal . Consisteixen en cel • lules aillades, medi de creixement apropiat i transferir o petits agregats de 2 a 20 cel • lules, que despres les cel•lules a un medi diferent per poden considerar- se relativament homoge- tat de provocar la maxima acumulacio del nies respecte at creixement i a la diferen- producte (220, 223). ciacio, havent-se comprovat , a mes, que En l'actualitat, doncs, es poden dur a son les millors adaptades tant per la selec- terme cultius de cel•lules vegetals en sus- ci6 de cel•lules de rapid creixement com pensio que mostrin un ampli espectre de per 1'expressi6 de diversos programes de models de diferenciacio citologics i bioqui- diferenciacio bioquimica ( ex: acumulacio mics. i que puguin cultivar-se en serie en de pigments , formaci6 d ' enzims , etc.). medis standard completament definits, Les cel • lules vegetals , en comparaci6 amb una gran probabilitat d'exit. amb la majoria de microorganismes, re- D'altra banda, per tat que un cultiu de quereixen un medi de creixement mes cel•lules vegetals en suspensio assoleixi un complexe , en el qual , a mes d'altres sals nivell de produccio biotecnologicament inorganiques i elements traca, i l'adminis- rendible, cal augmentar at maxim la velo- traci6 del nitrogen en forma d ' ions nitrat i citat de biosintesi en la poblaci6 de cel.lu- amoni , rutinariament se suministren tres les cultivades, molt heterogenies respecte vitamines: tiamina , piridoxina i acid nico- a] metabolisms secundari. Amb aquesta fi- tinic, encara que la seva necessitat absolu- nalitat, previament s'ha d'obtenir una po- ta tan sols ha estat comprovada en alguns blaci6 de cel•lules de gran capacitat biosin- POT7,9N7.IL B/OTF__CNOLOGIC DEL CULTIU DE CELLULES i'7.Y;ET4LS PER A L'OB7'ENCIO DE PRODUCTES FARA7A(,F.UT/CS 51

tetica mitjancant un programa de selecci6 tivament (185), i en el cas dels alcaloides eficac el qual deu complir, segons Tabata i serpentina i ajmalicina en Catharanthus col. (185), les seguents condicions: a) gran roseus (222, 223). variabilitat en la poblaci6 cellular inicial L'eficacia d'aquest proces de selecci6 de- per tal de disposar d'un bon material de pen en gran mesura de la sensibilitat i partida per a la seleccio; b) utilitzaci6 del rapidesa del metode analitic aplicat per a clonatge de cel•lules individuals mitjan- determinar el metab6lit secundari. En cant plaques com a metode d'aillament, i aquest sentit, el radioimmunoassaig es c) utilitzacio d'un metode senzill, i alhora considerat actualment el metode mes pre- sensible, de "screening" per tal de detectar cis i sensible, ates que un gran nombre de els productes secundaris en els diferents mostres es poden analitzar quantitativa- dons. ment a nivell de nano- i picomol de forma Aixi, la primera etapa d'aquest procedi- totalment automatitzada (106, 127, 145, ment seguit en alguns laboratoris consis- 207, 209). No obstant aix6, tambe poden teix en seleccionar plantes altament pro- aplicar-se d'altres metodes alternatius, en- ductives d'entre una poblacio d'individus cara que mes molestos, especialment quan d'una mateixa especie, ja que es pot trobar s'han d'analitzar mescles de compostos du- una gran diversitat quan a l'acumulaci6 de rant un proces de seleccio de soques de constituents secundaris. Amb I'inici dels cultius cel•lulars. Un exemple d'aix6 el cultius de call a partir d'aquestes plantes es constitueix I'anomenat "cell squash met- d'esperar que els factors genetics, respon- hod", procediment molt versatil i econ6- sables en la planta intacta d'aquesta gran mic descrit per Tabata i col. (185) i consis- productivitat, es preservaran en el cultiu tent en pressionar el material soluble pro- cellular i influenciaran acumulant els me- vinent de petits fragments de call entre tab6lits secundaris en una gran proporci6. lamines de paper de filtre, les quals poste- L'estudi comparatiu dels resultats fins ara riorment poden ser ruixades amb reactius obtinguts demostren que aquesta estrate- especifics per tal de detectar la presencia gia d6na com a resultat una major proba- de metab6lits secundaris (ex: reactiu de bilitat de trobar una coca de cel•lules amb Dragendorff per alcaloides). Aquest meto- un gran contingut de productes secundaris de, encara que tan sols dona una estimaci6 (147, 222). aproximada del contingut del producte se- Els cultius de cel•lules en suspensi6 deri- cundari dels calls, s'ha comprovat que es vats d'aquestes soques de gran productivi- suficientment segur, per exemple, pel tat, via cultiu de call, es depositen damunt "screening" de calls de Nicotiana tabacum discs d'agar en un medi adequat i poste- altament productius en nicotina (130). riorment s'analitzen les microcol6nies o Un requeriment previ per l'aplJcac16 calls desenrotllats respecte a llur contingut biotecnol6gica dels cultius en suspensi6 de de compost secundari. D'aquesta manera cel•lules vegetals es aconseguir una gran es poden seleccionar aquelles soques alta- estabilitat de les soques quant al creixe- ment productives i de rapid creixement les ment 1 a la capacitat de biosintesi. Aixi, quals posteriorment seran utilitzades per mentre que el creixement ha estat conside- l'establiment dels cultius de cel•lules en rat fins ara com un factor molt estable, suspensi6 (213). Aquest tipus de metodo- s'ha observat una marcada variabilitat res- logia ha estar aplicat amb exit durant la pecte al potencial bioquimic per acumular selccci6 de soques de Lithosperinum e/.rth- compostos secundaris• desconeixent-se de rorhizon 1 Nicotiana tabacuin de gran pro- moment les causes d'aquesta inestabilitat ductivitat en shikonina i nicotina, respec- bioquimica (42). 52 C.iRLLS COUIN 1, FR.9.M1'CE;SC {'tL 1DOi/.97, J.I L'.1tF, B.IS77D.1 l JOSI'P .t1AA'Ft_ LL.1BRI:S

TAULA 2 Exemples de productes naturals aillats de cultius de call

Compost Classe de compost Planta Rendiment Relcrcncto (% PS) shikonina naftoquinona Lithospermum ervthrorhi:on 12,0 184 solasonina alcaloide Solanum laciniatum 3,3 223 glicirricina saponina Glvcvrrhi:a glabra 3,0 190 cafeina purina Coffea arabica 1,6 61 paniculida C sesquiterpc Andrographis paniculata 0,9 28 efedrina fenetilamina Ephedra gerardiana 0,6 140 visnagina furocrom Ammi visnaga 03 87

ACUMULACIO DE METABOLITS nombrosos estudis amb calls i cultius cel- SECUNDARIS lulars en suspensio de diverses plantes, en els quals s'ha descrit la formacio, i a vega- Els cultius de teixits i cel•lules vegetals, des acumulacio en concentracions eleva- ja des de la seva relativament curta aplica- des, de molts constituents secundaris defe- cio, han estat contemplats com a fonts po- rents, havent-se comprovat la influencia tencials de constituents secundaris de di- del medi, en especial la font de nitrogen i versa utilitat, i especialment de substan- la presencia de fitohormones, sobre la pro- cies medicinals. Ates que les plantes supe- duccio d'aquests compostos (2, 9, 100, riors son els productors mes importants de 212). productes naturals d'interes farmaceutic, A la taula 2 es relacionen diversos pro- una de les principals avantatges que poten- ductes naturals aIllats de cultius de call cialment podria esperar-se dels cultius de altament productius. Aquests exemples, i cel•lules i teixits vegetals seria l'acumu- els de la figura 1, indiquen que en els cul- lacio de grans concentracions d'aquests tius cel•lulars poden acumular-se compos- compostos i el descobriment de rutes alter- tos derivats de rutes biosintetiques molt natives per a la produccio d'aquestes subs- distintes. No obstant aixo, encara que en tancies medicinals. Aixi mateix, tot sovint els cultius de call pot assolir-se una gran s'ha relacionat aquest potential amb el re- acumulacio de compostos, com ja ha estat cent i impressionant progres en l'inere- indicat anteriorment, aquests sistemes no ment de 1'acumulaci6 de compostos secun- tenen aplicacio biotecnologica. En alguns daris d'interes farmaceutic mitjancant sis- casos, pero, 1'elevada acumulacio de cons- temes microbians (90). Aixo no obstant, tituents secundaris en cultius de call o de degut als factors economics abans esmen- cel•lules en suspensio probablement esta tats, la produccio industrial d'aquest tipus relacionada amb la presencia de models de de compostos mitjancant el cultiu de cel- diferenciacio, essent un exemple d'aixo la lules i teixits vegetals tan sols podra tenir produccio de glicoalcaloides esteroidics de exit si els esforcos es concentren en pro- Solanurn khasianum (95), o l'acumulacio ductes vegetals especifics farmacologica- d'alcaloides en cultius de Papav-er soinnil -- ment actius, a partir de plantes rares i/o de rum quan hi ha present un gran nombre de dificil adquisicio. cel•lules laticiferes especialitzades (125). En la darrera decada s'han publicat Encara que alguns metabolits secundaris POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIC' DE. CEL L L LES L'EGEIALS PER A L'OBTENCIO DE PRODCCTES FARM.9CEUTics 53

