UNIVERSITE D’ANTANANARIVO ------DOMAINE : SCIENCES ET TECHNOLOGIES ------ECOLE DOCTORALE : SCIENCES DE LA VIE ET DE L’ENVIRONNEMENT

Thèse de Doctorat

Spécialité : Biodiversité et Santé (Biochimie)

ETUDES CHIMIQUE ET BIOLOGIQUE DE

Crotalaria bernieri (Fabaceae), UNE PLANTE

MEDICINALE NATIVE DE MADAGASCAR

Présentée et soutenue publiquement par :

ANDRIAMAMPIANINA Herizo Lalaina Titulaire du DEA de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales

Le 28 Décembre 2018 Devant le jury composé de :

Président : Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel Rapporteur interne : Docteur HDR RASAMIRAVAKA Tsiry Rapporteur externe : Professeur RASOANAIVO Herilala Léa Examinateurs : Professeur RAVAOMANARIVO Lala Harivelo Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna Directeur de thèse : Professeur RAKOTO Danielle Aurore Doll

DEDICACE

A ma femme Maholy et à ma fille Kristen, pour leur présence à tout moment, pour toute l’affection et le bonheur qu’elles m’apportent chaque jour, et surtout pour la patience qu’elles ont eue durant ces longues années d’études. Pour leur amour et leur soutien. Je leur dédie cette thèse

REMERCIEMENTS Ce travail de thèse a été effectué :

- au sein du Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales (LABASM), de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo ; - au Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et Sciences des Aliments (LCSNSA) de l’Institut Universitaire et Technologique (IUT) de La Réunion ; - à l’unité Molécules de Communication et Adaptation des Microorganismes (MCAM) du Muséum National d’Histoire Naturelle (MNHN) de Paris ; - au laboratoire d’anatomie-cytopathologie (ACP) de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Je voudrais remercier tout d’abord le Grand Dieu tout puissant de m’avoir donné la force, le courage et la persistance qui m’ont permis de mener à terme ce mémoire. Que son Nom soit glorifié pour des milliers et des milliers d’années.

J’exprime mes plus vifs remerciements au Professeur RAKOTO Doll, mon Directeur de thèse, pour avoir dirigé mon travail. Merci pour son encadrement, sa disponibilité et sa gentillesse. Qu’elle trouve ici l’expression de ma vive reconnaissance pour m’avoir fait bénéficier de son expérience et de sa rigueur scientifique et professionnelle. Sans son encouragement et son soutien, je ne serais pas arrivé à ce stade. Je n’oublie pas son engagement et sa forte implication au cours de cette thèse. En plus de sa précieuse aide scientifique, elle m’a permis de participer à un congrès international très intéressant.

Je tiens également à exprimer ma profonde gratitude à Monsieur JEANNODA Victor, Directeur de l’Ecole doctorale Sciences de la Vie et de l’Environnement, de m’avoir accueilli au sein de son laboratoire. Je tiens à le remercier chaleureusement de m’avoir fait preuve d’un grand soutien dans toutes les étapes de réalisation de cette thèse. Je lui remercie de m’avoir confié ce sujet de recherche et offert l’opportunité de travailler sur un projet scientifique intéressant et stimulant. Il n’a jamais cessé de me motiver et de m’encourager.

Je tiens à exprimer mes sincères remerciements aux membres du jury, à savoir:

- Monsieur le Professeur ANDRIANTSIMAHAVANDY Abel qui m’a fait l’honneur d’accepter de présider le jury de ce mémoire, malgré ses lourdes responsabilités et son emploi du temps très chargé. Je lui témoigne ici ma gratitude et ma profonde reconnaissance.

- Madame le Professeur RASOANAIVO Herilala Léa et Monsieur le Docteur- HDR RASAMIRAVAKA Tsiry qui ont accepté d’être les rapporteurs scientifiques de ce travail malgré leurs nombreuses occupations.

- Monsieur le Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna et Madame le Professeur RAVELOSON RAVAOMANARIVO Lala Harivelo, qui ont aimablement voulu siéger en tant qu’examinateurs et accepté de consacrer du temps pour évaluer ce mémoire. Tous mes sincères remerciements ;

J’exprime toute ma gratitude au Professeur Bernard BODO de m’avoir accueilli dans son laboratoire de Molécules de Communication et Adaptation des Microorganismes (MCAM) du Muséum National d’Histoire Naturelle (MNHN). Je lui suis très reconnaissant de ses encouragements et de sa gentillesse, de ses enseignements ludiques sur la détermination structurale par RMN, sur la chimie des alcaloïdes et sur les histoires passionnantes du Muséum.

Je remercie vivement le Professeur Thomas PETIT pour son accueil au sein du laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et Sciences des Aliments (LCSNSA) de l’Institut Universitaire et Technologique (IUT) de La Réunion, pour son précieux appui et ses conseils chaleureux. J’ai particulièrement apprécié sa disponibilité et ses compétences scientifiques.

Mes chaleureux remerciements vont à toute l’équipe du LABASM.

- J’adresse mes remerciements au Professeur RANDRIANARIVO Hanitra Ranjàna qui m’a prodigué des conseils techniques judicieux tout au long de mes années de recherche. - Je remercie vivement le Professeur RAJEMIARIMOELISOA Clara et le Docteur RAHARISOLO Clairette de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM) pour leur grande disponibilité dans la réalisation de l’étude anatomo-pathologique. - Mes remerciements vont également au Docteur RANDRIAMAMPIANINA Lovarintsoa Judicaël, qui m’a souvent aidé durant les diverses étapes de cette thèse.

Mes vifs remerciements vont également aux chercheurs du MNHN notamment à:

- Soizic Prado, responsable de l’équipe de recherche CBAF pour ses suggestions ; - Alexandre Deville et Alain Blond pour la réalisation des spectres RMN ;

- Lionel Dubost et Arul Marie de la plateforme de spectrométrie de masse pour les spectres de masse. - Séverine Amand, sans qui un tel travail n’aurait pu être abattu. Ses compétences, son efficacité et sa disponibilité forcent mon admiration. Son amitié m’est très précieuse et je lui adresse toute mon affection.

Je remercie mes parents et mes beaux-parents pour m’avoir soutenu moralement et aussi financièrement de temps en temps.

Merci à mes amis et collègues, en particulier au Professeur RAZAFINTSALAMA Vahinalahaja, Docteur RAKOTONIAINA Minozanany Mamihery, Docteur RAZAFINDRAKOTO Anjarasoa Ravo, Docteur RATSIMANOHATRA Holy Christiane, Docteur RAZANATSEHENO Mihajasoa Stella, Docteur RASOLOFONANTENAINA Rojovola et à tous les doctorants et stagiaires du LABASM pour les très bons moments partagés ensemble qui ont rendu ce stage particulièrement agréable.

Un grand merci et toute mon amitié à toutes les doctorantes que j’ai côtoyées au Muséum et à qui je souhaite le meilleur pour la suite de leur parcours.

Enfin, j’adresse toute ma reconnaissance à tous ceux qui, de près ou de loin, ont contribué à l’élaboration de cette thèse et qui n’ont pas pu être cités ici.

TABLE DES MATIERES Page GLOSSAIRE………………………………………………………………………………….. i LISTE DES ABREVIATIONS………………………………………………………………. iv LISTE DES TABLEAUX…………………………………………………………………….. vi LISTE DES FIGURES……………………………………………………………………….. viii INTRODUCTION GENERALE…………………………………………………………….. 1

PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE 1.1 LES PLANTES MEDICINALES 4 1.1.1 GENERALITES 4 1.1.2 UTILISATIONS DES PLANTES MEDICINALES 4 1.1.3 LE POTENTIEL ANTIMICROBIEN DES PLANTES MEDICINALES 6 1.2 DONNEES SUR LES ESPECES DU GENRE Crotalaria 7 1.2.1 GENERALITES 7 1.2.2 DESCRIPTION BOTANIQUE 7 1.2.3 REPARTITION GEOGRAPHIQUE 8 1.2.4. LES ESPECES PRESENTES A MADAGASCAR 9 1.2.5 UTILISATIONS DES ESPECES DE Crotalaria DANS LE MONDE 11 1.2.5.1. Utilisations en alimentation humaine et animale 11 1.2.5.2. Utilisations en médecine traditionnelle 12 1.2.5.3. Autres utilisations 12 1.2.6. IMPORTANCE ECONOMIQUE DES ESPECES DE Crotalaria 14 1.3 TRAVAUX PHYTOCHIMIQUES ANTERIEURS SUR LE GENRE Crotalaria 14 1.3.1 GENERALITES SUR LES ALCALOIDES 14 1.3.1.1. Les alcaloïdes dérivés de la Pyrrolizidine (AP) 17 1.3.1.1.1. Définition 17 1.3.1.1.2. Structure 17 1.3.1.1.3. Toxicité 18 1.3.1.1.4. Propriétés pharmacologiques 19 1.3.1.1.5. Exemples d’AP isolés du genre Crotalaria 19 1.3.1.2. Les alcaloïdes dérivés de la Guanidine (AG) 21 1.3.1.2.1. Définition 21 1.3.1.2.2. Structure et classification 21 1.3.1.2.3. Propriétés pharmacologiques 23 1.3.2 GENERALITES SUR LES FLAVONOIDES 23 1.3.2.1. Définition 23 1.3.2.2. Structure et classification 24 1.3.2.2.1. Les flavonoïdes au sens strict 24 1.3.2.2.2. Les isoflavonoïdes 25 1.3.2.3. Propriétés pharmacologiques 25 1.3.2.4. Exemples de flavonoïdes isolés du genre Crotalaria 26 1.4. DONNEES SUR LA TOXICITE DU GENRE Crotalaria 27

1.4.1. TOXICITE CHEZ LES ETRES HUMAINS 27 1.4.2. TOXICITE CHEZ LES ANIMAUX 28 1.5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DES Crotalaria 29 1.5.1. PROPRIETES ANTIMICROBIENNES 29 1.5.1.1. Activités antibactériennes 29 1.5.1.2. Activités antifongiques 29 1.5.2. PROPRIETES ANTIOXYDANTES 30 1.5.3. PROPRIETES ANTI-INFLAMMATOIRES 30 1.5.4. PROPRIETES ANTICANCEREUSES 30 1.5.5. PROPRIETES ANALGESIQUES 30 1.5.6. PROPRIETES CYTOTOXIQUES 30 1.5.7. PROPRIETES ANTIPARASITAIRES 31 1.5.7.1. Activité anti-Leishmaniose 31 1.5.7.2. Activité anthelminthique 31 1.5.7.3. Activité nématicide 31

DEUXIEME PARTIE : ETUDES PRELIMINAIRES DES DIFFERENTES ESPECES DE Crotalaria PRESENTES A MADAGASCAR 2.1. INTRODUCTION 32 2.2. MATERIELS ET METHODES 32 2.2.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES ET COLLECTE DES ECHANTILLONS 32 2.2.2. MATERIELS D’ETUDE 33 2.2.3. IDENTIFICATION BOTANIQUE 33 2.2.4. PREPARATION DES EXTRAITS 33 2.2.4.1. Préparation du matériel végétal 33 2.2.4.2. Préparation des extraits bruts 33 2.2.5. DETERMINATION DES FAMILLES CHIMIQUES 34 2.2.5.1. Détection des alcaloïdes 35 2.2.5.2. Détection des flavonoïdes (Test de WILLSTÄTTER) 35 2.2.5.3. Détection des leucoanthocyanes (Test de BATE-SMITH) 35 2.2.5.4. Détection des saponosides (Test de mousse) 36 2.2.5.5. Détection des tanins et polyphénols 36 2.2.5.6. Détection des désoxyoses (Test de KELLER-KILIANI) 36 2.2.5.7. Détection des iridoïdes 36 2.2.5.8. Détection des anthraquinones (Test de BORNTRAGER) 37 2.2.5.9. Détection des stéroïdes et triterpènes 37 2.2.6. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES SOURIS 37 2.2.6.1. Les souris 37 2.2.6.2. Méthodes utilisées dans l’étude de la toxicité aigüe chez la souris 38 2.2.6.2.1. Administration de l’extrait à tester 38 2.2.6.2.2. Observation des symptômes 38 2.2.7. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES 38 2.2.7.1. Les milieux de culture 38 2.2.7.2. Les germes 39

2.2.7.3. Les antibiotiques de référence 39 2.2.7.4. Etude du spectre d’activité antimicrobienne 39 2.3. RESULTATS 41 2.3.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES 41 2.3.1.1. Les différents sites d’enquête 41 2.3.1.2. Les différentes espèces de Crotalaria inventoriées 41 2.3.1.3. Choix des matériels d’étude 45 2.3.2. DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES 48 2.3.3. EXTRACTION 52 2.3.4. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS 52 2.3.5. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES 55 2.4. DISCUSSION ET CONCLUSION 58 2.5. PERSPECTIVES 62

TROISIEME PARTIE : ETUDE DE Crotalaria bernieri Baill. INTRODUCTION 63 Chapitre 1: ETUDE CHIMIQUE 1.1. INTRODUCTION 64 1.2. MATERIELS ET METHODES 64 1.2.1. MATERIEL D’ETUDE 64 1.2.1.1. Position Systématique 64 1.2.1.2. Description botanique 64 1.2.1.3. Habitat et répartition géographique 66 1.2.1.4. Récolte et identification botanique 66 1.2.1.5. Utilisations empiriques 66 1.2.1.6. Préparation des organes 66 1.2.2. LES CONSOMMABLES UTILISES 67 1.2.3. METHODE D’EXTRACTION 67 1.2.3.1. Préparation des extraits 67 1.2.3.2. Extraction des alcaloïdes totaux 68 2.2.6.2.1. Extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre de feuilles 68 2.2.6.2.2. Extraction des alcaloïdes totaux à partir de l’EMF 68 1.2.4. PURIFICATION DES ALCALOIDES 69 1.2.4.1. Chromatographie préparative 69 1.2.4.1.1. Chromatographie liquide sur colonne à pression atmosphérique 69 1.2.4.1.2. Chromatographie liquide sur colonne à haute performance 70 1.2.5. METHODES ANALYTIQUES 71 1.2.5.1. Chromatographie sur couche mince (CCM) 71 1.2.5.2. Détermination des familles chimiques 72 1.2.4. CALCUL DU RENDEMENT D’EXTRACTION ET DE PURIFICATION 73 1.3. RESULTATS 73 1.3.1. EXTRACTION 73 1.3.1.1. Les extraits bruts d’organes 73 1.3.1.2. Les alcaloïdes totaux 74

1.3.2. LES FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS LES EXTRAITS 78 1.3.3. PURIFICATION DES ALCALOIDES 78 1.3.3.1. Chromatographie de l’EAT sur colonne de gel sephadex ® LH-20 79 1.3.3.2. Chromatographie de la fraction AT2 sur colonne de silice RP8 80 1.3.3.3. Purification de AT2 par HPLC 82 1.4. DISCUSSION ET CONCLUSION 83

Chapitre 2: DETERMINATION STRUCTURALE DES COMPOSES ISOLES 2.1. INTRODUCTION 87 2.2. MATERIEL ET METHODES 87 2.2.1. ACTIVITE OPTIQUE 87 2.2.2. SPECTROMETRIE DE MASSE 87 2.2.3. SPECTROMETRIE DE RMN 88 2.2.3.1 Les spectres monodimensionnels (1D) 89 2.2.3.2 Les spectres bidimensionnels (2D) 89 2.3. RESULTATS ET DISCUSSION 90 2.3.1. STRUCTURE DU COMPOSE C1 90 2.3.2. STRUCTURE DU COMPOSE C2 97 2.3.3. STRUCTURE DU COMPOSE C3 101 2.4. DISCUSSION ET CONCLUSION 106

Chapitre 3: ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX 3.1 INTRODUCTION 108 3.2. MATERIEL ET METHODES 108 3.2.1. MATERIELS 108 3.2.1.1. Les animaux d’expérimentation 108 3.2.1.1.1. Les souris 108 3.2.1.1.2. Les poussins 108 3.2.1.1.3. Les têtards de grenouille 109 3.2.1.1.3. Les alevins de poisson 109 3.2.1.1.3. Les puces 109 3.2.1.2. Les extraits utilisés 109 3.2.2. METHODES 109 3.2.2.1. Etude de la toxicité aigüe chez la souris 109 3.2.2.1.1. Voies d’administration des extraits 109 3.2.2.1.2. Détermination de la DL50 chez la souris 110 3.2.2.2. Etude des lésions anatomo-pathologiques 111 3.2.2.2.1. Prélèvement et fixation des organes 111 3.2.2.2.2. Inclusion 112 3.2.2.2.3. Microtomie et étalement des coupes 112 3.2.2.2.4. Coloration des coupes et montage des lames 112 3.2.2.3. Etude des effets des extraits sur les fonctions rénales et hépatiques 113 3.2.2.3.1. Détermination enzymatique du taux d’ALAT dans le sang 113 3.2.2.3.2. Détermination enzymatique du taux d’ASAT dans le sang 114

3.2.2.3.3. Dosage de la créatinine 114 3.2.2.3.4. Dosage de l’urée 114 3.2.2.4. Etude des effets des extraits sur les poussins 115 3.2.2.5. Etude des effets des extraits sur les animaux à sang froid 115 3.2.2.6. Etude des effets des extraits sur les puces 115 3.3. RESULTATS 116 3.3.1 EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS 116 3.3.1.1. Effets des extraits des différents organes de la plante 116 3.3.1.2. Les symptômes d’intoxication selon la voie d’administration 117 3.3.1.2.1. Voie intrapéritonéale 117 3.3.1.2.2. Voie sous-cutanée 117 3.3.1.2.3. Voie orale 118 3.3.1.3. Détermination de la DL50 de l’EMF sur souris 121 3.3.1.4. Effets des extraits et fractions partiellement purifiés sur les souris 122 3.3.1.4.1. Effets des alcaloïdes totaux (EAT) et non alcaloïdes totaux (nEAT) 122 3.3.1.4.2. Effets des fractions obtenues par chromatographie sur gel LH20 123 3.3.1.4.3. Evolution de la toxicité des extraits 123 3.3.1.5. Lésions anatomo-pathologiques 124 3.3.1.5.1. Lésions macroscopiques 124 3.3.1.5.2. Lésions microscopiques 125 3.3.1.6. Effets de l’EMF sur les fonctions hépatiques et rénales 134 3.3.2. EFFETS DE L’EMF SUR LES POUSSINS 135 3.3.3 EFFETS DE L’EMF SUR LES ANIMAUX A SANG FROID 136 3.3.3.1. Effets de l’EMF sur les têtards de grenouille 136 3.3.3.2. Effets de l’EMF sur les alevins de poisson 137 3.3.3.2. Effets de l’EMF sur les puces 138 3.4. DISCUSSION ET CONCLUSION 138

Chapitre 4 : ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES 4.1 INTRODUCTION 144 4.2 MATERIEL ET METHODES 144 4.2.1 MATERIELS 144 4.2.1.1. Les milieux de culture 144 4.2.1.2. Les microorganismes 144 4.2.1.3. Les antibiotiques de référence 145 4.2.1.4. Les extraits utilisés 145 4.2.2 ETUDE DU SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE 146 4.2.2.1. Activités antibactériennes et antilevuriennes 146 4.2.2.2. Activité antimoisissure 146 4.2.2.3. Détermination de la CMI, CMB et CMF 146 4.2.3 ANALYSES STATISTIQUES 148 4.3. RESULTATS 148

4.3.1. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS BRUTS DE DIFFERENTS 148 ORGANES DE LA PLANTE EN MILIEU SOLIDE 4.3.2. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES ALCALOIDES TOTAUX ET DES 151 FRACTIONS PURIFIEES EN MILIEU SOLIDE 4.3.3. DETERMINATION DES CMI, CMB ET CMF EN MILIEU LIQUIDE 153

4.4. DISCUSSION ET CONCLUSION 159

CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 163

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ET WEBOGRAPHIQUES 165

ANNEXES ANNEXE 1 : FICHE D’ENQUETE ETHNOBOTANIQUE ANNEXE 2 : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE ANNEXE 3 : COMPOSITION DES REACTIFS GENERAUX POUR LES ALCALOÏDES ANNEXE 4 : DONNEES DU SPECTRE RMN 1H ET 13C DES DIFFERENTS EXTRAITS ET COMPOSES ISOLES ANNEXE 5 : PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

GLOSSAIRE A Analgésique : substance qui atténue ou supprime la sensation de douleur. Anorexie : perte ou diminution de l'appétit, souvent liée à des problèmes psychologiques. Anti-apoptotique : substance qui contre la mort cellulaire programmée. Antioxydant : propriété de capter les radicaux libres, responsables entre autres du vieillissement des cellules. Antispasmodique : un produit permettant de lutter contre les spasmes musculaires. Les spasmes musculaires étant des contractions intenses et brutales de la musculature lisse ou involontaire. Ataxie : trouble de la coordination des mouvements volontaires souvent dus à une atteinte du système nerveux. B Bronchite : inflammation des bronches (voies respiratoires supérieures). Brûlures alternariennes : une maladie commune du feuillage de la pomme de terre et de la tomate, due à diverses espèces de champignons du genre Alternaria. C Chromone : composé chimique dérivé du benzopyrane (ou chromène). Chromophore : groupement d'atomes comportant une ou plusieurs doubles liaisons, et formant avec le reste de la molécule une séquence de doubles liaisons conjuguées, c'est-à-dire une alternance de doubles et de simples liaisons. Dans les organismes vivants, les chromophores peuvent servir à la détection de la lumière (photorécepteur) ou à l'absorption de l'énergie lumineuse (photosynthèse). Colique récidivante : douleur intestinale fréquente couplée à l'évacuation de selles liquides. Colonne capillaire WCOT : colonne tubulaire ouverte dont la phase stationnaire est déposée sur la paroi interne. Son diamètre interne est inférieur à 1 mm et non rempli de support poreux. Sa longueur est de plusieurs dizaines de mètres. Convulsions cloniques : contractions saccadées, brèves et répétées à courts intervalles. Cytotoxique : relatif à une substance pouvant détruire une cellule. D Décoction : procédé consistant à faire bouillir une substance dans un liquide, pour en extraire les principes solubles. Diurétique : substance qui augmente la sécrétion urinaire. Dysenterie : maladie infectieuse de l’intestin grêle caractérisée par des diarrhées fréquentes, parfois hémorragiques souvent mêlées de mucus, de glaires et accompagnées de fortes crampes abdominales.

i

E Edulcorant : substance chimique donnant une saveur douce et pouvant se substituer au sucre. Eczéma : maladie chronique allergique ou infectieuse de la peau, caractérisée par des lésions consistant en squames couvertes de boutons séreux provoquant des démangeaisons. Effet NOE : décrit une interaction entre deux spins à travers l'espace et non pas à travers les liaisons chimiques. Encéphalose hépatique : syndrome neuropsychiatrique complexe dû à une insuffisance hépatocellulaire. Elle est caractérisée par des modifications de l’état de conscience et du comportement, des changements de personnalité, des signes neurologiques. Exophtalmie : protrusion du globe oculaire hors de l’orbite (en avant) liée à une augmentation du contenu de l’orbite. On parle aussi d’yeux exorbités. F Fasciculation : une brève contraction d'un groupe de fibres musculaires, involontaire, localisée et survenant de manière aléatoire. Elle ne se traduit que par un léger mouvement transmis à la peau. Fibrose : augmentation anormale de la quantité de tissu conjonctif fibreux dans un tissu ou un organe. H Hémosidérine : pigment insoluble contenant de l'hydroxyde ferrique. Hépatomégalie : augmentation du volume du foie. Histiocytes : cellules macrophages libres du tissu conjonctif assurant le remplacement des cellules. Hyperhémie : rougissement des oreilles par dilatation des vaisseaux. Hypoglycémiant : produit qui diminue le taux du sucre dans le sang. Hypoxie : état d’un tissu ou d’un organe présentant une oxygénation insuffisante I Ictère : jaunissement de la peau, des muqueuses et du blanc de l'œil, lié le plus souvent à une affection du foie. Isoniazide : un antibiotique utilisé contre la tuberculose. L Leishmanicide : sert à tuer le protozoaire flagellé du genre Leishmania, responsable d’une maladie chronique à manifestation cutanée et/ou viscérale. Léthargie : endormissement et ralentissement des fonctions vitales pendant l'hibernation chez les animaux. M Molluscicide : propriété de tuer les mollusques (limaces, escargots, …). Morphine : principal alcaloïde dérivé de l'opium, utilisé comme médicament pour ses propriétés analgésiques, et pouvant entraîner à long terme une dépendance importante.

ii

Mucus : substance produite par les cellules glandulaires des différentes muqueuses de l'organisme. Multiséminée : formée de nombreuses graines (synonyme : polysperme). Mydriatique : substance qui dilate la pupille. N Nécrose : forme de dégât cellulaire qui mène à la mort prématurée et non programmée des cellules dans le tissu vivant. Nyctinastique : mouvement qui se rencontre uniquement chez les végétaux supérieurs en réponse à l'apparition de l'obscurité. Il se traduit par la fermeture des pétales d'une fleur à la tombée du jour, l'arrêt du mouvement des feuilles pour un grand nombre de légumineuses ou le repli des feuilles. O Oblongue : forme qui est plus longue que large et dont les angles sont arrondis. En botanique, se dit d'un organe nettement plus long que large, à bords parallèles sur une grande partie de la longueur et arrondi aux deux extrémités. Obovale : présentant la forme d'un ovale, dont la partie supérieure est plus large que la partie inférieure. P Pantropicale : qualifie une espèce présente dans toutes les zones tropicales du globe. Peste : maladie causée par une bactérie appelée Yersinia pestis. Phytopathogène : capacité d’infecter et de déclencher des maladies chez les végétaux. Piloérection : érection des poils. R Raie D du sodium : paire de raies du spectre de l'atome de sodium neutre. S Sinus rétro-orbital : région cartilagineuse richement vascularisée chez les rongeurs. Stéatose hépatocytaire : une lésion du foie correspondant à la surcharge de graisse dans le cytoplasme des hépatocytes. Sulfone : composé organique contenant un groupe sulfonyle.

iii

LISTE DES ABREVIATIONS

AANP : Acides Aminés Non Protéiques AcOEt : Acétate d’éthyle AG : Alcaloïdes dérivés de la Guanidine ALAT : ALanine AminoTransférase ANOVA : ANalyse de Variance One-way AP : Alcaloïdes dérivés de la Pyrrolizidine ASAT : ASpartate AminoTransférase ATCC : American Type Culture Collection AU : Unité arbitraire d’Absorbance BAE : n-Butanol/Acide acétique/Eau CC : Chromatographie sur Colonne ouverte CCM : Chromatographie sur Couche Mince CD3OD : Méthanol tétradeutérié CH2Cl2 : Dichlorométhane CH3CN : Acétonitrile CL50 : Concentration Létale 50 % CLHP : Chromatographie Liquide Haute Performance CMB : Concentration Minimale Bactéricide CMF : Concentration Minimale Fongicide CMI : Concentration Minimale Inhibitrice CNRE : Centre National de la Recherche sur l’Environnement COSY : Correlated Spectroscopy COSY : COrrelated SpectroscopY DHI : Diamètre du Halo d’Inhibition DL50 : Dose létale 50 % dm : Décimètre DMSO : Diméthyl Sulfoxyde DMSO-d6 : Diméthyl Sulfoxyde deutéré EAC : Extrait Acétate d’éthyle de Cosses EAF : Extrait Acétate d’éthyle de Feuilles EAG : Extrait Acétate d’éthyle de Graines EAR : Extrait Acétate d’éthyle de Racines EAT : Extrait d’Alcaloïdes Totaux EB : Extrait Brut EHC : Extrait Hexanique de Cosses EHF : Extrait Hexanique de Feuilles EHG : Extrait Hexanique de Graines EHR : Extrait Hexanique de Racines EMC : Extrait Méthanolique de Cosses EMF : Extrait Méthanolique de Feuilles EMG : Extrait Méthanolique de Graines EMR : Extrait Méthanolique de Racines ESI : Électronébulisation ESI : Spectrométrie de Masse par Electrospray FAO : Food and Agriculture Organization FeCl3 : Chlorure Ferrique FTM : Foiben’ny Tao-tsaritany eto Madagasikara GC-MS : Gas Chromatography-Mass Spectrometry

iv

Glu : Glucose GPS : Global Positioning System HCl : Acide chlorhydrique Hex : Hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation Hz : Hertz INT : Chlorure de para-iodonitrotétrazolium ip : Intrapéritonéale IPM : Institut Pasteur de Madagascar J : Constante de couplage exprimée en Hz LABASM : Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales LCSNSA : Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et Sciences des Aliments LMG : Laboratorium voor Microbiologie, Universite it Gent, Belgium m/z : masse/charge d'un ion MeOH : Méthanol MHA : MUELLER-HINTON Agar MHB : Mueller-Hinton Bouillon MHz : Mégahertz min : Minute MNHN : Muséum National d’Histoire Naturelle NaCl : Chlorure de sodium nEAT : Extrait non Alcaloïdes Totaux NH4OH : Ammoniaque NOe : Effet Overhauser Nucléaire NOESY : Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY OMS : Organisation Mondiale de la Santé ONG : Organisation Non Gouvernementale PBZT : Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza PDA : Potato Dextrose Agar pH : Potentiel d’Hydrogène ppm : Partie par million QTOF : Quadripole-Time of Flight Rf : Référence frontale Rha : Rhamnose RMN : Résonance Magnétique Nucléaire du Proton RP : Reverse Phase SM : Spectrométrie de Masse TCI : Triple CryoProbe Inverse résonance TMS : Tétraméthylsilane (Si(CH3)4) TOCSY : TOtal Correlation SpectroscopY TOF : Time of Flight UFC : Unité Formant Colonie uma : unité de masse atomique UV : Ultraviolet WCOT : Wall COated upon Tubular column δ : déplacement chimique exprimé en ppm δC : Déplacement chimique du carbone δH : Déplacement chimique de l’hydrogène

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LISTE DES TABLEAUX Page Tableau 1 : Liste des espèces de Crotalaria présentes à Madagascar…………………….. 9 Tableau 2 : Sélection d’indications thérapeutiques des différentes espèces de Crotalaria 13 Tableau 3 : Les différentes familles d’alcaloïdes selon le précurseur……………………. 16 Tableau 4 : Les AP isolés de différentes espèces de Crotalaria………………………….. 20 Tableau 5 : Liste des germes testés………………………………………………………. 39 Tableau 6 : Normes utilisées pour l’interprétation des résultats obtenus par la méthode des disques…………………………………………………………………... 40 Tableau 7 : Les espèces de Crotalaria recensées lors des enquêtes ethnobotaniques……. 43 Tableau 8 : Liste des espèces de Crotalaria étudiées et les organes utilisés……………… 46 Tableau 9 : Criblage phytochimique des différents organes des espèces de Crotalaria….. 49 Tableau 10 : Liste des EB de différents organes de chaque espèce de Crotalaria…………. 52 Tableau 11 : Effets des EB issus de différents organes de diverses espèces de Crotalaria sur la souris………………………………………………………………….. 53 Tableau 12 : Effets des extraits sur la croissance des germes en milieu solide…………….. 56 Tableau 13 : Rendement d’extraction et caractéristiques des différents extraits préparés à partir des organes de C. bernieri……………………………………………... 73 Tableau 14 : Résultats du criblage phytochimique réalisé sur les différents extraits de C. bernieri……………………………………………………………………… 78 Tableau 15 : Fractions obtenues lors de la purification de l’EAT sur colonne ouverte de gel Sephadex ® LH-20 à partir de 1 g de l’EAT……………………………... 75 Tableau 16 : Fractions obtenues lors de la purification de AT2 sur colonne ouverte de gel de silice RP8…………………………………………………………………. 81 Tableau 17 : Liste des différents extraits bruts et partiellement purifiés utilisés pour les tests biologiques……………………………………………………………... 86 Tableau 18 : Données de RMN du composé C1 en solution dans DMSO-d6 et CD3OD…... 91 Tableau 19 : Données de RMN du composé C2 en solution dans DMSO-d6 et CD3OD…... 98 Tableau 20 : Données de RMN du composé C3 en solution dans DMSO-d6……………… 101 Tableau 21 : Effets des extraits issus des différents organes de C. bernieri sur la souris…... 117 Tableau 22 : Symptômes d’intoxication et leur temps d’apparition selon la voie et la dose de l’EMF…………………………………………………………………….. 118 Tableau 23 : Influence des voies d’administration sur l’activité toxique de l’EMF……….. 120 Tableau 24 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h)……………… 121 Tableau 25 : Mortalité (%) par injection par voie ip de EAT et nEAT à différentes doses… 122 Tableau 26 : Mortalité (%) par injection par voie ip des fractions AT2 à AT5 à différentes doses……………………………………………………………………….. 123 Tableau 27 : Lésions tissulaires provoquées par EMF à 43,57 mg/kg injecté par voie ip….. 126 Tableau 28 : Lésions tissulaires provoquées par EMF à 28,56 mg/kg administré par voie orale pendant 10 et 30 jours………………………………………………….. 128 Tableau 29 : Effets de l’EMF sur les fonctions hépatique et rénale………………………... 134 Tableau 30 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les têtards de grenouille… 136 Tableau 31 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les alevins de poissons….. 137

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Tableau 32 : Les différents microorganismes utilisés avec leurs références………………. 145 Tableau 33 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode de microdilution en milieu liquide……………………………………………… 147 Tableau 34 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des bactéries Gram (-) en milieu solide…………… 149 Tableau 35 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des bactéries Gram (+) en milieu solide………… 150 Tableau 36 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des champignons en milieu solide………………… 150 Tableau 37 : Liste des souches de microorganismes testées sur les différentes fractions partiellement purifiées issues des feuilles de C. bernieri…………………….. 151 Tableau 38 : Effets des alcaloïdes totaux et des différentes fractions purifiées (1mg/disque) sur la croissance des microorganismes en milieu solide………. 152 Tableau 39 : Valeurs des CMI et CMB (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des bactéries Gram (-) en milieu liquide……………………….. 155 Tableau 40 : Valeurs des CMI et CMB (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des bactéries Gram (+) en milieu liquide………………………. 156 Tableau 41 : Valeurs des CMI et CMF (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des levures en milieu liquide…………………………………... 157

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LISTE DES FIGURES Page Figure 1 : Représentation des organes de Crotalaria (exemple : C. cleomifolia)…...... 8 Figure 2 : Structure d’un noyau pyrrolizidine…………………………………………. 17 Figure 3 : Structure de quatre bases de nécine………………………………………… 17 Figure 4 : Les éléments structuraux indispensables pour la toxicité des AP………….. 18 Figure 5 : Structure chimique de la monocrotaline……………………………………. 19 Figure 6 : Structure chimique de quelques AP isolés du genre Crotalaria…………… 20 Figure 7 : Structure chimique de la fulvine, isolée de C. fulva………………………... 21 Figure 8 : Structure d’un squelette de guanidine……………………………………… 22 Figure 9 : Les différents groupes d’AG……………………………………………….. 23 Figure 10 : Structure générale du noyau des flavonoïdes………………………………. 24 Figure 11 : Structure de base des flavonoïdes au sens strict……………………………. 25 Figure 12 : Structure des différentes sous-classes d’isoflavonoïdes……………………. 25 Figure 13 : Structure chimique de 4' hydroxy flavone-7-O-rhamnoside isolé de C. grahamiana………………………………………………………………..... 26 Figure 14 : Structure chimique des flavonoïdes isolés de C. sessiliflora……………….. 26 Figure 15 : Structure chimique des flavonoïdes isolés de C. lachnophora……………... 27 Figure 16 : Cartographie des lieux de récolte des différentes espèces de Crotalaria…... 42 Figure 17 : Plantes-matériels d’étude…………………………………………………… 47 Figure 18 : Activité des EB (1 mg/disque) des différentes espèces de Crotalaria sur la croissance de Bacillus megaterium et Candida albicans…………………… 58 Figure 19 : Crotalaria bernieri Baill……………………………………………………. 65 Figure 20 : Schéma de la chromatographie en phase liquide à haute performance……... 71 Figure 21 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des extraits non alcaloïdes totaux nEAT et alcaloïdes bases totaux EAT obtenus lors du fractionnement par le n-butanol de la solution aqueuse acidifiée issue de la poudre de feuilles…………………………………………………………… 75 Figure 22 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des extraits non alcaloïdes totaux nEAT’ et alcaloïdes totaux EAT’ obtenus lors du fractionnement par le n-butanol de la solution aqueuse acidifiée issue de l’EMF……………………………………………………………………….. 76 Figure 23 : Schéma récapitulatif de l’extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre de feuilles…………………………………………………………… 77 Figure 24 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des fractions obtenues par purification de l’EAT sur colonne ouverte de gel Sephadex ® LH-20… 80 Figure 25 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) de AT2a et AT2c obtenues par purification de AT2 sur colonne ouverte de gel de silice RP8... 81 Figure 26 : Chromatogramme de AT2c obtenu après purification par HPLC…………… 82 Figure 27 : Procédé de purification et d’isolement des composés 1-3 à partir de l’extrait EAT de feuilles de C. bernieri…………………………………….. 83 Figure 28 : Spectre de masse du composé C1 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 579………………………………………………………… 90

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3 Figure 29 : Sous-structure A Corrélations COSY et couplages JH-H (Hz)……………... 93 3 Figure 30 : Sous-structure B Corrélations COSY et couplages JH-H (Hz)……………... 94 Figure 31 : Sous-structure C…………………………………………………………….. 95 Figure 32 : Assemblage des sous-structures A, B et C et les corrélations observées sur les spectres de RMN 2D, COSY et HMBC………………………………… 95 Figure 33 : Structure du composé C1 : apigénine-8-C--rhamnopyranosyl-(1->2)-β- glucopyranoside ou 2''-O--rhamnoside vitexine………………………….. 96 Figure 34 : Spectre de masse du composé C2 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 199………………………………………………………… 98 Figure 35 : Sous-structure A, B, C déduites de l’analyse des spectres de RMN 1D ; 2D COSY et HSQC du composé C2…………………………………………… 99 Figure 36 : Assemblage des sous-structures A, B, C par l’utilisation des corrélations HMBC………………………………………………………………………. 100 Figure 37 : Structure du composé C2 : N-(4-aminobutyl)-N-(3-méthyl-2butèn-1-yl)- guanidine ou sphaerophysine……………………………………………….. 100 Figure 38 : Spectre de masse du composé C3 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 536………………………………………………………… 101 Figure 39 : Eléments de structure A, B, C et D déduits des données des spectres COSY et HSQC…………………………………………………………………….. 103 Figure 40 : Assemblage des éléments de structure A, B, C et D grâce aux corrélations HMBC………………………………………………………………………. 103 Figure 41 : Modes d’assemblage parallèle (A) et antiparallèle (B) de la sous-structure en C14………………………………………………………………………... 104 Figure 42 : Couplage entre les protons H-2’ et H-3’ dans les assemblages parallèle A et antiparallèle B………………………………………………………………. 104 Figure 43 : Spectres RMN 1H calculés pour les assemblages : parallèle (A) et antiparallèle (B)……………………………………………………………... 105 Figure 44 : Structure du composé C3 : Cyclocrotalarine……………………………….. 105 Figure 45 : Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode de Reed et Muench (1938)……………………………………………………………… 121 Figure 46 : Evolution de la toxicité des extraits pour les trois doses (DL0, DL50, DL100 ip) testées……………………………………………………………………. 124 Figure 47 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 3 min. Grossissement x10 et x40…. 129 Figure 48 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 24 h. Grossissement x10 et x40…... 129 Figure 49 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 j. Grossissement x10 et x40... 130 Figure 50 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 et x40………….. 130 Figure 51 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 15 min. Grossissement x10 et x40……….... 131 Figure 52 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours. Grossissement x10 et x40………... 131

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Figure 53 : Coupes histologiques du cerveau traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 et x40……… 132 Figure 54 : Coupes histologiques du cerveau traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 30 jours. Grossissement x10 et x40… 132 Figure 55 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 et x40……… 133 Figure 56 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours. Grossissement x10 et x40… 133 Figure 57 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 30 jours. Grossissement x10 et x40… 134 Figure 58 : Comparaison des taux plasmatiques d'ALAT et ASAT des souris traitées avec l’EMF par rapport à celles des témoins (n = 3)……………………….. 135 Figure 59 : Comparaison des taux plasmatiques de la créatinine et de l’urée des souris traitées avec l’EMF par rapport à celles des témoins (n = 3)……………….. 135 Figure 60 : Courbe montrant la mortalité et l’effet-dose provoqués par l’EMF sur les têtards de grenouille………………………………………………………… 137 Figure 61 : Courbe montrant la mortalité et l’effet-dose provoqués par l’EMF sur les alevins de poisson…………………………………………………………... 138 Figure 62 : Activité antimicrobienne des alcaloïdes totaux et des fractions purifiées sur la croissance de B. cereus et C. albicans en milieu solide ………………..... 152 Figure 63 : Activité antimicrobienne des alcaloïdes totaux et des fractions purifiées sur la croissance de S. aureus et S. pyogenes en milieu solide…………………. 153 Figure 64 : Détermination de la CMI des extraits issus des différents organes de C. bernieri par la méthode de microdilution en milieu liquide………………... 154 Figure 65 : Détermination de la CMI des fractions issues de la chromatographie sur gel de Sephadex LH20 (AT5, AT3) et silice RP8 (AT2a) par la méthode de microdilution en milieu liquide……………………………………………... 154

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INTRODUCTION GENERALE

Introduction générale

Le règne végétal constitue une source quasiment inépuisable de substances naturelles variées, qui sont douées de propriétés aussi bien nutritives, curatives que toxiques. Bien avant que la science ne se soit dotée des outils nécessaires pour mettre en évidence et caractériser les principes actifs, l’homme, à travers les siècles, a appris à distinguer les plantes et à les utiliser pour se nourrir, se vêtir, se défendre contre des ennemis et également pour se soigner. Il a acquis de ses ainés des connaissances inestimables sur l’utilisation de ces substances végétales et les a transmises de génération en génération. Plus tard, avec les progrès dans différentes disciplines scientifiques (chimie, physiologie, médecine, toxicologie, etc.), une grande variété de molécules ont été découvertes et plusieurs mécanismes d’action ont été élucidés, ce qui a modernisé et diversifié les usages des principes actifs ou toxiques de la plante, notamment comme outils de recherche scientifique dans les sciences du vivant, et également comme sources de médicaments, de produits cosmétiques et agricoles. De nos jours, les vertus thérapeutiques des plantes comptent parmi les propriétés utiles les plus recherchées et les plus utilisées. Près des trois quarts de la population mondiale se soignent quasi-exclusivement avec des plantes médicinales (Nguyen, 2007). Cela est dû au fait que les médicaments prescrits par la médecine moderne ne sont pas toujours disponibles, ou accessibles à cause de l’éloignement des centres de santé ou alors leur coût est trop élevé pour la plus grande partie de la population. De plus, ils sont à l’origine d’effets indésirables, qui ont pour résultat de détériorer davantage l’état sanitaire des défavorisés. Plus grave encore, une résistance de nombreux microorganismes vis-à-vis des médicaments d’usage courant a été constatée au cours des dix dernières années (Roca et al., 2015). Cette résistance est due à la prescription immodérée et souvent inappropriée des médicaments (Sharifi-Rad, 2016). En devenant insensibles à tout traitement, ces microorganismes limitent la gamme d’antibiotiques disponibles en pharmacie. La situation est d’autant plus alarmante que les infections causées par les souches de microorganismes résistantes font un grand nombre de victimes, en termes de morbidité et de mortalité. Face à ces divers inconvénients, l’utilisation des plantes médicinales en tant que remèdes alternatifs est devenue une des priorités du monde médical. Elles représentent une bonne source de nouvelles molécules d'intérêt (Salehi et al., 2017). Pourtant, en dépit du fait indiscutable que les plantes constituent un réservoir de molécules bioactives, le potentiel floristique demeure encore peu exploré.

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Introduction générale

Madagascar est connu mondialement pour ses richesses naturelles, et dispose d’une grande diversité floristique à laquelle s’ajoute une tradition séculaire d’utilisation traditionnelle des plantes (Blanc-Pamard, 2003). Il est l’un des pays les plus riches en plantes médicinales. Parmi celles-ci, 80% sont endémiques et nombreuses sont celles qui n’ont pas encore fait l’objet d’études approfondies (Rabesa, 1993 ; Cortadellas et al., 2010). C’est dans ce sens que l’unité de recherche Toxicologie du Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences Médicales (LABASM) de la mention Biochimie Fondamentale et Appliquée de la Faculté des Sciences (Université d’Antananarivo) a travaillé depuis plusieurs années sur les plantes. De nombreuses plantes endémiques, natives et introduites, toxiques ou médicinales, y ont déjà été étudiées (Jeannoda, 1986 ; Rakoto Ranoromalala, 1989 ; Randrianarivo, 1996 et 2003 ; Rajemiarimoelisoa, 2000 ; Randriamampianina, 2016 ; Ratsimiebo, 2017). Leur activité sur les animaux, les végétaux et les microorganismes a été étudiée en vue de les valoriser ultérieurement en tant que remèdes ou pesticides. Le LABASM a développé des programmes de recherche pour chaque type de plantes étudiées. Nous avons intégré l’un d’entre eux, en l’occurrence le programme Crotalaria. Reconnu comme le plus vaste genre de la famille des Fabaceae, avec environ 700 espèces inventoriées et possédant une large distribution dans les pays tropicaux et subtropicaux, le genre Crotalaria constitue une source de substances à potentialités industrielles et thérapeutiques importantes (voir Synthèse bibliographique, § 1.2, page 7). En outre, un grand intérêt est accordé à ces plantes dans les domaines de l’agro-écologie, la biotechnologie, la chimie et la biochimie. Toutefois, de par l’abondance spécifique de ces plantes, les études antérieures sur le genre Crotalaria ne sont pas exhaustives. Subséquemment, plusieurs espèces n’ont pas encore fait l’objet d’étude approfondie. Seules certaines espèces comme Crotalaria juncea, Crotalaria axillaris et Crotalaria pallida ont été les plus étudiées (L’Etang, 2012). Ainsi, les potentialités des autres espèces de ce genre restent peu connues jusqu’à présent. Lors de tests préliminaires de toxicité effectués systématiquement dans notre laboratoire d’accueil sur différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar, Crotalaria bernieri Baill., une Fabacée native de Madagascar, dont les feuilles font l’objet d’utilisations thérapeutiques, d’après les enquêtes ethnobotaniques, s’est révélée toxique pour la souris et les microorganismes. L’objectif principal de cette étude a consisté à prospecter dans quelles mesures les propriétés toxiques et pharmacologiques de C. bernieri pourraient être exploitées à des fins

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Introduction générale utiles notamment dans la lutte contre les animaux nuisibles tels que les rongeurs et le développement des nouvelles alternatives thérapeutiques antimicrobiennes. Ainsi, nos travaux ont essentiellement consisté en :  des études préliminaires sur différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar, qui avaient essentiellement pour but de sélectionner une espèce possédant des propriétés intéressantes pour la conduite des investigations plus approfondies ;  des investigations plus approfondies sur les molécules présentes dans C. bernieri, leurs propriétés et leurs mécanismes d’action. A moyen terme, les résultats pourraient servir de point de départ pour une approche appliquée dans la lutte contre les organismes nuisibles (souris, puces, microorganismes pathogènes) ;  l’évaluation des risques liés à l’utilisation des extraits de C. bernieri.

Les travaux réalisés dans le cadre de cette thèse sont présentés en trois parties : o la première est consacrée à la « Synthèse bibliographique » qui rapporte des données pertinentes permettant de mieux situer les travaux entrepris et faciliter la compréhension et l’interprétation des résultats obtenus ; o la deuxième rapporte les études préliminaires entreprises sur différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar ; o la troisième, qui est l’étude de C. bernieri Baill., est subdivisée en quatre chapitres :  dans le premier, « Etude chimique », les différentes méthodes d’extraction et de purification employées pour obtenir les différents extraits utilisés pour nos investigations ;  dans le deuxième, nous exposons les travaux sur la « Détermination structurale des composés isolés » ;  dans le troisième, « Etude des effets des extraits sur les animaux », et le quatrième « Etude des effets des extraits sur les microorganismes », nous rapportons les travaux réalisés et résultats relatifs aux effets des différents extraits sur différents modèles biologiques.

Une conclusion générale sur l’ensemble de l’étude, suivie des perspectives terminent le document. Les travaux réalisés et les résultats obtenus dans le cadre de cette thèse ont fait l’objet de deux articles scientifiques, une communication orale et une communication affichée (Annexe V).

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PARTIE I

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Synthèse bibliographique

Pour mieux cadrer notre sujet de thèse, justifier le choix de nos objectifs et faciliter la compréhension ainsi que l’interprétation des résultats obtenus, nous rapportons dans cette première partie des données bibliographiques concernant :  les plantes médicinales ;  les espèces du genre Crotalaria ;  les travaux antérieurs sur la phytochimie du genre Crotalaria ;  la toxicité et les propriétés pharmacologiques du genre Crotalaria.

1.1. LES PLANTES MEDICINALES

1.1.1. GENERALITES

Par définition, une plante médicinale est un végétal dont au moins une partie possède des propriétés thérapeutiques. Il s'agit d'une plante qui est utilisée pour prévenir, soigner ou soulager divers maux (Elqaj et al., 2007). Des études ont montré que sur les 300 000 espèces végétales recensées sur la planète, plus de 200 000 ont des vertus médicinales et environ 35 000 sont employées de par le monde à des fins médicinales, ce qui constitue le plus large éventail de la biodiversité utilisé par les êtres humains (Millogo et al, 2005). Selon l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), plus de 80% de la population mondiale ont recours aux plantes médicinales pour faire face aux problèmes de santé, non seulement par manque d’accès aux médicaments prescrits par la médecine moderne, mais aussi parce que ces plantes ont souvent une réelle efficacité (Farnsworth, 1990). Ainsi, le marché mondial de plantes médicinales, en expansion rapide, représente plus de 60 milliards de dollars par an (OMS, 2002). A Madagascar, plus de 6 000 plantes médicinales ont été inventoriées et font actuellement l'objet d'utilisations thérapeutiques. Par ailleurs, environ 90% des Malagasy utilisent les plantes médicinales (Gyre, 2012). Leur commerce est devenu un vrai métier. Dans les rues de la capitale, on entend souvent les cris des marchands ambulants de tisanes (tambavy) contenues dans un arrosoir et vendues dans des gobelets.

1.1.2. UTILISATIONS DES PLANTES MEDICINALES

La plupart des plantes médicinales contiennent des principes actifs qui agissent directement sur l'organisme. Elles sont utilisées aussi bien en médecine moderne qu'en médecine traditionnelle. A titre d’illustration, en voici quelques exemples parmi les plus connus (Encyclopédie des plantes médicinales, 2001 ; Nicolas, 2012) :

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Synthèse bibliographique

 Allium sativum (Liliacées) ou « ail », combat les infections du nez, de la gorge et des bronches (expectorant), réduit le taux de cholestérol et apaise les troubles circulatoires, comme l'hypertension. Hypoglycémiant, l'ail est aussi un précieux complément alimentaire pour les diabétiques.  Artemisia absinthium (Astéracées) ou « absinthe », a un effet tonique puissant sur le système digestif, notamment au niveau de l'estomac et de la vésicule biliaire. La plante est aussi un antiinflammatoire et un léger antidépresseur. Son amertume contribue à son effet thérapeutique lorsqu'elle est absorbée à petites doses.  Cinnamomum verum (Lauracées) ou « cannelle », est utilisée contre le rhume, la grippe et les troubles digestifs. Elle favorise aussi l'expulsion des gaz dans l’estomac. C’est également un antispasmodique et antiseptique.  Curcuma aromatica (Zingibéracées) ou « curcuma », est efficace dans le traitement des troubles digestifs et hépatiques. Cette plante a également un effet anticoagulant, antiinflammatoire et hypocholestérolémiant.  Cataranthus roseus (Apocynacées) ou « pervenche de Madagascar », est utilisée par les Malagasy comme vermifuge, antipaludique et diurétique en infusion, et aussi pour soigner les piqûres de guêpe ou pour désinfecter les plaies.  Cinnamosma fragrans (Canellacées) ou « mandravasarotra », une plante médicinale endémique de Madagascar, a le pouvoir de servir d’antidote aux poisons, de défendre l’organisme et de purifier le sang. Elle est également utilisée pour soigner la grippe, la toux, la fièvre, les bronchites et les infections du foie.  Adansonia suarezensis (Malvacées) ou « baobab » : est réputée pour le pouvoir anticancéreux de son écorce bouillie.  Harungana madagascariensis (Hypericacées) : guérit les dermatoses et la gale par application de sa gomme.

