Y Nesidiocoris Tenuis Con El

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos

Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber)

(Hemiptera: Anthocoridae) y

Nesidiocoris tenuis (Reuter)

(Hemiptera: Miridae), depredadores

importantes en cultivos hortícolas protegidos,

con nuevas barreras físicas selectivas

y modernos plaguicidas

TESIS DOCTORAL

Fermín Amor Parrilla Ingeniero Agrónomo 2013

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos

Compatibilidad de Orius laevigatus (Fieber)

(Hemiptera: Anthocoridae) y

Nesidiocoris tenuis (Reuter)

(Hemiptera: Miridae), depredadores

importantes en cultivos hortícolas protegidos,

con nuevas barreras físicas selectivas

y modernos plaguicidas

TESIS DOCTORAL

Fermín Amor Parrilla Ingeniero Agrónomo

Directores: Elisa Viñuela Sandoval Catedrática y Dra. Ingeniera Agrónoma (Universidad Politécnica de Madrid) Guy Smagghe Professor Dr. ir. (Ghent University), Belgium

Madrid, 2013

Tribunal nombrado por el Magfco. Y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid, el día de de 2013.

Presidente D./Da

Vocal D./D.a

Secretario D./D.a

Suplente D./D.a

Realizada la lectura y defensa de la tesis el día de de 2013 en Madrid, en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos.

Calificación:

El Presidente Los Vocales

El Secretario

“Sine agricultura nihil”

A mis padres, y a Sara

AGRADECIMIENTOS.

Esta Tesis Doctoral se ha llevado acabo en la Unidades de Protección de Cultivos de la E.T.S.I. Agrónomos de Madrid (España) y de la Facultad de Bioingeniería de Gante (Bélgica), como parte de los proyectos del Plan Nacional de I+D+I AGL2007-66399- C03-01 y AGL2010-22196-C02-02, y gracias a una beca FPI (BES-2009-014631) otorgada por el Ministerio de Economía y Competitividad (antiguo Ministerio de Ciencia e Innovación).

Es bonito poder dar las gracias a todas las personas que de un modo u otro, me han ayudado a que esta tesis sea posible, incluso cuando yo ni siquiera sabía que la iba a escribir allá por 2006. A todos ellos, a los que nombro y a los que no, mi más sincera gratitud.

A mis padres Miguel y Remedios, porque todo lo que he conseguido ha sido gracias a ellos, por su apoyo e inculcarme su capacidad de sacrificio, trabajo y valores.

A Sara, por estar siempre a mi lado, y hacer que cada día cuando llego a casa me sienta el hombre más feliz del mundo.

A Elisa, mi tutora, por darme la oportunidad de trabajar en investigación, transmitirme toda su experiencia, confiar en mi trabajo, y su apoyo personal.

To Guy, my promoter in Belgium, because he invited me to be part of his work team two times, and also for his personal motivation and patience.

A Flor, porque fue la primera persona que confió en mi trabajo, y me contagió el interés por la entomología, por su vitalidad y alegría.

A Pilar, porque siempre ha estado ahí cuando la he necesitado, y sus consejos me han ayudado a no perder el rumbo.

A Ángeles, por su apoyo e interés ante los problemas diarios, y las continuas “discusiones” de metodología.

A Pedro, por contagiar su entrega al trabajo, no hay día en el que no te enseñe algo, su constancia y humor.

A Yara, Nacho y Luis, que siempre me habéis ayudado en mi trabajo diario, Torre de Potter, semillado de plantas, construcción de jaulas, muestreos en “La Poveda”, “diseño” de bichos para las presentaciones, limpieza de material… pero me quedo con vuestra amistad.

A Antonio López, por confiar en mi trabajo y su apoyo personal.

A Ignacio Colomer, por enseñarme los entresijos de la horticultura Almeriense.

A mis compañeros de laboratorio, Gladis, Gloria, Javi, Cherre, Edu, Pedro, Rabeh, Dani, Sotero, Geraldo, Jader, Sara, Guille, Edu, Juan, Raquel, Valentín, Essen, Gabriela, Rosa Mari, Antonio, Celeste… y en especial a los que más me han sufrido… Paloma, mi inseparable compañera y sobretodo mi amiga, sin ella el día a día hubiese sido más complicado, y seguro más aburrido. A Agustín, el amigo con el que me reencontré en el laboratorio, gracias por esas risas sin control, “trazos”, y estar ahí en todo momento. A Rosa, por estar siempre dispuesta a ayudarme y su amistad. A Mar, por compartir esas grandes anécdotas en viajes y apoyo. A Andrea “la ninfa”, porque a pesar de que me da mucha guerra… lo que nos reímos… y aprendo de ella. A Luis Hiernaux, por poner la nota forestal en este grupo, eres uno más amigo.

Al “equipo Gante”, Paloma, Marta y Olivier, por ser mi familia en Bélgica, todo fue posible gracias a vosotros. (To the “Ghent team”, Paloma, Marta and Olivier, because they were my family in Belgium, everything was possible because of you guys).

To Olivier, thanks for all the trips, Belgian beers and your friendship.

To mates in Agrozoology lab in Ghent, Patrick, Luc, Rik, Didier, Leen, Bjorn, Ivan, Hanneke, Ruben, Jisheng, Moises, Maarten, Sara, Jochem, Astrid, Silvia, Thijs, Na, Dorien, Peter… Dankjewel!!!.

Al “club del café”, aquí seguro que me dejo a alguien, Paloma, Agustín, Rosa, Pilar, Yara, Nacho, Luis, ocasionalmente Flor, Mar, Celeste… porque todos los días es bueno empezar la mañana riéndose, haciendo quinielas y llegando al laboratorio un poco más tarde de lo previsto… qué tertulianos se ha perdido el mundo.

A todo el personal de la universidad, escuela y del departamento que siempre me ha ayudado cuando lo he necesitado, Carolina Palomo, Silvia Muñoz, Carmen González, Carmen Dieguez, Román Zurita, Anabel Torres, Esther Plaza, Julio Sebastián, Pedro Aguado, Juan Pablo del Monte, Mª Dolores Curt… y especialmente al servicio de envío de bibliografía de la biblioteca de la E.T.S.I. Agrónomos, que sin su ayuda no hubiese podido escribir un solo párrafo de esta tesis.

Al personal de la finca experimental “La Poveda” (Pedro, Tasio, Paulino…) y del CSIC (Alberto Fereres, Arantxa Moreno, Beatriz Dader…) por su ayuda en los ensayos de campo.

A Carmen Calleja por resolver mis dudas moleculares.

A Beatriz Díaz por sus enseñanzas de Sadie y Surfer.

A todos mis amigos por los buenos momentos que me dan… a los birratoureros (Edu, Fer, Mario, Fede, Carlos, José David, Javi, David, Miguel), a los getafenses (David, Alfredo, Esther…) a la manada, (Tere, Álvaro, Noe, Paty, Luis, Carlos, Willy…), a los sin fronteras (José Luis, Sergio…).

Índice

ÍNDICE. i

ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS. vii

RESUMEN. ix

SUMMARY. xii

1. INTRODUCCIÓN GENERAL. 1

1.1. La agricultura sostenible y el control de plagas. 1

1.2. Gestión Integrada de plagas (GIP) en cultivos

hortícolas protegidos. 3

1.3. Enemigos naturales. 8

1.3.1. Orius laevigatus. 8

1.3.1.1. Sistemática. 8

1.3.1.2. Distribución geográfica y hábitat. 9

1.3.1.3. Descripción y biología del insecto. 10

1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos

hortícolas protegidos. 14

1.3.2. Nesidiocoris tenuis. 16

1.3.2.1. Sistemática. 16

1.3.2.2. Distribución geográfica y hábitat. 16

1.3.2.3. Descripción y biología del insecto. 17

1.3.2.4. Importancia en la GIP de cultivos

hortícolas protegidos. 21

2. OBJETIVOS. 24

i Índice

3. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES. 25

3.1. Lugar de estudio y condiciones ambientales. 25

3.1.1. Laboratorio. 25

3.1.2. Invernadero. 26

3.1.3. Campo (túneles semi-comerciales). 27

3.2. Material biológico y su manejo. 28

3.2.1. Cría de Orius laevigatus. 28

3.2.2. Cría de Nesidiocoris tenuis. 28

3.2.3. Material vegetal. 31

3.3. Análisis estadístico. 33

4. COMPATIBILIDAD DE LOS ENEMIGOS NATURALES

ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS CON EL

USO DE MALLAS TRATADAS CON BIFENTRIN COMO

MÉTODO FÍSICO DE CONTROL. 35

4.1. Introducción. 35

4.2. Materiales y métodos. 37

4.2.1. Características y manejo de la malla tratada

con bifentrin y malla control. 37

4.2.2. Laboratorio. 39

4.2.2.1. Evaluación de la preferencia entre

malla control y tratada con bifentrin. 39

ii Índice

4.2.2.2. Evaluación de la toxicidad de la

malla tratada con bifentrin por contacto. 42

4.2.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en invernadero. 43

4.2.4. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 45

4.3. Resultados y discusión. 56

4.3.1. Laboratorio. 56

4.3.1.1. Evaluación de la preferencia entre

malla control y tratada con bifentrin. 56

4.3.1.2. Evaluación de la toxicidad de la malla

tratada con bifentrin por contacto. 58

4.3.2. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en invernadero. 59

4.3.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada

con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales). 63

4.3.3.1. Otoño 2011. 63

4.3.3.2. Primavera-verano 2012. 69

4.3.3.3. Otoño 2012. 75

iii Índice

5. TOXICIDAD DE MODERNOS INSECTICIDAS SOBRE

LOS ENEMIGOS NATURALES ORIUS LAEVIGATUS Y

NESIDIOCORIS TENUIS. 81

5.1. Introducción. 81

5.1.1. Insecticidas evaluados. 84

5.1.1.1. Abamectina. 84

5.1.1.2. Deltametrina. 85

5.1.1.3. Emamectina. 86

5.1.1.4. Flubendiamida. 87

5.1.1.5. Spinosad. 88

5.1.1.6. Spiromesifen. 89

5.2. Materiales y métodos. 90

5.2.1. Insecticidas evaluados. 90

5.2.2. Clasificación de los insecticidas. 91

5.2.3. Resumen de los ensayos realizados con insecticidas. 92

5.2.4. Contacto residual sobre placas de cristal

en laboratorio. 92

5.2.5. Persistencia. 98

5.3. Resultados. 100

5.3.1. Contacto residual sobre placas de cristal

en laboratorio. 100

5.3.1.1. Orius laevigatus. 100

5.3.1.2. Nesidiocoris tenuis. 107

5.3.2. Persistencia. 114

iv Índice

5.3.2.1. Orius laevigatus. 114

5.3.2.2. Nesidiocoris tenuis. 119

5.4. Discusión. 124

5.4.1. Contacto residual sobre placas de cristal

en laboratorio. 124

5.4.2. Persistencia. 130

6. ECDYSONE AGONISTS: ECOTOXICOLOGY ON

ORIUS LAEVIGATUS. INSECT TOXICITY BIOASSAYS

AND MOLECULAR DOCKING APPROACHES. 132

6.1. Introduction. 132

6.1.1. The ecdysone receptor. 132

6.2. Objectives. 134

6.3. Material and methods. 135

6.3.1. Chemicals. 135

6.3.2. Insects bioassays. 137

6.3.3. EcR-LBD sequence. 137

6.3.4. Confirmation of expression of EcR in nymphs

of Orius laevigatus. 141

6.3.5. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies. 141

6.4. Results. 142

6.4.1. Efficacy and toxicological effects of

methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849. 142

6.4.2. OlEcR-LBD sequence, phylogenetic tree

v Índice

and expression in nymphs. 144

6.4.3. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies. 149

6.5. Discussion. 152

7. CONCLUSIONS. 155

8. BIBLIOGRAFÍA. 157

APÉNDICE. 179

Índice de figuras. 179

Índice de tablas. 185

vi ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS.

-3D. Three dimensional. -16L: 8O. Fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas de oscuridad. -20E. 20-hydroxyecdysone. -a.i. Active ingredient. -ANOVA. Análisis de varianza. -BOE. Boletín Oficial del Estado. -CABYV. Cucurbit aphid-borne yellows virus. -CINEMA. Colour Interactive Editor for Multiple Alignments. -CEE. Comunidad Económica Europea. -CMV. Cucumber mosaic virus. -CSIC. Centro Superior de Investigaciones Científicas. -DAH. Diacylhydrazine. -DBD. DNA-binding domain. -DDT. Días después del tratamiento. -DNA. Deoxyribonucleic acid. -EC. Concentrado emulsionable. -EEC. European Economic Community. -EcR. Ecdysone receptor. -EcR-LBD. Ecdysone receptor ligand-binding domain. -E.T.S.I.A. Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos. -F. F de Fisher. -GABA. Ácido gamma-aminobutírico. -GIP. Gestión Integrada de Plagas. -g.l. Grados de libertad. -HR. Humedad Relativa. -HRE. Hormone response elements. -i.a. Ingrediente activo. -IIC, Intelligent Insect Control. -IPM. Integrated Pest Management. -IRAC. Insecticide Resistance Action Committee. -K. K de Krushall-Wallis.

vii -LAA. Laboratorio Arbitral Agroalimentario. -LBD. Ligand-binding domain. -LBP. Ligand-binding pocket. -LLINs. Long lasting insecticidal nets. -LSD. Least significant difference (Mínimas diferencias significativas). -MAGRAMA. Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente. -MFRC. Maximum field recommended concentrations. -MACs. Molting-accelerating compounds. -NtEcR-LBD. LBD of the EcR of N. tenuis. -OILB. Organización Internacional para la Lucha Biológica e Integrada. -OJEU. Oficial Journal of the European Union. -OlEcR-LBD. LBD of the EcR of O. laevigatus. -OMS. Organización Mundial de la Salud. -P. Valor p de probabilidad. -PAR. Radiación fotosintéticamente activa. -PCR. Polimerase Chain Reaction. -PI. Producción Integrada. -PIEC. Predicted Inicial Environmental Concentration. -P1A. Ponasterone A. -RACE. Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR. -RNA. Ribonucleic acid. -RXR-USP. Retinoid X receptor- Ultraspiracle. -SC. Suspensión concentrada. -SG. Gránulos solubles en agua. -sp. Especie. -spp. Especies. -t. t de Student. -TSWV. Tomato spotted wilt virus. -UE. Unión Europea. -USP. Ultraspiracle. -UV. Ultravioleta. -W. W de Wilcoxon. -WG. Granulado dispersable en agua. -WHO. World Health Organisation.

viii RESUMEN.

La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico, el físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos es a veces necesario para el adecuado manejo de plagas en cultivos hortícolas. Por ello, el objetivo general de este estudio es aportar conocimientos para mejorar el control de plagas en cultivos hortícolas, mediante la integración de tres estrategias de lucha: biológica, física y química.

Una parte de este trabajo ha consistido en el estudio de los posibles efectos que mallas tratadas con insecticida (bifentrin) pudieran provocar mediante diferentes ensayos de laboratorio, invernadero y campo, en los enemigos naturales Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (depredador de trips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (depredador de mosca blanca y Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), y otros agentes de biocontrol comúnmente usados en cultivos hortícolas protegidos. Este tipo de mallas se han empleado con éxito en entomología médica para controlar mosquitos vectores de la malaria, y actualmente se está trabajando en su desarrollo para uso agrícola como método de exclusión, y método directo de control de plagas.

En los ensayos realizados en laboratorio, O. laevigatus y N. tenuis no fueron capaces de detectar la presencia de bifentrin en el ensayo de preferencia. Además, no se produjo mortalidad a corto plazo (72 horas) en ambos chinches depredadores. Por el contrario, se registró una elevada mortalidad cuando se expusieron por contacto a la malla tratada durante 72 horas en cajas de dimensiones reducidas (10 cm de diámetro X 3 cm de altura). En ensayos llevados a cabo bajo condiciones más reales de exposición, en un invernadero experimental con jaulas de 25 X 25 X 60 cm de altura, no se produjo ningún efecto en la mortalidad a corto plazo (72 horas) o en los parámetros reproductivos de O. laevigatus y N. tenuis. Finalmente, en ensayos de campo realizados en túneles semi-comerciales (8 m de largo X 6,5 m de ancho X 2,6 m de altura), ni las condiciones ambientales [temperatura, humedad relativa, radiación ultravioleta (UV) y

ix fotosintéticamente activa (PAR)], ni los enemigos naturales, se vieron afectados por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo. Sin embargo, los resultados no fueron concluyentes, debido al bajo establecimiento de los agentes de biocontrol liberados. Por lo tanto, más estudios son necesarios en invernaderos comerciales para confirmar los resultados preliminares de compatibilidad.

Además, en este trabajo se han evaluado los efectos letales (mortalidad) y subletales (parámetros reproductivos) de seis modernos insecticidas sobre los chinches depredadores O. laevigatus y N. tenuis, mediante ensayos de laboratorio y persistencia. Los ensayos se realizaron por contacto residual, aplicando los insecticidas a la dosis máxima de campo sobre placas de cristal (laboratorio) o plantas (persistencia). Los productos fitosanitarios se seleccionaron por representar a un grupo de modernos plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos para los enemigos naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados, oroganofosforados o carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde O. laevigatus y N. tenuis están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso de inclusión en la lista comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, Anexo I de la Directiva 91/414/CEE: abamectina y emamectina (avermectinas neurotóxicas, activadoras del canal del cloro), deltametrina (piretroide neurotóxico, modulador del canal del sodio, control positivo), flubendiamida (neurotóxico, modulador del receptor de rianodina), spinosad (naturalito neurotóxico, agonistas/antagonistas del receptor de nicotínico acetilcolina) y spiromesifen (inhibidor de la acetil CoA carboxilasa).

El estudio mostró que O. laevigatus fue más susceptible a los insecticidas que N. tenuis. Además, los resultados revelaron que flubendiamida y spiromesifen fueron compatibles con los dos enemigos naturales estudiados, y por tanto se podrían usar en programas de GIP. Por el contrario, los insecticidas abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad no fueron selectivos para ninguno de los chinches depredadores. Sin embargo, los estudios de persistencia demostraron que a pesar de que estos insecticidas no proporcionaron selectividad fisiológica, pueden proporcionar selectividad ecológica en algunos casos. Abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían ser compatibles con N. tenuis si el enemigo natural es introducido en el cultivo 4 días después de su aplicación. En el caso de O. laevigatus, abamectina, deltametrina y spinosad se clasificaron como persistentes, por lo tanto es necesario completar el

x estudio con experimentos de semi-campo y campo que determinen si es posible su uso conjunto en programas de GIP. Por otro lado, emamectina podría ser compatible con O. laevigatus si el enemigo natural es introducido en el cultivo 7 días después de su aplicación.

Por último, se ha comprobado la selectividad de tres insecticidas aceleradores de la muda (MACs) (metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849) sobre O. laevigatus y N. tenuis. Además de realizar estudios para evaluar la toxicidad en laboratorio de los insecticidas por contacto residual e ingestión (principal modo de acción de los MAC´s), se extrajo RNA de los insectos y con el cDNA obtenido se secuenció y clonó el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor de ecdisona correspondiente a O. laevigatus (OlEcR-LBD) y N. tenuis (NtEcR-LBD). Posteriormente, se obtuvo la configuración en tres dimensiones del LBD y se estudió el acoplamiento de las moléculas de los tres insecticidas en la cavidad que forman las 12 α-hélices que constituyen el EcR-LBD. En el caso de N. tenuis se debe mencionar que no fue posible la obtención de la secuencia completa del LBD. Sin embargo, se obtuvo una secuencia parcial (hélice 6-hélice 11), que mostró una alta conservación de aminoácidos con respecto a la obtenida en O. laevigatus. Los ensayos de toxicidad mostraron que metoxifenocida, tebufenocida y RH-5849 no produjeron ningún efecto nocivo en ambos depredadores. Además, los estudios de modelado por homología y acoplamiento molecular llevados a cabo con O. laevigatus, también indicaron que los MACs no produjeron ningún efecto deletéreo en este enemigo natural. Por lo tanto, estos compuestos pueden ser aplicados de manera segura en programas de GIP en los cuales O. laevigatus y N. tenuis estén presentes.

SUMMARY.

The new pesticide legislation on pest control is aimed at integrated pest management (IPM). These programs are based on the most environmentally sustainable approaches, where biological, physical control and other non-chemical methods are the cornerstone. However, selective pesticides are often required for pest management on horticultural crops. Therefore, the main goal of this study is to provide knowledge to improve pest control on horticultural crops through the integration of three strategies: biological, physical and chemical.

Firstly, the effects of insecticide treated nets (bifenthrin) were evaluated in different laboratory, greenhouse and field experiments on the natural enemies Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) (predator of thrips), Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) (predator of whiteflies and Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae)), and other biocontrol agents commonly used on protected horticultural crops. These types of nets have been successfully used in medical entomology to control mosquito malaria vectors, and work is currently being done on their use as exclusion barriers and as a direct method of pest control in agriculture.

In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no short- term mortality (72 hours) was recorded on both predatory bugs. In contrast, a high mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages of 25 X 25 X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive parameters were not affected. Lastly, in field experiments carried out in semi-commercial tunnels (8 m long X 6.5 m width X 2.6 m high), neither environmental conditions [temperature, relative humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] nor natural enemies were affected by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop. However, results were not conclusive, mainly due to a low settlement of the released biocontrol agents, and further studies are needed in commercial greenhouses to confirm our preliminary results of compatibility.

xii Secondly, the lethal (mortality) and sublethal effects (reproductive parameters) of six modern pesticides on the predatory bugs O. laevigatus and N. tenuis has been evaluated through laboratory and persistence experiments. Trials were carried out by residual contact, applying the insecticides to the maximum field recommended concentration on glass plates (laboratory) or plants (persistence). Insecticides were chosen as representatives of modern pesticides with a more selective mode of action on natural enemies than organochlorine, organophosphorus and carbamate insecticides. Moreover, they were also chosen because of their frequent use on horticultural crops where O. laevigatus and N. tenuis are present. All of them have been included or have been requested for inclusion in the community list of active substances on the agricultural market, Annex I of the European Directive 91/414/EEC: abamectin and emamectin (neurotoxic avermectins, chloride channel activators), deltamethrin (neutotoxic pyrethroid, sodium channel modulator, positive commercial standard), flubendiamide (neurotoxic, rianodine receptor modulator), spinosad (neurotoxic naturalyte, nicotinic acetylcholine receptor allosteric activator) and spiromesifen (inhibitors of acetyl CoA carboxylase).

The study showed that O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides than N. tenuis. In addition, the research results indicated no impact of flubendiamide and spiromesifen on the two natural enemies studied under laboratory conditions. Consequently, both pesticides are candidates to be included in IPM programmes where these biocontrol agents are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad were not selective for both predatory bugs in laboratory experiments. However, persistence test demonstrated that in spite of the lack of physiological selectivity, these pesticides can provide ecological selectivity in some cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad could be compatible with N. tenuis if the mirid bug is released 4 days after the insecticide treatment on the crop. With regard to O. laevigatus, abamectin, deltamethrin and spinosad were classified as persistent in our assays, thus the study should be completed with semi-field and field experiments in order to ascertain their possible joint use in IPM programs. In contrast, emamectin could be compatible with O. laevigatus if the pirate bug is released 7 days after the insecticide treatment on the crop.

xiii Finally, the selectivity of three moulting accelerating compounds (MACs) (methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849) has also been evaluated on O. laevigatus and N. tenuis. In addition to laboratory experiments to evaluate the toxicity of the insecticides by residual contact and ingestion, molecular approaches were used as well. RNA of both insects was isolated, cDNA was subsequently synthesized and the complete sequence of the ligand binding domain (LBD) of the ecdysone receptor of O. laevigatus (OlEcR-LBD) and N. tenuis (NtEcR-LBD) were determined. Afterwards, the three dimensional structure of LBD was constructed. Finally, the docking of the insecticide molecules in the cavity delineated by the 12 α-helix that composed the EcR- LBD was performed. In the case of N. tenuis, it should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD.However, a partial sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and a strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. Results showed no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849, on both predatory bugs. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking experiments also suggested that MACs were devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. Therefore, our results indicate that these compounds could be safely applied in IPM programs in which O. laevigatus and N. tenuis are present.

xiv

CCaappííttuulloo 11

Capítulo 1. Introducción general

1. INTRODUCCIÓN GENERAL.

1.1. La agricultura sostenible y el control de plagas.

En los últimos 50 años la población mundial ha visto duplicado su número, sin embargo, la superficie destinada a cultivos agrícolas únicamente ha aumentado en un 10 %, por lo que el desarrollo de los productos fitosanitarios de síntesis ha sido clave para intensificar y asegurar las producciones agrícolas. No obstante, durante la segunda mitad del siglo pasado la facilidad con la que se podían adquirir y utilizar, favoreció su uso indiscriminado. Con el tiempo, comenzaron a observarse los primeros problemas de resistencias, aparición de nuevas plagas, y a lo largo de las últimas décadas del siglo XX empezaron a descubrirse algunos efectos nocivos de los insecticidas en el medioambiente, operarios agrícolas, y residuos en alimentos (Delgado, 2010; Zalom, 2010; Chandler et al., 2011; Köhler & Triebskorn, 2013). Por ello, en la actualidad las modernas tendencias productivas agrícolas de los países desarrollados tratan de encuadrar los sistemas productivos dentro de una agricultura sostenible, siendo un objetivo prioritario la obtención de productos agrícolas de calidad y saludables para el consumidor mediante el empleo de prácticas de cultivo que respeten el medio ambiente.

Dentro de este contexto, se han puesto en marcha numerosos sistemas productivos entre los que cobra cada vez más importancia en el mundo la Producción Integrada (PI). Sus principios han sido establecidos por la Organización Internacional para la Lucha Biológica e Integrada (OILB), y se define como “un sistema de explotación agraria que produce alimentos y otros productos de alta calidad, mediante el uso de recursos naturales y de mecanismos reguladores, para reemplazar los insumos contaminantes y asegurar una producción sostenible” (Boller et al., 2004). En España, la PI cuenta con una normativa regulada por el Real Decreto 1201/2002, de 20 de noviembre (BOE, 2002).

1 Capítulo 1. Introducción general

Dentro de la PI uno de los elementos esenciales es la protección de cultivos, donde el control de plagas se hace siempre desde la perspectiva de la Gestión Integrada de Plagas (GIP) (Viñuela, 2005). Este concepto se puede definir como “una racionalización en el manejo de las fitopatologías que puedan afectar a los cultivos, en la que se integran distintas herramientas, priorizando las medidas de prevención y anteponiendo los métodos físicos, biológicos y tecnológicos a los químicos” (Delgado, 2010).

Por ello a partir del 1 de enero del 2014 la aplicación de los principios generales de la GIP será obligatoria para todos los usuarios profesionales de la Unión Europea (UE), en base a lo dispuesto en la Directiva 2009/128/CE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 21 de Octubre de 2009 sobre “uso sostenible de los plaguicidas” (OJEU, 2009). Esta directiva ha sido transpuesta recientemente en España a través del Real Decreto 1311/2012, de 14 de septiembre, adaptándola al marco español (BOE, 2012). Los principios de la GIP contenidos en el Anexo III de la referida Directiva ponen especial énfasis en (OJEU, 2009):

-La prevención o eliminación de organismos nocivos mediante la rotación de cultivos, utilización de técnicas de cultivos adecuadas, variedades resistentes, equilibrio en el manejo del riego, abonado y adecuada limpieza de la maquinaria agrícola. -La vigilancia de organismos nocivos mediante métodos e instrumentos adecuados. -La aplicación de umbrales económicos antes de la realización de tratamientos fitosanitarios. -El uso de métodos sostenibles biológicos, físicos y otros no químicos se anteponen a los químicos siempre que permitan un control satisfactorio de las plagas. -La selectividad de plaguicidas, los cuales deben tener menores efectos secundarios tanto para la salud humana, como para aquellos organismos no diana y medio ambiente. -Los usuarios profesionales deberán limitar la utilización de plaguicidas. -El diseño de estrategias para evitar la aparición de resistencias. -La comprobación del éxito de las medidas fitosanitarias aplicadas.

2 Capítulo 1. Introducción general

1.2. Gestión Integrada de plagas (GIP) en cultivos hortícolas protegidos.

La aplicación de programas de GIP están cobrando cada vez más importancia a nivel Mundial. La GIP en invernaderos se originó en el norte de Europa básicamente como respuesta a los problemas derivados de resistencia a insecticidas de algunas plagas (como Trialeurodes vaporariorum (Westwood) (Hemiptera: Aleyrodidae) y Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae), y la dificultad consiguiente para su control (Gabarra et al., 2008). Fruto de su éxito, actualmente en los Países Bajos más del 90 % de los cultivos de tomate, pepino, pimiento y berenjena se producen mediante este sistema (Van Lenteren, 2009). En España, un primer paso para la introducción de programas de GIP en cultivos hortícolas protegidos del sureste español, se produjo con la incorporación a principio de los años 90 de Bombus terrestris (L.) (Hymenoptera: Apidae) en la polinización del cultivo del tomate, ya que muchos de los insecticidas utilizados no eran compatibles con los abejorros (Gabarra et al., 2008). No obstante, todavía habría que esperar varios años para el paso decisivo hacia métodos de control de plagas más respetuosos, que fue la detección de sustancias no autorizadas en pimiento (Beltrán et al., 2010). En la actualidad en la provincia de Almería, la principal zona de producción de cultivos hortícolas protegidos de España, y una de las más importantes a nivel mundial con una superficie cultivada de 37.695 ha (Junta de Andalucía, 2010), la GIP se ha desarrollado especialmente en cultivos como el pimiento, tomate, berenjena y cucurbitáceas, con el control biológico como pilar básico (Robledo et al., 2009; Van der Blom, 2007, 2008, 2010). Además de esta herramienta fundamental para el cambio de los sistemas productivos, se dispone de otras que integran el concepto de GIP en invernaderos hortícolas, como el monitoreo de plagas, la aplicación racional de insecticidas selectivos y diversos métodos de control, como el físico o cultural que se desarrollarán a continuación.

El monitoreo es la base sobre la cual se decide cualquier tipo de intervención en el cultivo, ya que proporciona información de la presencia, estadio de desarrollo y abundancia de la plaga en el mismo (Grant, 1997). Para ello se utilizan trampas cromotrópicas pegajosas que utilizan el color como atrayente de ciertas plagas, además de trampas de luz, alimenticias y feromonas (Medina et al., 2008). La inspección

3 Capítulo 1. Introducción general periódica del cultivo es también una herramienta importante en este apartado, ya que proporciona información puntual sobre su estado sanitario (Lapchin & Shtienberg, 1999). En cultivos hortícolas la fijación de muestreos no se puede generalizar, ni simplificar a un muestreo aleatorio de un determinado número de plantas, variando su forma de realización en función de la época del año y cultivo, siendo fundamental la colaboración del personal de la explotación (Delgado, 2010).

En cuanto al manejo de productos fitosanitarios, como se ha descrito anteriormente y en base a la Directiva Europea 2009/128/CE que promulga el uso sostenible de plaguicidas, su utilización no es preferente (OJEU, 2009). Sin embargo, entre las herramientas más utilizadas actualmente se encuentra el uso conjunto del control químico y biológico (Medina et al., 2008; Gentz, et al., 2010). Por ello en el marco de la GIP es esencial el estudio del efecto que los plaguicidas producen en los enemigos naturales, aspecto que se desarrollará en el capítulo 5 de esta tesis.

La piedra angular de cualquier programa de GIP es el control biológico (Zalom et al., 2010). Aunque existen numerosas y variadas definiciones del término, éste se puede definir como el uso de un ser vivo con el fin de reducir la densidad de otro, idealmente por debajo de un umbral económico de daños (Jacas & Urbaneja, 2008). Para llevar a cabo una aplicación eficiente es necesario un conocimiento de las plagas primarias y secundarias que aparecen en el cultivo, así como conocer los enemigos naturales y entomopatógenos asociados a las distintas plagas con el fin de conservar la fauna útil que de manera espontánea lo coloniza (Gabarra, 2005). En el control biológico principalmente se usan enemigos naturales (insectos depredadores y parasitoides), aunque también se pueden utilizar microorganismos entomopatógenos (virus, bacterias, hongos, nematodos) (Grant, 1997; Viñuela, 2005; Urbaneja & Jacas, 2008). En cultivos protegidos el control biológico es principalmente inoculativo estacional o aumentativo, es decir, los agentes de biocontrol se introducen periódicamente una o más veces al año con la finalidad de que se multipliquen en los cultivos pero sin establecerse de forma permanente (Urbaneja & Jacas, 2008). Las principales plagas encontradas en cultivos hortícolas protegidos, así como los enemigos naturales empleados para su control en España se detallan en la tabla 1 a,b:

4 Capítulo 1. Introducción general

Tabla 1a. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados para su control en España.

Cultivos Especies plaga Enemigos naturales utilizados Parasitoides Depredadores Otros Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum Eretmocerus mundus Amblyseius swirskii Orius laevigatus Frankliniella occidentalis Amblyseius swirskii Orius laevigatus Pimiento Spodoptera exigua, Helicoverpa armigera Bacillus thuringiensis Virus de la poliedrosis nuclear Aphis gossypii, Myzus persicae Aphidius colemani Macrosiphum euphorbiae, Aulacorthum solani Aphidius ervi Cocinélidos y Crisopas Tetranychus urticae, Poliphagotarsonemus latus Phytoseiulus persimilis Amblyseius swirskii Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum Eretmocerus mundus Nesidiocoris tenuis Encarsia formosa Macrolophus pygmaeus Frankliniella occidentalis Nesidiocoris tenuis Macrolophus pygmaeus Tomate Tuta absoluta Trichogramma achaeae Nesidiocoris tenuis Bacillus thuringiensis Liriomyza spp. Diglyphus isaea Macrosiphum euphorbiae Aphidius ervi Cocinélidos y Crisopas Tetranychus urticae, Aculops lycopersici Phytoseiulus persimilis Bemisia tabaci, Trialeurodes vaporariorum Eretmocerus mundus Amblyseius swirskii Nesidiocoris tenuis Frankliniella occidentalis Amblyseius swirskii Orius laevigatus Tuta absoluta Nesidiocoris tenuis Bacillus thuringiensis Berenjena Aphis gossypii Aphidius colemani Tetranychus urticae, Poliphagotarsonemus latus Phytoseiulus persimilis Amblyseius swirskii Liriomyza spp. Diglyphus isaea

5 Capítulo 1. Introducción general

Tabla 1b. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados para su control en España.

