MULTIPLICATION DE Millettia Taolanaroensis Du Puy & Labat ET

UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ********* FACULTE DES SCIENCES DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIES MENTION : BIOCHIMIE FONDAMENTALE ET APPLIQUEE MEMOIRE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE MASTER PARCOURS : BIOTECHNOLOGIES

MULTIPLICATION DE Millettia taolanaroensis Du Puy & Labat ET DE Millettia pinnata L. Panigrahi EN VUE DE LEUR VALORISATION POUR LA RESTAURATION ECOLOGIQUE

Présenté par : RANDRIANIRINA Vahatra Ainga Tahina Soutenu publiquement le 25 Juin 2021 devant les membres de jury composé de : Président : Professeur RAHERIMANDIMBY Marson Encadreurs : Professeur RAMANANKIERANA Heriniaina Docteur RANDRIAMBANONA Herizo Examinateurs : Professeur RASAMIRAVAKA Tsiry Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina

Remerciements

Je tiens tout d’abord à adresser toutes mes reconnaissances et mes dévouements à DIEU tout puissant par sa grâce et sa bonté car j’ai pu mener à terme mon mémoire. Le présent travail est le fruit d’une collaboration étroite entre le Laboratoire de Biotechnologie-Microbiologie de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo et le Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherche sur l’Environnement (CNRE). Nous aimerions dédier nos remerciements les plus sincères aux personnes suivantes :

Messieurs le Professeur RAHERIMANDIMBY Marson et le Docteur RAMAHAZOSOA Irrish Parker, Doyens successifs de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo, Monsieur le Responsable de la Mention Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences le Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna et Monsieur le Responsable du parcours Biotechnologies le Professeur TSIRINIRINDRAVO Herisetra Lalaina de m’avoir permis de soutenir ce mémoire de fin d’étude.

Monsieur le Professeur RAMANANKIERANA Heriniaina et Monsieur le Docteur Yves Jean Michel MONG, les Directeurs successifs du CNRE, Monsieur le Docteur RANDRIAMBANONA Herizo, Chef du Département « Ecosystèmes Terrestres » du CNRE et responsable du projet Mi-Restaure, Monsieur le Professeur RASOLOMAMPIANINA Rado, Chef du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du CNRE de m’avoir accueilli chaleureusement au sein de cette institution.

Ce travail a énormément bénéficié de l’aide financière du programme SEP2D ainsi que des partenaires tels que la société Rio Tinto QMM (QIT Madagascar Minerals) et la société CANOPY Madagascar dont nous tenons à remercier vivement.

Nous adressons également notre profonde gratitude à :

 Professeur RAHERIMANDIBY Marson, de nous avoir fait le grand honneur d’accepter de présider le jury de ce mémoire.  Professeur RAMANANKIERANA Heriniaina, Docteur RANDRIAMBANONA Herizo, qui ont bien voulu encadrer et diriger notre travail ; pour leur disponibilité à la réalisation de ce mémoire malgré leurs multiples responsabilités, leur rigueur scientifique et leur précieux conseils nous ont permis de travailler dans les meilleures conditions.  Professeur Rasamiravaka Tsiry et Docteur RANDRIANIERENANA Ando Lalaniaina, qui ont accepté d’apporter leurs compétences dans le jugement de ce travail, malgré leurs nombreuses occupations.

Aux Docteurs RAKOTOARIMANGA Nirina Christophe, ANDRIANANDRASANA Martial Doret, RAZAKATIANA Adamson Tsoushima Ernest et Madame RATSIZAFY Irinah, RAKOTO JOSEPH Felana Niaina qui ont grandement contribué au succès de ce travail.

Toute l’équipe du LME : chercheurs, stagiaires, personnels et techniciens ; mes remerciements à tous pour votre accueil et tous vos conseils. Je tiens à exprimer également ma profonde reconnaissance à ma famille particulièrement à mes parents qui m’ont toujours soutenu durant toutes mes années d’étude, à mes frères et à ma sœur qui m’encouragent et m’ont réconfortés en tout moment. Enfin, à mes amis et à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à la réalisation de ce mémoire.

Merci à tous !

TABLE DES MATIERES

GLOSSAIRE ------i

LISTE DES ABREVIATIONS ------ii

LISTE DES FIGURES ------iii

LISTE DES TABLEAUX ------iv

LISTE DES ANNEXES ------v

INTRODUCTION ------1

I. GENERALITES ------4

1. Genre Millettia ------4 1.1. Description ------4 1.2. Distribution ------4 1.3. Utilisations ------4

2. Germination ------5 2.1. Définitions ------5 2.2. Processus de germination ------5 2.3. Conditions de germination ------5 2.3.1. Conditions internes de la germination ------6 2.3.2. Conditions externes de la germination ------6

3. Bouturage ------6 3.1. Définition ------6 3.2. Principe de bouturage ------7 3.3. Principaux facteurs de réussite du bouturage ------7 3.3.1. Age du pied mère ------7 3.3.2. Niveau de prélèvement des boutures ------7 3.3.3. Qualité et préparation des boutures ------7 3.3.4. Stade et période de bouturage ------8 3.3.5. Traitements appliqués aux boutures ------8 3.3.6. Composition et propriétés physico-chimiques des substrats ------8

4. Culture in vitro ------8 4.1. Définition ------8 4.2. Principales étapes de la culture in vitro ------9 4.2.1. Phase d’initiation ------9 4.2.2. Phase de multiplication------9 4.2.3. Phase de régénération ------9

4.2.4. Phase d’acclimatation ------9 4.3. Facteur influençant la culture in vitro ------10 4.3.1. Milieu de culture ------10 4.3.1.1. Eléments minéraux ------10 4.3.1.2. Eléments organiques ------10 4.3.1.2.1. Source de carbone ------10 4.3.1.2.2. Vitamines ------11 4.3.1.2.3. Acides aminés ------11 4.3.1.3. Régulateurs de croissance ------11 4.3.1.4. Charbon actif ------12 4.3.1.5. Agent gélifiant ------12 4.3.2. Génotype ------12 4.3.3. Conditions de culture ------12

II. MATERIELS ET METHODES ------13

1. Matériels végétaux ------13

2. Méthodologie ------14 2.1. Germination ------14 2.1.1. Etude morphométrique des fruits et des graines ------14 2.1.2. Test de germination ------15 2.1.3. Conditions de culture ------16 2.1.4. Suivi et évaluations de la germination ------16 2.1.4.1. Durée de vie latente ------17 2.1.4.2. Taux de germination ------17 2.1.4.3. Temps moyen de germination ------17 2.1.5. Observation de la croissance des plantules ------17 2.2. Bouturage ------18 2.2.1. Préparation des boutures ------18 2.2.2. Traitement auxinique des boutures et mise en place des dispositifs ------18 2.2.3. Conditions de culture ------18 2.2.4. Suivi et évaluation des boutures ------19 2.3. Culture in vitro ------19 2.3.1. Préparation et stérilisation du milieu de culture ------19 2.3.2. Autres additifs ------19 2.3.3. Préparation et désinfection du matériel végétal------19 2.3.4. Mise en culture des bourgeons ------21 2.3.5. Conditions de culture ------21 2.3.6. Suivi et évaluation ------21 2.4. Traitements des données et analyses statistiques ------21

III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS ------22

1.1. Germination ------22 1.1.1. Morphométrie ------22 1.1.2. Effets des différents prétraitements sur la germination ------22

1.1.2.1. Durée de vie latente ------22 1.1.2.2. Taux de germination ------24 1.1.2.3. Temps moyen de germination ------25 1.1.3. Effet des différents prétraitements sur la croissance des plantules ------26 1.1.3.1. Nombre de foliole des plantules ------26 1.1.3.2. Hauteur des plantules ------28

1.2. Bouturage ------29 1.2.1. Débourrement des bourgeons ------29 1.2.2. Effet de l’AIB sur l’enracinement des boutures ------30

1.3. Culture in vitro ------30

IV. DISCUSSION ------34

1. Germination ------34 1.1. Morphométrie ------34 1.2. Effet des différents prétraitements sur la germination des graines ------34 1.3. Effets des différents prétraitements sur la croissance des plantules ------36

2. Bouturage ------36

3. Culture in vitro ------37

V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES ------39

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ------41

ANNEXES

RESUME

GLOSSAIRE  Auxine : régulateur de croissance qui favorisent la rhizogenèse et la formation des cals.  Cal : amas de cellules végétales indifférenciées.  Cellule : unité fondamentale d’un organisme vivant capable de se reproduire toute seule.  Différenciation cellulaire : perte progressive des caractères cytologiques et physiologiques des cellules embryonnaires et acquisition des cellules adultes, éventuellement liées à la spécialisation.  Dédifférenciation cellulaire : retour progressif de cellules différenciées vers l’état méristématique.  Espèces pionnières : Espèce capable de coloniser un milieu instable, très pauvre en matière organique et aux conditions édaphiques et climatiques difficiles.  Explant : fragment d’une plante excisée qui est utilisée pour initier la culture in vitro.  Hétérotrophe : qui se nourrit de substances organiques  Photopériode : alternance de période d'illumination et de période sombre dans le cycle journalier d'une plante.  Rhizogenèse : formation de racine.  Totipotence : propriété qu’ont les cellules végétales de pouvoir se dédifférencier, c'est- à-dire de régénérer une plante entière si elles sont cultivées sur un milieu approprié.  Dormance : état de divers organes végétaux (bourgeons, graines, tubercules, …) qu'une contrainte physiologique empêche de se développer.

LISTE DES ABREVIATIONS  °C : Degré Celsius  µ : Micron  AIA : Acide Indole Acétique  AIB : Acide Indole Butyrique  ANA : Acide Naphtalène Acétique  B : Bore  Ca : Calcium  cm : Centimètre  Co : Cobalt  Cu : Cuivre  Dl : Durée de vie latente  g/l : Gramme par litre  I.S.T.A: International Seed Testing Association  IUCN: International Union for Conservation of Nature  j : Jour  K : Potassium  LME : Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement  Mg : Magnésium  min : Minute  mm : Millimètre  Mn : Manganèse  Mo : Molybdène  N : Azote  Ni : Nickel  P : Phosphore  pH : Potentiel d’hydrogène  ppm : Partie par million  S : Souffre  TG : Taux de germination  TMG : Temps moyen de germination  Zn : Zinc

