RPCV (2007) 102 (563-564) 261-265 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Propolis effect in vitro on canine Transmissible Venereal Tumor cells
Efeito in vitro da Própolis sobre células do Tumor Venéreo Transmissivel canino
Sandra Bassani-Silva 1*, José M. Sforcin 2, Anne S. Amaral 1, Luiz F. J. Gaspar 1, Noeme S. Rocha 1
1Department of Veterinary Clinics, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Husbandry, UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brazil 2Department of Microbiology and Immunology, Biosciences Institute, UNESP, Botucatu, SP, 18618-000, Brazil
Summary: Transmissible venereal tumor (TVT) is a sexually proposta pelo Serviço de Patologia Veterinária desta transmissible neoplasm, attracting researchers’ interest because Universidade, e as neoplasias foram divididas em três grupos: of its origin, manner of transmission, and possibility of TVT linfocitóide, TVT plasmocitóide e TVT misto. Neste estudo, spontaneous regression, which modify the behavior of this a própolis foi efetiva sobre as células de TVT. A própolis tumor in comparison to other neoplasias. Chemotherapy apresentou efetiva atividade antitumoral sobre as células de procedure is still the preferred treatment for patients with TVT, incluindo nas do grupo plasmocitóide, considerada a TVT in spite of its toxic side effects that lead to treatment forma mais maligna, com efeito citotóxico após 48 horas e na interruption in some cases. Since antitumor property of propolis maior concentração da própolis. has been reported, this work attempted to verify its possible antitumor action on TVT malignancy. Five animals from the Veterinary Hospital, FMVZ, UNESP, Campus of Botucatu, Introduction Brazil, were used. Based on the cell morphology stained with Giemsa, a new nomenclature was proposed by the Pathology Veterinary Service of this University, and the TVT-cells were Transmissible venereal tumor (TVT) is a contagious divided into three groups: "lymphocyte-like" transmissible and sexually transmissible neoplasm with an unclear venereal tumor, "plasmocyte-like" transmissible venereal tumor origin and affecting only canines. It has a world wide and "mixed" transmissible venereal tumor. In this study, distribution but is detected mainly in tropical and propolis was active against TVT-cells. Propolis showed an effective antitumoral activity against TVT-cells, including the subtropical zones (Varaschin et al ., 2001). "plasmocyte-like" cells, considered the most malignant form, Despite its ubiquitous distribution and studies on its with a cytotoxic effect with the highest propolis concentration origin and classification, the nature and behavior of after 48h. these tumor cells remain controversial. Related studies support the hypothesis of a histiocytic origin (Tinucci- Resumo: O tumor venéreo transmissível (TVT) é uma neoplasia sexualmente transmissível que desperta, no meio -Costa, 1999; Albanese et al ., 2002; Murgia et al ., científico, o interesse pela sua origem, modo de transmissão e 2006). questionável regressão espontânea. O comportamento versátil Its diagnosis may be done through cytological or desse tumor difere dos mecanismos de outras neoplasias. O histological examinations. Cytological evaluation of procedimento quimioterápico continua sendo o tratamento de fine needle-aspirations reveals abundant round or oval eleição para os pacientes com TVT, apesar dos efeitos colaterais tóxicos graves causados por essa conduta terapêutica, necessi- cells with diameter of 14 to 30 mm, cytoplasmatic tando a interrupção do tratamento em alguns casos. Uma vez border well-delineated. Cellular nuclei are round or que pesquisadores têm relatado a propriedade antitumoral da oval, usually eccentric with variable size. They appear própolis em inúmeras neoplasias, este estudo objetivou verificar with clumped chromatin and contain one or more a possível ação antitumoral da própolis sobre a agressividade do prominent nucleoli. The nuclear:cytoplasmic ratio is TVT. Foram utilizados 5 animais provenientes do atendimento do Hospital Veterinário da FMVZ – UNESP, Campus de high (Boscos et al ., 1999). The cytoplasm is discretely Botucatu, Brasil. Baseado na morfologia celular de preparados basophilic with small, empty space and multiple citológicos corados com Giemsa, uma nova nomenclatura foi vacuoles mainly located close to the cytoplasmic border (Varaschin et al ., 2001). Studies on TVT of natural origin do not show any predisposition of gender or breed, and it is found mainly in adult animals during reproductive age. TVT may also have extra-genital location (Rodrigues et al ., 2001) and metastasis to many other organs has also *Correspondência: [email protected] been reported (Boscos et al ., 1999; Ferreira et al ., Fax: + 55 14 3811-6293 2000; Park et al ., 2006).
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The normal diploid number of chromosomes in the and using the new nomenclature proposed by the somatic cell of the dog ( Canis familiaris ) is 78, and Patology Veterinary Service of this University, the 76 of these are acrocentric. TVT has a stable number tumors were classified in "lymphocyte-like" transmis- of about 59:16 metacentric chromosomes and 43 sible venereal tumor, "plasmocyte-like" transmissible acrocentric chromosomes. The constant and specific venereal tumor and "mixed" transmissible venereal chromosomal aberrations, the identical rearrangement tumor. These smears were stained with Giemsa of the LINE/c-myc in all tumors, including the (Santos do Amaral, 2007). Brazilian ones (Portela et al ., 2003), suggest that TVT cases developed from the same origin and subsequently Propolis and TVT cell cultures were transmitted continually as allografts in many Propolis was collected in the Beekeeping Section, different geographical locations (Chu et al ., 2001). FMVZ, UNESP, Campus of Botucatu, located on the Although chemotherapy has been used for TVT Lageado Experimental Farm. Propolis samples were treatment with further tumor regression, in many cases collected from colonies of Africanized honeybees there are toxic side effects due to this therapeutic (Apis mellifera ) with plastic nets, which were later procedure, with eventual treatment interruption frozen to remove the propolis. (Ogilvie, 1996). Besides, Tinucci-Costa (1999) and The propolis sample was analysed by gas-chroma- Brandão et al . (2002) reported that some TVTs are tography, gas chromatography-mass spectrometry resistant to chemotherapy. and thin layer chromatograph, revealing that its main Propolis is a resinous beehive product with a components are phenolic compounds (flavonoids, complex composition, produced by bees from the aromatic acids, benzopyranes), di- and triterpenes, secretions of trees, flowers, leaves and pollen. Bees essential oils, among others. Propolis was ground and use it to seal combs, cover irregular surfaces or other mixed with 70% ethanol (30 g propolis to 100 mL insects and eventual intruders that die inside the of 70% ethanol), and protected from bright light, beehive, in order to avoid their decomposition under moderate shaking, for 7 days. After this period, (Banskota et al ., 2001). solutions were filtered and used at adequate concen- Propolis presents several therapeutic properties, trations in the biological assays (Sforcin et al ., 2005). such as antibacterial, antifungal, anti-inflammatory, TVT cells from biopsies of each animal were put in immunomodulatory, among others (Sforcin et al ., RPMI 1640 medium and processed, in order to carry 2002; Orsi et al ., 2005; Sforcin et al ., 2005; Sforcin, out the cell cultures immediately. TVT cells were 2007). Many authors have reported its antitumor counted in a hematocytometer by Trypan blue property (Matsuno et al ., 1997; Banskota et al ., 2001). exclusion in order to obtain a final concentration of Thus, the goal of this work was to verify the possible 2x10 6 cells/mL, and were incubated at 37 ºC under 5% in vitro action of propolis on canine venereal CO tension into 96-well microplates with flat bottom transmissible tumor (TVT). 2 in RPMI 1640 medium supplemented with 20 mM HEPES (Sigma Chemical Co., USA), 2x10 -5 M 2-mer- Material and methods captoethanol (Sigma), 0.2% sodium bicarbonate, 1% glutamine 2 mM and 10% of heat-inactivated fetal calf Clinical data of the dogs serum. Then, propolis was added to the monolayers of This work conforms with Ethical Principles in each 5 animals in the following 4 concentrations: 10, Animal Research adopted by the Brazilian College of 25, 50 and 100 µg/well (100 µl). The final volume in Animal Experimentation (n. 60/2002). each well was 100 µl. All assays were carried out in From January to July 2003, 30 dogs were subjected duplicate (Orsi et al ., 2005). to physical examination, anamnesis and complete Propolis effect was analyzed after 6, 24 and 48 h, clinical history at the Veterinary Hospital, FMVZ, comparing propolis-treated cells with the control UNESP, Campus of Botucatu. From those, 25 dogs cells. Cell viability was analyzed by Trypan blue of either gender, any breed or age, with cytological exclusion. In order to observe a possible effect of the TVT diagnosis and absence of previous antitumor propolis solvent, other cells were incubated only with treatments were used for culture standardization. Five 70% ethanol (20 µl), corresponding to the highest dogs included in these conditions were selected for the propolis concentration (100 µg). propolis assays, and among these five tumors, 2 of them were plasma cells-like TVT, 2 were lymphocyte- like TVT and one was a lympho-plasma cell TVT form. Statistical analysis Friedman’s test was used in order to analyze cell Cytopathological analysis viability in the cultures, for each propolis concentra- Cytopathological analyses were carried out on tion according to the time period. Kruskall-Wallis’s tumor smears obtained by puncture or exfoliation for test was used to analyze the time period according to the TVT diagnosis and, based on the cell morphology propolis concentrations.
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Analysis of variation was used to analyze cellular by Giemsa as well as chromosome analysis revealed concentration in the cultures, for each propolis that the cells were really from TVT. No antibiotic was concentration according to the time period and for added to the cultures within 48 h. Our preliminary every time period according to propolis concentra- 25 cultures showed that within this time period, tions. The value of each animal was considered to be antibiotics were not necessary. So, we chose this time the average of the two duplicates. period to carry out our cell cultures. Comparing propolis-treated cells with control cells, one may verify that propolis showed a time-concentra- Results and discussion tion effect on TVT. After 6 h, propolis (100 µg) showed a significant Differences between cellular lineages were seen in antitumor activity (p<0.05). It was also effective at morphological characteristics of TVT, influencing lower concentrations, but in a long-term way (after its biological behavior (Varaschin et al ., 2001). 24 h with 50 µg, and 48 h with 25 µg) (Tables 1 and According to cell characteristics, a new terminology 2). With regards to TVT morphology, plasma cell-like for TVT has been suggested by our group and tumors TVT was more resistant to propolis action (Table 3). were classified into lymphocyte-like TVT, plasma One may verify a similar number of 70% ethanol- cell-like TVT and lympho-plasma cell-like TVT forms treated cells and control, indicating the absence of (Amaral et al ., 2004; Bassani-Silva, 2005; Gaspar, propolis solvent effect and suggesting that the results 2005). This morphology classification shows TVT were exclusively due to propolis components. malignancy: plasma cell-like TVT shows a higher The chemical composition of propolis is very frequency of nuclear abnormalities associated with a complex and is dependent upon the source plant. Bud larger expression of P-glycoprotein, an elevated rate of exudates of different poplar species are the main metastasis and cellular proliferation in comparison to sources of propolis in temperate zone, including lymphocyte-like TVT or lympho-plasma cell-like Europe, Asia and North America. Samples originating TVT forms. Plasma cell-like TVT is the most injurious from these regions are characterized by similar chemi- and also the most malignant (Bassani-Silva, 2005; cal composition; the most important constituents Gaspar, 2005). appeared to be phenolics: flavonoids, aromatic acids To be sure that the culture did not contain any other and their esters. The main vegetal source of propolis cells than TVT, morphologic analysis of culture cells in Botucatu, São Paulo State, Brazil, is Baccharis
Table 1 - TVT cell viability (average %) after 6, 24 and 48 h of incubation with different propolis concentration (P) (µg) and 70% ethanol (20 µl) Time period Group 0 h 6 h 24 h 48 h Control 52.07 Aa 81.41 Aa 76.12 Aa 60.83 Aa P (10 µg) 52.07 Aa 44.38 Aab 9.39 ABab 1.47 Bb P (25 µg) 52.07 Aa 31.56 Aab 1.00 Bb 0Bc P (50 µg) 52.07 Aa 0.41 Bb 0Bb 0Bc P (100 µg) 52.07 Aa 0Bb 0Bb 0Bc 70% Ethanol 52.07 Aa 80.79 Aa 75.06 Aa 60.02 Aa Different capital letters indicate significant differences between each time period according to propolis concentration ( α=0,05). Different small letters indicate significant differences between each propolis concentration according to the time period ( α=0,05). n=5 averages of each animal.
Table 2 - TVT cell concentration (x 10 6 cells/mL) after 6, 24 and 48 h of incubation with different propolis concentration (P) (µg) and 70% ethanol (20 µl) Time period Group 0 h 6 h 24 h 48 h Control 2.00 Aba 2.52 Ba ± 0.31 1.70 Aa ± 0.42 1.15 Ca ± 0.27 P (10 µg) 2.00 Aab 1.28 ACbc ± 1.25 0.28 BCbc ± 0.30 0.08 Bb ± 0.13 P (25 µg) 2.00 Aab 0.96 Bbc ± 0.95 0.08 BCbc ± 0.11 0.02 Cb ± 0.03 P (50 µg) 2.00 Ab 0.31 Bbc ± 0.63 0.03 Bbc ± 0.04 0.01 Bb ± 0.01 P (100 µg) 2.00 Ab 0.02 Bb ± 0.04 0.01 Bb ± 0.02 0. Bb ± 0 70% Ethanol 2.00 Aab 1.85 Abc ± 0.15 1.56 Bc ± 0.38 1.20 Ba ± 0.35 Different letters indicate significant differences by the variation analysis for repeated measures on entirely random experiment, for every group between each circumstance and for every circumstance, between each group, with a significance of α=0,05. n=5 averages of each animal.
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Table 3 - Propolis (P) effect, according to its concentration and period of incubation, on different TVT cell morphology*. Plasma cell-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg) n=2 averages of each animal 0 h 2.00 2.00 2.00 2.00 6 h 1.95 ± 0.75 1.42 ± 0.61 0.77 ± 0.94 0.06 ± 0.04 24 h 0.47 ± 0.28 0.20 ± 0.04 0.07 ± 0.01 0.03 ± 0.04 48 h 0.19 ± 0.16 0.06 ± 0.01 0.03 ± 0.01 0 ± 0 Lymphocyte-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg) n=2 averages of each animal 0 h 2.00 2.00 2.00 2.00 6 h 1.25 ± 1.76 0.98 ± 1.39 0.01 ± 0 0± 0 24 h 0.24 ± 0.34 0.01 ± 0.02 0± 0 0± 0 48 h 0.02 ± 0.03 0± 0 0± 0 0± 0 Lympho-plasma cell-like TVT P (10 µg) P (25 µg) P (50 µg) P (100 µg) n=1 average 0 h 2.00 2.00 2.00 2.00 6 h 0 0 0 0 24 h 0 0 0 0 48 h 0 0 0 0 * 2 x 10 6 cells/mL Results are expressed in mean ± standard deviation. dracunculifolia DC., followed by Eucalyptus citriodora from propolis and propolis itself could be potentially Hook and Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze useful in the control of tumor growth in experimental (Bankova et al ., 1999). models. The main constituents of our propolis sample were The literature reports immune suppression during isolated and identified: flavonoids are present in small TVT growth, allowing metastasis. In order to reduce quantities in Brazilian propolis (kaempferid, 5,6,7- the side effects of chemotherapy and considering that trihydroxy-3,4’-dimethoxyflavone, aromadendrine- propolis possesses antitumor, anti-metastatic and 4’-methyl ether); a prenylated p-coumaric acid and immunomodulatory activities, its introduction as a two benzopyranes: E and Z 2,2-dimethyl-6-carbo- therapeutic procedure in vivo could provide new xyethenyl-8-prenyl-2H-benzopyranes); essential oils contribution to TVT treatment, as well as to other (spathulenol, (2Z,6E)-farnesol, benzyl benzoate and neoplasia treatments. prenylated acetophenones); aromatic acids (dihy- There are no works dealing with propolis and TVT, drocinnamic acid, p-coumaric acid, ferulic acid, demonstrating the originality of our research and its caffeic acid, which are common for poplar propolis, great contribution to the therapeutic procedures. 3,5-diprenyl- p-coumaric acid, 2,2-dimethyl-6- carboxy-ethenyl-8-prenyl-2H-1-benzo-pyran); di- and triterpenes, among others. Seasonal variations in propolis composition are not significant and are Bibliography predominantly quantitative (Bankova et al ., 1998). Albanese F, Poli A, Millanta F, Abramo F (2002). Primary Twenty-three components have been isolated from cutaneous extragenital canine transmissible venereal Brazilian propolis, with cell-toxicity against fibrosar- tumour with Leishmania-laden neoplastic cells: a further coma in men and murine colon carcinoma (Banskota suggestion of histiocytic origin? Veterinary et al ., 1998). Artepilin-C is an isolated component of Dermatology, 13: 243-246. Brazilian propolis with cytotoxic activity against Amaral AS, Gaspar LFJ, Bassani-Silva S, Rocha NS (2004). tumor cells in vitro . This cytotoxicity was related to Cytological diagnostic of transmissible venereal tumor DNA fragmentation, inducing apoptosis (Matsuno et in the Botucatu region, Brazil (descriptive study: 1994- al ., 1997). 2003). Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, Orsolic et al . (2004) showed that according to the 99(551): 167-171. results obtained in their study on the growth and Bankova V, Boudourova-Krasteva G, Popov S, Sforcin JM, metastatic potential of a transplantable mammary Cunha-Funari SR (1998). Seasonal variations of the chemical composition of Brazilian propolis. Apidologie, carcinoma of CBA mouse, the antitumor activity of 29: 361-367. tested compounds can be related to the immunomodu- Bankova V, Boudourova-Krasteva G, Sforcin JM, Frete X, latory properties of the compounds, their cytotoxicity Kujumgiev A, Maimoni-Rodella R, Popov S (1999). to tumor cells, and their capacity to induce apoptosis Phytochemical evidence for the plant origin of Brazilian and necrosis. They also showed that experimental data propolis from São Paulo State. Zeitschrift fur corroborate that polyphenolic compounds isolated Naturforschung, 54c: 401-405.
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Banskota AH, Tezuka Y, Prasain JK, Matsushige K, Saiki I, Orsi RO, Sforcin JM, Funari SRC, Bankova V (2005). Kadota S (1998). Chemical constituents of Brazilian Effects of Brasilian and Bulgarian propolis on bactericidal propolis and their cytotoxic activities. Journal of Natural activity of macrophages against Salmonella Products, 61: 896-900. Typhimurium. International Immunopharmacology, Banskota AH, Tekuza Y, Kadota S (2001). Recent progress 5(2): 359-368. in pharmacological research of propolis. Phytotherapy Orsolic N, Knezevic AH, Sver L, Terzic S, Basic I (2004). Research, 15: 561-571. Immunomodulatory and antimetastatic action of Bassani-Silva S (2005). Efeito da própolis sobre a agressivi- propolis and related polyphenolic compounds. Journal dade do tumor venéreo transmissível canino: ensaios in of Ethnopharmacology, 94: 307-315. vitro . (Masters dissertation, Faculdade de Medicina Park MS, Kim Y, Kang MS, Oh SY, Cho DY, Shin NS, Kim Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, DY (2006). Disseminated transmissible venereal tumor Botucatu, Brasil). in a dog. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, Boscos CM, Tontis DK, Samartzi FC (1999). Cutaneous 18(1): 130-133. involvement of TVT in dogs: a report of two cases. Portela RF, Spim JS, Castelli EC, Amaral AS, Gaspar LFJ, Canine Practice, 24: 6-11. Rocha NS (2003). Molecular detection of canine trans- Brandão CVS, Borges AG, Ranzani JJT, Rahal, SC, Teixeira missible venereal tumor by PCR. In: XXIV Congresso CR, Rocha NS (2002). Tumor venéreo transmissível: Brasileiro de Patologia, 24, 2003, Florianópolis: estudo retrospectivo de 127 casos (1998-2000). Revista Congresso Brasileiro de Patologia. n.08-02. de Educação Continuada CRMV-SP, 5: 25-31. Rodrigues GN, Alessi AC, Laus JL (2001). Intraocular Chu RM, Sun TJ, Yang HY, Wang DG, Liao KW, Chuang transmissible venereal tumor in a dog. Ciência Rural, TF, Lin CH, Lee WC (2001). Heat shock proteins in 31: 141-143. canine transmissible venereal tumour. Veterinary Santos do Amaral A, Bassani-Silva S, Ferreira I, Fonseca Immunology and Immunopathology, 82: 9-21. LS, Andrade FHE, Gaspar LFJ, Rocha NS (2007). Ferreira AJA, Jaggy A, Varejão AP, Ferreira MLP, Correia Cytomorphological caracterization of transmissible JMJ, Mulas JM, Almeida O, Oliveira P, Prada J (2000). canine venereal tumor. Revista Portuguesa de Ciências Brain and ocular metastases from a transmissible Veterinárias (Accept to publication). venereal tumour in a dog. Journal of Small Animal Sforcin JM, Kaneno R, Funari SRC (2002). Absence of Practice, 41: 165-168. seasonal effect on the immunomodulatory action of Gaspar LFJ (2005). Caracterização citomorfológica do brasilian propolis on natural killer activity. J Venom tumor venéreo transmissível canino correlacionada com Anim Toxins, 8: 19-29. danos citogenéticos, taxa de proliferação e resposta Sforcin JM, Orsi RO, Bankova V (2005). Effect of propolis, clínica à quimioterapia. (PhD thesis, Faculdade de some isolated compounds and its source plant on Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade antibody production. Journal of Ethnopharmacology, Estadual Paulista, Botucatu, Brasil). 98: 301-305. Matsuno T, Jung SK, Matsumoto Y, Saito M, Morikawa J Sforcin, JM (2007). Propolis and the immune system: a (1997). Preferential cytotoxicity to tumour cells of review. Journal of Ethnopharmacology, 113: 1-14. 3,5-diprenyl-4-hidroxycinnamic acid (artepilin C) Tinucci-Costa M (1999). Canine transmissible venereal isolated from propolis. Anticancer Research, 17: 3565- tumor. Revista de Educação Continuada CRMV-SP, 2: 3568. 46-52. Murgia C, Pritchard JK, Kim SY, Fassati A, Weiss RA Varaschin MS, Wouters F, Bernins VMO, Soares TMP, (2006). Clonal origin and evolution of a transmissible Tokura VN, Dias MPLL (2001). Tumor venéreo cancer. Cell, 126(3): 477-487. transmissível canino na região de Alfenas, Minas Ogilvie GK (1996). Chemotherapy. In: Small animal clinical Gerais; formas de apresentação clínico-patológicas. oncology, 2ª edição. Editores: SJ Withrow e EG Clínica Veterinária, 6: 332-338. MacEwen. W.B. Saunders (Filadelfia), 70-86.
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RPCV (2007) 102 (563-564) 267-273 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Maturação in vitro de oócitos de cadelas domésticas: efeitos na qualidade oocitária e presença espermática na maturação in vitro
Bitch oocytes in vitro maturation: effects of oocyte quality and spermatozoa in in vitro maturation
A. A. Rocha*, R. Bastos, I. C. N. Cunha, C. R. Quirino
Universidade estadual do Norte Fluminense, Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias, Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal Av. Alberto Lamego, 2000 – Horto, Campos dos Goytacazes, Brasil – CEP.: 28013-602
Resumo: Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em maturation. In this period the female reproductive physiology canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos das allows acceptance of males and matting occurs, and the occytes fêmeas representam uma fonte importante de estudos que stay in contact whit spermatozoa in the uterine tube. The aim of envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos in vitro . this study was to investigate the effect of female age, estrous Porém os resultados obtidos nas técnicas de maturação in vitro cycle and body codition on quantity and quality of oocyte; and (MIV) para espécie canina, por exemplo, são muito inferiores se the influence of interactions between canine spermatozoa and comparados com os de outros mamíferos domésticos. Nesta oocyte during the IVM process. Results showed significant espécie o mecanismo de maturação pré-ovulatória ocorre de influence of age with older bitches obtaining lower number of forma diferente exigindo que após a ovulação os oócitos oocytes with good quality. Similar results were obtained in permaneçam ainda de 2 a 5 dias completando a maturação nos relation the females with low body condition, whith higher rates oviductos. De acordo com a fisiologia reprodutiva da fêmea of degenerate oocytes. In relation the presence of canine durante este período já se observa a aceitação da cópula com o spermatozoa in the IVM, it was verified that the contact macho, o que permite o contacto dos oócitos já ovulados com os spermatozoa-oocyte raises the IVM significantly. espermatozóides. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da fase do ciclo éstrico, da idade e do índice de condição Keywords: Oocyte, bitch, in vitro maturation, spermatozoa corporal de cadelas domésticas na qualidade oocitária, e avaliar a influência da presença de espermatozóides caninos durante o processo de MIV. Os resultados obtidos neste estudo demonstram a existência de uma influência significava da idade da fêmea, tendo-se verificado que quanto mais velha for a Introdução cadela, menor é o número de oócitos de melhor qualidade obtidos. Dados semelhantes foram verificados com cadelas com Na aplicação das biotecnologias reprodutivas em baixo índice de condição corporal em que se observaram canídeos, os oócitos recuperados de folículos ováricos taxas de oócitos degenerados também elevadas. Em relação das fêmeas representam fonte importante de estudos à presença de espermatozóides caninos no processo de que envolvem o desenvolvimento dos gametas femininos MIV, verificou-se que o contato espermatozóide-oócito eleva significantemente o índice de MIV. in vitro . Porém os resultados verificados nas técnicas de maturação in vitro (MIV) para espécie canina, por Palavras-chave: oócito, cadela maturação in vitro , espermatozóide exemplo, são muito inferiores se comparados com outros mamíferos domésticos. Em cadelas e raposas, o Summary: Oocytes recovered from ovarian folicules represent mecanismo de maturação pré-ovulatória acontece de important studies for in vitro gametes development. In canids, studies with reproductive biotechnologies are increasing, forma diferente se comparados com outras espécies de however studies from in vitro maturation (IVM) of canine mamíferos. Nestas fêmeas a ovulação ocorre de 1 a 2 oocytes are poor if compared with other domestic mammals. dias após o pico pré-ovulatório de LH, ainda no início The mechanisms for canine oocyte maturation are different. da fase de estro, e os folículos ováricos iniciam sua After ovulation oocytes still remain 2-5 days completing the luteinização antes mesmo da ovulação, além disso, estes oócitos são ovulados ainda imaturos, no início da primeira divisão meiótica (MI) e logo após a ovulação ocorre a quebra da vesícula germinativa. Desta forma após a ovulação os oócitos requerem ainda de 2 a 5 dias para completar a maturação (Otoi et al. , 2000). *Correspondência: [email protected]/[email protected] Fisiologicamente, no momento da ovulação, a fêmea Tel: +55 21 97155317; +55 21 33914702 destas espécies já se encontra aceitando a monta do
267 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 267-273 macho, fazendo com que seus oócitos imaturos estro e diestro) e animais em repouso reprodutivo per maneçam em contato com espermatozóides por (anestro). longos períodos no trato genital (Yamada et al. , 1992). A maturação in vitro (MIV) de oócitos retoma a Avaliação da idade dos animais esperança de preservação de espécies em extinção, Todas as cadelas foram avaliadas quanto à idade, porém resultados satisfatórios nem sempre são verifi- tendo sido feita pela inspeção da dentição formada no cados quando trata-se de MIV em oócitos de cadelas. momento da recolha (erupção, desgaste e perda den- Vários motivos podem influenciar em bons índices de tária). Neste estudo utilizou-se os padrões descritos MIV, entre eles a qualidade oocitária parece possuir por Román (1999). grande impacto (Hewitt e England, 1997b). Para a As fêmeas avaliadas foram divididas em 3 grupos: espécie canina não se sabe ainda ao certo, quais os cadelas pré-púberes (entre 6 meses e 1,5 anos), cadelas motivos que podem levar a dadora, a apresentar quan- maturas (entre 1,5 e 8 anos), cadelas com mais de 8 tidade maior ou menor de oócitos e índices diferentes anos. de qualidade oocitária. Os aspectos mais discutidos até o momento referem a idade da cadela dadora e da Avaliação do estado nutricional (índice corporal) fase do ciclo éstrico em que esta se encontra (Nickson et al. , 1993; Yamada et al. , 1993; Hay et al. , 1997; A análise do índice corporal foi baseado no sistema Rodrigues et al. , 2003). de avaliação da condição corporal da Nestlé PURINA ® Estudos em cães podem servir como modelo experi- (Laflamme, 1997; Mawby et al. , 2001; Kealy, 2002). mental próximo ao ideal para o desenvolvimento da Por este sistema os animais foram subdivididos em reprodução assistida em canídeos, contribuindo para três grupos: cadelas magras, regulares e obesas. preservação de espécies em extinção (Bolamba et al. , 1998). Porém a baixa competência meiótica de oócitos Preparação dos meios de cultura e procedimento cultivados in vitro ainda é um obstáculo para a fertili- de maturação zação in vitro e consequentemente desenvolvimento A preparação dos meios de lavagem dos oócitos, embrionário nos programas de recuperação genética. bem como os meios de maturação foram preparados Por este motivo, este estudo buscou verificar se a diariamente em material estéreis e em capela de fluxo idade, a fase do ciclo éstrico e estado nutricional da laminar. O fluido foi mantido em tubos cônicos, em fêmea dadora de ovários possui efeito na quantidade e estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO em ar, para qualidade oocitária, bem como determinar se existe 2 equilíbrio até o momento de utilização. influencia da presença de espermatozóides em dife- Os meios de manipulação dos oócitos foram rentes etapas do processo de MIV de oócitos. preparados com TCM-199 (sem heppes) acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB), e equilibrados em pH Material e métodos 7,5. Os meios de maturação seguiaram protocolo de TCM 199, acrescido de 10% de soro de cadela em estro, e penicilina e estreptomicina, equilibrados em Avaliação das cadelas pH 7,6. O soro de cadela em estro foi previamente Foram utilizadas 107 cadelas dadoras de ovários, coletado e armazenado em microtubos para congelação. com idades variando de 6 meses a 16 anos, prove- Todo o material foi previamente equilibrado em nientes da rotina de ovariohisterectomia (OSH) do estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar, pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) do município menos por 2 horas antes da utilização. As culturas de Campos dos Goytacazes – RJ, Brasil e do Hospital foram realizadas em placas plásticas de cultura celular, Veterinário da Universidade Estadual do Norte com 4 gotas de 100 µl do meio de maturação cobertas Fluminense (UENF – RJ, Brasil). A avaliação de todas por óleo mineral Sigma ®, em cada gota eram tratados as cadelas utilizadas foi feita antes do procedimento de 15 a 20 oócitos. de OSH, através de exame clínico e anamnese com o proprietário do animal. Obtenção e classificação dos oócitos Os ovários recolhidos das cadelas foram levados ao Avaliação da fase do ciclo éstrico das fêmeas Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético As cadelas passaram por exame clínico com Animal (LRMGA/UENF) e o início do processamento inspeção da região vulvar e perineal, seguido de recolha do material ocorreu em no máximo 3 horas do término de material para realização de citologias vaginais para da cirurgia. O par de ovários de cada fêmea separada- estadiamento do ciclo (Johnston et al. , 2001). Após a mente foi fatiado e escarificado com lâminas de bisturi, cirurgia, a avaliação da superfície ovariana permitiu a o fluido obtido foi avaliado em estéreo-microscópico confirmação da determinação da fase do ciclo. em aumento de 20 a 40X, dentro de fluxo laminar. Neste estudo, os animais foram divididos em dois Os oócitos foram classificados em grau I, grau II e grupos: animais em atividade reprodutiva (pro-estro, degenerados conforme descrição de Hewitt e England
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(1997a). Para cada cadela, todos os oócitos obtidos ovários, na quantidade e qualidade dos oócitos obtidos. foram contados e classificados em cada um dos grupos. Nesta etapa, cada par de ovários proveniente de dadoras, foi processado separadamente para que os Maturação in vitro dos oócitos oócitos pudessem ser contados e avaliados. Os oócitos foram separados em três grupos (GI, GII e degenerados). Os oócitos classificados em grau I foram selecionados Experiência II – Influência de diferentes tempos de para o processo de MIV por 72 horas e/ou co-incu- co-incubação entre o espermatozóide e oócito, na bação com espermatozóides, de acordo com o grupo indução da maturação in vitro de oócitos de cadelas. de tratamento. Durante este período, os oócitos foram Esta etapa propôs verificar a influência da presença mantidos em gotas de meio de maturação suplementa- de espermatozóides caninos durante o período de dos com hormonas (TCM + FSH + LH + antibióticos), maturação in vitro de oócitos de cadelas. Para isto, em estufa a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO em ar. 2 quatro tratamentos foram propostos: Grupo controle - Os oócitos de grupos tratados foram submetidos a oócitos cultivados em meios de MIV, por 72 horas. meio de fecundação (Talp Fec) durante a co-incubação Grupo spz 48h – oócitos maturados por 48 horas, e com espermatozóides. incubados por 24 horas com espermatozóides caninos. Grupo spz 24h – oócitos maturados por 24 horas e Seleção do doador e preparação do sêmen incubados por mais 24 horas com espermatozóides Foi utilizado um único doador de sêmen, um cão da caninos e retornaram o cultivo por mais 24 horas em raça Bull Terrier de 2 anos, em boas condições de saúde. meio de MIV. Grupo spz 0h – oócitos imaturos foram O sêmen foi recolhido por massagem peniana e incubados por 24 horas com espermatozóides caninos mostrou-se dentro de excelentes padrões quanto a moti- em meio de FIV, e após este período passaram por 48 lidade, vigor, concentração e patologias espermáticas, horas de MIV. Todos os tratamentos completaram 72 segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal horas de MIV. O esquema a seguir demonstra o deli- (1996). Os espermatozóides viáveis foram selecionados neamento proposto (Figura 1). pela técnica de gradiente de centrifugação com Percoll ®, ajustando a concentração espermática a 10 6 esperma- Analise estatística tozóides/ml. Após a análise preliminar, onde foi realizada a análise descritiva, os dados foram submetidos a Determinação da MIV (avaliação da configuração análise de variância (ANOVA) e as médias foram nuclear) comparadas pelo teste T com 5% de significância. Durante a avaliação foram considerados maturados todos os oócitos que se apresentaram em metáfase II (MII) com cromossomos visivelmente condensados. Os oócitos em fases anteriores a MII ou sem identifi- Resultados e discussão cação de material nuclear foram considerados imaturos e degenerados respectivamente (Hewitt e England, Experiência I 1997a). Idade das cadelas dadoras de ovários. A ANOVA Para determinar se houve maturação, os oócitos mostrou que não houve diferença estatística entre os tratados foram corado por iodeto de propídeo e verifi- efeitos analisados (P>0,05). As cadelas pré-púberes, cados em microscópio de fluorescência (aumento de maduras e com mais de 8 anos obtiveram em média 40X, filtro excitador 510, posição G 247). a mesma quantidade de oócitos. Porém em relação a qualidade oocitária verificou-se diferença estatística Delineamento experimental entre os grupos (P<0,05). A Tabela 1 apresenta as Experiência I – Influência da idade, da fase do ciclo médias e desvios-padrão para o número total de éstrico e do estado nutricional das fêmeas dadoras de oócitos.
Grupos 0 h 24 h 48 h 72 h
Controle MIV MIV MIV avaliação Sptz 48 MIV MIV sptz-oócito avaliação Sptz 24 MIV sptz-oócito MIV avaliação Sptz 0 sptz-oócito MIV MIV avaliação
Figura 1 - Delineamento experimental da Experiência II
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Os dados descritos na tabela mostram que com o Índice corporal das cadelas dadoras de ovários. Foi aumento da faixa etária ocorre diminuição na qualidade possível observar influência significativa entre a das estruturas analisadas. Estes estudos concordam condição corporal as cadelas ováriohisterectomizadas com os apresentados por Rocha et al. (2004) que relatou na qualidade dos oócitos obtidos dos folículos que a média de oócitos de melhor qualidade foi ováricos (P<0,05). significantemente menor em cadelas idosas. Para as quatro avaliações realizadas (número total de Estes dados sugerem que deficiências na regulação oócitos, número de oócitos GI, GII e degenerados) o dos eixos de estímulo hormonal, bem como a capaci- resultado estatístico foi semelhante. Observou-se que dade de fertilização oocitária in vivo estariam os animais que estavam magros apresentaram redução relacionadas com a idade avançada das fêmeas. no número total de oócitos. Em relação à qualidade destes oócitos, em todas as classes analisadas, as Fase do ciclo éstrico das cadelas dadoras de fêmeas magras apresentaram diminuição da qualidade ovários. A ANOVA não mostrou diferença significati- das estruturas, com redução no número de oócitos GI va em nenhum dos grupos (P>0,05). O número total e GII (P<0,05), ao comparar com cadelas de índice de oócitos apresentou médias semelhantes tanto para corporal regular ou obesas (Tabela 3). cadelas em e atividade reprodutiva, como para as que Pelo fato de poucas hipóteses terem sido avaliadas estavam em repouso reprodutivo. O mesmo resultado sobre este aspecto, sugere-se que os diferentes estados foi verificado em relação a qualidade oocitária nos nutricionais das fêmeas acarretam grande variação na dois estados reprodutivos. A Tabela 2 mostra os resul- concentração plasmática de leptina. A leptina é um tados visualizados para a característica efeito do ciclo hormônio secretado pelo tecido adiposo sendo crucial éstrico na quantidade e qualidade oocitária. em diversos processos fisiológicos, principalmente o
Tabela 1 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes faixas etárias Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Faixa Etária Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerados Pré-púberes 59,1 + 16,0 a 16,2 + 7,6 a 17,5 + 4,2 a 25,4 + 9,0 a (n=11) Maturas 57,3 + 22,8 a 15,5+10,1 ab 18,6 + 9,6 ab 22,9 + 8,0 ab (n=38) Com mais de 8 anos 54,6 + 15,6 a 11,5 + 5,7 b 16,1 + 6,6 a 27,1 + 7,4 a (n=58) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
Tabela 2 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos GI, GII e degenerados obtidos de ovários de cadelas em estação reprodutivo e repouso reprodutivo Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Fase do ciclo éstrico Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado Repouso reprodutivo 55,0 +18,1 a 13,4 + 8,0 a 17,0 + 7,6 a 24,8 + 7,9 a (n=69) Atividade reprodutiva 57,7 + 9,0 a 13,5 + 8,7 a 17,4 + 7,7 a 26,5 + 8,0 a (n=38) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
Tabela 3 - Médias e desvios-padrão para número total de oócitos, oócitos de grau I, grau II e degenerados obtidos de ovários de cadelas em diferentes estados nutricionais Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Score corporal Total de oócitos Oócitos de Grau I Oócitos de Grau II Oócitos degenerado Magras 40,5 + 2,8 a 7,7 + 3,8 a 11,1 + 4,7 a 21,7 + 7,9 a (n=39) Regular 65,8+16,6 b 17,8 + 9,1 b 21,2 + 7,5 b 26,7 + 7,5 b (n=51) Obesas 62,1 + 7,9 b 13,4 + 3,7 b 18,6 + 3,6 b 30,1 + 5,7 b (n=17) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
270 Rocha AA et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 267-273 reprodutivo (Zhang et al. , 1994; Mantzoros, 2000). O desenvolvimento oocitário canino, in vivo e in vitro , Desta forma os animais em estado de sub-alimen- ainda não foi totalmente estudado, muito pouco se tação, bem como em sobre-alimentação (obesas) sabe sobre a fisiologia deste processo. Porém, os apresentam respectivamente deficiência e abundância resultados deste estudo comprovam a possibilidade da deste hormônio (Stergios Moschos et al. , 2002). presença de espermatozóides caninos induzir a Lebrethon et al. (2000) determinaram que a elevação retomada da meiose, atingindo assim a maturação na concentração plasmática de leptina acelera a oocitária in vitro . Saint-Dizier et al. (2001), freqüência dos pulsos do GnRH. Sendo que direta- mostraram que a penetração espermática in vitro mente este fato irá estimular a secreção do FSH e LH. induz o término da maturação oocitária atingindo Estes dois últimos hormônios, por sua vez, possuem consequentemente fase de metáfase II, sendo que 10% grande importância no desenvolvimento oocitário de MII já foi verificada versus 2,1% em oócitos intra-folicular, atuando diretamente na qualidade da controle sem presença de espermatozóides. célula oocitária (Hafez, 1995; Figueiredo et al. , 2002). Algumas espécies de mamíferos já estudados apresentam Em tal estudo não foram avaliadas as concentrações duas hipóteses que podem auxiliar na discussão destes plasmáticas da hormona leptina, porém os dados resultados. Eppig (2001) verificou que em oócitos de observados podem sugerir o fato de cadelas em murganhos a forte união das células do cumulus realiza condição corporal ideal ou sobre-alimentadas, logo, efeito inibitório no processo de maturação, sendo este com maior quantidade de tecido adiposo e possivel- efeito revertido no momento em que se inicia a expan- mente maior concentração plasmática de leptina, são da camada de células do cumulus . apresentarem maior número de oócitos, associado a Por outro lado, Hay (1996) cita que vários autores elevação direta da qualidade destas estruturas. descreveram o fato da interação entre esperma- tozóides e a zona pelúcida dos oócitos estimular a Experiência II síntese do fator promotor da maturação (MPF) no citoplasma oocitário. Estes estudos foram realizados A ANOVA realizada neste trabalho determinou que os em bovinos (Hay, 1996). grupos tratados, consequentemente que sofreram Desta forma, o resultado deste estudo leva a crer que influência da presença de espermatozóides durante o contato do espermatozóide canino estimule a algum momento do processo de maturação, atingiram retomada da meiose, induzindo a separação das taxas maiores de MIV, se comparados com o células do cumulus e consequentemente a maturação grupo controle, o qual não passou por co-incubação in vitro . Durante o processo de fertilização oocitária, espermática (P<0,05). em situação in vivo ou in vitro , como verificada neste Neste experiência foram utilizados 748 oócitos, estudo, o espermatozóide canino necessita ultrapassar provenientes de 82 cadelas em idade matura, condição a barreira fisiológica formada pela compactação das corporal regular e em anestro, divididos nos seguintes células do cumullus ao redor do oócito. A expansão grupos: 178 (grupo controle), 196 (grupo SPZ 48), desta camada induzida pela passagem do esperma- 203 (grupo SPZ 24) e 171 (grupo SPZ 0) de forma tozóide, seja por ação enzimática das reações acrosso- aleatória a 38,5 ºC em atmosfera de 5% CO 2 em ar. mais ou mecânicas, concorda com estudos já citados Sendo que apenas os oócitos que atingiram MII foram de Eppig (2001), que verificou esta ação em considerados maturados. A Tabela 4 mostra as médias murganhos. Este fato sugere que a ativação do processo e desvios encontrados em cada grupo de tratamento e de maturação possivelmente seja influenciada pela cada situação de divisão meiótica (oócitos maturos e presença espermática em oócitos caninos, devido a imaturos). ação de expansão das células do cumulus .
Tabela 4 - Médias reais e desvios-padrão para número de oócitos degenerados ou não identificados, imaturos e maturos (MII) nos grupos controle e tratados com espermatozóides Médias e desvio-padrão das diferentes classes de oócitos Tratamento % degenerados % oócitos em diferentes estádios de MIV Não identificados Imaturos Maturos (MII) Controle 30,35 + 14,02 a 64,75 + 11,91 a 4,91 + 4,76 a (n=178) SPZ 48 18,15 + 10,97 b 55,66 + 16,71 a 26,19 + 18,57 b (n=196) SPZ 24 15,51 + 6,70 b 60,13 + 16,87 a 24,36 + 13,27 b (n=203) SPZ 0 20,58 + 8,77 b 59,46 + 14,06 a 19,96 + 17,89 b (n=171) A avaliação deve ser seguida em colunas, onde letras diferentes determinam que houve variação estatística entre os dados analisados (P<0,05).
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Além disso, a idéia de que o amadurecimento do Figueiredo JR, Rodrigues APR, Amorim CA (2002). núcleo da célula espermática esteja relacionado com a Manipulação de oócitos inclusos em folículos ováricos elevação da concentração de MPF dentro do pré-antrais - Moifopa. In: Gonçalves PBD, Figueiredo ooplasma, também concorda com os resultados JR, Freitas VJF Biotécnicas aplicadas à reprodução obtidos, indicando que a interação estimulada pelo animal. São Paulo, Varela: 227-260. Hafez ESE (1995). Hormônios, fatores de crescimento e espermatozóide de cão pode controlar fatores reprodução. In: Hafez, E.S.E. Reprodução animal. São citoplasmáticos dos gametas femininos. Mesmo sem Paulo, Manole, 59-94. as mensurações das concentrações de MPF intra-ooci- Hay MA (1996). Canine gametes – evaluation of oocyte tária, a concordância dos fatos sugere que como maturation and penetrating potential of spermatozoa verificado na espécie bovina (Hay, 1996), em cães o pre-freeze and post-thaw. Doctoral thesis – Toronto, The contato entre células do cumulus e espermatozóide Faculty of Graduate Studies of The University of também possa elevar as taxas de maturação na espécie. Guelph, 182. Para confirmação de tal fato porém, são necessários Hay MA, King WA, Gartley CJ, Leibo SP, Goodrowe KL maiores estudos que determinem as concentrações dos (1997). Canine spermatozoa – cryopreservation and eva fatores que promovem a maturação e sua ocorrência e of gamete interaction. Theriogenology, 48(8): 1329- aumento em células imaturas que permanecem na 1342. Hewitt DA e England GCW (1997a). The canine oocyte presença de espermatozóides. penetration assay; its use as an indicator of dog sperma- Os valores médios obtidos para a MIV dos oócitos na tozoal performance in vitro . Ani Reprod Sci, 50: forma convencional (apenas em meios de cultivo 123-139. suplementados) foram de 4,9% em média. Esta taxa é Hewitt DA, England GCW (1997b). Effect of preovulatory bastante semelhante com o que boa parte da literatura endocrine events upon maturation of oocytes of domes- descreve (Hay, 1996; Hewitt e England, 1998a; Hewitt tic bitches. J Reprod Fert, Supp 51: 83-91. e England, 1998b; Vannucchi, 2003). Hewitt DA, England GCW (1998a). The effect of oocyte Sabe-se também que mesmo com os resultados obtidos size and bitch age upon oocyte nuclear maturation in nos grupos tratados (em média 23,5% de MIV), este vitro . Theriogenology, 49: 957-966. estudo encontra-se bastante distantes do sucesso que a Hewitt DA, England GCW (1998b). An investigation of técnica apresenta em outras espécies. Porém, para capacitation and the acrossome reaction in dog sperma- tozoa using a dual fluorescent staining technique. Ani espécie canina este resultado pode ser considerado Reprod Sci, 51: 321-332. como um grande avanço na biotecnologia aplicada a Jonhston SD, Kustritz MRV, Olson PNS (2001). The canine reprodução de carnívoros. estrous cycle. In: Jonhston SD, Kustritz MRV, Olson PNS. Canine and Feline Theriogenology. Philadelphia, W.B. Saunders: 16-31. Conclusão Kealy D (2002). Effects of a diet restriction on life span and age-related changes in dogs. J Am Vet Med, 220: Os resultados obtidos neste estudo permite concluir 1315-1320. que a elevação das taxas de MIV de oócitos de cadelas Laflamme DP (1997). Development and a validation of a domésticas, é possível com adequação da técnica, body condition score system for dogs. Canine Practice, onde oócitos ainda imaturos podem ser incubados 22: 10-15. Lebrethon MC, Vandersmissen E, Gerard A, Parent AS, com espermatozóides caninos, sendo que, este fato Junien JL, Bourguignon JP (2000). in vitro stimulation eleva significantemente as taxas de maturação in vitro . of the prepubertal rat gonadotropin-releasing hormone Além disso, a idade das cadelas dadoras de ovários, pulse generator by leptin and neuropeptide Y through bem como a condição corporal em que esta fêmea se distinct mechanisms. Endocrinology, 141: 1464-1469. encontra, influencia na quantidade de oócitos de melhor Mantzoros CS (2000). Role of leptin in reproduction. Ann qualidade, conferindo maior índice de oócitos viáveis NY Acad Sci, 900: 174-183. para técnica de MIV. Mawby D, Bartges JW, Moyers T (2001). Comparison of a body fat estimates by dual-energy x-ray absorptiometry and deuterium oxide dilution in client owned dogs. Bibliografia Compendium of continuing education, 23(9A): 70. 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RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Perfil de susceptibilidade a antibióticos de agentes etiológicos de mastite subclínica bovina em Portugal
Antimicrobial susceptibility traits of subclinical bovine mastitis pathogens in Portugal
Sandro F. Nunes*, Lina M. Cavaco, Cristina L. Vilela e Ricardo Bexiga
Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon). Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa
Resumo: A mastite bovina permanece a razão mais frequente cefazolin, cefoperazone, cefquinome, aminosidine, strepto- para a utilização de antibióticos nas explorações leiteiras. A mycin, gentamycin, sulfamethoxazole/trimethoprim, rifaximin escolha do fármaco a administrar é geralmente empírica, and colistin. Overall, cefazolin (91.0%) and the association baseada na sua disponibilidade para administração intra- amoxicillin/clavulanate (90.2%) revealed higher in vitro mamária e reflete a experiência adquirida do Médico efficacy. Cephalosporins were the antimicrobial group showing Veterinário. Informação relativa às susceptibilidades dos better results, including Gram negative microrganisms. High microrganismos isolados em diferentes regiões geográficas levels of in vitro resistance to penicillin and ampicillin were assume uma crescente importância. Este trabalho visou a found for Gram positive pathogens, especially against avaliação da susceptibilidade a 12 fármacos, por difusão em Staphilococcus aureus and Streptococcus agalactiae . Globally, disco, de 234 isolados contagiosos e ambientais de mastite the high number of resistances found in this study, when subclínica, obtidos em explorações da zona centro de Portugal, compared to other countries, may reflect the selective pressure no período compreendido entre 2000 e 2003. Os fármacos on resistant strains due to misguided antibiotherapies. testados foram: penicilina, ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefazolina, cefoperazona, cefquinoma, aminosidina, estreptomicina, gentamicina, sulfametoxazole/trimetoprima, rifaximina e colistina. No total dos isolados testados, cefazolina Introdução (91,0%) e a associação amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) revelaram a maior eficácia in vitro . As cefalosporinas A mastite permanece como a patologia de maior constituíram o grupo de fármacos com os melhores resultados, inclusivamente contra microrganismos Gram negativos. Níveis impacto económico nas explorações de bovinos elevados de resistência in vitro a penicilina e ampicilina foram leiteiros. A forma subclínica de infecção, apesar de observados para microrganismos Gram positivos, particular- menos evidente para o produtor do que a clínica, é a mente face a Staphilococcus aureus e Streptococcus agalactiae . que mais afecta o rendimento económico da produção De uma forma global, o maior número resistências encontrado de leite. O impacto das mastites subclínicas deriva da neste estudo, em comparação com outros países, poderá ser reflexo da pressão selectiva sobre estirpes resistentes devidas a diminuição do nível de produção e qualidade do leite, antibioterapias mal direccionadas. particularmente por aumento do número de células somáticas, constituindo igualmente a razão mais Summary: Bovine mastitis remains the main reason for frequente para a administração de antibióticos em antibiotic use in dairy farms. Antimicrobial drug selection is bovinos leiteiros (Hillerton e Berry, 2005). usually empirical, based on the drug availability for intramam- mary administration and reflects the previous experience of the Questões de saúde pública, principalmente as Veterinarian. Information regarding susceptibility of the micror- relacionadas com a presença de resíduos e a dissemi- ganisms isolated in different geographic regions has become of nação de resistências bacterianas aos antibióticos, major importance. The present work aimed at assessing the determinaram recomendações para uma redução susceptibility to 12, through disc diffusion, drugs of 234 gradual da utilização de antibióticos em medicina contagious and environmental mastitis pathogens from subclinical mastitis cases, isolated in dairy farms from the veterinária (WHO, 2001). A identificação dos agentes central region of Portugal, from 2000 to 2003. The drugs tested etiológicos de qualquer infecção e a avaliação do seu were: penicillin, ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, perfil de sensibilidade a fármacos antimicrobianos torna-se assim essencial para a adequada selecção da antibioterapia a instituir (Gentilini et al. , 2002). No entanto, e no caso específico de mastite, este *Correspondência: [email protected] procedimento nem sempre é passível de ser adoptado Tel: +351 213652800, ext. 1263; Fax: +351 213652882 pelo clínico assistente da exploração, sobretudo pela
275 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 morosidade associada ao processo. É frequente a gentamicina 10 µg (CN), penicilina 10 U (P) e decisão de antibioterapia imediatamente após a sulfametoxazole/trimetoprima 25 µg (SXT) produzidos detecção de infecção clínica, bem como a adminis- pela Oxoid ® e cedidos pela Intervet/Schering-Plough; tração de antibióticos de forma preventiva, aquando colistina 10 µg (CL), fornecidos pela BBL ™; rifaximina do período de secagem dos animais. 40 µg (RAX), produzidos pela Mast Diagnostics ™ ™ e A escolha sobre o fármaco a utilizar é geralmente cedidos pela Univete; e aminosidina 60 µg (AN), tomada de forma empírica, com base na experiência cedidos pela Ceva Saúde Animal. A escolha dos prévia adquirida do clínico e nos resultados de estudos fármacos teve por base a sua disponibilidade no mer- realizados em outros países. A disponibilidade dos cado português, para administração intramamária em fármacos de novas gerações, com um maior amplo bovinos leiteiros. espectro de acção, surge como uma alternativa fácil, associada a uma maior probabilidade de sucesso Teste de sensibilidade a antibióticos terapêutico. No entanto, a selecção de estirpes com A susceptibilidade aos diferentes antibióticos foi resistências a antibióticos é um processo rápido, pelo avaliada pelo método de difusão em disco, de acordo que a utilização deste tipo de fármacos não deverá ser com as normas instituídas pelo Clinical and considerado para uma primeira escolha terapêutica. Laboratory Standards Institute (CLSI, 2002) para Existem, em vários países Europeus, recomendações testes de susceptibilidade a antibióticos de bactérias fundamentadas para a primeira e segunda escolhas do de origem veterinária. Cada isolado foi propagado em princípio activo a utilizar em terapêutica de mastites placas de agar Mueller-Hinton (Oxoid ®) ou Mueller- (Vaarst et al. , 2002). No entanto, a extrapolação de Hinton suplementado com 5% de sangue desfibrinado informação obtida em outros países, com práticas de carneiro (Biomérieux ®) dependendo do seu género. clínicas e de maneio diferentes, deverá ser cautelosa- Após aposição dos discos impregnados com os fárma- mente considerada. É assim essencial o conhecimento cos sobre as placas, estas foram incubadas a 37 ºC de quais os principais agentes etiológicos de mastite durante 24 horas em aerobiose. em Portugal e do seu perfil de susceptibilidade aos Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento fármacos antimastíticos. obtidos foram registados e comparados com os limites O presente trabalho visou avaliar o perfil de de sensibilidade definidos para isolados de origem susceptibilidade de isolados de mastites subclínicas, veterinária (CLSI, 2002). Nos casos omissos, foram obtidos em 12 explorações do centro de Portugal entre adoptados os limites de sensibilidade recomendados 2000 e 2003, face aos fármacos disponíveis no pelos fabricantes dos discos. mercado nacional para terapêutica de mastites. Análise estatística Material e métodos Para efeitos de análise estatística os isolados testados que apresentaram um perfil de sensibilidade Isolados bacterianos intermédia foram considerados como resistentes. Diferenças observadas entre perfis de sensibilidade Um total de 234 isolados de mastite subclínica foram avaliadas por Teste de Friedman e Qui-quadrado bovina foi incluído neste estudo, agrupado de acordo (α≤ 0,05). A análise dos dados foi elaborada recorrendo com a epidemiologia da infecção: microrganismos de ao programa SPSS versão 12.0. natureza contagiosa (35 Staphylococcus aureus , 61 Streptococcus agalactiae , 9 Streptococcus dysgalactiae ) e ambiental (68 Staphylococcus coagulase -negativos Resultados SCN, 51 Streptococcus spp. e 10 bacilos Gram negativos). Os isolados estudados, obtidos de amostras de leite Os padrões de sensibilidade in vitro dos 234 isola- de quartos com mastite subclínica detectada através dos de natureza contagiosa e ambiental, estabelecidos do Teste Californiano de Mastites ( +++ ), foram recolhi- com base na avaliação dos halos de inibição de cresci- dos em 12 explorações comerciais leiteiras do mento dos 12 princípios activos testados, são apresen- Ribatejo-Oeste durante o período de 2000 a 2003 tados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. No total dos (Bexiga et al. , 2005). Após isolamento e identificação isolados testados, cefazolina (91,0%) e a associação bioquímica (API System, BioMérieux), procedeu-se à amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) apresentam a sua preservação a -70 ºC. maior eficácia in vitro , seguidas de cefquinoma (78,3%), cefoperazona (76,5%) e rifaximina (72,2%). Fármacos Nenhum dos grupos de isolados testados apresentou Os fármacos testados foram: amoxicilina/ácido susceptibilidades significativamente diferentes entre clavulânico 30 µg (AMC), ampicilina 10 µg (AMP) si face a P e AMP. Ambos os princípios activos exibem cefazolina 30 µg (KZ), cefoperazona 75 µg (CFP), reduzida eficácia contra Staph. aureus , Strep. agalac- cefquinoma 10 µg (CEQ), estreptomicina 10 µg (S), tiae e SCN (< 40% de isolados sensíveis) e apenas
276 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 isolados de Strep. dysgalatiae e Streptococcus spp. Os países nórdicos possuem recomendações apresentam níveis superiores de sensibilidade. nacionais para um uso controlado destes fármacos, Em oposição, os restantes antibióticos beta-lactâmi- particularmente em casos de mastite bovina. Estas cos apresentam a maior eficácia, especialmente face a preconizam a administração parenteral de um número isolados ambientais. A associação AMC apresenta boa muito reduzido de fármacos, preferencialmente peni- eficácia relativamente a todos os isolados particular- cilina G (Hillerton e Berry, 2005). A vantagem da mente contra bactérias do género Streptococcus . As administração sistémica face à terapêutica local pode cefalosporinas constituem o grupo de fármacos com ser explicada, em parte, pelo seu efeito colateral em maior eficácia contra os isolados testados, inclusiva- infecções subclínicas eventualmente presentes em mente contra Gram negativos. outros quartos e pela melhor difusão do fármaco na Os aminoglicosídeos AN e CN revelam bons níveis presença de coágulos ou micro-abcesso que impedem de inibição do crescimento dos isolados testados, com a sua progressão pela via intramamária, diminuindo a excepção de Streptococcus spp. Apresentam ainda os assim a incidência de novos casos. melhores resultados relativamente a Gram negativos. As decisões terapêuticas são geralmente empíricas e Pelo contrário, S apresenta um dos maiores níveis baseiam-se nas experiências anteriores de sucesso no de resistências. A maior eficácia é obtida contra SCN, tratamento para a exploração em questão. Raramente apenas com 30,9% de isolados sensíveis. o veterinário tem informação sobre a identificação do SXT e RAX apresentam níveis médios de sensibili- agente patogénico e respectivo padrão de sensibilidade dade. SXT apresenta o segundo melhor valor contra para o guiar na decisão terapêutica (Owens et al. , Staph. aureus e uma boa eficácia contra microrganismos 1997). Gram negativos. RAX apresenta melhores resultados Discrepâncias expressivas na prevalência, incidência que SXT, face a bactérias Gram positivas, com excepção de e antibioresistências dos agentes patogénicos da mas- Staph. aureus . tite têm sido identificadas e descritas, limitando uma Cl apresenta, quando considerado o total dos possível extrapolação dos perfis de susceptibilidade isolados, os níveis mais baixos de sensibilidade, com dos agentes contagiosos e ambientais entre os vários apenas 9,4% de isolados sensíveis. Considerando países. apenas os microrganismos Gram negativos, apenas A prevalência de mastites de origem contagiosa, 50% destes é sensível a CL. causadas por Staph. aureus , Strep. agalactiae e Strep. dysgalactiae , permanece elevada em Portugal em comparação com outros países (Myllys et al. , 1998; Discussão Bradley, 2002; Schlegelova et al. , 2002; Bexiga et al. , 2005). Mais preocupante ainda é o facto de não se A utilização de antibióticos no tratamento de terem verificado alterações expressivas nas espécies e mastite tem-se tornado uma importante fonte de frequência de isolados, em relação aos referidos há discussão, e por vezes mesmo discórdia, como conse- mais de 20 anos na mesma área geográfica (Atalaia, quência da crescente preocupação com o uso prudente 1983; Bexiga et al. , 2005). No Reino Unido, verifica-se destes fármacos em animais. que as infecções por Strep. agalactiae se encontram Devido à diversidade de agentes etiológicos de mas- controladas e que as causadas por Staph. aureus se tite, foram desenvolvidas estratégias de controlo encontram em declínio. Pelo contrário, observa-se um baseadas na minimização da exposição do úbere a aumento de infecções causadas por agentes ambien- agentes patogénicos, dos quais se salienta o plano de tais, especialmente Gram negativos e Strep. uberis controlo dos 5 pontos (Neave et al. , 1966). Deste (Bradley, 2002; Hillerton e Berry, 2005). Cenário plano, fazem parte a utilização e manutenção ade- semelhante verifica-se na Finlândia e França, com quadas das salas de ordenha, a desinfecção dos tetos tendência para a diminuição de mastites devidas a após a ordenha ( post-dip ), o tratamento das mastites agentes contagiosos em oposição às causadas por clínicas durante a lactação, o refugo de animais afec- agentes ambientais (Myllys et al. , 1998; Guerin- tados por mastites crónicas e a antibioterapia de Faublee et al. , 2003; Pitkala et al. , 2004). secagem. Contudo, ocorrem invariavelmente novos De acordo com a maioria dos dados referidos na casos de mastite e o uso de fármacos antimicrobianos literatura disponível, não têm ocorrido alterações assume um papel importante no seu controlo. significativas das susceptibilidades a antibióticos dos Em Portugal, Reino Unido e na maioria dos países agentes patogénicos de mastite. No entanto, são Europeus, o tratamento da mastite é feito por adminis- frequentemente referidas diferenças entre os perfis de tração intramamária de fórmulas farmacêuticas resistência dos microrganismos, em função da locali- contendo um ou mais antibióticos, por vezes associados zação geográfica das explorações a partir das quais a corticosteróides. Outras vias de administração são foram isolados (Owens et al. , 1990; Owens et al. , reservadas apenas para o tratamento de mastite clínica 1997; Watts and Salmon, 1997; Myllys et al. , 1998; severa ou infecções crónicas de Staph. aureus (Serieys Salmon et al. , 1998; De Oliveira et al. , 2000; Erskine et al. , 2005). et al. , 2002; Pitkala et al. , 2004). Informação sobre
277 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 incidência e prevalência dos agentes patogénicos foram testados representantes de 3 gerações distintas: envolvidos localmente, respectivos perfis de sensibili- KZ representante da 1ª, CFP da 3ª e CEQ da 4ª. Os dade a fármacos antimicrobianos tem-se tornado resultados obtidos mostram uma elevada eficácia de decisiva na escolha do fármaco a administrar no todas elas contra microrganismos Gram positivos e tratamento e controlo de mastite bovina. Gram negativos. De realçar que KZ, uma cefalosporina Os resultados obtidos neste estudo permitem de 1ª geração cujo espectro de acção é direccionado estabelecer um perfil generalizado das sensibilidades predominantemente para as bactérias Gram positivas, a antibióticos dos isolados obtidos de mastite sub- mostrou-se eficaz face a 40% dos isolados Gram clínica bovina da região Ribatejo-Oeste. negativos. Entre os fármacos mais utilizados para o controlo de A elevada sensibilidade de Strep. dysgalactiae às infecções intramamárias bovinas, encontram-se os cefalosporinas, assim como à maioria dos antibióticos antibióticos beta-lactâmicos, que se podem considerar testados com acção para microrganismos Gram divididos em dois grandes sub-grupos: penicilinas e positivos, está de acordo com o descrito na literatura cefalosporinas. Analisando os resultados obtidos face (Owens et al. , 1990; Owens et al. , 1997; Erskine et al. , a estes fármacos, verificaram-se diferenças significa- 2002; Rossitto et al. , 2002). tivas entre a susceptibilidade a penicilinas, P e AMP, e Os aminoglicosídeos têm como espectro de acção aos restantes fármacos: AMC e cefalosporinas. Estas bactérias Gram negativas. Entre os três fármacos diferenças poderão ser devidas à produção de beta-lac- testados, o maior número de resistências verificou-se tamases pelos isolados, especialmente do género em relação a S, com apenas 10 isolados Gram Staphylococcus, frequente em isolados de mastite negativos susceptíveis. Apesar do seu espectro de (Watts e Salmon, 1997; De Oliveira et al. , 2000). A acção, S revelou-se menos eficaz face a bactérias elevada eficácia verificada para a associação Gram-negativas do que face a SCN. No entanto, o amoxicilina e ácido clavulânico, um inibidor de reduzido número de isolados Gram negativos testados beta-lactamases, contra Staph. aureus e restantes poderá ter originado uma distorção dos resultados, SCN, suporta esta hipótese. Os resultados obtidos no pelo que deverão ser realizados estudos com base presente estudo diferem da maioria dos dados publica- numa maior amostragem de microrganismos Gram dos, que referem para staphylococci isolados de negativos. mastite uma baixa resistência a P e AMP (Watts et al. , AN e CN apresentam eficácia elevada relativamente 1995; Owens et al. , 1997; Costa et al. , 2000; De aos isolados Gram negativos (80%) mas também contra Oliveira et al. , 2000; Gentilini et al. , 2000; Erskine et Staph. aureus e SCN, com taxas de sensibilidade al. , 2002). O espectro de acção destes fármacos, próximo ou acima de 70%. Este valor é ligeiramente dirigido a microrganismos Gram positivos, justifica a inferior ao verificado em outros países (Costa et al. , sua ineficácia face a isolados Gram negativos. 2000; Gentilini et al. , 2000; Erskine et al. , 2002). As cefalosporinas são categorizadas em gerações, Apesar destes bons resultados, AN não está corrente- de acordo com o seu espectro de acção. Neste estudo, mente disponível como preparação intramamária no
Tabela 1 - Percentagens de susceptibilidade de agentes Tabela 2 - Percentagens de susceptibilidade de agentes ambien- contagiosos a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico tais a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), (AMC), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), cefquino- cefquinoma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), ma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), gentamicina gentamicina (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), rifaximina (RAX) rifaximina (RAX) e colistina (CL). e colistina (CL). % Susceptibilidade – Agentes contagiosos % Susceptibilidade – Agentes contagiosos Staph. Strep. Strep. Total SCN Streptococcus Gram Total aureus agalactiae dysgalactiae spp. negativos (n=35) (n=61) (n=9) (n=105) (n=68) (n=51) (n=10) (n=129) AMP 28,6 34,4 88,9 37,2 AMP 36,8 60,8 0 43,4 P 28,6 21,3 77,8 28,6 P 39,7 54,9 0 42,6 AMC 82,9 98,4 100 93,4 AMC 85,3 100,0 40 87,6 KZ 94,3 96,8 100 96,2 KZ 86,8 98,0 30 86,8 CFP 37,1 88,7 100 72,5 CFP 79,4 86,3 50 79,8 CEQ 80,0 74,2 100 78,3 CEQ 76,5 88,2 40 78,3 AN 71,4 8,2 44,5 32,4 AN 85,3 31,4 80 63,6 S 5,7 1,6 0 2,8 S 30,9 2,0 10 17,8 CN 71,4 6,6 33,4 30,5 CN 69,1 37,3 80 57,4 SXT 91,4 35,5 66,7 56,8 SXT 64,7 56,9 80 62,8 RAX 77,1 54,1 77,8 63,8 RAX 89,7 76,5 20 79,1 CL 0 3,2 11,1 2,8 CL 19,1 2,0 50 14,7
278 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 mercado europeu, inviabilizando a sua utilização. mos Gram positivos de origem ambiental, verificamos A susceptibilidade dos isolados face a SXT que a maioria dos fármacos com um espectro de acção contrasta com o descrito na literatura. Embora a adequado se revelou eficaz, à excepção de P e AMP. elevada eficácia contra Staph. aureus esteja de acordo Uma vez mais, estes resultados reforçam a necessi- com o descrito na bibliografia, a susceptibilidade de dade do conhecimento dos perfis de sensibilidade dos Strep. dysgalactiae (66,7%) e bactérias Gram negativas isolados nacionais, a fim de evitar a extrapolação de (80%) encontram-se abaixo do descrito com uma dados referentes a outros países que podem sugerir susceptibilidade de aproximadamente 96% (Erskine et terapêuticas menos adequadas. al. , 2002). De uma forma global, o maior número de isolados A ansamicina RAX é um antibiótico semi-sintético resistentes encontrados neste estudo poderá reflectir a de largo espectro, indicado para administração intra- existência de práticas de antibioterapia incorrecta- mamária e intra-uterina em bovinos de leite. Os mente dirigidas, que acarretam uma pressão de estudos de susceptibilidade para isolados de origem selecção sobre estirpes resistentes. Este facto tem veterinária são ainda raros, sendo mesmo inexistentes sérias implicações em saúde animal, considerando relativamente a isolados de mastite bovina. A a possibilidade de dispersão horizontal de genes susceptibilidades elevadas observadas confirmam a de resistência. A proximidade entre o Homem e os abrangência do espectro de acção deste fármaco, com animais ou seus produtos tornam esta preocupação maior eficácia em relação aos Gram positivos do que extensiva à saúde pública. Também a facilidade de aos Gram negativos. acesso a antibióticos por pessoas não credenciadas, O elevado número de resistências a CL, deve-se em acentua os riscos de uma terapêutica não dirigida. Este grande medida ao seu espectro de acção restrito a aspecto apenas recentemente foi objecto de legislação, bacilos Gram negativos (Guerin-Faublee et al. , 2003). com a criação da Receita Veterinária que visa o No entanto, contrariamente ao observado anterior- controlo na prescrição de antibióticos a animais de mente em isolados de mastite (Guerin-Faublee et al. , produção. 2003) apenas 50% dos bacilos Gram negativos se No entanto, pensamos que um dos principais mostraram susceptíveis a este fármaco, valor inferior factores que contribuirá para o estabelecimento de ao verificado relativamente a AN, CN e SXT. medidas adequadas de controlo de mastites é o De um modo geral, os isolados mais prevalentes na conhecimento dos perfis de susceptibilidade dos região do Ribatejo-Oeste, testados neste estudo, agentes etiológicos locais, sendo necessária a realização apresentam valores de susceptibilidade inferiores aos e publicação de estudos realizados noutras regiões de verificados noutros países (Owens et al. , 1990; Watts Portugal. Uma vez conhecido o panorama nacional, et al. , 1995; Myllys et al. , 1998; De Oliveira et al. , será possível aos clínicos responsáveis pelas explo- 2000; Gentilini et al. , 2002; Guerin-Faublee et al. , rações uma escolha fundamentada do fármaco a 2002; Rossitto et al. , 2002; Yoshimura et al. , 2002; utilizar, reduzindo o insucesso terapêutico e, simul- Guerin-Faublee et al. , 2003; Rajala-Schultz et al. , taneamente, a utilização de antibióticos. 2004; Luthje and Schwarz, 2006). Considerando o grupo de isolados responsáveis por mastites de natureza contagiosa, verifica-se uma baixa percentagem Agradecimentos de agentes sensíveis a P e AMP, o que inviabiliza a adopção das recomendações dos países nórdicos. O presente estudo foi financiado pelo Centro de Inclusivamente em relação a Strep. agalactiae , que é Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal referido com sendo sempre sensível a P, foram (CIISA) da Faculdade de Medicina Veterinária, e pela encontradas resistências in vitro em 78,7% dos Fundação de Ciência e Tecnologia – Projecto isolados. Também em Staph. aureus foram encontrados POCTI/CA/1995/95/2003. elevadas percentagens de resistências o que, aliado Os autores agradecem à Ceva Saúde Animal, ao facto de este microrganismo poder assumir uma Intervet/Schering-Plough e Univete a cedência de localização intracelular e assim evadir-se às defesas discos com antibióticos. Os autores agradecem ainda do animal e resistir à antibioterapia, corrobora a aos produtores envolvidos no estudo. necessidade de considerar o refugo de animais com mastites crónicas, de acordo com o plano de controlo dos 5 pontos. Bibliografia Em relação aos microrganismos ambientais, Atalaia V (1983). Contribuição para o estudo das mamites verifica-se uma diferença entre o perfil de bactérias bovinas da região do Ribatejo-Oeste. Repositório de Gram positivas e Gram negativas. Estas provocam Trabalhos do Laboratório Nacional de Investigação infecções geralmente clínicas, agudas, com uma Veterinária, 15: 95-116. expressiva componente inflamatória, e poderá ser Bexiga R, Cavaco LM, Vilela CL (2005). Mastites subclínicas bovinas na zona do Ribatejo-Oeste. Revista da Sociedade considerada a não utilização de antibióticos no seu Portuguesa de Ciências Veterinárias, 100, (553-554): controlo. Considerando então apenas os microrganis- 39-44.
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280 RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Comparing the effect of three different disbudding methods on behaviour and plasma cortisol of calves
Comparação do efeito de três métodos de descorna sobre o comportamento e o cortisol plasmatico de vitelas
George Stilwell G 1*, Miguel S. Lima 1, Donald M. Broom 2
1CIISA, Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL (TULisbon) 2Centre for Animal Welfare and Anthrozoology, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge, CB3 0ES, Reino Unido
Summary: This paper compares the effects of three disbudding foi avaliado durante a descorna, aos 15 minutos pós-descorna e methods on cortisol and behaviour of calves. We compared the antes de cada colheita de sangue. results of several studies in which thirty six calves were Durante o procedimento HI debateu-se mais do que qualquer disbudded in the following way: five scoop disbudded (S); outro grupo e S debateu-se mais do que CP, ND-CP, ND-HI. seven hot-iron disbudded (HI), eight caustic paste disbudded Não houve diferença no cortisol entre grupos antes da descorna (CP); eight sham-disbudded with iron (ND-HI); and eight e às 24 horas. À 1, 3 e 6 horas S apresentou mais cortisol do que sham-disbudded with paste (ND-CP). Cortisol was measured 15 qualquer outro grupo. Uma hora após descorna CP e HI minutes before the procedures and 1, 3, 6 and 24 hours after mostraram cortisol mais elevado do que os grupos simulados e dehorning. Behaviour was assessed during the procedure, 15 CP tinha níveis mais elevados do HI. minutes after dehorning and before each blood sampling. Comparando com os grupos simulados, S apresentou sempre During the procedure HI showed more struggling behaviours mais sinais de dor excepto às 24 horas e mais às 6 horas than all other groups. Group S struggled more than CP, ND-HI quando comparado com os outros métodos. À 1 e 3 horas CP e and ND-CP. There was no difference in cortisol base-line and 24 HI apresentaram mais comportamentos de dor do que ND-CP e hours values between any of the groups. Compared with all ND-HI. other groups, S had higher cortisol at 1, 3 and 6 hours. At 1 hour Apesar de existir diferenças de idade entre grupos estes cortisol was higher in CP and HI compared with sham-disbudded resultados sugerem que a guilhotina causa dor intensa até and in CP compared with HI. Compared with sham-disbudded 6 horas; o ferro quente provoca dor mais intensa durante o groups, S showed more pain-related behaviours at all times procedimento; a descorna por ferro quente ou pasta causa dor except 24 hours and more pain behaviours at 6 hours compared até 3 horas, não existindo diferenças comportamentais entre with the other methods; CP and HI showed more signs than estes métodos. sham-disbudded until 3 hours. Although there were differences in age between groups, these Palavras-chave: descorna, guilhotina, ferro-quente, pasta results suggest that: scoop-disbudding causes more pain than cáustica, dor, comportamento, cortisol any other method until 6 hours; dehorning with hot-iron elicits more struggling during the procedure; hot-iron and caustic paste disbudding causes pain until 3 hours but there are no significant differences between them. Introduction
Keywords: pain, scoop, hot-iron, caustic paste, dehorning, Cattle disbudding is a routine procedure that is behaviour, cortisol considered necessary and acceptable in modern dairy farms (Stafford e Mellor, 2005; EFSA, 2006). Resumo: Este artigo compara o efeito de três métodos de descorna sobre o cortisol e comportamento de vitelas. Keeping adult horned cows in free stall dairy farms Comparámos os resultados de diversos ensaios em que 36 threatens animal and human safety and welfare vitelas foram descornadas da seguinte forma: guilhotina (S, because these animals have more potential to cause n=5); ferro quente (HI, n=7); pasta caustica (CP, n=8); descorna injury. This is evident by the wounds and various simulada com ferro (ND-HI, n=8); descorna simulada com injuries, especially problematic when the udder is pasta (ND-CP, n=8). O cortisol foi medido 15 minutos antes da descorna e à 1, 3, 6 e 24 horas pós-descorna. O comportamento affected, that are seen in dairy farms where horned animals are kept. The International Association for the Study of Pain (IASP) definition for pain is that it is "an unpleasant * Correspondência: [email protected]; Tel: +351 213652800; Fax: +351 213652810 sensory and emotional experience associated with Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária actual or potential tissue damage, or described in Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa terms of such damage" (Merskey, 1979), modified
281 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 slightly by Broom and Fraser (2007) to "an aversive further injury (Broom e Johnson, 2000; Rushen, 2000; sensation and feeling associated with actual or Mellor et al ., 2005). Head shaking, ear flicking, head potential tissue damage". It is also useful to follow the rubbing and quick transitions from standing to lying rule by which "animals should be given the benefit of have been used to assess pain following disbudding any doubt so that, where there is a choice, judgments (Morisse et al ., 1995; Graf and Senn, 1999; Vickers et should overestimate the intensity of pain to avoid al ., 2005; Stilwell, 2008; Stilwell et al ., 2008b). These missing animals in pain" (Molony and Kent, 1997). measures also have to be dealt with caution because According to these statements, we should consider cattle is a species in which concealment of vulnerability horn bud amputation or burning, by caustics or heat, and weakness seems to be adaptive (Broom, 2001; as a potentially painful procedure. Dobromylskyj et al ., 2005) and because different Pain management is sometimes ignored or forgotten animals give different responses to pain as a result of in farm animals, as it is evident in several surveys in diverse and complex factors such as age, breed, previous which practitioners report their efforts to control pain experiences, temperament etc. With cattle, very subtle after painful procedures (Whay and Huxley, 2005; signs (e.g. inert lying) may be of crucial importance Huxley and Whay, 2006; Stilwell, unpublished). while others, very important in other species, might be Although common sense and legislation (Decreto- seldom exhibited. Although the extrapolation "if it Lei nº48/2001) require cornual nerve blocking before hurts humans it must hurt animals" is advisable, the disbudding and it is well established that this simple same may not be true for the assessment of pain as it intervention is known to reduce struggling, procedure may lead to the exclusion of very specific or subtle length and appetite reduction, it is rarely performed changes in behaviours that are important for pain in dairy farms. A recent survey with practitioners evaluation (Stilwell, 2005). at the 2007 Congress of the Portuguese Buiatric The 2007 practitioners survey (Stilwell, data not Association, showed that anaesthesia and analgesia published) showed that the disbudding methods used are seldom performed for calf disbudding (Stilwell, in Portugal are: chemical disbudding with a caustic unpublished). The main reason for this is the idea that paste (80 % of farms), thermo-cautery with a hot-iron the procedure is not painful, or is only temporarily (60% of farms) and guillotine disbudding, also known painful. Other reasons may result from the belief that as scoop (12% of farms). Some farms use more than cattle are very resistant to pain, perhaps a consequence one method. of difficulty in detecting pain-related behaviours in Caustic paste disbudding is done by applying a thin these animals, or that the alleviation of pain is too layer of sodium or calcium hydroxide (pH 14) over the expensive, or that currently available drugs are not horn bud of calves under the age of 6 weeks. The efficient (Whay and Huxley, 2005; Huxley and Whay, hot-iron disbudding is done by applying for 30 to 60 2006). Although some studies (Petrie et al ., 1995; seconds a specific device, heated to over 600 ºC, over Morisse et al ., 1995; McMeekan et al ., 1998; Graf and the horn bud of 6 to 8 weeks old calves, burning the Senn, 1999; Vickers et al ., 2005) have looked at the growing tissue at its base. The scoop-disbudding is welfare of calves, following the different disbudding done by closing the sharp jaws of the tool, amputating methods, only two tried to compare the effects of the horn and tissue at its base, sometimes including hot-iron and caustic paste disbudding (Morisse et al ., the surrounding skin and bone. This method is usually 1995; Vickers et al ., 2005). used in older animals, above the age of 10 weeks. Cortisol is a physiological variable frequently used The handling and restraining of the animals also in the assessment of pain because it is well established differ according to the method used. Because calves to that stress activates the Hypothalamus-Pituitary- be paste-disbudded are small, they are easily subdued Adrenal (HPA) axis (Stott, 1981; Broom and Johnson, and forced to lie down. Animals for hot-iron or scoop 2000; Matteri et al ., 2000; Moberg, 2005). A few disbudding have to be firmly restrained because of minutes after a painful experience cortisol is released need to remain still for longer periods. and is usually kept above baseline while acute pain is The objective of this study was to compare cortisol felt. Stimuli other than pain (fear, handling, hunger, and behaviour of calves disbudded with the three anxiety, tissue damage and many other environmental methods used in Portugal (scoop, hot-iron or caustic effects) can cause an increase in plasma cortisol, so it paste), so as to try and grade them according to their is important to control these factors and to understand effects on welfare. the circadian cycle that is shared by all individuals (Broom, 1988; Harbuz and Lightman, 1992; Mellor et al ., 2005; Lane, 2006; Stilwell et al ., 2008a). Material and methods Another way to evaluate pain is to assess behaviour Experiment design modification. This can be done by objective ly measuring the incidence of pain-related behaviours Three dairy farms were selected according to the that are usually related to the effort of the animal to dehorning method used. We tried to replicate the field get rid of the pain source, to speed recovery or to avoid conditions in a way to conveniently assess the pain and
282 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 distress experienced by the calves. Handling tech- Scoop disbudding: this study was done in a single nique, operator and calf age were the ones routinely day. Five Holstein-Frisian female calves with mean used in each farm. All animals were used to human age 117±32 days were kept in concrete floored handling and regular presence in the paddocks. The paddocks. Concentrate, grass hay and water were different studies were done for several days but all permanently available. For disbudding the calves were disbudding, blood sampling and behaviour recording put into a crunch and the head was restrained with a started at 10 a.m. in similar weather conditions – clear rope. The scoop-dehorner was pushed against the head sky and mild temperatures. In each farm, animals to and rapidly closed to cut off the horn base. The proce- be disbudded or sham-disbudded were randomly dure was repeated for the other bud and took no more selected and an individual number was sprayed on than 45 seconds in total. Due to farm constraints, there both flanks. Blood sampling into a heparinised was no sham scoop-disbudded group but two other Starsted ® tube (7 ml) took place approximately 15 groups were formed to test regional anaesthesia and minutes before the disbudding and then at 1, 3, 6 and analgesia efficacy (Stilwell, 2008). 24 hours after the disbudding. Blood was immediately Hot-iron disbudding: this study was repeated with centrifuged. Plasma was then frozen at minus 20 ºC. different animals along several days. Fifteen female Cortisol was assayed in duplicate and measured by a calves with mean age 98±15 days were kept in validated solid radioimmunoassay, without extraction, concrete floored paddocks. They were already weaned using a commercial kit (Coat-A-Count; Diagnostic and were eating concentrate and alfalfa/grass hay. Product Corporation, Los Angeles, CA, USA) at the The disbudding procedure was done with the calves Faculdade de Medicina Veterinaria in Lisbon. standing and the head restrained by a head-halter. Behavioural assessment was done during the While one person gently pressed the calves against a procedure in which the degree of struggling was wall another operator applied the hot-iron to the base graded from 0 = no struggling behaviour recorded, to of each horn bud for the duration of 30 to 45 seconds. 5 = all struggling behaviours were recorded. At 15 The sham-iron-disbudding was done in the same way minutes, 1, 3, 6 and 24 hours after the disbudding the but a cold device was applied to the head. The total incidence of five different pain-related behaviours procedure took from 90 to 120 seconds and was were recorded for a period of 15 minutes. The always done by the same stockman. behaviours assessed are described in Table 1. Caustic-paste disbudding: this study was repeated Handling and blood collection was as quick and with different animals along several days. Sixteen peaceful as possible so as to reduce stress and was Holstein-Friesian female calves with mean age 25±10 done by an experienced veterinarian inside the first 30 days, kept in a large straw-bedded paddock with seconds after restrain access to a computer-controlled milk distributor and The number of animals in each group and mean age ad libitum concentrate and grass hay. These animals are presented in Table 2. were randomly allocated to treatment groups with no Each farm’s husbandry conditions and disbudding age differences: CP - caustic paste disbudded with no method used were as follows: treatment (n=8) and ND-CP - sham-disbudded (n=8).
Table 1 – Description of the behaviours recorded at disbudding and for 24 hours after the procedure Struggling at dehorning Description Hot-iron and Scoop Lifting front limbs; falling on back limbs; backing; (occurrence of any of the five behaviours were added) vocalization; open mouth. Caustic paste Trying to rise; shaking head; stretching back limbs; (occurrence of any of the five behaviours were added). vocalization; open mouth. Behaviours after dehorning Description Ear flick Flicking ears with no apparent reason (e.g. presence of flies). Head shake Shaking head. Head rub Scratch head against objects or using back leg. Transitions (lying/raising) Lying and raising hastily with no resting objective. Inert lying Sternal lying with head on flank and ignoring external stimulus.
Table 2 – Number and age (mean ±SD) of calves in each group accordingly to the disbudding method used Disbudding method Scoop Hot-iron Caustic Paste Sham-dehorned Sham-dehorned (S) (HI) (CP) (ND-HI) (ND-CP) Animals (n) 5 7 8 8 8 Age in days 117 ±33 a 98 ±15 b 25 ±10 c 76 ±11 b 31 ±5 c Different superscript letters indicate difference in age between groups for which p < 0.05
283 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288
For the disbudding, animals were forced to lie down, sham-disbudded groups at any time (always p ≥0.05). the hair around the horn bud was clipped and the paste In contrast, at 1 hour, both sham-disbudded groups was applied to each horn. Sham-paste-disbudded showed lower cortisol than S (p<0.004) and CP calves animals were handled in the same way but an inert gel (p<0.001) and group HI had higher cortisol than ND-HI was applied instead of the paste. The total procedure (p=0.002) but only showed a trend towards difference took no more than 60 seconds. (p=0.051) when compared with group ND-CP. When Two calves were removed from the study (one from comparing the different disbudding methods at 1 hour group ND-CP and one from group HI) due to respira- the S group showed higher cortisol levels compared to tory disease and the need for treatment. CP and HI groups (p=0.019 and p=0.003, respectively), and CP had higher cortisol than HI (p=0.001). At 3 and 6 hours there was still a difference between S and Statistical analysis the other disbudded groups: for CP p=0.002 and p=0.019, respectively; and for HI p=0.03 and p=0.01, Distributions of these variables were shown by respectively. Levene and Shapiro–Wilks tests to be non-normal, so The different pain-related behaviour’s incidence for non-parametric analyses were used. Differences the various groups is shown in Table 3. Struggling was between the five groups at each time were determined significantly higher in the HI group than in any of the by the Mann–Whitney U-test following a Kruskal– other groups (p<0.01) and group S struggled more –Wallis one-way analysis of variance. P-values less than both sham-disbudded and the CP animals than 0.05 were considered significant. SPSS ® for (p<0.05). In contrast there were no differences in Windows (version 14) was used for the analysis. struggling between sham-disbudded groups and caus- tic paste disbudded animals (p>0.491). The S group showed more pain behaviours than Results sham-disbudded at all times (p<0.001) except at 24 hours but only at 6 hours when compared with the two There was a difference in ages between the other disbudded groups (CP p=0.03 and HI p=0.048). disbudded groups (Table 2) but not between the two The HI group showed more behaviours than the ND- hot-iron groups (HI and ND-HI) and the two caustic HI at 15 minutes, 1 hour and 3 hours (at 6 hours there paste groups (CP and ND-CP). was a trend with p=0.054) and more behaviours than Comparing cortisol values at each moment (Figure ND-CP at all times except at 24 hours. The group CP 1) we found that there were no differences between showed higher incidence of pain-related behaviours groups at –15 minutes (baseline) or at 24 hours when compared to both sham-disbudded groups at 15 (p=0.669 and 0.126, respectively). Additionally, minutes and 1 hour and at 3 hours when compared there were no differences in cortisol between the two with ND-HI.
