AISLAN CRISTINA RHEDER FAGUNDES PASCOAL
Campomanesia adamantium e Campomanesia guaviroba: fitoquímica e estudo in vitro e in vivo visando à determinação da atividade biológica e toxicidade.
CAMPINAS 2015
ii iii
iv
v
vi RESUMO
O Brasil, dispondo de uma flora rica e diversificada, é uma potencial fonte de novas substâncias com atividade farmacológica e com menos efeitos colaterais. Neste trabalho realizou-se o estudo fitoquímico e a avaliação do potencial antiproliferativo in vitro e atividade antitumoral in vivo, atividade antinociceptiva e anti-inflamatória de
Campomanesia adamatium, típica do bioma Cerrado e de Campomanesia guaviroba, encontrada em áreas de Mata Atlântica. Preparou-se o extrato bruto etanólico a partir das folhas das espécies vegetais, realizou-se o fracionamento por extração líquido-líquido e o isolamento de alguns constituintes químicos por métodos cromatográficos. Determinou- se o conteúdo de fenólicos totais solúveis e de flavonóides totais por ensaios colorimétricos, a análise do perfil químico por ESI-MS/MS e a quantificação de compostos fenólicos por UHPLC-MS nos extratos e frações. Foi possível identificar:
ácido gálico, 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona, 2’,4’-dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’- metoxi-chalcona, miricitrina e quercetina em C. guaviroba e ácido gálico, 2’,4’- dihidroxi-6’-metoxichalcona (cardamonin), 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona, quercetina, quercitrina e miricitrina em C. adamantium e isolar dois compostos de C. adamantium, cardamonin e miricitrina. Extratos e frações apresentaram atividade antiproliferativa in vitro frente a algumas linhagens celulares tumorais e a fração diclorometânica de C. guaviroba apresentou baixa toxicidade aguda in vivo e atividade antitumoral in vivo. As frações diclorometânicas de C. adamantium e C. guaviroba apresentaram atividades antinociceptiva e antiedematogênica, semelhantes ao controle positivo Indometacina. Assim, este trabalho demonstrou o potencial farmacológico dessas espécies como a confirmação da presença de compostos fenólicos nesses extratos.
vii
viii ABSTRACT
Brazil, featuring a rich and diverse flora, is a potential source of new substances with pharmacological activity and fewer side effects. This work was carried out to evaluate the in vitro anti-proliferative potential, in vivo antitumoural activity in a solid- tumor Erlich model and in vivo antinociceptive and anti-inflammatory activity of
Campomanesia adamatium, typical of the Cerrado biome, and Campomanesia guaviroba, found in the Atlantic Forest. A crude ethanol crude extract of the leaves was prepared and a liquid-liquid partition was performed. Quantification of total phenolic compounds and flavonoids was determined by colorimetric assays. The chemical profile was determined by ESI-MS/MS and compounds quantified by UHPLC-MS. The extracts and fractions of these species have phenolic substances, including flavonoids and the analysis by ESI-
MS/MS and UHPLC-MS allowed the identification of gallic acid, 2',4'-dihydroxy-5'- methyl-6'-methoxichalcone, 2',4'-dihydroxy-3',5'-dimethyl-6'-methoxichalcone, quercetin and miricitrin in C. guaviroba and gallic acid, 2 ', 4'-dihydroxy-6'-methoxichalcone, 2',
4'-diidroxi-5'-methyl-6'-methoxichalcone, quercetin, quercitrin and miricitrin in C. adamantium. It was possible to isolate two compounds from C. adamantium, cardamonin and miricitrin. The extracts and fractions exhibited antiproliferative activity in vitro against some tumor cell lines and the dichlorometanic fraction of C. guaviroba showed low acute toxicity and antitumor activity in vivo. The evaluation of the anti-inflammatory and antinociceptive activities of the dichlorometanic fractions of C. adamantium and C. guaviroba showed similar activities to the positive control indomethacin. Thus, this work demonstrated the pharmacological potential these species as confirmation of the presence of phenolic compounds in these extracts.
ix
x ÍNDICE
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS xviii LISTA DE FIGURAS xix LISTA DE TABELAS xxi 1. INTRODUÇÃO 23 2. REVISÃO DA LITERATURA 28 2.1. Família Myrtaceae 28 2.2. Câncer 32 2.3. Plantas e quimioterápicos 34 2.4. Inflamação 34 2.5. Plantas e anti-inflamatórios 47 3. OBJETIVOS 52 4. MATERIAL E MÉTODOS 53 4.1. Coleta e identificação do material vegetal 53 4.2. Preparação dos extratos brutos 53 4.3. Fracionamento dos extratos brutos 53 4.4. Análise do teor de fenólicos solúveis totais dos extratos e frações 54 4.5. Análise do teor de flavonoides totais (flavonóis e flavonas) dos extratos e 55 frações 4.6. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS 56 4.7. Quantificação por UHPLC–MS 56 4.8. Isolamento e identificação dos constituintes químicos 57 4.9. Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa frente a linhagens tumorais 59 e linhagem não tumoral 4.10. Análises da expressão dos genes TNF-α e NF-kB1 em cultura de células de 61 câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) 4.11. Análises da fragmentação do DNA por citometria de fluxo em cultura de 62 células de câncer pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) 4.12. Ensaios in vivo com as frações dos extratos etanólicos brutos de C. 63 guaviroba e C. adamantium 4.12.1. Animais 64 4.12.2. Avaliação da toxicidade aguda 64 4.12.3. Ensaios para avaliação da atividade antitumoral em tumor sólido de 64
xi Ehrlich 4.12.4. Ensaios para avaliação do potencial antinoceptivo e anti-inflamatório 67 4.12.4.1. Teste de contorções abdominais 67 4.12.4.2. Edema de pata induzido por carragenina em camundongos 68 4.13. Análises estatísticas 69 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 70 5.1. Estudo fitoquímico 70 5.1.1. Fracionamento dos extratos brutos 70 5.1.2. Análise do teor de fenólicos solúveis totais e de flavonoides totais 70 5.1.3. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS 72 5.1.4. Quantificação por UHPLC–MS 75 5.1.5. Isolamento e identificação dos constituintes químicos 77 5.2. Avaliação do potencial antiproliferativo e antitumoral 83 5.2.1. Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa frente a linhagens 83 tumorais e linhagem não tumoral 5.2.2. Análises da expressão dos genes TNF-α1 e NF-kB1 em cultura de células 94 de câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) 5.2.3. Análise por citometria de fluxo da fragmentação do DNA em cultura de 99 células 5.2.4. Avaliação da toxicidade aguda 102 5.2.5. Ensaios em tumor sólido de Ehrlich 104 5.3. Avaliação do potencial antinoceptivo e anti-inflamatório in vivo 113 5.3.1. Atividade antinociceptiva 113 5.3.2. Atividade anti-edematogênica induzida por carragenina 115 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 120 7. PERSPECTIVAS 123 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 124 9. ANEXOS 150
xii
Dedico este trabalho ao meu melhor amigo, companheiro fiel, meu marido, Vinicius e ao meu tesouro, meu filho João Gabriel.
xiii
xiv AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a Nossa Senhora Aparecida por me darem forças nos momentos difíceis e por terem colocado no meu caminho pessoas que fizeram diferença neste meu aprendizado.
Obrigada Professor Dr. Marcos José Salvador por lá em 2008 ter me aceitado em seu grupo de pesquisa e me dado a oportunidade de seguir com meus estudos e sempre me incentivar quando propunha experimentos e mais experimentos, por nunca “podar” meus anseios.
Ao meu maior incentivador, Vinicius Pascoal, meu marido, que sempre compra minhas ideias, e me ajuda com suas opiniões e discussões sobre meus resultados. Ao meu filho, João Gabriel, luz da minha vida, que traz uma alegria estonteante para cada dia e que chegou bem juntinho do início do doutorado e que me mostrou que minha capacidade de conciliar vida profissional e meu papel de mãe. Vocês são meus tesouros! À minha mãe por me ajudar quando precisei, quando ela brincava com João para eu preparar seminários, estudar para as provas, etc.
Agradeço a todos da divisão de Farmacologia e Toxicologia do CPQBA e especialmente à Paula, Ana Lúcia e João Ernesto. Paula obrigada por me ensinar a lidar com os animais com toda a paciência do mundo e Aninha por sempre me ajudar quando precisei, tirando minhas dúvidas.
Begona e Professora Alexandra obrigada por toda ajuda! Rebeka Tomasin muito obrigada sempre! A todos do laboratório Multiusuário de Pesquisa Biomédica por me receberem tão bem e a disponibilidade de me ajudar, especialmente à Kelly, Thiago e à minha fiel “escudeira” Mariana, que pensei que ia me abandonar de tanto trabalho, mas
xv ela persistiu. Priscila e Professora Elan obrigada pela ajuda com os histopatológicos e
Professor Léo por me ensinar com a gavagem dos animais, fazer mil perguntas nas apresentações e suas opiniões. Além de toda ajuda no meu trabalho, obrigada a todos por nossas conversas, pela boa convivência diária, pelos jogos da copa.
Agradeço à FAPESP, CNPq, CAPES, FAEPEX-UNICAMP e Proppi-UFF pelo suporte financeiro.
A todos que passaram pela minha vida nesses anos deixando meus dias melhores e colaboraram de uma maneira ou outra para meu trabalho, muito obrigada!
xvi LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
a.C. antes de Cristo AAS ácido acetilsalicílico AINES anti-inflamatórios não esteroidais Ca5 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona Ca6 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona C13 Carbono 13 Cae Extrato etanólico bruto de Campomaesia adamantium Caeb Fração butanólica do extrato etanólico bruto de C. adamantium Caed Fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de C. adamantium Caeh Fração hexânica do extrato etanólico bruto de C. adamantium Caehi Fração hidroalcóolica remanescente do extrato etanólico bruto de C. adamantium Cge Extrato etanólico bruto de Campomaesia guaviroba Cgeb Fração butanólica do extrato etanólico bruto de C. guaviroba Cged Fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de C. guaviroba Cgeh Fração hexânica do extrato etanólico bruto de C. guaviroba Cgehi Fração hidroalcóolica remanescente do extrato etanólico bruto de C. guaviroba COX ciclo-oxigenase dC depois de Cristo ESI-MS/MS Electrospray Ionisation tandem mass spectrometry FFM Febre familiar do mediterrâneo H Hidorgênio HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HMQC HeteronuclearMultiple-Quantum Correlation IC inibição de crescimento IL-1 Interleucina-1 kV Quilovolt LOX lipo-oxigenase LT Leucotrienos
xvii m/z relação massa/carga MeOH-D Metanol deuterado MHz Mega Hertz MS Espectrometria de massas NCI Instituto Nacional do Câncer NF-kB factor nuclear kappa B nm Nanômetro ºC graus Celsius PN Produtos naturais ppm partes por milhão RMN ressonância magnética nuclear RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SN-38 7-etil-10-hidroxicamptotecina TMS Tetrametilsilano TNF-α Fator de Necrose Tumoral α UHPLC Ultra high performance liquid chromatography V Volt v/v volume/volume
xviii LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Substâncias isoladas de Taxus brevifolia. 37 Figura 2. Alcaloides da Vinca. 39 Figura 3. Estrutura química da camptotecina e derivados. 41 Figura 4. Estrutura química da podofilotoxina e derivados. 43 Figura 5. Esquema do fracionamento dos extratos etanólicos brutos das folhas de Campomanesia adamantium e Campomanesia guaviroba. 54 Figura 6. Esquema do ensaio da avaliação antitumoral do modelo de tumor sólido 65 de Ehrlich. Figura 7. Esquema do ensaio da avaliação da atividade antitumoral do modelo 66 sólido de Ehrlich, animais tratados via oral. Figura 8. Esquema do ensaio de avaliação da atividade antinociceptiva induzida por 66 ácido acético. Figura 9. Esquema do ensaio da avaliação anti-edetamotênica induzido por 69 carragenina. Figura 10. Estruturas das substâncias identificadas no extrato bruto etanólico das folhas de Campomanesia guaviroba e/ou Campomanesia adamantium e em suas frações. 74 Figura 11. Substância 5,7,3’,4’,5’-pentahidroxi-flavonol-3-O--L-ramnosídeo isolada e identificada na fração butanólica das folhas de C. adamantium. 78 Figura 12. Substância 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona isolada e identificada da fração butanólica das folhas de Campomanesia adamantium. 81 Figura 13. Gráfico da atividade antiproliferativa de C. guaviroba (Cge) e suas frações (Cgeh, Cged, Cgeb e Cgehi) e o quimioterápico doxorrubicina 85 Figura 14. Gráfico da atividade antiproliferativa de C. adamantium (Cae) e suas frações (Caeh, Caed, Caeb e Caehi) e o quimioterápico doxorrubicina. 88 Figura 15. Gráfico da atividade antiproliferativa de quercetina, quercitrina, miricitrina e ácido gálico. 91 Figura 16. Gráfico da atividade antiproliferativa das chalconas Ca5 e Ca6 e o quimioterápico doxorrubicina. 93 Figura 17. Análise de expressão do gene TNF-α1 por PCR em Tempo Real das células NCI-H460. 96 Figura 18. Análise de expressão do gene NF-kB1 por PCR em Tempo Real das células NCI-H460. 99 Figura 19. Porcentagem de células NCI-H460 com DNA fragmentado por análise em citômetro de fluxo. 102 Figura 20. Desenvolvimento do tumor (mL) dos animais tratados via intraperitoneal. 106 Figura 21. Evolução do tumor (mL) dos animais tratados via intraperitoneal. 108 Figura 22. Avaliação do volume do tumor dos animais tratados via oral. 110 Figura 23. Número de contorções abdominais dos animais em tratamento. 114 Figura 24. Evolução do aumento em porcentagem da espessura da pata dos animais em tratamento. 116 Figura 25. Evolução do aumento em porcentagem da espessura da pata dos animais em tratamento. 117
xix
xx LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Constituintes químicos não-voláteis e atividades biológicas descritos na literatura para espécies do gênero Campomanesia (Myrtaceae). 31 Tabela 2. Conteúdo de fenólicos solúveis totais e de flavonoides totais do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e de suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e solução hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e solução hidroalcoólica remanescente (Caehi). 72 Tabela 3. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia guaviroba e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) por ESI-MS/MS. 73 Tabela 4. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcoólica remanescente (Caehi) por ESI-MS/MS. 74 Tabela 5. Substâncias quantificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcoólica remanescente (Caehi) e Campomanesia guaviroba e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e hidroalcóolica remanescente (Cgehi) por UHPLC-MS. 77 Tabela 6. Dados de RMN de 1H (200 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade, J, em Hz) e de RMN de 13C (50 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade) para o flavonóide Caeb31. 80 Tabela 7. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e controle positivo doxorrubicina. 86 Tabela 8. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e de suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Caehi) e controle positivo doxorrubicina. 89 Tabela 9. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL das substâncias identificadas nos etanólico bruto das folhas de C. guaviroba e C. adamantium e de suas frações (quercetina, quercitrina, ácido gálico) assim como o composto isolado Caeb31 (miricitrina) e controle positivo doxorrubicina. 92
xxi
Tabela 10. Valores de concentração que leva à inibição de 100% do crescimento celular (TGI) em µg/mL da chalcona isolada de C. adamantium (Ca5 - 2’,4’- dihidroxi-6’-metoxichalcona) e a chalcona identificada em C. guaviroba (Ca6- 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona) e controle positivo doxorrubicina. 94
xxii 1. INTRODUÇÃO
Os produtos naturais têm sido utilizados na medicina popular ao longo dos séculos para o tratamento de inúmeras doenças. As plantas, especialmente, têm demonstrado um papel importante no desenvolvimento da medicina tradicional (Cragg et al., 2009). Registros na Mesopotâmia de 2600 anos a.C. documentam o uso de mais de
1000 derivados de plantas e muitos ainda são usados nos dias atuais no tratamento de tosses, resfriados, parasitas e processos inflamatórios (Borchardt, 2002). Atualmente, os medicamentos usados na terapia de inúmeras doenças são derivados direta ou indiretamente de vegetais, micro-organismos, organismos marinhos, vertebrados e invertebrados terrestres (Newman et al., 2000; Chin et al., 2006). Estudos demonstram que medicamentos derivados de produtos naturais são capazes de tratar 87% das enfermidades humanas, como as atividades antibacteriana, anticoagulante, imunossupressora e anticancerígena (Newman et al., 2003).
Analisando os medicamentos lançados entre os anos de 1981 a dezembro de 2010,
4,72% são medicamentos com princípios ativos isolados de produtos naturais enquanto
28,56% são produtos totalmente sintéticos. Porém, observando a origem dos outros produtos, 41,86% são moléculas de semi-síntese ou fármacos sintéticos com grupos farmacofóricos baseados em estruturas de produtos naturais (Newman et al., 2012). Dos
51 medicamentos anti-inflamatórios, nenhum foi isolado de plantas ou outra origem natural, 37 foram desenvolvidos a partir de síntese e 13 derivados de produtos naturais, especialmente pela semi-síntese e 1 produto biológico (derivado de proteína). Entre os
128 medicamentos anticâncer lançados no mesmo período, 12 eram produtos naturais
23 inalterados, 32 derivados de produtos naturais, 20 totalmente sintéticos e 35 semi- sintéticos ou que mimetizam o produto natural (Newman et al., 2012),
Recursos naturais com atividade anti-inflamatória são utilizados na medicina popular para o tratamento de febre, dor, enxaqueca e artrite ao longo da história. No início dos anos de 1800, o avanço nas pesquisas levou ao isolamento e identificação de bioativos puros, comumente referidos como produtos naturais (PN). Os primeiros compostos foram estricnina, morfina, atropina, quinina e colchicina (Cragg et al, 2014).
Em 1826, E. Merck desenvolveu o primeiro produto natural puro comercial, a morfina.
Este foi o início de uma nova era na medicina, onde fármacos poderiam ser purificadas a partir de plantas e administradas em dosagens precisas, independente da origem ou da idade do material vegetal (Newman et al., 2000; Cragg & Newman, 2001).
Em 30 dC, Celsius descreveu os quatro sinais clássicos da inflamação (calor, dor, rubor e tumor) e usava extratos de folhas da árvore Salgueiro para tratar esses sinais
(Vane & Botting, 1987). Por muitos anos, as plantas contendo salicilatos foram utilizadas terapeuticamente até que com o desenvolvimento das pesquisas científicas, levou-se desenvolvimento do produto final derivado do ácido salicílico, o ácido acetilsalicílico
(AAS ou Aspirina®) que foi lançada no mercado pela Bayer em 1899 e ainda é utilizada nos dias atuais (Zündorf, 1997). Outro exemplo de produto natural é a colchicina, alcaloide isolado de Colchicum autumnale, tem sido usada durante séculos na artrite gotosa aguda e nos últimos 50 anos ele tem sido empregado para um número crescente de doenças, como febre familiar do Mediterrâneo (FFM), esclerodermia, amiloidose e cirrose hepática (Ben-Chetrit & Levy, 1998). A quinina é outro alcaloide isolado de
Cinchona officinalis utilizado no tratamento da malária, que apresenta atividade
24 antipirética, anti-inflamatória e analgésica (Sangeetha et al., 2011). A medicina tradicional chinesa e Ayurveda fazem uso de muitas plantas medicinais com propriedades anti-inflamatórias e são usadas por milhares de pessoas. Portanto, as misturas de ervas ou os princípios ativos isolados são alvo de muitos estudos.
Os quimioterápicos de origem vegetal presentes na terapêutica são um incentivo
às pesquisas nesta área. A vincristina e vimblastina são bons exemplos de alcaloides, que foram isolados da Catharanthus roseus (L.) G. Don, conhecida também como Vinca, é utilizada pela população de Madagascar no tratamento de diabetes. Durante os testes de atividade hipoglicemiante, os extratos dessa espécie produziram granulocitopenia em consequência da supressão da medula óssea dos animais, sugerindo avaliação em modelos de leucemias e linfomas. Na atualidade, os medicamentos contendo vincristina ou vimblastina como fármacos são de grande utilidade no tratamento de linfoma de
Hodgkin, sarcoma de Kaposi, câncer de ovário e testículos e leucemia linfoblástica aguda infantil (Brandão et al., 2010). Espécies do gênero Podophyllum, tais como P. peltatum e
P. emodii, são utilizadas pelas populações nativas da América e da Ásia no tratamento do câncer de pele e verrugas. Estudos levaram ao isolamento da podofilotoxina, uma lignana ariltetralínica, da qual foram obtidos o etoposídeo e o teniposídeo, cujos estudos experimentais permitiram a introdução desses na terapia para o combate ao câncer
(Brandão et al., 2010). Em 2002, no bilionário mercado mundial farmacêutico, um terçodo lucro foi representado por apenas dois grupos de quimioterápicos derivados de produtos naturais, os taxanos e os derivados da camptotecina (Oberlis et al., 2004; Chin et al., 2006).
25 O Brasil, dispõe de uma flora rica e diversa, é uma potencial fonte de novas substâncias com atividade farmacológica e com menos efeitos colaterais. Assim, realizou-se o estudo fitoquímico e a avaliação do potencial farmacológico de
Campomanesia adamatium, típica do bioma Cerrado e de Campomanesia guaviroba, encontrada em áreas de Mata Atlântica. A família Myrtaceae, a qual o gênero
Campomanesia pertence, apresentam vegetais com importância alimentícia e medicinal, tais como Psidium guajava L. (goiabeira), Eugenia uniflora (pitangueira) e Eucalyptus
(eucalipto). Atividades biológicas descritas em Myrtaceae incluem as atividades anti- inflamatória, citotóxica, antinociceptiva e também de proteção da mucosa gástrica. Essas atividades, na maioria dos casos estão relacionadas com as atividades de flavonoides, que têm se mostrado eficaz em alguns casos (Sandhar et al., 2011).
Estudos com o gênero Campomanesia são recentes, entre os anos de 2004 e 2014, e foram descritas algumas atividades biológicas como potencial antinociceptivo, anti- inflamatório, protetor da mucosa gástrica e contra cepas de bactérias, fungos e protozoários (Markan et al., 2004; Bonilla et al., 2005; Cardoso et al., 2010; Brandelli et al., 2013; Ferreira et al., 2013; Michel et al., 2014). Para confirmar seu uso popular, estudos froam realiados com a espécie C. xanthocarpa, para confirmar seu uso popular, no tratamento de pacientes com hipercolesterolemia e os resultados demonstraram que pacientes que receberam esta espécie vegetal tiveram os níveis de colesterol total e LDL reduzido (Klafte et al., 2009). Com base em resultados anteriores em compostos fenólicos descritos no gênero, este trabalho se propôs avaliar o potencial antiproliferativo e anti-inflamatório em C. adamantium e C. guaviroba que são utilizadas na medicina popular. Em 2013, foi descrito a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de extratos
26 das folhas de C. adamantium cultivadas no estado de Minas Gerais (Ferreira et al., 2013) e estudos com extratos das folhas de C. guaviroba com potencial farmacológico e fitoquímico apresentados neste trabalho são inéditos, bem como a avaliação da atividade anticancer de fitoderivados das folhas de C. adamantium.
27 2. Revisão de literatura
2.1. Considerações gerais sobre a família Myrtaceae
De acordo com APG III (2009) Myrtaceae pertence a Família das Dicotiledôneas, localizada na ordem Myrtales, no grupo Rosídeas, na subclasse Malvidis. A família compreende 121 gêneros distribuídos em 3800-5800 espécies de arbustos e árvores, distribuídas pela Austrália, Sudeste Asiático, e da área tropical para o sul da América e com poucas espécies na África (Wilson et al., 2001). As características da família são: folhas com glândulas com óleos essenciais, e flores com ovário médio a inferior, estames geralmente numerosos, floema interno e pontuações nos vasos do xilema (Conti et al.,
1997; Wilson et al, 2001).
Estudos fitoquímicos realizados com algumas espécies de Myrtaceae mostraram a ocorrência de esteroides, terpenoides, óleos essenciais, flavonoides e taninos. O estudo de espécies de Mytaceae pode ser justificado pela diversidade estrutural dos constituintes químicos, complexidade taxonômica, importância alimentícia, medicinal e quanto às atividades biológicas: tais como anti-iflamatória, cicatrizante, anti-séptica, antidiarreica, antiulcerogênica, antioxidante e antimutagênica (Lorenzi & Abreu Matos, 2002; Di Stasi
& Hiruma-Lima, 2002; Gonçalvez et al., 2005; Donatini et al., 2009; Neri-Numa et al.,
2013). Os óleos essenciais de algumas Myrtaceae foram caracterizados quimicamente e avaliados quanto as atividades biológicas, sendo que na maioria das espécies estudadas, os óleos essenciais apresentaram principalmente atividade antifúngica e antibacteriana.
Em alguns casos, há também relato de óleos essenciais de Myrtaceae com promissora atividade citotóxica, larvicida e antioxidante (Stefanello et al., 2011).
28 O gênero Campomanesia, a que pertence às espécies em estudo, está incluído na subfamília Myrtoideae (Cronquist, 1968; Landrun, 1986). As espécies desse gênero possuem diversificada importância econômica. Seus frutos comestíveis são consumidos por várias espécies de pássaros e mamíferos, sendo também usados na produção de doces caseiros, sorvetes, aguardente, licores e refrescos. É conhecida como “gabiroba” e utilizada popularmente como antidiarréico e antisséptico das vias urinárias (Piva, 2002).
Há alguns estudos químicos e avaliação de atividade biológica in vitro e in vivo relacionada com a espécie C. adamantium. Suas folhas e cascas são usadas na medicina popular como antiinflamatórias, antidiarréicas, anti-sépticas das vias urinárias e para o tratamento da gripe (Coutinho et al., 2008; Pavan et al., 2009; Pascoal et al., 2011a). A atividade antioxidante dos extratos de C. adamantium foi avaliada pelo método do DPPH e cinco flavanonas e três chalconas foram isoladas do extrato alcoólico das folhas deste vegetal (Coutinho et. al., 2008). A atividade antituberculose também foi avaliada frente ao microrganismo Mycobacterium tuberculosis do extrato dos frutos de C. adamantium, resultados esses que demonstraram a capacidade destes extratos de inibir o crescimento deste microorganismo em concentrações variando de 7,8 a 62,5 µg/mL (Pavan et al.,
2009). A atividade antioxidante foi também avaliada pelo método ORACFL e quatro flavonóis e três chalconas foram identificados no extrato bruto de C. adamantium, coletada em Curitiba (PR), Brasil (Pascoal et al., 2011a). As folhas desta espécie foram avaliadas quanto a sua atividade anti-inflamória e antinociceptiva in vitro e in vivo e os flavonóides quercitina, miricetina e miricitrina foram os constituintes identificados neste trabalho (Ferreira et al., 2013).
29 Quanto à C. guaviroba, estudos com o óleo essencial de suas folhas relataram a atividade antiproliferativa desta espécie frente a linhagens celulares de leucemia (Pascoal et al., 2011b). Porém, até o presente momento, não foram encontrados relatos de trabalhos na literatura acerca das propriedades farmacológicas com os contituíntes não- voláteis. Nas duas espécies em estudo não há relatos na literatura trabalhos sobre a atividade antiproliferativa em linhagens celulares tumorais in vitro e atividade antitumoral em modelos animais in vivo. A tabela 1 sumariza os constituintes químicos não-voláteis e atividades biológicas documentados em literatura para espécies do gênero
Campomanesia (Myrtaceae).