6 Capítulo 1. Introducción general

Con respecto a los métodos físicos de control, el más común es el uso de barreras físicas habiendo numerosos tipos (Weintraub, 2009), un primer tipo de barreras son las mallas anti-insectos que actúan como un simple método de exclusión (Díaz et al., 2004), siendo su uso imprescindible en los cultivos hortícolas protegidos de Almería. Además de este tipo de mallas, también existen modernos plásticos y mallas fotoselectivas que bloquean la transmisión de luz ultravioleta (UV) alterando la visión y orientación del insecto (Antignus et al., 1996). Varios estudios muestran la efectividad de estas barreras controlando tanto las poblaciones de la plaga (moscas blancas, pulgones y trips), como los virus que éstas transmiten debido a la imposibilidad de volar y dispersarse en un ambiente pobre en luz UV (Costa & Robb, 1999; Antignus et al., 2001; Chyzik et al., 2003; Fereres et al., 2003; Summers et al., 2004; Doukas & Payne, 2007a; Legarrea et al., 2010). Sin embargo, a pesar de que existen estudios que afirman que el uso de barreras físicas es compatible con el control biológico (Chyzik et al., 2003; Doukas & Payne, 2007b; Sal et al., 2009) éstas pueden tener un efecto negativo, ya que pueden también interferir en la orientación de algunas especies de enemigos naturales disminuyendo su capacidad de depredación y parasitación (Chiel et al., 2006). Más recientemente, se viene trabajando en la utilización de mallas tratadas con insecticidas, que se han empleado con éxito en entomología médica (Hougard et al., 2002), y cuyo aplicación en el ámbito agrícola será abordada en el capítulo 4 de esta tesis.

Finalmente, para el control de plagas en cultivos de invernadero es necesario aplicar todos los métodos culturales disponibles que nos permitan evitar la proliferación de insectos plaga y los virus que éstos son capaces de transmitir. Además de ser necesaria una profunda revisión de todo el sistema de cultivo, incluyendo la estructura del invernadero, y el manejo del cultivo para facilitar la actuación y la reproducción de la fauna auxiliar. Entre las medidas más importantes destacan: la realización de una buena gestión del clima y la ventilación, limpieza de los invernaderos de plantas y restos vegetales antes del inicio del cultivo, la eliminación de malas hierbas que puedan hospedar insectos plagas o ser reservorio de virus, hacer una buena gestión del abonado, destruir brotes, hojas viejas y frutos dañados, el empleo de plantas refugio como sistemas de cría de enemigos naturales dentro del propio cultivo, y mantener una floración en la medida de lo posible constante en el cultivo a través de prácticas

7 Capítulo 1. Introducción general agronómicas o mediante la adición de fuentes florales que sirvan como método de control biológico por conservación (Van der Blom, 2002; Gabarra, 2005; Pineda & Marcos-García, 2008; Frank, 2010).

1.3. Enemigos naturales.

1.3.1. Orius laevigatus.

1.3.1.1. Sistemática.

La sistemática de Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) que se cita a continuación está basada en la clasificación de Fauna Europaea (2013a).

REINO: Animalia. SUBREINO: Eumetazoa. PHYLLUM: Arthropoda. SUBPHYLLUM: Hexapoda. CLASE: Insecta. ORDEN: Hemiptera. SUBORDEN: Heteroptera. INFRAORDEN: Cimicomorpha. SUPERFAMILIA: Cimicoidea. FAMILIA: Anthocoridae. SUBFAMILIA: Anthocorinae. TRIBU: Orinii. GÉNERO: Orius Wolff, 1811. SUBGÉNERO: Orius Wolff, 1811. ESPECIE: laevigatus (Fieber, 1860).

8 Capítulo 1. Introducción general

1.3.1.2. Distribución geográfica y hábitat.

En Europa el área de distribución de O. laevigatus abarca toda la cuenca mediterránea, extendiéndose a las islas de la Macaronesia, la fachada atlántica de Francia y las islas Británicas (Figura 1) (Ferragut & González, 1994). En España está ampliamente repartido, siendo una de las especies más frecuentes y abundantes. Se asocia a gran cantidad de especies botánicas donde puede localizar sus presas y realizar su puesta o alimentarse de polen (Lacasa & Llorens, 1998b). En el estudio de distribución de las especies de Orius peninsulares llevado a cabo por Ferragut y González (1994) en las Comunidades Autónomas de Valencia, Murcia, Andalucía y Extremadura, el 47 % de los ejemplares encontrados fueron O. laevigatus, siendo una especie muy frecuente en zonas cultivadas o limítrofes a éstas, encontrándose tanto en cultivos protegidos, como al aire libre y en vegetación espontánea.

Figura 1. Distribución geográfica de O. laevigatus en Europa.

Presente

Ausente

Fuente, Fauna Europaea (2013b).

9 Capítulo 1. Introducción general

1.3.1.3. Descripción y biología del insecto.

Los antocóridos son insectos hemimetábolos. Su ciclo biológico comprende tres estados, huevo, ninfa y adulto (Figura 2).

Figura 2. Ciclo biológico de O. laevigatus [Fuente, Bonte, (2010)].

Los huevos poseen 0,4 mm de longitud y 0,13 mm de ancho, al principio son incoloros y previamente a la eclosión de la ninfa se tornan de un color blanco lechoso. Los huevos son introducidos en el tejido de la hoja, a menudo en la zona del peciolo o sobre la vena principal del envés de ésta, y algunas veces en partes de la flor o inflorescencias (Figura 3) (Malais & Ravensberg, 2006).

Figura 3. Huevos y ninfa a punto de eclosionar de O. laevigatus.

Las ninfas pasan por cinco estadios ninfales, cuando emergen de sus huevos son brillantes y casi sin color, pero en pocas horas se vuelven amarillentas, su longitud varía entre 0,7 mm recién emergidas, y 2,1 mm las ninfas más desarrolladas (Lacasa & Llorens, 1998b). Los ojos son rojos, conspicuos y fácilmente visibles en todos los estadios. En el segundo estadio empiezan a desarrollarse los esbozos alares, pero sólo se hacen claramente visibles en el quinto estadio ninfal (Malais & Ravensberg, 2006).

10 Capítulo 1. Introducción general

El adulto de O. laevigatus (Figura 4) se encuentra frecuentemente en las flores, tiene un tamaño entre 1,4 y 2,4 mm, su coloración es variable, siendo más común encontrarlos de color marrón oscuro, aunque también pueden mostrar tonos más claros e incluso negros. El color de las antenas también es variable, presentando una coloración más oscura en el primer segmento y rojiza en la extremidad del último. La cabeza es prominente entre los ojos y posee largas sedas con el extremo romo, al igual que las dos largas sedas en los ángulos del protórax. Las patas de este depredador son amarillas, pudiendo presentar el tercer par más oscuro que los anteriores. En la parte membranosa de los hemiélitros es donde presenta la característica principal de esta especie, siendo la mitad basal de la membrana transparente y la mitad apical oscura, con una separación rectilínea entre ambas (Figura 5) (Ferragut & González, 1994; Lacasa & Llorens, 1998b).

Figura 4. Adulto de O. laevigatus. Figura 5 . Hemiélitros de O. laevigatus [Fuente, Dongbu Farm Ceres, (2013)]. con la base de la membrana incolora y el extremo oscuro [Fuente, Ferragut & González, (1994)].

El abdomen está formado por 9 segmentos y presenta un notable dimorfismo sexual que permite distinguir machos de hembras sin dificultad bajo lupa binocular (Figuras 6-7). En las hembras es simétrico y termina en un ovipositor ligeramente curvado y de bordes aserrados, que se emplea para cortar los tejidos vegetales e insertar en ellos los huevos. En los machos es asimétrico, estando desplazado hacia el lado izquierdo debido a una torsión que hace que la parte ventral de los segmentos pase a ser dorsal, y quedando en posición dorsal las piezas que constituyen la genitalia masculina (Ferragut & González, 1994).

11 Capítulo 1. Introducción general

Figura 6. Macho (izquierda) y hembra (derecha) Figura 7. Esquema del abdomen del macho de O. laevigatus. (izquierda) y de la hembra (derecha) de Orius sp. [Fuente, Bonte, (2010)].

El ciclo biológico de O. laevigatus se ve afectado por diversos factores bióticos y abióticos, tales como la temperatura, tipo de alimentación y en menor medida por la planta huésped, humedad relativa o fotoperiodo (Tomassini & Nicoli, 1995; Malais & Ravensberg, 2006). El efecto de la temperatura y tipo de dieta en los parámetros de desarrollo de O. laevigatus son resumidos en la siguiente tabla:

Tabla 2. Tiempo de desarrollo y supervivencia de O. laevigatus bajo diferentes temperaturas y tipos de alimentación.

Tiempo de Temperatura desarrollo Supervivencia

(ºC) Tipo de alimentación ninfas N1-N5 ninfas N1-N5 (días) (%) 151 Ephestia kuehniella 43 ------201 Ephestia kuehniella 20,4 ------251 Ephestia kuehniella 13,2 ------301 Ephestia kuehniella 9,3 ------262 Ephestia kuehniella 16,3 78,1 262 Frankliniella occidentalis 15,1 46,4 253 Ephestia kuehniella 14,5 85 Ephestia kuehniella y polen de 253 pimiento 14,6 90 253 Polen de pimiento 17,7 65 Fuente, 1Alauzet et al., (1994); 2Tomassini & Nicoli (1994); 3Vacante et al., (1997).

12 Capítulo 1. Introducción general

Según Alauzet y colaboradores (1994) el tiempo medio de incubación del huevo se ve incrementado hasta casi 4 veces en función de la temperatura. A 15 ºC el tiempo medio se sitúa en 11,7 días, mientras que a 30 ºC es de 3,3 días, valores muy similares a los descritos por Cocuzza y colaboradores (1997a). Sin embargo, el porcentaje de huevos eclosados no se ve tan influenciado, situándose por encima del 73 % en un rango de temperaturas comprendido entre 15-30 ºC (Alauzet et al., 1994). Por otro lado, el tiempo de desarrollo ninfal (N1-N5) también es dependiente de la temperatura, reduciéndose de 43 a 10 días cuando la temperatura se incrementa de 15 ºC a 30 ºC (Cocuzza et al., 1997a).

El tipo de dieta también afecta al desarrollo idóneo de O. laevigatus. En el estudio llevado a cabo por Tomassini y Nicoli (1994) la supervivencia de ninfas alimentadas con Ephestia kuehniella Zeller (Lepidoptera: Pyralidae) fue aproximadamente un 30 % mayor que cuando se alimentan de Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae), sin embargo, el tiempo de desarrollo no se vio afectado. Por otro lado Vacante y colaboradores (1997) describieron que la adición de polen a huevos de E. kuehniella no afectó ni a la supervivencia de las ninfas, ni a su desarrollo. No obstante, el uso únicamente de polen de pimiento redujo la supervivencia de las ninfas e incrementó su tiempo de desarrollo.

Respecto a los hábitos alimenticios, tanto las ninfas como los adultos de O. laevigatus son conocidos por ser depredadores polífagos que pueden alimentarse de un amplio rango de presas: trips, moscas blancas, pulgones, huevos y pequeñas larvas de lepidópteros, ácaros o incluso miembros de su propia especie. Además, pueden alimentarse también de polen lo cual es una gran ventaja para su mantenimiento en el cultivo en periodos de ausencia de presa (Alvarado et al., 1997; Lacasa & Llorens, 1998b; Urbaneja et al., 2005a; Arnó et al., 2008). En cuanto a su comportamiento de búsqueda y dispersión en el cultivo, el género Orius detecta a la presa principalmente mediante el sentido del olfato o del tacto y no con la vista, siendo su área de búsqueda las antenas. Son buenos voladores y se desplazan con rapidez (Malais & Ravensberg, 2006).

13 Capítulo 1. Introducción general

En cuanto a su comportamiento reproductivo, los adultos de O. laevigatus se aparean desde el primer día de emergencia (Tawfik & Ata, 1973). Las hembras tras su primera cópula evitan sucesivas, ya que almacenan el esperma y lo usan a lo largo de su periodo de oviposición. Por otro lado, los machos son polígamos, pudiendo inseminar con éxito hasta tres hembras por día (Leon-Beck et al., 2009). El parámero izquierdo de los machos está modificado en un órgano que sirve para penetrar la pared del cuerpo de la hembra durante la cópula. El macho penetra a la hembra entre el séptimo y el octavo segmento abdominal, e inyecta el esperma dentro del tubo de copulación. El esperma es recogido en el saco espermático, que es un compartimento anterior a la pared vaginal al final del tubo de copulación (Schuh & Slater, 1995).

La temperatura también posee una significativa influencia en la capacidad reproductiva de O. laevigatus. Según el estudio llevado a cabo por Alauzet y colaboradores (1994), alrededor del 80 % de las hembras empiezan a ovipositar a temperaturas comprendidas entre 20-30 ºC, mientras que a 15 ºC el 50 % mueren sin hacerlo. Además, a 30 ºC el número total de huevos ovipositados es dos veces mayor, y el periodo de preoviposición 9 veces menor que a 15 ºC. Sin embargo, la longevidad de las hembras se reduce de 70 a 20 días.

Por otro lado el tipo de alimentación también puede influenciar en la fecundidad de O. laevigatus. Tomassini y Nicoli (1995) describieron una menor fecundidad en hembras alimentadas con F. occidentalis (56 huevos/hembra) que en aquellas que fueron alimentadas con E. kuehniella (119 huevos/hembra). Además de la temperatura y dieta, el tipo de planta en el que realicen la puesta también puede afectar al potencial reproductivo de Orius spp. (Richards & Schmidt, 1996; Lundgren & Fergen, 2006).

1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos hortícolas protegidos.

La especie O. laevigatus se utiliza con éxito en el control biológico de trips en diversos cultivos hortícolas y ornamentales protegidos (Urbaneja, et al., 2005a). Destacando su utilización en pimiento al ser el principal depredador de F. occidentalis y Thrips tabaci Lindeman (Thysanoptera: Thripidae), los cuales ocasionan en el cultivo daños directos a hojas y frutos que deprecian su valor comercial, y transmiten el tospovirus Tomato spotted wilt virus (TSWV) (Arnó et al., 2006; Bosco et al., 2008; Van der Blom, 2010).

14 Capítulo 1. Introducción general

En España, los primeros éxitos a gran escala se produjeron en el Campo de Cartagena, donde se aplicó satisfactoriamente en el cultivo de pimiento desde el año 2000. En Almería no se produjo una introducción masiva hasta el final de la campaña del 2006- 2007, debido principalmente a los distintos ciclos de cultivo, la masiva concentración de invernaderos y al solape de diferentes cultivos con distintos ciclos (Van der Blom, 2007, 2008, 2010).

Para la aplicación de O. laevigatus en programas de GIP se debe tener en cuenta:

-Las condiciones ambientales del invernadero: al menos durante los primeros meses tras su introducción la humedad relativa debe ser superior al 60 % para favorecer el desarrollo de las ninfas (Robledo et al., 2009).

-El cultivo: O. laevigatus se introduce en una amplia gama de cultivos, pero siempre teniendo en cuenta que éstos sean buenos productores de polen (pimiento, gerbera, fresa, berenjena). En el caso particular del tomate no se establece de manera adecuada debido a sus pelos glandulares (Malais & Ravensger, 2006; Robledo et al., 2009; Biobest, 2013a).

-Los enemigos naturales: el uso de O. laevigatus es compatible con la utilización de otros agentes de biocontrol, como Amblyseius swirskii Athias-Henriot (Acari: Phytoseiidae) en pimiento (Van der Blom, 2008, 2010).

-La aplicación: se hace en pequeños montones en la superficie de la hoja del cultivo o mediante el uso de cajas de aplicación, siendo el material extendido en capas finas de 1- 2 cm. Los insectos se reparten de manera homogénea por todo el cultivo, reforzando aquellas zonas propensas a la entrada de trips. Además la suelta se realizará a la sombra y en plantas con flores. Las introducciones de O. laevigatus en pimiento se realizan unas 4 semanas después del trasplante, repartiéndose su aplicación en 2 o 3 semanas (Robledo et al., 2009). En cuanto a dosis de suelta, si se desea realizar un tratamiento preventivo será de 1-2 individuos/m2. Si es curativo, se introduciría en las áreas afectadas a una dosis de 5-10 individuos/m2 (Biobest, 2013a).

15 Capítulo 1. Introducción general

1.3.2. Nesidiocoris tenuis.

1.3.2.1. Sistemática.

La sistemática de Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae) que se cita a continuación está basada en la clasificación de Fauna Europaea (2013c)

REINO: Animalia. SUBREINO: Eumetazoa. PHYLLUM: Arthropoda. SUBPHYLLUM: Hexapoda. CLASE: Insecta. ORDEN: Hemiptera. SUBORDEN: Heteroptera. INFRAORDEN: Cimicomorpha. SUPERFAMILIA: Miroidea. FAMILIA: Miridae. SUBFAMILIA: Bryocorinae. TRIBU: Dicyphini. GÉNERO: Nesidiocoris Kirkaldy, 1902. ESPECIE: tenuis (Reuter, 1895).

1.3.2.2. Distribución geográfica y hábitat.

En Europa N. tenuis se encuentra principalmente en la cuenca Mediterránea y franja atlántica de Francia (Figura 8). En España aparece con mayor frecuencia y abundancia en cultivos hortícolas protegidos de la zona del litoral Mediterráneo e Islas Canarias, encontrándose principalmente sobre solanáceas (Goula & Alomar, 1994; Calvo & Urbaneja, 2004; Téllez & Tapia, 2006; Sánchez et al., 2009a; Castañé et al., 2011).

16 Capítulo 1. Introducción general

Figura 8. Distribución geográfica de N. tenuis en Europa.

Presente

Ausente

Fuente, Fauna Europaea (2013d).

1.3.2.3. Descripción y biología del insecto.

Los míridos son insectos hemimetábolos. Su ciclo biológico comprende tres estados, huevo, ninfa y adulto (Figura 9).

Figura 9. Ciclo biológico de N. tenuis [Fuente, Calvo & Urbaneja, (2003)].

17 Capítulo 1. Introducción general

Los huevos son depositados por las hembras en el interior de la epidermis del tejido vegetal, de forma que sólo es visible la lígula (apéndice respiratorio) (Franco, 2010).

Las ninfas pasan por cinco estadios ninfales (Figura 9), diferenciándose unos de otros por su tamaño, el cual se incrementa con el desarrollo y por la aparición de esbozos alares en los dos últimos estadios (Figura 10) (Calvo & Urbaneja, 2004).

Figura 10. Ninfas de N. tenuis, estadio N1 (izquierda) y N5 (derecha).

En el último estadio ninfal ya se puede diferenciar el sexo del individuo, presentando la genitalia de la hembra una T invertida y la del macho un punto negro (Figura 11) (Téllez & Tapia, 2006).

♀ ♂

Figura 11. Detalle de la hembra y macho de N. tenuis, [Fuente, Téllez & Tapia, (2006)].

Dentro de las especies ibéricas del género, el adulto de N. tenuis se distingue por las manchas o bandas negras que destacan sobre la coloración verde claro de fondo, siendo el tamaño de esta especie inferior a 4 mm (Figura 12). En la cabeza son negros el tilo, los ojos y una banda en el borde posterior típica de la especie. En las antenas existen bandas negras en los distintos artejos, lo que les confiere un aspecto anillado. Los hemiélitros son grisáceos, translúcidos y con una pilosidad fina y oscura. La base y la punta de las tibias, así como los tarsos, están oscurecidos (Goula & Alomar, 1994).

18 Capítulo 1. Introducción general

Figura 12. Adulto de N. tenuis.

La duración del ciclo biológico y supervivencia de N. tenuis está muy influenciada por el tipo de presa (Tabla 3a), planta huésped (Tabla 3b) y condiciones ambientales (Tabla 4).

Tabla 3. Parámetros biológicos de N. tenuis (25 ºC, 75 % HR) en función del a. Efecto del tipo de presa en tomate y b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella.

a. Efecto del tipo de presa en tomate.

Duración Supervivencia Longevidad adultos Presa desarrollo ninfal (%) (Días) Huevos/día/hembra (Días) Bemisia tabaci 13,2 60,5 24,1 2,5 Trips 20,6 59 ------Araña roja 23,4 45 ------Huevos Ephestia kuehniella 12,9 73,7 22,6 4,6

Sin presa 0 0 14,9 1

b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella.

Duración Supervivencia Longevidad adultos Cultivo desarrollo ninfal (%) (Días) Huevos/día/hembra (Días)

Pimiento 14 64,3 23 1,7 Tomate 12,8 72,7 22,6 4,6 Berenjena 12,6 73,7 16,3 2,3 (Fuente, Urbaneja et al. 2003, 2005b).

19 Capítulo 1. Introducción general

Cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella o Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae), la duración del ciclo es inferior y la supervivencia mayor que cuando la presa es trips o araña roja. Cuando se desarrolla sobre tomate o berenjena también su ciclo es más rápido que cuando lo hace sobre pimiento. Estos resultados ponen de manifiesto la versatilidad de N. tenuis como enemigo natural, sin embargo, muestra una cierta preferencia por B. tabaci y huevos de E. kuehniella, así como por plantas con pilosidad como el tomate y la berenjena (Calvo & Urbaneja, 2004). Otro factor importante en la biología de N. tenuis es su incapacidad de alcanzar el estado adulto en ausencia de presa (Urbaneja et al., 2005b).

Tabla 4. Parámetros biológicos de N. tenuis a diferentes rangos de temperatura cuando es alimentado con huevos de E. kuehniella sobre planta de tomate.

Tiempo eclosión Duración Mortalidad Número de Temperatura huevos desarrollo ninfal ninfas Proporción de ninfas/hembra (ºC) (Días) (Días) (%) hembras durante 21 días

15 30,8 ± 0,2 a 55,9 ± 0,3 a 37,2 46,3 0,80 ± 0,2 c 20 17 ± 0,2 b 21,2 ± 0,4 b 18,3 39,6 79,5 ± 5,5 a 25 8,9 ± 0,1 c 12,9 ± 0,3 c 6,5 52,6 60,0 ± 5,0 b 30 7,5 ± 0,05 d 9,7 ± 0,3 d 13,3 60,8 68,0 ± 5,0 ab 35 6,3 ± 0,02 e 8,6 ± 0,5 e 48,3 64,5 62,4 ± 10,4 ab (Fuente, Sánchez et al., 2009a).

Los resultados descritos por Sánchez y colaboradores (2009a) explican el patrón de distribución geográfica de N. tenuis, ya que el rango óptimo de temperatura para su desarrollo se sitúa entre los 20-30 ºC.

Respecto a los hábitos alimenticios, tanto las ninfas como los adultos son conocidos por ser depredadores polífagos, pudiendo alimentarse de moscas blancas, trips, pulgones, minadores, ácaros y lepidópteros (Urbaneja et al., 2005b). Ambos estados se desplazan con rapidez sobre la superficie de la hoja, lo cual les confiere una gran capacidad de búsqueda de presas. Tras su detección, clavan su estilete para posteriormente succionar sus jugos internos (Calvo & Urbaneja, 2004). Además N. tenuis posee alimentación mixta, fitófaga y zoófaga (Arnó et al., 2006; Sánchez et al.,

20 Capítulo 1. Introducción general

2006), la cual hace que en ausencia de presa pueda ocasionar daños en el cultivo. En tomate puede producir punteaduras en frutos, abortos florales y formación de anillos necróticos sobre tallos y hojas (Sánchez et al., 2008; Calvo et al., 2009; Castañé et al., 2011). Sin embargo, según Sánchez (2009b) no es esperable una reducción en el rendimiento del cultivo de tomate para valores inferiores a 0,65 N. tenuis por hoja independientemente de la población de mosca blanca, o hasta 5 N. tenuis por hoja cuando el número de moscas blancas sea superior a 26 por hoja.

En cuanto a su comportamiento reproductivo, no ha sido ampliamente estudiado. Según El-Desouki y colaboradores (1976), el periodo de apareamiento suele ser tanto diurno como nocturno, la hembra acepta fácilmente al macho para la cópula, la cual es larga (superior a dos horas), y una vez finalizada, tanto machos como hembras son capaces de acoplarse varias veces. El cortejo en míridos puede ser relativamente elaborado según especies, sin embargo, la posición de la cópula es similar debido a la configuración asimétrica de los machos. Éstos tienen el parámero izquierdo más largo, por lo que la cópula se realiza por el lado derecho de la hembra y una vez la pareja está acoplada el macho gira 180 º (Franco, 2010) (Figura 13).

Figura 13. Posición de cópula en N. tenuis, [Fuente, Téllez & Tapia, (2006)].

1.3.1.4. Importancia en la GIP de cultivos hortícolas protegidos.

N. tenuis es un depredador principalmente usado en cultivo de tomate y berenjena para el control de B. tabaci, y en menor medida de T. vaporariorum, pudiendo depredar otras plagas como F. occidentalis, T. urticae, y huevos de lepidóptero (Gabarra et al., 2008; Robledo et al., 2009). Actualmente su valor como agente de biocontrol viene dado por los buenos resultados obtenidos en el control de Tuta absoluta (Meirick) (Lepidoptera: Gelechiidae) en cultivo de tomate (Urbaneja et al., 2009; Mollá et al., 2011).

21 Capítulo 1. Introducción general

Para la aplicación de N. tenuis en programas de GIP se debe tener en cuenta:

-Las condiciones ambientales del invernadero: las temperaturas deben ser altas (>20 ºC) para su correcto establecimiento. Los meses de primavera y verano son los más adecuados para su introducción en el cultivo de tomate, ya que durante el invierno el desarrollo de sus poblaciones se hace más lento, no observándose una población elevada en el cultivo (Van der Blom, 2005; Robledo et al., 2009).

-La existencia de presa en planta: no sólo por prevenir posibles daños en el cultivo a causa de su carácter fitófago (Sánchez et al., 2008; Calvo et al., 2009; Castañé et al., 2011), sino porque como se ha visto anteriormente, la supervivencia de N. tenuis en el cultivo se ve condicionada por la presencia de presa (Urbaneja et al., 2005b).

-El cultivo y el ciclo del mismo: existen estudios que muestran que la planta de tomate es una buena hospedadora para N. tenuis (Urbaneja et al. 2005b), pero sobre plantas de pimiento muestra cierta dificultad a la hora de alcanzar niveles poblacionales adecuados (Calvo & Belda, 2006). Además, N. tenuis posee un ciclo biológico lento, por lo que sólo sería recomendable su uso en aquellos cultivos protegidos que posean un ciclo de cultivo largo, más de 3 meses, como tomate, o berenjena, y no sería recomendable en pepino, calabacín, judía, melón y sandía (Van der Blom, 2007).

-Los enemigos naturales: el uso de N. tenuis es compatible con la utilización de otros agentes de biocontrol, como los parasitoides Eretmocerus mundus Mercet (Hymenoptera: Aphelinidae) y Encarsia formosa Gahan (Hymenoptera: Aphelinidae) (Robledo et al., 2009).

-La aplicación: la suelta se realiza distribuyendo el producto sobre las hojas del cultivo o en cajas de cartón que se cuelgan de los tallos. Las introducciones se harán al principio en focos, aumentando la posibilidad de encuentro entre sexos, para luego realizarlas de manera más general por todo el cultivo (Biobest, 2013b). La dosis de suelta recomendada es de 1-2 individuos/m2 a las 2-4 semanas tras la realización del trasplante (Calvo et al., 2009). Con baja disponibilidad de presa, la reproducción y la instalación de N. tenuis se ralentiza, esto suele ocurrir en tomate, donde se suele empezar con bajas poblaciones de mosca blanca debido a las medidas preventivas que

22 Capítulo 1. Introducción general se toman para la entrada de adultos (malla 10 X 20 hilos/cm2), o a prácticas culturales (deshojados y podas). En estos casos se aconseja alimentar a N. tenuis utilizando huevos de E. kuehniella (Robledo et al., 2009), o sucrosa (Urbaneja-Bernat et al., 2013). Actualmente y con unos resultados prometedores, se está poniendo en práctica una nueva estrategia para el control de mosca blanca y T. absoluta en tomate, que es la inoculación de N. tenuis en plántulas que posteriormente serán usadas en el trasplante, con el fin de que se establezca en el cultivo desde el inicio del mismo, reduciendo así el uso de productos fitosanitarios (Calvo & Belda, 2010; Calvo et al., 2012a,b).

CCaappííttuulloo 22

2. Objetivos

2. OBJETIVOS.

La nueva legislación en materia fitosanitaria se dirige hacia una Gestión Integrada de Plagas (GIP). Estos programas dan preferencia a aquellos métodos más respetuosos y sostenibles con el medio ambiente, siendo piezas claves en ellos el control biológico, físico y otros de carácter no químico. Sin embargo, el uso de insecticidas selectivos en cultivos hortícolas es a veces un complemento necesario para el adecuado manejo de plagas. Por ello, el objetivo general de esta tesis es aportar conocimientos para mejorar el control de plagas en cultivos hortícolas mediante la integración de tres estrategias de lucha: biológica, física y química. Para su consecución los objetivos particulares tratados en el estudio son los siguientes:

-Estudiar la compatibilidad de nuevas barreras físicas (mallas tratadas con bifentrin) con enemigos naturales utilizados en cultivos hortícolas protegidos (Capítulo 4).

-Estudiar la toxicidad de modernos insecticidas (abamectina, deltametrina, emamectina, flubendiamida, spinosad y spiromesifen) empleados en cultivos hortícolas protegidos sobre los agentes de biocontrol O. laevigatus y N. tenuis (Capítulo 5).

-Estudiar la compatibilidad de insecticidas aceleradores de la muda (RH-5859, tebufenocida y metoxifenocida) con los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis, así como su modo de acción mediante estudios de modelado por homología y de acoplamiento molecular (“docking”) (Capítulo 6).

CCaappííttuulloo 33

Capítulo 3. Materiales y métodos generales

3. MATERIALES Y MÉTODOS GENERALES.

3.1. Lugar de estudio y condiciones ambientales.

3.1.1. Laboratorio.

Los ensayos de laboratorio correspondientes a mallas tratadas con bifentrin (Capítulo 4, puntos 4.2.2. y 4.3.1.) y toxicidad de insecticidas (Capítulo 5 y 6, puntos 6.3.2. y 6.4.1.), se realizaron en las instalaciones que la Unidad de Protección de Cultivos posee en la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos (E.T.S.I.A.) de Madrid.

Las condiciones ambientales del insectario (4,25 m de largo, 2 m de ancho y 2,5 m de alto) en la que se llevaron a cabo los ensayos fueron las siguientes:

• Temperatura: 25 ± 5º C. • Humedad relativa del aire (HR): 50 ± 5 %. • Fotoperiodo: 16 horas luz: 8 horas oscuridad (16L: 8 O).

Para permitir la renovación del aire y evitar variaciones bruscas de la temperatura, la cámara incluía un equipo de ventilación y calefacción (Interclisa®, modelo CUCV026M3-CXE026M3), regulado por un termostato (Sunvic®).

Mediante un higrostato conectado a un humificador se reguló el porcentaje de humedad (Defensor®, modelo 505), controlada por un termohigrómetro digital con memoria de niveles máximos y mínimos.

La iluminación dentro de la cámara fue proporcionada por dos tubos fluorescentes (Gro- Lux®) en cada estante. En cuanto al fotoperiodo, un reloj conmutador (Orbis®) controló el encendido y apagado de las lámparas.

25 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

3.1.2. Invernadero.

El invernadero que la Unidad de Protección de Cultivos posee en los Campos de Prácticas de la E.T.S.I.A. (Madrid), consta de una estructura de cristal, con un sistema de refrigeración, calefacción, iluminación y riego por goteo (Figuras 14-15). En él se realizaron parte de los ensayos de toxicidad de mallas tratadas con bifentrin (capítulo 4, puntos 4.2.3. y 4.3.2.), y se mantuvieron las plantas tratadas con insecticidas empleadas en los estudios de persistencia (capítulo 5, puntos 5.2.5. y 5.3.2.).

Figura 14. Vista general del invernadero. Figura 15. Interior del invernadero.

Las condiciones ambientales de temperatura y humedad relativa se registraron mediante un medidor (Tinytag Ultra 2®, Gemini Data Loggers, Chichester, Reino Unido), (Figura 16). Además, en los ensayos de persistencia también se realizaron mediciones puntuales de la radiación ultravioleta (UV) y fotosintéticamente activa (PAR), las cuales se tomaron diariamente a las 12 horas, realizando 6 medidas tanto en el interior como en el exterior del invernadero. Los radiómetros empleados en la medición de la radiación UV y PAR fueron (Ultra-Violet Meter®, modelo MU-200, y Quantum-Meter®, modelo BQM, Apogee Instruments, Logan, Estados Unidos), respectivamente (Figura 17-18).

26 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

Figura 16. Medidor de temperatura y Figura 17. Medidor de radiación ultravioleta (UV). humedad relativa.

Figura 18. Medidor de radiación fotosintéticamente activa (PAR).

3.1.3. Campo (túneles semi-comerciales).

Los ensayos de campo en túneles semi-comerciales con mallas tratadas con bifentrin (Capítulo 4, punto 4.2.4. y 4.3.3.) se realizaron a 22 km de Madrid en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid), perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

Los parámetros de temperatura, humedad relativa, radiación UV y PAR se registraron del mismo modo al descrito anteriormente para los ensayos llevados a cabo en invernadero. El estadio fenológico de las plantas se determinó según Meier (1997), en 6 plantas elegidas al azar en cada una de las unidades experimentales. Finalmente, los valores de pluviometría se obtuvieron de la estación metereológica situada en el barrio de La Poveda (Arganda del Rey, Madrid) (Meteoclimatic, 2013).