H

HO

VI V IV

COO

L

GHa

VII VIII Ix

H3H

xII XIII

Compost Classc de compost Planta Rendiment Reterencia (% PS) verbacosid glucosid polifenolic Svringa vulgaris 16 51 I alizarina antraquinona Morinda citrifolia 15-18 220 II acid rosmarinic ester cafeoil Coleus blumei 15 141 V shikonina naftoquinona Lithospertnum erythrorhizon 12 183 V diosgenina triterpe Dioscorea deltoidea 7,2 146 VI jatrorricina alcaloide Berheris stolonifera 7 77 V11 cafeoil putrescina ester cafeoil Nicotiana tahacum 6 15 V111 trigonelina alcaloide Trigonella,foenungraecum 5 139 IX nicotina alcaloide Nicotiana tahacum 1-3,4 130 X ajmalicina alcaloide Catharanthus roseus 1 223 XI serpentina alcaloide Catharanthus roseus 0,8 223 XI1 ubiquinona-10 benzoquinona Nicotiana tahacum 0,5 79 XI11 glutatio peptid Nicotiana tahacum 0,2 14 Fig. I. C'ultius de ccl•lules vegetals en suspensio de gran rendiment en la produccio de diversos productes turals. na- 54 ('.IRLF.'S COD/N.1. FR.W('F.S(' L"IL.ID0tI.-I T. J1 L MF_ BASTID.•1 t JOSE!' .1! l.V L 1.1 INKIiS es produeixen en menor proporcio en els seng (64, 154) i de P. quinquefolium (82), cultius de c6lules en suspensio que en havent-se comprovat farmacologicament els de call, s'han descrit alguns casos en els que 1'extracte de call es gairebe tan actiu quals s'han assolit concentracions molt com el d'arrel de ginseng, la qual to un elevades. En la figura l es mostren alguns Ilarg perfode de formacio. exemples de productes naturals aillats de D'altra banda, els cultius de cel•lules ve- cultius de c6lules en suspensio de gran getals poden formar diversos tipus de qui- productivitat, destacant-ne pel seu elevat nones en quantitat relativament elevades. rendiment, considerablement mes gran Es el cas, per exemple, de les especies Cas- que en la planta intacta, l'acumulacio sia angustifblia, els cultius de call de la d'antraquinones i verbascosid en cultius qual produeixen antraquinones i diantro- cel•lulars de Morinda citrifolia (220) i nes, amb una notable activitat laxant (60), Svringa vwlgaris (50), respectivament, i i de C. tora, usada al Japo tambe com a d'acid rosmarfnic en Coleus blurnei (141, laxant, la qual acumula antraquinones, 221), i mes recentment en Anchusa o//ici- com ara el crisofanol o 1'emodina, en una nalis (41) i diverses especies de Rosmari- proporcio deu vegades superior a la de la nus i Salvia (211). D'especial interes tam- planta intacta (181). Aixo no obstant, es de be, degut al procediment amb el qual s'han destacar la famflia de les Rubiacies com obtingut les soques, es la considerada acu- una de les mes estudiades actualment en mulacio de cafeoil-putrescina i feruoil- relacio a la produccio d'aquest tipus de putrescina en cultius de c6lules en sus- metabolits secundaris (80, 81, 155, 214). pensio de Nicotiana tabacum (15). Un altre grup de compostos d'interes Dels altres compostos que son represen- farmaceutic i produits tambe per cultius tants a la figura 1, la ubiquinona, consti- cel•lulars son els pigments del tipus nafto- tuent de la cadena respiratoria mitocon- quinona, emprats en alguns paisos pel drial, s'acumula en cultius cel•lulars en tractament de cremades i malalties de la suspensio de Nicotiana tabacuni en un ni- pell. Aixf, en cultius de c6lules en suspen- veil molt mes gran que no pas en la planta sio de Lithospermuin ervthrorhi_on s'ha sencera (79). L'elevada produccio del tri- obtingut un nivell de pigments de gairebc peptid glutatio en cultius de c6lules foto- vuit vegades superior al de 1'arrel usada mixotrofiques en suspensio d'aquesta ma- com a droga crua (183• 199), havent-se teixa especie es particularment interessant comprovat aixf mateix quc aquests pig- ates que aquest compost es excretat al ments, derivats de la shikonina, son simi- medi de cultiu (14). El triterpe diosgenina lars als de 1'arrell (180, 183). D'altra Ban- es d'especial interes per a la sfntesi parcial da, els extractes cloroformics dels cultius d'esteroides i fitosterols (188). Els alcaloi- de call han mostrat una activitat antimi- des indolics ajmalicina i serpentina, d'apli- crobiana davant germens gram-positius cacio actual en el tractament de malalties semblant a la de 1'extracte cloroformic de circulatories, han estat aillats en cultius de I'arrell (182). c6lules en suspensio de C'atharanthus ro- Els alcaloides, en general, son especial- seus, encara que en aquest cas ha estat ment dificils de produir mitjancant els cul- necessari un procediment riguros de selec- tius cel•lulars. La rao per la qual aixo suc- cio de soques altament productives per tal ceeix no es prou clara, pero s'ha suggerit, d'assolir una acumulacio elevada d'aquests almenys pel que fa a alguns alcaloides• que metabolits secundaris (222. 223). Els gin- la disminucio de la seva biosintesi podria senosids s'acumulen tambe en gran pro- ser deguda a un bloqueig metabolic d'una porcio en cultius de cel•lules de Panax gin- reaccio especifica en la ruta biosintetica. POTL'A'(1 1, BIOTECNOLOGIC DEL. Cl LHt' DL CEL L('LES 17:GET.1LS PER A L'oBTL',vC16 DEPRODC-CTES LAR,tIAC'EUM's 55

Aixi, per exemple, en cultius de cel•lules Tots aquests exemples poscn de mani- indiferenciades de Datura i Scopolia s'ha fest que existeix una serie important d'es- demostrat que els baixos nivells alcaloidics tructures quirniques molt diferents i que, son causats principalment per la suprensio obviament, poden expressar-se moltes ru- de la formacio d'acid tropic , la meitat aci- tes biosintetiques distintes a nivell de cul- da de la hiosciamina ( 179). D'altra banda, tius de teixits i cel•lules en suspensio d'ori- en cultius cel • lulars de Stephania cepha- gen vegetal. Aixi, doncs, si es considers el rantha s'ha observat que la reacc16 de me- notable progres dels darrers anys en el tilacio i la formacio del grup metilendioxid camp de ]a produccio de metabolits secun- no tenon lloc en les etapes finals de la ruta daris en cultius de cel•lules en suspensio, biosintetica que condueix a la formacio sembla raonable pensar que alguns d'a- dels alcaloides cefarantina i isotetrandrina, quests compostos en el futur es podran acumulant - se en el seu Ilocels alcaloides acumular en grans quantitats mitjancant intermediaris aromalina 1 berbamina (1). l'aplicacio biotecnologica d'aquests siste- S1 fos possible d'eliminar aquesta manta mes (195, 204). A mes, no tan sols cal de metilacio, els cultius cel • lulars de S. aplicar aquesta biotecnologia als cultius cepharantha serien capacos de produir 1'al- que en 1'actualitat ofereixen un baix rendi- caloide d'interes medicinal, cefarantina. A ment, sing que existeixen encara nombro- vegades tambe s'han observat resultats ne- ses plantes d'interes medicinal de les quals gatius en la produccio d'alcaloides en cul- Ilurs capacitate de biosintesi han d'esser tius cel•lulars de C'atharanthus roseus (152, investigades. 156); aixo no obstant , amb aquesta matei- xa planta, 1 d'altres com Stemmadenia to- mc'ntosa. i 1 •oacanga a/i•icana ( I 74), Berhe- ELS CULTIUS DE CEL•LULES COM ris u ilsoniae (23 ), Solanum dulcalna- A FONT DE NOUS PRODUCTES ra (49 ), Coptis japonica ( 151), Duhoisia leichhardtii (215), Ochrosia clliptica (97), 1 Si 1'espectre de constituents secundaris diverses especies de Ruta ( 53), s'han dut a en els cultius de cel•lules vegetals es com- terme amb exit experiencies relatives a la para amb el de la planta intacta 1 Ilurs produccio i/o acumulaci6 d'aquests tipus diferents organs, s'observa que la planta, de metabolits secundaris. en la majoria dels casos, conte un espectre En qualsevol cas, pero, una de les plan- mes ampli que les cel•lules derivades d'e- tes mes estudiades des del punt de vista de Ila, observant-se tambe una diferencia en la seva possible aplicacio biotecnologica les quantitate relatives d'aquests compos- per a l'obtencio de productes farmaceutics tos (20, 185). No obstant aixo, sorprenent- es Catharanthus roseus, amb la qual s'han ment, en repetides ocasions alguns me- realitzat nombrosos estudis, alguns d'ells tabolits secundaris no trobats en la planta ja esmentats , dirigits els uns al coneixe- original s'han alilat dels cultius cel•lulars ment del metabolisme de Ilurs alcaloides. derivats d'elles. A la taula 3 es relacionen principals compostos farmacologicament alguns exemples de productes secundaris, actius d'aquesta especie, alguns dels quals entre els quals hi ha diverses classes d'alca- son emprats clinicament en l'actualitat, i loides, cumarines, antraquinones i sesqui- cis altres a determinar els factors interns terpens, que es produeixen predominant- i externs que influeixen en una major acu- ment en cultius de cel•lules en suspensio mulacio d'aquests metabolits secundaris mes que en la planta sencera, o fins i tot de en aquests sisternes experimentals (38, 46, mancra exclusiva en aquests sistemes ex- 47, 101, 103, 114, 120, 133, 163, 193). perimentals. 56 ('ARLES CODINA, FRANCESC 17LADOMAT, JAUME BASTIDA I JOSEP MANEL LLABRFS

TAULA 3 Exemples de metabolits secundaris produits en major proporcio , o exclusivament, en cultius de cehlules en suspensio que no pas en la planta sencera

Compost (7asse do compost Mania Reterencia edulina alcaloide Ruta graveolens 169 isopimpinelina furanocumarina Ruta graveolens 169 rutacultina furanocumarina Ruta graveolens 169 armoring alcaloide Stephania cepharantha 165 norsanguinarina alcaloide Papaver somnilerurrt 63 3-metilpurpurina antraquinona Digitalis lanata 62 5-hidroxidigitoluteina antraquinona Tectona grandis 43 lucidina antraquinona Morinda citrifolia 107 paniculides sesquiterpens .-indrographis paniculata 132 pericina, pericalina alcaloides Picralima nitida 8 hinokiol , ferruginol diterpens Thuja occidentalis 16 vomilenina alcaloide Rawawolfa serpentina 173 tarennosid iridoide glucosid Gardenia jasininoides 201

En els darrers anys, 1'equip d'investiga- ten el valor potencial dels sistemes de dors encapcalat pel Prof. Zenk, ha aconse- cultius de cel•lules en suspensio com a guit d'elucidar la sequencia biosintetica fonts d'enzims intermediaris i/o especifics, dels alcaloides heteroyohimbinics ajmali- aixi com de nous productes vegetals que cina i els seus isomers utilitzant cultius de no s'acumulen en la planta intacta o ho fan cel•lules en suspensio de Catharanthus ro- en quantitats insuficients. seus (75, 149, 171, 197, 224). Els estudis Estudis realitzats recentment en diver- amb material de planta intacta no propor- sos laboratoris han comprovat 1'enorme cionaren la determinacio d'una sequencia variabilitat bioquimica de diferents soques biosintetica tan complexa, i ha estat tan de cultius de cel•lules en suspensio de Ca- di- sols mitjancant 1'aplicaci6 de la tecnica de tharanthus roseus, les quals acumulen quanti- cultius cel•lulars que s'han pogut aIllar en versos intermediaris i alcaloides en 172). quantitat suficient els enzims implicats, al- tats molt diferents (93, 94, 99, 134, hora que s'han pogut elucidar estructural- Ates que aquests noun compostos secun- ment per primera vegada diversos inter- daris que es vagin descobrint en els cultius mediaris (84). Aixi mateix, una altra plan- eel•lulars probablement tindran propietats ta estudiada en aquest sentit es Dioscorea quimiques i biologiques desconegudes, se- deltoidea, els cultius cel•lulars de la qual ria molt interessant si les diferents soques han permes d'identificar nous intermedia- de cultius cel•lulars en les quals s'acumu- ris de la biosintesi del seu metabolit d'inte- len aquests productes naturals fossin sot- res farmaceutic, el triterpe diosgeni- meses a bioassaigs convenientment disse- na (189). Aquests fets, logicament, ressal- nyats. Puix que algunes de les noves subs- POILACIAL BIOTECA0LOGIC DEL CLL77C DE CELLCLES I h.'GET.4LS PER A L'OBI'EVCIO DE PRODL'CTES F.4R.AMACEL'TICS 57

