DETECCIÓN DE BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EN ANFIBIOS DE UN BOSQUE HÚMEDO TROPICAL SUBMONTANO LOCALIZADO EN EL MUNICIPIO DE SANTA MARÍA-BOYACÁ
JANETH DEL PILAR BAHAMÓN CARMONA
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para optar el título de
BIÓLOGA
Director Andrés Acosta Galvis Facultad De Ciencias Pontificia Universidad Javeriana
Codirector Marcela Franco Correa Facultad De Ciencias
PONTIFICA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA Bogotá, D.C Noviembre 2010 DETECCIÓN DE BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EN ANFIBIOS DE UN BOSQUE HÚMEDO TROPICAL SUBMONTANO LOCALIZADO EN EL MUNICIPIO DE SANTA MARÍA-BOYACÁ
JANETH DEL PILAR BAHAMÓN CARMONA
APROBADO
Ingrid Shuler Ph.D Andrea Forero Decana Académico Directora de Carrera
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.”
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946.
Tabla de Contenido
1. Resumen……………………………………….…………………………………….…………1 2. Introducción………………………………….………………….………………………...…...1 3. Justificación y Planteamiento del problema.……..……..………….…...... 2 4. Marco Teórico…………...……………………………………………………………………..3 4.1 Generalidades del hongo Batrachochitryum dendrobatidis………………………………...3 4.2 Distribución mundial de Batrachochitryum dendrobatidis…………………………………5 4.2.1 Oceanía……………………………………………………………………………………...5 4.2.2 Asia…………………………………………………………………………………………..6 4.2.3 Europa………………………………………………………………………………………7 4.2.4 América del Norte………………………………………………………………………….8 4.2.5 Centroamérica…………………………………………………………………………….10 4.2.6 América del Sur…………………………………………………………………………...13 4.2.7 Reportes de Batrachochitryum dendrobatidis en Colombia……………………………..16 4.3 Técnicas de detección de Batrachochitryum dendrobatidis………………………………..17 5. Objetivos…………………………………………………………………………………...... 18 5.1 Objetivo General……………….…….……………………………..…………………..…..18 5.2 Objetivos Específicos…………………..…………………………………..…...... 19 6. Metodología……………………………...………………………………………..…………..19 6.1 Área de Estudio……………………………………………………………………………...19 6.1.1 Lugares de muestreo……………………………………………………………………...21 6.2 Obtención de muestras……………………………………………………………………...24 6.3 Extracción de ADN…………………………………………………………………………26 6.4.1 Diagnóstico de Batrachochitryum dendrobatidis…………………………………………26 6.4.2 Preparación del volumen final de reacción para cada muestra………………………..28 6.4.3 Montaje de PCR en Tiempo Real………………………………………………………..28 6.4.4 Reproducibilidad de resultados…………………………………………………………..28 6.5 Análisis de Resultados………………………………………………………………………29 6.6 Análisis Estadístico………………………………………………………………………….30 7. Resultados………………………………………………………………...... 31 7.1 Especies de Anfibios encontradas………………………………………………………….31 7.2 Contagio de Bd con respecto al tipo de hábito de las especies de anfibios………………33 7.3 Especies de anfibios que presentan el patógeno…………………………………………..34 7.3.1 Reproducibilidad de los resultados………………………………………………………35 7.4 Variables medioambientales estudiadas y su posible asociación con la detección de Batrachochytrium dendrobatidis………………………………………………………………..43 7.4.1 Estadísticos descriptivos…………………………………………………………………..43 7.4.2 Resultados………………………………………………………………………………….43 8. Discusión………………………………………………………………………………………44 8.1 Especies de anfibios encontradas…………………………………………………………..45 8.2 Especies que presentaron el patógeno……………………………………………………..46 8.2.1 Resultados que apoyan la propuesta de contagio en ambientes lénticos………………47 8.2.2 Resultados que refutan la propuesta de contagio en ambientes lénticos………………48 8.2.3 Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni como posibles reservorios de Batrachochytrium dendrobatidis…………………………………………………………..…….50 8.2.4 Posible explicación de la llegada de Batrachochytrium dendrobatidis al bosque estudiado…………………………………………………………………………………………51 8.3 Asociación entre la temperatura y humedad del ambiente y con la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis………………………………………………………………...52 9. Conclusiones.…………………….……………………………………………………………53 10. Recomendaciones……………………………………………………………………………53 11. Bibliografía………………………………………………………………………………….55 11. Anexos ……………………………………………………………………………………….66 10.1 Anexo I…………………………………………………………………………………….66
Título: Detección de Batrachochytrium dendrobatidis en anfibios de un Bosque Húmedo Tropical Submontano localizado en el municipio de Santa María-Boyacá
1. Resumen
El presente proyecto pretendió detectar la presencia del hongo patógeno Batrachochitryum dendrobatidis (Bd) en anfibios localizados en un bosque húmedo tropical submontano situado en el municipio de Santa María- Boyacá. Se realizó la búsqueda de anfibios durante muestreos diurnos y nocturnos para colectar el mayor número de especies posibles utilizando el método de relevamiento por encuentros visuales (REV), a cada espécimen capturado se le realizó un raspado con escobillón estéril de la superficie ventral, miembros anteriores e inferiores, interior de los dedos, parche ventral y parte dorsal; y su detección se efectuó mediante diagnóstico molecular (PCR en Tiempo Real), amplificando un fragmento de la secuencia ribosomal 18S y 5,8S altamente conservada y usando como estándar una solución de ADN puro proveniente del Animal Health Laboratory - Australia. Del orden Anura se analizaron 13 especies pertenecientes a las familias Aromobatidae, Bufonidae, Centrolenidae, Hylidae, Leptodactylidae y Strabomantidae , del orden Apoda una especie perteneciente a la familia Caeciliidae y del orden Caudata una especie perteneciente a la familia Plethodontidae; de las 95 muestras analizadas dos resultaron positivas, demostrando así la presencia de Bd y el bajo número de casos de anfibios infectados en este Bosque Húmedo Tropical Submontano que hace parte de la región oriental de Colombia. Además de la detección del quitridio, se llevó a cabo una regresión logística binaria que demostró que no existe relación entre la presencia de Bd en los anfibios encontrados y la temperatura y humedad del ambiente en la zona de estudio (Temperatura P=0,509; Humedad Relativa P=0,426).
2. Introducción
Uno de los principales factores que ha producido la disminución de las poblaciones de anfibios es la Quitridiomicosis (Berger et al.1998; Daszak et al. 1999; Longcore et al. 1999; Pressier et al.
1 1999; Bosch et al. 2001; Collins & Storfer 2003), enfermedad emergente causada por el hongo patógeno Bd (Longcore et al.1999). Este quitridio afecta a los anfibios en gran medida ya que degrada la queratina presente en el estrato córneo y granuloso de la epidermis de anfibios adultos y la queratina que compone la región oral de los renacuajos. Debido a que Colombia es el segundo país más diverso en especies de anfibios a nivel mundial, el impacto de esta enfermedad en sus poblaciones podría ser devastador, sin embargo, a la fecha no se han observado patrones definidos de preferencia tanto de hábitats como de hospederos ni su presencia en algunas zonas del país.
Con el fin de generar aportes al conocimiento sobre la presencia de Bd, este estudio se llevó a cabo en Santa María (Boyacá), municipio que forma parte del rango de distribución del algunas especies del Piedemonte Llanero y que además son propias de una de las regiones más diversa en especies de anfibios en Colombia: La Orinoquía. Así mismo este municipio presenta unas condiciones óptimas teóricamente que podrían favorecer el crecimiento y la dispersión de Bd.
Se pretendió identificar las especies de la zona que podrían verse afectadas por el patógeno y establecer si la presencia de Bd se encuentra asociada con algunas variables medioambientales como la temperatura y humedad. Para cumplir con el desarrollo de los objetivos se realizó la búsqueda de anfibios juveniles y adultos durante muestreos diurnos y nocturnos usando el método de relevamientos por encuentros visuales (REV), los especímenes fueron capturados usando guantes de nitrilo estériles, se les realizó un raspado con escobillón de toda la superficie del cuerpo y estos resultados fueron analizados mediante PCR en Tiempo Real con el propósito de evaluar la presencia del patógeno. Adicionalmente se estableció mediante una regresión logística binaria si variables ambientales como la temperatura y humedad estaban asociadas con el quitridio.
Como resultados se obtuvieron un total de 15 especies de anfibios que representa a los tres órdenes de anfibios. Adicionalmente se analizaron 95 muestras de las cuales dos resultaron positivas para Bd: Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni, estas dos especies comparten hábitos acuáticos y juntas llevan a cabo la ovoposición y/o metamorfosis en cuerpos
2 de agua lénticos. Los resultados de la regresión logística binaria indicaron que no existe asociación entre la temperatura y humedad y la presencia del patógeno.
3. Justificación y Planteamiento del Problema
La Quitridiomicosis es una enfermedad emergente de anfibios causada por el hongo patógeno Bd (Longcore et al. 1999). Este hongo Chytridiomicete es el principal agente causal del declive y extinción de especies de anfibios a nivel mundial (Berger et al.1998; Daszak et al. 1999; Longcore et al. 1999; Pressier et al. 1999; Bosch et al. 2001; Collins & Storfer 2003), ya que degrada la queratina presente en el estrato córneo y granuloso de la epidermis de los anfibios adultos impidiendo así el intercambio gaseoso con el medio y en larvas causa deformaciones del disco oral (Berger et al. 1999; Fellers et al. 2001; Vredenburg & Summers 2001). Actualmente existen reportes de la enfermedad en América del Norte, América del Sur, Europa, África, Asia y Oceanía, tanto para anuros como para salamandras (Fellers et al. 2001; Bosch et al. 2001; Bradley et al. 2002; Davidson et al. 2003; Ron 2005; Kriger & Hero 2006).
Debido a que Colombia es el segundo país más diverso en especies de anfibios a nivel mundial con 750 especies actualmente (Acosta, com.pers.) podría verse fuertemente afectado por la presencia de este patógeno, enfrentando la mortalidad masiva y la extinción de muchas especies endémicas. A la fecha existen vacíos de información en el país acerca de las especies de anfibios que presentan quitridiomicosis, la distribución de esta enfermedad, sus causas y efectos directos sobre las poblaciones de anfibios ya que sólo se ha reportado esta enfermedad en el departamento del Valle del Cauca (Cordillera Occidental) y en los departamentos de Santander y Cundinamarca ubicados hacia el occidente de la Cordillera Oriental (Ruíz y Rueda-Almonacid 2008; Velásquez et al. 2008); teniendo en cuenta lo anterior este estudio pretende generar aportes al conocimiento sobre la presencia de Bd en el municipio de Santa María (Boyacá) y establecer si esta está asociada con algunas variables medioambientales como la temperatura y humedad del municipio.
4. Marco Teórico 4.1 Generalidades del hongo Batrachochitryum dendrobatidis
3 Dentro de los principales factores que han producido la disminución de las poblaciones de anfibios está la Quitridiomicosis (Berger et al.1998; Daszak et al. 1999; Longcore et al. 1999; Pressier et al. 1999; Bosch et al. 2001; Collins & Storfer 2003), enfermedad emergente causada por el hongo patógeno Bd (Longcore et al.1999). Esta enfermedad al parecer es originaria de África y una hipótesis de su amplia diseminación es a causa de la comercialización mundial de la especie Xenopus laevis con fines médicos (Weldon 2004). Batrachochytrium dendrobatidis es un organismo acuático, único en el subphylum Chytridiomycota conocido por parasitar vertebrados (Kriger & Hero 2006b). El hongo posee dos etapas en su ciclo de vida, una en la que es sésil con un esporangio reproductivo y otra mótil con las zoosporas liberadas por el zoosporangio (Johnson et al. 2003). En anfibios adultos Bd sólo coloniza las células queratinizadas del estrato córneo y el estrato granuloso de la epidermis (Longcore et al. 1999) presentándose en mayor concentración en el parche ventral y la entrepierna (Pressier et al. 1999). No obstante, cuando los niveles de infección son muy altos, los adultos tienden a presentar el hongo en la parte dorsal y ventral del cuerpo (Parker et al. 2002). Algunos síntomas de infección incluyen mudas de piel excesivas, hiperqueratosis, hiperplasia, posición del cuerpo anormal, aletargamiento, pérdida de reflejos y anorexia (Berger et al. 1998; Nichols et al. 2001). En las larvas de anuros la infección se limita a las células queratinizadas del disco oral y puede causar deformaciones o pérdida de partes de la boca (Berger 1999; Fellers et al. 2001; Vredenburg & Summers 2001).
Según Berger et al. (2004) y Lips et al (2006) se da una proliferación y transmisión rápida del patógeno en las épocas de lluvia (caracterizadas por presentar temperaturas de 17 a 25°C), ya que los individuos se encuentran más cercanos a los cuerpos de agua por lo cual la densidad poblacional de anfibios aumenta. Pero, no sólo las poblaciones de anfibios con hábitos acuáticos decrecen, también sucede con los anfibios de hábitos terrestres, pero a menor velocidad ya que una hipótesis de su contagio explica que puede darse durante el amplexo o al entrar en contacto con algún sustrato contaminado con el patógeno (Puschendorf & Bolaños 2006).
