الجمهورية العربية السورية جامعة دمشق كلية الهندسة الزراعة قسم وقاية النبات

تقصي انتشار الفطر Phytophthora infestans المسبب لمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا في سوريا ودراسة التنوع الفيزيولوجي و الجزيئي للمسبب

Surveying the distribution of late blight Phytophthora infestans on potato in Syria and Studying the physiological and molecular variability of the pathogen

رسالة أعدت لنيل درجة الماجستير في الهندسة الزراعية

قسم وقاية النبات

إعداد

سليمة نور الدين إبراهيم

بإشراف

األستاذ الدكتور وليد نفاع الدكتور انطونيوس ال داو ود

قسم وقاية النبات- كلية الزراعة دائرة أمراض النبات- هيئة الطاقة الذرية

5102 م – 0341 هـ

1

الملخص

هدفت الدراسة إلى تقصي انتشار الفطر Phytophthors infestans المسبب لمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا، وتعريف وتحديد نمط التزواج للعزالت المتحصل عليها من حقول مصابة باللفحة المتأخرة خالل األعوام 1122 و 1122 و 1122 من خمس مناطق رئيسة لزراعة البطاطا في سورية

)حماه، الغاب، طرطوس، الالذقية ودرعا(. تباينت نسبة اإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة تبعاً للمنطقة الجغرافية التي تزرع فيها البطاطا، حيث وصلت في محافظة حماة إلى 28.73 %، وكانت في منطقة الغاب 21.21 %، بينما لم تتجاوز في محافظة الالذقية 22.22 %، وفي محافظة طرطوس 2.1 %. بينما لم تالحظ أية إصابة في العينات التي أخذت من محافظة درعا.

P. infestans أمكن في هذه الدراسة الحصول على 22 عزلة من الفطر ُصنفت باالعتماد على الصفات المورفولوجية للحوامل البوغية واألبواغ الكونيدية، إضافة إلى بعض العزالت التي لم تؤكد تبعيتها

مورفولوجيا للفطر P. infestans. ثم تم تأكيد التصنبف جزيئياً باستخدام تقانة تفاعل البلمرة التسلسلي PCR باالعتماد على المرئستين )ITS3 و PINF2( المتخصصتين بالكشف عن الفطر P.infestans

لـ 73 عزلة أن 37 عزلة أعطت حزماً (bp)456، وهذا ما يؤكد التصنيف المورفولوجي لهذه العزالت وتبعيتها للنوع P. infestans، بينما لم تع ِط العزالت المشكوك بتصيفها مورفولوجياً أي حزمة.

كما أظهرت جميع عزالت الفطر P. infestans وجود حزمة واحدة )170bp( في اختبار نمط التزاوج باستخدام المرئستين )INF-1 وINF-2( المتخصصتين بالكشف عن نمط التزاوج A1 ، وهذا يشير إلى أن جميع العزالت المتحصل عليها من مناطق مختلفة لزراعة البطاطا في سورية هي من نمط تزاوج واحد )A1(، وعدم وجود أي عزلة من نمط التزاوج اآلخر A2، وهذا ما يفسر عدم أو ندرة مصادفة األبواغ البيضية في الظروف المحلية.

أظهرت نتائج التحليل االحصائي Genstat عند مستوى احتمال 5 % عدم وجود أي تأثير للمبيد Infinto في تثبيط نمو عزالت الفطر P. infestans بينما أدى المبيد Indofil M-45 إلى تثبيط نمو

الفطر بشكل واضح في المخبر، وهذا ما يؤكد ايضاً أن هذه العزالت هي من نمط الت ازوج A1.

2

الفهرس

العنوان الصفحة 5 فهرس األشكال 6 فهرس الجداول 3 المقدمة 17 الدراسة المرجعية 17 مرض اللفحة المتأخرة 14 الموطن األصلي 15 الوضع التصنيفي للفطر P. infestans 15 األعراض الظاهرية لمرض اللفحة المتأخرة 16 الظروف البيئية المالئمة للفطرP. infestans 13 دورة الحياة 13 مرحلة التطفل )التكاثر الالجنسي( 11 مرحلة التكاثر الجنسي 11 مصادر التلقيح و طرائق انتقال وانتشار الفطر P. infestans 32 التوصيف الفيزيولوجي 32 اختبار الحساسية للمبيدات 33 اختبار نمط التزاوج 37 اختبار الشراسة للفطر P. infestans 34 التوصيف الجزيئي 36 األوساط المستخدمة لتنمية الفطر P. infestans 33 أهداف البحث 31 مواد وطرائق البحث 31 مواقع الدراسة وجمع العينات النباتية

3

31 العزل المخبري 31 تحضير أوساط الزرع 31 تعريف المسبب المرضي 31 تأكيد التصنيف جزيئيا ً 72 استخالص الـدنا من الفطر 73 تقدير كمية الحمض النووي دنا )DNA( وتحديد نقاوته

تقانة تفاعل البلمرة التسلسلي PCR على مرئسات متخصصة لتحديد العزالت المصابة 77 P.infestanse 75 تحديد نمط التزاوج باستخدام تفاعل البلمرة التسلسلي PCR 73 اختبار ردود فعل العزالت على بعض المبيدات الفطرية 71 تحضير الوسط المعذي المضاف اليه المبيد الفطري 71 اختبار سمية المبيدات الفطرية على نمو الفطر 71 التحليل اإلحصائي 71 النتائج والمناقشة 42 عزل الفطر 41 تأكيد تصنيف العزالت الفطرية بتقانة تفاعل البلمرة التسلسلي PCR 44 اختبار نمط التزاوج 46 اختبار ردود فعل العزالت على بعض المبيدات الفطرية 52 االستنتاجات و المقترحات 51 المراجع 53 الملخص باللغة االنكليزية

4

فهرس األشكال

رقم الشكل العنوان رقم الصفحة 1 مساحة وانتاج البطاطا في سورية من عام 3217-3224 11 3 أعراض اإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة على أوراق البطاطا 16

دورة حيـــاة مـــرض اللفحـــة المتـــأخرة علـــى البطاطـــا والبنـــدورة المتســـبب عـــن 11 7 الفطر P. infestans

النسبة المئوية للعينات المصابة بمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا تبعـاً 71 4 للمنطقة الجغرافية التي تم جمع العينات منها. الصــــــفات المورفولوجيــــــة للمشــــــيجة والحوامــــــل واألكيــــــاس البوغيــــــة للفطــــــر 42 5 Phytophthora . sp توضــع الحــزم بحجــم pb 456 لـــ 12 عزلــة مــن الفطرر P. infestans 43 6 باختبار PCR باستخدام مرئستين متخصصتين تفاعـل البلمـرة التسلسـلي PCR باسـتخدام المرئسـتين ITS4 و PERY2 47 3 المتخصصتين في الكشف عن النوع P. erythroseptica عــدد عـــزالت الفطـــر P. infestans نتيجـــة اختبـــار PCR باســـتخدام 47 1 مرئستين متخصصتين )ITS3 و PINF2( توضع الحزم بحجـم pb 170 لعـزالت مـن الفطـر P. infestans باختبـار 45 1 PCR باستخدام مرئستين متخصصتين بنمط التزاوج A1 12 تأثير المبيد إندوفيل أم-23 على نمو عزالت الفطر P. infestans 41

5

فهرس الجداول

الجدول العنوان رقم الصفحة 31 1 مناطق جمع العينات، وتاريخ الجمع وعدد العينات 72 3 عدد العزالت المستخدمة في الدراسة الجزيئية وأماكن الحصول عليها 71 7 المحاليل المستخدمة في التوصيف الجزيئي 77 4 التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تفاعل البلمرة التسلسلي PCR للكشف عن النوع P. infestans 74 5 التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تفاعل البلمرة التسلسلي PCR للكشف عن النوع P. erythroseptica كشاهد 74 6 مواد تفاعل التضخيم PCR المستخدم للكشف عن النوع P. infestans

75 3 البرنامج الزمني لتفاعل البلمرة التسلسلي PCR

75 1 التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تحديد نمط التزاوج .P infestans 76 1 مـواد تفاعـل التضـخيم PCR المسـتخدم للكشـف عـن نمـط التـزاوج عنـد الفطـر .P infestans 76 12 البرنـــامج الزمنـــي لتفاعـــل البلمـــرة التسلســـلي PCR لتحديـــد نمـــط التـــزاوج .P infestans 73 11 العزالت المستخدمة في اختبار الحساسية تجاه بعض المبيدات الفطرية 71 13 تراكيز المبيدات المستخدمة 42 17 النســـبة المئويـــة للعينـــات المصـــابة بمـــرض اللفحـــة المتـــأخرة علـــى البطاطـــا تبعـــاً للمنطقة الجغرافية التي تم جمع العينات منها 41 14 توزع العزالت التي اثبتت تبعبتها جزيئياً للفطر P. infestans باستخدام المرئستين ITS3 و PINF2 43 15 تأثير المبيد إندوفيل أم-23 في نمو الفطر P.infestans 43 16 قيم L.S.D عند مستوى حرية 5 %

6

المقدمـــــة

تعد البطاطا من أهم محاصيل الخضر في الوطن العربي وفي عدد كبير من دول العالم، وهي تتبع

الفصيلة الباذنجانية Solanaceae التي تضم نحو 01 جنساً وحوالي 1111 نوعاً، وتسمى نسبة إلى 1522 Solanum الجنس الذي ُيعد أهم وأكبر أجناس الفصيلة الباذنجانية، حيث يحتوي على أكثر من نوعاً. والبطاطا .Solanum tubersosum L نبات حولي عشبي يصل طوله إلى 122سم. يزرع في جميع أنحاء العالم في المناطق الباردة والمعتدلة وشبه اإلستوائية )الصباغ، 1115(، ويحتل المرتبة الرابعة كأهم محصول غذائي في العالم بعد الذرة والقمح واألرز.

التصنيف العلمي للبطاطا

Kingdom: Plantae

(unranked): Asterids

Order: Solanales

Family: Solanaceae

Genus: Solanum

Species: S. tuberosum L. Linnaeus. 1753

الموطن األصلي و موعد الزراعة : البطاطا عالمية اإلنتشار والتوزع، والموطن األصلي لها هو منطقة أنداس في البيرو وبوليفيا حيث استخدمت البطاطا من قبل شعوب اإلنكاس INCAS منذ حوالي 2000 سنة كسلعة رئيسة في التغذية، وقد دلت االكتشافات األثرية على استخدام البطاطا منذ 800 سنة سابقة على األقل.

زرعت البطاطا أوالً في جنوب البيرو وأقصى شمالي غربي بوليفيا بين 5222-1222 قبل الميالد، والصين في عام 1700، واليابان عام 1766، والهند عام 1610.

7

أدخلت البطاطا إلى إسبانيا في عام 1570، ونقلت بواسطة البحارة اإلسبان إلى أوروبا، ثم أدخلت إلى مناطق أخرى من العالم ، ويعود الفضل للمهاجرين االسكتلنديين واإليرلنديين بددخال البطاطا إلى أمريكا الشمالية عام 1700 )فضول ونفاع، 3226(. ومنذ ذلك الحين انتشرت زراعتها حول العالم وأصبحت المحصول الرئيسي في عدة بلدان حيث تعد المحصول األساسي في أوروبا وبشكل خاص أوروبا الشرقية والوسطى، ولكن التوسع األكثر سرعة حدث في جنوب وشرق أسيا، وقد تصدرت الصين منذ عام 3223 إنتاج البطاطا في العالم، حيث تنتج الصين والهند ثلث إنتاج البطاطا في العالم، وهكذا انتشر انتاج البطاطا من البلدان األغنى إلى المناطق ذات الدخل المنخفض في العالم.

المساحة المزروعة و اإلنتاجية عالمياً و محلياً : ارتفع إنتاج البطاطا العالمي من 260 مليون طنـا ً فـي عـام 1999 إلر 320 مليـون طنـاً عـام 3223 )Howard, 2008(. حيث بلغت المساحة المزروعة عام )2013( 32000 هكتا اًر وبدنتاجية 650.000 طنــا ً )FAO, 2008(، كمــا بلــ إنتــاج البطاطــا عــام )3217( 761 مليــون طنــاً، حيــث إن ثلثــي اإلنتــاج العالمي من البطاطا يستخدم لإلستهالك البشري والباقي يستخدم كعلف للحيوانات أو إلنتاج النشاء. تحتل البطاطا المرتبة األولى من حيث المساحة المزروعة واإلنتاجية، إذ تزيد المساحة المزروعـة بهـا على 12 مليون هكتار أي ما يعادل 22% من إجمالي المساحة المزروعة بالخضر الدرنية في العالم .)FAO, 3212(

األهمية الغذائية و الصحية

البطاطا العادية من محاصيل الخضار الرئيسة في سورية نظ اًر لقيمتها الغذائية الجيدة وتنوع استخدامها الحتواء درناتها مكونات وعناصر غذائية ضرورية لجسم اإلنسان، فهي تحتوي على 12 % ماء، و 3% بروتين و11% نشاء، وهي غنية باألمالح المعدنية )Fe-P-K(، فقد بلغت كمية

البوتاسيوم(of DV %18) 620 مل ، كما يعد مصد اًر لفيتامين C، ففي درنة بطاطا متوسطة الحجم )152 غ( تحتوي مع قشرتها على 18 مل فيتامين C )45 % من الحاجة اليومية(، كما بلغت نسبته في

الدرنات المقلوعة حديثاً 36 مل في 122غ، في حين تنخفض نسبته في الدرنات المخزنة إلى 32 مل في 122غ، كما تحتوي أيضاً على كميات قليلة من الفيتامينات )A,B(،وتحتوي مركبات نباتية

8

مثل carotenoids ومركبات فينولية طبيعية مثل حمض كلوروجينيك الذي يشكل حتى 01 % من الفينوالت الطبيعية، كما وجد أن البطاطا تحتوي على حمض crypto- 4-O-caffeoylquinic) (chlorogenic acid وحمض neo-chlorogenic acid( 5-O- caffeoylquinic( و3,4- dicaffeoylquinic وحمض 3,5-dicaffeoylquinic. كما تعتبر البطاطا غنية بالكربوهيدرات، والشكل السائد من الكربوهيدرات هو النشاء المقاوم لعمليات

الهضم باإلنزيمات الموجودة في المعدة والمعي الدقيق ويصل إلى األمعاء الغليظة سليماً، ولهذا النشاء تأثيرات فيزيولوجية مماثلة وفوائد صحية كاأللياف، كما أنه يمنح الحماية ضد أمراض سرطان القولون، ويخفض كوليسترول البالسما، وتزيد تراكيز ثالثي جليسريد الشبع وامكانية تخفيض الدهن المخزن. وزيادة كمية النشاء المقاوم في البطاطا تعتمد على طرائق التحضير، فتبريد البطاطا بعد طبخها يزيد من كمية النشاء المقاوم بشكل ملحوظ، حيث تحتوي البطاطا المطبوخة على 3% نشاء مقاوم من أصل كمية النشاء الكلي، بينما يزيد إلى 17% عند التبريد )Englyst et al., 1992). تؤثر طريقة الخزن والطبخ بشكل كبير في وفرة المادة المغذية في البطاطا، وتشير الدراسات إلى أن البطاطا ترفع سكر الدم لذا تستثنى في أغلب األحيان من حمية األفراد الذين يعانون من ارتفاع السكر في الدم (Fernandes et al., 2005).