tancies tindran tambe noves i interessants ESTUDIS AMB CEL•LULES propietats fisiologiques, aquests bioassaigs IMMOBILITZADES deurien incloure analisis per a la determi- nacio d'activitat antimicrobiana, antiinfla- Un proces molt prometedor i fructifer matoria, antiviral, antihemorragica, an- en els darrers anys ha estat la immobilitza- tiartritica, anticancerigena i d'altres activi- cio d'enzims i de cel•lules bacterianes o tats farmacologicament importants. Per fungiques, tecnica mitjancant la qual les aixo, el "screening" dels cultius de cel•lules cel•lules o els enzims son atrapats en els i teixits vegetals mitjancant bioassaigs enreixats de polimers, com ara membranes d'activitats farmacologiques pot esser un de colagen, poliacrilamida, alginat calcic, metode eficac per a 1'explotaci6 de princi- poliestire, gel d'agar, derivats de cel•lulosa, pis actius products per aquests sistemes ex- poliureta o d'altres suports (34, 48, 109, perimentals. 118, 206). Les cel•lules immobilitzades res- De fet, aquesta metodologia ha propor- ten viables durant un cert temps (diverses cionat ja alguns fruits en el descobriment setmanes) i els enzims actius, degut a que de substancies insospitades de possible us segueixen estant en el seu entorn natural. medicinal. Aixi, per exemple, Veliky i Lat- Aquests biocatalitzadors atrapats son espe- ta (205) trobaren una certa activitat anti- cialment utils perque es poden utilitzar de microbiana en alguns teixits de call acllats forma continuada per a la produccio de de diverses plantes. En cultius d'Emblica diversos constituents, havent-se trobat of/icinalis s'ha comprovat que I'activitat aplicacions d'aquesta tecnica en camps antimicrobiana era deguda a la presencia com ara la sintesi organica, analisis clini- de galat d'etil, format per les cel•lules en ques i quimiques, industria, medicina i una quantitat forca considerable (89). Aixi d'altres (26, 27, 33, 73, 108, 161). mateix, s'ha observat inhibicio de la secre- En contrast amb les reaccions enzimati- cio del suc gastric en ratas i millora de les ques tradicionals, les quals es duen a terme ulceres pectiques inducdes per l'adminis- en processos en serie, aquestes cel•lules im- tracio oral d'acid acetic, com a efecte dels mobilitzades es disposen en columnes, on extractes aquosos preparats a partir de cul- la solucio nutritiva i els substrats a trans- tius de call o de cel•lules en suspensio d'I- formar son bombejats a traves de la capa sodon japonicus, havent-se comprovat, a de cel•lules de forma que els productes, en mes, que aquesta activitat era gairebe la la majoria dels casos, s'alliberen dels bio- mateixa que la de 1'extracte elaborat a par- catalitzadors immobilitzats a la solucio tir de la planta intacta (128). A mes dels circulant, i poden, aixi, separar-se conti- exemples exposats, s'han dut a terme amb nuament de 1'eluat. A mes, les avantatges exit diversos "screenings" farmacologics d'aquests sistemes son multiples degut, en- de nombrosos cultius de cel•lules els quals tre d'altres raons, a que els processos d'ex- ban permes d'aillar diverses substancies traccio i/o purificacio dels enzims no son amb activitat antitumoral i antiviral (121, necessaris, l'activitat enzimatica despres 122). Tenint en compte la impressionant de la immobilitzacio i I'estabilitat opera- varietal de compostos secundaris exis- cional de les cel•lules immobilitzades son tents, alguns tan complexes com alcaloides elevades, el cost de 1'enzim o del biocata- o terpenoids, sembla probable que els cul- litzador es baix degut al seu us prolongat i, tius de cel•lules constituiran sistemes efica- finalment, a que poden dur-se a terme cos per I'acllament d'intermediaris fins ara reaccions multienzimatiques. desconeguts, o be de nous productes natu- La immobilitzacio de cel•lules, a mes rals. d'haver-se emprat en experiencies amb mi- 58 (IRLLES (01)/V I, I R I V(I:5C [/1 l1)O.IL IT..lU %1l: B IS17D I 1 J)SFL' SLI of 1. LL IBRL.:S croorganismes, tambe ha estat aplicada transformacio en cultius cel•lulars son oxi- amb exit a cel•lules vegetals. Aixi, per dations, reductions, hidroxilacions, meti- exemple, s'ha obtingut una considerable lacions, demetilacions, glicosilacions, iso- productivitat d'antraquinones i d'alcaloi- meritzacions, etc., les quals mostren una des del grup de l'ajmalicina en sisternes de semblanca molt considerable amb les reac- cel•lules immobilitzades de Morinda citri- cions de transformacio microbianes, estu- folia (24) i Catharanthus roseus (25), res- diades i aplicades biotecnologicament amb pectivament, aixi com la producc16 d'una exit durant mes de 50 anys. Aixo no obs- citoquinina en cel•lules immobilitzades de tant, les cel•lules vegetals tenen la capacitat tabac (203) i la modificacio de diverses addicional de catalitzar diverses reaccions prote'fnes vegetals (105). D'altra Banda, de conjugacio en les quals residus glicosil, mitjancant aquesta tecnica s'han assolit acil o aminoacil, compostos amino o es- reaccions de biotransformacio com, per tructures peptidil, son afegits a grups fun- exemple, la conversio de codeinona en co- cionals dels substrats. Algunes d'aquestes de'fna amb cel•lules de Papaver somnife- reaccions caracteristiques de les planter, rum (66) i la 12 (3-hidroxilaci6 de glicosids corn ara la glicosilacio en un lloc especific cardiacs de Digitalis lanata (24, 123, 124). d'un substrat multifuncional, semblen Aixi, doncs, degut als prometedors resul- constituir un potencial de gran interes per tats obtinguts fins ara amb sistemes micro- al desenvolupament biotecnologic, ja que bians, i ates que les cel•lules vegetals, com- en molts casos aquests glicosids o be no parativament mes sensibles, romanen en- poden sintetitzar-se per procediments qui- zimaticament actives durant la immobi- mics, o tan sols amb la complexa implica- litzacio, estudis d'aquest tipus fan molt cio de grups protectors. L'aplicacio biotec- atractives aplicacions similars amb cel•lu- nologica d'aquest potencial, pero, reque- les vegetals, en especial si s'utilitzen so- reix una rigurosa selecci6 de soques ques adequadament seleccionades. adients ates que en la majoria dels casos les cel•lules vegetals duen a terme mes d'u- na reacc16 de biotransformacio amb un BIOTRANSFORMACIO DE substrat determinat (9, 10, 12, 170). SUBSTRATS En els darrers anys s'ha prestat una con- siderable atencio a les reaccions de bio- Els cultius de cel•lules en suspens16 transformacio utilitzant diversos compos- s'han investigat intensament en els darrers tos esteroidics, corn ara el 5a-pregnan, anys respecte a Ilur capacitat per efectuar 5(3-pregnan, testosterona, progesterona, la transformacio parcial de compostos or- 5(3-pregnan-3,20-d iona i d'altres andro- ganics, naturals o sintetics, i d'estructures gens, aixi com sapogenines 1 fitosterols (5, molt diverses i complexes, aplicats de for- 65, 175, 176). D'entre els nombrosos estu- ma exogena (5, 100, 143, 144, 148). dis realitzats recentment cal destacar-ne Aquestes investigations han demostrat les transformacions de la testosterone a que les cel•lules vegetals posseeixen un 4-androsten-3,17-diona, 5a-androstan-17 gran potencial bioquimic per a efectuar (3-ol-3-ona, 5a-androstan-3(3, 1713-diol, llur transformacions especifiques de compos- dipalmitat i 3- i 17-f3monogluc6sids, tos organics que donen lloc tot sovint a epiandrosterona, els seus palmitat i gluco- compostos mes complexes i. des del punt sid, i testosterona glucosid, en cultius de de vista farmaceutic, de major utilitat. cel•lules de Nicotiana tahacum (65). Al- Els principals tipus de reaccions que es guns d'aquests compostos com, per exem- produeixen durant els processor de bio- ple, 1'epiandrosterona plarnitat, epiandros- I'M ES'CIIL BIOTECNOLOGIC DEL ('C'L77C' DE CEL LCLI:S J i (1E ALS PER A L'OBTEJ'CIO DEPRODCCTES fARSIACEL'77CS 59

terona glucosid i testosterona glucosid, Com ja ha estat indicat anteriorment, han estat trobats per primer cop com a aquesta gran varietat de reaccions de metabolits de la testosterona en cultius de transformacio representen un gran poten- c6lules vegetals. cial, la realitzacio del qual requereix ]a D'altra banda , tambe els alcaloides han seleccio de soques adequades en les quals estat recentment objecte de diversos estu- una d'aquestes reactions alternatives s'ha- dis de blot ransformacio , com ara la con- gi incrementat a compte de les altres. El versio d'elipticina en 5-formileliptici- principal interes en aquest camp. doncs. na (96 ), de tetrahidroberberina en berberi- implica la 12(3-hidroxilaci6 estereoespeci- na (216), d'anhidrovinblastina en vinblas- fica de la digitoxina i del derivat semisin- tina (1 13) 1 de loganina en secologani- tetic (3-metildigitoxina per tal de produir la na (191), realitzats , respectivament, en droga terapeuticament activa. No obstant cultius de c6lules en suspensio de Choisva aixo, estudis amb cultius de c6lules en ternata, Coptis japonica, i de Catharanthus suspensio de Digitalis lanata han demos- roseus en els darrers dos casos. trat que en la transformacio de la (3-metil- Un camp d 'excepcional interes per a l'a- digitoxina, a mes de la reaccio de 12(3- plicacio farmaeeutica dels cultius de cel.lu- hidroxilaci6, tenen hoc tambe diverses les vegetals es el relatiu als cardenolids, reaccions alternatives (3, 7). Per aixo, el ates que aquests compostos son amplia- procediment biotecnologic ideal hauria de ment emprats en medicina . Aixi, la digoxi- consistir exclusivament en la 12(3-hidroxi- na, constituent natural en les plantes de laci6 directa de la (3-metildigitoxina i evi- Digitalis lanata, es el compost mes interes- tar totes les altres reaccions, per a la qual sant d'aquest tipus de productes naturals cosa cal seleccionar una coca que catalitzi degut a Ilurs propietats farm acologiques. tan sols aquesta reaccio de biotransforma- Aixo no obstant, durant el proces d'ailla- cio. Aquest proces sembla ser fins ara el ment es forma un subproducte altament proces de biotransformacio mes altament toxic, la digitoxina; per aixo , en aquest desenvolupat en cultius de c6lules vege- exemple la finalitat basica de la biotrans- tals i ha assolit un nivell el qual permet de formacio consisteix en la conversio de di- considerar seriosament llur aplicacio co- gitoxina en digoxina per una 1213-hidroxi- mercial. laci6. Tant els aglicons com els glicosids Un altre aspecte important de I'aplicacio cardiacs han estat intensament estudiats biotecnologica de les reactions de bio- respecte a Ilur transformacio per cultius de transformacio es el fet que una reaccio c6lules vegetals (6, 78, 83, 111, 135, bioquimica particular no necessariament 176). tindra lloc durant totes les fases de la corba de creixement cel•lular. Ates que els cons- tants canvis en la composicio quimica del medi nutritiu durant un title de creixe- ment condueix a canvis substancials en la fisiologia de la cel•lula (55, 71), pot trobar- se, en principi, un punt optim per a I'ex- pressio dels enzims. Aixi, per exemple, en la produccio d'esculina en cultius cel•lulars OH H O-D-D-O de Lithospertnuin ervthrorhizon s'ha obser- vat que la velocitat maxima de glucosilacio D = digitoxosa R = H digitoxina to lloc a la fase de creixement exponencial R = OH digoxina de les cel•Iules (186). Aquest fenomen tam- 60 (IRLL.(O1)IA I.1RIy(L.'(17LIDOIfIT.JII I1ERI.SIH)IIJO.SL1 tIIvILLLL. IIiRIi.S be ha estat verificat en estudis sobre la te; 3) que els metabolits s'acumulin en les glucosilacio d'acids aromatics i l'acumula- cel•lules sense que siguin rapidament cata- cio de compostos fen6lics, respectivament, bolitzats o, a ser possible, que s'alliberin al en cultius de cel•lules en suspensi6 de Ni- medi liquid, i 4) que els costos de produc- cotina svlrestris (153) i d'Acer pseudoplata- cio, inclosos els medis de cultiu, precursors nus (208). i extracci6 quimica, siguin suficientment Totes aquestes dades indiquen el gran baixos per tal que el proces esdevingui ren- potencial dels cultius de cel•lules vegetals dible. per l'aplicacio biotecnologica, pero eviden- Respecte al primer requeriment, en ge- cien tambe que son necessaris els comple- neral es pensa que les cel•lules vegetals xes procediments de selecc16 per tal d'ob- proliferen massa lentament per fer-les crei- tenir aquelles cel•lules que tenen la maxi- xer en fermentadors a gran escala. Aixo no ma capacitat per a catalitzar una reacci6 obstant, diverses experiencies amb cultius especifica d'entre una gran xarxa metaboli- cel•lulars han suggerit que la velocitat de ca. A mes, els resultats obtinguts fins ara creixement pot accelerar-se considerable- indiquen que en l'optimitzaci6 dels pro- ment millorant les condicions de cultiu 1 cessos biotecnologics cal prestar una gran seleccionant les soques cultivades (86, atencio a la condicio fisiologica de les cel- 159). Encara que ja s'han obtingut algunes lules, ja que pot influir en gran mesura dades prometedores, caldran mes esforcos sobre el nivell de 1'enzim responsable. en la millora o aprofitament de la velocitat biosintetica de compostos medicinals en cultius de c6lules en suspensio mitjancant PERSPECTIVES la regulaci6 bioquimica i genetica del me- tabolisme secundari. Una avaluaci6 critica de factual situaci6 En relac16 amb el segon requisit, el de de la tecnologia dels cultius de cel•lules i 1'estabilitat genetica de les cel•lules cultiva- teixits vegetals revela que una gran varie- des, el metode d'emmagatzematge per con- tat de reaccions bioquimiques especifiques gelacio, segons els estudis de diferents au- de les plantes poden expressar-se a nivell tors, podria utilitzar-se per a la conserva- de cel•lules indiferenciades. Aixi mateix, cio de valuosos estocs de cultius (32, 44, una comparaci6 amb els processos biotec- 85, 126). Aixo no obstant, cal destacar la nol6gics microbians permet de contemplar importancia del control de les variacions els cultius de cel•lules vegetals en suspen- nuclears o citoplasmatiques que poden te- sio corn a fructifers en aquells casos en els nir floc en les cel•lules cultivades en el pas quals son requerides reaccions caracteristi- del cultiu en laboratori al processament ques dels vegetals (162, 200). industrial (119, 178), motiu pel qual son Aixo no obstant, per l'aplicacio indus- necessaris, a mes a mes, estudis citogenics trial dels cultius cel•lulars en la producc16 i fisiol6gics dirigits a aconseguir el control de compostos medicinals cal que s'acom- de 1'estabilitat biosintetica. pleixin, corn a minim, els seguents requi- L'estudi del tercer problema, relatiu a sits: 1) que la velocitat de creixement cel- l'alliberament de metabolits cel•lulars al lular i de la biosintesi siguin prou elevades medi de cultiu, pot ser important per tal per tal d'obtenir un rendiment considera- d'evitar possibles repressions metab6li- ble del producte final en un periode curt ques o controls "feedback" negatius, de- de temps; 2) que les cel•lules cultivades guts a 1'exces d'acumulacio del producte siguin geneticament estables per a propor- final a la cel•lula. Ates que les cel•lules cionar una quantitat constant del produc- vegetals en general tendeixen a acumular POIT''NCLIL BIOTF,CNOLOGIC DEL CL'LTIL DE CEL LLLES l'EGETALS PER A L'OBTENC16 DE PRODLCTES FARMACELT/CS 61