Según Garner et al (2005) las poblaciones de anfibios afectadas por este patógeno desaparecen en pocos meses. Primero los adultos mueren rápidamente debido a la imposibilidad de intercambio gaseoso con el medio y de mantener la homeostasis entre los fluidos y electrolitos (Berger et al. 1998; Pressier et al.1999; Velázquez et al. 2008); mientras que las larvas que inicialmente se
4 encuentran infectadas sólo en la región bucal, mueren más tarde cuando se completa su proceso de metamorfosis y la queratina (y con ella el hongo) se extienden en todo el cuerpo. Es así que aunque los hospederos hayan desaparecido Bd puede mantenerse en el medio gracias a sus facultades saprobias. El diagnóstico de éste patógeno puede hacerse mediante análisis histológicos o histoquímicos de muestras de piel post-mortem, por medio de PCR convencional (Annis et al. 2004) o, por técnicas de diagnóstico moleculares altamente sensibles como PCR en Tiempo Real (Boyle et al. 2004).
A nivel global la disminución de las poblaciones de anfibios a causa de la Quitridiomicosis ha sido reportada en países como: Nueva Zelanda, Tasmania, Australia, Indonesia, Japón, China, Korea, Inglaterra, Alemania, Suiza, Austria, España, Canadá, Estados Unidos, Hawaii, México, Honduras, Costa Rica, Puerto Rico, Panamá, Cuba, Venezuela, Ecuador, Perú, Chile, Brasil, Bolivia, Argentina, Uruguay y Colombia.
4.2 Distribución mundial de Batrachochitryum dendrobatidis
Los reportes más importantes teniendo en cuenta la literatura existente a nivel mundial sobre estudios orientados a Bd en anfibios se presentan a continuación de manera geográfica:
4.2.1 Oceanía
En Oceanía la quitridiomicosis ha sido reportada en países como: Nueva Zelanda, Tasmania y Australia.
En Nueva Zelanda se reportó quitridiomicosis en la especie Litoria raniformis colectada en el periodo de 1999-2000. Los individuos con quitridiomicosis fueron encontrados muertos y con mudas de piel excesivas. Se les realizaron cortes histológicos y tinción con hematoxilina y eosina, lo cual confirmó la presencia del patógeno. Pese a estos resultados los autores afirmaron que no es raro detectar a éste patógeno en Nueva Zelanda ya que las Litorias son regularmente exportadas e importadas desde y hasta granjas de Estados Unidos y otros países en donde pueden
5 entrar en contacto con especies reservorio de Bd como Lithobates catesbeianus y Xenopus laevis (Waldman et al. 2001).
En Tasmania el primero en detectar la enfermedad fue Obendorf (2005) en 5 especies de anuros tanto en áreas urbanas como rurales, posteriormente Pauza y Driessen (2008) reportaron la quitridiomicosis en renacuajos de las especies Litoria burrowsae (=Litoria burrowsi), Litoria ewingii, Crinia signífera y Crinia tasmaniensis a temperaturas de 12 a 21°C usando PCR en Tiempo Real. Observaron una baja incidencia de la enfermedad ya que su distribución era restringida y sugirieron que los procesos antropogénicos podrían ser los principales responsables de facilitar la dispersión del patógeno, sin embargo, no fue posible afirmar que Bd fuese el causante del declive.
En Australia Berger et al. (1998) reportaron la quitridiomicosis en anuros de un Bosque Húmedo lluvioso montano, en el cual se observaron eventos de mortalidad en masa asociados con declinaciones significativas de las poblaciones de anfibios. El primer reporte data de 1993 en las especies Litoria spenceri, Litoria caerulea, Litoria lesueuri, Litoria nannotis, Litoria rheocola, Mixophyes fasciolatus, Mixophyes fleayi, Bufo marinus (=Rhinella marina), Limnodynastes tasmaniensis, Limnodynastes dumerilii, Taydactylus eungellensis Taudactylus acutirostris; estos resultados fueron obtenidos mediante el uso de técnicas histológicas. No se observaron signos aparentes de la enfermedad pero la microscopía evidenció hiperplasia e hiperqueratosis de la epidermis. Gracias a los resultados obtenidos se concluyó que la quitridiomicosis es una enfermedad fatal de anuros y que puede ser la causa más posible de los recientes declives de anfibios. Posteriormente Retallick et al. (2004) detectaron una prevalencia de Bd en Taudactylus eungellensis del 18% y en Litoria wilcoxii/ yungguy del 28%. La especie Taudactylus eungellensis ha desaparecido de los Bosques Lluviosos ubicados en el Parque Nacional Eungella desde 1985, pero ahora persiste estable con Bd por lo cual los autores no creen que Bd haya sido el causante inicial del declive de esta especie. Concluyeron que la presencia de Bd varía entre temporadas, siendo más prevalente en invierno y primavera. Luego Berger et al (2004) reportaron que de 241 anfibios de vida libre analizados, 133 se encontraban infectados con Bd (52,2%) pertenecientes a 34 especies. La enfermedad afectó anfibios de altitudes bajas y altas de las familias Hylidae (19 especies), Myobatrachidae (14 especies) y Bufonidae (1 especie).
6 Encontrando que la tasa de mortalidad incrementa a bajas temperaturas que van desde los 17 a los 23°C.
4.2.2 Asia
En Asia la quitridiomicosis ha sido reportada en países como: Indonesia, Japón, China, Korea
El primer reporte de la enfermedad para Indonesia lo dio Kusrini et al. (2008) para las especies Rhacophorus javanus (=Rhacophorus margaritifer), Rana chalconota (=Hylarana chalconota), Leptobrachium hasseltii, Limnonectes microdiscus y Leptophryne cruentata que presentaron bajos y moderados niveles de infección.
En el 2008 Une et al. reportaron a Bd en Japón y para todo el continente de Asia en las especies de ranas exóticas exportadas desde otros países como Lepidobatrachus laevis, Ceratophrys cornuta, Ceratophrys ornata, Ceratophrys calcarata, Chacophrys pierottii, Occidozyga lima, Leptodactylus pentadactylus y Plethodontohyla tuberata. Luego Goka et al. (2009) reportaron en Japón a Bd en especies de anfibios cautivas y de vida libre como Xenopus laevis (26/128) individuos comprados en Sudáfrica, Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) (17/17) individuos comprados en Japón, Lepidobatrachus laevis (1/4) comprados en Argentina, Ceratophrys cornuta (32/89) adquiridos en Argentina y Brazil, Ceratophrys cornuta (2/3) adquiridos en Suriname, Fejervarya limnocharis, Hyla japonica, Rana nigromaculata (=Pelophylax nigromaculatus) y Rana rugosa (=Glandirana rugosa), y las salamandras Andrias japonicus (4/12) y Cynops ensicauda.
Bai et al. (2010) reportaron el patógeno en las especies altamente asociadas a cuerpos de agua Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) encontrada a una altitud de 1890 a 2900 m.s.n.m, Rana pleuraden (=Babina pleuraden) colectada a una altura de 2000 m.s.n.m y Odorrana andersonii y Rana chaochiaoensis encontradas a 1890msnm; en un bosque húmedo subtropical siempre verde y un bosque de coníferas subalpino que presentaba temperaturas menores a los 30°C. Para la detección se usaron PCR en Tiempo Real y técnicas histológicas. Concluyeron que la diversidad de anfibios en China está en riesgo por la presencia de Bd y que hay una necesidad
7 urgente de monitorear la distribución del patógeno en los anfibios de China y entender la susceptibilidad de las especies de anfibios nativos a la quitridiomicosis.
En Korea el primer reporte de la enfermedad lo dio Yang et al. (2009). De una muestra de 36 individuos 14 resultaron positivos (38.8%). Estos resultados se obtuvieron mediante PCR convencional y técnicas histológicas. Las especies infectadas con el patógeno fueron Bufo gargarizans, Hyla japonica y Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus). Comentaron que son urgentes los estudios para determinar el impacto de la quitridiomicosis en los anfibios de Korea y monitorear su distribución tanto en el país como en toda Asia.
4.2.3 Europa
En Europa la quitridiomicosis ha sido reportada en países como: Inglaterra, Alemania, Suiza, Austria y España.
Bosch et al. (2001) realizaron el primer reporte de la enfermedad para Europa concluyendo que la quitridiomicosis es la causa más posible del declive de esta especie en el área. Durante 1999 ocurrieron eventos de mortalidad en masa de sapos post-metamórficos de vida libre de la especie Alytes obstetricans, una de las especies más abundantes en áreas protegidas de España en el 86% de los estanques en que anteriormente habitaban. Estos eventos ocurrieron a una altura de 2000 m.s.n.m. El hongo se detectó mediante técnicas histológicas y la enfermedad fue asociada a altitudes superiores.
En Inglaterra Cunningham et al. (2005) reportaron quitridiomicosis en poblaciones de Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) mediante el uso de PCR en Tiempo Real.
En Alemania Mutschmann et al. (2000) reportaron quitridiomicosis en las especies Dendrobates auratus y Dendrobates pumilo (=Oophaga pumilio) importadas a este país desde Costa Rica, y en la especie Phyllobates vittatus importada desde la Guayana Francesa.
8 Tobler & Schmidt (2010) reportaron una declinación fuerte de más del 50% de las poblaciones de anfibios en Suiza y la presencia del hongo en renacuajos de la especie Alytes obstetricans. Sugirieron que las variaciones intra-específicas con bases genéticas podrían proporcionar resistencia o tolerancia a Bd conllevando a la persistencia de sus poblaciones.
En Austria Richter & Kubber (2010) reportaron por primera vez el quitridio en un individuo de la especie Dendrobates tinctorius tomada de un almacén de venta de animales domésticos usando técnicas histológicas.
4.2.4 América del Norte
En América del Norte la quitridiomicosis ha sido reportada en países como: Canadá y Estados Unidos.
Forzan et al. (2010) reportaron por primera vez a Bd en la isla Prince Edward ubicada en la costa este de Canadá. De las 115 muestras tomadas 31 resultaron positivas, 25 correspondía a la especie Rana clamitans (=Lithobates clamitans) 5 a la especie Rana pipiens (=Lithobates pipiens) y 1 de la especie Rana sylvatica (=Lithobates sylvaticus). Sólo un individuo fue encontrado muerto, el resto no mostró signos aparentes de la enfermedad.
En Canadá se reportó la enfermedad en los anuros Bufo americanus (=Anaxyrus americanus), Hyla versicolor, Pseudacris triseriata, Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus), Rana clamitans (=Lithobates clamitans), Rana palustris (=Lithobates palustris), Rana pipiens (=Lithobates pipiens), Rana septentrionalis (=Lithobates septentrionalis), Rana silvatica (=Lithobates sylvaticus) y en las salamandras Ambystoma maculatum y Notophthalmus viridescens. El primer registro data de 1895 lo cual indica que la enfermedad no es nueva pero no explica el declive de las poblaciones de Canadá (Oullet et al. 2004).
En Estados Unidos Green & Sherman (2001) reportaron el patógeno Bd en la especie Bufo canorus (=Anaxyrus canorus) colectada en el año 1976 en la Sierra Nevada de California a una
9 altura de 3030m.s.n.m. Aunque no se observaron signos de la enfermedad Green et al. (2001) no aseguran que la quitridiomicosis haya causado el declive de las poblaciones, pero sí la susceptibilidad de Bufo canorus (=Anaxyrus canorus) al quitridio debido a la alta concentración de zoosporas encontradas en su epidermis. Luego Bradley et al. (2002) encontraron la enfermedad en una época durante la cual se reportaron muchas muertes de anuros en Arizona (1992-1999) en las especies Rana yavapaiensis, Rana chiricauensis (=Lithobates chiricahuensis) e Hyla arenicolor mediante técnicas histológicas. Davidson et al. (2008) concluyeron que la quitridiomicosis no siempre lleva a la mortalidad, la susceptibilidad a la infección varía entre individuos y especies. Algunos de los anfibios pueden recuperarse de la infección con Bd y otros podrían actuar como reservorio de la enfermedad. Davidson et al (2003) reportaron quitridiomicosis en la salamandra Ambystoma tigrinum al sur de Arizona en el año de 1999. Annis et al (2004) desarrollaron una técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa muy sensible y específica para detectar a Bd usando pequeños trozos de piel y reportaron la enfermedad en anfibios de las especies Bufo americanus (=Anaxyrus americanus), Bufo boreas (=Anaxyrus boreas), Bufo guttatus (=Rhaebo guttatus), Dendrobates azureus (=Dendrobates tinctorius), Dyscophus guineti, Hyla arenicolor, Limnodynastes dumerilii, Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus), Rana clamitans (=Lithobates clamitans), Rana palustris (=Lithobates palustris), Rana sylvatica (=Lithobates sylvaticus), Rana yavapaiensis (=Lithobates yavapaiensis), Xenopus tropicalis (=Silurana tropicalis y en la salamandra Ambystoma tigrinum). Posteriormente Cummer et al. (2005) reportaron a Bd mediante el uso de técnicas histológicas y PCR convencional en Nuevo México para la especie de salamandra Plethodon neomexicanus a 2950 m.s.n.m y concluyeron que es posible que el hongo fuera transmitido a la salamandra por contacto directo o indirecto con anfibios acuáticos simpátricos infectados como Ambystoma tigrinum o Pseudacris maculata. Para el caso de Hawaii, de 382 individuos analizados de la especie Eleutherodactylus coqui el 24% se encontraban infectados con Bd. Eleutherodactylus coqui es una especie introducida a Hawaii en 1980 ya que Hawaii no tiene anfibios nativos. El hongo se reportó en Bosques de Tierras bajas que presentaban altitudes entre los 0 y los 1100 m.s.n.m. Aunque las especies estudiadas no presentaban signos de la enfermedad, la diagnosis resultó positiva y se efectuó mediante PCR convencional. Los autores creen que Eleutherodactylus coqui podría convertirse en un vector de Bd y transportarlo a las zonas en donde Bd no ha llegado gracias a que el rango
10 de distribución de esta especie se expande rápidamente. Y explican la baja tasa de infección (2,4%) basándose en que la llegada del patógeno a la zona pudo ser reciente (Beard & O´Neill 2005).
