Inhibition Der Signaltransduktion Von Toll-Like-Rezeptoren Durch Annexin 1 Auf Der Oberfläche Apoptotischer Zellen

Inhibition der Signaltransduktion von Toll-like-Rezeptoren durch Annexin 1 auf der Oberfläche apoptotischer Zellen

Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg

vorgelegt von: Diplom-Biochemikerin Andrea Mahr aus Lichtenfels

November 2008

Tag der mündlichen Prüfung: ______Andrea Mahr

Der experimentelle Teil der vorliegenden Dissertation an der Naturwissenschaftlich- Mathematischen Gesamtfakultät der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg wurde in der Zeit von April 2005 bis Oktober 2008 unter der Leitung von Prof. Dr. P. H. Krammer in der Abtei- lung Immungenetik des Deutschen Krebsforschungszentrums in Heidelberg durchgeführt.

Erstgutachter: Herr Prof. Dr. Lutz Gissmann Abteilung Genomveränderungen und Karzinogenese Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg

Zweitgutachter: Herr Prof. Dr. Peter H. Krammer Abteilung Immungenetik Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg

I Andrea Mahr

Zusammenfassung

Apoptotische Zellen entstehen kontinuierlich im Rahmen der Entwicklung und Gewebe- homöostase multizellulärer Organismen. Ihre Beseitigung erfolgt durch Phagozyten wie Dendritische Zellen (DC). Während die Aufnahme von Pathogenen DC aktiviert und zur Auslösung einer Immunantwort führt, wirkt die Phagozytose apoptotischer Zellen antiinflammatorisch. Dies dient dem Schutz des Organismus vor Immunreaktionen gegen „Selbst“-An- tigene aus apoptotischen Zellen und damit vor Autoimmunerkrankungen. Durch welche Me- chanismen apoptotische Zellen DC beeinflussen ist jedoch weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Protein Annexin 1, das spezifisch auf der Oberfläche frühapoptotischer Zellen präsentiert wird, zu deren antiinflammatorischem Effekt beiträgt, indem es die Signaltransduktion von Toll-like Rezeptoren (TLR) und somit die Aktivierung von DC hemmt. Die Modulation der Immunantwort durch apoptotische Zellen und insbesondere durch das Protein Annexin 1 wurde in in vitro-Experimenten mit DC oder DC-ähnlichen Zelllinien aus Maus und Mensch untersucht. Vorinkubation mit apoptotischen Zellen oder rekombinantem Annexin 1 führt zu einer verminderten Aktivierbarkeit der DC durch TLR-Liganden. Dies zeigt sich in einer reduzierten Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie TNF, bei unveränderter Produktion des antiinflammatorischen Zytokins IL-10. Der Einfluss auf die Zytokinsekretion spiegelt sich in einer entsprechenden Regulation der Zytokin-mRNAs wider. Genexpres- sionsanalysen zeigen einen globalen negativ regulatorischen Einfluss von Annexin 1 auf die durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierten proinflammatorischen Gene. Diese Effekte beruhen auf einer Inhibition der TLR-induzierten Signaltransduktion. Vorinkubation mit Annexin 1 bewirkt eine Reduktion der TLR-induzierten Phosphorylierung und Aktivierung von MAP- Kinasen sowie eine verminderte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB. Die Regulation betrifft beide TLR-induzierte Signalwege, die von den Adaptormolekülen MyD88 bzw. TRIF abhängen: MyD88- und TRIF-abhängige Zytokine sind gleichermaßen inhibiert, und ein Ef- fekt von Annexin 1 ist auch in MyD88-defizienten Mäusen zu beobachten. Dementsprechend beeinflusst Annexin 1 sowohl die Aktivierung über den ausschließlich TRIF-abhängigen TLR3 als auch die MyD88-abhängige Signaltransduktion von TLR2 und dem IL-1-Rezeptor. Die Stimulierbarkeit der DC über den nicht mit den TLR verwandten TNF-Rezeptor wird durch Annexin 1 ebenfalls vermindert, was auf eine umfassendere Inhibition proinflammatorischer Signaltransduktion hinweist. Experimente mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid weisen darauf hin, dass der antiinflammatorische Effekt von einer durch Annexin 1 induzierten Proteinsynthese abhängt. Die Analyse der Annexin 1-vermittelten Effekte auf DC trägt zum Verständnis des Mechanismus bei, wie apoptotische Zellen das Immunsystem beeinflussen und möglicherweise zu peripherer Toleranz führen.

II Andrea Mahr

Summary

Apoptotic cells are generated continuously during development and tissue homeostasis of multicellular organisms. They are removed by phagocytes such as dendritic cells (DC). In contrast to pathogens, which activate DC upon uptake and lead to initiation of an immune response, apoptotic cells show an anti-inflammatory effect on DC. This protects the organism from immune reactions against self-antigens derived from apoptotic cells and, thus, from autoimmune diseases. Mechanistically, however, not much is known about the tolerogenic effect of apoptotic cells. This work shows that the protein annexin 1, which is presented specifically on the surface of early apoptotic cells, contributes to the anti- inflammatory effect by inhibiting the signal transduction of Toll-like receptors (TLR) and thus the activation of DC. The modulation of the immune response by apoptotic cells and the protein annexin 1 in particular was investigated in in vitro experiments, using DC or DC-like cell lines derived from mouse or humans. Pre-incubation with apoptotic cells or recombinant annexin 1 leads to a reduced reactivity of DC towards TLR ligands. This results in a reduced secretion of proinflammatory cytokines such as TNF, whereas the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 is unaffected. The influence on the secretion is mirrored by a corresponding regulation of the cytokine mRNAs. Gene expression analyses show a global negative impact of annexin 1 on LPS-induced proinflammatory genes. These effects are due to an inhibition of TLR-induced signal transduction. Pre-incubation with annexin 1 leads to a reduction of TLR-induced activation of MAP-kinases and NF-κB. Both pathways induced by TLR, depending on the adaptors MyD88 and TRIF, respectively, are affected: MyD88- and TRIF- dependent cytokines are inhibited to a similar extent, and the effect of annexin 1 can still be observed in MyD88-deficient mice. Correspondingly, annexin 1 inhibits activation mediated by the TRIF-dependent TLR3 as well as the MyD88-dependent signal transduction of TLR2 and the IL-1 receptor. The reactivity of the DC towards TNF, which acts via a non-TLR- related receptor, is reduced by annexin 1 as well, indicating a broad inhibition of proinflammatory signal transduction pathways. Experiments using the translational inhibitor cycloheximide indicated that the anti-inflammatory effect of annexin 1 depends on protein synthesis. The analysis of the effects of annexin 1 on DC contributes to a better understanding of the mechanism how apoptotic cells influence the immune system and possibly lead to peripheral tolerance.

III Andrea Mahr

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung II Summary III I. Einleitung 1 I.1. Dendritische Zellen bilden die Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunität 1 I.1.1. Angeborene und adaptive Immunität 1 I.1.2. Professionelle Antigen präsentierende Zellen 2 I.2. Pathogen-assoziierte Strukturen werden von Toll-like Rezeptoren erkannt 4 I.2.1. Toll-like Rezeptoren 4 I.2.2. Weitere PRR-Klassen 7 I.3. TLR-Signaltransduktion führt zur Aktivierung der DC 8 I.3.1. Initiation der Signaltransduktion durch Adaptormoleküle 8 I.3.2. Signaltransduktion von TLR4 9 I.3.3. Signaltransduktion anderer TLR 12 I.4. Die TLR-Signaltransduktion wird auf mehreren Ebenen negativ reguliert 13 I.4.1. Regulation durch extrazelluläre oder membranständige Moleküle oder durch verminderte Expression der Signalmoleküle 13 I.4.2. Intrazelluläre Inhibitoren einzelner Signalmoleküle 13 I.4.3. Inhibitoren mit mehreren Angriffspunkten 14 I.4.4. TLR-induzierte Apoptose 15 I.4.5. Endotoxin-Toleranz 16 I.5. DC können Immuntoleranz vermitteln 17 I.5.1. Mechanismen der T-Zell-Toleranz 17 I.5.2. Entstehung immunogener und tolerogener DC in vivo 19 I.5.3. Charakteristika tolerogener DC 20 I.5.4. Erzeugung tolerogener DC in vitro 21 I.6. Apoptotische Zellen beeinflussen professionelle Phagozyten 22 I.6.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Phagozytose 22 I.6.2. Anti-inflammatorische Beeinflussung der Phagozyten durch apoptotische Zellen 25 I.7. Annexin 1 ist ein antiinflammatorisches Protein auf der Oberfläche apoptotischer Zellen 28 I.7.1. Die Annexin-Familie 28 I.7.2. Annexin 1 31 I.8. Zielsetzung 35

IV Andrea Mahr

II Material und Methoden 36 II.1. Material 36 II.1.1. Häufig verwendet Puffer 36 II.1.2. Biologisches Material 37 II.1.3. Oligodesoxyribonukleotide 37 II.1.4. Antikörper 38 II.1.5. Reagenzien 39 II.1.6. Geräte und Material 41 II.2. Methoden 42 II.2.1. Zellbiologische Methoden 42 II.2.1.1. Kultivierung eukaryotischer Zellen 42 II.2.1.2. Präparation humaner Monozyten und Differenzierung zu DC 42 II.2.1.3. Präparation muriner Knochenmarkszellen und Differenzierung zu DC 43 II.2.1.4. Differenzierung der U-937 Zellen 44 II.2.1.5. Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten 44 II.2.1.6. Apoptoseinduktion 44 II.2.1.7. Kokultur-Experimente mit Phagozyten und apoptotischen Zellen 45 II.2.1.8. Experimente mit Phagozyten und rekombinantem Annexin 1 45 II.2.1.9. Transfektion der Zelllinie Raw264.7 46 II.2.1.10. Reporter-Experimente mit Raw264.7 Zellen 46 II.2.1.11. Messung der Aktivität der p38 Kinase in Raw264.7 Zellen 47 II.2.2. Proteinchemische Methoden 48 II.2.2.1. Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1 48 II.2.2.2. Bestimmung von Proteinkonzentrationen 49 II.2.2.3. LPS-Dekontamination 50 II.2.2.4. Bestimmung der LPS-Konzentration 50 II.2.2.5. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 50 II.2.2.6. Lyse eukaryotischer Zellen 51 II.2.3. Immunologische Methoden 51 II.2.3.1. ELISA 51 II.2.3.2. Durchflusszytometrische Messung von Apoptosemerkmalen 52 II.2.3.3. Western Blot 53 II.2.4. Molekularbiologische Methoden 53 II.2.4.1. Transformation kompetenter Bakterien 53 II.2.4.2. Isolierung von Plasmid-DNA 54 II.2.4.3. Isolierung von RNA 54 II.2.4.4. RNA-Qualitätsbestimmung mit dem Agilent Chip 54 II.2.4.5. Reverse Transkription 55 II.2.4.6. Quantitative Real Time-PCR 55 II.2.4.7. Genexpressionsanalysen 56

V Andrea Mahr

III. Ergebnisse 57 III.1. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die LPS-induzierte Zytokinsekretion in humanen und murinen DC 57 III.2. Annexin 1 inhibiert die Zytokinsekretion nach TLR-Stimulation auch in Gegenwart der LPS-blockierenden Substanz Polymyxin B 62 III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsynthese auf Ebene der mRNA 64 III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen 70 III.5. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivität von NF-κB 73 III.6. Annexin 1 inhibiert den MyD88- und den TRIF-abhängigen Weg 74 III.7. Annexin 1 inhibiert die Signaltransduktion des TNF-Rezeptors 77 III.8. Die Annexin 1-vermittelte Suppression ist an eine Proteinsynthese gekoppelt 79 IV. Diskussion 83 IV.1. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Sekretion proinflammatorischer Zytokine in DC 83 IV.2. Die Zytokinregulation erfolgt auf der Stufe der mRNA 86 IV.3. Annexin 1 inhibiert die Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB 87 IV.4. Annexin 1 beeinflusst MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege der TLR sowie die Signaltransduktion weiterer proinflammatorischer Rezeptoren 89 IV.5. Der inhibierende Effekt von Annexin 1 ist proteinsyntheseabhängig 90 IV.6. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf DC 91 IV.7. Rekombinantes Annexin 1 zeigt inhibitorische Effekte unabhängig von kontaminierendem LPS 94 IV.8. Ausblick 96 V. Anhang 98 V.1. Referenzen 98 V.2. Tabellen zu den Genexpressionsanalysen 112 V.3. Abkürzungsverzeichnis 115 V.6. Erklärung 119 V.7. Danksagung 120

VI I. Einleitung Andrea Mahr

I. Einleitung

I.1. Dendritische Zellen bilden die Schnittstelle zwischen angeborener und adaptiver Immunität

I.1.1. Angeborene und adaptive Immunität Alle multizellulären Organismen besitzen Abwehrmechanismen, die durch eindringende Erreger aktiviert werden und den Körper durch Beseitigung dieser Erreger vor Infektionen schützen. Das Immunsystem der Vertebraten verwendet sowohl angeborene als auch erworbene Mechanismen zur Abwehr von Pathogenen. Zellen des angeborenen Immunsystems erkennen Krankheitserreger mit Hilfe von Rezeptoren für bestimmte, weit verbreitete pathogene Merkmale und bekämpfen sie durch Mechanismen wie Phagozytose, Lyse oder Apoptose-Induktion. So können Pathogene unmittelbar nach dem Eindringen durch eine schnelle Reaktion abgewehrt werden. Bei unvollständiger Elimination durch die angeborenen Mechanismen werden sie in der Folge durch die erworbene oder adaptive Im- munantwort bekämpft. Die Komponenten des adaptiven Immunsystems, B- und T-Zellen, werden erst mehrere Tage nach der Infektion aktiviert. Sie verwenden antigenspezifische Rezeptoren, die durch somatische Rekombination und Mutation entstehen und auf den jeweiligen Erreger abgestimmt sind. Dies ermöglicht eine gezielte und effektive Abwehr von Pathogenen sowie die Etablierung eines immunologischen Gedächtnisses zwecks schneller spezifischer Reaktion bei einer Neuinfektion mit dem gleichen Erreger. Die Verwendung von Rezeptoren, die durch zufällige Mechanismen entstehen, birgt jedoch die Gefahr, dass sich das destruktive Potenzial des Immunsystems auch gegen den Organismus selbst richtet. Daher sind Mechanismen notwendig, die eine Unterscheidung zwischen harmlosen „Selbst“- Antigenen einerseits sowie „Fremd“- Antigenen bzw. Gefahrensignalen andererseits ermög- lichen. Ein Teil der potenziell autoreaktiven T- und B-Zellen wird schon am Ort der Entste- hung in Thymus und Knochenmark unschädlich gemacht (siehe I.5.1.). Eine Aktivierung der verbleibenden autoreaktiven Zellen muss in der Peripherie verhindert werden. Diese Aufgabe wird von Zellen des angeborenen Immunsystems übernommen. Nur wenn diese mit Hilfe ihrer pathogenspezifischen Rezeptoren einen Erreger als solchen identifiziert haben, aktivieren sie eine spezifische Immunantwort. Die Komponenten des adaptiven Immunsystems sind somit in der Regel auf eine Aktivierung durch das angeborene Immunsystem angewiesen. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die Antigen präsentierenden Zellen (antigen presenting cells, APC), in erster Linie Dendritische Zellen (dendritic cells, DC).

1 I. Einleitung Andrea Mahr

I.1.2. Professionelle Antigen präsentierende Zellen Zu den professionellen APC des Immunsystems gehören B-Zellen, Makrophagen und DC. Die Gemeinsamkeit dieser Klasse von Zellen besteht in der konstitutiven Expression von MHC-II (major histocompatibility complex II) -Molekülen auf ihrer Oberfläche, und somit in der Fähigkeit, aufgenommene Antigene den CD4+ T-Zellen zu präsentieren. Daneben können sie wie alle kernhaltigen Zellen den CD8+ T-Zellen Antigene über MHC-I präsentieren. Die verschiedenen Typen professioneller APC erfüllen jedoch im Immunsystem unterschiedliche Aufgaben. B-Zellen können mit Hilfe ihres membranständigen B-Zell-Rezeptors nur spezifische An- tigene aufnehmen. In den sekundären lymphatischen Organen präsentieren sie diese Anti- gene CD4+ T-Helferzellen. Diese B-Zell-T-Zell-Interaktion ist im Fall der meisten Antigene Voraussetzung für die Aktivierung der B-Zelle und für die Reifung zur Antikörper produzie- renden Plasmazelle. Da CD4+ T-Helferzellen nur nach Stimulation durch Antigen präsentie- rende DC dazu in der Lage sind, B-Zellen zu aktivieren, ist die Abhängigkeit der spezifischen Immunantwort vom angeborenen Immunsystem gewährleistet. Bei Makrophagen steht weniger die Funktion als APC im Vordergrund, sondern ihre Fä- higkeit zur Phagozytose. Sie sind darauf spezialisiert, am Ort der Entzündung Pathogene aufzunehmen und zu töten. Werden sie durch pathogenassoziierte Merkmale (siehe I.2.), oder durch Zytokine wie Interferon γ (IFNγ) aktiviert, so eliminieren sie aufgenommene Pa- thogene durch Verdau in ihren Lysosomen, sowie durch Produktion reaktiver Sauerstoff- und Stickstoff-Moleküle (oxidative burst). Außerdem sezernieren sie proinflammatorische Media- toren, die zur Migration und Aktivierung weiterer Immunzellen führen. Antigenpräsentation durch Makrophagen ist weniger für die initiale Aktivierung naiver T-Zellen wichtig, als vielmehr für die Verstärkung der Aktivität von Effektor-T-Zellen am Ort der Entzündung (Male 2006). DC hingegen fungieren im Rahmen einer Immunantwort als hauptsächliche Vermittler der Aktivierung naiver T-Zellen (Priming). Damit stellen sie das zentrale Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar. Eine Voraussetzung für diese Funktion ist die Lokalisation der DC im Körper. Unreife DC befinden sich hauptsächlich in der Peripherie: In der Haut (epidermale Langerhans-Zellen sowie dermale DC), in den meisten Organen und im Bindegewebe (interstitielle DC) sowie in den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Ver- dauungs- und Atemtraktes (mukosale DC) (Sato & Fujita 2007). DC sind somit ideal positio- niert, um eindringende Pathogene zu entdecken und werden oft als „Wachtposten“ des Immunsystems bezeichnet. Des Weiteren verfügen DC über vielfältige Möglichkeiten der Aufnahme von Pathogenen. Sie sind fähig zur Phagozytose, Makropinozytose und Endozy- tose. Die Erkennung pathogener Strukturen führt zur Aktivierung der DC und zu einer verrin- gerten Phagozytoseaktivität. Infolge einer Hochregulation sogenannter Homing-Rezeptoren

2 I. Einleitung Andrea Mahr wie CCR7 kommt es zur Migration der DC in die Lymphknoten. Zudem werden vermehrt MHC-II-Moleküle mit gebundenen Peptiden auf der Oberfläche präsentiert, wodurch im Zusammenhang mit ebenfalls verstärkt exponierten kostimulatorischen Molekülen wie CD80, CD86 und CD40 eine Stimulation spezifischer T-Zellen möglich wird. Die Fähigkeit zur Phagozytose teilen die DC mit Makrophagen, jedoch ist die Expression von MHC-II-Peptid- Komplexen auf DC um ein Vielfaches höher als auf anderen APC. Während in Makrophagen antigene Proteine in Lysosomen meist vollständig degradiert werden, besitzen DC speziali- sierte Vesikel, die sogenannten MHC-II-reichen Kompartimente oder MIICs, in welchen die Antigene nur partiell verdaut und auf MHC-II-Proteine geladen werden (Banchereau & Steinman 1998; Delamarre et al. 2005). Schließlich sind DC in hohem Maße fähig zur sogenannten Kreuzpräsentation (cross presentation) von Peptiden: Sie können aufgenommene Antigene nicht nur über MHC-II, sondern auch über MHC-I präsentieren. Ihre Phago- somen weisen eine geringere Aktivität proteolytischer Enzyme auf als die der Makrophagen, und die Senkung des pH-Werts im Rahmen der Reifung der Phagosomen ist verzögert. Dies erlaubt den Export teilweise verdauter Proteine in das Zytosol, von wo aus sie der Präsenta- tion über MHC-I zugänglich werden. Somit können DC nicht nur mit CD4+, sondern auch mit CD8+ T-Zellen interagieren (Savina & Amigorena 2007). Ob DC T-Zellen aktivieren, hängt unter anderem von der Art der aufgenommenen Anti- gene ab. Zu den beschriebenen Reifungsprozessen mit nachfolgender Aktivierung von CD4+ und CD8+ T-Zellen kommt es, wenn DC körperfremdes oder mit Gefahrensignalen behaftetes Material aufnehmen, etwa Pathogene oder virusbefallene Zellen. Jedoch beobachtet man auch die Phagozytose und Präsentation körpereigenen Materials, etwa in Form apoptotischer Zellen. In diesem Fall wäre eine nachfolgende Aktivierung der adaptiven Immunantwort schädlich, da eine Immunreaktion gegen körpereigenes Gewebe und somit eine Autoimmun- erkrankung die Folge sein könnte. Viele Publikationen zeigen, dass DC in einer solchen Situation das adaptive Immunsystem in entgegengesetzter Weise beeinflussen, und Tole- ranz auslösen (siehe I.5., I.6.). Somit stellen DC das Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar: einerseits als Initiatoren spezifischer Immunantworten, andererseits als Auslöser peripherer Toleranz gegen Selbst-Antigene.

3 I. Einleitung Andrea Mahr

I.2. Pathogen-assoziierte Strukturen werden von Toll-like Rezeptoren erkannt

Während die adaptive Immunantwort gegen individuelle Antigene eines bestimmten Erregers gerichtet ist, detektieren Zellen des angeborenen Immunsystems ein breites Spektrum von Pathogenen. Dies geschieht durch die Erkennung Pathogen-assoziierter molekularer Strukturen (Pathogen-associated molecular patterns oder PAMP) (Medzhitov & Janeway 1997). Beispiele für PAMP sind Moleküle wie Lipopolysaccharid (LPS) oder doppelsträngige RNA, die in vielen Pathogenklassen verbreitet und für das Pathogen essenziell sind, sodass sie trotz des Selektionsdrucks des Immunsystems gegen derartige Strukturen nicht verändert werden können. PAMP werden von sogenannten Pattern Recognition Rezeptoren (PRR) auf der Oberfläche von Zellen des angeborenen Immunsystems erkannt. Einige PRR vermitteln ausschließlich Phagozytose, andere führen durch eine proinflammatorische Signaltransduktion zur Aktivierung der Zielzelle.

I.2.1. Toll-like Rezeptoren Toll-like Rezeptoren (TLR) stellen eine wichtige Klasse von PRR dar. Nachdem der Rezeptor Toll in der Fruchtfliege zunächst als eines der Moleküle identifiziert wurde, die für die dorsoventrale Achsenbildung des Embryos wichtig sind (Anderson et al. 1985a; Anderson et al. 1985b), erkannte man bald auch seine Funktion im Immunsystem der Fliege bei der Abwehr von Pilzinfektionen (Lemaitre et al. 1996). Schließlich zeigte sich für die Toll- homologen Proteine in Vertebraten, die TLR, ebenfalls eine Rolle bei der Immunabwehr. Die Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems über TLR führt bei Vertebraten in einem weiteren Schritt zur Auslösung einer adaptiven Immunantwort (Medzhitov et al. 1997). TLR kommen sowohl auf der Zelloberfläche als auch intrazellulär vor. Zu den Oberflä- chenrezeptoren gehören TLR1, 2, 4 und 6, die Lipide erkennen, sowie TLR5 und 11, deren Liganden Proteine sind. Im Zellinneren findet man TLR3, 7, 8 und 9, die bakterielle oder virale Nukleinsäuren detektieren. Einen Überblick über die TLR mit Beispielen für die jeweiligen Liganden gibt Tabelle I.1. Im Menschen wurden bislang elf, in der Maus 13 TLR beschrieben (Kawai & Akira 2006; Kawai & Akira 2007). Im Menschen ist TLR11 jedoch nicht funktionell (Zhang et al. 2004), in der Maus ist dies vermutlich für TLR8 der Fall (Jurk et al. 2002). Für die Signaltransduktion der TLR ist die Bildung von Homodimeren oder, vor allem im Fall von TLR2, von Heterodimeren notwendig (Kawai & Akira 2006). Verschiedene TLR2- Heterodimere erkennen verschiedene Liganden. Dadurch können z.B. diacylierte Lipopeptide (TLR2/TLR6) von triacylierten Lipopeptiden (TLR2/TLR1) unterschieden werden (Takeuchi et al. 2001; Takeuchi et al. 2002). Es wurden auch endogene Liganden für TLR beschrieben. Meist sind dies Substanzen, die aus nekrotischen oder spätapoptotischen Zellen stammen und somit bei einem normalen Gleichgewicht zwischen Zelltod und Aufnahme apoptotischer Zellen durch Phagozyten nicht 4 I. Einleitung Andrea Mahr freigesetzt werden (Übersicht über endogene Liganden: Marshak-Rothstein 2006; Kono & Rock 2008). In einigen Fällen ist bei der Interpretation dieser Daten jedoch Vorsicht geboten, vor allem im Fall vermeintlicher TLR4-Liganden. Hier besteht die Gefahr einer Kontamination mit dem extrem potenten TLR4-Stimulus LPS, von dem geringste Mengen für eine Aktivie- rung genügen. Für bestimmte Hitzeschockproteine (Hsp60 und Hsp70), die zunächst als endogene TLR4 Liganden beschrieben wurden, wurde gezeigt, dass die gefundene Aktivität von einer solchen Kontamination herrührte (Bausinger et al. 2002; Gao & Tsan 2003). Dagegen bestätigen mehrere Publikationen eine Rolle von endogenem Chromatin als Ligand für TLR9. Dies ist interessant im Zusammenhang mit der Pathogenese systemischer Auto- immunkrankheiten wie dem Systemischem Lupus Erythematosus (SLE): Da TLR9 mit endo- somalen Strukturen assoziiert intrazellulär vorkommt, findet eine Bindung an körpereigenes Chromatin nicht statt. Kommt es jedoch infolge einer unzureichenden Beseitigung apoptotischer Zellen zur Freisetzung von Chromatin-Protein-Komplexen, so können diese von spezifischen B-Zellen aufgenommen werden und intrazellulär an TLR9 binden, wodurch es zur Autoantikörperbildung kommt. In der Folge können sich Immunkomplexe aus Immunglobulin und Chromatin bilden, die über Fc-Rezeptoren in Phagozyten gelangen. Dies ermöglicht wiederum die Bindung des Chromatins an TLR9, und es kommt zur Aktivierung der Zielzelle. Körpereigene DNA könnte somit als „Auto-Adjuvans“ wirken (Boule et al. 2004; Marshak- Rothstein 2006; Baccala et al. 2007). Eine ähnliche Rolle bei der Pathogenese von SLE wurde für endogene snRNAs (small nuclear RNAs) vorgeschlagen. Auch diese werden in Anwesenheit entsprechender Antikörper aus SLE-Seren von Phagozyten aufgenommen, wo sie über TLR7 oder TLR8 stimulatorisch wirken können (Vollmer et al. 2005).

5 I. Einleitung Andrea Mahr

Rezeptor Liganden (Beispiele) Quelle der Liganden Referenzen triacylierte Lipopeptide Bakterien-Zellwand TLR1/TLR2 Synthetisches Analog Takeuchi et al. 2002 Pam3CSK4 triacylierter Lipopeptide diacylierte Lipopeptide wie Bakterien-Zellwand; MALP-2 (macrophage Mykoplasmen activating lipopeptide, 2kDa) Takeuchi et al. 2001 Synthetisches Analog TLR2/TLR6 Pam2CSK4 diacylierter Lipopeptide Peptidoglycan Bakterien-Zellwand Zellwand gram-positiver Takeuchi et al. 1999 Lipoteichonsäure Bakterien Zellwand von Pilzen / TLR2/Dectin-1 Zymosan Gantner et al. 2003 Hefen Doppelsträngige RNA Viren TLR3 Synthetisches Analog Alexopoulou et al. 2001 Poly(I:C) doppelsträngiger RNA Zellwand gram-negativer TLR4 Lipopolysaccharid Poltorak et al. 1998 Bakterien TLR5 Flagellin Bakterielle Flagellen Hayashi et al. 2001 einzelsträngige RNA Viren Diebold et al. 2004; Agrawal & Kandimalla einige siRNAs TLR7; 2004; Sioud 2005 TLR8 Moleküle der Imidazochinolin- Synthetische Moleküle mit Hemmi et al. 2002; Familie wie Imiquimod (R-837) antiviraler Aktivität Jurk et al. 2002 und Resiquimod (R-848) TLR9 Hypomethylierte CpG-DNA Bakterien, Viren Hemmi et al. 2000 TLR10 Ligand unbekannt Hasan et al. 2005 unbekannte Komponente Uropathogene Bakterien Zhang et al. 2004 TLR11 Profilin-ähnliches Protein Toxoplasma gondii Yarovinsky et al. 2005

Tabelle I.1: TLR und Beispiele für ihre Liganden. Grau unterlegt sind TLR, die intrazellulär (an endosomale Strukturen gebunden) vorliegen.

