Volně Žijící Améby Rodu Vannella (Amoebozoa) a Jejich Geny Pro Cytochrom C Oxidázu I (COI)

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE

Volně žijící améby rodu Vannella (Amoebozoa) a jejich geny pro cytochrom c oxidázu I (COI)

Diplomová práce Michaela Bochníčková

Vedoucí práce: prof. MVDr. Iva Dyková, DrSc. Brno 2016

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Michaela Bochníčková Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie Volně ţijící améby rodu Vannella (Amoebozoa) a jejich Název práce: geny pro cytochrom c oxidázu I (COI)

Studijní program: Ekologická a evoluční biologie

Studijní obor: Zoologie

Vedoucí práce: prof. MVDr. Iva Dyková, DrSc.

Akademický rok: 2015/2016

Počet stran: 69 Klíčová slova: Amoebozoa; Vannella spp.; cytochrom oxidáza I; DNA barcoding

Bibliographic Entry

Author: Bc. Michaela Bochníčková Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology Free-living amoebae of the genus Vannella (Amoebozoa) Title of Thesis: and their cytochrom c oxidase I (COI) genes

Degree programme: Ecological and Evolutionary Biology

Field of Study: Zoology

Supervisor: Iva Dyková D.V.M., D.Sc., Professor of Parasitology

Academic Year: 2015/2016

Number of Pages: 69 Keywords: Amoebozoa; Vannella spp.; Cytochrom c oxidase I; DNA barcoding

Abstrakt V současné době je známo, ţe identifikace volně ţijících améb včetně tzv. nahých améb skupiny Vannellida, nemůţe být zaloţena výhradně na jejich morfologii. Pro identifikaci těchto organismů se doporučuje kombinovat pouţití znaků morfologických a molekulárních. Doposud byla jako molekulární marker vyuţívána téměř výhradně 18S rDNA. V některých případech ale 18S rDNA nedokáţe rozlišit améby na úrovni druhu. V reakci na to byl pro Vannellida vybrán krátký úsek genu pro COI (tzv. DNA barcode) a doporučen jako vhodný molekulární marker. Nicméně v průkopnické studii bylo pouţito poměrně málo (celkem 12) kmenů rodu Vannella. Při studiu našeho datasetu (90 kmenů vannellidních améb reprezentovaných 240 sekvencemi zahrnujícími i sekvence molekulární klony) se nepodařilo jednoznačně potvrdit pouţití COI pro rozlišení druhů skupiny Vannellida.

Abstract Currently, the identification of free-living amoebae in general and naked lobose amoebae of the vannellid group specifically, cannot be based strictly on their morphology. For the identification of these organisms, a combination of morphological features and molecular markers is recommended. Until now, the 18S rDNA has been almost exclusively used as a molecular marker. However, in some cases the 18S rDNA cannot distinguish amoebae at the species level. In response, short fragment of the gene for COI (i.e. DNA barcode) was selected for Vannellida and recommended as an adeuqate molecular marker. Nonetheless, the pioneering study used relatively small number of Vannella strains, 12 in total. The study of our dataset (90 strains of vannelid amoebae represented by 240 sequences including sequences of molecular clones) did not confirmed unambiguously the usage of COI at species level within Vannellida.

Poděkování Děkuji paní profesorce MVDr. Ivě Dykové, DrSc. za odborné vedení, cenné rady, vstřícnost a čas věnovaný přípravě mé diplomové práce. Děkuji také konzultantovi, RNDr. Tomáši Tymlovi, který mne trpělivě připravoval pro práci v laboratoři molekulární biologie a odborně vedl při přípravě sekvencí i při provádění fylogenetických analýz. Mé poděkování patří také rodině a příteli za stálou podporu při studiu.

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s vyuţitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 29. dubna 2016 ……………………………… Michaela Bochníčková

Seznam použitých zkratek

AIC Akaike infromation criterion AMK Aminokyseliny BLAST Basic Local Alignment Search Tool CBOL Consortium of the Barcode of Life CCAP Culture Collection of Algae and Protozoa COI Cytochrom c oxidase I ddH2O Double-distilled water dNTP Deoxynucleotidtriphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid GTR General time-reversible model ITS Internal transcribed spacer LSU rRNA Large subunit ribosomal RNA ML Maximum Likelihood mtDNA Mitochondrial DNA NCBI National Centre for Biotechnology Information PCR Polymerase chain reaction ProWG Protist Working Group rbcL Ribulose 1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase rDNA Ribosomal DNA rRNA Ribosomal RNA SDS Sodium Dodecyl Sulfate SOC Super Optimal Broth medium with Catabolite repression SSU rRNA Small subunit ribosomal RNA TBE Tris/Borate/EDTA TNES Tris-HCl/NaCl/EDTA/SDS tRNA Transfer RNA Pozn. Vysvětlení zkratek uvádím v angličtině. Jsou odvozeny z angličtiny a v této podobě i pouţívány v českých textech.

Obsah

1 Úvod ...... 9

1.1 Volně ţijící améby rodu Vannella Bovee, 1965 ...... 9

1.2 Molekulární taxonomie ...... 13

1.2.1 Molekulární markery ...... 14

1.3 DNA barcoding ...... 15

1.3.1 Cytochrom c oxidáza podjednotka I ...... 17

1.3.2 DNA barcoding u volně ţijících améb ...... 19

1.4 Cíl práce ...... 21

2 Materiál a metody ...... 22

2.1 Materiál ...... 22

2.2 Metody ...... 28

2.2.1 Izolace DNA ...... 28

2.2.2 Polymerázová řetězová reakce ...... 28

2.2.3 Elektroforetická analýza ...... 28

2.2.4 Přečištění PCR produktu ...... 29

2.2.5 Klonování ...... 29

2.2.6 Kontrola a příprava sekvencí pro analýzy ...... 31

2.2.7 Editace sekvencí a fylogenetické analýzy ...... 32

3 Výsledky ...... 35

4 Diskuze ...... 49

5 Závěr ...... 53

6 Pouţitá literatura ...... 54

1 Úvod

1.1 Volně žijící améby rodu Vannella Bovee, 1965

Rod Vannella ustavil Bovee (1965) pro tzv. nahé volně ţijící améby (Gymnamoebia) řazené v době jejich prvních studií do rodu Flabellula Schaeffer, 1926. Východiskem pro ustavení nového rodu bylo doplnění charakteristiky rodu Flabellula publikované v téţe práci (Bovee 1965) a zdůraznění zásadních morfologických rozdílů mezi oběma rody. V charakteristice rodu Vannella přirovnal Bovee (1965) tvar trofických stadií k trojúhelníku (při pomalém pohybu) a k rozvinutému vějíři při rychlém pohybu. Rozlišil transparentní protoplasmu v podobě širokého lemu, který zaujímá čtvrtinu aţ polovinu buňky a šíří se i do stran (zejména při rychlém pohybu) a zrnitou vlastní buněčnou masu vejčitého, případně kulovitého tvaru. Zdůraznil hladký okraj buněk při pohybu po podloţce (bez známek erupcí protoplasmy) a vznik kónických paprsčitých panoţek se zaoblenými konci u plovoucích stadií. Jádro charakterizoval jako kulovité, vezikulární s výrazným kulovitým endosomem a uvedl, ţe délka améb nepřesahuje při pohybu 75 µm. Do nově ustaveného rodu zahrnul Bovee sladkovodní i mořské druhy améb. Za typový druh rodu označil a detailně popsal druh Vannella mira Schaeffer, 1926. Vývoj poznatků o volně ţijících amébách rodu Vannella zásadním způsobem ovlivnila mimořádná osobnost oboru, Frederick C. Page. Na základě podrobného studia dvou kmenů sladkovodních améb ustavil rod Platyamoeba (Page 1969) a popsal nové druhy, P. placida Page, 1968 a P. stenopodia Page, 1969. Na úrovni světelného mikroskopu odlišil rod Platyamoeba od rodu Vannella s důrazem na morfologii plovoucích stadií. Společný taxon sdruţující rody Vannella a Platyamoeba do čeledi Vannellidae ustavil Bovee (1970). V pozdějších studiích zaměřených na ultrastrukturu prokázali Page (1979, 1980) a Page & Blakey (1979), ţe na povrchu trofozoitů sladkovodních i mořských druhů rodu Vannella lze detekovat glykokalyx diferencovaný do tzv. glykostylů, které mají na příčném průřezu tvar pětiúhelníků a na podélném řezu připomínají věţovité útvary, nebo indiánské stany (teepee). U zástupců rodu Platyamoeba se podařilo prokázat jen

9 vláknitý nebo zcela amorfní glykokalyx. Ultrastrukturu glykokalyxu zařadil Page (1988) do klíče pro určování sladkovodních a půdních nahých améb jako zásadní rodové kritérium. Nově popisované druhy plochých améb byly řazeny do rodů Vannella a Platyamoeba na základě „vějířovitého“ morfotypu pohybujících se stadií a podle ultrastruktury buněčného povrchu poměrně dlouho (Moran et al. 2007) i kdyţ uţ v roce 2002 byla vhodnost tohoto znaku zpochybněna molekulárními metodami, sekvencemi malé podjednotky ribozomálního RNA genu (Sims et al. 2002). Vyuţití molekulárních technik při rekonstrukci fylogeneze a taxonomie vannellidních améb znamenalo velký krok vpřed. Za zlomovou je povaţována studie z roku 2007, v níţ Smirnov et al. (2007) stanovili, ţe ţádný z udávaných morfologických znaků vannellidních améb se neshoduje se vztahy mezi rody odvozenými z molekulárních analýz a k jejich rozlišení lze dospět pouze kombinací molekulárních a morfologických znaků. V této studii pak představili zcela nový pohled na uspořádání v rámci čeledi Vannellidae. Osekvenovali geny pro 18S rRNA u 21 vannellidních améb a provedli fylogenetickou analýzu sekvencí. Ta ukázala, ţe rody Vannella a Platyamoeba netvoří významně oddělené klady. Oba rody proto uvedení autoř sloučili na základě priority popisu do rodu Vannella, a to bez ohledu na typ glykokalyxu. Srovnání sekvencí malé ribozomální podjednotky (18S rRNA) také ukázalo, ţe Vannella platypodia a morfologicky podobné améby tvoří linii jasně oddělenou od ostatních améb rodu Vannella. Na základě toho byl ustaven nový rod Ripella, kam byla V. platypodia a sekvenčně podobné druhy přesunuty. V současné době tvoří skupinu vannellidních améb 45 nominálních druhů (Tabulka 1) náleţejících k 6 rodům. Jsou to Vannella, Ripella, Pessonella, Clydonella, Paravannella a Lingulamoeba (Kudryavtsev 2014, Smirnov et al. 2007, Smirnov et al. 2011). Nová klasifikační schémata pro protista, která publikovala Adl et al. (2005, 2012) vypouští čeleď Vannellidae, uvádí „Vannellida“ překvapivě s autory Smirnov et al. (2005), i kdyţ v jeho publikaci se ještě o čeledi Vannellidae mluví. Vzhledem k tomu, ţe většina protistologů poslední klasifikační schéma zaloţené do značné míry na nově shromáţděných molekulárních datech přijala, pouţívám i já v textu termín „skupina Vannellida“.

Tabulka 1. Nominální druhy skupiny Vannellida Smirnov et al. 2005

Clydonella rosenfieldi Saywer, 1975 C. sindermanni Sawyer, 1975 C. vivax (Schaeffer, 1926) Sawyer 1975 C. wardi Sawyer, 1975

Lingulamoeba leei Sawyer, 1975

Paravannella minima Kudryavtsev, 2014

Pessonella marginata Pussard, 1973

Ripella platypodia (Gläser, 1912) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 *

Unda maris Schaeffer, 1926 U. schaefferi Sawyer, 1975

Vannella aberdonica Page, 1980 V. anglica Page, 1980 V. arabica Page, 1980 V. australis (Page, 1983) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. bursella (Page 1974) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. caledonica Page, 1979 V. calycinucleolus (Page, 1974) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. cirifera (Frenzel, 1892) Page, 1988 *** V. contorta Moran, Anderson, Dennett, Caron et Gast, 2007 ** V. crassa Schaeffer, 1926 V. croatica Smirnov, Bondarenko, Glotova et Nassonova, 2016 V. danica Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 V. devonica Page, 1979 V. douvresi (Sawyer, 1975) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. ebro Smirnov, 2001 V. epipetala Amaral-Zettler, Cole, Laatsch, Nerad, Anderson et Reysenbach, 2006 V. flabellata (Page, 1974) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. langae (Sawyer, 1975) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. lata Page, 1988

V. mainensis (Page, 1971) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. mira (Schaeffer, 1926) Smirnov 2002 V. miroides Bovee, 1965 V. murchelanoi (Sawyer, 1975) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. nucleolilateralis (Anderson, Nerad et Cole, 2003) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007** V. oblongata Moran, Anderson, Dennett, Caron et Gast, 2007 ** V. peregrinia Smirnov et Fenchel, 1996 V. persistens Smirnov et Brown, 2000 V. placida (Page, 1968) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. plurinucleolus (Page, 1974) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. pseudovannellida (Hauger, Rogerson et Anderson, 2001) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. sensilis Bovee, 1953 V. septentrionalis Page, 1980 V. schaefferi (Singh et Hanumaiah, 1979) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 ** V. simplex Wohlfarth-Botterman, 1960 V. weinsteini (Sawyer, 1975) Smirnov, Nassonova, Chao et Cavalier-Smith, 2007 **

Pozn. * druh původně zařazený do rodu Vannella ** druh původně zařazený do rodu Platyamoeba *** druh původně zařazený do rodu Saccamoeba

1.2 Molekulární taxonomie

Skupina vannellidních améb je příkladem toho, jak můţe fenotypová heterogenita a s tím spojený nedostatek sdílených morfologických znaků znesnadnit studium organismů a jejich fylogenezi. Rozvoj molekulárně-genetických metod a vznik molekulární taxonomie přinesly nové moţnosti studia těchto organismů vedoucí k hlubšímu pozumnění jejich vzájemných vztahů.

Na rozdíl od klasické taxonomie, která staví na morfologii organismů, je molekulární taxonomie zaloţena na vzájemném srovnávání homologních nukleotidových sekvencí makromolekul – RNA, DNA a proteinů. K analýze biomolekul lze přistoupit v případě, ţe znaky nezbytné k uspokojivému rozlišení organismů chybí, nejsou řádně vyvinuté nebo tak významné aby na nich mohlo být srovnání zaloţeno. Nespornou výhodou vyuţití molekulárních metod v taxonomii je fakt, ţe informační biomolekuly se v organismech vyskytují ve velkém mnoţství, a to jak v organismech ţivých, tak po určitou dobu i mrtvých nebo v jejich částech. Všechny známé formy ţivota jsou zaloţeny na nukleových kyselinách a kaţdá nukleotidová pozice můţe být teoreticky povaţována za nezávislý znak. Molekulární znaky jsou také diskrétní, nemusíme je váţit a lze díky nim porovnat i vzájemně si nepříbuzné a tedy i nepodobné druhy. Rekonstrukce starobylých fylogenetických vztahů na základě biomolekul však vyţaduje dobrou znalost a analýzu pomalu se vyvíjejících nukleotidových a aminokyselinových sekvencí. Ne všechny geny jsou totiţ vyhovujícími molekulárními markery a ne všechny molekulární markery jsou univerzálně pouţitelné u všech organismů pro analýzu dané skupiny organismů (Avise 2004).

V sekvencích informačních makromolekul dochází v průběhu času ke změnám, ty jsou způsobeny mutacemi a dochází k nim z velké části náhodně. Právě náhodný vznik mutací způsobuje mezi studovanými organismy sekvenční variabilitu a přítomnost těchto rozdílů v sekvencích homologních molekul poukazuje na vzájemnou genetickou odlišnost organismů, jakoţto výsledek molekulární evoluce. Na základě toho je pak moţné určit stupeň jejich podobnosti a zrekonstruovat jejich vztahy a strukturu. Pro molekulární systematiku je klíčové to, ţe různé geny kumulují mutace různě rychle.

Rozdíl v rychlostech jakými se v genu hromadí mutace je závislý na tom do jaké míry je gen schopen tolerovat změny bez ztráty své původní funkce. Příkladem mohou být molekuly histonu, které se stávají nefunkčními jiţ po změně několika málo aminokyselin, na rozdíl od toho oblasti ITS ribozomální RNA neztrácejí funkčnost i při záměně velkého počtu nukleotidů. Za poslední desetiletí došlo téţ k výraznému zrychlení sekvenování nukleových kyselin a díky vysoké účinnosti a neustálému vylepšování metodiky se molekulární analýza stala nedílnou součástí taxonomie a fylogenetiky (Patwardhan et al. 2014).