27 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

3.2. Material biológico y su manejo.

3.2.1. Cría de Orius laevigatus.

Los adultos y ninfas evaluados en los ensayos fueron suministrados por Agrobío (ORIcontrol®, La Mojonera, España) y Distiagro (Oriline®, Sagunto, España), respectivamente. Para asegurar su calidad, el día de su recepción se separaban en lotes de 30 insectos confinándolos en cajas de plástico redondas (5 cm de altura y 12 cm de diámetro, con una rejilla de ventilación de 3 cm de diámetro), a las que se les añadía una judía verde como fuente de líquido, y como dieta 0,4 gr de huevos de E. kuehniella (Entofood®, Koppert, La Mojonera, España). Las cajas se mantenían en el laboratorio durante 24 h bajo las condiciones ambientales descritas anteriormente. Transcurrido este periodo se evaluaba el estado de cada lote, seleccionándose únicamente para la realización de los ensayos aquellos lotes cuya mortalidad media era inferior al 10 %.

3.2.2. Cría de Nesidiocoris tenuis.

La metodología empleada en la cría de N. tenuis que se describe a continuación se desarrolló íntegramente en nuestro laboratorio en 2011, a partir de 500 adultos procedentes de la empresa Agrobío (NESIDIOcontrol®, La Mojonera, España).

Los adultos se colocan en cajas de metacrilato (40 X 30 X 30 cm), con una tapa cubierta con visillo en la parte superior para facilitar la ventilación. En ambos laterales, y con el fin de facilitar la manipulación de los insectos se dispone de mangas de visillo (Figura 19).

Figura 19. Caja de cría de adultos N. tenuis (40 X 30 X 30 cm).

28 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

En cada caja de cría de adultos, se introducen 500 gr de judías verdes [Phaseolus vulgaris L. (Fabaceae)] (Figura 20), a modo de sustrato de oviposición y fuente de líquido, y como dieta 4,8 gr de huevos de E. kuehniella distribuidos en cuatro comederos de 3,5 cm de diámetro cada uno (Figura 21).

Figura 20. Judías verdes utilizadas como Figura 21. Dieta basada en huevos de E. kuehniella. sustrato de oviposición y fuente de líquido.

La puesta de dos días procedente de la caja de cría de adultos se coloca en cajas de plástico (22 X 10 X 7 cm), con una rejilla de ventilación (13 X 4 cm) (Figura 22). En cada una se introducen de 2 a 5 judías verdes. Tras un plazo aproximado de ocho días a una temperatura de 25 ± 5º C, HR 50 ± 5 % y fotoperiodo 16L: 8O, se obtienen las primeras ninfas N1 (Figura 23). Para su óptimo desarrollo en cada una de las cajas de cría de ninfas se introducen 65 gr de judías verdes y 0,4 gr de huevos de E. kuehniella, paso que se repite a los 7 días, retirando además aquellas judías verdes en mal estado.

Figura 22. Caja de cría de ninfas de N. tenuis, Figura 23. Ninfas N1 de N. tenuis. (22 X 10 X 7 cm).

Pasados 3 días, cuando las ninfas alcanzan el estadio N4-N5, se introducen de nuevo en cajas de cría de adultos (Figura 19) hasta completar su ciclo de desarrollo.

29 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

Tabla 5. Resumen de la cría de N. tenuis a una temperatura de 25 ± 5º C, humedad relativa (HR) 50 ± 5 % y fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad (16L: 8O).

Día Actividad Se parte de una caja de cría (40 X 30 X 30 cm) con 500 adultos de 0 N. tenuis de 3-4 días de edad, en la cual se introducen 500 gr de judías verdes y 4,8 gr de huevos de E. kuehniella Se retiran las judías verdes de la caja de cría de adultos, y 2 se introducen en cajas de cría de ninfas (22 X 10 X 7 cm). (De 2-5 judías verdes por caja de cría de ninfas) Se introducen 65 gr de judías verdes y 0,4 gr de huevos de 10 E. kuehniella en cada una de las cajas de cría de ninfas Se repite el paso realizado el día 10, retirando aquellas 17 judías verdes en mal estado Las ninfas N4-N5 son introducidas de nuevo 20 en cajas de adultos (40 X 30 X 30 cm), con 500 gr de judías verdes y 4,8 gr de huevos de E. kuehniella Ciclo completo 22-24 (25 ± 5º C; HR, 50 ± 5 %; fotoperiodo, 16L: 8O)

30 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

3.2.3. Material vegetal.

En los ensayos de toxicidad de mallas tratadas con bifentrin en invernadero (capítulo 4, puntos 4.2.3. y 4.3.2.) y persistencia (capítulo 5, puntos 5.2.5. y 5.3.2), se emplearon plantas de pimiento [Capsicum annuum L. (Solanaceae)] variedad California Wonder (CMI, Courtaboeuf Cedex, Francia), cuando el enemigo natural a evaluar fue O. laevigatus, y plantas de tomate [Solanum lycopersicum L. (Solanaceae)] variedad Marmande (Batlle S.A., Molins de Rei, España), en el caso de N. tenuis.

Por otro lado, en los ensayos realizados en campo en túneles semi-comerciales (capítulo 4, puntos 4.2.4, y 4.3.3.), se emplearon plantas de pepino [Cucumber sativus L. (Cucurbitaceae)]. En el ensayo de otoño del 2011 se utilizó la variedad Ashley (Rocalba, Gerona, España), mientras que en los ensayos posteriores de primavera- verano y otoño del 2012 la variedad empleada fue Marumba (Enza Zaden C.I., Sª María del Águila, España).

Para la obtención de las plantas, el semillado se realizó a 3 cm de profundidad en semilleros de 80-150 alveólos, con una mezcla de tierra y vermiculita en proporción 1:2. Una vez realizado el semillado, las bandejas se trasladaron a una cámara de germinación con unas condiciones ambientales de 25 ± 5º C y humedad relativa 75 ± 5 %.

Tras su germinación, en un plazo de 4, 7 y 14 días, para semillas de pepino, tomate y pimiento, respectivamente, las plántulas de tomate y pimiento se trasladaron en bandejas de plástico al invernadero que posee la Unidad de Protección de Cultivos en los Campos de Prácticas de la E.T.S.I.A. Dos semanas más tarde, se trasplantaron a macetas de 12 cm de diámetro (Figuras 24-25) hasta alcanzar el tamaño deseado (Figuras 26-27). En el caso de los semilleros con plántulas de pepino, se trasladaron a la finca experimental “La Poveda” con el fin de garantizar una buena aclimatación de la planta (Figura 28). En un plazo de 10-14 días se procedió a realizar el trasplante en campo, cuando el estadio fenológico de la planta era aproximadamente de primera-segunda hoja verdadera del tallo principal desplegada (Figura 29).

31 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

Figura 24. Plántulas de tomate Figura 25. Plántulas de pimiento recién trasplantadas. recién trasplantadas.

Figura 26. Plantas de tomate (50 cm) empleadas Figura 27. Plantas de pimiento (30-40 cm) en los ensayos. empleadas en los ensayos.

Figura 28. Semilleros de pepino. Figura 29. Trasplante de pepino, estado fenológico primera-segunda hoja verdadera del tallo principal desplegada

32 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

3.3. Análisis estadístico.

Los datos de los ensayos se analizaron con el programa Statgraphics® Plus, Versión 5.0 (STSC, 1987).

Las pruebas de contraste de hipótesis utilizadas aparecen en la tabla 6 agrupadas según el tipo de variable a analizar.

Tabla 6. Pruebas de contraste de hipótesis aplicadas en los ensayos.

Variable Variable Pruebas independiente dependiente empleadas Observaciones

Compara medias Categórica Cuantitativa t-de Student entre 2 grupos

Análisis de Compara medias Categórica Cuantitativa Varianza entre >2 grupos

2 grupos. Categórica Cuantitativa Mann-Whitney- Análisis no Wilcoxon paramétrico

>2 grupos. Categórica Cuantitativa Kruskall-Wallis Análisis no paramétrico

(Fuente, Martínez-González et al., 2001).

En los capítulos 5 y 6 (puntos 6.3.2. y 6.4.1.) los resultados se sometieron a análisis de varianza de una vía (ANOVA). El requisito indispensable para poder realizar el test F de análisis de varianza es la verificación de dos hipótesis, la hipótesis de normalidad (Test de Kolmogorov-Smirnoff, P≥0,05) y homocedasticidad (Test de Barlett, P≥0,05).

33 Capítulo 3. Materiales y métodos generales

La primera hipótesis exige que los datos sigan una distribución normal y la segunda, que las varianzas sean homogéneas. Cuando no se cumplió alguna de las hipótesis, normalidad y/o homocedasticidad, se recurrió a hacer un cambio de variable. Cuando los parámetros evaluados fueron un porcentaje, la transformación utilizada fue y=arcsen (√(x/100)). En el resto de los casos se utilizó, y=log (x+1).

Si después del cambio de variable no se cumplieron las premisas anteriores, se recurrió al test no paramétrico de Kruskall-Wallis. Por el contrario, si las hipótesis se cumplieron y se detectaban diferencias significativas (P<0,05), se recurrió al Test LSD (mínimas diferencias significativas). Este test separa las medias de los datos en grupos homogéneos para facilitar la comparación entre los distintos tratamientos.

Por otro lado, los resultados que aparecen en el capítulo 4 se analizaron mediante el test de la t de Student. Al igual que en el análisis de varianza (ANOVA), para poder aplicar este tipo de análisis es necesario que se cumplan las hipótesis de normalidad y homocedasticidad.

Para comprobar si la variable cuantitativa sigue una distribución normal, se deben cumplir tres requisitos, que la curtosis, la cual analiza el grado de concentración que presentan los valores alrededor de la zona central de la distribución, sea menor a dos veces su error estándar (en valor absoluto); que la asimetría, concepto que se refiere a si la curva que forman los valores de la serie representa la misma forma a izquierda y derecha de un valor central (media aritmética), sea menor que dos veces su error estándar (en valor absoluto), y finalmente que el valor máximo y mínimo de la variable cuantitativa quede dentro del intervalo definido por tres desviaciones estándar por encima y por debajo de la media. Si se cumplieron estos requisitos, además hay que comprobar que las varianzas de ambos grupos sean iguales, es decir, homogéneas. Para ello se recurrió a la prueba F de Snedecor que nos permite comprobar que no haya diferencias significativas entre las varianzas, P≥0,05. Si en algún caso la hipótesis de normalidad y homocedasticidad no se cumplieron, se recurrió al test no paramétrico de Mann-Whitney-Wilcoxon (Martínez-González et al., 2001).

CCaappííttuulloo 44

Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4. COMPATIBILIDAD DE LOS ENEMIGOS NATURALES ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS CON EL USO DE MALLAS TRATADAS CON BIFENTRIN COMO MÉTODO FÍSICO DE CONTROL 1.

4.1. Introducción.

Las mallas tratadas con insecticida se desarrollaron inicialmente como barreras físico- químicas para tratar de controlar a varias especies de mosquitos vectores de la malaria [Anopheles spp. (Diptera: Culicidae)] (Hougard et al., 2002). Principalmente son utilizadas en países tropicales, particularmente en Asia, y cada vez su uso está más extendido en el continente africano (Lines et al., 1996; Hougard et al., 2002). Existen dos tipos de mallas tratadas con insecticida: mallas convencionales usadas como mosquiteras que se bañan en una solución insecticida a la dosis recomendada, o mallas insecticidas de larga duración [“long lasting insecticidal nets” (LLINs)] que llevan incorporado el tratamiento insecticida en el interior de sus fibras (Jaramillo et al., 2011). Los piretroides son los compuestos comúnmente empleados en este tipo de barreras debido a su elevado efecto de choque y alto potencial insecticida a bajas dosis, combinado con su relativa seguridad para personas y uso doméstico (Zaim et al., 2000). Los piretroides recomendados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para su uso en entomología médica son: alfa-cipermetrina (10 %), ciflutrin (5 %), deltametrina (1-25 %), etofenprox (10 %), lambda-cihalotrin (2,5 %) y permetrina (10 %) (Jaramillo et al., 2011). Todos ellos, a excepción de permetrina, están incluidos en la lista comunitaria de sustancias activas incluidas para uso agrícola, anexo I de la Directiva 91/414/CEE (MAGRAMA 2013a). Además, otros piretroides como bifentrin, también incluido en el anexo anterior, se ha evaluado como posible candidato para ser utilizado en este tipo de mallas con resultados positivos (Hougard et al., 2002; Chouaibou et al., 2006).

1 Safety of insecticide-impregnated nets on natural enemies commonly used in horticultural crops. En redacción.

35 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

A parte de su uso en entomología médica, desde hace años también se viene trabajando en el desarrollo de posibles aplicaciones agrícolas. Las mallas tratadas con insecticidas pueden actuar como un método de exclusión, que reduzca el número de insectos capaces de entrar en los invernaderos, y como un método directo de control de plagas, (Díaz et al., 2004). Algunos trabajos realizados en campo en cultivos hortícolas como col, berenjena africana y pepino, han mostrado resultados prometedores en el uso de este tipo de mallas. En un cultivo de col, el uso de mallas tratadas con deltametrina produjo una menor incidencia y daño ocasionado por lepidópteros y pulgones (Díaz et al., 2004; Martín et al., 2006; Licciardi et al., 2008). En el cultivo de berenjena africana, la malla tratada con el acaricida dicofol también controló con éxito a los ácaros Poliphagotarsonemus latus (Banks) (Acari: Tarsonemidae) y Tetranychus spp. (Acari: Tetranychidae) (Martín et al., 2010). En un cultivo de pepino, Dader y colaboradores (2012) describieron como la utilización de mallas tratadas con bifentrin redujo la entrada del pulgón Aphis gossypii Glover (Hemiptera: Aphididae), y la incidencia de los virus CMV (Cucumber mosaic virus) y CABYV (Cucurbit aphid-borne yellows virus). Por otro lado, ensayos llevados a cabo en lechuga por Legarrea (2011) en laboratorio y en invernadero también mostraron la efectividad de mallas tratadas con deltametrina sobre el pulgón Myzus persicae Sulzer (Hemiptera: Aphididae).

Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado estudios sobre los posibles efectos que pudieran provocar las mallas tratadas con insecticidas en los enemigos naturales. Por ello, es necesaria la realización de ensayos, que bajo diferentes escenarios y formas de exposición nos proporcionen información sobre su compatibilidad en el marco de la GIP.

36 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.2. Materiales y métodos.

4.2.1. Características y manejo de la malla tratada con bifentrin y malla control.

La malla tratada con bifentrin con la que se realizaron los ensayos, fue suministrada por la empresa Intelligent Insect Control (IIC) (Castelnau Le Lez, Francia) (Figura 30). Este tipo de malla lleva incorporado el tratamiento insecticida en el interior de sus fibras (LLINs), siendo su dosis inicial de 3,6 gr bifentrin/kg de malla según el fabricante. En cuanto a sus características físicas, la malla posee 10 X 10 hilos/cm, tamaño de poro 1 X 1 mm y color amarillo claro (Figura 31).

1 mm.

Figura 30. Malla tratada con bifentrin Figura 31. Detalle de las características físicas de tras su recepción. la malla tratada con bifentrin.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), las mallas tipo LLINs pueden mantener su capacidad insecticida durante tres años en condiciones de campo (WHO, 2005). Aún así, antes de la realización de los ensayos y con el fin de preservar sus propiedades insecticidas, la malla se almacenó en una cámara frigorífica a 10-12 ºC en ausencia de luz por recomendación del fabricante.

En los ensayos de campo realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid), la malla tratada con bifentrin no se reemplazó en ninguno de los tres ciclos de cultivo evaluados, de modo que para comprobar que la degradación de la malla no fuese excesiva, al final de cada ciclo de cultivo la cantidad de bifentrin

37 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

presente en la misma se analizó en el Laboratorio Arbitral Agroalimentario (LAA), dependiente del Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA) (Tabla 7).

Tabla 7. Dosis de la malla tratada con bifentrin tras cada ciclo de cultivo y su reducción en los ensayos realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid).

Final ciclo Final ciclo Final ciclo Dosis inicial Otoño 2011 Primavera- Otoño 2012 (Septiembre 2011) (Diciembre 2011) Verano 2012 (Noviembre 2012) (Julio 2012) gr bifentrin/kg de malla 3,6 2,9 2,3 2,1

Reducción respecto a la

dosis inicial ----- 19,4 36,1 41,7 (Septiembre 2011) (%)

Reducción respecto a la

dosis inicial ----- 19,4 20,7 8,7 de cada ciclo (%)

Además en cada uno de los ensayos se contó con una malla control, suministrada también por la empresa IIC, que poseía características idénticas a las descritas anteriormente para la malla tratada con bifentrin, pero sin tratamiento insecticida.

38 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.2.2. Laboratorio.

4.2.2.1. Evaluación de la preferencia entre malla control y tratada con bifentrin.

El primer ensayo tuvo por objeto determinar la preferencia entre malla control y tratada, ya que con frecuencia los piretroides producen efectos de repelencia e irritabilidad tanto en plagas, como en organismos beneficiosos (Penman & Chapman, 1988; Rieth & Levin, 1998; Liu & Stansly, 1995; Willes & Jepson, 1994; Takken, 2002; Provost et al., 2003; Maund et al., 2011). Para la realización del ensayo se construyeron cinco estructuras de metacrilato en forma de Y basadas en las propuestas por Chiel y colaboradores (2006) con algunas modificaciones. Los tres extremos eran libres, de 25 cm de longitud el brazo principal, 11 cm de longitud los brazos laterales, 5 cm de diámetro, y forrados con film de color negro para garantizar que la entrada de la luz fuese únicamente cenital (Figura 32).

Figura 32. Tubos en Y empleados en los ensayos de preferencia.

Durante el montaje y realización de los ensayos, los tubos en Y se colocaron verticalmente sobre una placa de cristal a modo de soporte (Figura 33). A continuación, los extremos superiores de cada estructura se cubrieron con las mallas objeto de estudio. En un extremo la malla control, y en el otro la malla tratada con bifentrin, ambas sujetas por unos topes de metacrilato (Figura 34). En el interior de los tubos se introdujo como atrayente alimenticio una porción de judía verde impregnada con huevos de E. kuehniella (Figura 35). Y finalmente para evitar que los insectos se escapasen, ambos extremos se cerraron con Parafilm® (Figura 36).

39 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 33. Placa de cristal a modo de base. Figura 34. Montaje tubo en Y.

Figura 35. Judías verdes impregnadas con Figura 36. Extremo tubo Y cerrado con huevos de E. kuehniella a modo de atrayente parafilm. alimenticio.

Tras el montaje de las cinco estructuras se trasladaron al insectario para la realización del ensayo, disponiéndose en el mismo como se indica en la figura 37.

Figura 37. Disposición de los tubos en Y en el insectario (ensayo de preferencia en laboratorio).

C, Malla control; B, Malla tratada con bifentrín.

40 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Una vez en el insectario, en cada uno de los tubos en Y se introdujeron 25 individuos por un orificio de 0,5 mm situado en la base (Figura 38). Para el enemigo natural O. laevigatus se liberaron adultos. Sin embargo, en el caso de N. tenuis se liberaron ninfas

N2, ya que la talla de los adultos (≈4 mm) era mayor al tamaño de poro de las mallas a ensayar (1 X 1 mm), y por tanto eran incapaces de atravesarla.

Figura 38. Orificio (0,5 mm de diámetro) en la base del tubo en Y por el cual se introdujeron los insectos.

Basados en pruebas preliminares, a las 8 horas se evaluó el número de insectos que alcanzaron el extremo del tubo en Y. Este tiempo asegura que al menos el 75 % de los insectos introducidos son capaces de alcanzar el extremo del mismo, y que la mortalidad sea inferior al 10 % (datos no mostrados).

Adicionalmente, para los insectos que alcanzaron el extremo del tubo en Y se evaluó la mortalidad a corto plazo (72 horas). Para ello se recuperaron y agruparon en tantas repeticiones como fue posible, de tal forma que hubiese 15 insectos por repetición y al menos 4 repeticiones por malla a evaluar. Cada unidad de ensayo consistió en una caja de plástico redonda (11,5 cm de diámetro x 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro) en la cual se suministró como alimento 0,4 gr de E. kuehniella y una judía verde como fuente de líquido.

41 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.2.2.2. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin por contacto.

El segundo ensayo llevado a cabo en laboratorio, tuvo por objeto determinar la toxicidad de la malla tratada por contacto bajo una forma más desfavorable de exposición, en cajas de dimensiones reducidas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura. En los ensayos se determinó la mortalidad (efecto letal) y los parámetros reproductivos (efecto subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de al menos el 50 %.

Cada unidad experimental consistió en 15 adultos de O. laevigatus o N. tenuis confinados en cajas de ensayo diseñadas por Jacas y Viñuela (1994). La parte superior e inferior de las cajas consistieron en placas de cristal (12 X 12 X 0,5 cm) envueltas en malla tratada con bifentrin o malla control. Ambas placas estuvieron conectadas entre sí por medio de un aro de metacrilato (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), con un orificio de 0,5 cm de diámetro, en el cual se colocó una aguja hipodérmica conectada a un circuito de ventilación forzada durante todo el periodo de evaluación. En el interior de las cajas se ofrecieron 0,4 gr de huevos de E. kuehniella como alimento y un trozo de judía verde como fuente de líquido (Figura 39). Se hicieron cinco repeticiones por malla a evaluar (75 insectos en total por cada malla evaluada), con un tiempo de exposición de 72 horas, que es la duración de exposición habitual en ensayos de contacto residual con productos fitosanitarios en laboratorio.

Figura 39. Ensayo en laboratorio, unidad experimental Figura 40. Ensayo en laboratorio, (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), para ensayos de vista general del ensayo. contacto residual.

42 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo la lupa binocular y se reagruparon en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) para evaluar sus parámetros reproductivos del mismo modo al que se describe en el capítulo 5, punto 5.2.4.

4.2.3. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin en invernadero.

Tras la realización de los ensayos de laboratorio, se evaluó la compatibilidad de adultos de O. lavigatus y N. tenuis con el uso de mallas tratadas con bifentrin en un invernadero experimental bajo condiciones de exposición más reales, en jaulas de 25 X 25 X 60 cm de altura. Al igual que en el ensayo anterior, se evaluó la mortalidad (efecto letal) y parámetros reproductivos (efecto subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de al menos el 50 %.

La unidad experimental en la que se confinaron los insectos fue la diseñada por González-Núñez y colaboradores (1998), con algunas modificaciones. La estructura de 60 cm de altura era de madera, al igual que la base (25 X 25 cm). El techo, y dos de los laterales se cubrieron con visillo de color blanco, en uno de ellos además se dispuso de una manga para facilitar la manipulación. En los dos laterales restantes, uno se cubrió con una lámina de metacrilato para facilitar el seguimiento y observación del ensayo (Figura 41). En el otro, se colocó la malla a evaluar, bien tratada con bifentrin o control (Figura 42). En el interior de las cajas se ofrecieron huevos de E. kuehniella (0,8 gr/jaula) como alimento (Figura 43), y como soporte vital, plantas de pimiento para O. laevigatus o de tomate en el caso de N. tenuis.

Un total de 25 adultos de O. laevigatus o N. tenuis se introdujeron en cada una de las cajas. Se emplearon cinco repeticiones por malla a evaluar (75 insectos en total por cada malla evaluada) (Figura 44), con un tiempo de exposición de 72 horas con la finalidad de comparar los resultados con aquellos obtenidos por contacto residual en el punto 4.2.2.2.

43 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 41. Ensayo en invernadero, jaula Figura 42. Ensayo en invernadero, jaula de 25 X 25 X 60cm de altura, lateral de 25 X 25 X 60cm de altura, lateral cubierto por una lámina de metacrilato cubierto por las mallas a evaluar, tratada para la observación. con bifentrin o control.

Figura 43. Ensayo en invernadero, Figura 44. Ensayo en invernadero, comederos (3,5 cm de diámetro) con huevos vista general del ensayo. de E. kuehniella.

Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo lupa binocular y reagruparon en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) para evaluar sus parámetros reproductivos del mismo modo al que se describe en el capítulo 5, punto 5.2.4.

44 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.2.4. Evaluación de la toxicidad de la malla tratada con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales).

Finalmente, se evaluaron los efectos de la malla tratada con bifentrin en condiciones reales de cultivo, mediante ensayos de campo (túneles semi-comerciales), y sobre diferentes especies de enemigos naturales comúnmente usados en control biológico de pepino (Figura 45).

Figura 45. Enemigos naturales evaluados en los ensayos de campo (túneles semi-comerciales) en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid). En negrita aparecen aquellas especies que aparecieron de manera espontánea en el cultivo.

45 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Para su evaluación se emplearon tres invernaderos tipo túnel (8 m de largo X 6,5 m de ancho X 2,6 m de altura) siguiendo un diseño en parcelas subdivididas (“split-plot”) con tres repeticiones (Figuras 46-47).

Figura 46. Montaje de los invernaderos tipo túnel.

Figura 47. Diseño y vista general del ensayo con tres invernaderos, cada uno de ellos lleva en su banda lateral (4 m de largo X 2 m de altura) los dos tipos de mallas, control y tratada con bifentrin

46 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Cada invernadero tipo túnel se dividió en dos parcelas experimentales (4 m de largo X 6,5 m de ancho) (Figura 48) separadas entre sí por una malla comercial de 10 X 20 hilos/cm y color blanco, suministrada por la empresa Criado y López S.L. (El Ejido, España). En los laterales de cada parcela experimental (4 m de largo X 2 m de altura) se colocó la malla tratada con bifentrin o la malla control (Figura 49), con el objeto de simular su uso práctico en los laterales de los invernaderos comerciales, y el resto del invernadero, techo y puertas, se cubrió con la malla comercial anteriormente citada.

Figura 48. Vista lateral de las dos parcelas Figura 49. Vista lateral de la parcela experimentales correspondientes a un invernadero. experimental (26 m2).

En cada una de las parcelas experimentales se trasplantaron 42 plantas de pepino distribuidas en 7 filas, con 6 plantas por fila separadas entre sí 0,6 m, marco de plantación habitual en el cultivo (Maroto, 2002) (Figura 50).

47 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 50. Distribución de las plantas marcadas en cada parcela experimental del invernadero.

Una vez que el cultivo adquiría el estado fenológico de segunda-tercera hoja verdadera del tallo principal desplegada (Meier, 1997), se procedía a la liberación de la plaga. A continuación, y en función del establecimiento inicial de ésta, se procedía a la liberación de los enemigos naturales.

En las tablas 8 y 9 se muestran las plagas y enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como su dosis y modo de suelta en el ciclo de cultivo de otoño 2011.

48 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Tabla 8. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011.

Fecha de introducción Fecha de primera Insectos Origen en el cultivo aparición en el cultivo Modo de suelta/dosis 3 pulgones alados/planta marcada Aphis gossypii Liberado 21 y 23 septiembre 28 septiembre (Figura 51) +

Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales Bemisia tabaci Liberado 21 y 23 septiembre 28 septiembre mediante plataforma de liberación (Figuras 52-53)/ 9 adultos/m2 * + Modo de suelta y dosis empleada por Sal y colaboradores (2008). Los pulgones utilizados para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón. Además, se inocularon con 5 pulgones/planta semanalmente en aquellas plantas marcadas con un nivel de infestación menor a 19 pulgones/planta, en base a la experiencia propia adquirida en otros ensayos para garantizar un buen establecimiento de la plaga. * Modo de suelta y dosis recomendada por Fernández (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.

Tabla 9. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011.

Fecha de introducción Fecha de primera Insectos Origen en el cultivo aparición en el cultivo Modo de suelta/dosis Liberado en el centro de cada una 5 octubre 19 octubre de las parcelas experimentales Aphidius colemani Liberado 28 octubre 10 noviembre mediante plataforma de liberación (Figura 52 y 54/10 adultos/m2 +

22 larvas L3/planta marcada Adalia bipunctata Liberado 5 octubre Sin datos (Figura 55)/ 2 * 28 octubre 10 larvas L3/m 11 adultos/planta marcada/ Orius laevigatus Liberado 5 octubre 13 octubre 5 adultos/m2 & 1 sobre con 250 individuos/planta Amblyseius swirskii Liberado 5 octubre 13 octubre marcada (Figura 56)/105 individuos/m2 #

+ Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. A. colemani fue suministrado por la empresa Agrobío (APHIcontrol®, La Mojonera, España). * Modo de suelta y dosis recomendada por el distribuidor, AGROBÍO (2013a). A. bipunctata fue suministrada por la empresa Agrobío (ADALIAcontrol®, La Mojonera, España). & Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La Mojonera, España). # Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). A. swirskii fue suministrado por la empresa Agrobío (SWIRScontrol®, La Mojonera, España).

49 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 51. Inoculación de A. gossypii. Figura 52. Plataforma de liberación de adultos de B. tabaci y A. colemani.

Figura 53. Liberación de adultos Figura 54. Liberación de adultos de A. colemani de B. tabaci.

Figura 55. Larvas L3 de A. bipunctata Figura 56. Sobres de liberación de tras su liberación. A. swirskii.

50 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

En cuanto a las plagas y enemigos naturales estudiados en el ciclo de primavera- verano del 2012, se produjeron algunas modificaciones en base a los resultados obtenidos en el anterior ciclo de cultivo. Se sustituyó al enemigo natural Adalia bipunctata L. (Coleoptera: Coccinellidae) por Chrysoperla carnea (Stephens) (Neuroptera: Chrysopidae), ya que no se estableció, ni se encontró en ninguno de los muestreos realizados. Además, también se incluyeron en el estudio las plagas, Aeolothrips sp. (Thysanoptera: Aeolothripidae), F. occidentalis y Tetranychus sp., y el enemigo natural Orius majusculus (Reuter) (Hemiptera: Anthocoridae), todos ellos de aparición espontánea en el cultivo.

En las tablas 10 y 11 se detallan las plagas y enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como su dosis y modo de suelta.

Tabla 10. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.

Fecha Insectos Origen de introducción Fecha de primera Modo de suelta/dosis en el cultivo aparición en el cultivo

Aphis gossypii Liberado 1 junio 7 junio 3 pulgones alados/planta marcada + Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales Bemisia tabaci Liberado 1 junio 7 junio mediante plataforma de liberación/ 9 adultos/m2 * Aeolothrips sp. Exógeno ------7 junio ------Frankliniella occidentalis Exógeno ------7 junio ------Tetranychus sp. Exógeno ------20 junio ------+ Modo de suelta y dosis empleada por Sal y colaboradores (2008). Los pulgones utilizados para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón. Además, se inocularon con 5 pulgones/planta semanalmente en aquellas plantas marcadas con un nivel de infestación menor a 19 pulgones/planta, en base a la experiencia propia adquirida en otros ensayos para garantizar un buen establecimiento de la plaga. * Modo de suelta y dosis recomendada por Fernández (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.

51 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Tabla 11. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012.

Fecha de introducción Fecha de primera Insectos Origen en el cultivo aparición en el cultivo Modo de suelta/dosis Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales Aphidius colemani Liberado 6 julio Sin datos mediante plataforma de liberación/ 10 adultos/m2 +

Chrysoperla carnea Liberado 29 junio Sin datos 7 larvas L3/planta marcada/ 6 julio 3 larvas L3/m2 *

Orius laevigatus Liberado 20 junio 27 junio 11 adultos/planta marcada/ 5 adultos/m2 &

Orius majusculus Exógeno ------13 junio ------

Amblyseius swirskii Liberado 20 junio 27 junio 1 sobre con 250 individuos/planta marcada /105 individuos/m2 # Liberados sobre la superficie del cultivo donde se detectaron los Phytoseiulus persimilis Liberado 4 julio No muestreado focos de Tetranychus sp. 12 julio (Figura 57)/ 20 individuos/m2 @ + Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. A. colemani fue suministrado por la empresa Agrobío (APHIcontrol®, La Mojonera, España). * Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. C. carnea fue suministrada por la empresa Biobest (Chrysopa-System®, Vícar, España). & Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La Mojonera, España). # Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). A. swirskii fue suministrado por la empresa Agrobío (SWIRScontrol®, La Mojonera, España). @ Modo de suelta y dosis recomendada por el distribuidor, AGROBÍO (2013b). P. persimilis fue suministrado por la empresa Agrobío (PHYTOcontrol®, La Mojonera, España).

En el ensayo realizado en otoño del 2012 no se evaluaron aquellos enemigos naturales que en ciclos anteriores no se pudieron cuantificar o no se establecieron de manera adecuada en el cultivo de pepino, como fue el caso de los depredadores A. bipunctata, C. carnea y A. swirskii. Además, y en base a la dificultad de establecimiento de B. tabaci, se liberó F. occidentalis como presa principal del depredador O. laevigatus.

52 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Finalmente, también se incluyó en el muestreo las plagas, Aeolothrips sp. y Aleyrodes sp. (Hemiptera: Aleyrodidae), así como el enemigo natural O. majusculus, todos ellos de aparición espontánea en el cultivo.

En las tablas 12 y 13 se detallan las plagas y enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como su dosis y modo de suelta.

Tabla 12. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2012.

Fecha Fecha de primera Insectos Origen de introducción aparición en el Modo de suelta/dosis en el cultivo cultivo

Aphis gossypii Liberado 19 septiembre 28 septiembre 3 pulgones alados/planta marcada + Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales por Bemisia tabaci Liberado 11 septiembre 19 septiembre medio de una planta de melón infestada (Figura 58) 15 adultos/m2 *

Aleyrodes sp. Exógeno ------25 septiembre ------(Figura 59)

Aeolothrips sp. Exógeno ------25 septiembre ------Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales por Frankliniella occidentalis Liberado 11 septiembre 19 septiembre medio de una planta de melón infestada (Figura 58) 8 adultos-ninfas/m2 & + Modo de suelta y dosis empleada por Sal y colaboradores (2008). Los pulgones utilizados para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón. Además, se inocularon con 5 pulgones/planta semanalmente en aquellas plantas marcadas con un nivel de infestación menor a 19 pulgones/planta, en base a la experiencia propia adquirida en otros ensayos para garantizar un buen establecimiento de la plaga. * Modo de suelta y dosis recomendada por Morales (comunicación personal). Las moscas blancas utilizadas para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón. & Modo de suelta y dosis recomendada por Morales (comunicación personal). Los trips utilizados para infestar la parcela experimental procedían de una cría de laboratorio propia realizada sobre planta de melón.

53 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 57. Liberación de Figura 58. Liberación de adultos Figura 59. Adultos de P. persimilis. de B. tabaci y adultos- Aleyrodes sp. ninfas de F. occidentalis.

Tabla 13. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2012.

