1. ÚVOD
1. 1 Taxonomie stafylokoků Stafylokoky patří do velké skupiny grampozitivních koků, která zahrnuje více než 30 aerobních nebo fakultativně anaerobních rodů. Původně byly grampozitivní koky děleny na základě katalázové aktivity a buněčné morfologie do dvou čeledí, Micrococcaceae a Streptococcaceae . Rod Staphylococcus původně patřil, spolu s rody Micrococcus, Stomatococcus a Planococcus, do čeledi Micrococcaceae . Z genetických studií s použitím molekulárně biologických metod vyplývá, že i když stafylokoky a mikrokoky byly zaměňovány vzhledem ke katalázové aktivitě a podobné morfologii, nevykazují stafylokoky žádnou příbuznost s mikrokoky. Rod Staphylococcus jeví větší příbuznost s rodem Macrococcus (Sedláček, 1999) a na základě fylogenetických analýz je nyní řazen v čeledi Staphylococcaceae řádu Bacillales . Více než polovina grampozitivních koků se vyskytuje v klinickém materiálu, mohou zde být přítomny jak stafylokoky, tak mikrokoky. Diferenciace stafylokoků od mikrokoků je někdy obtížná. Nejjednodušším kritériem je morfologie a produkce pigmentů. Z fyziologických testů je to tolerance k NaCl. Z biochemických testů potom přítomnost oxidázy, cytochromy a, b, c a d mají zástupci rodu Micrococcus a Kocuria, zatímco většina stafylokoků je vybavena pouze cytochromy a a b. Rozdílný je také výskyt těchto rodů v klinických vzorcích. V nich se mikrokoky častěji nacházejí jako saprofytické mikroorganismy, na rozdíl od stafylokoků, které se v klinických vzorcích často vyskytují jako podmíněné patogeny. Dále můžeme použít k odlišení antibiotika, především citlivost k bacitracinu a furazolidonu. Stafylokoky jsou bacitracin rezistentní a furazolidon citlivé, u mikrokoků jsou výsledků citlivosti opačné. Ze složitějších stanovení je kritériem složení buněčné stěny (typ peptidoglykanu) a procentuální obsah bází GC (Kloos, 1997). Stafylokoky patří k nejdéle studovaným bakteriím. Mezi první mikrobiology, kteří si uvědomovali souvislost mezi infekcí a kokovitými bakteriemi, byl francouzský přírodovědec Louis Pasteur. První druh Staphylococcus aureus , popsal v roce 1884 německý bakteriolog F. Rosenbach. Taxonomicky správně se tento nejznámější, ale také nejvýznamnější stafylokok jmenuje Staphylococcus aureus subsp. aureus (Petráš, 1998). Další stafylokok, který byl nalezen jako součást mikroflóry kůže v roce 1891, byl nazván „Staphylococcus epidermidis albus “ (Welch). Současný název Staphylococcus epidermidis pochází z roku 1916 (Evans) (Petráš, 2002). Tyto dva stafylokoky lze od sebe spolehlivě odlišit jejich schopností produkovat enzym plazmokoagulázu. Zatímco Staphylococcus aureus jako koaguláza pozitivní byl od počátku
12 považován za patogenní, koaguláza negativní Staphylococcus epidermidis byl zařazen jako komenzální mikrob. Ještě v roce 1974 v 8. vydání Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology byly prezentovány pouze tři druhy stafylokoků. Ale v následujícím roce bylo popsáno sedm druhů stafylokoků, především koaguláza negativních. Jsou to Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, a Staphylococcus warneri . V dalších letech přibývaly nové druhy stafylokoků a tento trend stále pokračuje (Petráš, 2002). V současné době je validně popsáno 39 druhů stafylokoků, 9 z nich má dva poddruhy, jeden má tři poddruhy ( Staphylococcus sciuri ). Celkem je tedy popsáno 49 taxonů stafylokoků. Jen sedm druhů stafylokoků je koaguláza pozitivních, v klinickém humánním materiálu je z nich nejčastější Staphylococcus aureus, velmi vzácně se vyskytuje Staphylococcus intermedius . Zbývající stafylokoky jsou koaguláza negativní, z nich se asi dvě třetiny vyskytují u člověka. Nejčastěji se jedná o druhy Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus a Staphylococcus hominis. Z genetických studií s použitím molekulárně biologických metod vyplývá, že i když stafylokoky a mikrokoky byly zaměňovány vzhledem ke katalázové aktivitě a podobné morfologii, nevykazují stafylokoky žádnou příbuznost s mikrokoky. Rod Staphylococcus patří nyní do čeledi Staphylococcaceae řádu Bacillales . 1. 2 Výskyt stafylokoků
Stafylokoky jsou velmi rozšířeny v přírodě, kde primárně osídlují kožní pokryv těla, kožní žlázy a sliznice savců a ptáků. Na těchto místech často představují dominantní mikroflóru. Odtud se mohou šířit do ústní dutiny, horních cest dýchacích, krevního řečiště, močového ústrojí a působit zde jako infekční agens. Druhy rodu Staphylococcus patří mezi původce závažných hnisavých onemocnění a alimentárních intoxikací člověka. Vzhledem k nozokomiálnímu charakteru představují stafylokokové infekce v celosvětovém měřítku vážný epidemiologický problém (Schaberg et al., 1991). Kůži nejčastěji osidluje Staphylococcus epidermidis , který dává přednost vlhkým místům s vyšším obsahem živin na lidské kůži (Schleifer et al., 1975). Na sušších oblastech lidské kůže se vyskytují druhy Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri nebo Staphylococcus haemolyticus (Kloos a Bannerman, 1994). Rozdílná je velikost populací, Staphylococcus hominis bývá zastoupený početněji, zatímco Staphylococcus warneri vytváří menší populace.
13
Hlavním druhem, který se vyskytuje u lidí i primátů, je Staphylococcus aureus subsp. aureus , který se vyskytuje např. v nosní dutine. Zde může být součastí normální mikroflóry. V určitých biovarech může osidlovat také domácí i volně žijící zvířata, a také ptáky. Dalším druhem, který se vyskytuje u lidí je Staphylococcus auricularis, který se nachází v prostředí zevního zvukovodu. Také druh Staphylococcus saprophyticus se nachází v menších populacích na kůži člověka a primátů (Martineau et al., 2000). Z dalších druhů, které je možné izolovat z lidské kůže jsou to Staphylococcus cohnii subsp. cohnii a Staphylococcus cohnii subsp. urealitycum. Stafylokoky reprezentují jednu z hlavních složek normální mikroflóry člověka. V průběhu 80 tých let, s objevy nových druhů stafylokoků, se začaly objevovat nové poznatky o tom, že koaguláza negativní stafylokoky nejsou jen součástí fyziologické mikroflóry kůže a sliznic člověka a ostatních savců, ale jsou známy jako původci nozokomiálních nákaz a podílejí se na infekčních onemocněních. Přibývá dokladů o jejich možném infekčním působení. Vzhledem k jejich nozokomiálnímu charakteru mohou představovat vážný epidemiologický problém (Martin de Nicolas et al., 1995). Pokud byly koaguláza negativní stafylokoky považovány za původce infekčního onemocnění, pak jen druhy Staphylococcus epidermidis a Staphylococcus saprophyticus . Ostatní druhy byly považovány za klinicky nevýznamné (Kloos a Bannerman, 1994). Podle rozmezí hostitele můžeme koaguláza negativní stafylokoky rozdělit do tří skupin, druhy, které se vyskytují u člověka ( Staphylococcus cohnii, Staphylococcus hominis ), druhy, které se vyskytují u člověka a zvířat ( Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis ), a druhy izolované ze živočichů a potravin ( Staphylococcus arlettae, Staphylococcus felis ). V rámci těchto skupin můžeme koaguláza negativní stafylokoky dále dělit podle citlivosti nebo rezistence k novobiocinu. Druhy rezistentní k novobiocinu jsou např. Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus , Staphylococcus cohnii subsp. cohnii , Staphylococcus cohnii subsp. urealyticum , Staphylococcus saprophyticus subsp. saprophticus (Sedláček, 1999). Z hlediska ekologie odlišujeme dva druhy populací, a to autochtonní (domorodé) a allochtonní (příležitostné). Toto dělení vzniklo na základě studia mikrobiálních společenstev. Zatímco autochtonní organismy se v prostředí vyskytují přirozeně a také se v něm mnohonásobně množí, allochtonní organismy jsou početně méně zastoupené a v prostředí se vyskytují jen přechodně. Důvodem je to, že nejsou plně adaptovány na podmínky prostředí, ve kterém se vyskytují, a proto jsou z tohoto prostředí eliminovány (Němec, 1986). Přechodné stafylokokyse na kůži vyskytují
14 jako kontaminanty z jiných zdrojů. Z tohoto důvodu se množí velmi často pouze omezeně a vymizí během několika hodin nebo dnů. 1. 3 Morfologie stafylokoků
Stafylokoky jsou grampozitivní koky o velikosti 0,5 – 1,5 µm, vyskytují se jednotlivě, ve shlucích nebo v krátkých řetízcích. Kolonie mohou být různé velikosti, jejich morfologie je závislá na druhu stafylokoka. Kolonie bývají lesklé i matné, okraje hladké nebo vroubkované, nejčastěji jsou vypouklé. Barva kolonií je nejčastěji světlá, některé druhy stafylokoků tvoří pigment, který má karotenoidní charakter. Barva kolonií potom bývá přes béžovou až do žluté. Mnoho koaguláza negativních stafylokoků pigment neprodukuje, příkladem je Staphylococcus epidermidis. Také Staphylococcus hominis vetšinou netvoří pigment a pokud ano, tak bývá krémově až žlutě zbarvený. Některé druhy stafylokoků produkují hemolyziny, na krevním agaru potom dochází k hemolýze, tj. k rozkladu erytrocytů v kultivačním médiu a k projasnění ( Staphylococcus aureus subsp. aureus ) (Votava et al., 1990). Mezi druhy, které neprodukují hemolyzin, patří například Staphylococcus hominis , Staphylococcus saprophyticus nebo Staphylococcus saccharolyticus . U některých zástupců stafylokoků se setkáváme s tvorbou slizu, tyto kmeny potom přisedají k povrchu, na kterém tvoří biofilm. Schopnost adheze a růstu ve formě biofilmu pomáhá stafylokokům kolonizovat povrchy poškozených tkání a cizorodých materiálů. Bakterie, které tvoří biofilm, tak snáze odolávají vlivům imunitního systému (Christensen et al., 1990). Jejich odolnost vůči antibiotikům bývá oproti bakteriím, které nejsou schopny tvořit biofilm, řádově vyšší (Davenport et al., 1986). 1. 4 Fyziologie stafylokoků
Buňky jsou nepohyblivé, nesporulující, většinou kataláza pozitivní, to znamená, že produkují enzym katalázu. Výjimku tvoří dva zástupci anaerobních druhů, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius a Staphylococcus saccharolyticus . Stafylokoky jsou odolné vůči podmínkám zevního prostředí, rostou v širokém rozmezí teplot, a to od 18 o C do 40 o C. Schopnost růstu při určité teplotě je také dána původem izolovaného kmene.
15
Jsou schopny růstu na půdách obohacených NaCl, udává se rozmezí 5 15 %. Této vlastnosti se v paxi využívá při jejich kultivaci na selektivních médiích, která jsou obohacena NaCl. I když se jedná o fakultativně anaerobní bakterie, vykazují lepší růst za aerobních podmínek. Výjimku tvoří dva kataláza negativní taxony, Staphylococcus aureus subsp. anaerobius a Staphylococcus saccharolyticus , které jsou anaerobní. Stafylokoky jsou citlivé k furazolidonu, rezistentní k bacitracinu (Falk and Guering, 1983; Urbášková, 1998) . Jsou chemoorganotrofní, některé druhy mají převážně respirační metabolismus, jiné mají fermentativní metabolismus. Jako zdroj uhlíku a energie využívají aminokyseliny nebo cukry, které mohou metabolizovat za aerobních podmínek. Hlavními produkty jsou kyselina octová a
CO 2. Zdrojem dusíku jsou organické látky, aminokyseliny a vitamíny skupiny B. Respirační řetězec u většiny stafylokoků postrádá cytochrom c, z toho vyplývá negativní test na cytochromoxidázu. U stafylokoků je buněčná stěna tvořena peptidoglykanem, kyselinou teikoovou, která je ve vodě rozpustný polymer, a proteiny. Na peptidoglykan je navázán L lyzin a mezipeptidické můstky jsou tvořeny oligoglycinovými peptidy (Kloos et al., 1992). Tyto mezipeptidické můstky jsou citlivé k působení lysostafinu. U některých druhů stafylokoků může být glycinový zbytek nahrazen L serinem nebo L alaninem. Tyto kmeny mají nižší citlivost k působení lysostafinu. Kyselina teikoová, která je obsažena v buněčné stěně, je ve vodě rozpustný polymer. V buněčné stěně bývá substituována různými molekulami, např. N acetylglukosaminem, glukózou, glycerolem nebo ribitolem. Buněčná stěna plní v buňce více funkcí. Zajišťuje buňce oporu, podílí se na transportu látek do buňky i z buňky. Obsahuje enzymy, které jsou nezbytně nutné pro životní funkci buňky. Složky peptidoglykanu jsou látky, které se významně podílejí na patogenitě buňky (endotoxiny), látky, které potlačují imunitní reakce. Teikoové kyseliny zase významně ovlivňují adsorpci buněk na povrch (Schleifer a Steber, 1974). Mezi významné proteiny, které obsahuje buněčná stěna, patří protein A, kolagen, fibrogen, které hrají důležitou roli při adhezi buněk. Protein A patří mezi nejlépe prostudované proteiny buněčné stěny a v praxi se využívá k diagnostickým účelům.
16
1. 5 Genetika stafylokoků
Procentuální obsah bází G + C v DNA se u stafylokoků se pohybuje v rozmezí 30–40 %, což je téměř poloviční hodnota než mají mikrokoky. Velikost geonomu se udává v rozmezí 2000 – 3000 bp. Kromě chromozomální DNA obsahuje většina stafylokoků také extrachromozomální DNA, která je v buňce přítomna ve formě plasmidů. Tyto plasmidy jsou nekonjugativní, jejich přenos do recipientní buňky probíhá pomocí transformace nebo transdukce. Plasmidy se klasifikují do inkompatibilních skupin. Plasmidy nesou dodatkové informace, které nejsou pro bakteriální buňku životně důležité. V hostitelských buňkách většinou kódují rezistenci k antibiotikům (např. penicilinázový plazmid), někdy může přítomnost plasmidu způsobovat multirezistenci bakteriálních kmenů. Vztahu mezi rezistencí k antibiotiku a přítomnosti určitého plasmidu lze využít k identifikaci jednotlivých kmenů. Díky molekulárně biologickým metodám, které jsou v dnešní době stále více využívány, dochází ke klasifikace nových druhů stafylokoků a k novému fylogenetickému členění. Tyto metody nám umožňují studium geonomu bakterií, studium vnitrodruhové i mezidruhové variability. Patří sem například ribotypizace, různé modifikace PCR, analýza restrikčních fragmentů, amplifikace 16S 23S rRNA, DNA DNA hybridizace, DNA RNA hybridizace , pulsní gelová elektroforéza (PFGE), inverzní gelová elektoforéza (FIGE) různě modifikované metody PCR a mnoho dalších metod (Bingen et al., 1994). Příkladem může být rozdělení stafylokoků do šesti skupin na základě genetické příbuznosti určené DNA DNA hybridizací (Kloos a Wolfshohl, 1979; Kloos et al., 1992). Na základě genového sekvencování 16S rRNA byly stafylokoky rozděleny podrobněji, a to do 11 skupin (Trülzsch et al., 2002) . Díky těmto novým molekulárním metodám lze klasifikovat nové druhy stafylokoků a tím také dochází k novému fylogenetickému členění. Molekulární metoda, která využívá vnitrodruhového i mezidruhového DNA polymorfismu, je ribotypizace (Bingen et al., 1994). Tato metoda umožňuje studium geonomu a za určitých okolností umožňuje identifikaci mikroorganismů. Při ribotypizaci dochází k hybridizaci fragmentů buněčné DNA a značené rRNA sondy, která pochází z E. coli . Buněčná DNA je štěpena restrikčními endonukleázami, používají se např. Eco RI, Hin dIII, Hin fI, DRAI, štěpením vznikají fragmenty DNA. Nejčastěji používanou sondou je rDNA, která pochází z E. coli . Tento fragment je evolučně stabilní a hybridizuje s jakýmkoli bakteriálním geonomem (Izard et al., 1992).