6 I. Einleitung Andrea Mahr

I.2.2. Weitere PRR-Klassen Zu den PRR gehören neben den TLR weitere Rezeptorklassen. Wichtige Vetreter sind C-Typ-Lektin Rezeptoren (CLR), NOD-like Rezeptoren (nucleotide binding oligomerization domain-like receptors, NLR) und RIG-like Rezeptoren (retinoid induced gene-I-like receptors, RLR). CLR sind Zelloberflächenrezeptoren, die pathogenspezifische Kohlenhydrate erkennen und für die Internalisierung von Pathogenen von Bedeutung sind. Hierzu gehören z.B. DC- SIGN, der Makrophagen-Mannoserezeptor (MMR), DEC-205 (Decalektin, 205 kDa) und Dectin-1, ein Rezeptor für β-Glucan (Cambi & Figdor 2003). Die Rezeptoren der NLR-Familie befinden sich intrazellulär. Man unterteilt sie in NOD-Rezeptoren und NALP (NACHT-, LRR- and pyrin domain containing protein)-Rezeptoren. Beispiele sind NOD1 und NOD2, die Bestandteile des Peptidoglycan der bakteriellen Mureinschicht erkennen (Kanneganti et al. 2007). Die RLR sind Rezeptoren mit RNA-Helicase-Domäne (Creagh & O'Neill 2006). Dazu gehören RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) und MDA5 (melanoma differentiation associated antigen 5), die beide virale doppelsträngige RNA erkennen (Meylan & Tschopp 2006; Meylan et al. 2006). Eine weitere Möglichkeit der Erkennung von Pathogenen anhand charakteristischer Strukturen auf ihrer Oberfläche stellen Rezeptoren für Komplement und die Fc-Teile von Antikörpern dar, die durch das Immunsystem „markierte“ Erreger binden.

7 I. Einleitung Andrea Mahr

I.3. TLR-Signaltransduktion führt zur Aktivierung der DC

I.3.1. Initiation der Signaltransduktion durch Adaptormoleküle TLR bilden zusammen mit den Rezeptoren für IL-1 und IL-18 eine Proteinfamilie, deren Mitglieder sich durch eine intrazelluläre TIR- (Toll/IL-1 Rezeptor-) Domäne auszeichnen. Die extrazelluläre Domäne besteht bei den TLR aus Leucin Rich Repeats (Martin & Wesche 2002). Der initiale Schritt der Signaltransduktion ist die Interaktion der TIR-Domäne mit intra- zellulären Adaptormolekülen, die ebenfalls TIR-Domänen aufweisen. Bislang wurden fünf solcher Adaptoren beschrieben. Dies sind MyD88, Mal (auch TIRAP genannt), TRIF (auch als TICAM-1 bezeichnet), TRAM (TICAM-2) und der negative Regulator SARM (O'Neill & Bowie 2007). Eine Übersicht gibt Tabelle I.2.

Adaptor Bezeichnung Referenzen Medzhitov et al. 1998; MyD88 Myeloid differentiation primary response gene 88 Kawai et al. 1999 MyD88 adaptor like / Horng et al. 2001; Mal / TIRAP TIR domain containing adaptor protein Fitzgerald et al. 2001 Yamamoto et al. 2002b; TIR domain containing adaptor protein inducing IFNβ / TRIF / TICAM1 Hoebe et al. 2003; TIR domain containing adaptor molecule 1 Oshiumi et al. 2003 TRIF related adaptor molecule / Fitzgerald et al. 2003; TRAM / TICAM2 TIR domain containing adaptor molecule 2 Yamamoto et al. 2003; SARM Sterile α- and armadillo-motif-containing protein Carty et al. 2006

Tabelle I.2 : Adaptormoleküle der TLR

Die verschiedenen TLR unterscheiden sich in der Verwendung der Adaptormoleküle. TLR4 bindet alle vier bekannten aktivierenden Adaptoren: MyD88, das die gleichzeitige Bin- dung von Mal erfordert (Yamamoto et al. 2002a), sowie TRIF, das gemeinsam mit TRAM rekrutiert werden muss (Fitzgerald et al. 2003). Dadurch werden bei TLR4 als einzigem TLR sowohl ein MyD88-abhängiger als auch ein MyD88-unabhängiger (TRIF-abhängiger) Signaltransduktionsweg aktiviert. Die meisten anderen TLR führen nur zu MyD88-abhängiger Signaltransduktion, wobei der Ko-Adaptor Mal nicht in allen Fällen erforderlich ist. Benötigt wird er außer bei TLR4 auch bei TLR2, der wie erwähnt Heterodimere mit TLR1 oder TLR6 bilden kann, nicht aber bei den intrazellulären TLR. TLR3 ist als einziger TLR ausschließlich TRIF-abhängig (O'Neill & Bowie 2007). Die Funktion des Adaptors SARM besteht in der negativen Regulation des TRIF-abhängigen Signalwegs von TLR3 und TLR4 durch direkte Bin- dung an TRIF (Carty et al. 2006). 8 I. Einleitung Andrea Mahr

Die Verwendung unterschiedlicher Adaptormoleküle sowie Abweichungen in der nachfolgenden Signaltransduktion der verschiedenen TLR ermöglichen eine auf das aktivierende Pathogen abgestimmte Reaktion der Zelle. Eine weitere Feinabstimmung ermöglichen Wechselwirkungen und Synergismen der verschiedenen Signale bei gleichzeitiger Aktivie- rung mehrerer TLR (Trinchieri & Sher 2007).

I.3.2. Signaltransduktion von TLR4 Die TLR-abhängige Signaltransduktion wurde in zahlreichen Publikationen zusammenfassend dargestellt (Takeda & Akira 2005; Kawai & Akira 2007; Watts et al. 2007). Aktivie- rung von TLR hat drei wesentliche Folgen: Zum einen die Produktion und Sekretion proinflammatorischer Zytokine, zum anderen die Präsentation kostimulatorischer Moleküle auf der Zelloberfläche, und bei vielen TLR auch die Sekretion von Typ I IFN. Die Signaltrans- duktion von TLR4 ist vereinfacht in Abbildung I.1 dargestellt.

I.3.2.1. MyD88-abhängiger Weg MyD88-abhängig wird im Signaltransduktionsweg von TLR4 zunächst IRAK4 (Interleukin- Rezeptor assoziierte Kinase 4) rekrutiert. Die Bindung von IRAK4 an MyD88 erfolgt durch eine homologe Wechselwirkung zwischen den Todesdomänen der beiden Moleküle. Darauf- hin bindet IRAK1 und wird phosphoryliert. Die Phosphorylierung bewirkt eine Dissoziation vom Rezeptor und ermöglicht die Wechselwirkung mit einem Signalkomplex, zu dem TRAF6 (TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 6) gehört. TRAF6 fungiert als E3 Ubiquitin-Ligase, die sich selbst, in Kooperation mit dem als E2-Ligase wirkenden Komplex aus Ubc13 und Uev1A, mit einer K63-verknüpften Poly-Ubiquitin-Kette versieht. Diese Poly-Ubiquitinierung bewirkt eine Bindung an TAK1 (TGFβ-aktiverte Kinase 1), zusammen mit den TAK1 bindenden Proteinen TAB1 und TAB2 (Wang et al. 2001a; Kawai & Akira 2007). Gebundenes TAK1 wird durch Auto-Phosphorylierung aktiviert (Kishimoto et al. 2000). TAK1 kann zum einen als MAPKKK (Mitogen-aktivierte Protein Kinase Kinase Kinase) fungieren, zum anderen kann es auch den IKK (IκB-Kinase)-Komplex aktivieren (Wang et al. 2001a). Somit werden entweder auf diesem direkten Weg, oder über Phosphorylierung weiterer Mediatoren durch TAK1, sowohl der MAP Kinase- als auch der NF-κB Signaltransduktionsweg aktiviert. Am Ende der MAP-Ki- nase-Kaskade steht die Phosphorylierung der MAP-Kinasen p38, JNK und Erk, die ihrerseits Transkriptionsfaktoren wie AP-1 durch Phosphorylierung aktivieren. Zudem wirkt vor allem p38 auch an der posttranskriptionalen Stabilisierung der mRNAs proinflammatorischer Zyto- kine wie TNF mit (Brook et al. 2000). Für die Aktivierung von NF-κB wird zunächst IKKβ durch TAK1 phosphoryliert und durch TRAF6 ubiquitiniert (Yamamoto et al. 2006; Adhikari et al. 2007). Durch die Aktivität des IKK-Komplexes werden an NF-κB gebundene inhibitorische Moleküle (IκB) phosphoryliert, die im unstimulierten Zustand die nukleäre Translokation und/oder die DNA-Bindung von NF-κB verhindern. Infolge der Phosphorylierung dissoziieren

9 I. Einleitung Andrea Mahr diese Inhibitoren ab, werden ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, sodass NF-κB-abhän- gige Transkription möglich wird. Zusätzlich wird die NF-κB-Aktivität durch weitere Modifikationen wie Phosphorylierung, Ubiquitinierung und Acetylierung gesteuert (Perkins 2006). Der MyD88-abhängige Weg führt somit zu einer Transkription AP-1- und NF-κB- abhängiger Gene. Hierzu gehören die proinflammatorischen Zytokine TNF, IL-1, IL-6 und viele andere. Diese Darstellung ist aus Gründen der Übersichtlichkeit sowie aufgrund teilweise unsi- cherer oder kontroverser Daten vereinfacht. Beispielsweise sind in dem TRAF6 enthaltenden Signalkomplex noch weitere Moleküle vertreten, wie z.B. ECSIT (evolutionary conserved signalling intermediate in TLR signalling), das MEKK1 aktivieren kann, oder p62, das die atypische Proteinkinase PKCζ bindet (Martin & Wesche 2002). Zudem werden die MAP- Kinasen vermutlich differenziell über verschiedene Wege reguliert. Neben TAK1 sind hierbei weitere MAPKKKs beteiligt. So wurde gezeigt, dass eine von der MAPKKK Tpl2 abhängige Erk-Aktivierung für die posttranskriptionale Regulation von TNF verantwortlich ist (Dumitru et al. 2000). Die MAPKKK Ask-1 wird ebenfalls durch TRAF6 aktiviert. Dieser Prozess hängt zusätzlich von der Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies ab (Matsuzawa et al. 2005). Die Bedeutung des MyD88-abhängigen Wegs zeigt sich bei MyD88-defizienten Mäusen (Adachi et al. 1998; Kawai et al. 1999): Diese können im Gegensatz zum Wildtyp nach LPS- Stimulation bestimmte Zytokine wie TNF, IL-1β und IL-6 nicht produzieren und sind weniger anfällig gegenüber einem Endotoxin-Schock (Kawai et al. 1999). Andere Zytokine werden jedoch auch in Abwesenheit von MyD88 sezerniert. Dabei handelt es sich um Typ I IFN sowie IFN-abhängige Gene wie IP-10, RANTES und MCP-1 (Kawai et al. 2001; Doyle et al. 2002; Serbina et al. 2003). Außerdem kommt es wie beim Wildtyp zur Expression kostimulatorischer Moleküle auf der Zelloberfläche (Kaisho et al. 2001). Diese MyD88- unabhängigen Effekte hängen zusammen, denn Typ I IFN induzieren über einen autokrinen Mechanismus die Sekretion IFN-abhängiger Gene und sind auch wesentlich verantwortlich für die Oberflächenexpression von CD40, CD80 und CD86 (Montoya et al. 2002; Hoebe et al. 2003). MyD88-defiziente Mäuse weisen zudem noch immer eine LPS-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB auf, die jedoch im Vergleich zum Wildtyp zeitlich verzögert eintritt (Kaisho et al. 2001; Kawai et al. 2001). Diese Beobachtungen an MyD88- defizienten Mäusen ließen auf die Existenz des MyD88-unabhängigen Signalwegs schließen.

10 I. Einleitung Andrea Mahr

Abb.I.1. Signaltransduktion von TLR4. LPS bindet an den TLR4-Rezeptorkomplex, der auch MD2 und CD14 enthält (Jiang et al. 2005; nicht gezeigt). Es folgt eine Aktivierung zweier Signalwege, von denen einer durch die Bindung der Adaptoren MyD88 und Mal eingeleitet wird, der andere über die Adaptoren TRIF und TRAM. Die Signaltransduktion führt zur Aktivierung von NF-κB und weiterer Transkriptionsfaktoren und somit zur Expression von proinflammatorischen Zytokinen, Chemokinen sowie Typ I IFN. Die Induktion von Typ I IFN hängt zusätzlich von IRF3 ab, das über den TRIF-Signalweg aktiviert wird. Typ I IFN wirken autokrin durch JAK-STAT-abhängige Signaltransduktion über den IFNα/β-Rezeptor (IFNAR) und spielen eine Rolle bei der Induktion IFN-abhängiger Gene sowie bei der Oberflächenexpression von Aktivierungsmarkern (nicht gezeigt). Weitere Erläuterungen siehe Text.

I.3.2.2. MyD88-unabhängiger Weg Der MyD88-unabhängige Signalweg wird durch die Bindung des Adaptors TRIF an TLR4 eingeleitet. TRIF-abhängige Signalwege sind verantwortlich für alle im Falle einer MyD88- Defizienz noch beobachteten zellulären Reaktionen, denn in MyD88/TRIF doppelt- defizienten Mäusen ist keine Reaktion auf LPS mehr nachweisbar (Yamamoto et al. 2003; Hoebe et al. 2003). Die – zeitlich verzögerte – Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen erfolgt durch die Bindung von RIP1 (Rezeptor-interagierendes Protein 1) an TRIF. Daraufhin wird der TRAF6 und TAK1 enthaltende Komplex rekrutiert (Cusson-Hermance et al. 2005), der auch im MyD88-abhängigen Weg zur Aktivierung dieser Signalwege führt. Der moleku- lare Mechanismus der NF-κB-Aktivierung ist noch nicht vollständig aufgeklärt und zelltypab- hängig unterschiedlich. Neuere Erkenntnisse zeigen eine Rolle von TRADD (TNF-receptor 1 associated via death domain) im TRIF-abhängigen Signalweg auf, denn Bindung von TRADD an RIP1 ist essenziell für dessen Ubiquitinierung, vermutlich durch Rekrutierung von TRAF-Molekülen, analog zu seiner Funktion in der durch TNF-Rezeptor 1 vermittelten

11 I. Einleitung Andrea Mahr

Signaltransduktion (Chen et al. 2008; Ermolaeva et al. 2008; Pobezinskaya et al. 2008). Es wurde auch postuliert, dass TRIF direkt mit TRAF6 interagiert (Sato et al. 2003). Andere Publikationen zeigen jedoch, dass zumindest in murinen Makrophagen TRAF6 für die TRIF- abhängige NF-κB Aktivierung nicht notwendig ist (Gohda et al. 2004). Neben der Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB kommt es im TRIF-abhängigen Weg zusätzlich zur Aktivierung des IFN-regulierenden Faktor 3 (IRF3), indem TRAF3 sowie die als nichtkanonische IKKs bekannten Moleküle Tank bindende Kinase 1 (TBK1) und IKKi rekrutiert werden. Diese phosphorylieren direkt IRF3, welches infolgedessen dimerisiert und in den Zellkern gelangt. IRFs sind, neben anderen Transkriptionsfaktoren wie AP-1 und NF-κB, essenziell für die Induktion von Typ I IFN und IFN-abhängigen Genen (Hacker et al. 2006; Oganesyan et al. 2006). Daraus erklärt sich die Abhängigkeit dieser Gruppe von Genen vom TRIF-Signalweg. In TRIF-defizienten Mäusen ist eine LPS-induzierte Expression von IFN und IFN-abhän- gigen Genen nahezu nicht mehr möglich (Yamamoto et al. 2003). Das Gleiche gilt für die Oberflächenexpression kostimulatorischer Moleküle (Hoebe et al. 2003). Interessant ist, dass als MyD88-abhängig bezeichnete Zytokine wie TNF, IL-1 und IL-6 ebenfalls nicht mehr induzierbar sind (Yamamoto et al. 2003). Dies lässt darauf schließen, dass es keine Dichotomie zwischen MyD88- und TRIF-abhängigen Genen gibt, sondern dass MyD88 für die TRIF- abhängigen Gene abkömmlich ist, der TRIF-Signalweg jedoch für beide Gruppen essenziell ist.

I.3.3. Signaltransduktion anderer TLR Andere TLR unterscheiden sich von TLR4 sowohl in der Verwendung der Adaptormole- küle als auch in der nachfolgenden Signaltransduktion. Ein wesentlicher Unterschied zeigt sich z.B. in der Regulation von IFN und IFN-abhängigen Genen. Diese ist zwar im Fall einer Stimulation mit LPS von TRIF und der Aktivierung von IRF3 abhängig, jedoch kommt es bei TLR7, 8 und 9, die nur an MyD88 binden, ebenfalls zur Sekretion von Typ I IFN. Verantwort- lich ist in diesem Fall eine MyD88-abhängige Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF7 (Uematsu & Akira 2007). Dies spielt eine Rolle bei plasmazytoiden DC, die von allen Immun- zellen die höchste TLR7- und TLR9-Expression aufweisen und die hauptsächlichen Produ- zenten von Typ I IFN darstellen (Colonna et al. 2004).

12 I. Einleitung Andrea Mahr

I.4. Die TLR-Signaltransduktion wird auf mehreren Ebenen negativ reguliert

Um überschießende Immunreaktionen und Autoimmunität zu vermeiden, wird die TLR- Signaltransduktion durch verschiedene Mechanismen negativ reguliert (Übersicht in Liew et al. 2005; Abb. I.2.). Viele der bekannten Regulationsmechanismen werden als direkte Folge der TLR-Stimulation im Sinne einer negativen Rückkoppelung aktiviert. Die Regulation erfolgt auf verschiedenen Stufen, in vielen Fällen rezeptornah.

I.4.1. Regulation durch extrazelluläre oder membranständige Moleküle oder durch verminderte Expression der Signalmoleküle Extrazellulär treten lösliche TLR auf, die die Signaltransduktion der zellmembranständi- gen Rezeptoren inhibieren. Ein Beispiel ist löslicher TLR4 (soluble TLR4, sTLR4), der mögli- cherweise mit den Korezeptoren CD14 und MD2 wechselwirkt, und so deren Bindung an TLR4 verhindert (Iwami et al. 2000). Des Weiteren wird die Expression der TLR sowie der Adaptoren reguliert. Die E3 Ubiquitin-Ligase TRIAD3A führt z.B. zum proteasomalen Abbau von TLR4 und TLR9 (Chuang & Ulevitch 2004). TGFβ supprimiert die LPS-Signaltransduk- tion, indem es die Expression von TLR4 hemmt (McCartney-Francis et al. 2004) und den proteasomalen Abbau von MyD88 einleitet (Naiki et al. 2005). Ebenfalls auf der Stufe des Rezeptors oder der Adaptormoleküle greifen verschiedene Transmembranrezeptoren inhibi- torisch in die Signaltransduktion ein. Dazu gehören IL-1 receptor like-1 (IL1RL1, auch ST2L) (Brint et al. 2004) und single immunoglobulin IL-1 receptor related (SIGGIR) (Wald et al. 2003), die wie TLR zur Familie der Rezeptoren mit TIR-Domäne gehören und daher mit den TIR-Domänen des Rezeptors oder der Adaptoren wechselwirken können. Schließlich bewirkt auch der Transmembranrezeptor triggering receptor expressed on myeloid cells-2 (TREM-2), dessen Ligand noch unbekannt ist, eine Hemmung der TLR-induzierten Zytokinsekretion, wobei der genaue Angriffspunkt im TLR-Signalweg noch ungeklärt ist (Sharif & Knapp 2008).

I.4.2. Intrazelluläre Inhibitoren einzelner Signalmoleküle Auch intrazellulär sind viele negative Regulatoren der TLR-Signaltransduktion bekannt. Zuerst entdeckt wurde Tollip (Toll interagierendes Protein), das direkt an TLR bindet (Bulut et al. 2001; Zhang & Ghosh 2002). Eine verkürzte Spleiß-Variante von MyD88, MyD88s, bindet MyD88 und inhibiert die Rekrutierung von IRAK-4 (Janssens et al. 2003 ; Burns et al. 2003). Ebenfalls auf der Stufe der IRAKs wirkt IRAK-M, das auch bei der Entstehung von Endotoxin- Toleranz (siehe I.4.5.) eine Rolle spielt (Kobayashi et al. 2007). Eine selektive Hemmung des TRIF-Signalwegs erfolgt durch die Src-homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2 (SHP-2), die an TBK1 bindet (An et al. 2006). Die Proteinphosphatase Calci- neurin, die bei der T-Zell-Rezeptor Signaltransduktion eine aktivierende Rolle spielt, hemmt die Signaltransduktion von TLR2 und TLR4 durch Bindung an den Rezeptor oder die Adapto-

13 I. Einleitung Andrea Mahr ren MyD88 oder TRIF (Kang et al. 2007). Das Zinkfinger-Protein A20 inhibiert TLR-Signal- wege durch Deubiquitinierung von TRAF6 (Boone et al. 2004). Da TRAF6 sowohl im MyD88- abhängigen als auch im TRIF-abhängigen Weg eine Rolle spielt, können so beide Wege zugleich beeinflusst werden. Auch eine Regulation in rezeptorferneren Abschnitten des Sig- nalwegs ist denkbar. Die MAP-Kinase Signalwege werden z.B. durch verschiedene Phosphatasen reguliert (Übersicht in Liu et al. 2007).

I.4.3. Inhibitoren mit mehreren Angriffspunkten Einige inhibitorische Mechanismen greifen an mehreren Stellen der TLR-Signalwege zugleich ein. Ein Beispiel ist die durch Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) induzierte Signaltransduktion (Fukao & Koyasu 2003). Diese hemmt zum einen die LPS-induzierte Aktivität von MAP-Kinasen wie p38 (Fukao et al. 2002), zum anderen wird die NF-κB-abhän- gige Transkription blockiert. Die Inhibition betrifft sowohl den MyD88-abhängigen als auch den TRIF-abhängigen Weg. Diese Beobachtungen könnten zum Teil auf eine direkte Bin- dung von PI3K an TRIF zurückzuführen sein (Aksoy et al. 2005). Zudem führt PI3K über eine Aktivierung von Proteinkinase B (PKB oder Akt) zu einer Inhibition von Glycogen Synthase Kinase 3β (GSK3β). Dadurch wird die hemmende Wirkung von GSK3β auf den Transkrip- tionsfaktor CREB (cAMP Responsive Element Binding Protein) aufgehoben. Aktives CREB kann nun mit NF-κB um den Ko-Transkriptionsfaktor CBP (CREB-bindendes Protein) kompe- titieren (Martin et al. 2005). Eine weitere Möglichkeit der umfassenden Inhibition der TLR-Signalwege ist die Aktivie- rung des Transkriptionsfaktors STAT3, z.B. durch IL-10 oder Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). STAT3 induziert ein antiinflammatorisches Genexpressionsprogramm (Murray 2005), das zu einem tolerogenen Phänotyp der DC führt. Dies spielt z.B. bei der Immunevasion von Tumoren eine Rolle, da in Tumor-infiltrierenden DC häufig STAT3 aktiviert ist (Yu et al. 2007). Aktivierung STAT3-abhängiger Transkription ist möglicherweise ein entscheidendes Kriterium für eine tolerogene Funktion von APC (Cheng et al. 2003). Mitglieder der Familie der Suppressors of Cytokine Signalling (SOCS) spielen ebenfals eine inhibitorische Rolle. SOCS1 hemmt die Signaltransduktion von TLR4 (Nakagawa et al. 2002; Kinjyo et al. 2002) und anderen TLR an mehreren Stellen. Zum einen inhibiert es die STAT1-Signaltransduktion, die nach TLR-Stimulation sekundär infolge der Sekretion von Typ I IFN ausgelöst wird (Baetz et al. 2004), zum anderen führt es zur Degradation des Adaptors Mal und hemmt somit die Signaltransduktion von TLR2 und TLR4 (Mansell et al. 2006). Expression von SOCS2 kann zur proteasomalen Degradation von TRAF6 führen (Machado et al. 2008). SOCS3 hemmt die Ubiquitinierung von TRAF6 (Frobose et al. 2006). Jedoch hat es auch aktivierende Effekte, vor allem durch die Inhibition des antiinflammatorischen Transkriptionsfaktors STAT3. SOCS3 ist daher nicht rein antiinflammatorisch, sondern scheint DC in Richtung TH2-induzierender Aktivität zu modulieren (Yoshimura et al. 2007).

14 I. Einleitung Andrea Mahr

Schließlich gibt es Berichte, dass auch die Aktivierung des Transkriptionsfaktors PPARγ antiinflammatorisch wirkt. Hierbei wurde eine Inhibition von MAP-Kinasen wie auch von

NF-κB gezeigt (Appel et al. 2005).

Abb. I.2.: Negative Regulation der TLR-Signaltransduktion. Negative Regulatoren der TLR-Signalwege greifen an unterschiedlichen Stellen an. Dadurch kann es sowohl zu einer selektiven Inhibition des MyD88-abhängigen (gelb) als auch des TRIF-abhängigen (blau) Signalwegs kommen. Ein Effekt auf beide Arme der TLR-Signaltransduktion wird beobachtet, wenn die Hemmung direkt am Rezeptor erfolgt oder ein Signalmolekül betrifft, das sowohl MyD88- als auch TRIF-abhängig aktiviert wird (grün). Einige inhibitorische Mechanismen haben viele Angriffspunkte und führen daher ebenso zu einer Hemmung beider Signalwege (orange). Weitere Erläuterungen siehe Text.

I.4.4. TLR-induzierte Apoptose

TLR-Stimulation kann in verschiedenen Zelltypen zu Zelltod führen (Choi et al. 1998; Aliprantis et al. 1999), vor allem wenn die NF-κB Aktivität inhibiert ist (Kitamura 1999). Offen- sichtlich können TLR-abhängig sowohl proinflammatorische und überlebensfördernde NF-κB- Signalwege als auch Apoptose induziert werden, ähnlich wie es für den TNF-Rezeptor bekannt ist (Wajant et al. 2003). Sowohl MyD88- als auch TRIF-abhängig kann Zelltod ausgelöst werden (Übersicht in Salaun et al. 2007). MyD88 hat eine Todesdomäne, über die IRAK4 rekrutiert wird (siehe I.3.2.). Diese Todesdomäne kann jedoch auch an das Protein FAS-associated via death domain (FADD) binden, woraufhin Caspase-8 rekrutiert und aktiviert wird (Aliprantis et al. 1999; Aliprantis et al. 2000). Die TRIF-abhängige Apoptose wird von einem RIP-Bindemotiv in TRIF vermittelt (Kaiser & Offermann 2005).

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I.4.5. Endotoxin-Toleranz Einige der genannten negativen Regulatoren spielen eine Rolle bei der sogenannten En- dotoxin-Toleranz, einem Zustand der vorübergehenden Nicht-Reaktivität gegenüber weiterer Stimulation nach vorhergehender Aktivierung durch TLR-Liganden. (West & Heagy 2002; Fan & Cook 2004). In vivo spielt dieser Effekt eine Rolle bei der Eindämmung von Immun- reaktionen und senkt z.B. die Lethalität bei Sepsis. Man unterscheidet eine frühe Phase, die sich in Änderungen der Signaltransduktion in Immunzellen manifestiert, und eine späte Phase, die durch gegen LPS gerichtete Antikörper vermittelt wird. In vitro kann man Endoto- xin-Toleranz z.B. bei aus Sepsis-Patienten gewonnenen monozytischen Zellen beobachten, oder bei Makrophagen, die für drei bis 24 Stunden einem schwachen Endotoxin-Stimulus ausgesetzt waren (West & Heagy 2002). Außer LPS können auch andere TLR-Liganden eine solche Toleranz induzieren, und dabei in manchen Fällen auch die Stimulierbarkeit durch nicht verwandte TLR-Stimuli beeinflussen, im Sinne einer „cross tolerance“ (Sato et al. 2002; Dalpke et al. 2005). In der Forschung birgt das Phänomen der Endotoxin-Toleranz die Gefahr von Artefakten, die z.B. durch Kontaminationen mit dem potenten TLR4-Stimulus LPS in aufgereinigten rekombinanten Proteinen entstehen. Die Entstehung von Endotoxin-Toleranz auf zellulärer Ebene beinhaltet mehrere Mecha- nismen. Zum einen gibt es Hinweise auf eine Herunterregulation von TLR (Nomura et al. 2000). Daneben spielt die Induktion oder Aktivierung intrazellulärer negativer Regulatoren eine Rolle, die zum Teil durch die autokrine Wirkung LPS-induzierter und sezernierter lösli- cher Substanzen vermittelt wird. Beispiele sind die transforming growth factor β (TGFβ)-ab- hängige Hochregulation der Src homology 2 containing inositol 5’ phosphatase (SHIP) (Sly et al. 2004) und die zum Teil TNF-abhängige Induktion von IRAK-M (van 't Veer et al. 2007). Zudem führt LPS direkt sowie indirekt über die Sekretion von Typ I IFN und nachfolgende Aktivierung von STAT1 zur Expression von SOCS1 (Kinjyo et al. 2002; Nakagawa et al. 2002), das zur negativen Rückkoppelung der Signaltransduktion beiträgt. Die Vielzahl der beteiligten Moleküle weist auf einen komplexen Mechanismus hin, der an mehreren unabhängigen Stellen inhibierend wirkt. Zum Teil erfolgt die Hemmung rezeptornah. So wurde gezeigt, dass die Rekrutierung von MyD88 an den Rezeptor und die IRAK1- Phosphorylierung vermindert ist (Medvedev et al. 2002). Aber auch rezeptorferne Schritte sind betroffen, etwa die Aktivierung von MAP-Kinasen, die durch Phosphatasen wie MAP- Kinase-Phosphatase 1 (MKP-1) reguliert wird (Nimah et al. 2005). Der Effekt betrifft sowohl die Aktivierung der MAP-Kinasen, als auch die durch NF-κB und IRF3 vermittelte Signaltransduktion, und erstreckt sich auf den MyD88- und auf den TRIF-abhängigen Sig- nalweg (Sato et al. 2002). Die Transkription fast aller LPS-induzierten MyD88- und TRIF- abhängigen proinflammatorischen Zytokine ist bei Endotoxin-Toleranz vermindert (Mages et al. 2007). Einige der antiinflammatorischen LPS-induzierten Gene sind jedoch nicht inhibiert

16 I. Einleitung Andrea Mahr oder sogar verstärkt exprimiert, wie etwa der lösliche IL-1-Rezeptor-Antagonist (Learn et al. 2000).