Figure 1 – Mean ±SD plasma cortisol of calves disbudded by different methods
S - Scoop; HI - hot-iron; CP - caustic paste; ND-HI – sham-disbudded with iron; ND-CP – sham-disbudded with paste. Different superscript letters in each period of time indicate difference between groups for which p < 0.05
284 RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Perfil de susceptibilidade a antibióticos de agentes etiológicos de mastite subclínica bovina em Portugal
Antimicrobial susceptibility traits of subclinical bovine mastitis pathogens in Portugal
Sandro F. Nunes*, Lina M. Cavaco, Cristina L. Vilela e Ricardo Bexiga
Centro Interdisciplinar de Investigação em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon). Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa
Resumo: A mastite bovina permanece a razão mais frequente cefazolin, cefoperazone, cefquinome, aminosidine, strepto- para a utilização de antibióticos nas explorações leiteiras. A mycin, gentamycin, sulfamethoxazole/trimethoprim, rifaximin escolha do fármaco a administrar é geralmente empírica, and colistin. Overall, cefazolin (91.0%) and the association baseada na sua disponibilidade para administração intra- amoxicillin/clavulanate (90.2%) revealed higher in vitro mamária e reflete a experiência adquirida do Médico efficacy. Cephalosporins were the antimicrobial group showing Veterinário. Informação relativa às susceptibilidades dos better results, including Gram negative microrganisms. High microrganismos isolados em diferentes regiões geográficas levels of in vitro resistance to penicillin and ampicillin were assume uma crescente importância. Este trabalho visou a found for Gram positive pathogens, especially against avaliação da susceptibilidade a 12 fármacos, por difusão em Staphilococcus aureus and Streptococcus agalactiae . Globally, disco, de 234 isolados contagiosos e ambientais de mastite the high number of resistances found in this study, when subclínica, obtidos em explorações da zona centro de Portugal, compared to other countries, may reflect the selective pressure no período compreendido entre 2000 e 2003. Os fármacos on resistant strains due to misguided antibiotherapies. testados foram: penicilina, ampicilina, amoxicilina/ácido clavulânico, cefazolina, cefoperazona, cefquinoma, aminosidina, estreptomicina, gentamicina, sulfametoxazole/trimetoprima, rifaximina e colistina. No total dos isolados testados, cefazolina Introdução (91,0%) e a associação amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) revelaram a maior eficácia in vitro . As cefalosporinas A mastite permanece como a patologia de maior constituíram o grupo de fármacos com os melhores resultados, inclusivamente contra microrganismos Gram negativos. Níveis impacto económico nas explorações de bovinos elevados de resistência in vitro a penicilina e ampicilina foram leiteiros. A forma subclínica de infecção, apesar de observados para microrganismos Gram positivos, particular- menos evidente para o produtor do que a clínica, é a mente face a Staphilococcus aureus e Streptococcus agalactiae . que mais afecta o rendimento económico da produção De uma forma global, o maior número resistências encontrado de leite. O impacto das mastites subclínicas deriva da neste estudo, em comparação com outros países, poderá ser reflexo da pressão selectiva sobre estirpes resistentes devidas a diminuição do nível de produção e qualidade do leite, antibioterapias mal direccionadas. particularmente por aumento do número de células somáticas, constituindo igualmente a razão mais Summary: Bovine mastitis remains the main reason for frequente para a administração de antibióticos em antibiotic use in dairy farms. Antimicrobial drug selection is bovinos leiteiros (Hillerton e Berry, 2005). usually empirical, based on the drug availability for intramam- mary administration and reflects the previous experience of the Questões de saúde pública, principalmente as Veterinarian. Information regarding susceptibility of the micror- relacionadas com a presença de resíduos e a dissemi- ganisms isolated in different geographic regions has become of nação de resistências bacterianas aos antibióticos, major importance. The present work aimed at assessing the determinaram recomendações para uma redução susceptibility to 12, through disc diffusion, drugs of 234 gradual da utilização de antibióticos em medicina contagious and environmental mastitis pathogens from subclinical mastitis cases, isolated in dairy farms from the veterinária (WHO, 2001). A identificação dos agentes central region of Portugal, from 2000 to 2003. The drugs tested etiológicos de qualquer infecção e a avaliação do seu were: penicillin, ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, perfil de sensibilidade a fármacos antimicrobianos torna-se assim essencial para a adequada selecção da antibioterapia a instituir (Gentilini et al. , 2002). No entanto, e no caso específico de mastite, este *Correspondência: [email protected] procedimento nem sempre é passível de ser adoptado Tel: +351 213652800, ext. 1263; Fax: +351 213652882 pelo clínico assistente da exploração, sobretudo pela
275 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 morosidade associada ao processo. É frequente a gentamicina 10 µg (CN), penicilina 10 U (P) e decisão de antibioterapia imediatamente após a sulfametoxazole/trimetoprima 25 µg (SXT) produzidos detecção de infecção clínica, bem como a adminis- pela Oxoid ® e cedidos pela Intervet/Schering-Plough; tração de antibióticos de forma preventiva, aquando colistina 10 µg (CL), fornecidos pela BBL ™; rifaximina do período de secagem dos animais. 40 µg (RAX), produzidos pela Mast Diagnostics ™ ™ e A escolha sobre o fármaco a utilizar é geralmente cedidos pela Univete; e aminosidina 60 µg (AN), tomada de forma empírica, com base na experiência cedidos pela Ceva Saúde Animal. A escolha dos prévia adquirida do clínico e nos resultados de estudos fármacos teve por base a sua disponibilidade no mer- realizados em outros países. A disponibilidade dos cado português, para administração intramamária em fármacos de novas gerações, com um maior amplo bovinos leiteiros. espectro de acção, surge como uma alternativa fácil, associada a uma maior probabilidade de sucesso Teste de sensibilidade a antibióticos terapêutico. No entanto, a selecção de estirpes com A susceptibilidade aos diferentes antibióticos foi resistências a antibióticos é um processo rápido, pelo avaliada pelo método de difusão em disco, de acordo que a utilização deste tipo de fármacos não deverá ser com as normas instituídas pelo Clinical and considerado para uma primeira escolha terapêutica. Laboratory Standards Institute (CLSI, 2002) para Existem, em vários países Europeus, recomendações testes de susceptibilidade a antibióticos de bactérias fundamentadas para a primeira e segunda escolhas do de origem veterinária. Cada isolado foi propagado em princípio activo a utilizar em terapêutica de mastites placas de agar Mueller-Hinton (Oxoid ®) ou Mueller- (Vaarst et al. , 2002). No entanto, a extrapolação de Hinton suplementado com 5% de sangue desfibrinado informação obtida em outros países, com práticas de carneiro (Biomérieux ®) dependendo do seu género. clínicas e de maneio diferentes, deverá ser cautelosa- Após aposição dos discos impregnados com os fárma- mente considerada. É assim essencial o conhecimento cos sobre as placas, estas foram incubadas a 37 ºC de quais os principais agentes etiológicos de mastite durante 24 horas em aerobiose. em Portugal e do seu perfil de susceptibilidade aos Os diâmetros dos halos de inibição de crescimento fármacos antimastíticos. obtidos foram registados e comparados com os limites O presente trabalho visou avaliar o perfil de de sensibilidade definidos para isolados de origem susceptibilidade de isolados de mastites subclínicas, veterinária (CLSI, 2002). Nos casos omissos, foram obtidos em 12 explorações do centro de Portugal entre adoptados os limites de sensibilidade recomendados 2000 e 2003, face aos fármacos disponíveis no pelos fabricantes dos discos. mercado nacional para terapêutica de mastites. Análise estatística Material e métodos Para efeitos de análise estatística os isolados testados que apresentaram um perfil de sensibilidade Isolados bacterianos intermédia foram considerados como resistentes. Diferenças observadas entre perfis de sensibilidade Um total de 234 isolados de mastite subclínica foram avaliadas por Teste de Friedman e Qui-quadrado bovina foi incluído neste estudo, agrupado de acordo (α≤ 0,05). A análise dos dados foi elaborada recorrendo com a epidemiologia da infecção: microrganismos de ao programa SPSS versão 12.0. natureza contagiosa (35 Staphylococcus aureus , 61 Streptococcus agalactiae , 9 Streptococcus dysgalactiae ) e ambiental (68 Staphylococcus coagulase -negativos Resultados SCN, 51 Streptococcus spp. e 10 bacilos Gram negativos). Os isolados estudados, obtidos de amostras de leite Os padrões de sensibilidade in vitro dos 234 isola- de quartos com mastite subclínica detectada através dos de natureza contagiosa e ambiental, estabelecidos do Teste Californiano de Mastites ( +++ ), foram recolhi- com base na avaliação dos halos de inibição de cresci- dos em 12 explorações comerciais leiteiras do mento dos 12 princípios activos testados, são apresen- Ribatejo-Oeste durante o período de 2000 a 2003 tados nas tabelas 1 e 2, respectivamente. No total dos (Bexiga et al. , 2005). Após isolamento e identificação isolados testados, cefazolina (91,0%) e a associação bioquímica (API System, BioMérieux), procedeu-se à amoxicilina/ácido clavulânico (90,2%) apresentam a sua preservação a -70 ºC. maior eficácia in vitro , seguidas de cefquinoma (78,3%), cefoperazona (76,5%) e rifaximina (72,2%). Fármacos Nenhum dos grupos de isolados testados apresentou Os fármacos testados foram: amoxicilina/ácido susceptibilidades significativamente diferentes entre clavulânico 30 µg (AMC), ampicilina 10 µg (AMP) si face a P e AMP. Ambos os princípios activos exibem cefazolina 30 µg (KZ), cefoperazona 75 µg (CFP), reduzida eficácia contra Staph. aureus , Strep. agalac- cefquinoma 10 µg (CEQ), estreptomicina 10 µg (S), tiae e SCN (< 40% de isolados sensíveis) e apenas
276 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 isolados de Strep. dysgalatiae e Streptococcus spp. Os países nórdicos possuem recomendações apresentam níveis superiores de sensibilidade. nacionais para um uso controlado destes fármacos, Em oposição, os restantes antibióticos beta-lactâmi- particularmente em casos de mastite bovina. Estas cos apresentam a maior eficácia, especialmente face a preconizam a administração parenteral de um número isolados ambientais. A associação AMC apresenta boa muito reduzido de fármacos, preferencialmente peni- eficácia relativamente a todos os isolados particular- cilina G (Hillerton e Berry, 2005). A vantagem da mente contra bactérias do género Streptococcus . As administração sistémica face à terapêutica local pode cefalosporinas constituem o grupo de fármacos com ser explicada, em parte, pelo seu efeito colateral em maior eficácia contra os isolados testados, inclusiva- infecções subclínicas eventualmente presentes em mente contra Gram negativos. outros quartos e pela melhor difusão do fármaco na Os aminoglicosídeos AN e CN revelam bons níveis presença de coágulos ou micro-abcesso que impedem de inibição do crescimento dos isolados testados, com a sua progressão pela via intramamária, diminuindo a excepção de Streptococcus spp. Apresentam ainda os assim a incidência de novos casos. melhores resultados relativamente a Gram negativos. As decisões terapêuticas são geralmente empíricas e Pelo contrário, S apresenta um dos maiores níveis baseiam-se nas experiências anteriores de sucesso no de resistências. A maior eficácia é obtida contra SCN, tratamento para a exploração em questão. Raramente apenas com 30,9% de isolados sensíveis. o veterinário tem informação sobre a identificação do SXT e RAX apresentam níveis médios de sensibili- agente patogénico e respectivo padrão de sensibilidade dade. SXT apresenta o segundo melhor valor contra para o guiar na decisão terapêutica (Owens et al. , Staph. aureus e uma boa eficácia contra microrganismos 1997). Gram negativos. RAX apresenta melhores resultados Discrepâncias expressivas na prevalência, incidência que SXT, face a bactérias Gram positivas, com excepção de e antibioresistências dos agentes patogénicos da mas- Staph. aureus . tite têm sido identificadas e descritas, limitando uma Cl apresenta, quando considerado o total dos possível extrapolação dos perfis de susceptibilidade isolados, os níveis mais baixos de sensibilidade, com dos agentes contagiosos e ambientais entre os vários apenas 9,4% de isolados sensíveis. Considerando países. apenas os microrganismos Gram negativos, apenas A prevalência de mastites de origem contagiosa, 50% destes é sensível a CL. causadas por Staph. aureus , Strep. agalactiae e Strep. dysgalactiae , permanece elevada em Portugal em comparação com outros países (Myllys et al. , 1998; Discussão Bradley, 2002; Schlegelova et al. , 2002; Bexiga et al. , 2005). Mais preocupante ainda é o facto de não se A utilização de antibióticos no tratamento de terem verificado alterações expressivas nas espécies e mastite tem-se tornado uma importante fonte de frequência de isolados, em relação aos referidos há discussão, e por vezes mesmo discórdia, como conse- mais de 20 anos na mesma área geográfica (Atalaia, quência da crescente preocupação com o uso prudente 1983; Bexiga et al. , 2005). No Reino Unido, verifica-se destes fármacos em animais. que as infecções por Strep. agalactiae se encontram Devido à diversidade de agentes etiológicos de mas- controladas e que as causadas por Staph. aureus se tite, foram desenvolvidas estratégias de controlo encontram em declínio. Pelo contrário, observa-se um baseadas na minimização da exposição do úbere a aumento de infecções causadas por agentes ambien- agentes patogénicos, dos quais se salienta o plano de tais, especialmente Gram negativos e Strep. uberis controlo dos 5 pontos (Neave et al. , 1966). Deste (Bradley, 2002; Hillerton e Berry, 2005). Cenário plano, fazem parte a utilização e manutenção ade- semelhante verifica-se na Finlândia e França, com quadas das salas de ordenha, a desinfecção dos tetos tendência para a diminuição de mastites devidas a após a ordenha ( post-dip ), o tratamento das mastites agentes contagiosos em oposição às causadas por clínicas durante a lactação, o refugo de animais afec- agentes ambientais (Myllys et al. , 1998; Guerin- tados por mastites crónicas e a antibioterapia de Faublee et al. , 2003; Pitkala et al. , 2004). secagem. Contudo, ocorrem invariavelmente novos De acordo com a maioria dos dados referidos na casos de mastite e o uso de fármacos antimicrobianos literatura disponível, não têm ocorrido alterações assume um papel importante no seu controlo. significativas das susceptibilidades a antibióticos dos Em Portugal, Reino Unido e na maioria dos países agentes patogénicos de mastite. No entanto, são Europeus, o tratamento da mastite é feito por adminis- frequentemente referidas diferenças entre os perfis de tração intramamária de fórmulas farmacêuticas resistência dos microrganismos, em função da locali- contendo um ou mais antibióticos, por vezes associados zação geográfica das explorações a partir das quais a corticosteróides. Outras vias de administração são foram isolados (Owens et al. , 1990; Owens et al. , reservadas apenas para o tratamento de mastite clínica 1997; Watts and Salmon, 1997; Myllys et al. , 1998; severa ou infecções crónicas de Staph. aureus (Serieys Salmon et al. , 1998; De Oliveira et al. , 2000; Erskine et al. , 2005). et al. , 2002; Pitkala et al. , 2004). Informação sobre
277 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 incidência e prevalência dos agentes patogénicos foram testados representantes de 3 gerações distintas: envolvidos localmente, respectivos perfis de sensibili- KZ representante da 1ª, CFP da 3ª e CEQ da 4ª. Os dade a fármacos antimicrobianos tem-se tornado resultados obtidos mostram uma elevada eficácia de decisiva na escolha do fármaco a administrar no todas elas contra microrganismos Gram positivos e tratamento e controlo de mastite bovina. Gram negativos. De realçar que KZ, uma cefalosporina Os resultados obtidos neste estudo permitem de 1ª geração cujo espectro de acção é direccionado estabelecer um perfil generalizado das sensibilidades predominantemente para as bactérias Gram positivas, a antibióticos dos isolados obtidos de mastite sub- mostrou-se eficaz face a 40% dos isolados Gram clínica bovina da região Ribatejo-Oeste. negativos. Entre os fármacos mais utilizados para o controlo de A elevada sensibilidade de Strep. dysgalactiae às infecções intramamárias bovinas, encontram-se os cefalosporinas, assim como à maioria dos antibióticos antibióticos beta-lactâmicos, que se podem considerar testados com acção para microrganismos Gram divididos em dois grandes sub-grupos: penicilinas e positivos, está de acordo com o descrito na literatura cefalosporinas. Analisando os resultados obtidos face (Owens et al. , 1990; Owens et al. , 1997; Erskine et al. , a estes fármacos, verificaram-se diferenças significa- 2002; Rossitto et al. , 2002). tivas entre a susceptibilidade a penicilinas, P e AMP, e Os aminoglicosídeos têm como espectro de acção aos restantes fármacos: AMC e cefalosporinas. Estas bactérias Gram negativas. Entre os três fármacos diferenças poderão ser devidas à produção de beta-lac- testados, o maior número de resistências verificou-se tamases pelos isolados, especialmente do género em relação a S, com apenas 10 isolados Gram Staphylococcus, frequente em isolados de mastite negativos susceptíveis. Apesar do seu espectro de (Watts e Salmon, 1997; De Oliveira et al. , 2000). A acção, S revelou-se menos eficaz face a bactérias elevada eficácia verificada para a associação Gram-negativas do que face a SCN. No entanto, o amoxicilina e ácido clavulânico, um inibidor de reduzido número de isolados Gram negativos testados beta-lactamases, contra Staph. aureus e restantes poderá ter originado uma distorção dos resultados, SCN, suporta esta hipótese. Os resultados obtidos no pelo que deverão ser realizados estudos com base presente estudo diferem da maioria dos dados publica- numa maior amostragem de microrganismos Gram dos, que referem para staphylococci isolados de negativos. mastite uma baixa resistência a P e AMP (Watts et al. , AN e CN apresentam eficácia elevada relativamente 1995; Owens et al. , 1997; Costa et al. , 2000; De aos isolados Gram negativos (80%) mas também contra Oliveira et al. , 2000; Gentilini et al. , 2000; Erskine et Staph. aureus e SCN, com taxas de sensibilidade al. , 2002). O espectro de acção destes fármacos, próximo ou acima de 70%. Este valor é ligeiramente dirigido a microrganismos Gram positivos, justifica a inferior ao verificado em outros países (Costa et al. , sua ineficácia face a isolados Gram negativos. 2000; Gentilini et al. , 2000; Erskine et al. , 2002). As cefalosporinas são categorizadas em gerações, Apesar destes bons resultados, AN não está corrente- de acordo com o seu espectro de acção. Neste estudo, mente disponível como preparação intramamária no
Tabela 1 - Percentagens de susceptibilidade de agentes Tabela 2 - Percentagens de susceptibilidade de agentes ambien- contagiosos a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico tais a ampicilina (AMP), amoxicilina/ácido clavulânico (AMC), (AMC), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), penicilina (P), cefazolina (KZ), cefoperazona (CFP), cefquino- cefquinoma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), ma (CEQ), aminosidina (AN), estreptomicina (S), gentamicina gentamicina (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), (CN), sulfametoxazole/trimetoprima (SXT), rifaximina (RAX) rifaximina (RAX) e colistina (CL). e colistina (CL). % Susceptibilidade – Agentes contagiosos % Susceptibilidade – Agentes contagiosos Staph. Strep. Strep. Total SCN Streptococcus Gram Total aureus agalactiae dysgalactiae spp. negativos (n=35) (n=61) (n=9) (n=105) (n=68) (n=51) (n=10) (n=129) AMP 28,6 34,4 88,9 37,2 AMP 36,8 60,8 0 43,4 P 28,6 21,3 77,8 28,6 P 39,7 54,9 0 42,6 AMC 82,9 98,4 100 93,4 AMC 85,3 100,0 40 87,6 KZ 94,3 96,8 100 96,2 KZ 86,8 98,0 30 86,8 CFP 37,1 88,7 100 72,5 CFP 79,4 86,3 50 79,8 CEQ 80,0 74,2 100 78,3 CEQ 76,5 88,2 40 78,3 AN 71,4 8,2 44,5 32,4 AN 85,3 31,4 80 63,6 S 5,7 1,6 0 2,8 S 30,9 2,0 10 17,8 CN 71,4 6,6 33,4 30,5 CN 69,1 37,3 80 57,4 SXT 91,4 35,5 66,7 56,8 SXT 64,7 56,9 80 62,8 RAX 77,1 54,1 77,8 63,8 RAX 89,7 76,5 20 79,1 CL 0 3,2 11,1 2,8 CL 19,1 2,0 50 14,7
278 Nunes SF et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 275-280 mercado europeu, inviabilizando a sua utilização. mos Gram positivos de origem ambiental, verificamos A susceptibilidade dos isolados face a SXT que a maioria dos fármacos com um espectro de acção contrasta com o descrito na literatura. Embora a adequado se revelou eficaz, à excepção de P e AMP. elevada eficácia contra Staph. aureus esteja de acordo Uma vez mais, estes resultados reforçam a necessi- com o descrito na bibliografia, a susceptibilidade de dade do conhecimento dos perfis de sensibilidade dos Strep. dysgalactiae (66,7%) e bactérias Gram negativas isolados nacionais, a fim de evitar a extrapolação de (80%) encontram-se abaixo do descrito com uma dados referentes a outros países que podem sugerir susceptibilidade de aproximadamente 96% (Erskine et terapêuticas menos adequadas. al. , 2002). De uma forma global, o maior número de isolados A ansamicina RAX é um antibiótico semi-sintético resistentes encontrados neste estudo poderá reflectir a de largo espectro, indicado para administração intra- existência de práticas de antibioterapia incorrecta- mamária e intra-uterina em bovinos de leite. Os mente dirigidas, que acarretam uma pressão de estudos de susceptibilidade para isolados de origem selecção sobre estirpes resistentes. Este facto tem veterinária são ainda raros, sendo mesmo inexistentes sérias implicações em saúde animal, considerando relativamente a isolados de mastite bovina. A a possibilidade de dispersão horizontal de genes susceptibilidades elevadas observadas confirmam a de resistência. A proximidade entre o Homem e os abrangência do espectro de acção deste fármaco, com animais ou seus produtos tornam esta preocupação maior eficácia em relação aos Gram positivos do que extensiva à saúde pública. Também a facilidade de aos Gram negativos. acesso a antibióticos por pessoas não credenciadas, O elevado número de resistências a CL, deve-se em acentua os riscos de uma terapêutica não dirigida. Este grande medida ao seu espectro de acção restrito a aspecto apenas recentemente foi objecto de legislação, bacilos Gram negativos (Guerin-Faublee et al. , 2003). com a criação da Receita Veterinária que visa o No entanto, contrariamente ao observado anterior- controlo na prescrição de antibióticos a animais de mente em isolados de mastite (Guerin-Faublee et al. , produção. 2003) apenas 50% dos bacilos Gram negativos se No entanto, pensamos que um dos principais mostraram susceptíveis a este fármaco, valor inferior factores que contribuirá para o estabelecimento de ao verificado relativamente a AN, CN e SXT. medidas adequadas de controlo de mastites é o De um modo geral, os isolados mais prevalentes na conhecimento dos perfis de susceptibilidade dos região do Ribatejo-Oeste, testados neste estudo, agentes etiológicos locais, sendo necessária a realização apresentam valores de susceptibilidade inferiores aos e publicação de estudos realizados noutras regiões de verificados noutros países (Owens et al. , 1990; Watts Portugal. Uma vez conhecido o panorama nacional, et al. , 1995; Myllys et al. , 1998; De Oliveira et al. , será possível aos clínicos responsáveis pelas explo- 2000; Gentilini et al. , 2002; Guerin-Faublee et al. , rações uma escolha fundamentada do fármaco a 2002; Rossitto et al. , 2002; Yoshimura et al. , 2002; utilizar, reduzindo o insucesso terapêutico e, simul- Guerin-Faublee et al. , 2003; Rajala-Schultz et al. , taneamente, a utilização de antibióticos. 2004; Luthje and Schwarz, 2006). Considerando o grupo de isolados responsáveis por mastites de natureza contagiosa, verifica-se uma baixa percentagem Agradecimentos de agentes sensíveis a P e AMP, o que inviabiliza a adopção das recomendações dos países nórdicos. O presente estudo foi financiado pelo Centro de Inclusivamente em relação a Strep. agalactiae , que é Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal referido com sendo sempre sensível a P, foram (CIISA) da Faculdade de Medicina Veterinária, e pela encontradas resistências in vitro em 78,7% dos Fundação de Ciência e Tecnologia – Projecto isolados. Também em Staph. aureus foram encontrados POCTI/CA/1995/95/2003. elevadas percentagens de resistências o que, aliado Os autores agradecem à Ceva Saúde Animal, ao facto de este microrganismo poder assumir uma Intervet/Schering-Plough e Univete a cedência de localização intracelular e assim evadir-se às defesas discos com antibióticos. Os autores agradecem ainda do animal e resistir à antibioterapia, corrobora a aos produtores envolvidos no estudo. necessidade de considerar o refugo de animais com mastites crónicas, de acordo com o plano de controlo dos 5 pontos. Bibliografia Em relação aos microrganismos ambientais, Atalaia V (1983). Contribuição para o estudo das mamites verifica-se uma diferença entre o perfil de bactérias bovinas da região do Ribatejo-Oeste. Repositório de Gram positivas e Gram negativas. Estas provocam Trabalhos do Laboratório Nacional de Investigação infecções geralmente clínicas, agudas, com uma Veterinária, 15: 95-116. expressiva componente inflamatória, e poderá ser Bexiga R, Cavaco LM, Vilela CL (2005). Mastites subclínicas bovinas na zona do Ribatejo-Oeste. Revista da Sociedade considerada a não utilização de antibióticos no seu Portuguesa de Ciências Veterinárias, 100, (553-554): controlo. Considerando então apenas os microrganis- 39-44.
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280 RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Comparing the effect of three different disbudding methods on behaviour and plasma cortisol of calves
Comparação do efeito de três métodos de descorna sobre o comportamento e o cortisol plasmatico de vitelas
George Stilwell G 1*, Miguel S. Lima 1, Donald M. Broom 2
1CIISA, Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária, UTL (TULisbon) 2Centre for Animal Welfare and Anthrozoology, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge, Madingley Road, Cambridge, CB3 0ES, Reino Unido
Summary: This paper compares the effects of three disbudding foi avaliado durante a descorna, aos 15 minutos pós-descorna e methods on cortisol and behaviour of calves. We compared the antes de cada colheita de sangue. results of several studies in which thirty six calves were Durante o procedimento HI debateu-se mais do que qualquer disbudded in the following way: five scoop disbudded (S); outro grupo e S debateu-se mais do que CP, ND-CP, ND-HI. seven hot-iron disbudded (HI), eight caustic paste disbudded Não houve diferença no cortisol entre grupos antes da descorna (CP); eight sham-disbudded with iron (ND-HI); and eight e às 24 horas. À 1, 3 e 6 horas S apresentou mais cortisol do que sham-disbudded with paste (ND-CP). Cortisol was measured 15 qualquer outro grupo. Uma hora após descorna CP e HI minutes before the procedures and 1, 3, 6 and 24 hours after mostraram cortisol mais elevado do que os grupos simulados e dehorning. Behaviour was assessed during the procedure, 15 CP tinha níveis mais elevados do HI. minutes after dehorning and before each blood sampling. Comparando com os grupos simulados, S apresentou sempre During the procedure HI showed more struggling behaviours mais sinais de dor excepto às 24 horas e mais às 6 horas than all other groups. Group S struggled more than CP, ND-HI quando comparado com os outros métodos. À 1 e 3 horas CP e and ND-CP. There was no difference in cortisol base-line and 24 HI apresentaram mais comportamentos de dor do que ND-CP e hours values between any of the groups. Compared with all ND-HI. other groups, S had higher cortisol at 1, 3 and 6 hours. At 1 hour Apesar de existir diferenças de idade entre grupos estes cortisol was higher in CP and HI compared with sham-disbudded resultados sugerem que a guilhotina causa dor intensa até and in CP compared with HI. Compared with sham-disbudded 6 horas; o ferro quente provoca dor mais intensa durante o groups, S showed more pain-related behaviours at all times procedimento; a descorna por ferro quente ou pasta causa dor except 24 hours and more pain behaviours at 6 hours compared até 3 horas, não existindo diferenças comportamentais entre with the other methods; CP and HI showed more signs than estes métodos. sham-disbudded until 3 hours. Although there were differences in age between groups, these Palavras-chave: descorna, guilhotina, ferro-quente, pasta results suggest that: scoop-disbudding causes more pain than cáustica, dor, comportamento, cortisol any other method until 6 hours; dehorning with hot-iron elicits more struggling during the procedure; hot-iron and caustic paste disbudding causes pain until 3 hours but there are no significant differences between them. Introduction
Keywords: pain, scoop, hot-iron, caustic paste, dehorning, Cattle disbudding is a routine procedure that is behaviour, cortisol considered necessary and acceptable in modern dairy farms (Stafford e Mellor, 2005; EFSA, 2006). Resumo: Este artigo compara o efeito de três métodos de descorna sobre o cortisol e comportamento de vitelas. Keeping adult horned cows in free stall dairy farms Comparámos os resultados de diversos ensaios em que 36 threatens animal and human safety and welfare vitelas foram descornadas da seguinte forma: guilhotina (S, because these animals have more potential to cause n=5); ferro quente (HI, n=7); pasta caustica (CP, n=8); descorna injury. This is evident by the wounds and various simulada com ferro (ND-HI, n=8); descorna simulada com injuries, especially problematic when the udder is pasta (ND-CP, n=8). O cortisol foi medido 15 minutos antes da descorna e à 1, 3, 6 e 24 horas pós-descorna. O comportamento affected, that are seen in dairy farms where horned animals are kept. The International Association for the Study of Pain (IASP) definition for pain is that it is "an unpleasant * Correspondência: [email protected]; Tel: +351 213652800; Fax: +351 213652810 sensory and emotional experience associated with Departamento de Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária actual or potential tissue damage, or described in Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa terms of such damage" (Merskey, 1979), modified
281 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 slightly by Broom and Fraser (2007) to "an aversive further injury (Broom e Johnson, 2000; Rushen, 2000; sensation and feeling associated with actual or Mellor et al ., 2005). Head shaking, ear flicking, head potential tissue damage". It is also useful to follow the rubbing and quick transitions from standing to lying rule by which "animals should be given the benefit of have been used to assess pain following disbudding any doubt so that, where there is a choice, judgments (Morisse et al ., 1995; Graf and Senn, 1999; Vickers et should overestimate the intensity of pain to avoid al ., 2005; Stilwell, 2008; Stilwell et al ., 2008b). These missing animals in pain" (Molony and Kent, 1997). measures also have to be dealt with caution because According to these statements, we should consider cattle is a species in which concealment of vulnerability horn bud amputation or burning, by caustics or heat, and weakness seems to be adaptive (Broom, 2001; as a potentially painful procedure. Dobromylskyj et al ., 2005) and because different Pain management is sometimes ignored or forgotten animals give different responses to pain as a result of in farm animals, as it is evident in several surveys in diverse and complex factors such as age, breed, previous which practitioners report their efforts to control pain experiences, temperament etc. With cattle, very subtle after painful procedures (Whay and Huxley, 2005; signs (e.g. inert lying) may be of crucial importance Huxley and Whay, 2006; Stilwell, unpublished). while others, very important in other species, might be Although common sense and legislation (Decreto- seldom exhibited. Although the extrapolation "if it Lei nº48/2001) require cornual nerve blocking before hurts humans it must hurt animals" is advisable, the disbudding and it is well established that this simple same may not be true for the assessment of pain as it intervention is known to reduce struggling, procedure may lead to the exclusion of very specific or subtle length and appetite reduction, it is rarely performed changes in behaviours that are important for pain in dairy farms. A recent survey with practitioners evaluation (Stilwell, 2005). at the 2007 Congress of the Portuguese Buiatric The 2007 practitioners survey (Stilwell, data not Association, showed that anaesthesia and analgesia published) showed that the disbudding methods used are seldom performed for calf disbudding (Stilwell, in Portugal are: chemical disbudding with a caustic unpublished). The main reason for this is the idea that paste (80 % of farms), thermo-cautery with a hot-iron the procedure is not painful, or is only temporarily (60% of farms) and guillotine disbudding, also known painful. Other reasons may result from the belief that as scoop (12% of farms). Some farms use more than cattle are very resistant to pain, perhaps a consequence one method. of difficulty in detecting pain-related behaviours in Caustic paste disbudding is done by applying a thin these animals, or that the alleviation of pain is too layer of sodium or calcium hydroxide (pH 14) over the expensive, or that currently available drugs are not horn bud of calves under the age of 6 weeks. The efficient (Whay and Huxley, 2005; Huxley and Whay, hot-iron disbudding is done by applying for 30 to 60 2006). Although some studies (Petrie et al ., 1995; seconds a specific device, heated to over 600 ºC, over Morisse et al ., 1995; McMeekan et al ., 1998; Graf and the horn bud of 6 to 8 weeks old calves, burning the Senn, 1999; Vickers et al ., 2005) have looked at the growing tissue at its base. The scoop-disbudding is welfare of calves, following the different disbudding done by closing the sharp jaws of the tool, amputating methods, only two tried to compare the effects of the horn and tissue at its base, sometimes including hot-iron and caustic paste disbudding (Morisse et al ., the surrounding skin and bone. This method is usually 1995; Vickers et al ., 2005). used in older animals, above the age of 10 weeks. Cortisol is a physiological variable frequently used The handling and restraining of the animals also in the assessment of pain because it is well established differ according to the method used. Because calves to that stress activates the Hypothalamus-Pituitary- be paste-disbudded are small, they are easily subdued Adrenal (HPA) axis (Stott, 1981; Broom and Johnson, and forced to lie down. Animals for hot-iron or scoop 2000; Matteri et al ., 2000; Moberg, 2005). A few disbudding have to be firmly restrained because of minutes after a painful experience cortisol is released need to remain still for longer periods. and is usually kept above baseline while acute pain is The objective of this study was to compare cortisol felt. Stimuli other than pain (fear, handling, hunger, and behaviour of calves disbudded with the three anxiety, tissue damage and many other environmental methods used in Portugal (scoop, hot-iron or caustic effects) can cause an increase in plasma cortisol, so it paste), so as to try and grade them according to their is important to control these factors and to understand effects on welfare. the circadian cycle that is shared by all individuals (Broom, 1988; Harbuz and Lightman, 1992; Mellor et al ., 2005; Lane, 2006; Stilwell et al ., 2008a). Material and methods Another way to evaluate pain is to assess behaviour Experiment design modification. This can be done by objective ly measuring the incidence of pain-related behaviours Three dairy farms were selected according to the that are usually related to the effort of the animal to dehorning method used. We tried to replicate the field get rid of the pain source, to speed recovery or to avoid conditions in a way to conveniently assess the pain and
282 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 distress experienced by the calves. Handling tech- Scoop disbudding: this study was done in a single nique, operator and calf age were the ones routinely day. Five Holstein-Frisian female calves with mean used in each farm. All animals were used to human age 117±32 days were kept in concrete floored handling and regular presence in the paddocks. The paddocks. Concentrate, grass hay and water were different studies were done for several days but all permanently available. For disbudding the calves were disbudding, blood sampling and behaviour recording put into a crunch and the head was restrained with a started at 10 a.m. in similar weather conditions – clear rope. The scoop-dehorner was pushed against the head sky and mild temperatures. In each farm, animals to and rapidly closed to cut off the horn base. The proce- be disbudded or sham-disbudded were randomly dure was repeated for the other bud and took no more selected and an individual number was sprayed on than 45 seconds in total. Due to farm constraints, there both flanks. Blood sampling into a heparinised was no sham scoop-disbudded group but two other Starsted ® tube (7 ml) took place approximately 15 groups were formed to test regional anaesthesia and minutes before the disbudding and then at 1, 3, 6 and analgesia efficacy (Stilwell, 2008). 24 hours after the disbudding. Blood was immediately Hot-iron disbudding: this study was repeated with centrifuged. Plasma was then frozen at minus 20 ºC. different animals along several days. Fifteen female Cortisol was assayed in duplicate and measured by a calves with mean age 98±15 days were kept in validated solid radioimmunoassay, without extraction, concrete floored paddocks. They were already weaned using a commercial kit (Coat-A-Count; Diagnostic and were eating concentrate and alfalfa/grass hay. Product Corporation, Los Angeles, CA, USA) at the The disbudding procedure was done with the calves Faculdade de Medicina Veterinaria in Lisbon. standing and the head restrained by a head-halter. Behavioural assessment was done during the While one person gently pressed the calves against a procedure in which the degree of struggling was wall another operator applied the hot-iron to the base graded from 0 = no struggling behaviour recorded, to of each horn bud for the duration of 30 to 45 seconds. 5 = all struggling behaviours were recorded. At 15 The sham-iron-disbudding was done in the same way minutes, 1, 3, 6 and 24 hours after the disbudding the but a cold device was applied to the head. The total incidence of five different pain-related behaviours procedure took from 90 to 120 seconds and was were recorded for a period of 15 minutes. The always done by the same stockman. behaviours assessed are described in Table 1. Caustic-paste disbudding: this study was repeated Handling and blood collection was as quick and with different animals along several days. Sixteen peaceful as possible so as to reduce stress and was Holstein-Friesian female calves with mean age 25±10 done by an experienced veterinarian inside the first 30 days, kept in a large straw-bedded paddock with seconds after restrain access to a computer-controlled milk distributor and The number of animals in each group and mean age ad libitum concentrate and grass hay. These animals are presented in Table 2. were randomly allocated to treatment groups with no Each farm’s husbandry conditions and disbudding age differences: CP - caustic paste disbudded with no method used were as follows: treatment (n=8) and ND-CP - sham-disbudded (n=8).
Table 1 – Description of the behaviours recorded at disbudding and for 24 hours after the procedure Struggling at dehorning Description Hot-iron and Scoop Lifting front limbs; falling on back limbs; backing; (occurrence of any of the five behaviours were added) vocalization; open mouth. Caustic paste Trying to rise; shaking head; stretching back limbs; (occurrence of any of the five behaviours were added). vocalization; open mouth. Behaviours after dehorning Description Ear flick Flicking ears with no apparent reason (e.g. presence of flies). Head shake Shaking head. Head rub Scratch head against objects or using back leg. Transitions (lying/raising) Lying and raising hastily with no resting objective. Inert lying Sternal lying with head on flank and ignoring external stimulus.
Table 2 – Number and age (mean ±SD) of calves in each group accordingly to the disbudding method used Disbudding method Scoop Hot-iron Caustic Paste Sham-dehorned Sham-dehorned (S) (HI) (CP) (ND-HI) (ND-CP) Animals (n) 5 7 8 8 8 Age in days 117 ±33 a 98 ±15 b 25 ±10 c 76 ±11 b 31 ±5 c Different superscript letters indicate difference in age between groups for which p < 0.05
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For the disbudding, animals were forced to lie down, sham-disbudded groups at any time (always p ≥0.05). the hair around the horn bud was clipped and the paste In contrast, at 1 hour, both sham-disbudded groups was applied to each horn. Sham-paste-disbudded showed lower cortisol than S (p<0.004) and CP calves animals were handled in the same way but an inert gel (p<0.001) and group HI had higher cortisol than ND-HI was applied instead of the paste. The total procedure (p=0.002) but only showed a trend towards difference took no more than 60 seconds. (p=0.051) when compared with group ND-CP. When Two calves were removed from the study (one from comparing the different disbudding methods at 1 hour group ND-CP and one from group HI) due to respira- the S group showed higher cortisol levels compared to tory disease and the need for treatment. CP and HI groups (p=0.019 and p=0.003, respectively), and CP had higher cortisol than HI (p=0.001). At 3 and 6 hours there was still a difference between S and Statistical analysis the other disbudded groups: for CP p=0.002 and p=0.019, respectively; and for HI p=0.03 and p=0.01, Distributions of these variables were shown by respectively. Levene and Shapiro–Wilks tests to be non-normal, so The different pain-related behaviour’s incidence for non-parametric analyses were used. Differences the various groups is shown in Table 3. Struggling was between the five groups at each time were determined significantly higher in the HI group than in any of the by the Mann–Whitney U-test following a Kruskal– other groups (p<0.01) and group S struggled more –Wallis one-way analysis of variance. P-values less than both sham-disbudded and the CP animals than 0.05 were considered significant. SPSS ® for (p<0.05). In contrast there were no differences in Windows (version 14) was used for the analysis. struggling between sham-disbudded groups and caus- tic paste disbudded animals (p>0.491). The S group showed more pain behaviours than Results sham-disbudded at all times (p<0.001) except at 24 hours but only at 6 hours when compared with the two There was a difference in ages between the other disbudded groups (CP p=0.03 and HI p=0.048). disbudded groups (Table 2) but not between the two The HI group showed more behaviours than the ND- hot-iron groups (HI and ND-HI) and the two caustic HI at 15 minutes, 1 hour and 3 hours (at 6 hours there paste groups (CP and ND-CP). was a trend with p=0.054) and more behaviours than Comparing cortisol values at each moment (Figure ND-CP at all times except at 24 hours. The group CP 1) we found that there were no differences between showed higher incidence of pain-related behaviours groups at –15 minutes (baseline) or at 24 hours when compared to both sham-disbudded groups at 15 (p=0.669 and 0.126, respectively). Additionally, minutes and 1 hour and at 3 hours when compared there were no differences in cortisol between the two with ND-HI.
Figure 1 – Mean ±SD plasma cortisol of calves disbudded by different methods
S - Scoop; HI - hot-iron; CP - caustic paste; ND-HI – sham-disbudded with iron; ND-CP – sham-disbudded with paste. Different superscript letters in each period of time indicate difference between groups for which p < 0.05
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Table 3 – Degree of struggling during disbudding and individual and total incidence of pain-related behaviours (mean ±SD) of calves for the first 24 hours post-disbudding with scoop (S), hot-iron (HI), caustic paste (CP) or sham-disbudded (ND-HI and ND-CP) Time from disbudding Group Behaviour 0 + 15 min + 1 h + 3 h + 6 h + 24 h Total Struggling (¥) 2,2 a Head shake 10 16 5 5 4 40 Ear flick 4 3 1 7 3 18 S Head rubbing 7 9 3 6 2 27 n=5 Transitions 1 0 0 0 0 1 Inert lying 0 0 0 0 0 0 Total 22 28 9 18 9 86 Mean 4.40 a 5.60 a 1.80 a 3.60 a 1.80 a 17.2 Struggling (¥) 3,43 b Head shake 9 8 2 4 0 23 Ear flick 16 16 3 4 3 42 HI Head rubbing 18 6 5 3 0 32 n=7 Transitions 0 1 0 1 0 2 Inert lying 0 0 0 1 0 1 Total 43 31 10 13 3 100 Mean 6.14 a 4.43 a 1.43 a 1.86 b# 0.43 a 14.29 Struggling (¥) 0,8 c Head shake 22 8 0 0 0 30 Ear flick 9 3 6 0 0 18 CP Head rubbing 13 8 7 2 1 31 n=8 Transitions 7 3 2 2 0 14 Inert lying 0 1 4 1 0 3 Total 51 23 19 5 1 99 Mean 6.38 a 2.88 a 2.38 a 0.50 bc 0.13 a 12.38 Struggling (¥) 1,00 c Head shake 1 0 1 1 2 5 Ear flick 3 1 0 2 1 7 ND-HI Head rubbing 0 0 0 0 0 0 n=8 Transitions 0 0 0 0 0 0 Inert lying 0 0 0 0 0 0 Total 4 1 1 3 3 12 Mean 0.6 b 0.3 b 0.1 b 0.4 bc 0.4 a 1.7 Struggling (¥) 0,80 c Head shake 0 0 1 0 2 3 Ear flick 3 0 0 0 1 4 ND-CP Head rubbing 0 1 0 1 0 2 n=6 Transitions 0 0 1 0 0 1 Inert lying 0 0 0 0 0 0 Total 3 1 2 1 3 10 Mean 0.5 b 0.2 b 0.3 b 0.2 c 0.5 a 1.7 (¥) Results from adding the occurrence of five struggling behaviours. From 0=no struggling behaviour observed to 5= all struggling behaviours observed. Different superscript letters in each period of time indicate difference between groups for which p < 0.05.
When comparing HI and CP groups no differences in CP group (14 observations). Inert-lying behaviour were found in the incidence of pain-related behaviours was recorded in three caustic-paste disbudded although at 6 hours there was a trend (p=0.054) for animals, in one hot-iron disbudded calf and never seen higher behaviour incidence in HI than in the CP group. in the scoop or sham-disbudded groups. Vocalizations By comparing the incidence of individual were recorded only during the actual disbudding of behaviours (Table 3) between the different groups we two animals in the HI group. In the sham-disbudded found that a higher number of very active behaviours animals ear-flicking was almost the only behaviour (head-shaking and head-rubbing) were seen in groups recorded. Although not statistically significant, nine S and HI, but a more even distribution in group CP. pain-related behaviours were still observed in the Transitions were very rarely recorded in S and HI smaller S group at 24 hours compared with three animals (one or two observations) but were common observations in the HI and one in the CP group.
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Discussion which was seen to be still very severe by the pain- -related behaviour observations. Although these results were taken from studies at The other two disbudding methods only showed different farms, the weather, time of day, and study higher cortisol at 1 hour, when compared with sham- design were very similar. There was a difference in the -disbudded, suggesting that pain is limited to the first age of the animals, the scoop-disbudded were the oldest few hours after the procedure. Morisse et al . (1995) and the paste-disbudded the youngest, because the age showed similar results although differences were less at which these methods are applicable do not overlap. evident. There were also important differences between There were also differences in some husbandry con- the caustic-paste and hot-iron groups indicating that ditions, namely the pens’ floor and the feeding (calves the first causes a more intense pain at 1 hour. Similar in the ND-CP and CP groups were not yet weaned). results were found by Morisse et al . (1995). However, the fact that there were no differences in However, the behaviour-incidence analysis show baseline and ‘24 hours’ cortisol levels between groups that at 1 and 3 hours all three methods cause similar and between sham-disbudded groups at all times, pain and that at 6 hours the pain is much more severe suggests that handling, environment and calf’s age had in the scoop-disbudded than in all the other groups. In no effect on the results. Other studies have compared contrast with the cortisol results, the comparison of cortisol and behaviour of calves disbudded at different behaviour incidence in the ND-CP and ND-HI groups ages and found no significant differences in the with the CP or HI ones show that the disbudded calves responses (Taschke and Folsch, 1997). still suffer some pain at 6 hours and that there are no The hot-iron disbudded group showed a very high differences between these two disbudded groups. It is degree of struggling, average grade of 3.63, and worth mentioning that the S group shows a wavering included the only two animals that vocalized in all the in the behaviour incidence that is not found in any of studies (both calves with maximum struggling score the other groups – a decrease at 3 hours compared of 5). These behaviours are a sign of intense distress with 1 hour and a new, very significant, increase at 6 that was to be expected when an extremely hot device hours. This may have been a consequence of the is in contact with live tissue for more than 30 seconds intensity of pain suffered by these animals that and the animals are forcedly restrained. The fact that reduced their activity in response to a previous very relatively few animals vocalize when exposed to painful period or because the severe inflammation intense stress and pain is probably due to cattle created a state of hyperalgesia that resulted in extra bio-adaptation by which signs of vulnerability are pain. Another possibility is that the decrease in hidden from potential predators (Broom, 2001). behaviour at 3 hours was due to an external factor, not The actual disbudding through amputation is proba- evident to the observer, which distracted the calves. bly equally painful but the procedure is very quick and Although there were only five calves scoop-disbud- so the animal does not have to struggle so much to get ded, at 24 hours there were still nine pain-related away from restraint and from the aggression source. behaviours recorded in the S group compared with With caustic-paste, the struggling was minimal and three for the HI and both ND groups and one for the not different from sham-disbudded calves. We suggest CP group. This may indicate that pain is felt for long that there are two reasons for this: because product periods after scoop-disbudding. However, the fact that activation, caustic activity and, consequently, pain there was a very large variation between individuals takes a few seconds to come to effect; and because meant that this difference was found to be non- younger animals (~1 month) are more used to -significant. handling and usually resist less to restrain and human By comparing the total incidence of each behaviour proximity. within each group, it was shown that the scoop The method that showed the uppermost and longest disbudding caused almost exclusively three behaviours pain-related distress was the scoop-disbudding. The – head-shaking, ear-flicking and head-rubbing, extent and duration of cortisol increase was similar to being the first the most prevalent. The majority of that found in other studies (Petrie et al ., 1995; Stafford behaviours shown by the hot-iron disbudded calves et al ., 2003). The cortisol level was higher in the S were also these three but the most prevalent was group compared with all other groups at all times "ear-flicks". In contrast, the behaviours caused by until, at least, 6 hours after the procedure. The cortisol’ caustic-paste disbudding were more evenly distributed. response level at 1 hour may even have been limited The animals disbudded by caustic-paste showed a by the "ceiling effect" that is described as the maxi- relatively high incidence of "transitions" compared mum hormonal level possibly attained after a negative with the other methods but it is not certain if this was experience (Molony and Kent, 1997; Molony et al ., due to the difference in the type of pain or the age of 2002). This physiological limitation should also be the animals. Other studies (Vickers et al ., 2005) taken in account when reading the results at 6 hours showed a high incidence of "transitions" after hot-iron because the decrease may be due to the exhaustion of disbudding in animals aged 10 to 30 days. However, the system and not necessarily to the reduction in pain, these animals had been sedated a few hours previously
286 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288 with xylazine and it was not possible to rule out an from standing to lying and back to standing seem to be ongoing response to the sedative. very frequent after paste disbudding but not after other Very few animals showed the "inert-lying" behaviour methods of disbudding. We also concluded that young and of the four that did show it three were from the CP animals react to distress caused by burns by adopting group. The animals showing "inert lying" behaviour an apathetic attitude that may prevent the recognition were also the ones that showed cortisol levels higher of pain in these animals. than the group average. High cortisol levels have been shown to be related to states of depression (Tse, 2004). Lane (2006) also suggests that a state of Acknowledgements helplessness and frustration, that may result from a situation in which an animal is not able to escape or The authors acknowledge Prof Dr Luísa Mateus; cope with pain, causes a state very similar to depression. Eng Marta Vacas de Carvalho; Casal de Quintanelas Very high levels of glucocorticoids have been detected and Alexandre Arriaga e Cunha; Barão & Barão Lda in animals suffering from this kind of frustration and Eng Ricardo Basílio, Agropecuária Afonso (Gregory, 2004; Sumida et al ., 2004). The inert lying Paisana and Dr João Paisana; Dr Rita Campos de may be the best way these calves have to cope with the Carvalho. pain caused by some methods of disbudding. At this moment we can not say if this is a response to the type of pain (e.g. chemical burn) or the way very young animals react to severe pain, distress and high cortisol. Bibliography It is well known that young calves adopt an inert Broom DM (1988). The scientific assessment of animal posture when frightened or anxious, for example when welfare. Appl Anim Behav Sci, 20: 5-19. left unattended in the field by their dam, and so this Broom DM (2001). Evolution of pain. In: Pain - its nature behaviour may be a biological response to stress, and management in man and animals. Editors: Lord triggered by high levels of cortisol. Soulsby and D Morton. Roy Soc Med Int Cong Our results show that comparing different methods Symp Ser, 246: 17-25. is useful even when there are differences in age Broom DM and Fraser AF (2007). Domestic Animal because it shows what really happens in the field. Behaviour and Welfare, 4th ed. Wallingford: CABI. We also showed that by assessing the physiological Broom DM and Johnson KG (2000). Stress and Animal (cortisol) and behavioural response it is more likely to Welfare. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht (The understand the differences in intensity and duration of Netherlands). Decreto Lei nº 48/2001 (2001) Diário da República I Série pain-related distress. This is especially true for the A, nº35, de 10 de Fevereiro. methods that cause long lasting pain because cortisol Dobromylskyj P, Flecknell PA, Lascelles BD, Livingston A, is less reliable for dull and chronic pain (Broom and Taylor P, Waterman-Pearson A (2005). Pain assessment. Johnson, 2000; Mellor et al ., 2005; Lane, 2006). Thus In: Pain Management in animals. Editors: Flecknell PA the fact that cortisol returns to baseline levels should and Waterman-Pearson A. WB Saunders (London, UK), not be seen as a sign of "no pain". 53-79. We conclude that amputation-disbudding causes EFSA (2006). The risks of poor welfare in intensive calf more intense and long-lasting pain when compared farming systems. Annex to The EFSA Journal, 366: with caustic-paste and hot-iron disbudding. Morisse et 1-36. al . (1995) and the EFSA report on welfare of calves Graf B and Senn M (1999). Behavioural and physiological (2006) assert that caustic paste is more painful than responses of calves to dehorning by heat cauterization with or without local anaesthesia. Appl Anim Behav Sci, hot-iron disbudding, but Vickers et al . (2005) suggest 62: 153-171. that the contrary is true. Our results show that hot-iron Gregory NG (2004). Physiology and Behaviour of Animal disbudding causes very severe distress during the pro- Suffering. Blackwell Science, Oxford, UK cedure and pain that lasts for at least 3h. Compared Harbuz MS and Lightman SL (1992). Stress and the with hot-iron, paste disbudding causes less struggling HPA-axis: acute, chronic and immunological activation. during the procedure, higher cortisol level at 1 hour J Endocrinol, 134: 327-39. and the same incidence of pain-related behaviours Huxley JN and Whay HR (2006). Current attitudes of cattle until 3 hours. Although more studies should be made practitioners to pain and the use of analgesics in cattle. to evaluate differences during the first hour, we suggest Vet Rec, 159: 662-668 that the overall distress does not differ between these Lane J (2006). Can non-invasive glucocorticoid measures be two methods. used as reliable indicators of stress in animals? Anim Welfare, 15: 331-342. Our study also shows that the behaviours performed Matteri RL, Carroll JA and Dyer CJ (2000). Neuroendocrine by animals in pain differ with the method and, probably, responses to stress. In: The biology of animal stress - with the age of the animal. This should be taken in basic principles and implications for animal welfare. account in the field at the risk of considering a painful Editors: GP Moberg and JA Mench. CABI Publishing procedure as non painful. For example, transitions (New York, USA), 43-76.
287 Stilwell GG et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 281-288
McMeekan CM, Stafford KJ, Mellor DJ, Bruce RA, Ward Stafford KJ and Mellor DJ (2005). Dehorning and disbudding RN, Gregory NG (1998). Effects of regional analgesia distress and its alleviation in calves – review. Vet J, 169: and/or a non-steroidal-anti-inflammatory analgesic on 337–349. the acute cortisol response to dehorning in calves. Res Stott GH (1981). What is animal stress and how it is measured. Vet Sci. 64: 147-150. J Anim Sci, 52: 150-153. Mellor DJ Cook CJ and Stafford KJ (2005). Quantifying Stilwell G (2005). Dor em Animais – Extrapolação e some responses to pain as a stressor. In: The Biology of antropomorfismo. Medicina Veterinária. 61: 4-8. Stress – basic principles and implications for animal Stilwell G (2008). O efeito de anestesia regional associada welfare. Editors: GP Moberg and JA Mench. CABI ou não a um AINE sobre o cortisol e comportamento de Publishing (New York, USA), 171-198. vitelas descornadas por amputação com alicate. Vet Med Merskey H (1979). Pain terms: a list with definitions and a (Portuguese issue), 10: 60-68. note on usage. Recommended by the International Stilwell G, Campos Carvalho R, Lima MS, Broom DM Association for the Study of Pain (IASP) Subcommittee (2008a). The effect of duration of manual restraint on Taxonomy. Pain, 6: 249-252. during blood sampling on plasma cortisol levels in Moberg GP (2005). Biological response to stress: implications calves. Anim Welfare, 17: 383-385. for animal welfare. In: The biology of animal stress – Stilwell G, Lima MS, Broom DM (2008b). Comparing basic principles and implications for animal welfare. plasma cortisol and behaviour of calves dehorned with Editors: GP Moberg and JA Mench. CABI Publishing caustic paste after non-steroidal-anti-inflammatory (New York, USA), 1-22. analgesia. Livest Sci, 119(1-3): 63-69. Molony V and Kent JE (1997). Assessment of Acute Pain in Sumida Y, Kaname H, Mori Y, Kojima K, Kubo C and Farm Animals Using Behavioural and Physiological Tashiro N (2004). The effects of a switch-off response Measurements. J Dairy Sci, 75: 266-272. accompanied by hypothalamically induced restlessness Molony V, Kent JE and McKendrick IJ (2002). Validation of on immunoendocrinological changes in cats. Neuroim- a method for assessment of acute pain in lambs. Appl munomodulat, 11(2): 103-12. Anim Behav Sci, 76: 215–38. Taschke AC and Folsch DW (1997). Ethological, physiological Morisse JP, Cotte JP and Huonnic D (1995). Effect of and histological aspects of pain and stress in cattle when dehorning on behaviour and plasma cortisol responses being dehorned. Tierarztl Prax, 25: 19-27. in young calves. Appl Anim Behav Sci, 43: 239-247. Tse S (2004). Relationship between baseline cortisol, social Rushen J (2000). Some issues in the interpretation of functioning and depression: a mediation analysis. behavioral responses to stress. In: The biology of animal Psychiat Res, 126: 197-201. stress – basic principles and implications for animal Vickers KJ, Niel L, Kiehlbauch LM and Weary DM (2005). welfare. Editors: GP Moberg and JA Mench. CABI Calf Response to Caustic Paste and Hot-Iron Dehorning Publishing (New York, USA), 23-42. Using Sedation With and Without Local Anesthetic. J Stafford KJ, Mellor DJ, Todd SE, Ward RN and McMeekan Dairy Sci, 88: 1454-1459. CM (2003). The effect of different combinations of Whay HR and Huxley JN (2005). Pain relief in cattle: a lignocaine, ketoprofen, xylazine and tolazoline on the practitioner’s perspective. Cattle Pract, 13: 81-85. acute cortisol response to dehorning in calves. New Zeal Vet J, 51: 219-226.
288 RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Intoxicação aguda pelo feto comum ( Pteridium aquilinum (L.) Kühn) em bovinos
Acute intoxication by bracken fern ( Pteridium aquilinum (L.) Kühn) in bovines
C. Pinto 1, M. C. Peleteiro 2, M. A. Lobo 3, J. Machado 3, L. Silva 4
1Serviço de Desenvolvimento Agrário de São Miguel, 9500-343 Ponta Delgada 2Departamento de Morfologia e Clínica, Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa 3Departamento de Ciências Agrárias da Universidade dos Açores, 9701-851 Terra Chã, Angra do Heroísmo 4Departamento de Biologia da Universidade dos Açores, Apartado 1422, 9501-801 Ponta Delgada
Resumo: A ocorrência natural de síndromes hemorrágicas Summary: The aim of this study was to characterise a naturally cutâneas em bovinos jovens explorados em regime de pastoreio occurring cutaneous bleeding syndrome frequently associated nos Açores, e o seu desfecho frequentemente fatal, conduziu ao with fatal outcomes of young cattle on the Azores Islands. estudo e caracterização deste problema clínico. All cases were observed in Holstein-Friesian cattle from 24 Os casos descritos ocorreram em bovinos de raça Holstein- dairy herds. Most outbreaks occurred from May to October. -Friesian, provenientes de 24 explorações. A maioria das The affected animals were between 4 to 21 months old. ocorrências foi registada nos meses de Maio a Outubro. Os Morbidity rate was 19%. Mortality in sick animals was 77%. animais afectados tinham idades compreendidas entre os 4 e os Main clinical signs consisted of cutaneous bleeding in areas 21 meses. A taxa de morbilidade foi de 19% e a taxa de mortali- particularly exposed to insect (ears, nostrils and limbs), dade nos animais afectados foi de 77%. petechiae in the mucosa, naso-labial ulcers, fever and anorexia. Os principais sinais clínicos observados foram hemorragias The haematological results showed panleucopenia with pronoun- cutâneas nas áreas mais expostas aos insectos picadores ced neutropenia and relative lymphocitosis, thrombocytopenia (orelhas, focinho e membros), petéquias nas mucosas, úlceras and microcytic normocromic anaemia. Bone marrow examina- naso-labiais, melena, febre e anorexia. Os hemogramas tion revealed medullary aplasia, without megakaryocytes and revelaram panleucopenia, com diminuição acentuada dos changes in the erythroid cell lines. Necropsy and histopathological leucócitos granulócitos, linfocitose relativa, trombocitopenia e findings showed congestive and haemorrhagic lesions of anemia do tipo microcítico normocrómico. O exame da medula serosae; intestinal ulcers and necrosis; petechias in abomasal óssea mostrou rarefacção do tecido hematopoiético, com and urinary bladder mucosa and presence of bracken fragments ausência de megacariócitos e alterações nas linhagens de inside the ruminal content in some cases. células eritróides. A necrópsia e a histopatologia revelaram: Bracken fern ( Pteridium aquilinum ) with signals of herbivory alterações congestivo-hemorrágicas nas serosas; úlceras e was identified in pastures where the outbreaks occurred. necrose intestinal; petéquias na mucosa abomasal e da bexiga; An average of 3165 µg/g of ptaquiloside was determined in em alguns cadáveres registou-se a presença de fragmentos de 20 bracken samples. Significant differences were noted in feto comum no conteúdo ruminal. haematological parameters between cases and control samples. Nas pastagens onde ocorreram os surtos identificou-se o All these findings lead to the diagnosis of acute bracken Pteridium aquilinum com sinais de herbivoria. A análise de 20 poisoning. amostras desta infestante revelou um teor médio de 3165 µg/g Low levels in glutathione peroxidase in heifers from herds with de ptaquilósido. acute bracken poisoning compared to controls suggest that A comparação com dados hematológicos de bovinos saudáveis selenium may have a role in the genesis of cattle bracken (controlos) permitiu registar diferenças significativas em todos diseases. os parâmetros analisados. Os dados obtidos conduziram ao Considering the high numbers of cases of bovine enzootic diagnóstico de intoxicação aguda pelo feto comum (IAF). As haematuria (chronic bracken disease) reported on the Azores diferenças observadas nos valores de glutationa peroxidase Islands, this study emphasises the implications of bracken- entre os dois grupos, apontam para que as carências em selénio -infested pastures in animal health. possam contribuir para o aparecimento de problemas clínicos provocadas pela ingestão de feto comum. Considerando o elevado número de casos de hematúria enzoótica bovina (doença crónica devida à ingestão do feto Introdução comum) reportada nos bovinos dos Açores, este trabalho realça a importância do estudo das implicações na saúde animal das O feto comum [ Pteridium aquilinum (L.) Kühn] é pastagens infestadas pelo feto comum. uma das cinco plantas mais abundantes no planeta (Smith, 1995). As únicas limitações para a sua expansão parecem ser as temperaturas e secura extremas das regiões polares e desérticas. O abandono de determinadas culturas e de terrenos agrícolas
289 Pinto C et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298 menos férteis, a extensificação e a desflorestação, têm infestadas por Pteridium spp , no Brasil, Quénia e facilitado a difusão desta planta que é actualmente Reino Unido (Dobereiner, 1967; Jarrett et al. , 1978). considerada uma das principais pragas do reino Estas neoplasias devem-se à actuação concertada dos vegetal (Page, 1986; Santos, 1990). vírus da papilomatose bovina tipo 4 (BPV-4) e a Os diversos compostos existentes no feto comum carcinogénios presentes no feto comum (Campo, constituem um verdadeiro arsenal bioquímico 1997). A hematúria enzoótica dos bovinos (HEB) e (Cooper-Driver, 1976a,b). Salienta-se pelos seus ovinos resulta da presença na bexiga de múltiplos efeitos patogénicos nos animais o ptaquilósido (Ptq), tumores, que têm como principal factor etiológico a um glicósido sesquiterpenóide com propriedades exposição prolongada destes animais ao feto comum, mutagénicas e cancerígenas (Van der Hoeven et al. , tanto em condições naturais como experimentais 1983; Hirono et al. , 1984; Evans, 1986). As várias (Price e Pamukcu, 1968; McCrea e Head, 1981; estruturas da planta apresentam propriedades tóxicas Bringuier e Jean-Blain, 1987; Xu, 1992). A HEB e os (Tokarnia et al. , 1967) incluindo os rizomas e os tumores de bexiga que lhe estão associados é actual- esporos (Villalobos-Salazar et al. , 1994), sendo o mente a principal causa de rejeição de bovinos no aporte alimentar insuficiente associado a períodos de Matadouro Industrial de São Miguel, tendo sido escassez alimentar de qualidade, o factor mais reprovadas para consumo 18% das vacas abatidas em determinante do seu consumo (Hannam, 1986; 2006. Têm sido registados também alguns casos de Lawson, 1989; Pinto et al. , 1996a). Os bovinos em carcinomas do tracto digestivo superior (Pinto et al. , pastoreio manifestam maior apetência pelos rebentos 1996b). e pelas porções terminais das frondes imaturas do feto No presente trabalho descrevem-se e caracterizam-se comum, com maior palatibilidade (Bringuier e Jean- clinicamente 24 ocorrências naturais de intoxicação Blain, 1987), mas que apresentam uma concentração aguda pelo feto comum em bovinos jovens explorados de Ptq mais elevada (Smith et al. , 1993). Por outro nos Açores em regime de pastoreio. Foi dada especial lado, as carências em minerais como o sódio, potássio, atenção ao estudo dos parâmetros hematológicos e às cloro e fósforo levam à perversão do apetite nos concentrações séricas de oligoelementos, os quais bovinos (Naylor e Ralston, 1991), podendo ser foram comparados com os de uma amostra de bovinos responsáveis pela ingestão de plantas tóxicas. clinicamente saudáveis. Foram descritas e bem caracterizadas nos ruminantes e monogástricos domésticos (Smith, 1990), cinco síndromes associadas à ingestão do Material e métodos Pteridium spp : (1) deficiência em tiamina, (2) intoxicação aguda, (3) cegueira brilhante nos ovinos Os casos observados ocorreram em bovinos de raça (bright blindness ), (4) carcinomas do tracto digestivo Holstein-Friesian, provenientes de 24 explorações de superior e (5) hematúria enzoótica. A deficiência em bovinos leiteiros das ilhas de São Miguel (22 surtos), tiamina é induzida por uma tiaminase do tipo I e Terceira (1) e São Jorge (1). A maior parte dos surtos afecta sobretudo monogástricos que consomem de IAF foram referenciados por clínicos veterinários rebentos e rizomas desta planta (Evans, 1976). A das Associações Agrícolas da Ilha de São Miguel, intoxicação aguda pelo feto comum (IAF) tem sido durante os anos de 1995 até 2005 inclusive. observada predominantemente em bovinos com O diagnóstico da doença baseou-se na anamnese menos de dois anos de idade (Tokarnia et al. , 1967), e e no exame clínico dos bovinos afectados, comple- esporadicamente em bovinos e ovinos adultos (Smith mentado com hemograma. Em alguns animais et al. , 1999). A IAF resulta em necrose do epitélio prepararam-se esfregaços de medula óssea esternal intestinal e aplasia da medula óssea, com consequên- que foram corados pelo método de Wright (Jain, cias quase sempre fatais (Tokarnia et al. , 1967; Evans 1993). Sempre que possível, foi realizada necrópsia et al. , 1982). A nível medular a produção de plaquetas dos cadáveres e foram colhidas amostras para exame pelos megacariócitos é reduzida ou bloqueada, histopatológico e microbiológico. O conteúdo dos originando trombocitopenia e crise hemorrágica reservatórios gástricos foi observado para identifi- aguda. São também afectadas as células precursoras cação de fragmentos de P. aquilinum ingeridos. dos leucócitos granulócitos e dos eritrócitos, provo- Os hemogramas foram realizados em contador cando leucopenia, com consequente aumento da automático modelo Hemavet 850 ( CDC Technologies susceptibilidade às doenças infecciosas e anemia Inc. ). As amostras de sangue de 29 bovinos suspeitos (Smith, 1990; Xu, 1992). Esta síndrome foi reproduzi- de IAF foram colhidas para tubos com EDTA potássico da experimentalmente por administração oral de Ptq a (Sarstedt Monovette ®) e foram comparados com um vitelo (Hirono et al. , 1984). A cegueira brilhante outras provenientes de um grupo de 77 bovinos nos ovinos é devida à atrofia progressiva da retina. clinicamente saudáveis (controlos), não expostos ao Quanto aos carcinomas do tracto alimentar superior, feto comum, pertencentes a 7 explorações de bovinos foram referidos tumores da nasofaringe, esófago e leiteiros sem registo de casos de HEB ou de IAF. A pré-estômagos de bovinos que pastoreiam em áreas selecção das explorações controlo foi realizada com
290 Pinto C et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298 recurso à base de dados sobre HEB e tumores de Maio, Junho, Agosto Setembro e Outubro (Figura 1). bexiga do programa de monitorização das neoplasias Observou-se uma taxa de morbilidade de cerca de 19% diagnosticadas no Matadouro Industrial de São numa população total de 248 bovinos jovens distribuí- Miguel, existente no Serviço de Desenvolvimento dos por 24 explorações. A taxa de mortalidade registada Agrário de São Miguel (Pinto et al. , 2004). no grupo de bovinos afectados por IAF foi de 77%. A Em 25 novilhas clinicamente saudáveis provenientes morte dos animais atingidos ocorreu poucos dias após a de 4 explorações com casos de hematúria enzoótica e observação dos primeiros sinais da doença. surtos de IAF foi realizado um estudo de carências em oligoelementos (zinco, cobre, selénio, iodo e cobalto), cujos resultados foram comparados com um grupo con- trolo constituído por um conjunto de 33 novilhas com idades semelhantes, pertencentes a 5 explorações sem historial de HEB ou IAF. Para este estudo foram colhi- das amostras de sangue para tubos com heparina de lítio Nº Nº de surtos ocorridos Nº de animais afectados (Sarstedt ®) e tubos de vácuo para separação de soro ( BD Vacutainer ™) e remetidas para o laboratório europeu de nNº de surtos nNº de animais Mês referência " NBV Consultants, Nutrition-Biochimie Figura 1 - Distribuição anual das ocorrências clínicas registadas de Vétérinaire ", Dardilly, França. intoxicação aguda pelo feto comum ( Pteridium aquilinum ) em bovinos Foram observadas as pastagens onde ocorreram os dos Açores, relativos ao período compreendido entre 1995 e 2005 inclusive. surtos para identificação do feto comum e procura de Os principais motivos da consulta referidos pelos sinais de herbivoria, pela evidência de corte da extremi- proprietários dos bovinos suspeitos de IAF foram: dade das frondes e rebentos com maior palatabilidade "suores de sangue " (hematidrose), diarreia com da planta pelos animais. Em 20 amostras de frondes e sangue, apatia, anorexia, polipneia, suspeita de rebentos tenros de feto comum realizaram-se exames pneumonia e morte súbita em alguns animais. Os toxicológicos para pesquisa de ptaquilósido, por croma- bovinos atingidos foram na quase totalidade novilhas tografia líquida de alta pressão (Agneux e Lauren, de substituição de raça Holstein-Frisiean, com idades 1991). Na tentativa de investigar a razão da ingestão do compreendidas entre os 4 e os 21 meses, com maior P. aquilinum pelos bovinos foram ainda determinados, incidência na faixa etária dos 5-6 meses até ao em 10 amostras desta planta, os valores de potássio e primeiro ano de idade. A síndrome ocorreu em grupos fósforo por espectrofotometria de absorção atómica no de 3 a 50 novilhas, exploradas em regime de pastoreio Laboratório de Química do Departamento de Ciências livre, rotativo, controlado por cerca eléctrica, ou por Agrárias da Universidade dos Açores. sebes e paredes divisórias em cerca de 70% dos surtos. A análise estatística dos dados utilizou os programas Nos restantes 30% dos casos as novilhas encontravam-se Microsoft Excel 2003 e a aplicação estatística SPSS v.13 na pastagem presas a uma estaca por corrente metálica para a aplicação do teste T aos parâmetros que apresen- fixada na canela ou no pescoço. Na maioria das explo- tam uma distribuição normal e do teste não paramétrico rações, os grupos de novilhas eram heterogéneos, pois de Mann-Whitney aos parâmetros que não seguem uma continham animais com idades e tamanhos díspares, distribuição normal, com o objectivo de comparar os alguns com má condição corporal, pelagem acasta- dois grupos de animais, com e sem sintomas de IAF. nhada e baça (acromotriquia) sugestiva de carência em A maioria dos bovinos com sinais clínicos de IAF minerais ou parasitismo intenso (Figuras 2 e 3). foi submetida a terapia com antibióticos de largo espectro, para combater as infecções bacterianas secundárias, corticoesteróides (prednisolona) para controlar a inflamação e estimular a hematopoiese (Jain, 1993), trissilicato de magnésio para proteger a mucosa do tubo digestivo (Evans et al. , 1982), vitaminas e minerais para promover o apetite e auxiliar a regeneração tecidular. A transfusão sanguínea (400 a 1200 ml por animal) foi aplicada em três bovinos tendo-se apenas conseguido o prolongamento da vida destes animais por mais alguns dias ou semanas.
Resultados Figura 2 - Grupo heterogéneo de novilhas em exploração com casos de intoxicação aguda pelo feto comum. A novilha da esquerda com A maioria das ocorrências de IAF em bovinos dos pelagem castanha (acromotriquia) e de menor tamanho apresentava sintomas e morreu da doença. Os fetos junto à parede apresentam a Açores foi registada no período compreendido entre extremidade superior das frondes (porções mais tenras) consumidas Abril e Outubro, sendo mais frequentes nos meses de pelos bovinos (herbivoria).
291 Pinto C et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298
equimoses na esclera. A córnea de alguns bovinos apresentava úlceras e erosões de dimensão variável e algumas sequelas de processos anteriores de querato- -conjuntivite infecciosa por Moraxella bovis . A mucosa vaginal das vitelas e novilhas afectadas apre- sentava petéquias, mesmo na ausência de outros sinais, sendo este um dos sinais mais precoces de IAF. Uma das novilhas observada numa fase terminal da doença apresentava mucosas ictéricas (com valores aumentados de bilirrubina no soro); contudo este não foi um sinal frequentemente registado. Na maioria dos casos foi registada temperatura rectal superior a 40 ºC. Os animais que se encontravam em estádios terminais da doença apresentavam hipotermia. Os bovinos com
Figura 3 - Hemorragias cutâneas, no pescoço, orelhas e focinho. compromisso respiratório evidenciaram ruídos respi- ratórios alterados à auscultação. Nas Tabelas 1 e 2 apresentam-se os valores hema- tológicos comparativos entre os grupos de novilhas Alguns dos bovinos observados apresentavam infes- afectadas pela IAF e novilhas provenientes de explo- tações por piolhos ( Linognathus vituli ). No geral os rações sem casos registados de IAF e HEB. animais afectados pela IAF apresentavam pior Os valores eritrocitários, hemoglobina e plaquetas condição corporal. são apresentados na Tabela 1. A contagem total de Os principais sinais clínicos observados foram leucócitos com comparação entre leucócitos granulócitos depressão do estado geral, hemorragias cutâneas nas (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) e agranulócitos áreas mais expostas aos insectos picadores (orelhas, (linfócitos e monócitos), apresenta-se na Tabela 2. focinho e membros), ou no local de inoculação Verificaram-se diferenças significativas (valor de medicamentosa. A diarreia foi muitas vezes o sinal P<0,05) entre os animais afectados por IAF e os ani- mais proeminente, sendo nos estádios iniciais fluida. mais controlo para todos os parâmetros hematológicos Com o evoluir do processo as fezes evidenciavam avaliados, com diminuição acentuada das várias linhas muco sanguinolento e finalmente coágulos de sangue celulares em relação aos valores de referência no moldados ao intestino. Foram observadas com fre- primeiro grupo. quência úlceras ou pequenas erosões naso-labiais. A Os resultados do estudo comparativo dos valores conjuntiva ocular apresentava-se congestionada numa sanguíneos de zinco, cobre, selénio (glutationa fase inicial da doença; com o evoluir do processo peroxidase), iodo plasmático e cobalto (Vit. B12) são tornava-se pálida, com petéquias e por vezes apresentados na Tabela 3.
Tabela 1 - Valores hematológicos comparativos entre bovinos com sintomas de intoxicação aguda pelo feto comum e bovinos saudáveis (controlos) Doentes Controlos Valores de (n=29) (n=77) referência* Parâmetros Média Média Média Valor de P Min-Máx Min-Máx Min-Máx ± SD ± SD Eritrócitos 5,2 7,9 7 <0,001 (x10 6/µl) 0,8 - 9,5 5,7 - 10,4 5,0 - 10,0 2,1 1,1 Hemoglobina 5,6 8,6 11 <0,001 (g/dl) 1,7 - 9,9 5 - 10,9 8,0 - 15,0 2,0 1,1 Hematócrito 18,0 29,1 35 <0,001 (%) 5,1 – 37,4 16,6 – 43,1 24 - 46 7,0 5,0 Plaquetas 59,7 348,3 500 <0,001 (x10 3/µl) 6 - 196 53 - 673 100 - 800 54,5 138,5 ± SD = Desvio padrão; *Jain NC (1993) – Essentials of Veterinary Hematology, Lea & Febiger, Philadelphia, p. 21.
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Tabela 2 - Valores leucocitários comparativos entre bovinos com sintomas de intoxicação aguda pelo feto comum e bovinos saudáveis (controlos) Doentes Controlos Valores de (n=18) (n=77) referência Parâmetros Média Média Média Valor de P Min-Máx Min-Máx Min-Máx ± SD ± SD Leucócitos 2,5 10,4 8 <0,001 (x10 3/µl) 0,7-5,5 5,3-18,5 4,0-12,0 1,3 2,5 Neutrófilos 0,21 3,55 2 <0,001 (x10 3/µl) 0,03-0,7 1,20-6,96 0,6-4,1 1,18 1,16 Linfócitos 2,14 5,69 4,5 <0,001 (x10 3/µl) 0,60-5,2 2,69-9,97 2,5-7,5 1,18 1,39 Monócitos 0,13 0,73 0,4 <0,001 (x10 3/µl) 0,02-0,6 0,17-2,87 0,025-0,84 0,13 0,45 Eosinófilos 0,03 0,38 0,7 <0,001 (x10 3/µl) 0,00-0,16 0,03-1,72 0-2,4 0,04 0,41 Basófilos 0,00 0,03 0,05 0,004 (x10 3/µl) 0,00-0,04 0,00-0,13 0-0,2 0,01 0,03 Leucócitos 9,6 37,7 38 <0,001 Granulócitos 1,9-20,4 15,4-51,3 17,0-69,0 % 5,5 7,7 Leucócitos 90,4 62,3 62 <0,001 Agranulócitos 79,6-98,1 48,8-84,6 47,0-82,0 % 5,5 7,7 ± SD = Desvio padrão; *Jain NC (1993) – Essentials of Veterinary Hematology, Lea & Febiger, Philadelphia, p. 21.
Tabela 3 - Valores de zinco, cobre, selénio (GSHpex), iodo e cobalto (Vit. B12) em bovinos de explorações com e sem problemas de intoxicação aguda pelo feto comum e/ou hematúria enzoótica (controlos) Doentes Controlos Valores de (n=25) (n=33) referência * Parâmetros Média Média Média Valor de P Min-Máx Min-Máx Min-Máx ± SD ± SD Zinco 13,9 14,6 0,239 (µmol/L) 7,9 - 17,1 9,8 - 19,8 13,6 - 21,0 2,5 2,3 Cobre 7,8 9,4 0,125 (µmol/L) 2,4 – 14,5 3,1 - 18,8 11,8 - 18,0 3,4 4,2 GSHpex 44,0 172 <0,001 (U/gHb) 12 - 199 26 - 461 155 – 600 36,3 138,6 IIP (iodo) 3,3 ** (µg/L) 1 – 12 ND > 105 ND 3,6 Vit. B12 39,8 ** (ng/ml) 3,6 – 89,2 ND 12 - 20 ND 37,9 ± SD = Desvio padrão; t = Teste T; GSHpex = glutationa peroxidase; * NBV Consultants 2005; **n = 10; ND = não determinado.
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Verificaram-se níveis relativamente baixos de zinco, comparados com os valores doseados nas principais cobre, selénio, iodo e cobalto nas populações de bovinos plantas forrageiras como o azevém e o trevo branco, estudadas. Registaram-se diferenças significativas nos das pastagens açorianas (Pereira, 1993). valores de glutationa peroxidase (GSHpex), entre as O diagnóstico diferencial incluiu a leptospirose duas populações de novilhas estudadas, com valores aguda em bovinos jovens, cujo quadro clínico também muito abaixo dos valores de referência nas novilhas se pode caracterizar pelo aparecimento de diáteses pertencentes ao grupo problema (Tabela 3). Os valores hemorrágicas, com hemorragias cutâneas e petéquias de iodo inorgânico plasmático em 10 novilhas de nas mucosas muito semelhantes aquelas observadas explorações problema foram muito inferiores aos nos casos de IAF. Nos casos clínicos observados de valores de referência. leptospirose, registou-se icterícia, fotossensibilidade, O exame dos aspirados de medula óssea revelou hemoglobinúria, proteinúria com turvação marcada da diminuição acentuada do número de células (panci- urina, leucocitose e boa resposta ao tratamento com topenia) das três séries: eritróide, mielóide e linfóide, antibióticos e corticóides, o que não sucedeu na quase com ausência de megacariócitos. Registaram-se ainda totalidade dos casos de IAF submetidos a terapia. A alterações de maturação da série eritróide com sinais taxa de sucesso da terapia instituída nos casos de IAF de deseritropoiese: tamanho, forma e coloração foi reduzida (inferior a 25%). Apenas os animais anormal das células. Nos aspirados de medula óssea observados e tratados numa fase precoce da doença obtidos de bovinos não expostos às toxinas do feto recuperaram. A IAF pode confundir-se com septicémias comum registou-se abundância celular, maturação agudas e outras doenças hemorrágicas dos bovinos, normoblástica, sem alterações morfológicas visíveis e como: carbúnculo hemático, pasteurelose septicémica, presença de grande número de megacariócitos em e intoxicações por furazolidona, por soja tratada com vários estádios de maturação. tricloroetileno e por trevo doce ( Melilotus spp.), mico- Na necrópsia registaram-se alterações congestivo- toxicoses e lesões radioactivas (Radostits et al ., 2007). -hemorrágicas nas fáscias de tecido conjuntivo subcutâneo, omento e serosas dos órgãos digestivos (Figura 4). No exame da cavidade torácica obser- varam-se com frequência lesões de pneumonia, pleurisia com aderências à parede costal, e petéquias e equimoses extensas no epicárdio. Em dois cadáveres, na abertura da traqueia e brônquios observaram-se intensas infestações por Dictyocaulus viviparus . A abertura dos órgãos do tubo digestivo revelou presença de petéquias e sufusões hemorrágicas (Figura 5); erosões e úlceras na mucosa do abomaso e intestino, por vezes com extensas áreas de enterite, necrose e até ruptura intestinal (Figura 6). Registaram-se petéquias na mucosa da vesícula biliar e da bexiga (Figura 7). Em alguns cadáveres foi possível observar a presença de fragmentos de feto comum no conteúdo ruminal (Figura 8). Figura 4 - Hemorragias na serosa ruminal. Os resultados histopatológicos revelaram presença de enterite necrosante com perda das vilosidades, acentuado edema e hemorragia; infiltração inflamatória da submucosa, vasos trombosados e necrose do tecido linfático com presença de aglomerados bacterianos. No abomaso observaram-se hemorragias focais e edema da submucosa. Em algumas amostras de fígado observaram-se imagens de necrose centrolobular e por vezes hepatite necrótica multifocal dispersa, com presença de aglomerados bacterianos. A nível dos linfonodos havia sinais de depleção linfóide caracteri- zada por uma diminuição no número e dimensões dos folículos. Os valores de ptaquilósido, potássio e fósforo, obtidos na análise de amostras de feto comum colhidas em pastagens onde ocorreram surtos de IAF em bovinos apresentam-se na Tabela 4. Os valores de fósforo e potássio são relativamente elevados, quando Figura 5 - Hemorragias com necrose e ruptura intestinal.
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Tabela 4 - Valores de ptaquilósido (n=20), cálcio, potássio e fósforo (n=10) em amostras de feto comum
Ptaquilósido Cálcio Potássio Fósforo µg/g g/Kg g/Kg g/Kg Média 3165 1,7 21,7 5,0 Mínimo-Máximo 614 - 8441 1,2 - 2,3 14,6 - 31,6 3,2 - 12,2 Desvio Padrão 1701 0,3 5,1 2,7
Discussão
A distribuição anual das ocorrências clínicas de IAF nos Açores parece acompanhar o aumento da biomassa disponível do feto comum, que atinge o seu valor máximo no final da Primavera até ao início do Outono (Leitão, 2005). Pelo contrário, apenas se registou uma ocorrência de IAF (Jan/05) nos meses compreendidos entre Novembro e Março, coincidindo com a maior escassez de P. aquilinum . É no final do Verão e princípio do Outono que se verificam períodos de maior escassez forrageira, sobretudo nas pastagens de baixa altitude (< 200 m), sendo muitas vezes o P. aquilinum a única planta verde disponível na pastagem. Esta planta infestante é abundante sobretudo junto às paredes e sebes divisórias das pastagens das explorações com problemas de HEB na ilha de São Miguel (Pinto et al. , Figura 6 - Abomasite com petéquias e úlceras. 2000). Constitui uma prática comum, por parte dos produtores, o corte mecânico do feto comum após o pastoreio dos bovinos nos meses de Verão, seguindo-se o aparecimento de novos rebentos com maior palati- bilidade e níveis mais elevados de ptaquilósido. Este facto poderá contribuir para o maior número de ocor- rências clínicas de IAF nos meses de Agosto a Outubro (Figura 1). A explicação mais plausível para o número de bovinos afectados por surto ser maior no mês de Maio, poderá dever-se ao aumento da população bovina de risco (vitelas após o desmame e novilhas) nesta época do ano devido à maior concen- tração de partos nos meses de Inverno. Na generalidade dos casos, os bovinos que compunham os grupos onde foram diagnosticados os
Figura 7 - Petéquias e sufusões hemorrágicas na mucosa da bexiga. casos de IAF consumiam apenas erva em regime de pastoreio, sem qualquer suplemento mineral ou alimento concentrado. Numa das explorações em que constatámos haver distribuição de alimento concentra- do, este era fornecido em pequena quantidade e como o grupo era heterogéneo, havia dominância social por parte dos animais mais corpulentos que impedia o acesso ao alimento dos bovinos de menor tamanho. É sabido que os solos de origem vulcânica são naturalmente deficitários em selénio, cobre, cobalto e iodo (Grace, 1994), por conseguinte as plantas forrageiras produzidas nestes solos vão reflectir estas carências, bem como os animais que pastoreiam nestas áreas. Nos exames hematológicos realizados aos bovinos com sintomas de IAF salienta-se a leucopenia, com Figura 8 - Fragmentos de feto comum no conteúdo ruminal. diminuição acentuada de todas as populações
295 Pinto C et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298 leucocitárias, a trombocitopenia e a anemia do tipo casos de hematúria enzoótica podendo ser superior a microcítico normocrómico, com valores baixos de dois anos (toxicidade crónica), enquanto que os sinais hemoglobina e eritrócitos muito pequenos. Contudo, clínicos de IAF ocorrem ao fim de 2 a 4 semanas de mesmo os animais do grupo controlo apresentam ingestão de cerca de 1 kg de matéria seca por dia de microcitose acentuada, com volume corpuscular frondes verdes feto comum de (Evans et al. , 1982). A médio (VCM) inferior a 52 fentolitros, sugestiva de doença tem carácter cumulativo e depende dos níveis carência em minerais com função eritropoiética como de toxicidade do feto, avaliada pelo seu teor em o ferro, cobre e o cobalto (Jain, 1993). As carências ptaquilósido. Os valores médios de ptaquilósido (3165 em cobre foram confirmadas nos dois grupos, controlo µg/g MS) foram muito elevados nas amostras de frondes e problema, podendo justificar os baixos valores de colhidas nas pastagens onde ocorreram os surtos de hemoglobina e a microcitose observada nas duas po- IAF. São considerados elevados os teores de ptaqui- pulações estudadas. O cobre interfere no metabolismo lósido acima de 500 µg/g MS (Smith et al. , 1994). do ferro através da ferroxidase I (ou ceruloplasmina), A elevada concentração em fósforo e potássio uma enzima dependente do cobre, que converte o doseada em 10 amostras de feto comum pode justi- ferro ferroso Fe 2+ em ferro férrico Fe 3+ e promove a sua ficar a apetência dos bovinos por esta planta. É sabido incorporação na transferrina que veicula este elemento que as carências em fósforo, sódio, potássio e cloro para os tecidos extra-hepáticos (Keen e Graham, são causa de perversão do apetite nos bovinos (Naylor 1989). e Ralston, 1991), podendo justificar a ingestão de Os linfócitos embora em número inferior aos plantas tóxicas, como o P. aquilinum . valores de referência no grupo problema, não foram Os efeitos tóxicos do ptaquilósido podem ser tão afectados pelas toxinas do feto comum como os exacerbados pela ausência de água à disposição das neutrófilos e os eosinófilos. Na fórmula leucocitária novilhas na maioria das explorações acompanhadas, registou-se linfocitose e aumento relativo dos bem como pelas carências generalizadas em oligoele- leucócitos agranulócitos no grupo com sintomas de mentos nos bovinos estudados. O zinco, o cobre e o IAF. As toxinas do feto comum possuem um efeito selénio fazem parte de metalo-enzimas como a radiomimético a nível da medula óssea (Evans et al. , superóxido dismutase e a glutationa peroxidase que 1982; França et al. , 2002), afectando todas as desempenham importantes funções anti-oxidativas linhagens celulares. Contudo, como existe produção (Keen e Graham, 1989), protectoras e reparadoras das extra-medular de linfócitos, os seus valores não se lesões induzidas no ADN pelo ptaquilósido. Por encontram tão deprimidos a nível sanguíneo nos casos conseguinte, o valor deprimido de GSHpex observado de IAF. A análise dos aspirados de medula óssea nos bovinos pertencentes a explorações com problemas confirmou a depressão acentuada da actividade da de IAF pode facilitar o desenvolvimento dos processos medula óssea (aplasia), com ausência de megacariócitos neoplásicos, como os tumores de bexiga, tão comuns e células precursoras dos leucócitos granulócitos nos na população bovina da ilha de São Miguel. bovinos com IAF. Nas séries eritróides registou-se Os baixos valores de iodo inorgânico plasmático nas hipoplasia e alterações morfológicas sugestivas de novilhas das explorações problema, podem levar a perda de funcionalidade dos glóbulos vermelhos. As hipotiroidismo, com anemia subsequente e atrasos no alterações hematológicas verificadas nos bovinos com crescimento. Os valores obtidos de vitamina B12 IAF, sobretudo a trombocitopenia, justificam o quadro foram muito díspares, sendo abaixo dos valores con- hemorrágico observado nos animais com sintomas siderados normais em 4 de 10 novilhas estudadas. As clínicos da doença. concentrações sanguíneas de vitamina B12 reflectem As extensas lesões na mucosa do tracto digestivo a ingestão de cobalto na dieta dos ruminantes (Grace, com necrose intestinal associada à diminuição 1994). acentuada dos leucócitos facilitaram a entrada em As condições climatéricas, a orografia e o tipo de circulação de bactérias, com subsequente septicémia e solos existentes nas ilhas do arquipélago dos Açores, morte por choque séptico. As infecções respiratórias facilitam o crescimento e a expansão do feto comum. com pneumonias e pleurisias são frequentes nos casos O maneio das pastagens com corte mecânico desta de IAF, sendo uma consequência provável da leucopenia infestante, uma ou duas vezes por ano, após o pastoreio, e debilidade orgânica geral provocada pelas toxinas do favorece o aparecimento de frondes tenras mais feto comum, exacerbadas pelas carências minerais e apetecíveis e com maior toxicidade para os bovinos, parasitismo observados. por apresentarem níveis mais elevados de ptaquilósido As lesões macroscópicas observadas na mucosa da (Pinto et al. , 2004). A colocação dos bovinos em bexiga dos bovinos afectados pela IAF, lembram os pastagens infestadas pelo P. aquilinum , sem forneci- tumores de bexiga observados nos casos de HEB. Esta mento adicional de qualquer suplemento alimentar e observação sugere-nos que os casos de IAF poderão por vezes sem água à disposição, cria condições representar a parte visível do "iceberg", que é a toxici- propícias ao aparecimento de surtos de IAF, HEB e dade induzida pelas toxinas do feto comum. A relação carcinomas do tracto digestivo superior nos bovinos. causa efeito está muito distanciada no tempo nos Em algumas freguesias da ilha de São Miguel, os
296 Pinto C et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 289-298 produtores mais antigos associam os sintomas da IAF França TN, Tokarnia CH e Peixoto PV (2002). Enfermidades a carbúnculo hemático, também conhecido por antraz, determinadas pelo princípio radiomimético de tendo-se instituído como profilaxia a vacinação dos Pteridium aquilinum (Polypodiaceae). Pesquisa efectivos contra o Bacillus anthracis e outras Veterinária Brasileira, 22(3), 85-96. clostridioses. Baseando-se em experiências anteriores, Grace N (1994). Managing trace elements deficiencies. AgResearch (New Zealand Pastoral Agricultural os produtores denominaram algumas áreas geográficas Research Institute, Lda). Palmerston North, 1-70. da ilha como sendo terras de "carbúnculo". Foi Hannam DAR (1986). Bracken poisoning in farm animals possível constatar que estas áreas são actualmente as with special reference to the North York moors. In mais afectadas pela hematúria enzoótica bovina Bracken, ecology, land use and control technology. Ed. (HEB) e onde se regista maior número de surtos de R.T. Smith & J.A. Taylor. Carnforth, Lancashire, IAF. Parthenon, pp 133-188. A prevenção dos problemas associados à ingestão Hirono I, Kono K, Takahashi K, Yamada H, Niwa M, Ojika do feto comum nos bovinos deve basear-se na sensibi- H, Kigoshi H, Niiyama K, Uosaki Y (1984). lização dos produtores para as doenças e prejuízos Reproduction of acute bracken poisoning in a calf with consequentes, na melhoria das pastagens com Ptaquiloside, a bracken constituent. Vet Record, 115: aplicação de herbicidas adequados ao controlo e 375-378. Jain NC (1993). Essentials of Veterinary Hematology. Lea & erradicação da infestante e na correcção das carências Febiger. Philadelphia, pp 3, 77 e 162. minerais dos bovinos em pastoreio. Jarrett WFH, McNeil PE, Grimshaw WTR, Selman IE, McIntyre WIM (1978). 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Transmissão da tuberculose bovina entre espécies domésticas e silvestres em Portugal: primeiras evidências moleculares em isolados de Mycobacterium bovis de uma exploração no Alentejo
Bovine tuberculosis transmission between domestic and feral species in Portugal: first molecular evidences in Mycobacterium bovis isolates from a farm in Alentejo
Elsa L. Duarte 1,2 , Margarida Domingos 1, Teresa Albuquerque 1, Alice Amado 1 e Ana Botelho 1*
1Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Departamento de Bacteriologia, Estrada de Benfica nº 701, 1549-011 Lisboa 2Laboratório de Sanidade Animal/ ICAM, Universidade de Évora, Apartado 94, 7002-554 Évora codex
Resumo: No âmbito de um estudo mais alargado para a carac- Portuguese isolates but previously described in Spain and terização molecular de estirpes de Mycobacterium bovis (M. France, and presented the same number of repetitions in each of bovis ) e de Mycobacterium caprae (M. caprae ) isoladas em the nine MIRU-VNTR loci characterised. This molecular data, Portugal, tipificaram-se dois isolados de M. bovis provenientes along with the spatial closeness of both animals, allowed us to de um bovino e de um javali ( Sus scrofa ), que coabitavam na conclude on the probability of M. bovis transmission between mesma exploração na região do Alentejo. Duas metodologias, them, providing the first evidences that, in Portugal, domestic reconhecidas pela sua reprodutibilidade e poder discriminatório, and feral species can share the same strains. These results foram utilizadas na genotipagem: o "spoligotyping" e a análise should encourage further studies on the role of feral species in de MIRU-VNTR, caracterizando nove loci do genoma, que bovine tuberculosis epidemiology in Portugal. variam no número de repetições nucleotídicas contíguas: VNTR 3232, ETR-A, ETR-B, MIRU-26, QUB 11b, QUB 11a, Keywords: Bovine tuberculosis, feral animals, wild boar, ETR-C, VNTR 4156 e MIRU-4. Ambos os isolados apresen- molecular epidemiology, spoligotyping, MIRU-VNTR typing taram idêntico padrão spoligotyping SB0265, pouco frequente em Portugal mas já descrito em Espanha e em França, e igual Abreviaturas: ATCC - American Type Culture Collection; número de repetições em cada um dos nove loci estudados. ETR - Exact Tandem Repeat; pb- pares de bases; DR - Direct Estes dados, aliados à proximidade espacial dos animais, Repeat; MIRU - Mycobacterial Interspersed Repetitive Units; apontam para a probabilidade de transmissão de M. bovis entre MTC - Mycobacterium tuberculosis complex; PCR-REA - eles, constituindo as primeiras evidências em Portugal de partilha Polymerase Chain Reaction - Restriction Endonuclease de estirpes entre espécies silvestres e domésticas. Estes resultados Analysis; QUB - Queen’s University of Belfast; SNIRB - deverão incentivar estudos mais aprofundados sobre o papel das Sistema Nacional de Identificação e Registo de Bovinos; VNTR espécies silvestres na epidemiologia da tuberculose bovina em - Variable Number Tandem Repeats Portugal.
Palavras-chave: Tuberculose bovina, animais silvestres, javali, Introdução epidemiologia molecular, spoligotyping, MIRU-VNTR A possibilidade de animais silvestres albergarem Summary: Included in a broader study of Portuguese Mycobacterium bovis (M. bovis ) and Mycobacterium caprae estirpes de Mycobacterium bovis (M. bovis ) comuns (M. caprae ) strains molecular typing, two isolates from a bovine às espécies domésticas, funcionando como potenciais and a wild boar ( Sus scrofa ), that inhabited the same farm in the reservatórios responsáveis pela reintrodução da Alentejo region, were typed. Two techniques were chosen on the doença em explorações livres de tuberculose, tem sido basis of their reproducibility and discriminatory power: um tema amplamente debatido em vários países. Em Spoligotyping and MIRU-VNTR analysis, with characterization of nine different genome loci (VNTR 3232, ETR-A, ETR-B, Portugal, sem o apoio de dados moleculares sobre as MIRU-26, QUB 11b, QUB 11a, ETR-C, VNTR 5156 e MIRU- estirpes isoladas, as informações recolhidas junto das 4) that vary in the number of tandem repeats. Isolates shared the explorações no âmbito dos inquéritos epidemiológicos same SB0265 spoligotype pattern, an infrequent pattern for oficiais apenas fornecem indícios da transmissão entre espécies domésticas e silvestres. Afigura-se, por isso, essencial recorrer a abordagens integradas dos dados da epidemiologia convencional com técnicas de genotipagem para confirmar ou refutar conexões epi- *Correspondência: [email protected] demiológicas entre isolados.
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As diferentes espécies bacterianas pertencentes ao mediastínicos, tendo as amostras sido enviadas para o complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC), do laboratório em Janeiro de 2004. qual fazem parte M. tuberculosis , M. africanum , M. O isolamento bacteriano foi realizado por bovis , M. caprae , M. microti e M. canettii , possuem sementeira em meios selectivos sólidos e líquidos. entre si cerca de 99,9% de homologia genética A identificação foi efectuada por PCR-REA baseado (Brosch et al ., 2000), o que tem dificultado o desen- no gene gyr B segundo Niemann et al . (2000). volvimento de técnicas moleculares específicas de O spoligotyping foi efectuado de acordo com o diagnóstico e de tipificação. Presentemente, as técnicas protocolo descrito por Kamerbeek et al . (1997). de genotipagem mais comuns recorrem à amplifi- Resumidamente, a região DR de cada isolado foi cação por PCR de regiões do genoma sufi cientemente amplificada recorrendo a um par de iniciadores, um estáveis para servirem de marcador epidemiológico deles marcado com a biotina. Os produtos de PCR mas com potencial polimorfismo para diferenciar foram desnaturados e hibridados numa membrana estirpes sem relação epidemiológica entre si. No caso onde se encontravam os 43 oligonucleotidos covalen- dos membros do MTC, estas técnicas incluem o temente ligados (Figura 1). A presença ou ausência spoligotyping (de "spacer" , "oligonucleotide" e de cada um dos oligonucleótidos espaçadores foi "typing") e a análise de MIRU-VNTR (Mycobacterial avaliada recorrendo a um conjugado de estreptavidi- Interspersed Repetitive Unit – Variable Number na-peroxidase (Roche) e visualizado numa película Tandem Repeats). autoradiográfica. Registou-se o perfil de cada isolado, O spoligotyping, desenvolvido pela primeira vez um número binário de 43 dígitos (1 presença, 0 ausên- por Kamerbeek et al . (1997), baseia-se na detecção de cia do espaçador), que foi inserido e comparado com 43 sequências espaçadoras variáveis de 35 a 41 pb que os perfis existentes na base de dados internacional separam sequências repetidas directas (DR) de 36 pb, http://www.mbovis.org . existentes na região genómica denominada DR (Direct Para cada isolado procedeu-se ao estudo de nove Repeat). Com base no conhecimento da sequência do loci MIRU-VNTR: VNTR 3232, ETR-A, ETR-B, genoma de M. tuberculosis e M. bovis , Supply et al . MIRU-26, QUB 11b, QUB 11a, ETR-C, VNTR 4156 (2000 e 2001) desenvolveram a tipificação por MIRU- e MIRU-4. Cada locus foi amplificado por PCR -VNTR que se baseia na determinação do número utilizando os iniciadores descritos por Frothingham e de cópias de sequências nucleotídicas repetidas em Meeker O’ Connell (1998), Supply et al . (2001), tandem, em determinadas regiões do genoma ( loci ) de Skuce et al . (2002) e van Deutekom et al . (2005). O micobactérias, escolhidas pela sua estabilidade e peso molecular dos produtos de PCR foi avaliado por poder discriminatório. Os VNTR têm sido especial- electroforese em gel de agarose Nusieve (Cambrex) a mente úteis na genotipagem de bactérias patogénicas 3%, 5 horas a 120 Volts usando um marcador de peso que possuem, à semelhança do MTC, um genoma molecular de 100 pb (Promega). Através da análise muito conservado como Bacillus anthracis ou Yersinia da base de dados http://minisatellites.u-psud.fr, pestis (Lindstedt, 2005). construiu-se uma tabela de interpretação que permitiu Utilizados em conjunto, o spoligotyping e a tipifi- definir, para cada locus , a relação entre o peso molecu- cação pelos MIRU-VNTR, por assentarem em regiões lar dos produtos de amplificação obtidos e o número independentes do genoma, permitem confirmar ou de repetições correspondente. refutar suspeitas de ligações epidemiológicas entre isolados.
Material e métodos
Inserido num estudo de epidemiologia molecular da tuberculose bovina no nosso país, dois isolados de M. bovis provenientes de um bovino – LNIV 386/01/04 - e de um javali ( Sus scrofa ) – LNIV 15176/03- foram tipificados. Os dois animais pertenciam à mesma exploração no Alentejo, perto da fronteira com Espanha. No javali, um animal adulto, foram apenas observadas lesões de necrose nos linfonodos parotídeos, tendo sido estes enviados para análise bacteriológica no LNIV em Novembro de 2003. No Figura 1 - Passos principais da técnica Spoligotyping: 1 - Cada espaçador ("spacer") da região DR é ligado covalentemente a uma bovino, mantido sempre na mesma exploração de membrana; 2 - As sequências espaçadoras são amplificadas por PCR acordo com o SNIRB e o único em que se isolou usando iniciadores complementares das sequências conservadas repetidas M. bovis , foram observadas lesões mais extensas directas (DR); 3 - Os produtos de PCR hibridam com os espaçadores na membrana e a presença ou ausência das 43 sequências espaçadoras para envolvendo o pulmão, linfonodos brônquicos e cada isolado é avaliada, através de um sinal de quimioluminescência.
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Figura 3 - Resultados do Spoligotyping: Película autoradiográfica dos produtos de PCR hibridados com 43 nucleótidos espaçadores: B - Isolado M. bovis LNIV 386/01/04 de bovino; J - Isolado M. bovis LNIV 15176/03 de javali; Mt - controlo positivo estirpe M. tuberculosis H37Rv ATCC 25177; C - Controlo negativo; Mb - controlo positivo estirpe M. bovis BCG ATCC 19015
Discussão
A utilização de marcadores epidemiológicos inde- Figura 2 - A - Resultados de amplificação por PCR gyr B.- Amplicon de pendentes e em regiões do genoma não relacionadas, 1020 pb específico do MTC; M - marcador de pesos moleculares (Hyperladder III Bioline) 1 - Isolado M. bovis LNIV 386/01/04 de permite obter resultados de maior fiabilidade em bovino; 2 - Isolado M. bovis LNIV 15176/03 de javali; 3 - Estirpe de epidemiologia molecular, visto aumentar a possibili- referência M. bovis BCG ATCC19015; 4 - Estirpe de referência M. dade de discriminação entre isolados. tuberculosis H37Rv ATCC 25177; B - Análise de restrição por endonucleases (REA) com os enzimas Rsa Num estudo anterior, por nós realizado no nosso I e Sac II. M - marcador de pesos moleculares de 100 pb (Promega) ; 1 país, envolvendo a tipificação de 143 estirpes de M. e 5 - Isolado M. bovis LNIV 386/01/04 de Bovino; 2 e 6 - Isolado M. bovis e M . caprae o índice discriminatório da técnica bovis LNIV 15176/03 de Javali; 3 - Estirpe de referência M. bovis BCG ATCC 19015; 4 - Estirpe de referência M. tuberculosis H37Rv ATCC de spoligotyping foi de 0,9 (Duarte et al ., 2008), 25177; 7 - Estirpe M. caprae LNIV 15244/04 confirmando a utilidade desta técnica na tipificação dos isolados de M. bovis . A capacidade discriminatória Resultados de uma técnica ou de um conjunto de técnicas de genotipagem é calculada recorrendo ao índice de Ambos os isolados foram identificados como Gaston e Hunter (Hunter e Gaston, 1988) que traduz-se Mycobacterium bovis por PCR-REA (Figura 2). matematicamente pela probabilidade de dois isolados, Os dois isolados apresentaram o mesmo perfil de escolhidos ao acaso numa população e sem relação spoligotyping, registado na base internacional como epidemiológica, serem diferenciados pela(s) técnica(s) SB0265, cujas principais características são a ausência em questão. O perfil de spoligotyping apresentado das sequências espaçadoras 3, 6, 9, 16, 21 e 39-43 pelos dois isolados estudados é pouco frequente em (Figura 3). Portugal (2,1 %), de acordo com Duarte et al . (2005), Ambos os isolados apresentaram o mesmo número o que aumenta a probabilidade destes dois isolados de repetições (Figura 4) para cada um dos nove loci serem a mesma estirpe. Este perfil foi anteriormente MIRU-VNTR caracterizados: QUB11b, duas repetições identificado em bovinos em Espanha (Aranaz et al ., (205 pb); ETR-A, uma repetição (270 pb); VNTR 3232, 1996) e em França (Haddad et al ., 2001); em javalis seis repetições (517 pb); ETR-C, duas repetições (324 está referido em estirpes provenientes da Estremadura pb); QUB11a, onze repetições (857 pb); ETR-B, quatro Espanhola (Parra et al ., 2005), uma região bastante repetições (349 pb); MIRU-26, cinco repetições (540 próxima da zona da exploração Alentejana estudada. pb); VNTR 4156, uma repetição (622 pb); MIRU-4, Para cada um dos nove loci MIRU-VNTR estudados, três repetições (406 pb). verificou-se que os dois isolados possuíam exactamente
Figura 4 - Resultados da análise MIRU-VNTR para os nove loci indicados na figura. O peso molecular de cada locus está indicado lateralmente. B - Isolado M. bovis LNIV 386/01/04 de bovino; J - Isolado M. bovis LNIV 15176/03 de javali; Mt - Controlo positivo estirpe M. tuber- culosis H37Rv ATCC 25177; M - Marcador de pesos moleculares (Hyperladder IV Bioline)
301 Duarte EL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 299-303 o mesmo número de repetições. Resultados de outros esclarecer se os javalis no nosso país são hospedeiros autores indicam que a associação do spoligotyping e de manutenção e reservatórios importantes da doença, análise por MIRU-VNTR é altamente discriminatória ou hospedeiros fundo de saco. Neste último caso, a (Skuce et al ., 2002; Hilty et al ., 2005; Allix et al ., incidência da doença diminuirá à medida que cami- 2006). nharmos no sentido da erradicação da tuberculose Recorrendo a vários marcadores epidemiológicos, bovina. No entanto, qualquer que seja a relevância das trabalhos têm sido publicados demonstrando que espécies silvestres na epidemiologia da doença, o javalis e bovinos partilham as mesmas estirpes de M. risco de transmissão ao Homem e animais domésticos bovis quando co-habitam as mesmas regiões de existe e será fundamental considerá-lo futuramente na Espanha, Itália ou de vários países da Europa Central elaboração e implementação de medidas de controlo e (Serraino et al ., 1999; Machackova et al ., 2003; erradicação eficazes da tuberculose bovina em Aranaz et al ., 2004; Parra et al ., 2003 e 2005; Portugal. Hermoso de Mendoza et al ., 2006). No entanto, a importância destes animais na epidemiologia da tuber- culose bovina é difícil de avaliar pois prevalências Agradecimentos elevadas em populações silvestres poderão não implicar forçosamente um papel importante na trans- Agradece-se o apoio técnico prestado por Ilda missão da doença aos bovinos (Corner, 2006). Lopes (LNIV) na preparação do DNA das amostras e Existem outros parâmetros a serem considerados, à Dra. Lia Ticló e Dra. Filipa Lourenço da Direcção entre os quais a densidade populacional dos javalis na Geral de Veterinária por terem facultado dados área estudada e a sua interacção com as espécies relativos aos movimentos dos animais constantes domésticas, nomeadamente a partilha de zonas de no SNIRB. pastagem e de abeberamento. Estes animais também podem transpor cercas facilmente e cobrem um Bibliografia território que pode atingir um raio de 50 km na época de caça (Serraino et al ., 1999), aumentando a possi- Allix C, Walravens K, Saegerman C, Godfroid J, Supply P, bilidade de contacto com outras espécies. Fauville-Dufaux M (2006). Evaluation of the epidemio- Aranaz et al . (2004) defendem que os javalis em logical relevance of Variable-Number Tandem-Repeat Espanha são um reservatório da tuberculose bovina, Genotyping of Mycobacterium bovis and comparison of por esta se ter tornado endémica nestes animais em the method with IS6110 Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis and Spoligotyping. J Clin determinadas regiões. Também o aparecimento de Microbiol, 44: 1951-1962. surtos em coutadas de caça sem proximidade com Aranaz A, Liebana E, Mateos A, Dominguez L, Vidal D, explorações bovinas reforçou esta convicção. No Domingo M, Gonzolez O, Rodriguez-Ferri EF, entanto, Serraino et al . (1999) num estudo realizado Bunschoten AE, van Embden JD, Cousins D (1996). no Norte de Itália, defendem que estes animais são Spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium bovis hospedeiros de fundo de saco e sem importância na strains from cattle and other animals: a tool for studying transmissão da doença aos bovinos, por serem animais epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol, 34: de actividade nocturna e com pouco contacto com 2734-2740 espécies domésticas. Os mesmos autores observaram Aranaz A, de Juan L, Montero N, Sanchez C, Galka M, que as lesões nos javalis, à semelhança do animal que Delso C, Alvarez J, Romero B, Bezos J, Vela AI, Briones estudámos, se encontravam muitas vezes confinadas V, Mateos A, Dominguez L (2004). Bovine tuberculosis (Mycobacterium bovis ) in wildlife in Spain. J Clin aos linfonodos da cabeça, sugerindo a infecção por via Microbiol, 42: 2602-2608 digestiva, diminuindo a possibilidade de contagiarem Brosch R, Garnier T, Cole ST (2000). Comparative os bovinos directamente por via aerógena. A presença genomics of the Mycobacteria. Inter J Med Microbiol, de lesões menos extensas e características nos javalis 290: 143-152. deverá alertar para a necessidade de uma inspecção Corner LAL (2006). The role of wild animal populations in rigorosa das carcaças atendendo ao carácter zoonótico the epidemiology of tuberculosis in domestic animals: do agente. how to assess the risk. Vet Microbiol, 112: 303-312. No presente trabalho, os dados apresentados van Deutekom H, Supply P, de Haas PEW, Willery E, Hoijng sugerem a transmissão do agente infeccioso entre os SP, Locht C, Coutinho RA, van Soolingen D (2005). dois animais ou a existência de uma fonte de infecção Molecular Typing of Mycobacterium tuberculosis by comum a ambos. No caso da transmissão entre os dois Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable- Number Tandem Repeat Analysis, a more accurate animais, o seu sentido é difícil de apurar visto a tuber- method for identifying epidemiological links between culose ter um período de incubação longo, com patients with tuberculosis. J Clin Microbiol, 43: 4473- quadros pouco uniformes e uma evolução arrastada. 4479. Em trabalhos futuros, recorrendo a um maior número Duarte EL, Domingos M, Amaro A, Amado A, Botelho A de isolados e com o apoio de dados de inquéritos (2005). Molecular typing of Portuguese Mycobacterium epidemiológicos mais pormenorizados, convirá bovis by Spoligotyping (Abstract). The Fourth
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International Conference on Mycobacterium bovis . Machackova M, Matlova L, Lamka J, Smolik J, Melicharek Dublin, Ireland, 22nd-26th August. I, Hanzlikova M, Docekal J, Cvetnik Z, Nagy G, Lipiec Duarte EL, Domingos M, Amado A e Botelho A (2008). M, Ocepek M, Pavlik I (2003). Wild Boar ( Sus scrofa ) Spoligotype diversity of Mycobacterium bovis and as a possible vector of mycobaterial infections: review of Mycobacterium caprae animal isolates. Veterinary literature and critical analysis of data from Central Microbiology, 130: 415-421. Europe between 1983 to 2001. Vet Med Czech, 48: Frothingham R, Meeker-O'Connell WA (1998). Genetic 51-65. diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex Niemann S, Harmsen D, Rusch-Gerdes S, Richter E (2000). based on variable numbers of tandem DNA repeats. Differentiation of Clinical Mycobacterium tuberculosis Microbiol, 144: 1189-1196. Complex isolates by gyr B DNA Sequence Polymor- Haddad N, Ostyn A, Karoui C, Masselot M, Thorel MF, phism Analysis. J Clin Microbiol, 38: 3231-3234. Hughes SL, Inwald J, Hewinson RG, Durand B (2001). Parra A, Fernandez-Llario P, Tato A, Larrasa J, Garcia A, Spoligotype diversity of Mycobacterium bovis strains Alonso JM, Hermoso de Mendoza M, Hermoso de isolated in France from 1979 to 2000. J Clin Microbiol, Mendoza J (2003). Epidemiology of Mycobacterium 39: 3623-3632. bovis infections of pigs and wild boars using a molecular Hermoso de Mendoza J, Parra A, Tato A, Alonso JM, Rey approach. Vet Microbiol, 97: 123-133. JM, Pena J, Garcia-Sanchez A, Larrasa J, Teixido J, Parra A, Larrasa J, Garcia A, Alonso JM, Mendoza JH Manzano G (2006). Bovine tuberculosis in wild boar (2005). Molecular epidemiology of bovine tuberculosis (Sus scrofa ), red deer ( Cervus elaphus ) and cattle ( Bos in wild animals in Spain: A first approach to risk factor taurus ) in a Mediterranean ecosystem (1992-2004). analysis. Vet Microbiol, 110: 293-300. Prev Vet Med, 74: 239-247. Serraino A, Marchetti G, Sanguinetti V, Rossi MC, Zanoni Hilty M, Diguimbaye C, Schelling E, Baggi F, Tanner M, RG, Catozzi L, Bandera A, Dini W, Mignone W, Zinsstag J (2005). Evaluation of the discriminatory Franzetti F, Gori A (1999). Monitoring of transmission power of variable number tandem repeat (VNTR) typing of tuberculosis between wild boars and cattle: genotypical of Mycobacterium bovis strains. Vet Microbiol, 109: analysis of strains by molecular epidemiology techniques. 217-222. J Clin Microbiol, 37: 2766-2771. Hunter PR, Gaston MA (1988). Numerical index of the Skuce RA, McCorry TP, McCarroll JF, Roring SMM, Scott discriminatory ability of typing systems: an application AN, Brittain D, Hughes SL, Hewinson RG, Neill SD of Simpson's index of diversity. J Clin Microbiol, 26: (2002). Discrimination of Mycobacterium tuberculosis 2465-2466. complex bacteria using novel VNTR-PCR targets. Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, Van Microbiol, 148: 519-528. Soolingen D, Kuijper S, Bunschoten A, Molhuizen H, Supply P, Mazars E, Lesjean S, Vincent V, Gicquel B, Locht Shaw R, Goyal M, Van Embden J (1997). Simultaneous C (2000). Variable human minisatellite-like regions in detection and strain differentiation of Mycobacterium the Mycobacterium tuberculosis genome. Molecular tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol, 36: 762-771. Microbiol, 35: 907-914. Supply P, Lesjean S, Savine E, Kremer K, van Soolingen D, Lindstedt BA (2005). Multiple-locus variable number tandem Locht C (2001). Automated High-Throughput repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic Genotyping for study of global epidemiology of bacteria. Electrophoresis, 26: 2567-2582. Mycobacterium tuberculosis based on mycobacterial interspersed repetitive units. J Clin Microbiol, 39: 3563-3571.