17
1. 6 Klinický význam stafylokoků
Stafylokoky jsou velmi rozšířeny v přírodě, kde primárně osídlují kožní pokryv těla, kožní žlázy a sliznice u savců a ptáků. Na těchto místech často představují dominantní mikroflóru. Odtud se mohou šířit do ústní dutiny, horních cest dýchacích, krevního řečiště, močového ústrojí a působit zde jako infekční agens. Druhy rodu Staphylococcus patří mezi původce závažných hnisavých onemocnění a alimentárních intoxikací člověka. Vzhledem k nozokomiálnímu charakteru představují stafylokokové infekce v celosvětovém měřítku vážný epidemiologický problém (Schaberg et al., 1991). Koaguláza negativní stafylokoky jsou fyziologickou mikroflórou kůže a sliznic člověka a zvířat, představují jednu z hlavních složek normální mikroflóry člověka, na infekcích zdravého člověka se podílejí jen vzácně. Za určitých podmínek však mohou vyvolat různá onemocnění, především u oslabených jedinců. Jedná se o pacienty v nízkém nebo naopak vysokém věku, imunitně oslabené, pacienty s různými implantáty. Další známou skupinou jsou narkomané, kteří drogu aplikují intravenózně (Drozenová a Petráš, 2000). V současné době patří koaguláza negativní stafylokoky mezi podmíněné patogeny a o jejich etiologickém uplatnění rozhoduje stav odolnosti napadeného organismu (Geary et al., 1997). Neustále přibývá prací, které dokumentují typy infekcí s prokázaným etiologickým působením koaguláza negativních stafylokoků (Stillman et al., 1987). Tyto infekce se mohou klinicky manifestovat jako lokalizovaný nebo septický proces a mohou být získány komunitně nebo nozokomiálně. V posledních letech došlo k prudkému nárůstu těchto infekcí vzhledem k zvýšenému počtu imunosuprimovaných pacientů a pacientů s implantovaným cizorodým materiálem. Jedná se například o umělé chlopně nebo různé kloubní implantáty. Koaguláza negativní stafylokoky mohou tento materiál kolonizovat a učinit z něj septické ložisko (Hébert et al., 1988). Vytvářejí na povrchu těchto umělých náhrad biofilm, ve kterém jsou uzavřeny bakteriální buňky. Při vzniku biofilmu vytvářejí bakterie vzájemnou agregací mikrokolonie, obklopené polysacharidovou substancí, tzv. slizem (Costerton et al., 1995). Vrstva slizu působí jako bariéra difúze k cílovým buňkám pro antibiotika (Lewis, 2001). Bakterie rostoucí v podobě biofirmu unikají snáze vlivům imunitního systému, lépe překonávají mechanické účinky krevního toku a jejich odolnost vůči antibiotikům bývá oproti bakteriím planktonickým řádově vyšší (Stewart a Costerton, 2001). Mezi infekce běžně spojované s tvorbou biofirmu patří například periodontitida, osteomyelitida, otitis media nebo cystická fibróza. Biofilm se také snadno tvoří na dlouhodobě zavedených močových nebo intravenózních katétrech, na tracheálních cévkách a na
18 umělých implantátech (Stewart a Costerton, 2001). Kolonizovaný katétr se tak stává chronickým zdrojem infekce (Costerton et al., 1999). Koaguláza negativní stafylokoky jsou nejčastěji izolovány z hemokultur a podle některých autorů odpovídají asi za čtvrtinu nozokomiálních sepsí (Pittet a Wemzel, 1995). Velká část nozokomiálních izolátů koaguláza negativních stafylokoků je multirezistentní, byla prokázána produkce beta laktamázy (80 90 % kmenů) a u velkého procenta kmenů (60 80 %) byla dokonce zjištěna rezistence na methicilin (Huebner a Goldmann, 1999). Dalším důležitým faktorem, který řadí koaguláza negativní stafylokoky mezi původce nozokomiálních nákaz, je produkce slizu a δ hemolyzinu jako důležitých faktorů virulence. 1. 7 Odběr a transport vzorků
Vzorky jsou, bez ohledu na původ, nejčastěji odebírány pomocí komerčně dodávaných jednorázových sterilních tamponů. Takto lze odebírat různé stěry z prostředí, ale také biologický materiál, např. vzorky z krku a dalších částí horních cest dýchacích, vzorky stolice, poševní výtěry a další. Tampony jsou plastové nebo hliníkové tyčinky (podle typy vzorku) se syntetickou bavlnou ve sterilní zkumavce. Existuje několik typů tampónů, dříve se používaly tampóny suché, bez transportní půdy, které vyžadují rychlé zpracování vzorku. Vzhledem k předpokládanému výskytu mikroorganismů, které jsou citlivé na podmínky vnějšího prostředí, je vhodnější použití tampónů s transportní půdou. Nejčastěji používané jsou univerzální Amiesova nebo Stuartova půda, a to s aktivním uhlím nebo bez něj. Tyto půdy zaručují přežití odebraných mikroorganismů po dobu 48 hodin, a to včetně náročných druhů. U stafylokoků není problém s odběrem a transportem vzorků, neboť jsou odolné vůči podmínkám vnějšího prostředí (vysychání nebo střídání teplot). 1. 8 Uchovávání stafylokoků
Pro krátkodobé uchovávání stafylokoků se používá masopeptonový agar ve zkumavce. Do něj je bakteriální kultura naočkovaná vpichem. Pro delší uchování se takto naočkovaná kultura zalije parafinovým olejem. Pro dlouhodobé uchovávání existuje více způsobů. Nejčastěji se používá hloubkové zamražení při – 75 oC. Toto se provádí v ochranném médiu, kterým je například 50 % glycerol nebo bujón.
19
Další používanou technikou je lyofilizace, která umožňuje uchování bakteriálních kultur několik roků. Tato metoda se provádí ve vakuu a spočívá v rychlém zmražení se sublimací vody a jejího odvedení. K většině bakterií je tato technika šetrná. Umožňuje dlouhodobé uchovávání bakteriálních kultur, buňky zůstávají životaschopné po několik let. 1. 9 Kultivace stafylokoků
Stafylokoky jsou obecně kultivačně nenáročné mikroorganizmy. K růstu nepotřebují žádná speciální kultivační média, používají se běžná kultivační neselektivní média jako je například krevní agar (KA), trypton sojový agar (TSA) nebo BHI agar (brain heart infusion). V případě práce s izolátem, kde předpokládáme kontaminaci, je velmi vhodné použít selektivní médium. Jsou to například Columbia CNA agarnebo média se zvýšenám obsahem NaCl. Některé druhy ale rostou rychleji na půdách obohacených heminem nebo při zvýšené tenzi CO 2 (Schleifer a Krämer, 1980). Velké procento stafylokoků se kultivuje aerobně při 37 o C 18 – 24 hodin v termostatu. Doporučuje se odečítat morfologii kolonií po třech dnech kultivace v termostatu a dvou dnech kultivace při pokojové teplotě (Kloos a Bannerman, 1999). Výjimku tvoří dva anaerobní druhy, a to Staphylococcus aureus subsp. anaerobius a Staphylococcus saccharolyticus , které vyžadují anaerobní kultivaci bez přístupu kyslíku. 1. 10 Diferenciace stafylokoků
1. 10. 1 Diferenciace na základě přítomnosti koagulázy Rod Staphylococcus je tradičně dělen na základě schopností produkovat enzym plazmokoagulázu na koaguláza pozitivní a koaguláza negativní.
Koaguláza pozitivní druhy patří mezi klinicky významné patogeny. V současné době existuje sedm koaguláza pozitivních druhů. V humánním klinickém materiálu se vyskytují pouze kmeny Staphylococcus aureus subsp. aureus , eventuálně velmi vzácně Staphylococcus intermedius . Ostatní koaguláza pozitivní stafylokoky jako je Staphylococcus hyicus , Staphylococcus delphini , Staphylococcus lutrae nebo Staphylococcus aureus subsp. anaerobius , jsou zvířecího původu. Přesto může kontaktem dojít k přenosu na člověka a k případnému onemocnění.
20
Nejvýznamnějším z nich je Staphylococcus aureus subsp. aureus díky přítomnosti velkého množství toxinů (enterotoxiny, exotoxiny, toxin syndromu toxického šoku, syndrom opařené kůže exfoliativní toxiny a další). Tento druh může způsobovat řadu různých závažných onemocnění od různých kožních infekcí, ranných infekcí, alimentárních intoxikací, přes závažnější onemocnění jako jsou septikemie, pneumonie, meningitidy, onemocnění urogenitálního traktu, endokarditidy, osteomyelitidy a další. V současné době patří Staphylococcus aureus subsp. aureus mezi nejvíce studovaný druh vzhledem k výskytu meticilin rezistentních kmenů (MRSA) (Van Belkum et al., 1993; Smeltzer et al., 1996; Gould, 2005) .
Koaguláza negativní druhy v současné době nejsou považovány pouze za součást fyziologické mikroflóry na kůži a sliznici. Dnes jsou uznávány za podmíněné patogeny, které se mohou podílet na vzniku různých infekčních onemocnění, která byla dříve přisuzována pouze druhu Staphylococcus aureus . V literatuře je obvykle uváděno přibližně 20 druhů (poddruhů) koaguláza negativních stafylokoků, které se uplatňují jako etiologická agens v lidských onemocnění. Nejčastěji jsou to Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis se dvěma poddruhy – Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (Petráš, 2004). Problémem je také rezistence k meticilinu, která byla zjištěna také u koaguláza negativních stafylokoků. Rezistence může být podmíněna přítomností mecA genu (Slaughter et al, 2001). U kmenů Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus xylosu nebo Staphylococcus sciuri byla zjištěna rezistence k oxacilinu a meticilinu (Kloos et al., 1997).
Koaguláza negativní stafylokoky citlivé k novobiocinu Sem patří především Staphylococcus epidermidis , který u oslabených jedinců může způsobovat infekce operačních ran, infekce močového ústrojí, endokarditidy, bakteriemie z hemokultur, podílí se na infekcích kloubních náhrad (Patric, 1990; Fidalgo et al., 1990). Dalšími nejčastěji izolovanými druhy jsou Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus haemolyticus . Tyto druhy mohou být odpovědny za řadu pooperačních komplikací, jako jsou záněty chlopní, záněty kloubů, endokarditidy, septikemie nebo infekce močových cest. Podobně se uplatňuje i Staphylococcus warneri , který bývá spojován s infekcemi močových cest, osteomyelitidou a endokarditidou, a Staphylococcus simulans , který je velmi často spojován s chronickou osteomyelitidou. Z veterinárního hlediska je důležité se zmínit o třech druzích, kterými jsou Staphylococcus felis , který způsobuje cystitidu, otitidu, ale také rané infekce u koček, a dále Staphylococcus warneri a Staphylococcus simulans jako původců mastitid u zvířat.
21
Koaguláza negativní stafylokoky rezistentní k novobiocinu Sem patří nedávno popsaný nový druh Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus , který byl popsán prof. Kloosem a jeho spolupracovníky v roce 1998. Tyto kmeny jsou většinou izolovány z hemokultur a velmi často jsou multirezistentní (Petráš et al., 2002). U imunitně oslabených pacientů způsobuje septikemie (Kloos et al., 1998). Jako klinicky velmi významný patří do této skupiny Staphylococcus saprophyticus , který bývá spojován se záněty urogenitálního traktu, s cystitidami, urosepsemi a u mužů se záněty prostaty (Martineau et al., 2000). Z klinicky méně významných druhů sem patří například Staphylococcus cohnii a Staphylococcus schleiferi jako původci artritid. Dále potom Staphylococcus xylossus, Staphylococcus lugdunensis a Staphylococcus caprae , kteří mohou způsobovat infekce močových cest nebo se mohou spolupodílet na endokarditidách, septikemiích a katetrových infekcích (Kloos and Bannerman, 1999). Důležitou skutečností je, že v posledních letech klinický význam těchto druhů stafylokoků stoupá. 1. 10. 2 Diferenciace podle rozmezí hostitele
Podle rozmezí hostitele můžeme koaguláza negativní stafylokoky rozdělit do tří skupin. 1. skupina – druhy, které osídlují pouze člověka 2. skupina – druhy, které se vyskytují u člověka a u zvířat 3. skupina – druhy, které se vyskytují u živočichů nebo v potravinách
V rámci těchto skupin se mohou koaguláza negativní stafylokoky dělit na základě vztahu k novobiocinu na novobiocin citlivé a novobiocin rezistentní (Sedláček, 1999).
Do první skupiny patří tyto druhy stafylokoků :
Novobiocin citlivé Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis subsp. capitis, Staphylococcus hominis subsp . hominis, Staphylococcus saccharolyticus.
Novobiocin rezistentní – Staphylococcus cohnii subsp . cohnii, Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus.
22
Do druhé skupiny patří tyto druhy stafylokoků :
Novobiocin citlivé – Staphylococcus capitis subsp . urealyticus, Staphylococcus caprae, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus warneri. Novobiocin rezistentní – Staphylococcus cohnii subsp . urealyticus, Staphylococcus pulveri, Staphylococcus saprophyticus subsp . saprophyticus, Staphylococcus sciuri subsp . sciuri, Staphylococcus xylosus. Do třetí skupiny patří tyto druhy stafylokoků :
Novobiocin citlivé – Staphylococcus carnosus subsp. carnosus, Staphylococcus carnosus subsp. utilis, Staphylococcus condimenti, Staphylococcus felis, Staphylococcus chromogenes, Staphylococcus muscae, Staphylococcus piscifermentans, Staphylococcus simiae Novobiocin rezistentní – Staphylococcus arlettae, Staphylococcus equorum, Staphylococcus gallinarum, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus lentus, Staphylococcus saprophyticus subsp. bovis, Staphylococcus sciuri subsp. carnaticus, Staphylococcus sciuri subsp. rodentium, Staphylococcus succinus, Staphylococcus vitulinus, Staphylococcus succinus subsp. casei, Staphylococcus equorum subsp . linens, Staphylococcus fleuretii a jeden z posledních validně popsaných Staphylococcus nepalensis (Nováková et al., 2006) V současné době posledními navrženými druhy stafylokoků, které nebyly dosud validně popsány jsou „ Staphylococcus pettenkoferi“ a „ Staphylococcus croceolyticus“. 1. 10. 3 Diferenciace na základě molekulárně biologických metod
Nejspolehlivěji lze stafylokoky rozdělit na základě příbuznosti jejich genomů, k tomu se využívá genetické příbuznosti určené DNA DNA hybridizací a sledování termostability DNA heteroduplexů (Kloos et al, 1992). DNA příbuznost jednotlivých genů je graficky znázorňována dendrogramy. Přes nesporné výhody molekulárně biologických analýz je velmi důležitá také fenotypová analýza a v neposlední řadě také morfologické a fyziologické vlastnosti sledovaných kmenů, jejich vztah k antibiotikům, případně bakteriofágům.
Takto byly stafylokoky rozčleněny do šesti skupin (Kloos et al, 1992) :
23
1. Staphylococcus epidermidis koaguláza negativní novobiocin citlivé druhy Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus lugdunensis.
2. Staphylococcus saprophyticus koaguláza negativní novobiocin rezistentní druhy Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus kloosii, Staphylococcus arlettae, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus equorum, Staphylococcus galinarum 3. Staphylococcus simulans koaguláza negativní novobiocin citlivé produkující beta galaktosidázu druhy Staphylococcus simulans, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus felis 4 Staphylococcus intermedius koaguláza pozitivní novobiocin citlivé druhy Staphylococcus intermedius, Staphylococcus aureus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus delphini 5. Staphylococcus hyicus koaguláza variabilní novobiocin rezistentní druhy Staphylococcus hyicus, Staphylococcus chromogenes 6. Staphylococcus sciuri koaguláza negativní novobiocin rezistentní produkující oxidázu druhy Staphylococcus sciuri, Staphylococcus lentus Podrobnější členění bylo provedeno díky metodě genového sekvenování 16S rRNA. Touto metodou byly stafylokoky rozděleny do 11 skupin (Trülzsch et al., 2002). Jsou to Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus warneri, Staphylococcus simulans, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus hyicus intermedius a Staphylococcus saprophyticus.
24
1. 11 Charakteristika druhu Staphylococcus epidermidis Patří do skupiny koaguláza negativní novobiocin citlivých stafylokoků společně s druhy Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri, Staphylococcus capitis, Staphylococcus caprae, Staphylococcus lugdunensis . Jak již bylo uvedeno v kapitole 1. 1 Taxonomie stafylokoků, Staphylococcus epidermidis byl nalezen jako druhý stafylokok Welchem v roce 1891 jako součást fyziologické kožní mikroflóry v roce 1891. Původně byl nazván „ Staphylococcus epidermidis albus“. Současné označení Staphylococcus epidermidis pochází z roku 1916 (Evans) (Petráš, 2002). 1. 11. 1 Morfologie, kultivace Jsou to grampozitivní koky, nesporulující, nepohyblivé, vyskytují se v párech, ve čtveřicích nebo ve shlucích, o velikosti 0,8 – 1,2 m. Kolonie jsou hladké, lesklé nebo matné, kulaté nebo konvexní. Okraje mohou být celistvé nebo zvlněné, velikost kolonií se pohybuje v rozmezí 5 – 10 mm. Kmeny netvoří pigment. Kmeny Staphylococcus epidermidis rostou aerobně v širokém rozmezí teplot 15 – 45 o C. Charakteristickým znakem jako u většiny stafylokoků je růst při vyšších koncentracích chloridu sodného, a to 10 – 15 % (Schleifer a Kloos, 1975). 1. 11. 2 Biochemie Kmeny druhu Staphylococcus epidermidis jsou koaguláza negativní, oxidáza negativní. Clumping faktor mají negativní, ale produkují katalázu. Ze sacharidů okyselují galaktózu , fruktózu, maltózu, sacharózu, glycerol, laktózu a asi 60 % kmenů manózu. Kyselinu netvoří z trehalózy, manitolu, xylózy, glukózy, arabinózy, celobiózy, melibiózy, melezitózy, rafinózy, ribózy, sorbitolu a xylitolu. Kmeny rodu Staphylococcus vykazují fosfatázovou aktivitu, ale existují kmeny, které mají fosfatázu negativní. Tento druh hydrolyzují močovinu, většina kmenů redukuje nitráty a dekarboxyluje arginin. Naopak dekarboxylace ornithinu vykazuje negativní reakci stejně jako hydrolýza eskulinu. Pozitivní reakci vykazuje acetoin. Jen malé procento kmenů produkuje β galaktosidázu a negativní je produkce β glukuronidázy (Schleifer a Kloos, 1975). Kmeny jsou citlivé k novobiocinu a furazolidonu, vykazují rezistenci k bacitracinu. Jsou také rezistentní k lysozymu a optochinu. Z dalších antibiotik je udávána rezistence k penicilinu,
25 oxacilinu, amoxicilinu, streptomycinu a gentamicinu, objevuje se také rezistence k meticilinu (Kloos et al., 1998). Dalším důležitým znakem je produkce slizu a δ hemolyzinu jako faktorů, které ovlivňují virulenci kmenů. V současné době se udává asi 20 % silné produkce slizu u kmenů Staphylococcus epidermidis (Freeman et al., 1989). Co se týká produkce δ hemolyzinu, byla prokázána asi u 70 % kmenů Staphylococcus epidermidis (Kubešová a Petráš, 1996). Současný výskyt obou faktorů virulence se pohybuje pouze okolo 5 % (Woznicová et al., 1993). Obsah G+C v DNA odpovídá rozmezí 30 – 39 %, které je obecně uváděno pro stafylokoky (Schleifer and Kloos, 1975). 1. 12 Identifikace stafylokoků
1. 12. 1 Fenotypová identifikace Metody typizace koaguláza negativních stafylokoků jsou pro rutinní laboratoře limitované. Fenotypová charakteristika se provádí pomocí komerčně dodávaných setů, které bývají doplněny řadou konvenčních testů. Doporučují se metody rychlé, jednoduché a spolehlivé. Základem je dobrý identifikační systém, který se skládá z co nejširší palety biochemických rozlišujících znaků, případně z biotypizace kmenů průkazem slizu a δ hemolyzinu a dále zjištěním typu rezistence na antimikobiální látky ( Herchline a Ayers, 1991). Z nejběžněji používaných identifikačních systémů jsou to STAPHYtest 16 (Pliva Lachema), a dále API STAPH a ID32 STAPH (bioMérieux), který umožňuje identifikaci 35 druhů rodu Staphylococcus a Micrococcus (Brun et al., 1990; Hébert et al., 1988). Tyto mikrotesty jsou schopny identifikovat asi 70 – 80 % kmenů a ani v případě rozšíření o konvenčními testy, nemusí dojít ke konečné identifikaci (Herwald et al., 1990). Vzhledem k tomu, že testy pro okyselování cukrů nejsou dostatečně standardizovány a vzhledem k tomu, že asi 10 % kmenů neposkytuje charakteristické výsledky, nelze výsledky získané pomocí různých testovacích systémů porovnat (Monsen et al., 1998). Z těchto důvodů dochází stále k vývoji nových identifikačních systémů, které jsou založeny na enzymatických reakcích. Jsou to například MiocroScanRapid gram Positive Indetification Systém nebo BBL crystal Gram Positive Identification Systém, které se používají k identifikaci grampozitivních koků (Monsen et al., 1998; Von Baum et al., 1998).
