Universidade Federal Da Paraíba

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS

TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA A CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ , Matricaria chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS.

JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA

JOÃO PESSOA – PB 2007

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JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da

Saúde/Laboratório de Tecnologia Farmacêutica

da Universidade Federal da Paraíba, em cumpri mento às exigências para a obtenção do título de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de concentração: Farmacoquímica.

Orientador: Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo

JOÃO PESSOA – PB 2007

JÚLIA BEATRIZ PEREIRA DE SOUZA

Aprovado em 21 de Dezembro de 2007

COMISSÃO EXAMINADORA

______Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo

______Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly Moura

______Prof. Dr. Cícero Flávio Soares Aragão

______Profª. Drª. Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz

______Prof. Dr. Celso Amorim Câmara

S731 Souza, Júlia Beatriz Pereira de Tecnologia analítica baseada na pirólise acoplada a cromatografia gasosa/espec trometria de massa para caracterização de extratos de Erythrina mulungu Linné , Matricaria chamomilla Linné, E Passiflora

alata Curtis / Júlia Beatriz Pereira de Souza - João Pessoa, 2007. 126 p. il. Orientador: Rui Oliveira Macêdo Tese (Doutorado): UFPB/CCS/LTF 1. Produtos Naturais. 2. Pirólise-Cromatografia gasosa- Espectrometia de massa. 3. Erythrina mulungu 4. Matricaria chamomilla . 5. Passiflora alata

UFPB/BC CDU: 547.9 (043)

Este trabalho é dedicado aos meus pais

Magnólia Pereira de Souza e José Anchieta de

Souza, meus primeiros referenciais da verdadeira sabedoria e inteligência, baseadas nos princípios de honestidade, trabalho, perseverança, humildade, educação, esperança, fé e amor.

AGRADECIMENTOS À Deus, Trindade Santa, eterna sabedoria; À Virgem Maria, exemplo de fortaleza, perseverança, fé e esperança; Ao Prof. Dr. Rui Oliveira Macêdo pelo acolhimento, confiança e orientação; À Universidade Federal da Paraíba, professores, funcionários, prestadores de serviço, na pessoa de Franscysmary Nogueira e José Jailto, pela atenção e empenho em proporcionar o bom andamento dos trabalhos experimentais; Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, na pessoa da Profª Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz, pela valiosa contribuição na minha formação acadêmica; Aos então discentes do Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, em especial, Luciano Augusto de Araújo Ribeiro, pela amizade e companheirismo; Aos Colegas da linha de pesquisa em Desenvolvimento e Ensaios de Medicamentos, Ana Cláudia Dantas de Medeiros, Ana Flávia Oliveira dos Santos, Antonilêni Duarte Medeiros, Elisana Moura e Hallisson Pires, Fábio Santos Souza, Francisca Maria Souza, Francinalva Dantas de Medeiros, Fabíola e Pablo, Irinaldo Diniz Bazílio Jr, João Paulo Guedes, Lidiane Pinto Correia, Rodrigo Molina, Rodrigo Albuquerque, Louisianny Guerra da Rocha, Márcia Ferraz Pinto, Mônica Oliveira da Silva Simões, Sayonara Maria Lia Fook Meira Braga, pela força, companheirismo e amizade; A Januária Costa dos Santos Lima, pela amizade, apoio, disponibilidade e colaboração. Às amigas, Ana Paula Barreto Gomes e Ertha Janine Medeiros Lacerda, pela presença constante, paciência, apoio e incentivo; Aos companheiros do Laboratório de Bromatologia, Profª Rita de Cássia Queiroga, Elieidy, Carlos Eduardo, Renata Lima, pela atenção, apoio e companheirismo. A Mônica Tejo, Daniel, Kerly e Ranielly Silveira, irmãos que a vida me deu. A Inise Machado de Lima e Igor Machado, pela partilha e pela força transmitida diante dos mais diversos sentimentos durante a concretização desse trabalho. À família Santa Maria, em especial Ana Goldfarb, Sheylla Lacerda e Adriana Gomes Magalhães, e cada um dos colegas de trabalho, nas pessoas de Lourdes, Filomena, Pollyana, Gigliola, Dimitri, Wellington, Joselito, João, Angelo, Simone, Gilberto Cerqueira, Marly, Cláudia, Sandra, Guttemberg...pelo apoio, companheirismo, carinho e atenção. Aos amigos de todas as horas, Katiúscia Barbosa, Samuel, Janaína e Costa, Tia Carmen, Paulo, Vilma, Davi, Fernanda, Drª. Dalva, José Edson e Maria Hilda, Pe. Rui Braga, Pe. Eduardo, Pe. Ribamar, D. Epaminondas Araújo..., verdadeiros presentes de Deus. À minha família, meus pais Magnólia Pereira de Souza e José Anchieta de Souza (Juca), meus irmãos, José Anchieta de Souza Jr e Emílio José Pereira de Souza, meus sobrinhos, Navarro, Ana Beatriz e Lorena Beatriz, Tia Neném (Aparecida) e Ramos, pelo apoio incentivo e compreensão nos tantos momentos de ausência;

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

“33 Como é profunda a riqueza, a sabedoria e a ciência de Deus! Como são insondáveis Suas decisões, e como são impenetráveis Seus caminhos! 36 Porque todas as coisas vêm dEle, por meio dEle e vão para Ele. A Ele pertence a glória para sempre. Amém.”.

Paulo de Tarso Carta aos romanos, capítulo XI. (Século – I, d.C) i

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...... iii LISTA DE QUADROS ...... v LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ...... vi RESUMO ...... vii ABSTRACT ...... viii

1. INTRODUÇÃO ...... 1

CAPÍTULO I 2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1. Plantas com Atividade Ansiolítica ...... 3 2.1.1. Erythrina mulungu Linné...... 5 2.1.2. Matricaria chamomilla Linné ...... 7 2.1.3. Passiflora alata Curtis ...... 8 2.2. Fitoterapia ...... 10 2.3. Legislação para Fitoterápicos ...... 14 2.4. Desenvolvimento Tecnológico e Produção de Fitoterápicos ...... 14 2.4.1. Soluções Extrativas e Extratos Secos por Nebulização ...... 16 2.4.2. Processo de secagem por Nebulização ...... 18 2.4.2.1. Fases do Sistema ...... 19 2.4.2.2. Aplicação da técnica de Nebulização ...... 22 2.5. A Qualidade dos Fitoterápicos ...... 25 2.6. Métodos Analíticos ...... 27 2.7. Técnicas Analíticas ...... 30 2.7.1. Pirólise ...... 30 2.7.2. Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e Espectrometria 35 de Massa (Pir-GC/MS) ...... 2.7.3 Cromatografia ...... 36 2.7.4. Cromatografia Gasosa (CG) ...... 37 2.7.5. Espectrometria de Massas ...... 40 OBJETIVOS ...... 43 3. REFERÊNCIAS ...... 44

CAPÍTULO II

“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO .”...... 55 REFERÊNCIAS ...... 75

CAPÍTULO III

“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Matricaria chamomilla LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO” ...... 80 REFERÊNCIAS ...... 96 CAPÍTULO IV

“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR NEBULIZAÇÃO .”...... 99 REFERÊNCIAS ...... 124

iii

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Figura 01 - Erythrina mulungu Linné...... 5 Figura 02 - Matricaria chamomilla Linné ...... 7 Figura 03 - Passiflora alata Curtis ...... 9 Figura 04 - Sistema de Secagem por Spray-Drier de Soluções Extrativas Vegetais 18 Figura 05 - Pirolizador de microforno ...... 33 Figura 06 – Pirolizador de Ponto de Curie ...... 34 Figura 07 - Pirolizador de Filamento ...... 35 Figura 08 - Diagrama esquemático de um cromatógrafo a gás ...... 38 Figura 09 - Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas de

triploquadrupolo (Quatro LC, Waters/Micromass) ...... 42

CAPÍTULO II Figura 01 - Alcalóides isolados de Erythrina mulungu Linné ...... 57 Figura 02 - Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de

Erythrina mulungu Linné na faixa de temperatura de 350 a 750°C.... 67

CAPÍTULO III Figura 01 – Alguns constituintes químicos isolados de M. chamomilla Linné ...... 81 Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das flores de Matricaria chamomilla Linné na faixa de temperatura de 350 a 650°C ...... 89

CAPÍTULO IV Figura 01 - Flavonóides isolados de Passiflora alata Curtis ...... 100 Figura 02 - Saponinas de Passiflora alata Curtis: quadrangulosídeo e ácido 3-

soforosil oleanóico ...... 101 Figura 03 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de Passiflora alata Curtis na faixa de temperatura de 450 a 750°C...... 115 iv

LISTA DE QUADROS

CAPÍTULO I

Quadro 01 - Classificação Sistemática de Erythrina mulungu Linné ...... 06 Quadro 02 - Classificação Sistemática de Matricaria chamomilla Linné ...... 08 Quadro 03 - Classificação Sistemática de Passiflora alata Curtis ...... 10

CAPÍTULO II

Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Erythrina mulungu Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey...... 61

CAPÍTULO III

Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Matricaria chamomilla Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 650°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey...... 85

CAPÍTULO IV

Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Passiflora alata Curtis obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 450 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey...... 104

LISTA DE ABREVIAÇÕES

µµµL: microlitro ANVISA: Agencia Nacional de Vigilância Sanitária CG/EM: Cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massas CLAE: Cromatografia líquida de alta eficiência E. mulungu: Erythrina mulungu FID: Detector de Ionização por Chama M. chamomilla: Matricaria chamomilla m/z: Razão massa/carga mL: mililitro mm: milímetro P. alata: Passiflora alata Pir-CG/EM: Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e Espectrometria de Massa RDC: Resolução da Diretoria Colegiada SNC: Sistema Nervoso Central µm: micrômetro

SOUZA, J.B.P. de - TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA A CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ , Matricaria chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS. Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos – CCS/LTF/UFPB. (2007) João Pessoa – PB.

RESUMO

A caracterização de extratos secos vegetais nebulizados empregados na produção de fitoterápicos é uma necessidade para a garantia da qualidade do produto final a ser obtido a partir desse produto intermediário. Essa caracterização deve ser rápida, eficiente, permitindo a identificação do maior número de constituintes possível, respeitando a característica de fitocomplexo do material vegetal. O presente trabalho explorou a caracterização de extratos secos neulizados de Erythrina mulungu Linné, Matricaria chamomilla Linné e Passiflora alata Curtis, três plantas farmacologicamente caracterizadas pela atividade sobre o Sistema Nervoso Central e encontradas no mercado em preparações farmacêuticas como calmantes, indutoras do sono entre outras indicações. O presente estudo baseou-se na tecnologia analítica da pirólise acoplada à cromatografia gasosa/espectrometria de massa (Pir-CG/EM) para a obtenção de um perfil pirolítico composto pelos produtos de decomposição obtidos por pirólise, separados por cromatografia gasosa e identificados por espectrometris de massa com auxílio da Biblioteca Espectral Willey. Os extratos secos foram obtidos a partir de soluções extrativas hidroalcoólicas variando de 10 a 90 % adicionados de 10 % de dióxido de silício coloidal em um nebulizador (Spray-Drier). Foram analisados em uma faixa de temperatura de 350 – 750 °C, possibilitando a caracterização constando de 166 compostos químicos obtidos dos extratos secos nebulizados de Erythrina mulungu Linné, 80 de Matricaria chamomilla Linné e 235 de Passiflora alata.

vii

SOUZA, J.B.P. de – Analytical Tecnology Based on Pyrolisis coupled Gas Chromatografy/Mass Spectrometry for Erythrina mulungu LINNÉ , Matricaria chamomilla LINNÉ, E Passiflora alata CURTIS Extracts Characterization. Tese de Doutorado - Programa de Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos – CCS/LTF/UFPB. (2007) João Pessoa – PB.

ABSTRACT

The spray-dried plants extracts characterization employed in the production of phytotherapeutic is a need for ensuring the quality of the final product to be derived from this product intermediary. This characterization has been fast, efficient, allowing the identification of the largest number of constituents possible, respecting the characteristic of phytocomplex of plant material. The present work explored the characterization of spray-dried extracts of Erythrina mulungu Linné, Matricaria chamomilla Linné and Passiflora alata Curtis, three plants characterized pharmacologically by the central nervous system activity and found on the market in pharmaceutical preparations as tranquillizers, inducing sleep among other indications. This present study was based on analysis of the pyrolysis technology coupled with gas chromatography-mass spectrometry (Pyr-GC/MS) for a pyrolytic profile composed of decomposition products obtained by pyrolysis, separated by gas chromatography and identified by mass spectrometry with the help of Spectral Library Willey. The dried extracts were obtained from extractive solutions hydroalchoolics ranging from 10 to 90% with the addition of 10% of colloidal silic dioxide in a nebulizer (Spray - Drier). They were examined in a temperature range of 350-750 °C of the spray-dried extracts, showing the characterization with 166 chemical compounds of Erythrina mulungu Linné, 80 of Matricaria chamomilla Linné and 235, Passiflora alata extracts. 1

1. Introdução

A crescente procura por medicamentos fitoterápicos tem despertado o interesse da indústria farmacêutica e a preocupação dos órgãos reguladores da saúde, com eficácia a segurança e a qualidade desses produtos. Na visão atual o produto fitoterápico é um medicamento tecnicamente elaborado através de processos tecnologicamente adequados. Segundo a legislação vigente (RDC 48/2004/ANVISA), essa definição deixa entrever que a transformação de uma planta em medicamento deve ter como objetivo a preservação da integridade química e farmacológica de vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de utilização, além de proporcionar sua administração que atenda as necessidades de dosagem adequadas à atuação terapêutica. Para tanto, a produção de fitoterápicos pressupõe a realização de estudos de desenvolvimento e o estabelecimento dos procedimentos e etapas adequadas de processamento, objetivando a produção de produtos farmacêuticos adequados, de acordo com os conceitos atuais de qualidade para o cumprimento de requisitos pré- estabelecidos que conduzam à sua total adequabilidade ao fim a que se destinam. Para que a qualidade desses produtos seja garantida, são necessários métodos analíticos capazes de avaliar a integridade da composição desde as matérias-primas, produtos intermediários até o produto acabado. Atualmente, a escolha de métodos analíticos baseia-se, inicialmente, na escolha de marcadores, substâncias ou grupo de substâncias, preferencialmente responsáveis pela ação farmacológica. Com o entendimento do fitoterápico como fitocomplexo, a tendência no campo das metodologias analíticas, é o desenvolvimento de métodos capazes de fornecer uma avaliação mais abrangente da composição do produto, de forma a se aproximar ao máximo da composição que melhor refletiria a ação terapêutica do produto. Essa é a proposta da utilização da pirólise acoplada à cromatografia gasosa/espectrometria de massas para a caracterização dos extratos secos de Erythrina mulungu , Matricaria chamomilla e Passiflora alata , matérias-primas utilizadas na produção de diversas formulações comerciais utilizadas no tratamento de transtornos do sistema nervoso central.

Capítulo I

2. Revisão da Literatura

2.1. Plantas com atividade ansiolítica Há uma tendência mundial do uso de plantas em preparações de origem vegetal como recurso terapêutico influenciado por fatores culturais, econômicos e sociais. Atualmente, existem vários fitoterápicos industrializados contendo material vegetal individual ou em associações com indicações para insônia, stress e ansiedade. No nosso trabalho, foi utilizado material de três espécies vegetais utilizadas em preparações fitoterápicas industriais, cujos estudos anteriores apontam para comprovação de suas atividades biológicas sobre o sistema nervoso central. A despeito dos grandes avanços no campo da terapêutica médica, os estudos realizados pelo Instituto Nacional de Saúde Mental dos Estados Unidos (National Institute of Mental Health, Betesda, USA – NIMH), revelaram um alarmante aumento das desordens do Sistema Nervoso Central (SNC) ralatadas, sendo a ansiedade e a insônia, as duas principais. (MURRAY e LOPEZ, 2001; NIMH, 2001). Um dado do NIMH relata a ansiedade irá acometer sete de cada dez indivíduos, por volta do ano 2.020, somente nos Estados Unidos. Também os países em desenvolvimento, 4/5 da população mundial, irá passar por uma dramática mudança nas necessidades de cuidados com a saúde da população, como as desordens relacionadas à ansiedade ultrapassarão seus tradicionais inimigos, as doenças infecciosas (CHERR, 1999; ZAL, 2000). Ansiedade é uma das desordens mentais mais comuns que afetam a espécie humana. Sua prevalência têm aumentado nos últimos anos, devido ao tenso estilo de vida imposto aos homens pela atmosfera competitiva e desumana impregnada no dia-a- dia. (DHAWAN et al., 2001). Durante as últimas duas décadas, a farmacoterapia com drogas psicoativas foi reconhecida como sendo a mais eficaz para o controle da ansiedade, do estresse e dos distúrbios do sono. Entretanto, o uso prolongado das drogas psicotrópicas conduz a uma variedade de efeitos colaterais autonômicos, endócrinos, alérgicos, hematopoiéticos e neurológicos. Além disso, tais agentes aliviam primeiramente os sintomas e oferecem um efeito paliativo de uma natureza provisória. (HANDA, 1995). Substâncias ansiolíticas, principalmente o grupo dos benzodiazepínicos ocupam um notável posto entre as drogas mais utilizadas pelo homem (UHLEMHUNT et al ., 4

1999, HIGGINS et al, 2000). As principais razões apontadas para a prescrição foram: insônia, depressão, ansiedade, queixas somáticas, sintomas de dor e sintomas de estresse (LUDERER 1995, MANT 1996, ARGYROPOULOS e NUTT, 1999). Contudo, as drogas ansiolíticas têm uma razão risco/benefício desfavorável, pois produzem aminésia, dependência, síndrome de abstinência, reações paradoxais em humanos e diminuição das funções psicomotoras (LADER and MORTON, 1991; KAN et al.,1997; SCHWEIZER and RICKELS, 1998). Estes sintomas podem levar ao aumento da possibilidade de acidentes automobilísticos e de fraturas (BARBONE, et al.,1998; PIERFITTE et al., 2001). Também, foi observado que fatores como idade acima de 45 anos, consumo por período maior que um ano, a farmacologia da droga, fatores intrínsecos ao paciente, distúrbios de personalidade, insônia crônica, doenças crônicas, histórico prévio de dependência a substâncias estão associados à dependência a essas drogas e à síndrome de retirada. (SONAVANE et al ., 2002). Como a presença dos fatores etiológicos responsáveis pela ansiedade e tensão não têm expectativa de diminuição, há uma necessidade e um interesse grande na busca para agentes novos e outras terapias com menor potencial para indução de reações adversas (CARLINI, 2003). As pessoas, em geral, em busca de segurança, economia e eficácia no tratamento da ansiedade, tensão e estresse, estão começando a escolher produtos fitoterápicos e outras alternativas de tratamento (NEWELL et al ., 1996). Com essa visão, várias plantas têm um grande campo na exploração clínica (DHAWAN, et al ., 2004). Desde tempos antigos algumas plantas têm sido utilizadas com tais propósitos. Hoje o uso desses extratos está ganhando aceitação de médicos e pacientes. Embora para a maioria das plantas, os dados químicos e farmacológicos sejam ainda incompletos e seus princípios ativos ainda não identificados. (CARLINI, 2003). As terapias com plantas medicinais podem ser consideradas como medicinas alternativas ou complementares e a busca de plantas medicinais para doenças psiquiátricas progrediu significativamente na década passada (ZHANG, 2004). Isto é refletido no largo número de ervas medicinas cujo potencial psicoterapêutico foi avaliado em uma variedade dos modelos animais. Esses estudos fornecem suporte para o desenvolvimento de medicamentos fitoterápicos, levando à necessidade de estudos e desenvolvimento de métodos de controle da qualidade. Uma vez que o consumo de medicamentos com base em plantas 5 medicinais apresenta várias dificuldades, que vão desde a identificação correta do material botânico utilizado, à inexistência de estudos de segurança, eficácia e qualidade de grande parte das plantas utilizadas (ROCHA, 2004). Entre tais plantas, Erythrina mulungu, Matricaria chamomilla e Passiflora alata, já são encontradas no mercado em preparações farmacêuticas, merecendo especial atenção.

2.1.1. Erythrina mulungu Linné

“Dizer que alguém merece chá de mulungu é publicidade bastante em diagnóstico psicopático. Na sombra do mulungu não brincam crianças e sim meninos já taludos. A penumbra da árvore enfraquece, debilita, esgota. Por isso tranqüiliza os candidatos sôfregos da insanidade .” Luís da Câmara Cascudo (l97l).