4.2.5 Centroamérica
En Centroamérica la quitridiomicosis ha sido reportada en países como: México, Honduras, Costa Rica, Puerto Rico, Panamá y Cuba.
En México la enfermedad ha sido reportada en las especies de anfibios: Eleutherodactylus saltator (=Craugastor saltator), Ptychohyla erythromma, Agalychnis moreletii, Hyla euphorbiacea, Hyla eximia, Exerodonta melanomma, Rana megapoda (=Lithobates megapoda), Rana montezumae (=Lithobates montezumae), Rana neovolcanica (=Lithobates neovolcanicus), Rana spectabilis (=Lithobates spectabilis) y en las salamandras: Ambystoma altamirani, Ambystoma granulosum, Ambystoma rivulare, Ambystoma velasci,; en alturas que van desde 939 a los 3200m.s.n.m. Las técnicas más utilizadas fueron PCR en Tiempo Real y microscopías. Lips et al. (2004) y Frías et al. (2008) sugieren que Bd podría ser el causante del declive de algunas especies en el área (Lips et al. 2004; Frías et al. 2008).
En el año 2003 Puschendorf et al. (2006) realizaron muestreos en tierras altas del Parque Natural Pico Bonito- Honduras, lugar en el cual se detectaron los inicios del declive de especies para el año 1989, desde la época casi la mitad de las especies endémicas de anfibios están en declive y algunas parecen extintas ya que no han vuelto a ser vistas en los lugares en que comúnmente habitaban. Se obtuvieron resultados positivos de Bd usando técnicas histológicas en las especies Rana maculata (=Lithobates maculatus) encontrada a 945msnm y la especie Eleutherodactylus aurilegulus (=Craugastor aurilegulus) encontrada letárgica a un rango altitudinal de 120 a 945m.s.n.m. En Honduras Felger et al. (2007) documentaron la presencia de Bd en renacuajos capturados durante el 2005 pertenecientes a las especies Agalychnis moreletii capturada a los 1800msnm y Rana maculata (=Lithobates maculatus), capturada a los 900m aproximadamente. Al realizar la captura de estos especímenes algunos se encontraron muertos y en otros se observó despigmentación de las partes bucales. De los 56 renacuajos 10 (17,8%) presentaron Bd.
11
En Costa Rica, Lips et al. (2003) reportaron una declinación de anfibios en Las Tablas desde 1993 y para 1998 aproximadamente el 50% de las especies típicas de la localidad no volvieron a ser encontradas. Por lo anterior se realizó la búsqueda del hongo Bd que fue reportado en las especies de anuros Atelopus chiriquiensis, Eleutherodactylus melanostictus (=Craugastor melanostictus) y en la salamandra Oedipina grandis. Estos resultados llevaron a la conclusión de que la infección por Bd es la causa más próxima del declive de las poblaciones de anfibios en Las Tablas. Posteriormente Puschendorf & Bolaños (2006) reportaron al igual que Lips et al. (2003), mediante cortes histológicos, la presencia de Bd en la especie Eleutherodactylus fitzingeri (=Craugastor fitzingeri) que al contrario de las especies mencionadas anteriormente, es común, con un amplio rango de distribución y se mantiene abundante en la mayor parte de Costa Rica. Puschendorf et al. (2009) usaron información publicada y nueva de la presencia de éste patógeno en 647 anfibios de 35 especies con el fin de crear un modelo predictivo de la distribución potencial del patógeno en el país. Utilizaron técnicas histológicas y encontraron en quitridio en 21 sitios de los 156 analizados.
En Puerto Rico, Burrowes et al. (2004) observaron la presumible extinción y declinación de las poblaciones de Eleutherodactylus a elevaciones menores a 400 m.s.n.m. y comprobaron la presencia de Bd en las especies pertenecientes a colecciones biológicas Eleutherodactylus coqui colectada en 1978 y Eleutherodactylus karlschmidti colectada en 1976. Sugirieron una posible interacción sinérgica entre la sequía y la patogenicidad de Bd en los anfibios, ya que al disminuir la humedad en el ambiente, los anfibios tienden a ser más susceptibles y a contraer el patógeno.
Berger et al. (1998) reportaron una mortalidad masiva de las poblaciones de anfibios en Panamá, siendo Eleutherodactylus cruentus (=Pristimantis cruentus), Eleutherodactylus emcelae (=Craugastor emcelae), Cochranella albomaculata (=Sachatamia albomaculata), Cochranella prosoblepon (=Espedarana prosoblepon), Bufo haematiticus (=Rhaebo haematiticus), Atelopus varius y Atelopus chiriquiensis las especies que resultaron positivas para quitridiomicosis, sugiriendo que la causa posible del declive de los anfibios en Panamá podría ser esta enfermedad, el diagnóstico se realizó mediante el uso de cortes histológicos y aunque no se observaron signos
12 aparentes de la enfermedad, microscópicamente se evidencio hiperplasia e hiperqueratosis de tejidos.
Díaz et al. (2007) reportaron quitridiomicosis en Cuba para la especie Bufo longinasus dunni (=Peltophryne longinasus). Esta especie de anuro diurno es un sapo pequeño endémico del centro de Cuba que vive en las montañas, presenta un rango de distribución restringido y está altamente asociado con los hábitats acuáticos. El espécimen infectado fue encontrado cerca de un cuerpo de agua a una altura de 780msnm, letárgico y con hiperplasia e hiperqueratosis de la epidermis. Se le realizaron cortes histológicos que fueron teñidos con hematoxilina y eosina y con PAS.
4.2.6 América del Sur
En Venezuela se han llevado a cabo mayor número de estudios acerca de la quitridiomicosis. Desde 1970 se han venido observando disminuciones en la abundancia de algunas especies como Atelopus cruciger y desaparición de otras como Atelopus mucubajiensis. El primer reporte de quitridiomicosis en Venezuela data de 1986 en la especie Atelopus cruciger a unos 1465m.s.n.m (Bonaccorso & Guayasamin 2003). Posteriormente en el 2002 la especie Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) también fue diagnosticada como positiva para Bd, siendo colectada a 2370m.s.n.m. De esta especie el 96% (46) de los individuos muestreados presentaron el patógeno (Hanselmann et al. 2004). Luego en el 2004 se encontró una hembra adulta de la especie Atelopus mucubajiensis en los Andes de Venezuela que presentaba decoloración en algunas partes de la piel, lesiones en la cabeza, malos reflejos y anorexia (Lampo et al. 2006). Estas investigaciones concluyeron que Bd podría ser causante del declive y extinción de estas especies, pero también sugieren que Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) podría ser reservorio del patógeno en Venezuela por la alta prevalencia de Bd que se presentó y porque no se evidenciaron en ésta signos de la enfermedad relacionados con la mortalidad. Sanchez et al. (2008) detectaron el patógeno en las especies Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus),
13 Dendropsophus meridensis, Gastrotheca nicefori, Hypsiboas crepitans, Hyloscirtus jahni, Hyloscirtus olatydactylus, Mannophryne collaris, Engystomops pustulosus, Pseudis paradoxa y Scarthyla vigilans, habitantes tanto de estanques, arroyos y hábitats terrestres que ocupaban un rango altitudinal de 80 a 2600m.s.n.m. Los autores recomendaron tratar de entender los factores que contribuyeron a una baja prevalencia de infección y cargas de zoosporas en la mayoría de las especies, y entender los factores extrínsecos que podrían mediar la vulnerabilidad de las especies al patógeno.
En Ecuador existen registros de Bd desde 1989 en la especie Telmatobius niger. Esta especie endémica de los Andes del Ecuador presentaba una amplia distribución hasta que dejó de ser registrada desde 1994. Los individuos que presentaron el quitridio fueron encontrados muertos y con ulceraciones cutáneas y secreciones pegajosas. Por todo lo anterior Merino et al. (2005) concluyeron que Bd pudo ser la causa de las disminuciones y aparentes extinciones en el Ecuador no solo de la especie Telmatobius niger sino de todo el género Telmatobius.
Seimon et al. (2007) reportaron la quitridiomicosis en los Andes de Perú a una altitud de 5348m.s.n.m en individuos de las especies Pleurodema marmorata (=Pleurodema marmoratum) y Telmatobius marmorata que fueron encontrados muertos. Estas poblaciones desaparecieron rápidamente desde el 2002 donde se observó la muerte de individuos adultos y la desaparición de renacuajos. El diagnóstico de Bd se realizó mediante el uso de cortes histológicos realizando tinciones con hematoxilina y eosina y usando PCR en Tiempo Real.
Solís et al. (2010) realizaron muestreos en los años 2006-2007 y reportaron a Bd en la especie Xenopus laevis, de los 58 individuos analizados 14 presentaron el patógeno. Llegaron a la deducción de que la rápida dispersión exhibida por esta rana en Chile sugiere que la transmisión entre especies puede ser posible y tal vez podría poner en peligro las especies nativas.
En el caso de Brasil, la enfermedad fue reportada mediante el uso de técnicas histológicas en anuros de las especies Colostethus olfersioides (=Allobates olfersioides), Bokermannohyla gouveai, Hypsiboas freicanecae, Thoropa miliaris y Crossodactylus caramaschii, que fueron colectadas desde 1981. Documentaron que el rango altitudinal de Bd va desde los 100m.s.n.m
14 hasta los 2400m.s.n.m y aunque los anfibios infectados difieren en su estrategia reproductiva y en los tiempos de actividad, todos llevan a cabo parte de su desarrollo en el agua. No obstante, aunque el hongo está presente, no se ha observado una disminución en las poblaciones de anfibios. La ocurrencia de la enfermedad fue baja, de sólo 6 individuos de 96 muestreados en total. Carnaval et al. (2006) concluyeron que sus resultados son consistentes con la hipótesis de que el clima está ligado a la quitridiomicosis y que esto conlleva al declive (Carnaval et al. 2006).
Barrionuevo et al. (2008) reportaron el hongo Bd por primera vez en Bolivia en renacuajos de la especie Rhinella quechua, especie endémica y típica de Bosques húmedos montanos, a una altitud de 2530m.s.n.m usando cortes histológicos y realizando tinciones con hematoxilina y eosina. Observaron anormalidades en las partes bucales del disco oral de renacuajos.
En Argentina la enfermedad fue reportada por primera vez por Herrera et al. (2005), posteriormente Barrionuevo & Mangione (2006) también la reportaron en el noroeste de Argentina mediante la realización de cortes histológicos. En los dos casos se informaron eventos de mortalidad masiva de las especies Leptodactylus ocellatus, Telmatobius atacamensis y Telmatobius pisanoi. Aunque los individuos no mostraron signos de la enfermedad a la hora de la colecta, microscópicamente si se observó hiperplasia e hiperqueratosis de tejidos. El rango altitudinal que presentó Bd en este país fue desde los 1000 a los 4500m.s.n.m. Las tres especies se ven altamente relacionadas con los cuerpos de agua ya que Telmatobius atacamensis y Telmatobius pisanoi son de hábitos acuáticos y Leptodactylus ocellatus pone sus huevos en nidos de espuma en la superficie del agua. Debido a que durante estas temporadas se dieron cambios bruscos de temperatura que tendieron a la baja, no se pudo concluir que la quitridiomicosis es la única causa responsable de las declinaciones de estas poblaciones sino un gran número de factores que actúan sinérgicamente. También la especie Elachistocleis bicolor presentó el patógeno en tierras calientes y húmedas de tierras bajas (Arellano et al. 2009).
Para el caso de Uruguay, la enfermedad fue reportada en Montevideo ya que se venían evidenciando eventos de mortandad en un cultivo de Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) desde 1999. La diagnosis se efectuó mediante técnicas histológicas y algunos signos de la enfermedad incluían letargo, mudas de piel excesivas, hiperplasia e hiperqueratosis.
15 Los eventos ocurrieron a temperaturas entre 17 a 19°C aproximadamente. Mazzoni et al. (2003) en su investigación sugirieron que el comercio internacional de especies podría jugar un papel importante en la diseminación de ésta y otras enfermedades infecciosas emergentes. Borteiro et al. (2009) reportó a Bd en anfibios nativos de Uruguay mediante el uso de técnicas histológicas en los renacuajos de las especie Hypsiboas pulchellus, Odontophrynus maisuma, Physalaemus henselii y Scinax squalirostris y comentaron que los efectos de la enfermedad en estas especies eran desconocidos. Además, la enfermedad es de potencial preocupación para la conservación de especies que están en declive aparentemente como lo son Physalaemus henselii y Odontophrynus maisumo, dada su restringida distribución en los hábitats en los que han incrementado los disturbios actualmente.