استعماالت البطاطا تستخدم البطاطا في التغذية بطرائق وأشكال مختلفة، إذ يستخدم اإلنسان درنات البطاطا العادية في غذائه بعد سلقها أوقليها أو طبخها مع الخضار األخرى، كما ويصنع منها العديد من المنتجات الغذائية

مثل النشاء الرقائق والمكعبات المجففة )الصباغ، 1115(. وتعتبر البطاطا من أكثر الخضار استعماالً، وتستهلك كمية كبيرة منها كغذاء لإلنسان وللماشية، أو في الصناعة )أحمد عبد المنعم ، 1111(.

المركبات السامة في البطاطا

تحتوي البطاطا على مركبات سامة glycoalkaloids وأكثرها شيوعاً solanine و chaconine، وتتركز هذه المركبات السامة في األو ارق والسوق والثمار، وتلعب دو اًر في حماية النبات. كما وجد أن أعلى تركيز من الـ glycoalkaloids يكون في األزهار وأقل تركيز في قشرة درنة البطاطا.

9

تحتوي البطاطا العادية على نسبة 13 – 32 مل / ك ، بينما في الدرنات المخضرة تكون النسبة من هذه المركبات 352 – 312 مل / ك ، وفي البشرة الخضراء تصل النسبة 1522 – 3322 مل / ك .

يلعب التعرض للضوء دو اًر مهماً في زيادة نسبة هذه المركبات السامة في محتوى الدرنة، حيث تسبب هذه المركبات السامة لالنسان صداعا ً واسهاال ً وتشنجات وغيبوبة وموت في الحاالت الخطيرة. ولكن حدوث التسمم بالبطاطا ا ًنادر ألن تعرض الدرنة لالضاءة يؤدي إلى اخضرارها، وهذا مؤشر على أنها أصبحت سامة، ويجب استبعادها وعدم استهالكها. يشير برنامج علم السموم الوطني األمريكي أن متوسط استهالك الفرد األمريكي من سموم السوالنين

إلى 21.3 مل يومياً أثناء استهالكه للبطاطا، وقد حدثت العديد من حاالت التسمم نتيجة استهالك بطاطا خضراء أو شرب شاي من أوراق البطاطا.

اإل نتاج والمساحة المزروعة بالبطاطا في سورية تعد البطاطا في سورية من أهم محاصيل الخضر المزروعة، حيث تستخدم في مجالي اإلستهالك

الطازج والتصنيع، ويحتل محصول البطاطا مرك اًز متقدماً من بين المحاصيل األخرى كونه من المحاصيل المتحملة للجفاف، ويأتي في قائمة محاصيل الخضر المتوسطة التحمل للملوحة )Munn, 2000(، حيث تزيد المساحة المزروعة به عن 22.228 ألف هكتار موزعة على ثالث عروات، إذ تشغل العروة الربيعة

ما يقارب 32%، تليها العروة الخريفية بنحو 21%، وأخي اًر العروة الصيفية 8% )المجموعة اإلحصائية الزراعية السنوية، 1121(. تحتل المحافظات ادلب وحلب وحماه المراتب الألولى من حيث اإلنتاجية الغذائية والمساحة ويستأثر محصول البطاطا باهتمام عالمي كبير كونه أكثر المحاصيل الغذائية غنى بالطاقة.

11

الشكل 0:مساحة وانتاج البطاطا في سورية من عام 3224-3217 )المجموعة االحصائية الزراعية السنوية 3217(

زراعة البطاطا في سورية تزرع البطاطا في القطر العربي السوري في ثالث عروات رئيسة هي: - العروة الربيعية: وتتم الزراعة خالل الفترة الواقعة بين منتصف كانون الثاني إلى منتصف شباط وهو الموعد األمثل للزراعة في محافظات الالذقية وطرطوس وحمص ومنطقة القصير وحماة )منطقة الغاب( وحلب ودير الزور والحسكة ودرعا. - العروة الصيفية: تزرع البطاطا خالل الفترة الواقعة بين أذار ونيسان )في حاالت نادرة حتى آيار( وهو الموعد األمثل للزراعة في المناطق الباردة أو التي تتميز على األقل بنهار حار وليل يميل إلى البرودة مثل منطقة القلمون )دمشق( ومنطقة القريتين )حمص( ومنطقة السلمية )حماه( والمناطق الجبلية المرتفعة كمنطقتي النبك والزبداني )ريف دمشق( وجبل الحلو وتلكلخ )حمص ( ومنطقة مصياف )حماه(، وتنتشر زراعة العروة الصيفية في دوما والغوطتين والكسوة والتل وقطنا من محافظة ريف دمشق.

11

- العروة الخريفية: وتزرع فيها البطاطا خالل الفترة من منتصف تموز حتى منتصف آب، وهو الموعد األمثل للزراعة كموسم ثاني في المناطق الدافئة المالئمة للزراعة الربيعية )الصباغ، .)1115

تصاب البطاطا بالعديد من األمراض الفطرية التي تسبب خسائر اقتصادية هامة وكبيرة ومن أهمها مرض النقطة السوداء المتسبب عن الفطر Colletotrichum coccodes، ومرض العفن الجاف المتسبب عن أنواع من الجنس Fusarium ، حيث يعتبر هذان المرضان من األمراض الفطرية المهمة التي تصيب درنات البطاطا أثناء التخزين وتسبب خسائر كبيرة قد تصل إلى 21 % من اإلنتاج.

كما وتصاب البطاطا بالعديد من األمراض المهمة األخرى، كمرض اللفحة المبكرة الذي يسببه الفطر Alternaria solani، ومرض الذبول الفرتيسليومي المتسبب عن الفطر Verticillium dahlia ومرض القشرة السوداء المتسبب عن الفطر Vander Zaag,1997) Rhizoctonia solani).

وعلى الرغم من الخسائر االقتصادية الكبيرة التي تسببها األمراض المذكورة أعاله يبقى مرض اللفحة المتأخرة late blight من أكثر أمراض البطاطا أهمية في سورية، وهو موضوع الدراسة الحالية.

12

الدراسة المرجعية

مرض اللفحة المتأخرة:

سجل المرضPhytophthora infestans )Mont.)De Bary ألول مرة على البطاطا 1147 في.Philadelphia New York ويتبع العامل الممرض المسبب لهذا المرض للجنس Phytophthora الذي ينتمي إلى الفصيلة Pythiaceae التي تحوي على عوامل ممرضة إجبارية وغير

إجبارية التطفل، ويضم هذا الجنس أنواعاً مختلفة تسبب لفحات مختلفة على البطاطا والقرعيات والفليلفة والبندورة وتسبب عفن الساق والجذور )Heffer et al., 2002(. و يشمل هذا الجنس أكثر من 65 نوعا ً جميعها ممرضة للنبات ولها مجال واسع من ئنائيات الفلقة (Meirinho et al., 2010).

يعد هذا المرض األكثر أهمية من حيث الخسائر التي يلحقها بمحصول البطاطا في العالم، حيث

لعب دو ا ًر هاما ً في مجاعة البطاطا المشهورة في ايرلندة (1846 - 1845( عندما دخل إلى أور وبا في القرن التاسع عشر متسبباً بموت أكثر من مليون شخصاً وهجرة أكثر من مليونين من السكان إلى مناطق أخرى من العالم، ومنذ ذلك الحين أصبح المرض مثبت في كل البلدان التي تزرع فيها البطاطا (Goodwin et al., 1994; Corbiere et al., 2010(

كما قيمت النتيجة المباشرة الجتياح هذا المرض لقارة أور وبا وخاصة في ايرلندا بأن حوالي 8 مليون من السكان إما تعرضوا للمجاعة أو هاجروا، ولذلك فقد اعتبر مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا من أهم األمراض في التاريخ )Paulr et al., 2001(.

درس هذا المرض من قبل العالم باستور، وكانت له الريادة في دراسة النظرية الميكروبية لهذا المرض، وأهمية الظروف الجوية في انتشاره على البطاطا، بينما نسب البعض هذا المرض إلى التربة

السيئة أو إلى الشيطان )Bourke, 1993(.

سبب هذا المرض خسائر اقتصادية هامة في مناطق أخرى من العالم كما ذكر Shock وآخرون

)1111(. حيث بلغت الخسارة االقتصادية عالمياً لهذا المرض 3 بليون ا ًدوالر سنوياً، الجزء الرئيسي منها في الدول النامية، وقد بلغت تكلفة المكافحة الكيميائية 1.8 بليون ا ًدوالر تصرف سنويا ُ، 600 مليون دوالر في الدول النامية لوحدها .(Baker, 2002). أما في الهند، فقد سبب االنتشار الكبير لهذا المرض

13

خسائر جسيمة وصلت إلى 65 % فاقداً في المحصول)Hussain, 2013(. كما أدى هذا المرض في التسعينات من القرن الماضي وبشكل خاص في شرق أور وبا إلى حدوث خسائر كبيرة في الغلة .)Schiermeier, 2001; Garelik, 2002(

في بولندا تسسبب اللفحة المتأخرة خسارة هامة قدرت بحوالي Piekarczyk and abilas), % 33

1986(. أما في رومانيا الخسارة قدرت من قبل Pietkiewicz )1111( كانت 42 % في التجارب التي أجريت عام 2071 على الصنف الحساس Bintje بينما على االصناف األخرى تقدر 21-2 %.

وقد أحدث هذا المرض ا اضر اًر كبي رة على البندورة في البرزايل، كما أنه كان عامال ً محددا ً لزراعة و إنتاج البطاطا في الجزائر، فقد أدى إلى فشل زراعة البطاطا والبندورة في غرب وفي وسط الجزائر حيث تعتبر هذه المناطق مناطق رئيسة إلنتاج البطاطا في الجزائر )Corbiere et al., 2010(.

كما يصيب هذا الفطر باإلضافة للبطاطا والبندورة أنواعا ً نباتية أخرى مثل الفليفلة والبطيخ والقرعيات والحمضيات والفريز والكستناء ) ,.Hardy et al., 2001; Rizzo et al ., 2002 ; Brasier et al Islam et al.,2005 ; 2005 (. وقد ازدادت أهمية المرض في سورية خالل السنوات األخيرة بعد زيادة مساحات البطاطا الخريفية، وكذلك بسبب التغيرات التي طرأت على المناخ، كما أن التوسع في زراعة البندورة المحمية والخريفية زادت من خطر اإلصابة، ويستطيع الفطر أن يحافظ على حياته لفترة زمنية طويلة في بعض المناطق في العالم على شكل أبواغ بيضية قد تصل الى عدة سنين في الظروف غير المناسبة.

الموطن األصلي للمرض

يعتبر الموطن األصلي لهذا المرض وسط المكسيك Goodwinet ( Toluca Valley of Mexic al., 1992.; Haverkort et al.,2009( حيث كانت مجتمعات فطر P. infestans في وسط المكسيك عالية التنوع، وهذا يشير إلى أن منشأ هذا المرض هو من هذه المنطقة، ومن المحتمل أنه هاجر إلى مناطق أخرى في العالم بواسطة األبواغ المحمولة بالتيارات الهوائية أو من البطاطا أو البندورة المصابة (Zellner, 2004) كما وجد أن الساللة )US-1( هاجرت من المكسيك الى أوروبا عبر شمال أمريكا في أوائل عام Keil et al .,2010( 1840(. لكن الدراسات الجديدة اعترضت على تلك النظرية

14

وبينت أن األنداس هي الموطن األصلي )Montarry et al .,2010(. افترض بيركلي أن تلك األوبئة

انتشرت من الدرنات المستوردة من أمريكا الجنوبية )Hu et al., 2012( حيث لعبت الهجرة دو اًر مهماً في االنتشار ووصلت الوبائية بهذا المرض إلى أمريكا الشمالية وروسيا وأوروبا نتيجة لتطور المقاومة للمبيدات الفطرية المستخدمة لمكافحتها مثل phenylamide وحدوث انتشار واسع ألنماط وراثية جديدة .)Ristaino, 2002(

الوضع التصنيفي للفطر P. infestans

تعود تسمية الفطر Phytophthora infestans إلى اللغة اليونانية حيث Phyto تعني نبات و phthora مدمر و infestans معدي. - Domain:Eukarya - Kingdom: Stramenopiles (chromista) -Phylum: Oomycota -Order: Peronosporales - Family: Peronosporaceae -Genus: Phytophthora Phytophthora infestans ) Mont. de Bary)

عن )Thines and kamuon,2010(

أعراض اإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة

تظهر أعراض اإلصابة على هيئة مساحات ميتة على أطراف الوريقات وفي قواعدها، ثم تتسع لتعم سطح الوريقة بكاملها، و يتحول لونها إلى األسود )الشكل 3(، وفي وجود الرطوبة يظهر على السطح السفلي زغب أبيض أو رمادي قرب حواف البقع وهي عبارة عن الحوامل البوغية للفطر، أما في الطقس الجاف تبقى البقع صغيرة الحجم ومحدودة، وعلى السيقان تظهر بقع مشابهة لتلك الموجودة على األوراق،

وتمتد اإلصابة من قمة النبات إلى أسفله، وتمتد البقع حول الساق التي تجف وتتشقق طولياً وتصبح سهلة

15

الكسر. أما على الدرنات فتظهر اإلصابة على شكل بقع داكنة غائرة على سطح الدرنة، واذا كشطت الدرنة يظهر عفن جاف لونه بني تحت سطح البشرة بسمك 1 – 3 سم )نفاع، 3213(.

الشكل 3: أعراض اإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة على أوراق البطاطا

الظروف البيئية المالئمة النتشار الفطرP. infestans

ينتشر المرض بتوفر درجات حرارة مثلى تتراوح بين 16 – 31 ˚م ورطوبة جوية بين 15 – 122 % كما اأشار Erwin, and Ribeiro )1116( حيث وجد أن المناخ البارد والرطب في شمال شرق

أ ور وبا كان مناسبا ً جدا ً لتطور وانتشار المرض، وهو مرض استوطن في ايرلندة ألكثر من 150 سنة، حيث إن غياب ظهور التكاثر الجنسي في المناطق الحارة والباردة ينسب إلى غياب نمط التزاوج A2 في تلك المناطق.

كما وجد أن تعريض مشيجة الفطر لدرجة حرارة بين – 12 و - 32 ˚م لمدة تزيد عن ساعة أدى الى موتها، بينما استطاعت الحفاظ على حيويتها عند تعريضها لدرجة حرارة تتراوح بين -7 و -5 ˚م لمدة 34 ساعة.

16

دورة الحياة:

يعتبر الفطر P. infestans متخالف المشائج Heterothallic أي يتطلب نمطين مختلفين فيزيولوجياً لحدوث التكاثر الجنسي A1 و Jmour and Hamada., 2006) A2 (. و hemibiotrophic أي يستطيع أن يقتل مضيفاته ويتغذى على النسيج الميت (Thaler et al.,2004) وتمر دورة حياة الفطر بمرحلتين: مرحلة التطفل ومرحلة السكون )الشكل 7 (.