Figura 01: Erythrina mulungu Linné, destaque da árvore em período de floração e detalhes das folhas. Fonte. http://www.pl.barc.usda.gov/usda_plant/plant_detail_a.cfm?plant_id=211 http://www.dierbergertropicais.com.br/luisbacher/albuns/arvores/pages/Eugenia%20mul ungu_jpg.htm

Erythrina mulungu Linné é árvore de porte médio, casca avermelhado fulva, grossa e sulcada, ramos expandindo-se em copa ampla, com espinhos triangulares, 6 compressos, fulvas; folhas largamente pecioladas, trifolioladas; folíolos largos, rombóides; racemos laterais, recurvos, com mais ou menos 30 cm de comprimento; pedúnculo, arredondado, quando novo com pêlos tenuíssimos; pedicelos ternados, glabros vermelhos, com 4 cm de comprimento; cálice largo, truncado; flores vermelhas, estandarte amplo, recurvo, com 4-5 cm de comprimento, corena lanceolada, falciforme, asas minúsculas, ovário piloso (CORRÊA, 1984). Árvore eminentemente ornamental, presta-se para arborização de jardins e parques. Na época de floração (junho-agosto) perde quase totalmente as folhas, cobrindo-se de flores intesamente rubras. É planta calmante das tosses nervosas, provocadora do sono e útil nas doenças do fígado. A madeira fornece quando seca, 68,16 % de fibras, sendo, pois, de alta importância para a indústria do papel (CORRÊA, 1984).

Quadro 01 - Classificação Sistemática de Erythrina mulungu Linné Classificação Científica Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Fabales Família Leguminosae-Papilionaceae Subfamília Faboideae Gênero Erythrina Espécie Erythrina mulungu L. Sinonímia Científica Erythrina verna Corallodendrum mulungu Kuntze Sinonímia Popular Mulungu, suína, amansa-senhor, capa-homem, canivete, bido-de-papagaio, murungu, sapatinho-de-judeu, sananduva, corticeira, eritrina.

2.1.2. Matricaria chamomilla Linné A camomila é uma planta herbácea anual que alcança, em média, de 10 a 30 cm de altura, é ereta, tem estames alternados e caules delgados, rasteiros e muito ramificados. Apresenta folhas bem recortadas e flores miúdas, semelhantes a margaridas brancas com o miolo amarelo, exalando um perfume delicado (OLIVEIRA, et al., 1991).

Figura 02: Matricaria chamomilla L. Detalhe dos capítulos florais. Fonte. http://laherbloguisteria.blogspot.com/2007/05/flor-de-manzanilla.html e http://www.ag-network-chile.net/Medicinal%20Herbs.htm

Apresenta-se como capítulos longamente cônicos, com flores marginais linguladas e femininas, em número de dez a vinte, em geral, com 6 a 9 mm oblonga, tridenteada no vértice e percorrida por quatro nervuras. As flores internas ou do disco são hermafroditas numerosas, em média com 2 mm de comprimento de corola amarela tubulosa, pentadenteada e mostram cinco estames com as anteras unidas; do tubo sobressai a ponta do estilete com dois estigmas recurvados. Todas as flores aparecem sem papo. O receptáculo é nu, cônico, medindo até 6 mm de comprimento, desprovido de palhetas e oco no seu interior. O invólucro é côncavo e formado de três fileiras de brácteas, cujo número varia de vinte a trinta. As brácteas são lanceoladas, obtusas, amareladas, largamente escariosas, inteiras no vértice e atigindo 2,5 mm de comprimento (OLIVEIRA, et al., 1991).

Quadro 02 - Classificação Sistemática de Matricaria chamomila Linné Classificação Científica Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Asterales Família Asteraceae Gênero Matricaria Espécie Matricaria chamomilla L. Chamomilla vulgaris Gray Chrysantemum chamomilla (L.)Bernh. Sinonímia Científica Matricaria kochiana Sch. Bip. Matricaria recutita var kochiana (Sch. Bip.) Greuter Chamomilla, camomila-comum, macela-nobre, camomila- Sinonímia Popular vulgar, camomila-da-alemanha, Chamomile

2.1.3. Passiflora alata Curtis A espécie P. alata é aparentemente originária da região leste do Brasil, mas encontra-se largamente distribuída em várias regiões, da Amazônia até São Paulo. Conforme a região, recebe os mais diversos nomes populares, conforme descrito no quando abaixo. Trepadeira com caule quase quadrangular, estreitamente alado, glabro; folhas oval-oblongadas, ou ovais, agudas, glabras, de 11-18 cm de comprimento e 8-10 cm de largura, na face brilhantes e no verso pálidas; pecíolo de 2,5-3 cm de comprimento nas folhas adultas, na parte superior profundamente sulcado, nas margens com 2-4 glândulas sésseis dispostas aos pares; estípulas pequenas, foliáceas, 2-3 vezes mais curtas do que os pecíolos; flores pendentes, abertas com 11-17 cm de diâmetro; sépalas sub-carnosas, oblongo-obtusas, no verso perto do ápice, coniculadas, semelhante, por fora alvacentas e por dentro vermelhas, nas bases espessadas; corona da fauce filamentosas e filamentos pluriseriados e distintos; exteriores carnosas, mais longas de que as pétalas e transversalmente listradas de roxo e no ápice roxas, os interiores 9 pequenos, dentiformes; fruto ovóide, obovóide ou piriforme, glabro de 8-11 cm de comprimento e 5 cm de espessura na parte mais larga, na base e ápice um tanto escavados.

Figura 03: Passiflora alata . Detalhes das folhas, flor e fruto. Fonte. http://www.passiflora.it/alata.htm http://www.floratoskana.de/images/Passiflora_alata_g.jpg

Quadro 03 - Classificação Sistemática de Passiflora alata Curtis. Classificação Científica Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Ordem Violales Família Passifloriaceae Gênero Passiflora Espécie Passiflora alata Curtis Sinonímia Científica Passiflora alata Dryander Passiflora alata var. latifolia (DC.) Mast., Passiflora latifolia DC . Passiflora phoenicia Lindl. Sinonímia Popular Flor-da-paixão, maracujá-açú, maracujá-amarelo, maracujá-comprido, maracujá-comum-de-refresco, maracujá-mamão, maracujá-melão, maracujá-silvestre, maracujá-suspiro, passiflora, maracujá-grande; fragant granadilla, winged-stem passiom flower, passiflore à tiges ailées

2.2. Fitoterapia

O uso de plantas medicinais pelo homem data de épocas remotas, quando estes as utilizavam como fonte de alimentação e para cura de seus males. O uso de vegetais perde-se no tempo, na história do ser humano. O consumo de plantas medicinais teria sido a primeira forma de uso de medicamento que se tem notícia. Paulatinamente o conhecimento empírico vem se associando ao científico como forma de permitir o uso seguro dos agentes fitoterápicos. Mesmo após o sucesso da quimioterapia moderna, ainda persiste a utilização de plantas medicinais pelo homem com fins terapêuticos. O século vinte foi um triunfo para a indústria farmacêutica dominada pela síntese química, que substituiu os extratos 11 naturais por moléculas sintéticas que muitas vezes não guardam relação estrutural óbvia com produtos naturais (RASKIN et al ., 2002). Ainda assim, um grande número (estimado em cerca de 50% em 1991) dos medicamentos de origem sintética é baseado em um precursor que é um produto natural, ou contém um farmacóforo que é derivado de um produto natural (BALANDRIN et al ., 1993). A Organização Mundial de Saúde estima que 80% da população depende da medicina tradicional para suas necessidades básicas de saúde, e que quase 85% da medicina tradicional envolve o uso de plantas medicinais, seus extratos vegetais e seus ativos (CALIXTO, 2000). No Brasil se estima a existência de cerca de 60 mil espécies de um total de mais de 155 mil reconhecidas entre as angiospermas tropicais (GIULIETTI et al. , 1990; PRANCE, 1977). A necessidade de se explorar racionalmente esta biodiversidade fez crescer o interesse por áreas do conhecimento como a Química de Produtos Naturais, com linhas de pesquisa como Fitoquímica, Metodologia Analítica, Atividade Biológica, Ecologia Química, Síntese, Biotransformação, Biotecnologia, Quimiossistemática, Produtos Naturais Marinhos e Química de Microorganismos (PINTO et al. , 2002). Toda esta biodiversidade favorece o desenvolvimento de novos fármacos a partir de produtos de origem natural, como foi relatado no Relatório Anual de Química Medicinal ( Annual Reports of Medicinal Chemistry ) de 1984 a 1997, que indicou que 60% das drogas aprovadas e pré-aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration) são de origem natural (PINTO et al. , 2003). Apesar do sucesso que a indústria farmacêutica acumulou ao longo do século passado, dados recentes têm mostrado que atualmente as grandes indústrias farmacêuticas enfrentam uma crise sem precedentes. Assim, de 1996 à 2001, o número de novas substâncias químicas aprovadas (NCE, “ new chemical entities ”) diminuiu em 50%, apesar do gasto em pesquisa e desenvolvimento ter aumentado em quase 40%. Estima-se que para atender às expectativas de investidores e manter uma taxa anual de crescimento de 10%, a indústria farmacêutica deve aprovar, em média, 4 novas moléculas/ano, e cada uma delas deve alcançar vendas de cerca de 350 milhões de dólares/ano. Em 1996, menos de 1/4 de todas as moléculas aprovadas atingiram este nível de lucratividade (BOLTEN et al. , 2002). As razões de tal dificuldade são variadas. Em primeiro lugar, as indústrias se encontram atualmente sob um ambiente regulatório mais rigoroso e exigente, o que torna a aprovação de um novo fármaco um processo muito mais arriscado. Baseado em grande medida nos desastres do passado, as agências 12 regulatórias passaram a ser mais exigentes com os testes clínicos, exigindo, por exemplo, que se estude o efeito de uma molécula em determinadas subpopulações. Outro fator, e talvez o mais importante é a complexidade das doenças para as quais terapias satisfatórias ainda não são disponíveis e que têm amplo mercado em potencial. Estas são geralmente doenças crônicas e multifatoriais, que quando comparadas à doenças infecto-parasitárias por exemplo, apresentam uma fisiopatologia muito mais complexa. Neste grupo encontram-se, por exemplo, o câncer, diabetes, doença coronariana, hipertensão, depressão entre outras. Esta dificuldade em se desenvolver terapias significativamente melhores que as atualmente disponíveis para doenças crônico-degenerativas, contrasta com o grande aumento no número de alvos moleculares conhecidos para estas doenças, que foi em grande parte possibilitado pelos avanços em biologia molecular e pelo sequenciamento do genoma humano. Para superar estas dificuldades, a indústria farmacêutica tem investido massivamente em estratégias e tecnologias que possam aumentar as chances de sucesso no desenvolvimento de novos medicamentos. Exemplos de tais tecnologias são a química combinatorial, técnicas de screening biológico rápido ( high throughput screening ) e técnicas computacionais que tentam prever o perfil de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade de novos protótipos de fármacos ainda no processo de desenvolvimento, sempre no sentido de diminuir as chances de falha em fases mais avançadas (ALVAREZ, 2004). A crença relativamente disseminada na indústria farmacêutica de que a química combinatorial deveria ser a solução para a busca de novos fármacos, levou ao fechamento pela maioria das indústrias, de seus programas de prospecção de produtos naturais como fontes de novas substâncias farmacologicamente ativas, uma vez que o isolamento de novos produtos naturais que possam ser ou originar novos medicamentos foi considerado um processo improvável, caro e lento frente à possibilidade da síntese paralela de milhares de moléculas oferecida pela química combinatorial (ALVAREZ, 2004). Mesmo com o crescimento da indústria farmacêutica e o impacto que esta teve no tratamento de doenças e na sua prevenção - principalmente para a população de países desenvolvidos - a fitoterapia é uma forma de medicina alternativa que se encontra em expansão mesmo nos países desenvolvidos, enquanto que nos países em desenvolvimento ela é em muitos casos a única opção disponível (CAPASSO et al ., 2000). 13

O uso de plantas com finalidades terapêuticas é uma prática comum no Brasil, que tem sido transmitida através das gerações, com origem na cultura indígena (SIMÕES et al. , 2001), misturando-se posteriormente com as tradições européias e africanas, e constituindo o atual conhecimento popular. Este conhecimento tem despertado o interesse nacional e internacional pelo potencial terapêutico e econômico que representa (BERG, 1993), já que o Brasil possui a maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, com uma grande diversidade de solos e climas que favorecem a riqueza e variedade de tipos de vegetação e espécies de flora distribuídas nos diversos ecossistemas (DIAS, 1995). Nos últimos anos, este aumento na busca por alternativas terapêuticas fez crescer o mercado mundial de fitoterápicos, tanto entre os países desenvolvidos, quanto entre aqueles em desenvolvimento, onde em muitos casos esta é a única opção terapêutica disponível (CAPASSO et al. , 2000). Este mercado movimenta atualmente cerca de 22 bilhões de dólares por ano. Nos Estados Unidos, estima-se que as vendas de produtos fitoterápicos em 1999 tenham alcançado 5 bilhões de dólares, enquanto as vendas na União Européia neste mesmo ano alcançaram 7 bilhões de dólares (CALIXTO, 2000), sendo a Alemanha o maior mercado mundial de fitoterápicos (PINTO et al. , 2002). Entretanto os gastos com investimento em pesquisa e desenvolvimento não ultrapassam 15% desses valores (DICKSON et al. , 2004). As razões que levaram a esta expansão, mesmo com o aparente sucesso que a indústria farmacêutica teve no século passado, estão relacionadas a uma mudança de paradigma, devido à falta de avanço das terapias convencionais em tratar doenças crônicas ou de fisiopatologia multifatorial. Porém isso pode levar à uma falsa percepção de que a fitoterapia seja sempre uma opção terapêutica natural e segura, o que leva muitas vezes à auto-medicação (RASKIN et al. , 2002). Embora disseminada, a crença na inocuidade dos produtos fitoterápicos devido a serem produtos “naturais” é perigosa, pois muitas espécies de plantas produzem metabólitos tóxicos, ou que podem interagir com medicamentos alopáticos. Além disso, condições inadequadas de produção e armazenamento da matéria-prima vegetal, assim como a adulteração pode levar a fitoterápicos com contaminantes que oferecem considerável risco à saúde, como metais pesados e aflatoxinas. A medicina tradicional chinesa, por exemplo, utiliza-se de muitas espécies vegetais potencialmente tóxicas na preparação de seus medicamentos. Deng (DENG, 14

2002) lista várias preparações da medicina chinesa que têm provocado intoxicações agudas.

2.3. Legislação para Fitoterápicos

No Brasil, o registro de fitoterápicos é realizado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e regido pela Resolução da Diretoria Colegiada número 48 (RDC 48), de 16 de Março de 2004 (BRASIL, 2004), que visa atualizar a normatização do registro de medicamentos fitoterápicos. Esta resolução define medicamento fitoterápico como: “Todo medicamento obtido empregando-se exclusivamente matérias-primas ativas vegetais. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela reprodutibilidade e constância de sua qualidade. Sua eficácia e segurança são validadas através de levantamentos etnofarmacológicos de utilização, documentações tecnocientíficas em publicações ou ensaios clínicos fase 3. Não se considera medicamento fitoterápico aquele que, na sua composição, inclua substâncias ativas isoladas, de qualquer origem, nem as associações destas com extratos vegetais”. A RDC 48 da ANVISA estabelece a necessidade de um controle de qualidade adequado para os medicamentos fitoterápicos, que assegure tanto a sua eficácia quanto a ausência de toxicidade. A resolução estabelece ainda a necessidade de controle da matéria-prima vegetal, que obviamente constitui uma das mais importantes etapas do controle de qualidade, com influência direta na qualidade do produto final. Portanto, faz-se necessário a identificação botânica do material vegetal, cultivo e coleta em condições adequadas, pré-tratamento e armazenamento correto, a fim de garantir que o material vegetal seja cultivado e colhido em condições e na época em que os constituintes químicos estejam mais abundantes.

2.4. Desenvolvimento Tecnológico e Produção de Fitoterápicos

Os fitoterápicos são medicamentos obtidos a partir de matérias-primas exclusivamente vegetais, com finalidades profiláticas, paliativas, curativas ou de diagnóstico. Geralmente um fitoterápico contém uma mistura complexa, consistindo em diferentes produtos do metabolismo primário como os triglicérideos (gorduras vegetais) e carboidratos, sais minerais, vitaminas, corantes e clorofilas, e substâncias do 15 metabolismo secundário, que são biologicamente ativas como os flavonóides, alcalóides, terpenos, etc. As drogas, sejam de origem natural ou sintética, raramente são administradas na sua forma bruta, ou na forma de substâncias químicas puras (YORK, 2005). Este fato pode se justificado pela baixa dosagem das drogas usadas atualmente, o que exclui a possibilidade de obtenção de doses adequadas e seguras sem que a droga seja processada. Isso envolve matérias-primas que podem ter graus de processamento variáveis, como a planta na forma de pó, extratos da planta obtidos por maceração exaustiva ou extração à quente (Soxhlet por exemplo), ou formas mais elaboradas como liofilizados ou extratos secos nebulizados ( Spray Drying) . Portando a administração de agentes terapêuticos necessita de sua incorporação em uma forma farmacêutica caracterizada normalmente pelo seu estado físico de apresentação, constituída de componentes farmacologicamente ativos e de adjuvantes farmacêuticos. Podendo variar desde soluções relativamente simples até sistemas de liberação complexos, dependendo do uso apropriado de adjuvantes e excipientes (YORK, 2005). Desta forma entende-se por medicamento ou forma farmacêutica, um meio de administrar um agente terapêutico de maneira segura, eficiente, reprodutível e prática ao organismo (YORK, 2005). Portanto, a visão atual de medicamento fitoterápico é de um produto elaborado a partir de matérias-primas exclusivamente vegetais, através de processos tecnologicamente adequados. Segundo a RDC 48/2004/ANVISA (BRASIL, 2004), essa definição deixa antever que a transformação de uma planta em medicamento deve ter como objetivo a preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de utilização. A produção de fitoterápicos pressupõe que estudos de desenvolvimento tenham sido realizados anteriormente, estando procedimentos e etapas de processamento devidamente estabelecidas, objetivando a produção de produtos farmacêuticos adequados, de acordo com os conceitos atuais de qualidade, que são o nível de satisfação de produtor e usuário do medicamento e o cumprimento de requisitos pré- estabelecidos que conduzam à sua total adequabilidade ao fim a que se destinam. (TOLEDO, et al., 2003). O desenvolvimento tecnológico de um produto fitoterápico exige estudos em diversas áreas de conhecimento, isto pressupõe, obrigatoriamente, o trabalho 16 multidisciplinar uma vez que envolve conhecimentos botânicos, agronômicos, etnofarmacológicos, etnobotânicos, farmacológicos, fitoquímicos, farmacognósticos, médicos e de tecnologia farmacêutica, entre outros. Lembrando que a cadeia de desenvolvimento de fitoterápicos tem, normalmente, como ponto de partida o conhecimento popular (TOLEDO, et al, .2003) O nosso trabalho explora a qualidade de extratos vegetais secos por aspersão (nebulizados). Tal material vêm sendo utilizado tanto como produtos finais, quanto intermediários na obtenção de diferentes formas farmacêuticas (VASCONCELOS, 2004).