30 Tabela 1. Constituintes químicos não-voláteis e as atividades biológicas descritas na literatura para espécies do gênero Campomanesia (Myrtaceae). Espécie Parte da planta Atividades biológicas Substâncias identificadas ou Referência isoladas C. adamantium folhas in vivo anti-inflamatória e quercetina, miricitrina e miricetina. Ferreira et al., 2013 antinociceptiva C. adamantium frutos antimicrobiana 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavanona, Cardoso et al., 2010 5,7-dihidroxi-6-metilflavanona, 5,7- dihidroxi-8- metilflavanona, 5,7-dihidroxi-6,8- dimetilflavanona, 2’,4’-diidroxi-6’- metoxichalcona e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona
C. adamantium frutos anti- Mycobacterium 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavavona, Pavan et al., 2009 tuberculosis 5,7-diidroxi-6-metilflavanona, 5,7-diidroxi- 8- metilflavanona, 5,7-diidroxi-6,8- dimetilflavanona, 2’,4’-diidroxi-6’- metoxichalcone e 2’,4’- diidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona
C. adamantium frutos anti-inflamatória, anti- 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavavona, Souza et al., 2014 hiperalgésico e antidepressiva. 5,7-diidroxi-6-metilflavanona, 5,7- dihidroxi-8- metilflavanona, 5,7-dihidroxi-6,8- dimetilflavanona, 2’,4’-dihidroxi-6’- metoxichalcone e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona
C. adamantium folhas atividade antioxidante isoquercetrina, miricetina, quercitrina, Pascoal et al., 2011a quercetina, 2’,4’-dihidroxi-6’- metoxichalcona, 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’- metoxichalcona e 2’,4’-dihiroxi-3’,5’-dimetil-6’- metoxichalcona
C. eugenioides folhas anti- Staphylococcus aureus, C. ND Moura-Costa et al., albicans, C. parapsicoides, C. 2012 tropicalis, Leishmania amazonensis, HSV-1, Polivírus
C. lineatifolia sementes atividade antimicrobiana champanonas A, B e C Bonilla et al., 2005
C. lineatifolia folhas atividade antioxidante e quercitrina, catequina Madalosso et al., prevenção de ulcerações 2012 gástricas em ratos
C. pubescens frutos atividade antimicrobiana 7-hidroxi-5-metoxi-6-metilflavanona, Cardoso et al., 2010 5,7-dihidroxi-6-metilflavanona, 5,7- diidroxi-8-metilflavanona, 5,7-dihidroxi- 6,8-dimetilflavanona, 2’,4’-dihidroxi-6’- metoxichalcona e 2’,4’- dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcone C. velutina folhas Atividade anti-inflamatória e miricitrina Michel et al., 2013 atinoceptiva C. xanthocarpa frutos atividade antimicrobiana caracterização de flavonóides, saponinas e Souza-Moreira et al., taninos 2011
C. xanthocarpa folhas Redução dos níves de colesterol caracterização de flavonóides, saponinas e Klafke et al., 2010 total e LDL em pacientes e taninos e terpenos atividade antioxidante in vitro
C. xanthocarpa folhas anti-Trichomonas vaginalis ND Brandelli et al., 2013
C. xanthocarpa folhas hipoglicêmica e controle de peso ND Biavatti et al., 2004 in vivo C. xanthocarpa folhas gastroprotetora caracterização de flavonóides, saponinas e Markman et al., 2004 taninos
*ND: não foram detectados relatos em literatura
31 2. Câncer
O câncer é o termo utilizado para descrever um conjunto de mais de 100 doenças que se caracterizam por um crescimento descontrolado e podendo invadir tecidos adjacentes ou ainda podem cair na corrente sanguínea ou linfática, levando a formação de tumores secundários em diferentes partes do organismo (INCA, 2014; WHO, 2013a).
Suas causas são variadas, podendo ser externas (radiações, vírus e xenobióticos) e internas (predisposição genética, desequilíbrio hormonal e deficiências do sistema imunológico) (Lopes et al., 2002).
O câncer pode levar anos para se desenvolver a partir de uma célula normal, sendo que apresentam um microambiente com caracteríticas como a perda de contato célula-célula, promoção de crescimento inadequado, a senescência, hipóxia, acidose, isquemia, entre outros (Gatenby & Gillie, 2008; Vendramini-Costa & Carvalho, 2012).
A iniciação do tumor a partir de uma célula normal envolve alterações irreversíveis no DNA ocasionada por carcinógenos, que ativam oncogenes e/ou inativação genses supressores de tumor. Em seguida, ocorre a promoção do tumor por agentes promotores, como estrogênio, progesterona, agentes infecciosos como o vírus da hepatite B e C, Helicobacter pylori, agentes químicos, como o tabaco e inflamação crônica, que levam ao aumento de divisões das células mutadas e reduz o processo de morte celular. A fase seguinte é a progressão do tumor, em que há um aumento da massa tumoral, invasão de tecidos e metástases, e acúmulo de novas mutações que podem deixá-lo mais agressivo e não responsivo às terapias disponíveis (Coussens & Werb,
2002; Karin & Greten, 2005; Weinberg, 2008; Vendramini-Costa & Carvalho, 2012).
32 Entre os anos de 2007 até 2030 está previsto um aumento de 45% no número de mortes por câncer no mundo. Estima-se que os novos casos na maioria dos países desenvolvidos, passem de 11,3 milhões em 2007 para 15,5 milhões em 2030. É a segunda maior causa de morte depois das doenças cardiovasculares, e evidências epidemiológicas apontam que essa é também uma tendência emergente no mundo menos desenvolvido
(WHO, 2013b). Importante causa de doença e morte no Brasil, desde 2003, as neoplasias malignas constituem-se na segunda causa de morte na população brasileira, representando quase 17% dos óbitos de causa conhecida, notificados em 2007 no Sistema de Informações sobre Mortalidade (INCA, 2014). O tratamento do câncer pode ser realizado por excisão cirúrgica, irradiação e quimioterapia, dependendo do tipo de tumor e do estágio de desenvolvimento da doença. A quimioterapia pode ser utilizada como terapia propriamente dita ou como adjuvante de outros tipos de tratamento (Rang et al.,
2012).
Segundo estimativas realizadas bianualmente, em 2014 são esperados aproximadamente 576 mil novos casos de câncer, incluindo os casos de pele não melanoma, reforçando a magnitude do problema do câncer no país. Os tipos mais incidentes de cânceres são os de pele não melanoma (182 mil casos novos), próstata (69 mil), mama (57 mil), cólon e reto (33 mil), pulmão (27 mil) e estômago (20 mil) e colo do útero (15 mil) (INCA, 2014).
As principais classes de fármacos usados na quimioterapia contra o câncer atualmente incluem os antimetabólitos, que inibem principalmente a síntese de purinas
(mercaptopurina, tioguanina, entre outros); agentes que inibem a formação de desoxirribonucleotídeos (hidroxiureia, fluoruracila); agentes que modificam o DNA por
33 alquilação (cisplatina); agentes que interagem com a topoisomerase II (bleomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, etoposídeo); agentes inibidores da síntese do RNA ou de proteínas (actinomicina D, vincristina e vimblastina) e os que interagem com a tubulina
(taxanos) (Brandão et al., 2010; Rang et al., 2012).
Entretanto, para todos os grupos de agentes antitumorais apresentados existe uma alta incidência de efeitos adversos associados à elevada toxicidade. Ainda, a eficácia desta terapia contra o câncer pode ser comprometida pela resistência aos fármacos disponíveis (MDR = multidrug resistence ou resistência a multifármacos). A multirresistência é uma condição em que as células cancerosas são protegidas dos efeitos tóxicos de diversos medicamentos contra o câncer, com diferentes estruturas químicas e modos de ação. A ocorrência da MDR é muito acentuada, o que obriga o clínico a optar por terapias de associação de dois ou mais fármacos (Jendiroba et al., 2002). A MDR clássica caracteriza-se por alterações no gene MDR1 que codifica a glicoproteína P, canal responsável pela entrada e saída do fármaco na célula tumoral e outras (Aggarwal et al.,
2006, Baguley, 2010). Outros mecanismos importantes de MDR incluem alterações na expressão e/ou síntese de enzimas-alvo (Beck, 1990), ativação ou degradação alterada do fármaco (Morrow & Cowan, 1990), reparo aumentado do DNA (Hammond et al., 1989) e falência dos processos de apoptose (Hannun, 1977; Liu et al., 2001). Deve-se destacar que alguns desses mecanismos de resistência a fármacos podem coexistir, promovendo um alvo tumoral refratário ao tratamento por fármacos (Teodori et al., 2002).
2.3. Plantas e quimioterápicos
Para a busca de compostos para o tratamento do câncer, centros de excelência em pesquisa desenvolveram programas de triagem para testar fármacos experimentais.
34 Como exemplo, nos Estados Unidos, o Instituto Nacional do Câncer (NCI), desde 1937 busca compostos potencialmente ativos para combater o câncer. Em 1955, o NCI formou uma organização para integrar recursos de laboratório com pesquisas clínicas visando o desenvolvimento de novos fármacos anticâncer (Cancer, 2014a).
As plantas e seus derivados deram um impulso aos medicamentos antineoplásicos. Taxus brevifolia é popularmente chamada de teixo do Pacífico ou teixo ocidental, é uma árvore da família de teixo (Taxaceae) e é encontrado do Alasca à
Califórnia. Esta planta pode chegar a 25 metros e do extrato da casca desta espécie foi isolado e identificado em 1971 por Wani e colaboradores o composto paclitaxel (1)
(Taxol®) (Figura 1), um diterpeno que mostrou uma potente atividade para o tratamento de certos tipos de câncer. A grande questão é que esta espécie cresce lentamente e leva em torno de 100 anos até que a casca seja colhida e para a extração de um quilo de taxol, precisa-se de cem toneladas de cascas de T. brevifolia, o que representa a utilização de cerca de 3000 árvores (Wani et al., 1971). Este fato levou ao desmatamento de populações selvagens e de espécies afins do gênero Taxus na tentativa de se obter paclitaxel (Encyclopaedia Britannica, 2014). Portanto, o uso de uma fonte natural para a obtenção desta substância teve de ser descartado, e a semi-síntese se tornou uma opção.
Em 1980, foi descoberto que o paclitaxel age estabilizando microtúbulos (Schiff &
Horwitz, 1980) e só em 1992, o paclitaxel foi aprovado pela FDA (Food and Drug
Administration) (FDA, 2014).
Os extratos obtidos a partir de folhas da espécie Taxus baccata, conduziu ao isolamento da molécula de 10-desacetilbacatina III (10-DAB), que possui a estrutura química semelhante à estrutra do paclitaxel e também apresentou atividade anticâncer
35 (Denis et al., 1988). Portanto, a 10-DAB poderia ser transformada em paclitaxel e seu análogo docetaxel (2) (Figura 1). A vantagem de se utilizar esta técnica de produção é que se evita a corte de plantas, já que as folhas são renováveis (Denis et al., 1988). Em
1994, foi desenvolvida a síntese total de taxol (Nicolau et al., 1994; Holton et al., 1994).
O taxol é o tratamento atual de escolha para o câncer de ovário, utilizado por via intravenosa e em combinação com outros fármacos anti-tumorais como a cisplatina ou carboplatina, nos casos em que o paciente apresenta metástases, e a cirurgia não é uma opção e tratamentos com terapias de platina padrão falharam (Thurston, 2007). Ele também é usado em câncer de pulmão de células não-pequenas, câncer de mama metastático e como terapia de segunda linha em pacientes com sarcoma de Kaposi
(Drugs, 2014a).
O docetaxel age através da ruptura dinâmica dos microtúbulos em células cancerígenas altamente mitóticas e é capaz de interferir com o crescimento e proliferação de células de câncer (Drugs, 2014b). Inicialmente, esse medicamento foi indicado para o tratamento de câncer de mama, mas pode ser usado no tratamento do câncer do pulmão de células não pequenas, também de certos tipos de câncer da cabeça e pescoço e estômago e em conjunto com outros medicamentos (prednisona) para tratar alguns tipos de câncer de próstata (Thurston, 2006; Drugs, 2014b). Com base em estudos com pacientes com câncer de mama, foi sugerido que o docetaxel é mais ativo do que o paclitaxel, por possuir uma meia-vida mais longa, a captação celular mais rápida e com maior retenção intracelular (Riou et al., 1994).
36
Figura 1. Substância isolada de Taxus brevifolia, paclitaxel (1) e seu análogo docetaxel
(2).
Catharanthus roseus (L.) G. Don (Apocynaceae) é uma planta nativa de
Madagascar, anteriormente descrita como Vinca rosea (L.), esta planta está espalhada por todo o mundo e é usada como planta ornamental (Van Bergen & Snoeijer, 1996). Na medicina popular, C. roseus é usado por seus efeitos como hipotensor, hipoglicemiante e por suas propriedades purgativas (Svoboda & Blake, 1975) além de seu principal uso é no tratamento de diabetes (Moudi et al., 2013). Os principais metabolitos secundários encontrados nestas espécies são taninos e alcaloides, e mais de 100 compostos têm sido descritos na literatura (Vega-Ávila et al., 2012). Estes alcaloides, que têm grande impacto econômico e terapêutico, são conhecidos como alcaloides da vinca, e entre eles, vinblastina (3), vincristina (4), vindesina (5), vinorelbina (6) (semi-sintética) e vinflunina
37 (7) são usados no tratamento de câncer (Figura 2). As propriedades antitumorais de C. roseus foram descobertas por dois grupos independentes na década de 1950. O mecanismo de ação dos alcaloides da vinca está associado ao bloqueio do ciclo celular, uma vez que estes compostos ligam-se aos microtúbulos, β-tubulina, que formam o fuso mitótico na célula, inibem a polimerização de microtúbulos no ciclo celular (Thurston,
2006). Vincristina é indicado para leucemia aguda, e também útil em combinação com outros agentes oncolíticos, no tratamento da doença de Hodgkin, linfomas malignos não-
Hodgkin, rabdomiosarcoma, neuroblastoma, e tumor de Wilms (Gragg et al., 2005;
Thurston, 2006). Vinblastina é um medicamento usado principalmente na quimioterapia do câncer de bexiga e de outras condições, tais como linfoma, câncer testicular, câncer de mama ou sarcoma de Kaposi (Gragg et al., 2005; Thurston, 2006).
38
Figura 2. Alcaloides da Vinca: vinblastina (3), vincristina (4), vindesina (5), vinorelbina
(6), a vinflunina (7).
Originária do sul da China, a Camptotheca acuminata é uma árvore cujos
extratos começaram a ser estudados na década de 1950. Na década de 1960, o
alcaloide camptotecina (8) (Figura 3) foi isolado a partir de 20 kg de amostra de
madeira e casca de C. acuminata (Wall et al., 1966). O uso clínico da camptotecina foi
limitado devido à baixa solubilidade em água e o NCI decidiu formular uma solução
intravenosa do sal de sódio da camptotecina, solúvel em água que pôde ser utilizado
em ensaios clínicos. Em 1996, dois análogos da camptotecina, topotecano (9) e
irinotecano (10), receberam a aprovação da FDA para serem usados contra câncer do
ovário, pulmão, mama e cólon.
39 A camptotecina inibe uma proteína nuclear, a topoisomerase I (Topo I), que é uma enzima essencial para os processos celulares, pois inibe a re-ligação de DNA de cadeia simples (Hsiang et al., 1985; Husain et al., 1994).
O topotecano é um composto semi-sintético hidrófilo, com um grupo N, N- dimetilaminometil em C9 que é responsável pela melhoria da solubilidade em água. O seu mecanismo de ação está baseado no fato de que este composto inibe a formação de
DNA na fase S do ciclo celular por inibição da topoisomerase I, que em seguida, impede a religação de ssDNA, afetando assim os processos de transcrição e de replicação (Staker et al., 2002). O topotecano é indicado para o tratamento de certos tipos de câncer de pulmão, de ovário e do colo do útero e tem demonstrado atividade favorável para o tratamento de metástases cerebrais (Wong & Berkenblit, 2004; Bruce et al., 2011). E irinotecano é um análogo semi-sintético da camptotecina, que é hidrolisado in vivo em a 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38), tornando-se um metabólito ativo (Thurston, 2006). SN-38 é 1000 vezes mais potente do que o irinotecano como um inibidor da topoisomerase I purificada in vitro (Rahier et al.,
2005). É indicado para o tratamento de câncer colorretal avançado e é mais comumente administrado em perfusão intravenosa. Além disso, irinotecano foi avaliado contra e câncer de pulmão de não-pequenas células e células-pequenas, câncer de ovário e câncer de colo uterino e está sendo testado em ensaios clínicos recentes envolvendo pacientes com gliomas malignos (Gragg et al., 2005; Thurston,
2006).
40 Figura 3. Camptotecina (8) e derivados: topotecano (9) e irinotecano (10).
Outro estudo buscando agentes antitumorais em plantas com sucesso foi o com
Podophyllum peltatum também chamado Mayflower ou Mandrake, é uma planta herbácea perene da família Berberidaceae, nativo do leste da América do Norte. Os rizomas secos são utilizados pelas suas propriedades medicinais no tratamento de verrugas genitais (Enciclopédia Britânica, 2014b). Podofilotoxina (11), um composto lignano, foi inicialmente isolado a partir de P. peltatum, e foi capaz de bloquear a mitose
(Loike & Horwitz, 1976; Loike et al., 1978). P. emodi (syn. P. hexandrum Royle) é nativa das altitudes mais baixas e os arredores do Himalaia, e é uma boa fonte de podofilotoxina, já que seu rendimento é maior que em P. peltatum. Ainda a podofilotoxina é também encontrado em outras espécies como Linum, Dasylinum e
Linopsis (Guerram et al., 2012).
41 Estudos demonstraram que os derivados da podofilotoxina apresentam moderrada atividade anticancerígena, mas por causa de seus efeitos tóxicos seu uso foi proibido em 1950 (Greenspan et al., 1950; Leiter et al., 1950). A empresa Sandoz
Pharmaceuticals iniciou estudos para síntese de derivados de podofilotoxina, em uma tentativa de se obter compostos anticancerígenos menos tóxicos. Em 1966 foi sintetizado o composto etoposídeo (12) e o posteriromente teniposido (13) em 1967, com maior atividade anti-neoplásica (Hande, 1998) (Figura 4).
O etoposídeo é utilizado para tratar o câncer de pulmão e dos testículos e atua sobre a enzima topoisomerase II, que está presente em todas as células. Esta enzima promove a quebra da cadeia dupla de DNA para que ocorra a sua duplicação. Devido à sua baixa solubilidade em água, foi desenvolvido o pró-fármaco fosfato de etoposídeo, e pode ser administrado de forma segura ao longo de períodos de curta duração (5-30 min), é farmacocineticamente equivalente ao etoposídeo e também possui toxicidade semelhante ao etoposídeo (Budman et al., 1994; Thompson et al., 1995; Kaul et al.,
1995; Schacter, 1996). O teniposídeo é um análogo de etoposido e é usado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda em crianças quando os tratamentos de primeira escolha não são bem sucedidos (Drugs, 2014c; Thurston, 2006).
42
Figura 4. Podofilotoxina (11) e derivados etoposídeo (12) e teniposídeo (13).
A dificuldade do tratamento de alguns tumores sólidos e a pesquisa de compostos capazes de interagir seletivamente com as células neoplásicas, impulsiona os estudos na busca de novos agentes quimioterapêuticos em plantas. Além da busca por fármacos novos mais eficazes, há também uma preocupação com a extinção de espécies que nunca foram avaliadas para atividades biológicas e podem causar um impacto econômico nos países em desenvolvimento pelo na produção de novos de medicamentos nesta patologia.
43
2.4. Inflamação
A inflamação é a resposta do hospedeiro contra injúria em um tecido ou após a invasão de patógenos, cujo objetivo é a eliminação da causa inicial da lesão celular.
Assim, a resposta inflamatória é um evento em que as células e mediadores trabalham para neutralizar e eliminar estímulos nocivos e manter a homeostase (Cotran et al., 2006;
Medzhitov, 2010). Embora a inflamação seja essencialmente um processo fisiológico e benéfico, os processos inflamatórios podem levar a lesões teciduais quando respondem de maneira exacerbada ao agente agressor e estão envolvidos na patogênese e progressão de muitas doenças como asma, rinite, artrite, aterosclerose, esclerose múltipla e lesão de isquemia-reperfusão (McFarland & Martin, 2007; Waldburger & Firestein, 2009; Nathan
& Ding, 2010; Eltzschig & Eckle, 2011; Mandhane et al., 2011; Van-Assche et al.,
2011). A inflamação pode ser aguda ou crônica, dependendo do tempo de exposição ao agente agressor. Assim, inflamações que duram horas ou dias são consideradas agudas e se caracterizam por fenômenos exsudativos - permeabilidade vascular, com acúmulo de líquido na região inflamada (edema), fibrina, leucócitos, especialmente neutrófilos, e hemácias. As que persistem por semanas e meses, crônicas, se caracterizam por fenômenos proliferativos, com proliferação de vasos, fibroblastos, com migração e proliferação local de monócitos e linfócitos. A inflamação aguda pode evoluir para a resolução dos danos ou tornar-se crônica (Montenegro & Fecchio, 1999).
O processo inflamatório apresenta quatro sinais cardinais: calor, rubor, edema e dor. O calor e o rubor são decorrentes da vasodilatação que leva ao local afetado uma maior quantidade de sangue (hiperemia), e, portanto, há um aumento da temperatura pelo
44 aumento de sangue e há vermelhidão pela concentração de sangue. O tumor (edema) se dá pelo aumento da permeabilidade vascular que permite o extravasamento de líquidos, e a dor que é resultante da compressão dos nervos pelo tumor e pelos mediadores químicos liberados. Virchow, no século XIX acrescentou o quinto sinal da inflamação, a perda de função, que é consequência de vários fatores, especialmente do edema e dor, onde o
órgão deixa de ser usado pelo desconforto causado pelo processo inflamatório
(Montenegro & Fecchio, 1999).
A resposta inflamatória envolve vários eventos celulares e a liberação de inúmeras enzimas e mediadores químicos. As reações inatas podem se dividir em eventos vasculares e celulares no local que sofreu a agressão. Os eventos vasculares caracterizam- se por inicial vasoconstrição, seguido de vasodilatação, que provocam um aumento no fluxo sanguíneo (calor e rubor) e por alterações na permeabilidade vascular, conduzindo ao extravasamento de exsudato para o interstício, por mediadores, produzidos a partir do plasma e das células. Os leucócitos circulantes aderem-se ao endotélio vascular e migram para o tecido intersticial em direção ao local da lesão, sob sinalização de agentes quimiotáticos (citocinas e leucotrienos), e fagocitam o agente agressor e degradam o tecido que foi lesado (Coutinho et al., 2009).
Dentre os mediadores da inflamação, encontram-se histamina, metabólitos do
ácido araquidônico (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), fator de ativação plaquetária, bradicinina, óxido nítrico, neuropeptídeos e citocinas. A histamina é armazenada no interior de lisossomas de mastócitos, basófilos e plaquetas (Montenegro
& Fecchio, 1999). O ácido araquidônico é liberado dos fosfolipídios das membranas celulares pela ação da enzima fosfolipase A2, quando a célula sofre estímulos mecânicos,
45 químicos, físicos ou através de outros mediadores (Cotran et al., 2006). O ácido araquidônico livre é metabolizado pela enzima ciclo-oxigenase (COX) (isoforma COX-2) resultando na biossíntese de prostaglandinas e tromboxanos (prostanóides) e ou pela enzima lipo-oxigenase (LOX), dando origem aos leucotrienos (LT) (Botting, 2006; Rang et al., 2012).
Nas células endoteliais do tecido lesionado a enzima NO sintase (NOS), forma indutível (i-NOS), produz óxido nítrico (NO) e este apresenta potente ação vasodilatadora, aumentando a permeabilidade vascular. Também atua como regulador do recrutamento de leucócitos e exerce ação citotóxica contra micro-organismos. Já as citocinas mais importantes no processo inflamatório são as citocinas pró-inflamatórias
TNF-α (Fator de Necrose Tumoral α), IL-1 e IL-6 (Interleucina-1 e interleucina-6), liberadas por macrófagos ativados e vários outros tipos celulares, que favorecem a aderência leucocitária ao endotélio, aumentam a síntese de prostaciclina e desencadeiam uma cascata de citocinas secundárias. Já as citocinas secundárias atraem e ativam as células inflamatórias móveis (Cotran et al., 2006; López-Posadas et al., 2008).
Assim, o organismo age para que o agressor seja eliminado e o tecido danificado seja reparado. Porém, o processo inflamatório pode progredir com a formação de abscessos, quando um agente piogênico se instala no tecido, ou progredir para a inflamação crônica, quando esse processo é sempre ativado. A inflamação crônica desempenha um papel importante no stress oxidativo, e pode estar associada a inúmeras doenças como doença de Alzheimer, Parkinson, disfunções cardíacas, diabetes e câncer, doenças auto-imunes como artrite, aterosclerose, doenças do trato respiratório, como asma, rinite (Wellen & Hotamislgil, 2005; Medzhitov, 2010). O processo inflamatório
46 tem sido associado à carcinogênese pela atividade das lipo-oxigenases (Furstenberger et al., 2006) e podem levar ao câncer de pâncreas, câncer de próstata, de mama, entre outros cânceres (Tong et al., 2002; Ding et al., 2003; Matsuyama et al., 2004). Acredita-se que mais de 25% dos tipos de câncer estão relacionados a infecções crônicas e outros tipos de inflamação (Schetter et al, 2010).
2.5. Plantas com propriedades anti-inflamatórias
Os agentes anti-inflamatórios são fármacos utilizados para interferir no processo reacional de defesa do organismo, diminuindo a inflamação e tentando amenizar o desconforto do paciente. São divididos em glicocorticoides e anti-inflamatórios não – esteroidais (AINES).
Os glicocorticoides são hormônios esteróides, sintetizados no córtex da glândula adrenal, que afetam o metabolismo dos carboidratos e reduzem a resposta reduzem a resposta inflamatória (Hardman et al., 2003). Os glicocorticoides sintéticos são muito parecidos com os endógenos, modulam processos inflamatórios e imunológicos e agem inibindo da transcrição do gene da enzima ciclo-oxigenase-2 e à indução da proteína lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2 e reduzem a produção de citocinas pró- inflamatórias, tais como TNF-α e IL-1 (Rang et al., 2012). Indicados para doenças auto- imunes e na prevenção e/ou tratamento da rejeição de transplantes e alergias. Apresenta, principalmente com o uso em longo prazo, uma lista de efeitos colaterais indesejáveis como equimose e purpúria, face arredondada (chamada de fácies em lua), pelo acúmulo de gordura na região posterior do pescoço e das costas (chamado de corcova ou giba de búfalo) e pela distribuição irregular da gordura corporal, com predomínio na região
47 abdominal e tronco, alterações oftalmológicas, como a catarata e glaucoma, elevações no colesterol LDL (lipoproteína de baixa densidade) e triglicerídeos, e redução dos níveis de colesterol HDL (lipoproteína de alta densidade) entre outros efeitos indesejados (Rang et al., 2012).
Assim, os efeitos colateriais dos glicocorticoides limitam seu uso. Para a maior parte dos casos de processos inflamatórios são utilizados os anti-inflamatórios não- esteroidais (AINES) que atuam inibindo a enzima ciclo-oxigenase (COX), impedindo a formação de prostaglandinas, e de tromboxanos, mediadores do processo inflamatório
(Rang et al., 2012). Atualmente existem mais de 50 medicamentos desta classe no mercado mundial, e a maioria inibe tanto a isoforma COX-1 quanto a isoforma COX-2.
Assim, a atividade anti-inflamatória (e provavelmente analgésica e antipirética) esteja relacionada com a inibição da COX-2 e os efeitos indesejados principalmente no trato gastroinstestinal, seja pela ação sobre a COX-1 (Rang et al., 2012). Fármacos inibidores da COX-2 estão em uso terapêutico e apesar de apresentarem menos efeitos indesejados, ainda não são bem tolerados pelos pacientes quanto era esperado em relação aos efeitos indesejados quanto ao sistema gástrico. Além disso, estudos demonstraram efeitos dessa classe de medicamento sobre o sistema cardiovascular, como elevação da pressão arterial, podem predispor ao acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio (Rang et al., 2012,
Harirforoosh et al., 2013).