LISTE DES FIGURES Figure 1 : Balance hormonale et réponse physiologique au cours de la culture in vitro (Zryd, 1988)...... 12 Figure 2 : Carte du site de récolte des échantillons ...... 13 Figure 3 : Mesure de la longueur de fruit de Millettia pinnata ...... 14 Figure 4 : Mesure de la longueur de fruit de Millettia taolanaroensis ...... 14 Figure 5 : Mesure de la longueur de graine de Millettia pinnata ...... 14 Figure 6 : Pesage de la graine à la balance de précision ...... 14 Figure 7 : Trempage des graines à l’eau ambiante pendant 10min ...... 15 Figure 8 : Trempage des graines à l’eau ambiante pendant 8h ...... 15 Figure 9 : Trempage des graines à l’acide sulfurique ...... 16 Figure 10 : Rinçage des graines à l’eau courante ...... 16 Figure 11 : Trempage des graines à l’eau chaude dans un bain Marie ...... 16 Figure 12 : Traitement auxinique des boutures ...... 18 Figure 13 : Etapes de la stérilisation des matériels végétaux avant la mise en culture...... 20 Figure 14: Durée de vie latente de la germination de Millettia pinnata ...... 23 Figure 15 : Durée de vie latente de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements ...... 23 Figure 16 : Taux de germination de Millettia pinnata suivant les différents prétraitements .. 24 Figure 17 : Taux de germination de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements...... 24 Figure 18: Variation de la croissance de Millettia pinnata suivant le nombre de foliole ...... 27 Figure 19 : Variation de la croissance de Millettia mill suivant le nombre de foliole ...... 27 Figure 20 : Evolution de la croissance en hauteur de Millettia pinnata ...... 28 Figure 21: Evolution de la croissance en hauteur de Millettia taolanaroensis ...... 28 Figure 22: Débourrement des bourgeons de Millettia pinnata ...... 29 Figure 23 : Débourrement des bourgeons de Millettia taolanaroensis ...... 30 Figure 24: Enracinement de bouture de Millettia pinnata ...... 30 Figure 25: Culture aseptique de Millettia pinnata ...... 32 Figure 26: Culture aseptique de Millettia taolanaroensis ...... 33

iii

LISTE DES TABLEAUX Tableau 1: Caractéristiques des fruits et graines ...... 22 Tableau 2 : Temps moyen de germination de Millettia pinnata...... 25 Tableau 3 : Temps moyen de germination de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements ...... 26 Tableau 4 : Effet de l’auxine (AIB) sur le débourrement des bourgeons de Millettia pinnata...... 29 Tableau 5 : Effet de l’auxine (AIB) sur le débourrement des bourgeons de Millettia taolanaroensis...... 29 Tableau 6: Résultats des tests de désinfection des explants et de production de cultures aseptiques de Millettia pinnata ...... 31 Tableau 7: Résultats des tests de désinfection des explants et de production de cultures aseptiques de Millettia taolanaroensis...... 32

LISTE DES ANNEXES Annexe 1 : Classification systématique des espèces étudiées ...... Annexe 2 : Photo de Millettia taolanaroensis et de Millettia pinnata...... Annexe 3 : Composition du milieu MS (Murashige et Skoog) ......

INTRODUCTION

Introduction

INTRODUCTION Madagascar fait partie des centres de biodiversité les plus importants du monde (Myers et al., 2000). Le nombre des espèces végétales et animales ainsi que leur taux d’endémicité font de la biodiversité malgache un bien public mondial (Carret et al., 2010). Le pays concentre en effet un nombre élevé d’espèces végétales (soit 12 000 espèces de plantes) dont la plupart sont endémiques de la grande île (Koechlin et al., 1974 ; Phillipson, 1994 ; Schatz et al., 1996 ; Goodman & Benstead, 2005). Cependant, cette biodiversité est menacée à cause de la déforestation (CIRAD, 2018). L’analyse de l’évolution du couvert forestier sur six décennies a montré que Madagascar a perdu 44% de ses forêts naturelles depuis les années 1950 (CIRAD, 2018). La déforestation, principalement due à l’action de l’homme (culture sur brûlis), aux feux, aux catastrophes naturelles constitue un des principaux problèmes environnementaux de Madagascar (Minten et al., 2013 ; Styger et al., 2007 ; Scales 2014). Elle est à mettre en relation avec la croissance démographique rapide, la paupérisation généralisée des populations. L'accélération de la réduction du couvert forestier est surtout attribuable à la pratique de la culture itinérante sur brûlis ("tavy") pour assurer les besoins alimentaires d’une frange importante de la population rurale. L’exploitation minière conduit également à une altération des caractéristiques écologiques du milieu dont les premiers symptômes sont la réduction du couvert végétal (Elaw, 2010 ; Fan et al., 2012 ; Wang et al., 2012).

La société QMM (Qit Minerals Madagascar) est parmi ces grandes sociétés d’exploitation minière à Madagascar. Elle exploite de l’ilménite dans la région de Fort-Dauphin localisée dans un environnement naturel très sensible avec un taux d’endémisme élevé et un écosystème littoral unique. Pour réduire les impacts environnementaux, QMM a mis en place un programme environnemental qui inclut, entre autres activités, la conservation des espèces animales et végétales, la restauration, la réhabilitation des sites exploités et l’amélioration des conditions de vie de la population locale (Hong-Wa, 2004).

La famille des FABACEAE pourrait jouer un rôle important dans la restauration des sols appauvris en azote, et pourrait être utilisée comme espèces pionnières prioritaires pour la réhabilitation des forêts tropicales humides dégradées, grâce à sa symbiose fixatrice d’azote avec les rhizobia (Diabate et al., 2005). En outre, cette symbiose permet d’améliorer l’acquisition de l'azote, d’augmenter la séquestration du carbone dans le sol, de stabiliser la matière organique du sol et d’améliorer la fertilité du sol (Moura et al., 2020). D’ailleurs, les bactéries ont des capacités inter-fonctionnelles qui sont essentielles pour les plantes et peuvent améliorer leur croissance (Tang et al., 2020).

Introduction

Millettia taolanaroensis Du Puy & Labat appartenant à la famille des FABACEAE est l’une des espèces endémiques se trouvant uniquement dans les environs de Fort-Dauphin au Sud-Est de Madagascar c’est-à-dire dans la même zone d’exploitation de QMM. C’est une espèce menacée, en danger (EN) selon IUCN (GSPM, 2011), de la forêt littorale, avec une zone d’occupation moins de 500 km2 et une zone d’habitation fragmentée et menacée par l’exploitation et l’extraction minière (Du Puy et al., 2002, Banzouzi et al., 2008) et qui devrait être conservée. Une autre espèce appelée Millettia pinnata L. Panigrahi, introduite à Madagascar, (Kull et al., 2012) est connue comme une source de biodiesel à partir de l’huile de ses graines (Scott et al., 2008 ; Mukta & Sreevalii, 2010). La société Canopy Energy qui travaille dans plusieurs activités du secteur des énergies renouvelables envisage de faire une plantation à grande échelle de Millettia pinnata à Madagascar pour produire de biodiesel. Ainsi, l’exploitation des graines de Millettia pinnata serait une source de revenu assez conséquent pour la population locale. Compte tenu du potentiel écologique et économique du genre Millettia, l’intérêt pour les plantations extensives s’avère indispensable afin de répondre aux besoins des deux sociétés qui est d’utiliser le genre Millettia pour restaurer et ou réhabiliter la zone dégradée par l’exploitation minière, de promouvoir une nouvelle source de revenus pour la population locale et de conserver l’espèce menacée. L’obtention des jeunes plants en masse est donc nécessaire. Cependant, aucune étude sur la multiplication des espèces de Millettia présentes à Madagascar n’a été faite. Pourtant des études sur la germination (Kumar et al., 2007), le bouturage (Rout & Nayak, 2015) et la culture in vitro (Sujatha, 2007) ont déjà été entreprises pour l’espèce Millettia pinnata en Inde. Les avancées des techniques de multiplication asexuée permettent de produire en masse des plants avec des méthodes simples économiques ainsi que des méthodes utilisant des outils puissants aux perspectives industrielles. Ainsi l’objectif principal de cette étude est de développer des techniques de multiplication pour la régénération du genre Millettia à Madagascar en vue de sa conservation et de sa valorisation. Les objectifs spécifiques sont de :  Déterminer le/les prétraitements améliorant la germination des graines et la croissance des plantules  Déterminer le potentiel d’enracinement des boutures et débourrement des bourgeons foliaires  Etablir une culture aseptique pour Millettia pinnata et Millettia taolanaroensis afin d’obtenir des explants viables, sains et indemnes des microorganismes phytopathogènes en vue d’une production massive de plantules.

Introduction

Le présent document rapporte les travaux réalisés en trois parties : la synthèse bibliographique des connaissances actuelles sur les axes de recherches développés, les matériels et les méthodes et enfin les résultats. Ces trois parties sont précédées d’une introduction générale et sont terminées par une partie qui soulignera la discussion suivie de la conclusion et des perspectives.

Synthèse bibliographique

I. GENERALITES 1. Genre Millettia 1.1.Description Le genre Millettia appartient à la famille des FABACEAE sous famille des PAPILIONOIDEAE et dans la tribu de MILLETTIEAE. Il est l’un des genres qui forment le grand groupe central de la tribu des MILLETTIEAE à part Tephrosia, Derris et Lonchocarpus (Geesink, 1984). Généralement, le genre peut être des buissons à grands arbres, hermaphrodites et décidus. Les feuilles sont alternes, composées imparipennées avec 2 à 12 paires de folioles. Les inflorescences sont axillaires ou terminales, pseudoracèmes, souvent produites lorsque les pousses émergent des bourgeons. Les fleurs sont généralement de couleur rose, violette ou bleu et souvent en grappes de 2 à 4 le long de l’axe. Les fruits sont des gousses obovales à oblongues, effilées à la base, plates, quelque peu ligneuses, se divisant éventuellement en 2 valves tordues ou spirales, avec des graines aplaties et discoïdes.

1.2.Distribution Le genre Millettia est originaire de diverses régions humides et subtropicales du monde. Le genre Millettia est composé environ de 260 espèces, dont 121 en Asie tropicale et 139 en Afrique (Banzouzi et al., 2008). Millettia de Madagascar compte 8 espèces qui sont toutes endémiques de la grande île (Labat, 1996 ; Du Puy et al., 2002) et une autre espèce appelée Millettia pinnata qui est introduite à Madagascar (Kull et al., 2012).

1.3.Utilisations Le genre Millettia est multiusage. Le bois peut être utilisé pour la parqueterie lourde, les menuiseries intérieures, les meubles. Le bois est également employé pour les instruments de musique de haute qualité, en particulier les guitares (Tchinda, 2008). Quelques espèces de Millettia malagasy sont aussi connues pour leurs propriétés médicinales (Banzouzi et al., 2008). L’écorce a plusieurs propriétés médicinales pour traiter les infections hépatiques, le diabète, les hernies, les maladies de la peau, la constipation, la fièvre, les rhumatismes, l’épilepsie, la variole, l’œdème, les abcès et les maladies parasitaires (Tchinda, 2008 ; Harrison et al., 2011 ; Rajemiarimiraho et al., 2014). Le genre Millettia est aussi utilisé comme poison de pêche, insecticide, fongicide et vermifuge (Du Puy et al., 2002 ; Tchinda, 2008 ; Rajemiarimiraho et al., 2014).

Synthèse bibliographique

2. Germination 2.1.Définitions Une graine est un organe de dissémination des plantes à fleurs. Elle est formée de trois éléments différents (Young & Young, 1986), dont le tégument (couche protectrice), l’endosperme (tissus de réserves nutritives) et l’embryon. Ce dernier est formé d’une radicule (future racine), d’un ou plusieurs cotylédons, d’une épicotyle (future tige), d’une plumule (bourgeon apical) et d’un hypocotyle qui fait le lien entre les parties aériennes et les parties souterraines de la future plante.

La germination correspond au passage de l’état de vie ralentie à l’état de vie active, où les réserves qui jusque-là assuraient le métabolisme résiduel de l’embryon vont être activement métabolisées pour assurer la croissance de la plantule (Jeam et al., 1998). Selon Côme (1970), une semence a germé lorsqu’elle a donné une plantule capable de croître normalement. Cette définition est également celle de l’I.S.T.A. (1985).