Ilurs metabolits secundaris en vacuols o en tants ; 5) la produccio d'alguns dels com- el citoplasma , caldria idear un metode per postos medicinals localitzats en teixits o alterar la permeabilitat de la membrana organs morfologicament especialitzats, en cellular. En aquest sentit, s'ha obtingut sisternes de cultius no tan sols per induccio algun resultat positiu amb cultius de cel.lu- d'estructures organitzades especifiques les de Si'mpht'tuin officinale que acumulen sing tambe per algunes soques de cultius fins un 20 % del pes sec de glutamina en absencia d'organitzacio , i 6) la demos- (I 92), pero la seva aplicacio generalitzada tracio de 1'6s dels cultius de cel • lules vege- requercix encara un nombre mes elevat tals per a la biotransformacio especffica de d'experiencies. productes naturals. Finalment, el quart requeriment esta re- Ates que les planter posseeixen un gran lacionat amb els complexes problemes nombre de propietats bioquimiques que economics de la produccio industrial, els son especifiques dels vegetals , i que enca- quals dependen basicament del cost de ra son absolutament indispensables per a produccio i de la demanda del compost. I'obtencio de productes farmaceutics, llurs Una part considerable del cost de produc- cel•lules ofereixen un potencial extremada- cio hauria de correspondre a la font de ment interessant per a les aplicacions bio- carboni organic i a I'electricitat necessaria tecnologiques dirigides a aquells proble- pets processor d'aireacio , agitacio , regula- mes que no es poden resoldre amb cap cio de la temperatura , etc. D'altra banda, altre tipus de cel•lules vives o per medic I'us del cultiu continu o semicontinu en estrictament qufmics. Iloc del sistema de cultiu en serie no tan Aixo no obstant , a mes de i'obtencio de sols pot reduir els costos de produccio per productes d'interes farmaceutic i/o medi- la reesterilitzacio del fermentador i la ne- cinal mitjancant els cultius de cel • lules ve- cessitat de propagac16 de les cel • lules a getals, l'aplicacio biotecnologica d'aquests partir del stock original , sing tambe pot sistemes experimentals tambe va dirigida permetre un canvi programat de la compo- envers la millora de plantes d'interes agrf- sicio del medi i regular aixi t'activitat bio- cola (19, 40 , 76, 210) i forestal (137, 196), sintetica de les cel • lules (30). a I'obtencio de soques resistents a herbici- Aixi, doncs, els principals i mes recents des o antibiotics ( 1 15), a 1'estudi del meta- avencos en la recerca experimental sobre bolisme de pesticides i d'altres compostos la produccio de substancies d'interes me- qufmics presents en i'ambient ( 150), etc. dicinal mitjancant sistemes de cultius de Finalment , la biotecnologia marina, enca- cel•lules vegetals son, entre d'altres: 1) el ra que en alguns casos no tingui el seu descobriment de diversos cultius cel•lulars origen en cel • lules vegetals, actualment es capacos de produir compostos medicinals objecte d'intensos estudis per la seva pos- especffics a una velocitat igual o superior a sible aplicacio a l'obtencio d ' antibiotics, la de les plantes intactes, 2 ) la troballa, agents anticancerigens , toxines i productes mitjancant bioassaigs , de noves substan- naturals en general amb activitat farma- cies fisiologicament actives d'aplicacio te- cologica i/o terapeutica (36, 88 , 131, 160). rapeutica ; 3) el coneixement dels factors Encara que els avencos abans esmentats de control involucrats en el metabolisme han confirmat l'esperanca d'aconseguir en secundari ; 4) la demostraci6 que I'activitat un futur proxim I ' optimitzacio d'alguns biosintetica de cel•lules cultivades pot aug- sistemes experimentals en la produccio in- mentar-se regulant els factors ambientals dustrial dels compostos d'interes farma- i/o condicions de cultiu , o be mitjancant la ceutic , resten encara molts problemes, tant selecc16 o induccio artificial de clons mu- teorics com practics, que haurien de solu- 62 CIRLESCODLS.I, FR-L\YLS( IIL.IDO.MI.11, 11t.tIE B.ISIID.A I .IOSE[' t1A.SLL LL.IBRLS cionar-se previament. Aixi, d'entre els nitida cell suspension culture by opiate receptor principals desafiaments amb els quals en- binding studies. Planta Med., 46:210-214. cara s'han d'afrontar els cientifics en 9. BARZ, W. (1977a) Catabolism of endogenous and exogenous compounds by plant cell cultu- aquest camp pot citar-se la desrepressio de res. En: Plant Tissue Culture and its Bio- les cel•lules, determinar la interdependen- technological Application (Barz, W., Reinhard, cia de les cel•lules entre si, aconseguir 1'es- E. and Zenk, M.H., eds.) Springer. Berlin. pp. tabilitzaci6 dell genotips, i de fer creixer la 153-171. 10. BARZ, W. (1977b) Degradation of polyphenols biomassa uniforme de cel•lules a baix in plants and plant cell suspension cultures. cost (168). Per aixo, les activitats de recer- Phrsiol. Veg., 15:261-277. ca, taut individuals corn col•lectives, hau- II. BARZ , W., REINHARD, E. I ZENK, M.H. (1977) rien de comprendre tots els aspectes d'a- Plant Tissue Culture and its Bio-technological quests sistemes de cultius per a una millor .Application. Springer. Berlin. 12. BARZ, i HOSEL, W. (1979). Metabolism and de- comprensio del metabolisme secundari i la gradation of phenolic compounds in plants. seva aplicaci6 biotecnologica. Rec. Adv. Phrtochem.. 12:339-369. 13. BARZ, W. i ELLIS, B.E. (1980) Potential of plant cell cultures for pharmaceutical production. En: Natural Products as .tledicinal Agents (Beal, J.L. BIBLIOGRAFIA and Reinhard, E., eds.) Hippokrates Verlag. Stuttgart. pp. 471-507. I. AKASU, M., ITOKAWA I FUJITA, M. (1976) Bisco- 14. BERGMAN, L. I RENNENBERG, H. (1978). Efflux claurine alkaloids in callus tissues of Stephania and production of glutathione in suspension cepharantha. Phrtochemistr1,, 15:471-473. cultures of Nicotiana tahacum. 1. PIlan_enpiir- 2. ALFERMANN, A.W., MERZ, D. I REINHARD, E. siol.. 88:175-186. (1975) Induction of anthocyanin biosynthesis in 15. BERLIN, J. i KNOBLOCH, K.H. (1980) Biochemi- tissue cultures of Daucus carota. Planta 11ed., cal characterization of a variant tobacco cell suppl.: 70-78. line accumulating high levels of cinnamoyl pu- 3. ALFERMANN, A.W. Boy, H.M., DOLLER, P.C., trescine derivatives. Iloppe Seller's Z. Phrsiol. HAGEDORN, W., HEINS, M., WAHL, J. i REIN- Chem.. 361:219-220. HARD, E. (1977) Biotransformation of cardiac 16. BERLIN, J. (1983) Naturstoffe aus pflanzlichen glycosides by plant cell cultures. En: Plant Tis- Zellkulturen. Chenne in. Zeit, 17:77-84. sue Culture and its Bio-technological.-lpplicalion 17. BERLIN, J. (1984) Plant cell cultures - a future (Barz , W., Reinhard, E. and Zenk. M.H., eds.) source of natural products. Endeavour, 8:5-8. Springer. Berlin . pp. 125-141. 18. BHUJwAN1, S.S. i R.AZDAN, M.K. (1983) Develop- 4. ALFERMANN, A.W. i REINHARD, E. (1976) Pro- ments in Crop Science. Vol. 5. Plant Tissue Cul- duction of Natural Compounds hr Cell Culture ture: Theort' and Practice. Elsevier. Amsterdam. Methods. Ges. Strahlen and Umwltforshg. Mun- 19. Buss, F.A. (1984) The application of new plant chen. biotechnology to crop improvement. HortScien- 5. ALFERMANN, A.W., i REINHARD, E. (1980) Bio- ce. 19:43-48. transformation by plant tissue cultures. Bull. 20. BOHM, H. (1978) Regulation of alkaloid produc- Soc. Chim. France, part 11: 35-45. tion in plant cell cultures. En: Frontier of Plant 6. ALFERMANN, A.W., SCHULLER, I. i REINHARD, E. Tissue Culture (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Cal- (1980) Biotransformation of cardiac glycosides gary. Calgary, Canada. pp. 201-2 12. by immobilized cells of Digitalis lanata . Planta 21. BOHM, H. (1980) The formation of secondary Med., 40:218-223. metabolites in plant tissue and cell cultures. Int. 7. ALFERMANN, A.W„ BERGMAN, W., FIGUR, C., Rev. ('r/o/., suppl. JIB:183-208. HELMBOLD, U. SCHAWANTAG, D. SCHULLER, 1. i 22. BRAIN, K.R. (1974) Accumulation of L-DOPA REINHARD, E. (1983) Biotransformation of in cultures from .tlucuna pruriens. 3rd Int. (3-methyldigitoxin to J3-methyldigoxin by cell Congr. Plant tissue and Cell Culture. Leicester. cultures of Digital lanata. En: Plant Biotechno- Abstr. 73. logy (Mantell, S.H. and Smith, H., eds.) Cam- 23. BREULING , M., ROTHENBERGER , S., ALFERMANN, bridge Univ. Press. Cambridge. pp. 67-74. A.W. i REINHARD, E. (1984) Production of pro- 8. ARENS, H., BORBE , H.O., ULBRICH, B. i toberberine alkaloids by suspension cultures of STOCKIGT, J. (1982) Detection of pericine, a Berheris nilsoniae. Farm. Tijd. voor Belgic, new CNS-active indole alkaloid from Picralima 61:334. POTE.NCIAL BIOTECNOLOGIC DE.L ('17,111 'W" ('FZ L('LES L'EGET.4LS PER .4 L'OBJEN('IO DE PRODCCTES FAR.LIACE(`T/CS 63

