Escola Politécnica da Universidade de São Paulo Departamento de Engenharia Química

Meriellen Dias

COMPARAÇÃO DO PERFIL PROTEÔMICO ATRAVÉS DA TÉCNICA DE

ESPECTROMETRIA DE MASSAS DOS FUNGOS Aspergillus niger E Rhizopus

microsporus SUBMETIDOS À ESTRESSE PELA ADIÇÃO DE COBRE

São Paulo, 2018 Meriellen Dias

COMPARAÇÃO DO PERFIL PROTEÔMICO ATRAVÉS DA TÉCNICA DE

ESPECTROMETRIA DE MASSAS DOS FUNGOS Aspergillus niger E Rhizopus

microsporus SUBMETIDOS À ESTRESSE PELA ADIÇÃO DE COBRE

Tese apresentada à Escola Politécnica da Universidade de São Paulo para obtenção do título de doutor em Ciências.

Área de Concentração: Engenharia Química

Orientador(a): Dra. Maria Anita Mendes

São Paulo, 2018 Escola Politécnica da Universidade de São Paulo - Departamento de Engenharia Química

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TRABALHO REALIZADO NO LABORATÓRIO DEMPSTER MS LAB DO DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA DA ESCOLA POLITÉCNICA DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO.

APOIO FINANCEIRO: FAPESP / VALE-BNDES / CAPES / CNPQ

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Dedicatória

Dedico essa conquista primeiramente aos meus pais Ademir e Maria Ida pelo apoio, incentivo e amor incondicional, ao meus irmãos Mastrangello e Maylla por estarem sempre ao meu lado. As minhas avós Auda (in memoriam) e Ozília por me ensinarem o verdadeiro significado da palavra família!

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AGRADECIMENTOS

À Deus pelo dom da vida, pela força para vencer cada obstáculo, mesmo enfrentando tantos percalços ao longo do caminho.

Aos meus pais Maria Ida Dipre Dias e Ademir Dipalma Dias pela oportunidade da vida, por todo apoio e amor incondicional, mesmo com toda distância sempre estiveram presente em todos os momentos, apoiando-me em cada tropeço e cada sonho realizado. Amo vocês!

Aos meus irmãos Mastrangello Dias e Maylla Dias, pela parceria, amor, compreensão em cada etapa da minha vida. Amo vocês!

À minha família tios e primos pelo apoio e compreensão em todos os momentos.

À minha orientadora, Drª. Maria Anita Mendes, pela confiança, incentivo e oportunidades que me proporcionou ao longo da nossa convivência. Agradeço por compartilhar seu conhecimento e me ensinar tanto, e por me apoiar e incentivar a sempre superar meus limites, obrigada pelo apoio incondicional recebido por todos esses anos, seu profissionalismo é um exemplo a ser seguido. Mas OBRIGADA principalmente a esse ser humano ímpar que eu tenho a honra de ter como amiga, serei eternamente grata a Deus por todos os momentos por nós vividos.

Ao Dr. Enrique Eduardo Rozas Sanchez, por todo apoio incondicional, por compartilhar seu conhecimento, por me ensinar tanto, pela parceria de todas as horas e acima de tudo, obrigada por nossa amizade Rocitas!!!

À Dra. Lidiane Maria de Andrade, obrigada por seu apoio minha amiga, desde minha chegada a São Paulo há 7 anos atrás, obrigada pelas noites em claro e finais de semana dedicado ao mundo das “omicas”, seu apoio foi fundamental. Obrigada por me ouvir, por me aconselhar, por me acolher com tanto carinho, por compartilhar todos os momentos, isso só fortalece a nossa amizade e cumplicidade.

Ao Prof. Dr. Cláudio Augusto Oller do Nascimento, por me proporcionar toda infraestrutura para o desenvolvimento deste trabalho, pela confiança e por ter me acolhido no laboratório DEMPSTER MS LAB no Departamento de Engenharia Química da Escola Politécnica da USP, obrigada pelos ensinamentos e pela amizade.

À Dra. Mariana de Paula Eduardo por compartilhar seu conhecimento e por me ensinar sobre o universo dos fungos, obrigada pelo carinho, parceria, atenção, conversas e amizade.

Ao grande amigo Hugo Hashimoto pela parceria, companhia em todas as horas, por me tirar do mundinho USP e me apresentar esta cidade que eu aprendi a amar, obrigada pelas conversas, risadas (e como damos risadas), por compartilhar seus conhecimentos, obrigada por sua amizade japaaaaa boyyyy!

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Ao Dr. Victor Bridi Telles obrigada pela amizade, pelo cuidado e paciência, pelas conversas e companhia no laboratório, sou privilegiada em ter sua amizade.

Ao Jorge Luís Coleti, sem palavras para agradecer todos os momentos que estivemos juntos, pelas conversas, risadas e companhia em todos os momentos desta jornada.

Ao Prof Dr. Jorge Alberto Soares Tenório, obrigada pelo apoio, amizade, e parceria, além de “emprestar” os meninos do Larex (Jorge, Hugo e Victor), sem o auxílio e disposição em nos acompanhar durante as noites de ensaios no laboratório, este trabalho não seria possível. Serei eternamente grata pelo cuidado e pela parceria!

Ao Robson, obrigada pelo amor, carinho, atenção, paciência e compreensão nos últimos meses, sou muito grata a Deus por ter você ao meu lado!

Ao Thalles, obrigada por compartilhar seus conhecimentos e pelo auxílio no tratamento dos dados.

Agradeço aos demais colegas da pós-graduação, obrigada pela convivência e por todos os momentos de aprendizado.

À todos que aqui não nomeei, mas que contribuiram para minha formação e para a realização deste trabalho.

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“Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar de novo e fazer um novo fim”. (Chico Xavier)

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ...... 1

2 OBJETIVO ...... 3

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...... 4 3.1 METAIS TÓXICOS 4 3.1.1 COBRE ...... 5 3.2 MICRORGANISMOS 6 3.3 FUNGOS FILAMENTOSOS 6 3.3.1 GÊNERO ASPERGILLUS ...... 9 3.3.2 GÊNERO RHIZOPUS ...... 10 3.4 PROTEÔMICA 12 3.4.1 DEFINIÇÃO E IMPORTÂNCIA ...... 12 3.4.2 TÉCNICAS PROTEÔMICAS ...... 14 3.4.3 APLICAÇÕES PROTEÔMICAS ...... 17

4 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 19 4.1 ISOLAMENTO E MANUTENÇÃO DAS LINHAGENS FUNGICAS. 19 4.2 PADRONIZAÇÃO DO INÓCULO 19 4.3 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DOS FUNGOS A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC AO COBRE EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA E SUBMERSA. 20 4.3.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DOS FUNGOS A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC AO COBRE EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA ...... 20 4.3.2 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DOS FUNGOS A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC AO COBRE EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA ...... 20 4.5 EXTRAÇÃO DE PROTEÍNAS E PREPARAÇÃO DO EXTRATO PROTEICO DOS FUNGOS A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA. 22 4.6 DIGESTÃO DO EXTRATO PROTÊICO PARA ANÁLISE POR NANOLC-ESI-Q-TOF 22 4.7 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS PELA TÉCNICA NANOLC-ESI-Q-TOF 23 4.9 DESENHO EXPERIMENTAL DA ANÁLISE PROTEÔMICA. 25

5 RESULTADOS ...... 26 5.1- AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DOS FUNGOS A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC AO COBRE EM MEIO, SEMI-SÓLIDA E SUBMERSA. 26 5.1.1 AVALIAÇÃO DA TOLERÂNCIA DO A.NIGER VC E R.MICROSPORUS VC AO COBRE EM FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA (TOXICIDADE EM PLACAS) ...... 27

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5.1.2 CURVA DE CRESCIMENTO E QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO CELULAR - FERMENTAÇÃO SUBMERSA ...... 29 5.2 ENSAIOS DE ADSORÇÃO EM BATELADA PARA REMOÇÃO CU2+ 31 5.3 ANÁLISES PROTEÔMICAS DAS ESPÉCIES 32 5.3.1- ASPERGILLUS NIGER VC ...... 33 5.3.2- RHIZOPUS MICROSPORUS VC ...... 45

6 DISCUSSÃO ...... 57

7 CONCLUSÕES ...... 69

8 PUBLICAÇÕES E PARTICIPAÇÕES EM CONGRESSOS INTERNACIONAIS . 71

9 PUBLICAÇÕES EM REVISTA CIENTÍFICA ...... 71

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 73

ANEXO I ...... 82

ANEXO II ...... 100

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RESUMO

O aumento da complexidade dos resíduos produzidos nos processos de mineração, que acompanha a crescente expansão deste setor no Brasil, tem revelado a necessidade de novas técnicas para o tratamento ecologicamente correto dos rejeitos de mineração. Desta forma, a biorremediação, uma técnica de baixo custo que utiliza microrganismos extremófilos na recuperação de metais tóxicos, se apresenta como um método economicamente viável no tratamento dos rejeitos contendo íons metálicos. Assim, mediante uma análise proteômica dos fungo isolados do ambiente de mineração, quando submetidos a estresse com ions de cobre, podemos compreender seu comportamento fisiológico no processo de biorremediação. Para isso, Aspergillus niger VC e Rhizopus microsporus VC, isolados do ambiente de mineração foram incubados junto a íons de cobre e mediante analise proteômica foram identificados biomarcadores de estresse oxidativo nos fungos. O proteoma realizado utilizando a técnica de NanoLC- ESI-Q-TOF identificou a expressão de proteínas que mudaram sob a influência do cobre em comparação a seus respectivos controles. Os resultados mostraram que as duas cepas obtidas do ambiente de mineração possuem diferentes mecanismos de resistência. Sendo assim, A.niger VC apresentou uma redução na expressão proteica, das quais 132 foram diferencialmente expressas na presença de íons Cu2+. Por sua vez, a cepa R.microsporus VC exibiu uma superexpressão proteica, com 389 proteínas expressas na presença do metal. Nestes cultivos foram identificadas proteínas relacionadas ao choque térmico e à adsorção de metais, conhecidas como proteínas de choque térmico (HSPs) e metaloproteínas, produzidas em resposta ao estresse imposto pela presença do agente indutor de estresse. No entanto, as enzimas envolvidas na defesa contra o estresse oxidativo, identificadas na ausência de metal, são um indicativo de adaptação metabólica em resposta ao ambiente de mineração. Assim concluímos que tanto A.niger VC como R.microsporus VC, são fungos que apresentam importantes características que permitem sua utilização como agentes de biorremediação dos rejeitos de mineração.

Palavras–chave: Proteômica, Biorremediação, Estresse Oxidativo, Fungos Filamentosos, Espectrometria de Massas.

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ABSTRACT

The increase in the complexity of the waste produced in the mining process, with the growing expansion of this sector in Brazil, has revealed the need for new techniques for the ecologically correct treatment of this toxic waste. Therefore, bioremediation, a low cost technique that uses endophilic microorganisms in the recovery of toxic metals, presented as an economically viable method in the treatment of metal ion-containing wastes. In this way, through proteomic analysis of the isolated fungus from the mining environment, when submitted to stress with copper ions, we can understand their physiological behavior in the bioremediation process. In this regard, Aspergillus niger VC and Rhizopus microsporus VC, isolated from the mining environment were incubated with copper ions and in result of proteomic analysis, biomarkers of oxidative stress were identified in the fungus. The proteome performed using the NanoLC-ESI-Q- TOF technique identified the expression of proteins that changed under the copper influence compared to their respective controls. The results showed that the two strains obtained from the mining environment have different resistance mechanisms. Thus, A.niger VC presented a reduction in protein expression, of which 132 were differentially expressed in the presence of Cu2+ ions. In turn, the strain R.microsporus VC exhibited a protein overexpression, with 389 proteins expressed in the metal presence. In these cultivations, proteins related to thermal shock and the adsorption of metals, known as HSPs and metalloproteins, produced in response to the stress imposed by the presence of the stress-inducing agent. However, the enzymes involved in defense against oxidative stress, identified in absence of metal, are indicative of metabolic adaptation in response to the mining environment. Therefore we conclude that both A.niger VC and R.microsporus VC are fungus that present important characteristics that allow their to be used as bioremediation agents for mining waste.

Keywords: Proteomic, bioremediation, oxidative stress, filamentous fungus, Mass Spectrometry

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LISTA DE ABREVIATURAS

Abreviação Significado ACN Acetonitrila AF Ácido fórmico Co Cobalto CONAMA Conselho nacional do meio ambiente Cu Cobre DNPM Departamento nacional de produção mineral EPA Agência de proteção ambiental- Norte americana ESI Ionização por eletrospray FDR Taxa de falsa descoberta FGH S-formylglutathione hydrolase GO Ontologia genética GSH Glutationa HSP Proteína de choque térmico m/z Razão massa/carga MIC Míxima concentração inibitória Mo Molibidênio nano LC Nano cromatografia líquida PD Potato dextrose (amido de batata) PDA Potato dextrose ágar pI Ponto isoelétrico Q-TOF Quadrupolo –Tempo de vôo TFA Ácido trifluoroacético Zn Zinco TCA Ciclo do ácido tricarboxílico

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Dez principais proteínas identificadas com maior número de peptídeos em condições diferentes de cultivo do fungo A.niger VC...... 35 Tabela 2: Identificação de HSPs diferencialmente expressas em A.niger VC após incubação em presença e ausência de íons Cu2+...... 39 Tabela 3: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massas do fungo A.niger VC em presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 40 Tabela 4: Metaloproteínas diferencialmente expressas A.niger VC em presença e ausência de íons Cu2+...... 44 Tabela 5: Dez principais proteínas identificadas com maior número de peptídeos em condições diferentes de cultivo do fungo R.microsporus VC...... 46 Tabela 6: Identificação de HSPs diferencialmente expressas em R.microsporus VC após incubação em presença e ausência de íons Cu2+...... 48 Tabela 7: Proteínas identificadas por espectrometria de massas do fungo R.microsporus VC em presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 52 Tabela 8: Metaloproteínas diferencialmente expressas R.microsporus VC na presença e ausência de íons Cu2+...... 56

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Aplicações de fungos filamentosos em diferentes setores industriais e de pesquisa (PUTZKE e PUTZKE, 2002, CHAMBERGO e VALENCIA, 2016)...... 8 Figura 2: Imagens adquiridas em estereomicroscópio da espécie A.niger VC (ScopeA1, Carl Zeiss-320 X)...... 10 Figura 3: Imagens adquiridas da espécie R.microsporus VC em estereomicroscópio (ScopeA1, Carl Zeiss- 320X)...... 12 Figura 4: Fonte de ionização MALDI – Ionização da mistura amostra/matriz BRUKER, 2013a)...... 15

Figura 5: Fonte de ionização ESI- Ionização de amostra líquida submetida a uma diferença de potencial elétrico...... 16

Figura 6: Mapa de localização da lagoa de rejeito - Mina de Sossego - Canaã dos Carajas- PA...... 19 Figura 7: Fluxograma das etapas de análise proteômica dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC...... 25

Figura 8: Placas inoculadas com esporos de A.niger VC em meio de cultivo PDA após 15 dias: (A) Sem cobre. (B) 50 mg/L de cobre. (C) 100 mg/L de cobre. (D) 200 mg/L de cobre. (E) 400 mg/L de cobre...... 28

Figura 9: Placas inoculadas com esporos de R.microsporus VC no meio de cultivo PDA após 15 dias: (A) Sem cobre. (B) 50 mg/L de cobre. (C) 100 mg/L de cobre. (D) 200 mg/L de cobre...... 28 Figura 10: Curva de crescimento celular do fungo A.niger VC ( ) ausência de cobre, ( ) 50mg/L de Cu2+...... 30

Figura 11: Curva de crescimento celular do fungo R.microsporus VC ( ) ausência de cobre, ( ) 50mg/L de Cu2+...... 30 Figura 12: Adsorção de íons Cu2+ no cultivo dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC em 50 mg/L...... 32 Figura 13: Diagrama de Venn do perfil proteômico da espécie A.niger VC: 72 horas de incubação em meio PD: (A) ausência de cobre; (B) presença de cobre...... 33

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Figura 14: Função Molecular no fungo A.niger VC na ausência de cobre (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 37 Figura 15: Função Molecular no fungo A.niger VC em presença de cobre (50 mg/L Cu2+) (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 37 Figura 16: Processos Biológicos expressos no fungo A.niger VC: ( ) ausência de cobre e ( ) presença de Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 42 Figura 17: Diagrama de Venn da análise proteômica da espécie R.microsporus VC com 48 horas de incubação em meio PD: (A) ausência de cobre; (B) presença de cobre...... 45 Figura 18: Função Molecular do fungo R.microsporus VC na ausência de cobre (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 50 Figura 19: Função Molecular do fungo R.microsporus VC em presença de cobre (50mg/L Cu2+) (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 50 Figura 20: Processos Biológicos expressos no fungo R.microsporus VC: ( ) ausência de cobre e ( ) presença de Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org)...... 54

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1 INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

O aumento na produção de cobre no Brasil tem incentivado a exploração de novas jazidas de minério, destacando-se a Empresa Vale S.A., principal produtora de concentrado de cobre no estado do Pará. A produção de concentrado de cobre foi ampliada em 90% entre os anos 1998 e 2015, para a produção de cobre primário e secundário. Estima-se que em 2030 a produção nacional do metal atinja 374.000 t/ano, uma vez que as reservas brasileiras estão avaliadas em 21 milhões de toneladas (Departamento Nacional de Produção Mineral, 2017).

A crescente expansão dos processos de mineração no Brasil vem aumentando quantitativamente a complexidade dos resíduos tóxicos lançados ao meio ambiente. Metais como o cobre e o cromo, apesar de terem um importante papel nas reações bioquímicas da biota, são tóxicos em altas concentrações. A toxicidade desses metais está relacionada à concentração do íon, que, quando superior à capacidade de resistência do organismo, provoca danos fisiológicos devido à interferências nos processos biológicos, como ativação enzimática, transcrição e tradução de DNA ou na integridade celular (VULLO, 2003; GADD 2014).

A busca por processos que minimizem os danos ambientais causados pela presença de metais tóxicos tem se intensificado nos últimos anos. Alguns estudos têm demonstrado o potencial dos microrganismos tais como algas, bactérias e fungos em processos de biorremedição por eles se adaptarem às altas concentrações de metais tóxicos e por ser um processo economicamente viável e ecologicamente correto, quando comparado às atuais tecnologias de tratamento de efluente como preciptação, troca-iônica osmose reversa ou evaporação (GADD, 2014).

Assim, o estudo do estresse oxidativo dos microrganismos vem despertando grande interesse, devido à relação existente entre as respostas fisiológicas e os danos sofridos pelo metabolismo celular. Os microorganisnos respondem de maneiras diferentes quando submetidos a presença de poluentes, emitindo respostas que vão da super expressão ou subexpressão de compostos orgânicos (principalmente proteinas), Estes compostos são usados como biomarcadores convencionais, embora seu uso exija um profundo conhecimento dos mecanismos tóxicos, e esses biomarcadores são apenas parcialmente conhecidos, pois se concentram em proteínas já caracterizadas, mas excluem outras que também podem ser alteradas (IRAZUSTA et al., 2012). 1

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A proteômica é uma importante abordagem na descorberta de novos biomarcadores, os quais são complementos protêicos ou componentes celulares que reagem especificamente a um poluente, indicando quando o poluente está causando dano ambiental (LÓPEZ e GÓMEZ, 2006). Portanto, as abordagens proteômicas fornecem ferramentas para estudar variações significativas na expressão das proteínas entre diferentes ambientes (e.g poluído e não poluído) possibilitando sua utilização como biomarcadores (IRAZUSTA et al.,2012). No entanto, o uso destas abordagens proteômicas nos estudos ambientais não está livre de limitações, contudo mudanças na expressão protêica são essenciais quando examinarmos o comportamento celular.

Neste contexto, amostras de solo e água foram coletadas em diferentes pontos da lagoa de rejeito da Mina de Sossego (Canaã dos Carajás- Pará), dessas coletas foram isoladas 23 espécies de fungos, sendo realizados testes prévios de adsorção de íons Cu2+ em cada espécie, sendo observado maior potencial de adsorção de íons metálicos nos fungos Aspergillus niger e Rhizopus microsporus. Portanto, a caracterização de proteínas através da análise proteômica dos fungos Aspergillus niger e Rhizopus microsporus proveniente de mina de cobre (Vale) foi utilizada como ferramenta para elucidar a resposta metabólica dos fungos após a exposição ao cobre.

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2 OBJETIVO

O presente trabalho teve por objetivo caracterizar o perfil proteômico dos fungos Aspergillus niger VC e Rhizopus microsporus VC, provenientes da mina de cobre “Sossego” da Empresa Vale S.A (Canaã dos Carajas- Para- Brasil), expostos ao cobre como agente indutor do estresse oxidativo.

Para atingir esse objetivo as seguintes etapas foram realizadas:

 Estudar a curva de crescimento dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC na presença e na ausência de cobre  Avaliar o potencial de adsorção de cobre pelos fungos;  Identificar e caracterizar o perfil proteômico, em condições de estresse oxidativo dos microrganismos nas diferentes condições de cultivo;  Identificar proteínas expressas, superexpressas e subexpressas nos fungos;  Identificar proteínas envolvidas na tolerância ao cobre pelos fungos;  Identificar e propor quais vias metabólicas estão sendo induzidas durante o estresse oxidativo.

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3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Metais Tóxicos

Considerando o metabolismo celular, metais como zinco (Zn), cobre (Cu), cobalto (Co) e molibdênio (Mo), são usualmente encontrados nos grupos prostéticos das enzimas de vias metabólicas essenciais. Entretanto, esses metais abundantemente presentes na natureza, em concentrações elevadas, podem ser tóxicos.

Consequentemente, os rejeitos produzidos pela exploração de minérios que contêm altas concentrações de metais, significam um risco ambiental. Alterações na microbiota do solo e da água, induzindo à seleção de microrganismos que desenvolveram resistência a esses metais, reduzindo o número de espécies microbianas na microbiota local (KAVAMURA e ESPOSITO, 2010).

Em ecossistemas expostos à contaminantes (e.g metais tóxicos), plantas e animais podem absorvê-los e acumulá-los, sendo este processo denominado bioacumulação. Essa bioacumulação, potencializada na cadeia alimentar, resulta em mortalidade ou problemas reprodutivos nos animais do topo da cadeia (CALLENDER, 2007; JIMENEZ et al., 2004; KORF et al., 2008; SIMEONOV et al., 2011).

Estudos realizados pelas agências americanas ATSDR (Agency for Toxic Substances and Disease Registry) e EPA (Enviromental Protection Agency) constataram que a exposição a metais como cobre, cromo, zinco e níquel por períodos prolongados são prejudiciais à saúde humana, resultando em sutis mudanças psicológicas. No entanto, a origem dessa exposição é geralmente ignorada (ATSDR, 2004; GADD, 2004; SIMEONOV et al., 2011).

No Brasil, o Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) estabelece resoluções para despejo de efluentes contendo metais. A Resolução nº 430, de 13 de Maio de 2011 complementar a Resolução nº 357, de 17 de Março de 2005, estabelece como limite máximo para emissão de cobre em efluentes o valor de 1,0 mg/L, sendo despejado direta ou indiretamente, nos corpos de água. Portanto, o controle das emissões dos metais tóxicos, como cobre por exemplo, deve ser realizado diretamente na fonte poluidora, antes de serem encaminhados ao ecossistema.

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3.1.1 Cobre

O cobre está presente na natureza em quatro estados de oxidação: metálico (Cu0), íon cuproso (Cu+1), íon cúprico (Cu2+) e íon trivalente (Cu3+).

Nos microrganismos, os íons de cobre metálico são essenciais para eucariotos e bactérias, sendo utilizados estruturalmente em processos bioquímicos e como cofatores catalíticos essenciais para a vida. Entretanto, excesso de íons cobre na célula gera espécies reativas, a partir de sua reação com o oxigênio, ocasionando danos aos ácidos nuclêicos, lipídeos e proteínas (LALLIOTI et al., 2009; BANCI et al., 2011).

Nos seres humanos o cobre desempenha um papel importante no metabolismo, pois atua como cofator de uma série de metaloenzimas envolvidas na formação de hemoglobina sendo que um homem adulto necessita diariamente de 2 mg de cobre, e que o mesmo esteja presente no corpo humano em uma concentração de 150 mg. A deficiência deste metal na dieta pode causar anemia, diarréia e distúrbios nervosos. Por outro lado, o sulfato de cobre quando ingerido de forma excessiva pode causar vômitos, diarréia, câimbras, convulsões e até mesmo a morte (ATSDR, 2004; COBRE-NAUTILUS, 2016).

A produção brasileira de cobre se distribui pelos estados do Pará (68%), Goiás (23,7%) e Bahia (8,3%), de acordo com o Departamento Nacional de Produção Mineral (DNPM/Sumário Mineral, 2014).

O cobre metálico é muito utilizado por apresentar alta durabilidade, boa resistência à corrosão, boa maleabilidade e ductibilidade, podendo ser transformados em lâminas, fios, bastões e tubulações, além da cunhagem de moedas e peças decorativas. Também é utilizado como fungicida, anti-incrustrante em pintura de cascos de navios, inseticida, além aditivo agrícola para solos, evitando que qualquer deficiência de cobre afete as colheitas (ATSDR, 2004; FARIAS, 2014). Entretanto, produtos e resíduos de metais tóxicos, presentes em inúmeras atividades agrícolas, urbanas e industriais, são potenciais contaminantes de mananciais e solo.

Por isso, a busca por processos que minimizem os danos ambientais causados pela presença desses metais tóxicos tem se intensificado nos últimos anos, e um dos processos mais atrativos é a biorremediação, ou seja, o processo pelo qual microrganismos são aplicados visando reduzir ou remover as contaminações no ambiente. 5

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3.2 Microrganismos

As bactérias, fungos e leveduras podem crescer em diversos substratos (sólido, líquido), oferecendo diferentes aplicações biotecnológicas de interesse industrial dependedo das técnicas de cultivo utilizadas como por exemplo, fermentação em estado sólido (SOCCOL, 1994). Os fungos filamentosos são muito comuns no processo de fermentação em estado sólido, pois o processo reproduz algumas condições de seu habitat natural.

Os ecossistemas das áreas de mineração são habitados por diferentes grupos de microrganismos tais como algas, fungos, leveduras e bactérias, cuja diversidade é influenciada pelos metais presentes no ecossistema (WHITMAN et al., 1998; TORTORA et al., 2008). As células destes organismos possuem a capacidade para acumular metais na membrana celular (bioacumulação), efeito diretamente dependente do metabolismo de cada linhagem microbiana (GADD, 2001).