2.2.Processus de germination Le processus de germination se déroule de la manière suivante pour la majorité des angiospermes (Bewley, 1997) :

L’eau est d’abord absorbée par les ouvertures naturelles de la graine, puis diffusée à travers ses tissus (Young & Young, 1986). Les cellules de la graine deviennent ensuite turgescentes. La graine grossit alors en volume et devient davantage perméable à l’oxygène et au dioxyde de carbone. A la suite de l’hydratation, sous l’effet de la dilatation de la graine, les téguments s’ouvrent, et l’embryon subit des changements métaboliques qui réamorcent sa croissance. Des enzymes commencent à dégrader les réserves contenues dans l’albumen ou dans les cotylédons, et les nutriments parviennent aux régions en croissance de l’embryon. La synthèse de molécules donne lieu à une augmentation en taille de l’embryon jusqu’à ce que ce dernier émerge de la graine (Nivot, 2005). Le premier organe à émerger de la graine est généralement la radicule qui constitue la racine embryonnaire. S’ensuit l’émergence de l’épicotyle et les cotylédons, qui constituent la partie aérienne de la plantule (Nivot, 2005).

2.3.Conditions de germination Les facteurs de germination, c’est-à-dire ceux qui interviennent au moment de la germination, sont nombreux. D’après Boualem (2014), la germination dépend des conditions internes liées à l’état physiologique et aux caractéristiques de la graine et des conditions externes liées aux facteurs de l’environnement.

Synthèse bibliographique

2.3.1. Conditions internes de la germination En général, la dormance constitue un facteur majeur inhibant la germination de la graine à part la longévité.

 Dormance : trois (3) formes de dormance ont été définies par Willan (1992) comme un blocage au bon déroulement de la germination d’une graine viable. La dormance tégumentaire où l’enveloppe de la graine empêche le passage de l’eau, de l’oxygène et de la radicule. La dormance embryonnaire qui est liée à l’incapacité de l’embryon à germer. La dormance mixte qui fait intervenir en même temps la dormance tégumentaire et la dormance embryonnaire. Pour lever la dormance, il faut prétraiter les graines.  Longévité : c’est la durée pendant laquelle les semences restent vivantes et capables de garder leur pouvoir germinatif.

2.3.2. Conditions externes de la germination Selon Soltner (2007), la graine exige la réunion des conditions extérieures favorables à savoir l’eau, l’oxygène et la température pour assurer la germination.

 Eau : la germination exige obligatoirement de l’eau, celle-ci doit être apportée à l’état liquide. Elle est remise en solution dans les réserves de la graine, pour être utilisée par l’embryon et active ainsi les divisions cellulaires (Soltner, 2007).  Oxygène : la germination exige obligatoirement de l’oxygène (Soltner, 2007) pour la respiration et pour oxyder les réserves dans la graine en vue d’acquérir de l’énergie (Meyer et al., 2004).  Température : la température est certainement le facteur le plus important de germination compte tenu du rôle qu’elle joue dans la vitesse des réactions biochimiques (Ammari, 2011) et la solubilité de l’oxygène dans l’embryon (Chaussat et al., 1975).

3. Bouturage 3.1. Définition Le bouturage est la régénération conforme d’une plante à partir d’un fragment appelé « bouture », prélevée sur la plante mère et qui peuvent être des tiges, des rameaux, des feuilles ou des racines. Ces boutures sont ensuite placées dans des conditions telles, qu’elles puissent développer les organes qui leurs manquent (Sbay & Lamhamedi, 2015). C’est la technique la plus utilisée pour multiplier des plantes par voie végétative.

Synthèse bibliographique

3.2. Principe de bouturage Il consiste d’abord à séparer une portion de la plante mère et à lui donner les soins indispensables à la reconstitution des organes manquants. Une feuille doit former des bourgeons et des racines, une portion de racine doit former des bourgeons et une portion de tige doit former des racines (Hartmann et al., 1997).

La bouture de tige est le fragment le plus largement utilisé. Ainsi, le processus de l’enracinement des boutures suit trois étapes (Dembélé, 2012) dont :

. L’induction racinaire : des cellules peu différenciées, possédant le potentiel de se dédifférencier, reçoivent le signal que donne la hausse de la teneur en auxine à la base de la bouture. . L’initiation racinaire : après l’induction racinaire, ces cellules réacquièrent leur potentiel méristématique et commencent à se diviser, formant ainsi un amas de cellules. Ces amas prennent graduellement la forme d’un apex de racine. . L’élongation de racine : les cellules continuent de se développer, formant une racine qui traverse les tissus jusqu’à la surface de l’épiderme ou de l’écorce et qui s’allonge à l’extérieur de la tige.

3.3. Principaux facteurs de réussite du bouturage Plusieurs facteurs influencent la réussite de la filière bouturage, notamment l’état physiologique de la plante mère, la période de prélèvement, l’âge du pied mère et les techniques de culture.

3.3.1. Age du pied mère Les boutures prélevées sur des plantes jeunes s’enracinent plus facilement que sur des arbres âgés. La capacité d’enracinement semble donc perdue rapidement avec l’âge croissant du plant (Sbay & Lamhamedi, 2015).

3.3.2. Niveau de prélèvement des boutures Le succès du bouturage est conditionné par la position et la hauteur de prélèvement des boutures sur l’arbre. Plus le rameau prélevé sur le pied mère est plus proche du système racinaire, plus la rhizogenèse est facile (Sbay & Lamhamedi, 2015).

3.3.3. Qualité et préparation des boutures Le plant mère doit croître normalement et être exempt de dommage causé par des ravageurs et des agents pathogènes.

Synthèse bibliographique

Le prélèvement des boutures se fait de manière à éviter que la bouture subisse des stress hydriques. Il est préférable de prélever tôt le matin. La surface foliaire des boutures doit être réduite pour qu’il n’y ait excès de perte d’eau par transpiration. Il est aussi nécessaire de les conserver dans des sacs humides ou dans une glacière pour éviter le dessèchement des boutures, particulièrement lors du trajet entre le site d’échantillonnage des boutures et la station de bouturage (Sbay & Lamhamedi, 2015).

3.3.4. Stade et période de bouturage Pour cibler la meilleure période de récolte, l’état d’activité de la plante peut être observé pour avoir une bonne qualité de bouture. L’époque la plus favorable pour réussir le bouturage est celle avant ou juste après le débourrement des bourgeons de l’arbre (Sbay & Lamhamedi, 2015).

3.3.5. Traitements appliqués aux boutures L’utilisation des phytohormones améliore l’enracinement des boutures. Chez certains nombres d’espèces, la seule hausse de la teneur en Acide Indole Acétique (AIA) à la base de la bouture suffit à induire la formation de racine adventive. Chez d’autres, il est nécessaire de donner un traitement à base d’auxines de synthèse comme l’Acide Indole Butyrique (AIB) et l’Acide Naphtalène Acétique (ANA). Les auxines de synthèse sont plus efficaces que l’auxine naturelle (Dembélé, 2012).

3.3.6. Composition et propriétés physico-chimiques des substrats La proportion de matière organique dans le substrat d’enracinement doit être relativement élevée pour garantir une bonne capacité de rétention en eau. Le pH du substrat ne doit pas dépasser de 6 à 7 (Sbay & Lamhamedi, 2015).

Le substrat d’induction de racine doit être bien aéré, avec une porosité de 20 à 40%, pour éviter l’asphyxie racinaire, la mort des cellules, la pourriture et la prolifération de pathogène. Une quantité d’oxygène suffisante doit être disponible dans le substrat. L’oxygène est essentiel à la respiration cellulaire qui libère l’énergie nécessaire à la division cellulaire. Un substrat bien drainé permet la diffusion de l’oxygène et du gaz carbonique libéré au cours de la respiration (Hartmann et al., 1997).

4. Culture in vitro 4.1. Définition La culture in vitro est une technique utilisée au laboratoire et qui consiste à cultiver un fragment de plante appelée « explant » sur un milieu synthétique, dans un espace réduit et dans

Synthèse bibliographique des conditions stériles (Razanadrasoa, 2014). Les explants peuvent être soit des cellules libres, soit des tissus ou fragments de tissus, soit un organe ou fragment d’organe.

La culture in vitro est basée sur la totipotence cellulaire c’est-à-dire toute cellule végétale est capable de régénérer un autre individu identique à celui dont elle est issue (Boutherin & Brong, 1989 ; El Tachy, 2010).

4.2.Principales étapes de la culture in vitro Quatre principales étapes caractérisent la culture in vitro : l’initiation, la multiplication, la régénération et l’acclimatation.

4.2.1. Phase d’initiation La phase d’initiation consiste à obtenir des souches saines qui vont servir de bases à la production des plants. Trois objectifs importants sont pris en compte dans cette étape : l’asepsie, la survie des explants et la reprise des croissances (Gerart, 2010). Cette phase d’initiation favorise la formation des bourgeons néoformés, adventifs ou axillaires et la contamination est le principal problème à maîtriser.

4.2.2. Phase de multiplication Cette étape permet de favoriser l’apparition des pousses axillaires ou adventives suite au repiquage des plantules obtenues au stade précédent et qui seront à leur tour fragmentées et multipliées (Sbay & Lamhamedi, 2015). Cela permet d’obtenir de façon indéfinie le matériel de départ.

4.2.3. Phase de régénération Cette étape se caractérise par la naissance de racines (rhizogenèse) sur les tiges feuillées obtenues au stade précédent. Le but est alors de différencier les initiaux racinaires et leur développement. Le milieu de culture de cette phase est caractérisé par l’équilibre hormonal (Razafiarison, 2010).

4.2.4. Phase d’acclimatation La phase d’acclimatation consiste à l’adaptation des plants obtenus aux conditions extérieures (Sbay & Lamhamedi, 2015). La base des plants est d’abord nettoyée pour éliminer les géloses avant d’être transférée dans un substrat horticole.

Synthèse bibliographique

4.3.Facteur influençant la culture in vitro La réussite de la culture in vitro nécessite des conditions non négligeables comme le milieu de culture utilisée, la nature de la plante mère et les conditions de culture (asepsie, lumière et la température)

4.3.1. Milieu de culture Un milieu de culture est une solution aqueuse qui est constituée principalement d’eau, des éléments minéraux, des éléments organiques et des phytohormones (Ramanankierana, 2000). Cette solution aqueuse est solidifiée par l’agar et nécessite un chauffage à l’ébullition pendant quelques minutes pour pouvoir se dissoudre et pour être stérile. Tous les éléments essentiels à la croissance de l’explant doivent donc être incorporés au milieu sans qu’une carence puisse survenir.

4.3.1.1.Eléments minéraux Les éléments minéraux sont constitués principalement des macroéléments et des microéléments.

Les macroéléments sont apportés en quantité variable suivant les besoins des souches tissulaires en culture. Pour les équilibres utilisés, on se réfère souvent à des milieux déjà définis comme celui de Murashige et Skoog (1962). Parmi les macroéléments, l’azote (N), le phosphore (P) et le soufre (S) qui sont des constituants fondamentaux des tissus végétaux, ensuite le potassium (K), le calcium (Ca) et le magnésium (Mg) qui interviennent en particulier dans le maintien de l’équilibre entre cations et anions dans la plante.