Cependant, l’ingestion de ces plantes est parfois associée à des intoxications graves, voire mortelles. Ces accidents sont généralement dus à leur méconnaissance ou à leur confusion avec d’autres plantes, mais le plus souvent à la non-maîtrise des doses à absorber. Comme toutes substances à visée thérapeutique, les plantes médicinales doivent être employées avec précaution.

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Synthèse bibliographique

1.1.3. LE POTENTIEL ANTIMICROBIEN DES PLANTES MEDICINALES

Les plantes médicinales sont utilisées depuis l'antiquité, pour soulager et guérir les maladies humaines. En fait, leurs propriétés thérapeutiques sont dues à la présence de centaines, voire de milliers de composés naturels bioactifs appelés : « les métabolites secondaires ». Ces derniers sont accumulés dans différents organes et parfois dans des cellules spécialisées de la plante. Ces produits, à structure chimique souvent complexe, ont des fonctions très différentes chez la plante comme la protection contre l’attaque des pathogènes ou des herbivores et l’attraction des pollinisateurs. Ils constituent aussi des molécules très utiles pour l’homme, comme les colorants, les arômes, les pesticides ou bien les drogues. Le pouvoir de guérison des plantes provient ainsi de leurs effets. Leur utilisation par l’homme dans de nombreuses préparations thérapeutiques est très largement répandue. On distingue classiquement plusieurs groupes de métabolites secondaires en fonction de leur nature biochimique et de leur origine biosynthétique. A titre d’exemples, on peut citer les composés phénoliques, les terpènes et stéroïdes, les alcaloïdes, les polypeptides, etc. Quelques-uns de ces composés seront décrits au paragraphe 1.3 ; page 14. De nombreux antimicrobiens issus des plantes connaissent actuellement un usage répandu. Bien que d’autres soient encore administrés suivant des indications empiriques, certains ont été produits à l’échelle industrielle. Des études ont montré que 78% des médicaments d’origine naturelle sont des antimicrobiens. Ces substances sont douées de propriétés antibactériennes et ont la capacité soit de tuer les bactéries (effet bactéricide), soit d’inhiber leur croissance (effet bactériostatique) (Elghozi et Duval, 1992). A titre d’illustration, nous pouvons citer :

 La phlorétine, un dihydrochalcone isolé des feuilles du pommier (Rosacées) est active sur les bactéries Gram (+) (Donald et Bishop, 1952).  La protoanémonine, une lactone insaturée qui se rencontre dans toute la famille des Ranunculaceae, est peu sélective et son spectre d'activité s'étend aux Champignons inférieurs et aux bactéries Gram (-) (Baer et al., 1946).  La canavanine, un acide aminé non protéique tiré de Canavalia ensiformis (Fabaceae), présente une action bactéricide et fongicide sur les microorganismes (Srb, 1954).  La cépharanthine, un alcaloïde isolé de Stephania cepharantha (Menispermaceae), utilisée dans le traitement de la tuberculose et de la lèpre. Elle a été découverte au Japon -6-

Synthèse bibliographique

avant la seconde guerre mondiale (et par conséquent avant l'emploi de la pénicilline), une époque où les médicaments synthétiques (isoniazide et sulfones) n'étaient pas encore connus (Hasegawa, 1952).

1.2. DONNEES SUR LES ESPECES DU GENRE Crotalaria

1.2.1. GENERALITES

Le genre Crotalaria constitue le plus vaste genre de la famille des Fabaceae avec environ 700 espèces. L’Afrique est de loin le continent le plus riche avec environ 500 espèces (Polhill, 1982 ; Burkill, 1995 ; Subramaniam et al., 2013). La dénomination de ce genre vient du mot grec « krotalon » et latin « crotalum », qui signifient respectivement « castagnettes » et « crotale », à cause du son que produisent les gousses mures lorsqu’elles sont agitées ou remuées par le vent (de Villers et al., 1827). Les représentants sont aussi appelés sonnettes et crotalaires en français ; rattlebox et ragwort en anglais. En malagasy, les noms amberivatry et kitsakitsana sont souvent utilisés pour l'ensemble des espèces (Polhill, 1982).

1.2.2. DESCRIPTION BOTANIQUE (Peltier, 1959 ; Polhill, 1982) Les crotalaires sont des plantes annuelles ou vivaces, herbacées, arbrisseaux ou arbustes. Leur taille est très variable d’une espèce à l’autre, pouvant atteindre jusqu’à 4 m de hauteur.

 Les feuilles sont alternes, simples ou composées digitées, trifoliolées, parfois unifoliolées ou 5- à 7- foliolées ; le pétiole est très diversement développé (2 à 6 cm de long) ; les pétiolules sont généralement très courts et subégaux, parfois presque nuls ; les stipules sont libres, grandes et foliacées ou petites et plus ou moins pointues.  Les fleurs sont zygomorphes, disposées en grappes terminales, axillaires ou opposées aux feuilles ; les bractées sont linéaires, plus ou moins développées (1 à 3,5 mm de long) et généralement filiformes. Elles sont généralement de couleur jaune parfois pourprée ou blanchâtre ; la corolle est presque toujours plus longue que le calice ; l’étendard est ovale ou elliptique, veiné de brun rougeâtre ; les ailes sont égales ou assez souvent plus courtes que la carène et l'étendard ; l’ovaire est supère, uniloculaire, contenant deux ou plusieurs ovules ; le style est plus ou moins fortement coudé au-dessus de l'ovaire, pubescent à sa partie distale et le stigmate est petit (Figure 1).

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Synthèse bibliographique

 Le fruit est une gousse cylindrique, turgide, quelquefois ellipsoïde ou aplatie longitudinalement, glabre ou pubescente à l'extérieur, parfois pubescente ou laineuse à l'intérieur, terminée par un court bec pointu (Figure 1).  Les graines, de couleur jaune pâle, virant à l’orange ou au rouge foncé, sont habituellement réniformes, parfois obliques-cordiformes, à tégument lisse ou ornementé (Figure 1).  Le système racinaire est constitué d’un pivot plutôt court avec de très nombreuses racines latérales pouvant comporter d’importantes quantités de nodules actifs en forme de coraux (Figure 1).

c

d b

nodules

a e Figure 1 : Représentation des organes de Crotalaria (exemple : C. cleomifolia) (Source : PROTA, 2004). a : rameau en fleurs et en fruits ; b : fleur ; c : graine ; d : fruits ; e : racines.

1.2.3. REPARTITION GEOGRAPHIQUE ET HABITAT

Le genre Crotalaria est largement réparti dans le monde. Il se trouve principalement dans les régions tropicales et subtropicales de l'hémisphère sud (Polhill, 1982). La plupart des espèces poussent dans un endroit où elles peuvent jouir de la lumière directe, sur un terrain humide c’est-à-dire pas loin d’une rivière. Elles se retrouvent fréquemment dans les champs de

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Synthèse bibliographique maïs et manioc, dans les terres abandonnées, dans les savanes boisées et sablonneuses, dans les jachères et les pâturages, au bord des routes et au voisinage des habitations.

1.2.4. LES ESPECES PRESENTES A MADAGASCAR

À Madagascar, le genre Crotalaria est représenté par 53 espèces dont 34 sont endémiques, 12 introduites et 7 natives (Tableau 1 ; pages 9 à 11). Il est réparti dans presque toutes les régions mais le Sud et les Hauts-Plateaux se révèlent les plus riches. La majorité des espèces endémiques et natives ont une gousse globuleuse, cylindrique ou subcylindrique, multiséminée et des feuilles trifoliolées. Les espèces introduites sont, par contre, pantropicales et ont des feuilles simples (Peltier, 1959).

Tableau 1: Liste des espèces de Crotalaria présentes à Madagascar (Polhill, 1982 ; Alain et Petit, 1992)

Espèces Noms vernaculaires Origine C. andringitrensis - M C. androyensis Aolilolo M C. ankaizinensis Hengitrala, Kisotisohy, Kisotrisotry M C. ankaratrana - M C. anomala - M C. bosseri - M C. calva - M C. capuronii Santatra, Sarivonga, Teloravy M C. cornu-ammonis Hianala M C. coursii Ambihotra, Famamo, Sarinambatry M C. craspedocarpa Ankiaomby, Bevarimpotsy, Hazongoaika M Endémiques C. cyanoxantha Tsihanamaro M

C. decaryana Hanginola, Sariambatry M Ambarivatendolo, Ambarivatendolokely, Korintsampotsy, Mangakely, C. diosmifolia M Ramanjavona, Voasarinkalavola, Voatelinondry C. edmundi-bakeri - M C. emirnensis - M C. fiherenensis Aeky, Ena, Kifafahazo, Tsipolahy, M Hazomendo, Teloravy, C. grevei Tsanganakoholahy, Vahimainty, Vaho, M Zangaio, Zauga, Zongo M : Madagascar ; C : Comores ; A : Afrique ; AC : Autres Continents ; - : Nom vernaculaire inconnu

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Synthèse bibliographique

Tableau 1: Liste des espèces de Crotalaria présentes à Madagascar (Polhill, 1982 ; Alain et Petit, 1992)

Espèces Noms vernaculaires Origine C. humbertiana - M C. humbertii - M Angefotsy, Famamo, Fanamonala, C. ibityensis Hazongaga, Hazonondry, Kitsakitsana, M Tombokanjiva C. isaloensis - M Engitratainakoho, Hazomanarakandro, C. laevigata Kinesakinesa, Kinesanesa, Sarihengitra, M Tsiakasy C. leandriana - M C. mahafalensis Firo M C. mandrarensis Mahatsara M Endémiques C. manongarivensis - M C. peltieri - M C. perrieri - M C. pervillei Kiritsakiritsa, Manaramody, Teloravy M C. poissonii - M Akahomilahy, Ambarivatrindolo, Anky, C. tanety Angeafotsy, Fanamonala, Hazondandy, M Kitsakitsana, Tombokangiva, Vahipasika C. toamasinae - M Famakiasa, Hazombevavy, Laingoakalana, Maintsoririnina, C. xanthoclada M Otsiotsitany, Tendroibo, Tsileompangady, Tsipika, Vahipasika C. alata - M, A, AC Amberivatrindolo, Hazongoaka, C. berteroana M, AC Ranomanga C. goreensis Taimborika M, A C. grahamiana - M, AC C. hirta - M, C Introduites C. juncea - M, A C. micans Antsotry, Manarakandro, Odiandro M, AC C. ochroleuca - M, A Aika, Aikaberavina, Aikavavy, Ambarivatrindoly, Ambarivatrindolo, C. pallida M, AC Hatakataky, Kirintsa, Kitsonakoho, Tsiakondroakondro, Zanaharimanatrika M : Madagascar ; C : Comores ; A : Afrique ; AC : Autres Continents ; - : Nom vernaculaire inconnu -10-

Synthèse bibliographique

Tableau 1: Liste des espèces de Crotalaria présentes à Madagascar (Polhill, 1982 ; Alain et Petit, 1992)

Espèces Noms vernaculaires Origine C. spectabilis - M, A, AC Introduites C. trichotoma Ahimatavy, Marofolehana M, A C. verrucosa - M, AC Tsilomboasary, Voasarimadibo, Voasarimbiby, C. aculeata M, A Voasarinalika, Voasarinkalavola C. bernieri Ranomanja M, C, A Aikamanga, Aikavavy, Beravina, C. incana M, A Engitenakoho, Kirikintsana, Kirintsana C. lanceolata Tsitsina M, A C. ononoides Vangairidrano M, A Natives Akondrondolo, Akondronjaza, Bosy, Amberivatrindolo, Faliakoho, Famonakoho, C. retusa M, A, AC Hintsakitsaka, Kinesakinesa, Kinsakinsa, Kitsakitsanakoho, Mangakely, Tsiankazolahy Ambarivatrandololahy, Bemiray, Kirintsana, C. uncinella Lakamisilahikely, Hazongaga, Hazonondry, M, A, AC Tibohitra, Vahipasika, Zapitsakaondry M : Madagascar ; C : Comores ; A : Afrique ; AC : Autres Continents ; - : Nom vernaculaire inconnu

1.2.5. UTILISATIONS DES Crotalaria DANS LE MONDE

Partout où les différentes espèces de Crotalaria poussent naturellement, des utilisations empiriques sont connues. Par ailleurs, pour la même espèce et le même organe (feuille, tige, racine, gousse, graine…), les utilisations varient d’un endroit à un autre. A titre d’illustration :

1.2.5.1. UTILISATIONS EN ALIMENTATION HUMAINE ET ANIMALE

En Afrique, en Inde et au Vietnam, des espèces comme C. brevidens, C. natalitia, C. ochroleuca, C. pallida, C. polysperma et C. retusa sont utilisées comme légumes-feuilles en employant aussi bien les feuilles fraîches que les feuilles séchées. Celles-ci sont finement hachées, bouillies et consommées avec des aliments de base tels que le maïs, les haricots, le sorgho, le sésame ou la pâte d’arachide. A cause de leur goût légèrement amer, la plupart des gens les cuisent avec d’autres légumes. Pourtant, elles sont de plus en plus demandées comme légume traditionnel sur les marchés urbains (Johns et Kokwaro, 1991 ; Burkill, 1995 ; Uiso et Johns, 1996 ; Faridah et al., 1997).

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Synthèse bibliographique

Au nord de l’Ouganda, les fleurs et les jeunes gousses sont cueillies et séchées séparément pour être utilisées comme condiments pour les soupes (Maundu et al., 1999). Aux Etats-Unis, en Afrique Orientale et en Inde, les Crotalaria sont cultivées comme plantes fourragères et leur utilisation dans la constitution des pâturages est très importante. A titre d’illustration : C. juncea, C. retusa et C. intermedia sont utilisées pour nourrir les vaches laitières (Stehlé, 1953). C. juncea et C. ochroleuca sont utilisées comme fourrage pour les lapins. Leur teneur en protéines est respectivement de 14 à 16% et 19 à 30% (Lebas, 2007).

1.2.5.2. UTILISATIONS EN MEDECINE TRADITIONNELLE

Le genre Crotalaria est réputé pour guérir plusieurs maladies. Différentes espèces ont fait l’objet de différents usages thérapeutiques. Le tableau 2 (page 13) résume ceux-ci.

1.2.5.3. AUTRES UTILISATIONS

Au Soudan, en Angleterre et dans diverses régions de l'Extrême-Orient, les fibres de tiges des crotalaires sont utilisées pour la fabrication de filets, de cordes et de papiers (Stehlé, 1953).

Certaines espèces comme C. retusa et C. pallida étaient autrefois employées pour la fabrication des teintures (Polhill, 1982). A Madagascar, les crotalaires sont classées parmi les plantes les plus utilisées empiriquement à des fins pesticides. Des espèces comme C. craspedocarpa ; C. decaryana ; C. diosmaefolia ; C. ibityensis et C. fiherenensis sont employées comme insecticides (Ratsimamanga et al., 1969 ; Boiteau, 1986 ; Rasoanaivo et al., 1993 ). D’autres espèces comme C. craspedocarpa ; C. coursii ; C. cytisoides ; C. incana ; C. mahafalensis et C. xanthoclada sont utilisées en tant que poisons de pêche (Rasoanaivo et al., 1993 ; Voarisoa, 1998). L’association du maïs avec des crotalaires (C. grahamiana et C. retusa), est une bonne alternative dans le contrôle des mauvaises herbes (Striga asiatica et Striga hermontica) (Husson et al., 2008).

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Synthèse bibliographique

Tableau 2 : Sélection d’indications thérapeutiques des différentes espèces de Crotalaria

Espèces et pays Organes Indications Mode d’utilisation Références concernés utilisés C. natalitia écorce des Furoncles Mastication Prota (2004) (Afrique) racines C. lachnosema Nuhu et al. Gale Décoction et bain plante entière (Nigeria) (2009) Gale Application locale feuilles feuilles Nuhu et al. Fièvre Décoction fraiches (2009) ; C. retusa Décoction Grenand et al. (Nigeria, Inde, Troubles cardiaques mélangée dans des plante entière (1987) ; Guyane) soupes ou du thé Lachman et al. feuilles et (1987) Rhume Décoction fleurs Articulations Cataplasme racines douloureuses et enflées Lachman et al. Prévention des C. pallida infections de la peau et Infusion plante entière (1987) ; (Guyane) Austin et traitement du muguet Bourne (1992) Eczéma et d'autres Bouillie avec du sel partie aérienne affections de la peau Décoction C. pilosa Eruption herpétique ; appliquée autour de racines Tiwari (1999) (Inde, Guyane) syphilis l'aine C. podocarpa Baoux, et al. Affections génitales Infusion partie aérienne (Niger) (1976) Pernet et al. Antidysentérique Infusion feuilles C. cytisoides (1956) ; (Madagascar) Ratsimamanga Gale Application locale plante entière et al. (1969) Décoction: une C. diosmifolia Empoisonnement par Ratsimamanga cuillerée à soupe feuilles (Madagascar) des plantes toxiques et al. (1969) par jour C. uncinella Pernet et al. Antidysentérique Décoction feuilles (Madagascar) (1956) feuilles Heckel C. fulva Affections galeuses et Application locale fraiches et (1910) ; Pernet (Madagascar) tumeurs blanches en emplâtre poudre de et al. (1957) graines C. spinosa Pernet et al. Paludisme Décoction feuilles (Madagascar) (1957)

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Synthèse bibliographique

1.2.6. IMPORTANCE ECONOMIQUE DE Crotalaria

Parmi les Légumineuses utilisables dans l'agriculture, les espèces de Crotalaria occupent une place importante. En effet, grâce aux bactéries fixatrices d’azote présentes dans les nodosités de leurs racines, de nombreuses espèces sont utilisées comme engrais vert ou plantes de couverture pour améliorer la fertilité du sol. A titre d’exemples, on peut citer :

 en Indonésie et au Sud-Est des Etats-Unis, C. pallida et C. spectabilis sont plantées et utilisées comme engrais vert pour améliorer les sols (Faridah et al., 1997) ;

 la culture de C. lachnophora est encouragée au Rwanda en tant qu’engrais vert dans des systèmes de rotation, avec le pois cajan (Cajanus cajan) et Tephrosia vogelii. Au Guatemala, elle a été préconisée comme plante d’ombrage pour les caféières, et aussi pour préserver le sol (Brink, 2015). L’enfouissement de leurs feuilles, tiges et rameaux permet non seulement un apport considérable en matière organique mais surtout une action nématicide très efficace. Par conséquent, des espèces comme C. pallida, C. juncea, C. retusa, et C. spectabilis sont utilisées pour réduire la population de nématodes phytoparasites du genre Meloidogyne, Pratyleiichiis ou Rotylenchulzis sur les cultures auxquelles elles se trouvent associées (Brodie et al., 1970 ; Silva et al.,1989 ; Rich et Rahi, 1995).

1.3. TRAVAUX ANTERIEURS SUR LA PHYTOCHIMIE DU GENRE Crotalaria

De par sa grande importance agronomique et médicinale, le genre Crotalaria a fait l’objet de nombreux travaux comprenant des investigations phytochimiques et pharmacologiques. De ces études a résulté l’isolement d’une large variété de métabolites secondaires, mais les alcaloïdes dérivés de la pyrrolizidine et les flavonoïdes sont les composés majoritaires et les plus fréquemment décrits dans la littérature (L’etang, 2012 ; Aronson, 2014 ; Brink, 2015 ; Sudanicha et al., 2017). Nous produisons ci-dessous quelques données sur chacune de ces deux familles de composés.

1.3.1. GENERALITES SUR LES ALCALOÏDES

Ces substances naturelles et organiques contiennent au moins un atome d'azote dans leur structure chimique, avec un caractère basique de degré variable. Souvent d’origine végétale, les alcaloïdes dérivent d’acides aminés. Ils peuvent également être trouvés dans

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Synthèse bibliographique d’autres organismes vivants tels que les arthropodes, les amphibiens, les champignons, les mousses, les éponges, les bactéries, etc (Mann et al., 1994 ; Couture, 2016). Plusieurs alcaloïdes sont très toxiques et offrent, par conséquent, un arsenal chimique de défense des plantes contre l'attaque des herbivores et des microorganismes. Depuis l'identification du premier alcaloïde à savoir la morphine à partir de l’opium en 1806 (Harborne et Herbert, 1995), plus de 10 000 alcaloïdes ont été isolés des plantes (Hesse, 2002). Il existe plusieurs manières de classer les alcaloïdes. Puisque l’atome d’azote dans leur structure provient, en général, d’un acide aminé, une façon raisonnable de les classer est alors de les regrouper, selon leur précurseur biosynthétique. Le tableau 3 (page 16) distingue les différentes familles d’alcaloïdes selon leur acide aminé précurseur. D’autres composés azotés peuvent aussi servir de précurseurs.

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Synthèse bibliographique

Tableau 3 : Les différentes familles d’alcaloïdes selon le précurseur (Muniz, 2006)

Précurseur Alcaloïdes Structure

Pyrrolidines Ornithine

Pyrrolizidines

Tropanes

Lysine Pipéridines

Quinolizidines

Indolizidines

Phénylalanine (R=H) et Tyrosine (R=OH) Isoquinoléines

Arginine Guanidine

Tryptophane Indoles

Histidine Imidazoles

Acide nicotinique Pyridines

Acide anthranilique Quinoléines

Acridines

Quinazolines

Terpéniques et stéroïdiques Précurseur non acide aminé Plusieurs structures Purines, macrocycles

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Synthèse bibliographique

1.3.1.1. LES ALCALOÏDES DERIVES DE LA PYRROLIZIDINE (AP)

1.3.1.1.1. DEFINITION

Les alcaloïdes dérivés de la pyrrolizidine ou alcaloïdes pyrrolizidiniques (AP) sont des substances naturellement présentes dans une grande variété d’espèces végétales car plus de 6000 espèces en contiennent. Les Boraginaceae, les Fabaceae, les Asteraceae et les Orchidaceae sont les principales familles végétales qui en contiennent (FAO, 2010). Chez les Fabaceae, le genre Crotalaria est de loin le plus connu pour sa forte teneur en AP (Rizk, 1991 ; Hartmann et Witte, 1995). Cependant, la quantité de ces composés dépend du stade végétatif de la plante, de la saison et des organes qui les contiennent.

1.3.1.1.2. STRUCTURE

Chez les végétaux, plus de 500 structures différentes d’AP ont été identifiées et isolées (Wiedenfeld, 2013). La voie de synthèse de ces alcaloïdes est celle de la L-ornithine ; leur structure de base est un noyau pyrrolizidine (figure 2). Le suffixe « -izidine » signifie que la structure possède un atome d’azote en jonction du cycle.

Figure 2 : Structure d’un noyau pyrrolizidine

La grande majorité des AP sont des esters (mono- ou diesters) entre une nécine (amino- alcool à squelette pyrrolizidinique) et un ou deux acides néciques (acides aliphatiques mono- ou dicarboxyliques) (Bruneton, 2009). Le cycle est toujours substitué par un groupe hydroxyméthyle (-CH2OH) en C-1 et présente parfois une fonction alcool secondaire (-OH) en C-2, en C-6 ou en C-7 (figure 3).

La plupart des AP dérivent de quatre bases de nécine : la rétronécine, l’héliotridine, l’otonécine considérées comme toxiques chez les Vertébrés et la platynécine qui est non toxique (figure 3) (Hartmann et Witte, 1995).

Retronécine Héliotridine Otonécine Platynécine

Figure 3 : Structure de quatre bases de nécine

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Synthèse bibliographique

1.3.1.1.3. TOXICITE

Très toxiques, les AP sont les toxines les plus largement répandues et provoquent des empoisonnements de masse chez les humains et les animaux. Pour la plupart des AP, le foie est le principal organe cible de la toxicité (Roeder et Wiendenfeld, 2013). La toxicité est due à la présence de l’un des éléments suivants dans leur structure, à savoir :  une insaturation en position 1-2 (figure 4 a) ;  un ou deux hydroxyles attachés au noyau pyrrole par un carbone (figure 4 b) ;  une chaîne ramifiée dans la partie acide (figure 4 c) ;  une estérification sur au moins un de ces hydroxyles (figure 4 d). En règle générale, les AP n’ont pas la même toxicité. Les diesters macrocycliques sont les plus toxiques. Puis viennent les diesters acycliques, qui sont plus toxiques que les monoesters. La toxicité s’explique par l’oxydation de ces alcaloïdes au niveau des microsomes hépatiques, engendrant des structures pyrroliques qui se comportent en agents alkylants des protéines et des acides nucléiques (Bruneton, 2009).

d c

b

a

Figure 4 : Les éléments structuraux indispensables pour la toxicité des AP (Rosemann, 2006)

Chez les êtres humains, l’intoxication est due soit à l’ingestion d’aliments d’origine végétale comme les céréales ou de produits à base de céréales (farine ou pain) contaminés par des graines contenant des AP ; ou des produits d’origine animale (lait ou œufs), indiquant le transfert des AP de l’alimentation de consommation animale aux tissus comestibles ; soit par utilisation directe et intentionnelle d’espèces végétales en tant qu’aliments ou remèdes traditionnels. Chez les animaux, l’intoxication est causée par l’ingestion des végétaux contenant des AP. Ils broutent ces végétaux dans des conditions de sécheresse ou de surpâturage ou bien, ils

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Synthèse bibliographique peuvent également les consommer lorsque ceux-ci sont présents sous leur forme séchée dans leur alimentation. Les rongeurs, les porcs, la volaille, le bétail et les chevaux sont les plus sensibles à l’intoxication aux AP (FAO et OMS, 2011, 2014). Différents types de toxicité peuvent être causés par les AP, à savoir : hépatotoxicité et toxicité pulmonaire (Mattocks, 1986 ; OMS, 1988) ; cardiotoxicité (Akhavein et al., 2007) ; cancérogénicité et génotoxicité (FAO et OMS, 2014).

1.3.1.1.4. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES

Les AP sont largement considérés comme des métabolites secondaires importants en raison de leurs propriétés biologiques. Ils peuvent agir comme agents antitumoraux (Bruneton, 2009), antiviraux et antimicrobiens (Singh et al., 2002), anticancéreux (Kovach et al., 1979) et antidiabétiques (Sridhar et Bhagya, 2007). Certains AP ne sont pas toxiques mais possèdent des propriétés intéressantes. Ainsi, la platiphylline est douée des propriétés antispasmodiques et mydriatiques. L’allantoine est connue pour ses propriétés cicatrisantes (Bruneton, 1993 ; 2009).

1.3.1.1.5. EXEMPLES D’AP ISOLES DU GENRE Crotalaria

Selon Polhill (1982), environ 50 AP différents ont été isolés dans les organes d’environ

45 espèces de Crotalaria. La monocrotaline (figure 5), de formule C16H23O6N, constitue le principal alcaloïde du genre Crotalaria et peut se retrouver dans toutes les espèces (Pilbeam et al., 1983). Elle a été isolée pour la première fois dans les tiges, les feuilles et les graines de C. retusa et C. spectabilis.

Figure 5: Structure chimique de la monocrotaline

Le Tableau 4 (page 20) regroupe des exemples d’AP isolés du genre Crotalaria en précisant l’espèce et la partie de la plante concernée (Aronson, 2014). Les structures chimiques de certains de ces types sont présentées dans les figures 6 et 7 (pages 20 à 21).

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Synthèse bibliographique

Tableau 4 : Les AP isolés de différentes espèces de Crotalaria (Aronson, 2014)

Espèces AP isolés Organes C. albida Croalbidine Partie aérienne C. anagyroides Anacrotine, methylpyrrolizidine Graines C. aridicola Déhydropyrrolizidines Partie aérienne C. burhia Croburhine, crotalarine Partie aérienne C. candicans Crocandine, cropodine, turneforcidine Graines C. crassipes Rétusamine Graines C. crispata Crispatine, fulvine Partie entière C. dura Dicrotaline Partie aérienne C. fulva Fulvine Partie entière C. globifera Crotaline, globiférine, trichodesmine Partie aérienne C. goreensis Hydroxymethylenepyrrolizidine Graines C. grahamiana Grahamine, monocrotaline Graines C. grantiana Grantianine, grantaline Graines C. incana Anacrotine, intégerrimine Partie aérienne C. intermedia Intégerrimine, usaramine Graines C. madurensis Crotafoline, madurensine, Graines C. mitchelii Rétusamine Non précisée C. mucronata Mucronitine, mucronitinine Graines C. nana Crotananine, cronaburmine Graines C. retusa Rétusamine, Rétusine, Rétorsine, Senecionine Non confirmé C. semperflorus Crosempérine Non confirmé Rétronecanol Non confirmé C. spectabilis Spectabiline Partie entière C. stricta Crotastrictine Non confirmé C. trifoliastrum Alkylpyrrolizidines Non confirmé C. usaramoensis Usaramine, usaramoensine Non confirmé C. virgulata Grantaline, grantianine Non confirmé C. walkeri Acetylcrotaverrine, crotaverrine Non confirmé

Rétusine Rétusamine Rétorsine Senecionine

Figure 6 : Structure chimique de quelques AP isolés du genre Crotalaria (Roseman et al., 1996)

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Synthèse bibliographique

Figure 7 : Structure chimique de la fulvine, isolée de C. fulva (Ratsimamanga et al., 1969)

1.3.1.2. LES ALCALOÏDES DERIVES DE LA GUANIDINE

Des données bibliographiques concernant les alcaloïdes dérivés de la guanidine (AG) sont présentées dans ce paragraphe car ces types de composés ont été rencontrés dans nos matériels d’étude.

1.3.1.2.1. DEFINITION

Les alcaloïdes dérivés de la guanidine ou alcaloïdes guanidiniques (AG) sont des composés présents naturellement chez les microorganismes, les invertébrés marins et terrestres ou encore chez les végétaux supérieurs. Plus de 100 AG ont été identifiés depuis la découverte de la guanidine par Strecker en 1861 (Mori et al., 1987). La guanidine est un composé issu de l'oxydation de la guanine qu'on retrouve dans certains légumes (champignons, navets, etc…) ou crustacés (moules). Elle se retrouve en petites quantités dans l'urée, une substance éliminée dans les urines et qui est issue de la dégradation des protéines. Les dérivés de la guanidine sont la créatine et l'arginine, des acides aminés censés doper l'organisme. Cependant, les AG sont relativement rares et exceptionnels comme métabolites secondaires chez les végétaux supérieurs car la plupart d’entre eux ont été trouvés chez de nombreuses espèces d’éponges marines appartenant à différents genres (Hemimycale, Monanchora, Batzella, Ptilocaulis (Croué, 2014).

1.3.1.2.2. STRUCTURE ET CLASSIFICATION

La structure de base des AG naturels est un squelette de guanidine (figure 8, page 22) qui est un dérivé des amidines dans lesquels l’atome de carbone (C) central est totalement substitué par des azotes (N).

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Synthèse bibliographique

Figure 8 : Structure d’un squelette de guanidine

Les voies de biosynthèse des AG sont encore inconnues. Selon Snider et Shi (1993), la structure de ces métabolites suggère l’intervention de polycétides. Ils proposèrent comme dernière étape de synthèse de ces molécules l’addition d’une guanidine libre à une structure proche de celle d’un polycétide. Les polycétides sont une famille de produits naturels issus de la condensation de monomères d’acyl-CoA tels que l’acétyl-CoA et le propionyl-CoA, avec des unités de malonyl-CoA ou de méthylmalonyl-CoA. Leur nom provient du fait que ces composés présentent des groupements fonctionnels β-cétoniques. Après chaque réaction de condensation, le groupement β-cétonique nouvellement formé peut être réduit, hydraté et à nouveau réduit, ou bien ne subir qu’une seule modification. Les AG forment ainsi une famille de produits possédant une grande diversité structurale et dont les activités biologiques sont remarquables (Gaitatzis et al., 2002). La biosynthèse de ces produits est assurée par des polycétides-synthétases, un important complexe enzymatique multifonctionnel. Structurellement, les AG peuvent être classés en quatre groupes (Santos et al., 2015) :  les AG à squelette pyrimidinamine monocyclique ou cyclopentapyrimidinamine bicyclique (figure 9 a);  les AG à squelette triazaacénaphthylène tricyclique contenant uniquement un fragment de guanidine (figure 9 b) ;  les AG à squelette triazaacénaphthylène tricyclique contenant au moins un fragment de guanidine (figure 9 c) ;  les AG à squelette cyclopentaquinazolinamine tricyclique (figure 9 d).

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Synthèse bibliographique

Groupe 1 Groupe 2 Groupe 3 Groupe 4

Contenant uniquement Contenant au moins un un fragment de fragment de guanidine guanidine (a) (b) (c) (d)

Figure 9 : Les différents groupes d’AG

1.3.1.2.3. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES

Les AG sont des composés particulièrement intéressants en raison de leurs multiples activités biologiques telles que les activités anticancéreuses et antitumorales (Makarieva et al., 2012), antifongiques (Rubiolo et al., 2013), antibactériennes (Laville et al., 2009), anti-VIH (Hua et al., 2007), antimalariales et antiparasitaires (Hua et al., 2004), antileucémiques (Makarieva et al., 2011), anti-inflammatoires, antivirales et antidiabétiques (Carbone et al., 2017). Les AG sont toxiques pour certains animaux. Par ailleurs, il existe peut-être un risque pour l’homme à très forte dose (Peirs, 2005). Certains AG de synthèse présentent toutefois un réel intérêt, agissant comme catalyseurs, édulcorants puissants, désinfectants ou comme substances mimétiques de nucléotides, de sucres, de lipides et de peptides.

1.3.2. GENERALITES SUR LES FLAVONOÏDES

1.3.2.1. DEFINITION

Les flavonoïdes représentent une classe de métabolites secondaires largement répandus dans le règne végétal. Ils sont considérés comme des pigments quasiment universels des végétaux et souvent responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. Le terme flavonoïde regroupe une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols (Seyoum et al., 2006).

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Synthèse bibliographique

1.3.2.2. STRUCTURE ET CLASSIFICATION

Du point de vue structural, les flavonoïdes se répartissent en plusieurs classes de molécules. En effet, plus de 6400 structures ont été identifiées (Harborne et Wiliams, 2000). Ils ont en commun la structure du diphénylpropane à 15 atomes de carbone constitué de deux noyaux aromatiques (désignés par les lettres A et B), reliés par un hétérocycle oxygéné (désigné par la lettre C) (figure 10) (Dacosta, 2003).

Figure 10 : Structure générale du noyau des flavonoïdes (Di Carlo et al., 1999)

D’une façon générale, les flavonoïdes se trouvent soit à l’état libre, auquel cas ils sont dits « aglycones », soit sous forme de « C- ou O-glycosides », auquel cas ils sont liés à des sucres tels que le glucose, le rhamnose, l’arabinose (Dacosta, 2003). Dans la plupart des cas, les flavonoïdes aglycones, notamment les flavonoïdes simples et polymethylés, sont présents sous forme de cires dans les feuilles, les écorces et les bourgeons floraux tandis que les flavonoïdes sous forme glycosidique sont plutôt présents dans les vacuoles des fleurs, des feuilles, des tiges ou des racines (Iwashina, 2000). La famille des flavonoïdes peut se diviser en deux grands groupes : les flavonoïdes au sens strict et les isoflavonoïdes. (Bruneton, 2009).

1.3.2.2.1. LES FLAVONOÏDES AU SENS STRICT

Dans ce groupe se trouvent les chalcones, les aurones, les flavones, les flavonols, les flavanones, les flavanonols, les flavanes, les flavan-3-ols, et les flavyliums (figure 11, page 25). A l'exception des chalcones et des aurones, les flavonoïdes au sens strict dérivent d'une structure 1,3-diphénylpropane.

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Synthèse bibliographique

Chalcone Aurone R=H : Flavone R=OH : Flavonol

R=H : Flavane R=H : Flavanone Flavylium R=OH : Flavanonol R=OH : Flavan-3-ol

Figure 11: Structure de base des flavonoïdes au sens strict (Bruneton, 2009)

1.3.2.2.2. LES ISOFLAVONOÏDES

Ces composés diffèrent des autres flavonoïdes par la position du cycle B, qui dans leur cas est attaché en position 3 (en 2 pour les autres flavonoïdes), formant un squelette de base 1,2-diphénylpropane. Il existe de nombreuses sous-classes d’isoflavonoïdes telles que les isoflavones, les isoflavanones, les isoflavanols, les isoflavanes, les roténoïdes, les ptérocarpanes, les coumaronochromones et les 3-arylcoumarines (figure 12). Les isoflavonoïdes sont quasi-uniquement présents chez les Fabaceae, puisque 85 % d’entre eux ont été isolés de cette famille et plus particulièrement de la sous-famille des Papilionoideae (Dewick et Harbourne, 1992 ; Iwashina, 2000).

Isoflavones Isoflavanones Isoflavanols Isoflavanes

Roténoïdes Ptérocarpanes Coumaronochromones 3-arylcoumarines

Figure 12: Structure des différentes sous-classes d’isoflavonoïdes (Iwashina, 2000)

1.3.2.3. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES

Les flavonoïdes possèdent de nombreuses propriétés biologiques. Plusieurs d’entre eux sont doués d’activités antibactérienne et antifongique (Gonzalez et al., 2008) ; antivirale (Andres et al., 2009) ; antioxydante (Halbwirth, 2010) ; anti-inflammatoire (Mladinka et al.,

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Synthèse bibliographique

2010) ; antitumorale (Stavric et Matula, 1992) ; anticancéreuse (Das et al.,1994) ; hypotenseur et diurétique (Bidet et al., 1987) ; antiparasitaire (Batista et al., 2009 ) ; insecticide (Yenesew et al., 2009 ; Sreelatha et al., 2009), etc.

1.3.2.4. EXEMPLES DE FLAVONOÏDES ISOLES DU GENRE Crotalaria

Plusieurs molécules de flavonoïdes ont été isolées de diverses espèces du genre Crotalaria. En voici quelques exemples :  Le 4'-hydroxyflavone-7-O-rhamnoside (figure 13) est un flavonoïde à activités antimicrobienne et anti-inflammatoire qui a été isolé des fleurs de C. grahamiana (Vanitha et al., 2012).

Figure 13 : Structure chimique de 4' hydroxy flavone-7-O-rhamnoside isolé de C. grahamiana

 Les composés 2',4',5,7-tétrahydroxyisoflavone [1] ; 2',4',7- trihydroxyisoflavone [2] ; 4',7-dihydroxyflavone [3] et isovitexine [4] (figure 14) ont été isolés de tous les organes de C. sessiliflora (Yoo, 2004).

[1]=R=OH [3]= R1=H et R2=H [2]=R=H [4]=R1=OH et R2=C-Glycosidique

Figure 14 : Structure chimique des flavonoïdes isolés de C. sessiliflora

 Les composés lachnoisoflavone A [5] et lachnoisoflavone B [6] (figure 15, page 27) ont été isolés de toute la partie de C. lachnophora. Ils ont montré une activité inhibitrice vis-à-vis de la croissance d’Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae (Awouafack et al., 2011).

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Synthèse bibliographique

[5] Lachnoisoflavone A : 7,2',4'- [6] Lachnoisoflavone B : 4,8-dihydroxy-2- trihydroxy-5"-isopropényl-4",5"- isopropényl-2,3-dihydro-5H-[1]benzofuro dihydrofurano [2",3":5,6] isoflavone [2,3-b] furo [3,2-g] chromen-5-one

Figure 15 : Structure chimique des flavonoïdes isolés de C. lachnophora

1.4. DONNEES SUR LA TOXICITE DU GENRE Crotalaria

Un nombre non négligeable d’espèces de Crotalaria sont réputées dangereux pour la santé de l’homme et des animaux. La toxicité est généralement liée à la présence des différentes substances toxiques qu’elles synthétisent dont les plus fréquents sont les AP et les acides aminés non protéiques (AANP). L’intoxication est due à l’ingestion, soit accidentelle ou liée à des habitudes alimentaires soit à des fins médicinales, de ces espèces végétales. Les parties le plus souvent incriminées dans les empoisonnements sont les feuilles et les graines où sont accumulés les principes toxiques. L’Union européenne (2010) a réglementé les alcaloïdes dans les aliments pour animaux en établissant une teneur maximale de 3000 mg pour les graines de mauvaises herbes et les fruits non moulus ni broyés contenant des alcaloïdes ou d’autres substances toxiques. Chez le genre Crotalaria, cette teneur maximale est fixée à 100 mg de graines/Kg d’alimentation animale totale.

1.4.1. TOXICITE CHEZ LES ETRES HUMAINS

Les intoxications sont rares et s’expliquent par la consommation régulière et inappropriée d’espèces de Crotalaria toxiques en tant que tisanes ou remèdes traditionnels (Coulombe, 2003). Ces plantes peuvent être responsables de graves intoxications hépatiques qui, dans certains cas, peuvent entraîner la mort (FAO et OMS, 2011). Habituellement, l'intoxication chronique se traduit par une perte d'appétit, des douleurs, une distension abdominale et une hépatomégalie. A titre d’exemple, voici quelques cas d’intoxications :  en Guadeloupe, des intoxications graves ont été constatées, surtout chez les enfants, à cause de la consommation du thé appelé « thé à sonnettes » préparé à partir des

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Synthèse bibliographique

organes de C. retusa et utilisé comme remède populaire contre les indispositions (Fournet, 2002) ;

 en Jamaïque, des cas très sévères d’atteintes hépatiques ont été observés chez les jeunes enfants à cause de l’administration inconsidérée de tisanes préparées à l’aide des feuilles de C. fulva (Schoental, 1963 ; Ratsimamanga et al., 1969).

1.4.2. TOXICITE CHEZ LES ANIMAUX

L'intoxication se produit suite à l'ingestion de la plante fraîche ou séchée dans le foin. Cependant, la plante fraîche est rarement consommée à cause de son amertume. L'ingestion peut être importante chez tous les herbivores si la plante est séchée dans le foin, où elle perd de son amertume tout en restant toxique. Les chevaux, les bovins et les volailles sont les espèces les plus affectées (Passemard et Priymenko, 2007). La toxicité est dose dépendante, c'est-à-dire qu'elle se manifeste suite à l'ingestion cumulée d'une certaine quantité de la plante. Le plus souvent, l'intoxication est chronique : les symptômes n'apparaissent que plusieurs mois après le début de l’ingestion. Les signes cliniques possibles sont ceux d'une insuffisance hépatique, c’est-à-dire : amaigrissement chronique ; léthargie et anorexie ; coliques récidivantes et ictère ; ataxie ; photosensibilisation et des signes d'encéphalose hépatiques au stade terminal avant la mort (Smith et al., 2003 ; Amory, 2004). Le pronostic dépend de la quantité de crotalaires ingérée par rapport au poids de l’animal et à la sensibilité de celui-ci, mais il est toujours très réservé. Il n’y a pas de traitement réellement efficace car les lésions hépatiques sont irréversibles. De nombreux cas d’intoxications d’animaux par le genre Crotalaria ont été rapportés dans la littérature. Citons par exemples que :  l’ingestion de C. burkeana a entrainé, chez le bétail, une maladie mortelle appelée «crotalariose » ou « crotalisme » affectant le système nerveux, les poumons et le foie (Watt et Breyer-Brandwijk, 1962 ; Polhill, 1982) ;

 dans l'Ouest de l'Australie, C. crispata et C. retusa étaient responsables, d'une hépatite toxique appelée « Kimberley horse disease » ou « walkabout disease » chez les chevaux. Les symptômes observés étaient principalement la perte d'appétit, l’amaigrissement et les errements sans but (Gardner, 1952). Plusieurs espèces comme C. aridicola, C. dura, C. juncea ou C. sagittalis sont aussi toxiques pour les chevaux (Watt et Breyer-Brandwijk, 1962 ; Miller, 1967) ;

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Synthèse bibliographique

 les graines de C. spectabilis et C. retusa sont toxiques pour le bétail, la volaille et les oiseaux (Ritchey et al., 1941). Elles pourraient entrainer des hémorragies pulmonaire et intra-hépatique ainsi qu’une nécrose du foie chez les rats (Sanders et al., 1936) ; les souris (Neal et al., 1935) et les cochons (Emmel et al.,1935).

1.5. PROPRIETES PHARMACOLOGIQUES DES Crotalaria

De nombreuses études pharmacologiques ont été réalisées sur plusieurs espèces de Crotalaria. Les recherches ont été effectuées sur des extraits bruts, des extraits purifiés et des composés isolés (produits purs).

1.5.1. PROPRIETES ANTIMICROBIENNES 1.5.1.1. ACTIVITES ANTIBACTERIENNES

Les extraits éthanoliques de graines et de fleurs de C. juncea sont actifs contre Staphylococcus aureus, Escherichia coli ; Klebsiella pneumoniae ; Pseudomonas aeruginosa et Vibrio cholerae (Chouhan et Singh, 2010). Le Cp-AMP, un peptide isolé de graines de C. pallida, est un agent antibactérien efficace contre Escherichia coli et Proteus sp (Pelegrini et al., 2009). En outre, les extraits méthanoliques de ses feuilles possèdent une activité significative contre Escherichia coli ; Klebsilla pneumoniae ; Pseudomonas aeruginosa ; Bacillus sp. et Staphylococcus aureus (Kiruthiga et al., 2014). Les extraits méthanoliques de tiges et de graines de C. incana ont montré un effet antibactérien sur Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Salmonella typhi (Alemu et al., 2015).

1.5.1.2. ACTIVITES ANTIFONGIQUES

Les extraits méthanoliques de feuilles de C. quartiniana ont une activité antifongique contre C. albicans (Omori, 2011). Les extraits aqueux de fruits de C. trichotoma ont montré une activité inhibitrice sur la croissance d’Alternaria solani, un champignon phytopathogène responsable des maladies nommées « brûlures alternariennes » chez les tomates (Ravikumar et al., 2013). Les extraits aqueux de feuilles de C. juncea inhibent la croissance d’Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium solani, et Rhizoctonia solani (Hussain et al., 2015).

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Synthèse bibliographique

1.5.2. PROPRIETES ANTIOXYDANTES

L’orientin et l’isoorientine, des composés isolés des extraits acétate d’éthyle de la partie aérienne de C. sessiliflora, ont montré une forte activité antioxydante (Mun'im et al., 2003). Les extraits des organes de C. retusa ; C. pallida ; C. juncea ont aussi révélé des propriétés antioxydantes intéressantes (Govindappa et al., 2011 ; Devendra et al., 2012 ; Dinakaran et al., 2014).

1.5.3. PROPRIETES ANTI-INFLAMMATOIRES

L’acide crotalique, un triterpène isolé de la partie aérienne de C. emarginella, a présenté une activité anti-inflammatoire significative chez le rat. Son activité est similaire à celle de l’oxyphényl butazone, un anti-inflammatoire standard (Ahmed et al., 2006). Les extraits méthanoliques de tiges de C. pallida et éthanoliques de racines de C. burhia ont montré une activité anti-inflammatoire (Weng et al., 2003 ; Talaviya et al., 2014).

1.5.4. PROPRIETES ANTICANCEREUSES

Les extraits éthanoliques de feuilles et de fleurs de C. agatiflora ont révélé une bonne activité anticancéreuse. Ils ont provoqué un signe d’apoptose et de nécrose dans la culture d’une lignée cellulaire cancéreuse HeLa (Le Roux et al., 2009). Les extraits éthanoliques de racines de C. burhia ont montré une activité anti- cancéreuse chez la souris (Kataria, 2012).

1.5.5. PROPRIETES ANALGESIQUES

Les extraits méthanoliques de racines de C. burhia ont exercé une activité analgésique significative chez le rat et la souris. Cette activité est similaire à celle de l’aspirine et la morphine (Vyas et al., 2016).

1.5.6. PROPRIETES CYTOTOXIQUES

La madurensine et la doronénine, alcaloïdes isolés des extraits éthanoliques de feuilles de C. agatiflora, ont un effet cytotoxique sur les cellules cancéreuses U-937 (Le Roux et al., 2011). Les extraits méthanoliques et éthanoliques de feuilles de C. juncea avaient un effet inhibiteur de 50% sur la prolifération des cellules HeLa (Khanra et al., 2015).

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Synthèse bibliographique

1.5.7. PROPRIETES ANTIPARASITAIRES

1.5.7.1. ACTIVITE ANTI-LEISHMANIOSE

Les extraits aqueux des feuilles, graines, tiges et racines de C. spectabilis ont montré une activité inhibitrice importante sur l’enzyme protéase des peptides des Leishmania chagasi et Leishmania amazonensis (Pacheco et da Silva-López, 2012). Les extraits éthanoliques de C. retusa, à une concentration égale à 5,6 mg/ml, ont eu une forte action leishmanicide contre Leishmania chagasi (da Rocha et al., 2009).

1.5.7.2. ACTIVITE ANTHELMINTHIQUE

Les extraits chloroformique et méthanolique de feuilles de C. pulchra ont exercé une activité anthelminthique vis-à-vis de Pheretima posthuma (ver de terre) et Ascaridia galli (ver intestinal humain) (Rama Devi et al., 2010). Les extraits éther de pétrole et éthanolique de feuilles de C. pallida ont montré une activité antihelminthique significative sur Pheretima posthuma. Leur activité est similaire à celle de l’Albendazole, un anthelminthique standard (Panda et al., 2015).

1.5.7.3. ACTIVITE NEMATICIDE

Les extraits aqueux de feuilles de C. grantiana ont révélé une activité nématostatique vis-à-vis de Meloidogyne incognita qui infecte les tomates (Jourand et al., 2004). Les extraits aqueux de racines de C. spectabilis ont présenté une activité inhibitrice contre le développement des larves de Meloidogyne incognita (Subramaniyan et Vadivelu, 1990).

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PARTIE II

ETUDES PRELIMINAIRES DES DIFFERENTES ESPECES DE Crotalaria PRESENTES A MADAGASCAR

Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

2.1. INTRODUCTION

Les travaux menés dans cette deuxième partie ont consisté essentiellement en des études préliminaires sur les plans chimique, biologique et toxicologique sur différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar. L’objectif était de sélectionner une espèce possédant des propriétés intéressantes pour la conduite des investigations plus approfondies. Ainsi, nos travaux ont comporté essentiellement :  des enquêtes ethnobotaniques pour rassembler le maximum d’informations sur les plantes et leurs utilisations ;  un criblage phytochimique afin de détecter les différentes familles chimiques des métabolites secondaires probablement responsables des activités biologiques ;  des tests de toxicité réalisés sur les souris et les microorganismes.

2.2. MATERIELS ET METHODES

2.2.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES ET COLLECTE DES ECHANTILLONS

Les recherches au sein de l’Unité de Toxicologie ont porté sur des plantes issues de toutes les régions de Madagascar et ne se sont pas cantonnées à une zone d’étude particulière. Un maximum de plantes du genre Crotalaria a alors été collecté au cours des missions sur le terrain organisées par les équipes du LABASM, de Mai 2013 à Juin 2015. D’une part, les différentes espèces connues de Crotalaria ont été repérées grâce à des données bibliographiques, à savoir la description botanique, la répartition géographique voire la localisation précise de chaque espèce à Madagascar. D’autre part, lorsqu’une espèce était trouvée sur les lieux mais n’était pas inventoriée dans la bibliographie, elle était tout de même récoltée. Au niveau de chaque localité visitée, des enquêtes ethnobotaniques ont ainsi été menées auprès des agents de proximité (ONG ou projets), des communautés villageoises, de paysans locaux et autres personnes ressources dont des guides, des gardes forestiers, etc. Le but était de collecter toutes les informations relatives aux espèces de Crotalaria rencontrées, notamment leurs vertus médicinales, leur toxicité et leurs éventuelles autres utilisations. Des données précises et détaillées, incluant les organes ou parties utilisés, le mode de préparation de la plante, ainsi que d’autres informations utiles ont été recueillies et notées sur une fiche d’enquête mise au point au laboratoire (voir en Annexe 1).