2.4.1. Soluções extrativas e extratos secos por nebulização Uma etapa importante na preparação de um medicamento de origem vegetal é a operação de extração. Freqüentemente são empregadas misturas de solventes, tais como etanol, metanol ou acetona com água, com o objetivo de aumentar o rendimento na extração das substâncias de interesse, baseando-se, principalmente, na sua solubilidade e estabilidade (VOIGT, 1993). Define-se secagem como a operação usada para a remoção ou eliminação de um líquido volátil que contém um substrato não volátil de um material por aplicação de calor, o que se consegue por transferência de um líquido a partir de uma superfície para uma fase gasosa insaturada (LACHMAN et al , 2001;CASEDEBAIG et al., 1989a). Ainda, a secagem consiste em diminuir a atividade da água através da eliminação da mesma, e é um método de preservação de produtos biológicos, uma vez que não envolve tratamento por aquecimento severo, e permite estocagem a uma temperatura ambiente (SCHUCK, et al ., 2005) Grandes quantidades de produtos líquidos (leites desnatados e comuns, frações resultantes de filtração por membrana e separação cromatográfica) são secas de forma a produzir rações, alimentos e ingredientes. A maioria desses pós é seco pela técnica de nebulização (SCHUCK et al ., 2005). A tecnologia de secagem por nebulização pode ser realizada utilizando – se o aparelho Spray Drier, que permite a passagem de uma solução pré – formulada num sistema previamente aquecido a uma temperatura estabelecida anteriormente. Por meio da atomização de líquidos em pequenas gotículas, o secador do nebulizador, permite uma elevada área superficial para a transferência de massa e calor. 17

Os líquidos são aspergidos no meio de uma corrente de ar aquecido, de modo que cada gotícula seca firma uma partícula sólida individual (AULTON, 2005). Spray Drying – secagem do pó por nebulização ou aspersão – é o processo industrial mais extensamente utilizado que envolve formação e secagem de partículas. É altamente adequado para a produção contínua de sólidos secos, seja na forma de pós, granulados ou aglomerados, a partir de soluções, emulsões ou suspensões. Conseqüentemente, A nebulização é um processo ideal no qual o produto final obedece a padrões de qualidade relacionados à distribuição do tamanho de partícula, do índice de umidade residual, densidade do pó, e forma das partículas (MEDEIROS, 2006). É uma forma eficiente de secagem devido à grande área superficial disponível para aquecimento e transferência de massa como resultado da atomização do líquido em pequenas gotículas da ordem de algumas centenas de mícrons (FARID, 2003). Ainda, a técnica é largamente utilizada na manufatura de muitos produtos industriais, como: alimentos instantâneos, detergentes para roupas, cerâmicas, e produtos agroquímicos; o crescimento no setor farmacêutico deve-se às inúmeras vantagens em relação às tecnologias que utilizam várias etapas de processo e competem com as tecnologias de redução de partícula (MEDEIROS, 2006). Os produtos secos por nebulização (nebulizados) são facilmente reconhecíveis, sendo de aparência uniforme. As partículas apresentam uma forma característica de esferas ocas, algumas vezes com um pequeno orifício, que resulta do processo de secagem. À medida que a gotícula entra na corrente de ar aquecido, é seca pelo lado externo, formando uma crosta externa, remanescendo ainda líquido no interior. Esse líquido evapora e o vapor formado internamente escapa, forçando a passagem e formando o orifício na esfera (AULTON, 2005). Na indústria farmacêutica, a utilização de adjuvantes farmacotécnicos apropriados, juntamente com a tecnologia de spray drying, representa um passo importante na garantia da estabilidade e qualidade de extratos de plantas. Isto se deve ao fato de que os adjuvantes podem conseqüentemente, influenciar na biodisponibilidade dos produtos (MACÊDO, et al ., 2001 ).

2.4.2. Processo de secagem por nebulização (Spray Drying)

A nebulização baseia-se na secagem de líquidos e suspensões, por divisão destes em finas gotículas, dentro de uma torre de secagem munida de ar quente circulante (MASTERS, 1978; BASSANI et al., 1990).

Figura 04 : Sistema de Secagem por Spray-Drier de Soluções Extrativas Vegetais. (1) Agitação e aquecimento, (2) Amostra, (3) Bomba, (4) Tubo de amostra, (5) Atomizador, (6) Desbloqueador, (7) Câmara de aquecimento, (8) Agulha injetora, (9) Câmara de secagem, (10) Ciclone, (11) Tubo de exaustão, (12) Tubo coletor da amostra.

O processo de secagem por nebulização tem como mecanismo a aspersão de uma forma líquida de uma determinada substância através de um jato que passa por um sistema fechado no qual a temperatura previamente programada para aquecer promove a retirada da água e / ou solvente rapidamente, depositando assim, a forma de pó em finas partículas do produto seco (MEDEIROS, 2006a). Para aquecer o sistema, promove-se a ativação de um fluxo de gás (geralmente o ar) que ao circular pelo aparato eleva a temperatura do mesmo, com isso, ocorre a 19 evaporação do líquido presente na amostra, bem como um fluxo livre da amostra seca, e ainda, pode-se controlar o tamanho das partículas secas (MEDEIROS, 2006a). Dentre as variáveis do processo de secagem, pode-se dizer que são de suma importância: a razão de evaporação e a distribuição do tamanho da partícula do produto seco. A razão de evaporação e a diferença de temperatura do processo (temperaturas de entrada e de saída do sistema) determinam a quantidade de ar necessário para secar a amostra, que por sua vez, determina o tamanho da partícula seca. Quanto maior for a temperatura de secagem da amostra, menor será o fluxo de ar necessário para o processo (MEDEIROS, 2006a). Segundo Medeiros (2006a), o processo de secagem dá-se por uma única etapa. E os componentes do sistema podem ser visualizados a seguir:

2.4.2.1. Fases do sistema a) Atomizador A atomização ou redução do tamanho de partículas consiste em produzir gotículas de tamanho e área superficial específicos, assim, esta é uma etapa crítica da secagem por nebulização. É justamente a razão de atomização, juntamente com as condições estabelecidas no processo, que controla o grau de secagem das partículas, e com isso, controla também o tempo de residência das partículas na câmara de secagem. Dentre as técnicas de atomização, podemos citar:

1) Atomização por jato pressurizado – o jato de aspersão do líquido forma-se através da força que o fluido exerce para passar através do pequeno orifício de atomização; a energia requerida para tal processo é suprida por uma bomba alimentadora. Por este processo, é possível obter uma distribuição de tamanho de partículas de diâmetros diminutos, assim, é bastante indicado quando a minimização do diâmetro da partícula é requerida. Ainda, o tamanho de partícula obtido é uma função do fluxo do líquido aspergido através do jato e também do diâmetro do orifício do jato de atomização.

2) Atomização por jato de fluido duplo – o jato de aspersão forma-se quando a amostra líquida juntamente com o gás comprimido passa através do orifício do jato 20 aspersor. A energia requerida para a atomização é provida pelo gás comprimido, que geralmente é o ar. Neste processo, são geradas partículas de diâmetros maiores e a média dos tamanhos das partículas produzidas é em função do fluxo do jato de aspersão, e também da razão e pressão exercidas pelo ar.

3) Atomização centrífuga – o jato de aspersão é formado pela passagem da amostra líquida através de um disco rotatório, a energia requerida para isto é fornecida pelo motor do atomizador. São obtidas partículas de diâmetros maiores, o que é determinado em função do diâmetro do disco rotatório e das rotações por minuto do mesmo.

b) Fluxo de ar / gás O fluxo de ar ou gás utilizado no processo serve para promover o aquecimento do sistema, pois à medida que a temperatura aumenta, faz com que o ar aqueça e circule por todo sistema, aquecendo o mesmo. A amostra aspergida e o ar quente misturam-se durante a atomização, o que é bastante importante, pois isto influencia na evaporação, no controle do tamanho de partícula, na densidade da amostra e na degradação pelo calor. A velocidade, a orientação e a forma como o fluxo de ar quente ocorre vão influenciar no processo.

Os tipos de fluxo existentes no processo de secagem são:

1) Fluxo co-corrente – neste tipo de fluxo, tanto o jato de aspersão, quanto o fluxo de ar movimentam-se para baixo na câmara de secagem, e a amostra é aspergida no fluxo de ar quente, o que aumenta a razão de secagem instantânea.

2) Fluxo contra-corrente – a amostra aspergida e o fluxo de ar têm movimentos de sentidos opostos, ou seja, a amostra movimenta-se para baixo na câmara de secagem, e o fluxo de ar movimenta-se para cima; isto faz com que as partículas produzidas tenham um maior tamanho, pois o movimento contrário do fluxo em relação à amostra aumenta o tempo de queda da partícula, permitindo com isso, um tempo extra de secagem. 21

3) Fluxo misto ou fluxo de fo nte – o ar quente movimenta-se para baixo na câmara de secagem e a amostra é aspergida para cima da mesma, ao encontrar o ar quente, a amostra é seca e desce juntamente com o ar quente na câmara de secagem.

Como foi visto anteriormente, a mistura do fluxo de ar ou gás com a amostra pode ocorrer de várias formas. Os tipos de fluxo podem ser realizados de forma lenta, ou turbulenta. A escolha de um ou outro tipo de fluxo varia de acordo com o objetivo desejado, assim, se a secagem é o único objetivo, por exemplo, é melhor aplicar um fluxo mais rápido; se o importante é o tamanho da partícula seca, então é desejável utilizar um fluxo mais lento. O fluxo de mistura lento é utilizado quando é importante a minimização do tamanho da partícula, pois como a velocidade de mistura da solução aspergida com o gás é menor no momento da atomização, ocorre uma maior secagem da partícula, permitindo obter uma distribuição de tamanho menor da mesma. Já um fluxo de mistura rápido permite uma secagem instantânea da gotícula aspergida, produzindo com isso, uma distribuição de tamanho de partículas maiores, isto porque a turbulência gerada faz com que as gotículas aspergidas circulem mais rápido na câmara de secagem.

c) Separação das partículas do pó seco As partículas do pó seco são continuamente depositadas na parte inferior do sistema de secagem por nebulização. O movimento do fluxo de ar quente empurra as partículas secas na direção de um ciclone, ou ainda em alguns tipos de aparato, existem filtros de separação das partículas secas. A separação primária da amostra seca ocorre na câmara de secagem, a separação do pó do ar circulante ocorre no ciclone. Após a passagem pelo ciclone, as partículas de pó são depositadas num recipiente coletor da amostra, e o ar circulante do sistema sai através de um exaustor. d) Bomba de alimentação A bomba de alimentação é um dispositivo que leva a amostra até o atomizador do sistema, funcionando a uma velocidade pré-programada, de forma a funcionar rápida ou lentamente. 22

2.4.2.2. Aplicação da técnica de Nebulização (Spray Drying) A secagem por nebulização é bastante útil na indústria farmacêutica devido à rapidez da secagem e à forma única do produto final. Existem três aplicações principais para os processos de secagem por nebulização: (1) secagem de materiais termo- sensíveis, (2) alteração da forma física dos materiais para uso na produção de comprimidos e de cápsulas e, (3) encapsulação de partículas sólidas e líquidas (LACHMAN, 2001). Diferentes métodos de secagem produzem materiais amorfos com propriedades físicas diferentes, como por exemplo, em termos de tamanho de partícula, estrutura e área de superfície, e seu comportamento térmico pode diferir. A lactose seca por SpDr é o excipiente mais comum nas indústrias farmacêuticas, principalmente como diluente na produção de comprimidos (KAMRUL E ROOS, 2005). Foi demonstrado que a concentração da amostra tem efeito importante nas propriedades do material seco por nebulização. Um estudo com o excipiente lactose mostrou que um aumento no teor de lactose na amostra da solução ou suspensão a ser seca por nebulização em preparações mais concentradas resultou numa diminuição da percentagem de lactose amorfa nos produtos secos via nebulização (CHIDAVAENZI et al., 1997). Spray drying tem sido uma técnica usada com sucesso na indústria farmacêutica para processar pós, uma vez que oferece um meio de obtenção de pós com tamanho de partículas e forma pré-determinados. Adicionalmente, a lactose seca por processo de nebulização é um dos excipientes mais utilizados na indústria farmacêutica, e tem sido comercializada por muitos anos, sendo sua maior vantagem ser utilizada para a compressão direta (REGE et al., 2003). A cinética de secagem de gotículas de vários tamanhos tem sido um dos experimentos de secagem mais importantes e largamente realizados em relação ao entendimento do fenômeno associado à secagem de alimentos relacionados às operações de secagem por nebulização incluindo a morfologia das partículas (ALAMILLA- BELTRÁN, et al., 2005). O tempo de secagem varia na ordem de 5-100 segundos; o tamanho das partículas secas pode variar entre 2-500 µm, o que depende da configuração do aparelho bem como das condições empregadas para secagem. (CORRIGAN, 1993). 23

As principais vantagens da técnica de secagem por nebulização são a minimização dos efeitos térmicos sobre o material tratado, devido ao tempo extremamente curto de contato do líquido disperso com o calor, a versatilidade na obtenção de pós, grânulos ou aglomerados e o elevado rendimento por tempo de produção. Consiste numa técnica de baixo custo, quando comparada à liofilização, e pouco destrutiva quando comparada a outras técnicas que empregam calor (MASTERS, 1978; LIST et al., 1989). A escolha de um método de secagem para uma solução extrativa vegetal específica envolve uma série de fatores, tais como natureza do produto a ser submetido ao processo, a massa de solvente ou de água a ser removida, a massa de produto a ser processada por unidade de tempo, a estabilidade das substâncias ativas contidas no produto, a higroscopicidade e outras características físicas do produto final, bem como os custos de produção envolvidos (LIST et al., 1989). As indústrias farmacêuticas têm um interesse especial pelos extratos vegetais secos, pois apresentam as vantagens características inerentes às formas farmacêuticas sólidas, precisão de dosagem e facilidade de manuseio, transporte e armazenagem, além de favorecerem a manutenção da estabilidade química, microbiológica e farmacológica. Os extratos secos são preparados a partir de uma solução extrativa vegetal, podendo ser submetidos às técnicas de liofilização ou de nebulização, entre outras (MASTER, 1978; LIST et al., 1989). A secagem por nebulização, aspersão ou spray-drying é mais utilizada na preparação de extratos secos. Como o tempo de exposição ao calor é reduzido, a técnica adquire especial importância na secagem de extratos que possuem compostos ativos termolábeis (CASEDEBAIG et al., 1989). Do ponto de vista das exigências modernas, a preparação de extratos vegetais hidroalcoólicos e aquosos constitui uma etapa preliminar que leva à obtenção de um produto intermediário, geralmente, um extrato seco. A solução extrativa é o resultado da extração da fração de interesse terapêutico e da dissolução parcial dos constituintes presentes em um vegetal. O extrato seco é considerado tecnologicamente viável para fins de produção em larga escala, caracterizado pela estabilidade física, química, farmacológica e microbiológica (CASEDEBAIG et al., 1989; JACOB et al., 1984; PAULA, 1996; SOUZA, 1997). No desenvolvimento galênico de fitoterápicos vêm sendo utilizadas várias técnicas de secagem de extratos aquosos e hidroalcoólicos, de forma a manter a 24 estabilidade e obter formas intermediárias de produção. Dentre as técnicas de secagem mais empregadas, encontra-se a nebulização ou spray-drying , devido à facilidade de redispersão, acondicionamento, preparação de formas farmacêuticas sólidas e padronizadas e pela qualidade do produto acabado (ARAGÃO, 2002).

No campo da indústria farmacêutica de fitoterápicos, a matéria-prima vegetal seca por nebulização padronizada encontra aplicação na preparação de comprimidos, cápsulas, granulados, pomadas e outras formas famacêuticas como um produto intermediário. Entre outras vantagens, apresenta maior estabilidade, menor higroscopicidade, distribuição homogênea dos constituintes da preparação, assim como uma manipulação mais simples, o que permite pesagem e doseamento mais fáceis e exatos (MASTERS, 1978; GAUDY et al., 1991). A questão da estabilidade das substâncias ativas frente ao processo de nebulização merece especial atenção, uma vez que uma possível perda ou diminuição da atividade farmacológica não pode ser descartada (ARAGÃO, 2002). Estudos sobre a obtenção de extratos secos nebulizados (CARVALHO, 1997) têm demonstrado a viabilidade deste método, principalmente a adição de adjuvantes de nebulização, como dióxido de silício coloidal (Aerosil ®), a fim de melhorar as características físicas do extrato nebulizado. O dióxido de silício coloidal vem se destacando devido as suas propriedades, tais como: elevada pureza, inércia química e farmacológica. O produto seco obtido com a adição de dióxido de silício coloidal apresenta fluidez, decorrente do baixo diâmetro das partículas (16 µm), com elevada superfície específica (200 m2/g), bem como, possui melhor estabilidade frente à umidade devido aos grupos silanóis e siloxanos nas extremidades da molécula, o que lhe confere a característica de absorver até 40% de seu peso em água sem prejuízo das propriedades tecnológicas. Este último fator é importante para a manutenção da qualidade dos produtos, principalmente tratando-se de produtos obtidos a partir de extratos vegetais altamente higroscópicos (WADE et al., 1994). A caracterização de extratos secos vegetais nebulizados empregados na produção de fitoterápicos é uma necessidade para a garantia da qualidade do produto final a ser obtido a partir desse produto intermediário. Essa caracterização deve ser rápida, eficiente, permitindo a identificação do maior número de constituintes possível, respeitando a característica de fitocomplexo do material vegetal. 25

2.5. A Qualidade dos Fitoterápicos

A indicação de medicamentos fitoterápicos na terapêutica humana não deve sugerir a substituição de medicamentos convencionais registrados, mas aumentar as opções terapêuticas oferecendo produtos de boa qualidade e respeitando os preceitos éticos que regem a utilização de substâncias com finalidade terapêutica (SOUZA, 2003). O uso popular e mesmo tradicional não são suficientes para validar as plantas medicinais como medicamentos eficazes e seguros (SIMÕES et al. , 2001). Neste sentido, as plantas medicinais não se diferenciam de qualquer outro produto sintético. Se a intenção é utilizar uma planta medicinal como medicamento, ela deve ter sua ação comprovada e sua toxicidade potencial avaliada cientificamente como qualquer outro medicamento. O desafio que acompanha este crescimento na procura e uso de medicamentos fitoterápicos, é a necessidade de garantir sua qualidade. Como qualquer medicamento, os fitoterápicos devem ter a sua eficácia e ausência de toxicidade comprovadas, bem como a reprodutibilidade lote a lote de sua ação (BATEMAN et al. , 1998; ERNST, 2003; STEDMAN, 2002). A garantia da qualidade dos produtos fitoterápicos certamente não tem acompanhado o crescimento na popularidade destes produtos. A falta de testes clínicos que demonstrem de forma inequívoca a sua eficácia, e a ausência de reprodutibilidade dos produtos fitoterápicos são as maiores críticas que esta forma de terapia tem sofrido ao longo dos anos. Existem poucos estudos na literatura realizados com o objetivo específico de se comparar a qualidade dos fitoterápicos comercializados, mas os poucos estudos realizados reforçam a idéia bastante generalizada de que a qualidade dos fitoterápicos é extremamente variável (ALVAREZ, 2004). Um fator limitante na análise de fitoterápicos é a ausência, na maioria dos casos, de substâncias de pureza conhecida que possam ser usadas para fins de comparação e padronização dos extratos vegetais, ou seja, padrões de referência. Entretanto, mesmo quando possível, o uso de marcadores químicos nem sempre irá garantir a reprodutibilidade da ação terapêutica, principalmente devido à complexidade química inerente ao fitoterápico. 26

Sabe-se hoje que muitas vezes a eficácia de um produto fitoterápico não pode ser atribuída a uma determinada substância, ou muitas vezes nem mesmo a uma classe específica de produtos naturais. Nestes casos, o controle de qualidade baseado no uso de marcadores químicos, nem sempre irá garantir a reprodutibilidade da ação terapêutica destes produtos (CAPASSO et al. , 2000). Os efeitos sinérgicos e os aditivos dos diferentes componentes de uma mesma espécie, ou de várias plantas, são responsáveis pela atividade biológica (ALVES, 2005). A complexidade química dos produtos fitoterápicos impõe um grande desafio analítico para o seu controle de qualidade físico-químico. Neste sentido, qualquer método de controle físico-químico que seja sensível a variações nas concentrações relativas de vários constituintes do fitoterápico, e não apenas a um único marcador ou a alguns marcadores relacionados, constitui-se em uma ferramenta importante na análise de produtos naturais, para garantir a reprodutibilidade da ação terapêutica do fitoterápico. Além disso, a falta de reprodutibilidade de atividade de mais de 40% dos extratos de plantas é um dos maiores obstáculos no uso de plantas para a descoberta de novos medicamentos uma vez que as atividades detectadas nos screenings freqüentemente não se repetem numa segunda extração e teste da mesma planta (RASKIN et al., 2002) . Somando-se a isso, os perfis bioquímicos de plantas cultivadas em diferentes estações, períodos do ciclo de vida e locais variam muito. Os autores propõem que, uma vez que os fatores ambientais e genéticos afetam muito a composição bioquímica dos extratos de plantas, a produção de fitoterápicos necessitará de monoculturas uniformizadas geneticamente, de plantas, crescidas em condições totalmente padronizadas para assegurar a consistência bioquímica e para otimizar a segurança e a eficácia em cada safra. Desta maneira, o processo para padronização de misturas fitoquímicas complexas deve envolver da semente ao comprimido, lote a lote. Portanto, o controle da qualidade do material vegetal tem como pré-requisito principal, obter fitoterápicos com reprodutibilidade de ação. Este requisito vale para qualquer medicamento fitoterápico, mesmo aqueles elegíveis para registro simplificado. Sendo uma das maiores dificuldades, o desenvolvimento de fitoterápicos que apresentem reprodutibilidade lote a lote da ação terapêutica, devido a variabilidade na concentração de marcadores, decorrente dos efeitos de sazonalidade no cultivo das 27 plantas. Para isso torna-se muito importante o estudo da variação sazonal dos constituintes químicos da planta. Para garantir a uniformidade da composição de um fitoterápico, é necessário que os diferentes produtos intermediários sejam caracterizados através de seus constituintes químicos ou de sua atividade farmacológica. Nenhuma das duas alternativas é rápida ou de fácil execução. A opção mais segura seria identificar e quantificar as substâncias ativas, o que nem sempre é possível devido ao grande número de componentes presentes no extrato. A utilização de substâncias marcadoras, relacionando a concentração das substâncias mais abundantes, ou de grupos químicos com a atividade biológica, é uma alternativa a ser avaliada. (SIMÕES, et al., 2001). A partir do estabelecimento dos parâmetros de qualidade para a matéria-prima, e considerando-se um planejamento adequado e um controle do processo de produção do produto final, a qualidade do medicamento estará, em grande parte, assegurada (IHRING e BLUME, 1992). Portanto, a qualidade da matéria-prima vegetal é a determinante inicial da qualidade do fitoterápico, mas não garante a eficácia, a segurança e a qualidade do produto final. A segurança e a eficácia dependem de diversos fatores, tais como, metodologia de obtenção, formulação e forma farmacêutica, entre outros e, portanto, devem ser definidas para cada produto, estabelecendo-se os parâmetros de controle da qualidade do produto final. A qualidade adequada das matérias-primas deve ser realizada de acordo com bases científicas e técnicas. Nos procedimentos rotineiros de análise da qualidade, geralmente é preconizado o emprego de metodologias físico-químicas e biológicas, sendo necessária à correlação entre os parâmetros analisados e a finalidade a que se destina o medicamento. Para tanto, deve-se garantir o resultado da análise qualitativa e quantitativa dos princípios ativos, a fim de comprovar que não houve degradação, de modo que o produto final não perdeu suas características terapêuticas (ABREO, et al. , 2007).