Fecha de introducción Fecha de primera Insectos Origen en el cultivo aparición en el cultivo Modo de suelta/dosis Liberado en el centro de cada una de las parcelas experimentales Aphidius colemani Liberado 2 octubre 17 octubre mediante plataforma de liberación/ 10 adultos/m2+ 11 adultos/planta marcada y Orius laevigatus Liberado 2 octubre 11 octubre parcela experimental/ 5 adultos/m2*

Orius majusculus Exógeno ------25 septiembre ------+ Modo de suelta y dosis basado en la experiencia propia adquirida en otros ensayos. A. colemani fue suministrado por la empresa Agrobío (APHIcontrol®, La Mojonera, España). * Dosis empleada por Colomer y colaboradores (2011). O. laevigatus fue suministrado por la empresa Agrobío (ORIcontrol®, La Mojonera, España).

54 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

En cuanto a la evaluación del ensayo, semanalmente se realizaron dos tipos de muestreos:

-En el primero, se determinó que porcentaje de las 42 plantas por parcela experimental estaban ocupadas por plagas o enemigos naturales. Para ello, se muestreó la totalidad de la planta determinando su presencia o ausencia, sin cuantificar su densidad de población.

-En el segundo, se determinó la densidad de plaga y enemigos naturales en 11 plantas marcadas por parcela experimental (Figura 50). Para ello, se muestrearon 3 hojas por planta marcada. El criterio de elección de las mismas fue al azar, pero teniendo en cuenta la posición que tienden a ocupar las diferentes plagas en el cultivo (Tabla 14).

Tabla 14. Localización de plagas en el cultivo de pepino en función de las observaciones tomadas en campo en los distintos ciclos de cultivo de otoño (2011 y 2012) y primavera-verano (2012).

Plaga Localización en el cultivo Observaciones Poco móvil inicialmente, soporta temperaturas Tendencia a ocupar la parte más por debajo de 15 ºC. Aphis gossypii baja del cultivo inicialmente. Su inoculación fue exitosa tanto en los ciclos de otoño como de primavera-verano. Muy móvil, se establece en el cultivo de manera adecuada a temperaturas comprendidas Aeolothrips sp. y Brotes tiernos, flores, parte entre los 25-30 ºC Frankliniella occidentalis mitad-superior de la planta. (ciclo de primavera-verano), por debajo de 15 ºC desaparece paulatinamente del cultivo (ciclo de otoño). Bemisia tabaci y Brotes tiernos, parte mitad- No se establece en el cultivo de Aleyrodes sp. superior de la planta. manera permanente. Coloniza el cultivo con rapidez, problemático cuando las Tetranychus sp. Tendencia a ocupar la parte más temperaturas son superiores a baja del cultivo inicialmente. 25 ºC (ciclo primavera-verano)

55 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.3. Resultados y discusión.

4.3.1. Laboratorio.

4.3.1.1. Evaluación de la preferencia entre malla control y tratada con bifentrin.

La repelencia se produce cuando un insecto detecta químicos a cierta distancia evitando el área tratada sin entrar en contacto con la misma, mientras que la irritabilidad se produce cuando un insecto se aleja de una superficie tratada tras entrar en contacto con la misma (Mongkalangoon et al., 2009). Ambos efectos son con frecuencia producidos por los piretroides tanto en plagas, como en organismos beneficiosos (Penman & Chapman, 1988; Rieth & Levin, 1998; Liu & Stansly, 1995; Willes & Jepson, 1994; Takken, 2002; Provost et al., 2003; Maund et al., 2011). Sin embargo, en nuestros ensayos no se detectó ningún efecto de repelencia o irritabilidad, ya que tanto las ninfas

N2 de N. tenuis, como los adultos de O. laevigatus mostraron igual preferencia por la malla control y la tratada con bifentrin (N. tenuis, +t=1,08; P=0,30 y *t=0,81; P=0,44; O. laevigatus, +t=-0,42; P=0,68 y *t=-0,35, P=0,73) (Figura 60). Esta divergencia de resultados con los descritos en la bibliografía, puede ser debida a que la malla tratada tiene incorporado en sus fibras el insecticida haciéndolo menos detectable para el insecto, que cuando se expone al mismo por contacto residual sobre sustrato inerte o vegetal.

Figura 60. Porcentaje de ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus que alcanzaron el extremo de los tubos en Y a las ocho horas de su liberación, cuando se sitúan en posición vertical. a. Valor referido al número total de insectos introducidos en el tubo en Y. b. Valor referido al número total de insectos que eligieron entre las dos mallas evaluadas. a 100 b 100

80 80 * + a a a a 60 60 a a Malla control Malla control a a Malla bifentrin Malla bifentrin 40 40 Distribución (%) Distribución (% ) 20 20

0 0 N. tenuis O. laevigatus N. tenuis O. laevigatus

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05). 56 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Adicionalmente, en el caso de los insectos que alcanzaron el extremo del tubo en Y, se evaluó la mortalidad a corto plazo (72 horas) (Figura 61). Ni para N. tenuis, ni O. laevigatus hubo diferencias estadísticamente significativas entre ambas mallas (t=-0,93; P=0,38 y t=-1,44; P=0,19, respectivamente), siendo la mortalidad registrada a las 72 horas inferior al 10 %.

Figura 61. Mortalidad a las 72 horas en ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus tras atravesar las mallas control y tratada con bifentrin en el ensayo de preferencia con tubos en Y.

100

60 Malla control

Malla bifentrin 40

Mortalidad 72Mortalidad (%) h 20 a a a a 0 N. tenuis O. laevigatus

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

Este resultado era esperable, ya que a pesar de que bifentrin actúa por contacto e ingestión, y posee un elevado efecto de choque (Tomlin, 2009), el tiempo de exposición de las ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus a la malla tratada con bifentrin no fue prolongado. Únicamente entraron en contacto con la misma en el momento de atravesarla atraídos por el cebo alimenticio, por lo que parece que la contaminación con el plaguicida fue mínima.

57 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.3.1.2. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin por contacto.

En la figura 62 se muestran los datos de mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus, tras su exposición por contacto durante 72 horas a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura. Esta forma de exposición produjo diferencias estadísticamente significativas entre ambas mallas (N. tenuis, t=-43,22; P<0,05; O. laevigatus, t=35,88; P<0,05). En la malla control la mortalidad no superó el 10 %, sin embargo, cuando ambos enemigos naturales se expusieron a la malla tratada con bifentrin, la mortalidad registrada en N. tenuis fue del 84 %, y en el caso de O. laevigatus del 100 %. Debido a la alta mortalidad registrada no se pudieron evaluar posibles efectos subletales.

Figura 62. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición por contacto a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura.

b 100 b 80

60 Malla control Malla bifentrin 40 Mortalidad Mortalidad 72 (%) h 20 a a 0 N. tenuis O. laevigatus

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

A diferencia del caso anterior, al incrementarse el tiempo de exposición a la malla tratada con bifentrin, y los enemigos naturales estar confinados en una unidad experimental de pequeñas dimensiones (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), sin posibilidad de evitar el contacto con la misma, se produjo un aumento significativo de la mortalidad en ambos chinches depredadores. Coincidiendo con nuestros resultados,

58 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin numerosos estudios describen como bifentrin es un insecticida poco selectivo dado su amplio espectro de actividad, clasificando este producto como tóxico para una amplia gama de organismos beneficiosos pertenecientes a distintos órdenes, Orius spp. (Hemiptera: Anthocoridae), Macrolophus pygmaeus (Rambur) (Hemiptera: Miridae), Podisus maculiventris Say (Hemiptera: Pentatomidae), Trichogramma chilonis Ishii (Hymenoptera: Trichogrammatidae), Telenomus remus (Nixon) (Hymenoptera: Scelionidae), Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae), B. terrestris, Chrysoperla rufilabris (Burmeister) (Neuroptera: Chrysopidae), Ceraeochyrsa cubana (Hagen) (Neuroptera: Chrysopidae), y ácaros fitoseidos, como Phytoseiulus persimilis Athias- Enriot (Acari: Phytoseiidae) y Amblyseius californicus (McGregor) (Acari: Phytoseiidae), (Schuster & Stansly, 2000; Alzoubi & Cobanoglu, 2008; Albernaz et al., 2009; Thomazoni et al., 2009; Besard et al., 2010; Carmo et al., 2010; Dai, et al., 2010; Hussain et al., 2010; Biobest, 2013c; Koppert, 2013).

4.3.2. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero.

En la figura 63 se muestran las condiciones ambientales registradas durante la realización del ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero.

Figura 63. Condiciones ambientales registradas en el ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero realizado en Mayo del 2012 sobre los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis.

Ensayo N. tenuis 30 100 25 80

20 60

15 40

10 HR media (%) 20

Tem5 peratura m edia (ºC) 0 18-V 19-V 20-V 21-V 18-V 19-V 20-V 21-V Días de ensayo Días de ensayo Ensayo O. laevigatus

30 100 25 80 20 60

15 40

10 HR media20 (%)

Temperatura5 media (ºC) 0 25-V 26-V 27-V 28-V 25-V 26-V 27-V 28-V Días de ensayo Días de ensayo 59 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

En las figuras 64-65 se muestran los resultados obtenidos en el ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero, realizado con adultos de N. tenuis y O. laevigatus en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura. No hubo diferencias estadísticamente significativas de mortalidad entre las mallas control y tratada con bifentrin (N. tenuis, t=-1,53; P=0,16 y O. laevigatus, t=-0,76; P=0,46), que fue del 14,15 %, y 22,10 % para N. tenuis, y del 22,96 % y 33,02 % para O. laevigatus. (Figura 64).

Figura 64. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.

100

60 Malla control a Malla bifentrin 40 a a Mortalidad 72 h (%) h 72 Mortalidad 20 a

0 N. tenuis O. laevigatus

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

En cuanto a la evaluación de posibles efectos subletales, no se observaron efectos negativos en la descendencia de N. tenuis, situándose el número de ninfas por hembra y día entorno a 4,5 para ambas mallas (t=-0,44; P=0,66) (Figura 65).

60 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 65. Descendencia evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de N. tenuis tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.

Descendencia

6 a a 4

2 Nº ninfas/hembra/día 0 Malla control Malla bifentrin

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

En línea con estos resultados, tampoco los parámetros reproductivos de fecundidad y fertilidad de O. laevigatus se vieron afectados, siendo el número de huevos por hembra y día en la malla control y tratada con bifentrin de 3,61 y 2,66 respectivamente (t=1,30; P=0,24), y la fertilidad en ambas mallas, entorno al 75 % (t=-0,36; P=0,72) (Figura 66).

Figura 66. Fecundidad y fertilidad evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura.

Fecundidad Fertilidad

10 100

8 80 a a

6 60 a 4 40 a 2 20 % Huevos eclosados Nº huevos/hembra/día

0 0 Malla control Malla bifentrin Malla control Malla bifentrin

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

61 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Por ello, la malla tratada con bifentrin fue selectiva para adultos de N. tenuis y O. laevigatus en los ensayos realizados en invernadero. Para explicar la no susceptibilidad de ambos chinches depredadores, se debe tener en cuenta que la exposición a la malla tratada con bifentrin fue menor que en el caso de los ensayos llevados a cabo en laboratorio por contacto, ya que al ser las cajas de ensayo de mayor tamaño (25 X 25 X 60 cm de altura), los enemigos naturales tienen una mayor movilidad, y la posibilidad de evitar el contacto con la superficie tratada con bifentrin. Nuestros resultados concuerdan con los descritos por Maund y colaboradores (2011), que en su revisión sobre la ecotoxicología de piretroides sintéticos, indican que en general este tipo de compuestos tienden a ser más selectivos cuando son evaluados en ensayos de semi- campo y campo que en laboratorio.

62 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.3.3. Evaluación de la toxicidad de malla tratada con bifentrin en campo (túneles semi-comerciales).

4.3.3.1. Otoño 2011.

En el ensayo de otoño del 2011 las condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino fueron iguales bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura 67).

Figura 67. Ensayo de campo. Condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de otoño del 2011.

1400 100 *s) 2

*s) 1200

2 80

1000 mol/m

mol/m 800 Control 60 Control Bifentrin Bifentrin 600 Exterior 40 Exterior 400

200 20 PAR medio (

0 ( media UV Radiación 0 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI

Días de muestreo Días de muestreo

25 100

20 80

Control Control 15 60 Bifentrin Bifentrin

10 40

5 (%) media HR 20

Temperatura media (ºC) media Temperatura 0 0 6-X/13-X 29-X/3-XI 29-IX/5-X 14-X/19-X 20-X/28-X 6-X/13-X 4-XI/10-XI 29-X/3-XI 29-IX/5-X 14-X/19-X 20-X/28-X 4-XI/10-XI 11-XI/18-XI 21-IX/28-IX 21-IX/28-IX 11-XI/18-XI Intervalos de muestreo Intervalos de muestreo

25 40 20

15 30

10 Control 20 5 Bifentrin

0 10 Pluviometría(mm) acumulada

0 Estado fenológico medio fenológico Estado 6-X/13-X 29-IX/5-X 29-X/3-XI 14-X/19-X 20-X/28-X 4-XI/10-XI 21-IX/28-IX 11-XI/18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI

Intervalos de muestreo Días de muestreo

63 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a O. laevigatus, A. swirskii, Aphidius colemani Viereck (Hymenoptera: Braconidae) y A. bipunctata. Sin embargo, los datos obtenidos no fueron concluyentes debido a que ninguno de ellos se estableció de manera adecuada en el cultivo.

-Orius laevigatus y Amblyseius swirskii: Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por estos enemigos naturales (42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, únicamente se detectaron en el cultivo durante las tres semanas posteriores a su liberación (5-X) (Figura 68 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por O. laevigatus osciló entre un 3-13 % en la malla control, y un 1-5 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 68 a,b). En el caso de A. swirskii los porcentajes fueron ligeramente superiores, 8-25 % en la malla control, y del 8-30 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 68 a,b). Cuando se cuantificó la densidad media de ambos enemigos naturales en las plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental), se vio que los niveles alcanzados fueron muy bajos (<0,5 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 68 c) (O. laevigatus, W=23,5; P=0,26 y A. swirskii, W=31,5; 0,99). O. laevigatus y A. swirskii no se establecieron por la escasez de presa presente en el cultivo. Inicialmente B. tabaci estuvo presente en el mismo, con porcentajes que oscilaron entre el 30-40 % en ambas mallas (Figura 68 a,b). Sin embargo, no se estableció probablemente porque la temperatura media en el ensayo no fue superior a los 25 ºC (Figura 67), y esta plaga necesita temperaturas más altas (próximas a los 30 ºC) para su desarrollo óptimo (Malais & Ravensberg, 2006). Al cuantificar la densidad media de B. tabaci en las plantas marcadas para determinar si su establecimiento se había visto influenciado por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo, los niveles alcanzados fueron muy bajos (<0,3 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 68 c) (B. tabaci, W=26; P=0,56).

64 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 68 a,b. Ciclo de otoño 2011, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci. c. Densidad media de población en las plantas marcadas de O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci.

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).

a Malla control b Malla bifentrin

100 100

80 80

60 B. tabaci 60 B. tabaci O. laevigatus O. laevigatus 40 A. swirskii 40 A. swirskii 20 20 Plantas ocupadas (% ) Plantas ocupadas (% ) 0 0 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI Días de muestreo Días de muestreo

c * 2

1,5

Malla control 1 Malla bifentrin a a a 0,5 a a a

Nº medio individuos/planta marcada marcada individuos/planta medio Nº 0 B. tabaci O. laevigatus A. swirskii

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

-Aphidius colemani: Coincidiendo con lo descrito por Jacobson y Croft (1998) y Malais y Ravensberg (2006), las primeras momias del parasitoide aparecieron a las dos semanas tras la liberación de los adultos en el cultivo (5-X y 28-X) (Figura 69 a,b). Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por momias de A. colemani (42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, su presencia fue constante desde su primera aparición (19-X) hasta la finalización del ensayo (18-XI) (Figura 69 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por A. colemani osciló entre un 5-20 % en la malla control, y un 8-30 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 69 a,b). Sin embargo, cuando se cuantificó la densidad media del parasitoide en las plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental), se observó que los niveles alcanzados fueron muy bajos (<1 momia/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 69 c) (A. colemani, W=32,5; P=0,99). La razón de que creciera tan poco en el

65 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin cultivo no fue atribuida a la escasez de presa presente en el mismo, ya que el pulgón A. gossypii se estableció de manera adecuada tanto en la malla control, como en la tratada con bifentrin (Figura 69 a,b,c), sino a la posibilidad de que entre el depredador A. bipunctata y el parasitoide A. colemani se hubiera producido una depredación intragremial (Pell et al., 2008).

Figura 69 a,b. Ciclo de otoño, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii. c. Densidad media de población en el cultivo del enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii.

a Malla control b Malla bifentrín 100 100

80 80

60 A. gossypii 60 A. gossypii

40 Momias A. 40 Momias A. colemani colemani 20 20 Plantas ocupadas (% ) Prlantas ocupadas (% )

0 0 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI Días de muestreo Días de muestreo

c 50

* a 40 a

30 Malla control Malla bifentrin 20

Nº medio individuos/planta marcada a a 0 A. gossypii A. colemani

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2). Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

66 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

-Adalia. bipunctata: La interpretación de los resultados obtenidos con el depredador A. bipunctata es complicada, ya que previamente a su liberación (5-X) se pudo observar como la población de pulgón, que se había instalado correctamente en el cultivo en ambas mallas, se incrementó significativamente en la malla control respecto la malla tratada con bifentrin (t=-3,15, P<0,05) (Figura 70). Esta diferencia parece ser debida a la presencia de hormigas en una de las parcelas experimentales correspondiente a la malla control (Figura 71), ya que se ha visto que su presencia en colonias de pulgón facilita su dispersión y protección frente a los enemigos naturales, favoreciendo su crecimiento a niveles superiores de los que alcanzaría en su ausencia (Burgio et al., 1997).

Figura 71. Ciclo de otoño 2011, evolución de la población de A. gossypii en las mallas control y tratada con bifentrin.

90 + 80 * 70 60

planta/ marcada 50 * Malla 40 bifentrín 30 Malla control A. gossypii 20 10

Nº medio 0 28-IX 5-X 13-X 19-X 28-X 3-XI 10-XI 18-XI Días de muestreo

* Representa diferencias estadísticamente significativas (P<0,05). + Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).

Figura 71. Hormigas en el cultivo.

67 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Otro hecho que dificultó la interpretación de los resultados fue la imposibilidad de determinar la presencia o densidad de población en el cultivo de A. bipunctata, ya que una vez liberado no se encontró en ninguno de los muestreos realizados. Sin embargo, tras sus dos liberaciones se observó un control a corto plazo de la población de A. gossypii tanto en la malla control, como en la tratada con bifentrin (Figura 70). Después de su primera liberación (5-X), la población de pulgón disminuyó entorno a un 50 % en ambas mallas, no habiendo diferencias significativas entre ellas (W=430,5, P=0,13) (Figura 70). Por otro lado, tras su segunda liberación (28-X), de nuevo se observó una disminución de la población de pulgón en ambas mallas, pero esta vez se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre ellas (W=297,5, P<0,05), siendo un 30 % mayor la disminución en la malla control (Figura 70). Este resultado puede ser atribuido a la interferencia que produjeron las hormigas en el ensayo, ya que tras un periodo de descenso de temperaturas y lluvia (20-X al 28-X) (Figura 67), las hormigas desaparecieron de la parcela experimental correspondiente a la malla control. De este modo, en ausencia de protección y tras la segunda liberación de A. bipunctata en el cultivo (28-X), la población de pulgón en dicha parcela experimental disminuyó proporcionalmente en mayor número que en el resto de parcelas del ensayo, al tener A. bipunctata una mayor cantidad de presa disponible.

68 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.3.3.2. Primavera-Verano 2012.

Al igual que en el ensayo de otoño del 2011, en el ciclo de primavera-verano 2012 las condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino fueron iguales bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura 72).

Figura 72. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de primavera-verano del 2012.

1800 160 *s)

1600 2 140

*s) 1400 2 120 mol/m

1200 100 mol/m Control Control

1000 Bifentrin 80 Bifentrin 800 Exterior Exterior 60 600 400 40 PAR medio ( medio PAR 200 20 Radiación UV media ( media UV Radiación 0 0 7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII 7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII Días de muestreo Días de muestreo

35 100 30 80 25

20 60 Control Control 15 Bifentrin Bifentrin 40 10 HR media (%) media HR

Temperatura media (ºC) media Temperatura 5 20 0 0 1-VI/7-VI 8-VI/13-VI 1-VI/7-VI 28-VI/4-VII 14-VI/20-VI 21-VI/27-VI 5-VII/12-VII 8-VI/13-VI 28-VI/4-VII 14-VI/20-VI 21-VI/27-VI 13-VII/17-VII 5-VII/12-VII 13-VII/17-VII Intervalos de muestreo Intervalos de muestreo

100

60 Control

40 Bifentrin

20 Estado fenológico medio

0 7-VII 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 17-VII Días de muestreo

69 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a los enemigos naturales liberados, O. laevigatus y A. swirskii, ni al enemigo natural que colonizó de manera espontánea el cultivo, O. majusculus. Sin embargo, en el caso de los enemigos naturales C. carnea y A. colemani los datos obtenidos no fueron concluyentes debido a que ninguno de ellos se estableció de manera adecuada en el cultivo.

-Chrysoperla carnea: No se pudo determinar su presencia o densidad de población en el cultivo, ya que una vez liberado no se encontró en los muestreos realizados. Además, tampoco se observó ningún efecto en la población de pulgón tras su liberación (datos no mostrados). Este hecho podría ser debido a que las larvas de este depredador ven limitada su locomoción por la pilosidad de la hoja de pepino, dificultando su capacidad de depredación y en consecuencia su establecimiento (Burgio et al., 1997).

-Aphidius colemani: No se dispuso del tiempo suficiente (al menos dos semanas tras su primera liberación, 6-VII) para que apareciesen las primeras momias de pulgón en el cultivo, ya que el ensayo fue interrumpido prematuramente (17-VII) al ser colonizado en su totalidad por un ataque de araña roja, Tetranychus sp. (Figuras 73-74).

Figura 73. Detalle de ataque por araña roja. Figura 74. Vista general del ataque de araña roja.

Para controlar a este ácaro fitófago se realizaron dos sueltas del ácaro depredador P. persimilis (4-VII y 12-VII), que fueron insuficientes debido a la rapidez de crecimiento de la araña roja, que hubiera requerido para su control la aplicación de un acaricida, lo cual se descartó para no interferir en el crecimiento de las poblaciones de enemigos naturales presentes.

70 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Como se indica en la figura 75, la malla tratada con bifentrin no dificultó la entrada o establecimiento de Tetranychus sp., siendo el porcentaje de plantas atacadas en el cultivo estadísticamente idéntico en ambas mallas, (4-VII, ataque Tetranychus sp. <50 %, t=- 0,63, P=0,56, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=0,41, P=0,69, planta muerta, t=1,26, P=0,27; 12-VII, ataque Tetranychus sp. <50 %, t=1,29, P=0,26, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=0,89, P=0,42, planta muerta, t=-1,68, P=0,16; 17-VII, ataque Tetranychus sp. <50 %, sin datos, en la malla control ninguna planta poseía un ataque de Tetranychus sp. inferior al 50 %, ataque Tetranychus sp. >50 %, t=-0,8, P=0,46, planta muerta, t=0,31, P=0,77). La falta de susceptibilidad de Tetranychus sp. a la malla tratada con bifentrin puede ser atribuida a que no entrase en contacto directo con la misma, debido a que el tamaño de poro de la malla (1 X 1 mm) no es el más adecuado para evitar la entrada de este ácaro fitófago, cuyas dimensiones del adulto (hembra) son 400-500 m (Zhang, 2003).

Figura 75. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas atacadas por Tetranychus sp. en las mallas control y tratada con bifentrin.

Malla control Malla bifentrin

100 100 80 80 Ataque Tetranychus Ataque Tetranychus 60 60 sp. < 50 % planta sp. < 50 % planta Ataque Tetranychus Ataque Tetranychus 40 40 sp. > 50 % planta sp. > 50 % planta Planta muerta 20 20 Planta muerta Plantas atacadas (% ) Plantas atacadas (% )

0 0 4-VII 12-VII 17-VII 4-VII 12-VII 17-VII Días de muestreo Días de muestreo

-Orius laevigatus, Orius majusculus y Amblyseius swirskii: El principal motivo para que se produjese el adecuado establecimiento de O. laevigatus, O. majusculus, y en menor medida, A. swirskii, estuvo relacionado con la colonización del cultivo de manera espontánea por los trips Aeolothrips sp. y F. occidentalis. Ambos sustituyeron como presa alternativa a B. tabaci, la cual de nuevo no se estableció en el ensayo (datos no mostrados). Como puede observarse en la figura 76, la malla tratada con bifentrin no supuso un impedimento para la entrada o establecimiento de los trips en el cultivo, no produciéndose diferencias estadísticamente significativas con respecto a la malla control (13-VI, W=648, P=0,18; 20-VI, W=652, P=0,17; 27-VI, W=471, P=0,34; 4-VII, W=505,5, P=0,62; 12-VII, 509,5, P=0,47). No existen datos en la

71 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin literatura de la actividad insecticida de mallas tratadas con piretroides en trips, aunque es un hecho conocido que los piretroides tienen un amplio espectro de actividad, y son utilizados para el control de tisanópteros, por lo que un control era esperable (De Liñán, 2003). Sin embargo, la falta de susceptibilidad de Aeolothrips sp. y F. occidentalis a la malla tratada con bifentrin puede ser atribuida a que no entrase en contacto directo con la misma, debido a que su densidad de hilos (10 X 10 hilos/cm) no es el más adecuado para evitar su entrada, necesitando de mallas más densas para su control (10 X 14 a 26 X 26 hilos/cm) (Lacasa & Llorens, 1998a).

Por otro lado, la población de trips disminuyó progresivamente tras la liberación de los enemigos naturales O. laevigatus y A. swirskii (20-VI), y la aparición espontánea de O. majusculus (13-VI) en ambas mallas.

Figura 76. Ciclo de primavera-verano 2012, evolución de la población de Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips) en las mallas control y tratada con bifentrin.

* 35 30 25 Malla 20 bifentrin 15 Malla control 10

0 Nº medio trips /planta marcada 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII Días de muestreo

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).

Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por estos enemigos naturales (42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, el control de la población de trips parece ser debido principalmente a la sinergia formada por O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.), y no a la acción de A. swirskii. En el transcurso del ensayo se observa un incremento del porcentaje de plantas ocupadas por Orius spp. (malla control, de un 1 a un 33 %; malla tratada con bifentrin de un 6 a un 44 %), en

72 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

detrimento de la población de trips en ambas mallas (malla control, de un 92 a un 9 %; malla tratada con bifentrin de un 94 a un 12 %), mientras que A. swirskii únicamente estuvo presente en el cultivo durante las dos semanas posteriores a su liberación (el porcentaje de plantas ocupadas fue <20 % en ambas mallas) (Figura 77).

Figura 77. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales Orius spp. y A. swirskii y sus presas, Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips).

Malla control Malla bifentrin

100 100

80 80

60 Trips 60 Trips Orius spp. Orius spp. 40 A. swirskii 40 A. swirskii

20 20 Plantas ocupadas (%) Plantas ocupadas (%) ocupadas Plantas

0 0 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII Días de muestreo Días de muestreo

En la figura 78 se muestra la densidad media de Orius spp. en las plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental). Coincidiendo con los resultados descritos en los ensayos de preferencia en laboratorio (tubos en Y), y los realizados en invernadero en jaulas (25 X 25 X 60 cm de altura), se observa como tampoco O. laevigatus y O. majusculus resultaron afectados por la malla tratada con bifentrin, no produciéndose diferencias estadísticamente significativas con respecto a la malla control (27-VI, W=522, P=0,71; 4-VII, W=550,5, P=0,91; 12-VII, W=424,5; P=0,06).

73 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 78. Ciclo de primavera-verano del 2012, evolución de la población de Orius spp. en las mallas control y tratada con bifentrin.

2 *

1,5

/planta marcada Malla bifentrin 1 Malla control

O riu s sp p . 0,5

N º m e d io 0 13-VI 20-VI 27-VI 4-VII 12-VII Días de muestreo

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).

74 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

4.3.3.3. Otoño 2012.

Como se vio en ciclos de cultivo anteriores, en el ciclo de otoño del 2012 las condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino fueron iguales bajo la malla tratada con bifentrin y la control (Figura 79).

Figura 79. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de otoño del 2012.

1400 * s) 2 1200 80 *s) m o l/m 2 1000 60

mol/m Control Control

800 Bifentrin Bifentrin 600 40 Exterior Exterior 400 20 PAR medio ( PAR medio 200 0 0 Radiación UV media ( 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X Días de muestreo Días de muestreo

25 100 20 80

15 60 Control Control 10 Bifentrin 40 Bifentrin HR media(%) 5 20 Temperatura media (ºC) 0 0 3-X/11-X 3-X/11-X 26-IX/2-X 26-IX/2-X 12-X/17-X 18-X/24-X 25-X/31-X 12-X/17-X 18-X/24-X 25-X/31-X 19-IX/25-IX 19-IX/25-IX Intervalos de muestreo Intervalos de muestreo

45 80 40 35 60 30 25 Control 40 20 Bifentrin 15 20 10

5 Estado fenológico medio Pluviometríaacumulada (mm) 0 0 19-IX/25-IX 26-IX/2-X 3-X/11-X 12-X/17-X 18-X/24-X 25-X/31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X Intervalos de muestreo Días de muestreo

75 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Los resultados indican que la malla tratada con bifentrin parece no afectar a los enemigos naturales liberados, O. laevigatus y A. colemani, ni al enemigo natural que colonizó de manera espontánea el cultivo, O. majusculus. Sin embargo, los datos obtenidos no fueron concluyentes, ya que los chinches depredadores no se establecieron en el cultivo, y en el caso de A. colemani la no homogeneidad en el crecimiento de la población de su presa, A. gossypii, dificultó la interpretación de los resultados.

-Orius laevigatus y Orius majusculus: Cuando se evaluó que porcentaje de plantas ocupadas por los enemigos naturales (42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, la presencia del conglomerado de especies formado por O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) fue constante desde su primera aparición (25-IX) hasta la finalización del ensayo (31-X) (Figura 80 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por Orius spp. osciló entre un 2-11 % en la malla control, y un 1-13 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 80 a,b). Cuando se cuantificó la densidad media de ambos enemigos naturales en las plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental), se vio que los niveles alcanzados fueron muy bajos (<0,15 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 80 c) (Orius spp., t=-0,41; P=0,68). El principal motivo de que no se establecieran fue de nuevo atribuido a la escasez de presa presente en el cultivo. Inicialmente las moscas blancas B. tabaci y Aleyrodes sp., así como los trips Aeolothrips sp. y F. occidentalis estuvieron presentes en el mismo en ambas mallas (Figura 80 a,b), pero tras un descenso brusco de la temperatura media la segunda semana de ensayo (26-IX al 2-X) (15 ºC) (Figura 79), ambas poblaciones desaparecieron paulatinamente del cultivo. Al cuantificar la densidad media de B. tabaci, Aleyrodes sp. y trips en las plantas marcadas para determinar si su establecimiento se había visto influenciado por la presencia de la malla tratada con bifentrin en el cultivo, los niveles alcanzados fueron muy bajos en todos ellos (<1 individuos/planta marcada), y significativamente iguales bajo ambas mallas (Figura 80 c) (B. tabaci, t=-0,16; P=0,87; Aleyrodes sp., W=11; P=0,83; trips, W=19; P=0,93).

76 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Figura 80 a,b. Ciclo de otoño 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp., Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips). c. Densidad media de población en las plantas marcadas de O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp.,

Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips).

a Malla control b Malla bifentrin 100 100

80 80 B. tabaci B. tabaci 60 60 Aleyrodes sp. Aleyrodes sp.

Trips 40 Trips 40

Orius spp. Orius spp. 20 Plantas ocupadas(%) 20 Presencia en el cultivo (%)

0 0 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X Días de muestreo Días de muestreo

c * 2

1,5 a a a Malla control 1 a Malla bifentrin a a 0,5 a a

Nº medio individuos/planta marcada marcada individuos/planta Nºmedio 0 B. tabaci Aleyrodes sp. Trips Orius spp.

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2). Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

-Aphidius colemani: Al igual que en el ciclo de otoño del 2011, las primeras momias del parasitoide aparecieron a las dos semanas tras la liberación de los adultos en el cultivo (2-X) (Figura 81 a,b). Cuando se evaluó el porcentaje de plantas ocupadas por momias de A. colemani (42 plantas por parcela experimental), sin cuantificar su densidad de población, su presencia fue constante desde su primera aparición (17-X) hasta la finalización del ensayo (31-X) (Figura 81 a,b). El porcentaje de plantas ocupadas por A. colemani osciló entre un 36-48 % en la malla control, y un 52-64 % en la malla tratada con bifentrin (Figura 81 a,b). Al cuantificar la densidad poblacional media durante el ensayo en las plantas marcadas (11 plantas por parcela experimental), los valores mostraron un

77 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

adecuado establecimiento del parasitoide en el cultivo (Figura 81 c), no habiendo diferencias estadísticamente significativas entre malla la control y la tratada con bifentrin (t=-1,3, P=0,26) (Figura 81 c).

Figura 81 a,b. Ciclo de otoño 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa A. gossypii. c. Densidad media de población en las plantas marcadas de A. colemani (momias) y su presa A. gossypii. a Malla control b Malla bifentrín 100 100 80 80

60 A. gossypii 60 A. gossypii 40 Momias A. colemani 40 Momias A. colemani 20 20 0 0 Presencia en el cultivo (%) Presencia en el cultivo (%) 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X 25-IX 2-X 11-X 17-X 24-X 31-X Días de muestreo Días de muestreo

c 180 a 160 140

* 120 100 a Malla control 80 Malla bifentrin

marcada marcada 60 a 40 a 20 0 2 *Planta planta / individuos medio Nº marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m ). A. gossypii A. colemani Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0.05).

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2). Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

En este ciclo de cultivo el crecimiento de la población de A. gossypii no fue homogéneo entre los tratamientos evaluados, lo que dificultó el análisis de los datos (Tabla 15). En el muestreo previo a la liberación de A. colemani (2-X), el establecimiento de A. gossypii fue significativamente superior en la malla tratada con bifentrin que en la malla control (W=374; P<0,05); en la tercera semana de muestreo (11-X) las poblaciones tendieron a igualarse, y coincidiendo con la primera aparición de momias de A. colemani en el cultivo (17-X), el número de A. gossypii por planta marcada fue significativamente superior en la malla tratada con bifentrin (t=3,07; P<0,05) (Tabla 15).