1- مرحلة التكاثر الالجنسي:

ينمو الفطر متطفالً داخل األنسجة النباتية حيث تكون مشيجة الفطر بين خلوية Intercellular، ويحصل الفطر على احتياجاته الغذائية بدرسال ممصات Haustoria داخل الخاليا، ويتم التكاثر الالجنسي بتشكيل أبواغ اسبورانجية ليمونية الشكل ومحمولة على حوامل متفرعة تخرج من ثغور البشرة، ولذلك تشاهد على السطح السفلي ألوراق النبات المصاب. ويتم انبات األكياس البوغية

2- انبات غير مباشر إذ يتحول البوغ الكونيدي إلى كيس بوغي يحتوي على العديد من األبواغ السابحة

ويحدث هذا االنبات بوجود رطوبة عالية ودرجات حرارة منخفضة نسبياً )1-13 م°( تنتشر األبواغ

السابحة وتنبت مباشرة إلى مشيجة، واذا ما صادفت العائل المناسب فدن العدوى يمكن أن تحصل خالل ساعتين، وتتشكل األكياس البوغية خالل 7-5 أيام. و األبواغ السابحة قادرة على تكرار مراحل السباحة والتحوصل عدة مرات.

1- انبات مباشر إذ يعطي البوغ أنبوبة إنبات تنمو لتكوين المشيجة، ويحدث ذلك عادة عندما يكون

الوسط أقل رطوبة ودرجات الح اررة مرتفعة نسبياً )أعلى من 11 م°(.

يقضي الفطر فصل الشتاء على شكل مشيجة في الدرنات المصابة، والتي تصبح مصد اًر لإلصابة إذا استعملت للزراعة من جديد، أو يشتي في التربة على أبواغ بيضية Oospores موجودة في المخلفات النباتية أو حرة في التربة في المناطق التي تتشكل فيها األبواغ البيضية، وتمتاز هذه األبواغ بجدار سميك ومقاوم للظروف غير المناسبة. وعندما تصبح درجة حرارة التربة أكثر من 6 ˚م يمكن لألبواغ البيضية أن

تنبت إما مباشرة لتعطي مشيجة جديدة، أو أن يكون اإلنبات غير كما ذكر سابقاً.

17

وفي حال كانت اإلصابة على األوراق يخرج من الثغور حوامل بوغية تحمل عدداً من األكياس البوغية التي يمكن أن يصل عددها في البقعة الواحدة على الورقة إلى 900,000 كيسا ً بوغياً، وكل منها قادر

على أن يحرر العديد من األبواغ السابحة. واذا توفرت الظروف المناسبة يمكن للبوغ السابح أن يحدث العدوى من جديد على الورقة، أو أن يسقط على التربة ويصيب الدرنات.

2 - مرحلة التكاثر الجنسي:

يتكاثر الفطر جنسياً بنكوين األبواغ البيضية Oospores، وقد عرفت ألول مرة في المكسيك عام 1151 .)Beagle, 2006(

يمر البوغ البيضي بفترة سكون من الزمن قد تصل إلى عدة أسابيع أو أشهر، وهو قادر على أن يحافظ على حياته لفترة زمنية طويلة قد تصل إلى عدة سنين في الظروف غير المناسبة، ولكن عندما تتوفر له الظروف المالئمة ينمو بتكوين حامل ينتهي بكيس تتشكل بداخله األبواغ السابحة.

يتطلب حدوث العدوى توفر رطوبة كافية لتحرير األبواغ السابحة وتتشكل األكياس البوغية خالل 7 – 5 أيام من حدوث العدوى في الطقس البارد والرطب )Fry et al.,1993(.

18

مصادر االلقاح و طرائق انتقال وانتشار الفطر P. infestans

يلعب تواجد الدرنات المصابة على أكوام النفايات دو اًر مهماً كمصدر للعدوى في الموسم التالي بواسطة الريح، كما أن زراعة الدرنات المصابة في تربة ذات رطوبة عالية تشجع الفطر على إنتاج األكياس البوغية على الدرنات المصابة، والتي تنتشر بواسطة ماء التربة وتصيب درنات ونباتات مجاورة مؤدية إلى لفحة مبكرة للساق )Keil et al ., 2010(. كما وتلعب األبواغ البيضية وبذار الدرنات

والنفايات والعوائل العشبية القريبة من البطاطا ودرنات البطاطا المصابة دو اًر مهماً في حدوث المرض في بداية الموسم (Turkensteen et al., 2000).

الشكل 7: دورة حياة مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا والبندورة المتسبب عن الفطر )Agrios,.(2005)P. infestans Heinrich Anton de Bary (1861)

19

التوصيف الفيزيولوجي والمورفولوجي لعزالت الفطر P. infestans

يمكن تصنيف عزالت الفطر P. infestans الذي يصيب البطاطا باالعتماد على الصفات الشكلية والفيزيولوجية باإلضافة إلى اختبارات الشراسة واختبارات الحساسية للمبيدات، وكذلك باستخدام تقانات البيولوجيا الجزيئية.

اختبار الحساسية للمبيدات:

وجد في أمريكا الشمالية وروسيا وأوروبا أن هناك تناسب بين وبائية المرض وتطور مقاومة مجتمعات الممرض للمبيدات الفطرية، وظهور أنماط وراثية جديدة أكثر شراسة (Beagle, 2006(.

وقد وجد تباين كبير في مقاومة العزالت المختلفة للمبيدات الفطرية، وقد استخدمت المبيدات الفطرية كأحد االختبارات الممكنة لدراسة التباين الفيزيولوجي بين العزالت للعديد من الفطريات، وفي الكاميرون تم جمع 233 عزلة من الفطر P. infestans : 53 عزلة من الباذنجانيات العنبية، و 104 عزلة من البطاطا، و 76 عزلة من البندورة، وتم اختبار حساسيتها تجاه المبيد Metalaxyl عند درجة حرارة 18°م، وقد تبين أن 49 % من العزالت كانت مقاومة للمبيد )Fontem et al.,2004(.

كما تم اختبار 13 عزلة في دراسة أخرى في أيسالندا على وسط الشيلم المضاف إليه 5 مل / ل Metalaxyl، وقد تبين أن عزلة واحدة فقط كانت مقاومة للمبيد المختبر، و 12 عزلة كانت متوسطة المقاومة (Lafsson and Hermansen .2001 )، كما استخدمت العديد من المبيدات األخرى لدراسة التباين الفيزيولوجي بين عزالت الفطر فيتوفثورا في الكثير من الدراسات ) ;Harrison et al.,1990 .)Zhang et al., 2007; Ning et al., 2008

كان هناك توافق مابين ظهور عزالت مقاومة للمبيدات واكتشاف النمط الجنسي A2 للفطر في أغلب مناطق أوروبا وفي بلدان أخرى من العالم، مما يشير لدور التكاثر الجنسي في ظهور صفة المقاومة عند بعض األفراد الناتجة )Cohen and Gisi, 1996(.

كما تم اختبار حساسية 85 عزلة إزاء المبيد ميتاالكسيل وذلك على تركيزين 5 ميكروغرام / مل و 172 ميكروغرام / مل، وقد أظهرت النتائج تباين كبير في حساسية هذه العزالت، فقد كان 20 % منها

حساساً، و 2 % حساسة إلى متوسطة الحساسية، و 39 % متوسطة الحساسية، و 35 % متوسطة

21

المقاومة، بينما كان 4 % منها فقط مقاوماً. كما تبين أن العزالت الحساسة إلى متوسطة الحساسية كانت من النمط الجنسي A1، بينما العزالت المتوسطة المقاومة الى المقاومة كانت من النمط الجنسي A2 .)Lafsson and Hermansen., 2001(

كما تم استخدام المبيد السابق بأربعة تراكيز )mg/L 100 ,50 ,15 ,0( على 11 عزلة من الهند وكانت جميعها حساسة (Chimote et al., 2010(.

استخدم المبيد Mefenoxam على 79 عزلة برازيلية جمعت خالل أعوام 2007-2006، فكانت نسبة العزالت الحساسة 50.6%، ونسبة العزالت المقاومة 57.1 % لعام 2006، بينما بلغت نسبة العزالت المقاومة 40 % في عام De Miranda et al., 2010) 3223(.

كما استخدمت طريقة القرص الطافي التي وصفت من قبل (Beninal et al., 2009( الختبار حساسية العزالت للمبيدات. وذلك بأخذ أقراص وريقات لصنف نبات البطاطا حساس بقطر )15( مم باستعمال ألة خاصة بعمر )5( أسابيع من نباتات تنمو في البيوت الزجاجية وذلك بوضع وجه علوي للوريقة باتجاه األسفل في أطباق بترية تحتوي المبيد المراد اختباره بشكل محلول سائل باالضافة إلى طبق بتري يحوي ماء مقطر كشاهد ثم يتم وضع )32( ميكرون من معلق البوغي لفطرP.infestans في مركز كل وريقة عائمة في األطباق البترية الحاوية على الماء ومحلول المبيد ثم حضنت الوريقات الملقحة لمدة )3( أيام على درجة حرارة )15- 11(°° ثم فحصت األكياس البوغية المنتجة على قرص الورقة الطافي ثم فحصت تحت المجهر. اعتبرت العزالت التي أنتجت أبواغ على األقراص العائمة في طبق يحوي مبيد سائل بتركيز 122 مل / ل مقاومة والعزالت التي أنتجت أبواغ على األقراص العائمة في طبق يحوي مبيد سائل بتركيز 12 مل / ل متوسطة والتي تبوغت على الماء فقط حساسة.

في سورية استخدم العديد من المبيدات الفطرية: Azoxystrobin ،Mancozeb ،Metalaxyl-M ،Chlorothalonil في مكافحة مرض اللفحة المتأخرة المتسبب عن الفطر P.infestans على صنف البطاطا سبونتا في حمص خالل موسمي 2008 - 2009، وقد أظهرت النتائج أن استخدام خليط المبيدين )Mancozeb +Metalaxyl-M( أعطى أعلى كفاءة في مكافحة المرض خالل موسمي الدراسة مقارنة بباقي المعامالت، إذ كانت النسبة المئوية للكفاءة 74.32% و 57.24 % للموسمين 2008 - 2009 على التوالي. بينما أعطى المبيد Mancozeb أقل كفاءة في

مكافحة المرض خالل موسمي الدراسة إذ كانت النسبة المئوية للكفاءة 42 % و 22.03 %، لذلك رت بت

21

Mancozeb < : المبيدات الفطرية المختبرة وفقًا لفاعليتها في مكافحة المرض تنازلًيا كاآلتي Azoxystrobin < Chlorothalonil .Mancozeb + Metalaxyl-M )الناصر، 3213(.

اختبار نمط التزاوج

يمكن تصنيف عزالت الفطر P. infestans الذي يصيب البطاطا الى نمطي تزاوج A1 و A2، ومن الشائع تنمية العزالت على المستنبتات بجانب بعضها البعض لتحديد الطبيعة الجنسية لها من خالل

قدرتها على الت ازوج وانتاج األبواغ البيضية.

وقد وجد مثالً من خالل تنمية عزالت مختلفة من الفطر P. infestans على وسط مغذي في شبه جزيرة Nagasaki أن هناك سيادة للعزالت من النمط الوراثي A2، بينما كانت العزالت التابعة للنمط

الوراثي A1 قليلة نسبيا ً (Mitsuru et al., 2002 (.

وقد استخدمت أحياناً العزلة A2 كعزلة قياسية على وسط مغذي حيث وضعت العزلة المختبرة على حافة طبق البتري والعزلة القياسية A2 على الجانب اآلخر، وحضنت األطباق عند درجة حرارة 15 – 11 ˚م في الظالم لعشرة أيام أو حتى تشكل األبواغ البيضية، وقد بلغت عزالت الفطر P. infestans 107 عزلة من نمط التزاوج A1 و 92 عزلة من نمط التزاوج A2، ولم يتم تحديد أية عزلة ذاتية الخصوبة )Mazakoval et al., 2006(

أجري االختبار السابق في كولومبيا و Antioquia باستخدام نمط التزاوج A1 كعزلة قياسية .P infestans خالل )1994-2000( حيث وجد أن كل العزالت كانت من نمط تزاوج A1 لعدم تشكل األبواغ البيضية (Ramelli et al., 2009(.

أجري اختبار التزاوج بهدف تحديد نمط التزاوج في عدة مناطق في العالم، ففي شمال نيكارغوا وجد أن كل مجتمعات الفطر P. infestans كانت من نمط التزاوج Blandón-Díaz, 2011( A2(. أما في مناطق انتاج البطاطا الرئيسة في فرنسا، فقد ت اعتبرالعزالت التي شكلت األبواغ البيضية مع العزلة التي تملك نمط تزاوج A1 عزالت ذات نمط تزاوج A2. أما العزالت التي شكلت األبواغ البيضية مع العزلة التي تملك نمط تزاوج A2 عزالت من نمط التزاوج Montarry et al., 2010( A1(.

22

لوحظ نمط التزواج A1 و نمط التزاوج A2 في العزالت التي جمعت من مناطق تغطي معظم أجزاء الهند خالل األعوام من 1113 إلى 3226 بنسبة 30 % نمط تزاوج A1 و40 % نمط تزاوج A2 .)Chimote et al.,2010(

كما هيمن نمط التزاوج A2 في )Mexicok-Del Fuerte- Valley, Sinaloa( في منطقتين، المنطقة األولى مزروعة بالبطاطا والبندورة، والمنطقة الثانية زرعت بالبندورة فقط خالل عامي 1114 و 1115، بينما وجد نمط التزاوج A1 فقط خالل عامي 1116 و 1113، أما ظهور كال نمطي التزاوج

كان محصو ا ًر بحقول قليلة جداً في المنطقة األولى (Jaime-Garcia et al., 2000) وقد وجد نمط التزاوج A2 في العزالت التي جمعت من أوراق وثمار وس وق البندورة في البرازيل .)De Miranda et al., 2010(

اختبار الشراسة للفطر P. infestans

ظهرت أنماط وراثية عديدة للفطر P. infestans حيث ميز أوالً في السبعينات النمط الو ارثي US 1- في Gevens and Seidl, 2013) Wisconsin). وقد استخدم اختبار بصمة األصابع الذي يستخدم لمعرفة التتابع التكراري للقواعد اآلزوتية في صبغي ساللة الفطر قيد الدراسة، ومقارنتها مع السالالت األخرى من ناحية تتابع القواعد اآلزوتية وتستخدم هذه الطريقة في دراسة السالالت الممرضة لالنسان، وكذلك الفطريات الطبية. ولللتأكد من انتماء النمط الوراثي السابق للفطر P. infestans الذي

بقي سائدا ً حتى العقد األخير من القرن العشرين ,.Fry and Goodwin, 1997b; Corbiere et al .)2010; Goodwin, 1994)

أما في بداية الثمانينات وجد النمط الوراثي BR‑1 اضافة للنمط US-1 في البرازيل، حيث اعتبرت عزالت النمط الوراثي BR‑1 ذات نمط تزاوج A2 وارتبطت بمحصول البطاطا ). ,Gevens and Seidl Reis et al., 2002 ; 2013(. أما عزالت النمط الوراثي US-1 فكانت من نمط التزاوج AI ونمط فردي mtDNA Ib وارتبطت بمحصول البندورة ) Reis et al., 2002, 2003(.