I.5. DC können Immuntoleranz vermitteln

I.5.1. Mechanismen der T-Zell-Toleranz Das Repertoire der T-Zell-Rezeptoren gewährleistet Reaktivität gegen eine große Vielfalt von Pathogenen, da es durch somatische Rekombination der Gene für die Ketten des T-Zell- Rezeptors entsteht. Da es bei diesem zufälligen Ereignis auch zur Ausbildung autoreaktiver T-Zell-Rezeptoren kommt, muss es Mechanismen geben, die die Entstehung oder die Akti- vierung autoreaktiver T-Zellen verhindern. Diese werden als zentrale und periphere Toleranz klassifiziert (Abb. I.3.). Als zentrale Toleranz bezeichnet man die Elimination autoreaktiver T-Zellen bei ihrer Reifung im Thymus im Rahmen der sogenannten negativen Selektion. Die Selbst-Antigene werden hierbei von Epithelzellen der thymischen Medulla (medullar thymic epithelial cells oder mTEC) oder von DC präsentiert. Die thymische Expression von Antigenen, die ansonsten nur in bestimmten Organen oder Entwicklungsstadien auftreten, ist dabei zum Großteil durch die Aktivität des Transkriptionsfaktors AIRE (autoimmune regulator) bedingt (Kyewski & Klein 2006). Bei starker Bindung an diese Antigene werden die entsprechenden Thymozyten deletiert. Da die zentrale Toleranz jedoch nicht alle Antigene abdeckt, muss es auch in der Peripherie die Möglichkeit geben, autoreaktive T-Zellen unschädlich zu machen. Ein möglicher Mechanismus der peripheren Toleranz ist erstens die sogenannte Igno- ranz. Dazu kommt es, wenn etwa die T-Zellen ihr Antigen unter normalen Umständen nicht antreffen, z.B. infolge fehlender Prozessierung und Präsentation oder aufgrund der Lokalisa- tion des Antigens. Zweitens können autoreaktive T-Zellen durch Induktion von Apoptose deletiert werden. Dies geschieht z.B. in bestimmten „immunprivilegierten“ Körperteilen wie der vorderen Augenkammer, dem Gehirn oder den Hoden. Zusätzlich sorgen hier Zytokine wie TGFβ oder IL-10 zu einer Hemmung der T-Zell-Aktiverung. Drittens kann in den autoreaktiven T-Zellen Anergie induziert werden, ein Zustand der Nicht-Reaktivität gegen- über Antigenen. Viertens können regulatorische T-Zellen die Aktivität autoreaktiver T-Zellen hemmen (Male 2006). Die als „natürliche“ regulatorische T-Zellen (nTreg) bezeichneten CD4+CD25+ T-Zellen, deren regulatorische Eigenschaften von der Aktivität des Transkriptionsfaktors FoxP3 abhängen, entstehen im Rahmen der zentralen Toleranz im Thymus, sowie in der Peripherie unter dem Einfluss von TGFβ (Kretschmer et al. 2005). Im Immunsystem des Darmes entstehen FoxP3+ Treg unter dem Einfluss CD103+ DC, wobei ebenfalls TGFβ sowie Retinsäure eine Rolle spielen (Coombes et al. 2007). Während diese FoxP3+ Treg andere T-Zellen zellkontaktabhängig hemmen, gibt es weitere Typen regulatorischer Zellen, die über die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine (IL-10 bzw. TGFβ) wir- 17 I. Einleitung Andrea Mahr

ken, die sogenannten Tr1- sowie TH3-Zellen. Diese entstehen in der Peripherie aus naiven CD4+ T-Zellen, z.B. unter dem Einfluss tolerogener DC in der Lunge (Akbari et al. 2001; Jonuleit & Schmitt 2003). Daneben gibt es noch weitere, darunter CD8+ (Hoglund 2006) und doppelt negative regulatorische T-Zellen (Thomson et al. 2006).

Abb. I.3.: Mechanismen der zentralen und peripheren Toleranz und Rolle der DC. Zentrale Toleranz wird im Thymus induziert. Dort präsentieren mTEC und DC den sich entwickelnden T-Zellen (TC) Selbst-Peptide auf MHC-Molekülen und führen zur negativen Selektion hochaffiner autoreaktiver Thymozyten. Zudem kommt es im Thymus zur Entstehung von nTreg. Da einige potenziell autoreaktive T-Zellen dennoch in die Peripherie gelangen, müssen sie dort durch Mechanismen der peripheren Toleranz unter Kontrolle gehalten werden. Dazu zählen Ignoranz, Deletion, Anergie und Hemmung durch Treg. DC übernehmen eine wichtige Funktion bei der Etablierung peripherer Toleranz. Unter bestimmten Bedingungen, etwa unter dem Einfluss von IL-10, TGFβ oder von antiinflammatorischen Signalen auf der Oberfläche apoptotischer Zellen, bilden sie einen tolerogenen Phänotyp aus und führen zu peripherer T-Zell-Toleranz. Es wurde auch beobachtet, dass DC Antigene aus der Peripherie in den Thymus transportieren, wo sie zur zentralen Toleranz beitragen (Bonasio et al. 2006; nicht gezeigt). Neben ihrer Funktion in der Induktion von Toleranz (links, blau) vermitteln DC auch die Auslösung von Immunantworten (rechts, orange). Nach Antigenaufnahme in Anwesenheit von Gefahrensignalen reifen sie und können spezifische T-Zellen aktivieren. Dies macht DC zur zentralen Instanz bei der Entscheidung über Tolerierung oder Abwehr von Antigenen. Weitere Erläuterungen siehe Text.

18 I. Einleitung Andrea Mahr

I.5.2. Entstehung immunogener und tolerogener DC in vivo DC spielen eine wichtige Rolle bei der Auslösung peripherer Toleranz. Ob DC immuno- gen oder regulatorisch bzw. tolerogen sind, hängt von ihrem Reifungsstatus ab, und dieser wiederum von dem Milieu, dem die DC ausgesetzt waren. Gefahrensignale wie etwa TLR-Liganden führen zu einer vollständigen Reifung der DC. Reife DC aktivieren T-Zellen durch Präsentation des Antigens über MHC (Signal 1) bei gleichzeitiger Expression kostimulatorischer Moleküle wie CD80, CD86 und CD40 (Signal 2) und Sekretion von Zytokinen (Signal 3) (Lutz & Schuler 2002). DC werden hingegen tolerogen, wenn sie Antigene aufnehmen, ohne Gefahrensignalen ausgesetzt zu sein. Welche Art von Toleranz diese DC auslösen, hängt dabei von der Art der Antigenaufnahme und der Umgebung ab, denn je nach gewähltem System ergaben sich unterschiedliche Ergebnisse. Wurde das Antigen in vivo im steady state in DC eingebracht, entweder als Fusionsprotein mit einem Antikörper gegen den DC-spezifischen Phagozytose- rezeptor DEC-205 (Hawiger et al. 2001; Bonifaz et al. 2002) oder nach Integration in apoptotische Zellen (Liu et al. 2002a), kam es nach initialer Proliferation antigenspezifischer T-Zel- len zu deren Deletion durch Apoptose. Andere Publikationen weisen darauf hin, dass auch andere Formen der T-Zell-Toleranz denkbar sind. In in vitro –Experimenten konnte z.B. durch unreife DC eine Form von regulatorischen T-Zellen (Tr1 Zellen) generiert werden (Jonuleit et al. 2000). Auch in vivo-Experimente in Mäusen (Menges et al. 2002) und sogar in Menschen (Dhodapkar et al. 2001 ; Dhodapkar & Steinman 2002) demonstrierten die Induktion IL-10 produzierender T-Zellen durch unreife bzw. semireife (siehe I.5.3.) DC. Der wesentliche Un- terschied zwischen diesen Gruppen von Experimenten besteht darin, dass in den zuletzt genannten Studien die DC nicht in vivo sondern außerhalb des Körpers mit Antigen beladen wurden (Steinman et al. 2003). In vivo ist das wahrscheinlichste Szenario einer Entstehung tolerogener DC durch Anti- genaufnahme im steady state die Phagozytose apoptotischer Zellen (siehe I.6.2). Zusätzlich kann das Mikromilieu am Ort der Antigenaufnahme die DC beeinflussen. Tumorzellen geben beispielsweise Mediatoren wie IL-10, VEGF und TGFβ ab, die eine antiinflammatorische Wirkung auf DC haben (Igney & Krammer 2002). Jiang et al. (2007) beschreiben einen möglichen Mechanismus, nach dem geweberesidente DC (z.B. Langerhans Zellen der Haut) auch im steady state die Fähigkeit zur Migration erlangen und tolerogene Eigenschaften erhalten können. Als residente Zellen wechselwirken DC über das Adhäsionsmolekül E-Cadherin mit den umliegenden Zellen, z.B. Keratinozyten, sowie mit anderen DC. Die Cluster-Bildung unreifer DC in vitro beruht ebenfalls auf solchen Wechselwirkungen. Zerstö- rung dieser Wechselwirkung führt zur Oberflächenexpression des Chemokinrezeptors CCR7, der für die Migration zum Lymphknoten erforderlich ist. Dies geht einher mit einer nur geringen Präsentation kostimulatorischer Moleküle und fehlender Sekretion proinflammatorischer

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Zytokine. Zumindest teilweise beruhen diese Effekte auf β-Catenin-abhängiger Signaltransduktion. Injektion dieser DC in Mäuse induzierte die Bildung IL-10-produzierender regulatorischer T-Zellen und konnte die Ausbildung von Experimenteller Autoimmuner Encephalomyelitis (EAE) verhindern (Jiang et al. 2007).

I.5.3. Charakteristika tolerogener DC Man nahm zunächst an, dass tolerogene DC einen unreifen Phänotyp haben (Jonuleit et al. 2000) und Antigene über MHC (Signal 1) in Abwesenheit kostimulatorischer Moleküle oder proinflammatorischer Zytokine (Signal 2 und 3) präsentieren. Diese Hypothese ist jedoch nach neueren Erkenntnissen nicht ganz zutreffend, da ein gewisser Grad von Reifung sowohl für die Migration der DC als auch für eine ausreichende Antigen-Präsentation erforderlich ist. Lutz & Schuler (2002) sprechen von semireifen DC als den eigentlichen tolerogenen DC und definieren diese als DC, die zwar Antigene und eine – im Vergleich zu reifen DC geringere – Menge kostimulatorischer Moleküle präsentieren, jedoch gewisse proinflammatorische Zytokine (Signal 3), vor allem TH1-Antworten auslösende Zytokine (Morelli & Thomson 2007), nicht sezernieren. Dieses Konzept entspricht der Beobachtung, dass migrierende DC, die apoptotische Zellen oder andere Antigene im steady state aufgenommen haben, tatsäch- lich einen gewissen Grad an Reifung aufweisen (Akbari et al. 2001; Blankenstein & Schuler 2002). Auch DC, die in vitro mit TNF behandelt wurden, haben einen semireifen Phänotyp und antiinflammatorische Eigenschaften (Menges et al. 2002). Eine weitere Studie zeigt, dass DC nach Aufnahme apoptotischer Zellen einen gewissen Grad an Reifung aufweisen und zur Toleranz von CD8+ T-Zellen (cross tolerance) gegenüber Antigenen aus den verwendeten apoptotischen Zellen führen (Albert et al. 2001). Die von Jiang et al. (2007) in Abwesenheit von Gefahrensignalen erzeugten DC, die sich funktionell als tolerogen erwiesen (siehe I.5.2.) entsprechen ebenfalls einem semireifen Phänotyp. Vermutlich gibt es mehrere Entstehungswege und somit auch verschiedene Typen tolerogener DC. Deren charakteristische Merkmale sind jedoch unzureichend bekannt. Allgemein kann man postulieren, dass eine tolerogene DC zur Ausübung ihrer Funktion die Fähigkeit zur Migration aufweisen und gegenüber proinflammatorischen Stimuli wie TLR-Liganden eine verminderte Reaktivität besitzen sollte (Morelli & Thomson 2007). Andere denkbare Eigen- schaften, die aber nicht zwingend in allen Fällen gegeben sein müssen, sind die Oberflä- chenexpression negativ kostimulatorischer Moleküle wie PDL-1 (programmed cell death ligand 1) (Guleria et al. 2007; Probst et al. 2005), sowie inhibitorischer Rezeptoren wie immunoglobulin-like transcript 4 (ILT-4). Letztere werden z.B. durch suppressorische T-Zellen in DC induziert (Chang et al. 2002). Außerdem wurde für regulatorische DC die Sekretion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 (z.B. Akbari et al. 2001) sowie die Expression von

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Indolamin-2,3-Dioxygenase (IDO) beschrieben. Dieses Tryptophan depletierende Enzym erzeugt Abbauprodukte, die T-Zell-Apoptose fördern (Mellor & Munn 2004).

I.5.4. Erzeugung tolerogener DC in vitro Die Charakterisierung tolerogener DC und die Wege ihrer Entstehung sind von großem klinischem Interesse, da sie als therapeutisches Mittel zur Induktion von Toleranz gegenüber Transplantaten oder Allergenen oder zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten in Frage kommen. Es gibt viele Möglichkeiten der in vitro-Generation tolerogener DC, was vermutlich eine ähnliche Vielfalt in vivo widerspiegelt. Ein Beispiel ist die Behandlung unreifer DC mit IL-10 oder TGFβ (Morelli & Thomson 2007). IL-10 wirkt hauptsächlich durch Aktivierung von STAT3 und die dadurch induzierte Genexpression (El Kasmi et al. 2006). Mit IL-10 behan- delte DC können zu Anergie von T-Zellen führen (Jonuleit et al. 2001; Steinbrink et al. 1997). Weitere Substanzen, die tolerogene Effekte auf DC haben, sind Prostaglandin E2, das die cAMP-Synthese aktiviert, 1α, 25-Dihydroxyvitamin D3, das Antioxidans N-Acetyl-Cystein, und Cobalt-Protoporphyrin, welches Hämoxygenase induziert. Auch bereits als Immun- suppressiva oder Antiphlogistika zugelassene Medikamente, z.B. Corticosteroide oder Aspi- rin, haben neben ihren Effekten auf T-Zellen auch tolerogene Wirkung auf DC. DC, die ex vivo mit Donor-Antigen gepulst und mit Rapamycin behandelt wurden, können zur Entste- hung von Treg führen und Transplantatabstoßung verhindern (Turnquist et al. 2007). Be- handlung von DC mit HLA-G, dem Liganden für den inhibitorischen Rezeptor ILT-4 führt ebenfalls zu einem tolerogenen Phänotyp (Ristich et al. 2005).

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I.6. Apoptotische Zellen beeinflussen professionelle Phagozyten

I.6.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Phagozytose Im Rahmen der normalen Gewebehomöostase sterben im Menschen durchschnittlich etwa 100 000 Zellen pro Sekunde einen apoptotischen Zelltod (Vaux & Korsmeyer 1999). Diese werden rasch von professionellen Phagozyten aufgenommen (Parnaik et al. 2000), darunter auch von DC (Albert et al. 1998). In der Maus ist vor allem der CD8+ DC-Subtyp auf die Aufnahme apoptotischer Zellen spezialisiert (Iyoda et al. 2002). Ist die Phagozytose apoptotischer Zellen gestört, kann es zu einer sekundären (spätapoptotischen) Nekrose kommen. Dabei geht die Membranintegrität verloren, sodass Moleküle aus dem Zellinneren frei werden, die ähnlich wie PAMPs proinflammatorisch wirken. Neben den pathogenassoziierten Strukturen gibt es also auch endogene Moleküle, die „Gefahrensignale“ darstellen (Matzinger 1994; Matzinger 2002). Diese auch als „Alarmine“ bezeichneten Substanzen werden gemeinsam mit den PAMP als DAMP (damage associated molecular patterns) zusammengefasst (Bianchi 2007). Beispiele für solche „endogene Adjuvanzien“ sind Harnsäure (Shi et al. 2003), ATP (Hanley et al. 2004) und das DNA-bindende Protein high mobility group box 1 (HMGB1) (Scaffidi et al. 2002). In der Diskussion sind auch Hitzeschockproteine, die Polypeptide binden und eine Immunantwort gegen diese auslösen könnten (Binder et al. 2000; Binder et al. 2007). Während einige Publikationen, vor allem über endogene TLR4-Liganden, kritisch zu sehen sind (siehe I.2.2.), ist die Existenz endogener proinflammatorischer Substanzen an sich ein generell akzeptiertes Paradigma. Als strukturelle Voraussetzung für die immunsti- mulatorische Funktion wurde ein Auftreten hydrophober Bereiche an der Moleküloberfläche vorgeschlagen (Seong & Matzinger 2004). Die Existenz solcher Substanzen macht die schnelle Aufnahme apoptotischer Zellen un- abdingbar für die Vermeidung von Autoimmunität. (Übersicht über PRR-Liganden aus apoptotischen Zellen: Kono & Rock 2008).

I.6.1.1. „Find me“-Signale zur Rekrutierung der Phagozyten Um eine schnelle Entsorgung zu gewährleisten, sezernieren apoptotische Zellen sogenannte „Find me“-Signale, die professionelle Phagozyten anlocken. Ein Beispiel ist Lysophosphatidylcholin, das im Rahmen des apoptotischen Prozesses infolge einer Caspase-abhängigen Aktivierung der Kalzium-unabhängigen Phospholipase A2 (iPLA2) aus Phosphatidylcholin entsteht (Lauber et al. 2003).

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I.6.1.2. „Eat me“-Signale zur Induktion der Phagozytose Zur weiteren Beschleunigung ihrer Aufnahme präsentieren apoptotische Zellen auf ihrer Oberfläche „Eat me“-Signale, die an Rezeptoren auf der phagozytischen Zelle binden (Über- sicht in Lauber et al. 2004). Das bekannteste „Eat me“-Signal ist Phosphatidylserin, das sehr früh im Verlauf der Apoptose von der Innenseite der Plasmamembran nach außen verlagert wird (Tanaka & Schroit 1983; Fadok et al. 1992). Einige Publikationen berichten, dass Phosphatidylserin auf apoptotischen Zellen für die effektive Vermittlung der Phagozytose oxidiert sein muss (Kagan et al. 2002; Borisenko et al. 2004). Phagozyten besitzen Rezepto- ren, die Phosphatidylserin entweder direkt oder über Brückenmoleküle erkennen. Von dem zunächst als Phosphatidylserin-Rezeptor vorgeschlagenen Molekül (Fadok et al. 2000) zeigte sich später, dass es keine direkte Rolle bei der Phagozytose spielt (Bose et al. 2004) und dass es intranukleär lokalisiert ist (Mitchell et al. 2006; Cui et al. 2004; Cikala et al. 2004). Kürzlich wurden weitere Moleküle als Phosphatidylserin-Rezeptoren identifiziert. TIM-4 und TIM-1 aus der Familie der T-Zell Immunglobulin- und Mucin-Domänen- enthaltenden Proteine (Miyanishi et al. 2007; Kobayashi et al. 2007) erkennen Phosphatidylserin über ihre Immunglobulin-Domäne. Der G-Protein gekoppelte Rezeptor BAI 1 (brain specific angiogenesis inhibitor 1) bindet über seine extrazelluläre Thrombospon- din-ähnliche Domäne an Phosphatidylserin (Park et al. 2007). Eine weitere Publikation beschreibt Stabilin-2 als Phosphatidylserin-Rezeptor (Park et al. 2008). Die Erkennung von Phosphatidylserin ist also redundant, und zu den direkten Phosphatidylserin-Rezeptoren kommen weitere, die Phosphatidylserin über Brückenmoleküle erkennen. Eine Übersicht über diese und weitere „Eat-me“ Signale gibt Tabelle I.3. Auch Annexin 1 findet man an Phosphatidylserin gebunden auf der Oberfläche frühapoptotischer Zellen (Arur et al. 2003; Weyd 2005). Eine Rolle als „Eat-me“-Signal konnte in unserem Labor jedoch nicht bestätigt werden (Weyd 2005). Neben dem Auftreten von „Eat-me“-Signalen kommt es auch zu einem Verlust von „Don’t-eat-me“-Signalen wie CD31 oder CD47 und damit zu einer verminderten Abstoßung der Phagozyten (Brown et al. 2002 ; Gardai et al. 2005). Infolge der vielfältigen Mechanismen für das Auffinden und die Aufnahme apoptotischer Zellen geschieht die Beseitigung durch professionelle Phagozyten sehr schnell. Die Aufnahme durch nichtprofessionelle Phagozyten wie etwa Epithelzellen erfolgt mit einer um mehrere Stunden verzögerten Kinetik. Offensichtlich spielen hier andere Signale eine Rolle, die erst später auftreten, und die nichtprofessionelle Phagozytose hat allenfalls eine Bedeutung als unterstützendes System, wenn der schnellere Mechanismus versagt (Parnaik et al. 2000).

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Ligand auf der Rezeptor auf der Brückenmolekül Referenzen apoptotischen Zelle phagozytischen Zelle Miyanishi et al. 2007 ; - TIM-4, TIM-1 Kobayashi et al. 2007 - BAI1 Park et al. 2007 - Stabilin-2 Park et al. 2008 Savill et al. 1990 ; Vitronectin-Rezeptor Hanayama et al. 2002 ; MFG-E8 (αvβ3-Integrin) Borisenko et al. 2004 ; Phosphatidylserin Rubartelli et al. 1997 Ishimoto et al. 2000 ; Gas6 Mer-Tyrosinkinase Scott et al. 2001 Protein S Mer (TAM-Familie) Anderson et al. 2003 Balasubramanian et al. β2-GPI β2-GPI-Rezeptor 1997 Calreticulin CD91 (LRP) Gardai et al. 2005 Annexin 1 ? Arur et al. 2003 Scavenger Rezeptoren Platt et al. 1996 ; OxLDL-ähnliche SR-A Platt et al. 1999 ; Bereiche der - LOX-1 Oka et al. 1998 ; Plasmamembran CD68 Erdosova et al. 2002; CD36 Ren et al. 1995 Thrombospondin- Komplex aus CD36 und Thrombospondin-1 Savill et al. 1992 Bindestellen dem Vitronectin Rezeptor

CR3 (αMβ2-Integrin); Takizawa et al. 1996 ; C3b/bi-Bindestellen C3b/bi CR4 (αxβ2-Integrin) Mevorach et al. 1998 Kollektin-Bindestellen Kollektine Komplex aus Calreticulin Ogden et al. 2001 ; (veränderte C1q und CD91 (LRP) Vandivier et al. 2002 Zuckerstrukturen) SP-A, SP-D Devitt et al. 1998 ; Verändertes ICAM3 - CD14 Moffatt et al. 1999

Tabelle I.3: Brückenmoleküle („Synapse“) zwischen apoptotischen und phagozytischen Zellen. MFG-E8 = milk fat globule-EGF-factor 8; Gas6 = Growth arrest specific gene 6; β2-GPI = β2-Glycoprotein I; LRP = low density lipoprotein (LDL) receptor related protein, auch α2-Makroglobulin-Rezeptor; oxLDL = oxidized Low Density Lipoprotein; SR-A = Scavenger Receptor, Class A; LOX-1 = Lectin-like oxidized LDL receptor 1; CR3 , CR4 = complement receptor 3, 4; SP-A, SP-D = Surfactant Protein A, D; ICAM3 = intercellular adhesion molecule 3.

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Defekte in der Phagozytose apoptotischer Zellen wurden mit der Pathogenese chroni- scher entzündlicher Erkrankungen und systemischer Autoimmunkrankheiten in Verbindung gebracht. Bei Mäusen mit einer genetischen Defizienz verschiedener „Eat-me“ Signale, etwa der Brückenmoleküle C1q oder MFG-E8 oder des Mer-Tyrosinkinase Rezeptors, ist die Auf- nahme apoptotischer Zellen deutlich gestört, und zugleich findet man Symptome einer Autoimmunkrankheit, die dem Systemischen Lupus erythematodes (SLE) ähneln (Botto 1998; Hanayama et al. 2004; Cohen et al. 2002). Im Falle von Mer kann dies auch mit einem Verlust negativ regulatorischer Signaltransduktion zusammenhängen (Sen et al. 2007; siehe I.6.3.). Beim Menschen sind Komplementdefekte ebenfalls mit dem Auftreten von SLE assoziiert (Taylor et al. 2000). Vermutlich führt in diesen Fällen die fehlende Beseitigung der Auto- antigene zur Bildung von Autoantikörpern und folglich zum Auftreten der Krankheit (Rosen & Casciola-Rosen 1999, Rodenburg et al. 2000).

I.6.2. Anti-inflammatorische Beeinflussung der Phagozyten durch apoptotische Zellen Vieles spricht dafür, dass apoptotische Zellen nicht nur aktiv ihre eigene Beseitigung be- schleunigen, sondern auch den Reifungszustand der phagozytierenden Zellen beeinflussen. Die Aufnahme sterbender Zellen ist also wahrscheinlich kein „Null-Ereignis“, wie zunächst (z.B. Stern et al. 1996) angenommen wurde. Nach der Aufnahme apoptotischer Zellen migrieren DC zu den Lymphknoten (Huang et al. 2000) und präsentieren das aufgenommene Material den T-Zellen (Albert et al. 1998). Dies führt vermutlich zu T-Zell-Toleranz, da die Antigenaufnahme in Abwesenheit von Gefahrensignalen bzw. unter dem Einfluss antiinflammatorischer Signale der apoptotischen Zellen stattgefunden hat. Tatsächlich findet man in Milz und Lymphknoten einen großen Anteil an DC mit einer niedrigen Expression kostimulatorischer Marker (Wilson et al. 2003), die diesen tolerogenen DC aus der Peripherie entsprechen könnten. Der inhibierende Einfluss apoptotischer Zellen auf DC wird durch eine Vielzahl von Daten belegt.

I.6.2.1. Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinsekretion von Makrophagen und DC Die Aufnahme apoptotischer Zellen durch professionelle Phagozyten beeinflusst deren Fähigkeit zur TLR-induzierten Zytokinsekretion in antiinflammatorischer Weise. Voll et al. (1997) zeigten dies mit humanen Monozyten bzw. mononukleären Blutzellen (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs). Nach Vorinkubation mit apoptotischen Zellen sezernierten diese nach einem LPS-Stimulus weniger TNF, IL-1 und IL-12, jedoch mehr IL-10. Dieser Effekt wurde zumindest teilweise durch die Bindung der apoptotischen Zellen an CD36 vermittelt. Viele der nachfolgenden Studien verwendeten Makrophagen, um den Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinsekretion zu zeigen. Die Studien weichen teilweise in den Ergebnissen für einzelne Zytokine ab, jedoch zeigt sich insgesamt ein negativ regulatorischer

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Einfluss apoptotischer Zellen auf proinflammatorische Mediatoren bei gleichzeitig unverän- derter oder erhöhter Sekretion antiinflammatorischer Zytokine. Fadok et al. (1998) zeigten für humane Makrophagen einen negativen Effekt apoptotischer Zellen auf die Sekretion von TNF, IL-1β, IL-8, IL-10 und weitere, während die Produktion von TGFβ, Platelet Activating Factor (PAF) und Prostaglandin E2 gefördert wurde. Die zuletzt genannten Mediatoren führten dabei in auto- oder parakriner Weise zur Inhibition der proinflammatorischen Zyto- kine. McDonald et al. (1999) zeigten ähnliche Daten für die murine Makrophagen-Zelllinie J774. Eine Studie von Huynh et al. (2002) demonstrierte einen antiinflammatorischen Einfluss apoptotischer Zellen auf Makrophagen in vivo. In entzündete Bauchhöhlen oder Lungen injizierte apoptotische Zellen wurden durch Makrophagen aufgenommen, die dadurch zur Sekretion von TGFβ angeregt wurden. In der Folge kam es zu einem schnelleren Abklingen der Entzündung im Vergleich zu nicht mit apoptotischen Zellen behandelten Tieren und zu einer geringeren Sekretion proinflammatorischer Zytokine wie TNF. In diesem Modell war Phosphatidylserin auf der Oberfläche apoptotischer Zellen essenziell für den Effekt. Auf die Zytokinsekretion von DC haben apoptotische Zellen einen ähnlichen Einfluss. Für humane, mit GM-CSF aus Monozyten differenzierte DC wurde z.B. gezeigt, dass apoptotische Zellen die LPS-induzierte Sekretion von IL-12 hemmten, während die IL-10-Produktion gesteigert wurde (Urban et al. 2001). Die TNF-Sekretion war in diesem Fall unbeeinflusst. Ähnliche Daten ergaben sich mit murinen DC – auch hier wurde IL-12 negativ, IL-10 hingegen positiv beeinflusst (Stuart et al. 2002). Im Gegensatz zu den Studien in Makrophagen spielte in keinem der beschriebenen Fälle ein auto- oder parakriner Effekt antiinflammatorischer Zytokine (TGFβ oder IL-10) eine Rolle. Manche Studien beschreiben eine Produktion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 (Gao et al. 1998) und TGFβ (Chen et al. 2001) durch die apoptotischen Zellen selbst. Ob diese löslichen Mediatoren für die tolerogene Beeinflussung von Phagozyten ausreichen, ist jedoch fraglich, denn mehrere Studien zeigen, dass der suppressive Effekt Zellkontakt zwischen apoptotischer und aufnehmender Zelle erfordert (Cvetanovic & Ucker 2004; Johann et al. 2006).