78 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Tabla 15. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii en la malla control y tratada con bifentrin.

* A. gossypii/planta marcada

Días de muestreo Malla control Malla bifentrin t W P

25-IX 15,69 ± 2,52 a 26,60 ± 9,02 a ----- 486 0,45 2-X 30,81 ± 5.62 a 59,63 ± 10,75 b ----- 374 <0,05 11-X 83,33 ± 790 a 92,36 ± 13,91 a 0,56 ----- 0,57 17-X 83,42 ± 10,32 a 134,33 ± 12,95 b 3,07 ----- <0,05 24-X 93,18 ± 12,78 a 226,69 ± 26,50 b ----- 276,5 <0,05 31-X 80,46 ± 15,15 a 249 ± 30,49 b ----- 229 <0,05

*Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2). Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05).

Este mayor crecimiento del pulgón bajo la malla tratada no se debe a un efecto negativo de ésta sobre el parasitoide A. colemani, ya que al analizar el ratio de momias de A. colemani/A. gossypii en el cultivo, fue significativamente igual de bajo en la malla control y la tratada con bifentrin (Tabla 16).

Tabla 16. Ciclo de otoño del 2012, ratio momias A. colemani/A. gossypii en la malla control y tratada con bifentrin.

Ratio momias A. colemani/A. gossypii Días de muestreo Malla control Malla bifentrin t W P

17-X 0,36 ± 0,08 a 0,30 ± 0,06 a ----- 506,5 0,63 24-X 0,90 ± 0,23 a 0,65 ± 0,20 a ----- 423 0,12 31-X 0,93 ± 0,47 a 0,98 ± 0,65 a ----- 337,5 0,94

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05).

Por otro lado, si se analiza a nivel individual la evolución de la población de A. gossypii en cada una de las repeticiones, se puede observar una alta variabilidad incluso entre módulos pertenecientes al mismo tratamiento (Tabla 17). Además, al calcular los ratios de momias de A. colemani/A. gossypii en cada uno de los módulos, los valores más bajos se registraron en aquellas repeticiones con mayor número de A. gossypii (Tabla 17).

79 Capítulo 4. Compatibilidad de enemigos naturales con el uso de mallas tratadas con bifentrin

Tabla 17. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii y ratio de momias A. colemani/A. gossypii por repetición (módulo) en la malla control y tratada con bifentrin.

* A. gossypii/planta marcada

Días de muestreo Malla control Malla bifentrin

Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 17-X 100,64 ± 23,97 69,73 ± 15,64 79,91 ± 12,46 143,45 ± 21,65 96 ± 16,04 163,55 ± 25,37 24-X 130,27 ± 27,67 64,36± 19,77 84,91 ±13,55 271,45 ± 43,78 80,45 ± 27,97 328,18 ±25,98 31-X 159,18 ± 27,99 34,91 ± 14,76 40 ± 11,70 321,09 ± 37,53 50,55 ± 18 378,36 ± 22,97

Ratio momias A. colemani/A. gossypii

Días de muestreo Malla control Malla bifentrin

Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 Módulo 1 Módulo 2 Módulo 3 17-X 0,35 ± 0,18 0,43 ± 0,17 0,32 ± 0,06 0,18 ± 0,06 0,59 ± 0,14 0,14 ± 0,02 24-X 0,33 ± 0,09 1,66 ± 0,60 0,74 ± 0,30 0,20 ± 0,06 1,57 ± 0,51 0,19 ± 0,03 31-X 0,10 ± 0,03 2,13 ± 1,33 0,54 ± 0,17 0,16 ± 0,07 2,74 ± 1,89 0,07 ± 0,01 . *Planta marcada=muestreo de 3 hojas/planta; 11 plantas marcadas/parcela experimental (26 m2).

Es un hecho conocido que la influencia del comportamiento de los parasitoides en la dinámica de poblaciones y de la sus presas, posee su mejor ejemplo en la respuesta funcional (Fernández-Arhex & Corley, 2004), definida como la relación entre el número de presas consumidas por un depredador en función de la densidad de presa, en un espacio e intervalo de tiempo fijos (Solomon, 1949). A. colemani posee una respuesta funcional tipo II (Zamani et al., 2006), es decir, su tasa de consumo aumenta con la densidad de presa, pero disminuye la velocidad de aumento hasta alcanzar una plataforma en la cual la tasa de consumo permanece constante, independientemente de la densidad de presa disponible (Fernández-Arhex & Corley, 2004). Por lo que los resultados obtenidos podrían ser debidos a que A. colemani alcanzó su tasa máxima de consumo de pulgón, a partir de la cual es constante en aquellos módulos en los que la densidad de A. gossypii fue muy elevada, módulo1 (malla control) y módulos 1 y 3 (malla tratada con bifentrin) (Tabla 17), y no a un efecto de la malla objeto de estudio.

CCaappííttuulloo 55

Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5. TOXICIDAD DE MODERNOS INSECTICIDAS SOBRE LOS ENEMIGOS NATURALES ORIUS LAEVIGATUS Y NESIDIOCORIS TENUIS 1.

5.1. Introducción.

El principal problema de compatibilización del control biológico surge al utilizarlo de manera conjunta con el control químico, pues a pesar de que actualmente su uso es más racional, aún existen insecticidas autorizados en los cultivos que pueden ser no selectivos para una cierta especie de enemigo natural (Medina et al., 2008). Por tanto, un paso previo esencial para su uso conjunto es estudiar el efecto que los plaguicidas producen en los agentes de biocontrol.

Según Croft (1990) las principales vías por las cuales los enemigos naturales se exponen a los plaguicidas son: contacto directo, en el momento de la aplicación los organismos beneficiosos entran en contacto con el compuesto o inhalan sus vapores. Contacto residual, el enemigo natural entra en contacto con el plaguicida tras su aplicación en el medio. Ingestión, los agentes de biocontrol se contaminan a través del consumo de presa o planta huésped que ha entrado en contacto con el plaguicida (Figura 82).

Figura 82. Principales formas de exposición de los enemigos naturales a los plaguicidas.

Contacto directo Contacto residual Ingestión

1 FERNÁNDEZ, Mª. M., AMOR, F., BENGOCHEA, P., VELÁZQUEZ, E., MEDINA, P., FERERES, A. & VIÑUELA, E. 2012. Effects of the insecticides methoxyfenozide and abamectin to adults of the natural enemies Eretmocerus mundus (Mercet) (Hymenoptera: Aphelinidae), Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) and Nesidiocoris tenuis Reuter (Hemiptera: Miridae) under laboratory conditions. IOBC/wprs Bulletin, 82, 1-7.

Effects of pesticides commonly used on horticultural crops on the predatory bugs Orius laevigatus (Fieber) (Hemiptera: Anthocoridae) and Nesidiocoris tenuis (Reuter) (Hemiptera: Miridae). En redacción.

81 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

El modo más común por el cual los enemigos naturales se exponen a los plaguicidas es por contacto residual (Croft, 1990). Sin embargo, no siempre es la forma de exposición más adecuada para evaluar el efecto de un plaguicida, ya que también dependerá de su modo de acción, pudiendo ser interesante analizar otras formas de exposición (ingestión, aplicación tópica o contaminación de la cadena trófica) para tener una visión más completa de su efecto (Candolfi, et al., 2000; Medina et al., 2008).

La OILB, a través del grupo de trabajo “Plaguicidas y Organismos Beneficiosos”, tiene como uno de sus objetivos identificar los productos fitosanitarios que respeten a los enemigos naturales y puedan ser usados en programas de GIP (IOBC, 2013). La selección de plaguicidas se realiza en base a un esquema secuencial que asume que aquellos que son inocuos en laboratorio, serán seguros en semi-campo y campo, no necesitando de otros estudios. Si por el contrario no lo son, se pasa al siguiente nivel de evaluación (Van de Veire et al., 2002a) (Figura 83).

Figura 83. Secuencia de pruebas para la evaluación de los efectos secundarios en organismos beneficiosos.

Inocuo Inocuo Inocuo Ensayos de laboratorio (Estadio más susceptible, estadio menos susceptible) Ensayos Ensayos Semi-campo Campo Ensayos de laboratorio extendido Tóxico Tóxico Tóxico

Otros ensayos: Persistencia

Según Hassan (1994), Sterk y colaboradores (1999) y Van de Veire y colaboradores (2002a), en una primera fase se desarrollan ensayos de laboratorio en condiciones controladas que tienen por objetivo estudiar la toxicidad del residuo fresco del insecticida sobre placas de cristal en (a) los estados de desarrollo más susceptibles, y (b) menos susceptibles del enemigo natural. Los estados de desarrollo más susceptibles corresponden a adultos en parasitoides, estadios juveniles en ácaros, y

82 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas larvas o ninfas en el caso de insectos depredadores por su mayor movilidad. Por otro lado, los estados de desarrollo considerados menos susceptibles son parasitoides en el interior de su huésped, o en el caso de ácaros e insectos depredadores, los adultos, aunque en este apartado también se podría considerar el estado de desarrollo de huevo y pupa (Medina, et al., 2003a). Adicionalmente, también pueden llevarse a cabo (c) ensayos de laboratorio extendido, que tienen por objeto el estudio de la toxicidad del residuo fresco del insecticida sobre material vegetal.

Siguiendo el esquema secuencial propuesto por la OILB, y si el producto insecticida presenta toxicidad para el enemigo natural en estudio tras los ensayos de laboratorio. El siguiente paso será la realización de (d) ensayos de semi-campo, sobre plantas en invernadero o al aire libre a pequeña escala. De seguir siendo nocivo el plaguicida, se empezarían a desarrollar los (e) ensayos de campo, los cuales corresponden a las condiciones reales de cultivo.

Los parámetros a evaluar en estos ensayos son los efectos directos a corto plazo, mortalidad, cambios en la población del enemigo natural y posibles efectos a largo plazo o efectos subletales, que son fundamentalmente en el caso de parasitoides el parasitismo, y en el de depredadores, parámetros reproductivos (fecundidad, fertilidad o descendencia) (Medina et al., 2008). Además, también se pueden considerar en el estudio otro tipo de efectos subletales, como los producidos a nivel fisiológico (longevidad, desarrollo, proporción sexual, inmunología) o aquellos que afectan a su comportamiento (movilidad, orientación, comportamiento alimenticio de puesta y aprendizaje) (Desneux et al., 2007), o incluso los efectos a nivel de poblaciones, comunidades y ecosistemas, aún más difíciles de determinar (Köhler & Triebskorn, 2013). En base al efecto total que produzcan en los enemigos naturales, los plaguicidas se clasifican básicamente en cuatro categorías: 1-2-3-4 (1 inocuo, 2 ligeramente tóxico, 3 moderadamente tóxico y 4 tóxico) (Hassan, 1994).

Los plaguicidas pueden proporcionar selectividad fisiológica y/o ecológica (Croft, 1990), por lo que otro tipo de estudio para identificar los plaguicidas no persistentes, (f) es la duración del efecto nocivo de los insecticidas o persistencia. Para ello, los compuestos son aplicados sobre material vegetal, que puede ser mantenido al aire libre bajo una cubierta que le proteja de la lluvia, pero que permita una exposición directa

83 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas con la luz solar simulando las condiciones de degradación del insecticida en campo o en invernadero. En este caso, la toxicidad de los residuos del plaguicida es evaluada a diferentes intervalos de tiempo hasta la perdida de su toxicidad (categoría 1 OILB para laboratorio extendido), clasificándose en cuatro categorías según el tiempo que tarda en alcanzarse: A-B-C-D (A=poco persistente, <5 días, B=ligeramente persistente, 5-15 días, C=moderadamente persistente, 16-30 días, D=persistente >30 días).

5.1.1. Insecticidas evaluados.

Los productos fitosanitarios descritos a continuación se seleccionaron por representar a un grupo de modernos plaguicidas con modos de acción en principio más selectivos para los enemigos naturales que antiguos plaguicidas como organoclorados, organofosforados y carbamatos, y por su uso frecuente en cultivos hortícolas donde los enemigos naturales evaluados están presentes. Todos ellos están incluidos o en proceso de inclusión en la lista comunitaria de sustancias activas para uso agrícola, anexo I de la Directiva 91/414/CEE (MAGRAMA 2013a).

5.1.1.1. Abamectina.

La avermectina B1, comúnmente conocida como abamectina, fue desarrollada por Merc Sharp & Dohme Agvet (actualmente Syngenta Crop Protection) en 1985 (Mei, et al., 2011).

Las avermectinas son un grupo de 16 lactonas macrocíclicas producidas durante la fermentación del microorganismo del suelo Streptomyces avermitilis Kim & Goodfellow (Bacteria: Streptomycetaceae) (Ikeda et al., 2003). Burg y colaboradores (1979) describieron las características de su cultivo, estructura, así como las características y propiedades físicas de las avermectinas producidas durante el proceso de fermentación, el cual da lugar a cuatro pares homólogos de moléculas altamente relacionadas entre sí, entre las que se encuentra la avermectina B1 o abamectina.

De acuerdo con la clasificación de los modos de acción de insecticidas/acaricidas del IRAC (Insecticide Resistance Action Committee) (2013), pertenece al grupo 6: activador del canal del cloro. Las avermectinas se unen a los receptores del

84 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas neurotransmisor ácido gamma-aminobutírico (GABA) en las células nerviosas inhibidoras, creando una corriente de iones cloro constante hacia el interior de las células del músculo, que se traduce en una supresión continua de la contracción muscular, poniéndose de manifiesto con síntomas de parálisis (Clark et al., 1994).

En cuanto a su rango de acción, abamectina es un producto utilizado como acaricida, nematicida e insecticida (Tomlin, 2009). Como insecticida controla distintas especies de insectos pertenecientes a diferentes órdenes: lepidoptera, coleoptera, homoptera y diptera (Mei, et al., 2011). Actúa por ingestión y contacto, presentando movimiento translaminar (Tomlin, 2009).

En España está autorizado el uso de Vertimec 1,8 % EC (Syngenta Agro S.A.) en una amplia variedad de cultivos, siendo utilizado principalmente contra ácaros y minadores de hoja (Liriomyza spp. (Diptera: Agromyzidae) (MAGRAMA, 2013b).

5.1.1.2. Deltametrina.

Los piretroides son el mayor grupo de insecticidas neurotóxicos. Su origen insecticida viene dado por el extracto natural piretro, derivado de las flores del género Chrysanthemum (Asteraceae). Los primeros piretroides sintéticos fotoestables, con alta capacidad insecticida, baja toxicidad a mamíferos, y limitada persistencia en el suelo, se desarrollaron entre 1968-1974 por Michael Elliot y colaboradores en los laboratorios Rothamsted (Reino Unido). El primero de estos compuestos fue la permetrina, seguido a continuación por la cipermetrina y la deltametrina (Davies et al., 2007).

De acuerdo con la clasificación del IRAC (2013), deltametrina pertenece al grupo 3: moduladores del canal de sodio. Afecta al sistema nervioso, produciendo una apertura permanente de los canales de sodio que causan hiperexcitación, y en algunos casos bloqueo nervioso (Casida & Durkin, 2013).

Se trata de un producto con amplio espectro de actividad, por lo que se utiliza para controlar plagas de diferentes órdenes: coleoptera, lepidoptera, tisanoptera, homoptera, ortoptera, díptera, etc. Actúa por contacto e ingestión, tiene un elevado efecto de choque (Tomlin, 2009), y cierta actividad repelente (De Liñán, 2003). En nuestro estudio fue

85 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas empleado como control positivo para asegurar que bajo las condiciones de nuestros ensayos los dos enemigos naturales resultarían afectados.

En España el uso de la formulación utilizada en este estudio Decis 2,5 % EC (Bayer Crop Science S.L.), estaba autorizada en un elevado número de cultivos (De Liñán, 2010), y fue sustituida en 2011 por una nueva formulación, Decis Protech 1,5 % EW (Bayer Crop Science S.L.) (De Liñán, 2011).

5.1.1.3. Emamectina.

El benzoato de emamectina (denominado comúnmente como emamectina) es un derivado de la avermectina B1 o abamectina, anteriormente descrita. Fue descubierto en evaluaciones de selección in vivo (“screening”) en Helicoverpa virescens (Fabricius) (Lepidoptera: Noctuidae) y Spodoptera eridiana (Cramer) (Lepidoptera: Noctuidae) entre varios cientos de derivados de avermectinas (Jansson et al., 1996).

Al igual que abamectina, el modo de acción principal de la emamectina es la activación de los canales cloro (grupo 6 IRAC) descrito anteriormente. Emamectina ha sido desarrollado principalmente para el control de plagas pertenecientes al orden lepidoptera en una amplia variedad de cultivos (Tomlin, 2009). Actúa por ingestión y en menor medida por contacto (Dybas & Babu, 1988), y aunque presenta un movimiento translaminar no es un insecticida sistémico, ya que el movimiento está limitado a los tejidos de las hojas tratadas, y es casi inexistente en hojas adyacentes y demás partes de la planta (Willis & Mc Dowell, 1987).

En España el uso de Affirm 0,855 % SG (Syngenta Agro S.A.) está autorizado en cultivos hortícolas y vid (MAGRAMA, 2013c).

86 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.1.1.4. Flubendiamida.

Insecticida perteneciente al grupo químico de las diamidas. Los primeros pasos en el descubrimiento del compuesto flubendiamida fue llevado a cabo por investigadores del centro de investigación Nihon Nohyaku (Japón) durante el desarrollo de un herbicida, en el año 1993 (Lahm, et al., 2009).

Para clasificar a este plaguicida, IRAC ha creado un nuevo grupo principal/punto de acción primario, el 28: moduladores del receptor de rianodina, con acción nerviosa y muscular (IRAC, 2013). El receptor de rianodina, también conocido como el receptor del canal del calcio, debe su nombre al metabolito de origen vegetal rianodina, extraído de la planta Ryania speciosa Vahl (Salicaceae). El ión calcio juega un papel esencial en el sistema nervioso y el comportamiento de insectos (Liu, et al., 2010a), y dependiendo del tipo de célula en la cual es liberado se desencadenarán diferentes estímulos celulares o fisiológicos (Ebbinghaus-Kintscher et al., 2007). El compuesto flubendiamida activa el receptor de rianodina produciendo una liberación incontrolada de iones calcio (Casida & Durkin, 2013), lo que provoca alteraciones en la contracción muscular del insecto que se manifiestan con un rápido cese de la alimentación, regurgitación, letargo y parálisis (Lahm, et al., 2009).

Flubendiamida muestra una alta especificidad en el control de plagas pertenecientes al orden lepidóptera (Tohnishi, et al., 2005; Ebbinghaus-Kintscher, et al., 2007; Lahm, et al., 2009) y se ha mostrado ineficaz contra plagas pertenecientes a los órdenes coleoptera, homoptera o frente ácaros fitófagos (Hirooka, et al. 2007). Actúa por ingestión y presenta movimiento translaminar (Hirooka, et al., 2007; Lahm, et al., 2009; Tomlin, 2009).

En España el uso de Fenos 24 % WG (Bayer Crop Science S.L.) está permitido en cultivos hortícolas y en ornamentales herbáceas (MAGRAMA, 2013d).

87 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.1.1.5. Spinosad.

Spinosad es un compuesto derivado de la fermentación del actinomiceto Saccharopolyspora spinosa Mertz y Yao (Bacteria: Pseudonocardiaceae), mezcla de dos metabolitos (lactosas macrocíclicas), spinosin A y spinosin D (Thompson et al., 2002).

IRAC (2013) ha incluido a spinosad en el grupo 5: agonistas/antagonistas del receptor nicotínico de acetilcolina. La acción de este compuesto se sitúa principalmente sobre los receptores nicotínicos de la acetilcolina, donde ejerce un efecto sinérgico a la actividad de la acetilcolina pero en un lugar de actuación diferente. De esta manera, cuando se fija sobre el receptor permite la entrada de cationes, que al ser continua provoca una excitación constante de las células nerviosas, traduciéndose en contracciones musculares, temblores, parálisis y finalmente la muerte del insecto (Salgado, 1997, 1998; Medina et al., 2003a,b). Por otro lado, el spinosad probablemente también ejerce una acción adicional sobre los receptores del GABA, neurotransmisor que activa los canales que permiten el flujo de los iones hacia las células, provocando una sintomatología similar a la descrita anteriormente (Salgado 1997, 1998; Cleveland et al., 2002).

Spinosad es muy activo frente a dípteros (Adán et al., 1996), aunque se utiliza también para el control de lepidópteros, homópteros, tisanópteros y coleópteros en una amplia variedad de cultivos (Tomlin, 2009), y contra termitas (Dripps et al., 2011), teniendo actividad por contacto e ingestión (Tomlin, 2009).

En España el uso de Spintor 480 SC (Dow Agrosciences Ibérica S.A.) está permitido en cultivos hortícolas, vid y frutales (MAGRAMA, 2013e).

88 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.1.1.4. Spiromesifen.

Spiromesifen es el segundo compuesto descrito perteneciente a la clase química de los ácidos tetrónicos espirocíclicos, descubiertos por Bayer Crop Science en los años 90 (Bretschneider, et al., 2005). Su precursor fue spirodiclofen, y recientemente se ha introducido en el mercado el tercer compuesto perteneciente a esta familia, spirotetramat (Marĉić, et al., 2011).

IRAC (2013) lo ha incluido en el grupo 23: inhibidores de la acetil CoA carboxilasa, impidiendo la síntesis de lípidos necesarios para el desarrollo de los insectos (Tomlin, 2009). Su inclusión en este grupo se ha hecho con la salvedad de que no se ha identificado aún la proteína sobre la que actúa, y que es responsable del efecto biológico que produce.

Spiromesifen actúa contra moscas blancas (Bemisia spp. (Hemiptera: Aleyrodidae) y Trialeurodes spp. (Hemiptera: Aleyrodidae)), y ácaros tetraníquidos, como Tetranychus spp. tras su aplicación foliar (Nauen, et al., 2005). Su modo de acción principal es por contacto, aunque también alguna cantidad del insecticida puede penetrar dentro del tejido foliar (Marĉić, et al., 2011).

En España el uso de Oberon 24 % SC (Bayer Crop Science S.L.) está autorizado en cultivos hortícolas y ornamentales leñosas y herbáceas (MAGRAMA 2013f).

89 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.2. Materiales y métodos.

5.2.1. Insecticidas evaluados.

Las características de los insecticidas estudiados se dan en la tabla 18.

Tabla 18. Características de los insecticidas evaluados.

Ingrediente Concentración Incluido en el Concentración activo Modo de acción Producto/ máxima en Anexo I 1 (mg i.a./l) (i.a.) (IRAC) casa comercial hortícolas en 91/414/CEE3 España (cc/hl)2

Abamectina Activador canal de cloro Vertimec 1,8 % EC/ 100 18 Sí Syngenta Agro S.A.

Deltametrina Moduladores del canal Decis 2,5 % EC/ 50 12,5 Sí de sodio Bayer Cropscience S.L.

Emamectina Activador canal de cloro Affirm 0,855 % SG/ 150 12,82 Pendiente 4 Syngenta Agro S.A.

Flubendiamida Moduladores del receptor Fenos 24 % WG/ 25 60 Pendiente 4 de rianodina Bayer Cropscience S.L.

Agonistas/antagonistas Spintor 480 SC/ Spinosad del receptor de nicotínico Dow Agrosciences 25 120 Sí acetilcolina Ibérica

Spiromesifen Inhibidores de la acetil Oberon 24 % SC/ 60 144 Sí CoA carboxilasa Bayer Cropscience S.L.

EC, Concentrado emulsionable; SG, Gránulos solubles en agua; SC, Suspensión concentrada; WG, Granulado dispersable en agua; i.a., ingrediente activo. 1IRAC ((Insecticide Resistance Action Committee). 2Producto comercial. 3Sustancias incluidas en el anexo I de la Directiva 91/414/CEE trasladadas al anexo I del Reglamento Nº 1107/2009 (MAGRAMA 2013a). 4Con registro excepcional en España: Emamectina (27-7-2010 a 31-1-2015) (MAGRAMA 2013c); Flubendiamida (5-7-2010 a 30-4-2015) (MAGRAMA 2013d).

90 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.2.2. Clasificación de los insecticidas.

Para cada parámetro estudiado, los valores medios de mortalidad se corrigieron por la fórmula de Schneider-Orelli:

Y las reducciones en fecundidad, fertilidad y descendencia se calcularon por la fórmula de Abbot:

Una vez obtenidos los valores corregidos, se utilizaron para clasificar los insecticidas según propone la OILB (Hassan, 1994) (Tabla 19).

Tabla 19. Clasificación de los productos fitosanitarios según el efecto sobre los organismos en: a. Ensayos de laboratorio, laboratorio extendido, semi-campo y campo.

Laboratorio extendido / Categorías OILB Laboratorio Semi-campo / Campo

1. Inocuo <30% <25% 2. Ligeramente tóxico 30–79% 25-50% 3. Moderadamente tóxico 80–99% 51-75% 4. Tóxico >99% >75% b. Ensayos de persistencia.

Categorías OILB Persistencia (días) A. Poco persistente <5 B. Ligeramente persistente 5-15 C. Moderadamente persistente 16-30 D. Persistente >30

91 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.2.3. Resumen de los ensayos realizados con insecticidas.

A continuación se resumen los ensayos realizados con insecticidas en los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis (Figura 84).

Figura 84. Resumen de ensayos realizados con insecticidas en los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis.

O. laevigatus

Adultos (estado menos susceptible) N. tenuis Ensayos de laboratorio, contacto residual sobre placas de cristal O. laevigatus

Ninfas N2 (estadio más susceptible) N. tenuis O. laevigatus

Persistencia, sobre plantas de Adultos pimiento o tomate (estado menos susceptible)

N. tenuis

5.2.4. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio.

En la aplicación residual de los compuestos se utilizó la Torre de Potter (Figura 85), un pulverizador automático que permite la distribución del producto de manera uniforme por toda la superficie a tratar y con el tamaño de gota más pequeño posible (Potter, 1952).

En el cálculo de las soluciones se utilizó el PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration) (Barret et al., 1994) (Tabla 20), el cual es función de la dosis máxima aplicada en campo del insecticida, y del gasto de agua para cada tipo de cultivo considerando un factor de corrección. Esta fórmula propuesta por la OILB en 1993, es

92 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas el resultado de medir los residuos foliares en campo después de haber realizado un tratamiento racional con el producto.

Tabla 20. Cálculo del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration).

PIEC (g/cm2) = DMC * fd / 100 DMC (g/ha) = Dosis máxima de campo fd = factor de corrección

En los ensayos se usó el PIEC (300), debido a que el gasto de agua considerado habitual en cultivos hortícolas es de 300 l/ha. La dosis máxima de campo se obtuvo en base a las indicaciones del vademécum de productos sanitarios en cultivos hortícolas (De Liñán, 2011), a excepción de Decis 2,5 % EC (deltametrina) (De Liñán, 2010), que fue sustituida en 2011 por una nueva formulación, Decis Protech 1,5 % EW (Bayer Crop Science S.L.) (De Liñán, 2011).

El factor de corrección empleado fue 1, que es el valor correspondiente para cultivos herbáceos.

Tabla 21. Valores del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration) para los insecticidas evaluados.

Ingrediente activo PIEC (/cm2)

Abamectina 3 Deltametrina 1,5

Emamectina 4,5 Flubendiamida 0,75 Spinosad 0,75 Spiromesifen 1,8

93 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Para calcular las soluciones de los compuestos en cada aplicación residual, además del PIEC, es necesario conocer el valor medio de pulverización con el que se está trabajando, que no deberá ser menor de 1 mg/cm², ni superar los 2 mg/cm², con una variación del 10 % como máximo (Vogt et al., 1998). Por ello, antes de comenzar a tratar las repeticiones en cada uno de los ensayos, se pulverizó un 1 ml de agua destilada sobre un porta de peso y área conocida, y pesado de nuevo para calcular la cantidad de agua que quedó en la superficie. La operación se repetía diez veces, secando el porta cuidadosamente entre ellas para finalmente hallarse la media, que es el valor del residuo por área tratada.

El equipo de pulverización debe estar previamente calibrado a una presión de 50 Kpa y limpio de posibles residuos antes de comenzar el ensayo. Por ello, entre la aplicación de los diferentes tratamientos, se lavó la Torre de Potter con agua destilada y acetona. Las placas de cristal pulverizadas (12 X 12 X 0,5 cm) en los ensayos por contacto residual se dejaban secar antes de montar las unidades de ensayo (Figura 86).

Figura 85. Torre de Potter. Figura 86. Placas de vidrio (12 X 12 X 0,5 cm).

En los ensayos se evaluó la mortalidad (efecto letal) y parámetros reproductivos (efecto subletal) cuando el porcentaje de supervivientes fue de al menos el 50 %. A continuación se resumen los parámetros evaluados en los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis (Tablas 22-24).

94 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 22. Parámetros evaluados en adultos de O. laevigatus y N. tenuis.

Adultos Mortalidad: 72 horas (O. laevigatus y N. tenuis)

Durante 6 días

Fecundidad: nºhuevos/hembra/día (O. laevigatus)

Fertilidad: % huevos eclosados (O. laevigatus) Descendencia: nºninfas/hembra/día (N. tenuis)

Tabla 23. Parámetros evaluados en ninfas N2 de O. laevigatus.

Ninfas N2 de O. laevigatus Mortalidad: 72 horas, 7 días y 11 días Durante 6 días en adultos Fecundidad: nºhuevos/hembra/día Fertilidad: % huevos eclosados

Tabla 24. Parámetros evaluados en ninfas N2 de N. tenuis.

Ninfas N2 de N. tenuis Mortalidad: 72 horas, 5 días y 10 días Durante 6 días en adultos Descendencia: nºninfas/hembra/día

La unidad experimental consistió en 15 adultos (estado menos susceptible) ó ninfas N2 (estadio más susceptible) de O. laevigatus ó N. tenuis confinados en cajas de ensayo diseñadas por Jacas y Viñuela (1994). La parte superior e inferior de las cajas consistía en placas de cristal tratadas con los insecticidas evaluados. Ambas placas estaban conectadas entre sí por medio de un aro de metacrilato (10 cm de diámetro X 3 cm de altura), con un orificio de 0,5 cm de diámetro, en el cual se colocó una aguja hipodérmica conectada a un circuito de ventilación forzada durante todo el periodo de evaluación para evitar la acumulación de vapores (Figura 87). En el interior de las cajas

95 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

se ofrecieron huevos de E. kuehniella como alimento y un trozo de judía verde como fuente de líquido (Figura 88). Se hicieron cinco repeticiones por tratamiento (75 insectos en total por tratamiento), con un tiempo de exposición de 72 horas en el caso de adultos.

En el caso de ninfas N2, el tiempo de exposición fue función del tiempo que tardaban en completar su ciclo biológico, permaneciendo en la unidad de ensayo hasta que al menos el 80 % de los individuos que formaban parte del tratamiento control no alcanzasen su estado adulto, 11 días en el caso de O. laevigatus, y 10 días para N. tenuis (Castañé et al., 1996; Bakker et al. 2000; Tedeschi et al., 2002; Van de Veire et al., 2002a).

Figura 87. Unidad experimental de ensayo Figura 88. Judía verde y huevos de E. kuehniella. de contacto residual.

Los adultos supervivientes por tratamiento se sexaron bajo lupa binocular, para posteriormente reagruparlos en cajas de plástico redondas (O. laevigatus, 11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro; N. tenuis, 9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro) sin residuos de insecticidas para evaluar sus parámetros reproductivos.

En el caso de O. laevigatus 3 machos y 3 hembras supervivientes (Cocuzza et al., 1997b) eran introducidos por cada unidad de ensayo hasta formar 4 repeticiones por compuesto a evaluar (24 insectos en total por tratamiento). Cada unidad de ensayo constaba de una vaina de judía verde, la cual servía de sustrato de oviposición y fuente de líquido, y 0,4 gr de huevos de E. kuehniella (Figura 89). Cada dos días, durante un periodo de seis, se reponía el sustrato de oviposición y se contaban el número de huevos depositados en cada vaina de judía verde. Las vainas de judía con puesta se introducían en nuevas cajas de plástico redondas (9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación 5,5

96 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

cm. diámetro) (Figura 90) y en un plazo de siete días se contaban el porcentaje de huevos eclosados.

Figura 89. Cajas de evaluación de fecundidad Figura 90. Detalle de caja de evaluación en O. laevigatus (11,5 cm diámetro, 5 cm de de fertilidad en O. laevigatus (9 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro).

En el caso de N. tenuis un macho y una hembra supervivientes eran introducidos por cada unidad de ensayo hasta formar 12 repeticiones por compuesto a evaluar (24 insectos en total por tratamiento) (Lara et al., 2010). Cada unidad de ensayo constaba de una vaina de judía verde la cual servía de sustrato de oviposición y fuente de líquido, y 0,4 gr de huevos de E. kuehniella (Figura 91). Cada 2 días durante un periodo de seis se reponía el sustrato de oviposición, siendo las vainas de judía repuestas introducidas en vasos de plástico (8 cm de diámetro, 11 cm de altura) cubiertos con visillo por la parte superior (Figuras 92). En un plazo de once días se contaba el número de ninfas emergidas.

Figura 91. Cajas de evaluación de descendencia Figura 92. Vasos de evaluación de descendencia en N. tenuis (9 cm diámetro, 3 cm de altura, en N. tenuis (8 cm de diámetro, 11 cm de altura). ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro).

97 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.2.5. Persistencia.

Los ensayos de persistencia en adultos de O. laevigatus y N. tenuis se llevaron a cabo en aquellos compuestos que en laboratorio por contacto residual no fueron clasificados según la OILB categoría 1 (inocuos).

Para determinar la persistencia de los insecticidas, ambos chinches depredadores se expusieron a los residuos de los plaguicidas a diferentes intervalos de tiempo (0, 4, 7, 14, 21 y 31 días) hasta la pérdida de su toxicidad (categoría 1 OILB para laboratorio extendido), clasificándolos en cuatro categorías según el tiempo que ésta tarda en alcanzarse, A-B-C-D (A=poco persistente, <5 días, B=ligeramente persistente, 5-15 días, C=moderadamente persistente, 16-30 días, D=persistente >30 días) (Hassan, 1994)..