Devido às reações adversas apresentadas pelas duas classes de medicamentos anti-inflamatórios, pacientes com dores crônicas e incapacitantes como artrite e artrose buscam alternativas de tratamento com os fitoterápicos. Fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de plantas medicinais e são obtidos empregando-se exclusivamente
48 derivados de droga vegetal e oferecem garantia de qualidade, tendo efeitos terapêuticos comprovados, composição padronizada e segurança de uso para a população (ANVISA,
2014).
Diferentemente do tratamento do câncer, as plantas têm sido utilizadas em processos inflamatórios na forma de fitoterápicos e não como moléculas isoladas, como
Harpagophytum procumbens (garra-do-diabo) em casos de artrite reumatoide, Uncaria tomentosa (unha-de-gato) para osteoartrite e artrite reumatoide, Boswellia serrata em casos de dor e rigidez em pacientes com artite, Pterodon pubescens (Sucupira), além de formulações de uso tópico com Arnica montana (arnica comum) e Solidago microglossa
(falsa arnica) em inflamações agudas por trauma ou crônicas de doenças auto-imunes.
Em 2005, foi lançado no mercado farmacêutico Acheflan®, indicado no tratamento local de processos inflamatórios nas formas farmacêuticas de aerosol e de creme, com pesquisa
100% nacional, do óleo essencial de Cordia verbenacea (erva-baleeira), padronizado em
2,3-2,9% do terpeno α-humuleno (Aché, 2014).
Ensaios clínicos com plantas medicinais para tratar a artrite reumatóide têm sido desenvolvidos. Assim extratos de Tripterygium wilfordii que já são usados na China em doenças auto-imunes, incluindo artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, nefrite e asma, vêm sendo aceitos pela medicina ocidental. Após resultados promissores em artrite reumatoide, iniciou-se o interesse nesta planta, que é rica em terpenóides, com três principais diterpenóides: triptólido, tripdióiido e triptonide, sendo responsáveis pela atividade imunossupressora e anti-inflamatória (Récio et al., 2012). Extratos de Boswellia serrata Roxb. ex Colebr. (Burseraceae) foram estudados em casos de reumatismo músculo-esquelético induzidos por artrite reumatoide e em espondilite anquilosante do
49 tipo moderada a grave, onde 66% dos pacientes mostraram bons resultados com pouco ou nenhum efeito indesejável. Outros ensaios foram realizados e indicaram que B. serrata foi clinicamente efetiva (Ernst, 2008).
Em pacientes com doença intestinal inflamatória, foram testadas cápsulas contendo Artemisia absinthium L. (Asteraceae) que levou à remissão completa dos sintomas em 65% dos pacientes (Omer et al., 2007) e o suco de Triticum aestivum L.
(Poaceae) reduziu o índice de atividade da doença em geral e da severidade da hemorragia retal em pacientes (Ben-Arye et al., 2002).
Além da produção de fitoterápicos, as plantas por apresentarem um metabolismo secundário capaz de produzir mais de 200000 pequenas moléculas distintas que garantem vantagens para a sobrevivência e perpetuação da espécie em seu ecossistema (Pichersky
& Gang, 2000), são uma fonte para a busca de novas moléculas, mais seguras, eficazes e com menos efeitos colaterais. A seleção de novas plantas baseada no conhecimento popular e etnofarmacologia, relações filogenéticas e taxonômicas e até mesmo escolha aleatória são estratégias que podem ser utilizadas para avaliação de atividades biológicas de extratos inicialmente in vitro e in vivo, combinados com técnicas para o isolamento e identificação destes metabolitos, demonstrando um vasto campo de pesquisa em plantas
(Deng, 1985).
As principais classes de metabólitos secundários que têm demonstrado atividades biológicas são os compostos fenólicos (flavonas, isoflavonas, flavonóis, catequinas, tocoferóis, e ácidos fenólicos) e os terpenoides. Os compostos fenólicos, frequentemente, possuem propriedades anti-inflamatórias e anti-oxidantes, interagindo com as proteínas envolvidas na transdução de sinal e a expressão gênica, reduzindo a produção de
50 citocinas pró-inflamatórias através da inibição do sistema de complexo de NF-kB / IkB
(factor nuclear kappa B – IkB) (Hanai & Sugimoto, 2009; Gautam & Jachak, 2009; Ríos et al., 2009; Venkatesha et al., 2011).
Diversos terpenoides (lactonas sesquiterpênicas, cucurbitacinas, lanostanoides, triterpenoides e diferentes saponinas) também apresentam atividade anti-inflamatória
(Yuan et al., 2006). As lactonas sesquiterpênicas inibem a atividade do NF-kB
(Ghantous et al., 2010; Merfort, 2011), e cucurbitacinas têm apresentado sua atividade em inibir JAK-STAT e fator nuclear de células T ativadas (NF-AT) que apresentam funções relacionadas com a inflamação (Ríos et al., 2009). Os canabinoides, que são triterpenos, podem influenciar a produção citocinas e quimiocinas em um mecanismo para suprimir as respostas inflamatórias e com atividade anti-inflamatória e analgésica
(Davis & Hatoum, 1983; Rahn & Hohmann, 2009; Cascio et al., 2010). Nos Estados
Unidos e Canadá, Nabilone, composto derivado sintético, é indicado no tratamento das dores em pacientes com fibromialgia (Nascimento et al., 2013).
Assim o estudo de produtos naturais é uma área muito explorada e de grande potencial para a busca de novas moléculas com atividade farmacológica superior às encontradas no mercado, mas especialmente com menos efeitos colaterais.
51 3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
O objetivo geral deste estudo foi avaliar o potencial farmacológico dos extratos de
C. adamantium e C. guaviroba em modelos experimentais de câncer e inflamação e a identificação de metabólitos secundários presentes nestes extratos.
Foram objetivos específicos:
Realizar o estudo fitoquímico com o isolamento, purificação e identificação de alguns constituintes dos extratos bioativos, utilizando a avaliação da atividade antiproliferativa in vitro frente a linhagens tumorais para direcionar o estudo;
Proceder a análise quantitativa dos compostos detectados nos extratos e frações bioativos utilizando a técnica de UHPLC acoplada à espectrometria de massas;
Analisar in vitro se o efeito de morte celular ocorre por apoptose utilizando citometria de fluxo (fragmentação do DNA) e análise de expressão dos
genes NFkB e TNF de extratos, frações e algumas das substâncias isoladas e identificadas nos extratos bioativos;
Avaliar in vivo a toxicidade aguda e a atividade antitumoral em tumor sólido de Erhlich em camundongos da fração que apresentou melhor atividade antiproliferativa em cultura de células in vitro;
Investigar in vivo a atividade antinociceptiva e anti-inflamatória em camundongos nos modelos de contorções abdominais induzidos por ácido acético e de edema de pata induzido por carragenina da fração que apresentou melhor atividade antiproliferativa em cultura de células in vitro.
52 4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Coleta e identificação do material vegetal
O material vegetal (folhas) da espécie C. adamantium foi coletado no Campus da
UFPR em Curitiba (PR) pela Profa. Dra. Maria Élida Alves Stefanello (QO/UFPR), a identificação botânica foi realizada pelo Prof. Dr. Armando Carlos Cervi da UFPR e uma exsicata do vegetal encontra-se depositada no Herbário da UFPR. O material vegetal
(folhas) de C. guaviroba foi coletado em Campinas (SP) pelo Prof. Dr. Ivany Ferraz
Marques Valio (DBV-IB-UNICAMP). A identificação botânica foi realizada pelo Prof.
Jorge Tamashiro (DBV-IB-UNICAMP) e uma exsicata foi depositada no Herbário do IB-
Unicamp.
4.2. Preparação dos extratos brutos
O material vegetal foi estabilizado e seco em estufa com ar circulante à temperatura de 40 °C, foi pulverizado e o pó foi submetido ao processo de maceração exaustiva com etanol em uma proporção pó/solvente de 1:5 (massa/volume) e o solvente trocado a cada 24 horas. O solvente das soluções obtidas foi removido sob pressão reduzida, obtendo-se os extratos etanólicos brutos das folhas. Estes extratos foram estocados em freezer a -80 oC.
4.3. Fracionamento dos extratos brutos
Os extratos etanólicos foram dissolvidos em metanol:água na proporção 9:1 (v/v) e submetidos à partição líquido-líquido com hexano. Acrescentou-se 40% de água à
53 solução hidroalcoólica e prosseguiu-se a partição com diclorometano, seguido de butanol
(Figura 5).
Figura 5. Esquema do fracionamento dos extratos etanólicos brutos das folhas de Campomanesia adamantium e Campomanesia guaviroba pela técnica da partição líquido-líquido, utilizando os solventes hexano, diclorometano e butanol.
4.4. Análise do teor de fenólicos solúveis totais dos extratos e frações
Os extratos brutos e frações foram analisados quanto ao seu conteúdo de compostos fenólicos totais solúveis utilizando o método colorimétrico Folin-Ciocalteu
54 (Piccinelli et al., 2004; Naczk & Shahidi, 2004). Para tanto, os extratos e frações foram solubilizados em etanol em concentrações de 200 µg/mL. Para a substância de referência,
ácido gálico, foi elaborada a curva analítica nas concentrações de 6, 12, 25, 50, 100 e
200µg/mL. As absorbâncias das amostras e amostra-padrão foram medidas em espectrofotômetro em 730 nm e os resultados foram expressos como mg de ácido gálico equivalente (GAE) por grama de extrato ou fração em base seca (μg de EAG/mg). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
4.5. Análise do teor de flavonoides totais (flavonois e flavonas) dos extratos e frações
Para determinação dos flavonoides totais foi utilizado o ensaio espectrofotométrico baseado na formação de um complexo entre o íon Al+3 e o grupo carbonílico presente na molécula de flavonoide. Em uma placa com 96 poços, adicionou- se 100 µL de água, 60 µL de etanol, 10 µL de cloreto de alumínio (solução aquosa de 40 mg/mL), 10 µL de acetato de sódio (solução aquosa de 32,81 mg/mL) e 20 µL dos extratos e frações. Foi realizada uma curva analítica com o flavonóide quercetina nas concentrações de 12, 25, 50, 100, 150 e 200 µg/mL. A placa foi incubada por 30 minutos e feita à análise em espectrofotômetro em 415 nm. Os resultados foram expressos em μg de equivalentes de quercetina por miligrama de extrato ou fração em base seca (μg de quercetina/mg). Todos os experimentos foram realizados em triplicata.
55 4.6. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS
Análises preliminares por ESI-MS foram realizadas com extratos e frações das espécies vegetais em estudo de desreplicação. As amostras (1 mg) foram dissolvidas em solução contendo 50% (v/v) de metanol grau cromatográfico e 50% de uma solução aquosa de 0,5% de hidróxido de amônio (Merck, Darmstadt, Alemanha). As análises de
ESI-MS/MS foram realizadas por inserção direta no Espectrômetro de Massas
Quadrupolar, com ionização por eletrospray, em modo negativo para análise de substâncias fenólicas. As condições gerais foram de temperatura da fonte de 100 oC, voltagem do capilar de 3,0 kV e do cone de 30 V. Os íons com relação massa/carga (m/z) de interesse foram selecionados e submetidos a colisões com argônio (ESI-MS/MS). Os constituintes foram identificados por comparação de seus espectros de fragmentação ESI-
MS/MS com espectro de amostras-padrão autênticas do banco de substâncias padrão do grupo de pesquisa do Laboratório de Farmacognosia e Bioensaios do Curso de Farmácia do IB-UNICAMP.
4.7. Quantificação por UHPLC–MS
Foi realizada a quantificação dos compostos identificados previamente por ESI-
MS/MS por cromatografia líquida de ulta-alta eficiência e espectrometria de massas.
Concentrações das substâncias identificadas nos extratos das folhas foram analisadas no equipamento Acquity UHPLC system (Waters, Milford, MA, USA) usando uma coluna
(2.1 × 50 mm, 1.7 μm de tamanho de partícula) à temperatura de 30 °C. O gradiente foi de água deionizada com 1% de ácido fórmico (A) e metanol (B) começando com 10% B e até chegar a 100% de B em 5 minutos, mantendo até em 5.50 minutos, retornando para
56 condição inicial e estabilizando por 7 minutos. A detecção foi realizada em modo negativo. As condições do espectrômetro de massas Acquity TQD (Micromass Waters,
Milford, MA, USA) foram: voltagem do capilar 3.00 kV, Cone 30.00 V, temperatura da fonte 130°C, temperatura de dessolvatação 250 °C. Curva de calibração foi estabelecida através da representação gráfica da área de pico contra concentrações variaram entre 0,01
μg/mL e 100 μg/mL dos padrões, exceto miricitrina que foram utilizadas concentrações entre 0,01μg/mL e 25 μg/mL, com a análise de regressão linear. O limite de detecção
(LD) e o dos componentes foi avaliado visualmente com uma relação sinal-para-ruído de
3:1 e o limite inferior de quantificação (LQ) foi definida como a concentração mais baixa na curva de calibração com uma relação sinal-para-ruído de 10:1.
4.8. Isolamento e identificação dos constituintes químicos
A fração butanólica da C. adamantium (500 mg) foi submetida à coluna clássica contendo sephadex LH-20 e eluída de maneira isocrática com metanol. Foram coletadas frações de 10 mL cada. Foram obtidas 198 frações, que foram monitoradas por CCD.
A fração 31 (Caeb31-5,3 mg) foi submetida à análise por ESI-MS/MS. 1 mg da amostra foi dissolvida em solução contendo 50% (v/v) de metanol grau cromatográfico e
50% de uma solução aquosa de 0,5% de hidróxido de amônio (Merck, Darmstadt,
Alemanha). Foi realizada injeção direta no espectrômetro de massas quadrupolar –
Micromass da Waters, por com ionização por eletrospray, em modo negativo. As condições gerais foram as mesmas descritas na identificação dos compostos nos extratos e frações descritas anteriormente. Obteve-se o espectro e observou-se a presença de apenas um pico, que foi submetido à fragmentação por ESI-MS/MS.
57 Caeb31 (4 mg) foi ainda submetida às análises de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) no Instituto de Química da Universidade Federal do Paraná, realizados pela Profa
Dra Maria Élida Stefanello Alves. Os espectros foram registrados no equipamento Bruker
AC 200 e ou 400 Avance espectrômetro, observando-1H a 200 e 400 MHz e 13C a 50 ou
100 MHz, respectivamente, assim como a técnica bidimensional HMBC. O solvente utilizado foi o metanol deuterado (MeOH-D4), com tetrametilsilano (TMS) como referência interna.
No isolamento do segundo composto, a fração diclorometânica do extrato bruto de C. adamantium foi submetida a uma coluna a vácuo de sílica gel eluída diclorometano, acetato de etila e metanol (300 mL, cada solvente). A fração eluída com acetato de etila
(0, 95 g) foi submetida à uma coluna clássica de sílica gel eluída com as misturas de acetato de etila com hexano (1:1, 2:1, 5:1, 100 mL cada uma), misturas de acetato de etila e metanol (4:1, 2:1, 1:5 (100 mL cada uma) e metanol puro (50 mL). Depois de análises em CCD, 10 frações foram obtidas. A fração 2 (251,3 mg), eluída com acetato de etila com hexano 1:1, foi submetida a outra coluna clássica de sílica gel, eluída com diclorometano, misturas de diclorometano-metanol (99:0.5, 99:1, 98:2, 50 mL cada uma) e metanol (20 mL), seguidas de análises em CCD obtendo-se 7 frações. A subfração 2-2
(24,4 mg) foi submetida à CCD preparativa, eluída com hexano-acetona 3:2 (duas vezes) dando origem ao segundo composto isolado (Ca5-17,6 mg).
A fração Ca5 foi submetida à análise por ESI-MS/MS. 1 mg da amostra foi dissolvida em solução contendo 50% (v/v) de metanol grau cromatográfico e 50% de uma solução hidroalcoólica de 0,5% de hidróxido de amônio (Merck, Darmstadt,
Alemanha. Foi realizada injeção direta no espectrômetro de massas qadrupolar, por com
58 ionização por eletrospray, em modo negativo. As condições gerais foram as mesmas descritas na identificação dos compostos nos extratos e frações descritas anteriormente.
Obteve-se o espectro e observou-se apenas um pico, que foi submetido à fragmentação por ESI-MS/MS.
Ca5 (4 mg) foi também submetida às análises de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) no Instituto de Química da Universidade Federal do Paraná, realizados pela Profa
Dra Maria Élida Stefanello Alves. Os espectros foram registrados no equipamento Bruker
AC 200 e ou 400 Avance espectrômetro, observando-1H a 200 e 400 MHz e 13C a 50 ou
100 MHz, respectivamente. O solvente utilizado foi o clorofórmio deuterado e metanol deuterado (CDCl3+MeOH-D4), com TMS como referência interna.
4.9. Avaliação da atividade antiproliferativa in vitro frente a linhagens tumorais e linhagem não tumoral
Os extratos, frações, compostos isolados e padrões foram avaliados quanto à atividade antiproliferativa em painel de células tumorais humanas, sendo que a inibição de crescimento foi calculada a partir da dosagem de proteínas utilizando-se o ensaio da sulfarrodamina B (SBR) de acordo com Skehan et al. (1990). Também foi avaliada a atividade antiproliferativa frente a uma linhagem não tumoral VERO (rim de macaco) ou
HaCat (queratinócitos humanos). Para a realização dos experimentos foram utilizadas as seguintes linhagens celulares nas suas respectivas densidades de inoculação: pulmão
(NCI-H460: 4,0 x 104), mama (MCF-7: 6,0 x 104), mama resistente (NCI-ADR/RES: 5,0 x 104), melanoma (UACC-62: 4,0 x104), ovário (OVCAR-3: 6,5 x 104) e próstata (PC03:
4,5 x 104). As células foram cultivadas em meio de cultura RPMI 1640, com 5% de soro
59 fetal bovino inativado, a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. (Skehan et al.,
1990). Foram inoculados 100 µL/well de células em RPMI1640/SFB
10%/penicilina/estreptomicina 50 µg/mL, nas suas respectivas densidades de inoculação, em placas com 96 poços e incubadas a 37 ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2. Após
24 horas, as amostras foram adicionadas em concentrações crescentes de 0,25 a 250
µg/mL. Após 48 horas as células foram fixadas com 50 µL de ácido tricloroacético a 50% a 4 ºC e mantidas por 1 hora a 4 ºC. Em seguida as placas foram lavadas com água destilada e mantidas em temperatura ambiente até a secagem. A coloração foi então realizada pela adição de 50 µL de sulfarrodamina B a 0,4 % dissolvida em ácido acético a
1%. As placas foram incubadas à 4 ºC durante um período de 30 minutos, lavadas com
ácido acético a 1% e secas novamente em temperatura ambiente. O corante foi solubilizado com 150 µL/poço solução de Trizma base (10 µM, pH 10,5) e a leitura espectrofotométrica realizada em 540 nm, em um leitor de microplacas. Como controle positivo utilizou-se o quimioterápico doxorrubicina e como controle negativo o diluente
DMSO/RPMI-1640 (0,1%). Foram analisados também em cada placa teste um branco do meio de cultura (sem células), um branco da suspensão celular (controle do inóculo) e o branco das amostras teste. Cada droga-teste foi analisada, pelo menos, em triplicata.
Calcularam-se as médias das absorbâncias descontadas de seus respectivos brancos e, através das fórmulas a seguir, foi determinada a inibição de crescimento (IC) de cada amostra testada.
Se T > C, a droga estimulou o crescimento e não apresentou IC. Se T ≥ T0 e < C, a droga foi citostática e a fórmula utilizada foi 100 x [(T-T0)/ (C-T0)].
0 0 Se T< T0, a droga foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 x [(T-T )/(T )]
60 Onde T é a média da absorbância da célula tratada; C é o controle de célula sem
0 adição de drogas depois das 48h; T é o controle das células no dia da adição das drogas.
O resultado obtido foi subtraído de 100%, obtendo-se então a porcentagem de crescimento. Com esses resultados, foram produzidos gráficos relacionando a concentração da amostra e seu efeito. As amostras foram consideradas ativas quando apresentaram inibição de crescimento maior que 50%, preferencialmente apresentando seletividade para os tipos celulares.
Conforme a potência das amostras calculou-se a concentração necessária para inibir 50% do crescimento celular (GI50) ou concentração necessária para inibir totalmente o crescimento celular (TGI, total growth inhibition) em cada linhagem celular.
Para esse cálculo, utilizaram-se o programa Origin 8.0 para a construção da regressão sigmóide das curvas obtidas com as médias da porcentagem de crescimento (Shoemaker,
2006).
4.10. Análises da expressão dos genes TNF-α e NF-kB1 em cultura de células de câncer pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
Células da linhagem NCI-H460 foram semeadas em placas de 6 poços (1x105 células/poço) e submetida ao tratamento com os extratos e frações Cae, Cge, Caed, Cged
(concentração de 20 µg/mL) e as substâncias isoladas e identificadas nos extratos (Ca5,
Ca6, quercetina, quercitrina, ácido gálico, miricitrina, nas concentrações de 20 µg/mL) e doxorrubicina (20 µg/mL) por 24 horas de incubação. Células tratadas com o diluente
RPMI/DMSO na proporção 99:1 foram utilizadas como controle negativo. Para análise
61 dos efeitos dos tratamentos na expressão dos genes TNF-α e NF-kB1, foi realizada a técnica de PCR em Tempo Real. O RNA total foi extraído das células com TRIzol®, de acordo com as recomendações do fabricante. A reação de transcriptase reversa foi realizada com 1 µg de RNA, usando a enzima SuperScript III (Invitrogen, de acordo com as recomendações do fabricante) e PCR-RT quantitativo foi realizado no equipamento
Applied Biosystems 7500 System. As condições do PCR foram (20 μL de volume de reação) foram: 50 °C por 2 minutos (1 ciclo); 95 °C por 10 minutos (1 ciclo); 95 °C por
15 segundos, 60 °C for 1 min (40 ciclos). Os primers TNF-α e NF-kB1 foram desenhados pela Applied Biosystems (números de identificação: NF-kB1: Hs00765730_m1 e TNF-α
Hs01113624_g1) e o controle endógeno foi 18S (VIC/MGB, Applied Biosystems).
4.11. Análises da fragmentação do DNA por citometria de fluxo em cultura de células de câncer pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
Células da linhagem NCI-H460 foram semeadas em placas de 6 poços (1x105 células/poço) e submetida ao tratamento com os extratos e frações Cae, Cge, Caed, Cged
(concentração de 20 µg/mL) e as substâncias isoladas e identificadas nos extratos (Ca5,
Ca6, quercetina, quercitrina, ácido gálico, miricitrina, na concentração de 20 µg/mL) e doxorrubicina (20 µg/mL) por 24 horas de incubação. As células tratadas com o diluente
RPMI/DMSO na proporção 99:1 foram usadas como controle negativo. Após estes procedimentos, as células foram removidas dos poços, através da utilização de raspador, lavou-se com tampão, e ressuspenso em 300 mL de uma solução hipotônica iodeto de propídio (50 mg/ml de citrato de sódio a 0,1% e 0,1% de Triton X-100). As amostras foram incubadas durante a noite a 4 °C e analisadas por citometria de fluxo em um
62 sistema Scalibur Facs. Os histogramas das amostras foram analisados usando o programa
Cell Quest Software Pro.
4.12. Ensaios in vivo com as frações dos extratos etanólicos brutos de C. guaviroba e C. adamantium
Para a realização dos ensaios in vivo foram enviados pedidos à Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) do Instituto de Biologia (IB), UNICAMP, tendo sido autorizados procedimentos experimentais (protocolos no 2443-1 e no 2444-1) e Comite de
Ética em Experimentação Animal (CEEA-UFF) (protocolo no 601).
4.12.1. Animais
Foram utilizados camundongos (linhagens Swiss e Balb C), obtidos do CEMIB
(Centro multidisciplinar para a investigação biológica - UNICAMP) e Núcleo de Animais de Laboratório da UFF (NAL – UFF), e mantidos no Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA), Departamento de Farmacologia e
Toxicologia, Unicamp, Campinas e Laboratório Multiusuário de Pesquisa Biomédica de,
UFF, Nova Friburgo. Os grupos experimentais foram mantidos em gaiolas individuais identificadas, com ração e água. A sala apresentou temperatura constante de 22 ºC ± 3 ºC com umidade relativa do ar entre 30 e 70 %. Antes do início dos testes os animais foram identificados e examinados, sendo rejeitados aqueles que apresentaram quaisquer alterações de comportamento.
63 4.12.2. Avaliação da Toxicidade Aguda
Camundongos machos (Swiss) foram tratados, pela via intraperitoneal, com doses crescentes de frações dos extratos de C. guaviroba (300, 1000 e 2000 mg/Kg), utilizando solução salina de NaCl a 0,9 % como diluente e C. adamantium (300 mg/Kg), utilizando solução salina de NaCl a 0,9 % como diluente e após a administração foram mantidos em observação por um período mínimo de 14 dias. O grupo controle foi previsto. Os animais foram separados em grupos de 5 animais. O número de animais mortos para cada uma das doses foi anotado e a dose letal (DL50) calculada pelo método de Litchfield e
Wilcoxon (1949). Esses dados foram utilizados para estabelecer as doses que foram utilizadas para avaliação da atividade nos modelos de câncer murino.
4.12.3. Ensaios para avaliação da atividade antitumoral em tumor sólido de
Ehrlich
O modelo de tumor sólido de Ehrlich tem como função a análise da atividade antiproliferativa sistêmica da droga-teste (Nascimento et al., 2006). Foram coletados 2 mL de líquido ascítico do animal doador. As células foram contadas e ressuspensas em solução salina, em quantidade suficiente para a inoculação de 2,5x106 células/60 µL em cada animal (camundongos fêmeas Balb C), por via subcutânea. Primeiramente realizou- se o experimento administrando as células no coxim plantar dos animais, que foram separados em grupos com 8 animais e o tratamento iniciado um dia após a inoculação das células tumorais. Os animais foram tratados com veículo, solução salina de NaCl 0,9%
(controle negativo), doxorrubicina na dose de 3 mg/Kg (controle positivo) e fração diclorometânica do extrato bruto etanólico de C. guaviroba e C. adamantium nas doses
64 de 30, 100 e 300 mg/Kg, utilizando solução salina de NaCl a 0,9 % como diluente e utilizando a via intraperitonial (i.p.). Os animais receberam o tratamento a cada três dias durante dezesseis dias de experimento e o volume das patas avaliados nos mesmos dias com hidropletismômetro. Os animais foram eutanasiados, o tumor retirado, pesado e medido.
Figura 6. Esquema do ensaio da avaliação antitumoral do modelo de tumor sólido de Ehrlich.
No segundo experimento, a mesma concentração de células foi inoculada nas costas dos animais, alterando o esquema de tratamento. Os animais foram tratados
65 diariamente, por via oral (v.o.), com solução salina de NaCl 0,9% (controle negativo), doxorrubicina na dose de 3 mg/Kg (controle positivo) e fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de C. guaviroba e C. adamantium nas doses de 25 e 50 mg/Kg, utilizando solução salina de NaCl a 0,9 % como diluente. O tratamento iniciou-se um dia após a inoculação das células e por mais 14 dias. No décimo sexto dia, os animais foram sacrificados, os tumores retirados, o peso e volume avaliados.
Figura 7. Esquema do ensaio da avaliação da atividade antitumoral do modelo sólido de
Ehrlich, animais tratados via oral.
66 4.12.4. Ensaios para avaliação do potencial antinociceptiva e anti- edematogênico
4.12.4.1. Teste de contorções abdominais
Na avaliação da atividade antinociceptiva foi utilizado o modelo de contorções abdominais induzidas por ácido acético (Witkin et al., 1961), conforme figura 8.