26
1. 12. 2 Molekulárně biologická identifikace Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem, a také vzhledem k tomu, že u kmenů izolovaných z klinického materiálu existuje mnohem větší důvod k tomu, aby došlo k spolehlivé identifikaci, jsou stále více využívány molekulární metody typizace stafylokoků (Van Belkum et al., 1996) . Existují různé metody, ale ne všechny z nich jsou pro naše účely vhodné a mnoho z nich poskytuje těžko interpretovatelné výsledky. Jedná se především o anylýzu chromozomálních restrinkčních fragmentů, gelovou elektroforézu v pulzním poli, DNA DNA hybridizaci nebo DNA hybridizaci hypervariabilních sekvencí (Bialkovska Hobrazanska et al., 1990; Izard et al., 1992). Existují ovšem metody, které jsou velmi vhodné pro identifikaci stafylokoků a dokáží identifikovat i takové, u kterých se běžně setkáváme s obtížemi. Mezi metody, které jsou vhodné pro identifikaci stafylokoků,patří například techniky založené na identifikaci kmenů pomocí vysoce konzervativních úseků genomu, jako jsou sekvence, které nesou geny pro rRNA nebo tRNA. Například pomocí ITC PCR, což je metoda amplifikace intergenových mezerníků mezi 16S 23S rDNA, bylo identifikováno přes 200 kmenů stafylokoků především z klinického materiálu a kmeny byly zařazeny do 31 druhů (Mendoza et al., 1998). Tato metoda je vhodná také pro to, že neumožňuje detekci vnitrodruhového polymorfismu. Tím na jedné straně zjednodušuje vyhodnocování výsledků, ale na druhé straně touto metodou není možné zařadit kmeny do poddruhů. Některé kmeny byly zařazeny do druhů až po restrikci PCR produktu enzymy DraI nebo HinfI. Co se týká použití v rutinních mikrobiologických laboratoří, je to metoda rychlá, nevyžaduje kultivaci kmenů, takže identifikace je provedena za 24 – 48 hodin, ekonomicky je také nenáročná (Mendoza et al., 1998). Zrychlení identifikace koaguláza negativních stafylokoků umožnuje metoda PCR prováděná v reálném čase. Nespornou výhodou této techniky je měření fluorescence v průběhu analýzy a tím sledování tvorby PCR produktu. Přínos této metody je především při identifikaci vzorku v klinických laboratořích, kde je důležitá především rychlost a spolehlivost identifikace, neboť výsledek amplifikace je znám do hodiny (Edwards et al., 2001), nevýhodou je však počáteční nákladná investice. Technika 16S rRNA hybridizace in situ je v poslední době využívána u bakteriemií, které jsou vyvolány koaguláza negativní stafylokoky tvorbou biofilmu u pacientů s voperovanými implantáty. Nespornou výhodou je možnost identifikace stafylokoků přímo ve vzorcích odebraných z napadené tkáně (Krimmer et al., 1999). Další metodou, která je vhodná pro identifikaci stafylokoků, je ribotypizace (Cookson et al., 1992). Ribotypizace je metoda poměrně časově náročná, ale dobře reprodukovatelná a stabilní. Ribotypy
27 jsou stabilní i po dvaceti pasážích buněk (Izard et al., 1992). Při ribotypizace je vyžadována poměrně široká databáze kmenů, velmi důležité při této technice je srovnání s referenčními kmeny. Daleko větší uplatnění má tato metoda pro vnitrodruhové studie (Izard et al., 1992; Sedláček a Švec, 2002). Ribotypizace také umožňuje sledování souvislosti mezi výskytem rezistence a tvorbou ribotypu, což je důležité vzhledem ke stále častěji objevující se multirezistence u koaguláza negativních stafylokoků. Velký epidemiologický význam má studium ribotypů v rámci druhu (Wilton et al., 1992). Vzhledem k taxonomickým objevům nových druhů stafylokoků přibývají nové poznatky o tom, že koaguláza negativní stafylokoky se podílejí na různých infekčních onemocněních. Obvykle se ve světové literatuře uvádí okolo 20 druhů (poddruhů) koaguláza negativní stafylokoků, které se nacházejí v humánním klinickém materiálu a uplatňují jako etiologická agens u lidských onemocněních. Důvodem může být několik faktorů, jako například výskyt multirezistence k antibiotikům, odolnost k dezinfekčním prostředkům, které se používají ve zdravotnických zařízeních.
28
2. CÍL PRÁCE 1. Izolace koaguláza negativních stafylokoků z materiálu nozokomiálních nákaz (stěry z prostředí nemocnic, z nástrojů). 2. Fenotypová charakteristika na uceleném souboru kmenů pomocí komerčního biochemického setu (STAPHYtest), doplněná klíčovými dodatkovými testy. 3. Sledování citlivosti k antimikrobiálním látkám (antibiotikům). 4. Průkaz tvorby slizu a delta hemolyzinu jako faktorů virulence u testovaného souboru izolátů. 5. Molekulárně biologická analýza vybraných izolátů metodou ribotypizace jako vhodného nástroje pro preciznější diagnostiku, studium patogenity a epidemiologickou analýzu původců infekcí. 6. Srovnání klasické fenotypové identifikace s metodou ribotypizace. Záměrem této práce je stanovení biodiverzity patogenních druhů rodu Staphylococcus a dále monitoring kmenů způsobujících nozokomiální infekce patřící do taxonu Staphylococcus epidermidis . Provedení biotypizace a ribotypizace vybraných kmenů Staphylococcus epidermidis a porovnání výsledků.
29
3. MATERIÁL A METODIKA 3. 1 Příprava kultivačních médií a chemikálií Uchovávací šikmý agar Složení : Nutrient agar (Merck)………………………43 g Destilovaná voda………………………. 1 000 ml Složky rozpustíme a rozplňujeme po 3 – 5 ml do zkumavek. Sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Zkumavky s agarem našikmíme a necháme ztuhnout. Tryptic soya agar (Merck) Složení : Tryptic soya agar………………………. 40 g Destilovaná voda…………………… 1 000 ml Sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Po vychladnutí asi na 60 o C rozléváme do Petriho misek. Krevní agar ( Merck) Složení : Columbia Blood Agar ……………………… 42 g Destilovaná voda………………………… 1 000 ml Sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Po vychladnutí na 50 o C přidáme 7 ml beranní krve na 100 ml média. Rozléváme do Petriho misek. V termostatu je vždy jedna miska z připravené šarže ponechána do druhého dne pro kontrolu sterility. Mueller Hinton agar (Merck) Složení : Mueller Hinton agar………………………35 g Destilovaná voda……………………… 1 000 ml Sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Po vychladnutí asi na 60 o C rozléváme do Petriho misek. Agar s kongo červení Složení : Brain Hearth Infusion Agar (Merck).…………… 18, 5 g Sacharóza……………………………….. ……… 25, 0 g Kongo Red……………………………………….. 0, 4 g Destilovaná voda………………………. ………. 500 ml
30
Kongo červeň rozpustíme v 50 ml destilované vody. Všechny složky přidáme do 450 ml destilované vody. Sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Po vychladnutí asi na 60 o C rozléváme do Petriho misek. Fyziologický roztok Složení : Chlorid sodný…………………………… 8, 5 g Destilovaná voda………………………. 1 000 ml Rozplňujeme dle potřeby do zkumavek a sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa). Kataláza Složení : Peroxid vodíku…………………………. 3 ml Destilovaná voda………………………. 27 ml Získáme 3 % roztok, který uchováváme v lednici v tmavých lahvích ( použitelnost max. 2 týdny). 3. 2 Příprava médií pro izolaci DNA
YT médium Složení : Trypton……………………… 1, 6 g Yeast extract…………………. 1, 0 g Destilovaná voda……………. 100 ml Kultivační médium plníme do zkumavek po 6 ml a sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa).
BHI médium Složení : Brain Hearth Infusion…………… 3, 7 g Destilovaná voda……………. … 100 ml Kultivační médium plníme do zkumavek po 6 ml a sterilizujeme v autoklávu 15 minut při 121 o C (100 kPa).
TES pufr Složení : 1 M Tris HCl………………… 1, 0 ml 0, 5 M EDTA…………………. 30, 0 ml 3 M NaCl………………………. 5, 0 ml Destilovaná voda………………. doplnit do 100 ml
31
Sterilizujeme v autoklávu 20 minut při 121 o C (100 kPa).
PBS pufr Složení : NaCl……….…………………. 0, 8 g KCl……….…………………… 0, 02 g
Na 2 HPO 4………………………0, 144 g
KH 2 PO 4………………………..0, 024 g Destilovaná voda………………. 100 ml PH upravíme na 8, 0 a sterilizujeme v autoklávu 20 minut při 121 o C (100 kPa).
TE pufr 10 : 1 Složení : Tris HCl……………………….. 1, 58 g EDTA…………………. ……… 1, 29 g Destilovaná voda……………… . 100 ml
Lysozim 100 mg/ml (159 000 U/mg, SERVA) 1 g lysozimu rozpustíme v 10 ml TE 10 : 1 pufru, rozplníme po 500 g a uchováváme při – 20 o C.
RNáza 10 mg/ml (70 U/mg, AppliChem) 10 mg enzymu rozpustíme v 1 ml TE 10 : 1 pufru, 10 minut vaříme, po vychladnutí rozplníme a uchováváme při – 20 o C. Připravujeme směs lysozymu a RNázy (500 l lysozymu, 25 RNázy).
Lysostafin 5 mg/ml (SIGMA) 5 mg lysostafinu rozpustíme v 1 ml redestilované vody.
SDS 10 % (BIO RAD) 10 g SDS rozpustíme ve 100 ml destilované vody, zahříváme na 68 o C, upravíme hodnotu pH na 7, 2.
Proteináza K 10 mg/ml (25 U/mg, SIGMA) 250 mg enzymu rozpustíme v 25 ml redestilované vody a rozplníme po 500 g. Uchováváme v lednici při teplotě 4 o C. STOP pufr Složení : Sacharóza………………………..….. 50 g Bromfenolová modř…………………. 0, 25 g
32
TBE 10x koncentrovaný…………….. 100 ml Pufr uchováváme v lednici. 3. 3 Příprava médií pro ribotypizaci
3. 3. 1 Vakuový blotting 0, 25 N Kyselina chlorovodíková Složení : Destilovaná voda……………………… 975 ml Koncentrovaná HCl…………………… 25 ml
Transferový roztok Složení : 0, 5 M NaOH…………………………. 20 g NaCl…………………………………… 35 g Destilovaná voda…………………. 1 000 ml Hydroxid rozpustíme ve vodě a přidáváme NaCl.
Roztok 2x SSC Složení : 20x SSC liquid (Amresco)……………. 20 ml 1M Tris + HCl……………………….… 40 ml Destilovaná voda…………………….. 140 ml 3. 3. 2 Prehybridizace a hybridizace Hybridizační roztok Složení : 20x SSC ………………………………………………. 25 ml 0, 5 % blocking reagens (DIG Detection Kit)…….…… 0, 5 g 0, 1 % N Laurylsarcosine (SIGMA cHEMICAL)……… 0, 1 g 10 % SDS…………………………………………….… 200 l Destilovaná voda……………………………………….. 75 ml Roztok rozpustíme ve vodní lázni při 56 o C asi 30 minut (připravujeme vždy čerstvý). Pro následnou hybridizaci přidáváme do cca 12 ml hybridizačního roztoku 25 – 50 l tepelně denaturované rRNA sondy a 5 l λ markru.
33
3. 3. 3 Promývání po hybridizaci Roztok 2x SSC Složení : 20x SSC ……………………………… 20 ml 10 % SDS……………………………….. 2ml Destilovaná voda……………………… 175 ml Roztok 0, 1x SSC Složení : 20x SSC ………………………………. 2 ml 10 % SDS……………………………… 1ml Destilovaná voda……………………. 197 ml 3. 3. 4 Detekce Neředěný pufr 1 Složení : 1M Tris + HCl …………………………… 40 ml 3M NaCl….……………………………….. 20 ml Destilovaná voda……………………… … 340 ml Detekční pufr 1 Složení : Neředěný pufr 1 ………………………… 100 ml Destilovaná voda……………………… … 900 ml
Detekční pufr 2 Složení : Blocing reagens (Roche)……………………. 1 g Neředěný pufr 1 ………………………… 100 ml Roztok rozpustíme ve vodní lázni při 56 o C. Do roztoku přidáme 16 l anti DIG AP (Roche).
Detekční pufr 3 Složení : Roztok A 1M Tris + HCl …………………………….. 20 ml 3M NaCl….……………………………… 6, 66 ml Destilovaná voda ………………. doplnit do 100 ml Roztok B
MgCl 2…………………………………… 2, 033 ml
34
Destilovaná voda ………………. ………… 100 ml Používáme čerstvě připravený roztok. Na konec detekce přidáme do 40 ml pufru 600 l NBT/BCIP solution (Roche). 3. 4 Testované mikroorganismy
Pro studii byl použit soubor grampozitivních koaguláza negativních koků, respektive stafylokoků, které byly izolované z nemocničního prostředí v souvislosti s problematikou nozokomiálních nákaz. Jednalo se o stěry z prostředí, nástrojů a rukou personálu. Odběry byly prováděny ve zdravotnických zařízeních v Brně, konkrétně na šesti lůžkových odděleních nemocnic. Stěry byly provedeny v Úrazové nemocnici (ÚN), Masarykově onkologickém ústavu (MOÚ), Centru kardiovaskulární a transplantační chirurgie (CKTCH), nemocnici Milosrdných bratří (Polní), ve Fakultní dětské nemocnici (FDN) a Fakultní nemocnici Bohunice (FNB). Vzorky byly odebírány v průběhu tří let (2001 – 2004). Stěry byly do laboratoře dodávány na komerčních tamponech s Amiesovou nebo Stuartovou transportní půdou. Bakteriální kmeny byly ze stěrů izolovány kultivačně na krevní agar a trypton sojový agar. Kmeny byly kultivovány v termostatu za aerobních podmínek, kultivace probíhala při teplotě 37 o C 24 hodin. Po této době byla provedena makroskopická a mikroskopická morfologie. Zařazení jako presumptivní Staphylococcus sp. bylo ověřeno barvením dle Grama a katalázovým testem. Od koaguláza pozitivních stafylokoků byly odlišeny jednak zkumavkovým testem ITEST STAPHY KOAGULÁZA, který slouží k detekci volné koagulázy, a jednak sklíčkovým testem, který slouží k detekci vázané koagulázy (clumping faktor). Dále byla hodnocena tvorba pigmentu a hemolýza. Potom byly izoláty uchovávány do dalšího zpracování v lednici na šikmém agaru technikou vpichu. Takto byl získán soubor celkem 215 kmenů grampozitivních, koaguláza negativních stafylokoků. Kmeny byly očíslovány, do tabulky byly zaznamenány další tyto údaje číslo kmene, název zdravotnického zařízení, kde byl odběr proveden, místo odběru a datum odběru. K souboru byly přidány dva kmeny Staphylococcus epidermidis z Národní referenční laboratoře (NRL) Státního zdravotního ústavu (SZÚ) v Praze a sbírkový kmen Staphylococcus epidermidis z České sbírky mikroorganismů v Brně (CCM). Kmeny z NRL byly potom označeny čísly NRL a sbírkový kmen číslem CCM (tabulka č. 3. 1). V průběhu uchovávání kmenů a vytváření souboru stafylokoků byly bakteriální kmeny přeočkovávány kvůli zachování životaschopnosti.