24. BRODELIUS , P.. DEUS . B., MOSBACH , K. i ZENZ, rime acid production and growth characteristics M.H. (1979 ) Immobilized plant cells for the of .lnchusa oflicinalis cell suspension cultures. production and transformation of natural pro- Planta .lied., 50:346-350. ducts . FEBS Lett., 103:93-97. 42. DEUS-NEUMANN, B. 1 ZENK, M.H. (1984) Insta- 25. BRODELIUS , P. i NILSSON , K. (1980 ) Entrapment bility, of indole alkaloid production in Catha- of plant cells in different matrices . FIBS Lett., ranthus roseus cell suspension cultures. Plania 122:312-316. tiled.. 50:427-433. 26. BRODELIUs , P. (1983 ) Production of biochemi- 43. DHRUVA, B.R., RAMA RAO, A.V., SRINIV.AS.AN, cals with immobilized plant cells : Possibilities R. 1 VENKAT.ARAMAN, K. (1972) Structure of a and problems ..-Inn. .VYAcad. Sci.. 413 : 383-393. quinone from teak tissue culture. Ind. J. Chem., 27. BRODELtus , P. (1984 ) Immobilized viable plant 10:683-685. cells.:inn . NY.4cad. Sci., 434 : 382-393. 44. DIETTRICH, B.. NEUMANN, D., SCHINDLER, U. i 28. BIIT (' HER, D .N. i CONNOLLY, J.D. (1971) An LUCKNER, M. (1982) Crvopreservation of Digi- investigation of factors which influence the pro- talis lanata cells cultivated in vitro. Plania duction of abnormal terpenoids by callus cultu- Med., 45:154. res of . 4ndrographis paniculata Nees . J. L'xp. 45. DIXON. R.A., DEY, P.M. i WHITEHEAD, I.M. Bot., 22 :314-322. (1982) Purification and properties of chalcone 29. BUTENKO , R.G. (1967 ) Tissue culture of medici- isomerase from cell suspension cultures of Pha- nal plants and prospective of its usage in medi- seolus vrdgaris. Biochinr. Biophrs..-1cia. 715:25-33. cine. Prohl. Pharmacolog ., 21:184-191. 46. DOLLER, G., ALFERMANN, A.W. i REINHARD, E. 30. CALCOTT. P.H. (1981 ) Continuous Cultures of (1976) Production of indole alkaloids in tissue Cells. CRC Press. Florida. cultures of Catharanthus roseus. Planta .'Lied., 31. CAREw . D.P. i STABA , E.J. (1965 ). Plant tissue 30:14-20. culture: its fundamentals , application and rela- 47. DOLLER, G. (1978) Influence of the medium on tionship to medicinal plant studies . Llordia, the production of serpentine by suspension cul- 28:1-26. tures of Catharanthus roseus (L.) G. Don. En: 32. CHEN , T.H.H., KARTHA , K.K., LEUNG, N.L., Production of Natural Compounds bP Cell C'ut- KIIRZ. W.G.W., CHATSON. K.B. i CONSTABEL, F. ture,ilethods (Alfermann. A.W. and Reinhard, (1984) Cryopreservation of alkaloid-producing Ed., eds.) Ges. Strahlen and Umweltforschg. cell cultures of periwinkle (Catharanthus ro- Munchen. pp. 109-116. selcs). Plant Phisiol .. 75:726-731. 48. DURAND, G. i NAVARRO, J.M. (1978) Immobili- 33. CHIBATA, 1. i ToS.A, T. (1980 ) Immobilized mi- zed microbial cells. Process Biochenr.. 13:14-23. crobial cells and their applications. Trends Bio- 49. EHMKE, A. i EILERT. (1984) Steroid alkaloids in chenr . 5:88-90. tissue cultures of Solanum dulcanrara. Farrar. 34. CHIBAT.A, 1. i TOSA, T. (1981) Use of immobili- Tijd. voor Belgie, 61:333. zed cells . Ann. Rev . Biophrs. Bioeng., 10:197- 50. ELLIS, BE. (1980) Accumulation of hydroxy- 216. plenylethanol glucosides in cultures cells of 35. COLMAN, R. (1984 ) Biotechnology demands a St'ringa vulgaris. Z. Pht'siol. Chem., 361:242. special strategy . Nest- Sci., 1396:26-27. 51. ELLIS, BE. (1983) Production of hydroxyphenyl- 36. COLWELL. R.R. (1983 ) Biotechnology in the ma- ethanol glycosides in suspension cultures of rine sciences . Science, 222:19-23. Srringa Izdgaris. Phrtochenustrr, 22:1941-1943. 37. CONSTABEL , F., GAMBORG, O.L., KURZ. W.G.W. 52. ELLIS, BE. (1984) Probing secondary metabo- i STECK, W. (1974) Production of secondary lism in plant cell cultures. Can. J. Bot., 62:2912- metabolites in plant cell cultures . Planta Med., 2917. 25:158-165. 53. ENGEL, B. i REINHARD, E. (1984). Acridone- 38. CONSTABEL . F.. GAUDET-LA PRAIRIE, P., KURZ, alkaloid formation in suspension cultures of W.G.W. i KUTNEY , J.P. (1982 ) Alkaloid produc- Ruta species. Farrar. Tijd. voor Belgii;, 61:335. tion in Catharanthus roseus cell cultures. X11. 54. EVANS, D.A. i SHARP, W.R. (1983) Handbook of Biosynthetic capacity of callus from original ex- Plant Cell Culture. Macmillan. London. plants and regenerated shoots . Plant ('ell Re- 55. EVERETT, N.P., WANG, T.L., Got LD, A.R. i ports. 1:139-142. STREET, H.E. (1981) Studies on the control of 39. CORDUAN, G. i REINHARD, E. 1972 Synthesis of the cell cycle in cultured plant cells. 2. Effect of volatile oils in tissue cultures of Ruta grareo- 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Proto- lens. I'hrtochernistrl '. 11:917-922. plasma. 106:15-22. 40. DALE , P.J. (1984 ) Tissue culture and forage crop 56. FOWLER, M.W. (1981) Plant cell biotechnology improvement. Span , 27:55-57. to produce desirable substances. ('here. Ind., 41. DE-EKNAMKUL, W. i ELLIS, B.E. (1984 ) Rosma- 7:229-233. 64 ('ARLES CODINA, FRANCES(' IJLADO.tL4T, J.IC7IE B.ISI7DA 1 JOSF_P.t1ANEL LLABRLS