Camundongos Swiss fêmeas (20-25 g) divididos em grupos com 6 animais em cada grupo, foram submetidos ao teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético
1% (0,1 mL/g do peso do animal) via intraperitoneal, e as contrações dos músculos abdominais com o alongamento das patas posteriores foram contados por 30 minutos imediatamente após a injeção de ácido acético. Os animais foram mantidos 1 hora em jejum, e logo depois tratados via oral, 30 minutos antes da injeção de ácido acético, em seus respectivos grupos com solução salina 0,9% (controle negativo), indometacina 10 mg/Kg e a fração Cged nas doses de 125 e 250 mg/Kg e a fração Caed 125 e 250 mg/Kg.
Figura 8. Esquema do ensaio de avaliação da atividade antinociceptiva induzida por
ácido acético.
67 4.12.4.2 Edema de pata induzido por carragenina em camundongos
O efeito antiedematoso foi avaliada pelo método do edema da pata induzido por carragenina em camundongos Swiss fêmeas (20-25 g), divididos em grupos com 6 animais em cada grupo, de acordo com o anteriormente descrito (Winter et al., 1962) com modificações (Figura 8). Os animais foram tratados por via oral, por gavagem, com solução salina 0,9%, a indometacina 10 mg/kg, a fração Cged nas doses 125 e 250 mg/kg e a fração Caed nas doses 125 e 250 mg/Kg. Após 30 minutos a administração dos compostos, o edema foi induzido pela injeção de carragenina (300 μg) diluído em solução salina no tecido sub-plantar da pata direita traseira. Na pata esquerda, introduziu-se a agulha, causando o dano induzido por perfuração mecânica correspondente. A espessura das patas foi medida com um paquímetro digital antes e 1, 2, 3, 4 horas após a injeção de carragenina. O edema inflamatório foi expresso como a variação da espessura (Δ). A indometacina foi usada como o fármaco de referência (controle positivo), enquanto o grupo salina 0,9% como o controle negativo. O grupo tratado com salina 0,9% foi considerado como máximo de inflamação e todos os outros tratamentos foram comparados com este grupo.
O aumento percentual das patas foi calculado através da expressão:
E (%) = (Tf -To x 100)To
E(%) = aumento percentual do tamanho da pata
To = tamanho inicial da pata
Tt = tamanho da pata após ser ferida com agullha e após ser injetada com carragenina
68 O resultado final foi obtido subtraindo-se os valores controle (patas apenas feridas com a agulha) dos valores testes (patas injetadas com carragenina).
Figura 9. Esquema do ensaio da avaliação anti-edetamotênica induzido por carragenina.
4.13. Análises estatísticas
Os resultados foram expressos em média, seguidos do desvio padrão ou
coeficiente de variação. Para a análise estatística dos dados, foi utilizado o programa
GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA), pelo qual foram
realizadas as análises de variância (ANOVA), seguidos pelo teste de Tukey. Os
resultados foram considerados significativos quando a significância teve valor inferior
a 5% (p < 0,05).
69 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Visando o estudo fitoquímico e avaliação do potencial farmacológico com ensaios in vitro e in vivo do extrato etanólico das folhas de C. adamantium e C. guaviroba, obteve-se os seguintes resultados:
5.1. Estudo fitoquímico
5.1.1. Fracionamento dos extratos brutos
Os extratos etanólicos brutos de C. adamantium e C. guaviroba foram submetidos
à partição líquido-líquido, resultando em frações hexânicas, diclorometânicas, butanólicas e hidroalcoólicas remanescentes. A partir dessas frações prosseguiram-se os estudos fitoquímicos biomonitorados.
5.1.2. Análise do teor de fenólicos solúveis totais e de flavonóides totais
Substâncias fenólicas de plantas podem pertencer a diversas classes de metabólitos secundários, incluindo os fenóis simples, ácidos fenólicos (derivados de
ácidos benzoico e cinâmico), cumarinas, flavonoides, estilbenos, taninos, lignanas e ligninas (Naczk & Shahidi, 2004). Utilizando ensaios espectrofotométricos foi possível analisar o teor de fenólicos solúveis totais utilizando o reagente de Folin-Ciocalteau para os extratos brutos e frações das espécies estudadas. O reagente de Folin-Ciocalteau consiste de uma mistura dos ácidos fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de oxidação 6+. Porém, em presença de determinados agentes redutores, como as substâncias fenólicas, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a média do estado de oxidação dos metais está entre 5 e 6, cuja coloração permite a determinação da concentração das substâncias redutoras (Ikawa et al., 2003; Naczk & Shahidi, 2004).
70 Para a análise do teor de flavonoides totais utilizou-se também um ensaio espectrofotométrico baseado na formação do cátion Al3+ forma complexos estáveis com os flavonóides em solvente metanol. A formação deste complexo promove um desvio batocrômico do máximo de absorção.
Os resultados obtidos na determinação do teor de fenóis solúveis totais e de flavonoides totais estão apresentados na Tabela 2. Em todas as amostras analisadas foram detectadas substâncias fenólicas, sendo encontrados em menor concentração nas frações hexânica e hidroalcóolica remanescente de C. guaviroba e se concentrando em maior quantidade na fração butanólica. Esses resultados eram esperados, devido à polaridade dos flavonóides e do solvente, ambos polares. C. adamantium apresentou uma concentração maior quando comparada à C. guaviroba e a distribuição dos compostos fenólicos entre as frações foi mais uniforme, sendo que menor concentração também foi encontrada na fração hexânica.
Foi obtida uma maior concentração de flavonoides totais no extrato etanólico bruto de C. adamantium (17,98 μg quercetina/mg) do que no extrato etanólico bruto de
C. guaviroba (3,04 μg quercetina/mg). Os flavonoides totais se concentraram na fração diclorometânica de C. guaviroba (10,51 μg quercetina/mg) e na fração hexânica C. adamantium (19,19 μg quercetina/mg). Essa concentração de flavonoides totais na fração hexânica de C. adamantium não é esperada, devido à polaridade destes compostos e do solvente, mas esses experimentos foram realizados mais duas vezes e esses resultados persistiram. A hipótese é que pelo método utilizado ser um método colorimétrico, substâncias coloridas presentes nesta fração podem interferir neste processo, levando a um resultado falso-positivo.
71 Tabela 2. Conteúdo de fenólicos solúveis totais e de flavonóides totais do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e de suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e solução hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e solução hidroalcoólica remanescente (Caehi).
Amostra Conteúdo Conteúdo de flavonóides totais fenólico (μg E quercetina/mg)* (μg EAG/mg)* Cge 5,87 (0,45) 3,04 (0,05) Cgeh 3,33 (0,20) 10,51 (1,97) Cged 12,68 (0,46) 4,73 (1,04) Cgeb 15,77 (3,61) 5,52 (0,03) Cgehi <3,12 0,38 (0,1) Cae 13,44 (0,37) 17,98 (0,61) Caeh 8,76 (0,55) 19,19 (2,7) Caed 11,48 (0,51) 11,12 (2,4) Caeb 13,97 (0,05) 13,61 (1,86) Caehi 13,23 (0,81) 6,71 (0,01)
*os resultados são expressos como média dos ensaios em triplicata seguidos do desvio padrão; μg AGE/mg: fenóis solúveis totais expressos em termos de micrograma de equivalentes de ácido gálico por mili grama de extrato ou fração em base seca; μg quercetina/mg: flavonóides totais expressos em termos de micro grama equivalentes de quercetina por miligrama de extrato ou fração em base seca.
Nas análises do teor de fenólicos totais solúveis observou-se que os extratos analisados no presente estudo apresentaram concentrações próximas quando comparados Cae aos dados de literatura. Coutinho e colaboradores em 2008 descreveram a quantidade de fenólicos totais solúveis em C. adamantium cultivadas em diferentes cidades da região
Centro-Oeste e coletadas em diferentes épocas do ano com valores entre 7,2 a 21,1 mg
EAG/g.
5.1.3. Análise do perfil químico dos extratos e frações por ESI-MS/MS
A análise do perfil químico por espectrometria de massas com ionização por electrospray (ESI-MS) com inserção direta das amostras é conhecida como fingerprint e
72 tem sido empregada na análise de matrizes complexas como vinho, azeite, cerveja e
extratos de origem vegetal (Moller et al., 2007; Roesler et al., 2007; Tiberti et al., 2007).
As análises dos extratos brutos e frações das plantas em estudo por ESI-MS/MS em modo
negativo, devido à comparação do seu espectro de fragmentação com padrões autênticos,
possibilitaram sugerir a presença de algumas substâncias nas amostras estudadas (Tabela
3 e 4 e Figura 10, anexos 1 a 10). No extrato e frações de C. guaviroba foi possível
identificar o ácido gálico; as chalconas 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona e
2’,4’-dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona e o flavonoide miricitrina, porém para
alguns íons majoritários não foi possível identificar o constituinte com base no perfil de
fragmentação, tais como: m/z 311, 325, 339 e 377. Já no extrato e frações de C.
adamantium foi possível a identificação do ácido gálico; das chalconas 2’,4’-dihidroxi-
6’-metoxichalcona (Ca5) e 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona (Ca6) e dos
flavonoides quercetina, quercitrina e miricitrina.
Tabela 3. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia guaviroba (Cge) e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e hidroalcóolica remanescente (Cgehi) por ESI-MS/MS.
Análises ESI-MS/MS (m/z) Substâncias Amostras de C. guaviroba [M-H]- Fragmentos MS/MS Cge Cgeh Cged Cgeb Cgehi m/z m/z (25 eV)* Ácido gálico + + - - - 169 169→ 125, 79, 53 2’,4’-dihidroxi-5’- + - + - + 283 283→268, 240, 198, metil-6- 179, 164, 136, 108, metoxichalcona 79 2’,4’-dihidroxi- + - - + - 297 297→282, 254, 191, 3’,5’-dimetil-6’- 178, 163, 150, 134, metoxichalcona 122 Miricitrina + - - + - 463 463→435, 349, 319, 317 * energia de colisão
73 Tabela 4. Substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcóolica remanescente (Caehi) por ESI-MS/MS.
Análises ESI-MS/MS (m/z) Substâncias Amostras de C. adamantium [M-H]- Fragmentos MS/MS Cae Caeh Caed Caeb Caehi m/z m/z (25 eV)* Ácido gálico + + + + + 169 169→ 125, 79, 53 2’,4’-dihidroxi-6’- + + + - + 269 269→253, 226, 198, metoxichalcona 184, 177, 165, 150, 139, 122, 108, 97, 94, 65 2’,4’-dihidroxi-5’- + + + - - 283 283→268, 240, 198, metil-6’- 179, 164, 136, 108, 79 metoxichalcona Quercetina + - - + + 301 301→271, 255 Quercitrina + - - + + 447 447→301 Miricitrina + + - + + 463 463→435, 349, 319, 317 *: energia de colisão
Figura 10. Estruturas das substâncias identificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia guaviroba e/ou Campomanesia adamantium e em suas frações.
74 5.1.4. Quantificação por UHPLC–MS
Foi realizada a quantificação de algumas substâncias utilizando cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS/MS) que aumenta a sensibilidade e especificidade do método. Além disso, a técnica pode detectar uma grande gama de substâncias com uma poderosa capacidade de separação e diminuiu o consumo de fase móvel (Li et al., 2014). O limite de detecção (LD) foi estimado visualmente como a concentração que produz picos cromatográficos com uma relação sinal-para-ruído de 3 e o limite de quantificação com uma relação sinal-para- ruído de 10. Com esse método foi possível quantificar alguns constituintes fenólicos nos extratos e frações de C. guaviroba e C. adamantium como observados na tabela 5. Em C. guaviroba foi possível quantificar três substâncias: ácido gálico, quercetina e miricitrina.
Assim, o ácido gálico encontrou-se mais concentrado na fração butanólica (5,45 µg/mg) e fração diclorometânica (3,12 µg/mg). Já no extrato bruto e fração hidroalcoólica remanescente essas concentrações foram de 0,29 e 0,54 µg/mg, respectivamente. Na fração hexânica a concentração estava abaixo do limite de quantificação. A chalcona
2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona (Ca6) identificada no extratos apresentou concentrações abaixo do limite de detecção e a chalcona 2’,4’-dihidroxi-3’,5’-dimetil-6’- metoxichalcona não havia quantidade em massa suficiente para que fosse realizada a quantificação. O flavonoide quercetina que não havia sido observado no fingerprint pode ser identificado na corrida cromatográfica. Isto ocorre porque na inserção direta no espectrômetro de massas, tudo se ioniza ao mesmo tempo então há o chamado efeito da matriz, onde são mais evidentes os íons que se ionizam mais facilmente. Por outro lado, na corrida cromatográfica, os extratos ou frações passam pela coluna cromatográfica, que
75 conforme a maior afinidade dos compostos pela fase estacionária ou móvel, vão sendo carregados pela fase móvel, sendo detectados pelo espectrômetro de massas com diferentes tempos de retenção, geralmente um composto por vez no pico. Então podemos identificar compostos que não são facilmente ionizáveis. Assim as concentrações variaram de 0,49 µg/mg (Cgeh) a 2,54 µg/mg (Cged). E o flavonoide miricitrina foi o composto que se apresentou em maior concentração variando de 24,19 µg/mg (Cgeb) a
0,59 µg/mg (Cgehi) (anexos 11-15).
Já em C. adamantium foi possível a quantificação de seis substâncias. Ácido gálico esteve presente em todas as frações, porém abaixo do limite de quantificação em
Caeh e concentrou-se preferencialmente na fração butanólica (47,94 µg/mg). Já a chalcona Ca5 (2’,4’-diidroxi-6’-metoxichalcona) foi a que se apresentou em maior concentração no extrato bruto entre as substâncias identificadas e quantificadas e concentrou-se na fração diclorometânica (179,3 µg/mg), fração da qual esta substância foi isolada posteriormente. A concentração da chalcona Ca6 esteve entre 55,36 µg/mg em
Caed e 5,03 µg/mg em Caehi. Entre os flavonoides, quercitrina apresentou-se mais concentrada no extrato bruto (35, 68 µg/mg), seguido por miricitrina (22,17 µg/mg) e quercetina (5,25 µg/mg) (anexos 16 a 20). Conforme a polaridade dos solventes, média polaridade do diclorometano e alta polaridade do butanol, as substâncias com diferenças nas polaridades foram se distribuindo pelas frações. Assim, as chalconas concentraram-se nas frações diclorometânicas e os flavonóis glicosilados nas butanólicas, assim como o
ácido gálico. Já a quercetina, um flavonol não-glicosilado, se distribui de maneira semelhante entre as frações diclorometânicas e butanólicas.
76 Tabela 5. Substâncias quantificadas no extrato etanólico das folhas de Campomanesia adamantium (Cae), frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcóolica remanescente (Caehi) e Campomanesia guaviroba e frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e hidroalcoólica remanescente (Cgehi) por UHPLC-MS.
-: não quantificado na amostra; Ca5: chalcona 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona; Ca6: chalcona 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona. Os tempos de retenção obtidos para as amostras- padrão foram: 0,64; 4,84; 5,12; 3,17; 3,31 e 2,99 minutos, em média, respectivamente para ácido gálico, Ca5, Ca6, quercetina, quercitrina e miricitrina.
5.1.5. Isolamento e identificação dos constituintes químicos
A partir do extrato bruto das folhas de C. adamantium foram possíveis o isolamento e a identificação de duas substâncias. A primeira substância foi isolada da fração butanólica de C. adamantium (Figura 11) e foi identificada pela análise de seus dados espectroscópicos de RMN de 1H e 13C, uni e bi-dimensionais e de espectrometria de massas, ESI-MS (Anexos 21 a 25) e informações da literatura (Markham & Geiger, 1994; Agrawal, 1989; Markham, 1982) sendo possível propor para Caeb31 a estrutura miricetina-3-O-α-L- ramnosídeo (miricitrina). Flavonol glicosilado: Esta categoria de flavonoide caracteriza-se no espectro de RMN de 1H pela presença de um sinal referente a hidrogênio anomérico entre 4,0 e 6,00 ppm.
77 OH OH 2' 8 HO 9 O 2 OH
O OH O '' HO 1 O '' HO 6 OH
Figura 11. Substância 5,7,3’,4’,5’-pentahidroxi-flavonol-3-O--L-ramnosídeo (miricitrina, Caeb31) isolada e identificada na fração butanólica das folhas de Campomanesia adamantium.
Caeb 31: RMN de H1 (400 MHz, MeOD) δH em ppm (mult ( J em Hz), H): 6,20 (d, 2,1, H-6), 6,36 (d, 2,1, H-8); 6,95 (s, H-2’ e H-6’); 5,32 (d, 1,6, H-1”), 4,22, (dd, 1,6 e 3,5, H- 2”); 3,78 (dd, 3,5 e 9,5, H-3”); 3,35 (dd, 9,5, H-4”); 3,51 (m, H-5”); 0,96 (d, 6,2, H-6”). RMN de 13C (50 MHz, MeOD) δC em ppm: 159,6 (C-2), 136,5 (C-3), 178,8 C-4), 163,4 (C-5), 99,9 (C-6), 166,0 (C-7), 94,82 (C-8),158,7 (C-9), 106,0 (C-10), 122,1 (C-1’), 109,7 (C-2’ e C-6’), 147,0 (C-3’ e C-5’), 138,0 (C-4’), 103,8 (C-1”), 72,0 (C-2”), 72,27 (C-3”), - 73,5 (C-4”), 72,18 (C-5”), 17,8 (C-6”). Fórmula molecular C21H20O12. [M-H] = 463 m/z.
Fisicamente a substância Caeb31 apresentou-se como sólido amarelo solúvel em MeOH. No espectro de RMN de 1H (200 MHz, MeOD), vide anexo 21, observou-se em 6,20 e 6,40 ppm a presença de dois dubletos acoplados em meta (J =2,1 Hz) e integrados para um hidrogênio cada que foram atribuídos, respectivamente, ao H-6 e H-8 do anel A da aglicona, que associados ao singleto em 6,95 (2H), sugeriram o esqueleto de um flavonol com anel B com mesmo padrão de substituição da miricetina (Harborne, 1996). Na região entre 1 e 5 ppm, pode-se observar a presença de hidrogênios de açúcares. Os dubletos em 5,32 (J = 1,6 Hz, 1H) e em 0,96 (J = 6,2 Hz, 3H) e o multipleto entre 3,3–4,5 são típicos de uma unidade glicosídica (Tabela 6). O dubleto
78 em 5,32 ppm (J = 1,6 Hz) pode ser atribuído ao hidrogênio do carbono anomérico em O- glicosídeo com configuração . No espectro de RMN de 13C (50 MHz, MeOD) foram observados treze sinais relativos à aglicona (Agrawal, 1989). Na região dos açúcares (102,0 a 68,0 ppm e 18,2 ppm) observaram-se 6 sinais, o que sugeriu a presença de uma unidade glicosídica (Tabela 6). Os valores de deslocamento químico se mostraram compatíveis com os da ramnose, principalmente devido ao sinal em 18,2 ppm, correspondente a uma metila (Agrawal, 1989). A análise dos espectros bidimensionais HMBC e HMQC possibilitou observar acoplamentos e correlações importantes para a elucidação estrutural (Tabela 6). A correlação H-1’’ ( 5,32 ppm)/C3 ( 136,5 ppm) indicou a ligação da raminose no carbono 3 da aglicona (Agrawal, 1989). Portanto, a unidade monossacarídica possivelmente tratar-se-á da -O--L-ramnosídeo. Pela análise do espectro de massa, confirmou-se a estrutura proposta. O espectro ESI-MS (modo negativo, 30 V), apresentou o íon em m/z 463, confirmando a fórmula 13 molecular C21H20O12, augerido pelo espectro de RMN de C. Assim, com a análise dos dados de RMN de 1H, RMN de 13C, HSQC, HMBC e ESI-MS e comparando com dados da literatura (Ceruks et al., 2007; Harborne, 1996; Agrawal, 1989; Markham, 1982), foi possível propor para Caeb31 a estrutura do flavonol miricitrina (miricetina 3-O--L- ramnosídeo).
79 Tabela 6. Dados de RMN de 1H (400 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade, J, em Hz) e de RMN de 13C (50 MHz, MeOD, em ppm, multiplicidade) para o flavonoide Caeb31.
Posição Literatura Caeb31 Literatura Caeb31 δH em ppm, Caeb31 Miricitrina Miricetrina multiplicidade HMBC δH em ppm, δC, em ppm δC, ppm (J em Hz) multiplicidade (J em Hz)
2 159,6 158,3 - - - 3 136,5 134,5 - - - 4 178,8 177,9 - - - 5 163,4 162,9 - - - 6 99,9 99,9 (1H) 6,20 d (2,1) (1H) 6,36 d 8, 10, 6, 7 (1,8) 7 166,0 165,4 - 8 94,8 94,3 (1H) 6,40 d (2,1) (1H) 6,18 d 6, 10, 9, 7, 4 (fraco) (1,8) 9 158,7 157,5 - - - 10 106,0 105,0 - - - 1’ 122,1 122,5 - - - 2’ e 6’ 109,7 109,5 (2H) 6,95 s (2H) 7,04 s 2’, 6’, 1’, 4’, 3’, 2 3’ e 5” 147,0 146,4 (2H) 7,04 d (9,0) (2H) 7,1 d (9,0) - 4’ 138,0 137,1 - - - 1’’ 103,8 102,0 (1H) 5,32 d (1,6) (1H) 5,18 d 3, 3’’ (1,0) 2’’ 72,0 70,3 (1H) 4,22 dd (1,6 e 3,1 a 4,0 m 3’’, 4’’ 3,5) 3’’ 72,3 70,4 (1H) 3,78 dd (3,5 e 3,1 a 4,0 m 4’’ 9,5) 4’’ 73,5 71,3 (1H) 3,35 dd (9,5)* 3,1 a 4,0 m 6’’, 2’’ 5’’ 72,2 69,6 3,51 m 3,1 a 4,0 m 4’’ 6’’ 17,8 17,3 (3H) 0,96 d (6,2) (3H) 0,979d 5’’, 4’’ (5,3)
-: sinal não observado; *: sinal parcialmente encoberto pelo solvente; Ceruks et al., 2007 1 13 (RMN H , 300 MHz, DMSO-d6); RMN C , 75 MHz, DMSO-d6)
A segunda substância Ca5 foi isolada da fração diclorometânica de C. adamantium empregando diferentes procedimentos cromatográficos. A partir da análise dos dados espectrais de Ca5 e também utilizando RMN 1H, 13C, HSQC, HMBC e espectrometria de massas foi possível a identificação da chalcona 2’,4’-dihidroxi-6’- metoxichalcona ou (2E)-(2,4-dihidroxi-6-metoxifenil)-3-fenil-2-propen-1-one ou Cardamonin (Ca5 (Figura 12)), em concordância com os dados espectrais descritos por Itokawa e colaboradores em 1981.
80
HO OH
OMe O
Figura 12. Substância 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona (Ca5) isolada e identificada da fração butanólica das folhas de Campomanesia adamantium.
1 Ca5: RMN de H (200 MHz, CDCl3+MeOD) δH (mult (J em Hz); H): 3,92 (s; 3H,
6’-OCH3), 5,97 (d (2,2); 1H, H-3’), 6,01 (d (2,2); 1H, H-5’), 7,41 (m; 3H, H-3, H-4 e H- 5), 7,61 (m; 2H, H-2 e H-6), 7,75 (d (15,6); 1H, H-β), 7,91 (d (15,7); 1H, H-α). RMN de 13 C (50 MHz, CDCl3+MeOD) δC: 135,4 (C-1), 128,2 (C-2 e C-6), 128,7 (C-3 e C-5), 129,9 (C-4), 127,6 (C-α), 141,9 (C-β), 192,5 (C=O), 105,8 (C-1’, observado apenas através do HMBC), 163,2 (C-2’), 91,6 (C-3’), 164,9 (C-4’), 96,1 (C-5’), 163,2 (C-6’), - 55,7 (6’-OCH3). Fórmula molecular C16H14O4,, [M-H] 269 uma.
Dados espectrais da literatura para Cardamonin (Itokawa et al., 1981): RMN 1 de H (200 MHz, CDCl3) δH (mult (J em Hz); H): 3,98 (s; 3H, 6’-OCH3), 6,02 (d (3); 1H, H-3’), 6,08 (d (3); 1H, H-5’), 7,36 (m; 3H, H-3, H-4 e H-5), 7,76 (m; 2H, H-2 e H-6), 13 7,80 (d (16); 1H, H-β), 7,94 (d (16); 1H, H-α). RMN de C (50 MHz, CDCl3) δC: 136,5 (C-1), 129,0 (C-2 e C-6), 129,7 (C-3 e C-5), 130,7 (C-4), 129,7 (C-α), 142,4 (C-β), 193,0 (C=O), 106,4 (C-1’), 168,3 (C-2’), 92,3 (C-3’), 165,8 (C-4’), 97,0 (C-5’), 164,3 (C-6’),
56,3 (6’-OCH3).
Fisicamente a substância Ca5 apresentou-se como sólido amarelo solúvel em metanol. Com relação a Ca5, no espectro de RMN1H foi possível se observar dois dubletos um em δ 7,75 e outro em δ 7,91, integrados para um hidrogênio cada em (J= 15
Hz), típicos de hidrogênios trans-olefínicos do esqueleto de uma chalcona. Em 3,92 observou-se um singleto integrado para 3H característico de um grupo metoxila -OCH3.
81 Hidrogênios em δ 5,97 (1H, d, J=2,2 Hz) e δ 6,01 (1H, d, J=2,2 Hz) sugerem a presença de um anel A 2’,4’, 6’-trissubstituído e os sinais em δ 7,41 (m; 3H, H-3, H-4 e H-5) e δ
7,61 (m; 2H, H-2 e H-6), são consistentes com um anel B não substituído.
No espectro de RMN de C13 observou-se o sinal referente à carbonila em δ 192,5 ppm e os sinais em δ 127,6 (C-α) e δ 141,9 (C-β), são típicos do esqueleto de uma chalcona (Agrawal, 1989). A análise dos espectros bidimensionais HMBC e HSQC
(Anexos 30-35) possibilitou a observação da correlação entre -OCH3 ( 3,92 ppm)/ C-
6’( 164,3 ppm), o que confirmou a ligação da metoxila na posição 6’ da aglicona.
Assim, com a análise dos dados de RMN de 1H, RMN de 13C, HSQC, HMBC e
ESI-MS/MS e observando-se dados da literatura (Itokawa et al., 1981; Agrawal, 1989), foi possível propor para Ca5 a estrutura da chalcona 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona.
Em C. guaviroba esses resultados químicos são inéditos, enquanto em C. adamantium coletadas em Curitiba-PR em estudo anterior já foram identificados flavonóides como isoquercitrina, quercitrina, miricetina, quercetina e das chalconas 2’,4’- diidroxi-6’-metoxichalcona, 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona e 2’,4’-dihidroxi-
3’,5’-dimetil-6’-metoxichalcona (Pascoal et al., 2011a). Quercetina, miricetina e miricitrina foram compostos identificados em outros estudos com espécies de
Campomanesia cultivadas no estado de Minas Gerais (Ferreira et al., 2013; Michel et al.,
2013) e chalconas identificadas neste presente estudo foram previamente identificadas nos frutos de C. adamantium e C. pubescens cultivados nos estado do Mato Grosso do
Sul (Pavan et al., 2009; Cardoso et al., 2010), demonstrando que os metabólitos secundários derivados da rota dos fenilpropanoides estão sendo produzidos em espécies do gênero mesmo em condições diferentes de solo, clima, altitude, composição
82 atmosférica, índice pluviométrico, sazonalidade e possível ataque de patógenos. Já o
ácido gálico foi descrito pela primeira vez no gênero Campomanesia. Porém, observando os espectros obtidos por espectrometria de massas (anexos 1 a 10), outros constituintes ainda não puderam ser identificados o que motiva continuação dos estudos fitoquímicos.
5.2. Avaliação do potencial antiproliferativo e antitumoral 5.2.1. Avaliação in vitro da atividade antiproliferativa frente a linhagens tumorais e linhagem não tumoral
Na triagem inicial dos extratos etanólicos brutos e das frações das espécies vegetais estudadas, verificou-se que algumas amostras apresentaram-se biologicamente ativas em reduzir a proliferação celular e pode-se calcular a concentração capaz de inibir o crescimento das células em 50% (GI50) nas culturas celulares estudadas (Tabelas 7 e 8).