I.6.2.2. Einfluss apoptotischer Zellen auf DC-Reifung und Fähigkeit zur T-Zell- Stimulation Die erwähnten Studien mit humanen bzw. murinen DC, die einen tolerogenen Effekt apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion zeigten, beschreiben übereinstimmend auch eine Inhibition der durch LPS-Stimulation ausgelösten Reifung. Die Hochregulation der Akti- vierungsmarker CD86 (Urban et al. 2001; Stuart et al. 2002) und CD83 wurde ebenso wie die Oberflächenexpression von MHC-II (Urban et al. 2001) durch apoptotische Zellen vermindert. T-Zellen, die mit derart behandelten DC inkubiert wurden, zeigten eine geringere Proliferation 26 I. Einleitung Andrea Mahr

(Urban et al. 2001; Stuart et al. 2002) und eine verminderte Sekretion von IFNγ und IL-4 (Urban et al. 2001). Ähnliches beschreibt eine neuere Studie (Williams et al. 2008), die eine durch apoptotische Zellen induzierte, IFNγ-vermittelte Aktivierung des Enzyms IDO in den DC als Ursache für die verminderte T-Zell Stimulation beschreibt. Die Aufnahme apoptotischer Zellen macht DC aber vermutlich nicht völlig unfähig zur Ausbildung eines immunogenen Phänotyps. Eine solche Annahme würde bedeuten, dass jede Infektion mit intrazellulären Erregern, die mit Apoptose der Wirtszelle verbunden ist, Toleranz gegen den Erreger auslösen würde. Im Falle einer Infektion in vivo ist die Sti- mulation vermutlich sehr stark, sodass eine vollständige Reifung der Phagozyten möglich ist. Somit ergibt sich das Modell, dass in Abwesenheit einer Infektion die Aufnahme apoptotischer Zellen durch DC zu peripherer Toleranz gegen Selbst-Antigene führt. Im Rahmen einer Infektion, wenn hohe Konzentrationen pathogener Stimuli auftreten, können jedoch alle DC, auch nach eventueller vorheriger Aufnahme apoptotischer Zellen, vollständig reifen und eine Immunantwort auslösen. Die verminderte Aktivierbarkeit durch kleine Konzentrationen an proinflammatorischen Stimuli ist nur eines von mehreren Charakteristika tolerogener DC (siehe I.5.3.). In letzter Instanz ist von Interesse, welche Veränderungen durch die Aufnahme apoptotischer Zellen in DC induziert werden, die letztendlich die tolerogene Funktion verursachen. Möglicherweise weisen die entstehenden DC den in I.5.3. beschriebenen semireifen Phänotyp auf. In vitro- Studien zeigten entweder keine oder eine nur schwach ausgeprägte Hochregulation kostimulatorischer Moleküle auf DC durch die Aufnahme apoptotischer Zellen (Stuart et al. 2002; Williams et al. 2008). In einem System aus primären humanen DC und mit iC3b opsonisier- ten apoptotischen Zellen wurde eine Herunterregulation kostimulatorischer Moleküle auf den phagozytierenden Zellen beobachtet, die einherging mit einer vermehrten Oberflächenex- pression des Chemokinrezeptors CCR7, der eine Migration zu den Lymphknoten ermöglicht (Verbovetski et al. 2002).

27 I. Einleitung Andrea Mahr

I.7. Annexin 1 ist ein antiinflammatorisches Protein auf der Oberfläche apoptotischer Zellen

I.7.1. Die Annexin-Familie

I.7.1.1. Vorkommen der Annexine Die Annexine bilden eine evolutionär konservierte Proteinfamilie. Sie kommen in Tieren, Pflanzen, Pilzen und Protisten vor, nicht aber in den bisher untersuchten Hefen und Bakte- rien. Die zwölf Annexine der Wirbeltiere werden als Annexin A1-A11 sowie Annexin A13 bezeichnet, vereinfachend kann jedoch der wirbeltierspezifische Buchstabe A weggelassen werden. Annexine sind ubiquitär exprimiert, jedoch gibt es gewebespezifische Unterschiede („Annexin-Fingerabdruck“) (Gerke & Moss 2002). Während einige Annexine (vor allem Annexin 2 und 11) fast ubiquitär exprimiert sind, treten andere (vor allem Annexin 3, 9, 10 und 13) vermutlich eher gewebespezifisch auf. Dies lässt sich aus der Häufigkeit der mit den jeweiligen Annexinen übereinstimmenden Expressed Sequence Tags aus verschiedenen Datenbanken ableiten (Morgan & Fernandez 1998; Morgan et al. 1999).

I.7.1.2. Struktur der Annexine Annexine sind dadurch charakterisiert, dass sie in Anwesenheit von Kalzium reversibel über negativ geladene Phospholipide (wie Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidsäure) an Membranen binden können. Daher stammt ihr Name (engl. to annex = anheften, binden). Die Membranbindung findet über den evolutionär konservierten C-termi- nalen Teil (Kerndomäne) der Annexine statt, der aus vier (im Fall von Annexin 6 jedoch acht) sogenannten Annexin-Repeats von je etwa 70 Aminosäuren besteht (Gerke & Moss 2002). Der N-Terminus liegt auf der membranabgewandten Seite der Annexine. Die N-Termini der verschiedenen Annexine unterscheiden sich in Länge (vier Aminosäuren bei Annexin 4 bis mehr als 100 Aminosäuren bei Annexin 7 und 11) und Primärsequenz sowie posttranslatio- nalen Modifizierungen (Abb. I.4.), und sind daher vermutlich für die Vermittlung der unterschiedlichen Funktionen der verschiedenen Annexine verantwortlich. Zudem enthalten sie bisweilen Motive für Phosphorylierungen, Bindung an verschiedene Liganden und proteolytische Spaltung (Übersicht bei Raynal et al. 1993).

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Struktur / Annexin Expression Zahl der Aminosäuren IS: Granulozyten, T-Zellen, Makrophagen, Hassall-Körperchen VS: Epithel des Verdauungstrakts von Zunge bis Ösophagus NS: Neuronen, Ependymzellen, Mikroglia, Hypophyse 1 S: vor allem oberflächliche Schichten des Epithels von Respira- 346 tions- und Urogenitaltrakt, Prostata, Plazenta (Syncy- tiotrophoblast), Haut IS: Hassall-Körperchen, Retikulumzellen im Lymphgewebe VS: Epithelzellen von Drüsengängen und Myoepithelzellen von 2 der Zunge bis zum Magen 339 NS: Ependymzellen S: respiratorisches Epithel (alle Schichten), Pankreas, Plazenta

IS: Granulozyten, Monozyten 3 S: Plazenta, Prostata 323 IS: Hassall-Körperchen VS: Epithel, vor allem im unteren Bereich (Magen bis Dickdarm) 4 NS: Neuronen, Oligodendrozyten, Ependymzellen 319 S: Plazenta

IS: Milz 5 S: Chondrozyten, Lunge, Leber, Niere; Haut, Herz, Uterus, Pla- 320 zenta, Skelettmuskel

IS : reife T- und B-Lymphozyten 6 VS : Inselzellen des Pankreas ; sekretorische Epithelien 673 S: Leydig-Zellen, Plazenta IS: Milz (mRNA) NS: Gehirn (mRNA) 7 S: Muskel, Lunge, Erythrozyten; Leber (mRNA), Niere (mRNA), 488 Fibroblasten (mRNA), Plazenta (mRNA)

8 S: Lunge, Haut, Leber, Niere (schwache Expression) 327

S: Keratinozyten; eventuell in geschichteten Plattenepithelien, 9 nicht jedoch in anderen Epithelien 345

S: Hepatozyten, vermindert exprimiert in hepatozellulärem Karzi- 10 nom (mRNA) 324 IS: Granulozyten, T- und B-Zellen (spezifische Herunterregulation in aktivierten CD8+ T-Zellen); 11 VS: Dick- und Dünndarm, Pankreas S: Herzmuskel, Lunge, Leber, Niere, Hoden, Prostata, Plazenta, 505 Ovar .

13 VS: Dünn- und Dickdarm (spezifisch) 316

29 I. Einleitung Andrea Mahr

Tabelle I.4.: Struktur der humanen Annexine und Expressionsmuster. Die schematische Darstellung der Struktur der Annexine zeigt die Annexin-Repeats in blau, die N-Termini in rot. Mit Ausnahme von Annexin 13, das myristoyliert ist (Myr) sind die N-Termini acetyliert (Ac). Auch weitere Modifikationen, vor allem Phosphorylierungen, finden hauptsächlich in den N-Termini statt (nicht gezeigt). Während die Membranbindung über die C-terminale Domäne erfolgt, wird die Bindung an Liganden im Allgemeinen durch den N-Terminus vermittelt. Dementsprechend beruhen strukturelle und funktionelle Unterschiede zwischen den Annexinen hauptsächlich auf den N-Termini, die sich in ihrer Länge und Zusammensetzung stark unterscheiden. Die Expressionsdaten beruhen auf Studien zur Lokalisation der Proteine (bzw. mRNAs, wo angegeben) in primären humanen Geweben. Expression in Zelllinien wurde aufgrund der häufig beobachteten veränderten Expression der Annexine bei maligner Entartung (Mussunoor & Murray 2008) nicht berücksichtigt. Beschrieben ist die Expression im Immunsystem (IS), Verdauungssystem (VS), Nervensystem (NS) und sonstigen Geweben (S). Nicht für alle Annexine liegen vergleichende Studien für die Expression in verschiedenen Geweben vor, daher ist die Liste zwangsläufig unvollständig. Im Fall von Annexin 1, 2 und 4 (Dreier et al. 1998), Annexin 6 (Clark et al. 1991), Annexin 5 und 8 (Kirsch et al. 2000; Reutelingsperger et al. 1994) sowie Annexin 11 (Hofmann et al. 2008) liegen Analysen vor, die die Expression in vielen Geweben vergleichend gegenüberstellen. Für Annexin 7 ist die Expression für einige Gewebe auf Proteinebene belegt, eine vergleichende Studie zeigt daneben eine umfassendere Analyse auf mRNA-Ebene (Salzer et al. 2002; Magendzo et al. 1991). Für andere Annexine, deren Expression vermutlich auf wenige Gewebe beschränkt ist, beruhen die Angaben auf Publikationen, die keine umfassende Expressionsanalyse beinhalten. Dazu gehören das in Darmzellen exprimierte Annexin 13 (Wice & Gordon 1992), das als Autoantigen in Pemphigus vulgaris identifizierte und auf Keratinozyten exprimierte Annexin 9 (auch Annexin 31 genannt; Morgan & Fernandez 1998; Nguyen et al. 2000), Annexin 3 (Le Cabec et al. 1992 ; Kollermann et al. 2008) und Annexin 10 (Liu et al. 2002b).

I.7.1.3. Funktionen der Annexine Für Annexine wurden intra- und extrazelluläre Funktionen beschrieben. Diese sind sehr vielfältig und vermutlich können einige davon redundant von mehreren Annexinen übernom- men werden. Als membranbindende Proteine sind Annexine intrazellulär an der Organisation von Membranstrukturen beteiligt. Einige Annexine (1, 2, 4, 6 und 7) können zudem an zwei Membranen gleichzeitig binden, einige (Annexin 1, 2 und 5) verknüpfen die Membran mit Zytoskelettbestandteilen wie F-Actin. Dies ermöglicht Funktionen bei Endo- und Exozytose sowie beim Vesikeltransport (Mayran et al. 2003 ; Creutz 1992 ; Gerke et al. 2005). Extrazelluläre Funktionen wurden vor allem für Annexin 1, 2 und 5 beschrieben. Während Annexin 1 eine Funktion im Immunsystem zugeschrieben wird (siehe I.7.2.4.), fungiert Annexin 2 auf Zelloberflächen als Ko-Rezeptor für Plasminogen und Plasminogen-Aktivator und ist daher an der Fibrinolyse beteiligt (Kim & Hajjar 2002; Ling et al. 2004). Annexin 5 wirkt antithrombotisch durch die Verhinderung der Bindung von Koagulationsfaktoren an Phospholipide. Dies spielt vor allem in der Plazenta eine Rolle. Beim Anti-Phospholipid- syndrom, das durch erhöhtes Thromboserisiko und vermehrte Schwangerschaftsverluste

30 I. Einleitung Andrea Mahr gekennzeichnet ist, spielen Antikörper gegen Phospholipide und Phospholipid-bindende Proteine wie β2-GPI und Annexin 5 eine Rolle (Rand 2000).

I.7.2. Annexin 1

I.7.2.1. Struktur von Annexin 1 Annexin 1 (346 Aminosäuren, ca. 37 kDa) besteht wie alle Annexine aus einer C-termi- nalen membranbindenden Kerndomäne und einem N-Terminus (Abb. I.5.). Im Fall von Annexin 1 ist dieser 40 Aminosäuren lang und enthält Motive für die Phosphorylierung durch Proteinkinase C und für Wachstumsfaktor-Rezeptorkinasen wie EGF (epidermal growth factor)-Rezeptor und HGF (hepatic growth factor )-Rezeptor (Oudinet et al. 1993; Haigler et al. 1987; Skouteris & Schroder 1996). Zudem ist die erste Aminosäure, ein Alanin, acetyliert. Die Konformation von Annexin 1 ändert sich in Abhängigkeit von der Kalzium-Konzentration: In Abwesenheit von Kalzium ist der N-Terminus in die Kerndomäne integriert, bei höheren Konzentrationen nimmt er dagegen eine exponierte Position ein (Rosengarth & Luecke 2003). Möglicherweise entspricht diese Konformationsänderung einem Übergang vom inaktiven in den aktiven Zustand des Proteins. Zudem enthält der N-Terminus mehrere Schnittstellen für Proteasen. Im Verlauf der Apoptose kann er z.B. unter Verbleib eines 33 kDa Restfragments abgespalten werden (Debret et al. 2003; Riess 2006). Ein N-terminales Peptid ähnlicher Größe wird auch durch die Spaltung durch Humane Leukozyten-Elastase (HLE) freigesetzt. Diese spaltet Annexin 1, nachdem es während der Anheftung von Neutrophilen an das Endothel externalisiert wurde (Rescher et al. 2006). Auch für Proteinase 3 auf der Oberfläche aktivierter Neutrophiler wurde eine Funktion bei der Spaltung von Annexin 1 beschrieben (Vong et al. 2007). Während der Translokation zwischen verschiedenen Vesikeln in Neutrophilen werden die ersten acht Aminosäuren des N- Terminus entfernt, vermutlich von einer membranständigen Metalloprotease der Vesikel und der Plasmamembran (Movitz et al. 1999; Movitz & Dahlgren 2000), bei Sekretion aus der Prostata (siehe I.7.2.3) die ersten 29 Aminosäuren (Christmas et al. 1991). Die meisten Autoren nehmen an, dass die Funktion von Annexin 1 durch den N-Terminus vermittelt wird. In einer großen Zahl von Publikationen haben N-terminale Peptide, zumeist das 25 Aminosäuren lange sogenannte „Ac2-26“ (bisweilen „Ac1-25“) Peptid gleiche oder ähnliche Effekte wie das Gesamtprotein, allerdings erst in höheren Konzentrationen (im zweistelligen µM-Bereich) (Walther et al. 2000). Die oben beschriebene Spaltung von Annexin 1 könnte daher alternativ als Inaktivierung des Proteins oder als Freisetzung des aktiven Teils interpretiert werden. Allerdings sollte man die mit Peptiden durchgeführten Experimente kritisch betrachten, bis die Identität des aktiven Teils von Annexin 1 abschlie- ßend geklärt ist.

31 I. Einleitung Andrea Mahr

Als aktiver Teil von Annexin 1 wird außerdem ein Nonapeptid aus der Kerndomäne, das sogenannte Antiflammin-2, diskutiert (Zouki et al. 2000). Inzwischen wurde auch schon postuliert, dass Antiflammin-2 kooperativ mit dem N-Terminus an den Formylpeptidrezeptor (FPR) bindet (Kamal et al. 2006), der als Rezeptor für Annexin 1 beschrieben wurde (siehe I.7.2.5).

Abb. I.4.: Struktur von Annexin 1. Annexin 1 enthält C-terminal vier Annexin-Repeats, die in der Annexin-Familie stark konserviert sind. Die Bindung an negativ geladene Phospholipide erfolgt in Abhängigkeit von Kalzium und wird über drei Typ II- (gelb) und drei Typ III- (orange) Kalziumbindungsstellen vermittelt. Innerhalb des dritten Repeats befindet sich die Antiflammin- Sequenz (grün), die zum Teil für die antiinflammatorischen Eigenschaften verantwortlich gemacht wird. Die N- Termini der Annexine unterscheiden sich stark voneinander und werden im Allgemeinen als funktionsvermittelnd angesehen. Der N-Terminus von Annexin 1 ist acetyliert und kann durch verschiedene Kinasen an Serin, Threonin oder Tyrosin phosphoryliert werden (P). Außerdem kann eine Isopeptidbindung zwischen einem Gluta- min des N-Terminus und einem Lysin (Transglutaminierung, tG) ausgebildet werden. Auf diese Weise kann Annexin 1 kovalent verknüpfte Dimere bilden (Ando et al. 1991). Zudem wurde eine Bindung des N-Terminus an Liganden wie S100A11 (Mailliard et al. 1996) und den FPR (Perretti et al. 2001) beschrieben. Verschiedene Proteasen können N-terminale Fragmente abspalten. Weitere Erläuterungen siehe Text.

I.7.2.2. Expression von Annexin 1 Die Expression von Annexin 1 ist gewebe- und entwicklungsspezifisch reguliert. Eine starke Expression beobachtet man in vielen Leukozyten, vor allem in neutrophilen Granulo- zyten und Monozyten (Morand et al. 1995). In Neutrophilen macht Annexin 1 einen Anteil von etwa zwei Prozent des Gesamtproteingehaltes aus (Francis et al. 1992). Außerdem wird es in Makrophagen, DC, NK- und T-Zellen exprimiert, nicht oder kaum jedoch in B-Zellen. In Zellen des Nervensystems wurde Annexin 1 ebenfalls nachgewiesen (Dreier et al. 1998). In manchen Geweben ist die Regulation entwicklungsspezifisch: In der Leber wurde Annexin 1 z.B. nur während der frühen Embryonalentwicklung und der Regeneration nachgewiesen (Masaki et al. 1994).

32 I. Einleitung Andrea Mahr

I.7.2.3. Externalisierung von Annexin 1 Der Mechanismus der Annexin-Externalisierung ist generell noch unbekannt. Da Annexine keine sekretorischen Signalsequenzen aufweisen und ihre Sekretion nicht mit Inhi- bitoren des klassischen Sekretionswegs blockiert werden kann (Comera & Russo-Marie 1995), wird ein alternativer Mechanismus, möglicherweise unter Beteiligung eines ABC- Transporters, angenommen (Danielsen et al. 2003 ; Chapman et al. 2003). Annexin 1 wird in verschiedenen Situationen externalisiert: Von verschiedenen Zelltypen wie Leukozyten oder Astrozyten wird es nach Behandlung mit Glukokortikoiden induziert und sezerniert (Comera & Russo-Marie 1995; Perretti & Flower 1996; Mizuno et al. 1997). Bei der Anheftung von neutrophilen Granulozyten an das Gefäßendothel wird Annexin 1 ebenfalls nach außen transportiert und hemmt die Extravasation der Neutrophilen (Perretti et al. 1996). Außerdem gelangt es in frühen Stadien der Apoptose auf die Zelloberfläche (Arur et al. 2003; Weyd 2005). Annexin 1 wird auch von der Prostatadrüse abgegeben und kommt in hohen Konzentrationen in der Samenflüssigkeit vor (Christmas et al. 1991).

I.7.2.4. Bekannte Funktionen von Annexin 1 Neben den für Annexine typischen intrazellulären Funktionen wie Membranaggregation, Endo- und Exozytose, sowie einer proliferationshemmenden Funktion im EGF-Rezeptor-Sig- nalweg (Croxtall et al. 1993) wurden für Annexin 1 vor allem immunologische Funktionen beschrieben (Übersicht in Perretti & Gavins 2003; Parente & Solito 2004; Lim & Pervaiz 2007). Schon lange ist bekannt, dass Annexin 1 zumindest teilweise die Wirkung von Gluko- kortikoiden vermittelt. Dies geschieht durch die Inhibition der Phospholipase A2 (PLA2) (Wallner et al. 1986). Die Spezifität dieses Effekts wurde zwar angezweifelt, da die Hem- mung auch von einer Bindung des Phospholipid-Substrats anstelle des Enzyms kommen könnte (Bastian et al. 1993), mittlerweile wurde jedoch gezeigt, dass zelluläre PLA2 (cPLA2) im Gegensatz zu löslicher PLA2 (sPLA2) spezifisch durch Annexin 1 gehemmt wird (Kim et al. 1994). Auch beobachtet man gesteigerte PLA2-Aktivität, wenn Annexin 1 durch siRNA herunterreguliert ist (Solito et al. 1998). Ein weiterer gut charakterisierter Effekt von Annexin 1 ist die Hemmung der Extravasation von Neutrophilen und Monozyten durch das Gefäßendothel (Getting et al. 1997; Lim et al. 1998). Möglicherweise desensitiviert Annexin 1 in diesem Fall chemotaktische Rezeptoren (siehe I.7.2.5). Dazu beitragen könnte auch ein weiterer durch Annexin 1 vermittelter Effekt, die Induktion der Spaltung (Shedding) des Adhäsionsmoleküls L-Selektin, das für den Prozess der Extravasation wichtig ist und durch die Spaltung inaktiviert wird (Strausbaugh & Rosen 2001; de Coupade et al. 2003). Weiterhin gibt es Publikationen, die einen Einfluss von Annexin 1 auf die Produktion pro- und antiinflammatorischer Mediatoren durch phagozytische Zellen zeigen. Es wurde beobachtet, dass Annexin 1 in LPS-stimulierten Makrophagen die IL-10 Produktion steigert,

33 I. Einleitung Andrea Mahr dagegen aber die Synthese der mRNAs von IL-12 sowie der induzierbaren NO-Synthase (iNOS) hemmt (Ferlazzo et al. 2003). Die Bedeutung der antiinflammatorischen Effekte von Annexin 1 zeigt sich in Annexin 1- defizienten Mäusen (Hannon et al. 2003). Diese zeigen eine erhöhte Sensitivität gegenüber inflammatorischen Stimuli, die mit einer verstärkten Auswanderung von Leukozyten zum Ort der Entzündung verbunden ist. Die Anwendung von Glukokortikoiden zur Therapie der induzierten Entzündungen hat einen im Vergleich zum Wildtyp stark verminderten Effekt.

I.7.2.5. Die Annexin 1-Rezeptoren Der Rezeptor, über den extrazelluläres Annexin 1 seine Effekte vermittelt, ist nach Walther et al. (2000) und Perretti et al. (2001) identisch mit dem Rezeptor für formylierte Pep- tide, dem FPR. Auch die verwandten Proteine FPRL1 und FPRL2 (FPR-like 1 und 2) wurden als Annexin 1-Rezeptoren beschrieben (Ernst et al. 2004). Für diese Rezeptoren, insbesondere für FPRL1, wurde ein weites Spektrum strukturell nicht verwandter Liganden beschrieben, die in mehreren Fällen nur schwach binden (Übersicht in Le et al. 2002). Mehrere Befunde belegen die Rolle der FPR-Familie als Annexin 1-Rezeptoren. So ist z.B. in FPR- defizienten Mäusen oder in Anwesenheit spezifischer FPR-Inhibitoren der Annexin 1-Effekt auf die Migration von Neutrophilen stark vermindert, und Transfektion von HEK293-Zellen mit dem FPR verleiht diesen die Fähigkeit, Annexin 1 zu binden. Die Bindung der Rezeptoren der FPR-Familie an Annexin 1 ist mit einer Dissoziationskonstante um 1 µM (Walther et al. 2000) etwa 10 000 mal schwächer als ihre Bindung an formylierte Peptide. Die Verwendung der gleichen Rezeptoren für das antiinflammatorische Molekül Annexin 1 wie für Chemotaxis und Zellaktivierung auslösende formylierte Peptide aus Bakterien oder Mitochondrien erscheint erklärungsbedürftig. Eine mögliche Erklärung ist die Desensitivierung des Rezep- tors durch Annexin 1: Der FPR ist ein G-Protein gekoppelter Rezeptor, dessen Aktivierung letztlich zu einem Kalziumsignal und zur Aktivierung von MAP-Kinasen führt. Walther et al. (2000) beobachteten, dass geringe Konzentrationen an Annexin 1-Peptiden (um 20 µM) zur Inhibition einer nachfolgend durch fMLP ausgelösten Produktion reaktiver Sauerstoffspezies durch Neutrophile führen. Hohe Konzentrationen der gleichen Peptide jedoch (um 200 µM) lösen selbst ein oxidatives Signal aus. Dies führen die Autoren darauf zurück, dass bei schwacher Stimulation nur das Kalziumsignal ausgelöst wird, es aber nicht zur vollen Aktivie- rung von MAP-Kinasen kommt. Die abgeschwächte Aktivität des Signalwegs führt jedoch zu Desensitivierung des FPR selbst sowie anderer chemotaktischer Rezeptoren. Dieses Phä- nomen der homologen und heterologen Desensitivierung ist für G-Protein gekoppelte Rezeptoren gut beschrieben worden und beinhaltet Phosphorylierung und Internalisierung von Rezeptoren (Ali et al. 1999). Inwiefern eine Aktivierung des FPR andere Signalwege wie die von TLR beeinflussen kann, ist unbekannt.

34 I. Einleitung Andrea Mahr

I.8. Zielsetzung

Die Reaktion des Immunsystems gegenüber einem bestimmten Antigen wird in erster Linie durch DC festgelegt. Während gegenüber Pathogenen eine adaptive Immunantwort ausgelöst wird, werden harmlose Fremdantigene und Komponenten des eigenen Körpers toleriert. Die Entscheidung über eine immunogene oder tolerogene Reaktion hängt von Signalen ab, die die DC bei der Antigenaufnahme erhalten. Pathogene enthalten Strukturen, die über proinflammatorische Rezeptoren wie TLR zu einer Reifung der DC führen. Die Auf- nahme von Selbst-Antigenen in Form apoptotischer Zellen beeinflusst die DC hingegen in antiinflammatorischer Weise. Welche Moleküle der apoptotischen Zellen diesen Effekt aus- üben und durch welche Signalwege er vermittelt wird, ist noch unvollständig untersucht. Annexin 1 ist ein Protein, das in frühen Stadien der Apoptose auf die Zelloberfläche gelangt (Arur et al. 2003; Weyd 2005) und die durch TLR Stimulation induzierte Aktivierung der DC hemmt (Weyd 2005; Dörner 2007). In dieser Arbeit sollten die Effekte von Annexin 1 auf die TLR-vermittelte Signaltransduk- tion untersucht werden. Mit Hilfe eines in vitro Systems mit primären DC oder DC-ähnlichen Zelllinien sollten die Effekte apoptotischer Zellen und des aufgereinigten Proteins Annexin 1 auf die Transkription und Sekretion verschiedener TLR-induzierter Zytokine charakterisiert werden. Eine Genexpressionsanalyse in Annexin 1-behandelten und –unbehandelten TLR- stimulierten DC sollte weiteren Aufschluss über die Effekte auf mRNA-Ebene geben. Der Einfluss von Annexin 1 auf die intrazelluläre Signaltransduktion sollte anhand der Aktivierung von Signaltransduktionsmolekülen wie MAP-Kinasen und NF-κB charakterisiert werden. Die Interferenz des Annexin 1-Effekts mit dem MyD88- und/oder TRIF-abhängigen Signalweg sollte durch separate Analyse MyD88- und TRIF-abhängiger Zytokine sowie durch die Ver- wendung von DC aus MyD88-defizienten Mäusen beurteilt werden. Durch den Einsatz ver- schiedenartiger proinflammatorischer Stimuli, deren Signaltransduktion mit den TLR4- Signalwegen mehr oder weniger verwandt ist, sollte beurteilt werden, ob der Effekt von Annexin 1 sich nur auf bestimmte TLR erstreckt, oder ob eine umfassendere Inhibition proinflammatorischer Signalwege vorliegt. Des Weiteren sollte untersucht werden, ob Annexin 1 seine Effekte über die Induktion einer Proteinsynthese vermittelt. Zur Abgrenzung der Annexin 1-abhängigen Wirkungen von durch kontaminierendem LPS ausgelösten tolerogenen Effekten sollten Schlüsselexperimente mit der LPS-neutralisierenden Substanz Polymyxin B durchgeführt werden. Die Charakterisierung des Effekts von Annexin 1 auf die proinflammatorische Signaltransduktion in DC gibt einen Einblick in einen möglichen Mecha- nismus der durch apoptotische Zellen ausgelösten peripheren Toleranz.