1.2.1 Molekulární markery

Molekulární marker je definován jako část molekuly DNA, jejíţ identifikovatelný fragment je umístěn na konkrétním místě v genomu (lokus). Má délku odpovídající řádově stovkám párů bází, nemá zpravidla efekt na fenotyp organismu, ale lze jej determinovat biochemickou analýzou (Avise 2004). Takový specifický úsek DNA můţe být vyuţit k určení identity studovaného jedince a při srovnání s určitou skupinou organismů vypovídá o jejich vzájemné genetické podobnosti či naopak rozdílnosti. Tato informace je esenciální pro rekonstrukci historie jejich vztahů. Molekulární markery (znaky) lze rozlišovat z různých hledisek, například podle umístění v buňce – na jaderné markery a mitochondriální markery nebo podle genetické funkce – na sekvence kódující ribozomální RNA, transferové RNA, proteiny a nekódující sekvence (Martin & Hine 2004, Patwardhan et al. 2014).

Jaderné markery. Ze skupiny jaderných markerů je v biologii pravděpodobně nejhojněji vyuţívaným markerem ribozomální RNA (rRNA). Oceňovanými vlastnostmi rRNA je její všudypřítomná distribuce, velikost a přítomnost vysoce konzervativních i variabilních oblastí. Tyto vlastnosti z ní činí uznávaný druhově specifický genetický marker, neocenitelný nástroj na posouzení evoluční historie mnoha organismů (Van de Peer et al. 2000, Avise 2004). Ribozomy jsou sloţeny z rRNA a proteinů. U všech eukaryotických organismů rRNA sestává ze dvou podjednotek, malé ribozomální podjednotky (SSU) a velké ribozomální podjednotky (LSU). Malá podjednotka obsahuje jeden druh RNA, 18S rRNA u eukaryot a 16S rRNA u prokaryot. Pokud jde o velkou podjednotku bakterie a archea mají dva druhy RNA (5S a 23S rRNA).

Eukaryota mají celkem 3 druhy RNA (5S, 5.8S a 28S rRNA). Geny pro rRNA se vyvíjejí pomaleji neţ geny kódující proteiny a jsou tak zvlášť důleţité pro fylogenetické analýzy vzdáleně příbuzných druhů. Nejvíce jsou vyuţívány geny pro 18S rRNA, 16S rRNA, 5S rRNA a 28SRNA (Patwardhan et al. 2014).

Mitochondriální markery. Genom mitochondrií je na rozdíl od jaderného genomu ţivočichů haploidní a aţ na výjimky se ţivočišná mitochondriální DNA (mtDNA) vyskytuje ve formě uzavřené kruhové molekuly dvouřetězcové DNA (Avise 2004). Typická velikost se pohybuje mezi 15 a 20 kb. V jedné mitochondrii se tato dvouřetězcová molekula vyskytuje asi v 10 kopiích a jedna buňka obsahuje 102 – 105 mitochondrií. Velké mnoţství mtDNA v buňce zvyšuje úspěšnost její izolace, coţ je jednou z největších výhod jejího pouţití. Pouţití mtDNA je oblíbené zejména díky malému genomu s jednoduchou strukturou a organizací, absenci intronů, větších oblastí repetitivní DNA a vysoké frekvenci nukleotidových substitucí a tedy i rychlé evoluci. Téměř celá mtDNA je zahrnuta do kódování. Ţivočišná mitochondriální DNA sestává z 37 genů; 2 genů kódující rRNA, 13 protein kódujících genů a 22 genů kódujících tRNA. Nejvíce vyuţívanými geny pro molekulární analýzy jsou Cyt B (gen kódující enzym cytochrom B), podjednotky NAD dehydrogenázy a COI/COII (gen kódující podjednotku I/II enzymu cytochrom oxidázy) (Simon et al. 1994, Zhang & Hewitt 1996, Avise 2004, Patwardhan et al. 2014). Mitochondriální DNA označil za ideální molekulární marker pro řešení otázek fylogenetických vztahů na úrovni druhu jiţ Avise et al. (1987).

1.3 DNA barcoding

DNA barcoding je technika, která vyuţívá krátký, standardizovaný úsek DNA k identifikaci druhů. Pojem „barcode“ v překladu znamená čárový kód a v biologii se pod tímto pojmem rozumí takový úsek DNA, v jehoţ sekvenci se druhy studovaného taxonu od sebe liší co moţná nejvíce a jedinci daného druhu mezi sebou naopak co nejméně. Ideální čárový kód by měl být krátký, aby jeho analýza byla rychlá a levná, protoţe metoda DNA barcodingu má identifikaci organismů v první řadě urychlit a usnadnit. Velkého významu nabývá zejména v případě obtíţně identifikovatelných organismů nebo v situacích, kdy máme k dispozici poškozený či nedokonale vyvinutý 15 organismus a správné zařazení by za normálních okolností nebylo moţné nebo vyţadovalo znalosti zkušeného taxonoma. Tato metoda je v posledních letech velmi oblíbená. Úsilí mnohých taxonomů se zaměřuje na nalezení vhodného DNA barcodu pro různé skupiny organismů a vytvoření komplexní referenční knihovny sdruţující odpovídající genetická data. V roce 2004 vznikla mezinárodní iniciativa Consortium of the Barcode of Life (tj. CBOL) věnující se rozvoji DNA barcodingu. Cílem iniciativy je ustanovit tuto techniku jako celosvětový standard pro identifikaci biologických druhů. Experti konsorcia zaměřují pozornost zejména na krátké oblasti genu pro cytochrom c oxidázu I, která se osvědčila u mnohých skupin ţivočichů (Hebert et al. 2003). Jednou ze skupin konsorcia, která vznikla nedávno je Protist Working Group (tj. ProWG). Cílem ProWg je posoudit a sjednotit snahy o nalezení vhodného barcodu pro všechny linie protistů, vytvořit jednotný plán na dokončení tohoto výběru a iniciovat projekt, který vyvrcholí vytvořením referenční knihovny dat o těchto organismech. Protista jsou velmi heterogenní sběrnou skupinou, sdruţující organismy sdílející určité charakteristické znaky. Podle Adl et al. (2005) jde o jednobuněčné eukaryotické organismy, jejichţ buňky netvoří specializované tkáně. Buněčná diferenciace, ke které u protist dochází, je omezena výhradně na sexuální reprodukci a klidová či rezistentní stádia, například cysty. Z pohledu identifikace a zařazení do druhů jsou protista povaţována za velmi problematickou skupinu. Moţnosti jejich studia jsou značně znesnadněny malými rozměry, omezeným počtem vhodných určujících znaků, časovou a technickou náročností pozorování a kultivace a v neposlední řadě i extrémní diverzitou v rámci skupiny. Ve světle těchto skutečností se protista jeví jako ideální skupina, kde by vhodný DNA barcode významně usnadnil studium organismů a tím poskytl nové informace o jejich ekologii a diverzitě. Přesto, ţe pouţití molekulárních markerů u protist má dlouhou historii, DNA barcoding se v protistologii začal pouţívat teprve nedávno. Na rozdíl od jiných skupin ţivočichů, rostlin či hub zatím u protist nebyl pouţit ţádný set molekulárních markerů, který by fungoval u všech linií. Dosud nejpouţívanějšími molekulárními markery této skupiny jsou geny kódující ribozomální RNA, 18S rDNA, D1-D2 popř. D2-D3 oblasti 28S rDNA a ITS oblasti rDNA, přičemţ 18S rDNA se jako vhodný barcode osvědčila u skupin Foraminifera (De Vargas et al. 1999, Pawlowski & Lecroq 2010) a Diatoma

(Zimmermann et al. 2011). Pouţití oblastí 28S rDNA bylo úspěšné u skupin Ciliophora (Gentekaki & Lynn 2009), Haptophyta (Liu et al. 2009) a Acantharia (Decelle et al. 2012). Oblasti vnitřních transkribovaných mezerníků (ITS1, ITS2), které ohraničují gen kódující sloţku transkripční jednotky 5.8S, jsou běţně vyuţívanými barcody u hub (Schoch et al. 2012). U protist byly úspěšně pouţity například u Chlorarachniophytes (Gile et al. 2010) a améb rodu Naegleria (De Jonckheere 1994, 1998, 2002, 2004, De Jonckheere & Brown 2005, Skulinová 2015). Mimo genů kódujících rRNA je jako barcode vyuţívána i COI. Úspěšně byla vyuţita u protist včetně červených řas (Saunders 2005, 2008, Le Gall & Saunders 2010), hnědých řas (Kucera & Saunders 2008, McDevit & Saunders 2009), dinoflagellatů (Stern et al. 2010), nahých (Nassonova et al. 2010) a skořepatých (Kosakyan et al. 2012) améb. Některé další skupinově specifické barcody jsou sekvence genu pro velkou podjednotku RuBisCO (rbcL), chloroplastový 23S rRNA gen pro fotosyntetizující protista a další. Nalezení jednoho DNA barcodu univerzálního pro celou skupinu je však nepravděpodobné, zejména proto, ţe protista se vyvíjí nezávisle, dlouho a mají komplexní evoluční historii, která způsobuje jejich vysokou genetickou variabilitu. Z tohoto důvodu protistologové ze skupiny ProWG představili pro barcoding protist dvoukrokovou analýzu. Sestává z předběţné identifikace za pouţití univerzálního eukaryotického barcodu, tzv. pre-barcode, a následného pouţítí barcodu specifického pro studovanou skupinu. U této strategie navrhují jako univerzální pre- barcode přibliţně 500 bází dlouhou V4 oblast 18S rDNA. Zdůraznili, ţe morfologie kaţdého analyzovaného organismu by měla být bez rozdílu povahy vstupního materiálu zaznamenána. Ve volně přístupné sbírce by měly být uchovány mikrofotografie, fixované buňky, ţivé či zamraţené kultury a data o lokalitě a charakteru habitatu (Pawlowski 2012).

1.3.1 Cytochrom c oxidáza podjednotka I

Cytochrom c oxidáza je enzymatický membránový komplex představující poslední článek elektronového transportu v mitochondriálním dýchacím řetězci. U prokaryot se nachází na cytoplazmatické membráně, u eukaryot je lokalizován ve vnitřní membráně mitochondrií. Gen kódující podjednotku I cytochrom c oxidázy je

17 součástí mtDNA. Sekvence genu COI je vyuţívána stále častěji jako genetický marker. Kompletní gen pro COI má délku přibliţně 894 bází, část kódující podjednotku I je dlouhá přibliţně 650 bází. (Patwardhan et al. 2014). Ve snaze seznámit se blíţe s tímto molekulárním markerem, jsem vyhledala práce o pouţití COI u eukaryotických organismů. Pročtením literatury jsem zjistila, ţe COI byla mezi lety 1994 a 2015 pouţita jako molekulární marker k určování druhů a rekonstrukci fylogeneze nejméně u 30 kmenů ţivočichů. První zprávy o vyuţití COI pro fylogenetickou analýzu u ţivočichů jsem našla v práci Folmer et al. (1994). Autoři popsali „univerzální“ DNA primery pro amplifikaci úseku genu pro COI z 11 kmenů bezobratlých ţivočichů. Tyto COI primery tvoří sekvence, které měly být vhodné pro fylogenetické analýzy na úrovni druhu i na vyšší úrovni (Folmer et al. 1994). Ukázalo se, ţe tyto primery nejsou vyhovující pro všechny skupiny. Přesto obliba cytochrom c oxidázy při sestavování fylogenetických vztahů ţivočichů s postupem času rostla. Největší počet literárních údajů pochází z let 2010 aţ 2015. Ty dosvědčují, ţe COI byla nejčastěji vyuţívána u skupin Arthropoda, Mollusca, Platyhelmintes, Nematoda, Echinodermata, Cnidaria a Chordata. Tento marker byl uspěšný zejména u korýšů (Lefébure et al. 2006, Costa et al. 2007, Bucklin et al. 2010), pavouků (Barrett & Hebert 2005) a hmyzu. Konkrétně u Lepidoptera byla úspěšnost markeru téměř 100%, coţ vzbudilo velké očekávání podobného úspěchu i u ostatních skupin zejména proto, ţe motýli jsou jednou z nejrozmanitějších skupin ţivočichů vůbec (Hebert et al. 2003, Yu et al. 2012). Nejstarší zmínka o pouţití COI u měkkýšů se objevuje ve studii publikované jiţ v roce 1998, kdy se za pomoci tohoto markeru podařilo odhalit pravý původ portugalské ústřice Crassostrea angulata a srovnat diskutované fylogenetické vztahy mezi portugalskými a pacifickými ústřicemi (Foighil et al. 1998). Velká pozornost byla věnována i zástupcům Gastropoda (Remigio & Hebert 2003, Grande et al. 2004). Kvůli nesnadné identifikaci na základě morfologie zaujímá COI v posledních letech místo v identifikaci a fylogenetických analýzách i u zástupců skupiny Nematoda (Prosser et al. 2013) a to u hlístic volně ţijících (Derycke et al. 2010) i u parazitických (Eamsobhana et al. 2010). Hledání „čárových kódů“ pro rozlišení druho bylo úspěšné i u savců, ptáků, ryb, paryb, objţivelníků a plazů (Griffiths et al. 2013, Hebert et al. 2004, Ivanova et al. 2012, Serra-Periera et al. 2010, Vences et al. 2012, Ward et al.

2003, Ward et al. 2005). Zajímavé jsou i zprávy o barcodingu, který se osvědčil u skupiny Echinodermata (Bribiesca-Contreras et al. 2013, Hoareau et al. 2010, Ward et al. 2008) a Cnidaria (Bucklin et al. 2010, Kitahara et al. 2010, Ortman 2008, Sinniger et al. 2008). V případě Platyhelmintes je v posledních letech problematika barcodingu také diskutována a objevují se snahy najít vhodný COI primer vyhovující této skupině organismů, jelikoţ primery navrţené Folmerem (1994) uţ u ploštěnců několikrát selhaly. U plostěnců je pozornost věnována zejména zástupcům skupin Cestoda, Trematoda (Kandil et al. 2010, Léon-Regagnon 2010, Van Steenkiste et al. 2015) a Monogenea (Vanhove et al. 2013).

1.3.2 DNA barcoding u volně žijících améb

Od počátku 90. let minulého století je studiu améb na molekulární úrovni věnována stále větší pozornost. Molekulární diverzita těchto organismů byla studována zejména u druhů rodu Acanthamoeba (Booton et al. 2005, Dyková et al. 1999, Visvesvara et al. 2007), Vannella (Dyková et al. 2005a, Fahrni et al. 2003, Nassonova et al. 2010), Nebela (Heger et al. 2011, Kosakyan et al. 2012, Lara et al. 2008, Nikolaev et al. 2005), Neoparamoeba (Dyková et al. 2005b, Dyková & Fiala 2003) a Entamoeba (Clark et al. 2006). Převáţná většina analýz publikovaných do roku 2010 byla zaloţena na sekvencích genu pro 18S rRNA, popřípadě aktinu a tubulinu. Gen pro 18S rRNA se ukázal být velmi uţitečným pro odvození fylogenetických vztahů unvitř skupiny Amoebozoa (Bolivar et al. 2001, Pawlowski & Burki 2009, Smirnov et al. 2005). Nicméně při rozlišování druhů volně ţijících améb je limitován zejména nízkou mírou evoluce a vnitrodruhovým polymorfismem (Smirnov et al. 2007). Lepší rozlišení vztahů nabízí oblast ITS. To bylo potvrzeno několika studiemi, například u améb rodu Vannella (Dyková et al. 2005a, Nassonova et al. 2010) či rodu Acanthamoeba (Köhsler et al. 2006). Podle Nassonova a kol. (2010) však ve srovnání s 18S rDNA a ITS oblastní nabízí nevyšší stupeň rozlišení vztahů v rámi druhů rodu Vannella COI. Pokud jde o Amoebozoa, byla COI poţita jako molekulární marker ve 13 studiích, které se zabývaly améboidními organismy 9 rodů: Paravannella (Kudryavtsev 2014), Vannella (Nassonova et al. 2010), Cochliopodium (Gaisen et al. 2014, Tekle 2014), Quadrulella (Fiz-Palacios et al. 2014, Kosakyan et al. 2012, Oliviero et al.