Segundo protocolo do NCI, extratos brutos de origem vegetal com valores de GI50 ≤ a 30
µg/mL devem ser considerados significativos para se prosseguir nos estudos na busca de novos compostos com atividade antitumoral (Alley, 1988; Costa-Lotufo et al., 2005) assim como a citotoxicidade seletiva quando comparadas com linhagens celulares não tumorais. Os dois compostos isolados de C. adamantium e as substâncias identificadas nos extratos e frações por espectrometria de massas também tiveram suas atividades antiproliferativas avaliadas.
Portanto, foi possível observar que o extrato bruto etanólico de C. guaviroba e suas frações apresentaram atividade antiproliferativa frente a algumas das linhagens estudadas (Figura 13 e Tabela 6). O extrato bruto apresentou melhores resultados para as linhagens de glioma (U251) (GI50= 30,18 µg/mL) e leucemia (K562) (GI50= 15,41
µg/mL), sendo bem inferior ao GI50 encontrados na linhagem não-tumoral VERO (GI50=
83 79,03 µg/mL). A fração hexânica apresentou seletividade para as linhagens de leucemia
(K562) (GI50=25,02 µg/mL), glioma (U251) (GI50=30,30 µg/mL) e ovário (OVCAR-03)
(GI50=31,53µg/mL) e a para células não-tumorais VERO a concentração que inibiu o crescimento celular em 50% foi de 82,43 µg/mL. A fração diclorometânica foi a que apresentou GI50< 30 µg/mL para um número maior de linhagens, entre elas, leucemia
(K562) (GI50=13,44 µg/mL), glioma (U251) (GI50= 24,33 µg/mL) e ovário (OVCAR-03)
(GI50= 26,62 µg/mL). Porém a concentração tóxica para VERO desta fração também esteve próxima aos 30 µg/mL. A fração butanólica apenas para a linhagem de leucemia
(K562) apresentou uma concentração efetiva, sendo próxima à concentração tóxica para as células VERO. Na fração hidroalcóolica a atividade antiproliferativa só foi alcançada em altas concentrações (acima de 100 µg/mL) em apenas duas linhagens, o que não a torna atrativa para se dar continuidade no estudo com esta fração.
84
Figura 13. Gráfico da atividade antiproliferativa C. guaviroba (Cge), e suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e hidroalcóolica (Cgehi) e o quimioterápico doxorrubicina em cultura de células tumorais, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração. GI50 - concentração necessária para inibir o crescimento celular em 50%.
85
Tabela 7. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cge) e suas frações hexânica (Cgeh), diclorometânica (Cged), butanólica (Cgeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Cgehi) e controle positivo doxorrubicina.
Linhagens Amostras de células Cge Cgeh Cged Cgeb Cgehi Doxorrubicina
VERO 79,03 82,43 29,47 32,40 >250 0,13 U251 30,18 30,30 24,33 31,75 >250 0,03 MCF-7 69,94 > 250 >250 >250 213,00 0,07 NCI- 141,21 86,74 80,54 60,48 >250 0,1 ADR/RES 786-0 87,98 87,76 31,01 67,39 >250 3,55 NCI-H460 101,47 90,09 51,23 60,18 >250 0,13 PC-3 97,66 92,73 35,56 45,01 >250 0,15 OVCAR-03 105,28 31,53 26,62 193,52 >250 0,38 HT-29 105,48 108,72 84,63 79,00 >250 0,09 K562 15,41 25,02 13,44 28,17 113,35 0,12
GI50 – Concentração que leva a inibição de 50% do crescimento celular, em µg/mL; Resultados apresentados como média dos ensaios realizados em triplicata. O desvio padrão observado esteve abaixo de 5%; Linhagens: linhagem célular não cancerosa (VERO), glioma (U251); mama (MCF-7); ovário resistente a múltiplos fármacos (NCI- ADR/RES); rim (786-0); pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460); próstata (PC- 3); ovário (OVCAR-03); cólon (HT-29); leucemia (K562). Resultados promissores em negrito (GI50< 30 µg/mL).
Os resultados obtidos para o extrato bruto etanólico de C. adamantium e frações estão apresentados na tabela 8 e figura 14. Neste ensaio a linhagem não-tumoral utilizada foi uma linhagem de queratinócitos (HaCat). O extrato bruto apresentou resultados promissores frente a algumas linhagens celulares tumorais (Figura 13), como ovário resistente a múltiplos fármacos (NCI/ADR-RES) (GI50= 3,28 µg/mL), ovário (OVCAR-
03) (GI50=11,25 µg/mL), glioma (U251) (GI50= 22,32 µg/mL), mama (MCF-7) (GI50=
28,90 µg/mL), rim (786-O) (GI50= 30,26 µg/mL) e a ação antiproliferativa em células
86 HaCat capaz de inibir o crescimento em 50% foi de 17,98 µg/mL. A fração hexânica apresentou boa atividade antiproliferativa com resultados de GI50 variando de 1,19
µg/mL para células de ovário resistente (NCI/ADR-RES) a 45,82 µg/mL para linhagem celular de pulmão (NCI-H460). A fração diclorometânica apresentou atividade frente às linhagens de câncer de mama (MCF-7), ovário resistente (NCI/ADR-RES), rim (786-0), ovário (OVCAR-03) e cólon (HT-29), com melhores resultados para NCI-H460 (GI50=
1,47 µg/mL) e ovário (OVCAR-03) (GI50= 7,26 µg/mL). A fração butanólica de C. adamantium apresentou efeito antiproliferativo frente a todas as linhagens tumorais, com maior GI50 para a linhagem celular de pulmão (NCI-H460) de 52,8 µg/mL e melhor atividade para a linhagem de ovário resistente (NCI/ADR-RES) (GI50= 4,03 µg/mL). A fração hidroalcóolica de C. adamantium também apresentou atividade antiproliferativa, porém com GI50 variando de 32,68 µg/mL para linhagem OVCAR-03 a 112,48 µg/mL para linhagem 786-0.
87
Figura 14. Gráfico da atividade antiproliferativa C. adamantium (Cae), e suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e hidroalcóolica (Caehi) e o quimioterápico doxorrubicina em cultura de células tumorais, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração.
88
Tabela 8. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Cae) e de suas frações hexânica (Caeh), diclorometânica (Caed), butanólica (Caeb) e fração hidroalcoólica remanescente (Caehi) e controle positivo doxorrubicina.
Linhagens Amostras de células Cae Caeh Caed Caeb Caehi Doxorrubicina HaCat 17,98 15,59 7,05 46,97 25,61 0,23 U251 22,32 25,86 >250 24,55 65,62 0,054 MCF-7 28,90 25,43 23,82 29,22 78,88 0,084 NCI- 3,28 1,19 1,47 4,03 55,34 9,22 ADR/RES 786-0 30,26 26,94 26,69 32,65 112,48 0,078 NCI-H460 62,93 45,82 >250 52,80 90,58 0,265 PC-3 ------OVCAR-03 11,25 8,67 7,26 42,79 32,68 0,103 HT-29 31,77 26,53 26,39 30,27 59,06 0,258 K562 ------
GI50 – Concentração que leva a inibição de 50% do crescimento celular, em µg/mL; Resultados apresentados como média dos ensaios realizados em triplicata. O desvio padrão observado esteve abaixo de 5%; Linhagens: linhagem celular não-cancerosa (HaCat), glioma (U251); mama (MCF-7); ovário resistente a múltiplos fármacos (NCI- ADR/RES); rim (786-0); pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460); próstata (PC- 3); ovário (OVCAR-3); cólon (HT-29); leucemia (K562). Resultados promissores em negrito (GI50< 30 µg/mL). - não avaliado.
Os resultados da atividade antiproliferativa em células tumorais e não tumorais para a substância isolada miricitrina e bem como para as substâncias identificadas nos extratos, estão apresentados na tabela 9 e 10. O flavonol glicosilado miricitrina, que foi isolado da fração butanólica de C. adamantium, não apresentou atividade antiproliferativa frente às linhagens testadas, exceto na linhagem MCF-7, porém com GI50 próximo a 50
µg/mL. O flavonol glicosilado quercitrina apresentou atividade frente à duas linhagens, rim (786-0) e leucemia (K562) com GI50 de 2 µg/mL, já o flavonol quercetina
89 apresentou-se ativo frente à 9 das 10 linhagens testadas com GI50 de 0,08 a 5,28 µg/mL, no entanto também foi tóxica às células não cancerosas HaCat GI50 =1,20 µg/mL. O ácido gálico também apresentou atividade antiproliferativa em concentrações abaixo de 8,57
µg/mL para inibir o crescimento em 50% e também foi citotóxica células não cancerosas
HaCat (GI50 =5,23 µg/mL) (Figura 15).
As chalconas Ca5 (2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona, cardamonin) isolada da fração diclorometânica de C. adamantium e a chalcona identificada em C. guaviroba e
C. adamantium Ca6 (2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona) foram capazes de inibir 100% do crescimento celular em algumas linhagens com concentrações abaixo de
10 µg/mL. A chalcona Ca5 apresentou atividade frente às linhagens UACC-62, NCI-
ADR/RES E 786-O com TGI< 6 µg/mL e a chalcona Ca6 nas linhagens MCF-7, PC-3 e
HT-29 com TGI< 15 µg/mL (Figura 16).
90 Figura 15. Gráfico da atividade antiproliferativa quercetina, quercitrina, miricitrina e ácido gálico em cultura de células tumorais, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração.
91 Tabela 9. Valores de concentração que leva à inibição de 50% do crescimento celular (GI50) em µg/mL das substâncias identificadas nos etanólico bruto das folhas de C. guaviroba e C. adamantium e de suas frações hexânica (quercetina, quercitrina, ácido gálico) assim como o composto isolado Caeb31 (miricitrina) e controle positivo doxorrubicina.
Linhagens de Amostras células quercetina quercitrina miricitrina ácido doxorrubicina gálico U251 4,62 >50 >50 4,73 0,02 UACC-62 0,40 >50 >50 2,05 0,02 MCF-7 1,28 >50 48,18 1,42 NCI-ADR/RES 4,99 >50 8,03 1,95 786-0 >50 1,95 >50 0,37 0,07 NCI-H460 0,08 >50 >50 8,57 2,85 PC-3 2,37 >50 >50 5,74 0,07 OVCAR-03 - - - - - HT-29 5,28 >50 >50 4,04 0,069 K562 2,62 0,37 >50 0,13 0,018 HaCat 1,20 >50 >50 5,23 0,22
GI50 – Concentração que leva a inibição de 50% do crescimento celular, em µg/mL; Resultados apresentados como média dos ensaios realizados em triplicata. O desvio padrão observado esteve abaixo de 5%; Linhagens: linhagem celular não cancerosa (HaCat), glioma (U251); mama (MCF-7); ovário resistente a múltiplos fármacos (NCI- ADR/RES); rim (786-0); pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460); próstata (PC- 3); ovário (OVCAR-3); cólon (HT-29); leucemia (K562). Resultados promissores em negrito. - não avaliado.
92
Figura 16. Gráfico da atividade antiproliferativa das chalconas Ca5 e Ca6 e o quimioterápico doxorrubicina em cultura de células tumorais, relacionando porcentagem de crescimento versus concentração.
93 Tabela 10. Valores de concentração que leva à inibição de 100% do crescimento celular (TGI) em µg/mL da chalcona isolada de C. adamantium (Ca5 - 2’,4’-dihidroxi-6’- metoxichalcona) e a chalcona identificada em C. guaviroba (Ca6- 2’,4’-dihidroxi-5’- metil-6’-metoxichalcona) e controle positivo doxorrubicina.
Linhagens de células Amostras
Ca5 Ca6 Doxorrubicina UACC-62 2,17 10,62 0,085 MCF-7 41,66 8,10 0,43 NCI-ADR/RES 2,85 14,59 1,62 786-0 5,46 13,36 1,15 NCI-H460 >125 14,66 0,21 PC-3 15,70 9,20 0,065 OVCAR-03 125,0 12,94 0,85 HT-29 >125,0 8,63 1,97 U251 - - - K562 - - - VERO 5,99 13,27 6,12
TGI – Concentração que leva a inibição de 100% do crescimento celular, em µg/mL; Resultados apresentados como média dos ensaios realizados em triplicata. O desvio padrão observado esteve abaixo de 5%; Linhagens: linhagem de célula não cancerosa (HaCat), glioma (U251); mama (MCF-7); ovário resistente a múltiplos fármacos (NCI- ADR/RES); rim (786-0); pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460); próstata (PC- 3); ovário (OVCAR-3); cólon (HT-29); leucemia (K562). Resultados promissores em negrito (GI50< 30 µg/mL). - não avaliado.
5.2.2. Análises da expressão dos genes TNF-α e NF-kB em cultura de células de
câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460)
O Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é uma citocina transmembrana, relacionada aos processos inflamatório e imune. Após desagregação proteolítica pela ação da enzima conversora de TNF (TACE), torna-se uma citocina solúvel. Existem dois receptores TNF-α: TNFRI, encontrados em praticamente todas as células do corpo, e
TNFRII, presentes principalmente em células hematopoiéticas. A ativação dos receptores
TNF leva via ao recrutamento de proteínas intracelulares, que ativam múltiplas vias de
94 transdução de sinal e que induz genes envolvidos na inflamação e também a sobrevivência das células e morte celular (Varfolomeev & Ashkenazi, 2004; Vendramini-
Costa & Carvalho, 2012). Sinais de sobrevivência dependente de TNF são mediados principalmente pela sinalização de NF-kB (Sakurai et al., 2003; Skaug et al., 2009;
Vallabhapurapu & Karin, 2009), enquanto que o sinal de morte induzida por TNF é acionado por caspase-8 apoptose dependente ou RIP1 necroptosis / 3-dependente (Wang et al., 2008; Kim et al., 2008; He et al., 2009; Zhang et al., 2009; Feoktistova et al.,
2011; Günther et al., 2011; Kaiser et al., 2011; Oberst et al., 2011; Tenev et al., 2011;
Xiao et al., 2011). Em tumores, essa citocina atua no crescimento e na metástase das células malignas, e os receptores de TNFRI e TNFRII são encontrados em biópsias de tumores e infiltrados de leucócitos e estão associados a um mau prognóstico em tumores humanos, a perda de responsividade hormonal, caquexia e astenia (Vendramini-Costa &
Carvalho, 2012). TNF-α é uma citocina que caracteriza o grau de agressividade em certos tipos de câncer, assim como interleucina IL-6 e IL-1β e estão relacionados na promoção do tumor avaliadas em modelos animais (Balkwill1 & Mantovani, 2010).
Assim, foi avaliada primeiramente a expressão dos genes TNF-α em cultura de células de câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) tratadas com os extratos brutos (Cae e Cge), as frações (Caed e Cged) e os flavonoides quercetina, quercitrina, miricitrina, as chalconas 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona (Ca5) e 2’,4’- dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona (Ca6), ácido gálico e o quimioterápico doxorrubicina na concentração de 20 µg/mL por 24h. Quando comparados com o controle negativo, células cultivadas com o diluente (RPMI 1640/DMSO, 99:1), apenas
95 as células tratadas com a fração Cged apresentaram um aumento na expressão do gene
TNF-α, estatisticamente significativo, conforme figura 17.
A n á lis e d a e x p re s s ã o d o g e n e T N F -a lfa e m c é lu la s N C I-H 4 6 0 1 5
*
a
v
i
t a
l 1 0
e
r
o
ã
ç a
c 5
i
f
i
t
n
a u
Q 0
a o a o e e d d c a a 5 6 v in a g e e i n in n a a i a l i r i t ic C C g á t t tr C C a C C g e i i g b c c c u r i r e r o r n r d e i e i u u o c M le x Q Q o Á r o t D n o C
Figura 17. Análise de expressão do gene TNF-α por PCR em Tempo Real das células NCI-H460 tratadas por 24h com 20 µg/mL do quimioterápico doxorrubicina, Cae, Cge, Caed, Cged, ácido gálico, quercetina, miricitrina, chalconas Ca5 e Ca6. (*p<0,05, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, comparados com o controle negativo).
A expressão do segundo gene analisado por RT-PCR foi NF-kB, que está relacionado com processos importantes como imunidade, inflamação, regeneração de tecidos, promoção do câncer, sinalização da proliferação, sobrevivência, diferenciação e
96 migração (Naugler & Karin, 2008; DiDonato et al., 2012; Perkins, 2012). NF-kB é um fator de transcrição nuclear que apresenta cinco diferentes subunidades (Rel A (p65), c-
Rel, Rel B, p50, e p52) e pode regular a expressão de alguns genes, entre eles os que regulam a expressão de citocinas, a óxido nítrico sintase indutível (i-NOS) e a ciclo- oxigenase-2 (COX-2) (Lawrence et al., 2001). Estas proteínas são sequestradas no citoplasma como precursores inativos que formam um complexo com a proteína inibidora
IkB. Frente aos estímulos extracelulares, os complexos inativos NF-kB/IkB-α podem se dissociar, e os dímeros livres de NF-kB podem translocar para o núcleo e ativar a transcrição de genes de compostos que são regulados por NF-kB (Lawrence et al., 2001).
O desenvolvimento da resposta inflamatória é controlado por várias citocinas, tais como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e a interleucina-1β (IL-1β), que são secretadas pelos fagócitos (Baldwin, 2001). A produção destas citocinas é controlada pelo NF-kB
(Baldwin, 2001) que pode estar ativado em situações como tabagismo, estresse, dieta inapropriada, obesidade, álcool, agentes infecciosos, radiação e outros estímulos que também podem ativar a resposta inflamatória e são fatores de risco para o desenvolvimento de um câncer (Vendramini-Costa & Carvalho, 2012). Este fator de transcrição desempenha um papel na transformação das células e está ativo em muitas células tumorais, regulando a expressão da maioria dos genes anti-apoptóticos (Bcl-2,
Bxcl1, c-FLIP, survivina), controlando a transcrição de genes relacionados com a proliferação celular (como c-myc, ciclina D1, fatores de crescimento e COX-2) e regulando a expressão de genes de produtos relacionados com a invasão, metástase e angiogênese (moléculas de adesão, VEGF, CXCR4) (Aggarwal & Gehlot, 2009). Nas análises de expressão do gene NF-kB, em cultura de células de câncer de pulmão, tipo
97 não pequenas células (NCI-H460) tratadas com os extratos brutos (Cae e Cge), as frações
(Caed e Cged) e os flavonoides quercetina, quercitrina, miricitrina, as chalconas 2’,4’- dihidroxi-6’-metoxichalcona (Ca5) e 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona(Ca6),
ácido gálico e o quimioterápico doxorrubicina na concentração de 20 µg/mL por 24h foram representados na figura 18. Houve um aumento na expressão nas células tratadas com o quimioterápico doxorrubicina e o extrato Cae e uma diminuição da expressão nas células tratadas com a fração Cged. Assim, apenas a fração Cged estaria atuando na inibição da expressão dos genes relacionados à proteína NF-KB. A supressão do gene
NF-KB diminui a proliferação celular assim como é proteína chave no processo inflamatório. Assim, esse potencial de inibição deste gene pode ser de significativa contribuição na busca de novos fármacos para o tratamento do câncer e inflamação.
Ho e colaboradores 2010, demonstraram em seus experimentos em células de câncer gástrico que o ácido gálico não aletrou a expressão dos genes NF-kB, mas o houve um aumento nível de citoplasmática IkκB ligada com NF-kB, assim inibindo a sua atividade.
Nos resultados do presente estudo, a não diminuição da expressão dos genes NF- kB pelos demais grupos que receberam outros tratamentos (Figura 18) não descarta a possibilidade de ativação da via extrínseca da apoptose, e avaliação dos níveis citoplasmáticos de IκκB ligada com NFk-B, que o torna inativo. Experimentos como estes poderiam ser realizados para se confirmar a possível interação destes compostos com NFk-B. Assim, substâncias que podem bloquear a atividade desta proteína são bons alvos na busca de para diminuir ou inibir o crescimento do tumor, já o NF-kB é o principal fator de prevenção TNF-α-indução de apoptose, e a inibição desse fator de transcrição deve melhorar a eficácia na indução da apoptose nas terapias de câncer (Beg & Baltimore, 1996).
98
A n á lis e d a e x p re s s ã o d o g e n e N F K b e m c é lu la s N C I-H 4 6 0
1 .5 *
a
v i
t *
a
l
e R
1 .0 o
ã *
ç
a
c
i
f i
t 0 .5
n
a
u Q 0 .0
a a o o e e d d a a c 5 6 v in a g e e n n in i a a i a i i r l t ic C C g t tr t á C C a C C e i i g g b c c c u r r i e r r o n r e e i d u u i o M c le x Q Q o Á r o t D n o C
Figura 18. Análise de expressão do gene NF-kB por PCR em Tempo Real das células NCI-H460 tratadas por 24h com 20 µg/mL o quimioterápico doxorrubicina, Cae, Cge, Caed, Cged, ácido gálico, quercetina, miricitrina, chalconas Ca5 e Ca6. (*p<0,05, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, comparados com o controle negativo).
5.2.3. Análise por citometria de fluxo da fragmentação do DNA em cultura de células
Foram realizadas as análises da fragmentação do DNA por citometria de fluxo em cultura de células de câncer pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) tratadas por
99 24 horas com a os extratos brutos (Cae e Cge), as frações (Caed e Cged) e os flavonoides quercetina, quercitrina, miricitrina, as chalconas 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona (Ca5) e 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona (Ca6), ácido gálico e o quimioterápico doxorrubicina na concentração de 20 µg/mL. A fase irreversível do processo apoptótico é a fragmentação nuclear que é causada por endonucleases, que clivam o DNA em fragmentos de 180-200 pares de base (pb) ou maiores (Sladkova et al., 2000). O iodeto de propídio é um agente que intercala na molécula de DNA (corante de ácidos nucleicos) e emite uma fluorescência amarela e vermelha. O iodeto de propídio não penetra na membrana de células viáveis, portanto usa-se triton, um detergente que rompe a membrana celular, para determinação da porcentagem de células com DNA fragmentado.
As células rompidas pelo tampão de lise expõem os núcleos, permitindo que iodeto de propídio se ligue ao DNA (Peres & Curi, 2005). As células com núcleos íntegros emitem alta fluorescência, já que o iodeto de propídio é excitável por laser de argônio e emite fluorescência na faixa de 560-580 nm. A condensação da cromatina e a fragmentação do
DNA podem ser observadas pela ocorrência de eventos com baixa fluorescência (Peres &
Curi, 2005). Todas as células foram tratadas por 24h e os resultados paresentados na figura 19. As células que receberam o quimioterápico doxorrubicina apresentaram
54,21±3,55% do DNA fragmentado e o flavonóide quercetina induziu a fragmentação do
DNA em 48,96±3,10% das células. A fração Caed induziu fragmentação do DNA em
30,63±2,21% das células e a fração Cged em 25,36±1,85%. O extrato bruto Cae foi capaz de induzir a fragmentação do DNA em 23,14±1,39% das células e Cged em
21,48±2,14%. As células tratadas com os flavonóides quercitrina e miricitrina apresentaram 14,59±1,25% e 32,37±5,64% das células com fragmentação do DNA,
100 respectivamente, sendo que a quercitrina não diferiu estatisticamente do controle negativo. O ácido gálico foi capaz de induzir a fragmentação do DNA em 22,86±2,48% das células e as chalconas Ca5 e Ca6 apresentaram resultados de 17,04±1,06% para C5, não diferindo estatisticamente do controle negativo e a Ca6 apresentou 21,68±1,62% das células tratadas com o DNA fragmentado. Assim, as células que receberam os tratamentos apresentaram indução da fragmentação do DNA estatisticamente significativos quando comparados ao controle negativo, exceto as células tratadas com o flavonoide quercitrina e a chalcona Ca5, como apresentados na figura 18. O flavonoide quercitrina difere-se do flavonoide quercitina pela ligação de um açúcar na molécula (3-
O-L-rhamnosídeo), tornando esta última molécula mais polar. Essa maior polaridade pode ter dificultado a entrada da substância na célula, pela dificuldade me atravessar a bicamada lipídica, não produzindo o mesmo efeito que a quercetina, que apresentou atividade próxima à do quimioterápico doxorrubicina.
Entre as duas chalconas utilizadas como tratamento, a Ca6 apresenta uma metila substituindo um hidrogônio em sua estrutura química quando comparada com a chalcona
Ca5. Esta metila pode ter alterado a polaridade da molécula facilitando sua atravessia pela membrana celular bi-lipídica. Esse resultado pode ser observado no aumento da porcentagem de células com DNA fragmentado das células tratadas com Ca6 comparadas com as células que foram tratadas com Ca5.
101 o
d A p o p to s e
a
t n
e 6 0
m * g
a *
r
f
A
N D
4 0 *
m *
o
c
s * * a
l * *
u l
e 2 0
c
e
d
m
e
g a
t 0 n
e c o a o a 5 6 r e e d d a a c v n i in a a o i i a g e e in in l t c C a g t r á ir C C P a i C t t C C e i g i g b c c c e u r r o i r e d ir N r e i e o u u c M l x Q Q o Á r o t D n o C
Figura 19. Porcentagem de células NCI-H460 com DNA fragmentado por análise em citômetro de fluxo. Células cultivadas por 24h com 20µg/mL dos compostos seguintes: doxorrubicina, Cae, Cge, Caed, Cged, quercetina, quercitrina, miricitrina, ácido gálico, Ca5, Ca6 na concentração de 20µg/mL e controle negativo (diluente RPMI-1640/DMSO 99:1) (*p<0,05, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, comparado com o controle negativo).
5.2.4. Avaliação da toxicidade aguda
A primeira fração avaliada foi a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto de C. guaviroba (Cged). No ensaio de toxicidade aguda os animais Swiss machos foram divididos em 3 grupos com 5 animais em cada grupo. Inicialmente os animais foram
102 pesados e o grupo 1 foi tratado com uma dose de 300 mg/Kg via intraperitoneal (i.p.), utilizando como veículo solução salina de NaCl a 0,9%. A via intraperitoneal foi a via escolhida para este experimento por ser uma via que mais utilizada na experimentação animal e grande parte do produto administrado é absorvida pela circulação portal, podendo ser metabolizado pelo fígado e sendo disponibilizado na circulação geral. Os animais ficaram em observação por 4 horas e alguns sinais foram observados como leve piloereção e leves contorções abdominais. Após 4 horas esses sinais desapareceram.
O grupo 2 foi tratado com 1000 mg/Kg e o grupo 3 com uma dose de 2000 mg/Kg. Nestes grupos os sinais de intoxicação foram de piloereção e contorções abdominais. Após 4 horas esses sinais desapareceram. Os animais permaneceram em observação por 14 dias e o peso verificado no sétimo e décimo quarto dias, não se observando alterações significativas que indicassem sinais comportamentais sugestivos de toxicidade.
Ao final do décimo quarto dia os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e feita a observação dos órgãos. No grupo 1 não se observou qualquer alteração, enquanto no grupo 2 e 3 algumas alterações foram observadas em alguns animais. O animal 1 do grupo 2 apresentou fígado aderido ao diafragma e ao intestino e os animais 2 e 5 do grupo 3 apresentaram coloração do fígado alterada, com a aderência do mesmo ao diafragma no animal 2. Esses sinais podem indicar toxicidade, porém, a aderência do fígado ao diafragma e ao intestino pode ser o sinal de uma peritonite desenvolvida pela injeção intraperitoneal e não toxicidade da fração testada.
Não foi possível calcular a DL50 (dose capaz de matar 50% dos animais), já que a dose mais alta utilizada da fração não causou a morte de nenhum animal. Assim, devido
103 os sinais apresentados por alguns animais estabeleceu-se que a dose máxima para o tratamento do tumor sólido de Erlich seria de 300 mg/Kg.