35 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II. Material und Methoden

II.1. Material

II.1.1. Häufig verwendet Puffer

Puffer Zusammensetzung

Lysepuffer 500 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10 mM Imidazol, 5 mM Tris (pH 7), (prokaryotisch) 0,5 mg/ml Lysozym, 1 % (w/v) Complete Proteaseinhibitoren Hac 0,5 M Essigsäure, pH 3,4

NH4Ac 5 mM Ammoniumacetat, pH 5 Spaltungspuffer 50 mM Tris-HCl (pH 7), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT 150 mM NaCl, 30 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM PMSF, Lysepuffer (eukaryotisch) 10 % (w/v) Glycerol, 1 % (w/v) Triton X-100, 1 Tablette Complete Proteaseinhibitoren / 500 ml Puffer 24 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5 % (w/v) Acrylamid, 0,1 % (w/v) SDS, Sammelgel (SDS-PAGE) 0,1 % (w/v) APS, 0,1 % (w/v) TEMED 37,5 mM Tris-HCl (pH 8,8), 10-12 % (w/v) Acrylamid, Trenngel (SDS-PAGE) 0,1 % (w/v) SDS, 0,03 % (w/v) APS, 0,1 % (w/v) TEMED Probenpuffer reduzierend (5x) 50 % (v/v) Glycerol, 10 % (w/v) SDS, 50 mM Tris (pH 6,8), (SDS-PAGE) 25 % (v/v) β-Mercaptoethanol, 0,25 mg/ml Bromphenolblau Laufpuffer (SDS-PAGE) 25 mM Tris-Base, 0,19 M Glycin, 1 % (w/v) SDS Coomassie-Lösung 0,26 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 40 % Methanol, 10 % Eisessig Entfärber (Coomassie) 30 % Ethanol, 10 % Essigsäure Transferpuffer (Western Blot) 25 mM Tris, 0,19 M Glycin, 20 % (v/v) Methanol, 0,037 % (w/v) SDS TBS (Tris-buffered saline) 50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,6 TBST TBS, 0,05 % (w/v) Tween-20 Coating-Puffer 1 (ELISA) 100 mM Natriumcarbonat, pH 9,6 Coating-Puffer 2 (ELISA) 200 mM Natriumphosphat, pH 6,5 ELISA-Puffer PBS, 10 % (v/v) FCS Citratpuffer (ELISA) 0,03 M Zitronensäure, 0,07 M Natriumcitrat, pH 5,0

OPD-Substratlösung (ELISA) 0,5 mg/ml o-Phenylendiamin, 0,1 % (v/v) H2O2

Annexin-Bindungspuffer 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH 7,4

137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, PBS pH 7,4 PBST PBS, 0,05 % (w/v) Tween-20 MACS-Puffer PBS, 0,5 % (w/v) HSA, 2 mM EDTA FACS-Puffer Annexin-Bindungspuffer, 10 % (v/v) FCS

36 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.1.2. Biologisches Material Mausstämme Stamm Charakterisierung C57BL/6 Inzuchtstamm; im hauseigenen Tierstall gezüchtet C57BL/MyD88-KO Mausstamm mit fehlender Expression von MyD88 (Adachi et al. 1998)

Eukaryotische Zelllinien Zelllinie Herkunft Referenz Jurkat Humanes T-Zell-Lymphom Schneider et al. 1977 U-937 Humanes Histiozytom Sundstrom & Nilsson 1976 Murine Monozyten / Makrophagen, aus Raw264.7 Raschke et al. 1978 Abelson-Leukämie-Virus induziertem Tumor

Plasmide Plasmid Verwendung Referenz / Firma pET-41a(+) Bakterielle Proteinexpression Novagen, Madison, USA Firefly-Luziferase-Reporterplasmid zur Messung pTATA-Luc, 4 x NF-κB Li-Weber et al. 2000 der NF-κB-Aktivität in eukaryotischen Zellen Plasmid zur konstitutiven Expression von Renilla- pGL4.74[hRluc/TK] Promega, Mannheim Luziferase in eukaryotischen Zellen Plasmid zur Expression von Green Fluorescent pGFP-N1 Protein (GFP) in eukaryotischen Zellen, zur Clontech, Heidelberg Bestimmung der Transfektionseffizienz

II.1.3. Oligodesoxyribonukleotide Oligodesoxyribonukleotide wurden bei der Firma MWG bestellt. Primer für die quantitative PCR wurden mit ultrareinem Wasser auf eine Konzentration von 100 µM eingestellt und vor der Verwendung auf 5 µM (1:20) verdünnt. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des Programms Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/ primer3_www.cgi) anhand folgender Kriterien ausgewählt: Länge zwischen 18 und 25 Nukleotiden, Schmelztemperatur 55-70°C, GC-Gehalt 40-60 %. Um eine Verfälschung der RT-PCR-Ergebnisse durch eventuelle DNA-Kontaminationen zu vermeiden, wurden nur intronüberspannende Primer verwendet, sodass genomische DNA aufgrund der größeren Länge der Sequenz nicht amplifiziert wurde, oder ein derartiges Produkt anhand seiner höhe- ren Schmelztemperatur identifiziert werden konnte. Hierfür wurde die Fluoreszenz der PCR- Produkte während eines Temperaturgradienten (55°C-95°C) im Anschluss an die quantitative SYBR-Green-PCR gemessen.

37 II. Material und Methoden Andrea Mahr

Oligo-dT-Primer wurden mit RNAse-freiem Wasser auf 50 µM eingestellt und für die Re- verse Transkription verwendet.

Primer Sequenz (5’ – 3’) CD3_fw ATG GAG TTC GCC AGT CGA GA CD3_rev CAT TGG GCA ACA GAG TCT GCT GAPDH_fw GGT GAA GGT CGG AGT CAA CGG A GAPDH_rev GAG GGA TCT CGC TCC TGG AAG A IL-1B_fw TCA AGT GTC TGA AGC AGC CAT IL-1B_rev AGA TTC GTA GCT GGA TGC CG IL-10_fw TAC AGC AGA GGA ACC TCC AGT C IL-10_rev ATG CAG GTA CAG CGT ACA GTT C IL-8_fw AGA CAG CAG AGC ACA CAA GC IL-8_rev ACT CCT TGG CAA AAC TGC AC Oligo-dT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TNF_fw CAT CTT CTC GAA CCC CGA GTG A TNF_rev CCT CTG ATG GCA CCA CCA G

II.1.4. Antikörper

Antikörper Isotyp Firma Erk1 Maus IgG1 BD Transduction Laboratories; Heidelberg IκBα Kaninchen, polyklonal Santa Cruz, Heidelberg Phospho-Akt (Thr 308) Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Danvers, MA, USA Phospho-Akt (Ser 473) Maus IgG2b Cell Signaling, Danvers, MA, USA Phospho-ATF2 Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Danvers, MA, USA Phospho-Erk Kaninchen, polyklonal Promega, Mannheim Phospho-GSK3β Kaninchen, polyklonal Cell Signaling, Danvers, MA, USA Phospho-IκBα Kaninchen IgG Cell Signaling, Danvers, MA, USA Phospho-JNK Kaninchen, polyklonal Promega, Mannheim Phospho-p38 Kaninchen, polyklonal Promega, Mannheim Phospho-STAT3 (Tyr 705) Kaninchen IgG Cell Signaling, Danvers, MA, USA SOCS1 Maus IgG1κ Zymed, München SOCS3 Maus IgG2b Serotec, Düsseldorf Tubulin Maus IgG1 Sigma, München

Als Sekundärantikörper für den Western Blot dienten an HRP (engl. horse radish peroxidase = Meerrettich-Peroxidase) gekoppelte polyklonale anti-Maus- bzw. anti-Kanin- chen-IgG Antikörper aus der Ziege (Santa Cruz, Heidelberg). Biotinylierter monoklonaler

38 II. Material und Methoden Andrea Mahr

Anti-Annexin 1-Antikörper (DAC5) wurde von Heiko Weyd zur Verfügung gestellt (Weyd 2005).

II.1.5. Reagenzien Chemikalien wurden, wenn nicht anders angegeben, von den Firmen Serva (Heidelberg), Fluka (Neu-Ulm), Sigma (München), Roth (Karlsruhe) und Merck (Darmstadt) bezogen.

Produkt Hersteller 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) Pierce, Rockford, IL, USA oder Sigma, München Absolutely RNA® Microprep Kit Stratagene, La Jolla, CA, USA Ammoniumperoxodisulfat Sigma, München Ampicillin Sigma, München Annexin 5-FITC Immunotools, Friesoythe BCA (bicin choninic acid) –Kit Pierce, Rockford, IL, USA Benzonase Merck, Darmstadt Biocoll-Lösung Biochrom, Berlin Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma, München CL4B-Sepharose Sigma, München Complete Proteaseinhibitor Roche, Mannheim Cycloheximid Sigma, München Desoxyribonukleotid- (dNTP-) Mix Sigma, München Dual Luciferase Reporter Assay System Promega, Mannheim Enhanced Chemoluminescence- (ECL)-Lösungen Amersham, Little Chalfont, Großbritannien ELISA matched antibodies für humanes IL-8 Immunotools, Friesoythe EndoFree Plasmid Maxi Kit Macherey-Nagel, Düren Fötales Kälberserum (FCS) Gibco BRL, Karlsruhe Glutamax Gibco BRL, Karlsruhe GM-CSF, human (Leukine®) Schering, Berlin GM-CSF, murin Immunotools, Friesoythe GSH-Sepharose-Kügelchen Amersham, Little Chalfont, Großbritannien Humanes Serumalbumin (HSA) Baxter, Unterschleißheim IgG-Sepharose Amersham, Little Chalfont, Großbritannien IFNγ, human Immunotools, Friesoythe IL-1, human Peprotech, Hamburg IL-4, human Immunotools, Friesoythe IL-8, human Immunotools, Friesoythe Isopropylthiogalactosid (IPTG) Roth, Karlsruhe Kanamycin Sigma, München Limulus Amöbozyten-Lysat- (LAL-) Endotoxin Kit Cambrex, Walkersville, USA

39 II. Material und Methoden Andrea Mahr

LAL-Wasser Cambrex, Walkersville, USA LB-Medium Invitrogen, Carlsbad, USA LPS (aus E. coli 026:B6) Sigma, München LPS (ultrarein) Invivogen, Toulouse, Frankreich MACS-LS-Säulen Miltenyi, Gladbach Magnesiumchlorid Applied Biosystems, Darmstadt Magnetische Kügelchen, gekoppelt an Anti-CD14 Miltenyi, Gladbach β-Mercaptoethanol Neolab, Heidelberg Natrium-Desoxycholat Keller, Mannheim N-t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe MP Biomedicals, Eschwege (Inhibitor des FPR) OptiEIA Zytokin-ELISA Kits BD Pharmingen, Heidelberg p38 MAP Kinase Assay Kit Cell Signaling, Danvers, MA, USA

Pam2CSK4 Invivogen, Toulouse, Frankreich

Pam3CSK4 Invivogen, Toulouse, Frankreich 10 x PCR Buffer II Applied Biosystems, Darmstadt Penicillin / Streptomycin Gibco BRL, Karlsruhe Phorbolmyristoylacetat (PMA) Sigma, München Phosphatidylserin Sigma, München PolyFect Quiagen, Hilden Polymorphprep Axis Shield, Oslo, Norwegen Polymyxin B Sigma, München Sigma, München oder Invivogen, Toulouse, Poly(I:C) Frankreich PreScission Protease Amersham, Little Chalfont, Großbritannien Reverse Transkriptase Applied Biosystems, Darmstadt RNA 6000 Nano Chip Kit Agilent Technologies, Waldbronn RNAse-Inhibitor Applied Biosystems, Darmstadt RNAse ZAP Ambion, Austin, TX, USA RPMI-Medium (pulverisiert) Gibco BRL, Karlsruhe Streptavidin-Agarose Invitrogen, Karlsruhe Streptavidin-HRP Jackson ImmunoResearch, West Grove, USA Streptavidin- PE BD Pharmingen, Heidelberg SYBR Green PCR Core Reagents Applied Biosystems, Darmstadt Tetramethylendiamin (TEMED) Sigma, München TNF, human Calbiochem, La Jolla, CA, USA Triton X-114 Sigma, München Trypsin / EDTA Gibco BRL, Karlsruhe

40 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.1.6. Geräte und Material Es wurden ausschließlich gammabestrahlte Zellkulturmaterialien (Kulturschalen, Kultur- flaschen, Pipetten und Zentrifugenröhrchen etc.) der Firmen Renner (Dannstadt), Falcon (Becton Dickinson, San Jose, USA), Greiner (Frickenhausen) und Nunc (Wiesbaden) verwendet. 6-Loch-Platten für die Differenzierung humaner DC wurden von Corning/Fisher (San Francisco, CA, USA) bezogen. Für ELISAs wurden 96-Loch-Platten mit halber Fläche der Firma Corning B.V. (Schiphol-Rijk, Niederlande) verwendet.

Gerät / Material Hersteller 96-Loch-Platten und Deckel für quantitative PCR, Applied Biosystems, Darmstadt MicroAmp Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Waldbronn Chip Priming Station Agilent Technologies, Waldbronn Dialyseschläuche Spectrapor, Roth, Karlsruhe ELISA-Reader Victor, Wallac, Turku, Finnland Endotoxin-Säulen Detoxi-Gel, Pierce, Rockford, USA Entwicklungsmaschine Classic E.O.S., Agfa, Köln Filme zur Detektion von Chemilumineszenz Amersham, Little Chalfont, Großbritannien (Hyperfilm ECL) Filterpapier (Chromatographiepapier) Whatman, Dassel Gefrierschrank –20°C Liebherr, Ochsenhausen Gefrierschrank –80°C Forma Scientific (Thermo), Dreieich Geltrockner Modell 583, Biorad, München Hüllen für Chemilumineszenz-Filme Rego, Augsburg Inkubator für die Zellkultur Steri-Cult, Forma Scientific (Thermo), Dreieich Kühlzentrifuge Megafuge 3.0 RS, Heraeus (Thermo), Dreieich Luminometer Lumat LB9507 Berthold Technologies Mikroskop Axiovert 25, Zeiss, Jena Nitrocellulose-Membran (Hybond) Amersham, Little Chalfont, Großbritannien Schüttler für Bakterienkulturen HAT Infors, Infors AG, Bottmingen, Schweiz SDS-PAGE & Westernblot-Apparatur Mini Protean II, BioRad, München Sezierbesteck Fine Science Tools, Heidelberg Sterile Werkbank SteriGRAD Hood, Baker, Sanford, USA Tischzentrifuge Biofuge Fresco, Heraeus (Thermo), Dreieich Ultrazentrifuge Sorvall Evolution RC Thermo Electron, Waltham, USA UV-Strahler Stratalinker 2400 Stratagene, La Jolla, USA Zellseparator Midi-MACS, Miltenyi, Gladbach Zählkammer nach Neubauer HBG, Lützellinden

41 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2. Methoden

II.2.1. Zellbiologische Methoden

II.2.1.1. Kultivierung eukaryotischer Zellen Alle Arbeiten zur Kultivierung eukaryotischer Zellen wurden unter einer sterilen Werkbank durchgeführt. Eukaryotische Zellen wurden im Brutschrank bei 37°C, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 kultiviert. Das verwendete Kulturmedium variierte je nach Zelltyp.

Zelltyp Medium Zusammensetzung Differenzierungsmedium RPMI, 1 % Glutamax, 1 % AB-Serum; Primäre humane DC für humane DC 1000 U/mL GM-CSF, 500 U/mL IL-4 Supplementiertes RPMI RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS U-937 RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS, U-937 Differenzierungsmedium 10 µg/mL PMA RPMI, 1 % Glutamax, 5% FCS ; Differenzierungsmedium Primäre murine DC 10 % Überstand der GM-CSF produzie- für murine DC renden Zelllinie GM-PC Raw264.7 Supplementiertes DMEM DMEM, 1 % Glutamax, 10 % FCS Primäre humane Neutrophile Supplementiertes RPMI RPMI, 1 % Glutamax, 10 % FCS J16 GM-PC GM-PC-Medium RPMI, 1 % Glutamax, 5 % FCS

II.2.1.2. Präparation humaner Monozyten und Differenzierung zu DC Die Präparation von Monozyten erfolgte aus 250-500 mL heparinisiertem Vollblut. Je 15 mL Biocoll-Lösung wurden mit 35 mL Blut langsam überschichtet und zentrifugiert (700 x g; 20 min; 20°C; ohne Bremse). Der Ring mit den mononukleären Zellen wurde abgenommen und nach Verdünnung mit einem etwa gleichen Volumen RPMI-Medium abzentrifugiert (200 x g, 15 min, 20°C, mit Bremse). Es folgten zwei weitere Waschschritte (gleiche Zentrifugationsbedingungen), in denen das Pellet in 100 mL RPMI-Medium aufgenommen und abzentrifugiert wurde. Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS wurden die Zellen in 20 mL PBS aufgenommen und gezählt. Die Isolierung der Monozyten aus den mononukleären Zellen erfolgte mit einem CD14- „Magnetic-Bead-Kit“ der Firma Miltenyi. Die Lymphozyten wurden in 80 µL MACS-Puffer je 1·107 Zellen resuspendiert und nach Zugabe von 10 µL anti-CD14-Kügelchen-Suspension je 1·107 Zellen für 15 min bei 4°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend wurde die Suspen- sion über eine mit 3 mL MACS Puffer äquilibrierte MACS-LS-Säule in einem magnetischen

42 II. Material und Methoden Andrea Mahr

Zellseparator gegeben. Die Säule wurde dreimal mit je 3 mL MACS-Puffer gewaschen. Dann wurde sie aus dem Magnetfeld entfernt und die CD14-positiven Monozyten wurden mit 5 mL MACS-Puffer eluiert. Die Zellen wurden gezählt, pelletiert (10 min bei 300 x g und 20°C) und in einer Konzentration von 1,5·106 Zellen in RPMI mit 1 % Glutamax und 1 % AB-Serum in 6- Loch-Platten ausgesät (3 mL pro Loch). Etwa 1 h später waren die Monozyten adhärent und das Medium konnte gegen Differenzierungsmedium für humane DC (3 mL pro Loch) ausge- tauscht werden. Nach drei Tagen wurden pro Loch 0,5 mL Medium mit 3500 U/mL GM-CSF und 1500 U/mL IL-4 zugegeben. Nach insgesamt sechs Tagen wurden die unreifen DC vorsichtig mit dem Zellkultur-Überstand abgenommen und für weitere Experimente verwendet. In Fällen, in denen die Kultur viele apoptotische DC aufwies, wurden die Zellen vor Verwen- dung bei geringer Geschwindigkeit (700 rpm bzw. 100 x g) 10 min bei 20°C pelletiert und in frischem Medium aufgenommen.

II.2.1.3. Präparation muriner Knochenmarkszellen und Differenzierung zu DC Murine DC wurden aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus dem Knochenmark der Beinknochen gewonnen. Für die Sektion wurde durch Alkohol sterilisiertes Sezierbesteck verwendet. Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet und mit den Extremitäten auf einer Unterlage fixiert. Alle weiteren Arbeiten fanden unter einer sterilen Werkbank statt. Die Haut über den Beinen wurde durch einen Schnitt von Hüfte bis Ferse geöffnet und die Knochen durch Entfernung der Muskeln freigelegt. Femur und Tibia wurden unterhalb der Hüfte bzw. oberhalb des Knöchels durchtrennt und samt Kniegelenk in eine mit PBS gefüllte Petrischale gegeben. Nach Entfernung des Kniegelenks und letzter Gewebereste wurden die Knochen in eine zweite Petrischale mit PBS gegeben. Das Knochenmark wurde mit Hilfe einer 23G- Kanüle aus den Röhrenknochen gespült und durch Aufziehen mit einer Kanüle in eine 1 mL- Spritze mechanisch homogenisiert. Die Zellsuspension wurde durch ein 40 µm Zellsieb in ein 50 mL-Röhrchen überführt und zweimal mit RPMI / 1 % Glutamax / 5 % FCS gewaschen (Zentrifugationen für 10 min bei 460 x g und 4°C). Die Differenzierung zu DC erfolgte mit Hilfe eines GM-CSF-haltigen Überstands der murinen Zelllinie GM-PC. Hierfür wurden je 1,5·106 hämatopoetische Vorläuferzellen in 1 mL Differenzierungsmedium für murine DC in einer 24-Loch-Platte ausgesät. Nach zwei Tagen wurde das Medium vollständig erneuert, nach zwei weiteren Tagen wurde nochmals 50 % des Mediums durch neues Medium ersetzt. Weitere zwei bis drei Tage später wurden die DC für Experimente verwendet. In einigen Fällen wurde statt des Zellüberstands rekombinantes GM-CSF verwendet. In diesem Fall wurden je 2·106 hämatopoetische Vorläuferzellen in 10 mL RPMI-Medium / 1 % Glutamax / 10 % FCS mit 1000 U/mL murinem GM-CSF in einer sterilen unbeschichteten Kulturschale ausgesät. Nach drei Tagen wurden 10 mL Medium mit 1000 U/mL GM-CSF zugefügt. Weitere drei bis vier Tage später wurden die DC verwendet.

43 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2.1.4. Differenzierung der U-937 Zellen U-937 Zellen sind humane monozytische Zellen, die in Suspension wachsen. Durch verschiedene Substanzen können sie zu adhärenten Zellen differenziert werden, die in ihrem Phänotyp Makrophagen bzw. DC ähneln. 4-5·106 U-937-Zellen wurden in 30 mL supplementiertem RPMI in einer 75 cm2-Zellkulturflasche ausgesät und mit 10 µg/mL PMA für drei bis vier Tage differenziert. Die differenzierten Zellen wurden einmal mit PBS gewaschen und für 4 min mit Trypsin / EDTA vom Boden der Zellkulturflasche gelöst. Nach Abstoppen der pro- teolytischen Reaktion mit 12 mL Medium wurden die Zellen pelletiert (5 min bei 460 x g und 4°C) und sofort für die weitere Verwendung ausplattiert, um ein Aggregieren der Zellen in Suspension zu verhindern.

II.2.1.5. Präparation primärer humaner neutrophiler Granulozyten Primäre humane neutrophile Granulozyten wurden durch Dichtezentrifugation aus 80 mL heparinisiertem Vollblut isoliert. Je 4 mL Polymorphprep wurden mit je 5 mL Blut in 15 mL- Röhrchen vorsichtig überschichtet und zentrifugiert (40 min bei 470 x g und 20°C, ohne Bremse). Nach der Zentrifugation flotieren die mononukleären Lymphozyten auf dem Poly- morphprep, während sich die polymorphkernigen Neutrophilen als Ring in der Interphase sammeln. Die Erythrozyten werden unter diesen Bedingungen pelletiert. Der obere Ring aus mononukleären Lymphozyten wurde vorsichtig entfernt. Die Neutrophilen der unteren Ringe wurden vereinigt und zum Ausgleich der Molarität in ein gleiches Volumen 0,45 % NaCl-Lö- sung gegeben. Nach Zentrifugation (10 min bei 820 x g und 20°C) wurde der Überstand ver- worfen und die verbliebenen Erythrozyten durch einminütige Inkubation in eiskalter 0,2 % NaCl-Lösung hypoton lysiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von 5 mL eiskalter 1,6 % NaCl- Lösung gestoppt, und die Neutrophilen nach erneuter Zentrifugation in einer Konzentration von 2·106 Zellen/mL in supplementiertem RPMI in 6-Loch-Zellkulturplatten (3 mL pro Loch) ausgesät und bis zur weiteren Verwendung im Brutschrank inkubiert.

II.2.1.6. Apoptoseinduktion

Für diese Arbeit wurden verschiedene Typen apoptotischer Zellen verwendet. Jurkat T- Zellen wurden mit 50 mJ/cm² UV-C-Strahlung bestrahlt (6-Loch-Platten, 2,5 mL einer 1 Mio/mL Zellsuspension pro Loch) und für 2 h in supplementiertem RPMI bei 37°C inkubiert. Primäre Neutrophile starben nach Entnahme aus dem Körper durch Entzug von Überlebens- signalen spontan und zeigten etwa 24 h nach Blutentnahme die typischen Charakteristika frühapoptotischer Zellen. Murine Thymozyten wurden erhalten, indem ein Thymus mit Hilfe eines Zellsiebs und dem Kolben einer 2 mL-Spritze homogeni-siert wurde. Die Zellsuspen- sion wurde auf 2 Mio Zellen/mL eingestellt und in 6-Loch-Platten (5 mL pro Loch) inkubiert. Nach etwa 6 h wiesen die Thymozyten durch spontanen Zelltod einen frühapoptotischen Phänotyp auf. 44 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2.1.7. Kokultur-Experimente mit Phagozyten und apoptotischen Zellen Um zu untersuchen, ob apoptotische Zellen die Zytokinsekretion und Signaltransduktion von Phagozyten beeinflussen, wurden Kokultur-Experimente durchgeführt. Das gewählte Medium entsprach jeweils dem Kulturmedium der verwendeten Phagozyten (siehe II.2.1.1.). Waren die apoptotischen Zellen zunächst in einem anderen Medium kultiviert worden, so wurden sie vor dem Experiment abzentrifugiert (1200 rpm, 10 min, 20°C) und in dem Phago- zyten-Medium aufgenommen. Experimente zur Messung der Zytokinsekretion wurden in 48-Loch-Platten durchgeführt. Hier wurden je 1·105 Phagozyten pro Loch in 500 µL ausgesät. Nach einer mindestens 30- minütigen Inkubationszeit, in der die Zellen adhärieren konnten, wurden apoptotische Zellen in einem Volumen von 250 µL hinzugegeben. Das Verhältnis zwischen apoptotischen Zellen und Phagozyten betrug je nach Experiment zwischen 2:1 und 10:1. Nach einer Inkubations- zeit von 4 h (wenn nicht anders angegeben) erfolgte die Stimulation der Zellen mit TLR-Sti- muli. Etwa 18 h nach der Stimulation wurden 250 µL Überstand abgenommen und im ELISA auf die Sekretion von Zytokinen untersucht. Für Experimente zur quantitativen Erfassung der LPS-induzierten mRNA-Regulation von U-937 Zellen in An- und Abwesenheit apoptotischer Zellen wurden 6-Loch-Platten verwendet. In diese wurden 1-2·106 U-937 Zellen in 2 mL Medium ausplattiert. Nach vollständiger Adhärenz der U-937 Zellen wurde das Medium abgenommen und durch frisches Medium mit oder ohne apoptotische Zellen ersetzt. 4 h später wurden die Zellen stimuliert, und nach verschiedenen Zeitintervallen lysiert. Für die RNA-Isolierung wurde das NucleoSpin RNAII Kit von Macherey-Nagel verwendet.