2015), Hyalosphenia (Fiz-Palacios et al. 2014, Heger et al. 2013, Kosakyan et al. 2012, Oliviero et al. 2015), Padaungiella (Fiz-Palacios et al. 2014, Kosakyan et al. 2012), Arcella (Fiz-Palacios et al. 2014), Alcodera (Fiz-Palacios et al. 2014, Kosakyan et al. 2012), a Nebella (Fiz-Palacios et al. 2014, Oliviero et al. 2015, Kosakyan et al. 2012, Kosakyan et al. 2013, Kosakyan et al. 2015, Singer et al. 2015). Heger et al. (2011) úspěšně testoval pouţitelnost COI na 6 druzích skořepatých améb rodu Cyphoderia a Pseudocorythion řazených mezi Rhizaria.

1.4 Cíl práce

Cílem diplomové práce bylo ověření pouţití sekvence genu pro cytochrom c oxidázu I jako vhodného barcodu pro skupinu vannellidních améb. V souladu se zadáním vycházela metodika diplomové práce z postupů publikovaných v práci Nassonova et al. 2010 a zahrnula (a) získání sekvencí genu pro COI u vybraných kmenů vannelldiních améb ze sbírek školitelky a konzultanta, (b) provedení fylogenetické analýzy získaných sekvencí a (c) porovnání výsledné fylogenetické analýzy s jiţ publikovanými výsledky.

2 Materiál a metody

2.1 Materiál

Pro vlastní práci jsem od školitelky a konzultanta dostala genetický materiál, který reprezentoval 98 cíleně vybraných kmenů volně ţijících/amfizoických améb skupiny Vannellida (Tabulka 2). Soubor tvořily dvě skupiny kmenů: (a) 57 kmenů zařazených do rodů Vannella (48) a příbuzných rodů Ripella (7) a Lingulamoeba (2); (b) 41 kmenů, které charakterizoval vannellidní, vějířovitý morfotyp trofozoitů a typické ultrastrukturní znaky ale zařazení do rodů nebylo na rozdíl od předchozí skupiny (a) potvrzeno molekulární analýzou. Výchozím materiálem pro izolace améb byly ţivočišné tkáně, zejména ţábry ryb a vzorky environmentálního původu, s převahou vzorků mořských. Enviromentální vzorky měly původ zpravidla v půdě, sedimentech a biofilmech. Materiál pocházel z různých geografických lokalit šesti světových kontinentů (S. Amerika, Antarktida, Afrika, Evropa, Asie a Austrálie). Pro diplomovou práci bylo připraveno 118 vzorků DNA, z nichţ 9 jsem sama extrahovala ze suspenzí buněk uloţených v lyzačním pufru TNES (Asahida et al. 1996). Vzhledem k několika duplikacím vzorků DNA, které byly extrahovány v různých fázích kultivace několika kmenů (tj. z různých pasáţí), převyšoval celkový počet vzorků DNA výše uvedený počet kmenů vybraných pro studium genů pro cytochrom c oxidázu I.

Tabulka 2. Kmeny améb a vzorky genomové DNA vybrané pro analýzy

Typ Rok DNA Typ Přístupová čísla sekvencí Název kmene1 extrakce Lokalita Původ izolátu izolace Literární odkaz číslo biotopu3 SSU rDNA4 DNA2 kmene 805R 957 R S Česká republika, chov PaÚ AV ČR Carassius auratus auratus, ledviny 1992 JQ271713 Dyková et al. 1996 4354V 27 R S Česká republika, rybník Podřezaný Tinca tinca, ţábry 1990 AY929911, AY929930* Dyková et al. 2005a 4362V/IIV 25 R S Česká republika, rybník Podřezaný Pseudorasbora parva, ţábry 1990 AY929909, AY929928* Dyková et al. 2005a 4432/IV 41 R S Česká republika,řeka Vltava Squalius cephalus, mozek 1990 AY929910, AY929929* Dyková et al. 2005a A368 1113 R M Arktida, Svalbard, Petuniabukta Hyas araneus, ţábry 2010 - - A503 1056 R M Arktida, Svalbard, Petuniabukta Hyas araneus, ţábry 2010 - - AB03 1243 R S Arktida, Svalbard, Petuniabukta mech, kopečková tundra 2010 - - AB06 278 F-Ch S Arktida, Svalbard, Brucebyen mech z okraje jezírka 2010 - - ACN1V 922 R M Španělsko - SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 2003 JQ271724 Dyková & Kostka 2013 AGDI 710 R M Austrálie, Tasmánie Salmo salar, ţábry 2007 - - ASL3V 709 R M Austrálie, Tasmánie Salmo salar, ţábry 2007 JQ271725 Dyková & Kostka 2013 BA01 1384 R S Arktida, Svalbard, Nordenskiöldbreen sediment na dně kryokonitů 2011 - - 1401 R

BAK1V 786 R P Malajsie, Borneo, park Bako mangrove, bahno 2008 JQ271726 Dyková & Kostka 2013 774 R

BEN3VV 1001 R P Španělsko, Kanárské ostrovy, Tenerife bahno z pláţe 2010 JQ271727 Dyková & Kostka 2013 1000 R

991 R

BOTMV 689 R S Česká republika, import4 Botia macracantha, povrch kůţe 2006 JQ271728 Dyková & Kostka 2013 CAMEV 784 R P Kamerun, Mt.Cameroon vulkanický písek 2008 JQ271729 Dyková & Kostka 2013 CH11 396 R S Čína, provincie Hubei - 2002 - - 398 R

CH88/IV 210 R S Čína, provincie Hubei, Ye Zhi Hu Hypophthalmichthys molitrix, ţábry 2000 AY929912 Dyková et al. 2005a 232 R

CHN4 1364 R M USA, SC, Charleston, ostrov Jameson povrch chaluhy 2011 - - 23

Tabulka 2. Pokračování Typ Rok DNA Typ Přístupová čísla sekvencí Název kmene1 extrakce Lokalita Původ izolátu izolace Literární odkaz číslo biotopu3 SSU rDNA4 DNA2 kmene CHORV 942 R M Chorvatsko, Istrie, pláţ Savudrija rozkládající se krab 2007 JQ271730 Dyková & Kostka 2013 CSPE1 279 F-Ch M Česká republika, import4 Crassostrea angulata 2015 - - CVG8 266 F-Ch M Itálie, Capo Vaticano biofilm z neurčené chaluhy 2014 - - CVG5S 268 R M Itálie, Capo Vaticano mořský sediment 2014 - - DP13/IR 513 R S Česká republika, přehrada Ţelivka Dresissena polymorpha, hepatopankreas 2005 JQ271714 Dyková & Kostka 2013 524 R S

ELH1V 987 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271732 Dyková & Kostka 2013 ELH3V 989 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271734 Dyková & Kostka 2013 ELH4V 993 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271735 Dyková & Kostka 2013 ELH5V 994 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271736 Dyková & Kostka 2013 ELH6V 995 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271737 Dyková & Kostka 2013 ELH7V 988 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, El Hierro povrch řas 2010 JQ271738 Dyková & Kostka 2013 EXNP 775 R M Austrálie, Tasmánie, Launceston Salmo salar, ţábry 2008 - - F24 C101 R S Antarktida, ostrov Vega sladkovodní jezírko 2013 - - C102 R

GAU6 DE51 R M Norsko, Vevang, Gaustad povrch chaluhy 2011 - - GAU21 DE114 R M Norsko, Vevang, Gaustad povrch chaluhy 2011 - - GERBV 781 R S Německo, Baden-Württemberg Oncorhynchus mykiss, ţábry 2008 HM363624 Dyková et al. 2010 780 R

GERL14R 849 R S Německo, Baden-Württemberg Oncorhynchus mykiss, ţábry 2009 HM363630 Dyková et al. 2010 GERL34R 857 R S Německo, Baden-Württemberg Oncorhynchus mykiss, ţábry 2009 HM363631 Dyková et al. 2010 GERL41V 852 R S Německo, Baden-Württemberg Oncorhynchus mykiss, ţábry 2009 HM363632 Dyková et al. 2010 GR01 1354 R M Řecko, Kavala povrch chaluhy 2011 - -

Tabulka 2. Pokračování Typ Rok DNA Typ Přístupová čísla sekvencí Název kmene1 extrakce Lokalita Původ izolátu izolace Literární odkaz číslo biotopu3 SSU rDNA4 DNA2 kmene ISCR2 691 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, La Gomera písek z pláţe 2007 - - ISCRHV 687 R M Španělsko, Kanárské ostrovy, La Gomera písek z pláţe 2007 JQ271739 Dyková & Kostka 2013 ISOKONTV 245 R M Itálie, Sicílie Dicentrarchus labrax, ţábry 1999 JQ271741 Dyková & Kostka 2013 250 R

JAM1 1377 R M Jamajka, Montego Bay, Northern Estates písek z pláţe 2011 - - JAMF2 1437 R S Jamajka, Montego Bay, Northern Estates sladkovodní jezírko, detrit 2011 - - JAMX1 1361 R M Jamajka, Montego Bay, Northern Estates písek z pláţe 2011 - - JAMX4 1360 R M Jamajka, Montego Bay, Northern Estates písek z pláţe 2011 - - JAMX6 1381 R M Jamajka, Montego Bay, Northern Estates písek z pláţe 2011 - - JAMX7 1402 R M Jamajka, Montego Bay, Northern Estates písek z pláţe 2011 - - JRF2V 1002 R M Antarktida, ostrov James Ross písek z pláţe 2010 JQ271744 Dyková & Kostka 2013 JRM2 1009 R M Antarktida, ostrov James Ross písek z pláţe 2010 - - Kont2PeV 1063 R M Francie, Villefranche kontaminant P.eilhardi CCAP 1560/2 2004 JQ271745 Dyková & Kostka 2013 LITHOVV 636 R M Chorvatsko, ostrov Brač, Jaderské moře povrch řasy Lithophyllym racemus 2006 JQ271746 Dyková & Kostka 2013 634 R

MCH 321 F-Ch M Chorvatsko, Istrie, Verudela plţ Littorina littorea 2015 - - MSPE/IV 241 R M Austrálie, Tasmánie, Launceston Salmo salar, ţábry 2003 JQ271747 Dyková & Kostka 2013 249 R

NS9A DE119 R M Velká Británie, SZ pobřeţí Skotska Salmo salar, ţábry 2012 - - PET1V 815 R M Arktida, Svalbard, Petuniabukta povrch hnědé řasy Lithoderma 2008 - - PET1Z 878 R M Arktida, Svalbard, Petuniabukta povrch hnědé řasy Lithoderma 2008 - - PHILMV 738 R M Austrálie, Tasmánie, přístav Maquari Salmo salar, ţábry 2007 JQ271748 Dyková & Kostka 2013 740 R

PHILVV 1035 R M Austrálie, Tasmánie, přístav Maquari Salmo salar, ţábry 2007 JQ271749 Dyková & Kostka 2013 PMCH/IV 6 R M Chorvatsko, Jaderské moře, pláţ v Pule Pachygrapsus marmoratus, coelom.tekutina 2000 AY929919, AY929935* Dyková et al. 2005a

Tabulka 2. Pokračování Typ Rok DNA Typ Přístupová čísla sekvencí Název kmene1 extrakce Lokalita Původ izolátu izolace Literární odkaz číslo biotopu3 SSU rDNA4 DNA2 kmene PRAV6 C82 R S Česká republika biofilm chovné nádrţe pstruţí farmy 2012 - - PS2/IR 242 R S Česká republika, import ze Singapuru Pangasianodon hypophthalms,ţábry 2000 JQ271716 Dyková & Kostka 2013 246 R R/IIV 483 R M USA, Mississippi, Biloxi, Gulf Coast Callinectes sapidus, hemolymfa 2005 JQ271750 Dyková & Kostka 2013 491 R

RSH1L 234 R M Austrálie, Tasmánie, Launceston Salmo salar, ţábry 2003 JQ271690 Dyková & Kostka 2013 RSL/IL 341 R M Austrálie, Tasmánie Salmo salar, ţábry 2003 AY929908 Dyková et al. 2005a RSSF/IV 253 R M Austrálie, Tasmánie, přístav Maquari Salmo salar, ţábry 2003 JQ271752 Dyková & Kostka 2013 257 R

RT3TTV 1006 R P Belize, Cockscomb písek z pláţe 2010 JQ271753 Dyková & Kostka 2013 S3M13/IV 12 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271754 Dyková & Kostka 2013 S4M24/IV 18 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271756 Dyková & Kostka 2013 S4M30V 1062 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271757 Dyková & Kostka 2013 S6M33V 1041 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271758 Dyková & Kostka 2013 S7M35/IV 11 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271759 Dyková & Kostka 2013 S7M36V 209 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271760 Dyková & Kostka 2013 S98M8/IV 16 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1998 AY929906, AY929926* Dyková et al.2005a SBF5-7 217 F-Ch S UK, Skotsko Oncorhynchus mykiss, ţábry 2003 - - SEDFSV 1037 R M Austrálie, Tasmánie, Stringers Cove sediment z plovoucích chovných klecí 2003 JQ271763 Dyková & Kostka 2013 SH2 DE118 R M UK, Shetlandy, Lerwick Salmo salar, ţábry 2012 - - SH3 DE115 R M UK, Shetlandy, Lerwick Salmo salar, ţábry 2012 - - SH8 C6 R M UK, Shetlandy, Lerwick Salmo salar, ţábry 2012 - - SMA7V/IV 279 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 2000 JQ271767 Dyková & Kostka 2013 281 R

Tabulka 2. Pokračování Typ Rok DNA Typ Přístupová čísla sekvencí Název kmene1 extrakce Lokalita Původ izolátu izolace Literární odkaz číslo biotopu3 SSU rDNA4 DNA2 kmene SMA13V/IV 270 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 2000 JQ271765 Dyková & Kostka 2013 271 R SMA26/IV 280 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 2000 JQ271765 Dyková & Kostka 2013 282 R SMA30V 1038 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 2000 JQ271766 Dyková & Kostka 2013 SMAS2 211 F-Ch M Antarktida, ostrov James Ross písek z pláţe 2014 - - SMAS3 251 F-Ch M Antarktida, ostrov James Ross písek z pláţe 2014 - - SS8FJ1/IV 14 R M Irsko, Farad Scophthalmus maximus, ţábry 2000 AY929915, AY929931* Dyková et al. 2005a ST4F/I 369 R M Austrálie, Tasmánie Salmo salar, ţábry 2003 - - SUM1S/IR 274 R S Česká republika, Rumburk,řeka Labe Silurus glanis, ţábry 2000 AY929921 Dyková et al. 2005a SV136A 890 R M Arktida, Svalbard, Petuniabukta Hyas araneus, ţábry 2009 - - SYM43/IV 1064 R M Španělsko, SZ pobřeţí Atlantiku Scophthalmus maximus, ţábry 1996 JQ271768 Dyková & Kostka 2013 T02V 685 R M Austrálie, Tasmánie Thunnus maccoyii, ţábry 2007 JQ271769 Dyková & Kostka 2013 686 R

ULLAPV 713 R M UK, Skotsko, přístav Ullapool písek 2007 JQ271770 Dyková & Kostka 2013 VVV 82 R S Německo, Bonn pouzdro na kontaktní čočky 1997 AY929923, AQY929937* Dyková & Kostka 2013 W181GR 114 R S Čína, Wuhan, provincie Hubei, rybí trh Carassius gibelio, ţábry 2001 AY929913 Dyková et al. 2005a WA6A 1432 R M Austrálie, Perth písek z pláţe 2011 - - WA6F 1417 R M Austrálie, Perth písek z pláţe 2011 - - ZER12 212 F-Ch S Česká republika, Ţermanice Oncorhynchus mykiss, ţábry 2014 - - ZER14 213 F-Ch S Česká republika, Ţermanice Oncorhynchus mykiss, ţábry 2014 - -

1 rody identifikované na základě SSU rRNA (Dyková & Kostka 2013) 2 R = různé typy extrakce 3 S = sladkovodní 4 sekvence ITS označené hvězdičkou (*) V = rod Vannella F-Ch = Fenol-Chloroformová extrakce M = mořské 5 neznámý geografický původ L = rod Lingulamoeba P = půdní R = rod Ripella 27

2.2 Metody

2.2.1 Izolace DNA

Vzorky DNA, které jsem převzala od školitelky a konzultanta byly izolovány fenol-chloroformovou extrakcí nebo pomocí komerčních kitů Qiagen Dneasy Tissue Kit (Qiagen, Německo) a JETQUICK Tissue DNA Spin Kit (Genomed, USA). Způsoby extrakce jsou u jednotlivých vzorků uvedeny v Tabulce 2. Přístupová čísla sekvencí dopňují data o jednotlivých kmenech v publikaci Dyková & Kostka (2013). Sama jsem k extrakci DNA z buněk koncentrovaných v lyzačním pufru TNES pouţila fenol-chloroformovou extrakcí podle Sambrook & Russell (2001). Extrahovanou DNA jsem skladovala při teplotě -20°C.