Les microéléments, parfois appelés « oligoélément » qui jouent un rôle essentiel dans le mécanisme enzymatique comme activateurs ou constituants de coenzymes sont apportés à faible quantité. Les principaux d’entre eux sont : le fer (Fe), le cuivre (Cu), le zinc (Zn), le manganèse (Mn), le nickel (Ni), le molybdène (Mo), le bore (B), le chlore (Cl) et le cobalt (Co). Ils sont apportés dans le milieu le plus souvent pour pallier tout risque de carence, quelquefois pour favoriser la croissance (Boxus et Quoirin, 1974).

4.3.1.2.Eléments organiques 4.3.1.2.1. Source de carbone Du fait de la faible assimilation photosynthétique en culture in vitro, les explants sont hétérotrophes et ils ont besoin d’une source de carbone. Le saccharose est la source de carbone la plus efficace (Gautheret, 1959). La concentration utilisée varie de 20 à 60g/l. Il fournit

Synthèse bibliographique l’énergie nécessaire au développement des explants et maintient une pression osmotique donnée du milieu de culture (Zryd, 1988).

4.3.1.2.2. Vitamines Les vitamines favorisent le développement des explants en culture. Elles ont pour rôle d’intervenir comme catalyseur de diverses réactions métaboliques (Kaul & Sabharwal, 1972). Les vitamines les plus utilisées sont : les thiamines (vitamines B1), le myo-inositol, l’acide nicotinique (niacine) et la pyridoxine (vitamine B6) (Zryd., 1988).

4.3.1.2.3. Acides aminés L’apport d’acides aminés favorise la prolifération de certains composés (niacine, acide folique, biotine…) (Sbay & Lamhamedi, 2015). Les acides aminés fournissent une source d’azote réduit et, comme ions, de l’ammonium, ce qui cause l’acidification du milieu (Gamborg, 1995).

4.3.1.3.Régulateurs de croissance Les régulateurs de croissance sont regroupés en trois grands groupes : (i) l’hormone activatrice (les auxines, les cytokinines et les gibbérellines) (ii) l’hormone inhibitrice (les acides abscissiques) (iii) les auxines et les cytokinines qui sont les plus utilisés en culture in vitro (Murashige, 1973).

 Les auxines favorisent la rhizogenèse et la formation des cals (Sbay & Lamhamedi, 2015). L’Acide Indole Acétique (AIA) est l’auxine extraite des végétaux par contre l’Acide Naphtalène Acétique (ANA), l’Acide Indole Butyrique (AIB) et l’Acide 2,4 Dichlorophenoxyacétique (2,4 D) sont des auxines de synthèse.  Les cytokinines sont connues pour leur rôle dans la maturation des cellules indifférenciées, la néoformation des bourgeons (Fujimura & Komamine, 1975) et l’induction de la multiplication cellulaire. Les plus utilisés sont la kinétine, la zéantine (cytokinine naturelle) et le 6-benzylaminopurine (BAP cytokinine de synthèse).

Le plus souvent, les auxines et les cytokinines sont utilisées en combinaison du fait de leur effet interactif considérable (Murashige, 1973). La figure 1 illustre la balance hormonale entre l’auxine et la cytokinine.

Synthèse bibliographique

Figure 1 : Balance hormonale et réponse physiologique au cours de la culture in vitro (Zryd, 1988).

4.3.1.4.Charbon actif Le charbon actif est une substance adsorbante qui neutralise les produits phénoliques (toxique) libérés par l’explant. Une très faible quantité de charbon possède une capacité d’absorption inégalable sur une surface énorme (Raharimalala, 2016).

4.3.1.5. Agent gélifiant C’est pour solidifier le milieu de culture. La concentration utilisée varie entre 6 à 10 g/l en moyenne. L’intérêt de gélifier le milieu avec de l’agar est de constituer un complexe colloïdal laissant circuler les ions. Par contre, le problème majeur est l’insuffisance d’aération dans le milieu, qui est néfaste à la croissance de certains tissus (Dermaly, 1986).

4.3.2. Génotype Le génotype de la plante intervient de façon importante. Il est démontré qu’au sein d’une même espèce, il existe des différences d’aptitude à la régénération en fonction des génotypes étudiés (Brown et al., 1985). Des variations de réponses d’une espèce à l’autre sont également observées.

4.3.3. Conditions de culture La lumière est indispensable pour réguler certains processus morphogénétiques. Dans la salle de culture, l’intensité lumineuse varie entre 5 à 25 W/m2 ou de 1000 à 5000 lux. La photopériode (durée d’exposition à la lumière) est exprimée en heure/jour.

La température des salles de culture est maintenue entre 22 à 25°C. La température des explants à l’intérieur des récipients de culture peut être supérieure de 2 à 4°C à celle de la salle (Auge et al., 1983 ; Razanadrasoa, 2014).

MATERIELS ET METHODES

Matériels et méthodes

II. MATERIELS ET METHODES 1. Matériels végétaux Les graines, les boutures et les explants de Millettia pinnata et de Millettia taolanaroensis sont les matériels végétaux (leur classification et leurs photos d’illustration sont données en Annexe 1 et 2). Les graines, les boutures et les explants de Millettia pinnata ont été récoltés à Sainte Marie (S 17°05’38,1’’, E 49°48’44,1’’, 3m) et ceux de Millettia taolanaroensis ont été récoltés à Fort Dauphin (S 25°04' 16,4'' ; E 46° 50' 22,8'' ; 3m) (figure 2). Des boutures de Millettia pinnata ont également été collectées à partir des jeunes plantules en pépinière de la Société Canopy à Moramanga. En outre, des explants des deux espèces ont été prélevés à partir des plantules sous serre du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) du Centre National de Recherches sur l’Environnement (CNRE) à Antananarivo.

Figure 2 : Carte du site de récolte des échantillons

Matériels et méthodes

2. Méthodologie 2.1.Germination Cette partie a pour objectif de faire l’étude morphométrique des fruits et des graines et d’effectuer les tests de germination pour Millettia pinnata et Millettia taolanaroensis.

2.1.1. Etude morphométrique des fruits et des graines L’analyse morphologique permet de caractériser les graines étudiées. Vingt-cinq (25) fruits et 25 graines avec 5 répétitions pour chaque espèce ont fait l’objet d’évaluation des paramètres suivants :

 La longueur, la largeur et l’épaisseur des fruits et des graines en mm qui ont été mesurées à l’aide d’un pied à coulisse électronique (figures 3, 4, 5) ;

 Les poids individuels des fruits et des graines qui ont été obtenus en utilisant une balance de précision (figure 6).

Figure 3 : Mesure de la longueur de fruit de Figure 4 : Mesure de la longueur de fruit de Millettia pinnata Millettia taolanaroensis

Figure 5 : Mesure de la longueur de graine de Figure 6 : Pesage de la graine à la balance de

Millettia pinnata précision

Matériels et méthodes

2.1.2. Test de germination L’objectif a été de mettre au point une technique de prétraitement qui favorise la germination des graines de Millettia pinnata et de Millettia taolanaroensis. Les prétraitements ont pour but de lever les dormances des graines mais également d’obtenir une germination uniforme. Les différents prétraitements mécaniques, physiques, chimiques ou autres sont effectués avant les processus de la germination proprement dite pour éliminer la dormance des graines.

De ce fait, les graines après un mois de stockage ont été soumises à différents prétraitements, tel que :

 Le prétraitement à l’eau ambiante : les graines de Millettia pinnata ont été trempées dans l’eau ambiante sous 2 temps différents (20 graines fois 5 répétitions pour chaque temps de trempage), l’une pendant 10 min (figure 7) et l’autre pendant 8h en renouvelant l’eau toutes les heures (figure 8). Pour Millettia taolanaroensis en plus des deux traitements préalablement décrits, un trempage de 15 min a également été effectué étant donné que le tégument paraît plus dur.

Figure 7 : Trempage des graines à l’eau Figure 8 : Trempage des graines à l’eau ambiante

ambiante pendant 10min pendant 8h

 Le prétraitement à l’acide sulfurique concentré (H2SO4 95%) : c’est un mode de

scarification chimique. Les graines des deux espèces ont été scarifiées à l’H2SO4 pendant 15s (figure 9). Pour Millettia taolanaroensis, en plus du trempage à l’acide pendant 15s d’autres graines ont été trempées dans l’acide sulfurique 95% pendant une minute. Ensuite, les graines ont été soigneusement rincées à l’eau courante pour faire disparaître toute trace d’acide avant de les semer (figure 10).

Matériels et méthodes

Figure 9 : Trempage des graines à l’acide Figure 10 : Rinçage des graines à sulfurique l’eau courante  Trempage à l’eau chaude 60°C : c’est une méthode de scarification thermique. Les graines ont été trempées dans l’eau chaude 60°c sous plusieurs temps différents (20 graines fois 5 répétitions pour chaque temps de trempage) : 30s, 5min et 30min. L’expérimentation a été effectuée dans un bain Marie pour garder la température constante (figure 11).

Figure 11 : Trempage des graines à l’eau chaude dans un bain Marie

2.1.3. Conditions de culture Une fois les prétraitements terminés, les graines prétraitées et les graines témoins (20 graines par prétraitement fois 5 répétitions) ont été semées sur du sable stérilisé (substrat de germination) dans un germoir installé sous la serre. Les graines ont été par la suite recouvertes d’une mince couche de sable stérile et arrosées avec de l’eau courante tous les jours. La température d’incubation (température du germoir) a été fixée à 30°C puisque la plupart de ces espèces vivent dans des régions à température annuelle variant de 24 à 30°C. 2.1.4. Suivi et évaluations de la germination Des observations et suivis ont été faits tous les jours. Le test de germination est considéré comme terminé lorsque le nombre de graines ayant germé reste constant pendant 3 jours successifs. Une graine a été considérée germée lorsque les deux feuilles cotylédonaires

Matériels et méthodes apparaissent (Benmahioul et al., 2010). Le nombre de graines germées a été noté à chaque suivi et les paramètres suivants ont été calculés pour évaluer la réussite de la germination. 2.1.4.1.Durée de vie latente La durée de vie latente désigne le temps qui s’écoule entre le premier jour d’incubation et le premier jour de germination.

푫풍 = T1 − T0 Dl : durée de vie latente T1 : premier jour de germination T0 : jour d’incubation 2.1.4.2.Taux de germination Le taux de germination correspond au pourcentage des graines qui ont germées au cours du test de germination (Labouriau, 1983). L’expression mathématique du taux de germination et la suivante : nombre de graines germées 푻품 = × 100 nombre total des graines

Tg : taux de germination 2.1.4.3.Temps moyen de germination Il s’agit d’une durée moyenne entre le début et la fin de germination. La formule est :

푻푴푮 = ∑ 퐽 × 푛 /푁

TMG : Temps Moyen de Germination. J : nombre de jours comptés à partir du commencement de la germination. n : Nombre de graines germées par jour. N : Nombre total de graines germées. 2.1.5. Observation de la croissance des plantules L’obtention des plants vigoureux est également l’objectif de cette étude en plus de la réussite de la germination. Ainsi, les graines ayant germé ont été transférées dans des pots contenant du sable et du sol prélevé à la pépinière du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement (LME) à concentration respective 2/3 et 1/3. La longueur (à partir du collet jusqu’à l’apex de la plantule) et le nombre de folioles de chaque graine ayant germé ont été pris

Matériels et méthodes

1 mois après semis pour chaque traitement afin d’évaluer la vitesse de croissance de chaque plantule. Ce suivi a été effectué toutes les semaines pendant un mois.