II.2.1.8. Experimente mit Phagozyten und rekombinantem Annexin 1 Um den Einfluss von rekombinantem Annexin 1 auf Phagozyten zu untersuchen, wurden analog zu den Kokultur-Experimenten mit apoptotischen Zellen Experimente mit rekombinantem humanem und murinem Annexin 1 durchgeführt. Für Experimente zur Bestimmung der Zytokinsekretion wurden je 1·105 Phagozyten pro Loch in 500 µL in einer 48-Loch-Platte ausgesät. Nach Adhärenz der Zellen – frühestens 30 min nach dem Ausplattieren – wurde lösliches Annexin 1 in einer Konzentration zwischen 1 und 10 µg/mL zugegeben. Meist wurde mit löslichem Annexin 1 über Nacht inkubiert, in einigen Fällen auch kürzer. Im Fall der U-937 Zellen wurde kein lösliches, sondern über Phosphatidylserin an die Platte gebundenes Annexin 1 verwendet. Hierfür wurden die Platten zunächst über Nacht mit in Methanol gelöstem Phosphatidylserin inkubiert (200 µL einer 0,3 µg/mL Lösung). Das Methanol verdunstet und eine mit Phosphatidylserin beschichtete Platte bleibt zurück. Die Löcher wurden zweimal mit 500 µL PBS gewaschen und mit Anne- xin-Bindepuffer bzw. 1-5 µg Annexin 1 pro Loch in Annexin-Bindepuffer inkubiert. Nach 1-2 h wurde der Annexin-Bindepuffer entfernt und 1·105 U-937 Zellen pro Loch ausgesät. Nach 45 II. Material und Methoden Andrea Mahr einer Inkubationszeit von 4 h wurden die Zellen stimuliert. Nach etwa 18 h konnten die Über- stände mittels ELISA analysiert werden. Um den Einfluss von Annexin 1 auf die mRNA-Induktion in primären humanen DC zu untersuchen, wurden 3-5·105 Zellen pro Loch einer 24-Loch-Platte in 1 mL ausgesät. Nach Adhärenz der Zellen wurde Annexin 1 in löslicher Form in der jeweils angegebenen Konzentration (meist 5 µg/mL) zugegeben. In Experimenten mit dem Translationsinhibitor Cycloheximid wurde dieses in der Konzentration 10 µg/mL etwa 30 min vor dem Annexin 1 zu den Zellen gegeben. Ebenso wurde die LPS-blockierende Substanz Polymyxin B (10 µg/mL) vor Zugabe von Annexin 1 in das Kulturmedium pipettiert. Die Stimulation erfolgte am nächsten Tag. Die Lyse der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation sowie die RNA-Isolierung wurde mit dem „Absolutely RNA Microprep Kit“ von Stratagene durchgeführt.

II.2.1.9. Transfektion der Zelllinie Raw264.7 Für die Durchführung von Reporter-Experimenten wurden Raw264.7 Zellen in 75 cm2 Zellkulturflaschen über Nacht in DMEM mit 1 % Glutamax und 10 % FCS (0,3 Mio Zellen pro mL, 15 mL pro Flasche) kultiviert. Am nächsten Tag betrug die Konfluenz der Zellen zwischen 50 und 80 %. Kurz vor der Transfektion wurde das Medium entfernt, die Zellen einmal mit warmem PBS gewaschen, und 10,5 mL neues Medium zugegeben. Für die Transfektion wurden 10,5 µg des Plasmids pTATA-Luc 4 x NF-κB und 0,5 µg des Kontrollplasmids pGL4.74[hRluc/TK] in 700 µL DMEM ohne Zusätze verdünnt und mit 70 µL des Transfektionsreagens PolyFect vermischt. Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtempera- tur wurden 4,2 mL DMEM mit 1 % Glutamax und 10 % FCS zu dem Ansatz pipettiert, und das Transfektionsgemisch auf die Zellen gegeben. Am folgenden Tag konnten die Zellen abtrypsiniert und für Reporterexperimente eingesetzt werden.

II.2.1.10. Reporter-Experimente mit Raw264.7 Zellen Die gemäß 2.1.9. transfizierten Zellen wurden abtrypsiniert, in frischem Medium aufgenommen und in 24-Loch-Platten ausplattiert (5·105 Zellen in 1 mL pro Loch). Nach etwa 30-60 min wurden 3 µg/mL rekombinantes Annexin 1 bzw. apoptotische Zellen im Verhältnis 5:1 zu den Phagozyten gegeben und für 6-10 h inkubiert. Stimuliert wurde mit LPS für 8-12 h. Die weiteren Schritte erfolgten mit dem „Dual Luciferase Reporter Assay System“ der Firma Promega nach dem Protokoll des Herstellers. Die Proben wurden mit 100 µL des im Kit enthaltenen Lysepuffers lysiert. Das gewählte System, das die Bestimmung der Aktivität zweier verschiedener Luziferasen in der gleichen Probe erlaubt, ermöglicht eine Normierung der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität auf die Transfektionseffizienz. Das Plasmid pTATA-Luc 4 x NF-κB kodiert für eine Luziferase aus Glühwürmchen (Firefly) unter einem NF-κB-abhängigen Promotor. Die Menge an exprimierter Firefly-Luziferase hängt somit von 46 II. Material und Methoden Andrea Mahr der induzierten NF-κB-Aktivität ab. Das kotransfizierte Plasmid pGL4.74[hRluc/TK] kodiert für eine Luziferase aus dem Organismus Renilla reniformis unter dem Promoter der Tyrosinki- nase (TK) aus dem Herpes simplex Virus. Dieser Promotor weist eine konstitutive Aktivität auf. Da die Plasmide zusammen und somit mit der gleichen Effizienz transfiziert werden, kann man durch Normierung der Firefly-Luziferase-Aktivität auf die Aktivität der Renilla- Luziferase transfektionsbedingte Unterschiede zwischen verschiedenen Proben ausgleichen. Die Messung der Luziferase-Aktivität erfolgte in einem Lumat LB 9507 Luminometer (Bert- hold Technologies) nach folgendem Protokoll: Injektion des Firefly-Luziferase-Substrats (50 µL) Verzögerung (2 sec) Messung (10 sec) Injektion des Renilla-Luziferase-Substrats (50 µL) Verzögerung (2 sec) Messung (10 sec) Die Reaktion der Firefly-Luziferase wurde durch den Puffer des Renilla-Luziferase- Substrats abgestoppt, sodass die beiden Reaktionen getrennt voneinander in der gleichen Probe analysiert werden konnten.

II.2.1.11. Messung der Aktivität der p38 Kinase in Raw264.7 Zellen Die Messung der Aktivität der p38 Kinase wurde mit dem p38 Kinase Assay Kit der Firma CellSignaling durchgeführt. Raw264.7 Zellen wurden für diesen Zweck in Petrischalen aus- gesät (2-3 Mio Zellen pro Platte in 10 mL). Nach etwa 1 h wurde Annexin 1 (5 µg/mL) zugegeben und über Nacht mit den Zellen inkubiert. Das Medium wurde vollständig abgenommen und durch neues Medium, mit oder ohne LPS, ersetzt. Nach verschiedenen Zeitspannen wurde das Medium abgenommen, die Zellen einmal mit PBS gewaschen, und schließlich mit 1 mL des im Kit enthaltenen Kinase-Lysepuffers für 5 min auf Eis lysiert. Die Lysate wurden in 1,5 mL Reaktionsgefäße überführt. Zwecks höherer Effizienz der Lyse wurden die Reaktionsgefäße 4 x 5 sec lang im Ultraschallbad behandelt, wobei zwischen den Ultra- schallbehandlungen mit Eis gekühlt wurde. Schließlich wurden die Gefäße für 10 min bei 13000 rpm (18000 x g) und 4°C abzentrifugiert. Die klaren Überstände wurden abgenommen und bei –80°C gelagert oder direkt für Immunpräzipitation und Kinaseaktivitätsmessungen eingesetzt. Für die Immunpräzipitation der phosphorylierten p38 Kinase wurde ein Mastermix angesetzt, der pro Reaktion folgende Komponenten enthielt: 20 µL des an Kügelchen immobili- sierten monoklonalen, gegen Phospho-p38 gerichteten Antikörpers, 50 µL Kinase- Lysepuffer, 10 µL CL4B-Sepharose, 20 µL Streptavidin-Agarose, 0.5 µg DAC5-Biotin. Die CL4B-Kügelchen wurden zugesetzt, um ein größeres und deutlicher sichtbares Pellet zu erhalten. Das System aus Streptavidin-Agarose-Kügelchen und biotinyliertem Antikörper 47 II. Material und Methoden Andrea Mahr diente als Ladekontrolle. Der biotinylierte Antikörper lässt sich im Western Blot durch Fär- bung mit Streptavidin-HRP nachweisen. Er wird durch die Streptavidin-Agarose-Kügelchen präzipitiert und geht bei den Waschschritten im gleichen Ausmaß verloren wie die durch Anti- Phospho-p38 Kügelchen präzipitierte phosphorylierte Kinase. Eventuelle durch das Waschen bedingte Verluste an p38 Kinase spiegeln sich daher in Verlusten an biotinyliertem Antikör- per wider. Diese vom Hersteller nicht vorgesehene Ladekontrolle war nötig, da nicht die Ge- samtmenge an p38 Kinase präzipitiert wurde, sondern nur die phosphorylierte Form. Da- durch ist es nicht möglich, eventuelle waschbedingte Verluste durch Färbung gegen die gesamte p38 Kinase abzuschätzen. Zu 80 µL dieses Mastermixes wurden 300 µL Zelllysat gegeben und über Nacht rotierend inkubiert. Für die Messung der Kinaseaktivität wurden die Präzipitate 30 sec bei 14000 x g abzentrifugiert, 2 x mit je 500 µL Kinase-Lysepuffer und 2 x mit je 500 µL des ebenfalls im Kit enthaltenen Kinase-Puffers gewaschen und schließlich in Kinasepuffer mit 200 µM ATP und 1 µg ATF2 aufgenommen. Die Reaktion der ATP-abhängigen Phosphorylierung von ATF2 durch die p38 Kinase wurde für 30 min bei 30°C unter leichtem Schütteln durchgeführt und durch Zugabe von SDS-Probenpuffer gestoppt. Die Proben wurden für 2 min auf 95°C erhitzt und konnten bei –20°C gelagert werden. Im Western Blot wurde phosphoryliertes ATF2 mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers detektiert.

II.2.2. Proteinchemische Methoden

II.2.2.1. Aufreinigung von rekombinantem Annexin 1 Humanes und murines Annexin 1 wurden durch Expression in Bakterien gewonnen. Für die Aufreinigung waren die Proteine am C-Terminus mit einer Sequenz aus Protein A versehen, die durch eine Spaltung mit Prescission Protease entfernt werden konnte. Die Kon- strukte zur bakteriellen Expression wurden von Isabel Vogler zur Verfügung gestellt (Vogler 2005). Die Expression erfolgte in BL21(DE3)pLysS pTK1 E. coli-Zellen mit Hilfe des Vektors pET-41a(+). Für die Aufreinigung wurde eine Vorkultur in 300 mL LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin angeimpft und bei 37°C unter Schütteln (220 rpm) inkubiert. Am nächsten Morgen wurde die Vorkultur 1:10 verdünnt und bis zu einer OD600 von 0,6 unter Schütteln kultiviert. Die Expression von Annexin 1 wurde durch 1 mM IPTG induziert. Nach 4 h wurden die Bakterien 30 min bei 2070 x g und 4°C abzentrifugiert und einmal mit PBS gewaschen. Das Pellet wurde gewogen und in einem vierfachen Volumen an bakteriellem Lysepuffer unter Schütteln 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lyse erfolgte durch fünfmaliges Einfrieren in flüssigem Stickstoff und anschließendes Auftauen im Wasserbad bei 37°C. Unterdessen wurden pro mL Lysat 200 µL IgG-Sepharose 6-Kügelchen in einem Zentrifu- 48 II. Material und Methoden Andrea Mahr genröhrchen mit je 50 mL der folgenden Puffer für 10 min bei 4°C rollend äquilibriert: 2 x TBST, 1 x HAc, 1 x TBST 1 x HAc, 2 x TBST. Die Zentrifugationen erfolgten für 5 min bei 2500 x g und 4°C. Das Lysat wurde mit Benzonase im Verhältnis 1:2000 versetzt und 30-60 min bei Raumtemperatur geschüttelt, bis die Suspension nur noch leicht-viskos war. Nach einer Zentrifugation für 30 min bei 13300 x g und 4°C wurde der Überstand des Bakterienlysats auf die äquilibrierten Sepharose-Kügelchen gegeben und 1-2 h bei 4°C rollend inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Kügelchen 5 min bei 2500 x g und 4°C zentrifugiert und nach vollständigem Entfernen des Überstandes mit je 50 mL der folgenden

Puffer je 10 min bei 4°C rollend gewaschen: 3 x TBST, 1 x NH4Ac, 1 x Spaltungspuffer. Zu je 100 µL Kügelchen wurden 250 µL Spaltungspuffer und 8 Einheiten PreScission-Protease gegeben, um das Annexin 1-Konstrukt von der Protein A-Domäne zu trennen, die an den Kügelchen verblieb. Die Proteolyse erfolgte rollend über Nacht bei 4°C. Am nächsten Mor- gen wurden die IgG-Kügelchen 10 min bei 1840 x g und 4°C zentrifugiert und der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Die Kügelchen wurden ein weiteres Mal mit einem kleinen Volumen Spaltungspuffer gewaschen. Die Überstände beider Zentrifugationen wurden vereinigt. Die PreScission-Protease trug ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag und wurde im folgenden Schritt über eine Inkubation mit GSH-Kügelchen aus der Präparation entfernt. Für 3 Liter Ursprungskultur wurden 4 mL GSH-Kügelchen 5 min bei 460 x g und 4°C pelletiert und der Überstand vollständig entfernt. Die Äquilibrierung der Kügelchen erfolgte durch zweimaliges Waschen mit 50 mL kaltem PBS. Die Proteinlösung wurde zugegeben und das Gemisch 2 h bei 4°C rollend inkubiert. Die anschließende Zentrifugation erfolgte für 5 min bei 460 x g und 4°C und wurde mehrfach wiederholt, um in der Lösung verbliebene GSH-Kügel- chen zu entfernen. Schließlich wurde die Proteinlösung über Nacht gegen PBS dialysiert (MWCO 10 000 Da), wobei der Puffer ein- bis zweimal gewechselt wurde.

II.2.2.2. Bestimmung von Proteinkonzentrationen

Die Konzentration von Proteinen in Lösung kann über verschiedene Verfahren bestimmt werden. Eine einfache Methode ist der Nachweis mit Hilfe von Kupfersulfat und Bicincho- ninsäure (BCA). Zunächst reduzieren die Peptidbindungen des Proteins Cu2+ zu Cu+. Die Cu+-Ionen werden von je zwei Molekülen BCA chelatiert; es entsteht ein violetter löslicher Komplex, dessen Absorption bei 560 nm bestimmt werden kann. Die Reaktion wird durch Detergenzien und reduzierende Reagenzien gestört. Die Bestimmung wurde mit einem BCA- Kit der Firma Pierce nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. 10 µL der Proteinlö- sungen bzw. eines BSA-Standards wurden in 96-Loch-Platten mit 100 µL BCA-Färbelösung versetzt und für 15 min bei 37°C inkubiert. Die Intensität der Färbung wurde über die Mes- sung der Absorption bei 560 nm im ELISA-Reader bestimmt.

49 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2.2.3. LPS-Dekontamination Bakteriell exprimierte Proteine enthalten große Mengen Endotoxin, die DC und Makrophagen stimulieren. Das bakteriell exprimierte Annexin 1 wurde entweder durch Bin- dung an säulengekoppeltes Polymyxin B (Detoxigel, Pierce) oder durch Waschen mit dem Detergens Triton X-114 dekontaminiert. Für die Dekontamination mit Hilfe der Detoxigel Säulen wurden alle Puffer mit endotoxinfreiem Wasser angesetzt und vor Gebrauch entgast. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolu- men 1 % (w/v) Natrium-Desoxycholat regeneriert, mit 5 Säulenvolumen endotoxinfreiem Wasser gewaschen und mit 5 Säulenvolumen endotoxinfreiem PBS äquilibriert. Ein Säulen- volumen Proteinpräparat wurde auf die Säule gegeben und 15 min bei 4°C mit der Matrix inkubiert. Das Protein wurde mit PBS eluiert, dessen NaCl-Gehalt auf 0,5 M erhöht worden war, um die Effizienz der Elution zu erhöhen. Nach Regeneration mit 5 Säulenvolumen 1 % Natrium-Desoxycholat wurde die Säule zur Dekontamination weiterer Proteinlösungen verwendet oder bis zum nächsten Gebrauch in 25 % Ethanol bei 4°C gelagert. Die Dekontamination mit Triton X-114 erfolgte nicht im Anschluss, sondern während der Proteinreinigung. Das an die IgG-Sepharose gebundene Annexin 1 wurde mit Triton X-114 (0,1 % in TBS) gewaschen (1 L/g Bakterienpellet). Um das Detergens zu entfernen, wurde im Anschluss daran so lange mit TBS gewaschen, bis Triton X-114 anhand einer fotometrischen Messung bei 232 nm nicht mehr nachweisbar war.

II.2.2.4. Bestimmung der LPS-Konzentration Der LPS-Gehalt der Annexin 1-Präparationen wurde mit Hilfe des Limulus-Amöbozyten- Lysat (LAL)-Tests der Firma Cambrex bestimmt. Der Test basiert auf der Aktivität eines Enzyms aus Amöbozyten des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus), das durch LPS aktiviert wird. Wird Amöbozytenlysat mit einer LPS-haltigen Probe versetzt, steigt die Enzymaktivität proportional zur LPS-Konzentration und kann über die Abspaltung von p- Nitroanilin (Absorption bei 405 nm) aus einem farblosen Peptidsubstrat bestimmt werden. Die Proben wurden je nach erwartetem LPS-Gehalt 1:10 bis 1:1000 in endotoxinfreiem Wasser verdünnt und auf 37°C vorgewärmt. Als Standard dienten Verdünnungen einer LPS-Lösung mit Konzentrationen zwischen 2 und 0,125 Europäischen Units (EU) LPS (1 EU entspricht ungefähr 0,1 ng/mL LPS). 50 µl Probe wurden mit 50 µl vorgewärmtem Amöbozyten-Lysat versetzt. Nach 6 min Inkubation bei 37°C folgte die Zugabe des Substrates. Nach zehnminütiger Inkubation wurde die Reaktion mit 10-prozentiger SDS-Lösung abgestoppt und die Absorption der Proben bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt.

II.2.2.5. SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Die Polyacrylamid-Gelelekrophorese dient der Auftrennung von Proteingemischen nach Größe (Laemmli 1970). Das Gel besteht aus einem polymerisierten Gemisch aus Acrylamid 50 II. Material und Methoden Andrea Mahr und Bisacrylamid. Durch das Verhältnis der beiden Chemikalien kann die Porengröße des entstehenden Gels variiert und dem Molekulargewicht der aufzutrennenden Proteine ange- passt werden. Die aufzutrennende Proteinlösung wird mit einem Natriumdodecylsulfat (SDS)- und β-Mercaptoethanol-haltigen Puffer versetzt und erhitzt. Dadurch werden die Proteine denaturiert, und Dodecylsulfat lagert sich mit seinem hydrophoben Rest an die Aminosäure- ketten an. Die Anzahl der angelagerten SDS-Moleküle ist annähernd proportional zum Mole- kulargewicht des Proteins. Da jedes Dodecylsulfat-Molekül eine negative Ladung besitzt, wandern die Proteine im Gel Richtung Anode. Die Laufweite verhält sich umgekehrt proportional zum dekadischen Logarithmus der Masse. Die Gele bestanden aus einem 5-prozentigem Sammelgel und einem 10 bis 12- prozentigem Trenngel. Die Gelzusammensetzung ist bei den Puffern aufgeführt. Die Poly- merisation wurde mit Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumperoxodisulfat (APS) gestartet. Das Trenngel war etwa 55 mm hoch, das Sammelgel 15 mm, die Dicke betrug etwa 1,5 mm. Die Proteinproben wurden mit SDS-Probenpuffer versetzt und für 3 min bei 95°C denaturiert. Die Auftrennung erfolgte für 1-2 h bei 40 mA pro Gel (Spannungsbe- grenzung 140 V). Die Gele wurden direkt für Western Blots verwendet.

II.2.2.6. Lyse eukaryotischer Zellen Eukaryotische Zellen wurden für 5-10 min bei 460 x g und 4°C zentrifugiert und der Über- stand vollständig entfernt. Das Pellet wurde in ca. 100 µl eukaryotischen Lysepuffer pro 1·106 Zellen gründlich resuspendiert und unter gelegentlichem Schütteln 30 min auf Eis lysiert. Die Entfernung von Zellresten erfolgte durch eine Zentrifugation für 30 min bei 12 000 x g und 4°C. Die Proteinkonzentration wurde durch einen BCA-Assay bestimmt. Bis zur weiteren Verwendung konnten die Lysate bei –20°C gelagert werden.

II.2.3. Immunologische Methoden

II.2.3.1. ELISA

Der ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) dient der Detektion von Proteinen in Lösung. Das Protein wird durch spezifische Antikörper erkannt und die Bindung durch eine Enzymreaktion sichtbar gemacht. Im Gegensatz zum Western Blot wird das Protein beim ELISA nicht denaturiert und kann in seiner nativen Struktur vom Antikörper erkannt werden. Zur Bestimmung der Konzentration von humanem und murinem TNF, von murinem MCP-1 sowie humanem IP-10 und IL-10 wurden OptiEIA-Kits der Firma BD Pharmingen verwendet, die nach dem Sandwich-ELISA-System aufgebaut sind. Zur Messung von humanem IL-8 dienten Reagenzien der Firma Immunotools. Protein-Standards und Antikörper wurden nach Herstellerangaben verdünnt. Das Volumen der Proben und des Standards

51 II. Material und Methoden Andrea Mahr betrug abweichend von den Angaben des Herstellers 50 µl pro Loch, da 96-Loch-Platten mit der Hälfte der Standard-Fläche verwendet wurden. Für den Nachweis von murinem TNF wurde der Coating-Puffer 2 (pH 5,5) verwendet, für alle anderen der Coating-Puffer 1 (pH 9,6). Die Beschichtung der Platten mit Capture-Antikörper in Coating-Puffer erfolgte über Nacht bei 4°C. Am nächsten Morgen wurden die Platten fünfmal mit PBST gewaschen und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen für 1 h bei Raumtemperatur mit ELISA-Puffer inkubiert. Nach fünfmaligem Waschen wurde der Zellkulturüberstand auf die Platten gegeben und 1,5 h inkubiert. Im Anschluss wurden die Platten fünfmal gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit dem Detektions-Antikörper und Streptavidin-HRP inkubiert. Nach achtmaligem Waschen erfolgte die Entwicklung mit OPD-Substratlösung

(1-10 min). Die Reaktion wurde mit 25 µl 1,5 M H2SO4 abgestoppt und die Farbintensität bei 490 nm im ELISA-Reader bestimmt.

II.2.3.2. Durchflusszytometrische Messung von Apoptosemerkmalen Ein Durchflusszytometer ermöglicht die Analyse von Oberflächenmolekülen einzelner Zellen. Die Zellen einer Suspension werden im Gerät vereinzelt und mit ein oder zwei LASER-Strahlen verschiedener Wellenlänge bestrahlt. Wurden die Oberflächenmoleküle mit Antikörpern oder Molekülen markiert, die an fluoreszierende Farbstoffe gekoppelt sind, so werden diese durch den LASER zur Emission von Licht einer höheren Wellenlänge angeregt. Dies wird vom Gerät mit Hilfe mehrerer Detektoren quantifiziert. In fixierten Zellen ist auch der Nachweis intrazellulärer Proteine möglich. Zur Beurteilung der Apoptose wurde die Externalisierung von Phosphatidylserin durch Bindung von an Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) gekoppeltes Annexin 5 gemessen. Die Externalisierung von Phosphatidylserin ist ein Merkmal frühapoptotischer Zellen. Spätapop- totische Zellen, deren Membranintegrität zerstört ist, können durch Färbung mit 7-AAD nachgewiesen werden. Der Farbstoff, der in Zellen mit intakter Membran nicht eindringen kann, interkaliert in spätapoptotischen Zellen in deren DNA und kann über seine Fluoreszenz detektiert werden. Zunächst wurden 0,5-1·105 Zellen pro Färbung durch fünfminütige Zentrifugation bei 3500 rpm (5000 x g) bei 4°C pelletiert. Die Pellets wurden in FACS-Puffer aufgenommen und mit den Färbereagenzien versetzt (Annexin 5-FITC 1:25; 7-AAD 1:200). Nach 15-minütiger Inkubation auf Eis wurden die Färbeansätze mit je 1 mL FACS-Puffer versetzt und abzentrifugiert. Nach Aufnahme in 200 µL FACS-Puffer konnten die Proben im Durchflusszytometer gemessen werden. Zur Auswertung diente die Software Cell Quest Pro.

52 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2.3.3. Western Blot Der Western Blot dient dem Nachweis spezifischer Proteine in einem nach Größe aufgetrennten Proteingemisch. Die in einem SDS-Gel aufgetrennten Proteine werden elektropho- retisch auf eine Membran transferiert. Hierfür werden Gel und Membran zwischen Anoden- und Kathodenplatte gebracht, wobei mit Transferpuffer benetzte Filterpapiere den Kontakt zu den Elektroden herstellen. Nach dem Transfer können spezifische Proteine mit Hilfe Peroxi- dase-gekoppelter Antikörper und einem chemilumineszenten Substrat auf einem lichtsensitiven Film sichtbar gemacht werden. 50 µg Zelllysat oder 1-2 µg rekombinantes Protein wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit dem Semi-Dry-Verfahren auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert. Der Transfer erfolgte über einen Zeitraum von 2 h bei 0,8 mA/cm2 Membran. Die Spannung wurde auf 6 V beschränkt. Nach dem Transfer wurden die freien Bindungsstellen der Membran durch einstündige Inkubation in 5 % BSA in TBST abgesättigt. Die Inkubation mit dem Erstantikörper erfolgte je nach Antikörper für 4-16 h. Die Antikörper wurden in den vom Hersteller angegebenen Ver- dünnungen in TBS/0,1 % BSA eingesetzt. Nach drei zehnminütigen Waschschritten mit TBST wurde die Membran für ca. 1 h mit einem HRP-gekoppelten Zweitantikörper inkubiert (Verdünnung 1:10000 in TBST/0,1 % BSA). Nach dreimaligem Waschen mit TBST und Ent- fernung des Detergens durch zweimaliges kurzes Waschen mit TBS wurde frisch angesetzte ECL-Lösung zugegeben. Das Detektionsenzym HRP katalysiert mit den in dieser Lösung enthaltenen Substraten eine Reaktion, die unter Chemilumineszenz abläuft. Diese wurde mit Hilfe eines lichtsensitiven Films detektiert.

II.2.4. Molekularbiologische Methoden

II.2.4.1. Transformation kompetenter Bakterien

E.coli BL21(DE3)pLysS pTK1 Bakterien (Invitrogen, Karlsruhe), die nach der CaCl2-Me- thode kompetent gemacht und bei –80°C gelagert worden waren, wurden auf Eis aufgetaut. Zu 40 µL Bakteriensuspension wurden 2 µL Plasmid-DNA gegeben und einige Minuten auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde dann auf einer auf 37°C vorgewärmten LB-Agarplatte (LB- Medium mit 20 mg/mL Agar) ausgestrichen, die Antibiotika (Kanamycin oder Amipicillin, 50 µg/mL) für die Selektion enthielt. Dieser Temperatursprung (Hitzeschock) führte zur Auf- nahme des Plasmids durch die Bakterien. Nach Inkubation über Nacht konnten einzelne Klone in flüssiges antibiotikahaltiges LB-Medium angeimpft werden, um daraus das Plasmid zu isolieren.

53 II. Material und Methoden Andrea Mahr

II.2.4.2. Isolierung von Plasmid-DNA Zur Präparation von Plasmiden im Miniansatz wurden ca. 1,5 mL einer 3 mL Übernacht- kultur (37°C) der Bakterien bei 13000 rpm in einer Tischzentrifuge 1 min lang abzentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 250 µL P1-Puffer (25 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM Glucose; 10 mM EDTA; 100 µg/mL RNAse A) resuspendiert. Die Lyse der Zellen erfolgte durch Zugabe von 250 µL P2-Puffer (0,2 M NaOH; 1 % SDS) für 5 min bei Raumtemperatur. Dann wurde der Ansatz mit 300 µL eisgekühltem P3-Puffer (3 M Kaliumacetat, pH 4,8) 5 min lang auf Eis neutralisiert. Das Präzipitat aus Protein und genomischer DNA wurde durch Zentrifugation (13000 rpm, 10 min, 4°C) pelletiert. Die Plasmid-DNA wurde aus 500 µL Überstand mit 2 Volumina Ethanol für 5 min bei Raumtemperatur gefällt und abzentrifugiert (10 min, 13000 rpm, 4°C). Das Pellet wurde einmal mit 70-prozentigem Ethanol gewaschen, 20 min luftge- trocknet, und in 50 mL TE-Puffer gelöst. Die erhaltene DNA-Menge lag jeweils bei 30-50 µg. Präparationen im Maxiansatz wurden mit dem EndoFree Plasmid Maxi Kit der Firma Qiagen durchgeführt. Mit dieser Methode wurde verunreinigendes LPS auf weniger als 0,1 EU/µg DNA reduziert. Dies war nötig, um zu verhindern, dass die mit den Plasmiden transfizierten Makrophagen aktiviert wurden. Zudem erhöht ein geringer LPS-Gehalt die Transfektionseffizienz. Die Präparation erfolgte nach Angaben des Herstellers.