35
Tabulka č. 3. 1 Testované kmeny
Číslo kmene Zdravotnické zařízení Místo odběru Datum odběru 1/01 MOÚ ruce po chirurg. mytí 18.9.2001 2/01 MOÚ operační stůl 18.9.2001 3/01 MOÚ anest. skříňka rouška 18.9.2001 4/01 ÚN čistá emitní miska 2.10.2001 5/01 ÚN jednorázové rukavice 2.10.2001 6/01 ÚN jednorázové rukavice 2.10.2001 7/01 ÚN skříň s čistým prádlem 2.10.2001 8/01 ÚN skříň s čistým prádlem 2.10.2001 9/01 ÚN stěna pokoje za postelemi 2.10.2001 10/01 ÚN povrch převoz. vozíku 3.10.2001 11/01 ÚN vnitřek lednice s léky 3.10.2001 12/01 ÚN konstrukce úklid vozíku 3.10.2001 13/01 ÚN krabice jednoráz. rukavice 3.10.2001 14/01 ÚN vodovodní baterie 3.10.2001 15/01 ÚN manipulační plocha 3.10.2001 16/01 ÚN vyšetřovací lůžko 10.10.2001 17/01 MOÚ podložní mísa 23.10.2001 18/01 ÚN sesterna vodovod. baterie 23.10.2001 19/01 ÚN manipul.plocha v sesterne 23.10.2001 20/01 ÚN čisté ložní prádlo 23.10.2001 21/01 ÚN podložní mísa 23.10.2001 22/01 ÚN čisté prádlo ve skladu 23.10.2001 23/01 ÚN sterilní dřez na oplach 25.10.2001 24/01 MOÚ ruce vrchní sestry 1.11.2001 25/01 FDN čisté prádlo 1.11.2001 26/01 FDN vyš.komora převazový stolek 1.11.2001 27/01 FDN vyšetřovna – emitní miska 1.11.2001 28/01 FDN přebalovací stůl 1.11.2001 29/01 FNB čisté prádlo 12.11.2001 30/01 FNB kyslíková maska 12.11.2001 31/01 FNB ústí dýchacího přístroje 12.11.2001 32/01 FNB vodovodní baterie 12.11.2001 33/01 MOÚ používané rukavice 18.12.2001 34/02 FNB ruce sestry připravující infuzi 10.1.2002 35/02 FNB oděv zaměstnance 10.1.2002
36
36/02 FNB čisté prádlo na vozíku 10.1.2002 37/02 FNB čistá nádoba 10.1.2002 38/02 FNB jídelní stolek 10.1.2002 39/02 FNB čisté prádlo 10.1.2002 40/02 ÚN nádobí pro pacienty 10.3.2002 41/02 ÚN čistá emitní miska 10.3.2002 42/02 ÚN přípravná plocha 10.3.2002 43/02 ÚN pracovní oděv sestry 10.3.2002 44/02 ÚN čisté ložní prádlo 10.3.2002 45/02 ÚN umyvadlo 10.3.2002 46/02 FDN pinzeta adaptační 5.4.2002 47/02 FDN kyslíková maska 5.4.2002 48/02 FDN bedna na odpad 5.4.2002 49/02 ÚN police čisté prádlo 18.4.2002 50/02 ÚN převaz. vozík 18.4.2002 51/02 ÚN konstrukce postele 18.4.2002 52/02 ÚN dolní plocha vozíku 18.4.2002 53/02 ÚN skříň čisté prádlo 18.4.2002 54/02 ÚN úklidový vozík 18.4.2002 55/02 ÚN převaz. vozík 18.4.2002 56/02 ÚN ruce sestry 18.4.2002 57/02 ÚN manipul. plocha na léky 18.4.2002 58/02 ÚN police bažant 18.4.2002 59/02 ÚN čistý mop 18.4.2002 60/02 ÚN konstrukce převoz. vozíku 18.4.2002 61/02 ÚN čisté prádlo v polici 18.4.2002 62/02 ÚN čistá nádoba na moč 18.4.2002 63/02 MOÚ podložní mísa 19.4.2002 64/02 MOÚ plášť doktora 19.4.2002 65/02 MOÚ ruce sestry 19.4.2002 66/02 MOÚ sedací plocha lehátka 19.4.2002 67/02 MOÚ konstrukce postele 19.4.2002 68/02 MOÚ zásuvka nočního stolku 19.4.2002 69/02 MOÚ podložka na přípravu infuzí 19.4.2002 70/02 MOÚ čisté prádlo 19.4.2002 71/02 MOÚ skříň na prádla 19.4.2002 72/02 MOÚ čisté prádlo 19.4.2002 73/02 MOÚ konstrukce čisté postele 19.4.2002 74/02 MOÚ vozík podložní mísy 19.4.2002
37
75/02 ÚN přípravna léků 19.4.2002 76/02 ÚN manipulační plocha 19.4.2002 77/02 ÚN čistá podložní mísa 19.4.2002 78/02 ÚN čisté nádobí pro pacienty 19.4.2002 79/02 ÚN čisté nápojové nádobí 19.4.2002 80/02 MOÚ box vstupní prostor 16.5.2002 81/02 MOÚ box pracovní plocha 16.5.2002 82/02 MOÚ box pracovník 16.5.2002 83/02 MOÚ box nerez prac. plocha 21.6.2002 84/02 MOÚ rukavice 21.6.2002 85/02 ÚN povrch dých přístroje 27.6.2002 86/02 ÚN pean 27.6.2002 87/02 ÚN pean 27.6.2002 88/02 ÚN matrace 27.6.2002 89/02 ÚN povrch anest. stolku 2.7.2002 90/02 ÚN narkotizační maska 2.7.2002 91/02 ÚN laryngoskop 2.7.2002 92/02 ÚN povrch pumpy 2.7.2002 93/02 ÚN vstup. dveře oper.sálu 2.7.2002 94/02 ÚN povrch anest. přístroje 2.7.2002 95/02 ÚN operační lampa 2.7.2002 96/02 ÚN odhazovací stojan 2.7.2002 97/02 ÚN pojízdný úklid vozík 2.7.2002 98/02 ÚN povrch oper. stolu 2.7.2002 99/02 ÚN filtr police pro obuv 2.7.2002 100/02 ÚN infuzní stojan 2.7.2002 101/02 ÚN parapet anestezie 2.7.2002 102/02 ÚN ruce po dezinfekci 2.7.2002 103/02 ÚN rouška na oper.stole 2.7.2002 104/02 ÚN podlaha u oper. stolu 2.7.2002 105/02 ÚN vnitřek stolku anestezie 2.7.2002 106/02 ÚN stěna v čistící místností 2.7.2002 107/02 MOÚ rukavice 9.7.2002 108/02 ÚN antistatická obuv na sál 30.7.2002 109/02 ÚN přípravný stolek 30.7.2002 110/02 CKTCH medikační stolek 20.8.2002 111/02 CKTCH převaz. vozík 20.8.2002 112/02 CKTCH boční odkládací plocha 20.8.2002 113/02 CKTCH operační stůl 20.8.2002
38
114/02 CKTCH povrch oken 20.8.2002 115/02 CKTCH úložný prostor pro materiál 20.8.2002 116/02 CKTCH přípravná plocha 20.8.2002 117/02 CKTCH defibrilátor 20.8.2002 118/03 CKTCH instrument. stolek 8.3.2003 119/03 CKTCH ARO stolek 8.3.2003 120/03 ÚN rampa s pálením 8.3.2003 121/03 ÚN plášť operatéra 8.3.2003 122/03 ÚN operační stůl 8.3.2003 123/03 ÚN sál police na obuv 8.3.2003 124/03 ÚN odhazování 8.3.2003 125/03 ÚN šití instrumentářky 8.3.2003 126/03 ÚN operační lampa 19.3.2003 127/03 ÚN operační lampa 19.3.2003 128/03 ÚN povrch vyš. stolku 19.3.2003 129/03 ÚN rukavice lékaře–nesterilní 19.3.2003 130/03 Polní vyšet. stůl 25.3.2003 131/03 Polní video gastro 25.3.2003 132/03 MOÚ ruce anest. sestry 25.3.2003 133/03 MOÚ podlaha 25.3.2003 134/03 MOÚ ruce po mytí 25.3.2003 135/03 MOÚ tampony 25.3.2003 136/03 MOÚ přípravný stolek –anest. 25.3.2003 137/03 MOÚ ruce sestry 25.3.2003 152/03 MOU podlaha 25. 3. 2003 153/03 MOU vyšetřovací stůl 25. 3. 2003 154/03 MOU ruce sestry 25. 3. 2003 155/03 MOU manipulační plocha 25. 3. 2003 156/03 MOU konstrukce postele 25. 3. 2003 157/03 MOU čisté prádlo 25. 3. 2003 139/03 CKTCH úklidový vozík 1.4.2003 140/03 CKTCH ruce lékaře 1.4.2003 141/03 CKTCH police s prádlem 1.4.2003 142/03 CKTCH obuv na sál 1.4.2003 143/03 CKTCH nesterilní rukavice 1.4.2003 144/03 CKTCH tácek s nástroji 9.4.2003 145/03 CKTCH vyš. stolek 9.4.2003 146/03 CKTCH stolek s rentgen. snímky 9.4.2003 147/03 CKTCH úložný prostor pro materiál 9.4.2003
39
148/03 CKTCH přípravná plocha 9.4.2003 149/03 CKTCH instrumentační stolek 9. 4. 2003 150/03 CKTCH defibrilátor 9.4.2003 151/03 CKTCH úložný prostor pro materiál 9.4.2003 169/04 CKTCH obuv na sál 9. 4. 2003 175/03 MOÚ vyšetřovací stůl 19.4.2003 176/03 MOÚ manipulační plocha 19.4.2003 177/03 MOÚ přípravný stolek –anest. 19.4.2003 178/03 MOÚ tampony 19.4.2003 205/03 MOÚ čistá emitní miska 20.6. 2003 206/03 MOÚ přípravná plocha 20. 6. 2003 207/03 MOÚ pracovní oděv sestry 20. 6. 2003 208/03 MOÚ čisté ložní prádlo 20. 6. 2003 209/03 MOÚ umyvadlo 21. 8. 2003 210/03 MOÚ stěna za postelí 21. 8. 2003 211/03 MOÚ konstrukce postele 21. 8. 2003 212/03 ÚN dolní plocha vozíku 21. 8. 2003 159/04 MOÚ ruce anest. sestry 25.3.2004 160/04 MOÚ podlaha 25.3.2004 161/04 MOÚ ruce po mytí 25.3.2004 179/04 MOÚ podložní mísa 3. 5. 2004 180/04 MOÚ plášť doktora 3. 5. 2004 181/04 MOÚ čistá nádoba 3. 5. 2004 182/04 MOÚ jídelní stolek 3. 5. 2004 158/04 CKTCH úklidový vozík 10.5.2004 162/04 CKTCH ruce lékaře 10.5.2004 174/04 CKTCH tácek s nástroji 10.5.2004 213/04 ÚN skříň čisté prádlo 24. 5. 2004 214/04 ÚN úklidový vozík 24. 5. 2004 215/04 ÚN převaz. vozík 24. 5. 2004 216/04 ÚN podlaha 24. 5. 2004 185/04 ÚN konstrukce úklid vozíku 9. 6. 2004 186/04 ÚN jednorázévé rukavice 9. 6. 2004 187/04 ÚN vodovod. baterie 9. 6. 2004 188/04 ÚN manipulační plocha 9. 6. 2004 189/04 ÚN vyšetřovací lůžko 9. 6. 2004 190/04 ÚN podložní mísa 9. 6. 2004 191/04 ÚN vodovodní baterie 9. 6. 2004 192/04 ÚN čisté prádlo 9. 6. 2004
40
193/04 MOÚ čisté ložní prádlo 12. 7. 2004 194/04 MOÚ podložní mísa 12. 7. 2004 195/04 MOÚ čisté prádlo ve skladu 12. 7. 2004 196/04 MOÚ dřez na oplachování 12. 7. 2004 166/04 CKTCH převazový stolek 17.8.2004 167/04 CKTCH vodovodní baterie 17.8.2004 168/04 CKTCH obklady 17.8.2004 183/04 CKTCH police s prádlem 17.8.2004 184/04 CKTCH nesterilní rukavice 17.8.2004 197/04 CKTCH kyslíková maska 17.8.2004 198/04 CKTCH ústí dýchacího přístroje 17.8.2004 199/04 CKTCH vodovodní baterie 17.8.2004 200/04 CKTCH používané rukavice 17.8.2004 201/04 CKTCH plocha lehátka 17.8.2004 202/04 CKTCH konstrukce postele 17.8.2004 203/04 CKTCH noční stolek 17.8.2004 204/04 CKTCH podložka na přípravu infuzí 17.8.2004 163/04 CKTCH medikační stolek 17.8.2004 164/04 CKTCH převaz. vozík 17.8.2004 165/04 CKTCH emitní miska 17.8.2004 170/04 CKTCH konstrukce postele 17.8.2004 171/04 CKTCH lůžkoviny 17.8.2004 172/04 CKTCH obuv lékaře 17.8.2004 173/04 CKTCH boční odkládací plocha 17.8.2004 04/386 NRL hemokultura 7. 6. 2004 05/070 NRL nosohltan potkana 27 .1. 2005 2124 CCM 7221 CCM Červeně označené kmeny byly studovány ribotypizací.
41
3. 5 Kultivace kmenů Po ukončení sběru vzorků byly kmeny stafylokoků vyočkovány z uchovávacího agaru na krevní agar technikou křížového roztěru k posouzení čistoty a růstových vlastností kultury. Kmeny z NRL byly dodány na tamponech s Amiesovou transportní půdou, takže postup kultivace byl stejný jako u nemocničních kmenů. Lyofilizáty byly otevřeny a byl do nich přidán masopeptonový bujon. Po rozpuštění byly kmeny kultivovány na miskách stejně jako kmeny z tamponů. Kultivace probíhala termostatu při teplotě 37 o C 24 hodin. Po skončení kultivace byla opět byla provedena makroskopická identifikace. Byla hodnocena velikost a tvar kolonií, přítomnost hemolýzy, případně tvorba pigmentu. Misky byly ponechány do druhého dne při pokojové teplotě pro další kontrolu tvorby hemolýzy. Kmeny byly zpracovávány postupně, prvním krokem bylo provedení fenotypové charakteristiky. Na vybraném souboru kmenů byla potom provedena genotypová charakteristika. 3. 6 Mikroskopie
Mikroskopie preparátů byla prováděna barvením dle Grama. Na základě tohoto barvení lze odlišit mikroorganismy na grampozitivní a gramnegativní v závislosti na chemickém složení buněčné stěny obou skupin bakterií. 3. 6. 1 Barvení dle Grama • Na podložní sklíčko připravíme nátěr testované bakteriální kultury a dokonale vysušíme • Fixujeme plamenem • Převrstvíme krystalovou violetí – 30 sekund, barvivo slijeme a krátce opláchneme destilovanou vodou • Převrstvíme Lugolovým roztokem – 30 sekund, barvivo slijeme a krátce opláchneme destilovanou vodou • Preparát odbarvujeme etanolem nebo acetonem – 20 30 sekund, opláchneme destilovanou vodou
42
• Dobarvíme zředěným karbolfuchsinem nebo safraninem, barvivo slijeme a opláchneme destilovanou vodou • Preparát osušíme a pozorujeme pod olejovou imerzím použijeme zvětšení 100 x Hodnocení : grampozitivní mikroorganismy jsou zbarveny tmavě fialově až modročerně, gramnegativní bakterie jsou zbarveny červeně nebo růžově. 3. 7 Fenotypová identifikace
3. 7. 1 Komerční sety
STAPHYtest 16 (PLIVA Lachema a.s.) Tento set je určen k identifikaci zástupců rodu Staphylococcus . Obsahuje dehydratovaná diagnostická média uložená v mikrojamkách na mikrotitrační destičce. Testy jsou na destičce řazeny na výšku ve dvou sloupcích (A – H) ve dvou po sobě následujících řadách. Na jedné destičce tedy lze otestovat 6 kmenů pomocí 16 testů. V prvním řádku jsou to tyto testy : URE (hydrolýza močoviny), ARG (produkce arginin dihydrolázy, ORN (dekarboxylace ornithinu), GAL (produkce β galaktozidázy), GLR (produkce β glukuronidázy), NIT (redukce nitrátů), PHS (produkce fosfatázy), PYR (produkce pyrrolinodyl arylamidázy). Druhý řádek obsahuje těchto dalších 8 testů : ESL (hydrolýza eskulinu), SUC (tvorba kyseliny ze sacharózy), TRE (tvorba kyseliny z trehalózy), MAN (tvorba kyseliny z manitolu), XYL (tvorba kyseliny z xylózy), MLT (tvorba kyseliny z maltózy), MNS (tvorba kyseliny z manózy), GLN (rezistence k novobiocinu). Set je doplněn testy na průkaz tvorby acetoinu a důkaz oxidázy, které jsou dodávány ve formě diagnostických proužků. Pracovní postup Z čisté 24 hodinové kultury byla připravena ve fyziologickém roztoku suspenze. Zákal suspenze odpovídal 2. stupni McFarlandovy zákalové stupnice. Suspenzi homogenizujeme a inokulujeme 0,1 ml do každé jamky mikrotitrační destičky, přitom dbáme na to, aby nedošlo ke kontaminaci sousedních jamek. K jamkám H, G, a F (urea, arginin, ornitin) přidáme 2 kapky parafinového oleje. Destičku umístíme do polyetylénového sáčku, abychom zabránili vysychání suspenze. Kultivujeme v termostatu při teplotě 37 o C 24 hodin.
43
Hodnocení Před odečítáním jamky C, B a A (nitráty, fosfatáza, pyrrolidonyl arylamidáza) zakapeme 1 kapkou činidla určeného pro příslušnou reakci. Při negativním výsledku redukce nitrátů přidáme do příslušné jamky malé množství zinkového prášku, pro hodnocení barevných reakcí používáme tabulku „ Interpretace reakcí“. Pro konečné vyhodnocení STAPHYtestu 16 i dalších dodatkových testu byl při identifikaci použit počítačový program TNW verze 6.0. API Staph (bioMérieux) Je to standardizovaný systém pro identifikaci rodu Staphylococcus , Micrococcus a Kocuria , který obsahuje 19 miniaturizovaných biochemických testů. Jde o strip, ve kterém jsou testy seřazeny v jedné řadě. Jsou to tyto testy : GLU (okyselování glukózy), FRU (okyselování fruktózy), MNE (okyselování manózy), MAL (okyselování maltózy), LAC (okyselování laktózy), TRE (okyselování trehalózy), MAN (okyselování manitolu), XLT (okyselování xylitolu), MEL (okyselování melebiózy), NIT (redukce nitrátů), PAL (produkce fosfatázy), VP (produkce acetoinu), RAF (okyselování rafinózy), XYL (okyselování xylózy), SAC (okyselování sacharózy), MDG (okyselování α methyl D glukozidu, NAG (okyselování N acetyl glukozaminu), ADH (dekarboxylace argininu), URE (štěpení urey). Oproti STAPHYtestu 16 tato souprava obsahuje testy GLU, FRU, LAC, XLT, MEL, VP, RAF, MGD a NAG. Pracovní postup byl proveden podle návodu výrobce. 3. 7. 2 Komerční a dodatkové testy ONPG test (PLIVA Lachema a.s.) ONPG test je určen pro detekci β galaktozidázy, enzym hydrolyzující orto nitrofenyl β D galaktopyranozid, za uvolnění žlutého orto nitrofenolu. Proužek s ONPG testem vložíme do suspenze testovaného kmene ve fyziologickém roztoku, inkubujeme v termostatu při teplotě 37 o C 24 hodin. Hodnocení: Pozitivní reakce se projeví žlutým zbarvením. Tento test odpovídá testu GAL ve STAPHYtestu, je vhodnější pro slabší a opožděné reakce. OXI test (PLIVA Lachema a.s.) OXI test je určen k průkazu oxidázy, za přítomnosti atmosférického kyslíku mikroorganismy, které obsahují cytochrom c, oxidují.
44
Na reagenční zónu na proužku naneseme kličkou několik kolonií. Pozitivní reakce se projeví vznikem modrého zbarvení. VP test VP test je určen pro rychlou detekci produkce acetoinu. Substrátem pro tvorbu acetoinu je pyruvát sodný, který je obsažen v zóně proužku. Proužek vložíme do suspenze testovaného kmene ve fyziologickém roztoku, inkubujeme v termostatu při teplotě 37 o C 2 4 hodiny. Po skončení inkubace přikápneme po 3 kapkách činidla pro VPT I a činidla pro VPT II. Hodnocení : V případě pozitivní reakce (tvorby acetoinu) vzniká červené zbarvení, reakcí s α naftolem (činidlo pro VPT I) v alkalickém prostředí (činidlo VPT II). β D glukozidáza (ITEST plus ) Diagnostické disky jsou určeny pro detekci β D glukozidázy jako doplňkového testu k identifikaci některých druhů koaguláza negativních stafylokoků. Disk vložíme do husté suspenze testovaného kmene (3. stupeň Mc Farlandovy zákalové stupnice) v destilované vodě. Inkubujeme v termostatu při teplotě 37 o C 3 hodiny. Hodnocení : V případě pozitivní reakce se suspenze zbarví žlutě. Principem je detekce β D glukozidázy, která hydrolyzuje o nitrofenyl β D galaktopyranozid, za vzniku zbarveného o nitrofenolu. Průkaz plazmokoagulázy (ITEST plus ) Souprava slouží pro stanovení produkce stafylokokové plazmokoagulázy, jedná se o detekci tzv. volné koagulázy. Do aglutinační zkumavky dáme roztok králičí plazmy a přidáme testovanou bakteriální kulturu. Inkubujeme v termostatu při teplotě 37 o C 3 hodiny nebo při laboratorní teplotě do druhého dne. Hodnocení : V případě pozitivní reakce dojde ke ztuhnutí plazmy nebo k vytvoření sraženin. To je způsobeno tím, že přítomná plazmokoaguláza přemění fibrinogen králičí plazmy na nerozpustný fibrin. Průkaz clumping faktoru (ITEST plus ) Test slouží pro stanovení produkce enzymu vázané koagulázy, pozitivní buňky obsahují protein A. Na černé políčko detekční kartičky kápneme kapku latexové suspenze anti Staphylococcus aureus , kde je je navázán králičí imunoglobulin (IgG) a fibrinogen.