4.2.7 Reportes de Batrachochytrium dendrobatidis en Colombia
Aunque Colombia es el segundo país más diverso en especies de anfibios a nivel mundial, también es el primer país con el mayor número de especies amenazadas (214) (UICN Red List). Las principales amenazas de los anfibios de Colombia son: La destrucción de hábitat (Rueda 1999), la agricultura, quema, ganadería y uso indiscriminado de pesticidas (Uribe et al. 1994, Rueda-Almonacid et al. 2004; UICN Red List 2010), la introducción de especies invasoras como Rana catesbeiana en departamentos de Antioquia, Caldas, Cundinamarca, Sucre, Tolima y Valle del Cauca (Rueda 1999) y en los alrededores del municipio de Santa María- Boyacá (Lynch 2005); esta especie invasora constituye un factor de riesgo importante para los anfibios ya que es un predador muy hábil que tiende a competir y a desplazar a la fauna anfibia autóctona (Rueda 1999), otras amenazas son la captura y comercialización especialmente de anuros de la familia Dendrobatidae “para abastecer el mercado ilegal de mascotas y desarrollar pruebas de investigación biomédica” (Rueda 1999) y las enfermedades como la quitridiomicosis (Rueda et al. 2006; Ruíz y Rueda-Almonacid 2008; Velásquez et al. 2008).
16 Ruíz & Rueda (2008) reportaron la enfermedad en anuros pertenecientes a colecciones biológicas provenientes de ecosistemas de páramo y subpáramo mediante el uso de técnicas histológicas (Berger et al. 1999). De los 53 individuos analizados, tres especies resultaron positivas mostrando así una baja frecuencia de la enfermedad. Fueron colectados 5 anuros en El Santuario de Flora y Fauna Guanentá en Santander de la especie Atelopus mittermeieri capturados en Junio de 2004 a una altura de 2250-2750m. De la especie Hyloscirtus bogotensis se encontró 1 individuo casi muerto y con mudas de piel excesivas en el municipio La Calera a una altura de 3127m.s.n.m. De la especie Eleutherodactylus elegans (=Pristimantis elegans) fue encontrado 1 individuo muerto en la vegetación sin signos evidentes de la enfermedad en el Parque Ecológico Matarredonda en el departamento de Cundinamarca a una altura de 3260m.s.n.m. Luego de esta investigación se concluyó que la quitridiomicosis posiblemente es el principal factor causal de la disminución y desaparición de las poblaciones de anfibios colombianos como las de las especies de anuros Colostethus subpunctatus (=Hyloxalus subpunctatus), Atelopus muisca, Atelopus lozanoi y la salamandra Bolitoglossa adspersa.
Por último, Velásquez et al. (2008) reportaron la enfermedad en anuros del bosque piemontano del Valle del Cauca, en la vertiente occidental de la Cordillera Occidental en los municipios de Dagua, El Cairo, Yotoco y Cali. El criterio de escogencia de las localidades de estudio fue el de seleccionar localidades para las cuales se hubiese presentado casos de mortalidad en masa, disminución y desaparición de anfibios. De los 466 individuos analizados 22 pertenecientes a 16 especies (Colostethus fraterdanieli, Hyloxalus abditaurantius, Hyloxalus fascianigrus, Hyloxalus lehmanni, Hyloscirtus alytolilax, Gastrotheca dendronastes, Pristimantis thectopternus, Pristimantis gracilis, Pristimantis palmeri, Pristimantis erythropleura, Pristimantis w-nigrum, Pristimantis crhysops, Pristimantis silverstonei, Strabomantis ruizi, Centrolene buckleyi y Nymphargus griffithsi) resultaron positivos para Bd mediante el uso de técnicas histológicas basadas en Berger et al (1998) efectuando tinciones tanto con hematoxilina y eosina como con Periodic Acid Shiff (PAS). El registro más antiguo data de 1994, sólo se observó inflamación de la epidermis. Se detectó que la baja especificidad de hospederos de Bd pudo contribuir a la desaparición de muchas especies de anfibios en el Valle del Cauca.
17 De las 5743 especies de anfibios conocidas a nivel mundial, Colombia posee aproximadamente 750 ubicándose como el segundo país más diverso en especies de anfibios después de Brasil. Al menos 50 de estas especies han sufrido un declive de manera precipitada convirtiendo a éste grupo de vertebrados en el más vulnerable a la extinción. Las causas de dicho declive no son claras, pero teniendo en cuenta la reciente y masiva extinción de anfibios a nivel mundial a causa del hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis no se descarta que este quitridio pudiese ser el causante de las pérdidas de anfibios en el territorio colombiano (Ruíz & Rueda 2008). Por tal razón, es más que necesario estudiar la presencia del patógeno en Colombia, su distribución, comportamiento, ecología y el impacto que pueda tener sobre la fauna colombiana.
4.3 Técnicas de detección de Batrachochytrium dendrobatidis
Tanto en Colombia como a nivel mundial la detección del hongo Bd se ha efectuado mediante el uso de técnicas histológicas realizando tinciones con Hematoxilina y Eosina (H&E) (Berger et al. 1999a; Berger et al. 1999b; Waldman et al. 2001; Bonaccorso & Guayasamin 2003). Aunque inicialmente son una buena herramienta para la detección de la enfermedad, podrían fallar en la detección en una gran porción de anfibios infectados (Boyle et al. 2004). Las técnicas histológicas pueden arrojar falsos negativos si el grado de infección del anfibio es muy bajo (Berger et al. 2002; Boyle et al. 2004), no son específicas ya que están sujetas a susceptibilidades porque dejan abierta la posibilidad de detectar falsos positivos confundiendo células de la epidermis con las zoosporas del patógeno (Kriger et al. 2006), son técnicas invasivas puesto que requieren una muestra de piel (Berger et al. 2002; Lips et al. 2003; Boyle et al. 2004) y adicionalmente su análisis consume mucho tiempo.
Otra manera de realizar el diagnóstico de Bd es mediante técnicas moleculares como PCR convencional (Annis et al. 2004), Toe-clip PCR (Boyle et al. 2004) y PCR en Tiempo Real (Kriger et al. 2006). Todas estas técnicas moleculares tienen el mismo fundamento, pero existen algunas variaciones entre ellas. La PCR convencional (Annis et al. 2004) es una técnica sensible y cualitativa que identifica sus productos en la fase plana. Es un proceso que desarrolla la etapa
18 de amplificación y detección de manera individual y usa un volumen de reacción de 50µL aproximadamente.
La Toe-clip PCR, ésta técnica desarrollada por Boyle et al. (2004) permite una detección rápida sensible y cuantitativa de las zoosporas de Batrachochytrium dendrobatidis que infectan los dedos de los anfibios. Tiene la ventaja de que puede detectar a Batrachochytrium dendrobatidis en individuos recientemente infectados llevando una delantera de 7 a 14 días sobre las técnicas histológicas. Pero uno de los problemas de esta técnica radica en que tiende a disminuir las posibilidades de supervivencia de los anfibios por la pérdida de órganos (McCarthy & Parris 2004), raya en problemas éticos y el análisis de un solo dedo puede no ser suficiente para la detección de la enfermedad (Boyle et al. 2004).
La PCR en Tiempo Real es una excelente herramienta para la diagnosis de Batrachochytrium dendrobatidis pues es una técnica no invasiva que requiere solamente de un raspado con escobillón sobre la piel del anfibio, como la quitridiomicosis es una enfermedad cutánea el escobillón tiende a remover fragmentos de piel que podrían contener zoosporas y zoosporangios del quitridio, remplazando así el toe-clip o las muestras de tejido. Además es una técnica altamente sensible, específica y cuantitativa que permite un análisis rápido y que identifica los productos de amplificación en la fase exponencial fusionando las etapas de amplificación y detección del ADN reduciendo el tiempo total de reacción.
5. Objetivos
5.1 Objetivo General Detectar la presencia del hongo patógeno Batrachochytrium dendrobatidis en anfibios localizados en un Bosque Húmedo Tropical Submontano del municipio de Santa María-Boyacá.
5.2 Objetivos Específicos
19 Identificar las especies de anfibios presentes en un Bosque Húmedo Tropical Submontano localizado en el municipio de Santa María-Boyacá.
Determinar la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en anfibios localizados en un Bosque Húmedo Tropical Submontano (Santa María-Boyacá).
Evaluar el grado de asociación entre la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis y la temperatura y humedad del ambiente en muestras de anfibios localizados en un Bosque Húmedo Tropical Submontano (Santa María-Boyacá).
6. Metodología Propuesta 6. 1 Área de Estudio
Este estudio se llevó a cabo en el municipio de Santa María- Boyacá (Figura 1) que limita al Sur con el Departamento de Cundinamarca, al Norte con los municipios Macanal y Campohermoso, al Este con el municipio San Luis de Gaceno y al Oeste con el municipio de Chivor, su altura sobre el nivel del mar es de 850 m. Se caracteriza por poseer una vegetación propia de los bosques húmedos tropicales sub-montanos, está ubicado sobre la cordillera Oriental de Colombia 4° 51’ 48” latitud Norte; 73° 16’ 04” de longitud Oeste.
20 Colombia
Figura 1. Mapa de ubicación geográfica del área de estudio. Municipio de Santa María – Boyacá. Fuente (ArcGis 9.3)
Santa María presenta una temperatura media anual de 24°C, aunque tiende a oscilar entre 16 y 36°C y una Humedad Relativa de 85%, además tiene un régimen de lluvias bimodal que generalmente se da entre los meses abril-junio y entre octubre-noviembre. Este municipio se halla emplazado en la parte media baja del piedemonte llanero es decir un segmento alto de la gran cuenca del río Orinoco a la que pertenecen las micro-cuencas de los ríos: Bata, Guavio, Tunjita, Lengupa y Bocachico. Morfológicamente se puede decir que Santa María posee un tipo de relieve de laderas cuya característica principal son los relieves escarpados con acumulación de materiales de derrubio al pie de la vertiente y originando problemas de erosión de diferente grado, ya sea por escurrimiento, fenómenos de remoción en masa y reptación sobre planos de ladera (Figura 2),
21 debido a lo mencionado anteriormente éste municipio está en una zona catalogada como una de las más activas de la región, encontrándose una gran cantidad de deslizamientos.
Figura 2. Panorámica del municipio de Santa María- Boyacá. Fuente EOT del municipio de Santa María
6.1.1 Lugares de muestreo
Gracias a la información proporcionada por habitantes de la región se seleccionaron varios lugares de muestreo con características particulares en los cuales se han avistado gran cantidad de anfibios. Aunque en general se mantiene una temperatura y humedad relativa promedio en el municipio, si tienden a variar un poco según el tipo de vegetación y los cuerpos de agua que presentaron, estas localidades fueron:
Quebrada de las Vueltas
La Quebrada de las Vueltas (Figura 3) hace parte del Río La Libertad y se encuentra ubicada en la parte urbana del municipio de Santa María a una latitud Norte de 4° 51’ 30.5” y una longitud Oeste 73° 15’ 56.8”. Su temperatura promedio es de 23.3°C y su porcentaje de humedad es de 97.9%. Presenta un caudal permanente y vegetación herbácea y leñosa en sus orillas. Proporciona un hábitat lótico para todas las especies. Debido a que ésta quebrada se encuentra en la parte urbana, se observan algunos desechos principalmente plásticos que podrían contribuir al stress y
22 susceptibilidad de los anfibios, principalmente renacuajos. Los muestreos se realizaron tanto en las orillas y rocas de la quebrada, como en el camino que dirigía hacia allí en donde se observó gran cantidad de vegetación herbácea y pequeñas zanjas cubiertas por hojarasca en donde se acumulaba el agua lluvia.
Figura 3. Quebrada de Las Vueltas. Fuente EOT del Municipio de Santa María.
Quebrada la Cristalina
La Quebrada La Cristalina (Figura 4) es una micro-cuenca que pasa por la Vereda Caño Negro, se encuentra a una latitud Norte de 4° 50’ 53.7” y una longitud Oeste 73° 16’ 20.7”. Su temperatura promedio es de 23°C y su porcentaje de humedad es de 84%. Se encuentra rodeada por bosques naturales que se encargan de liberar hojas que tienden a formar capas de hojarasca en las orillas y sobre el agua, sus aguas cristalinas hacen de esta quebrada un sitio de gran interés turístico. Proporciona un hábitat lótico para muchas especies, presenta musgos de agua y algas que se aferran a las rocas. En las orillas tiende a acumularse lodo y gran cantidad de materia orgánica. Los muestreos se realizaron tanto al interior de la quebrada en pequeñas formaciones de agua empozada, como en el camino que dirigía hacia la misma caracterizado por presentar pastizales, helechos y plantas herbáceas de mediano tamaño.
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Figura 4. Quebrada la Cristalina. Fuente Diego Riaño.
Río Batá
Este río (Figura 5) es una micro-cuenca del río Orinoco, actualmente es el receptor de las aguas servidas del alcantarillado municipal por las quebradas La Argentina, El Toro y Caño Cangrejo, está a una latitud Norte de 4° 51’ 31.9” y una longitud Oeste 73° 15’ 57.1”. Su temperatura promedio es de 27.7°C y su porcentaje de humedad es de 65%. Es un río de aguas rápidas y corrientes fuertes, presenta una vegetación herbácea y leñosa. Los muestreos se realizaron en los dos costados del río, efectuando la búsqueda en rocas, vegetación circundante y en pequeños cuerpos de agua temporales de aguas oscuras y lodo. Adicionalmente se realizaron muestreos en pastizales inundados aledaños al río a una latitud Norte de 4° 51’ 30.5” y una longitud Oeste 73° 15’ 56.8” de longitud Oeste.
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Figura 5. Río Batá. Fuente EOT del Municipio de Santa María.