2.2.Bouturage Cette partie a pour objectif de déterminer le potentiel d’enracinement des boutures et débourrements des bourgeons foliaires des boutures issues de la tige principale et des rameaux.

2.2.1. Préparation des boutures Les rameaux et les tiges principales ont été découpés à l’aide des sécateurs pour obtenir des coupes nettes. Les boutures à préparer ont une longueur de 15 à 20 cm. Sur chaque bouture il y a 3 à 5 bourgeons. La coupe se fait en biseau, pour une meilleure pénétration dans le sol. Elle se fait juste au-dessus d’un bourgeon à la partie supérieure de la bouture et au- dessous du bourgeon à la base de la bouture. 2.2.2. Traitement auxinique des boutures et mise en place des dispositifs La base des boutures a été trempée pendant 24h dans une solution contenant ou non une concentration déterminée d’AIB (figure 12). Les doses d’AIB utilisées étaient de 0 et 1000 ppm. Ainsi, en fonction de la disponibilité des échantillons, 12 pieds par traitement pour les boutures issues de la tige principale récoltée en pépinière et 12 pieds par traitement pour les boutures issues des rameaux récoltées à Sainte-Marie ont été préparés pour Millettia pinnata, tandis que 40 pieds par traitement pour les boutures issues des rameaux pour Millettia taolanaroensis.

Figure 12 : Traitement auxinique des boutures 2.2.3. Conditions de culture Une fois les traitements à l’auxine terminés, les boutures traitées et les boutures témoins ont été repiquées dans le substrat d’enracinement qui est un mélange de sol et de sable de concentration respective (1/3 ; 2/3) contenu dans un sac en plastique et conditionné en serre.

Matériels et méthodes

2.2.4. Suivi et évaluation des boutures L’arrosage des boutures, les observations et les suivis se font quotidiennement pendant 3 mois. Le bouturage est réussi lorsque les boutures ont développé des racines. Le taux de débourrement des bourgeons et le taux d’enracinement sont les paramètres à suivre pour évaluer la réussite du bouturage. 2.3.Culture in vitro L’objectif de cette étude est de mettre au point des techniques de désinfection des explants. L’efficacité de deux désinfectants : l’hypochlorite de sodium (eau de Javel 2,6% de chlore actif) et l’hypochlorite de calcium ont été comparés.

2.3.1. Préparation et stérilisation du milieu de culture Le milieu de Murashige et Skoog (MS), mis au point en 1962 pour la recherche sur la croissance optimale de cals de tabac, est utilisé comme milieu de base. Il est aussi employé d’une manière très générale pour tous types de cultures in vitro. Les éléments minéraux du milieu Murashige et Skoog sont donnés en annexe II.

Les solutions mères plus concentrées sont préalablement préparées puis conservées au réfrigérateur. Les solutions de macroéléments sont 20 fois plus concentrées. Les solutions de microéléments sont 20 fois plus concentrées. Le complexe vitaminique et organique est 20 fois plus concentré. Des solutions 1N de HCl et de NaOH sont préparées pour ajuster le pH du milieu à 5,7 avant la stérilisation. La stérilisation des milieux de culture est effectuée par autoclavage à une température de 120°C pendant 20 min sous une pression à 1 bar. 2.3.2. Autres additifs Des additifs ont été ajoutés au milieu de MURASHIGE & SKOOG tel que le saccharose comme source de carbone à une concentration de 40 g/l ainsi que la bacto-agar pour solidifier le milieu à une concentration de 10 g/l.

2.3.3. Préparation et désinfection du matériel végétal La stérilisation des explants varie suivant les différents essais qui ont été faits au cours de l’expérimentation. Des améliorations ont été prises au cours des essais. La figure 13 ci-après représente les différentes étapes de la stérilisation des explants. Les rameaux contenant des bourgeons sont prélevés sur les pieds mères, les feuilles ont été débarrassées. Les bourgeons sont ensuite rincés à l’eau du robinet pendant 10 min. Après rinçage, diverses méthodes de désinfection ont été faites. Pour la stérilisation n°1, les explants sont rincés deux fois à l’eau

Matériels et méthodes distillée stérile pendant 1 min puis plongés dans l’eau de Javel pendant 1 min suivie d’un rinçage à l’eau distillée stérile. Ils sont ensuite trempés deux fois dans de l’alcool à 70° pendant 30 s puis rincés à l’eau distillée stérile.

Pour la stérilisation n°2, les explants ont été rincés deux fois à l’eau distillée stérile pendant 1 min à chaque fois puis trempés deux fois dans de l’alcool à 70° pendant 30 s, suivi d’un trempage à l’hypochlorite de calcium (CaOCl2) à 5% pendant 10 min et enfin un rinçage à l’eau distillée stérile. La stérilisation n°3 et n°4 consiste à tremper les explants dans de l’eau savonneuse pendant 7min, puis nettoyée à l’aide d’un coton imbibé de liquide vaisselle, suivi d’un rinçage à l’eau distillée stérile. Ils sont ensuite plongés dans de l’alcool 70° pendant 30 s, répété deux fois puis trempés dans du CaOCl2 (5% pour stérilisation n°3 et 3% pour la stérilisation n°4) pendant 10 min et enfin, les explants sont rincés à l’eau distillée stérile.

Figure 13 : Etapes de la stérilisation des matériels végétaux avant la mise en culture.

Les rameaux désinfectés sont conservés dans des boîtes stériles avant la préparation et la mise en culture. Les bourgeons, 5 à 7 mm de long, sont alors excisés des rameaux.

Matériels et méthodes

2.3.4. Mise en culture des bourgeons Après préparation et désinfection, les bourgeons, long de 5 à 7 mm sont introduits délicatement et de façon rapide dans le milieu de culture. La base étant enfoncée dans le milieu. La rapidité de la manipulation est une des conditions de la réussite des cultures.

Notre objectif est d’obtenir des plantules suffisamment rajeunies et indemnes de toutes sortes de contamination pour être propagées in vitro.

2.3.5. Conditions de culture Les cultures sont conditionnées dans des tubes en verre fermés par des capuchons en coton cardé. Ces capuchons sont scellés par du papier aluminium pour éviter une trop forte évaporation et pour limiter la contamination. Les cultures sont ensuite incubées dans les conditions suivantes :  Température 25°C  Photopériode de 16h  Humidité de l’atmosphère ambiante

2.3.6. Suivi et évaluation Les observations et les suivies se font quotidiennement. Les taux de contamination et les taux de culture aseptiques sont les paramètres à suivre.

2.4.Traitements des données et analyses statistiques Un test de Kruskal-Wallis a été effectué et les moyennes ont été comparées selon la procédure de Dunn suivi de la correction de Bonferroni en utilisant le logiciel XLSTAT version 2014. L’objectif de cette analyse est de rechercher si les facteurs étudiés présentent des différences significatives ou non sur les différents tests effectués, au risque d’erreur ou seuil de probabilité de 5%.

RESULTATS ET INTERPRETATIONS

Résultats et interprétations

III. RESULTATS ET INTERPRETATIONS 1.1.Germination 1.1.1. Morphométrie Le tableau 1 montre les résultats analytiques obtenus de la mesure biométrique de Millettia pinnata et Millettia taolanaroensis. Les variables sont : longueur, largeur, épaisseur, poids des fruits et des graines.

Tableau 1: Caractéristiques des fruits et graines Espèces Millettia pinnata Millettia taolanaroensis Paramètres Longueur (mm) 52,43±6,46 52,75±12,47

Fruits Largeur (mm) 28,93±4,14 15,79±1,98

Epaisseur (mm) 12,45±1,30 5,26±0,68

Poids (mg) 4,81±0,95 1,54±0,68

Longueur (mm) 26,61±1,88 9,71±1,26

Graines Largeur (mm) 20,15±2,07 8,86±0,97

Epaisseur (mm) 9,75±1,40 3,03±1,06

Poids (mg) 3,19±0,69 0,15±0,04

Les mensurations effectuées révèlent que le fruit de Millettia pinnata ont une longueur de 52,43±6,46 mm, 28,93±4,14 mm de large, 4,81±0,95 mm d’épaisseur et pèsent 4,81±0,95 g. Alors que les dimensions de leurs graines sont de 26,61±1,88 mm de long, 20,15±2,07 mm de large, 9,75±1,40 mm d’épaisseur et pèsent 3,19±0,69 g.

Tandis que le fruit de Millettia taolanaroensis ont une longueur de 52,75±12,47 mm, 15,79±1,98mm de large, 5,26±0,68 mm d’épaisseur et pèsent 1,54±0,68 g. Leurs graines ont des dimensions de 0,15±0,04 mm de long, 9,71±1,26 mm de large, 8,86±0,97mm d’épaisseur et pèsent 3,03±1,06 g. 1.1.2. Effets des différents prétraitements sur la germination 1.1.2.1. Durée de vie latente  Millettia pinnata : le temps d’initiation de la germination varie selon les différents prétraitements (figure 14).

Résultats et interprétations

120 100 80

60 (%) 40 20

Taux de germination de Taux 0 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Jours T EC30s EC5min EC30min EF10min EF8h Ac15s

Figure 14: Durée de vie latente de la germination de Millettia pinnata T= témoin ; EC= eau chaude ; EF= eau froide ; Ac= acide sulfurique Les graines prétraitées à l’acide sulfurique pendant 15s ont une durée de vie latente plus courte (12j), suivie des graines trempées à l’eau froide pendant 8h (12,20±0,44j) et les graines témoins (12,60±0,54j). Les graines trempées à l’eau chaude pendant 30s et 30min ont la même durée de vie latente (13±0,00j), ensuite les graines prétraitées à l’eau chaude 5min avec une durée de vie latente de (13±0,54j). Les graines prétraitées à l’eau froide pendant 10min ont un temps de latence plus long (14±0,00j).

 Millettia taolanaroensis : la figure 15 montre la durée de vie latente de germination de Millettia taolanaroensis en fonction des différents prétraitements.

120 100 80 60 40 20 0 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Jours

Taux de germination (%) germination de Taux T EC30s EC5min EC30min EF10min EF15min EF8h Ac15s Ac1min

Figure 15 : Durée de vie latente de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements T= témoin ; EC= eau chaude ; EF= eau froide ; Ac= acide sulfurique

Le temps d’initiation des graines de Millettia taolanaroensis varie entre 9 à 13j selon les prétraitements. Le prétraitement à l’acide sulfurique pendant 1min a permis d’écourter la durée de vie latente des graines (9±0,44j) suivi des graines scarifiées à l’acide sulfurique pendant 15s (10±0,00j), des graines trempées à l’eau chaude pendant 30s (10±0,44j) et des graines trempées à l’eau ambiante pendant 8h (10±0,83j). Les graines trempées à l’eau

Résultats et interprétations chaude pendant 5min, eau froide 10min et eau froide 15min ont des durées de vie latente respective 11±0,00j ; 11±0,44j et 12±0,83j. Les graines prétraitées à l’eau chaude 30 min et les graines témoins ont une durée de vie latente plus longue (13±0,00j et 13±0,54j).

1.1.2.2.Taux de germination  Millettia pinnata : la figure 16 montre les taux de germination de Millettia pinnata.