Atualmente esses microrganismos têm sido muito utilizados em processos de biorremediação, visando explorar a diversidade genética e a versatilidade metabólica microbiana, para a transformação de contaminantes em produtos menos tóxicos que podem ser integrados nos ciclos biogeoquímicos naturais (UETA et.al., 1999). Dentre eles, a utilização de enzimas fúngicas também vêm sendo exploradas quanto à sua aplicabilidade na recuperação de ambientes degradados por poluentes químicos e pela indústria mineradora (CHAMBERGO e VALENCIA, 2016). Por este motivo, os fungos filamentosos têm sido estudados nos últimos anos visando os processos de biorremediação.

3.3 Fungos Filamentosos

Os fungos são organismos eucariontes, unicelulares (leveduras) ou multicelulares (fungos filamentosos), haplóides (homo ou heterocarióticos), com parede celular contendo quitina e α-glucanos (TORTORA et.al., 2008). A estrutura de um fungo filamentoso consiste em um micélio – (constituído por hifas com 5 a 10 µm de largura) e esporos latentes. Os micélios formados ao longo do crescimento do fungo envolvem o substrato, de onde são absorvidos os nutrientes orgânicos necessários para continuar crescendo e/ou sobrevivendo (PELCZAR et.al., 1996; TORTORA et.al., 2008).

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Os fungos apresentam atividades biológicas únicas, que os tornam indispensáveis ao meio ambiente, participam da decomposição de matéria orgânica, desempenham papéis ecológicos críticos no ciclo global do carbono e na reciclagem de nutrientes. São essenciais a sobrevivência de muitos organismos com os quais estabelecem associações como mutualismo, destacam-se na absorção e mineralização de íons metálicos, além de apresentarem grande potencial em processos biotecnológicos como por exemplo biocombustíveis e também na produção biológica como enzimas degradantes de biomassa (BAKER et al., 2008, CHAMBERGO e VALENCIA, 2016).

Atualmente tem sido descobertas de novas aplicações para a biomassa de fungos, pois apresentam grande potencial para seu uso industrial como por expemplo, na fabricação de produtos farmacêuticos, biossorventes, biocatalisadores para reações quirais, suplementos nutricionais, cosméticos, agroquímicos, biomateriais e enzimas, onde cada um desses bioprodutos tem um valor de mercado potencialmente alto (CHAMBERGO e VALENCIA, 2016). A Figura 1 apresenta algumas das principais aplicações dos fungos em diferentes setores.

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Figura 1: Aplicações de fungos filamentosos em diferentes setores industriais e de pesquisa.(PUTZKE e PUTZKE, 2002, CHAMBERGO e VALENCIA, 2016).

O estudo dos fungos filamentosos vem aumentando a cada ano, pois são amplamente distribuídos em todos os habitats e ecossistemas terrestres, conhecidos por produzir grande variedade de proteínas heterólogas, uma grande variedade de ácidos orgânicos e outros metabólitos, além de enzimas como proteases, amilases, celulases, lípases, lactases. Apresentam ainda capacidade de remoção de compostos orgânicos e inorgânicos presentes no meio ambiente. São extremamente resistentes à variações de temperatura e pH, sobrevivem em condições adversas e seu metabolismo secundário encontra-se associado aos processos de esporulação sexuada e assexuada (TORTORA et al., 2008; CHAMBERGO e VALENCIA, 2016). Dentre os fungos filamentos podemos destacar os gêneros Aspergillus sp. e Rhizopus sp. por apresentarem grande potencial em processos de bioremediação.

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3.3.1 Gênero Aspergillus Os fungos do gênero Aspergillus são classificados dentro do Reino Fungi como pertencentes ao Filo: Ascomycota, Classe: Eurotiomycetes, Ordem: Eurotiales, Família: Trichocomaceae, Gênero: Aspergillus, sendo as principais espécies: A.flavus, A.fumigatus, A.nidalus, A.niger, A.oryzae, A.candidus, A.ochraceus e A.deflectus.

O gênero Aspergillus possue características anamorfas (fase assexuada ou mitótica) e podem ser uni- ou pluricelulares, sendo a última forma a mais abundante na natureza (KLICH, 2002; CAROLIS, 2012). São economicamente importantes devido ao grande potencial de geração de diversos produtos, destacando a produção de ácido citríco.

O fungo Aspergillus sp. possui habilidade de degradar biomassa vegetal bem como se adaptar metabolicamente à diferentes fontes de carbono e nitrogênio, permitindo ocupar uma série de nichos ecológicos como solos, madeira e outros resíduos orgânicos (BOUWS et al., 2008). O fungo filamentoso Aspergillus sp. se destaca pelo potencial biotecnológico, sendo amplamente utilizado na indústria na produção de enzimas e ácidos orgânicos tais como ácido cítrico e ácido gálico. Este fungo apresenta grande capacidade de biossorção de metais tóxicos, capacidade de produção de enzimas e ácidos orgânicos, podendo aumentar os rendimentos e reduzir o custo do descarte dos resíduos de biomassa provenientes de processos industriais (WAIHUNG et al., 1999; KAPOOR et al., 1999)

Na década de sessenta, Sternberg (STERNBERG et al. 1977) descreveram o A.niger como uma importante fonte de produção de enzimas, mediante a fermentação industrial do fungo; destacando a produção da enzima glucoamilase, muito utilizada na fabricação de xarope com alto teor de frutose e também a pectinase utilizada para clarificar a sidra e o vinho. Kapoor, (KAPOOR et al., 1999) identificou a capacidade do fungo A.niger para remover metais tóxicos como cobre, zinco e níquel (10 mg/L) de águas residuais de indústrias químicas. Liu (LIU et al., 2006), em estudos de biossorção, descreveu a eficiência do fungo A.niger na remoção de cádmio (Cd+2) e zinco (Zn+2) por meio de atividades metabólicas. Pel (PEL et al., 2007) sequenciou o genoma da espécie A.niger codificando 14.165 genes. A espécie A.niger VC coletada em ambiente de mina, e estulizado neste estudo está representada na Figura 2.

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Figura 2: Imagens adquiridas em estereomicroscópio da espécie A.niger VC (ScopeA1, Carl Zeiss-320 X).

Long,(LONG et al.,2017) estudou a absorção de cobre (II) utilizando micélios e esclerócios do fungo A.oryzae G15, descrevendo os esclerócios (73,53 mg/g) como as estruturas com maior capacidade de biosorção que os micélios (35,34 mg/g), e atribuíndo essa absorção à maior quantidade de sítios carboxílicos expostos após a diferenciação celular. Além da capacidade de regeneração e reutilização dos biossorventes carregados de Cu(II), indicando que A.oryzae G15 poderia ser considerado como uma alternativa viável para a remoção de Cu(II) nas águas residuais.

3.3.2 Gênero Rhizopus

Os fungos do gênero Rhizopus são classificados no Reino Fungi como pertencentes ao Filo: Zygomicota, Classe: Zygomicetes, Ordem: Mucolares, Família: Mucolaceae, Gênero: Rhizopus, sendo as espécies mais comuns R.oligosporus, R.arrhizua, R.circicans, R.delemar, R.oryzea, R.microsporus, R.formosa e R.stolonifer. Estes fungos são formados por inúmeros filamentos denominados hifas, que se entrelaçam dando origem ao micélio, podendo ser encontrados no solo, frutas e vegetais em decomposição, fezes de animais e também no pão (SPIER, 2005). Classificado como termotolerante, uma das principais vantagens de se utilizar este fungo é sua fácil manipulação, pois é capaz de crescer em diferentes substratos e produzir grande variedade de bioprodutos (KITPREECHAVANICH et al., 2008). 10

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R.oryzae é amplamente utilizado em países asiáticos em processos fermentativos em escala industrial, como por exemplo, na produção de glucoamilases (MERTENS e SKORY, 2007; KITPREECHAVANICH et al., 2008). O fungo R.microsporus é comumente encontrado no solo, resíduos vegetais e alimentícios. É um patógeno encontrado em diversos ambientes principalmente em solos com pH neutro (SPIER, 2005).

A capacidade do fungo R.arrhizus para biosorver o cianato de ferro (III) presente em agúas residuais, reduzindo significativamente sua concentração em condição altamente alcalina (pH 13) e também que o fungo R.arrhizus é uma alternativa eficaz na remoção de outras espécies de metais tóxicos presentes nos efluentes, foi descrito por Aksu (AKSU et al., 1999)

Estudos demonstraram que os esporos do fungo R.oryzar imobilizados em criogel de poli ácool vinílico macroporoso (PVA-criogel) podem ser usados como biocatalisante, capazes de produzir L(+) ácido lático (LA). As células de fungos presas em PVA-criogel apresentam maior resitência e maior rendimento de LA no ciclo de trabalho interativo do que nas células livres, sendo uma alternativa mais atraente para aplicações biotecnológicas. (EFREMENKO et al., 2006)

Em 2017, Kodal e Aksu descreveram a biossorção de corantes pelo fungo R.arrhizus em presença do agente tensioativo catiônico brometo de cetil trimetilamônio (CTAB). Neste estudo foi observado que após a adição de CTAB houve alteração do pH, indicando maior absorção de corante pela biomassa fúngica em presença do agente tensoativo (KODAL e AKSU, 2017). A espécie R.microsporus VC coletada em ambiente de mina, e estulizado neste estudo está representada na Figura 3.

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Figura 3: Imagens adquiridas da espécie R.microsporus VC em estereomicroscópio (ScopeA1, Carl Zeiss- 320X).

Devido à importância dos fungos em processos de bioremediação, o estudo proteômico se destaca como uma técnica eficaz na identificação de biomarcadores ambientais e no estudo do metabolismo do fungo em condições de estresse oxidativo.

3.4 Proteômica

3.4.1 Definição e Importância

A dinâmica celular depende do fluxo de informações entre os diferentes processos fisiologicos, ou seja, informações do DNA são transcritas em RNAm que são traduzidas em proteínas ou metabólitos que interagem com outras moléculas que participam das redes regulatórias. No entanto, a quantidade de sequências de DNA no banco de dados não é suficiente para identificar todas as funções biológicas, o que reforça a necessidade do estudo do RNAm, proteínas e metabólitos, gerando os novos campos de pesquisa denominados “ômicas”: genômica, transcriptômica, proteômica, metabolômica, entre outras (ZHANG et.al., 2010).

O termo proteôma foi usado pela primeira vez por Marc Wilkins, em meados dos anos 90, para descrever o conjunto completo de proteínas que são expressas e modificadas a partir do genoma (WILKINS et al., 1996; ZHAO et al., 2003). Atualmente a proteômica tem sido definida como uma técnica complementar, capaz de mostras mediante uma visão abrangente o perfil protêico de um organismo, célula ou tecido em uma condição específica.

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A análise proteômica tem como objetivo obter e identificar todas as proteínas presentes nas células, integrando-as uma visão fisiologica, para criar um mapa tridmensional da célula, facilitando a localização destas proteínas no ambiente celular. Esta é uma análise essencialmente diferente do estudo do genoma, que funciona como um repositório estático das informações genéticas (GRAVES e HAYSTEAD, 2002).

Esta análise permite a caracterização de todas as proteínas (ou maior parte delas) presentes em diferentes tipos de amostras como célula, tecido, organismo ou fluidos gerados em diferentes estados fisiológicos (DI CIERO e BELLATO, 2003). Assim, permite uma comparação qualitativa e quantitativa do conjunto de proteínas expressas nas diferentes etapas da divisão celular, nas quais os diferentes estados metabólicos são dependentes do estágio de desenvolvimento celular e do ecossistema em que os organismos vivem (WITTMANN- LIEBOLD et al., 2006; BARROS et al., 2010).

A proteômica surge também como uma ferramenta muito versátil na busca de novas informações, mediante as quais é possível caracterizar ou identificar alterações produzidas por diferentes estímulos ambientais, que podem ser moduladas por modificações pós-traducionais. Consequentemente, a identificação das proteínas expressas pelos microrganismos quando submetidos a algum tipo de estresse determina um perfil protêico característico para aquelas células sob condições específicas (HECKER et al., 2010; WILHELM et al., 2014 ).

O interesse na área proteômica vem aumentando, devido principalmente à integração e automatização de uma variedade de técnicas e equipamentos que permitem separar, identificar, quantificar, caracterizar e observar mudanças pós-traducionais, processamento, danos e degradação de proteínas de interesse (HECKER et al., 2010).

Os estudos proteômicos têm gerado informações que permitem alcançar diferentes objetivos como: a) identificar as proteínas envolvidas nas rotas metabólicas relacionadas aos diferentes processos celulares; b) identificar novos marcadores biológicos relacionados ao estresse oxidativo; c) compreender melhor as proteínas de adsorção de metais e a utilização das mesmas na descontaminação do meio ambiente (BARROS et al., 2010; WILHELM et al., 2014).

Entretanto, a análise proteômica total ainda é desafiadora devido à sua alta complexidade, pois um gene particular pode gerar múltiplas proteínas distintas, apresentando

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propriedades físico-químicas variadas e diferentes intervalos de interação proteína-proteína, exigindo o desenvolvimento de técnicas analíticas cada vez mais robustas (DOMON; AEBERSOLD, 2006; HECKER et al., 2010; WILHELM et al., 2014).

3.4.2 Técnicas Proteômicas

A proteômica envolve as etapas de isolamento das proteínas a partir de uma fonte biológica, este isolamento é realizado através de técnicas unidimensionais como cromatografia líquida ou gel (LC ou 1D, respectivamente) ou bidimensionais como LC/LC ou eletroforese 2D-PAGE. A eletroforese 2D-PAGE envolve o extrato celular (mistura complexa de proteínas) disperso em um gel de poliacrilamida que permite a separação das proteínas através do ponto isoelétrico (pI) e da massa molecular (MM) (GÖRG et al., 2004). A eletroforese 2D-PAGE tem resolução suficiente para separar diferentes estados de uma proteína e identificar a proporção relativa entre elas, acrescentando dados significativos no estudo da fisiologia de determinado organismo ou de uma via metabólica (MANN e JENSEN, 2003). A cromatografia líquida, por sua vez, utiliza o extrato celular digerido, permitindo a detecção de proteínas menos abundantes, pouco solúveis ou com mesmos pontos isoelétricos, além de possibilitar o acoplamento a um espectrômetro de massas (HAN et al, 2010).

A identificação e caracterização das proteínas realizada por espectrometria de massas unida a essas duas técnicas descritas anteriormente (2D-PAGE/MS, LC/MS), alcança uma visão global da expressão gênica em relação aos níveis de proteína, possibilitando comparar perfis de expressão protêica em diferentes condições, e, ainda, permitindo também detectar e caracterizar proteínas de interesse (RUPP, 2004; PITARCH et al. 2003). O espectrômetro de massas é um instrumento que permite a separação de acordo com a razão massa/carga (m/z) dos íons na fase gasosa das amostras. Os espectrômetros são amplamente utilizados para medir, por exemplo, a massa molecular de polipeptídeos ou para determinar a sequência de aminoácidos e modificações presentes nestes peptídeos e/ou proteínas. Esta técnica é capaz de fornecer de forma rápida, precisa e sensível a massa de compostos como proteínas e peptídeos (DOMON e AEBERSOLD, 2006).

Um espectrômetro de massas engloba quatro componentes principais: uma fonte de ionização para a formação de íons, um analisador de massas onde os íons formados são

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separados de acordo com sua razão massa/carga, um detector e um sistema de aquisição dos dados. Fontes de ionização como MALDI (Matrix Assisted Lazer Desorption Ionization) e ESI (Electronspray Ionization) tem sido amplamente utilizadas em análises de biomoléculas. Na fonte de ionização do tipo MALDI (Figura 4), a amostra é co-cristalizada com uma matriz, geralmente ácido orgânico aromático de baixo peso molecular (como ácido α-ciano-4- hidroxinâmico e o ácido sinapínico), que absorve a energia de um laser e transfere essa energia para a amostra, propiciando sua ionização e dessorção (DOMON e AEBERSOLD, 2006). É uma técnica muito sensível e apresenta maior tolerância à presença de contaminantes, como sais e detergentes.

Figura 4: Fonte de ionização MALDI – Ionização da mistura amostra/matriz (BRUKER, 2013a).

Na fonte de ionização do tipo ESI (Figura 5) a amostra líquida é submetida a uma diferença de potencial elétrico formando um spray eletrostático, a partir do qual são produzidas gotículas carregadas que se repelem e tornam-se cada vez menores, devido a temperatura até serem dessolvatadas (CROTTI et al., 2006).

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Figura 5: Fonte de ionização ESI- Ionização de amostra líquida submetida a uma diferença de potencial elétrico.

Uma das principais ferramentas de massas atuais a nanocromatografia acoplada à fonte de ionização ESI e um analisador quadrupolo-TOF (NanoLC-ESI-Q-TOF) é muito utilizada no estudo do perfil proteômico. Está técnica permite a identificação das proteínas através da determinação da massa molecular, e da sequência de aminoácidos dos peptídeos obtidos pela digestão de uma mistura de proteínas. Devido à sua alta sensibilidade, está técnica confere um alto grau de precisão no sequenciamento de peptídeos fornecendo informações mais detalhadas sobre modificações pós-traducionais (BATEMAN et al., 2002). Desta forma, a espectrometria de massas é uma técnica eficaz no mapeamento global das modificações protêicas, cuja identificação se dá através da comparação das sequências obtidas com os bancos de dados utilizando ferramentas de bioinformática. Estas ferramentas possuem uma função chave para a pesquisa proteômica, pois fornecem informações sobre a sequência e funções das proteínas, localização subcelular, modificações pós-traducionais, domínios, sítios e estrutura bem como homologia com outras proteínas (PITARCH et al., 2003). 16

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3.4.3 Aplicações proteômicas

A proteômica possibilita uma abordagem mais dinamica na investigação de sistemas biológicos, sendo utilizada para amplificar as informações sobre a síntese e degradação de proteínas em situações específicas, nas modificações pós-traducionais e interações entre proteínas (HAN et al., 2010).

As modificações na cadeia polipeptídica podem ocorrer através da adição de grupos químicos tais como metila, acetila, sulfato, glicídios, fosfato ou uma protease (HAN et al., 2010). Em biotecnologia industrial, a análise proteômica de microrganismos é aplicada no monitoramento de alterações celulares durante a expressão de proteínas heterólogas, na identificação de limitantes de velocidade nas vias metabólicas, no desenvolvimento de cepas mais eficientes, na produção de bioprodutos de interesse e na busca de novas enzimas e promotores.

O estudo proteômico também é largamente aplicado na comparação do perfil protêico de microrganismos submetidos à diferentes condições experimentais (temperatura, nutrientes, pH, estresse químico- metais tóxicos) a fim de caracterizar a resposta ao estímulo ambiental (HAN et al., 2010). Os diferentes estímulos aplicados aos microrganismos alteram as propriedades físico-químicas das proteínas, e, consequentemente, suas funções no metabolismo tais como a localização celular e interações com outras biomoléculas.

A caracterização de proteínas intra e extracelular pode fornecer novas informações sobre a fisiologia fúngica (HAFERBURG e KOTHE, 2010). Particularmente, a investigação das alterações no proteôma e metabolôma induzidas por metais é identificada pelo termo metaloproteômica (HAFERBURG e KOTHE, 2010).

Metaloproteômica é um campo emergente que visa analisar proteínas de microroganismos submetidos à estresse por íons metálico, aumentando a compreensão do funcionamento desses organismos e possíveis aplicações biotecnológicas, como biorremediação e identificação de biomarcadores (ZHAO e POH, 2008). Ainda existem poucos trabalhos na literatura descrevendo a relação entre as proteínas super ou subexpressadas por microrganismos submetidos à uma determinada condição de estresse. Tsekova, (TSEKOVA et al. 2001) estudou o aumento da atividade da fosfatase ácida extracelular, quando o fungo A.niger foi submetido ao estresse oxidativo através da presença

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de 2 mM de íons cobre II no meio. Alterações proteômicas no fungo Trichosporon asahii na presença dos compostos como arsenito de sódio (NaAsO2) e cloreto de cádmio (CdCl2) foram verificadas no perfil metabólico do fungo, junto à redução de proteínas como fosfoglicerato- quinase, fator de elongação 2 e proteínas de choque térmico como HPS 70 (ILYAS, 2014).

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4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Isolamento e manutenção das linhagens fungicas.

As linhagens de fungos foram isoladas a partir de solo e água da lagoa de rejeito da Mina do Sossego localizada em Canaã dos Carajás no Pará, por pesquisadores do CEPEMA – POLI-USP e ICB – USP. As espécies foram mantidas em tubos de ensaio com meio Potato Dextrose Agar (PDA: Amido de Batata – 4 g/L, Dextrose – 20 g/L , Agar – 15 g/L) a 25º C. A localização aproximada da região de coleta dos materiais é apresentada na Figura 6.

Figura 6: Mapa de localização da lagoa de rejeito - Mina de Sossego - Canaã dos Carajas- PA.

Fonte: Google Earth (23/02/2018)

4.2 Padronização do Inóculo

Para a padronização do inóculo, ambos os fungos foram cultivados por 15 dias em frascos erlenmeyers de 500 mL contendo 100 mL de meio PDA a 25 ºC para promover a formação de esporos. Os esporos foram coletados utilizando uma solução salina 0,9% (NaCl- PA) e sua concentração celular foi determinada pela contagem numa câmara de Neubauer observada através de um microscópio óptico. Diversas alíquotas contendo 106 esporos/mL

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foram congeladas em frascos de 2 mL em solução de glicerol (20%) e armazenadas em ultrafreezer (-80 ºC).

4.3 Avaliação da tolerância dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC ao cobre em fermentação semi-sólida e submersa.

4.3.1 Avaliação da tolerância dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC ao cobre em fermentação semi-sólida

A fermentação em meio semi-sólido foi utilizada com o objetivo de verificar a tolerância (crescimento celular) dos fungos A.niger VC e Rhizopus microsporus VC provenientes da mina de Sossego e expostos à íons metálicos Cu+2. Os estudos foram realizados em placas, com meio PDA sintético, às quais foram adicionadas diferentes concentrações de uma solução estoque de sulfato de cobre (4.000 mg/L de íons Cu+2 ) afim de se obter concentrações finais de 50, 100, 200, 400, 800 e 1200 mg/L de íons cobre. Como controle, foi preparada uma placa sem a presença do metal. As concentrações de íons Cu2+ utilizadas foram estabelecidas se baseando nas concentrações de cobre registradas nos diferentes pontos da lagoa de rejeito (concentração máxima 1200 mg/L).

Após a solidificação do meio de cultura na ausência e na presença de cobre nas concentrações estudadas, as placas foram inoculadas com 100 µL de uma solução contendo 106 esporos / mL, e incubadas a 30ºC e observadas por 15 dias. O teste foi realizado em triplicata, totalizando 21 placas para cada espécie. Nesta etapa, foi possível observar qual a concentração mínima inibitória (MIC) que permite o crescimento do fungo, por verificação visual e registro fotográfico.

4.3.2 Avaliação da tolerância dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC ao cobre em fermentação submersa

Os fungos foram cultivados a 30 ºC em uma incubadora com agitador orbital, utilizando frascos erlenmeyer de 500 mL e meio Potato Dextrose (PD - Potato Dextrose - Amido de Batata: 4,0 g/L e Dextrose: 16 g/L). O fungo A.niger VC foi incubado em 200 mL de meio por 140 horas sob agitação de 250 rpm, na ausência e presença de 50 mg/L de Cu+2, e o fungo R.microsporus VC foi incubado em 100 mL de meio durante 90 horas com uma

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rotação de 150 rpm.

Nos cultivos em frascos agitados, a determinação da concentração celular média foi calculada através da relação de massa seca com o volume do cultivo. Volumes conhecidos de amostra foram coletados, as amostras foram filtradas com auxílio de um sistema a vácuo (Sartorius Stedim Biotech S.A), através de uma membrana de ésteres de celulose com diâmetro de 0,45 µm (Merck Millipore), previamente seca em micro-ondas potência a 180 W por 15 min e pesada. Após filtragem as membranas contendo as amostras foram novamente secas em micro-ondas utilizando as mesmas condições anteriores (OLSSON e NIELSEN, 1997), e pesadas em balança de precisão (Shimadzu Corp AUW220D).

A quantificação celular foi calculada através da diferença entre as massas das amostras conforme mostra a Equação 1.

Equação 1: Cálculo da concentração celular da massa seca das células.

(1)

Onde: X = concentração celular da amostra (g/L);

Ms = massa da membrana contendo a massa seca de célula (g);

Mm = massa da membrana seca (g);

Ma = massa da amostra (g); D = densidade da amostra (considerou-se 1000 g/L)

4.4 Ensaios de adsorção em batelada para remoção de Cu (II)

O ensaio de remoção de íons Cu2+ foram realizados durante o crescimento celular nos cultivos dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC contendo 50 mg/L de cobre. O cultivo foi realizado segundo o item 4.3.2.

Os experimentos para a análise de remoção do íon metálico foram realizados em batelada. Os tempos de incubação, determinados a partir das curvas de crescimento, foram

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estabelecidos em 72 e 90 horas para A.niger VC, e em 48 e 60 horas para a R.microsporus VC. Em seguida, as culturas foram filtradas (0,22 micra-Millex) e a concentração de íons cobre presente no meio de cultivo foi determinada pela medida da energia de dispersão em um espectrômetro de fluorescência de raios-X (EDX-Epsilon 3 Panalytical). Neste caso, foi utilizado um substrato com baixo teor de nutrientes (meio PD) para o desenvolvimento de microrganismos, o que facilita o crescimento de forma mais espalhada, aumentando assim a superfície de contato líquido-célula (CORREA e BENTO, 2010; DHANKHAR, 2011).

4.5 Extração de proteínas e preparação do extrato proteico dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC em fermentação submersa.

As análises proteômicas das cepas A.niger VC e R.microsporus VC foram feitas utilizando cultivos em meio PD na ausência e na presença de íons Cu2+. As células foram lavadas com água deionizada, liofilizadas e maceradas (pó). Aproximadamente 2 mg de biomassa de cada amostra foram pesados, às quais foram adicionados 50 µL de ácido fórmico 70% (Sigma Aldrich - LC-MS Ultra-98%), sob agitação em vórtex por 2 minutos, seguido da adição de 50 µL de acetonitrila. A solução foi mantida em banho ultrassônico por 15 minutos, com intuito de facilitar a extração das proteínas, e em seguida as amostras foram centrifugadas por 2 minutos a 17.400 g.

Para determinação da concentração do extrato bruto de proteínas foi utilizado o reagente de Bradford (Sigma Aldrich) e albumina de soro bovino (BSA) como padrão. A leitura das absorbâncias foi realizada em um espectrofotômetro UV-vis - λ 595 nm (modelo UV2600 –marca Shimadzu) (SEDMAK e GROOSBER, 1977). Após a quantificação, os extratos protêicos dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC, cultivados em presença e ausência de cobre, foram aliquotados em micotubos de 250 µL (Eppendorf) contendo 50 mg de proteína/mL de solução, as quais foram secas em centrífuga a vácuo para posterior digestão enzimática.