45
V této suspenzi rozetřeme kolonie testovaného kmene. Detekční kartičkou pohybujeme krouživými pohyby. Hodnocení : V případě pozitivní reakce dojde ke zřetelné aglutinaci, která je způsobena reakcí clumping faktoru s fibrinogenem nebo proteinu A s králičím IgG. Průkaz katalázy Test slouží průkazu produkce katalázy pomocí peroxidu vodíku. Na podložní sklíčko přidáme do kapky peroxidu vodíku kličkou testovanou bakteriální kulturu. Hodnocení: V případě pozitivní reakce dojde k rozkladu peroxidu vodíku na vodu a kyslík, který se projeví formou bublinek. 3. 8 Stanovení citlivosti k antimikrobním látkám
3. 8. 1. Rodová a vnitrodruhová diferenciace Citlivost k vybraným antibiotikům byla stanovena podle doporučené standardní metodiky NRL pro antibiotika SZÚ CEM Praha (Urbášková, 1998). Byla testována citlivost k k bacitracinu (BAC, 0,04 UI) firmy ITEST, furazolidonu (FUR, 100 g) firmy OXOID a novobiocinu (NOV, 5 g) firmy ITEST. 3. 8. 2 Antibiotická typizace Z dalších antibiotik byly vybrány oxacilin (OXA, 1 g), tetracyklin (TET, 30 g), erytromycin (ERY, 15 g), chloramfenikol (CPM, 30 g), kotrimoxazol (COT, 25 g) a amoxycilin/klavulová kyselina (AMC, 20/10 g) firmy BIO RAD . Citlivost k antimikrobiálním látkám byla stanovena diskovou difúzní metodou. Při této metodě se na povrch Mueller Hinton média rozetře 300 l inokula o hustotě suspenze 0,5 McFarlandovy stupnice a nechá se vsáknout. Po vsáknutí se na povrch pevné půdy umístí antibiotické disky tak, aby nedošlo k vzájemnému překrývání zón. Kultivujeme v termostatu dnem vzhůru při teplotě 37 o C 24 hodin. Citlivost nebo rezistence se projeví tvorbou inhibičních zón.
46
Hodnocení: Citlivost nebo rezistence k určitému antibiotiku stanovíme podle velikosti inhibiční zóny, která je udávána v mm. 3. 9 Průkaz faktorů virulernce
3. 9 1 Průkaz tvorby extracelulárního slizu
Průkaz tvorby slizu byl proveden naočkováním kmenů na Brain Hearth agar se sacharózou a kongo červení (Freeman et al., 1989). Misky byly kultivovány v termostatu dnem vzhůru při teplotě 37 o C po dobu 24 48 hodin. Hodnocení: Tvorba slizu byla hodnocena metodikou NRL pro stafylokoky se čtyřbodovou stupnicí silná produkce slizu (černé kolonie s krystalickou konzistencí), střední produkce slizu (černé lesklé kolonie), slabá produkce slizu (hnědé kolonie s černáním okolo). Za negativní výsledek byl považován růst červených lesklých kolonií. 3. 9. 2 Průkaz tvorby δ hemolyzinu
Průkaz tvorby δ hemolyzinu byl proveden na krevním agaru (Columbia agar Base) s 5 % defibrinované beranní krve, pomoci synergie s β hemolyzinem kmene Staphylococcus intermedius CCM 2885 a Staphylococcus aureus CCM 6188 (Hebert and Hancock, 1985). Kmeny produkující β hemolyzin byly naočkovány na krevní agar ve formě čáry a kolmo na tuto čáru byly naočkovány testované kmeny. Misky byly kultivovány v termostatu dnem vzhůru při teplotě 37 oC 24 48 hodin. Hodnocení: Za pozitivní reakci bylo považováno zvýraznění kompletní hemolýzy Staphylococcus intermedius a Staphylococcus aureus v místě styku s testovanými kmeny.
47
3. 10 Molekulárně biologická analýza
Fenotypovou analýzou bylo zjištěno, že ve sledovaném souboru kmenů koaguláza negativních stafylokoků byl procentuálně nejvíce zastoupen druh Staphylococcus epidermidis . Reprezentativní soubor těchto kmenů byl vybrán k molekulárně biologické analýze ribotypizaci. Důvodem redukce počtu analyzovaných izolátů byla ekonomická a časová náročnost této metody. 3. 10. 1 Izolace DNA Kmeny Staphylococcus epidermidis byly kultivovány na krevním agaru v termostatu při teplotě 37 oC 24 hodin. Následně byly kmeny naočkovány do tekutého kultivačního média 2YT (yeast extrakt a trypton) a kultivovány na třepačce v termostatu při teplotě 37 oC 20 hodin. Zcentrifugované buňky bakteriální kultury byly promyty TES pufrem a opět zcentrifugovány. Následně byly buňky resuspendovány v PBS pufru a přidáním směsi lysozymu a RNAázy (100 l) a lysostafinu (10 l) byla zahájena lyze buněk. Vzorky byly inkubovány v termostatu při 37 oC, dokud nebyla suspenze viskózní. V dalším kroku přidáme SDS (dodecylsulfát sodný) a pomocí proteinázy K byly odstraněny proteiny. Suspenzi inkubujeme do vyčeření ve vodní lázni o teplotě 56 oC. Následuje fenolová extrakce ve třech po sobě jdoucích krocích: extrakce směsí fenol, chloroform, izoamylalkohol – opakujeme 2 x extrakce směsí chloroform, izoamylalkohol 1 x Vyextrahovanou DNA vysrážíme 95 % ethanolem při nízké teplotě, zcentrifugujeme a získanou DNA promyjeme 70 % ethanolem. Zcentrifugujeme a necháme vysušit ve vakuu. DNA rozpustíme v TE pufru a necháme stát přes noc. Rozpouštění lze urychlit zahřátím na 55 oC. 3. 10. 2 Stanovení koncentrace a čistoty DNA Určení přibližné koncentrace a čistoty vyizolované DNA bylo stanoveno měřením absorbance u zředěného vzorku při 260 nm. Měření bylo prováděno pomocí přístroje RNA/DNA kalkulátoru firmy Pharmaci Biotech. Pro ribotypizaci byly použity vzorky, jejichž koncentrace byla vyšší než 0,2 g/ l a u kterých se hodnota A 260/A280 výrazně nelišila od hodnoty 1,8, což je kritérium pro nečistoty způsobené proteiny.
48
3. 10. 3 Restrikce DNA K restrikčnímu štěpení odebíráme 17 l rozpuštěné DNA, přidáme 2 l restrikčního pufru a 1 l enzymu Eco RI, kterým DNA štěpíme. Štěpení probíhá do druhého dne v termostatu při teplotě 37 oC. S restrikčním enzymem pracujeme rychle a v ledu, abychom zachovali jeho aktivitu. Štěpení zastavíme přidáním 3 l stop pufru. Dále provádíme zkušební elektroforézu (ELFO), abychom si ověřili, zda došlo k restrikci DNA. K tomu používáme 0,6 % agarózový gel, který obsahuje etidiumbromid, na něj se nanáší 3 l vzorku. Elektroforéza probíhala 60 minut při 80 V, po skončení byl gel prohlédnut pomocí transluminátoru. Za předpokladu, že štěpení DNA proběhlo v pořádku, je elektroforéza provedena znovu ve vaně o rozměrech 20 x 21 cm. Používáme stejný agarózový gel s etidiumbromidem, ale nanášíme vetší množství vzorku – 17 l a elektroforéza probíhá 18 hodin při 50 V. K testovaným vzorkům DNA byly na gel přidány hmotnostní standardy. 3. 10. 4 Vakuový přenos (Vacuum Blotter medel 785, BIO RAD) Vakuový alkalický blotting slouží k přenesení DNA z agarózového gelu na hybridizační membránu (Biodyne, Gelman Laboratory). Při přenosu průběžně doléváme „transfer“ roztok, doba přenosu je 90 minut. 3. 10. 5 Hybridizace Hybridyzaci předchází prehybridizace, která probíhá v hybridizačním válci (Hybridiser HB 2d Techne, Schoeller Instruments) při teplotě 60 oC za působení hybridizačního roztoku. Po ní následuje vlastní hybridizace, při které nasedá denaturovaná rRNA sonda na odhalená vlákna DNA. Sonda je značená digoxigeninem a spolu s DNA λ fága je přidána do hybridizačního roztoku, tento proces probíhá přes noc při teplotě 60 o C. Poté je membrána promyta roztoky 2 x SSC a 0,1 x SSC.
3. 10. 6 Detekce Sondu značenou digoxigeninem detekujeme pomocí NBT (nitrobluetetrazolium) a X fosfátu. Do detekčního pufru 2 přidáme anti DIG alkalickou fosfatázu, přebytek reagencie odstraníme promytím detekčním pufrem 1 a detekčním pufrem 3. Do 40 ml použitého detekčního pufru 3
49 přidáme NTB (substrát), roztok nalijeme do připraveného PE igelitu, kam umístíme membránu, vyhladíme vzduchové bubliny a igelit zatavíme. Membránu vyvíjíme na temném místě několik hodin. Po skončení vyvíjení membránu propláchneme vodou a necháme uschnout. 3. 10. 7 Vyhodnocení Vyhodnocení ribotypizace bylo provedeno pomocí počítačového programu GelCompar II (Applied Maths). Dendrogram byl sestrojen pomocí UPGMA shlukovací metody, za použití Dice korelačního koeficientu.
50
4. VÝSLEDKY 4. 1 Kultivace a morfologie testovaných kmenů Tato studie se zabývala testováním koaguláza negativních stafylokoků, které byly izolovány z nemocničního prostředí v souvislosti s problematikou nozokomiálních nákaz. Kmeny byly dodávány formou stěrů na tampónech s transportní půdou, izolace byla provedena na Columbia agaru (Merk) s obsahem 7 % beranní krve. Testované kmeny byly kultivovány v termostatu při teplotě 37 o C po dobu 24 hodin. 4. 1. 1 Makroskopická morfologie Vyrostlých kolonie byly pozorovány po 24 hodinové kultivaci. Misky byly ponechány do druhého dne při pokojové teplotě a opět byla pro porovnání provedena kontrola vyrostlých kolonií. U všech sledovaných kmenů odpovídala morfologie rodu Staphylococcus – kolonie byly vypouklé, kulaté, lesklé s celistvým okraji, některé kmeny tvořily pigment, jehož zbarvení se pohybovalo od šedé přes smetanovou až do béžové (kmeny č. 14, 19, 33, 51, 72, 92, 96, 97, 101, 116, 117, 120, 122, 133, 185). Většina kmenů, které tvořily pigment, patřila do skupiny neidentifikovaných, zbytek tvořil druh Staphylococcus cohnii subsp. cohnii a Staphylococcus xylosus . Hemolýzu (matnou případně jasnou) na krevním agaru tvořilo 48 % kmenů ze sledovaného souboru. 4. 1. 2 Mikroskopická morfologie Byla sledována v preparátu barveném dle Grama, sledované kmeny byly pozorovány mikroskopem Olympus při zvětšení 1 200 x pod imerzním olejem. Všechny pozorované buňky byly grampozitivní a netvořily spóry. Uspořádání bylo buď jednotlivé nebo buňky tvořily dvojice, čtveřice. Byly také pozorovány typické útvary ve formě hroznů.
51
4. 2 Fenotypová charakteristika
4. 2. 1 Výsledky komerčních a dodatkových testů a komerčních setů Ve sledovaném souboru 215 kmenů bylo na základě fenotypové charakteristiky identifikováno až na úroveň druhu celkem 204 kmenů koaguláza negativních stafylokoků, které byly zařazeny do 14 různých druhů a poddruhů rodu Staphylococcus . 11 kmenů nebylo bohužel identifikováno (5 %) ani s použitím doplňkových testů. (tabulka č. 4. 1). Tabulka č. 4. 1 Zastoupení jednotlivých druhů a poddruhů
Pořadové Druh a poddruh Počet kmenů % číslo 1 S. epidermidis 97 45,1 2 S. hominis subsp . hominis 31 14,4 3 S. haemolyticus 22 10,2 4 S. warneri 15 7,0 5 S. hominis subsp. novobiosepticus 7 3,3 6 S. capitis subsp . urealyticus 6 2,8 7 S. cohnii subsp. cohnii 5 2,3 8 S. cohnii subsp . urealyticus 5 2,3 9 S. capitis subsp. capitis 4 1,9 10 S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3 1,4 11 S. auricularis 3 1,4 12 S. simulans 2 0,9 13 S. xylosu 2 0,9 14 S. caprae 2 0,9 Neidentifikováno 11 5,1 Výsledky identifikace vycházejí z komerčních a dodatkových testů, komerčních setů STAPHY test 16 (Pliva Lachema) a API Staph (bioMerieux). Tímto setem (API Staph) byly ověřeny výsledky souboru kmenů Staphylococcus epidermidis , který byl vybrán pro ribotypizaci. Cílem bylo především rozšířit spektrum testů použitých pro identifikaci těchto kmenů a také srovnání úspěšnosti druhové identifikace stafylokoků pomocí obou setů. Na základě výsledků jednotlivých testů lze konstatovat, že oba použité sety byly srovnatelné. Pouze některé reakce založené na okyselovaní cukrů byly slabší u soupravy STAPHYtest 16 (SUC, MLT, MNS) oproti setu API Staph, kde byly reakce vzhledem k použitému indikátoru přesvědčivější a jednodušší pro odečítání.
52
Konečné vyhodnocení identifikací bylo provedeno u výsledků STAPHYtestu 16 počítačovým programem TNW verze 6.0 firmy Pliva Lachema; u soupravy API Staph byl použit apiweb . Úspěšnost identifikace je dána výstupem z počítačového programu který umožňuje automatický odečet výsledků a následné vyhdnocení. Celkový počet identifikovaných druhů a poddruhů s uvedením úspěšnosti identifikace udává graf č. 4. 1. Graf č. 4. 1 Úspěšnost identifikace testovaného souboru
Celkové počty identifikovaných druhů
87 90 85 80 75 67 70 65 60 50 55 50 Celkem počet 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Dobrá identifikace Velmi dobrá identifikace Výborná identifikace Z tohoto grafu vyplývá, že největší počet kmenů (87) byly kmeny s „velmi dobrou identifikací “, což činí 42, 6 %. „Výborná identifikace “ zahrnovala 67 kmenů (31,4 %). 50 kmenů (24,5 %) bylo pomocí TNW programu identifikováno jako „ dobrá identifikace “.
53
Graf č. 4. 2 udává počet „výborně identifikovaných“ jednotlivých druhů a poddruhů v daném souboru kmenů koaguláza negativních stafylokoků. Z tohoto grafu je zřejmé, že největší počet kmenů s „výbornou identifikací “ zahrnoval druh Staphylococcus epidermidis s počtem 28 kmenů, na druhém místě to byl Staphylococcus hemolyticus (14 kmenů) a dále Staphylococcus hominis subsp. hominis (13 kmenů). Graf č. 4. 2 Počty „výborně identifikovaných “ druhů a poddruhů
Počty výborné identifikace
30
25
20
počet 15
10 Výborná identifikace
5
0 i s s s s s s r s ii is s s i i u u u t u i s e n e u c n c i c r n u a id i c n c i i i a a s r i r i t h t p t l l m t t y o a y o p m y a l ly u u l a r o l p c c h c y w a . a . i m c e h o e e p r x d . s e p p o i . i . m r r s u s . S p S io u s u r S p e b b p a . e s a b . . . S b p u u a . h o s p s s S S u . v s s s b i s . S o i b i p n u n u t is i s . s h s b n i p i p is o i a u s t c n c s m b i . o p h . s u S S h s a o u c c c . i S is . . t n S S y i h m p o o r h p . a S s . S
54
Počty jednotlivých druhů a poddruhů s „velmi dobrou identifikací“ jsou uvedeny v grafu č. 4. 3 Graf č. 4. 3 Počty „velmi dobře identifikovaných “ druhů a poddruhů
Počty velm i dobře identifikovaných
50
45
40
35
30
počet 25 Velmi dobrá identifikace
20
15
10
5
0
s i i s s e is is u er s s ni s tis s ris n u ra id in tic rn cu cu h cu pi cu la la o s p rm m ly a ti yti co yti a ti u u yl ca e ho o w ep al . al . c hy ric im x . id . em S. s e sp re sp p au . s S. S ep sp a io ur ub u b ro . S S. b . h ob p. s p . su ap S su S ov s ii s s . s is n u b hn ub iti p in p. s co i s p b s m s tis . ni ca u o ub p i S h S. s s . h s ca co u S is . S. tic in S hy om o p . h p r S sa S.
Obdobně jako u „výborné identifikace “ je na prvním místě Staphylococcus epidermidis s 50 kmeny, dále následuje Staphylococcus hominis subsp. hominis se 14 kmeny, na třetí místě jsou se 4 kmeny Staphylococcus hemolyticus, Staphylococcus warneri a Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus .
55
Na grafu č. 4. 4 jsou uvedeny počty druhů a poddruhů s „dobrou identifikací“. Na prvním místě je to 19 kmenů druhu Staphylococcus epidermidis , dále s 10 kmeny Staphylococcus warneri a 4 kmeny druhů Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus hemolyticus . Graf č. 4. 4 Počty „dobře identifikovaných “ druhů a poddruhů
Počty dobře identifikovaných
20
18
16
14
12 Dobrá identifikace počet 10
8
6
4
2
0
s s s ri s ii s s s s s e di n i cu ne us u hn u tis u ri an su ra i i ti r ic tic o tic pi tic la ul lo p rm om ly wa t ly . c ly a y cu xy ca de h o . ep a p a . c ph ri sim . . p i p. em S o s re s re sp o au . S S e s a b i . u ub . u b p r . S S. ub . h o p i s p su a S s S ov bs ni bs s . s is . n su h su iti sp in p s co ii p b m s iti . n ca su o ub p S h . s . h s ca co S u S is . S. tic in S hy om o p . h p r S sa S.