Já para Caed a maior concentração que foi possível solubilizar em solução salina de NaCl 0,9% foi de 300 mg/Kg. Nenhum animal sofreu toxicidade letal nesta dose com esta amostra. Os animais apresentaram leve piloereção e leves contorções abdominais.
Não houve alterações significativas de peso e observaram-se manchas amarelas e pretas nos rins de um animal e nos demais, aderência do fígado ao diafragma. Não se observou alterações significativas quanto ao peso dos animais.
5.2.5. Ensaios em tumor sólido de Ehrlich
Após a observação da atividade antiproliferativa em cultura de células tumorais da fração Cged e Caed, a próxima etapa foi à avaliação da atividade biológica em modelo experimental de câncer, utilizando camundongos fêmeos Balb C. Dessa forma, foi utilizado o modelo de tumor sólido de pata induzido pela aplicação de células tumorais de
Ehrlich no coxim plantar dos animais no dia 1 (D1), visando avaliar o potencial de redução do volume tumoral dos animais tratados com as frações Cged e Caed administradas via intraperitoneal (i.p.), que teve início no dia 3 (D3) do ensaio, após a fixação e crescimento do tumor. O tratamento prosseguiu-se até o dia 15 (D15) e no dia
16 (D16) os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical.
Os animais foram tratados a cada 3 dias e em cada dia de tratamento o volume da pata foi avaliado com hidropletismômetro. Os volumes dos tumores foram comparados entre os grupos que sofreram diferentes tratamentos e realizou-se a análise estatística utilizando o teste ANOVA, seguido do teste de Tukey, p<0,05. Pelos resultados obtidos
104 com os animais tratados com Cged (Figura 20) pode-se observar que no terceiro dia do ensaio (D3) os cinco grupos não apresentaram diferenças significativas quanto ao volume tumoral. No sexto dia houve diferenças significativas entre o grupo salina e doxorrubicina (p<0,05), grupo salina e Cged 300 mg/Kg (p<0,05), grupo salina e Cged
100 mg/Kg (p<0,05); entre o grupo salina e Cged 100 mg/Kg (p<0,05) e entre o grupo salina e o grupo tratado com 30 mg/Kg (p<0,05). No nono dia do ensaio (D9) não observou-se diferenças significativas entre os grupos assim como no décimo segundo dia
(D12). No décimo quinto dia, comparando-se os grupos tratados com o grupo salina, verificou-se diferenças significativas entre o grupo salina e doxorrubicina (p<0,05) e salina e Cged 100 mg/Kg (p<0,05). No décimo sexto dia do ensaio (D16) houve diferenças significativas entre os grupos salina e doxorrubicina (p<0,05); entre o grupo salina e Cged 300 mg/Kg (p<0,05); entre o grupo salina e Cged 100 mg/Kg (p<0,05) e entre o grupo salina e o grupo tratado com 30 mg/Kg (p<0,05). De maneira geral, a fração Cged nas diferentes doses não apresentou uma atividade antitumoral constante entre os dias que se obtiveram os volumes dos tumores, porém ao final do ensaio todos os grupos tratados apresentaram diferenças significativas quando comparados ao grupo salina. Os tratamentos não apresentaram diferenças significativas quando comparados ao grupo tratado com o quimioterápico doxorrubicina. Assim, pode-se observar que o quimioterápico doxorrubicina (3 mg/Kg) foi capaz de reduzir 52,65±0,028% quando comparado com o grupo salina. A redução do volume tumoral dos animais tratados com
Cged 300 mg/Kg foi de 26,48±0,093%, dos animais tratados com Cged 100 mg/Kg foi de
34,58±0,051% e os animais tratados com Cged 30 mg/Kg tiverem uma redução do volume tumoral em 28,04±0,071%.
105
s a lin a
D o x o rru b ic in a 3 m g /K g C g e d 3 0 0 m g /K g 0 .5 C g e d 1 0 0 m g /K g
C g e d 3 0 m g /K g
0 .4
)
L
m
e
m
g
(
a
t
a t
n i
a 0 .3
e
p c
h
r
a
o
d
p
a g
r e
m
u
e
s
o s
t 0 .2
e
n p
e f
s
e m
c d
u
a
A d
a 0 .1 b
0 .0 0 5 1 0 1 5 2 0
te m p o (d ia s )
Figura 20. Desenvolvimento do tumor (mL) dos animais tratados com salina, com o quimioterápico doxorrubicina (doxo) a 3 mg/Kg e com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cged) nas concentrações de 300 mg/Kg (Cged 300), 100 mg/Kg (Cged 100) e de 30 mg/Kg (Cged 30) nos 16 dias do ensaio, via intraperitoneal. D3= terceiro dia de ensaio, D6 sexto dia de ensaio, D9= nono dia de ensaio, D12= décimo segundo dia de ensaio, D15= décimo quinto dia de ensaio, D16= décimo sexto dia de ensaio. Resultados representam a média de 8 animais por grupo. Foi realizada análise da variância, ANOVA, seguido do Teste de Tukey. Grupo tratado com quimioterápico doxorrubicina, a=b=c=d=f=p<0,05, diferindo estatisticamente do grupo salina (controle negativo) nos tempos iguais. Grupo tratado com Cged 100 mg/Kg diferindo estastiticamente do grupo salina (controle negativo) nos tempos D15 e D16, e=g=p<0,05. D16 grupo tratado com Cged 300 mg/Kg i=p<0,05 quando comparadas ao grupo salina (controle negativo). D16 grupo tratado com Cged 30 mg/Kg h=p<0,05 quando comparadas ao grupo salina (controle negativo).
106
O mesmo ensaio foi realizado com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Caed), que foi a fração que apresentou atividade antiproliferativa in vitro mais promissora. Os grupos foram divididos em tratados com salina NaCl 0,9%, quimioterápico doxorrubicina 3 mg/Kg, Caed 300 mg/Kg, Caed
100mg/Kg e Caed 30 mg/Kg (Figura 21). O tratamento dos animais teve início no terceiro dia do ensaio (D3), quando não houve diferenças significativas dos volumes tumorais entre os grupos. Os volumes tumorais continuaram a aumentar até o sexto dia
(D6), sendo o grupo tratado com doxorrubicina diferiu estatisticamente do controle negativo e no nono dia (D9) do ensaio não houve diferenças entre os grupos. No décimo segundo dia (D12), décimo quinto (D15) e décimo sexto (D16) foi possível observar diferenças significativas entre o grupo salina e o grupo tratado com o quimioterápico doxorrubicina (p<0,05), que ao final do experimento, o quimioterápico doxorrubicina 3 mg/Kg foi capaz de reduzir o volume tumoral em 37,63±0,049%.
107 s a lin a
D o x o rru b ic in a 3 m g /K g
0 .4 C a e d 3 0 0 m g /K g C a e d 1 0 0 m g /K g
C a e d 3 0 m g /K g
) 0 .3
L
m
e
m
g
(
a
t
a
t
n
a
e
p
c
r
a
o
d
p
0 .2 a
r e
m
u
e
s o
s d
t
e
n
p
e
s e
m c
u
a A d 0 .1 b
a
0 .0 0 5 1 0 1 5 2 0
te m p o (d ia s ) Figura 21. Desenvolvimento do tumor (mL) dos animais tratados com salina, com o quimioterápico doxorrubicina (doxo) 3 mg/Kg, com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Caed) nas concentrações de 30 mg/Kg
(Caed 30), 100 mg/Kg (Caed 100) e de 300 mg/Kg (Caed 300) nos 16 dias do ensaio, via intraperitoneal. D3= terceiro dia de ensaio, D6 sexto dia de ensaio, D9= nono dia de ensaio, D12= décimo segundo dia de ensaio, D15= décimo quinto dia de ensaio, D16= décimo sexto dia de ensaio. Resultados representam a média de 8 animais por grupo. Foi realizada análise de variância, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, a=b=c=d=e= p<0,05, diferindo estatisticamente do grupo salina.
108 A fim de se avaliar a atividade antitumoral das frações Cged e Caed por via oral, prosseguiu-se o experimento com tumor sólido de Erlich, sendo os animais tratados diariamente, um dia após a inoculação do tumor, por gavagem nas doses de 25 e 50 mg/Kg (Figura 22). O grupo experimental tratado com o quimioterápico doxorrubina a 3 mg/Kg não apresentou diferença estatística do controle positivo. Resultado este esperado, já que apenas 5 % deste fármaco é absorvido pelo trato gastrointestinal, conforme descrito na bula do medicamento. As frações Cged e Caed não foram capazes de diminuir o crescimento tumoral quando comparadas com o grupo controle, e a fração Caed na dose
25 mg/Kg aumentou o volume do tumor quando comparados com o contorole negativo, tratados com salina 0,9%. Assim, a fração Cged, que foi ativa em tumor sólido de Erlich quando os animais foram tratados via intraperitoneal em dose de 30 a 300 mg/Kg, perdeu essa atividade quando administrada via oral, nas doses de 25 e 50 mg/Kg tratados diariamente. Os compostos presentes nesta fração podem ter sido metabolizados durante a absorção a metabólitos inativos assim como não terem sido absorvidos pelo trato gastrointestinal, já que pela via intraperitoneal os compostos estão prontamente disponíveis para serem carregados pela corrente sanguínea até os sítios de ação.
109
A tiv id a d e A n titu m o ra l
0 .3
* )
L m
(
r
o 0 .2
m
u t
o d
e 0 .1
m
u l
o V 0 .0
a g g g g g n K K K K K li / / / / / a g g g g g s m m m m m 3 0 5 5 5 0 a 2 2 5 n d i d e d d c e e e i a a g g b C C u C C r r o x o D
Figura 22. Avaliação do volume do tumor dos animais tratados com salina (0,9%), com o quimioterápico doxorrubicina a 3 mg/Kg, com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Caed) e C. guaviroba nas doses de 25 e 50 mg/Kg tratados via oral, a cada 24 horas, no decorrer dos 16 dias de experimentação. Foi realizada análise estatística, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, onde * = grupos diferem estatisticamente do grupo salina (controle negativo) p<0,05 comparados os grupos experimentais.
Os resultados das atividades antiproliferativas in vitro e antitumoral in vivo mostraram promissores, principalmente devido à baixa toxicidade in vivo das amostras, particularmente para a fração diclorometânica do extrato etanólico das folhas de C. guaviroba (Cged) que apresentou atividade antitumoral. As doses utilizadas podem ser consideradas baixas se comparadas com dados de literatura para outras plantas já estudadas empregando modelos experimentais com doses efetivas com redução do volume do tumor entre 100 mg/Kg e 1000 mg/Kg, via intraperitoneal (Longato et al.,
110 2011; Marchetti et al., 2012). A atividade antiproliferativa dos compostos identificados em C. adamantium e C. guaviroba podem ser alguns dos compostos responsáveis por essa atividade nos extratos e frações, principalmente as chalconas, que apresentaram uma capacidade de inibir totalmente o crescimento de algumas linhagens celulares com concentrações efetivas abaixo de 10 μg/mL e foram os compostos encontrados em maior concentração no extrato bruto e na fração diclorometânica de C. adamantium. Das substâncias isoladas e identificadas pode-se observar promissora atividade antiproliferativa no flavonoide quercetina, no ácido gálico e nas chalconas cardamonin e
2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-metoxichalcona. A atividade antiproliferativa da quercetina já foi descrita para linhagens celulares de câncer de próstata, glioblastoma, mama, e de cólon (Kuo, 1996; Kuo et al., 2004; Lee et al., 2006; Vijayababu et al., 2006; Mense et al., 2008; Murakami et al., 2008; Galluzzo et al., 2009; Kumar et al., 2011). Muitos estudos na tentativa de se elucidar os mecanismos com que este flavonol interage com as células tumorais e como induz a morte celular estão sendo realizados. Sabe-se que a quercetina rompe a cadeia de DNA, pode inibir enzimas e cinases de transdução de sinal associadas com a sobrevivência celular e pode induzir a ativação de p38, que uma das suas funções é ativar caspase-3, que é uma enzima pró-apoptótica (Bulzomi et al., 2012).
Sharmila e colaboradores (2014) estudaram o efeito da quercetina em modelo de ratos com câncer de próstata. Os animais que desenvolveram este carcinoma apresentaram diminuição das enzimas antioxidantes e proteínas apoptóticas, mas os animais suplementados com quercetina tiveram uma diminuição da sobrevivência das células, da atividade proliferativa e das proteínas anti-apoptóticas, demonstrando uma potencial atividade quimiopreventiva deste composto.
111 O ácido gálico é capaz de inibir células cancerosas, com menor toxicidade, sendo um composto com multi-alvos, cuja atividade já descrita inclui indutor de apoptose, efeito antiangiogênico, inibitor de NFkB entre outros efeitos (Verma et al., 2013). Já o flavonóide glicosilado quercitrina apresentou atividades anti-melanogênica em células
B16F10 (melanoma) (Hong et al., 2013). Miricitrina, em estudo realizado com ratos que apresentaram lesões pré-malignas induzidas, apresentou atividade quimiopreventiva em tumores de cólon (Asano et al., 2007). Xu e colaboradores (2013) descreveram a atividade antiproliferativa e indução de apoptose dos flavonóides micitrina, quercetina e quercitrina, porém as concentrações utilizadas foram de 37,5 a 600 μmol/L, e o IC50 para miricitrina seria de 267,12 μmol/L (124 μg/mL) e 418 μmol/L (128 μg/mL), concentrações mais que 2X maior que a maior concentração testada neste presente trabalho. Já o flavonol quercitrina não apresentou atividade nas concentrações avaliadas.
Por ser um composto glicosilado e apresentar maior polaridade que a quercetina, a mesmanão pode ser absorvida e consequentemente não ter exercido sua possível atividade no interior das células. Compostos isolados e identificados em frutos de
Syzygium samarangense, Myrtaceae nativa da Ásia, entre eles chalconas, flavonóis e
ácido fenólicos foram avaliados quanto à atividade citotóxica, e entre estes compostos a chalcona cardamonin foi um dos compostos que apresentaram atividade com IC50 de 9,45
μg/mL (35 μM) em células de câncer humano de cólon (SW-480) (Simirgiotis et al.,
2008), condizente com os apresentados neste trabalho. Assim, estes compostos podem estar agindo em conjunto ou separadamente na atividade antiproliferativa, na indução da apoptose em células de câncer de pulmão, tipo não pequenas células (NCI-H460) e na
112 atividade antitumoral da fração Cged em tumor sólido de Ehrlich, presentes nas espécies estudadas.
A fração Caed, que apresentou atividade antiproliferativa em algumas linhagens de células tumorais, quando testadas em animais perdeu esse efeito. Os compostos presentes nesta fração podem ter sido metabolizados pelo fígado, inativando-os ou não foram absorvidos nas concentrações necessárias para que chegassem em concentrações efetivas no alvo de ação.
5.3. Avaliação do potencial antinoceptivo e anti-edematogênico in vivo
5.3.1. Atividade antinociceptiva
O ensaio de contorções abdominais induzidas por ácido acético é o modelo típico de atividade antinociceptiva. A irritação local causada pela administração intraperitoneal deste agente desencadeia a liberação de vários mediadores, tais como bradicinina, substância P e PG, bem como as citocinas, tais como IL-1β, TNF-α e IL-8. Estes mediadores ativam nociceptores que contribuem para o desenvolvimento da dor inflamatória (Braggio et al., 2002). Assim, é um modelo útil para avaliar analgesia moderada produzida pela atividade de anti-inflamatórios (Pires et al., 2004). A figura 23 representa o número de contorções abdominais durante 30 minutos dos diferentes grupos tratados. O resultado da análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de Tukey
(p<0,05) demonstrou que o controle positivo, o fármaco Indometacina (10 mg/Kg) e as frações Cged e Caed nas doses de 125 mg/Kg e 250 mg/Kg apresentaram reduções estatisticamente significativas quando comparadas ao controle negativo tratados apenas com salina 0,9%. Indometacina foi capaz de diminuir 68,18% das contorções abdominais,
113 Cged 125 mg/Kg inibiu 82,68% e Cged 250 mg/Kg diminuiu 40,26% das contorções abdominais. Já as frações Caed 125 mg/Kg inibiu 74,95% e Caed 250 mg/Kg foi capaz de inibir as contrações abdominais em 85,93% das contrações abdominais. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os grupos Cged 125 e 250 mg/Kg e Caed
125 e 250 mg/Kg quando comparadas com o controle positivo indometacina 10 mg/Kg.
Figura 23. Número de contorções abdominais dos animais em tratamento: a) tratados com salina, com o fármaco de referência Indometacina a 10 mg/Kg e com fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Caed) nas concentrações de 250 mg/Kg 125 mg/Kg e b) tratados com salina, com o fármaco de referência Indometacina a 10 mg/Kg com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cged) nas concentrações de 250 mg/Kg 125 mg/Kg em 30 minutos após a injeção de ácido acético 1%. Resultados representam a média de 6 animais por grupo. Foi realizada análise de variância, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, onde * = grupos diferem estatisticamente do grupo salina (controle negativo) p<0,05.
114 5.3.2. Atividade anti-edematogênica induzida por carragenina
A injeção subplantar de carragenina na pata traseira dos animais causa um edema constituído por uma fase inicial rápida e por uma fase tardia mais sustentada. A primeira fase é mediada pela liberação de histamina, serotonina e cininas, enquanto que a segunda fase é relacionada à liberação de prostaglandinas (Winter et al., 1962; Morris, 2003; Kale et al, 2007; Ince et al., 2009). Portanto, o edema produzido pela carragenina nas patas dos camundongos é um dos sinais da resposta inflamatória, decorrente do aumento da permeabilidade vascular, que foi progressiva durante as 4 horas de observação experimental, variando o aumento em 45,8 a 66,9 % no grupo representado pelo controle negativo, tratado apenas por solução salina 0,9%, conforme observado na figura 24. No controle positivo, indometacina 10mg/Kg, o aumento da porcentagem da espessura da pata esteve entre 27,7% na primeira hora e chegando a 34,7 % na quarta hora de observação. No grupo experimental tratado com Cged 125 mg/Kg o aumento da espessura da pata variou entre 16,4 e 31,9%, 250 mg/Kg nas 4 horas de observação e a espessura da pata aumentou entre 16,3 % e 49,1 % no grupo que recebeu a fração Cged na dose de 250 mg/Kg. No grupo experimental Caed 125 mg/Kg o aumento da espessura da pata variou entre 14,25% na primeira hora e 36,23% na quarta hora e no grupo tratado com 250 mg/Kg, a espessura aumentou em 20,13% na primeira hora, atingindo o máximo na terceira hora com um aumento em 26,24% e na quarta hora, o aumento da espessura foi de 18,40% com relação ao tempo zero (antes da aplicação da carragenina).
Após 1 hora da aplicação da carragenina, os 3 grupos experimentais se diferiram de forma estatisticamente significativa do controle negativo. Na segunda hora apenas o grupo Cged 125 mg/Kg mostrou-se estatisticamente diferente e nos tempos 3 e 4 horas,
115 os 3 grupos se reduziram novamente de forma estatisticamente significativa do controle negativo. Porém quando analisados entre si os 3 grupos experimentais (indometacina 10 mg/Kg e Caed 125 e 250 mg/Kg), os animais tratados com Cged 125 mg/Kg mostrou-se com uma maior atividade anti-edematosa estatisticamente significativa.
s a lin a in d o m e ta c in a 1 0 m g /K g 8 0 C g e d 1 2 5 m g /K g C g e d 2 5 0 m g /K g
6 0
m
e
a
g
t
a a
t *
p
n
a
e
c
d
r
a
o
r
p
u 4 0 * s
m * *
s
e
e
p
o
t
s
n e
*
e
a
m
d u
A 2 0 * * * *
0
0 1 2 3 4 5 te m p o (h ) Figura 24. Evolução do aumento em porcentagem da espessura da pata dos animais em tratatamento com salina, com o fármaco de referência Indometacina a 10 mg/Kg e com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba (Cged) nas doses de 125 e 250 mg/Kg, via oral em 4 horas. Resultados representam a média de 6 animais por grupo. Tempo 1: após 1 hora da aplicação da carregenina na pata direita e na pata esquerda o trauma com agulha. Tempo 2: após 2 horas da aplicação da carragenina na pata direita e na pata esquerda o trauma com agulha; Tempo 3: após 3 horas da aplicação da carragenina na pata direita e na pata esquerda o trauma com agulha; Tempo 4: após 4 horas da aplicação da carragenina na pata direita e na pata esquerda o trauma com agulha. Resultados representam a média de 6 animais por grupo. Foi realizada análise estatística, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, onde * = grupos diferem estatisticamente do grupo salina (controle negativo) p<0,05 comparados os grupos experimentais em tempos iguais.
116
Já na avaliação da atividade anti-edematogênica da fração Cged, conforme Figura
25, após 1 hora da aplicação da carragenina, os 3 grupos experimentais se diferiram de forma estatisticamente significativa do controle negativo. Na segunda e terceira hora apenas o grupo Caed 250 mg/Kg mostrou-se estatisticamente diferente e no tempo 4 horas os 3 grupos se diferiram novamente de forma estatisticamente significativa do controle negativo. Quando analisados entre 3 grupos experimentais (indometacina 10 mg/Kg e Caed 125 e 250 mg/Kg) não apresentaram atividade anti-edematosa diferentes estatisticamente significativas.
S a lin a In d o m e ta c in a 1 0 m g /K g 8 0 C a e d 1 2 5 m g /K g C a e d 2 5 0 m g /K g
6 0
m
e
a
g
t
a
a
t
p
n
a
e
c
d
r
a
o
r
p
u 4 0 *
s
m
s
e e
*
p
o t
s * *
n e
*
e *
a
m d u * A 2 0 * *
0
0 1 2 3 4 5 te m p o (h )
Figura 25. Evolução do aumento em porcentagem da espessura da pata dos animais tratados com salina, com o fármaco de referência indometacina a 10 mg/Kg e com a fração diclorometânica do extrato etanólico bruto das folhas de C. adamantium (Caed) nas doses de 125 mg/Kg e 250 mg/Kg, via oral em 4 horas. Resultados representam a média de 6 animais por grupo. Foi realizada análise estatística, ANOVA, seguido do Teste de Tukey, onde * = grupos diferem estatisticamente do grupo salina (controle negativo) p<0,05 comparados os grupos experimentais em tempos iguais.
117
Estudos recentes demonstraram o potencial anti-inflamatório do gênero em modelo animal, com estudos das espécies C. adamantium e C. velutina, coletadas em
Minas Gerais, sendo possível identificar miricitrina, miricetina e quercetina. Em cultura de células de macrófagos imortalizados, miricitrina e miricetina foram avaliadas quanto ao seu potencial de diminuir a produção de óxido nítrico quando estimuladas por LPS e
IFN- γ, assim como de TNF-α e a diminuição das concentrações da interleucina pro- inflamatória IL-10 (Ferreira et al., 2013; Michel et al., 2014). A ação anti-inflamatória pode ser considerada como um dos potenciais usos farmacológicos do gênero assim como o composto miricitrina como um possível marcador no gênero, para isso sendo necessário a avaliação deste composto nos modelos utilizados e a padronização da concentração deste composto no gênero.
As substâncias derivadas dos fenilpropanóides (flavonas, flavonóides, isoflavonas, ácidos fenólicos) apresentam atividade anti-inflamatória e esta atividade, em algumas moléculas, está relacionada com a interação com mediadores inflamatórios como exemplo a interação NFκB (Gautam & Jachak, 2009; Recio et al., 2012).
Os polifenóis derivados de plantas têm demonstrado atividade anti-inflamatória modulando vias pró-inflamatórias e podendo modular o mediador TNF, direta ou indiretamente, modulando a ação de outras moléculas em estudos in vitro e in vivo
(Gupta et al., 2014). Entre estes compostos, a quercetina está sendo extensamente estudada. Em macrófagos humanos este composto é capaz de diminuir a expressão dos genes relacionados ao processo inflamatório como IL-6, IL-8, TNF-α e COX-2 (Overman et al., 2011) e em células de queratinócitos expostas a luz ultra-violeta, a quercetina foi capaz de diminuir a expressão dos genes relacionados a inflamação IL-1B, IL6, and TNF
118 e suprimir o mediador NFκB (Valerio et al., 2009; Vicentini et al., 2011). Em ensaios com animais, a quercetina mostrou-se eficiente em diminuir processo inflamatório induzido por carragenina e em animais com artrite induzida, melhorou a recuperação da função motora em ratos após trauma a agudo da medula espinhal (Morikawa et al., 2003;
Rivera et al., 2008; Mamani-Matsuda et al., 2006).
Outro constituinte fenólico identificado em C. adamantium e C. guaviroba foi o
ácido gálico que apresenta diversas atividades biológicas descritas, entre elas a anti- inflamatória que foi avaliada em ratos e in vitro. Foi possível identificar que este composto interfere no funcionamento dos leucócitos polimorfonucleares (PMN) e a inibição da liberação e atividade de mieloperoxidase, bem como uma possível interferência com o conjunto de ativos NADPH-oxidase poderia ser o mecanismo pelo qual este composto agiu na inflamação (Kroes et al., 1992). Reddy e colaboradores
(2010) identificaram que o ácido gálico inibe preferencialmente a enzima COX-2, que este composto se liga no mesmo sítio de ligação dos anti-inflamatórios não-esteroidais
(AINES), demostrando o potencial anti-inflamatório deste composto. Estudos recentes puderam verificar que o ácido gálico está envolvido na sub-regulação de TNF-α e IL-1β através da supressão da ativação do NF-kB e que este composto é capaz de inibir significativamente quinze das dezesseis vias biológicas das vias associadas a processos inflamatórios em intestinos de camundongos e NF-kB também foi demonstrado o potencial anti-inflamatório, in vitro e in vivo, através do controle do processo do sistema imune e da resposta fisiológica ao estímulo inflamatório (Hsinag et al., 2013). Assim, as atividades anti-inflamatórias das espécies estudadas podem relacionadas com a presença de constituintes fenólicos.
119 6. CONSIDERAÇÕES FINAIS Diante dos resultados obtidos pode-se concluir que:
O extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba e C. adamantium e suas
frações em hexano, diclorometano, butanol e hidroalcoólica apresentaram
substâncias fenólicas em sua composição, dentre eles flavonoides;
Pelas análises por ESI-MS/MS foi possível identificar quatro substâncias em C.
guaviroba e seis em C. adamantium;
Nas análises realizadas por UHPLC-MS/MS ainda foi identificado o flavonóide
quercetina em C. guaviroba que não havia sido possível a identificação prévia por
ESI-MS/MS;
Na quantificação realizada por UHPLC-MS/MS nas amostras de C. adamantium
as substâncias 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona e 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-6’-
metoxichalcona., quercitrina, miricitrina e ácido gálico estão em concentrações
entre 0,80 a 179 μg/mg do extrato seco. Nas análises realizadas com C. guaviroba
as substâncias identificadas encontram-se em concentrações entre 0,29 a 24,19
μg/mg;
O extrato etanólico bruto das folhas de C. guaviroba e C. adamantium e suas
frações em hexano, diclorometano, butanol e hidroalcoólica apresentaram
atividade antiproliferativa in vitro frente a algumas linhagens tumorais humanas;
A fração diclorometânica do extrato de C. guaviroba não apresentou toxicidade
aguda letal nos animais nas concentrações de 300, 1000 e 2000 mg/Kg;
A fração diclorometânica do extrato de C. guaviroba apresentou atividade
antiproliferativa in vivo no modelo de tumor sólido de Erlich quando comparada
ao grupo salina;
120 A fração diclorometânica do extrato de C. adamantium não apresentou toxicidade
letal nos animais na concentração de 300 mg/Kg;
A fração diclorometânica do extrato de C. adamantium não apresentou atividade
antiproliferativa in vivo no modelo de tumor sólido de Erhlich até a dose de 300
mg/Kg, quando comparada ao grupo salina;
Em cultura de células NCI-H460, nas análises realizadas por PCR em Tempo
Real dos genes TNF-α e NF-kB não mostrou nenhuma alteração que indicasse que
as substâncias isoladas estariam agindo sobre o gene TNFα. A fração Caed
aumentou a expressão do gene TNFα1 e a fração Caed diminuiu a expressão do
gene NFkB. Os extratos Cae e Cge aumentaram a expressão deste mesmo gene
nas células NCI-H460.