4.6 Digestão do extrato protêico para análise por nanoLC-ESI-Q-TOF A digestão do extrato protêico foi realizada por dois protocolos:

1) Digestão Tríptica: A enzima tripsina (Sigma) foi solubilizada em 400 µL de

bicarbonato de amônio 50 mM (NH4HCO3) visando concentração final de 0,05 22

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µg de enzima/µL. Ao extrato protêico foram adicionados 50 µL da solução (1:50 / enzima/proteína), e incubados à 37ºC por 24 horas. Após esse período, o processo de digestão foi interrompido pela adição de 10 µL de ácido trifluoroacético 10% e a solução foi mantida por 90 minutos a 37ºC. As amostras foram centrifugadas por 30 minutos a 17.400 g a temperatura de 6 ºC, e o sobrenadante contendo as proteínas digeridas foi analisado. 2) Digestão Quimotríptica: A enzima quimotripsina (Roth) foi solubilizada em 1 mM de ácido clorídrico (HCl) visando uma concentração de 0,5 µg de enzima/µL. Ao extrato protêico foram adicionados 50 µL da solução contendo quimotripsina (1:50 / enzima:proteína), e incubados a 25ºC por 24 horas. O processo de digestão foi então interrompido pela adição de 10 µL de ácido trifluoroacético 10% e a solução foi mantida por 90 minutos a 25 ºC. As amostras foram centrifugadas por 30 minutos à temperatura de 6ºC a 17.400 g e o sobrenadante contendo as proteínas digeridasfoi analisado.

4.7 Identificação das proteínas pela técnica NanoLC-ESI-Q-TOF

A identificação das proteínas foi realizada através da técnica de nanocromatografia líquida de alta eficiência acoplada ao espectrômetro de massas utilizando um sistema NanoLC-ESI-Q-TOF (nano LC modelo UltiMate 3000 da Thermo Scientific e ESI-Q-TOF modelo Impact II da Bruker Daltonics), contendo fonte de ionização captivespray e analisador de massas do tipo quadrupolo tempo de voo (TOF). As proteínas digeridas foram separadas em nanocoluna PepMap (C18, partículas de 5 μm, tamanho dos poros de 300 Å, 15 cm de comprimento, 75 μm de diâmetro interno; Thermo Scientific), utilizando um gradiente de 3 a 97% (v/v) de acetonitrila (Sigma-Aldrich) contendo 0,1 % de ácido fórmico, durante 180 min à vazão de 0,3 µL/min.

O instrumento foi operado com ionização no modo positivo e os espectros dos íons precursores (MS) foram adquiridos na faixa de 50-3000 m/z com uma frequência de aquisição de 2 Hz, voltagem do capilar em 1,5 kV, temperatura da fonte em 150 ºC, fluxo do gás de secagem de 3 L/min e pressão do nebulizador de 0,2 bar. Os espectros de fragmentação dos íons precursores (MS/MS) foram adquiridos com uma frequência de aquisição de 4 a 16 Hz e

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energia de colisão entre 23 e 65 eV. Os espectros de massas obtidos foram integrados e processados utilizando o software PEAKS Studio 8.5.

4.8 Processamentos dos dados e identificação de proteínas

Os arquivos de dados (.d) obtidos das análises NanoLC-MS/MS foram importados para o software PEAKS Studio 8.5 (Bioinformatics Solution Inc., Waterloo, Canadá) e os espectros MS/MS foram submetidos à análise através da busca no banco de dados usando peaksDB, PTM e Spider (ZHANG et al., 2012). Uma vez que o fungo R.microsporus VC (isolado) é filogenéticamente diferentes dos outros fungos (WU et al., 2003) e tem uma base de dados de proteínas não curadas, e A.niger apresenta um número baixo de proteínas curadas em seu banco de dados, os peptídeos sequenciados de novo com pontuação média de confiança local (ALC) ≥ 50% foram submetidos ao banco de dados Uniprot/ TrEMBL, onde são descritas 49.897 sequências para espécie R.microsporus (baixadas em agosto de 2017) e banco de 36.152 sequências para espécie A.niger UniprotKB (baixadas em setembro de 2017).

Os parâmetros de entrada foram configurados da seguinte forma: tolerância de massa de precursor de 20 ppm (MS), tolerância de massa de fragmento de 0,025 Da (MS/MS), tripsina ou quimotripsina como enzima específica em uso, máximo de duas falhas de clivagem, Cys carbamidometilação (+57.02 Da) como modificação fixa e Met oxidação (+15.99 Da) como modificação variável. As taxas de descoberta falsa (FDRs) para proteínas e peptídeos foram fixadas em um máximo de 1%. Todas as proteínas identificadas têm pelo menos 01 peptídeo único.

Com o intuito de obter informações sobre as funções das proteínas, papel biológico e suas relações no mapa de reações bioquímicas, os conjuntos de dados proteômicos apresentados foram analisados utilizando ferramentas de bioinformática que operam sobre algorítmos relacionados com a evolução de sequências protêicas, e, que dotados de um banco de dados abrangente possam fornecer tais infomações. Este recurso bioinformático inclui informações sobre as vias de regulação metabólica, famílias e subfamílias de genes, função molecular, processo biológico e componente celular (BANCI et al.,2011).

A ontologia genética (GO) é uma importante ferramenta de bioinformática com características de genes em todas as espécies, e pode ser dividida em componente celular, função molecular e processos biológicos. Neste estudo as análises de proteínas identificadas

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foram realizadas pelo sistema de classificação Uniprot - The universal protein knowledgebase (THE UNI CONSORTIUM1,2,3,4, 2017).

4.9 Desenho experimental da análise proteômica. Como descrito anteriormente, a proteômica tem sido empregada amplamente nos estudos de microrganismos aplicados em processos de bioremediação, por ser uma técnica efetiva na identificação de proteínas relacionadas a adsorção de íons metálicos e identificação de possíveis biomarcadores ambientais.

A Figura 7 representa o fluxograma dos processos envolvidos no estudo proteômico dos fungos.

Figura 7: Fluxograma das etapas de análise proteômica dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC.

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5 RESULTADOS

5.1- Avaliação da tolerância dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC ao cobre em meio, semi-sólida e submersa.

Em geral, a inerente robustez dos processos biotecnológicos exige um significativo controle de todas as etapas de produção, pois pequenas variações podem resultar em grandes diferenças nos bioprocessos (e.g rendimento, tempo). Consequentemente, diferentes tipos de fermentação (e.g estado sólido ou líquido) apresentam significativa diferença, mesmo quando os processos são semelhantes (microrganismo, fonte de carbono, temperatura, etc). Processos de fermentação microbiana têm sido estabelecidos como uma poderosa ferramenta para a produção de diferentes compostos orgânicos (eg. enzimas, ácidos orgânicos) devido ao seu baixo custo, eficácia e vantagens ambientais (DEY et al., 2016).

Chang, (CHANG et al. 2014) estudou a aplicação de fungos na degradação de substâncias tóxicas como bisfenol A, bisfenol F, nonilfenol e tetrabromobisfenol, responsáveis pela desregulação endócrina. A utilização do fungo Pleurotus eryngii em fermentação submersa e sólida, mostrou que a taxa de remoção de produtos químicos tóxicos utilizando o fungo P.eryngii apresentou maior eficiência na fermentação semi-sólida. Das, (DAS et al. 2015) estudou a produção de ácido fumárico através da fermentação submersa e sólida, utilizando o fungo R.oryzae e resíduos de celulose de diferentes tamanhos de partícula. Neste caso, observou-se maior produção de ácido fumárico na fermentação submersa de 23,47 ± 0,7 g/L em 48 horas de cultivo, enquanto a fermentação sólida produziu 41,65 g de ácido fumárico/ kg de peso seco do sólido em 21 dias.

A fermentação sólida ou semi-sólida vem se destacando como uma técnica promissora na produção enzimática, pois imita o habitat natural dos fungos filamentosos e permite a utilização de matéria prima de baixo valor agregado ou resíduos sólidos (ALI e ZULKALI, 2011). No entanto, a fermentação submersa é o método preferido da indústria, devido ao melhor controle de parâmetros como agitação, temperatura, aeração, espuma, pH, entre outros fatores importantes na produção enzimática (HANSEN et al., 2015). Tendo em vista os trabalhos reportados na literatura, no presente estudo, a tolerância à presença de cobre foi avaliada em função do tipo de fermentação (em estado semi-sólido e submersa).

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5.1.1 Avaliação da tolerância do A.niger VC e R.microsporus VC ao cobre em fermentação semi-sólida (Toxicidade em placas)

Muitos íons metálicos têm influência direta sobre o processo fisiológico e bioquímico de microrganismos. O crescimento, que reflete o metabolismo celular, tem sido usado como indicador chave na toxicidade de metais pesados para microrganismos (URUNAKUMARA e XUECHENG, 2008).

Com o objetivo de se verificar a tolerância dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC ao íon metálico Cu+2, foram realizados estudos de crescimento dos fungos em meio sintético PDA (fermentação sólida) com concentrações finais de 50, 100, 200, 400, 800 e 1200 mg/L de íons Cu+2. As Figuras 8 e 9 apresentam fotos das culturas em placa após 15 dias de incubação dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC, respectivamente. Pôde-se observar que não houve inibição da fase germinativa do fungo pelo metal em concentrações de 50, 100, 200 e 400 mg/L no período de 15 dias para a cepa A.niger VC, entretanto, para o fungo R.microsporus VC foi observada a inibição germinativa em concentrações acima 200 mg/L de íons Cu2+.

Verificou-se que em ambos os cultivos o processo germinativo, crescimento de hifas e consequentemente formação de micélios deu-se de forma mais lenta nos fungos após exposição ao metal, sugerindo modificação no metabolismo dessa espécie em concentrações mais elevadas de cobre. As imagens das placas onde os crescimentos foram totalmente inibidos não estão sendo apresentadas.

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Figura 8: Placas inoculadas com esporos de A.niger VC em meio de cultivo PDA após 15 dias: (A) Sem cobre. (B) 50 mg/L de cobre. (C) 100 mg/L de cobre. (D) 200 mg/L de cobre. (E) 400 mg/L de cobre.

A B C

D E

Figura 9: Placas inoculadas com esporos de R.microsporus VC no meio de cultivo PDA após 15 dias: (A) Sem cobre. (B) 50 mg/L de cobre. (C) 100 mg/L de cobre. (D) 200 mg/L de cobre.

A B C

D

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De acordo com os resultados apresentados acima, tanto o A.niger VC como o R.microsporus VC apresentaram maior inibição na fase germinativa quando expostos às maiores concentração de Cu+2. Os resultados corroboram com a literatura que reporta, que o cobre é um elemento essencial para o metabolismo do fungo, no entanto, quando presente em altas concentrações inibe a atividade germinativa, como observado para o fungo A.niger VC em concentrações superiores a 400 mg/L de cobre e para o R.microsporus VC em concentrações acima de 200 mg/L (ANAHID et al., 2011).

5.1.2 Curva de Crescimento e Quantificação da Concentração Celular - Fermentação submersa Com a avaliação da tolerância dos fungos em presença de íons cobre através do processo de fermentação semi-sólida, foram estimadas concentrações de 50, 100, 200 e 400 mg/L de íons Cu2+ para os testes em meio líquido (fermentação submersa) a fim de determinar a melhor concentração de trabalho para as duas espécies. Na fermentação submersa foi observada a MIC em 50 mg/L de íons Cu2+ para o fungo R.microsporus VC, enquanto para o fungo A.niger VC a MIC foi de 200 mg/L de íons Cu2+. A partir dos dados observados na fermetação submersa foi definida a concentração de 50 mg/L de íons Cu2+ para este estudo, pois acima desta concentração não foi observado crescimento celular do fungo R.microsporus VC após 168 horas de incubação.

O padrão de crescimento do fungo A.niger VC foi determinado em células cultivadas em meio potato dextrose (PD) controle e na presença de 50 mg/L de íons Cu2+ (Figura 10). As células de controle mostraram a fase de adaptação e o crescimento acelerado, atingindo a fase estacionária em aproximadamente 140 h. Em contraste, foi observada uma pequena inibição do crescimento celular pelo tratamento com cobre, contudo a fase estacionária não foi alcançada. A taxa de crescimento celular foi 14,63% menor quando o fungo foi tratado com metal, sugerindo maior resitência da espécie A.niger VC a exposição aos íons cobre.

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Figura 10: Curva de crescimento celular do fungo A.niger VC ( ) ausência de cobre, ( ) 50mg/L de Cu2+.

Ao comparar o padrão de crescimento do fungo R.microsporus VC, cultivados em meio PD (controle e presença de 50 mg/L de Cu2+), Figura 11, as células do controle apresentam crescimento celular acelerado, atingindo a fase estácionária em aproximadamente 70 horas. Em contraste, o cultivo na presença do metal foi observado inibição do crescimento celular do fungo R.microsporus VC, atigindo o início da fase estacionária em aproximadamente 50 horas de cultivo. Foi observada a redução de 65,14% do crescimento celular em presença do agente oxidante, sugerindo menor resitência da espécie a íons cobre.

Figura 11: Curva de crescimento celular do fungo R.microsporus VC ( ) ausência de cobre, ( ) 50mg/L de Cu2+.

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5.2 Ensaios de adsorção em batelada para remoção Cu2+

Este estudo foi realizado a fim de determinar o poder de adsorção de cobre pelos fungos A.niger VC e R.microsporus VC em dois pontos da curva de crescimento celular e através destas análises, foi possível determinar os pontos de coleta para realização da análises proteômicas. Através da análise proteômica, é possível observar modificações do metabolismo fungico após exposição a íons cobre.

Para análise de adsorção foram escolhidos os pontos de 72 e 90 horas de cultivo do fungo A.niger VC e o tempo de 48 e 60 horas para R.microsporus VC. O resultado dos experimentos individuais para os fungos estudados são apresentados na Figura 12, onde é possível observar o comportamento da remoção de íons cobre do meio em função crescimento celular em presença do íon metálico. No caso da adsorção do metal pelo fungo A.niger VC, cultivado no meio PD contendo 50 mg/L de íons Cu2+, nos pontos de 72 e 90 horas foi obervada uma remoção de 31 mg/L em 72 horas de cultivo, e 18,7 mg/L em 90 horas, sendo o percentual de adsorção realizada pela biomassa fúngica, 62,0 % e 37,4 %, respectivamente.

Para o fungo R.microsporus VC nos tempos de 48 e 60 horas de crescimento celular em meio PD contendo 50 mg/L de íons Cu2+, e foram removidos 22,5 mg/L e 21,8 mg/L, sendo observada uma pequena redução na porcentagem de adsorção do íons metálico 45,0 % e 42,7%, respectivamente.

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Figura 12: Adsorção de íons Cu2+ no cultivo dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC em 50 mg/L.

Os dados obtidos a partir da adsorção doi determinada os tempos de coleta de material de 72 h para fungo A.niger VC e 48 h para R.microsporus VC para a realização das análise proteômica.

5.3 Análises Proteômicas das espécies

Os efeitos da exposição ao cobre no proteoma dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC foram investigados por abordagem proteômica qualitativa de identificação das proteínas realizada através da técnica nanoLC-ESI-Q-TOF.

Para identificar e caracterizar o perfil proteômico dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC em resposta a exposição aos íons Cu2+, foram utilizados os tempos de cultivo de 72 horas para a espécie A.niger VC e 48 horas para a espécie R.microsporus VC (item 4.3.2), sendo realizado o estudo proteômico nestes pontos por apresentar maior absorção dos íons metálicos. O diagrama de Venn é o modo usual para avaliar a distribuição protêica entre os cultivos, bem como as proteinas comuns (sobreposição) aos cultivos estudados.

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5.3.1- Aspergillus niger VC A análise quantitativa da expressão protêica do fungo A.niger VC revelou um total de 1608 proteínas identificadas em pelo menos duas repetições, sendo 1476 proteínas identificadas no cultivo em ausência de cobre e 1352 proteínas no cultivo contendo os íons metálicos, este resultado mostra uma redução de aproximadamente 17% no número de proteínas expressas no cultivo contendo os íons Cu2+,A partir do diagrama de Venn (Figura 13) do fungo A.niger VC, observou se 1220 proteínas comuns aos dois cultivos (ausência e presença de cobre).

Contudo, apenas 132 proteínas foram expressas exclusivamente no meio contendo íons metálicos. Apesar do fungo A.niger VC não apresentar grande alteração no crescimento celular, provavelmente devido à resistência ao metal, a diferença na expressão protêica ocorre possivelmente em consequência da ativação da resposta ao estresse oxidativo que permite a sobrevivência e crescimento celular.

Figura 13: Diagrama de Venn do perfil proteômico da espécie A.niger VC: 72 horas de incubação em meio PD: (A) ausência de cobre; (B) presença de cobre.

A B 256 1220 132

As 1220 proteinas comuns mostradas no diagrama de Venn representam principalmente proteínas relacionadas ao metabolismo basal do fungo (77,8%). As proteínas mais representatitvas no fungo A.niger VC nos diferentes cultivos foram identificadas de acordo com o número de peptídeos, sendo elas a proteína NACHT domain protein, translation elongation factor 2, fatty acid synthase beta subunit, pyruvate carboxylase, Aspergillus niger genomic contig, An04c0090, heat shock protein sspB-Aspergillus niger e ATP synthase subunit beta. Comparando as proteínas expressas na ausência e presença de cobre, foram 33

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identificadas diferentes proteínas (Tabela 1), mostrando a diferença das respostas do metabolismo celular após a exposição ao estresse oxidativo.

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Tabela 1: Dez principais proteínas identificadas com maior número de peptídeos em condições diferentes de cultivo do fungo A.niger VC.

Nº de acesso -10logp Cobertura (%) Peptídeos Proteínas Ausência Cobalamin-independent A0A117DYT5 44342 52 37 methionine synthase A0A100IED2 42355 46 36 Elongation factor 2-oxoglutarate dehydrogenase A0A117DXF8 41556 34 26 E1 component A0A117E173 34101 38 22 Hsp70 chaperone A0A100IAD1 34517 25 16 Aminopeptidase C A0A100IFA7 30427 22 13 Aconitase family protein Glycogen debranching enzyme A0A124BUR9 24060 6 13 Gdb1 Aspergillus niger contig An10c0020, genomic contig A2QUW9 24336 38 12 (EC 1.1.1.-) Aspergillus niger contig An16c0250, genomic contig A2R8S1 28850 21 12 (EC 3.4.14.-) Bifunctional purine A0A100IA47 25819 15 12 biosynthesis protein Ade16 Presença 50 mg/L Cu2+ G3XZT4 39087 46 25 Uncharacterized protein Translation elongation factor D7GAW3 36317 57 17 1-alpha (Fragment) A0A100INN3 26592 36 14 14-3-3 protein I7B155 25053 53 12 Calmodulin (Fragment) Aspergillus niger contig An12c0380, genomic contig A2R121 28732 39 11 (EC 1.3.1.-) NADH-ubiquinone A0A100IQ03 27053 35 10 oxidoreductase 39 kDa subunit Aspergillus niger contig An16c0230, genomic contig A2R8G7 26480 37 8 (EC 1.1.1.100) Aspergillus niger contig An08c0230, genomic contig A5ABB4 21941 24 7 (EC 1.1.1.91) A0A100IPI0 17412 18 7 Heat shock protein 60 A0A100IU47 25347 25 7 Norsolorinic acid reductase

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Dentre as proteínas comuns aos cultivos na ausência e na presença de íons Cu2+, podemos destacar a presença de proteínas características de condições de estresse, como serine/threonine-protein phosphatase, relacionadas à conformação das organelas e componentes do proteossoma, proteínas mitocondriais como cytochrome c oxidase subunit 2, cytochrome b-c1 complex subunit 7, proteases de pré-equivalência mitocondrial, e pyruvate carboxylase.

Em Ontologia Genética (GO, do inglês Gene Ontology), a função molecular detalha as reações a nível molecular, vinculadas às atividades catalítica, transporadoras e antioxidantes. A análise dos dados mostrou 10 funções moleculares na ausência e presença de 50 mg/L de íons Cu2+, sendo elas, ligação, reguladora enzimática, reguladora de transcrição, peroxidases, receptora, molécula estrutural, transdutora de sinais, catalítica, superóxido desmutase, proteínas marcadoras (protein tag), fosforilação, transportadora de oxigênio e transportadora.

Na comparação das funções moleculares das diferentes proteínas expressas nos cultivos do fungo A.niger VC na ausência (Figura 14) e presença de íons cobre (Figura 15), observa-se uma redução de 7,1% nas proteínas relacionadas às atividades catalítica redução de 56 para 52% e de 50% nas proteínas de atividade reguladora enzimática redução de 2 para 1% em condições de estresse por cobre. Proteínas com funções de atividades transdutora de sinal, peroxidases e moléculas estruturais também não foram identificadas na condição de estresse. Observou-se em presença de cobre, abundância na expressão de proteínas com atividade de ligação (13,9%), e expressão de proteínas com atividades superóxido dismutase, transportadora de oxigênio e reguladora de transcrição (ligação de proteínas ao DNA).

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Figura 14: Função Molecular no fungo A.niger VC na ausência de cobre (Uniprot, http://www.uniprot.org).

2% atividade catalítica

atividade peroxidase 36% atividade transdutora de sinal

atividade molécula estrutural 56% atividade transportadora

ligação 2% 2% 1% atividade reguladora 1% enzimática

Figura 15: Função Molecular no fungo A.niger VC em presença de cobre (50 mg/L Cu2+) (Uniprot, http://www.uniprot.org).

1% 1% atividade catalítica

atividade superóxido dismutase 41% atividade transportadora

atividade transportadora de 52% oxigênio ligação

atividade reguladora enzimática 1% 1% 3% atividade do reguladora de transcrição

Dentre as funções moleculares identtificadas na ausência do agente oxidante, foram identificadas duas classes protêicas, que expressaram somente uma proteína para cada função, sendo elas: função molecular correspondente a atividade do fator de transcrição da RNA polimerase II, ligação de DNA específica de sequência, identificando a proteína Aspergillus 37

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niger genomic contig, An07g08100, e uma proteína com função de marcação denominadas protein tag como Aspergillus niger contig, An08g02950, cuja função molecular está relacionada ao processo de fosforilação em resposta à interações químicas ou mudanças ambientais.

Nas proteínas relacionadas às funções moleculares identificadas em ambos os cultivos, não foram observadas alterações expressivas na porcentagem de proteínas com atividade catalítica, atividade transportada e atividade reguladora enzimática. Contudo, proteínas com funções com atividade transdutora de sinal, molécula estrutural e peroxidases não foram identificadas nos cultivos contendo cobre.

Dentre as 132 proteínas expressas exclusivamente no cultivo em presença de cobre, observou-se um aumento de 13,9% nas proteínas de ligação, quando comparado ao cultivo na ausência de cobre. Proteínas de ligação como calmodulin, NADH: flavin oxidoreductase, 1- phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase, 14-alpha sterol demethylase Cyp51B foram expressas em presença de cobre. Também foi observada expressão de oxidoreductase (atividade catalítica), como aldo-ceto redutase, NADH-flavina oxidoredutase e NADH- oxidase, proteínas que catalisam a reação oxidação-redução (redox), alterando assim o estado intracelular.

No entanto, as proteínas de choque térmico (HSPs) diferencialmente expressas foram encontradas em maior proporção na ausência do metal, quando comparadas as HPSs identificadas na presença de Cu2+ (Tabela 2).

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Tabela 2: Identificação de HSPs diferencialmente expressas em A.niger VC após incubação em presença e ausência de íons Cu2+.

Nº de acesso Proteínas -10lgP Peptídeos Cultivo

A0A100I2M0 Mitochondrial protein import protein 8923 3 (0) Mas5

A0A100IN43 Survival factor 1 11767 4 (0)

A0A100ITR6 DnaJ domain protein 6887 1 (0)

A0A117DZ14 T-complex protein 1, alpha subunit 8187 1 (0)

A2QQ88 Mitochondrial import innermembrane 6650 1 (0) translocase subunit TIM44

A0A124BXP0 Cytochrome P450 alkane 9409 2 (0) hydroxylase A0A100IK26 Cytochrome P450 19784 3 (0) monooxygenase A0A117DZ55 Aha1 domain family 8367 2 (0)

A0A117E173 Hsp70 chaperone 34101 22 (0)

A0A100INN3 14-3-3 protein 26592 14 (1)

A0A124BY48 LMBR1domain protein 6108 1 (1)

A2QIV5 Superoxide dismutase (Cu-Zn) 5064 1 (1)

A0A100IPI0 Heat shock protein 60 17412 7 (1)

Q6A596 Heat shock protein 27818 15 (1)

Legenda: proteínas expressas: ausência de Cu2+(0), presença de Cu2+ (1)

Nota-se que em condições de estresse, ocorre redução na expressão de proteínas relacionadas à mitocôndria, enquanto aumentam significativamente as proteínas HSP, catalase e catalase-peroxidase. Proteínas como HSP, HPS 60 e superoxido desmutase geralmente abundantes sob o estresse de cobre (FENG, 2017) foram identificadas em presença do metal. Contudo, devido à restistência apresentada pelo fungo A.niger VC não foram observadas maiores expressões de proteínas de choque térmico. Na Tabela 3 são apresentadas proteínas diferencialmente expressas em presença de cobre.

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Tabela 3: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massas do fungo A.niger VC em presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

Nome Nº de acesso Massa (Da) Função

Resposta ao estímulo Superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) A2QIV5 25274 Cataliza a dismutação do superóxido. Heat shock protein 60 (mitocondrial) A0A100IPI0 61846 Restaurar a atividade biológica de uma proteína desdobrada usando proteínas auxiliares, como chaperones. Heat shock protein (70 familly) Q6A596 66884 Atua na interação seletiva e não covalente com ATP. LMBR1 domain protein A0A124BY48 125927 Atua na interação seletiva e não covalente com uma proteína chaperone.

Regulação na produção de proteínas LSM domain family protein A0A124BW51 12839 Facilita o processamento de RNA, incluindo degradação, edição e regulação. A.niger contig An14c0130, A2R359 86617 Atua no movimento dos nucleossoma ao longo de um genomic contig fragmento de DNA. A.niger contig An01c0190, A2Q8R5 35217 Mutação; genomic contig Ligação de um complexo de proteína a um filamento de actina, evitando assim a adição, troca ou remoção de outras subunidades de actina. A.niger contig An17c0110, A2R9R2 46585 Oxidação; genomic contig Vincula e aumenta a atividade de uma enzima. A.niger contig An06c0090, A2QLM3 64565 Atua na montagem, disposição de partes constituintes. genomic contig ou desmontagem de estruturas citoesqueléticas que compreendem filamentos de actina.