اكتشفت في آواسط التسعينات الساللة US-8 ذات نمط التزاوج A2 وحساسة للمبيد Mefenoxam واآلكثر شراسة على درنات البطاطا حيث تسببت بتعفن سريع للدرنات أكثر من العزالت السابقة

23

(Kirk et al., 2009, 2010). كما تعتبر من أكثر العزالت شراسة على األ اورق ) .Goodwin et al .)1996; Kirk et al., 2001

وبعد ذلك انتشر على البطاطا والبندورة المصابة على طول الساحل األمريكي الشرقي النمط الوراثي الجديد US-22 المسبب للوباء بالفطر P. infestans في فلوريدا عام Ristaino, 2010; ) 2007 .)Hu et al., 2012)

التوصيف الجزيئي

استخدمت طرائق لوجياالبيو الجزئيئة في تحديد االختالفات الوراثية بين األنواع والسالالت المختلفة من الفطريات في منطقة (internal transcribed spacer) بتشخيص الفطور وتحديد الفروقات بين السالالت الفطرية الممرضة.

تعتمد الطرائق الجزيئية على عزل DNA، ومن ثم تضخيمه باحدى التقنيات المتاحة بواسطة جهاز)PCR) حيث تتوافر عدة طرائق الستخالص الحمض النووي ال ريبي المنقوص األوكسجين DNA، ومنها طريقة CTAB(Cetyltrimethyl-Ammonium Bromide) حسب ماهو معتمد في المراجع العلمية )Ristaino et al.,2001(

وقد استخدمت الطريقة السابقة مع بعض التعديالت باستبدال المادة: Chloroform :isoamyl (alcohol (24:1 بمادة (phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1، حيث نفذ هذا االختبار على نماذج عشبية ألوراق البطاطا والبندورة المجففة والتي جمعت خالل مجاعة البطاطا في آواخر القرن التاسع عشر وأوائل القرن العشرين، وجرى التضخيم في منطقة ITS-II من ribosomal) DNA) rDNA، واستخدمت فيها المرئسات )Herb1/PINF( لتحديد العينات المصابة بالفطر .P infestans، فكان حجم الشقفة المضخمة May and Ristain,. 2004( 100 bp(.

وقد استخلص الـ DNA باستخدام الطريقة المعدلة الموصوفة من قبل (Goodwin et al .,1996) من عزالت مصدرها نباتات مصابة بالفطر P. infestans، وذلك بتطوير اختبار PCR من خالل تطوير تحليل سالسل المنطقة (ITS-II( في منطقة (rDNA(ribosomal DNA من أنواع الجنس Phytophthora واستخدمت المرئسات )PISP-1 و ITS3)، حيث كانت الشروط المثلى الختبار

24

Kim 122 – 12 DNA 61-55 PCR : درجة حرارة االرتباط تتراوح بين ْم ، وتراكيز من نانوغرام .)and Lee, 2001)

في سويسرا وجنوب ألمانيا عام )2001( استخلص DNA وفقاً للبروتكول المعدل الجديد الموصوف (Zolan and Pukkila ,1985) و إجراء اختبار Restriction fragment length ( RFLP ) polymorphisms وتستخدم هذه الطريقة لدراسة الحمض النووي DNA للنواة أو المتقدرات )الميتوكوندريا(، وذلك بعد استخالصه، ثم تقطيعه بواسطة أنزيمات القطع إلى قطع مختلفة األطوال في مناطق محددة ويتم التعرف على هذه القطع باستخدام طريقة الرحالن الكهربائي.

وتعتمد طريقة Polymerase Chain Reaction )PCR) على التضاعف االنتخابي لمنطقة محددة من الحمض النووي DNA بمساعدة سالسل متعددة النيكليوتيدات )مرئسات(، وأنزيم بوليمراز

ثابت ح اررياً والذي يعرف أيضاً باسم Taq polymerase وبعد االنتهاء من مضاعفة المنطقة المطلوبة من الحمض النووي، يتم فصلها وتعريفها باالعتماد على طريقة الرحالن الكهربائي.

و Simple Sequence Repeat )SSR) وهي تقنية معتمدة على PCR باستخدام مرئسات متخصصة.وهي عبارة عن تكرارت عشوائية من bp 10-1 وعادة ما تكون من bp 5-1 وهو األكثر

شيوعاً وهي تستخدم مرئساتين بدالً من مرئسة واحدة. ITSII أما في مصر فقد صممت المرئسات على أساس منطقة ، ور ح لت منتجات التضاعف على هالمة أغاروز وبتركيز 1,2 %، كما استخدموا الطرائق السيرولوجية مثل اختبار االليزا غير المباشر واختبار البصمة النسيجية المناعية للكشف عن الفطر El_Komy et al., 2010( P. infestans(.

اختار الباحثون منطقة ITSII ألنها منطقة محافظة تطورياً و تميز الفطر P. infestans )Tooley and Villared.,1985; Trout et al.,1997; Jean et al.,1998( كما استخدمت طريقة DNeasy Plant Mini Kit في عزل الدنا من بذور البطاطا في 2007 - 2009 المستوردة والتي اختبرت للكشف عن األصابة الكامنة بالفطر P. infestsan ، حيث تم أخذ 47 درنة من كل شحنة على التوالي مع المرئسات )reverse primer 08-4( و )Judelson and )forward primer 08-3) Tooley., 2000(، فوجد أن معدل االصابة في عام 2007 كان 11.2 %، أما في عام 2008 فكان معدل اإلصابة 12.7 %، ولم تكن أية شحنة خالية من اإلصابة، وفي عام 2009 كان معدل االصابة يفوق 12 %، ومتوسط االصابة الكامنة % Keil et al., 2010) 9.2). وأعيدت الطريقة السابقة في

25

عزل الـ DNA من عينات مأخوذة من مناطق مختلفة في الهند خالل األعوام من 1116 – 3226 .)Chimote et al.,2010(

لقد تمت دراسة التباين الجزيئي لـ 287 عزلة من الفطر P. infestans في البيرو باستخدام تقانات الـ PCR و RFLP و DNA fingerprinting، وقد أظهرت النتائج وجود تباين كبير بين العزالت وخاصة تلك المتحصل عليها من األنواع البرية والمزروعة، وقد توزعت العزالت المتحصل عليها من

األنواع البرية في أربع سالالت مختلفة و ارثياً. حيث إن الساللة EC-1 كانت سائدة على البطاطا المزروعة والبرية مع تواجدها أيضاً على البندورة البرية، بينما كانت الساللة PE-3 متواجدة على البطاطا المزروعة أكثر من تواجدها على العوائل األخرى، باستثناء عزلتين لهذه الساللة تواجدتا أيضاً على البندورة البرية. وكانت الساللة US-1 سائدة على نباتات النوع Solanum. caripense أما الساللة PE-7 فقد كانت سائدة على نباتات البندورة البرية ونادرة على العوائل األخرى ) ,Garry et al., 1999 2000و أحمد عبد المنعم، 1111(.

األوساط المستخدمة في تنمية الفطر P. infestans

على الرغم من أن الفطر P. infestans اختياري التطفل إال أنه يصعب تنميته على بيئة PDA، لذلك تم استخدام أوساط انتخابية مختلفة، ففي تايوان جمعت أوراق البطاطا والبندورة، وقطعت إلى قطعة صغيرة

بقطر 4 مم، وطهرت سطحياً في 1 % من هيبو كلوريد الصوديوم لمدة 3 دقائق، وغسلت بالماء المقطر والمعقم لمدة 3 دقائق، ثم وضعت على أوساط مغذية مختلفة: شيلم A و عصير V8 اغار و حبوب الذرة آغار و بذور البازالء وبذور الشوفان آغار . وقد وجد Hartman وآخرون (1995( أن نمو عزالت الفطر P. infestans كان أفضل على الوسط شيلم A آغار ويتركب هذا الوسط المغذي من 11 غ /ل)dextrose( و 21 غ ) حبوب شيلم( ويكمل الحجم إلى 2 ليتر (Griffith et al.,1995). كما استخدم الوسط شيلم آغار ويتألف 21 غ حبوب شيلم و11غ .سكروز g Bacto agar 20, لعزل الفطر P. infestans من قبل Peters وآخرون )2007(.

تم الحصول على مزارع نقية في جامعة موسكو من عينات أوراق بندورة مصابة، ون ميت في وسط بازالء سائل ) 221غ( من البازالء المفرزة والمغلية في ليتر ماء معقم لمدة 10 دقائق وتصفيتها من خالل عدة طبقات من الشاش والتعقيم باألتوكالف( )Elansky and Milyutina, 2007 (.

26

أهداف البحث  تقصي انتشار مرض اللفحة المتأخرة في أهم مناطق زراعة البطاطا في سوريا.  عزل المسبب المرضي.

 تأكيد تصنيف الفطر المسبب جزيئياً باستخدام بادئات متخصصة  تحديد نمط التزاوج  اختبار ردود فعل العزالت لبعض المبيدات الفطرية على الوسط المغذي كمؤشر على نمط التزاوج.

27

مـــــــــواد وطرائـــــــق البحث

مواقع الدراسة وجمع العينات النباتية

تم القيام بالعديد من الجوالت لحقول مزروعة بالبطاطا في مناطق مختلفة من المحافظات السورية كما هو مبين في الجدول )2(، وذلك خالل األعوام 3211 و3217 و 1122 ، حيث أجري استقصاء حقلي في مواقع الدراسة خالل أشهر أيار وتشرين األول وتشرين الثاني. تم أخذ 211 نبات بشكل عشوائي من كل موقع، وحسبت النسبة المئوية للنباتات المصابة التي أبدت أعراض مرضية واضحة لإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة.

جمعت العينات النباتية من نباتات تبدي أ اعرض مرضية مميزة لمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا في

سورية، حيث تم أخذ العينات بشكل عشوائي، ود ون على كل عينة اسم المنطقة وتاريخ الجمع، ولم نتمكن من أخذ عينات خالل العام 1121.

الجدول 0: مناطق جمع العينات، وتاريخ الجمع وعدد العينات

منطقة الجمع عدد الحقول تاريخ الجمع عدد العينات

درعا مركز بحوث ازرع 25/11/2011 10 7 5/11/2013 2 حماة 14 18/11/2013 4 غاب 25 12/5/2014 2 الالذقية 27 10/5/2014 3 طرطوس

عزل المسبب المرضي

أخذت قطع صغيرة من نسيج أوراق البطاطا المصابة، وتم تطهيرها سطحيا بالكحول 32 % لمدة 72 ثانية، وغسلت بالماء المعقم، ووضعت في محلول من هيبوكلوريت الصوديوم 1 % لمدة 3 دقائق، وغسلت بالماء المقطر ثالث مرات، ثم وضعت بين شرائح بطاطا في طبق بتري، وذلك بعد أن غسلت

درنات البطاطا جيداً بالماء، وتم تطهيرها سطحيا بنقعها بمحلول من هيبوكلوريت الصوديوم 1 % لمدة

28

دقيقتين، وغسلت جيداً بالماء المقطر، ثم وضعت على ورق نشاف حتى جفت جيدا ً. ح ض نت األطباق عند درجة حرارة º 32م لمدة 7 أيام إلى أن لوحظ ظهور مشيجة الفطر على الجزء العلوي لشرائح البطاطا .(Jmour and Hamada.2006)

تحضير أوساط الزرع

بما أن الفطر P. infestans ال ينمو على أوساط الزراعة الشائعة مقارنة مع معظم الفطريات الممرضة األخرى اختيارية التطفل، لذا استخدم وسط الشيلم االنتخابي )Rye A(، وقد تم تحضير هذا

الوسط تبعاً لطريقة (Caten and Jinks, 1968)

 نقعت بذور الشيلم لمدة 36 ساعة في 211 مل ماء مقطر ، ثم التخلص من السائل.

 طحنت البذور بواسطة مطحنة كهربائية، واضيف لها 211 مل ماء مقطر، وح ضنت في حمام مائي عند درجة حرارة º 31م، ُصف يت عبر قطعة من الشاش مؤلفة من أربع طبقات.  أضيف 23 غ من اآلغار و 11 غ ديكستروز الى الرشاحة، ثم أكمل الحجم إلى 1 ليتر.

 عقم الوسط باألتوكالف على درجة حرارة 211 لمدة 15 دقيقة.

 أضيف المضاد الحيوي الذي يحت وي Rifampicin بمعدل 21 مل / ل.

تعريف المسبب المرضي

بعد ظهور النموات الفطرية على شرائح البطاطا، تم نقلها إلى أطباق بتري تحتوي على الوسط المغذي Rye A، ثم أجري الفحص المجهري لهذه العزالت من أجل تعريفها، حيث تم االعتماد على صفات المشيجة والحوامل. حيث المشيجة بين- خلوية وغير مقسمة واألكياس البوغية ليمونية الشكل ذي حلمة طرفية ومحمولة على حوامل متفرعة وهي قليلة التمايز وغير محدودة النمو.

تأكيد تصنيف الفطر P. infestans جزيئياً

بعد تصنيف العزالت المتحصل عليها مورفولوجياً، تم تأكيد التصنيف باستخدام بادئات متخصصة، حيث استخدم في هذه الدراسة 28 عزلة حصلنا عليها من أربع مناطق جغرافية مختلفة )الجدول 1(.

29

الجدول 5: عدد العزالت المستخدمة في الدراسة الجزيئية وأماكن الحصول عليها

الموقع عدد العزالت

حماة 13

الغاب 10

طرطوس 8

الالذقية 6

استخالص الـدنا DNA

تم استخالص الـدنا من الفطر باالعتماد على طريقة Cetyltrimethyl Ammonium Murray and Thompson, 1980( CTAB Bromide( وفق اآلتي:

- جمعت المشيجة الهوائية للفطر من أطباق بتري منمى عليها بكشط المشيجة، ثم طحنها إلى مسحوق ناعم باستخدام اآلزوت السائل.

- أخذ حوالي 231 مل من مطحون مشيجة الفطر ووضعت في أنبوب أبندورف سعة 1 مل.

- أضيف 850 ميكرولتر من محلول االستخالص الدافئ CTAB إلى األنبوب وتم مزجها بلطف )جدول .)2

- حضنت العينة في حمام مائي درجة حرارته º 23م لمدة 30 دقيقة، وحركت دو ارنياً بلطف كل 10 دقائق للمساعدة في تحرير األحماض النووية.

- أضيف 700 ميكرولتر من مزيج من )الكلوروفورم و كحول ايزوميل( بنسبة )1:24( إلـى األنبوب ومزجت بلطف.