2.6. Métodos Analíticos

Quimicamente, os fitoterápicos são misturas complexas de vários compostos biologicamente ativos, que muitas vezes não são possíveis de ser isolados e cujas 28 atividades farmacológicas muitas vezes não são possíveis de serem identificadas (CORDELL, 2000). A separação destes compostos é muito difícil ou não custo-efetiva, e, muitas vezes, elimina o efeito terapêutico combinado de muitos compostos ou, ainda, gera uma substância que sozinha é tóxica (ALVES, 2005) A análise química de uma planta tem importância significativa no fornecimento de informações valiosas que podem sugerir finalidades para o seu uso, bem como na avaliação do padrão de qualidade de matérias-primas vegetais. Portanto, os métodos analíticos permitem a avaliação da qualidade do produto fitoterápico, garantindo, assim, a constância de ação terapêutica e a segurança de utilização. Até o momento a determinação de métodos analíticos depende, inicialmente, da escolha dos marcadores, substâncias ou grupo de substâncias, preferencialmente responsáveis pela ação farmacológica em estudo, que estejam presentes tanto na matéria-prima, como nos produtos intermediários do processamento e no produto final. (BASSANI, 2005). Devido ao fato de raramente os princípios ativos responsáveis pela atividade farmacológica serem conhecidos, o controle da qualidade, a padronização e a estabilidade destes medicamentos se tornam tarefas bastante complexas, embora possíveis principalmente por causa dos avanços nos métodos analíticos de alta resolução (SIANI, et al ., 2003) Segundo Sonaglio e colaboradores (SONAGLIO et al., 2003), vistos de forma pragmática, os métodos analíticos cumprem duas funções diferenciadas: a) A avaliação do teor de substâncias ativas ou grupo de substâncias ativas e do perfil qualitativo dos constituintes químicos de interesse, presentes na matéria-prima vegetal, produtos intermediários e produto final.

A avaliação quantitativa, semi-quantitativa ou qualitativa envolve a utilização de métodos espectrofotométricos, cromatográficos, físicos, físico-químicos ou químicos. Nos casos em que os constituintes responsáveis pela atividade farmacológica são desconhecidos utiliza-se marcadores químicos selecionados segundo a sua abundância, facilidade de detecção e doseamento, preferencialmente aqueles com maior labilidade frente a uma determinada etapa tecnológica. Quando o objetivo analítico é o controle da qualidade do produto final, registro do produto ou monitoramento do processo tecnológico, as exigências analíticas 29 incidentes devem considerar diversos fatores, como especificidade, exatidão, precisão e tempo de rotina analítica, ou seja, o método analítico deve ser validado para o marcador. Recomenda-se, também, que o mesmo possa ser utilizado em estudos de estabilidade, permitindo, inclusive, a detecção de produtos oriundos da degradação das substâncias ativas ou dos marcadores químicos. Em relação aos processos tecnológicos, a sua inserção ocorre em nível de controle da qualidade das matérias-primas, de produtos intermediários e finais, considerando as características específicas da matriz analisada. Nos casos de controle de processamento, os métodos selecionados para avaliação das substâncias de interesse devem considerar o tempo da etapa de transformação, caracterizando-se, portanto, como método simples, rápido e robusto. Segundo as circunstâncias, o método pode assumir características qualitativas ou quantitativas. (SONAGLIO et al ., 2003)

b) Avaliação das características físicas e físico-químicas dos produtos tecnologicamente transformados.

Importante pelo fato de que essas características podem interferir sobre o perfil biofarmacêutico do produto fitoterápico. Constitui exemplo a velocidade de dissolução de formas farmacêuticas sólidas, diretamente relacionadas à liberação dos princípios ativos, à qual se condiciona o tempo necessário para ocorrer o início da absorção das substâncias ativas, e, conseqüentemente, para o início da ação do medicamento, tempo de duração da ação e intervalo entre as doses (SONAGLIO et al ., 2003). Além disso, a utilização de métodos analíticos visando à quantificação de substâncias ativas ou de referência bem como de aspectos relativos à forma farmacêutica são essenciais para a obtenção da homogeneidade dos lotes de produção. Faltam tecnologias rápidas e eficientes para isolar e caracterizar novas entidades químicas, principalmente as que aparecem em pequenas quantidades (ALVES, 2005). Uma forma de garantir a eficácia das plantas medicinais seria através de padronização. Já é bem conhecido que a eficácia terapêutica das plantas medicinais não é influenciada por um único composto ou até mesmo por uma simples classe de compostos. Portanto, a análise química não pode se limitar a um simples composto – tal como um único marcador químico - mas deve estender-se a vários grupos de constituintes, de maneira a se obter uma caracterização química tão completa quanto possível. Conseqüentemente, a atividade não pode ser prevista com precisão somente 30 com a identificação de um constituinte ou grupo de constituintes, o que dificulta a padronização do material por análise química.

2.7. Técnicas Analíticas

Atualmente o uso de técnicas hifenadas, como cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (CG/EM) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com diferentes detectores, como ultravioleta, infravermelho, arranjo de diodos, espectrometria de massas, entre outros, tem auxiliado nesses estudos. A pirólise analítica é uma técnica, na qual, substâncias, geralmente de alto peso molecular como polímeros, são aquecidas de forma rápida, mas controlada, em uma atmosfera inerte, a uma temperatura suficientemente alta para induzir a degradação térmica das substâncias (WAMPLER et la. , 1999). Acoplada à cromatografia gasosa interfaciada à espectrometria de massas (Pir-CG/EM), a pirólise estende a utilidade da cromatografia gasosa a substâncias de alto peso molecular que não seriam passíveis de análise direta. A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo (pirograma) que pode ser utilizado para fins de classificação, como uma espécie de impressão digital da amostra ( fingerprint analysis ) (FANG et al. , 1990). A análise deste padrão de pirólise por métodos comparativos com bancos de dados de bibliotecas analíticas de espectros de massas permite que se quantifique a similaridade de diferentes amostras, com a vantagem de que o método é sensível (em maior ou menor grau) a variações dos diversos componentes, e não apenas de um único marcador.

2.7.1. Pirólise A pirólise é uma técnica de degradação de moléculas de alto peso molecular em fragmentos menores, utilizando exclusivamente energia térmica (WAMPLER et al. , 1999). A pirólise analítica é uma técnica que é geralmente acoplada à cromatografia gasosa, onde o pirolisador serve como um método de introdução da amostra. A cromatografia gasosa se beneficia da pirólise, pois através desta torna-se capaz de analisar substâncias de alto peso molecular, e conseqüentemente com baixa pressão de vapor, como polímeros sintéticos e naturais, tais como resinas, madeira, carvão, borracha, e até mesmo bactérias e vírus (BLAZSO, 1997; BONFANTI et al. , 1997). Ao mesmo tempo, a cromatografia gasosa capilar ajuda a separar a mistura complexa de 31 componentes resultantes da degradação térmica de polímeros e outras substâncias de alto peso molecular (WAMPLER, 1999). Na pirólise, o modo de fragmentação de uma molécula é dependente da força relativa de suas várias ligações químicas, e, portanto moléculas diferentes quimicamente terão padrões de pirólise característicos. Segundo Wampler (WAMPLER, 1999), para se beneficiar do alto poder de resolução fornecido através do uso de colunas cromatográficas capilares, a pirólise deve satisfazer um requisito básico: A amostra deve ser transferida à entrada da coluna como um “ plug ” o mais compacto possível, para evitar o alargamento da banda cromatográfica extra-coluna. Para que isso aconteça, alguns critérios devem ser observados: a) A amostra deve ser aquecida rapidamente : se a amostra sofre um aquecimento gradual, sua transferência da porta de injeção (pirolisador) para a coluna, ocorrerá durante um intervalo de tempo suficiente para causar alargamento da banda cromatográfica.

b) A amostra deve ser muito pequena : amostras grandes, além de ultrapassar a capacidade de massa de colunas capilares, podem levar a um aquecimento não uniforme da amostra. Em uma situação de aquecimento não uniforme, a região da amostra que sofre aquecimento mais lento irá também ser transferida de forma mais lenta para a coluna, o que resultará em perda de resolução através do alargamento da banda cromatográfica.

c) O pirolisador deve ter um volume interno pequeno : Isto garante que os produtos de pirólise sejam transferidos para a coluna de forma eficiente e rápida pelo gás de arraste, minimizando o alargamento de pico extracoluna e reações de degradação secundárias.

d) O fluxo de gás carreador deve ser suficiente : O fluxo de gás carreador (gás de arraste) deve ser suficiente para a transferência rápida dos produtos de pirólise para a coluna. Uma vez que o uso de um pirolisador adiciona um volume morto (pois não há separação cromatográfica no pirolisador) ao sistema, este volume, por menor que seja, deve ser eficientemente provido com um fluxo de gás de arraste.

Apesar da sua ampla aplicabilidade, a pirólise analítica foi pouco explorada quantitativamente, sendo mais utilizada para fins qualitativos. Uma das principais razões para este fato é a baixa reprodutibilidade frequentemente atribuída a esta técnica. Entre as razões que contribuem para a falta de reprodutibilidade, pode-se citar o tamanho da amostra (maior do que a capacidade da coluna) e a falta de uniformidade da mesma, falta de reprodutibilidade na velocidade de aquecimento e temperatura final do pirolisador, e a transferência lenta do pirolisado para a coluna (WAMPLER et al. , 1987). Em resumo, a reprodutibilidade dos pirogramas (ou falta desta) pode ser atribuída principalmente a características físico-químicas da amostra, a parâmetros do pirolisador, à maneira como a amostra é introduzida no pirolisador, à velocidade de aquecimento e temperatura do mesmo, e à manutenção de um fluxo de gás de carreador constante (WHITE et al. , 1991). Deste modo, todas as razões que contribuem para uma pobre performance cromatográfica, discutidos acima, acabam contribuindo também para uma baixa reprodutibilidade. Segundo Tsuge e Takeuchi (TSUGE et al. , 1977), são 3 os principais tipos de pirolisadores: O pirolisador de filamento (aquecimento resistivo), o de ponto de Curie (aquecimento indutivo) e o pirolisador de microforno. Os dois primeiros tipos são classificados como pirolisadores de modo pulsado, enquanto que o pirolisador de microforno é considerado como sendo de modo contínuo. A Figura 5 mostra uma representação esquemática de um pirolisador de microforno vertical. Este pirolisador consiste de uma zona aquecida a uma temperatura constante e pré-determinada, na qual a amostra é inserida através de um mini-cadinho metálico para que possa sofrer pirólise. Os detalhes deste tipo de pirolisador variam de acordo com cada fabricante, mas os principais constituintes incluem: (A): um botão para liberar a amostra, que cai por força da gravidade no tubo de quartzo aquecido; (B): O-ring (anel); (C): um mecanismo para prender e liberar o cadinho (geralmente de platina) que contêm a amostra; (D): uma entrada para o gás carreador; (E): o cadinho que contêm a amostra; (F): um tubo de quartzo por onde a amostra é introduzida; (G): um filamento para aquecimento; (K e N): O-rings para interfaciamento com o cromatógrafo a gás; (P): coluna cromatográfica (cromatógrafo à gás). No pirolisador de microforno, a temperatura de pirólise é pré configurada e a amostra, uma vez inserida na zona de pirólise, será submetida a um aquecimento isotérmico.

Figura 05: Pirolisador de microforno. Reproduzido a partir de (TSUGE et al. , 1977). O pirolisador de ponto de Curie (STANKIEWICZ et al. , 1998) tem como mecanismo de aquecimento, o ponto de Curie de metais ferromagnéticos. Quando estes metais são submetidos a um campo de radiofrequência apropriado, eles sofrem aquecimento até atingirem uma temperatura característica de cada material. Este tipo de pirolisador (Figura 6) se caracteriza por possuir uma alta velocidade de aquecimento (o Ponto de Curie do metal é alcançado em menos de 0,2 segundos), e alta reprodutibilidade na temperatura final de pirólise. A amostra é normalmente colocada ® em contato com uma fina folha do metal ferromagnético (Pyrofoil ) ou em um ® filamento do mesmo (Pyrowire ).

Figura 06: Pirolisador de Ponto de Curie. Adaptado de (STANKIEWICZ et al. , 1998).

A temperatura final de pirólise depende da composição da liga metálica utilizada. Várias ligas metálicas são disponíveis comercialmente com Pontos de Curie que cobrem uma ampla faixa de temperatura. Os principais componentes de um pirolisador por ponto de Curie incluem uma bobina de radiofrequência para induzir o aquecimento, uma entrada para o gás carreador, um termopar, e um capilar para ® introdução da amostra e da liga metálica, na forma de Pyrofoil .

O pirolisador de filamento (Figura 7) se baseia no aquecimento de amostras colocadas em um tubo de quartzo através de uma resistência elétrica. Neste tipo de pirolisador a amostra sofre um aquecimento durante um tempo que pode ser pré- programado (0-100 segundos), e pode alcançar temperaturas de pirólise de até 1200 ºC. Uma das vantagens deste tipo de pirolisador é a possibilidade de se realizar análises seqüenciais, variando em cada intervalo a temperatura e o tempo de pirólise. Cada modelo de pirolisador tem vantagens e desvantagens próprias, como por exemplo, a 35 capacidade limitada da massa de amostra que pode ser analisada por pirolisadores de Ponto de Curie quando comparados com pirolisadores de filamento. Entretanto, devido à sua reprodutibilidade na temperatura final de pirólise e à sua elevada velocidade de aquecimento, o pirolisador de Ponto de Curie é um dos mais utilizados em aplicações que demandam um alto grau de reprodutibilidade, em especial em aplicações quantitativas.

Figura 07 : Pirolisador de Filamento. Adaptado de (STANKIEWICZ et al. , 1998).

2.7.2. Pirólise Acoplada à Cromatografia Gasosa Capilar e Espectrometria de Massa (Pir-CG/EM): A técnica de pirólise acoplada à cromatografia gasosa e espectrometria de massas (Pir-CG/EM) é uma das mais eficientes técnicas para estudo de composição volumose de complexos de moléculas orgânicas. Constitui uma combinação poderosa na caracterização de diversos tipos de materiais, de origem natural ou sintética, incluindo a identificação e classificação de bactérias e vírus (KIM et al. , 2003; SOBERA et al. , 2003; TALON et al. , 2002). A espectrometria de massas como sistema de detecção alia informação estrutural importante aos componentes separados pelo cromatógrafo a gás. Em geral, a espectrometria de massas é utilizada tendo como método de ionização impacto eletrônico. Este método de ionização induz fragmentação abundante e reprodutível, que pode ser utilizada para fins de identificação dos constituintes do pirolisado, geralmente 36 através de comparação com um banco de dados de espectros (biblioteca) do sistema de aquisição. Além disso, o detector de massas pode ser considerado como “universal”, respondendo à maioria dos compostos orgânicos com sensibilidade e especificidade. Devido a alta sensibilidade da técnica de espectrometria de massas (WILLARD et al. , 1992), a quantidade de amostra necessária por análise é mínima, o que é essencial para que a resolução elevada resultante do uso das colunas capilares em cromatografia gasosa seja preservada. As aplicações da técnica de Pir-CG/EM são muito variadas. Geralmente, para a análise dos dados resultantes do padrão complexo de pirólise de compostos de alto peso molecular, incluindo os dados de espectrometria de massas, técnicas de análise estatística multivariada (tais como análise de componentes principais e análise hierárquica de clusters ) se fazem necessárias (ALVAREZ, 2004).

2.7.3. Cromatografia

A análise de produtos fitoterápicos é complexa devido à natureza da amostra, que quase invariavelmente apresenta interferentes com características físico-químicas muito próximas das do analito. Por isso, a seletividade do método analítico de escolha é crítica para a validade dos resultados obtidos. As técnicas cromatográficas são bastante utilizadas, pois envolvem a separação destes interferentes e permitem a quantificação do analito de forma precisa, exata e sensível (MEDEIROS, 2006b). A cromatografia é um método físico-químico de separação dos componentes de uma amostra, os quais são particionados entre duas fases, uma estacionária e outra, móvel. A fase móvel carreia o analito pela fase estacionária, e durante essa passagem os componentes da mistura são distribuídos de forma que cada composto é seletivamente retido nesta fase (CIOLA, 1998). As diferentes técnicas cromatográficas são classificadas de acordo com critérios relacionados à técnica empregada, ao mecanismo de separação envolvido e aos diferentes tipos de fases utilizados. Essa classificação pode ser baseada, na forma do leito cromatográfico: cromatografia em coluna ou planar; no estado físico da fase móvel: cromatografia gasosa, líquida e de fluido supercrítico; no mecanismo de separação: cromatografia de adsorção, de partição, de troca iônica, de exclusão e por afinidade. A cromatografia se destaca dentre os modernos métodos de análise química, 37 efetuando a separação, identificação e quantificação das espécies químicas (CIOLA, 1998; COLLINS et al. , 1997). Uma das aplicações principais das técnicas cromatográficas é a análise quantitativa de componentes de uma mistura, baseado principalmente na capacidade que a maioria das técnicas de separação tem de introduzir uma quantidade reprodutível de amostra na coluna, e na relação linear entre a quantidade de soluto introduzido e a resposta do sistema detector. Onde a concentração ou distribuição da massa do soluto no espaço é descrita pela análise do pico cromatográfico (MEDEIROS, 2006b).

2.7.4. Cromatografia Gasosa (CG)

A cromatografia gasosa é uma técnica analítica, qualitativa e quantitativa, que permite a separação de compostos de uma mistura (amostra) através da partição dos componentes da amostra entre uma fase líquida (estacionária) e uma fase gasosa (móvel). A interação que ocorre entre os componentes da amostra e as duas fases é do tipo partição gás-líquido, onde a fase estacionária é um líquido não-volátil ligado à parede interna de um tubo capilar de sílica fundida, e a fase móvel é um gás inerte, chamado gás carreador, H 2, N 2 ou He (MEDEIROS, 2006b). A amostra é introduzida no equipamento através de um injetor sob aquecimento, favorecendo a vaporização dos compostos, um fluxo de gás contínuo carreia a amostra através da coluna, que se encontra em um forno, onde a temperatura pode se manter constante, ou aumentar através de uma rampa de aquecimento. Essa programação de temperatura favorece uma melhor separação dos compostos e diminui o tempo de análise. O analito segue até um detector que gera um sinal para um sistema de aquisição (ROUESSAC et al. , 2000). A figura 05 apresenta um esquema de equipamento de cromatografia gasosa.

Figura 08: Diagrama esquemático de um cromatógrafo a gás.