Nas análises realizadas em citometria de fluxo para avaliação da fragmentação do
DNA das células NCI-H460, todas as substâncias, exceto quercitrina e Ca5,
aumentaram significativamente a porcentagem de células com DNA fragmentado,
quando comparadas com o controle negativo, assim como Cae, Caed e Cged.
Na avaliação da atividade antinociceptiva, as frações Caed e Cged apresentaram
atividade comparada com o fármaco de referência indometacina, diferindo
estatisticamente do grupo tratado com salina;
Na avaliação da atividade anti-edematogênica, as frações Caed e Cged
apresentaram atividade comparada com o fármaco de referência Indometacina,
diferindo estatisticamente do grupo tratado com salina;
121 Portanto, os resultados obtidos neste trabalho indicam que as atividades biológicas in vitro e in vivo de C. guaviroba e C. adamantium com baixa toxicidade in vivo podem ser relacionadas com a presença de constituintes fenólicos, dentre os quais a quercetina,
ácido gálico e as chalconas 2’,4’-dihidroxi-6’-metoxichalcona e 2’,4’-dihidroxi-5’-metil-
6’-metoxichalcona acumulados no extrato etanólico das folhas destes vegetais. A atividade antitumoral pode ser relacionada com a atividade anti-inflamatória, já que os constituintes fenólicos presentes nas amostras bioativas podem alterar o microambiente do tumor, modulando a inflamação que pode estar associada a presença de tumores malignos. Portanto, os resultados obtidos confirmam o potencial da família Myrtaceae e do genero Campomanesia como fontes de moléculas bioativas e insumos para a saúde, sendo importante a continuidade dos estudos com as amostras bioativas mais promissoras com vistas a aplicações farmacológicas, biotecnológicas e clínicas.
122 7. PERSPECTIVAS FUTURAS
A partir deste trabalho, pode-se seguir com os estudos em novas abordagens tais como:
Continuidade do estudo fitoquímico com vistas ao isolamento de outros
constituintes biativos nestas espécies que não puderam ser identificados;
Avaliação do possível mecanismo de ação na atividade anti-inflamatória e
antitumoral e o detalhamento dos estudos biológicos de maneira a contribuir para
a busca de novos insumos farmacêuticos e agentes farmacologicamente ativos;
Estudos quanto a sazonalidade e impacto de fatores ambientais e climáticos na
constituição química e atividades biológicas destas espécies vegetais;
Estudos para a obtenção de extratos secos padronizados destas espécies vegetais e
a avaliação da possibilidade de emprego de algumas das moléculas identificadas
como marcadores químicos;
Estudos agronômicos para o desenvolvimento e produção de mudas e de plantas
em grande escala;
Estudos biotecnólogicos com cultura de células e tecidos para conservação de
recursos genéticos e estabelecimento de banco de germoplasmas, estudos para a
obtenção de biomassa e produtos naturais bioativos in vitro, dentre outras
possíveis abordagens.
123
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aché, 2014. http://www.ache.com.br/PressRoom/News.aspx?NewsId=156. Acesso em
20 -09-2014.
Aggarwal BB, Gehlot P, 2009. Inflammation and cancer: how friendly is the relationship for cancer patients? Current Opinion in Pharmacology, 9, 351-69.
Aggarwal BB, Ichikawa H, Garodia P, Weerashinghe P, Sethi G, Bhatt ID, Pandey MK,
Shishodia S, Nair MG, 2006. From traditional ayurvedic medicine to modern medicine: identification of therapeutic targets for suppression of inflammation and cancer. Expert
Opinion Terapeutics Targets, 10, 87-118.
Agrawal PK, 1989. Carbon-13 NMR of flavonoids. Amsterdam: Elsevier, 564p.
Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, Abbott BJ,
Mayo JG, Shoemaker RH, Boyd MR, 1988. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Research, 48, 589-
601.
ANVISA, 2014. http://www.anvisa.gov.br/medicamentos/fitoterapicos/definicao.htm
Acesso em 21-08-2014.
APG III. The Angiosperm Phylogeny Group, 2009. An update of the Angiosperm
Phylogeny Group classification for the orders and families of flowering plants: APG III.
Botanical Journal of the Linnean Society, 161: 105–121.
124 Asano N, Kuno T, Hirose Y, 2007. Preventive effects of a flavonoid myricitrin on the formation of azoxymethane- induced premalignant lesions in colons of rats. Asian Pacific
Journal of Cancer Prevention, 8, 73-76.
Baguley BC, 2010. Multiple Drug Resistence Mechanisms in Cancer. Molecular
Biotechnology, 46, 308-316.
Baldwin AS, 2001. Series introduction: The transcription factor of NFk-B and humam disease. Journal of Clinical Investigation, 107, 3–6.
Balkwill F, Mantovani A, 2001. Inflammation and cancer: back to Virchow? Lancet, 357,
539-545.
Beck WT, 1990. Mechanisms of multidrug resistance in human tumor cells. The roles of
P glycoprotein, DNA topoisomerase II, and other factors. Cancer Treatment Reviews, 17,
11-20.
Beg AA, Baltimore D, 1996. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha- induced cell death. Science, 274, 782-784.
Ben-Arye E, Goldin E, Wengrower D, Stamper A, Kohn R, Berry E, 2002.Wheat grass juice in the treatment of active distal ulcerative colitis: a randomized double-blind placebo-controlled trial. Scand Journal of Gastroenterology, 37, 444–449.
Ben-Chetrit E, Levy M, 1998. Colchicine: 1998 Update. Seminars in Arthritis and
Rheumatism, 28, 48–59.
Biavatti MW, Farias C, Curtius F, Brasil LM, Hort S, Schuster L, Leite, Prado SRT,
2004. Preliminary studies on Campomanesia xanthocarpa (Berg.) and Cuphea carthagenensis (Jacq.) JF Macbr. Aqueous extract: weight control and biochemical parameters. Journal of Ethnopharmacology, 93, 385-389.
125 Bonilla A, Duque C, Garzón C, Takaishi Y, Yamaguchi K, Hara N, Fujimoto Y, 2005.
Champanones, yellow pigments from the seeds of champa (Campomanesia lineatifolia).
Phytochemistry, 66, 1736–1740.
Borchardt JK, 2002. The Beginnings of Drug Therapy: Ancient Mesopotamian Medicine.
Drug News Perspectives, 15,187-192.
Botting RMJ, 2006. Cyclooxygenase: Past, present and future. A tribute to John R. Vane
(1927–2004). Journal of Thermal Biology, 21, 208- 219.
Braggio MM, Lima MEL, Veasey EA, Haraguchi M, 2002. Atividades farmacológicas das folhas da Sesbania virgata (Cav.) Arquivos do Instituto Biológico,69,49-53.
Brandão HN, David JP, Couto RC, Nascimento JAP, David JM, 2010. Química e farmacologia de quimioterápicos antineoplásicos derivados de plantas. Química Nova,
33, 1359-1369.
Brandelli CL, Vieira PB, Macedo AJ, Tasca T, 2013. Remarkable anti-trichomonas vaginalis activity of plants traditionally used by the Mbyá-Guarani indigenous group in
Brazil. BioMed Research International, doi: 10.1155/2013/826370.
Bruce JN, Fine RL, Canoll P, Yun J, Kennedy BC, Rosenfeld SS, Sands SA, Surapaneni
K, Lai R, Yanes CL, Bagiella E, DeLaPaz RL, 2011. Regression of recurrent malignant gliomas with convection-enhanced delivery of topotecan. Neurosurgery, 69, 1272–1279.
Budman DR, Igwemezie LN, Kaul S, Behr J, Lichtman S, Schulman P, Vinciguerra V,
Allen SL, Kolitz J, Hock K, O'Neill K, Schacter L, Barbhaiya RH, 1994. Phase I evaluation of a water soluble etoposide prodrug, etoposide phosphate, given as a five minute infusion on days 1, 3, 5. Journal Clinical Oncology, 12, 1902–1909.
126 Bulzomi P, Galluzzo P, Bolli A, Leone S Bolli A, Marino M, 2012. The pro-apoptotic effect of quercetin in cancer cell lines requires ER-dependent signals. Journal of Cellular
Physiology, 27, 1891-1898.
Cancer, 2014. http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/NCI/drugdiscovery Accesso
25-04-2014.
Cardoso CAL, Silva JRM, Kataoka VMF, Brum CS, Poppi NR, 2008. Avaliação da atividade antioxidante, toxicidade e composição química por CG-EM do extrato hexânico das folhas de Campomanesia pubescens. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e
Aplicada, 29, 3, 297-301.
Cascio MG, Gauson LA, Stevenson LA, Ross RA, Pertwee RG, 2010. Evidence that the plant cannabinoid cannabigerol is a highly potent alpha2-adrenoceptor agonist and moderately potent 5HT1A receptor antagonist. British Journal of Pharmacology, 159,
129–141.
Ceruks M, Romoff P, Favero OA, Lago JHG, 2007. Polar phenolic constituents from
Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae). Química Nova, 30, 597–599.
Chin YW, Balunas MJ, Chai HB, Kinghorn D, 2006. Drug discovery from natural sources. The Aaps Journal, 8, 239-253.
Conti E, Litt A, Wilson PG, Graham SA, Briggs BG, Johnson LAS, Sytsma, KJ, 1997.
Interfamilial Relationships In Myrtales: Molecular phylogeny and patterns of morphological evolution. Systematic Botany, 22, 629-647.
Costa-Lotufo LV, Khan MTH, Ather A, Wilke DV, Jimenez PC, Pessoa C, Moraes
MEA, Moraes MO, 2005. Journal of Ethnopharmacology, 99, 21-30.
127 Cotran RS, Kumar, V.; Collins, T. Patologia Estrutural e Funcional. 7ª ed. Rio de Janeiro:
Editora Guanabara Koogan, 2006.
Coussens LM, Werb Z, 2002. Inflammation and cancer. Nature, 420, 860-867.
Coutinho ID, Coelho RG, Kataoka VMF, Honda NK, Silva JRM, Vilegas W, Cardoso
CAL, 2008. Determination of phenolic compounds and evaluation of antioxidant capacity of Campomanesia adamantium leaves. Eclética Química, 33, 53-60.
Coutinho MAS, Muzitano MF, Costa SS, 2009. Flavonoides: Potenciais agentes terapêuticos para o processo inflamatório. Revista Virtual Quimica, 1, 241-256.
Cragg GM, Grothaus PG, Newman DJ, 2014. New horizons for old drugs and drug leads.
Journal of Natural Products, 77, 703-723.
Cragg GM, Newman DJ, 2001. In New Vistas in Therapeutics from Drug Design to Gene
Therapy, Annals of the New York Academy of Sciences; Skarlatos, S. I.; Velletri, P.;
Morris, M., Eds.; The New York Academy of Sciences, New York, 953, 3−25.
Cragg GM, Newman DJ, 2005. Plants as a source of anti-cancer agents. Journal of
Ethnopharmacology, 100, 72-79.
Cragg MS, Harris C, Strasser A, Scott CL, 2009. Unleashing the power of inhibitors of oncogenic kinases through BH3 mimetics. Nature Reviews Cancer, 9, 321–326.
Cronquist A, 1968. The evolution and classification of flowering plants. Boston:
Houghton Mifflin, 396p.
Davis WM, Hatoum NS, 1983. Neurobehavioral actions of cannabichromene and interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. General Pharmacology, 14, 247–252.
Deng Q-S. Trends in pharmacological sciences. Trends in Pharmacological Sciences,
1985, 6, 453-455.
128 Denis JN, Greene AE, Guenard D, Gueritte-Voegelein F, Mangatal L, Potier P, 1988. A highly efficient, practical approach to natural taxol. Journal American Chemistry Society,
110, 5917–5919.
Di Stasi LC, Hiruma-Lima CA, 2002. Plantas medicinais na Amazônia e na Mata
Atlântica. São Paulo: Editora UNESP, p.323-330.
DiDonato JA, Mercurio F, Karin M, 2012. NF-κB and the link between inflammation and cancer. Immunological Reviews, 246, 379-400.
Ding XZ, Hennig R, Adrian TE, 2003. Lipoxygenase and cyclooxygenase metabolism: new insights in treatment and chemoprevention of pancreatic cancer. Molecular Cancer,
2, 1–12.
Donatini RS, Ishikawa T, Barros SBM, Bacchi EM, 2009. Atividade antiúlcera e antioxidante do extrato de folhas de Syzygiun jambos (L.) Alston (Myrtaceae). Revista
Brasileira de Farmacognosia, 19, 89-94.
Drugs, 2014a. http://www.drugs.com/pro/taxol.html Accesso 25-04-2014
Drugs, 2014b. Available from: http://www.drugs.com/cdi/docetaxel.html Accesso 25-04-
2014.
Drugs, 2014c. http://www.drugs.com/mtm/teniposide.html Accesso 25-04-2014
Eltzschig HK, Eckle T, 2011. Ischemia and reperfusion from mechanism to translation.
Nature Medicine, 17, 1391–1401.
Encyclopaedia Britannica, 2014a. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/370900/mayapple> Accesso 20-04-2014
Encyclopaedia Britannica, 2014b. http://www.britannica.com/EBchecked/topic/640963/Pacific-yew> Accesso 20-04-2014
129 Ernst, E 2008. Frankincense: systematic review. BMJ, 337, 1439-1441.
FDA, 2014. http://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2011/020119s010s011lbl.pdf.
Accesso 20-04-2014.
Feoktistova M, Geserick P, Kellert B, Dimitrova DP, Langlais C, Hupe M, Cain K,
MacFarlane M, Häcker G, Leverkus M, 2011. cIAPs Block Ripoptosome Formation, a
RIP1/Caspase-8 Containing Intracellular Cell Death Complex Differentially Regulated by cFLIP Isoforms. Molecular Cell, 43, 449–463.
Ferreira LC, Graber-Guimarães A, de Paula CA, Michel MCP, Guimarães RG, Rezende,
SA, de Souza-Filho JD, Saúde-Guimarães DA, 2013. Anti-inflammatory and antinociceptive activities of Campomanesia adamantium. Journal of Ethnopharmacology,
145, 100–108.
Furstenberger G, Krieg P, Muller-Decker K, Habenicht AJR, 2006. What are cyclooxygenases and lipoxygenases doing in the driver’s seat of carcinogenesis?
International Journal of Cancer, 119, 2247–2254.
Galluzzo P, Martini C, Bulzomi P, Leone S, Bolli A, Pallottini V, Marino M, 2009.
Quercetin-induced apoptotic cascade in cancer cells: antioxidant versus estrogen receptor alpha-dependent mechanisms. Molecular Nutrition & Food Research, 53, 699-708.
Gatenby RA, Gillie RJ, 2008. A microenvironmental model of carcinogenesis. Nature
Reviews Cancer, 8, 56-61.
Gautam R, Jachak SM, 2009. Recent developments in anti-inflammatory natural products. Medicinal Research Reviews, 29, 767-820.
130 Ghantous A, Gali-Muhtasib H, Vuorela H, Saliba NA, Darwiche N, 2010. What made sesquiterpene lactones reach cancer clinical trials? Drug Discovery Today, 15, 668-678.
Gonçalves AL, Alves-Filho A, Menezes H, 2005. Estudo Comparativo Da Atividade
Antimicrobiana De Extratos De Algumas Árvores Nativas. Arquivo Instituto Biológico,
72, 353-358.
Greenspan E, Lester J, Shear MJ, 1950. Effect of alpha-peltatin, beta-peltatin and podophyllotoxin on lymphoma and other transplanted tumors. Journal of National Cancer
Institute, 10, 1273–1293.
Guerram M, Jiang ZZ, Zhang LY, 2012. Podophyllotoxin, a medicinal agent of plant origin: past, present and future. Chinese Journal of Natural Medicines, 10, 161-169.
Günther C, Martini E, Wittkopf N, Amann K, Weigmann B, Neumann H, Waldner MJ,
Hedrick SM, Tenzer S, Neurath MF, Becker C, 2011. Caspase-8 regulates TNF-α- induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature, 477, 335–339.
Gupta SC, Tyagi AK, Deshmukh-Taskar P, Hinojosa M, Prasad S, Aggarwal BB,
2014.Downregulation of tumor necrosis factor and other proinflammatory biomarkers by polyphenols. Archives of Biochemistry and Biophysics, 559, 91–99.
Hammond JR, Johnstone RM, Gros P, 1989. Enhanced efflux of (3H) Vinblastine from chinese hamster ovary cells transfected with a full-length complementary DNA clone for the MDR 1 Gene. Cancer Research, 49, 3867-3871.
Hanai H, Sugimoto K, 2009. Curcumin has bright prospects for the treatment of inflammatory bowel disease. Current Pharmaceutical Design, 15, 2087-2094.
Hande KR, 1998. Etoposide: four decades of development of a topoisomerase II inhibitor. European Journal of Cancer, 34, 1514–1521.
131 Hannun YA, 1977. Apoptosis and the dilemma of cancer chemotherapy. Blood, 89, 1845-
1853.
Harborne JB, 1996. The flavonoids: Advances in Research since 1986. Chapman & Hill,
New York.
Hardman JG, Limbird LE, Gilman AG, 2003. Goodman e Gilman: As bases farmacológicas da terapêutica. 10a ed. Rio de Janeiro: McGraw-Hill, 1647 p.
Harirforoosh S, Asghar W, Jamali F, 2013. Adverse Effects of Nonsteroidal
Antiinflammatory Drugs: An Update of Gastrointestinal, Cardiovascular and Renal
Complications. Journal of Pharmacy & Pharmaceutical Sciences, 16, 821 – 847.
He S, Wang L, Miao L, Wang T, Du F, Zhao L, Wang X, 2009. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell, 12, 1100-1111.
Holton RA, Somoza C, Kim HB, Liang F, Biediger RJ, Boatman PD, Shindo M, Smith
CC, Kim S, 1994. First total synthesis of taxol. Journal of American Chemistry of
Society, 116, 1597–1600.
Hong CO, Lee HA, Rhee CH, Choung SY, Lee KW, 2013. Separation of the antioxidant compound quercitrin from Lindera obtusiloba Blume and its antimelanogenic effect on
B16F10 melanoma cells. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 77, 58-64.
Hsiang CY, Hseu YC, Chang YC, Kumar KJ, Ho TY, Yang HL, 2013. Toona sinensis and its major bioactive compound gallic acid inhibit LPS-induced inflammation in nuclear factor-κB transgenic mice as evaluated by in vivo bioluminescence imaging.
Food Chemistry, 136, 426-434.
Hsiang YH, Hertzberg R, 1985. Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase I. Journal Biological Chemistry, 27, 14873-14878.
132 Husain I, Mohler JL, Seigler HF, Besterman JM, 1994. Elevation of topoisomerase I messenger RNA, protein, and catalytic activity in human tumors: demonstration of tumor-type specificity and implications for cancer chemotherapy. Cancer Research, 54,
539-546.
Ikawa M, Schaper TD, Dollard CA, Sasner JJ, 2003. Utilization of Folin−Ciocalteu phenol reagent for the detection of certain nitrogen compounds. Journal of Agricutural and Food Chemistry, 51, 1811-1815.
INCA, Instituto Nacional do Câncer, 2014. Disponível em: http://www.inca.gov.br.
Accesso em 17-10-2014.
Itokawa H, Morita M, Mihashi S, 1981. Phenolic compounds from the rhizome of Alpinia speciosa. Phytochemistry, 20, 2503-2506.
Jendiroba DB, Klostergaard J, Keyhani A, Paliaro L, Freireich EJ, 2002. Effective cytotoxicity against human leukemias and chemotherapy-resistant leukemia cell lines by
N-N-Dimethylsphingosine. Leukemia Research, 26, 301-310.
Johnson IS, Wright HF, Svoboda GH, 1959. Experimental basis for clinical evaluation of antitumor principles from Vinca rosea Linn. Journal of Laboratory and Clinical
Medicine, 54, 830-838.
Kaiser WJ, Upton JW, Long AB, Livingston-Rosanoff D, Daley-Bauer LP, Hakem R,
Caspary T, Mocarski ES, 2011. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8- deficient mice. Nature, 471, 368–372
Kale M, Misar AV, Dave V, Joshi MM, 2007. Anti-inflammatory activity of Dalbergia lanceolaria barks ethanol extract in mice and rats. Journal of Ethnopharmacology, 112,
300–304.
133 Karin M, Cao Y, Greten FR, Li ZW, 2002. NFk-B in cancer: From innocent bystander to major culprit. Nature Reviews Cancer, 2, 301–310.
Karin M, Greten FR, 2005. NF-κB: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. Nature Reviews Immunology, 5, 749-759.
Kaul S, Igwemesie LN, Stewart DJ, Fields SZ, Kosty M, Levithan N, Bukowski R,
Gandara D, Goss G, Dwyer PO', 1995. Pharmacokinetics and bioequivalence of etoposide following intravenous administration of etoposide phosphate and etoposide in patients with solid tumors. Journal Clinical of Oncology, 13, 2835–2841.
Kim YH, Lee DH, Jeong JH, Guo ZS, Lee YJ, 2008. Quercetin augments TRAIL- induced apoptotic death: Involvement of the ERK signal transduction pathway.
Biochemical Pharmacology, 75, 1946–1958.
Kroes BH, Van den Berg AJ, Quarles Van Ufford HC, Van Dijk H, Labadie RP, 1992.
Anti-inflammatory activity of gallic acid. Planta Medica, 58, 499-504.
Ktafke JZ, da Silva MA, Panigas TF, Belli KC, de Oliveira MF, Barichello MM, Rigo
FK, Rossato MF, Soares dos Santos AR, Pizzolatti MG, Ferreira J, Viecili PR, 2010.
Effects of Campomanesia xanthocarpa on biochemical, hematological and oxidative stress parameters in hypercholesterolemic patients. Journal of Ethnopharmacology, 127,
299-305.
Kumar R, Verma V, Jain A, Rajeev K, Jagdamba J, Maikhuri P, Gupta G, 2011.
Synergistic chemoprotective mechanisms of dietary phytoestrogens in a select combination against prostate cancer. The Journal of Nutritional Biochemistry, 22, 723-
731.
134 Kuo PC, Liu HF, Chao JI, 2004. Survivin and p53 modulate quercetin-induced cell growth inhibition and apoptosis in human lung carcinoma cells. The Journal of Biological
Chemistry, 279, 55875–55985.
Kuo SM, 1996. Antiproliferative potency of structurally distinct dietary flavonoids on human colon cancer cells. Cancer Letter, 110, 41–48.
Landrum LR, 1986. Campomanesia. In: Flora Neotrópica. New York: The New York
Botanical Garden, 45, 7-72.
Lawrence T, Gilroy DW, Colville-Nash PR, Willoughby DA, 2001. Possible new role for
NF-κB in the resolution of inflammation. Nature Medicine, 7, 1291–1297.
Lee TJ, Kim OH, Kim S, Park JW, Kwon TK, 2006. Quercetin arrests G2/M phase and inducescaspase-dependent cell death in cells. Cancer Letter, 240, 234–242.
Leiter J, Downing V, Hartwell JL, Shear MJ, 1950. Damage induced in sarcoma 37 with podophyllin, podophyllotoxin, alpha-peltatin, beta-peltatin and quercetin. Journal of
National Cancer Institute, 10, 1273–1293.
Li G, Cai C, Ren T, Tang X. 2014. Development and application of a UPLC-MS/MS method for the pharmacokinetic study of 10-hydroxy camptothecin and hydroxyethyl starch conjugate in rats. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 88, 345-
353.
Litchfield JT, Wilcoxon F, 1949. A simplified method of evaluating dose-effect experiments. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 95, 99-103.
Liu M, Wilairat P, Go ML, 2001. Antimalarial alkoxylated and hydroxylated chalconas: structure – activity relationship analysis. Journal of Medicinal Chemistry, 44, 4443-4452
135 Loike JD, Brewer CF, Sternicht H, Gensler WJ, Horwi SB, 1978. Structure-activity study of the inhibition of microtubules assembly in vitro by podophyllotoxin and its congeners. Cancer Research, 38, 2688- 2693.
Loike JD, Horwitz SB, 1976. Effects of podophyllotoxin and VP16-213 on microtubule assembly in vitro and nucleoside transport in HeLa cells. Biochemistry, 15, 5435–5442.
Longato GB, Rizzo LY, Sousa IM, Tinti SV, Possenti A, Figueira GM, Ruiz AL, Foglio
MA, de Carvalho JE, 2011. In vitro and in vivo anticancer activity of extracts, fractions, and eupomatenoid-5 obtained from Piper regnellii leaves. Planta Medica, 77, 1482-1488.
Lopes AA, Oliveira AM, Prado CBC, 2002. Principais genes que participam da formação de tumores. Revista de Biologia e Ciências da Terra, 2, 1519-5228.
López-Posadas R, Ballester I, Abadía-Molina AC, Suárez MD, Zarzuelo A, Martínez-
Augustin O, Sánchez de Medina F, 2008. Effect of flavonoids on rat splenocytes, a structure-activity relationship study. Biochemical Pharmacology, 15, 495-506.
López-Posadas R, Ballester I, Abadía-Molina AC, Suárez MD, Zarzuelo A, Martínez-
Augustin O, Sánchez de Medina F, 2008. Effect of flavonoids on rat splenocytes, a structure-activity relationship study. Biochemical Pharmacology, 76, 495-506.
Lorenzi H, Abreu-Matos FJ, 2002. Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas cultivadas. Nova Odessa: Instituto Plantarum. 544p.
Lucas EJ, Belsham SR, Niclughadha EM, Orlovich DA, Sakuragui CM, Chase MW,
Wilson PG, 2005. Phylogenetic Patterns in: The Fleshy-Fruited Myrtaceae - Preliminary
Molecular Evidence. Plant Systematics and Evolution, 251, 35-51.
136 Luo JL, Maeda S, Hsu LC, Yagita H, Karin M, 2004. Inhibition of NFk-B in cancer cells converts inflammation-induced tumor growth mediated by TNFα to TRAIL-mediated tumor regression. Cancer Cell, 6, 297–305.
Madalosso RC, Oliveira GC, Martins MT, Vieira AED, Barbosa J, Caliari MV, Castilho
RO, Tagliati, CA, 2012. Campomanesia lineatifolia Ruiz & Pav. as a gastroprotective agent. Journal of Ethnopharmacology, 139, 772– 779.
Mamani-Matsuda M, Kauss T, Al-Kharrat A, Rambert J, Fawaz F, Thiolat D, Moynet D,
Coves S, Malvy D, Mossalayi MD, 2006. Therapeutic and preventive properties of quercetin in experimental arthritis correlate with decreased macrophage inflammatory mediators. Biochemical Pharmacology, 72, 1304-1310.
Mandhane SN, Shah JH, Thennati R, 2011. Allergic rhinitis: an update on disease, present treatments and future prospects. International Immunopharmacology, 11, 1646–
1662.
Marchetti GM, Silva KA, Santos AN, Sousa IMO, Tinti SV, Figueira GM, Foglio MA,
Carvalho JE, 2012. The anticancer activity of dichloromethane crude extract obtained from Calea pinnatifida. Journal of Experimental Pharmacology, 4, 157-162.
Markman BEO, Bacchi EM, Kato ETM, 2004. Antiulcerogenic effects of Campomanesia xanthocarpa. Journal of Ethnopharmacology, 94, 55-57.
Matsuyama M, Yoshimura R, Mitsuhashi M, Hase T, Tsuchida K, Takemoto Y,
Kawahito Y, Sano H, Nakatani T, 2004. Expression of lipoxygenase in human prostate cancer and growth reduction by its inhibitors. Internatinal Journal of Oncology, 24, 821-
827.