- ثفل األنبوب لمدة 10 دقائق عند 10000 دورة/دقيقة ودرجة حرارة º 4م

- أخذ 500 ميكرولتر من الطبقة العلوية )الرائق( ووضعت في أنبوب جديد.

31

- ثفلت العينة مرة ثانية كما في الخطوة السابقة بعد إضافة 500 ميكروليتر من مزيج من الكلوروفورم وكحول ايزوميل بنسبة )1:24(

- أخذ 500 ميكروليتر من الرائق ووضعت في أنبوب جديد وتركت على الجليد مدة 30-20 دقيقة.

- رسب الدنا بضعفي الحجم من اإليتانول النقي البارد.

- ثفل األنبوب لمدة 21 دقائق عند 21111 دورة/دقيقة ودرجة حرارة º 2م.

- استبعد السائل مع المحافظة على الـدنا وجفف األنبوب تحت ساحبة الهواء عند درجة حرارة الغرفة.

- غسل الـدنا بدضافة 1 مل إيتانول 81 % ثم ثفل األنبوب لمدة 3 دقائق عند 10000 دورة/دقيقة ودرجة حرارة º 2م.

- استبعد السائل وجفف األنبوب تحت ساحبة الهواء عند درجة حرارة الغرفة لفترة تكفي للتخلص بشكل كامل من اإليتانول.

- أذيب الـدنا في 211 ميكروليتر من محلول TE أو 211 ميكروليتر ماء مقطر معقم.

- بعد تقدير كمية الدنا وتحديد نقاوته، حفظت العينات عند درجة حرارة º 11-م لحين االستخدام.

الجدول 4: المحاليل المستخدمة في التوصيف الجزيئي

تركيبها المحاليل CTAB 0.1M Tris HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 20mM EDTA (pH 8.0), buffer 2% (w/v) CTAB (ceytl trimethyl ammonium bromide), and immediately before use 3% 2-mercapto-ethanol were added. TE buffer 10mM Tris HCl, 1mM EDTA (pH8.0) 10X TBE 750mM Tris HCl, 900mM Boric acid, and 2mM Na2-EDTA buffer

31

تقدير كمية الحمض النووي DNA وتحديد نقاوته

DNA ت م تقدير كمية الحمض النووي ونقاوتـه باستخـدام جهاز المطيـاف اللونـي Spectrophotometer، والذي يعتمد مبدأ عمله على قياس كمية الـدنا في العينات، وذلك عن طريق امتصاصه لألشعة فوق البنفسجية بأطوال موجات 362 – 312 نانومتر. استخدم ماء مقطر معقم لتعيير

الجهاز وتمديد الـدنا، واعتبر الحمض نقياً عندما ت اروحت ق ارءة الجهاز من 2.2 – 1 .

يوضع ضمن كل أنبوب )cuvette( خاص بالمطياف الضوئي 11 مل ماء مقطر، ثم تنقل األنابيب إلى الحفرة المخصصة لها ضمن الجهاز حيث يتم تعييره وتصفيره. بعدها يتم استبعاد 2 مل من أحد

األنبوبين ويضاف 2 مل من الـدنا بدالً منها ثم تنقل إلى الجهاز ليتم قياس تركيز الـدنا للعزلة المختبرة، وبعد قياس كل عينة يغسل االنبوب بالماء المقطر مرتين. تكرر العملية ذاتها مع كل العزالت.

ولتحديد نوعية الـدنا والتأكد من عدم تقطعه، تم تحميل كمية قليلة من الـدنا المستخلص في هالمة )gel( من اآلغاروز وفق الطريقة التالية:

لتحضير هالمة آغاروز 2 %، يوزن 1 غرام من اآلغاروز، وتوضع في دورق، ثم يضاف لها 211 مل محلول TBE تركيزه ) 1X ( حيث تخلط مع بعضها بشكل جيد وتوضع في المايكروويف مدة 1 –

2 دقائق، وتحرك كل فترة حتى تمام ذوبان اآلغاروز. بعدها يخرج الدورق ويترك ليبرد قليالً إلى أن تصل درجة حرارته إلى حوالي º 31م حيث يضاف إليه 7 ميكروليتر ايثيديوم بروميد، وتخلط ببطء، ثم تصب في الصندوق وذلك بعد وضع الحواجز على طرفيه ووضع المشط. وبعد تجمد الجل يزال المشط والحواجز وينقل إلى جهاز الرحالن الكهربائي Electrophoresis الذي يحوي بدوره محلول الرحالن TBE تركيزه 1X. يؤخذ بعدها 3 ميكروليتر من كل عينة دنا وتخلط مع 1 ميكروليتر من مادة بروموفينول الملونة، ثم تحقن في الحفرة المخصصة لها كما يحقن مؤشر جزيئي معروف الوزن الجزيئي ) ( DNA Ladder في الحفرة األولى من الجل للمقارنة مع القطع المراد دراستها. بعدها يوصل التيار الكهربائي لتجري عملية الرحالن بحيث يكون القطب السالب باتجاه الـدنا، وشدة التيار الكهربائي 100 فولت لمدة ساعة ونصف، ينقل الهالم بعدها إلى جهاز التوثيق Gel documentation حيث يتم تصوير الهالم باألشعة فوق البنفسجية.

32

تقانة تفاعل البوليميراز التسلسلي PCR

استخدمت في هذه الدراسة مرئستان متخصصتان ITS3 و PINF2 للكشف عن النوع .P Tooleyp et al., 1997( infestans (، ويتم تفاعل البوليميراز التسلسلي PCR وفق الخطوات التالية:

Denaturation : وفيه يفقد جزيء ال ـDNA خواصه الطبيعية حيث ينفصل شريطي الـ DNA عن بعضهما البعض وتتم هذه الخطوة عند درجة حرارة C °03 فتعمل هذه الحرارة العالية على كسر الروابط

الهيدروجينية بين شريطي DNA ويصبح كل منهما شريطاً منفرداً أو سلسلة منفردة تسمح بأن تكون قالباً لتكوين سلسلة أخرى تكملها لتصبح شريطاً مزدوجاً .

Annealing: ويتم فيها خفض درجة الحرارة إلى C°33 وفيها يلتصق كل من قطعتي الـ primer بالمكان المخصص بها.

Extention: وتتم عند درجة حرارة C°81 وفيها يقوم إنزيم Tag polymerase بربط النيوكليوتيدات

على باقي الشريط المنفرد مكمالً له إلى شريط مزدوج مطابق للنسخة األصلية لشريط الـ DNA.

ويبين الجدول )2( التسلسل النيكليوتيدي لهاتين المرئستين. كما استخدم شفع المرئسات ITS4 و PERY2 ) الجدول 3( المتخصص في الكشف عن النوع P. erythroseptica كشاهد.

وت م إجراء تفاعل التضخيم بحجم تفاعل كلي µl 30 مكون من مواد التفاعل المبينة في الجدول )2(، وذلك ضمن أنبوب أبندورف سعه 1 مل.

الجدول 3 : التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تفاعل البلمرة التسلسلي PCR للكشف عن النوع P. infestans

المرئسات التسلسل النيكليوتيدي 5\ GCATCGATGAAGAACGCAGC 3\ ITS3 5` CGATTCAAATGCCAA GCTAAAG 3\ PINF2

33

الجدول 2 : التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تفاعل البلمرة التسلسلي PCR للكشف عن النوع P. erythroseptica كشاهد

شفع المرئسات المتخصص في الكشف عن النوع P. erythroseptica ITS4 (5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3` PERY2, 5`-CTGTTCCGGCGTAAGCTG- 3`

الجدول 6: مواد تفاعل التضخيم PCR المستخدم للكشف عن النوع P. infestans

الكمية المادة dNtps 10um 1 µl 3 µl 10 X PCR MgSo4 1 µl

Primer 1 1 µl

Primer 2 1 µl

DNA 3 µl

Taq 0,5 µl

Water 19.5 µl

وضعت أنابيب التفاعل في جهاز المدور الحراري )Thermocycler( وفق شروط التفاعل التالية: بدأ

التفاعل بتسخين المزيج حتى درجة الحرارة 02 °م لمدة دقيقة، أتبعت بـ 21 دورة تحت الشروط التالية:

02 °م لمدة 21 ثانية ليتم فصل سلسلتي الـ Denaturation( DNA(، و 55 °م دمج )Annealing( ليتم التحام البادئات، و 81 °م إستطالة )Extension( ليتم استكمال السلسلة، وتم فصل نواتج التفاعل بعد إضافة صبغة بروموفينول لها في هالمة من اآلغاروز 2% والتي تحتوي على صبغة ايثيديوم بروميد ومحلول الرحالن TBE تركيزه 1X، في جهاز الرحالن الكهربائي تحت جهد كهربائي 211 فولت لمدة ساعة ونصف، ثم ثقت والنتائج بتصوير هالمة اآلغاروز باستخدام األشعة فوق البنفسجية.

34

الجدول 1: البرنامج الزمني لتفاعل البلمرة التسلسلي PCR

عدد الدورات المدة الزمنية درجة الحرارة 94°c 5 m 1

94°c 15 sec

55°c 15 sec 30

72°c 15 sec

72 7 m 1

4°c

تحديد نمط التزاوج باستخدام تفاعل البلمرة التسلسلي PCR

استخدم تفاعل البلمرة التسلسلي PCR باالعتماد على المرئسات المتخصصة INF-1 و INF-2 )الجدول 7( لتحديد نمط التزاوج لعزالت الفطر P. infestans. حيث أجري التفاعل بحجم كلي µl 25.

الجدول 8: التسلسل النيكليوتيدي للمرئستين المستخدمتين في تحديد نمط التزاوج P. infestans

المرئسات التسلسل النيكليوتيدي 5\ AAGCTATACTGGGACAGGGT 3\ INF-1 5` GCGTTCTTTCGTATTACCAC 3\ INF-2.

35

ويبين الجدول )0( التراكيز المستخدمة في تفاعل البلمرة التسلسلي باالعتماد على بادئات متخصصة

لتحديد نمط التزاوج.

الكمية المادة

dNtps 10um 1 µl

10 X PCR 3 µl MgSo4 0,8 µl

Primer 1 2.25 µl

Primer 2 2.25 µl

DNA 1 µl

Taq 0.3 µl

Water 14.4 µl

بدأ التفاعل بتسخين المزيج حتى درجة الحرارة 03 °م لمدة 2 دقائق، أتبعت بـ 21 دورة تحت الشروط التالية: 03 °م لمدة 23 ثانية ليتم فصل سلسلتي الـ DNA، و 32°م دمج Annealing ليتم إدخال البادئات، و 81 °م إستطالة Extension ليتم استكمال السلسلة.

الجدول 01: البرنامج الزمني لتفاعل البلمرة التسلسلي PCR لتحديد نمط التزاوج P. infestans

عدد الدورات المدة الزمنية درجة الحرارة 95°c 5 m 1 95°c 35 sec 30 56°c 35 sec 30 70°c 35 sec 30

70 ºc 5 m 1

4ºc

36

ردود فعل العزالت تجاه بعض المبيدات الفطرية

مبيد Ridomil Gold)1116( )سينجنتا( ويتألف meferoxan+mancozeb أما مبيد Ridomil )maetalaxil+ mancozeb()1116(MZ

تم اختيار المبيدين الفطريين Indofil M-45 )المادة الفعالة mancozeb 75% WP )، وهو ينتمي إلى المجموعة الكيميائية (dithiocarbamate) وصيغته العامة C4H6MnN2S4(*)zn) y)على شكل مسحوق قابل للبلل بمعدل استخدام )2.50-1.75( مل / ليتر ماء فهو ينشيط عمل مثبطات مجموعة السلفوهيدريل للحموض األمينية واألنزيمات في الخاليا الفطرية، مما يؤدي إلى قطع استقالب

الليبيدات والتنفس وانتاج طاقة ATP .

والمبيد الثاني إنفينيتو Infinito )المادة الفعالة Fuopicolide and propamocarbHCL SC( حيث fluopicolide يثبط تصنيع البروتين -dichloro-N 2.6 وينتمي إلى مجموعة benzamide ومادة propamocarb تنتمي إلى مجموعة carbamate وهومبيد كربمائي جهازي

EC50=29.3 ug/ml P. cactorum )حركة أكروباتية( EC50= 643346 ug/ml P. infestans EC50=1222ug/ml p.nicotinae

وظهرت له صفة المقاومة بألمانيا p.nicotinae بمعدل استخدام )626 -500) مل /ليتر، المستخدمين في مكافحة مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا، علما أن المبيدين السابقين معتمدين من قبل الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية في مكافحة هذا المرض في سوريا. وقد تم اختيار ثالث عزالت ممثلة لثالث مناطق جغرافية مختلفة )الجدول 22(. كما يبين الجدول )21( تراكيز المبيدات المستخدمة.

الجدول 00: العزالت المستخدمة في اختبار الحساسية تجاه بعض المبيدات الفطرية

العزلة المنطقة 2 الالذقية

1 طرطوس

2 الغاب

37

الجدول 05: تراكيز المبيدات المستخدمة

المبيد المستخدم التركيزاألول التركبز الثاني Indofil M-45 1435ملغ/ ل 345 ملغ/ ل INFINTO 522 ملغ/ ل 636 ملغ/ ل تحضير الوسط المعذي المضاف اليه المبيد الفطري

تم تحضير الوسط المغذي RyeA كما هو مذكور سابقاً، وبعد تعقيمه عند درجة حرارة 211 درجة مئوية لمدة 11 دقيقة، ثم تركه حتى يبرد إلى درجة حرارة 21 ̊ م تقريباً، ثم أضيف المبيدان الفطريان وفق التراكيز المدروسة إلى ليتر البيئة جدول)21(. وصب الوسط المغذي المضاف إليه المبيد في أطباق بتري بمعدل 11 مل في كل منها، مع وسط مغذي بدون إضافة أي مبيد، حيث استخدم كشاهد. اختبار سمية المبيدات الفطرية على نمو الفطر

تم أخذ قطعة من اآلجار الحاملة لمشيجة الفطر بقطر 3 مم، ووضعت في وسط الطبق البتري على الوسط المغذي المضاف إليه المبيد، حيث تم تحضير تركيزين من كل مبيد، وبمعدل ثالثة مكررات لكل تركيز ولكل عزلة فطرية، إضافة إلى الشاهد. حضنت األطباق في الحاضنة عند 11 ± 2˚م.

قراءة النتائج

تم قياس أقطار المزراع الفطرية بعد 21 أيام من التحضين، وقورنت مع الشاهد لحساب نسبة التثبيط، حيث حسبت نسبة التثبيط وفق المعادلة التالية معادلة )Henderson and Tiltton, 1955 (:

نسبة التثبيط= )قطر المستعمرة في الشاهد – قطرالمستعمرة في المعاملة( x 211

)قطر المستعمرة في الشاهد(

التحليل اإلحصائي

سوف يتم تحليل النتائج احصائياً باستخدام البرنامج Genstat تحليل التباين Analysis of variance وتحديد مدى معنوية الفروقات في النتائج المستحصل عليها عند مستوى %3.