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Multifunctional tryptophan biosynthesis proteinP05328 82910 Atua na catálise da transferência de um grupo, por exemplo, um grupo metilo, grupo glicosilo, grupo acilo, contendo fósforo ou outros grupos, de um composto aceptor de elétron. Ferulic acid decarboxylase 1 G3XWH2 58587 Cataliza a descarboxilação reversível de ácidos carboxílicos Aromáticos. Cyclin-dependent kinases regulatory G3Y702 12501 Atua na modulação e atividade de uma proteína serina/treonina subunit quinase dependente de ciclina, enzimas da família proteína quinase que são reguladas por associação com ciclinas e outras proteínas. Phospholipase (EC 3.1.4.4) A2R689 135876 Atua na célula utilizando um lípido contendo inositol para converter um sinal em uma resposta metabólica. Peptidylprolyl isomerase A2R2I4 11345 Mutação Adenosine kinase A0A100IQC1 38325 Atua na produção de nucleósido de purina de seus derivados, sem nova síntese celular. A.niger contig An09c0070, A2QTQ4 41928 Mutação genomic contig Catálise de reação de fosfato. Legenda: As 132 proteínas expressas pelo fungo A.niger VC em presença de cobre encontram-se na Tabela 2 do Anexo I.

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Os processos biológicos estão relacionados a uma série de eventos dentro do metabolismo celular como, por exemplo, são responsáveis por um conjunto de funções moleculares, processos metabólicos, processo celular ou resposta ao estímulo. Dentre as diferentes proteínas expressas nos diferentes cultivos, foram classificados nove processo biológico. Nos cultivos de 72 h do fungo A.niger VC, percebe-se redução significativa nas proteínas dos processos celulares (74,4% ), metabólicos (81,5%) e localização celular (32,4%). Vale a pena notar que, mesmo na ausência de Cu2+, proteínas de resposta ao estímulo foram identificadas, o que significa que os íons Cu2+ presentes no cultivo não foram os únicos responsáveis por este estímulo (Figura 16).

Figura 16: Processos Biológicos expressos no fungo A.niger VC: ( ) ausência de cobre e ( ) presença de Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

processo catabólico do formaldeído 1

esporulação assexuada 1 7 regulação biológica 16 12 localização 37 1 resposta ao estímulo 13 1 processo de desenvolvimento 1 5 organização dos componentes celulares 11 32 processo celular 125 27 processo metabólico 146

0 50 100 150 200 Nº proteínas

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No cultivo do fungo A.niger VC em presença de íons cobre, além da supressão de proteínas envolvidas nos metabolismo celular, nota-se a redução de aproximadamente 90% das proteínas relacionadas com a resposta ao estímulo, como autophagy-related protein 8, protein transport protein sec13, survival factor 1, Aspergillus niger genomic contig, An09c0040, entre outras. Por outro lado, na ausência de íons cobre foi observada a proteína S- formylglutathione hydrolase (FGH), uma enzima chave na biossíntese de glutationa (GSH), que é o principal antioxidante endógeno gerado pelas células (S-formilglutationa + H2O → glutationa + formiato).

Dentre os processos metabólicos identificados na ausência do agente oxidante, destacam proteínas correspondentes ao metabolismo de aminoácidos, nitrogênio, carboidratos e compostos de carbono, metabolismo de lipídeos, biossíntese de vitaminas e cofatores enzimáticos, como, por exemplo, autophagy-related protein 8, probable glucan endo-1,3- beta-glucosidase eglC, alpha,alpha-trehalose-phosphate synthase [UDP-forming]2. Estas enzimas estão relacionadas às reações e via químicas na quebra de polissácarídeos, além de proteínas que resultam na alteração da parede celular, ou dos dissacarídeos isômeros da sacarose. Funções que auxiliam na manutenção da forma estrutural da célula e protegem a lise osmótica do metabolismo fúngico (THE UNI CONSORTIUM1,2,3,4, 2017). Também foi observada na ausência de íons metálicos a subexpressão de enzimas envolvidas na glicólise e gliconeogênese, como pyruvate kinase e enolase, bem como a glutamine synthetase e adenosylhomocysteinase, enzimas envolvidas no metabolismo dos aminoácidos e que estão associadas à assimilação de cobre na célula.

Enzimas da via glicolítica foram identificadas em maior concentração na ausência do metal, como por exemplo, pyruvate kinase, pyruvate carboxylase, phosphoenolpyruvate carboxykinase, pyruvate dehydrogenase, malate synthase, phosphoglycerate mutase, isocitrate lyase. Entretanto, na presença do metal não foram identificadas proteínas da via glicolítica. A redução de enzimas pertencentes à via glicolítica, reduzem o fornecimento de ATP e intermediários, sendo afetadas em presença de cobre. Logo o estresse causado pelo cobre causa danos principalmente nas etapas catalíticas posteriores à glicólise afetando o desenvolvimento célular.

Em presença de cobre foi observada a sub expressão de proteínas responsáveis pela transferência catalítica como acetyl-CoA-acetyltransferase, branched-chain amino acid

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aminotransferase, arylamine N-acetyltransferase 2 e Aspergillus niger genomic contig, An10c0050. A presença de íons métalicos também ocasionou a sub expressão de proteínas doadoras de elétrons como 3-isopropylmalate dehydrogenase e Aspergillus niger genomic contig, An18c0170, que associadas a um grupo glicosil contendo fósforo, transformam-se em proteínas receptoras (THE UNI CONSORTIUM1,2,3,4, 2017).

Na espécie A.niger VC em ambos os cultivos (ausência e presença de íons Cu2+), foi caracterizado um amplo repertório de proteínas em resposta à mudanças ambientais (ambiente de mina). Através dos resultados obtidos no estudo proteômico, podemos destacar as proteínas associadas a um cofator de íons metálicos, denominados metaloproteínas, onde existem ordens naturais de estabilidade para os metais divalentes. Entre as metaloproteínas expressas em ambas as culturas pelo fungo A.niger VC (Tabela 4), observou-se uma inibição da expressão da proteína sob condições de estresse (adição de cobre).

Tabela 4: Metaloproteínas diferencialmente expressas A.niger VC em presença e ausência de íons Cu2+.

Nºde Accesso Proteínas -10lgP Peptídeos Classificação Cultura

A2QIL3 Aminopeptidase 22978 13 Metaloprotease (0) A2QAJ5 Dipeptidase 5625 1 Metaloprotease (0) A2RBC2 Probable 3468 1 Metalopeptidase (0) carboxypeptidase, An18g06210 A2QQ88 Mitochondrial import 6650 1 Chaperona (0) innermembrane translocase subunit TIM44 A0A117DZ14 T-complex protein 1, 8187 1 Chaperona (0) alpha subunit A0A117DZ55 Aha1 domain family 8367 2 Chaperona (0) A0A100IRN1 Vacuolar 7979 2 Metalocarboxipeptidase (1) carboxypeptidase Cps1 A0A124BY48 LMBR1 domain 6108 1 Chaperona (1) protein A2QIV5 Superoxide dismutase 5064 1 Superoxide dismutase (1) Legenda: proteínas expressas: ausência de Cu2+(0), presença de Cu2+ (1)

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5.3.2- Rhizopus microsporus VC A análise quantitativa da expressão protêica do fungo R.microsporus VC revelou um total de 1459 proteínas identificadas em pelo menos duas repetições, sendo 1070 proteínas identificadas no cultivo em ausência de cobre e 1232 proteínas no cultivo contendo os íons metálicos, este resultado mostra um aumento de aproximadamente 15% no número de proteínas expressas no cultivo contendo íons Cu2+. A partir do diagrama de Venn (Figura 17) o fungo R.microsporus VC, observou-se 843 proteínas comuns aos dois cultivos (ausência e presença de cobre)

Figura 17: Diagrama de Venn da análise proteômica da espécie R.microsporus VC com 48 horas de incubação em meio PD: (A) ausência de cobre; (B) presença de cobre.

B A 843 389 227

Das 843 proteínas comuns aos cultivos, conforme demonstrado no diagrama de Venn, 75% delas correspondem ao metabolismo basal do fungo. As proteínas mais representatitvas no fungo R.microsporus VC nos diferentes cultivos foram classificadas de acordo com o número de peptídeos identificados, como por exemplo, putative Fas2p, ATP- citrate synthase, pyruvate decarboxylase isozyme, Hsp71-like protein, elongation factor 1- alpha fructose-bisphosphate aldolase, class II e ATP synthase subunit alpha. Comparando as proteínas expressas na ausência e presença de cobre, foram identificadas diferentes proteínas (Tabela 5), mostrando a diferença das respostas do metabolismo celular após a exposição ao estresse oxidativo.

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Tabela 5: Dez principais proteínas identificadas com maior número de peptídeos em condições diferentes de cultivo do fungo R.microsporus VC.

Nº de acesso -10logp Cobertura (%) Peptídeos Proteínas

Ausência A0A1X0S6B0 33618 50 16 Rhizopuspepsin II A0A1X0S6C4 30395 47 14 Extracellular aspartic proteinase A0A0A1MR64 27333 12 14 Uncharacterized protein A0A1X0S5Y9 25394 29 7 Lipase Putative V-type proton A0A0A1NIV8 21183 37 7 ATPase subunit B A0A0C7BZ89 20125 16 7 Uncharacterized protein A0A1X0RQ56 18045 17 6 Glucoamylase 1 A0A1X0RQ56 18045 17 6 Glucoamylase 1 A0A1X0RUE4 19543 11 6 Heme peroxidase Putative Lipase A0A0A1NRG7 24819 24 6 preproprotein (Precursor) Presença 50 mg/L Cu2+ A0A0A1NWB8 41161 58 30 Putative Heat shock protein 70 Uncharacterizedprotein A0A1X0RYW6 34513 50 18 (Fragment) A0A0C7CL20 33057 24 15 Putative Transketolase NAD-specificglutamate A0A1X0RNB3 19422 16 12 dehydrogenase (EC 1.4.1.2) A0A0C7BPW7 25188 29 10 Uncharacterized protein A0A1X0SB54 27024 28 10 40S ribosomal protein S6 ATP-dependent 6- phosphofructokinase(ATP-PFK) A0A1X0S2U0 23839 12 8 (Phosphofructokinase) Putative Ubiquinol-cytochrome c A0A0C7B4Q9 26118 44 8 reductase cytochrome c1 subunit Putative 30S ribosomal A0A0A1P1D1 20202 44 7 protein S10e A0A1X0S364 24767 32 7 Ribosomal protein L19

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Dentre as proteínas comuns a os cultivos, podemos destacar a presença de proteínas características de condições de estresse, como Serine/threonine-protein phosphatase, duas proteínas da família HPS-7 e HSP 60, seis proteínas da família HSP 70, duas proteínas da família HSP 90, HSP e SSB1. Observou-se também a presença de proteínas mitocondriais como mitochondrial cytochrome c oxidase subunit, cytochrome b-c1 complex subunit 7, e protease como pyruvate carboxylase que apresenta interação seletiva e não covalente com qualquer íons metálico. A maioria das HPS diferencialmente expressas no fungo R.microsporus VC foram identificadas após exposição aos íons Cu2+ (Tabela 6).

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Tabela 6: Identificação de HSPs diferencialmente expressas em R.microsporus VC após incubação em presença e ausência de íons Cu2+.

Nº de acesso Proteínas -10LgP Peptídeos Cultivo A0A0A1MR01 HSP20-like chaperone 7692 1 (0) A0A1X0RMA2 DUF1744-domain-containing 5664 1 (0) protein A0A0C7BDR3 Putative DNA polymerase 6128 1 (0) A0A0C7BZ89 Uncharacterized protein 20125 7 (0) A0A0C7BF35 Uncharacterized protein 4961 1 (0) A0A1X0RUE4 Heme peroxidase 19543 6 (0) A0A0C7BYC4 Catalase 12324 2 (0) A0A1X0RT54 Catalase 12324 2 (0) A0A0A1N1T5 Catalase 7935 1 (1) A0A1X0RL43 Heat shock protein Hsp90 11698 2 (1) A0A0A1NWB8 Putative Heat shock protein 41161 30 (1) 70 A0A0C7BLY5 Putative Heat shock protein 6608 1 (1) 78, mitochondrial A0A1X0S643 DnaJ-domain-containing 7116 1 (1) protein A0A1X0SDV8 ATPase GET3 6497 2 (1) A0A0C7C734 Uncharacterized protein 4589 1 (1) A0A0C7BEY1 Uncharacterized protein 4320 1 (1) A0A0C7C0M8 Unncharacterized protein 9619 2 (1) A0A0C7BDX0 Uncharacterized protei 11698 2 (1)

A0A1X0RQT6 Cytochrome P450 9498 2 (1) Legenda: proteínas expressas: ausência de Cu2+(0), presença de Cu2+ (1)

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O detalhamento das reações a nível molecular realizado através GO (Uniprot) mostrou a identificação de proteínas referentes à 8 funções moleculares principais: ligação, reguladora enzimática, peroxidases, catalítica, transportadora, reguladora de função molecular e atividade estrutural constitutiva do ribossomo.

Ao comparar as funções moleculares das diferentes proteínas expressas nos cultivos do fungo R.microsporus VC na ausência (Figura 18) e presença de íons cobre (Figura 19), foi observada em condições de estresse uma redução de 50% nas proteínas com atividade reguladora do transporte e peroxidases, enquanto observou-se um aumento da expressão de proteínas de ligação (17,6%). Por outra lado, proteínas responsáveis pela estrutura do ribossomo e regulação da função estrutural da molécula não foram identificadas. No cultivo contendo íons metálicos nota-se a expressão de proteínas com função estrutural molecular e proteínas responsáveis pela regulação enzimática.

Nos cultivos na ausência de íons metálicos, foi possível observar a expressão de enzimas que atuam na integridade estrutural do ribossomo no citoplasma e proteínas responsáveis pela repação do DNA celular como, 60S ribosomal protein L20, Putative 40S ribosomal protein S6, Putative DNA polymerase, DUF1744-domain-containing protein. Na presença de cobre foi observada a expressão de proteínas de regulação da atividade enzimática como, ERG2 and sigma1 receptor-like protein, Protein phosphatase PP2A regulatory subunit B e Proliferating cell nuclear antigen, estas enzimas atuam como cofatores de íons metálicos que se unem a proteína receptoras de elétrons no processo de catalise substrato proteico.

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Figura 18: Função Molecular do fungo R.microsporus VC na ausência de cobre (Uniprot, http://www.uniprot.org).

2% 2% constituinte estrutural do ribossomo 34% atividade catalítica

atividade da peroxidase

atividade do transportador 6% 54% ligação

2% regulador de função molecular

Figura 19: Função Molecular do fungo R.microsporus VC em presença de cobre (50mg/L Cu2+) (Uniprot, http://www.uniprot.org).

1% atividade catalítica

atividade da peroxidase 40% atividade da molécula estrutural atividade do 52% transportador ligação

atividade reguladora 3% enzimática 3% 1%

.

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Análisando as diferentes proteínas expressas no cultivo contendo íons cobre (389 proteínas), observa-se uma pequena redução de enzimas relacionadas à atividade catalítica (3,7%), dentre as quais foram identificadas proteínas como cytochrome P450, malic enzyme, acyl-CoA desaturase, oxidoreductase activity atuando em presença de NAD(P)H.

Dentre as proteínas de ligação expressas no cultivo de estresse induzido pelo cobre, podemos destacar, calreticulin, cell division/GTP binding protein, tyrosine--tRNA ligase, arginyl-tRNA synthetase e ATP-dependent metallopeptidase Hfl, proteínas que atuam seletivamente no citoplasma celular e não covalentemente com íons, átomos.

A expressão de proteínas com atividade de transferência/transportadora, relacionadas ao movimento de substâncias, íons ou moléculas, dentro e fora da célula ou entre grupos celulares, foi reduzida em presença do metal. Proteínas com atividade transportadoras como V-type proton ATPase subunit G, cytochrome b-c1 complex subunit rieske, mitochondrial também foram diferencialmente expressas na presença do cobre.

Proteínas de estresse oxidativo, como HSP, dnaJ-domain-containing protein foram identificadas no cultivo contendo o íon metálico, entretando, o fungo adaptado ao ambiente de mineração, apresenta proteínas de choque térmico em seu metabolismo basal. Proteínas relacionadas ao estresse oxidativo, como as HSPs foram encontradas em maior proporção em presença do metal. Na Tabela 7 são apresentadas algumas proteínas expressas em presença de cobre.

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Tabela 7: Proteínas identificadas por espectrometria de massas do fungo R.microsporus VC em presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

Nome Nº de acesso Massa (Da) Função

Resposta ao estímulo Catalase (EC 1.11.1.6) A0A0A1N1T5 54551 Libera o oxigênio produzido pelo estresse oxidativo (cofactor metálico usa o Fe2+, Cu2+, Mg2+ ou Zn2+). DnaJ-domain-containing protein A0A1X0S643 44080 Atua na interação seletiva e não covalente com uma proteína de choque térmico. Heat shock protein (Hsp90) A0A1X0RL43 85167 Propicia a manutenção de peptídeos sobre condições de estresse. Processo celular Eukaryotic translation initiation factor 3 A0A0C7BKN5 44975 Regulação da iniciação da tradução. subunit M (eIF3m)

Putative Actin-like protein 2 A0A0A1P7B5 39001 Arp2 / 3 complexo de proteína. Putative F-actin-capping protein subunit A0A0A1NNW7 29530 Interação seletiva e não covalente com formas monoméricas beta isoforms 1 and 2 ou multiméricas de actina, incluindo filamentos de actina. Putative Histone H1/5 A0A0C7B1S0 23636 Atua nas funções moleculares pelas quais um produto genético interage seletivamente e não covalentemente com o DNA. Tubulin-specific chaperone A A0A0A1PL34 12071 Atua na conclusão do dobramento de alfa e beta-tubulina; ocorre após a dobragem parcial mediada por chaperonina; mediada por um complexo de cofatores dobráveis.

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Putative Ribonucleoprotein-associated A0A0A1N4D2 13667 Interação seletiva e não covalente com uma molécula de protein (Ribonucleo protein-associated RNA ou uma sua porção. protein) Eukaryotic translation initiation factor 3 A0A0A1MPZ9 27207 Funções no início da tradução mediada por ribossomo de subunit J RNAm em um polipéptido. Eukaryotic translation initiation factor 3 A0A1X0RWZ1 113260 Funções no início da tradução mediada por ribossomo de subunit A RNAm em um polipéptido. Putative F-actin-capping protein subunit A0A0A1NNW7 29530 Atua na ligação de um complexo de proteína ou proteína à beta isoforms 1 and 2 extremidade farpada (ou mais) de um filamento de actina, evitando assim a adição, troca ou remoção de outras subunidades de actina. Putative Transketolase A0A0C7CL20 73799 Mutação; Atua nas reações e caminhos químicos, incluindo anabolismo e catabolismo, pelos quais os organismos vivos transformam substâncias químicas. Reparo do DNA, síntese e degradação de proteínas. Uncharacterized protein A0A0A1P250 33263 Mutação. NAP-domain-containing protein A0A1X0RTZ3 44918 Atua no arranjo e a união de um nucleossomo. T-complex protein 1 subunit delta A0A1X0RKK8 57419 Atua na montagem covalente e não covalente de polipéptidos. 3-isopropylmalate dehydratase A0A1X0RUE0 81951 Atua na biossíntese de aminoácidos.

Reparo do DNA Uncharacterized protein A0A0C7C0M8 49737 Atua na interação seletiva e não covalente com o DNA danificado. Legenda: As 389 proteínas expressas pelo fungo R.microsporus VC em presença de cobre encontram-se na Tabela 4 do Anexo II .

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Dentre as proteínas expressas pelo fungo R.microsporus VC, tanto em presença quanto na ausência de cobre, foram encontrados 6 processos biológicos do fungo (Figura 20). Nos cultivos do fungo R.microsporus VC em presença do íon Cu2+, percebe-se aumento significativo na presença de proteínas relacionadas aos processos celular, metabólicos, localização celular e regulação biológica.

Figura 20: Processos Biológicos expressos no fungo R.microsporus VC: ( ) ausência de cobre e ( ) presença de Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

19 regulação biológica 11

27 localização 9

8 resposta ao estímulo 7

16 organização de componentes celulares 3

122 processo celular 74

123 processo metabólico 74

0 50 100 150

Nº proteínas

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Dentre as proteínas relacionadas à síntese protêica, destacam-se as ribossomais e os fatores de elongação. Enzimas relacionadas à via glicolítica foram afetadas pela presença de íons cobre, reduzindo assim o fornecimento de ATP e intermediários.

Em ambos os cultivos foram observadas proteínas correspondentes ao metabolismo dos aminoácidos, do nitrogênio, dos carboidratos e compostos de carbono; metabolismo de lipídeos, biossíntese de vitaminas e cofatores enzimáticos, no entanto, proteínas como por exemplo glycoside hydrolase, phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, methionine aminopeptidase 2, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase foram identificadas somente em presença do íons cobre.

No cultivo do fungo R.microsporus VC em presença de íons Cu2+, além da superexpressão de proteínas envolvidas nos metabolismo celular, não houve aumento significativo de proteínas referentes à resposta ao estímulo. No entanto, houve a expressão de catalase, dnaJ-domain-containing protein, heat shock protein (Hsp90), sugerindo alteração dos processos metabólicos, devido à mudança de estado ou atividade célular, bem como modificação do organismo.

Enzimas envolvidas na glicólise e gliconeogênese, como pyruvate kinase e enolase, bem como a glutamine synthetase e adenosylhomocysteinase, proteínas associadas à assimilação de cobre na célula, foram identificadas em ambos os cultivos. Dentre as metaloproteínas diferencialmente expressas em ambos os cultivos do fungo R.microsporus VC (Tabela 8), observa-se que sob o estresse induzido pelo cobre foram expressas proteínas não detectadas na ausência do metal, assim como uma maior expressão de metaloproteases, como por exemplo Leukotriene A(4) hydrolase, Putative AFG3 family Protein e ATP-dependent metallopeptidase Hfl.

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Tabela 8: Metaloproteínas diferencialmente expressas R.microsporus VC na presença e ausência de íons Cu2+.

Nºde Accesso Proteínas -10lgP Peptídeos Classificação Cultura

A0A1X0S1W9 Uncharacterized protein 11862 1 Metaloprotease (0)

A0A0A1PKX7 Uncharacterized protein 10416 1 Metaloprotease (0)

A0A0C7BQQ3 Uncharacterized protein 16828 4 Metaloprotease (0)

A0A0A1MZB9 Uncharacterized protein 10839 3 Metaloprotease (0)

A0A0C7AWK5 Uncharacterized protein 12007 1 Metaloprotease (0)

A0A1X0S9G4 Peptidase M22, 5935 1 Metaloprotease (0) glycoprotease

A0A0A1N8S1 GrpE protein homolog 12687 1 Chaperona (0)

A0A1X0RX01 ATP-dependent 7174 1 Metaloprotease (1) metallopeptidase Hfl

A0A0A1NPA5 Putative AFG3 family 8085 1 Metaloprotease (1) Protein

A0A0C7BAC5 Putative Cell division 8085 1 Metaloprotease (1) protease ftsH

A0A0C7B9Z9 Putative YALI0A10615p 8085 1 Metaloprotease (1)

A0A0C7C4D0 Leukotriene 4909 1 Metaloprotease (1) A(4) hydrolase

A0A0A1NVS8 Methionine 3734 1 Metaloprotease (1) aminopeptidase 2 (MAP 2) (MetAP 2)

A0A0A1P552 Uncharacterized protein 4340 1 Chaperona (1) Legenda: proteínas expressas: ausência de Cu2+(0), presença de Cu2+ (1)

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6 DISCUSSÃO

Os fungos são microrganismos com amplo potencial na absorção de íons metálicos em diferentes concentrações e tem sido vastamente estudado em processos de biorremediação de áreas contaminadas com metais. O cobre, é um metal de transição essencial para uma ampla gama de enzimas, mas em excesso pode inibir o crescimento celular, metabolismo e as expressão protêica (KRUMOVA et al., 2016). As condições de estresse oferecidas pelo ambiente de mineração de cobre, permitem o surgimento de microrganismos resistentes ou adaptados molecularmente para manter a homeostase, suprimindo o estresse oxidativo intracelular (LUNA et al 2015).

Assim, foi possível observar que, nas análises da fermentação semi-sólida, os fungos isolados do ambiente de mineração apresentaram inibição da fase germinativa quando exposto a concentração superiores a 400 mg/L e 200 mg/L para os fungos A.niger VC e R.microsporus VC de Cu2+, respectivamente. Segundo a literatura, o cobre é um elemento essencial para o metabolismo do fungo, entretanto, quando presente em altas concentrações inibe a atividade germinativa (ANAHID et al., 2011).

A comparação do crescimento dos fungos cultivados em meio líquido, na ausência e presença de Cu2+, mostrou que em condições de estresse gerados pela adição de cobre, o fungo A.niger VC apresentou maior resistência. A.niger VC não exibiu redução na fase logarítmica do crescimento durante as 140 horas de cultura na presença de cobre, enquanto o fungo R.microsporus VC apresentou uma redução de 65,14% na velocidade de crescimento, e o início da fase estacionária foi observado após 50 horas de cultivo, em presença do agente oxidante.

Nos cultivos dos fungos A.niger VC e R.microsporus VC na ausência e na presença de íons metálicos, foi possível observar que a alteração do crescimento celular pode estar relacionada à influência direta dos íons metálicos sobre os processos fisiológicos dos microrganismos, tais como bloqueios de grupos funcionais biologicamente importantes ou desnaturação de enzimas. Como o crescimento reflete o metabolismo celular, ele tem sido usado como um indicador chave na tolerância de metais tóxicos para microrganismos (URUNAKUMARA e XUECHENG, 2008).

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A adsorção de íons metálicos por fungos pode ser afetada por variáveis como condições físico-químicas resultantes de alterações no pH, ligantes disponíveis e outros metabólitos presentes no meio (KAPOOR et al., 1999; DHANKHAR, 2011; GADD,2014). O pH é um dos fatores mais importantes no processo de remoção de metais utilizando biomassas microbianas, visto que influencia na solubilidade dos metais (PINO, 2005; GADD, 2014).

Considerando os resultados de adsorção de cobre apresentados pelos fungos foi possível determinar que a maior eficiência, ou seja, máxima absorção de cobre para o A.niger VC é aproximadamente 72 horas de cultivo (62%) e aproximadamente 48 horas para o R.microsporus VC(45%).

A baixa adsorção do metal registrada na coleta realizada após 90 horas de incubação para A.niger VC e 60 horas para R. microsporus VC, sugere que a redução do pH alterou o metabolismo de absorção do fungo, sendo registrados os pH’s de 2,31 para A.niger VC e 2,91 para de R.microsporus VC ao final dos cultivos contendo íons metálicos. Isto sugere que, em pH ácido, a carga global da superfície da parede celular do fungo torna-se positiva, reduzindo assim a capacidade de adsorção (SARI e TUZEN, 2009; DHANKHAR, 2011; GADD, 2014). Portanto, a partir dos resultados obtidos no estudo de absorção de Cu2+, foram determinados os tempos de cultivos de 72 horas para o fungo A.niger VC e 48 horas para a espécie R.microsporus VC, como sendo os pontos de maior adsorção escolhidos para o estudo proteômico.