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RPCV (2007) 102 (563-564) 305-313 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Diagnóstico de paratuberculose ovina
Diagnosis of paratuberculosis in sheep
1 2 1 1,3 Ana Cláudia Coelho *, Adosinda Maria Coelho , Maria de Lurdes Pinto , Jorge Rodrigues
1Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 202, 5001-911 Vila Real Codex 2Direcção Regional de Agricultura de Trás-os-Montes, Rua da República, 133, 5370-347 Mirandela 3Centro de Ciência Animal e Veterinária (CECAV), Apartado 1013, 5001-801 Vila Real
Resumo: A paratuberculose (doença de Johne), causada por Introdução Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis (Map) é uma doença de natureza infecciosa. Afecta principalmente os A paratuberculose (doença de Johne), causada por ruminantes, originando uma enterite crónica granulomatosa. O diagnóstico em ovinos é particularmente complicado pela Mycobacterium avium subespécie paratuberculosis ausência de um teste considerado "golden standard" e pela (Map) é uma doença de natureza infecciosa. Afecta inespecificidade dos sinais clínicos. A detecção da bactéria principalmente os ruminantes, originando uma através da cultura ou métodos moleculares e a avaliação das enterite crónica granulomatosa (Chiodini et al ., 1984; lesões histopatológicas constituem os métodos mais eficazes Clarke, 1997). Esta entidade nosológica tem um longo para a confirmação do diagnóstico de paratuberculose. A cultura a partir das amostras de fezes e tecidos apresenta baixa período de incubação, sendo caracterizada por um sensibilidade e necessita de meses de incubação antes que quadro de emagrecimento progressivo e fatal, ocorra o aparecimento de colónias. O diagnóstico molecular é acompanhado frequentemente de diarreia (Chiodini baseado na detecção da sequência específica IS900 de Map et al ., 1984; Raizman et al ., 2007). As perdas através da técnica de reacção em cadeia da polimerase (PCR) a económicas são elevadas e traduzem-se na diminuição partir dos tecidos, fezes e sangue sendo considerados métodos alternativos rápidos e, altamente, específicos. No diagnóstico da produção e no aumento do refugo dos animais são ainda aplicados os métodos imunológicos baseados na (Losinger, 2006). Nenhum tratamento eficaz é resposta imunológica do hospedeiro. conhecido e, nas raras circunstâncias em que se procede à terapia, são utilizados, os agentes antimi- Summary: Paratuberculosis (Johne's disease), a chronic crobianos normalmente, utilizados para o género granulomatous enteritis and regional lymphadenitis which affects domestic and wild ruminants, is caused by Mycobacterium . O tratamento é muito dispendioso, Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map). sendo usado apenas para prolongar a vida a animais Diagnosis of the disease is difficult in sheep because of the lack com fins de reprodução extremamente valiosos of a golden standard test, as well as the lack of specificity (Harris e Barletta, 2001). Em Portugal, a doença foi of clinical signs make the diagnosis of paratuberculosis in descrita pela primeira vez, em bovinos, no ano de sheep different. Detection of bacteria by means of culture or molecular methods and the evaluation of histopathological 1961, por Petisca e seus colaboradores (Petisca et al ., lesions constitute the most effective method of confirming a 1961). paratuberculosis diagnosis. The culture of bacteria from faeces and tissue samples is less sensitive and requires months of incubation before colony growth occurs. Diagnosis based on the Diagnóstico detection of IS900-specific sequences of Map by polymerase chain reaction (PCR) from tissues, faeces and blood are alternative methods considered to be very quick, and highly As técnicas de diagnóstico utilizadas para detectar a specific. Immunological methods are also used for detection of doença são influenciadas pela sua evolução e pela infected sheep based on the immunological response to the prevalência da mesma no efectivo (Sweeney et al ., infection. 1995). O controlo da doença numa exploração depende consideravelmente da capacidade para detectar precocemente animais jovens infectados. A detecção da infecção no hospedeiro, durante a fase subclínica, é complicada, pois a bactéria multiplica-se lentamente sendo raramente excretada nas fezes. Por outro lado, não existe ou é diminuta a resposta *Correspondência: [email protected] imunitária nesta fase. Os anticorpos estão ausentes e Tel: +351 259350405; Fax: +351 259350629 embora ocorra hipersensibilidade do tipo retardado
305 Coelho AC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 305-313 nas fases precoces da infecção, esta não é tão magnésio e fósforo, nem sequer podem ser tomadas significativa como na tuberculose bovina (European para orientação no diagnóstico da paratuberculose já Commission, 2000). O diagnóstico em ovinos é que são pouco específicas (Garrido et al ., 2000). particularmente complicado pela ausência de um teste Os estudos hematológicos podem revelar anemia considerado "golden standard" e pela inespecificidade normocrómica, hipoproteinemia, descida dos valores dos sinais clínicos. séricos de cálcio e magnésio (Kimberling, 1988).
Diagnóstico clínico-epidemiológico Diagnóstico diferencial
Os sinais clínicos apresentados pelos ovinos são Nos pequenos ruminantes, deve estabelecer-se o insuficientes para estabelecer um diagnóstico. Ocorre, diagnóstico diferencial com doenças que acompanham principalmente, uma perda crónica progressiva de a hipoproteinemia e emagrecimento, como o parasitis- peso corporal como resultado da má absorção e perda mo interno (estrongilose, coccidiose) e externo, de músculo. Embora a doença seja sempre crónica, há doenças víricas, tumores, intoxicações ou outras uma variação considerável no seu curso. Por vezes afecções crónicas (linfadenite caseosa, maedi-visna, progride relativamente rápido, podendo durar poucos adenocarcinoma pulmonar dos ovinos, peritonite dias desde o aparecimento do emagrecimento até à crónica, artrite-encefalite caprina, pneumonia ovina morte. Em outros casos, após a perda da condição progressiva), ou com afecção intestinal (Hartnagel, corporal, não há deterioração clínica por longos 2000), salmonelose, abcessos internos por períodos. (Kimberling, 1988). Os pequenos rumi- Corynebacterium pseudotuberculosis , intoxicação por nantes podem ser assintomáticos de 2 até 7 anos molibdénio, má nutrição (aporte inadequado de (Navarre e Pugh, 2002). macronutrientes, falta de energia, proteínas e/ou Certas características da infecção por Map podem micronutrientes como o cobalto ou cobre) (Stehman, orientar o médico veterinário até um diagnóstico 1996). presuntivo. A observação de animais com mais de dois anos de idade, com frequência fêmeas depois do parto, afectadas por um quadro de emagrecimento Diagnóstico anátomo-patológico progressivo com diarreia intermitente ou contínua em fases iniciais que termina com a morte do animal, são Diagnóstico macroscópico os dados clínicos mais característicos. A morbilidade Um aspecto importante no estudo anátomo- é baixa, sendo raro encontrar mais de um ou dois -patológico da paratuberculose, especialmente nos animais doentes ao mesmo tempo (Garrido et al ., pequenos ruminantes, é a falta de correlação existente 2000). entre a gravidade dos sinais clínicos e a extensão e Os critérios clínicos que permitem suspeitar de alcance das lesões macro e microscópicas (Chiodini et paratuberculose estão sobretudo ligados à diarreia al ., 1984; Barker et al ., 1993). As lesões específicas persistente e ao emagrecimento, observados na forma localizam-se com a máxima frequência na válvula clássica nos bovinos. Estes não serão os mesmos nas íleo-cecal e no íleo, assim como, nos linfonodos outras formas clínicas ou em pequenos ruminantes, associados. Consistem num engrossamento da mucosa principalmente, quando a diarreia aparece pela e na formação de pregas transversais que não desa- primeira vez no efectivo (Brugère-Picoux, 1987). parecem após se fazer a tracção do intestino (Figura A ausência de animais com sinais clínicos, não 1). Os linfonodos mesentéricos e íleo-cecais aparecem descarta a possibilidade de que a paratuberculose se encontre numa exploração, visto que é normal a ausência de sinais clínicos. Nestes casos, a para- tuberculose pode manifestar-se apenas com uma diminuição da produção leiteira (Goodger et al ., 1996), ou com uma maior susceptibilidade a proble- mas de mamites (Garrido et al ., 2000; Raizman et al ., 2007). Em certas ocasiões formam-se edemas intermandibulares, na prega da pele do pescoço e nas patas, associadas à descida dos níveis séricos de proteínas totais, própria dos estados caquéticos avançados e, que muitos clínicos interpretam como deficiências na absorção de nutrientes ou perdas de proteína a nível intestinal (Juste et al ., 1992). Outros dados biopatológicos, como a diminuição da taxa de cálcio sérico ou a manutenção das concentrações de Figura 1 - Engrossamento da mucosa e formação de pregas transversais.
306 Coelho AC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 305-313 aumentados de tamanho e edematosos, apreciando-se uma dilatação dos vasos linfáticos na superfície dos mesmos. Nos casos mais avançados, os sinais de caquexia (perda de depósitos gordos, atrofia serosa), ainda que inespecíficos, são também achados constantes. De forma muito esporádica, descreve- ram-se calcificações a nível do endocárdio e da aorta. Estas lesões eram acompanhadas de atrofia muscular e desaparecimento de depósitos gordos (Clarke, 1997). A observação macroscópica de lesões características em animais com sintomatologia compatível, permite suspeitar da infecção por Map, com uma elevada fiabilidade. Contudo, a ausência das mesmas não excluirá esta doença (Garrido et al ., 2000). Figura 2 - Atrofia e edema das vilosidades acompanhadas de intenso infiltrado composto por células epitelióides na lâmina própria Diagnóstico histopatológico (Hematoxilina – Eosina – ampliação 10x). As lesões histopatológicas que confirmam o diagnóstico de paratuberculose com infecção subclínica, são tipicamente caracterizadas por células gigantes tipo Langhans e agrupamentos de macrófagos epitelióides. Quando presente, o bacilo compatível com Map, é mais facilmente encontrado no citoplasma das células gigantes tipo Langhans. O exsudado inflamatório granulomatoso pode estar presente na lâmina própria das vilosidades intestinais (Buergelt e Ginn, 2000; González et al ., 2005). As lesões histológicas características evidenciam-se facilmente, mediante técnicas rotineiras como a coloração por hematoxilina-eosina (Figura 2), que se pode comple- mentar com a técnica de Ziehl-Neelsen para a pesquisa de bactérias álcool-ácido resistentes associadas às lesões (Figura 3), e cujo aparecimento, é uma carac- Figura 3 - Íleo, presença de bacilos álcool-ácido resistentes na mucosa terística que permite assegurar o diagnóstico. O exame intestinal (Ziehl-Neelsen – ampliação 40x). histopatológico do tecido intestinal, quando se inclui a válvula íleo-cecal, é considerado como uma técnica de Diagnóstico bacteriológico elevado valor diagnóstico (Barker et al ., 1993; Clarke, 1997). O isolamento de Map em meios selectivos de As técnicas imunohistoquímicas aplicadas à paratu- cultura é o método mais conclusivo de identificação. berculose apresentam maior sensibilidade que a técnica A combinação de bactérias que crescem muito de coloração de Ziehl-Neelsen, podendo ser aplicada lentamente, dependência de micobactina, álcool-ácido quer a amostras frescas, quer às fixadas, embora resistência, morfologia de colónia e celular uniforme, tenham como principais desvantagens serem mais oferece pouca oportunidade de erro ao microbiolo- demoradas e dispendiosas, que a coloração de rotina gista responsável pela identificação. (Coetsier et al ., 1998). A biópsia deve ser o único teste disponível para Identificação microscópica em esfregaço descartar a infecção em ruminantes valiosos que se encontram em jardins zoológicos (artiodáctilus) nos A visualização de Map em esfregaços corados quais, anticorpos específicos não são detectados e, o mediante a técnica de Ziehl-Neelsen a partir de animal não excreta bacilos suficientes para a cultura amostras de fezes, mucosa intestinal ou gânglio das fezes (Buergelt e Ginn, 2000). O principal incon- linfático, é considerada como uma boa técnica de veniente das técnicas anátomo-patológicas, é que diagnóstico rápido (European Commission, 2000; requerem o sacrifício dos animais. Alternativamente, Steingart et al ., 2006). Nos casos mais avançados da recomenda-se a realização de uma biópsia do gânglio doença, o diagnóstico não oferece nenhuma dúvida linfático íleo-cecal ou do parênquima hepático, para uma vez que os bacilos são muito abundantes e adop- análise histopatológica e bacteriológica (Garrido et tam uma disposição característica em grumos, devido al ., 2000). à manutenção da estrutura que têm no interior dos
307 Coelho AC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 305-313 macrófagos (Stewart et al ., 2004; Vaughan et al ., rápida, durante períodos em que a dita actividade é 2005) (Figura 4). Nos casos em que a abundância de insignificante em Map. As técnicas de cultura das bacilos é menor, o diagnóstico torna-se mais difícil, micobactérias baseiam-se na elevada resistência que uma vez que, a reduzida amostra que se examina ao estas apresentam à acção de determinadas substâncias microscópio, pode não permitir a visualização da bactericidas, nas quais se homogenizam as amostras micobactéria. Na espécie bovina é frequente o apare- com o objectivo de destruir os microrganismos cimento de bacilos com características semelhantes a contaminantes (Garrido et al ., 2000). Map, com a única diferença que não formam agrega- Finalmente, a incubação deve realizar-se em dos, podendo induzir a falsas qualificações positivas condições tais, que aportem os nutrientes e os factores (Juste e Aduriz, 1990). Relativamente à sensibilidade, de crescimento necessários para Map (micobactina), e a técnica dificilmente proporciona informação nos sem que estes se degradem durante períodos de mais casos subclínicos. Quando se incluem amostras fecais de 6 semanas (até 6-12 meses), em que permanecem a de animais com infecções clínicas e subclínicas 37 ºC. Estas condições exigem que seja necessário procedentes de explorações com um historial de usar tubos de vidro herméticos para evitar as perdas de paratuberculose, a sensibilidade é de 36,4% (Zimmer humidade e minimizar os riscos de contaminação et al ., 1999). fúngica (Juste et al ., 1991; Juste et al ., 2000; Wells et al ., 2002). O isolamento de Map, tanto a partir de fezes Cultura como de tecidos animais, é a prova considerada de referência. Nos ovinos, as melhores amostras para As dificuldades de cultura devem-se essencialmente diagnóstico são a válvula íleo-cecal e os linfonodos à baixa taxa de crescimento, porque qualquer outra mesentéricos caudais e íleo-cecal. É ainda possível espécie bacteriana de crescimento normal pode esgotar isolar Map do parênquima hepático, baço, rim, o meio de cultura antes que comece o crescimento linfonodos hepáticos, traqueobronquiais e supra- de Map e também devido aos longos períodos de mamários (Stehman, 1996; Pavlík et al ., 2000). incubação que exigem grande capacidade armaze- Map é capaz de crescer na maioria dos meios namento e acompanhamento ao longo do tempo, utilizados para o isolamento de micobactérias, desde necessitando de grande quantidade de mão-de-obra que, nos mais comuns, se coloque micobactina. Os especializada (Stewart et al ., 2004). meios mais utilizados são aqueles à base de ovo como O processo de isolamento de Map efectua-se em três o de Herrold (HEYM), ou o de Löwenstein-Jensen etapas: enriquecimento, descontaminação e incubação (Aduriz, 1993; Aduriz et al ., 1995; Garrido, 2002; prolongada em meios especiais. A fase de enrique- OIE, 2008). Contudo, também se usam sintéticos cimento permite aumentar as probabilidades de como as diferentes variantes do meio de Middlebrook. isolamento a partir de amostras com baixa carga As colónias em Löwenstein-Jensen são difíceis de microbiana. A fase de descontaminação é essencial, visualizar, necessitando de 40 semanas para o cresci- já que esta permite eliminar mais rapidamente os mento (Stehman e Shulaw, 1996). Uma variante microrganismos competidores de crescimento, de cultura que tem tido muito êxito em alguns aproveitando a menor velocidade de crescimento de laboratórios é a radiométrica, BACTEC 12B“ que se Map, para submeter os inóculos a condições letais caracteriza pelo seu elevado grau de automatização para as células com actividade metabólica mais para detectar o crescimento das micobactérias 14 mediante a quantificação do CO 2, libertado durante a metabolização do 14 C presente em alguns nutrientes do meio líquido (meio Middlebrook 7H12). O aparelho Bactec 460 (Becton Dickinson) realiza a dosagem de 14 C, traduzindo este valor sobre a forma numérica (índice de crescimento), proporcionalmente ao número de bactérias e à sua taxa de crescimento (Whittington et al ., 1999; Eamens et al ., 2007). Recentemente, foram introduzidos três outros métodos baseados na fluorescência: Bactec 9000, o sistema MGIT de cultura líquida e o sistema MBBact. As experiências iniciais efectuadas com amostras fecais apresentaram alguns problemas, como a conta- minação dos meios por fungos (European Commission, 2000). O sistema BACTEC apresenta vantagens significativas na cultura de estirpes ovinas Figura 4 - Bacilos álcool-ácido resistentes compatíveis com Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis em esfregaço de tecidos relativamente ao sistema MGIT (Gumber e (coloração de Ziehl-Neelsen, aumento 100x). Whittington, 2007).
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Contribuição da biologia molecular para parafina, a sensibilidade da técnica diminui devido à a investigação sobre Map complexidade da execução. Contudo, esta é uma técnica rápida e eficaz para a identificação de Map, Os recentes avanços na biologia molecular, assim como de outras bactérias pertencentes ao grupo providenciam novas aproximações no diagnóstico. Mycobacterium ou M. avium (Miller et al ., 2002). Muita da pesquisa acerca da diferenciação de estirpes A técnica de PCR aplicada em amostras de sangue debruçou-se sobre técnicas moleculares como RFLP tem revelado uma boa sensibilidade e especificidade (Choy et al ., 1998), endonucleases de restrição, (Juste et al ., 2003; Buergelt et al ., 2004; Buergelt e electroforese em gel de campo pulsado (Hughes et al ., Williams, 2004; Bhide et al ., 2006; OIE, 2008). 2001), que permite discriminar Map de outras Recentemente, o aperfeiçoamento desta metodologia subespécies de Mycobacterium avium (Stevenson e como a PCR em tempo real tem revelado vantagens Sharp, 1997). relativamente ao método clássico de PCR tornando esta prova adequada ao diagnóstico da doença, em futuros estudos epidemiológicos (Cook e Britt, 2007). Detecção do DNA bacteriano A análise de novas sequências de inserção do complexo M. avium , como a IS901 e a IS1311, parece A descoberta da sequência de inserção IS 900 , a sua facilitar a diferenciação entre espécies e estirpes, caracterização como sendo específica de Map, e a sua possibilitando o seu uso em estudos epidemiológicos. descrição por Vary et al . (1990) tem proporcionado A hibridação in situ com a sonda IS900 tem-se uma excelente ferramenta de identificação desta revelado eficaz na detecção de Map em tecidos espécie, mediante uma simples reacção de PCR. Esta humanos e animais (Whittington et al ., 1998). sequência é um fragmento de 1451 pares de bases repetida 15 a 20 vezes no genoma de todas as estirpes de Map (Vary et al ., 1990). Provas imunológicas A técnica de PCR permite a detecção rápida e específica de Map em amostras clínicas, já que os Uma característica comum às infecções por resultados podem estar disponíveis em três dias, em micobactérias é o desenvolvimento de respostas comparação com as várias semanas necessárias para imunitárias de natureza espectral. Assim, nos estádios a cultura. Mediante a técnica, é possível detectar quan- iniciais da infecção, observa-se uma escassa ou nula tidades ínfimas de microrganismos. A concentração resposta humoral, predominando a resposta do tipo das micobactérias, a sua viabilidade e a posterior celular. Por isso, nesta fase, as técnicas baseadas na extracção do DNA são passos que devem ser detecção de anticorpos proporcionam resultados optimizados para incrementar a sensibilidade da negativos. Pelo contrário, as técnicas que detectam o técnica (Fang et al ., 2002). O principal problema que segundo tipo de resposta produziriam resultados limita a sensibilidade do método é a presença de positivos e, conforme progredisse, inverter-se-iam. Por inibidores nas amostras fecais. Um elevado grau de último, nas fases finais da doença, pode instaurar-se o sensibilidade é raramente observado devido aos estado de anergia, pelo que os animais não seriam problemas durante a preparação de material. Diversos detectados por nenhuma das técnicas (Garrido et al ., inibidores estão presentes em diferentes tipos de 2000). amostra, por exemplo, grandes quantidades de DNA irrelevante, polissacarídeos, sais biliares entre outros (Vary et al ., 1990; European Commission, 2000). Imunidade celular A técnica de PCR torna-se mais rápida e menos dispendiosa como método de diagnóstico, quando se Técnicas in vivo - Intradermorreacção (IDR) efectua com um "pool" de amostras fecais, traduzin- A intradermorreacção (IDR) tem sido a técnica mais do-se os resultados a nível de rebanho ou efectivo utilizada no diagnóstico da paratuberculose. Como (Marsh e Whittington, 2001). antigénios foram empregues extractos proteicos Quando a técnica de PCR se aplica a amostras de purificados obtidos a partir de Map, que são tecidos (Stevenson e Sharp, 1997; Englund et al ., conhecidos como Johnina ou Paratuberculina, ou de 2001; Ellingson et al ., 2005; Mckenna et al ., 2005; M. avium (OIE, 2008). Devido à maior facilidade de Sivakumar et al ., 2005) a sensibilidade é maior, já que, produção e à semelhança antigénica que apresentam para além de um menor efeito de diluição dos bacilos M. avium e Map, preferiu-se o uso de tuberculina desprendidos dos tecidos infectados, produzem-se aviária como reactivo de diagnóstico à paratubercu- menores efeitos inibidores da reacção. Tal como na lose bovina. O teste envolve a injecção de 0,2 ml de cultura, a eleição da zona da válvula íleo-cecal e Johnina PPD (derivado proteico purificado) por via linfonodos correspondentes, pode incrementar as intradérmica. Como local de inoculação, recomenda-se possibilidades de alcançar um diagnóstico correcto. a zona da tábua do pescoço, fazendo-se a mesma Quando se utilizam tecidos fixados em formol ou interpretação que na tuberculose, embora a leitura se
309 Coelho AC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 305-313 faça às 48 horas. Considera-se uma reacção positiva sorbent Assay" (ELISA) (OIE, 2008). Como não quando se observa um aumento da espessura da pele ocorre uma resposta humoral forte até às fases finais de três ou mais milímetros. Em qualquer caso, esta da doença, a sensibilidade destes testes é maior nos técnica tem baixa sensibilidade e especificidade animais com lesões multibacilares (lepromatosas) (Radostits et al ., 1994; Kalis et al ., 2003), pelo que (Clarke et al ., 1996). não é adequada ao diagnóstico individual (Garrido et A FC tem sido uma das técnicas imunológicas al ., 2000). mais utilizadas no diagnóstico da paratuberculose bovina sendo os valores de especificidade de 97,1%, Técnicas in Vitro aceitando que a sua sensibilidade seja baixa. Em geral, observa-se que não se alcança uma concordância Dentro deste grupo incluem-se as provas de elevada entre os títulos de FC e o estado de infecção transformação linfocitária, a inibição da migração real dos animais (Garrido et al ., 2000). leucocitária e a detecção da produção de interferão- γ A AGID é uma técnica rápida e barata, cujo uso se (IFN- γ). As três utilizam, como antigénio, um deriva- generalizou nos últimos anos. A sua principal do PPD e, são essencialmente uma réplica in vitro de vantagem é proporcionar valores de especificidade alguns dos fenómenos que se produzem na prova que rondam os 100%. Em relação à sua sensibilidade, intradérmica. Estas três técnicas têm como inconve- os resultados proporcionaram valores diferentes em niente a necessidade de manter vivos os linfócitos para função do estado clínico dos animais incluídos em sua estimulação, pelo que devem ser executadas num cada estudo (Sherman et al ., 1990). Em definitivo, curto período após a colheita de amostras (Garrido et a AGID parece proporcionar uma especificidade al ., 2000; Huda et al ., 2003). satisfatória que a torna muito conveniente para a A prova de transformação linfocitária consiste na confirmação rápida de casos suspeitos (Garrido et al ., demonstração do efeito de transformação linfoblástica, 2000). isto é, da regressão das populações de linfócitos A técnica de ELISA foi utilizada, inicialmente, sensibilizados frente aos antigénios micobacterianos para o diagnóstico de paratuberculose bovina. presentes no PPD. Considera-se uma prova altamente Posteriormente, realizaram-se muitas modificações sensível (Garrido et al ., 2000). com o fim de optimizar o rendimento da técnica A prova da inibição da migração leucocitária é de original. A pré-adsorção dos soros suspeitos com M. mais fácil execução, já que consiste, simplesmente, phlei é uma modificação importante para aumentar a em observar o grau de dispersão de um concentrado especificidade da técnica (Bech-Nielsen et al ., 1992). de leucócitos, quando se incubam em presença de um Este processo, remove anticorpos inespecíficos que antigénio. Se se encontram sensibilizados frente ao podem, potencialmente, reagir com antigénios Map, mesmo, tenderão a ficar fixados, enquanto que, se não eliminando grande parte das reacções cruzadas e estão, tenderão a estender-se por toda a superfície diminuindo o número de falsos positivos. A sensibili- sobre a qual se colocam (Garrido et al ., 2000). dade e especificidade do teste são variáveis de acordo A prova do interferão- γ baseia o seu fundamento na com a modificação individual da prova, assim como, libertação de uma citoquina, interferão- γ, que se com a fase clínica em que se encontra o animal ou da produz após a estimulação antigénica dos linfócitos T, natureza da amostra (leite ou soro) (Hardin e Thorne, fundamentalmente linfócitos do tipo CD4 +. 1996). É possível encontrar valores de sensibilidade Posteriormente, a quantificação do IFN- γ realiza-se que variam entre os 15,4% e os 100% (Dargatz et al ., mediante um ensaio biológico ou mediante a prova de 2001), com uma média situada entre 40%-50% (Hope ELISA (Garrido et al ., 2000; Stewart et al ., 2004). et al ., 2000; Whitlock et al ., 2000), sendo que a sensibilidade do teste é mais elevada nas fases finais da infecção, quando os animais desenvolvem sinais Imunidade humoral clínicos, atingindo os valores mais baixos nos animais O uso da serologia no diagnóstico da paratubercu- que são fracos excretores (Whitlock et al ., 2000). A lose parece ter um valor limitado. As principais razões especificidade tem sido estimada entre os 50% e os para este facto são a ocorrência relativamente tardia de 99,5% (Hope et al ., 2000; Nielsen et al ., 2002; Singh seroconversão no decurso da doença e, a inexistência et al ., 2007). de uma correlação forte com o grau de excreção fecal. Existem muitas variantes ao método ELISA, sendo Por outro lado, a especificidade dos testes serológicos uma das suas componentes cruciais a preparação dos é afectada pelas reacções cruzadas com outros agentes antigénios usados para capturar anticorpos a partir do infecciosos (Nielsen et al ., 2001). soro problema (Jark et al ., 1997; Singh et al ., 2007). Actualmente existem três técnicas capazes de A automatização do teste ELISA é já uma realidade, determinar a presença de anticorpos contra Map no permitindo o processamento de grande número de soro de animais infectados. Estes são a fixação de amostras, embora acarrete alguns inconvenientes complemento (FC), a imunodifusão (AGID), e o relacionados com o seu processamento (Dimech, ensaio imunoenzimático: "Enzyme-Linked Immuno- 2000).
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A combinação das técnicas AGID e ELISA fornece Buergelt CD e Williams JE (2004). Nested PCR on blood maior sensibilidade, embora, não seja economi- and milk for the detection of Mycobacterium avium camente viável. Em ovinos, têm-se obtido bons subsp. paratuberculosis DNA in clinical and subclinical resultados, quando se utilizam testes serológicos para bovine paratuberculosis . Aust Vet J, 82: 497–503. Chiodini RJ, van Kruiningen HJ, Merkal RS (1984). a pesquisa de anticorpos, em animais que apresentam Ruminant paratuberculosis (Johne’s disease): The sintomatologia clínica, tendo-se encontrado uma current status and future prospects. Cornell Vet, 74: associação entre a forma multibacilar de paratubercu- 218-262. lose e um título elevado de anticorpos no soro (Clarke Choy E, Whittington RJ, Marsh I, Marshall J, Campbell MT et al ., 1996). A técnica de AGID parece ser a (1998). A method for purification and characterization mais específica com uma sensibilidade razoável na of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis from detecção de animais nas fases tardias da doença the intestinal mucosa of sheep with Johne’s disease. Vet (Dubash et al ., 1996). Microbiol, 64: 51-60. Clarke CJ (1997). The pathology and pathogenesis of Deve-se ter em atenção que um resultado positivo paratuberculosis in ruminants and other species. J Comp aos testes serológicos em animais que evidenciam Pathol, 116: 217-261 sinais clínicos indica a presença de paratuberculose. Clarke CJ, Patterson IAP, Armstrong KE, Low JC (1996). Contudo, a doença não pode ser descartada se o Comparison of the absorbed ELISA and agar gel animal apresentar um teste negativo. As ovelhas e as immunodiffusion test with clinicopathological findings cabras parecem responder de maneira diferente na in ovine clinical paratuberculosis. Vet Rec, 139: formação de anticorpos. As ovelhas tendem a 618-621. desenvolver anticorpos nas fases tardias da doença, ao Coetsier C, Havaux X, Mattelard F, Sadatte S, Cormont F, Buergelt K, Limbourg B, Latinne D, Bazin H, Denef JF, contrário dos caprinos, nos quais os anticorpos podem Cocito C (1998). Detection of Mycobacterium avium ser detectados muito mais cedo (Navarre e Pugh, subsp. paratuberculosis in infected tissues by new 2002). species - specific immunohistological procedures. Clin Diagn Lab Immunol, 5: 446-451. Cook KL e S Britt JS (2007). Optimization of methods for Bibliografia detecting Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in environmental samples using quantitative, real-time Adúriz JJ (1993). Epidemiologia, diagnostico y control de la PCR. J Microbiol Methods, 69: 154-160 paratuberculosis ovina en la Comunidad Autonoma del Dargatz DA, Byrum BA, Barber LK, Sweeney RW, Pais Vasco. Tese para a obtenção do grau de Doutor em Whitlock RH, Shulaw WP, Jacobson RH, Stabel JR Medicina Veterinária. 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RPCV (2007) 102 (563-564) 315-319 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Determinação de aflatoxinas B1 e M1 em fígados de suíno por cromatografia liquida de alta resolução
Determination of aflatoxins B1 and M1 in swine liver by high-performance liquid chromatography
H. Marina Martins* e Salomé A. Magalhães
INRB,IP – Laboratório Nacional de Investigação Veterinária – Serviço de Micologia Estrada de Benfica 701, 1549-011 Lisboa
Resumo: As técnicas de pesquisa e quantificação de Aflatoxina Introdução B1 (AFB1) e M1 (AFM1) em materiais biológicos (fígados, leite, soro ou rim) estão limitadas a metodologias que usam a cromatografia em camada fina (TLC), cujos limites de detecção Actualmente estão descritos dezasseis metabolitos não são compatíveis com os mínimos requeridos oficialmente. tóxicos que são classificados como aflatoxinas. Na A excepção é a pesquisa de AFM1 em leite e produtos lácteos. natureza, no entanto, apenas ocorrem cinco compostos O objectivo deste trabalho foi desenvolver e verificar o produzidos por Aspergillus flavus , A. parasiticus e A. desempenho de uma técnica de cromatografia líquida de nomius : aflatoxinas B1, B2, G1, G2 e B3, os outros alta precisão com fase reversa (RP-HPLC) para detecção de Aflatoxina B1 e M1 em fígados de suíno. Para isso onze são derivados obtidos por via metabólica nos utilizaram-se matrizes negativas (25 g), as quais foram diferentes órgãos animais e humanos (Kurtzman et al ., submetidas a contaminações com diferentes teores de AFB1 e 1987; Betina, 1989). A aflatoxina M1 é um desses AFM1 (entre 0,4 e 4,8 µg/kg). O limite de detecção encontrado derivados (14-hidroxi-aflatoxina B1), encontrado foi de 1mg/kg para as duas aflatoxinas. As recuperações destes pela primeira vez em leite de vacas cuja dieta estava ensaios situaram-se entre 77% e 92% para a AFB1 e 99% a 120% para a AFM1. A aplicabilidade da técnica foi ainda contaminada com a molécula percursora - AFB1 testada em condições naturais através da respectiva aplicação (Smith e Moss, 1985). à pesquisa e quantificação de AFB1 e AFM1 em 37 amostras Esta micotoxina é metabolizada no fígado de todos de fígados de suínos colhidas em matadouros. os mamíferos, podendo ser também encontrada na urina. A fórmula empírica é: C 17 H12 O7; É solúvel em Palavras-chave: Aflatoxina B1 (AFB1), Aflatoxina M1 (AFM1), HPLC, fígado de suíno mistura de clorofórmio:metanol (97,3); emite fluorescência azul sob luz UV com um comprimento Summary: Improvements on usual techniques for detection and de onda de 357 nm, apresentando Rf =0,34. quantification of Aflatoxins B1 (AFB1) and M1 (AFM1) from Os efeitos citotóxicos, teratogénicos, mutagénicos, biological material (liver, kidney, serum and milk) are needed, carcinogénicos e imunossupressores induzidos pelas considering the limitations of the current methods available (TLC). The aim of this study was to develop an adaptation aflatoxinas derivam basicamente da afectação do of a reverse phase high-performance liquid chromatography sistema da função oxidase microsomal (MFO) quer (RP-HPLC) with fluorescence detection technique for nos hepatócitos, quer noutras células alvo. Aflatoxins B1 and M1, having pig liver as matrix. Blanks of pig As espécies animais que dispõem de arsenais liver were artificially contaminated with different levels for both enzimáticos capazes de reduzir a aflatoxina B1 a AFB1 and AFM1 (between 0.4 and 4.8 µg/kg). The detection limit found, was 1mg/kg for both AFB1 and AFM1. Recoveries aflatoxicol são susceptíveis de ser atingidas por formas rates were 77 to 92% for AFB1 and 99 to 120% for AFM1. The agudas de intoxicação. A relação entre os teores da practicability of this technique was tested using 37 samples of aflatoxina B1 reduzida e da oxidada, num determinado pig livers obtained in slaughterhouses. parênquima, pode servir de indicador útil para caracterizar a situação de toxicidade aguda (Smith e Keywords: Aflatoxin B1 (AFB1), Aflatoxin M1 (AFM1), HPLC, swine liver Moss, 1985). A acção das enzimas MFO sobre a aflatoxina B1 conduz à formação de diversos metabolitos. As hidroxilações do C1 na posição 4 e no carbono ß do *Correspondência: [email protected] radical carbonil do anel ciclopentanóico origina LNIV, Serviço de Micologia, Estrada de Benfica, 701, respectivamente aflatoxinas M1 e Q1 (Smith e Moss, 1549-011 Lisboa 1985). A interacção das aflatoxinas com macro-
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-moléculas pode ser do tipo covalente ou não, sendo a para a AFB1 e AFM1. O extracto com AFB1 foi eluído activação metabólica um pré-requisito indispensável em metanol (J.T. Baker HPLC – 8402) e a da AFM1 para que o primeiro tipo de ligação se verifique. com acetonitrilo (J.T. Baker HPLC – 9012). As aflatoxinas têm uma alta afinidade para os Para a separação final e quantificação utilizou-se ácidos nucléicos, sendo particularmente reactivas uma coluna de HPLC de fase reversa e derivatização com o átomo de azoto 7 (N-7) da base guanina. As pós coluna com uma solução aquosa de hidrobrometo aflatoxinas M1 e P1-N Guanina também podem ser – perbrometo de piridina (Sigma P- 3179). do tipo covalente. São precisamente estes tipos de A fase móvel utilizada foi uma mistura de ácido ligações bioquímicas que estão na base da indução dos acético, acetonitrilo (licrosolv), 2-propanol e água efeitos carcinogénicos e mutagénicos das aflatoxinas. (2:10:10:78), com um fluxo de 1,2 ml/min. O tempo Existem no entanto diversos factores, modeladores de retenção foi de 10,48 min para a AFB1 e de destas reacções e que, em última instância, são 7,35 min para a AFM1. responsáveis pelas diferentes susceptibilidades das Para avaliação da reprodutibilidade prática da espécies animais aos efeitos carcinogénicos. técnica na detecção directa de AFB1 e AFM1 em Atendendo ao papel que o fígado desempenha na fígados de suínos, utilizaram-se 37 amostras colhidas metabolização das aflatoxinas e considerando que este em diferentes matadouros e aplicou-se-lhes o proce- órgão destoxificador funciona como uma espécie de dimento analítico anteriormente descrito. “reservatório” biológico destas toxinas fúngicas, o A análise estatística descritiva e analítica dos fígado de animais de produção tem sido usado como resultados foi efectuada como em Maroto et al . matriz preferencial nos planos oficiais de vigilância (2005). de contaminantes químicos da cadeia alimentar, para detecção de aflatoxinas no organismo dos animais. Actualmente, existe apenas uma técnica oficial- mente reconhecida para a detecção de aflatoxina nesta Resultados e discussão matriz orgânica - Cromatografia em Camada Fina (TLC). Esta técnica porém tem um valor de MRLP As taxas de recuperações de aflatoxina B1 e M1 a que está abaixo do exigido na legislação europeia. partir das 6 amostras de fígado de suíno contaminadas O objectivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de artificialmente, variaram entre 77%-92% e 99%- um protocolo analítico baseado numa técnica de 120% respectivamente (Quadro 1). HPLC para detectar e quantificar aflatoxinas B1 e M1 em fígados de suíno. Quadro 1 - Parâmetros analíticos para a determinação de AFB1 e AFM1 em amostras de fígado de suíno contaminadas e respectivas percentagens de recuperação Nível de Concentração % Material e métodos contam. (µg) (µg/kg) Recuperação AFB1 0,80 0,65 87,5 Para determinar o nível de desempenho da técnica 1,60 1,25 83,0 foram usadas seis porções de fígado de suíno compro- 2,40 2,05 83,3 vadamente negativos usando uma técnica de TLC 3,20 2,60 76,5 (Gimeno, 1982). As matrizes utilizadas neste estudo 4,00 3,10 80,0 foram acondicionados ao abrigo da luz e mantidas 4,80 4,35 91,9 congeladas a –18 ºC até ao processamento analítico. AFM1 0,40 0,37 98,7 Partindo de 25 g das referidas matrizes, em triplicado, 0,80 0,96 120,0 e procedeu-se à respectiva contaminação com as 1,20 1,40 117,0 seguintes concentrações de AFB1 (Sigma A6636): 1,60 1,90 120,0 0,8 µg, 1,6 µg, 2,4 µg, 3,2 µg, 4,0 µg e 4,8 µg/kg de 2,00 2,30 117,0 fígado; e de AFM1 (Sigma - A6428): 0,4 µg, 0,8 µg, 2,40 2,75 117,0 1,2 µg, 1,6 µg, 2,0 µg, 2,4 µg/kg de fígado. Para validação da técnica de pesquisa e quantifi- Em termos de taxa de recuperação, verificou-se que cação de aflatoxinas por cromatografia líquida de alta se encontravam dentro dos limites de aceitabilidade, precisão (HPLC), utilizou-se o método descrito por conforme estabelecido na Directiva 98/53/CE de 16 Chiavaro et al . (2005), com as modificações intro- Julho. duzidas por Mannetta et al . (2005), referido como O aumento do nível de contaminação das amostras tendo um limite de detecção de 1 µg/kg. traduziu-se num aumento percentual dos teores de Para isso procedeu-se a uma extracção a partir de AFB1 e AFM1 recuperados (Gráficos 1 e 2). 25 g da matriz contaminada, com uma mistura de A avaliação estatística dos resultados obtidos permi- metanol-água (80-20), seguida da filtração. Purificou-se tiu confirmar a aplicabilidade da etodologia à matriz uma alíquota (10 ml) com colunas de imunoafinidade proposta (Quadro 2).
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Gráfico 1 - Variação de AFB1 (%) com o aumento do nível de Gráfico 2 - Variação de AFM1 (%) com o aumento do nível de contaminação contaminação Quadro 2 - Parâmetros estatísticos para a determinação de AFB1 e AFM1 em amostras de fígado de suíno contaminadas
Nível Concentação X B _ z-score Incertezas de cont. (µl) (µg Kg -1 ) AFB1 20 0,65 0,8 0,22 0,176 -0,852 0,352 40 1,25 1,6 0,22 0,352 -0,994 0,704 60 2,05 2,4 0,22 0,528 -0,663 1,056 80 2,60 3,4 0,22 0,748 -1,069 1,496 100 3,10 4,0 0,22 0,880 -1,023 1,760 120 4,35 4,8 0,22 1,056 -0,426 2,112 AFM1 20 0,37 0,40 0,22 0,088 -0,341 0,176 40 0,96 0,80 0,22 0,176 0,909 0,352 60 1,40 1,20 0,22 0,264 0,758 0,528 80 1,90 1,60 0,22 0,352 0,852 0,704 100 2,30 2,00 0,22 0,440 0,682 0,880 120 2,75 2,40 0,22 0,528 0,663 1,056 X- valor predicto, após ajuste ; _- Desvio padrão esperado ; B- Parâmetro da equação de Horwitz (Horwitz et al ., 1980).
Por análise dos dois primeiros parâmetros do (Horwitz et al ., 1980), é possível correlacionar a Quadro 2, verifica-se que existe uma correlação percentagem de desvio padrão residual com a con- significativa entre eles, como se pode observar nos centração dos analitos. gráficos de regressão (Gráficos 3 e 4). No que concerne à aplicação prática do procedi- Por observação do coeficiente de correlação de mento analítico a 37 amostras de fígado de suíno, ambas as rectas, pode-se inferir uma dependência constatou-se que todos os resultados eram negativos. linear entre as duas variáveis (AFB1 R=0,98 e AFM1 Em Portugal nunca se confirmou a detecção de R=0,99). contaminações naturais de aflatoxinas em fígados De acordo com a equação de Horwitz modificada nas espécies pecuárias. Concentração de AFB1 AFB1 Concentração (ugKg-1) de Concentração de AFM1 AFM1 Concentração (ugKg-1) de
Gráfico 3 - Variação da concentração de AFB1 em µg/kg com o Gráfico 4 - Variação da concentração de AFM1 em µg/kg com o aumento do nível de contaminação aumento do nível de contaminação
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Contudo, em rastreios em alimentos compostos para Bibliografia suínos, efectuados nos últimos 10 anos em Portugal, têm sido encontados algumas contaminações por aflatoxina B1 (Martins et al ., 2005). Trabalhos Betina V (1989). Aflatoxins, sterigmatocytins and versicolo- realizados por Martins e Martins (2001) referem a rins. In Mycotoxins: Chemical, Biological and detecção de micotoxinas em Portugal, em rações para Environmental Aspects. Cap. 7. Elsevier, New York, espécies pecuárias. Nesse estudo indica-se que em USA: 114-150. 106 amostras de rações para suínos, 17,9% estavam Chiavaro E, Cacchioli C, Berni E e Spotti E (2005). contaminadas com aflatoxinas com teores entre 0,001 Immunoaffinity clean-up and direct fluorescence a 7,47 mg/kg. Noutro estudo efectuado pelos mesmos measurement of aflatoxins B1 and M1 in pig liver: autores, constatou-se que, num total de 305 amostras Comparison with high-performance liquid chromatogra- de milho, apenas 19 (6,2%) foram positivas para phy determination. Food Add and Contam, 22(11): 1154-1161. aflatoxina B1, embora com níveis abaixo do limite Directiva 98/53/CE da Comissão 16 de Julho (1998). Jornal máximo legalmente admitido (0,02 mg/kg) (Martins, Oficial das Comunidades Europeias L201/93-101. 2003). Estes resultados sugerem que a monitorização Furtado MR, Pearson AM, Hogberg MG, Miller ER, Gray JI de aflatoxinas deve ser preferencialmente dirigida para e Aust SD (1982). Withdrawal Time Required for a detecção nas fontes alimentares: alimentos compos- clearence of afltoxins from pig tissues. J Agric Food tos, matérias-primas, alimentos complementares, e Chem, 30: 101-106. não para os materiais ou tecidos orgânicos. Furtado MR, Pearson AM, Hogberg MG e Miller ER (1979). Os resultados deste trabalho são convergentes com Aflatoxin Residue in the tissues of pigs fed a contami- nated diet. American Chem Soc, 27: 1531-1534. as indicações referidas por Chiavaro et al . (2005), Gimeno AG e Martins ML (1982). Multimycotoxin method segundo os quais a correlação entre as contaminações for analysis of 17 mycotoxins in raw materials, mixed das rações ingeridas pelos suínos e a presença dos feeds, food products and animal tissues by thin layer metabolitos fúngicos nos respectivos fígados têm um chromatography. Proceedings Book. V Intern. IUPAC carácter excepcionalmente fortuito. Ou seja, mesmo Symposium on Mycotoxins and Phycotoxins. quando se sacrifica os suínos que acabaram de ingerir Vienna/Technical University/Austria: 1-3. uma ração contendo teores elevados de aflatoxina B1 Honstead JP, Dreessen DW, Stubblefield RD e Shotwell OL não é possível encontrar níveis detectáveis destas (1992). Aflatoxin in swine tissues during drought condition: Epidiological studies. J Food Protec, 55: micotoxinas nos fígados desses animais. 182-186. Existem alguns dados obtidos experimentalmente a Horwitz W, Kamps LR e Boyer KW (1980). Quality partir de fígados de suínos alimentados com rações assurance in the analysis of foods for trace constituents. contaminadas com aflatoxina. Em 1979, Furtado J Assoc of Anal Chem, 63: 1344-1355. et al ., estudaram os resíduos de aflatoxina B1 nos Kurtzman CB, Horn BW e Hesseltine CW (1987). fígados em suínos cujas dietas foram contaminadas, Aspergillus nomius , a new aflatoxin producing species tendo-se verificado que, ao fim de 21 dias, 36% dos related to Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii . animais apresentavam fígados hipertrofiados, 25% Antonie van Leeuwenhoek, 53: 147-158. Manetta AC, Di Giuseppe L, Giammaro M, Fusaro I, manifestaram perda de peso e 18% anorexia. Noutro Simonella A, Granmenzi A e Formigoni A (2005). estudo realizado pelos mesmos autores (Furtado et al ., High-performance liquid chromatography with post- 1982), conclui-se que quanto maior for o intervalo column derivatisation and fluorescence detection for entre a ingestão de ração contaminada seguida de uma sensitive determination of aflatoxin M1 in milk and dieta controlo, e o abate dos animais, menos evidentes cheese. Journal of Chromatography A, 1083: 219-222. são as lesões hepáticas. Esta hipótese está de acordo Maroto A, Boquè R, Riu J, Riusánchez I e Òdena M (2005). com os estudos efectuados por Miller et al . (1982) e Uncertainty in aflatoxin B1 analysis using information Trucksess et al . (1982). Em 1992, Honstead et al ., from proficiency tests. Anal Bioanal Chem, 382: 1562-1566. fizeram estudos complementares aos efectuados pelos Martins ML e Martins HM (2001). Natural occurrence of autores anteriores, tendo concluído que, em condições alatoxins in swine feed in Portugal (1996/1999). IN: ambientais adversas, também se verificam decrésci- Occurrence of toxigenic fungi and mycotoxins in plants, mos dos resíduos de aflatoxinas nos tecidos . food and feed in Europe. Logrieco, A. (eds). COST De acordo com Rodricks e Stoloff (1977), a razão Action 835, CNR, Bari, Italy: 131-146. entre os níveis de contaminação por aflatoxina B1 nas Martins HM (2003). Ocurrence of aflatoxins in raw rações e o nível detectado nos tecidos é de 800:1, pelo material and in feed stuff in Portugal (2000/2002). que se pode concluir que a utilização de fígados de Acta do Congresso Food Protection, International Conference, Maio, Monte da Caparica, Portugal, 77. animais para demonstração de contaminação das Martins HM, Guerra MM e Bernardo F (2005). Fungos e respectivas dietas por aflatoxina B1, não tem grande micotoxinas em alimentos compostos para suínos na relevância prática em matéria de controlo oficial desta última década em Portugal (1995/2004). Revista da toxina e do seu metabolito M1. Sociedade Científica de Suinicultura, 2: 6-12.
318 Martins HM e Magalhães SA RPCV (2007) 102 (563-564) 315-319
Miller DM, Wilson DM, Wyatt RD, Mckinney JR, Crowell Smith JE e Moss MO (1985). Mycotoxins. Formation, WA e Stuart BP (1982). High-performance liquid analysis and significance. Ed. John, Wiley e Sons Lda. chromatography determination and clearence time of Chichest, UK, 148. aflatoxin residue in swine tissues. J Assoc of Anal Truckseess MW, Stolof L, Brumley WC, Wilson DM, Hale Chem, 65: 1-4. OM, Sangster LT e Miller DM (1982). Aflatoxicol and Rodricks JV e Stoloff L (1977). Aflatoxins residues from aflatoxins B1 and M1 in the tissues of pigs receiving contaminated feed in edible tissues of producing aflatoxin. J Assoc of Anal Chem, 65: 884-887. animals. In: “Mycotoxins in Human and Animal Health”. Ed. By J.V. Rodricks Hesseltine CW e MA Mehlman (Park Forest South, Illinois: Pathotox Publishers, Inc.), Illinois, USA: 67-79.
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RPCV (2007) 102 (563-564) 321-325 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Aflatoxin M1 determination in cheese by immunoaffinity column clean-up coupled to high-performance liquid chromatography
Determinação de Aflatoxina M1 em queijos por HPLC com purificação por colunas de imunoafinidade
H. Marina Martins 1*, Salomé A. Magalhães 1, Inês Almeida 2, Marta Marques 1, M. Manuela Guerra 3, F. Bernardo 4
1INRB-IP, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Serviço de Micologia, Estrada de Benfica 701, 1549-011 Lisboa 2Faculdade de Medicina Veterinária - Universidade Lusófona de Humanidades e Tecnologia, Campo Grande 376, 1749-024 Lisboa 3Escola Superior de Hotelaria e Turismo do Estoril, Avenida Condes de Barcelona, 2769-510 Estoril 4CIISA - Faculdade de Medicina Veterinária - TULisbon. Av. da Universidade Técnica, 1300-147 Lisboa
Summary: A simple and feasible method is described for Introduction analysing aflatoxin M1 (AFM1) in a cheese matrix. The method involves immunoaffinity as a purification step followed by high-performance liquid chromatography (HPLC) with Aflatoxins (AFs) are produced by certain species of post-column derivatisation and fluorescence detection. One Aspergillus and occur mainly in crops from tropical hundred and twenty eight samples of several types of hard cheese from five different European countries were acquired and subtropical regions where warm and humid from supermarkets in Lisbon, Portugal. Eight samples (6.25%) weather provides optimal conditions for the growth of contained levels of AFM1 at the maximum permissible level moulds. Aflatoxins were classified as Group 1 (0.05 µg/kg) while 120 (93.75%) were not contaminated carcinogens ("i.e." carcinogenic to humans) in 1993 (<0.005 µg/kg). These results indicate a very low occurrence of by the WHO International Agency for Research on AFM1 in dairy products, which might be attributed to a good monitorization in preventing the contamination of moulds and Cancer (Aycicek et al ., 2002). Evidence exists for the AFM1 in cheese production. role of AFs in causing genetic mutations and primary liver cancer in human populations by modifying the Keywords: Aflatoxin M1, Cheese, HPLC, Immunoaffinity structure of liver cells DNA (Van Egmond, 1989). Aflatoxins are activated by oxidation into the epoxide Resumo: No presente estudo é descrito um método simples e prático para analisar a presença de aflatoxina M1 (AFM1) em form that reacts with DNA to form an N7 guanine queijos. O método envolve um passo de purificação com adduct that produce chronic effects from ingestion of colunas de imunoafinidade, seguido de Cromatografia Líquida contaminated food (Günsen and Büyükyörük, 2002). de Alta Eficiência (HPLC), com pós-derivatização e detecção The second major Aspergillus species that produce por fluorescência. Cento e vinte e oito amostras de vários tipos aflatoxins is A. flavus , which produces only B aflatoxins, de queijo, de cinco países da Europa, foram adquiridos em supermercados de Lisboa, Portugal. Oito amostras (6,25%) and A. parasiticus , which produces both B and G continham níveis de AFM1 no limite máximo permitido aflatoxins. Aflatoxin M1 is a hidroxilated derivative of (0,05 µg/kg), enquanto 120 não estavam contaminadas aflatoxin B1 (AFB1), which occurs in the milk of (<0,005 µg/kg). Os resultados obtidos indicam uma baixa lactating animals (Cole and Cox, 1981; Betina, 1989). ocorrência de AFM1 em produtos derivados do leite, o que pode It is estimated that approximately 1 to 3% of the AFB1 ser atribuído à monitorização adequada, utilizada na produção de queijos, para a prevenção da contaminação por fungos e initially present in animal foodstuff appears as AFM1 AFM1. in milk (Elgerbi et al ., 2004). The presence of aflatoxin in cheese can be due to the Palavras-chave: Aflatoxina M1, Queijo, HPLC, Colunas de contamination of AFM1 in raw milk as a consequence imunoafinidade of the carry over of AFM1 from contaminated dairy cow feed to milk. A part from this cause, and according to López et al . (2001), the presence of AFs in cheese may be fundamentally due to two causes more: (i) synthesis of Aflatoxin (B1, B2, G1 and G2) by fungi *Correspondência: [email protected]; Fax: +351 217115337 which grow on cheese such as A. flavus , A. parasiticus Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, Serviço de and A. nomius , though the scarce presence of carbo- Micologia, Estrada de Benfica 701, 1549-011 Lisboa Portugal hydrates does not make it a very suitable substrate,
321 Martins HM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 321-325 and (ii) the use of powdered milk with AFM1 to enrich funnel. The water phase (lower layer) and the hexane milk employed in cheese elaboration (Kurtzman et al ., phase was then washed twice with 10 ml water and the 1987). water phase also collected. Subsequently both water Govaris et al . (2001) suggested that the general phases were homogenised and then applied to an consensus, which one can draw from the numerous immunoaffinity column (Aflaprep M R.Biopharm studies on the fate of AFM1, is that the removal of Rhône Ltd). The toxin was eluted from the column whey during cheese-making eliminates an appreciable using 1 ml methanol. amount of the toxin in milk, although cheese usually contains a higher concentration of AFM1 than the High-performance liquid chromatography (HPLC) milk from which it is made. Association of AFM1 and post-column derivatisation with casein seems to be the cause of this behaviour. The AFM1 extracted from cheese samples was Currently available research results further show that analysed by HPLC with post-column derivatisation the concentration of AFM1 is 2.5 to 3.3 fold higher in according to the method described by Manetta et al . many soft cheeses and 3.9 to 5.8 fold higher in hard (2005) with some modifications. cheeses than that in milk from which these cheeses The determination of AFM1 was carried out by were made. isocratic reverse-phase liquid chromatography using a Regarding the legal position, the European LiChrospher 100 RP-18, 5 µm column, 25x4.6 mm Community has reduced the maximum admissible Ecopack (Code-LiChroCart 250-4, Ref. 1.50212.0001; level of AFB1 in complete feeds for dairy cattle from Merck), with fluorescence detector and computing 20 to 10 µg/kg, and decided in July 1998-L201/43 integrator Merck Hitachi (Compaq Deskpro); excita- to return the draft suggested maximum level of tion and emission wavelengths were 353 and 423 nm. 0.05 µg/kg for AFM1 in milk and dairy products. The mobile phase was acetic acid/acetonitrile/2- The purpose of the present study was to investigate propanol/water (2:10:10:78, v/v/v/v), filtered through the occurrence of AFM1 in 48 commercial samples of a 0.22 µm filter membrane, degassed and used at a hard cheese made from raw cow’s milk in five different flow rate of 1.2 ml/min. As a post-column derivatising European countries and collected from several super- agent an aqueous solution of 50 mg/L PBPB was used. markets in Lisbon, Portugal. Additionally an assessment The calibration curve was determined using a range on the feasibility of a method that combines of standards from 0.1 ng/ml to 0.8 ng/ml. The detection immunoafinity and HPLC for the analysis of AFM1 in limit was 0.005 µg/kg. AFM1 was obtained from Sigma the cheese matrix was made. (Code-A-6428; Aldrich, Spain).
Validation (indirect evaluation) Material and methods Analytical performance was studied according to Samples Guia Relacre 13 (2001). The recovery was determined spiking an AFM1-free cheese at 20-80 ng/kg, for a A total of 128 packaged samples of commercial total of 24 samples. The formula used was: hard cheese (several types of cheese from five Recovery (%) = [(C1-C2)/C3]*100; (C1 - fortified European countries) were purchased in different sample; C2 - sample value; C3 - standard value supermarkets in Lisbon, Portugal. Each 10 g sample regarding the contamination under study). was ground in a blender and then analysed. The method accuracy was examined based on the Horwitz equation, which had provided a statistical Preparation of samples and Immunoaffinity evaluation of the results (Horwitz and Albert, 2006). Column procedure AFM1 analysis was carried out following the method described by Elgerbi et al . (2004). Results and discussion A sample of 10 g of cheese was cut into small pieces Natural occurrence of AFM1 and blended for 2 min at high speed (Waring Blender, Model Nº 38 BL 40 USA) with 80 ml of The used method involved immunoaffinity as a dichloromethane (Code-1.06050, Merck, Portugal) purification step followed by high-performance liquid and 7 g of diatomaceous earth. After washing further chromatography with post-column derivatisation and with 40 ml dichloromethane, the mixture was filtered fluorescence detection. Of the 128 analysed samples, (microfiber filter paper) and pressed to released 8 (6.25%) contained levels of AFM1 at the maximum maximum amount of filtrate. The filtrates were permissible level (0.05 µg/kg), and 120 (93.75%) were combined and evaporated in a rotary evaporator at not contaminated (< 0.005 µg/kg) (Table 1). 40 ºC. The residue was dissolved in 1 ml methanol, In Portugal, very few literature data is available on 30 ml water and 50 ml n-hexane (Code-1.04363, the occurrence of AFM1 in raw, commercial milk and Merck, Portugal) and transferred to a separating dairy products.
322 Martins HM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 321-325
Table 1 - AFM1 occurrence in cheese samples (µg/kg) Range Contamination (µg/kg) Number of positive samples (%) Mean (µg/kg) Standard Deviation ≤ 0.005* 45 (93.75) 0.0015 0.0013 >0.005** 3 (6.25) 0.01 0.02 * Not detected, <0.005 (mg/kg); ** Positive samples
Table 2 - Recovery percentages of aflatoxin M1 in spiked samples of various cheeses
Spiked level (ng/kg) % Recovery ± SD % RSD r HorRat r 20 100.3 ± 0.035 2.71 0.06 40 108.3 ± 0.026 1.02 0.03 60 108.3 ± 0.084 2.11 0.06 80 91.7 ± 0.138 3.11 0.09 SD- Standard deviation; RSDr- Repeatability standard deviation; HorRat- Horwitz ratio According to Ouakinin and Martins (1982) from a revealed that the presence of AFM1 in cheese samples total of 74 samples of raw milk, 29 (39%) revealed to was high (89.47%), which was related to the insuffi- be positive, with a mean level of 0.062 (µg/kg). cient control of AFB1 in feeds. In 2005, Kokkonen et Martins and Martins (1995) analysed a total of al . did not find AFM1 in cheese samples, associating 182 samples of national cheese (Portugal) by TLC, these results to a good manufacturing practice applied observing that all of them were not contaminated by to cheese production. AFM1 associating these results to the way animals Finally, in accordance with other published reports, were fed (pasture). where monitoring for AFB1 in feed and AFM1 in milk Regarding a survey conducted by Martins and does exist (Martins et al ., 2005), it seems that the Martins, in the year 2000, in raw and ultra high contamination of cheese with AFM1 doesn’t appear to temperature treated milk (UHT), the incidence of be a serious threat to public health. AFM1 contamination in the milk samples was high The adopted detection method for the recovery of (83.2%); AFM1 was detected in 80.6% of raw milk AFM1 greatly depends on the chosen clean-up and 84.2% of UHT milk. solvents and on the sort of cheeses used, as the HPLC As far as dairy products are concerned, AFM1 was analysis can be impaired by the presence of various detected in 2 out of 48 (4.2%) natural Portuguese contaminants (Dragacci et al ., 1995). Mortimer et al . yoghurts analysed, with levels ranging from 36 to 50 (1987) refers that the use of immunoaffinity gives ng/kg. Of the 48 yoghurts with pieces of strawberries significantly cleaner extracts, which improves the tested, 16 samples (33.3%) contained levels between accuracy and precision of the assays particularly 11-65 ng/kg (Martins and Martins, 2004). when the expected levels of AFM1 are low. During that year, Martins et al . analysed another matrix (powder milk), which was collected from Indirect evaluation of the method Portuguese dairy factories. None of the samples con- tained AFM1. The method used in this study was simple and In 2005, the occurrence of AFM1 was studied in proved to be suitable for analysing AFM1 in cheese Portuguese soft cheese, revealing that in a total of 42 matrix. samples no one was contaminated with AFM1 (Guerra The linear regression is a process for estimating the et al ., 2005). trend of the outcomes. The curve was obtained by the Regarding other countries, De Sylos et al . (1996) method of least squares. This method assumes that the didn’t detect this aflatoxin in any commercial dairy best-fit curve, is the one which has the minimal sum product analysed in Campinas, Brazil, during 1989- of deviations squared (least square error). From the 1999. equation of the calibration curve for AFM1 in cheese, According to Dragacci and Fremy (1996), the occur- with 95% confidence interval, it can be seen from rence of AFM1 in cheese is rather infrequent except that that there is a strong correlation between the two when AFB1 is found in feeds for dairy cattle. variables (R 2 = 0.9998); a value like this, justifies the Regarding the results found by Bários et al . (1996), lower results obtained for uncertainty. The curve the higher amount of AFM1 in Spanish cheese was tendency demonstrated that by the method of least observed in ripened and semi-ripened samples, with squares, there is normal distribution of the errors as levels of 105.33 and 73.80 ng/g respectively. well as homogeneity of variance. In a survey carry out by Pietry et al . (1997) in According to the obtained results, the raise of Italy on 223 cheese samples (Grana Padano), it was spiking shows a raise of the content (%) of AFM1 observed that the majority was free from AFM1 recovered. (97.7%). Based on the results for spiked samples, the mean In Turkey, a study done by Oruç and Sonal (2001), recoveries ranged from 89.6% to 108.3% (Table 2);
323 Martins HM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 321-325 regarding these values one can prove the applicability AFs in cheese, this situation may be attributed to a of the method, because there is a consensus between good monitorization in preventing the contamination the results obtained in this study and the limits of moulds and AFM1 in the production of these dairy established by Official Journal of the European products. The adopted method revealed to be adequate Communities - L201/100 (1998). to the analysed samples characteristics, was simple to The qualitative evaluation of the method was done execute and proved to be suitable for analysing AFM1 by calculating intralaboratory precision and the in cheese and with a very good performance. z-scores (Table 3) (Horwitz et al ., 1980; Horwitz and Albert, 2006). The Horwitz ratio (HorRat) is a normalized performance parameter that indicates the Bibliography acceptability of methods of analysis and is now one of Aycicek H, Yarsan E, Sarimehmetoglu B, Cakmak O (2002). the acceptability criteria for many recently adopted Aflatoxin M1 in white cheese and butter consumed in chemical methods of analysis of AOAC International, Istambul, Turkey. Veterinary Human Toxicology, 44: European Union and other European organizations 295-296. (Horwitz and Albert, 2006). Bários MJ, Gualder MJ, Cabanas JM, Medina LM, Jordano R (1996). Occurrence of aflatoxin M1 in cheese from Table 3 - "Z-scores" for the determination of aflatoxin M1 in the south of Spain. Journal of Food Protection, 59: 898- spiked samples of various cheeses 900. [ ] (µg/kg) "z-score" Betina V (1989). Mycotoxins, chemical, biological and 1.27 0.28 environmental aspects. Elsevier Science Publishin g 2.59 0.35 Company, New York, pp. 438. 3.99 0.50 Cole RJ and Cox RH (1981). The aflatoxins. In: Handbook of Toxic Fungal Metabolites. Academic Press, INC. 4.45 -0.33 (London) LDT, pp. 1-66. [ ]- Concentration; "z-score"- parameter for method accuracy De Sylos CM, Rodriguez-Amaya DB, Carvalho PRN Consistent deviations from the ratio on the low side (1996). Occurrence of aflatoxin M1 in milk and dairy (values <0.5) may indicate unreported averaging or products commercialised in Campinas, Brazil. Food Additives and Contaminants, 13: 169-172. excellent training and experience, as consistent Dragacci S, Gleizes E, Fremy JM and Candlish AAG (1995) deviations on the high side (values >2) may indicate Use of Immunoaffinity Chromatography as a purification unhomogeneity of the test samples, need for optimiza- step for the determination of aflatoxin M1 in cheeses. tion of the method or unsatisfactory method (Horwitz Food Addtives and Contaminants, 12: 59-65 and Albert, 2006). The results obtained for Horwitz Dragacci S and Fremy JM (1996). Application of ratio for repeatability (HorRat r) and for the repeata- immunoaffinity columns cleanup to aflatoxin M1 bility standard deviation (RSD r, %) are described in determination and survey in cheese. Journal of Food Table 2 and are adequate. The method was considered Protection, 59: 1011-1013 . accurate and fit for purpose. Elgerbi AM, Aidoo KE, Candlish AAG, Tester RF (2004). It was assumed that any normal distribution could Occurrence of aflatoxin M1 in randomly selected in be transformed into a standard normal distribution North African milk and cheese samples. Food Additives and Contaminants, 21: 592-597. by converting data results into z-scores. The z statistic Govaris A, Roussi V, Koidis PA, Botsoglou NA (2001). is therefore very informative because through it was Distribution and stability of aflatoxin M1 during possible to see if the performance is "well behaved", processing, ripening and storage of Telemes cheese. taking into account the following criteria: Food Additives and Contaminants, 18: 437-444. |z| ≤2 Satisfactory, will occur in about 95% of cases Guerra MM, Martins HM, Bernardo FM (2005). Assessing produced by a "well behaved system". aflatoxin M1 and Listeria monocytogenes contamination 2<|z|<3 Questionable, will occur in about 5% of in traditional fresh cheese produced in Portugal. cases. Intrafood 2005 Innovation in traditional foods - EFFoST |z| ≥3 Unsatisfactory, will occur in about 0.27% of conference. Proceeding book, Pedro Fito & Fidel Toldrà cases. (Eds), 477-480. As it can be seen in Table 3 all the values for z-score Guia Relacre 13, 2001. Validação de Métodos Internos de Ensaio em Química Analítica. Relacre GT03, Comissão are <2, so the method can be classified with a 95% técnica 03 da Relacre. interval, as satisfactory, which means that their Günsen U and Büyükyörük I (2002). Aflatoxins in retail performance is very good. food products in Bursa, Turkey. Veterinary Human Toxicology, 44: 289-290. Horwitz W, Kamps LR, Boyer KW (1980). Journal Official Conclusion of Analytical Chemistry, 63: 1344. Horwitz W and Albert A (2006). The Horwitz Ratio The results obtained under the studied conditions (HorRat): A Useful Index of Method Performance with indicate a very low occurrence of AFM1 in dairy Respect to Precision. Journal of AOAC International, products. Considering the causes of contamination of 89(4): 1095-1109.
324 Martins HM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 321-325
Journal Official European Communities L 201/100, Martins HM, Guerra MM, Bernardo F (2007). Occurrence 17/7/98. Reg (CE) nº 1525/98. of aflatoxin B1 in dairy cow’s feed over 10 years in Kokkonen M, Jestoi M, Rizzo A (2005). Determination of Portugal (1995-2004). Revista Ibero-Americana selected mycotoxins in mould cheese with liquid chro Mycologia, 24: 69-71. matography coupled to tandem with mass spectrometry. Martins ML and Martins HM (2004). Aflatoxin M1 in Food additives and Contaminants, 22: 449-456. yoghurts in Portugal. International Journal of Food Kurtzman CP, Horn BW, Hesseltine CW (1987). Aspergillus Microbiology, 91: 315-317. nomius , a new aflatoxin-producing species related to Martins ML and Martins HM (1995). Ocorrência de Aspergillus flavus and Aspergillus tamarii . Antonie van Aflatoxinas, Ocratoxina A, Esterigmatosistina e Patulina Leeuwenhoek, 53: 147-158. em queijos Nacionais. Veterinária Técnica, 1: 18-22. Lòpez C, Ramos L, Rámadan S, Bulácio L, Pérez J (2001). Mortimer DN, Gilbertm J, Shepherdm MJ (1987). Rapid and Distribution of aflatoxin M1 in cheese obtained from highly sensitive analysis of aflatoxin M1 in liquid and milk artificially contaminated. International Journal of powdered milks using an affinity column clean-up. Food Microbiology, 64: 211-215. Journal of Chromatography, 407: 393-398. Manetta AC, Di Giuseppe L, Giammaro M, Fusaro I, Oruç HH and Sonal S (2001). Determination of aflatoxin Simonella A, Granmenzi A, Formigoni A (2005). High- M1 levels in cheese and milk consumed in Bursa, performance liquid chromatography with post-column Turkey. Veterinary and Human Toxicology, 43: 292- derivatisation and fluorescence detection for sensitive 293. determination of aflatoxin M1 in milk and cheese. Ouakinin J and Martins ML (1982). Ocorrência de Journal of Chromatography, 1083: 219-222. Aflatoxina M1 nos Leites. Repositório de Trabalhos Martins ML and Martins HM (2000). Aflatoxin M1 in raw do Instituto Nacional de Veterinária, XIV: 75-78. and high temperature treated milk commercialised in Pietry A, Bertuzzi T, Bertuzzi P, Piva G (1997). Aflatoxin Portugal. Food Additives and Contaminants, 17: 871- M1 occurrence in samples of Grana Padano Cheese. 874. Food Additives and Contaminants, 14: 341-344. Martins HM, Guerra MM, Bernardo F (2005). A six year Van Egmond HP (1989). Aflatoxin M1: Occurrence, survey (1999-2004) of the ocurrence of aflatoxin M1 in Toxicity, and Regulation. In: Hans P. van Egmond (Ed.) dairy products produced in Portugal. Mycotoxin Mycotoxins in Dairy Products. Elsevier Applied Research, 21: 192-195. Science, New York, pp. 11-55.
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RPCV (2007) 102 (563-564) 327-330 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Determinação do teor de humidade em salsichas tipo Frankfurt utilizando microondas
Moisture determination in Frankfurt type sausages by microwave methodology
Maria José E. Fernandes*, Maria João R. Fraqueza, Marília C. Ferreira, António S. Barreto
CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica e Lisboa - TULisbon
Resumo: O objectivo deste trabalho foi validar a determinação results were not significantly different at 95% level of confi- da humidade pelo método microondas (Smartsystem, CEM dence. The accuracy of microwaves method was evaluated using Corporation, USA) na matriz salsichas tipo Frankfurt, com these same matrixes, it was obtained a relative error of 0.13%. diferentes formulações. Os parâmetros estabelecidos no ensaio The precision was determined by the coefficient of repeatabili- foram temperatura de secagem 103 ºC e potência utilizada 75% ty variation, with a value of 0.78%. The intermediate precision (250 W de energia para 100% de potência) com um critério de in microwave method was evaluated using different times and estabilização definido por uma variação de perda de peso da operators. This method has a steady behavior in different condi- amostra não superior a 0,9 mg em menos de 5 segundos. Para tions of work. The microwaves method seems to be a reliable comparar as médias dos resultados obtidos na determinação da alternative to the moisture reference method in matrix used such humidade em amostras de salsichas tipo Frankfurt, através dos as Frankfurt type sausages. métodos de secagem em estufa e em microondas, aplicou-se o teste t de Student, para um nível de confiança de 95%. Não se observaram diferenças significativas entre os resultados obtidos pelos dois métodos. Foi ainda avaliada a exactidão do Introdução método microondas, na matriz em estudo, tendo-se obtido um erro relativo de 0,13%, enquanto a precisão, determinada A determinação da humidade é um procedimento através do coeficiente de variação da repetibilidade, obteve um valor de 0,78%. Para avaliar a precisão intermédia, fez-se variar o fundamental em bromatologia. A necessidade de um tempo e o operador, concluindo-se que este método tem um método de determinação expedita é inquestionável comportamento estável em condições de trabalho diferentes. A quer pelo número de solicitações quer pela premência metodologia microondas revelou ser uma alternativa viável ao na obtenção rápida de resultados. método de referência para a determinação do teor de humidade O método por microondas, tendo como base o em salsichas tipo Frankfurt. princípio da extracção da água pelo calor é de resposta Summary: The aim of this work was to present results of rápida (± 3min). Nele ocorre uma absorção da energia microwaves Smartsystem (CEM Corporation, USA) optimiza- das microondas pelos compostos polares das amostras, tion used for moisture determination in Frankfurt type sausage, como a água, com consequente desidratação. with different formulations. The parameters established for Existem vários métodos para a determinação da assay were drying temperature 103 ºC and 75% of power (250 W of energy for 100% of power) with a stabilization criterion água livre de um alimento, dos quais se destaca a defined for a loss of weight variation no higher than 0.9 mg in titulação de Karl Fischer, que quantifica o conteúdo less than 5 seconds. The methods, air-drying oven and em água por meio de uma reacção estequiométrica, microwaves oven-drying, have been compared through a t enquanto que a maioria dos restantes se fundamenta Student test using different Frankfurt type sausage samples. The na desidratação da amostra até peso constante, a determinada temperatura e pressão. A secagem das amostras em estufa a 103±2 ºC é o método analítico mais utilizado (Hart e Fisher, 1991). A escolha do método mais adequado é efectuada tendo em conta as características do produto a analisar, tais como a composição em açúcares ou em matéria gorda e a existência de substâncias voláteis distintas * Correspondência: [email protected] da água, de modo a limitar a possível decomposição CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária. Avenida da da amostra durante o seu aquecimento. Universidade Técnica, Polo Universitário do Alto da Ajuda, 1300-477 Lisboa A determinação do teor de humidade pelo método Tel/Fax: +351 213652880 microondas está contemplada em referências oficiais,
327 Fernandes MJE et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 327-330 nomeadamente no método 985.14 "Moisture in Meat Métodos analíticos and Poultry Products. Rapid Microwave Drying Método de Referência - NP 1612 (2002): foi efectu- Method", publicado pela Association of Official da pesagem de 8 g de amostra homogeneizada para Analytical Chemistry (AOAC, 2000). Contudo, este uma cápsula com areia, previamente seca em estufa requer validação e referências quanto às condições de (Memmert, U60) a 103±2 ºC. A amostra foi posterior- utilização do aparelho: temperatura, potência e critério mente submetida a ciclos de secagem em estufa a de estabilização (variação de peso/variação do tempo). 103±2 ºC, arrefecimento em exsicador e pesagem, até Estas condições devem ser monitorizadas para cada peso constante segundo a Norma Portuguesa NP 1612 tipo de produto, em função da sua composição (2002) referente a carnes, derivados e produtos específica e características, de modo a que não ocorra cárneos. A determinação foi efectuada em duplicado carbonização da amostra. para cada amostra. Os resultados foram expressos em As referências de utilização deste método em percentagem. produtos cárneos são limitadas, sendo a indústria dos lacticínios e do tomate as mais empenhadas na vali- Método Microondas - AOAC 985.14 (2000): dação desta técnica (Reh e Gerber, 2003). Estudos Pesaram-se aproximadamente 2 g de amostra, num efectuados a amostras de leite concentrado, com e sem aparelho microondas (CEM Corporation, Smartsystem adição de açúcar, pré-misturas para gelados e iogurtes, 5 - moisture/solids analyser) com balança interna, referem o método microondas como uma boa alterna- utilizando filtros em fibra de vidro, 4x4 cm (Ref. tiva ao método clássico de secagem em estufa para 200150), como suportes de amostras. a determinação do teor total de sólidos (método Os parâmetros estabelecidos para este ensaio foram indirecto) em produtos lácteos (Reh e Gerber, 2003). temperatura de secagem 103 ºC e potência utilizada Um outro estudo efectuado com sucedâneos do 75% (o Smartsystem utiliza 250 W de energia quando tomate, comparam os resultados obtidos por este programado para 100% de potência) com um critério método com os determinados em estufa de vácuo a 70 de estabilização definido por uma variação de perda ºC. Os resultados do método microondas apresen- de peso da amostra não superior a 0,9 mg, em menos taram uma boa repetibilidade e reprodutibilidade para de 5 segundos. a determinação do teor total de sólidos em polpa de Efectuaram-se cinco réplicas para a determinação tomate, tendo-se concluído que esta técnica é uma de humidade em cada amostra. alternativa válida ao método de secagem em estufa de vácuo (Wang, 1987). Metodologia de validação e tratamento estatístico Oito laboratórios, trabalhando em colaboração, testaram o CEM Analyzer AVC-MP para a determi- A validação da determinação de humidade em nação da humidade em farinha. Após optimização do salsichas tipo Frankfurt utilizando o aparelho método nesta matriz, os autores concluíram que pelo microondas Smartsystem, foi efectuada por compara- método microondas foi possível obter uma resposta ção dos resultados obtidos com os conseguidos através rápida e resultados reprodutíveis do teor de humidade do método de referência, utilizando-se o teste t de em farinha (Davis e Lai, 1984). Student, para um nível de confiança de 95%. O objec- O objectivo deste trabalho foi validar o método tivo principal deste ensaio comparativo, foi estudar microondas (Smartsystem, CEM Corporation, USA) a proximidade dos resultados obtidos pelos dois para a determinação da humidade em salsichas tipo métodos, isto é, avaliar a exactidão do método Frankfurt, com diferentes formulações. alternativo relativo ao de referência. Outra forma de avaliar a exactidão do método de determinação da humidade por microondas foi deter- minar o erro relativo, Er (%), considerando o valor Material e métodos verdadeiro o resultado médio das determinações obtidas pelo método de referência. Deste modo, o erro Colheita e preparação de amostras relativo foi calculado aplicando a expressão: Foram adquiridas no mercado 10 latas de salsichas (Xmicro – Xref) tipo Frankfurt, com diferentes formulações que apre- Er = x100 sentaram como ingredientes principais porco e aves, Xref porco, porco e aves com pedacinhos de presunto, em que: porco e aves com pedacinhos de fiambre, porco e aves Xmicro = média dos valores de humidade obtidos com pedacinhos de bacon, de modo a abranger pelo método microondas possíveis diferentes teores de humidade. Após Xref = média dos valores de humidade obtidos pelo homogeneização em picadora eléctrica (Moulinex, método de referência D56), todas as amostras foram sujeitas à determinação de humidade, em simultâneo, pelo método de A precisão do método de determinação do teor referência e microondas. humidade em salsichas tipo Frankfurt, foi avaliad a
328 Fernandes MJE et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 327-330 pela série de determinações efectuadas (n=10), sobre Quadro 1 - Comparação de médias obtidas pelos dois métodos a mesma amostra, pelo mesmo técnico, no mesmo de determinação do teor de humidade em salsichas tipo aparelho e no mesmo dia. Determinou-se o coefi- Frankfurt, com diferentes formulações ciente de variação da repetibilidade (%), aplicando a Método Referência Microondas seguinte expressão: n 20 50 Média 71,24 70,27 Sr Cvr = x100 Desvio padrão (%) ±3,04 ±2,99 x Intervalo de confiança (%) 69,67 - 72,80 69,58 - 70,96 em que: Teste t-Student 1,2 Sr = desvio de padrão de repetibilidade Significancia n.s. x = média das 10 repetições efectuadas na mesma n.s - não significativo amostra A precisão intermédia do método microondas, foi Determinação do erro relativo avaliada utilizando-se como amostra uma única lata O erro relativo exprime a componente de erros de salsichas tipo Frankfurt. Após homogeneização sistemáticos. Cabe ao laboratório definir qual o seu separaram-se seis porções iguais, sendo uma analisada grau de exigência em termos de exactidão do método de imediato (T 0) e as restantes foram congeladas a em estudo, o qual deve basear-se, sempre que possível, -18 ºC, posteriormente descongeladas (4 ºC/12h) em em dados bibliográficos referentes ao método em dias pré-determinados (T 2, T 3, T 4, T 8 e T 9) e analisadas questão ou na sua ausência, como é o caso, em em simultâneo por dois operadores. Os factores de critérios de bom senso. Um valor de "Er" inferior ou variabilidade estudados na determinação de humidade igual a 5% em alguns casos pode ser satisfatório, pelo método microondas foram o tempo (6 dias) e o sendo no entanto este valor meramente indicativo operador (2). (Anónimo, 1995). O erro relativo encontrado foi de 0,13%, bastante inferior a 5%, considerando-se portanto um valor bastante satisfatório. Resultados e discussão Avaliação da precisão Comparação entre os dois métodos O valor médio e desvio padrão do teor de humidade apurado na avaliação da repetibilidade, numa série de Os resultados (médias, desvios padrão e intervalo de determinações (n=10) sobre uma mesma amostra de confiança) da determinação do teor de humidade (%), salsicha tipo Frankfurt de porco, realizadas pelo em salsichas tipo Frankfurt com diferentes formulações, mesmo técnico, no mesmo aparelho e no mesmo dia, pelos métodos de secagem em estufa a 103±2 ºC e em foi de 73,30±0,57%. O valor desta média encontra-se aparelho microondas estão apresentados no Quadro 1. dentro do intervalo de confiança determinado (72,89 - A média do teor de humidade encontrada pelo 73,70). método de secagem em estufa foi de 71,24±3,04%, O coeficiente de variação da repetibilidade foi de enquanto que pelo método de secagem em microondas 0,78%, verificando-se uma baixa variabilidade nos foi de 70,24±2,99%. resultados de determinação do teor de humidade pelo Verificou-se que ambas as médias se encontram método microondas na mesma amostra. Na bibliografia dentro dos respectivos intervalos de confiança: encontrou-se um estudo com amostras de leite 69,67–72,80 para o método de secagem em estufa e concentrado, com e sem adição de açúcar, pré-mis- 69,58-70,96 para o método de secagem em microon- turas para gelados e iogurtes, no qual se obtiveram das. Observaram-se desvios elevados em relação à valores de coeficientes de variação da repetibilidade média tanto para o método de secagem em estufa inferiores a 0,3%; no entanto, devemos ter em conta as (3,04%) como para o método de secagem em características físicas das amostras, as quais, neste microondas (2,99%) que se atribuem à utilização de caso, são naturalmente homogéneas. amostras de salsichas com diferentes formulações e portanto com diferentes valores de humidade. Apesar Avaliação da precisão intermédia de o número de ensaios efectuados para o método de secagem em microondas ser superior ao do método de Os resultados da análise de variância dos valores do referência, verificou-se que apresentava um desvio teor de humidade (%) obtidos pelo método de padrão mais baixo, logo uma menor dispersão dos secagem em microondas, para uma mesma amostra de resultados obtidos. salsicha tipo Frankfurt de porco, em dias diferentes e Pela comparação das médias dos teores de humidade realizadas por 2 analistas, encontram-se em síntese no obtidos pelos dois métodos de ensaio, observou-se não Quadro 2. Neste quadro, podemos observar que, para existirem diferenças significativas (p> 0,05) entre um nível de confiança de 95%, este método teve um ambos. comportamento estável em condições de trabalho
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Quadro 2 - Verificação da homogeneidade de valores obtidos na mesma amostra em tempos diferentes e com analistas diferentes
Fonte da variação SQ g.l. QM F cal F tab p Analista 0,020 1 0,020 0,309 6,608 n.s Dia 0,143 5 0,029 0,436 5,050 n.s Resíduo (Erro) 0,328 5 0,066 Total 0,491 11 SQ - soma dos quadrados; gl - graus de liberdade; QM - quadrados médios; n.s - não significativo diferentes, não se verificando diferenças significativas Bibliografia quando se fez variar o dia de análise e o analista, Anónimo (1995). Guia Relacre. Validação de métodos internos factores de variabilidade dentro de um laboratório. de ensaio em análise química. Relacre (Lisboa). O método microondas mostrou ser uma alternativa AOAC (2000). Moisture in meat and poultry products. viável ao método de referência para a determinação do Rapid microwave drying method. Association of teor de humidade em salsichas tipo Frankfurt. Official Analytical Chemistry. 5ª Edição. Edição AOAC Conclui-se que se trata de uma metodologia simples, (USA). Chapter 39: 1-2. Davis AB e Lai CS (1984). Microwave utilization in the de resposta rápida e capaz de fornecer resultados rapid determination of flour moisture. Cereal Chemistry, idênticos aos do método de referência para a determi- 81 (1): 1-2. nação do teor de humidade em salsichas tipo Hart FL e Fisher HJ (1991). Introducción: Métodos Frankfurt, independentemente da sua formulação. A generales para el análisis básico y mineral. In: Analise validação deste método deverá ser alargada a outros moderno de los alimentos. Editora Acribia. (Zaragoza). produtos, de modo a rentabilizar o aparelho microon- Reh CT e Gerber A (2003). Total solids determination in das dentro de um laboratório de bromatologia, justifi- dairy products by microwave oven technique. Food Chemistry, 82: 125-131. cando o elevado investimento na aquisição deste Wang SL (1987). Microwave drying method for total solids equipamento. determination in tomatoes: collaborative study. Journal Association of Official Analytical Chemistry, 70 (4): 758-759.
330 RPCV (2007) 102 (563-564) 331-338 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Aspectos bacteriológicos e físico-químicos da lingüiça frescal de frango elaborada com diferentes concentrações de polifosfato de sódio
Bacteriological and physical-chemistry aspects of poultry sausage elaborated with different concentration of sodium polyphosphate
Márcia M. Lopes 1*, Leonardo P. Silva 1, Carlos A.C. Júnior 2, Anderson J. Teodoro 3, Sérgio B. Mano 4, Mônica Q. Freitas 4, Robson M. Franco 4, Henrique S. Pardi 4
1Pós-Graduação em Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal da Universidade Federal Fluminense (UFF), Niterói – RJ 2Curso de Medicina Veterinária da UFF, Niterói – RJ 3Curso de Nutrição da Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO), Rio de Janeiro – RJ 4Departamento de Tecnologia dos Alimento, Faculdade de Veterinária da UFF, Niterói – RJ
Resumo: O presente trabalho teve como objetivo avaliar a sensorial acceptance. From 11 th day, samples with 0.3% and influência de diferentes concentrações de polifosfato de sódio 0.5% of polyphosphate had presented a inhibition in microor- no comportamento da microbiota e nos aspectos físico-químicos ganisms growth. Relatively to lactic acid bacteria, enterobacteria da lingüiça frescal de frango. Foram elaboradas quatro formu- and Pseudomonas sp. counts, only in this last group was lações de lingüiça frescal de frango (A – sem polifosfato; observed inferior counts in samples with 0.3% of polyphos- B – 0,1% de polifosfato; C – 0,3% de polifosfato; D – 0,5% de phate. In the analysis of pH, it was observed that the addition of polifosfato). Realizaram-se análises bacteriológicas (contagem polyphosphate significantly affected initial pH of poultry de bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas, bactérias ácido sausage samples and improved their income when polyphos- láticas, Pseudomonas sp. e enterobactérias), determinação do phate concentration was increased. The results from test of pH, do rendimento pós-fritura e teste de aceitação sensorial. A acceptance had disclosed that only significant differences partir do 11º dia, as amostras contendo 0,3% e 0,5% de polifos- (p<0.05) were detected relative succulence. Considering results, fato apresentaram inibição no crescimento das bactérias hete- the use of polyphosphate can cause an increase in sausage rotróficas aeróbias mesófilas. Quanto à contagem de bactérias income after-cooking and a greater succulence not compromis- ácido láticas, enterobactérias e Pseudomonas sp., apenas neste ing, however, the increase of microbiota present. último grupo observaram-se contagens inferiores nas amostras contendo 0,3% de polifosfato. Observou-se também que a Keywords: poultry sausage; sodium polyphosphate adição do polifosfato afetou sensivelmente o pH inicial das amostras de lingüiça de frango e melhorou o rendimento das mesmas, a partir do aumento da concentração do aditivo. O teste de aceitação revelou que apenas no atributo suculência foi Introdução constatada diferença significativa (p<0,05). Pode-se afirmar que o uso do polifosfato ocasionou aumento no rendimento A produção e o consumo de carne de frango têm pós-fritura e maior aceitação quanto à suculência do produto final, não comprometendo, entretanto, o aumento da microbiota crescido consideravelmente durante os últimos 30 presente. anos. A demanda de proteína animal, bem como a aceitação em todo o mundo têm colocado este alimento Palavras-chave: lingüiça de frango; polifosfato de sódio numa posição muito favorável (Mulder, 1995). Considerando o cenário mundial, constatou-se nas Summary: The present work had as objective to evaluate the influence of different concentrations of sodium polyphosphate últimas décadas, uma acelerada alteração na forma de in microbiota behavior and physical-chemical characteristics in consumo da carne de frango. Numa primeira fase, o fresh poultry sausage. Four formularizations of fresh poultry frango inteiro perdeu espaço para o frango em partes, sausage had been elaborated (A – without polyphosphate; e posteriormente, ambos perderam mercado para os B – 0.1% of polyphosphate; C – 0.3% of polyphosphate; D – produtos processados de frango. Esse cenário 0.5% of polyphosphate). Bacteriological analysis (heterophylic aerobic mesophylic, lactic acid bacteria, Pseudomonas sp. and demonstra um processo de substituição do produto in enterobacteria counts) and pH analysis, income and test of natura pelo produto elaborado, ao qual é agregado valor, conveniência e praticidade (Sarantópolos, 1992). Nos EUA, em 1960, somente 2% da carne de frango era destinada ao processamento, enquanto em 1996 esta proporção aumentou para 37% (Madava, *Correspondência: [email protected] 1999).
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Dentre os produtos à base de frango mais comer- meio (Snyder e Maxcy, 1979). cializados está a lingüiça, produto cárneo industriali- De acordo com Chen et al. (1973) e Molins et al. zado elaborado a partir de carnes de uma ou mais (1987), os polifosfatos possuem menor eficiência espécies de animais de açougue, adicionado ou não de quando atuantes sobre as bactérias Gram negativas. gorduras, ingredientes, e embutido em tripas naturais Segundo o estudo realizado por Molins et al. (1987), ou artificiais, obtido na forma crua ou cozida, em alimentos cuja microbiota é predominantemente dessecado ou não, defumado ou não, curado ou não. constituída por bactérias Gram negativas, os polifos- Este produto tem sua classificação variável de acordo fatos (0,4%) não foram capazes de retardar a deterio- com a composição da matéria-prima e a tecnologia ração dos mesmos, embora diante de concentrações utilizada no processo de fabricação (Brasil, 2000). superiores a 1% de pirofosfato de sódio, os autores Dentre os possíveis aditivos utilizados no processo de observaram um aumento da vida útil da carne suína elaboração da lingüiça frescal de frango estão os armazenada sob refrigeração. polifosfatos. Estes promovem a retenção de água, O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar proporcionando um aspecto mais homogêneo e a influência das diferentes concentrações de polifosfato brilhante ao corte, aumentando a tenrura e suculência no comportamento da microbiota naturalmente encon- dos produtos. Melhora também a uniformidade e a trada na lingüiça frescal de frango. Além deste, também esta bilidade da cor do produto final, além de atuar foram traçados os seguintes objetivos: acompanhar a sinergicamente com os ascorbatos contra a rancidez. evolução dos valores de pH e contagem de microrga- Industrialmente, são utilizados os sais de sódio ou nismos da lingüiça frescal de frango com diferentes potássio de tripolifosfato, hexametafosfato ou pirofos- concentrações de polifosfato; avaliar o efeito da fato, em virtude das seguintes propriedades: solubili- adição de polifosfato no rendimento pós-fritura das dade, higroscopicidade, poder complexante dos metais, amostras de lingüiça de frango, e a preferência do capacidade emulsificante e pH (Pardi et al. , 2001). consumidor em relação às diferentes formulações Os polifosfatos são aditivos com ampla aplicação na através da análise sensorial. indústria de alimentos, apresentando destaque no processamento de produtos cárneos. São classificados em três categorias: trifosfato de sódio (STPP), piro- Material e métodos fosfato de sódio (TSPP) e hexametafosfato de sódio (SHMP). Dentre estes, o tripolifosfato de sódio é o Para elaboração da lingüiça frescal de frango, mais utilizado na indústria de carnes, em função de utilizou-se como matéria-prima o peito de frango seu maior poder quelante e maior retenção de água resfriado, obtido de matadouro sob Inspeção Estadual, proporcionada à carne (Shimp, 1981). localizado no município de Valença – RJ. Visando a Segundo Wu et al. (1990), a injeção de polifosfatos obtenção da matéria-prima com uma carga microbiana no músculo afeta a sua capacidade de retenção de inicial reduzida, realizou-se a desossa do peito, bem água, bem como a solubilidade das proteínas miofi- como a retirada da pele, no laboratório de Tecnologia brilares, a partir da sua interação com o complexo de Carnes e Derivados do Departamento de actomiosina. Tecnologia dos Alimentos da Faculdade de Veterinária Vários estudos demonstram que a ação dos polifos- da Universidade Federal Fluminense. fatos sobre as propriedades funcionais dos alimentos A partir da obtenção do filé de peito de frango, está diretamente relacionada com a concentração de procedeu-se o processo de moagem do mesmo, sal nos mesmos (Froning e Sackett, 1985; Sofos, juntamente com o toucinho em moedor da marca 1985; Young et al. , 1987). C.A.F. Após a mistura de todos os ingredientes, a De acordo com alguns autores (Zessin e Shelef, massa obtida foi mantida em geladeira (0±1 °C), por 1988; Knabel et al. , 1991; Zaika e Kim, 1993; Lee et aproximadamente meia hora, para fixação dos al. , 1994), além da ação sobre as propriedades condimentos. Após este período, procedeu-se ao funcionais, os polifosfatos também apresentam ação embutimento. Este processo foi realizado em embu- inibitória sobre os microrganismos. tideira da marca Picelli, utilizando-se tripa natural de As hipóteses levantadas para explicar o mecanismo ovino refrigerada. antibacteriano dos polifosfatos incluem o seqüestro de Posteriormente ao processo de embutimento, as íons metálicos (cálcio e magnésio) essenciais na amostras foram embaladas em bandejas isotérmicas, estrutura da parede celular bacteriana (Post et al. , envoltas por filme PVC, e armazenadas em geladeira, 1963; Lee et al. , 1994; Zaika et al. , 1997), o seqüestro mantendo-se refrigeradas a 0±1 °C, durante o período de íons metálicos (ferro e magnésio) presentes no de realização do experimento. sistema citocromo (Firstenberg-Eden et al. , 1981; Na Tabela 1, observam-se os ingredientes utilizados Seward et al. , 1982; Molins et al. , 1984), a repressão na elaboração da lingüiça de frango, bem como as na síntese de enzimas, bem como a inibição da ativi- suas formulações. É importante ressaltar que o tipo de dade enzimática (Wagner e Busta, 1985; Wood e polifosfato utilizado no presente trabalho foi o tripo- Clark, 1988) e a alteração da atividade de água do lifosfato de sódio.