A cromatografia à gás é um dos métodos mais utilizado para a análise quantitativa e qualitativa de componentes voláteis, ou passíveis de derivatização. Esta técnica possui alto poder de resolução, o que torna possível a análise de dezenas de compostos de uma mesma amostra. A identificação pode ser feita comparando-se o tempo de retenção de um padrão com o da amostra, ou relacionar o logaritmo de um dado de retenção com uma outra propriedade da amostra, como temperatura de ebulição, números de átomos de carbono ou massa molecular, este método é chamado de índice de retenção de Kovats (HARRIS, 1998). O índice de retenção tem a vantagem de variar muito pouco, ou de maneira linear, com a temperatura. Vários detectores podem ser utilizados, como Detector de Ionização por Chama (FID), considerado universal já que é capaz de detectar qualquer substância orgânica; Detector de Condutividade Térmica, que se baseia na modulação da condutividade térmica dos gases de arraste pelos analitos; Detector de Nitrogênio/Fósforo; de Infravermelho por Transformata de Fourier; e Espectrometria de Massas, que é seletivo, sensível e universal (COLLINS et al. , 1997). Dependendo do tipo de substância analisada e do detector empregado, consegue- -12 se detectar até cerca de 10 g. Essa sensibilidade faz com que haja necessidade de introduzir apenas pequenas quantidades de amostra (respeitando sempre a capacidade de massa das colunas capilares), o que em certos casos é uma grande vantagem em relação a outras técnicas que necessitam quantidades maiores de amostra (VOGEL, 1992) É importante salientar que a cromatografia gasosa é excelente como técnica quantitativa, 39 sendo possível a obtenção de resultados quantitativos em concentrações que variam de picogramas a miligramas. A cromatografia gasosa é uma técnica com excelente poder de resolução, tornando possível, muitas vezes, a análise de dezenas de substâncias de uma mesma amostra. Um dos principais motivos que a torna de uso bastante acentuado é a sua sensibilidade. A cromatografia gasosa se aplica à análise de substâncias voláteis e termicamente estáveis. Esta é a principal limitação de seu uso. Entretanto, mesmo com substâncias não voláteis, muitas vezes é possível formar um derivado com estas características através da reação do analito com um reagente de derivatização (WILLARD et al. , 1992). Esta consiste em transformar a substância de interesse em um derivado com características adequadas para serem analisadas por cromatografia gasosa. A derivação também pode ser usada para a introdução de grupos específicos. A análise cromatográfica isoladamente é rápida, podendo ser efetuada em minutos. No entanto, na maioria das vezes há necessidade de etapas de preparação da amostra, antes que ela possa ser analisada, para que não haja interferências durante a análise e contaminação da coluna cromatográfica. Às vezes, esta etapa de preparação é longa e complexa, aumentando em muito o tempo e o custo da análise. Além disso, a cromatografia gasosa não é uma técnica qualitativa eficiente, necessitando, muitas vezes, de técnicas auxiliares para a identificação segura das substâncias presentes na amostra (WILLARD et al. , 1992). A cromatografia gasosa é, atualmente, uma das técnicas de análise de maior uso que fornece dados quantitativos quando são usados padrões de concentração conhecida com a concentração desconhecida de diversos produtos e podendo também ser usada como técnica de identificação, em casos especiais, principalmente quando acoplada a um espectrômetro de massas ou outro tipo de detector. Os recentes avanços nessa área fazem da cromatografia gasosa uma técnica altamente atrativa empregada nas mais diversas áreas, como a análise ambiental, nas indústrias químicas, farmacêuticas, de alimentos, de produtos petroquímicos e outras (ALVAREZ, 2004).

2.7.5. Espectrometria de Massas

A espectrometria de massa atômica é uma ferramenta versátil e largamente usada na identificação dos elementos presentes em amostras e na determinação de suas concentrações (SCOOG, 2002). É uma técnica analítica baseada na determinação da massa atômica ou molecular de uma espécie individual numa amostra. O grande desenvolvimento da técnica, resultando no aumento de sua aplicabilidade, ocorreu a partir da década de 70, devido ao acoplamento às técnicas cromatográficas, ao surgimento de novas formas de ionização, e ao desenvolvimento de computadores e aplicativos. A importância do seu acoplamento com técnicas cromatográficas se deve ao tipo de informação que se obtém, como identificação de compostos, quantificação de compostos conhecidos e elucidação da estrutura e de propriedades químicas de moléculas (ANDREY, 2003). Na espectrometria de massas, moléculas gasosas são ionizadas, aceleradas por um campo elétrico para um analisador, numa região de alto vácuo, e então separadas de acordo com sua relação massa/carga. A grande quantidade de energia que normalmente é fornecida à molécula para que ocorra a ionização, faz com que esta fragmente, resultando em espectros de massas característicos de cada substância. O espectro de massas corresponde a abundância relativa dos íons em função da razão massa/carga (razão m/z ) (ANDREY, 2003). A ionização pode ser do tipo impacto eletrônico, ionização química, ionização por bombardeamento de átomos rápidos (FAB), ionização a laser auxiliada por matriz (MALDI), ionização por eletrospray (ESI) ou ionização química a pressão atmosférica (APCI) entre outras. Na ionização por impacto eletrônico ocorre o bombardeamento da amostra por um feixe de elétrons energéticos (variando de 20 – 120 eV), gerando íons radicais geralmente com energia em excesso. Os espectros produzidos são bastante reprodutíveis. A ionização química é uma técnica mais amena, produzindo menos fragmentação que a ionização por impacto eletrônico. Os íons produzidos são do tipo quasimoleculares [MH]+, pelo ganho ou perda de prótons, e o nível de fragmentação dependerá da afinidade da molécula por prótons (HARRIS, 1998). O analisador pode ser do tipo quadrupolo, tempo de vôo (TOF), setor magnético e íon trap. No quadrupolo a separação dos íons ocorre com base na razão massa/carga, onde os íons são transmitidos ao detector a depender da combinação e variação das voltagens aplicadas (sempre uma superposição de voltagens DC e de radiofrequência) 41 nas barras metálicas do quadrupolo. A análise pode também ser sequencial (Tandem, MS/MS ou MSn), usando dois ou mais estágios de análise de massas, onde um ou mais íons são selecionados e monitorados, em seguida induzidos a sofrer fragmentação por colisão com um gás inerte, como argônio ou hélio, e os fragmentos dos íons selecionados são então monitorados. Duas formas de operação básica de um instrumento de quadrupolo são possíveis: quando se deseja detectar substâncias em uma mistura com massas diferentes (razões m/z diferentes), pode-se operar o quadrupolo no modo de operação chamado de SCAN (com uma voltagem DC contínua e radiofreqüência sobrepostas aplicadas ao quadrupolo), varrendo uma faixa de massa ampla. Já quando a substância a ser analisada é conhecida, pode-se selecionar uma razão m/z específica, de modo que o quadrupolo só transmitirá ao detector íons com uma razão m/z pré-determinada (radiofrequência e voltagem DC fixas em um determinado valor). Este segundo modo de detecção é chamado de SIM (Monitoramento do íon selecionado) (HARRIS, 1998). Quando mais de um quadrupolo (filtro de massas) é utilizado, diversas combinações de operação do instrumento são possíveis (figura 06). No caso mais comum, tem-se um quadrupolo, seguido de uma célula de colisão e um segundo quadrupolo em tandem. Neste tipo de instrumento, chamado de triplo quadrupolo, cada estágio de filtro de massas (dois ao todo) pode ser operado no modo SCAN ou SIM, dando origem a vários modos de aquisição. No modo de aquisição chamado de “Daughter Scan”, o primeiro quadrupolo é operado no modo SIM, selecionando o íon molecular do composto em estudo, em seguida este íon é fragmentado na célula de colisão e no terceiro quadrupolo, uma faixa de massa correspondente aos possíveis fragmentos gerados é varrida pelo segundo estágio que é operado no modo SCAN. No modo de aquisição mais seletivo e sensível, utilizado principalmente para a análise de traços em matrizes complexas, o primeiro quadrupolo é operado no modo SIM, selecionando um íon precursor, este íon é então induzido a se fragmentar na célula de colisão, e o fragmento (íon filho) é transmitido pelo segundo quadrupolo, operado no modo SIM. Deste modo, uma (ou mais) transições entre um íon pai e um íon filho são monitoradas. Este modo de aquisição é chamado de MRM (Monitoramento de Reações Múltiplas) (WATSON et al. , 2003).

Figura 09: Diagrama esquemático de um espectrômetro de massas de triploquadrupolo (Quatro LC, Waters/Micromass).

OBJETIVOS

Geral Desenvolver a tecnologia analítica para caracterizar os produtos obtidos através de processos pirolíticos.

Específicos • Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e cascas de Erythrina mulungu Linné. • Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e cascas de Matricária chamomilla Linné. • Estudar os processos pirolíticos nos extratos secos nebulizados das folhas e cascas de Passiflora alata Curtis.

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Capítulo II

A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização de extratos secos por nebulização de Erythrina mulungu Linné, na qual a amostra sofre 10 processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por cromatografia gasosa e identificados por espectrometria de massa através da biblioteca espectral de Wiley para Class-5000.

Antecedentes da Invenção 15 A Erythrina mulungu Mart. Ex Benth (Leguminosae-Papilionaceae), possui como sinonímia científica Erythrina verna e Corallodendrum mulungu Kuntze e popularmente é conhecida como: suína, amansa-senhor, capa-homem, canivete, bico-de- papagaio, murungu, sapatinho-de-judeu, sananduva, corticeira, eritrina e mulungu. É apreciada por suas belas flores avermelhadas. É uma planta da família Fabaceae, árvore 20 de médio porte, bem ramificada e nativa do sul do Brasil em regiões tropicais e subtropicais (NEILL, 1988 e LOURENZI, 1992). Produz uma inflorescência avermelhada, visto que essas flores têm a mesma cor de corais, por vezes, esta espécie é também chamada de árvore de corais (LOURENZI, 1992). Existe cerca de 115 espécies conhecidas de Erythrina Mart. (Leguminoseae, 25 Papilionaceae) nas regiões tropicais e subtropicais, bem como em algumas regiões temperadas do mundo (NEILL, 1988) e aproximadamente metade delas foram estudadas (GARCÍA-MATEOS, et. al ., 2001). Algumas de suas espécies são utilizadas pela população devido ao seu efeito calmante (VASCONCELOS et al ., 2003). Como em outras espécies do gênero, os alcalóides são os principais constituintes 30 químicos presentes em E. mulungu . Muita pesquisa foi realizada para a investigação da presença de alcalóides de Erythrina na última década, uma vez que representam um grupo de produtos químicos muito ativos e com várias propriedades e estão sempre 56

presentes nas espécies do gênero. Os alcalóides foram encontrados em 72 das 107 espécies do gênero Erythrina estudadas. Na E. mulungu é relatado cerca de 20 alcalóides isoquinolínicos. Muitos deles apresentaram atividades anti-inflamatória, cardioativa, narcótica e sedativa. 5 Análises fitoquímicas demonstraram que essas plantas acumulam alcalóides eritrínicos, flavonóides, terpenóides, e glicosídeos (SARRAGIOTO et. al ., 1981; SOTO-HERNANDEZ; JACKSON, 1994; NKENGFACK et. al ., 1997). Os alcalóides de E. mulungu encontrados principalmente nas cascas, flores e sementes agem no sistema nervoso central, levando à um bloqueio neuromuscular e ao 10 relaxamento da musculatura lisa e ação anticonvulsivante sendo lentamente absorvidos no trato intestinal e rapidamente eliminadas pela urina (GÁRIN-AGUILAR et al., 2000). Na sua composição fitoquímica foi demonstrada a presença dos seguintes alcalóides: hipaforina, erisopina, eritamina, eritrina, eritrocoraloidina, erisotrina, 15 eritrartina, cristamina, erisodina N-óxido, erithrartina N-óxido (SARRAGIOTTO et. al ., 1981). Os compostos químicos alcaloídicos foram também identificados em flores de Erythryna mulungu por BOLZANI et al., (2007), cujos resultados foram objetos da patente PI0504517-7A. 20 Vegetais do gênero Erythrina são amplamente utilizados em medicamentos folclóricos para tratar diversos problemas de saúde, tais como agitação, insônia, e processos inflamatórios (GARCÍA-MATEOS, et. al ., 2001). Em algumas comunidades do Brasil, uma tintura preparada a partir de folhas ou do decocto da casca de Erythrina mulungu é usada para acalmar agitação e outras 25 desordens do sistema nervoso central como insônia e depressão (ONUSIC et al ., 2002; RODRIGUES; CARVALHO, 2001; LEITE et al ., 2000; RODRIGUES e CARVALHO, 2001). Preparações comerciais do extrato bruto de E. mulungu estão disponíveis no Brasil e Estados Unidos em drogarias como um medicamento fitoterápico. No entanto, há uma falta de estudos demonstrando a sua segurança, eficácia e mecanismo de ação. 30 Apesar do amplo uso de E. mulungu, suas propriedades só começaram a ser avaliadas recentemente por estudos pré-clínicos (ONUSIC et al ., 2002). Além disso, muitos 57

estudos têm investigado o potencial ansiolítico apenas do extrato bruto, não enfatizando, por exemplo, quais componentes de E. mulungu alteraram este estado emocional.

Figura 01: Alcalóides isolados de E. mulungu (BOLZANI, V.S., et al ,.2007).

Foi demonstrado que tratamentos agudos e crônicos com extrato hidroalcoólico 10 de E. mulungu produz efeitos ansiolíticos semelhantes aos provocados pelo conhecido composto ansiolítico: diazepam (ONUSIC et. al ., 2002, 2003). Efeitos centrais tais como anticonvulsivante, ansiolítico, analgésico e antiinflamatório já foram demonstrados em várias espécies pertencentes ao gênero Erythrina , incluindo E. mulungu (DE OLIVEIRA et al ., 2000; GARÍN – AGUILAR et. al . , 2000; ONUSIC et 15 al . , 2002, 2003; VASCONCELOS et al . , 2002, 2004; VASCONCELOS et. al ., 2003).

Sumário da Invenção

A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de compostos químicos 20 complexo, denominado de pirograma, o qual pode ser utilizado para fins de classificação da amostra na forma de impressão digital do material analisado. A análise 58

do pirograma usando bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite que se identifique os diferentes componentes químicos produzidos no processo pirolítico com a vantagem de ser uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos poluentes e outros reagentes. 5 Descrição detalhada do invento

A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado à cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos 10 produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por nebulização da Erythryna mulungu . Foi estudado o extrato seco nebulizado de Erythrina mulungu para a caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de temperatura de 350 a 750°C. 15 Os extratos hidroalcoólicos do pó das folhas e cascas de Erythrina mulungu obtido da região Sul do país foram obtidos pelo método de extração por maceração em proporções de água:etanol variando de 10 a 90 %. Os extratos foram secos por nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer , da marca LabPlant contendo 10 % de dióxido de silício coloidal. Os sistemas de alimentação e atomização são constituídos 20 por uma bomba peristáltica, um atomizador com agulha injetora (0,5 mm d.i.) sob pressão. Os extratos secos foram separados por sedimentação na base de um ciclone e a circulação do fluído aquecido na temperatura de entrada a 140 °C assegurada por um sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de saída variou de 90 – 95 °C sob um

fluxo de alimentação de 3,0 mL.min -1. 25 Para a preparação das amostras analíticas foram pesados exatamente 2 g da amostra e transferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução água:metanol (1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada através de papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m 2 de gramatura, velocidade de filtração de 10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de 30 500 µL do filtrado para tubo ependorf e adicionados 500 µL da solução de água:metanol (1:1) e homogeneizado. 59

O processo pirolítico do extrato seco de Erythrina mulungu, foi conduzido usando um pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um sistema de cromatografia gasosa/espectrometria de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A). Utilizou-se uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de 5 comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A temperatura da interface foi de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte programação de temperatura 50ºC (inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4 mL/min e uma razão de split de 1:16. O espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre 50 e 450 10 u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma energia 70 eV. Foram injetados diretamente no pirolizador, com auxílio de uma seringa, um volume fixo de 1 µL da amostra. Os processos pirolíticos foram estudados na faixa de temperatura de 350 a 750°C. 15 Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados através da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de massas da biblioteca Wiley, 6th Edition for Class-5000 de 1999, com 229.119 espectros).

20 Estado da técnica da invenção desejada

A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais, tais como, cromatografia líquida de alta eficiência, cromatografia em camada delgada, 25 cromatografia gasosa e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, eletroforese capilar, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, cromatografia gasosa combinada com análises de componente principal vêm sendo utilizadas na investigação de compostos isolados de diferentes grupos químicos (FLAUSINO, JR.O, et al .,2007; CHRISTY, A.A., e t al .,1998; DE FERRANTE, e t al .,2007; 30 PADASHETTY, S.A. e t al .,2007; DHALWAL, K. e t al ., 2007; WAN, J.; e t al .,2007; YI, T., e t al ., 2007; LI, Y. e t al .,2006; MA, L., e t al .,2007; I, Y., e t al ., 2006;) dos quais, certo número de compostos ativos são identificados e quantificados por essas técnicas, 60

mas nem sempre dão acesso à qualidade intrínseca total da planta e, portanto ainda não têm sido utilizadas como ferramenta para a caracterização de material vegetal no controle da qualidade dessas amostras vegetais, no contexto de fitocomplexos. A patente PI0504517-7 A, teve como objetivo a padronização química de 5 extratos brutos secos por rotavapor e por liofilização de flores da Erythrina mulungu , especificamente em relação aos compostos alcaloídicos derivados da eritrina que incluem a 11-OH-eritravina, seus isósteros, sais, derivados e/ou solvatos, eritrartina e/ou eritravina isolados de extrato bruto ou da fração purificada da Erythryna mulungu ou sintetizados quimicamente. 10 O controle da qualidade de fitoterápicos tem empregado técnicas cromatográficas líquida e gasosa com o uso de diferentes detectores na identificação e quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e produtos. Métodos analíticos para identificação de compostos químicos da Erythrina 15 mulungu droga vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura especializada. Dados atuais mostram que foram publicados 17 trabalhos com estudos desta planta e seus extratos, sendo 13 deles voltados para estudos farmacológicos sobre a atividade no sistema nervoso central de animais de laboratórios, 01 com atividade antibacteriana, 01 com isolamento e identificação de alcalóides, 01 com estudos 20 farmacognósticos e 01 com composições farmacêuticas. Métodos analíticos qualitativos e quantitativos para componentes químicos da Erythrina mulungu na forma de extratos secos e produtos não constam da literatura. A tecnologia analítica baseada em processos pirolíticos é bastante utilizada para caracterização de polímeros com alto peso molecular que são transformados em 25 moléculas menores e, portanto capazes de serem identificadas. A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos, com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado da 30 associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da Erytrhina mulungu com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas foi possível identificar todos os compostos químicos produzidos a partir desta matéria-prima. O cromatograma 61

resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a caracterização dos extratos secos por nebulização das cascas e folhas de Erythrina mulungu na forma de impressão digital. Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente 5 invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES, Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Erythrina mulungu. No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral.

10 Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Erythrina mulungu Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey.

Substância Química Obtida por Pirólise Dados químicos Nome Fórmula P.M.