57. FOWLER, M.W. (1983) Commercial application 73. HAMILTON, R.. PEDERSEN, H. i CHIN, C.K. and economic aspects of mass plant cell culture. (1984) Immobilized plant cells for the produc- En: Plant Biotechnology (Mantell, S.H. and tion of biochemicals. Biotechnol. Bioeng. Smith, H., eds.) Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18. Symp., 14:383-396. Cambridge Univ. Press. Cambridge. pp. 3-37. 74. HEINSTEIN, P.F. (1985) Future approaches to 58. FOWLER, M.W. (1984a) Time for plant cell cul- the formation of secondary natural products in ture'? Nature 307:504. plant cell suspension cultures. J. Nat. Prod., 59. FOWLER, M.W. (1984b) Plant-cell cultures: Na- 48:1-9. tural products and industrial application. Bio- 75. HEMSCHEIDT, T. i ZENK, M.H. (1980) Glucosi- technol. Genet. Eng. Rev., 2:41-68. dases involved in indole alkaloid biosysnthesis 60. FRIEDRICH, H. and BAIER, S. (1973) Anthracen- of ('atharanthus cell cultures. FFBS Lett., Derivated in Kalluskulturen aus Cassia angus7i- 110:187-191. lolia. Phvtocheinistry, 12:1459-1462. 76. HESS, C.E. (1984) Biotechnology: Implications 61. FRISCHKNECHT, P.M., BAUMANN, T.W. I WAN- for horticulture and society. IlortScience, NER, H. (1977) Tissue culture of Cgffea arahica 19:620-623. growth and caffeine formation. Planta Afed., 77. HINZ, H. i ZENK, M.H. (1981) Production of 31:344-350. protoberberine alkaloids by cell suspension cul- 62. FURUTA, T., KOJIMA, H. i KATSUTA, T. (1972a) tures of Berheris species. Naturlviss., 68:620- 3-methylpurpurin and other anthraquinones 621. from callus tissue of Digitalis lanata. Phttoche- 78. HIROTANI, M. i FURUYA, T. (1980) Biotransfor- mistry, 11:1073-1076. mation of digitoxigenin by cells suspension cul- 63. FURUYA, T., IKUTA, A. i SYONO, K. (1972b) tures of Digitalis purpurea. Phttochemistry, Alkaloids from callus tissue of Papaver sonuufe- 19:531-534. runt. Phvtochemistry, 11:3041-4044. 79. IKEDA, T., MATSUMOTO, T. i NOGUCHI, M. 64. FURUYA, T. i ISHII, T. (1973) The manufactu- (1976) Formation of ubiquinone by tobacco ring of Panax plant tissue culture containing plant cells in suspension culture. Phvtoche- crude saponins and crude sapogenins which are mistrv, 15:568-569. identical with those of natural Panax roots. Jap. 80. INOUE, K., SHIOB.AR.A, Y., NAYESHIRO, H., INOU- Patent N.° 48-31917. YE, H., WILSON, G. 1 ZENK, M.H. (1984a) 65. FURUYA, T. (1978) Biotransformation by plant Biosynthesis of anthraquinones and related cell cultures. En: Frontiers of Plant Tissue Cultu- compounds in Galium mollugo cell suspension re (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Calgary. Calgary, cultures. Phvtochemistrt. 23:307-311. Canada. pp. 191-200. 81. INOUE, K., UEDA, S.. NAYESHIRO, H.. MORITO- 66. FURUYA, T., YOSHIKAW.A, T. i T.AIRA, M. (1984) ME, H. i INOUYE, H. (1984a) Biosynthesis of Biotransformation of codeinone to codeine by naphtoquinones and anthraquinones in Strepto- immobilized cells of Papaver .somniferum. carpus dunnii cells cultures. Phytochemistry, Phytochemistry, 23: 999-1001. 23:313-318. 67. GAUTHERET, R.J. (1977) La Culture des Tissus 82. JHANG, J.J., STABA, E.J. i KIM, J.K. (1974) Ame- et des Cellules des Vegetau.v. Masson. Paris. rican and Korean ginseng tissue cultures: 68. GAUTHERET, R.J. (1983) Plant tissue culture: a growth, chemical analysis and plantlet forma- history. Bot. AIag., 96:393-410. tion. In vitro, 9:253-259. 69. GOLDSTEIN, WE.. INGLE, M.B. i LASURE, L. 83. JONES, A., VELIKY, I.A. i OZUBKO, R.S. (1978) (1980) Product cost analysis. En: Plant Tissue Biotransformation of cardenolidcs by plant cell Culture as a Source of Biochemicals (Staba, E.J., suspension cultures. I. Isolation and identifica- ed.). CRC Press. Florida. pp. 191-234. tion of periplogenin from cultures of Daucus 70. GOLDSTEIN, W.E. (1983) Large-scale processing carota Ca68 incubated with digitoxigenin. Lloy- of plant cell culture. Ann. NY Acad. Sci., dia, 41:476-487. 413:394-408. 84. K.AN-FAN, CH, i HUSSON, H.-P. (1979) Isolation 71. GOULD, A.R. (1984) Control of the cell cycle in and biomimetic conversion of 4,21 dehydro- cultured plant cells. Crit. Rev. Plant Sc,.. 1:315- geissoschizine. J.C.S. Chem. Comm., 1015- 344. 1016. 72. GRESSHOFF, P.M. (1978) Phytohormones and 85. KARTHA. K.K. (1985) Crvopreservation of'Plant growth and differentiation of cells and tissues Cells and Organs. CRC Press. Florida. cultured in vitro. En: Plnvtnhormones and Rela- 86. KATO, K., SHIOZAWA, Y., Y.AMAD.A, A., NISHIDA, ted Compunds.. Comprehensive Treatise (Le- K. i NOGUCHI, M. (1972) A jar fermentor cultu- tham, D.S., Goodwin, P.B. and Higgins, T.J.V., re of Nicotiana tabacuin L. cell suspensions. Agr eds.) Elsevier. Amsterdam, pp. 1-29. Biol. Chem., 36:899-902. POTENCIAL B1OTECNOLOGIC DEL CUL NU DL CELLULES I'EGET I LS PER A L 'OBTENCIO DE PRODL 'CTES Ft R ,MACEL ' TICS 65

87. KAUL, B. i STABA , E. J. (1967 ) Ammi visnaga ture: potential sources of clinically important tissue cultures . Multi-liter suspension growth anti-tumor agents. Pure .-ippl. Cheri., 54:2523- and examination for furanochromes . Planta 2536. Med.. 15:145-156. 102. KUTNEY, J.P., AWERYN, B., CHOI, L.S.L., HON- 88. KAUL , P.N. (1982 ) Biomedical potential of the DA, T., KOLODZIEJCZYK, P.. LEWIS, N.G., SATO, sea. Pure.1 ppl. Chem., 54:1963-1972. T., SLEIGH, S.K., STUART, K.L., WORTH, B.R., 89. KHANNA , P. i NAG, T.N. (1973) Isolation, iden- KURZ, W.G.W., CHATSON, K.B. i CONSTABEL, F. tification and screening of phyllemblin from (1983) Studies in plant tissue culture. The F_mhlica olftcinalis Gaertn tissue culture. Indian synthesis and biosynthesis of indole alkaloids. J. I'harmac1, , 35:23-24. Tetrahedron, 39:3781-3795. 90. KIESUCH , K. (1980 ) New examples of microbial 103. KUTNEY, J.P. (1984) Studies in plant tissue cul- transformations in pharmaceutical industry. ture. Synthesis and biosynthesis of clinically im- Bull. Soc. C'him. Franc. Panic 11.:9-17. portant anti-tumor agents. Pure Appl. Chem., 91. KING. P . J. (1980 ) Cell proliferation and growth 56:1011-1024. in suspension cultures. Int. Rev. Ct'tol., supp. 104. LECLERQ, J. (1984) Plant cells and tissues cultu- 11.1:25-24. res in vitro and pharmaceutical industry. J. 92. KNOBLOCH, K.H., HAHLBROCK . K. (1977) Pharm. BeIg., 39:401-408. 4-Coumarate : CoA ligase from cell suspension 105. LEE, J.W. i LoPEz, A. (1984) Modification of cultures of Petroselinum hortense Hoffm. Arch. plant proteins by immobilized proteases. C'rit. Biochem . Biophps., 184:237-248. Rev. Food Sci. Nutr., 21:289-322. 93. KHOL , W., VOGELMANN . H. 1 HOFLE , G. (1980) 106. LEHTOLA, T., HUHTIKANG.AS, A., LUNDELL, J. i Alkaloids from Catharanthus roseus tissue cul- VALLANEN, T. (1982) Radioimmunoassay of tures . Planta Med., 39 : 283-284. lysergic acid derivatives from Claviceps paspali 94. KOHL , W., WITTE , B., SHELDRICK , W.S. i HOFLE, fermentation cultures. Planta tfed., 45:161. G. (1984 ) Indolealkaloid aus Catharanthus ro- 107. LEISTNER, E. (1975) Isolierung. Identifizierung seus Zellkulturen . IV. 16R- 19,20-E-Isositsirikin, and Biosynthese von Anthrachiponen in Zell- 16R-19,20-Z-Isositsirikin and 21-Hydroxycy- suspensiomkulturen von .tforinda citri_folia. clolochnerin. Planta Med., 50:242-244. Planta .11ed., suppl: 214-224. 95. KORATE , CH. K. i RADWAN , S.S. (1979) Enrich- 108. LINDSEY, K. I YEOMAN, M.M. (1983) Novel ex- ment of Solanum khasianum callus generating perimental systems for studying the production rootlets with steroidal glycoalkaloids . Z. Natur- of secondary metabolites by plant tissue cultu- forschg., 34c:636-636. res. En: Plant Biotechnology (Mansell, S.H. and 96. KOUADIO, K., RIDE.AU, M., GANSER , G.. CHE- Smith, H., eds.) Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18. NIEUX , J.C. i VIEL, C. (1984) Biotransformation Cambridge Univ. Press. Cambridge. pp. 39-66. of ellipticine into 5-formyl ellipticine by Chois- 109. LINDSEY, K. i YEOMAN, M.M. (1984) The viabi- va ternata strains . Plant Cell Rep., 3:203-205. lity and biosynthetic activity of cells of Capsi- 97. KOUADIO, K., CRECHE , J., CHENIEUX, J.C., Ri- cum frutescens Mill. cv. annuurn immobilized DEAU, M. i VIEL, C. (1985) Alkaloid production in reticulate polyurethane. J. E.rp. Bot., by Ochrosia elliptica cell suspension cultures. J. 35:1684-1696. Plant Phi'siol., 118:277-283. 110. Liu, M.-C. (1974) A post-seminar report to the 98. KREUZALER, F. i HAHLBROCK , K. (1975) Enzy- US-ROC cooperative science program on plant mic synthesis of an aromatic ring from acetate tissue and cell cultures. Taman sugar. 21:1-6. units . Partial purification and some properties 111. LUCKNER, M., KUBERSKI, C., SCHEIHNER, H., of flavonone synthase from cell suspension cul- SCHW1EBODE, C. i DIETTRICH, B. (1982) Princi- tures of Petroselinum hortense. Fur. J. Bio- ples regulating cardenolide formation in cell chem., 56:205-2 13. cultures of Digitalis lanata. Planta .tied., 99. KURZ, W.G.W., CHATSON , K.B. CONSTABEL, F., 45:134. KUTNEY , J.P., CHOI, L.S.L., KOLODZIEJCZYK, P., 112. LUDERITZ, T. I GRISEBACH. H. (1981) Enzymic SLEIGH . S.K. i STUART . K.L. (1980 ) The produc- synthesis of lignin precursors. Comparison of tion of catharanthine and other indole alkaloids cinnamoyl-CoA reductase and cinnamyl alco- by cell suspension cultures of Catharanthus ro- hol: NADP'dehydrogenase from spruce (Picea seus. Planta . tied., 39:284. ahies L.) and soybean (Glycine max L.). Eur. J. 100. KURZ, W.G.W. i CON5TABEL, F. (1985) Aspects Biochem., 119:115-124. affecting biosynthesis and biotransformation of 113. M(' LAUCHL.AN, W.R., H.ASAN, M.. BAXTER, R.L. secondary metabolites in plant cell cultures. i SCOTT, A.I. (1983) Conversion of anhydrovin- CRC Crit. Rev. Biotechnol., 2:105-118. blastine to vinblastine by cell-free homogenates 101. KUTNEY, J . P. (1982 ) Studies in plant tissue cul- of Catharanthus roseus cell suspension cultures. 66 CARLES COD/NA, FRANCESC tILADO.t/A7', JAL'ME BASTIDA I JOSEP SIANEL LLABRT,S