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Tabela 1 - Ingredientes, em percentuais, das formulações A, B, pH. A análise de pH foi realizada pelo método poten- C e D de lingüiça frescal de frango utilizadas no presente ciométrico, descrito nos Métodos Analíticos Físico- experimento -Químicos, para Controle de Produtos Cárneos e seus Ingredientes Formulações Ingredientes (Lanara, 1981b). Para a medição do pH (%) A B C D foi utilizado um eletrodo acoplado ao potenciômetro Peito de frango 85,05 84,95 84,75 84,55 da marca HORIBA, modelo M-13. Toucinho 10,00 10,00 10,00 10,00 Sal 1,50 1,50 1,50 1,50 Análise sensorial. Quanto à análise sensorial, foi Alho 0,25 0,25 0,25 0,25 realizado o teste de aceitação, buscando-se avaliar o Pimenta 0,20 0,20 0,20 0,20 "status afetivo" das amostras analisadas através do uso Água3,00 3,00 3,00 3,00 de uma escala hedônica verbal de nove pontos, variando Polifosfato* - 0,10 0,30 0,50 de 1 (desgostei muitíssimo) a 9 (gostei muitíssimo). *Estabilizante polifosfato – Accord B. Registro no Ministério da Saúde Na escala hedônica, o provador expressa sua aceitação sob o n° 4.0119.004701-5 / DIPOA AUP n° 129/94. Ind. Brasileira / Peso: 250 g. Laboratório Griffith do Brasil S/A. CNPJ pelo produto, seguindo uma escala previamente 52.542.446/0001-41. estabelecida que varia gradativamente, com base nos atributos gostar e desgostar, onde a preferência fica implícita. Contagem de bactérias heterotróficas aeróbias Para realização do teste de aceitação, utilizaram-se mesófilas. A contagem de bactérias heterotróficas trinta julgadores não treinados, consumidores habituais aeróbias mesófilas (BHAM) foi realizada pelo método do produto-teste, com idade variando entre 20 e 32 de plaqueamento em profundidade, baseando-se no anos, sendo 21 indivíduos do sexo feminino e 9 método do Laboratório de Referência Animal (Lanara, indivíduos do sexo masculino. 1981a). Para tal, utilizou-se o meio de cultura "Plate As amostras de lingüiça de frango foram preparadas Count Agar" (PCA; Merck Cat. Nº 1.05463), com em fogão convencional, utilizando-se óleo de soja incubação a 35 °C e leitura em 24 h. Os resultados para a fritura. O processo de fritura durou, aproxi- foram expressos em log UFC/g de amostra. madamente 10 minutos, com a temperatura do óleo variando entre 170-180 °C. Depois da fritura, as amostras foram partidas em pedaços de, aproximada- Contagem de bactérias ácido láticas. Para a mente 5 cm, e distribuídas em copos plásticos de contagem de bactérias ácido láticas, utilizou-se o meio 50 mL para apresentação aos julgadores. "All Purpose Agar com Tween" (APT; Merck Cat. As amostras foram devidamente codificadas com Nº 1.104530). Para manter as condições de microaero- números de três dígitos colhidos aleatoriamente, e filia necessárias para o crescimento dos microrganismos apresentadas aos julgadores de forma seqüencial, em em questão, recobriu-se a superfície das placas com que cada julgador provou todas as amostras em ordem uma sobrecamada do mesmo meio (APT Agar Base, de apresentação aleatorizada. 2005). Após a completa solidificação do ágar, as Juntamente com as amostras, foi fornecida aos placas foram incubadas invertidas a 35 °C por 48 h julgadores uma ficha de avaliação e um copo d’água para posterior leitura. Os resultados foram expressos para o enxágüe bucal entre as degustações. em log UFC/g de amostra. Rendimento pós-fritura. Para obter o valor do rendi- Pseudomonas Contagem de sp. Para a contagem de mento da lingüiça de frango, foi realizada a pesagem Pseudomonas sp., utilizou-se o meio de cultura das amostras antes do processo de fritura e posterior- "Cetrimide Ágar Base" (Cetrimide Agar; Merck Cat. mente ao mesmo. Sendo assim, o rendimento foi Nº 1.05284). Utilizou-se a técnica de espalhamento obtido a partir da diferença de peso encontrada antes e em superfície, com posterior incubação das placas a depois da fritura das amostras. Para realizar tal 35 °C e leitura em 72 h. Para averiguação da existência procedimento, utilizou-se uma balança eletrônica de de pigmentação fluorescente nas colônias, utilizou-se precisão. uma lâmpada ultravioleta. Análise estatística. A análise estatística dos resulta- Contagem de enterobactérias. Quanto à contagem dos obtidos nas análises bacteriológicas constou de de enterobactérias, utilizou-se o meio de cultura uma análise descritiva simples, através da qual se "Violet Red Bile Dextrose" (VRBD; Merck Cat. realizou a média e proporção dos diversos dados Nº 1.10275), incubando-se as placas a 35 °C por 24 h. estudados, procedendo-se um estudo comparativo Para efeito de contagem, foram consideradas colô- com utilização de tabelas e gráficos. Para realização nias de enterobactérias as que apresentaram coloração da referida análise estatística descritiva e confecção vermelha com zona de precipitação ao redor das dos gráficos, utilizou-se o programa Microsoft ® Excel mesmas. Os resultados foram expressos em log UFC/g 2002. de amostra. Os resultados obtidos a partir da análise sensorial
333 Lopes MM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 331-338 foram avaliados por análise de variância (ANOVA). Sustentando tal teoria, os autores justificam a ação Nos parâmetros onde o valor de F calculado foi maior bactericida dos polifosfatos quando adicionados em ou igual ao do F tabelado, procedeu-se a realização do meios de cultura ou culturas celulares, uma vez que teste de Tukey, em que a diferença entre as médias estes não apresentam tais enzimas. aritméticas das amostras é comparada com o valor Reforçando a teoria exposta anteriormente, Zaika et crítico DMS (Diferença Mínima Significativa). al. (1997) avaliaram o efeito dos polifosfatos quando adicionados ao meio de cultura BHI, utilizado para o cultivo de Listeria monocytogenes . Segundo os autores, Resultados e discussão com a adição dos polifosfatos de cadeia longa houve redução no tempo de duplicação e na fase de latência do Conforme os resultados obtidos neste trabalho, microrganismo estudado. Tal efeito não foi observado observou-se que a ação do polifosfato de sódio sobre com a adição de polifosfatos de cadeia curta. a microbiota estudada variou conforme o tipo de Contrariando os resultados obtidos por Zaika et al. microrganismo, bem como o tempo de armazenagem (1997), Rajkowski et al. (1994) não observaram o das amostras de lingüiça de frango. efeito bactericida do hexametafosfato quando adi- No presente estudo, durante os primeiros 10 dias de cionado a amostras de leite UHT, inoculadas com armazenagem não foi observada ação inibitória do Listeria monocytogenes e Staphylococcus aureus . polifosfato de sódio sobre as bactérias heterotróficas Segundo os autores, a adição de 0,5% e 1,0% de aeróbias mesófilas (Figura 1). Tal resultado também hexametafosfato não acarretou redução do tempo de foi obtido por Molins et al. (1984), que estudaram o duplicação do Staphylococcus aureus e Listeria mono- efeito dos polifosfatos (pirofosfato de sódio, tripo- cytogenes . Para justificar tais resultados, os autores lifosfato de sódio, hexametafosfato de sódio) no afirmam que as altas concentrações de Ca +2 e Mg +2 crescimento de Staphylococcus aureus , bactérias presentes no leite impediram que o hexametafosfato heterotróficas aeróbias mesófilas e bactérias hete- inibisse o crescimento bacteriano. Nas amostras rotróficas aeróbias psicrotróficas, durante 7 dias de adicionadas de hexametafosfato não foram verificadas armazenagem a 5 °C. Neste estudo, os autores alterações na morfologia celular de ambos os micror- observaram que não houve diferença estatística ganismos estudados. significativa (p<0,05) entre as contagens dos referidos De acordo com Palumbo et al. (1994), os polifos- microrganismos nas amostras controle e nas amostras fatos dependem da interação com o cloreto de sódio tratadas com 0,5% de polifosfato, embora tenha sido para inibir o crescimento dos microrganismos. No observado um discreto aumento da fase de latência trabalho desenvolvido pelos autores, o aumento da das bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas das fase de latência da Aeromonas hydrophila K144 só foi amostras tratadas com 0,5% de pirofosfato de sódio e observado quando existiu a interação do polifosfato 0,5% de tripolifosfato de sódio. Segundo os autores com o cloreto de sódio em concentrações superiores a citados anteriormente, a discreta ação antibacteriana 3,5%. No presente trabalho, todas as amostras de dos polifosfatos pode ser explicada pela ação de lingüiça de frango foram adicionadas de 1,5% de polifosfatases e pirofosfatases presentes na muscu- cloreto de sódio, o que pode explicar a ação discreta latura da carne, capazes de hidrolisar os fosfatos, e do polifosfato de sódio sobre o crescimento dos assim, inibir sua ação sobre os microrganismos . microrganismos.
Figura 1 - Valores médios dos logaritmos das contagens de bactérias Figura 2 - Representação gráfica dos valores médios dos logaritmos das heterotróficas aeróbias mesófilas das amostras de lingüiça de frango, contagens de bactérias ácido láticas das amostras de lingüiça de frango, formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%), durante os 19 dias de polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%), durante os 19 dias de armazenagem sob refrigeração (0 ± 1 °C). armazenagem sob refrigeração (0±1 °C).
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Sofos (1985) também afirmou em seu trabalho que Pseudomonas fluorescens. Ao término dos 19 dias de o tripolifosfato de sódio, agindo isoladamente, não foi armazenagem, as amostras sem polifosfato e as capaz de reduzir o crescimento bacteriano. Segundo o amostras adicionadas de 0,5% de polifosfato apresen- autor, as diferentes concentrações de cloreto de sódio taram contagem de 5,4 log UFC/g, ao passo que as foram as responsáveis pela diferença observada nas amostras adicionadas de 0,3% de polifosfato apresen- contagens de bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas taram contagem de 4,7 log UFC/g. A inibição das das amostras de produtos cárneos processados. O Pseudomonas pela ação dos polifosfatos também foi autor registrou que diante da adição de 2,0% de cloreto confirmada por Elliot et al. (1964). Os autores de sódio, a contagem de bactérias heterotróficas demonstraram em seu estudo que as espécies não aeróbias mesófilas atingiu 8,0 log UFC/g no 20º dia pigmentantes de Pseudomonas foram completamente de armazenagem, ao passo que no 40º dia de inibidas na presença do polifosfato. Neste mesmo armazenagem, as amostras adicionadas de 3,8% de sal estudo, observou-se que as espécies pigmentantes de atingiram contagens inferiores a 8,0 log UFC/g. No Pseudomonas não foram detectadas na fase inicial de presente trabalho, onde se utilizou 1,5% de cloreto de armazenagem da carne de frango resfriada. sódio em todos os tratamentos, a máxima contagem de É importante ressaltar que as bactérias ácido láticas bactérias heterotróficas aeróbias mesófilas foi de possuem ação inibitória sobre diversas espécies de 7,9 log UFC/g, registrada no 19º dia de armazenagem. Pseudomonas sp. (Raccach e Baker, 1978), o que pode No presente estudo, observou-se que até o 10º dia de justificar a não predominância do referido microrga- armazenagem, a contagem de bactérias heterotróficas nismo, conforme descrevem alguns autores (Barnes, aeróbias mesófilas e a contagem de bactérias ácido 1976; Lee e Han, 1986; Lahellec et al. , 1997). Outro láticas foi bastante semelhante em todos os tratamen- aspecto observado na contagem de Pseudomonas foi a tos estudados. Tal fato sugere que a microbiota inexistência de espécies pigmentantes, contrariando os predominante das amostras de lingüiça de frango era achados de Cox et al. (1975) e Gallo et al. (1988) que constituída de bactérias ácido láticas, fato este que afirmam que na fase inicial de armazenagem ocorre a contraria os resultados descritos por diversos autores predominância de espécies pigmentantes. (Barnes, 1976; Lee e Han, 1986; Lahellec et al. , No presente trabalho, o crescimento das enterobac- 1997). Porém, é importante considerar que no presente térias não foi inibido pelo uso do polifosfato (Figura trabalho utilizou-se unicamente o meio de cultura 4). Chen et al. (1973) revelaram em seu estudo que a APT Agar para a contagem das bactérias ácido láticas. espécie E. coli tolerou concentrações de até 6% de Este meio não é seletivo, permitindo o crescimento de polifosfato. Embora tenha sido realizado o processo outras espécies de bactérias (Emdchemicals, 2004). de higienização dos envoltórios, é possível que o uso Na contagem de Pseudomonas sp. (Figura 3), obser- de tripas naturais de ovino tenha contribuído parcial- va-se que a partir do 8º dia de armazenagem, as mente para a contagem de enterobactérias registrada. amostras tratadas com 0,3% de polifosfato apresen- Os resultados apresentados na Figura 5 demonstram taram contagens inferiores quando comparadas aos que a adição de polifosfato afetou sensivelmente o pH demais tratamentos. Tal fato concorda com os resultados inicial das amostras de lingüiça de frango, formuladas encontrados por Zessin e Shelef (1988) que afirmaram com diferentes teores do aditivo em questão, onde a em seu estudo que o uso de 0,3% de tripolifosfato de amostra A apresentou o menor valor (5,6), observan- sódio foi suficiente para inibir o crescimento de do-se um aumento gradativo de acordo com a adição
Figura 3 - Representação gráfica dos valores médios dos logaritmos das Figura 4 - Representação gráfica dos valores médios dos logaritmos das contagens de Pseudomonas sp. das amostras de lingüiça de frango, contagens de enterobactérias das amostras de lingüiça de frango, formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%), durante os 19 dias de polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%), durante os 19 dias de armazenagem sob refrigeração (0±1 °C). armazenagem sob refrigeração (0±1 °C).
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amostras controle. Froning e Sackett (1985) também observaram que a injeção de tripolifosfato de sódio em amostras de peito de peru proporcionou menores perdas durante o cozimento. De acordo com os resultados apresentados pelos autores, as amostras controle apresentaram uma perda de 33% durante o tratamento térmico, enquanto que as amostras tratadas com tripolifosfato de sódio apresentaram uma perda equivalente a 26,7% do peso das amostras. Além da adição de polifosfato, os autores afirmam que a adição de cloreto de sódio, na concentração de 7%, contribuiu para o aumento do rendimento das amostras de peito de peru. Figura 5 - Representação gráfica dos valores médios do pH das amostras de lingüiça de frango, formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%), durante Tabela 2 - Resultados do peso inicial e após cocção e rendi- os 19 dias de armazenagem sob refrigeração (0±1 °C). mento das amostras de lingüiça de frango formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; do polifosfato nas amostras. Observa-se que no B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%). tratamento D houve estabilidade em relação ao Tratamento Peso (g) Rendimento aumento do pH entre o dia da formulação das Inicial Após cocção (%) amostras e o 7º dia de armazenagem. Em relação aos A 89,41 65,84 73,64 demais tratamentos, houve um aumento gradativo e B 57,94 43,74 75,49 constante. Assim como no presente estudo, Shahidi e C 96,18 76,78 79,82 Synowieck (1997) também verificaram que as D 67,35 55,10 81,81 amostras tratadas com polifosfato apresentaram valores de pH maiores do que as amostras controle. Segundo os autores, que estudaram o efeito de dife- Os resultados obtidos por Froning e Sackett (1985) rentes polifosfatos em produtos cárneos, o aumento do revelaram que as amostras tratadas com tripolifosfato valor de pH foi maior quando houve adição de de sódio apresentaram um rendimento semelhante ao pirofosfato de sódio, tripolifosfato de sódio e encontrado no presente estudo, embora os autores hexametafosfato de sódio, respectivamente. Shults et tenham utilizado uma concentração de cloreto de al. (1972) também demonstraram que o pirofosfato de sódio bastante superior a utilizada nas amostras de sódio foi mais efetivo na elevação do pH da carne lingüiça de frango. Deve-se ressaltar também que os bovina, quando comparado ao uso de tripolifosfato e autores não revelaram a concentração de tripolifosfato hexametafosfato de sódio. de sódio utilizada no experimento. Estes mesmos A elevação dos valores de pH a partir do uso do autores descreveram que o uso de polifosfato também polifosfato também foi verificado por Shimp (1981), melhorou as características sensoriais do peito de que afirma que o polifosfato apresenta, isoladamente, peru. Para realizar a análise sensorial, os autores um pH maior do que o da carne. Craig et al. (1996) utilizaram um painel de 16 julgadores treinados, que confirmaram a existência de um aumento no pH indicaram que as amostras tratadas com pirofosfato de inicial de produtos cárneos, pois segundo os autores, sódio e tripolifosfato de sódio apresentaram melhor soluções contendo sais de fosfatos possuem pH maior desempenho nos atributos sabor, suculência e tenrura, que 7,0. quando comparadas às amostras controle. Barbut et al. (1988) também observaram que a No presente trabalho, verificou-se que as amostras adição de 0,4% de tripolifosfato de sódio provocou um tratadas com 0,3% de polifosfato apresentaram maior aumento no pH das amostras de salsicha de peru tipo aceitação quanto à suculência, sugerindo esta concen- Frankfurt. Segundo os autores, a alcalinidade propor- tração como sendo a ideal na formulação do produto cionada pelo tripolifosfato de sódio provocou o em questão (Tabela 3). O aumento da aceitação quanto aumento do pH da proteína muscular, superando o seu à suculência, nas amostras contendo 0,3% de polifos- ponto isoelétrico e causando, assim, um aumento na fato, não foi acompanhado do aumento da aceitação solubilidade proteica. quanto à impressão global. Tal fato pode ser explicado Quanto ao rendimento pós-fritura das amostras de pela pior aparência das amostras contendo 0,3% e lingüiça de frango, ficou evidente que as amostras 0,5% de polifosfato, que a partir de observação adicionadas de polifosfato de sódio, apresentaram pessoal, se mostraram com envoltório rompido após menores perdas durante o processo de fritura (Tabela a fritura. Porém, é importante ressaltar que os 2). A adição de 0,5% de tripolifosfato de sódio julgadores participantes deste estudo não eram treina- proporcionou um aumento de 8,17% no rendimento dos, o que pode ter gerado uma certa indefinição na da lingüiça, comparando-se com o rendimento das expressão dos resultados.
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Tabela 3 - Escores de aceitação obtidos a partir do teste de aceitação realizado por 30 julgadores (n), onde avaliou-se a dureza, a suculência, o sabor e a impressão global das amostras de lingüiça de frango, formuladas com diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; B - 0,1%; C - 0,3%; D - 0,5%). Tratamento n Dureza Suculência Sabor Impressão Global A 30 5,96 a 5,33 a 6,60 a 6,06 a B 30 6,20 a 6,20 a 7,20 a 6,90 a C 30 6,03 a 6,63 b 7,23 a 6,93 a D 30 5,93 a 6,46 a 7,50 a 7,10 a Obs. Valores da análise sensorial seguidos de letras iguais, entre os tratamentos, não diferem entre si ao nível de 5% de probabilidade segundo o teste de Tukey. Figura 6 - Representação gráfica dos escores obtidos nos atributos dureza, suculência, sabor e impressão global, a partir do teste de aceitação realiza- do com as amostras de lingüiça de frango formuladas com Wu et al. (1990) também descreveram que as diferentes concentrações de polifosfato (A - Sem polifosfato; B - 0,1%; amostras de lombo suíno tratadas com hexametafosfato C - 0,3%; D - 0,5%). e pirofosfato de sódio apresentaram melhor desem- penho nos atributos sabor e suculência. Segundo os autores, tal fato explica-se pela atuação dos polifos- As amostras tratadas com polifosfato apresentaram fatos sobre a solubilização proteica, o que permite valores de pH mais elevados durante os primeiros dez maior retenção de água no produto. Deste modo, há dias de armazenagem. A partir de então, verificou-se maior exposição dos sítios proteicos para fixação dos homogeneidade entre os valores de pH nos diferentes condimentos utilizados na elaboração do produto, tratamentos estudados. Também verificou-se que o proporcionando um melhor sabor ao mesmo. polifosfato proporcionou um aumento considerável no Assim como no presente trabalho, Young et al. (1987) rendimento pós-fritura da lingüiça de frango. também observaram que o uso do polifosfato propor- cionou um aumento no diâmetro das amostras de pastel de frango. Possivelmente, esse fato ocorre devido à Bibliografia maior retenção de água no produto, acarretando um APT Agar Base. Disponível em http://www.remel.com. aumento no seu volume. É importante ressaltar que esse Acesso em 15 de Janeiro de 2005. aspecto reflete diretamente na apresentação do produto, Barbut S, Maurer AJ, Lindsay RC (1988). Effects of reduced tornando-o mais atrativo ao consumidor. Shults et al. sodium chloride and added phosphates on physical (1972), também concordando com os resultados and sensory properties of turkey frankfurters. Journal obtidos no presente estudo, afirmaram em seu trabalho of Food Science, 53(1): 62-66. que o aumento de volume proporcionado pelo uso de Barnes EM (1976). Microbiological problems of poultry at polifosfato está diretamente relacionado ao aumento do refrigerator temperatures – a review. Journal Science pH e à capacidade de desfazer o complexo actomiosina. Food Agriculture, 27: 777-782. Segundo os autores, a mistura de 0,3% de tripolifosfato, Brasill (2000). Ministério da Agricultura e do 0,1% de hexametafosfato de sódio e 1,0% de cloreto de Abastecimento, Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Inspeção de Produtos de Origem sódio foi a mistura que proporcionou uma menor Animal. Regulamento Técnico de Identidade e redução no volume da carne bovina, após o processo de Qualidade de Lingüiça. Aprovado pela Instrução cozimento a 70 °C. Normativa nº 4 de 31 de março de 2000. Chen TC, Culota JT, Wang WS (1973). Effects of water and microwave energy precooking on microbiological Conclusão quality of chicken parts. Journal of Food Science, 38: 155-158. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que Cox NA, Juven JE, Thomson MAJ, Chew V (1975). Spoilage em termos bacteriológicos o polifosfato inibiu apenas odors in poultry meat produced by pigmented and non- parte da microbiota estudada, verificando-se conta- pigmented Pseudomonas. Poultry Science, 54: 200-206. gens inferiores para as bactérias heterotróficas Craig JA, Bowsers JA, Wang X, Seib PA (1996). Inhibition of lipid oxidation in meat by inorganic phosphate and aeróbias mesófilas nas amostras tratadas com 0,3% ascorbate salts. Journal of Food Science, 61(5): 1-4. e 0,5% de polifosfato, e para a contagem de Elliot RP, Straka RP, Garibaldi JA (1964). Polyphosphate Pseudomonas nas amostras tratadas com 0,3% de inhibition of growth of Pseudomonas from poultry meat. polifosfato. Estas amostras também apresentaram Journal of Applied Microbiology, 12, 517-519. maior aceitação quanto ao atributo suculência, Emdchemicals. Manual of Microbiology. Disponível em: provavelmente em função da maior retenção de água 337 Lopes MM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 331-338 Firstenberg-Eden R, Rowley DB, Shattuck E (1981). Rajkowski KT, Calderone SM, Jones E (1994). Effect of Inhibition of Moraxella-Acinetobacter cells by sodium polyphosphate and sodium chloride on the growth of phosphate and sodium chloride. Journal of Food Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in Science, 46: 579-582. ultra-high temperature milk. Journal of Dairy Science, Froning GW e Sacket TB (1985). Effect of salt and phos- 77: 1503-1508. phates during tumbling of turkey breast muscle on meat Sarantópolos CIGL (1992). Novas tendências em embala- characteristics. Poultry Science, 64: 1328-1333. gens de frango. In: Conferencia Apinco - 1992 De Gallo L, Schmitt RE, Schmid-Lorenz W (1988). Microbial Ciencia E Tecnologias Avícolas. Santos: 1992. Anais... spoilage of refrigerated fresh broilers. 1. 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Poultry Science, 41(9): 703-705. 338 RPCV (2007) 102 (563-564) 339-342 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avaliação quantitativa por colorímetro digital da cor do ovo de galinhas poedeiras alimentadas com urucum ( Bixa orellana ) Quantitative evaluation by a digital colorimeter of the color of the egg of laying hens fed with annatto ( Bixa orellana ) Marcia Nalesso Costa Harder 1*, Solange Guidolin Canniatti-Brazaca 1, Valter Arthur 2 1Universidade de São Paulo – Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz" - ESALQ/USP – Laboratório de Agroindústria, Alimentos e Nutrição, Av. Pádua Dias, 11, CEP 13.418-900, Piracicaba/SP, Brasil 2Universidade de São Paulo – Centro de Energia Nuclear na Agricultura - CENA/USP – Laboratório de Irradiação de Alimentos Resumo: O presente trabalho avaliou, quantitativamente, os Introdução efeitos da adição de urucum ( Bixa orellana L .) na cor das gemas dos ovos. Para a obtenção das amostras foram utilizados 125 animais divididos em cinco grupos: Controle (T1 - 0%) e A cor é o primeiro critério utilizado na aceitação ou quatro tratamentos com adição de urucum na ração (0,5% - T2; rejeição, por isso, na indústria de alimentos a cor é um 1,0% - T3; 1,5% - T4 e 2,0% - T5). Após 23 semanas foi inici- atributo importante (Batista, 1994). A adição de ada a coleta dos ovos e medida a cor por colorímetro digital. Na corantes nos alimentos é, muitas vezes, uma exigência avaliação, foram obtidos os parâmetros L*, a*, b*, C* e Hº. Os do consumidor. Se a cor for atraente, dificilmente o ali- grupos, T1 e T2 apresentaram para L* os valores mais baixos e T4 e T5 os mais altos. T4 e T5 representaram para a* os maiores mento não será ingerido ou, pelo menos, provado (Silva valores que diferem dos demais. T1 e T2 apresentaram para et al ., 2000). Na indústria avícola, os consumidores dão b* os menores valores, sendo diferentes dos demais. Assim, preferência aos ovos com gema amarelo-alaranjado e conclui-se que a utilização de 1,5 a 2,0% de urucum na ração frangos com pele bem pigmentada de amarelo (Englert, poedeiras é favorável, pois realça a cor das amostras. 1987; Biscaro e Canniatti-Brazaca, 2006). Summary: The present research evaluated, quantitatively, the O ovo é um alimento completo, tendo todas as vitami- effects of the annatto ( Bixa orellana L .) in the egg yolk colour nas, aminoácidos e minerais que irão constituir um ser by digital colorimeter. For sampling, 125 animals were used vivo (Englert, 1998; Biscaro e Canniatti-Brazaca, 2006). divided in five groups: Control (T1 - 0%) and four treatments Segundo Joly (2005), o urucum ( Bixa orellana ) é a with annatto in the feed (0.5% - T2; 1.0% - T3; 1.5% - T4 and única espécie pertencente à família Bixaceae , nativo 2.0% - T5). After 23 weeks the eggs were picked and measured the yolks colour by digital colorimeter. The evaluation, was da América Tropical e extremamente cultivado. O performed with the parameters L*, a*, b*, C * and Hº. For L*, Brasil é um dos maiores produtores mundiais de grãos T1 and T2 presented the inferior values and, T4 and T5 the de urucum. Da produção brasileira, cerca de 70% dos highest. For a* T4 and T5 represented the highest values, grãos produzidos destinam-se ao processamento do different from the others. For b* T1 and T2 presented the colorau, 20% são utilizados na produção do corante e smallest values. In conclusion the 1.5 to 2.0% of annatto used in the laying hens feed is useful, because it enhances the colour 10% são exportados. Dessa forma, a produção of the samples. brasileira de urucum in natura é muito pequena, não conseguindo, por vezes suprir o mercado interno (Batista, 1994; Franco et al ., 2008). O fruto do urucum contém proteínas, beta-caroteno e outros carotenóides, dos quais os mais abundantes são: a Bixina e a Norbixina. A DL (dose letal) de urucum, para rato, por via intraperitoneal é de 700 mg/kg (Catálogo Rural, 2008). A pigmentação resulta da deposição de xantofilas (grupo de pigmentos carotenóides) na gema do ovo. As fontes de pigmentos carotenóides podem ser naturais, como por exemplo, as do grupo do milho, do urucum e do pimentão vermelho, entre outros. Podem ser empregues também carotenóides sintéticos, tais *Correspondência: [email protected] Tel: +55 19 3429-4118; Fax: +55 19 34267559 como a cantaxantina 10% (pigmento vermelho) e o 339 Harder MNC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 339-342 etil éster beta apo-8-caroteno (pigmento amarelo) os seguintes ingredientes: farelo de soja, farelo de trigo, (Garcia et al ., 2002). milho integral moído (62%), óleo vegetal e premix Discute-se sobre a legislação a aplicar quanto ao uso mineral, vitamínico e aminoacídico, sendo fornecida de de corantes naturais, como aditivos (FAO 1991; Franco 50 a 70 g de ração por ave ao dia, acompanhando et al . 2002). Segundo as recomendações do Comité sempre as recomendações de consumo para a linhagem. FAO/OMS "Joint Expert on Food Additives – JECFA" A partir da 19ª semana de vida dos animais começou a ao lado das especificações de identidade e pureza, as ser fornecida ração para aves de postura em produção, condutas a serem observadas nos estudos e avaliações cuja composição é a seguinte: calcário calcítico, farelo toxicológicas devem ser seguidas. Para os corantes de soja, farelo de trigo, milho integral moído (61,98%), naturais, especificamente o urucum, essa avaliação óleo vegetal, premix mineral, vitamínico e aminoacídi- deve ser considerada no seguinte grupo: "corante co. Foi fornecida de 80 a 120 g de ração por ave ao dia, isolado quimicamente inalterado de um alimento e seguindo sempre as recomendações de consumo da usado no produto em níveis normalmente nele encon- linhagem. O urucum começou a ser administrado no trados, não sendo necessários dados toxicológicos". início da 20ª semana, sendo que as amostras começa- Os principais factores que motivaram a realização ram a serem colhidas a partir da 23ª semana. deste estudo foram o alto custo dos pigmentos sintéti- Os animais foram alojados em instalações individuais cos usados actualmente e os efeitos prejudiciais que e adequadas para o conforto dos animais e foi fornecida estes causam à saúde humana e animal, a necessidade água em abundância. As dimensões para o galpão de maior diversificação agrícola e a escassa informação eram: comprimento de 80 m; largura de 20 m; pé existente sobre a utilização como fonte de pigmentos direito de 3,8 m e beiral de 1,20 m, possuindo uma da gema do ovo e a necessidade de determinar valores área total de 160 m 2 e alojando aproximadamente 4 exactos de cor em gemas de ovos. aves/m 2. Já as gaiolas dimensionadas para fêmeas, Presentemente, a metodologia empregada para possuíam: largura de 0,25 m; profundidade de determinação da cor em gema de ovos, baseia-se no 0,38 m e altura de 0,44 m. A temperatura média do padrão de cores da Roche. Esta é uma metodologia alojamento permaneceu ao redor dos 27 ºC durante o extremamente subjectiva e limitada à percepção de período do experimento, para o bem estar dos animais. quem faz a análise. Com isso, o objetivo deste estudo A ração foi fornecida na totalidade, pela manhã, ao foi avaliar a variação na coloração da gema de ovos redor das 7:00 hs, para padronização da postura. produzidos por poedeiras que receberam diferentes quantidades de urucum na ração com auxílio de uma Colheita de amostras e sua análise. A coleta dos metodologia exacta e padronizada de determinação da ovos foi feita logo após o fornecimento da ração. cor, utilizando-se o sistema CIE L*a*b*. Depois de colhidos, os ovos foram imediatamente encaminhados ao Laboratório de Irradiação de Material e métodos Alimentos (CENA/USP), onde se encontra o equipa- mento para análise de cor. A quantificação de cor foi realizada através de Animais e maneio alimentar colorímetro Minolta CR-200 b, previamente calibrado Foram utilizados 5 tratamentos com 5 repetições e em superfície branca de acordo com padrões pré- cada repetição continha 5 animais, totalizando 125 -estabelecidos (Bible e Singha, 1997). aves poedeiras da raça Hy-Line brown, em idade de Foram quebrados em superfície plana e a medição postura (por volta de 20 semanas) debicadas e vacinadas foi realizada diretamente na superfície da gema, de acordo com esquema básico de vacinações para mantendo-se a integridade da mesma. Não houve prevenção de canibalismo e principais doenças que armazenamento dos ovos. afectam as aves poedeiras. Os animais foram alimen- Foram avaliados 3 parâmetros de cor: L*, a* e b*. O tados diariamente com ração comercial, urucum valor de a* caracteriza coloração na região do vermelho inteiro ( in natura ) e amido de milho (como inerte), nas (+a*) ao verde (-a*), o valor b* indica coloração no concentrações de 0,5% - T2; 1,0% - T3; 1,5% - T4 e intervalo do amarelo (+b*) ao azul (-b*). O valor L 2,0% - T5 (de urucum em relação ao peso da ração) nos fornece a luminosidade, variando do branco e, grupo controle (T1) recebendo somente ração (L=100) ao preto (L=0) (Harder, 2005). comercial, balanceadas adequadamente para atingir O Croma é a relação entre os valores de a* e b*, o objectivo deste. onde se obtém a cor real do objecto analisado. Hue- As sementes de urucum utilizadas são da variedade -Angle é o ângulo formado entre a* e b*, indicando a EMBRAPA-2, doadas pela EMEPA de João Pessoa, saturação da cor do objecto. Paraíba, Brasil, provenientes da safra 2003. Esta Para cálculo do Croma foi utilizada a fórmula variedade apresenta alto teor de bixina, sendo deter- matemática (1) e, para se calcular Hue-Angle, utiliza- minado em 4,00% (EMEPA, 2008). -se a fórmula (2). Durante as primeiras 8 semanas foi administrada C = √(a2+b2) (1) ração para aves de postura em crescimento, que contém Hº = arctg b*/a* (2) 340 Harder MNC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 339-342 Análise estatística. O delineamento experimental taram melhores resultados, de maior quantidade de empregado foi conduzido em blocos completos vermelho e menor de amarelo, o que significa que casualizados, considerando cada 5 animais um bloco. teriam melhor aceitação dos consumidores que Foram feitas 5 repetições por tratamento e as análises preferem ovos com gema que tenham coloração mais foram realizadas em triplicado. Os resultados foram acentuada (tendência ao avermelhado). submetidos à análise de variância, com teste F. Barbosa Filho (2004) confirma que a cor da gema Obtendo-se significância no teste F ao nível de 5%, está relacionada com a presença de agentes pigmen- prosseguiu-se a análise estatística dos dados com a tantes presentes no alimento dos animais. Diz ainda aplicação do teste de Tukey. Estas análises foram que os factores ambientais ou sistema de criação (em realizadas pelo programa estatístico computacional gaiolas ou em cama) não interfere nesta característica. SAS (Statistical Analysis System Institute, 1996). Encontrou valores de L* que variaram de 53,4 a 64,5, semelhante aos valores encontrados neste trabalho. Biscaro e Canniatti-Brazaca (2006), avaliando Resultados e discussão diferentes alimentações de poedeira, incluindo uma com adição de pó de pimentão, observaram diferenças As análises de cor de gema normalmente são para cor das gemas, utilizando-se o colorímetro efectuadas através do leque colorimétrico ROCHE, Minolta. Quando compararam os valores obtidos na numa escala de valores de 1 a 15. Pedroso (1999) colorimetria, observaram grande diferença apenas nos encontrou valores ao redor de 7, no leque ROCHE, valores de a*, que representa coloração no intervalo para gema de ovos encontrados no mercado; para do vermelho (+a*) ao verde (-a*). Concluíram então adição de 60 ppm de cataxantina na dieta de que ovos derivados de poedeiras que se alimentaram poedeiras, Garcia et al . (2002) encontrou valores de com ração adicionada de pó de pimentão obtiveram 14,3 do leque; Sucupira et al . (2007) suplementando a melhores resultados, já que os seus valores de a* alimentação de codornas com levedura de cana-de- ficaram mais elevados. Estes valores concordam com -açúcar, encontrou valores ao redor de 9 do leque. os resultados encontrados neste trabalho e com Porém, sendo esta metodologia muito subjetiva, Hamilton (1992), que relata a adição de fontes para encontrou-se no colorímetro Minolta uma forma de pigmentação. verificação mais precisa. Os valores do Croma encontrados (Tabela 2) para a Na Tabela 1 podem ser observados os valores de L*, gema dos ovos ficaram entre 50,08 a 53,47. Para Hue- a* e b*. -Angle, foram encontrados valores de 0,19 a 0,04. Para todos os parâmetros L*, a* e b* houve difer- Foi observado também que, com o tempo de enças significativas (P ≤0,05) entre os tratamentos, armazenamento, principalmente sem refrigeração, os sendo o mais expressivo o tratamento T5 (2,0% de pigmentos migram para algumas regiões, formando urucum). Observou-se um aumento do valor a*, sendo manchas e diminuindo a intensidade da cor das gemas. que os tratamentos T4 e T5 (1,5% e 2,0% de urucum respectivamente) apresentaram os melhores resultados Tabela 2 - Valores médios calculados e desvio padrão de (mais vermelho). Para o parâmetro b*, houve uma Croma (C*) e Hue (Hº) dos ovos de cada tratamento tendência ao amarelo (valores +), sendo que os Tratamento 1 tratamentos T3, T4 e T5 (1,0%; 1,5% e 2,0% de uru- Croma Hue (º) cum respectivamente) obtiveram melhores resultados, T1 50,08145±4,78 0,19±0,05 pois apresentando valores decrescentes, que ainda T2 50,83521±4,67 0,16±0,05 pertencem ao espectro amarelo, notou-se que as cores T3 50,45815±4,02 0,13±0,04 obtidas têm uma tendência avermelhada (em função T4 51,99289±3,74 0,09±0,04 de a*). Portanto, apesar de todos os tratamentos se T5 53,46844±3,56 0,04±0,02 diferenciaram do controle (T1) os tratamentos T4 e T5 1 T1 – Controle, T2 – 0,5% de urucum, T3 – 1,0% de urucum, T4 – (1,5% e 2,0% de urucum respectivamente) apresen- 1,5% de urucum, T5 – 2,0% de urucum. Tabela 1 - Valores médios e desvio padrão dos parâmetros L*, a* e b* de gema de ovos de cada tratamento Tratamento 1 L* a* b* T1 63,23± 5,46 A 2,23± 3,25 A 53,42± 7,02 A T2 61,12± 4,25 AB 5,14± 2,58 B 51,74± 5,82 AB T3 60,01± 3,89 B 7,02± 2,33 C 50,13± 5,69 B T4 59,58± 3,94 BC 8,45± 2,55 D 49,97± 4,68 B T5 57,48± 3,66 C 9,61± 1,69 D 49,15± 4,29 B ABCD Médias seguidas da mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey (p>0,05). 1T1 – Controle, T2 – 0,5% de urucum, T3 – 1,0% de urucum, T4 – 1,5% de urucum, T5 – 2,0% de urucum. 341 Harder MNC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 339-342 O urucum possui substâncias, xantofilas e Batista CLLC (1994). Produção e avaliação da estabilidade carotenóides, que passam para a gema do ovo. Estes de corante hidrossolúvel de urucum. 71 p. 1. ed. Ed. pigmentos não são sintetizados pelas aves e devem ser UFLA. Brasil. incorporados nas rações (Araya et al ., 1977). Além Bible BB, Singha S (1997). Canopy position influences disso, as substâncias que conferem cor, utilizadas na CIELab coordinates of peach color. Hortscience, 28: 992-993. experiência apresentaram-se eficientes, pois promo- Biscaro LM, Caniatti-Brazaca SG (2006). Cor, betacaro- veram boa pigmentação e foram biologicamente teno e colesterol em gema de ovos obtidos de poedeiras aproveitáveis, uma vez que foram incorporadas às que receberam diferentes dietas. Ciência Agrotécnica. 6: gemas. 1130-1134. Dovorák et al . (2007) utilizaram o sistema de Catálogo Rural. In: http://www.agrov.com/vegetais/fru/ análise de cor CIELab para poedeiras alimentadas urucum.htm. 02/06/2008. com sementes de tremoço e comprovaram a eficácia Dovorák P, Straková E, Kunová J, Kunová V (2007). Egg da metodologia, além de comprovarem que a adição yolk colour depends upon the composition of the feeding de ingredientes ricos em certos carotenóides pro- mixture for laying hens. Acta Veterinaria Brunensis 76: movem uma cor desejável à gema de ovos. 121-127. Emepa. In: http://www.emepa.org.br/urucum_manejo.php. 09/06/2008. Conclusões Englert SI (1987). Avicultura. 288 p. 4ª ed. Editora Agropecuária. Brasil. Englert SI (1998). Avicultura: tudo sobre raças, manejo e De acordo com os resultados obtidos conclui-se que alimentação. 238 p. 7. Editora Agropecuária. Brasil. o tratamento contendo 2,0% de urucum é mais FAO (1991). Necesidades de vitamina A, hierro, folato y eficiente nos aspectos cor. O tratamento contendo vitamina B12: informe de uma consulta mista 1,5% também apresentou resultados promissores, FAO/OMS de expertos. (Serie Estúdios FAO portanto, por factores econômicos, esta talvez seja Alimentación y Nutricición). 121 p. uma opção que não deve ser descartada. Franco CFO, Silva FCP, Cazé Filho J, Barreiro Neto M, São Portanto, conclui-se que a utilização de urucum para José AR, Rebouças TNH, Fontinélli ISC (2002). a alimentação de poedeiras é viável, já que o torna o Urucuzeiro: agronegócio de corantes naturais. 120 p. 1. ovo mais atractivo. ed. Editora EMEPA. Brasil. Outro factor interessante com relação ao urucum é Franco CFO, Fabri EG, Barreiro Neto M, Manfiolli MH, Harder MNC, Rucker NGA (2008). Urucum: sistemas que, ele se tornou um marcador de tempo, pois conforme de produção para o Brasil. 112 p.1. ed. Editora EMEPA. o tempo de armazenamento houve uma migração dos Brasil. pigmentos, formando manchas e indicando um maior Garcia EA, Mendes AA, Pizzolante CC, Gonçalves HC, ou menor tempo de armazenamento pela característica Olveira RP, Silva MA (2002). Efeitos dos níveis de das manchas formadas. cataxantina na dieta sobre o desempenho e qualidade dos ovos de poedeiras comerciais. Revista Brasileira de Ciência Avícola, 1: 1-7. In: Agradecimentos http://www.scielo.br/pdf/rbca/v4n1/11427.pdf. 02/06/2008. À EMEPA (Empresa Estadual de pesquisa Hamilton PB (1992). The use of light-performance liquid Agropecuária da Paraíba), na pessoa do Dr. Camilo chromatography for studying pigmentation. Poultry Flamarion, pela doação do urucum, aos docentes Science, 71: 718-724. Antonio Augusto Domingos Coelho e Vicente José Harder MNC (2005). Efeito do urucum ( Bixa orellana L .) na Maria Savino do Departamento de Genética/ESALQ/- alteração de característica de ovos de galinha poedeiras. 74 p. 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Ciência Rural, 37: 528-532. 342 RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avaliação do grau de conformidade da rotulagem de géneros alimentícios de origem animal face à legislação nacional e comunitária em vigor Animal food products labeling conformity evaluation concerning to National and European legislation in force Joana C. Monteiro 1*, Paulo Vaz-Pires 1,2 , Rui M. Barros 3 1ICBAS, Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar, Universidade do Porto, Largo Professor Abel Salazar, 2, 4099-003 Porto 2CIMAR, Centro de Investigação Marinha e Ambiental, Universidade do Porto, Rua dos Bragas, 289, 4050-123 Porto 3Biostrument, Lda. CIDEB-Universidade Católica Portuguesa, Rua Dr. António Bernardino de Almeida, 4200-072 Porto Resumo: Este trabalho tem como objectivo avaliar o grau de establishments, although when a sector assessment is done, conformidade da rotulagem de géneros alimentícios à venda independently of the location in which the product is bought, a para o consumidor final, face aos requisitos legais nacionais e biggest non-conformity tax (93%) is verified in egg sector. europeus. Foram elaboradas checklists baseadas nas normativas legais para três grandes grupos de alimentos de origem animal: Keywords: labeling, food safety, meat, eggs, fish products, carnes, ovos e pescado. Cada checklist foi construída tendo em traceability consideração os requisitos gerais aplicados à rotulagem de géneros alimentícios e ainda os requisitos específicos de cada sector e/ou produto. Após validação das mesmas, foram reali- zadas auditorias a 3 tipos de estabelecimentos de distribuição de Introdução géneros alimentícios ao consumidor final. Foram recolhidas aleatoriamente, nos referidos estabelecimentos, 92 amostras de Desde o início da civilização que o Homem se preo- produtos do sector das carnes, 14 amostras do sector dos ovos, e ainda 40 amostras do sector do pescado, num total de 146 pro- cupa com a qualidade e a segurança dos alimentos. Em dutos. Os resultados das auditorias mostram que 48% do total 1202, King John of England proclamou as primeiras dos géneros alimentícios avaliados apresentam não-conformi- leis britânicas relativas a géneros alimentícios, dades, sendo que 71% destas se verificaram em superfícies de "Assize of Bread", que proibia a adulteração do pão média dimensão. O sector das carnes é o que apresenta a maior (FDA, 2005). Em 1906, nos Estados Unidos da taxa de não-conformidades (69%) nas referidas superfícies; no entanto, numa avaliação por sector, independentemente do local América (EUA) é aprovado o Food and Drug Act, que de compra, verifica-se uma maior taxa de não-conformidades cria a primeira agência federal, actualmente designada (93%) no sector dos ovos. como Food and Drug Administration (FDA), com o objectivo de proteger os consumidores nacionais. Palavras-chave: rotulagem, segurança alimentar, carnes, ovos, Surgiam assim os primeiros rótulos de géneros alimen- pescado, rastreabilidade tícios, que coincidiram com o aparecimento dos Summary: The objective of the work is to evaluate and assess primeiros movimentos da protecção dos consumidores. the labeling conformity of animal food products, on sale to Em Portugal, mais recentemente, o Decreto-Lei consumers, concerning to National and European legislation in nº 560/99 vem consolidar diferentes diplomas sobre force. Checklists were made based on legislation concerning 3 requisitos aplicáveis à rotulagem dos géneros alimen- animal food product groups: meat, eggs, and fish products. Each checklist was organized considering general food legisla- tícios e definir a rotulagem como um conjunto de tion and also specific legislation to each sector and/or product. menções e indicações, incluindo imagens, símbolos e After the assessment, audits were done to 3 kinds of consumer marcas de fabrico ou comércio. O rótulo é um meio de food distribution establishments. At those establishments, 92 transmitir a informação necessária para que o consumi- meat product samples, 14 egg samples, and 40 fish product dor possa proceder à escolha adequada quanto à função, samples were randomly evaluated, in a total of 146 evaluated products. The results of these audits show that 48% of the total conservação e aplicação do produto. Desta forma, as food products evaluated do not conform and 71% of these indicações devem ser completas, esclarecedoras e non-conformities are verified in mid-dimension establishments. verdadeiras, relativamente à composição, qualidade, The meat sector is the most non-conform (69%) at those quantidade, validade, entre outras características rela- tivas à constituição do produto, ou seja, o rótulo deve apresentar um certo número de informações que a lei *Correspondência: [email protected] considera indispensáveis. Assim, e de acordo com a Tel: 918467444 Directiva 2000/13/CE e o Decreto-Lei nº 560/99, a 343 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 rotulagem, a apresentação e a publicidade dos géneros 1760/2000), produtos da pesca e da aquicultura alimentícios não podem ser susceptíveis de induzir em (Regulamento (CE) nº 2065/2001), ovos (Regulamento erro o consumidor quanto às características ou efeitos (CE) nº 2295/2003) e organismos geneticamente do alimento. De acordo com a lei geral da rotulagem, modificados (OGM) (Regulamento (CE) nº 1829/2003 não é permitida a alegação de efeitos ou propriedades e Regulamento (CE) nº 1830/2003). que o alimento não possua ou que não se encontrem devidamente comprovados, ou ainda sugerir que o género alimentício possui características especiais, Legislação alimentar quando todos os géneros alimentícios similares possuem essas mesmas características. A legislação alimentar, tal como previsto no Quanto à forma, e ainda de acordo com o Decreto- Regulamento (CE) nº 178/2002, tem como objectivo -Lei nº 560/99, a rotulagem pode figurar quer sobre a promover um elevado nível de protecção da vida e embalagem, ou até rótulo, etiqueta, cinta, gargantilha, saúde humana, a protecção dos interesses dos letreiro ou documento acompanhando ou referindo-se consumidores, fornecendo-lhes uma base que lhes ao respectivo produto. permita fazer escolhas com conhecimento de causa A informação contida no rótulo, nomeadamente em relação aos alimentos que consomem, e a livre a referente ao lote, permite que se faça o acom- circulação de géneros alimentícios na Comunidade panhamento do produto desde o produtor até ao Europeia, tendo sempre em consideração as boas consumidor. Esta função do rótulo é cada vez mais práticas no comércio dos géneros alimentícios. Desta importante quando se constata o alargamento dos forma, pretende-se prevenir fraudes, géneros alimentí- mercados mundiais dos géneros alimentícios. Com cios adulterados e quaisquer outras práticas que isto nasce um novo conceito associado ao rótulo – a possam induzir em erro o consumidor final. Rastreabilidade. No que se refere à legislação aplicável à rotulagem, cabe à Directiva 2000/13/CE o estabelecimento dos requisitos gerais, incluindo regras na apresentação e Rotulagem e rastreabilidade publicidade dos géneros alimentícios destinados ao consumidor final, a restaurantes, hospitais, cantinas e De acordo com o Regulamento (CE) nº 178/2002, outras colectividades similares. A directiva supracitada a rastreabilidade é a capacidade de detectar a origem nunca chegou a ser transposta para a legislação e seguir o rasto de um género alimentício, de um nacional. No entanto, o Decreto-Lei nº 560/99 procede animal produtor de géneros alimentícios ou de uma à consolidação e simplificação da legislação existente substância, destinados a ser incorporados em géneros sobre rotulagem. alimentícios ou com probabilidades de o ser ao Ainda no âmbito da legislação comunitária, o longo de todas as fases de produção, transformação e Regulamento (CE) nº 853/2004, apesar de não ser distribuição, incluindo a venda ao consumidor final. aplicável ao comércio retalhista, estabelece regras Assim, e de acordo com o referido diploma, a rastrea- específicas para os operadores das empresas do sector bilidade é aplicável e obrigatória para todas as alimentar aplicáveis aos géneros alimentícios de empresas da cadeia alimentar. origem animal. Assim, para além dos requisitos gerais Um sistema de rastreabilidade é implementado nas previstos no Regulamento (CE) nº 178/2002, este tipo empresas através da criação de um sistema de gestão de alimentos deve ostentar uma marca de salubridade de registos de informação aplicáveis ao género ou uma marca de identificação, reforçando uma vez alimentício, que permitam: localizar e retirar rapida- mais a ideia de que a rastreabilidade dos géneros mente do mercado esses produtos alimentares, ao alimentícios constitui um elemento essencial para longo da cadeia alimentar, sempre que estes possam garantir a segurança dos alimentos. constituir um risco para a saúde pública dos consumi- Para além dos requisitos gerais, foi criada legislação dores (Comissão das Comunidades Europeias, 2000); específica sobre rotulagem para os diferentes sectores e identificar a origem do problema, a montante, de alimentares (Tabela 2, Material e métodos). Esta modo a poder corrigi-lo e evitá-lo no futuro. situação faz com que a legislação aplicável a um A rastreabilidade é uma ferramenta de gestão de rótulo de um produto passe a estar dispersa em vários risco para ser usada na resolução de um problema de diplomas. segurança alimentar, não sendo por si só uma medida De acordo com Decreto-Lei nº 560/99, a fiscaliza- de segurança alimentar. No contexto da rotulagem, a ção do cumprimento das regras previstas competia à rastreabilidade melhora a fiabilidade dos rótulos dos Direcção-Geral de Fiscalização e Controlo da géneros alimentícios e a sua credibilidade. Qualidade Alimentar (DGFCQA) e às Direcções Actualmente existem na Comunidade Europeia e, Regionais de Agricultura (DRA). No entanto, desde consequentemente, em Portugal, sistemas específicos Janeiro de 2006 os dois organismos anteriormente de rastreabilidade para alguns produtos como por referidos foram extintos, passando esta fiscalização a exemplo: carne de bovino (Regulamento (CE) nº ser da competência da Agência de Segurança 344 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 Tabela 1 - Famílias e número de produtos avaliados dentro de Tabela 2 - Legislação Europeia e Nacional referente a rotulagem cada sector de alimentos de origem animal. dos 3 sectores de produtos de origem animal. Sector Número de produtos Sector Diploma avaliados Geral Carnes Preparados de carne 23 Regulamento (CE) nº 853/2004 Aves (excepto ratites) 21 Regulamento (CE) nº 854/2004 Produtos à base de carne 17 Carnes Bovinos 15 Geral Decreto-Lei nº 147/2006 Suínos 8 Decreto-Lei nº 251/91 Pequenos ruminantes 4 Bovino Regulamento (CE) nº 1760/2000 Lagomorfos 4 Regulamento (CE) nº 1825/2000 Pescado Congelado, ultracongelado Regulamento (CE) nº 275/2007** e descongelado 23 Decreto-Lei nº 323-F/2000 Bacalhau e espécies afins secas 10 Despacho nº 25 958-B/2000 Fresco 7 Despacho nº 10 818/2001 Ovos Classe A 14 Despacho Normativo nº 30/2000 Total 146 Carne picada e Preparados Regulamento (CE) nº 2076/2005 de carne Decreto-Lei nº 556/99 Alimentar e Económica (ASAE). O referido diploma Decreto-Lei nº 147/2006 prevê ainda a aplicação de coimas quando se verifica Produtos à base de carne Decreto-Lei nº 342/98 * a falta, inexactidão ou deficiência das indicações Aves Regulamento (CEE) nº 1906/90 obrigatórias, a existência de indicações não permitidas Regulamento (CEE) nº 1538/91 ou susceptíveis de induzirem em erro o consumidor, Suínos Decreto-Lei nº 71/98 assim como a comercialização de géneros alimentícios Despacho Normativo nº 30/2000 com a data limite de consumo ultrapassada ou sem Pequenos ruminantes Sem legislação específica rotulagem em português (no caso dos pré-embalados). Lagomorfos Sem legislação específica A coima pode ter um montante mínimo de 100 € até Ovos o máximo de 44 892 € . Classe A Regulamento (CEE) nº 1907/90 Neste trabalho pretendeu-se compilar os requisitos Regulamento (CE) nº 2295/93 legais aplicáveis à rotulagem de três sectores de pro- Despacho Normativo nº 30/2000 dutos de origem animal, e avaliar o grau de conformi- Pescado dade dos mesmos. Geral Decreto-Lei nº 375/98* Fresco Regulamento (CE) nº 104/2000 Congelado, ultracongelado Decreto-Lei 37/2004 Material e métodos e descongelado Decreto-Lei nº 251/91 Bacalhau e espécies afins secas Decreto-Lei nº 25/2005 Para a realização deste trabalho foi feita a selecção *Revogado pelo Decreto-Lei nº 111/2006. de uma grande superfície pertencente a uma cadeia **Foi publicado e entrou em vigor após a pesquisa exaustiva feita com representação em todo o território nacional; uma para a realização deste trabalho. superfície de dimensão média, também pertencente a Após recolha, os produtos foram avaliados e classi- uma cadeia de supermercados com representação a ficados em conformes, quando apresentavam o rótulo nível nacional; e de uma outra média superfície de acordo com os requisitos previstos na legislação, e pertencente a uma rede de supermercados com repre- em não conformes, quando não constavam uma ou sentação a nível local. As superfícies encontravam-se mais menções previstas e obrigatórias. localizadas nas regiões do Douro Litoral e Minho. Estes dados foram tratados estatisticamente, uti- Neste trabalho foram avaliados 146 géneros alimen- lizando o programa SPSS ®, sendo que para cada tipo tícios de origem animal seleccionados aleatoriamente. de superfície (grande e média dimensão), os produtos Na Tabela 1, estão discriminados para cada sector os foram divididos tendo em consideração o sector diferentes tipos de produtos avaliados. Para a avalia- (carne, pescado e ovos) e o estado de conservação ção do grau de conformidade da rotulagem foram (refrigerado, congelado/ultracongelado e outros). elaboradas checklists onde constam as menções obrigatórias e facultativas aplicáveis à rotulagem das referidas famílias de produtos, bem como os requisitos Resultados gerais e específicos, aplicáveis na venda de géneros alimentícios ao consumidor final. Estas checklists No presente estudo foi avaliado o grau de não-con- foram elaboradas tendo como base as normativas formidade de 146 produtos de origem animal (carne, legais nacionais e comunitárias em vigor até Fevereiro pescado e ovos), disponíveis ao consumidor tendo em de 2007 (ver Tabela 2). consideração dois tipos de local de venda (grande e 345 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 média superfície). A Tabela 3 mostra que do total de Decreto-Lei nº 560/99, respectivamente), ausência produtos avaliados, cerca de 48% apresentaram não- das menções "Não volte a congelar" e "Sem pele" em -conformidades, dos quais mais de 71% (50 produtos) pedaços de carcaça sem pele (art.º 7, Regulamento correspondem a não-conformidades verificadas em (CE) nº 251/91, art.º 1, Regulamento (CE) nº 1538/91, superfícies de média dimensão. Neste tipo de superfície, respectivamente), e por último sem o símbolo do o sector onde se registou maior número de não-con- Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e formidades foi o sector das carnes, correspondendo a das Pescas (MADRP) quando existem referências ao uma taxa de 69% (24 produtos). Contudo, e quando modo de produção das galinhas (Despacho Normativo se avalia a taxa de não-conformidades por sector nº 30/2000). No caso de carne proveniente de lagomor- (independentemente do local de compra), verifica-se fos, nomeadamente em produtos não pré-embalados, que o sector das carnes apresenta uma menor taxa de foi identificada a ausência da data de acondiciona- não-conformidade (aprox. 38%), quando comparada mento prevista no art.º 15 do Decreto-Lei nº 147/206. com a do pescado (55%) e a dos ovos (93%). Nos preparados de carne, foram registadas várias não- No sector das carnes (ver Tabela 4), as famílias de -conformidades, nomeadamente a ausência de: data produtos onde se regista a maior taxa de não-con- limite de consumo e/ou de acondicionamento (art.º 15, formidades foi a dos produtos de aves (aprox. 62%), Decreto-Lei nº 147/206); lista de ingredientes (art.º coelhos (50%) e preparados de carne (aprox. 48%). 14, Decreto-Lei nº 560/99); percentagem de cada No caso da carne de aves foram identificadas diversas espécie, no caso de mistura de carnes picadas (Cap. não-conformidades, das quais se salientam a ausência IV, Decreto-Lei nº 556/99), e ainda ausência de marca da identificação da categoria do produto (A ou B) e de salubridade prevista no art.º 5 do Regulamento sem indicação do estado de conservação de comer- (CE) nº 853/2004. No caso da carne de bovino, cialização das carcaças (art.º 3, e art.º 5, ponto 4 do registou-se uma taxa de não-conformidade de 40% Regulamento (CE) nº 1906/90, respectivamente), (Tabela 4), devido essencialmente a: ausência de indi- ausência da indicação da quantidade líquida e das cação do local de cria e engorda; número de aprovação menções obrigatórias em português (art.º 3 e 24 do do matadouro; da indicação do local de desmancha e Tabela 3 - Avaliação dos produtos tendo em consideração o sector e o local de venda (os números a negrito encontram-se mencionados no texto). Avaliação Sector Superfície Não conforme Conforme N % Por local % Sector N % Por local % Sector Grande 11 30,6 31,4 25 69,4 43,9 Carnes Média 24 42,9 68,6 32 57,1 56,1 Total 35 38,0 100,0 57 62,0 100,0 Grande 3 23,1 13,6 10 76,9 55,6 Pescado Média 19 70,4 86,4 8 29,6 44,4 Total 22 55,0 100,0 18 45,0 100,0 Grande 6 85,7 46,2 1 14,3 100,0 Ovos Média 7 100,0 53,8 0 0,0 0,0 Total 13 92,9 100,0 1 7,1 100,0 Grande 20 35,7 28,6 36 64,3 47,4 Total Média 50 55,6 71,4 40 44,4 52,6 TOTAL 70 47,9 100,0 76 52,1 100,0 Tabela 4 - Avaliação do sector das carnes por famílias de produtos. Avaliação Carne Não conforme Conforme N % Tipo de carne N % Tipo de carne Aves 13 61,9 8 38,1 Bovino 6 40,0 9 60,0 Suíno 0 0,0 8 100,0 Coelhos 2 50,0 2 50,0 Preparados de carne 11 47,8 12 52,2 Produtos à base de carne 3 17,6 14 82,4 Pequenos ruminantes 0 0,0 4 100,0 346 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 respectivo número de aprovação do estabelecimento; Por último, e no caso dos ovos, verificaram-se 3 menções obrigatórias em português (art.º 24, Decreto- tipos de não-conformidade, nomeadamente a falta na Lei nº 560/99), e ainda o facto de existirem produtos embalagem do símbolo do MADRP (quando existe nos quais é feita a referência à origem, quando as referência ao modo de criação das galinhas) e indi- informações não coincidiam com a aplicação dessa cação do modo de conservação; e, no ovo, a ausência referência, nomeadamente a indicação do local do da categoria de qualidade (Despacho Normativo nº nascimento, cria e engorda, e abate (art.º 3, Cap. I do 30/2000; Cap. III, secção I, Regulamento (CE) nº Decreto-Lei nº 323-F/2000). Nos caso dos produtos à 2295/2003). base de carne as principais não-conformidades Neste estudo pretendeu-se avaliar o grau de registadas foram a ausência de: referência às conformidade face ao estado de conservação e de condições especiais de conservação e utilização, consequente venda dos produtos alimentares. Foram referência à quantidade líquida, e lista de ingredientes classificados os produtos refrigerados, ultracongela- (art.º 3, 7º e 14º do Decreto-Lei nº 560/99, respectiva- dos/congelados e outros estados. Quando comparamos mente), menção "Não volte a congelar" (art.º 7, o sector das carnes e do pescado, verifica-se que não Decreto-Lei nº 251/91), e omissão da marca de salu- há diferenças significativas entre o número de não bridade (art.º 5, Regulamento (CE) nº 853/2004). Será conformidades para produtos refrigerados e ultracon- importante salientar que as carnes de suíno e de gelados. Contudo, é de salientar que todos os produtos pequenos ruminantes não apresentaram quaisquer refrigerados do sector do pescado se apresentaram não-conformidades. não-conformes (Tabela 5). No caso do sector do pescado foram avaliadas as não-conformidades agrupando-se os produtos quanto ao seu estado de conservação (congelados/ultraconge- Discussão lados, refrigerados e outros). Para o grupo de produtos congelados/ultracongelados, as principais não-confor- A rotulagem dos géneros alimentícios deve ser vista midades registadas foram a ausência de: marca de como um requisito fundamental para a garantia da identificação (Cap. X do Decreto-Lei nº 375/98); livre concorrência mas, ao mesmo tempo, como um condições especiais de conservação, menções obriga- veículo informativo e vinculativo entre produtor, tórias em português, e indicação do lote precedido distribuidor e consumidor. Pertence ao passado o pela letra "L" (art.º 3, 24 e 25 do Decreto-Lei nº tempo em que o mercado dos alimentos era realizado 560/99, respectivamente); método de produção (Cap. de forma próxima e directa, onde existia um compro- 2, art.º 4 do Regulamento (CE) nº 104/2000), e ainda misso entre produtor e consumidor. Os rótulos eram "não volte a congelar após descongelação" (art.º 6, usados como "armas" publicitárias, explorando-se o Decreto-Lei nº 37/2004). No pescado refrigerado potencial artístico dos mesmos, mas hoje, os rótulos verificou-se a ausência do nome científico e a zona de são vistos como formas de responsabilização do acto captura (Cap. 2, art.º 4, Regulamento (CE) nº da compra, nomeadamente assegurar a saúde humana. 104/2000). No agrupamento outros, onde se inclui o Face à mudança de comportamentos sociais e bacalhau e espécies afins secas, registou-se a ausência tecnológicos, houve a necessidade de criar regras para da denominação comercial do bacalhau e categoria de proteger os consumidores. qualidade (art.º 4, 7 do Decreto-Lei nº 25/2005, Na alimentação, como em outras áreas, as respectivamente), e identificação relativa ao acondi- sociedades organizam-se estabelecendo uma dinâmica cionador ou vendedor na União Europeia (art.º 3, própria à regulamentação e normativas, adequando as Decreto-Lei nº 560/99). mesmas ao conhecimento científico e à evolução das Tabela 5 - Avaliação dos produtos dos três sectores, tendo em conta o estado de conservação em que se encontram na venda ao consumidor final. Avaliação Sector Estado de Conservação Não Conforme Conforme N % Por estado % Por sector N % Por estado % Por sector Refrigerado 25 39,1 71,4 39 60,9 68,4 Carnes Ultracongelado/congelado 10 47,6 28,6 11 52,4 19,3 Outros estados 0 0,0 0,0 7 100,0 12,3 Refrigerado 7 100,0 31,8 0 0,0 0,0 Pescado Ultracongelado/congelado 11 47,8 50,0 12 52,2 66,7 Outros estados 4 40,0 18,2 6 60,0 33,3 Refrigerado 32 45,1 56,1 39 54,9 52,0 TOTAL Ultracongelado/congelado 21 47,7 36,8 23 52,3 30,7 Outros estados 4 23,5 7,0 13 76,5 17,3 347 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 exigências dos mercados. Assim, com mais ou menos carne de bovino ou para os ovos. A ausência de um mudanças, assistimos à sucessão de diplomas que sistema de rastreabilidade eficaz também se verifica revogam ou alteram parcialmente outros anterior- para a carne de lagomorfos e de pequenos ruminantes. mente publicados, numa tentativa de se adaptarem à Contudo, neste caso a situação pode ser considerada realidade em frequente mudança. ainda mais preocupante face à ausência de legislação Contudo, este esforço nem sempre é bem conseguido, específica, nacional e comunitária, para estes dois como é o caso da legislação aplicável à rotulagem dos grupos de produtos. Deste modo, a única legislação géneros alimentícios. Com a realização deste trabalho, aplicável a estes casos é a legislação geral da e nomeadamente nos sectores abordados, foi possível rotulagem de géneros alimentícios prevista pelo já verificar que a legislação apresenta graves lacunas e supracitado Decreto-Lei nº 560/99. contradições, tornando-a ambígua e por vezes de difícil O aparecimento de legislação que crie sistemas de interpretação. Por outro lado a dispersão da mesma faz rotulagem e rastreabilidade específicos para todos os com que a aplicação dos requisitos impostos seja de produtos do sector alimentar (sem excepção), é uma mais difícil execução e leve a erros de interpretação situação urgente e emergente, na medida em que está por parte dos diferentes operadores. No entender dos em causa a saúde e protecção dos consumidores. autores, tal situação poderia ser minimizada caso se Desta forma, é necessário que, enquanto permanecem procedesse à consolidação de alguns diplomas. essas tais lacunas da legislação, os géneros alimentí- Salientamos, por exemplo, o facto de Portugal não cios sejam rotulados de acordo com os diplomas ter ainda transposto para o direito nacional a Directiva em vigor e que a fiscalização seja também mais 2000/13/CE, de 20 de Março de 2000, apesar do eficiente, de forma a garantir a protecção e saúde dos Decreto-Lei nº 560/99, de 18 de Dezembro de 1999, consumidores. prever na sua maior parte o descrito nessa mesma directiva. A taxa considerável de não-conformidades detectada Agradecimentos neste estudo poderá ser explicada na maior parte dos casos pelas razões supracitadas e não por uma tentativa de fraude ou de lesar os consumidores. No Agradeço aos responsáveis das três unidades de sector das carnes, uma das não-conformidades mais venda a retalho (não identificados por razões de frequentes é a ausência de data limite de consumo, sigilo) o acesso aos estabelecimentos para a realização prevista no art.º 15 do Decreto-Lei nº 147/2006, em do trabalho. carnes frescas e preparados de carne cortados e Gostaria de agradecer ao Doutor Paulo Vaz-Pires, ao embalados (não pré-embalados) nos locais de venda Doutor Paulo Martins da Costa, e à Dr. Eduarda Neves de carne, e vendidos refrigerados. No entanto, o art.º 4 por todo o apoio e disponibilidade prestada ao longo do Decreto-Lei nº 560/99 prevê que, em géneros do decurso deste trabalho. Gostaria ainda de agradecer alimentícios não pré-embalados, não seja obrigatória a ao Doutor Rui Barros e à Biostrument, Lda, pela aposição da data limite de consumo. Neste exemplo é orientação e acolhimento durante a realização do notória a contradição entre a legislação específica, trabalho, nomeadamente no tratamento dos dados. aplicável à venda de carnes e seus produtos, e a geral Agradeço ainda o apoio incondicional prestado pela para géneros alimentícios, sendo evidente que deverão Liliana Sanches. ser as normativas da legislação específica a prevalecer. Contudo, o facto do referido diploma só ter entrado em vigor a 1 de Agosto de 2006, pode ajudar a Bibliografia explicar a ausência ou deficiente aplicação da referida normativa por parte de algumas empresas do sector Comissão das Comunidades Europeias (2000). Princípios de alimentar. Segurança dos Alimentos. Livro Branco sobre a Outra deficiência na legislação verifica-se ao nível Segurança dos Alimentos . Livro Branco da Comissão, da rotulagem da carne de suíno prevista no Decreto- COM (1999) Bruxelas, 12.01.2000. 10-11 -Lei nº 71/98. Este diploma cria um sistema voluntário Decreto-Lei nº 251/91 de 16 de Julho. Diário da República de rotulagem da carne de suíno, ao qual podem aderir nº 161 série I-A . Ministério da Agricultura Pescas e os operadores do sector alimentar que pretendam Alimentação. Lisboa. rotular esses produtos, garantindo desta forma a Decreto-Lei nº 71/98 de 26 de Março. Diário da República qualidade e informação adequada do produto ao nº 72 – Série I-A . Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. consumidor. Porém, na realidade verificou-se que este Decreto-Lei nº 342/98 de 5 de Novembro. Diário da "sistema voluntário" praticamente não teve adesão por República n.º 256 – Série I-A . Ministério da Agricultura, parte dos operadores, o que, associado ao facto de do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. não existir nenhum sistema de rotulagem específico, Decreto-Lei nº 375/98, de 24 de Novembro. Diário da resulta na ausência de um sistema de rastreabilidade República nº 272 – Série I-A . Ministério da Agricultura, aplicável a este tipo de carne, como já acontece para a do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. 348 Monteiro JC et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 343-349 Decreto-Lei nº 556/99 de 16 de Dezembro de 1999. Diário Regulamento (CEE) nº 1906/90 do Conselho de 26 de Junho da República nº 291 – Série I-A . Ministério da de 1990. Jornal Oficial nº L 173 . Comunidade Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Económica Europeia. Bruxelas. Lisboa. Regulamento (CEE) nº 1907/90 do Conselho de 26 de Junho Decreto-Lei nº 560/99 de 18 de Dezembro. Diário da de 1990. Jornal Oficial nº L 173 . Comunidade República nº 239/99 – Série I-A . Ministério da Económica Europeia. Bruxelas. Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Regulamento (CEE) nº 1538/91 da Comissão de 5 de Junho Lisboa. de 1991. Jornal Oficial nº L 143 . Comunidade Decreto-Lei nº 323-F/2000 de 20 de Dezembro. Diário da Económica Europeia. Bruxelas. República nº292 – I série A . Ministério da Agricultura, Regulamento (CE) nº 2295/93 da Comissão de 23 de do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. Dezembro. Jornal Oficial nº L 340 . Comunidade Decreto-Lei nº 37/2004 de 26 de Fevereiro. Diário da Europeia. Bruxelas. República nº 48 – Série I-A . Ministério da Agricultura, Regulamento (CE) nº 104/2000 do Conselho de 17 de do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. Dezembro de 1999. Jornal Oficial nº L 017 . Decreto-Lei nº 25/2005 de 28 de Janeiro. Diário da Comunidade Europeia. Bruxelas. República nº 20 – Série I-A . Ministério da Agricultura, Regulamento (CE) nº 1760/2000 do Parlamento Europeu e Pescas e Florestas. Lisboa. do Conselho de 17 de Julho de 2000. Jornal Oficial nº L Decreto-Lei nº 111/2006 de 9 de Junho. Diário da 204 . Comunidade Europeia. Bruxelas. República nº 112 – Série I-A . Ministério da Agricultura, Regulamento (CE) nº 2065/2001 da Comissão de 22 de do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. Outubro de 2001. Jornal Oficial nº L 278 . Comunidade Decreto-Lei nº 147/2006 de 31 de Julho. Diário da Europeia. Bruxelas. República nº 146 – Série I . Ministério da Agricultura, do Regulamento (CE) nº 1825/2000 da Comissão de 25 de Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. Agosto de 2000. Jornal Oficial nº L 216 . Comunidade Despacho nº 25 958-B/2000 de 20 de Dezembro. Diário da Europeia. Bruxelas. República nº 292 – Série II . Ministério da Agricultura, Regulamento (CE) nº 178/2002 do Parlamento Europeu e do do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Lisboa. Conselho de 28 de Janeiro de 2002. Jornal Oficial da Despacho Normativo nº 30/2000 de 6 de Julho. Diário da União Europeia nº L 31 . Comunidade Europeia. República nº154 – Série I - B. Ministério da Bruxelas. Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Regulamento (CE) nº 1829/2003 do Parlamento Europeu e Lisboa. do Conselho de 22 de Setembro de 2003. Jornal Oficial Despacho Normativo nº 10 818/2001 de 23 de Maio. Diário da União Europeia nº L 268 . Comunidade Europeia. da República nº 154 – Série II . Ministério da Bruxelas. Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas. Regulamento (CE) nº 1830/2003 do Parlamento Europeu e Lisboa. do Conselho de 22 de Setembro de 2003. Jornal Oficial Directiva 2000/13/CE do Parlamento Europeu e do da União Europeia nº L 268 . Comunidade Europeia. Concelho de 20 de Março de 2000. Jornal Oficial da Bruxelas. União Europeia nº L 109 . Comunidade Europeia. Regulamento (CE) nº 853/2004 do Parlamento Europeu e do Bruxelas. Conselho de 29 de Abril de 2004. Jornal Oficial da FDA _ Food and Drug Administration (2005). Milestones in União Europeia nº L 226 . Comunidade Europeia . U.S. Food and Drug Administration . Acedido em 13 de Bruxelas. Março de 2007 em: Regulamento (CE) nº 854/2004 do Parlamento Europeu e do http://www.fda.gov/opa com/backgrounders/miles.html Conselho de 29 de Abril de 2004. Jornal Oficial nº L Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das 139 . Comunidade Europeia. Bruxelas. Pescas. (2006). Rastreabilidade – Instrumento da gestão Regulamento (CE) nº 2076/2005 da Comissão de 5 de de risco . MADRP. Lisboa. Acedido a 26 de Março de Dezembro de 2005. Jornal Oficial nº L 338 . 2007 em: Comunidade Europeia. Bruxelas. www.minagricultura.pt/oportal/extcnt/docs Regulamento (CE) nº 275/2007 da Comissão de 15 de /FOLDER/PROT_TEMAS/F_ALIMENTACAO Março de 2007. Jornal Oficial nº L 76 . Comunidade /DOCS_DGV/RASTREABILIDADE.HTM Europeia. Bruxelas. 349 COMUNICAÇÃO BREVE REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Avaliação comparativa entre o glicosímetro portátil e o método laboratorial enzimático-colorimétrico segundo Trinder na dosagem glicêmica em cães Comparative evaluation between the portable glucometer and Trinders´s enzymatic-colorimetric method to dose the glycemic values in dogs Grazielle Anahy de Sousa Aleixo 1*, Maria Cristina de O. Cardoso Coelho 1, Ana Luiza Neves Guimarães 1, Moacir Bezerra Andrade 1, José Antônio Aleixo da Silva 2 1Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE, Brasil 2Departamento de Engenharia Florestal da UFRPE, Brasil Resumo: O glicosímetro é um aparelho portátil empregado para the canine specie assisted at the Veterinary Hospital of the Rural mensurar a concentração de glicose no sangue, que vem sendo Federal University of Pernambuco (UFRPE) were collected. In utilizado na medicina humana desde a década de 1970. Pelo spite of the results obtained with the glucometer being different fato desse equipamento ser de baixo custo e ainda oferecer from the laboratorial method, it was concluded that the glucose resultados em poucos segundos com pequenas amostras de measurement in dogs using this equipment can be considered sangue, ele tem sido utilizado por alguns médicos veterinários efficient, with capillary such as with venous blood, because the para dosar a glicemia em cães. O intuito deste trabalho foi de differences are inside the margin established by the regulators mensurar a concentração de glicose em cães no glicosímetro entities of the area. portátil Accu-Chek ® Advantage com amostras de sangue capilar e venoso, e comparar seus resultados com aqueles alcançados Keywords: Accuracy, glucose biosensor, glycemia, glycemic com o método enzimático-colorimétrico segundo Trinder value. realizado em laboratório, tendo em vista que a segunda técnica é considerada padrão. Foram coletadas amostras de sangue de 36 animais da espécie canina atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE). A glicose é a principal fonte de energia utilizada Apesar dos resultados obtidos com o glicosímetro terem sido pelo sistema nervoso central e um açúcar essencial diferentes do método laboratorial, concluiu-se que a dosagem para o funcionamento de outros órgãos vitais como o de glicose em cães utilizando esse equipamento, tanto com sangue capilar quanto venoso, pode ser considerada eficaz, pois coração, rins e fígado (Nelson, 1997). Em condições as diferenças estão dentro da margem estabelecida pelos órgãos fisiológicas, o organismo consegue manter a quanti- reguladores da área. dade de glicose no sangue em nível suficiente para seu adequado funcionamento (Pica et al ., 2003). Palavras-chave: Acurácia, biosensor de glicose, glicemia, valor Os valores de glicose fora do padrão, principal- glicêmico. mente em processos crônicos, trazem conseqüências Summary: The glucometer is a portable equipment employed negativas como degeneração progressiva e falência de to measure the glucose concentration in blood that has been órgãos importantes (Pica et al ., 2003). A melhor used in human medicine since the decade of 1970. The fact that maneira de reduzir as complicações associadas às the equipment has a low cost and still offer results in few seconds alterações na glicemia é tentando manter seu nível em with small samples of blood, has made some veterinarian doctors use it to dose the glycemia in dogs. The intention of this concentrações normais (Bush, 2004), e para isso se faz work was to measure the glucose concentration in dogs with the necessário realizar medições da sua quantidade (Pica portable glucometer Accu-Chek ® Advantage with samples of et al ., 2003). capillary and venous blood, and to compare their results with Muitos médicos mensuram os níveis de glicose those reached with the enzymatic-colorimetric method accord- sangüínea com glicosímetros aprovados para uso ing to Trinder, accomplished at a laboratory, since the second technique is considered pattern. Blood samples of 36 animals of doméstico, ao invés de utilizar os métodos laboratoriais que são mais caros e demoram mais tempo para serem realizados (Goldstein et al ., 2004). No ano de 1983, a Associação Americana de Diabetes (American Diabetes Association – ADA), *Correspondência: [email protected] Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos, recomendou que o erro total da medição da glicemia CEP: 52.171-900, Recife/PE, Brasil obtida nesse aparelho não deveria ser superior a 10% Tel: + 55 81 3320-6417 do valor conseguido pelo método padrão (Johnson e 351 Sousa Aleixo GA et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 351-354 Baker, 2001; Pica et al ., 2003; Briggs e Cornell, -se 10 µl da amostra de plasma contida no tubo de 2004). Já a Organização Internacional para eppendorf com uma pipeta de precisão e a mesma era Padronização (International Organization for adicionada a um mL do reativo de trabalho c em um Standardization – ISO) recomendou que 95% das tubo de ensaio. O preparado era incubado em banho- mensurações deveriam estar entre ± 20% dos valores -maria a 37 ºC por dez minutos. Decorrido o tempo de referência para concentrações de glicose > 100 necessário, retirava-se a amostra do banho-maria e a mg/dl e entre ± 20 mg/dl para valores de glicose < 100 coloração desenvolvida era lida em espectrofotômetro mg/dl (Dai et al ., 2004), enquanto que a Food and a 505 nm no sistema de bioquímica semi-automático Drug Administration (FDA) requer que todos os modelo SB-190 d. glicosímetros tenham uma taxa de erro < 20% nas Para dosar a glicemia dos pacientes no glicosímetro concentrações de glicose sangüínea entre 30 a 400 portátil a foram coletadas amostras de sangue capilar mg/dl (Briggs e Cornell, 2004). através de uma punção na face medial da orelha externa A maioria dos biosensores de glicose sangüínea produzida por uma agulha hipodérmica descartável e. foram desenvolvidos para amostras de sangue capilar Previamente à punção, realizava-se a tricotomia da (Funk et al ., 2001; Casella, 2003; Kerr, 2003; Kumar área e em seguida, aplicava-se álcool a 70% f com o et al ., 2004; Boyd et al ., 2005; Newman e Turner, intuito de promover a anti-sepsia do local. 2005). Assim como em humanos, amostras desse tipo A tira teste g era inserida no equipamento a e ao de sangue podem ser coletadas na orelha dos animais aparecer um símbolo de gota de sangue piscando no (Maele et al ., 2005). A primeira referência de um monitor, aplicava-se a amostra na tira teste em um trabalho no qual foi coletado sangue capilar da orelha prazo de 15 segundos. Após 26 segundos, o monitor de cães para dosar a glicemia com um glicosímetro fornecia a quantidade de glicose sangüínea em mg/dL. portátil é de Wess e Reusch (2000b). Por causa da Uma gota de sangue venoso anteriormente colhido dificuldade em se obter uma amostra capilar em para realização do teste laboratorial, também foi alguns cães, ou para minimizar a dor do paciente ao submetida a medição no glicosímetro. Depois da ser submetido à uma punção na orelha, alguns veteri- amostra de três mL ser depositada no tubo de ensaio, nários tem optado por usar sangue venoso proveniente mantinha-se aproximadamente 0,2 mL na seringa. de veno-punções eletivas para realizar outros testes Pressionava-se o êmbolo da seringa para gerar uma laboratoriais (Cohn et al ., 2000; Kumar et al ., 2004). gota de sangue que era aplicada na tira teste, previa- Nos últimos anos muitos glicosímetros portáteis de mente acoplada ao glicosímetro portátil. Os próximos vários fabricantes têm sido lançados no mercado. As passos se procederam da mesma forma que descrito melhorias anunciadas incluem maior precisão, mensu- com a amostra de sangue capilar. rações mais rápidas, diminuição na quantidade de Para o cálculo da suficiência amostral, ao nível de volume sangüíneo requerido e redução na necessidade 5% de probabilidade com um erro estipulado (E) de de um técnico para realizar o teste (Wess e Reusch 5%, utilizou-se um processo de amostragem inteira- 2000a). mente aleatória, conforme descrito por Meunier et al . Esta pesquisa teve como objetivo mensurar a con- (2001). Com o intuito de comparar as médias con- centração de glicose em amostras de sangue capilar e seguidas em cada tratamento, utilizou-se o teste de venoso de cães no glicosímetro portátil Accu-Chek ® Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Todas as Advantage a, e correlacionar seus resultados com análises estatísticas foram realizadas pelo programa aqueles alcançados com o método laboratorial SYSTAT 10 Versão Demo. enzimático-colorimétrico segundo Trinder. Os resultados de glicemia alcançados com o gli- Para execução da pesquisa, foi determinada a cosímetro variaram entre 55 a 93 mg/dL utilizando dosagem de glicose no sangue de 36 cães atendidos no amostras de sangue capilar, e 50 a 92 mg/dL com Hospital Veterinário da UFRPE. sangue venoso, enquanto que empregando o método A glicemia foi mensurada de três formas. No laboratorial, os valores conseguidos estavam entre primeiro método, o laboratorial enzimático-colo- 62 e 106 mg/dL. Os resultados para as estatísticas rimétrico (que serviu como método de referência), descritivas estão na Tabela 1. foram colhidas amostras de três mL de sangue venoso Observa-se que para os três métodos a suficiência por punção da veia cefálica ou safena. A amostra era amostral foi atingida, já que o número de amostras acondicionada em um tubo de ensaio contendo uma utilizadas para o estudo foi de 36, e também que os gota de ácido etileno diamino tetra acético (EDTA) erros de amostragem foram todos inferiores a 5%. com fluoreto de sódio b e em seguida centrifugada por Procedeu-se então à análise da variância, onde, 15 minutos a 2500 rotações por minuto, para percebe-se que existe uma diferença estatística signi- obtenção do plasma. ficativa entre os três métodos de mensuração da O plasma foi coletado com uma pipeta de precisão, glicemia. Com o intuito de analisar mais detalhada- sendo então colocado em um tubo de eppendorf e mente as diferenças que ocorreram, empregou-se o mantido sob refrigeração na geladeira a uma tempera- teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade, tura de 4 ºC até a hora da realização do teste. Coletava- encontrando os resultados descritos na Tabela 2. 352 Sousa Aleixo GA et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 351-354 Tabela 1 - Média do método considerado para todos os animais, Coeficiente de variação em porcentagem para todos os animais (CV %), Número de amostras representativo da população (NAR) e Erro de amostragem (EA %) para as variáveis consideradas. GSC (mg/dL) GSV (mg/dL) ENZ-COL (mg/dL) – 76,06 72,28 82,58 CV % 9,40 10,20 10,20 NAR 15 17 17 EA % 3,14 3,40 3,39 Em que: GSC = Glicosímetro com sangue capilar; GSV = Glicosímetro com sangue venoso; ENZ-COL = Método enzimático-colorimétrico segundo Trinder. Tabela 2 - Teste de Tukey para os métodos enzimático-colorimétrico segundo Trinder, glicosímetro com sangue capilar e glicosímetro com sangue venoso. Métodos de análise sanguínea Médias dos tratamentos Enzimático-colorimétrico 82,58 a Glicosímetro / sangue capilar 76,06 b Glicosímetro / sangue venoso 72,28 b Os resultados indicam que não houve grande (1999) citam que quando o organismo é submetido a variação entre os resultados obtidos no glicosímetro alguma situação de estresse, o sistema nervoso com amostras de sangue capilar ou venoso, corrobo- simpático libera catecolaminas que resultam na rando com uma pesquisa realizada por Wess e Reusch ativação da glicogenólise e, conseqüentemente, (2000a) onde foi demonstrado que existia relação levam a um quadro de hiperglicemia transitória. entre as concentrações de glicose nesses dois tipos de Os resultados obtidos no presente trabalho indicam amostras. Kumar et al . (2004) descrevem que tanto o que a dosagem de glicose em sangue de cães utilizando método que utiliza sangue capilar, quanto venoso, o glicosímetro portátil a pode ser considerada eficaz, permite uma rápida estimativa da glicemia no visto que os resultados alcançados com esse equipa- glicosímetro portátil, funcionando como referência mento estão dentro da margem estabelecida por até que os resultados laboratoriais possam ser órgãos reguladores. Também foi constatado que o conseguidos para direcionar as decisões clínicas a sangue venoso pode ser empregado com esta finali- serem tomadas. dade, mesmo o equipamento sendo preferencialmente Ao comparar os diferentes métodos (glicosímetro e destinado para sangue capilar, mas como a amostra laboratorial), ficou constatado que estatisticamente capilar é aquela que mais se aproxima do valor obtido existe diferença significativa entre eles. Calculando as com o método laboratorial padrão, ela deve ser a relações entre o glicosímetro portátil com amostra de primeira opção de escolha. sangue capilar e venoso com o método enzimático- -colorimétrico, as variações foram de 7,90% e 12,47%, respectivamente. Entretanto, esta margem a) Glicosímetro portátil Accu-Chek ® Advantage - Roche pode ser considerada clinicamente aceitável visto que Diagnóstica Brasil Ltda. - São Paulo/SP b) EDTA com fluoreto de sódio - GLISTAB ® - Labtest - Lagoa a FDA requer que todos os glicosímetros tenham uma Santa/MG taxa de erro < 20% na concentração de glicose c) Kit de Glicose SL - CELM - Barueri/SP sangüínea para valores entre 30 a 400 mg/dL (Briggs d) Sistema de bioquímica semi-automático modelo SB 190 - e Cornell, 2004). CELM - Barueri/SP De acordo com Kumar et al . (2004) o uso de sangue e) Agulha hipodérmica descartável - Plascalp - Feira de Santana/BA capilar no glicosímetro é aquele que mais se aproxima f) Álcool a 70% - Miyako do Brasil Ind. Com. Ltda - dos resultados laboratoriais, assim como foi observa- Guarulhos/SP do no presente experimento, entretanto Cohn et al . g) Tiras de teste Accu-Chek ® Advantage II - Roche Diagnóstica (2000) citam que ao realizar essa mensuração em cães, Brasil Ltda. - São Paulo/SP alguns veterinários têm optado por utilizar sangue venoso, dada a dificuldade em conseguir amostras capilares em determinadas situações. Outro momento em que o uso do sangue venoso pode ser mais Bibliografia recomendado é quando um paciente for ser submetido a uma veno-punção para coletar sangue com o intuito Boyd R, Leigh B e Stuart P (2005). Capillary versus venous de realizar outros exames de rotina, porque assim o blood glucose estimations. Emerg Med J, 22: 177-179. animal não precisará receber punções adicionais, Briggs AL e Cornell S (2004). Self-monitoring blood evitando desta maneira, um procedimento que pode glucose (SMBG): now and the future. J Phar Prac, 17: ser estressante e doloroso. Migliorini e Kettelhut 29-38. 353 Sousa Aleixo GA et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 351-354 Bush BM (2004). Nutrientes e Metabólitos. In:Interpretação Kumar G, Leong B e Kumar S (2004). Correlation of de Resultados Laboratoriais para Clínicos de Pequenos capillary and venous blood glucometry with laboratory Animais. Editora Roca (São Paulo), 167-223. determination. Prehos Emerg Care, 8: 378-383. Casella M (2003). Home monitoring of blood glucose by Maele IV, Rogier N e Daminet S (2005). Retrospective study owners of diabetic cats and dogs: tecnical problems and of owner’s perception on home monitoring of blood glu- evaluation of differences between home and hospital cose in diabetics dogs and cats. Can Vet J, 46: 718-723. blood glucose curves. 44 p. Tese (Doutorado em Meunier IMJ, Silva JAA e Ferreira RLC (2001). Inventário Medicina Veterinária) – Universidade de Zurique. florestal. Programa de estudo. Imprensa Universitária – Cohn LA, Mccaw DL, Tate DJ e Johnson JC (2000). UFRPE (Recife). Assessment of five portable blood glucose meters, a Migliorini RH e Kettelhut IC (1999). O pâncreas endócrino. point-of-care analyzer, and color test strips for measuring In: Fisiologia. 2. ed. Editora: Guanabara Koogan (Rio de blood glucose concentration in dogs. J Am Vet Med Janeiro), 842-854. Assoc, 216: 198-202. Nelson RW (1997). Diabete melito. In: Tratado de Medicina Dai K, Tai D, Ho P, Chen C, Peng W, Chen S, Hsu C, Liu Y, Veterinária. II vol. Editora Manoli (São Paulo), 2085- Hsieh H, Yang C, Tsai M e Mao SJT (2004). Accuracy 2122. of the easy touch blood glucose self-monitoring system: Newman JD e Turner APF (2005). Home blood glucose a study of 516 cases. Clin Chim Acta, 349: 135-141. biosensors: a comercial perspective. Biosens Bioelectron, Funk DL, Chan L, Lutz N e Verdile VP (2001). Comparison 20: 2435-2453. of capillary and venous glucose measurements in Pica CQ, Menezes JR, Albertazzi JA e Camiña RM (2003). healthy volunteers. Prehos Emerg Care, 5: 275-277. Avaliação comparativa de glicosímetros portáteis Goldstein DE, Little RR, Lorenz RA, Malone JL, Nathan D, através de curva glicêmica induzida. In: Congresso Peterson CM e Sacks DB (2004). Test of glycemia in Brasileiro de Metrologia, 3, 2003, Recife: Anais .... diabetes. Diab Care, 27: 1761-1773. Recife: Sociedade Brasileira de Metrologia, 1-7. Johnson RN e Baker JR (2001). Error detection and Wess G e Reusch C (2000a). Evaluation of five portable measurement in glucose monitors. Clin Chim Acta, 307: blood glucose meters for use in dogs. J Am Vet Med 61-67. Assoc, 216: 203-209. Kerr MG (2003). Exames práticos na clínica. In: Exames Wess G e Reusch C (2000b). Capillary blood sampling from Laboratoriais em Medicina Veterinária (Bioquímica the ear of dogs and cats and use os portable meters to Clínica e Hematologia). 2. ed. Editora: Roca (São measure glucose concentration. J Small Anim Pract, 41: Paulo), 327-338. 60-66. 354 CASO CLÍNICO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Torção de mesentério – um caso clínico Mesenteric torsion – a case report Teresa Figueiredo Soares 1*, C. Lavrador 2, N. Alexandre 3, R. Mascarenhas 2 1Hospital Veterinário da Universidade de Évora, Pólo da Mitra, 7000-093 Évora 2Departamento de Medicina Veterinária, Universidade de Évora, Pólo da Mitra, 7000-093 Évora 3Departamento de Zootecnia; Universidade de Évora, Pólo da Mitra, 7000-093 Évora Resumo: Os autores descrevem um caso clínico numa cadela Caso clínico Boxer de dezoito meses, cujo diagnóstico definitivo de torção mesentérica, foi alcançado numa laparotomia exploratória de urgência. A cirurgia foi um sucesso e passados dezoito meses da Anamnese mesma, a cadela apresenta-se em bom estado geral e exame Apresentou-se para consulta de urgência no serviço de clínico normal. Esta é uma situação pouco frequente nos nossos animais de companhia, de prognóstico grave e cuja taxa de consulta externa de pequenos animais do Hospital mortalidade ronda os 100%. Está descrita com maior incidência Veterinário da Universidade de Évora (H.V.U.E.) a na raça Pastor Alemão e Pointer, não tendo sido encontrados, até cadela "Dharma", de raça Boxer com dezoito meses de à data, quaisquer registos na raça Boxer. A maior parte dos idade e 25 kg de peso corporal, com queixas de dor diagnósticos é apenas alcançado em necrópsia, dado que a abdominal aguda generalizada de início súbito. Para maioria dos animais sucumbe antes de um diagnóstico definitivo. prevenção da dirofilariose era tratada mensalmente com Summary: The authors describe a case report of mesenteric ivermectina e pirantel. Apresentava as vacinas e despara- torsion (clockwise), in a boxer female dog, aged 18 months. The sitações actualizadas, tendo sido desparasitada no dia diagnosis was made by an urgent exploratory laparotomy. The anterior à consulta de urgência. Não comeu nas últimas affected portion of the intestine was surgically removed with doze horas e não havia história de trauma anterior. success and the dog was fully recovered, bright, alert and responsive. Eighteen months after the surgery, the dog exhibits a good overall clinical condition. This is a rare pathology in Exame físico small animals with a bad prognosis and with a mortality rate of around 100%. It is described in German Shepard dog, English No exame físico o animal apresentava dor aguda à Pointer but not in Boxer dogs so far. Most of the diagnosis are palpação abdominal especialmente no quadrante dorsal, made at necropsy since most of the animals die before a definite sendo detectável uma massa de consistência firme. diagnosis is made. Apresentava uma marcha típica de dor, com base de apoio alargada dos membros posteriores e adquiria, em estação, a posição de cifose. A temperatura rectal era de 38,2 ºC. Não apresentava diarreia ou vómito. As mucosas ocular e oral estavam rosadas e húmidas, com tempo de repleção capilar de dois segundos. Os vasos sanguíneos da esclera estavam ligeiramente con- gestionados. O tempo de retracção da prega cutânea era inferior a dois segundos. Após a administração de um analgésico (metamizol, "Novalgina ®", 2 g por via endovenosa) ficou mais calma, mas, à palpação con- tinuava a apresentar os sinais clínicos atrás descritos. Análises laboratoriais O hemograma revelou uma neutrofilia moderada (Quadro 1). O perfil bioquímico revelou uma redução da activi- dade da bilirrubina total e directa, bem como um *Correspondência: [email protected] aumento da actividade dos enzimas hepáticos ALT, Tel: 266 760809 ext. 4467 AST e Fosfatase Alcalina (Quadro 2). 355 Figueiredo Soares T et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 355-360 Quadro 1 - Hemograma Valores de referência canídeo (Ettinger, 2000) Eritrócitos 6,78x10 6/mL 5,5-8,5x10 6/mL Hemoglobina 16,8 g/dL 11-18 g/L Hematócrito 47,5% 37-55% V.G.M. 70,1 fL 60-77 fL H.G.M. 24,8 pg 19,5-24,5 pg C.M.H.G. 35,4 g/dL 32-36 g/dL Leucócitos 17,6x10 3/µL 6-18 x 10 3/µL Neutrófilos 80,3% 14,1x10 3/µL 60-75% 3,6-12x10 3/µL Linfócitos 10,9% 1,9x10 3/µL 12-30% 1-5,4x10 3/µL Monócitos 8,1% 1,4x10 3/µL 2-12% 0,12-1,5x10 3/µL Eosinófilos 0,6% 0,1x10 3/µL 2-10% 0,12-0,18x10 3/µL Basófilos 0,1% 0,0x10 3/µL 0-2% 0-0,12x10 3/µL Quadro 2 - Análises bioquímicas Valores de referência canídeo (Ettinger, 2000) Ureia 30 mg/dL 10-30 mg/dL Creatinina 0,9 mg/dL 1-2 mg/dL Bilirrubinas Total 0,17 mg/dL 0,07-0,61 mg/dL Directa 0,02 mg/dL 0,06-0,12 mg/dL AST/GOT 31 U/L 6,2-19,2 U/L ALT/GPT 37 U/L 4,8-24U/L Fosfatase alcalina 51 U/L 3-16 U/L Amilase 567 U/L 185-700 U/L Exames complementares no quadrante dorsal direito, pelo que face ao quadro agudo, se optou por uma laparotomia exploratória de O exame radiográfico abdominal nas projecções urgência. latero-lateral e ventro-dorsal revelou aumento do Pelos sinais radiológicos e ecográficos, concluímos diâmetro de ansas do intestino delgado configurando pela presença de uma obstrução intestinal. Entre os um ileus paralítico ou adinâmico (Figura 1). O ratio diagnósticos diferenciais incluem-se causas de entre o diâmetro intestinal máximo e a altura 5ª vértebra obstrução intra-luminal como corpos estranhos lineares lombar no seu ponto mais estreito, era neste caso e não-lineares, causas de obstrução intra-mural nos superior a 2, o que indicava com alta probabilidade quais se incluem neoplasias e granulomas da parede uma obstrução intestinal. Não se observou perda de intestinal e causas de obstrução extra-mural tais como contraste das vísceras na cavidade abdominal ou a invaginação intestinal e torção do mesentério. O outros sinais radiológicos eventualmente indicadores ileus adinâmico causado por uma enterite parvovírica, de peritonite. também deve ser considerado nos diagnósticos A ultrassonografia abdominal foi inconclusiva, diferenciais sobretudo em cães jovens. Na lista de embora tenha confirmado a existência de uma massa diferenciais que poderiam causar um ileus adinâmico, podíamos também incluir a torção uterina, a torção esplénica e a pancreatite severa. Cirurgia Como pré-medicação foram administrados sulfato de atropina (0,045 mg/Kg, SC), amoxicilina e ácido clavulâmico "Synulox ®" (30 mg/Kg, IM), enrofloxacina "Baytril ®" (5 mg/Kg, SC), metamizol "Novalgina ®" (2 g, IV) e acepromazina "Calmivet®" (0,02 mg/Kg, IV). A indução da anestesia foi feita com solução de tiopental sódico a 2,5%, 8 mg/kg IV. A manutenção da Figura 1 - Aumento do diâmetro intestinal. anestesia foi feita com uma mistura de oxigénio e 356 Figueiredo Soares T et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 355-360 isoflurano "Isoflo ®" (2%), administrada em circuito Os vasos da arcada mesentérica, provenientes da respiratório fechado. artéria mesentérica cranial, os vasos terminais e os Após tricotomia e assepsia da parede abdominal vasa recta no tecido adiposo mesentérico, foram ventral, a paciente foi colocada em decúbito dorsal e ligados com "Safil green 2/0 B.Braun ®" (ácido foi realizada uma incisão de cerca de 5 cm sobre a poliglicólico), com ligadura dupla e seccionados. Os linha branca, caudal à cicatriz umbilical. O acesso à locais de incisão do intestino foram delimitados com cavidade abdominal, revelou a presença de grande 2 pinças intestinais, tendo sido as incisões feitas quantidade de líquido intra-abdominal sero-sanguino- obliquamente para que as duas extremidades ficassem lento. Foi feita uma exploração cuidadosa de toda a com diâmetros semelhantes. Após a incisão, limparam- extensão do trato gastro-intestinal e detectada na -se os bordos da parede intestinal com uma compressa porção terminal do íleo, a cerca de 2 cm cranial à embebida em solução de polividona iodada. Foi válvula ileo-cecal, uma torção de mesentério de 180º, efectuada uma anastomose topo a topo com duas no sentido dos ponteiros do relógio, com encarceração suturas: uma contínua de aposição e, sobre esta, uma de cerca 60 cm de jejuno e íleo, sem sinais de ruptura segunda sutura de Cushing, usando fio de sutura intestinal (Figura 2). absorvível monofilamentado com agulha cilíndrica (Monosyn 3/0 B.Braun ®). O mesentério foi suturado com sutura contínua simples (Safil green 2/0 B.Braun ®). Após lavagem copiosa da cavidade abdo- minal com soro fisiológico aquecido, o peritoneu e a camada muscular adjacente foram encerrados com pontos em X (Safil green 1/0 B.Braun ®). Foi colocado um dreno de Penrose dada a grande quantidade de fluido existente, de forma a permitir fazer lavagens peritoneais. Durante a cirurgia foi feita fluidoterapia em perfusão contínua com soro fisiológico (60 gotas/minuto) e administrados 250 mg de metronidazol Figura 2 - A torsão de mesentério e 40 mg acetato de medroxiprednisolona (Solu- -Medrol ®) por via endovenosa. Este segmento foi exteriorizado, sendo as restantes ansas protegidas com panos de campo. Foi realizada a Pós-operatório e acompanhamento de manutenção enterectomia da porção encarcerada, que apresentava congestão intensa e mesmo necrose em algumas Durante o pós-operatório foi feita a medicação zonas, desde a zona imediatamente cranial ao início da antibiótica com 260 mg de amoxicilina e ácido ® lesão até à zona terminal do íleo, junto à válvula ileo- clavulâmico (Synulox ), SC, TID associado com ® cecal, estando esta intacta (Figuras 3 e 4). 