38

النتائــــج والمناقــــشـــــــــــة

تقصي انتشار مرض اللفحة المتأخرة

عزل المسبب المرضي

تباينت نسبة اإلصابة بمرض اللفحة المتأخرة تبعاً للمنطقة الجغ ارفية التي تزرع فيها البطاطا، حيث وصلت في محافظة حماة إلى 28.73 %، وكانت في منطقة الغاب 21.21 %، بينما لم تتجاوز في محافظة الالذقية 22.22 %، وفي محافظة طرطوس 2.1 %. بينما لم تالحظ أية إصابة في العينات التي أخذت من محافظة درعا.

يالحظ مما سبق أن أعلى معدل إصابة بمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا كان في محافظة حماة

ومنطقة الغاب، بينما كانت منخفضة نسبياً في الالذقية وطرطوس، ويعود ذلك لتوافر الظروف المالئمة النتشار المرض في تلك المحافظات خالل األشهر التي تم جمع العينات فيها.

40

35

30

25

20

15 النسبة المئوية للنباتات المصابة 10

5

0 طرطوس الالذقية الغاب حماه درعا منطقة جمع العينات

الشكل 3: النسبة المئوية النتشار مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا تبعاً للمنطقة الجغرافية التي تم جمع العينات منها.

39

عزل الفطر

جمعت عينات من أنسجة نباتية تبدي أعراض إصابة بمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا من 21

حقالً موزعة في خمس مناطق جغ ارفية مختلفة تزرع فيها البطاطا. وبعد إج ارء عملية العزل، وباالعتماد على الصفات المورفولوجية لمشيجة الفطر، وللحوامل واألكياس البوغية، تم الحصول على 22 عزلة

تنتمي مورفولوجياً للجنس .Phytophthora sp، إذ إن الخيوط الفطرية غير مقسمة، واألكياس البوغية ليمونية الشكل ذي حلمة طرفية ومحمولة على حوامل غير متمايزة )الشكل 3(. وهذه الصفات الشكلية تتوافق مع الصفات العامة للفطر .Lepoivre, 2003 ; Kirk et al., 2004 ( P. infestans (.

الشكل 2: الصفات المورفولوجية للمشيجة والحوامل واألكياس البوغية للفطر .Phytophthora sp

الجدول 04: النسبة المئوية لعزالت الفطر P. infestans المسبب لمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا تبعاً للمنطقة الجغ ارفية التي تم جمع العينات منها.

منطقة الجمع عدد العينات عدد العزالت % لعزالت الفطر P. infestans حماة 3 6 15431 % الغاب 14 1 +)3(* 53414 %

الالذقية 35 13 61 %

ط طوس 33 13 + )12(* 44444 % عدد العينات الكلي 38 48 8.13 %

* عينات مشكوك بتبعيتها للفطر P. infestans اعتمادا على الصفات المورفولوجية

41

تأكيد تصنيف العزالت الفطرية بتقانة تفاعل البلمرة التسلسلي PCR

\ استخدمت في هذا االختبار مرئستان متخصصتان ) GCATCGATGAAGAACGCAGC 5) \ \ ITS3 3 و ) PINF2 (5` CGATTCAAATGCCAA GCTAAAG 3 في الكشف عن الفطر P. infestans لـ 28 عزلة متحصل عليها من أربع مناطق مختلفة )12 عزلة تبدي صفات مورفولوجية متوافقة مع الفطر P. infestans و22 عزلة مشكوك فيها(.

أظهرت النتائج أن 12 عزلة أعطت حزماً بطول (bp)456، وهذا يشير إلى أن هذه العزالت تتبع النوع P. infestans، وقد توزعت هذه العزالت كما يلي: 2 عزالت من محافظة الالذقية، و2 عزالت من طرطوس، و2 عزالت من حماه، و21 عزالت من منطقة الغاب. وهذا يؤكد أن العزالت التي تم تصنيفها

مورفولوجيا على أنها فيتوفتو ار هي التي أعطت حزماً bp 232، بينما العزالت التي لم نستطع تصنيفها مورفولوجيا ً على أنها فيتوفتورا لم تظهر أي حزمة باستخدام المرئستان المتخصصتين في الكشف عن النوع P. infestans .

الجدول 03: توزع العزالت التي اثبتت تبعبتها جزيئياً للفطر P. infestans باستخدام المرئستان ITS3 و PINF2

مصدر العزلة عدد عزالت الفطر Phytophthora infestans

الالذقية 2

طرطوس 2 حماه 2

الغاب 21 تتفق النتائج التي حصلنا عليها مع تلك التي حصل عليها ).Tooley et al.1997( عندما استخدموا البادئات السابقة ذاتها، حيث أظهرت هذه المرئسات تخصصية في الكشف عن النوع P. infestans. كما تتطابق مع اختبارات PCR باستخدام المرئسة المتخصصة ) GenBank accession no ,AY770739( للكشف عن الفطرP. infestans التي أجريت من قبل )El_Komy et al.,2010) على العزالت المأخوذة من صنفي بطاطا احداهما مقاوم واألخر حساس. ويبدو أن هناك مرئسات أخرى متخصصة في الكشف عن هذا النوع ولكن لم تختبر في هذه الدراسة، فقد استخدم ) ,.Jyan et al 2002( شفعين من البادئات )Pi1S-1 , Pi2A-1 ( و )Pi1S-1 , Pi2A-2 (، وأظهرت نتائجهم أن 41

زوج المرئسات )Pi1S-1 , Pi2A-1( لم يكن متخصصاً في الكشف عن النوع P. infestans وانما أعطى حزماً بحجم bp 231 في أنواع أخرى أيضاً مثل P. capsici و P. citrophthora ، بينما أظهر شفع المرئسات اآلخر )Pi1S-1 , Pi2A-2 ( تخصصية في الكشف عن النوع P. infestans فقط حيث كانت نتائج التضخيم بحجم bp 331 .

الشكل 6: تضخيم حزم دنا بحجم pb 456 لـ 12 عزلة من الفطر P. infestans باختبار PCR باستخدام المرئستين ITS3 و PINF2 المتخصصتين.

وباستخدام شفع المرئسات )ITS4 – PERY2 ( المتخصص بالفطر P. erythroseptica تم التأكد من أن شفع المرئسات )ITS3 – PINF2 ( متخصص بالكشف عن النوع P. infestans )الشكل 8(

42

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

PERY2 - ITS4

الشكل 1: تفاعل البلمرة التسلسلي PCR باستخدام المرئستين ITS4 و PERY2 المتخصصتين في الكشف عن النوع P. erythroseptica

الالذقية طرطوس حماه غاب

الشكل 8:عدد عزالت الفطر P. infestans نتيجة اختبار PCR باستخدام المرئستين متخصصتين )ITS3 و PINF2 (.

43

اختبار نمط التزاوج

تم اختبار نمط الت ازوج للعزالت التي تم تأكيد تصنيفها جزيئياً للفطر P. infestans والبال عددها 12 عزلة، وذلك باستخدام شفع المرئسات AAGCTATACTGGGACAGGGT( INF-1( و INF-2 .)GCGTTCTTTCGTATTACCAC(

أظهرت جميع العزالت وجود حزمة واحدة حيث كان حجم التضاعف 170bpالشكل )0( وهذه النتيجة تشير إلى أن جميع العزالت المختبرة هي من نمط التزاوج A1، وعدم وجود أي عزلة من نمط التزاوج اآلخر A2 الشكل )0( وهذا ما يفسر عدم أو ندرة مصادفة األبواغ البيضية في الظروف المحلية، إذ إن الفطر متخالف المشائج Heterothallic أي أن تشكل األبواغ البيضية يحتاج لوجود مشائج من الطرازين A1 و A2، حيث يحدث التكاثر الجنسي بين أعضاء مؤنثة Oogonia على مشائج من أحد النمطين وأعضاء مذكرة Antheridia على مشائج من النمط اآلخر.

تتوافق هذه النتائج مع نتائج الدراسات التي أجريت من قبل Jong وآخرون 1113 على عزالت بطاطا مصابة بمرض اللفحة المتأخرة، حيث تبين أن جميع العزالت من نمط التزواج A1. ويبدو أن هناك توزع جغرافي لكل من نمطي التزاوج، فقد أشار Mazakova وآخرون )1112(، بعد استخدام زوج من البادئات المتخصصة بالنمط PHYB-1 , PHYB-2( A2)، أن جميع العزالت المتحصل عليها من عينات أوراق وثمار ودرنات أخذت من محاصيل البطاطا والبندورة، كانت من نمط التزاوج A2 وبحجم تضخيم bp743.

44

الشكل 9: حزم دنا بحجم 170pb لعزالت من الفطر P. infestans مضخمة باختبار PCR وباستخدام المرئستين المتخصصتين بنمط التزاوج A1.

45

وجد في شبه جزيرة Nagasaki في اليابان أن هناك سيادة للعزالت من النمط الوراثي A2، بينما

كانت العزالت التابعة للنمط الوراثي A1 قليلة نسبياً (Mitsuru et al., 2002 (. بينما أشار Ramelli وآخرون )1110 ( أن كل العزالت المتحصل عليها من كولومبيا وAntioquia كانت من نمط التزاوج A1، وقد أعزي عدم تشكل األبواغ البيضية لعدم وجود نمط التزاوج A2 . وبالمقابل فدن الدراسات التي أجريت في شمال نيكارغوا أكدت أن كل مجتمعات الفطر P. infestans كانت من نمط التزاوج A2 )Blandón-Díaz, 2011(. أما في فرنسا فقد أشارت دراسة أجريت في عامي 1112 و 1113 لتحديد نمط التزاوج، باالعتماد على التصالب بين العزالت على الوسط المغذي وليس على المؤشرات الجزيئية،

لوجود نمطي التزاوج A1 و A2 حيث اعتبرت العزالت التي شكلت أبواغاً بيضية مع العزلة ذي نمط التزاوج A1 من نمط التزاوج A2، أما العزالت التي شكلت أبواغاً بيضية مع العزلة التي تملك نمط ت ازوج A2 عزالت ذات نمط تزاوج Montarry et al., 2010) A1(.

كما لوحظ وجود كال نمطي التزاوج A1 و A2 في عزالت تم الحصول عليها من مناطق تغطي معظم أجزاء الهند خالل الفترة من عام 2008 وحتى 1112، حيث شكل نمط التزاوج A1 نسبة 72 % بينما كانت نسبة وجود نمط التزاوج اآلخر Chimote et al.,2010( )% 40 ( A2(.

اختبار ردود فعل العزالت على بعض المبيدات الفطرية

تم اختبار فاعلية تركيزين مختلفين من المبيدين Indofil M-45 والمبيد Infinto في تثبيط النمو الفطري لثالث عزالت من الفطر P. infestans ممثلة لثالث مناطق جغرافية مختلفة على الوسط المغذي شيلم A .

أظهرت النتائج عدم وجود أي تأثير للمبيد Infinto في تثبيط نمو عزالت الفطر P. infestans حيث لم يالحظ وجود أي فرق في قطر المزارع الفطرية بين الشاهد والعزالت النامية على الوسط المغذي المضاف إليه المبيد.

بينما يوضح الجدول )23( أن المبيد Indofil M-45 أدى إلى تثبيط نمو الفطر بشكل واضح، ولم يالحظ وجود فروق معنوية في النمو ما بين العزالت سواء في الشاهد أو المعامل. لقد أدى التركيز 2.83 مل /ل إلى انخفاض معنوي في نمو العزالت مقارنة مع الشاهد، فقد تراوحت نسبة التثبيط من 82.3 % إلى 71.18 %. لقد أدى التركيز 2.5 % إلى زيادة في نسبة التثبيط وبفروق معنوية مقارنة مع التركيز

46

األول، فقد تراوحت نسبة التثبيط بين 73 % و 01 %. ولكن لم يالحظ توقف تام للنمو حتى على التركيز األعلى.

الجدول 02: تأثير المبيد إندوفيل أم-23 في نمو الفطر P.infestans الت كيز 1435 نسبة التثبيط الت كيز 345 نسبية التثبيط ملغ/ل قط الشاهد العزلة )%( ملغ / ل )%( المستعم ة % 12 % 13433 الالذقية c 2435 b 1477 a 345 % 15 % 3645 طرطوس c 1413 b 1417 a 345 % 15464 % 3641 الغاب c 1413 b 141 a 341

القيم المتبوعة بأحرف متشابهة ال يوجد بينها فروق معنوية عند مستوى إحتمال %5

قيم L.S.D )أقل فرق معنوي( عند مستوى حرية 3 % بين العزالت، وبين التراكيز، وكذلك بين تفاعل )تراكيز*عزالت( مبينة في الجدول 22

الجدول 06: قيم L.S.D عند مستوى حرية 3 %

L.S.D تراكيز العزالت تفاعل تراكيز*عزالت 2425 1.722 1.382 1.382

47

8

7

6

5 control 4 1.75 mg/l 3

2.5 mg/l

المزرعة قطر الفطرية الفطرية

2

1

0 الغاب طرطوس الالذقية العزالت الفطرية

الشكل 21: تأثير المبيد إندوفيل أم-23 في نمو عزالت من الفطر P. infestans

Christoph وتتفق هذه النتائج مع نتائج د ارسات سابقة حيث ب ين وآخرون )1122( أن المبيد Infinto يظهر كفاءة عالية في تثبيط نمو عزالت الفطر P. infestans التي تملك نمط التزاوج A2 وهي A2 MLG_33 و .(A2-Green 33) ,13-A2 MLG (A2-Blue 13) وهذا دليل إضافي إلى أن جميع العزالت المتحصل عليها في هذه الدراسة كانت من نمط التزاوج A1.

وقد أشارت العديد من الدراسات السابقة لوجود تباين في ردود فعل عزالت الفطر P. infestans تجاه العديد من المبيدات المستخدمة في مكافحة مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا، ومنها الدراسات التي أجريت من قبل الباحثيين ).Jmour and Hamada. 2006( في تونس عند استخدام المبيد الفطري Ridomil Gold فيه 2% ميتاالكسي في اختبار حساسية عزالت الفطر P. infestans حيث وجدت عزالت حساسة و متوسطة ومقاومة، كما لوحظ ظهور سالالتين مقاومتين للميتاالكسي. كما استخدم المبيد الفطري ميتاالكسي وفينيالميد من قبل الباحثيين Jaimasit و Prakob (2010) على العزالت التي تم جمعها من أهم مناطق زراعة البطاطا Chiang Mai and Tak provinces خالل عام 1112-1110 فتبين معظم العزالت حساسة و18 عزلة متوسطة الحساسية و11 عزلة مقاومة للميتاالكسي، وقد أوضحت هذه الدراسات أن العزالت الحساسة للميتاالكسي كانت من نمط التزاوج .)Lafsson and Hermansen., 2001(A1

48

وهذه تفسر الفاعلية لمبيد ميتاالكسيل في مكافحة مرض اللفحة المتأخرة على البطاطا في سورية على

صنف البطاطا سبونتا في حمص خالل موسمي 2008 - 2009 )الناصر، 1121(، وهذا أيضاً مؤشر أخر على أن عزالت هذا الفطر في الظروف المحلية هي من نمط التزاوج A1.