Tetrahedron 39:3777-3780. 129. NOMINE, G. (1980) La place des bioconversions 114. MC CARTHY, J.J., RATCHIFFE, D. i STRETT, H.E. dans l 'acces industriel aux steroides . Bull. Soc. (1980) The effect of nutrient medium composi- Chim. France. Partie 11: 18-23. tion on the growth cycle of Catharanthus roseus 130. OGINO, T., HIRAOKA, N. i TABATA, M. (1978) (L.) G. Don cells grown in batch culture. J. Exp. Selection of high nicotine-producing cells lines Bot., 31:1315-1325. of tobacco callus by single cell cloning . Phvto- 115. MALIGA, P. (1984) Isolation characterization of chemistrv, 17:1907-1910. mutants in plant cell culture. Annu. Rev. Plant 131. OKAMI, Y. (1982) Potential use of marine mi- Phvsiol., 35:519-542. croorganisms for antibiotics and enzym produc- 116. MANTELL, S.H. i SMITH, H. (1983) Plant Bio- tion. Pure Appl. ('hem., 54:1951-1962. technology. Soc. Exp. Biol., Sem. Series 18. 132. OVERTON, K.H. (1977) Biosynthesis of mevalo- Cambridge Univ. Press. Cambridge. noid-derived compounds in cell cultures. En: 117. MARTIN, S.M. (1980) Environmental factors: B. Plant Tissue Culture and its Bio-technological Temperature, aeration and pH. En: Plant Tissue Application ( Barz , W., Reinhard, E. and Zenk, Culture as a Source of Biochemicals (Staba, E.J., M.H., eds.) Springer. Berlin . pp. 66-75. eds.) CRC Press. Florida. pp. 143-148. 133. PAREILLEUx, A. i VINAS, R. (1983) Influence of 118. MATTIASSON, B. (1983) immobilized Cells and aeration rate on the growth yield in suspension Organells. CRC Press. Florida. cultures of Caiharanthus roseus (L.) G. Don. J. 119. MEANS, F. Jr. (1983) Heritable variation in plant Ferment. Technol., 6:429-433. cell culture. Annu. Rev. Plant Phvsiol., 34:327- 134. PETIARD, V. (1980) Antimitotic activities of 346. Catharanthus roseus tissue cultures . En: Natural 120. MERILLON, J.M., RIDEAU, M. I CHENIEUX, J.C. Products as .1ledicinal Agents (Beal. J.L. and (1984) Influence of sucrose on levels of ajmalici- Reinhard, E., eds.) Hippokrates Verlag. Stutt- ne, serpentine , and tryptamine in C'atharanihus gart. pp. 447-469. roseus cells in vitro. Planta .11ed., 50:497-501. 135. PFEIFFER. B., Roos, W. i LUCKNER, M. (1982) 121. MISAWA, M., SAKATO, K., TANAKA, H., HAYASHI, Accumulation of purpureaglycoside A in vacuo- M. i SAMEJIMA, H. (1974) Production of physio- les of Digitalis lanata cells cultivated in vitro. logically active substances by plant cell suspen- Planta .11ed., 45:154. sion cultures. En: Tissue Culture and Plant 136. PINOL, M.T., PALAZON, J. I SERRANO, M. (1984) Science (Street, HE., ed.) Academic Press. Lon- Growth and nicotine content of tobacco callus don. pp. 405-432. cultures wihtout organogenesis . Plant Sci. Lett., 122. MISAWA, M., TANAKA, H., CHIYO, O. i MUKAI, 35:219-223. M. (1975) Production of a plasmin inhibitory 137. POWLEDGE, T.M. (1984) Biotechnology touches substance by Scopolia japonica suspension cul- the forest. Bio/technology 2:763-772. tures. Biotech. Bioeng., 17:305-314. 138. PUHAN, Z. i MARTIN, S.M. (1971) The industrial 123. MORITZ, S., ALFERMAANN, A.W. i REINHARD, E. potential of plant cell culture. Prog. Ind. Micro- (1982) Continuous biotransformation by immo- hiol.. 9:13-29. bilized cells in bioreactors. Planta Med., 45:154. 139. RADWAN, S.S., I KOKATE, CH. K. (1979) Produc- 124. MORITZ, S., ALFERM.ANN, A.W. i REINHARD, E. tion of higher levels of trigonelline by cell cultu- (1984) Biotransformation of cardenolids by im- res of Trigonella jbenum-graecum than by the mobilized cells of Digitalis lanata. Farm. Tijd. differentiated plant . Planta, 147:340-344. roar Belgie, 61:321. 140. RAMAWAT, K.G. i ARYA, H.C. (1979) Effect of 125. MORRIS, P. i FOWLER, M.W. (1980) Growth and amino acids on ephedrine production in F.phe- alkaloid content of cell suspension cultures of dra gerardiana callus cultures. Phvtochemistrv, Papaver sominierum. Planta Med., 39:284-285. 18:484-485. 126. NAG, K.K. i STREET. H.E. (1975) Freeze preser- 141. RAZZAQUE, A. i ELLIS, B.E. (1977 ) Rosmarinic vation of cultured plant cells. Phvsiol. Plant., acid production in Coleus cells cultures. Planta, 34:254-265. 137:287-291. 127. NICKEL, S. I STABA, E.J. (1977) RIA-test of Digi- 142. REINERT, J. I BAJAJ, Y.P.S. (1977) Applied and talis plants and tissue cultures. En: Plant Tissue Fundamental Aspects of Plant Cell, Tissue and ('ulture and its Bio-technological . Ipplication Organ Culture. Springer. Berlin. (Bari, W., Reinhard, E. and Zenk, M.H., eds.) 143. REINHARD, E. (1974) Biotransformation by Springer. Berlin . pp. 278-286. plant tissue cultures . En: Tissue Culture and 128. NISHI, I. I MITSUOKA, S. (1975) Production of Plant Science (Street, HE.. ed.) Academic Press. anti-pectic ulcer substance by tissue cultures of London. pp. 433-459. Isodon plants. Japan Patent Appl. N.° 50- 144. REINHARD, E. i ALFERMANN, A.W. (1980) Bio- 12288. transformation by plant cell cultures. Adv. Bio- POTF.NC I4L BIOTEC'NOLOGIC DEL CULTIC DE CEL-LULES VEGETALS PER .4 L'OBTENCIO DEPRODUCTES FARMACEUTICS 67

chem. Eng., 16:49-83. 159. SHIMIZU, Y. i NOGUCHI, M. (1973) Tank culture 145. ROBINS, R.J., WEBB, A.J.. RHODES , M.J.C., PAY- of tobacco cells. Kagaku To Kogvo 26:231-234. NE, i MORGAN , M.R.A. (1984 ) Radioimmunoas- 160. SHIMIZU, Y. (1985) Bioactive marine natural say for the quantitative determination of quini- products, with emphasis on hadling of water- ne in cultured plant tissues . Planta ,%Ied., soluble compounds. /. Nat. Prod., 48:223-235. 50:235-238. 161. SHULER, M.L., SAHAI, O.P., i HALLSBY, G.A. 146. ROKEM , J.S., T.AL, B. 1 GOLDBERG , I. (1985) (1983) Entrapped plant cell tissue cultures. Ann. Methods for increasing diosgenin production by NY Acad. Sci., 413:373-382. Dioscorea cells in suspension cultures . J. Nat. 162. SHULER, M.L., PYNE, J.W. i HALLSBY, G.A. Prod., 48:210-222. (1984) Prospects and problems in the large scale 147. ROLLER , U. (1978) Selection of plants and plant production of metabolites from plant cell tissue tissue cultures of ('atharanthus roseus with high cultures. J. Am. Oil. Chem. Soc., 61:1724-1727. content of serpentine and ajmalicine. En: Pro- 163. SMART, N.J. i FOWLER, M.W. (1984) Mass culti- duction of Natural Compounds by Cell Culture vation of Catharanthus roseus cells using a non- Methods ( Alfermann , A.W. and Reinhard, E., mechanically agitated bioreactor. Appl. Bio- eds.) Ges . Strahlen and tlmweltforschg. Mun- chem. Biotechnol., 9:209-216. chen . pp. 95-108. 164. SENER, F., STABA, E.J. i MANGOLD, H.K. (1974) 148. ROSAZZA, J.P. (1982 ) Micorbial Transforma- Lipids in plant tissue cultures. 11. Unusual fatty tions cif Bioactive Compounds. CRC Press. Flo- acids in lipids of Hvdnocarpus anthehninthica rida. cultures. Chem. Phys. Lipids, 12:344-350. 149. RUEFFER , M., KAN-FAN , C., HUSSON, H.-P., 165. STABA, E.J. i KAUL, B. (1971) Production of STOCKIGT, J. i ZENZ, M.H. (1979 ) 4,21-dehydro- diosgenin by plant tissue culture technique. geissoschizine , an intermediate in heteroyohim- U.S. Patent N.° 3.628. 287. hine alkaloid biosynthesis . J.C.S. Chem. 166. STABA, E.J. (1977) Tissue culture and phar- Comm., 1016-1018. macy. En: Applied and Fundamental Aspects of 150. SANDERMANN , H. Jr., SCHEEL , D. i TRENCK, Plant Cell, Tissue and Organ Culture (Reinert, T.V.D. (1984) Use of plant cell cultures to study J. and Bajaj, Y.P.S., eds.) Springer. Berlin. pp. the metabolism of environmental chemicals. 694-702. Ecotoxicol. Environ. Safety. 8:167-182. 167. STABA, E.J. (1980) Plant Tissue Culture as a 151. SATO, F. i YAMADA, Y. (1984) High berberine- Source of Biochemicals. CRC Press. Florida. producing cultures of ('opus japonica cells. 168. STABA, E.J. (1985) Milestones in plant tissue Phvtochemistr1,, 23:281-285. culture systems for the production of secondary 152. SCHALLENBERG, J. i BERLIN, J. (1979) 5-Methyl- products. J. Nat. Prod., 48:203-209. triptophan resistant cells of Catharanthus ro- 169. STECK, W., BAILEY, B.K., SHYLUK, J.P. 1 GAM- seus. Z. Naturforschg., 34c:541-545. BORG, O.L. (1971) Coumarins and alkaloids 153. SCHLEPPHORST, R. i BARZ, W. (1979) Metabo- from cell cultures of Ruta graveolens. Phvtoche- lism of aromatic acids in plant cell suspension mistr1,, 10:191-194. cultures. Planta .11ed., 36:333-342. 170. STECK, W. i CONSTABEL, F. (1974) Biotransfor- 154. SCHONBERGER, G. i REINHARD, E. (1984) Pro- mation in plant cell cultures. Llovdia, 37:185- duction of saponins in cell cultures of Panax 191. ginseng C.A. Meyer. Farm. Tijd. voor Belgic, 171. STOCKIGT, J. (1980) Enzymatic formation of in- 61:329. termediates in the biosynthesis of ajmalicine: 155. SCHULTE, U., EL-SHAGI, H. i ZENK , M.H. (1984) strictosidine and cathenamine. Phvtochemistrv, Optimization of 19 Rubiaceae species in cell 18:965-971. culture for the production of anthraquinones. 172. STOCKIGT, J. (1980) Indole alkaloids from cell Plant Cell Rep., 3:5 1-54. suspension cultures of C'atharanthus roseus and 156. SCOTT, Al.,.MIZUKAMI, H. i LEE, S.-L. (1979) C'atharanihus ovalis. Planta Med., 39:285-286. Characterization of a 5-methyltryptophan resis- 173. STOCKIGT, J., PFITZNER, A. 1 FIRL. J. (1981) tant strain of Catharanthus roseus cultured cells. Indole alkaloids from cell suspension cultures of Phviochemistr1,, 18:795-798. Raun'olha serpentina Benth. Plant Cell Rep., 157. SEIBER , M. i KADKADE, P.G. (1980) Environ- 1:36-39. mental factors : A. Light. En: Plant Tissue Cultu- 174. STOCKIGT, J. i PAWELKA, K.-H. (1982) Indole re as a Source of Biochemicals ( Staba , E.J., ed.) alkaloids from cell suspension cultures of Stem- CRC Press. Florida. pp. 123-142. madenia tomentosa and t'oacanga africana. 158. SAHARGOOL, P.D. (1985) Future uses of plant Planta Med., 45:155. cell culture techniques . Biochem. Educ.. 13: 175. STOHS, S.J. i ROSENBERG. (1976) Steroids and 50-54. steroid metabolism in plant tissue cultures. Lot'- 68 CARLES CODL\A. I-RA.ACESC I IL•IDO.tI.II JAL.tiL B.4S17DA I JOSEP.tl.1SEL LLIBRES