100 mg de enrofloxacina (Baytril 2,5% ), SC, SID e 250 mg de metronidazol, IV, TID. A analgesia foi feita com 2 g de metamizol (Novalgina ®) IV, TID nas primeiras vinte e quatro horas após a cirurgia. Foi mantida a dieta zero, com fluidoterapia à base de soro glucosado a 5% com adição de uma solução de substituição à base de vitaminas e aminoácidos (Duphalyte‚) durante todo o período de internamento. Decorridas 24 horas, removeu-se o dreno abdominal e após 36 horas pós cirurgia, foi-lhe dada alta hospitalar, uma vez que apresentava bom estado geral, os seus sinais vitais estavam normais, não apresentava Figura 3 - Após a secção do mesentério vómito, diarreia, nem dor à palpação abdominal (Figura 5). Foi medicada com 500 mg de cefalexina PO, BID durante vinte dias, 100 mg de cimetidina (Tagamet ®) PO, BID durante quinze dias e uma associação de vitaminas lipossolúveis (vitamina A 15.000 U.I. e vitamina E 35 mg, PO, SID) durante o mesmo período. Foi-lhe também prescrito 100 mg de carprofeno (Rimadyl ®) PO, SID nos primeiros quatro dias. Foi recomendada uma dieta de elevada digestibili- dade (Royal Canin Digestive Low Fat Canine ®) em Figura 4 - A porção removida pequenas refeições de 3 em 3 horas e uma vigilância 357 Figueiredo Soares T et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 355-360 Discussão A torção de mesentério é uma patologia rara (Tvedten, 1973) e está descrita com maior incidência em cães machos, de idades compreendidas entre os dois e os três anos de raças de porte médio-grande, como o Pastor Alemão e Pointer, havendo também registos em animais de raças miniatura (Camble e Page, 1992; Fossum et al ., 2002; Yanoff et al ., 1992; Matushek e Cockshutt, 1987; Parker e Presnell, 1972; Shealy e Henderson, 1992; Westermarck e Rimaila- -Pärnänen, 1989). O caso descrito neste artigo, parece ser pouco frequente, pois tratava-se de uma cadela de raça Boxer, com apenas 18 meses de idade. Através da anamnese e do exame clínico não foi possível identificar a etiologia do processo patológico, podendo este ter sido favorecido pela desparasitação recente. De facto, Nemzek et al . (1993) registaram um caso de torção de mesentério associado a uma despa- rasitação, mas outras associações têm sido observadas, nomeadamente com a ingestão de grandes quanti- dades de alimento num curto espaço de tempo, o exercício vigoroso, o trauma abdominal, a cirurgia abdominal e a presença de corpos estranhos gastroin- testinais (Matushek e Cockshutt, 1987; Shealy e Henderson, 1992; Nemzek et al ., 1993; Brown, 2001; Fossum et al ., 2002). Em termos de patologias concomitantes e talvez predisponentes, a torsão de Figura 5 - A cadela Dharma ao fim de 48 h pós-operatórias mesentério também tem sido descrita associada a tumores, volvo gástrico, gastroenterite, invaginação crónica ileocólica, enterite linfo-plasmocítica, parvovi- apertada até à reavaliação, agendada para quatro dias rose, carcinoma ileal e insuficiência pancreática depois. Ao fim de dois dias teve um episódio de exócrina (Matushek e Cockshutt, 1987; Walshaw, vómito pelo que lhe foi suspenso o carprofeno. Nessa 1989; Shealy e Henderson, 1992; Nemzek et al ., 1993; altura, foi-lhe prescrita Vitamina B12, (hidroxicoba- Rahal et al ., 2000; Brown, 2001). lamina) 20 mg/Kg de 3 em 3 meses por via IM. Os sintomas de marcha de dor e posição de cifose, Passados 18 meses da cirurgia, a cadela estava em observados no exame clínico deste paciente não se perfeito estado de saúde, exibindo alegria e muita encontram descritos na bibliografia. Os resultados das actividade (Figura 6). análises hematológicas (neutrofilia), bioquímicas (aumento da actividade das enzimas hepáticas) e radiológicas conferem com os descritos por outros autores (Brown, 2001; Camble e Page, 1992; Carberry e Flanders, 1993; Fossum et al ., 2002; Matushek e Cockshutt, 1987; Parker e Presnell, 1972; Walshaw, 1989; Westermarck e Rimaila-Pärnänen, 1989) o que levou à suspeita de torção de mesentério. Diversas ansas intestinais estavam distendidas, com aumento do seu diâmetro, indicando a existência provável de obstrução intestinal. Como referência, considera-se que o diâmetro normal do intestino delgado canino corresponde a duas vezes o diâmetro de uma costela (Riedesel, 2002). O diagnóstico de distensão intestinal pode ser ainda obtido através do ratio entre o diâmetro intestinal máximo e a altura do corpo da 5ª vértebra lombar no ponto mais estreito: valores superiores a 1,6 indicam a presença de distensão e valores superiores a 2 indicam uma alta Figura 6 - A cadela Dharma ao fim de 18 meses após a enterectomia probabilidade de obstrução (Papazaglou et al ., 2003). 358 Figueiredo Soares T et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 355-360 De um modo geral, como diagnóstico diferencial, reduzir os riscos de anemia megaloblástica, pois o sempre que surjam evidências de obstrução ou local de absorção desta vitamina é exactamente na dilatação intestinal patológica, deve colocar-se a porção terminal do íleo, a porção de intestino que foi hipótese de torção de mesentério com envolvimento removida (Brown, 2003). de intestino delgado e/ou grosso (ceco-cólico) A torção de mesentério tem um prognóstico grave, (Carberry e Flanders, 1993). sendo geralmente fatal com uma taxa de mortalidade Quando a anamnese e os sinais imagiológicos e muito elevada que ronda os 100% (Matushek e clínicos sugerem fortemente uma obstrução intestinal, Cockshutt, 1987; Shealy e Henderson, 1992; Carberry há a indicação de uma laparotomia exploratória e Flanders, 1993; Orsher e Rosin, 1993; Rahal et al ., imediata (Parker e Presnell, 1972; Walshaw, 1989). De 2000; Brown, 2001; Fossum et al ., 2002). A maior facto, o diagnóstico definitivo surge na cirurgia ou na parte dos cães morre em 24 horas pela necrópsia (Shealy e Henderson, 1992; Shahar et al ., progressão natural da doença ou por eutanásia 1998; Fossum et al ., 2002). Kik e Linde-Sipman (Brown, 2001). Não se conhecem factores objectivos (1993) afirmam que em dez casos de torção de mesen- de prognóstico positivo e o sucesso terapêutico parece tério, apenas um foi diagnosticado clinicamente tendo ser fortuito (Shealy e Henderson, 1992). Estão asso- os restantes sido achados de necrópsia. No caso da ciados de forma subjectiva a uma maior taxa de sucesso, Dharma, os sinais clínicos e imagiológicos sugeriam a rapidez de diagnóstico, a extensão de ressecção uma obstrução intestinal, o que determinou a opção intestinal, a torção limitada a um ângulo de rotação pela cirurgia de urgência. Os achados cirúrgicos menor ou igual a 180º e uma intervenção cirúrgica encontrados vão de encontro ao descrito pelos espe- rápida (Shealy e Henderson, 1992; Brown, 2001). No cialistas: presença de líquido na cavidade abdominal, caso relatado por Rahal et al . (2000), o êxito da ansas intestinais necrosadas, de cor negra-púrpura, operação de uma cadela com torção de mesentério foi com conteúdo gasoso e líquido (Parker e Presnell, atribuído ao não desenvolvimento da síndrome do 1972; Shealy e Henderson, 1992). intestino curto. A torção de mesentério é uma urgência médico- Assim, os factores que poderão ter contribuído para -cirúrgica (Fossum et al ., 2002), pelo que se não for o sucesso do tratamento e a sobrevivência da Dharma resolvida imediatamente, o animal poderá morrer antes terão sido a rapidez de decisão da laparotomia explo- de se iniciar a terapêutica (Parker e Presnell, 1972; ratória, o facto da torção ter sido limitada a 180º e não Westermarck e Rimaila-Pärnänen, 1989; Ellison, 1996; ter havido complicações cardiovasculares (colapso Rahal et al ., 2000). O tratamento cirúrgico da torção de circulatório). mesentério consiste na descompressão abdominal, na correcção da torção, na ressecção do segmento intes- tinal afectado e no rápido restabelecimento do volume Bibliografia plasmático (Butler, 1972; Carberry e Flanders, 1993; Brown DC (2001). Mesenteric torsion in dogs. Compend et al et al Orsher e Rosin, 1993; Shahar ., 1998; Fossum ., Contin Edu Pract Vet, 2(6): 1-4. 2002; ). É necessário, frequentemente, um tratamento Brown DC (2003). Capter 41 – Small intestine. In Textbook agressivo intra e pós-operatório, para obter a estabili- of small animal surgery, Slatter, D., 3 rd edition. Vol. 1, dade cardiovascular (Brown, 2001). No entanto, W.B. Saunders Company, Philadelphia, 653-654. no caso da Dharma, não houve alterações cardiovas- Butler HC (1972). Surgery of the small intestine and colon. culares, pelo que a recuperação pós-operatória foi Vet Clin North Am, 2(1): 155-166. relativamente rápida. Camble PJ e Page CA (1992). Mesenteric torsion in a toy Durante o período pós-operatório, apenas se registou dog. Vet Record, 13(12): 283-4. um episódio de vómito, provavelmente devido ao Carberry CA e Flanders JA (1993). Cecal-colic volvulus in two dogs. Vet Surg, 22(3): 225-228. efeito agressivo do carprofeno sobre a mucosa gástrica. Ellison WG (1996). Ressecção e Anastomoses intestinais. In A bibliografia refere várias complicações como a Bojrab, M.J., Técnicas atuais em cirurgia de pequenos peroxidação lípidica tóxica do tecido isquémico, animais, Editora Roca, S. Paulo, 231-240. a síndrome do intestino curto, hemorragias, má coap- Ettinger SJ, Feldman EC (2000). Textbook of veterinary tação da anastomose, estenoses pós-cirúrgicas, internal medicine: diseases of dog and cat. 5 th Edition. disfunções digestivas e aderências (Ullman e Pavletic, Fossum TW, Hedlund CS, Hulse DA, Johnson AL, Seim III 1991; Shealy e Henderson, 1992; Yanoff et al ., 1992; HB, Wielard MD, Carroll G L (2002). Intestinal volvulus Brown, 2001; Fossum et al ., 2002). Nenhuma dessas and torsion, In Small Animal Surgery, Mosby. New York, complicações foi observada no presente caso. De 395-398. modo a evitar a síndrome do intestino curto, foi Kik MJ e Linde-Sipman van der JS (1993). Mesenterial recomendada uma dieta altamente digerível, em torsion in dogs. Tijdschr Diergeneeskd, 118(4): 115-116. Matushek KJ e Cockshutt JR (1987). Mesenteric and gastric pequenas refeições, várias vezes ao dia (6-8), bem volvulus in a dog. JAVMA, 191(3): 327-328. como um suplemento vitamínico-mineral à base de Nemzek JA, Walshaw R, Hauptman JG (1993). Mesenteric et al vitaminas lipossolúveis (Yanoff ., 1992; Brown, volvulus in the dog: a retrospective study. J Am Anim 2001). A administração de vitamina B12 destina-se a Hosp Assoc, 29: 357-362. 359 Figueiredo Soares T et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 355-360 Orsher RJ e Rosin E (1993). Small intestine. In, Textbook of Shealy PM, Henderson RA (1992). Canine intestinal volvulus. small animal surgery, Slatter, D., 2 nd edition. Vol. 1, W.B. A report of nine new cases. Vet Surg, 21(1): 15-19. Saunders Company, London, 593-599. Tvedten HW (1973). Fatal volvulus in a puppy (a case Papazaglou LG, Patsikas MN, Rallis T (2003). Intestinal report). Vet Med Small Anim Clin, 38: 506-510. foreign bodies in dogs and cats. Compend Contin Edu Ullman SL, Pavletic MM (1991). Open intestinal anastomosis Pract Vet, 25(11): 830-843. with surgical stapling equipment in 24 dogs and cats. Vet Parker WM e Presnell KR (1972). Mesenteric torsion in the Surg, 20(6): 385-391. dog: two cases. Can Vet J, 13(12): 283-284. Yanoff SR, Willard MD, Boothe HW e Walker M (1992). Rahal SC, Garib MI, Mamprim MJ, Teixeira CR (2000). Short-bowel syndrome in four dogs. Vet Surg, 21(3): Mesenteric torsion in a dog. Can Vet J, 41(9): 710-711. 217-222. Riedesel EA (2002). The Small Bowell. In, Thrall, D.E., Walshaw R (1989). What is your diagnosis? JAVMA, Textbook of veterinary diagnostic radiology. 4 th Edition. 194(11): 1631-1632. W.B. Saunders Company. Philadelphia, 639-660. Westermarck E, Rimaila-Pärnänen E (1989). Mesenteric Shahar R, Harrus S, Yakobson B (1998). Mesenteric vein torsion in dogs with exocrine pancreatic insufficiency: trombosis in a dog. J Am Anim Hosp Assoc, 34(5): 21 cases (1978-1987). JAVMA, 195(10): 1404-1406. 431-433. 360 CASO CLÍNICO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Ovário-histerectomia laparoscópica em uma gata com fetos mumificados – relato de caso Laparoscopic ovaryhysterectomy in a female cat with mumified fetus – case report F. Schiochet 1*, C. A. C. Beck 1, V. Pinto 2, R. Stedile 1, E. Contesini 1, M. M. Alievi 1, P. H. Yamazaki 1, D. F. Jurinitz 1, S. B. L. Bernardes 1 1Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil 2Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Luterana do Brasil Resumo: A ovário-histerecotmia é o tratamento usual para Introdução muitas afecções ováricas e uterinas, entre elas: piómetra, torção uterina, ruptura uterina, prolapso uterino e quistos ováricos. A mumificação é o resultado da morte fetal na última metade da Na cirurgia veterinária, tanto a ovário-salpingo- gestação com reabsorção fetal incompleta, sendo os agentes -histerectomia (OSH) como a ovariectomia são virais os principais causadores de aborto nos felinos. A procedimentos cirúrgicos comumente utilizados na videocirurgia por minimizar o trauma cirúrgico oferece vanta- esterilização eletiva de cadelas e gatas com o objetivo gens importantes e vêm crescendo na medicina veterinária. O de impedir a reprodução ou tratar várias afecções caso relatado é de um felino, fêmea, sem raça determinada, de 3,8 kg e de idade desconhecida. O aumento de volume uterino do trato reprodutivo (Malm et al ., 2004), entre elas: foi evidenciado durante a visualização da cavidade abdominal quistos ováricos, piómetra, torção uterina e prolapso por meio de uma videolaparoscopia. Nenhuma complicação foi uterino (Stone et al ., 1998). A mumificação é o observada durante o procedimento cirúrgico, bem como durante resultado da morte fetal na última metade da o pós-operatório, concluindo-se que a técnica foi segura e gestação com reabsorção fetal incompleta (Wallace e efetiva. Davidson, 1997). O aborto pode resultar de alterações Palavras-chave: ovário-histerectomia, laparoscopia, gata, fetos fetais, maternos ou placentários. Na gata, os agentes mumificados. virais (como na leucemia felina, peritonite infecciosa felina e rinotraqueíte felina) são os mais importantes e Summary: The ovaryhysterectomy is the usual treatment to a reabsorção fetal pode ocorrer sem qualquer sinal many ovarian and uterine diseases, among them pyometra, uterine torsion, uterine prolapse and ovarian cysts. The mummi- clínico ou corrimento vaginal (Grooters, 1998). fication is the result of fetus death in the last half of pregnancy As abordagens minimamente invasivas não estão with incomplete fetus resorption, the virus agents are the main surgindo para substituir totalmente a cirurgia cause of abortion in felines. Because it minimizes the surgical convencional, mas, sim, para incorporar-se ao trauma, the video surgery offers important advantages and is arsenal cirúrgico moderno (Pinotti e Nasi, 1994) e increasing in the veterinarian medicine. The case reported is from a female feline, non-determined breed, 3.8 kg and vêm ganhando espaço importante na cirurgia unknown age. The increase uterine volume was evidenced veterinária devido às suas vantagens relacionadas during the visualization of the abdominal cavity through a ao reduzido trauma cirúrgico, destacando-se: video laparoscopy. No complication was observed during the possibilidade de realizar a intervenção terapêutica surgical procedure, as after the surgery, it was concluded that durante o diagnóstico, menor volume de sangramento the technique was safe and effective. durante a cirúrgia, magnificação das imagens (Beck et Keywords : ovariohysterectomy, laparoscopic, cat, mumified al ., 2003), melhor aspecto estético (Campos, 2004), fetus. melhor preservação da função imunológica (Cohen et al ., 2003), entre outras. A primeira utilização da laparoscopia terapêutica foi descrita em duas cadelas com piómetra, sendo a secção dos ligamentos e vasos ovarianos realizada por laparoscopia e o restante do procedimento realizado por cirurgia convencional através da ampliação da *Correspondência: [email protected] incisão pré-púbica existente. Não ocorreram complica- Tel: +55 51 96661910, +55 51 33086095 ções durante o pós-operatório em qualquer dos animais 361 Schiochet F et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 361-364 (Minami et al ., 1997). Desde então, outros relatos 10 mmHg, sendo esta mantida durante todo o procedi- foram descritos e os autores consideraram que a técnica mento. Sob visão direta, com a ótica no primeiro de videolaparoscopia ou videolaparoscopia assistida trocarter, outros dois trocarteres (10 e 5 mm de Ø) em cães com piómetra pode ser empregadas com foram colocados, respectivamente à direita e à esquer- segurança e eficiência (Brun et al ., 2004b; Brun et al ., da do primeiro, mantendo-se disposição triangular 2004c; Brun et al. , 2006; Uchoa et al ., 2004). entre eles (Figura 1). Nestes dois trocarteres foram O presente relato tem como objetivo descrever o introduzidas as pinças de trabalho para a realização do acesso laparoscópico para o procedimento de OSH em procedimento cirúrgico. Com o auxílio de uma pinça uma gata com fetos mumificados. de apreensão e uma de Kelly foi possível apreender e sustentar o corpo uterino, fixando-o à parede abdominal ventral, cerca de 2,5 cm à direita da linha alba, através Descrição do caso da passagem de um ponto de reparo transcutâneo, com fio monofilamento de náilon 2-0 (Figura 2A), a fim de O caso relatado é de um felino, fêmea, sem raça evitar a colocação de um quarto trocarter. determinada, 3,8 kg de peso e com idade desconhecida, proveniente de uma associação de proteção dos Figura 1 - Localização dos três trocartes para OSH laparoscópica animais. A gata não apresentava sinais clínicos como destacando a distribuição triangular alteração de temperatura, corrimento vaginal ou anorexia. O procedimento cirúrgico foi realizado no Hospital de Clínicas Veterinárias da Universidade Federal do Rio Grande do Sul em caráter experimental, sendo o aumento de volume uterino, com presença de fetos mumificados, evidenciado durante a cirurgia. O protocolo anestésico constou de medicação pré-anestésica com acepromazina (0,2 mg/kg) e meperidina (5 mg/kg). Na indução anestésica foi utilizado midazolam (0,5 mg/kg) e propofol (4 mg/kg). A manutenção foi mantida com isofluorano vaporizado em oxigênio a 100% com fluxo de 200 ml/kg. Cerca de trinta minutos antes de iniciar a cirurgia foi administrado ampicilina sódica (20 mg/kg) profilaticamente e a fluidoterapia foi mantida com solução de ringer lactato (10 mg/kg/hs). Com a tricotomia na região ventral já realizada, posi- cionou-se o animal em decúbito dorsal sendo realizada a anti-sepsia de rotina com álcool-álcool iodado- Após a dissecção dos vasos uterinos, em conjunto -álcool. com o corpo uterino, foram realizadas duas ligaduras A cirurgia iniciou com uma incisão abrangendo cranialmente à cérvix, com uma distância de aproxi- pele, subcutâneo e linha alba (técnica aberta) cerca de madamente 1,5 cm entre elas (Figura 2B). As 4 cm cranial à cicatriz umbilical e com aproximada- ligaduras foram realizadas com a utilização de um mente 1 cm de extensão. Neste sítio foi inserido o porta-agulhas endoscópico e um contra-porta-agulhas, primeiro trocarter de 10 mm de diâmetro (Ø) sob utilizando-se um segmento de aproximadamente visão direta. Após, conectou-se a ele a mangueira do 11 cm de fio ácido poliglicólico 3-0. Na seqüência o insuflador e a cavidade abdominal foi insuflada com corpo uterino foi seccionado com os seus respectivos dióxido de carbono (CO 2) até atingir a pressão de vasos numa distância média entre as duas ligaduras Figura 2 - Passagem da agulha para fixação do corpo uterino (A). Confecção da primeira ligadura nos vasos e corpo uterino (B). Secção do corpo e vasos uterinos (C) 362 Schiochet F et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 361-364 Figura 3 - Fixação do ovário trancutaneamente (A). Imagem laparoscópica da confecção da 2ª ligadura nos vasos ovarianos (CAVO) (B). Secção dos vasos ovarianos entre as ligaduras (C) (Figura 2C). Houve presença de discreta hemorragia Figura 4 - Remoção em conjunto dos ovários e do útero na extremidade do 2° trocarte (A). Visualização dos fetos mumificados no interior do sendo o coto uterino cauterizado com o auxílio de uma útero removido da cavidade abdominal (B) pinça de eletrocautério bipolar. Na seqüência, o complexo artério-venoso ovariano (CAVO) do lado esquerdo foi dissecado, sendo reali- zada a fixação do ovário através de um ponto de reparo transcutâneo entre o ligamento suspensório e os vasos ovarianos, utilizando-se fio monofilamento de náilon 2-0 (Figura 3A). O objetivo de suspender o ovário foi tornar possível a realização das ligaduras, onde é indispensável o uso de ambas as mãos do cirurgião. Com o ovário fixado, foram realizadas duas ligaduras com ácido poliglicólico 3-0 cranialmente ao Alguns autores recomendam a técnica aberta para a ovário, com uma distância de aproximadamente 1,5 cm colocação do primeiro trocarter e o valor de pressão entre elas (Figura 3B). Posteriormente, com uma do pneumoperitoneu de 12-14 mmHg (Freeman e tesoura de Metzenbaum os vasos do CAVO foram Hendrickson, 1998). No presente estudo, optou-se seccionados a uma distância média entre as ligaduras pela técnica aberta por ser considerada mais segura, (Figura 3C), bem como o ligamento suspensório e as acrescida da característica anatômica dos gatos que estruturas adjacentes presentes do lado esquerdo. O apresentam a parede abdominal delgada e a cavidade mesmo procedimento de fixação, ligadura e secção abdominal pequena, o que favorece a possibilidade de dos vasos ovarianos foram realizados no lado contra- lesão iatrogênica quando se utiliza a técnica fechada. -lateral. A cirurgia teve seqüência com a remoção dos A pressão de CO 2 utilizada para o estabelecimento e pontos de reparo transcutâneos, promovendo-se a manutenção do pneumoperitoneu foi de 10 mmHg e retirada em bloco do útero e ovários da cavidade. permitiu excelente visualização da cavidade e espaço Devido ao aumento de volume uterino, a remoção dos suficiente para a manipulação do instrumental cirúrgi- ovários e do útero foi em conjunto com a extremidade co, além de minimizar os efeitos cardiovasculares do segundo trocarter (Figura 4A). Ao seccionar o (Zorron et al ., 2004) e as alterações respiratórias útero externamente, observou-se a presença dos fetos decorrentes do aumento da pressão intra-abdominal mumificados (Figura 4B). (Normando et al ., 2004). Ao final do procedimento a cavidade foi inspe- A manobra de fixação do corpo uterino e ovários na cionada, desinsuflada e os trocarteres removidos. A parede abdominal mostraram-se efetivas, evitando a parede abdominal foi suturada com fio ácido colocação de um quarto trocarter. Este procedimento poliglicólico 3-0 padrão Sultan e a pele com pontos baseou-se em um estudo de ovário-histerectomia isolados simples com monofilamento de náilon 3-0. laparoscópica com uso de três portais em cães realiza- No pós-operatório foi administrado amoxacilina do por Brun et al . (2004a). triidratada (20 mg/kg) por dez dias e cetoprofeno As técnicas normalmente utilizadas para oclusão (2 mg/kg) por três dias. dos vasos ovarianos são: eletrocautério bipolar, clipes de titânio, ligadura com fio de sutura e grampeador Discussão vascular e os vaso e corpo uterino podem ser ligados através de endoloop ou ligadura extracorpórea A cirurgia minimamente invasiva por apresentar (Freeman e Hendrickson, 1998). No presente estudo vantagens vêm despertando crescente interesse, foi utilizado ligadura com o fio ácido poliglicólico havendo necessidade da realização de estudos para o 3-0 e o mesmo mostrou-se adequado tanto pela estabelecimento de novas técnicas com aplicabilidade facilidade de manipulação quanto pela resistência na clínica (Brun e Beck, 1998). No caso relatado, o aces- realização da ligadura, proporcionando uma excelente so videolaparoscópico permitiu-nos adequada visuali- oclusão dos vasos ovarianos, entretanto, nos vasos zação do útero, ovários e suas estruturas. uterinos, provavelmente devido ao aumento uterino, a 363 Schiochet F et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 361-364 ligadura em massa mostrou-se instável, havendo Cohen RV, Pinheiro, FJC, Schiavon CA, Correa, JLL (2003). necessidade de cauterização. Alterações sistêmicas e metabólicas da cirurgia O felino do caso relatado apresentou uma laparoscópica. Rev Bras Videoc, 1: 77-81. recuperação rápida não apresentando sinais de dor ou Freeman LJ, Hendrinkson DA (1998). Minimally invasive desconforto no pós-operatório. De acordo com os surgery of the reproductive system. In: Veterinary Endosurgery. Editor: Freeman LJ, St. Louis: 205-225. resultados obtidos, pode-se concluir que o acesso Grooters AM (1998). Ovariopatias e Uteropatias. In: Manual laparoscópico descrito mostrou-se efetivo para a Saunders: Clínica de Pequenos Animais. Editores: OSH terapêutica em útero com fetos mumificados. Birchard SJ e Sherding RG. Roca (São Paulo, São Paulo, Brasil): 27-35. Bibliografia Malm CP, Savassi-Rocha PR, Gheller VA, Oliveira AR, Lamounier V (2004). Ovário-histerectomia: estudo Beck CAC, Pippi NL, Brun MV, Leme MC, Contesini EA, experimental comparativo entre as abordagens Stedile R (2003). Criptoquidectomia em coelhos: modelo laparoscópicas e aberta na espécie canina. Intra-opera- experimental para tratamento laparoscópico. Ciência tório I. 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Rev Bras Videoc, 1: 103-108. 364 CASO CLÍNICO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Ablação química de hematoma etmoidal com abordagem auxiliar por sinusostomia frontal – relato de caso Chemical ablation of ethmoid hematoma with ancillary approach by frontal sinusostomy – case report Geison Morel Nogueira 1, José Wanderley Cattelan 2, Claudia Acosta Duarte 3, Sergio da Silva Fialho 4, Paola Castro Moraes 2, Paulo Sérgio Patto dos Santos 5 1Curso de Mestrado em Cirurgia Veterinária, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal/SP, Brasil 2Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal/SP, Brasil 3Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP), Bandeirantes/PR, Brasil 4Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria/RS, Brasil 5Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Araçatuba/SP, Brasil Resumo: O hematoma etmoidal é descrito como sendo uma Introdução rara afecção de etiologia desconhecida, capaz de causar epistaxe em eqüinos. Este relato descreve um eqüino de hipismo, 10 anos, Dentre as causas de epistaxe em eqüinos, o raça anglo-árabe, que apresentava tal enfermidade. Foi instituído o tratamento por ablação química através de administração hematoma etmoidal é descrito como sendo uma rara intralesional, transendoscópica de solução de formaldeído 4%, afecção (Esmeraldino et al ., 2005) de etiologia a cada quinze dias, totalizando dez aplicações. Adicionalmente, desconhecida (Schumacher et al ., 1998; Nickels, foi feito sinusotomia em seio frontal para viabilizar a ablação 1999; Ainsworth e Biller, 2000; Pascoe, 2006) , química nessa outra região, onde foram realizadas quatro caracterizada por formação não neoplásica originada infusões. A administração da solução foi feita até o extravasa- mento ao redor do ponto de aplicação, variando o volume entre na submucosa do labirinto etmoidal, de caráter pro- 60 e 100 mL. O animal foi mantido em repouso durante todo o gressivo e destrutivo, que pode invadir o assoalho e tratamento, sendo este finalizado apenas com a remissão total parede dos seios maxilar e frontal (Nickels, 1999; do hematoma etmoidal. Ainsworth e Biller, 2000; Tremaine, 2002; Pascoe, 2006). A formação é composta de sangue e tecido Palavras chave: hematoma etmoidal, formaldeído, sinusostomia fibroso, encapsulado por epitélio respiratório normal Summary: Ethmoid hematoma is described as being a rare (Schumacher et al ., 1998). disease of unknown etiology, capable of causing epistaxis in Lesões angiomatosas na submucosa dos seios horses. This report describes a ten-year-old Anglo-Arabian paranasais adjacentes têm sido sugeridas como causa jumping horse, which presented this disease. Chemical ablation da enfermidade, resultando em áreas de hemorragia treatment was established through transendoscopic intralesional administration of 4% formaldehyde solution, every two weeks, organizada (Tremaine, 2002). ten applications in total. In addition, frontal sinus sinusostomy Além da epistaxe, normalmente espontânea, que was accomplished allowing the chemical ablation in the region pode ocorrer durante ou após o exercício físico, of the paranasal sinus, where four infusions were made. The observa-se ainda balançar de cabeça, odor fétido nas administration of the solution was made until the overflow narinas (Nickels, 1999; Ainsworth e Biller, 2000), around the application point, varying the volume between sixty and a hundred mL. The animal was kept at rest during the entire respiração estertorosa, tosse e exoftalmia (Ainsworth treatment, and exercise resumed only after complete remise of e Biller, 2000). the ethmoid hematoma. O diagnóstico é baseado nos achados clínicos, exame radiográfico e endoscopia (Nickels, 1999; Keywords: ethmoid hematoma, formaldehyde, sinusostomy Tremaine, 2002; Ohnesorge et al ., 2004; Pascoe, 2006), sendo definitivo com avaliação histopatológica (Nickels, 1999; Esmeraldino et al ., 2005), podendo ainda ser utilizada a tomografia computadorizada (Ohnesorge et al ., 2004). O método de tratamento depende da localização e tamanho do hematoma, sendo instituídos a remoção cirúrgica (Bell et al ., 1993; Ainsworth e Biller, 2000; Tremaine, 2002; Pascoe, 2006), administração 365 Nogueira GM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 365-368 intralesional de solução de formaldeído (Schumacher et al ., 1997; Ohnesorge et al ., 2004; Pascoe, 2006), ablação a laser (Bell et al ., 1993; Tremaine, 2002; Ohnesorge et al ., 2004) e crioterapia (Schumacher et al ., 1997; Ainsworth e Biller, 2000). Relato do caso Este relato descreve um eqüino de hipismo, 10 anos, raça anglo-árabe, que apresentava secreção nasal serossanguinolenta unilateral, odor fétido nas narinas e respiração estertorosa evidente ao exercício. À percussão evidenciou-se som maciço na região do seio paranasal frontal direito. Figura 3 - Notar presença do hematoma etmoidal através da sinusostomia no seio frontal Realizado exame radiográfico foi observado radiopacidade aumentada no seio frontal, e imagem radiopaca bem delimitada na cavidade nasal (Figura 1 O exame endoscópico revelou neoformação enca- e 2). psulada, de coloração enegrecida, entre as conchas nasais dorsal e ventral direita. Na ocasião, foi coletado fragmento para exame histopatológico, que eviden- ciou cápsula de tecido fibroso e epitélio respiratório, com estroma formado por rede vascular, macrófagos e células gigantes. Instituiu-se, como tratamento, a ablação química através da administração intralesional transendoscópica de solução de formaldeído 4%, a cada quinze dias, totalizando dez aplicações. Tal procedimento foi realizado com o animal em posição quadrupedal, sem contenção química. Adicionalmente, foi feito sinusostomia (Figura 3) no seio paranasal frontal para viabilizar a ablação química nessa outra região. Figura 1 - Verificar presença do hematoma etmoidal no seio frontal e Com o animal submetido à anestesia geral inalatória cavidade nasal (seta) e em decúbito lateral esquerdo, foi realizado o proce- dimento cirúrgico. Feita a tricotomia e anti-sepsia da região frontal foi traçada uma linha imaginária transversal entre os forames supra-orbitários. O encontro desta com outra longitudinal dividindo a face ao meio determinou um ângulo, cuja bissetriz serviu de direcionamento para o local da sinusostomia (Shuttleworth e Smythe, 1960), sendo esta demarcada aproximadamente 4,0 cm rostral a cavidade orbitária, com base na imagem radiográfica do hematoma neste ponto. Após a realização de uma incisão de pele curvilínea de aproximadamente 3,0 cm, e feito a divulsão do tecido subcutâneo, houve a exposição do osso nasal. Foi utilizado um trépano de 1,7 cm de diâmetro para abertura do seio paranasal frontal, evidenciando-se claramente o hematoma etmoidal. Foi feito uma infusão intralesional transoperatória com solução de formaldeído 4%, seguindo-se mais três com intervalos de quinze dias com o animal em posição quadrupedal. As administrações da solução ocorreram até o momento de extravasamento ao redor do ponto de Figura 2 - Observar radiopacidade na região etmoidal (seta) aplicação, variando o volume entre 60 e 100 mL. 366 Nogueira GM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 365-368 A sinusostomia foi mantida por um período de trando morbidade superior quando comparada à 45 dias com uso de gaze estéril na abertura óssea, administração intralesional de formaldeído. objetivando impedir o desenvolvimento do tecido de Schumacher et al . (1998) citam o uso da solução de granulação no local e a entrada de sujidades, trocada formaldeído a 4% intralesional infundida em diariamente durante a realização do curativo. hematoma etmoidal. No presente trabalho, a ablação O animal foi mantido em repouso durante todo química com esta solução a 4% apresentou vantagens o tratamento, sendo este finalizado apenas com a em relação às técnicas anteriormente comentadas. remissão total do hematoma etmoidal. Segundo Frees et al . (2001), o uso em concentração a Foi realizado monitoramento endoscópico e radio- 10% causou quadro neurológico de ataxia, demência e lógico por três meses para, logo após, permitir o "head pressing", em função do contato desta solução retorno às atividades atléticas. com o bulbo olfatório e lobo cerebral frontal, prove- niente de comunicação anormal entre a cavidade nasal e a abóbada cranioventral, por erosão e necrose da Discussão lâmina cribiforme ventral em um eqüino de 18 anos. O formaldeído a 4% promove a dissecção do tecido A exposição para remoção cirúrgica do hematoma coagulado através da hidrólise protéica, responsável etmoidal é conseguida através de trepanação maxilar pela redução do tamanho da lesão, não sendo observa- ou frontal (Specht et al ., 1990; Bell et al ., 1993; dos efeitos de toxicidade sistêmica resultantes de Tremaine, 2002; Pascoe, 2006), sendo esta acompa- ingestão ou inalação da solução (Schumacher et al ., nhada de perda sangüínea acentuada (Specht et al ., 1998). 1990; Schumacher et al ., 1997; Schumacher et al ., Schumacher et al . (1997) relatam desenvolvimento 1998; Ainsworth e Biller, 2000; Pascoe, 2006), de laminite após a terceira administração de podendo, segundo Specht et al . (1990), ser controlada formaldeído 4% em 1 dos 21 animais tratados, e através de técnicas variadas, como o uso de eletro- Ruggles et al . (1991) citam a formação de enfisema cautério, compressão digital, aplicação de "spray" de subcutâneo local em cinco eqüinos após a realização nitrogênio líquido ou aplicação de gaze impregnada de sinusotomia. Neste estudo, porém, não foi com solução de epinefrina, sendo necessário, contudo, observada qualquer alteração durante ou após o trata- a administração de grandes volumes de fluido mento. cristalóide e transfusão sangüínea. Specht et al . (1990) relatam perda sangüínea durante o procedimento cirúrgico de nove animais, Conclusão entre três e quinze litros, e Bell et al . (1993) estimam em média quatro litros e meio por animal. Ambos A escolha do método utilizado no tratamento indicam ainda a técnica de oclusão bilateral tem- baseou-se na avaliação da dimensão e localização do porária da artéria carótida, descrita por Wyn-Jones et hematoma etmoidal do animal em questão, sendo a al . citado por Bell et al . (1993), como alternativa a fim abordagem auxiliar através da sinusostomia frontal de de minimizar a hemorragia transoperatória. fundamental importância, em função das aplicações As complicações associadas à cirurgia incluem seriadas de formaldeído 4% na extensão do hematoma ainda seqüestros ósseos, encefalites, periostite e no seio paranasal frontal. secreções nasais persistentes (Schumacher et al ., Não foram observadas complicações decorrentes do 1998; Ainsworth e Biller, 2000), além de trauma no tratamento instituído, ou da sinusostomia, sendo este lobo olfatório e estruturas adjacentes ao encéfalo, animal acompanhado por um período de três anos durante o período transoperatório, pela proximidade após o procedimento, em atividade atlética plena, sem da lâmina cribiforme em alguns casos (Tremaine, qualquer indício de recidiva. 2002). Outras técnicas são descritas para o hematoma etmoidal, como a criocirurgia, não sendo, contudo Bibliografia exeqüível no início do tratamento de hematomas volumosos (Pascoe, 2006) ou utilizada apenas para Ainsworth DM, Biller DS (2000). Hematomas etmoidais. In: ablação de lesões de pequeno tamanho (Schumacher Reed S M, Bayly W M. Medicina Interna Eqüina. et al ., 1997). Também pode ser utilizado o laser Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, p. 222-223. transendoscópico (Tremaine, 2002), porém apresenta Bell BTL, Baker GJ, Foreman JH (1993). Progressive ethmoid hematoma: characteristics, cause, and treat o fator limitante de custo do equipamento (Bell et al ., et al et al ment. Equine Respiratory Disorders, 15(10): 1391 - 1993; Schumacher ., 1997; Schumacher ., 1397. 1998). Esmeraldino A, Ayala KCT, Rodríguez NC, Pianta C, Apesar dos problemas expostos, Pascoe (2006) Fallavena LCB (2005). Hematoma etmoidal progressivo apresenta como método mais indicado ao tratamento em eqüino da raça crioula: relato de caso. Veterinária em da enfermidade a remoção cirúrgica, mesmo demons- Foco, Canoas: 3(1): 51-54. 367 Nogueira GM et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 365-368 Frees KE, Gaughan EM, Lillich JD, Cox J, Gorondy D, Schumacher J, Honnas C, Yarbrough T, Pascoe J, Meagher D, Nietfeld JC, Kennedy GA, Cash W (2001). Severe com- Woods P (1997). Ablation of progressive ethmoidal plication after administration of formalin for treatment hematomas of horses by intralesional injection of of progressive ethmoidal hematoma in a horse. Journal formaldehyde solution. In: 43 Rd Annual Convention of American Veterinary Medical Association, 219(7): 950- The American Association of Equine Practitioners, 952. Phoenix. Proceedings… Lexington: Aaep, p. 244-245. Nickels FA (1999). Nasal passages. In: Auer JA, Stick JA. Schumacher J, Yarbrough T, Pascoe J, Woods P, Meagher D, Equine Surgery. W.B. 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Diseases of the nasal cavities and examination of normal paranasal sinuses in horses. paranasal sinuses. Equine Respiratory Diseases, Ithaca. Veterinary Surgery, 20(6): 418-423. Disponível em: 368 Suplemento DA REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Vol. CII · Nº 563-564 SUPLEMENTO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Victor Manuel d'Albuquerque Matos António Martins Mendes Faculdade de Medicina Veterinária, UTL. Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa Origens Victor Manuel d'Albuquerque Matos, de seu nome completo, nasceu em Queluz, no dia 12 de Dezembro de 1923, filho de Manuel de Matos, sargento-ajudante e de sua esposa D. Arminda dos Santos Albuquerque. Formação profissional Frequentou o ensino primário em Leiria e concluiu os estudos secundários no Liceu D. João III, em Coimbra, sendo já seu pai oficial do exército. No ano lectivo de 1941-42 matriculou-se na Escola Superior de Medicina Veterinária concluindo a licenciatura em Ciências Médico-Veterinárias em Julho de 1946. profissional, procurou actualizar-se em Reprodução Quando ainda aluno finalista foi eleito presidente da Animal e Inseminação Artificial (1952), Associação de Estudantes e, por inerência, dirigiu Aperfeiçoamento em Avicultura (1954) e Gestão "Medicina Veterinária" - a respectiva revista técnica. Avícola (1966). Foi um aluno distinto na frequência da nova disciplina de "Tecnologia e Inspecção Sanitária dos Produtos de Origem Animal", criada pelo excepcional Professor Primeiras ocupações profissionais na que foi o Doutor Eugénio Antunes Tropa e que abria Metrópole novos horizontes aos futuros licenciados. Dotado de grande habilidade para o desenho foi o Naquele tempo, terminada a guerra, a desmobilização primeiro "sebenteiro" desse Professor, ilustrando os de numerosos médicos veterinários (milicianos ou apontamentos por ele elaborados. O Professor Tropa militares) que reocupavam as suas antigas ocupações não o esqueceu, pois, em carta pessoal datada de 12 de teve como consequência natural uma saturação do Março de 1963, afirmava texualmente: «O senhor tem mercado, mesmo para um licenciado dos mais que ser aproveitado para o Ensino Superior [...] graduados do seu curso, como era o caso do colega sinto que deve ir para os Estudos Gerais. Se não o Matos. Mesmo assim, depois de exercer clínica em aproveitarem é porque desconhecem o mérito e sobre- Cantanhede, foi veterinário assalariado na Intendência tudo as qualidades dos jovens». de Pecuária de Coimbra (1947). Essa situação, Penso, no entanto, que a carreira académica não extremamente precária, não podia seduzi-lo. o atraía. Pelo menos a carta do Professor não teve As Colónias, que haviam sofrido um desenvolvi- consequências. mento notável durante esse período, surgiam como Concluída a licenciatura, em 1946, não era fácil recurso alternativo, principalmente Angola, com a sua conseguir um emprego estável. Albuquerque Matos pecuária e pescado... Sabia-se pouco da complexa procurou então completar a formação recebida na patologia das populações animais, quase toda por Escola, fazendo uma série de estágios na Intendência estudar. Simplesmente, a ida para qualquer das de Pecuária de Coimbra (1946), no Matadouro colónias era feita por concurso público, pois os únicos Municipal de Lisboa (1946) e no Serviço de serviços existentes eram os oficiais, e o último ainda Parasitologia do Laboratório Central de Patologia estava válido. Aliás, o mesmo sucedia com outras Veterinária (1948). Frequentou também o Curso de profissões como a Agronomia, a Silvicultura e a Avicultura, da Direcção Geral dos Serviços Pecuários Saúde. Desconhecia-se quando seria aberto novo (1946). Mais tarde, já com uma boa formação concurso. 371 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 371-375 A Companhia de Diamantes de Angola - serviço da Diamang, durante um curto período de Diamang tempo, pois na sequência de desentendimento com o "acting manager" Eng. Retie, foi-lhe imposto o fim do Em 1913 os três prospectores da Companhia de contrato nos termos do art. 12º: quando isso conviesse Pesquisas Mineiras de Angola descobriram os à Companhia, sem aviso prévio e sem justificar a primeiros diamantes num acampamento junto à sua demissão, mediante o pagamento de uma indemnização fronteira Nordeste, na região da Lunda, a Oeste do rio igual a "três meses de ordenado", como descrevemos Cassai, em terras de habitantes ainda não submetidos noutro local destas memórias. à ocupação portuguesa. Os postos militares mais Continuam, no entanto as aquisições de gado de avançados encontravam-se a cerca de 300 km a oeste talho, tracção e criação. No fim de 1922 o efectivo era do rio Cassai. de 2900 cabeças – dos quais 958 vacas e touros e 1072 A Companhia de Diamantes de Angola (Diamang) bois de trabalho. fundou-se em 16 de Outubro de 1917. Dificuldades Em 1927 a ideia da criação própria de bovinos decorrentes da I Grande Guerra atrasaram as sofreu um forte revés, por ter sido possível fazer a sua explorações mineiras até 1919 quando se instalou na aquisição nas Rodésias a preços inferiores aos de Lunda. A produção diamantífera aumentou gradual- Angola. As dificuldades na alimentação eram grandes, mente obrigando ao incremento das populações as perdas pelas doenças muito elevadas. Em 1927 o europeias e nativas. Criaram-se novos Serviços, número de cabeças de bovinos mantém-se à volta das indispensáveis ao progresso da empresa que possuía o 4000 cabeças de bovinos. A Diamang decide vender as exclusivo de pesquisa e lavra dos diamantes em toda a suas principais explorações pecuárias à Companhia Colónia. Para além dos serviços técnicos e adminis- Agrícola e Pecuária de Angola ("K") e durante os 20 trativos indispensáveis ao seu progresso, criaram-se anos seguintes limitar-se-á ao gado julgado necessário serviços de assistência médico-sanitária, cultural para carne durante um ano e algumas vacas para e recreativa para os seus trabalhadores e toda a fornecimento de manteiga e leite aos empregados. população do Chitado. Fundou-se o Museu do Dundo A partir de 1928 o fornecimento anual de gado e o Laboratório de Investigação Biológica, aos quais bovino passou a ser efectuado pela "K" e são os iriam caber o estudo e conservação de colecções médicos vetrinários que lhe prestam a assistência. referentes à Etnografia e História da Fauna, Flora, Foi somente depois de terminada a guerra de 1939-45 Arqueologia, Mineralogia e Folclore da Lunda. Os que a ideia de possuir explorações pecuárias próprias trabalhos efectuados pelos melhores especialistas se impôs, pelo desenvolvimento da Companhia e seriam divulgados pelas suas excelentes publicações consequente aumento das populações que a serviam. Culturais e Científicas. Igualmente surgiu a Estação Meteorológica do Dundo que fornecia observações destinadas à agricultura e à navegação aérea. Albuquerque de Matos na Diamang Além de tudo isso a Diamang preocupou-se com a Pecuária que fornecia gado de trabalho e alimentos Um anúncio publicado nos jornais diários, em para os seus os trabalhadores. Em 1919 a Companhia meados de 1947 deu-lhe conhecimento que a ainda era abastecida a partir do Bié (Angola) e Diamang procurava contratar um médico veterinário Charlesville (Congo Belga). Existiam apenas algumas para os seus serviços na Lunda. Respondendo ao pequenas criações de gado bovino indígena que pedido, foi submetido a entrevista com o respectivo forneciam leite e manteiga aos empregados europeus. administrador-delegado, Comandante Ernesto de Outras pequenas criações de ovinos, caprinos e suínos Vilhena, e seleccionado. O contrato que assinou, em contribuíam para o abastecimento em carne. 12 de Fevereiro de 1947, numa folha de papel selado Em 1920 desenhou-se um grande projecto para a com $30, segundo escreve, «...era mais do que leonino, criação de bovinos em larga escala, com um efectivo era Diamantino e foi melhorando, com o passar do de 6000 cabeças, divididas em manadas conduzidas tempo, pela aposição de cláusulas e novas exigências» por pastores europeus a cavalo. Encontraram-se concluindo: «mas, ou se tinha necessidade e espírito grandes dificuldades na sua realização, sobretudo pela de aventura ou se rejeitava!». «Desses contratos elevada mortalidade causada pela peripneumonia assinei eu cinco! Mas de 30 meses além dos contagiosa. Em todo o caso o estado geral do gado era prolongamentos...». bom, de tal modo que o Alto-comissário General O primeiro trabalho feito por Albuquerque Matos Norton de Matos, quando em 1921 visitou a Lunda, para a Diamang foi prestar assistência, durante a recomendou que a produção fosse desenvolvida e viagem a bordo do navio Benguela e depois até à fosse contratado um médico-veterinário. Por esse Lunda, a um núcleo de animais, adquiridos em tempo a influência americana ainda era dominante e o Portugal e constituído por gado leiteiro das raças inglês a língua mais falada. No entanto a adopção da Turina e Holandesa, suínos Large-White e cavalos de referida recomendação levou à contratação do Dr. sela. Os três novilhos e uma novilha da raça Holandesa Abel Pratas, que foi o primeiro médico veterinário ao foram cedidos pela Direcção Geral dos Serviços 372 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 371-375 Pecuários do lote com uma centena de animais por ela 3 - Bovinos importados directamente da Holanda. Os bovinos de raça Turina foram adquiridos na região de Aveiro e os 3.1 - Produção de leite - Até 1948 todo o leite cavalos provieram da Estação Zootécnica Nacional. consumido pelos empregados da companhia era Recordo ainda a passagem de Victor Matos por Nova produzido por vacas indígenas, por vezes cruzadas Lisboa, comandando a operação "Arca de Noé" com touros turinos. Em 1948 fizeram-se as primeiras numa composição especial do caminho-de-ferro de importações de 10 vacas das raças turina e holandesa. Benguela. Recordo-me que os animais foram Conseguiram-se produções razoáveis de leite, pelo desembarcados para que descansassem, antes de que se fizeram novas importações de 44 animais em continuarem viagem. Tal como ele, eu também era 1952 e 1955. O número de descendentes era de 115, recém-chegado à colónia. dos quais 66 vacas em fins de 1961. A Secção Agricolo-Pecuária foi desdobrada em Numa tentativa de criar animais adaptados à região duas: "Agricultura" e "Pecuária", passando esta a ser importaram-se da Rodésia do Sul (Zâmbia) 16 chefiada pelo médico veterinário a partir de Junho de novilhas e 4 novilhos de raça Jersey que pudessem ser 1948, a qual veio depois, como consequência do mantidos em regime que não fosse o de estabulação desenvolvimento atingido, a ser transformada em permanente. Contra as expectativas o efectivo Jersey Serviço. mostrou-se de difícil aclimatação. Dos cruzamentos Vejamos, sumariamente, alguns resultados realizados existiam, em 1961, 55 animais dos quais só conseguidos e programas estabelecidos. 13 tinham iniciado a produção. A produção de leite passou de 93.561 litros em 1948 para 255.627 litros em 1961. 1 - Avicultura 3.2 - Produção de carne 1.1 - Galináceos - Em fins de 1948 existiam apenas umas escassas centenas de galináceos de raça 3.2.1 - Gado de talho - Foi somente a partir de 1957 indefinida que haviam produzido 14.500 ovos e que se iniciaram criações de gado de corte na região. fornecido 324 aves. Foram ensaiadas as raças Até esse ano todo o gado para o abastecimento de carne Leghorn, Australorp, Transmontana e Rhode Island era fornecido pela "K". Em 1961 o número de animais Red. Em 1952, importaram-se 1000 pintos do dia da adquiridos foi de 2247 e o de abatidos de 3346. África do Sul e iniciou-se a avicultura em larga escala, tornando já possível o fornecimento do respectivo 3.2.2 - Gado de criação - Depois de fazer o núcleo-base, constítuido por 1000 pintos do dia e 3000 reconhecimento da região, em 1954, para determinar ovos para incubação, ao aviário de Malange em 1955 as zonas mais favoráveis, iniciaram-se, 2 anos depois, e 1956. Posteriormente a raça Rhode Island foi as aquisições de pequenos núcleos de raças angolanas substituída pela New-Hampshire. A Secção de no Sul da Colónia e, no ex-Congo Belga produtos Pecuária detinha dois aviários em 1961, com 13.844 resultantes dos cruzamentos Afrikander e Devon. Os galináceos que forneceram 9725 pintos de um dia, bons resultados obtidos levaram ao aumento das 18.144 aves para consumo e 604.977 ovos, aquisições desta procedência e da Rodésia do Sul quantidades suficientes para o abastecimento da (Zâmbia). No fim de 1961 o total de gado de criação população mais diferenciada. De assinalar que todas era de 11.000 cabeças, prevendo-se o auto-abasteci- as rações eram compostas à base de produtos locais. mento em 1965, quando o gado de criação atingisse as Existiam incubadoras para 8000 ovos. 20.000. As vacas angolanas foram também submetidas a ensaios de cruzamentos com touros Zebu, dando 1.2 - Meleagrídeos - Depois de 1955 importaram-se excelentes resultados. 200 perus da raça Beltsville - Small White. No fim de 1961 existiam 798 perus e produziram-se 12.062 ovos. 4 - Instalações 1.3 - Palmípedes - Um pequeno núcleo Khaki- O programa de desenvolvimento pecuário, iniciado Campbell, que forneceu, em 1961, 150 aves e 5594 em 1956, implicou a ocupação de terras que atingiam ovos. 5 anos depois o total de 79.500 hectares, divididos em 10 unidades. Foram abertas centenas de quilómetros de "picadas", construídas pontes, casas para empregados 2 - Suínos e trabalhadores e 350 quilómetros de vedações de As criações de suínos de raças primitivas foram arame de aço a 4 fiadas. Ficaram existentes 10 sendo substituídas pelas de "Large-White" trazidas de tanques-banheiros por imersão e 4 por aspersão, Portugal em 1948 e 1955. Em fins de 1961 existiam 10 mangas de vacinação, 7 balanças para gado, 534 animais que contribuíram com 670 adultos e armazéns, barragens, captações de água, enfim, tudo o 36 adolescentes para o abastecimento de carnes, que era indispensável a uma exploração pecuária de satisfazendo as necessidades locais. grande envergadura como se propunha a Diamang. 373 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 371-375 5 - Pessoal Aveiro e Figueira da Foz. Interessou-se então pelos problemas da pesca e da tecnologia do bacalhau e Em 1952 o quadro do pessoal médico veterinário foi pelos da respectiva armazenagem frigorífica. Por aumentado para dois e depois para 5, por se preverem inerência do cargo foi vogal permanente das graves problemas sanitários e não haver pessoal subal- Comissões Técnicas Regionais dos Distritos de terno com treino adequado. Em todo caso, existiam 12 Aveiro, Coimbra, Viseu, Leiria e Castelo Branco. auxiliares de pecuária, 1 escriturário e um auxiliar de Contudo continuou a manter interesse pelos construções. Com a alteração da Secção para Serviço problemas da produção pecuária, tendo realizado o quadro de médicos veterinários foi aumentado para viagens de estudo a organizações cooperativas da 7, estando já preenchidas 4 vagas. Previa-se o aumento Holanda e da França. dos auxiliares de pecuária para dezasseis, devido á necessidade de instalar novas explorações. Albuquerque Matos desempenhou funções de Chefe de Secção de Pecuária até Setembro de 1960, Chefe do Regresso a Angola Serviço Agro-pecuário de Fevereiro de 1961 a Julho de 1962, quando a Secção foi desdobrada em dois A reforma do Dr. Abel Pratas, que fora Director dos Serviços, ficando ele como chefe do Serviço de Serviços de Veterinária em Angola, durante várias Pecuária. O Serviço Agrário foi entregue a um dezenas de anos, e a promoção do seu adjunto Dr. Engenheiro Agrónomo com vencimento superior ao Isidoro Martins dos Santos a Inspector Provincial, seu. Sentindo-se desconsiderado pela nova organiza- estava gerando um natural movimento de interesse ção, requereu o fim do seu contrato e regressou a pelo cargo de Director Provincial dos Serviços de Portugal em Abril de 1963. Veterinária que, nos termos do respectivo Estatuto, era Durante os 15 anos ao serviço da Diamang de livre escolha do Ministro de entre os médicos organizou e desenvolveu a pecuária em moldes de veterinários chefes do quadro, o que não era do exploração racional, introduziu raças importadas de agrado do Governo Central sempre cioso das suas bovinos, suínos e aves, estudou a sua aclimação, prerrogativas. Segundo a legislação em vigor só patologia e condições locais de alimentação e repro- excepcionalmente poderia essa nomeação recair num dução; realizou a prospecção para o desenvolvimento médico veterinário privado. A escolha vai cair sobre da criação extensiva de bovinos; na Circunscrição um médico veterinário que desenvolvera uma activi- do Chitado instalou 8 unidades de exploração que, dade excepcional ao serviço de uma empresa privada adicionadas às duas já existentes, totalizavam cerca de - o colega Albuquerque de Matos - que é nomeado, em 80.000 hectares ocupados com 22.000 cabeças de comissão ordinária de serviço, por Portaria de 14 de gado bovino. Para 1963 projectava-se a ocupação de Setembro de 1967. Tomou posse no Ministério do mais 12.000 hectares, para serem ocupados por mais Ultramar, em 28 de Dezembro do mesmo ano e iniciou duas unidades de exploração. as suas funções em Angola, em 25 de Janeiro de 1968. A partir de 1951, em viagens de estudo percorreu Ficava dependente do Secretário Provincial do o ex-Congo Belga, a ex-África Equatorial Francesa e Fomento Rural que era desempenhado por um outro a ex-Rodésia do Sul (Zâmbia). Os contactos com o colega, o Dr. Vasco Antunes Sousa Dias. Por ocasião ex-Congo Belga mantiveram-se até 1961 por frequentes da posse em Lisboa e sua confirmação em Luanda viagens de informação e missões de compras. Em produziram-se os habituais discursos, pelo Ministro, Angola, colaborando com os Serviços de Veterinária, pelo referido Secretário Provincial e pelo empossado. realizou repetidas viagens de informação por toda a Naturalmente que Albuquerque de Matos tinha o seu Colónia e missões de compras no Sul, estacionando próprio programa para o desempenho do seu cargo, alguns meses na região do Humbe, adquirindo gado mas o mesmo sucedia com o Secretário Provincial Dr. bovino e organizando a sua deslocação em autênticos Sousa Dias que era quem mandava... Qualquer deles "comboios de gado" que se deslocavam "a passo de possuía uma personalidade forte... e o choque foi boi" até à Lunda. Em Moçambique visitou Estações inevitável. Vítor Matos recusava-se a contemporizar Zootécnicas e as mais importantes criações de gado com a burocracia oficial, como profundo conhecedor bovino de leite e de corte. do meio ambiente e da sua melhor utilização para o fomento pecuário em Angola. No desempenho das suas funções foi: Presidente da Comissão Provincial Regresso a Portugal em 1963 de Fomento Pecuário e Presidente do Conselho Administrativo do Fundo de Fomento Pecuário; Vogal Em Fevereiro de 1964 foi nomeado Delegado da do Conselho Administrativo da Caixa de Crédito Comissão Reguladora do Comércio do Bacalhau, em Agro-pecuário de Angola; Vogal do Grupo de 374 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 371-375 Trabalho para o Estudo do Fomento Pecuário do Trabalhos publicados Ultramar; Membro do Grupo de Trabalho para a revisão do III Plano de Fomento (sector Pecuário) 1 – Contribuição para o estudo da Doença em Angola; Presidente do Fundo de Caça; Vogal Respiratória Crónica das Aves – Furaltadona e do Conselho de Protecção da Natureza; Vogal Tilosina-Furaltadona (1969). Instituto de Investigação da Comissão Executiva da Junta Provincial de Científica de Angola, Luanda. Povoamento de Angola. Como Delegado de Angola 2 – Mycoplasma (1970). Bibliografia Temática – participou em numerosas reuniões internacionais em: Centro de Documentação Científica do Instituto de Paris, Luanda, Lourenço Marques, Pretória e Investigação Científica de Angola, Luanda. Johannesburg. Em 1969 visita oficialmente o Instituto 3 – Intoxicações Alimentares – Procedimentos a Francês para a Febre Aftosa e em Inglaterra os adoptar em surtos colectivos (col. de H. Tondela e Laboratórios de Weibridge e o Centro de Referência Cruz). Mundial para a Febre Aftosa em Pirbright. Em 1970 4 – Ocupação Pecuária de Angola (2005). RPCV, visita na República Federal Alemã: as Estações de 100 (555-556): 115–123. Melhoramento animal em Hanover, Warburg, Landshut, Deustad e Munique. Nota do autor deste escrito – Infelizmente a maior parte dos trabalhos científicos de Albuquerque Matos perderam-se nos arquivos da Diamang. Muitos outros, Regresso definitivo a Portugal como os apresentados nas Jornadas Veterinárias de Angola e de Moçambique foram apenas policopiados Por despacho de 30 de Janeiro de 1971, foi-lhe e distribuídos aos participantes ou tiveram a publi- dada por finda a comissão ordinária de serviço como cação impedida por motivos relacionados com a inde- Director Provincial dos Serviços de Veterinária de pendência de Angola. Angola. Terminou as suas funções em 22 de Fevereiro do mesmo ano e regressou a Lisboa no dia seguinte. Foi louvado por despacho do Governador-geral de Agradecimentos Angola de 15 de Março de 1971. Retoma funções na Comissão Reguladora do À Exma. Senhora D. Maria Augusta Albuquerque de Comércio do Bacalhau. O seu sentido de previdência Matos e ao colega H. Tondela e Cruz pelos elementos aconselhara-o a ir para Angola em comissão ordinária recolhidos no arquivo pessoal do falecido e sem os de serviço e, desse modo, ficara com direito ao seu quais este trabalho não poderia ter sido escrito. Aos lugar logo que terminasse aquela comissão. colegas Alexandre Leitão e Cardoso Resende, pelos seus incentivos e ajudas pessoais. 375 SUPLEMENTO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS VII Encontro da Sociedade Portuguesa de Epidemiologia e Medicina Veterinária Preventiva Auditório do Edifício Cultural da Câmara Municipal de Peniche Peniche, 24 e 25 de Novembro de 2007 Em 2007, a SPEMVP realizou a sua reunião André Moura (biólogo marinho, especialista em científica anual em Peniche, tendo a organização cetáceos e doutorando na School of Biological and estado a cargo de Ana Elisa Vieira da Silva (Médica Biomedical Sciences da Universidade de Durham, Veterinária Municipal de Peniche) e Virgílio da Inglaterra) que apresentou uma comunicação sobre Silva Almeida (Direcção da SPEMVP). variação genética do sistema imunitário de golfinhos O Encontro contou com a apresentação de 23 da costa portuguesa; e Peter Rock, ornitólogo espe- comunicações orais e 9 posters, cujos resumos aqui cialista em aves sinantrópicas que falou sobre métodos se apresentam, e com a participação de oitenta de controlo de gaivotas urbanas. médicos veterinários e estudantes universitários. O VII Encontro teve o patrocínio do Município de O Prémio "Peter Ellis", atribuído ao melhor Peniche, Vetlima, TNA – Tecnologia e Nutrição trabalho nas áreas da Epidemiologia e da Medicina Animal, Merial Portuguesa – Saúde Animal Lda., Veterinária Preventiva, realizado por estudantes dos Esteve Veterinária, Bayer Saúde Animal, B-Braun, cursos de Medicina Veterinária nacionais, distin- António G. Oliveira, British Council e FCT. Contou guiu o poster "Aplicação da Detecção Remota à ainda com apoios de Huiotis, Hotel Praia Norte, Epidemiologia" da autoria de Hugo Martins e de Nespresso, Companhia das Lezírias e Veterinária Telmo Nunes. O prémio foi entregue pelo próprio Actual. Peter Ellis, convidado de honra do VII Encontro da SPEMVP. O Dr. Peter Ellis é um nome incontornável no ensino, na investigação e na consolidação da Epidemiologia Económica Veterinária enquanto Comunicações orais ciência. Em 1976 foi co-fundador da International Society for Veterinary Epidemiology and Economics Analysis of immune system genetic (ISVEE). Criou, em 1977, na Universidade de variation in delphinids from the Reading, em Inglaterra, a primeira unidade europeia Portuguese coast de investigação e prestação de serviços em Epidemiologia Veterinária Económica, a VEERU André Moura (Veterinary Epidemiology and Economics Research Universidade de Durham Unit). Nos últimos trinta anos, a VEERU treinou 260 estudantes MSc, MPhil e PhD em Epidemiologia Cetaceans have high dispersal capabilities and live Veterinária Económica, coordenou e participou em in an environment that presents few geographic barriers inúmeros projectos internacionais de investigação e to dispersal. As such, it was predicted that cetacean de desenvolvimento. A intensa actividade extra- species would be comprised of large panmitic popula- muros da VEERU contribui decisivamente para que tions widespread over large areas. However, several a Universidade de Reading obtivesse o Queen's studies revealed the existence of both morphological Anniversary Prize for Higher and Further Education and molecular units confined to a geographic area em 1998, e de novo em 2005 . smaller than their dispersal abilities (Hoelzel, 1994; Como oradores convidados, o VII Encontro da Hoelzel, 2002). This is the case of bottlenose SPEMVP, contou com a presença de Dirk Pfiffer (Tursiops truncatus ) and common-dolphin ( Delphinus (Professor de Epidemiologia Veterinária no Royal delphis ) populations along the European coast. For the Veterinary College da University of London e na bottlenose-dolphin, genetic variation was geographi- London School of Hygiene and Tropical Medicine) cally structured along Europe, with the Iberian West que interveio sobre a pandemia de Gripe Aviária; coast revealing the highest levels of variation (Natoli 377 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 et al ., 2005; Natoli et al ., 2004). The common-dolphin Projecto piloto de implementação de has also revealed geographic structuring in morphology rede de epidemiovigilância animal em and diet, with variation detected along relatively short Trás-os-Montes coastlines such as western Iberia (Murphy et al ., 2006; Silva, 1999; Pusineri et al ., 2007). Also, genetic analysis 1 has revealed a possible correlation between different Júlia Rodrigues Mascarenhas , Miguel Ângelo 1 2 morphotypes and particular environments (Natoli et Fernandes , Raimundo Maurício , Humberto 1 al ., In Press; Amaral et al ., 2007). Pessegueiro 1 One hypothesis to explain this is that different Direcção Regional de Agricultura e Pescas do Norte 2 environmental pressures are maintaining the apparent Instituto Politécnico de Bragança - Escola Superior Agrária structuring through natural selection. To test this hypothesis, variation in non-neutral genetic markers No âmbito do projecto transfronteiriço INTERREG can be compared to neutral genetic markers, super- III, e tendo em vista eliminar obstáculos de natureza imposed with environmental data, and congruence sanitária, à livre circulação de animais e produtos de between datasets assessed. One of the biggest challenges origem animal, foi desenvolvido entre a Região of using this approach in non-model animals is the agrária de Trás-os-Montes e a Comunidade de Castilla difficulty in finding appropriate non-neutral markers y León um projecto de rede de epidemiovigilância whose function is sufficiently well known to allow a animal. robust conclusion to be made. One such example is Os objectivos do projecto centram-se no desenvolvi- the Major Histocompatibility Complex (MHC) gene mento das acções de saneamento das espécies family, whose products mediate pathogen recognition pecuárias (1), na introdução do sistema de identifi- by the immune system. The commonly accepted cação geográfica no registo das explorações pecuárias framework is that diversity in the MHC encoding (2), no estabelecimento de rede de informação epi- genes allows the successful resistance to different demiológica entre as diferentes instituições envolvidas pathogens (Bernatchez & Landry, 2003; Hughes & (3) e na agilização do sistema de notificação de Yeager, 1998). As such, by looking at MHC diversity doenças. Os beneficiários directos do sistema são os and comparing it to neutral markers, it is possible Serviços Oficiais, o Laboratório de apoio e certifi- to identify differences in pathogen load in natura l cação das explorações agro-pecuárias, os produtores populations. agropecuários, os agentes económicos, bem como os In this talk I’ll present preliminary results on the agentes de certificação e marketing. Para além disso MHC variation along the Portuguese coast for os beneficiários indirectos do sistema envolvem ainda common-dolphin compared to neutral markers. This os profissionais do sector e outros serviços de controlo. coast is a good system because it is ecologically O projecto em fase piloto definiu uma estratégia diverse owing to being in the transition between the baseada em três princípios: Eficácia, pela aplicação Mediterranean and Eurosiberian biogeographic prática e célere dos planos de contingência das regions (Alcaraz et al ., 2006). Also common-dolphins doenças dos animais, particularmente em zonas are abundant in the Portuguese coast and show both fronteiriças; Eficiência, através da maximização dos morphological and genetic variation that indicates recursos na aplicação dos planos de contingência e de possible geographic structure (Sequeira et al ., 1996; controlo e erradicação de zoonoses; e Sustentabilidade, Natoli et al ., In Press; Amaral et al ., 2007). During the pelo envolvimento dos diferentes sectores interessados 2007 summer months, skin samples from wild ranging e adopção de mecanismos adequados de gestão da common-dolphins were obtained along the southern informação. and southwest coast and the location where samples A estratégia definida objectiva-se em quatro were collected was recorded. In future years, more resultados principais: samples will be obtained from the northern coast of Resultado 1: o reforço da identificação animal Portugal in order to sample the whole coast. As no (fundamentos para identificação electrónica); samples were obtained from bottlenose dolphins, this Resultado 2: o registo de explorações – Sistema de objective will be pursued in the following years. Informação Geográfica; Samples obtained in Portugal will be compared with Resultado 3: a adopção de um circuito de data from strandings in other areas of Europe. Data informação e de níveis de competência (movimen- obtained will also be interpreted in a conservation tação animais); perspective, bearing in mind recent conservation Resultado 4: o controlo das doenças dos animais e actions along Europe concerning this species. fauna silvestre. Tais resultados estarão plasmados em actividades a desenvolver que incluem a organização e implementação de tarefas (1), a recolha de dados ao nível das explorações agro-pecuárias (2), a identifi- cação animal e o sistema de registo (3), a avaliação e estudos de prevalência de zoonoses na região 378 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 transfronteiriça (4) e a produção de informação e arquipélago dos Açores. O presente trabalho teve o vigor do circuito informativo. Apresentam-se os como objectivo responder às questões seguintes: resultados preliminares e o desenvolvimento do Quais os OE essenciais nas condições de produção projecto. dos Açores? Quais os OE mais deficitários nos bovinos explorados? Quais as consequências do insuficiente aporte destes micro-nutrientes na alimen- Vigilância epidemiológica da PPCB em tação dos bovinos? Portugal Tendo em vista a avaliação do estado em OE nos bovinos, foram colhidas e analisadas no laboratório do Luciano Duarte NBVC ( Nutrition-Biochimie Vétérinaire Consultants) , Direcção de Serviços de Veterinária da Região Norte em França, mais de 500 amostras de sangue de bovino de 69 explorações diferentes ilhas dos Açores (53 de A Peripneumonia Contagiosa dos Bovinos (PPCB) São Miguel, 8 da Terceira, 6 da Graciosa e 2 de Santa é uma doença respiratória específica dos bovinos, Maria). Foram analisadas 287 amostras de vacas causada pelo Mycoplasma mycoides subsp. mycoides leiteiras, 129 de novilhas, 43 de bovinos de raça Brava, SC, transmitido por inalação de aerossóis infectantes. 13 de vitelos recém-nascidos e 12 de bovinos de carne É uma doença que se instala lenta e insidiosamente, da raça Limousine e Charolesa. podendo causar até 90% de morbilidade e 50% de Os OE de maior importância nesta região, devido à mortalidade num efectivo atingido. O primeiro Plano natureza vulcânica dos solos são o iodo, o cobalto, o de Luta contra a PPCB em Portugal foi instituído em selénio, o cobre e o zinco. 1983, após a declaração de um foco da doença no Os resultados obtidos indicam que mais de 92% dos concelho de Monção. A implementação de Planos de bovinos estudados apresentaram níveis muito baixos Erradicação suportados por um vasto e coordenado de iodo plasmático, associados a valores de tiroxina conjunto de medidas de profilaxia e polícia sanitária inferiores ao normal. Cerca de 85% das explorações permitiu reduzir a incidência da doença ao longo dos rastreadas apresentaram pelo menos um bovino anos, tendo sido diagnosticado o último foco de PPCB deficitário em vitamina B12 (indicadora do estado em Portugal na Região do Entre-Douro e Minho em nutricional em cobalto). As carências neste elemento 1999. Culminando com o trabalho desenvolvido foram mais acentuadas nos bovinos de carne (75%), durante cerca de 20 anos, em 2003, Portugal é reco- raça brava (54%), bovinos jovens da raça HF (mais de nhecido como país Indemne de PPCB pela OIE. No 51%) e vacas leiteiras (37%), respectivamente. Cerca ano 2000 deu-se início a uma nova etapa de actuação, de 31% das vacas e 85% das novilhas analisadas com a implementação de um Plano de Vigilância apresentavam valores baixos de selénio (glutationa Nacional tendo como objectivos, a detecção precoce peroxidase). Os valores de cobre revelaram que cerca de novos focos e, fundamentalmente, a demonstração de 31% das vacas leiteiras e 72% das novilhas se da indemnidade de Portugal perante as instituições encontravam carenciadas neste elemento. internacionais. Cerca de 38% das vacas apresentaram valores É apresentada uma avaliação epidemiológica, deficitários de zinco, enquanto que nas novilhas este qualitativa e qualitativa, do Plano de Vigilância da valor ascendeu a 53%. PPCB em Portugal de 2000 a 2007. Os resultados obtidos neste rastreio em OE indicam que estes micronutrientes são importantes factores limitativos da expressão do potencial produtivo e da Carências em oligoelementos em bovinos saúde dos bovinos explorados nesta região. O reforço alimentar em OE é fundamental para garantir bons dos Açores níveis de produtividade e prevenir o aparecimento de patologias como a infertilidade, aumento das células 1 1 2 Carlos Pinto , José Viana e Paulo Aranha somáticas no leite e mortalidade em vitelos. Estes são 1 Serviço de Desenvolvimento Agrário de São Miguel, os principais problemas sanitários que a pecuária 9500-343 Ponta Delgada, Portugal ([email protected]) açoriana enfrenta na actualidade. 2 Sociedade Açoriana de Sabões, Avenida Litoral, 19, A avaliação e a correcção das carências em minerais, 9560-401 Lagoa, Açores particularmente dos OE, deverão ser incluídas nos programas profilácticos sanitários e no maneio O fornecimento de oligoelementos (OE) na alimentar dos bovinos de todas as explorações do alimentação é essencial para a saúde e produtividade arquipélago, de forma a garantir a sua rentabilidade e dos bovinos. A importância destes micronutrientes é sustentabilidade futura. particularmente importante quando exploramos animais de elevado potencial genético, em condições de pastoreio e em solos de origem vulcânica com carências específicas em OE como se verifica no 379 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Avaliação do efeito da administração de Análise da dispersão pelo vento de oligoelementos no crescimento de novilhos culicoides imicola em Portugal Continental Carlos Pinto 1, José Viana 1 e Paulo Aranha 2 Nunes T, Martins H, Baptista F, Fonseca I, 1Serviço de Desenvolvimento Agrário de São Miguel, Boinas F 9500-343 Ponta Delgada, Portugal ([email protected]) CIISA – Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon, 2Sociedade Açoriana de Sabões, Avenida Litoral, 19, Av. da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa 9560-401 Lagoa, Açores O conhecimento dos factores ambientais que Tendo-se concluído que existem carências generali- condicionam a ocorrência e a dispersão de insectos zadas em iodo, cobalto, selénio, cobre e zinco na vectores de doenças é fundamental para o estudo e população bovina dos Açores foram implementados e controlo destas. A doença da Língua Azul é uma desenvolvidos ensaios com e sem suplementação arbovirose que afecta ruminantes, sendo transmitida nestes oligoelementos (OE) para avaliar de uma forma por algumas espécies do género Culicoides spp objectiva os seus efeitos no crescimento de novilhos (Diptera: Ceratopogonidae). machos da raça Holstein-Friesian. Estes insectos são extremamente sensíveis às Foram constituídos 5 grupos de 22 a 32 novilhos no condições climatéricas, sendo o seu nicho ecológico Posto Experimental de Culturas de Altitude (PECA) determinado por factores como a temperatura, o tipo e do Serviço de Desenvolvimento Agrário de São ocupação do solo e a densidade animal. Miguel (SDASM). Os 5 grupos foram divididos em Desde Maio de 2005 está implementado em dois subgrupos homogéneos de forma aleatória para Portugal um programa de vigilância entomológica que o peso, o número, tamanho e idade dos novilhos de culicoides . A observação pontual de Culicoides fossem idênticos. Um subgrupo foi suplementado com imicola em áreas fora do seu nicho ecológico levanta OE e outro não, designado por controlo. a hipótese de estas capturas resultarem da dispersão de Todos os novilhos foram desparasitados no início indivíduos resultante do transporte pelo vento. e final do ensaio. Foram realizadas análises hema- O objectivo deste trabalho consiste na investigação tológicas e pesquisa de OE numa amostra significativa das ocorrências de Culicoides imicola fora do seu nicho de animais, no início e no final do ensaio. Os novilhos ecológico, ou em períodos do tempo considerados foram explorados em regime de pastoreio rotacional anormais para as zonas de colheita. em pastagens permanentes compostas predominante- Para este estudo foram calculadas as retrotajectorias mente por azevém e trevo branco. de massas de ar utilizado o modelo Hysplit da NOAA Foram testadas cápsulas intra-ruminais de libertação (Draxler e Rolph, 2003), a partir dos pontos de colheita lenta de OE em 3 grupos de novilhos. Foram avaliados considerados anormais, num ponto de destino de 10 o efeito do selénio e iodo na água da bebida e cápsulas metros AGL, com uma duração de 48 horas e até ao de cobalto administradas por via oral em outros 3 momento de colocação das armadilhas. Estas retrotra- grupos de novilhos. jectorias foram comparadas com o padrão de direcção Registaram-se diferenças significativas nos pesos do vento para o território continental. vivos médios entre os animais suplementados com OE Embora o estudo se encontre em fase final de e os controlos respectivos. Houve melhoria nos análise, foi possível observar que uma proporção parâmetros hematológicos nos novilhos suplementados, significativa das ocorrências está relacionada com o que faz antever maior resistência às doenças com retrotrajectorias que têm origem ou passagem por consequente incremento no seu estado hígido. zonas onde os Culicoides imicola são capturados em Os resultados obtidos apontam para que a suplemen- números consideráveis e resultam de ventos com uma tação com micro-minerais melhore a produtividade e a origem Sul-Sudeste relativamente pouco frequentes rentabilidade das explorações de bovinos em pastoreio no Território Continental. dos Açores, contribuindo para a sua sustentabilidade, a médio e a longo prazo. 380 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Resultados do rastreio apícola nacional intestinal) em 18,8% dos apiários (14,8-22,9%). As 2006 outras doenças pesquisadas foram identificadas em menor percentagem de apiários, nomeadamente a Francisco Santos 1, Yolanda Vaz 2, Mauro Bragança 2, Ascosferiose ( fungo Ascosphaera sp.) (3,7%; IC 1,7- Maria José Valério 3, Sofia Quintans 1 5,6%), a Loque Americana ( Paenibacillus larvae ) 1Direcção-Geral de Veterinária (2,3%; IC 0,7-3,8%), Amebiase ( Malpigamoeba 2Faculdade de Medicina Veterinária – TULisbon mellificae ) (2,3%; IC 0,7-3,8%), Galeriose ( Galleria 3Laboratório Nacional de Investigação Veterinária mellonella , traça da cera) (1,1%; IC 0,03-2,2%) e a Acarapisose ( Acarapis woodi , ácaro da traqueia) A Direcção-Geral de Veterinária (DGV) em parceria (0,3%; IC >0-0,8%). com a Federação Nacional dos Apicultores de Portugal Não foi possível a identificação de Loque Europeia (FNAP) e com o apoio da Faculdade de Medicina (Melissococcus pluton ) ou Cria Ensacada (vírus). Veterinária (FMV) levou a cabo entre Março e A recolha de dados foi feita em apenas 208 apiários Setembro o Rastreio Apícola Nacional (RAN 2006) (58%). Em 75% destes apiários foi indicada a morte no âmbito do Programa Sanitário Apícola 2006. de pelo menos uma colónia em 2005/06. Foi determi- Os objectivos principais deste rastreio foram nada uma mortalidade por apiário de 34% das determinar a prevalência e distribuição geográfica das colónias eliminadas neste período, variando entre 4 e doenças das abelhas e estimar morbilidade e mortali- 89%. As causas de mortalidade indicadas pelos dade associada. O estudo pretende ainda avaliar o apicultores foram a varroose em apenas 15%, Loque impacto das doenças e apoiar a formulação de medidas Americana 5% e fogo 2% sendo os restantes 78% destinadas a diminuir a incidência das mesmas. devidos a outras causas. O rastreio foi realizado numa amostra seleccionada As principais características dos apiários apontam aleatoriamente em 5 estratos de tamanho de apiário para a existência de apenas 11% de apiários (nº de colónias), proporcionalmente à sua representa- transumantes, com maior expressão no Algarve; cerca tividade, numa população de cerca de 30.500 apiários de um terço dos apiários não é feita substituição registado na base de dados do INGA. Para uma de cera dos quadros do ninho (32%); a alimentação prevalência esperada de 50%, IC 95% e erro de 4%, a de colónias é efectuada por 63% dos apicultores; o amostra aleatória simples é de cerca de 600 apiários, material é desinfectado em 77% dos casos e os os quais distribuídos pelas 7 Direcções Regionais de utensílios são desinfectados 61%, mas destes, 51% Agricultura (DRA), resultaram numa amostra de 656 fazem-no apenas uma vez ao ano. A enxameação apiários. Foram indicados nominalmente à FNAP, os interna está na origem dos novos enxames para 73% produtores aleatoriamente seleccionados a constar da dos apiários, a esta segue-se a enxameação externa amostra em cada DRA. (48%) e o desdobramento (44%). A aquisição foi Em cada apiário, os técnicos da FNAP recolheram efectuada por 9,8% e 12,1% indicaram outras ori- amostras de parte das colmeias, seleccionando-se as gens de enxames em 2005. Foram identificados 13 que apresentaram alguma alteração e as mais expostas diferentes produtos comerciais para o tratamento da (das extremidades). Foram também recolhidos dados, varroose, cuja duração média é entre 1 e 2 meses. registados num questionário. Janeiro e Julho são os meses em que se iniciam As amostras de abelhas, favos e criação foram tratamentos em mais apiários. enviadas ao Laboratório Nacional de Investigação O RAN 2006 não conseguiu cumprir a amostragem Veterinária para análise anatoma-patológica e planificada mas permitiu a obtenção de informação pesquisa de várias doenças das abelhas . importante para a decisão sanitária, útil ao desenho de Os dados foram introduzidos pelos técnicos da futuros programas sanitários apícolas. FNAP numa base de dados com acesso restrito on-line e posteriormente verificados pela DGV e analisados Agradecimentos: com apoio da FMV. FNAP, organizações de apicultores e direcções O RAN 2006 apresentou uma taxa de cumprimento regionais de agricultura. de 63% (356 apiários amostrados) não tendo sido implementado na DRA de Entre-Douro e Minho e cobrindo 125 concelhos (41% dos existentes). A DRATM foi a região com melhor execução, ultrapas- sando os 90%, enquanto que na DRARO foram cumpridas apenas 19% das recolhas previstas. A varroose ( Varroa destructor ), como esperado, foi a parasitose mais frequente afectando 27,0% (IC 22,4- 31,6%) dos apiários, seguindo-se da Senotainiose (forma larvar da Senotaina tricuspis) em 19,8% (IC 15,6-23,9%) e a Nosemose ( Nosema apis , protozoário 381 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Caracterização genética de estirpes Associação entre paratuberculose e do vírus da doença hemorrágica viral contagem de células somáticas obtidos de coelho-bravo ( Oryctolagus cuniculus ) em Portugal entre F.M. Baptista 1, S.S. Nielsen 1, N. Toft 2 1Department of Large Animal Sciences, Faculty of Life Sciences, 1994 e 2006 University of Copenhagen, Grønnegårdsvej 8, DK-1870 Frederiksberg C, Denmark A. Muller 1, 2 *, J. Freitas 1, 2 , E. Silva 1, 2 , J. Abrantes 3, 4 , 2Danish Meat Association, Vinkelvej 11, 8620 Kjellerup, Denmark P. J. Esteves 3, 4 e G. Thompson 1, 2 1Departamento de Clínicas Veterinárias, Instituto de Ciências A Paratuberculose é uma doença de declaração Biomédicas Abel Salazar (ICBAS), Universidade do Porto obrigatória à OIE. Trata-se de uma enterite crónica 2Unidade Multidisciplinar de Investigação Biomédica (UMIB), Universidade do Porto infecciosa, causada pelo Mycobacterium avium subsp. 3Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos Genéticos paratuberculosis (MAP; Chiodini et al ., 1984). (CIBIO), ICETA, Universidade do Porto Publicações recentes sugerem que os consumidores 4Departamento de Zoologia e Antropologia, Faculdade de Ciências da são cronicamente expostos ao MAP através da Universidade do Porto; ingestão de produtos lácteos pasteurizados (Grant et * ICAV–Universidade do Porto, Rua Padre Armando Quintas, 4485-661 Vairão al ., 2002; Ayele et al ., 2005). Telefone: (351) 252 660410; Fax: (351) 252 661780 A Contagem de Células Somáticas (CCS) no leite email: [email protected] destinado a consumo humano é um dos principais indicadores de qualidade e é utilizada em vários países A doença hemorrágica viral (DHV) ocorre na para determinar o preço do leite. Consequentemente, Península Ibérica desde o início dos anos noventa, leite com elevadas CCS é muitas vezes destinado à causando uma redução severa na abundância do alimentação de animais jovens para diminuir a CCS coelho-bravo ( Oryctolagus cuniculus ), de forma a no tanque. Os animais jovens são mais susceptíveis à colocar em risco a sobrevivência da espécie. Um surto infecção por MAP (Doyle, 1953) e podem ser preco- de DHV ocorrido em 2006 no Parque da Cidade do cemente infectados pela ingestão de leite contaminado Porto, permitiu pela primeira vez, a caracterização do (Taylor, 1981). A presença de anticorpos contra o vírus numa população de coelho-bravo em Portugal. MAP no leite pode ser utilizado como indicador de As estirpes isoladas neste estudo formam um grupo excreção do agente (Nielsen and Ersbøll, 2006; separado e diferem em mais de 3% de substituições Nielsen and Toft, 2006). Assim, a determinação de nucleotídicas das estirpes de DHV mais semelhantes, uma associação entre a presença de anticorpos e publicadas e depositadas no "Gene Bank". Não foram elevada CCS pode indicar que o leite com elevada encontradas alterações genéticas consistentes entre CCS esteja infectado com MAP. estirpes das subespécies O. c. algirus e O. c. cuniculus . CCS e anticorpos foram medidos repetidamente em A análise subsequente de estirpes de DHV obtidas 7251 vacas provenientes de 26 explorações leiteiras entre 1994 e 2005 de várias localizações geográficas para investigar a associação entre a ocorrência de no País corroboram este achado. A origem e possível anticorpos contra MAP e elevada CCS. Os resultados evolução do vírus na Península Ibérica em comparação da regressão robusta mostram uma relação log-linear às dos da Europa Central são discutidas. entre a idade em que o animal é pela primeira vez pos- itivo ao ELISA e tem elevada CCS (R 2 = 0.51). Das 1733 vacas positivas para MAP e com elevada CCS, a mensuração de CCS elevada (>300.000 cel/ml) foi anterior à detecção de anticorpos em 46% dos animais. Os resultados obtidos sugerem uma forte associação entre os dois eventos e indicam um potencial risco de transmissão de MAP quando leite com elevada CCS é utilizado para alimentação de animais jovens. 382 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Urban gulls: a problem coming to Gripe aviária e comunicação social Portugal José Pimentel de Carvalho Peter Rock 7, Parkside Avenue, Winterbourne, Bristol BS36 1LU Desde alguns anos que a crise da Gripe Aviária, é [email protected] forte motivo de inquietação na comunidade interna- cional, por motivos de índole cientifica, económica ou With numbers of urban gulls rising exponentially in politica. UK, Media headlines describing the attendant Mais que nunca a sobrevivência das instituições e problems (particularly attacks) have been legion for das empresas baseia-se em dois pilares: a excelência e more than a decade, but by far the most common a comunicação. A comunicação é necessária e benéfica complaints are about noise, followed by mess and se for organizada de modo permanente, tal como damage. The oft-quoted health risks associated with qualquer outro aspecto de gestão corrente. urban gulls are unfounded. Urban gulls do, however, Sem dúvida que o público tem o direito de ser have serious cost implications for local economies. informado e os que detêm o conhecimento têm a Urban colonies of 1,000 pairs are common in UK, obrigação de o transmitir correctamente. No entanto but there are many with more than 2,000 pairs. e como em muitas outras situações, também no Projections for the future (based on observed colonial caso da Gripe Aviária nem toda a comunicação tem growth rates) suggest that massive colonies in excess sido gerida no interesse de todos. of 5,000 pairs will be seen within the next 10 years. Assim, o sensacionalismo de eventuais cenários de Presently, Britain’s urban gull population is likely to pandemia de Gripe, arquitectados pelos meios de be between 130-190,000 pairs, but within 10 years comunicação social e a divulgação de informação por it may reach 1 million pairs with urban gulls far vezes alarmista por parte de algumas instituições, outnumbering wild gulls. originaram nomeadamente na Europa, fortes senti- In response to the exponential growth in numbers of mentos de receio e até mesmo de medo. roof-nesting gulls, the pest control industry has Na presente abordagem transmitimos algumas developed proportionately, but pest control systems informações relacionadas com o modo de comunicar have made little or no impact on annual growth rates com os media, nas suas diversas facetas, tentando and may have further complicated an already complex contribuir, para que os que têm o dever de comunicar issue. Current control methods are described. Lethal o façam com profissionalismo, rigor e eficácia . control is shown to be impractical and unwise. We have never, in any sphere, solved problems without first knowing, precisely, what we are dealing with. Aplicação de dados populacionais à Current control methods simply attempt to deal with vigilância e controlo da Gripe Aviária symptoms; they do not address the root causes. em Portugal We know a great deal about the species involved, but almost all of this information has been derived from Bragança M. 1, Nunes T. 1, Cara-d’Anjo A. 2, studies at wild colonies and it has little or no relevance Santos P. 2, Fernandes A. 2, Vaz Y. 1, Almeida V. 1, in urban situations. The only sensible solution lies in Melo M. 1, Louzã A. 1 researching urban gull ecology. Controlling food 1UISEE/FMV, Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon supply will be the key to acceptable management, but 2DGV, Direcção Geral de Veterinária we know very little (apart from anecdote) about how and where urban gulls obtain their food and, in A 27 de Setembro de 2007 Portugal passou a integrar particular, where they obtain the high quality food a lista de países europeus com casos confirmados de necessary for chick-rearing. gripe aviária (GA). Este recente foco ocorre em duas The management of urban gulls will require detailed exploração de produção de patos em Santarém (Vila knowledge. The first requirement will be to know how Nova da Barquinha e Tomar), em que se confirma a many pairs are breeding in your town and exactly presença de GABP (H5N2). A detecção do agente, where. Reliable, accurate information will enable que até então classificado como exótico em Portugal, informed decision-making. And, depending upon resulta de uma estratégia de amostragem que se local circumstances, management strategies may be enquadra no Plano Nacional de Vigilância (Decisão da possible. In a climate of financial constraint, secure Comissão nº 2002/649/CE de 5 de Setembro) iniciado information will ensure that effort and money are not em 2003. wasted. O presente trabalho visa analisar as mais-valias e deficiências de dois sistemas implementados a nível nacional para as populações do sector avícola domés- tico e industrial. Nessa perspectiva abordam-se, o SIREA (Sistema Informático de Registo Espécies 383 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Avícolas Domésticas) e SIGSA (Sistema Informático Pandemia de gripe: O plano de acção do para Gestão e Saneamento Avícola) como fonte de Centro de Saúde de Braga denominadores epidemiológicos e analisar os respec- tivos potenciais de aplicação na vigilância e controlo Joana Marques 1, José Manuel Carvalho Araújo 2, da GA em Portugal. Mário Freitas 3 1Interna do Internato Complementar de Saúde Pública 2Chefe de serviço de Saúde Pública – Centro de Saúde de Braga A influenza aviária em anatídeos 3Especialista em Saúde Pública selvagens do centro de Portugal De acordo com as directrizes da Organização David Rodrigues 1, Maria Ester Figueiredo 2, Mundial de Saúde, o Centro de Saúde de Braga (CSB) António Fabião 2, Armando Louzã 3, Nuno Santos 4 elaborou um Plano que permitisse a gestão do esperado 1Departamento Florestal – Escola Superior Agrária de Coimbra impacto da pandemia que se aguarda. O grupo de Email: [email protected] trabalho do CSB contemplou uma miríade de 2Departamento de Engenharia Florestal – Instituto Superior de situações possíveis e as respectivas respostas que Agronomia poderão ser oferecidas pelo CSB, o que o levou a 3UISEE – Faculdade de Medicina Veterinária considerar fases distintas nos períodos pré e 4Pygargus Vet inter-pandémicos, e 4 níveis no período pandémico. Em cada uma destas fases e níveis, delegou-se a Estudos laboratoriais recentes mostraram que responsabilidade de certas áreas funcionais a algumas espécies de Anatídeos selvagens podem entidades do CSB, encontrando-se as acções destes transportar o H5N1 altamente patogénico sem perfeitamente definidas, e sendo cumulativas com as desenvolverem doença ou serem afectados. Contudo, das fases precedentes. Como um evento desta escal a na Europa Ocidental, parece não existir quaisquer requer o envolvimento de grupos e organizações tanto casos de detecção do vírus em aves selvagens do sector da saúde como outros, este plano conduz à saudáveis (só foi encontrado em aves mortas ou aves articulação com a Protecção Civil, referindo-se estas doentes e que acabariam por morrer rapidamente). Por acções como pontos de "decisão-chave". Desta forma, outro lado, os estudos sobre a detecção de vírus de os prestadores de cuidados de saúde e a comunidade influenza aviária de baixa patogenicidade em aves serão continuamente informados e alertados, e a aquáticas selvagens sempre consideraram que estes gestão de recursos humanos e materiais ocorrerá em não afectavam as aves infectadas, até que um estudo tempo útil, visto que a priorização e coordenação de recente mostrou que isso poderá não corresponder à acções contempladas no Plano será essencial face a tal realidade. crise. Baseados nos resultados dos estudos sobre a Ecologia dos Anatídeos em Portugal discutimos os dados ecológicos fundamentais para perceber a Medicina Preventiva no Oceanário de origem dos surtos de influenza aviária, assim como a Lisboa sua evolução e disseminação, discutindo também os surtos que se verificaram na Europa em 2006 e 2007. Nuno Pereira, Núria Baylina, Gonçalo Nunes e Elsa Serão apresentados e discutidos os resultados sobre Santos a presença de vírus de baixa patogenicidade identifi- cados pelo Laboratório Nacional de Investigação Um Programa de Controlo Sanitário, onde estão Veterinária em zaragatoas cloacais por nós recolhidas incluídas as medidas de Medicina Preventiva é um em anatídeos selvagens do Centro de Portugal, que instrumento central na manutenção da saúde e bem foram capturados vivos e marcados visualmente estar dos animais da colecção. (http://pt-ducks.naturlink.pt). Este Programa engloba aspectos relacionados com a observação e vigilância do estado de saúde dos animais; protocolos alimentares e suplementação vitamínica; protocolos de quarentena e de rastreio sanitário, o valor diagnóstico e epidemiológico da realização de necropsias; elaboração e utilização dos registos médicos, controlo de parasitoses, análises da água, do ar e dos alimentos; transporte de animais e desinfecção. A metodologia escolhida foi a separação por grupos de animais atendendo à diversidade da colecção animal – Peixes (Teleósteos e Elasmobrânquios), Aves, Mamíferos Marinhos e Invertebrados. 384 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 No Oceanário, desde o início da sua actividade, há 94/10,88%; freguesias não urbanas: 27/31,40%). 