II.2.4.3. Isolierung von RNA Die Isolierung von RNA erfolgte im Fall der U-937 Zellen mit dem NucleoSpin® RNA II Kit der Firma Macherey-Nagel, das für 1-5·106 Zellen pro Lysat verwendet werden kann. Aus humanen DC wurde RNA mit dem Absolutely RNA® Microprep Kit der Firma Stratagene isoliert. Dieses Verfahren wurde aufgrund der limitierten Zellausbeute aus einer Blutspende gewählt, da es für kleinere Zellzahlen (1-5·105 Zellen pro Lysat) optimiert ist. Die Isolierung erfolgte nach dem jeweiligen Herstellerprotokoll. Das Prinzip der Isolierung war in beiden Fällen die selektive Bindung der Nukleinsäuren an eine Silica-Membran, die mehrmals gewaschen wurde, um verunreinigende Substanzen zu entfernen. DNA wurde durch Inkubation mit einer RNAse-freien DNAse abgebaut. Nach weiterem Waschen der Membran wurde die RNA mit RNAse-freiem Wasser eluiert. Zur Reinigung der Arbeitsgeräte wurde 70- prozentiger Ethanol sowie RNAse ZAP verwendet. Stets wurden Pipettenspitzen mit Filtern benutzt.

II.2.4.4. RNA-Qualitätsbestimmung mit dem Agilent Chip Die Qualität der isolierten RNA wurde mit dem RNA 6000 Nano Chip Kit der Firma Agilent untersucht. Die Analyse erfolgte nach dem Protokoll des Herstellers. Sie basiert auf dem Prinzip einer miniaturisierten Kapillarelektrophorese (Lab-on-a-Chip-Verfahren). Dabei wird ein Minichip verwendet, der aus einem Netzwerk untereinander verbundener Kanäle besteht. In die Löcher des Chips wurde zunächst ein Gel gegeben, das mit einem 54 II. Material und Methoden Andrea Mahr

Fluoreszenzfarbstoff versetzt worden war. Das Gel wurde mit Hilfe der Chip Priming Station der Firma Agilent durch Überdruck gleichmäßig verteilt. Dann wurden die RNA-Proben sowie ein Molekulargewichts-Standard aufgetragen. Es folgte eine spannungsinduzierte Größen- trennung der RNA-Fragmente nach Molekulargewicht in einem entsprechenden Gerät (Agilent 2100 Bioanalyzer). Mittels einer LASER-induzierten Fluoreszenzdetektion erhielt man am Ende des Laufs ein Elektropherogramm für jede Probe. Anhand der Signale für 28S und 18S rRNA und deren Verhältnis zueinander, sowie anhand des Auftretens von Abbauprodukten wurde von der Software ein sogenannter RIN-Wert (RNA Integrity Number) auf einer Skala von 1 bis 10 ermittelt. Die RIN-Skala (Schroeder et al. 2006) hat sich mittlerweile als Qualitätsstandard für RNA durchgesetzt. Dabei entspricht 1 einer vollständig degradierten RNA, und 10 einer völlig intakten RNA. RNA-Proben mit einer RIN unterhalb von 5 sollen laut Empfehlung des Herstellers nicht für quantitative Analysen der mRNA verwendet werden. RIN-Werte zwischen 8 und 10 entsprechen einer sehr hohen Qualität.

II.2.4.5. Reverse Transkription Mittels Reverser Transkription (RT) kann aus Gesamt-RNA cDNA hergestellt werden. Oligo-dT-Desoxyribonukleotide hybridisieren an das PolyA-Ende der mRNAs und werden als Primer für die RT-Reaktion eingesetzt. Zunächst wurde die RNA mit Oligo-dT-Primern für 10 min bei 72°C denaturiert. Danach wurde der Reaktionsansatz (1 U/µL RNAse-Inhibitor,

1 mM dNTPs, 1 x PCR Buffer II, 5 mM MgCl2, 0,5 U/µL Reverse Transkriptase in 100 µL) für 45 min bei 42°C inkubiert und anschließend für 5 min bei 90°C inaktiviert.

II.2.4.6. Quantitative Real Time-PCR Bei der quantitativen Real Time-PCR werden wie bei der konventionellen PCR-Methode DNA-Abschnitte vervielfältigt. Dem Reaktionsgemisch wird jedoch zusätzlich ein Farbstoff zugesetzt (SYBR Green), der in DNA interkaliert. Das Einlagerungsprodukt aus DNA und Farbstoff kann durch LASER-Licht zur Fluoreszenz angeregt werden. Dies wird ausgenutzt, um bereits während der Reaktion den Anstieg der PCR-Produkte über den Anstieg der Fluo- reszenz nachzuweisen. Da der Anstieg in Proben, die eine höhere Ausgangskonzentration an der jeweiligen cDNA haben, schneller geht als in geringer konzentrierten Proben, lassen sich die Proben so quantitativ bestimmen. Die PCR wurde im ABI PRISM 7700 Sequenz- Detektor durchgeführt. Von jeder Probe wurden Triplikate in einem Reaktionsvolumen von je 25 µL gemessen.

55 II. Material und Methoden Andrea Mahr

Reaktionsschema (Ansatz pro Triplikat): Primerkonzentration (nM) 300 / 300 500 / 500 900 / 900 Primer (forward) (µL) 5,3 8,8 15,8 Primer (reverse) (µL) 5,3 8,8 15,8 SYBR-Green-Mix (µL) 27,6 27,6 27,6 Wasser 31,9 24,8 10,9

Der SYBR-Green-Mix enthielt 300 µL 10 x SYBR-Green-Puffer, 360 µL 25 mM MgCl2, 240 µL dNTPs (je 10 mM), 15U/µL Hot Gold Star Taq-Polymerase und 30 U/µL Uracil-N- Glycosylase. Alle verwendeten Primer wurden in einer Konzentration von 500 nM eingesetzt, bis auf die Primer für GAPDH (900 nM) und TNF (300 nM). Die im Kit in limitierender Menge enthaltenen Enzyme wurden ohne Änderung des Protokolls bisweilen durch andere Produkte (HotGoldStar DNA Polymerase und Uracil-N-Glycosylase, Eurogentec, Köln) ersetzt.

II.2.4.7. Genexpressionsanalysen Genexpressionsanalysen wurden mit Hilfe von Illumina Sentrix® Human Ref-8 Chips durchgeführt. Hierfür wurde RNA wie beschrieben aus 1,5·106 humanen DC pro Probe isoliert. Aus einem Drittel der isolierten RNA wurde cDNA hergestellt, der Rest wurde für die Analysen verwendet, die durch das RZPD (Ressourcenzentrum Primärdatenbank) durchge- führt wurden. Die Auswertung erfolgte mit der Software Illumina Bead Studio.

56 III. Ergebnisse Andrea Mahr

III. Ergebnisse

III.1. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die LPS-induzierte Zytokinsekretion in humanen und murinen DC

Die Aufnahme apoptotischer Zellen durch DC löst in der Regel keine Immunantwort aus, sondern zeigt antiinflammatorische Effekte oder führt sogar zur Induktion von Toleranz (Savill et al. 2002; Steinman & Nussenzweig 2002). Die Phagozytose apoptotischer Zellen wird durch apoptosespezifische Oberflächenmoleküle vermittelt (Lauber et al. 2004). Daher liegt es nahe, dass auch die inhibitorische Wirkung auf die Phagozyten auf spezifischen Molekü- len auf der Oberfläche der apoptotischen Zellen beruht. Das Protein Annexin 1 wird in einem frühen Stadium der Apoptose, etwa zeitgleich mit der Exposition von Phosphatidylserin, aus dem Zytosol auf die Zelloberfläche transloziert. Daher könnte Annexin 1 ein antiinflammatorisches Signal darstellen, das sterbende Zellen an DC übermitteln (Weyd 2005). Um den Effekt apoptotischer Zellen bzw. des Proteins Annexin 1 auf DC zu untersuchen, wurden in vitro-Experimente durchgeführt, in denen DC oder DC-ähnliche Zelllinien mit apoptotischen Zellen oder rekombinantem Annexin 1 vorinkubiert und später mit TLR-Ligan- den stimuliert wurden. Die dadurch induzierte Aktivierung der DC ließ sich je nach Dauer der Stimulation durch verschiedene zelluläre Effekte nachweisen, beginnend mit der intrazellulä- ren Signaltransduktion bis hin zur Sekretion von Zytokinen und der Expression von Aktivie- rungsmarkern auf der Oberfläche (Abb. III.1). Eine antiinflammatorische Beeinflussung der DC durch die Vorinkubation sollte sich in einer verminderten Aktivierbarkeit äußern. Die Sti- muli wurden in sehr geringen Konzentrationen eingesetzt, da eine Inhibition am besten beobachtet werden kann, wenn der Stimulus in nicht sättigenden Konzentrationen verwendet wird. Im Fall der Zelllinien wurden aus diesem Grund regelmäßig Titrationskurven der TLR- Liganden gemessen, um für die folgenden Experimente eine Konzentration im linearen Be- reich der Titrationskurve auszuwählen. Als apoptotische Zellen dienten mit 50 mJ/cm2 UV-C bestrahlte Jurkat-T-Zellen zwei bis vier Stunden nach der Bestrahlung oder spontan sterbende primäre humane neutrophile Granulozyten einen Tag nach ihrer Isolierung. Neben diesen humanen apoptotischen Zellen wurden auch apoptotische murine Thymozyten eingesetzt. In allen Fällen wiesen die verwendeten Zellen einen frühapoptotischen Phänotyp auf, bei dem frühe Merkmale der Apop- tose wie die Exposition von Phosphatidylserin und morphologische Veränderungen bereits nachweisbar waren, die Zellmembran jedoch noch intakt war (Daten nicht gezeigt). Die Wahl frühapoptotischer Zellen spiegelt die Situation in vivo wider, da professionelle Phagozyten apoptotische Zellen im Normalfall rasch beseitigen. Spätapoptotische (sekundär nekrotische) Zellen mit zerstörter Membranintegrität treten daher in vivo kaum auf (Parnaik et al. 2000).

57 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.1. Experimenteller Aufbau. Primäre DC oder Modell-Zelllinien wurden mit apoptotischen Zellen oder Annexin 1 vorinkubiert und mit einem TLR-Ligand stimuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation konnten die dadurch hervorgerufenen Vorgänge und deren Beeinflussung durch die Inkubation analysiert werden. Intrazelluläre Signaltransduktion tritt unmittelbar nach der Stimulation auf. Es folgt die Expression bestimmter mRNAs und die Sekretion von Zytokinen. Zwei Tage nach der Stimulation exprimieren reife DC Aktivierungsmar- ker auf der Oberfläche und besitzen somit die Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation.

Als Phagozyten wurden primäre humane und murine DC sowie verschiedene Zelllinien eingesetzt. Primäre humane DC wurden durch Differenzierung mit GM-CSF und IL-4 aus humanen Monozyten gewonnen. Murine DC stammten aus isolierten Knochenmarkszellen der Maus nach Differenzierung mit murinem GM-CSF. Zelllinien kamen zum Einsatz, um die mit den primären Zellen erhaltenen Ergebnisse zu ergänzen bzw. zu untermauern. Als Mo- dell für humane DC wurde die Zelllinie U-937 nach Differenzierung mit PMA verwendet. Bei U-937 Zellen handelt es sich um eine aus einem histiozytischen Lymphom gewonnene humane monozytische Zelllinie. Die Differenzierung bewirkt eine Adhärenz der Zellen, die mit der Ausbildung DC- bzw. Makrophagen-ähnlicher Eigenschaften einhergeht (Dörner 2007). Daneben wurde die murine Makrophagen-Zelllinie Raw264.7 eingesetzt. Makrophagen ähneln DC in der Signaltransduktion insofern, als sie durch TLR-Stimuli aktivierbar sind und sich durch apoptotische Zellen hemmen lassen (Fadok et al. 1998; McDonald et al. 1999). Die infolge der LPS-Stimulation sezernierten Zytokine wurden mittels ELISA quantifiziert (Abb. III.2.). Im humanen System inhibierten apoptotische Zellen die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF (Abb. III.2.A, E). Bemerkenswerterweise zeigte eine Vorinkubation mit Annexin 1 (1-5 µg/mL) ebenfalls einen hemmenden Effekt auf die TNF- Sekretion (Abb. III.2.B, F). Die Inhibition war dosisabhängig und lag je nach Experiment im Bereich einer 20-80-prozentigen Reduktion. Im Fall der U-937 Zellen wurde Annexin 1 nicht löslich hinzugegeben, sondern an eine mit Phosphatidylserin beschichtete Oberfläche gebunden, auf der anschließend die Phagozyten ausgesät wurden. In dieser Form hemmte es die TNF-Produktion deutlich (Abb. III.2.B), während es in löslicher Form nahezu inaktiv

58 III. Ergebnisse Andrea Mahr war (Daten nicht gezeigt). U-937 Zellen sezernierten nach LPS-Stimulation auch das antiinflammatorische Zytokin IL-10. Dieses war jedoch im Gegensatz zu TNF durch Inkuba- tion mit apoptotischen Zellen oder Annexin 1 nur sehr schwach oder nicht reduziert (Abb. III.2.C, D), es lag also keine globale Inhibition der Zytokinsynthese vor. In humanen DC führte die Stimulation mit den verwendeten niedrigen LPS-Konzentrationen nicht zu einer signifikanten Sekretion von IL-10 (Daten nicht gezeigt). Mit Raw 264.7 Zellen (Abb. III.3.A, C) und mit murinen DC (Abb. III.3.B, D) ergaben sich analoge Ergebnisse für den Einfluss apoptotischer Zellen auf die TNF-Sekretion. Sowohl humane als auch murine apoptotische Zellen (Abb. III.3.A bzw. III.3.B) als auch humanes und murines Annexin 1 (Abb. III.3.C bzw. III.3.D) konnten die TNF-Sekretion in vergleichbarem Maß wie im humanen System unterdrücken. Die Suppression muriner DC durch humane apoptotische Zellen bzw. humanes Annexin 1 weist auf eine Kreuzreaktivität hin. Diese besteht auch in der entgegengesetzten Richtung, insofern als murine apoptotische Zellen auch humane DC inhibieren (Heiko Weyd, persönliche Kommunikation). Diese Ergebnisse machen deutlich, dass sowohl apoptotische Zellen als auch rekombinantes, aufgereinigtes Annexin 1 in der Lage sind, die LPS-induzierte Sekretion des proinflammatorischen Zytokins TNF in humanen und murinen DC zu unterdrücken. Das Ausmaß der Inhibition war experimentabhängig und lag meist im Bereich von 20-80 %, wobei Annexin 1 bisweilen ebenso potent war wie apoptotische Zellen. Der Effekt zeigt eine Kreuz- reaktivität zwischen den Spezies Mensch und Maus.

59 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.2. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsekretion LPS-stimulierter humaner Phagozyten. A) 1· 105 PMA-differenzierte U-937 Zellen wurden mit apoptotischen Jurkat T-Zellen (aJ) in den angegebenen Verhältnissen für 4 h vorinkubiert und dann mit verschiedenen LPS-Konzentrationen stimuliert. Die sezernierte Menge an TNF wurde 16 h später im ELISA gemessen. B) Vertiefungen von Zellkulturplatten wurden mit Phosphatidylserin und danach mit 5 µg Annexin 1 (Anx1) beschichtet. Nach 2 h wurden 1· 105 PMA-differenzierte U-937 Zellen in die beschichteten Vertiefungen ausgesät. Weitere 4 h später folgte die Stimulation mit 5 ng/mL LPS. Die TNF-Konzentration wurde 16 h später im ELISA bestimmt. C) Wie A, die IL-10 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. D) Wie B, die IL-10 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. E) 1· 105 humane DC wurden mit apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) in den angegebenen Verhältnissen für 4 h vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach 16 h wurde die TNF-Konzentration in den Überständen mittels ELISA gemessen. F) 1· 105 humane DC wurden für 6 h mit den angegebenen Konzentrationen an Annexin 1 vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach 16 h wurde die TNF-Konzentration im ELISA gemessen. Fehlerbalken zeigen die Standardabwei- chungen von Triplikaten an. Die Daten sind repräsentativ für jeweils mindestens drei unabhängige Experimente.

60 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsekretion LPS-stimulierter muriner DC und Makrophagen. A) 1· 105 Raw 264.7 Zellen wurden im Verhältnis 5:1 mit apoptotischen humanen Neutrophilen (aNΦ) für 6 h vorinkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen stimuliert. B) 1· 105 primäre murine DC wurden im Verhältnis 5:1 mit apoptotischen murinen Thymozyten (aT) inkubiert und 4 h später mit den angegebenen LPS- Konzentrationen stimuliert. C) 1· 105 Raw 264.7 Zellen wurden mit 5 µg/mL löslichem humanen Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen stimuliert. D) 1· 105 primäre murine DC wurden mit 7 µg/mL murinem Annexin 1 für 6 h inkubiert und mit den angegebenen LPS-Konzentrationen stimuliert. Die Konzentrationsbestimmung des Zytokins TNF erfolgte in allen Fällen 16 h nach Stimulation mittels ELISA. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von Triplikaten an. Jedes der gezeigten Resultate ist repräsentativ für mindestens drei unabhängige Experimente.

61 III. Ergebnisse Andrea Mahr

III.2. Annexin 1 inhibiert die Zytokinsekretion nach TLR-Stimulation auch in Gegenwart der LPS-blockierenden Substanz Polymyxin B

Die Inhibition der TNF-Produktion durch rekombinantes Annexin 1 ist ein Hinweis auf eine mögliche Rolle dieses Proteins bei der Vermittlung des antiinflammatorischen Effekts apoptotischer Zellen. Die Verwendung bakteriell exprimierter und aufgereinigter Proteine in Experimenten mit DC oder Makrophagen birgt jedoch die Gefahr, dass bakterielle Substan- zen, die bei der Aufreinigung nicht vollständig entfernt wurden, das Ergebnis verfälschen. Dies betrifft insbesondere das in E.coli reichlich vorhandene und durch die üblichen Aufreini- gungsmethoden kaum vollständig zu entfernende LPS, das in geringsten Mengen zu einer Stimulation der Zellen über TLR4 führt. Bei Untersuchungen zur Suppression der TLR- Signaltransduktion besteht hier vor allem die Gefahr von Artefakten, die durch Endotoxin- Toleranz auftreten können. Hierbei handelt es sich um eine Phase vorübergehender Nichtreaktivität gegenüber weiterer TLR-Stimulation nach Kontakt mit LPS (siehe I.4.5.). Da in dem verwendeten Protokoll nach mehrstündiger Vorinkubation mit einem aus Bakterien gewonnenen Protein eine Hemmung der Reaktion auf einen nachfolgenden TLR-Stimulus beobachtet wurde, kann man ohne weitere Kontrollen nicht darauf schließen, ob Annexin 1 oder das in der Präparation enthaltene LPS diesen Effekt verursacht. Aus dem in dieser Arbeit verwendeten Annexin 1 wurde LPS weitgehend entfernt. Dies geschah entweder durch selektive Bindung des LPS an säulengekoppeltes Polymyxin B, oder durch ausgiebiges Waschen von säulengebundenem Annexin 1 mit dem Detergens Triton X-114. Geringe Reste von LPS verblieben jedoch in der Präparation, wie mit Hilfe des LAL-Tests zum Nachweis von LPS bestimmt wurde. Die Endkonzentration des durch das Annexin in das Kulturmedium eingebrachten LPS betrug je nach Annexin 1-Präparation in etwa zwischen 0,02 und 1 EU/mL (2-100 pg/mL). Um zu beurteilen, inwiefern mit Endotoxin-Toleranz durch diese Verunreinigung zu rechnen ist, wurden die Zellen mit entsprechenden LPS-Konzentrationen anstelle von Annexin 1 vorinkubiert und dann stimuliert. Die Toleranzinduktion war zelltypabhängig unterschiedlich stark ausgeprägt. Im Fall der humanen DC war die Zytokinproduktion tatsächlich vermindert, während im U-937 System kein inhibitorischer Effekt sichtbar war (Daten nicht gezeigt sowie H. Weyd, persönliche Kommunikation). Im murinen System wurde der Einfluss einer Vorinkubation mit entsprechenden LPS-Konzentrationen noch nicht getestet, jedoch konnte hier ein Annexin 1-spezifischen Antikörper zumindest in einigen Experimenten den inhibitorischen Effekt der Proteinpräparation aufheben, was auf einen spezifischen Annexin 1-Effekt hindeutet (Dörner 2007).

62 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Um die antiinflammatorischen Eigenschaften von Annexin 1 unter Ausschluss einer mög- lichen Endotoxin-Toleranz auch bei primären humanen DC zu beurteilen, wurde dem Kultur- medium das Antibiotikum Polymyxin B zugesetzt, das an LPS bindet und dadurch dessen Effekt neutralisiert. Die verwendete Konzentration von Polymyxin B (10 µg/mL) zeigte in der FACS-Analyse von Zelltodmerkmalen vernachlässigbare Toxizität auf die Zellen (Daten nicht gezeigt). Sie führte jedoch zu einer vollständigen Inhibition der TNF- und IL-8-Sekretion nach Stimulation der DC mit 10 ng/mL LPS, einer verglichen mit der kontaminierenden LPS- Menge um mehr als 1000-fach höheren Konzentration (Daten nicht gezeigt). Als Stimulus wurde anstelle von LPS das bakterielle triacylierte Lipopeptid Pam3CSK4 verwendet. Die Stimulierbarkeit der DC durch diesen Liganden, der an das Heterodimer aus TLR2 und TLR1 bindet, wurde durch Polymyxin B nicht beeinflusst (Abb. III.4.D). Die Pam3CSK4-induzierte Sekretion von TNF, IL-8 und IL-6 wurde durch Annexin 1 in Anwesenheit von Polymyxin B um durchschnittlich 50 % verringert (Abb. III.4. A-C). Die Inhibition humaner DC durch Annexin 1 war in Anwesenheit von Polymyxin B meist kaum vermindert (Abb. III.4.D), was darauf schließen lässt, dass Endotoxin-Toleranz bei dem beobachteten Effekt keine große Rolle spielt. In einigen Experimenten war die LPS-Toleranz deutlicher zu erkennen, sie trug aber nie mehr als etwa 40 % zu dem beobachteten antiinflammatorischen Effekt der Annexin 1-Präparation bei (Daten nicht gezeigt). Die Potenz von Polymyxin B zeigte sich bei Verwendung stark LPS-kontaminierter Annexin 1- Präparationen. Diese führten bereits ohne weitere LPS-Stimulation zu einer hohen TNF-Produktion, die jede weitere TLR-Stimulation um Größenordnungen übertraf. In Anwesenheit von Polymyxin B kehrte sich der Effekt solcher kontaminierter Präparationen jedoch um, und die Pam3CSK4-induzierte TNF- Sekretion wurde inhibiert (Abb. III.4.D). Auch für andere Stimuli und für Effekte auf mRNA- und Signaltransduktionsebene wurde beobachtet, dass die antiinflammatorische Wirkung der Annexin 1-Präparation auch in Anwesenheit von Polymyxin B noch vorhanden war (Abb.III.16.B, C, Abb.III.17.E und Daten nicht gezeigt). Insgesamt ergibt sich das Bild, dass humane DC zwar auf geringe LPS-Konzentrationen durchaus mit Endotoxin-Toleranz reagieren können, dass diese jedoch bei Verwendung des bakteriell exprimierten Annexin 1 nahezu keine Rolle spielt. Der inhibierende Effekt ist folglich auch in primären humanen DC vielmehr dem Annexin 1 selbst zuzuschreiben.

63 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Zytokinsekretion auch in Gegenwart der LPS- neutralisierenden Substanz Polymyxin B. A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 10 µg/mL Polymyxin B sowie 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und mit 4 ng/mL Pam3CSK4 (PAM3) stimuliert. Am nächsten Tag wurde die Konzentration des sezernierten TNF im ELISA bestimmt. B) Wie A, die IL-8 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. C) Wie A, die IL-6 Konzentration wurde im ELISA bestimmt. D) 1· 105 primäre humane DC wurden in An- oder Abwesenheit von 10 µg/mL Polymyxin B (PoMB) mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht inkubiert. Das verwendete Annexin 1 war dabei entweder mit Hilfe von säulengebundenem Polymyxin B von verunreinigendem LPS dekontaminiert worden, oder die Präparation enthielt noch große Mengen LPS (*). Nach über Nacht Inkubation wurden die Zellen mit 4 ng/mL

Pam3CSK4 stimuliert. Die Konzentration an sezerniertem TNF wurde im ELISA bestimmt.

III.3. Apoptotische Zellen sowie Annexin 1 beeinflussen die Zytokinsynthese auf Ebene der mRNA

Die Produktion von Zytokinen wird auf mehreren Ebenen reguliert. Neben der Transkrip- tion können das Spleißen der prä-mRNA, die mRNA-Stabilität oder posttranslationale Schritte wie etwa die Spaltung bestimmter Zytokine wie IL-1β oder TNF durch Proteasen sowie die Sekretion betroffen sein. Aufgrund der Vielfalt an Regulationsmechanismen stellt sich die Frage, ob sich die beobachtete Regulation der Zytokine durch Annexin 1 bzw. apoptotische Zellen schon auf der Ebene der mRNA-Transkripte widerspiegelt. Um dies zu untersuchen, wurden zunächst U-937 Zellen mit apoptotischen Jurkat-T-Zellen vorinkubiert und mit LPS stimuliert. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Stimulation wurden die Zellen geerntet und die RNA isoliert. Die Qualität der isolierten RNA wurde durch

64 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Kapillarelektrophorese unter Verwendung von RNA Nano Chips der Firma Agilent untersucht und war jeweils sehr hoch (RIN zwischen 8 und 10). Quantitative PCR gab Aufschluss über die Kinetik der transkriptionellen Zytokinregulation und die Beeinflussung durch apoptotische Zellen. Es zeigte sich, dass die Menge an TNF mRNA relativ rasch anstieg, nach etwa einer Stunde ein Maximum erreichte, und innerhalb von fünf Stunden wieder abfiel. In Anwesen- heit apoptotischer Zellen war die Menge an TNF mRNA im Vergleich zur Kontrolle zu jedem Zeitpunkt reduziert (Abb. III.5.A). Die IL-10 mRNA wurde in ähnlicher Weise wie TNF durch LPS hochreguliert, jedoch mit unterschiedlicher Kinetik. Das Expressionsmaximum trat spä- ter auf und die Expression hielt länger an. Die Anwesenheit apoptotischer Zellen hatte in Analogie mit den für sezerniertes IL-10 gefundenen Daten keinen signifikanten Einfluss auf die Menge an IL-10 mRNA (Abb. III.5.B).

Abb. III.5. Die Hemmung der Zytokinproduktion durch Annexin 1 erfolgt auf Ebene der mRNA. A) 3· 106 U-937 Zellen wurden mit apoptotischen Jurkat T-Zellen (aJ) für 4 h inkubiert. Nach Entfernung nicht phagozytierter apoptotischer Zellen durch Medienwechsel wurden die U-937 Zellen für verschiedene Zeiten mit 10 ng/mL LPS stimuliert. Mittels quantitativer RT-PCR wurde die Induktion der TNF mRNA gemessen. B) Wie A, die Induktion der IL-10 mRNA wurde mit quantitativer RT-PCR bestimmt. C) 4· 105 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde die Induktion der TNF mRNA mit quantitativer RT-PCR bestimmt. D) Wie C, die Induktion der IL-8 mRNA wurde mittels quantitativer PCR gemessen.