49

االستنتاجات والمقترحات

• هذه نتيجة انتشار مرض اللفحة المتأخرة المتسبب عن الفطر Phytophthora infestans في

مناطق زراعة البطاطا في سوريا بنسب متفاوتة تبعاً للمحافظة التي تزرع فيها البطاطا.

• توافق التصنيف المورفولوجي للفطر P. infestans مع التصنيف الجزيئي باستخدام مرئستين متخصصتين )ITS3 و PINF2 (

• يعزى عدم تشكل األبواغ البيضية للفطر P. infestans في الظروف المحلية لوجود نمط تزاوج واحد فقط )A1 ( أمكن تحديده في هذه الدراسة باستخدام شفع متخصص من المرئسات ) -INF .)1 /INF-2

• لقد أمكن في هذه الدراسة باستخدام المبيدين Infinto و Inofil M-45 تأكيد أن جميع العزالت المتحصل عليها في الظروف المحلية هي من نمط تزاوج واحد )A1(.

• إجراء المزيد من الدراسات المتعلقة بمرض اللفحة المـتأخرة على البطاطا والتركيز على المناطق التي لم نستطع الحصول منها على عدد كاف من العينات وخاصة محافظة درعا.

• االهتمام بفرز الدرنات واستبعاد تلك التي تبدي أعراض إصابة بالفطر P. infestans، طالما أن األبواغ البيضية ال تتشكل في الظروف المحلية، فدن مصدر اإلصابة األهم هي الدرنات المصابة الحاملة لمشيجة الفطر.

• اختبار المبيدات المستخدمة في هذه الد ارسة حقلياً وخاصة المبيد Infinto الذي لم يؤد إلى تثبيط نمو الفطر P. infestans على األوساط المغذية، ولكن هناك دراسات تشير لفاعليته في مكافحة المرض.

51

المراجع العربية

- الصباغ،عبد العزيز )2003(.علم التصنيف النباتي )الجزء النظري(- جامعة دمشق.

- المجموعة اإلحصائية الزراعية السورية )1121(.الجمهورية العربية السورية .وزارة الزراعة و اإلصالح الزراعي .المكتب المركزي لإلحصاء.

- المجموعة اإلحصائية الزراعية السورية )1122(. الجمهورية العربية السورية. وزارة الزراعة و اإلصالح الزراعي. المكتب المركزي لإلحصاء

- الناصر، زكريا )1121(. تقييم بعض المبيدات الفطرية في مكافحة اللفحة المتأخرة Phytophthora infestans على البطاطا في محافظة حمص.2012. مجلة جامعة دمشق للعلوم الزراعية) 1121(، المجلد )17(، العدد 2، الصفحات: 112.

- حسن، أحمد عبد المنعم )2070( . البطاطا - جامعة القاهرة – الدار العربية للنشر والتوزيع.

- فضول جودة، ونفاع وليد )2006(. علم الفطريات. منشورات جامعة دمشق. 1050 صفحة.

- فضول جودة، ونفاع وليد )1110(. علم الفطريات. منشورات جامعة دمشق. 217 صفحة.

- نفاع وليد )1121(. أمراض النبات الفطرية .منشورات جامعة دمشق.صفحة 102.

51

المراجع األجنبية

Agrios,G.(2005).Plant Pathology.5th eds:Academic Press,San Diego.

Baker, B.2002. Plant Gene Expression Center, USDA, Albany; CA, USA, (status:May),found on: http://www.bakerlab.usda.gov/BakerLab/PDF/class4.pdf.

Beagle, J. 2006. Tracking the evolutionary history with historical collections.outlook on pest Management –August .2006.

Beninal, L., R. Corbière, A. Kedad, D. Andrivon and Z. Bouznad, 2009. A2 mating type, metalaxyl resistance and complex virulence profiles : common features in some Phytophthora infestans isolates from Algeria. Proceedings of the 11th Euroblight Workshop, Hamar, Norway.28-31.

Blandón-Díaz,J.U. 2011.Insights into population structure and epidemiology of Phytophthora infestans from Nicaragua.Doctoral Thesis, Swedish University of Agricultural Sciences.Uppsala, Swed.73 pages.

Bourke, A.The visitation of God”? The potato and the great Irish famine, Lilliput Press, Dublin, Ireland, 1993.

Brasier, C. M.,Beales, P. A. , Kirk, S. A. , Denman, S.and Rose, J. , 2005.Phytophthora kernoviaesp. nov., an invasive pathogen causing bleeding stem lesions on forest trees and foliar necrosis of ornamentals in Britain. Mycological Research, vol. 109, pp. 853-859.

Caten, C. E., and Jinks. J. L. 1968. Spontaneous variability of single isolates of Phytophthora infestans. I. Cultural variation. Can. J. Bot. 46: 329-348.

Chimote, V.P. ,Kumar, M., Sharma, P.K., Singh, P.H. , and Singh, B.P.2010. Characterization of changes in phenotype and genotype of Phytophthora infestans isolates from India.Journal of Plant Pathology, 92 (3), 669-677.

Christoph, A., Braun, Wanningen, R., and Schirring, A.2014. Infinito®: Protection against different Phytophthora infestans isolates of the A2 & A1 mating type. PPO – Special Report NO 16 – 2014, 117-122.

Cohen, Y., and Gisi, U.. 1996. Resistance to phenylamid fungicides :A Cas Study with Phytophthora infestans Involving Mating Type and Race Structure. Annual Review of Phytopathology. vol. 34:549-572.

52

Corbiere,R., Rekad,F.Z., Galfout, A.,Andrivon,D., Bouznad,Z., 2010.Phenotypic and genotypic characteristics of Algerian isolates of Phytophthora infestans.PPO-Special Report no. 14 (2010), 133 – 146.

De Miranda,B.E.C., Suassuna, N.D., and Reis,A.2010.Mating type, mefenoxam sensitivity, and pathotype diversity in Phytophthora infestans isolates from tomato in Brazil.Pesq.agropec. bras., Brasília, v.45, n.7, p:671-679.

De Paulo, J.J. and C.A. Powell. 1995.Extraction of double-stranded RNA from plant tissues without the use of organic.solvents. Plant Dis. 79:246-248.

El_Komy, M.H., Abou-Taleb, E.M. ,Aboshosha, S.M., and El-Sherif, E.M. 2010. Serological and molecular detection of late blight and disease development in potato..International Journal of Agriculture and Biology ISSN Print: 1560–8530; ISSN Online: 1814–9596.

Elansky, S.N., and Milyutina, D.I. 2007.Heteroplasmosis in Phytophthora infestans.Russian Journal of Genetics, 2007, Vol. 43, No. 3, pp. 255–258.

Englyst, HN., Kingman, SM., Cummings, JH. 1992. Classification and measurement of nutritionally important starch fractions. Eur J ClinNutr. 46: S33–S50.

Erwin, D. C., and Ribeiro, O. K. 1996.Phytophthora Diseases Worldwide. American, Phytopathological Society, St. Paul, MN.562 pages pp. 562.

FAO.2008. Food and Agriculture Organizatio of the United Nations.Rome, Italy.

FAO.2010. Food and Agriculture Organizatio of the United Nations.Rome, Italy.

Fernandes, G.,Velang,i A., Wolever, TMS .2005. Glycemic index of potatoes commonly consumed in North America".Journal of the American Dietetic Association 105 (4): 557–62.

Fontem, D.A., Olanya, O.M., Njualem, B.F .2004.Reaction of certain Solanaceous and Astraceous plant species to inoculation with Phytophthora infestansin Cameroon. J. Phytopathol. 152: 331-336.

Food and Agriculture Orgaization of the United Nations..2014.

53

FRY, W.E., and Goodwin, S.B. 1997b. Resurgence of the Irish potato famine fungus. Bioscience 47:363-371.

Fry, W.E., Goodwin, S.B., Dyer, A.T., Matuszak, J.M., Drenth, A., Tooley, P.W., Sujkowski, L.S., Koh, Y.J., Cohen, B.A., Spielman, L.J., Deahl, K.L., Inglis, D.A., and Sandlan, K.P .1993. Historical and recent migrations of Phytophthora infestans: chronology, pathways, and implications. Plant Dis. 77: 653-661.

Garelik, G. 2002.Agriculture.Taking the biteout of potato blight. Science 298:1702-1704.

Garry, G., Forbes, G. , Salas1, A., Perez1, W. , Santa Cruz1, M., Pined1, H. M. ,Gonzales1, E. , Rivera1, M., and Nelson1. R. J.1999-2000. Characterization of Phytophthora infestance Colonizing different Solanaceous Species in Peru,with Implications on the Control of Potato Late Blight.CIP Program Report 1999- 2000.

Gevens, A. J., and Seidl, A. C. 2013. First Report of Late Blight Caused by Phytophthora infestans Clonal Lineage US-22 on Tomato and Potato in Wiscons in March 2013, Volume 97, Number 3Pages 423.2 - 423.2.

Goodwin, S. B., Cohen, B. A., and Fry, W. E. 1994.Panglobal distribution of a single clonal lineage of the Irish potato famine fungus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91: 11591-11595.

Goodwin, S. B., Cohen, B. A., Deahl, K. L. and Fry, W. 1994.b Migration from Northern Mexico as the probable cause of recent genetic changes in populations of Phytophthorainfestansin the United States and Canada. Phytopathology 84:553-558.

Goodwin, S. B., Drenth, A., and Fry, W. E. 1992.Cloning and genetic analyses of two highly polymorphic, moderately repetitive nuclear DNAs from Phytophthora infestans.Curr.Genet.22: 107-115.

Goodwin, S.,Sujkowski, L., Fry, W. 1996.Widespread distribution and probable origin of resistance to metalaxylin clonal genotypes of Phytophthora infestans in the United States and western Canada. Phytopathology 86:793–800.

Griffith, G.W., Snell, R., and Shaw, D.S. 1995. Late blight (Phytophthora infestans) on tomato in the tropics. Mycologist 9, 87-89.

54

Hardy, G. E., Barrett S., and Shearer, B. L. 2001 .The future of phosphite as a fungicide to control the peat moss borne plant pathogen Phytophthora cinnamomi in natural ecosystems,” Austria Plant Pathol, vol. 30, pp.133-139.

Harrison, J. G., Barker, H., Lowee, R.,and Rees, A. 1990. Estimation of amounts of Phytophthora infestans mycelium in leaf tissue by enzyme-linked immunosirbent assay. Plant Pathology .39, 274-277.

Hartman, G.L. and Y.H. Huang. 1995. Characteristics of Phytophthora

Haverkort,A.J.,Struik,P.C., Visser,R.G.F., and Jacobsen,E.2009.Applied Biotechnology to Combat Late Blight in Potato Caused by Phytophthora infestans.Potato Res.52: 249-264.

Heffer , V., M.L. Powelson, and K.B. Johnson. 2002. Oomycetes. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PHI-I-2002-0225.

Henderson, C.F. and E. W. Tilton.( 1955). Tests with acaricides against the brow wheat mite, J.Econ.Entomol. 48:157-161.

Howard, H. W. 2008. physiological races of Phytophthora infestans:A comparison of the differential hosts at the plant breeding institute, Cambriding , with thost of the Scottish society for research in plant breeding.Annals of Applied Biology volume 40issue3,pages 584-593.

Hu, C. H., Perez, F. G., Donahoo R. S., McLeod , A., Myers K., Ivors K., Secor G., Roberts P. D., Deahl K, Fry W. E., and Ristaino J. B. 2012. Recent Genotypes of Phytophthora infestans in the Eastern United States Reveal Clonal Populations and Reappearance of Mefenoxam Sensitivity.” Plant Disease 96 (9): 1323–1330.

R.D., Platt, H.W. , Hall, R., 1998. Long-term survival of Phytophthora infestans on liquid media prepared from autoclaved seeds. Canadian J. Plant Pathol., 20: 165–170.

Hussain, T., Singh., B.P., Firoz, A.2013. Real Time PCR based determination of Phytophthora infestans colonization in potato tubers at cold storage in India Online Journal of BioSciences and Informatics, Vol: 4, Issue:2, 159-178.

55

Islam, S.Z., Babadoost, M., Lambert, K.,Ndeme, A., and Fouly,H.M. 2005. Characterization of Phytophthora capsici isolates from processing pumpkin in Illinois, Plant Dis, vol. 89, pp. 191-197.

Jaime-Garcia, R., Trinidad-Correa, R., Felix-Gastelum, R., Orum, T. V., Wasmann, C. C., and Nelson, M. R. 2000. Temporal and spatial patterns of genetic structure of Phytophthora infestans from tomato and potato in the Del Fuerte Valley. Phytopathology 90:1188-1195.

Judelson, H.S. and Tooley P.W. 2000. Enhanced Polymerase Chain Reaction Methods for Detecting and Quantifying Phytophthora infestans in Plants. Phytopathology. 90:1112-1119.

Jyan, M. H., Huang, L. C., Ann, P. J. and Liou, R. F. 2002. Rapid detection of Phytophthora infestans by PCR. Plant Pathol. Bull. 11:25-32.

Jean, B.R., M. Madritch, C.L. Trout, and G. Parra. 1998. PCR amplification of ribosomal DNA for species identification in the plant pathogen genus Phytophthora. Appl. Environ. Microbiol.64, 948-954.

Jong, K.K, Heeom,S, Pyolee, S.,Hee,S, Kamoun,S .2005.A Genetic Marker Associated with the A1 Mating Type Locus in Phytophtho rinfestansJ. Microbiol. Biotechnol. 15(3), 502–509.

Jmour, W. and Hamada, W. 2006.First report of A2 mating type of Phytophthora infestans in Tunisia using molecular markers and some observations on its metalaxyl resistance. Tunisian Journal of Plant Protection 1: 85-91.

Jaimasit, P., and Prakob, W. 2010. Characterization of Phytophthora infestans population in potato crops from Chiang Mai and Tak Provinces. Journal of Agricultural Technology 6(1): 117-125.

Kim,k.S., and Lee, S.Y.2001.Selection of RAPD Markers for Phytophthora infestans and PCR Detection of Phytophthora infestans from Potatoes.The Journal of Microbiology, p.126-132.

Kirk, W.,Felcher, K., Douches, D., Niemira, B., Hammerschmidt, R. 2001.Susceptibility of potato (Solanumtuberosum.) foliage and tubers to the US- 8 genotype of Phytophthora infestans. Am J Potato Res 78:319–322.

56

Kirk, W., P. Wharton, R. Hammerschmidt, F. Abu-el Samen and D. Douches. 2004. Late Blight [Online]. Michigan State University Extension Bulletin E- 2945. East Lansing, MI. Available at: http://www.potatodiseases.org/lateblight.html(verified 18 March 2010).

Kirk, W., Abu-El Samen, F., Tumbalam, P., Wharton, P., Douches, D., Thill, C.,and Thompson ,A. 2009.Impact of different US genotypes of Phytophthora infestans on potato seed tuber rot and plant emergence in a range of cultivars and advanced breeding lines. Potato Res 52:121–14

Keil, S., Marianne,B., Lauer, F., Zellner, M. 2010. Infection rate of potato seed tubers with Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. PPO-Special Report no. 14 .217 - 222.