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Pour chaque plante identifiée, les organes utilisés (feuilles, écorces de tiges, graines et cosses) ont alors été récoltés en priorité puis systématiquement complétés avec les autres parties végétales disponibles au cours de la mission. Les échantillons ainsi obtenus ont été préparés afin de faciliter leur transport jusqu’au laboratoire, c’est-à-dire que les rameaux ont été effeuillés, les fruits (graines et cosses) éventuellement séparés des tiges, En outre, des herbiers ont été confectionnés pour une détermination systématique ultérieure.

2.2.2. MATERIELS D’ETUDE

Le choix des organes a reposé avant tout sur leur disponibilité au moment des récoltes. Les feuilles, les écorces de tiges, les graines et les cosses de différentes espèces de Crotalaria ont constitué les matériels d’étude utilisés dans ce travail. Les graines et les cosses n’ont été que peu utilisées à cause de leur disponibilité limitée.

2.2.3. IDENTIFICATION BOTANIQUE

Une première identification de chaque espèce récoltée a été faite par comparaison avec les herbiers de référence de l’herbarium du Parc Botanique et Zoologique de Tsimbazaza (PBZT). La détermination botanique finale de chaque échantillon a été réalisée avec l’aide de Roger Marcus POLHILL, Botaniste au Royal Botanic Gardens de Kew et expert en systématique des Légumineuses (Fabaceae).

2.2.4. PREPARATION DES EXTRAITS

2.2.4.1. PREPARATION DU MATERIEL VEGETAL

Les organes récoltés sont séchés séparément dans un endroit sec, propre, aéré et à l’ombre pour éviter qu’un ou plusieurs de leurs composants chimiques ne soient altérés par les rayonnements solaires. Une fois secs, ils sont réduits en poudre à l’aide d’un broyeur de marque Blender (Robot Coupe GT 550). Après tamisage, les poudres fines obtenues sont conservées à la température ambiante dans des bocaux hermétiques.

2.2.4.2. PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS

Pour chaque type de matériel végétal, 10 g de poudre sont mis en suspension dans une solution hydroéthanolique (eau/éthanol : 25 %/75 %) suivant le rapport 1/10 (p/v). Le mélange est ensuite soumis à une agitation magnétique durant 3 h à la température ambiante puis laissé

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria macérer à +4°C pendant une nuit. Le macérat est filtré sur quatre épaisseurs de gaze après avoir été agité de nouveau pendant 30 min. Le filtrat est centrifugé (centrifugeuse JOUAN, TH12) à 10 000 tours/min pendant 15 min. Le culot est éliminé, alors que le surnageant est évaporé à sec à l’aide d’un évaporateur rotatif Büchi (Rotavapor R110) sous pression réduite à 45°C. Le résidu d’évaporation est repris dans de l’eau distillée. L’extrait hydroéthanolique obtenu à partir de chaque organe constitue l’extrait brut (EB) à partir duquel tous les tests biologiques ont été effectués.

2.2.5. DETERMINATION DES FAMILLES CHIMIQUES

Les réactions de détection des familles chimiques ou criblage phytochimique ont été effectuées sur les poudres de différents organes de chaque espèce de Crotalaria selon les méthodes décrites par Bruneton (1993), Fong et al. (1997) ainsi que Firdouse et Alam (2011). Cette méthode, permettant d’accéder à des résultats essentiellement qualitatifs, est utilisée en étape préliminaire à des études plus approfondies. Quatre types d’extraits sont préparés préalablement pour les tests :

 Extrait acide

Dans un tube à essais, 500 mg de poudre sont mélangés à 2 ml d’acide chlorhydrique (HCl) 2 N. La suspension est laissée macérer à +4°C pendant 12 h puis filtré. Le filtrat obtenu constitue l’extrait acide servant à détecter les alcaloïdes.

 Extrait hydroéthanolique

La poudre (500 mg) est mise en suspension dans 10 ml de mélange hydroéthanolique 75 %. Après macération de l’ensemble pendant une nuit, une filtration conduit à l’obtention d’un extrait hydroéthanolique déstiné à la détection des flavonoïdes et des leucoanthocyanes.

 Extrait aqueux

Dans un tube à essais, 500 mg de poudre sont délayés dans 10 ml d’eau distillée. Le mélange est porté à ébullition pendant 30 min puis mis à macérer à +4°C pendant 12 h. L’extrait aqueux obtenu après filtration est utilisé pour détecter les saponosides, les tanins et polyphénols, les désoxyoses, les iridoïdes ainsi que les anthraquinones.

 Extrait chloroformique

La poudre (500 mg) est mélangée à 3 ml de chloroforme. Le tube est hermétiquement fermé et la suspension est laissée macérer à +4°C pendant au moins 12 h. L’extrait

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria chloroformique est obtenu par filtration de la suspension. Cet extrait est utilisé pour détecter les stéroïdes et les triterpènes.

2.2.5.1. DETECTION DES ALCALOÏDES

L’extrait acide est réparti dans quatre tubes à essais (1 ml par tube) dont le premier sert de témoin.

2.2.5.1.1. TEST DE MAYER

Quatre gouttes de réactif de Mayer sont ajoutées dans le second tube. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité blanchâtre ou crémeux révèle la présence d’alcaloïdes.

2.2.5.1.2. TEST DE WAGNER

Quatre gouttes de réactif de Wagner sont ajoutées dans le troisième tube. La présence d’alcaloïdes est indiquée par une floculation ou un précipité de couleur jaune.

2.2.5.1.3. TEST DE DRAGENDORFF

Dans le quatrième tube sont ajoutées trois gouttes du réactif de Dragendorff. L’apparition d’une floculation ou d’un précipité jaune montre la présence d’alcaloïdes. La réalisation d’un test de confirmation s’avère nécessaire dans le cas où les résultats des tests seraient positifs. Ainsi, la présence des alcaloïdes est confirmée si le précipité formé dans chaque tube est solubilisé par l’addition de 0,5 ml de mélange hydroéthanolique 80 %.

2.2.5.2. DETECTION DES FLAVONOÏDES (Test de WILLSTATTER)

Quelques gouttes de HCl 12 N et 2 tournures de magnésium sont ajoutées à 1 ml d’extrait hydroéthanolique. Le changement de la coloration traduit la présence de flavonoïdes, à savoir :  une coloration rouge-pourpre pour les flavonols,  une coloration rouge-violacé pour les flavones,  une coloration orange pour les flavonones.

2.2.5.3. DETECTION DES LEUCOANTHOCYANES (Test de BATE-SMITH)

Dans un tube à essais, le mélange de 0,5 ml d’extrait hydroéthanolique et de 0,5 ml de HCl 12 N est porté à ébullition pendant 30 min.

L’apparition d’une coloration rouge après refroidissement indique la présence de leucoanthocyanes. -35-

Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

2.2.5.4. DETECTION DES SAPONOSIDES (Test de mousse)

L’extrait aqueux est agité énergiquement pendant au moins 5 min. L’apparition d’une mousse de 3 cm de hauteur, persistant pendant 30 min indique la présence de saponosides.

2.2.5.5. DETECTION DES TANINS ET POLYPHENOLS

Trois tubes à essai contenant chacun 0,5 ml d’extrait aqueux sont préparés.

2.2.5.5.1. TEST A LA GELATINE

Quelques gouttes de gélatine 10 % (p/v) sont ajoutées dans le premier tube. L’apparition d’un précipité révèle la présence de tanins hydrolysables de type catéchique.

2.2.5.5.2. TEST A LA GELATINE SALEE

La formation de précipité après ajout de quelques gouttes de gélatine salée (gélatine aqueuse 1% mélangée avec du chlorure de sodium (NaCl) 10 %) dans l’extrait à tester indique la présence de tanins condensés de type pyrogallique.

2.2.5.5.3. TEST AU CHLORURE FERRIQUE

Après ajout de chlorure ferrique 10 % en solution méthanolique dans l’extrait aqueux, le virage de la coloration au bleu-vert indique la présence de tanins de type catéchol, tandis qu’une coloration noir-bleuâtre démontre celle de tanins de type pyrogallol.

2.2.5.6. DETECTION DES DESOXYOSES (Test de KELLER-KILIANI)

L’extrait aqueux est repris dans 0,5 ml de FeCl3 10 % additionné de 0,5 ml d’acide acétique glacial. Après une légère agitation du mélange, de l’acide sulfurique (H2SO4) 36 N est versé le long de la paroi du tube incliné. La présence de désoxyoses est montrée par l’apparition d’un anneau pourpre à l’interface.

2.2.5.7. DETECTION DES IRIDOÏDES

Un mélange de 0,5 ml d’extrait aqueux et de quelques gouttes de HCl 12 N est chauffé au bain-marie bouillant pendant 30 min. L’apparition d’un précipité vert foncé ou bleu foncé révèle la présence d’iridoïdes.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

2.2.5.8. DETECTION DES ANTHRAQUINONES (Test de BORNTRAGER)

Du benzène de volume 1 ml est mélangé avec l’extrait aqueux (V/V). La solution obtenue est agitée énergiquement puis laissée au repos. Après décantation, le mélange est additionné de 0,5 ml d’ammoniaque (NH4OH) 25 %. Le virage de la phase alcaline (phase inférieure) au rouge indique la présence d’anthraquinones.

2.2.5.9. DETECTION DES STEROÏDES ET TRITERPENES

L’extrait chloroformique est distribué dans trois tubes à essai dont le premier sert de témoin. Les méthodes utilisées sont celles de Liebermann-Burchard et de Salkowski.

2.2.5.9.1. TEST DE LIEBERMANN-BURCHARD

Dans le deuxième tube, quelques gouttes d’anhydride acétique sont ajoutées dans 0,5ml d’extrait chloroformique. Le mélange est soumis à une légère agitation, puis 2 ml de

H2SO4 36 N y sont ensuite additionnés. Le résultat est observé au bout de 1 h. La présence de triterpènes est indiquée par l’apparition d’un anneau rouge violacé tandis que la coloration de la phase aqueuse en vert révèle la présence de stéroïdes.

2.2.5.9.2. TEST DE SALKOWSKI

Dans le troisième tube incliné, 1 ml de H2SO4 36 N est versé. L'apparition d'un anneau rouge au niveau de l'interface traduit la présence de stérols insaturés.

2.2.6. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS

2.2.6.1. LES SOURIS

Les souris (Mus musculus) mâles et femelles de race OF-1, pesant entre 20 et 30 g, proviennent de l’animalerie de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Elles sont placées dans des cages en plastique contenant des litières de copeaux de bois. Les animaux disposent d’eau de robinet et de nourriture ad libitum. La litière est renouvelée toutes les semaines.

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2.2.6.2. METHODES UTILISEES DANS L’ETUDE DE LA TOXICITE AIGUE CHEZ LA SOURIS

2.2.6.2.1. ADMINISTRATION DE L’EXTRAIT A TESTER

La vitesse de pénétration et les effets des extraits varient en fonction des voies d’administration chez un organisme animal. Dans cette étude, seule la voie intrapéritonéale (ip) a été testée sur souris. Elle consiste à injecter l’extrait dans la cavité abdominale de l’animal (Sandberg et al., 1990, Semi et al., 2008). Les composés passent ainsi dans la circulation générale et atteignent rapidement les organes ou tissus où ils vont exercer leurs effets. La concentration de chaque extrait injecté est de 100 mg/ml, une concentration la plus utilisée dans l’évaluation de la toxicité d’extraits de plante (Gome et al., 2011 ; Morabandza, 2016). Le volume d’extrait à injecter est de 0,3 ml pour 25 g de souris. Deux lots de trois souris (de même sexe) sont utilisés pour chaque test : le premier qui sert de lot témoin ne reçoit que du sérum physiologique (NaCl 9 ‰), le second reçoit de l'extrait dissous dans de l'eau distillée.

2.2.6.2.2. OBSERVATION DES SYMPTOMES

Les symptômes d’intoxication développés par les souris sont observés immédiatement après administration de l’extrait à tester. Ils sont déterminés par comparaison avec les réactions de souris témoins. Tout changement de comportement, pouvant aller jusqu’à la mort des souris testées est noté pendant 24 h (Bürger et al, 2005).

2.2.7. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES

2.2.7.1. LES MILIEUX DE CULTURE

Les milieux utilisés sont de qualité pour analyse et de marque BIO-RAD. Il s’agit :  du milieu de MUELLER-HINTON Agar (MHA) servant à étudier la sensibilité des microorganismes aux extraits en milieu solide ;  du milieu Columbia Agar destiné à la culture de Streptococcus et aux tests sur ce germe ;  du milieu Potato Dextrose Agar (PDA), utilisé pour la culture des moisissures et la détermination de l’activité antifongique. La composition de ces milieux est détaillée en Annexe 2.

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2.2.7.2. LES GERMES

Les souches microbiennes pathogènes utilisées comprennent des bactéries Gram (–) et Gram (+) et une levure unicellulaire, qui sont des germes couramment recherchés dans les analyses et/ou contrôles microbiologiques médicaux et alimentaires. Ces microorganismes sont tous des souches pures provenant de la collection du Laboratoire de Microbiologie de l’Environnement du Centre National de la Recherche sur l’Environnement (CNRE) / Madagascar (Tableau 5).

Tableau 5 : Liste des germes testés

Germes Souche Référence

Escherichia coli CCM 4516 Klebsiella pneumoniae ATTC 13883 Gram- Salmonella typhimurium LMG 3264 Salmonella enterica ATCC 14028 Bactéries Bacillus cereus ATCC13061 Bacillus megaterium LMG 7127 Gram+ Enterococcus faecalis ATTC 29212 Streptococcus pneumoniae ATCC 6301 Staphylococcus aureus ATCC 11632 Levure Candida albicans ATCC 10231

ATCC: American Type Culture Collection ; LMG: Laboratorium voor Microbiologie, Universite it Gent, Belgium

2.2.7.3. LES ANTIBIOTIQUES DE REFERENCE

Des disques pré-imprégnés d’antibiotiques : acide nalidixique 30 µg pour les bactéries Gram (-) ; netilmicine 30 µg pour les bactéries Gram (+) et nystatine 100 µg pour C. albicans ont été utilisés comme référence.

2.2.7.4. ETUDE DU SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE

L’activité antimicrobienne in vitro des EB a été déterminée par la méthode de diffusion en milieu solide ou méthode des disques décrite par Pyun et al. (2006) et Ngameni et al. (2009). Afin d’obtenir une culture jeune et des colonies isolées, chaque souche microbienne est repiquée en milieu gélosé suivant la méthode par épuisement, puis incubée à l’étuve selon

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria les conditions de température et de durée optimales. A partir des cultures ainsi revivifiées, une ansée de colonie est prélevée puis mise en suspension dans de l’eau physiologique. La turbidité de cette suspension est ajustée visuellement à celle de l’étalon 0,5 Mac Farland (108 CFU/ml) puis diluée au 1/100 pour obtenir un inoculum estimé à 106 CFU/ml. 2 ml de cet inoculum sont ensuite étalés uniformément à la surface du milieu Columbia Agar pour Streptococcus, du MHA pour les autres bactéries et du PDA pour Candida albicans. Des disques stériles de 6 mm de diamètre (BioMérieux REF 54991), préalablement imprégnés de 10 μl d’extrait de concentration 100 mg/ml sont déposés à la surface du milieu de culture préalablement ensemencé. La quantité de chaque extrait à tester est de 1 mg par disque, dose généralement utilisée dans l’évaluation des activités antimicrobiennes d’extraits de plantes (Sandeep et al., 2010 ; Govindappa et al., 2011 ; Linthoingambi et Mutum, 2013 ; Marimuthu et al., 2014). Les substances dans l’extrait à tester diffusent radialement du disque vers la gélose en formant un gradient de concentration. Chaque test est dupliqué. Des disques d’antibiotiques de référence (voir plus haut) sont utilisés comme témoin. Les boîtes de Petri sont ensuite incubées à 37°C pendant 24 h pour les bactéries et à 25°C pour Candida albicans. L’activité antimicrobienne est appréciée par la mesure du diamètre du halo d’inhibition (DHI) de la croissance microbienne qui se forme autour du disque sur lequel l’extrait a été déposé après 24 h. Plus grand est le DHI, plus sensible est le microorganisme. Les résultats sont exprimés selon les normes de Ponce et al. (2003) et Celikel et Kavas (2008) présentées dans le tableau 6.

Tableau 6 : Normes utilisées pour l’interprétation des résultats obtenus par la méthode des disques

DHI (mm) Sensibilité des germes

<8 mm Résistant 9-14 mm Sensible 15-19 mm Très sensible >20 mm Extrêmement sensible

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2.3. RESULTATS 2.3.1. ENQUETES ETHNOBOTANIQUES ET COLLECTE DES ECHANTILLONS 2.3.1.1. LES DIFFERENTS SITES D’ENQUETE

Nous avons pu effectuer des enquêtes ethnobotaniques dans différents domaines biogéographiques de Madagascar, notamment :  dans le domaine de l’Est : la forêt d’Analamazaotra (Andasibe), Antsapanana, Ampitabe, Vatomandry et Mahanoro ;  dans le domaine de l’Ouest : Miandrivazo, Ankilizato, Morondava, les forêts d’Ampijoroa et de Marofandilia ;  dans le domaine du Centre : Tsimahandry, Mahitsy, Fihaonana, Manjakandriana Ambatoloana, la forêt de Mandraka, celle d’Ambohitantely, Mantasoa, Arivonimamo, Ampefy, Soavinandriana Itasy, Behenjy, Antsirabe, Ibity, Manandona et Betafo.

A titre d’illustration, une carte montrant la localisation de ces différentes zones est présentée sur la figure 16 (page 42).

2.3.1.2. LES DIFFERENTES ESPECES DE Crotalaria INVENTORIEES

Au total, 23 espèces de Crotalaria dont 7 endémiques, 8 natives et 8 introduites à Madagascar ont été inventoriées lors des enquêtes ethnobotaniques. Leurs utilisations, les parties utilisées et les modes de préparation ont été déterminés lors des enquêtes ethnobotaniques. Le tableau 7 (pages 43-44) résume ces résultats ainsi que les lieux de récolte et leurs coordonnées GPS.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Figure 16 : Cartographie des lieux de récolte des différentes espèces de Crotalaria. Source : FTM (Foiben’ny Tao-tsaritany eto Madagasikara) et auteur.

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Tableau 7 : Les espèces de Crotalaria recensées lors des enquêtes ethnobotaniques

Coordonnées Parties Espèces Lieu de récolte Utilisations Mode de préparation GPS utilisées S : 20°25′06.8″ Poison de pêche Feuilles, C. coursii Morondava Plante à l’état frais E : 045°25′50.9″ (« famamo ») écorce de tiges S : 20°03′46.2″ Mantasoa Cuites avec du bouillon de riz et E : 046°59′27.9″ C. cytisoides Diarrhée, dysenterie Feuilles de légume-feuilles (« vary S : 19°49'52.4″ Ibity amin’ny anana »)

E : 046°51'23.9″ S : 20°03′50.1″ C. diosmifolia Ibity (Mont Kiboy) - - - E : 047°00′02.3″ Betafo (bord du lac S : 19°49′52.5″ C. emirnensis - - - Tatamarina) E : 046°51′23.9″ Endémiques S : 20°04′03.8″ C. ibityensis Ibity (Mont Kiboy) Insecticides Plante entière - E : 047°00′02.0″ S : 20°06'45.3″ C. tanety Ibity - - - E : 047°04'37.7″ S : 18°30′24.4″ C. xanthoclada Fihaonana - - - E : 047°10′45.1″ Maux de ventre, S : 20°03′46.2″ Feuilles Décoction C. bernieri Ibity diarrhée, E : 046°59′27.9″ Nourriture des bœufs Plante entière Plante à l’état frais Mélangées avec des feuilles de Engrais vert S : 18°54′06.9″ Plante entière Tephrosia et de dingadingana C. cleomifolia Manjakandriana (compost) E : 047°45′08.1″ (Psiadia altissima) Café Graines Grillées

Natives Tsimahandry S : 19°01′55.6″ Fourrage pour les C. incana Plante entière Plante à l’état frais (Fihaonana) E : 046°44’14.3″ bétails C. incana var. S : 19°02′26.0″ Fourrage pour les Ampefy Plante entière Plante à l’état frais purpurascens E : 046°44′02.8″ bétails S : 20°06'45.3″ Ibity Fièvre Partie aérienne Bain de vapeur C. spinosa E : 047°04'37.7″ - : Dans les villages où les enquêtes ont été réalisées, la plante ne fait l’objet d’aucune utilisation -43-

Tableau 7 : Les espèces de Crotalaria recensées lors des enquêtes ethnobotaniques (suite)

Coordonnées Parties Espèces Lieu de récolte Utilisations Mode de préparation GPS utilisées Carion S : 18°54'06.8″ C. lanceolata - - - (Manjakandriana) E : 047°42'09.8″ S : 19°26′23.7″ C. retusa Mahanoro - - - E : 048°52′53.8 S : 18°57′15.6″ C. uncinella Mantasoa Dysenterie Feuilles Décoction E : 047°52′28.4″ S : 18°54′06.9″ Insecticides, C. grahamiana Manjakandriana Plante entière Plante à l’état frais E : 047°45′08.1″ engrais vert Behenjy, S : 20°12'12.0″ C. fulva Soavinandriana - - - E : 046°12.5'19″ Itasy S : 19°33′27.1″ C. spectabilis Vatomandry Engrais vert Plante entière Enfouissement dans le sol E : 048°49′55.9″ Engrais vert S : 18°58′08.8″ C. lachnophora Ambohimangakely (compost), plante de Plante entière Enfouissement dans le sol E : 048°52′54.6″ couverture S : 19°33'27.1″ Plante ornementale, C. micans Mahanoro Plante entière - E : 048°49'55.9″ clôture Introduites S : 19°25'36.5″ Arivonimamo E : 046°32'21.0″ Engrais vert C. pallida Plante entière - S : 20°12'12.3″ Behenjy E : 046°12.3'25″ S : 19°02′07.2″ Feuilles et C. trichotoma Ampefy Nourriture des bœufs Plante à l’état frais E : 046°44′26.0″ tiges Antsapanana Fourrage pour les S : 18°59'49.1″ C. zanzibarica (Route de bétails, engrais vert, Plante entière Plante à l’état frais E : 048°56'46.3″ Vatomandry) plante de couverture - : Dans les villages où les enquêtes ont été réalisées, la plante ne fait l’objet d’aucune utilisation

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La plupart des espèces sont utilisées à des fins médicinales pour soigner diverses maladies notamment la diarrhée et la dysenterie, avec comme mode de préparation le plus utilisé la décoction. D’autres sont employées pour nourrir les bétails et aussi comme plantes de couverture et engrais vert. Concernant la partie utilisée, elle varie en fonction des usages des plantes mais les feuilles et la plante entière sont les plus utilisées.

2.3.1.3. CHOIX DES MATERIELS D’ETUDE

A partir de la liste établie lors des enquêtes ethnobotaniques, nous avons sélectionné 18 espèces de Crotalaria devant faire l’objet d’études préliminaires sur les plans chimique, biologique et toxicologique. La sélection de ces espèces a été dictée par trois critères :  endémicité de la plante ;  disponibilité des organes au cours de la mission de récolte ;  absence d’étude scientifique approfondie.

Le tableau 8 (page 46) présente les différentes espèces de Crotalaria ayant servi de matériels d’étude avec les organes utilisés.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Tableau 8 : Liste des espèces de Crotalaria étudiées et les organes utilisés

Organes Espèces Noms vernaculaires utilisés C. cytisoides Lakamisikely F, T, G, C Ambarivatendolo, Ambarivatendolokely, C. diosmaefolia Korintsampotsy, Mangakely, Ramanjavona, F, T, G, C Voasarinkalavola, Voatelinondry

C. emirnensis - F, T Angefotsy, Famamo, Fanamonala, Hazongaga, C. ibityensis F, T Hazonondry, Kitsakitsana, Tombokanjiva Akahomilahy, Ambarivatrindolo, Anky,

Endémiques C. tanety Angeafotsy, Fanamonala, Hazondandy, F, T Kitsakitsana, Tombokangiva, Vahipasika Famakiasa, Hazombevavy, Laingoakalana, C. xanthoclada Maintsoririnina, Otsiotsitany, Tendroibo, F, T, G, C Tsileompangady, Tsipika, Vahipasika C. bernieri Ranomanja F, T, G, C C. cleomifolia Amberivatrindolo, Kitsakitsan’akoho F, T, G, C Aikamanga, Aikavavy, Beravina, Engitenakoho, C. incana F, T, G, C Kirikintsana, Kirintsana Akondrondolo, Akondronjaza, Bosy, C. retusa Amberivatrindolo, Faliakoho, Famonakoho, F, T, G, C

Natives Hintsakitsaka, Kinesakinesa, Kinsakinsa C. spinosa - F, T, G, C Ambarivatrandololahy, Bemiray, Kirintsana, C. uncinella Lakamisilahikely, Hazongaga, Hazonondry, F, T, G, C Tibohitra, Vahipasika, Zapitsakaondry C. fulva - F, T C. micans Antsotry, Manarakandro, Odiandro F, T, G, C

Aika, Aikaberavina, Aikavavy, Ambarivatrindoly, Ambarivatrindolo, C. pallida F, T, G, C Hatakataky, Kirintsa, Kitsonakoho, Tsiakondroakondro, Zanaharimanatrika Introduites C. spectabilis - F, T, G, C C. trichotoma Ahimatavy, Marofolehana F, T, G C. zanzibarica - F, T, G, C F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses ;- : nom vernaculaire inconnu

Des photos montrant les plantes-matériels d’étude sont présentées sur la figure 17 (pages 47-48).

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C. diosmifolia C. emirnensis C. ibityensis C. tanety

C. bernieri C. cleomifolia C. spinosa C. fulva

C. incana C. micans C. pallida C. uncinella

C. cytisoides C. xanthoclada

Figure 17 : Plantes-matériels d’étude Source : Auteur

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C. spectabilis C. retusa C. zanzibarica C. trichotoma

Figure 17 : Plantes-matériels d’étude (suite) Source : Auteur

2.3.2. DETECTION DES FAMILLES CHIMIQUES

Un criblage phytochimique a été effectué sur les poudres de différents organes de chaque espèce de Crotalaria selon la méthode décrite au § 2.2.5 (pages 34-37) afin de déterminer les différentes familles chimiques présentes. Les résultats sont montrés dans le tableau 9 (pages 49-51).

D’après ces résultats, les différents organes des espèces de Crotalaria étudiés contenaient principalement des alcaloïdes, des flavonoïdes, des tanins et polyphénols, des stéroïdes, des triterpènes, des stérols insaturés et des désoxyoses. Les saponosides n’ont été trouvés que dans les feuilles de C. tanety et C. trichotoma ainsi que dans les graines de C. cleomifolia, C. spinosa, C. micans, C. pallida et C. spectabilis. Les leucoanthocyanes et les anthraquinones n’étaient présents que dans les graines de C. cleomifolia et les feuilles de C. tanety, respectivement. Les iridoïdes n’ont pas été détectés dans tous les différents organes.

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Tableau 9 : Criblage phytochimique des différents organes des espèces de Crotalaria

Familles C. cytisoides C. diosmaefolia C. emirnensis C. ibytiensis C. tanety C. xanthoclada Tests chimiques F T G C F T G C F T F T F T F T G C Mayer ------+ - - - - - + - + + Wagner ------+ - - - - - + - + + Alcaloïdes Dragendorff ------+ - - - - - + - + + Test de confirmation ------+ - - - - - + - + + Saponosides Test de mousse ------+ - - - - - Flavonoïdes Willstätter + + + + + + + + - - + - + + - - - - Gélatine 1% ------+ - + + + + - Tanins et Gélatine salée 10% + + + + + + + + + + + + + + + + + + polyphénols FeCl3 + + - + + + + + + + + + + + - + + + Stéroïdes Liebermann- + ------Triterpènes Burchard - - + + + + - + - - - + + - - + - - Stérols insaturés Salkowski - + - + - + - + - - - - + + - - + - Désoxyoses Keller-Kiliani + - - - + + - - + + - - + - - - + + Iridoïdes HCl à chaud ------Leucoanthocyanes Bate-Smith ------Anthraquinones Borntrager ------+ + - - - - F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses + : réaction positive ; - : réaction négative

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Tableau 9 : Criblage phytochimique des différents organes des espèces de Crotalaria (suite)

Familles C. bernieri C. cleomifolia C. incana C. retusa C. spinosa C. uncinella Tests chimiques F T G C F T G C F T G C F T G C F T G C F T G C Mayer + - - + + - + ------+ - + - + + + - - - Wagner + - - + + - + ------+ - + - + + + - - - Alcaloïdes Dragendorff + - - + + - + ------+ - + - + + + - - - Test de confirmation + - - + + - + ------+ - + - + + + - - - Saponosides Test de mousse ------+ ------+ - - - - - Flavonoïdes Willstätter ------+ - + - - - - + + - - - - + - - Gélatine - + - - - + - + - - - - + + + + - + - - - + - - Tanins et Gélatine salée - + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + polyphénols FeCl3 + + + + + + + - + + + - + - - + + + - + + - + - Stéroïdes Liebermann- + - + + ------+ - - - - - + Triterpènes Burchard - - + + - + + ------+ + + + + + Stérols insaturés Salkowski - - + + - + + + - - + + ------+ + + + + + Désoxyoses Keller-Kiliani + - + - + + + - + + - - + + - + + - + - + - - - Iridoïdes HCl à chaud ------Leucoanthocyanes Bate-Smith ------+ ------Anthraquinones Borntrager ------F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses + : réaction positive ; - : réaction négative

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Tableau 9 : Criblage phytochimique des différents organes des espèces de Crotalaria (suite)

Familles C. fulva C. micans C. pallida C. spectabilis C. trichotoma C. zanzibarica Tests chimiques F T F T G C F T G C F T G C F T G F T G C Mayer - - + - + - + + + + + - - - + - + + + + + Wagner - - + - + - + + + + + - - - + - + + + + + Alcaloïdes Dragendorff - - + - + - + + + + + - - - + - + + + + + Test de confirmation - - + - + - + + + + + - - - + - + + + + + Saponosides Test de mousse - - - + + - - - + - - - + - + + - - - - - Flavonoïdes Willstätter - + ------Gélatine 1% - - - + - - - + + + - - - + - + - - - + + Tanins et Gélatine salée 10% + + + + + - + + + + + + + + + + - + + + + polyphénols FeCl3 + + + - + - + + - + + + - + + - - + + + + Stéroïdes Liebermann- - - - + - + ------+ + - - + - - Triterpènes Burchard - - - + + + - + + ------+ - + + + Stérols insaturés Salkowski - - - + - + - - + + - - + + - - + - + - + Désoxyoses Keller-Kiliani + - + ------+ - - + - - - + - + + Iridoïdes HCl à chaud ------Leucoanthocyanes Bate-Smith ------Anthraquinones Borntrager ------F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses + : réaction positive ; - : réaction négative

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

2.3.3. EXTRACTION Suivant la technique décrite au § 2.2.4.2 (page 33), 10 g de poudre de chaque type de matériel végétal sont mis en suspension dans 100 ml de mélange hydroéthanolique (eau/éthanol : 25% / 75%). Cette méthode a permis d’obtenir plusieurs extraits bruts ou EB (tableau 10) qui seront utilisés pour les tests biologiques.

Tableau 10 : Liste des EB de différents organes de chaque espèce de Crotalaria

Espèces Organes EB

C. cytisoides F, T, G, C F, T, G, C C. diosmaefolia F, T, G, C F, T, G, C C. emirnensis F, T F, T C. ibityensis F, T F, T C. tanety F, T F, T Endémiques C. xanthoclada F, T, G, C F, T, G, C C. bernieri F, T, G, C F, T, G, C

C. cleomifolia F, T, G, C F, T, G, C C. incana F, T, G, C F, T, G, C C. retusa F, T, G, C F, T, G, C Natives C. spinosa F, T, G, C F, T, G, C C. uncinella F, T, G, C F, T, G, C C. fulva F, T F, T

C. micans F, T, G, C F, T, G, C C. pallida F, T, G, C F, T, G, C C. spectabilis F, T, G, C F, T, G, C

Introduites C. trichotoma F, T, G F, T, G C. zanzibarica F, T, G, C F, T, G, C F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses

2.3.4. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS

La caractérisation de la toxicité aiguë sur souris, l’animal standard de laboratoire le plus utilisé en recherche biomédicale, a été entreprise. Ainsi, les symptômes développés par l’animal pendant 24 h, suite à l’administration d’une dose unique importante d’EB de divers organes de la plante, ont été observés.

Les tests ont été effectués sur deux lots de trois souris en administrant, par voie ip, 100 mg/ml d’EB. Le lot témoin a été traité avec du NaCl 9 ‰ (voir méthode au § 2.2.6, page 38). Le tableau 11 (pages 53 à 54) montre les résultats obtenus.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Tableau 11 : Effets des EB issus de différents organes de diverses espèces de Crotalaria sur la souris Mortalité Temps Espèce EB testé Symptômes (%) de survie Contorsion abdominale ; F 66 24 h fasciculation ; perte d’appétit ; convulsion ; mort C. cytisoides T 0 - Contorsion abdominale ; G 0 - fasciculation ; hypoactivité ; retour à C 0 - l’état normal F 0 - T 0 - C. diosmaefolia Contorsion abdominale juste après G 0 - l’injection, démangeaison au niveau C 0 - du museau ; retour à l’état normal F 0 - C. emirnensis T 0 - Contorsion abdominale ; fasciculation F 66 12 h

Endémiques C. ibityensis ; perte d’appétit ; convulsion ; mort T 0 - F 0 - Contorsion de l’abdomen juste après C. tanety l’injection, hypoactivité ; T 0 - démangeaison au niveau du museau ; F 0 - retour à l’état normal T 0 - Contorsion abdominale ; perte C. xanthoclada G 100 24 h d’appétit ; difficulté respiratoire ; convulsion ; mort C 0 - Aucun F 100 5 min Contorsion abdominale ; C 100 7 min fasciculation ; exophtalmie ; difficulté C. bernieri T 66 12 h respiratoire ; convulsion ; mort G 0 - Aucun Contorsion abdominale ; ataxie ; F 100 10 min exophtalmie ; difficulté respiratoire ; convulsion, mort C. cleomifolia 0 - T Aucun G 0 - C 0 - Aucun

Natives F 0 - T 0 - C. incana G 0 - Contorsion abdominale juste après C 0 - l’injection ; tremblement du corps ; F 0 - hypoactivité ; démangeaison au niveau T 0 - du museau ; retour à l’état normal C. retusa G 0 - C 0 - F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses ; - : pas de mortalité

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Tableau 11 : Effets des EB issus de différents organes de diverses espèces de Crotalaria sur la souris (suite) Mortalité Temps Espèce EB testé Symptômes (%) de survie F 0 - Contorsion abdominale juste après l’injection ; tremblement du corps ; T 0 - hypoactivité ; démangeaison au niveau C. spinosa C 0 - du museau ; retour à l’état normal

Contorsion abdominale ; ataxie ; G 66 12 h exophtalmie ; difficulté respiratoire ;

Natives convulsion ; mort F 0 - T 0 - C. uncinella G 0 - Contorsion abdominale juste après C 0 - l’injection ; tremblement du corps ; F 0 - C. fulva retour à l’état normal T 0 - F 0 - T 0 - Contorsion abdominale, exophtalmie ; C. micans hyperémie ; diminution de la G 100 13 min fréquence respiratoire ; convulsion ; mort C 0 - Aucun F 100 6 min Contorsion abdominale ; ataxie ; T 100 15 min exophtalmie ; perte d’appétit ; C. pallida G 100 24 h difficulté respiratoire ; convulsion ;

C 100 12 h mort F 0 - T 0 - Contorsion abdominale juste après C. spectabilis G 0 - l’injection ; tremblement du corps ; Introduites C 0 - hypoactivité ; démangeaison au niveau F 0 - du museau ; retour à l’état normal T 0 - C. trichotoma Fasciculation ; exophtalmie ; G 100 2 h hypoactivité ; difficulté respiratoire ; convulsion ; mort F 100 10 min Contorsion abdominale ; hypoactivité ; hyperhémie ; T 100 25 min piloérection ; convulsion ; mort C. zanzibarica G 0 - Contorsion abdominale juste après l’injection ; tremblement du corps ; C 0 - hypoactivité ; démangeaison au niveau du museau ; retour à l’état normal F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses ; - : pas de mortalité

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Parmi les différentes espèces de Crotalaria testées, sept espèces, à savoir C. bernieri (feuilles, cosses), C. cleomifolia (feuilles), C. micans (graines), C. pallida (feuilles, écorces de tiges, graines, cosses), C. trichotoma (graines), C. zanzibarica (feuilles, tiges) et C. xanthoclada (graines) se sont révélées toxiques sur les souris. Elles ont provoqué des symptômes d'intoxication dont les plus marquants étaient une contorsion abdominale, une ataxie, une exophtalmie, une diminution progressive de la fréquence respiratoire et une convulsion. La mort survenait entre 5 min à 24 h après l’administration de l’extrait. Chez les souris survivantes, les symptômes développés étaient globalement les mêmes : une contorsion abdominale apparaissait juste après injection suivie d’un tremblement du corps, d’une hypoactivité et d’une démangeaison au niveau du museau. Les souris se remettaient progressivement entre 3 à 24 h après l’administration de l’extrait.

2.3.5. EFFETS DES EXTRAITS SUR LES MICROORGANISMES

Un criblage des différentes espèces de Crotalaria à activité antimicrobienne s’avère nécessaire pour identifier les potentialités curatives intéressantes. Le but de cette partie est d’abord de déterminer si les extraits des organes de chaque espèce ont une activité antimicrobienne qui mérite d’être approfondie pour le développement de molécules à orientation thérapeutique et de justifier le bien-fondé scientifique de son utilisation médicinale. A cet effet, des tests d’antibiogramme ont été réalisés. L’activité antimicrobienne de chaque EB a été évaluée sur 9 souches de bactéries (Gram (+) et Gram (-)) et une souche de levure selon la méthode de diffusion en milieu solide décrite au § 2.2.7.4 (pages 39 à 40). Des disques pré-imprégnés d’antibiotique ont été utilisés comme témoin :  acide nalidixique 30 µg : pour les bactéries Gram (-),  netilmicine 30 µg : pour les bactéries Gram (+) et  nystatine 100 µg pour la levure. Tous les tests ont été effectués en double et chaque extrait a été testé à raison de 1mg/disque. Les résultats obtenus exprimés en DHI (mm) sont résumés dans le tableau 12 (pages 56-57).

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Tableau 12 : Effets des extraits sur la croissance des germes en milieu solide Diamètre du halo d’inhibition (mm) Germes E.c K.p S.t S.e B.c B.m E.f S.p S.a C.a Espèce / EB testé F 10 - 7 8 - - - - - 7 T 8 - 7 7 - - - - - 8 C. cytisoides G 8 - 7 ------C 7 ------F 8 - - - 8 8 - 8 - 8 T 7 ------7 C. diosmaefolia

G 7 ------8 - - C 7 ------F - - 7 ------7 C. emirnensis T - - - - 7 - - - - - F ------8 Endémiques C. ibityensis T ------7 F ------7 C. tanety T ------7 F ------9 - 7 T ------8 - - C. xanthoclada G ------9 - 7 C ------9 - - F 8 - 10 8 13 14 - 19 11 15 T - - - 11 - - - 8 7 7 C. bernieri G 8 - 10 8 - 12 - 9 - 11 C 8 - 10 12 - 11 - 8 7 7 F 11 - - 9 - 8 - - - 8 T 10 - - - 8 - - - - 8 C. cleomifolia G 8 - - - 9 - - - - 9 C 7 - - - 10 - - - - 7 F ------7 7 7 T ------7 7 7 C. incana G ------C ------F 10 - 11 - - 10 - - - 12 Natives T - - 10 - - 11 - - - 10 C. retusa G ------8 C ------9 F 7 - 8 8 - - - 7 - - T 7 - 7 8 - - - 7 - - C. spinosa G - - 7 8 - - - 8 - - C - - 8 7 - - - 7 - - F 7 - 7 8 ------T 7 - 8 8 - - - - - 8 C. uncinella G ------C ------Ac. nal. 30 µg 25 30 29 28 nt nt nt nt nt nt Net. 30 µg nt nt nt nt 22 24 22 23 17 nt Nyst. 100 µg nt nt nt nt nt nt nt nt nt 27 F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses ; E.c : Escherichia coli ; K.p : Klebsiella pneumoniae ; S.t : Salmonella typhimurium ; S.e : Salmonella enterica ; B.c : Bacillus cereus ; B.m : Bacillus megaterium ; E.f : Enterococcus faecalis ; S.p : Streptococcus pneumoniae ; S.a : Staphylococcus aureus ; C.a : Candida albicans ; Ac. nal. 30 µg : Acide nalidixique ; Net. 30 µg : Netilmicine ; Nyst. 100 µg : Nystatine ; nt : non testé ; - : aucun halo d’inhibition -56-

Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

Tableau 12 : Effets des extraits sur la croissance des germes en milieu solide (suite) Diamètre du halo d’inhibition (mm) Germes E.c K.p S.t S.e B.c B.m E.f S.p S.a C.a Espèce / EB testé F - - 7 ------8 C. fulva T ------8 F 7 ------15 T ------11 C. micans G 7 - - - - 7 - - - 10 C - - - - - 7 - - - 10 F 10 - 7 8 10 10 - - - 7 T 9 - - - 8 9 - - - 7 C. pallida G 9 ------7 C 11 ------F 10 - - - 8 8 - - - 8 C. spectabilis T 9 - 7 - 9 7 - - - 8

Introduites G - - - - 8 7 - - - 8 C - - - - 8 8 - - - 7 F - - - - - 7 - - - 7 C. trichotoma T ------7 G ------F - - - - 11 9 - 8 8 7 T - - - - 9 8 - - 8 7 C. zanzibarica G - - - - 11 8 - 7 - 7 C - - - - 8 8 - - - 7 Ac. nal. 30 µg 25 30 29 28 nt nt nt nt nt nt Net. 30 µg nt nt nt nt 22 24 22 23 17 nt Nyst. 100 µg nt nt nt nt nt nt nt nt nt 27 F : feuilles ; T : écorces de tiges ; G : graines ; C : cosses ; E.c : Escherichia coli ; K.p : Klebsiella pneumoniae ; S.t : Salmonella typhimurium ; S.e : Salmonella enterica ; B.c : Bacillus cereus ; B.m : Bacillus megaterium ; E.f : Enterococcus faecalis ; S.p : Streptococcus pneumoniae ; S.a : Staphylococcus aureus ; C.a : Candida albicans ; Ac. nal. 30 µg : Acide nalidixique ; Net. 30 µg : Netilmicine ; Nyst. 100 µg : Nystatine ; nt : non testé ; - : aucun halo d’inhibition

D’après ces résultats, la sensibilité des souches variait en fonction des extraits testés. Chez les bactéries Gram (+) et Gram (-), les DHI variaient de 7 à 19 mm selon l’extrait utilisé et la souche testée. L’extrait de feuilles de C. bernieri a été le plus actif donnant un DHI égal à 19 mm vis-à-vis de Streptococcus pneumoniae. Cependant, aucun extrait n'a montré d’activité sur Klebsiella pneumoniae et Enterococcus faecalis. Chez la levure, les DHI variaient de 7 à 15 mm. Presque tous les extraits testés se sont montrés actifs mais leur efficacité était différente. Les extraits des feuilles de C. bernieri et C. micans ont eu les meilleures activités avec un halo d’inhibition de 15 mm de diamètre. Toutefois, tous les extraits se sont avérés beaucoup moins actifs par rapport aux antibiotiques de référence utilisés. Ces derniers ont donné des DHI considérables avec des valeurs allant de 17 à 30 mm vis-à-vis des germes testés.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

A titre d’illustration, l’effet provoqué par les EB des différentes espèces de Crotalaria sur la croissance de Bacillus megaterium et Candida albicans en milieu solide est montré sur la figure 18.

Bacillus megaterium Candida albicans 1 : EB feuilles de C. bernieri (DHI = 14 mm) E1 : EB feuilles de C. cytisoides (DHI = 7 mm) 2 : EB tiges de C. spectabilis (DHI = 7 mm) E2 : EB cosses de C. retusa (DHI = 9 mm) 3 : EB feuilles de C. spectabilis (DHI = 7 mm) E3 : EB feuilles de C. micans (DHI = 15 mm) 4 : EB feuilles de C. cleomifolia (DHI = 8 mm) T1, T2, T3 : Témoins 5 : EB feuilles de C. incana (DHI = 0 mm) 6 : EB feuilles de C. spinosa (DHI = 0 mm)

Figure 18 : Activité des EB (1 mg/disque) des différentes espèces de Crotalaria sur la croissance de Bacillus megaterium et Candida albicans

2.4. DISCUSSION ET CONCLUSION

Les enquêtes ethnobotaniques réalisées au cours des missions sur le terrain nous ont permis de recenser 23 espèces de Crotalaria dont 7 endémiques, 8 natives et 8 introduites à Madagascar, soit 43 % (23/53) des crotalaires Malagasy connues. Elles ont été récoltées dans les domaines biogéographiques du Centre, de l’Est et de l’Ouest de l’Île. Cependant, les espèces cosmopolites trouvées sont beaucoup plus nombreuses que les espèces endémiques car la majorité de ces dernières se rencontrent dans le domaine du Sud (Polhill, 1982). Grâce à ces investigations, nous avons pu collecter des informations relatives aux espèces de Crotalaria recensées, notamment leurs vertus médicinales, leur toxicité, et leurs éventuelles autres utilisations ainsi que d’autres informations utiles comme leurs modes de préparation. Selon les différentes localités visitées, plusieurs espèces seraient utiles aussi bien sur les plans médicinal, alimentaire qu’agricole et certaines d’entre elles auraient des usages multiples. A titre

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria d’illustration :  C. bernieri n’était pas seulement utilisée comme nourriture des bœufs mais figurait également dans la pharmacopée traditionnelle de la région d’Ibity où ses feuilles étaient utilisées sous forme de décocté pour soigner les maux de ventre et la diarrhée ;  C. zanzibarica était utilisée dans la région de l’Est de Madagascar non seulement comme fourrage pour les bétails mais aussi comme plante de couverture et engrais vert pour améliorer la fertilité du sol.

Il a été constaté que les vertus curatives des plantes et leurs autres utilisations relevées dans la littérature et celles issues des enquêtes concordaient pour certaines plantes. A titre d’exemples :  C. cytisoides, employée en infusion antidysentérique (Pernet et al., 1957 ; Rakoto- Ratsimamanga et al., 1969) ;  C. uncinella, utilisée en décoction comme antidysentérique (Pernet et al., 1957) ;  C. lachnophora, utilisée non seulement en tant qu’engrais vert dans des systèmes de rotation, avec le pois cajan (Cajanus cajan) et Tephrosia vogelii mais également pour préserver le sol (Brink, 2015) ;  C. ibityensis, employée comme insecticide et C. coursii en tant que poison de pêche (Ratsimamanga et al., 1969 ; Rasoanaivo et al., 1993 ; Voarisoa, 1998).

L’analyse phytochimique effectuée sur les différents organes des espèces de Crotalaria étudiés a révélé la présence des métabolites secondaires très variés mais les alcaloïdes, flavonoïdes, tanins et polyphénols étaient les composés majoritaires. Ces composés sont relativement courants chez le genre Crotalaria (Kumar et al., 1999 ; L’Etang, 2012 ; Aronson, 2014 ; Brink, 2015 ; Sudanicha et al., 2017). Les métabolites secondaires de nos plantes étaient de nature très variable. Cette diversité apparaissait dans quelques-unes d’entre les plantes déjà étudiées : c’est le cas de C. incana pour laquelle l’analyse a révélé l’absence de produits tels que les alcaloïdes par rapport à C. pallida et C. zanzibarica. D’après Stevenson et al. (2012), la production de métabolites secondaires dépend de l’espèce, du lieu et de la période de récolte (stade phénologique) de la plante. Certaines de nos plantes avaient montré des différences dans la composition chimique de leurs organes. C’est ce qui a été observé à titre d’exemples pour les feuilles et les écorces de tige de C. xanthoclada ou encore les graines et les cosses de C. cleomifolia.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

D’après les tests sur souris, les EB de chaque organe de différentes espèces de Crotalaria notamment C. bernieri (feuilles, cosses), C. cleomifolia (feuilles), C. micans (graines), C. pallida (feuilles, écorce de tiges, graines, cosses), C. trichotoma (graines), C. zanzibarica (feuilles, tiges) et C. xanthoclada (graines) étaient toxiques. Cette toxicité variait selon les espèces. Ainsi l’administration par voie ip de leurs EB a entrainé l’apparition de plusieurs symptômes mais les plus marquants étaient essentiellement une contorsion abdominale, une ataxie, une exophtalmie, une diminution progressive de la fréquence respiratoire et des convulsions cloniques intenses avant la mort. Ces symptômes suggèrent que les principes actifs pourraient agir particulièrement sur les systèmes nerveux, respiratoire et cardiaque. La faible toxicité de certaines espèces comme C. diosmaefolia (feuilles, écorce de tiges, cosses, graines) ; C. emirnensis (feuilles, écorce de tiges), C. spinosa (feuilles, écorce de tiges, cosses), C. zanzibarica (cosses, graines), etc. pourrait être due soit à la faible concentration soit à l’absence de principes toxiques (l’espèce demeurait non toxique) soit à des interactions entre les différentes molécules qu’elles contiennent. Enfin, il faut ajouter que la production de toxines par une plante donnée pourrait dépendre du stade phénologique. Il est donc possible que la période de récolte corresponde à un faible taux ou à une absence de toxine dans l’organe étudié (Rakoto Ranoromalala, 2012).

Quant aux effets des EB des différentes espèces de Crotalaria sur la croissance des microorganismes testés en milieu solide, sur les 18 espèces étudiées, 9 se sont avérées actives sur les germes testés (DHI supérieur à 8mm). Par ailleurs, les DHI variaient d’une bactérie à une autre et d’un extrait à un autre. Les extraits des feuilles de C. bernieri et ceux de C. micans étaient les plus actifs en créant des halos d’inhibition, respectivement de 19 mm sur Streptococcus pneumoniae et de 15 mm sur Candida albicans. Cependant, le spectre d’activité, c’est-à-dire la liste des germes qui ont manifesté de la sensibilité variait beaucoup selon les extraits, tant du point de vue du nombre que des espèces des microorganismes inhibés. De plus, le pouvoir inhibiteur de croissance d’un extrait n’était pas le même vis-à-vis de tous les germes qui lui étaient sensibles. A titre d’exemples :  l’EB de feuilles de C. bernieri a inhibé la croissance de 3 bactéries Gram (+), 4 bactéries Gram (–), et la levure Candida albicans. Ayant ainsi inhibé la croissance de 8 germes sur les 10 testés, cet extrait a montré le plus large spectre d’activité. Son activité antimicrobienne était également la plus importante (DHI compris entre 8 à 19mm) de tous les extraits testés ;

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

 l’activité des espèces suivantes était restreinte à un microorganisme : C. diosmaefolia (graines) sur Streptococcus pneumoniae ; C. ibityensis (feuilles) sur Candida albicans ; C. retusa (graines et cosses) sur Candida albicans ; C. fulva (feuilles et écorce de tiges) sur Candida albicans ; C. micans (tous les organes) sur Candida albicans et C. pallida (graines et cosses) sur Escherichia coli.