dia, 38:181-194. an anti-plant virus substance. Phtsiol. Plant., 176. STOHS, S.J. (1977) Metabolism of steroids in 41:313-320. plant tissue cultures. En: Plant Tissue Culture 188. TAL, B., ROKEM, J.S. i GOLDBERG, I. (1984a) and its Bio-technological Application (Barz. W., Timing of diosgenin appearance in suspension Reinhard, E. and Zenk, M.H., eds.) Springer. cultures of Dioscorea deltoidea. Planta .fled., Berlin. pp. 142-152. 50:239-241. 177. STREET, H.E. (1973) Plant cell cultures: their 189. TAL, B., T.AMIR, 1., ROKEM, J.S. I GOLDBERG, 1. potential for metabolic studies. En: Biosynthesis (1984b) Isolation and characterization of an in- and its Control in Plants (Milborrow, By., ed.). termediate steroid metabolite in diogenin Academic Press. London. pp. 93-125. biosynthesis in suspension cultures of Dioscorea 178. STREET, H.E. (1977) Applications of cell suspen- deltoidea cells. Biochern. J. Mol. .-Ispects, sion cultures. En: Applied and Fundamental As- 219:619-624. pects of Plant Cell. Tissue and Organ Culture 190. TAMAKI, E., MORISHLIA, 1., NISHII>A, K., K.ATO, (Reinert, J. and Bajaj, Y.P.S., eds.) Springer. K. i MATSUMOTO, T. (1973) Process for prepa- Berlin. pp. 649-667. ring licorice extract-like material for tobacco 179. TATABA, M., YAMAMOTO, H., i HIR.AOK.A, N. flavouring. U.S. Patent N.° 3.710.512. (1971) Alkaloid production in the tissue cultu- 191. TAN.AHASHI, T., N.AGAKURA, N., INOUYE. H. i res of some solanaceous plants. En: Les Cultures ZENK, M.H. (1984) Radioimmunoassay for the de Tissue des Plantes. C.R.N.S. Paris. pp. 389- determination of loganin and the biotransfor- 402. mation of loganin to secologanin by plant cell 180. TABATA, M., MIZUK.AMI, H., HIRAOKA. N. i Ko- cultures. Pln-tochemistrr, 23:1917-1922. NOSHIMA, M. (1974) Pigment formation in ca- 192. TANAKA, H., MACHIDA, Y., MUKAI, N. i MIS.A- llus cultures of Lithosperrnum ervthrorhizon. WA. M. (1974) Accumulation of glutamine by Phvtochernistr1-, 13:927-932. suspension cultures of Symphynnn o(frcinale. 181. TABATA, M., HIRAOKA, N., IKENOUE, M., SANO, .-igr. Biol. C'hern., 38:987-992. Y. i KONOSHIMA. M. (1975a) The production of 193. TAYLOR, W.I. I F.ARNSWORTH, N.R. (1975) The anthraquinones in callus cultures of Cassia tora. Catharanthus .Alkaloids. Marcel Dekker. New Lloydia, 38:131-134. York. 182. TABATA, M., MizLr MI, H., NODE, i KONOSHI- 194. TEUSCHER. E. (1973) Probleme der Sekundar MA, M. (1975b) Antimicrobial activity of Lit- stoffbildung in pflanzlichen Zellkulturen. Phar- hosperrnum erythrorhi_on callus cultures. Yaku- mazie, 28:6-18. gaku Zasshi, 95:1376-1379. 195. THORPE. T.A. (1978) Frontiers of Plant Tissue 183. TABATA, M., MIZUKAMI, H., HIRAOKA, N. i Ko- Culture. Univ. Calgary. Calgary, Canada. NOSHIMA, M. (1976) The production and regula- 196. THORPE, T.A. (1983) Biotechnological applica- tion of shikonine derivatives in cultured cells. tion of tissue cultures to forest-tree improve- Abstr. 12th. Phytochem. Symp. Japan. Kyoto. ment. Biotechnol..,ldv., 1:263-278. pp. 1-8. 197. TREIMER, J.F. i ZENK, M.H. (1979a) Purifica- 184. TABATA, M. (1977) Recent advances in the pro- tion and properties of strictosidine synthasc, the duction of medicinal substances by plant cell key enzyme in indole alkaloid formation. Etc. cultures. En: Plant Tissue Culture and its Bio- J. Biochern., 101:225-233. technological Application (Barz, W., Reinhard, 198. TREIMER, J.F. i ZENK, M.H. (I979b) Strictosidi- E. and Zenk, M.H., eds.) Springer. Berlin. pp. ne synthase from cell cultures of Apocynaceae 3- 1 6. plants. FEBS Lett., 97:159-162. 185. TABATA, M., OGINO, T., YOSHIOKA, K., YOSHI- 199. TSUKAD.A, M. i TABATA, M. (1984) Intracellular KAWA, N. i HIRAOKA. (1978) Selection of cells localization and secretion of naphtoquinone lines with higher yield of secondary products. pigments in cell cultures of Lithospernium En: Frontiers of Plant Tissue Culture (Thorpe, erythrorhi=on. Planta ;fled., 51:338-341. T.A., ed.) Univ. Calgary. Calgary, Canada. pp. 200. TUDGE, C. (1984) Drugs and dyes from plant 213-222. cell cultures. New Sci., 101:25. 186. TABATA. M., UMETANI, Y., SHIMA, K. i TANAKA, 201. UEDA, S., KOBAYASHI, K., MURAMATSU, T. I S. (1984) Glucosylation of esculetin by plant iNOUYE, H. (1981) Studies on monotcrpene glu- cell suspension cultures. Plant Cell Tissue Or- cosides and related natural product. Part XL. gan Cult., 3:3-10. Iridoid glucosides of cultured cells of Gardenia 187. TAK.AYAM.A, S., MISAWA, M.. Ko. K. i MISATO, T. jasminoides f. grandiflora. Planta .sled., 41:I86- (1977) Effect of cultural conditions on the 191. growth of .9grosternma githago cells in suspen- 202. ULBRICH, B. i ZENK, M.H. (1979) Partial purifi- sion culture and the concomitant production of cation and properties of hydrox}cinnamo%l- POTENCIAL BIOTECNOLOGIC DEL CULTIU DE CPL-LULES VEGET.4LS PER A L'OBTENCIO DE PROD UCTES F.4RMACEUTIC'S 69

Coa: quinate hydroxycinnamoyl transferase 215. YAMADA, Y. i ENDO, T. (1984) Tropane alka- from higher plants. Phvtocheruistrv, 18:929-933. loid production in cultured cells of Duhoisia 203. VANKOVA, R., VANEK, T., MACEK, T., JIRKU, V. i leichhardtii. Plant Cell Rep., 3:186-188. KAMINEK, M. (1983) Production of a cytokinin 216. YAMADA, Y. i OKADA. N. (1985) Biotransforma- (trans-zeatin) by cytokinin-dependent and cyto- tion of tetrahydroberberine to berberine by kinin-autonomous tobacco cells immobilized on enzyms prepared from cultured Coptis japonica polyhenyleneoxide. Abstr. 2nd. Int. Conf. cells. Phvtochemistrv, 24:63-65. Chem. Biotechnol. Biol. Active Nat. Prod. Bu- 217. YEOMAN, M.M. i FORCHE, E. (1980) Cell prolife- dapest. pp. 2I8. ration and growth in callus cultures. Int. Rev. 204. VASIL. I.K. (1980) Perspectives in Plant Cell and C't'tol.. suppl. 11.-1:1-24. Tissue Culture. Academic Press. London. 218. YEOMAN, M.M., MIEDZYBRODZCA, M.B., LIND- 205. VEUKY, I.A. i LATTA, R.K. (1974) Antimicrobial SEY. K. i Mc LAUCHLAN, W.R. (1980) The activity of cultured plant cells and tissues. Llov- synthetic potential of cultured plant cells. En: dia, 37:611-620. P/ant Cell Cultures: Results and Perspectives 206. VENKATSUBRAMANIAN, K. (1979) Immohih:ed (Sala, F., Parisi, B., Cella, R. and Ciferri, 0., Microbial (ells. ACS Symp. Series N.° 106. Am. eds.) Elsevier. Amsterdam. pp. 327-343. Chem. Soc. Washington. 219. YEOMAN, M.M., LINDSEY, K., MIEDZYBRODZKA, 207. WEILER, E.W. (1977) Radioimmuno-screening M.B. i Mc LAUCHLAN, W.R. (1982) Accumula- methods for secondary plant products. En: tion of secondary products as a facet of differen- Plant Tissue Culture and its Bio-technological tiation in plant cell and tissue cultures. En: Dir Application ( Barz, W., Reinhard , E. and Zenk, ferentiation In Vitro (Yeoman, M.M. and Tru- M.H., eds .) Springer . Berlin . pp. 266-277. man, D.E.S., eds.) Cambridge Univ. Press. 208. WESTCOTT, R.J. i HENSHAw . G.C. (1976) Pheno- Cambridge. pp. 65-82. lic synthesis and phenylalanine ammonia lyase 220. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H. i SCHULTE, U. (1975) activity in suspension cultures of .-leer pseudo- Anthraquinone production by cell suspension platanus L. Planta, 131:67-73. cultures of Morinda citritblia. Planta Med., 209. WESTEKEMPER , P., WIF.(ZOREK, U., GtJERITTE, suppl.: 79-101. F., L.ANGLOIS, N., L.ANGLOIs, N., POTTIER, P. i 221. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H.. UBRICH, B. (1977a) ZENK, M.H. (1980 ) Radioimmunoassay for the Production of rosmarinic acid by cell-suspen- determination of the indole alkaloid vindoline sion cultures of Coleus h/umei. Naturwiss., in Catharanthus. Planta .filed., 39:24-37. 64:585-586. 210. WET, J. M.J. de ( 1983) Biotechnology and the 222. ZENK, M.H., EL-SHAGI, H., ARENS, H., future of agriculture . Ill. Res., 25:3-5. STOCKIGT, J., WEILER, E.W. i DEUS, B. (1977b) 211. WHITAKER, R.J., HASHIMOTO , T. i EVANS, D.A. Formation of the indole alkaloids serpentine (1984) Production of the secondary metabolite and ajmalicine in cell suspension cultures of rosmarinic acid, by plant cell suspension cultu- Catharanthus roseus. En: Plant Tissue Culture res..4nn . N)'.-tcad. Sci.. 435 :364-366. and its Biotech nologicalApplication (Barz, W., 212. WI('HERS , H.J., WIJNSMA , R., VISSER , J.F., MA- Reinhard, E. and Zenk, M.H. eds.) Springer. LINGRE, T.M. i HtUING, H.J. (1985 ) Production Berlin. pp. 27-43. of L-DOPA by cell suspension cultures of .ilacu- 223. ZENK. M.H. (1978) The impact of plant cell na pruriens . 11. Effect of environmental parame- culture on industry. En: Frontiers of Plant Tis- ters on the production of L-DOPA. Plant Cell sue Culture (Thorpe, T.A., ed.) Univ. Calgary. Tissue Organ Cult., 4:75-82. Calgary, Canada. pp. 1-13. 213 . WIDHOLM , J.M. (1980 ) Selection of plant cell 224. ZENK, M.H. (1980) Enzymologie and Metabo- lines which accumulate compounds . En: P/ant lismus von Alkaloiden in Catharanthus roseus Tissue Culture as a Source of Biochemicals (Sta- Zellkulturen. Iloppe Set'ler's Z. Phvsio/. ('hem., ba. E.J ., ed.) (R( Press . Florida. pp. 99-114. 361:354-355. 214. WIJNSMA, R., VERPOORTE , R., HARKES , P.A.A. i 225. ZIMMERMANN, A. 1 HAHLBROCK, K. (1975) BAERHPIM - SVENDSEN , A. ( 1984 ) The production Light-induced changes of enzyme activities in of secondary metabolites in callus cultures of parsley cell suspension cultures. Purification (inchona ledgeriana Moens. Farm. Tujd. voor and some properties of phenylalanine ammonia Belgic, 61:328. lyase. Arch.. Biochem. Bioph vs.. 166:54-62.