(+)-3-methylcyclopentanone C6H10 O 98 (4.2.2)propella-7,9-diene C H 132 Tricyclo[4.2.2.0(1,6)]deca-7,9-diene (CAS) 10 12 .beta.-angelica lactone C5H6O2 98 1-(2,3-epoxypropoxy)-2-propene C8H14 O 126 1,2,3,4-cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)- C H O 134 (CAS) 5 10 4 1,2,4 – cyclopentanetrione –(CAS) C5H4O3 112 1,2,4 – cyclopentanetrione, 3-ethyl–(CAS) C7H8O3 140 1,2-benzenedicarbonitrile (CAS) C H N 128 Phthalonitrile 8 4 2 1,2-benzenedicarboxilic acid, bis(2-methylpropyl) ester (CAS) C H O 278 Isobutyl Phthalate 16 22 4 1,2-benzenedicarboxilic acid, butyl 2-methylpropyl ester (CAS) C H O 278 N-Butyl Isobutyl Phthalate 16 22 4 1,2-benzenedicarboxilic acid, butyl cyclohexyl ester C H O 304 Phthalic acid, butyl cyclohexyl ester 18 24 4 1,2-benzenedicarboxilic acid, dibutyl ester (CAS) C H O 178 Di-N-Butyl Phthalate 16 22 4 1,2-benzenedicarboxilic acid, dibutyl ester (CAS) C H O 278 Butyl Phthalate 16 22 4 1,2-benzenedicarboxilic acid, dilpropyl ester (CAS) Propyl Phthalate C14 H18 O4 250

1,2-benzenedicarboxilic acid, dipentyl ester (CAS) C H O 306 Amyl Phthalate 18 26 4 1,2-cyclohexanedione-(CAS) C6H8O2 112 1,2-dimethylbenzene C H 106 0-xylene 8 10 1,3 – cyclohexanedione, 4-propyl–(CAS) C9H14 O2 154 1,3,5,7- cyclooctatetraene (CAS) C8H8 104 1,3-benzenedicarbonitrile (CAS) C H N 128 Isophthalonitrile 8 4 2 1,3-cyclopentadiene, 5-(1-methylethylidene)- (CAS) C H 106 6,6-dimethylfulvene 8 10 1,3-cyclopentadienone, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112 1,3-cyclopentadienone, 4-propyl- (CAS) C9H14 O2 154 1,3-cyclopentanedione – (CAS) C5H6O2 98 1,3-cyclopentanedione, 2-methyl – (CAS) C6H8O2 112 1,3-diphenyl-2-(phenylimido)propan-1,3-dione C H NO 313 1,3-propanedione, 1,3-diphenyl-2-(phenylimino)- (CAS) 21 15 2 1,3-propanediol C3H8O2 76 1,4- cyclohexanedione (CAS) C H O 112 Tetrahydroquinone 6 8 2 1,4-benzenedicarbonitrile (CAS) C H N 128 Terephthalonitrile 8 4 2 1,4-cyclohexadienone (CAS) C H O 112 Tetrahydroquinone 6 8 2 1-acetoxy-2-propanol C5H10 O3 118 1-hexen-3-ol C H O 100 Propylvinylcarbinol 6 12 1H-Imidazole, 2,4-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96 1H-Imidazole, 2-ethyl- (CAS) C5H8N2 96 1H-indene (CAS) C H 116 indonaphtene 9 8 1H-indene, 1-chloro-2,3-dihydro- (CAS) C9H9Cl 152 1H-Indene-1-methylene- (CAS) C10 H8 128 1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) C H N 96 3,5-dimethylpyrazole 5 8 1-nitro-2-phenylethane C8H9NO 2 151 1-octen-3-ol C8H16 O 128 1-Penten-3-ol (CAS) C H O 86 Ethyl vinyl carbinol 5 10 1-propanol, 3-chloro- (CAS) C3H7ClO 94 1-propen-1-thiol C3H6S 74 2(3H)-Furanone, 5-methyl- (CAS) C H O 98 .alpha.-angelica lactone 5 6 2 2(3H)-pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl-(CAS) C5H8N2O 112 2,2-pyrrolidinedione, 1-methyl-3-phenyl- (CAS) C H NO 189 Phensuximide 11 11 2 63

2,3,4,5-cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3. alpha.,5. beta.)- C H O 148 (CAS) 6 12 4 2,3,7-trimethyloctanal C11 H11 O 170 2-amine-2-methylpropanediol-(1,3) C4H11 N2O 105 2-cyclopenten-1-one,2-hydroxy-3-methyl-(CAS) C H O 112 Corylone 6 8 2 2-Decanone C10 H20 O 156 2-furanmethanol (CAS) Furfuryl alcohol C6H5O2 98 Furylcarbinol 2-heptanone, 6-methyl- (CAS) C8H16 O 128 2-hexanone-5-methyl- (CAS) C H O 114 Isamyl methyl ketone 7 14 2H-Inden-2-one, 1,3-dihydro- (CAS) C H O 132 2-Indanone 9 8 2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one C5H6O2 98 2-methyl-3-phenylthiirene 1,1-dioxide C H O S 180 Thiirene, methylphenyl-, 1,1-dioxide (CAS) 9 8 2 2-methylhexanoic acid C7H14 O2 130 2-methyl-propan-1-ol C4H10 O 74 2-methylvaleric acid C6H12 O2 116 2-nonanone C9H18 O 142 2-pentanone-4methyl-(CAS) C H O 100 Methyl isobutil ketone 6 12 2-penten-1-ol,(E)-(CAS) C H O 86 Trans-PENT-2-ENOL 5 10 2-pentenal, 2-methyl- (CAS) C6H10 O 98 2-pentene, 3-ethyl-(CAS) C7H14 O 98 2-pyridinecarbonitrile (CAS) 2-cyanopyridine C6H4N2 104 Picolinonitrile 2-Undecanone C H O 170 Methyl nonyl ketone 11 22 3(2H)-pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) C H N O 112 2,3,4,5-tetrahydro-6-methyl-3-oxopyridazide 5 8 2 3,4-diphenyl-3,4-dimethyl-hexa-1,5-diyne Cyclopropane, 1,1’-(1,2-diethynyl-1,2-dimethyl-1,2- C14 H18 186 ethanediyl)bis- (CAS) 3,6-dicyclopropyl-3-methyl-hepta-4,5-diene-1-yne Cyclopropane, 1,1’-(4-ethynyl-1,4-dimethyl-1,2-butadiene- C14 H18 186 1,4diyl)bis- (CAS) 3-Butene-1,2-diol (CAS) C H O 88 Erythrol 4 8 2 3-methyl pentanoic acid C H O 116 3-methyl valeric acid 6 12 2 3-pentanol C5H12 O 88 64

3-pentanone, 2,2-dimethyl- (CAS) C H O 114 tert-butyl ethyl ketone 15 20 2 3-pentenone (CAS) C H 142 Diethyl ketone 10 22 4-phenylamino-6-ethoxycarbonyl-1-phenyl-1H-pyrazolo(4,3- C H N O 358 c)pyridine 21 18 4 2 5-hepten-3-one, 5-methyl-, cis/trans C5H10 O 86 7-octen-4-ol (CAS) C H O 128 1-octen-5-ol 8 16 9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) C H O 282 Oleic acid 18 34 2 Acetic acid, methyl ester (CAS) C H O 74 Methyl acetate 3 6 2 Allyl ethyl ether C5H10 O 86 Anthracene (CAS) C14 H10 178 Azetidine, 2-phenyl- (CAS) C9H11 N 133 Aziridine,2-methyl-3-(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-, trans- C H N 86 (CAS) 9 17 Aziridinone,1,3-bis(1,1-dimethylethyl)-(CAS) C10 H19 NO 169 Azulene (CAS) C H 128 Cyclopentacycleheptene 10 8 Benz(a)azulene C14 H10 178 Benzene, 1,3-dimethyl- (CAS) C H 106 m-xylene 8 10 Benzene, 1,4-dimethyl- (CAS) C H 106 p-xylene 8 10 Benzene, 1-propynyl- (CAS) C9H8 116 Benzene, ethyl- (CAS) C H 106 Phenylethane 8 10 Benzene,1,1’-(1,2-ethynedyl)bis – (CAS) C14 H10 178 Benzenemethanimine C H N 105 Benzaldimine 7 7 Benzenemethanol C7H8O 108 Bicyclo(4.4.1)undeca-1,3,5,7,9-pentaen-11-one (CAS) C11 H8O 156 Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS) Benzenecyclobutane C8H8 104 Cardene Borinic acid, diethyl (CAS) C H BO 86 DIETHYL- BORIC ACID 4 11 Butane, 1-(2-propeniloxy)-(CAS) C H O 114 Allyl n-butyl ether 7 14 Butanedial (CAS) C H O 86 Succinilaldehyde 4 6 2 Butyl-2-ethylhexyl phthalate C20 H26 O4 330 Cyclohexaneethanamine, N-.alpha.-dimethyl- (CAS) C10 H21 N 155 cyclohexanone C6H10 O 98 65

Cyclohexanone, 2-prothyl-(CAS) C3H6O 140 Cyclohexanone, 5-methyl-2-(1-methylethyl)-, cis- (CAS) C H O 154 Isomenthone 10 18 Cyclohexene, 1(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl- (CAS) C11 H20 O 168 Cyclohexene,1-(1,1-dimethylethoxy)-2-methyl- (CAS) C H O 168 1-methyl-2-T-butoxycyclohexene 11 20 Cyclopentanol (CAS) C5H10 O 86 Cyclopentene, 1-ethenyl-3-methylene- (CAS) C8H10 106 Decanoic acid (CAS) C H O 172 Capric acid 10 20 2 Diazene, Bis(1,1-Dimethylethyl)-(CAS) C H N 142 1-1-1’,1’-TETRAMETHYLAZOETANE 8 18 2 Di-Isopentyl Phthalate C18 H26 O4 306 Di-N-butyl phthalate C16 H22 O4 278 Docosanoic acid C H O 340 Behenic acid 22 44 2 Eicosanoic acid (CAS) C H O 312 Arachidic acid 20 40 2 Ethyl.alpha.-azido-.beta.-[(1-pheny)-5-pyrazolyl]acrylate C14 H13 N5O2 283 Furan, 2,5-dihydro-3,5-dimethyl- (CAS) C6H10 O 98 Furan, 2,5-dimethyl- (CAS) C6H8O 96 Heptadecanoic acid (CAS) C H O 270 Margaric acid 17 34 2 Heptane-2,3,5-trimethyl-(CAS) C H 142 2,3,5-trimethyleptane 10 22 Heptane-2,3,6-trimethyl-(CAS) C26 H30 O16 142 Heptanoic acid C7H14 O2 130 Hexadecanal, 2-methyl- (CAS) C H O 254 Formylhexadecane 17 34 Hexadecanoic acid (CAS) C H O 256 Palmitic acid 16 32 2 Hexadecanoic acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS) C H O 330 1-monopalmitin 19 38 4 Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1,3propanediyl ester (CAS) C H O 569 1,3-dipalmitin 35 68 5 Hexanal, 2-methyl-(CAS) C7H14 O 114 Hexanoic acid (CAS) C H O 116 Caproic acid 6 12 2 Lactic acid, monoanhydride with 1-butaneboronic acid, cyclic C H BO 156 ester (CAS) 7 13 3 L-histidine, 1-methyl- L- (CAS) C7H11 N3O2 169 L-treonine, ethyl ester (CAS) C6H13 NO 3 147 Methanamine, N-methyl-N-nitroso- (CAS) C H N O 74 Dimethylnitrosamine 2 6 2 Methyl ethanoate C3H6O2 74 N-(3-butenyl)-dimethylamine C3H13 N 99 66

Naphtalene C10 H8 128 Nitroso dimethylamine C2H6N2O 74 Nitrous acid, butyl ester (CAS) C H NO 103 n-butyl nitrite 4 9 2 Nonadecanoic acid C19 H38 O2 298 Nonanoic acid C H O 158 Pelargic acid 9 18 2 N-phenyl-4a,8a.-(oxoiminooxo)naphtalene C18 H13 NO 2 275 octadecanoic acid (CAS) C H O 284 Stearic acid 18 36 2 Octanoic acid C H O 144 Caprylic acid 8 16 2 Oxetane (CAS) C H O 58 Trimethylene oxide 3 6 Oxirane, 2,3-diethyl- (CAS) C H O 100 3,4-hepoxyhexane 6 12 Pentadecanilic acid (CAS) C H O 242 Pentadecylic acid 15 30 2 PENTANAL C5H10 O 86 Pentanal, 2,4-dimethyl – (CAS) C H O 114 Valeraldehyde, 2,4-dimethyl 7 14 Pentanal, 3-hydroxy-2-methyl C H O 116 Valeraldehyde, 3-hydroxy-2-methyl 6 12 2 Pentanoic acid C H O 102 Valeric acid 5 11 2 Phenanthrene (CAS) C14 H10 178 Phenol, 2-methyl- (CAS) C H O 108 o-toluol 7 8 Phenol, 3-methyl- (CAS) C H O 108 m-toluol 7 8 Phenol, 4-methyl- (CAS) C H O 108 p-toluol 7 8 Phthalic acid, butyl ester, with butyl glycolate (CAS) C18 H24 O6 336 Piperidine,2,6-dimethyl – (CAS) C7H15 N 113 Propanal (CAS) C3H6O 58 Propanenitrile, 3-(dimethylamino)- (CAS) C5H10 N2 98 Propanoic acid C H O 74 Propionic acid 3 6 2 Propanoic acid, 2 propenyl ester(CAS) C H O 114 Allyl propionate 6 10 2 Propanoic acid, 2-diazo-3methylphenylamino0-3-oxo-,ethyl C H N O 247 ester 12 13 3 3 Propanoic acid-2,2-dimethyl-(CAS) C H O 102 Pivalic acid 5 10 2 S-N,N’-dimethyl-1,2-propanediamine C5H14 N2 102 Styrene C8H8 104 67

Benzene, Ethenyl- (CAS) Tetradecanoic acid (CAS) C H O 228 Myristic acid 14 28 2 Trimethyl-aluminum C3H9Al 72 Undecanal, 2-methyl- (CAS) C12 H24 O 184 Urea, methyl- (CAS) C2H6N2O 74

5 Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas e cascas de Erythrina mulungu Linné na faixa de temperatura de 350 a 750°C.

REINVINDICAÇÕES 5 1. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos secos por nebulização dos pós das folhas e cascas da Erythrina mulungu , caracterizada por compreender: 10 - processo pirolítico na faixa de 350 – 750ºC - 167 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I 2. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa/espectrometria de massas para caracterização dos extratos secos por nebulização dos pós das folhas e cascas da Erythrina mulungu , caracterizada por compreender: 15 - processo pirolítico na faixa de 350 – 750ºC - 167 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I 69

Resumo

TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA 5 CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Erythrina mulungu LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO .

A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos 10 secos nebulizados de Erythrina mulungu Linné separação desses compostos por cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa, fornecendo uma caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 750° C, constando de um total de 167 compostos químicos obtidos.

Anexo I

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados defolhas de Erythrina mulungu, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 1 4.785 98 C H O 90 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) 2 6.406 112 C H O 95 Corylone 6 8 2

3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10 O 90 - T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

Cont.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 1 4.785 98 C H O 90 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) 2 6.406 112 C H O 95 Corylone 6 8 2

3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10 O 90 -

1,2,3,4-Cyclopentanetetrol, 4 13.995 134 C H O 83 (.alpha..,2.beta.,3beta.,4.alpha.)- (CAS) 5 10 4

9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) 5 19.869 282 C H O 87 Me(CH ) CH:CH(CH ) CO H Oleic acid 18 34 2 2 7 2 7 2 T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Erythrina mulungu, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 750°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

Furan, 2,5- Dimethyl- (CAS) 1 3.475 96 C H O 80 5 8

Benzene, ethenyl- (CAS) 2 4.140 104 C H 92 Styrene 8 8

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

Cont.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 3 5.076 98 C H O 90 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

4 6.634 1H-Indene (CAS) 116 C9H8 80

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

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Capítulo III

A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização de extratos secos por nebulização de flores de Matricaria chamomila Linné, na qual a amostra sofre processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por 10 cromatografia gasosa e identificados por espectrometria de massa através da biblioteca espectral de Wiley para Class-5000. Descrição do Estado da Técnica O gênero Matricaria (Asteraceae) é uma fonte de fitomedicamentos de crescente importância freqüentemente utilizada (DRAGLAND et al., 2003), empregada como 15 componente de misturas para chás e como um valioso ingrediente de muitas preparações galênicas tais como tinturas e extratos (ZAITER, et al., 2007) Flores secas de Matricaria chamomilla Linné são largamente utilizadas para provocar efeitos sedativos, espasmolíticos e anti-inflamatórios. Estudos demonstraram que os componentes responsáveis por esses efeitos ainda não foram completamente 20 caracterizados (AVALLONE, et al. , 2000). Foi demonstrada atividade depressiva da infusão liofilizada de flores de M. chamomilla , no sistema nervoso central em camundongos (DELLA LOGGIA et al., 1982). Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de esclarecer quais componentes são responsáveis pelo efeito sedativo. Foi demonstrado, também, que M. 25 chamomilla contém vários ligantes dos receptores benzodiazepínicos, dos quais o mais interessante, do ponto de vista farmacológico, é o flavonóide apigenina. Os autores relatam que a apigenina exibe atividade ansiolítica em camundongos sem nenhum efeito sedativo ou miorelaxante (VIOLA, et al., 1995). Entre as 16 das mais de 80 espécies do gênero estudadas quimicamente, os 30 constituintes de maior importância encontrados foram sesquiterpenos e flavonoides. Os resultados obtidos com M. chamomilla indicam a presença de sesquiterpenos lactonas dos tipos eudesmanolídeo, germacranolídeo e guaianolídeo e um glicosil monoterpeno

(ZAITER, et al., 2007), e alguns derivados cumarínicos, como a 7-metoxicumarina e 7- hidroxicumarina, componentes aos quais se atribuem suas propriedades espasmolíticas (COSTA, 2002). Análises do extrato metanólico de M. chamomila , por HPLC revelaram a 5 presença de vários compostos capazes de se ligar a receptores benzodiazepínicos centrais, os quais ainda estão em processo de identificação. Um desses compostos foi identificado por HPLC-ESI-MS/MS, como apigenina.

10 Figura 01 – Alguns constituintes químicos isolados de M. chamomilla

Os estudos levam a crer que os efeitos sedativos dos extratos de M. chamomilla 15 são obtidos por outros compostos com atividade nos receptores benzodiazepínicos (AVALLONE, et al. , 2000).

Sumário da Invenção A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo, denominado pirograma, que pode ser utilizado para fins de classificação da amostra na 5 forma de impressão digital do material analisado. A análise do pirograma usando bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite que se identifique os diferentes compostos químicos produzidos no processo pirolítico com a vantagem de ser uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos poluentes e outros reagentes.

10 Descrição Detalhada do Invento

A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado a cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos 15 produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por nebulizaçã o da Matricaria chamomilla. Foi estudado o extrato seco nebulizado de flores de Matricaria chamomilla , para a caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de temperatura de 350 a 650°C. 20 Os extratos hidroalcoólicos do pó das flores de Matricaria chamomilla cultivadas no município do Conde-PB, foram obtidos pelo método de extração por maceração (à frio) em proporções de água:etanol variando de 10 a 90 %. Os extratos foram secos por nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer , da marca LabPlant contendo 10 % de dióxido de silício coloidal. O sistema de alimentação e atomização é 25 constituído por uma bomba peristáltica, um atomizador com agulha injetora (0,5 mm d.i.) sob pressão. Os extratos secos foram separados por sedimentação na base de um ciclone e a circulação do fluído aquecido na temperatura de entrada a 140 °C assegurada por um sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de saída variou de 90 – 95 °C

sob um fluxo de alimentação de 3,0 mL.min -1. 30 Na preparação das amostras foram pesados exatamente 2 g da amostra e tranferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução água:metanol (1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada através de

papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m 2 de gramatura, velocidade de filtração de 10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de 500 µL do filtrado para tubo eppendorff e adicionados 500 µL da solução de água:metanol (1:1) e homogeneizado. 5 O processo pirolítico do extrato seco de Matricaria chamomilla, foi realizada em um pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um cromatógrafo a gás interfaciado com espectrômetro de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A). Utilizou-se uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A temperatura da interface foi 10 de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte programação de temperatura 50ºC (inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4 mL/min e uma razão de split de 1:16. O espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre 50 e 450 u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma 15 energia 70 eV. Foram injetados diretamente no pirólise, com auxílio de uma seringa, um volume fixo de 1 µL de padrão e amostra, separadamente. Foram utilizadas as seguintes temperaturas de pirólise: 350°C, 450ºC, 550ºC e 650ºC. Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados 20 através da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de massas com o espectro de massas da biblioteca Wiley, 6th Edition for Class-5000 de 1999.

Estado da técnica da invenção desejada 25 A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais. Técnicas como cromatografia em camada delgada, cromatografia gasosa e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, eletroforese capilar, espectroscopia de ressonância magnética nuclear, cromatografia gasosa combinada com análises de componente 30 principal, vêm sendo utilizadas na investigação de compostos isolados de diferentes grupos de químicos de M. chamomilla , entre eles, lactonas, flavonóides, óleos

essenciais, compostos fenólicos (AVALLONE. R. e t al .,2000; ZAITER, L. e t al .,2007; NARDER. N., e t al .,2006; BLAZEKOVIC, B. STANIC, G. e t al .,2004; HETHELYI, B. et al .,2002; FONSECA, F. e t al ., 2002; REPCAK, M. e t al ., 2001; RUBIOLO, P. e t al .,2006; SCHILCHER, H. e t al ., 2005) . 5 O controle da qualidade de fitoterápicos têm empregado técnicas cromatográficas líquida e gasosa com uso de diferentes detectores na identificação e quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e produtos. Métodos analíticos para a identificação de compostos químicos da M. 10 chamomilla droga vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura especializada. Dados recentes mostram que foram publicados 13 trabalhos com estudos com essa espécie e seus extratos envolvendo estudos fitoquímicos e farmacológicos. A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos, 15 com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar todos os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado da associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da Matricaria chamomilla com a cromatografia gasosa/ espectrometria de massas foi possível identificar todos os compostos químicos produzidos a partir desta matéria- 20 prima. O cromatograma resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a caracterização dos extratos secos por nebulização das folhas de Matricaria chamomilla na forma de impressão digital. Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES, 25 Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Matricaria chamomila. No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral.

Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Matricaria chamomila Linné obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 350 a 650°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey. Dados Químicos e Substância Química Obtida por Pirólise Probabilidade Fórmula P.M.

(+)-3-methylcyclopentanone C6H10 O 98 1,2,3,4-cyclopentanetretol,

(1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)- (CAS) C5H10 O4 134 1,2,3,4-tetrahydroxy-cyclopentane

1,2,4-Cyclopentenetrione (CAS) C5H4O3 112

1,2,4-Cyclopentenetrione, 3-ethyl- (CAS) C7H8O3 140

1,2-cyclohexanedione (CAS) C6H8O2 112

1,2-Cyclopentanediol trans- (CAS) C5H10 O2 102

1,3,5,7-cyclooctatetraene (CAS) C8H8 104

1,3-Cyclohexanedione, 4-propyl- (CAS) C9H14 O2 154

1,3-cyclopentadione C5H6O2 98

1,3-cyclopentenedione, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112

1-Formylcyclopentene C6H8O 96 1-Hexen-3-ol (CAS) C6H12 O 100 Propyl vinyl carbinol

1H-Imidazole, 4,5-dihydro-2,4-dimethyl- (CAS) C5H10 N2 98

1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96 1-nonen-3-ol (CAS) C9H18 O 142 Hexylvinylcarbinol 1-octen-3-ol C8H16 O 128 Amyl vinyl carbinol 1-penten-3-ol (CAS) C5H10 O 86 Ethyl vinyl carbinol

1-penten-3-ol (E)- (CAS) C5H10 O 86

1-penten-3-ol, 4-methyl- (CAS) C6H12 O 100

1-penten-3-one (CAS) C5H8O 84 2(3H)-furanone, 5-methyl- (CAS) C5H6O2 98 .alpha.-Angelica lactone 2(5H)-furanone, 5-methyl- (CAS) C5H6O2 98 .beta.-Angelica lactone

2,4-dimethylfuran C6H8O 96

2-Butenal, 2-ethenyl- (CAS) C6H8O 96 2-cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) C6H8O2 112 Corylone 2-cyclopenten-1-one, 2-methyl- (CAS) C6H8O 96 2- methyl-2-cyclopenten-1-one 2-cyclopenten-1-one, 3-methyl- (CAS) C6H8O 96 3- methyl-2-cyclopenten-1-one 2H-1-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS) C10 H8O3 176 7-methoxycoumarin

2-Hexen-1-ol, (E)- (CAS) C6H12 O 100 2-penten-1-ol (Z)- (CAS) C5H10 O 86 Z-2-pentenol 2-pentenal, 2-methyl- (CAS) C6H10 O 98 .alpha.-methyl-.beta.-ethylacrolein

2-pentene, 3-ethyl- (CAS) C7H14 98 3 methyl pentanoic acid C6H12 O2 116 3 methyl valeric acid

3(2H)-Pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) C5H8N2O 112 3-butene-1,2-diol (CAS) C8H16 O 128 Erythrol

4-pentenal, 2-ethyl (CAS) C7H12 O 80

5-methyl hexanoic acid C7H14 O2 130 7-octen-4-ol (CAS) C8H16 O 128 1-octen-5-ol

9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) C18 H34 O2 282

Oleic acid Aziridine, 2-methyl-3(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-, C9H17 N 139 trans- (CAS)

Aziridone, 1,3-bis(1,1-dimethylethyl)- (CAS) C10 H19 NO 169 Benzene, propyl- (CAS) C9H12 120 Isocumene

Benzeneacethaldehyde (CAS) C8H8O 120 Benzofuran, 4,5,6,7-tetrahydro-3,6-dimethyl- (CAS) C10 H14 O 150 Menthofuran Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS) C8H8 104 Cardene

Borinic acid, diethyl- (CAS) C4H11 BO 86

Cis-2-pentenol C5H10 O 86

Cyclohexanone C5H10 O 98

Cyclohexanone, 2-ethyl- (CAS) C8H14 O 126

Cyclohexanone, 2-propyl- (CAS) C9H16 O 140

Cyclopentane, ethylidene- (CAS) C7H12 96

Cyclopentanol C5H10 O 86

Cyclopentanone (CAS) C5H8O 84

Cyclopentanone, 3-methyl C6H10 O 98

Cyclopentene, 1-ethyl- (CAS) C7H12 96

Cyclopentene, 3-ethyl- (CAS) C7H12 96 Docosanoic acid (CAS) C22 H44 O2 340 Behenic acid Eicosanoic acid (CAS) C20 H40 O2 312 Arachidic acid

Ether, di-3-buten-2-yl C8H14 O 80

Heneicosanoic acid (CAS) C21 H42 O2 326 Heptadecenoic acid (Z)- (CAS) C17 H34 O2 270 Margaric acid

Heptane, 2-3-5-trimethyl- (CAS) C10 H22 142

Heptane, 4(-1-methylethyl)- (CAS) C10 H22 142 Heptanoic acid (CAS) C7H14 O2 130 Enanthic acid Hexadecanoic acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS) C19 H38 O4 330 Glyceril palmitate Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1,3-propadienyl ester

(CAS) C35 H68 O5 569 Glycerol, 1,3-dipalmitate Hexadecenoic acid (CAS) C16 H32 O2 256 Palmitic acid Hexanoic acid (CAS) n-hexanoic acid C6H12 O2 116 Caproic acid Lactic aced, monoanhydride with 1-butaneboronic acid, C7H13 BO 3 156 cyclic ester (CAS)

Methoxy-6-vinylphenol C9H10 O2 150 Nitrous acid, butyl ester (CAS) C4H9NO 2 103 N-butyil nitrite

Nonadecanoic acid (CAS) C19 H32 O2 298 Nonanoic acid (CAS) C9H18 O2 158 Pelargic acid octadecanoic acid (Z)- (CAS) C18 H36 O2 284 Estearic acid Octanoic acid (CAS) C8H16 O2 144 Caprylic acid Pentadecanoic acid (CAS) C15 H30 O2 242 Pentadecylic acid Pentanoic acid (CAS) C5H10 O2 102 Valeric acid

Piperidine, 2,6-dimethyl- (CAS) C7H15 N 113

Styrene C8H8 104

Benzene, ethenyl- (CAS) Tetradecanoic acid (CAS) C14 H28 O2 228 Myristic acid

Figura 02 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco de flores de M. 5 chamomilla Linné na faixa de temperatura de 350 a 650°C.

REINVINDICAÇÕES

3. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos do pó das 5 flores da Matricaria chamomilla Linné, secos por nebulização, caracterizada por compreender: - processo pirolítico na faixa de 350 – 650ºC - 80 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I 4. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa / espectrometria de 10 massas para caracterização dos extratos do pó das flores da Matricaria chamomilla Linné, secos por spray dryer, caracterizada por compreender: - processo pirolítico na faixa de 350 – 650ºC - 80 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I

Resumo

“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À 5 CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Matricaria chamomilla LINNÉ SECOS POR NEBULIZAÇÃO” .

10 A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos secos nebulizados de flores de Matricaria chamomilla Linné separação desses compostos por cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa, fornecendo uma caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 650° C, 15 constando de um total de 80 compostos químicos obtidos.

Anexo II

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados capítulos florais de Matricaria chamomilla, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 1 4.996 98 C H O 88 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

2 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10 O 91 - 3 12.500 2-Methoxy-6-vinylphenol 150 C9H10 O2 82 - Hexanoic acid (CAS) 4 14.051 116 C H O 84 HO C(CH ) Me Caproic acid 6 12 2 2 2 4 2H-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS) Coumarin, 7-methoxy 5 17.313 176 C10 H8O3 95

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados capítulos florais de Matricaria chamomilla, Linné a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 550°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 1 4.914 98 C H O 89 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) Corylone 2 6.495 112 C6H8O2 95

3 7.609 1-Penten-3-ol 86 C5H10 O 91 - T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

Cont. Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura 4 12.539 2-Methoxy-6-vinylphenol 150 C9H10 O2 83 - Hexanoic acid (CAS) 5 17.349 116 C H O 84 HO C(CH ) Me Caproic acid 6 12 2 2 2 4 2H-Benzopyran-2-one, 7-methoxy- (CAS) Coumarin, 7-methoxy 6 176 C10 H8O3 95

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecula

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Capítulo IV

TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR NEBULIZAÇÃO . 5 A presente invenção diz respeito a uma tecnologia analítica para caracterização de extratos secos por nebulização de folhas de Passiflora alata Curtis, na qual a amostra sofre processo de pirólise cujos produtos obtidos são separados por cromatografia gasosa e identificados por espectrometria de massa através da biblioteca espectral de 10 Wiley 6ª edição para Class-5000. A família Passifloraceae apresenta distribuição tropical e subtropical, congregando espécies arbóreas, arbustivas, lianas e herbáceas, sendo o seu maior gênero, Passiflora, que compreende em torno de 500 espécies e ocorre nas áreas mais quentes da América, com algumas espécies na Ásia e Austrália e uma espécie em 15 Madagascar (DHAWAN et al., 2001). A maioria das referências ao uso de Passiflora na medicina popular está direcionada às suas propriedades psicotrópicas (FREISE, 1933; PIO CORREA, 1984; ROYG e MESA, 1945; MOREIRA, 1862), e a maioria dos estudos farmacológicos têm demonstrado efeitos no sistema nervoso central, tais como ação ansiolítica e sedativa e 20 propriedades anticonvulsivantes (DHAWAN et al., 2001; SOLEIMANI et al. 1997; PETRY et al. 2001; DE-PARIS et al. 2002). No Brasil, a referida espécie, conhecida como "maracujá", foi posta à utilização também como diurético e analgésico (OGA et. al. , 1984). As espécies mais utilizadas na medicina popular brasileira são P. alata e P. 25 edulis . P. alata é a única espécie presente na Farmacopéia Brasileira, mas existem poucas investigações sobre suas propriedades farmacológicas (PETRY et al. 2001; DE- PARIS et al. 2002). Uma solução líquida oral da planta na dose de 5 mL três vezes ao dia é recomendada na insônia, ansiedade, tosse seca, irritação da mucosa respiratória, distúrbios nervosos da menopausa e algumas condições de dor (Monteiro da Silva Ltda, 30 2000). Muitos compostos isolados de Passiflora spp. têm sido sugeridos como princípios ativos responsáveis pelo efeito ansiolítico/sedativo alegado, tais como

100

flavonóides (como apigenina, vitexina, kampferol, homorientina, chrystina), alcalóides harmane (harman, harmaline, harmalol) e derivados da pirona (maltol), mas, até agora os princípios ativos ainda não foram identificados (SPERONI et al.,1996a. SOLEIMANI et al., 1997 e DHAWAN et al., 2001). Os dados mostram, contudo, que 5 os flavonóides são os candidatos mais próximos (SPERONI et al. 1996a.; DHAWAN et al., 2001). A esse respeito, extratos de Passiflora alata foram comparados com seu conteúdo de flavonóides e atividade ansiolítica (PETRY et al. 2001).

Flavónoide R8 R7 R6 R3 R Vitexina C-glicosil H H H H Iso-vitexina H H C-glicosil H H Orientina C-glicosil H H H OH 10 Figura 01: Flavonóides isolados de Passiflora alata. (Adaptadado de DHAWAN, et al ., 2004). Extratos de folhas de P. alata apresentaram C - glycosyl flavonóides isovitexin e vitexin juntamente com outros grandes flavonóides não identificados. Recentemente 15 saponinas foram descritas como compostos adicionais que podem contribuir para os seus efeitos farmacológicos (REGINATTO et. al ., 2001).

101

Figura 02: Saponinas de P. alata : quadrangulosídeo e ácido 3-soforosil oleanóico (DOYAMA, J.T., et al. , 2005).

5 Sumário da Invenção A pirólise de matérias-primas vegetais produz um padrão de pirólise complexo, denominado pirograma, que pode ser utilizado para fins de classificação da amostra na forma de impressão digital do material analisado. A análise do pirograma usando bancos de dados de bibliotecas de espectros de massas permite que se identifique os 10 diferentes compostos químicos produzidos no processo pirolítico com a vantagem de ser uma tecnologia limpa sem uso de solventes orgânicos poluentes e outros reagentes.

Descrição detalhada do invento A invenção está baseada no fato de que o processo pirolítico acoplado a 15 cromatografia gasosa / espectrometria de massa permite a obtenção de cromatogramas ricos em picos cromatográficos correspondentes aos diferentes compostos químicos

102

produzidos nas condições estabelecidas para o processo pirolítico em extrato seco por nebulização da Passiflora alata. Foi estudado o extrato seco nebulizado de folhas de Passiflora alata , para a caracterização dos produtos obtidos através de tecnologia de pirólise na faixa de 5 temperatura de 350 a 650°C. Os extratos hidroalcoólicos do pó das folhas de Passiflora alata foram obtidos pelo método de extração por maceração (à frio) em proporções de água:etanol variando de 10 a 90 %. Os extratos foram secos por nebulização num aparelho Mini-Spray Dryer , da marca LabPlant contendo 10 % de dióxido de silício coloidal. O sistema de 10 alimentação e atomização é constituído por uma bomba peristáltica, um atomizador com agulha injetora (0,5 mm d.i.) sob pressão. Os extratos secos foram separados por sedimentação na base de um ciclone e a circulação do fluído aquecido na temperatura de entrada a 140 °C assegurada por um sistema de aspiração, co-corrente. A temperatura de

saída variou de 90 – 95 °C sob um fluxo de alimentação de 3,0 mL.min -1. 15 Na preparação das amostras foram pesados exatamente 2 g da amostra e tranferidos para erlenmeyer de 25 mL adicionando-se 4 mL de solução água:metanol (1:1). Esta solução foi sonicada durante 20 minutos. Em seguida filtrada através de papel de filtro faixa preta de 125 mm (84 g/m 2 de gramatura, velocidade de filtração de 10 mL/9 s, porosidade de 12,5 – 15,0 µm). Foi transferida uma alíquota de 500 µL do 20 filtrado para tubo eppendorff e adicionados 500 µL da solução de água:metanol (1:1) e homogeneizado. O processo pirolítico do extrato seco de Passiflora alata, foi realizada em um pirolizador (Shimadzu, Pyr-4A) diretamente acoplado a um cromatógrafo a gás interfaciado com espectrômetro de massas (Shimadzu, GCMS-QP5050A). Utilizou-se 25 uma coluna de 5% fenil e 95% dimetilpolisiloxano com 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e 0,25 µm de tamanho de partícula. A temperatura da interface foi de 300 ºC. O forno foi operado com a seguinte programação de temperatura 50ºC (inicial) e 9ºC/ min até 280ºC. Utilizou-se como gás de arraste o Hélio a um fluxo de 1,4 mL/min e uma razão de split de 1:16.

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O espectrômetro de massas foi configurado para varrer uma faixa de massa entre 50 e 450 u.m.a. Os espectros de massas foram obtidos por impacto eletrônico a uma energia 70 eV. Foram injetados diretamente no pirólise, com auxílio de uma seringa, um 5 volume fixo de 1 µL de padrão e amostra, separadamente. Foram utilizadas as seguintes temperaturas de pirólise: 450ºC, 550ºC, 650ºC e 750°C. Os compostos químicos produzidos nos processos pirolíticos foram identificados atrvés da análise comparativa dos seus espectros de massas com os espectros de massas com o espectro de massas da biblioteca Wiley, 6th Edition for Class-5000 de 1999. 10 Estado da técnica da invenção desejada A literatura apresenta diversas técnicas de separação e identificação de constituintes de matrizes complexas, como as matérias-primas vegetais. Souza, Schapoval e Bassani (2002) realizaram um trabalho utilizando cromatografia líquida de 15 alta eficiência (CLAE), para quantificar flavonóides isolados ou compostos em matrizes biológicas complexas. Moraes (1995) estudou a diferenciação entre P. edulis, P. alata e P. incarnata , com base nos flavonóides, tendo constatado que o perfil cromatográfico destas três espécies permite diferencia-las através de CLAE. Mueller e colaboradores (2007) utilizaram a técnica de cromatografia líquida (LC) acoplada a um detector de 20 ultra-violeta (UV) para a determinação de flavonóides em extratos e folhas de P. alata . O controle da qualidade de fitoterápicos tem empregado técnicas cromatográficas, líquida e gasosa com uso de diferentes detectores na identificação e quantificação de um ou vários marcadores do material vegetal ou seus extratos e produtos. 25 Métodos analíticos para a identificação de compostos químicos da P. alata droga vegetal, seus extratos e produtos são pouco citados na literatura especializada. Dados recentes mostram que foram publicados 6 trabalhos com estudos com essa espécie, seus extratos e chá, sendo 2 deles voltados para estudos farmacológico, 1 de investigação dos efeitos do chá sobre parâmetros bioquímicos e 3 com estudos fitoquímicos com 30 isolamento e identificação de flavonóides (PETRY, et al. , 2001; OGA et al. , 1984; DOYAMA et al. , 2004; VARGAS et al. , 2007; MÜLLER et al., 2005; PEREIRA et al. , 2000).

104

A presente invenção buscou associar a tecnologia pirolítica, que catalisa a transformação de compostos químicos originais de um material em novos compostos, com a cromatografia gasosa/espectrometria de massas (CG/EM), que permite identificar todos os compostos químicos formados a partir da tecnologia pirolítica. Como resultado 5 da associação dos processos pirolíticos dos extratos secos por nebulização da P. alata com a cromatografia gasosa/ espectrometria de massas foi possível identificar todos os compostos químicos produzidos a partir desta matéria-prima. O coramatograma resultante com a riqueza de picos cromatográficos permitiu a caracterização dos extratos secos por nebulização das folhas de P. alata na forma de impressão digital. 10 Não foram encontradas referências de aplicação da técnica utilizada na presente invenção (Pir-CG/EM), nos bancos de dados pesquisados – Periódicos CAPES, Scifinder e MedLine, para caracterização de extratos secos de Passiflora alata. No quadro abaixo, está representada a lista padrão de substâncias fornecidas pela comparação dos pirogramas obtidos com a biblioteca espectral. 15 Quadro 01 - Interpretação do cromatograma pirolítico do extrato seco de Passiflora alata Curtis obtido por CG/EM acoplado ao pirolisador em uma faixa de temperatura de 450 a 750°C, com o auxílio da Biblioteca de Espectros da Willey. Substância Química Obtida por Pirólise Dados Químicos Nome Fórmula P.M.