Neste sentido, a caracterização proteômica dos fungos isolados do ambiente de mina A.niger VC e R.microsporus VC, foi utilizada como uma ferramenta que agrega informações sobre o perfil metabólico do fungo e possibilita a identificação de biomarcadores quando o microrganismo é submetido ao estresse pela exposição ao cobre. Por ser um metal essencial para uma ampla gama de enzimas, a ligação metal- proteína é relevante para modificações pós-traducionais, ou seja, o íon metálico atua na estabilidade e alterações das funções moleculares e processos biológicos indispensáveis para a vida celular (FENG et al., 2017).

Sabe-se, que em excesso o cobre pode ser tóxico, por desencadear a geração de espécies reativas de oxigênio, que causam danos a lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos (HODGKINSON e PETRIS, 2012; FENG et al.,2017). Os fungos possuem mecanismos de absorção de metais além de um amplo sistema regulatório e biossintético para a

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incorporação dos íons metálicos a proteínas (HAGEDOORN, 2015). O excesso de cobre leva a distúrbios metabólicos, podendo ocasionar graves danos ao crescimento e desenvolvimento das células, influenciando no proteôma fúngico (BANCI et al., 2011). As proteínas possuem cofatores metálicos que desempenham um importante papel na catálise enzimática, transporte e regulação (KRESTSINGER,2013), proteínas cobre dependentes, como citocromo c oxidase, exercem um papel crítico na sobrevivência celular (HAMZA e GITLIN 2002).

Serrano, (SERRANO et al., 2004) observou que a absorção de cobre e ferro foram fatores limitantes no crescimento celular da levedura Saccharomyces cerevisiae. Em relação à categoria de funções metabólicas. Labbé, (LABBÉ et al., 1999) observou que a expressão de genes reguladores de metal concentra-se em um conjunto de fatores de transcrição que se ligam ao DNA de Sccharomyces pombe. Banci, (BANCI et al., 2011) observaram que após a exposição a 1 mM de cobre, a levedura Saccharomyces cerevisiae apresentou comprometimento das funções mitocondriais e ativação de resposta ao estresse oxidativo. Curiosamente nesta levedura ocorreu a expressão de proteínas de ativação das vias de sobrevivência, ou seja, proteínas envolvidas na transdução de sinal que levaram o crescimento e a sobrevivência celular.

Neste contexto, foi realizado o estudo proteômico dos fungos A.niger VC e R. microsporus VC na ausência e na presença de Cu2+ em cultivos de 72 e 48 horas, respectivamente. As análises proteômicas dos fungos estudados foram realizadas através da técnica NanoLC-ESI-Q-TOF. Para o fungo A.niger VC, foram identificadas 1476 e 1352 proteínas, respectivamente na ausência e na presença de Cu2+, respectivamente enquanto que para o fungo R. microsporus VC foram identificadas 1070 e 1232 proteínas na ausência e em presença de Cu2+, respectivamente.

Os resultados obtidos nas análises proteômicas do fungo sob a influência do cobre (50 mg/L) mostraram maior resistência e redução da expressão protêica para o fungo A.niger VC, sendo diferencialmente expressas 132 proteínas. Enquanto o fungo R.microsporus VC apresentou baixa resistência e maior expressão protêica em presença do metal, sendo 389 proteínas diferencialmente expressas.

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As proteínas diferencialmente expressas no fungo A.niger VC foram classificadas quanto a suas funções moleculares e agrupadas em 9 classes de proteínas. Essas categorias funcionais representam os principais processos biológicos dos eucariotos, incluindo catabólismo do formaldeído, esporulação assexuada com formação de um esporo celular, localização, regulação biológica, organização de compontes celulares, resposta ao estímulo, processos celular e processos metabólicos, com proteínas resposáveis pelo dobramento, respiração celular, metabolismo de aminoácidos (piruvato, etanol, transporte de íons metálicos e homeostase.

A análise proteômica do A.niger VC em resposta ao cultivo na presença de íons cobre, revelou uma subexpressão de proteínas responsáveis pela transcrição do DNA. Em Sccharomyces pombe os genes regulados por metal foram encontrados em conjunto com os fatores de transcrição de DNA, o mesmo ocorreu para o Schizosaccharomyces pombe quando submetido ao estresse por metal (LABBÉ et al., 1999; PELLETIER et al., 2002), ou seja, a metaloregulação desses fatores de transcrição de ligação com o DNA fúngico envolvem alterações protêicas em decorrência da exposição ao metal.

A identificação das proteínas de marcação (protein tag) Aspergillus niger contig, An08g02950, no cultivo na ausência de Cu2+, descata-se por atuar no metabolismo a fim de direcionar alterações do processo celular, modificação, transporte ou degradação protêica (Instituto Europeu de Bioinformática, https://www.ebi.ac.uk/genomes/AM270986.html), sugerindo que o cobre como agente indutor de estresse inibe a expressão destas espécies proteicas.

A proteína S-formylglutatonone hydrolase (FGH), correspondente ao processo de fosforilação em resposta às interações químicas ou mudanças ambientais foi observada na ausência do metal. A FSH se destaca como uma enzima chave na biossíntese da glutationa (GSH), que é a principal molécula antioxidante endógena gerada pelas células (S- formilglutathion + H2O → glutatião + formiato). As enzimas relacionadas ao GSH dependem da energia metabólica, requerendo energia adicional para a síntese, ou regulando negativamente a reação catalisada, aclimatando as células ao estresse de Cu2+, reduzindo a expressão da enzima com maior consumo de energia (XIA et al., 2011). Quando avaliada a sensibilidade do fungo A.niger VC aos íons de cobre, observamos uma tendência de inibição sinérgica do crescimento, que pode ser caracterizada pela redução da glutationa (GSH),

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sugerindo que o cobre aumenta o mecanismo de defesa do hospedeiro e consequentemente, o fator NADPH oxidase.

A Cobalamin-independent methionine synthase (MetE) não foi observada na presença de cobre, sugerindo que a agregação de cobre pode estar relacionada ao estresse oxidativo. Embora este fungo tenha sido isolado do ambiente da mina, a exposição ao cobre inibe a produção de MetE dentro da célula. Estudos com E.coli descrevem uma subexpressão de MetE após a exposição ao peróxido de hidrogênio (H2O2), induzindo uma resposta de choque térmico, e também foi observada uma redução na capacidade de transcrição da célula em resposta ao estresse (HONDORP e MATTHEWS, 2004).

A glicólise é uma importante fonte de energia para a conversão de proteínas chaves no metabolismo do piruvato, enquanto produzem ATP e NADH, a partir daí as células utilizam duas estratégias de produção de energia, fermentação e respiração, embora na presença e ausência do agente oxidante, regenera-se NAD+ (ASKEW et al., 2009). No entanto, o tratamento de A.niger VC com cobre, mostrou uma redução na expressão das proteínas da via glicolítica.

O dados proteômicos observados neste estudo mostram que as células do fungo A.niger VC em presença de Cu2+ (50 mg/L) sofrem redução das proteínas envolvidas no processo da respiração mitocondrial, sendo observada uma sub expressão de proteínas pertecentes ao ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e de cadeia respiratória. A expressão da proteína aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3) em presença de cobre sugere que a função respiratória mitocondrial das células, após a exposição do agente oxidante, foi reduzida. Proteína da família das aldehyde dehydrogenase são responsáveis pelo controle da respiração celular durante a fermentação e na biossíntese dos transportadores de elétrons e acetato, durante o crescimento anaeróbio (TESSIER et al., 1998; SAINT-PRIX et al., 2004; BANCI et al., 2011).

O A.niger VC em ausência de cobre apresentou maior concentração de enzimas relacionadas com o metabolismo de aminoácidos, devido à redução na atividade mitocondrial, sendo a grande maioria correlacionada com degradação de aminoácidos. Proteínas intermediárias ao ciclo do TCA, obtidas através da degradação dos aminoácidos, como malate dehydrogenase e acetyl-CoA-acetyltransferase foram identificadas somente na ausência do metal. A incapacidade de identificar proteínas do ciclo do TCA na presença de cobre, 61

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provavelmente resultou da sua baixa abundância, ou devido à sub expressão destas enzimas na membrana celular.

A.niger VC em presença de cobre, apresentou indícios da inibição do crescimento celular, representado pela presença do agente redutor glutationa (GSH). Isto sugere um aumento no mecanismo de defesa e consequentemente aumento no fator de transcrição relacionado às proteínas que ligam no cobre. Enzimas relacionadas à GSH podem depender do metabolismo energético, necessitando de altos níveis energéticos para a síntese ou para reações catalisadas, que devem ser reguladas negativamente, pois quando as células enfrentam altas concentrações de Cu2+, elas necessitam de maior energia para se aclimatar ao estresse provocado pelo Cu2+, e, portanto, enzimas com maior consumo de energia serão reduzidas (XIA et al., 2011).

O metabolismo celular tem desenvolvido muitas estratégias para lidar com mudanças adversas no ambiente. Entre essas, as proteínas de resposta ao estresse por choque térmico (HSP) é a mais conservada (WELCH, 1992; FEHRENBACH e NIESS, 1999). Na geração de mecanismos de defesa, através do complexo NADPH/oxidase, cytochrome c oxidase, superóxide dismutase (SODs), laccases, transportadoras de ferro redutor e toxinas microbianas, estas proteínas atuam como cofator, essencial para absorção do metal (DING et al., 2014; DJOKO et al., 2015). A indução destas proteínas pode inicialmente ser interpretada como um sinal de estresse fisiológico. Está estabelecido que a indução é um fator fundamental nos processos de reparo, segundo cada tipo de dano, e na prevenção contra a agregação e coagulação de proteínas não nativas (SANTORO, 2000; RICHTER et al., 2010).

Proteínas relacionadas ao complexo proteico situado nas membranas mitocondriais denominado complexo TOM foram expressas em ambos os cultivos, como cytochrome c oxidase subunit 1, cytochrome c oxidase subunit 2 e cytochrome c oxidase subunit 6A, mitochondrial (cytochrome c oxidase polypeptide VIa). Este complexo atua no DNA através da membrana mitocondrial para o uso da fosforilação, com isto uma grande maioria das proteínas destinadas as mitocôndrias são codificadas no núcleo e sintetizadas no citoplasma, sendo marcadas por uma sequência de proteínas N-terminal (MAIO et al., 2017). Estudos com S.cerevisiae tratados com cobre mostraram que proteínas do citosol do complexo TOM da membrana externa mitocondrial apresentaram uma expressão reduzida nas suas subunidades

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(COBINE et al., 2006). No entanto, em presença de cobre, observou-se uma sub expressão destas proteínas registrando-se só a presença de cytochrome c1.

A.niger VC mostrou indução de proteínas da família HPSs 60 em presença de cobre. As HSP 60 têm sido associadas diretamente à resposta ao estresse oxidativo, devido à um conjunto de dois anéis que promovem o dobramento das proteínas em seu estado nativo, importando proteínas da matriz mitocondrial ou que se concentram no espaço intermembranar (RAGGAM et al., 2010; IRAZUSTA et al, 2012 ). Proteínas como 14-3-3 protein, superóxide dismutase (SOD) e catalases (FEDER e HOFMANN, 1999; ROBERTS et al., 2002; LI et al., 2009) que apresentam tolerância ao estresse abiótico, foram identificadas na presença do agente oxidante.

Em presença de cobre foi observada a indução de SOD (Cu-Zn), proteínas envolvidas na resposta ao estresse, predominantemente localizadas no citoplasma onde atuam como antioxidante e chaperona frente aos efeitos dielétricos e oxidativos (JAMIESON, 1998; IRAZUSTA et al, 2012; FENG et al., 2017). Assim, a atividade SOD (Cu-Zn) foi indicada como diretamente responsável pela produção de células mutantes do fungo, adaptadas ao estresse oxidativo (IRAZUSTA et al., 2010). Nossos dados sugerem que as proteínas acima citadas estão associadas à tolerância ao cobre. Contudo, diferentes HSPs foram identificadas na ausência do metal, sugerindo adaptação do A.niger VC ao ambiente de mina (choque térmico, privação de glicose e diferentes metais tóxicos, etc).

As metaloproteínas, podem manifestar maior afinidade por complexos de cobre, zinco, cobalto e níquel, complexos ferrosos, manganês, e menor afinidade por complexos de cálcio e magnésio (WALDRON et al., 2009). Estas proteínas atuam na fisiologia celular como enzimas catalíticas, de transporte, de armazenamento e transdutora de sinal. Segundo seus grupos protéticos elas podem ser classificadas como metalopeptidases, metalocarboxilases, metaloprotease, além de metalochaperonas: chaperonas e superoxido desmutase. Neste estudo as metaloproteínas foram diferencialmente expressas na ausência e na presença de Cu2+. No entanto, foram identificadas em maior proporção na ausência do agente oxidante.

No fungo A.niger VC, foi observada redução na expressão de metaloproteínas quando submetido ao estresse com cobre, sugerindo que a metalização através das enzimas

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expressas vacuolar carboxypeptidase Cps1 e superoxide dismutase, ocorre dentro do espaço intermembranar da mitocôndria. Cobine, (COBINE et al., 2006) estudou o citocromo c oxidase como chaperona de cobre para superóxido desmutase no citoplassma da levedura, de modo que a metalização de cobre ocorre dentro da organela.

Contudo não estão claras quais metaloenzimas capturam o metal, ainda que o cobre esteja presente na análise de proteínas transportadoras, que atuam na aquisição, mobilização e sequestro do cobre (WALDRON et al., 2009; SILAR et al., 2011; FENG et al., 2017). No entanto, considerando que o cobre é relevante para modificações pós-traducionais da proteínas, a subexpressão de metaloproteínas pode refletir na resistência do A.niger VC frente ao metal.

As proteínas diferencialmente codificadas no fungo R.microsporus VC foram classificadas quanto às suas funções moleculares e agrupados em 6 classes que representam os principais processos biológicos dos eucariotos. Estas funções atuam na síntese protêica, localização, regulação biológica, organização de compontes celulares, resposta ao estímulo, processos celulares e processos metabólicos, incluindo proteínas responsáveis pelo enovelamento, respiração celular e metabolismo de aminoácidos (piruvato, etanol, transporte de íons metalicos e homeostase).

O fungo R.microsporus VC apresentou grande alteração no crescimento celular no cultivo contento cobre. A super expressão proteica observada após exposição aos íons cobre ocorre possivelmente devido à ativação da resposta ao estresse oxidativo que leva à sobrevivência e crescimento celular.

Em presença do metal, foi observada a expressão de proteínas responsáveis pela mudanças na atividade das vias do ciclo do TCA, obtidas através da degradação dos aminoácidos, como mitochondrial pyruvate carrier, putative acetyl-CoA hydrolase/transferase. Os dados protêicos gerados nos cultivos do fungo R.microsporus VC mostram que as células tratadas com cobre, sofrem redução em todos os processos envolvidos na respiração mitocondrial. Uma das principais funções da mitocôndria é a geração de ATP através dos complexos respiratórios que transportam os elétrons obtidos a partir da oxidação de NADH e FADH até o citocromo para a redução do oxigênio (RICHTER et al., 2010).

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Proteínas como cytochrome P450, malic enzyme, acyl-CoA desaturase, oxidoreductase activity atuando em presença de NAD(P)H foram codificadas em presença do agente oxidante. Responsáveis por reações de oxido-redução (redox), estas proteínas se ligam ao substrato atuando na tranferência de elétrons, em que o oxigênio molecular é reduzido ou incorporado como um doador de elétrons, ocorrendo interação seletiva e não covalente com os íons presentes no meio, alterando assim o metabolismo da célula (HAGEDOORN, 2015).

No fungo R.microsporus VC o complexo piruvato desidrogenase foi suprimido em presença de cobre. O piruvato produzido através da via glicolítica e pela via das pentoses fosfato no metabolismo celular é oxidado, seguido do processo de descarboxilação à acetil- CoA pelo complexo piruvato desidrogenase na respiração aeróbica (VELLUCCI et al, 2007), sugerindo que a disponibilidade de acetil-CoA gerado pelo piruvato pode ser importante para a sobrevivência de R.microsporus VC em condições de estresse.

FMN-linked oxidoreductase (FMN) foi expressa sob estresse com cobre. Enzima responsável pela interação seletiva atuando no estado oxidativo do átomo envolvendo intermediários na biossíntese de aminoácidos aromáticos entre outros compostos, precursores de enzimas elétron doadoras. Além disso, a FMN atua como proteína responsável pela alteração da parede celular, e na manutenção estrutural da célula, protegendo a lise osmótica do metabolismo fúngico (THE UNI CONSORTIUM1,2,3,4, 2017).

De acordo com a atividade mitocondrial do fungo R.microsporus VC, em presença do metal, foi observada a expressão de proteínas relacionadas ao metabolismo do aminoácido e à síntese de proteínas. Estas são phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase, methionine aminopeptidase 2, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase, putative aspartate-semialdehyde dehydrogenase. A expressão de proteínas do citosol pelo complexo TOM, não foram prejudicadas, como é sugerido pela presença das subunidades cytochrome b5 e cytochrome P450 expressas em presença de cobre. Também verificou-se a expressão da subunidade do complexo mitocondrial cytochrome b-c1 rieske, que atua junto ao cofator Fe-S na mitocôndria bem como no citoplasma, participando da transferência de elétrons do ubiquinol para o citocromo durante o processo de fosforilação oxidativa (MAIO et al., 2017).

A presença do agente oxidante faz com que o fungo seja capaz de realizar modificações no metabolismo celular, a fim de sobreviver a mudanças ambientais. Dentre as

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respostas metabólicas ao estresse oxidativo podemos destacar a expressão das HSPs, que inicialmente pode ser caracterizada como resposta fisiológica ao estresse causado pelo metal (RICHTER et al., 2010). Contudo, sabe-se que sob condições de estresse de cobre, ocorre redução na expressão de proteínas relacionadas à mitocôndria, enquanto as proteínas de choque térmico e catalase aumentam significativamente (FENG, 2017). Esta classe de proteínas, além de atuar em condições normais, podem ser expressas ou sobreexpressas em condições de estresse. Logo, proteínas de HSPs identificadas no cultivo em presença do metal sugerem modificações na estrutura da parede celular do fungo. As HSPs expressas podem ser responsáveis pela resistência à toxicidade ou absorção do metal.

Em resposta à exposição ao cobre, o fungo R.microsporus VC, apresentou proteínas de choque térmico e defesa ao estresse oxidativo, como por exemplo HSPs (HSP 70, HSP 78, HSP 90) e ATPase GET3, foi possível observar um aumento na expressão de HSPs em presença de cobre. As HPS 70 e HSP 90 são subgrupos da família das HSPs mais abundantes, pois apresentam maior afinidade à citoproteção por desenvolverem uma rede regulatória complexa que controla a expressão gênica em resposta ao estresse ambiental (GOLLI- BENNOUR e BACHA, 2011). Portanto, a expressão de HSPs no R.microsporus VC pode ser sugerida como uma resposta de adaptação celular ao estresse causada pela exposição ao cobre. As modificações no metabolismo celular e expressão de metaloproteínas, ocorrem através da oxidação catalisada pelo metal, pois através desse mecanismo o íon divalente é ligado à uma cadeia polipeptídica, gerando espécies reativas de oxigênio capazes de danificar as cadeias de aminoácidos vizinhas (IRAZUSTA et al., 2012).

Na espécie R.microsporus VC em ambos os cultivos, em ausência e presença de íons Cu 2+, foi caracterizado um amplo repertório de proteínas relacionadas a resposta do metabolismo fungico as condições tóxicas nas áreas de mineração. Através dos resultados obtidos no estudo proteômico, podemos ressaltar as metaloproteínas, proteínas associadas a íons metálicos como cofator. Como descrito no item 5.3.1 as metaloproteínas podem manifestar maior afinidade por complexos metálicos, pois atuam estruturalmente na célula em diferentes formas enzimáticas funcionais, por exemplo, armazenamento, catálise e transporte de acordo com seu grupo protêico.

No cultivo do fungo R.microsporus VC em presença de cobre, foi observada uma maior expressão de metaloproteínas como ATP-dependent metallopeptidase Hfl, cytochrome 66

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P450 e methionine aminopeptidase, putative cell division protease ftsH. As alterações nas vias metabólicas sugerem a presença do metal, pomove mudança de estado ou atividade celular, bem como modificação dos organismos (secreção, expressão gênica, etc) que resultam em distúrbios da homeostase celular, geralmente relacionados à temperatura, umidade e estresse oxidativo (WALDRON et al., 2009).

Entre as metaloproteínas identificadas a ATPase GET, do fenótipo Get3, destaca-se por sua sensibilidade ao cobre atuando no metabolismo como chaperona controlada por reações redox (VOTH et al., 2014). A função de chaperona independente do ATP é particularmente crucial nestas condições de estresse, pois sua exposição a espécies reativas de oxgênio provocam grave e rápida redução nos níveis celulares de ATP.

Três proteína hipotéticas foram classificadas como metaloprotease, como por exemplo, putative cell division protease ftsH, que atua como metaloprotease de zinco dependente de ATP, tanto para proteínas citoplasmáticas quanto para proteínas de membranas. Estudos realizados com thermotoga maritima, descrevem a proteína FtsH, como um membro da subclasse de metaloproteases de zinco (Zn2+), que tem como característica estrutural uma região C-terminal no domínio da protease que consiste de três hélices (NARBERHAUS et al.,2009).

Chiu, (CHIU et al., 2014) estudou a regulação do oxigênio reativo (redox) realizada a partir da clivagem da metionina através da catálise da metaloproteínas methionene aminopepitdase (MetAP1 e MetATP2) contendo íons cobalto (Co2+). Esta metaloproteína se destaca por ser essencial no mecanismo de proliferação e viabilidade do fungo. As enzimas segregadas, tais como serina proteases e metaloproteases, são controladas por inibidores de protease no meio extracelular, enquanto que a atividade da protease celular é freqüentemente controlada pelo seqüestro das enzimas em compartimentos discretos, como organelas ou membranas. Isto sugere que as metaloproteínas methionine aminopeptidase e putative cell division protease ftsH, interagem no metabolismo do fungo na presença do íons cobre.

A análise proteômica do fungo R.microsporus VC submetido ao estresse induzido por cobre, possibilitou mostrar a diferenciação do perfil protêico, mesmo o microrganismo já estando adaptado ao ambiente de mineração, contendo altos teores de metal tóxico. Uma maior expressão protêica em presença do metal foi observada, quando comparado ao cultivo

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em ausência do agente oxidante, sugerindo que proteínas de choque térmico e metaloproteínas identificadas podem estar relacionadas com a exposição e absorção de cobre.

Os resultados desse estudo para os fungos A.niger VC e R.microsporus VC mostraram que mesmo os fungos provenientes do ambiente de mina, adaptados a uma grande diversidade de íons metálicos, quando cultivados em ausência e presença de cobre, apresentam diferentes comportamentos no crescimento celular, absorção e expressão protêica.

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7 CONCLUSÕES

Os fungos A. niger VC e R.microsporus VC apresentam características úteis no processo de remoção de metais de ambientes contaminados, devido à sua maior absorção e tolerância ao cobre. Estas características foram adquiridas durante a adaptação das espécies fúngicas ao ambiente de mineração de onde foram isolados.

No processo de fermentação semi-sólida, os fungos A.niger VC e R.microsporus VC apresentaram mínima concentração inibitória (MIC) em 400 mg/L e 200 mg/L de Cu2+, respectivamente.

No processo de fermentação em meio líquido, o fungo A.niger VC não exibiu decaimento da fase exponencial até o final da cultura (140 h) indicando resistência ao metal. Por outro lado o fungo R.microsporus VC apresentou uma redução de 65,14 % no crescimento celular, observando-se o início da fase estacionária após cerca de 50 horas de exposição ao cobre.

A presença do fator de elongação de proteínas e os sistemas de transcrição ativos, indicam que os fungos A.niger VC e R.microsporus VC, isolados do ambiente de mina de cobre, continuam crescendo e se reproduzindo durante os testes, confirmando sua adaptação para metabolizar o cobre.

A análise do perfil proteômico do fungo A .niger VC mostrou a sub expressão de proteínas em resposta ao estresse oxidativo causado pelo cobre. A exposição das células de A.niger VC ao cobre inibiu a expressão protêica, exceto das proteínas de choque térmico HSPs e SOD, que neutralizam o estresse oxidativo. Isto sugere que a adaptação a ambiente contaminado com metais confere aos fungos estudados vantagens adaptativas frente a exposição aos íons cobre. Em presença do metal foi observada a expressão de proteínas biomarcadoras como HSP 60 e superóxido desmutase [Cu-Zn] que apresentam características de absorção de metais.

O perfil proteômico do fungo R.microsporus VC mostrou super expressão de proteínas em resposta ao estresse de cobre, aumentando a presença das proteínas HSPs, sugerindo a ativação de vias metabólicas responsáveis pela resposta ao estresse oxidativo e absorção de cobre, sendo identificadas como proteínas biomarcadoras HSP 70, HSP 78, HSP 90. A super expressão de metaloproteínas no R.microsporus VC indica que a cadeia

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polipeptídica ligada a íons divalentes geram espécies reativas de oxigênio, sugerindo alteração das vias metabólicas, devido à mudança de estado ou atividade celular.

Os resultados proteômicos mostraram que o fungo autóctone à mina, adaptado às condições de estresses por exposição à diversos íons metálicos, expressou diferencialmente suas proteínas em resposta à ausência ou presença de cobre na cultura.Os resultados mostram que a resposta dos fungos ao cobre envolvem a expressão de proteínas responsáveis por diferentes processos celulares, como metabolismo energético e estresse oxidativo. As alterações do metabolismo das espécies A.niger VC e R.microsporus VC, isolados do ambiente de mina, sugerem a expressão de mecanismo de resistência ao cobre dos fungos, mesmo já estando adaptados a diferentes espécies de íons metálicos. Proteínas de estresse oxidativo encontram-se associadas à membrana plasmática e vias metabólicas que mantém a homeostase frente ao cobre.

Deste modo, os fungos A.niger VC e R.microsporus VC descritos neste trabalho, apresentaram potencial em processos de biorremediação e biolixiviação de rejeitos de mineração e industriais. Além disso, o profundo conhecimento de proteínas relacionadas ao estresse de cobre em fungos poderão torná-los biomarcadores ambientais, guiando futuras aplicações destes fungos nos processos de biorremediação líquida.