6.2 Obtención de muestras
Esta investigación fue llevada a cabo durante los meses de Octubre de 2009 y 2010, y el mes de Mayo de 2010. Se efectuaron tres salidas de campo, la primera salida se realizó desde el día 23 hasta el 24 de Octubre de 2009, durante esta época se presentaron fuertes lluvias que causaron inundaciones y formaciones de bastantes cuerpos de agua temporales, la temperatura y humedad promedio de esta salida fueron 23.5°C y 88%; la segunda salida se efectuó desde el 01 al 02 de Mayo de 2010, durante esta época se observaron pocas lluvias, disminución del número cuerpos de agua temporales y pérdida de humedad en la vegetación, la temperatura y humedad promedio de esta salida fueron 23°C y 96.7%; la tercera salida se llevó a cabo desde el 01 al 04 de Octubre del 2010, esta época se caracterizó por presentar fuertes lluvias, temperaturas bajas, e inundaciones de áreas abiertas, la temperatura y humedad promedio de esta salida fueron 25.7°C y 74.2%.
La evaluación de anfibios se efectuó en las horas de la mañana (8-12 horas) con el fin de registrar especies diurnas y en las horas de la noche (20-24 horas) dado que la mayoría de anfibios tienen una actividad nocturna. Los ejemplares adultos y juveniles fueron avistados y capturados
25 utilizando el método de Relevamiento por Encuentros Visuales (REV) descrito por Rueda et al. (2006) el cual consiste en la búsqueda limitada de individuos observando libremente por unidad de tiempo de esfuerzo. Se muestrearon diferentes tipos de micro-hábitats entre los cuales están: quebradas, charcas temporales, vegetación herbácea, vegetación leñosa y pastizales.
Cada uno de los anfibios se capturó utilizando un par de guantes de nitrilo nuevos y fue depositado en bolsas plásticas individuales estériles, todo esto con el propósito de que no existiese contaminación cruzada. Posteriormente los individuos fueron examinados físicamente para evidenciar la presencia o ausencia de signos de la enfermedad como mudas de piel excesivas, hiperqueratosis, hiperplasia, posición del cuerpo anormal, aletargamiento, pérdida de reflejos y anorexia (Berger et al. 1998; Nichols et al. 2001), sin embargo, la ausencia de signos de la enfermedad no eximió la realización del raspado del cual se habla posteriormente. Se tomaron las muestras para la detección de Bd realizando un raspado con hisopo estéril de la superficie ventral, miembros anteriores e inferiores, interior de los dedos, parche ventral y parte dorsal del espécimen. Las muestras fueron preservadas a 4°C en 300µL de etanol al 70%). Finalmente y luego de tomadas las muestras, los individuos fueron liberados cerca al punto en donde fueron encontrados. Se siguió el protocolo de toma de muestras de Vredenburg & Briggs (2004-2007).
Durante el muestreo fueron tomados los datos de la temperatura del aire y humedad relativa usando un Data Logger TESTO 175-TL, y un termo hidrómetro Max-Min Digital CORNWALL y, las coordenadas y la altitud usando un GPS Garmin GPSMAP 60. La información acerca de los nombres de las especies se obtuvo gracias al seguimiento en la identificación asesorado por parte del especialista de la Colección de Anfibios de La Pontificia Universidad Javeriana y al seguimiento de claves taxonómicas. Toda la información antes mencionada fue consignada en libretas de campo, disponible para así conocer las condiciones medioambientales que ofrece el lugar de muestreo y que podrían estar favoreciendo el crecimiento y propagación del patógeno en caso de que éste estuviese presente.
26 6.3 Extracción de ADN
La extracción del posible ADN de Bd presente en las muestras se realizó tomando los tubos eppendorf de 1.5mL que contenían los escobillones y se adicionó directamente 50µL de solución PrepMan Ultra de Applied Biosystems ®, se homogenizó en un vortex por 45 seg y se centrifugó dos veces a temperatura ambiente usando una velocidad de 13x103 rpm por 30 seg, posteriormente las muestras se introdujeron en un baño termostatado a 100°C por 10 min, se incubaron por 2 min en hielo y se llevaron a centrifugar de nuevo a 13x103 rpm por 3min, por último el volumen obtenido fue almacenado a -20°C hasta ser procesado (Boyle et al. 2004).
6.4 Diagnóstico de Batrachochytrium dendrobatidis 6.4.1 Introducción a la técnica de PCR en Tiempo Real
El diagnóstico de Batrachochytrium dendrobatidis se efectuó utilizando La Reacción en Cadena de la Polimerasa- en Tiempo Real (Real Time-PCR). La PCR en Tiempo Real es una variante de la PCR convencional, se usa para amplificar un fragmento de ADN y cuantificar simultáneamente dicho producto de amplificación. Aunque ésta técnica ofrece estas posibilidades, en ésta investigación sólo se efectuó la detección de Bd mas no la cuantificación de zoosporas presentes en la epidermis de los anfibios ya que para realizar la cuantificación es necesario haber realizado previamente una curva patrón de concentración de zoosporas vs absorbancias (realizada en el proyecto macro “ Detección de la Chytridiomycosis en ensamblajes de anfibios en Colombia ” del cual hace parte este trabajo de grado). Para efectuar un corrido de PCR en tiempo real se necesitan algunos componentes principales como: a) Primers específicos: Los primers escogidos para PCR en Tiempo Real se seleccionan a partir de regiones altamente conservadas lo que limita la región de alta tasa de variación. Para el caso de los hongos, las regiones de ADNr que están relativamente conservadas y que los diferencia de otros organismos son las regiones 18S, 5.8S y 28S (Ochoa 2008; Córdova et al. 2010). Para el desarrollo de ésta investigación se utilizó el primer iniciador ITS1-3 Chytr, que consta de 29 bases y que hace parte del espaciador intergénico del ADNr. Y el primer 5.8S Chytr, que consta
27 de 22 bases y hace parte del gen 5.8S. Se utilizaron los mismos primers que los reportados por Boyle et al. (2004) (Figura 6).
Figura 6. Secuencias de primers utilizadas tomado de Boyle et al. (2004)
b) ADN Polimerasa: La enzima ADN Polimerasa sintetiza las secuencias complementarias de las hebras del ADN utilizando dNTPs, que se encuentran ya incluidos en la Master Mix. En la actualidad existen varios tipos de ADN Polimerasas. Para esta investigación se utilizó la Taq Polimerasa, ésta es una enzima termoestable aislada de Termus aquaticus (Taq), una bacteria que soporta altas temperaturas. La Taq polimerasa ha simplificado enormemente la técnica de la PCR, ya que ha permitido su automatización (desarrollo del termociclador) ya que sólo se activa a temperaturas muy altas y además proporciona estabilidad (Roche .S.A®). c) Sonda: Una sonda es un fragmento muy corto de ADN que contiene un fluorocromo y que “tiene la propiedad de unirse al ADN de doble cadena y provocar una reacción de fluorescencia. El incremento de los productos de amplificación del ADN durante la reacción, representa un aumento en la intensidad de la fluorescencia medida en cada ciclo, lo que permite cuantificar la concentración de ADN” (Córdova et al., 2010).
Para esta investigación se utilizó una sonda TaqMan o de hidrólisis. Ésta sonda consta de un fluorocromo (reporter) que se encuentra inactivado por un quencher. Se adhiere al ADN sin mostrar fluorescencia, en el momento en que la enzima Taq Polimerasa empieza a sintetizar la
28 cadena complementaria durante la fase de elongación, separa al quencher del reporter y hace evidente la fluorescencia de la sonda (Roche .S.A®).
6.4.2 Preparación del volumen final de reacción para cada muestra
Se preparó un volumen final para cada reacción de 20µL de acuerdo al protocolo de Roche S.A®, de los cuales 9 µL son de agua para PCR, 2µL de solución previamente preparada de Primers [9µM] (ITS1-3 Chytr y 5,8S Chytr) y Sonda TaqMan [6µM] , 4µL de solución Master Mix de Roche (que contiene la solución tampón, los dNTPs y la enzima Taq Polimerasa) y 5µL de ADN provenientes de la extracción de ADN de cada muestra. Luego de servir los 20µL para cada capilar, éstos fueron sellados y centrifugados a 2500 rpm durante 7 segundos. Posteriormente los capilares fueron transferidos al Light Cycler Instrument en el cual se realizó el corrido de PCR.
6.4.3 Montaje de PCR en Tiempo Real
El montaje de la PCR en Tiempo Real se realizó utilizando el equipo LightCycler 1.5 Sistem de Roche S.A®. Inicialmente se incluyó el programa de Pre-incubación (95°C *10 min) por un ciclo, para activar la enzima Taq Polimerasa, posteriormente 50 ciclos, los programas de Denaturación (95°C* 15 seg) para que se diera la separación del ADN de doble cadena, Anillaje (60°C* 1 min) para que los primers se aparearan con el ADN molde, y Extensión (72°C *2 seg) durante la cual se da la polimerización por parte de la Taq Polimerasa ocurriendo allí la lectura de la fluorescencia a una longitud de onda de 530mn, ya que es en ese momento en donde se debe leer la fluorescencia de la sonda TaqMan. Finalmente se incluyó el programa de Enfriamiento (40C* 30 seg.) por un ciclo para frenar la reacción de los residuos de la enzima Taq Polimerasa.
6.4.4 Reproducibilidad de resultados
Cada muestra fue analizada por triplicado. Se utilizó agua de PCR como control negativo y diferentes diluciones de ADN de Bd realizadas a partir de un estándar puro proveniente de Australia (Animal Health Laboratory) como controles positivos. El estándar puro de ADN estaba
29 a una concentración de 1000 zoosporas/µL, a partir de éste se realizaron diluciones seriadas de 10 y 100, las cuales fueron utilizadas como los estándares de nuestros corridos, su nominación fue la siguiente:
Dilución Nominación
1000zoosporas/ µL Estándar 1000 Dilución en 10 Estándar 100 Dilución en 100 Estándar 10
Debido a que el interés particular de ésta investigación es la detección de Bd mas no la cuantificación del mismo, se utilizaron los estándares 1000, 100 10 para algunos corridos, y para otros sólo los estándares 100 y 10. Vale la pena aclarar que la reproducibilidad del resultado ya sea positivo o negativo depende de la comparación de su curva de amplificación con respecto a las del blanco y las de los estándares utilizados.
6.5 Análisis de resultados
El gráfico que arroja el termociclador luego de finalizado el corrido de PCR en Tiempo Real son unas curvas de amplificación. Dicho gráfico consta de un eje Y, que muestra la intensidad de la fluorescencia de la sonda; y en el eje X, el número de ciclos utilizados. Es necesario que se forme una curva de amplificación de manera exponencial para que el resultado sea positivo, y además dicha curva debe estar por encima del comportamiento del blanco que debe ser lineal, pues en él no debería darse la amplificación de ningún fragmento (Figura 7).
30
Figura 7. Gráfico de RT-PCR con sus respectivos estándares, blanco y muestra de interés. Las curvas azul y negra representan la amplificación del ADN presente en el estándar 1000 y 100 utilizados, la línea morada representa el patrón lineal de los blancos de PCR en Tiempo Real y la curva de amplificación agua marina corresponde a una muestra de interés que indica la presencia de Bd.
La curva de amplificación de una muestra positiva analizada debe tener un comportamiento análogo al de los estándares utilizados ya que si el ADN de Bd está presente, éste deberá amplificarse exponencialmente a medida que se avance en el número de ciclos hasta que se estabilice, según la concentración inicial que existía en la muestra será el comportamiento de la curva. Adicionalmente algunos de los resultados obtenidos fueron reproducidos en laboratorios de la Universidad Estatal de San Francisco por el investigador principal Vance Vredenburg mediante PCR en Tiempo Real, orientados a validar la información obtenida.
6.6 Análisis Estadístico
Se llevó a cabo un análisis de regresión logística binaria usando el programa SPSS Statistics 18. con el fin de reconocer si la Temperatura y Humedad del ambiente están asociadas a la detección del hongo Bd en los anfibios localizados en un Bosque Húmedo Tropical Submontano (Santa María-Boyacá), osea si este hongo tiene o no preferencia por alguna temperatura y/o humedad
31 relativa de las que ofrece la zona de estudio. Como variables independientes se tomaron la Temperatura y Humedad Relativa y como variable dependiente la presencia/ausencia de Bd. Este modelo es más robusto que el análisis discriminante al no requerir supuestos como el de normalidad u homogeneidad, permite predecir y/o evaluar la asociación u relación entre una variable dependiente categórica dicotómica (Ausencia/Presencia) y unas variables independientes cuantitativas (Temperatura- Humedad) que se presumen relevantes o influyentes. Este tipo de análisis estadístico permite introducir como variables predictoras de la respuesta tanto variables cuantitativas como categóricas y arroja un coeficiente de regresión (β) que corresponde a la probabilidad que tiene un individuo de presentar el resultado evaluado, en este caso la presencia o ausencia del patógeno.
7. Resultados 7.1 Especies de Anfibios encontradas
En el Bosque Húmedo Tropical Submontano estudiado localizado en el municipio de Santa María se encontraron 15 especies pertenecientes a los tres órdenes (Tabla. 1)
Tabla 1. Especies de anfibios encontradas en el área de estudio.