2.2.2 Polymerázová řetězová reakce

K amplifikaci fragmentů genu pro cytochrom c oxidázu I (COI) jsem pouţila univerzální primery LCO1490 a HCO2198 (Folmer et al. 1994). Pro PCR reakční směs jsem smíchala 2,5 µl 10x Taq Buffer Complete s finální koncentrací 1,5 mM MgCl2 (Top-Bio, Česká republika), 2 µl směsi nukleotidů dNTP-Mix (Qiagen, Nizozemsko) kaţdá báze v koncentraci 0,1 mM, 0,5 µM forward primeru LCO1490 a 0,5 µM reverse primeru HCO2198 (Generi Biotech, Česká republika), 1 U (0,04U/µl) Taq-Purple DNA polymerázy (Top-Bio, Česká republika), 17 µl ddH2O a 0,5 µl templátové DNA. U negativní kontroly jsem DNA nahradila stejným mnoţstvím ddH2O a kontroly jsem pouţila při kaţdé amplifikaci. Reakční směs jsem rozdělila do zkumavek a vloţila do termocycleru Mastercycler® EP Gradient S (Eppendorf, Německo), kde proběhla PCR. Sestávala z počáteční denaturace při 95°C/3 min, následně z 35 cyklů denaturace při 95°C/1 min, annealingu při 40°C/1 min a elongace při 72°C/1,5 min a finálního cyklu při 72°C/15 min.

2.2.3 Elektroforetická analýza

Výsledný PCR produkt jsem ověřila pomocí horizontální agarózové elektroforézy. Za nosič jsem zvolila 1% agarózový gel (Serva, Německo) rozpuštěný

28 v 0,5x TBE pufru podle Sambrook & Russell (2001) s přídavkem fluorescenčního barviva GoodView Nucleic Acid Stain (Beijing SBS Genetech, Čína) v koncentraci 0,04‰. Z celkového objemu reakce 25µl jsem odebrala 5µl čerstvého PCR produktu, které jsem nanesla na gel, a zbytek jsem uloţila při teplotě 5°C k případnému přečištění produktu ţádoucí velikosti. Elektroforetickou separaci jsem provedla v elektroforetické vaně Gel XL Plus (Labnet International, Inc., USA) v 0,5x TBE pufru při napětí 100 V po dobu 25 min. Pro srovnání velikosti fragmentů jsem pouţila 100 bp velikostní DNA standard GeneRuler DNA Ladder ready-to-use (Thermo Scientific, USA). Identifikaci a následnou fotodokumentaci produktu ţádoucí velikosti jsem provedla pomocí UV transiluminátoru Syngene G:Box (Syngene, Velká Británie). Stejným způsobem jsem provedla amplifikaci a vizualizaci DNA i pro následné klonování.

2.2.4 Přečištění PCR produktu

PCR produkty, které měly předpokládanou velikost cca. 700 nukleotidových bází a při vizualizaci se u nich na gelu neobjevily prouţky jiné velikosti, jsem přečistila, a to přímo z reakční směsi uloţené v chladničce. Produkt jsem z roztoku přečistila pomocí komerčního kitu High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Švýcarsko) podle protokolu od výrobce. Přečištěnou DNA jsem rozpustila v 50 µl ddH2O, z nichţ jsem 20 µl odeslala k sekvenační analýze a zbylých 30 µl jsem archivovala při -20°C. Sekvenování bylo provedeno komerčně firmou Macrogen Europe sídlící v Nizozemsku. V případech, kdy jsem DNA neodesílala k sekvenování, ale bezprostředně ji pouţila k dalšímu zpracování při klonování, rozpouštěla jsem přečištěnou DNA ve 20 µl Elution pufru (High Pure PCR Product Purification Kit) místo vody.

2.2.5 Klonování

V případech, kdy nebylo moţné sekvence PCR produktů spojit, měly zdvojený signál nebo šlo o kmeny geograficky zajímavé, jsem přistoupila ke klonování. Klonování jsem prováděla pomocí komerčního kitu TOPO® TA Cloning® Kit (Invitrogen, USA). Čerstvý vyizolovaný PCR produkt (viz.výše) jsem smíchala s pCR®4-TOPO® vektorem a solným roztokem (TOPO® TA Cloning® Kit) a inkubovala 5 min při pokojové teplotě, coţ zajistilo ligaci PCR produktu do klonovacího vektoru. Pro transformaci pCR®4-TOPO® konstruktu do kompetentních 29

E.coli buněk jsem přidala 2 µl klonovací směsi ke kompetentním buňkám a nechala je 10 min inkubovat na ledové tříšti, následně jsem je rychle přesunula do vodní lázně (Memmert, Německo) při 42°C a po uplynutí 30 s zpět na led. Poté jsem k buňkám přidala 250 µl S.O.C média (tj. Super Optimal Broth medium with Catabolite repression, Invitrogen, USA), dobře uzavřené zkumavky jsem vloţila do laboratorní třepačky (N-BIOTEK, Inc., Korea) a nechala inkubovat při 37°C a 200 rpm po dobu 1 hod. Suspenzi jsem rozetřela sterilní hokejkou na předehřáté agarové plotny (LB Broth with Agar, Sigma-Aldrich, USA), a ty jsem uloţila přes noc do inkubátoru (Weiss Technik UK, Velká Británie) při 37°C v uzavíratelném sáčku, dnem vzhůru. Následující den jsem misky s agarem zkontrolovala. Ve většině případů došlo na agaru přes noc k hojnému nárůstu kolonií. Jednotlivé kolonie jsem přenesla pomocí mikropipety opatřené sterilní špičkou do 1,5 ml zkumavek obsahujících 30 µl ddH2O, a popsala jsem je. Uzavřené zkumavky jsem uloţila do laboratorní třepačky na 10 min při 37°C a 200 rpm. Po uplynutí 10 minut obsahovala zkumavka suspenzi buněčných klonů, tedy DNA pro další kroky klonování. Přítomnost poţadovaného fragmentu DNA v plasmidu jsem ověřila kontrolou délky amplifikované části plasmidu (ohraničené M13 primery) pomocí agarózové elektroforézy. Směs této ověřovací reakce obsahovala 1,25 µl 10x Taq Buffer Complete s finální koncentrací 1,5 mM MgCl2 (Top-Bio, Česká republika), 1 µl dNTP-Mix (Qiagen, Nizozemsko), kaţdá báze v koncentraci 0,1 mM, 1 µM primeru M13F a 1 µM primeru M13R (Generi Biotech, Česká republika), 0,5 U (0,04 Uµl) Taq-Purple DNA polymerázy (Top-Bio, Česká republika), 7,25 µl ddH2O a 2 µl DNA, resp. buněčné suspenze. Zbytek suspenze jsem uloţila při teplotě 5°C k závěrečnému namnoţení buněk. PCR reakční směs jsem rozdělila do zkumavek a vloţila do termocycleru Mastercycler® EP Gradient S (Eppendorf, Německo). Amplifikace sestávala z prodlouţené počáteční denaturace při 95°C/10 min, 20 cyklů denaturace při 95°C/30 s, annealingu při 54°C/1 min a elongace při 72°C/1 min a závěrečnou elongací při 72°C/10 min. Velikost výsledného produktu jsem ověřila pomocí agarózové elektroforézy a zobrazila pomocí UV transiluminátoru (viz výše). Na gel jsem nanesla 6 µl PCR produktu a zbytek jsem uchovala při -20°C pro případ, ţe by bylo nutné kontrolu opakovat.

Zkumavky o celkovém objemu 15 ml jsem asepticky naplnila 3 ml LB média (LB Broth, Sigma-Aldrich, USA) a přidala 12 µl Ampicilinu 0,5 (Biotika a.s., Slovenská republika) v koncentraci 12,5 mg/µl. Do takto ošetřeného média jsem přidala zbývající objem buněk ze suspenze (viz výše) a vzorek jsem vloţila do třepacího inkubátoru na 14-18 hod při teplotě 37°C a 200 rpm. Z namnoţených buněk jsem vyizolovala plasmid pomocí komerčního kitu High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche, Švýcarsko) podle protokolu dodaného výrobcem. Plasmid jsem rozpustila v 75 µl vody, z roztoku jsem odebrala 20 µl a odeslala na sekvenování do firmy Macrogen Europe a zbytek jsem archivovala při -20°C. Koncentraci plasmidu (ng/µl), která se ve vzorcích obvykle pohybovala v rozmezí od 85 do 254 ng/µl jsem zjišťovala pomocí spektrofotometru Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, USA).

2.2.6 Kontrola a příprava sekvencí pro analýzy

Identitu získaných sekvencí jsem ověřovala v programu BLAST (Basic Local Alignment Search Toool), který hledá oblasti podobností mezi zadanou nukleotidovou či proteinovou sekvencí a srovnává je se sekvencemi uloţenými v databázi GenBank (NCBI). BLAST vyuţívá heuristický přístup, zaloţený na hledání úseku sekvencí vykazujících nejvyšší stupeň podobnosti. Při velkém počtu sekvencí bylo pouţití této metody velmi výhodné vzhledem k její rychlosti a relativní přesnosti. Algoritmus tohoto programu nejprve rozloţí danou sekvenci na kratší úseky a potom hledá shodu mezi těmito fragmenty a sekvencemi v databázi. Pokud nalezne úsek shodný nebo velmi podobný hledané sekvenci, rozšíří své hledání od tohoto úseku v obou směrech. Míra shody mezi sekvencemi je pak kvantifikována pomocí skóre a sekvence s nejvyšším skóre, tedy s největší shodou, jsou řazeny v tabulce pod sebe. V programu jsem pracovala v rozhraní “nucleotide blast”, které udává, ţe program bude srovnávat nukelotidové sekvence. V nastavení parametrů vyhledávání v databázi jsem volila moţnost “megablast”, popř. “blastn”. Algoritmus “megablast” je primárně uzpůsoben pro vyhledávání dlouhých, velmi podobných sekvencí a je proto uţitečný při porovnávání v rámci druhu. V případech, kdy výsledek vyhledávání nebyl uspokojivý, nastavila jsem algoritmus “blastn”, který sekvenci rozdělí na kratší úseky a

31 vyhledá tak podobné sekvence i jiných organismů. Zbylé vstupní infromace jsem ponechala v přednastaveném programu, do okénka v panelu jsem vloţila zkopírovanou sekvenci a zahájila vyhledávání příkazem “BLAST”. Ve výsledné tabulce srovnání jsem se orientovala zejména podle konečné míry identity “Ident”, která je procentuálním vyjádřením podílu shodných pozic a jejich celkového počtu. Po utřídění výsledků podle této hodnoty, jsem byla schopná přibliţně určit totoţnost zadané sekvence a přesvědčit se tak, ţe jsem neosekvenovala gen jiného organismu, který by vzorek potenciálně kontaminoval (Altschul et al. 1990, Macholán 2014). Pro další úpravy sekvencí genu pro COI jednotlivých kmenů jsem si vybrala program Geneious 9.1.2 (Biomatters Ltd., Nový Zéland). Pro získání finální sekvence v celé délce amplifikovaného úseku bylo nutné spojit 5' a 3' konec sekvencí. V ojedinělých případech, kdy byla sekvence dostatečně dlouhá a kvalitní, nebylo potřeba získat sekvenci z opačného směru a vytvářet kontig . Program jsem nastavila tak, ţe v zadané sekvenci automaticky nalezl a ořezal primery. V případech, kdy program nenalezl v sekvenci primer, podle kterého by mohl ořez provést (tj. konec sekvence nebyl kvalitní), provedla jsem ořezání manuálně na základě vizuálního zhodnocení celého úseku. Důsledkem toho byla sekvence uměle zkrácena, coţ zhoršilo její kvalitu. Drobné úpravy automaticky vytvořeného kontigu v podobě vymazání nevhodných mezer jsem po vizuálním zhodnocení sekvence provedla také manuálně. Výsledné upravené sekvence byly ořezány z obou stran a připraveny k dalšímu zpracování. Jejich délka se pohybovala mezi 492-673 bázemi.

2.2.7 Editace sekvencí a fylogenetické analýzy

Všechny nově získané sekvence COI byly alignovány společně se sekvencemi molekulárních klonů druhů rodu Vannella z publikace Nassonova et al. (2010) a sekvencemi Paravannella minima získaných z databáze GenBank (NCBI) . Alignment byl získán pomocí programu MAFFT 7.017 (Katoh & Standley 2013) v přednastaveném reţimu, který byl nainstalován jako součást platformy Geneious. Ve vzniklém alignmentu byly všechny sekvence zkráceny podle sekvencí Nassonova et al. (2010) na délku 492-495 bází. Vzhledem k existenci RNA editace u skupiny Amoebozoa, poprvé zaznamenané u Physarum polycephalum (Bass 2001, Byrne et al.

2002, Byrne & Gott 2002, Miller et al. 1993, Takano et al. 2001) a prokázané i u Vannella spp. (Nassonova et al. 2010), bylo nezbytné sekvence získané z genomové DNA upravit, aby bylo moţné je přeloţit do sekvence aminokyselin (AMK). Podle Nassonova et al. (2010) byla editace nutná na 141. pozici zkrácených sekvencí, konkrétně se jednalo o inzerci cytosinu (C). Kromě této pozice se rozdíly objevily i na jiných pozicích v sekvencích, které narušovaly čtecí rámec. Tato místa byla upravena podle alignmentu a podle situace u ostatních sekvencí, v některých případech i degenerovanými kódy pro nukleotidy. U takto upravených sekvencí byla provedena kontrola čtecího rámce podle alternativního „Mold Protozoan Mitochondrial“ genetického kódu (Pritchard et al. 1990).

První dataset obsahoval (a) všechny nově získané sekvence, tj. sekvence PCR produktů (z 54 kmenů) a molekulárních klonů (185 molekulárních klonů ze 37 kmenů), (b) všechny dostupné sekvence pro Vannella spp. přístupné v databázi GenBank (71 molekulárních klonů z 11 kmenů), (c) 3 sekvence molekulárních klonů Parvannella minima, (d) 8 sekvencí molekulárních klonů Cochliopodium spp., (e) 5 sekvencí Pythium spp. a (f) 3 sekvence Phytophthora spp. Tento dataset byl alignován na základě sekvencí aminokyselin (AMK) podle „Mold Protozoan Mitochondrial“ genetického kódu za pouţití programu MAFFT. K fylogenetické analýze byla pouţita metoda maximální věrohodnosti, která byla provedena v programu FastTree 2.1.5 (Price et al. 2009) za pouţití obecného časově-reverzibilního modelu (GTR). První analýza byla určena k ověření pozice houbových organismů Pythium a Phytophthora vůči studovaným organismům a předběţnému ověření identity zpracovávaných sekvencí.

Druhý dataset sekvencí genu pro COI obsahoval (a) všechny mnou nově získané sekvence, sekvence PCR produktů (z 54 kmenů) a molekulárních klonů (185 molekulárních klonů ze 37 kmenů), (b) všechny dostupné sekvence pro Vannella spp. v databázi GenBank (71 molekulárních klonů z 11 kmenů), (c) 3 sekvence molekulárních klonů Parvannella minima a (d) 8 sekvencí molekulárních klonů Cochliopodium spp. pouţitých jako outgroup. Alignment aminokyselinových sekvencí podle „Mold Protozoan Mitochondrial“ genetického kódu byl proveden za pouţití

33 programu MAFFT. K fylogenetické analýze byla vyuţita metoda maximální věrohodnosti s pouţitím programu FastTree 2.1.5 (Price et al. 2009) a GTR.

Třetí dataset sekvencí genu pro COI obsahoval (a) nově získané sekvence všech 90 kmenů (PCR produkty a výběr molekulárních klonů), které byly úspěšně amplifikovány (b) výběr 12 sekvencí Vannella spp. získaných z databáze GenBank, (c) 1 sekvenci Paravannella minima z databáze GenBank a (d) 7 skevencí Cochliopodium spp. z databáze GenBank slouţících jako outgroup. Alignment sekvencí AMK podle „Mold Protozoan Mitochondrial“ genetického kódu byl proveden v programu MAFFT. Vzniklý alignment byl podroben testování programem jModelTest2 (Darriba et al. 2012), který na základě Akaikeho informačního kritéria (AIC) vybral vhodný model pro zadaná data. Fylogenetická analýza podle modelu TIM3+I+G vybraného programen jModelTest2, byla provedena v programu PhyML (Guindon et al. 2010), který byl spuštěn jako součást platformy Geneious.