120 (a) (a) (a) (a) (a) (a) 100 (a) 80 60

(%) 40 20 0

Taux de germination germination de Taux T EC30s EC5min EC30min EF10min EF8h Ac15s Prétraitements

Figure 16 : Taux de germination de Millettia pinnata suivant les différents prétraitements T= témoin ; EC= eau chaude ; EF= eau froide ; Ac= acide sulfurique

Aucune différence significative n’a été observée pour le taux de germination entre les graines prétraitées et les graines témoins. Le taux de germination élevé (100%) a été observé sur les graines traitées à l’eau chaude 30s, eau chaude 30min, eau froide 8h et les graines témoins. Des taux de germination inférieurs à ceux des graines témoins ont été observé chez les graines trempées à l’eau froide 10min (90±10%), acide sulfurique 15s (85±16,58%) et les graines trempées à l’eau chaude pendant 5min (85±8,66%).

 Millettia taolanaroensis : la figure 17 représente le taux de germination de Millettia taolanaroensis.

120 (b) (b) (ab) (ab) (ab) (ab) 100 (ab) 80 (a) (a) 60

(%) 40 20 0

Taux de germination germination de Taux T EC30s EC5min EC30min EF10min EF15min EF8h Ac15s Ac1min Prétraitements

Figure 17 : Taux de germination de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements. T= témoin ; EC= eau chaude ; EF= eau froide ; Ac= acide sulfurique

Résultats et interprétations

Les prétraitements améliorent le taux de germination de Millettia taolanaroensis, une différence significative entre les graines prétraitées et les graines témoins a été observée. Le taux de germination le plus élevé (100%) a été obtenu sur les graines trempées à l’eau chaude (30 s et 5 min) suivi des graines trempées à l’acide sulfurique pendant 1min et des graines trempées à l’eau froide (15 min ; 8 h) avec un taux de germination de 95±8,66%. Les prétraitements à l’eau froide pendant 10 min et à l’acide sulfurique pendant 15s ont des taux de germination respective de 90±10% et 85±8,66%. Le taux de germination le plus faible a été observé chez les graines prétraitées à l’eau chaude 30 min (57±14,83%) et les graines témoins (50±10%).

1.1.2.3.Temps moyen de germination  Millettia pinnata : le tableau 2 donne le temps moyen de germination de Millettia pinnata.

Tableau 2 : Temps moyen de germination de Millettia pinnata.

Prétraitement TMG (j) Groupes

T 13,95±0,38 ab EC30s 16±0,50 bc EC5min 15±0,49 abc EC30min 14±0,31 abc EF10min 16±0,59 c EF8h 15±0,47 abc Ac15s 13±0,30 a Les moyennes classées dans le même groupe ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% (test de Kruskal-Wallis). T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

Les graines prétraitées à l’acide sulfurique présentent un temps moyen de germination plus court (13±0,30 j) suivi des graines témoins (13,95±0,38 j). Ensuite les graines prétraitées à l’eau chaude 30 min, à l’eau froide 8 h et à l’eau chaude 5min ont des temps moyens de germination respectifs 14±0,31j ; 15±0,47j et 15±0,49j. Les temps moyens de germination plus longs ont été observés chez les graines traitées à l’eau chaude pendant 30s (16±0,50 j) et les graines prétraitées à l’eau froide 10min (16±0,59 j).

Résultats et interprétations

 Millettia taolanaroensis : la variation du temps moyen de germination est représentée dans le tableau 3. Tableau 3 : Temps moyen de germination de Millettia taolanaroensis suivant les différents prétraitements

Prétraitement TMG (j) Groupes T 18±5,18 ab EC30s 16±0,51 ab EC5min 16±0,68 ab EC30min 17±0,25 ab EF10min 18±1,06 b EF15min 19±1,94 b EF8h 16±0,91 ab Ac15s 15±1,85 ab Ac1min 12±0,56 a Les moyennes classées dans le même groupe ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% (test de Kruskal-Wallis). T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

L’analyse statistique montre que le temps moyen de germination des graines prétraitées et des graines témoins sont significativement différents (p=0,0017, alpha=0,05). Le prétraitement à l’acide sulfurique pendant 1min présent un temps moyen de germination plus court (12±0,56 j) suivi par les graines trempées à l’acide sulfurique pendant 15s (15±1,85 j). Les prétraitements à l’eau froide 8 h, à l’eau chaude 30 s et à l’eau chaude 5min ont des temps moyens de germination respectifs 16±0,91j ; 16±0,51j et 16±0,68 j. Les trempages à l’eau chaude pendant 30min et à l’eau froide pendant 10 min ont des temps moyens de germination respectifs 17±0,25 j et 18±1,06 j. Les graines témoins ont eu un temps moyen de germination de 18±5,18j et les graines trempées à l’eau froide 15min ont un temps moyen de germination plus long (19±1,94 j)

1.1.3. Effet des différents prétraitements sur la croissance des plantules 1.1.3.1.Nombre de foliole des plantules  Millettia pinnata : la figure 18 montre les variations de la croissance en nombre de folioles de Millettia pinnata.

Résultats et interprétations

16 14 12 10 8 6 4

2 Nombre de folioles de Nombre 0 4 semaines 5 semaines 6 semaines 7 semaines T EC30s EC5min EC30min EF10min EF8h Ac15s

Figure 18: Variation de la croissance de Millettia pinnata suivant le nombre de foliole T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

Statistiquement, le nombre de folioles des plantules issues des graines prétraitées à l’eau chaude 5min est élevé (7±1,01) par rapport aux autres plantules issues des autres prétraitements des graines (environ 5 folioles) après 4 semaines. Le nombre de folioles le plus faible a été observé chez les graines prétraitées à l’eau froide pendant 10 min (5±1,73). Aux 5, 6 et 7ème semaines, aucune différence significative n’a été observée.

 Millettia taolanaroensis : la figure 19 montre l’évolution de la croissance en nombre de folioles de Millettia taolanaroensis.

Nombre de folioles de Nombre 0 4 semaines 5 semaines 6 semaines 7 semaines

T EC30s EC5min EC30min EF10min EF15min EF8h Ac15s Ac1min

Figure 19 : Variation de la croissance de Millettia taolanaroensis suivant le nombre de foliole T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

Le test de Kruskal-Wallis a montré qu’il y a une différence significative entre les différents prétraitements à la 5ème semaine (p=0,000 ; alpha= 0,05). Le nombre de folioles des plantules issues des graines prétraitées à l’acide sulfurique 1 min est élevé (17,20±4,39) par rapport aux autres plantules issues des autres prétraitements des graines (12 à 16 folioles).

Résultats et interprétations

1.1.3.2.Hauteur des plantules  Millettia pinnata : la figure 20 montre l’évolution de la croissance en hauteur de Millettia pinnata.

35 30 25 20 15

10 Hauteur (cm) Hauteur 5 0 4 semaines 5 semaines 6 semaines 7 semaines T EC30s EC5min EC30min EF10min EF8h Ac15s Figure 20 : Evolution de la croissance en hauteur de Millettia pinnata T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

L’analyse statistique a montré qu’aucune différence significative n’a été observée à la 7ème semaine (p=0,068, alpha=0,05). Les plantules atteignent une hauteur moyenne de 24,78±5,42 cm à 30,20±5,66 cm après 7 semaines de semis.

 Millettia taolanaroensis : la figure 21 montre l’évolution de la croissance en hauteur de Millettia taolanaroensis.

1 Hauteur (cm) Hauteur 0 4 semaines 5semaine 6 semaines 7 semaines T EC30s EC5min EC30min EF10min EF15min EF8h Ac15s Ac1min

Figure 21: Evolution de la croissance en hauteur de Millettia taolanaroensis T= témoin ; EC=eau chaude ; EF=eau froide ; Ac= acide sulfurique

L’analyse statistique montre des différences significatives entre la hauteur moyenne des plantules issues de différents prétraitements (p=0,027 ; alpha= 0,05). La hauteur des plantules issues des graines trempées à l’acide sulfurique pendant 15 s est plus élevée par rapport à celle

Résultats et interprétations des autres prétraitements. Les plantules les plus courtes ont été obtenues avec le traitement avec l’eau ambiante pendant 15 min.

1.2.Bouturage 1.2.1. Débourrement des bourgeons  Millettia pinnata : le tableau 4 montre l’effet de l’auxine sur le débourrement des bourgeons.

Tableau 4 : Effet de l’auxine (AIB) sur le débourrement des bourgeons de Millettia pinnata.

Types de boutures Témoins AIB 1000ppm

Taux de Rameaux 0% 14,28% débourrement Tige principal 53,33% 25%

Un faible taux de débourrement a été enregistré chez les boutures issues des rameaux traités à l’AIB 1000ppm (14,28%). Pour les boutures issues de la tige principale récoltée à Moramanga, les boutures témoins (53,33%) ont un taux de débourrement plus élevé que les boutures traitées à l’AIB 1000ppm (25%). La figure 22 illustre le débourrement de bourgeon pour la bouture de Millettia pinnata

Figure 22: Débourrement des bourgeons de Millettia pinnata  Millettia taolanaroensis : le taux de débourrement des bourgeons pour Millettia taolanaroensis est faible (tableau 5). Tableau 5 : Effet de l’auxine (AIB) sur le débourrement des bourgeons de Millettia taolanaroensis. Témoin AIB 1000 ppm Taux de Rameaux 5% 2,5% débourrement Tige principal - -

Résultats et interprétations

Les boutures témoins ont donné un taux de débourrement de 5% et les boutures traitées à l’AIB 1000 ppm ont donné un taux de débourrements de 2,5%. La figure 23 illustre le débourrement de bourgeon de bouture de Millettia taolanaroensis.

Figure 23 : Débourrement des bourgeons de Millettia taolanaroensis

1.2.2. Effet de l’AIB sur l’enracinement des boutures  Millettia pinnata : Seules les boutures de Millettia pinnata issues de la tige principale récoltée à la pépinière (Moramanga) ont donné des racines (Figure 24) et avec un taux faible. Les boutures trempées à l’AIB 1000 ppm ont présenté le taux le plus élevé (16,66%) suivi des boutures témoins qui ont eu un taux d’enracinement de 9,09%.

Figure 24: Enracinement de bouture de Millettia pinnata

 Millettia taolanaroensis : Aucune bouture ne s’est enracinée pour Millettia taolanaroensis ; les boutures qui ont débourré ne présentent aucune racine.

1.3.Culture in vitro  Millettia pinnata : Le tableau 6 résume les résultats de la production de culture aseptique pour Millettia pinnata.