Como sustrato se utilizaron plantas de pimiento (30-40 cm de altura) en el caso de O. laevigatus (Figura 93), o plantas de tomate (50 cm de altura) en el caso de N. tenuis (Figura 94). Las plantas fueron tratadas con un pulverizador manual hasta punto de goteo (Figuras 95-96), permaneciendo en el invernadero durante la totalidad del ensayo. Para evaluar cada tratamiento, las hojas se cortaron a diferentes intervalos de tiempo como se ha mencionado anteriormente, y se introdujeron en un eppendorf de 1,5 ml con una solución de 1,5 % de agar nutritivo, con el fin de asegurar la hidratación de las hojas. A continuación, las hojas eran colocadas en una caja de plástico redonda (11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro) (Figuras 97-98). En cada una de las unidades de ensayo (5 repeticiones por compuesto a evaluar) se introdujeron 15 adultos de O. laevigatus o N. tenuis (75 adultos en total por tratamiento) a los que se les suministró 0,4 gr huevos de E. kuehniella.

Para cada uno de los residuos del insecticida, la mortalidad fue evaluada tras 72 horas, siendo además evaluados los parámetros reproductivos cuando el plaguicida resultó inocuo (categoría 1 OILB para laboratorio extendido) para el parámetro de mortalidad. En su evaluación se siguió la misma metodología que en el punto 5.2.4.

98 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 93. Planta de pimiento (30-40 cm de altura). Figura 94. Planta de tomate (50 cm de altura).

Figura 95. Planta de pimiento tras el tratamiento. Figura 96. Planta de tomate tras el tratamiento. con el insecticida. con el insecticida.

Figura 97. Unidad experimental de O. laevigatus Figura 98. Unidad experimental de N. tenuis en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, en el ensayo de persistencia (11,5 cm de 5 cm de altura, ventilación en la tapa de diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la 5,5 cm de diámetro). . tapa de 5,5 cm. de diámetro)

99 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.3. Resultados.

5.3.1. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio

5.3.1.1. Orius laevigatus.

En las tablas 25 y 26 se muestra un resumen de los resultados tras la exposición de adultos y ninfas N2 de O. laevigatus al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal durante 72 horas y 11 días, respectivamente. Para ambos estados los efectos insecticidas fueron similares, produciéndose diferencias estadísticamente significativas con respecto al control en adultos a las 72 horas (F6,27=328,35; P<0,05) y en ninfas N2 a las 72 horas, (K=32,69; P<0,05), 7 días (F3,16=169,90; P<0,05) y 11 días (F3,16=95,46; P<0,05).

En cuanto a la mortalidad, los compuestos abamectina, deltametrina y spinosad fueron los que produjeron una mayor toxicidad, con valores del 100 % en adultos y ninfas N2 tras 72 horas de exposición. En el caso de emamectina, los porcentajes de mortalidad producidos en adultos y ninfas N2 fueron similares tras 72 horas de exposición, 46,66 % y 53,33 %, respectivamente. Sin embargo, sólo el 8 % de las ninfas

N2 fueron capaces de alcanzar el estado adulto tras su exposición al insecticida durante 11 días. Por otro lado, los compuestos flubendiamida y spiromesifen produjeron las mortalidades más bajas para ambos estados de O. laevigatus. Sus porcentajes de mortalidad fueron respectivamente del 5-12 % para adultos, y del 13,33-21,33 % para ninfas N2 (Figuras 99-100).

100 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 25. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en adultos de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Compuestos Mortalidad Incremento Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación 72 h (%)1 (%)2 (huevos/♀/día) 1 (%)3 (%)1 (%)3 OILB4 (efecto total) Control 7,99 ± 2,49 a ------5,50 ± 0,84 a ------83,67 ± 0,31 a ------Abamectina 100 ± 0 c 100 ------4 Deltametrina 100 ± 0 c 100 ------4 Emamectina 46,66 ± 3,65 b 42,03 4,47 ± 0,86 a 18,73 76,43 ± 3,55 a 8,65 2 Flubendiamida 4,99 ± 1,66 a -3,26 6,33 ± 0,77 a -15,09 82,29 ± 0,23 a 1,65 1 Spinosad 98,66 ± 1,33 c 98,54 ------3 Spiromesifen 11,99 ± 5,33 a 4,35 5,92 ± 0,99 a -7,64 82,27 ± 0,20 a 1,67 1 F (g.l.) o K 328,25 (6;27) ------0,83 (3;12) ------3,23 (3;12) ------P <0,05 ------0,50 ------0,06 ------1 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05). 2 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 3 Fecundidad y fertilidad corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

101 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 26. Porcentajes de mortalidad, fecundidad y fertilidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas de cristal en laboratorio.

Incremento Compuestos Mortalidad Mortalidad Mortalidad a los Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación 72 h (%)1 7 días (%)1 11 días (%)1 11 días (huevos/♀/día) 1 (%)3 (%)1 (%)3 OILB4 (%)2 (efecto total) Control 1,33 ± 1,33 a 10,66 ± 2.66 a 15,99 ± 4,52 a ------7,32 ± 0,47 a ------71,42 ± 2,59 a ------Abamectina 100 ± 0 c ------100 ------4 Deltametrina 100 ± 0 c ------100 ------4 Emamectina 53,33 ± 3,65 b 89,33 ± 2,66 b 91,99 ± 3,26 b 90,47 ------3 Flubendiamida 3,99 ± 1,63 a 9,33 ± 3,99 a 13,33 ± 2,98 a -3,17 6,91 ± 0,78 a 5,60 69,60 ± 3,79 a 2,55 1 Spinosad 100 ± 0 c ------100 ------4 Spiromesifen 0 ± 0 a 11,99 ± 2,49 a 21,33 ± 4,42 a 6,36 7,14 ± 0,66 a 2,46 75,37 ± 3,39 a -5,53 1 F (g.l.) o K 32,69 169,90 (3;16) 95,46 (3;16) ------0,10 (2;9) ------0,80 (2;9) ------P <0,05 <0,05 <0,05 ------0,90 ------0,48 ------1 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05). 2 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 3 Fecundidad y fertilidad corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

102 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 99. Porcentajes de mortalidad en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

c c c 100

80 60 b 40

20 a

% Mortalidad 72 h a a 0 Control Spinosad Abamectina Emamectina Deltametrina Spiromesifen Flubendiamida Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

100 c c c b b 90 80 Control 70 b Abamectina 60 Deltametrina 50 Emamectina 40 Flubendiamida

% Mortalidad 30 a a Spinosad 20 a a a a Spiromesifen 10 a a a 0 72 h 7 días 11 días

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

103 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Respecto a la reproducción, tras la evaluación de los parámetros de fecundidad y fertilidad se vio que no hubo diferencias estadísticamente significativas ni en los tratamientos de adultos (F3,12=0,83; P=0,50 y F3,12=3,23; P=0,06) (Tabla 25), ni en los de ninfas N2 de O. laevigatus (F2,9=0,10; P=0,90 y F2,9=0,80; P=0,48) (Tabla 26).

En el caso de adultos, la fecundidad fue de 6,33, 5,92, y 4,47 huevos por hembra y día para los compuestos flubendiamida, spiromesifen y emamectina, respectivamente, con una fertilidad entorno al 80 % (Figuras 101-102).

Figura 101. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

8 a a a 6 a

2 Nº huevos / hembra/día / huevos Nº

0 Control Emamectina Flubendiamida Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

104 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 102. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

100 a a a a 80

% Huevos eclosados Huevos % 20

0 Control Emamectina Flubendiamida Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

En el caso de aquellas ninfas N2 que consiguieron llevar al estado adulto, la fecundidad se situó entorno a 7 huevos por hembra y día para los compuestos flubendiamida y spiromesifen, y la fertilidad fue del 69,6 % y 75,37 %, respectivamente (Figuras 103- 104).

Figura 103. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus expuestas al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas de cristal en laboratorio.

8 a a a

2 Nº huevos / hembra/día / huevos Nº

0 Control Flubendiamida Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

105 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

100 a 80 a a

% Huevos eclosados Huevos % 20

0 Control Flubendiamida Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

Por lo tanto según los resultados obtenidos tras la exposición de adultos y ninfas N2 de O. laevigatus al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal, y siguiendo la clasificación de la OILB, los plaguicidas pueden clasificarse en base a su efecto total como:

Tabla 27. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.

Clasificación OILB1 (efecto total) Compuestos O. laevigatus: Contacto residual en laboratorio

Adultos Ninfas N2 Abamectina 4 4 Deltametrina 4 4 Emamectina 2 3 Flubendiamida 1 1 Spinosad 3 4 Spiromesifen 1 1 1Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

106 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.3.1.2. Nesidiocoris tenuis.

En las tablas 28 y 29 se muestra un resumen de los resultados tras la exposición de adultos y ninfas N2 de N. tenuis al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal durante 72 horas y 10 días, respectivamente. Para ambos estados los efectos insecticidas fueron similares, produciéndose diferencias estadísticamente significativas con respecto el control en adultos a las 72 horas (F6,28=33,44; P<0,05) y en ninfas N2 a las 72 horas (F6,28=21,76; P<0,05), 5 días (F6,28=28,40; P<0,05) y 10 días (F6,28=44,60; P<0,05).

En cuanto a la mortalidad, los compuestos abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad produjeron las mortalidades más elevadas tanto en adultos, como en ninfas N2. En adultos, los porcentajes de mortalidad fueron superiores al 50 % para todos los compuestos anteriormente mencionados tras 72 horas de exposición. En el caso de ninfas N2, aunque se supone que es el estado más expuesto, las mortalidades fueron menores, entorno al 40 % tras 10 días de contacto, excepto para emamectina que alcanzó el 86,66 %. Por otro lado, los compuestos flubendiamida y spiromesifen produjeron las mortalidades más bajas para ambos estados de N. tenuis. Situándose sus porcentajes de mortalidad entre el 4-6 % en el caso de adultos, y entre un 12-22 % en ninfas N2 (Figuras 105-106).

107 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 28. Porcentajes de mortalidad y descendencia en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Compuestos Mortalidad Incremento Descendencia Reducción Clasificación 72 h (%)1 (%)2 (ninfas/♀/día) 1 (%)3 OILB4 (efecto total) Control 1,33 ± 1,33 a ------6,43 ± 0,46 a ------Abamectina 54,28 ± 8,06 b 53,66 ------2 Deltametrina 54,50 ± 4,83 b 53,89 ------2 Emamectina 60,14 ± 7,69 bc 59,60 ------2 Flubendiamida 6,66 ± 2,98 a 5,40 4,95 ± 0,19 a 23,02 1 Spinosad 71,05 ± 5,66 c 70,66 ------2 Spiromesifen 3,99 ± 2,66 a 2,70 6,24 ± 0,73 a 2,95 1 F (g.l.) o K 33,44 (6;28) ------2,95 (2;26) ------P <0,05 ------0,07 ------1 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0.05) 2 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 3 Descendencia corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

108 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 29. Porcentajes de mortalidad y descendencia en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal en laboratorio.

Incremento Clasificación Compuestos Mortalidad Mortalidad Mortalidad a los Descendencia Reducción OILB4 72 h (%)1 5 días (%)1 10 días (%)1 10 días (ninfas/♀/día) 1 (%)3 (efecto total) (%)2

Control 1,11 ± 1,1a 2,64 ± 1,65 a 12,86 ± 3,11 a ------5,01 ± 0,53 a ------Abamectina 14,91 ± 2,80 bc 22,53 ± 5,95 c 42,37 ± 5,41 b 34,23 2,23 ± 0,66 a 55,49 2 Deltametrina 25,78 ± 7,01 c 28,93 ± 7,13 c 41,38 ± 4,19 b 32,73 4,13 ± 0,57 a 17,56 2 Emamectina 67,99 ± 3,88 d 74,66 ± 5,33 d 86,66 ± 3,65 c 84,69 ------3 Flubendiamida 4,63 ± 1,90 ab 10,29 ± 1,99 ab 21,93 ± 3,58 a 10,4 4,30 ± 0,81 a 14,17 1 Spinosad 15,90 ± 6,97 bc 18,28 ± 5,15 bc 40,67 ± 2,72 b 31,91 5,13 ± 0,62 a -2,40 2

Spiromesifen 0 ± 0 a 3,89 ± 1,62 a 11,98 ± 3,66 a -1,01 4,77 ± 0,76 a 4,79 1 F (g.l.) o K 21,76 (6;28) 28,40 (6;28) 44,60 (6,28) ------2,30 (5;64) ------P <0,05 <0,05 <0,05 ------0,055 ------1 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0.05)

2 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 3 Descendencia corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio en base al efecto total del insecticida: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

109 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 105. Porcentajes de mortalidad en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

100 c 80 b bc 60 b 40 20 a

% Mortalidad 72 h a a 0 Control Spinosad Emamectina Abamectina Deltametrina Spiromesifen Flubendiamida Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

100 c

80 d d Control Abamectina 60 Deltametrina b b b Emamectina 40 c Flubendiamida % Mortalidad c c a Spinosad bc bc bc Spiromesifen 20 ab a a a ab a a a 0 72 h 5 días 10 días

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

110 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Respecto a la reproducción, para el parámetro de descendencia se vio que no hubo diferencias estadísticamente significativas ni en los tratamientos de adultos (F2,26=2,95;

P=0,07) (Tabla 28), ni en los de ninfas N2 (F5,64=2,30; P=0,055) (Tabla 29). Sin embargo, abamectina produjo una reducción en la descendencia del 55,49 % (Tabla 29).

En adultos, el número de ninfas por hembra y día fueron de 4,95 y 6,24 para los compuestos flubendiamida y spiromesifen, respectivamente. (Figura 107).

Figura 107. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

8 a a 6 a

Nº / ninfas hembra/día 2

0 Control Flubendiamida Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

111 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

En el caso de aquellas ninfas N2 que consiguieron llevar al estado adulto, el número de ninfas por hembra y día osciló entre 2,23-5,13 (Figura 108).

6 a a a a a 4 a

Nº ninfas / hembra/día 2

0 Control Abamectina Deltametrina Flubendiamida Spinosad Spiromesifen Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

112 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Por lo tanto según los resultados obtenidos tras la exposición de adultos y ninfas N2 de N. tenuis al residuo fresco de los compuestos sobre placas de cristal, y siguiendo la clasificación de la OILB, los plaguicidas pueden clasificarse en base a su efecto total como:

Tabla 30. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de N. tenuis tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio.

Clasificación OILB1 (efecto total) Compuestos N. tenuis: Contacto residual en laboratorio

Adultos Ninfas N2 Abamectina 2 2 Deltametrina 2 2 Emamectina 2 3 Flubendiamida 1 1 Spinosad 2 2 Spiromesifen 1 1 1Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio: 1=inocuo (reducción<30%), 2=ligeramente tóxico (reducción 30-79%), 3=moderadamente tóxico (reducción 80-99%) y 4=tóxico (reducción>99%)

113 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.3.2. Persistencia.

5.3.2.1. Orius laevigatus.

En la figura 109 se muestran las condiciones ambientales registradas en el invernadero durante la degradación de los residuos en plantas de pimiento.

Figura 109. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Condiciones ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre-Octubre del 2010.

25 100

80 20

60 15 40 HR media (%) 10 20 Temperatura media (ºC)

5 0 2-X 4-X 6-X 8-X 2-X 4-X 6-X 8-X 10-X 12-X 14-X 16-X 18-X 20-X 10-X 12-X 14-X 16-X 18-X 20-X 20-IX 22-IX 24-IX 26-IX 28-IX 30-IX 20-IX 22-IX 24-IX 26-IX 28-IX 30-IX Días de ensayo Días de ensayo

2500 160

140 2000

mol/m2*s) 120 100

mol/m2*s) 1500 PAR interior UV interior 80 PAR exterior UV exterior 1000 60

PAR medio ( 500 20

0 0 Radiación UV media (

-X -X -X 2-IX 6-IX 8-IX 2-X 4-X 6-X 8 2 4 8-X 2-X 4-X 6-X 8-X 20-IX 2 24-IX 2 2 30-IX 10-X 1 1 16-X 1 20-X 10-X 12-X 14-X 16-X 18-X 20-X 20-IX 22-IX 24-IX 26-IX 28-IX 30-IX Días de ensayo Días de ensayo

La temperatura media registrada durante el ensayo se situó entorno a los 20 ± 5 ºC, a excepción de los últimos días de ensayo, que cayó por debajo de 15 ºC a causa de una avería en la calefacción del invernadero. La humedad relativa media osciló entre un 60- 80 %, la radiación PAR media en el invernadero fue un 31 % menor que en el exterior, y la radiación UV media un 48 % menor. Un resumen de los valores medios, máximos y mínimos de radiación registrados en el invernadero durante el ensayo se dan en la tabla 31.

114 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 31. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Resumen de las radiaciones PAR y UV registradas en el interior del invernadero en Septiembre del 2010.

PAR interior UV interior (mol/m2*s) (mol/m2*s) Medio 846,6 ± 55,85 41,9 ± 3,81 Máximo 1285 79,2 Mínimo 175 8,3

En la tabla 32 se muestran los datos de mortalidad en adultos de O. laevigatus, tras su exposición durante 72 horas al residuo de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento. Se produjeron diferencias estadísticamente significativas con respecto al control en todos los intervalos de tiempo evaluados, residuo de 0 días

(F4,20=51,08; P<0,05), 4 días (F4,19=40,28; P<0,05), 7 días (F4,20=73,10; P<0,05), 14 días

(F3,16=382,42; P<0,05), 21 días (F3,15=42,76; P<0,05) y 31 días (F3,16=26,51; P<0,05).

Los compuestos abamectina y deltametrina produjeron mortalidades superiores al 85 % en adultos de O. laevigatus durante toda la duración del ensayo (31 días). Incluso cuando los adultos del chinche depredador se expusieron al residuo de 31 días de abamectina y deltametrina, se produjeron mortalidades del 90,66 % y 87,99 %, respectivamente. Por otro lado, el compuesto spinosad también produjo mortalidades elevadas durante todo el ensayo con valores que oscilaron entre el 86,66 % y el 43,99 %. Sin embargo, se observó una progresiva degradación del insecticida a partir del día 14 de ensayo, como puede apreciarse en los porcentajes de mortalidad registrados los días 14, 21 y 31, 75,99 %, 49,32 % y 43,99 %, respectivamente. En el caso de emamectina, hubo una mortalidad superior al 40 % cuando los adultos de O. laevigatus se expusieron al residuo de 0 y 4 días. Sin embargo, tras exponerse al residuo de 7 días la mortalidad fue sensiblemente menor (26,66 %) (Figura 110).

115 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 32. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).

0 DDT1 4 DDT1 7 DDT1 14 DDT1 21 DDT1 31 DDT1

Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Mortalidad Clasificación Compuestos 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 72 h (%)2 OILB5 (efecto total) (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ (Incremento (%)3)/ OILB4 OILB4 OILB4 OILB4 OILB4 OILB4

Control 9,33 ± 3,99 a 6,66 ± 3,84 a 6,66 ± 4,21 a 5,32 ± 1,33 a 4,99 ± 1,66 a 2,66 ± 1,63 a ------Abamectina 100 ± 0 c 100 ± 0 c 100 ± 0 d 100 ± 0 c 91,99 ± 2,49 c 90,66 ± 4,98 c D (100)/4 (100)/4 (100)/4 (100)/4 (91,57)/4 (90,40)/4 Deltametrina 100 ± 0 c 100 ± 0 c 100 ± 0 d 97,33 ± 1,63 c 96,00 ± 4,00 c 87,99 ± 10,41 c D (100)/4 (100)/4 (100)/4 (97,18)4 (95,79)/4 (87,66)/4 Emamectina 54,66 ± 7,7 b 42,66 ± 8,58 b 26,66 ± 8,94 b ------B (49,99)/2 (38,57)/2 (21,43)/1 Spinosad 86,66 ± 8,43 c 82,66 ± 9,56 c 77,32 ± 5,41 c 75,99 ± 4,00 b 49,32 ± 9,79 b 43,99 ± 10,45 b D (85,29)/4 (81,42)/4 (75,70)/4 (74,64)/3 (46,66)/2 (42,46)/2 F (g.l.) o K 51,08 (4;20) 40,28 (4;19) 73,10 (4;20) 382,42 (3;16) 42,76 (3;15) 26,51 (3;16) ------P <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 <0,05 ------1 DDT=Días después de tratamiento 2 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05) 3 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico (reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción 51-75%) y 4=tóxico (reducción>75%) 5 Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)

116 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 110. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).

c c cc d d c c c c 100 c c c c 90 c 80 b 70 b b Control 60 b b Abamectina 50 Deltametrina 40 b Emamectina 30 Spinosad % Mortalidad 72 h 20 a a a 10 a a a 0 Residuo 0 Residuo 4 Residuo 7 Residuo 14 Residuo 21 Residuo 31 días días días días días días

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P>0,05).

En el caso de emamectina, se evaluaron los posibles efectos subletales que el residuo de 7 días podría haber ocasionado en los parámetros reproductivos de fecundidad y fertilidad. No hubo diferencias estadísticamente significativas con respecto el control para el número de huevos por hembra y día (t=0,38; P=0,71), y porcentaje de eclosión de los mismos (t=-1,18; P=0,28), siendo los valores de 5,77 y del 85,41 %, respectivamente (Tabla 33).

117 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 33. Fecundidad y fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras exponerse al residuo de 7 días de emamectina durante 72 horas sobre hoja de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).

Compuestos Fecundidad Reducción Fertilidad Reducción Clasificación (huevos/♀/día) 1 (%)2 (%)1 (%)2 OILB3

Control 6,44 ± 1.21 a ------80,05 ± 3,36 a ------Emamectina 5,77 ± 1.23 a 10,40 85,41 ± 3,00 a -6,70 1 t 0,38 ------1,18 ------P 0,71 ------0,28 ------1 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (t-Student; P≥0,05) 2 Fecundidad y fertilidad corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 3 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico (reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción 51-75%) y 4=tóxico (reducción>75%)

Por lo tanto según los resultados obtenidos en el ensayo de persistencia con adultos de O. laevigatus y siguiendo la clasificación de la OILB, los productos se clasificaron en base a su efecto total como:

Tabla 34. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas en adultos de O. laevigatus cuando se aplicaron sobre plantas de pimiento y degradaron en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s).

Clasificación OILB1 (efecto total)

Compuestos O. laevigatus: Persistencia en plantas de pimiento

Adultos Abamectina D Deltametrina D Emamectina B Spinosad D 1 Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)

118 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.3.2.2. Nesidiocoris tenuis.

En la figura 111 se muestran las condiciones ambientales registradas en el invernadero durante la degradación de los residuos en plantas de tomate.

Figura 111. Ensayo de persistencia sobre tomate en el enemigo natural N. tenuis. Condiciones ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre del 2011.

30 100

25 80

20 60

15 40 HR media (%)

Temperatura media (ºC) 20

5 0 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX Días de ensayo Días de ensayo

2500 180 160 2000 140 mol/m2*s)

120 1500 mol/m2*s)

PAR interior 100 UV interior PAR exterior 80 UV exterior 1000 60

PAR medio ( 500 40 20

0 Radiación UV media ( 0 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX 14-IX 15-IX 16-IX 17-IX 18-IX Días de ensayo Días de ensayo

La temperatura media y humedad relativa registrada durante el ensayo se situó entorno a los 20 ± 5 ºC y 60-75 %, respectivamente. Las medidas puntuales medias diarias del PAR y radiación UV en el interior del módulo invernadero fueron muy constantes, siendo su media en el transcurso del estudio de 1161,7 ± 43,38 mol/m2*s y 78,4 ± 3,36 mol/m2*s, respectivamente.

119 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

En la tabla 35 se muestran los datos de mortalidad en adultos de N. tenuis, tras su exposición durante 72 horas a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas de tomate. El residuo de 0 días de los compuestos abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad produjo una ligera mortalidad en adultos de N. tenuis, habiendo diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (F4,20=9,21; P<0,05). El compuesto más tóxico fue abamectina, con un porcentaje de mortalidad del 51,99 %, seguido de deltametrina, emamectina y spinosad, con mortalidades del 37,44 %, 37,61 % y 35,15 %, respectivamente. Esta toxicidad inicial se vio reducida cuando adultos del chinche depredador se expusieron al residuo de 4 días de los compuestos evaluados, no habiendo diferencias estadísticamente significativas con respecto al control (F4,20=1,19, P=0,34), y no superándose el 20 % de mortalidad en ninguno de los compuestos. (Figura 112)

120 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Tabla 35. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas y descendencia en adultos de N. tenuis tras exponerse a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

0 DDT1 4 DDT1 4 DDT1 Incremento Incremento Reducción Clasificación Compuestos Mortalidad (%)3/ Mortalidad (%)3/ Descendencia (%)5/ OILB6 72 h (%)2 OILB4 72 h (%)2 OILB4 (ninfas/♀/día) 2 OILB4 (efecto total)

Control 7,99 ± 5,33 a ------7,99 ± 5,33 a ------8,22 ± 0,96 a ------Abamectina 51,99 ± 8,27 c 47,82/2 15,99 ± 4,52 a 8,69/1 9,61 ± 0,79 a -16,91/1 A Deltametrina 37,44 ± 4,43 bc 32,01/2 14,66 ± 3,88 a 7,25/1 8,02 ± 0,62 a 2,43/1 A Emamectina 37,61 ± 4,74 bc 32,19/2 7,99 ± 2,66 a 0/1 6,21 ± 0,44 a 24,45/1 A Spinosad 35,15 ± 0,46 b 29,52/2 18,66 ± 3,26 a 11,60/1 7,81 ± 1,15 a 4,99/1 A F (g,l,) o K 13,06 ------1,19 (4,20) ------2,37 (4;51) ------P <0,05 ------0,34 ------0,06 ------1 DDT=Días después de tratamiento 2 En cada columna los datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (ANOVA, LSD; P≥0,05) 3 Mortalidad corregida por la fórmula de Schneider-Orelli: M(%)=[(Mtratado - Mcontrol)/(100 - Mcontrol)]x100 4 Categorías toxicológicas de la OILB en laboratorio extendido: 1=inocuo (reducción<25%), 2=ligeramente tóxico (reducción 25-50%), 3=moderadamente tóxico (reducción 51-75%) y 4=tóxico (reducción>75%) 5 Descendencia corregida por la fórmula de Abbot: P(%)=[1-(Ptratado/Pcontrol)] x100 6 Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)

121 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Figura 112. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de N. tenuis tras exponerse a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

100

80 c Control 60 Abamectina bc bc Deltametrina 40 b Emamectina Spinosad

% Mortalidad 72 h 72 Mortalidad % a 20 a a a a a

0 Residuo 0 días Residuo 4 días

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05),

Posteriormente se evaluaron los posibles efectos subletales que el residuo de 4 días de abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad podrían haber ocasionado en la descendencia de N, tenuis. No se produjeron diferencias estadísticamente significativas con respecto el control en su descendencia, (F4,51=2,37; P=0,06), oscilando el número de ninfas por hembra y día entre 6,21 y 9,61 (Figura 113).

Figura 113. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras exponerse al residuo de 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

10 a a a a 8 a 6

2 Nº ninfas / hembra/día

0 Control Abamectina Deltametrina Emamectina Spinosad Compuestos

Datos seguidos por la misma letra no son significativamente diferentes (P≥0,05).

122 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Por lo tanto según los resultados obtenidos en el ensayo de persistencia con adultos de N. tenuis y siguiendo la clasificación de la OILB, los productos se clasificaron en base a su efecto total como:

Tabla 36. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas adultos de N. tenuis cuando se aplicaron sobre plantas de tomate y degradaron en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

Clasificación OILB1 (efecto total)

Compuestos N. tenuis: Persistencia en plantas de tomate

Adultos Abamectina A Deltametrina A Emamectina A Spinosad A 1 Categorías toxicológicas de la OILB para persistencia: A=poco persistente (<5 días), B=ligeramente persistente (5-15 días), C=moderadamente persistente (16-30 días), D=persistente (>30 días)

123 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.4. Discusión.

5.4.1. Contacto residual sobre placas de cristal en laboratorio.

El estudio mostró la compatibilidad de los compuestos flubendiamida y spiromesifen, con adultos y ninfas N2 de O. laevigatus y N. tenuis. Sin embargo, los insecticidas abamectina, deltametrina, emamectina y spinosad no fueron selectivos para ambos chinches depredadores independientemente del estado evaluado. Por otro lado, y aunque ambas especies pertenecen al mismo orden, Hemiptera, el antocórido O. laevigatus fue más sensible a los plaguicidas que el mírido N. tenuis.

Abamectina no fue selectivo para ninguno de los depredadores evaluados cuando se expusieron al residuo fresco del insecticida sobre placas de cristal, a una dosis de 18 mg i.a./l. En el caso del enemigo natural O. laevigatus abamectina fue clasificado como tóxico para adultos y ninfas N2. Este compuesto parece afectar muy severamente a esta especie, ya que varios autores han reportado una mortalidad del 100 % cuando ninfas

N1, N2 y adultos se expusieron por contacto residual en laboratorio a dosis inferiores (10-13,5 mg i.a./l) a las utilizadas en nuestro ensayo (18 mg i.a./l) (Van de Veire et al., 1996; Van de Veire & Tirry, 2003 y Biondi et al., 2012a). Además, la toxicidad de este compuesto es extensiva a otra especie del género Orius, pues Studebaker y Kring (2003) describieron mortalidades entre el 56,3-100 %, cuando ninfas y adultos de Orius insidiosus (Say) (Hemiptera: Anthocoridae) se expusieron por contacto residual también en laboratorio, a dosis comprendidas entre 9-20 g i.a./ha.

Por otro lado, y aunque la mortalidad registrada fue menor en N. tenuis, abamectina fue clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2. Mortalidades similares a las registradas en ninfas N2 de N. tenuis (42,37 %), se encontraron en ninfas N2 y N3 del también mírido M. pygmaeus (38 %), cuando se expusieron por contacto residual a una dosis de 10 mg i.a./l del insecticida en condiciones de laboratorio (Van de Veire & Tirry, 2003). Además, abamectina produjo efectos deletéreos en la descendencia de N. tenuis, reduciendo en un 55,49 % el número de ninfas por hembra y día con respecto al testigo. Varios autores también han descrito como en ensayos de laboratorio abamectina afectó a la reproducción de los míridos depredadores Deraeocoris brevis (Uhler)

124 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

(Hemiptera: Miridae), M. pygmaeus y del antocórido depredador O. laevigatus (Tedeschi et al., 2002; Kim et al., 2006; Biondi et al., 2012a).

El piretroide sintético deltametrina fue utilizado como control positivo en nuestro estudio, por lo que como era de esperar, no fue selectivo con ninguno de los depredadores evaluados cuando se expusieron al residuo fresco del insecticida sobre placas de cristal, a una dosis de 12,5 mg. i.a./l. Este compuesto está considerado como un insecticida muy potente y de amplio espectro (Tomlin, 2009). De hecho, en las bases de datos de las casas comerciales Biobest (2013c) y Koppert (2013) se encuadra a este producto en la categoría OILB 4, siendo tóxico para una amplia gama de enemigos naturales pertenecientes a distintos órdenes, C. carnea, E. formosa, Trichogramma spp. (Hymenoptera: Trichogrammatidae), hemípteros de los géneros Nabis (Nabidae), Deraeocoris (Miridae), Geocoris (Lygaeidae), Orius (Anthocoridae), y ácaros fitoseidos, como A. swirskii y P. persimilis (Durán et al., 1998; Biobest, 2013c y Koppert, 2013).

En nuestro ensayo fue clasificado como tóxico para adultos y ninfas N2 de O. laevigatus. Otros autores han descrito también como deltametrina fue tóxico para O. laevigatus y O. insidiosus, produciendo una mortalidad del 100 % en ninfas y adultos bajo diversas formas de exposición (tratamiento tópico, residual o ingestión) en laboratorio (Angeli et al., 2005; Torres et al., 2007a; Vilela et al., 2007; Amor et al., 2012a). Por otro lado, y aunque la mortalidad registrada fue menor en N. tenuis, deltametrina fue clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2, resultado confirmado por Wanumen (2012) en adultos de N. tenuis en laboratorio.

Emamectina pertenece a la misma familia química que la abamectina (avermectinas), por lo que eran de esperar resultados similares a los descritos anteriormente. Sin embargo, al tratarse de una nueva generación de avermectinas (Jungmann et al., 2005), sintetizadas y modificadas para incrementar su capacidad insecticida y especificidad (Wei et al., 2005), en nuestro estudio emamectina fue más selectivo para ambos chinches depredadores, cuando se expusieron a su residuo fresco sobre placas de cristal en laboratorio a una dosis de 12,82 mg i.a./l. No obstante, a pesar de exhibir una mayor selectividad con respecto a abamectina, emamectina fue clasificado como ligeramente tóxico para adultos, y moderadamente tóxico para ninfas N2 de O. laevigatus y N.

125 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

tenuis. Estos resultados de toxicidad son similares a los obtenidos por Biondi y colaboradores (2012a) en condiciones de laboratorio, cuando adultos de O. laevigatus se expusieron a brotes de plantas de tomate tratadas a una dosis ligeramente superior (14,25 mg i.a./l) a la de nuestro estudio (12,82 mg i.a./l). Además, este compuesto tampoco resultó inocuo para otra especie del género Orius, ya que Studebaker y Kring (2003) describieron mortalidades entre el 68,8-100 %, cuando ninfas y adultos de O. insidiosus se expusieron por contacto residual también en laboratorio, a dosis comprendidas entre 4,5-10 g i.a./ha. Por otro lado, en el estudio llevado a cabo por López y colaboradores (2011), emamectina resultó ser selectivo para los míridos depredadores M. pygmaeus y N. tenuis tras su exposición a su residuo fresco durante 72 horas. Sin embargo, era de esperar una mayor selectividad, puesto que los ensayos se realizaron en condiciones de semi-campo en un invernadero, y emamectina tiene tendencia a una rápida fotodegradación sobre la superficie de la hoja (Willis & Mc Dowell, 1989; Prabhu et al., 1991). Además, en la realización del ensayo se utilizó sustrato vegetal vivo (plantas de tomate), que puede favorecer la absorción y degradación del insecticida, disminuyendo los niveles de residuo, y por tanto la exposición.