Vzniklý fylogenetický strom byl editován v programu Adobe Illustrator (Adobe Systems Incorporated, USA) a CorelDraw (Corel Corporation, Kanada).

3 Výsledky

Fragment COI genu jsem úspěšně amplifikovala ze vzorků DNA, které reprezentovaly 90 kmenů vannellidních améb, ze vzorků 8 kmenů se amplifikace nezdařila. Neúspěšné amplifikace redukovaly počet kmenů pouţitelný pro další práci ve skupině (a) z 56 na 50 (s výsledným zastoupením 41 kmenů rodu Vannella, 8 kmenů rodu Ripella a 1 kmene rodu Lingulamoeba). Skupina kmenů (b) jejichţ rodové zařazení nebylo předem určeno analýzou sekvencí 18S rDNA byla redukována na 40. U kmenů, u nichţ nedošlo k amplifikaci, jsem zatím nezjistila ţádný důvod neúčinnosti primerů.

Délka sekvencí PCR produktů se před hrubým opracováním v programu Geneious pohybovala mezi 650 – 800 bázemi. Celkově se mi podařilo spojit sekvence PCR produktů reprezentujících 63 kmenů (Tabulka 3). Po jejich editaci však bylo na finální analýzy moţné pouţít pouze 54 z nich, protoţe nebylo moţné je přeloţit do aminokyselinové sekvence.

Při amplifikaci COI došlo v několika případech k chybnému nasednutí primerů a tvorbě nespecifických PCR produktů. Při ověřování délky PCR produktů agarózovou elektroforézou jejich délka přibliţně odpovídala hledaným sekvencím COI, takţe nebyly okamţitě vyřazeny. Nespecifičnost reakce byla rozeznána aţ po sekvenaci (sekvence byly nakonec delší nebo naopak kratší neţ ţádoucí COI) a zároveň vţdy potvrzena při ověřování identity v programu BLAST. Výsledkem ověřování těchto sekvencí v programu BLAST byly většinou sekvence pocházející z celogenomového sekvenování, tj. genů jiných neţ je COI a jejichţ zařazení bylo často označeno pouze jako předpokládané.

Mezi získanými sekvencemi molekulárních klonů se objevily i takové, které délkou i identitou odpovídaly sekvencím genu pro COI, bylo moţné je přeloţit do aminokyselinové sekvence, ale ověření v BLASTu ukázalo, ţe se jedná o bakteriální sekvence z celogenomového sekvenování (rody Methanococcus, Shewanella, Colwellia, Pseudoalteromonas, Legionella), u nichţ bylo poznamenáno, ţe se jedná o domnělé 35 sekvence COI. Celkově se pomocí „folmerových“ primerů amplifikovaly úseky domnělé bakteriální COI z jednoho molekulárního klonu u kaţdého z 8 kmenů vannellidních améb. Jednalo se o kmeny CSPE, JAMX1, ISOKONT, PET1V, PET1Z, SH3, SMAS3 a SMA13V. Společným rysem jmenovaných kmenů je původ v mořském prostředí. Sekvence těchto jednotlivých klonů byly z analýzy vyřazeny, ale díky většímu počtu molekulárních klonů u kaţdého z kmenů, nebylo zastoupení kmenů ve finální analýze omezeno.

Častým jevem při ověřování nejvyšší shody se sekvencemi vannellidních améb pomocí algortimu BLAST bylo vyhledání sekvencí nejbliţších podobných organismů, které ale neodpovídaly reálnému zařazení studovaných kmenů améb. V řadě případů (Tabulka 3) BLAST přiřadil k dotazovaným sekvencím jako nejpodobnější sekvence Pythium spp. a Phytophthora spp., houbové organismy řazené mezi Oomycota. O nesprávnosti tohoto přiřazení jsem se přesvědčila provedením předběţné fylogenetické analýzy (vzniklé z prvního datasetu, výsledek není v práci pro rozměrnost graficky prezentován). Ve výsledném fylogenetické analýze vytvořily sekvence Pythium spp. a Phytophthora spp. samostatnou linii, která nenarušila monofylii vannellidních améb.

Pro ověření variability COI genu jsem u 37 kmenů připravila z amplifikovaných produktů celkem 185 klonů (Tabulka 4), pro jeden kmen v počtu 1 aţ 12.

Tabulka 4 shrnuje výsledek alignmentu všech klonů kaţdého ze zařazených kmenů (37 celkem) s uvedením vzájemné podobnosti procentuálním vyjádřením identických nukleotidových pozic (Identical sites). Nejniţší podobnost vykazovaly molekulární klony kmene AB06 (84,4%). Naopak 100% shoda byla prokázána u kmenů BA01, GERL41, JAMX1, PET1V a T02. Tyto poměrně nízké heterogenity v rámci kmenů byly potvrzeny i fylogenetickými analýzami. Molekulární klony jednotlivých kmenů (včetně AB06) se řadily pospolu, k jejich promíchání docházelo ojediněle, a to pouze v případě sekvenčně identických kmenů.

Tabulka 3. PCR produkty jednotlivých kmenů, jejich sekvenčně nejpodobnější organismy vyhledané pomocí algoritmu Somewhat similar sequences (blastn) v programu BLAST s přístupovými čísly k sekvencím a procentuální mírou shody a překryvu.

Překryv Délka/ Přístupové Shoda Kód kmene1 Nejvyšší shoda v GenBank druh (kmen) (Query počet bází číslo (Ident) cover) 805* 664 Pythium sp. HQ708847 84% 84% 4354* 607 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 83% 80% 4362V/II* 611 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 83% 80% 4432/I* 623 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 83% 78% A368 541 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354168 82% 91% ACN1* 631 Pythium undulatum HQ708987 82% 87% AGDI* 643 Vannella simplex (CCAP 1589/3) GQ354154 82% 68% BA01* 492 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354168 82% 97% BAK1 532 Parvamoeba rugata (CCAP 1556/1) JN202434 81% 93% BEN3V* 673 Pythium canariense JX397976 82% 92% BOTM 601 Vannella simplex (L4C) GQ354191 83% 72% CAME 635 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354142 86% 77% CH11* 615 Vannella simplex (L4C) GQ354191 84% 70% CH88/I* 633 Vannella simplex (L4C) GQ354191 84% 68% CHN4* 630 Pythium multisporum HQ708744 80% 99% CHOR* 644 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354168 84% 76% CVG5S* 618 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354164 86% 75% CVG8* 607 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354168 84% 78% ELH1* 663 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 84% 74% ELH3* 663 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 84% 74% ELH4 598 Vannella calycinucleolus (CCAP 1565/6) GQ354136 85% 79% ELH5* 662 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354164 84% 74% ELH6* 617 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354145 82% 79% ELH7* 662 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354164 74% 84% EXNP* 619 Vannella simplex (CCAP 1589/3) GQ354154 71% 82% F24* 631 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354142 78% 95% GAU21* 663 Pythium sp. FR774195 80% 82% GERB* 618 Pythium violae HQ708998 82% 99% GERL14* 612 Pythium kadovanense KP938425 81% 80% GERL34* 609 Pythium violae HQ708998 82% 99% ISCR2* 601 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 82% 83% JAMF2* 639 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 68% 83% JAMX4* 625 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 79% 85% JAMX6* 626 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 79% 85% JAMX7* 626 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 78% 85% JRF2* 620 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354142 79% 95% Kont2Pe* 602 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 79% 86%

Tabulka 3. Pokračování Překryv Délka Přístupové Shoda Kód kmene1 Nejvyšší shoda v GenBank druh (kmen) (Query /počet bází číslo (Ident) cover) MSPE/I 643 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354166 76% 94% PMCH/I* 624 Vannella bursella (CCAP 1565/10) GQ354148 76% 84% PS2/I* 651 Pythium sp. HQ708859 97% 82% R/II* 631 Pythium mamillatum GU071819 98% 79% RSH1* 664 Pythium sulcatum HQ708881 99% 84% RSSF/I* 642 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 76% 83% S4M24/I* 602 Vannella bursella (CCAP 1565/10) GQ354148 78% 84% S4M30* 586 Vannella bursella (CCAP 1565/10) GQ354148 89% 100% S7M35/I* 639 Vannella bursella (CCAP 1565/10) GQ354148 74% 84% SBF5-7* 596 Pythium sp. HQ708859 98% 83% SEDFS* 547 Vannella simplex (Geneva) GQ354199 88% 83% SH8* 663 Pythium sp. KT247387 91% 80% SMA7V/I* 642 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354142 76% 87% SMA13V/I 645 Vannella persistens (CCAP 1589/13) GQ354142 76% 87% SMA26/I* 646 Vannella calycinucleolus (CCAP 1565/6) GQ354136 76% 100% SS8FJ1/I 663 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 74% 84% ST4F/I* 663 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 74% 84% SUM1S/I* 637 Pythium irregulare GU071865 97% 83% SYM43/I* 536 Vannella arabica (CCAP 1589/7) GQ354168 88% 84% T02 603 Vannella danica (CCAP 1589/17) GQ354159 81% 82% VV* 639 Vannella simplex (L4C) GQ354191 67% 84% W181G* 664 Pythium heterothallicum KT692894 95% 82% WA6A* 616 Vannella calycinucleolus (CCAP 1565/6) GQ354136 80% 100% WA6F* 616 Vannella calycinucleolus (CCAP 1565/6) GQ354136 80% 100% ZER12* 631 Pythium sp. HQ708859 83% 99% ZER14* 632 Pythium aphanidermatum HQ708485 84% 97% 1 PCR produkty kmenů pouţitých ve finální analýze označeny *

Tabulka 4. Molekulárně klonované kmeny, sekvenčně nejpodobnější organismy vyhledané pomocí algoritmu Somewhat similat sequences (blastn) v programu BLAST s přístupovými čísly k sekvencím a procentuální mírou shody a překryvu.

Překryv Délka Počet klonů Nejvyšší shoda v GenBank Přístupové Shoda Kód kmene (Query (bp) (Identita)* druh (kmen) číslo (Ident) cover) A368 663-664 4 (99,4%) Vannella arabica GQ354168 82% 74% A503 663 5 (99,8%) Vannella arabica GQ354168 82% 74% AB03 488-662 2 (99,8%) Vannella persistens GQ354180 94% 74% AB06 662-663 12 (84,4%) Vannella persistens GQ354142 95% 74% ACN1 658 5 (99,8%) Pythium brevec FR774196 80% 82% BA01 663 3 (100%) Vannella arabica GQ354168 82% 74% BAK1 657-658 10 (99,2%) Pythium sp. HQ708770 78% 99% BOTM 660 12 (99,4%) Vannella simplex GQ354191 83% 65% CAME 663-664 6 (98,6%) Vannella persistens GQ354142 86% 74% CSPE1 652-714 2 (99,4%) Pythium attrantheridium GU071826 80% 99% DP13/I 715 1 (-) Phytophthora personii KP749431 82% 89% ELH6 443-663 5 (99,2%) Pythium mamillatum GU071819 80% 99% Vannella persistens GQ354145 83% 82% GAU6 662- 663 4 (99,2%) Vannella bursella GQ354148 99% 74% GERL41 660-711 3 (100%) Vannella danica GQ354164 83% 65% GR01 661 4 (99,4%) Vannella simplex GQ354199 83% 74% Pythium aff. perplexum HQ708474 80% 99% ISCRH 312- 664 4 (99,6%) Vannella danica GQ354159 84% 74% ISOKONT 654-714 2 (99,6%) Phytophthora sp. GU799672 82% 85% Vannella danica GQ354164 86% 69% JA M1 518- 663 4 (99,6%) Vannella danica GQ354159 85% 74% JAMX1 651-663 2 (100%) Vannella danica GQ354164 86% 70% JRM2 663 3 (99,6%) Pythium balticum KT692820 82% 92% LITHOV 663-664 7 (99,4%) Vannella simplex GQ354155 85% 74% Phytophthora europaea HQ708293 75% 74% MCH 713- 714 3 (99,8%) Pythium mamillatum GU071819 82% 99% MSPE/I 662-663 12 (98,2%) Vannella arabica GQ354166 94% 74% PET1V 640-664 7 (100%) Vannella danica GQ354159 85% 73% PET1Z 652-663 7 (99,4%) Vannella danica GQ354159 86% 69% PHILM 661 6 (99%) Vannella arabica GQ354168 84% 71% Pythium canariense HQ708528 80% 99% PHILV 663 5 (99,6%) Vannella simplex GQ354154 82% 66% RT3TT 660 11 (99,4%) Vannella simplex GQ354191 84% 65% S6M33 661-712 3 (99,8%) Pythium canariense JX397976 81% 94% Vannella arabica GQ354168 84% 71% SH3 652- 663 1 ( -) Vannella simplex GQ354199 85% 74% SMA13V/I 663 6 (98,6%) Vannella simplex GQ354199 85% 74% Vannella persistens GQ354142 86% 74% SMA30 663- 714 3 (99,8%) Vannella persistens GQ354142 86% 69% SMAS2 663 6 (98,6%) Vannella arabica GQ354168 82% 74% SMAS3 663 5 (99,4%) Pythium spinosum HQ708835 80% 98%

Tabulka 4. Pokračování Překryv Délka Počet klonů Nejvyšší shoda v GenBank Přístupové Shoda Kód kmene (Query (bp) (Identita)* druh (kmen) číslo (Ident) cover) SS8FJ1/I 662-714 3 (99,8%) Vannella simplex GQ354154 84% 74% Pythium sp. HE862402 81% 81% SV136A 663- 664 4 (99,4%) Vannella danica GQ354164 83% 74% T02 714 3 (100%) Vannella simplex GQ354154 82% 61% * identita nukleotidových pozic mezi sekvencemi molekulárních klonů

Z celkového počtu 90 nově získaných sekvencí pouţitých ve finální analýze bylo (a) 57 sekvencí upraveno podle Nassonova et al. 2010 inzercí cytosinu na 141. pozici zkrácené skevence, (b) 29 sekvencí vyţadovalo kromě inzerce zmíněné ve výše uvedené studii více bodových úprav a (c) 4 sekvence nevyţadovaly pro překlad do aminokyselinové sekvence ţádnou korekci.

Finální fylogenetická analýza rozdělila třetí dataset s 52% bootstrapovou podporou na dvě hlavní linie (Obrázek 1): (a) na linii obsahující sekvence Vannella spp. (dříve determinované podle sekvence 18S rDNA) a sekvence kmenů, k nimţ nejsou sekvence 18S rDNA zatím k dispozici; (b) linii obsahující převáţně sekvence Ripella spp. (dříve determinované podle 18S rDNA), sekvenci Lingulamoeba sp. a Paravannella minima. Velmi zvláštní pozici zaujala sekvence kmene ACN1 (determinovaná jako Vannella sp. podle sekvence 18S rDNA), která je se 100% bootstrapovou podporou sesterská k oběma hlavním liniím (Obrázek 1).