10 anos, a Medicina Preventiva é uma das compo- Identificaram-se proglótis grávidos de Dipylididae nentes principais na gestão e maneio dos animais ao (Dipylidium caninum ), ovos de Taeniidae, Strongy- nosso cuidado. loididae ( Strongyloides sp.), Ancylostomatidae, Nesta apresentação serão discutidos os aspectos Ascarididae ( Toxocara sp.), Trichuridae ( Trichuris sp., acima referidos e os dados relacionados com a casuís- Capillaria sp.) e oocistos de Eimeriidae ( Isospora tica observada nestes dez anos. sp.). A menor diversidade parasitária e as prevalências mais elevadas, excepto para Toxocara sp., verificaram-se nas freguesias não urbanas. Contaminação parasitária ambiental por Embora o tipo de parasitismo identificado nas áreas fezes de canídeos no concelho de Peniche* rurais tenha sido idêntico ao registado nas urbanas, verificou-se uma grande variabilidade na diversidade Rosa, F. 1, Crespo, M.V. 2, Silva, A.E. 3 e no grau de eliminação parasitário nas diferentes 1Instituto de Investigação Científica Tropical/DES, zonas estudadas. Assim, Ancilostomatidae sobressaiu; Rua da Junqueira, 14, 1300-343 Lisboa, Portugal predominaram as infecções simples, embora nas ([email protected]) freguesias não urbanas as infecções mistas tenham 2 Escola Superior Agrária/Instituto Politécnico de Santarém, sido superiores em cerca de 19%, relativamente ao Apartado 310-2001 904 Santarém, Portugal ([email protected]) valor obtido para esta infecção nas freguesias urbanas; 3Câmara Municipal de Peniche, Largo do Município, 2524-909 Peniche a maior diversidade parasitária ocorreu no Inverno, e ([email protected]). o valor mais elevado da prevalência global, no *Projecto "Contaminação parasitária por fezes de canídeos de zonas Outono. urbanas e rurais do Ribatejo e Oeste e Vale do Tejo" da Escola Identificaram-se algumas zonas de maior risco de Superior Agrária de Santarém/IPS, Instituto de Investigação Científica Tropical/DES e com o apoio das Câmaras Municipais. contaminação por parasitas, particularmente o Bairro do Mercado, na área urbana e a Serra d’el Rei, na não A existência de dejectos caninos nos jardins e vias urbana. públicas representa um aspecto desagradável para os Apesar da elevada contaminação por fezes de transeuntes e constitui um veículo de disseminação de ca nídeos, as prevalências da eliminação parasitária numerosos agentes patogénicos, entre os quais os foram baixas. No entanto, determinaram-se zonas endoparasitas. Estes são responsáveis por diversas de maior risco, que sugerem a importância de se zoonoses, muitas vezes negligenciadas por sintoma- continuar a desenvolver esforços no sentido de tologia pouco expressiva e por falta de informação. procurar implementar medidas de controlo adaptadas No entanto, cada vez mais os serviços veterinários à realidade regional, numa perspectiva pluri-sectorial municipais estão empenhados na implementação de e pluridisciplinar, envolvendo a participação de estratégias que minimizem as implicações em Saúde diferentes instituições e áreas de intervenção, Púbica. nomeadamente, saúde, ambiente, educação, engenharia, Neste contexto, o presente trabalho refere-se à segurança e ordem pública entre outras. avaliação da abundância de dejectos caninos, e à Alcançar um nível de qualidade ambiental adequado presença de elementos parasitários para determinação e extensível a toda a população deve ser o desafio da de zonas de risco em áreas urbanas e não urbanas do Vigilância em Saúde Ambiental de qualquer município. Concelho de Peniche, tendo em vista a promoção de medidas que fomentem e incentivem a higiene e segurança dos espaços públicos. Entre Janeiro e Dezembro de 2006, nas três fregue- sias urbanas de Peniche realizou-se mensalmente a colheita de seis amostras de fezes de canídeos em cada uma das seis zonas seleccionadas na cidade, num total de 864 amostras. Procedeu-se ainda à contagem do número de dejectos presentes em todos os espaços públicos de três bairros da cidade. Nas freguesias não urbanas efectuou-se apenas uma colheita de 86 amostras, correspondente a 10% da população de cães, durante o período da campanha de vacinação anti-rábica. As análises coprológicas foram realizadas com base em métodos qualitativos (Willis e de sedimentação espontânea). Das 950 amostras, 121 (12,74%) evidenciaram a eliminação de formas parasitárias (freguesias urbanas: 385 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Leishmaniose Canina em Portugal provavelmente, seria ainda menor se ao universo Continental – o que sabem os estudado fossem adicionados os donos de cães que não proprietários de cães acerca desta zoonose visitam os CAMV. Torna-se, assim, evidente que é necessário desenvolver esforços adicionais para parasitária sensibilizar e esclarecer os donos de cães acerca desta parasitose. O Médico-Veterinário clínico de pequenos 1 2 3 Rodolfo Neves , Luís Cardoso , Maria O. Afonso , animais tem um papel preponderante, mas devem 4 Lenea Campino juntar-se a esta causa as autoridades veterinárias 1Intervet Portugal, Lda. – Estrada Nacional 249 Km 14,2 nacionais e regionais, os académicos e a indústria Apartado 144 – 2726-930 Mem Martins – Fax: 219 202 231 – [email protected] farmacêutica. 2Departamento de Ciências Veterinárias, CECAV – Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro – 5001-801 Vila Real 3Unidade de Entomologia Médica – Instituto de Higiene e Medicina Babesiose Canina – Estudo Tropical – UNL – R. Junqueira, 96, 1349-008 Lisboa Epidemiológico no Nordeste 4Directora da Unidade de Leishmanioses – Instituto de Higiene e Transmontano 2005/2006 Medicina Tropical – UNL D. Diz Lopes, F.T. Rodrigues A Leishmaniose Canina (LCan) é uma doença Bragança zoonótica grave, causada por parasitas do género Leishmania , de percurso evolução clínica crónica, Numa época em que tanto se fala de doenças considerada grave pelo seu prognóstico e potencial de emergentes, particularmente as transmitidas por propagação. As avaliações efectuadas em Portugal vectores artrópodes, e em que temos vindo a constatar Continental sugerem que, nos últimos anos, terá na nossa prática clínica um número crescente de casos ocorrido um aumento da sua prevalência em de Babesiose e de Leishmaniose, considerámos algumas regiões. Uma vez que o tratamento é prolon- oportuno começar a recolher de forma sistemática gado e doloroso para o cão, dispendioso para os donos dados clínicos relevantes que ajudassem a conhecer e, na maioria das vezes, não permite uma cura para- melhor a epidemiologia destas doenças na nossa sitária definitiva, é essencial que se utilizem as medidas região . preventivas actualmente disponíveis. Contudo, estas só Pretendemos com este estudo, que assenta somente serão postas em prática se os proprietários dos cães na nossa experiência clínica e curiosidade científica, estiverem sensibilizados para a sua utilização, o que, contribuir para um melhor conhecimento epidemio- por sua vez, só ocorrerá se estes tiverem conhecimento lógico da Babesiose Canina no Nordeste suficiente acerca desta parasitose zoonótica. É então Transmontano. essencial tentar determinar o grau de conhecimento Recolhemos os dados de 49 canídeos diagnosticados existente acerca desta doença, para que posteriormente, com Babesiose Canina e confirmados laboratorial- e caso seja necessário, se desenvolvam acções de sensi- mente por esfregaço de sangue periférico corado com bilização e esclarecimento nas áreas geográficas Diff-Quick de 1 de Janeiro de 2005 a 31 de Dezembro consideradas prioritárias. de 2006. Em 2006, foi elaborado um questionário sobre LCan Do total de canídeos em estudo, 61% tinham que foi entregue a proprietários de cães que visitaram aptidão de caça, sendo os podengos a raça mais Centros de Atendimento Médico-Veterinário (CAMV). representativa (53%). Foram recolhidos 1480 questionários respondidos, Não obstante a dispersão dos casos pelos Concelhos provenientes de 123 dos 278 concelhos de Portugal de influência da Clínica - Bragança, Vinhais e Continental. Verificou-se que: 40% a 70% dos donos de Vimioso - verificou-se um numero elevado (39%) na cães não conheciam a LCan, 55% a 80% dos donos de área envolvente à Serra da Nogueira, uma zona de cães não sabiam qual o resultado do tratamento, 60% a caça por excelência, com muita vegetação e que possui 75% dos donos de cães não sabiam como prevenir a a maior extensão de carvalho negral, Quercus pyrenaica , LCan, 70% a 85% dos donos de cães não sabiam quais do País. os sinais clínicos típicos e 75% a 90% dos donos de Durante os dois anos em análise não diagnosticámos cães não sabiam que se trata de uma zoonose. qualquer caso nos meses de Julho, Agosto e Setembro, Finalmente, só entre 6% a 12% dos donos de cães sendo os meses em que tivemos um maior número de inquiridos demonstraram ter um conhecimento diagnósticos positivos os de Dezembro e Março, com satisfatório acerca da LCan. Constatou-se que o nível 7 casos em cada um deles. de conhecimento era superior nas áreas geográficas Em quatro casos clínicos verificámos que existia onde o risco de infecção para o cão é considerado uma co-infecção, 2 casos com Erlhichia , 1 com superior e nas áreas urbanas. Hepatozoon e outro com Leishmania . Os resultados encontrados permitem concluir que o Nem sempre foi possível identificar os ixodídeos nível de conhecimento acerca da doença é reduzido e, vectores, no entanto num dos casos reportados, que 386 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 contou com a colaboração do Centro de Estudos de continental. A prevalência amostral varia entre as Vectores e Doenças Infecciosas do Instituto Nacional zonas de estudo, mas é similar à descrita noutros de Saúde Dr. Ricardo Jorge (CEVDI/INSA), países. confirmou-se que os ixodídeos eram da espécie A localização e as características das lesões também Dermacentor reticulatus . são concordantes com o descrito na bibliografia. A dispersão na região do Dermacentor reticulatus e, Com base nestes resultados, é discutido o papel do em particular, na área do Parque Natural de Javali no ciclo epidemiológico da tuberculose. Montesinho tinha sido já confirmada num estudo realizado pelo CEVDI/ INSA, em que participámos, que num total de 76 ixodideos recolhidos de Setembro A epidemiologia espacial aplicada ao a Novembro de 2004, confirmou que 36 (47%) eram estudo das doenças infecto-contagiosas da espécie Dermacentor reticulatus , ocorrendo estes em maior número no mês de Novembro. Alexandre José Teixeira Fernandes Concluímos com este estudo que o período de Mestre em Epidemiologia (UFMG-Brasil) maior risco para Babesiose Canina no Nordeste Transmontano decorre durante as estações de Outono Nos últimos 50 anos têm ocorrido grandes e Inverno, os canídeos com aptidão de caça são os transformações ao nível global, económicas, sociais mais susceptíveis e que o Dermacentor reticulatus ou ambientais. Muitos autores relacionam estas poderá ser a espécie de ixodídeo com maior transformações com as chamadas doenças emergentes importância na transmissão desta doença. ou reemergentes, devido ao desequilíbrio que estas transformações provocaram em diversos sistemas. Existe nos dias de hoje a necessidade de analisar as Epidemiologia da tuberculose no Javali doenças numa perspectiva multidisciplinar, para assim (Sus scrofa ) em Portugal se poder compreender o fenómeno complexo que se constitui a doença. Para tal a ciência não pode apenas Nuno Santos 1,2,3 , Margarida Correia-Neves 2, se limitar em estudar o agente etiológico, mas também Virgílio Almeida 3 os factores que propiciam a doença e como esta se 1Pygargus Lda, Braga, Portugal relaciona com estes. Existe a necessidade de fazer uso [email protected] de ciências biológicas e sociais. Os fatores biológicos 2Instituto de Investigação em Ciências da Vida e da Saúde, Universidade são quantificáveis, o mesmo não ocorre com do Minho facilidade em relação aos fatores sócio-econômicos, [email protected] por isso cada vez mais tem sido usada a pesquisa 3Faculdade de Medicina Veterinária - TULisbon qualitativa como alternativa à pesquisa quantitativa. [email protected] A Epidemiologia Espacial, corrente da Epidemiologia que nasceu na década de noventa O objectivo deste estudo é caracterizar a presença de preocupa-se com o estudo das causas da doença e não tuberculose em Javali no centro e no sul de Portugal das causas dos casos de doença, em que a população se continental. constitui como uma floresta, num espaço com Foram recolhidas 179 amostras de órgãos em Javalis caracterís ticas específicas, em que as regiões vizinhas caçados em montarias nas 9 zonas de estudo. se assemelham mais do que as mais afastadas. Esta A tuberculose foi diagnosticada por uma combinação considera que se deve tomar em conta fatores de técnicas: bacteriologia, inspecção macroscópica, económicos-sociais-politicos e biológicos, para observação de cortes histológicos e de esfregaços e entender a doença num determinado espaço. Por isso biologia molecular. faz uso das tecnologias do geoprocessamento e Isolámos Mycobacterium bovis de 18 animais, de Sistemas de Informação Geográfica que possibilitam 3 zonas de estudo. criar um modelo parcial do "espaço" para detectar os Foram recolhidos dados sobre sexo e idade; sistemas (muitas vezes ocultos) que se relacionam variáveis relativas à densidade, à diversidade de com a doença. Cada região (espaço) tem características ungulados selvagens e à dinâmica populacional do específicas e únicas, a doença apresenta relações Javali; e à densidade e à prevalência de tuberculose em diferentes com diferentes fatores, em diferentes ungulados domésticos. regiões. Estes estudos não deverão ser feitos a grande As variáveis relativas à densidade e à diversidade de escala, pois podem passar despercebidas relações ungulados selvagens; dinâmica populacional de Javali específicas. e prevalência de tuberculose em ungulados domésticos; Falta formação aos agentes de saúde nos materiais e estão relacionadas com a ocorrência de tuberculose métodos da Epidemiologia Espacial. nas populações de Javali. O autor usa como exemplo um estudo acerca da Os nossos resultados confirmam a presença da raiva bovina na região de Belo Horizonte entre 1998 tuberculose em Javali no centro e sul de Portugal e 2004, um estudo que apesar de baixos recursos 387 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 financeiros e logísticos permitiu detectar como se 19.2% ( n= 2727), seguindo-se as Enterobacteriaceae relacionou a doença com as variáveis em causa nos com 18,2% ( n= 2588) e os Enterococcus spp com diferentes municípios da região em estudo . 10,7% ( n=1519). Abaixo dos 10% surge E. coli com A implementação das metodologias da Epidemiologia 3,0% ( n=421), Streptococcus agalactiae com 2,8% Espacial nos organismos de saúde poderá aumentar a (n=392), Streptococcus uberis com 2,5% (n=349) e os eficiência no combate e prevenção de doença, sem B (-) Não Enterobactiaceae com 1,7% (N=243). implicar um aumento do custo financeiro, sendo que Os Enterococcus spp surgem com mais de 80% a médio longo prazo poderá representar um ganho de resistências para a peniclina (93%; 1241/1335), económico, pois a doença em si é um custo económico cloxacilina (94,4%; 1368/1449), Estreptomicina e social para sociedade. (92,2%; 165/179), lincomicina (90,3%; 1234/1366) e pirlimicina (84,0%; 89/106); apenas se encontraram 71 isolados de Enterococcus com resistência à combi- Evolução das antibioresistências em nação amoxicilina – Àcido clavulânico em 1426 amostras de leite bovino, no período (5,0%). 2004-2007 Todos os isolados com Strep. agalactiae testados para pirlimicina (n=33), cefquinoma (n=150), Pereira A. 1, Santos P. 2, Eusébio M.J. 2, Madeira H. 1, cefazolina (n=310) e lincomicina/neomicina (34) Sousa J. 1, Niza Ribeiro J. 1,2 foram sensíveis. No ano de 2007 surgem os primeiros 1Segalab, SA – Departamento de Serviços Técnicos isolados com resistência à ampicilina (95,7%; 44/46) 2Segalab, SA – Departamento de Microbiologia Veterinária e à cloxacilina (6,9%; 9/131). Para o Strep. uberis obtivemos valores muito As mastites constituem uma das principais causas elevados de resistências para a estreptomicina de perdas económicas nas explorações leiteiras e a (91,7%:22/24), neomicina (92,3%; 12/13), gentamici- patologia que requer com maior frequência a utilização na (72,2%; 122/169) e pirlimicina (60,9%; 14/23) e de preparações comerciais contendo antibióticos. A lincomicina (49,7%; 157/316). Surgem também, em presença de bactérias resistentes a um ou mais 2007, os primeiros isolados de Strep. uberis antibióticos tem implicações directas no tratamento resistentes à ampicilina (87,5%; 21/24). das situações de mastites assim como na saúde do Para os restantes Streptococcus os valores asseme- consumidor, principalmente pelo consumo de leite cru lham-se aos obtidos para o Strep. uberis com excepção e derivados contendo estas bactérias resistentes. da percentagem elevada de resistências para o O objectivo deste trabalho consiste na avaliação das trimetroprim-sulfamida (20,9%; 449/2150). resistências aos antibióticos dos principais agentes Todos os isolados de Staph. aureus foram sensíveis bacterianos isolados a partir de 12 877 amostras de à enrofloxacina (n=243); Os valores mais elevados de leite individuais de vacas com mastite subclínica ou resistência foram observados para a colistina (80.0%; clínica e a sua evolução ao longo dos anos 2004, 28/35), estreptomicina (57.1%; 105/184), peniclina 2005, 2006 e 2007. Não foram consideradas para este (51.7%; 1241/2400), penetamato (20.6%; 306/1482), trabalho os resultados de amostras de leite cujo pedido ampicilina (15.7%; 103/656) e pirlimicina (14.4%; de ensaio foi apenas identificação microbiológica ou 64/443). Abaixo dos 1% de resistência temos a cefa- apenas antibiograma. Todos os ensaios foram realizados zolina (0.8%; 18/2254) e a cefquinoma (0.7%; 6/864). pelo Departamento de Microbiologia Veterinária do Foram encontradas percentagens elevadas de Laboratório de Sanidade Animal e Segurança resistência nos isolados de E. coli para a peniclina Alimentar (Segalab, SA.). (99.7%; 286/287), cloxacilina (99.3%; 285/287), Foram efectuadas 14203 identificações de agentes espiramicina (95.5%; 127/133) e penetamato (83.4%; nas 12877 amostras de leite individuais, que foram 156/187); com menos de 5% de isolados resistentes agrupadas, pela sua importância na profilaxia e temos a ampicilina (4.1%; 4/97), enrofloxacina (4.4%; tratamento de mastites em Bastonetes Gram-negativos 6/136), cefquinoma (2.9%; 2/70), Gentamicina (B(-)) Não Enterobacteriaceae ( Pseudomonas spp, (3.6%;3/83) e a colistina (1.8%; 5/273). Areomonas spp, Acinetobacter spp, …), Enterobac- No caso das restantes Enterobacteriaceae, os teriaceae ( Serratia spp, Klebsiella spp, Enterobacter antibióticos para os quais foram detectadas menor spp, Citrobacter spp, …), Enterococcus spp, percentagem de isolados resistentes, foram a associação Escherichia coli, Staphylococcus spp ( Staph. chromo- lincomicina/neomicina (4.0%; 5/126), a enrofloxacina genes, Staph. epidermidis, Staph. haemolyticus, (4.3%; 38/874), a cefquinoma (7.4%; 21/282), a ampi- Staph. intermedius , …), Streptococcus uberis, cilina (7.8%; 46/590) e a gentamicina (9.6%; 30/312). Staphylococus aureus, Streptococcus agalactiae e A percentagem de isolados resistentes à amoxicili- Streptococcus spp ( Strep. dysgalactiae, Strep. na/ácido clavulânico foi de 67.2% para os bastonetes thoraltensis, Strep. bovis ., …) Os agentes mais Gram(-) Não Enterobacteriaceae (156/232); este foi frequentemente isolados foram Streptococcus spp o valor mais elevado encontrado para os diferentes com 24,3% (n = 3454), Staphylococus aureus com grupos de agentes. 388 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Estes dados reflectem apenas uma fracção do Falamos de produtores com uma enorme panorama nacional pois não é o único laboratório a experiência produtiva que, senão tivessem as suas operar nesta área. A curto e médio prazo será empresas organizadas, os seus sistemas da qualidade necessário implementar, a nível nacional, uma rede de implementados, os seus provadores credenciados, os monitorização e vigilância das antibioresitências. seus fornecedores de matérias-primas e serviços acreditados, as suas técnicas para evitar os pontos críticos nas suas empresas, não teriam subsistido ao Produtos tradicionais qualificados: longo dos tempos.... com os resultados que ainda hoje produtos antigos e segurança moderna estão à vista, com milhares de clientes fidelizados. Questão diferente é serem capazes de evidenciar Ana Soeiro toda esta parafernália de sistemas, técnicas e docu- Engenheira Agrónoma mentações de suporte... para contentamento de algumas regulamentações, quantas vezes desajustadas Os produtos tradicionais portugueses têm das realidades e dimensões das nossas pequenas forçosamente que ter qualidade. Se a não tivessem, empresas ou quantas vezes não devidamente explo- há muito tempo que teriam desaparecido do mercado. radas e aproveitadas pelas autoridades. Os produtos tradicionais qualificados respondem a Urge aproveitar o reconhecimento que a própria lei todos os quesitos actualmente colocados pelos con- confere as empresas e aos produtos tradicionais para sumidores, porquanto: simplificar as tarefas, diminuir a carga burocrática e o • Têm uma origem conhecida e comprovável; investimento não produtivo em estruturas, equipamentos • Têm uma "qualidade" específica, diferenciada e e metodologias que não acrescentam valor mas fazem ligada à sua origem geográfica ou ao saber fazer aumentar os custos e, portanto, baixar a competitivi- tradicional; dade dos produtos e das empresas. • As suas características sensoriais afastam-se Mas não se duvide sobre a capacidade humana e a absolutamente dos produtos correntes no mercado persistência dos nossos produtores. globalizado; Quem produz com qualidade e segurança, saberá • As matérias-primas com que são produzidos são sempre agradar aos consumidores e evidenciará que a obtidas a partir de raças e variedades autóctones ou, qualidade e a segurança não acontecem por acaso, mas pelo menos, muito bem adaptadas à região de que resultam sempre de um trabalho inteligente e de produção, assegurando o respeito pela biodiversidade um saber fazer secular. e pelas boas práticas agrícolas e ambientais; • Os ingredientes usados são naturais e as técnicas de produção são as ancestrais, desde a alimentação e maneio dos animais, até às operações tecnológicas de corte, salga, fermentação, cura, fumagem, secagem ao ar ou ao sol, conhecidas e usadas desde tempos imemoriais; • São objecto de acções específicas de verificação da conformidade em todas as fases do seu ciclo produtivo, desde as matérias-primas até aos locais de venda, passando pelos circuitos de transporte, armazenagem, fabrico, maturação ou pelas fase de ordenha, abate, desmancha, acondicionamento, etc., consoante o necessário para verificar o cumprimento integral das disposições dos respectivos Cadernos de Especificações ou normas técnicas de produção e apresentação comercial; • São seguros, na medida em que desde há séculos uns, há dezenas de anos outros, se mantêm no mercado, agradando aos seus consumidores e contribuindo para uma alimentação sã, diversificada e equilibrada. Mas, curiosamente, também noutras áreas se verifica a compatibilidade entre os "velhos produtos" e as "modernas técnicas". Siglas e referências como HACCP, ISO 9000, EN 45 011 e outras, qualificação, acreditação, certificação, etc., etc., começam a ser linguagem corrente entre o mundo dos tradicionais. 389 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Posters Evolução da seroprevalência da brucelose de pequenos ruminantes nos rebanhos e animais intervencionados em Análise factorial das correspondências de Trás-os-Montes e Alto Douro (2001-2004) factores de risco presentes nas explo- rações de pequenos ruminantes de Trás- A.M. Coelho 1,3 , A.C. Coelho 2, M.L. Pinto 2, os-Montes e Alto Douro com elevada sero- J. Rodrigues 2,3 1Direcção de Serviços Veterinários da Região Norte, prevalência de brucelose Divisão de Intervenção Veterinária de Vila Real – Núcleo do Corgo, Lugar de Codessais, 5000-421 Vila Real, Portugal A.M. Coelho 1,3 , A.C. Coelho 2, M.L. Pinto 2, 2Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de J. Rodrigues 2,3 Trás-os-Montes e Alto Douro, 1Direcção de Serviços Veterinários da Região Norte, Apartado 202, 5001-911 Vila Real Codex 3 Divisão de Intervenção Veterinária de Vila Real – Núcleo do Corgo, CECAV Portugal Lugar de Codessais, 5000-421 Vila Real, Portugal 2Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de A infecção por Brucella melitensis ocorre Trás-os-Montes e Alto Douro, naturalmente em ovinos e caprinos, sendo altamente Apartado 202, 5001-911 Vila Real Codex; patogénica para o homem. A região de Trás-os-Montes 3CECAV Portugal e Alto Douro é uma das áreas de Portugal onde a brucelose animal é considerada endémica. A brucelose além de constituir uma das zoonoses Neste estudo efectuou-se uma avaliação da evolução mais difundidas no mundo, ocasiona perdas económicas da brucelose nos anos compreendidos entre o início da no sector pecuário, devido à diminuição da produção, vacinação massiva na região até ao seu término (de ao aumento dos gastos com o saneamento e às 2001 a 2004) através da análise da informação limitações da comercialização de produtos animais. A disponível, recolhida através do Programa Informático transmissão da infecção, à semelhança do que ocorre de Saúde Animal (PISA), dos Serviços Oficiais da em outras doenças infecciosas, não depende somente anterior Direcção Regional de Agricultura de do agente etiológico, mas também, de uma série de Trás-os-Montes (DRATM). Foi utilizado o teste de condições que interactuam favorecendo ou impedindo qui-quadrado ( χ2) para comparar a evolução das a manutenção. A informação sobre os factores de risco seroprevalências ao longo dos anos de 2001 a 2004, do aparecimento da doença é necessária para definir tanto para rebanhos como para animais. Os limites de medidas de controlo e prevenção. confiança para as seroprevalências foram estabelecidos Neste estudo investigaram-se as características das pelo teste exacto binominal com 95% de intervalo de explorações que tinham seroprevalência elevada confiança (IC). A seroprevalência foi analisada com identificando-se possíveis factores de risco associados base nos resultados do Rosa de Bengala e da Fixação à infecção por Brucella na região de Trás-os-Montes e do Complemento. A partir da base de dados, Alto Douro. Foram analisados os Inquéritos calcularam-se as seroprevalências de rebanhos e Epidemiológicos (I.E.) da Direcção Geral de individuais. Da análise da informação oficial da DGV Veterinária (DGV), efectuados pelas Divisões de (2005) e da informação proveniente do PISA, com Intervenção Veterinária, de Bragança e de Vila Real, todos os dados registados, utilizados neste estudo, integradas na Direcção de Serviços de Veterinária verificou-se que, a seroprevalência dos rebanhos da anterior Direcção Regional de Agricultura de diminuiu de 2001 até 2003. Contudo, em 2004, Trás-os-Montes. Consideraram-se todos os I.E. aumentou, no entanto, para valores inferiores aos de efectuados no decurso da campanha de vacinação 2001 e 2002. Como este estudo correspondeu aos anos massiva de pequenos ruminantes com vacina Rev. 1 em que os animais foram sujeitos à vacinação massiva, (2001 a 2004), correspondendo a 37 I. E. efectuados esta ocorrência pode ter sido devida ao facto de em noutras tantas explorações seropositivas. 2002 e/ou 2003 algumas explorações vacinadas Os dados relativos às explorações e seroprevalência massivamente em 2001 ou 2002 (coincidindo com as obtidos pelo Programa Informático de Saúde Animal mais infectadas ou em maior risco), se encontrarem (PISA) foram tratados através da análise factorial em epidemiovigilância em 2002 e/ou 2003 (durante 30 das correspondências binárias nas explorações com meses) e, ao serem novamente intervencionadas em seroprevalência elevada. Verificou-se, através desta 2004, contribuíram para o aumento da seroprevalência análise que no eixo 1, havia explorações com elevadas dos rebanhos. Contudo, para níveis inferiores a 2001 e seroprevalências que reuniam algumas características 2002. Em relação à seroprevalência individual, esta consideradas como atípicas em explorações infectadas, diminuiu progressivamente de 2001 até 2004, o que como o facto de, não apresentarem abortos, nem os pode ser imputado à vacinação massiva. A comparação animais manifestarem sinais clínicos. Observou-se das seroprevalências na região de Trás-os-Montes e ainda como factor de risco, o facto da exploração ser Alto Douro, revela que, as mesmas, estão a diminuir a altamente seropositiva e não vacinar animais. nível individual revelando a eficácia da vacinação. 390 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Aplicação de Detecção Remota Estimativa da prevalência microbiológica à Epidemiologia em ovinos com suspeita clínica de paratuberculose. Cálculo efectuado Martins H., Nunes T. através de cultura e PCR em amostras Faculdade de Medicina Veterinária, TULisbon individuais e de "pool" de fezes A Detecção Remota é um processo de recolha de A.C. Coelho 1*, M.L. Pinto 1, A.M. Coelho 3, informação à distância sobre um objecto, área ou J. Rodrigues 1,2 , R. Juste 4 fenómeno geográfico através da produção de imagens *Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de captadas por diferentes sensores instalados em Trás-os-Montes e Alto Douro, satélites. O potencial de aplicação desta tecnologia Apartado 202, 5001-911 Vila Real Codex às necessidades da epidemiologia foi há muito 1CECAV Portugal; [email protected] identificado (Cline, 1970). No entanto continua a 2Direcção de Serviços Veterinários da Região Norte, Divisão de existir uma certa resistência em adoptar a detecção Intervenção Veterinária de Vila Real – Núcleo do Corgo, remota como ferramenta para o estudo da dinâmica Lugar de Codeçais, 5000-421 Vila Real, Portugal espacial e temporal de doenças de elevada corre- 3NEIKER (Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario), lação com variáveis ambientais tais como clima, Departamento de Sanidad Animal, Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizcaya, vegetação, uso do solo, entre outras. Esta situação España. deve-se principalmente ao elevado grau de exigência de conhecimento em ciências computacionais e A paratuberculose, ou doença de Johne é um morbo geográficas. de natureza infecciosa causada por Mycobacterium Actualmente, as maiores dificuldades na utilização avium subsp. paratuberculosis (Map). Afecta princi- desta tecnologia estão relacionadas com a grande palmente os ruminantes, originando uma enterite variedade de formatos de imagens disponibilizados e crónica granulomatosa. Neste trabalho efectuou-se com o seu reconhecimento pelos softwares de uma estimativa da prevalência da infecção ovina na Sistemas de Informação Geográfica (SIG). Existem região de Trás-os-Montes e Alto Douro através da ainda dificuldades acrescidas relacionadas com os cultura e PCR em amostras individuais e de "pool" de sistemas de referenciação utilizados em Portugal e que fezes. O tamanho da amostra foi calculado através do ® envolvem transformações dos sistemas de projecção programa WinEpiscope 2.0 dado um número de com que as imagens são fornecidas. 3.162 rebanhos de ovinos registados e, uma prevalência Para colmatar esta lacuna, está em desenvolvimento esperada de 10% com um erro de 5% e um nível de um pacote de dados de distribuição gratuita através da confiança de 95%. Estudaram-se 900 ovinos com Internet com imagens pré-processadas de diferentes suspeita clínica pertencentes a 150 explorações de sensores para formatos de aceitação universal pelos ovinos distribuídos por 12 Organizações de diversos softwares disponíveis e com as transformações Produtores Pecuários (OPP). Destes, 750 animais para os sistemas de projecção usados em Portugal foram estudados por grupo, ou "pool" constituído por (IgeoE, IGP). 5 ovinos por exploração, no total final de 150 "pools", Neste trabalho serão demonstrados os processos pela técnica de cultura e reacção em cadeia da envolvidos nas referidas conversões e transformações polimerase (PCR) em fezes. Da mesma forma, mas a assim como o motivo de selecção de determinados nível individual, estudaram-se 150 animais prove- sensores. Serão também descritos os métodos utilizados nientes das mesmas 150 explorações. Por exploração, para o controlo de qualidade, validação e para a obtiveram-se duas amostras de fezes: uma de "pool" e definição da respectiva metadata (informação geoes- uma amostra individual, no total de 300 amostras. A ® pacial de determinada imagem). Aspectos práticos análise foi feita com recurso ao programa SPSS 10.0 desta tecnologia aplicada à epidemiologia serão também com um nível de probabilidade p <0,05 como abordados. estatisticamente significativo. Os valores de prevalência foram comparados pelo teste estatístico do Qui-quadrado ( χ2). Os limites de confiança para as proporções foram estabelecidos através do teste binomial exacto com intervalo de confiança (IC) de 95%. Para o cálculo da prevalência estimada, quando se utilizou um "pool" de amostras, usou-se o programa Pooled Prevalence Calculator ®. A prevalência estimada através da cultura para as amostras individuais, foi de 2,0% (IC 0,4-5,7%). A prevalência estimada através da cultura nos animais incluídos no "pool" fecal situou-se entre 0,93% (IC 0,19-2,75%). A prevalência estimada para as amostras individuais através da PCR 391 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 foi de 4,7% (IC 1,9-9,4%). A estimativa da prevalência tante e que deve ser analisado, nomeadamente pelo por PCR, quando se utilizou um "pool" de amostras, Médico Veterinário para orientar a sua intervenção. A foi de 1,9% (IC 0,5-3,4%). Os resultados deste estudo utilização de ferramentas que permite quantificar as enfatizam uma baixa prevalência, nos animais com perdas devidas a mastites permite estabelecer priori- sinais clínicos compatíveis, calculada pela técnica de dades de intervenção, que devem ser contempladas cultura ou PCR em fezes, quer a nível individual quer quando se define um programa de controlo da calculada através de "pool" de amostras. qualidade do leite. Estimativa de custos e perdas com Estudo da prevalência de paratuberculose mastites em explorações do Entre-Douro ovina nas explorações de Trás-os-Montes e Minho e Alto Douro Aires T., Larisma H., Niza Ribeiro J. 1 1 3 Laboratório de Sanidade Animal e Segurança Alimentar – Segalab, SA A.C. Coelho *, M.L. Pinto , A.M. Coelho , J. Rodrigues 1,2 , R. Juste 4 A produção leiteira numa exploração pecuária é *Departamento de Ciências Veterinárias, Universidade de uma actividade económica e o trabalho desenvolvido Trás-os-Montes e Alto Douro, Apartado 202, 5001-911 Vila Real na área de saúde animal visa a produção de leite a Codex bCECAV Portugal; [email protected] partir de animais saudáveis, assegura o bem-estar cDirecção de Serviços Veterinários da Região Norte, Divisão de animal, e também promove a viabilidade económica Intervenção Veterinária de Vila Real – Núcleo do Corgo, Lugar de das explorações. Codeçais, 5000-421 Vila Real, Portugal As doenças que afectam os efectivos pecuários têm dNEIKER (Instituto Vasco de Investigación y Desarrollo Agrario), efeito directo na produção, reduzindo a eficiência de Departamento de Sanidad Animal, Berreaga, 1, 48160 Derio, Bizcaya, conversão dos factores de produção em outputs España. (Rushton et al. , 1999, cit in Radostits et al. , 2001). As mastites são a doença de produção que causa A paratuberculose ovina é uma doença crónica maiores perdas económicas nas explorações de debilitante dos pequenos ruminantes causada por vocação leiteira (Blosser, 1979, cit in Radostits et al. , Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Map) 2001). que origina perdas económicas significativas em todo Durante os anos de 2006 e 2007 desenvolvemos um o mundo. O presente trabalho é o primeiro estudo modelo económico que permite quantificar o impacto efectuado em larga escala para estimar a prevalência económico relacionado com a ocorrência de mastites. da paratuberculose nas explorações da região de O trabalho foi desenvolvido em 12 explorações de Trás-os-Montes e Alto Douro, desde que a doença foi leite com efectivo médio de 107 animais, (registando descrita pela primeira vez em 1987. Para a execução uma variação entre 43 e 276 animais) na região do desta investigação, colheram-se amostras de sangue Entre-Douro e Minho; o período de análise reporta aos inteiro, soro e fezes em 150 explorações de ovinos, anos 2005 e 2006. distribuídos por 12 Organizações de Produtores O modelo concebido categoriza as perdas da doença Pecuários (OPP) da região. O tamanho da amostra foi em cinco parâmetros de avaliação: calculado através do programa WinEpiscope 2.0 ® dado (1) custo e perdas relacionadas com os casos clínicos, um número de 3.162 rebanhos de ovinos registados e, (2) perdas de desvalorização do leite, (3) perdas com uma prevalência esperada de 10% com um erro de 5% leite não produzido, (4) perdas com refugos e mortes e um nível de confiança de 95%. Seguidamente devido a mastites, (5) perdas com leite descartado e aplicaram-se diferentes técnicas de diagnóstico para a (6) perdas de lactação devido a casos clínicos. estimação da prevalência: serologia (ELISA), cultura A recolha de dados para execução do modelo foi microbiológica de fezes e reacção em cadeia da obtida a partir de (1) registos da exploração, (2) polimerase (PCR) em amostras de fezes e sangue. A registos do contrate leiteiro e (3) através da execução análise foi feita com recurso ao programa SPSS 10.0® de um inquérito ao produtor. com um nível de probabilidade p <0,05 como Os custos e perdas relacionadas com as mastites, estatisticamente significativo. Os valores de prevalência obtido por este modelo são em média 249 euros/vaca/ano foram comparados pelo teste estatístico do variando este valor entre 96 e 449 euros/vaca/ano. A Qui-quadrado ( χ2). Os limites de confiança para as aplicação deste modelo demonstrou que, o refugo e proporções foram estabelecidos através do teste morte dos animais, são o factor com maior contribuição binomial exacto com intervalo de confiança (IC) de no total das perdas devido a doença, representando 95%. Os resultados deste estudo mostram que relati- 27% deste valor. vamente às técnicas individuais, foram a ELISA e, O trabalho desenvolvido permite perceber que a PCR em sangue as que detectaram maior percentagem gestão económica da exploração é um factor impor- de explorações positivas, 46,7% (IC 38,5-55,0%) e 392 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 42,7% (IC 34,6-51,0%), respectivamente. Considerando dos resultados laboratoriais obtidos (serologia e positivas as explorações com resultado positivo a bacteriologia do leite) e os resultados preliminares da qualquer uma das técnicas, encontraram-se 100 fase final relativa aos resultados laboratoriais em explorações, o que supõe que a prevalência estimada amostras de queijo. pelo conjunto das técnicas é de 66,7% (IC 58,5-74,1%). Verificou-se que, exceptuando as OPP’s de Montalegre, Vinhais e Torre de Moncorvo, em todas as outras, mais de metade das explorações Medicina da Conservação - a importância pertencentes a cada OPP da região estavam infectadas da monitorização epidemiológica em por Map. Os resultados deste estudo mostraram que é espécies selvagens uma infecção de elevada prevalência, em termos de explorações, ainda que, esta seja variável em função Ricardo M. L. Brandão da técnica de diagnóstico considerada. Centro de Ecologia, Recuperação e Vigilância de Animais Selvagens, Parque Natural da Serra da Estrela / Instituto da Conservação da Natureza e da Biodiversidade, Av. dos Bombeiros Voluntários, 8. Caracterização do sistema de produção 6290-520 Gouveia Tel: (+351) 91 9457984/238492411; Fax: (+351) 238 494183 de ovinos e caprinos e sua relação com a email:[email protected] epidemiologia da brucelose na região de Trás-os-Montes e Alto Douro Os processos ecológicos do planeta continuam a ser alterados pela perda global de biodiversidade; pela Júlia Rodrigues Mascarenhas 1, destruição, degradação e fragmentação dos habitats Manuel Machado 2, Lénia Beck 2, naturais; pelo aumento de poluentes químicos no ar, Miguel Ângelo Fernandes 1, José Luís Feio 3, água e solo; e pelas alterações climáticas e depleção Alcina Tavares 2, Ester Alves 2, da camada de ozono. A Medicina da Conservação, Humberto Pessegueiro 1, Cristina Ferreira 2 termo introduzido por Kock (1996) para descrever o 1Direcção Regional de Agricultura e Pescas do Norte amplo contexto ecológico da saúde, pretende conhecer 2Instituto dos Recursos Biológicos - Laboratório Nacional de melhor as consequências destes fenómenos, unindo Investigação Veterinária disciplinas que normalmente caminham separadas. 3União dos Agrupamentos de Defesa Sanitária de Trás-os-Montes e Conjugando os conhecimentos de áreas desde a Saúde Alto Douro - OPP de Vila Pouca de Aguiar. à Ecologia, tenta-se assim examinar o mundo de uma forma mais abrangente, para compreender melhor o No âmbito da Acção de Desenvolvimento estado actual da saúde dos processos ecológicos. Experimental e Demonstração do Programa AGRO, Definir Medicina da Conservação constitui por si só pretendeu-se caracterizar os sistemas de produção de um desafio. As perspectivas sobre a abrangência do leite e derivados, a partir raças autóctones de ovinos e termo são variadas e a abordagem depende natural- caprinos, numa perspectiva da segurança alimentar - mente da formação técnica e profissional de cada um. erradicando ou promovendo uma acentuada redução De um modo geral podemos considerar como da brucelose na cadeia alimentar. definição consensual de Medicina da Conservação O projecto foi dividido em 2 partes: avaliação e uma Ciência que se foca na intersecção entre o caracterização da situação actual e divulgação de ambiente, hospedeiros humanos e não-humanos, com técnicas seguras de produção e maneio animal. os agentes patogénicos e que pretende atingir a Saúde A caracterização incluiu 3 vertentes principais: Ecológica, e consequentemente, a dos Ecossistemas e entrevistas estruturadas em questionário com perguntas dos seus Habitantes. fechadas, colheita de amostras de sangue e colheita de Os contributos desde nova Medicina Global são a amostras de leite, sendo que a população a considerar inversão da tendência generalizada para a especialização na selecção se baseou no registo no PISA (Programa extrema do mundo científico actual, abrindo novas Informático de Saúde Animal) localizada na região de perspectivas integradoras sobre a Medicina e a Trás-os-Montes e Alto Douro. Para além da divul- Ecologia. As novas visões e conhecimentos que gação dos dados relativos ao maneio tradicional, os podem assim ser adquiridos sobre as doenças, a resultados obtidos reflectem o desenvolvimento e fisiologia dos patógenos, bem como da ecologia e dos demonstração em 4 áreas de intervenção: produção de próprios fenómenos sociais com os quais se inter-rela- leite, população de raças autóctones de ovelha e cabra, cionam devem gerar uma relação diferente com a confiança nos produtos derivados do leite e saúde Natureza. E é este objectivo de intervenção positiva animal e pública pela diminuição da incidência de que distingue a Medicina da Conservação de outras brucelose em ambas as populações. disciplinas com que se poderia confundir, e que pode São apresentados os resultados finais da primeira contribuir para dar mais impacto ao conhecimento fase do projecto de caracterização das explorações e científico, social e ambiental. Ao tentar compreender 393 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 as tendências biológicas a longo prazo, estudando as num centro de recuperação devem ser estudados inter-especificidades das doenças e as suas relações cuidadosamente. Cabe aos centros de recuperação com a variáveis ambientais, pode-se caminhar recolher animais vivos e cadáveres, determinar causas para acções de melhoria efectiva da saúde dos de entrada e morte respectivamente, patologias ecossistemas, abandonando a visão meramente predisponentes e agentes infecciosos, parasitários e antropocêntrica das ciências que trabalham em Saúde tóxicos presentes. No caso dos cadáveres é particular- Pública. mente relevante proceder à análise minuciosa de todos As doenças não devem ser necessariamente os órgãos, e respectivo conteúdo e lesões. consideradas à partida como uma ameaça ou um problema. Devemos tentar conhecer as suas dinâmicas e estudar a sua distribuição, de forma a poder Fotossensibilidade em ruminantes compreender os seus possíveis efeitos, para que todas em Portugal as eventuais intervenções necessárias possam ser realistas e eficazes. Para que a relevância e Josilene Nascimento Seixas 1, consequências das doenças sejam conhecidas, devem Carlos Augusto Pinto 2, Paulo Vargas Peixoto 3 existir redes de detecção e monitorização das mesmas, 1Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Bolsista do CNPq, de diferentes âmbitos (regional, nacional e internacio- Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, nal), que funcionem de forma integrada. As principais RJ 23890-000, Brasil ([email protected]) limitações da Medicina da Conservação residem no 2Serviço de Desenvolvimento Agrário de São Miguel, facto de ainda não estarem disponíveis todas as 9500-343 Ponta Delgada, Portugal ([email protected]) informações e dados necessários para se poder 3Departamento de Nutrição Animal e Pastagem, Instituto de Zootecnia, compreender completamente as inter-relações Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, existentes entre a Saúde Humana, Animal e dos RJ 23890-000, Brasil ([email protected]) Ecossistemas. A principal razão para tal é que muitos dos fenómenos ambientais, ecológicos e Doenças fotossensibilizantes têm um grande sociais se manifestarem de forma lenta, muitas impacto econômico em várias regiões do mundo. Na vezes imperceptível a curto e médio prazo . África do Sul, a "geeldikkop" enfermidade associada No sentido de contribuir para uma cada vez melhor à ingestão de Tribulus terrestris , já há mais de 50 anos monitorização epidemiológica em espécies selvagens havia afectado mais de meio milhão de ovinos. Entre em Portugal, torna-se cada vez mais essencial reforçar 30-50% do rebanho norueguês sofrem com "alved", e melhorar o funcionamento da Rede Nacional de uma doença fotossensibilizante que resulta da Recolha e Recuperação de Animais Selvagens, que ingestão de Narthecium ossifragum (Flåøyen, 1996). actualmente é composta por cerca de uma dezena de Na África do Sul, onde é conhecida como dikoor" centros de recuperação e cuja entidade gestora é o ("orelha inchada"), bem como na Nova Zelândia e na Instituto da Conservação da Natureza e da Austrália, ainda ocorrem surtos de fotossensibilização Biodiversidade. Esta rede deve constituir-se como um (FTS) determinadas pela ingestão de gramíneas do esqueleto da rede de epidemiovigilância da fauna gênero Panicum (Holland et al ., 1991; Miles et al ., silvestre, com o apoio científico de universidades e 1992). No Brasil, onde a FTS tem causado sérios laboratórios e apoio institucional de entidades estatais prejuízos aos pecuaristas, a maioria dos surtos ocorre com responsabilidades em temas relacionados com pela ingestão de Brachiaria spp, gramíneas que Saúde Pública Humana e Veterinária. constituem boa parte das pastagens. A intoxicação por Embora esta rede tenha surgido num contexto Lantana spp consitui sério problema na Austrália, e meramente relacionado com a recuperação de animais eventualmente, também é causa de FTS no Brasil selvagens, ou seja aos processos à recepção e (Tokarnia et al ., 2000). Apenas na Nova Zelândia, as tratamento de indivíduos, com o objectivo de os perdas decorrentes de quedas na produtividade em libertar no local onde foram encontrados sempre que decorrência do "eczema facial" (FTS causada pela isso seja possível, o potencial de trabalho que pode ser toxina de um fungo saprófita das ervas, Pithomyces desenvolvido em Centros de Recuperação é muito chartarum ) já somaram um montante de pelo menos maior. Para além de funcionarem como Hospitais para 100 milhões de dólares (Flåøyen & Frøslie, 1997). a Fauna Selvagem, os centros podem constituir-se Nos Açores, um dos principais sectores leiteiros de como locais privilegiados para uma primeira linha de Portugal, são comuns os relatos de FTS por produtores monitorização do estado de saúde das populações e com frequência são observadas sequelas de FTS na selvagens. Todos os animais que ingressam num prática clínica e na inspecção sanitária no matadouro, centro são matéria-prima de estudo e de trabalho. o que resulta em prejuízos significativos tanto em Mesmo que não se consiga libertar um indivíduo, há função da rejeição de fígados para consumo, como muito trabalho a realizar, e muita informação que deve pela drástica redução na produção de leite. Em um ser obtida através dele. Por isso, todos os animais estudo realizado nas ilhas de São Miguel e Terceira, vivos, cadáveres e partes de animais que ingressam entre 1999 e 2001, foram diagnosticados 23 surtos de 394 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 pitomicotoxicose com uma média de 11,4% de anátomo-histopatológicos, que variam de acordo com bovinos afectados nas manadas (máximo de 40% de o agente envolvido e com o grau de intoxicação. É morbilidade e 16,7% de mortalidade) (Pinto et al ., importante determinar os níveis de filoeritrina no 2005). Embora ainda não haja publicações sobre sangue ou na urina e os níveis da atividade sérica das doenças fotossensibilizantes no continente português, enzimas hepáticas (Kelerman et al ., 2005). Entre as deve-se atentar para a sua ocorrência, visto que diversas causas de FTS não relacionadas à ingestão de algumas das mais importantes plantas que causam plantas está a utilização de alguns medicamentos FTS também existem em Portugal Continental (fenotiazina, tetraciclina, sulfonamidas, tiazidas e (Franco, 1971; Franco, 1984; Franco & Afonso, corticóides) e de agentes químicos hepatotóxicos 1994). Fagopyrum esculentum é uma das poucas e (tetracloreto de carbono), como também a certas mais conhecida planta entre as que causam FTS doenças infecciosas (Rift Valley Disease) ou em casos primária e que existe em Portugal. A maior parte dos de obstrução biliar causada por faciolose, litíase biliar casos de FTS em animais domésticos é de origem e abscessos hepáticos (Tokarnia et al ., 2000). hepatógena e estão relacionados a ingestão de diversas Profilaticamente, em relação à pitomicotoxicose plantas. Pastagens constituídas predominantemente recomenda-se monitorar as pastagens, através da por Lolium perene e contaminadas por P. chartarum , contagem de esporos e observação das condições em muitos casos, acarretam graves prejuízos aos climáticas favoráveis ao crescimento do fungo criadores de ovinos e bovinos de diversos países, (humidade relativa do ar superior a 90% e temperatura inclusive em Portugal. Nos ruminantes dos Açores, a mínima diária superior a 16 ºC) e fazer a utilização de intoxicação por Lantana camara também tem especial sais de zinco (15-30 mg Zn/ kg PV/ dia) na água, no relevância (Pinto et al ., 2005). Plantas que causam alimento ou através de cápsulas intra-ruminais de cirrose hepática, como Senecio spp, Crotalaria spp e liberação lenta de óxido de zinco (Munday et al ., Echium plantagineum , também podem provocar FTS 2001). Com base no conhecimento dos factores que em parte dos animais (Tokarnia et al , 2000). As lesões determinam a ocorrência, frequência e distribuição cutâneas têm distribuição característica, sobretudo nas geográfica das intoxicações, medidas específicas áreas despigmentadas e/ou desprovidas de pelagem e podem ser adoptadas, porém, de uma forma geral, nas partes mais expostas à luz solar; nos ovinos, deve-se evitar o pastoreio excessivo, utilizar animais localizam-se nas regiões da face, onde desenvolvem de espécies ou idades resistentes a determinadas prurido, edema e conjuntivite. Porém, convêm plantas, evitar introduzir animais com fome ou sede ressaltar que fotodermatite é um sintoma que pode em pastagens com plantas tóxicas e sempre que ocorrer em diferentes grupos de doenças e que para possível, deve-se eliminar ou impedir o acesso às o diagnóstico é preciso associá-la aos achados espécies tóxicas. 395 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Vida Associativa pecuária em Moçambique, sobretudo para quem esteja na preparação da sua carreira profissional ou para O lançamento do livro "A Pecuária no Sul de quem se encontre interessado em aspectos do desen- Moçambique – As províncias do Sul: Inhambane, volvimento de Moçambique. Gaza e Maputo" da autoria do Dr. Fernando de Pinho O Dr. Pinho Morgado agradeceu ainda todos os Morgado foi realizado na Sede da SPCV no dia 7 de colaboradores na obra, referindo-se a António Rocha, Dezembro de 2007. Martins Mendes, Rita-Ferreira, Celestino Gonçalves, Após a abertura da sessão pelo Presidente da SPCV, Cardoso Paisana, Manuela Vilhena, Fernando Dr. Carlos Godinho, a apresentação do autor foi Songane, Amâncio Macamo, Célia Jordão, Sónia realizada pela Prof. Doutora Manuela Vilhena que Maciel e aos seus filhos José Carlos e José Manuel. salientou vários aspectos da vida profissional do Dr. Especial agradecimento foi endereçado ao Dr. Pinho Morgado em Moçambique. Francisco António Souto da GAPI, o principal patroci- Seguiu-se a apresentação do livro pelo Autor, tanto nador do livro. no que se refere à produção da obra como ao seu A sessão finalizou com um Porto de Honra para conteúdo, fazendo-se acompanhar com imagens todos os presentes, associados, colegas, familiares e ilustrando o trabalho realizado. O livro, de acordo com amigos do Dr. Pinho Morgado. o Autor, procura transmitir um pouco das acções desenvolvidas no campo pecuário pelos que produziam, mas também pelos que tiveram interferência nos quase últimos 100 anos, na defesa e promoção deste sector da economia, de grande importância para Moçambique e suas populações, vindo assim completar os anteriores livros referentes às Províncias do Norte e do Centro de Moçambique. O Dr. Fernando Pinho Morgado referiu também que muitos colegas e outras pessoas, não relacionadas directamente com o campo pecuário, irão encontrar no livro um pouco da sua vida, daquilo que viram, sentiram, sofreram, onde estiveram ou passaram e que nele vão reconhecer nomes de locais, amigos, parentes ou encontrar talvez um pouco de si mesmos na esperança de melhorarem o que os rodeia e contribuírem para o desenvolvimento do País onde nasceram ou vivem. Foi também objectivo do Autor que o livro pudesse facilitar, através das referências, a procura de elementos que contribuíram para um melhor conhecimento dos alicerces da 397 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 IN MEMORIUM Professor Doutor Victor Manuel Paes Caeiro Difícil e gratificante é recordar, em jeito de memória pública, o percurso da vida de Alguém que muito admirámos e estimámos! Um Homem rico de emoções, fonte perene de iniciativas, inesgotável polémico e inconformado da condição humana! Evocar a razão de ser e de estar, na vida que passa, de Alguém , condutor de homens, criador de factos, de sentimentos rebeldes, ávido de mais saber, significa a busca de uma inspiração em nós próprios, a forma de compreender o verdadeiro mistério da vida! Os bem-aventurados que tiveram o privilégio de, tantas vezes, discordarem da razão de ser e de estar de Alguém ficam credores da temperança que tanto ambicionam os homens comuns, na busca de uma incontida e efémera perfeição! A inconstância de Alguém é, simplesmente, aparente! Ele busca e persegue um ideal incon- formista, quasi impossível; qualquer dificuldade, um simples escolho, é quanto basta para o perturbar, Fotografia de Susana Rodrigues, Gabinete de Comunicação da Universidade de Évora esquecendo, por instantes, por vezes demasiado longos, um mundo perfeito irreal, mergulhando na Professor Catedrático de Parasitologia da Faculdade incompreensão de si próprio e na contestação dos de Medicina Veterinária de Luanda (1974/75). homens, seus supostos adversários, não inimigos! Regresso á Metrópole em Setembro de 1975 O culto do saber é uma ilusão do homem! Alguém (Quadro Geral de Adidos). procurou o limbo do conhecimento e foi um aprendiz Director Regional de Agricultura do Alentejo de feiticeiro, engenhoso e feliz do seu muito saber… (1980/81). Presidente da Comissão Instaladora da Escola Superior Agrária de Santarém (1982/84). Curriculum Vitae Membro e Director do Conselho Científico da Victor Manuel Paes Caeiro nasceu em Évora, em 17 Escola Superior Agrária de Beja, onde leccionou a de Dezembro de 1929. disciplina de Parasitologia (Curso de Produção Frequentou o liceu Nacional André de Gouveia de Animal 1986/96). 1940 a 1946. Presidente do Conselho Científico, da área das Regente Agrícola pela Escola de Regentes Agrícolas Ciências Agrárias da Universidade de Évora de Évora 1946/49. (1995/97). Licenciado pela Escola Superior de Medicina Membro de várias Sociedades Científicas. Veterinária (ESMV) de Lisboa 1950/55. Publicou cerca de duas centenas de trabalhos de Segundo Assistente da ESMV de Lisboa, nas investigação (matérias parasitológicas) em revistas disciplinas de Parasitologia e Entomologia e Patologia nacionais e estrangeiras. e Clinica das Doenças Parasitárias 1956/62. Participou em numerosos Congressos, Jornadas, Bolseiro da Fundação Calouste Gulbenkian Seminários, etc. sobre matérias parasitológicas. (Pretória 1958/59). Jubilou-se em Dezembro de 2000. Doutor em Ciências Médico-veterinárias (ESMV Os familiares, os amigos íntimos, os colegas de 1962). profissão veterinária, e, porque não, os adversários, Investigador do Instituto de Investigação Científica em vida, de Alguém irão recordá-lo até onde chegar de Angola (1963). temporalmente, o testemunho da sua presença física e Primeiro Assistente nos Estudos Gerais espiritual! E quando, ao longo dos anos, os homens, Universitários (EGU) de Angola (1964). perderem a sua memória colectiva, ficará, segura- Concurso para Professor Extraordinário do 3º grupo mente, o testemunho de Victor Manuel Paes Caeiro de disciplinas do Curso de Medicina Veterinária, dos que dignificou a Ciência Médico-veterinária e os EGU de Angola (1968). "seus" parasitas! Agregação em Novembro de 1968. Director da Faculdade de Medicina Veterinária de José António Carmona Abreu-Lopes Nova Lisboa (1972). Lisboa, Novembro 2007 398 SUPLEMENTO RPCV (2007) 102 (563-564) 377-399 Movimento de sócios Necrologia De 1 de Julho a 31 de Dezembro de 2007 foram Chegou ao nosso conhecimento o falecimento, em admitidos os sócios que a seguir se indicam. 2007, dos colegas Dr. Mário Carriço da Conceição, Estudantes: sócio nº 1214, no dia 29 de Julho; Dr. Rui Miguel 2403 Ricardo Manuel Abreu de Assunção; Varela Baptista, sócio nº 1473, em 18 de Outubro; 2404 Fernando Jorge Coutinho Roriz; Dr. Victor Manuel Paes Caeiro, sócio nº 1026, a 22 2405 Bruno Manuel Pisco Calisto Pateiro da Silva. de Outubro; Dr. João Manuel Machado Gouveia, sócio nº 1368, a 27 de Novembro; Dr. Vitor Manuel d'Albuquerque Matos, sócio nº 752, a 8 de Dezembro; Dr. António José Gonçalves Marques, sócio nº 1671; Dr. José Manuel França e Silva Matos Águas, sócio nº 1672; Dr. Antero António Trindade da Velha, sócio nº 671. Às suas famílias as nossas sentidas condolências. 399 ARTIGO DE REVISÃO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Ressuscitação cardiorespiratória em cães e gatos – revisão Cardiopulmonary resuscitation in dogs and cats – review Claudio Nazaretian Rossi 1*, Valéria Nobre Leal de Souza Oliva 2, Lídia Mitsuko Matsubara 3, Anna Cláudia Marques Serrano 4 1Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Campus de Jaboticabal. Via de acesso Professor Paulo Donato Castellane, s/n. CEP: 14884-900, Jaboticabal – São Paulo, Brasil. 2Faculdade de Odontologia, Curso de Medicina Veterinária, UNESP, Campus de Araçatuba. Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal. Rua Clóvis Pestana, 793. Jardim Dona Amélia. CEP: 16050-680. Araçatuba – São Paulo, Brasil. 3Faculdade de Medicina, UNESP, Campus de Botucatu. Distrito de Rubião Júnior, s/n. CEP: 18618-970. Caixa Postal 530. Botucatu – São Paulo, Brasil. 4Rua Rodrigues Paes, 219, Apto. 31. Bairro Chácara Santo Antônio. CEP: 04717-020 – São Paulo, Brasil. Resumo: A paragem cardiorespiratória (PCR) em cães e gatos 2002). A mesma pode ser classificada como é um evento de ocorrência comum, principalmente em pacientes respiratória ou cardiorrespiratória (Wingfield e críticos e durante os procedimentos anestésicos. Desta forma, é de vital importância detectar precocemente os momentos que Van Pelt, 1992). antecedem a mesma e saber como agir nessas ocasiões, pois, se Na paragem respiratória a ventilação cessa, mas o não for corretamente identificada e corrigida poderá causar a ritmo cardíaco está normal. Porém, se não revertida morte do animal em poucos minutos. O presente artigo tem por rapidamente, evolui para ritmo cardíaco letal e objetivo descrever as alterações que ocorrem momentos antes paragem cardiorespiratória, já que a hipoxemia e a da PCR propriamente dita e as manobras de emergência na ressuscitação cardiopulmonar-cerebral (RCPC) em cães e gatos, hipercapnia decorrentes da paragem respiratória, trazendo orientações relacionadas às medidas terapêuticas podem levar à acidose e à liberação de catecolaminas, corretas e imediatas a serem efetuadas. resultando em arritmias, tais como fibrilação ventri- cular, assistolia ou dissociação eletromecânica, Palavras-chave: paragem cardiorespiratória, ressuscitação atualmente conhecida como atividade elétrica sem cardiopulmonar-cerebral, cães e gatos pulso (AESP) (Nelson e Couto, 2001b). Summary: The cardiopulmonary arrest in dogs and cats is a As causas mais comuns de alterações respiratórias common occurrence, mainly in critical patients and during são aquelas causadas por anestésicos, obstruções das anesthetic procedures. Therefore it is very important an early vias respiratórias, doenças pulmonares e da cavidade detection and the knowledge about these situations, because if not properly identified and assisted the animal may die in a few pleural e causas iatrogênicas, como o espasmo da minutes. The present article has the objective of describing laringe provocado pela intubação em gatos (Muir e briefly the metabolic changes that occur moments before the Hubbell, 1995). cardiopulmonary arrest and the cardiopulmonary and cerebral O funcionamento do coração e consequentemente a resuscitation procedures in dogs and cats, bringing orientation circulação sanguínea, são interrompidos na fibrilação with the purpose of suggesting possible guidelines related to immediate therapeutic measures to be instituted. ventricular, na assistolia e na atividade elétrica sem pulso. Como a AESP pode ocorrer em animais com Keywords: cardiopulmonary arrest, cardiopulmonary-cerebral doença ou paragem cardiorespiratórias graves, é impor- resuscitation, dogs and cats tante verificar a presença de batimentos cardíacos e características de pulso no paciente, mesmo que o eletro- cardiograma esteja normal (Nelson e Couto, 2001b). Tem-se por definição de paragem cardiorespiratória De acordo com dados da Universidade da Geórgia, (PCR) a súbita interrupção da respiração e da circu- nos anos 80, a arritmia letal mais comum em cães e lação sanguínea (Robello e Crowe, 1989). Ainda que gatos foi a AESP (Robello e Crowe, 1989) e, por este afete todos os sistemas do organismo, os órgãos mais motivo, a desfibrilação elétrica não é recomendada acometidos são o cérebro, o coração e os rins (Welsh, como primeira opção no tratamento da PCR, como preconizado na medicina humana (Evans, 1999). De acordo com Crowe e Rabelo (2005) a AESP é uma *Correspondência: [email protected] arritmia muito comum em associação às complicações Tel: +55 13 97091153 anestésicas e à ocorrência de choque. 197 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 Em cães e gatos ocorre inicialmente a paragem ventilação pulmonar (B = Breathing); a circulação (C respiratória, que pode progredir para a paragem = Circulation). cardíaca. O tratamento rápido da paragem respiratória com ventilação assistida e oxigênio pode evitar a Vias Aéreas (A) paragem cardíaca, principalmente se não houver A prioridade na paragem cardiorespiratória é doença grave concomitante (Nelson e Couto, 2001b). estabelecer uma via aérea, sendo que a intubação A paragem cardiorespiratória, isoladamente, parece orotraqueal é o método mais eficiente. Clinicamente, ser mais comum do que a paragem respiratória em a hipoxemia pode estar associada à dispneia, orto- cães acima de quatro anos de idade. Em cães e gatos, pneia, taquipneia, taquicardia, síncope ou cianose a ressuscitação nas paragens respiratórias apresenta (Henik, 1992). melhores resultados do que nas cardiorespiratórias A limpeza prévia das vias aéreas e da cavidade oral (Nelson e Couto, 2001b). deve ser realizada antes da intubação e a sucção pode O termo ressuscitação cardiorespiratória (RCR) tem ser utilizada para remover vômito, sangue, muco ou sido substituído pelo termo ressuscitação cardio- líquidos da boca, faringe e traquéia. A traqueostomia pulmonar-cerebral (RCPC) para enfatizar a importância pode ser necessária se houver dificuldade de acesso à do cérebro durante a ressuscitação e o período após laringe para a intubação através da boca (Henik, a mesma, já que não há vantagem nenhuma em 1992). reestabelecer a função cardiorespiratória de um paciente com atividade cerebral diminuída ou ausente Respiração (B) (Gfeller e Fresno, 2002; Crowe e Rabelo, 2005). Uma vez confirmado o diagnóstico da paragem A ventilação deve ser iniciada assim que uma via cardiorespiratória, todos os esforços devem ser aérea estiver estabelecida. Pode ser realizada através instituídos com o objetivo de melhorar o fluxo sanguí- de aparelho de anestesia utilizando-se oxigênio a neo e reestabelecer o batimento cardíaco, já que os 100%, que é o melhor método, ou através de ambu objetivos imediatos da RCPC são prevenir a lesão com ar ambiente (21% O 2) ou conectado a uma fonte cerebral irreversível, restaurar o funcionamento de oxigênio a 100% (Henik, 1992). efetivo do coração e pulmões e corrigir a hipóxia A taxa de ventilação tem sido extensivamente tecidual e a acidose que se desenvolvem (Nelson e discutida, mas ainda não há consenso sobre a mesma. Couto, 2001b). O diagnóstico é realizado pela As frequências de 20 movimentos respiratórios por observação dos sinais clínicos listados na Tabela 1. minuto para cães de grande porte e de 24 para os de Somente 4,1% dos cães e 9,6% dos gatos sobrevivem pequeno porte, parecem ser mais eficazes que 12 a 15 após a ocorrência da paragem cardiorespiratória e, na respirações por minuto, como previamente recomen- paragem respiratória, as taxas de sobrevivência para dado (Nelson e Couto, 2001b). Já frequências de 12 cães e gatos são de 28,0% e 58,3%, respectivamente por minuto resultam em alcalose respiratória após 8 (Wingfield e Van Pelt, 1992). minutos de ventilação artificial (Sanders et al ., 1984). Tabela 1 - Sinais de paragem cardiorespiratória em cães e gatos Alguns pesquisadores recomendam taxas de venti- lações de 20 a 25 movimentos por minuto (Crowe, Apneia 1988), outros preconizam 20 a 40 movimentos Cianose respiratórios por minuto (Marks, 1999; Young, 1992) Hipotensão (pressão sistólica < 60 mmHg) ou ainda taxas de frequência respiratória semelhantes Aumento do tempo de reperfusão capilar (TRC) às compressões torácicas (Gfeller e Fresno, 2002). A Diminuição ou ausência de sangramento no campo cirúrgico literatura é, portanto, inconclusiva, mas o que Ausência de pulso palpável e batimentos cardíacos prevalece nos focos de discussão atuais são freqüên- Dilatação das pupilas cias respiratórias mais elevadas que as preconizadas antigamente (Gfeller e Fresno, 2002). A decisão de começar ou continuar a RCR deve ser É importante ressaltar que a ventilação e compressão baseada na reversibilidade dos problemas subjacentes simultâneas poderão levar a um risco maior de do paciente e na decisão do proprietário (Henik, barotrauma e pneumotórax, principalmente em 1992). Os procedimentos básicos compreendem pacientes pequenos, não sendo, portanto, recomendada medidas de apoio respiratório e circulatório, conforme (Haskins, 2003). Além disso, uma ventilação excessiva, se seguem. tanto em frequência como em amplitude, poderá levar a uma diminuição ainda maior do retorno venoso, Suporte básico da vida principalmente em pacientes hipovolêmicos. Foi realizado um estudo para determinar o efeito da Constatada a paragem cardiorespiratória, seguem-se taxa de ventilação/compressão e do decúbito durante a os procedimentos diretamente relacionados a RCR, ressuscitação, no qual foram utilizados 18 gatos divi- identificados pelas letras iniciais do alfabeto: a didos em dois grupos (Henik et al ., 1987). Os animais permeabilização das vias aéreas (A = Airway); a do grupo I foram posicionados em decúbito dorsal e 198 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 os do grupo II, em decúbito lateral. Dentro de cada cardíaca interna (Crowe 1988; Crowe et al. , 1988). grupo, os animais foram, ainda, divididos em três O mecanismo pelo qual o fluxo sanguíneo é gerado técnicas de ressuscitação: durante as compressões externas pode ser explicado • Técnica A: 5 compressões cardíacas e 1 pelas teorias da bomba torácica e da bomba cardíaca ventilação, de acordo com a Associação Americana do (Crowe e Rabelo, 2005). Coração (AHA); A teoria da bomba torácica é aquela onde o fluxo é • Técnica B: Compressão e ventilação simultâneas; gerado pelo deslocamento da vasculatura pulmonar • Técnica C: 10 compressões cardíacas e 1 devido às compressões torácicas. Com o aumento da ventilação. pressão intratorácica, gerada pela compressão do tórax, há influência na pressão venosa e no fluxo sanguíneo. Os valores da pressão parcial de oxigênio (PaO 2) A pressão venosa aumenta, diminuindo o fluxo e a foram significativamente maiores nos animais perfusão cerebral. Esse mecanismo é o mais impor- posicionados em decúbito lateral e que receberam 10 tante na compressão externa em cães com mais de compressões para cada ventilação. Em 50% dos 20 kg de peso (Crowe e Rabelo, 2005). animais submetidos à técnica A, ocorreu hipercapnia. Já a teoria da bomba cardíaca baseia-se no fato do Os resultados indicam que o aumento da oxigenação fluxo sanguíneo ser gerado pelo deslocamento das durante a paragem cardiorespiratória, no gato, foi câmaras cardíacas, sendo mais efetivo na geração de maior nos animais posicionados em decúbito lateral. fluxo ao cérebro, já que uma menor pressão venosa é Apesar da técnica C ter apresentado os melhores gerada. Isto é particularmente verdadeiro na compres- resultados neste estudo, pesquisas adicionais são são cardíaca interna. Quando se realiza a compressão necessárias para determinar os efeitos da técnica externa em animais de mais de 20 kg, este mecanismo et al. utilizada na RCR em felinos após a PCR (Henik , não representa qualquer vantagem, já que não se 1987). atinge a eficiência desejada (Crowe e Rabelo, 2005). A estimulação do ponto Jen Chung (Vaso Portanto, cães pequenos, filhotes e gatos devem ser Governador 26), através da acupuntura, pode ser efetivo posicionados em decúbito lateral para a realização da em reverter a paragem respiratória. O método consiste massagem cardíaca externa; já cães com mais de 20 na inserção de agulha de acupuntura ou hipodérmica kg devem ser posicionados em decúbito dorsal no ponto localizado na linha mediana do filtro (Henik, 1992). nasolabial, em profundidade de 10 a 20 mm, girando-a Uma outra manobra possível de se realizar são as até que o animal apresente sinais de reversão da compressões abdominais interpostas entre as compres- apneia. Em 69 casos de apneia ou depressão respi- sões torácicas externas. Isso aumenta o enchimento ratória, durante procedimentos anestésicos, verificou-se cardíaco durante a diástole, aumentando o fluxo 100% de sucesso com 10 a 30 segundos de estimu- sanguíneo total. Também melhora o fluxo arterial lação. Entretanto, em sete casos de apneia seguida de coronário, já que aumenta a pressão aórtica diastólica paragem cardíaca, tratada com o estímulo deste ponto, (Crowe e Rabelo, 2005). obteve-se sucesso de 43%, requerendo-se de 4 a 10 Se a paragem cardíaca ocorrer enquanto o tórax do minutos de estimulação. Essa técnica atua na paciente estiver aberto, a massagem cardíaca interna é depressão respiratória de origem central pela ação a técnica de escolha (Henik, 1992), já que resulta em reflexa dos receptores opiáceos cerebrais produzindo, aumento da pressão sanguínea arterial, do débito ainda, efeitos simpatomiméticos, com reflexos sobre cardíaco e da perfusão cerebral, miocárdica e dos et os sistemas cardiovascular e respiratório (Janssens tecidos periféricos; diminui a acidemia arterial al. , 1979). e venosa, com menores concentrações de lactato e maiores taxas de sobrevida, possibilitando melhor Circulação (C) recuperação neurológica se comparada com as O primeiro método utilizado para promover a circu- manobras externas (Haskins, 1992). lação artificial em animais, após a paragem cardiores- Em cães e gatos, as frequências recomendadas são piratória, é a compressão cardíaca externa. Este méto- de 80 a 120 (Wingfield e Van Pelt, 1992) de 80 a 100 do parece ser ineficaz em proteger o cérebro de (Haskins, 1989), e de 60 a 120 (Crowe, 1988a) injúrias e deve ser somente parte inicial do protocolo compressões por minuto, respectivamente, para ani- de ressuscitação (Evans, 1999), já que o fluxo sanguí- mais de pequeno, médio e grande porte. É importante neo gerado durante a compressão cardíaca externa é dar um intervalo entre elas para permitir a diástole e, de apenas 6 a 20 % do normal (Bircher e Safar, 1981). consequentemente, uma adequada perfusão sanguínea Sua eficácia é dependente da transmissão de força no para todos os órgãos. Esse intervalo limita o número esqueleto torácico, através dos pulmões, coração e de compressões a serem realizadas (Haskins, 2003). vasos intra-torácicos. Certas condições, tais como A decisão de substituir a compressão cardíaca externa fraturas de costela, efusão pleural, hérnia diafragmática pela interna deve ser tomada dentro de 5 minutos de e pneumotórax impedem a realização da manobra, inefetividade das compressões torácicas externas indicando a necessidade da toracotomia e compressão (Haskins, 2003) e quando a paragem ocorrer secun- 199 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 dariamente a uma hipovolemia grave, como a ocorrida massagem cardíaca interna já esteja sendo realizada. após trauma múltiplo ou hemorragia (Crowe e Rabelo, Os efeitos deletérios como lesão coronária, tampona- 2005). mento cardíaco e arritmias refratárias, que podem No caso de RCR interna, o clampeamento aórtico ocorrer, limitam a sua utilização (Marks, 1999). pode ser realizado na porção imediatamente caudal à A eficácia da utilização da via intra-óssea foi avalia- base do coração e é o método mais efetivo de se da, durante a paragem cardiorespiratória, comparan- promover fluxo sanguíneo cerebral e miocárdico no do-a com a via intravenosa. Para isso, administrou-se paciente com ausência de batimentos, aproximando-se um corante de fluoresceína por ambas as vias, sendo de 95% do fluxo normal de um coração normal que o tempo de aparecimento do mesmo, no globo (Crowe e Rabelo, 2005). ocular, pela via intravenosa, foi de 15 a 32 segundos, Essa manobra pode ser realizada utilizando-se uma enquanto que pela via intra-óssea este tempo foi de 5 sonda de nutrição enteral ou mesmo uma sonda uretral a 12 segundos, comprovando uma maior eficácia desta ou equipo de infusão venosa, passados ao redor da última (Aeschbacher e Webb, 1993). aorta com uma pinça hemostática fechando o vaso parcialmente. A técnica pode ser utilizada por até 10 Adrenalina (epinefrina). De todos os fármacos minutos, podendo se aliviar o mesmo por cerca de 5 empregados na paragem cardiorespiratória, nenhum é minutos e depois disso retomar a manobra (Crowe e tão utilizado quanto à adrenalina, mesmo possuindo Rabelo, 2005). efeitos em receptores α e β-adrenérgicos, resultando em maior consumo de oxigênio, quando comparada a outros fármacos que atuam somente em receptores Suporte avançado da vida α-adrenérgicos (Ditchey, 1984). O aumento da pressão arterial ocorre devido a vaso- Fármacos (D) constrição nos leitos vasculares, onde predominam os O suporte avançado da vida inclui o uso de fárma- receptores α-adrenérgicos, especialmente os recep- cos (D = Drugs ou Definitive therapy); do eletrocar- tores α-2, os quais ocasionam um aumento da diograma (E = Electrocardiographic rhythm) e, final- resistência vascular sistêmica, da pressão de perfusão mente, do acompanhamento após a ressuscitação (F = coronariana e do fluxo sanguíneo para o miocárdio Follow-up) ou suporte prolongado da vida (Marks, (Manisterski et al. , 2002). Entretanto, a vasodilatação 1999; Nelson e Couto, 2001b). pode ocorrer em leitos que contém receptores β, como A terapia com fármacos é um componente os músculo-esqueléticos (Vital, 2002). importante do suporte avançado da vida, já que a sua Em doses baixas (<0,2 mg/kg/min), produz efeitos administração promove aumento do fluxo sanguíneo β1 e β2 aumentando o fluxo sanguíneo nos músculos no miocárdio, restabelece a pressão arterial e corrige e diminuindo a pressão arterial e diastólica. Em doses as arritmias cardíacas e a acidose (Crowe, 1988). acima de 0,2-0,3 mg/kg/min há predominância dos Em quase todos os casos a adrenalina é o fármaco efeitos α-adrenérgicos, elevando a pressão arterial de eleição como terapia inicial, e a escolha de um diastólica, o débito cardíaco e a frequência cardíaca, segundo fármaco é instituída baseada no traçado com consequente broncodilatação, vasoconstrição eletrocardiográfico (Crowe et al. , 1988). renal e esplâncnica (Vital, 2002). Porém, doses As vias de administração dos fármacos podem ser: elevadas podem estar associadas a uma incidência • Intravenosa central: é a via de escolha, se estiver maior de fibrilação ventricular (Haskins, 2003). acessível (Marks, 1999); Sua meia-vida sérica é de 3 minutos, sendo indicada • Intratraqueal: utilizada somente se uma via intra- em estados de choque que não respondam a dopamina venosa não estiver disponível, pois permite a absorção ou durante as manobras de ressuscitação na paragem rápida dos fármacos pelos pulmões, devendo ser cardiorespiratória (Evans, 1996). evitada quando uma doença respiratória estiver Recomenda-se a administração de adrenalina, presente. As doses utilizadas devem ser, pelo menos, primeiramente, pelas vias intravenosa, intra-óssea (0,2 duas vezes maiores do que as preconizadas pela via mg/kg) ou intra-traqueal (0,4 a 0,8 mg/kg), seguida de intravenosa. O bicarbonato, o cálcio e a noradrenalina 5 a 10 ml de solução salina. Devido à meia vida curta são fármacos que não devem ser administrados por (3 a 4 minutos), a infusão contínua é recomendada, esta via (Manisterski et al. , 2002); iniciando-se com 0,05 a 0,1 mg/kg/min, podendo-se • Intra-óssea: pode ser mais rápida e eficiente que a aumentar esta dose progressivamente, a cada 10 via intravenosa, podendo ser utilizada para grandes minutos, até se atingir a resposta desejada, não se volumes; é a via de escolha para filhotes quando não aconselhando doses superiores a 1,5 a 2,0 mg/kg/min se dispõe de uma via intravenosa (Marks, 1999); (American Heart Association, 2000). • Intravenosa periférica: embora não seja a via ideal, Alguns autores testaram várias doses de adrenalina, pode ser utilizada, seguindo-se de injeção de solução administradas pela via traqueal, na paragem cardiores- salina estéril (Marks, 1999); piratória, verificando que somente doses 10 vezes • Intracardíaca: deve ser evitada, a menos que a maiores que a usualmente recomendada (0,3 mg/kg) 200 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 foram eficientes em aumentar a pressão sanguínea em humanos devido à ausência de dados relacionados arterial. A administração de adrenalina nas doses de a possíveis efeitos colaterais. 0,02, 0,035, 0,1 e 0,2 mg/kg provocaram uma diminuição significativa das pressões arteriais sistólica, Dopamina. É indicada nos quadros de bradicardia e diastólica e média por atuação em receptores hipotensão, após a restauração do fluxo sanguíneo β-adrenérgicos (Manisterski et al. , 2002). espontâneo (American Heart Association, 2000). Seus Outros autores também relataram diminuição da diferentes efeitos são dose-dependentes, produzindo pressão arterial em todos os cães após a administração ação em receptores dopaminérgicos, α e β-adrenérgi- de adrenalina traqueal na dose de 0,05 mg/kg, quando cos (Oliva, 2002b). É sempre administrada na forma comparada à administração de solução salina. Este de infusão contínua, e doses menores que 2 efeito é devido ao fato da adrenalina, nesta dose, estar mg/kg/min atuam predominantemente nos receptores associada a efeitos predominantes em receptores dopaminérgicos e doses entre 2 e 5 mg/kg/min atuam β-adrenérgicos, promovendo vasodilatação (Vaknin et em receptores β1, aumentando a frequência cardíaca, al. , 2001). o débito cardíaco e a contratilidade do miocárdio Quando houver a necessidade de aplicação exógena (Oliva, 2002b). de adrenalina e o paciente estiver sendo anestesiado A interação da dopamina com os diferentes tipos de com halotano, a dose utilizada deverá ser menor receptores, de acordo com a dose utilizada, poderá (0,01 mg/kg), já que o mesmo sensibiliza o miocárdio levar a sua escolha como possível agente que assegure à ação das catecolaminas (Oliva, 2002a). melhor perfusão esplâncnica, não só pelo aumento do débito cardíaco, mas também pela vasodilatação Vasopressina. Experimentalmente, a vasopressina ou promovida pelos receptores dopaminérgicos. hormônio anti-diurético tem-se mostrado como um dos agentes farmacológicos vasopressores mais indi- Dobutamina. Possui afinidade seletiva para receptores cados na RCR, em substituição à adrenalina. Os níveis β1, aumentando a força de contração. Não é, portanto, endógenos de vasopressina, em humanos submetidos recomendada como protocolo inicial de tratamento na à RCR, são significativamente maiores nos sobre- paragem cardíaca (Evans, 1999). É uma catecolamina viventes que naqueles em que a circulação espontânea de ação direta por não liberar noradrenalina dos não pode ser restaurada (Schmittinger et al. , 2005). terminais adrenérgicos, possui efeito predominante Diversos estudos realizados em suínos mostraram sobre o inotropismo cardíaco, sendo pouco afetados o que esse fármaco melhora o fluxo sanguíneo para os cronotropismo e a excitabilidade, o que lhe confere órgãos vitais, melhora o fornecimento de oxigênio e a baixo índice de taquicardia e arritmogenicidade. A taxa de ressuscitação quando comparada à adrenalina dose recomendada é de 1 a 5 mg/kg/min (Vital, 2002). (Schmittinger et al. , 2005). A vasopressina promove intensa vasoconstrição Atropina. Os fármacos parassimpatolíticos têm sido periférica em tecidos cutâneo, muscular, esquelético, recomendados, durante a PCR, devido à rápida intestinal e gorduroso, com efeitos menos expressivos progressão da bradicardia inicial em assistolia (Evans, nos leitos coronariano e renal, além de vasodilatação 1999). É indicada nos casos de bradicardia sinusal cerebral. Não produz vasodilatação da musculatura grave e no bloqueio átrio-ventricular, causados por et al. esquelética ou aumento no consumo de oxigênio pelo aumento do tônus vagal (Crowe , 1988). miocárdio, já que não apresenta atividade em receptores As pesquisas não elucidam o papel do tônus paras- β2-adrenérgicos (Araújo e Araújo, 2001) e seu efeito simpático e da terapia aniticolinérgica na parada pode variar de 10 a 20 minutos (Haskins, 2003). cardíaca, mas existem relatos que cães vagotomizados Schmittinger et al. (2005), relataram um caso de apresentam maior retorno da circulação espontânea RCR bem sucedida, com o uso da vasopressina, quando comparados a cães que não foram submetidos em um cão de 11 anos. A paragem cardíaca ocorreu à cirurgia de ressecção do nervo vago, indicando a sua durante a anestesia para a excisão de adenocarcinoma utilização no protocolo de ressuscitação da PCR mamário, com o diagnóstico de assistolia. Foram (DeBenhke, 1993). realizadas compressões torácicas externas, ventilação As doses variam de 0,02 a 0,04 mg/kg pelas por pressão positiva intermitente e a administração de vias intravenosa, intramuscular ou subcutânea. Se duas doses de vasopressina (0,8 UI/kg, IV), com administrada em doses inferiores a 0,015 mg/kg, pelas retorno da circulação espontânea. Três dias após vias intramuscular ou subcutânea, pode promover o animal recebeu alta, sem nenhuma alteração bradicardia paradoxal (Muir, 1978). neurológica. Como há pouca informação clínica até o momento, Lidocaína. É o fármaco de escolha nos casos de o seu uso é recomendado apenas para humanos, no arritmias ventriculares, bloqueando os canais de caso de assistolia, AESP, e nos casos em que a PCR sódio. Exerce maior efeito nos tecidos despolarizados permanece após o tratamento com adrenalina. Apesar (ex. isquêmicos) e/ou nos tecidos de impulso rápido. de todas as evidências favoráveis, o seu uso é limitado A lidocaína não é útil nas arritmias atriais, provavel- 201 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 mente porque os potenciais de ação nestas são tão Eletrocardiograma (E) curtos que os canais de sódio estão inativos apenas por Tão logo seja possível, deve-se conectar um monitor um breve momento, e os períodos diastólicos são de eletrocardiograma ao paciente. O diagnóstico relativamente longos (Roden, 1996). correto da arritmia cardíaca facilita o sucesso da RCR. Utiliza-se a dose de 2 mg/kg em cães, podendo ser A fibrilação ventricular, a assistolia ventricular e a repetida duas a três vezes, se necessário. Em gatos, AESP produzem o mesmo som à auscultação, mas o doses menores devem ser utilizadas para evitar toxici- tratamento difere para cada uma dessas arritmias dade (0,25 a 0,5 mg/kg como dose inicial) (Nelson e (Nelson e Couto, 2001b). Couto, 2001a). A fibrilação ventricular deve ser revertida com desfibrilador elétrico o mais rápido possível, sendo Bicarbonato de sódio. A utilização do bicarbonato de que, anteriormente, deve-se administrar adrenalina na sódio na RCR, em cães, deve ser limitada apenas aos dose de 0,2 mg/kg, para converter a fibrilação fina em casos em que ocorre acidose metabólica severa após espessa (Young, 1992). A assistolia ventricular deve tempo prolongado de ressuscitação, superiores há 10 ser tratada com sulfato de atropina na dose de 0,04 a minutos, sempre baseado no exame de hemogasome- 0,06 mg/kg, além do uso da adrenalina (Young, 1992). tria (VanPelt et al. , 1990). O tratamento para a AESP consiste na aplicação de dexametasona na dose de 2 mg/kg, que atua liberando O bicarbonato desvia a curva de dissociação da estoques de ATP das mitocôndrias das células hemoglobina para a esquerda, impedindo a utilização isquêmicas do miocárdio, restaurando a função do oxigênio, além de poder causar acidose paradoxal normal da membrana (Robello e Crowe, 1989), sendo devido à combinação do mesmo com íons hidrogênio que alguns pacientes podem se beneficiar com a livre, resultantes da degradação do ácido láctico. administração de cálcio, embora a sua administração Consequentemente, ocorre a produção de dióxido de apresente alguns riscos consideráveis (Haskins, 2003). carbono, que é livremente transportado para as células do cérebro e miocárdio, resultando em alcalose Fluidoterapia extracelular, hipernatremia e exacerbação da acidose Logo após a PCR ocorre uma vasodilatação e, como venosa central (Crowe, 1988; VanPelt et al. , 1990). consequência, uma anóxia tecidual, sendo assim impor- tante que se institua a fluidoterapia rapidamente com o Cálcio. A administração de cálcio é contra-indicada, intuito de se manter o volume sanguíneo circulante. A exceto em hipocalemias graves, hipocalcemias ou na taxa de infusão de ringer com lactato preconizada é de utilização de bloqueadores de canais de cálcio, como 40 ml/kg para cães, e de 20 ml/kg para gatos, exceto nos ocorre nos casos de sobredose de halotano ou isofluo- casos de anemia e hipoproteinemia, onde a fluido- rano (Crowe, 1988). terapia não é indicada (Haskins, 2003). O uso do gluconato de cálcio ou do cloreto de Se o paciente necessita de infusões rápidas de cálcio na RCR oferece resultados ruins. Após a volume devido à hemorragia grave como, por exemplo, reperfusão em órgãos isquêmicos, o cálcio penetra na no trauma ou choque hipovolêmico, a reposição com célula e atua como um catalisador na formação de colóides (Hetastarch 6%) apresenta melhores resulta- radicais superóxidos, principalmente dos radicais dos do que a infusão única de cristalóides (Ringer com hidroxila, que são os responsáveis por lesões de mem- Lactato), que não permanecem na circulação por mais brana, rompem a fosforilação oxidativa e bloqueiam a de uma hora e contribuem para o edema cerebral grave produção e liberação de ATP (trifosfato de adenosina) seguido de parada (Crowe e Rabelo, 2005). na mitocôndria. Estes superóxidos estão envolvidos A expansão de volume não é recomendada, a menos nas lesões de reperfusão do coração e cérebro (Crowe, que a hipovolemia esteja presente antes da paragem (Crowe e Rabelo, 2005). 1988). Por esse motivo o cálcio foi removido dos protocolos de RCR. Suporte prolongado da vida (F) Amiodarona. É um potente inibidor da automatici- dade anormal e, na maioria dos tecidos, prolonga a O atendimento à PCR exige, além dos procedimentos ação do potencial de ação e o período refratário nos citados, a observação contínua do paciente, mesmo átrios e ventrículos (Roden, 1996). É um anti-arrítmico nos casos em que o ritmo normal tenha sido pronta- da classe III utilizado na ressuscitação cardiorespi- mente reestabelecido (Young, 1992). ratória nos casos de taquicardia ventricular refratária Se a respiração espontânea está ausente, a (Marks, 1999). A amiodarona têm sido utilizada na ventilação artificial deve ser instituída e fármacos medicina humana nos casos de fibrilação ventricular vasoativos, como a dopamina e a dobutamina, podem não responsiva à lidocaína e à desfibrilação elétrica ser necessários, mantendo-se a ventilação e a perfusão (Marks, 1999). adequadas (Marks, 1999). 202 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 A lesão cerebral resultante da paragem cardiorespi- horas; o desferil (desferoxamina), um quelante de ratória e da ressuscitação surge em decorrência de ferro que diminui a quantidade de radicais livres de uma complexa interação de fatores, que incluem oxigênio, na dose de 40 mg/kg fornecido durante 15 sobrecarga neuronal de cálcio e diminuições do fluxo minutos em salina (Crowe e Rabelo, 2005). sanguíneo cerebral (Nelson e Couto, 2001b). Alguns procedimentos devem ser realizados objeti- No passado acreditava-se que a morte cerebral ocorria vando-se prevenir e diminuir as lesões neurológicas, após quatro minutos de parada, entretanto, com a utiliza- tais como o suporte volêmico, oxigênio suplementar, ção de drogas citoprotetoras e nos casos de hipotermia, a restauração do equilíbrio ácido-básico, suporte ressuscitação já se mostrou efetiva em até uma hora e metabólico e abordagem neuroprotetora e anti-edema meia de parada total em cães (Crowe e Rabelo, 2005). do sistema nervoso central (Crowe e Rabelo, 2005). Apesar dos fármacos estarem sob investigação, A utilização imediata de corticosteróides de rápida alguns deles já são utilizados nos protocolos de reani- ação em doses altas (dexametasona a 2 mg/kg) está mação, assim que o coração volta a bater e o fluxo associada a uma melhora significativa das taxas de possa estar reestabelecido no cérebro. Entre elas está ressuscitação. Acredita-se que os corticóides permi- o manitol, uma droga anti-radical livre na dose de 0,25 tam que haja uma liberação maciça de ATP na a 1 g/kg, administrado duas vezes em intervalo de mitocôndria das células miocárdicas isquêmicas e quatro horas ou em infusão contínua numa solução a possibilitem o retorno da função celular normal 10% para fornecer 4,4 g/kg em oito horas; o DMSO (Crowe e Rabelo, 2005). (dimetilsulfóxido) que também atua contra os radicais As condutas a serem tomadas no caso de uma livres, na dose de 250 mg/kg fornecido lentamente em paragem cardiorespiratória estão esquematicamente 15 minutos diluído em salina e repetido após quatro representadas na Figura 1. Organograma R.C.R. Procedimentos na paragem cardiorespiratória: l Ausência de batimentos cardíacos l Apneia, mucosas cianóticas Avaliar as Vias Respiratótias Aberta Obstruída Atividade respiratória efetiva? Desobstruir SIM NÃO l Monitorar o paciente l Intubação traqueal / l Definir as causas da parada traqueostomia e ventilação respiratória com oxigênio a 100% l Tratamento apropriado l Ventilar o paciente e avaliar o pulso / sons cardíacos Presente Ausente l Continuar ventilação até a l Compressão cardíaca externa ou interna (80 – 120 compressões / min) observação de respiração l Decúbito lateral (cães até 20 kg e gatos) ou dorsal (cães acima de 20 kg) espontânea l Ligar o monitor cardíaco l Seguir tratamento apropriado da arritmia observável l Fibrilação ventricular l Assistolia l Atividade elétrica sem pulso l Checar o pulso l Desfibrilação elétrica (2J-4J/kg) – 3 vezes l Fluidoterapia l RCR + Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l Oxigenação e ventilação l Desfibrilação elétrica (6J-8J/kg) – 3 vezes l Atropina (0.04mg/kg) l Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l RCR + Vasopressina (0.5 unidades/kg) l Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l Atropina (0.04mg/kg) l Desfibrilação elétrica (10J-12J/kg) – 3 vezes l Fluidoterapia l Bicarbonato de sódio l Desfibrilação interna (0.2J/kg) l Vasopressina (0.5 unidades/kg) l Cálcio (0.6ml/kg – solução 10% de l Desfibrilação interna (0.2J-0.3J/kg) – 3 vezes l Bicarbonato de sódio (0.5mEq/kg) gluconato de cálcio) l Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l Corticosteróide (Dexametasona l Cálcio (0.6ml/kg – solução 10% de 2.0mg/kg) gluconato de cálcio) l Adrenalina (0.2-0.3mg/kg) l Continuar RCR se a assistolia persistir Figura 1 - Esquema representativo das condutas a serem tomadas no caso de uma paragem cardiorespiratória. 203 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 Considerações finais Evans AT (1999). New thoughts on cardiopulmonary resuscita- tion. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Embora a PCR seja um evento de baixo índice de Practice, 29: 819-829. Gfeller WR e Fresno CA (2002). Cardiopulmonary cerebral reversibilidade, para que se tenha um melhor prognós- resuscitation (CPCR) update. In: 20 th ACVIM, Dallas. tico, é de suma importância um diagnóstico precoce Proceedings… Dallas: Texas, 11-13. para que se possa iniciar as manobras de ressuscitação Haskins SC (1989). Cardiopulmonary resuscitation. In: Current o mais rápido possível. Veterinary Therapy (Small animal practice), 2ª edição. Existem controvérsias quanto à relação entre o Editor: R.W. Kirk. WB Saunders Company (Filadélfia), número de ventilações e compressões torácicas, mas, 330-336. independentemente da técnica utilizada, é vital que as Haskins SC (1992). Internal cardiac compression. Journal of mesmas supram as necessidades mínimas para que se American Veterinary Medical Association, 200; 1945-1946. propicie a continuidade da oxigenação orgânica, Haskins SC (2003). Cardiopulmonary resuscitation. In: principalmente no que tange os órgãos vitais. Também Textbook of small animal surgery, 3ª edição. Editor: D. Slatter. Elsevier Science (Filadélfia), 2613-2623. é crucial que se tenha conhecimento dos passos a Henik RA (1992). Basic life support and external cardiac com- serem seguidos durante a manobra de ressuscitação, pression in dogs and cats. Journal of American Veterinary bem como a existência de uma equipe treinada e Medical Association, 200: 1925-1931. sincronizada, minimizando-se desta forma o tempo Henik RA, Wingfield WE, Angleton GM e Porter RE (1987). entre o diagnóstico da PCR e a sua intervenção, Effects of body position and ventilation/compression ratios melhorando, assim, a taxa de sucesso do procedimento. during cardiopulmonary resuscitation in cats. 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McGraw-Hill 849-860. Interamericana (Rio de Janeiro), 616-642. 204 Rossi CN et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 197-205 Sanders AB, Ewy GA e Taft TV (1984). Ressuscitation and Vital MA (2002). Agonistas e antagonistas adrenérgicos In: arterial blood gas abnormalities during prolonged Farmacologia Aplicada à Medicina Veterinária, 3ª edição. cardiopulmonary resuscitation. Annals of Emergency Editores: H.S. Spinosa, S.L. Górniak e M.M. Bernardi. Medicine, 13: 676. Guanabara Koogan (Rio de Janeiro), 72-86. Schmittinger CA, Astner S, Astner L, Kossler J, Wenzel V Welsh EM (2002). Cómo tratar…la parada cardio-respiratoria, (2005). Cardiopulmonary resuscitation with vasopressin in Waltham Focus, 12: 2-3. a dog. Veterinary Anaesthesia and Analgesia, 32: 112-114. Wingfield WE e Van Pelt DR (1992). Respiratory and Vaknin Z, Manisterski Y, Ben-Abraham R, Efrati O, Lotan D, cardiopulmonary arrest in dogs and cats: 265 cases (1986- Barzilay Z e Paret G (2001). Is endotracheal adrenaline 1991). 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Fortaleza – Ceará 2Departamento de Patologia e Medicina Legal, Faculdade de Medicina, Centro Especializado em Micologia Médica, Universidade Federal do Ceará. Fortaleza – Ceará Resumo: Atualmente, o gênero Malassezia compreende treze Introdução espécies. Este trabalho pretende realizar uma abordagem teórica sobre esta levedura em humanos e animais, enfocando os aspectos históricos, laboratoriais, clínicos e sensibilidade antifúngica. O O gênero Malassezia , até a década de 90, era diagnóstico laboratorial desta levedura é baseado em exame constituído por três espécies: M. furfur , M. sympodialis direto e identificação fenotípica e molecular. Em humanos e M. pachydermatis . Em 1996, o gênero teve sua taxo- sadios ou com dermatite já houve o isolamento de todas as espé- nomia revista com base em parâmetros fisiológicos, cies de Malassezia , com exceção das espécies M. nana , M. caprae e M. equina . Em cães e gatos saudáveis ou apresentando bioquímicos e moleculares, passando a englobar mais alguma enfermidade foram isoladas as espécies M. pachyder- quatro espécies: M. globosa , M. obtusa , M. restricta e matis , M. furfur , M. sympodialis , M. globosa e M. nana de M. slooffiae . A partir de 2002, através de estudos diferentes sítios anatômicos. Em 1997, o NCCLS liberou uma moleculares, quatro novas espécies foram incluídas: versão aprovada para o teste de sensibilidade antifúngica de leveduras. Porém, ainda não existe uma padronização para este M. dermatis , M. japonica , M. yamatoensis e M. nana . teste in vitro para Malassezia spp. Apesar dos diversos avanços Mais recentemente foram isoladas duas novas espécies: na pesquisa desta levedura nos últimos 10 anos, muito ainda se M. caprae e M. eqüina , totalizando, atualmente, 13 precisa estudar com relação ao gênero Malassezia , como, por espécies no gênero. exemplo, mais estudos epidemiológicos, bem como o desenvolvi- mento de uma padronização para o teste de sensibilidade in vitro . As espécies do gênero Malassezia constituem parte da microbiota de humanos sadios, podendo ser Palavras-chave: Malassezia spp., humanos, animais isoladas de áreas ricas em glândulas sebáceas, particu- larmente peito, costas e couro cabeludo. Além disto, Summary: Currently, the genus Malassezia comprehends thir- teen species. The aim of this article is to perform a theoretical também estão associadas a doenças cutâneas, incluindo approach about these yeasts in humans and small animals, a dermatite atópica, pitiríase versicolor e dermatite focusing the historic, laboratorial, clinical ant antifungal sensi- seborréica. Em humanos sadios com dermatites tivity aspects. The laboratorial diagnostic of this yeast is based já houve o isolamento de todas as espécies de on the direct exam and phenotypic and molecular identification. In humans with dermatitis, or healthy individuals, all species of Malassezia , com exceção de M. nana , M. caprae e Malassezia were already isolated, with the exception of M. M. eqüina . nana , M. caprae and M. equina . In dogs and cats, healthy or Na Medicina Veterinária é conhecida a participação with some illness, it has been isolated the species M. pachyder- de Malassezia spp. como parte da microbiota, bem matis , M. furfur , M. sympodialis , M. globosa , and M. nana , from different anatomic regions. In 1997, the NCCLS liberated como na etiopatogenia de algumas enfermidades, an approved version of standard methods for the antifungal principalmente dermatites e otites, tanto em animais sensitivity testing of yeasts. However, there is not a standard in domésticos quanto em selvagens. Em cães e gatos, já vitro susceptibility test for Malassezia spp. Despite the several foi descrito na literatura o isolamento das espécies M. advances in the research of this yeast in the last 10 years, there is still much to study concerning this genus, like, for example, pachydermatis , M. furfur , M. sympodialis , M. globosa more epidemiological studies, as well as the development of an e M. nana , de diferentes sítios anatômicos, em animais in vitro standard sensitivity test. sadios ou apresentando alguma patologia. Devido à inclusão de novas espécies ao gênero Keywords: Malassezia spp., humans, animals Malassezia , este trabalho pretende realizar uma abordagem teórica sobre as treze espécies, enfocando *Correspondência: [email protected] os aspectos históricos, laboratoriais, clínicos e sensi- Tel: +55 85 32242348; Fax: +55 85 40089117 bilidade antifúngica in vitro . 