56
4. 3 Citlivosti k antimikrobiálním látkám Ve sledovaném souboru kmenů byla charakterizována citlivost respektive rezistence ke zvolenému spektru antibiotik s cílem charakterizovat tyto nozokomiální izoláty vzhledem k možnému riziku rezistence. 4. 3. 1 Rodová a vnitrodruhová diferenciace
Byla testována citlivost k antibiotikům, a to k novobiocinu (NOV), k bacitracinu (BAC) a furazolidonu (FUR), pro testování byly použity komerčně dodávané disky. Citlivost byla testována diskovou difúzní metodou na Mueller Hinton agaru (Merck). Jako fenotypový znak pro rodovou diferenciaci, konkrétně pro odlišení rodu Staphylococcus a Micrococcus, byla použita antibiotika bacitracin a furazolidon. Pro vnitrodruhovou diferenciaci u rodu Staphylococcus byla navíc testována rezistence k novobiocinu. Charakteristika antibiotik použitých k rodové a vnitrodruhové diferenciaci byla převzata z údajů dodavatelů a je uvedena v tabulce č. 4. 2. Tabulka č. 4. 2 Charakteristika antibiotik použitých k rodové a vnitrodruhové diferenciaci ATB (koncentrace) Inhibiční zóna (mm) rezistentní Inhibiční zóna (mm) – citlivé Novobiocin (5 g) ≤ 16 > 16 Bacitracin (0,04 U) < 10 ≥ 10 Furazolidon (100 g) ≤ 16 > 16
Citlivost nebo rezistence k použitým antibiotikům byla dána příslušností testovaných kmenů k jednotlivým druhům a poddruhům rodu Staphylococcus . Sumárně jsou tyto dosažené výsledky uvedeny v následující tabulce č. 4. 3. Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis subsp . hominis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus warneri , Staphylococcus capitis subsp. urealyticus , Staphylococcus capitis subsp. capitis , Staphylococcus. auricularis , Staphylococcus simulans a Staphylococcus caprae
57
Všechny testované kmeny, které byly zařazeny do těchto druhů, jsou novobiocin a furazolidon citlivé a bacitracin rezistentní. Inhibiční zóny se pohybovaly v rozmezích, která jsou udávána dodavateli pro jednotlivé typy použitých antibiotik. Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Staphylococcus cohnii subsp . urealyticus, Staphylococcus. saprophyticus subsp . saprophyticus a Staphylococcus xylosus Všechny testované kmeny, které byly zařazeny do výše uvedených druhů, jsou novobiocin a bacitracin rezistentní a furazolidon citlivé. Inhibiční zóny se pohybovaly v rozmezích, která jsou udávána dodavateli pro jednotlivé typy použitých antibiotik.
Tabulka č. 4. 3 Vztah k použitým antibiotikům u jednotlivých druhů a poddruhů Druh a poddruh ATB Novobiocin Bacitracin Furazolidon S. epidermidis Citlivý Rezistentní Citlivý S. hominis subsp. hominis Citlivý Rezistentní Citlivý S. haemolyticus Citlivý Rezistentní Citlivý S. warneri Citlivý Rezistentní Citlivý S. hominis subsp . novobiosepticus Rezistentní Rezistentní Citlivý S. cohnii subsp. cohnii Rezistentní Rezistentní Citlivý S. cohnii subsp . urealyticus Rezistentní Rezistentní Citlivý S. capitis subsp. urealyticus Citlivý Rezistentní Citlivý S. capitis subsp. capitis Citlivý Rezistentní Citlivý S. auricularis Citlivý Rezistentní Citlivý S. simulans Citlivý Rezistentní Citlivý S. saprophyticus subsp . saprophyticus Rezistentní Rezistentní Citlivý S. caprae Citlivý Rezistentní Citlivý S. xylosus Rezistentní Rezistentní Citlivý 4. 3. 2 Antibiotická typizace Soubor látek s antimikrobiální aktivitou, které sloužily pro rodovou a vnitrodruhovou typizaci, byl rozšířen o další antibiotika. Cílem bylo zjistit citlivost respektive rezistenci a podle výsledků navrhnout antibiotika vhodná pro jednotlivá odběrová míst. K tomuto účelu byl vybrán soubor šesti antibiotik, kterými jsou koaguláza negativní stafylokoky izolované z prostředí nemocnic
58 běžně testovány (Urbášková, 1998). Byla sledována citlivost k oxacilinu (OXA), tetracyklinu (TET), erytromycinu (ERY), chloramfenikolu (CPM), kotrimoxazolu (COT) a amoxycilinu/klavulanové kyselině (AMC). Charakteristika antibiotik použitých k antibiotické typizaci je uvedena v tabulce č. 4. 4. Tabulka č. 4. 4 Charakteristika antibiotik použitých k antibiotické typizaci ATB (koncentrace) Hraniční zóna (mm) Oxacilin (1 g) ≥ 13 Tetracyklin (30 g) ≥ 19 Erytromycin (15 g) ≥ 23 Chloramfenikol (30 g) ≥ 18 Kotrimoxazol (25 g) ≥ 16 Amoxycilin/klavulanová kyselina (20/10 g) ≥ 20 Ve sledovaném souboru koaguláza negativních kmenů byla zjištěna poměrně vysoká rezistence k testovaným antibiotikům. Celkově bylo nejvíce kmenů rezistentních k amoxycilinu s klavulanovou kyselinou (54, 9%), oxacilinu (56,3 %), erytromycinu (56,8 %) a kotrimoxazolu (50,4 %). Více citlivých kmenů, to znamená nižší rezistence, byla prokázána u chloramfenikolu (32,8 %) a u tetracyklinu (28,4 %). Celkový přehled je uveden v tabulce č. 4. 5. Tabulka č. 4. 5 Celková rezistence k antimikrobiálním látkám u 204 testovaných kmenů Antibiotikum Počet rezistentních % rezistentních kmenů kmenů Oxacilin 115 56,3 Tetracyklin 58 28,4 Erytromycin 114 55,8 Chloramfenikol 67 32,8 Kotrimoxazol 103 50,4 Amoxycilin/klavulanová kyselina 112 54,9
59
Dále byla sledována rezistence na antimikrobiální látky (antibiotika) u jednotlivých druhů a poddruhů v testovaném souboru. Největší rezistence byla zjištěna u kmenů Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus. Téměř 90 % kmenů bylo rezistentní k oxacilinu, erytromycinu a amoxycilinu s klavulanovou kyselinou. Na tato uvedená antibiotika vykazovaly ve sledovaném souboru vysokou rezistenci také kmeny Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus haemolyticus. Podrobný výskyt rezistence jednotlivých druhů a poddruhů zastoupených ve sledovaném souboru je uveden v tabulce č. 4. 6. Tabulka č. 4. 6 Rezistence k antibiotikům Druh a poddruh Počet Počet rezistentních kmenů / % rezistentních kmenů kmenů OXA TET ERY CPM COT AMC S. epidermidis 97 58 / 59,8 24 / 24,7 57 / 58,8 37 / 38,1 55 / 56,7 59 / 60,8 S. hominis subsp . hominis 31 16 / 51,6 15 / 48,4 15 / 48,4 17 / 54,8 15 / 48,4 15 / 48,4 S. haemolyticus 22 18 / 81,8 8 / 36,4 19 / 86,4 6 / 27,3 18 / 81,8 19 / 86,4 S. warneri 15 4 / 26,7 4 /26,7 2 / 13,3 3 / 20,0 3 / 20,0 2 / 13,3 S. hominis subsp. novobiosepticus 7 6 / 85,7 3 / 42,9 6 / 85,7 4 / 57,1 3 / 42,9 6 / 85,7 S. capitis subsp . urealyticus 6 5 0 5 0 1 5 S. cohnii subsp. cohnii 5 2 1 2 0 2 1 S. cohnii subsp . urealyticus 5 4 3 4 0 4 3 S. capitis subsp. capitis 4 0 0 0 0 0 0 S. saprophyticus subsp. saprophyticus 3 0 0 0 0 0 0 S. auricularis 3 0 0 1 0 0 0 S. simulans 2 0 0 1 0 0 0 S. xylosu 2 1 0 1 0 1 1 S. caprae 2 1 0 1 0 1 1
60
4. 4 Průkaz tvorby faktorů virulence U všech kmenů byla testována produkce slizu a δ hemolyzinu jako dvou důležitých faktorů virulence.
4. 4. 1 Tvorba slizu Byla prokázána celkem u 154 kmenů, což je 75,5 %. Tato schopnost byla nejčastěji zjištěna u druhu Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (100 %), Staphylococcus epidermidis (87,6 %), Staphylococcus hominis subsp. hominis (80, 6 %) a Staphylococcus haemolyticus (72,7 %) Produkce slizu nebyla prokázána u žádného kmene ze sledovaného souboru u druhů Staphylococcus cohnii subsp. cohnii , Staphylococcus xylosus a Staphylococcus caprae (tabulka č. 4. 7). Tabulka č. 4. 7 Produkce slizu Druh a poddruh Počet kmenů Produkce slizu % S. epidermidis 85 87,6 S. hominis subsp. hominis 25 80,6 S. haemolyticus 16 72,7 S. warneri 10 66,6 S. hominis subsp . novobiosepticus 7 100 S. capitis subsp . urealyticus 4 S. cohnii subsp. urealyticus 2 S. capitis subsp. capitis 1 S. saprophyticus subsp. saprophyticus 2 S. auricularis 1 S. simulans 1 Celkem 154 75,5 Mezi jednotlivými druhy a poddruhy byla nalezena různá intenzita tvorby slizu. Silná tvorba slizu byla prokázána u 10 kmenů, vyskytovala se nejčastěji u druhu Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis subsp. hominis . Střední produkce slizu byla prokázána u 26 kmenů, jednalo se opět o druhy Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus , Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis subsp. hominis a
61 dále i Staphylococcus haemolyticus . Slabá produkce slizu byla prokázána u největšího počtu kmenů, vyskytovala se u 118 kmenů . 4. 4. 2 Produkce δ hemolyzinu Byla prokázána u celkem 136 kmenů, což je 66,7 %, co se týká druhového zastoupení, v souboru se vyskytovaly nejčastěji Staphylococcus haemolyticus (90,9 %) Staphylococcus epidermidis (82,5 %) a Staphylococcus hominis subsp. hominis (67,76 %) (tabulka č. 4. 8). Hemolyzin neprodukovaly žádné izoláty identifikované jako Staphylococcus simulans, Staphylococcus. xylosus a Staphylococcus caprae. Tabulka č. 4. 8 Produkce δ hemolyzinu Druh a poddruh Počet kmenů Produkce δ hemolyzinu % S. epidermidis 80 82,5 S. hominis subsp. hominis 21 67,7 S. haemolyticus 20 90,9 S. warneri 2 13,3 S. hominis subsp. novobiosepticus 4 57,1 S. capitis subsp. urealyticus 1 S. cohnii subsp. cohnii 3 S. cohnii subsp. urealyticus 1 S. capitis subsp. capitis 2 S. saprophyticus subsp. saprophyticus 1 S. auricularis 1 Celkem 136 66,7
62
4. 4. 3 Současná produkce slizu a δ hemolyzinu Byla prokázána u 76 kmenů, v tomto souboru byly zastoupeny 4 druhy, případně poddruhy. Nejčastější druh byl Staphylococcus epidermidis (58,8 %) a další v pořadí byl Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (42,9 %). Jejich výskyt uvádí tabulka č. 4. 9. Tabulka č. 4. 9 Současná produkce slizu a δ hemolyzinu Druh a poddruh Počet kmenů Produkce slizu a δ hemolyzinu % S. epidermidis 57 58,8 S. hominis subsp . hominis 10 32,3 S. haemolyticus 6 27,3 S. hominis subsp. novobiosepticus 3 42,9 Celkem 76 37,3
63
4. 5 Biotypizace druhu Staphylococcus epidermidis Ve sledovaném souboru kmenů koaguláza negativních stafylokoků byl procentuálně nejvíce zastoupen druh Staphylococcus epidermidis . Na základě fenotypové charakteristiky bylo ze souboru 204 kmenů koaguláza negativních stafylokoků identifikováno celkem 97 kmenů druhu Staphylococcus epidermidis , což činilo 45,1 %. Úspěšnost identifikace je uveden v grafu č. 4. 5. Graf č. 4. 5 Úspěšnost identifikace Staphylococcus epidermidis
S. epidermidis
50 50
45
40
35 28 30
25 19 S. epidermidis 20
15
10
5
0 Dobrá identifikace Velmi dobrá Výborná identifikace identifikace
Výsledky korespondují s celkovou úspěšností identifikace všech druhů a poddruhů. Největší počet kmenů (50) bylo s „velmi dobrou identifikací , což činilo 51,5 %. Na druhém místě to byly kmeny s „výbornou identifikací “, jednalo se o 28 kmenů (28,9%). Kmenů s „dobrou identifikací “ bylo 19 (19,6%). Z těchto 97 izolátů druhu Staphylococcus epidermidis byl vybrán reprezentativní soubor 33 kmenů, který byl podroben molekulárně biologické analýze ribotypizaci.
64
Úspěšnost identifikace souboru kmenů použitých k ribotypizaci je uvedena v grafu č. 4. 6. Graf č. 4. 6 Úspěšnost identifikace Staphylococcus epidermidis použitých k ribotypizaci
Identifikace S. epidermidis
Dobrá identifikace 3
Výborná Velmi dobrá identifikace 21 identifikace 11
Na základě úspěšnosti identifikace můžeme kmeny rozdělit do tří skupin. „Výborná identifikace “ byla u 21 kmenů, což je 60 %, „velmi dobrá identifikace “ zahrnovala 11 kmenů (31,4 %) a „dobrou identifikaci “ měly 3 kmeny, což činí 9,1 %.
65
Procentuální poměr srovnání úspěšnosti identifikací celkového počtu Staphylococcus epidermidis se souborem kmenů, které byly použity k ribotypizaci, je uveden v grafu č. 4. 7. Graf č. 4. 7 Srovnání úspěšnosti identifikace Staphylococcus epidermidis
Procentický poměr identifikací S.epidermis
60
55 S. epidermidis (ribotyp.) (%)
50 S. epidermidis (%)
45
40
35
30
25 procenta identifikací 20
15
10
5
0 Dobrá identifikace Velmi dobrá identifikace Výborná identifikace
66
Pro ribotypizaci byly zvoleny kmeny Staphylococcus epidermidis, které byly identifikovány s vysokou mírou spolehlivosti („ výborná identifikace “). V souboru byly také použity kmeny, které byly identifikovány „velmi dobře“ a „dobře“ (přibližně polovina kmenů). Kmeny byly vybrány tak, aby byly poměrně zastoupeny všechny zdroje izolace a pokryla se tak případná vnitrodruhová heterogenita ve vztahu k různým zdrojům. Sumární počty porovnávaných kultur Staphylococcus epidermidis jsou uvedeny v grafu č. 4. 6, který názorně demonstruje výše uvedenou situaci. Biochemické profily 33 podrobněji analyzovaných kmenů byly téměř homogenní, rozdílné reakce kmenů z ribogroups R1 až R4 jsou uvedeny v tabulce č. 4. 10. V rámci tohoto souboru byly zjištěny atypické reakce u dekarboxylace ornitinu (kmen č. 178) a u hydrolýzy eskulinu (kmeny č. 145 a 160) (tabulka č. 4. 10). Velká většina izolátů produkovala sliz a také produkce δ hemolyzinu byla častým znakem (tabulka č. 9), což svědčí o klinickém významu studovaných kmenů. Společně pozitivní reakce u izolovaných kmenů zahrnovaly produkci katalázy, acetoinu, ureázy a fosfatázy, redukci nitrátů na nitrity a tvorbu kyseliny ze sacharózy a maltózy. Společně negativní reakce byly u těchto izolátů u produkce oxidázy, volné i vázané koagulázy, žlutého pigmentu, β glukuronidázy, pyrrolidonyl arylamidázy, tvorba kyseliny z trehalózy, mannitolu a xylózy. Rozdílné reakce byly u argininu, kde 25 kmenů (75,8 %) mělo pozitivní reakci a 8 kmenů (24,2 %) negativní reakci. Obdobná situace byla u manózy, kde 22 kmenů (66, 7 %) bylo pozitivních a 11 kmenů (33,3 %) negativních. Všechny kmeny byly rezistentní k bacitracinu a citlivé k novobiocinu i furazolidonu. Jednotlivé rozdílné reakce neovlivnily výslednou identifikaci a nebyla pozorována žádná souvislost mezi fenotypovým profilem a ribotypy. Jak je z dendrogramu (obrázek č. 4. 2) zřejmé, tyto kmeny (č. 178, 160, 145) mají shodný ribotyp s ostatními zástupci skupiny R3 a tyto charakteristiky nijak neovlivňují genotypizaci. Vzhledem k tomu, že biochemické profily analyzovaných kmenů byly téměř homogenní a atypické reakce byly nalezeny jen u třech kmenů, nebyla pozorována žádná souvislost mezi biotypy a ribotypy.