No Total No de Orden Familia Taxón Individuos Microhábitat Lugar de Muestreo Salida colectados Pequeño empozamieto de agua que presetaba además Rheobates palmatus Quebrada La Cristalina acumulos de hojarazca, arena y Aromobatidae 1, 3 5 lodo Camino hacia el Río Batá, Rhinella gr. Pastizales, rocas y áreas camino hacia la quebrada La margaritifera abiertas Cristalina y hacia La Bufonidae 2, 3 9 Quebrada de las Vueltas Anura Pastizales, rocas y áreas Camino hacia el Río Batá y la Rhinella marina 1, 2, 3 11 abiertas quebrada La Cristalina Centrolenidae Rulyrana flavopunctata 1 1 Roca cercana al río Costado sur del Río Batá Dendropsophus Pastizal inundado con aguas Cercano al Río Batá mathiassoni 3 4 del río Batá Camino que va hacia La Dendropsophus minutus Pastizales y charcas Hylidae 2, 3 2 Quebrada de las Vueltas
32 Hypsiboas crepitans 1, 3 6 Plantas herbáceas, charcas Camino que va hacia La Hypsiboas lanciformis 1, 2, 3 9 temporales y pastizales Quebrada de las Vueltas
Hypsiboas punctatus 1, 3 9 Costado norte del camino que Phyllomedusa Árbol de gran tamaño con se dirige hacia la quebrada La hypochondrialis enredaderas y musgos 1 1 Cristalina Zanjas que se forman en el extremo izquierdo y que Camino que va hacia La Leptodactylus acumulan agua lluvia y Quebrada de las Vueltas, colombiensis hojarasca, carretera, charca y Orilla del Río Batá. Leptodactylidae 1, 2, 3 17 alrededor fangoso Pristimantis frater 1 1 Charcas y pequeños cuerpos de Cercanías al Río Batá, cerca a agua temporales, vegetación Pristimantis medemi La Quebrada de Las Vueltas Strabomantidae 1, 2, 3 14 herbácea Camino que va hacia La Siphonops annulatus Enterrada en el suelo Apoda Caeciliidae 1 1 Quebrada de las Vueltas Uno de los costados del Bolitoglossa Vegetación herbácea camino que se dirige hacia la altamazonica Caudata Plethodontidae 1, 3 5 quebrada La Cristalina
1. Salida de 23 al 24 de Octubre de 2009, 2. Salida del 01 al 02 de Mayo de 2010, 3. Salida del 01 al 04 de Octubre de 2010
En la primera salida se muestrearon un total de 16 individuos distribuidos en los ordenes Anura, Apoda y Caudata. Del orden Anura se muestrearon un total de 12 individuos distribuidos en 6 familias y 7 géneros. El género con mayor número de especies fue Hypsiboas (3 spp.) seguido por el género Pristimantis (2 spp.). Del orden Apoda se muestreó 1 individuo perteneciente a la familia Caeciliidae y del orden Caudata se muestrearon un total de 2 individuos pertenecientes a la familia Plethodontidae.
En la segunda salida se muestrearon un total de 22 individuos todos pertenecientes al órden Anura, distribuidos en 4 familias y 5 géneros. El género con mayor número de especies fue Rhinella (2 spp.). No fueron encontrados anfibios pertenecientes a los ordenes Apoda y Caudata.
Finalmente, en la tercera salida se muestrearon un total de 57 individuos. Del orden Anura se muestrearon un total de 54 individuos distribuidos en 5 familias y 6 géneros. El género con mayor número de especies fue Hypsiboas (3 spp.) seguido por los géneros Dendropsophus (2
33 spp.) y Rhinella (2 spp.). Durante esta salida no fueron registrados anfibios pertenecientes al orden Apoda, mientras que para el orden Caudata se muestrearon un total de 3 individuos pertenecientes a la familia Plethodontidae.
7.2 Contagio de Bd con respecto al tipo de hábito de las especies de anfibios
Debido a la condición anamniota de sus huevos, los anfibios tienden a proteger los mismos poniéndolos en lugares húmedos que eviten la deshidratación. El modo reproductivo es una combinación del lugar de ovoposición y el tipo de desarrollo. Teniendo en cuenta los 10 tipos de modos reproductivos que define Crump (1974), estos pueden ser llevados a cabo tanto en ambientes terrestres como acuáticos. Los ambientes acuáticos pueden ser lóticos si se caracterizan por presentar aguas fluyentes principalmente representadas por ríos, quebradas y arroyos; o lénticos si son cuerpos de agua cerrados que permanecen en un mismo lugar sin correr o fluir, como los lagos, lagunas, esteros, charcas, entre otros.
En el Bosque húmedo tropical submontano estudiado se observó que existen especies tanto de hábitos acuáticos como terrestres, en la tabla 2 se mencionan el tipo de ambiente que frecuentan las especies registradas y su tipo de modo reproductivo.
Tabla 2. Tipo de ambiente y modo reproductivo de las especies registradas en el área de estudio.
Tipo de Resultado de PCR Especie Modo Reproductivo Ambiente para la especie
Rhinella gr. margaritifera Negativo Huevos y renacuajos en lagunas Rhinella marina I Negativo temporales Dendropsophus mathiassoni Positivo Acuático léntico Dendropsophus minutus Negativo Hypsiboas crepitans Huevos depositados en la cavidad II Negativo de un árbol sobre le suelo, larvas Hypsiboas lanciformis Negativo
34 acuáticas que nadan libremente Hypsiboas punctatus Negativo
Huevos depositados en la vegetación por encima del agua, Phyllomedusa hypochondrialis IV larvas acuáticas que nadan Negativo libremente
Huevos depositados en nidos de Leptodactylus colombiensis V espuma cerca al agua, larvas Positivo acuáticas que nadan libremente
Pristimantis frater VIII Negativo Pristimantis medemi Huevos depositados fuera del Negativo Terrestre Siphonops annulatus agua con desarrollo directo Negativo NA Bolitoglossa altamazonica Negativo Huevos depositados en tierra, Rheobates palmatus VI larvas acuáticas que nadan Negativo libremente Huevos depositados en la Acuático lótico vegetación por encima del agua, Rulyrana flavopunctata IV larvas acuáticas que nadan libremente Negativo NA: No Aplica
Según los resultados obtenidos el mayor porcentaje de especies (60%) llevan a cabo sus modos reproductivos en ambientes acuáticos lénticos, seguido de los modos reproductivos en ambientes terrestres con un 27%, el menor porcentaje de especies (13%) se da en ambientes acuáticos lóticos. Estos valores podrían están relacionados de alguna manera con la presencia de Bd ya que luego de efectuados los análisis pertinentes se observó que las especies que presentaron el hongo son especies de hábitos acuáticos y que frecuentan ambientes lénticos como se describe en la tabla 6.
7.3 Especies de anfibios que presentan el patógeno
De los 95 individuos muestreados, sólo dos resultaron positivos, ya que se detectó en ellos la presencia del hongo patógeno (Tabla 3), ninguno presentó signos típicos de quitridiomycosis, al contrario se observó un comportamiento normalmente activo a diferencia de otros individuos
35 reportados por Berger et al. 1999 y Nichols et al. 2001 los cuales fueron encontrados muertos o con hiperplasia e hiperqueratosis de la epidermis . Los resultados positivos fueron: un individuo perteneciente a la familia Leptodactylidae capturado durante la primera salida y otro perteneciente a la familia Hylidae capturado durante la tercera salida.
Tabla 3. Listado de especies encontradas en el área de estudio y especies que presentaron el patógeno
No de muestras con Taxón Resultado Tipo de Modo Bd/muestras totales Reproductivo Bolitoglossa altamazonica - 0/5 8 Dendropsophus mathiassoni + 1/4 1 Dendropsophus minutus - 0/2 1 Hypsiboas crepitans - 0/6 3 Hypsiboas lanciformis - 0/9 3 Hypsiboas punctatus - 0/9 2 Leptodactylus colombiensis + 1/17 5 Phyllomedusa hypochondrialis - 0/1 4 Pristimantis frater - 0/1 8 Pristimantis medemi - 0/14 8 Rheobates palmatus - 0/5 6 Rhinella gr. margaritifera - 0/9 1 Rhinella marina - 0/11 1 Rulyrana flavopunctata - 0/1 4 Siphonops annulatus - 0/1 3
7.3.1 Reproducibilidad de los resultados Resultados Negativos
Los resultados negativos de los corridos de PCR en Tiempo Real que se muestran a continuación se encuentran organizados según el tipo de hábito que presentan las especies.
36 En general los análisis de los individuos muestreados arrojaron resultados negativos (93 muestras) ya que no se detectó ni amplificó ningún fragmento de ADN de Batrachochytrium dendrobatidis. En las tablas que se muestran a continuación se presentan los gráficos con resultados negativos de algunos corridos de PCR en Tiempo Real por especie.
La primera tabla (Tabla 4) contiene los resultados de PCR en Tiempo Real negativos para especies de hábitos terrestres, la segunda y tercera tabla (Tabla 5, Tabla 6) contienen los mismos resultados para especies de anfibios de hábitos acuáticos que habitan en ambientes lóticos y lénticos.
37 Tabla 4. Resultados negativos de los corridos de PCR en Tiempo Real para especies de anfibios de hábitos terrestres
38 Tabla 5. Resultados negativos de los corridos de PCR en Tiempo Real para especies de anfibios de hábitos acuáticos lóticos
39 Tabla 6. Resultados negativos de los corridos de PCR en Tiempo Real para especies de anfibios de hábitos acuáticos lénticos
40
41
Resultados Positivos
De las 95 muestras analizadas sólo 2 resultaron positivas y fueron pertenecientes a individuos de la familia Leptodactylidae e Hylidae, demostrando así la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en este Bosque Húmedo Tropical Submontano. Se observó que las especies que presentaron el hongo son especies de hábitos acuáticos y que frecuentan ambientes lénticos como se describe en la tabla 6.
Leptodactylus colombiensis
En la Figura 8 se muestran las curvas de amplificación tanto de los estándares 100 y 10 utilizados, el comportamiento lineal del blanco y la curva de amplificación de la muestra S17 correspondiente a la especie Leptodactylus colombiensis.
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Figura 8. Curva de amplificación de la muestra S17 perteneciente a un individuo de la especie Leptodactylus colombiensis. La curva de amplificación fucsia y rosada corresponde a los estándares 100 y 10 respectivamente. La línea morada que sigue un patrón lineal corresponde al blanco (Agua para PCR) y la curva de amplificación agua marina corresponde a la muestra positiva de Leptodactylus colombiensis.
Debido a que la muestra presentó una curva exponencial análoga a la de los estándares utilizados se tomó este resultado como positivo. Además se puede inferir que la concentración de ADN en la muestra S17 es mayor a la de los estándares utilizados ya que la intensidad de la fluorescencia de ésta es mayor y a que además empieza a amplificar unos cuantos ciclos antes que los estándares (ciclo 27 aproximados); a mayor concentración de ADN de Bd, mayor velocidad de amplificación y por tanto inicia más pronto en los ciclos.
Dendropsophus mathiassoni
A continuación se muestran las curvas de amplificación tanto de los estándares 1000, 100 y 10 utilizados, el comportamiento lineal del blanco y la curva de amplificación de la muestra Sm III (46) correspondiente a la especie Dendropsophus mathiassoni (Figura 9).
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Figura 9. Curva de amplificación de la muestra Sm III (46) perteneciente a un individuo de la especie Dendropsophus mathiassoni. La curva de amplificación azul y rosada corresponden al estándar 1000, la curva de amplificación verde corresponde al estándar 100 y la roja al estándar 10. La línea negra que sigue un patrón lineal corresponde al blanco (Agua para PCR) y la curva de amplificación morada corresponde a la muestra positiva de Dendropsophus mathiassoni.
Debido a que la muestra presentó una curva exponencial análoga a la de los estándares utilizados se tomó este resultado como positivo. Además podemos inferir que la concentración de ADN en la muestra Sm III (46) es menor a la de los estándares utilizados ya que la intensidad de la fluorescencia de ésta es menor y a que además empieza a amplificar unos cuantos ciclos después que los estándares (ciclo 32 aproximadamente); a menor concentración de ADN de Bd, menor velocidad de amplificación y por tanto inicia más tarde en los ciclos.
44 7.4 Variables medioambientales estudiadas y su posible asociación con la detección de Batrachochytrium dendrobatidis 7.4.1Estadísticos descriptivos
Teniendo en cuenta los 95 datos de las temperaturas y humedades registradas en campo se realizaron estadísticos descriptivos los cuales expresan que la temperatura mínima en el Bosque húmedo tropical submontano es de 20°C y la máxima es de 28.9°C, la media es de 24.8°C, la desviación estándar es de 1.79°C y la varianza de 3.2°C. Con respecto a la humedad, en el lugar de estudió se da un porcentaje mínimo de humedad del 64% y uno máximo de 99.9%, la media de los datos es de 81.86%, la desviación estándar es del 10.62% y la varianza de 112.9%.
7.4.2 Resultados de la posible asociación entre la temperatura y humedad y la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis
El análisis de regresión logística permite medir la proporción de cambio en la variable observacional (Ausencia o Presencia de Bd) de acuerdo a la influencia de cada una de las variables (Temperatura y Humedad del ambiente). Los valores de cambio son determinados por el exponente beta, con respecto al único valor de beta arrojado. En la tabla 7 se puede decir que el
2% de los anfibios tienen la probabilidad de presentar el patógeno a esas condiciones de temperatura y humedad.
Tabla 7. Probabilidad de presentar el patógeno. B: Valor de β, E.T: Error estándar, gl: Grados de libertad, Sig: Valor de significancia, Exp (β): Valor de probabilidad.