En se référant aux résultats de ces tests biologiques, l’utilisation de certaines espèces de façon empirique pour traiter différents maux a été justifiée au moins partiellement. Nous pouvons préciser à titre d’illustration que :  l'inhibition de la croissance d’Escherichia coli, une des bactéries responsables de la diarrhée, permet de valider les usages traditionnels de C. cytisoides ;  l’activité inhibitrice de C. bernieri contre la croissance de Salmonella enteridis, Bacillus cereus et Staphylococcus aureus, justifie son utilisation contre les maux de ventre et la diarrhée.

Toutefois, l’activité de tous les extraits testés restait inférieure à celle des antibiotiques de référence. Cela serait probablement dû, entre autres, au faible degré de pureté de ces extraits puisqu’ils étaient encore bruts.

Dans le cadre de cette étude préliminaire, nous n’avons pas pu déterminer l’indice de toxicité aiguë sur souris c’est-à-dire la DL50 ou Dose Létale 50 % des extraits toxiques et de caractériser leur activité en déterminant les indices d’activité antimicrobienne dont la CMI (Concentration Minimale Inhibitrice ), la CMB (Concentration Minimale Bactéricide) et la CMF (Concentration Minimale Fongicide) sur tous les germes qui leur ont été sensibles à cause de la faible disponibilité des organes et des extraits. L’idéal aurait été de déterminer ces indices afin d’évaluer et comparer nos extraits à ceux d’autres plantes.

En conclusion, les résultats de nos travaux constituent les premières données chimiques, biologiques et toxicologiques sur les différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar et enrichissent les connaissances sur les espèces du genre Crotalaria en général. Au terme de ce travail, il apparait que parmi les 23 espèces de Crotalaria étudiées, C. bernieri s’est montrée particulièrement performante vis-à-vis des organismes testés. Elle est à la fois toxique sur souris et possède un important pouvoir antimicrobien sur de nombreux pathogènes. Cette espèce sera alors retenue pour la conduite des investigations plus approfondies.

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Etudes préliminaires des différentes espèces de Crotalaria

2.5. PERSPECTIVES

Toutefois, les résultats obtenus dans cette présente étude ne constituent qu'une étape préliminaire dans la valorisation des espèces du genre Crotalaria ; des essais complémentaires s’avèrent indispensables, notamment :  l’extension des enquêtes ethnobotaniques à d’autres régions de Madagascar et en particulier dans le domaine du sud, là où poussent la plupart des espèces endémiques. L’objectif serait de valoriser ces espèces en explorant davantage leurs utilisations et les effets secondaires ou inconvénients éventuels liés à leur emploi et en mettant en évidence les spécificités de leurs molécules, tant sur le plan de la structure chimique que celui des activités biologiques ;  la collecte de matériels végétaux en quantité plus importante pour obtenir des extraits en quantité suffisante afin d’effectuer des études approfondies ;  la collecte de matériels végétaux à différents stades phénologiques ;  l’amélioration des procédés d’extraction et la mise au point d’une méthode de purification, ce qui nous permettra certainement d’optimiser l’activité des principes actifs ;  l’élargissement de notre étude à d’autres organismes-tests. Par ailleurs, certaines espèces n’ont montré aucune activité sur les modèles utilisés mais pourraient se révéler plus prometteuses sur d’autres organismes ;  la poursuite des travaux sur les microorganismes en utilisant d’autres germes tests.

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PARTIE III

ETUDE DE Crotalaria bernieri Baill.

Etude de C. bernieri Baill.

INTRODUCTION

Parmi les différentes espèces de Crotalaria recensées et étudiées (voir partie précédente), Crotalaria bernieri a été choisie pour une étude plus approfondie. Sa sélection a été dictée par divers critères, notamment :

 sa disponibilité en termes de quantité ;  ses nombreux usages empiriques surtout dans le traitement de maladies infectieuses ;  sa forte potentialité sur les organismes testés lors des études préliminaires (voir partie II, § 2.3.4 et 2.3.5) ;  l’absence des données scientifiques autres que botaniques la concernant dans la littérature.

Ainsi, l’objectif visé est d’approfondir les investigations sur les plans chimique, toxicologique et biologique et à prospecter dans quelle mesure la plante et les métabolites secondaires qu’elle contient pourraient être exploités à des fins utiles. La présente partie comporte 4 chapitres. Le chapitre 1 est consacré à l’étude chimique des extraits. La détermination structurale des principes actifs de C. bernieri fait l’objet du chapitre 2. Les chapitres 3 et 4 rapportent à l’étude des effets des extraits, respectivement sur les animaux et les microorganismes.

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CHAPITRE 1

Etude chimique

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1.1. INTRODUCTION

Ce chapitre décrit les matériels et procédés utilisés pour l’extraction et la purification des extraits et aussi pour la détermination des métabolites secondaires qu’ils contiennent. L’objectif visé est d’obtenir différents extraits et produits qui seront utilisés pour les investigations biologiques.

1.2. MATERIELS ET METHODES 1.2.1. MATERIEL D’ETUDE 1.2.1.1. POSITION SYSTEMATIQUE

Selon la classification de Cronquist (1988) et Du Puy et al., (2002), la position systématique de la plante matériel d’étude est : Règne : PLANTAE Sous-règne : TRACHEOBIONTA Embranchement : MAGNOLIOPHYTA Sous-embranchement : ANGIOSPERMAE Classe : MAGNOLIOPSIDA Sous-classe : ROSIDAE Ordre : FABALES Sous-ordre : LEGUMINOSINAE Famille : FABACEAE Sous-famille : PAPILIONOIDEAE Genre : Crotalaria Espèce : bernieri Baill. Synonyme : Crotalaria ankaranensis Nom vernaculaire : Ranomanja

1.2.1.2. DESCRIPTION BOTANIQUE (Polhill, 1982 ; Du Puy et al., 2002)

Crotalaria bernieri Baill. (Figure 19 ; page 65) est une herbacée annuelle très ramifiée, mesurant 20 à 100 cm de hauteur. Les feuilles sont trifoliolées, sans stipules, avec des pétioles beaucoup plus courts que les folioles. Les folioles sont lancéolées, étroitement linéaires à elliptiques oblongues et pouvant atteindre jusqu’à 50 mm de longueur. Les racèmes atteignent 8 à 15 cm de longueur et présentent de nombreuses fleurs rapprochées vers le sommet. Les

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Etude chimique bractéoles sont penchées et insérées à la base du calice ; elles sont plus petites que les bractées. Le calice, tronqué à la base, mesure 1,5 à 2,5 mm de longueur. L’étendard est obovale, subcirculaire, de couleur jaune pâle et parfois strié de brun rougeâtre. La carène est courtement arrondie vers le milieu ; elle présente un bec légèrement incurvé atteignant 3,5 à 5 mm de longueur. Les gousses sont généralement sessiles, oblongues-cylindriques, de 2 à 2,5 cm de long et 0,7 à 0,9 cm de large. Chaque gousse contient environ 30 à 40 graines. Les graines, de couleur brun pâle ou rouge orangé, sont oblongues-réniformes, lisses et de longueur 2 à 2,5mm.

a

b c d

Figure 19 : Crotalaria bernieri Baill : (a) : plante entière ; (b) : rameau fleuri ; (c) : fruits ; (d) : rameau feuillu Source: Auteur

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Etude chimique

1.2.1.3. HABITAT ET REPARTITION GEOGRAPHIQUE (Polhill, 1982)

Crotalaria bernieri se rencontre fréquemment dans les savanes boisées, dans les terres abandonnées, dans les champs de maïs et manioc ainsi qu’au bord des routes et au voisinage des habitations. Plante native de l’Île, elle pousse dans presque toutes les zones, à savoir : Antananarivo, Antsirabe, Betafo, Ankazobe, Alaotra, Moramanga, Sambirano. Mais elle est largement répandue dans les parties Ouest (Maevatanana) et Nord (Massif d’Ankarana, Massif de Bemaraha, Montagne d'Ambre) à partir de 800 à 1300 m d’altitude. Elle a été introduite dans plusieurs pays tropicaux comme les Comores, Kenya, Tanzanie, Ouganda et Mozambique.

1.2.1.4. RECOLTE ET IDENTIFICATION BOTANIQUE

C. bernieri a été récoltée à Ibity (Commune rurale d’Antsirabe, Région de Vakinankaratra), située à 175 Km au Sud d’Antananarivo avec les coordonnées GPS S : 20°03′46.2″, E : 046°59′27.9″. La collecte a été effectuée au mois d’Avril 2013, période durant laquelle la plante était au stade de fructification. La plante a été identifiée par Roger Marcus POLHILL, Botaniste au Royal Botanic Gardens de Kew et un spécimen, sous la référence HERIZO R. 010, a été déposé à l’herbarium du Département de Biologie et Ecologie Végétale de la Faculté des Sciences de l’Université d’Antananarivo.

1.2.1.5. UTILISATIONS EMPIRIQUES

Les enquêtes menées auprès des villageois ont révélé que le décocté de feuilles de C. bernieri est utilisé traditionnellement pour soigner les maux de ventre et la diarrhée. En dehors de ses usages thérapeutiques, la plante entière est aussi utilisée pour nourrir les bœufs. D’après la littérature, cette plante a été anciennement utilisée en teinturerie, d’où son appellation vernaculaire « ranomanja » de « rano » : eau, et « manja » : brune (http://www.ilerouge.org).

1.2.1.6. PREPARATION DES ORGANES

Les feuilles, les graines, les cosses et les racines de C. bernieri constituent les organes utilisés dans ce travail. Ils sont préparés selon la méthode décrite dans la deuxième partie, §

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Etude chimique

2.2.4.1 (page 33). Il faut noter que la majeure partie des travaux a été réalisée avec les feuilles, l’organe le plus disponible en quantité suffisante.

1.2.2. LES CONSOMMABLES UTILISÉS

Les produits chimiques ainsi que les solvants utilisés (de marque Prolabo®, Merck® ou NLabosi®) sont de qualité pure ou « pour analyse ».

Des plaques de gel de silice, 60 F254 Merck®, sur support en aluminium de dimensions 20 x 20 cm ont été utilisées pour la chromatographie sur couche mince (CCM) ; ces plaques peuvent être découpées aux dimensions voulues. Du gel réticulé de dextrane (Sephadex ® LH-20, 25-100 µm; Pharmacia Biotech Ltd) et de silice RP8 (LiChroprep ® ; 25-40 µm ; Merck) ont été utilisés pour la chromatographie sur colonne.

1.2.3. METHODES D’EXTRACTION 1.2.3.1. PREPARATION DES EXTRAITS (Rakoto Ranoromalala, 2012 ; Ratsimanohatra, 2017)

Les principes actifs de la plante ont été extraits à l’aide de la méthode par épuisements encore appelée extraction par lixiviation. Pour cela, trois solvants de polarité croissante, l’hexane, l’acétate d’éthyle et le méthanol sont utilisés. Pour éviter d’extraire des pigments qui persisteraient dans les différents extraits, 100 g de poudre de chaque organe subissent une dépigmentation puis sont mis en suspension dans 500 ml d’hexane. Le mélange est soumis à une agitation magnétique à la température ambiante pendant une nuit. Après filtration sur du papier Whatman n°1, le filtrat est récupéré puis l’opération est répétée jusqu’à ce que le marc ne soit plus coloré (poudre épuisée). Chaque matériel dépigmenté est ensuite séché à l’air libre et épuisé avec l’acétate d’éthyle puis le méthanol selon la même technique. Le traitement est arrêté quand le solvant n’est plus coloré. Après filtration, le filtrat issu de chaque extraction est concentré par évaporation à basse pression et à 45°C (voir deuxième partie, § 2.2.4.2, page 33) jusqu’à l’obtention d’un résidu sec.

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1.2.3.2. EXTRACTION DES ALCALOÏDES TOTAUX

Les alcaloïdes totaux ont été extraits dans des conditions acides-bases (Nguyen, 2007). Cette méthode permet de séparer les alcaloïdes des autres constituants qui ont la même solubilité quel que soit le pH. Le principe consiste à déplacer les alcaloïdes de leurs combinaisons (transformer les alcaloïdes bases en sels ou inversement) et de les extraire.

1.2.3.2.1. EXTRACTION DES ALCALOIDES TOTAUX A PARTIR DE LA POUDRE DE FEUILLES

Environ 100 g de poudre de feuilles sont humectés avec 225 ml d’une solution d’acide chlorhydrique (HCl) diluée 10%, puis mis en suspension dans 750 ml de méthanol (MeOH). Le mélange est agité pendant 24 h à la température ambiante. Après filtration sur filtre Büchner, la solution est évaporée à sec sous pression réduite et à 40°C. Le résidu ainsi obtenu, dissous dans 250 ml d’eau distillée, est versé dans une ampoule à décanter et extrait avec 500 ml de dichlorométhane (CH2Cl2). Après agitation, le tout est laissé au repos jusqu’à séparation nette de deux phases (organique et aqueuse). L’opération est répétée 3 fois, puis les phases organiques sont rassemblées et évaporées à sec, donnant l’extrait au CH2Cl2. La phase aqueuse est alcalinisée à pH 9 avec de l’ammoniaque (NH4OH) 20 %. Elle est de nouveau extraite au

CH2Cl2 (3 x 250 ml) pour donner un nouvel extrait organique et un nouvel extrait aqueux. Pour extraire les alcaloïdes totaux, la solution aqueuse est recueillie dans une ampoule à décanter et mélangée volume à volume avec du n-butanol. Le mélange est ensuite agité puis laissé reposer jusqu’à séparation nette de deux phases : une phase butanolique supérieure et une phase aqueuse inférieure. La phase aqueuse est séparée de la phase organique, puis de nouveau soumise à trois autres traitements successifs. Les phases sont rassemblées séparément puis évaporées à sec. Le résidu d’évaporation de la phase butanolique obtenue renferme les alcaloïdes totaux.

1.2.3.2.2. EXTRACTION DES ALCALOIDES TOTAUX A PARTIR DE L’EMF

Dans ce procédé, 2 g d’EMF sont acidifiés avec 50 ml d’une solution de HCl 10 % puis mis en suspension dans 170 ml de MeOH. Le mélange est soumis à une agitation continue pendant 24 h à la température ambiante. Après filtration, la solution est évaporée sous vide. Le résidu ainsi obtenu, dissous dans 55 ml d’eau distillée, est versé dans une ampoule à décanter et extrait au CH2Cl2 (3 x 300 ml). Après une légère agitation, le tout est laissé au repos jusqu’à séparation nette de deux phases. La phase organique est évaporée à sec, donnant l’extrait au

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CH2Cl2, tandis que la phase aqueuse est alcalinisée avec du NH4OH (20 %) à pH 9, puis de nouveau extraite au CH2Cl2 (3 x 55 ml) pour donner une nouvelle phase organique et une nouvelle phase aqueuse. La suite de l’opération est effectuée suivant la technique décrite au § 1.2.3.2.1 ci- dessus.

1.2.4. PURIFICATION DES ALCALOIDES 1.2.4.1. CHROMATOGRAPHIE PREPARATIVE

Dans la présente étude, les méthodes de chromatographie liquide sur colonne ouverte à pression atmosphérique (CC) et sur colonne à haute performance (HPLC) ont été utilisées.

1.2.4.1.1. CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE SUR COLONNE OUVERTE A PRESSION ATMOSPHERIQUE

Deux types de chromatographie ont été utilisées. Il s’agit :

a) Chromatographie d’exclusion sur gel de Sephadex ® LH-20

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme (structure spatiale). La colonne utilisée est remplie d’un gel de Sephadex® LH-20 (§ 1.2.2, page 67) présentant des caractères lipophiles et hydrophiles. Les grosses molécules, dont le diamètre est supérieur à celui des pores du gel sont exclues et sont éluées en premier. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car en diffusant à l’intérieur des grains de gel, elles sont ralenties. La séparation est donc réalisée dans l’ordre inverse des masses molaires c’est-à-dire que les substances sont éluées par ordre décroissant de leur poids moléculaire. Le gel est mis à gonfler dans le solvant d’élution MeOH 100% pendant 3 h à la température ambiante puis dégazé sous pression réduite. La suspension est ensuite coulée dans une colonne de verre de dimensions connues. Lorsque le gel est complètement sédimenté, sa surface supérieure est stabilisée avec une rondelle de papier filtre. La colonne est ensuite équilibrée à l’aide du solvant d’élution (3 fois le volume de la colonne). L’extrait à fractionner, dissous dans un volume minimum de MeOH, est déposé à la surface du gel. Les différentes fractions sont récupérées à l’aide d’un collecteur automatique GILSON Microcol® puis regroupées sur la base de leur profil en CCM. Cette méthode a été utilisée pour séparer les alcaloïdes des composés phénoliques.

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Etude chimique

b) Chromatographie d’adsorption sur gel de silice

Cette technique permet de séparer les constituants d’un mélange de substances, en fonction de leur polarité c'est-à-dire de leurs groupements fonctionnels. Elle est basée sur le partage des solutés entre l’adsorbant fixe (gel de silice) et la phase liquide mobile (éluant). Chacun des solutés est soumis à une force de rétention par adsorption et une force d’entrainement par la phase mobile. L’équilibre qui en résulte aboutit à une migration différentielle des solutés de l’échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation. Le gel de silice RP8 (§ 1.2.2, page 67) mis en suspension dans le système de solvants

MeOH/H2O (50/50, V/V), est coulé dans une colonne de verre de dimensions déterminées. La surface du gel est stabilisée par une rondelle de papier filtre. Une fois le gel équilibré, l’extrait à étudier, dissous dans un volume minimum de MeOH, est déposé à sa surface. L’échantillon est ensuite élué en phase inverse avec un gradient MeOH/H2O (0 : 100 à 100 : 0). Les différentes fractions sont éluées par gravité, collectées à la sortie de la colonne à l’aide d’un collecteur automatique, puis regroupées selon leur comportement en CCM. Cette méthode a été utilisée pour purifier les alcaloïdes.

1.2.4.1.2. CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE (HPLC)

L’HPLC est une technique de séparation basée sur l'hydrophobicité d'un composé ou d’un mélange de composés. L’échantillon à chromatographier est poussé par un éluant liquide (phase mobile) à travers une colonne remplie d'une phase stationnaire composée de grains solides très fins. Le débit de l’élution est régularisé par une pompe à haute pression. Dans la colonne, les divers composés de l’échantillon sont séparés les uns des autres en raison de leurs diverses affinités à l’égard des deux phases : stationnaire et mobile. A la sortie de la colonne les composés sont détectés à l’aide d’un détecteur UV. La figure 20 (page 71) montre le schéma illustrant le principe général de la méthode.

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Etude chimique

Figure 20 : Schéma de la chromatographie en phase liquide à haute performance 1 : Réservoirs des solvants, 2 : Dégazeur, 3 : Valve de gradient d'élution, 4 : Doseur de phase mobile (ou éluant), 5 : Pompe à haute pression, 6 : Vanne d'injection en position « inject », 6' : Vanne d'injection en position "load", 7 : Boucle d’injection de l'échantillon, 8 : Précolonne (facultative), 9 : Colonne analytique, 10 : Détecteur UV, 11 : Ordinateur, 12 : Décharge déchets

Dans nos expérimentations, l’appareillage utilisé comprend :  un détecteur UV GILSON 170 Diode Array Detector® réglé à λ = 254 nm ;  une pompe GILSON 321 Pump® (injection manuelle, vanne et boucle de 200 µl, Rhéodyne), réglée entre 165 à 178 bar ;  un ordinateur muni d’un programme spécial « Gilson Unipoint ».

Toutes les analyses sont effectuées en mode analytique et à la température ambiante.

La colonne utilisée est une C18 Acclaim Polar Advantage II, Thermo Scientific® (porosité : 5µm ; diamètre et longueur : 4,6 mm x 250 mm). La phase stationnaire utilisée est une silice greffée C18 et l’élution est réalisée avec un gradient de solvant ou phase mobile : eau (éluant A) et acétonitrile CH3CN (éluant B) de 100/0 à 95/5. Le volume d’échantillon injecté est de 50 µL et le débit d’élution est réglé à 1,6 ml/min pendant 20 min. La méthode HPLC a été utilisée pour purifier le mélange d’alcaloïdes.

1.2.5. METHODES ANALYTIQUES 1.2.5.1. CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

La CCM est employée pour suivre la purification des produits étudiés par vérification de leur présence et leur degré de pureté. Par ailleurs, elle donne une idée de la polarité des différents composés. Entrainés par un mélange de solvants constituant la « phase mobile », les composés ou les molécules migrent par capillarité sur une plaque de gel de silice 60 F254 (voir

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Etude chimique

§ 1.2.2, page 67) constituant la « phase stationnaire ». Différents systèmes de solvants peuvent être utilisés comme phase mobile mais dans cette étude, le système Butanol/Acide acétique/Eau (B/A/E) en proportion 6/2/2 (p/p/p) est employé. Les échantillons sont déposés à l’aide d’une micropipette de 5 µl sur une ligne située à 15 mm du bord inférieur et à 13 mm des bords latéraux de la plaque. Après son séchage à l’aide d’un séchoir à main, la plaque est mise à développer dans une cuve à chromatographie (DESAGA-HEIDELBERG ®) préalablement saturée par les vapeurs de solvant de migration. La chromatographie est arrêtée lorsque le front du solvant est à 5 mm du bord supérieur. La plaque est alors retirée de l’enceinte puis séchée. Les chromatogrammes sont visualisés sous lampe ultraviolette en utilisant un détecteur UV (Bioblock Scientific ®) aux longueurs d’ondes λ = 254 nm et λ = 366 nm. Les taches sont entourées d’un trait avec du crayon graphite et leurs Rf sont notées. Elles sont ensuite révélées par pulvérisation de réactifs appropriés :

 la vanilline sulfurique, un révélateur universel qui permet de détecter les sucres, les flavonoïdes, les terpenoïdes et les phénols. La solution est vaporisée sur la plaque CCM, puis celle-ci est chauffée à 110 °C pendant quelques minutes pour faire apparaître les composés sous différentes colorations ;

 le réactif de Dragendorff, qui est utilisé spécifiquement pour révéler les alcaloïdes. Après pulvérisation du réactif, des taches de couleur orange apparaissent.

La préparation de ces deux réactifs est donnée en Annexe 3.

1.2.5.2. DETERMINATION DES FAMILLES CHIMIQUES Toutes les réactions de détection des familles chimiques ont été effectuées à partir des extraits bruts de chaque organe. Quatre types d’extraits sont préalablement préparés pour la détermination des familles chimiques selon la méthode décrite dans la deuxième partie, § 2.2.5 (pages 34 à 37). En outre, dans cette partie, le criblage phytochimique de C. bernieri a été élargi aux acides aminés. La détection a été réalisée selon la méthode décrite par Firdouse et Alam (2011):  l’extrait aqueux est mélangé volume-à-volume avec une solution éthanolique de ninhydrine à 0,1 % (p/v). Après une légère agitation, le mélange est chauffé au bain-marie bouillant pendant 2 à 3 min. La formation d’une coloration bleu-violet caractérise la présence d’acides aminés.

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Etude chimique

1.2.6. CALCUL DU RENDEMENT D’EXTRACTION ET DE PURIFICATION

Les différents extraits et produits obtenus sont évaporés à sec. Les résidus résultants sont pesés et les rendements d’extraction calculés. Le rendement est le pourcentage du rapport entre le poids du résidu d’évaporation à sec et celui du matériel de départ. Il est estimé selon la formule suivante :

Poids du résidu d′évaporation à sec (g) 푅푒푛푑푒푚푒푛푡 (%) = × 100 Poids du matériel végétal de départ (g)

1.3. RESULTATS 1.3.6. EXTRACTION 1.3.6.1. LES EXTRAITS BRUTS D’ORGANES

Il s’agit des extraits préparés à partir des poudres des feuilles, graines, cosses et racines de C. bernieri. Pour chaque type de matériel végétal, 100 g de poudre ont été extraits successivement par l’hexane (4 x 500 ml), l’acétate d’éthyle (4 x 500 ml) et le méthanol (4 x 500 ml) selon la méthode décrite au § 1.2.3.1 (page 67). L’aspect, la couleur et le rendement d’extraction de chaque extrait sont présentés dans le tableau 13. Tableau 13 : Rendement d’extraction et caractéristiques des différents extraits préparés à partir des organes de C. bernieri Extraits Aspect Couleur Rendement (%) EHF visqueux vert noir 14,6 Feuilles EAF pâteux vert noir 22,5 EMF poudre amorphe marron clair 12 EHG huileux jaune clair 18,43 Graines EAG sirupeux marron foncé 12,12 EMG poudre amorphe marron clair 10 EHC visqueux vert noir 15,11 Cosses EAC pâteux vert noir 11,20 EMC poudre amorphe marron clair 4,16 EHR huileux jaune clair 13,67 Racines EAR pâteux marron foncé 15,32 EMR poudre amorphe marron clair 24,13 EHF : extrait hexanique de feuilles, EAF : extrait acétate d’éthyle de feuilles, EMF : extrait méthanolique de feuilles, EHG : extrait hexanique de graines, EAG : extrait acétate d’éthyle de graines, EMG : extrait méthanolique de graines, EHC : extrait hexanique de cosses, EAC : extrait acétate d’éthyle de cosses, EMC : extrait méthanolique de cosses, EHR : extrait hexanique de racines, EAR : extrait acétate d’éthyle de racines, EMR : extrait méthanolique de racines.

Les rendements d’extraction ainsi obtenus ont varié de 4,16 % à 24,13 % soit 4,16 g à 24,13 g. L’EMR a donné le meilleur rendement d’extraction.

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Etude chimique

Tous les extraits obtenus ont été testés sur les microorganismes (voir chapitre 4). Seuls les extraits méthanoliques solubles dans l’eau (EMF, EMG, EMC, EMR) ont été soumis à des tests de toxicité sur souris (voir chapitre 3). Du point de vue de la toxicité, l’EMF s’est avéré le plus actif. Il constitue alors l’extrait brut sur lequel tous les procédés de purification et les différents tests biologiques ont été entrepris.

1.3.6.2. LES ALCALOÏDES TOTAUX

Plusieurs molécules d’alcaloïdes à propriétés pharmacologiques intéressantes ont déjà été isolées du genre Crotalaria (Roeder et Wiedenfeld, 2013 ; Aronson, 2014). C’est la raison pour laquelle nous avons entrepris l’extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre et de l’extrait méthanolique des feuilles (EMF) de C. bernieri.

1.3.6.2.1. EXTRACTION A PARTIR DE LA POUDRE

Suivant la méthode décrite au § 1.2.3.2.1 (page 68), l’extraction à partir de 100 g de poudre de feuilles de C. bernieri a permis d’obtenir 5,85 g d’extrait d’alcaloïdes totaux (EAT) et 23,8 g d’extrait non alcaloïdes totaux (nEAT) soit respectivement un rendement de 5,85 % et 23,8%. L’analyse par CCM sur gel de silice avec le système de solvants B/A/E 6/2/2 (p/p/p) comme éluant, a montré que l’EAT et le nEAT comportaient chacun 4 bandes majeures révélables sous lumière UV (figure 21 a, page 75). La révélation de la plaque par le réactif de

Dragendorff a montré la présence d’alcaloïdes dans l’extrait EAT en donnant 4 taches de couleur orange (figure 21 b, page 75). Les deux extraits ont été soumis à des tests de toxicité sur souris et d’activité antimicrobienne. D’après les résultats (voir plus loin), l’EAT s’est avéré toxique et très actif vis-à-vis des microorganismes testés.

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Etude chimique

a b

1 2 1 2

Figure 21 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des extraits non alcaloïdes totaux nEAT (1) et alcaloïdes bases totaux EAT (2) obtenus lors du fractionnement par le n-butanol de la solution aqueuse acidifiée issue de la poudre de feuilles a: révélation à la vanilline sulfurique ; b : révélation par le réactif de Dragendorff

1.3.6.2.2. EXTRACTION A PARTIR DE EMF

Suivant la méthode décrite au § 1.2.3.2.2 (page 68), l’extraction des alcaloïdes à partir de 2 g d’EMF a permis d’obtenir 605 mg (30,25 %) d’extrait d’alcaloïdes totaux (EAT’) et 321 mg (16,05 %) d’extrait non alcaloïdes totaux (nEAT’). L’EAT’ s’est donc avéré le plus rentable. D’après les tests biologiques, l’EAT’ était toxique sur souris et peu actif sur les microorganismes. Par contre, nEAT’ n’a montré aucune toxicité vis-à-vis des organismes testés.

L’analyse par CCM a montré que l’EAT’ et le nEAT’ comportaient respectivement 4 et 5 bandes majeures révélables sous lumière UV (figure 22 a, page 76). La présence d’alcaloïdes a été confirmée dans l’extrait EAT’ par révélation de la plaque par le réactif de Dragendorff (figure 22 b, page 76).

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Etude chimique

a b

1 2 1 2 Figure 22 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des extraits non alcaloïdes totaux nEAT’ (1) et alcaloïdes totaux EAT’ (2) obtenus lors du fractionnement par le n-butanol de la solution aqueuse acidifiée issue de l’EMF a: révélation à la vanilline sulfurique ; b : révélation par le réactif de Dragendorff

Compte tenu de ces résultats, l’extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre de feuilles de C. bernieri s’est avérée la plus performante, tant du point de vue de l’activité toxique sur souris et sur des microorganismes que de la quantité de produits extraits. Par conséquent, la suite de l’étude chimique a été orientée vers la purification des alcaloïdes totaux extraits à partir de la poudre de feuilles de C. bernieri. La figure 23 (page 77) résume les étapes d’extraction de l’EAT à partir de la poudre de feuilles de C. bernieri.

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Etude chimique

Poudre de feuilles de 1. ACIDIFICATION avec HCl 10% C. bernieri (100 g) 2. MISE EN SUSPENSION dans 750 ml de MeOH 3. AGITATION (24 h) 4. FILTRATION

5. EVAPORATION 6. DILUTION à L’EAU Solution aqueuse

EXTRACTION au CH2Cl2 (3 x 500 ml)

Phase organique Phase aqueuse

EVAPORATION A SEC 1. BASIFICATION avec NH4OH 20 % à pH 9 EXTRAIT CH2Cl2 2. EXTRACTION au CH2Cl2 (3 x 250 ml)

Phase organique Phase aqueuse (Alcaloïdes)

PARTITION au n-butanol (v/v)

Phase butanolique Phase aqueuse

EVAPORATION EVAPORATION A SEC A SEC

ALCALOIDES NON ALCALOIDES TOTAUX (nEAT : 23,8 g) (EAT : 5,85 g)

Figure 23 : Schéma récapitulatif de l’extraction des alcaloïdes totaux à partir de la poudre de feuilles Les chiffres entre parenthèses indiquent les poids du matériel de départ, puis des résidus d’évaporation à sec des extraits.

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Etude chimique

1.3.7. LES FAMILLES CHIMIQUES PRESENTES DANS LES DIFFERENTS EXTRAITS DE LA PLANTE

Les résultats du criblage phytochimique auquel les différents extraits d’organes de C. bernieri ont été soumis sont montrés dans le tableau 14. Il apparaît ainsi que les tanins, polyphénols, stéroïdes, triterpènes et les stérols insaturés ont été trouvés dans presque tous les organes de la plante. Des flavonoïdes et des acides aminés étaient également présents dans tous les organes sauf dans les racines. Des alcaloïdes ont été détectés, notamment dans les feuilles et les cosses et des saponosides dans les racines. Les désoxyoses, iridoïdes, leucoanthocyanes et quinones n’ont été détectés dans aucun organe de C. bernieri. Tableau 14 : Résultats du criblage phytochimique réalisé sur les différents extraits de C. bernieri Familles Feuilles Graines Cosses Racines Tests chimiques a b c d e f g h i j k l Mayer - - + - - - - - + - - - Wagner - - + - - - - - + - - - Alcaloïdes Dragendorff - - + - - - - - + - - - Test de confirmation - - + - - - - - + - - - Saponosides Test de mousse ------+ Flavonoïdes Willstätter - + + - + + - - + - - - Acides aminés Ninhydrine 0,1% - - + - - + - - + - - - Gélatine 1% + - + - + + - - - + + + Tanins et Gélatine salée 10% + - + + + + - + - + + + polyphénols FeCl3 - + + - - + - - + - - + Stéroïdes + + - + + + + + - + + - Liebermann-Burchard Triterpènes + - - + + + + + - + + - Stérols insaturés Salkowski + - - + + + + + - + + - Désoxyoses Keller-Kiliani ------Iridoïdes HCl à chaud ------Leucoanthocyanes Bate-Smith ------Quinones Borntrager ------a : EHF, b : EAF, c : EMF, d : EHG, e : EAG, f : EMG, g : EHC, h : EAC, i : EMC, j : HER, k : EAR, l : EMR, + : test positif, - : test négatif

1.3.8. PURIFICATION DES ALCALOIDES

Tous les procédés d’extraction et de purification sont bioguidés par des tests de toxicité sur souris (voir méthode au § 3.2.2.1, page 109), et des tests d’activité antimicrobienne (voir méthode au § 4.2.2.1, page 146). A chaque étape de purification, l’homogénéité des produits obtenus est suivie par CCM (voir méthode au § 1.2.5.1, page 71). Elle est également appréciée par une analyse spectrométrique de Résonance Magnétique Nucléaire ou RMN (voir méthode au § 2.2.3 ; page 87). -78-

Etude chimique

1.3.8.1. CHROMATOGRAPHIE DE L’EAT SUR COLONNE OUVERTE DE GEL SEPHADEX ® LH-20

Dans le but de séparer les alcaloïdes en fonction de leur poids moléculaire, 1 g de l’EAT, repris dans 2 ml de MeOH, a été déposé sur une colonne de gel Sephadex ® LH-20 (Ø: 1,5 cm ; H : 1 m). La colonne a été éluée par gravité par le MeOH 100 % et les différentes fractions ont été récupérées à l’aide d’un collecteur automatique programmé à 150 gouttes par tube, soit un volume de 3 ml/tube. Les fractions recueillies ont été ensuite concentrées puis regroupées sur la base de leur comportement en CCM. En tout, 51 fractions F1 à F51 ont été obtenues et leur regroupement a permis d’obtenir 5 groupes de fractions nommés AT1 à AT5 (tableau 15).

Tableau 15 : Fractions obtenues lors de la purification de l’EAT sur colonne ouverte de gel Sephadex ® LH-20 à partir de 1 g de l’EAT Rendement par Groupes de N° tube Fractions Poids (mg) rapport à l’EAT (%) fractions 1-3 1-3 - - AT1

6-16 6-16 327 32,7 AT2 20-26 20-26 24 2,4 AT3 30-34 30-34 3 0,3 AT4 36-51 36-51 532 53,2 AT5 Solvant : MeOH 100 % ; - : aucun

Au total 5 chromatographies ont été effectuées pour fractionner 5 g de l’EAT. Les analyses par CCM (figure 24, page 80) et par RMN (voir Annexe 4) ont montré que AT1 (F1 à F3) correspondait au solvant d’élution ; AT2 (F6 à F16 ; 327 mg) contenait essentiellement un mélange d’alcaloïdes alors que AT3 (F20 à F26 ; 24 mg) était un mélange de sels et de flavonoïdes. Dans la fraction AT4 (F30 à F34 ; 3 mg) un composé hautement purifié a été obtenu. Il a été appelé C1. Pour la fraction AT5, elle était un mélange du composé C1 et autres produits moins polaires.

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Etude chimique

a

F1-F3 F6-F16 F20-F26 F30-F34 F36-F51 (AT1) (AT2) (AT3) (AT4) (AT5)

b

F1-F3 F6-F16 F20-F26 F30-F34 F36-F51 (AT1) (AT2) (AT3) (AT4) (AT5) Figure 24 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) des fractions obtenues par purification de l’EAT sur colonne ouverte de gel Sephadex ® LH-20 a: révélation par le réactif de Dragendorff ; b : révélation à la vanilline sulfurique

D’après les tests biologiques, seule AT2 était toxique sur souris et très active sur les microorganismes testés. Par contre, C1 a agi uniquement sur les microorganismes. AT2 a alors été reprise pour une deuxième purification.

1.3.8.2. CHROMATOGRAPHIE DE LA FRACTION AT2 SUR COLONNE OUVERTE DE GEL DE SILICE RP8

Le résidu d’évaporation de AT2 pesant 327 mg a été repris dans un volume minimum de MeOH. La solution a été ensuite déposée sur une colonne de gel de silice RP8 (Ø : 3 cm ;

H: 50 cm). L’élution a été conduite en phase inverse avec un gradient de solvant MeOH/H2O (0 : 100 à 100 : 0) et l’effluent a été récolté au moyen d’un collecteur automatique, programmé

à 75 gouttes par tube, soit un volume de 1,5 ml/tube. Au total, 19 fractions, F1 à F19 ont été ainsi

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Etude chimique obtenues. Leur regroupement selon leur profil chromatographique a donné 3 groupes de fractions dénommés AT2a, AT2b et AT2c (tableau 16).

Tableau 16 : Fractions obtenues lors de la purification de AT2 sur colonne ouverte de gel de silice RP8 Poids Rendement par Groupes de N° tube Fractions (mg) rapport à AT2 (%) fractions 1-5 1-5 135 41,28 AT2a

6-9 6-9 1,5 0,45 AT2b 10-19 10-19 32 9,78 AT2c

Système de solvants : MeOH/H2O (0 : 100 à 100 : 0) en phase inverse ; - : aucun

L’évaporation à sec de l’AT2b (F6 à F9) a permis d’obtenir 1,5 mg d’un composé pur appelé C2. D’après les analyses par CCM (figure 25) et par RMN (Annexe 4), AT2a (F1 à F5 ;

135 mg) et AT2c (F10 à F19 ; 32mg) renfermaient un mélange d’alcaloïdes. Par conséquent, AT2c a été purifié par HPLC (voir § 1.3.3.3, page 82) tandis que AT2a a été chromatographié une deuxième fois sur une colonne de gel de silice RP8 dans les mêmes conditions (phase inverse ;

MeOH/H2O (0 : 100 à 100 : 0). Cette étape a conduit à l’obtention de 2,3 mg d’un autre composé pur appelé C3.

a b b a

AT2a (F1 à F5) AT2c (F10 à F19)

Figure 25 : CCM sur gel de silice (éluant : B/A/E, 6/2/2, p/p/p) de AT2a et AT2c obtenues par purification de AT2 sur colonne ouverte de gel de silice RP8 a: révélation par le réactif de Dragendorff ; b : révélation à la vanilline sulfurique

-81-

Etude chimique

1.3.8.3. PURIFICATION DE AT2c PAR HPLC

L’extrait AT2c (32 mg) a été solubilisé dans un volume minimum de MeOH et soumis

à une chromatographie HPLC en mode analytique utilisant une colonne C18 Acclaim Polar

Advantage II, (4,6 mm x 250 mm). Le solvant était composé d’un gradient H2O/CH3CN de 100/0 à 95/5. Le débit d’élution était réglé à 1,6 ml/min et le volume d’échantillon injecté était de 50 µl.

Cette chromatographie a fourni 8 fractions (F1 à F8).

D’après le chromatogramme (figure 26) des extraits obtenus après purification de AT2c par HPLC, les produits n’ont pas été séparés correctement. Cette technique n’a donc pas abouti à l’isolement de composés purs. Toutefois, il a révélé la présence d’un composé majoritaire (probablement un alcaloïde) qui est élué à 11 min et correspondant à un pic AU=186,119 (AU : unité arbitraire d’absorbance).

Composé

majoritaire (probablement un alcaloïde).

AU = 186,119 Absorbance (AU) Absorbance

Temps (min)

Figure 26: Chromatogramme de AT2c obtenu après purification par HPLC Conditions d’analyse : HPLC en mode analytique; éluant : gradient

H2O/CH3CN de 100/0 à 95/5 ; détection UV à 254 nm

Les méthodes qui ont été utilisées pour purifier ou isoler les composés C1 à C3 à partir de l’extrait EAT de feuilles de C. bernieri sont résumées sur la Figure 27 (page 83).

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Etude chimique

EAT (1 g)

C.C. – Sephadex LH20 MeOH 100%

F1-F3 F6-F16 F20-F26 F30-F34 F36-F51 (AT1) (AT2 ; 327 mg) (AT3 ; 24 mg) (AT4) (AT5 ; 532 mg)

CC - SiO2 RP8 Composé C1 MeOH/H2O (3 mg) (0 : 100 à 100 : 0)

sF1-sF5 sF6-sF9 sF10-sF19 (AT2a ; 135 mg) (AT2b) (AT2c ; 32 mg)

HPLC C18 CC - SiO2 RP8 Composé C2 H2O/CH3CN MeOH/H2O (1,5 mg) (100 : 0 à 95 : 5) (0 : 100 à 100 : 0)

Composé C3 (2,3 mg) F1 F2…….. F8

Figure 27 : Procédé de purification et d’isolement des composés 1-3 à partir de l’extrait EAT de feuilles de C. bernieri

1.4. DISCUSSION ET CONCLUSION

Dans le but de cibler le maximum de molécules, les organes de C. bernieri ont été soumis à une extraction par épuisements successifs à l’aide de solvants de polarité croissante. Ainsi, l’hexane a été utilisé pour dégraisser et dépigmenter les organes, l’acétate d’éthyle pour obtenir les composés moyennement polaires et le MeOH pour extraire les composés polaires. Les rendements de l’extraction variaient en fonction de l’organe et de la nature du solvant utilisé. Ils allaient de 4,16 % (extrait méthanolique de cosses) à 24,13 % (extrait méthanolique de racines). Ces valeurs étaient nettement supérieures à celle des graines de C. spinosa dont l’extrait méthanolique a donné un rendement de 2,76 % (Randriamanantsoa, 2015) mais comparables à celle de l’extrait méthanolique de feuilles de C. cleomifolia avec un rendement d’extraction de 9,37 % (Ratefiarivony, 2015).

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Etude chimique

Plusieurs métabolites secondaires ont été détectés dans les différents extraits d’organes de C. bernieri. Comme dans le cas de nombreuses espèces de Crotalaria étudiées antérieurement, notamment C. emarginella (Ahmed et al., 2006), C. juncea (Hemendra et al., 2010), C. pallida (Govindappa et al., 2011), C. grahamiana (Vanitha et al., 2012), C. lachnophora (Brink, 2015), les alcaloïdes, flavonoïdes, tanins, polyphénols, stéroïdes et triterpènes étaient les groupes chimiques majoritaires. Comme il a été mentionné dans la synthèse bibliographique, les crotalaires possèdent un groupe d’alcaloïdes spécifiques appelés alcaloïdes pyrrolizidine (AP). Selon L’Etang (2012), les AP peuvent être localisés dans toute la partie aérienne de la plante mais majoritairement dans les graines. Dans le cas de C. bernieri, les alcaloïdes étaient présents uniquement dans les extraits des feuilles et des cosses. Ceci porte à penser que C. bernieri serait une des espèces ne contenant pas des AP dans les graines. C’est le cas par exemple de C. australis, C. maxillaris, et C. sphaerocarpa (Williams et Molyneux, 1987). Toutefois, nos résultats ne nous permettent pas de préciser la nature des alcaloïdes détectés dans les extraits de C. bernieri. Des investigations plus poussées seraient encore nécessaires afin de déterminer s’ils appartiennent à la famille des AP ou à d’autres familles d’alcaloïdes.

D’autre part, de nombreux travaux approfondis ont permis de découvrir la présence d’acides aminés chez le genre Crotalaria (Suri et al., 1975 ; Quereshi et al., 1977 ; Pilbeam et Bell, 1979 ; Brink, 2015). Leur détection dans les feuilles, graines et cosses de C. bernieri confirme ces résultats. Selon Bell (2003), ces acides aminés se trouvent naturellement dans les différentes parties des crotalaires, à savoir les graines, les racines, les tiges et les feuilles et jouent un rôle dans la protection contre les prédateurs, les agents pathogènes, voire dans la compétition vis-à-vis d'autres plantes. Ces acides aminés possèdent également des propriétés biologiques intéressantes à savoir, antimicrobiennes (Zimmerli et al., 2001 ; Borthakur et Soedarjo , 2003) ; antioxydantes (Prasad, et al., 2013) ; insecticides (Rosenthal, 2001 ; Mitri et al., 2009) ; nématicides (Oka et al.,1999), etc.

Il faut noter que la présente étude s’est principalement focalisée sur les alcaloïdes constituant les composés majoritaires des feuilles. Ce choix a été dicté par le fait que cet organe était le plus disponible en quantité suffisante et les études préliminaires ont révélé qu’il est doué de propriétés biologiques intéressantes. Les alcaloïdes pourraient donc être les molécules responsables de ces activités. Cette prédominance des alcaloïdes nous a alors conduits à les extraire des feuilles de C. bernieri.

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Etude chimique

D’après les analyses par CCM et RMN, la partition de la phase aqueuse par le n- butanol a permis de séparer les composés selon leur polarité : les tanins et les polyphénols qui contaminaient les alcaloïdes totaux ont été éliminés dans la phase aqueuse tandis que les alcaloïdes, les flavonoïdes et autres contaminants moins polaires étaient déplacés dans la phase butanolique toxique (EAT). La purification des alcaloïdes est complexe à cause de leur polarité. Il nous a alors fallu utiliser plusieurs méthodes chromatographiques pour les séparer des autres composés présents dans l’EAT. Chacune de celles-ci a fait l’objet d’une mise au point rigoureuse consistant à essayer plusieurs techniques de purification avant d’adopter celle qui était la plus performante en termes de toxicité de l’extrait obtenu et de rendement en toxine(s). Dans un premier temps, la chromatographie sur gel Sephadex® LH-20 a été adoptée afin de séparer les alcaloïdes en fonction de leur poids moléculaire. Dans cette méthode, plusieurs phénomènes peuvent intervenir dans la séparation de molécules, à savoir : le phénomène d’exclusion stérique (séparation par poids moléculaire), la rétention des molécules aromatiques sur le support (séparation par adsorption) et l’affinité des molécules polaires pour le gel (séparation par partition) (Audigie, 1982). Cette méthode s’est montrée efficace pour la purification de l’EAT car les alcaloïdes et les flavonoïdes ont été bien séparés. En outre, la toxicité de l’extrait a été maintenue. Dans un deuxième temps, la chromatographie sur gel de silice RP8, une méthode basée sur l’adsorption, a été ensuite utilisée pour séparer les mélanges d’alcaloïdes en fonction de leur polarité. Le gel de silice RP8 permet une bonne résolution des composés très polaires. En plus, de nombreux auteurs ont recours à son utilisation pour la séparation des alcaloïdes (Dinan et al., 2001 ; Dräger, 2002 ; Yuan et al., 2010). A l’issue de la purification de l’EAT, 3 composés, à savoir les composés C1, C2 et C3 ont été ainsi obtenus. A titre de comparaison, des flavonoïdes et triterpènes ont pu être isolés à l’état pur à partir de l’EMF de C. incana (Azam et al., 2013) et C. madurensis ( Magda et al., 2017) à l’aide de méthodes de purification identiques aux nôtres. Aussi, des alcaloïdes de type pyrrolizidine ont été isolés à partir de l’EMF de C. lachnosema et de l’EMG de C. naragutensis (Mattocks et Nwude, 1988) à l’aide de techniques de purification similaires mais leur protocole comportait plus d’étapes, parmi lesquelles figuraient des techniques de pointe telles que la GC-MS, ou celle sur silice spécifique (colonne capillaire WCOT : wall coated upon tubular column). A priori, la structure des composés C1, C2 et C3 reste encore à déterminer, ce qui permettra de conclure s’il s’agit des mêmes composés ou de produits différents. Mais d’un autre

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Etude chimique côté, le caractère natif de l’Ile de C. bernieri autorise à émettre l’hypothèse de la présence de structures originales dans ses extraits. Toutefois, certaines des fractions que nous avons obtenues lors du fractionnement de l’EAT n’ont pas pu encore être étudiées. Par conséquent, d’autres produits, connus ou nouveaux, pourraient encore être mis en évidence. C’est le cas par exemple :  des acides aminés et des flavonoïdes qui ont été détectés lors des criblages préliminaires. Notons que ces composés possèdent des activités biologiques intéressantes chez le genre Crotalaria (Pilbeam et Bell, 1979 ; Brink, 2015) ;  des fractions obtenues par HPLC dont l’étude n’a pas abouti à l’isolement de molécules mais a permis d’avancer l’hypothèse de la présence d’un composé majoritaire complexe (pic majoritaire), à rapprocher peut être des alcaloïdes de type pyrrolyzidine.

En guise de conclusion, les procédés d’extraction et de purification réalisés à partir de différents organes de la plante ont permis d’obtenir trois composés homogènes notés C1, C2 et C3 ainsi que divers extraits bruts et partiellement purifiés (tableau 17) qui vont être utilisés pour les études biologiques.

Tableau 17 : Liste des différents extraits bruts et partiellement purifiés utilisés pour les tests biologiques

Organes Extraits Abréviation Type d’extraits Graines EHG, EAG, EMG Extraits hexanique, acétate d’éthyle Cosses EHC, EAC, EMC et méthanolique Racines EHR, EAR, EMR Extraits bruts Extraits hexanique, acétate d’éthyle EHF, EAF, EMF et méthanolique Extrait d’alcaloïdes totaux EAT Extrait non alcaloïdes totaux nEAT Fractions obtenues après Feuilles Fractions chromatographie de l’extrait EAT sur AT à AT 2 5 partiellement colonne de gel de Sephadex LH-20. purifiées Fractions obtenues après chromatographie de la fraction AT2 AT2a à AT2c sur colonne de gel de Silice RP8

 Sur les animaux, tous les extraits ont été testés sauf les extraits bruts hexanique et acétate d’éthyle.  Sur les microorganismes, tous les extraits du tableau ci-dessus ont été testés.

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CHAPITRE 2

Détermination structurale des composés isolés

Détermination structurale

2.1. INTRODUCTION

Ce second chapitre décrit la détermination structurale des trois composés isolés à partir des feuilles de C. bernieri par le biais d’analyses en spectrométrie de masse (SM) et en spectroscopie RMN.

2.2. MATERIELS ET METHODES 2.2.1. ACTIVITE OPTIQUE (Rakotobe, 2009 ; Razafintsalama, 2012)

Les pouvoirs rotatoires des produits sont mesurés à l’aide d’un polarimètre de type PERKIN-ELMER 341, à la longueur d’onde de la raie D du sodium (λ = 589 nm). Les échantillons analysés sont solubilisés dans du MeOH à une concentration c (g/l) et versés dans une cuve de 0,3 ml et de 1 dm de longueur (l). L’angle de rotation α de la lumière polarisée provoquée par le produit dissous est mesuré à la température ambiante.

Le pouvoir rotatoire spécifique [α]D, exprimé en degrés, est calculé à partir de la formule suivante : 1000. α [α]D = 푙. 푐 avec : - c : concentration du produit (g/l), - l : longueur de la cuve de mesure (dm), - D : longueur d’onde du faisceau polarisé de la raie D du sodium (λ = 589 nm), - α : angle de rotation optique observé en degrés (valeur lue sur le polarimètre).

2.2.2. SPECTROMETRIE DE MASSE (Bruins, 1998 ; Ho et al., 2003)

Cette technique donne des informations telles que le poids moléculaires par la fragmentation d’un composé. Les molécules d'intérêt sont introduites dans la source d'ionisation du spectromètre de masse, où elles sont alors ionisées pour acquérir des charges positives ou négatives. Les ions se déplacent ensuite à travers l'analyseur de masse, puis entrent en contact avec le détecteur qui est relié à un système informatique. L'ordinateur affiche graphiquement un spectre de masse montrant l'abondance relative des signaux en fonction de leur rapport m/z (m étant la masse et z la charge de l’ion produit).