207 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 Aspectos Históricos e Taxonomia do e Guého (1990) definiram uma nova espécie, a M. Gênero Malassezia sympodialis . Até 1996, o gênero Malassezia compreendia apenas O gênero Malassezia pertence ao reino Eumycota , três espécies: M. furfur , M. pachydermatis e M. divisão Basidiomycota , classe Hymenomycetes , ordem sympodialis , segundo as características dos ácidos Tremellales e família Filobasidium uniguttulatum nucléicos, mostrando relação guanina-citosina de 66, (Hoog et al. , 2000). A nomenclatura e taxonomia 55,5 e 54%, respectivamente (Vargas et al. , 2004). deste gênero têm apresentado controvérsias desde Guého et al. (1996) revisaram a taxonomia do gênero, 1846, quando Eichstedt reconheceu a etiologia fúngica que passou a compreender mais quatro espécies: da pitiríase versicolor, uma micose superficial M. globosa , M. obtusa , M. restricta e M. slooffiae , benigna e crônica que foi descrita, pela primeira vez, baseados em estudos fisiológicos, bioquímicos e por William em 1801. O agente etiológico da pitiríase moleculares. versicolor permaneceu sem designação até 1853, A partir de estudos moleculares, quatro novas quando Robin o denominou Microsporum furfur por espécies foram incluídas: M. dermatis , M. japônica , considerá-lo um dermatófito, em virtude da presença M. yamatoensis e M. nana (Sugita et al. , 2002, 2003, de filamentos associados à levedura. Baillon, em 2004; Hirai et al. , 2004). Mais recentemente, duas 1889, reconheceu que o agente da pitiríase versicolor novas espécies lipodependentes foram identificadas: não estava relacionado com o gênero Microsporum , M. equina e M. caprae (Cabañes et al. , 2007). como acreditava Robin, e, em homenagem ao micolo- Atualmente, são 13 as espécies conhecidas de gista Malassez, denominou-o Malassezia furfur Malassezia que terão suas características fisiológicas (Vargas et al. , 2004; Chen e Hill, 2005). descritas a seguir. Malassez, em 1874, observou a presença de fungos Malassezia pachydermatis : É a única espécie a constituídos por células ovóides, raramente esféricas, crescer em meio agar Sabouraud sem suplementação com gemulação, sugerindo sua participação na lipídica. Apresenta assimilação positiva aos Tween 40 patogenia da caspa, que Sabouraud denominou e 60, fraca ou positiva ao Tween 80 e pode ou não Pityrosporum malassezii , em 1904, e que, em 1913, assimilar o Tween 20. As reações de esculina e Castellani e Chambers denominaram de Pityrosporum catalase podem ser positivas (+) ou negativas (-) e ovale (Vargas et al. , 2004; Chen e Hill, 2005). cresce em 37 e 40 °C (Vargas et al. , 2004). A reação Em 1951, Gordon cultivou microrganismos de de urease é positiva, porém algumas cepas apresentam formato arredondado de pacientes com ptiríase versi- reação negativa em um meio sólido suplementado color e denominou de Pityrosporum orbiculare . com vermelho fenol (Guillot e Bond, 1999). Somente em 1986 o Comitê Internacional de Malassezia furfur : Esta espécie é lipodependente, Taxonomia dos Fungos unificou os dois gêneros com necessitando de suplementação de ácidos graxos de a aceitação do nome Malassezia furfur (incluindo P. cadeia longa para o seu crescimento. Não cresce em ovale , P. orbiculare e M. furfur ) (Vargas et al. , 2004; agar Sabouraud simples, mas cresce bem em Chen e Hill, 2005). Sabouraud enriquecido com Tween 20, 40, 60 e 80, na A espécie Malassezia pachydermatis foi primeira- concentração de 0,1 a 10%, como único suplemento mente identificada, em 1925, a partir de escamas de lipídico. É catalase-positiva, apresenta uma fraca um rinoceronte indiano com dermatite esfoliativa. Por reação de ß-glicosidase (esculina negativa) e é a única sua semelhança com o P. ovale , mas seu tamanho espécie do gênero que assimila o Cremophor EL menor (2-3 µm em comparação aos 3-8 µm do P. adicionado ao meio Sabouraud. Cresce a 37 e 40 °C ovale ), Weidman propôs o nome Pityrosporum pachy- (Vargas et al. , 2004). dermatis para o organismo. Gustafson, em 1955, Malassezia sympodialis : Espécie lipodependente isolou leveduras de cães com otite externa e as rela- que assimila Tween 40, 60 e 80, mas não o Tween 20. cionou com o gênero Pityrosporum , denominado-as Apresenta reação catalase (+) e esculina (+), em 24 de Pityrosporum canis por não apresentarem a mesma horas. Cresce em 37 e 40 °C (Vargas et al. , 2004). lipodependência que as demais espécies do gênero. Malassezia globosa : Espécie lipodependente, não Slooff determinou que todas as espécies do gênero assimila os Tween 20, 40, 60 e 80. Apresenta reação que não fossem lipodependentes fossem denominadas catalase (+), mas não apresenta ß-glicosidase, ou seja, P. pachydermatis . Após a unificação dos gêneros é esculina (-). Pode apresentar um pequeno cresci- Pityrosporum e Malassezia , em 1986, o nome mento a 37 °C, entretanto, não cresce a 40 °C (Vargas Malassezia pachydermatis foi então adotado (Vargas et al. , 2004). et al. , 2004; Chen e Hill, 2005). Malassezia obtusa : Esta espécie é semelhante à M. O uso da análise genômica, no início da década de globosa , diferindo apenas na capacidade de apresentar 90, levou a uma classificação mais clara das leveduras reação esculina (+) (Vargas et al. , 2004). do gênero Malassezia . Por conseguinte, com base na Malassezia restricta : É a espécie lipodependente diferença na percentagem de guanina e citosina no mais exigente, não assimilando os Tween 20, 40, 60 e DNA, quando comparada com a M. furfur , Simmons 80 nem o Cremophor EL. Não apresenta ß-glicosidase 208 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 (esculina (-)), sendo a única espécie catalase (-). Pode lisa, brilhantes a opacas, textura cremosa e moderada- apresentar pequeno crescimento a 37 °C, porém não mente convexas. As células são ovóides (2,9-4,7 x 1,2- cresce a 40 °C (Vargas et al. , 2004). 3,1 µm), com formação de brotos na base estreita. M. slooffiae : Espécie lipodependente que assimila Espécie lipodependente que, assim como a M. caprae Tween 20, 40 e 60, mas não assimila o Tween 80. não assimila Tween 20 e cremophor EL, mas assimila Apresenta catalase (+) e esculina (-) e cresce bem a 37 fracamente Tween 40, 60 e 80. Apresenta reação de e 40 °C (Vargas et al. , 2004). catalase (+) e de esculina freqüentemente (-). Não M. dermatis : Esta espécie apresenta características cresce a 40 ºC, mas pode apresentar fraco crescimento fisiológicas semelhantes à M. furfur . Assimila os a 37 ºC (Cabañes et al. , 2007). Tween 20, 40, 60 e 80, apresenta reação de catalase (+) e esculina (-) e cresce bem a 37 e 40 ºC. Porém, a percentagem molecular de G+C do DNA da M. Diagnóstico laboratorial dermatis é 60,4% enquanto que a da M. furfur é de 66,0 a 66,7% (Sugita et al. , 2002). Exame direto M. japonica : Espécie lipodependente, assimila os O exame microscópico direto de escamas de pele Tween 40 e 60 como única fonte de lipídio, mas não pode ser realizado com aumento de 400x de lâminas assimila os Tweens 20 ou 80. Apresenta reação de preparadas com hidróxido de potássio (KOH) a 10%, catalase (+) e cresce bem a 37 ºC, porém não acrescido de tinta Parker Quink permanente, de cor apresenta crescimento à 40 ºC (Sugita et al. , 2003). negra, na proporção de três partes de KOH e uma de M. yamatoensis : Espécie lipodependente que tinta (3:1). Também podem ser utilizados o azul de apresenta características similares a M. furfur e M. metileno, o PAS (ácido periódico Schiff), coloração de dermatis , assimilando os Tween 20, 40 e 80 e apresen- Diff-Quick e o Giemsa (Vargas et al. , 2004; Chen e tando reação de catalase (+). Porém, não cresce a Hill, 2005). Exame direto de material proveniente de 40 ºC (Sugita et al. , 2004). zaragatoa de ouvido, ou saco conjuntival, pode ser M. nana : Espécie lipodependente semelhante à M. realizado por microscopia de imersão de lâminas sympodialis , não assimila o Tween 20, mas assimila os coradas com Diff-Quick ou de Gram (Crespo et al. , Tween 40, 60 e 60. Apresenta reações de catalase (+) 1999, Prado et al. , 2004). Ao microscópio, são e esculina (-) e cresce bem a 37 e 40 ºC (Hirai et al. , observadas leveduras esféricas ou ovais isoladas ou 2004). agrupadas em cachos, podendo ou não apresentar M. caprae : Após sete dias de crescimento a 32 ºC filamento curtos de parede grossa, com um ou dois as colônias são pequenas (com 0,5 a 1,8 mm de septos (Vargas et al. , 2004) (Figura 1). diâmetro), de coloração branca a creme, superfície lisa, brilhantes ou opacas e moderadamente convexas. Identificação fenotípica As células apresentam formato oval a esférico (2,7-4,5 x 1,7-4,5 µm), com formação de brotos na base estreita. As espécies de Malassezia podem ser identificadas Espécie lipodependente, não assimila Tween 20 e através de suas características morfológicas e assimila fracamente Tween 40, 60 e 80. Não assimila bioquímicas (Guillot et al. , 1996). Em relação às cremophor EL. Apresenta reação de catalase (+) e características morfológicas, consideram-se aspectos esculina freqüentemente (+). Não cresce a 40 ºC, mas macroscópicos da colônia e microscópicos da levedura. pode apresentar fraco crescimento a 37ºC (Cabañes et Geralmente, as colônias aparecem entre o segundo e o al. , 2007). quarto dia de incubação, a uma temperatura entre 35 e M. eqüina : Após sete dias de crescimento a 32 ºC as 37 ºC. Existem diversos meios de cultura descritos colônias são pequenas, (com <0,5 a 2 mm de para o isolamento das espécies lipodependentes, diâmetro), de coloração branca a creme, superfície sendo o agar Sabouraud-dextrose, com cloranfenicol, cicloeximida e óleo de oliva, e o meio agar Dixon os mais utilizados. A incorporação de óleos na superfície do meio apresenta baixo rendimento, sendo recomenda- da a incorporação das substâncias lipídicas no próprio meio de cultura (Vargas et al. , 2004). O meio utilizado para o cultivo parece não influenciar a micromorfologia da levedura (Guillot e Bond, 1999). As colônias de Malassezia spp., em meios apropria- dos e a uma temperatura de incubação de 35 a 37 ºC, são Figura 1 - Identificação fenotípica de M. pachydermatis . A) Exame de textura cremosa, de cor creme a marrom-clara, direto de material proveniente de zaragatoa de ouvido de um cão apre- topografia convexa, superfície lisa ou levemente rugosa, sentando sinais de otite. Lâmina corada com coloração de Gram. aspecto seco e de diâmetro variável de acordo com o Observam-se numerosas leveduras, arredondadas a ovais, apresentando gemulação. C e D) Colônias de M. pachydermatis em Agar Sabouraud tempo de incubação (Vargas et al ., 2004) (Figura 1). sem adição de ácidos graxos (C) e em agar Dixon (D). Quando se observa o crescimento de uma colônia 209 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 leveduriforme, deve-se proceder ao exame micros- enzimática foi obtida com a utilização das enzimas cópico da mesma, através de preparações com solução Cfo I e Bst F51, seguida de eletroforese em gel de salina, lactofenol azul de algodão ou corante de Gram. agarose 2%. Usando a enzima Cfo I pode-se distinguir Estruturas arredondadas ou ovais em gemulação (blas- nove diferentes espécies de Malassezia , incluindo M. toconídios), de aproximadamente 2-3 µm de largura e furfur , M. pachydermatis , M. globosa , M. obtusa , M. 4-5 µm de comprimento, associadas ou não à presença restricta , M. slooffiae , M. nana , M. japonica e M. de hifas e pseudo-hifas, devem ser observadas (Vargas yamatoensis , mas M. sympodialis e M. dermatis et al ., 2004) (Figura 1). produziram o mesmo padrão. Porém, estas duas espécies A identificação da espécie M. pachydermatis é podem ser diferenciadas usando a enzima Bst F51. baseada na sua não dependência de lipídios, verificada através do seu crescimento em meio agar Sabouraud sem a adição de ácidos graxos. Porém, a Frequência de Malassezia spp. em identificação das espécies lipodependentes é baseada na habilidade de assimilarem ésteres de polioxietileno humanos e pequenos animais (Tweens 20, 40, 60 e 80), seguindo a chave para Vários são os relatos de isolamento de Malassezia identificação de espécies, descrita por Guého et al . spp. em humanos sadios, porém, tanto a espécie isolada (1996) e o teste de difusão de Tween proposto por quanto a frequência do isolamento é variável. Já foram Guillot et al . (1996). O teste de assimilação do citadas na literatura, o isolamento das espécies M. furfur , Cremophor EL e esculina descrito por Mayser et al . M. sympodialis , M. pachydermatis , M. globosa , M. (1997) podem ser utilizados como instrumentos adi- restricta , M. slooffiae , M. japonica e M. yamatoensis cionais para a diferenciação das espécies M. furfur , M. (Sugita et al ., 2002, Sugita et al ., 2003, Sugita et al ., slooffiae e M. sympodialis . Após a identificação das 2004, Salah et al ., 2005, Sandstrom et al ., 2005). quatro novas espécies lipodependentes de Malassezia , Porém, a presença de M. pachydermatis na pele Sugita et al . (2004) propuseram uma nova tabela de humana é rara e transitória (Guillot e Bond, 1999). características fenotípicas para o gênero (Quadro 1). Apesar de espécies de Malassezia poderem ser encontradas na pele de indivíduos sadios, elas têm Identificação molecular sido implicadas em uma variedade de doenças Os testes fenotípicos para a identificação das espé- cutâneas e sistêmicas, como pitiríase versicolor, cies de Malassezia demandam tempo e são incapazes dermatite seborréica, dermatite atópica e fungemia de diferenciar as espécies M. dermatis , M. japonica , (Chen e Hill, 2005) (Figura 2). M. yamatoensis e M. nana , isoladas a partir de 2002. A pitiríase versicolor, uma infecção fúngica superfi- Portanto, vários estudos têm sido desenvolvidos com o cial crônica, é uma das desordens de pigmentação intuito de melhorar o processo de identificação destas mais comumente observada na clínica humana derma- leveduras. Em 2005, Mirhendi et al . descreveram um tológica. De pacientes apresentando esta enfermidade simples método de PCR e enzimas de restrição para a já foram isoladas as espécies M. furfur , M. globosa , identificação e diferenciação das 11 espécies de M. restricta , M. slooffiae e M. sympodialis (Erchida et Malassezia . A amplificação do PCR foi realizada al ., 2000; Nakabayachi et al ., 2000; Gupta et al ., utilizando-se os primers 5’-TAACAAGGATTCCCCTAGTA 2001; Rincon et al ., 2005; Salah et al ., 2005). e 5’-ATTACGCCAGCATCCTAAG e a digestão A dermatite seborréica caracteriza-se com inflamação Quadro 1 - Características fisiológicas das espécies de Malassezia . Espécie Crescimento Crescimento em Reação de Reação de Utilização de Tween Sab a a 32 ºC Dixon a esculina catalase 32 ºC 37 ºC 40 ºC 20 40 60 80 M. pachydermatis + + + + + ou - ±ou + + + + + M. furfur - +++ - + ++++ M. sympodialis - +++ + + -+++ M. globosa - +±ou -- - + ---- M. obtusa - +±ou -- + + ---- M. restricta - ++------M. slooffiae - + + + - + ± ou + + + - M. dermatis - +++ - + ++++ M. japonica - ++- ? + -±+- M. yamatoensis - ++- ? + ++++ M. nana - ++± - + ±++± M. caprae - ?±ou -- + + -+++ M. eqüina - ?±- - + ±+++ a Agar Sabouraud; +, positivo; -, negativo; ±, fracamente positivo. Fonte: Sugita et al. (2004); Cabañes et al. (2007). 210 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 A dermatite atópica é uma doença de pele crônica, multifatorial e inflamatória, associada com a regulação imunológica anormal; com alérgenos de Malassezia spp. sendo implicados na sua patogênese (Chen e Hill, 2005). As espécies mais frequentemente isoladas de pacientes apresentando dermatite atópica são M. furfur , M. sympodialis , M. restricta e recentemente M. japonica , M. dermatis e M. yamatoensis (Sugita et al ., 2002; Sugita et al ., 2003; Sugita et al ., 2004; Rincon et al ., 2005; Sandstrom et al ., 2005). Acreditava-se que apenas a M. pachydermatis colo- nizava os animais domésticos. Bond et al . (1995) descreveram o isolamento desta espécie em diferentes sítios anatômicos de cães saudáveis e verificaram uma maior incidência desta levedura no ouvido, seguido de lábio inferior e espaço interdigital dorsal. A menor incidência foi observada na axila e virilha (Bond et al ., 1995). Porém, atualmente já foram isoladas de vários sítios anatômicos as espécies lipodependentes de Malassezia (Bonde et al ., 1996; Bond et al ., 1997; Raabe et al ., 1998; Nardoni et al ., 2005). Em cães saudáveis, Raabe et al . (1998) isolaram as espécies M. pachydermatis , M. furfur e M. sympodialis tanto de ouvido quanto da pele. Das culturas de pele foram isoladas culturas mistas das três leveduras e de M. pachydermatis com M. furfur ou M. sympodialis . Porém, das culturas de ouvido também foram identifi- Figura 2 - Paciente apresentando pitiríase versicolor causada por cadas culturas isoladas de M. sympodialis . Malassezia spp. na região da nuca (A) e no tórax (B). O primeiro isolamento de M. pachydermatis de saco e descamação em áreas ricas em glândulas sebáceas, conjuntival foi descrito por Prado et al . em 2004. A como couro cabeludo, face e tronco. M. globosa , M. levedura foi isolada de 3% das amostras provenientes sympodialis , M. obtusa e M. yamatoensis foram as espé- de sacos conjuntivais de cães saudáveis na cidade de cies isoladas de pacientes apresentando esta desordem Fortaleza, Ceará. (Sugita et al ., 2004; Sandstrom et al ., 2005). Bond et al . (1996, 1997) descreveram, pela primeira Quadro 2 - Isolamento de Malassezia spp. em diferentes sítios anatômicos de cães e gatos sadios. Sítio Anatômico / M. pachydermatis M. furfur M. sympodialis M. globosa Hospedeiro Referências Referências Referências Referências Cães Ouvido Bond et al ., 1995 Raabe et al ., 1998 Raabe et al ., 1998 Raabe et al ., 1998 Giraão et al ., 2006 - Pele Raabe et al ., 1998 Raabe et al ., 1998 Raabe et al ., 1998 - Lábio inferior Bond et al ., 1995 - - - Espaço interdigital dorsal Bond et al ., 1995 - - - Axila Bond et al ., 1995 Kennis et al ., 1996 - - - Virilha Bond et al ., 1995 Kennis et al ., 1996 - - - Queixo Kennis et al ., 1996 - - - Saco conjuntival Prado et al ., 2004 - - - Gatos Ouvido Raabe et al ., 1998 Raabe et al ., 1998 Nardoni et al ., 2005 Crespo et al ., 1999 Raabe et al ., 1998 Nardoni et al ., 2005 Nardoni et al ., 2005 Pele - - Bond et al ., 1996 Bond et al ., 1997 Bond et al ., 1996 Bond et al ., 1997 Mucosas - - Bond et al ., 1996 Bond et al ., 1996 Bond et al ., 1997 Bond et al ., 1997 211 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 vez, o isolamento das espécies lipodependentes isolaram, além da M. pachydermatis , as espécies M. sympodialis e M. globosa da pele e mucosas de M. furfur e M. sympodialis de animais doentes gatos saudáveis. Em 1998, Raabe et al . relataram a (Crespo et al ., 2002). identificação de M. furfur e M. sympodialis em colônias Em gatos acometidos por otite externa, já foram mistas com M. pachydermatis de ouvido de gatos isoladas as espécies M. pachydermatis , M. furfur , M. saudáveis. Porém, o primeiro isolamento puro de M. globosa , M. sympodialis e M. nana (Hirai et al ., 2004; furfur em um gato saudável foi descrito por Crespo et Nardoni et al ., 2005). Apesar da M. pachydermatis al ., em 1999 (Quadro 2). Em estudo conduzido por poder estar envolvida em casos de otite externa em Nardoni et al . (2005), foi obtida cultura positiva em gatos, ela não ocorre com a mesma frequência que em 23% (12/52) das amostras provenientes de ouvidos de cães (Crespo et al ., 2000b). O primeiro isolamento de gatos sadios. M. globosa e M. pachydermatis foram uma espécie lipodependente foi relatado por Crespo et isoladas como espécies únicas em um (1,9%) e sete al . (2000b), que isolaram a levedura M. sympodialis (13,4%) gatos saudáveis, respectivamente, enquanto em dois gatos acometidos por otite externa. que a associação M. pachydermatis e M. furfur foram Em estudo conduzido por Nardoni et al . (2005), foi isoladas de quatro (7,7%) animais. obtida cultura positiva de 63,6% (63/99) das amostras A dermatite por Malassezia em cães foi descrita, provenientes de gatos acometidos por otite externa. pela primeira vez, por Dufait, em 1983. Desde então, Das amostras coletadas, 26 (26,3%) e 1 (1%) o papel em potencial desta levedura na etiopatogenia apresentavam somente a espécie M. pachydermatis e da dermatite tem sido estudado (Morris, 1999; M. globosa , respectivamente. M. pachydermatis foi Matousek e Campbell, 2002). As lesões de pele por isolada em associação com outra espécie lipodepen- Malassezia consistem de eritema e hiperpigmentação dente em 36 amostras: somente com a M. furfur , com e normalmente afetam o abdômen ventral, face, patas M. globosa e M. furfur , com M. sympodialis e M. e região perineal (Guillot e Bond, 1999). furfur e somente com M. globosa em 13 (13,2%), 2 Os fatores que favorecem a proliferação da M. (2%), 1 (1%) e 20 (20,2%) amostras, respectivamente. pachydermatis e a sua transição de um organismo Recentemente, em um gato apresentando otite comensal para um patógeno na pele do cão não estão externa no Japão, foi isolada uma espécie de bem elucidados. Presumivelmente ocorrem distúrbios Malassezia que apresentava características distintas nos mecanismos fisiológicos, químicos ou imunológi- das nove demais espécies conhecidas no momento do cos que restringem a colonização microbiana da pele experimento. Através de análises fenotípicas e mole- (Guillot e Bond, 1999). culares se chegou à classificação de uma nova espécie, Já foi identificada uma predisposição racial, apesar M. nana (Hirai et al ., 2004). de ocorrerem variações geográficas. Basset hound, Prado et al . (2004) isolaram pela primeira vez a M. dachshund, cocker spaniel, West Highland White terrier pachydermatis do saco conjuntival de cães. Porém, a e poodle têm sido relatadas como as raças de maior incidência desta levedura em cães apresentando úlcera risco. Não há predileção por sexo ou idade (Guillot e de córnea foi significativamente maior (P< 0,05) do Bond, 1999). que em cães sadios (23 vs. 3%). Estes dados indicam Em gatos, a dermatite por M. pachydermatis ocorre que o aumento de fosfolipídios associados com a com menor frequência que em cães, porém as lesões reação inflamatória presente na úlcera de córnea são semelhantes. Dos casos ocasionais de dermatite favorece o crescimento de leveduras lipofílicas como localizada ou generalizada descritos em gatos, as lesões a M. pachydermatis (Prado et al ., 2004). encontradas foram dermatite esfoliativa, eritema exsu- dado gorduroso e graus variados de prurido (Guillot e Bond, 1999). Perfil de sensibilidade antifúngica in vitro Otite externa associada a Malassezia é normalmente caracterizada por um exsudado de cerúmen marrom Em 1997, o National Committee for Clinical ou amarelado, com graus variados de eritema, prurido Laboratory Standards (NCCLS) liberou uma versão e dor (Guillot e Bond, 1999; Nardoni et al ., 2005). aprovada (M27-A) de métodos de macro e A espécie mais frequentemente isolada de cães é a microdiluição em caldo padronizados para o teste de M. pachydermatis . Girão et al . (2006) descrevem o sensibilidade antifúngica de leveduras. Em 2002 esta isolamento desta levedura em um número significati- versão foi revista (M27-A2), porém, este documento vamente maior de ouvidos de cães acometidos por não é aplicável para Malassezia spp. devido a sua otite externa, quando comparado com ouvidos sadios, lipodependência, à exceção da M. pachydermatis o que pode implicar o seu papel patogênico nesta (NCCLS, 2002). enfermidade. O teste de sensibilidade antifúngica, segundo o Crespo et al . (2000a) isolaram três espécies de NCCLS (2002), foi padronizado para espécies de leveduras lipodependentes de cães apresentando otite Candida e segue a metodologia que será descrita a externa, sem, no entanto, chegarem à identificação da seguir. O teste de macrodiluição e o de microdiluição espécie. Contudo, os mesmos autores, em 2002, são realizados com um volume final de 1 e 0,2 ml, 212 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 respectivamente. O meio utilizado é o RPMI 1640 Bibliografia tamponado com MOPS (ácido 2-[N-morfolino]- propanossulfônico), com o pH 7,0. A densidade do Bond R, Anthony RM, Dodd M, Lloyd DH (1996). Isolation inóculo foi padronizada para 0,5 a 2,5 x 10 3 UFC/ml. of Malassezia sympodialis from feline skin. J Med Vet Mycol, 34: 145-147. Ficou estabelecido que o tempo de incubação de Bond R, Howell SA, Haywood PJ, Lloyd DH (1997). 48 horas, a uma temperatura de 35 ºC, foi o que Isolation of Malassezia sympodialis and M. globosa promoveu resultados mais consistentes. from healthy pet cats. Vet Rec,141: 200-201. Para os derivados azólicos a concentração inibitória Bond R, Saijonmaa-Koulumies LE, Lloyd DH (1995). mínima (CIM) foi definida como a menor concen- Population sizes and frequency of Malassezia pachyder- tração com queda predominante (90% inibição) da matis at skin and mucosal sites on healthy dogs. J Small turbidez quando comparada com o controle (CIM 90). Anim Pract, 36: 147-150. Cabañes FJ, Theelen B, Castellá G, Boekhout T (2007). Two Já para a anfotericina B a CIM foi padronizada como new lipid-dependent Malassezia species from domestic aquela que demonstrava inibição total de crescimento animals. FEMS Yeast Research, doi:10.111/j.1567- (CIM 100) (NCCLS, 2002). 1364.2007.00217.x Vários estudos estão sendo realizados, buscando Chen T, Hill PB (2005). The biology of Malassezia organ- uma padronização do teste de sensibilidade para isms and their ability to induce immune responses and espécies de Malassezia . Gupta et al ., em 2000, skin disease. Vet Dermatol, 16: 4-26. Crespo MJ, Abarca ML, Cabañes FJ (1999). Isolation of realizaram um teste de sensibilidade baseados no Malassezia furfur from a cat. J Clin Microbiol, 37: método de diluição em agar. O método utilizava 1573-1574. inóculo de 1 x 10 4 células/ml e os meios Leeming- Crespo MJ, Abarca ML, Cabañes FJ (2000a). Atypical -Notman ou Sabouraud. Foram testadas as drogas lipid-dependent Malassezia species isolated from dogs cetoconazol, voriconazol, itraconazol e terbinafina. with otitis externa. J Clin Microbiol, 38: 2383-2385. A maioria das cepas foi sensível a cetoconazol, Crespo MJ, Abarca ML, Cabañes FJ (2000b). Otitis externa voriconazol e itraconazol, sendo que as cepas de M. associated with Malassezia sympodialis in two cats. J Clin Microbiol, 38: 1263-1266. furfur , M. globosa e M. obtusa foram as mais Crespo MJ, Abarca ML, Cabañes FJ (2002). Occurrence of resistentes a terbinafina. Malassezia spp. in the external ear canals of dogs and cats Um dos trabalhos mais recentes e com uma boa with and without otitis externa. Med Mycol, 40: 115-121. reprodutibilidade descreve o método de microdiluição Erchida VC, Martos AO, Casaño AV, Erchida AC, Fajardo FS para oito espécies de Malassezia com a utilização do (2000). Malassezia globosa as the causative agent of meio RPMI 1640, acrescido de Tween 20, testando pityriasis versicolor. Br J Dermatol, 143: 799-803. Girão MD, Prado MR, Brilhante RSN, Cordeiro RA, sete drogas antifúngicas: fluconazol, itraconazol, Monteiro AJ, Sidrim JJC, Rocha MFG (2006). voriconazol, cetoconazol, posaconazol, terbinafina e Malassezia pachydermatis isolated from normal and anfotericina B para oito espécies de Malassezia . O diseased external ear canals in dogs: A comparative tamanho do inóculo utilizado foi entre 2,0 e 3,5 x 10 3 analysis. Vet J, 172: 544-548. UFC/ml e o material foi mantido em estufa a 32 ºC Guého E, Midgley G, Guillot J (1996). The genus durante 48 horas ( M. furfur e M. pachydermatis ) ou Malassezia with description of four new species. 72 horas ( M. sympodialis , M. slooffiae, M. globosa , Antonie Van Leeuwenhoek, 69: 337-355. Guillot J, Bond R (1999). Malassezia pachydermatis : a M. obtusa , M. restricta e M. dermatis ) (Velegraki et review. Med Mycol, 37: 295-306. al ., 2004). Guillot J, Guého E, Lesourd M, Midgley G, Chévrier G, Dupont B (1996). Identification of Malassezia species. A practical approach. J Med Mycol, 6: 103-110. Considerações finais Gupta AK, Kohli Y, Faergemann J, Summerbell RC (2000). In vitro susceptibility of the seven Malassezia species to Nos últimos 10 anos, o estudo de Malassezia spp. ketoconazole, voriconazole, itraconazole and terbinafine. Br J Dermatol, 142: 758-765. tem ganhado destaque dentro da micologia médica, Gupta AK, Kohli Y, Faergemann J, Summerbell RC (2001). tanto humana quanto veterinária. Durante este período, Epidemiology of Malassezia yeasts associated with oito novas espécies foram isoladas, novos métodos de pityriasis versicolor in Ontario, Canada. Med Mycol, 39: identificação foram apresentados e está se buscando a 199-206. padronização dos testes de sensibilidade antifúngica. Hirai A, Kano R, Makimura K, Duarte ER, Handam JS, Porém, muito ainda se precisa estudar com relação a Lachance MA, Yamaguchi H, Hasegawa A (2004). Malassezia nana sp. Nov., a novel lipid-dependent yeast este gênero, como, por exemplo, mais estudos species isolated from animals. Int J Syst Evol Microbiol, epidemiológicos, com enfoque nas novas espécies 54: 623-627. descritas na literatura, bem como o desenvolvimento Hoog GS, Guarro J, Gené J, Figueiras MJ (2000). Atlas of de uma padronização para o teste de sensibilidade in Clinical Fungi. Centraalbureau voor Schimmelcultures vitro . (Utrecht). 213 Ribeiro do Prado M et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 207-214 Kennis RA, Rosser EJJr, Olivier NB, Walker RW (1996). Salah SB, Makni F, Marrakchi S, Sellami H, Cheikhrouhou Quantity and distribution of Malassezia organisms on F, Bouassida S, Zahaf A, Ayadi A (2005). Identification the skin of clinically normal dogs. J Am Vet Med Assoc, of Malassezia species from Tunisian patients with 208: 1048-1051. pityriasis versicolor and normal subjects. Mycoses, 48: Matousek JL, Campbell KL (2002). Malassezia dermatitis. 424-245. Compend Contin Educ Pract Vet, 24: 224-232. Sandstrom Falk MH, Tengvall Linder M, Johansson C, Mayser P, Haze P, Papavassilis C, Pickel M, Gruender K, Bartosik J, Back O, Sarnhult T, Wahlgren CF, Scheynius Guého E (1997). Differentiation of Malassezia species: A, Faergmann J (2005). The prevalence of Malassezia selectivity of Cremophor EL, castor oil and ricinoleic yeasts in patients with atopic dermatitis, seborrhoeic acid for M. furfur . Br J Dermatol, 137: 208-213. dermatitis and healthy controls. Acta Derm Venereol, Mirhendi H, Makimura K, Zomorodian K, Yamada T, Sugita 85: 17-23. T, Yamaguchi H (2005). A simple PCR-RFLP method Simmons RB, Guého E (1990). A new species of for identification and differentiation of 11 Malassezia Malassezia . Mycol Res, 94: 1146-1149. species. J Microbiol Methods, 61: 281-284. Sugita T, Tajima M, Takashima M, Amaya MT, Saito M, Morris DO (1999). Malassezia dermatitis and otitis. Vet Clin Tsuboi R, Nishikawa A (2004). A new yeast, Malassezia North Am – Small Anim Pract, 29: 1303-1310. yamatoensis , isolated from a patient with seborrheic Nakabayachi A, Sei Y, Guillot J (2000). Identification of dermatitis, and its distribution in patients and healthy Malassezia species isolated from patients with sebor- subjects. Microbiol Immunol, 48: 579-583. rhoeic dermatitis, atopic dermatitis, pityriasis versicolor Sugita T, Takashima M, Kodama MT, Tsuboi R, Nishikawa and normal subjects. Med Mycol, 38: 337-341. A (2003). Description of a new yeast species, Nardoni S, Mancianti F, Rum A, Corazza M (2005). Malassezia japonica , and its detection in patients with Isolation of Malassezia species from healthy cats and atopic dermatitis and healthy subjects. J Clin Microbiol, cats with otitis. J Fel Med Surg, 7: 141-145. 41: 4695-4699. NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Sugita T, Takashima M, Shinoda T, Suto H, Unno T, Tsuboi Standards. Reference method for broth dilution antifun- R, Ogawa H, Nishikawa A (2002). New yeast species, gal susceptibility testing of yeasts (2002). Approved Malassezia dermatis , isolated from patients with atopic Standard M27-A2. NCCLS, Wayne, Pa. dermatitis. J Clin Microbiol, 40: 1363-1367. Prado MR, Brito EHS, Girão MD, Monteiro AJ, Sidrim JJC, Vargas VES, Gompertz OF, Sidrim JJC, Jarabran MCD Rocha MFG (2004). Higher incidence of Malassezia (2004). Pitiríase versicolor e doenças por Malassezia pachydermatis in the eyes of dogs with corneal ulcer spp. In: Sidrim JJC, Rocha MFG, Micologia Médica à than in healthy dogs. Vet Microbiol, 100: 115-120. Luz de Autores Contemporâneos. Editora Guanabara Raabe P, Mayser P, Weiß R (1998). Demonstration of Koogan S.A. (Rio de Janeiro), 112-123. Malassezia furfur and M. sympodialis together with M. Velegraki A, Alexopoulos EC, Kritikou S, Gaitanis G pachydermatis in veterinary specimens. Mycoses, 41: (2004). Use of fatty acid RPMI 1640 media for testing 493-500. susceptibilities of eight Malassezia species to the new Rincon S, Celis A, Sopo L, Motta A, Cepero de Garcia MC triazole posaconazole and to six established antifungal (2005). Malassezia yeast species isolated from patients agents by a modified NCCLS M27-A2 microdilution with dermatologic lesions. Biomédica, 25: 189-195. method and Etest. J Clin Microbiol, 42: 3589-3593. 214 ARTIGO DE REVISÃO REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Parâmetros qualitativos da carne ovina: um enfoque à maturação e marinação Qualitative parameters of lamb meat: a focus in ageing and marination Nivea Maria Brancacci Lopes Zeola 1*, Pedro Alves de Souza 2, Hirasilva Borba Alves de Souza 2, Américo Garcia da Silva Sobrinho 3 1Departamento de Zootecnia, FCAV/Unesp, Jaboticabal/SP/Brazil. 2Professores do Departamento de Tecnologia, FCAV/Unesp, Jaboticabal/SP/Brazil. 3Professor do Departamento de Zootecnia, FCAV/Unesp, Jaboticabal/SP/Brazil Resumo: Sendo consideradas tecnologias de fácil aplicação e Introdução baixo custo, a maturação e a marinação com cloreto de cálcio podem ser utilizadas para melhoria da maciez da carne. Nesta O rebanho ovino do Brasil é de 14.027.271 cabeças, revisão serão discutidos os fatores que influenciam na qualidade sendo que na região Nordeste encontram-se 8.001.613 da carne, como, o processo de instalação do rigor mortis , avaliado pelas medidas de pH e temperatura da carcaça após o cabeças, na região Sul 3.709.358 cabeças, na região abate, a cor da carne, a capacidade de retenção de água, bem Centro-Oeste 943.506 cabeças, na região Sudeste como, a interação destes fatores com a utilização das tecnologias 856.059 cabeças, e na região Norte 516.734 cabeças. de maturação e marinação. Além destas abordagens, também O estado de São Paulo atualmente apresenta a maior será discutida a influência destas tecnologias no produto final, concentração de ovinos da região Sudeste com por meio da análise sensorial com o objetivo de avaliar o grau de aceitação destas carnes. 515.337 cabeças. O país ocupa o 16º lugar no ranking mundial em número de cabeças, sendo que a China Palavras-chave: características qualitativas, carne, marinação, está em 1º lugar com 366.641.000 cabeças maturação (ANUALPEC, 2008). A região Nordeste é reconhecida pelo potencial para Summary: Being considered technologies of easy application and low cost, ageing and marination with calcium chloride can produção de carne e pele ovina. No entanto, existe be used for improvement meat tenderness. In this revision the uma elevada demanda insatisfeita com este factors that influence meat quality will be discussed, as, process produto, o que resultou em aumento significativo nas of rigor mortis installation, evaluated by pH and temperature importações brasileiras de ovinos para o abate, de measures of carcass after slaughter, meat color, water holding carcaça de cordeiros e de animais adultos, no período capacity, as well as, the interaction of these factors with utilization of ageing and marination technologies. Besides, the influence of de 1992 a 2000, demonstrando que há muito espaço these technologies will also be discussed in final product, by para o crescimento da ovinocultura no Brasil (D'araújo means of sensorial analysis with the objective of evaluating the Couto, 2001). degree of acceptance of these meats. O consumo de carne ovina no Brasil ainda é baixo, em torno de 800 g/ per capita /ano, no entanto, o setor Keywords: qualitative characteristics, meat, marination, ageing está em fase de crescimento, pois estima-se que a pro- dução atingirá 100 milhões de cabeças nos próximos 10 anos e o segmento se firmará como boa alternativa de aplicação, sendo que atualmente a criação de cordeiros no País movimenta R$ 360 milhões ao ano, considerando o preço de venda do quilo da carne a R$ 5,00 (Galvão, 2004). O mercado consumidor apresenta elevada exigência em relação as características qualitativas da carne, o que torna necessário o conhecimento de parâmetros de qualidade no sistema de produção de ovinos destinados ao abate (Bressan et al ., 2001). Segundo Cunha et al . *Correspondência: [email protected] Departamento de Zootecnia, FCAV/Unesp - Via de Acesso (2004) as raças de corte utilizadas tradicionalmente Prof. Paulo Donato Castellane, s/n. CEP: 14884-900, pelos produtores no estado de São Paulo, como Ile de Jaboticabal/SP/Brazil France e Suffolk estão sendo substituídas pelas raças 215 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 deslanadas. Neste contexto, a raça ovina deslanada a milhares de miofibrilas, em que os sarcômeros Morada Nova considerada de pequeno porte, resultou constituem as unidades contráteis. O sarcômero do cruzamento de ovinos Bordaleiros, vindos de apresenta um disco em cada extremidade, conhecido Portugal, com ovinos deslanados africanos. São como disco Z e apresenta quatro tipos de grandes animais dóceis, adaptam-se rapidamente às diversas moléculas protéicas: actina, tropomiosina, troponina e práticas de manejo apresentando como equilíbrio miosina (Pearson e Young, 1989). No momento da zootécnico a dupla aptidão: carne e pele (Lima, 1985). contração muscular os filamentos de actina deslizam No entanto, os artigos encontrados na literatura a sobre os de miosina (James, 1993). respeito da qualidade físico química da carne de As fibras podem ser classificadas em vermelhas ou cordeiros Morada Nova são escassos. Também raros, lentas (Tipo I), intermediárias (Tipo IIA) e brancas ou senão inexistentes, são os trabalhos que estudaram o rápidas (Tipo IIB). Os músculos apresentam uma tempo ideal de maturação e a utilização do cloreto de mistura de todos os tipos em proporções variáveis, cálcio nas carnes provenientes desta raça. contribuindo para a cor do mesmo, sendo rara a A preferência pela carne ovina no mercado presença de músculos compostos exclusivamente de brasileiro apresenta aspectos comuns, como a busca fibras de um tipo, mesmo naqueles com aparência por carne macia com pouca gordura e muito músculo, predominantemente branca ou vermelha (Prata, 1999). comercializada a preços acessíveis (Silva Sobrinho, As fibras vermelhas apresentam teores mais elevados 2001). Devido a estes aspectos é fundamental nesta de mioglobina, contração lenta em função do metabo- fase de crescimento da atividade, a implantação lismo oxidativo e baixo metabolismo glicolítico, de técnicas racionais durante a criação, o abate e o sendo mais resistentes à fadiga do que as fibras brancas pós-abate, visando a obtenção de carne de melhor (Pearson e Young, 1989). As intermediárias, aliam qualidade para o mercado consumidor interessado características que não permitem enquadrá-las nos pelo produto. Desta forma, tornam-se de suma outros dois tipos, enquanto as brancas, possuem importância a otimização dos aspectos qualitativos da menor quantidade de mioglobina, alto metabolismo carne. glicolítico e contração rápida (Klont et al ., 1998). Em Neste contexto, técnicas utilizadas pós-abate como relação ao teor de calpastatina das fibras musculares, a maturação e a utilização do cloreto de cálcio, visam as do tipo I apresentam teores mais altos, quando melhorar as características organolépticas da carne, comparadas com as do tipo IIA, que apresentam teor como a maciez, beneficiando desta forma o consumi- intermediário, e as do tipo IIB, as quais apresentam dor (Bawcom et al ., 1995). De acordo com Osório e menor teor de calpastatina (Ouali e Talmant, 1990). Osório (1999) há escassez de estudos relacionados à A composição do tipo de fibra no músculo é de espécie ovina analisando o período de maturação particular importância para o metabolismo post necessário para alcançar o ótimo das características mortem e para a capacidade de retenção de água, sensoriais. afetando a qualidade da carne. Desta forma, estudos Sendo assim, a produção de carne ovina apresenta demonstram que músculos com predominância de escassez de pesquisas no setor, reforçando a necessidade fibras vermelhas são mais susceptíveis ao encurta- do desenvolvimento de novas tecnologias pós-abate mento pelo frio. A associação das fibras vermelhas ao que proporcionem características desejáveis à carne e encurtamento está relacionada com sua pequena que possam ser utilizadas em escala comercial. capacidade para reter o cálcio a baixas temperaturas e pH, assim como ao maior número de mitocôndrias (Cornforth et al ., 1980). Entretanto, Vestergaard et al . Características qualitativas da carne (1994) observaram que o aumento de fibras brancas na carne de bovinos foi associada à diminuição da maciez, em função do decréscimo na proteólise post A fibra muscular mortem . Esse resultado está relacionado ao aumento A carne é composta quase que exclusivamente de na proporção da calpastatina, que inibe a acção das músculo estriado voluntário, ou seja, de músculo calpaínas, responsáveis pela maturação da carne esquelético, com alguma musculatura lisa somente (Prates, 2000). como componente de paredes de vasos sangüíneos. Diversos trabalhos destacam a importância do Cada músculo é coberto por uma fina camada de conhecimento das características microscópicas e da tecido conjuntivo que se ramifica para seu interior. determinação dos tipos de fibra dos músculos, como Fibras nervosas e vasos sangüíneos entram e saem do contribuição na avaliação de aspectos relacionados à músculo, proporcionando enervação, bem como uma qualidade da carne (Sañudo et al ., 1998; Miller, 2001; cadeia vascular para suprimento de nutrientes e Arima, 2002). Calkins et al . (1981) indicaram possível remoção de resíduos do metabolismo (James, 1993). correlação entre o conteúdo de fibras vermelhas e A unidade estrutural do tecido muscular é uma intermediárias e alta taxa de marmoreio. Sendo assim, célula altamente especializada, denominada fibra a capacidade oxidativa de um músculo, medida pelas muscular. Uma fibra muscular é composta por centenas características de suas fibras musculares, pode servir 216 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 de instrumento na seleção de animais, visando sendo que este tipo de carne poderá ser encontrada em obtenção de carne com alto grau de marmoreio e ovinos. consequentemente mais macia. Já as carnes PSE (pale, soft and exudative) são oriundas de animais submetidos ao estresse e imedia- tamente abatidos. Acelera-se assim a glicólise Potencial hidrogeniônico (pH) anaeróbica, com rápida produção de ácido lático e Quando o animal é abatido, a produção de energia queda do pH, conferindo carnes pálidas, moles e tende a continuar para manter a homeostase, porém exudativas, com baixa capacidade de retenção de este processo será realizado com pouco oxigênio, água. Durante a cocção há perda elevada de umidade pois na sangria esvaiu-se a maior parte do oxigênio resultando em carne mais seca, dura e menos presente na hemoglobina. Com o ATP presente na saborosa, reduzindo sua utilidade no processamento, carcaça e o oxigênio do músculo (mioglobina), a sendo que em ruminantes este tipo de carne é pratica- geração de energia durante pouco tempo ocorrerá por mente inexistente, no caso de ovinos não há relatos de meio da glicólise aeróbica (Lehninger, 1986; Prates, carne PSE (Miller, 2001). 2000). Após este processo, a geração de energia será Zapata et al . (2005) avaliando o efeito do tempo de através da glicólise anaeróbica, pela utilização do maturação no pH final da carne caprina proveniente glicogênio muscular, entretanto este não será comple- dos músculos Biceps femoris e Semimembranosus , tamente oxidado a gás carbônico e água, pois a falta observaram que não houve influência (P>0,05) da de oxigênio afeta a via aeróbica do ciclo do ácido maturação sobre o pH da carne, com média de 5,84. cítrico e do sistema de citocromos, com a formação de Avaliando diferentes tempos de maturação da carne ácido lático, responsável pela queda no pH da carne bovina, Fernandes (2000) observaram valores de pH (Davies, 1989; Arima, 2002). de 5,39; 5,54 e 5,55, para os tempos de maturação 0, O desequilíbrio osmótico e a redução da temperatura 7 e 14 dias, respectivamente, sendo que para o tempo muscular, além da depleção das fontes de energia 0 houve diferença significativa (P<0,05) em relação (Jeacocke, 1993), promovem a saída de íons cálcio aos tempos 7 e 14, os quais não diferiram entre si. De para o sarcoplasma. Progressivamente as miofibrilas acordo com os autores, o aumento no valor do pH após entram em estado de contração irreversível (rigor), a maturação ocorreu devido a autólise e ao crescimen- através da formação das pontes cruzadas entre miosina to bacteriano. Do mesmo modo, Zapata et al . (2003) e actina, pelo deslizamento dos filamentos delgados, em estudo para averiguar a evolução do pH durante a que se sobrepõe aos filamentos grossos no interior da maturação do músculo Semimembranosus de cordeiros, banda A, promovendo o encurtamento do sarcômero. observaram que houve aumento do pH conforme Para que o músculo de um animal abatido se trans- aumentou o tempo de maturação. forme em carne, é necessário que ocorram processos Pérez et al . (1998) em estudo sobre o efeito da bioquímicos conhecidos como modificações post injeção com cloreto de cálcio (0,075M e 0,15M) no mortem . Dentre estes ocorre alteração do pH, que no pH do músculo Biceps femoris de bovinos, concluíram animal vivo varia de 7,3 a 7,5 (Zeola et al ., 2002). que não houve diferença significativa entre as carnes Com o decréscimo após o abate o pH pode chegar a do tratamento controle (5,36) e as que foram mari- 5,4, duas a oito horas após a sangria, quando se inicia nadas com cloreto de cálcio (5,21). Morris (1997) o rigor mortis . Neste processo o glicogênio muscular também não constatou diferenças no pH de carnes presente na carne favorece a formação do ácido lático, bovinas injetadas com 0,3 M de cloreto de cálcio. diminuindo o pH e tornando a carne macia e suculenta, Do mesmo modo, Zeola et al . (2005) também não com sabor ligeiramente ácido e odor característico. A observaram diferenças (P>0,05) no pH da carne de carne ovina atinge pH final entre 5,5 a 5,8 de 12 a ovelhas proveniente do músculo Longissimus , quando 24 horas decorrido o abate (Prates, 2000; Silva submetida ao tratamento controle e ao tratamento com Sobrinho, 2005). 0,3 M de cloreto de cálcio, com média de 5,53. Estresse do animal por período prolongado ou intenso exercício muscular no pré-abate causam Cor redução nos níveis de glicogênio, elevando o pH da carne e reduzindo os teores de glicose nos tecidos A cor da carne é o fator de qualidade mais musculares (Watanabe et al ., 1996). Nestas condições, importante que o consumidor pode apreciar no haverá maior possibilidade de crescimento microbiano, momento da compra, constituindo o critério básico diminuindo o período de conservação da carne sob para sua seleção, a não ser que outros fatores, como o refrigeração (Miller, 2001). odor, sejam marcadamente deficientes. O conteúdo de Carnes nestas condições são denominadas DFD mioglobina muscular influencia a cor da carne e seu (dark, firm and dry), ou seja, exibem coloração escura teor varia nos músculos durante o crescimento (Trout, e textura firme, sendo mais secas, porém como 2003). Outro fator que influencia a cor da carne é a apresentam alta capacidade de retenção de água, quando forma química da mioglobina que pode se apresentar cozidas são freqüentemente descritas como suculentas, reduzida (Fe ++ ), de cor vermelha púrpura, característica 217 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 da carne fresca embalada à vácuo ou do interior da dorsi de cordeiros, constataram que o tempo de massa muscular recém cortada; ou quando sob altas maturação não influenciou (P>0,05) a luminosidade pressões de oxigênio, na forma de oximioglobina, de (L*), o teor de vermelho (a*) e o teor de amarelo (b*). cor vermelha brilhante, ou ainda sob baixas pressões Zeola et al . (2005) não observaram diferença de oxigênio ou na presença de substâncias oxidantes, (P>0,05) nos parâmetros L* e a* da carne de ovelhas o ferro passa para a forma oxidada (Fe +++ ), originando proveniente do músculo Longissimus , submetida ao a metamioglobina, de cor marrom, associada pelos tratamento controle e ao tratamento com 0,3 M de consumidores a carnes estocadas por longos períodos cloreto de cálcio, com médias de 38,26 e 16,37, para (Trout, 2003). L* e a*, respectivamente. O consumidor discrimina a carne escura ao associar Em experimento para avaliar tecnologias para o esta cor com carne de animais velhos e com maior amaciamento da carne bovina, Fernandes (2000) dureza (Silva Sobrinho et al ., 2008). Esta relação observaram valores de L* de 34,62; 36,55 e 36,93; muitas vezes não é verdadeira, por exemplo, no caso valores de a* de 15,61; 16,05 e 17,30; e valores de b* de um animal abatido com poucas reservas de de 3,83; 5,90 e 7,23, para os tempos de maturação 0, glicogênio, a carne não atinge pH suficientemente 7 e 14 dias, respectivamente. Peixoto et al . (2002) baixo para produzir coloração normal, independente estudando características da carne bubalina maturada de sua idade e maciez (Sainz, 1996). Indiretamente a concluíram que o tempo de maturação influiu cor determina a vida de prateleira da carne, uma vez negativamente na cor dos cortes da carne. Na que aquelas carnes que desviam da cor ideal (vermelho avaliação subjetiva da cor, a carne maturada obteve a cereja) tendem a acumular-se no balcão (Dabés, preferência dos julgadores no início do processo, no 2001). entanto, ao final do processo a aceitação foi maior A cor da carne pode ser medida pelo método para as carnes não maturadas. subjetivo, que envolve observações sensoriais de A utilização das embalagens à vácuo durante o pigmentos da carne, da gordura, presença de tecido processo de maturação de carnes, apesar de limitar o conjuntivo e outros, sendo um método de grande crescimento de microorganismos causa a anaerobiose, rapidez e utilidade. Entretanto, pode também ser condição em que não é possível a formação do medida pelo método objetivo, através da utilização do pigmento vermelho-cereja desejado pelos consumi- colorímetro, o qual determina a cor da carne através dores no momento de compra, o que pode se tornar das coordenadas L*, a* e b*, responsáveis pela um entrave para a comercialização da carne maturada luminosidade, teor de vermelho e amarelo, respectiva- (Fernandes, 2000). De acordo com Arima et al . mente. De acordo com Miltenburg et al . (1992) citados por Peixoto et al . (2002) a carne maturada, quanto maiores os valores de L*, mais pálida é a mesmo após a equalização da cor, ainda apresenta um carne, e quanto maiores os valores de a* e b* mais gradiente diferenciado quando comparada à carne não vermelha e amarela, respectivamente. maturada. Em ovinos são citadas variações de 30,03 a 49,47 para L*, de 8,24 a 23,53 para a* e de 3,38 a 11,10 para Capacidade de retenção de água b* (Sañudo et al ., 2000). Souza et al . (2004) ao avaliarem a cor da carne proveniente do músculo O interesse no estudo da capacidade de retenção Longissimus dorsi de cordeiros abatidos aos 25 kg de de água pelo músculo decorre de sua influência no peso corporal, encontraram valores de L* de 33,64. aspecto da carne antes do cozimento e no seu Estes autores também citaram que é comum valores de comportamento durante o processo de cocção, tendo L* mais altos em cordeiros abatidos jovens (25 kg), como mérito avaliar a importância da sua participação pois estes apresentam maior quantidade de água e na suculência do produto (Pardi et al ., 2001). menor de gordura, quando comparados à animais mais Neste contexto a capacidade de retenção de água velhos, os quais modificam a composição centesimal pode ser definida como um parâmetro que avalia a da carne, prevalecendo maior deposição de gordura e capacidade da carne em reter água após a aplicação de em proporção menor, a quantidade de água no tecido forças externas (corte, moagem, pressão) e que no muscular, resultando em carne com L* menos eleva- momento da mastigação traduz sensação de suculên- da, ou seja, mais escura. cia ao consumidor (Dabés, 2001). Quando o tecido Corroborando com estes resultados, Martínez- muscular apresenta baixa retenção de água a perda de Cerezo et al . (2005) ao estudarem a cor da carne de umidade e conseqüente perda de peso durante a cordeiros da raça Churra em diferentes pesos de abate, estocagem serão maiores. Essas perdas ocorrem pelas observaram maior luminosidade na carne dos animais superfícies musculares expostas de carcaças ou cortes. que foram abatidos mais jovens. Ao estudarem a cor A menor capacidade de retenção de água da carne da carne não maturada de cordeiros, no músculo implica em perdas do valor nutritivo através do exuda- Longissimus dorsi , Souza et al . (2004) observaram to liberado, resultando em carne mais seca e com teor de a* de 14,84. Zapata et al . (2003) ao avaliarem menor maciez (Dabés, 2001). a cor da carne proveniente do músculo Longissimus A capacidade de retenção de água pode ser influen- 218 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 ciada pela queda no pH, sendo que carne com pH mais a maturação e a utilização de cloreto de cálcio. elevado apresenta tendência a maior capacidade de O processo de maturação da carne: Consiste no retenção de água (Huff-Lonergan e Lonergan, 2005); armazenamento da carne não processada, acima de a capacidade de retenção também esta relacionada à seu ponto de congelamento (-1,5 oC), comumente cor da carne, pois a quantidade de luz absorvida ou realizado sob temperatura de refrigeração (0 e 4 oC) refletida depende da estrutura da superfície, que varia com o objetivo de melhorar a maciez da carne através com o ponto isoelétrico das proteínas miofibrilares e a da fragmentação de proteínas sarcoplasmáticas e localização de água dentro das células (Pearson, miofibrilares (Prates, 2000). 1994). A regulação da maturação ocorre por meio de Os fundamentos químicos da capacidade de diferentes enzimas endógenas e inibidores das mesmas, retenção de água admitem que a mesma apresenta-se exercendo diversas modificações microscópicas, sob a forma de água ligada (5%), imobilizada (10%) e ultra-estruturais e proteolíticas, como a ruptura das livre (85%), sendo que o teor total de água da carne é linhas Z, fragmentação das miofibrilas, degradação da importante nos processamentos que a mesma irá sofrer, troponina, conectina e outros. O complexo de enzimas como resfriamento, congelamento, salga, cura, enlata- responsáveis pela maturação é representado principal- mento, etc. Quanto maior o teor de água ligada, maior mente pelas calpaínas (Prates, 2001), que apresentam-se a capacidade de retenção de água do tecido muscular basicamente sob duas formas, µ-calpaína e m-calpaína. (Dabés, 2001; Pardi et al ., 2001). Foram denominadas, inicialmente, como fator de Todos os fatores que influenciam a capacidade de ativação da quinase (KAF), fator ativado pelo cálcio retenção de água da carne in natura afetam também a (CAF), protease neutra ativada pelo cálcio (CANP) e capacidade de retenção de água da carne congelada e protease dependente de cálcio. São encontradas em descongelada. No congelamento, partes das células homogeneizados de tecidos com seu inibidor específico, rompidas durante o processo passam para os espaços a calpastatina (Rübensam, 1999). intercelulares formando, ao descongelar, o chamado O mecanismo de amaciamento da carne está rela- drip . cionado principalmente com o enfraquecimento da Em trabalho de avaliação do efeito da injeção com estrutura miofibrilar na região N 2 do sarcômero. O cloreto de cálcio sobre a capacidade de retenção de referido enfraquecimento pode ser provocado pela água do músculo Biceps femoris de bovinos, Pérez et cisão dos filamentos de titina e nebulina (Prates, al . (1998) concluíram que a capacidade de retenção de 2001). O músculo a ser maturado é um fator impor- água foi menor para as carnes tratadas com cloreto de tante a ser levado em consideração. Heinze e cálcio em comparação às amostras controle, provavel- Bruggemann (1994) conduziram um estudo utilizando mente devido a proteólise que ocorre quando a carne três diferentes músculos ( Psoas major, Gluteus recebe cloreto de cálcio. medius e Longissimus dorsi ) e concluíram que o Psoas major possui baixo potencial para a maturação quando comparado ao Longissimus dorsi ou ao Maciez Gluteus medius ; o índice de fragmentação miofibrilar Vários fatores influenciam a maciez final da carne. variou de 120 a 170 para o Gluteus medius e somente Entre eles, destacam-se a maturação (Culler et al ., de 80 a 85 para o Psoas major . 1978; Montossi et al ., 2005), a extensão da proteólise Em estudo para avaliar o efeito da maturação na pós-abate (Dransfield, 1994), a velocidade de queda carne ovina Koohmaraie et al . (1990) observaram do pH, a temperatura da carne durante o rigor mortis redução na força de cisalhamento para carnes matu- (Marsh, 1977), bem como o modo de preparo. Dentre radas durante 1 e 7 dias, com valores de 8,9 e 5,4 kg, as características organolépticas da carne (coloração, respectivamente. Avaliando os efeitos do tempo de maciez, suculência e sabor) a maciez é considerada maturação no amaciamento do músculo Longissimus a mais importante após a compra (Veiseth e dorsi de bovinos, Moura et al . (1999) encontraram Koohmaraie, 2001). valores de força de cisalhamento de 3,65 kg para A maciez sofre influência do encurtamento pelo carnes maturadas durante 1 dia e 2,55 kg para carnes frio, fenômeno que ocorre no post mortem , devido ao maturadas durante 7 e 14 dias. rápido resfriamento da carcaça, comprometendo a A carne dos ovinos apresenta constante da capacidade de algumas organelas sarcoplasmáticas em velocidade de maturação (k) de 0,21/dia, alcançando reterem o cálcio. Este é então liberado no sarcoplasma 80% de maturação em 7,7 dias, a temperatura de 1 oC, de maneira descontrolada, e na presença de ATP entretanto a carne dos bovinos apresenta k = 0,17/dia, propicia forte contração. A atividade contrátil produz necessitando de 9,5 dias para obter o mesmo estágio o encurtamento das fibras, reduzindo a maciez da de maturação (Prates, 2000). Apesar da grande carne (Dabés, 2001). Sañudo et al . (1998) apontam variação na maciez da carne, a maioria das proteínas como fatores intrínsecos que influenciam na maciez miofibrilares, incluindo as duas principais (miosina e da carne o tipo de músculo, a espécie, a raça e a idade actina), não sofrem degradação significativa durante o do animal, e como fatores extrínsecos, além de outros, período normal de maturação da carne à temperaturas 219 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 habituais de refrigeração (0 a 4 oC) (Bandman e Wheeler et al . (1991) a marinação com cloreto de Zdanis, 1988). Contudo, para temperaturas de acondi- cálcio pode ser utilizada com êxito em combinação ao cionamento relativamente elevadas (cerca de +30 oC) processo de maturação. verifica-se fragmentação significativa das cadeias A utilização do cloreto de cálcio reconhecida como mais pesadas de miosina na carne de bovinos. As poucas segura, segundo Wheeler et al . (1992) foi aprovada proteínas miofibrilares que sofrem fragmentação pela FDA no nível máximo de 3% do peso da amostra durante a maturação da carne, à temperatura de de uma solução de 0,8M. Estudos realizados por refrigeração, incluem a titina, a nebulina, a troponina, Zamora et al . (1998) demonstraram que as atividades a α-actina, a desmina e a filamina (Yates et al ., 1983). de m-calpaína e µ-calpaína são máximas na primeira Durante a maturação da carne, ocorre aumento hora post mortem , apresentando valores de 24 e 75 considerável de peptídeos e aminoácidos livres, unidades/g de músculo, respectivamente. Entretanto, devido principalmente, à fragmentação das proteínas estas atividades tendem a reduzir no processo de rigor sarcoplasmáticas (Yates et al ., 1983). A elevada mortis , embora os autores tenham observado atividade susceptibilidade das proteínas sarcoplasmáticas à de m-calpaína e µ-calpaína com até 100 horas post degradação post mortem resulta da circunstância de mortem , sendo que a atividade da m-calpaína diminui serem proteínas solúveis, estando portanto, sujeitas a muito lentamente e a atividade de µ-calpaína rapida- intensa desnaturação por ocasião da queda do pH mente (Thomson et al ., 1995). Desta forma, justifica-se (Yates et al ., 1983). a utilização de cloreto de cálcio para ativação das Esta afirmação fundamenta-se no fato de apenas proteases cálcio-dependentes logo após o abate, esta fração protéica sofrer extensa degradação durante através da artéria carótida com a utilização de aparel- a maturação muscular no post mortem , dado que as ho para bombear a solução (Koohmaraie et al ., 1989) proteínas miofibrilares e estromáticas não são ou após a instalação do rigor mortis , com a retirada do degradadas ou sofrem apenas uma limitada proteólise músculo de interesse e aplicação da solução por meio (Prates, 2000). de seringas em diversos locais (Moura et al ., 1999), sendo que de acordo com Rousset-Akrim et al . (1996) Cloreto de cálcio: Como a atividade de calpaína é o inconveniente de se utilizar o cloreto de cálcio logo pouco ativada em condições normais post rigor após o abate seriam os problemas de aparência e sabor mortem, alguns pesquisadores utilizam injeção de da carne. De acordo com Lemos (2005) o cloreto de solução de cloreto de cálcio, para auxiliar a ativação cálcio pode causar um efeito negativo sobre a cor da das proteases cálcio-dependentes, como é o caso da carne devido a sua capacidade de promover oxidação, m-calpaína, e sua inibidora, a calpastatina, induzindo uma vez que trata-se de um sal. à tenderização da carne (Koohmaraie et al ., 1990; Ao contrário da µ-calpaína, a calpastatina perde sua Simmons et al ., 1997; Moura et al ., 1999). atividade lentamente, com 54% de sua atividade A elevação na concentração de cálcio no músculo presente após 120 horas post mortem (Koohmaraie, post mortem é a principal causa do amaciamento que 1992; Thomson et al ., 1995). se desenvolve na carne durante o processo de matu- De acordo com Wheeler et al . (1991) a injeção com ração, uma vez que este íon é um agente indispensável cloreto de cálcio (0,3 M na proporção de 10% do peso à ação das calpaínas (Delgado et al . citados por da carcaça) aumenta a maciez da carne e melhora sua Harada e Lemos, 2003; Taylor, 2003). A calpaína avaliação global. Estes mesmos autores avaliaram o apresenta-se sob as formas calpaína I ou µ-calpaína, efeito da injeção com cloreto de cálcio em carcaças de calpaína II ou m-calpaína e calpaína III (Mohammad cordeiros e concluíram que as carnes do grupo et al ., 2004), sendo que a primeira necessita de 1 a controle apresentaram maior força de cisalhamento 5 mM de cálcio para se ativar, enquanto a calpaína II (3,14 kg) em comparação às carnes do grupo que necessita de 50 a 70 mM, quantidades maiores que recebeu injeção com cloreto de cálcio (2,67 kg). aquelas encontradas naturalmente na carne (Johnson Koohmaraie et al . (1990) em estudo para avaliar o et al ., 1990), e a terceira foi descrita recentemente em efeito da injeção com cloreto de cálcio (solução 0,3M) um trabalho sobre o potencial da calpaína III na em carcaças ovinas encontraram valores de força de tenderização do músculo Longissimus thoracis et cisalhamento de 8,9 e 4,1 kg, para o tratamento cont- lumborum em ovinos. Os autores afirmam que este role e o tratamento de injeção com cloreto de cálcio, estudo foi o primeiro a analisar a calpaína III como respectivamente, para carnes com 1 dia de maturação. enzima atuante no processo de proteólise miofibrilar Os autores também avaliaram a perda de peso durante no músculo esquelético post mortem (Mohammad et a cocção das carnes e observaram maiores perdas al ., 2004). (26,1%) nas carnes tratadas com cloreto de cálcio em Apesar da adição de cloreto de cálcio aos cortes comparação às do grupo controle (24,6%). cárneos objetivar a ativação das calpaínas, não se Em experimento realizado por Santos Filho (2003), conhece o mecanismo preciso pelo qual esta infusão com o objetivo de estudar o efeito da injeção com acelera a proteólise post mortem e o processo de cloreto de cálcio na maciez de amostras do músculo amaciamento (Koohmaraie, 1994). De acordo com Longissimus dorsi de bovinos anelorados, verificou-se 220 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 que a força de cisalhamento foi menor para amostras podem ser prejudicados, fazendo com que o produto que receberam 0,3 M de cloreto de cálcio em relação seja rejeitado pelo consumidor (Moura et al ., 1999). ao grupo controle, aos 21 dias de maturação. Morgan et al . (1991) observaram o desenvolvimento Estudando o efeito da injeção com cloreto de cálcio na de sabor amargo e metálico em carne bovina injetada carcaça de cordeiros, Polidori et al . (2000) obser- com solução 0,3 M de cloreto de cálcio. Entretanto, varam no músculo Longissimus thoracis et lumborum , em estudo para avaliar a aceitação pelo consumidor da redução na atividade de calpastatina nas amostras que carne bovina amaciada por 0,2 M de cloreto de cálcio, receberam solução de cloreto de cálcio, com valores Hoover et al . (1995) e Miller et al . (1995) observaram de 78,2 para o grupo controle e 23,8 para o grupo que que a injeção com cloreto de cálcio proporcionou recebeu cloreto de cálcio. maior maciez à carne e que não ocorreram problemas quanto ao sabor, quando feitas comparações com Características sensoriais da carne maturada e amostras controle. com cloreto de cálcio: de acordo com Silva (2002) a Estudando o efeito de diferentes concentrações de análise sensorial é uma ferramenta utilizada na cloreto de cálcio (0; 0,1; 0,2 e 0,3 M) na aceitabilidade tecnologia de alimentos que serve para medir, analisar da carne bovina maturada Heinemann e Pinto (2003) e interpretar as reações produzidas pelas características concluíram que a maioria dos provadores (67%) con- dos alimentos da forma que são percebidas pelos sideraram as amostras tratadas com cloreto de cálcio órgãos da visão, odor, gosto, tato e audição. Os métodos mais macias do que as não tratadas e que a concen- sensoriais dividem-se em três grupos: métodos de tração de cloreto de cálcio mais adequada para os diferença (teste triangular, teste duo-trio, teste de parâmetros sensoriais foi a de 0,2 M. Boleman et al . comparação pareada, teste de ordenação e teste de (1995) relataram que a adição de solução de 0,3 M de diferença do controle), métodos descritivos (perfil de cloreto de cálcio à carne bovina na proporção de 10% sabor, perfil de textura e ADQ ou análise descritiva do peso da amostra foi efetiva na melhoria da maciez, quantitativa) e métodos afetivos (teste de comparação mantendo a aceitabilidade da carne. pareada, teste de ordenação-preferência e teste de Avaliando o efeito de diferentes concentrações de escala hedônica). O objetivo do teste de aceitação é cloreto de cálcio (0,2 e 0,25 M) na qualidade da carne avaliar o grau com que o provador gosta ou desgosta de bovinos, Wheeler et al . (1993) observaram maior de um produto. maciez nas amostras tratadas com cloreto de cálcio, Muitas pesquisas foram realizadas nas últimas porém sem diferenças no sabor e na suculência. Do décadas a respeito das características da carne de mesmo modo, Polidori et al . (2000) observaram cordeiro, porém, a maioria destas foram baseadas em menor força de cisalhamento da carne ovina maturada métodos instrumentais e muito poucas em análise durante 6 dias injetada com cloreto de cálcio 0,3 M sensorial (Martínez-Cerezo et al ., 2005). Desta forma, (5,22 kgf/cm 2) em comparação à amostra que não foi os atributos sensoriais da carne adquirem especial injetada (5,99 kgf/cm 2). importância, sendo prioritários nas pesquisas ter como meta analisar a influência dos diferentes fatores sobre O processo de marinação da carne o produto final. Nenhum instrumento ou combinação de instrumentos pode substituir os sentidos humanos. Basicamente existem três métodos de marinação: Isto enfatiza o fato de que os instrumentos medem imersão, injeção e massageamento. A imersão é o parâmetros únicos, enquanto que os sentidos humanos método mais antigo e consiste em submergir a carne registram uma impressão holística da complexidade na salmoura permitindo que os ingredientes penetrem de um alimento (Rota e Oliveira, 2004). na carne através da difusão da água no espaço O interesse na avaliação sensorial da carne é que a extracelular, que depende do processo de osmose, preferência do consumidor tem que ser considerada. É fazendo com que a água saia ou penetre nas células, possível que para consumidores de uma determinada conforme a concentração de solutos na salmoura. A região, a carne macia de sabor pouco intenso pode não concentração de sal no tecido muscular é de aproxi- ser uma qualidade desejável. No experimento de madamente 0,9%, sendo que a maioria das salmouras Sañudo et al . (2000) foram encontradas diferenças são altamente hipertônicas, o que faz com que a água significativas para as características sensoriais de das células tenda a sair. Assim, um produto recém carcaças de raças inglesas e espanholas. Tanto o painel injetado não é estável quanto à retenção de água, ou de provadores inglês quanto o espanhol determinaram seja, caso fosse imediatamente cozido apresentaria um sabor e odor mais intenso para as carcaças baixo rendimento e perda de maciez. As vantagens inglesas, entretanto, os ingleses preferiram o sabor do deste método são a simplicidade, baixo custo, além de cordeiro inglês e os espanhóis o sabor do cordeiro permitir produção de pequenos lotes (Lemos, 2005). espanhol. A marinação realizada com injeção consiste em Embora a utilização do cloreto de cálcio apresente furar o músculo com agulhas e realizar a injeção da vantagens no amaciamento da carne, a coloração, a salmoura diretamente neste. A absorção é determinada palatabilidade e a perda de peso durante a cocção pela pressão da injeção e a vantagem deste método é a 221 Zeola NMBL et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 215-224 uniformidade do produto marinado (Lemos, 2005). Calkins CR, Dutson TR, Smith GC, Carpenter ZL e Davis Em estudo para avaliar características qualitativas da GW (1981). Relationship of fiber type composition to carne ovina, Zeola et al . (2004) utilizaram os métodos marbling and tenderness of bovine muscle. Journal of de marinação por imersão e injeção, e observaram que Food Science, Chicago, 46(3): 708-715. ambos os métodos foram eficientes para a melhoria da Cornforth DP, Pearson AM e Merkel RA (1980). Relationship of mitochondria and sarcoplasmatic reticu- qualidade da carne. lum to cold shortening. Meat Science, 4(2): 103-121. O massageamento é um método de marinação Culler RD, Parrish Junior JD e Dikeman ME (1978). recente, que consiste em colocar uma determinada Relationship of miofibril fragmentation index to certain quantidade de carne no massageador, adicionar a chemical, physical and sensory characteristics of bovine salmoura, fechá-lo, aplicar vácuo ou não, e fixar a longissimus dorsi muscle. Journal of Food Science, velocidade de rotação e o regime de processo (tempo Chicago, 43(4): 1177-1180. de trabalho e descanso), permitindo que em alguns Cunha EA, Bueno MS e Santos LE (2004). Carcaças de minutos a carne absorva a salmoura. É um processo cordeiros de raças de corte em criação intensiva. O que apresenta a vantagem da absorção rápida e uniforme Berro, Uberaba, 68: 46-50. da salmoura pela carne, com controle da temperatura Dabés AC (2001). Propriedades da carne fresca. Revista e capacidade de marinar grandes quantidades (Lemos, Nacional da Carne, São Paulo, 25(288): 32-40. D'Araújo Couto FA (2001). 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Optimization of tenderization, ageing de alto peso não atravessam estes tecidos facilmente. and tenderness. Meat Science, 36(1-2): 105-121. Fernandes JR (2000). Avaliação de diferentes tecnologias Além disso, o fluxo de água que penetra no músculo para o amaciamento da carne bovina in natura. 150p. avança perpendicularmente ao eixo das fibras muscu- Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) - lares e é necessário que atravesse as três camadas de Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade tecido conjuntivo antes de atingir o sarcolema. Com o Estadual de Campinas, Campinas. objetivo de facilitar esta migração faz-se o uso da Galvão F (2004). Rebanho lucrativo. Isto é Dinheiro, São injeção por meio de seringas, sendo as camadas do Paulo, 350: 82-83. tecido conjuntivo perfuradas pelas agulhas, facilitando Harada MM e Lemos ALSC (2003). Utilização de cloreto de a distribuição da salmoura pelo músculo (Lemos, cálcio para melhoria da maciez da carne bovina. 2001). 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Fazendeiro 1 1Centro de Investigação Interdisciplinar em Saúde Animal, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de Lisboa (TULisbon) Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa 2Universitatea de Stiinte Agricole Si Medicina Veterinara Cluj-Napoca, Facultatea de Medicina Veterinara, Roménia Resumo: Os asininos e os muares são cada vez mais utilizados faeces (EPG) with McMaster slide and faecal cultures to obtain em actividades lúdico-ocupacionais. Neste trabalho pretendeu-se infective larval stages (L3). In October 2004 donkeys were avaliar o seu grau de parasitismo em animais residentes na dewormed with ivermectin (Eqvalan ®) and its efficacy was Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Técnica de evaluated through the Faecal Egg Count Reduction Test and the Lisboa e o seu controlo através de uma desparasitação no Egg Reappearance Period till May 2005. Outono. During 2001-05, 8 donkeys were stabled (average 3 Os asininos foram examinados em 2001-05 e os muares em animals/year), with a prevalence of 100% for Strongylidae and 2001-02, para avaliação mensal do parasitismo gastrintestinal Trichostrongylus axei . These were also infected with Parascaris através de métodos coprológicos qualitativos, quantitativos para equorum (N=1) and Eimeria sp. oocysts (N=1). Strongyle determinação do nº ovos/g de fezes (OPG) com câmara de average EPG counts were low in the first two years of study, 200 McMaster e coproculturas para obtenção de larvas infectantes eggs/g, reaching 2000 EPG in 2004. These donkeys showed ((L3). Em Outubro de 2004 desparasitaram-se os asininos com three peaks of egg shedding, in Spring, Summer and Autumn. ivermectina (Eqvalan ®) e a sua eficácia foi avaliada pelos Teste The two mules examined in 2001/2002 were infected with de Redução da Contagem de Ovos Fecais e do Período de Strongyles too, showing an EPG peak in the Spring. The Reaparecimento de Ovos, até Maio de 2005. strategic deworming performed in October 2004 with Em 2001-05 foram estabulados 8 asininos (média de 3 ivermectin showed an efficacy of 100% in the FECRT of animais/ano), com uma prevalência de 100% para Strongylidae strongyle eggs and the ERP was 8 months, since EPG levels e Trichostrongylus axei . Nestes foram ainda assinalados remained lower than 200 EPG until May 2005, being effective animais positivos para Parascaris equorum (N=1) e oocistos de in the control of intestinal strongyles. Eimeria sp. (N=1). Os níveis de OPG de estrongilídeos variaram entre 200 e 2000 OPG . Os asininos apresentaram três Keywords: Equus asinus , gastro-intestinal parasites, picos de eliminação de ovos, na Primavera, Verão e Outono. Os strongyles, epidemiology, control, ivermectin. dois muares examinados em 2001-02 estavam infectados com estrongilídeos também, com um pico de OPG na Primavera. A desparasitação estratégica efectuada com ivermectina em Outubro de 2004 teve uma eficácia de 100% no TRCOF e o Introdução PRO foi de 8 meses, permanecendo inferior a 200 OPG até Maio de 2005, sendo um método que revelou eficácia no Os vestígios arqueológicos mais antigos sobre a pre- controlo dos estrongilídeos intestinais. sença dos asininos ( Equus asinus ) em Portugal datam do Paleolítico e desde que há registos históricos é Palavras-chave: Equus asinus , parasitismo gastrintestinal, estrongilídeos, epidemiologia, controlo, ivermectina. reconhecido o papel importante que estes equídeos têm desempenhado na agricultura e no transporte de Abstract: Donkeys and mules are often used in leisure bens e pessoas, chegando a atingir um efectivo de and occupational therapy . This work aimed an evaluation of cerca de 300 000 animais no nosso País (D'Andrade, parasitic levels of these animals at the Faculty of Veterinary 1939). Medicine, Technical University of Lisbon and its control with a strategic deworming in the Autumn. No entanto, as alterações sócio-económicas ocorridas In 2001-05 for donkeys and in 2001-02 for mules, a monthly em Portugal nos últimos 100 anos (nomeadamente na evaluation of the gastrointestinal parasites was performed, based agricultura e pecuária de subsistência), levaram à in qualitative and quantitative coprology for egg counting /g of redução das populações de equídeos, estimando-se um total de 96 471 animais no Recenseamento Geral da Agricultura de 1999. Os asininos, muitas vezes considerados os parentes pobres dos cavalos, atingiram o auge nos anos 1930 com mais de 275 000 animais recenseados, mas foram votados ao abandono e algumas * Correspondência: [email protected] das suas raças estiveram quase à beira da extinção, 225 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 como aconteceu com a Raça de Miranda, totalizando aplicação noutros sistemas de maneio idênticos e a nos últimos arrolamentos de gado cerca de 40 000 ampliação dos conhecimentos desta linha de trabalho, burros (Valério, 2001; INE, 2001). Situação semelhante com consequências na melhoria do Bem-Estar destes aconteceu com os híbridos, até porque o decréscimo equídeos no nosso País. destes equídeos acabou por ser em grande medida consequência da diminuição dos equídeos em geral e em particular dos factores que promoveram a Material e métodos diminuição dos asininos (Sousa e Martins, 2005; SNC, 2006). Foram examinados na FMV/UTL um total de oito Os asininos são equídeos pouco estudados no nosso asininos estabulados de raça cruzada (Europeia X País, e embora sejam menos utilizados como animais Africana), com idades que variaram entre 5 a 15 anos, de transporte e tracção, é cada vez maior a sua apetência de 2001 a 2005, com um número médio de 3 como animais de companhia, na terapia ocupacional asininos/ano, utilizados em aulas práticas de (asinoterapia), em actividades eco-turísticas e inclu- diferentes disciplinas e eram exercitados com regulari- sive como modelos para o ensino Médico-Veterinário. dade semanal no perímetro exterior aos estábulos, No entanto, pouco se sabe relativamente à susceptibi- para manutenção de bons níveis de Bem-Estar lidade dos burros às infecções parasitárias e ao seu Animal. Estes animais encontravam-se estabulados controlo com diferentes anti-helmínticos. Este último individualmente em sistema de baia ou box (de conhecimento é importante, pois a sua fármaco-cinética acordo com a disponibilidade de espaço resultante do não será forçosamente igual à dos cavalos, não só por movimento de casos clínicos de equídeos), eram razões que se prendem com a sua fisiologia, mas alimentados com palha e feno duas vezes por dia e as também com o tipo de alimentação e trânsito intestinal, suas camas eram compostas também por palha regime de criação/produção e maneio higio-sanitário (Figuras 1 e 2). Entre Novembro de 2001 a Junho de (Lloyd, 1997). 2002, dois híbridos (mulas) que estavam estabulados Na Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade na FMV/UTL para trabalhos de natureza genética, Técnica de Lisboa (FMV/UTL) os asininos residentes mas com o mesmo sistema de maneio, foram também (2-3 animais/ano) estão sujeitos a vários tipos de avaliados relativamente ao nível de parasitismo esforços e manipulação durante as aulas, pelo que o gastrintestinal. seu estado sanitário é avaliado regularmente, De acordo com Thienpont et al . (1986) e Madeira de nomeadamente em relação às parasitoses cutâneas e Carvalho (2001) foram efectuadas colheitas mensais gastrintestinais. O estudo efectuado na FMV/UTL de amostras fecais e os métodos coprológicos teve como principais objectivos a avaliação regular da qualitativos (método de flutuação com solução satura- composição e do nível de parasitismo gastrintestinal, da de açúcar com densidade 1,20-1,25), quantitativos dos factores que podem concorrer para uma maior (método de McMaster para determinação do nºovos/g infecção parasitária destes hospedeiros e da monitoriza- com um limiar de 50 OPG) e coproculturas para ção da eficácia do esquema de controlo anti-helmíntico obtenção de larvas infectantes (L3). Foram calculadas instituído. as médias mensais e por estação do OPG para estudo Atendendo ao crescente interesse na criação de da variação sazonal das populações de estrongilídeos. asininos em Portugal e à sua procura como animais de Determinou-se a prevalência (nº de parasitados/nº companhia, os dados obtidos sobre a epidemiologia e examinados) dos vários géneros e/ou espécies para o controlo das parasitoses gastrintestinais em burros e total de hospedeiros examinados (8 asininos e 2 híbridos estabulados na FMV/UTL, permitirão a sua muares) e para o total de culturas efectuadas (24 nos Figura 1 e Figura 2 - Fêmea e macho adultos de asinino nas condições de estabulação do estudo. 226 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 asininos e 7 nos muares) de acordo com Bush et al . Resultados (1997). Foram identificados os diferentes géneros e espécies no total de larvas infectantes (L3) observadas No período de 2001-05 foram estabulados no total nos asininos (2679 L3) e nos híbridos (1771 L3), para 8 asininos adultos (média de 3 animais/ano), os determinação da abundância proporcional (percenta- quais apresentaram uma prevalência de 100% para o gem de ocorrência) de acordo com Bello (1990) e parasitismo por Strongylidae e Trichostrongylus axei . Eydal e Gunnarsson (1994). A identificação dos Nestes equídeos foram ainda assinalados ovos de géneros e espécies de L3 foi realizada com base no Parascaris equorum (N=1) e oocistos de Eimeria sp. número de células intestinais segundo Madeira de (N=1) (Figura 3). Os 2 híbridos examinados entre Carvalho (2001). 2001-2002 apresentaram apenas ovos de Strongylidae . Após o estudo epidemiológico dos 3 primeiros Estas formas parasitárias foram as mais observadas anos, procedeu-se a uma desparasitação estratégica em qualquer amostra positiva (Figura 4). com ivermectina (Eqvalan ® Pasta Oral) em Outubro de A contagem de ovos de estrongilídeos nos asininos 2004, anti-helmíntico que foi seleccionado devido à permitiu verificar que nos dois primeiros anos do sua eficácia e segurança já testadas noutros trabalhos estudo os níveis foram baixos, média de 200 OPG. com asininos (Bliss et al ., 1985). No presente trabalho, Todavia, fruto da renovação do grupo de asininos e a sua eficácia foi avaliada até Maio de 2005 através do introdução de animais novos, o nível médio mensal de Teste de Redução de Contagem de Ovos Fecais OPG subiu para cerca de 1000 OPG a partir de 2003 e (TRCOF, em que é calculada a percentagem de para valores superiores a 2000 OPG em 2004, ano em redução do OPG médio entre o dia 0 (X 0) e o dia 14 que algumas contagens excederam 4000 OPG (X 14 ) após a desparasitação, através da fórmula: (Figuras 5 e 6). O cálculo do nível médio mensal de %Redução = 100(1-(X 14 -X 0)) e do Período de ovos/g permitiu verificar que os asininos estabulados Reaparecimento de Ovos (PRO, ou seja, o tempo que apresentaram três picos de eliminação de ovos, um na medeia entre o momento da desparasitação e o Primavera (em Maio), outro no Verão (em Agosto) e momento de reaparecimento de ovos de estrongilídeos um terceiro no Outono (em Novembro), sendo o pico com níveis de OPG ≥ 200), de acordo com Coles estival o mais elevado (Figuras 7 e 8) . Os 2 híbridos et al . (1992), Borgsteede et al . (1993) e Madeira de examinados apresentaram apenas eliminação fecal de Carvalho (2001). ovos de estrongilídeos, com um pico primaveril mais A análise estatística descritiva dos dados foi marcado (Figura 9). efectuada com o programa Excel do Microsoft Office 2003 ®. Figura 4 - Aspecto de um campo microscópico com ovos de Strongylidae numa amostra fecal com elevado nível de OPG (ampliação 100X). Original. Figura 3 - Número global de animais positivos num total de 8 asininos e 2 muares examinados. Figura 5 - Níveis médios de OPG por ano da população de asininos Figura 6 - Níveis de OPG em asininos (Maio de 2001 a Junho de (os desvios das barras representam o erro padrão da média). 2005). 227 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 Figuras 7 e 8 - OPG médios mensal e por estação em asininos estabulados (2001-04). apresentavam-se parasitados exclusivamente por L3 de Strongylidae (Figura 3). No entanto, nem sempre as culturas foram positivas e no caso dos asininos (com 24 culturas positivas) é de destacar a prevalência elevada de L3 de Cyathostomum s.l ., Strongylus vulgaris e Trichostrongylus axei , as quais foram positivas para 79,2% das mesmas. Nos híbridos (com 7 culturas positivas), o género Cyathostomum s.l . e a espécie Strongylus vulgaris foram os mais preva- Figura 9 - Níveis de OPG em burros e híbridos (mulas) (Novembro de lentes, com 100 e 57%, respectivamente (Figura 10). 2001 a Junho de 2002). Ao nível da abundância proporcional, o género Ainda que nem sempre tenha sido possível efectuar Cyathostomum s.l . foi o mais assinalado em ambos os contagens individuais, verificámos nalguns períodos grupos de equídeos, embora nos asininos seja notável que alguns dos animais, em particular nos asininos, a elevada presença de L3 de T. axei , ficando patente eram claramente mais eliminadores de ovos que os nos burros uma maior biodiversidade de géneros e restantes, nomeadamente as fêmeas mais velhas. Este espécies deste grupo de helmintes (Figura 11). foi o caso de alguns registos de 2004, previamente à A identificação das larvas infectantes foi baseada na desparasitação, em que as fêmeas analisadas apresen- observação de L3 a fresco ou coradas com soluto de taram níveis de OPG entre 2350 e 9050, muito acima lugol e para os géneros/espécies de Strongylidae mais dos níveis médios atingidos entre 2001 e 2003. importantes neste trabalho, todas apresentavam uma Quer ao nível de amostras positivas, quer na cauda da bainha longa e um número variável de células abundância proporcional, os asininos revelaram uma intestinais: Cyathostomum spp. com 8, Triodontophorus maior diversidade de géneros e espécies de L3 de spp. 18-20 e Strongylus vulgaris 28-32. Trichostrongylus estrongilídeos nas coproculturas. Globalmente, os axei apresentava uma cauda da bainha curta e 16 asininos estudados foram todos positivos para L3 de células intestinais, sendo no entanto um nemátode Strongylidae e Trichostrongylus axei . Os muares Trichostrongylidae (Figuras 12 a 15). Figura 10 - Prevalência (%) de géneros e espécies (L3) isoladas nas coproculturas de burros (N=24 culturas) e híbridos (N=7 culturas). Figura 11 - Abundância proporcional média (%) de géneros e espécies de L3 mais abundantes em burros (N=2679 L3) e em híbridos (N=1771 L3). (T. axei – Trichostrongylus axei ; Cyathos – Cyathostomum s.l .; Poterios. – Poteriostomum spp.; O. robu. – Oesophagodontus robustus ; S.eden. - S. edentatus ; Triod. spp. – Triodontophorus spp.; S. vulg. – Strongylus vulgaris ). 228 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 Figura 12 - Algumas larvas infectantes (L3) de nemátodes Strongylidae e Trichostrongylidae representativos das culturas fecais estudadas A) Cyathostomum sp.; B) Triodontophorus sp.; C) Strongylus vulgaris ; D) Trichostrongylus axei . (Originais, 12 e 13 ampliações de 200 X. 14 e 15, ampliação de 100 X). A desparasitação estratégica dos burros realizada Discussão com ivermectina em Outubro de 2004 teve uma eficácia média de 100% na eliminação de ovos de A análise dos resultados permitiu verificar que estes nemátodes gastrintestinais após 15 dias e durante 4 equídeos, ainda que estabulados, podem apresentar meses. O PRO determinado foi de 8 meses, pois o níveis de parasitismo por vezes elevado, principal- nível médio de OPG permaneceu inferior a 200 ovos/g mente por estrongilídeos intestinais e Trichostrongylus até Maio de 2005, mesmo após o seu reaparecimento axei . Estes dados vieram confirmar observações em Março (Figura 16). Assim, verificou-se um previamente efectuadas nos asininos da FMV na decréscimo acentuado do nível médio de OPG em década de 1990 e confirmam a necessidade de um 2005 (cerca de 30 ovos/g), quando comparado com os acompanhamento regular dos níveis de parasitismo, níveis de OPG de 2001 a 2004, que oscilaram entre mesmo em animais estabulados. Com ligeiras 200 e 2000 OPG (Figura 4). diferenças, os resultados aproximam-se de outros entretanto obtidos em populações de asininos no Centro e Norte do País, com 80% e 87% de burros parasitados, respectivamente (Madeira de Carvalho, observações pessoais, 2001; Gonçalves et al ., 2005; Sousa et al ., 2005). Os equídeos apresentam uma variação sazonal do número de ovos estrongilídeos eliminados nas fezes, com níveis máximos observados na Primavera e Verão/Outono, que é independente da raça, gravidez ou lactação e muito associado ao ciclo endógeno dos ciatostomíneos (Herd, 1986). Assim, o pico primaveril de OPG dos asininos pode ser explicado pela saída de Figura 16 - Níveis de OPG após desparasitação com Ivermectina Pasta Oral (IVM, Eqvalan ® Pasta Oral) em Outubro 2004 e sua evolução em larvas de ciatostomíneos após hipobiose Outono/ 2005. Invernal e o estival pode ser consequência do seu 229 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 retorno à pastagem durante os meses de Julho ou parecem ser mais predispostos para a infecção com Agosto, com consequente reinfecção e período-pré- estrongilídeos, em particular as fêmeas e com idades patente mais curto das formas ingeridas no Verão, avançadas. Para além do programa de desparasitação conforme está bem esclarecido nos cavalos (Monahan, instituído, estes animais com níveis de OPG mais 2000). elevados são potenciais candidatos para um controlo Na realidade, o aumento progressivo registado no anti-helmíntico através de desparasitação selectiva, nível de OPG poderá também ser consequência da ou seja, dirigida apenas para os asininos com maior renovação do grupo de asininos e da introdução de eliminação fecal de ovos de estrongilídeos, pois irão animais parasitados, pelo que a monitorização regular ser os principais responsáveis pela contaminação dos efectivos permite assinalar os animais que entram ambiental com formas parasitárias (Trawford, 2004). na exploração infectados e através dos níveis de OPG A concluir, este primeiro estudo permitiu identificar podemos estabelecer épocas mais adequadas para a os nemátodes da família Strongylidae e o Tricho- sua desparasitação, sendo este procedimento especial- strongylus axei como os parasitas gastrintestinais mais mente indicado para o controlo dos ciatostomíneos frequentes nos asininos em estabulação. Neste sistema (Reinemeyer, 1999; Madeira de Carvalho, 2001). de maneio verificou-se também que as épocas de No entanto não se deverá esquecer que estes são maior risco de infecção destes hospedeiros são a animais de trabalho, submetidos a maior esforço Primavera e o Verão, dado o elevado nível de OPG durante certos períodos do ano, nomeadamente em demonstrado nestas épocas. Com base nesta épocas de maior manipulação, como sejam as épocas informação e para o sistema de maneio estudado, a preparatórias dos exames de fim de semestre, as quais desparasitação estratégica dos asininos em Outubro poderão constituir períodos de maior stress para os com ivermectina revelou uma eficácia elevada durante asininos e contribuir para uma maior susceptibilidade pelo menos 8 meses, podendo constituir um programa às parasitoses, situação já verificada em Portugal em de controlo anti-helmíntico adequado ao reduzir a cavalos durante os períodos de mais trabalho e população parasitária até um limite mínimo aceitável desbaste (Agrícola, 1999; Gersão e Madeira de sem implicações para a saúde e bem estar do animal. Carvalho, 2005). Relativamente às L3 de estrongilídeos, as de Cyathostomum s.l . com 8 células intestinais foram Agradecimentos predominantes quer nos asininos, quer nos híbridos, confirmando a importância crescente dos O trabalho foi financiado pelo CIISA/FMV/UTL, estrongilídeos da subfamília Cyathostominae nos Projecto CIISA 8. Estrongilidose. equídeos em Portugal (Madeira de Carvalho et al ., Agradecimentos à “Merial Portuguesa” e à Dra. Ana 2002). Por outro lado, Trichostrongylus axei e Leal Barata Moura pela cedência dos anti-parasitários Strongylus vulgaris também foram muito frequentes usados neste ensaio. nos asininos, sendo espécies com um potencial patogénico elevado e que tendem a aparecer mais frequentemente quando não há um esquema de Bibliografia desparasitação regular com avermectinas (Madeira de Carvalho et al ., 2003). T. axei constitui um caso Agrícola R, Jorge H, Barbosa M, Madeira de Carvalho LM, peculiar, porque embora seja um parasita comum a Fazendeiro IM (1999). Influência do período de ruminantes e equídeos, os asininos regra geral desbaste de cavalos nos níveis de parasitismo gastrin- parecem ser mais susceptíveis a este parasita, pois testinal e em alguns parâmetros hemáticos. “VI Congreso Ibérico de Parasitologia”, 21-24 Setembro inclusive em situações de pastoreio misto com 1999, Córdoba, Espanha, p.169 (Resumo 275-O). ruminantes, equinos e asininos, este últimos Bello TR (1990). Antiparasitic treatment of horses with apresentam sempre maior grau de parasitismo po r pyrantel and febendazole followed by continual este tricostrongilídeo (Madeira de Carvalho, 2001). ivermectin treatments. Proc. Annual Convention of the A desparasitação estratégica com ivermectina no American Association of Equine Practitioners, 35: 419- Outono revelou uma eficácia de 100% e manutenção 429. de baixos níveis de OPG durante 8 meses, podendo Bliss DH, Svendsen ED, Georgoulakis IE, Grosomanidis S, constituir-se como uma boa abordagem ao controlo Taylor F, Jordan WJ (1985). Strategic use of das helmintoses gastrintestinais dos asininos neste anthelmintics in working donkeys in Mediterranean regime de estabulação ou idêntico. De resto, estes climatic conditions. Vet Rec, 117: 613-614 resultados podem ser comparáveis aos de outro ensaio Borgsteede FH, Boersema JH, Gaasenbeek CP, Van Der Burg WP (1993). The reappearance of eggs in faeces of com asininos, com 92% de eficácia ao fim de 14 dias horses after treatment with ivermectin. Vet Quart, 15 (1): de desparasitação, manutenção de níveis de OPG 24-26. baixos durante 7 meses e uma melhoria de 14% da sua Bush AO, Lafferty KD, Lotz JM, Shostak AW (1997). condição corporal (Bliss et al ., 1985). Parasitology meets ecology on its own terms: Margolis Além destes dados, verificámos que alguns asininos et al revisited. J Parasitol, 83 (4): 575-583. 230 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 225-231 Coles GC, Bauer C, Borgsteede FH, Geerts S, Klei TR, Madeira de Carvalho LM, Serra P, Afonso-Roque MM, Taylor MA, Waller PJ (1992). World Association for the Fazendeiro MI (2002). Ciatostominose equina: actuali- Advancement of Veterinary Parasitology (WAAVP) zação do seu conhecimento em Portugal. Proceedings of methods for the detection of anthelmintic resistance in the Veterinary Sciences Congress, Congresso de nematodes of veterinary importance. Vet Parasitol, 44 Ciências Veterinárias, 100 Anos da Sociedade (1-2): 35-44. 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Madeira de Carvalho LM, Afonso-Roque MM, Fazendeiro Valério N (Coord.) (2001). Estatísticas Históricas MI (2003). Morfotipos de L3 do género Cyathostomum Portuguesas. Vol. I. Versão em PDF, Instituto Nacional sensu lato (Nematoda: Strongyloidea) - Aplicações no de Estatística, 829 pp. estudo do parasitismo por ciatostomíneos em equinos. VII Cong. Port. Parasitol., Soc. Port. Parasitol., Inst. Hig. Med. Trop., Lisboa, 9-11 Abril 2003. Acta Parasitol Port, pp. 2. (Com. Oral). 