67
Tabulka č. 4. 10 Variabilní reakce studovaných 33 kmenů S. epidermidis
Kmen č. SLIZ δHEM HEM β GLS GAL ORN ESL ARG MNS R1 8 + + + + + + + 40 + + + + 50 + + + + 75 + + + + + 88 + + + + + + 99 + + + + + + 177 + + + + + NRL 04/386 NT + + NRL 05/070 NT + + + R2a 118 + + + 150 + + + + 174 + + + + + R2b 119 + + + 146 + + + + R3a 159 + + + + + 160 + + + + 161 + + + + 178 + + + + + + R3b 90 + + + + 104 + + + + 113 + + + + + + 114 + + + + + +
68
145 + + + + + + 148 + + + 151 + + + + + 169 + + + + + + 184 + + + + + R4 158 + + + + + 162 + + + + + 163 + + + + + + 164 + + + + + + 173 + + + + 176 + + + + + 183 + + + + + 152 + + + + CCM 2124 NT + + +
Vysvětlivky : SLIZ produkce slizu δ HEM produkce δ hemolyzinu HEM hemolýza (matná případně jasná) β GLS průkaz β D glukosidázy β GAL průkaz β galaktozidázy ORN dekarboxylace ornithinu ESL hydrolýza eskulinu ARG arginin dihydroláza MNS produkce kyseliny z mannózy NT netestováno
69
4. 6 Molekulárně biologická charakteristika 4. 6. 1 Výsledky ribotypizace Pro ribotypizaci byl vybrán soubor 33 izolovaných kmenů Staphylococcus epidermidis doplněný o tři referenční kultury (CCM 2124 T, NRL 04/386 a NRL 05/070). Na základě dosažených výsledků ribotypizace byly analyzované kmeny rozděleny do čtyř skupin ribogroup R1 R4 (obrázek č. 4. 1); dosažené ribogroup R1 až R4 téměř 100 % korelují s odběrovou lokalitou: Obr. 4. 1 Rozšíření izolátů (ribotyp R1 R4) vzhledem k místu odběru
ÚN (R1) CKTCH (R2) MOÚ (R3a) ÚN, CKTCH (R3b) R4 (OSTATNÍ)
70
Ribogroup R1 , jehož podobnost je v intervalu 95 %, pocházel z pracoviště Úrazové nemocnice (UN). Kmeny byly izolovány v rozmezí tří měsíců. Co se týká podobnosti ribotypů, první čtyři kmeny této skupiny vykazují téměř totožné ribotypy, dva poslední kmeny se mírně odlišují a nejvíce odlišným izolátem tohoto cluster je kmen 177. Součástí tohoto shluku byly i ribotypy referenčních kmenů NRL 04/386 a NRL 05/070. Ribogroup R2 (R2a a R2b) sdružuje pět kmenů na hladině podobnosti 80 %. Tyto kmeny byly izolovány s jednoročním odstupem na Centru kardiovaskulární a transplantační chirurgie (CKTCH). Z těchto výsledků je evidentní, že tento klon na tomto pracovišti přetrvává a jedná se z epidemiologického hlediska o závažné zjištění. U ribogroup R3 (R3a, R3b) je situace obdobná jako u cluster R1, kmeny mají ale vysokou hladinu podobnosti, a to 99 %. Tento cluster tvoří třináct kmenů a představuje nejvíce homogenní skupinu analyzovaných izolátů Staphylococcus epidermidis . Čtyři kmeny, které se sdružují v cluster R3a, pocházely z Masarykova onkologického ústavu (MOÚ). Ribogroup R3b tvoří devět kmenů, které jsou téměř totožné. Dva z těchto kmenů pochází z Úrazové nemocnice, ostatní z CKTCH. Tyto kmeny byly získány v průběhu dvouletého monitoringu, což svědčí o závažnosti situace, protože tento klon zde opět v prostředí přetrvává. Ribotypizace v tomto případě jednoznačně prokázala klonální identitu řady izolátů druhu Staphylococcus epidermidis . Poslední skupinu, Ribogroup R4 , tvoří osm kmenů s velmi heterogenní ribotypy, které se klastrují do několika jednoznačně vymezených skupin. Ribotypy těchto kmenů mají navzájem nízkou podobnost. Hladina podobnosti ribotypů je přibližně 60 %, přestože se jedná o kmeny biochemicky shodné. Kmeny byly izolovány z pracovišť MOÚ a CKTCH. Zajímavou skutečností je, že v rámci skupiny R4 se nachází typový kmen Staphylococcus epidermidis CCM 2124 T a jemu nejblíže příbuzný dle ribotypizace je kmen č.152, který pochází z MOÚ. Z epidemiologického hlediska je zřejmé, že všechny čtyři ribogroups korelují s místem nálezu, byla tedy shledána souvislost s odběrovou lokalitou a profilem ribotypů. Tento fakt svědčí o závažnosti situace, neboť tyto kmeny přetrvávají v nemocničním prostředí i několik let. Co se týká podobnosti, ribotypy v prvních třech skupinách si jsou velice podobné, na hladině podobnosti od 80 % do 99 %. Výjimku tvoří poslední skupina, kterou tvoří velmi heterogenní ribotypy, kde je také seskupen typový kmen. Vyhodnocení ribotypizace bylo provedeno pomocí počítačového programu GelCompar II (Applied Maths). Dendrogram byl sestrojen pomocí UPGMA shlukovací metody, za použití Dice korelačního koeficientu.
71
Obr. 4. 2 dendrogram ribotypizace Ribotypizace ( Eco RI) kmenů Staphylococcus epidermidis Druh Č. kmene Lokalita Ribogroup
72
5. DISKUZE 5. 1. Fenotypová charakteristika koaguláza negativních stafylokoků
Ve sledovaném souboru 215 kmenů grampozitivních koků, bylo na základě fenotypové charakteristiky identifikováno až na úroveň druhu či poddruhu celkem 204 kmenů koaguláza negativních stafylokoků, zbývajících 11 kmenů nebylo bohužel identifikováno ani s použitím doplňkových testů. Kultivační vlastnosti, makroskopická i mikroskopická morfologie izolátů odpovídaly popisu rodu Staphylococcus . Pro typizaci koaguláza negativních stafylokoků se doporučuje identifikační systém , který se skládá z široké palety biochemických testů, doplněný dodatkovými testy. Biotypizace bývá doplněna průkazem faktorů virulence (tvorba slizu a delta hemolyzinu), případně testováním rezistence k antimimikrobiálním látkám (Deighton, 1988, Herwald et al., 1990). Z identifikačních setů byly použity Staphytest 16 (Pliva Lachema), který byl doplněn setem API Staph (BioMérieux). S použitím identifikačního programu TNW byly izolované koaguláza negativní stafylokoky zařazeny do 14 různých druhů a poddruhů rodu Staphylococcus . Nejčastěji zastoupeným druhem byl Staphylococcus epidermidis, dále potom Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus haemolyticus, což je ve shodě s literárními údaji (Kubešová a Petráš, 1996). Testovaný soubor koaguláza negativních stafylokoků byl zhodnocen na základě úspěšnosti identifikace. Takto vznikly tří skupiny, kmeny s „výbornou identifikací“, s „velmi dobrou“ a s „dobrou identifikací“. 5. 2. Antimikrobiální látky
Byla testována citlivost respektive rezistence k vybraným antibiotikům, jednalo se o novobiocin, bacitracin a furazolidon (Urbášková, 1998). Na základě citlivosti nebo rezistence vznikly dvě skupiny kmenů. Tato tři antibiotika sloužila pro rodovou a vnitrodruhovou diferenciaci. Kmeny, které byly novobiocin a furazolidon citlivé a bacitracin rezistentní Staphylococcus epidermidis , Staphylococcus hominis subsp . hominis , Staphylococcus haemolyticus , Staphylococcus warneri , Staphylococcus capitis subsp. urealyticus , Staphylococcus
73 capitis subsp. capitis , Staphylococcus. auricularis , Staphylococcus simulans a Staphylococcus caprae Kmeny, které byly novobiocin a bacitracin rezistentní a furazolidon citlivé Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus, Staphylococcus cohnii subsp. cohnii, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, Staphylococcus. saprophyticus subsp . saprophyticus a Staphylococcus xylosus . Pro antibiotickou typizaci byl vybrán soubor šesti antibiotik. Sledovaný soubor překvapivě vykazoval poměrně vysokou rezistenci k vybraným antibiotikům, nejvíce rezistentních kmenů bylo prokázáno u kmenů druhu Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus. Zjištěná rezistence je v souladu s výsledky uvedenými NRL pro stafylokoky (Petráš, 2000). Vysoká rezistence byla zjištěna také u kmenů druhu Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus haemolyticus. Rezistenci k oxacilinu u 25 – 50 % nemocničních kmenů koaguláza negativních stafylokoků uvádí Urbášková (1998). V této práci byla rezistence k oxacilinu zjištěna u 56 % testovaných kmenů, což je evidentně alarmující údaj. Rezistenci u 65 % kmenů koaguláza negativních stafylokoků uvádí Kubešová a Petráš (1996). Důvodem vysoké rezistence koaguláza negativních stafylokoků může být prostředí, ze kterého pocházejí. V nemocničním prostředí se nacházejí pacienti, kteří jsou dlouhodobě léčeni antibiotiky. Ta působí nejen na patogeny, ale i na fyziologickou mikroflóru. V důsledku selekce pak toto prostředí slouží jako rezervoár kmenů s vysokou rezistencí vůči antibiotikům. Další významnou skutečností je fakt, že tyto zmiňované druhy byly také producenty slizu (Souli a Giamarellou, 1998). Vrstva slizu působí jako bariéra difúze antibiotik k cílovým buňkám. Díky slizové vrstvě se také v bezprostřední blízkosti bakterií koncentrují enzymy, které rozkládají antibiotika (Stewart, 1996). Také nahromadění odpadních produktů a relativní nedostatek živin vede ke změně fyzikálně chemických podmínek v mikrokoloniích. V této souvislosti je možné předpokládat, že v biofilmu dochází k fenotypovým změnám a ke vzniku klidových stádií buněk. Toto může být důvodem zvýšené odolnosti vůči antibiotikům (Lewis, 2001). Tyto kmeny koaguláza negativních stafylokoků, které tvoří biofilm a vykazují multirezistenci k antibiotikům, se mohou uplatňovat při vzniku nozokomiálních infekcí a že je toto nebezpečí reálné, vyplývá i z výsledků prezentované studie.
74
5. 3 Faktory virulence
Co se týká průkazu faktorů virulence, údaje o tvorbě slizu koaguláza negativními stafylokoky se u různých autorů liší (Davenport et al., 1986; Votava et al., 1990). Toto může být dáno jednak použitím různých metod, ale také různou interpretací. Někteří autoři používají pro průkaz tvorby slizu Christensenovu metodu s krystalovou violetí, na základě této metody byla schopnost tvorby slizu prokázána u 67 % kmenů izolovaných z krve (Davenport et al., 1986). Pro testovaný soubor koaguláza negativních stafylokoků byla použita metoda doporučovaná Národní referenční laboratoří pro stafylokoky , která využívá agar s kongo červení. Srovnání obou metod provedla Woznicová et al. (1993), která udává jako producenty slizu jen ty kmeny, které na půdě s kongo červení tvoří černé suché kolonie s matným a drsným povrchem (14 % kmenů), což odpovídá závěrům Freemana et al. (1989). Takto rostoucí kmeny byly považovány v testovaném souboru koaguláza negativních stafylokoků za silné producenty slizu. V prezentované práci je uveden celkový počet kmenů, které produkovaly sliz bez ohledu na stupeň intenzity produkce slizu. Tvorba slizu byla prokázána celkem u 154 kmenů, což je 75,5 %. Tato schopnost byla nejčastěji zjištěna u druhu Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (100 %), což se shoduje s údaji uvedenými v literatuře (Votava et al., 1990). Produkce slizu potencuje kolonizaci implantovaných materiálů, je jednou z vlastností, která je spojována s virulencí koaguláza negativních stafylokoků. Hlavní složkou slizu je polysacharid o molekulové hmotnosti 20 kDa, který vyvolává produkci protilátek u pacientů s infekcemi vyvolanými koaguláza negativními stafylokoky produkujícími sliz (Karamanos et al., 1997). Dalším významným faktorem virulence je δ hemolyzin, jeho výskyt je nejčastěji popisován u druhu Staphylococcus haemolyticus, v ětšina autorů se shoduje na hodnotě 100 % (Votava et al., 1990, Kubešová a Petráš, 1996). V souboru testovaných kmenů byla produkce δ hemolyzinu u celkem 136 kmenů, což je 66,7 %. Nejčastěji se vyskytovala u druhu Staphylococcus haemolyticus (90,9 %). Byla také sledována současná produkce slizu a δ hemolyzinu, která byla prokázána u 76 kmenů z celého souboru. Nejčastěji byl zastoupen druh Staphylococcus epidermidis (58,8 %) a další v pořadí byl Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (42,9 %). Drozenová a Petráš (2000) ve své práci prokázali největší současnou produkci obou faktorů virulence u druhu Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus (33,3 %). Rozdílné výsledky jsou dány tím, že do tohoto souboru
75 byly ale brány jen kmeny se silnou produkcí slizu. Jak již bylo uvedeno, v souboru testovaných kmenů nebyl zohledněn stupeň produkce. 5. 4 Biotypizace a ribotypizace Staphylococcus epidermidis
Pro ribotypizaci byl vybrán druh Staphylococcus epidermidis, tento druh měl v souboru testovaných koaguláza negativních stafylokoků největší zastoupení (45,1 %). Ribotypizace je metoda poměrně časově náročná, ale dobře reprodukovatelná a stabilní. Ribotypy jsou stabilní i po dvaceti pasážích buněk (Izard et al., 1992). Při ribotypizaci je vyžadována poměrně široká databáze kmenů, velmi důležité při této technice je srovnání s referenčními kmeny. Daleko větší uplatnění má tato metoda molekulární biologie pro vnitrodruhové studie (Izard et al., 1992, Sedláček and Švec, 2002). Oproti fenotypovým metodám spočívají výhody ribotypizace v tom, že DNA můžeme izolovat z jakýchkoliv bakteriálních buněk (Bingen et al., 1994). V závislosti na testovaném kmeni a použitém restrikčním enzymu můžeme identifikovat do druhu, případně do poddruhu ((Marsou et al., 2001, Kloos, 1997). Také použitý restrikční enzym významně ovlivňuje výsledek ribotypizace. Při použití několika restriktáz při identifikaci bývá dosaženo výrazně lepších výsledků, diskriminační síla se zvýšila ze 14,3 % na 31,6 %. Pro ribotypizaci rodu Staphylococcus se nejčastěji používají restrikční enzymy Eco RI, HindIII a DraI. V této práci byl pro restrikci kmenů použit enzym EcoRI a k hybridizaci sonda 16S 23S rRNA. Na základě literárních poznatků se dá předpokládat, že srovnání výsledků použitím dalšího restrikčního enzymu by bylo velmi vhodné. Důvodem, proč nebyl použit druhý restrikční enzym, byla ekonomická i časová náročnost této metody. Velmi důležité jsou podmínky ribotypizace, postup ribotypizace je možné standardizovat. Rozčlenění do skupin a vyhodnocení ribotypů však může být velmi subjektivní a v této fázi je velmi důležitá velikost použité databáze. Na základě šíře databáze je možné srovnat profily jednotlivých ribotypů testovaných kmenů s ribotypy referenčních kmenů. Na základě provedené ribotypizace byly analyzované kmeny rozděleny do čtyř skupin. Z epidemiologického hlediska je zřejmé, že všechny čtyři ribogroups koreluje s místem nálezu, byla shledána souvislost s odběrovou lokalitou a profilem ribogroups. Tento fakt svědčí o závažnosti situace, neboť tyto kmeny přetrvávají v nemocničním prostředí i několik let. Co se týká podobnosti, ribotypy v prvních třech skupinách jsou si velice podobné, na hladině podobnosti od 80 % do 99 % . Výjimku tvoří poslední skupina, kterou tvoří velmi heterogenní ribotypy, a kde je také seskupen typový kmen.
76
Vzhledem k tomu, že biochemické profily analyzovaných kmenů byly téměř homogenní a atypické reakce byly nalezeny jen u třech kmenů, nebyla pozorována žádná souvislost mezi biotypy a ribotypy. Metoda ribotypizace je vhodná jak pro identifikaci stafylokoků, ale i pro epidemiologické studie (Nováková et al., 2006). Kombinací ribotypizace a biotypizace potom dochází ke zvýšení diskriminační síly na 48,6 % (Izard et al, 1992). Ribotypizace také umožňuje sledování souvislosti mezi výskytem rezistence a tvorbou ribotypu, což je důležité vzhledem ke stále častěji objevující se multirezistence u koaguláza negativních stafylokoků. Velký epidemiologický význam má studium ribotypů v rámci druhu.
77
6. ZÁVĚR Koaguláza negativní stafylokoky se běžně vyskytují jako fyziologická mikroflóra kůže a sliznic člověka a zvířat. Za určitých podmínek mohou vyvolat různá onemocnění, především u oslabených jedinců. V předložené disertační práci byly testovány kmeny koaguláza negativních stafylokoků, které byly izolovány z nemocničního prostředí v souvislosti s výskytem nozokomiálních infekcí. V současné době patří koaguláza negativní stafylokoky mezi podmíněné patogeny, které způsobují různé infekce. Izolované kmeny byly identifikovány na základě fenotypových charakteristik, v souboru těchto kmenů byl doložen význam přesné bakteriální identifikace. Na základě biochemických testů bylo v souboru 215 testovaných kmenů identifikováno celkem 14 druhů a podruhů koaguláza negativních stafylokoků. Přibližně 5 % kmenů z testovaného souboru nebylo identifikováno, protože vykazovaly velmi netypické reakce nebo malou enzymovou aktivitu. Důležitým faktorem, který řadí koaguláza negativní stafylokoky mezi původce nozokomiálních nákaz, je produkce slizu a δ hemolyzinu jako důležitých faktorů virulence. Z výsledků této práce je zřejmé, že produkce faktorů virulence byla prokázána přibližně u 70 % identifikovaných kmenů koaguláza negativních stafylokoků, což svědčí o klinickém významu testovaných kmenů. Další důležitým zjištěním je to, že se kmeny koaguláza negativních stafylokoků vyznačují multirezistencí na antibiotika. Výsledky práce prokázaly, že největší rezistence byla prokázána k amoxycilinu s klavulanovou kyselinou, oxacilinu , erytromycinu a kotrimoxazolu. Významná rezistence k antibiotikům byla prokázána především u kmenů druhu Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus , a dále u Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hominis subsp. hominis a Staphylococcus haemolyticus. Z nejvíce početně zastoupeného druhu Staphylococcus epidermidis byl vytvořen reprezentativní soubor kmenů, které byly testovány ribotypizaci. Biochemické profily podrobněji analyzovaných kmenů druhu Staphylococcus epidermidis byly téměř homogenní, jak již bylo v této práci zmíněno. V rámci tohoto souboru byly zjištěny atypické reakce u dekarboxylace ornitinu a u hydrolýzy eskulinu. Velká většina izolátů produkovala sliz a také produkce δ hemolyzinu byla častým znakem. Jednotlivé rozdílné reakce neovlivnily výslednou identifikaci a nebyla pozorována žádná souvislost mezi fenotypovým profilem a ribotypy. Na základě dosažených výsledků ribotypizace byly analyzované kmeny rozděleny do čtyř skupin – ribogroup.
78
Co se týká podobnosti, ribotypy v prvních třech skupinách jsou si velice podobné, na hladině podobnosti od 80 % do 99 %. Výjimku tvoří poslední skupina, kterou tvoří velmi heterogenní ribotypy, kde je také seskupen typový kmen. Z epidemiologického hlediska je zřejmé, že všechny čtyři ribogroups korelují s místem nálezu, byla tedy shledána souvislost s odběrovou lokalitou a profilem ribotypů. Tento fakt svědčí o závažnosti situace, neboť tyto kmeny přetrvávají v nemocničním prostředí i několik let. Na základě výsledků lze konstatovat, že molekulárně biologické metody, např. ribotypizace, umožňují preciznější diagnostiku, studium patogenity a epidemiologickou analýzu infekcí vyvolaných koaguláza negativními stafylokoky. Tato studie prokázala, že ribotypizace je vhodná metoda pro charakterizaci epidemiologického významu druhu Staphylococcus epidermidis . Dále ukázala, že analyzované bakteriální kmeny mohou přetrvávat v nemocničním prostředí po několik let. Proto je velmi důležité provádět v nemocničních prostředí monitorování bakteriálních kmenů, které mohou způsobovat nozokomiální infekce (Van Belkum, 1996).