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8 PUBLICAÇÕES E PARTICIPAÇÕES EM CONGRESSOS INTERNACIONAIS

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6. ANDRADE, C.J.; DIAS, Meriellen; ANDRADE, L.M.; DELARMELINA, C.; DUARTE, M.C.T.; MENDES, M.A.; NASCIMENTO, C.O. Isolated Pseudomonas aeruginosa from mining site: proteome changes due to the copper. In: Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2017, Indinapolis, IN. 65th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, 2017.

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3. Lidiane M Andrade, Cristiano J Andrade, Meriellen Dias, Claudio AO Nascimento and Maria A Mendes. Chlorella and Spirulina Microalgae as Sources of Functional Foods, Nutraceuticals, and Food Supplements; an Overview. MOJ Food Processing & Technology v. 6: 00144, 2018.

Aceito

Levy Anderson César Alves, Rafael Celestino Souza,,Taciana Mara Couto da Silva, Deise Garrido, Meriellen Dias, Andreia Watanabe,Claudio Augusto Oller do NAscimeento, Maria Anita Mendes. Ana Lídia Ciamponi Urine metabolomics profile of adolescents with chronic kidney disease, Metabolomics 2018

Submetido

1. Meriellen Dias, José Thalles Jocelino Gomes de Lacerda, Lidiane Maria de Andrade, Claudio Augusto Oller do Nascimento, Enrique Eduardo Rozas, Maria Anita Mendes. Copper exposure effects on Aspergillus niger fungus proteome isolated from mine environmental. Journal of Hazardous Materials

2. Taliana Kênia Alencar Bezerra, José Thalles Jocelino Gomes de Lacerda, Maria Aparecida Juliano, Maria Anita Mendes, Meriellen Dias, Marcelo Antônio Morgano, Maria Teresa Bertoldo Pacheco, Marta Suely Madruga. Chelating and antioxidant capacity of peptides from chicken combs and wattles. Food Research International.

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ANEXO I

Proteínas diferencialmente expressas em Aspergillus niger VC

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Tabela 1: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massa do fungo A.niger VC na ausência de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

#Acesso -10lgP Convergência (%) #Peptídeos Proteinas A0A117DYT5 44342 52 37 Cobalamin-independent methionine synthase A0A100IED2 42355 46 36 Elongation factor A0A117DXF8 41556 34 26 2-oxoglutarate dehydrogenase E1 component A5AB29 41030 49 22 Glutamate decarboxylase (EC 4.1.1.15) A0A117E173 34101 38 22 Hsp70 chaperone A0A100IAD1 34517 25 16 Aminopeptidase C A0A100IFA7 30427 22 13 Aconitase family protein A0A124BUR9 24060 6 13 Glycogen debranching enzyme Gdb1 A2QUW9 24336 38 12 Aspergillus niger contig An10c0020, genomic contig (EC 1.1.1.-) A2R8S1 28850 21 12 Aspergillus niger contig An16c0250, genomic contig (EC 3.4.14.-) A0A100IA47 25819 15 12 Bifunctional purine biosynthesis protein Ade16 A0A117E141 24430 45 10 ATP synthase subunit 4, mitochondrial G3Y9G5 21056 11 9 Uncharacterized protein A0A172CE91 22513 26 8 Translation elongation factor 1-alpha (Fragment) A2R7U3 20162 29 7 Aspergillus niger contig An16c0170, genomic contig (EC 1.1.1.-) A0A117DZF6 30535 12 7 ER to Golgi transport protein Yif1 A0A100IQI4 16016 11 6 ABC transporter E2PSQ3 19859 16 6 Aspergillus niger contig An07c0160, genomic contig A2R070 15895 18 6 Aspergillus niger contig An12c0240, genomic contig G3XNR9 15823 22 6 Methyltransferase (Fragment) A0A100IUG8 17191 23 6 Short-chain dehydrogenase/reductase family protein G3XVV7 15865 30 6 Uncharacterized protein G3Y3M5 18070 7 6 Uncharacterized protein G3Y8V4 19884 12 6 Uncharacterized protein 83

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G3XN30 23435 41 6 Uncharacterized protein (Fragment) G3YG52 13410 18 6 Uncharacterized protein (Fragment) A2QA24 19439 14 5 Aspergillus niger contig An01c0330, genomic contig A2QLH0 13842 14 5 Aspergillus niger contig An06c0070, genomic contig A2R9C5 17031 13 5 Aspergillus niger contig An17c0040, genomic contig A0A124BY94 14760 29 5 Uncharacterized protein A2QJ58 14808 6 5 Uncharacterized protein G3XUS2 16232 5 5 Uncharacterized protein G3YG69 13457 29 5 Uncharacterized protein (Fragment) A2QLN6 13543 11 4 Aspergillus niger contig An06c0090, genomic contig A2QSZ5 15832 14 4 Aspergillus niger contig An09c0020, genomic contig (EC 2.1.1.-) A2R040 16212 21 4 Aspergillus niger contig An12c0220, genomic contig A2R6K2 17243 17 4 Aspergillus niger contig An16c0010, genomic contig (EC 2.1.1.41) A2R7Q2 16451 17 4 Aspergillus niger contig An16c0160, genomic contig (EC 2.4.1.83) A0A100IN43 11767 11 4 Survival factor 1 G3XZZ8 12283 10 4 Uncharacterized protein G3Y0V9 14251 18 4 V-type proton ATPase subunit A0A124BXJ2 9164 12 3 2-amino-3-carboxymuconate-6-semialdehyde decarboxylase A0A124BUY0 17585 9 3 2-methylcitrate dehydratase A0A100ILE8 17337 14 3 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase A2Q988 13440 11 3 Aspergillus niger contig An01c0250, genomic contig (EC 1.2.1.-) A2Q9M7 14515 10 3 Aspergillus niger contig An01c0290, genomic contig A2QF99 8924 6 3 Aspergillus niger contig An02c0450, genomic contig A2QPJ6 13181 17 3 Aspergillus niger contig An07c0340, genomic contig (EC 3.1.1.45) A2QPK9 9380 5 3 Aspergillus niger contig An07c0370, genomic contig A2R469 9522 12 3 Aspergillus niger contig An14c0200, genomic contig E2PSW1 15301 11 3 Aspergillus niger contig An17c0060, genomic contig (EC 2.7.1.20) A2RAC5 11531 8 3 Aspergillus niger contig An18c0080, genomic contig (EC 1.14.-.-)

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A0A100IK26 19784 7 3 Cytochrome P450 monooxygenase A0A117DZE0 8134 9 3 Glutamine synthetase A0A100I2M0 8923 9 3 Mitochondrial protein import protein Mas5 P55804 13684 49 3 NADP(+)-dependent glycerol dehydrogenase (EC 1.1.1.72) (Fragments) G3Y6S2 12580 2 3 Pre-mRNA splicing helicase G3XPH6 9417 48 3 Profilin A0A117E1L4 15559 12 3 Proteasome component PRE2 A0A124BWC0 8520 5 3 SPX domain protein A0A100IQF6 14953 9 3 Uncharacterized protein G3XMQ1 16611 7 3 Uncharacterized protein G3XNM7 11762 38 3 Uncharacterized protein G3XXV3 14109 12 3 Uncharacterized protein G3YAH5 13996 2 3 Uncharacterized protein A0A117E1H1 15384 4 2 Acetyl-CoA-acetyltransferase Q00217 14156 6 2 Alpha,alpha-trehalose-phosphate synthase [UDP-forming] 2 (EC 2.4.1.15) (Trehalose-6-phosphate synthase) (UDP-glucose- glucosephosphate glucosyltransferase) A2QEV0 11465 11 2 Altered inheritance of mitochondria protein 24, mitochondrial G3Y3K5 7436 6 2 Arginase (EC 3.5.3.1) D8FSP0 5446 9 2 Arylamine N-acetyltransferase 2 A2QAY4 8539 3 2 Aspergillus niger contig An01c0400, genomic contig A2QDZ5 8616 4 2 Aspergillus niger contig An02c0270, genomic contig A2QP65 7010 11 2 Aspergillus niger contig An07c0260, genomic contig (EC 3.5.1.19) A2QUB8 12235 5 2 Aspergillus niger contig An09c0150, genomic contig (EC 2.6.1.5) A2QUT4 8790 9 2 Aspergillus niger contig An09c0220, genomic contig (EC 2.5.1.49) A2QV31 6375 8 2 Aspergillus niger contig An10c0050, genomic contig (EC 2.7.8.23) A2QVE0 14178 6 2 Aspergillus niger contig An11c0040, genomic contig (EC 3.5.4.3) A2QWZ5 7891 5 2 Aspergillus niger contig An11c0240, genomic contig (EC 1.14.14.3) 85

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A5ABQ5 7628 3 2 Aspergillus niger contig An11c0340, genomic contig A2QYI1 11595 3 2 Aspergillus niger contig An12c0050, genomic contig (EC 1.14.-.-) A2R093 8994 26 2 Aspergillus niger contig An12c0260, genomic contig (EC 6.3.2.19) A2R0Z5 7851 2 2 Aspergillus niger contig An12c0350, genomic contig (EC 2.4.1.16) A2R7M4 9894 16 2 Aspergillus niger contig An16c0150, genomic contig A2RAW5 13525 19 2 Aspergillus niger contig An18c0160, genomic contig A0A100IAI5 7751 7 2 AT DNA binding protein A0A100I5M3 9296 4 2 Autophagy protein Atg20 A0A117E1A3 7335 2 2 Chitin synthase G A0A124BXP0 9409 4 2 Cytochrome P450 alkane hydroxylase A0A100IAY7 10332 3 2 Glycerol kinase A0A124BUT2 10627 6 2 Glyoxylate reductase A0A117E0Z1 14142 7 2 Guanine deaminase G3Y376 10223 4 2 Imidazoleglycerol phosphate synthase (EC 2.4.2.-) (EC 4.1.3.-) A0A100IF33 7836 3 2 Mitochondrial carrier protein A0A100IIK0 5442 1 2 Pentafunctional AROM polypeptide [Includes: 3-dehydroquinate dehydratase (3-dehydroquinase) (EC 4.2.1.10); 3-dehydroquinate synthase (DHQS) (EC 4.2.3.4); 3-phosphoshikimate 1- carboxyvinyltransferase (EC 2.5.1.19) (5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase) (EPSP synthase) (EPSPS); Shikimate dehydrogenase (EC 1.1.1.25); Shikimate kinase (SK) (EC 2.7.1.71)] G3YHN0 4955 2 2 Pentafunctional AROM polypeptide [Includes: 3-dehydroquinate dehydratase (3-dehydroquinase) (EC 4.2.1.10); 3-dehydroquinate synthase (DHQS) (EC 4.2.3.4); 3-phosphoshikimate 1- carboxyvinyltransferase (EC 2.5.1.19) (5-enolpyruvylshikimate-3- phosphate synthase) (EPSP synthase) (EPSPS); Shikimate dehydrogenase (EC 1.1.1.25); Shikimate kinase (SK) (EC 2.7.1.71)] G3Y6C3 7253 13 2 Phosphoglycerate mutase (EC 5.4.2.-) A2QHM1 9657 8 2 Protein transport protein sec13 A0A100IBY6 7675 2 2 PT repeat family protein 86

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A0A100INZ0 12228 19 2 Rho GDP-dissociation inhibitor G3Y1A2 11186 4 2 Serine/threonine-protein phosphatase 2A 56 kDa regulatory subunit

A0A100IGK5 11015 8 2 Short-chain dehydrogenases/reductase G3Y384 11607 4 2 Ubiquitinyl hydrolase 1 (EC 3.4.19.12) A0A117DWH9 9675 4 2 Uncharacterized protein A0A124BYS2 11374 3 2 Uncharacterized protein G3XPL1 4939 2 2 Uncharacterized protein G3Y1D3 7777 2 2 Uncharacterized protein G3YBW1 13660 7 2 Uncharacterized protein G3XVI7 5197 13 2 Uncharacterized protein (Fragment) G3Y1T0 9354 1 2 Uncharacterized protein (Fragment) A0A100IRD4 3450 4 1 2,4-dihydroxyhept-2-ene-1,7-dioic acid aldolase

A0A100IJM4 4447 3 1 3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase G3YDC2 4562 7 1 30kD heat shock protein A2QCE1 6484 2 1 3-isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.33) (Alpha-IPM isomerase) (Isopropylmalate isomerase) A0A100IIB7 8173 4 1 3-ketoacyl-CoA ketothiolase A0A117E4B2 8964 4 1 3-ketoacyl-CoA thiolase A0A100IB61 4838 3 1 3-ketoacyl-coA thiolase peroxisomal A A0A124BWJ7 3803 1 1 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase subunit alpha A0A100ICL4 6905 2 1 6-phosphofructo-2-kinase 1 A0A100IJH8 8847 3 1 AAA family ATPase A0A100ICU6 3477 1 1 ABC transporter A0A100IST5 6953 2 1 Acetolactate synthase A0A124BZ14 5028 4 1 Actin-bundling protein Sac6 A0A117E1J6 4019 6 1 ADP-ribose pyrophosphatase

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A0A117DY12 3198 2 1 Alpha/beta hydrolase A0A100IT77 3896 2 1 Alpha-ketoglutarate dependent xanthine dioxygenase A0A100I735 4259 2 1 Aminoadipic semialdehyde synthase A0A117DWN7 3268 4 1 Anthranilate phosphoribosyltransferase A0A100IHG1 4304 1 1 Anucleate primary sterigmata protein A A0A100IMZ2 4065 3 1 Arginase family protein A2Q7C2 4484 5 1 Aspergillus niger contig An01c0020, genomic contig A2Q7W4 6259 4 1 Aspergillus niger contig An01c0080, genomic contig A2Q878 5311 6 1 Aspergillus niger contig An01c0100, genomic contig (EC 5.3.3.-) A2QA94 7558 3 1 Aspergillus niger contig An01c0330, genomic contig (EC 3.5.2.3) A2QBA2 15111 5 1 Aspergillus niger contig An01c0470, genomic contig A2QCH0 3524 3 1 Aspergillus niger contig An02c0090, genomic contig A5AAH4 6361 2 1 Aspergillus niger contig An02c0310, genomic contig (EC 1.1.2.4) A2QEN3 6491 4 1 Aspergillus niger contig An02c0360, genomic contig A2QGD7 7178 4 1 Aspergillus niger contig An03c0080, genomic contig A2QGV0 3710 6 1 Aspergillus niger contig An03c0130, genomic contig A2QHC2 5183 1 1 Aspergillus niger contig An03c0200, genomic contig (EC 2.4.1.16) A2QHU7 3660 4 1 Aspergillus niger contig An04c0070, genomic contig A2QIG3 4466 3 1 Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig A2QIL1 7092 2 1 Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig A2QMT8 8564 4 1 Aspergillus niger contig An07c0080, genomic contig A2QMV4 6618 2 1 Aspergillus niger contig An07c0080, genomic contig A2QMW7 8395 5 1 Aspergillus niger contig An07c0090, genomic contig (EC 1.1.1.-) A2QMY3 3282 2 1 Aspergillus niger contig An07c0100, genomic contig A2QPA1 8536 1 1 Aspergillus niger contig An07c0300, genomic contig A2QPL2 4663 4 1 Aspergillus niger contig An07c0370, genomic contig A2QQR8 3750 2 1 Aspergillus niger contig An08c0100, genomic contig (EC 3.4.21.-) A2QRB1 8981 4 1 Aspergillus niger contig An08c0130, genomic contig (EC 2.3.1.16)

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A2QTP3 3318 2 1 Aspergillus niger contig An09c0070, genomic contig A2QUW6 4982 1 1 Aspergillus niger contig An10c0020, genomic contig A5ABF6 5734 2 1 Aspergillus niger contig An11c0010, genomic contig A2QVT6 8488 6 1 Aspergillus niger contig An11c0090, genomic contig A2QWF8 8209 2 1 Aspergillus niger contig An11c0200, genomic contig (Fragment) A5ABR4 4825 3 1 Aspergillus niger contig An11c0340, genomic contig A2QYN6 3300 2 1 Aspergillus niger contig An12c0060, genomic contig (EC 2.5.1.29) A2R0E9 12159 3 1 Aspergillus niger contig An12c0280, genomic contig (EC 3.4.-.-) A2R1M5 3687 2 1 Aspergillus niger contig An13c0060, genomic contig A2R3K0 4049 1 1 Aspergillus niger contig An14c0160, genomic contig A2R3M8 3285 1 1 Aspergillus niger contig An14c0170, genomic contig A2R3P5 4230 2 1 Aspergillus niger contig An14c0170, genomic contig A2R3T5 6436 5 1 Aspergillus niger contig An14c0180, genomic contig A2R3U3 4230 2 1 Aspergillus niger contig An14c0180, genomic contig A2R424 3765 2 1 Aspergillus niger contig An14c0190, genomic contig A2R5V8 5229 1 1 Aspergillus niger contig An15c0200, genomic contig A2R620 3808 1 1 Aspergillus niger contig An15c0210, genomic contig A2R8L9 4274 2 1 Aspergillus niger contig An16c0230, genomic contig A2R9B0 11854 6 1 Aspergillus niger contig An17c0030, genomic contig A2RB76 7983 3 1 Aspergillus niger contig An18c0170, genomic contig A2QPN1 3656 14 1 Autophagy-related protein 8 (Autophagy-related ubiquitin-like modifier atg8) A0A100ILA6 4933 3 1 BNR/Asp-box repeat protein A0A100IBT0 6822 3 1 Branched-chain amino acid aminotransferase A0A117DZ96 6696 3 1 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase G3Y5W3 4845 1 1 cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit A2QKY5 3571 2 1 Carboxypeptidase (EC 3.4.16.-) A0A100INJ4 4470 2 1 CBS domain protein

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A0A100IP67 10485 4 1 Chitin synthase activator T1SGS1 7370 3 1 Citrate synthase (Fragment) A0A0H5ARK2 5654 6 1 Citrate transport protein (Mitochondrial tricarboxylate transporter) A0A100IKL7 3675 2 1 CMGC/SRPK protein kinase A0A117DXV8 4594 6 1 Coiled-coil domain-containing protein A0A124BWT6 4742 2 1 Cyanate hydratase (Cyanase) (EC 4.2.1.104) (Cyanate hydrolase) (Cyanate lyase) A0A100IAM4 7092 1 1 Dead box ATP-dependent rna helicase G3Y417 8674 4 1 Decarboxylase yanB (EC 4.1.1.-) (Yanuthone D synthesis protein B) G3XN75 4707 5 1 Dehydrogenase A2QAJ5 5625 4 1 Dipeptidase (EC 3.4.13.19) G3XMY2 7405 1 1 DNA helicase (EC 3.6.4.12) A0A117DXI6 3456 1 1 DNA polymerase epsilon subunit C A0A100ITR6 6887 4 1 DnaJ domain protein A0A117E1K1 5384 3 1 Endo-1,3-beta-glucanase eglC A0A124BWC6 4232 9 1 ER-derived vesicles protein ERV14 A0A100IJ67 6664 3 1 Fe-containing alcohol dehydrogenase A0A100INL7 5856 8 1 Fumarylacetoacetate hydrolase family protein A0A100I3X8 3440 3 1 Gamma-glutamyltranspeptidase A0A100IPJ9 5786 5 1 GDSL lipase/acylhydrolase family protein A0A100I6Y8 3675 3 1 Glucooligosaccharide oxidase G3Y3M0 8507 5 1 Homoserine dehydrogenase (HDH) (EC 1.1.1.3) A0A100IH16 8444 6 1 Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase E2PSZ3 4726 2 1 IMP-specific 5'-nucleotidase 1 (EC 3.1.3.-) A0A100IU80 8320 5 1 Inorganic diphosphatase G3XMB9 3642 3 1 Ketoreductase azaE (EC 1.-.-.-) (Azaphilone biosynthesis cluster protein azaE) A0A100I9T7 3660 3 1 Kinase-related protein 90

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A0A100IB39 7093 3 1 Kynurenine aminotransferase A0A100IPR3 7964 3 1 Lysosomal protective protein A0A100IGU3 7653 2 1 Mannosyl-oligosaccharide glucosidase A0A117E128 3847 2 1 Metabolite transport protein G3XLM4 6559 2 1 Methylenetetrahydrofolate reductase (EC 1.5.1.20) A0A100IGC7 7893 5 1 Monothiol glutaredoxin-4 A0A117DY30 8155 2 1 mRNA splicing factor A0A100INU6 7316 2 1 NADH-ubiquinone oxidoreductase 64 kDa subunit A0A117E493 7020 2 1 Nitrogen assimilation transcription factor NirA G3Y421 7258 4 1 O-Mevalon transferase yanI (EC 2.-.-.-) (Yanuthone D synthesis protein I) A0A100IJZ0 5235 3 1 Oxidoreductase A0A100I9K6 8329 5 1 Peptide alpha-N-acetyltransferase Nat2 A0A100IL90 3425 1 1 Phosphatidylinositol 3-kinase Tor2 A0A100ILE0 4141 4 1 Phosphoglycerate mutase A0A117DUZ4 5037 4 1 Phosphoserine phosphatase A0A100IJ11 8488 2 1 Plasma membrane antiporter A2RBC2 3468 2 1 Probable carboxypeptidase An18g06210 (EC 3.4.17.-) (Peptidase M20 domain-containing protein An18g06210) A2RA98 3783 1 1 Protein kinase C (EC 2.7.11.13) Q00078 4985 1 1 Protein kinase C-like (EC 2.7.11.13) A0A117E2X4 3555 3 1 RNA-splicing protein MRS3 A0A100IUG1 7195 2 1 Ser/Thr protein phosphatase family A0A117E3Q4 3197 4 1 SH3 domain protein A0A100I2E9 4025 2 1 Siderophore biosynthesis protein Q00179 4189 2 1 Signal recognition particle 54 kDa protein homolog A2QJF4 6496 2 1 Signal recognition particle subunit SRP72 A0A124BV10 6349 4 1 Similar to An02g04850 91

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A0A100IKI6 4801 6 1 Small nuclear ribonucleoprotein U2, A A0A100II23 4026 5 1 Suppressor/enhancer of lin-12 protein 9 A0A100IK93 3143 1 1 Transporter mch1 A0A124BWL4 9366 5 1 tRNA methyltransferase subunit GCD14 A2QTW3 3550 13 1 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm2 A0A117DX56 3348 2 1 Ubiquitin fusion degradation protein UfdB A0A100IGC5 9992 1 1 Uncharacterized protein A0A100IRC0 4230 2 1 Uncharacterized protein A0A100ITS4 4960 0 1 Uncharacterized protein A0A117E225 7857 15 1 Uncharacterized protein A2R2V5 3201 5 1 Uncharacterized protein G3XTD1 6203 1 1 Uncharacterized protein G3XU92 3368 2 1 Uncharacterized protein G3XVP9 4660 2 1 Uncharacterized protein G3XY19 9992 4 1 Uncharacterized protein G3XZP8 4366 4 1 Uncharacterized protein G3Y822 5546 14 1 Uncharacterized protein G3YAF7 3379 8 1 Uncharacterized protein G3YBM9 6027 1 1 Uncharacterized protein G3YC04 8064 1 1 Uncharacterized protein G3YC44 3337 1 1 Uncharacterized protein G3YFP7 4386 5 1 Uncharacterized protein G3YG83 3270 0 1 Uncharacterized protein G3YHM6 3451 0 1 Uncharacterized protein G3XVT5 4785 1 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3Y9V6 8329 10 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3YFM4 3535 1 1 Uncharacterized protein (Fragment) A0A100I3G4 5317 4 1 Vacuolar protein sorting-associated protein 26

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A0A100IHM8 3505 2 1 Vacuolar protein sorting-associated protein 29 A0A100ING1 4359 5 1 Vacuolar protein sorting-associated protein 74 A0A100IKX4 5523 6 1 Xanthine phosphoribosyltransferase 1

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Tabela 2: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massa do fungo A.niger VC em presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

#Acesso -10lgP Convergencia (%) #Peptideos Proteinas G3XZT4 39087 46 25 Uncharacterized protein D7GAW3 36317 57 17 Translation elongation factor 1-alpha (Fragment) A0A100INN3 26592 36 14 14-3-3 protein I7B155 25053 53 12 Calmodulin (Fragment) A2R121 28732 39 11 Aspergillus niger contig An12c0380, genomic contig (EC 1.3.1.-) A0A100IQ03 27053 35 10 NADH-ubiquinone oxidoreductase 39 kDa subunit A2R8G7 26480 37 8 Aspergillus niger contig An16c0230, genomic contig (EC 1.1.1.100) A5ABB4 21941 24 7 Aspergillus niger contig An08c0230, genomic contig (EC 1.1.1.91) A0A100IPI0 17412 18 7 Heat shock protein 60 A0A100IU47 25347 25 7 Norsolorinic acid reductase A0A124BW23 16998 14 6 Aminotransferase, classes I and II A0A100IJG5 16692 18 5 Aflatoxin B1-aldehyde reductase GliO-like A2Q8R5 17300 19 5 Aspergillus niger contig An01c0190, genomic contig A2QYU0 17592 19 5 Aspergillus niger contig An12c0070, genomic contig (EC 1.3.1.-) G3XVT2 21786 12 5 Uncharacterized protein A2QCS1 18715 4 4 Aspergillus niger contig An02c0120, genomic contig A2QLM3 14786 8 4 Aspergillus niger contig An06c0090, genomic contig A2QN65 17996 13 4 Aspergillus niger contig An07c0110, genomic contig (EC 1.1.1.-) A2QW33 17009 15 4 Aspergillus niger contig An11c0150, genomic contig (EC 1.1.1.195) A0A117DYG4 14373 7 4 Eukaryotic translation initiation factor eIF-4A subunit, putative [Aspergillus flavus ATP-dependent RNA helicase FAL1 [Aspe A0A100IAS4 22207 15 4 Uncharacterized protein G3XUI1 16349 14 4 Uncharacterized protein A0A100IMW8 12331 12 3 Aldo-keto reductase 94