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Détermination structurale

L’ionisation d’une molécule peut être obtenue par différents procédés mais la méthode d’ionisation par électrospray ou électronébulisation (ESI) a été utilisée. Elle permet d’obtenir des ions non fragmentés, protonés de type [M+H]+ en mode positif ou des ions déprotonés de type [M-H]- en mode négatif. L’analyseur à temps de vol ((TOF) : Time of Flight) permet la séparation des ions, uniquement en fonction de l’énergie cinétique acquise après l’accélération dans le champ électrique. La distance parcourue est fonction de m. Les spectres de masse ont été enregistrés en modes positifs et négatifs sur un appareil Maxis II, Brüker®, France. Il s'agit d'un QTOF (Quadripole-Time of Flight) à haute résolution avec une source ESI. Les données ainsi obtenues permettent de calculer la masse moléculaire d’une molécule d’intérêt et d’en déduire sa formule brute. La spectrométrie de masse en tandem ou mode MS/MS, consiste à sélectionner un ion par une première spectrométrie de masse, à le fragmenter, puis à effectuer une deuxième spectrométrie de masse sur les fragments ainsi générés.

2.2.3. SPECTROMETRIE RMN (Günther, 1994 ; Massiot et Lavaud, 1995)

La résonance magnétique nucléaire (RMN) est la méthode la plus efficace pour élucider la structure d’une molécule. Elle est fondée sur les propriétés magnétiques que possèdent certains noyaux présentant une rotation nucléaire (spin). Dans des conditions appropriées, en présence d’un champ magnétique intense, ces noyaux entrent en résonance. La fréquence de résonance correspondante dépend de l’élément considéré, de son environnement électronique et du champ magnétique appliqué. Cette fréquence est traduite en termes de déplacement chimique δ (exprimé en ppm) par rapport à un produit de référence qui est le tétraméthylsilane (Si(CH3)4, TMS). Des informations sur la constante de couplage J (exprimée en Hz) sont également fournies.

Les spectres RMN ont été enregistrés sur un spectromètre Brüker Avance III HD 400 et 600 MHz (Wissembourg, France) équipé d’un système BBFO Plus SmartProbe et d’une triple résonance inverse CryoProbe (TCI). La fréquence de fonctionnement de l’appareil est de 400,13 et 600,19 MHz pour les protons 1H, et 150,92 MHz pour les carbones 13C.

Les échantillons sont d’abord solubilisés dans les solvants deutérés CD3OD, DMSO- d6 dans des tubes analytiques de 5 mm de diamètre. Par conséquent, les déplacements chimiques des carbones δC (en ppm) sont mesurés par rapport à la raie centrale du solvant utilisé.

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Détermination structurale

Les données RMN sont enregistrées sous forme d’expériences monodimensionnelles (spectres à une dimension ou RMN 1D) et bidimensionnelles (spectres à deux dimensions ou RMN 2D).

2.2.3.1. LES SPECTRES MONODIMENSIONNELS (1D)

Le spectre RMN 1H donne des informations sur les déplacements chimiques du proton (δH) permettant ainsi de déterminer les régions du spectre caractéristiques de certains groupements chimiques (ou sites protoniques). L’intensité du signal ainsi que celle de la courbe d’intégration sont proportionnelles au nombre de protons représentés par le pic donné.

Le spectre RMN 13C J-modulé permet d’observer directement les groupes fonctionnels contenant les carbones et d’en déduire leur nombre et leurs déplacements chimiques (δC). Ce spectre permet également de distinguer les carbones secondaires et quaternaires des carbones primaires et tertiaires.

2.2.3.2. LES SPECTRES BIDIMENSIONNELS (2D)

Les spectres monodimensionnels des composés donnent des signaux qui se chevauchent, ce qui complique leur interprétation. Par contre, le couplage interatomique qui est visible par l’analyse des spectres bidimensionnels permet d’élucider aisément la structure chimique du composé.

Les spectres à deux dimensions donnent plus d’informations, particulièrement sur la structure des molécules trop complexes à étudier à l'aide de la spectroscopie 1D.

 Le spectre HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) met en évidence les 1 corrélations entre les protons et les carbones directement liés entre eux ( JH-C). Il permet donc de distinguer les carbones protonés des carbones quaternaires.  Le spectre HMBC (Heteronuclear Multiple-Bound Correlation) détecte les corrélations entre protons et carbones à longue distance, c’est-à-dire à travers 2 3 4 plusieurs liaisons (couplage JC-H ou JC-H parfois même JC-H). Elle complète le COSY pour l’établissement de l’enchaînement des atomes d’une molécule.  Le spectre COSY (COrrelated SpectroscopY) permet de mettre en évidence 2 3 l’existence des couplages géminaux JH-H et les couplages vicinaux JH-H entre les protons voisins et ceux qui sont adjacents (protons séparés par deux ou trois liaisons). Cette expérience permet également de déterminer des fragments de structure.

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Détermination structurale

 Le spectre NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) met en évidence les couplages dipolaires (corrélations des protons proches dans l’espace). En effet, cette expérience fournit des informations stéréochimiques ou spatiales permettant ainsi de vérifier la structure et de déterminer la configuration relative de la molécule.  Le spectre TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY) montre les corrélations de tous les protons ayant une forte valeur des constantes de couplages, d’un même système de spin.

2.3. RESULTATS ET DISCUSSION 2.3.1. STRUCTURE DU COMPOSE C1

Le composé C1 a été obtenu sous forme d’un solide amorphe. Son spectre de masse ESI-Q-TOF, en mode positif, montre l’ion moléculaire protoné [M+H]+ à m/z = 579,1685 et en mode négatif l’ion [M-H]- à m/z = 577,1553. Sa masse M est donc de 578,1619 correspondant

à la formule brute C27H30O14 (masse calculée : 578,1635). Sa fragmentation en mode MS/MS positive (figure 28) fait apparaître des ions fragments à m/z = 433, 415, 397, 379, 367, 337, 313 et 283. L’ion à m/z = 415 provient de la perte de 164 uma (unité masse atomique), attribuable à un rhamnose et celui à m/z = 433 provient de la perte de 146 uma, attribuable à un rhamnose moins une molécule d’eau.

Figure 28 : Spectre de masse du composé C1 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 579

La formule brute indique 13 degrés d’insaturation. Comme le spectre de RMN 13C indique la présence de 8 doubles liaisons, le composé C1 comporte donc 5 cycles.

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Détermination structurale

1 Le spectre de RMN H en solution dans le DMSO-d6 (voir Annexe 4) présente 6

protons aromatiques, deux à H 6,757 et 6,199 ppm sous forme de singulets et quatre autres à

H 8,025 et 6,882 avec l’aspect caractéristique d’un noyau benzénique para-disubstitué. Dans

la zone H 5,095-2,900 ppm sont observés les signaux de 11 protons caractéristiques de protons liés à des carbones portant un atome d’oxygène. Les protons d’un méthine (CH) et d’un méthyle

(CH3) sont observés respectivement à H 2,136 et 0,465 ppm (tableau 18). Enfin le spectre

présente les signaux de 9 protons hydroxyliques entre H 4,000 et 13,200 ppm. Le déplacement

chimique de celui à H 13,125 ppm indique qu’il est fortement chélaté.

Le spectre de RMN 13C montre les signaux des 27 atomes de carbone de la molécule

répartis en un carbonyle à C 181,9 ppm et 14 atomes de carbone aromatiques ou éthyléniques

dont 5 sont porteurs d’un atome d’oxygène (à C 163,8 ; 161,2 ; 160,6 ; 155,8 et 155,8 ppm).

2 Les signaux de 11 carbones sp liés à un atome d’oxygène sont observés entre C 60 et 82 ppm

et celui d’un méthine acétalique l’est à C 100,3 en plus du méthyle à C 17,7 ppm (tableau 18).

Tableau 18 : Données de RMN du composé C1 dans DMSO-d6 et CD3OD (298 K, 1H 600,19 MHz ; 13C 150,92 MHz)

DMSO-d6 CD3OD

Position C δH ; multiplet ; J (Hz) HMBC Position C δH ; multiplet ; J (Hz)

C-2 163,8 - A1,2/ D C-2 166,7 - CH-3 102,3 C = 6,757 s CH-3 103,6 C = 6,603 s CO-4 181,9 - C CO-4 184,1 - C-4a 103,7 - C/ D C-4a 106,0 - C-5 160,6 - D/ (OH-5) C-5 162,7 - CH-6 98,4 D = 6,199 s CH-6 99,8 D = 6,279 s C-7 155,8 - F C-7 164,3 - C-8 104,5 - D/ F/ G C-8 105,7 - C-8a 155,8 - A1,2/ F C-8a 157,9 - C-1’ 121,6 - B1,2/ C C-1’ 123,5 - CH-2’ 128,9 A1 = 8,025 m 8,8 A2 CH-2’ 130,0 A1 = 7,987 m 8,9 CH-3’ 115,8 B1 = 6,882 m 8,8 B2 CH-3’ 117,0 B1 = 6,942 m 8,9 C-4’ 161,2 - A1,2/ B1,2 C-4’ 162,7 - CH-5’ 115,8 B2 = 6,882 m 8,8 B1 CH-5’ 117,0 B2 = 6,942 m 8,9 CH-6’ 128,9 A2 = 8,025 m 8,8 A1 CH-6’ 130,0 A2 = 7,987 m 8,9 CH Rha-1 100,3 E = 4,967 d 1,3 G CH Rha-1 102,5 E = 5,099 d 1,6 CH Rha-2 70,4 I = 3,563 sl CH Rha-2 72,2 I = 3,849 dd 3,2; 1,6 CH Rha-3 70,2 M= 3,084 dd 9,4; 2,9 E / I/ O CH Rha-3 72,0 M = 3,399 dd 9,6; 3,2 CH Rha-4 71,5 O = 2,900 dd 9,4; 9,2 I/ M/ Q /(P) CH Rha-4 73,5 O = 3,123 dd 9,4; 9,6 CH Rha-5 68,2 P = 2,136 dq 9,2; 6,2 E /O /Q CH Rha-5 70,0 P = 2,447 dq 9,4; 6,2 CH3 Rha-6 17,7 Q = 0,465 d 6,2 O/ L / H1,2 CH3 Rha-6 18,0 Q = 0,647 d 6,2 CH Glc-1 71,7 F = 4,764 d 10,0 G/ L CH Glc-1 73,7 F = 5,030 d 9,8

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Détermination structurale

Tableau 18 : Données de RMN du composé C1 dans DMSO-d6 et CD3OD (298 K, 1H 600,19 MHz ; 13C 150,92 MHz) (suite)

DMSO-d6 CD3OD

Position C δH ; multiplet ; J (Hz) HMBC Position C δH ; multiplet ; J (Hz) CH Glc-2 75,0 G = 4,045 ddd 10,0; 8,6 E/ F/ N CH Glc-2 78,1 G = 4,263 dd 9,8; 8,5 CH Glc-3 79,9 N = 3,422 dd 8,7; 8,6 F/ G/ K/ CH Glc-3 81,6 N = 3,640 m CH Glc-4 70,6 K = 3,376 dd 9,2; 8,7 L/ H CH Glc-4 72,4 K = 3,638 m CH Glc-5 81,8 L = 3,225 ddd 9,2; 5,7; 1,9 N CH Glc-5 82,8 L = 3,454 m CH2 Glc-6 61,1 H1 = 3,753 dl 11,5 F/ K CH2 Glc-6 63,0 H1 = 3,971 dd 12,1; 2,0 - - H2 = 3,510 dd 11,5; 5,7 K/ L - - H2 = 3,797 dd 12,1; 6,0 OH-5 - 13,125 sl OH-7 - 10,566 sl OH-4’ - 10,566 sl OH Rha-2 - 4,396 sl OH Rha-3 - 4,622 sl OH Rha-4 - 4,396 sl OH Glc-3 - 5,226 sl OH Glc-4 - 5,095 sl OH Glc-6 - 4,312 sl

L’analyse du spectre COSY qui met en évidence les corrélations des protons couplés entre eux, permet de définir les trois sous-structures A, B, C suivantes :

 Sous-structure A

6 Le méthyle à H 0,465 ppm ( CH3) est couplé avec le proton à 2,136 ppm, lui-même avec celui à 2,900 ppm qui est couplé avec celui à 3,084, celui-ci avec le proton à 3,563 et ce dernier avec le proton à 4,967 ppm (-1CH(O)-). Ces données permettent de définir une sous-

structure A. Ces protons sont respectivement liés aux carbones à C 17,7 ; 68,2 ; 71,5 ; 70,2 ; 70,4 et 100,3 ppm.

6 5 4 3 2 1 CH3- CH(O)- CH(O)- CH(O)- CH(O)- CH(O)-

Le spectre HMBC (voir Annexe 4) montre une séquence de corrélations confirmant l’enchaînement déduit du COSY (Figure 29, page 93). Des corrélations HMBC intenses sont observées entre H-5 et C-1 et entre H-1 et C-5 (Rha) permettant de cycliser cet enchaînement A via un atome d’oxygène (CH5-O-CH1), pour former une structure cyclique qui correspond à 3 celle du rhamnose (Rha). Les constantes de couplage vicinal JH-H entre H-5 et H-4 et entre H- 4 et H-3, de 9,4 Hz chacune, indiquent une disposition trans-diaxiale de ces trois protons. La 3 constante de couplage JH-H entre H-3 et H-2 (2,3 Hz) indique une disposition relative

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Détermination structurale axiale/équatoriale et celle entre H-2 et H-1 de 1,2 Hz une disposition trans-diaxiale. L’ensemble indique que cette sous-structure est une unité rhamnose (Figure 29). Ce point est confirmé par l’analyse des effets NOE (Nuclear Overhauser Effect) intenses entre H-5 et H-3, entre H-3 et

H-2 et entre H-4 et CH3-6. La petite constante de couplage observée pour H-1 suggère qu’il est en position  du rhamnose. L’ensemble de ces données conduit ainsi à dire que le composé C1 contient un groupement -rhamnosyle.

 

-L- rhamnopyranose

3 Figure 29 : Sous-structure A. Corrélations COSY et couplages JH-H (Hz)

 Sous-structure B

L’analyse du spectre COSY permet également de définir une sous-structure B (Figure

6 30, page 94) par la suite des corrélations partant du méthylèneoxy (- CH2-OH) à H 3,753 et

1 3,510 ppm pour aboutir au méthinoxy ( CH(O)-) à H 4,767 ppm :

6 5 4 3 2 1 CH2(OH)- CH(O)- CH(O)- CH(O)- CH(O)- CH(O)-

Les corrélations entre protons et carbones du spectre HMBC confirment cette séquence et celles observées entre H-1 et C-5 d’une part et entre H-5 et C-1 d’autre part, permettent de cycliser cet enchaînement B pour former un hétérocycle à 6 atomes, dont un oxygène. Il s’agit ici encore d’un pyranose. Les données de RMN, les déplacements chimiques H et C et tout particulièrement les 3 constantes de couplage JH-H permettent d’identifier cette sous-structure B comme étant un - 3 glucose : les valeurs fortes des constantes de couplage JH-H (entre 8,6 et 10,0 Hz) pour tous les protons, de H-1 à H-5 sont indicatives de leur position respective trans-diaxiale, comme dans le glucose. Ce point est confirmé par l’analyse des effets NOE dans le spectre NOESY. Des corrélations intenses sont observées entre H-3 et à la fois H-1 et H-5 indiquent leur situation sur la même face du cycle pyranose.

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Détermination structurale

3 La forte valeur de la constante de couplage de H-1 ( JH-H = 10,0 Hz) indique que le cycle est en position trans-diaxiale et qu’il s’agit d’un -glycoside (Figure 30). Enfin, la valeur de son déplacement chimique (C = 4,764 ppm) comme celle du carbone auquel il est fixé

(C = 71,7 ppm) indique que le composé C1 est un C-glycoside et non un O-glycoside.

β-D-glucopyranose

3 Figure 30 : Sous-structure B Corrélations COSY et couplages JH-H (Hz)

 Sous-structure C

L’analyse de la région aromatique permet de mettre en évidence 15 atomes de carbone caractérisant une structure de flavone. Outre le système benzénique para-disubstitué impliquant les protons à H 8,025 et 6,882 ppm et les deux protons aromatiques singulets à H 6,757 et

6,199 ppm, trois protons de phénols sont observés, l’un à H 13,125 ppm caractéristique d’un OH fortement chélaté, indiquant un groupe phénol en position -5 d’une flavone et les deux autres formant des signaux larges à H = 10,566 ppm.

L’analyse du spectre HMBC de cette partie flavonique montre des corrélations entre le carbone à C 161,2 ppm et les protons à 8,025 ppm et celui à C 121,6 avec les protons à 6,882 ppm, ce qui les fixe respectivement en position -4’ et -1’ du cycle benzénique para- disubstitué. Elle permet ainsi de construire un cycle chromone dihydroxylé sur les positions -5 et -7 et aussi de montrer que la position -8 est substituée. Les corrélations du carbone C-1’ avec à la fois les protons en 3’ et 5’ et aussi avec le proton en -3 d’une part et les corrélations du carbone C-2 avec les protons en 2’ et 6’ permettent de fixer le cycle benzénique en position -2. Ces éléments permettent de caractériser une structure trihydroxy-5,7,4’-flavone (ou apigénine) substituée en -8 (Figure 31, page 95).

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Détermination structurale

Figure 31 : Sous-structure C

 Assemblage des sous-structures A, B et C

Les fortes corrélations HMBC observées entre Rha H-1 et Glc C-2 et de Glc H-2 avec Rha C-1 permettent de lier les deux sous-structures glycosidiques A et B comme indiqué sur la Figure 32, en reliant ces deux positions par une liaison osidique pour former le rhamnosyl-(1- >2)-glucose. De plus le spectre NOESY montre une corrélation entre Rha H-1 et Glc H-2 qui confirme cet enchaînement.

Sur le spectre HMBC, les carbones C-8a et C-7 sont fortement corrélés avec Glc H-1.

Nous avons vu que le déplacement chimique du carbone Glc C-1 est de C 71,7 et non environ

C 100 ppm, il est donc lié à la position C-8 de la flavone par une liaison carbone-carbone : le composé C1 est donc un C-glycoside (Figure 32).

Figure 32 : Assemblage des sous-structures A, B et C et les corrélations observées sur les spectres de RMN 2D, COSY et HMBC

-95-

Détermination structurale

Le spectre NOESY confirme le positionnement du glycoside en C-8 de la flavone. Les protons aromatiques 2’ et 6’ sont corrélés non seulement aux protons H-3, H-3’ et H-5’ de la flavone, mais aussi aux protons H-2, H-4, H2-6 du glucose et plus faiblement à H-1, H-3 et H- 5. Si le glycoside avait été lié à la position -6 de la flavone avec un proton en -6, ces corrélations n’auraient pas été observées à cause des distances trop grandes. Toutes ces données conduisent à proposer la structure suivante pour le composé C1, qui apparaît comme étant l’apigénine-8-C--rhamnopyranosyl-(1->2)--glucopyranoside ou 2''-O--rhamnoside vitexine (figure 33).

C27H30O14 = 578,163

Figure 33 : Structure du composé C1 : apigénine-8-C--rhamnopyranosyl-(1->2)-- glucopyranoside ou 2''-O--rhamnoside vitexine

-96-

Détermination structurale

2.3.2. STRUCTURE DU COMPOSE C2

Le composé C2 a été isolé sous forme d’un solide amorphe. Son spectre de masse ESI- Q-TOF, en mode positif, montre un ion moléculaire protoné [M+H]+ à m/z = 199,1914. Sa masse M est donc de 198,1836 correspondant à la formule brute C10H22N4 (masse calculée : 198,1844) impliquant deux degrés d’insaturation. Sa fragmentation en mode MS/MS positive (figure 34) fait apparaître des ions fragments à m/z = 182,1654 ; 114,1044 ; 97,0765 ; 89,1073 et 42,0804.

Figure 34 : Spectre de masse du composé C2 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 199

13 Dans le spectre de C RMN en solution dans le DMSO-d6 (voir Annexe 4), les dix atomes de carbone de la formule brute se répartissent en deux méthyles à C 25,3 et 17,8 ppm, quatre méthylènes à 25,3 ; 38,8 ; 39,0 et 40,4 ppm, un méthine éthylénique (-CH=C) à C 119,3

2 et deux carbones quaternaires sp à C 135,8 et 155,6 ppm. Comme ce spectre indique la présence de deux doubles liaisons qui rendent compte des deux degrés d’insaturation : la molécule ne comporte donc pas de cycle. L’analyse des données du spectre HSQC permet ainsi d’identifier les atomes d’hydrogène auxquels les carbones sont liés (tableau 19, page 98).

-97-

Détermination structurale

Tableau 19 : Données de RMN du composé C2 en solution dans DMSO-d6 et CD3OD (298 K, 1H 600,19 MHz ; 13C 150,92 MHz)

DMSO-d6 CD3OD Position C δH mult. J (Hz) Position C δH mult. J (Hz) C-1’’ 155,6 - C-1’’ 157,4 - C-3’ 135,8 - C-3’ 139,2 - CH-2’ 119,3 a = 5,170 th 6,6 ; 1,4 CH-2’ 119,3 a = 5,258 th 6,6 ; 06 CH2-1 40,4 c1,2 = 3,115 brt 6,6 CH2-1 42,0 c1,2 = 3,256 t 6,8 CH2-4 39,0 d1,2 = 2,707 brt 6,6 CH2-1’ 40,5 b1,2 = 3,801 dh 6,6 ; 0,6 CH2-1’ 38,8 b1,2 = 3,711 brd 6,6 CH2-4 40,4 d1,2 = 2,962 t 7,2 CH2-2 25,6 g1,2 = 1,499 m CH2-2 27,0 h1,2 = 1,680 m CH2-3 25,6 h1,2 = 1,499 m CH2-3 26,0 g1,2 = 1,716 m CH3-4’ 25,3 e = 1,695 brd 1,0 CH3-4’ 25,7 e = 1,778 brqt 1,2 ; 0,6 CH3-5’ 17,8 f = 1,634 brd 1,0 CH3-5’ 18,0 f = 1,727 brqt 1,2 ; 0,6 5 NH - 5 H = 7,362 brs

L’examen du spectre COSY permet de définir trois sous-structures : A, B et C (figure 35) et deux enchaînements :

 l’un partant du méthylène à H 3,712 ppm (C 38,8) dont les déplacements chimiques (proton et carbone) indiquent qu’il est lié à un atome d’azote, correspond à

un groupe diméthylallyle (>N-CH2-CH=C(CH3)2) (Figure 35, sous-structure C) ;

 le second partant du méthylène à H 3,115 ppm (C 40,4) indique la présence d’une chaîne linéaire de quatre méthylènes, ceux aux deux bouts étant liés à un atome

d’azote: >N- CH2- CH2- CH2- CH2-N< (Figure 35, sous-structure A). Les deux -CH2- centraux de cette chaîne di-amino-n-butane étant confondus, les spectres de RMN du

composé C2 ont été enregistrés dans le méthanol (CD3OD) où ces atomes sont distingués (tableau 19) et dont l’analyse confirme les hypothèses précédentes ;

 enfin, le carbone restant à C 155,6 ppm est caractéristique d’un groupe guanidine :

(-N-)2C=NH (Figure 35, sous-structure B).

A B C

Figure 35: Sous-structure A, B, C déduites de l’analyse des spectres de RMN 1D ; 2D COSY et HSQC du composé C2

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Détermination structurale

 Assemblage des sous-structures A, B et C

L’analyse du spectre HMBC (Figure 36) a permis l’assemblage des sous-structures A,

B et C. Le carbone à C 155,6 ppm est corrélé aux deux méthylènes : celui à H 3,712 ppm (C

38,8) et celui àH 3,115 ppm (C 40,4), via un atome d’azote conduisant ainsi à la structure de la figure 37 (page 100) pour le composé C2. Les cinq protons mobiles à H 7,362ppm sont liés aux atomes d’azote comme indiqué sur cette figure.

Dans le spectre NOESY, les corrélations des deux méthyles, celui à H 1,695 (CH3-

4’) avec le proton à H 5,170 (H-2’) et l’autre àH 1,634 (CH3-5’) avec le méthylène àH 3,712

(CH2-1’) permet d’attribuer les deux méthyles sur la double liaison du groupe diméthylallyle à

C 25,3 (CH3-4’) et 17,8 (CH3-5’) ppm. Toutes ces conclusions ont été vérifiées sur les spectres de RMN enregistrés dans le méthanol tétradeutérié (CD3OD), où les deux méthylènes de la chaine di-amino-n-butane sont distingués (Tableau 19 ; page 98).

Le composé C2 est donc un alcaloïde dérivé de la guanidine formé par la substitution de l’un de ses atomes d’azote, à la fois par un groupe diméthylallyle et par une chaîne diamino- n-butyrique. Sa biosynthèse est expliquée par l’alkylation par l’isopentényl-diphosphate de l’azote en position -6 de l’arginine, suivie de la décarboxylation de son groupe acide carboxylique.

Figure 36 : Assemblage des sous-structures A, B, C par l’utilisation des corrélations HMBC

La structure du composé C2 a été identifiée comme étant celle de la N-(4- aminobutyl)-N-(3-méthyl-2butèn-1-yl)-guanidine ou sphaerophysine (figure 37, page 100).

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Détermination structurale

C10H22N4 = 198,1844

Figure 37 : Structure du composé C2 : N-(4-aminobutyl)-N-(3-méthyl- 2butèn-1-yl)-guanidine ou sphaerophysine

2.3.3. STRUCTURE DU COMPOSE C3

Le composé C3 a été obtenu sous forme d’un solide amorphe. Le spectre de masse ESI-Q-TOF réalisé en mode positif montre un ion moléculaire protoné [M+H]+ à m/z =

553,3246. Sa masse M est donc 552,3168 correspondant à la formule brute C28H40N8O2 (masse calculée : 552,3172). Un ion doublement chargé [M+2H]++ est observé à m/z = 277,1661. Il est caractérisé par la présence du pic isotopique dû au carbone 13, à m/z = 277,6665. Sa fragmentation en mode MS/MS positive présente des ions fragments à m/z = 536,2949 ; 511,2997 ; 277,1643 ; 260,1378 ; 235,1426 ; 218,1161 et 147, 0429 (figure 38).

Figure 38 : Spectre de masse du composé C3 : fragmentation par MS/MS de l’ion [M+H]+ à m/z = 536 1 13 Les spectres de RMN H et C enregistrés dans le DMSO-d6, comme dans le méthanol

CD3OD (Tableau 20 ; page 101) ne font apparaître que la moitié des protons et des atomes de -100-

Détermination structurale carbone de la formule brute, ce qui suggère que la molécule est symétrique. Ainsi, les spectres 1 13 de RMN H et C de composé C3 enregistré dans le DMSO-d6, renferment respectivement six carbones (Tableau 20) et quatre protons aromatiques caractéristiques d’un benzène para- disubstitué à H 6,658 et 7,018 ppm, ainsi qu’une fonction amide (-CO-NH-) dont le proton est observé à H 7,684 ppm et le carbonyle à C 170,7 ppm. On observe également deux méthines

(>CH-) à H 3,568 et 4,085 ppm (C 47,2 et 39,8 respectivement), quatre méthylènes (-CH2-) dont deux sont liés à un atome d’azote (vers C 40 ppm) et un carbone quaternaire à C 156,7 ppm attribuable à une guanidine.

L’analyse du spectre 1H-1H COSY met en évidence le couplage des deux méthines qui sont donc vicinales, et une séquence linéaire de quatre méthylènes formant une chaîne n-butyle dont les extrémités sont liées à un atome d’azote (>N- CH2- CH2- CH2- CH2-N<). Les liaisons directes (1J) entre protons et carbones sont déduites de l’analyse des corrélations du spectre HSQC. 1 Tableau 20 : Données de RMN du composé C3 (DMSO-d6, 298 K, H 600,19 MHz ; 13C 150,92 MHz)

DMSO-d6 CD3OD Position C δH mult. J (Hz) Position C δH mult. J (Hz) CO-1’ 170,7 - CO-1’ 174,0 - C-6 156,7 - C-6 158,5 - C-7’ 155,7 - C-7’ 157,3 - C-4’ 130,5 - C-4’ 131,8 - (CH)-5’ 128,7 d = 7,018 m 8,6 (CH)-5’ 130,2 d = 7,166 m 8,6 (CH)-9’ 128,7 d’ = 7,018 m 8,6 (CH)-9’ 130,2 d’= 7,166 m 8,6 (CH)-6’ 114,6 e = 6,658 m 8,6 (CH)-6’ 116,0 e = 6,737 m 8,6 (CH)-8’ 114,6 e’ = 6,658 m 8,6 (CH)-8’ 116,0 e’ = 6,737 m 8,6 CH-2’ 47,2 g = 3,568 dd 10,2; 7,2 CH-2’ 49,6 g = 3,735 dd 10,3; 7,2 CH2-4 40,3 i1 = 2,930 dt 6,1; 6,8 CH2-4 42,1 i1 = 3,011 dt 6,1; 6,8 CH2-4 - i2 = 2,930 dt 6,1; 6,8 CH2-4 - i2 = 3,011 dt 6,1; 6,8 CH-3’ 39,8 f = 4,085 dd 10,2; 7,2 CH-3’ 41,8 f = 4,296 dd 10,3; 7,2 CH2-1 37,6 j = 2,848 m CH2-1 39,3 j = 3,078 ddd 13,6; 6,2; 6,2 CH2-1 - k = 2,711 m CH2-1 - k= 2,818 ddd 13,6; 6,1; 6,1 CH2-2 26,2 m1,2 = 1,068 m CH2-2 27,7 m1,2 = 1,174 m CH2-3 25,7 l1,2 = 1,127 m CH2-3 26,7 l1,2 = 1,198 m OH (7’) - a = 9,200 s NH-CO - b = 7,684 dd 5,8; 5,8 NH-5 - c = 7,513 dd 5,6; 5,6

L’analyse du spectre HMBC qui met en évidence les corrélations à deux (2J) ou trois liaisons (3J) entre protons et atomes de carbone, permet de relier entre elles les sous-structures

-101-

Détermination structurale

ainsi définies (Figure 39). Les protons à H 7,018 ppm sont corrélés avec le carbone à C 155,7 ppm (tableau 20, page 101) dont le déplacement chimique correspond à celui d’un carbone phénolique. Le carbone quaternaire aromatique à C 130,5 ppm (tableau 20, page 101) est lui,

3 2 3 fortement corrélé aux protons à H 6,658 ( J) à 4,085 ( J) et à 3,568 ( J). Le carbonyle à C

3 170,7 ppm est corrélé ( J) avec les protons à H 4,085 (CH-3’), 3,568 (CH-2’), 7,684 (NH amide) et 2,711 et 2,848 (CH2-1). Enfin le carbone du groupe guanidine à C 156,7 ppm est corrélé avec les protons à H 7,513 (NH-5) et 2,930 (CH2-4).

A B C D

Figure 39 : Eléments de structure A, B, C et D déduits des données des spectres COSY et HSQC

L’ensemble de ces considérations aboutit à la sous-structure de la figure 40 (page 103), qui utilise tous les atomes repérés en RMN, mais qui ne rend compte que de la moitié des atomes de la formule brute (C14). Cette sous-structure comporte cinq doubles liaisons et un cycle et si on la double, elle ne rend compte que de 12 degrés d’insaturation. Or la formule brute indique 13 degrés d’insaturation. Comme il n’y a pas d’autres carbones sp2 possibles, donc pas d’autres doubles liaisons, la molécule doit comporter un cycle supplémentaire. Comme les carbones C- 2’ et C-3’ont encore chacun une liaison disponible, il convient de les relier pour former un 2 cyclobutane. De plus, le spectre HMBC montre que le carbone à C 39,8 (CH-3’) est corrélé J (ou 3J) avec le proton auquel il est directement lié (2J), et il en est de même avec le carbone à

C 47,2 (CH-2’), ce qui suggère une symétrie dans la molécule.

Enfin, les déplacements chimiques des protons et des atomes de carbone de ce cyclobutane du tableau 20 (page 101) sont cohérents avec ceux observés dans les cycles à quatre chaînons (Carmignani, 1999 ; Al Khdhairawi, 2017).

Cependant, il y a deux façons de former ce cycle à partir de la sous-structure en C14, en la doublant de façon parallèle (A) ou antiparallèle (B) (Figure 41, page 103).

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Détermination structurale

Figure 40 : Assemblage des éléments de structure A, B, C et D grâce aux corrélations HMBC

A B

Figure 41 : Modes d’assemblage parallèle (A) et antiparallèle (B) de la sous-structure en C14

C’est par le calcul des constantes de couplage entre (CH-2’) et (CH-3’) que la formule correcte a été déterminée. Les constantes de couplage observées sont présentées sur la figure 42 (page 104). Elles ont été calculées dans les deux configurations afin de voir celle qui correspond au spectre expérimental :  dans la structure parallèle (A), H-2’ est à la fois à 2 et 3 liaisons (2J et 3J) de H-3’ et donne donc deux constantes de couplage avec ce dernier (J = 7,2 et 10,2 Hz) et réciproquement H-3’ à la fois à 2 et 3 liaisons de H-2’ donne les mêmes couplages.  Dans la structure antiparallèle (B), H-2’ est vicinal (3 liaisons, ou 3J) de H-3’ et forme un triplet avec une seule constante de couplage (Figures 42 et 43, page 104).

-103-

Détermination structurale

A B

Figure 42 : Couplage entre les protons H-2’ et H-3’ dans les assemblages parallèle (A) et antiparallèle (B)

A A’

B B’

Figure 43 : Spectres RMN 1H calculés pour les assemblages : parallèle (A) et antiparallèle (B)

A’ et B’ : agrandissement de la partie 3-4 ppm. (CD3OD ; 600,19 MHz)

Les résultats expérimentaux montrent que le composé C3 est un dimère de la sous- structure de la figure 40 (page 103) où les deux chaînes en C14 sont parallèles. Il s’agit d’un alcaloïde dérivé de la guanidine et sa structure est donc celle donnée sur la figure 44 (page 104).

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Détermination structurale

Figure 44 : Structure du composé C3 : Cyclocrotalarine

Ce composé est original. Il n’est pas encore décrit dans la littérature et nous proposons de le nommer « cyclocrotalarine ». Ce nom est dicté par la présence du cyclobutane dans la structure et aussi par le nom de l’espèce Crotalaria.

2.4 DISCUSSION ET CONCLUSION

Grace aux différentes méthodes d’analyse spectrale, la structure des trois composés isolés des feuilles de C. bernieri a pu être déterminée comme étant respectivement la 2''-O-- rhamnoside vitexine, la sphaerophysine et la cyclocrotalarine.

Le premier composé (2''-O--rhamnoside vitexine) est un flavonoïde glycosidique appartenant au groupe des flavonols. Il a déjà été isolé de Podocarpus imbricatus (Podocarpaceae) (Gu et al., 1997) et des feuilles de Crataegus pinnatifida (Rosaceae) (Zhang et Xu, 2003). Il possède une activité antioxydante, une activité anti-apoptotique de la cellule adipeuse humaine (hADSCs) (Wei et al., 2014) et une propriété anticancéreuse (Ninfali et al., 2007). Il est largement utilisé dans le traitement des maladies du système cardiovasculaire (Wei et al., 2014). Le deuxième composé (sphaerophysine) est un alcaloïde dérivé de la guanidine. Il a d’abord été trouvé de Sphaerophysa salsula (Fabaceae) et sa structure déterminée par Birch et al. en 1957, puis révisée en 1970 par Heesing et Eckard. Enfin, Benn et al. (1996) ont isolé de Galega orientalis (Fabaceae) des composés apparentés. La sphaerophysine possède une propriété antibactérienne efficace contre Proteus vulgaris (Khramov, 1976) et une action

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Détermination structurale vasodilatatrice du système nerveux (Shvarev, 1960). Elle a également un effet hypotensif (Shvarev, 1958). La cyclocrotalarine est un nouvel alcaloïde guanidinique. Des substances apparentées

à la sous-structure en C14 avaient été précédemment isolées d’Albizzia julibrissin (Fabaceae), où elles jouent un rôle dans la fermeture des feuilles provoquée par l’obscurité ou mouvement nyctinastique (Ueda et al. 1997 ; 1999) et aussi comme facteur antifongique dans les semis d’orge (Stoessl 1965; Bird et al. 1985). Plusieurs dimères de cyclobutane ont aussi été isolés de différentes familles de plantes Asteraceae (Sagawa et al., 1997), Ginkgoaceae (Ma et al., 2016), Moraceae (Al-Khdhairawi et al. 2017) et Compositae (Carmignani et al. 1999). Ces trois types de composés n'ont jamais été trouvés dans les espèces de Crotalaria. A notre connaissance, ils ont été isolés pour la première fois du genre Crotalaria. Pourtant, un certain nombre de flavonoïdes glycosides ont été isolés des crotalaires dont par exemple :

 le 4' hydroxy flavone-7-O-rhamnoside isolé des fleurs de C. grahamiana, qui possède des propriétés antimicrobiennes et antiinflammatoires (Vanitha et al., 2012) ;  le 2',4',5,7-tetrahydroxyisoflavone, le 2',4',7-trihydroxyisoflavone, le 4',7- dihydroxyflavone et l’isovitexine isolés de toutes les parties de C. sessiliflora (Yoo et al., 2004).

Quant aux alcaloïdes dérivés de la guanidine, ils sont relativement rares et exceptionnels comme métabolites secondaires des plantes supérieures, car la plupart d’entre eux ont été isolés de nombreuses espèces d’éponges marines appartenant à différents genres Hemimycale, Monanchora, Batzella, Ptilocaulis (Croué, 2014). Cette première étude chimique approfondie sur C. bernieri a permis de révéler l’existence d’une molécule originale chez cette plante native de Madagascar, à l’instar des composés trouvés chez ses congénères africains (Awouafack et al., 2011), américains (Aronson, 2014) ou asiatiques (Azam et al., 2013). Elle a aussi permis de découvrir la présence de composés qui jusque là n’ont jamais été trouvés chez les crotalaires. Toutefois, ces produits purs ont été obtenus en trop faibles quantités pour pouvoir faire l’objet d’évaluations biologiques et toxicologiques. Leur préparation en quantité suffisante serait d’une importance capitale.

Les résultats de la présente étude chimique sont présentés dans les articles scientifiques (voir les détails en Annexe 5) ci-après :

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Détermination structurale

Article dans une revue internationale : Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Randrianarivo Hanitra Ranjàna, Victor Louis Jeannoda, Alain Blond, Bernard Bodo. Antimicrobial Guanidine Alkaloids from the Leaves of Crotalaria bernieri Baill. (En cours de soumission à Journal of Natural Products).

Communication affichée : Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Thomas Petit, Bernard Bodo, Lovarintsoa Judicaël Randriamampianina, Hanitra Ranjàna Randrianarivo, Victor Louis Jeannoda. Activité antimicrobienne des extraits de feuilles de Crotalaria bernieri : mise au point d’une alternative aux antibiotiques de synthèse. Salon de la recherche 4ème édition, 06 au 07 septembre 2018, Université d’Antananarivo.

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CHAPITRE 3

Etude des effets des extraits sur les animaux

Effets sur les animaux

3.1. INTRODUCTION

Dans le cadre des investigations biologiques sur la plante, l’étude de la toxicité sur les animaux était la première démarche que nous avons entreprise. L’objectif était d’abord de vérifier et évaluer cette toxicité sur la souris qui est le modèle standard, puis de rechercher d’autres activités ayant des applications possibles dans divers domaines comme l’agriculture, l’élevage ou la santé. Comme il a été annoncé plus haut (voir page 53, tableau 11), une toxicité sur souris a été mise en évidence dans les extraits de C. bernieri lors des expériences préliminaires. Aussi, pour mieux cerner et caractériser cette propriété toxique, nous avons procédé dans ce chapitre à :  l'évaluation de la toxicité aiguë et chronique sur souris incluant la description des

symptômes développés et la détermination de l’indice de toxicité DL50 ;  la localisation des sites d’action des principes actifs, par l’étude histopathologique d’organes de souris, ainsi que les effets sur les fonctions rénale et hépatique par la détermination des paramètres biochimiques (ALAT, ASAT créatinine et urée) ;  l’étude des effets de l’extrait sur d’autres animaux à sang chaud et à sang froid afin d’identifier les animaux sensibles et les précautions à prendre lors des utilisations éventuelles des extraits comme pesticides.

3.2. MATERIELS ET METHODES 3.2.1. MATERIELS 3.2.1.1. LES ANIMAUX D’EXPERIMENTATION 3.2.1.1.1. LES SOURIS (Mus musculus)

Les souris mâles et femelles, de race OF-1, pesant entre 20 et 30 g, proviennent de l’animalerie de l’Institut Pasteur de Madagascar (IPM). Elles sont placées dans des cages en plastique contenant des copeaux de bois. Les animaux disposent d’eau de robinet et de nourriture ad libitum. Leur litière est renouvelée toutes les semaines.

3.2.1.1.2. LES POUSSINS (Gallus gallus)

Les poussins d’élevage de race Hubbard âgés de 1 jour, ont été fournis par la société avicole AVITECH située à Mahazo (Antananarivo). Dès réception et tout au long des tests qui durent 24 h, ils sont placés dans des cartons bien chauffés à l’aide d’une ampoule électrique.

-108-

Effets sur les animaux

3.2.1.1.3. LES TETARDS DE GRENOUILLE (Ptychadena mascareniensis)

Les têtards sans pattes de grenouille ont été capturés dans les rizières situées aux alentours du Campus de l'Université d'Antananarivo (Ankatso). Ils sont placés dans un aquarium contenant de l’eau de rizière où ils sont adaptés pendant trois jours avant les tests.

3.2.1.1.4. LES ALEVINS DE POISSON (Cyprinus carpio)

Les alevins de poissons âgés d’une semaine ont été fournis par l’établissement « Maison de la ferme » sise à Ambohimangakely (Antananarivo). Pour mieux les adapter aux conditions du laboratoire, ils sont laissés séjourner pendant trois jours dans un aquarium aéré contenant de l’eau de source.

3.2.1.1.5. LES PUCES (Xenopsylla cheopis)

Les puces vectrices de la peste, collectées sur des rats capturés, proviennent de l’insectarium de l’Unité d’Entomologie de l’IPM. Elles sont élevées à une température fixée à 25°C et un taux d’humidité de 85 %, des conditions optimales strictes favorables à leur croissance et survie.

3.2.1.2. LES EXTRAITS UTILISÉS

Les différents extraits utilisés pour l’étude de la toxicité de C. bernieri sur les animaux sont ceux obtenus au cours de l’étude chimique (voir tableau 17, page 86). Notons que la grande majorité des travaux ont été réalisées avec l’extrait de feuilles, notamment l’EMF qui était le plus disponible en quantité.

3.2.2. METHODES 3.2.2.1. ETUDE DE LA TOXICITE AIGUE CHEZ LA SOURIS 3.2.2.1.1. VOIES D’ADMINISTRATION DES EXTRAITS 3.2.2.1.1.1. Administration par voie ip

L’injection est effectuée selon la méthode décrite au § 2.2.6.2 (page 38). La toxicité est évaluée pendant 24 h par administration d’une dose de l’extrait à étudier, à raison de 0,3 ml pour 25 g de souris. Deux lots de trois souris sont utilisés pour le test : le premier qui sert de témoin ne reçoit que du sérum physiologique (NaCl 9 ‰), le second reçoit de l'extrait dissous dans de l'eau distillée.

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Effets sur les animaux

3.2.2.1.1.2. Administration par voie sous-cutanée

Le test consiste à administrer sous la peau du dos de l’animal un volume d’extrait à tester de 0,25 ml à une souris de 25 g. Deux lots de trois souris sont également utilisés et le test dure 24 h.

3.2.2.1.1.3. Administration par voie orale

Cette technique consiste à injecter les extraits directement dans l’estomac de l’animal à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de gavage à bout arrondi. Une souris de 25 g est gavée de 0,25 ml d’extrait à tester. Deux lots de trois souris sont utilisés et les observations durent 24 h.

3.2.2.1.2. DETERMINATION DE LA DL50 CHEZ LA SOURIS

La DL50 est la quantité d’une substance, exprimée en mg/kg de poids de souris, qui, administrée en une fois provoque la mort de 50% des animaux testés au bout d’un temps d’expérimentation déterminé (24 h). Cet indice de toxicité aiguë est considéré comme une appréciation préliminaire et sa valeur dépend de plusieurs paramètres, comme la voie d’administration, l’animal utilisé, le sexe, l’âge, etc (Rakoto Ranoromalala, 2012).

Elle a été déterminée selon la méthode de Reed et Muench (1938), soit par :  calcul à partir de la formule suivante :

(0,5 − 푁) 푙표푔 퐷퐿 50 = 푙표푔퐵 + 푙표푔 푟 (푀 − 푁) avec :

B = dose immédiatement inférieure à la DL50 N = mortalité provoquée par la dose B M = mortalité provoquée par la dose immédiatement supérieure à la DL50 r = raison de la progression géométrique

 méthode graphique, où la valeur de la DL50 est déterminée à partir de l’intersection de la courbe des totaux cumulatifs des survivants et celle de la courbe des totaux cumulatifs des morts en fonction des doses injectées.

La DL50 est mesurée en injectant les extraits à tester à des lots de 5 souris de 25±2 g et de même sexe. Un autre lot recevant du sérum physiologique sert de témoin. Des doses d’extrait toxique en progression géométrique de raison (r) déterminée sont utilisées. La première dose

-110-

Effets sur les animaux

est la dose la plus forte qui provoque 0 % de mortalité chez les animaux testés (DL0) et la septième est la plus faible qui donne 100 % de mortalité (DL100).

3.2.2.2. ETUDE DES LESIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES (Hould, 1984 ; Diebold et al., 1991)

L'anatomo-pathologie, ou anatomie pathologique, informellement abrégée en « anapath » est l’étude des lésions et des modifications structurelles des organes et des tissus, causées par une maladie ou un empoisonnement.

Elle renseigne sur l’organe-cible et la nature des lésions provoquées par un principe toxique. Cette étude aide également à comprendre l’enchaînement des symptômes et la cause de la mort de l’animal test.

Les techniques d’anatomie pathologique comportent 4 étapes :  le prélèvement et la fixation des organes ;  l’inclusion ;  la microtomie et l’étalement des coupes ;  la coloration des coupes et le montage des lames.

3.2.2.2.1. PRELEVEMENT ET FIXATION DES ORGANES

Dans cette étude, deux voies d’administration différentes ont été adoptées : ip et orale.

Les doses d’extrait utilisées ont été la DL50 (dose létale) pour l’injection ip et la DL0 ip (dose non mortelle ou dose sub-létale) pour l’administration orale. Les souris traitées et non traitées (témoins) sont d’abord sacrifiées après une durée d’exposition déterminée selon la voie d’administration. Elles sont ensuite disséquées et les différents organes (cerveau, cœur, poumons, foie, reins et intestin) sont immédiatement prélevés. La première étape du traitement du prélèvement est la fixation. Elle permet la conservation des tissus dans un état aussi proche que possible de l’état vivant, et également le durcissement du prélèvement ainsi que la protection des tissus prélevés de toute hydrolyse due à la libération des enzymes contenus dans les lysosomes cellulaires. Ainsi, les organes prélevés sont placés dans du liquide fixateur (formol à 10 %) pendant au moins 48 h. Chaque organe fixé est ensuite découpé en petits fragments de 2 à 4 mm d’épaisseur à l’aide d’un bistouri.

-111-

Effets sur les animaux

3.2.2.2.2. INCLUSION

L’inclusion des organes dans la paraffine (56-58°) a pour but de faciliter l’obtention de coupes très fines. Afin de rendre cette étape possible, l’eau contenue dans ces organes doit d’abord être éliminée car elle n’est pas miscible à la paraffine. Les organes placés dans des cassettes (TISSUE-TEK III ®, Allemagne) sont donc introduits dans un automate à inclusion (SHANDON® Citadel 1000, Allemagne) pendant 17 h. Ce traitement comporte deux étapes :

 une déshydratation des fragments tissulaires par immersion successive dans des bains d'alcool éthylique à 90°, 96° et 100°, puis une substitution des alcools par le xylène. Ce dernier étant un éclaircissant, cela permet d’apprécier le degré de pénétration de la paraffine par la transparence acquise par la pièce ;

 une imprégnation des fragments dans une paraffine maintenue à l’état liquide.

Lorsque l’opération est terminée, toutes les cassettes sont retirées de la machine. L'inclusion se fait dans des moules en métal permettant la confection de blocs de paraffine durs. Ainsi, les fragments tissulaires de chaque cassette sont plongés dans la paraffine liquide maintenue à 56°C. Les moules sont ensuite placés à 4°C afin de solidifier la paraffine. En refroidissant, les fragments de tissus sont inclus dans un bloc solide et homogène de paraffine à partir duquel la microtomie est effectuée.

3.2.2.2.3. MICROTOMIE ET ETALEMENT DES COUPES

Cette étape aboutit à l’obtention de coupes très minces. Les blocs de paraffine sont débités sous forme de rubans minces de 3 µm d’épaisseur à l’aide d’un microtome rotatif (LEICA® RM 2245, Canada). Les coupes minces sont ensuite placées dans un bain thermostaté puis déplissées délicatement au moyen d’un scalpel. Elles sont ensuite repêchées à l’aide d’une lame de verre préalablement enduite de substance adhésive (ici un mélange de glycérine-albumine) pour que les coupes puissent y adhérer.

3.2.2.2.4. COLORATION DES COUPES ET MONTAGE DES LAMES

L'étape de la coloration des coupes est d'abord précédée du déparaffinage qui consiste à éliminer la paraffine des tissus avec du xylène afin de permettre aux colorants de pénétrer. Pour enlever le xylène, les coupes sont hydratées dans des bains d’éthanol de degré décroissant (100°, 96° et 90°) puis rincées à l’eau courante. Lors de la coloration, des colorants comme l’hématoxyline de Mayer colorant les noyaux en bleu noirâtre et l’éosine colorant le cytoplasme

-112-

Effets sur les animaux en rose ou en rouge, sont utilisés. Les lames colorées sont soumises à une déshydratation par bains d'éthanol de degré croissant (90°, 96° et 100°), puis éclaircies au xylène. Les coupes colorées sont montées entre lame et lamelle à l’aide d’une colle de montage « Eukitt ® ». L’observation et la prise de photographie sont effectuées sous un microscope optique (Olympus CH20, France) aux grossissements 10 et 40 fois.

3.2.2.3. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES FONCTIONS RENALE ET HEPATIQUE

Cette expérience permet d’observer les effets de l’extrait à tester sur les fonctions hépatique et rénale de la souris. Elle consiste à comparer les paramètres biochimiques sanguins tels que le taux d’alanine amino-transférase ou ALAT, le taux d’aspartate amino-tranférase ou ASAT, la créatininémie et l’urémie des souris traitées et ceux des non traitées. Une dose sub-létale d’extrait est administrée quotidiennement par voie orale pendant 30 jours. Pour cela, deux lots de cinq souris de même sexe sont utilisés : le premier qui sert de lot témoin ne reçoit que de l'eau distillée, le second reçoit de l'extrait à tester dissous dans de l'eau distillée. Après les 30 jours de test, les animaux sont anesthésiés par inhalation de chloroforme et des prélèvements de sang sont effectués à l’aide de tubes capillaires héparinés à travers le sinus rétro-orbital. Les échantillons de sang sont ensuite centrifugés à 1 500 x g pendant 10 min à 4°C (centrifugeuse BIOFUGE FRISCO/ Heraus instruments, Allemagne). Le plasma hépariné est immédiatement pipeté, réparti en aliquotes dans des tubes Eppendorf, puis congelé jusqu’à l’analyse. Après décongélation et homogénéisation à la température ambiante, les taux plasmatiques d’ALAT, ASAT, créatinine et urée sont mesurés par une méthode colorimétrique à l’aide d’un spectrophotomètre (VWR®, V-1200 spectrophotometer, Etats-Unis).