231 RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Eficácia do fungo nematófago Duddingtonia flagrans no controlo biológico da estrongilidose equina no Ribatejo Efficacy of the nematofagous fungi Duddingtonia flagrans in the biological control of horse strongylosis in the Ribatejo L. M. Madeira de Carvalho 1*, A. T. Gillespie 2, P. M. Serra 3, F.A. Bernardo 1, A. P. Farrim 4, I. M. Fazendeiro 1 1CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária (TULisbon), Av. da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa 2"Chr Hansen - BioSystems, A/S", 10-12 Boge Allé, DK-2970, Horsholm, Denmark 3NationWide Laboratories, Veterinary Diagnostic and Clinical Pathology Laboratory, UK 4Companhia das Lezírias, S.A., Lg. 25 de Abril, 17, 2135 Samora Correia Resumo: Para avaliar a eficácia do fungo nematófago Abstract: Field trials were performed to evaluate the capacity Duddingtonia flagrans no controlo biológico da infecção por of the nematode trapping fungus Duddingtonia flagrans to estrongilídeos intestinais de poldros em pastoreio, foram control strongyle infection in a group of yearlings on the pasture realizados dois ensaios numa coudelaria próxima de Lisboa, no in a horse stud farm near Lisbon, in Ribatejo. Field work was Ribatejo. Os trabalhos decorreram de 1997 a 1999, utilizando performed from 1997 to 1999, involving 2 groups of horses para cada ensaio 1 grupo controlo (C) e 1 grupo tratamento (D). with mixed strongyle infection kept on two similar pastures, Os animais apresentavam uma infecção natural por with the same management for the two groups, both dewormed estrongilídeos e o sistema de maneio foi idêntico para os dois at the beginning of the trial with pyrantel pamoate or grupos, sendo ambos desparasitados previamente com pamoato avermectins. One of the groups (D) received a daily dose of de pirantel ou com avermectinas. Os grupos D receberam uma D. flagrans during the whole trial (5x105spores/Kg bw) mixed dose diária de D. flagrans durante todo o ensaio (5x105 with a feed supplement, while the other (C) received a similar esporos/Kg PV), misturada com um suplemento alimentar. Os amount of supplement without fungus. Faecal samples were grupos C receberam uma quantidade semelhante de suplemento collected every fortnight for faecal worm egg counts (EPG) mas sem fungos. Foram colhidas quinzenalmente amostras de and cultures to assess percentage of larval reduction and fezes para contagem de ovos (OPG) e coproculturas (% de genera/species identification and pasture samples were collected redução larvar e identificação de géneros/espécies) e erva da for calculation of the number of L3/kg dry herbage and pastagem (avaliação do Nº L3/kg erva seca e % da sua redução). percentage of larval reduction. Blood samples were collected to Foram colhidas amostras de sangue para avaliação de parâmetros assess some blood parameters. The differences between the 2 sanguíneos. As diferenças entre os dois grupos foram analisadas groups were determined with Mann-Whitney Test, with p values pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05 e 0,1). <0,05 and 0,1. Nos ensaios na pastagem não houve uma diferença significativa The grazing animals did not show a significant difference in the nos valores de OPG entre os grupos C e D, embora o período da EPG levels in both groups, although the Spring/Summer period Primavera/Verão tenha permitido uma eliminação de ovos mais allowed lower EPG levels in the horses fed with D. flagrans . The baixa no grupo com D. flagrans . O Nº L3 nas coproculturas dos nºL3/g in faecal cultures was reduced significantly 62-72% in D grupos D foi reduzido significativamente entre 62-72%. O groups. The NºL3/kg dry herbage of the pasture used by group NºL3/kg erva seca da pastagem do grupo D foi reduzido D was significantly reduced 50 and 70%, when compared with significativamente entre 50 a 70%, comparativamente ao group C. These results show that D. flagrans is effective in grupo C. Estes resultados demonstram que D. flagrans é eficaz reducing the infective larval stages of strongyles in the faeces na redução das formas infectantes dos estrongilídeos de and on the herbage in horses raised on the pasture, thus being equídeos nas fezes e na erva num sistema de criação em useful to complement the classic control methods of horse pastoreio, o que poderá ser importante numa futura utilização strongylosis in Portugal. como complemento dos métodos clássicos de controlo da estrongilidose equina em Portugal. Keywords: Biological control, Duddingtonia flagrans , Strongyles, horse Palavras-chave: Controlo biológico, Duddingtonia flagrans , Estrongilídeos, cavalo *Correspondência: [email protected] 233 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Introdução tricostrongilídeos e estrongilídeos de ruminantes, equinos e suínos), promovendo a sua imobilização e a Desde a introdução do dissulfito de carbono, em sua morte (Barron, 1977; Bird e Herd, 1994). Sabe-se 1917, até à descoberta da moxidectina em 1990, que que parte da sua acção nematófaga também é devida os anti-helmínticos têm sido utilizados regularmente ao seu arsenal enzimático, pois este é fundamental na desparasitação dos equinos, tornando-se cada vez para perfurar e degradar a cutícula rica em quitina das mais baratos, diversificados, com maior margem de larvas infectantes, tendo sido isoladas até ao momento segurança, eficácia e espectro de acção. Por outro fosfatases ácidas, proteases, fosfofolipase C, lipases e lado, o controlo da estrongilidose equina tem sido pectinases (Meyer e Wiebe, 2003; Mota et al ., 2003). baseado no uso intensivo e quase exclusivo de Estes fungos são cosmopolitas, encontrando-se na anti-helmínticos, em detrimento da utilização racional comunidade microbiana do solo, pastagens e detritos dos anti-parasitários, dum adequado maneio das orgânicos, em solos naturais e agrícolas e em todas as pastagens, bem como da procura de meios alternativos zonas onde haja matéria orgânica em decomposição, e/ou complementares (Lyons et al ., 1999; Waller, localizações propícias também ao desenvolvimento de 1999). diversas populações de nemátodes parasitas (Bird e Os estrongilídeos, em particular os ciatostomíneos, Herd, 1994; Waller, 1999). concentram as atenções da investigação parasitológica O maior problema colocado pela utilização destes dos equinos, pela sua patogenicidade, resistência a fungos como agentes de controlo biológico, é a vários anti-helmínticos (piperazina, benzimidazóis e necessidade da sua presença nas massas fecais dos tetra-hidropirimidinas) e pela difícil remoção das suas hospedeiros, para uma eficaz redução das formas formas L3 e L4 enquistadas na mucosa e submucosa infectantes neste micro-ecossistema e consequente- do intestino grosso (Bird e Herd, 1994; Lichtenfels mente na pastagem. No entanto, sabe-se que após a et al ., 1998). Estes estrongilídeos permanecem como sua emissão, as fezes frescas de ruminantes e equinos uma importante causa de doença nos equinos, além são rapidamente colonizadas por estes fungos, sendo de que a sua resistência aos anti-helmínticos tem também frequente a sua ingestão durante o pastoreio, ocorrido quase paralelamente ao desenvolvimento de com subsequente excreção nas fezes (Larsen, 2000). novas moléculas (Lloyd e Soulsby, 1998). Grønvold et al . (1993) e Larsen et al . (1992, 1994, Nos ruminantes, o aparecimento de tricostrongilí- 1995), demonstraram a sua facilidade de adminis- deos resistentes desde meados do século XX, conduziu tração per os nos ruminantes e equinos, a persistência ao seu controlo sustentado e integrado, adaptado da sua viabilidade e modo de acção após passagem progressivamente também para o controlo da estrongili- pelo tubo digestivo destes ungulados, que se deve dose equina. Esta nova abordagem ao "maneio" das muito ao tipo especial de esporos, os clamidosporos, populações de parasitas, envolve o melhoramento da muito resistentes aos sucos digestivos e com elevada pastagem e da sua rotação, a criação de raças mais taxa de viabilidade após eliminação fecal. resistentes à infecção parasitária, o desenvolvimento de Este tipo de luta biológica tem sido estudado no vacinas para as principais helmintoses, suplementos controlo dos estrongilídeos intestinais do cavalo, alimentares em quantidade e qualidade e o seu controlo sendo considerada segura para os equídeos, além de através de métodos biológicos (Waller, 1997). provocar um forte índice de captura e destruição de O controlo biológico dos nemátodes gastrintestinais formas infectantes destes nemátodes. A alimentação dos animais domésticos, envolve a utilização de dos cavalos na pastagem com fungos nematófagos, fungos que infectam e destroem as suas formas de pode constituir uma alternativa e/ou complemento desenvolvimento na pastagem. Estes fungos aos anti-helmínticos, comprovada em trabalhos que evoluíram de forma independente e encontram-se conseguiram uma redução significativa de L3 nas distribuídos por vários grupos taxonómicos, podendo fezes e na pastagem, em particular L3 de ciatostomí- atacar ovos de nemátodes, outros que são endopara- neos, diminuindo substancialmente o risco de sitas e ainda outros com características predatórias infecção dos hospedeiros (Bird e Herd, 1994, 1995; (Larsen et al ., 1991; Bird e Herd, 1994). Larsen et al ., 1995,1996). Os fungos predadores ou nematófagos, constituem Com base nestes dados, procurámos avaliar o com- o maior grupo, caracterizando-se pela produção de um portamento e eficácia do fungo Duddingtonia flagrans sistema de hifas que formam uma "rede" ou "armadilha" no controlo dos estrongilídeos dos equinos numa (do original "trapping device"), onde capturam as exploração do Ribatejo, ensaios que foram realizados larvas infectantes vivas (larvas do 3º estádio ou em equinos pela primeira vez na Península Ibérica. L3) de nemátodes parasitas com uma fase exógena Este estudo envolveu a Faculdade de Medicina de desenvolvimento na pastagem. Posteriormente, Veterinária, Lisboa, a Companhia das Lezírias, S.A. expansões destas "armadilhas" ou "redes" penetram (CL) e a empresa "CHR HANSEN – BioSystems", da nas L3, crescem e absorvem o conteúdo das larvas Dinamarca", sendo esta última entidade a responsável infectantes de diversos nemátodes parasitas pela produção e distribuição do fungo D. flagrans . gastrintestinais dos animais domésticos (em particular Os objectivos dos ensaios constaram da avaliação da 234 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 eficácia da administração de um isolado de fungos D. desmame foi efectuado em Outubro/Novembro. flagrans em culturas fecais, na redução dos níveis de Os animais foram mantidos num sistema semi- eliminação parasitária e da contaminação das pasta- -extensivo de Outubro de 1997 a Março de 1998 gens de equinos aos quais se administrou D. flagrans , (1º ensaio) e de Fevereiro a Julho de 1999 (2º ensaio), por comparação com uma população controlo. permanecendo em dois parques contíguos de Simultaneamente foram pesquisadas eventuais altera- pastagem espontânea e dimensões semelhantes, tendo ções dos hospedeiros induzidas pela administração ainda a possibilidade de se abrigarem em telheiros ou dos fungos, através do estudo comparativo dos alojamentos na pastagem. Todos os equinos efectua- parâmetros sanguíneos dos dois grupos. Os resultados ram um pastoreio ad libitum , recebendo uma ração obtidos são aplicados ao modelo epidemiológico da diária de granulado, palha, feno e ainda um suplemento estrongilidose equina no Ribatejo e são apresentadas vitamínico (Neolait ®). propostas de controlo integrado utilizando este fungo Os equinos foram todos vacinados contra o Tétano e nematófago. Influenza com a vacina "Tetagripiffa" e desparasitados com pamoato de pirantel (PPIR) (Strongid ®), previamente à administração do fungo, no 1º ensaio Material e métodos em 13 de Novembro de 1997 e no 2º ensaio em 18 de Fevereiro de 1999. A administração de um Delineamento experimental anti-helmíntico antes do fungo é uma condição deste tipo de controlo, na medida em que os fungos têm uma O ensaio decorreu em dois períodos, de Novembro acção fundamentalmente preventiva ao eliminarem as de 1997 a Março de 1998 e de Fevereiro a Julho de larvas infectantes na pastagem. 1999, utilizando poldros com cerca de 10 – 12 meses Os fungos foram administrados aos animais do de idade, com uma infecção natural por estrongilídeos grupo D, numa dose diária de clamidosporos de intestinais. O conjunto inicial de animais foi dividido 5x10 5 /kg peso vivo (equivalente a um peso seco em dois grupos, de acordo com a condição corporal e de 10-20 g de material fúngico), misturados com o o número de ovos/g fezes (OPG), segundo Larsen et concentrado ou a silagem. O grupo C recebeu uma al . (1996). Procedeu-se a uma primeira contagem quantidade igual de alimento mas sem fungos. A individual do OPG, ordenando os equinos em dois administração de D. flagrans no 1º e 2º ensaio iniciou-se grupos para que o nível de infecção fosse semelhante a 25 de Novembro de 1997 e a 19 de Fevereiro de em ambos. 1999, respectivamente, ou seja no dia seguinte à Antes de iniciar a administração periódica dos desparasitação. O nível de parasitismo detectado no 2º fungos, os animais de ambos os grupos foram despa- ensaio obrigou a uma nova desparasitação dos equinos rasitados no início do teste com um anti-helmíntico de em Abril de 1999, os grupos D e C1 com doramectina largo espectro, para que o nível de infecção não fosse (DRM) (Dectomax ®) e o C2 com ivermectina (IVM) demasiado elevado e para minimizar o risco de uma (Eqvalan ®). estrongilidose clínica. O grupo ao qual foram admi- Os animais permaneceram nos parques de pastagem nistrados os fungos Duddingtonia flagrans designámos sob observação regular durante os períodos do estudo, como D, recebendo uma dose diária de material fúngico para detecção de alguma reacção à ingestão do produto nos alimentos, enquanto o grupo controlo, denominado e para certificação de que os animais ingeriam o C, recebeu uma quantidade igual de alimento sem material fúngico (Figura 1). fungos. Este trabalho experimental foi objecto de apreciação e autorização oficial pela Direcção-geral de Animais, maneio e tratamentos Veterinária, com a salvaguarda do bem-estar e mínimo No ensaio de 1997/98, foram utilizados 18 poldros grau de sofrimento dos animais. Além destas premissas machos repartidos por dois grupos com 9 animais. e caso fosse necessário, foram acordadas medidas Em 1999 foram utilizados três grupos, um grupo adicionais com o Médico-veterinário da exploração tratamento com 9 poldros machos (D), e dois grupos para minimizar o seu desconforto e eliminar possíveis controlo, o inicial com 12 poldros fêmeas (C1) e um deficiências inerentes à experimentação, nomeada- segundo, com 16 poldros de 1-2 anos (C2). Durante mente aparecimento de diarreias e cólicas, através da este último ensaio e por imperativos do maneio da administração suplementar de anti-parasitários, exploração, o C1 foi transferido em Maio para outra antibióticos, anti-inflamatórios e anti-espasmódicos. pastagem mais afastada, pelo que a partir daí o grupo D foi comparado com o C2, que se encontrava numa Material fúngico parcela de terreno próxima do ensaio inicial e incluía No ensaio foi utilizada a variante "Troll A" do fungo poldros criados pelo sistema normal de produção Duddingtonia flagrans , que ocorre normalmente na equina em pastoreio da CL (Figura 1). Todos os Dinamarca, isolado e identificado em Trollesminde, animais pertenciam à Coudelaria da CL, de raça perto de Roskilde, por Larsen et al . (1991) e Grønvold Lusitana ou Cruzada, com cerca de 200-250 kgs, cujo et al . (1993a). 235 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Figura 1. A e B - Grupos D e C no ensaio de 1997/98; C e D - Grupos D e C1 no ensaio de 1999; E e F - Administração de D. flagrans no comedouro do Grupo D e aspecto da aveia com o fungo misturada com a silagem. Os fungos foram previamente seleccionados , ensaio e por amostragem na pastagem, nas restantes cultivados e adicionados por métodos microbiológicos datas. industriais a grãos de aveia e embalados em saquetas Para determinação do nível de OPG utilizou-se o herméticas de plástico pelos Laboratórios "CHR método de McMaster de acordo com a técnica de HANSEN - BioSystems, A/S" (Figuras 1E e 1F). (O Thienpont et al . (1986), com um limiar de detecção de conteúdo de cada saqueta foi calculado previamente 50 ovos/g de fezes (OPG). Os resultados foram para cada dia, para a totalidade dos animais e peso expressos pela média aritmética do OPG do grupo global do grupo D). As embalagens foram para cada colheita. armazenadas à temperatura ambiente e os grãos de As culturas fecais foram realizadas a nível aveia com fungos foram misturados e homogeneizados individual no início, no meio e no fim do ensaio com o suplemento alimentar no comedouro, sendo paralelamente à determinação individual do OPG e administrados via oral numa dose diária de por amostragem nas restantes datas, sendo efectuadas clamidosporos de 5x10 5/kg peso vivo. de acordo com a metodologia de Madeira de Carvalho (1993) e Larsen et al . (1996). Basicamente, a partir de cada amostra colhida na pastagem foi retirada uma Métodos coprológicos e de cultura fecal subamostra com 4 g, num total de 36 g para cada Para diagnóstico do nível de infecção por cultura de grupo. Para cada lote de animais foram estrongilídeos utilizou-se a metodologia de Larsen efectuadas 3-5 culturas de grupo e quer estas quer as et al . (1996) e efectuámos a colheita de fezes com individuais foram incubadas durante 11-14 dias à frequência semanal (no início do ensaio) e quinzenal. temperatura de 26-28 ºC e humidade relativa de As colheitas foram realizadas individualmente 70-80%. As L3 foram recolhidas pelo método de Ueno (a partir do recto) no início, no meio e no fim de cada e Gutierres (1983), com copos de plástico e placas de 236 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Petri. Após conservação a 4 ºC era efectuada a foram extraídas por lavagem com água da torneira, contagem e calculado o nº médio de L3/g. As fezes centrifugação e filtração com peneiros de malha foram pesadas previamente, para determinação do decrescente de 1000, 500 e 20 mm, concentradas com nºL3/g fezes e da percentagem de desenvolvimento: funil de Buchner e bomba de vácuo e isoladas através % Des. larvar = L3/g médio/OPG médio em cada de aparelho de Baermann. O nível de contaminação colheita x100. foi expresso através da fórmula: Nº L3/kg Erva Seca = A percentagem média de redução larvar induzida Nº total L3 (em 10 ml) x 1000/Peso erva (gramas). pelo Duddingtonia flagrans foi determinada pela A percentagem de redução larvar na pastagem foi metodologia adaptada de Baudena et al . (2000a), com calculada com base na fórmula do ponto 2.4. adaptada a fórmula: à contagem de larvas na pastagem. % Redução = 100 – (L3/g nas culturas do grupo D/L3/g nas culturas do grupo C x100) Parâmetros hematológicos As larvas L3 dos estrongilídeos de equídeos foram Durante o primeiro ensaio foram realizadas três observadas numa alíquota de 100 ml de suspensão colheitas de sangue para apreciação de parâmetros aquosa entre lâmina e lamela, procedendo à sua sanguíneos nos dois grupos de animais em estudo: em contagem através da fixação e coloração diferencial Novembro de 1997 e Janeiro e Março de 1998. Os com soluto de lugol. O número total de L3 foi parâmetros analisados incluíram o hemograma, a calculado para 10 ml de líquido e determinado o fórmula leucocitária, albumina, globulinas, proteína número de L3/g fezes e a percentagem de desenvolvi- total, glucose e os enzimas ALT e AST. mento médio relativamente ao OPG médio para cada Para as fórmulas leucocitárias foram utilizados colheita. Os resultados foram expressos pela média esfregaços de sangue corados pelo Giemsa. Para as aritmética do total de contagens efectuadas. A sua contagens celulares foram utilizados os contadores identificação foi realizada com base nas chaves de MS9 ‰ and BPC BioSED ‰PRIME Automatic Soulsby (1965), Arundel (1985) e Bevilaqua et al . Photometer e para as restantes determinações foram (1993). utilizadas a técnica de espectrofotometria (proteínas totais, albumina, globulinas) através do aparelho Observação do desenvolvimento fúngico nas fezes "Photometer BPC BioSed srl – BPC Prime" e a técnica Durante o primeiro ensaio, as amostras fecais foram de fotometria de reflectância (glucose) com o aparelho ® colhidas individualmente e uma grama da amostra "Reflotron ". Os valores hematológicos de referência de fezes de cada um dos poldros de cada grupo foi foram considerados a partir dos trabalhos de Jain retirada para uma cultura fecal com um total de 9 (1993) e Kaneko et al . (1997). gramas, num total de 3 culturas por cada grupo, para Dados meteorológicos observação directa do micélio de D. flagrans segundo o método de Larsen et al . (1996). Esta avaliação foi As informações sobre precipitação total, humidade efectuada por observação ao microscópio durante relativa e temperatura média, mínima e máxima foram 4 datas de colheita para seguir o crescimento e obtidas a partir dos registos da estação meteorológica desenvolvimento do fungo durante 2 a 4 semanas de Coruche, a mais próxima do local da experiência, após o início da cultura. de Novembro de 1997 a Março de 1998 e de Fevereiro O desenvolvimento micelar de D. flagrans foi a Julho de 1999. classificado do seguinte modo: 0, sem desenvolvi- mento; +, pequeno micélio à superfície das fezes; ++, Análise estatística rede micelar mais desenvolvida com aspecto tridimen- Os dados de estatística descritiva foram obtidos com sional; +++, rede micelar completamente formada o programa "Microsoft Excel 2000 ®" e as diferenças com aspecto de tufo à superfície da amostra fecal. entre o grupo experimental e o grupo de controlo foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney, Nível de contaminação da pastagem programa "GraphPad InStat Version 3.05 for Windows 95/NT, 2000". Para este ensaio, foi considerado As colheitas foram efectuadas nas pastagens p<0,05 para valores significativos e p<0,1 para utilizadas por ambos os grupos com frequência biologicamente significativos. semanal, no início de cada ensaio, e quinzenal no restante período de estudo, pelo método do duplo W de Taylor (1939), com modificações e adaptações Resultados segundo Ludwig e Johnstone (1984) e Madeira de Carvalho (1993), num total de 400 amostras por folha Níveis de OPG e de abundância de L3 de pastagem para cada grupo do ensaio. Os métodos de extracção, conservação e contagem Os níveis de OPG foram semelhantes para os dois das larvas infectantes na pastagem foram efectuados grupos no início dos dois ensaios. No entanto, no 1º de acordo com Madeira de Carvalho (1993). As L3 ensaio, em 17/2/98 e no final do 2º ensaio (entre os 237 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 grupos D e C2), foram determinadas diferenças signi- ficativas pelo teste de Mann-Whitney (p<0,05). Também se observou em ambas as experiências que o reaparecimento dos ovos ocorreu sempre em primeiro lugar nos grupos controlo e posteriormente nos gru- pos Duddingtonia (Figura 2). As culturas fecais registaram uma redução signi- ficativa do número de L3/g dos grupos D comparati- vamente aos grupos C em ambos os ensaios. Em 1997/98, as diferenças foram mais notórias de Dezembro a Janeiro, p <0,05 em 6/1 e p<0,1 nas outras colheitas com diferenças mais acentuadas (Figura 3A). Também foram verificadas reduções significativas no número de L3/g de fezes nos animais que receberam D. flagrans em 1999 e nas restantes colheitas os valores do grupo D foram sempre inferiores aos dos grupos C1 e C2 (Figura 3B). As percentagens de desenvolvimento e redução larvar nos grupos D, Figura 2 - Valores de OPG (médias aritméticas) dos grupos C e D registaram sempre valores inferiores e superiores aos em 1997/98 (A) e 1999 (B). PPIR – Pamoato de pirantel; dos grupos C, respectivamente, com excepção de uma DRM – Doramectina; *Diferenças significativas entre grupos no teste colheita efectuada em Março de 1999. A proporção Mann-Whitney para p<0,05. média de L3 desenvolvidas entre o grupo C/grupo D no ensaio 1 foi de 6:1 e no ensaio 2 foram de 21,9:1 (C1/D) e 2,6:1 (C2/D). A média aritmética de L3/g nas coproculturas dos grupos D foi inferior à dos grupos C nos dois estudos de campo e a percentagem de redução larvar foi de 70% em 1997/98 e 62% e 72% em 1999 (Quadro 1 e Figura 4). Os valores da abundância proporcional dos grupos Controlo e Duddingtonia revelaram uma predominância de L3 do género Cyathostomum s.l. (99,8 a 100%). Nos grupos C e D também foram identificadas L3 dos géneros Poteriostomum e Triodontophorus , enquanto as L3 das espécies Gyalocephalus capitatus , Oesophagodontus robustus e Trichostrongylus axei foram identificadas apenas nos animais dos grupos controlo (Quadro 2). Nestas experiências de campo, as L3 de Cyathostomum s.l . não desapareceram por completo nas culturas, e o seu número aumentou substancial- mente cerca de 1,5 mês após a desparasitação com Figura 3 - Valores médios de L3/g de fezes nas culturas fecais dos PPIR em ambos os ensaios. Situação análoga ocorreu ensaios de 1997/98 (A) e 1999 (B). Grupos Controlo (C, C1 e C2) e Duddingtonia (D). Diferenças significativas pelo teste de também na desparasitação com DRM em 1999. Mann-Whitney: # p<0,1; * p<0,05; ** p<0,01. (As barras representam o erro padrão da média). Desenvolvimento fúngico nas fezes A observação foi efectuada apenas no ensaio de 1997/98 e em todas as culturas do grupo Duddingtonia foi observado o desenvolvimento do fungo, desde o grau baixo a máximo, o que permitiu comprovar que os animais ingeriram o fungo e este estava a formar a rede micelar tridimensional típica com elevada destru- ição larvar (Figura 5). As amostras do grupo controlo também revelaram algum grau de desenvolvimento fúngico mas não foram observadas formas típicas de desenvolvimento Figura 4 - Valores globais (médias aritméticas) de L3/g de fezes nos de D. flagrans , nomeadamente a rede e os clami- grupos Controlo (C) e Duddingtonia (D) nos ensaios efectuados no dosporos (Quadro 3). período de 1997/99. (As barras representam o erro padrão da média). 238 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Quadro 1 - Percentagens de desenvolvimento das L3 e de redução larvar em cultura (Os asteriscos representam o nível de significância global da redução do desenvolvimento larvar pela acção de D. flagrans ). Ensaio 1 Ensaio 2 Data %Des %Des % Data %Des %Des % Data %Des. %Des. % D C Redução D C1 Redução D C2 Redução 3-12-97 0 11 100 2-3-99 8,79 13,47 59,61 6-5-99 0,43 0,72 79,53 16-12-97 0,25 1,87 86,63 10-3-99 9,28 4,57 18,74 18-5-99 2,54 13,28 62,77 6-1-98 4,03 41,14 90,20 18-3-99 0,82 8,24 98,63 1-6-99 1,8 2,75 59,71 20-1-98 0,42 1,51 72,19 31-3-99 2,57 3,84 3,97 17-6-99 7,19 16,38 80,22 3-2-98 0,60 1,18 49,15 15-4-99 2,17 6,99 74,60 1-7-99 5,3 10,96 78,72 17-2-98 0,83 4,35 80,88 22-4-99 1,46 6,86 76,33 3-3-98 3,04 3,39 10,32 6-5-99 0,43 516,14 99,48 Média 1,53* 9,21 69,91 -- 3,65** 80,01 61,62 -- 3,45*** 8,82 72,19 aritm. Mínimo 0,25 1,18 10,32 -- 0,43 3,84 3,97 -- 0,43 0,72 59,71 Máximo 4,03 41,14 100,00 -- 9,28 516,14 99,48 -- 7,19 16,38 80,22 Desvio 1,60 15,84 30,83 -- 3,28 208,23 40,86 -- 2,50 5,84 10,07 padrão Erro pad. 0,65 5,98 11,63 -- 1,24 78,58 15,42 -- 1,12 2,60 3,80 Média *p<0,05; **p<0,10; ***p=0,22. Quadro 2 – Abundâncias proporcionais médias de géneros/espécies de estrongilídeos (L3) nos diferentes grupos dos ensaios (Percentagem de gén./esp. em 100 larvas). Abundâncias proporcionais (%) Grupo Cyath G.cap O.rob Poter S.equi S.eden Triod S. vulg T. axei Duddingtonia 97/98 100 0 0 0 0 0 0 0 0 Controlo 97/98 99,48 0 0 0,23 0 0 0,29 0 0 Duddingtonia 99 99,82 0 0 0,04 0 0 0,14 0 0 Controlo C1 99 99,40 0,34 0,01 0,22 0 0 0,03 0 0 Controlo C2 99 99,21 0 0 0,59 0 0 0 0 0,20 (Cyath – Cyathostomum s.l. ; G. cap – Gyalocephalus capitatus ; O. rob – Oesophagodontus robustus ; Poter – Poteriostomum spp. S. equi – Strongylus equinus ; S.eden. – S. edentatus ; Triod. spp. – Triodontophorus spp.; S. vulg. – Strongylus vulgaris ; T. axei – Trichostrongylus axei). Quadro 3 - Culturas fecais de amostras Controlo e Duddingtonia para observação do desenvolvimento fúngico. Culturas efectuadas em 4/12/97 CONTROLO DUDDINGTONIA Observação 1* 2* 3* 1 2 3 11-12-97 + + + ++ ++ ++ 19-12-97 + + + +++ +++ +++ 8-1-98 0 + + +++ ++ +++ 14-1-98 0 + + +++ ++ +++ Culturas efectuadas em 17/12/97 CONTROLO DUDDINGTONIA Observação 1* 2* 3* 1 2 3 8-1-98 + + 0 + + ++ 14-1-98 ++ ++ 0 ++ + +++ 5-2-98 ++ ++ 0 ++ ++ ++ Culturas efectuadas em 8/1/98 CONTROLO DUDDINGTONIA Observação 1* 2* 3* 1 2 3 14-1-98 +++ +++ +++ +++ +++ +++ 10-2-98 +++ +++ ++ +++ +++ +++ 2-3-98 +++ +++ ++ +++ +++ +++ Culturas efectuadas em 5/2/98 CONTROLO DUDDINGTONIA Observação 1* 2* 3* 1 2 3 10-2-98 ++ + ++ +++ +++ +++ 2-3-98 +++ ++ ++ +++ ++ +++ *As amostras controlo apresentavam culturas com outros fungos, mas não foram detectadas formas de D. flagrans . 239 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Figura 5 - A - Cultura de D. flagrans em placa de petri com 5 dias; B - Idem, com 21 dias, com aspecto de tufo; C - Rede de D. flagrans a envolver larvas L3 de estrongilídeos (objectiva de 4x); D - Idem, onde se notam melhor os clamidosporos (pontos redondos mais escuros) (objectiva de 10x); E e F - Actividade nematófaga de D. flagrans , com clamidosporos e conídeas no ambiente envolvente da larva (E) e hifas e clamidosporos no interior da L3 (F) (Objectiva 40x) (Originais). Contaminação da pastagem o nível de contaminação do parque utilizado pelo grupo que recebeu o fungo foi reduzido até zero nas A variação das L3 nas pastagens dos grupos duas últimas colheitas efectuadas em Fevereiro/ controlo acompanhou as flutuações da precipitação e Março, enquanto o parque do grupo controlo revelou humidade relativa durante o período de estudo, sempre larvas infectantes na erva (Figura 7A). Todas embora as pastagens com Duddingtonia flagrans não as L3 colhidas nas pastagens de ambos os grupos tivessem sofrido tanto esta influência (Figuras 6 e 7). pertenciam ao género Cyathostomum s.l . No início do estudo de 1997/98, o número de L3/kg No princípio do ensaio de 1999 registámos uma ES subiu progressivamente nos parques dos dois variação análoga nos níveis de L3 na pastagem, grupos, embora tenha registado valores inferiores para embora a partir de Março o parque do grupo D a pastagem utilizada pelo grupo D. Ainda que não apresentasse um decréscimo progressivo da sua tenham sido assinaladas diferenças significativas contaminação, que se prolongou até Julho (Figura (p=0,8), entre os dois grupos até ao fim deste ensaio, 7B). 240 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Triodontophorus spp. no grupo C1 (0,33% do total). Os valores globais de L3/kg erva seca nos dois ensaios, mostraram sempre níveis mais baixos de contaminação para as pastagens dos animais que recebiam D. flagrans . A percentagem média de redução de contaminação larvar nas pastagens dos animais alimentados com o fungo foi de 50,5% em Figura 6 - Valores da precipitação total, humidade relativa e 1997/98, 60,3% e 70,4% no primeiro e segundo temperatura média para a área de estudo durante o período dos ensaios ensaios de 1999, respectivamente (Figura 8). de Outubro de 1997 a Março de 1998 e de Fevereiro a Julho de 1999. Parâmetros hematológicos Os valores dos parâmetros sanguíneos entre os dois grupos não revelaram diferenças significativas (p<0,05), situando-se regra geral nos intervalos dos valores padrão. Os valores do grupo D aproximaram-se mais do padrão relativamente ao grupo controlo, embora as diferenças fossem mínimas (Quadro 4). No entanto, foram registados níveis baixos de hematócrito, eritrócitos e hemoglobina nos animais de ambos os grupos, características de uma ligeira anemia, que foi acompanhada de leucocitose, espe- cialmente por aumento da percentagem de linfócitos. Registámos ainda uma subida dos eosinófilos, especialmente no grupo D após administração de D. flagrans . Relativamente aos parâmetros bioquímicos , verificámos uma hiperproteinemia, consequência do aumento das globulinas, que provocaram uma inversão da relação albumina/globulina. Os valores de proteína Figura 7 - Variação do número de L3/kg ES nos parques de pastagem total atingiram o seu nível mínimo no fim do ensaio. dos grupos Controlo e Duddingtonia de Outubro de1997 a Março de Destacamos ainda o baixo valor de glucose em ambos 1998 (A) e de Fevereiro a Julho de 1999 (B). os grupos, especialmente no grupo controlo em 6/1/98. Discussão Os ensaios com Duddingtonia flagrans , variedade Troll A, demonstraram que o fungo administrado per os aos equinos na dose de 5X10 5 esporos/kg PV foi eliminado com sucesso nas fezes e em quantidade suficiente para uma redução significativa das larvas Figura 8 - Valores globais (médias aritméticas) de L3/kg ES nas infectantes nas coproculturas e na pastagem. Outros pastagens utilizadas pelos grupos Controlo (C) e Duddingtonia (D) nos ensaios efectuados de 1997 a 1999 (as barras representam o erro trabalhos de campo também demonstraram a acção padrão da média). nematófaga de D. flagrans sobre as L3 d e estrongilídeos de equídeos e de tricostrongilídeos de Esta contaminação superior nos grupos Controlo ruminantes em pastoreio (Grønvold et al ., 1993; revelou uma diferença significativa entre o grupo C1 Wolstrup et al ., 1994; Larsen et al ., 1995, 1995a, e D (p=0,038), até os animais de C1 serem transferidos 1996). para outra pastagem. A diferença entre o grupo C2 e D A eliminação de ovos não mostrou diferenças entre não mostrou diferenças significativas (p=0,15), mas os dois grupos nos dois ensaios, à semelhança do os valores de L3/kg ES foram sempre superiores na observado por Larsen et al . (1996). Isto deve-se por pastagem deste grupo controlo comparativamente à do um lado ao facto de os fungos não actuarem sobre os grupo D (Figura 7B). No ensaio 2, foram isoladas adultos e sim nas formas pré-parasitárias dos primordialmente larvas infectantes do género estrongilídeos no ambiente. Por outro, os poldros terão Cyathostomum s.l . (99,26% no grupo D e 99,67% ingerido larvas de ciatostomíneos durante a Primavera no grupo C1), mas também foram isoladas L3 de e Verão, que provavelmente se tornaram hipobióticas S. vulgaris no grupo D (0,74% do total) e de durante o Outono e o Inverno, pouco antes do início 241 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 Quadro 4 - Parâmetros hematológicos dos animais dos grupos Controlo e Duddingtonia flagrans em 1997/98. Fórmulas Leucocitárias N OPG Neutrófilos (%) Linfócitos (%) Monócitos (%) Eosinófilos (%) Basófilos (%) Valores padrão 22 - 72 17-68 0 – 7 0 - 10 0 - 4 (Jain, 1993) 43,8 ± 7,0 47,9 ± 6,0 3,6 ± 2,0 4,1 ± 2,9 0,4 ± 0,5 Controlo 13-11-97 9 1278 42,56 50,33 3,78 3,11 0,22 6-1-98 9 536 42,00 49,56 5,56 2,67 0,22 3-3-98 9 2663 40,56 53,67 2,67 3,11 0,00 D. flagrans 13-11-97 9 1333 49,67 44,44 4,11 1,56 0,22 6-1-98 9 759 43,22 48,56 3,78 4,11 0,22 3-3-98 9 2212 41,67 49,78 4,00 4,11 0,44 Hematócrito, contagens celulares e valores de hemoglobina N OPG Hematócrito(%) Leucócitos(n x 103ml) Eritrócitos(n x 106ml) Hb(g/dl) Valores padrão 34,5 ± 3,8 10,81 ± 1,87 8,6 ± 0,58 11,8 ± 1,6 (Jain, 1993) 32 9,05 9 14,4 Controlo 13-11-97 9 1278 24,83 18,72 6,18 12,71 6-1-98 9 536 26,21 17,27 6,64 13,53 3-3-98 9 2663 24,52 15,98 6,52 12,12 D. flagrans 13-11-97 9 1333 25,24 17,23 6,19 11,86 6-1-98 9 759 25,36 16,49 6,05 12,98 3-3-98 9 2212 24,31 15,99 6,17 12,11 Parâmetros bioquímicos N OPG Prot. Totais Albumina Globulinas Relação Glicose ALT AST (g/dl) (g/dl) (g/dl) Alb/Glob (mg/dl) U/L 25ºC U/L 25ºC Valores padrão 5,2 - 7,9 2,60 - 3,70 2,62 - 4,04 6,2 – 14,6 75-115 3 – 23 226 - 366 (Kaneko et al 1997) 6,35 ± 0,59 3,09 ± 0,28 3,33 ± 0,71 9,6 ± 1,7 95,6± 8,5 14 ± 11 296 ± 70 Controlo 13-11-97 9 1278 8,72 4,46 4,26 1,27 80,47 5,10 69,16 6-1-98 9 536 10,39 4,23 6,15 0,70 47,54 9,65 67,75 3-3-98 9 2663 4,56 3,26 1,41 2,97 * 10,2 289,4 D. flagrans 13-11-97 9 1333 9,66 4,06 5,60 0,77 73,42 4,60 74,20 6-1-98 9 759 10,19 4,17 6,02 0,71 70,61 10,70 88,30 3-3-98 9 2212 4,78 3,30 1,55 2,70 * 6,71 246,50 *Não determinado. dos ensaios de 1997/98 e 1999, respectivamente, pode apresentar um PRO mais curto nos animais sendo um comportamento típico destes nemátodes e jovens (Madeira de Carvalho et al ., 2003). que justifica em parte os picos de OPG primaveril e Mais trabalhos devem ser efectuados para encontrar estival (Reinemeyer, 1986). a melhor associação D. flagrans /anti-helmínticos, pois A desparasitação com o pamoato de pirantel poderá em trabalhos in vitro com Arthrobotrys spp. (outro explicar o curto período de reaparecimento dos ovos fungo nematófago), a ivermectina, abamectina, (cerca de 1 mês), pois este anti-helmíntico não é levamisol e principalmente o albendazol, reduziram o efectivo sobre as formas hipobióticas, como descrito crescimento do seu micélio (Araújo et al ., 1995). por Piché et al . (1990). Ainda que o fungo D. flagrans O número médio de L3/g de fezes e a sua percenta- tenha reduzido as L3 nas culturas e na pastagem, os gem de desenvolvimento foram sempre inferiores nos picos de OPG observados em Janeiro/Fevereiro de grupos Duddingtonia comparativamente aos grupos 1998 também poderão estar relacionados com a saída controlo. Por outro lado, os grupos que receberam das larvas hipobióticas da parede do intestino grosso D. flagrans comparativamente aos grupos controlo para o lume e subsequente maturação dos adultos revelaram uma percentagem de redução das populações (Reinemeyer, 1986). larvares na massa fecal de 62 a 72% no conjunto dos Este fenómeno também poderá explicar o curto dois ensaios. Larsen et al . (1995), registaram nas Período de Reaparecimento de Ovos (PRO) após culturas fecais com isolado CI 3 de D. flagrans uma desparasitação com a doramectina, pois este fármaco redução de L3 de ciatostomíneos de 90-99%, mas com 242 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 uma dose diária superior, de 5X10 6-5X10 7 esporos/kg pv. equídeos em pastoreio da CL (Madeira de Carvalho et No entanto, Silvina-Fernández et al . (1999) referem al ., 1997, 1999, 2000, 2001). Mas durante este pico, que o isolado Troll A de D. flagrans apresenta uma os animais do grupo D apresentaram uma redução actividade nematófaga mais potente que outros notória de L3 na pastagem. Assim, o aumento de isolados, com percentagens médias de redução larvar temperatura conjugado com a precipitação estimula- de 98,4% após administração individual de um único ram a actividade e migração larvar para a erva, assim cavalo, cujas fezes foram colocadas em parcelas como o crescimento fúngico e o aumento da sua experimentais para avaliar a sua a capacidade redutora. actividade nematófaga, situação que concorda com os Na realidade a administração individual de D. flagrans resultados de Fernández et al . (1997) e em parte com é eficaz no controlo da estrongilidose em animais os de Baudena et al . (2000a). De resto, Bird e Herd estabulados, pois os equinos em tratamento mantive- (1994) consideram que o desenvolvimento do micélio ram baixa eliminação de ovos (<50 OPG) durante 3-4 e a actividade nematófaga também são estimulados meses (Jorge et al ., 2000). pelo contacto com um número crescente de larvas Em ambos os grupos testados, C e D, o género infectantes, o que aconteceu entre Março e Julho de predominante das larvas infectantes foi o 1999. Cyathostomum s.l ., embora tivessem sido identificados De acordo com Baudena et al . (2000a), os fungos no total 3 e 6 géneros, nos grupos D e C, respectiva- nematófagos poderão ser utilizados com maior mente. No entanto não foi possível determinar eficácia durante o Inverno e Primavera no sul dos eventuais diferenças na sua redução devido ao EUA. Os nossos resultados parecem indicar uma melhor pequeno número de espécimes de alguns destes eficácia do D. flagrans durante a Primavera/Verão e géneros, como referido por Larsen et al . (1996). As L3 uma menor redução larvar durante o Outono/Inverno, de nemátodes do género Strongylus não foram pois este período é mais frio em Portugal. Alguns demonstradas nas culturas, provavelmente porque o dados confirmam esta hipótese, pois há uma período pré-patente destes é de 6 a 11 meses e os correlação positiva entre o seu desenvolvimento e animais utilizados nos ensaios tinham uma idade maior eficácia predadora e o aumento da temperatura inferior a 1 ano (Madeira de Carvalho et al ., 2001). (até 35 ºC), havendo um menor desenvolvimento do A contaminação das pastagens dos animais que micélio e fraca actividade nematófaga entre 5 a 10 ºC, receberam D. flagrans foi inferior à dos grupos o que pode questionar a sua utilização durante o controlo, embora só tivéssemos registado diferenças Inverno das zonas temperadas (Silvina-Fernández, significativas em 1999. A redução pouco expressiva 1998; Fernández et al ., 1999). de L3 na pastagem durante o ensaio de 1997/98, Nos parâmetros sanguíneos, as contagens celulares poderá ter sido consequência da redução progressiva de leucócitos e eritrócitos não revelaram diferenças da precipitação total e da oscilação da temperatura entre os dois grupos. No entanto, na fórmula leucoci- (valores mínimos de 7-9 ºC e máximos de 16-19ºC), tária, os neutrófilos e os linfócitos do grupo de Novembro a Fevereiro. Grønvold et al . (1996), Duddingtonia apresentaram valores mais próximos do estabeleceram como limites para o desenvolvimento padrão (Jain, 1993). A linfocitose foi notória e terá da rede micelar 10 e 35 ºC, abaixo e acima dos quais sido a responsável pela leucocitose nos dois grupos, o fungo cresce e reproduz-se menos, situando-se o embora mais evidente nos animais controlo. Este ponto óptimo de crescimento nos 30 ºC. O aumento da quadro hematológico é típico da ciatostominose, temperatura em Fevereiro/Março de 1998, poderá ter principalmente pelo aumento de neutrófilos e linfócitos aumentado a actividade nematófaga e contribuiu para (Ogbourne, 1978). os níveis mais baixos de L3 nas pastagens do grupo D. Nos parâmetros bioquímicos também não houve No entanto, as temperaturas baixas, o tempo seco e a diferenças entre os grupos e registámos em ambos má qualidade da erva (especialmente no parque do uma hiperproteinemia, hiperglobulinemia e inversão grupo C), não permitiram a migração das L3 e uma da relação albumina/globulina (=0,7). Esta situação diferença expressiva entre os dois grupos (Madeira foi acompanhada de hipoglicemia, mais evidente no de Carvalho et al ., 1999a, 2000). No ensaio de 1999 grupo controlo, que parece intimamente ligada à verificou-se uma situação distinta, com uma precipi- maturação das formas larvares hipobióticas de tação quase constante e um aumento progressivo de ciatostomíneos (Madeira de Carvalho, 2001). temperatura média de Março a Julho (valores mínimos A diminuição da relação albumina/globulina de 6,3 a 15,6 ºC e máximos de 16,6 a 31,7 ºC, deve-se a uma hipoalbuminemia por perda proteica no respectivamente), o que permite uma maior actividade intestino grosso e a uma hiperbetaglobulinemia por e migração das L3, como proposto por Mfitilodze e resposta à infecção por ciatostomíneos e o nível baixo Hutchinson (1988), Hutchinson et al . (1989) e de açúcares do sangue foi consequência da sua Baudena et al . (2000). absorção deficiente durante a irrupção das larvas de Assim, registou-se um pico de larvas na pastagem ciatostomíneos, de acordo com Murphy et al . (1997), no grupo controlo C1 em Abril/Maio, o que concordou Thamsborg et al . (1998) e Smets et al . (1999). com o pico primaveril previamente assinalado nos Estes animais apresentaram também baixa condição 243 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 corporal e diarreia líquida intermitente, sintomas administrações de anti-helmínticos, contribuindo característicos da ciatostominose do tipo 2. Este assim para retardar o aparecimento de resistências, quadro clínico, a época do ano e a utilização de ani- com especial interesse para o grupo das avermecti- mais jovens podem ter contribuído para uma menor nas/milbemicinas, pois devem ver preservada a sua eficácia da administração de D. flagrans no ensaio do eficácia enquanto anti-helmínticos de elevada margem Outono/Inverno de 1997/98 (Madeira de Carvalho, de segurança e grande espectro de acção durante o 2001). máximo tempo possível (Sangster, 1999, 2003). Ainda que não fizesse parte dos objectivos do trabalho, o ensaio de 1997/98 permitiu deduzir a existência de hipobiose nos ciatostomíneos dos Conclusões equídeos desta região: a) pelo curto período de reaparecimento dos ovos após desparasitação; b) O fungo Duddingtonia flagrans , variedade Troll A, existência de picos de OPG em Janeiro quando administrado na dose diária de 5x10 5 esporos/kg pv, normalmente deverão aparecer em Março/Abril; c) o revelou uma boa eficácia média de redução da popu- grupo que recebeu o D. flagrans apresentava um grau lação larvar em cultura, 62-72% e uma diminuição de contaminação mínimo da pastagem, mas o padrão significativa da contaminação da pastagem por L3 de de eliminação de ovos foi semelhante ao do grupo estrongilídeos de 50-70%, principalmente durante o controlo, pois este comportamento dependerá de período da Primavera/Verão, o que torna este meio de estímulos exógenos que as L3 recebem antes da sua controlo muito promissor nos equinos em pastoreio ingestão ou de fenómenos de imunidade dos próprios quando associado aos tratamentos estratégicos com equídeos (Reinemeyer, 1986; Proudman e Matthews, anti-helmínticos nesta época do ano. 2000; Chapman et al ., 2002). A administração de D. flagrans não provocou Em suma, não foram verificadas alterações alteração nos parâmetros sanguíneos estudados, sanguíneas nos equinos que receberam o fungo e constituindo a primeira observação a nível mundial que pudessem ser da responsabilidade desta admi- da não interferência deste fungo nematófago nos nistração, registando-se modificações sanguíneas parâmetros vitais dos equídeos em estudo. características de um quadro de ciatostominose, cuja Neste sistema de produção equina em pastoreio, sazonalidade coincidiu com o período do ensaio de a infecção por estrongilídeos intestinais pode ser 1997/98 (Madeira de Carvalho et al ., 2002). minimizada a partir do início da Primavera até ao De acordo com a bibliografia disponível, os ensaios Outono com a administração de Duddingtonia efectuados no nosso País com D. flagrans constituíram flagrans associada aos tratamentos anti-helmínticos o segundo trabalho de campo a nível mundial com convencionais da exploração . equinos naturalmente infectados em pastoreio em que Os resultados ora apresentados permitem antever a se comprovou a eficácia do fungo Duddingtonia importância da implementação do controlo biológico flagrans na redução da contaminação da pastagem e no controlo integrado da estrongilidose intestinal dos da infecção dos hospedeiros. equídeos, atendendo a que é um método prático, A administração deste fungo deve ser entendida inovador e que pode ser facilmente conjugado com os como um complemento da desparasitação estratégica tratamentos clássicos. dos equinos e não como um substituto da adminis- tração de anti-helmínticos, que no nosso país pode ter grande aplicação durante a Primavera, Verão e Agradecimentos provavelmente no início do Outono, o que concorda com outros trabalhos efectuados em regiões e épocas Este trabalho foi financiado pela FCT e pelo do ano quentes e húmidas (Fernandéz et al ., 1997; CIISA/FMV/UTL (Projecto 8. Estrongilidose) e "Chr. Baudena et al ., 2000a). Hansen – Biosystems, A/S, Dinamarca". Para Waller (1999), o controlo sustentável das Agradece-se a "CHR HANSEN - BioSystems, A/S" parasitoses dos equídeos passa pela combinação de pelo seu interesse neste projecto e pelo fornecimento uma boa higiene da pastagem, maneio do pastoreio, de D. flagrans para os ensaios. uso sensato e racional dos anti-helmínticos e adopção Os nossos agradecimentos à Administração da de medidas de controlo biológico. Esta forma de Companhia das Lezírias, em particular ao Sr. Engº controlo permitirá o contacto dos equinos com um Francisco Perestrello, pela sua disponibilidade e baixo nível de contaminação na pastagem e a ingestão conhecimentos para nos providenciar os animais, de uma baixa concentração de L3, que funcionará um locais e instalações onde efectuámos os trabalhos. Ao estímulo antigénico constante e um estado imunitário Pessoal Auxiliar da CL pela colaboração inestimável de pré-munição, como sugerido por Urquart et al . no maneio e contenção dos animais durante as (1987). colheitas. Ao reduzir a contaminação do ambiente, diminui À Professora Doutora Isabel Neto do Deptº de a infecção dos hospedeiros e reduz o número de Sanidade Animal, FMV, agradecemos o apoio na 244 Madeira de Carvalho et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 233-247 análise estatística dos dados. Agradecemos também Chapman MR, French DD, Taylor HW, Klei TR (2002). One à Técnica Auxiliar Lídia Gomes, do sector de season of pasture exposure fails to induce a protective Parasitologia e Patologia e Clínica das Doenças resistance to cyathostomes but increases numbers of Parasitárias pela colaboração nos ensaios de campo e hypobiotic third-stage larvae. J Parasitol, 88: 678-683. no apoio técnico laboratorial. Uma palavra de apreço Fernández AS, Larsen M, Nansen P, Grønvold J, Henriksen SA, Wolstrup J (1997). Effect of the nematode-trapping a todos os estudantes do 3º e 4º Anos que de 1997 fungus Duddingtonia flagrans on the free-living stages a 1999 acompanharam os trabalhos de campo e de of horse parasitic nematodes: a pilot study. Vet Parasitol, laboratório, permitindo uma maior celeridade nos 73(3/4) : 257-266. processos e um ambiente salutar de troca de ideias Fernández AS, Larsen M, Wolstrup J, Grønvold J, Nansen P, relativas a este novo tipo de controlo anti-parasitário. Bjorn H (1999). Growth rate and trapping efficacy of A todos o nosso Bem Hajam! nematode-trapping fungi under constant and fluctuating Finalmente, uma palavra de agradecimento e home- temperatures. Parasitol Res, 85(8/9): 661-668. nagem ao Doutor Adrian Gillespie, Técnico Superior Grønvold J, Nansen P, Henriksen SA, Larsen M, Wolstrup J, da "Chr. Hansen – Biosystems, A/S, Dinamarca" e Bresciani J, Rawat H, Fribert L (1996). Induction of co-Autor do trabalho, mentor do projecto, grande traps by Ostertagia ostertagi larvae, chlamydospore entusiasta do controlo biológico das helmintoses production and growth rate in the nematode–trapping fungus Duddingtonia flagrans . J Helmint, 70: 291-297. gastrintestinais e acima de tudo um grande amigo, Grønvold J, Wolstrup J, Larsen M, Henriksen SA, Nansen P que infelizmente nos deixou em Setembro de 2003, (1993). Biological control of Ostertagia ostertagi by ficando todos nós que o conhecíamos, tristes e feeding selected nematode-trapping fungi to calves. J consternados, mas motivados para continuar o seu Helminthol, 67: 31-36. trabalho que tantos frutos e amizades deixou, para que Grønvold J, Wolstrup J, Nansen P, Henriksen SA, Larsen M, a sua passagem por esta vida não tenha sido em vão. Bresciani J (1993a). Biological control of nematode Muito Obrigado Adrian! parasites in cattle with nematode-trapping fungi: a survey of danish Studies. Vet Parasitol, Special Issue: Environmental impact of avermectin usage in livestock, 48(1/4): 311-325. Bibliografia Hutchinson GW, Abba SA, Mfitilodze MW (1989). Seasonal translation of equine strongyle infective larvae Araújo JV, Santos MA, Ferraz S (1995). Efeito de drogas to herbage in tropical Australia. Vet Parasitol, 33 (3-4): anti-helmínticas sobre o crescimento de fungos nematófa- 251-263. gos do gênero Arthrobotrys. Naturalia, São Paulo, 20: Jain NC (1993). Essentials of Veterinary Hematology. Lea e 157-163. Febiger, Philadelphia, USA, 1 st Edition, 417 pp. Arundel JH (1985). Parasitic Diseases of the Horse. Jorge H, Agrícola R, Madeira de Carvalho LM, Gillespie AT, Veterinary Review N°28, University of Sydney. The Barbosa M, Fazendeiro IM (2000). 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J Helminthol, 68: 175-180. 478. 247 RPCV (2007) 102 (563-564) 249-252 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Formas curtas de Demodex no cão – primeira descrição em Portugal Short-tailed forms of Demodex in the dog – first description in Portugal Ana Oliveira 1*, José P. Leitão 2, António J. Santos Grácio 3 e Isabel Pereira da Fonseca 4 1North Caroline State University, College of Veterinary Medicine, 4700 Hillsbouroug Street, Raleigh, NC 27606 2Clínica Veterinária da Cabra Figa, Rua da Liberdade 890, 2635-128, Rio de Mourol 3Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Rua da Junqueira, 96, 1349-008 Lisboa 4Parasitologia e Patologia das Doenças Parasitárias, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Av. Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa Resumo: Os ácaros da família Demodecidae, totalizando pelo Introdução menos 50 espécies, são frequentemente encontrados na pele dos mamíferos. Alguns mamíferos podem chegar a albergar até quatro espécies diferentes destes artrópodes. Demodex canis Os ácaros da família Demodecidae, totalizando pelo caracteriza-se por uma forma longa e afilada e encontra-se, em menos 50 espécies, são frequentemente encontrados pequeno número, na pele da maioria dos cães saudáveis. na pele dos mamíferos. Alguns mamíferos podem Raspagens cutâneas obtidas num canídeo com demodicose chegar a albergar até 4 espécies diferentes destes (vulgo demodecose) generalizada permitiram observar uma artrópodes (Chesney, 1999) que tendem a ser específicos população mista de ácaros do género Demodex . Esta população era constituída pela espécie Demodex canis e por outros ácaros em relação ao hospedeiro (Nutting, 1977). mais pequenos que apresentavam um opistossoma curto e arre- Demodex canis , a primeira espécie descrita no cão dondado. A média dos seus comprimentos foi de 135,5 µm para por Leydig (1859), caracteriza-se por uma forma o comprimento total, 24,5 µm para o comprimento do gnatosso- longa e afilada e encontra-se, em pequeno número, na ma, 57 µm para o podossoma e 51 µm para o opistossoma. pele da maioria dos cães saudáveis (Nutting, 1976). A Tanto quanto se conhece, este é o primeiro relato da existência de uma possível nova espécie em Portugal. Porém, com base transmissão ocorre da cadela para as crias, no período exclusivamente na observação em microscópio óptico, não se neo-natal, por contacto directo, não ocorrendo trans- pode excluir as possibilidades de se tratar de espécimes de D. missão intra-uterina (Scott, 2001). gatoi ou de eventuais ácaros de uma variedade de D. canis . Desch (2003) descreve uma nova espécie de Demodex parasita do canídeo doméstico. Esta espécie, Summary: Demodex mites are commonly found on mam- malian skin. The family Demodecidae is composed of at least denominada de D. injai , apresenta aproximadamente 50 species and some mammalian hosts can harbor up to four o dobro do comprimento do D. canis e presença do different species. Demodex canis is the species found on the orgão opistossomal no macho. skin of most healthy dogs and is characterized by an elongated Nos últimos anos, vários relatos referem a presença shape. de uma terceira espécie no cão (Mason, 1993; Skin scrapings taken from of a dog with generalized demodeco- sis revealed a mixed population of mites of the genus Demodex . Lemmens et al ., 1994; Chen, 1995; Chesney, 1999; This population was formed by Demodex canis species and Tamura et al ., 2001). Esta possível nova espécie apre- another unidentified Demodex mite, probably a new species. senta menores dimensões, formato mais arredondado Unlike D. canis these mites are shorter and have a stubby form. (Mason, 1993; Lemmens et al ., 1994; Tamura et al ., The mean body length was 135.5 µm, the gnathosome length 2001) e algumas diferenças morfológicas em relação a was 24.5 µm, the podosome length was 57 µm and the opisto- some length was 51 µm. D. canis (Chen, 1995; Chesney, 1999). To the best of our knowledge, this is the first description of the No presente artigo, a existência de formas curtas de identification of this possible new species in Portugal although, Demodex no cão é, pela primeira vez, descrita em because our study was based on light microscopy, is not possi- Portugal. ble to exclude that this are mites of D. gatoi or a variant of D. canis. Material e métodos Um cão de raça indeterminada, macho castrado, aproximadamente com 4 anos de idade foi apresenta- do à consulta para avaliação dermatológica. O animal *Correspondência: [email protected] tinha sido encontrado abandonado na região de 249 RPCV (2007) 102 (563-564) 249-252 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Formas curtas de Demodex no cão – primeira descrição em Portugal Short-tailed forms of Demodex in the dog – first description in Portugal Ana Oliveira 1*, José P. Leitão 2, António J. Santos Grácio 3 e Isabel Pereira da Fonseca 4 1North Caroline State University, College of Veterinary Medicine, 4700 Hillsbouroug Street, Raleigh, NC 27606 2Clínica Veterinária da Cabra Figa, Rua da Liberdade 890, 2635-128, Rio de Mourol 3Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Rua da Junqueira, 96, 1349-008 Lisboa 4Parasitologia e Patologia das Doenças Parasitárias, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária, Av. Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa Resumo: Os ácaros da família Demodecidae, totalizando pelo Introdução menos 50 espécies, são frequentemente encontrados na pele dos mamíferos. Alguns mamíferos podem chegar a albergar até quatro espécies diferentes destes artrópodes. Demodex canis Os ácaros da família Demodecidae, totalizando pelo caracteriza-se por uma forma longa e afilada e encontra-se, em menos 50 espécies, são frequentemente encontrados pequeno número, na pele da maioria dos cães saudáveis. na pele dos mamíferos. Alguns mamíferos podem Raspagens cutâneas obtidas num canídeo com demodicose chegar a albergar até 4 espécies diferentes destes (vulgo demodecose) generalizada permitiram observar uma artrópodes (Chesney, 1999) que tendem a ser específicos população mista de ácaros do género Demodex . Esta população era constituída pela espécie Demodex canis e por outros ácaros em relação ao hospedeiro (Nutting, 1977). mais pequenos que apresentavam um opistossoma curto e arre- Demodex canis , a primeira espécie descrita no cão dondado. A média dos seus comprimentos foi de 135,5 µm para por Leydig (1859), caracteriza-se por uma forma o comprimento total, 24,5 µm para o comprimento do gnatosso- longa e afilada e encontra-se, em pequeno número, na ma, 57 µm para o podossoma e 51 µm para o opistossoma. pele da maioria dos cães saudáveis (Nutting, 1976). A Tanto quanto se conhece, este é o primeiro relato da existência de uma possível nova espécie em Portugal. Porém, com base transmissão ocorre da cadela para as crias, no período exclusivamente na observação em microscópio óptico, não se neo-natal, por contacto directo, não ocorrendo trans- pode excluir as possibilidades de se tratar de espécimes de D. missão intra-uterina (Scott, 2001). gatoi ou de eventuais ácaros de uma variedade de D. canis . Desch (2003) descreve uma nova espécie de Demodex parasita do canídeo doméstico. Esta espécie, Summary: Demodex mites are commonly found on mam- malian skin. The family Demodecidae is composed of at least denominada de D. injai , apresenta aproximadamente 50 species and some mammalian hosts can harbor up to four o dobro do comprimento do D. canis e presença do different species. Demodex canis is the species found on the orgão opistossomal no macho. skin of most healthy dogs and is characterized by an elongated Nos últimos anos, vários relatos referem a presença shape. de uma terceira espécie no cão (Mason, 1993; Skin scrapings taken from of a dog with generalized demodeco- sis revealed a mixed population of mites of the genus Demodex . Lemmens et al ., 1994; Chen, 1995; Chesney, 1999; This population was formed by Demodex canis species and Tamura et al ., 2001). Esta possível nova espécie apre- another unidentified Demodex mite, probably a new species. senta menores dimensões, formato mais arredondado Unlike D. canis these mites are shorter and have a stubby form. (Mason, 1993; Lemmens et al ., 1994; Tamura et al ., The mean body length was 135.5 µm, the gnathosome length 2001) e algumas diferenças morfológicas em relação a was 24.5 µm, the podosome length was 57 µm and the opisto- some length was 51 µm. D. canis (Chen, 1995; Chesney, 1999). To the best of our knowledge, this is the first description of the No presente artigo, a existência de formas curtas de identification of this possible new species in Portugal although, Demodex no cão é, pela primeira vez, descrita em because our study was based on light microscopy, is not possi- Portugal. ble to exclude that this are mites of D. gatoi or a variant of D. canis. Material e métodos Um cão de raça indeterminada, macho castrado, aproximadamente com 4 anos de idade foi apresenta- do à consulta para avaliação dermatológica. O animal *Correspondência: [email protected] tinha sido encontrado abandonado na região de 249 Oliveira A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 249-252 Lisboa, desconhecendo-se, portanto, anterior contacto mais arredondados podem ser observadas na Figura 2a com gatos ou com hamsters. e 2b. Na Figura 3 observam-se exemplares de D. canis . Na consulta foi elaborada a história pregressa, o A proporção entre as formas de ácaros da possível exame físico e várias raspagens cutâneas profundas, nova espécie e de D. canis foi de 16% (8/50). As obtidas com bisturi, na região da cabeça, pescoço, medições efectuadas estão descritas na Tabela 1. dorso, ventre e membros. O material recolhido foi O canídeo foi tratado com ivermectina via oral na observado em microscópio óptico nas ampliações de dosagem de 600 µg/kg/dia (Muller, 2004) durante 8 100 ×, 200 × e 400 ×, a seco e, após montagem, em meses, o que resultou na remissão da doença. meio de Hoyer, seguindo-se a sua mensuração. Para a distinção entre as formas de D. canis e da possível nova espécie de Demodex , efectuaram-se as seguintes medições: comprimento total, comprimento do gnatossoma, do podossoma e do opistossoma. Houve especial cuidado em não confundir as formas de D. canis que apresentavam contracção do abdómen, com as formas menores. Figura 2a e 2b - Ácaros com forma mais curta e opistossomas mais arredondados, vistos ventralmente. Resultados O exame físico revelou eritema, alopecia, seborreia oleosa, hiperpigmentação e liquenificação da pele de todo o corpo, principalmente da cabeça, pavilhões auriculares, pescoço e membros (Figura 1). As lesões eram acompanhadas de prurido moderado. Ao canídeo foi diagnosticada demodicose generali- zada e observaram-se, nas raspagens cutâneas, dois Figura 3 - Exemplares de D. canis , fêmeas (3a) e machos (3b). tipos morfológicos de ácaros do género Demodex . Algumas das formas mais curtas e com opistossomas Discussão A demodicose canina é uma doença parasitária da pele do cão causada pela proliferação de ácaros do género Demodex . Caracteriza-se, clinicamente, por eritema e alopecia sendo desencadeada por alterações genéticas ou imunológicas (Scott, 2001). No caso descrito, foi encontrada uma população mista de ácaros da espécie D. canis e formas curtas de Demodex , com predomínio da primeira, conforme mencionado por outros autores (Mason, 1993; Chen, 1995; Chesney, 1999). Estas formas curtas podem ser ácaros de uma variedade diferente de D. canis , espécimes de D. gatoi ou hipotéticos representates de uma nova espécie. As dimensões por nós encontradas para a possível Figura 1 - Presença de alopecia e hiperpigmentação cutânea. nova espécie são similares às descritas por outros Tabela 1 - Valores obtidos para o comprimento total e diferentes partes do corpo de Demodex sp.n. e D. canis . Na tabela apresentam- se a média, o desvio padrão e os valores mínimo e máximo para cada parâmetro. Comprimento total Comprimento do Comprimento do Comprimento do (µm) gnatossoma (µm) podossoma (µm) opistossoma (µm) Demodex sp.n. 135,5 + 6,3 24,5 + 0,6 57,0 + 3,8 51,0 + 5 (120,0-145,0) (22,5-25,0) (50,0-65,0) (40,0-60,0) Machos de D. canis 148,6 + 11,8 22,5 + 1,3 63,1 + 8 63,0 + 6,2 (123,0-170,0) (20,0-25,0) (48,0-80,0) (55,0-80,0) Fêmeas de D. canis 215,5 + 14,4 20,0 + 1,3 62,5 + 1,3 133,0 + 10 (177,5-235,0) (17,5-22,5) (60,0-65,0) (100,0-140,0) 250 Oliveira A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 249-252 autores. Chesney (1999) refere médias de 122,6 ±12,0 já descrita no Reino Unido (Scarf, 1988, Chesney, µm para o comprimento total, 19±2,6 µm para o 1999), Austrália (Mason, 1993), Bélgica (Lemmens gnatossoma, 56,3±8,0 µm para o podossoma e et al ., 1994), China (Chen, 1995), Grécia (Sarido- 47,2±9,2 µm para o opistossoma. De igual modo, michelakis et al ., 1999) e Japão (Tamura et al ., 2001). Tamura et al . (2001) apontam valores de 139,0±21,6 Ao contrário de D. canis , um ácaro dos folículos µm para o comprimento total, 18,0-25,7 µm para o pilosos e raramente das glândulas sebáceas (Scott, gnatossoma, 21,4-82,9 µm para o podossoma e 2001), a nova forma parece habitar o estrato córneo 56,4±10,3 µm para o opistossoma. No entanto, os da pele. Inicialmente proposta por Mason (1993) nossos valores diferem dos referidos por esta hipótese ganha fundamento com as seguintes Saridomichelakis et al . (1999), que observaram para observações: em dois casos descritos por Sarido- o comprimento total 165±19 µm e 80±18 µm para michelakis et al . (1999) as raspagens superficiais o opistossoma, não referindo medidas para o gnatos- apresentaram mais espécimes que as raspagens pro- soma e para o podossoma. fundas; a avaliação histopatológica de biópsias Segundo Nutting e Desch (1977) as dimensões dos cutâneas efectuadas em cães com parasitémia mista ácaros D. canis são de 168±5,3 µm para o compri- demonstraram a existência de ácaros do género mento total do macho e 224,3±18,3 µm para a fêmea, Demodex no estrato córneo da pele (Saridomichelakis para o gnatossoma do macho 20,4±1,9 µm e 24±2,0 et al ., 1999; Chesney, 1999). µm para a fêmea, para o podossoma do macho Em nossa opinião, esta possível nova espécie, pela 55,8±5,2 µm e 63,9±3,7 µm para a fêmea e para o primeira vez referida em Portugal, diferencia-se da opistossoma 91,6±3,9 µm no macho e 135,9±17,7 µm espécie D. canis devido ao menor comprimento do na fêmea. corpo, em particular do opistossoma, e ao formato Scott et al . (1995) sugerem que esta nova forma arredondado deste, em oposição à forma alongada e pudesse ser uma mutação de D. canis . Chesney (1999) afilada do de D. canis . No entanto não se podem comparou esta possível nova espécie a Demodex excluir as possibilidades de estas formas curtas serem gatoi , parasita da superfície da pele do gato e ácaros de uma variedade diferente de D. canis ou Saridomichelakis et al . (1999) a Demodex criceti , espécimes de D. gatoi . parasita das depressões epidérmicas da pele do No entanto, é nossa intenção continuar estes hamster, ambos caracterizados pela sua forma curta e estudos, recorrendo à microscopia electrónica de abdómen arredondado (Nutting, 1958; Desch e varrimento e a técnicas de diagnóstico molecular, de Stewart, 1999). Alguns estudos sugerem a hipótese de forma a confirmar ou não a existência de uma nova os ácaros encontrados nos cães serem na verdade espécie e averiguar as implicações desta na patogenia formas de D. gatoi ou D. criceti , embora em alguns de demodicose canina e no seu tratamento. casos não tenha havido contacto directo com gatos ou hamsters (Mason, 1993; Saridomichelakis et al ., 1999). O facto do género Demodex ser altamente Agradecimentos específico em relação ao hospedeiro não contribui para o possível contágio de cães por gatos ou hamsters À Profª. Doutora Isabel Fazendeiro pelas sugestões (Nutting, 1977). e facilidades na utilização do Laboratório de Prestação Entretanto, Tamura et al . (2001), face à diferente de Serviços de Doenças Parasitárias da Faculdade de conformação do opistossoma e à configuração e Medicina Veterinária de Lisboa. localização do poro genital, entre D. canis e a nova forma, sugerem que estejamos perante uma nova espécie. Além disso, através da microscopia Bibliografia electrónica encontraram outras diferenças estruturais Chen C (1995). A short-tailed demodectic mite and em relação a D. canis : a forma da quarta placa Demodex canis infestation in Chihuahua dog. Vet coxoesternal é quase rectangular na nova espécie e Dermatol, 6: 227-229. trapezoidal na espécie D. canis ; a presença exclusiva Chesney CJ (1999). Short form of Demodex species mite in de uma placa, em forma de banda, que divide o the dog: occurrence and measurements. J Small Anim podossoma do opistossoma na possível nova espécie; Pract, 40: 58-61. a localização e a forma da abertura do poro genital, Desch CE e Stewart TB (1999). Demodex gatoi : New vertical e acima da placa em forma de banda na species of hair follicle mite ( Acari: Demodecidae ) from possível nova espécie, arredondada e imediatamente the domestic cat ( Carnivora: Felidae ). J Med Entomol, abaixo da quarta placa coxoesternal no caso de D. 36: 167-170. canis . Os machos desta espécie apresentam corpos Desch CE e Hillier A (2003). Demodex injai : a new species of hair follicle mite ( Acari: Demodecidae ) from the mais curtos que os de D. canis e não foram encon- domestic dog ( Canidae ). J Med Entomol, 40: 146-149. tradas formas imaturas no estudo acima referido Lemmens P, Schrauwen E e Rooster H (1994). An (Tamura, 2002, com. pessoal). uncommon species of Demodex in a dog. Vlaams Esta possível nova espécie é cosmopolita tendo sido Diergeneeskundig Tijdschririft, 63: 19-21. 251 Oliveira A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 249-252 Leydig F (1859). Ueber Haarsackmilben und Krätzmilben. Nutting WB e Rauch H (1958). Demodex criceti n. sp. Arch. Natur . Berlin, 1: 338-354 Apud Nutting, W.B. e (Acarina: Demodicidae ) with notes on its biology. J Desch, C.E. (1977). Parasitol, 44: 328-333. Mason KV (1993). A new species of Demodex mite with Saridomichelakis M, Koutinas E, Papadogiannakis M, D. canis causing demodecosis. In: Proceedings of the Papazachariadou M, Liapi M e Trakas D (1999). Adult- Annual Member´s Meeting of the American Academy of onset demodecosis in two dogs due to Demodex mites Veterinary Dermatology and the American College of and a short-tailed demodetic mite. J Small Anim Pract, Veterinary Dermatology. AAVD and ACVD Meeting, 40: 529-532. San Diego, 92 (abstract). Scarff D (1988). Morphological differences in Demodex Muller RS (2004). Treatment protocols for demodicosis: an spp. In: Proocedings of the Fifth Annual Congress of the evidence-based review. Vet Dermatol, 15: 75-89. European Society of Veterinary Dermatology. ECVD- Nutting WB (1976). Hair follicle mites ( Demodex spp.) of -ESVD, London, 23. medical and veterinary concern. Corn Vet, 66: 214. Scott DW, Miller WH e Griffin CE (2001). Muller and Nutting WB (1983). Biology and pathology of hair follicle Kirk´s Small Animal Dermatology. 6ª Ed. W.B. mites (Demodecidae). 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Corn Vet, 68: 139-149. 252 RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Cytomorphological characterization of transmissible canine venereal tumor Caracterização citomorfológica do tumor venéreo transmissível canino Anne Santos do Amaral, Sandra Bassani-Silva*, Isabelle Ferreira, Luciano Santos da Fonseca, Fabio Henrique Evangelista de Andrade, Luiz Fernando Jantzen Gaspar, Noeme Sousa Rocha Department of Clinical Veterinary Medicine, Animal Pathology Service, Faculty of Veterinary Medicine and Zootechny, Botucatu, SP, 18618-000, Brazil Summary: Canine transmissible venereal tumor (TVT) has método de escolha para o diagnóstico de suspeitas de TVT, pois been the object of numerous investigations since 1876, when é uma técnica simples, minimamente invasiva e indolor e, além Novinsky reported the first successful experimental transplant disso, produz muito menos distorção da morfologia celular of a tumor using this neoplasia. Cytology must be the method of do que as amostras de biópsia fixadas por formalina. Mohanty choice for the diagnosis of suspected TVT, since it is a simple e Rajya (1977) descreveram que células de TVT in vitro technique, minimally invasive and painless and, furthermore, apresentaram-se sob dois tipos morfologicamente distintos. A produces much less distortion of cell morphology than biopsy classificação do TVT baseada na morfologia celular é adotada samples fixed in formalin. Mohanty and Rajya (1977) described pelo Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ-UNESP, that TVT cells in vitro presented two morphologically distinct Botucatu, Brasil, desde 1994. Porém ainda não havia trabalho types. The classification of TVT based on cell morphology has consolidando a utilização desta classificação no TVT. Como been adopted by the Veterinary Pathology Service of FMVZ- morfologia e função são duas características intimamente UNESP, Botucatu, Brazil, since 1994. However, there still is no relacionadas e as diferenças morfológicas devem ser sempre study consolidating the utilization of this classification in TVT. investigadas de modo que um tratamento adequado seja empre- As the morphology and function are two intimately related gado e como já se afirma existirem 2 subtipos de TVT, este characteristics and morphological differences must always be artigo visa padronizar a nova nomenclatura do TVT em todo o investigated such that adequate treatment would be employed mundo. Para tal, foram utilizados 132 cães sem restrição de and, as the existence of two TVT subtypes has already been sexo, idade ou raça, com diagnóstico clínico e citológico de affirmed, this article aims to standardize a new international tumor venéreo transmissível (TVT), atendidos no Hospital TVT nomenclature. To this end, one hundred and thirty-two Veterinário da FMVZ-UNESP, Botucatu, Brasil. A localização dogs were utilized - without restriction as to sex, age or breed - mais frequente foi a genital, seguida pela nasal; 25,2% dos with cytological and clinical diagnoses of transmissible venereal pacientes apresentavam metástases. Estas ocorreram mais tumor (TVT) attended to at the Veterinary Hospital of FMVZ- frequentemente na pele (31% das metástases), seguida pela UNESP, Botucatu, Brazil. The most frequent localization was localização mamária, em fêmeas, e em linfonodos, nos machos. genital, followed by nasal; 25.2% of patients presented metas- Foram colhidas amostras de 158 tumores para avaliação tases. These occurred most frequently on the skin (31% of citológica por microscopia ótica. As massas foram avaliadas de metastases), followed by mammary localization in females and acordo com a localização, em genitais ou extragenitais, e com o lymph nodes in males. Samples were collected from 158 tumors comportamento biológico, em primárias e não primárias for cytological evaluation by optical microscope. The masses (metastáticas ou recorrentes). A avaliação citológica incluiu a were evaluated according to localization, either genital or extra- classificação de acordo com o padrão morfológico predomi- genital, and biological behavior, in primary or non-primary ones nante, em linfocitóide (18,36%), plasmocitóide (52,53%) ou (metastatic or recurrent). The cytological evaluation included misto (29,11%). As amostras extragenitais e não primárias foram classification according to the predominant morphological predominantemente do padrão plasmocitóide. Os resultados pattern: lymphocytic (18.36%), plasmacytic (52.53%) or mixed encontrados permitem concluir que as diferenças morfológicas (29.11%). The extragenital and non-primary samples presented nas células do tumor venéreo transmissível estão relacionadas a predominantly a plasmacytic pattern. The results permited the um comportamento biológico mais agressivo do padrão plasmo- conclusion that the morphological differences in transmissible- citóide, quanto à sua capacidade de se desenvolver em locais -venereal-tumor cells are related to more aggressive biological extragenitais e metastatizar. behavior in the plasmacytic pattern, by its capacity to develop in extragenital locations and metastasize. Introduction Resumo: O tumor venéreo transmissível (TVT) canino tem sido objeto de numerosas investigações desde 1876, quando Novinsky relatou o sucesso do primeiro transplante experimental Canine transmissible venereal tumor (TVT) has de um tumor usando esta neoplasia. A citologia deve ser o been the object of numerous investigations since 1876, when Novinsky reported the first successful experimen- *Correspondência: [email protected] tal transplant of a tumor using this neoplasia (Cohen, Fax: + 55 14 3811-6293 1978; Murgia et al ., 2006). This tumor is transmitted 253 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 by implantation of viable tumor cells in mucous shown to be efficient and conclusive in diagnosing membrane, especially if there are abrasions or loss of this neoplasia (Amaral et al . 2004). integrity on the surface (Cohen, 1978; Rogers, 1997; Cytological samples of TVT are generally multicel- Murgia et al ., 2006). lular and contain round or oval cells that vary between Naturally occurring TVT generally develops in the 14 and 30 µ in diameter, with well-delimited cytoplas- external genitalia (Otomo et al ., 1981; Rogers et al ., mic borders. The nucleus, round or oval, is frequently 1998; Amaral et al ., 2004). Despite this, TVT occurs eccentric, of variable size, with rough and granular in the nasal and / or oral cavity, skin and conjunctive chromatin and with one or two prominent nucleoli mucosa, occurring together (Hamir, 1985; Varaschin (Wellman, 1990). The nucleus:cytoplasm ratio is et al ., 2001; Amaral et al ., 2004) or not (Bright et al ., relatively high (Boscos et al ., 1999). Until 2003, the 1983) with genital TVT, probably as a consequence of literature on transmissible venereal tumor, of natural social behaviors (Cohen, 1985; Amber e Adeyanju, occurrence or transplanted experimentally, had not 1986; Pérez et al ., 1994; Ginel et al ., 1995). reported on different cell types, despite descriptions The primary ocular masses develop from conjunctiva, found supporting these differences, including: the as reported by Boscos et al . (1998) and in nasal cases, absence of cytoplasmic vacuoles (Rogers, 1997) and may originate from another dog or as a result of auto- the presence of larger and more ovoid cells in relation -implanting starting from a genital mass (Miller et al ., to the typical TVT cell morphology (Boscos et al ., 1990; Pereira et al ., 2000; Rodrigues et al ., 2001). 1999). Varaschin et al . (2001) registered malignant Batamuzi and Bittegeko (1991) reported one case of TVTs presenting abundant cytoplasm. This morpholo- anal and genital TVT, assuming that the anal implant gy corresponds to plasmacytic TVT that, in studies was possible due to the existence of a generalized accomplished by our research group, were shown to cutaneous allergic process that could have produced be more aggressive than the lymphocytic form perianal inoculation of neoplasic cells by the associa- (Amaral, 2005; Gaspar, 2005; Bassani-Silva, 2007). tion of itching with injured skin. Many times the cellular aspect can vary between the The presence of metastases in naturally occurring primary tumor and the metastasis (Rogers, 1997; TVT suggests an estimated rate between 1.5 and 6%, Boscos et al ., 1999), or can be atypical in cases of old according to Ferreira et al . (2000), or from 0 to 17%, tumors (Boscos et al ., 1999). Furthermore, Mohanty according to Rogers (1997) and MacEwen (2001). and Rajya (1977) described how TVT cells in vitro TVT can present metastases in multiple organs, presented two morphologically distinct types: one, including subcutaneous ones, or in the lung, anterior small cells with round to oval nucleus; and the mediastinum, liver, spleen, kidneys and in superficial other, large cells with hyperchromatic nucleus and and deep lymph nodes of the thoracic and abdominal acidophilic cytoplasm. In 2003, Bassani-Silva et al . cavity (Park et al ., 2006), as well as in the tongue, had already reported the existence of varied degrees of pharynx (Ndiritu et al ., 1977), adenohypophysis aggressiveness, due to different cell lineages of TVT, (Manning and Martin, 1970) and even the brain with variable biological behavior. This existence of (Kroger et al ., 1991; Ferreira et al ., 2000). different TVT cell lineages was confirmed by Murgia Independent from the malignant potential of this et al . (2006) who, analyzing an amplified mitochondrial neoplasia, TVT is singular in its responsiveness to a DNA fragment, observed differences in the sequence variety of treatments (Rogers, 1997). Among the between the tumors and, therefore, that the ancestral various modalities of treatment, chemotherapy is clone of the tumor is divided into two subclasses, each accepted as the most effective (Erünal-Maral et al ., of which is distributed among many countries. 2000). A therapy with vincristine sulfate as the only Associated with modifications in morphology is the agent, in weekly applications, is the most effective fact that old tumors do not respond well to chem protocol, with four to eight intravenous applications otherapy (Boscos et al ., 1999), which is more effective being necessary to obtain a cure (Erünal-Maral et al ., the earlier the diagnosis (Pérez et al ., 1994). One 2000). In tumors resistant to vincristine, the drug of hypothesis is the existence of different TVT cell choice is doxorubicin (Rogers, 1997). lineages, characteristics that would influence their Cytology must be the method of choice for diagnosis biological behavior, such as the ability to produce of suspected TVT, since the technique is simple, cheap, erythropoietin or to metastasize (Rogers et al ., 1998). minimally invasive, and painless and, furthermore, The Veterinary Pathology Service of FMVZ- produces much less distortion of cell morphology than UNESP, Botucatu, Brazil, since 1994, has employed biopsy samples fixed in formalin (Daleck et al . 1987; a TVT classification based on cell morphology Erünal-Maral et al ., 2000; Bassani-Silva et al ., 2003; (Bassani-Silva et al ., 2003; Amaral et al ., 2004). This Amaral et al ., 2004). This exam has been used widely adopted classification resulted from the hypothesis of in diagnosis of TVT. Even in masses localized the existence of different TVT cell lineages with extragenitally (principally when there is necessity of respect to characteristics that influence its biological imaging for diagnosis), and that do not include TVT as behavior, suggesting that this neoplasia presents a differential diagnosis, the cytological exam was various degrees of aggressiveness, since TVTs of 254 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 plasmacytic morphology presented higher frequency the size of the tumor to be aspirated. In cases in which of nuclear abnormalities, associated with greater visualization of the genital mass was not possible, as expression of glycoprotein-P and augmented resistance well as in cases of intranasal masses, a gynecological to antitumoral action of propolis with almost all cases brush was used for collection of cells. In some cases of metastasis being of the plasmacytic type. In this tumoral fragments were loosened during clinical exam context, it is concluded that this type is more aggres- and were utilized to make cytological preparations by sive, in other words, more malignant compared to the impression technique. those of lymphocytic or mixed morphologies (Amaral, Cytological preparations were analyzed under opti- 2005; Gaspar, 2005 Bassani-Silva, 2007). cal microscope to be selected for the tumors specific Many authors utilize the classification of TVT into experimental groups, according to the characteristics atypical and typical, although this classification does of the predominant cell type, in the following manner: not appear adequate, since it is known that there are o Group L (Lymphocytic): predominance of 60% or differences in the prevalence of a determinate cell type more of TVT cells with round morphology, scarce and according to the region studied. In the southeastern finely granular cytoplasm, with the presence of vacuoles region of Brazil the predominant TVT is plasmacytic tracking the cell periphery, round nucleus with rough (Amaral et al ., 2004) while the southern region of the chromatin and the presence of one or two salient country TVT of lymphocytic morphology predomi- nucleoli (Figure 1A). nates (non-published data). • Group P (Plasmacytic): predominance of 60% or Although the classification of TVT based on cell more of TVT cells with ovoid morphology, more morphology has been employed by the Veterinary abundant cytoplasm (lower nucleus:cytoplasm ratio), Pathology Service of FMVZ-UNESP, Botucatu, with eccentrically located nucleus (Fig 1B). Brazil, since 1994, there is still no work consolidating • Group M (Mixed): mixed cellularity between the utilization of this TVT classification. As lymphocytic and plasmacytic cell types, in which none morphology and function are two intimately related surpassed 59% of the total. characteristics (Wilkening et al ., 2003) and morpho- The cytological preparations were evaluated initially logical differences must always be investigated in a with 10x objective for verification of cellularity of the manner to ensure that adequate treatment is employed, sample, pattern of coloration and distribution of cells. and as Murgia et al . (2006) have already affirmed the Next observations were made at progressive increases existence of two subclasses, the present article aims to amplification from of 250x to 400x to detail cell standardize the utilization of a new nomenclature for characteristics and to count the cells. After initial TVT throughout the world. scanning, the areas with the best pattern of cellular distribution and coloration were analyzed at 400x, with a minimum of ten random non-superimposed Material and methods fields counted on each slide to obtain classification of predominant cell type. Carefully detailed cytomor- The present study was approved by the Chamber of phological analysis was accomplished with the aid of Ethics in Animal Experimentation of FMVZ-UNESP, a reticulated glass (grade of integration 100/25, with campus at Botucatu, Brazil. In its development, 132 25 mm 2 area), which delimited the cell-count field. At dogs were utilized without restriction as to sex, age least 100 cells were counted from each sample; the or breed, with cytological and clinical diagnosis cells selected were categorized according to morpho- of transmissible venereal tumor, attended at the logy in lymphocytics or plasmacytics. Veterinary Hospital of FMVZ-UNESP. The inclusion of patients was conditional in requiring free and informed consent of the dog owners. Figure 1 - Cytomorphological scheme of transmissible canine Each tumoral mass was classified according to its venereal tumor types: lymphocytic ( A) and plasmacytic ( B) localization (as genital or extragenital ) and biological behavior (as primary , metastatic or recurrent ), which were considered the experimental units. In dogs with confirmed diagnosis of transmissible venereal tumor, samples were collected from 158 tumoral masses by aspirative cytology with a fine needle (CAAF), as described by Cowel and Tyler (1989), to make cytological preparations utilized for cytomorphological characterization. Two slides of each tumoral mass were left to dry in the open air, fixed in methanol and colored by the method of Giemsa. A 24 3/4G caliber needle was utilized independent of 255 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 Table 1 - Classification of neoplasic mass samples, based on localization and biological behavior CLASSIFICATION OF NEOPLASIC MASSES TOTAL LOCALIZATION Genital Extragenital n (%) 120 (63.8%) 68 (36.2%) 188 BIOLOGICAL BEHAVIOR Primary Metastatic Recurrent n (%) 121 (64.4%) 55 (25.2%) 12 (6.4%) 188 Table 2 - Frequency of neoplasic masses of lymphocytic, mixed and plasmacytic groups, according to localization LOCALIZATION GENITAL EXTRAGENITAL TOTAL GROUP n % n % n % LYMPHOCYTIC 26 a 89.7 03 10.3 29 100 MIXED 34a b 73.9 12 26.1 46 100 PLASMACYTIC 49 b 59.0 34 41.0 83 100 TOTAL 109 – 49 – 158 – a, b Different letters represent significant difference among groups by the test of Goodman (p=0.05) Data were analyzed at the Department of Biostatistics Figure 2 - Cytological samples of transmissible venereal tumor in the Institute of Biosciences of UNESP – Campus at of different cytomorphological types: A. lymphocytic pattern (predominance of round cells, scarce cytoplasm and high nucle- Botucatu, Sao Paulo, Brazil. us:cytoplasm ratio); B. plasmacytic pattern (predominance of For comparison between the morphology of TVT ovoid cells, ample cytoplasm and eccentric nucleus); C. mixed cells and the localization of the tumor (genital or pattern (presence of both morphological types without predom- extragenital) and biological behavior (primary or inance of either ). Giemsa, bar = 20µm non-primary masses), association tests were utilized, based on the Chi Square statistic (Zar, 1996). Results Approximately two thirds of the tumors were primary and of genital localization (63.8% and 64.4%, respectively), with only 6.4% recurrent and 25.2% metastatic (Table 1). The cytological preparations were analyzed and included in one of the experimental groups, defined as L, M or P, described previously. Lymphocytic cells tended to be smaller than plasmacytic ones. The plasmacytic pattern was the most frequent, with 52.53% of cases, followed by mixed (29.11%) and, finally, lymphocytic (18.36%). Figure 2 illustrates cytological sample characteristics of each group. Frequency comparisons of tumors in the three groups (L, P, M) with localization and biological behavior are presented in Tables 2 and 3. These data were analyzed by statistical tests based on Chi Square (χ2), with application of the Goodman test for com- parison of multi-nominal proportions. Significant difference was detected among groups in comparison between localization genital and extragenital (Table 2, Figure 3) and between categories of biological behavior (Table 3). Of the tumors with genital localization, the lymphocytic group presented a concentration of 82.76%, while in the mixed group, this number was reduced to 76.09% and, in the plasmacytic group, reduced even more, down to 62.65%. In relation to biological behavior, there also was significant difference between groups. To perform 256 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 Table 3 - Frequency of neoplasic masses of lymphocytic, mixed and plasmacytic groups, between primary and non-primary tumors (metastatic or recurrent) BIOLOGICAL BEHAVIOR PRIMARY NON-PRIMARY TOTAL GROUP n % n % n % LYMPHOCYTIC 26 a 89.7 03 10.3 29 100 MIXED 34a b 73.9 12 26.1 46 100 PLASMACYTIC 49 b 59.0 34 41.0 83 100 TOTAL 109 – 49 – 158 – a, b Different letters represent significant difference among groups by the test of Goodman (p=0.006) Table 4 - Frequency of lymphocytic and plasmacytic cells in cytological samples of transmissible venereal tumor according to localization and biological behavior of the tumor LOCALIZATION LYMPHOCYTIC CELLS PLASMACYTIC CELLS MEDIAN (%) P 25 (%) P 75 (%) p MEDIAN (%) P 25 (%) P 75 (%) p GENITAL 42 a 32.25 55.00 0.05 59 a 45.0 67.75 0.06 EXTRAGENITAL 38 b 31.00 46.50 62 a 53.5 69.00 BIOLOGICAL BEHAVIOR LYMPHOCYTIC CELLS PLASMACYTIC CELLS MEDIAN (%) P25 (%) P75 (%) p MEDIAN (%) P 25 (%) P 75 (%) p PRIMARY 42 a 33.75 57.25 0.005 58 a 42.75 66.25 0.006 NON-PRIMARY 37 b 30.75 42.25 63 b 57.75 69.25 a, b Different letters represent significant difference by the test of Mann-Whitney statistical analysis, the metastatic and recurrent masses Discussion were grouped as non-primary masses to increase the homogeneity between categories. In the lymphocytic Genital tumors were the most frequent, comprising group only 10.3% were non-primary masses, a 63.8% of the cases. The cases of nasal, ocular, anal frequency that rose to 26.1% in tumors of the mixed and subcutaneous TVT were considered primary due cytomorphological group and to 41% in tumors of the to transmission by cellular implant. This casuistry plasmacytic group. Table 3 and Figure 4 present these is similar to that reported by Weir et al . (1978), data in detail. Batamuzi and Bittegeko (1991), Ginel et al . (1995) Analysis of percentages of lymphocytic and plasma- and Rogers et al . (1998). cytic cells, according to tumor localization and A total of 33 patients in the study (25%), presented biological behavior, revealed significant differences dissemination of primary tumor, a value slightly higher – lymphocytic cells showed predominance in genital than has been reported, varying between 0 and 17% in masses compared to extragenital ones, and of plasma- naturally occurring cases (Rogers, 1997; MacEwen, cytic cells in non-primary tumors compared to 2001). primary ones. These observations are found in Table 4. The most frequent metastatic form was subcutaneous, Figure 3 - Frequency of genitally and extragenitally localized Figure 4 - Frequency of neoplasic masses of the lymphocytic, tumors according to cytomorphological group. Distributions of mixed and plasmacytic groups between primary and non-pri- lymphocytic and plasmacytic groups differed statistically mary tumors (metastatic or recurrent) 257 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 with 13 cases (31% of metastases). A similar finding dence of 82.76% of genitally located tumors, while in was registered by Brandão et al . (2002), relating 127 the plasmacytic group, this number was reduced cases of TVT, of which 22 were cutaneous masses. to 62.65%; only 10.3% of the lymphocytic group The cutaneous metastases are well-described in the presented non-primary masses, versus 41% of plasma- literature consulted (Oduye et al ., 1973; Ndiritu et al ., cytic group tumors. In a descriptive study completed 1977; Pandey et al ., 1989; Miller et al ., 1990; Kroger by our research group, out of 576 cases of TVT there et al ., 1991; Ayyappan et al ., 1994; Guedes et al ., also was predominance of plasmacytic TVT type in 1996; Boscos et al ., 1999). In males, neoplasic genital and extragenital masses (Amaral et al ., 2004). invasion was observed most frequently in inguinal Mohanty and Rajya (1977) described the occurrence lymph nodes and, in females, in mammary tissue – in of two distinct morphological types of TVT cells in these locations there was a significant difference culture in vitro , one cell line composed of small cells between sexes. No reports of mammary transmissible with nucleus round to oval and vesicular, and the other venereal tumor were found in the literature, but one showing large cells with a large hyperchromatic metastasis in regional and distant lymph nodes is nucleus. Boscos et al . (1999) reported the presence of well-established (Oduye et al ., 1973; Ndiritu et al ., ovoid cells in cutaneous transmissible venereal tumor 1977; Yang, 1987; Ayyappan et al ., 1994; Rogers et – this description is highly similar to that of the al ., 1998; Das and Das, 2000). In cases evaluated in plasmacytic pattern, which in our findings was the present study metastases were verified in lymph significantly superior / greater, in the extragenital nodes in only two females (inguinal in one, internal masses, to the lymphocytic pattern, which is closer to iliac in the other), while nine males presented metas- the morphology usually described for neoplasia. tases in inguinal lymph nodes. This distribution As the cutoff point for the number of cells for appears to be related to lymphatic drainage of the inclusion in groups was relatively arbitrary, in addition external genitalia, done exclusively to the inguinal to the comparison among cytomorphological groups, lymph nodes in males, and to inguinal lymph nodes a statistical analysis was performed on percentages of and iliac internal ones in females. The linking of dis- lymphocytics and plasmacytics cells versus tumor tribution of metastases with differences in lymphatic localization and biological behavior. This analysis draining in the two sexes was proposed by Oduye et al . revealed significant differences – there is predomi- (1973). As diagnostic exams by abdominal imaging nance of lymphocytics cells in genital masses were not performed in all cases, it is possible that a (median: 42 cells) when compared to extragenital ones greater number of females would present metastases (median: 38), and in the primary masses (median: 42 in the internal iliac lymph node. The neoplasic cells, in cells) compared to non-primary (median: 37 cells). some manner, were able to bypass the inguinal lymph Plasmacytics cells presented a median significantly nodes and fix in the mammary tissue. higher in non-primary tumors (median: 63) compared Approximately two thirds of sampled tumors were to primary ones (median: 58 cells). These findings of genital and primary localization (63.8% and 64.4%, corroborate the previous analysis, and lead to the respectively), with only 6.4% recurrent and 25% belief that the limit established for the division of metastatic, according to TVT behavior, following groups was adequate. MacEwen (2001). These comparisons indicate the association between The use of cytological exam for diagnosis of neo- the plasmacytic phenotype with extragenital localiza- plasias of round cells was recommended by Duncan tion, with non-primary masses (metastases or recur- and Prasse in 1979, when these authors considered it rences) and with the capacity to develop metastases. more advantageous than the histopathological exam. Of all the masses analyzed, only two of extragenital Since then, the cytological exam has been recom- localization, metastatic, were encompassed in the mended as essential to diagnosis (Amaral et al ., 2004; lymphocytic group and only two cases of lymphocytic Meinkoth and Cowell, 2002) and monitoring of treat- primary morphology developed metastases – these ment (Batamuzi and Kessy, 1993; Erünal-Maral et al ., were from one of the other two groups (plasmacytic 2000) of transmissible venereal tumor, being widely and mixed). Confirming our observation, Rogers used. Brandão et al . (2002) reported that out of 127 (1997) emphasized that the primary and metastatic TVT cases, 94.6% were diagnosed by cytological masses cannot have identical cytological appearance. exam. Ferreira et al . and Pereira et al ., in 2000, described The most frequent cytomorphological pattern was cases of intraocular TVT in which the histological plasmacytic, comprising 52.53% of cases, followed by pattern was so "uncommon" that immunohistochemical mixed (29.11%) and, finally, lymphocytic (18.36%). A studies were necessary to confirm the diagnosis. Even statistically significant difference was detected though the description was generic, this uncommon between the lymphocytic and plasmacytic groups in pattern may be a plasmacytic-type manifestation. the comparison between localization (genital and Rogers et al . (1998) supposed the existence of different extragenital) and between categories of biological lineages of transmissible venereal tumor in relation to behavior. The lymphocytic group presented a inci- characteristics that influence biological behavior, such 258 Santos do Amaral A et al. RPCV (2007) 102 (563-564) 253-260 as ability to metastasize. Finally, corroborating our Batamuzi EK, Kessy BM (1993). Role of exfoliative findings is the study of Murgia et al . (2006), which cytology in the diagnosis of canine transmissible vene- confirms the existence of two subclasses of TVT. real tumour. J Small Anim Pract, 34: 399-401. Boscos CM, Tontis DK, Samartzi FC (1999). Cutaneous involvement of TVT in dogs: a report of two cases. Conclusions Canine Pract, 24(4): 6-11. Boscos CM, Veveridis HN, Tondis DK, Stamou FC, Samartzi FC (1998). Ocular involvement of transmissible Based on the findings obtained during the experi- venereal tumor in a dog. Vet Ophtahlmol, 1: 167-170. ment, we can conclude that: the cytomorphological Brandão CVS, Borges AG, Ranzani JJT, Rahal, SC, Teixeira characteristics of the different cell patterns of trans- CR, Rocha NS (2002). Tumor venéreo transmissível: missible venereal tumor permit a distinction between estudo retrospectivo de 127 casos (1998 - 2000). 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