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A2QSY9 13478 14 3 Aspergillus niger contig An09c0020, genomic contig A2R501 11315 7 3 Aspergillus niger contig An15c0100, genomic contig (EC 1.1.3.13) A0A100IAW6 16037 9 3 Chitinase A0A117E3H5 10345 6 3 EH domain binding protein epsin 2 G3XLZ5 13459 15 3 Uncharacterized protein (Fragment) G3YGP4 9309 6 2 Aldehyde dehydrogenase (EC 1.2.1.3) A2Q9J5 6576 2 2 Aspergillus niger contig An01c0290, genomic contig (EC 4.1.1.21) A2QBX5 9255 15 2 Aspergillus niger contig An02c0010, genomic contig (EC 3.4.21.-) A2QMN7 10199 8 2 Aspergillus niger contig An07c0070, genomic contig A2QSI3 8992 6 2 Aspergillus niger contig An08c0280, genomic contig (EC 1.2.1.3) A2QYU3 9242 6 2 Aspergillus niger contig An12c0070, genomic contig (EC 1.3.1.-) A0A100IJ50 11196 1 2 Cell wall biogenesis protein phosphatase Ssd1 A0A117DX85 5277 10 2 Lectin family integral membrane protein A0A100IFU7 9654 11 2 Ras family protein (Ras-related protein Rab-6A) Q078W8 9654 11 2 Secretion related GTPase C A0A100IFI2 6758 4 2 Translation initiation factor 4B G3XP29 10868 3 2 Uncharacterized protein G3Y355 10518 1 2 Uncharacterized protein (Fragment) A0A117E3A2 6666 2 1 14-alpha sterol demethylase Cyp51B A0A100ICS8 5832 0 1 1-phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase A2Q7G2 5985 2 1 Aspergillus niger contig An01c0030, genomic contig A2Q9K1 5071 3 1 Aspergillus niger contig An01c0290, genomic contig (EC 1.1.1.184) A2QBD3 8046 6 1 Aspergillus niger contig An01c0470, genomic contig A2QC57 4795 1 1 Aspergillus niger contig An02c0040, genomic contig (Fragment) A2QES6 4827 3 1 Aspergillus niger contig An02c0390, genomic contig A2QGA4 4585 4 1 Aspergillus niger contig An03c0070, genomic contig A2QIK6 6057 3 1 Aspergillus niger contig An04c0140, genomic contig A2QMJ4 8589 5 1 Aspergillus niger contig An07c0050, genomic contig (EC 2.5.1.18)

95

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A2QMP0 4712 4 1 Aspergillus niger contig An07c0080, genomic contig A2QMR9 4203 0 1 Aspergillus niger contig An07c0080, genomic contig A2QQP7 3931 7 1 Aspergillus niger contig An08c0100, genomic contig A2QT31 11510 3 1 Aspergillus niger contig An09c0030, genomic contig (EC 1.14.13.1) A2QU00 4214 6 1 Aspergillus niger contig An09c0100, genomic contig A2QUJ9 4227 3 1 Aspergillus niger contig An09c0180, genomic contig A2QW14 5173 3 1 Aspergillus niger contig An11c0150, genomic contig A2QY47 5938 9 1 Aspergillus niger contig An11c0400, genomic contig A2QZJ8 6169 3 1 Aspergillus niger contig An12c0160, genomic contig A2R113 5553 3 1 Aspergillus niger contig An12c0380, genomic contig (EC 1.-.-.-) A2R162 7268 2 1 Aspergillus niger contig An13c0010, genomic contig (EC 1.14.14.-) A2R2K2 9417 3 1 Aspergillus niger contig An14c0030, genomic contig (Fragment) A2R2M7 6856 4 1 Aspergillus niger contig An14c0060, genomic contig (EC 1.-.-.-) A2R359 4522 1 1 Aspergillus niger contig An14c0130, genomic contig A2R447 6662 0 1 Aspergillus niger contig An14c0190, genomic contig (Fragment) A2R455 7921 10 1 Aspergillus niger contig An14c0200, genomic contig A2R4Z4 6067 0 1 Aspergillus niger contig An15c0100, genomic contig (EC 2.1.1.-) A2R5T3 6381 3 1 Aspergillus niger contig An15c0190, genomic contig A2RAX5 6911 1 1 Aspergillus niger contig An18c0160, genomic contig A2RAX9 5496 1 1 Aspergillus niger contig An18c0160, genomic contig A0A117E1A8 6650 3 1 BAR adaptor protein RVS167 A0A100I6D3 4228 0 1 Chitin synthase ChsE A0A100IME7 7402 6 1 Citrate and oxoglutarate carrier protein (DNA replication protein YHM2) G3Y702 4341 13 1 Cyclin-dependent kinases regulatory subunit G3XT55 4950 3 1 Dehydrogenase A0A100IU38 4540 1 1 DNA-binding protein HGH1 A0A100IFR6 6580 5 1 DUF92 domain protein A0A100I6B8 3970 1 1 Exocyst complex component Exo70 96

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G3XWH2 3658 3 1 Ferulic acid decarboxylase 1 (EC 4.1.1.102) (Phenacrylate decarboxylase) A0A100ITN0 58,85 2 1 Flavin-binding monooxygenase Q5F4N6 6938 2 1 Flavohemoglobin A0A100I3C3 5537 2 1 Glutathione transferase A0A100IUZ3 6257 17 1 Import inner membrane translocase subunit TIM9 (Tim10/DDP family zinc finger family protein) A0A124BY48 6108 1 1 LMBR1 domain protein A0A117E0V4 4096 4 1 L-PSP endoribonuclease family protein A0A100IJX6 3908 8 1 LSM domain family protein (Small nuclear ribonucleoprotein Sm D2) A0A124BW51 5762 9 1 LSM domain family protein (Small nuclear ribonucleoprotein SmD3) A0A117E2F8 6766 1 1 MFS transporter A0A100IMC6 4149 3 1 Mitochondrial fusion protein P05328 5687 2 1 Multifunctional tryptophan biosynthesis protein [Includes: Anthranilate synthase component 2 (AS) (EC 4.1.3.27) (Anthranilate synthase, glutamine amidotransferase component); Indole-3-glycerol phosphate synthase (IGPS) (EC 4.1.1.48); N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate isomerase (PRAI) (EC 5.3.1.24)] A0A100I973 10135 3 1 NADH oxidase G3XZG5 3794 2 1 NADH:flavin oxidoreductase G3XW35 3442 0 1 Non-ribosomal peptide synthetase A0A100IL69 5865 5 1 Nuclear transport factor 2 A0A100IJE3 4125 1 1 Patched sphingolipid transporter A0A100I3A5 7972 4 1 Phosphatidyl synthase A0A100I3L3 3733 1 1 Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase A0A100ISL2 3763 0 1 Polyketide synthase A0A100IQ55 4532 5 1 Seryl-tRNA synthetase A0A117DZC7 4295 1 1 Similar to An15g02770 A0A124BZ28 3665 2 1 Sulfite reductase

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A0A100IT00 4151 3 1 Tetratricopeptide repeat domain protein A0A100I5N0 12061 3 1 Translation initiation factor eIF-2B subunit family protein A2QP99 3486 3 1 Trehalose-6-phosphate synthase (EC 2.4.1.15) (UDP-glucose- glucosephosphate glucosyltransferase) A0A100IR20 5157 6 1 TrkA-N domain dehydrogenase A0A124BVK0 3456 0 1 tRNA processing endoribonuclease Trz1 A0A117DWN1 4953 6 1 Ubiquitin conjugating enzyme A0A100I6G1 9169 1 1 Uncharacterized protein A0A100IG69 6281 3 1 Uncharacterized protein A0A100ILR8 5928 4 1 Uncharacterized protein A0A100IQA7 11002 2 1 Uncharacterized protein A0A100IUH7 4839 1 1 Uncharacterized protein A2QR37 10225 6 1 Uncharacterized protein G3XLR0 4443 3 1 Uncharacterized protein G3XM24 5785 6 1 Uncharacterized protein G3XMP2 5877 2 1 Uncharacterized protein G3XRI8 5816 2 1 Uncharacterized protein G3XTP0 5433 7 1 Uncharacterized protein G3XW01 3764 4 1 Uncharacterized protein G3XW65 4766 3 1 Uncharacterized protein G3XWJ2 5252 2 1 Uncharacterized protein G3XXU4 5476 0 1 Uncharacterized protein G3Y528 5279 6 1 Uncharacterized protein G3Y6V8 5121 4 1 Uncharacterized protein G3Y7G1 4791 1 1 Uncharacterized protein G3YCH9 6051 5 1 Uncharacterized protein G3YDW1 5299 6 1 Uncharacterized protein G3YFA3 3734 4 1 Uncharacterized protein

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G3Y164 3598 2 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3Y2V8 5003 1 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3Y377 9939 2 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3Y8E7 5167 2 1 Uncharacterized protein (Fragment) G3YG09 6732 2 1 Uncharacterized protein (Fragment)

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ANEXO II Proteínas diferencialmente expressas em Rhizopus microsporus VC

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Tabela 3: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massa do fungo Rhizopus microsporus VC na ausência de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

#Acesso -10lgP Convergência (%) #Peptideos Proteinas A0A1X0S6B0 33618 50 16 Rhizopuspepsin II A0A1X0S6C4 30395 47 14 Extracellular aspartic proteinase A0A0A1MR64 27333 12 14 Uncharacterized protein A0A0C7C0F5 30723 29 12 Uncharacterized protein A0A0A1N5Q1 21673 14 8 Uncharacterized protein A0A1X0S5Y9 25394 29 7 Lipase A0A0A1NIV8 21183 37 7 Putative V-type proton ATPase subunit B A0A0C7BZ89 20125 16 7 Uncharacterized protein A0A0A1N4T5 29814 21 7 Uncharacterized protein A0A1X0RQ56 18045 17 6 Glucoamylase 1 A0A1X0RUE4 19543 11 6 Heme peroxidase A0A0A1NRG7 24819 24 6 Putative Lipase preproprotein (Precursor) A0A1X0SBM6 20831 9 5 Aconitate hydratase, mitochondrial (Aconitase) (EC 4.2.1.-) A0A0A1N6M5 17244 56 5 Uncharacterized protein A0A0C7BRR1 17515 23 5 Uncharacterized protein A0A1X0RXG9 20228 11 4 DAO-domain-containing protein A0A0C7BD37 13821 10 4 Putative Glucoamylase A0A0C7AX60 16443 9 4 Putative Lysine--tRNA ligase A0A0C7AZS3 14726 16 4 Saccharopine dehydrogenase [NAD(+), L-lysine-forming] (SDH) (EC 1.5.1.7) (Lysine--2-oxoglutarate reductase) A0A0C7BQQ3 16828 6 4 Uncharacterized protein A0A0A1NK49 20228 11 4 Uncharacterized protein A0A0C7CJW4 21393 26 4 Uncharacterized protein A0A0A1NQ83 14486 22 4 Uncharacterized protein A0A0A1NTV2 14565 14 4 Uncharacterized protein A0A0C7B430 15726 11 3 Putative 40S ribosomal protein S6 A0A0A1MWZ8 15555 2 3 Putative Ura2 bifunctional carbamoylphosphate synthetase-aspartate transcarbamylase 101

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A0A0C7B8I9 9925 10 3 Uncharacterized protein A0A0A1MZB9 10839 7 3 Uncharacterized protein A0A0C7CA95 12955 13 3 Uncharacterized protein A0A0A1NJS1 16213 13 3 Uncharacterized protein A0A0A1P0C6 17420 7 3 Uncharacterized protein A0A0C7BUG5 16178 24 3 Uncharacterized protein A0A0A1P7Q7 16275 12 3 Uncharacterized protein A0A0C7BYC4 12324 3 2 Catalase (EC 1.11.1.6) A0A1X0RT54 12324 3 2 Catalase (EC 1.11.1.6) A0A1X0SF09 10194 3 2 Composite domain of metallo-dependent hydrolase A0A0A1MTT9 12108 4 2 Homocitrate synthase, cytosolic isozyme (Putative Homocitrate synthase) A0A1X0RWI1 11493 11 2 Metallo-dependent hydrolase A0A1X0SCU7 16361 4 2 Polyadenylate-binding protein (PABP) A0A0A1N283 12195 19 2 Putative 30S ribosomal protein S10e A0A0A1N9Q0 8215 6 2 Putative Cell division control protein 48 A0A0A1NSK8 12108 4 2 Putative Homocitrate synthase A0A0C7C9Z1 11947 9 2 Putative Rhizopuspepsin-1 A0A0C7B9S5 9382 4 2 Putative Saccharopine dehydrogenase A0A0A1PJS7 14933 6 2 Ribosomal protein L19 A0A1X0RV51 7386 1 2 Sortilin A0A0A1NQL8 8192 9 2 Uncharacterized protein A0A1X0RVC5 8835 8 2 Saccharopine dehydrogenase [NAD(+), L-lysine-forming] (SDH) (EC 1.5.1.7) (Lysine--2-oxoglutarate reductase) A0A0A1P2W7 9133 6 2 Uncharacterized protein A0A0A1P6N2 12661 19 2 Uncharacterized protein A0A0C7BE20 15919 8 2 Uncharacterized protein A0A0A1NSA6 7479 10 2 Uncharacterized protein A0A0C7AVG7 9160 13 2 Uncharacterized protein A0A0C7BE71 9190 10 2 Uncharacterized protein A0A0C7CHZ8 9205 6 2 Uncharacterized protein A0A1X0S0H2 9259 2 2 Uncharacterized protein A0A0A1PI69 10146 8 2 Uncharacterized protein A0A0A1NKZ4 10256 10 2 Uncharacterized protein

102

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A0A0C7BTT0 10557 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7CLF1 11915 8 2 Uncharacterized protein A0A0A1P1S6 6055 2 1 3-isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.33) (Alpha-IPM isomerase) (Isopropylmalate isomerase) A0A0A1N0F5 7874 5 1 3-isopropylmalate dehydrogenase (EC 1.1.1.85) A0A1X0RX31 7074 4 1 60S ribosomal protein L20 A0A0A1MVC6 5749 6 1 Acyl-CoA N-acyltransferase (Putative Diamine N-acetyltransferase) A0A1X0S5L6 4644 1 1 ARM repeat-containing protein A0A0C7BYX8 7506 1 1 Arylsulfatase (AS) (EC 3.1.6.1) (Aryl-sulfate sulphohydrolase) A0A1X0RZH5 12502 1 1 DNA-directed RNA polymerase subunit (EC 2.7.7.6) A0A1X0S4H3 9906 5 1 Class I glutamine amidotransferase-like protein A0A0A1NC65 6662 9 1 Cytochrome b5 (Putative DNA damage response protein) A0A0C7BMC5 12409 1 1 DNA-directed RNA polymerase subunit (EC 2.7.7.6) A0A1X0RMA2 5664 0 1 DUF1744-domain-containing protein A0A1X0SE05 6554 0 1 Dynein heavy chain R9TFH8 10202 5 1 Elongation factor 1a (Fragment) R9TID6 10202 5 1 Elongation factor 1-alpha (Fragment) A0A1X0SFZ1 10154 3 1 FMN-linked oxidoreductase A0A0A1N8S1 12687 9 1 GrpE protein homolog A0A1X0S674 6220 2 1 HisG-domain-containing protein A0A0A1MR01 7692 5 1 HSP20-like chaperone A0A0A1N7S8 9778 4 1 Importin subunit alpha A0A1X0RQM0 6665 1 1 L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase A0A1X0S9G4 5935 4 1 Peptidase M22, glycoprotease A0A0C7B012 6587 4 1 Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase (EC 2.5.1.54) (3-deoxy-D-arabino- heptulosonate 7-phosphate synthase) (DAHP synthase) (Phospho-2-keto-3- deoxyheptonate aldolase) A0A0A1MZW9 4362 3 1 Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase (Putative Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase) A0A1X0RK01 6433 2 1 p-loop containing nucleoside triphosphate hydrolase protein A0A0A1PA24 7002 7 1 PRTase-like protein (Putative Uracil phosphoribosyltransferase 1) A0A0A1NRY1 6203 4 1 Purine nucleoside phosphorylase (EC 2.4.2.1) (Inosine-guanosine phosphorylase) A0A0C7CND5 4317 4 1 Putative Acyl-CoA dehydrogenase

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A0A0A1NED8 4310 2 1 Putative Ade16p A0A0C7AW58 4520 3 1 Putative Alanine-glyoxylate transaminase/(R)-3-amino-2-methylpropionate- pyruvate transaminase A0A0A1P9W1 5740 1 1 Putative Aminoadipate reductase A0A0A1NR83 6220 4 1 Putative ATP phosphoribosyltransferase A0A0A1N4G5 6433 2 1 Putative ATPase A0A0C7C594 5565 9 1 Putative ATP-dependent RNA helicase uap56 A0A0A1MVX3 5687 13 1 Putative Conidiation-specific protein 10 A0A0A1N4T4 6380 9 1 Putative Coronin A0A0A1NXU4 8898 7 1 Putative Cytosolic nonspecific dipeptidase A0A0C7B2P4 5749 6 1 Putative Diamine N-acetyltransferase A0A0C7BDR3 6128 0 1 Putative DNA polymerase A0A0A1P5J0 12409 1 1 Putative DNA-directed RNA polymerase A0A0C7BGP9 4738 0 1 Putative Dynein heavy chain A0A0C7BXZ7 4985 16 1 Putative Farnesyl pyrophosphate synthase A0A0A1N6T3 5881 7 1 Putative G2/M transition checkpoint protein Sum2 A0A0C7AZK7 5644 8 1 Putative Glucose 1-dehydrogenase A0A0C7BP47 4871 3 1 Putative Glucose repression regulatory protein TUP1 A0A0A1N8J8 5139 5 1 Putative Glutamate-5-semialdehyde dehydrogenase A0A0C7B2D1 11391 6 1 Putative Histone H1/5 A0A0A1N738 5781 5 1 Putative Isocitrate dehydrogenase, NAD-dependent A0A0C7B7V9 6275 1 1 Putative L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase A0A0A1P7D8 12643 11 1 Putative Lipase A0A0C7BS47 8392 4 1 Putative Monothiol glutaredoxin A0A0C7CC08 5587 8 1 Putative Myo-inositol-1-phosphate synthase A0A0C7B014 7032 3 1 Putative NMT-1 like protein A0A0C7BYD5 5901 0 1 Putative Osomolarity two-component system, response regulator SSK1 A0A0C7AZV5 6587 5 1 Putative Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase A0A0A1N203 4362 3 1 Putative Phosphoribosylaminoimidazole carboxylase A0A0C7C1S7 4310 1 1 Putative Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase A0A0A1P926 7426 4 1 Putative Pyruvate dehydrogenase complex dihydrolipoamide acetyltransferase A0A0C7CN07 6052 7 1 Putative Pyruvate dehydrogenase E1 component subunit beta, mitochondrial

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A0A0A1P1H5 3743 7 1 Putative Rho family, other A0A0C7CP68 5900 6 1 Putative Saccharopine dehydrogenase [NAD( ), L-lysine-forming] A0A0C7CKU8 5612 10 1 Putative Single-stranded DNA-binding protein A0A0C7CNP8 4040 6 1 Putative Small nuclear ribonucleoprotein A0A0A1NCE3 7523 9 1 Putative Small nuclear ribonucleoprotein D3 (Sm-like ribonucleo protein) A0A0C7AYK8 7523 8 1 Putative Sm-like ribonucleo protein A0A0A1P305 3938 2 1 Putative Tif5p A0A0A1N9L6 7002 7 1 Putative Uracil phosphoribosyltransferase 1 A0A0A1P346 4310 2 1 Putative ZYRO0A09130p A0A1X0S7H8 3793 5 1 Ras protein A0A1X0S7C6 8319 6 1 Ras-domain-containing protein A0A1X0SGT8 7522 7 1 Redoxin A0A0C7CK72 4611 2 1 Reticulon-like protein A0A1X0S6T9 5937 2 1 Saccharopine dehydrogenase A0A1X0S7S1 9830 1 1 Sec7-domain-containing protein A0A0C7CN13 4720 2 1 Succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial (EC 1.3.5.1) A0A1X0S380 13297 2 1 T-complex protein 1 zeta subunit A0A1X0RLN8 6615 4 1 TMP-TENI-domain-containing protein A0A0A1PF76 4853 2 1 Trehalase (EC 3.2.1.28) (Alpha-trehalose glucohydrolase) A0A0A1N7Z6 5935 3 1 tRNA N6-adenosine threonylcarbamoyltransferase, mitochondrial (EC 2.3.1.234) (N6-L-threonylcarbamoyladenine synthase) (t(6)A synthase) (t(6)A37 threonylcarbamoyladenosine biosynthesis protein) (tRNA threonylcarbamoyladenosine biosynthesis protein) A0A1X0SAG2 4040 6 1 U6 snRNA-associated Sm-like protein LSm7 A0A1X0S459 6274 1 1 UDP-Glycosyltransferase/glycogen phosphorylase A0A0A1NKM0 4004 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7BXG7 4143 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1N111 4169 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1NRF5 4250 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BXI4 4316 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7B9Q0 4496 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7AX08 4507 1 1 Uncharacterized protein

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A0A1X0RWL4 4576 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7CIG1 4631 6 1 Uncharacterized protein A0A0A1NT69 4699 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0S3F0 4733 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1P013 4835 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1NX83 5022 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1P8F9 5256 9 1 Uncharacterized protein A0A0C7AWX7 5261 0 1 Uncharacterized protein A0A0A1P8J2 5562 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1NR64 5867 7 1 Uncharacterized protein A0A0C7AVU2 5909 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7B0E6 5918 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BHX9 6140 0 1 Uncharacterized protein A0A0C7CCY7 6162 10 1 Uncharacterized protein A0A0A1N571 6274 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7CFG3 6615 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1NLP1 6713 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7BBB9 6855 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7B3Q7 6909 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7CG27 6927 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1PJY9 7102 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1PHW0 7128 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1NZR1 7663 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7B8U9 7692 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7BS85 7726 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7CAC3 8099 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1P093 8276 15 1 Uncharacterized protein A0A0C7BJP2 8361 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7B607 8447 7 1 Uncharacterized protein A0A0A1N605 8479 14 1 Uncharacterized protein A0A0C7CEW3 8609 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BXX1 8693 9 1 Uncharacterized protein A0A0A1P4S7 8916 12 1 Uncharacterized protein

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A0A0C7BUB7 9129 19 1 Uncharacterized protein A0A1X0S9S0 9164 24 1 Uncharacterized protein A0A0C7CBQ3 9208 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7B2L9 9407 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1PKX7 10416 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1MYV4 3759 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7BDB4 3825 1 1 Uncharacterized protein A0A1X0SGS1 3874 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7BK21 3970 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1NYA3 3973 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7BGA3 3981 0 1 Uncharacterized protein A0A0C7CLB0 3998 13 1 Uncharacterized protein A0A0A1P2C3 4003 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7AWD2 4258 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1MP00 4316 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7C5E2 4514 2 1 Uncharacterized protein A0A1X0RP42 4584 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1P6X1 4598 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7B7H7 4612 18 1 Uncharacterized protein A0A0C7BRJ8 4644 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1P0L9 4740 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7CBX4 4765 7 1 Uncharacterized protein A0A0C7BIF7 4908 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1NBY6 4923 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7BF35 4961 7 1 Uncharacterized protein A0A0A1PK59 4971 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1N1Z7 4992 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0RYN4 5144 1 1 Alpha-mannosidase (EC 3.2.1.-) A0A0C7C7V8 5174 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7BD06 5618 8 1 Uncharacterized protein A0A1X0RZ65 5687 9 1 Uncharacterized protein A0A0A1NAN5 5744 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BE81 5808 1 1 Uncharacterized protein

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A0A0A1NSR6 6322 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BU81 6618 7 1 Uncharacterized protein A0A0A1NPI3 6676 2 1 Uncharacterized protein A0A1X0SC01 7116 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1NDQ7 7237 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7BV03 7850 4 1 Uncharacterized protein A0A0A1MQ36 7959 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7C161 8341 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7B4X7 8371 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7AVZ1 8617 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BNJ2 9830 1 1 Uncharacterized protein A0A1X0S1W9 11862 0 1 Uncharacterized protein A0A0C7AWK5 12007 0 1 Uncharacterized protein A0A0A1P041 13228 5 1 Uncharacterized protein

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Tabela 4: Proteínas diferencialmente identificadas por espectrometria de massa do fungo R. microsporus VC na presença de íons Cu2+ (Uniprot, http://www.uniprot.org).