3.2.2.3.1. DETERMINATION ENZYMATIQUE DU TAUX D’ALAT DANS LE SANG

L’ALAT catalyse le transfert du groupement amine de l’alanine à l’oxoglutarate avec formation du glutamate et du pyruvate. Ce dernier est réduit en L-lactate par le lactate déshydrogénase (LDH) en présence du NADH réduit selon les réactions suivantes :

-113-

Effets sur les animaux

ALAT L-alanine + 2-oxoglutarate L-glutamate + pyruvate

Pyruvate + NADH + H+ LDH L-lactate + NAD+

La diminution de l'absorbance résultant de l’oxydation du NADH en NAD+, proportionnelle à l'activité de l’ALAT dans l’échantillon, est mesurée cinétiquement à 340 nm.

3.2.2.3.2. DETERMINATION ENZYMATIQUE DU TAUX D’ASAT DANS LE SANG

L’ASAT catalyse le transfert du groupement amine de l’aspartate à l’oxoglutarate avec formation du glutamate et de l’oxaloacétate. Ce dernier est réduit en L-malate par le malate déshydrogénase (MDH) en présence du NADH réduit selon les réactions suivantes :

L-aspartate + 2-oxoglutarate AS AT L-glutamate + oxaloacétate

Oxaloacétate + NADH + H+ MDH L-malate + NAD+

La diminution de l'absorbance due à l’oxydation du NADH en NAD+, proportionnelle à l'activité de l’ASAT dans l’échantillon, est mesurée cinétiquement à 340 nm.

3.2.2.3.3. DOSAGE DE LA CREATININE

La créatinine est dosée par une méthode cinétique qui repose sur la mesure de la formation d'un complexe coloré entre la créatinine et le picrate en milieu alcalin. La vitesse de formation de ce complexe qui se fait selon la réaction ci-dessous, est proportionnelle à la concentration de la créatinine présente dans l'échantillon.

Créatinine + acide picrique Complexe créatinine picrate

3.2.2.3.4. DOSAGE DE L’UREE

L’urée est hydrolysée par l’uréase en ammoniaque (NH4) et dioxyde de carbone (CO2).

Le NH4 ainsi produit réagit avec l’hypochlorite de sodium et le salicylate de sodium en présence d’un agent de couplage (nitroprusside de sodium) pour produire un chromophore vert. L’intensité de la coloration du chromophore est proportionnelle à la concentration de l’urée présente dans l’échantillon.

-114-

Effets sur les animaux

UREASE Urée + H2O 2 NH3 + CO2

NITROPRUSSIDE de SODIUM NH4 + Salicylate + NaClO Indophénol + NaCl OH-

Les taux plasmatiques moyens d'ALAT, ASAT, créatinine et urée des animaux témoins ont été comparés à ceux des animaux traités en utilisant la méthode paramétrique de « T-test de Student ». Les valeurs sont exprimées en moyenne de trois mesures ± écart-type. Une valeur de p˂0,05 est considérée comme une différence statistiquement significative (Schwartz, 1969).

3.2.2.4. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES POUSSINS

La sensibilité des poussins (Gallus gallus) aux extraits est comparée à celle de la souris. Ainsi, un lot de trois poussins d’un jour et un autre lot qui a servi de témoin sont utilisés.

Dans cette étude, une dose correspondant à la DL100 ip chez les souris est testée sur les poussins par voies orale et ip. L’extrait à tester de volume 0,25 ml est administré par gavage à un poussin de 25 g. Par voie ip, un volume de 0,3 ml d’extrait est injecté à un poussin de 25 g.

3.2.2.5. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES ANIMAUX À SANG FROID

Pour cette étude, des modèles aquatiques incluant les têtards de grenouille (Ptychadena mascareniensis) et les alevins de poisson (Cyprinus carpio) ont été adoptés. Les animaux sont répartis par lots de cinq dans des bocaux contenant chacun 250 ml d’eau de source. Ils sont ensuite testés avec l’extrait de concentrations croissantes suivant une progression géométrique de raison r connue. Un lot ne recevant pas d’extrait sert de témoin. L’expérience est effectuée en triple pendant 24 h au bout desquelles les animaux morts et survivants sont comptés.

La valeur de la CL50 (24 h) ou la concentration qui tue 50 % des animaux à sang froid testés en 24 h est déterminée statistiquement en utilisant le logiciel Graphpad Prism ® (GraphPad Prism Software, Version 5.01).

3.2.2.6. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS SUR LES PUCES

La méthode utilisée est celle de l’OMS (1982), appliquée à l’étude des effets des insecticides de synthèse sur les puces (Xenopsylla cheopis), vecteurs de la peste. Il s'agit -115-

Effets sur les animaux d'exposer les puces à une concentration déterminée d'extrait pendant un temps bien défini, et de compter par la suite le nombre de puces paralysées ou mortes à des intervalles de temps précis. La mortalité finale est déterminée après 24 h d'observation. Le pourcentage de puces trouvées mortes est ensuite calculé. Des bandelettes de papier Whatman n°1 sont découpées aux dimensions 1,5 cm × 6cm. La concentration de l’extrait et la date d’imprégnation sont inscrites au verso de chaque bandelette. Des carreaux de 1 cm de côté sont tracés sur les bandelettes. L’extrait à tester est ensuite déposé au milieu de chaque carreau à raison de 15,1 µl/cm2. Les papiers ainsi préparés sont mis à sécher à la température ambiante pendant 24 h. Les tests sont ensuite réalisés dans des tubes à essai de 18 cm de hauteur. Des lots de dix puces sont transférés dans les tubes puis les bandelettes pré-imprégnées d'une concentration déterminée d'extrait y sont placées pendant 8 h. Un tube contenant dix puces et une bandelette non imprégnée sert de témoin. Trois répétitions sont effectuées pour chaque concentration d’extrait. Une fois le temps d’exposition écoulé, les papiers imprégnés sont retirés et remplacés par des papiers vierges non imprégnés d’extrait. Les résultats sont lus par comptage du nombre de puces mortes, après 10, 20 et 30 min, puis après chaque heure jusqu'à la huitième heure. Après 24 h d'observation, le pourcentage de mortalité pour chaque concentration d’extrait testée est calculé.

3.3. RESULTATS 3.3.1. EFFETS DES EXTRAITS SUR LA SOURIS 3.3.1.1. EFFETS DES EXTRAITS DES DIFFERENTS ORGANES DE LA PLANTE

La toxicité des extraits de divers organes de C. bernieri a été évaluée sur deux lots de trois souris en administrant, par voie ip, 1200, 600, 300 et 150 mg/kg d’EB. Le lot témoin a été traité avec du NaCl 9 ‰ (§ 3.2.2.1.1.1, page 109). D’après les résultats, tous les extraits ont provoqué des symptômes d’intoxication chez les souris mais le tableau 21 (page 117) montre que seul l’extrait méthanolique de feuilles (EMF) a provoqué 100 % de mortalité à toutes les doses testées. L’EMF s’est ainsi révélé le plus toxique des extraits d’organes testés. Il a donc été utilisé pour la suite des expériences.

-116-

Effets sur les animaux

Tableau 21 : Effets des extraits issus des différents organes de C. bernieri sur la souris

Mortalité (%) Doses EMF EMG EMC EMR 1200 mg/kg 100 0 100 0 600 mg/kg 100 0 100 0 300 mg/kg 100 0 33 0 150 mg/kg 100 0 0 0 EMF : extrait méthanolique de feuilles ; EMG : extrait méthanolique de graines EMC : extrait méthanolique de cosses ; EMR : extrait méthanolique de racines

3.3.1.2. LES SYMPTÔMES D’INTOXICATION SELON LA VOIE D’ADMINISTRATION

La caractérisation de la toxicité aiguë sur souris, c’est-à-dire la description des symptômes d’intoxication développés par l’animal pendant 24 h selon la voie d’administration, a été réalisée en administrant l’EMF aux doses sub-létale (DL0) et létale (DL100) par voies intrapéritonéale (ip), sous-cutanée et orale. La première dose qui correspondait à la plus forte dose n’entraînant aucun décès des souris testées était de 28,56 mg/kg tandis que la deuxième qui indiquait la plus faible dose provoquant 100 % de mortalité des souris testées était de 81mg/kg.

3.3.1.2.1. VOIE INTRAPERITONEALE

A la dose létale 81 mg/kg, l’EMF était toxique sur souris. Un état agité apparaissait juste après l’injection, suivi d’une contorsion de l’abdomen et d’une augmentation de la fréquence respiratoire. L’activité motrice diminuait progressivement jusqu’à l’immobilisation totale de l’animal. La mort des souris, précédée d’une diminution de la fréquence respiratoire et de convulsions cloniques intenses, survenait 10 min après l’administration de l’extrait.

A la dose sub-létale 28,56 mg/kg, les symptômes étaient similaires à ceux provoqués par la dose létale sauf que leur temps d’apparition était plus long. Une démangeaison au niveau du museau et une rémission progressive étaient observées 2 h après l’administration de l’extrait. Aucune mortalité des souris n’a été observée 24 h après le test.

3.3.1.2.2. VOIE SOUS-CUTANEE

L’injection des doses de l’EMF de 81 mg/kg (DL100 ip) et 28,56 mg/kg (DL0 ip) a pratiquement provoqué les mêmes symptômes d’intoxication chez les souris. Toutefois, la différence résidait au niveau du temps d’apparition de ces symptômes. Une agitation et une

-117-

Effets sur les animaux contorsion abdominale apparaissaient juste après l’injection suivies d’un tremblement du corps et d’une hypoactivité puis, les souris se remettaient progressivement et elles étaient entièrement remises 10 h après l’administration de l’extrait. Aucune mortalité n’a été observée 24 h après le test.

3.3.1.2.3. VOIE ORALE

L’administration de la dose létale 81 mg/kg (DL100 ip), par voie orale n’a provoqué aucune mortalité sur les souris testées. Une contorsion abdominale apparaissait juste après administration de l’extrait, suivie d’une exophtalmie, d’une démangeaison au niveau du museau et d’un hoquet. Au bout de1 h, les souris reprenaient l’état normal. Par ailleurs, la dose provoquant 100 % de décès des souris testées par voie orale a été recherchée. Ainsi, la mortalité a été observée 1 h après l’ingestion de l’EMF à une dose 70 fois plus élevée que la DL100 ip, c’est-à-dire que la DL100 orale était de 6 000 mg/kg. Les différents symptômes d’intoxication développés en fonction du temps et de la dose administrée par voies ip, sous-cutanée et orale sont résumés dans le tableau 22.

Tableau 22 : Symptômes d’intoxication et leur temps d’apparition selon la voie et la dose de l’EMF Voie Dose Symptômes d’intoxication d’administration (mg/kg) Juste après l’injection  Agitation  Contorsion abdominale  Augmentation de la fréquence respiratoire 5 min  Exophtalmie  Etirement de la queue vers l’arrière  Etirement des oreilles vers l’arrière  Perte d’équilibre  Fasciculation Intrapéritonéale 81  Diminution progressive de l’activité motrice  Immobilisation totale de l’animal 8 min  Prostration (souris accroupies sur la litière)  Trainement des pattes postérieures  Augmentation de la profondeur de la respiration  Diminution du rythme respiratoire 10 min  Convulsion clonique intense  Mort des animaux (100% de mortalité)

-118-

Effets sur les animaux

Tableau 22 : Symptômes d’intoxication et leur temps d’apparition selon la voie et la dose de l’EMF (suite) Voie Dose Symptômes d’intoxication d’administration (mg/kg) Juste après l’injection  Agitation  Contorsion abdominale  Augmentation de la fréquence respiratoire 5 à 10 min  Exophtalmie  Etirement de la queue vers l’arrière  Etirement des oreilles vers l’arrière  Perte d’équilibre  Fasciculation  Hypoactivité Intrapéritonéale 28,56 30 à 40 min  Prostration (souris accroupies sur la litière)  Trainement des pattes postérieures  Augmentation de la profondeur de la respiration 2 h  Démangeaison au niveau du museau  Rémission progressive de l’animal 10 h  Retour à l’état normal 24 h  Survie des animaux (0% de mortalité)

Juste après l’injection  Agitation  Contorsion abdominale 5 à 10 min  Tremblement du corps  Exophtalmie  Etirement de la queue vers l’arrière  Etirement des oreilles vers l’arrière 81  Hypoactivité Sous-cutanée 3 h  Rémission progressive de l’animal  Démangeaison au niveau du museau 5 h  Retour à l’état normal 24 h  Survie des animaux (0% de mortalité)  Symptômes similaires à ceux provoqués par la dose 28,56 81 mg/kg  Survie des animaux (0% de mortalité)

-119-

Effets sur les animaux

Tableau 22 : Symptômes d’intoxication et leur temps d’apparition selon la voie et la dose de l’EMF (suite et fin) Voie Dose Symptômes d’intoxication d’administration (mg/kg) Juste après l’injection  Contorsion abdominale  Exophtalmie 10 min 81  Démangeaison au niveau du museau  Hoquet 24 h  Survie des animaux (0% de mortalité)

Juste après l’injection  Contorsion abdominale Orale 5 min  Hoquet 10 min  Exophtalmie  Diminution du rythme de la respiration 6000  Augmentation de l’amplitude de la respiration 25 min  Fasciculation  Trainement des pattes postérieures 2 h  Convulsion clonique  Mort des animaux (100% de mortalité)

Le taux de mortalité selon la voie d’administration de l’EMF aux doses 81, 1200, 3300, 3600 et 6000 mg/kg, est présenté dans le tableau 23.

Tableau 23 : Influence des voies d’administration sur l’activité toxique de l’EMF

Mortalité (%) au bout de 24 h Dose (mg/kg) Intrapéritonéale Sous-cutanée Orale 81 100 0 0 1200 100 0 0 3300 100 0 0 3600 100 100 0 6000 100 100 100

Il apparait qu’à la dose de 3300 mg/kg, dose 40 fois plus élevée que la DL100 ip (81 mg/kg), aucune mortalité n’a été observée ni par voie orale, ni par voie sous-cutanée. Par voie sous-cutanée, la DL100 était de 3600 mg/kg alors que par voie orale, elle était de

-120-

Effets sur les animaux

6000 mg/kg, dose 70 fois plus élevée que la DL100 ip (81 mg/kg). Par conséquent, l’injection par voie ip s’est avérée la plus toxique.

3.3.1.3. DETERMINATION DE LA DL50 DE L’EMF SUR SOURIS

La DL50 (24 h) a été évaluée par voie ip. Ainsi, sept doses en progression géométrique de raison r = 1,19 variant entre 28,56 et 81 mg/kg de poids de l’animal ont été utilisées. Les souris ont été réparties en huit lots de cinq animaux. Sept lots ont été traités avec les sept doses croissantes de l’EMF. Le dernier lot traité avec du sérum physiologique a servi de témoin. Les résultats de l’expérience sont consignés dans le tableau 24 et sur la figure 45.

Tableau 24 : Résultats expérimentaux de la détermination de la DL50 (24 h)

Nombre de souris Totaux cumulatifs Mortalité Dose (mg/kg) survivantes mortes survivantes mortes (%) 28,56 5 0 15 0 0 33,96 3 2 10 2 40 40,44 3 2 7 4 40 48,12 2 3 4 7 60 57,24 1 4 2 11 80 68,16 1 4 1 15 80 81 0 5 0 20 100

25

20

15

10 DL50

Nombre souris de Nombre 5

0 28,56 33,96 40,44 48,12 57,24 68,16 81 Dose (mg/kg)

Survivantes Mortes

Figure 45 : Détermination graphique de la DL50 (24 h) par la méthode de Reed et Muench (1938) -121-

Effets sur les animaux

La DL50 était de 43,75 mg/kg par la méthode graphique (figure 45, page 121) et de 43,40 mg/kg par la méthode de calcul (selon la formule décrite au § 3.2.2.1.2 ; page 110). Ainsi, la valeur moyenne de la DL50 (24 h) par voie ip a été estimée à 43,57 mg/kg de souris.

3.3.1.4. ETUDE DES EFFETS DES EXTRAITS ET FRACTIONS PARTIELLEMENT PURIFIEES SUR LES SOURIS

Comme il a été mentionné plus haut, les différentes étapes d’extraction et de purification des toxines étaient bioguidées par des tests de toxicité sur souris. Divers extraits et fractions partiellement purifiées ont ainsi été obtenus à l’issue de ces étapes. Ils ont été testés afin d’identifier les substances responsables de l’activité sur souris, ou tout au moins déterminer leur nature chimique.

3.3.1.4.1. EFFETS DES ALCALOÏDES TOTAUX (EAT) ET NON ALCALOÏDES TOTAUX (nEAT)

Deux extraits EAT et nEAT ont été obtenus respectivement après évaporation des phases organique et aqueuse issues de la partition au n-butanol (voir partie III, chapitre 1, figure 23, page 77).

Leurs effets sur souris ont été évalués pendant 24 h à des doses correspondant à la DL0

(28,56 mg/kg), la DL50 (43,57 mg/kg) et la DL100 (81 mg/kg) par voie ip et leur activité a été comparée à celle de l’EMF. Les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 25. Tableau 25 : Mortalité (%) par injection par voie ip de EAT et nEAT à différentes doses Mortalité (%) Extraits Dose (mg/kg) EMF EAT nEAT 28,56 0 100 0 43,57 50 100 0 81 100 100 0

D’après ces résultats, à la dose de 28,56 mg/kg, les souris injectées avec l’EAT sont toutes mortes. L’EAT s’est donc avéré plus toxique que l’EMF car celui-ci n’a provoqué aucune mortalité à cette dose. Par contre le nEAT, même à la dose de 81 mg/kg, n’a entrainé aucune mortalité. Ces résultats suggèrent que les alcaloïdes seraient les substances responsables de l’activité toxique sur souris.

-122-

Effets sur les animaux

3.3.1.4.2. EFFETS DES FRACTIONS OBTENUES PAR CHROMATOGRAPHIE SUR GEL DE SEPHADEX® LH-20

Les quatre fractions AT2 à AT5 obtenues par chromatographie sur colonne de gel de Sephadex® LH-20 de l’extrait EAT (voir partie III, chapitre 1, § 1.3.3.1, page 78) ont été testées par voie ip. Leur activité a été comparée à celle de l’EMF et l’EAT. Il faut noter que la fraction de tête AT1 n’a pas été soumise à des tests de toxicité car elle ne contenait aucune substance éluée.

Comme précédemment, trois doses correspondant à la DL0 (28,56 mg/kg), la DL50

(43,57 mg/kg) et la DL100 (81 mg/kg) de l’EMF ont été utilisées. Les résultats des tests sont montrés dans le tableau 26.

Tableau 26 : Mortalité (%) par injection par voie ip des fractions AT2 à AT5 à différentes doses Mortalité (%) Extraits Fractions Dose (mg/kg) EMF EAT AT2 AT3 AT4 AT5 28,56 0 100 100 0 0 0 43,57 50 100 100 0 0 0 81 100 100 100 0 0 0

Des quatre fractions testées, seule AT2 a provoqué une mortalité sur les souris aux trois doses injectées. Par conséquent, les alcaloïdes toxiques seraient concentrés dans AT2.

Il est important de noter que la fraction AT4, qui correspondait au 2''-O--rhamnoside vitexine (composé C1, voir plus haut) n’était pas toxique sur les souris testées. Les deux autres composés isolés (sphaerophysine et cyclocrotalarine) n’ont pas été testés à cause de leur faible quantité.

3.3.1.4.3. EVOLUTION DE LA TOXICITE DES EXTRAITS

D’après les tests ci-dessus, les extraits EMF et EAT ainsi que la fraction AT2 étaient tous toxiques par voie ip. Leur toxicité vis-à-vis des souris testées a augmenté, se traduisant par une diminution du temps de survie pour les trois doses testées : DL0 (28,56 mg/kg), DL50

(43,57mg/kg) et DL100 (81 mg/kg). La figure 46 (page 124) montre ces résultats.

-123-

Effets sur les animaux

14

12

10

8

6

4

Temps (min) survie de Temps 2

0 EMF EAT AT2

DL100 ip (81 mg/ml) DL50 ip (43,57 mg/ml) DL0 ip (28,56 mg/ml)

Figure 46 : Evolution de la toxicité des extraits pour les trois doses (DL0, DL50, DL100 ip) testées. Ces résultats témoignent que les extraits sont devenus de plus en plus homogènes car l’activité spécifique a augmenté.

3.3.1.5. LESIONS ANATOMO-PATHOLOGIQUES

Une étude des lésions macroscopiques et microscopiques a été effectuée au niveau de divers organes des souris traitées avec différentes doses d’EMF. Dans cette étude, deux voies d’administration ont été choisies pour des raisons de commodité : ip et orale. Les doses d’extrait utilisées étaient de 43,57 mg/kg de souris (DL50 ip) pour l’injection ip et 28,56 mg/kg de souris

(DL0 ip) (dose non mortelle) pour l’administration orale. La DL100 n’a pas été injectée car elle ne permettrait pas d’observer le développement des lésions au cours du temps. Les souris traitées par voie ip ont ensuite été sacrifiées 3, 5, 10, 15 min et 24 h après l'injection (tests de toxicité aiguë) tandis que celles traitées par voie orale n’ont été sacrifiées qu'après 10 et 30 jours d'administration quotidienne d'extrait (exposition subchronique à l’EMF). Les effets de l’EMF ont été ainsi appréciés par comparaison de coupes histologiques d’organes prélevés sur les souris non traitées (témoins) et sur des souris traitées.

3.3.1.5.1. LESIONS MACROSCOPIQUES

Après la dissection des souris sacrifiées, les organes sont d’abord observés in situ avant leur prélèvement. Ce premier examen d’autopsie a permis de constater la présence de taches blanchâtres au niveau du foie des souris intoxiquées par voie ip. Les autres organes, à savoir le

-124-

Effets sur les animaux cerveau, le cœur, les poumons, le foie, les reins, l’estomac et l’intestin semblaient macroscopiquement normaux.

3.3.1.5.2. LESIONS MICROSCOPIQUES

Tous les organes prélevés ont été affectés. Les lésions variaient selon l’organe, la voie d’administration et s’intensifiaient en fonction des doses de l’EMF. Par voie ip, des graves lésions ont été détectées au niveau des poumons, du foie et du cerveau, se traduisant par une vasodilatation, l’apparition de polynucléaires neutrophiles altérés, des nappes nécrotiques (ou nécrose) et hémorragiques et de foyers d’imbibition œdémateux. La présence de quelques polynucléaires neutrophiles et une légère dilatation des vaisseaux sanguins ont été observées au niveau du cœur, des reins, de l’estomac et de l’intestin. Par voie orale, les poumons, le foie, le cerveau et l’intestin étaient les organes les plus touchés. Les lésions ont été caractérisées par une vasodilatation, la présence de polynucléaires neutrophiles altérés, de petits foyers nécrotiques ou œdémateux et de larges zones de nécroses. En outre, des foyers de destruction ont été notés au niveau des poumons et de l’intestin après 30 jours d’exposition. Néanmoins, des vaisseaux sanguins modérément dilatés et quelques polynucléaires neutrophiles ont été observés au niveau du cœur, des reins et de l’estomac. Les détails des lésions histologiques dues à l’EMF sont présentés dans le tableau 27 (pages 126 à 127) pour la voie ip et dans le tableau 28 (page 128) pour la voie orale. Les lésions histologiques des organes les plus touchées sont illustrées sur les figures 47 à 57 (pages 129 à 134).

-125-

Effets sur les animaux

Tableau 27 : Lésions tissulaires provoquées par EMF à 43,57 mg/kg injecté par voie ip

Durée de Organes Lésions observées l’exposition - Bronchioles modérément dilatées - Vaisseaux sanguins très dilatés 3 min - Nappes hémorragiques associées à de nombreux polynucléaires neutrophiles - Polynucléaires neutrophiles inter-alvéolaires et péri-bronchiolaires - Vaisseaux sanguins très dilatés - Destruction alvéolaire remplacée par une large zone œdémateuse et nécrotique - Nombreux amas de polynucléaires neutrophiles altérés 5 min - Espaces inter-alvéolaires infiltrés de polynucléaires neutrophiles - Quelques nappes nécrotiques entourées de fibroblastes avec de rares fibres de collagène Poumons - Vaisseaux sanguins modérément dilatés - Alvéoles dilatées 10 min - Infiltrat inflammatoire diffus composé de polynucléaires neutrophiles altérés, de lymphocytes et de macrophages -Vaisseaux sanguins modérément dilatés - Alvéoles dilatées 15 min - Quelques foyers inflammatoires faits de polynucléaires neutrophiles altérés - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés - Lymphocytes et polynucléaires neutrophiles altérés 24 h - Macrophages et quelques fibrocytes - Larges nappes hémorragiques - Veines centrolobulaires modérément dilatées 3 min - Capillaires sinusoïdes légèrement dilatés - Petits amas de polynucléaires neutrophiles disséminés dans le parenchyme hépatique - Veines centrolobulaires modérément dilatées - Capillaires sinusoïdes légèrement dilatés 5 min - Nappes œdémateuses - Petits foyers d’hépatocytes détruits associés à des polynucléaires neutrophiles altérés - Veines centrolobulaires très dilatées - Capillaires sinusoïdes modérément dilatés - Quelques hépatocytes d’aspect graisseux (ébauche de stéatose hépatocytaire) 10 min - Nécrose hépatocytaire importante Foie - Infiltrat inflammatoire diffus avec des polynucléaires neutrophiles altérés - Lymphocytes, macrophages et fibroblastes - Veines centrolobulaires modérément dilatées - Capillaires sinusoïdes modérément dilatés - Nappes œdémateuses associées à des amas de polynucléaires neutrophiles - Stéatose hépatocytaire modérée 15 min - Quelques pigments d’hémosidérine observés - Larges nappes nécrotiques remplaçant les hépatocytes détruits - Parenchyme hépatique infiltré de polynucléaires neutrophiles altérés, de lymphocytes, de macrophages, de fibroblastes et de fibrocytes - Veines centrolobulaires et capillaires sinusoïdes légèrement dilatés - Stéatose hépatocytaire importante 24 h - Fibroblastes et fibrocytes dispersés dans le parenchyme hépatique 3 min - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau du myocarde 5 min Cœur 10 min - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau du myocarde et du péricarde 15 min 24 h

-126-

Effets sur les animaux

Tableau 27 : Lésions tissulaires provoquées par EMF à 43,57 mg/kg injecté par voie ip (suite).

Durée de Organes Lésions observées l’exposition - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la méninge 3 min - Petits amas de polynucléaires neutrophiles au niveau du parenchyme cérébral - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la méninge - Nappe hémorragique au niveau de la méninge - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau du parenchyme cérébral 5 min - Amas de polynucléaires neutrophiles altérés et de petits foyers de nécrose au niveau du parenchyme cérébral Cerveau - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la méninge - Vaisseaux sanguins très dilatés avec présence d’une nappe hémorragique et de 10 min polynucléaires neutrophiles altérés au niveau du parenchyme cérébral - Amas de polynucléaires neutrophiles altérés au niveau du parenchyme cérébral 15 min - Petite nécrose au niveau du parenchyme cérébral - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la méninge - Vaisseaux sanguins très dilatés avec présence de fibrocytes et de fibres de collagène au 24 h niveau du parenchyme cérébral - Vaisseaux sanguins inter-tubulaires légèrement dilatés 3 min - Infiltrat inflammatoire diffus composé de polynucléaires neutrophiles 5 min - Vaisseaux sanguins inter-tubulaires très dilatés, entourés de polynucléaires neutrophiles Reins - Quelques polynucléaires neutrophiles altérés 10 min - Amas des macrophages et lymphocytes 15 min - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés 24 h - Parenchyme rénal sensiblement normal - Histologie normale 3 min

- Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la sous muqueuse 5 min - Infiltrat inflammatoire diffus avec de nombreux polynucléaires neutrophiles au niveau Intestin de la muqueuse et sous muqueuse 10 min

- Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la sous muqueuse 15 min - Muqueuse infiltrée de rares polynucléaires neutrophiles altérés - Nombreux lymphocytes et macrophages au niveau de la muqueuse 24 h

- Histologie normale 3 min - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la sous muqueuse et de la séreuse - Quelques polynucléaires neutrophiles disséminés au niveau de la sous muqueuse et de 5 min la séreuse Estomac - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés au niveau de la sous muqueuse, du musculeuse 10 min et de la séreuse - Quelques polynucléaires neutrophiles disséminés au niveau de la sous muqueuse et du 15 min musculeuse - Nombreux polynucléaires neutrophiles au niveau de la séreuse 24 h

-127-

Effets sur les animaux

Tableau 28 : Lésions tissulaires provoquées par EMF à 28,56 mg/kg administré par voie orale pendant 10 et 30 jours

Durée de Organes Lésions observées l’exposition - Vaisseaux sanguins légèrement dilatés - Polynucléaires neutrophiles péri-vasculaires et péri-bronchiolaires - Parois inter-alvéolaires œdémateuses infiltrées par des polynucléaires neutrophiles altérés 10 jours - Destruction locale des alvéoles Poumons - Polynucléaires neutrophiles altérés dans les bronchioles - Vaisseaux sanguins très dilatés - Larges zones œdémateuses 30 jours - Foyers de destruction alvéolaire - Quelques polynucléaires neutrophiles altérés, de nombreux lymphocytes et macrophages - Veines centrolobulaires légèrement dilatées - Capillaires sinusoïdes modérément dilatés 10 jours - Parenchyme hépatique infiltré de quelques polynucléaires neutrophiles - Petits foyers œdémateux au niveau du parenchyme hépatique Foie - Veines centrolobulaires très dilatées - Capillaires sinusoïdes très dilatés - Larges zones œdémateuses 30 jours - Infiltrat inflammatoire diffus fait de très nombreux polynucléaires neutrophiles altérés - Larges zones de nécrose remplaçant les hépatocytes détruits - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau du myocarde et du péricarde 10 jours Cœur - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau du myocarde - Vaisseaux sanguins très dilatés au niveau du péricarde 30 jours - Quelques polynucléaires neutrophiles intravasculaires - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la méninge et du parenchyme cérébral 10 jours - Méninge infiltrée par quelques polynucléaires neutrophiles Cerveau - Parenchyme cérébral infiltré par de nombreux polynucléaires - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau du parenchyme cérébral - Amas de polynucléaires neutrophiles au niveau de la méninge et du parenchyme cérébral 30 jours - Foyers de nécrose au niveau du parenchyme cérébral - Vaisseaux sanguins inter-tubulaires modérément dilatés - Quelques polynucléaires neutrophiles péri-vasculaires et inter-tubulaires 10 jours - Petits amas de polynucléaires neutrophiles inter-tubulaires et au niveau du parenchyme Reins rénal - Vaisseaux sanguins inter-tubulaires très dilatés 30 jours - Amas polynucléaires neutrophiles altérés au niveau du parenchyme rénal - Petits foyers de destruction de la muqueuse - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la sous muqueuse 10 jours - Muqueuse et sous muqueuse infiltrées par de nombreux polynucléaires neutrophiles - Nappes œdémateuses au niveau de la muqueuse et de la sous muqueuse Intestin - Destruction de la muqueuse avec présence de larges nappes œdémateuses - Muqueuse infiltrée par de très nombreux polynucléaires neutrophiles 30 jours - Très nombreuses cellules mucosécrétantes au niveau de la muqueuse - Foyers de nécrose tissulaire - Muqueuse et sous muqueuse infiltrées par quelques polynucléaires neutrophiles - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la musculeuse infiltrées par de 10 jours nombreux polynucléaires neutrophiles Estomac - Amas de polynucléaires neutrophiles au niveau de la séreuse - Vaisseaux sanguins modérément dilatés au niveau de la muqueuse et de la musculeuse 30 jours - Musculeuse infiltrée par de nombreux polynucléaires neutrophiles

-128-

Effets sur les animaux

Témoin

1

2 3

5 4 8

7

6 a b

Figure 47 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 3 min. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : alvéole ; 2 : capillaires interalvéolaires ; 3 : bronchioles ; 4 : vaisseaux sanguins dilatés ; 5 : nappe hémorragique ; 6 : amas de polynucléaires neutrophiles ; 7 : polynucléaires neutrophiles inter-alvéolaires ; 8 : polynucléaires neutrophiles péri-bronchiolaires.

4

2

1

a 3 b

Figure 48 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 24 h. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : vaisseaux sanguins dilatés ; 2 : macrophages ; 3 : fibrocytes ; 4 : destruction alvéolaire.

-129-

Effets sur les animaux

1 3

4

2

a b

Figure 49 : Coupes histologiques des poumons traités par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : nappe hémorragique ; 2 : vaisseaux sanguins dilatés ; 3 : polynucléaires neutrophiles péri- bronchiolaires ; 4 : infiltrat inflammatoire.

Témoin

2

1

3

4 5 8 7 6 a b

Figure 50 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : parenchyme hépatique ; 2 : capillaires sinusoïdes ; 3 : veine centrolobulaire ; 4 : nappe hémorragique ; 5 : veine centrolobulaire dilaté ; 6 : capillaires sinusoïdes dilatés ; 7 : zone œdémateuse ; 8 : polynucléaires neutrophiles.

-130-

Effets sur les animaux

4 3 5

1

2 6 a b

Figure 51 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 15 min. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : veine centrolobulaire dilaté ; 2 : nappe hémorragique ; 3 : capillaires sinusoïdes dilatés ; 4 : veine centrolobulaire ; 5 : pigments d’hémosidérine ; 6 : polynucléaires neutrophiles.

5

1

3

2 a 4 b

Figure 52 : Coupes histologiques du foie traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : veine centrolobulaire dilaté ; 2 : parenchyme hépatique infiltré de polynucléaires neutrophiles altérés ; 3 : petits foyers œdémateux ; 4 : Infiltrat inflammatoire ; 5 : zone nécrotique.

-131-

Effets sur les animaux

Témoin 2

1

3

4

a b Figure 53 : Coupes histologiques du cerveau traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : parenchyme cérébral ; 2 : méninge ; 3 : amas de polynucléaires neutrophiles ; 4 : vaisseaux sanguins dilatés.

3

2 4

1

a b

Figure 54 : Coupes histologiques du cerveau traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 30 jours. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : amas de polynucléaires neutrophiles ; 2 : vaisseaux sanguins dilatés ; 3 : zone nécrotique ; 4 : polynucléaires neutrophiles altérés.

-132-

Effets sur les animaux

Témoin 2 3 4 5

1

6

7

a b

Figure 55 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 43,57 mg/kg par voie ip, après un temps d’exposition de 5 min. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : lumière intestinale ; 2 : muqueuse ; 3 : sous-muqueuse ; 4 : musculeuse ; 5 : séreuse ; 6 : vaisseaux sanguins dilatés ; 7 : infiltrat inflammatoire (polynucléaires neutrophiles).

1 2

3

1 a b

Figure 56 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 10 jours. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : vaisseaux sanguins dilatés ; 2 : infiltrat inflammatoire ; 3 : nappe œdémateuse.

-133-

Effets sur les animaux

2

3 1 4

5

a b

Figure 57 : Coupes histologiques de l’intestin traité par l’EMF à 28,56 mg/kg par voie orale, après un temps d’exposition de 30 jours. Grossissement x10 (a) et x40 (b). 1 : destruction de la muqueuse avec présence de larges nappes nécrotiques ; 2 : vaisseaux sanguins dilatés ; 3 : cellules mucosécrétantes ; 4 : mucus ; 5 : polynucléaires neutrophiles.

3.3.1.6. EFFETS DE L’EMF SUR LES FONCTIONS HEPATIQUE ET RENALE

Suivant la méthode décrite au § 3.2.2.3 (page 113), une dose non mortelle correspondant à la DL0 ip (28,56 mg/kg de souris) d’EMF a été administrée quotidiennement par voie orale pendant 30 jours sur souris. Les résultats (tableau 29) ont montré qu’aucune modification significative des taux plasmatiques d'ALAT, d'ASAT, de créatinine et d’urée des souris traitées par rapport à ceux des témoins n’a été observée.

Tableau 29 : Effets de l’EMF sur les fonctions hépatique et rénale

Fonction hépatique Fonction rénale Souris ALAT (UI/l) ASAT (UI/l) Créatinine (mg/ml) Urée (mg/ml) Témoins 369,5 ± 223,5 470 ± 129,9 6,3 ± 0,4 5,6 ± 0,2 Traitées 139,5 ± 39,8 311,2 ± 49,6 5,03 ± 0,6 3.27 ± 0,7

Les histogrammes montrant l’évaluation des paramètres biochimiques des souris traitées par l’EMF et ceux des non traitées sont présentés sur les figures 58 et 59 (page 29).

-134-

Effets sur les animaux

450 600

400 500 350

300 400

250 300

200 ALAT (UI/I) ALAT

150 (UI/I) ASAT 200

100 100 50

0 0 Témoin Test Témoin Test a b

Figure 58 : Comparaison des taux plasmatiques d'ALAT (a) et ASAT (b) des souris traitées avec l’EMF par rapport à celles des témoins (n = 3)

8,00 600 7,00 500 6,00

5,00 400

4,00 300

Créatinine (mg/ml) Créatinine 3,00 200 2,00 (mg/ml) Urée 100 1,00

0,00 0 Témoin Test Témoin Test c d Figure 59 : Comparaison des taux plasmatiques de la créatinine (c) et de l’urée (d) des souris traitées avec l’EMF par rapport à celles des témoins (n = 3).

3.3.2. EFFETS DE L’EMF SUR LES POUSSINS

Selon la méthode décrite au § 3.2.2.4 (page 115), l’EMF a été administré par voie ip et orale à la dose de 81 mg/kg (DL100 ip sur souris) sur un lot de trois poussins d’un jour mais cette dose n’a provoqué aucun symptôme d’intoxication, 24 h après l’injection.

-135-

Effets sur les animaux

3.3.3. EFFETS DE L’EMF SUR LES ANIMAUX À SANG FROID Nous avons étendu l’étude des effets des extraits à des animaux autres que les Mammifères afin d’étudier leur sensibilité vis-à-vis de l’intoxication de leur milieu par des substances toxiques.

3.3.3.1. EFFETS DE L’EMF SUR LES TETARDS DE GRENOUILLE

Suivant la méthode mentionnée au § 3.2.2.5 (page 115), sept concentrations de l’EMF allant de 46,23 μg/ml à 58,50 μg/ml en progression géométrique de raison r = 1,04 ont été testées sur sept lots de cinq têtards de grenouille. Trois essais ont été effectués. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 30. L’analyse statistique des valeurs et leur représentation graphique ont été effectuées à l’aide du logiciel GraphPad Prism®.

Tableau 30 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les têtards de grenouille

Concentration Témoin 46,23 48,08 50 52 54,08 56,25 58,50 (µg/ml) A : 0/5 A : 0/5 A : 0/5 A : 1/5 A : 2/5 A : 2/5 A : 3/5 A : 5/5 Répétition B : 0/5 B : 0/5 B : 1/5 B : 2/5 B : 2/5 B : 3/5 B : 4/5 B : 5/5 C : 0/5 C : 0/5 C : 1/5 C : 2/5 C : 3/5 C : 4/5 C : 4/5 C : 5/5

Cumul 0/15 0/15 2/15 5/15 7/15 9/15 11/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 13,33 33,33 46,66 60 73,33 100 Survie (%) 100 100 86,67 66,67 53,34 40 26,67 0

- A, B et C correspondent aux essais. - Les rapports indiquent le nombre de têtards morts sur le nombre de têtards du lot. Les résultats ci-dessus montrent que l’EMF s’est avéré toxique sur les têtards de grenouille. Un effet-dose a été remarqué (Figure 60, page 137). Les taux de mortalité variaient de 13,33 à 100% à des concentrations comprises entre 48,08 et 58,50 µg/ml. D’après cette méthode statistique, la valeur de la CL50 était de 52,59 µg/ml.

-136-

Effets sur les animaux

6

4

2

Nombre desNombre animaux morts 0 40 45 50 55 60 65 Concentration de EMF (µg/ml)

Figure 60 : Courbe montrant la mortalité et l’effet-dose provoqués par l’EMF sur les têtards de grenouille

3.3.3.2. EFFETS DE L’EMF SUR LES ALEVINS DE POISSON

Suivant la méthode décrite au § 3.2.2.5 (page 115), sept concentrations en progression géométrique de l’EMF allant de 10 μg/ml à 29,85 μg/ml avec une raison de 1,2 ont été testées sur sept lots de cinq alevins. Trois essais ont été effectués. Le tableau 31 présente les données expérimentales. Tableau 31 : Effets des différentes concentrations de l’EMF sur les alevins de poissons

Concentration Témoin 10 12 14,40 17,28 20,73 24,88 29,85 (µg/ml) A : 0/5 A : 0/5 A : 1/5 A : 3/5 A : 4/5 A : 4/5 A : 4/5 A : 5/5 Répétition B : 0/5 B : 0/5 B : 2/5 B : 2/5 B : 4/5 B : 4/5 B : 5/5 B : 5/5 C : 0/5 C : 0/5 C : 1/5 C : 1/5 C : 2/5 C : 4/5 C : 4/5 C : 5/5 Cumul 0/15 0/15 4/15 6/15 10/15 12/15 13/15 15/15 Mortalité (%) 0 0 26,66 40 66,66 80 86 100 Survie (%) 100 100 73,34 60 33,34 20 14 0

- A, B et C correspondent aux essais. - Les rapports indiquent le nombre de têtards morts sur le nombre de têtards du lot.

D’après ces résultats, l’EMF a montré une activité toxique sur les alevins de poisson. Un effet-dose a été également observé en fonction des concentrations de l’EMF (figure 61, page 138). Les taux de mortalité variaient de 26,66 % (12 µg/ml) à 100 % (29,85 µg/ml).

-137-

Effets sur les animaux

L’analyse statistique des valeurs et la représentation graphique (figure 61) effectuées

à l’aide du logiciel GraphPad Prism ® ont permis de trouver une valeur de CL50 égale à 16,96 µg/ml.

6

4

2

Nombre desNombre animaux morts 0 0 10 20 30 40 Concentration de EMF (µg/ml)

Figure 61 : Courbe montrant la mortalité et l’effet-dose provoqués par l’EMF sur les alevins de poisson

3.3.4. EFFETS DE L’EMF SUR LES PUCES

Selon la méthode décrite au § 3.2.2.5 (page 116), aux concentrations de 1 mg/ml, 2 mg/ml et 5 mg/ml de l’EMF, aucune mortalité des puces n’a été observée après 24 h d’exposition. Autrement dit, l’EMF ne s’est pas révélé toxique à ces doses testées.

3.4 DISCUSSION ET CONCLUSION

L’évaluation et la caractérisation de la toxicité des extraits des différents organes de C. bernieri ont été effectuées essentiellement sur la souris, animal standard de laboratoire le plus utilisé en recherche biomédicale. Parmi les différents extraits bruts testés, l’extrait de feuilles (EMF) s’est révélé le plus toxique. La faible ou non toxicité des extraits des autres organes de la plante pourrait être interprétée de deux manières : soit l’animal-test était insensible à l’extrait brut correspondant, soit la concentration en extrait utilisé était insuffisante pour provoquer des effets. En outre, une telle distribution inégale de la toxicité dans les différents organes d’une même plante a déjà été notée chez certaines espèces de Crotalaria : C. verrucosa (Meena et al., 2010) ; C. juncea (Al-Snafi, 2016).

-138-

Effets sur les animaux

D’après les tests sur souris, la toxicité de l’EMF variait selon la voie d’administration. L’injection par voie ip était beaucoup plus efficace que les voies orale et sous-cutanée. Par exemple, pour avoir les mêmes effets par voie ip, une dose 70 fois plus élevée a été nécessaire par voie orale. Ceci pourrait s’expliquer par le fait que par voie orale, les composés doivent transiter dans le tube digestif avant d’être absorbés pour parvenir aux organes ou tissus-cibles. Durant ce passage, les principes toxiques de l’EMF seraient probablement dégradés par les enzymes digestifs ou par la flore bactérienne, réduisant ainsi le nombre de molécules absorbées au niveau du tractus gastro-intestinal avant d’atteindre les différents organes cibles. Par conséquent, il faut une dose plus importante de l’EMF par voie orale pour provoquer les mêmes effets que par voie ip. Cette faible toxicité de C. bernieri par voie orale permet de justifier au moins partiellement son utilisation en tant que nourriture des bœufs (souvent évoquée lors des enquêtes ethnobotaniques). C’est pourquoi aucun cas d’intoxication des bœufs n’a été signalé car l’ingestion de la plante doit se faire en quantité très importante pour qu’elle soit toxique. Cependant, une vérification d’une éventuelle toxicité chronique devrait être faite. De même par voie sous-cutanée, l’EMF n’a provoqué que des symptômes à des doses qui étaient létales par voie ip. L’hypothèse d’une difficulté voire absence d’absorption peut être avancée pour expliquer cette observation. Les symptômes développés par l’EMF sur les souris étaient dominés par des troubles du système nerveux, respiratoire et cardio-vasculaire tels que les convulsions cloniques et l’augmentation du rythme respiratoire. Ces symptômes étaient similaires à ceux qui ont été observés avec les extraits des organes des autres espèces de Crotalaria : C. spectabilis (Kay, 1967), C. pallida (Gonzalo, 2015) ou C. juncea (Al-Snafi, 2016). Cette diversité des symptômes pourrait être due à l’implication de plus d’un principe toxique, chose normale pour un extrait brut tel que l’EMF. L’EMF peut être classé comme « extrêmement toxique » par voie ip

(DL50 = 43,57 mg/kg). En effet, en toxicologie, selon Nene Bi et al., (2008), quelle que soit la voie d’administration utilisée, une substance pharmacodynamique peut être classée en fonction de la valeur de sa DL50 24 h en :

 ultra toxique pour une DL50 inférieure à 5 mg/kg de poids corporel (PC),

 extrêmement toxique pour une DL50 comprise entre 5 et 50 mg/kg de PC,

 très toxique pour une DL50 comprise entre 50 et 500 mg/kg de PC,

 modérément toxique pour une DL50 comprise entre 500 à 5000 mg/kg de PC,

 légèrement toxique pour une DL50 entre 5000 et 15000 mg/kg de PC,

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Effets sur les animaux

 non toxique pour une DL50 supérieure à 15000 mg/kg de PC.

La comparaison de la toxicité de l’EMF de C. bernieri avec celle de ses congénères étrangers est difficile car les conditions d’évaluation de cet effet ne sont pas les mêmes : les animaux, les extraits d’organe et la voie d’administration utilisés sont différents. A titre d’illustration, la DL50 de l’extrait de graines de C. juncea chez le rat par voie ip est de 681mg/kg

(Barethia, 2013). L’extrait hydroéthanolique de C. madurensis présente une DL50 = 4000 mg/kg par voie orale chez la souris (Magda, 2017). Par contre, la DL50 est de 1300 mg/kg pour l’extrait EMF de C. lachnosema (Baba et al., 2017) et de 154 mg/kg pour celui de C. assamica (Chan et al., 1989). Par rapport aux autres plantes malagasy déjà étudiées au LABASM, l’EMF est moins toxique que l’extrait aqueux de graines de Cnestis glabra (Connaraceae) (DL50=36mg/kg)

(Jeannoda, 1986) ou l’EMF de graines d’Albizia viridis (DL50 entre 6,72 et 8,04 mg/kg) (Randrianarivo et al., 2014) et plus toxique que les bulbes de Rhodocodon madagascariensis

(Hyacinthaceae) (DL50 = 170 mg/kg) (Rakotobe, 2009). Mais la toxicité de l’EMF est comparable à celle de Pittosporum ochrosiaefolium (DL50 entre 46,24 et 47,15mg/kg) (Ratsimiebo, 2017). L’étude anatomopathologique des organes des souris ayant reçu différentes doses de l’EMF a révélé des lésions qui variaient selon l’organe, la voie d’administration et s’intensifiaient en fonction des doses de l’EMF. Les vasodilatations, les nappes hémorragiques et œdémateuses ainsi que l’infiltrat inflammatoire constitué surtout de polynucléaires neutrophiles étaient les principales lésions constatées. Celles-ci seraient dues à l’activité des molécules toxiques, en particulier les alcaloïdes, qui étaient présents en quantité importante dans l’extrait. A titre d’exemple, la présence des polynucléaires neutrophiles, surtout au niveau des poumons et du foie indique un phénomène de défense immunitaire des tissus vis-à-vis d’une agression chimique. Cette agression pourrait être occasionnée surtout par des composés acides ou basiques tels que les alcaloïdes (Rakoto Ranoromalala, 2012). En outre, il a été rapporté que la présence de nappes hémorragiques au niveau des tissus pulmonaires et hépatiques pourrait être causée par une augmentation de la perméabilité de la paroi des vaisseaux sanguins, favorisant ainsi la fuite sanguine (hématies et plasma) du secteur vasculaire vers les tissus. D’après certains auteurs (Allen, 1963 ; Allen et Chesney, 1992 ; Wiedenfeld et Edgar, 2011), cette activité pourrait être due au pouvoir hémolytique des alcaloïdes de types pyrrolizidines mais la présence de ces composés dans les extraits est encore à confirmer (voir Etude chimique).