Linie rodu Vannella tvoří několik clusterů s různou bootstrapovou podporou (7- 100%). Sekvence kmenů SMA26, WA6A a WA6F se seskupily společně s V. calycinucleolus se 100% podporou a podobně se také větví sekvence kmene GAU6 společně s V. bursella s bootstrapovou podporou 87% (Obrázek 1). Analýza odhalila několik dalších, velmi dobře bootstrapově podpořených dvojic (GR01 a ISCR2; ELH5 a ELH7; CHN4 a MCH; PET1V a PET1Z; ELH1 a ELH3; GERL41 a JAMF2) a trojici (4354, 4432 a 4362V). Clustery obsahující více neţ tři kmeny (4–7) a s vysokou bootstrapovou podporou (98–99%) jsem označila názvy A-G. Cluster A obsahuje sekvence sedmi kmenů (CBG8, S6M33, PHILM, PMCH, S4M24, S7M35, SYM43) smíšeného původu (Španělsko, Tasmánie, Itálie, Chorvatsko), které se vzájemně liší aţ 3 nukleotidovými pozicemi ve studovaném úseku COI. Cluster B obsahuje sekvence 4 kmenů (SS8FJ1, ST4F, CSPE1 klon 1 a klon 2, ISCRH) smíšeného původu (Irsko, Tasmánie, Česká republika, Španělsko), které se vzájemně liší 1-4 nukleotidovými pozicemi. Cluster C obsahuje sekvence 6 kmenů (AGDI, S4M30, PHILV, EXNP, T02, RSSF) pocházející z Tasmánie a Španělska, které se liší aţ 13 nukleotidovými pozicemi. Vyloučením kmene RSSF by se vzájemný rozdíl mezi sekvencemi sníţil

41 maximálně na 3 nukleotidové pozice. Cluster D obsahuje 4 polární kmeny (A368, SMAS2, A503, BA01) z Arktidy a Antarktidy, které se vzájemně liší aţ 3 nukleotidovými pozicemi. Cluster E obsahuje sekvence 8 kmenů (JAMX4, JAMX6, JAM1, ISOKONT, Kont2Pe, JAMX1, JAMX7, CVG5S) smíšeného původu (Jamajka, Itálie, Francie), které se vzájemně liší aţ 3 nukleotidovými pozicemi. Cluster F obsahuje 6 kmenů (SH3, SMA13V, SMA7V, SMA30, CAME, LITHOV) smíšeného původu (UK, Španělsko, Kamerun, Chorvatsko), které se vzájmeně liší aţ 40 nukleotidovými pozicemi. V případě vyloučení kmene LITHOV by se vzájemný rozdíl sníţil maximálně na 9 nukleotidových pozic. Cluster G obsahuje sekvence 5 kmenů (CH11, CH88, RT3TT, BOTM, VV) různého původu (Čína, Česká republika, Belize, Německo), které se vzájmeně liší aţ 22 nukleotidovými pozicemi. Vyloučením kmene VV by se vzájemný rozdíl sníţil nejvýše na 3 nukleotidové pozice. Posledním označeným clusterem je VS (Obrázek 1), který sdruţuje sekvence sedmi kmenů Vannella simplex avšak s velmi nízkou bootstrapovou podporou (34%) a velkými párovými rozdíly (aţ 41 pozic mezi kmeny CCAP 1589/3 a Ladoga).

Linie obsahující kmeny zařazené na základě 18S rDNA do rodů Ripella, Lingulamoeba a Paravannella (Obrázek 1) tvoří společný cluster se sedmi kmeny dříve přiřazenými do rodu Ripella a dosud nezařazenými kmeny ZER12, ZER14 a SBF5-7. Navíc tento cluster zahrnuje i kmeny GERB a BEN3V, které byly na základě 18S rRNA identifikovány jako Vannella sp. Bazální pozici vůči všem „Ripella spp.“ má Lingulamoeba sp. RSH1 (82% bootstrapová podpora). Sesterskou pozici k „Ripella spp.“ a Lingulamoeba sp. (kmen RSH1) zaujímá Paravannella minima (44% bootstrapova podpora).

Vliv fylogenetické pozice jednotlivých kmenů na rozsah úprav souvisejících s RNA editací je představen na Obrázku. 2. Sekvence kmenů ZER12, ZER14, W181G a BEN3V nevyţadovaly korekci RNA editace a ve výsledném fylogenetickém stromě (Obrázek 2) se začlenily výhradně do linie slučující kmeny rodu Ripella spp. Sekvence, u nichţ postačovala editace podle Nassonova et al. (2010), jsou promíchané se sekvencemi vyţadující větší rozsah oprav souvisejících s RNA editací.

Původ izolátu, ze kterého pocházely studované sekvence je znázorněn na Obrázku 3. Ze stromu je partné, ţe kmeny získané z tkání ryb jsou rozptýleny do všech linií, stejně tak kmeny získané z tkání bezobratlých. Rozloţení kmenů v rámci stromu neupozorňuje na ţádnou vazbu na ţivočišný původ.

Na základě typu biotopu, ze kterého pocházely izoláty studovaných kmenů, se sekvence rozdělily na dvě zřetelně oddělené skupiny mořských a sladkovodních kmenů (Obrázek 4). Výjimkami jsou sladkovodní kmen BA01, který se zařadil mezi kmeny mořské a mořské kmeny R, RSH a ACN1, které se začlenily mezi kmeny sladkovodní.

Do analýz bylo zahrnuto 13 nově sekvenovaných kmenů pocházejících z polárních oblastí, konkrétně Arktidy a Antarktidy (Obrázek 5). Tři z těchto kmenů (JRM2, SMAS3 a SV136A) jsou ve vzniklém stromě rozptýleny do různých linií, ostatní se sloučily do tří samostatných skupin. První skupinu tvoří kmeny PET1V a PET1Z, taktéţ s podporou 100%. Oba kmeny pocházejí ze Svalbardu (Arktida) a byly izolovány ze stejného materiálu. Zbylé dvě skupiny obsahují kmeny z obou polárních oblastí. První oddíl slučuje kmeny BA01, A503, SMAS2 a A368 se 100% bootstrapovou podporou. Zbývající polární kmeny AB03, AB06, JRF2 a F24 se zařadily do třetí samostatné skupiny s 81% bootsrapovou podporou

Obrázek 1. Fylogenetická rekonstrukce vztahů mezi kmeny rodu Vannella a dalšími zástupci skupiny Vannellida na základě srovnávání sekvencí genu pro COI metodou maximální věrohodnosti. Čísla u jednotlivých uzlů představují bootstrapové podpory44 (zobrazeny pouze hodnoty vyšší neţ 50%).

Obrázek 2. Fylogenetická rekonstrukce vztahů mezi kmeny rodu Vannella a dalšími zástupci skupiny Vannellida na základě srovnávání sekvencí genu pro COI metodou maximální věrohodnosti. Strom znázorňuje rozsah úprav souvisejících s RNA editací. Růţově jsou zvýrazněny sekvence upravené podle Nassonova et al.2010, modrou barvou sekvence vyţadující více úprav a ţlutě označené sekvence nevyţadovaly ţádnou korekci RNA editace.

Obrázek 3. Fylogenetická rekonstrukce vztahů mezi kmeny rodu Vannella a dalšími zástupci skupiny Vannellida na základě srovnávání sekvencí genu pro COI metodou maximální věrohodnosti. Strom znázorňuje rozloţení kmenů izolovaných z rybích tkání (zelená), z tkání bezobratlých ţivočichů (červená) a kmeny izolované z environmentálních vzorků. U šedě značených kmenů není původ izolátu znám.

Obrázek 4. Fylogenetická rekonstrukce vztahů mezi kmeny rodu Vannella a dalšími zástupci skupiny Vannellida na základě srovnávání sekvencí genu pro COI metodou maximální věrohodnosti. Strom barevně znázorňuje rozloţení kmenů izolovaných z mořského prostředí (modrá) a kmenů sladkovodních (červená). Fialová barva označuje kmen izolovaný z brakických vod.

Obrázek 5. Fylogenetická rekonstrukce vztahů mezi kmeny rodu Vannella a dalšími zástupci skupiny Vannellida na základě srovnávání sekvencí genu pro COI metodou maximální věrohodnosti. Oranţovou barvou jsou zvýrazněny kmeny původem z polárních oblastí.

4 Diskuze

V současné době je zřejmé, ţe identifikace volně ţijících améb zaloţená výhradně na porovnávání morfologických znaků není, zejména v případě tzv. nahých améb, dostačující (Nassonova et al. 2010, Pawlowski et al. 2012, Sims et al. 2002, Smirnov et al. 2007). Nedostatek viditelných znaků společně s předpokládanou ohromnou diverzitou těchto organismů podporuje snahu o nalezení vhodných molekulárních markerů (Pawlowski et al. 2012). Molekulární diverzita améb byla doposud studována především na základě 18S rDNA (Dyková et al. 2005a, Dyková & Fiala 2003, Fahrni et al. 2003, Heger et al. 2011, Lahr et al. 2011, Lara et al. 2008, Nassonova et al. 2010, Nikolaev et al. 2005, Visvesvara et al. 2007). V některých případech ale 18S rDNA nedokáţe rozlišit tradičně (na základě morfologie) uznávané druhy améb, např. Vannella simplex, Cochliopodium spp. (Smirnov et al. 2007, Tekle 2014). Ve snaze najít vhodný marker, který by jednoznačně vysvětloval mezidruhové vztahy améb, provedl autorský kolektiv Nassonova et al. (2010) analýzu améb rodu Vannella za pouţití různých molekulárních markerů (18S rDNA, ITS, COI). Nejvhodnějším markerem pro skupinu vannellidních améb označili tito autoři, na základě provedených analýz, fragment genu pro COI hojně vyuţívaný u mnohých eukaryotických organismů jako DNA barcode. Podle těchto autorů, můţe být COI ideálním barcodem i pro skupinu nahých volně ţijících améb Vannellida. Na základě výsledků získaných v diplomové práci však nemohu jednoznačně prohlásit, ţe navrhovaná sekvence genu pro COI je ideálním barcodem pro zástupce skupiny Vannellida. Ideální barcode by měl podle Hebert et al. (2003) identifikaci druhů usnadnit a celý proces v první řadě urychlit. V průběhu zpracovávání diplomové práce se však ukázalo, ţe pro získání kvalitních sekvencí je ve většině případů nutné přistoupit ke klonování a u získaných sekvencí je třeba provést úpravy RNA editace, bez kterých není moţný překlad do sekvencí AMK. Tento zdlouhavý proces, byť zakončený úspěšnou analýzou, nesplňuje kritéria DNA barcodingu. Moţnou alternativou pro identifikaci améb na úrovni druhu je dvoukroková analýza představená skupinou ProWG (Pawlowski et al. 2012) nebo hledání jiného markeru, který by kritériím barcodingu vyhovoval lépe.

K amplifikaci úseku genu pro COI jsou vyuţívány „univerzální“ primery LCO1490 a HCO2198 (Folmer et al. 1994). Podle kolektivu Nassonova et al. (2010) je pouţití zmíněných primerů u skupiny vannellidních améb vyhovující. Z výsledků diplomové práce je však zřejmé, ţe amplifikace pomocí kombinace univerzálních primerů byla úspěšná pouze v 91% všech pokusů o namnoţení studovaného úseku. Poměrně často docházelo k chybnému nasednutí primerů a tvorbě nespecifických produktů. Zaznamenala jsem také 8 případů, kdy získaná sekvence amplifikovaná těmito eukaryotickými primery identitou odpovídala bakteriální COI. Jako problematické tyto primery označuje například i Kudryavtsev (2014), který musel pro amplifikaci úseků COI u Paravannella minima pouţít alternativní reverzní primer, nebo Heger et al. (2011) jeţ byl nucen u skupiny skořepatých améb pouţít zcela jinou kombinaci primerů.

Existence RNA editace byla prokázána u kinetoplastidů kolektivem Benne et al. jiţ v roce 1986, kde se projevila inzercí/delecí uridinu. Posttranskripční úpravy se vyskytují u různých skupin organismů v různých modifikacích (Simpson et al. 2003). Mohou se projevit pouhou substitucí nukleotidové báze (Seeburg 2002) nebo inzercí či delecí nukleotidů (Stuart & Panigrahi 2002). U virů bylo jako důsledek RNA editace potvrzeno přidávání dalších nukleotidů na syntetizující se konec vznikajícího transkriptu (Thomas et al. 1988, Vidal et al. 1990, Volchkov et al. 2001). V rámci skupiny Amoebozoa byla RNA editace potvrzena například u Physarum polycephalum (Bass 2001, Byrne et al. 2002, Byrne & Gott 2002, Miller et al. 1993, Takano et al. 2001) či Acanthamoeba castellanii (Lonergan & Gray 1993, Lohan & Gray 2004, Price & Gray 1999). U vannellidních améb tento fenomén předpokládali i Nassonova et al. (2010) a v sekvencích stanovili inzerci C na domnělé 141. pozici sekvence fragmentu COI u všech studovaných druhů rodu Vannella. Zmíněná inzerce cytosinu byla potvrzena i u většiny nově sekvenovaných kmenů. U sekvencí 28 kmenů bylo nutné provést úpravy RNA editace v širším rozsahu, vţdy však v podobě singletonů. Pouze u 5 kmenů nevyţadoval překlad do sekvence AMK ţádné úpravy nukleotidových bází (Obrázek 2). Čtyři z těchto kmenů se zařadily mezi améby rodu Ripella a pátým kmenem byla Paravannella minima, u které byla existence RNA editace vyvrácena jiţ

50 dříve (Kudryavtsev 2014). U sekvecí COI ostatních rodů améb nebyla existence RNA editace zatím potvrzena ani vyvrácena. Avšak při procházení sekvencí COI vloţených do databáze GenBank je často pozorovatelným jevem absence jejich překladu do AMK sekvece. Tyto sekvence jsou ve většině případů označovány jako sekvence podobné sekvenci COI (tj. „COI-like“ popř. „similar to COI“) s poznámkou o předpokládané nutnosti úprav RNA editace. Tyto poznámky jsem konkrétně zaznamenala u skořepatých améb rodu Hyalosphaenia, (Fiz-Palacios et al. 2014, Gomaa et al. 2014, Heger et al. 2013) a Nebela (Kosakyan et al. 2012, Kosakyan et al. 2013).

Paravannella minima ve finální fylogenetické analýze zaujala sesterskou pozici k ostatním studovaným Vannellida, podobně jako v práci Kudryavtsev (2014) však s nízkou bootstrapovou podporou. Nečekanou pozici zaujal kmen ACN1, který se v analýze zařadil na bázi ostatních Vannellida s vysokou bootstrapovou podporou. Vzhledem k tomu, ţe byl tento kmen dříve zařazen na základě 18S rDNA do rodu Vannella bude ţádoucí provést revizi a stanovit jeho reálnou pozici v taxonu.

Analýza odhalila v rámci linie Vannella sp. několik dvojic a trojici s vysokou bootstrapovou podporou (99-100%). Sloučení dvojic ELH5 a ELH7; ELH1 a ELH 3; PET1V a PET1Z není překvapující, jelikoţ se jedná o kmeny pocházející totoţného materiálu. Ostatní dvojice kmenů byly sloučeny navzdory odlišnostem v původu nebo lokalitě sběru. Mořské kmeny CHN4 a MCH pocházejí z různých geografických lokalit (USA, Chorvatsko) a liší se i původ materiálu, ze kterého byly izolovány (MCH byl izolován z plţe, CHN4 pochází z environmentálního vzorku), dvojice mořských kmenů GR01 a ISCR2 z environmentálních vzorků se liší geografickým původem (Řecko, Španělsko), kmeny GERL41 a JAMF2 spojuje sladkovodní původ, avšak lokalitou (Německo, Jamajka) i charakterem materiálu (rybí ţábry, detrit) se odlišují, nicméně JAMF2 pochází z detritu na dně jezírka osazeného koi kapry. Trojice sladkovodních kmenů 4354, 4361V a 4432 sloučených do jednoho clusteru pochází z povodí Vltavy a rybníku Podřezaný na území Jiţních Čech a všechny tři kmeny byly izolovány z rybích tkání (ţábry, mozek).

Při zameření se na typ biotopu, ze kterého kmeny pocházejí, nabídla analýza dvě zřetelně oddělené linie sdruţující zvlášť sladkovodní a mořské kmeny. Výjimkou byla Lingulamoeba sp. (kmen RSH1) a kmen R, které se zařadili do linie sladkovodních améb, na druhé straně se sladkovodní polární kmen BA01 zařadil mezi kmeny mořské. Postavení sladkovodního kmene BA01 je poměrně zajímávé, jelikoţ se jedná o kmen izolovaný ze sedimentu na dně kryokonitu v ledovci Nordenskiöldbreen na Svalbardu v Arktidě. Vznik kryokonitových děr je podmíněn zahříváním prachových částic zachycených na povrchu ledovce. Díky spadu jsou tato místa na ledovci tmavší, lépe absorbují sluneční záření a dochází zde k rychlejšímu tání. Kryokonity jsou unikátním prostředím obsahujícím kapalnou vodu inokulovanou materiálem ze spadových částic a rozpouštějícího se ledovce (Christner et al. 2003). Právě spad smytý z povrchu ledovce by mohl být moţným vysvětlením podivného zařazení sladkovodního kmene mezi mořské. Částice, které ulpí na povrchu ledovce, pocházejí z jeho okolí, ve kterém se v tomto v tomto případě nachází i moře, jenţ mohlo být původním habitatem améb kmene BA01. Jiţ Schaeffer (1926) uvádí, ţe některé améby mají mimořádně širokou ekologickou valenci, zejména z pohledu schopnosti přeţití v prostředí s různou salinitou.