Kirk, WW., Rojas, A., Tumbalam, PG., Gachango, E., Wharton, PS., El-Samen FA., Douches, D., Coombs, J., Thill, C., and Thompson,A.(2010) Effect of different genotypes of Phytophthora infestans (Mont. de Bary) and temperature on tuber disease development. Am J Potato Res 87:509–520.

Kirk,W.,Wharton,PH., Hammerschmidt,R., El Samen,F.A and Douches,D. Late Blight. 2013.Michigan Potato Diseases.

Lafsson, S. O. and Hermansen, A. 2001. Outbreak of potato late Blight and First Report of Mating Type A2 and Metalaxyl Resistance of phytophthora infestans in Iceland. Plant Disease.85, 559.

Lepovire,ph. 2003.Phytopathologie.Editions De BoeckUniverste Presses agronomiques de Gembloux,Espagne.pp 427.

Murray, M.G., and Thompson, W.F. 1980. Rapid isolation of height molecular weight plant DNA.Nuc.acid.Res.8:4321-4325.

Miklas, P. N., Johnson, E., Stone. V., Beaver, J. S., Montoya, C., and Zapata, M. 1996.Selective mapping of QTL conditioning disease resistance in common bean. Crop Sci. 36:1344-1351.

Munns R.,2000.Wole plant responses to salinity. Aust .J.plant physiol. 13:143- 160.

57

Mitsuru, S.,Tetsuji, O., Yoshihiro, M. 2002. Characteristics of Phytophthora infestans isolates collected from potato crop in all area of Shimabara peninsula of Nagasaki prefecture in 2002. Proceedings of the Association for Plant Protection of Kyushu,49, 9-12.

May, K. J.and Ristaino, J. B.2004. Identity of historic mtDNA haplotype(s) of Phytophthora infestans in historical specimens from the Irish Potato Famine.Mycological .Research .108 (0): 1–9.

Mazakoval, J.,Taborsky,V.,Zouhar,M.,Rysanek,P.,Hausvater,E., and Dolezal,P. 2006. Occurrence and distribution of mating types A1 and A2 of Phytophthora infestans (Mont.) de Bary in the Czech Republic. Plant Protect. Sci., 42: 41–48.

Meirinho,S.,Carvalho, M., Dominguez, Á., and Choupina, A .2010. Isolation and Characterization by Asymmetric PCR of the ENDO1 Gene for Glucan endo-1,3-b-D-glucosidase in Phytophthora cinnamomi associated whit the ink Disease of Castanea sativa Mill.Braz. Arch. Biol. Technol. v.53 n. 3: pp. 513- 518.

Montarry,J.,Andrivon, D.,Glais, I.,Corbiere,R.,Orbiere,. Mialdea,G.and Delmotte, F.2010.Microsatellite markers reveal two admixed geneticgroups and an ongoing displacement within the Frenchpopulation of the invasive plant pathogen Phytophthora infestans.Molecular Ecology .19, 1965–1977.

Ning,Z.G., Huang,F.X., Feng,L.X., Qin,B.X., Yang,Y.H., Chen,Y.H and Xiu- hong LU. 2008. Sensitivities of Phytophthora infestansto Metalaxyl, Cymoxanil, and Dimethomorph. AgriculuralSciences in China, Volum 7, Issue7, page 831- 840.

Piekarczyk, K., Babilas. W., 1986. Occurrence of the most serious diseases and pests of potato in Poland in 1981. Biuletyn Instytutu Ochrony Roslin, 101-134.

Pietkiewicz, JB., 1991. Potato production and protection in Poland in the 1990s. Bulletin OEPP, 21(1):1-7.

Paulr, J. B., and Stephen, C.,Whisson. 2001.Phytophthora infestansenters the genomics era.Molecular Plant Pathology( 5 ) , 257–263.

Reis, A.,Suassuna, N.D., Alfenas, A.C., Mizubuti, E.S.G. 2000.Monitoramento da população de Phytophthora infestans naregião da Zona da Mata de Minas Gerais de 1998 a 2000.Fitopatologia Brasileira, v.27, p.614‑620.

58

Ristaino, J. B., Groves, C. T. and Parra, G. R. 2001.PCR amplification of the Irish potato famine pathogen from historic specimens. Nature 411: 695–697.

Reis, A.,Suassuna, N.D.,Alfenas, A.C.,and Mizubuti, E.S.G. 2002. Monitoramento da população de Phytophthorainfestansnaregiãoda Zona da Mata de Minas Gerais de 1998 a 2000. FitopatologiaBrasileira, v.27, p.614‑620.

Ristaino,J.B.2002.Tracking historic migrations of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.Microbes and Infection 4 .1369–1377.

Rizzo, D. M.,Garbelotto, M., Davidson, J. M., Slaughter, G. W.Koike, S. T.2002. Phytophthorar amorum as the cause of extensive mortality of Quercus spp. and Lithocarpusdensiflorus in California Plant Disease, vol. 86, pp. 205- 214.

Reis, A., Smart, C.D.,Fry., W.E., Maffia, L.A., Mizubuti,E.S.G. 2003.Characterization of isolates of Phytophthora infestans from Southern and Southeastern Brazil from 1998 to 2000. Plant Disease, v.87, p.896‑900.

Ramelli,E.G.,Villegas,S.J,Kafuri,L.A., and Rafael,Arango, E., Isaza, R.E.A. 2009. enters the genomics era.Molecular Plant Pathology2( 5 ) , 257–263.

Ristaino, J. 2010. The 2009 potato and tomato late blight epidemics: genealogical history, multiple sources and migration events. Phytopathology, 100:S161.

Ristainoa, J. B., Hua, C. H., Fittb, B. D. L.2012.Evidence for presence of the founder Ia mtDNA haplotype of Phytophthora infestans in 19th century potato tubers from the Rothamsted archives.Plant Pathology. 62:492-500.

Rojas,J.A,Kirk.W.W, Gachango,E., Douches,D.S,. Hanson,L.E.2013.Tuber Blight Development in Potato Cultivars in Response to Different Genotypes of Phytophthora infestans.Phytopathol 162 (2014) 33–42.

Schiermeier, Q. 2001. Russia needs help to fend off potato famine, researchers warn. Nature410:1011

Shock, C., Saunders,L., and Kimberling,K. 2002.Predicting the Spread and severity of Potato Late Blight (phytophthora infestans) in Oregon 2002. Malheur Experiment Station.-siological and Molecular Plant Pathology,volum 65,n°3,pp.157-167.

59

Tooleyp, P.W. Bunyard, B.A., Carras, M. M., Hatziloukas, E. 1997. Development of PCR Primers from Internal Transcribed Spacer Region 2 for Detection of Phytophthora Species Infecting Potatoes, Appliedand .Environmental Microbiology، Apr. 1997, p. 1467–1475

Trout, C. L.,Ristaino, J. B., Madritch, M. , and Wangsomboondee, T. 1997. Rapid detection of Phytophthora infestansin late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Dis. 81:1042-1048.

Turkensteen, L., Flier, W., Wanningen, R.,and Mulder, A. (2000). Production, survival and infectivity of oospores of Phytophthora infestans . Plant, Pathology 49 (6): 688-696.

Thaler, JS.,Owen. B, Higgins. VJ. (2004) The role of the jasmonate response in plant susceptibility to diverse pathogens with a range of lifestyles. Plant Physiol135: 530-.538.

Thines, M.,and Kamoun, S. (2010). Oomycete–plant coevolution: recent advances and future prospects. Current opinion in plant biology, 13 (4): 427- 433.

Vander Zaagt, D.E., Asscheman, E., Bokx, J.A. , Brinkman, H., Bus, C.B. , Hotsma, P.H., Meijers, C.P., Mulder, A., Scholte, K., Turkenstenn,L.J., and Wustman.R., 1997. Potato Diseases: diseases, pests and defects .Netherlands Potato Consultative Group (NIVAA), Holland,pp.1-85.

Zolan, M. E., and Pukkila, P. J. 1986. Inheritance of DNA methylation in Coprinuscinereus. Mol. Cell. Biol. 6: 195-200.

Zellner, M. 2004. Zur Epidemiologie und Bekämpfung von Phytophthora- Primärbefall an Kartoffeln. Mitt. Biol. Bundeanast -Land- Forstwirtsch 396: 189.

Zhang,X.Z. and Kim,B.S,. 2007. Physiological Races of Phytophthora infestans in Korea. Plant pathol. J. 23 (3) : 219-222.

61

Surveying the distribution of late blight Phytophthora infestans on potato in Syria and Studying the physiological and molecular variability of the pathogen

ABSTRACT

The objectives of this study were to survey the distribution of Phytophthora infestans, the causal agent of potato late blight disease, to Identify and to determinate the mating type of the isolates obtained from infected fields with late blight during the seasons 2011,2013 and 2014 from five major regions where potatoes are grown in Syria (Hama, AL Ghab, Tartous, Latakia and Darra). The incidence of late blight disease was varied according to the geographical region, where the potatoes are grown. It reached to 37.85% in Hama governorate and 32.42% in AL Ghab region. While, it didn`t exceed 11.11% in Latakia and 6.2 % in Tartous. No infected plants were observed in studied site in Darra. In this study, 43 isolates of P. infestans were obtained. Their classification was based on hyphae, sporangiophores and sporangium morphological characteristics. The classification of some isolates was not confirmed as P. infestans according to their morphology. The results of polymerase chain reaction (PCR) in using two specific primers ITS3 and PINF2 for detection of P. infestans showed that 23 of 37 isolates gave bands of 456 bp. This result confirm the morphological classification of these isolates and its belonging to P. infestans. All P. infestans isolates showed the presence of one band with 170 bp when tested by mating type assay using two specific primers INF-1 and INF-2 for the detection of mating type A1. This result indicated that all isolates collected from different potato growing regions in Syria are belonging to the mating type (A1) and no isolates belonged to the other mating type A2. Results of statistical analyses (Genstat) at probability level 5% showed that there was not any effect of fungicide Infinto in inhibiting the growth of P. infestans fungus. While, the fungicide Indofil M-45 could clearly inhibit the growth of the fungus, this also confirms that these isolates are from the mating type A1. This result explains the absence of oospore in local conditions.

61

قدمت هذه الرسالة استكماال لمتطلبات نيل درجة الماجستير في الهندسة الزراعية من قسم وقاية النبات، كلية الزراعة بجامعة دمشق

This Thesis has been submitted as a partial fulfillment of the requirement for the degree of master in Plant Protection Department at the Faculty of Agriculture, Damascus University.

تـــصريح

أصرح بأن هذا البحث " تقصي انتشار الفطر phytophthora infestans المسبب لمرض اللفحة المتأخرة على البطاطا في سوريا ودراسة التنوع الفيزيولوجي

والجزيئي للمسبب" لم يسبق أن قبل ألي شهادة علمية وال هو مقدم حالياً للحصول على شهادة أخرى.

المرشحة

سليمة نور الدين ابراهيم

DECLARATION

It is hereby declared that this work" A Surveying the distribution of late blight phytophthora infestans on potato in Syria and Studying the physiological and molecular variability of the pathogen" has not been accepted for any degree, nor has been submitted concurrently for any other degree.

Candidate Salima Noor Ibraheem

قرار لجنة المناقشة

نوقشت وأجيزت هذه الرسالة في جلسة علنية بتاريخ 6/3/6106 أمام لجنة الحكم

أ.د. جودة فضول ......

األستاذ في قسم وقاية النبات- كلية الزراعة جامعة دمشق رئيسا

أ.د. وليد نفاع ......

األستاذ في قسم وقاية النبات- كلية الزراعة جامعة دمشق عضوا ومشرفا

أ.د. زكريا الناصر ...... عضوا

األستاذ في قسم وقاية النبات- كلية الزراعة جامعة دمشق عضوا

شــــهادة

نشهد بأن العمل الموصوف في هذه الرسالة هو محصلة جهد شخصي قامت به المرشحة سليمة ابراهيم تحت إشراف األستاذ الدكتور وليد نفاع والدكتور انطونيوس الداوود . وان أية معلومات أو ط ارئق أو نتائج أخرى ذكرت في هذه الرسالة قد نسبت إلى مصادرها وم ؤلفيها بوضوح في النص وفي قائمة المراجع.

المشرفان األستاذ الدكتور وليد نفاع الدكتور انطونيوس الداوود

CERTIFICATION It is thereby certified that the work described in this thesis is the result of the authors own Salima Noor Ibraheem investigation under the supervision of Dr. Walid Naffaa and Antoniou Al-Daoude and any references to other research work have been duly acknowledged in this text.

SUPERVISORS

Dr. Walid Naffaa Dr. Antonious Al-Daoude

نصادق على ترشيح المرشح لدرجة الماجستير

المشرف العلمي: أ.د. وليد نفاع

المشرف المشارك: د. أنطونيوس الداوود

شــــكر وتــــقدير

أتقدم بجزيل الشكر والتقدير إلى عمادة كلية الزراعة ممثلة بعميد الكلية األستاذ الدكتور أيمن السعدي واألستاذ الدكتور عبد الوهاب مرعي النائب العلمي، ورئيس قسم وقاية النبات الدكتور غسان ابراهيم، وجميع الهيئة التدريسية في القسم.

كل الشكر والتقدير لألستاذين المشرفين: األستاذ الدكتور وليد نفاع والدكتور أنطونيوس الداوود، على الجهد الذي بذاله في إنجاز العمل ومراجعته وتدقيقه وحرصهما على إخراج العمل بأفضل صورة ممكنة.

عميق االمتنان والشكر للسادة أعضاء لجنة الحكم األستاذ الدكتور جودة فضول و األستاذ الدكتور زكريا الناصر، لجهودهم التي بذلوها في تقويم هذا العمل وتحكيمه إلخراجه بالصورة األمثل.

كما أتوجه بالشكر إلى هيئة الطاقة الذرية- ممثلة بالدكتور نزار مي رعلي رئيس قسم التقانة الحيوية والدكتور عماد عرابي رئيس دائرة األمراض والمهندسة السيدة أمينة والسيد مرعي والسيد عبد والسيدة سناء والسيدة زوزافين واألنسة عال الذين ساهموا قي توفير مستلزمات العمل المخبري ولهم مني كل المحبة والالحترام والتقدير.

كما أتوجه بالشكر إلى الهيئة العامة للبحوث العلمية الزراعية وأخص بالشكر المهندسة صفية المصرية والمهندسة لينا مطرود والمهندس فيصل الفرواتي للمساعدة في انجاز هذا البحث

شــــــــــكر وتــــــــقدير

الشكر لإلنسان الذي أفنى عمره إلسعادنا أبــــي

للشمس التي أنارت حياتي أمــــي

إلى زهرات حياتي في السراء والضراء أخـــــوتي

إلى زوجي العزيز الذي كان عوناً لي رزق

إلى أخي الحبيب وصديق حياتي الذي ساعدني في إنجاز البحث أخي حــــسان

إلى فراشـــــــــاتي الصــــــــغار أطفالي )جــــــــــودي وديــــــــــــــمة وجــــــــــولي(

إلى أختي ورفيقة عمري أمــــــــل