B E.T. Wald gl Sig. Exp(B) Paso 0 Constante -3,839 ,715 28,862 1 ,000 ,022
Debido a que Bd fue detectado solamente en las salidas durante las cuales se dieron épocas de lluvias podría pensarse que las variables de temperatura y humedad del ambiente están asociadas a la presencia del patógeno en el bosque; sin embargo, los resultados del análisis estadístico
45 indicaron que la temperatura y humedad del ambiente no están asociadas significativamente a la detección de Bd (P de T°= 0.509 y P de HR=0.426 (Tabla 8).
Tabla 8. Variables introducidas y valor de significancia. Los valores del P calculado son mayores al 0.05% por lo cual se acepta la hipótesis nula, que indica que la presencia de Bd no está asociada con las variables ambientales evaluadas. B: Valor de β, E.T: Error estándar, gl: Grados de libertad, Sig: Valor de significancia, Exp (β): Valor de probabilidad.
B E.T. Wald gl Sig. Exp(B) Paso 1a Temperatura ,617 ,934 ,435 1 ,509 1,853 Humedad ,119 ,149 ,633 1 ,426 1,126 Constante -29,005 34,955 ,689 1 ,407 ,000
8. Discusión 7.1 Especies de anfibios encontradas
En el Bosque Húmedo Tropical Submontano estudiado se encontraron en total 15 especies de anfibios pertenecientes a los tres órdenes (Anura: Rheobates palmatus, Rhinella gr. margaritifera, Rhinella marina, Rulyrana flavopunctata, Dendropsophus mathiassoni, Dendropsophus minutus, Hypsiboas crepitans, Hypsiboas lanciformis, Hypsiboas punctatus, Phyllomedusa hypochondrialis, Leptodactylus colombiensis, Pristimantis frater, Pristimantis medemi; Apoda: Siphonops annulatus y Caudata: Bolitoglossa altamazonica). Estos resultados coinciden con los documentados por Lynch (2005) quien reportó para la localidad de Santa María renacuajos de las especies de anuros Dendropsophus mathiassoni, Dendropsophus minutus, Hypsiboas punctatus, Scinax rostratus, Scinax ruber y Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus) y Lynch (2006) quien reportó para la localidad de Santa María a las especies Bufo marinus (=Rhinella marina), Dendropsophus minutus, Hypsiboas lanciformis, Hypsiboas punctatus, Phyllomedusa hypocondrialis, Pristimantis frater, Pristimantis savagei, Leptodactylus colombienesis, Leptodactylus mystaceus y Bolitoglossa altamazonica.
46
Del órden Apoda se encontró una especie de caecilia (Siphonops annulatus) perteneciente a la familia Caeciliidae, debido a su forma de vida subterránea es muy poco probable encontrar un individuo de esta especie, no obstante ésta especie ha sido reportada en los departamentos de Amazonas, Cesar, Meta, Putumayo, Vichada y Boyacá según Acosta (2000), Lynch (1999; 2006).
Finalmente del órden Caudata se encontró una especie Bolitoglossa altamazonica perteneciente a la familia Plethodontidae, ésta especie habita en la vegetación herbácea en bosques de tierras bajas. Este reporte coincide con lo documentado por Brame & Wake (1963), Acosta (2000) y Lynch (2006) quienes la reportaron en la Región Andina y Orinoquía en los departamentos de Boyacá y Cundinamarca.
8.2 Especies que presentaron el patógeno
De las 95 muestras analizadas pertenecientes a 15 especies 2 presentaron el hongo Batrachochytrium dendrobatidis. Una fue la especie Leptodactylus colombiensis y otra la especie Dendropsophus mathiassoni. La especie Leptodactylus colombiensis habita hoyos de lodo muy cercanos a charcas temporales en las cuales se reproduce y pone sus huevos en nidos de espuma. La especie Dendropsophus mathiassoni es una especie que habita en la vegetación herbácea de sabanas húmedas cerca de cuerpos de agua y se reproduce en charcas temporales y permanentes.
Teniendo en cuenta el tipo de ambiente en el cual se lleva a cabo el modo reproductivo y los resultados obtenidos, se puede inferir que Bd afecta principalmente a las especies de anfibios que llevan a cabo sus eventos reproductivos en cuerpos de agua lénticos, puesto que en ellos el agua no fluye y por tanto los anfibios tenderán a presentar una mayor exposición al patógeno porque éste se transmite por vía acuática mediante zoosporas y Bd se mantendrá más concentrado. Aunque los análisis moleculares sólo arrojaron estos resultados positivos, posiblemente otras especies que tienen modos reproductivos que dependen de cuerpos de agua lénticos podrían verse afectadas como: Rhinella gr. margaritifera, Rhinella marina, Dendropsophus minutus, Hypsiboas crepitans, Hypsiboas lanciformis, Hypsiboas punctatus y Phyllomedusa hypochondrialis.
47
Al igual que Leptodactylus colombiensis McCracken et al (2009) reportan en Bosques lluviosos de tierras bajas (<300m) del Ecuador la quitridiomicosis en especies del mismo género L. discodactylus (2/5), L. pentadactylus (4/5) y L. rhodomystax (1/1) que presentan modos reproductivos dependientes de los cuerpos de agua lenticos, así mismo reportaron el mayor porcentaje de la presencia de Bd (33%) en especies de dosel, seguido de un 25% para especies fosoriales, sus resultados se diferencian de los obtenidos durante esta investigación puesto que McCracken et al (2009) obtuvieron un porcentaje de especies positivas del 25% mientras que esta investigación tuvo sólo un 2.1%. También la especie Leptodactylus ocellatus (4/11) presentó el patógeno en Argentina, esta especie de la familia Leptodactylidae al igual que Leptodactylus colombiensis pone sus huevos en nidos de espuma y desarrolla sus larvas en cuerpos de agua temporales lénticos como lagunas y charcas, es generalista y se encuentra a un rango altitudinal desde el nivel del mar hasta los 1200m, altura a la cual también se reportó Bd en el Bosque Húmedo tropical submontano de Santa María en la especie del mismo género (818m.s.n.m) (Herrera et al. 2005).
Batrachochytrium dendrobatidis ha sido reportado en gran variedad de especies de la familia Hylidae a la cual pertenece la especie Dendropsophus mathiassoni, en el caso de la especie Agalychnis moreletii en Honduras (Felger et al. 2007) 10 individuos de los 56 analizados en total tenían Bd (17.8 %), Hypsiboas freicanecae perteneciente a un bosque lluvioso con alturas máximas de 2400m, de las 96 muestras tomadas correspondientes a ésta y otras especies 6 resultaron positivas (6.25%), este resultado es el más cercano a lo obtenido por esta investigación ya que de 95 muestras tomadas 2 resultaron positivas (2.1%) (Carnaval et al. 2006), Pachymedusa dacnicolor, Hyla eximia (Frías et al. 2008) quienes también se destacan por exhibir modos reproductivos dependientes de cuerpos de agua en ambientes lénticos e Hyla arenicolor (1/2) en Estados Unidos encontrándose a una altura de 890m lo cual coincide con la presente investigación que fue llevada a cabo a 880m de altura aproximadamente; y Sánchez et al. (2008) reportaron la presencia de Bd en 10 especies de anfibios que habitan tanto estanques como arroyos y sustratos terrestres entre los 80 y 2600m, de las 649 muestras analizadas 323 mostraron resultados positivos, el 26.7 % forma parte del porcentaje de individuos pertenecientes a la especie Dendropsophus meridensis
48
Aunque en las salidas de campo realizadas durante el desarrollo de ésta investigación no se registró ningún individuo con Bd para el género Eleutherodactylus (=Pristimantis en este caso), a la fecha existen un gran número de reportes de la enfermedad en especies de este género (Berger et al.1998; Burrowes et al.2004; Beard & O´Neil 2005; Puschendorf & Bolaños 2006) para el caso de Colombia Velásquez et al. (2008) reportan en el Valle del Cauca que el 10% de las 98 muestras analizadas pertenecientes al género Pristimantis presentaron el patógeno.
7.2.1 Resultados que apoyan la propuesta de contagio en ambientes lénticos
En ambientes lénticos se ha reportado el quitrido en las especies Pleurodema marmorata (=Pleuroderma marmoratum) (Seimon et al. 2006), Rhaebo haematiticus (Berger et al. 1998), Ambystoma mexicanum, Ambystoma granulosum, Ambystoma velasci, Lithobates montezumae, Lithobates neovolcanica, Lithobates spectabilis (Lips et al. 2004). Los resultados obtenidos discrepan de los mencionados anteriormente debido a que no se obtuvieron resultados positivos en la única especie de salamandra encontrada Bolitoglossa altamazonica, ni en las especies
Rhinella marina ni Rhinella gr. margaritifera que hacen parte al igual que Rhaebo haematiticus de la familia Bufonidae.
Nuestros resultados coinciden con lo reportado por Mazzoni et al. (2003) y Hanselmann et al. (2004) quienes confirmaron la presencia del patógeno en la especie Rana catesbeiana (=Lithobates catesbeianus), puesto que esta especie al igual que Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni pone sus huevos y larvas en cuerpos de agua permanentes de ambientes lénticos, y ha sido sugerida como potencial reservorio de la enfermedad mostrando altas concentraciones de Bd en su epidermis, demostrando que los anfibios que permanecen en cuerpos de agua tienen altos riesgos de presentar un alto grado de infección.
Así mismo, Green (2001) reportaron el patógeno en Bufo canorus (=Anaxyrus canorus), especie que se destaca por reproducirse en los bordes poco profundos de los estanques, que corresponden a cuerpos lénticos.
49 Otra especie que presentó un comportamiento parecido al de las especies que resultaron positivas para Batrachochytrium dendrobatidis es Alytes obstetricans ya que se reproducen en ambientes lénticos como estanques, lagunas permanentes, charcas (Bosh et al. 2001).
8.2.2 Resultados que refutan la propuesta de contagio en ambientes lénticos
Los resultados obtenidos discrepan de los obtenidos en investigaciones anteriores realizadas en Colombia por Velásquez et al. (2008) y Ruíz & Rueda (2008).
Velásquez et al. (2008) reportaron quitridiomicosis en 16 especies de anuros en ecosistemas de páramo y subpáramo, tanto de hábitos acuáticos como terrestres. De hábitos terrestres reportaron la enfermedad en individuos de las familias Hemiphractidae y Strabomantidae; en especies de hábitos acuáticos reportaron el hongo quitridio en las familias Hylidae, y Dendrobatidae que al igual que Dendropsophus mathiassoni sí presentan sus modos reproductivos en ambientes lénticos y en especies de la familia Centrolenidae que frecuentan ambientes lóticos en los cuales hacen las posturas de sus huevos y/o se da el desarrollo de sus renacuajos.
Ruíz & Rueda (2008) tampoco reportaron el patógeno en especies que frecuentan ambientes lénticos, sino en bosques piemontanos en especies terrestres como Eleutherodactylus elegans (=Pristimantis elegans) y en especies que habitan ambientes lóticos como Atelopus mittermeieri e Hyloscirtus bogotensis.
Los ecosistemas estudiados fueron diferentes al propuesto en este estudio en esta investigación al igual que los hábitos de las especies de anuros.
Estos resultados no coinciden con los de Bonaccorso & Guayasamin (2003) y Ruíz & Rueda (2008), que reportaron a Bd en las poblaciones de las especie Atelopus cruciger y Atelopus mittermeieri que se reproducen en ambientes lóticos como arroyos, estos autores al igual que Berger et al. (1998), Bradley et al. (2002) y Lips (1999) aseguran que las especies de anfibios que se reproducen en ambientes loticos están más asociadas con el quitridio. Los reportes del quitridio en el Bosque húmedo tropical submontano no coinciden con los presentados por
50 Carnaval et al. (2006) quienes reportaron la enfermedad en especies de anfibios con hábitos acuáticos que frecuentan ambientes lóticos, como Colostethus olfersioides (=Allobates olfersoides), Bokermannohyla gouveai, Hypsiboas frenicanecae, Thoropa miliaris y Crossodactylus caramaschii, ni con los registrados por Barrionuevo & Mangione (2006) en las especies Telmatobius atacamenensis y Telmatobius pisanoi, especies estrictamente acuáticas de ambientes lóticos.
La quitridiomicosis no sólo se da en ambientes acuáticos, también ha sido reportada en ambientes terrestres en algunas especies como Pristimantis cruentus, Eleutherodactylus emcelae (=Craugastor emcelae) (Berger et al. 1998), Eleutherodactylus fitzingeri (=Craugastor fitzingeri) (Puschendorf & Bolaños 2006), Eleutherodactylus coqui (Beard & O´Neil 2005), Eleutherodactylus karlschmidti (Burrowes et al. 2004), Gastrotheca dendronastes, Pristimantis thectopternus, Pristimantis gracilis, Pristimantis palmeri, Pristimantis erythropleura, Pristimantis w-nigrum, Pristimantis crhysops, Pristimantis silverstonei, Strabomantis ruizi (Velásquez et al. 2008) y en la salamadra Oedipina grandis (Lips et al. 2003), Lo mencionado anteriormente no coincide con los resultados obtenidos en esta investigación ya que las especies de hábitos terrestres como (Pristimantis frater, Pristimantis medemi, Siphonops annulatus y Bolitoglossa altamazonica) no presentaron el patógeno.