5 Závěr

V diplomové práci jsem připravila doposud největší soubor sekvencí genu pro cytochrom c oxidázu I u skupiny vannellidních améb. Stávající dataset byl obohacen o 240 sekvencí COI reprezentujících 90 kmenů.

Navzdory skutečnosti, ţe práce vycházela z mnohem většího souboru dat neţ první publikace na toto téma, neumoţňují výsledky diplomové práce jednoznačně zhodnotit praktické vyuţití COI pro analýzy směřující k určení druhů ve skupině Vannellida. Vyslovení striktního závěru ohledně případného nahrazení 18S rDNA v roli molekulárního markeru sekvencí genu pro COI komplikuje kromě nejednoznačného rozlišení studovaných améb na úrovni, v současné době uznávaných druhů, i celková náročnost procesu nezbytného pro získání kvalitních sekvencí a nutnost korekce RNA editace u sekvencí COI.

Získaná data potvrdila domněnku, ţe ani první studie o COI u skupiny Vannellida publikovaná v roce 2010 nepřinesla jednoznačné výsledky, coţ vyplývá ze skutečnosti, ţe autoři této práce nevyuţili všechny v té době dostupné vannellidní kmeny a důvod tohoto postupu nevysvětlili.

Dalšími směry, kterým by, podle mého názoru, bylo vhodné se v oblasti studia vannellidních améb, v budoucnu vydat je:

 Provedení analýzy datasetu za pouţití sekvence genu pro 18S rRNA jako molekulárního markeru a srovnání výsledků s analýzou COI sekvencí uvedenou v této práci;  Testování dalších molekulárních markerů, které by mohly potenciálně slouţit jako vhodný barcode pro skupinu Vannellida a usnadnit a urychlit sloţitou identifikaci těchto organismů zejména na úrovni druhu;  Provedení fylogenetické analýzy s rozšířeným zastoupením rodů skupiny Amoebozoa a ověřit pozici zvláštního kmene ACN1.

6 Použitá literatura

ADL S.M., SIMPSON A.G.B., LANE C.E, LUKEŠ J., BASS D., BOWSER S., BROWN M.W., BURKI F., DUNTHORN M., HAMPL V., HEISS A., HOPPENRATH M., LARA E., LE GALL L., LYNN D.H., MCMANUS H., MITCHELL E.A.D., MOZLEY-STANRIDGE S.E., PARFREY L.W., PAWLOWSKI J., RUECKERT S., SHADWICK L., SCHOCH C.L., SMIRNOV A. & SPIEGEL F.W. 2012: The revised classification of Eukaryotes. The Journal of Eukaryotic Microbiology 59: 429-493.

ADL S.M., SIMPSON A., FARMER M., ANDERSEN R., ANDERSON O., BARTA J., BOWSER S., BRUGEROLLE G., FENSOME R., FREDERICO S., JAMES T., KARPOV S., KUGRENS P., KRUG J., LANE C., LEWIS L., LODGE J., LYNN D., MANN D., MCCOURT R., MENDOZA L., MOESTRUP O., MOZLEY- STANDRIDGE S., NERAD T., SHEARER C., SMIRNOV A., SPIEGEL F. & TAYLOR M. 2005: The new higher level classification of eukaryotes with emphasis on the taxonomy of protists. Journal of Eukaryotic Microbiology 52: 399-451.

ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W. & LIPMAN D.J. 1990: Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 410-430.

ASAHIDA T., KOBAYASHI T., SAITOH K. & NAKAYAMA I. 1996: Tissue preservation and total DNA extraction from fish stored at ambient temperature using buffers containing high concentration of urea. Fisheries Science 62: 727–730.

AVISE J. 2004: Molecular markers, natural history, and evolution. Chapman & Hall, New York, 511 pp.

AVISE J., ARNOLD J., BALL M., BERMINGHAM E., LAMB T., NEIGEL J., REEB C. & SAUNDERS N. 1987: Intraspecific phylogeography: The mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematice. Annual Review of Ecology and Systematics 18: 489-522.

BARRETT R.D.H & HEBERT P.D.N. 2005: Identifying spiders through DNA barcodes. Canadian Journal of Zoology 83: 481-491.

BASS B.L. 2001: RNA editing. Oxford University Press. 187 pp.

BENNE R., VAN DEN BURG J., BRAKENHOFF J.P.J., SLOOF P., VAN BOOM J.H. & TROMP M.C. 1986: Major transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochonfdria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell 46: 819-826.

BOLIVAR I., FAHRNI J., SMIRNOV A.V. & PAWLOWSKI J. 2001: SSU rRNA- based phylogenetic position of genera Amoeba and Chaos (Lobosea, Gymnamoebia): the origin of Gymnamoebae revisited. Molecular Biology and Evolution 18: 2306-2314.

BOOTON G.C., VISVESVARA G.S., BYERS TJ., KELLY D. & FUERST P.A. 2005: Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. Journal of Clinical Microbiology 43: 1689-1693.

BOVEE E.C. 1965: An emendation of the amoeba genus Flabellula and a description of Vannella gen. nov. Transactions of the American Microscopical Society 84: 217-227.

BOVEE E.C. 1970: The lobose amebas. I. A key to the suborder Conopodina Bovee & Jahn, 1966, and descriptions of thirteen new or little known Mayorella species. Archiv für Protistenkunde 112: 178-227.

BRIBIESCA-CONTRERAS G., SOLÍS-MARÍN F.A., LAGUARDA-FIGUERAS A. & ZALDÍVAR-RIVERÓN A. 2013: Identification of echinoderms (Echinodermata) from an anchialine cave in Cozumel Island, Mexico, using DNA barcodes. Molecular Ecology Resources 13: 1137-1145.

BUCKLIN A., HOPCROFT R.R., KOSOBOKOVA K.N., NIGRO L.M., ORTMAN B.D., JENNINGS R.M. & SWEETMAN CH.J. 2010: DNA barcoding of Arctic Ocean holozooplankton for species identification and recognition. Deep-Sea Research II. 57: 40-48.

BUHAY J.E. 2009: „COI-like“ sequences are becoming problematic in molecular systematic and DNA barcoding studies. Journal of Crustacean Biology 29: 96-110.

BYRNE E.M. & GOTT J.M. 2002: Cotranscriptional editing of Physarum mitochondrial RNA requires local features of the native template. RNA 8: 1174-1185.

BYRNE E.M., STOUT A. & GOTT J.M. 2002: Editing site recognition and nucleotide insertion are separable processes in Physarum mitochondria. The EMBO Journal 21: 6154-6161.

CHRISTNER B.C., KVITKO B.H. & REEVE J.N. 2003: Molecular identification of Bacteria and Eukarya inhabiting na Antarctic cryoconite hole. Extremophiles 7: 177- 183.

CLARK C.G., KAFFASHIAN F., TAWARI B., WINDSOR J.J., TWIGG-FLESNER A., DAVIES-MOREL M.C.G., BLESSMANN J., EBERT F., PESCHEL B., LE VAN A., JACKSON C.J., MACFARLANE L. & TANNICH E. 2006: New insights into the phylogeny of Entamoeba species provided by analysis of four new small-subunit rRNa genes. International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology 56: 2235- 2239.

COSTA F.O., DEWAARD J.R., BOUTILLIER J., RATNASINGHAM S., DOOH R., HAJIBABAEI M. & HEBERT P.D.N. 2007: Biological identification through DNA barcodes: the case of the Crustacea. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 64: 272-295.

DARRIBA D., TABOADA G.L., DOALLO R. & POSADA D. 2012: jModelTest 2: more models, new heuristic and parallel computing . Nature Methods 9: 772.

DECELLE J., SUZUKI N., MAHE F., DE VARGAS C. & NOT F. 2012: Molecular phylogeny and morphological evolution of the Acantharia (Radiolaria). Protist 163: 435-450.

DE JONCKHEERE J. F. 1994: Comparison of partial SSUrDNA sequences suggests revisions of species names in the genus Naegleria. European Journal of Protistology 30: 333–341.

DE JONCKHEERE J. F. 1998: Sequence variation in the ribosomal internaltranscribed spacers, including the 5.8S rDNA, of Naegleria spp. Protist 149: 221–228.

DE JONCKHEERE J. F. 2002: A century of research on the amoeboflagellate genus Naegleria. Acta Protozoologica 41: 309-342.

DE JONCKHEERE J.F. 2004: Molecular definition and ubiquity of species in the genus Naegleria. Protist 155: 89-103.

DE JONCKHEERE J.F. & BROWN S. 2005: The identification of the vahlkampfiid amoebae by ITS sequencing. Protist 156: 89-96.

DERYCKE S., VANAVERBEKE J., RIGAUX A., BACKELJAU T. & MOENS T. 2010: Exploring the use of cytochrome oxidase c subunit 1 (COI) for DNA barcoing of free-living marine nematodes. Plos One. dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0013716.

DE VARGAS C., NORRIS R., ZANINETTI L., GIBB S.W. & PAWLOWSKI J. 1999: Molecular evidence of cryptic speciation in planktonic foraminifers and their relation to oceanic provinces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 2864-2868.

DYKOVÁ I., BOHÁČOVÁ L., FIALA I., MACHÁČKOVÁ B., PECKOVÁ H. & DVOŘÁKOVÁ H. 2005a: Fish-isolated amoebae of the genera Vannella Bovee, 1965 and Platyamoeba Page, 1969 and their phylogeny inferred from SSU rRNA gene and ITS sequences. European Journal of Protistology 41: 219-230.

DYKOVÁ I. & FIALA I. 2003: Molecular characterisation of Neoparamoeba strains isolated from gills of Scophthalmus maximus. Diseases of Aquatic Organisms 55: 11- 16.

DYKOVÁ I., KOSTKA M., WORTBERG F., NARDY E. & PECKOVÁ H. 2010: New data on aetiology of nodular gill disease in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Folia Parasitologica 57: 157-163.

DYKOVÁ I. & KOSTKA M. 2013: Illustrated Guide to Culture Collection of Free- living Amoebae. Academia, Praha, 363 pp.

DYKOVÁ I., LOM J., MACHÁČKOVÁ B. & SAWYER T.K. 1996: Amoebic infections in goldfishes and granulomatous lesions. Folia Parasitologoca 43: 81-90.

DYKOVÁ I., LOM J., SCHROEDER-DIEDRICH J.M., BOOTON G.C. & BYERS T.J. 1999: Acanthamoeba strains isolated from organs of freshwater fishes. The Journal of Parasitology 85: 1106-1113.

DYKOVÁ I., NOWAK B.F., CROSBIE P.B.B., FIALA I., PECKOVÁ H., ADAMS M.B., MACHÁČKOVÁ B. & DVOŘÁKOVÁ H. 2005b: Neoparamoeba branchiphila n.sp., and related species of the genus Neoparamoeba Page, 1987: morphological and molecular characterization of selected strains. Journal of Fish Diseases 28: 49-64.

EAMSOBHANA P., LIM P.E., SOLANO G., ZHANG H, GAN X. & YONG H.S. 2010: Molecular differentation of Angiostrongylus taxa (Nematoda: Angiostrongylidae) by cytochrome c oxidase subunit I (COI) gene sequences. Acta Tropica 116: 152-156.

FAHRNI J.F., BOLIVAR I., BERNEY C., NASSONOVA E., SMIRNOV A. & PAWLOWSKI J. 2003: Phylogeny of lobose amoebae based on actin and small-subunit ribosomal RNA genes. Molecular Biology and Evolution 20: 1881-1886.

FIZ-PALACIOS O., LEANDER B.S. & HEGER T.J. 2014: Old lineages in a new ecosystem: Diversification of arcellinid amoebae (Amoebozoa) and peatland mosses. PLoS ONE 9: e95238. doi:10.1371/journal.pone.0095238.

FOIGHIL D.Ó., GAFFNEY P.M., WILBUR A.E. & HILBISH T.J. 1998: Mitochondrial cytochrome c oxidase I gene sequences support an Asian origin for the Portuguese oyster Crassostrea angulata. Marine Biology 131: 497-503.

FOLMER O., BLACK M., HOEH W., LUTZ R. & VRIJENHOEK R. 1994: DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates. Molecular Marine Biology and Biotechnology 3: 294-299.

GEISEN S., KUDRYAVTSEV A., BONKOWSKI M., & SMIRNOV A. 2014: Discrepancy between species borders at morphological and molecular levels in the genus Cochliopodium (Amoebozoa, Himatismenida), with the description of Cochliopodium plurinucleolum n. sp. Protist 165: 364-383.

GENTEKAKI E. & LYNN D.H. 2009: High level genetic diversity but no population structure inferred from nuclear and mitochondrial markers of the peritrichous ciliate Carchesium polypinum in the Grand River basin (North America). Applied and Enviromental Microbiology 75: 3187-3195.

GOMAA F., KOSAKYAN A., HEGER T.J., CORSARO D., MITCHELL E.A. & LARA E. 2014: One alga to rule them all: unrelated mixotrophic testate amoebae (Amoebozoa, Rhizaria and Stramenopiles) share the same symbiont (Trebouxiophyceae). Protist 165:161-176.

GILE G.H., STERN R.F., JAMES E.R. & KEELING P.J. 2010: DNA barcoding of Chlorarachniophytes using nucleomorph ITS sequences. Journal of Phycology 46: 743- 750.

GRANDE C., TEMPLASO J., CERVERA J. & ZARDOYA R.. 2004: Phylogenetic relationships among Opisthobranchia (Mollusca: Gastropoda) based in mitochorndiral cox 1, trnV and rrnL genes. Molecular Phylogenetica and Evolution 33: 378-388.

GRIFFITHS A.M., MILLER D., EGAN A., FOX J., GREENFIELD A. & MARIANI S. 2013: DNA barcoding unveils skate (Chondrichthyes: Rajidae) species diversity in „ray“ products sold across Ireland and UK. PeerJ.

GUINDON S., DUFAYARD J.F., LEFORT V., ANISIMOVA M., HORDIJK W. & GASCUEL O. 2010: New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies: assessing the performance of PhyML 3.0. Systematic Biology 9: 307-321.

HEBERT P.D.N., CYWINSKA A., BALL S.L. & DEWAARD J.R 2003: Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society of London B- Biological Sciences 270: 313-321.

HEBERT P.D.N., STOECKLE M., ZEMLAK T. & FRANCIS CH. 2004: Identification of birds through DNA barcodes. Plos Biology 2.

HEGER T.J., BOOTH R.K., SULLIVAN M.E., WILKINSON D.M., WARNER B.G., ASADA T., MAZEI Y., MEISTERFELD R. & MITCHELL E.A.D. 2011: Rediscovery of Nebela ansata (Amoebozoa: Arcellinida) in eastern North America: biogeographical implocations. Journal of Biogeography 38: 1897-1906.

HEGER T.J., MITCHELL E.A.D. & LEANDER B.S. 2013: Holarctic phylogeography of the testate amoeba Hyalosphenia papilio (Amoebozoa: Arcellinida) reveals extensive genetic diversity explained more by enviroment than dispersal limitation. Molecular Ecology 22: 5172-5184.

HEGER T.J., PAWLOWSKI J., LARA E., LEANDER B., TODOROV M., GOLEMANSKY V. & MITCHELL E. 2011: Comparing potential COI and SSU rDNA barcodes for assessing the diversity and phylogenetic relationships of cyphoderiid testate amoebae (Rhizaria: Euglyphida). Protist 162: 131-141.

HOAREAU T.B. & BOISSIN E. 2010: Design of phylum-specific hybrid primers for DNA barcoding: addressing the need for efficient COI amplification in the Echinodermata. Molecular Ecology Resources 10: 960-967.

IVANOVA V., CLARE E. & BORISENKO A. 2012: DNA barcoding in mammals. Methods in Molecular Biology 858: 153-182.

KANDIL O.M., MAHMOUD M.S., ALLAM N.A.T. & NAMAKY A.H. 2010: Mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (cox 1) gene sequence of the Hymenolepis species. Journal of American Science 6: 640-647.

KATOH K. & STANDLEY D.M. 2013: MAFFT Multiple Sequence Alignment Software Version 7: Improvements in Performance and Usability. Molecular Biology and Evolution 30: 772-780.

KITAHARA M., CAIRNS S., STOLARSKI J., BLAIR D, & MILLER D. 2010: Comprehensive phylogenetic analysis of the Scleractinia (Cnidaria: Anthozoa) based on mitochondrial CO1 sequence data. Plos One 5.

KOSAKYAN A., GOMAA F., MITCHELL E., HEGER T.J., & LARA E. 2013: Using DNA.barcoding for sorting out protist species complexes: A case study of the Nebela tincta-collaris-bohemica group (Amoebozoa, Arcellinida, Hyalosheniidae). European Journal of Protistology 49: 222-237.