Flubendiamida, que pertenece a la clase química de las diamidas, muestra una alta especificidad contra plagas pertenecientes al orden lepidoptera (Tohnishi, et al., 2005; Ebbinghaus-Kintscher, et al., 2007; Lahm, et al., 2009). De hecho, no se ha mostrado efectivo contra otras plagas pertenecientes a los órdenes coleoptera, homoptera o frente a ácaros fitófagos (Hirooka, et al. 2007). Basado en esta alta especificidad, flubendiamida cabe esperar que sea un insecticida muy selectivo para los enemigos naturales.

En nuestro estudio fue clasificado como inocuo para adultos, y ninfas N2 de O. laevigatus y N. tenuis cuando se expusieron al residuo fresco del insecticida sobre placas de cristal, a una dosis de 60 mg i.a./l. Estos resultados de toxicidad coinciden con los obtenidos por Tohnishi y colaboradores (2005) en numerosos agentes de biocontrol, expuestos mediante distintas formas de exposición (tópica, residual y pulverización directa) en laboratorio. Para todos los enemigos naturales evaluados: Harmonia axyridis Pallas (Coleoptera: Coccinellidae), Coccinella septempunctata L. (Coleoptera: Coccinellidae), E. formosa, A. colemani, Cotesia glomerata (L.) (Hymenoptera:

126 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

Braconidae), C. carnea, Orius strigicollis (Poppius) (Hemiptera: Anthocoridae), Aphidoletes aphidimyza (Rondani) (Diptera: Cecidomyiidae), Amblyseius cucumeris (Oudemans) (Acari: Phytoseiidae) y P. persimilis, flubendiamida resultó selectivo a una dosis comprendida entre 100-400 mg i.a./l, valores muy superiores a la dosis comúnmente empleada en España en cultivos hortícolas, que es de 60 mg i.a./l. Si en laboratorio flubendiamida fue inocuo, su selectividad en semi-campo y campo está asegurada como reportaron Ebbinghaus y colaboradores (2007) en los agentes de biocontrol, C. septempunctata, Forficula auricularia L. (Dermaptera: Forficulidae), Cantharis spp. (Coleoptera: Cantharidae), Liocoris tripustulatus (Fabricius) (Hemiptera: Miridae), Anthocoris nemoralis (Fabricius) (Hemiptera: Anthocoridae), M. pygmaeus y ácaros fitoseidos.

Según la revisión de Williams y colaboradores (2003), spinosad es un compuesto menos selectivo para parasitoides que para depredadores. Numerosos estudios realizados en laboratorio con diferentes formas de exposición (tópica, residual e ingestión) han descrito efectos letales o subletales en los parasitoides A. colemani, Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera: Braconidae), Hyposoter didymator (Thunberg) (Hymenoptera: Ichneumonidae), Psyttalia concolor (Szepligeti) (Hymenoptera: Braconidae), T. chilonis y Bracon hebetor Say (Hymenoptera: Braconidae) (Viñuela et al., 2001; Takahashi et al., 2005; Khan et al., 2009; Hussain et al., 2010; Stara et al., 2011). Sin embargo, según la revisión de Biondi y colaboradores (2012b), también existen estudios que muestran la baja selectividad de spinosad sobre depredadores en laboratorio, variando los resultados en función de la especie, estado a evaluar o forma de exposición.

En nuestro estudio spinosad no resultó selectivo para ninguno de los chinches depredadores evaluados, cuando se expusieron a su residuo fresco sobre placas de cristal en laboratorio a una dosis de 120 mg i.a./l. En el caso particular de O. laevigatus, spinosad fue clasificado como moderadamente tóxico en adultos y tóxico para ninfas

N2. Resultados coincidentes se observaron en laboratorio cuando ninfas N2 y adultos de O. laevigatus fueron expuestos por contacto residual a dosis comprendidas entre 75-250 mg i.a./l (Van de Veire et al., 2002 b; Van de Veire & Tirry, 2003). Para otra especie perteneciente al género Orius, spinosad tampoco resultó selectivo bajo diferentes formas de exposición. Torres y colaboradores (2007a,b) describieron como en ensayos

127 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

de laboratorio se produjo una mortalidad comprendida entre el 40-85 % cuando ninfas y adultos de O. insidiosus se expusieron tópicamente a una dosis de 144 mg i.a./l. Por otro lado, Studebaker y Kring (2003) registraron mortalidades por encima del 78 % cuando ninfas N3 y adultos de O. insidiosus se expusieron por contacto residual sobre placas Petri a una dosis comprendida entre 90-199 g i.a./ha. Sin embargo, cuando se expone a las mismas dosis residuales de spinosad en ensayos de semi-campo y campo, parece ser selectivo y no afectó a ninfas N3 y adultos de O. insidiosus en algodón (Studebaker &

Kring (2003), o a ninfas N1, N2 de O. laevigatus en semi-campo, cuando plantas de judía verde se pulverizaron a una dosis de 192 mg i.a./l (Miles, 2006). Esto es indicativo que la selectividad a este insecticida está influenciada por factores abióticos como la radiación solar (Van de Veire et al., 2002b, 2004), ya que es la principal vía de degradación de spinosad sobre superficies vegetales (Dripps et al., 2011).

En el caso de N. tenuis, la mortalidad registrada fue menor, aunque spinosad fue clasificado como ligeramente tóxico para adultos y ninfas N2. Mortalidades iguales a las registradas en ninfas N2 de N. tenuis (40 %), fueron encontradas en ninfas N2 y N3 del también mírido M. pygmaeus cuando fueron expuestas por contacto residual a una dosis inferior (100 mg i.a./l) a la de nuestro estudio en laboratorio (120 mg i.a./l) (Van de Veire & Tirry, 2003). Por otro lado, en el estudio llevado a cabo por Arnó y colaboradores (2011), spinosad resultó ser selectivo para los chinches depredadores M. pygmaeus y N. tenuis, tras su exposición al residuo fresco del insecticida a una dosis igual a la empleada en nuestro ensayo (120 mg i.a./l). Sin embargo, se debe tener en cuenta que el estudio se realizó bajo condiciones de exposición más reales, laboratorio extendido sobre plantas de tomate, y por lo tanto es de esperar un menor efecto del insecticida. Aún así, Arnó y colaboradores (2011) observaron una reducción de la descendencia que no fue encontrada en nuestro estudio. Este resultado podría ser explicado por el comportamiento zoofitófago de M. pygmaeus y N. tenuis (Arnó et al., 2006; Sánchez et al., 2006), ya que al alimentarse de la planta podrían estar más expuestos a las toxinas del compuesto.

128 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

El compuesto perteneciente a la segunda generación de la clase química de los ácidos tetrónicos espirocíclicos, spiromesifen, resultó ser selectivo e inocuo tanto a adultos, como a ninfas N2 de O. laevigatus y N. tenuis cuando se expusieron a su residuo fresco sobre placas de cristal en laboratorio, a una dosis de 144 mg i.a./l. Según Nauen y colaboradores (2005), el principal modo de acción de este insecticida es por contacto, debido a que su alta lipofilicidad le permite adherirse a las ceras de las hojas, por lo que en laboratorio cuando es pulverizado sobre sustrato inerte los resultados podrían estar infraestimados. No obstante, resultados similares a los obtenidos en nuestro estudio de laboratorio también se observaron en ensayos de campo realizados por Bielza y colaboradores (2009), en los que tanto la densidad de población, como la actividad de O. laevigatus, no se vio afectada cuando spiromesifen fue aplicado foliarmente sobre plantas de pimiento a una dosis igual a la empleada en nuestro estudio (144 mg i.a./l). En línea con los resultados anteriores, la tercera generación perteneciente a la clase química de los ácidos tetrónicos espirocíclicos, spirotetramat, también se mostró muy selectivo en estudios de semi-campo y campo sobre los depredadores A. nemoralis, M. pygmaeus, O. insidiosus, y los parasitoides Aphelinus mali (Haldeman) (Hymenoptera: Aphelinidae), Aphytis lingnanensis Compere (Hymenoptera: Aphelinidae), Coccidoxenoides spp. (Hymenoptera: Encyrtidae) y Trichogramma cryptophlebiae Nagaraja (Hymenoptera: Trichogrammatidae) (Schnorbach, et al., 2008; Brück et al., 2009). Sin embargo, al igual que spiromesifen, ambos insecticidas no se han mostrado tan selectivos con los ácaros depredadores P. persimilis, Galendromus occidentalis (Nesbitt) (Acari: Phytoseiidae), Typhlodromus pyri Scheuten (Acari: Phytoseiidae) y Kampimodromus aberrans (Oudemans) (Acari: Phytoseiidae), debido a su buena actividad acaricida (Cloid et al., 2006; Saénz de Cabezón et al., 2006; Schnorbach, et al., 2008; Brück et al., 2009).

129 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

5.4.2. Persistencia.

En nuestro estudio, abamectina, spinosad y emamectina resultaron ser más persistentes para los adultos de O. laevigatus que para los de N. tenuis. La divergencia de resultados entre las dos especies de chinches depredadores pudiera ser atribuida en parte a las diferentes condiciones de radiación bajo las cuales se realizaron los estudios (misma época del año en dos años consecutivos). En el ensayo llevado a cabo con N. tenuis se registró una mayor radiación puntual media UV en el interior del invernadero (78,4 mol/m2*s), en comparación con la registrada en el ensayo con O. laevigatus (41,9 mol/m2*s) (Figuras 109 y 111), lo que pudo contribuir a una diferente velocidad de degradación de los compuestos, ya que todos ellos tienen tendencia a una rápida fotodegradación sobre la superficie de la hoja (Willis & Mc Dowell, 1989; Prabhu et al., 1991; Feely et al., 1992; Wrzesinski et al., 1996; Thompson et al., 1997; Dripps, et al., 2011; Amor et al., 2012b). De hecho, Van de Veire y colaboradores (2004) describieron como para el parasitoide E. formosa, la selectividad de abamectina y spinosad variaba en función de la localización y época del año en la que se realizaban los ensayos, ya que cuanto mayor era la radiación solar registrada en los mismos, los compuestos resultaban más selectivos. Otro factor a tener en cuenta es el diferente sustrato empleado en los estudios, planta de pimiento para O. laevigatus y planta de tomate en el caso de N. tenuis, pues la eficacia de los insecticidas puede verse afectada por las interacciones que se pudiesen crear con la planta por diferencias en la pilosidad de la hoja o ceras de la cutícula (Croft, 1990). Además y como se ha visto en los ensayos mediante contacto residual en laboratorio, puede existir también una razón fisiológica, pues O. laevigatus mostró una mayor sensibilidad a los insecticidas que N. tenuis, de modo que su capacidad para detoxificar los compuestos pudiera ser menor.

Por otro lado, el piretroide sintético deltametrina fue clasificado como persistente para O. laevigatus, mientras que para N. tenuis no lo fue. Resultados coincidentes se describieron en los estudios llevados a cabo por Olivares (2012) y Wanumen (2012) en O. laevigatus y N. tenuis, respectivamente. En ambos ensayos se evaluó en la primavera del 2012 la persistencia de deltametrina sobre plantas de tomate, siguiendo una metodología similar a la empleada en nuestro estudio. Para O. laevigatus el residuo de deltametrina fue evaluado a los 0, 5, 7 y 14 días, produciendo un 100 % de mortalidad

130 Capítulo 5. Toxicidad de modernos insecticidas

tras 72 horas de exposición en todos los casos. Sin embargo, en el caso de N. tenuis no se observó ningún efecto deletéreo tras exponerse al residuo de 4 días de deltametrina. En el medio ambiente los piretroides pueden ser degradados por medio de diferentes procesos, fotodegradación, biodegradación ó hidrólisis, y entre ellos, la fotodegradación es el proceso más común (Liu et al., 2010b). En nuestro caso, la divergencia de resultados entre ambas especies de chinches depredadores no puede ser explicada en su totalidad por este proceso, ya que los ensayos realizados por Olivares (2012) y Wanumen (2012) se llevaron a cabo en la misma época y año (primavera del 2012), y aún así los resultados fueron coincidentes a los descritos en nuestros estudios llevados a cabo en otoño. Por otro lado, la eficacia de deltametrina también puede verse afectada por el tipo de hoja en el que se aplica (Chowdhury et al., 2005), aunque tampoco explicaría la diferencia de toxicidad entre ambos enemigos naturales, ya que en el estudio realizado por Olivares (2012) y Wanumen (2012), el resultado es coincidente al observado en el nuestro estudio a pesar de que usaron el mismo sustrato vegetal, planta de tomate. Por tanto, y en base a lo descrito anteriormente en nuestros ensayos de laboratorio por contacto residual, la principal razón para explicar la diferencia de resultados parece ser la menor capacidad de O. laevigatus para detoxificar el piretroide deltametrina respecto N. tenuis.

131

CChhaapptteerr 66

Chapter 6. Ecdysone agonist

6. ECDYSONE AGONISTS: ECOTOXICOLOGY ON ORIUS LAEVIGATUS. INSECT TOXICITY BIOASSAYS

AND MOLECULAR DOCKING APPROACHES 1.

6.1. Introduction.

As it was already explained in chapters 1 and 5, knowledge of pesticide selectivity on beneficial insects is necessary for a successful implementation of biological and chemical control methods in IPM programs. Diacylhydrazine (DAH)-based insecticides such as RH-5849, tebufenozide, and methoxyfenozide, also known as molting- accelerating compounds (MACs), are more selective than conventional groups due to their interference with specific insect targets, such as insects’endocrinological pathways. They mimic the natural function of the insect molting hormone 20- hydroxyecdysone (20E), and their activity is based on binding specifically to the ecdysone receptor (EcR) of susceptible insects. They induce a premature lethal molting in larval stages and aborting reproduction in adults, especially in Lepidoptera and Coleoptera (Dhadialla et al., 1998, 2005; Pineda et al., 2007; Smagghe et al., 2013).

6.1.1. The ecdysone receptor.

The nuclear receptor superfamily is a group of transcription factors which are found in all metazoans or Animalia. To date, no members of this protein superfamily have been identified in plants, fungi, or unicellular eukaryotes (Laudet & Bonneton, 2005). They are involved in a vast array of biological processes such as molting and metamorphosis (Ashburner, 1973), embryonic development (King-Jones & Thummel, 2005), cell differentiation (Siaussat et al., 2007) and reproduction (Raikhel et al., 1999). For that reason, they are considered as important novel targets in pest control (Palli et al., 2005; Billas et al., 2009). The morphogenetic events associated with insect development are

1AMOR, F., CHRISTIAENS, O., BENGOCHEA, P., MEDINA, P., ROUGÉ, P., VIÑUELA, E. & SMAGGHE G., 2012. Selectivity of diacylhydrazine insecticides to the predatory bug Orius laevigatus: In vivo and modeling/docking experiments. Pest Manage. Sci., 18 (2): 1586-1594.

132 Chapter 6. Ecdysone agonist largely triggered by the action of a single class of steroid hormones, the ecdysteroids. It has been established that among all insect orders the ecdysteroid-induced orchestration of molting and metamorphosis is mediated by a heterodimer comprised of the EcR and Ultraspiracle (USP). The heterodimer is stabilized by 20E and recognizes specific promoter elements in the insect genome to regulate transcription (Heinrich, 2005).

The EcR is a member of the nuclear receptor superfamily, which is present in all arthropods (Graham et al., 2007; Fahrbach et al., 2012), and recently some functional orthologues have been discovered in a nematode as well (Shea et al., 2010). The basic structure of typical nuclear receptors includes several modular domains (Figure 114): an N-terminal region (A/B-domain), a DNA-binding domain (DBD, C-domain), a hinge region (D-domain), a ligand-binding domain (LBD, E-domain) and in some cases also a C-terminal F-domain (Kasuya et al., 2003). The A/B, D and F domains are usually poorly conserved and their structure is unknown. In contrast, the DBD and LBD are highly conserved and their structure has been determined for several receptors (Iwema et al., 2009). The DBD contains two typical cysteine-rich zinc finger motifs in tandem spanning about 80 amino acids which are involved in hormone response elements (HRE) recognition (Thomson et al., 2009). The LBD is usually formed by 12 α-helices numbered from helix-1 (H1) to helix-12 (H12), associated with a hairpin of two short β- strands (β1 and β2) in the loop between helices H5 and H6 (Carmichael et al., 2005). This domain is involved in receptor dimerization, ligand recognition and cofactor interactions (Nakagawa et al., 2009). Moreover, the 12 helices pack together in three antiparallel layers, and together with the β-strands, fully enclose the ligand-binding pocket (LBP) (Hill et al., 2013), which binds ecdysteroids, as well as certain nonsteroidal ecdysone receptor agonists, such as the DAH-based insecticides (Tohidi- Esfahani et al., 2011). Crystal structures of the LBD have provided important information about ligand recognition and the activation mechanism of nuclear receptors. In fact, homology models based on a comparison of the ecdysone receptor ligand- binding domains (EcR-LBD) with known crystal structures have been employed to determinate the three-dimensional (3D) structure of the EcR-LBD (Wurz, et al. 2000; Kasuya et al., 2003), and docking studies have been carried out to simulate how a candidate ligand binds to a receptor (Christiaens et al., 2010; Bengochea et al., 2012a, 2012b; Zotti et al., 2012a, 2012b).

133 Chapter 6. Ecdysone agonist

Figure 114. Modular structure (domains) of the insects’ ecdysone receptor.

A/B C D E F

(Source, Bengochea, 2012c).

6.2. Objectives.

In the current study, the side-effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on adults of O. laevigatus were tested in laboratory. Exposure of insects to a treated inert surface (worst-case laboratory test) as well as ingestion tests (primarily mode of action of MACs) was performed.

Next, the LBD of the EcR of O. laevigatus (OlEcR-LBD) was cloned and sequenced. Then, a three dimensional (3D) model of the OlEcR-LBD was constructed to evaluate if it exhibited the typical canonical structure with 12 α-helices, associated with a hairpin of two short β-strands.

Subsequently, a docking experiment was carried out to elucidate the interactions between the receptor ligand cavity and the natural 20E molting hormone. Finally, we compared these with the DAH-based ecdysone agonist insecticides to provide a better understanding of their selective activity on the predatory bug O. laevigatus.

134 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.3. Material and methods.

6.3.1. Chemicals.

The commercially available methoxyfenozide (Runner®, 24 % SC, Bayer, Madrid, Spain), tebufenozide (Mimic 2F®, 24 % SC, Dow Agrosciences Ibérica S.A., Madrid, Spain), as well as the technical grade compound RH-5849 (>95% pure, Rohm and Haas, Spring House, PA) were used in the tests. A broad spectrum insecticide, deltamethrin (Decis®, 2.5 % EC; Bayer, Madrid, Spain), was used as a positive commercial standard, and distilled water as a control (Table 37). Solutions of every product were freshly prepared prior to the assays in distilled water based on the maximum field recommended concentrations (MFRC) on horticultural crops for methoxyfenozide, tebufenozide and deltamethrin (De Liñán, 2011) and according to the manufacturer instructions for RH-5849.

135 Chapter 6. Ecdysone agonist

Table 37. Chemical tested in the experiments.

Maximun field Included in

Active ingredient Mode of action rate on Annex I 1 Concentration (a.i.) Trade name/Company (IRAC) Target horticultural 91/414/CEE3 (mg a.i./l) crops in Spain (cc/hl) 2

Methoxyfenozide Runner 24 % SC Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera 40 96 Yes Bayer compound

Tebufenozide Mimic 2F 24 % SC Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera, 75 180 Yes Dow Agrosciences Ibérica compound

RH-5849 Technical product > 95 % Moulting accelerating Lepidoptera, Coleoptera 75 180 No compound

Deltamethrin Decis 2.5 % EC Sodium channel Lepidoptera, Diptera, Hemiptera, 50 12.5 Yes Bayer modulator Thysanoptera, Coleoptera EC, Emulsifiable concentrated; SC, Suspension concentrated; a.i., active ingredient. 1IRAC ((Insecticide Resistance Action Committee). 2Formulated product (De Liñán, 2011). 3Pesticides included in the Annex I of the European Directive 91/414/EEC transferred to the Annex I of the Regulation Nº 1107/2009 (MAGRAMA, 2013a).

136 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.3.2. Insects bioassays.

The residual exposure test procedure was similar to that described in chapter 5: adults were exposed to fresh pesticide residue using the dismountable test cages designed by Jacas & Viñuela (1994). The floor and ceiling of the cages, consisting of glass plates (12 X 12 X 0.5 cm), were treated with the chemicals under a Potter precision spray tower. Five replicates per treatment and the control with 15 adults each were used. Adult mortality was recorded after 72 hours.

In order to assess the reproductive parameters, survivors were individually sexed under a binocular microscope and groups of three couples were transferred to ventilated plastic cages (11.5 cm in diameter, 5 cm high). Insects were fed ad libitum with E. kuehniella eggs and provided with green beans as a source of water and oviposition substrate, which were changed every two days for a 6-day period in total. The cumulative number of eggs per female at the end of the 6-day period was used to evaluate fecundity. The percentage of egg hatch, approximately 7 days after oviposition, was used to evaluate fertility. Four replicates were done per compound and control.

Exposure via ingestion: thin layers of E. kuehniella eggs, placed in Petri dishes (4 X 4 cm), were treated under the Potter precision spray tower. Groups of 15 adults were kept in ventilated plastic cages (11.5 cm in diameter, 5 cm high) and fed with the treated E. kuehniella eggs during three consecutive days. Control groups were supplied with untreated eggs only. Effects on mortality and reproductive parameters were assessed as described above.

6.3.3. EcR-LBD sequence.

Adults of O. laevigatus were used to extract total RNA using TRI Reagent (Sigma- Aldrich, Bornem, Belgium), based on the single-step liquid phase separation method (Chomeczynski, et al., 1987). The quality and quantity of the extracted RNA was examined by gel electrophoresis and spectrophotometry using a Nanodrop™ ND-1000 (Thermo Fisher Scientific BVBA, Asse, Belgium). Subsequently, first strand cDNA was synthesized using SuperScript™ II reverse transcriptase (Invitrogen NV,

137 Chapter 6. Ecdysone agonist

Merelbeke, Belgium) with the oligo(dT)12–18 primers according to the manufacturer’s protocol.

The OlEcR-LBD coding sequence was then determined through a number of Polimerase Chain Reaction (PCR) reaction steps (Sensoquest labcycler, Sensoquest GmbH Göttingen, Germany). The specific conditions of PCR reaction steps are shown in table 38. Partial sequences of the LBD were obtained using degenerate and specific primers (Table 39) located in the coding sequence of the LBD and DBD of the receptor and designed using Primer3 software (Rozen & Skaletsky, 2000). The design of the degenerate primers was based on known EcR sequences from different Mecoptera, Trichoptera, Strepsiptera, Coleoptera, Hymenoptera, Lepidoptera and Diptera insect species. Gene specific primers were designed in the partial sequence obtained with the degenerate primers. PCR products were purified using the Cycle Pure kit (Omega Bio- Tek, Norcross, GA). After purification, samples were sent for sequencing (Agowa, Berlin, Germany).

Table 38. Specific conditions of PCR reaction steps for determining the OlEcR-LBD sequence.

Fragments Primers l primer/10 l Denaturation Annealing Extension Phases PCR reaction (tª (ºC) / t (sec.) (tª (ºC) / t (sec.) (tª (ºC) / t (sec.) total

Fragment 1 degen. F2- degen. R3 0.2-0.2 94/30 49/30 72/35 32 (LBD) Fragment 2 degen. F4- spec. R2 0.2-0.8 94/30 53/30 72/55 32 (DBD and LBD) Fragment 3 spec. F2- degen. R3 0.4-0.4 94/30 49/30 72/35 32 (LBD) Bridge fragment spec. F3- (LBD) spec. R3 0-4-0.4 94/30 49/30 72/45 32 cloning F1- Cloning cloning R1 1-1 94/30 60/30 72/30 32

138 Chapter 6. Ecdysone agonist

Table 39. Degenerate and specific primers used to complete the OlEcR-LBD coding sequence.

Fragments Forward primer Reversed primer Fragment 1 5´-GAAGTNATGATGYTNMGNATG-3´ 5´-ACGTCCCAKATYTCWKCNARVAA-3´ (LBD) Fragment 2 5´-TGCGGHGAYMGDGCNTCYGG-3´ 5´-CCGACAGAATATGAGAAGGT-3´ (DBD and LBD) Fragment 3 5´-CGTAGTCGAAAACCTTCTCA-3´ 5´-ACGTCCCAKATYTCWKCNARVAA-3´ (LBD) Bridge fragment 5´-CCATCGGCTTGTCTACTTT-3´ 5´-CTTGGATCTTCTCGACTTTC-3´ (LBD) Cloning 5´-AAGAGTCACAAAAACCAACG-3´ 5´-AGCTTGAGTGAGAAGCACAT-3´

Afterwards, the whole fragment was cloned and sequenced for confirmation. The same O. laevigatus cDNA as used for identification of EcR-LBD was used for the initial PCR reactions of the cloning. Subsequently, the PCR products were ligated into a pGEM-T vector (Promega, Madison, WI) according to the manufacturer’s instructions. Then, plasmids were transformed in competent Escherichia coli XL-1 Blue Cells by heat stock and then plated out on an ampicilin-containing lisogeny broth agar plate. After 16 h incubation, formed colonies (Figure 115) were checked by colony PCR (Figure116) and several of these positive colonies were then purified using Plasmid mini prep kit (Omega Bio-Tek) and sent for sequencing (Agowa).

Figure115. Formed bacteria on an Figure 116. Ethidium bromide-stained ampicilin-containing LB agar plate. colony PCR.

139 Chapter 6. Ecdysone agonist

The EcR-LBD sequences of several arthropods and two human orthologs of EcR were retrieved by Blast searches against the Genbank database. The chosen sequences were then aligned by CLUSTALW2/CLUSTALX2 (Larkin et al., 2007) and the phylogenetic trees were designed using MEGA4 software (Tamura et al., 2007) Bootstrap analysis with 1.000 replicates for each branch position was used to assess support for nodes in the tree (Felsenstein, 1985).

Figure 117. Nucleotides and amino acids sequence of O. laevigatus.

Nucleotides sequence:

TTGCGGGGGATCCGGGCGTCCGGTTACCATTACAATGCCCTTACTTGTGAGGGTTGTAAAGG TTTTTTCCGGCGGAGTATAACGAAAAACAACGTTTACCAGTGCAAGTACGGAAACAACTGCG AGATCGACATGTACATGCGAAGAAAATGTCAAGAATGTCGGCTCAAAAAATGCCTATCGGT CGGGATGAGGCCAGAATGCGTAGTGCCCGAATATCAGTGCGCTGTGAAAAGAAAAGAAAAG AAAGCTCAAAAAGACAAAGACAAACCGGTGTCGACGACGAATGGGTCGCCCGAGGCTATCA AAGTCGAACCTGAACCTCATAGGGTCAGTTACACATCAAGTCTCTTTCAATCTATGATCAAA GAGTCACAAAAACCAACGACCGACACAGAGTTGGCAAAACTACCGGTGAATGGTGTCAAAC AAGTCAGCGCCGAACAGGAAGAACTCATCCATCGGCTTGTCTACTTTCAAAATGAGTTCGAA CACCCTTCGGAAGAAGACGTTCGCAGAATTAATGCTCCTAATGACAATGAAGAACAAAGTG ATCTGAAGTTCCGACATATAACTCAAATAACGATACTCACTGTACAGCTTATAGTCGAATTC GCCAAACGGCTTCCTGGGTTCGACAAACTACTTAGAGAAGATCAAATAGCTTTGTTAAAAGC ATGTTCTAGTGAAGTAATGATGTTAAGAATGGCGAGACGATATGACGCACAATCCGATTCTA TCCTTTTCGCAAATAACCAACCCTACACCCGAGATTCATACACGATGGCCGGAATGGGTGAC GTAGTCGAAAACCTTCTCATATTCTGTCGGCATATGTACCACATGAAAGTTGACAATGCCGA GTATGCTCTTCTTACTGCCATCGTTATATTTTCAGAACGACCTTCATTGACGGAAGGCTGGAA AGTCGAGAAGATCCAAGAGATTTATTTAGAAGCATTGAAATCGTACGTTGATCATCGAGCGA AGCCTAGGTCGCCGACAATATTCGCGAAGCTCCTTTCAGTCCTGACTGAGCTGAGGACTCTC GGAAACCAAAACAGCGAGATGTGCTTCTCACTCAAGCTTCAAAACCGAAAGCTCCCTCCATT GCTCGCAGAAATCTGGGA

Amino acids sequence:

LRGIRASGYHYNALTCEGCKGFFRRSITKNNVYQCKYGNNCEIDMYMRRKCQECRLKKCLSVG MRPECVVPEYQCAVKRKEKKAQKDKDKPVSTTNGSPEAIKVEPEPHRVSYTSSLFQSMIKESQKP TTDTELAKLPVNGVKQVSAEQEELIHRLVYFQNEFEHPSEEDVRRINAPNDNEEQSDLKFRHITQI TILTVQLIVEFAKRLPGFDKLLREDQIALLKACSSEVMMLRMARRYDAQSDSILFANNQPYTRDS YTMAGMGDVVENLLIFCRHMYHMKVDNAEYALLTAIVIFSERPSLTEGWKVEKIQEIYLEALKS YVDHRAKPRSPTIFAKLLSVLTELRTLGNQNSEMCFSLKLQNRKLPPLLAEIW

140 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.3.4. Confirmation of expression of EcR in nymphs.

A mixture of O. laevigatus nymphs of different stages was used to extract the total RNA and subsequently cDNA was synthesized following the same procedure described before. The expression of the EcR in O. laevigatus nymphs was investigated by PCR using specific primers designed to obtain the bridge fragment of the LBD.

6.3.5. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies.

Homology modeling of the OlEcR-LBD was performed with the YASARA Structure program (Krieger et al., 2002) running on a 2.53 GHz Intel core duo Macintosh computer. Different models were built from the X-ray coordinates of the EcR of H. virescens in complex with synthetic ligands (PDB code 3IXP), the RXR-USP receptor of Tribolium castaneum (Herbst) (Coleoptera: Tenebrionidae) bound to ponasterone A (P1A; PDB Code 2NXX, insect steroid hormone involved in regulating metamorphosis) (Iwema et al., 2007), the EcR-LBD of the hemiptera B. tabaci complexed to P1A (PDB code 1Z5X) (Carmichael et al., 2005), and the EcR-USP of H. virescens in complex with 20-hydroxyecdysone (20E; PDB code 2R40) (Browning et al., 2007), used as templates, respectively. The identity in amino acids in the LDB between OlEcR-LBD and the corresponding region of H. virescens, T. castaneum and B. tabaci is 63, 84 and 80%, respectively. Finally, a hybrid model was built up from the four previous models. PROCHECK (Laskowski et al., 1993) was used to assess the geometric quality of the three-dimensional model. In this respect, all of the residues of OlEcR-LBD were correctly assigned on the allowed regions of the Ramachandran plot (result not shown). Using ANOLEA (Melo et al., 1998) to evaluate the models, a single stretch of four residues (3LPVN6) over 235, corresponding to the disordered N-terminal end of OlEcR-LBD, exhibited energy over the threshold value. Molecular cartoons were drawn with YASARA and PyMol (W.L. DeLano, http://pymol.sourceforge.net). Docking of 20E, P1A, tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 to OlEcR-LBD was performed with the YASARA structure program. Clipping planes of OlEcR-LBD complexed to 20E, P1A, tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 were rendered with PyMol.

141 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.4. Results.

6.4.1. Efficacy and toxicological effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849.

Details of the biological activity of the treatments against adults of O. laevigatus are given in figures 118-120. Residual and ingestion exposure to methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 during 72 hours did not cause any loss of survival (P>0.05) over the controls. However, 100% of adults died after 24 hours in both experiments when exposed to deltamethrin.

Figure 118. Percentage of O. laevigatus mortality after 72 hours during the two performed experiments.

Residual contact (glass) Ingestion exposure b b 100 100

80 80

60 60 a a 40 a 40 a a a 20 20 a a % Mortality after 72 h % Mortality after 72 h 0 0 C o n tro l C o n tro l R H -5 8 4 9 R H -5 8 4 9 Deltamethrin Deltamethrin Tebufenozide Tebufenozide Methoxyfenozide Methoxyfenozide

Data followed by the same letter are not significantly different (P≥0.05).

142 Chapter 6. Ecdysone agonist

In addition, no sublethal side-effects of the three DAH-based insecticides on reproductive parameters were observed in both assays (P≥0.05).

Figure 119. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fecundity during the two carried out experiments.

Residual contact (glass) Ingestion exposure

10 10 a a 8 a 8 a a a 6 6 a a 4 4

Eggs/fem2 ale/day Eggs/fem2 ale/day

0 0 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849

Data followed by the same letter are not significantly different (P≥0.05).

Figure 120. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fertility during the two carried out experiments.

Residual contact (glass) Ingestion exposure

100 100 a a a a a a a 80 80 a

60 60

40 40 (%) Egg hatch (%) Egg hatch 20 20

0 0 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849 Control Methoxyfenozide Tebufenozide RH-5849

Data followed by the same letter are not significantly different (P≥0.05).

Based on these results, we decided to investigate the mechanism of DAHs selectivity towards O. laevigatus at molecular level using modeling and docking experiments.

143 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.4.2. OlEcR-LBD sequence, phylogenetic tree and expression in nymphs.

The cDNA encoding the LBD from OlEcR-LBD was cloned in order to obtain the sequence. However, it should be noted that the N-terminal end of the LBD was not completely obtained in spite of intensive efforts using the 3´RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR) system kit (Invitrogen, NV, Merelbeke, Belgium). The last two residues of the LBD were lacking. Thus, a consensus sequence of other hemipteran species, such as M. persicae, Nezara viridula (L.) (Hemiptera: Pentatomidae), Nilaparvata lugens (Stål) (Hemiptera: Delphacidae), Acyrthosiphon pisum (Harris) (Hemiptera: Aphididae) and B. tabaci, were used for our modeling analysis. Figure 121 shows a multiple alignment with the amino acid sequence of OlEcR-LBD, together with the EcR-LBD from most other known hemipteran species, and several members from other insect orders. OlEcR-LBD exhibits some amino acid substitutions in positions where conservation is usually very high throughout the class of Insecta. These residues are marked on the figure with blue dots (residues at position 54 in helix 3; 132 in helix 7; and 227 in helix 11). In addition, amino acids involved in the ligand binding are marked by red dots (Kasuya et al., 2003).