En Costa Rica tampoco sucede lo mismo que en el Bosque húmedo tropical submontano de Santa María puesto que Puschendorf & Bolaños (2006) afirman que no hay diferencias significativas entre los tipos de modos reproductivos de las especies, por lo tanto la prevalencia de Bd es igual tanto en especies de sustratos terrestres, cuerpos de agua lóticos, lénticos y especies de desarrollo directo. Los resultados obtenidos en esta investigación apoyan la idea de que los anfibios que se ven mayormente afectados por la enfermedad son las especies de hábitos acuáticos que realizan sus eventos de ovoposición y metamorfosis en ambientes lenticos, mientras que los resultados obtenidos por Berger et al.(1998) los refutan puesto que estos autores reportan la enfermedad en especies tanto de hábitos terrestres (Eleutherodactylus cruentus (=Pristimantis cruentus), Eleutherodactylus emcelae (=Craugastor emcelae)) como acuáticos tanto de ambientes lénticos (Bufo haematiticus (=Rhaebo haematiticus) como lóticos (Cochranella albomaculata
51 (=Sachatamia albomaculata), Cochranella prosoblepon (=Espadarana prosoblepon), Atelopus varius y Atelopus chiriquiensis).
También Lips (1999), Stuart et al. (2004) y Kriger & Hero (2006) están de acuerdo en que los anfibios asociados con cuerpos de agua podrían experimentar un mayor riesgo de infección, pero no diferencian entre ambientes lóticos y lénticos sino entre cuerpos de agua permanentes y efímeros apoyando la idea de que los individuos que habitan cuerpos de agua permanentes podrían experimentar un riesgo de infección mayor que los que sólo visitan charcas ocasionalmente.
8.2.3 Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni como posibles reservorios de Batrachochytrium dendrobatidis
De las especies encontradas ninguna presentó signos de la enfermedad ni siquiera las infectadas con Bd, debido a esto es posible que Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni puedan estar actuando como reservorios y dispersores de la enfermedad tal y como lo mencionan Woodhams & Alford (2005) y Kriger & Hero (2006a) para otras especies, sin embargo, es necesario cuantificar la concentración de zoosporas de Bd que infectan a estas especies con el fin de confirmar si éstas al igual que otras especies sugeridas como reservorios, soportan altas concentraciones del patógeno sin verse afectadas.
Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni manifiestan un amplio rango altitudinal y geográfico y facultades generalistas (Heyer 1994; UICN Red List), además están altamente relacionados con los cuerpos de agua, es así que si Bd está presente en las charcas y un individuo de alguna de estas dos especies ingresa a la misma, se verá contagiado por el hongo y posteriormente el anfibio podría contaminar a otros individuos y tipos de sustratos con el patógeno tal y como lo sugiere Longcore et al. (1999). Además al estar el anfibio en su época reproductiva, éste hará sus posturas en nidos de espuma que genera secretando sustancias mucosas y frotando rápidamente su piel (Crump, 1974) o directamente en el agua haciendo que los huevos también se contagien con el quitridio. Estos huevos madurarán a renacuajos, allí el hongo degradará la queratina presente en el disco oral causando deformaciones y se mantendrá
52 hasta que la totalidad de la epidermis finalice con queratina, lo cual según la especie pude variar de 12 meses a 3 años (Daszak et al., 1999). Posteriormente éstos individuos juveniles y/o adultos regresaran a los cuerpos de agua y los contaminarán antes de que puedan morir con el patógeno, afectando a otras especies de anfibios como: Dendropsophus minutus, Dendropsophus mathiassoni e Hypsiboas punctatus entre otras que también visitan los cuerpos de agua y que además hacen sus posturas allí. Bd podría estar asegurando su prevalencia en la zona infectando a los huevos y/o renacuajos, porque los adultos mueren muy pronto y los encargados de mantener y dispersar la enfermedad serán los futuros anfibios en estado juvenil y/o adulto tal y como lo asegura Daszak et al. (1999) pese a esto en ésta investigación no se analizó la presencia de Bd en huevos ni renacuajos por lo cual esto no puede ser comprobado.
8.3 Asociación entre temperatura y humedad del ambiente y la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis
Actualmente no existen muchos reportes sobre la relación que existe entre variables como la temperatura y humedad y la presencia de Bd Quintero (2008), al igual que éste trabajo utilizó una regresión logística binaria para conocer acerca de la relación entre estas variables, los datos fueron provenientes de muestras de anfibios tomadas en el extremo oriental de la cordillera de los Andes, al igual que esta investigación, Quintero (2008) concluyó que no existe una asociación significativa entre las variables evaluadas. Además los resultados arrojados por el análisis estadístico demuestran al igual que el mapa de distribución de Bd en la Península Ibérica diseñado por Walker et al. (2008) no hay asociación entre la presencia de Bd y estas variables ambientales.
Aunque la información bibliográfica sobre la asociación entre estas variables con el patógeno es limitada, sí se han llevado a cabo estudios que permitan conocer las condiciones de temperatura óptimas para el crecimiento de Bd. La media de la temperatura en Santa María fue de 24,8 °C, pero solo se obtuvieron resultados positivos en las especies Leptodacytlus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni muestreadas a temperaturas que van 23.9 y 25.5 °C
53 respectivamente. Sin embargo, Santa María presenta las condiciones favorables para el crecimiento del patógeno ya que su temperatura promedio 23.7°C está entre el rango de temperaturas optimas registradas por Nichols (1999); Berger et al. (2004) y Herrera et al. (2005) que va desde los 17 a los 25 °C.
9. Conclusiones
Se registraron un total de 15 especies pertenecientes a los tres órdenes de anfibios para el municipio de Santa María (Boyacá) caracterizado por presentar una vegetación propia de bosques húmedos tropicales submontanos.
Se reporta por primera vez la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis tanto para el municipio de Santa María, como para la vertiente oriental de la Cordillera Oriental de la cual no existen registros a la fecha.
Debido a la falta de estudios acerca de esta temática en el país la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis ha sido generalizada para todo el territorio nacional aunque sólo existen reportes en el Valle del Cauca, Santander y Cundinamarca. Esta investigación proporciona información valiosa acerca de la enfermedad, ya que ubica al patógeno en una nueva localidad y en un porcentaje muy bajo de individuos infectados (2,1%) comparativamente con otras localidades.
Se evidenció la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en especies de anfibios (Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni) pertenecientes al órden Anura, sin embargo algunas de las especies del órden Caudata también han presentado el patógeno en otros países.
Aunque las especies que arrojaron resultados positivos acerca de la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis llevan a cabo los procesos de ovoposición y/o metamorfosis en cuerpos de agua lénticos, no es posible asegurar que Bd este siguiendo un patrón específico ya que dicho patógeno también ha sido reportado tanto en ambientes terrestres como en ambientes acuáticos lóticos.
54
Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni podrían estar actuando como especies reservorio y dispersoras de la enfermedad puesto que en ninguno de los individuos analizados se observaron signos aparentes de la enfermedad, no obstante es necesaria una cuantificación de la concentración de zoosporas del quitridio que presentan dichas especies, con el fin de evidenciar si éstas soportan altas concentraciones del patógeno sin verse afectadas.
Los resultados obtenidos discrepan de los alcanzados por otras investigaciones en Colombia, debido a que en este caso sólo se presentaron resultados positivos en especies que frecuentan ambientes acuáticos lóticos.
La presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en las poblaciones de anfibios, no está asociada a las variables ambientales de temperatura y humedad.
10. Recomendaciones
Se recomienda hacer un monitoreo del estado de las poblaciones de anfibios en este Bosque húmedo tropical submontano, con el fin de conocer el impacto de la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis en los anfibios y que además permita evidenciar si realmente Leptodactylus colombiensis y Dendropsophus mathiassoni están actuando como reservorios de la enfermedad.
Se recomienda el análisis molecular de los especímenes depositados en museos y/o colecciones biológicas para analizar la presencia de Batrachochytrium dendrobatidis, y su posible vínculo con las declinaciones de especies de anfibios en el país.
Finalmente se sugiere realizar una cuantificación de la concentración del patógeno que permita conocer qué especies de anfibios se ven más afectadas, y generar estrategias de prevención y control de la enfermedad en éste y otros municipios.
55
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12. Anexos
Anexo I: Datos analizados
Código de Presencia/ Temperatura Humedad Muestra Ausencia
S1 0 24,7 85,1 S2 0 23,9 86,9 S4 0 23,5 87.0 S5 0 23,5 87,2 S6 0 23,6 87,2 S7 0 23,7 87,4 S8 0 23,3 89,4 S9 0 23,5 89,4 S10 0 23,4 89,3 S11 0 23,4 89.0 S12 0 23,4 88,7 S13 0 22,6 91,9 S14 0 20 92,5 S17 1 23,9 83,5 S18 0 23,9 83,7 S20 0 25,5 87.0 SM1 0 25.3 77.8 SM2 0 23.7 87.9 SM3 0 23.8 86.5 SM4 0 24 85.4 SM5 0 22.7 90.9 SM6 0 22.4 96.6 SM7 0 22.6 97.5 SM8 0 23.7 99.9 SM9 0 23 94.5 SM10 0 23.2 94.6 SM11 0 23.2 98.6 SM12 0 23,2 98,6 SM13 0 23.4 95.6
67 SM14 0 23,2 98,7 SM15 0 23,3 97,9 SM16 0 23,4 95,2 SM17 0 23,4 95,4 SM18 0 23.1 96.8 SM19 0 22.9 96.5 SM20 0 23,4 95,6 SM21 0 23 99.4 SM22 0 23,3 95,9 Sm III (1) 0 26,6 66.0 Sm III (2) 0 26,8 66.0 Sm III (3) 0 28,2 66.0 Sm III (4) 0 27,7 65.0 Sm III (5) 0 27,5 67.0 Sm III (6) 0 27,9 67.0 Sm III (7) 0 28,7 64.0 Sm III (8) 0 28,9 70.0 Sm III (9) 0 26,4 70.0 Sm III (10) 0 27,5 70.0 Sm III (11) 0 27,5 69.0 Sm III (12) 0 27,1 68.0 Sm III (13) 0 26,6 69.0 Sm III (14) 0 26,4 70.0 Sm III (15) 0 26,4 70.0 Sm III (16) 0 26,4 70.0 Sm III (17) 0 26 69.0 Sm III (18) 0 25,7 70.0 Sm III (19) 0 27,8 70.0 Sm III (20) 0 27,8 70.0 Sm III (21) 0 25,7 69.0 Sm III (22) 0 23 84.0 Sm III (23) 0 23 84.0 Sm III (24) 0 23 84.0 Sm III (25) 0 23 84.0 Sm III (26) 0 27,1 67.0 Sm III (27) 0 27 67.0 Sm III (28) 0 26,6 67.0 Sm III (29) 0 26,5 71.0
68 Sm III (30) 0 26,9 71.0 Sm III (31) 0 26,6 70.0 Sm III (32) 0 26,7 74.0 Sm III (33) 0 26,3 75.0 Sm III (34) 0 26,3 72.0 Sm III (35) 0 26 72.0 Sm III (36) 0 26 72.0 Sm III (37) 0 25,7 70.0 Sm III (38) 0 25,4 71.0 Sm III (39) 0 25,2 79.0 Sm III (40) 0 22,2 85.0 Sm III (41) 0 22,2 85.0 Sm III (42) 0 24,2 82.0 Sm III (43) 0 25,5 83.0 Sm III (44) 0 23,7 88.0 Sm III (45) 0 24,8 87.0 Sm III (46) 1 25,5 87.0 Sm III (47) 0 24 86.0 Sm III (48) 0 25,1 87.0 Sm III (49) 0 24,5 86.0 Sm III (51) 0 23,3 87.0 Sm III (52) 0 24,3 86.0 Sm III (53) 0 24,3 86.0 Sm III (54) 0 24,5 84.0 Sm III (55) 0 24,3 84.0 Sm III (56) 0 24,8 82.0 Sm III (57) 0 24,9 82.0 Sm III (59) 0 25 80.0
Estadísticos descriptivos N Mínimo Máximo Media Desv. típ. Varianza Temperatura 95 20,00 28,90 24,8000 1,79034 3,205 Humedad 95 64,00 99,90 81,8632 10,62578 112,907 N válido (según 95 lista)
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REGRESION LOGISTIK BIARIA
Codificación de la variable dependiente Valor Valor original interno d Ausencia 0 i Presencia 1 m e n s i o n 0
Tabla de clasificacióna Observado Pronosticado Respuesta Porcentaje Ausencia Presencia correcto Paso 1 Respuesta Ausencia 93 0 100,0 Presencia 2 0 ,0 Porcentaje global 97,9 a. El valor de corte es ,500
Variables en la ecuación B E.T. Wald gl Sig. Exp(B) Paso 0 Constante -3,839 ,715 28,862 1 ,000 ,022
Variables en la ecuación
B E.T. Wald gl Sig. Exp(B)
Paso 1a Temperatura ,617 ,934 ,435 1 ,509 1,853 Humedad ,119 ,149 ,633 1 ,426 1,126 Constante -29,005 34,955 ,689 1 ,407 ,000
70 Variables en la ecuación
B E.T. Wald gl Sig. Exp(B) Paso 1a Temperatura ,617 ,934 ,435 1 ,509 1,853 Humedad ,119 ,149 ,633 1 ,426 1,126 Constante -29,005 34,955 ,689 1 ,407 ,000 a. Variable(s) introducida(s) en el paso 1: Temperatura, Humedad.
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