Résultats et interprétations

Tableau 6: Résultats des tests de désinfection des explants et de production de cultures aseptiques de Millettia pinnata

Millettia pinnata Essai 1 2 3 4 5 Méthode de Stérilisation n°1 Stérilisation n°2 Stérilisation n°3 Stérilisation n°3 Stérilisation n°3 stérilisation (ED+EJ+Alcool) (ED+CaOCl2+Alcool) (ED+LV+CaOCl2+Alcool) (ED+LV+CaOCl2+Alcool) (ED+LV+CaOCl2+Alcool) Lieu de collecte serre serre pépinière sur le terrain serre Nombres d'explants 24 24 48 48 48 2 contaminés et Résultats après 1 à 5j 24 contaminés 1 contaminés 7 contaminés 3 contaminés 3 brunis 6 contaminés et Résultats après 5 à 10j 24 contaminés 16 contaminés 15 contaminés 8 contaminés 4 brunis Résultats après 10 à 10 contaminés et 24 contaminés 24 contaminés 48 contaminés 8 contaminés 15j 7 brunis Résultats après 15 à 23 contaminés et 24 contaminés 24 contaminés 48 contaminés 19 contaminés 20j 8 brunis Résultats après 20 à 33 contaminés et 24 contaminés 24 contaminés 48 contaminés 26 contaminés 25j 8 brunis Résultats après 25 à 33 contaminés et 24 contaminés 24 contaminés 48 contaminés 29 contaminés 30j 8 brunis Taux de 100% 100% 85% 100% 60% contamination Taux de culture 0% 0% 15% 0% 40% aseptique

ED : eau distillé ; EJ : eau de Javel ; LV : liquide vaisselle ; CaOCl2 : hypochlorite de calcium ; j : jour 31

Résultats et interprétations

La méthode de désinfection n° 1 et 2 n’ont donné aucune culture aseptique, tandis que la méthode de désinfection n°3 a donné des cultures aseptiques de 40% pour les explants récoltés en serre, 15% pour les explants récoltés en pépinière. Pour les explants récoltés sur terrain, aucune culture aseptique n’a été obtenue. La figure 25 illustre les cultures aseptiques obtenues pour Millettia pinnata.

Figure 25: Culture aseptique de Millettia pinnata  Millettia taolanaroensis : Le tableau 7 montre les résultats de l’établissement de la culture aseptique de Millettia taolanaroensis.

Tableau 7: Résultats des tests de désinfection des explants et de production de cultures aseptiques de Millettia taolanaroensis.

Essai 1 2 Stérilisation n°3 Stérilisation n°4 Méthode de stérilisation (ED+LV+CaOCl2+Alcool) (ED+LV+CaOCl2+Alcool) Lieu de collecte sur terrain serre Nombres d'explants 24 24 Résultats après 1 à 5j 24 contaminés 6 contaminés et 12 brunis Résultats après 5 à 10j 24 contaminés 10 contaminés et 12 brunis Résultats après 10 à 15j 24 contaminés 15 contaminés et 12 brunis Résultats après 15 à 20j 24 contaminés 16 contaminés et 12 brunis Résultats après 20 à 25j 24 contaminés 16 contaminés et 12 brunis Résultats après 25 à 30j 24 contaminés 16 contaminés et 12 brunis Taux de contamination 100% 98% Taux de culture aseptique 0% 2%

ED : eau distillé ; EJ : eau de Javel ; LV : liquide vaisselle ; CaOCl2 : hypochlorite de calcium ; j : jour

Résultats et interprétations

Les explants mis en culture suivant la méthode de désinfection n°3 ont été tous contaminés. Alors que la méthode de désinfection n°4 a donné une culture aseptique de 2,08%. La figure 26 montre la culture aseptique obtenue pour Millettia taolanaroensis.

Figure 26: Culture aseptique de Millettia taolanaroensis

DISCUSSION

Discussion

IV. DISCUSSION 1. Germination 1.1.Morphométrie L’analyse morphométrique montre que Millettia pinnata a un fruit de 52,43±6,46 mm de long, 28,93±4,14 mm de large et 12,45±1,30 mm d’épaisseur, les graines ont une longueur de 26,61±1,88 mm, 20,15±2,07 mm de large et une épaisseur de 9,75±1,40 mm. Ces résultats corroborent ceux d’Orwa et al. (2009) sur les caractéristiques des fruits (3-8 cm de long, 2-3,5 cm de large et 1-1,5 cm d’épaisseur) et des graines (1,5-2,5 cm de long, 1,2-2 cm de large et 0,8-0,9 cm d’épaisseur) de Millettia pinnata étudiés en Kenya. Pour Millettia taolanaroensis, les fruits sont longs de 52,75±12,47 mm, larges de 15,79±1,98mm, et ont une épaisseur de 5,26±0,68 mm. Leurs graines mesurent 9,71±1,26 mm de long, 8,86±0,97 mm de large et 3,03±1,06 mm d’épaisseur. Ces mensurations sont similaires aux caractéristiques des fruits taolanaroensis (40-90mm de long et 12-19 mm de large) et des graines (9-10 mm de long et 7-8 mm de large) de Millettia obtenues par Labat & Du Puy (1995).

Dans cette étude, l’importance de la caractérisation de la taille des graines réside sur le fait que dans la littérature plusieurs facteurs affectent le temps de germination y compris la taille des graines (Bu et al., 2008).

1.2.Effet des différents prétraitements sur la germination des graines  Millettia pinnata :

Un taux de germination de 100% a été obtenu avec une durée de vie latente de 12±0,54j et un temps moyen de germination de 13,95±0,38j chez les graines témoins. Ces résultats indiquent que les graines de Millettia pinnata stockées pendant un mois n’ont pas de dormance. Ils confirment donc les propos de Scott et al., (2008) qui ont rapporté que la dormance des graines de M. pinnata ne se manifeste qu’à partir de trois mois de stockage.

La durée de vie latente de germination plus courte a été observée chez les graines traitées à l’acide sulfurique pendant 15 s. Ceci peut être expliqué par le fait que l’acide sulfurique perturbe le tégument de la graine en permettant l’entrée de l’eau et en déclenchant la germination (Nikoleave, 1977 ; Amusa, 2011 ; Mojeremane et al., 2020) par sa capacité à éliminer la couche cireuse ou la matière dure du tégument de la graine (Bhattacharya & Saha 1990, Agbogidi et al., 2007).

Discussion

Aucune différence significative n’a été observée pour le taux de germination. Par contre le prétraitement à l’eau chaude 60°C pendant 30min et le trempage à l’eau froide pendant 8h sont les plus rapides et ont permis d’obtenir un taux de germination maximal (100%) au bout de 16j. Mukta & Sreevalii (2010) ont également trouvé que le trempage à l’eau chaude 50°C pendant 15 min est le plus rapide avec un taux de germination maximal 98%. Kumar et al. (2007), ont obtenu une augmentation de la germination de 44 à 100%, correspondant à une augmentation de 56% pour les graines traitées à l’eau chaude 60°C pendant 30min par rapport au témoin.

Les graines traitées à l’acide sulfurique pendant 15 s ont une durée de vie latente de 12j et un temps moyen de germination de 13,60±0,30j qui sont semblables à celle du témoin, mais un taux de germination inférieur aux graines non traitées. Selon Rabemirindra (2015), une immersion prolongée des graines dans l’acide peut endommager l’embryon qui provoque cette baisse du taux de germination.

 Millettia taolanaroensis

Pour Millettia taolanaroensis, les graines témoins ont une durée de vie latente plus longue par rapport aux graines prétraitées. Le prétraitement à l’acide sulfurique améliore le temps d’initiation de germination. Pour comparaison, Rabetokotany (2004) a indiqué que les prétraitements des graines de Dalbergia trichocarpa ont permis d’écourter la durée de vie latente de germination.

Environ 95% des graines prétraitées à l’acide sulfurique ont germé après 18j avec un temps moyen de germination de 11,89±0,56j. Selon Bio Yandou et al., (2019), l’acide sulfurique fragilise la surface tégumentaire en laissant une surface mate et piquetée, ce qui permet notamment une meilleure imbibition de la graine. Plusieurs auteurs ont également démontré que le traitement à l’acide sulfurique est utilisé pour lever la dormance des graines (Rasebeka et al., 2014 ; Aref et al., 2011). Le trempage à l’eau chaude pendant 30 s et 5min ont donné un taux de germination de 100%. Le prétraitement à l’eau chaude pendant 30 min a un taux de germination de 57±14,83% qui est significativement non différent des graines témoins. La baisse du taux de germination avec la durée de trempage de 30 min serait expliquée par le fait que le chauffage excessif aurait endommagé les graines (Phartyal et al., 2005) en affectant l’embryon (Dantani et al., 2019). Comme la scarification des graines par des acides et l’utilisation des prétraitements à l’eau chaude améliorent la germination des graines ayant des tégument dur (McDonald & Omoruyi 2003 ; Likoswe et al., 2008 ; Botsheleng et al., 2014, Mojeremane et al., 2017), cela nous indique que l’espèce Millettia taolanaroensis a également

Discussion des téguments durs. D’après Falemara et al., en 2014, ce type de tégument exerce une dormance physique. Willan a confirmé en 1992 que ce type d’inhibition est présente chez plusieurs genres de légumineuses.

1.3.Effets des différents prétraitements sur la croissance des plantules  Millettia pinnata

Cette étude a montré que les performances et la croissance des plantules issues des différents prétraitements suivent le même rythme. Selon Houehounha et al., (2009), la croissance et la vigueur des plantules dépendent de la disponibilité des réserves nutritives de la graine. On peut déduire alors que les graines prétraitées et les témoins ont les mêmes taux de réserves nutritives nécessaires à la croissance des plantules.

 Millettia taolanaroensis

La hauteur des plantules issues des graines prétraitées à l’acide sulfurique est significativement différente par rapport aux autres plantules. Ceci est dû au fait que les graines prétraitées à l’acide ont une durée de vie latente plus courte par rapport aux autres prétraitements. De plus, le nombre de folioles issues des prétraitements à l’acide sulfurique est significativement supérieur aux autres prétraitements. Dwain (1999) a démontré que le développement de la plante est assuré par le nombre de feuilles une fois la première feuille apparue.

2. Bouturage Les essais de bouturage de Millettia pinnata montrent que les boutures issues de la tige principale récoltée en pépinière ont un taux de débourrement supérieur aux boutures issues des rameaux récoltés sur le terrain. Selon Wright (1975), le débourrement des bourgeons dépend des réserves nutritives contenues dans les boutures alors que les boutures plus âgées sont fortement lignifiées et renferment peu de réserves nutritives pour assurer la reprise des boutures (Nguema et al., 2013). Pourtant les boutures récoltées sur le terrain sont âgées.

Pour les boutures issues des pépinières, le taux de débourrement des boutures témoins est supérieur à celui des boutures traitées à l’AIB 1000ppm. Le nombre de débourrement des bourgeons diminue avec l’augmentation du taux d’AIB vue que cette hormone de synthèse, à de fortes concentrations, inhibe le transport membranaire et le métabolisme des acides aminés (Tlalka et al., 2008).

Discussion

Aucun enracinement n’a été observé chez les boutures issues des rameaux. Le taux d’enracinement le plus élevé ont été observé chez les boutures issues de la tige principale traitées à l’AIB 1000 ppm (16,66%), suivi des boutures témoins (9,09%). De nombreux auteurs ont rapporté que le traitement des boutures à l’auxine augmente le pourcentage des boutures enracinées (Hudson et al., 1990 ; Hussen & Mohinder, 2006). Pour les boutures de Millettia taolanaroensis, aucun enracinement n’a été observé. La faible performance des boutures serait liée à l’âge du pied mère. La capacité d’enracinement est rapidement perdue avec l’âge croissant du plant (Sbay & Lamhamedi., 2015). Ceci peut être expliqué par le fait que la position des boutures de Millettia taolanaroensis sur la plante mère s’éloigne du système racinaire, alors que plus le rameau prélevé sur l’arbre est proche du système racinaire, plus la rhizogenèse sera facile (Sbay & Lamhamedi., 2015). 3. Culture in vitro Le problème majeur de cette étape réside dans la désinfection des explants. La majeure partie des contaminations apparues au cours des tests est due au développement rapide de champignon microscopique sur le milieu. Quelquefois les bactéries apparaissent, mais tardent par rapport au champignon. L’hypochlorite de sodium et l’hypochlorite de calcium sont souvent utilisés pour leur activité antimicrobienne, mais l’hypochlorite de sodium est moins recommandé pour une utilisation à longue durée à cause de sa capacité à pénétrer dans les cellules et à devenir ainsi toxique (Boccon-Gibod, 1989 ; Boxus et al., 2003).