KOSAKYAN A., HEGER T.J., LEANDER B.S., TODOROV M., MITCHELL E.A.D. & LARA E. 2012: COI barcoding of Nebelid testae amoebae (Amoebozoa: Arcellinida): Extensive cryptic diversity and redefinition of the Hyalospheniidae Schultze. Protist 163: 415-434.

KOSAKYAN A., MULOT M., MITCHELL E.A.D. & LARA E. 2015: Enviromental DNA COI barcoding for quantitative analysis of protists communities: A test using the Nebela collaris complex (Amoebozoa; Arcellinida; Hyalospheniidae). European Journal of Protistology 51: 311-320.

KÖHSLER M., LEITNER B., BLASCHITZ M., MICHEL R., ASPÖCK H. & WALOCHNIK J. 2006: ITS1 sequence variabilities correlate with 18S rDNA sequence types in the genus Acanthamoeba (Protozoa: Amoebozoa). Parasitology Research 98: 86-93.

KUCERA E. & SAUNDERS G.W. 2008: Assigning morphological variants of Fucus (Fucales, Phaeophycae) in Canadian waters to recognized species using DNA barcoding. Botany 86: 1065-1079.

KUDRYAVTSEV A. 2014: Paravannella minima n.g.n.sp. (Discosea, Vannellidae) and distinction of genera in the vannellid amoebae. European Journal of Protistology 50: 258-269.

LAHR D.J.G., GRANT J., NGUYEN T., LIN J.H. & KATZ L.A. 2011: Comprehensive phylogenetic reconstruction of Amoebozoa based on concatenated analyses of SSU- rDNA and actin genes. Plos One. dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0022780. 61

LARA E., HEGER T.J., EKELUND F., LAMENTOWICZ M. & MITCHELL E.A. 2008: Ribosomal RNA genes challange the monophyly of the Hyalospheniidae (Amoebozoa: Arcellinida). Protist 159: 165-176.

LE GALL L. & SAUNDERS G.W. 2010: DNA barcoding is a powerfull tool to uncover algal diversity : a case study of Phyllophoraceae (Gigartinales, Rhodophyta) in the Canadian flora. Journal of Phycology 46: 374-389.

LÉON-REGAGNON V. 2010: Evidence od new species Hamenatoloechus (Platyhelmintes: Digenea) using partial cox 1 sequences. Mitochondrial DNA 21: 12-17.

LEFÉBURE T., DOUADY C.J., GOUY M. & GIBERT J. 2006: Relationship between morphological taxonomy and molecular divergence within Crustacea: proposal of a molecular treshold to help species delimitation. Molecular Phylogenetics and Evolution 40: 435-447.

LIU H., PROBERT I., UITZ J., CLAUSTRE H., ARIS-BROSOU S., FRADA M., NOT F. & DE VARGAS C. 2009: Extreme diversity in noncalcyfying haptophytes explains a major pigment paradox in open oceans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106: 12803-12808.

LOHAN A.J. & GRAY M.W. 2004: Methods for analysis of mitochondrial tRNA editing in Acanthamoeba castellanii. Methods in Molecular Biology 265: 315-331.

LONERGAN K.M. & GRAY M.W. 1993: Editing of transfer RNAs in Acanthamoeba castellanii mitochondria. Science 259: 812-816.

MACHOLÁN M. 2014: Základy fylogenetické analýzy. Brno: Masarykova univerzita, 289pp.

MARTIN E. & HINE R. 2004: A Dictionary of Biology. 5th ed Oxford University Press. 704pp.

MCDEVIT D.C. & SAUNDERS G.W. 2009: On the utility of DNA barcoding for species differentiation among brown macroalgae (Phaeophycae) including a novel extraction protocol. Phycological Research 57: 131-141. 62

MILLER D., MAHENDRAN R., SPOTTSWOOD M., COSTANDY H., WANG S., LING M.L. & YANG N. 1993: Insertional editing in mitochondria of Physarum. Seminars in Cell Biology 4: 261-266.

MORAN D.M., ANDERSON O.R., DENNETT M.R., CARON D.A. & GAST R.J. 2007: A description of seven Antarctic marine gymnamoebae including a new subspecies, two new species and a new genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n.sp. Journal of Eukaryotic Microbiology 54: 169-183.

NASSONOVA E., SMIRNOV A., FAHRNI J. & PAWLOWSKI J. 2010: Barcoding Amoebae: Comparison of SSUm IT and COI genes as tools for molecular identification of naked lobose amoebae. Protist 161: 102-115.

NIKOLAEV S.I., MITCHELL E.A.D., PETROV N.B., BERNEY C., FAHRNI J. & PAWLOWSKI J. 2005: The testate lobose amoebae (order Arcellinida Kent, 1880) finally find their home within Amoebozoa. Protist 156: 191-202.

OLIVIERO A.M., LAHR D.J.G., GRANT J. & KATZ L.A. 2015: Are microbes fundamentally different than macroorganisms? Convergence and a possible case for neutral phenotypic evolution in testate amoeba (Amoebozoa: Arcellinida). Royal Society Open Science: doi: 10.1098/rsos.150414.

ORTMAN B.D. 2008: DNA barcoding the medusozoa and ctenophora. Ph.D. Dissertation, University of Connecticut, Storrs, CT, 121 pp.

PAGE F.C. 1969: Platyamoeba stenopodia. n. g., n. sp., a Freshwater Amoeba. The Journal of Protozoology 16: 437-441.

PAGE F.C. 1979: Two genera of marine amoebae (Gymnamoebia) with distinctive surface structures: Vannella Bovee, 1965 and Pseudoparamoeba n.gen., with two new species of Vannella. Protistologica 15: 245-257.

PAGE F.C. 1980: A key to marine species of Vannella (Sarcodina:Gymnamoebia), with description of new species. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 60: 929-946.

PAGE F.C. 1988: An illustrated key to freshwater and soil Gymnamoebae. Freshwater Biological Association, Ambleside, Cumbria. 122pp.

PAGE F.C. & BLAKEY S.M. 1979: Cell surface structure as a taxonomic character in the Thecamoebidae (Protozoa: Gymnamoebia). Zoological Journal of the Linnean Society 66: 113-135.

PATWARDHAN A., RAY S. & ROY A. 2014: Molecular markers in phylogenetic studies – A review. Phylogenetics and Evolutionary Biology 2.

PAWLOWSKI J., AUDIC S., ADL S., BASS D., BELBAHRI L., BERNEY C., BOWSER S., ČEPIČKA I., DECELLE J., DUNTHORN M., FIORE-DONNO A.M., GILE G., HOLZMANN M., JAHN R., JIRKŮ M., KEELING P., KOSTKA M., KUDRYAVTSEV A., LARA E., LUKEŠ J., MANN D.G., MITCHELL E.A.D., NITSCHE F., ROMERALO M., SAUNDERS G.W., SIMPSON A.G.B., SMIRNOV A.V., SPOUGE J., STERN R.F., STOECK T., ZIMMERMANN J., SCHINDEL D. & DE VARGAS C. 2012: CBOL Protist working group: Barcoding eukaryotic richness beyond the animal, plant and fungal kingdoms. PLoS Biology 10: e1001419.doi:10.1371/journal.pbio.1001419.

PAWLOWSKI J. & BURKI F. 2009: Untangling the phylogeny of amoeboid protists. The Journal of Eucaryotic Microbiology 56: 16-25.

PAWLOWSKI J. & LECROQ B. 2010: Short rDNA barcodes for species identification in foraminifera. Journal of Eucaryotic Microbiology 57: 197-205.

PRICE M.N., DEHAL P.S. & ARKIN A.P. 2009: FastTree: Computing large minimum-evolution trees with profiles instead of a distance matrix. Molecular Biology and Evolution 26: 1641-1650.

PRICE D.H. & GRAY M.W. 1999: Confirmation of predicted edits and demonstration of unpredicted edits in Acanthamoeba castellanii mitochondrial tRNAs. Current Genetics 35: 23-29.

PRITCHARD A.E., SEILHAMER J.J., MAHALINGAM R., SABLE C.L., VENUTI S.E. & CUMMING D.J. 1990: Nucleotide sequence of the mitochondrial genome of Paramecium. Nucleic Acid Research 18: 173-180.

PROSSER S., VELARDE-AGUILAR M., LÉON-REGAGNON V. & HEBERT P.D.N. 2013: Advancing nematode barcoding: A primer cockatail for the cytochrome c oxidase subunit I gene from vertebrate parasitic nematodes. Molecular Ecology Resources 13: 1108-1115.

REMIGIO E.A. & HEBERT P.D.N. 2003: Testing the utility of partial COI sequences for phylogenetic estimates of gastropod relationships. Molecular Phylogenetics and Evolution 29: 641-647.

ROBIDEAU G.P., DE COCK A.W., COFFEY M.D., VOGLMAYR H., BROUWER H., BALA K., CHITTY D.W., DÉSAULNIERS N., EGGERTSON Q.A., GACHON C.M., HU C.H., KÜPPER F.C., RINTOUL T.L., SARHAN E., VERSTAPPEN E.C., ZHANG Y., BONANTS P.J., RISTAINO J.B. & LÉVESQUE C.A. 2011: DNA barcoding of oomycetes with cytochrome c oxidase subunit I and internal transcribed spacer. Molecular Ecology Resources 11: 1002-1011.

SAMBROOK J. & RUSSELL D. 2001: Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory.

SAUNDERS G.W. 2005: Applying DNA barcoding to red macroalgae: a preliminary appraisal holds promise for future applications. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences 360: 1879-1888.

SAUNDERS G.W. 2008: A DNA barcode examination of the red algal family Dumontiacae in Canadian waters reveals substantial cryptic species diversity. The foliose Dilsea-Neodilsea complex and Weeksia. Botany 86: 773-789.

SCHAEFFER A.A. 1926: Taxonomy of the amebas; with description of thirty-nine new marine and freshwater species. The Carnegie Institution of Washington. Washington. 116pp.

SCHOCH C.L., SEIFERT K.A., HUHNDORF S., ROBERT V. & SPOUGE J.L. 2012: Nuclear ribosomal internal transcribed spacers (ITS) region as a universal DNA barcode marker for Funghi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: 6241-6246.

SEEBURG P.H. 2002: A-to-I editing: new and old sites, functions and speculations. Neuron 35: 17-20.

SERRA-PEREIRA B., MOURA T., GRIFFITHS A., GORDO L. & FIGUEIREDO I. 2010: Molecular barcoding of skates (Chondrichthyes: Rajidae) from the southern Northeast Atlantic. Zoologica Scripta 40: 76-84.

SIMON C., FRATI F., BECKENBACH A., CRESPI B., LIU H. & FLOOK P. 1994: Evolution, weighting and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Ethomological Society of America 87: 651-701.

SIMPSON L., SBICEGO S. & APHASIZHEV R. 2003: Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria: A complex business. RNA 9: 265-276.

SIMS G.P., AITKEN R. & ROGERSON A. 2002: Identification and phylogenetic analysis of morphologically similar naked amoebae using small subunit ribosomal RNA. Journal of Eukaryotic Microbiology 49: 478-484.

SINGER D., KOSAKYAN A., PILLONEL A., MITCHELL E., & LARA E. 2015: Eight species in the Nebela collaris complex: Nebela gimlii (Arcellinida, Hyalospheniidae), a new species described from Swiss raised bog. European Journal of Protistology 51: 79-85.

SINNIGER F., REIMER J.D. & PAWLOWSKI J. 2008: Potential of DNA sequences to identify zoanthids (Cnidaria: Zoantharia). Zoological Science 25: 1253-1260.

SKULINOVÁ K. 2015: Amfizoické améby rodu Naegleria: genová typizace kmenů izolovaných z ţaber ryb. Masarykova univerzita: 75pp.

SMIRNOV A.V. & BROWN S. 2004: Guide to the methods of study and identification of soil gymnamoebae. Protistology 3: 148-190.

SMIRNOV A.V., CHAO E., NASSONOVA E.S. & CAVALIER-SMITH T. 2011: A revised classification of naked lobose amoebae (Amoebozoa: Lobosa). Protist 162: 545- 570.

SMIRNOV A.V., NASSONOVA E.S., BERNEY C., FAHRNI J., BOLIVAR I. & PAWLOWSKI J. 2005: Molecular phylogeny and classification of the lobose amoebae. Protist 156: 129-142.

SMIRNOV A.V., NASSONOVA E.S., CHAO E. & CAVALIER-SMITH T. 2007: Phylogeny, evolution, and taxonomy of vannelid amoebae. Protist 158: 295-324.

STERN R.F., HORAK A., ANDREW R.I., COFFROTH M.A., ANDERSEN R.A., KÜPPER F.C., JAMESON I., HOPPENRATH M., VÉRON B., KASAI F., BRAND J., JAMES E.R. & KEELING P.J. 2010: Enviromental barcoding reveals massive dinoflagellate diversity in marine enviroments. PLoS ONE: dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0013991

STUART K. & PANIGRAHI A.K. 2002: RNA editing: complexity and complications. Molecular Microbiology 45: 591-596.

TAKANO H., ABE T., SAKURAI R., MORIYAMA Y., MIYAZAWA Y., NOZAKI H., KAWANO S., SASAKI N. & KUROIWA T. 2001: The complete DNA sequence of the mitochondrial genome of Physarum polycephalum. Molecular Genetics and Genomics 264: 539-545.

TEKLE Y. 2014: DNA barcoding in amoebozoa and challenges: the example of Cochliopodium. Protist 165: 473-484.

THOMAS S.M., LAMB R.A. & PATERSON R.G. 1988: Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P and V of the paramyxovirus SV5. Cell 54: 891-902.

VAN DE PEER Y., DE RIJK P. WUYTS J., WINKLEMANS T. & DE WACHTER R. 2000: The European small subunit ribosomal RNA database. Nucleic Acid Research 28: 175-176.

VANHOVE M.P., TESSENS B., SCHOELINCK C., JONDELIUS U., LITTLEWOOD D.T., ARTOIS T. & HUYSE T. 2013: Problematic barcoding in flatworms: A case study on monogeneans and rhabdocoels (Platyhelminthes). Zookeys 30: 355-379.

VAN STEENKISTE N., LOCKE S., CASTELIN M., MARCOGLIESE D. & ABBOTT C. 2015: New primers for DNA barcoding of digeneans and cestodes (Platyhelmintes). Molecular Ecology Resources 15: 945-952.

VENCES M., NAGY Z.T., SONET G. & VERHEYEN E. 2012: DNA barcoding amphibians and reptiles. Methods in Molecular Biology 858: 79-107.

VIDAL S., CURRAN J. & KOLAKOFSKY D. 1990: A suttering model for paramyxovirus P mRNA editing. The EMBO Journal 9: 2017-2022.

VISVESVARA G.S., BOOTON G.C., KELLEY D.J., FUERST P., SRIRAM R., FINKELSTEIN A. & GARNER M.M. 2007: In vitro culture, serologic and molecular analysis of Acanthamoeba isolated from the liver of a keel-billed toucan (Ramphastos sulfuratus). Veterinary Parasitology 143: 74-78.

VOLCHKOV V.E., VOLCHKOVA V.A., MÜHLBERGER E., KOLESNIKOVA L.V., WEIK M., DOLNIK O. & KLENK H.-D. 2001: Recovery of infectious ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. Science 291: 1965-1969.

WARD R., HANNER R. & HEBERT P.D.N. 2003: The campaign to DNA barcode all fishes, FISH-BOL. Journal of Fish Biology 74: 329-356.

WARD R.D., HOLMES B.H. & O´HARA T.D. 2008: DNA barcoding discriminates echinoderm species. Molecular Ecology Resources 8: 1202-1211.

WARD R., ZEMLAK T., INNES B., LAST P. & HEBERT P.D.N. 2005: DNA barcoding Australia´s fish species. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences 360: 1847-1857.

YU D.W., JI Y., EMERSON B.C., WANG X., YE CH., YANG CH. & DING Z. 2012: Biodiversity soup: metabarcoding of arthropods for rapid biodiversity assessment and biomonitoring. Methods in Ecology and Evolution 3: 613-623.

ZHANG D-X. & HEWITT G. 1996: Nuclear integrations: challenges for mitochondrial DNA markers. Trends in Ecology and Evolution 11: 247-251.

ZIMMERMANN J., JAHN R. & GEMEINHOLZER B. 2011: Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Organisms Diversity and Evolution 11: 173-192.