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Effets sur les animaux

Il est important de noter que tous les organes ont été touchés mais les poumons, le cerveau et le foie étaient les plus affectés. Ceci pourrait expliquer, au moins en partie, les nombreux symptômes d’intoxication manifestés par les souris. D’un autre côté, les atteintes enregistrées au niveau d’un organe pourraient avoir des répercussions sur d’autres organes vitaux justifiant ainsi tous les symptômes apparus. A titre d’illustration, la présence d’inflammation au niveau du cerveau pourrait conduire à des troubles nerveux, mais le manque d’oxygène, lui-même provoqué par des troubles respiratoires (dyspnée), voire par l’arrêt total de la respiration, pourrait entraîner l’hypoxie cérébrale dont les conséquences seraient des convulsions cloniques (Brunner et al., 2011). Il a aussi été rapporté qu’une lésion hépatique sévère peut aussi avoir un impact sur le système nerveux central (Chimmelli et Gray, 2014) à cause de l’incapacité du foie à éliminer les toxines et de leur accumulation dans le sang. Les lésions provoquées par l’EMF à 43,57 mg/kg injecté par voie ip disparaissaient en fonction de la durée d’exposition. Selon Chandrosama et al. (1998), le déroulement d’une réaction inflammatoire chez les animaux intoxiqués comporte 3 phases successives :  la phase vasculo-exsudative se traduisant par la vasodilatation, les foyers œdémateux ou hémorragiques par fuite des globules rouges ou de liquide plasmatique et la présence des polynucléaires neutrophiles,  la phase cellulaire (ou phase de détersion) se manifestant par la présence de plasmocytes, lymphocytes, histiocytes (se transformant en macrophages) pour nettoyer les polynucléaires altérés, les foyers œdémateux, hémorragiques ou nécrotiques,  la phase de cicatrisation se traduisant par la présence de capillaires hyperplasiques précédant une fibrose tissulaire constituée de fibrocytes et de fibres de collagène. Ces considérations sont en accord avec les résultats de nos études. A titre d’exemple, au niveau des poumons, du cerveau, du foie, des reins et de l’intestin, la phase vasculo- exsudative se situait au bout de 3 min après l’injection ip et se poursuivait même jusqu’à la 15ème minute pour certains organes (poumons, foie, cerveau). La phase cellulaire était observée à partir de la 15ème minute jusqu’à la 24ème heure après l’injection. Cependant la phase de cicatrisation n’a été pas constatée pour tous les organes sauf pour le cerveau et les reins. En plus, l’histologie du tissu rénal devenait sensiblement normale à partir de la 24ème heure. La durée d’exposition devrait être prolongée pour mieux observer les lésions. Les effets de l’EMF sur les fonctions rénale et hépatique, à la dose de 28,56 mg/kg/j pendant 30 jours, n’ont déclenché aucun changement significatif des taux plasmatiques

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Effets sur les animaux d’ALAT, d’ASAT, de créatinine et d’urée des souris traitées par rapport à ceux des témoins. Ce résultat pourrait indiquer qu’aucune modification fonctionnelle et structurelle des reins et du foie n’a été observée. Il se pourrait qu’à la dose utilisée, les dommages subis ne soient pas suffisamment importants pour provoquer une perturbation fonctionnelle au niveau de ces organes. Du point de vue des effets sur les animaux à sang froid, l’EMF s’est révélé toxique pour les alevins de poisson (CL50 =16,96 µg/ml) et les têtards de grenouille (CL50=52,59 µg/ml). Ces animaux étaient donc sensibles à l’EMF. Comparé aux extraits méthanoliques de graines d’Albizia (FABACEAE) de Madagascar dont la toxicité a été évaluée dans les mêmes conditions (Randrianarivo et al., 2014), l’EMF était moins toxique sur les alevins de poissons que l’EMG d’A. androyensis (CL50 = 3,86 μg/ml) et d’A. masikororum (CL50 = 4,15 μg/ml). Il

était également moins toxique sur les têtards de grenouille que l’EMG d’A. tulearensis (CL50=

15,04 μg/ml) et d’A. mahalao (CL50 = 21,87 μg/ml) mais plus toxique que l’EMG d’A. aurisparsa (CL50 = 60 μg/ml). Plusieurs expériences scientifiques ont démontré que l’activité toxique des extraits de plantes sur les animaux à sang froid est due généralement à l’action des saponosides (Roy et al., 1990 ; Françis et al., 2002 ; Hoffmann, 2003). Ces molécules réduiraient la tension superficielle de l’eau dans laquelle baignent ces animaux, les empêchant de respirer normalement par leurs branchies et entrainant ainsi leur mort. Or, le criblage phytochimique réalisé sur l’extrait n’a pas montré la présence de ces molécules dans l’EMF. Ce qui suggère que l’activité toxique de l’EMF sur les animaux à sang froid serait liée à des molécules différentes des saponosides. Rappelons que diverses espèces de Crotalaria malagasy (C. craspedocarpa, C. coursii, C. cytisoides, C. incana, C. mahafalensis, C. xanthoclada, etc.) sont bien connues pour leur toxicité sur les animaux à sang froid, ce qui explique leur large utilisation comme poisons de pêche (Voarisoa, 1998). A la dose utilisée, l’EMF n’a montré aucune activité toxique sur les puces et les poussins de un jour aussi bien par voie orale que par voie ip. Selon Rakoto Ranoromalala (2012), la toxicité d’un composé donné peut être semblable chez plusieurs types d’animaux mais en général, et en dehors des considérations sur l’influence des voies d’administration, une toxine agit spécifiquement sur quelques espèces animales et n’ont aucun effet sur d’autres. Notons qu’au cours des différentes étapes de purification, une augmentation de l’activité toxique des extraits et fractions purifiés renfermant les alcaloïdes a été observée même

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Effets sur les animaux

à une concentration inférieure à celle de l’EMF au départ. Ceci suggère que la faible activité toxique de l’EMF pourrait être due à la présence de contaminants qui ont masqué cette activité. Chaque étape de purification a donc permis d’éliminer ces contaminants et d’accentuer l’activité des principes toxiques. A titre d’exemple, l’activité spécifique de l’EAT et l’AT2 vis- à-vis des souris testées devient de plus en plus marquée. Ainsi, les alcaloïdes sembleraient être les responsables de la toxicité de la plante d’après les tests d’activité des différents extraits obtenus. Ceci permet de classer C. bernieri dans le groupe des crotalaires à alcaloïdes toxiques. A titre d’exemple : C. fulva (McLean et al., 1964), C. retusa et C. spectabilis (Chen et al., 2010) renferment des alcaloïdes toxiques sur les rats et les souris. Néanmoins, les résultats n’ont pas encore permis de connaître ni le nombre de composés impliqués dans la toxicité des feuilles de la plante ni leur originalité par rapport aux alcaloïdes connus en général et à ceux déjà isolés d’autres espèces de Crotalaria. Malgré l’isolement des trois composés à l’état pur, il n’a pas été possible d’évaluer leur toxicité vis-à-vis des animaux à cause de leur faible quantité. Par conséquent, il serait donc intéressant d’obtenir ces composés isolés en quantité suffisante pour approfondir les tests sur les animaux. Pour conclure, l’ensemble des travaux réalisés dans ce chapitre a permis d’une part de dégager quelques caractéristiques de la toxicité de l’EMF sur souris et d’autres animaux et d’autre part, d’avoir des connaissances sur les manifestations, le niveau et les causes de la toxicité ainsi que les composés responsables de celle-ci. Cette propriété toxique pourrait être exploitée dans la lutte contre les rongeurs nuisibles (souris et rats), moyennant d’autres investigations toxicologiques supplémentaires, notamment les tests sur d’autres animaux. Cependant, vu sa forte toxicité envers les poissons et les têtards et peut-être d’autres animaux à sang froid, son utilisation en milieu aquatique n’est pas préconisée.

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CHAPITRE 4

Etude des effets des extraits sur les microorganismes

Effets sur les microorganismes

4.1. INTRODUCTION Rappelons qu’au cours des études préliminaires menées dans la deuxième partie de ce travail, une excellente activité antimicrobienne a été mise en évidence dans les extraits des différents organes de C. bernieri. Cette activité a été particulièrement importante dans les feuilles de la plante. Par conséquent, le but de ce chapitre était d’abord de vérifier le bien-fondé de l’utilisation de la plante pour soigner les maladies infectieuses d’origine bactérienne telles que la diarrhée et les maux de ventre, et ensuite d’approfondir l’activité sur les germes sensibles en vue du développement des nouvelles alternatives thérapeutiques antimicrobiennes. Plusieurs souches microbiennes, le plus souvent responsables de pathologies humaines ont ainsi été utilisées. Dans un premier temps, les activités ont été évaluées par des tests d’antibiogramme en milieu solide par référence à des antibiotiques connus. Les indices de toxicité tels que la concentration minimale inhibitrice (CMI), la concentration minimale bactéricide (CMB) et la concentration minimale fongicide (CMF) ont ensuite été déterminés en milieu liquide pour renseigner sur le mécanisme d’action, bactéricide ou fongicide, bactériostatique ou fongistatique.

4.2. MATERIELS ET METHODES 4.2.1. MATERIELS 4.2.1.1. LES MILIEUX DE CULTURE

Les milieux utilisés sont de qualité pour analyse. Il s’agit :  du milieu de MUELLER-HINTON Agar (MHA) servant à étudier la sensibilité des bactéries aux extraits en milieu solide ;  du bouillon MUELLER-HINTON (MHB) utilisé pour étudier l’activité des extraits sur les bactéries en milieu liquide ;  du milieu Columbia Agar destiné à la culture de Streptococcus et aux tests sur ce germe ;  du milieu Potato Dextrose Agar (PDA), utilisé pour la culture des moisissures et la détermination de l’activité antifongique.

La composition de ces milieux est détaillée en Annexe 2.

4.2.1.2. LES MICROORGANISMES

Le spectre d’activité antimicrobienne de C. bernieri a été évalué sur 22 souches microbiennes provenant de la collection du Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles

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Effets sur les microorganismes et Sciences des Aliments (LCSNSA) de l’Université de La Réunion. Il s’agit de bactéries Gram (–) et Gram (+), de levures et de moisissures impliqués dans les pathologies humaines et dont des pathologies traitées par la plante telles que les diarrhées et les maux de ventre. La liste de ces germes est donnée dans le tableau 32. Tableau 32 : Les différents microorganismes utilisés avec leurs références

Germes Souches Références Campylobacter jejuni ATCC 29428 Enterobacter aerogenes ATCC 13048

Enterobacter cloacae ATCC 13047 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Gram (-) Salmonella enteridis ATCC 13076 Shigella flexneri ATCC 12022

Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 Bactéries Yersinia enterocolitica ATCC 23715 Proteus mirabilis ATCC 35659 Bacillus cereus ATCC 14579 Clostridium perfringens ATCC 13124

Enterococcus faecalis ATCC 29121 Gram (+) Listeria monocytogenes ATCC 19114 Staphylococcus aureus ATCC25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305

Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Candida albicans ATCC 10231 Levures Candida guilliermondii ATCC 6260 Champignons Candida krusei ATCC 14243 Aspergillus fumigatus ATCC 204305 Moisissures Aspergillus niger ATCC 16888

ATCC : American Type Culture Collection

4.2.1.3. LES ANTIBIOTIQUES DE REFERENCE Des disques pré-imprégnés d’antibiotiques fournis par Bio-Rad F 92430, Marnes-la- Coquette, ont été utilisés comme référence. Il s’agit de la pénicilline 6 µg ; de l’amoxicilline 25 µg ; du chloramphénicol 30 µg pour les bactéries et de la miconazole 50 μg pour les champignons.

4.2.1.4. LES EXTRAITS UTILISÉS

Tous les extraits et fractions obtenus lors de l’étude chimique (voir tableau 17, page

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Effets sur les microorganismes

86) ont été utilisés pour l’étude de l’activité antimicrobienne de différents organes de C. bernieri.

4.2.2. ETUDE DU SPECTRE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE 4.2.2.1. ACTIVITES ANTIBACTERIENNE ET ANTILEVURIENNE

Le pouvoir antibactérien et antilevurien a été déterminé par la méthode de diffusion en milieu solide ou méthode des disques décrite au § 2.2.7.4 (page 40).

4.2.2.2. ACTIVITE ANTIMOISISSURE

L’étude de l’activité antimoisissure a été réalisée selon la technique décrite par Favel et al., (1994). 1 ml de chaque extrait à tester de concentration égale à 1 mg/ml est ajouté dans 19 ml de milieu de culture PDA maintenu à 45°C. Le mélange est ensuite versé dans des boîtes de Petri et mis à sécher à l’étuve pendant 15 min à 37°C.

La suspension microbienne est ajustée visuellement à la turbidité de l’étalon 0,5 Macfarland (108 CFU/ml) puis diluée au 1/100 pour obtenir un inoculum estimé à 106 CFU/ml. 10 µl de cet inoculum sont ensuite déposées en stries à la surface du milieu PDA.

Pour les témoins positifs, des disques pré-imprégnés d’antibiotique de référence (miconazole 50 µg) est déposé à la surface du milieu PDA. Pour les témoins négatifs, des disques imprégnés de 10 µl de solvant d’extraction, sont déposés à la surface du milieu PDA.

Les boites de Petri sont incubées à 25°C pendant 72 heures. Le résultat est lu par mesure du DHI (mm) apparu autour du disque en cas d’inhibition de la croissance du germe.

4.2.2.3. DETERMINATION DE LA CMI, CMB et CMF

La CMI est la plus faible concentration d’un antibiotique pour laquelle la croissance bactérienne est inhibée après 24 h d’incubation. Elle caractérise l’effet bactériostatique d’un antibiotique. La CMB et/ou CMF est la plus faible concentration d’un antibiotique capable de tuer plus de 99,9 % des germes présents au départ (soit moins de 0,01 % de survivants). Elle définit l’effet bactéricide d’un antibiotique (Kil et al., 2009). Les CMI, CMB et/ou CMF ont été déterminées pour tous les extraits actifs sur les microorganismes testés (diamètre du halo d’inhibition supérieur ou égal à 8 mm) selon la méthode de microdilution en milieu liquide, mise au point par Kuete et al.(2009). Une suspension d’inoculum préparée à partir d’une culture pure de 24 h est diluée dans 2 ml du bouillon MHB. Elle est ajustée à l’étalon 0,5 Macfarland (108 CFU/ml) puis diluée au

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Effets sur les microorganismes

1/100 pour obtenir un inoculum estimé à 106 CFU/ml. Les extraits à tester sont resolubilisés dans de l’eau distillée stérile et stérilisés par ultrafiltration (Sartorius Stedim Biotech 0,20 µm). Une dilution en cascade d’extraits est ensuite effectuée de manière à obtenir une gamme de concentrations allant de 0,01 à 50 mg/ml. Dans chaque puits d’une rangée d’une microplaque à 96 puits (Greiner, VWR, Etats-Unis), 100 μl de chaque extrait dilué est mélangé à 95 μl de MHB. 5 μl d’inoculum sont ensuite ajoutés. Les extraits subissent ainsi une nouvelle dilution de moitié et les concentrations finales s’étalent de 0,005 mg/ml à 25 mg/ml. La rangée de puits suivante est préparée de la même façon pour effectuer le test en double. Deux témoins sont utilisés : un témoin négatif (T-) contenant seulement 100 µl de MHB et un positif (T+) préparé avec 5 μl d’inoculum et 95 μl de MHB. Après 24 h d’incubation à 37°C pour les bactéries et à 25°C pour les champignons, 40 µl de solution de chlorure de para-iodonitrotétrazolium (INT) à une concentration de 0,2 mg/ml sont ajoutés dans chaque puits. L’INT est un indicateur coloré de couleur jaune qui vire au violet en cas de croissance bactérienne. Les plaques sont de nouveau incubées pendant 30 min aux mêmes températures que précédemment. La croissance bactérienne est détectée par la coloration violette de l’INT. Ainsi, la CMI correspond à la plus faible concentration de l’extrait testé ne présentant pas de changement de coloration. Pour la détermination de la CMB et/ou CMF, 5 µl de chaque puits qui n’a présenté aucun changement de coloration sont ensemencés en stries sur du milieu MHA pour les bactéries et PDA pour les moisissures. La CMB ou la CMF correspond à la plus faible concentration où plus aucune colonie microbienne ne se développe après incubation des boîtes de Petri pendant 24 h à 37°C (pour les bactéries) et à 25°C (pour les champignons). D’une manière générale, les normes préconisées par Dalmarco et al., (2010) (tableau 33) ont été adoptées pour interpréter les résultats. Tableau 33 : Normes utilisées pour l’expression des résultats obtenus par la méthode de microdilution en milieu liquide

CMI Effet CMI < 100 µg/ml Excellent 100 > CMI < 500 µg/ml Modéré 500 > CMI <1000 µg/ml Faible CMI > 1000 µg/ml Inactif

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Effets sur les microorganismes

Les rapports CMB/CMI et CMF/CMI sont calculés afin de caractériser l’effet de l’extrait sur la croissance des différentes souches correspondantes. Selon Chamandi et al., (2015), l’extrait a un effet bactéricide ou fongicide lorsque le rapport est inférieur ou égal à 4 et comme bactériostatique ou fongistatique si le rapport est supérieur à 4.

4.2.3. ANALYSES STATISTIQUES

Tous les tests sont effectués en triple en milieu solide et en double en milieu liquide. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type. Une analyse de variance One-way (ANOVA) suivie d'un test de comparaison de Newman Keuls avec le logiciel STATICF ® est utilisée pour l'analyse statistique. Les estimations statistiques sont effectuées à un intervalle de confiance de 95 %.

4.3. RESULTATS Dans la présente partie de l’étude, les extraits bruts des divers organes de la plante ainsi que les extraits partiellement purifiés ont été testés. Ils sont présentés avec leur dénomination respective dans le tableau 17 (page 86).

4.3.1. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES EXTRAITS BRUTS DES DIFFERENTS ORGANES DE LA PLANTE EN MILIEU SOLIDE Le spectre d’activité antimicrobienne de C. bernieri a été étudié sur plusieurs germes pathogènes afin de prospecter des applications possibles des substances actives. Pour cela, la méthode de diffusion en milieu solide ou méthode des disques a été utilisée (§ 2.2.7.4, page 40) sur 22 souches microbiennes. Chaque extrait a été testé à raison de 1 mg/disque, une concentration classiquement utilisée pour l’évaluation de l’activité antimicrobienne des extraits de plantes (Govindappa et al., 2011; Linthoingambi et Mutum, 2013 ; Marimuthu et al., 2014). Les effets des différents extraits bruts de C. bernieri, exprimés en DHI (mm), sur la croissance des germes en milieu solide sont récapitulés dans les tableaux 34 à 36.

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Effets sur les microorganismes

Tableau 34 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des bactéries Gram (-) en milieu solide

Diamètre du halo d'inhibition (mm) Extraits/ Souches de bactéries Gram (-) Témoins Cj Ea Ec Esc Pa Se Sf Vp Ye Pm

EHF ------EAF ------

Feuilles EMF - 10±0,01 - - 9,33±0,47 - - 7±0,01 - 8,33±0,47

EHG ------7±0,01 - - EAG - - 10±0,01 - - - - 9±0,01 - 8±0,01

Graines EMG ------8±0,01 -

EHC - 9,67±0,47 ------EAC - - 9±0,01 - - - - 10,67±0,01 - -

Cosses EMC - - - - - 11±0,82 8±0,01 9±0,82 8±0,01 8±0,01

EHR - - - - 10±0,01 8±0,01 - - - - EAR ------9±0,01 - -

Racines EMR - - - - - 9±0,01 - - - 9±1,41 Amx 45,00 - - 23,00 10,00 27,00 25,00 - 10,00 - TP Chl 38,00 25,00 25,00 30,00 15,00 32,00 30,00 - 38,00 - Pen 40,00 ------25,00 Hex ------TN AcOEt ------Eds ------

Cj : Campylobacter jejuni ; Ea : Enterobacter aerogenes ; Ec : Enterobacter cloacae ; Esc : Escherichia coli ; Pa: Pseudomonas aeruginosa ; Se : Salmonella enteridis ; Sf : Shigella flexneri ; Vp : Vibrio parahaemolyticus ; Ye: Yersinia enterocolitica ; Pm : Proteus mirabilis ; − : pas d’activité ; TP : témoins positifs (Amx : amoxicilline 25 µg ; Chlor : chloramphénicol 30 µg ; Pen : pénicilline 6 µg) ; TN : témoins négatifs (Hex : hexane ; AcOEt : acétate d’éthyle ; Eds : eau distillée stérile) D’après ces résultats, la plupart des extraits se sont avérés actifs contre la croissance des microorganismes testés (16 souches sur 22). Les DHI allaient de 8 à 15 mm. Cependant, les germes sensibles ainsi que les niveaux d’inhibition variaient d’un extrait à l’autre. Parmi les souches testées, les plus sensibles étaient Salmonella enteridis (DHI = 11 mm, tableau 34), Streptococcus pyogenes (DHI = 15 mm, tableau 35, page 150) et Candida guilliermondii (DHI = 13 mm, tableau 36, page 150) respectivement chez les bactéries Gram (-), Gram (+) et les levures. Par contre, Campylobacter jejuni, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, Aspergillus fumigatus et Aspergillus niger étaient résistantes à tous les extraits testés. De tous les extraits utilisés, EAR s’est montré le plus actif en donnant un DHI = 15mm vis-à-vis de Streptococcus pyogenes (tableau 36). Notons que les activités de tous les extraits

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Effets sur les microorganismes

étaient nettement inférieures à celles des antibiotiques de référence.

Tableau 35 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des bactéries Gram (+) en milieu solide Diamètre du halo d'inhibition (mm) Partie de la Extraits Souches de bactéries Gram (+) plante/Témoins Bc Cp Ef Lm Sa Spn Spy EHF - - - - 7±0,01 - - Feuilles EAF ------EMF 9±0,01 8±0,01 - - 10±0,01 12,67±1,25 12,33±1,70 EHG - - - - 7±0,01 - - Graines EAG - - - - 9±0,82 11,33±0,47 9±0,01 EMG - - - - - 8,33±1,25 8±0,01 EHC - 9,67±1,25 - - 7±0,01 - - Cosses EAC 11,33±0,47 8,33±0,47 - - 10,33±0,47 13±0,82 12±1,41 EMC - - - - 7±0,01 8±0,01 7±0,01 EHR ------8±0,82 Racines EAR 11,33±0,94 7±0,01 - - 11±0,01 13±0,82 15±0,01 EMR 9±1,41 10±0,01 - - 8±0,01 13±0,83 12±1,41 Amx 15,00 27,00 - - 37,00 26,00 32,00 TP Chl 38,00 30,00 - 30,00 30,00 25,00 22,00 Pen 15,00 - - - 35,00 23,00 25,00 Hex ------TN AcOEt ------Eds ------

Bc : Bacillus cereus ; Cp : Clostridium perfringens ; Ef: Enterococcus faecalis ; Lm: Listeria monocytogenes ; Sa : Staphylococcus aureus ; Spn: Streptococcus pneumoniae ; Spy: Streptococcus pyogenes ; TP : témoins positifs (Amx : amoxicilline 25 µg ; Chlor: chloramphénicol 30 µg ; Pen: pénicilline 6 µg) ; TN : témoins négatifs (Hex : hexane ; AcOEt : acétate d’éthyle ; Eds: eau distillée stérile) ; −: pas d’activité Tableau 36 : Effets des extraits bruts (1 mg/disque) issus des différents organes de C. bernieri sur la croissance des champignons en milieu solide Diamètre du halo d'inhibition (mm) Partie de la Extraits Levures Moisissures plante/Témoins Ca Cg Ck Af An EHF - 7±0,01 - - - Feuilles EAF - 7±0,01 7±0,01 - - EMF 8±0,01 8,67± 0,94 7±0,01 - - EHG - 7±0,01 - - - Graines EAG - 13±0,82 - - - EMG - 11±0,01 - - - EHC - 7±0,01 - - - Cosses EAC - 7±0,01 - - - EMC - 7±0,01 - - - Ca : Candida albicans ; Cg : Candida EHR - 8±0,01 - - - guilliermondii ; Racines EAR - 7±0,01 - - - Ck : Candida krusei ; EMR - 8±0,82 - - - Af : Aspergillus fumigatus ; TP Mic 18,00 30,00 33,00 28,00 23,00 An : Aspergillus niger ; Hexane - - - - - TP : témoin positif (Mic: TN AcOEt - - - - - miconazole 50 µg) ; Eds - - - - - TN : témoin négatif

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Effets sur les microorganismes

4.3.2. ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES ALCALOÏDES TOTAUX ET DES FRACTIONS PURIFIEES EN MILIEU SOLIDE

Comme il a été mentionné plus haut, la grande majorité des travaux ont été réalisées avec l’extrait méthanolique de feuilles EMF, qui était le plus disponible quantitativement et le plus actif sur souris. Les alcaloïdes totaux et les différentes fractions partiellement purifiées issues de cet organe (voir tableau 17, page 86) ont alors été testés sur les souches de microorganismes sensibles à l’EMF, à savoir 5 bactéries et une levure (tableau 37). Tableau 37: Liste des souches de microorganismes testées sur les différentes fractions partiellement purifiées issues des feuilles de C. bernieri

Germes Souches Références Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Gram (-) Enterobacter cloacae ATCC 13047 Bactéries Bacillus cereus ATCC 14579 Gram (+) Staphylococcus aureus ATCC 25923 Streptococcus pyogenes ATCC 19615 Champignons Levures Candida albicans ATCC 10231 ATCC : American Type Culture Collection Les résultats sont présentés dans le tableau 38 (page 152) et montrés à titre d’illustration sur les figures 62 et 63 (pages 152 à 153). Pour ce qui est des alcaloïdes, l’extrait EAT s’est montré très actif en inhibant la croissance de toutes les souches testées avec des DHI allant de 8 mm (E. aerogenes) à 22,5 mm (C. albicans). En outre, il s’est avéré beaucoup plus actif que les antibiotiques de référence, l’amoxicilline 25 µg et le chloramphénicol 30 µg sur B. cereus (20,50 mm contre 10 mm et 15 mm respectivement). L’extrait nEAT avait une légère activité sur quatre parmi les six microorganismes testés. Les DHI variaient de 7 mm (S. aureus) à 9 mm (S. pyogenes). Presque toutes les fractions purifiées ont manifesté une activité antimicrobienne. Plus elles étaient purifiées, plus les DHI devenaient grands, variant de 8 à 27 mm. La fraction AT2 s’est avérée la plus active donnant un DHI égal à 27 mm vis-à-vis de C. albicans. Elle a également présenté une activité comparable à celle de l’antifongique de référence, la miconazole 30 µg.

La fraction AT2b en trop faible quantité, n’a pas été soumise au test d’activité antimicrobienne.

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Effets sur les microorganismes

Tableau 38 : Effets des alcaloïdes totaux et des différentes fractions purifiées (1 mg/disque) sur la croissance des microorganismes en milieu solide Diamètre du halo d’inhibition (mm) Extraits/ Témoins Gram (-) Gram (+) Levure Ea Ec Bc Sa Spy Ca EAT 8,00 10,50 20,50 15,00 22,00 22,50 Alcaloïdes totaux nEAT - 8,00 8,00 7,00 9,00 8,00 AT2 8,00 10,00 21,00 15,00 25,00 27,00 Fractions obtenues par AT - 8,00 10,00 10,00 12,50 12,00 chromatographie sur 3 AT - 12,00 13,00 14,50 15,50 16,50 gel de sephadex LH20 4 AT5 - 8,00 10,00 10,00 8,00 10,00 Fractions obtenues par AT2a 8,00 12,00 18,50 17,00 23,00 25,00 chromatographie sur AT2b nt nt nt nt nt nt gel de silice RP8 AT2c - 10,00 12,00 13,00 12,50 13,50 Amx 35,00 nt 10,00 27,00 nt nt TP Chlo 28,00 25,00 15,00 32,00 nt nt Mic nt nt nt nt nt 28 EAT : extraits d’alcaloïdes totaux ; nEAT : extraits non alcaloïdes totaux ; Ea : Enterobacter aerogenes ; Ec : Enterobacter cloacae ; Bc : Bacillus cereus ; Sa : Staphylococcus aureus ; Spy : Streptococcus pyogenes ; Ca : Candida albicans ; Amx: amoxicilline 25 µg; Chlo : chloramphénicol 30 µg ; Mic : miconazole 50 µg ; −: pas d’activité ; nt : non testé ; TP : témoins positifs

a b

Alc : alcaloïdes totaux ; F1 : non alcaloïdes totaux ; F2 : AT2 ; F3 : AT3 ; F4 : AT4 (Fractions obtenues par chromatographie sur gel de sephadex LH20) ; F5 : AT2c (Fractions obtenues par chromatographie sur gel de silice RP8) Figure 62 : Activité antimicrobienne des alcaloïdes totaux et des fractions purifiées sur la croissance de B. cereus (a) et C. albicans (b) en milieu solide (dépôt : 1mg/disque)

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Effets sur les microorganismes

c d

Alc : alcaloïdes totaux ; F1 : non alcaloïdes totaux ; F2 : AT2 ; F3 : AT3 ; F4 : AT4 (Fractions obtenues par chromatographie sur gel de sephadex LH20) ; F5 : AT2c (Fractions obtenues par chromatographie sur gel de silice RP8) Figure 63 : Activité antimicrobienne des alcaloïdes totaux et des fractions purifiées sur la croissance de S. aureus (c) et S. pyogenes (d) en milieu solide (dépôt : 1mg/disque)

4.3.3. DETERMINATION DES CMI, CMB ET CMF EN MILIEU LIQUIDE Les CMI, CMB et CMF constituent des indices d’activité antimicrobienne. Elles permettent notamment de comparer l’activité de plusieurs antibiotiques ou antifongiques sur une souche microbienne donnée. Elles ont été déterminées selon la technique décrite au § 4.2.2.3 (page 147) pour les extraits et fractions purifiées ayant donné un DHI supérieur ou égal à 8 mm. Les figures 64 et 65 illustrent des exemples de la détermination de la CMI par la méthode de microdilution en milieu liquide.

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Effets sur les microorganismes

12,5 6,25 3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0,09 0,04 0,02 T- T+ (mg/ml)

EMF

EAC

EMR

Zone A Zone B

Figure 64 : Détermination de la CMI des extraits issus des différents organes de C. bernieri par la méthode de microdilution en milieu liquide. Souche testée : Bacillus cereus

3,12 1,56 0,78 0,39 0,19 0,09 0,04 0,02 0,01 0,005 T- T+ (mg/ml)

AT5

AT3

AT2a

Zone A Zone B

Figure 65 : Détermination de la CMI des fractions issues de la chromatographie sur gel de sephadex LH20 (AT5, AT3) et silice RP8 (AT2a) par la méthode de microdilution en milieu liquide. Souche testée : Enterobacter cloacae

ZONE A : aucune croissance bactérienne qui se traduit par la coloration jaune ; ZONE B : croissance bactérienne visible traduisant par la coloration violette ; T- : témoin négatif (100 µl du MHB + 40 µl de solution de INT) ; T+ : témoin positif (95 µl du MHB + 5 µl d’inoculum + 40 µl de solution de INT)

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Effets sur les microorganismes

Les valeurs des CMI, CMB et CMF ainsi que le rapport CMB/CMI ou CMF/CMI sont récapitulés dans les tableaux 39 à 41.

Tableau 39 : Valeurs des CMI et CMB (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des bactéries Gram (-) en milieu liquide

Bactéries Extraits/ CMI (mg/ml) CMB (mg/ml) CMB/CMI Activité Gram (-) Fractions EMF 0,19 25 128 bactériostatique Enterobacter EAT 0,19 0,78 4 bactéricide aerogenes AT2 0,19 6,25 32 bactériostatique AT2a 0,19 6,25 32 bactériostatique EAG 0,78 25 32 bactériostatique EAC 6,25 25 4 bactéricide EAT 0,09 0,39 4 bactéricide nEAT 0,19 25 128 bactériostatique Enterobacter AT2 0,09 0,19 2 bactéricide cloacae AT3 0,19 0,39 2 bactéricide AT4 0,09 0,19 2 bactéricide

AT5 0,39 1,56 4 bactéricide

AT2a 0,04 0,19 2 bactéricide AT2c 0,09 0,39 4 bactéricide Pseudomonas EMF 0,78 25 32 bactériostatique aeruginosa EHR 0,19 25 128 bactériostatique EMC 0,09 12,50 128 bactériostatique Salmonella EHR 12,5 12,50 1 bactéricide enteridis EMR 12,5 25 2 bactéricide Shigella flexneri EMC 3,12 25 8 bactériostatique EAG 1,56 6,25 4 bactéricide Vibrio EAC 1,56 25 16 bactériostatique parahaemolyticus EMC 3,12 6,25 2 bactéricide EAR 1,56 1,56 1 bactéricide Yersinia EMG 1,56 12,50 8 bactériostatique enterolitica EMC 1,56 12,50 8 bactériostatique EMF 0,19 0,78 4 bactéricide EAG 1,56 3,12 2 bactéricide Proteus mirabilis EMC 1,56 0,78 0,5 bactéricide EMR 0,09 0,09 1 bactéricide

: Extraits bruts issus des différents organes de la plante ; : Alcaloïdes totaux et fractions issues de la purification par chromatographie sur gel de sephadex LH20 et silice RP8

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Effets sur les microorganismes

Tableau 40 : Valeurs des CMI et CMB (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des bactéries Gram (+) en milieu liquide

Bactéries Extraits/ CMI (mg/ml) CMB (mg/ml) CMB/CMI Activité Gram (+) Fractions EMF 0,09 0,19 2 bactéricide EAC 0,04 0,19 4 bactéricide EAR 0,04 0,19 4 bactéricide EMR 1,56 1,56 1 bactéricide EAT 0,01 0,02 2 bactéricide nEAT 0,19 6,25 32 bactériostatique Bacillus cereus AT2 0,005 0,02 4 bactéricide AT3 0,19 0,39 2 bactéricide

AT4 0,04 0,09 2 bactéricide

AT5 0,19 0,78 4 bactéricide

AT2a 0,01 0,04 4 bactéricide

AT2c 0,09 0,39 4 bactéricide EMF 0,19 0,39 2 bactéricide Clostridium EHC 12,50 25 2 bactéricide perfringens EAC 6,25 12,50 2 bactéricide EMR 6,25 ˃25 ND bactériostatique EMF 0,19 6,25 32 bactériostatique EAG 6,2 12,50 2 bactéricide EAC 3,12 25 8 bactériostatique EAR 0,78 25 32 bactériostatique EMR 12,50 25 2 bactéricide Staphylococcus EAT 0,04 0,19 4 bactéricide aureus AT2 0,04 0,09 2 bactéricide

AT3 0,19 0,78 4 bactéricide

AT4 0,09 0,39 4 bactéricide AT5 0,39 1,56 4 bactéricide

AT2a 0,02 0,02 1 bactéricide AT2c 0,19 0,39 2 bactéricide EMF 0,09 3,12 32 bactériostatique EAG 3,12 12,50 4 bactéricide EMG 12,5 25 2 bactéricide Streptococcus EAC 0,09 12,50 128 bactériostatique pneumoniae EMC 1,56 6,25 4 bactéricide EAR 0,78 ˃25 ND bactériostatique EMR 0,78 ˃25 ND bactériostatique ND : Non déterminé : Extraits bruts issus des différents organes de la plante ; : Alcaloïdes totaux et fractions issues de la purification par chromatographie sur gel de sephadex LH20 et silice RP8

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Effets sur les microorganismes

Tableau 40 : Valeurs des CMI et CMB (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des bactéries Gram (+) en milieu liquide (suite) Bactéries Extraits/ CMI (mg/ml) CMB (mg/ml) CMB/CMI Activité Gram (+) Fractions EMF 0,19 1,56 8 bactériostatique EAG 1,56 12,50 8 bactériostatique EMG 12,50 25 2 bactéricide EAC 0,19 0,78 4 bactéricide EHR 25 ˃25 ND bactériostatique EAR 0,04 0,04 1 bactéricide EMR 0,19 12,50 64 bactériostatique Streptococcus EAT 0,01 0,04 4 bactéricide pyogenes nEAT 3,12 25 8 bactériostatique

AT2 0,005 0,01 2 bactéricide AT3 0,19 0,78 4 bactéricide

AT4 0,04 0,09 2 bactéricide AT5 6,25 ˃ 25 ND bactériostatique

AT2a 0,01 0,02 2 bactéricide

AT2c 0,39 6,25 16 bactériostatique ND : Non déterminé : Extraits bruts issus des différents organes de la plante ; : Alcaloïdes totaux et fractions issues de la purification par chromatographie sur gel de sephadex LH20 et silice RP8

Tableau 41 : Valeurs des CMI et CMF (mg/ml) des extraits et des fractions purifiées, sur la croissance des levures en milieu liquide Extraits/ Levures CMI (mg/ml) CMF (mg/ml) CMF/CMI Activité Fractions EMF 0,09 0,195 2 fongicide EAT 0,01 0,09 4 fongicide nEAT 0,19 6,25 32 fongistatique AT2 0,005 0,01 2 fongicide Candida AT 0,04 0,09 2 fongicide albicans 3 AT4 0,02 0,04 2 fongicide AT5 0,19 0,39 2 fongicide AT2a 0,005 0,02 4 fongicide AT2c 0,09 0,78 4 fongicide EMF 0,04 0,04 1 fongicide EAG 0,04 1,56 32 fongistatique Candida EMG 0,19 25 128 fongistatique guilliermondii EHR 12,50 ˃25 ND fongistatique EMR 12,50 ˃25 ND fongistatique ND : Non déterminé : Extraits bruts issus des différents organes de la plante ; : Alcaloïdes totaux et fractions issues de la purification par chromatographie sur gel de sephadex LH20 et silice RP8 -157-

Effets sur les microorganismes

Ces résultats montrent que :  les CMI des extraits bruts issus des différents organes de C. bernieri variaient de 0,04 à 25 mg/ml. Les extraits qui ont exercé une forte inhibition sur la croissance des microorganismes (CMI = 0,04 mg/ml) étaient : EMF (C. guilliermondii) ; EAG (C. guilliermondii) ; EAC (B. cereus) et EAR (B. cereus et S. pyogenes) alors que EHR était le moins actif (CMI = 25 mg/ml) vis-à-vis de S. pyogenes. Quant aux CMB et CMF, les valeurs étaient également comprises entre 0,04 à 25 mg/ml pour tous les extraits sauf les extraits de racines (EHR, EAR, EMR) qui montraient une valeur supérieure à 25 mg/ml sur certaines bactéries Gram (+) (C. perfringens, S. pneumoniae, S. pyogenes) et la levure, C. guilliermondii. Les rapports CMB/CMI et CMF/CMI variaient de 1 à 100. Les extraits les plus efficaces étaient EMR (CMI = CMB = 0,09 mg/ml) sur P. mirabilis chez les bactéries Gram (-), EAR (CMI = CMB = 0,04 mg/ml) sur S. pyogenes chez les bactéries Gram (+) et EMF (CMI = CMF = 0,04 mg/ml) contre C. guilliermondii chez les levures ;  les valeurs de la CMI et CMB ou CMF de l’EAT étaient respectivement de 0,01 mg/ml (B. cereus, S. pyogenes, C. albicans) à 0,19 mg/ml (E. aerogenes) et de 0,02 mg/ml (B. cereus) à 0,78 mg/ml (E. aerogenes). Celles de nEAT étaient respectivement de 0,19 mg/ml (E. aerogenes, E. cloacae, C. albicans) à 3,12 mg/ml (S. pyogenes) et de 6,25 mg/ml (B. cereus, C. albicans) à 25mg/ml (E. cloacae, S. pyogenes). Sur toutes les souches de microorganismes testées, les rapports CMB/CMI et CMF/CMI ont indiqué que l’EAT a exercé une action bactéricide ou fongicide alors que l’extrait nEAT a seulement manifesté une action bactériostatique ou fongistatique.

 les CMI des différentes fractions purifiées variaient de 0,005 à 6,25 mg/ml. AT2 et

AT2a étaient les plus efficaces contre la croissance de B. cereus, S. pyogenes et C.

ablicans (CMI = 0,005 mg/ml) et AT5 le moins efficace sur la croissance de S. pyogenes (CMI = 6,25 mg/ml). En ce qui concerne les CMB, elles allaient de 0,01 à

25 mg/ml sauf pour la fraction AT5 où elle était supérieure à 25 mg/ml sur S. pyogenes. A l’exception de AT5 dont la CMB n’a pas pu être déterminée, la grande majorité (90,32%) des fractions purifiées avaient une action bactéricide ou fongicide sur toutes les souches bactériennes et levuriennes testées.

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Effets sur les microorganismes

4.4. DISCUSSION ET CONCLUSION

La présente étude a montré que les extraits des différents organes de C. bernieri ont inhibé la croissance de la plupart des microorganismes testés, indiquant la présence de composés antimicrobiens dans toutes les parties de la plante. Il a été constaté que les plantes qui renferment divers composés appartenant à des familles chimiques telles que les tanins et polyphénols, les stéroïdes, les triterpènes, les flavonoïdes et les alcaloïdes ont une activité antimicrobienne au-dessus de la moyenne (Geyid et al., 2005). Nous avons vu plus haut (Chapitre 1, Etude chimique, page 78) que ces classes de composés étaient présentes dans la totalité ou la plupart des organes de C. bernieri. Les extraits de C. bernieri ont généralement montré un large spectre d’activité. Ils étaient capables d'inhiber la croissance de différentes souches aussi bien bactériennes (Gram (-) et Gram (+)) que levuriennes. Cependant, chaque extrait présentait un spectre d'activité spécifique qui pourrait être dû à un certain nombre de facteurs tels que les types de microorganismes testés, la partie de la plante, la méthode d’extraction utilisée ainsi que la nature chimique et la concentration des composés bioactifs dans les extraits. A ce dernier propos, ceci permet de comprendre que l’extrait EMF étant donné qu’il contient plus de composés que l’extrait EHF, est plus concentré en principes actifs et donc plus actif que ce dernier. Les résultats obtenus avec la méthode de microdilution étaient plus fiables que ceux avec la méthode des disques. En effet, des extraits ayant induit un DHI réduit (8 à 9 mm) en milieu solide étaient excellents (CMI inférieure à 100 µg/ml) en milieu liquide. A titre d’exemple, l’EMF s’est avéré peu efficace en milieu solide contre la croissance de C. albicans (DHI = 8 mm) et B. cereus (DHI = 9 mm) alors qu’en milieu liquide, il a provoqué un excellent effet (CMI = 0,09 mg/ml). Il en est de même de l’activité de l’extrait EMR sur P. mirabilis (DHI = 9 mm et CMI = 0,09 mg/ml). Cela pourrait être dû au fait que les composés bioactifs étaient en contact direct avec les germes en milieu liquide alors qu'ils diffusaient peu ou pas du tout en milieu solide (Randriamampianina, 2016). Il faut noter qu’il n'y a pas de consensus sur l’appréciation du niveau de l’activité antimicrobienne des produits naturels d’après la valeur de leur CMI (Benko et Crovella, 2010). Pour Dalmarco et al. (2010), l’effet des extraits bruts et fractions ayant une CMI inférieure à 100 µg/ml était considéré comme excellent ; comprise entre 100 et 500 µg/ml comme modéré ; entre 500 et 1000 µg/ml comme faible et supérieure à 1000 µg/ml comme nul. Selon Kouitcheu et al. (2013), un extrait brut était considéré comme actif par rapport à tout microorganisme testé si sa CMI était inférieure ou égale à 8 mg/ml.

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Effets sur les microorganismes

Si l'échelle adoptée par Dalmarco et al. (2010) (page 148) est utilisée comme référence, 10 extraits ont montré un excellent effet, 8 un effet modéré, 5 un effet faible, tandis que les extraits restants étaient inactifs. L’effet était excellent sur P. mirabilis (EMR), S. enteridis (EMC), B. cereus (EMF, EAC, EAR), S. pneumoniae (EMF), S. pyogenes (EAR), C. albicans (EMF) et C. guilliermondii (EMF, EAG). Il était modéré sur E. aerogenes (EAG), P. mirabilis (EMF), P. aeruginosa (EMF), C. perfringens (EMF), S. aureus (EMF), S. pyogenes (EMR, EAC, EMF) et C. guilliermondii (EMC). L’effet était faible sur E. aerogenes (EAG), P. aeruginosa (EMF), S. aureus (EAR) et S. pneumoniae (EAR, EMR). Cependant, si l'interprétation de Kouitcheu et al. (2013) était prise en compte, seuls 9 extraits présenteraient une CMI supérieure à 8 mg/ml sur certains germes, ce qui signifie que tous les autres extraits de C. bernieri utilisés pourraient être qualifiés de bons antimicrobiens. En ce qui concerne les alcaloïdes totaux et les différentes fractions purifiées, ils étaient beaucoup plus actifs que les autres extraits sur la majorité sinon la totalité des souches testées.

D’après les deux méthodes d’évaluation des activités, les extraits EAT, AT2 et AT2a étaient les plus actifs sur toutes les souches testées :  en milieu liquide, leurs CMI et CMB comprises entre 0,005 à 0,09 mg/ml vis-à-vis de B. cereus, S. aureus, S. pyogenes et C. albicans permettent de les classer parmi les extraits ayant des effets excellents et un bon pouvoir antimicrobien (Dalmarco et al., 2010) ;  en milieu solide, leur activité était de loin plus importante que celle de l’amoxicilline 25 µg et le chloramphénicol 30 µg sur B. cereus et comparable à celle de la miconazole 30 µg sur C. albicans. Il est alors permis de penser que les principes actifs, à l’état pur, pourraient être au moins aussi ou plus efficaces que ces antibiotiques de référence.

Par ailleurs, aux concentrations utilisées, ces extraits EAT, AT2 et AT2a avaient une action bactéricide et fongicide sur les souches microbiennes testées. Tout ceci démontre que les alcaloïdes seraient les principaux responsables de l’activité antimicrobienne.

Néanmoins, la fraction AT4 à partir de laquelle le flavonoïde C1 (2''-O--rhamnoside vitexine) a été purifié, a montré une activité antimicrobienne intéressante (DHI supérieur ou égal à 12 sur Enterobacter cloacae, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes et Candida albicans ainsi qu’un effet bactéricide et fongicide). Ce composé pourrait donc jouer un rôle non négligeable dans l’activité antimicrobienne des feuilles de C. bernieri.

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Effets sur les microorganismes

La comparaison des activités antimicrobiennes des extraits de C. bernieri avec celles de ses congénères n'est pas facile car les conditions d’évaluation ne sont pas les mêmes (souches de microorganismes différentes, doses d'extraction utilisées, etc.). L’activité de C. bernieri peut cependant être comparée à quelques données disponibles :  du point de vue des DHI, la plupart des extraits de C. bernieri se sont montrés largement plus efficaces que les extraits éthanoliques de feuilles de C. brevidens sur Staphylococcus aureus (DHI = 8 mm) et Candida albicans (DHI = 7 mm) (Opande et al., 2017). L’activité des extraits de C. bernieri est généralement comparable à celle de l'extrait d'acétate d'éthyle de C. madurensis sur Bacillus subtilis et Staphylococcus aureus (DHI = 14 mm), Micrococcus luteus (DHI = 12 mm), Escherichia coli et Candida albicans (DHI = 10 mm) (Bhakshu et al., 2008). Elle est par contre moins importante que celle de l’extrait méthanolique de racines de C. burhia qui donne un DHI de 18 mm contre Bacillus subtilis et Pseudomonas aeruginosa (Sandeep et al., 2010) ;  du point de vue des indices antimicrobiens, l’EMF (CMI = 0,78 mg/ml, CMB = 25 mg/ml) et l’EAR (CMI = 0,19 mg/ml, CMB = 25 mg/ml) se sont montrés plus efficaces sur Pseudomonas aeruginosa que l’EMF de C. quartiniana (CMI = CMB = 37,5 mg/ml) (Omori et al., 2011). L'extrait hexanique de feuilles de C. retusa (CMI = 0,12 mg/ml, CMB = 37,5 mg/ml) (Maregesi et al., 2008) était moins actif contre Bacillus cereus que EMF (CMI = 0,09 mg/ml, CMB = 0,19 mg/ml), EAC et EAR (CMI = 0,04 mg/ml, CMB = 0,19 mg/ml). Cependant, les extraits de C. bernieri étaient moins actifs sur Proteus mirabilis (CMI = 0,097 mg/ml) que le peptide isolé des graines de C. pallida (CMI = 0,03 mg/ml) (Pelegrini et al., 2009).

Par rapport aux études antérieures réalisées au LABASM, la plupart des extraits de C. bernieri se sont avérés plus efficaces sur Candida albicans que les extraits de feuilles d’Albizia arenicola (CMI = 15,620 mg/ml) (Rakotomalala, 2012), les extraits méthanoliques de graines de Dodonaea madagascariensis (CMI = 18,75 mg/ml) (Razanatseheno, 2017) et les extraits méthanoliques de feuilles de Pittosporum ochrosiaefolium (CMI = 1,56 mg/ml) (Ratsimiebo,

2017). L’activité antibactérienne des fractions purifiées AT2 et AT2a de C. bernieri est similaire à celle des extraits d’alcaloïdes totaux d’Albizia bernieri sur Streptococcus pneumoniae (CMI=0,007 mg/ml) et Streptococcus pyogenes (CMI = 0,003 mg/ml) (Randriamampianina, 2016).

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Effets sur les microorganismes

L’ensemble de ces résultats a donc permis de valider scientifiquement le bien-fondé de l’utilisation traditionnelle de C. bernieri dans la thérapeutique des maladies infectieuses telles que les maux de ventre et la diarrhée. Ainsi, les différents extraits de la plante se sont montrés actifs aussi bien sur Bacillus cereus, Salmonella enteridis, Clostridium perfringens qui sont des bactéries les plus courantes, responsables d’intoxications alimentaires et de la diarrhée aqueuse (Ryan et al., 2004 ; Logan et Rodrigez, 2006), que sur Candida albicans, une levure pathogène impliquée dans les infections fongiques dont les plus fréquentes sont non seulement les candidoses superficielles (infections des muqueuses, glossite, vaginite, balanite etc.) mais également les candidoses gastro-intestinales et les diarrhées (Robert et al., 2001). Outre la thérapeutique de ces maladies, les extraits de C. bernieri seraient de bons candidats dans la lutte contre les infections engendrées par les germes sensibles tels que Streptococcus pyogenes et Candida albicans.

En conclusion, cette étude démontre clairement la forte potentialité de C. bernieri comme source de molécules antimicrobiennes naturelles à large spectre. Il faut souligner que les doses toxiques sur les souris sont très éloignées des doses actives sur les microorganismes. Ainsi, l’utilisation de ses extraits en tant qu’antibiotiques naturels pourrait être envisagée afin d’éviter l’apparition des phénomènes de résistance et apporter une alternative pour les antibiotiques de synthèse. A ce stade des travaux, les résultats sur les propriétés antimicrobiennes des différents organes de la plante notamment les graines, les cosses et les racines, ne permettent pas encore de déterminer la nature et le nombre de molécules impliquées dans leur pouvoir antimicrobien. Des investigations plus poussées sont encore nécessaires pour obtenir plus d’informations qui permettront d’avoir une meilleure appréciation sur ce point. Néanmoins, ces résultats montrent que les alcaloïdes seraient les principaux responsables de l’activité bactéricide ou fongicide des feuilles de C. bernieri. Les résultats de cette partie des travaux ont fait l’objet des articles scientifiques (voir les détails en Annexe 5) suivants : Article dans une revue internationale : Andriamampianina Herizo Lalaina., Rakoto Danielle Aurore Doll, Petit Thomas, Ramanankierana Heriniaina, Randrianarivo Hanitra Ranjàna, Jeannoda Victor Louis. Antimicrobial activity of extracts from Crotalaria bernieri Baill. (Fabaceae). African Journal of Microbiology Research, 2016; 10 (31) : 1229-1239.

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Effets sur les microorganismes

Communication orale : Andriamampianina Herizo Lalaina., Rakoto Danielle Aurore Doll, Randrianarivo Hanitra Ranjàna, Jeannoda Victor Louis. Etude de l’activité antimicrobienne des extraits de feuilles de Crotalaria bernieri, une plante médicinale de Madagascar : mise au point d’une alternative aux antibiotiques de synthèse. Doctoriales® 2016 de l’Universite de la Reunion, 05 au 09 avril 2016, Ile de la Réunion.

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CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

Conclusion générale et perspectives

CONCLUSION GENERALE

Les résultats de nos travaux constituent les premières données chimiques, biologiques et toxicologiques sur les différentes espèces de Crotalaria présentes à Madagascar et enrichissent ainsi les connaissances sur les espèces du genre Crotalaria en général. Ces travaux contribueront, même pour une modeste part, à la valorisation de notre biodiversité, notamment les plantes toxiques et médicinales Malagasy et ouvrent de nouvelles pistes de recherche sur les possibilités d’exploitation de leurs principes. Des informations relatives aux espèces recensées, notamment leurs vertus médicinales, leur toxicité, et leurs éventuelles autres utilisations signalées lors des enquêtes ou dans la littérature, ont été démontrées grâce à nos investigations. Ces dernières ont révélé que parmi nos plantes-matériels d’étude, nombreuses étaient celles douées de propriétés susceptibles de connaître des applications utiles. Nous avons notamment répertorié parmi nos extraits ceux qui montraient des propriétés toxiques sur les souris, animaux standards de référence, et sur les germes pathogènes. Par ailleurs, pour chaque type d’activité, nous avons pu déterminer laquelle de nos plantes étaient la plus performante. Ainsi, nos travaux ont apporté des réponses aux objectifs que nous nous sommes fixés. Les investigations approfondies réalisées sur C. bernieri, une plante médicinale native de Madagascar, nous ont permis :  du point de vue chimique, d’isoler un flavonoïde appelé 2''-O--rhamnoside vitexine et deux alcaloïdes nommés sphaerophysine et cyclocrotalarine. Ces trois types de composés n'ont jamais été trouvés dans les espèces de Crotalaria et ils ont été isolés pour la première fois d’un représentant du genre Crotalaria ;  du point de vue biologique, de montrer non seulement des activités toxiques exploitables sur les animaux mais surtout la forte potentialité des extraits comme source de molécules antimicrobiennes naturelles en particulier, leurs performances au moins égales à celles des antibiotiques de synthèse.  du point de vue environnemental, de préciser les dangers potentiels liés à l’utilisation des extraits de C. bernieri en milieu aquatique.