144 Chapter 6. Ecdysone agonist

Figure 121. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including OlEcR-LBD (helix 1 to 12). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Blue dots indicate amino acid substitutions in OlEcR-LBD sequence in positions where conservation is usually very high throughout the insect class. Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD (Kasuya et al., 2003). Green dots indicate hydrophilic, hydrophobic or aromatic residues involved in the ligand anchorage into the pocket. The figure has been prepared using CINEMA (Colour Interactive Editor for Multiple Alignments, Utopia, http;//cs.man.ac.uk/utopia/).

145 Chapter 6. Ecdysone agonist

As shown in figure 122, phylogenetic trees of the EcR-LBD, including various species from several insect orders such as Diptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Hemiptera, Orthoptera, Coleoptera together with a number of Crustacea and Chelicerata, group OlEcR-LBD together with the Hemiptera, close to N. viridula EcR-LBD. Maximum parsimony trees also confirmed this result (data not shown). Moreover, the EcR-LBDs of Hemiptera, Hymenoptera, Coleoptera, Phthiraptera, Blatodea and Orthoptera clustered away from Mecopterida superorder (which includes Lepidoptera and Diptera orders).

Figure 122. Phylogenetic tree of EcRs. This tree was constructed with the neighbor-joining method using the amino acid sequences of the LBD of the selected sequences. Bootstrap values as percentage of a 1000 replicates >50 are indicated on the tree.

146 Chapter 6. Ecdysone agonist

RT-PCR from RNA extracted from mixed nymphal stages of O. laevigatus also confirmed the expression of the EcR gene in this developmental stage (Figure 123).

Figure 123. Expression of EcR in adults and nymphs of O. laevigatus. Agarose gel electrophoresis of amplified EcR fragment using cDNA from nymphs and adults.

Additionally, we also attempted to sequence the EcR-LBD of another important predatory bug, the mirid N. tenuis. In the literature there is no information on the effects of MACs on this species, but our recent experiments show similar results to those in O. laevigatus. DAHs are devoid of any deleterious effect on N. tenuis (Figure 124) and it should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD. However, a partial sequence of the LBD was obtained, specifically a region between helix 6-helix 11 (Figure 124). A strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. There were some differences in the amino acids involved in binding with the ligand, however, these were not structurally different. Therefore, the structure of the LBP could be expected to be similar as well, but a definite conclusion concerning N. tenuis cannot be reached.

147 Chapter 6. Ecdysone agonist

Figure 124. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including N. tenuis (NtEcR-LBD) and OlEcR-LBD (Helix 6 to 11). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, NtEcR: Nesidiocoris tenuis, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD (Kasuya et al.,2003).

148 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.4.3. Modeling of OlEcR-LBD and docking studies.

The EcR-LBD of the predatory bug O. laevigatus, as modeled from the X-ray coordinates of different insect LBDs, exhibited the canonical 3D-conformation of the LBD of arthropod EcR built up of twelve α-helices (labeled H1-H12) associated with a short hairpin of two β-strands β1 and β2 (Figure 125 a). The model strikingly resembles that of T. castaneum RXR-USP used as one of the templates (PDB code 2NXX) (Figure 125 b) even though the loop that connects α-helix H2 to α-helix H3 was not correctly X- ray solved and is lacking from the 3D-structure of the RXR-USP. Helices H2, H3, H5, H8 and H11 in OlEcR-LBD delineated a ligand-binding cavity which usually accommodates the natural insect molting hormone 20E (Figure 125 c) and also the P1A molecule (Figure 125 e). Docking experiments performed with these two ecdysteroids yielded a typical H-bonding scheme the OlEcR-LBD shares with other arthropod EcR- LBDs. Both 20E and P1A interacted with the LBD-pocket via a network of six hydrogen bonds, involving the hydrophilic residues glutamic acid 14, threonine 44, threonine 47, alanine 102 and tyrosine 112. In addition, hydrophobic and stacking interactions occur with hydrophobic (methionine 209, cysteine 210, methionine 117) and aromatic residues (phenylalanine 101, tyrosine 107, tryptophan 228) located at the periphery of the ligand-binding cavity to complete the ligand anchorage into the pocket (Figure 125 d, f).

149 Chapter 6. Ecdysone agonist

Figure 125. Overall three-dimensional (3D) conformation of the modeled EcR-LBD domain of the predatory bug O. laevigatus (a) compared to LBD structure of the RXR-USP of T. castaneum (b). The twelve α-helices distributed along the polypeptide chain are numbered H1-H12 and the two β-strands β1 and β2 forming a protruding hairpin motif are indicated. N and C indicate the N-terminal and C-terminal ends of the polypeptide chain, respectively. (c) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR- LBD harboring 20-hydroxyecdysone (20E) (pink stick). (d) Network of hydrogen bonds (dashed dark lines) anchoring 20E to the OlEcR-LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according to the 3D-model built for the OlEcR-LBD. (e) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring ponasterone A (PA1) (pink stick). (f) Network of hydrogen bonds (dashed dark lines) anchoring P1A to the LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according to the three-dimensional model built for OlEcR-LBD.

150 Chapter 6. Ecdysone agonist

However, upon docking of tebufenozide (Figure 126 g) to the ligand-binding cavity of the OlEcR-LBD, more or less severe steric hindrances were shown to occur, especially with residues methionine 85, valine 120, leucine 125, glutamine 205, asparagine 206 and methionine 209, that form the wall of one of the two lobes of the ligand-binding cavity in which the ethyl-phenyl ring of tebufenozide becomes inserted. Also for the closely- related methoxyfenozide, a rather similar steric hindrance was observed upon docking of the ecdysone agonist in which the methoxy group of the agonist becomes inserted (Figure 126 h). Upon docking of the agonist RH-5849 (Figure 126 i), a less severe steric hindrance occurs with the ligand-binding cavity, involving residues methionine 85, Leucine 124 and Asparagine 206, owing to the lack of any substituent linked to the phenyl ring of this agonist.

Figure 126. (g) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring tebufenozide (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the ethyl group at the phenyl ring of tebufenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (h) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring methoxyfenozide (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the methoxy group at the phenyl ring of methoxyfenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (i). Clip view across the ligand- binding pocket of the OlEcR-LBD harboring RH-5849 (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the phenyl ring with the wall of the ligand-binding pocket, that is less severe compared with tebufenozide and methoxyfenozide.

These docking experiments suggest that DAH-based insecticides like tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 are likely to exert no deleterious effect on the predatory bug O. laevigatus, which supports the previous reported experimental data from biological activity tests performed with both insecticidal molecules.

151 Chapter 6. Ecdysone agonist

6.5. Discussion.

The DAH-based ecdysone agonist insecticides are active against several economically important lepidopteran and coleopteran pests, and considered as environmentally friendly compounds with an excellent margin of safety to non-target organisms (Dhadialla et al., 1998, 2005). Consequently, these pesticides are usually included in IPM (Integrated Pest Management) programs targeting different pests and crops all over the world.

Based on their mode of action, a significant effect on survival must not be expected when adults of natural enemies are exposed to pesticide residues or fed with treated diet. In the literature there are many studies supporting the compatibility of both adults and nymphs of predatory hemipterans with MAC pesticides (Smagghe & Degheele, 1995; Tedeschi et al., 2002; Elzen, 2001; Baur et al., 2003; Studebaker & Kring, 2003; Van de Veire & Tirry, 2003). In agreement with this, in our study, methoxyfenozide, tebufenozide, and RH-5849 were harmless to adults of O. laevigatus at short-term. Other beneficials belonging to different insect orders, as well as pollinators, also seem to be compatible with MAC pesticides (Mommaerst et al., 2006; Bueno et al., 2008; Giolo et al., 2008; Schneider et al., 2008; Carmo et al., 2010).

MACs beside their role in metamorphosis, are also essential in insect reproduction by taking part in vitellogenesis, ovulation and spermatocyte growth (Chapman, 1998). In our study, reproduction capacity of O. laevigatus females was similar to that of the control, which is in agreement with previous studies on this species (Van de Veire et al., 1996; Angeli et al., 2000, 2005; Van de Veire & Tirry, 2003). However, reproductive disturbances such as a lower fecundity in D. brevis (Kim et al., 2006) or a higher number of egg batches in Picromerus bidens L. (Hemiptera: Pentatomidae) were observed after methoxyfenozide exposure (Mahdian et al., 2007).

Pharmacokinetics and metabolic detoxification of compounds could play an important role in determining the biological spectrum of DAH-based ecdysone agonists (Smagghe & Degheele, 1994; Medina et al., 2002; Giolo et al., 2008). The latter molecular studies are consistent with the concept that an important process in the selectivity of these

152 Chapter 6. Ecdysone agonist compounds is the specific binding of the MACs to the target EcR that is governed by a lock-and-key principle (Dhadialla et al., 2005). For instance, the binding affinity is high in targeted Lepidoptera pests, whereas binding is low or not detectable in non-targeted insects (Carlson et al., 2001). In agreement with these results, previous studies have found tebufenozide to have an extremely low affinity for hemipteran EcRs belonging to the Sternorrhyncha, namely B. tabaci and M. persicae (Carmichael et al., 2005; Graham et al., 2007). In this respect, it appears that differences in the architecture of LBP may provide the differential binding affinities of the DAH-based compounds among different taxonomic orders (Carmichael et al., 2005). Consequently, for those non- sensitive insects such as O. laevigatus, it is expected that differences at LBP level may hinder the MACs´ binding.

The amino acid residues involved in the ligand binding with the OlEcR-LBD are indicated in figure 121. OlEcR-LBD exhibits a high conservation among these ligand binding-involved residues compared to other insects that show no or low susceptibility for MACs. In contrast, in Lepidoptera, which show a high sensitivity for tebufenozide and methoxyfenozide, we observed that the residues isoleucine 55, methionine 97 and isoleucine 108 are replaced by methionine 55 and two valines residues (97, 108), respectively. In particular, the presence of an isoleucine at position 55 in non-sensitive species generates steric hindrance between the γ-methyl group of the isoleucine-residue and the C5-methyl group at the B-ring of the tebufenozide or the C4-ethyl group of its B-ring, depending on the orientation of the tebufenozide molecule (Wurtz et al., 2000). In addition to these differences, we observed other substitutions in amino acids involved in the ligand-binding. Proline 48, isoleucine 222 and lysine 227 are conserved in lepidopteran BmEcR and HvEcR, but replaced in OlEcR by amino acids that are structurally different: lysine 48, phenylalanine 222 and glutamine 227 (Figure 121). Moreover, our docking results suggest that due to the restricted extent of the ligand- binding cavity, a steric clash occurred upon docking of tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 to the ecdysone-binding site of the LBD (Figures 126 g, h, i). An examination of the amino acid composition surrounding the restricted cavity allowed us to identify those amino acids that may play a role in this restriction. In particular, residues threonine 129 and isoleucine 130, present in TcEcR and TmEcR, and isoleucine 130 present in BmEcR and HvEcR, are replaced by valine in O. laevigatus (Figure 121). We suggest that these combined differences could explain the lack of

153 Chapter 6. Ecdysone agonist toxicity of the DAHs against the predatory bug, O. laevigatus. However, it should also be noted here that, owing to the intrinsic flexibility of the amino acids involved in the steric hindrance with tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849, some accommodation of the DAH agonists to the ligand-binding cavity of OlEcR-LBD should be achieved, which could prevent the most severe steric clash from occurring. In this respect, the binding of ecdysone to the ultraspiracle protein from H. virescens (Billas et al., 2001) was shown to depend on an induced fit mechanism. The plasticity responsible for the promiscuous character of the LBP for different agonists and antagonists, was further stressed by Billas et al., (2003, 2005). As a result, the steric discrepancies occurring upon binding of tebufenozide, methoxyfenozide and RH-5849 to the binding pocket of OlEcR-LBD are an important, but likely not the sole, explanation for the non-toxicity of these agonists to O. laevigatus.

154

CChhaapptteerr 77

7. Conclusions

7. CONCLUSIONS.

Firstly, the compatibility of a bifenthrin-treated net with natural enemies provided the following conclusions:

In experiments made under laboratory conditions, O. laevigatus and N. tenuis were not able to detect the presence of bifenthrin in a dual-choice test. Furthermore, no short- term mortality (72 hours) was recorded on either predatory bug. In contrast, a high mortality rate was found when they were exposed by contact to the bifenthrin-treated net for 72 hours in small cages (10 cm diameter X 3 cm high). In assays carried out under more realistic conditions of exposure, in an experimental greenhouse with cages of 25 X 25 cm X 60 cm high, short-term mortality (72 hours) and reproductive parameters were not affected on O. laevigatus and N. tenuis. Lastly, the bifenthrin- treated net was evaluated under field conditions in semi-commercial tunnels (8 m long X 6.5 m width X 2.6 high), to confirm the absence of deleterious effects on beneficial arthropods. Neither natural enemies nor environmental conditions [temperature, relative humidity, ultraviolet (UV) and photosynthetically active radiation (PAR)] were affected by the presence of the bifenthrin-treated net on the crop. However, results were not conclusive, mainly due to a low settlement of the released biocontrol agents, and further studies are needed in commercial greenhouses to confirm our preliminary results of compatibility.

Secondly, after evaluating the toxicity of six modern pesticides (abamectin, deltamethrin (positive commercial standard), emamectin, flubendiamide, spinosad and spiromesifen) on O. laevigatus and N. tenuis it can be concluded that:

O. laevigatus was more susceptible to all the studied pesticides than N. tenuis. In addition, the research results indicated no impact of flubendiamide and spiromesifen on the two natural enemies studied under laboratory conditions. Consequently, both pesticides are candidates to be included in IPM programmes where both natural enemies are present. On the other hand, abamectin, deltamethrin, emamectin and spinosad were not selective for both predatory bugs in laboratory experiments. However, persistence test demonstrated that in spite of the lack of physiological selectivity, these insecticides can provide ecological selectivity in some cases. Abamectin, deltamethrin, emamectin

155 7. Conclusions and spinosad could be compatible with N. tenuis if the mirid bug is released 4 days after the insecticide treatment on the crop. With regard to O. laevigatus, abamectin, deltamethrin and spinosad were classified as persistent in our assays, thus the study should be completed with semi-field and field experiments in order to ascertain their possible joint use in IPM programs. In contrast, emamectin could be compatible with O. laevigatus if the pirate bug is released 7 days after the insecticide treatment on the crop.

Finally, the toxicological effects and molecular docking approaches of MACs on O. laevigatus and N. tenuis reported the following conclusions:

Results showed no biological activity of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849, on either predatory bug. Moreover, modeling of the OlEcR-LBD and docking experiments also suggested that methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 were devoid of any deleterious effect on O. laevigatus. In the case of N. tenuis, it should be noted that in spite of intensive efforts, we did not manage to complete the sequence for the LBD. However, a partial sequence of the LBD was obtained (helix 6-helix 11), and a strong conservation between the amino acids of N. tenuis and O. laevigatus was observed. Therefore, our results indicate that these compounds could be safely applied in IPM programs in which O. laevigatus and N. tenuis are present.

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Capítulo 8. Bibliografía

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178

AAppéénnddiiccee

Apéndice

APÉNDICE.

-ÍNDICE DE FIGURAS.

1. Introducción general.

Figura 1. Distribución geográfica de O. laevigatus en Europa. Figura 2. Ciclo biológico de O. laevigatus. Figura 3. Huevos y ninfa a punto de eclosionar de O. laevigatus. Figura 4. Adulto de O. laevigatus. Figura 5. Hemiélitros de O. laevigatus con la base de la membrana incolora y el extremo oscuro. Figura 6. Macho (izquierda) y hembra (derecha) de O. laevigatus. Figura 7. Esquema del abdomen del macho (izquierda) y de la hembra (derecha) de Orius sp. Figura 8. Distribución geográfica de N. tenuis en Europa. Figura 9. Ciclo biológico de N. tenuis.

Figura 10. Ninfas de N. tenuis, estadio N1 (izquierda) y N5 (derecha). Figura 11. Detalle de la hembra y macho de N. tenuis.

Figura 12. Adulto de N. tenuis.

Figura 13. Posición de cópula en N. tenuis.

3. Materiales y métodos generales.

Figura 14. Vista general del invernadero. Figura 15. Interior del invernadero. Figura 16. Medidor de temperatura y humedad relativa. Figura 17. Medidor de radiación ultravioleta (UV). Figura 18. Medidor de radiación fotosintéticamente activa (PAR). Figura 19. Caja de cría de adultos N. tenuis (40 X 30 X 30 cm). Figura 20. Judías verdes utilizadas como sustrato de oviposición y fuente de líquido Figura 21. Dieta basada en huevos de E. kuehniella. Figura 22. Caja de cría de ninfas de N. tenuis, (22 X 10 X 7 cm).

Figura 23. Ninfas N1 de N. tenuis. Figura 24. Plántulas de tomate recién trasplantadas. Figura 25. Plántulas de pimiento recién trasplantadas. Figura 26. Plantas de tomate (50 cm) empleadas en los ensayos. Figura 27. Plantas de pimiento (30-40 cm) empleadas en los ensayos. Figura 28. Semilleros de pepino.

179 Apéndice

Figura 29. Trasplante de pepino, estado fenológico primera-segunda hoja verdadera del tallo principal desplegada.

4. Compatibilidad de los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis con el uso de mallas tratadas con bifentrin como método físico de control.

Figura 30. Malla tratada con bifentrin tras su recepción. Figura 31. Detalle de las características físicas de la malla tratada con bifentrin. Figura 32. Tubos en Y empleados en los ensayos de preferencia. Figura 33. Placa de cristal a modo de base. Figura 34. Montaje tubo en Y. Figura 35. Judías verdes impregnadas con huevos E. kuehniella a modo de atrayente alimenticio. Figura 36. Extremo tubo Y cerrado con parafilm. Figura 37. Disposición de los tubos en Y en el insectario (ensayo de preferencia en laboratorio). Figura 38. Orificio (0,5 mm de diámetro) en la base del tubo en Y por el cual se introdujeron los insectos. Figura 39. Ensayo en laboratorio, unidad experimental (10 cm de diámetro X 3 cm de altura) para ensayos de contacto residual. Figura 40. Ensayo en laboratorio, vista general. Figura 41. Ensayo en invernadero, jaula de 25 X 25 X 60 cm de altura, lateral cubierto por una lámina de metacrilato para la observación y seguimiento del ensayo. Figura 42. Ensayo en invernadero, jaula de 25 X 25 X 60 cm de altura, lateral cubierto por las mallas a evaluar, tratada con bifentrin o control. Figura 43. Ensayo en invernadero, comederos (3,5 cm de diámetro) con huevos de E. kuehniella. Figura 44. Ensayo en invernadero, vista general del ensayo. Figura 45. Enemigos naturales evaluados en los ensayos de campo (túneles semi-comerciales) en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid). En negrita aparecen aquellas especies que aparecieron de manera espontánea en el cultivo. Figura 46. Montaje de los invernaderos tipo túnel. Figura 47. Diseño y vista general del ensayo con tres invernaderos, cada uno de ellos lleva en su banda lateral (4 m de largo X 2 m de altura) los dos tipos de mallas, control y tratada con bifentrin. Figura 48. Vista lateral de las dos parcelas experimentales correspondientes a un invernadero. Figura 49. Vista lateral de la parcela experimental. Figura 50. Distribución de las plantas marcadas en cada parcela experimental del invernadero. Figura 51. Inoculación de A. gossypii Figura 52. Plataforma de liberación de adultos de B. tabaci y A. colemani. Figura 53. Liberación de adultos de B. tabaci. Figura 54. Liberación de adultos de A. colemani.

Figura 55. Larvas L3 de A. bipunctata tras su liberación. Figura 56. Sobres de liberación de A. swirskii. Figura 57. Liberación de P. persimilis.

180 Apéndice

Figura 58. Liberación de adultos de B. tabaci y adultos- ninfas de F. occidentalis. Figura 59. Adultos de Aleyrodes sp.

Figura 61. Mortalidad a las 72 horas en ninfas N2 de N. tenuis y adultos de O. laevigatus tras atravesar las mallas control y tratada con bifentrin en el ensayo de preferencia con tubos en Y. Figura 62. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición por contacto a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 10 cm de diámetro X 3 cm de altura. Figura 63. Condiciones ambientales registradas en el ensayo de toxicidad de malla tratada con bifentrin en invernadero realizado en Mayo del 2012 sobre los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis. Figura 64. Mortalidad en adultos de N. tenuis y O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura. Figura 65. Descendencia evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de N. tenuis tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura. Figura 66. Fecundidad y fertilidad evaluada durante un periodo de 6 días en adultos de O. laevigatus tras 72 horas de exposición a las mallas control y tratada con bifentrin en cajas de 25 X 25 X 60 cm de altura. Figura 67. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de otoño del 2011. Figura 68 a,b. Ciclo de otoño 2011, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci. c. Densidad media de población en las plantas marcadas de O. laevigatus, A. swirskii y su presa B. tabaci. Figura 69 a,b. Ciclo de otoño, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii. c. Densidad media de población en el cultivo del enemigo natural A. colemani (momias) y su presa, A. gossypii. Figura 70. Ciclo de otoño 2011, evolución de la población de A. gossypii en las mallas control y tratada con bifentrin. Figura 71. Hormigas en el cultivo. Figura 72. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de primavera-verano del 2012. Figura 73. Detalle de ataque por araña roja. Figura 74. Vista general del ataque de araña roja. Figura 75. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas atacadas por Tetranychus sp. en las mallas control y tratada con bifentrin. Figura 76. Ciclo de primavera-verano 2012, evolución de la población de Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips) en las mallas control y tratada con bifentrin. Figura 77. Ciclo de primavera-verano del 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales Orius spp. y A. swirskii y sus presas, Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips).

181 Apéndice

Figura 78. Ciclo de primavera-verano del 2012, evolución de la población de Orius spp. en las mallas control y tratada con bifentrin. Figura 79. Ensayo de campo, condiciones ambientales y estado fenológico de las plantas de pepino en el ensayo de otoño del 2012. Figura 80 a,b. Ciclo de otoño 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por los enemigos naturales O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp., Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips). c. Densidad media de población en las plantas marcadas de O. laevigatus y O. majusculus (Orius spp.) y sus presas, B. tabaci, Aleyrodes sp.,

Aeolothrips sp. y F. occidentalis (trips). Figura 81 a,b. Ciclo de otoño 2012, porcentaje medio de plantas ocupadas en las mallas control y tratada con bifentrin por el enemigo natural A. colemani (momias) y su presa A. gossypii. c. Densidad media de población en las plantas marcadas de A. colemani (momias) y su presa A. gossypii.

5. Toxicidad de modernos insecticidas sobre los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis.

Figura 82. Principales formas de exposición de los enemigos naturales a los plaguicidas. Figura 83. Secuencia de pruebas para la evaluación de los efectos secundarios en organismos beneficiosos. Figura 84. Resumen de ensayos realizados con insecticidas en los enemigos naturales O. laevigatus y N. tenuis. Figura 85. Torre de Potter. Figura 86. Placas de vidrio (12 X 12 X 0,5 cm). Figura 87. Unidad experimental de ensayo de contacto residual. Figura 88. Judía verde y huevos de E. kuehniella. Figura 89. Cajas de evaluación de fecundidad en O. laevigatus (11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm diámetro). Figura 90. Detalle de caja de evaluación de fertilidad en O. laevigatus (9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. de diámetro). Figura 91. Cajas de evaluación de descendencia en N. tenuis (9 cm diámetro, 3 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm. diámetro). Figura 92. Vasos de evaluación de descendencia en N. tenuis (8 cm de diámetro, 11 cm de altura). Figura 93. Planta de pimiento (30-40 cm de altura). Figura 94. Planta de tomate (50 cm de altura). Figura 95. Planta de pimiento tras el tratamiento con el insecticida. Figura 96. Planta de tomate tras el tratamiento con el insecticida. Figura 97. Unidad experimental de O. laevigatus en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). .

182 Apéndice

Figura 98. Unidad experimental de N. tenuis en el ensayo de persistencia (11,5 cm diámetro, 5 cm de altura, ventilación en la tapa de 5,5 cm de diámetro). . Figura 99. Porcentajes de mortalidad en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Figura 100. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 11 días sobre placas de cristal en laboratorio. Figura 101. Fecundidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio. Figura 102. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos de O. laevigatus tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Figura 104. Fertilidad evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de O. laevigatus expuestas al residuo fresco de los insecticidas durante 11 días sobre placas de cristal en laboratorio. Figura 105. Porcentajes de mortalidad en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Figura 106. Comparación de los porcentajes de mortalidad en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas desde 72 horas a 10 días sobre placas de cristal en laboratorio. Figura 107. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Figura 108. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos procedentes de ninfas N2 de N. tenuis expuestas al residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal en laboratorio Figura 109. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Condiciones ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre-Octubre del 2010. Figura 110. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s). Figura 111. Ensayo de persistencia sobre tomate en el enemigo natural N. tenuis. Condiciones ambientales en el invernadero durante la degradación de los residuos en Septiembre del 2011. Figura 112. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de N. tenuis tras exponerse a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s). Figura 113. Descendencia evaluada durante 6 días en adultos de N. tenuis tras exponerse al residuo de 4 días de los insecticidas sobre hoja de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

183 Apéndice

6. Ecdysone agonist: Ecotoxicology on Orius laevigatus. Insect toxicity bioassays and molecular docking approaches.

Figure 114. Modular structure (domains) of the insects’ ecdysone receptor. Figure115. Formed bacteria on an ampicilin-containing LB agar plate. Figure 116. Ethidium bromide-stained colony PCR. Figure 117. Nucleotide and amino acid sequence of O. laevigatus. Figure 118. Percentage of O. laevigatus mortality after 72 hours during the two performed experiments. Figure 119. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fecundity during the two carried out experiments. Figure 120. Effects of methoxyfenozide, tebufenozide and RH-5849 on O. laevigatus fertility during the two carried out experiments. Figure 121. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including OlEcR-LBD (helix 1 to 12). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Blue dots indicate amino acid substitutions in OlEcR-LBD sequence in positions where conservation is usually very high throughout the insect class. Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD (Kasuya et al., 2003). Green dots indicate hydrophilic, hydrophobic or aromatic residues involved in the ligand anchorage into the pocket. The figure has been prepared using CINEMA (Colour Interactive Editor for Multiple Alignments, Utopia, http;//cs.man.ac.uk/utopia/). Figure 122. Phylogenetic tree of EcRs. This tree was constructed with the neighbor-joining method using the amino acid sequences of the LBD of the selected sequences. Bootstrap values as percentage of a 1000 replicates >50 are indicated on the tree. Figure 123. Expression of EcR in adults and nymphs of O. laevigatus. Agarose gel electrophoresis of amplified EcR fragment using cDNA from nymphs and adults. Figure 124. Sequence alignment of ecdysone receptor ligand-binding domains (EcR-LBD), including N. tenuis (NtEcR-LBD) and OlEcR-LBD (Helix 6 to 11). In the following order: Diptera (DmEcR: Drosophila melanogaster, AaEcR: Aedes aegypti); Lepidoptera (BmEcR: Bombyx mori, HvEcR: Heliothis virescens); Coleoptera (TcEcR: Tribolium castaneum, TmEcR: Tenebrio molitor); Hymenoptera (AmEcR: Apis mellifera, NaEcR: Nasonia vitripennis); Hemiptera (BtEcR: Bemisia tabaci, NlEcR: Nilaparvata lugens, OlEcR: Orius laevigatus, NtEcR: Nesidiocoris tenuis, ApEcR: Acyrthosiphon pisum, NvEcR: Nezara viridula). Red dots indicate the amino acids involved in the ligand binding in the EcR-LBD (Kasuya et al.,2003). Figure 125. Overall three-dimensional (3D) conformation of the modeled EcR-LBD domain of the predatory bug O. laevigatus (a) compared to LBD structure of the RXR-USP of T. castaneum (b). The twelve α-helices distributed along the polypeptide chain are numbered H1-H12 and the two β-strands β1 and β2 forming a protruding hairpin motif are indicated. N and C indicate the N-terminal and C-terminal

184 Apéndice ends of the polypeptide chain, respectively. (c) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR- LBD harboring 20-hydroxyecdysone (20E) (pink stick). (d) Network of hydrogen bonds (dashed dark lines) anchoring 20E to the OlEcR-LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according to the 3D-model built for the OlEcR-LBD. (e) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring ponasterone A (PA1) (pink stick). (f) Network of hydrogen bonds (dashed dark lines) anchoring P1A to the LBD. Hydrophobic and aromatic residues interacting with the ligand by hydrophobic and stacking interactions, respectively, are colored orange. Residues are labeled according to the three-dimensional model built for OlEcR-LBD.

Figure 126. (g) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring tebufenozide (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the ethyl group at the phenyl ring of tebufenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (h) Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring methoxyfenozide (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the methoxy group at the phenyl ring of methoxyfenozide with the wall of the ligand-binding pocket. (i). Clip view across the ligand-binding pocket of the OlEcR-LBD harboring RH-5849 (blue stick). Note the steric clash (Æ) of the phenyl ring with the wall of the ligand-binding pocket, that is less severe compared with tebufenozide and methoxyfenozide.

-ÍNDICE DE TABLAS.

1. Introducción general.

Tabla 1a,b. Plagas principales de los cultivos hortícolas protegidos y enemigos naturales más utilizados para su control en España. Tabla 2. Tiempo de desarrollo y supervivencia de O. laevigatus bajo diferentes temperaturas y tipos de alimentación. Tabla 3. Parámetros biológicos de N. tenuis (25 ºC, 75 % HR) en función del a. Efecto del tipo de presa en tomate y b. Efecto del cultivo, cuando se alimenta de huevos de E. kuehniella. Tabla 4. Parámetros biológicos de N. tenuis a diferentes rangos de temperatura cuando es alimentado con huevos de E. kuehniella sobre planta de tomate.

3. Materiales y métodos generales.

Tabla 5. Resumen de la cría de N. tenuis a una temperatura de 25 ± 5º C, humedad relativa (HR) 50 ± 5 % y fotoperiodo de 16 horas de luz: 8 horas de oscuridad (16L: 8O). Tabla 6. Pruebas de contraste de hipótesis aplicadas en los ensayos.

185 Apéndice

4. Compatibilidad de los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis con el uso de mallas tratadas con bifentrin como método físico de control.

Tabla 7. Dosis de la malla tratada con bifentrin tras cada ciclo de cultivo y su reducción en los ensayos realizados en la finca experimental “La Poveda” (Arganda del Rey, Madrid). Tabla 8. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011. Tabla 9. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2011. Tabla 10. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012. Tabla 11. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de primavera-verano del 2012. Tabla 12. Plagas estudiadas, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2012. Tabla 13. Enemigos naturales estudiados, origen, fecha de introducción y primera aparición en el cultivo, así como sus dosis y modo de suelta en el ensayo de otoño del 2012. Tabla 14. Localización de plagas en el cultivo de pepino en función de las observaciones tomadas en campo en los distintos ciclos de cultivo de otoño (2011 y 2012) y primavera-verano (2012). Tabla 15. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii en la malla control y tratada con bifentrin. Tabla 16. Ciclo de otoño del 2012, ratio momias A. colemani/A. gossypii en la malla control y tratada con bifentrin. Tabla 17. Ciclo de otoño del 2012, evolución de la población de A. gossypii y ratio de momias A. colemani/A. gossypii por repetición (módulo) en la malla control y tratada con bifentrin.

5. Toxicidad de modernos insecticidas sobre los enemigos naturales Orius laevigatus y Nesidiocoris tenuis.

Tabla 18. Características de los insecticidas evaluados. Tabla 19. Clasificación de los productos fitosanitarios según el efecto sobre los organismos en: a. Ensayos de laboratorio, laboratorio extendido, semi-campo y campo. b. Ensayos de persistencia. Tabla 20. Cálculo del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration). Tabla 21. Valores del PIEC (Predicted Inicial Environmental Concentration) para los insecticidas evaluados. Tabla 22. Parámetros evaluados en adultos de O. laevigatus y N. tenuis.

Tabla 23. Parámetros evaluados en ninfas N2 de O. laevigatus.

Tabla 24. Parámetros evaluados en ninfas N2 de N. tenuis.

186 Apéndice

Tabla 27. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de O. laevigatus tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio. Tabla 28. Porcentajes de mortalidad y descendencia en adultos de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 72 horas sobre placas de cristal en laboratorio.

Tabla 29. Porcentajes de mortalidad y descendencia en ninfas N2 de N. tenuis tras su exposición al residuo fresco de los insecticidas durante 10 días sobre placas de cristal en laboratorio.

Tabla 30. Clasificación OILB en adultos y ninfas N2 de N. tenuis tras la exposición al residuo fresco de los insecticidas sobre placas de cristal en laboratorio. Tabla 31. Ensayo de persistencia sobre pimiento en el enemigo natural O. laevigatus. Resumen de las radiaciones PAR y UV registradas en el interior del invernadero en Septiembre del 2010. Tabla 32. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas en adultos de O. laevigatus tras exponerse a los residuos de 0, 4, 7, 14, 21 y 31 días de los insecticidas sobre hojas de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s). Tabla 33. Fecundidad y fertilidad en adultos de O. laevigatus tras exponerse al residuo de 7 días de emamectina durante 72 horas sobre hoja de pimiento en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s). Tabla 34. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas en adultos de O. laevigatus cuando se aplicaron sobre plantas de pimiento y degradaron en invernadero (Radiación UV media=41,9 mol/m2*s). Tabla 35. Porcentajes de mortalidad a las 72 horas y descendencia en adultos de N. tenuis tras exponerse a los residuos de 0 y 4 días de los insecticidas sobre hojas de tomate en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s). Tabla 36. Clasificación OILB de la persistencia de los insecticidas adultos deN. tenuis cuando se aplicaron sobre plantas de tomate y degradaron en invernadero (Radiación UV media=78,4 mol/m2*s).

6. Ecdysone agonists: Ecotoxicology on Orius laevigatus. Insect toxicity bioassays and molecular docking approaches.

Table 37. Chemical tested in the experiments. Table 38. Specific conditions of PCR reaction steps for determining the OlEcR-LBD sequence. Table 39. Degenerate and specific primers used to complete the OlEcR-LBD coding sequence.

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