(+)-3-methylcyclopentanone C6H10 O 98

(trans)-2-nonadecene C19 H38 266

(Z,Z0-3,9-cis-6,7-epoxy-nonadecadiene C19 H34 O 278

.alpha.-Cyano.alpha.-13C-tuloebe C8 13 C H7N 117

.beta.angelica lactone C5H6O2 98 [4.2.2]propella-7,9-diene C10 H12 132 Tricyclo [4.2.2.0(1,60]deca-7,9-diene (CAS)

[Cyano-13C]-1,3,5-cycloheptatrien-7-carbonitrile C7 13 CH 7N 117 1,2,3,4-Cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3.beta.,4.alpha.)- C5H10 O4 134 (CAS)

1,2,3,5-Cyclopentanetetrol, (1.alpha.,2.beta.,3. alpha.,5. C6H12 O4 148

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beta.)- (CAS)

1,2,4-Cyclopentatrione (CAS) C5H4O3 112

1,2,4-Cyclopentatrione, 3-ethyl (CAS) C7H8O3 140 1,2,4-Trioxolane, 3,5-diphenyl- (CAS) C14 H12 O3 228 Stylbene ozonide

1,2,4-Trioxolane, 3-methyl-5-phenyl- (CAS) C9H10 O3 166 1,2,4-Trioxolane, 3-phenyl- (CAS) C8H8O3 152 Styrene ozonide 1,2-Benzenedicarbonitrile (CAS) C8H10 N2 128 o-dicyanobenzene

1,2-Benzenedicarboxaldehyde (CAS) C8H6O2 134

1,2-Cyclohexadienone (CAS) C6H8O2 112

1,2-Oxiathiane, 6-dodecyl-, 2,2-dioxide (CAS) C16 H32 O3S 304 1,3,5,7-Cyclooctatetraene (CAS) C8H8 104 [8]Annulene 1,3-Benzenedicarbonitrile (CAS) C8H10 N2 128 m-dicyanobenzene 1,3-cyclopentadiene, 5-(1-methylethylidene)- (CAS) C8H10 106 6,6-dimethylfulvene

1,3-Cyclopentadienone, 2-methyl- (CAS) C6H8O2 112

1,3-Cyclopentanedienone (CAS) C5H6O2 98 1,4-Benzenedicarbonitrile (CAS) C8H10 N2 128 p-dicyanobenzene

1,5-Dihydroxy-4-methyl-1-phenyl-3-pentanone C12 H16 O3 208

11,14-Eicosadienoic acid, methyl ester (CAS) C21 H38 O2 322

12,15- Octadecadienoic acid, methyl ester (CAS) C19 H34 O2 294

13-Oxabicyclo[10.1.0]tridecane (CAS) C12 H22 O 182

1-acetoxy-2-propanol C5H10 O3 118

1-Docosanol (CAS) C22 H46 O 326

1-Eicosene (CAS) C20 H40 280

1-Heptadecene (CAS) C17 H34 238

106

1-Hexadecanol C16 H34 O 242

1-Hexadecene (CAS) C16 H32 224

1-hexen-3-ol (CAS) C6H12 O 100

1H-Imidazole-4-ethanamine, .beta.-methyl- (CAS) C6H11 N3 125

1H-Indene, 1-methyl- (CAS) C10 H10 130

1H-Indole (CAS) C8H7N 117

1H-Indole, 2-Methyl (CAS) C9H9N 131

1H-Indole, 3-ethanamine- (CAS) C10 H12 N2 160

1H-Indole, 3-Methyl (CAS) C9H9N 131

1H-Indole, 5-Methyl (CAS) C9H9N 131

1H-Indole, 6-methyl- (CAS) C9H9N 131

1H-Indole, 7-Methyl (CAS) C9H9N 131

1H-Pyrazole, 3,5-dimethyl- (CAS) C5H8N2 96

1H-tetrazole, 1-methyl- (CAS) C2H4N4 84

1-nitro-2-phenylethane C8H9NO 2 151

1-Nonadecene (CAS) C19 H38 266

1-Octadecene (CAS) C18 H36 252

1-octen-3-ol C8H16 O 128

1-Oxaspiro[4.5]decane-2,4-dione (CAS) C9H12 O2 168 1-penten-1-one (CAS) C5H8O 84 n-propylketene

1-penten-3-ol C5H10 O 86

1-penten-3-one (CAS) C5H8O 84

1-propene-1-thiol C3H6S 74

1-propylmethyl ether C4H10 O 74

1-Tricosanol (CAS) C23 H48 O 340 2(1H)-Benzocyclooctenone, decahydro-10a-methyl-, trans- C13 H22 O 194 (CAS) 2(3H)-Furanone, 5-methyl- (CAS) C5H6O2 98 .alpha.angelica lactone

2(5H)-Furanone C4H4O2 84

107

4-Hydroxybut-2-enoic acid lactone

2,4,6-Cycloheptatriene-1-carbonitrile (CAS) C8H7N 117

2,4-dimethylfuran C6H8O 96

2,5-Pyrrolinediione, 1-methyl-3-phenyl- (CAS) C11 H11 NO 2 189

2,6-Xylenol C8H10 O 122 2-butenal, 2-ethenyl- (CAS) C6H8O 96 Crotonaldehyde, 2-vinyl

2-Butenal, 2-methyl- (CAS) C5H8O 84

2-Butenoic acid lactone C4H4O2 84

2-chloroethyl linoleate C20 H35 ClO 2 342

2-cyclopenten-1-one, 2-methyl- (CAS) C6H8O 96

2-cyclopenten-1-one, 3-methyl- (CAS) C6H8O 96 2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) C6H8O2 112 Corylone 2-Furancarboxaldehyde (CAS) C5H4O2 96 Furfural 2H-Inden-2-one, 1,3-dihydro- (CAS) C9H8O 132 2-Indanone

2H-Pyran, 3,4-dihydro- (CAS) C5H8O 84

2H-Pyran, tetrahydro- (CAS) C5H10 O 86

2H-Pyran-2-one, 3,4-dihydro-5-methyl- (CAS) C6H8O2 112

2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one C5H6O2 98

2-Hydroxy-2-phenylacetonitrile C8H7NO 133

2-Pentenal, 2-methyl- (CAS) C6H10 O 98

2-Pentene, 3-ethyl- (CAS) C7H14 98

2-Phenylnitroethane C8H9NO 2 151

2-Pyridinecarbonitrile (CAS) C6H4N2 104 3 Methyl pentanoic acid C6H12 O2 116 3 methyl valeric acid

3(2H)-Pyridazinone, 4,5-dihydro-6-methyl- (CAS) C5H8N2O 112

3-buten-2-ol C4H8O 72

108

3-butene-1,2-diol (CAS) C4H8O2 88 Erythrol

3-Eicosene, (E) (CAS) C20 H40 280

3-Furaldehyde C5H4O2 96

3-furanmethanol (CAS) C5H6O2 98

3-Octadecene, (E)- (CAS) C18 H36 252 3-Pentanone, 2,2-dimethyl- (CAS) C7H14 O 114 Tert-butyl ethyl ketone

3-Pentenal, 4-methyl- (CAS) C6H10 O 98

4-vinyl-2-methoxy-phenol C9H10 O2 150

5-hepten-3-one, 5-methyl-, cis/trans C8H14 O 126

5-hexenoic acid, methyl ester (CAS) C7H12 O2 128

5-Methylhexanoic acid (CAS) C7H14 O2 130

6,11-Hexadecadien-1-ol C16 H30O 238

6-methyl-tetracos-5-em-7-yn-1-al C25 H44 O 360

7,10-Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS) C17 H30 O2 266

7-octen-4-ol (CAS) C8H16 O 128 7-Thiapentacyclo[4.4.0.0(2,5).0(3,9).0(4,80]decan-10-one, C9H8O3S 196 7,7-dioxide (CAS)

9- Octadecynoic acid, methyl ester (CAS) C19 H34 O2 294 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (CAS) C18 H32 O2 280 Linoleic acid

9,17-Octadienal, (Z)- (CAS) C18 H32 O 264

9-Eicosene, (E) (CAS) C20 H40 280

9-Eicosyne (CAS) C20 H38 278

9-Octadecen-1-ol, (Z)- (CAS) C18 H36 O 268

9-octadecenal, (Z)- (CAS) C18 H34 O 266

9-Octadecene (CAS) C18 H36 252 9-Octadecenoic acid (Z)- (CAS) C18 H34 O2 282 Oleic acid

9-Octadecyne C18 H34 250

109

Acethaldehyde, 2-propenylhydrazone (CAS) C5H10 N2 98

Acetic acid, methyl ester (CAS) C3H6O2 74

Antrhacene (CAS) C14 H10 178

Azetidine, 2-phenyl- (CAS) C9H11 N 133

Aziridine, 2-(1,1-dimethylethyl)-3-methyl-, trans- (CAS) C7H15 N 113 Aziridine, 2-methyl-3-(1-methylethyl)-1-(2-propenyl)-, trans- C9H17 N 139 (CAS)

Aziridine, 2-tert-butyl-1,3-dimethyl-, trans- (CAS) C8H17 N 127 Azulene (CAS) C10 H8 128 Cyclopentacycloheptene

Benzaldehyde (CAS) C7H6O 106 Benzene, (1-methyl-2-cyclopropen-1-yl)- (CAS) C10 H10 130 Cyclopropene, 3-methyl-3-phenyl Benzene, (1-methylene-2-propenyl)- (CAS) C10 H10 130 2-phenyl-1,3-butadiene Benzene, (1-methylethenyl)- (CAS) C9H10 118 .alpha.-methylstyrene

Benzene, (cyclopropylindenemethyl)- (CAS) C10 H10 130

Benzene, (isocianomethyl)- (CAS) C8H7N 117 Benzene, 1,1’-[oxybis(methylene)]bis- (CAS) C14 H14 O 198 Benzyl ether

Benzene, 1,2,3-trimethyl- (CAS) C9H12 120 Benzene, 1,2,4-trimethyl- (CAS) C9H12 120 Pseudocumol Benzene, 1,2-dimethyl- (CAS) C8H10 106 o-xylene

Benzene, 1,3-butadienyl- (CAS) C10 H10 130 Benzene, 1,3-dimethyl- (CAS) C8H10 106 m-xylene Benzene, 1,4-dimethyl- (CAS) C8H10 106 p-xylene

110

Benzene, 1-ethenyl-2-methyl- (CAS) C9H10 118 o-methylstyrene

Benzene, 1-ethoxy-4-methyl- (CAS) C9H12 O 136

Benzene, 1-isociano-2-methyl- (CAS) C8H7N 117

Benzene, 1-isociano-4-methyl- (CAS) C8H7N 117

Benzene, 1-propenyl- (CAS) C9H10 118

Benzene, ethyl- (CAS) C8H10 106

Benzeneacetonitrile (CAS) C8H7N 117

Benzeneacetonitrile, 2-methyl- (CAS) C8H7N 117

Benzeneacetonitrile, 3-methyl- (CAS) C8H7N 117

Benzeneacetonitrile, 4-methyl- (CAS) C8H7N 117 Benzenemethanimine (CAS) C7H7N 105 Benzaldimine

Benzenemethanol, .alpha.-methyl- (CAS) C8H10 O 122

Benzoic acid, methyl ester (CAS) C8H8O2 136

Benzonitrile, 4-methyl- (CAS) C8H7N 117 Bicyclo[4.2.0]octa-1,3,5-triene (CAS) C8H8 104 Cardene

Borane, diethylmethyl- (CAS) C5H13 B 84

Cyclohexanone C6H10 O 98

Cyclohexanone, 2-propyl- (CAS) C9H16 O 140

Cyclooctane, cycloctylidene C16 H28 220

Cyclopentane ethylidene- (CAS) C7H12 96

Cyclopentanol (CAS) C5H10 O 87

Cyclopentanone (CAS) C5H8O 84

Cyclopentanone, 3-methyl- (CAS) C6H10 O 98

Cyclopentene, 1-ethyl- (CAS) C7H12 96 Cycloprop[a]indene, 1,1a.,6,6a.-tetrahydro- (CAS) C10 H10 130 2,3-methylene-inden Cyclopropaneoctanoic acid, 2-[[2-[(2- C22 H48 O2 334 ethylcyclopropyl)cyclopropyl]methyl]-, methyl ester (CAS)

111

Decanoic acid (CAS) C10 H20 O2 172

Diazene, bis(1,1-dimethyl)- (CAS) C8H18 N2 142

Dicumyl peroxide C18 H22 O2 270

Docosanoic acid (CAS) C22 H44 O2 340

Eicosanoic Acid (CAS) C20 H40 O2 312 Eicosanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C21 H42 O2 326 Methyl Arachatate

Ethanol, 2-(9-octadecenyloxy)-, (Z)- (CAS) C20 H40 O2 312 Ethanone, 1-phenyl- (CAS) C8H8O 120 Acethophenone

Ethyl linoleate C20 H36 O2 308 Ethylbenzene C8H10 106 Benzene, ethyl- (CAS) Furan -3-carboxaldehyde C5H4O2 96 Furfural

Furan, 2,5-dihydro-3,4-dimethyl- (CAS) C6H10 O 98 Furan, 2,5-dimethyl- (CAS) C6H8O 96 2,5-Dimethylfuran

Heneicosanoic acid (CAS) C21 H42 O2 326 Heptadecanoic acid (CAS) C17 H34 O2 270 Margaric acid Heptadecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) 284 C18 H36 O2 Methyl Margarate

Heptane, 2,3,5-trimethyl- (CAS) C10 H22 142

Heptane, 2,5-dimethyl- (CAS) C9H20 128

Heptane, 3,5-dimethyl- (CAS) C9H20 128

Heptanoic acid (CAS) C7H14 O2 130 Hexadecanoic acid (CAS) C16 H32 O2 256 Palmitic acid

Hexadecanoic Acid, 2,3-dihydroxypropyl ester (CAS) C19 H38 O4 330

Hexadecanoic Acid, 2-hydroxy-1,3-propanediyl ester (CAS) C35 H68 O5 569

112

Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS) C17 H30 O2 266 Methyl Palmitate Hexadecanoic acid, methyl ester (CAS) C17 H30 O2 266 Methyl Palmitate Hexanoic acid (CAS) C6H12 O2 116 Caproic acid

Indolizine, 3-methyl- (CAS) C9H9N 131 Lactic acid, monoanhydride with 1-butaneboronic acid, cyclic C7H13 BO 3 156 ester (CAS)

L-histidine, 1-methyl- (CAS) C7H11 N3O2 169

Methanamine, N-methyl-N-nitroso- (CAS) C2H6N2O 74

Methyl (2R,3R)-2,3-Dihydroxy-3-phenylpropanoate C10 H12 O4 196

Methyl- (3R)-(-)- 5-oxo 3-propylpentanoate C9H16 O3 172

Methyl ethanoate C3H6O2 74

Methyl Octadecanoate C19 H38 O2 298

Methyl-(3R)-(-)-3-ethyl-5-oxopentanoate C8H14 O3 158

Methyllaurate C8H10 106

Naphthalene (CAS) C10 H8 128

N-benzylidene-dimethylammonium chloride C9H12 ClN 169

Nitrous acid, butyl ester (CAS) C4H9NO 2 103

Nonadecanoic acid (CAS) C19 H38 O2 289

Nonadecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C20 H40 O2 312 Nonanoic acid C9H18 O2 158 Pelargic acid

N-Phenyl-4a,8a-(oxoiminooxo)naphthalene C18 H13 NO 2 275 Octadecanoic acid (CAS) C18 H36 O2 284 Stearic acid Octanoic acid (CAS) C8H16 O2 144 Caprylic acid Oxacycloheptadec-8-em-2-one (CAS) C16 H28 O2 252 Ambrettolide

113

Oxirane, 2-ethyl-2-methyl- (CAS) C5H10 O 86

Pentadecanoic acid (CAS) C15 H30 O2 242

Pentadecanoic acid, 1,4-methyl-, methyl ester (CAS) 270 C17 H34 O2

Pentanoic acid (CAS) C5H10 O2 102

Phenanthrene (CAS) C14 H10 178 Phenol, 2,4-dimethyl- (CAS) C8H10 O 122 2,4-Xylenol Phenol, 2,5-dimethyl- (CAS) C8H10 O 122 2,5-Xylenol Phenol, 2-ethyl- (CAS) C8H10 O 122 o-Ethylphenol Phenol, 2-methyl- (CAS) C7H8O 108 o-cresol Phenol, 3,4-dimethyl- (CAS) C8H10 O 122 3,4-Xylenol Phenol, 3-ethyl- (CAS) C8H10 O 122 m-Ethylphenol Phenol, 3-methyl- (CAS) C7H8O 108 m-cresol Phenol, 4-ethyl- (CAS) C8H10 O 122 p-Ethylphenol Phenol, 4-methyl- (CAS) C7H8O 108 p-cresol

Piperidine, 2,6-dimethyl- (CAS) C7H15 N 113 Propanoic acid, 2,2-dimethyl- (CAS) C5H10 O2 102 Pivalic acid

Pyrazolo[5,1c]-as-triazin-4-ol, benzoate (ester) (CAS) C12 H8N4O2 240 Styrene C8H8 104 Benzene, ethenyl- (CAS)

Tetradecadien-4,9 ol-1 C14 H26 O 210

Tetradecanoic acid (CAS) C14 H28 O2 228

114

Myristic acid Tetradecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C15 H30 O2 242 Methyl Mirystate

Tridecanoic acid (CAS) C13 H26 O2 214

Tridecanoic Acid, Methyl Ester (CAS) C14 H28 O2 228

Trimethyl-aluminum C3H9Al 72 Trioxolane, 3-phenyl- (CAS) C8H8O3 152 Styrene ozonide

Tryptaminiumchloride C10 H13 ClN 2 196

9,12-Octadien-1-ol (CAS) C18 H34 O 266

9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)- (CAS) C18 H32 O2 280

9,12-Octadecadienoic acid, methyl ester, (E,E)- (CAS) C19 H34 O2 294

9,12-Octadecadienoic acid(Z,Z)-, methyl ester (CAS) C19 H34 O2 294 Bicyclo[4.4.1]undeca-1,3,5,7,9-pentaen-11-one (CAS) C11 H8O 156 1,6-methano(10)annulen-11-one

115

Figura 03 – Cromatogramas pirolíticos obtidos do extrato seco das folhas de Passiflora alata Curtis na faixa de temperatura de 450 a 750°C.

116

REINVINDICAÇÕES

1. Uso da tecnologia pirolítica para obtenção dos compostos químicos, constantes no quadro I desta patente, produzidos no processo pirolítico dos extratos do pó das 5 folhas da Passiflora alata Curtis, secos por nebulização, caracterizada por compreender: - processo pirolítico na faixa de 450 – 750ºC - 235 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I 10 2. Uso da tecnologia pirolítica acoplada a cromatografia gasosa/espectrometria de massas para caracterização dos extratos do pó das folhas da Passiflora alata Curtis, secos por nebulização, caracterizada por compreender: - processo pirolítico na faixa de 450 – 750ºC - 235 compostos químicos obtidos nos processos pirolíticos constantes no quadro I 15

117

Resumo

“TECNOLOGIA ANALÍTICA BASEADA NA PIRÓLISE ACOPLADA À 5 CROMATOGRAFIA GASOSA/ESPECTROMETRIA DE MASSA PARA CARACTERIZAÇÃO E OBTENÇÃO DE COMPOSTOS QUÍMICOS A PARTIR DE EXTRATOS DE Passiflora alata CURTIS SECOS POR NEBULIZAÇÃO .”

A presente invenção proporciona a utlilização da tecnologia analítica baseada na 10 pirólise para a obtenção de produtos de decomposição dos constituintes dos extratos secos nebulizados de folhas de Passiflora alata Curtis separação desses compostos por cromatografia gasosa e identificação por espectrometria de massa, fornecendo uma caracterização dos extratos na faixa de temperatura de 350 a 650° C, constando de um total de 235 compostos químicos obtidos. 15

Anexo III

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Passiflora alata Curtis a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 450°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

2(3)-Furanone-5- methyl- (CAS) 1 4.978 98 C H O 89 .alpha.Angelica lactone 5 6 2

2-Cyclopenten-1-one, 2-hydroxy-3-methyl- (CAS) 2 6.527 112 C H O 92 Corylone 6 8 2

3-butene, 1,2-diol (CAS) 3 7.601 88 C H O 89 H C:CHCH(OH)CH OH Erythrol 4 8 2 2 2 T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

119

Cont.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura Hexanoic acid (CAS) 4 14.057 116 C H O 84 HO C(CH ) Me Caproic acid 6 12 2 2 2 4 9-octadecenoic acid (Z)- (CAS) 5 19.887 282 C H O 93 Me(CH ) CH:CH(CH ) CO H Oleic acid 18 34 2 2 7 2 7 2 T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

120

Análise do cromatograma pirolítico dos extratos secos nebulizados das folhas de Passiflora alata Curtis a partir de uma solução extrativa hidroalcoólica 1:1, obtido por pirólise acoplada a CG/EM à 750°C, com auxílio da Biblioteca de Espectros Willey.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura 1 3.226 Furaldehyde 96 C5H4O2 81

Furan, 2,5- dimethyl- (CAS) 2 3.474 96 C H O 80 6 8

3 3.818 Benzene, 1,4-dimethyl 106 C8H1O 87

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

121

Cont.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

Benzene, ethenyl- (CAS) 4 4.125 104 C H 89 Styrene 8 8

5 5.267 Benzaldehyde (CAS) 106 C7H6O 94

6 5.533 Benzene , (1-methylethenyl)- CAS) 118 C9H10 87

Phenol, 2-methyl 7 6.791 108 C H O 91 o-cresol 7 8

8 7.035 Ethanone, 1-phenyl- (CAS) 120 C8H8O 86

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

122

Cont.

Pico TR Nome P.M. Fórmula Similaridade Estrutura

Phenol, 4-methyl- (CAS) 9 7.176 108 C H O 95 p-cresol 7 8

10 9.076 Naphtalene 128 C10 H8 91

11 12.374 1-Indole, 3-methyl- (CAS) 131 C9H9N 91

T.R.- Tempo de Retenção; P.M.- Peso Molecular

123

124

REFERÊNCIAS

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VARGAS, A.J., GEREMIAS, D.S., PROVENSI, G., FORNARI, P.E., REGINATTO, F.H., GOSMANN, G., SCHENKEL, E.P., FRÖDE, T.S. (2007). Passiflora alata and Passiflora edulis spray-dried aqueous extracts inhibit inflamation in mouse modelo of pleurisy. Fitoterapia 78, 112-119.

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