Le taux de contamination varie en fonction de la technique de désinfection, l’âge et la taille des explants. Les explants stérilisés à l’hypochlorite de sodium (eau de Javel 2,6% de chlore actif) n’ont donné aucune culture aseptique par rapport à l’hypochlorite de calcium 5%. Selon Auge et al., (1983), la stérilisation à l'hypochlorite de calcium est préférable à l'hypochlorite de sodium. Ramamonjiarisoa (2004) a noté que la destruction des microorganismes avec l’hypochlorite de sodium seul n’est pas totale. Les explants jeunes issus de la germination cultivée en serre du LME ont donné des résultats supérieurs à ceux issus de la pépinière. Ces résultats sont similaires à ceux de Dorion et al., (1987) qui ont trouvé que les explants de l’orme provenant d’un matériel végétal préparé en serre sont les plus réactifs alors que ceux prélevés des sujets âgés en plein air sont inhibés par les fortes contaminations. Pour Millettia taolanaroensis, les explants sur terrain sont tous contaminés. Les explants jeunes issus de la germination ont donné des résultats inférieurs à 5%. Selon Skirvin et al., (1999), la présence des poils sur l’explant empêche le désinfectant d’être en contact direct avec la surface des explants et rend les explants pubescents plus difficiles à décontaminer.

Discussion

En ce qui concerne la culture aseptique, les bourgeons mis en culture permettent d’obtenir des tiges feuillées avec des bourgeons néoformés et/ou racine. Ramanankierana (2000), a rapporté que l’obtention des tiges feuillées montre la capacité des bourgeons à produire des plantules axéniques rajeunies. Pourtant, la croissance des plantules ralentit après quelques semaines de culture, il est alors nécessaire de réaliser le microbouturage des cultures aseptiques sur un milieu neuf afin de les multiplier.

CONCLUSION ET PERSPECTIVEs

Conclusion et perspectives

V. CONCLUSION ET PERSPECTIVES

Les effets de la variation des prétraitements sur la germination et la croissance de Millettia pinnata et Millettia taolanaroensis ont été étudiés. En général, les graines de Millettia pinnata ont commencé à germer au 12ème jour pour les graines traitées à l’acide sulfurique pendant 15s, les graines trempées à l’eau froide pendant 8h et les graines témoins. Alors que pour Millettia taolanaroensis, la germination a commencé au 9ème jour pour les graines traitées à l’acide sulfurique pendant 1 min. Le pourcentage de germination de Millettia pinnata est élevé même pour les graines non traitées, mais le plus rapide est le prétraitement à l’eau chaude 60°C pendant 30 min. Par contre les différents prétraitements ont amélioré le taux de germination de Millettia taolanaroensis, mais le prétraitement avec l’acide sulfurique 1 min donne le meilleur taux de germination avec un temps moyen de germination réduit. Les différents prétraitements n’ont aucun effet sur la croissance de Millettia pinnata. Les prétraitements à l’acide sulfurique améliorent la croissance en nombre de folioles et en hauteur des plantules de Millettia taolanaroensis. D’un autre point de vue, l’utilisation de l’acide sulfurique semble limitée à cause des risques liés à la manipulation et au coût élevé. Dans ce cas, le trempage à l’eau chaude 60°C pendant 30s et 5 min peut être adopté. Enfin Millettia pinnata ne présente pas une dormance après 1 mois de collecte, alors que Millettia taolanaroensis présente une dormance physique comme la plupart des légumineuses.

Les résultats de bouturage nous permettent de conclure que les boutures issues de la tige principale améliorent la réussite de bouturage pour Millettia pinnata. Les boutures récoltées sur terrain sont plus âgées et s’enracinent difficilement pour les 2 espèces. L’utilisation d’hormone AIB 1000 ppm augmente le pourcentage d’enracinement.

La réussite de la culture aseptique dépend de la durée de trempage et aux concentrations à l’hypochlorite de calcium. Pour Millettia pinnata, le trempage pendant 10min au CAOCl2 5% a donné un taux de réussite satisfaisant. Alors que pour Millettia taolanaroensis, la concentration et la durée de trempage utilisées n’ont pas donné des meilleurs résultats. Nos résultats affirment que plus les explants sont adultes, plus les contaminations sont abondantes.

Enfin, les résultats de cette étude constituent une base de données importante sur la régénération du genre Millettia à Madagascar. Néanmoins, cette étude est loin d’être exhaustive, d’autres études doivent être envisagées pour compléter cette expérience afin d’avoir des résultats plus approfondis. Il s’agit de :

Conclusion et perspectives

 Déterminer la durée optimale de conservation des graines où ces dernières ne perdent pas encore leur capacité germinative.  Déterminer les conditions de prélèvement, le transport et les préparations des boutures, les traitements auxiniques (concentration + durée de trempage).  Déterminer la concentration et le temps de trempage à l’hypochlorite sodium et/ou hypochlorite de calcium pour Millettia taolanaroensis.  Mettre au point la technique de multiplication et d’enracinement in vitro ainsi que l’acclimatation de ces espèces afin d’assurer la survie des vitroplants en conditions naturelles de culture.

Références bibliographiques

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ANNEXES Annexe 1 : Classification systématique des espèces étudiées

 Millettia pinnata

Règne : VEGETAL Super-embranchement : CORMOPHYTES Embranchement : SPERMAPHYTES Sous-embranchement : ANGIOSPERMES Classe : DICOTYLEDONES Sous-classe : ROSIDEA Ordre : FABALES Famille : FABACEAE Sous-famille : PAPILIONOIDEAE Tribu : MILLETTIEAE Genre : Millettia Espèce : pinnata  Millettia taolanaroensis Règne : VEGETAL Super-embranchement : CORMOPHYTES Embranchement : SPERMAPHYTES Sous-embranchement : ANGIOSPERMES Classe : DICOTYLEDONES Sous-classe : ROSIDEA Ordre : FABALES Famille : FABACEAE Sous-famille : PAPILIONOIDEAE Tribu : MILLETTIEAE Genre : Millettia Espèce : taolanaroensis

Annexe 2 : Photos de Millettia taolanaroensis et de Millettia pinnata.

 Millettia taolanaroensis

Port de Millettia Feuilles et fruits de Millettia taolanaroensis taolanaroensis

 Millettia pinnata

Port de Millettia pinnata Feuilles et fruits de Millettia pinnata

Annexe 3 : Composition du milieu MS (Murashige et Skoog)

Eléments Concentration en mg/l

NH4NO3 1650

CaCl2,2H2O 440

Macroéléments MgSO4,7H20 370

KNO3 1900

KH2PO4 170

MnSO4, H2O 22,3

ZnSO4,7H2O 8,6

H3BO3 6,2 KI 0,83

Microéléments Na2MoO4,2H2O 0,25

CuSO4,5H2O 0,025

CoCl2,6H2O 0,025 EDTA 37,25

Fe2SO4 27,85

ABSTRACT

Multiplication of Millettia taolanaroensis Du Puy & Labat and Millettia pinnata L. Panigrahi for use in ecological restoration.

Abstract

The objective of this study was to develop techniques of sexual and asexual multiplication of the genus Millettia of Madagascar for their conservation and valorization. To this end, the work undertaken was: the determination of pre-treatments improving seed germination and seedling growth, the determination of the rooting potential of cuttings and leaf bud burst as well as the establishment of an aseptic culture for in vitro culture. The results showed that no significant difference was observed between pre-treated and control seeds for Millettia pinnata while soaking in hot water and sulphuric acid doubled the germination rate (100%±0% and 95±8.66% respectively) compared to the control for Millettia taolanaroensis. As for cuttings, cuttings from the main stem treated with AIB 1000 ppm gave the highest rooting rate (16.66%±0%) for Millettia pinnata yet no cuttings took root for Millettia taolanaroensis. Finally, disinfection method n°3 (soaking the explants in soapy water for 7 min, then in 70° alcohols for 30 s, then in CaOCl2 5% for 10 min) gave 40% aseptic cultures on Millettia pinnata explants and disinfection method n°4 (soaking of the explants in soapy water for 7 min, then in 70° alcohols for 30 s, then in CaOCl2 3% for 10 min) gave an aseptic culture rate of 2.08% for Millettia taolanaroensis. The results of this study constitute a very important scientific database on the regeneration of the genus Millettia in Madagascar.

Keywords: genus Millettia, germination, cuttings, in vitro culture, Madagascar

Author: RANDRIANIRINA Vahatra Ainga Tahina

Advisors: Pr RAMANANKIERANA Heriniaina

Dr RANDRIAMBANONA Herizo RESUME Multiplication de Millettia taolanaroensis Du Puy & Labat et de Millettia pinnata L. Panigrahi en vue de leur valorisation pour la restauration écologique.

Résumé

L’objectif de cette étude est de mettre au point des techniques de multiplication sexuée et asexuée du genre Millettia (FABACEAE) de Madagascar en vue de leur conservation et de leur valorisation. A cet effet, les travaux entrepris étaient : la détermination des prétraitements améliorant la germination des graines et la croissance des plantules, la détermination du potentiel d’enracinement des boutures et du débourrement des bourgeons foliaires ainsi que l’établissement d’une culture aseptique pour une culture in vitro. Les résultats ont montré qu’aucune différence significative n’a été observée entre les graines prétraitées et les graines témoins pour Millettia pinnata tandis que le trempage dans l’eau chaude et dans l’acide sulfurique ont permis de doubler le taux de germination (100 %±0 % et 95±8,66 % respectivement) par rapport au témoin pour Millettia taolanaroensis. Quant au bouturage, les boutures issues de la tige principale traitées à l’AIB 1000 ppm ont donné le taux d’enracinement le plus élevé (16,66%±0%) pour Millettia pinnata pourtant aucune bouture ne s’est enracinée pour Millettia taolanaroensis. Enfin, la méthode de désinfection n°3 (trempage des explants dans de l’eau savonneuse pendant 7 min, puis dans de l’alcool 70° pendant 30 s, puis dans du

CaOCl2 5% pendant 10 min) a donné des cultures aseptiques de 40% sur les explants de Millettia pinnata et la méthode de désinfection n°4 (trempage des explants dans de l’eau savonneuse pendant 7 min, puis dans de l’alcool 70° pendant 30 s, puis dans du CaOCl2 3% pendant 10 min) a donné un taux de culture aseptique de 2,08% pour Millettia taolanaroensis. Les résultats de cette étude constituent une base de données scientifique utile sur la régénération du genre Millettia à Madagascar.

Mots clés : genre Millettia, germination, bouturage, culture in vitro, Madagascar

Auteur : RANDRIANIRINA Vahatra Ainga Tahina

Encadreurs : Pr RAMANANKIERANA Heriniaina

Dr RANDRIAMBANONA Herizo