# Acesso -10lgP Convergência (%) #Peptideos Proteínas A0A0A1NWB8 41161 58 30 Putative Heat shock protein 70 A0A1X0RYW6 34513 50 18 Uncharacterized protein (Fragment) A0A0C7CL20 33057 24 15 Putative Transketolase A0A0C7BZS8 34501 25 12 Uncharacterized protein A0A1X0RNB3 19422 16 11 NAD-specific glutamate dehydrogenase (EC 1.4.1.2) A0A0C7BPW7 25188 29 10 Uncharacterized protein A0A0C7AW47 31445 31 10 Uncharacterized protein A0A0A1NFH3 22613 19 9 Uncharacterized protein A0A1X0SB54 27024 28 8 40S ribosomal protein S6 A0A1X0S2U0 23839 12 8 ATP-dependent 6-phosphofructokinase (ATP-PFK) (Phosphofructokinase) (EC 2.7.1.11) (Phosphohexokinase) A0A0C7B4Q9 26118 44 8 Putative Ubiquinol-cytochrome c reductase cytochrome c1 subunit A0A0A1N987 19292 13 8 Uncharacterized protein A0A1X0RKG4 20849 8 8 Uncharacterized protein (Fragment) A0A0A1P1D1 20202 44 7 Putative 30S ribosomal protein S10e A0A0C7B3N0 15531 7 7 Uncharacterized protein A0A0A1N1K5 19300 13 7 Uncharacterized protein A0A0C7B5L2 19694 26 7 Uncharacterized protein A0A1X0S364 24767 32 7 Ribosomal protein L19 A0A0C7AVD8 21815 28 6 Ribosomal protein L19 A0A0C7BHR4 13239 13 6 Uncharacterized protein A0A0C7BEF8 16996 13 6 Uncharacterized protein A0A1X0RS99 17016 13 6 Uncharacterized protein A0A0C7AY27 17460 9 6 Uncharacterized protein 109

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A0A0A1P7K7 21163 29 6 Uncharacterized protein A0A0C7B9R4 21910 47 6 Uncharacterized protein A0A1X0RLE1 16695 7 5 Aconitate hydratase, mitochondrial (Aconitase) (EC 4.2.1.-) A0A0A1NVK4 15966 15 5 Calreticulin A0A0A1MJ23 14411 17 5 Putative Mitochondrial DNA replication protein YHM2 A0A1X0RQZ1 14566 12 5 T-complex protein 1 subunit epsilon A0A0C7AY20 13476 24 5 Uncharacterized protein A0A0C7AWA2 14151 14 5 Uncharacterized protein A0A0A1PHU6 15966 15 5 Uncharacterized protein A0A0C7B2C5 16097 51 5 Uncharacterized protein A0A0C7BAK3 17058 15 5 Uncharacterized protein A0A0C7B6Q3 18195 26 5 Uncharacterized protein A0A0C7B9W7 22964 36 5 Uncharacterized protein A0A0A1NZW7 11551 50 5 V-type proton ATPase subunit G A0A0A1P8Z0 16929 6 4 Arginyl-tRNA synthetase A0A0A1NAC2 20073 11 4 Fructose-bisphosphate aldolase, class II (Putative Fructose 1,6- bisphosphate aldolase) A0A1X0RZI5 16136 9 4 Serine hydroxymethyltransferase (EC 2.1.2.1) A0A1X0S7G1 14059 14 4 Oxysterol-binding protein A0A0A1PJB8 12271 23 4 Putative Ras-like protein Rab-8A (Putative SEC4-like Rab/GTPase) A0A0A1MNA1 12339 9 4 Putative Ribosome biosynthesis protein SIK1 A0A0C7BJ98 12339 9 4 Putative ZYBA0S10-02674g1_1 A0A1X0RWG6 15106 18 4 Ras-domain-containing protein A0A0C7C6G3 9338 20 4 Uncharacterized protein A0A0A1NA88 10563 14 4 Uncharacterized protein A0A0C7B9C5 11051 7 4 Uncharacterized protein A0A0A1P250 18046 14 4 Uncharacterized protein A0A0C7BA84 22181 24 4 Uncharacterized protein

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A0A1X0RUE0 9525 5 3 3-isopropylmalate dehydratase (EC 4.2.1.33) (Alpha-IPM isomerase) (Isopropylmalate isomerase) A0A0C7BI12 12571 8 3 Acyl-CoA desaturase (EC 1.14.19.1) A0A1X0RNX9 9081 13 3 D subunit of V-type ATPase A0A0A1NCA3 16767 20 3 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I (eIF3i) (Eukaryotic translation initiation factor 3 39 kDa subunit homolog) (eIF-3 39 kDa subunit homolog) A0A0C7BQ70 11760 4 3 Glycogen [starch] synthase (EC 2.4.1.11) A0A0C7BNR4 10816 11 3 NADH-cytochrome b5 reductase (EC 1.6.2.2) A0A0C7BLI3 12810 11 3 Putative 3-phosphoglycerate dehydrogenase A0A0A1NY01 9464 10 3 Putative Acetyl-CoA hydrolase/transferase A0A0C7BLV8 10472 9 3 Putative Lanosterol 14-alpha demethylase A0A0A1P2Q1 12810 11 3 Putative Ser3p A0A0C7BNX1 9208 5 3 Putative Trehalose-6-phosphate synthase A0A0C7BJ15 9081 13 3 Putative V-type proton ATPase subunit D A0A1X0SA92 11361 7 3 T-complex protein 1 subunit alpha A0A0C7BSP5 8291 11 3 Uncharacterized protein A0A1X0SC14 9208 5 3 Uncharacterized protein A0A0C7AYA2 10004 13 3 Uncharacterized protein A0A0C7AW64 10931 25 3 Uncharacterized protein A0A0A1NL10 12258 7 3 Uncharacterized protein A0A0A1MNS5 12304 10 3 Uncharacterized protein A0A0C7B409 12960 8 3 Uncharacterized protein A0A0C7BPE6 14146 9 3 Uncharacterized protein A0A0A1PDR2 6946 6 2 26S protease regulatory subunit 10B (Putative 26S protease regulatory subunit S10B) A0A0A1PFV3 11254 13 2 6-phosphogluconolactonase (Putative 6-phosphogluconolactonase) A0A0A1NVW8 9790 18 2 Acyl-CoA N-acyltransferase (Putative Glucosamine-phosphate N- acetyltransferase) 111

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A0A1X0SDV8 6497 7 2 ATPase GET3 (EC 3.6.-.-) (Arsenical pump-driving ATPase) (Arsenite-stimulated ATPase) (Golgi to ER traffic protein 3) (Guided entry of tail-anchored proteins 3) A0A0C7BAZ3 9054 10 2 Chorismate synthase (EC 4.2.3.5) A0A1X0S1G3 7704 2 2 Coatomer subunit beta' A0A1X0SCV3 7090 3 2 Coatomer subunit gamma A0A1X0S4I1 8428 27 2 Cytochrome b5 A0A1X0RQT6 9498 4 2 Cytochrome P450 A0A0C7AY72 8606 5 2 Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1 (EC 2.4.99.18) A0A0C7B787 10425 18 2 E3 ubiquitin ligase complex SCF subunit sconC (Putative E3 ubiquitin ligase complex SCF subunit sconC) A0A0A1MPZ9 9692 6 2 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J (eIF3j) (Eukaryotic translation initiation factor 3 30 kDa subunit homolog) (eIF-3 30 kDa subunit homolog) A0A1X0S2D3 9186 8 2 NADH-cytochrome b5 reductase (EC 1.6.2.2) A0A1X0SDV7 8203 7 2 Glycoside hydrolase/deacetylase A0A1X0RL43 11698 3 2 Heat shock protein Hsp90 A0A0C7B4S8 5246 7 2 Methylthioribose-1-phosphate isomerase (M1Pi) (MTR-1-P isomerase) (EC 5.3.1.23) (S-methyl-5-thioribose-1-phosphate isomerase) (Translation initiation factor eIF-2B subunit alpha/beta/delta-like protein) A0A1X0S5T3 8296 2 2 Multi drug resistance-associated protein MRP A0A1X0SBG0 7813 9 2 NIPSNAP-domain-containing protein A0A0A1MLR0 6794 5 2 Phospho-2-dehydro-3-deoxyheptonate aldolase (EC 2.5.1.54) (3- deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase) (DAHP synthase) (Phospho-2-keto-3-deoxyheptonate aldolase) A0A0A1NMN2 8817 16 2 Proteasome subunit beta type (EC 3.4.25.1) A0A1X0RS84 8817 15 2 Proteasome subunit beta type (EC 3.4.25.1) A0A1X0RN15 11928 5 2 Protein serine/threonine phosphatase 2C 112

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A0A0A1NAZ6 11421 12 2 Protein YOP1 A0A0A1NHW8 7272 11 2 Purine and uridine phosphorylase A0A0C7B4A7 9935 6 2 Putative 26s protease regulatory subunit 4 A0A0C7CDL6 10935 8 2 Putative 40S ribosomal protein S12 A0A0A1P7B5 13144 10 2 Putative Actin-like protein 2 A0A0C7BBT2 9515 6 2 Putative Acyl-CoA carboxylate CoA-transferase A0A0A1P307 9036 6 2 Putative Aldehyde dehydrogenase (NAD ) A0A0A1P841 9130 2 2 Putative Cyclopropane-fatty-acyl-phospholipid synthase (S-adenosyl- L-methionine-dependent methyltransferase) A0A0A1NUZ7 6319 24 2 Putative DUTP pyrophosphatase A0A0C7BYK4 9790 18 2 Putative Glucosamine-phosphate N-acetyltransferase A0A0A1NUF7 8891 2 2 Putative Isoleucine-tRNA ligase A0A0C7AWL3 10175 7 2 Putative N-ethylmaleimide reductase A0A0C7BER9 9345 3 2 Putative Phosphoribosylformylglycinamidine synthase A0A0C7BB61 7697 7 2 Putative Pre-mRNA-processing factor 19 A0A1X0S7L7 9935 6 2 Putative RPT2-26S proteasome regulatory subunit A0A0A1N8S8 11390 5 2 Putative Serine-tRNA ligase (Seryl-tRNA synthetase) A0A0A1MUB7 11129 5 2 Putative Seryl-trna synthetase A0A0A1P596 7673 17 2 Putative Sorting nexin-3 A0A0C7BHS6 10936 4 2 Putative SPX domain containing protein A0A0C7B5C8 7234 12 2 Putative Translation initiation factor 2 subunit 2 A0A0C7BQE4 9656 9 2 Putative Vacuolar protein sorting-associated protein 26B A0A0C7B1X8 8974 12 2 Putative Vesicle-associated membrane protein 7 A0A0A1NGY3 7740 11 2 Putative V-type ATPase, D subunit A0A1X0S8S2 11893 13 2 Cytochrome b-c1 complex subunit Rieske, mitochondrial (EC 1.10.2.2) A0A1X0SC27 8974 18 2 Synaptobrevin-domain-containing protein

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A0A1X0RSV7 5744 10 2 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit G (eIF3g) (Eukaryotic translation initiation factor 3 RNA-binding subunit) (eIF-3 RNA- binding subunit) (Translation initiation factor eIF3 p33 subunit homolog) (eIF3 p33 homolog) A0A0A1PL34 6501 47 2 Tubulin-specific chaperone A A0A0A1MVE0 11457 9 2 Tyrosine--tRNA ligase (EC 6.1.1.1) (Tyrosyl-tRNA synthetase) A0A0C7BA65 6922 10 2 Uncharacterized protein A0A1X0RJT1 7008 11 2 Uncharacterized protein A0A0C7C5Z7 7173 7 2 Uncharacterized protein A0A0C7BSG0 7346 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7B680 7701 2 2 Uncharacterized protein A0A0C7B0P8 7813 8 2 Uncharacterized protein A0A0C7CPS8 7813 11 2 Uncharacterized protein A0A0C7BGR6 8203 6 2 Uncharacterized protein A0A0C7BSU1 8232 35 2 Uncharacterized protein A0A0A1N9Z4 8836 9 2 Uncharacterized protein A0A0A1N9B4 9052 14 2 Uncharacterized protein A0A0A1NBN1 9096 39 2 Uncharacterized protein A0A0C7B6Y1 9250 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7C0M8 9619 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7AX81 9703 11 2 Uncharacterized protein A0A0C7AW88 9895 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7B8K4 10821 5 2 Uncharacterized protein A0A1X0RNK7 10936 2 2 Uncharacterized protein A0A0A1P438 11200 5 2 Uncharacterized protein A0A0A1MLZ0 11257 9 2 Uncharacterized protein A0A0C7BK97 11389 11 2 Uncharacterized protein A0A1X0SBZ4 11485 3 2 Uncharacterized protein A0A0C7BQT3 11489 11 2 Uncharacterized protein 114

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A0A0A1P030 11611 6 2 Uncharacterized protein A0A0C7BVM2 11625 16 2 Uncharacterized protein A0A0C7BDX0 11698 3 2 Uncharacterized protein A0A0C7BIJ2 12051 19 2 Uncharacterized protein A0A0C7B537 12235 5 2 Uncharacterized protein A0A0C7C2A0 12806 28 2 Uncharacterized protein A0A1X0S585 13830 4 2 Malic enzyme A0A0C7BHM5 14950 9 2 Uncharacterized protein A0A1X0RVD2 17468 16 2 Uncharacterized protein A0A1X0SD88 5813 4 1 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 14 A0A0A1NWW2 10718 14 1 30S ribosomal protein S8 (Putative 30S ribosomal protein S8) A0A0C7BMG3 5402 18 1 40S ribosomal protein S29 (Putative 40S ribosomal protein S29-B) A0A1X0RV53 3870 17 1 40S ribosomal protein S30 A0A0A1N4A8 8363 11 1 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine synthase (DMRL synthase) (EC 2.5.1.78) A0A1X0SAW6 4333 3 1 6PF2K-domain-containing protein A0A1X0SFS8 5537 2 1 Acetyl-CoA hydrolase A0A1X0RZ64 4369 2 1 Acid protease A0A1X0RJS5 4282 3 1 Alpha/beta-hydrolase A0A1X0S4S7 3607 3 1 Ammonium transporter A0A0A1N088 4808 1 1 ANTH-domain-containing protein (Putative SLA2 homologue) A0A1X0SFH5 6497 2 1 Asparaginyl-tRNA synthetase A0A1X0RX01 7174 2 1 ATP-dependent metallopeptidase Hfl A0A0A1N1T5 7935 3 1 Catalase (EC 1.11.1.6) A0A0C7C1S4 7903 4 1 Cell division/GTP binding protein (Putative GTP binding protein) A0A1X0S7M9 4217 1 1 Chitin synthase A0A1X0S1U3 6630 14 1 ClpS-like protein A0A1X0RQP9 5498 6 1 Cytidine deaminase (EC 3.5.4.5) (Cytidine aminohydrolase)

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A0A0A1P3G3 7031 4 1 Diphosphomevalonate decarboxylase (EC 4.1.1.33) (Mevalonate pyrophosphate decarboxylase) A0A1X0S643 7116 3 1 DnaJ-domain-containing protein A0A1X0S5S7 5458 6 1 Dolichol-phosphate mannosyltransferase A0A1X0S966 10130 7 1 E set domain-containing protein A0A0A1NVG8 5282 6 1 ERG2 and sigma1 receptor-like protein A0A0C7BH34 6236 2 1 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A (eIF3a) (Eukaryotic translation initiation factor 3 110 kDa subunit homolog) (eIF3 p110) (Translation initiation factor eIF3, p110 subunit homolog) A0A0C7BWI1 8688 2 1 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit D (eIF3d) A0A0C7BKN5 5505 3 1 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit M (eIF3m) A0A1X0RKP9 3768 3 1 Eukaryotic translation initiation factor 4E A0A0A1P2U2 6138 4 1 FMN-linked oxidoreductase A0A1X0RZL8 5895 1 1 Glycogen [starch] synthase (EC 2.4.1.11) A0A0A1ML18 5947 1 1 Glycoside hydrolase A0A0A1P1N5 13605 4 1 Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-like protein (Putative Guanine nucleotide-binding protein subunit beta-2-like 1) A0A1X0S4M6 6146 5 1 Histone H2A A0A0C7AZS1 8680 1 1 Kinesin-like protein A0A0C7C4D0 4909 2 1 Leukotriene A(4) hydrolase (LTA-4 hydrolase) (EC 3.3.2.6) A0A1X0S1F7 4909 2 1 Leukotriene A(4) hydrolase (LTA-4 hydrolase) (EC 3.3.2.6) A0A1X0RMP7 3473 5 1 Mannose-1-phosphate guanyltransferase A0A0A1NVS8 3734 2 1 Methionine aminopeptidase 2 (MAP 2) (MetAP 2) (EC 3.4.11.18) (Peptidase M) A0A0C7BK67 3789 7 1 Mitochondrial pyruvate carrier A0A0A1N9G2 7985 12 1 mRNA stability protein A0A1X0RRI4 9582 3 1 NADPH:quinone reductase A0A1X0RTZ3 5371 3 1 NAP-domain-containing protein

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A0A1X0S9Y0 6024 2 1 NTF2-domain-containing protein A0A1X0RWB6 3468 2 1 Phosphoribosylamine--glycine ligase A0A1X0S6C1 7026 1 1 Phosphorylase kinase alphabeta A0A0A1PLE2 5693 10 1 Prefoldin A0A0A1P4Z3 7440 5 1 Proliferating cell nuclear antigen A0A0C7BRC5 6422 2 1 Proline dehydrogenase (EC 1.5.5.2) A0A0A1P613 3869 4 1 Proteasome subunit beta type (EC 3.4.25.1) A0A1X0RL44 3869 5 1 Proteasome subunit beta type (EC 3.4.25.1) A0A1X0SFT3 6199 3 1 Protein phosphatase PP2A regulatory subunit B A0A0C7B6P6 6199 3 1 Protein phosphatase PP2A regulatory subunit B A0A0C7BJH3 9025 5 1 Putative 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase A0A0C7BAP4 6630 14 1 Putative 50S ribosomal protein L7/L12 A0A0C7B1T2 4724 3 1 Putative Actin CyI A0A0A1NPA5 8085 2 1 Putative AFG3 family protein A0A0A1NAJ7 5899 1 1 Putative Alpha 1,3-glucosidase A0A0C7BS65 3468 2 1 Putative Aminoimidazole ribonucleotide synthetase A0A0A1NKD6 8449 3 1 Putative Argininosuccinate synthase A0A0C7B5Y1 4409 3 1 Putative Aspartate-semialdehyde dehydrogenase A0A0A1NLT1 5282 6 1 Putative C-8 sterol isomerase A0A0A1MN65 7903 5 1 Putative CDC10 A0A0A1PGZ4 6774 6 1 Putative Cell division control protein 12 (Septin) A0A0C7BAC5 8085 2 1 Putative Cell division protease ftsH A0A0A1PBW3 5319 2 1 Putative Centromere/microtubule-binding protein cbf5 A0A0A1NIF4 7557 11 1 Putative Conidiation-specific protein con-10 (Putative Stress-induced bacterial acidophilic repeat domain-containing protein) A0A0C7AWU6 3926 6 1 Putative DUF866 domain-containing protein A0A0C7BB32 4975 2 1 Putative Elongation factor Tu GTP binding domain-containing protein A0A0A1MUH8 5106 6 1 Putative Enoyl reductase A0A0C7C655 4975 2 1 Putative Eukaryotic peptide chain release factor GTP-binding subunit 117

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A0A0A1MI44 4975 4 1 Putative Eukaryotic release factor 3 A0A0C7BPJ2 5092 5 1 Putative Expressed protein A0A0A1NNW7 6211 9 1 Putative F-actin-capping protein subunit beta isoforms 1 and 2 A0A0A1N7Q3 9269 5 1 Putative Farnesyl pyrophosphate synthase A0A0A1PBA2 6199 2 1 Putative GTP cyclohydrolase II A0A0C7BLY5 6608 2 1 Putative Heat shock protein 78, mitochondrial A0A0C7B1S0 11013 8 1 Putative Histone H1/5 A0A0A1P7A1 5129 2 1 Putative Hydroxysteroid dehydrogenase A0A0C7BU29 8449 3 1 Putative KLTH0F06644p A0A0C7BSA5 3521 8 1 Putative Maltose O-acetyltransferase A0A0C7CCB8 9416 5 1 Putative Metacaspase-1A A0A0C7BI60 4581 4 1 Putative Mitochondrial inner membrane transporter A0A0C7AXE0 5129 1 1 Putative Multifunctional beta-oxidation protein A0A0C7AVN4 4499 4 1 Putative NADH dehydrogenase (Ubiquinone) Fe-S protein 4 A0A0A1NXG3 4970 13 1 Putative Ndufs5 domain-containing protein A0A0C7BQ12 4053 2 1 Putative Non-specific lipid-transfer protein A0A0C7BAH8 5371 3 1 Putative Nucleosome assembly protein 1-like 1 A0A0C7BQ23 3530 6 1 Putative Peanut-like protein 1 (Cell division control like protein 1) A0A0C7B215 7335 4 1 Putative Phenylalanyl-tRNA synthetase alpha chain A0A0C7BS17 3468 2 1 Putative Phosphoribosylamine-glycine ligase / phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase A0A0C7CAF8 6199 2 1 Putative Podospora anserina S mat genomic DNA chromosome 2, supercontig 2 A0A0C7BSB7 4653 3 1 Putative Pre-mRNA-splicing factor syf1 A0A0A1NC25 8717 15 1 Putative Proteasome subunit alpha type A0A0C7CAU0 6199 2 1 Putative Riboflavin biosynthesis protein A0A0A1N4D2 7417 19 1 Putative Ribonucleoprotein-associated protein (Ribonucleo protein- associated protein)

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A0A0A1NLK0 6392 5 1 Putative RNA-binding domain-containing protein A0A0A1NZR5 3530 2 1 Putative Sep5a A0A0A1NWR0 5129 2 1 Putative Short-chain dehydrogenase/reductase SDR A0A0C7CFD8 6826 2 1 Putative Signal recognition particle subunit SRP72 A0A0C7B6K0 3955 11 1 Putative Single-stranded DNA-binding protein A0A0C7BX09 4808 1 1 Putative SLA2 homologue A0A0A1NNX6 4375 9 1 Putative Small secreted protein, hesp-767 A0A0C7CC84 5455 3 1 Putative S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase A0A0C7C872 9826 3 1 Putative SNF7 family protein, charged multivesicular body protein 2A A0A0C7B5U5 3467 1 1 Putative SSD1 A0A0A1NJ40 4053 2 1 Putative Sterol carrier protein 2 A0A0C7CIW0 5980 2 1 Putative Succinate semialdehyde dehydrogenase A0A0A1NTX2 5582 2 1 Putative T-complex protein 1 subunit theta A0A0C7C8E6 4431 4 1 Putative Tryptophanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic A0A0C7AZP1 3887 4 1 Putative UDP-glucose 4-epimerase A0A0C7C802 4004 10 1 Putative UDP-glucuronate decarboxylase A0A0C7BFW8 5288 5 1 Putative Uridine kinase A0A0A1N3F3 4363 5 1 Putative Vesicle transporter SEC22 A0A0C7B9Z9 8085 2 1 Putative YALI0A10615p A0A0C7BTH8 11239 4 1 Putative YALI0D03762p A0A0A1NPR4 7167 3 1 Reticulon-like protein A0A1X0RQH6 4262 2 1 Dolichyl-diphosphooligosaccharide--protein glycosyltransferase subunit 1 (EC 2.4.99.18) A0A1X0S824 8985 5 1 S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase A0A1X0S583 3530 2 1 Septin A0A0C7BPM4 5455 3 1 S-methyl-5'-thioadenosine phosphorylase (EC 2.4.2.28) (5'- methylthioadenosine phosphorylase) (MTA phosphorylase) (MTAP) (MTAPase)

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A0A1X0RR53 4363 5 1 Snare-like protein A0A0C7BCL3 4573 8 1 Succinate--CoA ligase [ADP-forming] subunit alpha, mitochondrial (EC 6.2.1.5) (Succinyl-CoA synthetase subunit alpha) (SCS-alpha) A0A1X0SBZ8 5980 2 1 Succinic semialdehyde dehydrogenase A0A1X0RTY9 4349 1 1 Sulphite reductase hemo protein, beta subunit A0A1X0RKK8 4933 2 1 T-complex protein 1 subunit delta A0A0A1N750 7172 2 1 Terpene cyclase/mutase family member (EC 5.4.99.-) A0A1X0RZ60 4653 2 1 TPR-like protein A0A0C7BF82 5792 2 1 Trehalase (EC 3.2.1.28) (Alpha-trehalose glucohydrolase) A0A0A1NHG2 6212 2 1 Tryptophan synthase (EC 4.2.1.20) A0A1X0SCJ6 6498 6 1 t-SNARE A0A1X0SAG7 4997 10 1 Ubiquitin-related modifier 1 A0A0C7BWQ2 3382 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7AVQ4 3532 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1NRH4 3545 5 1 Uncharacterized protein A0A1X0SF93 3547 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0RSA6 3579 8 1 Uncharacterized protein A0A1X0RLR5 3659 18 1 Uncharacterized protein (Fragment) A0A0A1MZ78 3659 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7CJ29 3677 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7B3F6 3685 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0RLL1 3716 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BRD9 3736 0 1 Uncharacterized protein A0A0A1NMC4 3802 11 1 Uncharacterized protein A0A0C7BNR3 3895 0 1 Uncharacterized protein A0A0C7BMZ9 3898 9 1 Uncharacterized protein A0A0A1NEF3 3963 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BQE0 4053 2 1 Uncharacterized protein

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A0A0C7BWT9 4070 2 1 Uncharacterized protein A0A0A1MHX1 4108 15 1 Uncharacterized protein A0A0C7CGU6 4108 7 1 Uncharacterized protein A0A0C7BHI4 4282 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0SCV4 4300 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7BEY1 4320 7 1 Uncharacterized protein A0A0C7BF37 4333 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1P552 4340 6 1 Uncharacterized protein A0A0A1NBR2 4342 20 1 Uncharacterized protein A0A0A1NUV0 4349 1 1 Uncharacterized protein A0A1X0S0V3 4363 12 1 Uncharacterized protein A0A1X0S153 4417 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7AX13 4496 6 1 Uncharacterized protein A0A1X0SC90 4518 0 1 Uncharacterized protein (Fragment) A0A0C7BRS1 4533 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BU75 4564 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7C546 4575 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7C734 4589 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1NLE4 4639 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7C1J3 4688 0 1 Uncharacterized protein A0A0C7BZJ9 4713 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1NXG5 4803 11 1 Uncharacterized protein A0A1X0S1X8 4855 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7BM00 4932 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7B1A2 5039 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0S9I6 5092 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BGC0 5106 5 1 Uncharacterized protein A0A1X0S8A0 5178 1 1 Uncharacterized protein

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A0A1X0RWZ1 5245 2 1 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit A (eIF3a) (Eukaryotic translation initiation factor 3 110 kDa subunit homolog) (eIF3 p110) (Translation initiation factor eIF3, p110 subunit homolog) A0A0C7BP14 5363 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1N329 5388 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BJF3 5393 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7BE13 5437 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7BHZ8 5497 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7CEM0 5500 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7C997 5562 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7C7D0 5676 4 1 Uncharacterized protein A0A0A1P5K9 5699 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1MS40 5713 10 1 Uncharacterized protein A0A0C7CFE8 5713 25 1 Uncharacterized protein A0A0C7BQG4 5787 5 1 Uncharacterized protein A0A1X0RSE5 5843 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7BIS4 5843 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BW05 5843 12 1 Uncharacterized protein A0A0A1NPB0 5843 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0S3E7 5899 1 1 Uncharacterized protein A0A0A1N704 5908 2 1 Uncharacterized protein A0A1X0SE80 6076 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7CMM2 6199 7 1 Uncharacterized protein A0A0A1PBL5 6296 1 1 Uncharacterized protein A0A0C7C027 6346 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0RSS6 6389 19 1 Uncharacterized protein A0A0C7AWF1 6498 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7BSQ1 6669 5 1 Uncharacterized protein A0A0A1N0R9 6740 2 1 Uncharacterized protein 122

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A0A0C7BI63 6829 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7BRQ8 6879 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7BXE9 7010 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0RWK9 7063 9 1 Uncharacterized protein (Fragment) A0A0C7AXV9 7128 2 1 Uncharacterized protein A0A1X0S0V1 7167 3 1 Reticulon-like protein A0A0A1P1J4 7252 14 1 Uncharacterized protein A0A0C7BK51 7253 8 1 Uncharacterized protein A0A0C7B583 7304 1 1 Uncharacterized protein A0A1X0RXN1 7318 6 1 Uncharacterized protein A0A0C7BRF7 7320 3 1 Glucose-6-phosphate 1-epimerase (EC 5.1.3.15) A0A0A1PES5 7320 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0SC71 7360 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7B202 7360 2 1 Uncharacterized protein A0A0C7AZQ0 7702 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1PDQ0 7711 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0RLG9 8064 6 1 Uncharacterized protein A0A0A1PHY7 8087 7 1 Uncharacterized protein A0A0A1PE71 8120 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7BEK7 8237 6 1 Uncharacterized protein A0A0A1NBP7 8492 9 1 Uncharacterized protein A0A1X0SCN7 8519 6 1 Uncharacterized protein A0A0A1P5Q1 8626 4 1 Uncharacterized protein A0A1X0RVC6 8661 0 1 Uncharacterized protein A0A0A1NEX8 8985 5 1 Uncharacterized protein A0A0C7AYQ1 9069 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7B0B5 9078 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7CN29 9143 5 1 Uncharacterized protein

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A0A1X0RKZ0 9209 3 1 Uncharacterized protein A0A0C7C214 9582 3 1 Uncharacterized protein A0A0A1NGW1 10206 5 1 Uncharacterized protein A0A1X0SCV0 10224 11 1 Uncharacterized protein A0A0C7BBS2 10366 3 1 Uncharacterized protein A0A1X0RTA8 10887 4 1 Uncharacterized protein A0A0C7CIU9 11043 5 1 Uncharacterized protein A0A1X0SCQ2 3789 7 1 Mitochondrial pyruvate carrier

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