79
7. LITERATURA Bialkowska Hobrzanska H., Jaskot D., Hammerberg O. : Evaluation of restriction endonuclease fingerprinting of chromosomal DNA and plasmid profil analysis for characterization of multiresistant cagulase negative staphylococci in bacteremis neonates. J. Clin. Microbiol. Rev., 7, pp. 311 327, 1990 Bingen E. H., Denamur E., Elion J. : Use of ribotyping in epidemiological surveillance of nosocomial outbreaks. Clin. Microbiol. Rev. 7, pp. 311 327, 1994 Brun Y., Bes M., Boeufgras J. M. : International collaborative evaluation of the ATB 32 STAPH gallery for identification of the Staphylococcus species . Zbl. Bakt. 273, s. 319 326, 1990 Christensen G.D., Barker L.P., Mawhinney T.P. : Identification of an antigenic marker of slime production for Staphylococcus epidermidis . Infect. Imun. 58, 1990 Costerton J. W., Lewandowski Z., Caldwell D. E., Korber D. R., Lapppin Scott H. M. : Microbial Biofilms. Annu. Rev. Microbial., 49, s. 711 745, 1995 Costerton J. W, Stewart P. S., Greenberg E. P. : Bacterial biofilms : a common cause of persistent infections. Science 284, s. 1318 1322, 1999 Cookson B. D., Stapleton P., Ludlam H. : Ribotyping of coagulase negative staphylococci. J. Med. Microbiol. 36, 1992 Ewards K. J., Kaufmann M. E., Saunders N. A. : Rapid and accurete identification of coagulase negative staphylococci by real time PCR. J. Clin. Microbial., 39, pp. 3047 3051, 2001 Davenport D.S., Massanari R.M., Pfaller M.A. et al. : Usefulness of a test for slim production as a marker for clinically significant infection with coagulase negative staphylococci. J. Infect. Dis. 153, 1986
80
Deighton M.A. : Species identification , antibiotic sensitivity and slime production of coagulase negative staphylococci isolated from clinical specimens. Epidemiol. Infect. 111, pp. 99 113, 1988 Drozenová J., Petráš P. : Vlastnosti koagulázanegativních stafylokoků izolovaných z hemokultur. Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 49, 2000 Falk D., Guering S. J. : Differentiation of Staphylococcus and Micrococcus spp. with the taxo Bacitracin disc. J. Clin. Microbiol., 18 pp. 719 721, 1983 Fidalgo S., Vázguez F., Mendoza M. C. : Bacteriemia due to Staphylococcus epidermidis: microbiologic. Epidemiologic, clinical and prognostic features. Rev. Infect. Dis., 12, s. 520 528, 1990 Freeman D. J., Falkiner F. R., Keane C. T., : New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J. clin. Pathol. 42, 1989 Geary C., Jordens J. Z., Richardson J. F., Hawcroft D. M., Mitchell C. J. : Epidemiological typing of coagulase negative staphylococci from nosocomial infection. J. Med. Microbiol 46, 1997 Gould I. M. : The Clinical Significance of methicillin Resistant Staphylpcoccus aureus. J. Hosp. Infect. 61, s. 277 282, 2005 Hébert G. A., Hancock G. A. : Synergistic hemolysis exhibited by specie of styphylococci. J. Clin. Microbiol., 22, pp. 409 412, 1985 Hébert G. A. Cooksey R. C., Clark N. C., Hill B. C., Jarvis W. R., Thornsberry C. : Biotyping coagulase negative staphylococci. J. Clin. Microbiol. 26, 1988 Herchline T. E., Ayers L. L. W. : Occurrence of Staphylococcus lugdunensis in consetutive clinical cultures and relationship of isolation to infection. J. Clin. Microbiol., 29, s. 419 421, 1991 Herwaldt L.A., Boyken L.D., Pfaller M..A. : Biotyping of coagulase negative staphylococci. Diagn. Microbiol. infect. Dis. 13, 1990
81
Huebner J., Goldmann D. A. : Coagulase negative staphylococci : Role as pathogens. Annu. Rev. Med. 50, 1999 Izard N. C., Hachler H., Grehn M., Kayser F. H. : Ribotyping of coagulase negative staphylococci with special emphasis on intraspecific typing of Staphylococcus epidermidis. J. Clin. Microbiol. 30, 1992 Karamanos N. K., Sykorov A., Panagiotopovlov H. S. : The major 20 kDa polysacharid of Staphylococcus epidermidis extracellular slime and its antibodi in blood serum and differetiating among slime positive and negative S. epidermidis and other staphylococci species. Archives. Biochem. Biophysics. 342, pp. 389 395, 1997 Kloos W. E., Wolfshohl J. F. : Evidence for deoxyribionucleotide sequencu divergence between staphylococci living on human and other primate skin. Curr. Microbiol., 3, pp 167 172,1979 Kloos W. E., Schleifer K. H and Götz F. : The genus Staphylococcus . In The Prokaryotes, 2 nd end., Balows A., Trüper H. G., Dworkin M., Harder W., Schleifer K. H. (eds), 1992 Kloos W. E., Bannerman T. L. : Update of clinical significance of coagulase negative staphylococci. Clin. Microbiol. Rev. 7, 1994 Kloos W. E. : Taxonomy of systematics of staphylococci indigenous to human. In The Staphylococci in Human and Disease. Edited by K. B. Crossley and G. L. Archer, 1997 Kloos W. E., George C. G., Olgiate J. S., Pelt L. V., McKinnon M. L., Zimmer B. L., Müller E., Weinstein M. P. and Mirrett S. : Staphylococcus hominis subsp. nov., a novel trehalose and N acetylglucosamin negative and multiple antibiotic resistant subspecies isolated from human blood cultures. Int. J. Syst. Bacteriol. 48, pp. 799 812, 1998 Kloos W. E., Bannerman T. L. : Staphylococcus and Micrococcus In : Manual of Clinical Mocrobiology, 7 th edn., pp. 264 282. Murray P. R., Baron E. J., Pfaller M. A. Tenover F. C. and Yolken R. H., (eds). ASM Press, Washington, DC, 1999
82
Krimmer V., Merkert H., Von Eiff Ch., Frosch M., Eulert J., Löhr J. F., Hacker J., Ziebuhr W. : Detection of S taphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis in clinical samples by 16 rRNA directed in situ hybridizacion. J. Clin. Microbiol., 37, pp. 2667 2673, 1999 Kubešová J. , Petráš P.: Koagulázanegativní stafylokoky izolované z hemokultur. Scripta. Med. 69, 52 53, 1996 Lewis K. : Riddle of biofilms resistance. Antimicrob. Agents Chemother., 45, s. 999 1007, 2001 Marsou R., Bes M., Brun Z., Boudouma M., idrissi M., Meugnier H., Freney J., Etienne J : molecular techniques open up new vistas for typing of coagulase negative staphylococci. Pathol. Biol., 49, pp. 205 215, 2001 Martin de Nicolas M. M., Vindel A. : Epidemiological typing of clinically significant strain of coagulase negative staphylococci. J. Hospt. Infect. 29, 1995 Martineau F., Picard F. J., Ménard Ch., Roy P. H., Ouellette M. and Bergeron M. G. : Development of rapid PCR Assay specific of S taphylococcus saprophyticus and application to direct detection from urine samples. J. Clin. Microbial., 38, pp. 3280 3284, 2000 Mendoza M., Meugnier H., Bes M., Etienne J., Freney J. : Identification of Staphylococcus species by 16S 23S rDNA intergenic spacer PCR anylysis. Int. J. Sys. Bacteriol, pp. 1049 1055, 1998 Monsen T., Rönnmark M., Olofsson C., Wiström J. : An inexpensive and reliable methods for routine identification of Staphylococcal species. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 17, pp. 327 335, 1998 Němec M. : Ekologie mikroorganismů I., Přírodovědecká fakulta, UJEP Brno, str. 5 100, 1986 Nováková D., Sedláček I., Pantůček R., Štětina V., Švec P., Petráš P.: Staphylococcus equorum and Staphylococcus succinus isolated from human clinical specimens. J. Me.d Microbio.l 55, 523 528, 2006. Patric C. C. : Coagulase negative staphylococci : Pathogens with increasing clinical significance. J. Pediat. 116, 1990
83
Petráš P. : Taxonomické změny v rodu Staphylococcus . Zprávy CEM (SZÚ Praha); 1998; 7 (9) Petráš P. : nebezpečná koaguláza negativní stafylokok Staphylococcus hominis subsp . novobiosepticus. Zprávy CEM (SZÚ Praha), 9 (8), s. 324 326, 2000 Petráš P. : Biochemická identifikace stafylokoků. Remedia Klin. Mikrobiol. 4 (5), 2000 Petráš P. : Současný stav taxonomie rodu Staphylococcus se zřetelem k druhům významným pro klinickou mikrobiologii. Klin. Mikrobiol. Inf. Lék. 8, 2002 Petráš P. : Aktuality v taxonomii rodu Staphylococcus. Zprávy CEM (SZÚ Praha), 13 (7), s. 297 300, 2004 Pittet D., Wenzel R. P. : Nosocomial bloodstream infections. Secular trends in rates, mortality and contribution to total hospital deaths. Arch. Intern. Med., 155, pp. 1177 1184, 1995 Schaberg D. R., Culver D. H., Gaynes R. P. : Major trends in the microbial etiology of nosocomial infection. Am. J. Med 91, 1991 Schleifer K. H., Steber J. : Chemische Untersuchungen am Phagenreceptor von Staphylococcus epidermidis. Arch. Microbiol., 98, pp. 251 270, 1974 Schleifer K. H., Kloos W. E.. : Isolation and characterization of staphylococci from human skin. Int. Syst. Bacteriology, 25, pp. 251 270, 1975 Schleifer K. H., Krämer E. : Selective medium for isolating staphylococci. Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. Abt. I orig. C 1, pp. 270 280, 1980 Sedláček I.: Taxonomy of staphylococci. Remedia Klin. Mikrobiol 1999; 3 (2) Sedláček I., Švec P. : Characterization of Staphylococcus xylosus isolated from bats. In abstrakt book of 10 th International symposium on staphylococci and staphylococcal infection, Tsukuba Japan, pp. 171, 2002
84
Slaughter D. M., Patton T. G., Sievert G., Sobieski R. J., Crupper S. S. : Antibiotic resistance in coagulase negative staphylococci isolated from Cope´s gray treefrogs (Hyla chrysoscelis). FEMS Microbiol. Lett., 205, pp. 265 270, 2001 Smeltezer M. S., Pratt F. L., Gillaspy A. F., Young L. A. : Genomic fingerprinting for epidemiological differentiation of Staphylococcus aureus clinical isolated. J. Clin. Microbiol., 34, pp. 1364 1372, 1996 Souli M., Giamarellou H. : Effect of slime produced by clinical isolates of coagulase negative staphylococci on activities of various antimicrobial agents. Antimicrob. Agents Chemother. 42, 1998 Stewart P. S : Theoretical aspects of antibiotik diffusion into microbial biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 40, pp. 2517 2522, 1996 Stewart P. S., Costerton J. W. : Antibiotic resistance of bacteria in biofilms. Lancet 358, s. 135 138, 2001 Stillman R.I., Wenzel R.P., Donowitz L.G. : Emergence of coagulase negative staphylococci as major nosocomialn bloodsdtream patogens. Infect. Control. 8, 1987 Urbášková P. : Rezistence bakterií k antibiotikům. Vybrané metody, Praha Trios, 1998 Trülzsch K., Rinder H., Trček J., Bader L., Wilhelm U., Heesemann J. : Staphylococcus pettenkoferi a novel staphylococcal species isolated from clinical specimens. Diagnostic Microbiology and Inf. Disease 43, 2002 Van Belkum A., Bax R., Peerbooms P., Goessens W. H. F., Van Leeuwen N., Quint W. G. V. : Comparison of phage typing and DNA fingerprinting by polymerase chain reaction for discrimination of methicilin resistant Staphyl occus aureus strains. J. Clin. Microbiol., 31, pp. 798 803, 1993 Van Belkum A., Kluijtmans J., van Leeuwen W., Goessens W., ter Averst E., Wielenga J., Verbrugh H. A. : Monitoring persistence of coagulase negative staphylococci in a hematology department using phenotypic and genotypic strategies. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 17, 1996
85
Von Baum H., Klemme F. R., geiss H. K., Sonntag H. G. : Comparative evalaution of a commercial system for identification of gram.positive cocci. J. Clin. Microbiol., 17, pp. 849 852, 1998 Votava M., Skalka B., Šedivá J. : Tvorba slizu, hemolýza a proteolýza u koaguláza negativních stafylokoků izolovaných u člověka z hemokultur. Čs. Epidem. 39, 1990 Wilton J., Jung K., Vedin I., Aronsson B., Flock J. I. : Comparative evaluation of a new molecular methodfor typing Staphylococcus epidermidis . Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11, 1992 Woznicová V., Votava M., Skalka B : Srovnání dvou metod průkazu tvorby slizu u koaguláza negativních stafylokoků. Čs. Epidem. 42, 1993
86
Seznam tabulek
Tabulka č. 3. 1 Testované kmeny 36 Tabulka č. 4. 1 Zastoupení jednotlivých druhů a poddruhů 52 Tabulka č. 4. 2 Charakteristika antibiotik použitých k rodové a vnitrodruhové diferenciaci 57 Tabulka č. 4. 3 Vztah k použitým antibiotikům u jednotlivých druhů a poddruhů 58 Tabulka č. 4. 4 Charakteristika antibiotik použitých k antibiotické typizaci 59 Tabulka č. 4. 5 Celková rezistence k antimikrobiálním látkám u 204 testovaných kmenů 59 Tabulka č. 4. 6 Rezistence k antibiotikům 60 Tabulka č. 4. 7 Produkce slizu 61 Tabulka č. 4. 8 Produkce δ hemolyzinu 62 Tabulka č. 4. 9 Současná produkce slizu a δ hemolyzinu 63 Tabulka č. 4. 10 Variabilní reakce studovaných 33 kmenů S. epidermidis 68 Seznam obrázků Obr. 4. 1 Rozšíření izolátů (ribotyp R1 R4) vzhledem k místu odběru 70 Obr. 4. 2 Dendrogram ribotypizace 72 Seznam grafů Graf č. 4. 1 Úspěšnost identifikace testovaného souboru 53 Graf č. 4. 2 Počty „výborně identifikovaných“ druhů a poddruhů 54 Graf č. 4. 3 Počty „velmi dobře identifikovaných“ druhů a poddruhů 55 Graf č. 4. 4 Počty „dobře identifikovaných“ druhů a poddruhů 56 Graf č. 4. 5 Úspěšnost identifikace Staphylococcus epidermidis 64 Graf č. 4. 6 Úspěšnost identifikace Staphylococcus epidermidis použitých k ribotypizaci 65 Graf č. 4. 7 Srovnání úspěšnosti identifikace Staphylococcus epidermidis 66
87
Seznam použitých zkratek CCM Czech Collection of Microorganisms
CO 2 kysličník uhličitý DNA deoxyribonukleová kyselina Dnáza produkce deoxyribonukleázy ELFO elektroforéza G + C mol% guaninu a cytosinu v DNA ITS PCR PCR vnitřních přepisovaných mezerníků kDa kiloDaltonů kol. kolektiv MRSA metycilin rezistentní kmen Staphylococcus aureus NaCl chlorid sodný NBT nitrobluetetrazolium NRL Národní referenční laboratoř pro stafylokoky PCR polymerázová řetězová reakce rDNA DNA kódující geny pro rRNA RNA ribonukleová kyselina rRNA ribozomální ribonukleová kyselina SDS dodecylsulfát sodný tRNA transferová ribonukleová kyselina UPGMA nevážená párová skupinová metoda s aritmetickým průměrem Ostatní zkratky a složitější termíny jsou popsány v textu.
88
Přílohy Publikace
L. Malíková, I. Sedláček, D. Nováková, M. Němec : Ribotyping and biotyping of Staphylococcus epidermidis isolated from hospital enviroment . Folia Microbiologica, 2007, V tisku. Konference
Malíková L. : Průkaz enterotoxinů u kmenů Staphylococcus aureus. Celostátní konference hygienické služby s mezinárodní účastí, Luhačovice, 2001.
Malíková L. : Izolace koaguláza negativních stafylokoků z materiálů nozokomiálních nákaz. Konference „Aktuální problematika hygienických laboratoří“, Rožnov pod Radhoštěm, 2003.
Malíková L. : Distribution of gram positive coagulase negative catalase positive cocci isolated from hospital material. IX. Pracovní setkání biochemiků a molekulárních biologů, Brno, 2005.
Aktivita nad rámec tématu disertační práce
Malíková L., Steinhauserová I. : Porovnání záchytnosti vybraných selektivních půd pro Salmonelly. Konference „Negativní a pozitivní úloha mikroorganismů“, Čeladná, 1993
Steinhauserová I., Malíková L. : Výskyt alimentárních onemocnění v ČR v letech 1989 1992. Vývěskové sdělení. Pečenkovy epidemiologické dny, Hradec Králové, 1993
Steinhauserová I., Malíková L. : The occurence Campylobacter sp. in Czech Republic in 1993. 7 th International Congress of bakteriology and Applied Mikrobiology Division. Praha, 1994
Steinhauserová I., Malíková L. : Epidemiologická situace ve výskytu alimentárních onemocnění v ČR v roce 1993. Souhrny referátů o hygieně a technologii potravin XXIV. Lenfeldovy a Höklovy dny. VŠVF, Brno, s. 49, 1994
Steinhauserová I., Malíková L. : Výskyt Campylobacter jejuni u nás. Maso, 5, č. 4, s. 32 33, 1994
89
Malíková L. : Význam stanovení Campylobacter jejuni. Konference Krajské hygienické stanice pod záštitou MZ ČR, Brno, 1998 Malíková L. : Metody kultivace bakterií rodu Listeria. Konference Krajské hygienické stanice pod záštitou MZ ČR, Brno, 1999 Malíková L. : Vyšetřování prostředků zdravotnické techniky. Konference Krajské hygienické stanice pod záštitou MZ ČR, Brno, 2000. Malíková L.: Využití výpočetní techniky pro odhad nejistot mikrobiologické zkoušky. Konference hygienické služby, Nové Město na Moravě, 2002.
Malíková L. : Kontrola sterilizačních procesů ve zdravotnických zařízeních. Mezinárodní konference „Nemocniční hygiena“, Brno, 2004.
Malíková L. : Aplikace Nařízení Komise ES č. 2073/2005 o mikrobiologických kritériích pro potraviny. Konference Problematika hygienických laboratoří MPZ, Jihlava, 2006. Malíková L. : Současné požadavky na mikrobiologické a biologické odběry, vyšetření a hodnocení vod ke koupání. Inovační kurz v hygieně obecné a komunální, NCONZO Brno, 2006 Zapojení do pedagogické činnosti Pomoc při výuce předmětu Obecná mikrobiologie – cvičení : podzimní a jarní semestr 2001 2002 podzimní a jarní semestr 2002 2003 podzimní a jarní semestr 2003 2004
90