137 McFarland HF, Martin R, 2007. Multiple sclerosis: a complicated picture of auto - immunity. Nature Immunology, 8, 913–919.
Medzhitov R, 2010. Inflammation 2010: new adventures of an old flame. Cell, 140, 771-
776.
Mense SM, Hei TK, Ganju RK, Bhat HK, 2008. Phytoestrogens and breast cancer prevention: possible mechanisms of action. Environmental Health Perspectives, 116,
426–433.
Merfort I, 2011. Perspectives on sesquiterpene lactones in inflammation and cancer.
Current Drug Targets, 12, 1560-1573 .
Moller JKS, Catharino RR, Eberlin MN, 2007. Electrospray ionization mass spectrometry fingerprinting of essential oils: species from the Labiatae family. Food Chemistry, 100,
1283–1288.
Montenegro MR, Fecchio D, 1999. Inflamações: conceitos gerais e inflamação aguda. In:
Motenegro, Mario R.; Franco, Marcello. Patologia: Processos gerais. 4ª ed. São Paulo:
Atheneu, 109-128.
Morikawa K, Nonaka M, Narahara M, Torii I, Kawaguchi K, Yoshikawa T, Kumazawa
Y, Morikawa S, 2003. Inhibitory effect of quercetin on carrageenan-induced inflammation in rats. Life Sciences, 26, 709-721.
Morris CJ, 2003. Carrageenan-induced paw edema in the rat and mouse. Methods in
Molecular Biology, 225, 115-121.
Morrow CS, Cowan KH, 1990. Glutathione s-transferases and drug resistance. Cancer
Cells, 2, 15-22.
138 Moudi M, Go R, Seok CYY, Nazre M, 2013. Vinca Alkaloids. International Journal
Preventive Medicine, 4, 1231-1235.
Moura-Costa GF, Nocchi SR, Ceole LF, de Mello JCP, Nakamura CV, Dias-Filho BP,
Temponi LG, Ueda-Nakamura T, 2012. Antimicrobial activity of plants used as medicinals on an indigenous reserve in Rio das Cobras, Paraná, Brazil. Journal of
Ethnopharmacology, 143, 631–638.
Murakami A, Ashida H, Terao J, 2008. Multi-targeted cancer prevention by quercetin.
Cancer Letter, 269, 315–325.
Naczk M, Shahidi F, 2004. Extraction and analysis of phenolics in food. Journal of
Chromatography, 1054, 95-111.
Nascimento FRF, Cruz GVB, Pereira PVS, Maciel MCG, Silva LA, Azevedo APS,
Barroqueiro SB, Guerra RNM, 2006. Ascitic and solid tumor inhibition by Chenopodium ambrosioides L. Treatment. Life Sciences, 78, 2650-2653.
Nascimento SS, De Santana JM, Nampo FK, Ribeiro ÊAN, da Silva DL, Araújo-Júnior
JX, Almeida JRGS, Bonjardim LR, Araújo AAS, Quintans-Júnior LJ, 2013. Efficacy and
Safety of Medicinal Plants or Related Natural Products for Fibromyalgia: A Systematic
Review. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, Volume 2013,
Article ID 149468, 10 pages http://dx.doi.org/10.1155/2013/149468
Nathan C, Ding A, 2010. Nonresolving inflammation. Cell, 140, 871–882.
Naugler WE, Karin M, 2008. The wolf in sheep's clothing: the role of interleukin-6 in immunity, inflammation and cancer. Trends in Molecular Medicne, 14, 109-119.
Neri-Numa IA, Carvalho-Silva LB, Morales JP, Malta LG, Muramoto MT, Ferreira JEM,
Carvalho JE, Ruiz ALTG, Maróstica Júnior MR, Pastore GM, 2013. Evaluation of the
139 antioxidant, antiproliferative and antimutagenic potential of araçá-boi fruit (Eugenia stipitata Mc Vaugh Myrtaceae) of the Brazilian Amazon Forest. Food Research
International, 50, 70-76.
Newman DJ, Cragg GM, Snader KM, 2000. The influence of natural products upon drug discovery. Natural Product Reports, 17, 215-234.
Newman DJ, Cragg GM, Snader KM, 2003. Natural Products as sources of new drugs over the period 1981-2002. Journal of Natural Products, 66, 1022-1037.
Newman DJ, Cragg GM, Snader KM, 2012. Natural Products as sources of new drugs over the 30 years from 1981 to 2010. Journal of Natural Products, 75, 311-335.
Nicolau KC, Yang Z, Liu JJ, Ueno H, Nantermet PG, Guy RK, Claiborne CF, Renaud J,
Couladouros EA, Paulvannan K, Sorensen EJ, 1994. Total synthesis of taxol. Nature,
367, 630–634.
Noble RL, Beer CT, Cutts JH, 1958. Role of chance observation in chemotherapy: Vinca rosea. Annals of the New York Academy of Sciences, 76, 882-894.
Oberlis NH, Kroll DJ, 2004. Camptothecin and Taxol: Historic Achievements In
Products Research. Journal of Natural Products, 67, 129-135.
Oberst A, Dillon CP, Weinlich R, McCormick LL, Fitzgerald P, Pop C, Hakem R,
Salvesen GS, Green DR, 2011. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature, 471, 363–367.
Omer B, Krebs S, Omer H, Noor TO, 2007. Steroid-sparing effect of wormwood
(Artemisia absinthium) in Crohn’s disease: a double-blind placebo-controlled study.
Phytomedicine, 14, 87–95.
140 Overman A, Chuang CC, McIntosh M, 2011. Quercetin attenuates inflammation in human macrophages and adipocytes exposed to macrophage-conditioned media.
International Journal of Obesity, 35, 1165-1172.
Pascoal ACRF, Ehrenfried CA, Eberlin MN, Stefanello MEA, Salvador MJ, 2011a. Free- radical scavenging activity, determination of phenolic compounds and HPLC-
UV/DAD/ESI-MS profile of Campomanesia adamantium leaves. Natural Product
Communications, 6, 969-972.
Pascoal ACRF, Lourenço CC, Sodek L, Tamashiro JY, Franchi G, Nowill A, Stefanello
MEA, Salvador MJ, 2011b. Essential oil from the leaves of Campomanesia guaviroba
(DC.) Kiaersk. (Myrtaceae): chemical composition, antioxidant and cytotoxic activity.
Journal of Essential Oil Research, 23, 34-37.
Pavan FR, Leite CQF, Coelho RG, Coutinho ID, Honda NK, Cardoso CAL, Vilegas W,
Leite SRA, Sato DN, 2009. Evaluation of Anti-Mycobacterium tuberculosis activity of
Campomanesia adamantium (Myrtaceae). Química Nova, 32, 1222-1226.
Peres CM, Curi R, 2005. Como cultivar células. 1 ed., Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro, 281p
Perkins ND, 2004. NF-κB: Tumor promoter or suppressor? Trends in Cell Biology, 14,
64-69.
Piccinelli AL, De Simone F, Passi S, Rastrelli L, 2004. Phenolic constituents and antioxidant activity of Wendita calysina leaves (burrito), a folk Paraguayan tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 5863-5868.
141 Pichersky E, Gang DR, 2000. Genetics and biochemistry of secondary metabolites in plants: an evolutionary perspective. Trends Plant Science, 5, 39-445.
Pires PA, Malvar DC, Blanco LC, Vignoli T, da Cunha AF, Vieira E, Dantas TNC,
Maciel MAM, Côrtes WS, Vanderlinde FA, 2004. Estudo das atividades analgésicas do extrato metanólico da Capsicum frutescens – solanaceae (pimenta malagueta). Revista da
Universidade Rural, 24, 129-134.
Schiff PB, Horwitz SB, 1980. Taxol stabilizes microtubules in mouse fibroblast cells.
Proceedings of the National Academy of Sciences, 77, 1561-1565.
Piva MG, 2002. O Caminho das Plantas Medicinais: Estudo Etnobotânico. Rio de
Janeiro: Mondrian, 225p.
Rahier NJ, Thomas CJ, Hecht SM, 2005. Camptothecin and its analogs. In: Cragg GM,
Kingston DGI, Newman DJ (Eds). Anticancer Agents from Natural Products. Brunner-
Routledge Psychology Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, Fl, 5-22.
Rahn EJ, Hohmann AG, 2009. Cannabinoids as pharmacotherapies for neuropathic pain: from the bench to the bedside. Neurotherapeutics, 6, 713–737.
Reddy TC, Aparoy P, Babu NK, Kumar KA, Kalangi SK, Reddanna P, 2010. Kinetics and docking studies of a COX-2 inhibitor isolated from Terminalia bellerica fruits.
Protein & Peptide Letters, 17, 1251–1257.
Ríos JL, Recio MC, Escandell JM, Andújar I, 2009. Inhibition of transcription factors by plant derived compounds and their implications in inflammation and cancer. Current
Pharmaceutical Design, 15, 1212-1237.
142 Riou JF, Petitgenet O, Combeau C, Lavelle F, 1994. Cellular uptake and efflux of docetaxel (Taxotere®) and paclitaxel (Taxol®) in P388 cell line. Proceedings of
Americans Associate for Cancer Research, 35, 385-385.
Rivera L, Morón R, Sánchez M, Zarzuelo A, Galisteo M, 2008. Quercetin ameliorates metabolic syndrome and improves the inflammatory status in obese Zucker rats. Obesity,
16, 2081-2087.
Roesler R, Malta LG, Carrasco LC, Holanda RB, Sousa CAS, Pastore GM, 2007.
Atividade antioxidante de frutas do cerrado. Ciência e Tecnologia de Alimentos, 27, 53-
60.
Sakurai H, Suzuki S, Kawasaki N, Nakano H, Okazaki T, Chino A, Doi T, Saiki I, 2003.
Tumor necrosis factor-α-induced IKK phosphorylation of NF-κB p65 on serine 536 is mediated through the TRAF2, TRAF5, and TAK1 signaling pathway. The Journal of
Biological Chemistry, 278, 36916–36923.
Sangeetha S, Manjunatha N, Samanta MK, Malik M, 2011. Pharmacokinetic Evaluation of Quinine in Tablet Formulation From Herbal Extract International Journal of
Biopharmaceutics, 2, 1-7.
Schacter L, 1996. Etoposide phosphate: what, why, where, and how? Seminars in
Oncology, 23, 1–7.
Schetter AJ, Heegaard NH, Harris CC, 2010. Inflammation and cancer: interweaving microRNA, free radical, cytokine and p53 pathways. Carcinogenesis, 31, 37-49.
Sharmila G, Bhat FA, Arunkumar R, Elumalai P, Raja Singh P, Senthilkumar K,
Arunakaran J, 2014. Chemopreventive effect of quercetin, a natural dietary flavonoid on prostate cancer in in vivo model. Clinical Nutrition, 33, 718–726.
143 Shoemaker RH, 2006. The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen. Nature
Reviews Cancer, 6, 813-823.
Simirgiotis MJ, Adachi S, To S, Yanga H, Reynertson KA, Basile M, Gil JRR,
Weinsteinb IB, Kennellya EJ, 2008. Cytotoxic chalcones and antioxidants from the fruits of Syzygium samarangense (Wax Jambu). Food Chemistry, 107, 813–819.
Skaug, B, Jiang X, Chen ZJ, 2009. The role of ubiquitin in NF-κB regulatory pathways.
Annual Review of Biochemistry, 78, 769–796.
Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monks A, Mcmahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch
H, Kenney S, Boyd MR, 1990. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. Journal of National Cancer Institute, 82, 1107-1118.
Sladkova LV, Moskaleva EV, Posypanova GA, 2000. Apoptosis of cells of different lines and the characteristics of internucleosomal DNA fragmentation in cells: connection with the cell cycle. Tsitologiia, 42, 309-313.
Souza JC, Piccinelli AC, Aquino DFS, Souza VV, Schmitz WO, Traesel GK, Cardoso
CAL, Kassuya CAL, Arena AC, 2014. Toxicological analysis and antihyperalgesic, antidepressant, and anti-inflammatory effects of Campomanesia adamantium fruit barks.
Nutrition Neuroscience, http://dx.doi.org/10.1179/1476830514Y.0000000145
Souza-Moreira TM, Salvagnini LE, Santos E, Silva VYA, Moreira RRD, Salgado HRN,
Pietro RCLR, 2011. Antidiarrheal activity of Campomanesia xanthocarpa fruit. Journal of Medicinal Food, 14, 528–531.
Staker BL, Hjerrild K, Feese MD, Behnke CA, Burgin AB, Stewart L, 2002. The mechanism of topoisomerase I poisoning by a camptothecin analog. Proceedings of hte
National Academy of Sciences, 99, 15387–15392.
144 Stefanello MEA, Pascoal ACRF, Salvador MJ, 2011. Essential Oils from Neo-tropical
Myrtaceae: Chemical Diversity and Biological Properties. Chemistry & Biodiversity, 8,
73-94.
Svoboda GH, Blake DA, 1975. The phytochemistry and pharmacology of Catharanthus roseus (L.) G. Don, in Catharanthus Alkaloids, Taylor, W.I. and Farnsworth, N.R., Eds,
Marcel Dekker, Inc., New York, chap. 2.
Tenev T, Bianchi K, Darding M, Broemer M, Langlais C, Wallberg F, Zachariou A,
Lopez J, MacFarlane M, Cain K, Meier P, 2011. The Ripoptosome, a Signaling Platform that Assembles in Response to Genotoxic Stress and Loss of IAPs. Molecular Cell, 43,
689-689.
Teodori E, Dei S, Scapecchi S, Gualtieri F, 2002. The Medicinal Chemistry of Multidrug
Resistence (MRD) Reversing Drugs. II Farmaco, 57, 385-414.
Thompson DS, Greco FA, Miller AA, Srinivas NR, Igwemezie LN, Hainsworth JD,
Schacter LP, Kaul S, Barbhaiya RH, Garrow GC, Hande KR, 1995.A phase I trial of etoposide phosphate administered as a daily 30 minute infusion for 5 days. Clinical &
Pharmacology Therapeutcs, 57, 499–507.
Thurston DE, 2006. Chemistry and Pharmacology of Anticancer Drugs. CRC Press
(Taylor & Francis), Boca Raton, FL, USA, 281p.
Tiberti LA, Yariwake JH, Ndjoko K, Hostettmann K, 2007. Identification of flavonols in leaves of Maytenus ilicifolia and M. aquifolium (Celastraceae) by LC/ UV/MS analysis.
Jounal of Chromatography B, 846, 378-384.
145 Tong WG, Ding XZ, Adrian TE, 2002. The mechanisms of lipoxygenase inhibitor- induced apoptosis in human breast cancer cells. Biochemistry and Biophysical Research
Communications, 296, 942–948.
Valerio DA, Georgetti SR, Magro DA, Casagrande R, Cunha TM, Vicentini FT, Vieira
SM, Fonseca MJ, Ferreira SH, Cunha FQ, Verri-Jr WA, 2009. Quercetin reduces inflammatory pain: inhibition of oxidative stress and cytokine production. Journal of
Natural Products, 72, 1975-1979.
Vallabhapurapu S, Karin M, 2009. Regulation and function of NF-κB transcription factors in the immune system. Annual Review of Immunology, 27, 693–733.
Van Bergen MA, Snoeijer W, 1996. Revision of Catharanthus G. Don. Series of
Revisions of Apocynaceae XLI; Backhuys Publishers: Leiden, The Netherlands, 32–35.
Van-Assche T, Huygelen V, Crabtree MJ, Antoniades C, 2011. Gene therapy targeting inflammation in atherosclerosis. Current Pharmaceutical Design, 17, 4210–4223.
Vane J, Botting R, 1987. Inflammation and the mechanism of action of anti-inflamma- tory drugs. The FASEBJ Journal, 1, 89-96.
Varfolomeev EE, Ashkenazi A, 2004. Tumor necrosis factor: An apoptosis JuNKie? Cell,
116, 491-97.
Vega-Ávila E, Cano-Velasco JL, Alarcón-Aguilar FJ, Ortíz MCF, Almanza-Pérez JC,
Román-Ramos R, 2012. Hypoglycemic Activity of Aqueous Extracts from Catharanthus roseus. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Volume 2012,
Article ID 934258, 7 pages. http://dx.doi.org/10.1155/2012/934258
Vendramini-Costa DB, Carvalho J.E, 2012. Molecular Link Mechanisms between
Inflammation and Cancer. Current Pharmaceutical Design, 18, 3831-3852.
146 Venkatesha SH, Berman BM, Moudgil KD, 2011. Herbal medicinal products target defined biochemical and molecular mediators of inflammatory autoimmune arthritis.
Bioorganic & Medicinal Chemistry, 19, 21–29.
Verma S, Singh A, Mishra A, 2013. Gallic acid: Molecular rival of cancer.
Environmental Toxicology and Pharmacology, 35, 473–485.
Vicentini FT, He T, Shao Y, Fonseca MJ, Verri-Jr WA, Fisher GJ, Xu Y, 2011.
Quercetin inhibits UV irradiation-induced inflammatory cytokine production in primary human keratinocytes by suppressing NF-kappaB pathway. Journal of Dermatological
Science, 61, 162-168.
Vijayababu MR, Kanagaraj P, Arunkumar A, Ilangovan R, Dharmarajan A, Arunakaran
J, 2006. Quercetin induces p53-independent apoptosis in human prostate cancer cells by modulating Bcl-2-related proteins: a possible mediation by IGFBP-3. Oncology
Research, 16, 67-74.
Waldburger JM, Firestein GS, 2009. Garden of therapeutic delights: new targets in rheumatic diseases. Arthritis Research & Therapy, 11, 206- 217.
Wall ME, Wani MC, Cook CE, Palmer K H, McPhail AT, Sim GA, 1966. Plant antitumor agents Ⅰ. The isolation and structure of camptothecin, a novel alkaloidal leukaemia and tumor inhibitor from Camptotheca acuminata. Journal of American
Chemistry Society, 88, 3888-3890.
Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail AT, 1971. Plant antitumor agents
VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from
Taxus brevefolia. Journal of American Chemistry Society, 93, 2325–2327.
Weinberg RA, 2008. A biologia do câncer. Porto Alegre: Artmed, 864p.
147 Wellen KE, Hotamisligil GS. 2005. Inflammation, stress, and diabetes. The Journal of
Clinical Investigation, 115, 1111-1119.
WHO, 2013a. Disponível em: www.who.int/topics/cancer/en/index.html. Accesso em 17-
12-2013.
WHO, 2013b. Disponível em: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.
Acesso em 17-12-2013.
Wilson PG, O’Brien MM, Gadek PA, Quinn CJ, 2001. Myrtaceae revisited: A reassessment of infrafamilial groups. American Journal of Botany, 88, 2013–2025.
Wilson PG, O'brien MM, Heslewood MM, Quinn CJ, 2005. Relationships Within
Myrtaceae Sensu Lato Based On A Matk Phylogeny. Plant Systematics And Evolution
251, 3-19.
Winter CA, Risley EA, Nuss GW, 1962. Carrageenan-induced oedema in hind paw of the rat as an assay for anti-inflammatory drugs. Proceedings of the Society for Experimental
Biology and Medicine, 111, 544–547.
Witkin LB, Huebner CF, Galdi F, Keefe E, Spitaletta P, Plumer AJ, 1961.
Pharmacognosy of 2 amino-indane hydrochloride (SU 8629). A potent nonnacrotic analgesic. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 133, 400–408.
Wong ET, Berkenblit A, 2004. The role of topotecan in the treatment of brain metastases.
Oncologist, 9, 68–79.
Xiao Y, H Li, J. Zhang, A. Volk, S. Zhang, W. Wei, S. Zhang, P. Breslin, J. Zhang. 2011.
TNF-α/Fas-RIP-1–induced cell death signaling separates murine hematopoietic stem cells/progenitors into 2 distinct populations. Blood, 118, 6057–6067.
148 Xu RR, Zhang Y, Ye X, Xue S, Shi J, Pan J, Chen Q, 2013. Inhibition effects and induction of apoptosis of flavonoids on the prostate cancer cell line PC-3 in vitro. Food
Chemistry, 138, 48–53.
Yuan G, Wahlqvist ML, He G, Yang M, Li D, 2006. Natural products and anti- inflammatory activity. Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition, 15, 143-152.
Zhang H, Zhou X, McQuade T, Li J, Chan FK, Zhang J, 2011. Functional complementation between FADD and RIP1 in embryos and lymphocytes. Nature, 471,
373–376.
Zündorf U, 1997. Leverkusen: Bayer. 100 Years of aspirin: the future has just begun.
33p.
149
9. Anexos
Anexo 1. Espectro, após injeção direta em modo negativo em espectrômetro de massas (ESI-MS) do extrato etanólico bruto das folhas de Campomanesia guaviroba (Cge)
150
Anexo 2. Espectro, após injeção direta em modo negativo, em espectrômetro de massas (ESI-MS) do extrato etanólico bruto das folhas de Campomanesia adamantium (Cae)
151
Anexo 3. Espectro de massas ESI-MS da fração hexânica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo
152
Anexo 4. Espectro de massas ESI-MS da fração diclorometânica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo
153
Anexo 5. Espectro de massas ESI-MS da fração butanólica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo
154
Anexo 6. Espectro de massas ESI-MS da fração hidroalcoólica remanescente do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo
155
Anexo 7. Espectro de massas ESI-MS da fração hexânica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo
156
Anexo 8. Espectro de massas ESI-MS da fração diclorometânica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo
157
Anexo 9. Espectro de massas ESI-MS da fração butanólica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo
158
Anexo 10. Espectro de massas ESI-MS da fração hidroalcóolica remanescente do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo.
159
Anexo 11. Cromatograma obtido por HUPLC-MS do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo. a: quercetina, b: Ca6, c: Ca5, d: ácido gálico, e: miricitrina, f: quercitrina.
160
Anexo 12. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração hexânica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo. a: miricitrina, b: quercetina, c: Ca6, d: ácido gálico.
161
Anexo 13. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração diclorometânica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo. a: miricitrina, b: quercetina, c: Ca6, d: ácido gálico.
162
Anexo 14. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração butanólica do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo. a: miricitrina, b: quercetina, c: Ca6, d: ácido gálico.
163
Anexo 15. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração hidoralcóolica remanescente do extrato bruto de Campomanesia guaviroba em modo negativo. a: miricitrina, b: quercetina, c: Ca6, d: ácido gálico.
164
Anexo 16. Cromatograma obtido por HUPLC-MS do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo. a: quercetina, b: Ca6, c:Ca5, d: ácido gálico, e: miricitrina, f: quercitrina.
165
Anexo 17. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração hexânica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo. a: quercetina, b: Ca6, c:Ca5, d: miricitrina, e: quercitrina, f: ácido gálico.
166
Anexo 18. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração diclorometânica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo. a: quercetina, b: Ca6, c:Ca5, d: miricitrina, e: quercitrina.
167
Anexo 19. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração butanólica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo. a: miricitrina, b: quercitrina, c: quercetina, d: Ca6, e: Ca5.
168
Anexo 20. Cromatograma obtido por HUPLC-MS da fração hidroalcoólica do extrato bruto de Campomanesia adamantium em modo negativo. a: quercetina , b: Ca6, c: Ca5, d:ácido gálico, e: miricitrina, f: quercitrina.
169
Espectro de RMN de 1H da amostra CAEB-31-17 (MeOH-D4 – 400 MHz)
Anexo 21. Espectro de RMN H1 da amostra Caeb 31, MeOD, 400 MHz.
170 Espectro de RMN de 13C da amostra CAEB-31-17 (MeOH-D4 – 50 MHz)
Anexo 22. Espectro de RMN C13 da amostra Caeb 31, MeOD, 50 MHz.
Espectro HSQC da amostra CAEB-31-17 (MeOH-D4 – 50 MHz)
Anexo 23. Espectro HSQC da amostra Caeb 31, MeOD, 50 MHz.
171 Espectro HMBC da amostra CAEB-31-17 (MeOH-D4 – 50 MHz)
Anexo 24. Espectro de HMBC da amostra Caeb 31, MeOD, 50 MHz.
Aislan Caeb 31 17 (0.239) 2: Scan ES- 463.12 4.04e7 100
%
433.10
0 m/z 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740 760 780 800 Anexo 25. Espectro de massas ESI-MS/MS de Caeb31 em metanol, modo negativo, 30 V.
172
5000
4000
3000
2000
1000
0
5.0 0.0 ppm (f1) 1 Anexo 26. Espectro de RMN H da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 200 MHz.
173 1500
1000
500
0
6.10 6.00 5.90 5.80 ppm (f1) 1 Anexo 27. Espectro de RMN H da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 200 MHz – ampliação da 1ª. região aromática.
174 1500
1000
500
0
7.90 7.80 7.70 7.60 7.50 7.40 7.30 ppm (f1) 1 Anexo 28. Espectro de RMN H da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 200 MHz – ampliação da 2ª região aromática.
175 7000
192.583 167.242 164.926 163.260 141.965 135.521 129.946 128.795 128.227 127.669 96.199 91.648 55.744
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
-1000
200 150 100 50 0 ppm (t1)
13 Anexo 29. Espectro de RMN C da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz..
176 0
50
100
150
200
ppm (t1)
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm (t2) Anexo 30. Espectro HSQC da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz.
177 100
150
ppm (t1)
8.00 7.50 7.00 6.50 6.00 5.50 ppm (t2)
Anexo 31. Espectro HSQC da amostra Ca5 , CDCl3+MeOD, 50 MHz – ampliação da região aromática
178 0
50
100
150
200
ppm (t1)
8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 ppm (t2)
Anexo 32. Espectro HMBC da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz.
50
100
150
ppm (t1)
4.00 3.50 ppm (t2)
Anexo 33. Espectro HMBC da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz – ampliação da região da metoxila.
179 100
150
200
ppm (t1)
6.00 5.50 ppm (t2)
Anexo 34. Espectro HMBC da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz – ampliação da 1ª região aromática.
180 120
130
140
150
160
170
180
190
200 ppm (t1)
8.00 7.50 7.00 ppm (t2)
Anexo 35. Espectro HMBC da amostra Ca5, CDCl3+MeOD, 50 MHz – ampliação da 2ª região aromática.
181
Dados: RMN 1H – 3.92, s, 3H 5.97, d (2,2), 1H 6.01, d (2,2), 1H 7.41, m, 3H 7.61, m, 2H 7.75, d (15.6), 1H 7.91, d (15,6), 1H.
RMN 13C – 55,7; 91,6; 96,1; 127,7; 128,2; 128,7; 129,9; 141,9; 163,2; 164,9; 167,2; 192,5.
HSQC – correlações HMBC – correlações principais
1H 13C 3,92 55,7 1H 13C 5,97 91,6 3,92 163,2 6,01 96,2 5,97 96,2; 105,8, 163,2 e 164,9 7,41 128,7 e 129,9 7,41 128,2 e 135,4 7,61 128,2 7,61 129,9, 141,9 7,75 141,9 7,91 135,4, 141,9, 192,5 7,91 127,6
Carbonos quaternários: 135,4 (1’) e 105,8 (1, observado apenas através do HMBC).
Anexo 36. Dados espectrais da substância isolada e identificada de Campomanesia adamantium, a chalcona 2’,4’-diidroxi-6’-metoxichalcona ou (2E)-(2,4-diidroxi-6- metoxifenil)-3-fenilprop-2-em-1-one ou Cardamonin (Ca5).
182
Anexo 37. Autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais no Ensaio da Atividade Antitumoral em Modelo de Tumor Sólido de Erlich
183 Anexo 38. Autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais no Ensaio de Toxicidade Aguda
184
Anexo 39. Autorização da Comissão de Ética no Uso de Animais nos Ensaios de Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória.
185
A
n Anexo 40. Declaração da Comissão de Ética no Uso de Animais nos Ensaios de Atividade antinociceptiva e anti-inflamatória.
186
187
188
189
190
191
192
193
194
195
196
Anexo 41. Artigo publicado com parte dos resultados obtidos nesta tese.
197