Par rapport au principal objectif que nous nous sommes fixés et qui a consisté à prospecter dans quelles mesures les propriétés toxiques et pharmacologiques de C. bernieri pourraient être exploitées à des fins utiles notamment dans la lutte contre les animaux nuisibles tels que les rongeurs et le développement des nouvelles alternatives thérapeutiques antimicrobiennes, il est permis d’avancer que nos résultats sont prometteurs.

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Conclusion générale et perspectives

PERSPECTIVES Ce travail ouvre un certain nombre de perspectives, notamment :  la préparation en quantité plus importante des composés isolés pour approfondir les tests sur les animaux et les microorganismes ;  la poursuite de l’étude chimique des autres fractions non encore purifiées afin d’obtenir d’autres composés intéressants, notamment les alcaloïdes de types pyrrolizidines ;  l’extension des investigations à d’autres espèces animales afin d’identifier d’autres organismes sensibles ;  l’approfondissement des résultats obtenus sur les propriétés antimicrobiennes en utilisant d’autres germes pathogènes-tests et en recherchant les molécules auxquelles ces propriétés sont imputées ;  la détermination des mécanismes d’action des principes actifs notamment les interractions au niveau des membranes cellulaires ;  les essais préliminaires de soin sur des animaux infectés ;  la mise au point de nouveaux agents antimicrobiens pour soigner efficacement et à faible prix les infections bactériennes et levuriennes ;  les essais sur terrain avec des appâts élaborés à partir des extraits actifs ;  la restitution des résultats auprès des populations locales ;  la prospection d’autres propriétés biologiques et pharmacologiques mises en évidence chez d’autres espèces de Crotalaria ;  les investigations plus approfondies sur d’autres organes de la plante (écorce de tiges, graines, cosses et racines) afin de déterminer la distribution des principes actifs et éventuellement d’obtenir une gamme plus large et plus diversifiée d’extraits actifs ;  l’extension des travaux approfondis à d’autres espèces de crotalaires.

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260. http : //www.ilerouge.org/wiki/index.php?title=Ranomanja.

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ANNEXES

Annexes

ANNEXE I : FICHE D’ENQUETE ETHNOBOTANIQUE N° de la fiche : ………………………………………………. Date de l’enquête :…………………………………………... Enquêteur :………………………………………………….. Localité :……………………………………………...... Région : ………………………………………………. District :………………………………………………. Commune :……………………………………………. Fokontany :……………………………………………. Autres :………………………………………………... Source d’information : Nom :………………………………………………….. Profession :……………………………………………. Nom de la plante : Noms vernaculaires (préciser les noms ethniques) : ...... ………………………………………………. …………………………………………………………………………………………... Nom scientifique : …………………………………………………………………………………………... Parties collectées : □ Feuilles □ Tige □ Ecorce □ Racine □ Fruit □ Graines □ Bulbe Stade physiologique de la plante : □ Phase végétative □ En fleur □ En fruit Ecologie : ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………..……………… Observation :………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………… Usages : Thérapeutiques : ˜ □ Diarrhée ˜ □ Ody vavony ˜ □ Tension ˜ □ Paludisme ˜ □ Toux ˜ □ Autres maladies A des fins utiles : ˜ □ Insecticide ˜ □ Herbicide ˜ □Antiparasitaire ˜ □ Raticide ˜ □Tonique

Annexes

Autres (à préciser) :………………………………………………………………….

Effets secondaires (s’il y en a) : …………………………………………………..……………………………………………. ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… Mode d’utilisation (à décrire avec beaucoup de précision) : ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………………………………

ANNEXES II : COMPOSITION DES MILIEUX DE CULTURE

Composition du milieu de MUELLER-HINTON AGAR (Formule-type g/l) : - Extrait de viande...... 3g - Peptone...... 5g - Peptone trypsique de caséine...... 10g - Chlorune de sodium...... 5g - Glucose...... 2g - Agar...... 10g - Eau distillée...... q.s.p.1000 ml pH 7,3 ± 0,1 à 25°C

Composition du bouillon MUELLER-HINTON (Formule-type g/l) : - Extrait de viande ...... ……….....2 g - Peptone ………………………………………………………………………….17,5 g - Amidon ...... ……….....1,5 g pH = 7,3 ± 0,2 à 25°C

Composition du milieu Columbia Agar (Formule-type g/l) : - Polypeptones...... 17 g - Peptone pancréatique de cœur………………………………………………...……3 g - Amidon de maïs …………………………………………………………………....1 g - Chlorure de sodium……...... 5 g - Agar……...... 10 g - Extrait de levure...... 3 g

Annexes

pH = 7,3 ± 0,2 à 25°C

Composition du milieu Potato Dextrose Agar (Formule-type g/l) : - Amidon de pomme de terre………………………………………………………...4 g - Agar……………………………………………………………………………….15 g - Dextrose…………………………………………………………………………...20 g pH = 5.6 ± 0.2 à 37 °C

ANNEXES III : COMPOSITION DES REACTIFS GENERAUX POUR LES ALCALOÏDES

 Réactif de MAYER - Chlorure de mercure……………………………………………………………1,36 g - Iodure de potassium……………………………………………………………….5 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml  Réactif de WAGNER - Iodure de potassium………………………………………………………………2 g - Iode……………………………………………………………………………..1,27 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml  Réactif de DRAGENDORFF Il s’agit d’un mélange (v/v) de deux solutions, A et B. Solution A : - Nitrate de bismuth………………………………………………………………1,7 g - Acide tartrique ………...………………………………………………………...20 g - Eau distillée……………………………………………………………….qsp 100 ml Solution B : - Iodure de potassium………………………………………………………………10 g - Eau distillée qsp……………………………………………………………….....40 ml Le mélange est ensuite additionné de 10 g d’acide tartrique et son volume est ramené à 100 ml par de l’eau distillée.

 Composition du réactif à la vanilline sulfurique - Vanilline…………………………………………………………………………0, 5 g

- Acide sulfurique (H2SO4) 36 N…………………………………………………100 ml

Annexes

ANNEXES IV : DONNEES DU SPECTRE RMN 1H ET 13C DES DIFFERENTS EXTRAITS ET COMPOSES ISOLES

Figure : Spectre RMN 1H du composé C1 (2''-O-α- rhamnoside vitexine)

Figure : Spectre COSY du composé C1 (2''-O-α- rhamnoside vitexine)

Annexes

Figure : Spectre NOESY du composé C1 (2''-O-α- rhamnoside vitexine)

Figure : Spectre HMBC du composé C1 (2''-O-α- rhamnoside vitexine)

Annexes

Figure : Spectre RMN 1H du composé C2 (Sphaerophysine)

Figure : Spectre COSY du composé C2 (Sphaerophysine)

Annexes

Figure : Spectre NOESY du composé C2 (Sphaerophysine)

Figure : Spectre HMBC du composé C2 (Sphaerophysine)

Annexes

1 Figure : Spectre RMN H (DMSOd6) du composé C3 (Cyclocrotalarine)

Figure : Spectre COSY du composé C3(Cyclocrotalarine)

Annexes

Figure : Spectre NOESY du composé C3 (Cyclocrotalarine)

Figure : Spectre HMBC du composé C3 (Cyclocrotalarine)

Annexes

ANNEXES V : PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES

 Articles dans des revues internationales :

1. Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Thomas Petit, Heriniaina Ramanankierana, Hanitra Ranjàna Randrianarivo, Victor Louis Jeannoda. Antimicrobial activity of extracts from Crotalaria bernieri Baill. (Fabaceae). African Journal of Microbiology Research, 2016; 10(31): 1229-1239. 2. Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Randrianarivo Hanitra Ranjàna, Victor Louis Jeannoda, Alain Blond, Bernard Bodo. Antimicrobial Guanidine Alkaloids from the Leaves of Crotalaria bernieri Baill. (En cours de soumission à Journal of Natural Products).

 Communication orale :

1. Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Hanitra Ranjàna Randrianarivo, Victor Louis Jeannoda. Etude de l’activité antimicrobienne des extraits de feuilles de Crotalaria bernieri, une plante médicinale de Madagascar : mise au point d’une alternative aux antibiotiques de synthèse. Doctoriales® 2016 de l’Universite de la Reunion, 05 au 09 avril 2016, Ile de la Réunion.

 Communication affichée : 1. Herizo Lalaina Andriamampianina, Danielle Aurore Doll Rakoto, Thomas Petit, Bernard Bodo, Lovarintsoa Judicaël Randriamampianina, Hanitra Ranjàna Randrianarivo, Victor Louis Jeannoda. Activité antimicrobienne des extraits de feuilles de Crotalaria bernieri : mise au point d’une alternative aux antibiotiques de synthèse. Salon de la recherche 4ème édition, 06 au 07 septembre 2018, Université d’Antananarivo.

Annexes

Du 05 au 09 avril 2016, Île de La Réunion

Titre : Etude de l’activité antimicrobienne des extraits de feuilles de Crotalaria bernieri, une plante médicinale de Madagascar : mise au point d’une alternative aux antibiotiques de synthèse.

Herizo Lalaina Andriamampianina1, Danielle Aurore Doll Rakoto1, Hanitra Ranjàna Randrianarivo1, Victor Louis Jeannoda1. 1 : ED SVE, Laboratoire de Biochimie Appliquée aux Sciences médicales, Mention Biochimie fondamentale et appliquée, Faculté des Sciences, Université d’Antananarivo, Madagascar.

RESUME : A Madagascar, comme dans les autres pays africains, les maladies d’origine microbienne constituent un problème majeur pour la santé de l’homme à cause de leur fréquence et de leur gravité. Cependant, la consommation inappropriée et l’utilisation abusive d'antibiotiques ont accéléré la sélection de bactéries multirésistantes, constituant actuellement un réel problème pour la santé publique. Les conséquences collectives et individuelles de ce problème sont sérieuses : la plupart des infections, qu'elles soient bénignes ou graves, sont de plus en plus difficiles à traiter. Face à ces nombreux obstacles que présente l’utilisation des antibiotiques disponibles, il est indispensable de rechercher de nouvelles substances antimicrobiennes plus efficaces et à large spectre d’action. Une des stratégies pour cette recherche consiste à explorer les plantes utilisées en médecine traditionnelle. En effet, l’objectif de ma thèse consiste à mettre au point de produits actifs d’origine végétale, en alternative aux antibiotiques de synthèse. De ce fait, la présente étude est axée sur les principes actifs de feuilles de C. bernieri notamment pour les raisons suivantes : son endémicité ; la diversité de son utilisation thérapeutique ; la large répartition et la grande disponibilité sur notre île ; l’absence d’étude scientifique approfondie Pour ce faire, la plante a été récoltée ; bien séchée à l’ombre et à l’abri de l’humidité ; puis réduite en poudre. Les grandes familles de métabolites secondaires ont été recherchées dans la plante suivant les méthodes classiques de caractérisation. Pour avoir un extrait clarifié qui montre les meilleures caractéristiques, j’ai utilisé une technique d’extraction par épuisement successifs avec 3 solvants de polarité croissante. Afin d’évaluer les activités antibactériennes et antifongiques, les extraits ainsi obtenus ont été testés sur la croissance in vitro de 22 souches microbiennes impliquées dans plusieurs pathologies humaines. Des paramètres antibactériens à savoir la concentration minimale inhibitrice et la concentration minimale bactéricide des différents extraits ont été déterminés. D’après les résultats que j’ai obtenus, plusieurs familles chimiques ont été retrouvées dans les extraits de feuilles de C. bernieri. Les alcaloïdes et les flavonoïdes pourraient être parmi les molécules responsables de l’activité car ils sont très connus pour leurs propriétés antimicrobiennes. La présence de ces composés peut expliquer l’effet inhibiteur des extraits qui se sont avérés bactéricides contre les différents germes pathogènes testés. Toutefois, les valeurs de CMI obtenues ont montré que la plupart des extraits sont qualifiés comme de bon pouvoir antibactérien. Bref, les propriétés antimicrobiennes de C. bernieri ouvrent une voie prometteuse dans la lutte contre les maladies infectieuses et peuvent constituer une alternative à l’usage des médicaments de synthèse. Des essais complémentaires in vivo et une analyse phytochimique des extraits sont à conduire afin de pouvoir confirmer et élucider les performances mises en évidence. Mots clés : Crotalaria ; C. bernieri ; plantes médicinales, multirésistantes, antibiotiques de synthèse, maladies infectieuses, extrait méthanolique, flavonoïdes, alcaloïdes, activités antimicrobiennes.

Vol. 10(31), pp. 1229-1239, 21 August, 2016 DOI: 10.5897/AJMR2016.8186 Article Number: 934391E60068 ISSN 1996-0808 African Journal of Microbiology Research Copyright © 2016 Author(s) retain the copyright of this article http://www.academicjournals.org/AJMR

Full Length Research Paper

Antimicrobial activity of extracts from Crotalaria bernieri Baill. (Fabaceae)

Herizo Lalaina Andriamampianina1, Danielle Aurore Doll Rakoto1, Thomas Petit3,4, Heriniaina Ramanankierana2, Hanitra Ranjana Randrianarivo1 and Victor Louis Jeannoda1*

1Laboratory of Applied Biochemistry to Medical Sciences, Fundamental and Applied Biochemistry Department, Faculty of Sciences, University of Antananarivo, Antananarivo, Madagascar. 2Centre National de la Recherche pour l’Environnement (CNRE), Antananarivo, Madagascar. 3Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles et Sciences des Aliments (LCSNSA), Saint Pierre, La Réunion, France. 4UMR Qualisud, IUT de La Réunion, Saint Pierre, La Réunion, France.

Received 27 June, 2016; Accepted 25 July, 2016

This work was designed to study the antimicrobial activity of Crotalaria bernieri Baill. (Fabaceae). Extracts from leaf, root, pod and seed using hexane, ethyl acetate and methanol were tested in vitro for their activity against 17 bacteria, 5 fungi (3 yeasts and 2 molds) using disc diffusion and micro dilution methods. At the concentration of 1 mg/disc, all the extracts exhibited antimicrobial activity depending on the plant part and the extraction method used. The most sensitive germs were Salmonella enteridis, Streptococcus pyogenes and Candida guilliermondii with inhibition zone diameter (IZD) of 11 mm, 15 mm and 13 mm respectively. Most of extracts showed, broad activity spectrum varying from one extract to another. Minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC) and minimum fungicidal concentration (MFC) of all extracts were recorded. Ten extracts displayed an excellent effect (MIC < 100 µg/ml), 8 a moderate effect (MIC from 100 to 500 µg/ml), 5 a weak effect (MIC from 500 to 1000 µg/ml) and the others were ineffective (MIC > 1000 µg/ml). Leaf methanol extracts were the most efficient and Gram positive bacteria the most sensitive. All extracts had bactericidal (MBC/MIC ≤ 4) or fungicidal action (MFC/MIC ≤ 4) in certain microorganisms and bacteriostatic (MBC/MIC > 4) or fungistatic action (MFC/MIC > 4) in others. Antimicrobial activity might be due to tannins, polyphenols, steroids, triterpenes and flavonoids that were present in most of the plant organs, but alkaloids in leaf and pod and saponosides in root might also be involved. C. bernieri with the effectiveness of all its parts, the variety of its secondary metabolites, the great number of sensitive pathogen microorganisms and its ubiquity make this plant species an interesting source of antimicrobial agents.

Key words: Crotalaria bernieri, antimicrobial activity, disc diffusion method, microdilution method, minimum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, minimum fungicidal concentration.

INTRODUCTION

Antimicrobial resistance is one of the world’s most serious public health problems. There is an urgent need

*Corresponding author. E-mail: [email protected].

Author(s) agree that this article remains permanently open access under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0 International License

1230 Afr. J. Microbiol. Res

a b

c

FigureFigure 1. Crotalaria 1: Crotalaria bernieri bernieri(a) the whole a) plant;the whole (b) flower; plant: (c) fruits b) flowers;(Source: the c) authors). fruits Source: the authors

to find new disposable and affordable remedies to face MATERIALS AND METHODS this problem (Zongo et al., 2011). Many studies led to systematic screening of plant extracts as a source of anti- Plants bacterial compounds (Dalmarco et al., 2010; Stefanovic and Comic, 2011). Several Crotalaria species have been C. bernieri (Figure 1) were harvested in Ibity, District of Antsirabe, Region of Vakinankaratra, 200 km from Antananarivo region. The reported to display antimicrobial properties. For example, plant was collected in April and July, 2013 and was identified by Crotalaria madurensis is active against Bacillus subtilis, Polhill R.M. Voucher specimens (Herizo R. 010) of C. bernieri were Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida deposited in the herbarium of Plant Biology and Ecology albicans (Bhakshu et al., 2008), Crotalaria capensis Department of the Faculty of Sciences of the University of against Salmonella typhimurium (Dzoyem et al., 2014), Antananarivo. Crotalaria burhia against B. subtilis and S. aureus (Sandeep et al., 2010; Mansoor et al., 2011), Crotalaria Microorganisms strains juncea against S. aureus (Chouhan and Sushil, 2010),

Crotalaria pallida against E. coli and Pseudomonas sp The microorganisms used in this study consisted of 17 strains of (Pelegrini et al., 2009), and Cladophora trichotoma bacteria (10 Gram (-) and 7 Gram (+)), 3 yeasts and 2 molds (Table against Alternaria solani (Ravikumar and Rajkumar, 2013). 1). These strains were obtained from the collections of Laboratoire The purpose of this study was to assess the de Chimie des Substances Naturelles et Sciences des aliments antimicrobial activity of C. bernieri by testing plant part’s (LCSNSA) of La Réunion University. They were maintained on agar extracts obtained in different methods on pathogen slant at 4°C and cultured on a fresh appropriate agar plate during 24 h prior to antimicrobial tests. bacteria and molds. C. bernieri is one of the 53 Crotalaria species growing in Madagascar, an annual herb which is found in open vegetation, grassy places and roadsides in Chemicals for antimicrobial assay most regions of Madagascar (Peltier, 1959). It flowers on July to October and December to March (Polhill, 1982; Commonly used pre-impregnated discs, from Bio-Rad F 92430 Dupuy et al., 2002). Marnes-la-Coquette were chosen as antimicrobial references

Andriamampianina et al. 1231

Table 1. Bacterial, yeast and mold strains used to study antimicrobial activities.

Microorganisms Strains References Campylobacter jejuni ATCC 29428 Enterobacter aerogenes ATCC 13048 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Escherichia coli ATCC 25922 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 Gram(-) Salmonella enteridis ATCC 13076 Shigella flexneri ATCC 12022 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802 Yersinia enterocolitica ATCC 23715 Bacteria Proteus mirabilis ATCC 35659

Bacillus cereus ATCC 14579 Clostridium perfringens ATCC 13124 Enterococcus faecalis ATCC 29121 Gram(+) Listeria monocytogenes ATCC 19114 Staphylococcus aureus ATCC25923 Streptococcus pneumoniae ATCC 6305 Streptococcus pyogenes ATCC 19615

Candida albicans ATCC 10231 Yeasts Candida guilliermondii ATCC 6260 Candida krusei ATCC 14243 Fungi

Aspergillus fumigatus ATCC 204305 Molds Aspergillus niger ATCC 16888

Table 2. Abbreviations designating the different extracts tested. hexane, ethyl acetate and sterile distilled water, constituted hexane, ethyl acetate and methanol extracts respectively (Table 2). Hexane Ethyl acetate Methanol Extracts Extract Extract Extract Leaves LHE LEA LME Phytochemical screening

Seeds SHE SEA SME The reactions for the detection of chemical groups were those Pods PHE PEA PME developed by Fong et al. (1977) and Marini-Bettolo et al. (1981). Roots RHE REA RME

Antimicrobial assays

(Camara et al.,2013; Rakholiya et al., 2014): amoxicillin 25 µg, Antimicrobial activity test chloramphenicol 30 µg, penicillin 6 µg as antibiotics and miconazole 50 μg as antifungal. The in vitro antimicrobial activity of the extracts was determined using disc diffusion method described by Pyun and Shin (2006) and Ngameni et al. (2009). Two mL of inoculum corresponding to 0.5 MacFarland (108 CFU/ml) was uniformly spread on the surface of Preparation of extracts Columbia Agar medium (for Streptococcus); Mueller-Hinton Agar (MHA) for the other bacteria and Potato Dextrose Agar (PDA) for The dried leaves, seeds, seed pods, and roots of the plant were yeasts. Sterilized filter paper discs 6 mm diameter (BioMérieux, grounded into powder. The resulting powder (100 g) was extracted REF 54991) were impregnated with 10 μL of each extract to the successively with 4x500 mL of hexane, ethyl acetate and methanol concentration of 100 mg/mL (1 mg/disc). The soaked discs were for 24 h under stirring at room temperature. After filtration using a then placed on the surface of the agar and incubated at 37°C Whatman filter paper, each combined extract was evaporated during 24 h for bacteria, or at 25°C for yeasts. The inhibition zone under reduced pressure to dryness. The dry residues, dissolved in diameter (IZD) was measured and the results were interpreted by

1232 Afr. J. Microbiol. Res

Table 3. Extraction yields of C. bernieri extracts. MBC and MFC, 5 μl from each well that showed no change in color was transferred on MHA or PDA plate and incubated at 25°C Extracts Yield % (yeasts and molds) or at 37°C (bacteria) for 24 h. The lowest concentration at which no growth occurred on the agar plates LHE 14.6 corresponded to the MBC or MFC. Leaf LEA 22.5 The ratios MBC/MIC and MFC/MIC were calculated for each LME 12.0 extract, to determine the nature of the effect. The extract is bactericidal or fungicidal for MBC/MIC or MFC/MIC ≤ 4 and bacteriostatic or fungistatic when these ratios are >4 (Djeussi et al., SHE 18.4 2013; Bouharb et al., 2014; Chamandi et al., 2015). Seed SEA 12.1 SME 10.0 Statistical analyses

PHE 15.1 Results were expressed as mean values ± standard deviations of Pod PEA 11.2 three separate determinations. One-way analysis of variance PME 4.2 (ANOVA) which was followed by Newman Keuls comparison test with Staticf® software was used for statistical analysis. Statistical estimates were made at confidence interval of 95%. RHE 13.7 Root REA 15.3 RME 24.1 RESULTS

Extraction yields means of the scale used by Ponce et al. (2003) and Celikel and The extractive yield of different parts of C. bernieri with Kavas, (2008) stating that bacteria are not sensitive for IZD less different solvents varied from 4.2 (PME) to 24.1% (RME) than 8 mm, sensitive for IZD of 9 to 14 mm, very sensitive for IZD (Table 3). of 15 to 19 mm and extremely sensitive for IZD larger than 20 mm. Antifungal activity was evaluated by a method described by Favel et al. (1994). One ml of each extract was added to 19 ml of medium culture of PDA and maintained at 45°C. The mixture is Qualitative phytochemical analysis then poured into Petri dishes and dried for 15 min at 37°C. 10 µl of each tested microorganism corresponding to 0.5 MacFarland The major secondary metabolites identified in the different were spread on the medium surface. IZD were measured after organ extracts are presented in Table 4. Tannins, incubation at 25°C for 72 h. Negative controls were prepared by polyphenols, steroids, triterpenes and unsaturated sterols using the same solvents employed to dissolve the plant extract occurred in all the C. bernieri organs. Flavonoids were samples while the reference antibiotics were used as positive controls. All the experiments were performed in triplicate. The found in all organs except root. Alkaloids were present results were expressed as mean values ± standard deviations only in leaf and pod while saponins only in root. Iridoïds, (mm ± SD). leucoanthocyanins, and quinones were not detected in all parts of C. bernieri.

MIC, MBC and MFC determination Antimicrobial activity For extracts showing antibacterial activity in the disc diffusion method (IZD ≥ 8 mm), MIC (minimum inhibitory concentration), At 1 mg/disc, a concentration generally used for MBC (minimum bactericidal concentration) MFC (minimum antimicrobial activity assessment in plants (Sandeep et fungicidal concentration) were determined by microdilution al., 2010; Govindappa et al., 2011; Linthoingambi and method (Kuete et al., 2009). The concentration of each extract was adjusted to 25 mg/ml. Mutum, 2013; Marimuthu et al., 2014), the large majority This was serially diluted two-fold to obtain concentration ranges of C. bernieri extracts (16 of 22) inhibited the of 0.024 to 25 mg/ml. Each concentration was added in a well microorganism growth with IZD ranging from 8 to 15 mm (96-well microplate) containing 95 μl of Mueller-Hinton broth (Tables 5 to 7). However, activity depended on the (MHB) and 5 μl of inoculum (standardized at 0.5 MacFarland). A microorganism, the plant parts and extraction method positive control containing bacterial culture without the extract and a negative control containing only the medium, were also used. The most sensitive germs were S. enteridis analyzed. The plates were covered with sterilized aluminum foil, (IZD=11 mm), S. pyogenes (IZD=15 mm) and C. and then incubated at 25°C (yeasts and molds) or at 37°C guilliermondii (IZD=13 mm) in Gram (-) bacteria, Gram (+) (bacteria) for 24 h. The MIC of each extract was detected bacteria and yeasts, respectively. Gram (-) strains C. following addition 40 µl of 0.2 mg/ml p-iodonitrotetrazolium jejuni and E. coli, E. faecalis, Gram (+) L. monocytogenes chloride and incubation at 25°C (yeasts and molds) or at 37°C and the two molds A. fumigatus and A. niger were (bacteria) for 30 min (Kuete et al., 2009). Viable bacteria reduced the yellow dye to a pink color. MIC was defined as the lowest resistant to all the extracts. REA, with an IZD of 15 mm sample concentration that prevented this change and exhibited against S. pyogenes, displayed the highest antibacterial complete inhibition of bacterial growth. For the determination of activity.

Andriamampianina et al. 1233

Table 4. Phytochemical screening of C. bernieri extracts.

Leaf Seed Pod Root Chemical groups Tests a b c d e f g h i j k l Mayer - - + - - - - - + - - - Wagner - - + - - - - - + - - - Alkaloids Dragendorff - - + - - - - - + - - - Confirmatory test - - + - - - - - + - - - (solubility in ethanol)

Foam test ------+ Saponins Confirmatory test ------+ (hemolytic test)

Flavonoids Willstätter - + + - + + - - + - - - Leucoanthocyanins Bate-Smith ------

Gelatin 1% + - + - + + - - - + + + Tannins and Gelatin-salt 10% + - + + + + - + - + + + Polyphenols FeCl3 - + + - - + - - + - - +

Quinones Borntrager ------Steroids Liebermann-Burchard + + - + + + + + - + + - Iridoïds Hot HCl ------Triterpenes Liebermann-Burchard + - - + + + + + - + + - Unsaturated sterols Salkowsky + - - + + + + + - + + -

+: positive result; -: negative result a: LHE; b: LEA; c: LME; d: SHE; e: SEA; f: SME; g: PHE; h: PEA; i: PME; j: RHE; k: REA; l: RME.

In yeasts, most of leaf extracts were active against the with 10 sensitive microorganisms and seed extracts the three Candida strains tested, but seed and pod extracts narrowest ones with 8 sensitive microorganisms. were active only against C. guilliermondii. Antibiotics used as references in this study (amoxicillin 25 µg, chloramphenicol 30 µg, penicillin 6 µg and miconazole 50 DISCUSSION µg) were more effective than most of C. bernieri extracts. MIC, MBC, MFC and MBC or MFC/MIC ratio values are The present study shows that the C. bernieri extracts presented in Tables 8 to 10. MIC ranged from 0.048 to 25 inhibited the growth of most tested microorganisms, mg/ml. MIC maximum values registered was 12.5 mg/mL indicating the presence of antimicrobial compounds in all except for RHE on S. pyogenes (MIC=25 mg/ml). parts of the plant. Phytochemical screening showed the Concerning MBC or MFC, maximum values for all presence of diverse secondary metabolites, reported to extracts were 25 mg/ml except for root extracts on some have antimicrobial property. At this stage of the work, Gram (+) bacteria and C. guilliermondii (MBC>25 mg/ml). results did not yet allow to state whether the same or The ratio MBC or MFC/MIC varied from 1 to more than different compounds are involved in the different parts of 100. the plant. However, they suggested that C. bernieri The most sensitive microorganism were P. mirabilis in antimicrobial activity might be mainly due to tannins, Gram (-) bacteria (MIC=MBC=0.097 mg/ml), B. cereus polyphenols, steroids, triterpenes and flavonoids, which (MIC=0.048 mg/ml, MBC=0.195 mg/ml) and S. pyogenes were present in all or most of the plant organs. Alkaloids (MIC=MBC=0.048 mg/ml) in Gram (+) bacteria and C. might also be concerned in leaves and pods and guilliermondii (MIC=MFC=0.048 mg/ml) in yeasts. saponosides in root. All methanol extracts were active. This is also the case C. bernieri extracts showed generally a broad for ethyl acetate extracts except LEA. As to hexane antimicrobial spectrum. They were capable of inhibiting extracts, PHE and RHE were efficient but not LHE and the growth of different Gram (-) and Gram (+) bacterial SHE. Pod extracts had the broadest spectrum of activity strains as well as some yeasts. However, each extract

1234 Afr. J. Microbiol. Res

Table 5. In vitro Antimicrobial Activity (IZD in mm) of extracts (1 mg/disc) on Gram (-) bacteria.

Extracts/ Cj Ea Ec Esc Pa Se Sf Vp Ye Pm controls LHE ------Leaf LEA ------LME - 10.00±0.01 - - 9.33±0.47 - - 7.00±0.01 - 8.33±0.47

SHE ------7.00±0.01 - - Seed SEA - - 10.00±0.01 - - - - 9.00±0.01 - 8.00±0.01 SME ------8.00±0.01 -

PHE - 9.67±0.47 ------Pod PEA - - 9.00±0.01 - - - - 10.67±0.01 - - PME - - - - - 11.00±0.82 8.00±0.01 9.00±0.82 8.00±0.01 8.00±0.01

RHE - - - - 10±0.01 8.00±0.01 - - - - Root REA ------9.00±0.01 - - RME - - - - - 9.00±0.01 - - - 9.00±1.41

Amx 45.00 - - 23.00 10.00 27.00 25.00 - 10.00 - PC Chl 38.00 25.00 25.00 30.00 15.00 32.00 30.00 - 38.00 - Pen 40.00 ------25.00

Hex ------NC EtOAc ------Sdw ------

Cj: C. jejuni; Ea: E. aerogenes; Ec: E. cloacae; Esc: E. coli; Pa: P. aeruginosa; Se: S. enteridis; Sf: S. flexneri; Vp: V. parahaemolyticus; Ye: Y. enterocolitica; Pm: P. mirabilis PC: Positive control (Amx: Amoxicillin 25µg; Chlor: Chloramphenicol 30µg; Pen: Penicillin 6µg); NC: Negative control (Hex: Hexane; EtOAc: Ethyl acetate; Sdw: sterile distilled water); −: No activity.

displayed a specific activity spectrum that could be due cereus (LME, PEA, REA), S. pneumoniae (LME), S. to difference between the chemical nature and pyogenes (REA), C. albicans (LME) and C. guilliermondii concentration of bioactive compounds in extracts. The (LME, SEA). Moderate effects, were found against E. results obtained with microdilution method were more aerogenes (SEA), P. mirabilis (LME), P. aeruginosa reliable than those with disc diffusion. That might be due (LME), C. perfringens (LME), S. aureus (LME), S. to the fact that bioactive compounds were in direct pyogenes (RME, PEA, LME) and C. guilliermondii contact with germs in liquid medium whereas they (SME). Weak effects were observed on E. aerogenes diffused little or not at all in solid medium. (SEA), P. aeruginosa (LME), S. aureus (REA) and S. There was no consensus on the acceptable level of pneumoniae (REA, RME). inhibition for natural products (Benko and Crovella, The most efficient extracts were RME (MIC=MBC= 2010). For Dalmarco et al. (2010), for crude extracts and 0.097 mg/ml) against Y. enterolytica in Gram (-) bacteria, fractions, a MIC lower than 100 µg/mL was considered REA (MIC=MBC=0.048 mg/ml) against S. pyogenes in as an excellent effect, from 100 to 500 µg/ml as Gram (+) bacteria and LME (MIC=MFC=0.048 mg/ml) moderate, from 500 to 1000 µg/mL as weak, and over against C. guilliermondii. Some of the extracts were very 1000 µg/ml as inactive. According to Kouitcheu et al. effective against some organisms (LME against B. (2013), when a crude extract was used, the MIC values cereus, S. pneumoniae, C. albicans and C. guilliermondii, of 8 mg/mL or below against any microorganism tested REA against B. cereus and S. pyogenes) while others was considered as active. were totally inactive (SME against S. pneumoniae and S. If the scale adopted by Dalmarco et al. (2010) was pyogenes). used as a reference, 10 extracts displayed an excellent However, if the interpretation of Kouitcheu et al., effect, 8 a moderate effect, 5 a weak effect then the (2013) was taken into account, only nine extracts had remaining extracts were inactive. Excellent effects were MIC higher than 8 mg/mL on some germs, which means observed on P. mirabilis (RME), S. enteridis (PME), B. that all the other extracts of C. bernieri used showed Andriamampianina et al. 1235

Table 6. In vitro Antimicrobial Activity (inhibition zone diameter in mm) of extracts (1 mg/disc) on Gram (+) bacteria.

Plant Extracts Bc Cp Ef Lm Sa Spn Spy parts/controls LHE - - - - 7.00±0.01 - - Leaf LEA ------LME 9.00±0.01 8.00±0.01 - - 10.00±0.01 12.67±1.25 12.33±1.70

SHE - - - - 7.00±0.01 - - Seed SEA - - - - 9.00±0.82 11.33±0.47 9.00±0.01 SME - - - - - 8.33±1.25 8.00±0.01

PHE - 9.67±1.25 - - 7.00±0.01 - - Pod PEA 11.33±0.47 8.33±0.47 - - 10.33±0.47 13.00±0.82 12.00±1.41 PME - - - - 7.00±0.01 8.00±0.01 7.00±0.01

RHE ------8.00±0.82 Root REA 11.33±0.94 7.00±0.01 - - 11.00±0.01 13.00±0.82 15.00±0.01 RME 9.00±1.41 10.00±0.01 - - 8.00±0.01 13.00±0.83 12.00±1.41

Amx 15.00 27.00 - - 37.00 26.00 32.00 PC Chl 38.00 30.00 - 30.00 30.00 25.00 22.00 Pen 15.00 - - - 35.00 23.00 25.00

Hex ------NC EtOAc ------Sdw ------

Bc: B. cereus; Cp: C. perfringens; Ef: E. faecalis; Lm: L. monocytogenes; Sa: S. aureus; Spn: S. pneumoniae; Spy: S. pyogenes Amx: Amoxicillin 25 µg; PC: Positive control (Amx: Amoxicillin 25 µg; Chlor: Chloramphenicol 30 µg; Pen: Penicillin 6 µg; NC: Negative control (Hex: Hexane; EtOAc: Ethyl acetate; Sdw: sterile distilled water); −: No activity.

Table 7. In vitro Antimicrobial Activity (inhibition zone diameter in mm) of extracts (1mg/disc) on yeasts and molds

Yeast Mold Plant part Extract Ca Cg Ck Af An LHE - 7.00±0.01 - - - Leaf LEA - 7.00±0.01 7.00±0.01 - - LME 8.00±0.01 8,67± 0.94 7.00±0.01 - -

SHE - 7.00±0.01 - - - Seed SEA - 13.00±0.82 - - - SME - 11.00±0.01 - - -

PHE - 7.00±0.01 - - - Pod PEA - 7.00±0.01 - - - PME - 7.00±0.01 - - -

RHE - 8.00±0.01 - - - Root REA - 7.00±0.01 - - - RME - 8.00±0.82 - - - PC Mic 18.00 30.00 33.00 28.00 23.00

Hex - - - - - NC EtOAc - - - - - Sdw - - - - -

Ca: C. albicans; Cg: C. guilliermondii; Ck: C. krusei; Af: A. fumigatus; An: A. niger PC: Positive control (Mic: Miconazole 50µg); NC: Negative control (Hex: Hexane; EtOAc: Ethyl acetate; Sdw: sterile distilled water); −: No activity. 1236 Afr. J. Microbiol. Res

Table 8. MIC and MBC values (mg/mL) of C. bernieri extracts (1mg/disc) on Gram(-) bacteria

Gram(-) Bacteria Extracts MIC (mg/ml) MBC (mg/ml) MBC/MIC Enterobacter aerogenes LME 0.195 25 128.21

SEA 0.781 25 32.01 Enterobacter cloacae PEA 6.25 25 4.00

LME 0.781 25 32.01 Pseudomonas aeruginosa RHE 0.195 25 128.21

PME 0.097 12.5 128.87 Salmonella enteridis RHE 12.5 12.5 1.00 RME 12.5 25 2.00

Shigella flexneri PME 3.125 25 8.00

SEA 1.562 6.25 4.00 PEA 1.562 25 16.01 Vibrio parahaemolyticus PME 3.125 6.25 2.00 REA 1.562 1.562 1.00

SME 1.562 12.5 8.00 Yersinia enterolitica PME 1.562 12.5 8.00

LME 0.195 0.781 4.01 SEA 1.562 3.125 2.00 Proteus mirabilis PME 1.562 0.781 0.50 RME 0.097 0.097 1.00

antimicrobial activities. (MIC=0.195 mg/ml, MBC=25 mg/ml) were more efficient All the extracts had bactericidal action (MBC/MIC ≤ 4) against P. aeruginosa than the leaf methanol extract from in certain bacteria and bacteriostatic action (MBC/MIC >) C. quartiniana (MIC=MBC=37.5 mg/ml) (Omori et al., 4) in other ones. For example LME was bactericidal 2011). The leaf hexane extract from C. retusa (MIC=0.125 against B. cereus and C. perfringens but bacteriostatic mg/ml, MBC=37.5 mg/ml) (Maregesi et al., 2008) was against S. aureus and S. pneumoniae. The comparison less active against B. cereus than LME (MIC=0.097 of A. bernieri extract activities to foreign Crotalaria mg/ml, MBC=0.195 mg/ml), PEA and REA (MIC=0.048 species was not easy because antimicrobial activity was mg/ml, MBC=0.195 mg/ml). By contrast, C. bernieri assessed under different conditions (other microorganism extracts were less active on P. mirabilis (MIC between strains and extract doses used). 0.097 and 1.56 mg/ml) than a peptide isolated from C. Compared to available data, the IZD of C. bernieri pallida seeds (MIC=0.030 mg/ml) (Pelegrini et al., 2009). extracts were generally of the same order of magnitude Compared to the antibacterial activities from other plant as those of leaf ethyl acetate extract from C. madurensis extracts, several C. bernieri extracts were more efficient against B. subtilis and S. aureus (IZD=14 mm), M. luteus than methanolic aerial part extracts of Inula viscosa (IZD=12 mm), E. coli and C. albicans (IZD=10 mm against B. subtilis (MIC=25 mg/ml, MBC=50 mg/ml) and S. (Bhakshu et al., 2008) and leaf ethanol extract from C. aureus (MIC=12.5 mg/ml, MBC=50 mg/ml) (Larbi et al., pallida against X. axanopodis (IZD=16 mm), E. 2016). By contrast, tuber ethyl acetate extract of coli(IZD=14 mm) and C. michiganensis (IZD=13 mm) Tropaeolum pentaphyllum against E. coli (MIC=0.02 (Govindappa et al., 2011). Root methanol extract from C. mg/ml, MBC=0.64 mg/ml), P. aeruginosa (MIC=0.04 burhia was more efficient with an IZD of 18 mm against mg/ml, MBC=0.64 mg/ml) (da Cruz et al., 2016) and B. subtilis and P. aeruginosa (Sandeep et al., 2010). organic extract (aerial parts) of Rapanea parvifolia against If comparison was based on antimicrobial indexes, E. faecalis (MIC=0.03 mg/ml, MBC=0.06 mg/ml) (Suffredini LME (MIC=0.781 mg/ml, MBC=25 mg/ml) and REA et al., 2006) were more efficient.

Andriamampianina et al. 1237

Table 9. MIC and MBC values (mg/ml) of C. bernieri extracts (1mg/disc) on Gram(+) bacteria.

Gram (+) Bacteria Extract MIC (mg/ml) MBC (mg/mL) MBC/MIC LME 0.097 0.195 2.01 PEA 0.048 0.195 4.06 Bacillus cereus REA 0.048 0.195 4.06 RME 1.562 1.562 1.00

LME 0.195 0.390 2.00 PHE 12.5 25 2.00 Clostridium perfringens PEA 6.25 12.5 2.00 RME 6.25 ˃25 -

LME 0.195 6.25 32.05 SEA 6.25 12.5 2.00 Staphylococcus aureus PEA 3.125 25 8.00 REA 0.781 25 32.01 RME 12.5 25 2.00

LME 0.097 3.125 32.22 SEA 3.125 12.5 4.00 SME 12.5 25 2.00 Streptococcus pneumoniae PME 1.562 6.25 4.00 REA 0.781 ˃25 - RME 0.781 ˃25 -

LME 0.195 1.562 8.01 SEA 1.562 12.5 8.00 SME 12.5 25 2.00 Streptococcus pyogenes PEA 0.195 0.781 4.01 RHE 25 ˃25 - REA 0.048 0.048 1.00 RME 0.195 12.5 64.10

Table 10. MIC and MBC values (mg/ml) of C. bernieri extracts (1mg/disc) on yeasts.

Yeasts Extraits MIC (mg/ml) MFC (mg/ml) MFC/MIC Candida albicans LME 0.097 0.195 2.01

LME 0.048 0.048 1.00 SEA 0.048 1.562 32.54 Candida guilliermondii SME 0.195 25 128.21 RHE 12.5 ˃25 - RME 12.5 ˃25 -

On fungi, LME (MIC=0.097 mg/ml, MFC=0.195 mg/ml) pentaphyllum (da Cruz et al., 2016). was more efficient than leaf methanolic extract of Myrtus nivellei against C. albicans (MIC=4.5 mg/ml) (Touaibia and Chaouch, 2015) whereas LME, SEA and SME Conclusion against C. guilliermondii (MIC=0.08 mg/ml, MFC=0.32 mg/ml) were less efficient than ethyl acetate extract of T. This study clearly demonstrates the potential of C. bernieri

1238 Afr. J. Microbiol. Res

as a source of interesting natural wide spectrum Dupuy DJ, Labat JN, Rabevohitra R, Villiers JF, Bosser J, Morat J antimicrobial molecules. All its parts were efficient and (2002). The Leguminosae of Madagascar. Royal Botanic Gardens, Kew, Richmond, United Kingdom, pp. 243-288. could be easily found in significant amounts for the plant Dzoyem JP, Mc Gaw LJ, Eloff JN (2014). In vitro antibacterial, grows in fields, in the vicinity of homes, on roadsides and antioxidant and cytotoxic activity of acetone leaf extracts of nine can be cultivated. Furthermore, according to our survey under investigated Fabaceae tree species leads to potentially useful of local populations, C. bernieri is consumed by zebus extracts in animal health and productivity. BMC Complement Altern Med. 14(147):1-7. but no cases of poisoning have yet been reported. At Favel A, Steinmetz MD, Regli EV, Olivier RE, Balandsard G (1994). In present, our works are concerned with the isolation of vitro antifungal activity of triterpenoid saponins. Planta Med. 60:50- pure compounds from different extracts of C. bernieri and 53. the elucidation of their structures in order to better Fong EHS, Tin-Wa M, Farnsworth NR Dobberstein RH (1977). Phytochemical screening methods. Rev. Department of evaluate their pharmacological activity. pharmacognosy and pharmacology. College of pharmacy. University In view of later therapeutic use of C. bernieri, study on of Illinois. various experimental models of animals is also on going Govindappa M, Bharath N, Shruthi HB, Sadananda TS, Sharanappa P to assess the harmful effects it might have. (2011). Antimicrobial, antioxidant and in vitro antiinflammatory activity and phytochemical screening of Crotalaria pallida Aiton. Afr. J. Pharm. Pharmacol. 5(21):2359-2371. Kouitcheu LBM, Tamesse JL, Kouam J (2013). 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ABSTRACT

In order to exploit the toxic and pharmacological properties of the Crotalaria species (Fabaceae) present in Madagascar, ethnobotanical surveys were conducted in the Central, Eastern and Western areas of the island in order to collect all informations related to the species encountered, in particular their medicinal properties, their toxicity and their possible other uses. These surveys enabled us to identify and harvest 23 species of which 7 endemic, 8 native and 8 introduced. Preliminary chemical, biological and toxicological studies on these different Crotalaria species were conducted to select a species with interesting properties for conducting further investigations. Among the 23 species studied, C. bernieri, a medicinal plant from Madagascar, was found to be particularly effective. Ethnobotanical surveys revealed that the leaves are used to treat diarrhea and stomachaches. The qualitative phytochemical screening carried out on the powder of various organs (leaves, seeds, pods, roots) of the plant revealed the presence of very varied secondary metabolites. Alkaloids, flavonoids, tannins and polyphenols were the majority compounds. The leaf methanolic extract (LME), obtained by lixiviation with hexane, ethyl acetate and methanol, was tested on animals and microorganisms. It was purified by fractionation and chromatography methods. The results showed that alkaloids were mainly the compounds responsible for the toxic activity in mice and microorganisms. LME is weakly toxic to mice by oral and subcutaneous routes but very toxic by intraperitoneal route (ip route). With an LD50 equal to 43.57 mg/kg, it caused symptoms suggesting an attack of nervous, respiratory and cardiovascular systems and lesions in lungs, kidneys, liver, and intestine, characterized by vasodilation, an inflammatory infiltrate consisting of neutrophils, necrosis and edema. It did not affect renal and hepatic functions at a dose of 28.56 mg/kg/day for 30 days.

LME was also toxic to aquatic animals: its LC50 was estimated at 16.96 μg/ml and 52.59 μg/ml, respectively for fishes (Cyprinus carpio) and frog tadpoles (Ptychadena mascareniensis). On the other hand, it showed no toxic activity on fleas (Xenopsylla cheopis) and chicks (Gallus gallus). On the microorganisms, LME exerted a bactericidal and fungicidal effect against P. mirabilis, B. cereus, C. perfringens, C. albicans and C. guilliermondii. Its MIC varied from 0.04 to 25 mg/ml. Concerning the different purified fractions, they showed a bactericidal or fungicidal action on all the bacterial and yeast strains tested. Their MIC ranged from 0.005 to 6.25 mg/ml. AT2 and AT2a were the most effective against B. cereus, S. pyogenes and C. albicans (MIC = 0.005 mg/ml) and AT5 the least effective on S. pyogenes (MIC = 6.25 mg/ml). These results demonstrated the strong potentiality of C. bernieri as a source of natural antimicrobial molecules in particular, at least their performance equal to that of synthetic antibiotics. The chemical investigation of the total alkaloids (EAT) of leaves of C. bernieri led to the isolation and characterization of three chemical constituents: a flavonoid, 2''-O-α-rhamnoside vitexin, and two alkaloids named sphaerophysin and cyclocrotalarin of which the latter is original. These three compounds have been found for the first time in the genus Crotalaria. The toxic and pharmacological properties of C. bernieri could therefore be exploited for useful purposes, particularly in the fight against pests such as rodents and the development of new therapeutic antimicrobial alternatives. Key words: Crotalaria; C. Bernieri; medicinal plants, leaves, methanolic extract, toxicity, alkaloids, antimicrobial activities.

RESUME

Dans le but d’exploiter les propriétés toxiques et pharmacologiques des espèces de Crotalaria (Fabaceae) présentes à Madagascar, des enquêtes ethnobotaniques ont été conduites dans le domaine du Centre, de l’Est et de l’Ouest de l’Ile afin de collecter toutes les informations relatives aux espèces rencontrées, notamment leurs vertus médicinales, leur toxicité et leurs éventuelles autres utilisations. Ainsi, 23 espèces dont 7 endémiques, 8 natives et 8 introduites ont été recensées et collectées. Des études chimiques, biologiques et toxicologiques préliminaires sur ces différentes espèces de Crotalaria ont été réalisées afin de sélectionner une espèce possédant des propriétés intéressantes pour la conduite des investigations plus approfondies. Parmi les 23 espèces étudiées, C. bernieri, une plante médicinale de Madagascar, s’est montrée particulièrement performante vis-à-vis des organismes testés. Les enquêtes ethnobotaniques ont révélé que les feuilles de cette plante sont utilisées pour soigner les diarrhées et les maux de ventre. Le criblage phytochimique qualitatif réalisé sur la poudre de différents organes (feuilles, graines, cosses, racines) de la plante a révélé la présence des métabolites secondaires très variés mais les alcaloïdes, flavonoïdes, tanins et polyphénols étaient les composés majoritaires. L’extrait méthanolique de feuilles (EMF), obtenu par lixiviation par l’hexane, l’acétate d’éthyle puis le méthanol, a été utilisé pour les investigations sur les animaux et les microorganismes. Il a été purifié par des méthodes de fractionnement et de chromatographie bioguidées par des tests sur souris et microorganismes. Les résultats ont montré que les alcaloïdes étaient surtout les composés responsables de l’activité toxique sur les souris et les microorganismes. L’EMF est faiblement toxique pour la souris par voies orale et sous cutanée mais très toxique par voie ip. Avec une DL50 égale à 43,57 mg/kg par voie ip, il provoque des symptômes qui suggèrent une atteinte du système nerveux, respiratoire et cardio-vasculaire et des lésions au niveau des organes épurateurs (poumons, reins, foie, intestin), caractérisées par une vasodilatation, un infiltrat inflammatoire constitué de polynucléaires neutrophiles, des foyers œdémateux et nécrotiques. Il n’affecte pas les fonctions rénale et hépatique à la dose de 28,56mg/kg/j pendant 30 jours.

L’EMF est également toxique pour les animaux aquatiques : sa CL50 est estimée à 16,96 µg/ml et 52,59µg/ml, respectivement pour les alevins de poisson (Cyprinus carpio) et les têtards de grenouille (Ptychadena mascareniensis). Par contre, il n’a montré aucune activité toxique sur les puces (Xenopsylla cheopis) par contact et les poussins (Gallus gallus) aussi bien par voie orale que par voie ip. Sur les microorganismes, l’EMF exerce un effet bactéricide et fongicide contre P. mirabilis, B. cereus, C. perfringens, C. albicans et C. guilliermondii. Sa CMI variait de 0,04 à 25 mg/ml. Les différentes fractions purifiées ont montré une action bactéricide ou fongicide sur toutes les souches bactériennes et levuriennes testées. Leurs CMI variaient de 0,005 à 6,25 mg/ml. AT2 et AT2a étaient les plus efficaces contre la croissance de B. cereus, S. pyogenes et C. albicans (CMI = 0,005 mg/ml) et AT5 le moins efficace sur la croissance de S. pyogenes (CMI = 6,25 mg/ml). Ces résultats démontrent la forte potentialité des extraits de C. bernieri comme source de molécules antimicrobiennes naturelles. Leur activité est au moins similaire à celle des antibiotiques de synthèse. L’investigation chimique des alcaloïdes totaux (EAT) des feuilles de C. bernieri a conduit à l’isolement et à la caractérisation de trois constituants chimiques : un flavonoïde appelé 2''-O-α- rhamnoside vitexine, deux alcaloïdes nommés sphaerophysine et cyclocrotalarine. La cyclocrotalarine est une nouvelle molécule. Ces trois composés ont été décrits pour la première fois dans le genre Crotalaria. Les propriétés toxiques et pharmacologiques de C. bernieri pourraient donc être exploitées à des fins utiles notamment dans la lutte contre les animaux nuisibles tels que les rongeurs et le développement des nouvelles alternatives thérapeutiques antimicrobiennes.

Mots clés : Crotalaria ; C. bernieri ; plantes médicinales, feuilles, extrait méthanolique, toxicité, alcaloïdes, activités antimicrobiennes.