65 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Ein Problem bei der Untersuchung von Effekten im Kokultur-System aus Phagozyten und apoptotischen Zellen sind mögliche Kontaminationen mit apoptotischem Zellinhalt, die nur bei den behandelten Phagozyten auftreten und eventuell selbst durch Abwaschen der nicht phagozytierten apoptotischen Zellen vor Herstellung der Lysate nicht ausgeschlossen werden können. Daher wurde die Menge an CD3 mRNA in den RNA-Präparationen untersucht. Diese für die apoptotischen Jurkat-T-Zellen spezifische mRNA fand sich tatsächlich selektiv in den behandelten U-937 Zellen wieder, jedoch nur in sehr geringen Mengen (Daten nicht gezeigt). In weiteren Experimenten wurden die Phagozyten mit rekombinantem Annexin 1 anstelle apoptotischer Zellen vorinkubiert. Stimulation primärer humaner DC mit LPS führte wie bei den U-937 Zellen zu einem schnellen und vorübergehenden Anstieg der TNF mRNA, mit einem Maximum ca. zwei Stunden nach Stimulation. In Anwesenheit von Annexin 1 waren die Transkriptmengen zu jedem beobachteten Zeitpunkt reduziert, in dem gezeigten Experi- ment (Abb. III.5.C) um mehr als 50 %. Ebenso konnte eine Reduktion der induzierten IL-8 mRNA beobachtet werden (Abb. III.5.D). Ähnliche Experimente wurden mit vergleichbaren

Ergebnissen auch mit dem TLR2-Stimulus Pam3CSK4 durchgeführt (vgl. Abb. III.16.C und Abb. III.17.E). In diesen Experimenten wurde vor der Inkubation mit Annexin 1 die LPS-inhibierende Substanz Polymyxin B zugegeben, um Endotoxin-Toleranz auszuschließen. Um zu untersuchen, wie Annexin 1 das globale Transkriptionsprofil LPS-stimulierter humaner DC beeinflusst, wurden zwei unabhängige Genexpressionsanalysen (Microarrays) durchgeführt. In einem Experiment betrug die Vorinkubationszeit mit Annexin 1 vier Stunden, im anderen Fall wurden die DC zusätzlich über Nacht mit Annexin 1 inkubiert. Von einem Teil der RNA wurde im Vorfeld cDNA synthetisiert, um die Suppression der mRNAs von TNF und IL-1β zu beurteilen. Abb. III.6.A und B zeigen beispielhaft für eines der beiden Experimente, dass die mRNAs dieser Zytokine durch Annexin 1 signifikant herunterreguliert waren. Dies wurde als Kriterium verwendet, um für die restliche RNA das gesamte Transkriptionsprofil zu analysieren. Ein weiteres Kriterium für die Verwendung der RNA für diese Zwecke war die Annexin 1-abhängige Herunterregulation der Zytokine auf der Ebene der sezernierten Pro- teine in einem Experiment, das mit DC der gleichen Zellpräparation parallel durchgeführt wurde (ELISA; Daten nicht gezeigt). Abb. III.6.C zeigt die Expressionsmuster verschiedener proinflammatorischer Gene, wie sie mit Hilfe des Microarrays gemessen wurden. Gezeigt sind die Ergebnisse für alle Gene, die sich (1.) unter den 20 durch LPS am höchsten induzierten mRNAs befanden und die (2.) bekanntermaßen DC-typische proinflammatorische Zytokine oder – im Fall von Cyclooxygenase 2 (COX2) – Enzyme darstellen. Für alle Gene, die diesen Kriterien entsprachen, ergab sich das gleiche Muster der Regulation (Abb. III.6.C): Anwesenheit von Annexin 1 ohne weitere Stimulation für fünf Stunden oder über Nacht führte zu einer schwachen Hochregulation, wobei dies nach Inkubation über Nacht noch ausge-

66 III. Ergebnisse Andrea Mahr prägter war. Durch Stimulation mit LPS für eine Stunde wurde die Expression sehr stark er- höht. Diese Hochregulation war jedoch in Anwesenheit von Annexin 1 deutlich schwächer, vor allem im Fall von IL-6, IL-1β, COX2, IL-23α, IL-1α und IL-12β. TNF und IL-8 waren weniger stark betroffen. Eine Wiederholung des Experiments lieferte ein vergleichbares Ergebnis (Abb. III.6.D). Zwar war die Induktion der einzelnen Gene in beiden Experimenten (donorab- hängig) unterschiedlich stark, jedoch konnte das Muster der Regulation durch Annexin 1 reproduziert werden.

Abb. III.6. Die transkriptionelle Inhibition durch Annexin 1 umfasst die wichtigsten LPS-induzierten proinflammatorischen Gene. A) 1,5· 106 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 4 h oder über Nacht (üN) inkubiert und für 1 h mit 1 ng/mL LPS stimuliert oder unbehandelt belassen. Aus einem Teil der gewonnenen RNA wurde cDNA synthetisiert, und die Menge an induzierter TNF mRNA mittels quantitativer PCR bestimmt. B) Wie A, die Induk- tion der IL-1β mRNA wurde mittels quantitativer PCR gemessen. C) Wie A, ein Teil der gewonnenen RNA wurde mit Hilfe eines Illumina Sentrix® Human Ref-8 Chips analysiert. Gezeigt sind die durch LPS am stärksten induzierten proinflammatorischen Gene. D) In einem weiteren Experiment wurden 1,5· 106 primäre humane DC für 4 h mit 5 µg/mL Annexin 1 inkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Nach quantitativer PCR-Analyse für einige Kon- trollgene (analog zu A, B) wurde ein Teil der RNA für die Analyse in einem weiteren Illumina Sentrix ® Human Ref-8 Chip verwendet.

Eine Diskrepanz mit den durch quantitative PCR erhaltenen Daten zeigte sich im Fall der TNF mRNA. Diese zeigte sich im Microarray durch Annexin 1 nicht signifikant reduziert. Die

67 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Ursache für diesen Widerspruch ist unklar, jedoch wurde zur Klärung der widersprüchlichen Ergebnisse in einem anderen Labor eine unabhängige quantitative PCR mit anderen Primern sowie einer anderen Methode (Taqman PCR) durchgeführt. Hierbei ergab sich ebenfalls eine mehr als 50-prozentige Herunterregulation der LPS-induzierten TNF mRNA (Christina Falschlehner, persönliche Kommunikation). Für IL-1β stimmte der Chip mit der Kontrolle im Regulationsmuster überein. Insgesamt wurden etwa 120 Gene durch LPS mehr als zweifach induziert (blau in Abb.III.7.A). Ein Teil dieser Gene war nach vorheriger Inkubation mit Annexin 1 vermindert exprimiert, z.B. IL-1α, COX2, Pentraxin 3 (PTX3) und Early Growth Response 1 (Egr1). Andere Gene waren nicht betroffen (z.B. NFKBIA, das Gen für IκBα), und eine weitere Gruppe sogar verstärkt induziert (z.B. TRAF1) (Abb.III.7.B). Dieses Regulationsmuster war in beiden Analysen weitgehend reproduzierbar. Ein auffälliger Unterschied zwischen den beiden Analysen lag darin, dass LPS nur im gezeigten Fall – möglicherweise donorspezifisch – zur Induktion von IFNβ und von IFN-abhängigen Genen wie CXCL10 (IP-10), IFN- stimuliertem Gen 15 (ISG15) und weiteren (in Klammern in Abb.III.7.A) führte. In ähnlicher Weise gehörten nur in der gezeigten Analyse bestimmte IFN-abhängige Gene (in Klammern in Abb.III.7.B) zur durch Annexin 1 positiv regulierten Gruppe. Abgesehen davon war der Einfluss von Annexin 1 auf LPS-regulierte Gene in beiden Analysen sehr ähnlich. Interessant ist auch die durch Inkubation mit Annexin 1 selbst verursachte Genregulation (Abb.III.7.C und Tabellen V.1. und V.2. im Anhang). Viele Gene waren in beiden Analysen mit gleicher Tendenz reguliert. Reproduzierbar herunterreguliert waren z.B. Egr1, IL-8- Rezeptor β (IL8RB) und CD14. Unter den induzierten Genen waren auch einige, die durch LPS ebenfalls hochreguliert wurden, vor allem Zytokine und Chemokine wie IL-1β, IL-8, IL-6 und CCL20. Diese wurden durch Annexin 1 jedoch wesentlich schwächer beeinflusst als durch LPS. Da die Genexpressionsanalysen nicht unter Verwendung der LPS-blockierenden Substanz Polymyxin B durchgeführt wurden, muss in weiteren Experimenten geklärt werden, ob das beobachtete Regulationsmuster ausschließlich durch Annexin 1 selbst hervorgerufen wurde. Die Expressionsprofile nach (fünfstündiger) Annexin 1- und (einstündiger) LPS- Behandlung sind zumindest nicht identisch, denn durch Annexin 1 wurden auch nicht LPS- induzierte Gene verstärkt exprimiert, z.B. Regulator of G-Protein Signalling 16 (RGS16), CCR7 und SOCS2, während einige LPS-induzierte Gene wie Egr-1 durch Annexin 1 deutlich herunterreguliert wurden (Abb.III.7.C). Ein Teil der Beobachtungen wurde zudem auch unter Ausschluss von LPS-Effekten bestätigt: Die Induktion von TNF, IL-8 und IL-1β durch Annexin 1 war in Anwesenheit von Polymyxin B bei einigen Spendern nicht mehr feststellbar, bei anderen jedoch nach wie vor schwach vorhanden. Die Annexin 1-vermittelte Hemmung der LPS-induzierten Expression dieser Gene ist auch unter Ausschluss von LPS-Effekten deutlich (Abb. III.17.E und Daten nicht gezeigt).

68 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Insgesamt zeigt sich ein deutlicher negativ regulatorischer Einfluss von Annexin 1 auf die Transkription proinflammatorischer Gene in LPS-stimulierten humanen DC. Die nach Vorinkubation mit Annexin 1 selbst hochregulierten Gene umfassten einen Teil der LPS- induzierten Gene sowie weitere Transkripte. Zumindest ein Teil der beobachteten Effekte ist somit auf die Aktivität von Annexin 1 selbst zurückzuführen, eine endgültige Klärung kann jedoch nur eine Genexpressionsanalyse in Anwesenheit von Polymyxin B liefern.

g A CCL3 Abb. III.7. Annexin 1 beeinflusst das NFKBIA IL1β TNF Transkriptionsprofil humaner DC. CCL20 CCL4 6 104 IL-6 IL-1α 1,5· 10 primäre humane DC wurden mit IL-8 DUSP2 (ISG15) 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 4 h vorinku- IL-23α CXCL2 Egr1 biert und für 1 h mit 1 ng/mL LPS stimuliert (IFNβ1) 103 COX2 oder unbehandelt belassen. Gezeigt ist der [willkürliche Einh.] [willkürliche

(CXCL10) SOCS2 Einfluss von Annexin 1- bzw. LPS-Be- IFIT3 handlung auf die Regulation aller signifikant Expression in LPS-stimulierter in LPS-stimulierter Expression Probe 102 LPS exprimierten Gene für das auch in 2 3 4 102 103 104 Abb.III.6.D gezeigte Experiment. Die dia- Expression in unstimulierter Probe [willkürliche Einh.] gonalen Linien zeigen Identität (fett) und zweifache Änderung (dünn) der Expression NFKBIA B CCR7 EBI3 nach oben und unten an. Vor allem im STAT1 RELB SOCS2 (ISG15) TNF ISG20 rechten oberen Quadranten (stark expri- 4 104 (IFIT3) IL-1β CCL20 TRAF1 mierte Gene) kann eine weniger als zweifa- (IFI44L) IL-6 IL-8 che Änderung auch signifikant sein. Durch (CXCL10) DUSP2 ZFP36 3 RGS16 LPS mehr als zweifach induzierte Gene 103 IL23α TNC CCXL2 IL-1α [willkürliche Einh.] [willkürliche CD14 sind durch fettgedruckte blaue Punkte

IFNβ1 Egr1 markiert und direkt oder mit Pfeilen

2 LPS 102 PTX3 COX2 beschriftet. Durch LPS weniger als

Expression in Anx1/ LPS-stimulierter Probe LPS-stimulierter Probe in Anx1/ Expression RGS18 Anx1

10 2 10 3 10 4 zweifach induzierte sowie inhibierte Gene 102 103 104 Expression in LPS-stimulierter Probe [willkürliche Einh.] sind durch einfache Punkte markiert und mit Linien versehen. Gene, die in der CCR7 TNFAIP2 DUSP1 unabhängigen Analyse nicht in der gleichen C ISG20 DUSP5 (Mx1) Weise reguliert waren wie im gezeigten 1044 Bcl3 (IFIT2) Fall, sind in Klammern gesetzt. IL1β SOCS2 A) Gezeigt ist die Änderung der Genregula- IL-6

3 CCL20 tion durch LPS-Stimulation im Vergleich zu 103 CD14 IL-8 unstimulierten DC. B) Gezeigt ist die Ände- [willkürliche Einh.] [willkürliche (CXCL10) RGS16 rung der Genregulation durch Annexin 1-

1022 IL-8RB Vorbehandlung im Vergleich zu mit einfa- Expression in Anx1-behandelter Probe Probe in Anx1-behandelter Expression Egr1 Anx1 2 3 4 cher LPS-Stimulation behandelten DC. C) 102 103 104 Expression in unstimulierter Probe [willkürliche Einh.] Gezeigt ist die Änderung der Genregulation durch 5 h Annexin 1-Behandlung.

69 III. Ergebnisse Andrea Mahr

III.4. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivierung von MAP-Kinasen

Die Reduktion der mRNA-Expression TLR-induzierter Zytokingene durch Annexin 1 lässt vermuten, dass bereits die TLR-induzierten Signalwege inhibiert werden. Eine Folge der TLR-Stimulation ist die Aktivierung der MAP-Kinasen p38, JNK und Erk. Um zu beurteilen, ob Annexin 1 diese beeinflusst, wurde die Phosphorylierung der MAP-Kinasen in Zelllysaten von U-937 und humanen DC im Western Blot untersucht. Kinetiken zeigten, dass in beiden Zell- typen eine Stimulation mit LPS zu einem raschen Anstieg der Phosphorylierung von p38 und JNK führt. Eine maximale Phosphorylierung wurde nach etwa 30 Minuten beobachtet. Eine Phosphorylierung von Erk trat durch Stimulation mit den sehr gering gewählten LPS-Kon- zentrationen jeweils nicht auf (Abb. III.8.A, B).

Abb. III.8. LPS-Stimulation führt in U-937 Zellen und humanen DC zur Phosphorylierung von MAP-Kina- sen. A) 1,5· 106 PMA-differenzierte U-937 Zellen wurden für die angegebenen Zeitintervalle mit 10 ng/mL LPS stimuliert und anschließend lysiert. Die Phosphorylierung von Erk, p38 und JNK wurde mittels Western Blot analysiert. B) 1· 106 primäre humane DC wurden für verschiedene Zeitintervalle mit 1 ng/mL LPS stimuliert und anschlie- ßend lysiert. Die Analyse der Phosphorylierung von Erk, p38 und JNK erfolgte mittels Western Blot.

Zur Untersuchung des Effekts von Annexin 1 auf die LPS-induzierte Phosphorylierung von MAP-Kinasen wurden U-937 Zellen in An- oder Abwesenheit von Annexin 1 für 30 Minuten mit verschiedenen LPS-Konzentrationen stimuliert. Dabei zeigte sich, dass die Phosphorylierung von p38 und JNK in Anwesenheit von Annexin 1 leicht abgeschwächt war (Abb. III.9.A, B).

70 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.9. Annexin 1 inhibiert die Phosphorylierung von p38 und JNK in U-937 Zellen. A) Annexin 1 (Anx1) wurde an mit Phosphatidylserin beschichtete Zellkulturplatten gebunden. Nach 2 h wurden 1,5· 106 PMA-differenzierte U-937 Zellen in die beschichteten Vertiefungen ausgesät. Nach weiteren 4 h wurden die Zellen mit den angegebenen LPS-Konzentrationen für 30 Minuten stimuliert. Die Lysate wurden im Western Blot bezüglich der Phosphorylierung von p38 untersucht. B) Wie A, im Western Blot wurde die Phosphorylierung der JNK Kinase analysiert.

Mit humanen DC ergab sich ein ähnliches Bild (Abb. III.10.). Aufgrund begrenzter Zell- ausbeuten konnte nicht in jedem Experiment die Phosphorylierung aller MAP-Kinasen untersucht werden. Von insgesamt acht unabhängigen Experimenten war in drei Fällen die Phosphorylierung von p38 in Anwesenheit von Annexin 1 leicht reduziert. Dies war zu allen untersuchten Zeitpunkten nach der Stimulation erkennbar (Abb. III.10.A). In zwei Experi- menten zeigte sich eine sehr deutliche Reduktion der Phosphorylierung. In einem dieser Fälle wurde auch die Phosphorylierung von JNK und Erk bestimmt, die ebenfalls reduziert war (Abb. III.10.B). In drei Experimenten war im Western Blot keine Änderung durch Annexin 1 sichtbar.

Abb. III.10. Annexin 1 inhibiert die Phosphorylierung von p38, JNK und Erk in primären humanen DC. A) 1· 106 primäre humane DC wurden mit 3 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und mit 1 ng/mL LPS für die angegebenen Zeitintervalle stimuliert. Die Phosphorylierung von p38 wurde in den Lysaten mittels Western Blot bestimmt. B) 1· 106 primäre humane DC wurden mit 3 µg/mL Annexin 1 für 6 h vorinkubiert und für 30 min mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Phosphorylierung der MAP Kinasen p38, JNK (Pfeilspitzen) und Erk in den Lysaten wurde im Western Blot analysiert.

71 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Eine leichte Reduktion der p38-Phosphorylierung wurde auch mit Raw264.7 Zellen beobachtet (Abb. III.11.B oben). Die Ergebnisse ließen vermuten, dass Annexin 1 die Aktivie- rung von MAP-Kinasen hemmt, sie jedoch nicht vollständig verhindert. Da im Western Blot die Hemmung in einigen Fällen schwer zu beurteilen war, wurde zur unabhängigen Bestäti- gung der Ergebnisse die Aktivität der p38 Kinase in Lysaten von Raw264.7 Zellen bestimmt. Aktivitätsmessungen von Kinasen stellen den funktionell relevanten Parameter dar, und ermöglichen eine sensitivere Messung, da jedes einzelne aktive Kinase-Molekül eine große Menge an Substrat phosphorylieren kann. Zu diesem Zweck wurde die phosphorylierte Kinase immunpräzipitiert und mit den Substraten ATP sowie ATF-2 inkubiert. Die Menge an phosphoryliertem ATF-2 wurde im Western Blot bestimmt. Da nicht die gesamte p38 Kinase, sondern nur die phosphorylierte Form präzipitiert wurde, war es nicht möglich, eventuelle beim Waschen der Präzipitate entstandene Verluste an aktiver Kinase durch Detektion der in den einzelnen Proben noch enthaltenen Gesamtmenge an p38 zu beurteilen. Um eine Lade- kontrolle zu erhalten, wurde den Lysaten daher ein biotinylierter Antikörper (DAC5-Biotin) sowie an Agarose-Kügelchen gekoppeltes Streptavidin zugegeben (Abb. III.11.A).

Abb. III.11. Annexin 1 senkt die LPS-induzierte Aktivität der p38 Kinase in Raw 264.7 Zellen. A) Prinzip der Kinase-Aktivitätsmessung mit Lade- kontrolle. Aus den stimulierten Zelllysaten wurde die phosphorylierte Kinase mit Hilfe von an Agarose ge- koppeltem Anti-Phospho-p38 Antikörper präzipitiert. Die Aktivität der isolierten Kinase wurde anhand der ATP-abhängigen Phosphorylierung des Substrats ATF-2 analysiert. Phosphoryliertes ATF-2 wurde im Western Blot quantifiziert. Als Ladekontrolle diente ein System aus Streptavidin-Agarose und einem biotiny- lierten Antikörper (DAC5). Dieser wurde durch spezifische Bindung des Biotin an das an Agarose gekoppelte Streptavidin präzipitiert und konnte mittels Streptavidin-HRP im Western Blot quantifiziert werden. B) 4· 106 Raw 264.7 Zellen wurden mit 4 µg/mL Annexin 1 (Anx1) über Nacht inkubiert und für die angegebenen Zeitintervalle mit 5 ng/mL LPS stimuliert. Ein Teil der Lysate wurde für die Bestimmung von Phospho-p38 im Western Blot verwendet (WB). Aus einem Teil der Lysate wurde die phosphorylierte p38 Kinase präzipitiert und ihre Aktivität anhand der Phosphorylierung von ATF-2 wie in A beschrieben im Western Blot ermittelt (KA).

72 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Der Verlust an präzipitertem biotinyliertem Antikörper entspricht dem Verlust an phospho- rylierter Kinase und kann im Western Blot durch Detektion mit Streptavidin-HRP quantifiziert werden. Zwei von drei unabhängigen Experimenten mit diesem System zeigten eine Reduktion der p38 Kinase-Aktivität. Die Kinase-Aktivitätsmessung war dabei jeweils deutlich sensitiver als die Quantifizierung der phosphorylierten Kinase im Western Blot (Abb. III.11.B). Insgesamt weisen die Ergebnisse auf eine Hemmung der Aktivität von MAP-Kinasen durch Annexin 1 hin. Am besten wurde dies bislang für p38 untersucht. Das Ausmaß der Hemmung war jedoch variabel und die Reduktion war im Durchschnitt nicht größer als 30-40 %.

III.5. Annexin 1 inhibiert die TLR-induzierte Aktivität von NF-κB

Neben MAP-Kinasen wird TLR-abhängig auch der Transkriptionsfaktor NF-κB aktiviert. Dieser spielt ebenfalls eine entscheidende Rolle bei der Expression proinflammatorischer Zytokingene. Um den Einfluss von Annexin 1 auf diesen Prozess zu beurteilen, wurde zu- nächst im Western Blot der Effekt auf die Phosphorylierung und Degradation von IκBα im Western Blot bestimmt. Dabei zeigte sich jedoch, dass bei den verwendeten geringen LPS- Konzentrationen keine signifikante Änderung dieser Parameter zu beobachten war (Daten nicht gezeigt). Vermutlich war wie im Fall der Erk-Phosphorylierung (Abb. III.8.) die Methode nicht sensitiv genug zur Erfassung geringer Unterschiede. Eine sensitivere Methode zur Be- stimmung der NF-κB-Aktivität stellen Experimente mit NF-κB Reporterplasmiden dar. Hierfür wurde die Zelllinie Raw264.7 verwendet. Im Gegensatz zu humanen DC konnte diese Zelllinie relativ effizient mit einem Reporterplasmid transfiziert werden, das Firefly-Luziferase unter einem NF-κB-abhängigen Promoter exprimiert. Mit GFP-Reporterplasmiden wurde in Vorversuchen beobachtet, dass die erreichte Transfektionseffizienz bei etwa 30 % lag. Mit anderen Transfektionsreagenzien wurde aufgrund der generellen Schwierigkeiten bei der Transfektion von Makrophagen (Dokka et al. 2000) noch geringere Effizienzen erreicht. Zur Normierung der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität auf die Transfektionseffizienz wurde ein Plasmid kotransfiziert, das Renilla-Luziferase unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors kodiert. Nach der Transfektion wurden die Zellen in An- oder Abwesenheit von Annexin 1 oder apoptotischen humanen Neutrophilen inkubiert und mit LPS für acht Stunden stimuliert. Messung der NF-κB-induzierten Luziferase-Aktivität in den Lysaten ergab, dass diese in Anwesenheit von Annexin 1 oder apoptotischen Zellen um etwa 50 % reduziert war (Abb. III.12.). Die gezeigten Daten sind repräsentativ für zwei von vier Experimenten. In den anderen beiden Fällen war die Inhibition weniger ausgeprägt. Unterschiede im Ausmaß der Inhibition sind möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die Reaktivität der Zellen gegen- über den verwendeten LPS-Konzentrationen schwankte. Bei zu hoher Stimulation ist eine Inhibition der Signaltransduktion erschwert. 73 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Insgesamt erkennt man jedoch eine deutliche Reduktion der LPS-induzierten NF-κB-Akti- vität durch Annexin 1 in Raw264.7 Zellen.

Abb. III.12. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Aktivität von NF-κB in der Zelllinie Raw 264.7 5· 105 Raw 264.7 Zellen, die mit dem NF-κB Reporterplasmid pTATA-Luc 4 x NF-κB sowie dem Kontrollplasmid pGL4.74[hRluc/TK] transient transfiziert waren, wurden mit apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) im Verhältnis 5:1 oder mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für 6 h vorinkubiert. Dann wurden sie mit den angegebenen LPS- Konzentrationen für 8 h stimuliert und anschließend lysiert. Die Aktivität des Transkriptionsfaktors NF-κB wurde luminometrisch analysiert. Die Fehlerbalken geben die Standardabweichungen von Triplikaten an.

III.6. Annexin 1 inhibiert den MyD88- und den TRIF-abhängigen Weg

Die Stimulation von TLR führt zur Aktivierung von Signaltransduktionsvorgängen, die durch Bindung verschiedener Adaptormoleküle an den Rezeptor eingeleitet werden. Man unterscheidet MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege. Im Fall der Stimulation mit LPS werden beide Adaptoren gebunden (Yamamoto et al. 2003; Hoebe et al. 2003). Eine Hem- mung der Produktion von Zytokinen wie TNF sowie der Signaltransduktion von MAP-Kinasen und NF-κB kann aus der Inhibition jedes der beiden Signalwege resultieren. Um zu analysieren, welcher der beiden Wege durch Annexin 1 reguliert wird, wurden mehrere Wege beschritten. Zum einen wurde die Sekretion des Chemokins IP-10 nach LPS-Stimulation bestimmt. Dieses gehört zu einer Gruppe von Zytokinen, die im Falle einer TLR4-Stimulation nur von der Aktivität des TRIF-abhängigen Signalwegs abhängen. Andere Zytokine wie TNF, IL-6 oder IL-1 sind dagegen von beiden Adaptoren abhängig (Yamamoto et al. 2003). Vorinkuba- tion humaner DC mit apoptotischen Neutrophilen (Abb. III.13.A) oder Annexin 1 (Abb. III.13.B) führte zu einer Verminderung der IP-10 Sekretion. Wie im Fall von TNF betrug die Reduktion je nach Experiment 30 bis 80 %. Dies weist auf eine Beteiligung des TRIF-Signal- wegs hin.

74 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.13. Annexin 1 beeinflusst die Sekretion des MyD88-unabhängigen Zytokins IP-10 nach LPS-Sti- mulation. A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) in den angegebenen Verhältnissen für 6 h vorinkubiert und anschließend mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Konzentration des sezernierten MyD88- unabhängigen Zytokins IP-10 wurde im ELISA bestimmt. B) 1· 105 primäre humane DC wurden mit den angegebenen Konzentrationen an löslichem Annexin 1 (Anx1) über Nacht vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Konzentration des sezernierten IP-10 wurde im ELISA ermittelt.

Eine weitere Möglichkeit, die Beteiligung des TRIF-Signalwegs zu beurteilen, ist die Ver- wendung des TLR3-Stimulus Poly(I:C). Dieser führt in humanen DC nicht zu einer signifikanten Sekretion von TNF, jedoch zu hoher IP-10-Sekretion. Diese war in Anwesenheit von Annexin 1 stark reduziert (Abb. III.14.A). Da TLR3 ausschließlich den Adaptor TRIF bindet, zeigt dies ebenso eine Interferenz der Annexin 1-Signaltransduktion mit diesem Signalweg. Andere Rezeptoren führen nur zur Aktivierung MyD88-abhängiger Signaltransduktion. Ein Beispiel ist TLR2. In Heterodimeren mit TLR1 bzw. TLR6 erkennt dieser Rezeptor bakterielle tri- bzw. di-acylierte Lipopeptide bzw. deren synthetische Analoga Pam3CSK4 und

Pam2CSK4. Eine Vorinkubation mit Annexin 1 konnte auch die TLR2-vermittelte TNF-Sekre- tion signifikant inhibieren (Abb. III.14.B). Ein weiterer Rezeptor, der ausschließlich einen MyD88-abhängigen Signalweg aktiviert, ist der mit den TLR verwandte IL-1 Rezeptor. Stimulation humaner DC mit IL-1 alleine führte nur zu einer sehr geringen Sekretion von TNF (Abb. III.14.C) und anderen Zytokinen (Daten nicht gezeigt). Die gemessenen Zytokinkonzentrationen lagen in einem Bereich, der in der Nähe der Detektionsgrenze des ELISA lag und in dem folglich nicht von exakten Messwerten ausgegangen werden kann. Daher wurde der Kultur gleichzeitig mit dem IL-1-Stimulus das synergistisch wirkende Zytokin IFNγ zugesetzt. IFNγ-Stimulation alleine bewirkt keine Sekretion von TNF, erhöht aber die IL-1 induzierte Sekretion (Sizemore et al. 2004; Abb. III.14.C). Die durch derartige Stimula- tion hervorgerufene TNF-Sekretion wurde durch Annexin 1 inhibiert. Auch die durch Syner- gismus mit IFNγ erhöhte LPS-induzierte TNF-Sekretion wurde durch Annexin 1 reduziert (Abb. III.14.C). Die Hemmung der durch TLR2 und den IL-1 Rezeptor ausgelösten Effekte durch Annexin 1 in humanen DC lässt darauf schließen, dass auch die MyD88-abhängige Signaltransduktion inhibiert wird. 75 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.14. Annexin 1 hemmt die Signaltransduktion rein MyD88-abhängiger sowie rein TRIF-abhängiger Rezeptoren. A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit den angegebenen Annexin 1 (Anx1)-Konzentrationen über Nacht vorinkubiert und mit 5 µg/mL des TLR3 Liganden Poly(I:C) stimuliert. Nach 16 h wurde die Konzentration von IP- 10 in den Überständen mittels ELISA gemessen. B) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1

über Nacht inkubiert und mit TLR2 Stimuli (3 ng/mL Pam2CSK4 bzw. 9 ng/mL Pam3CSK4) für weitere 16 h stimuliert. Die TNF-Sekretion wurde im ELISA analysiert. C) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und mit 100 ng/mL IL-1 bzw. 1 ng/mL LPS in An- oder Abwesenheit von 100 U/mL IFNγ stimuliert. Die Konzentration des sezernierten TNF wurde 16 h später mittels ELISA bestimmt.

Im murinen System eröffnet die Verfügbarkeit von MyD88-defizienten Mäusen (Adachi et al. 1998; Kawai et al. 1999) eine weitere Möglichkeit, die Effekte auf den TRIF-Signalweg gesondert zu untersuchen. MyD88-defiziente Mäuse können bestimmte (MyD88-abhängige) Zytokine nicht sezernieren, darunter TNF und IL-6. Daher wurde das TRIF-abhängige Chemokin MCP-1 im ELISA bestimmt. Annexin 1 reduzierte die durch Poly(I:C) oder LPS induzierte Sekretion von MCP-1 in MyD88 defizienten Mäusen in vergleichbarem Ausmaß wie im Wildtyp (Abb. III.15.A, B). Dies zeigt auch im Maussystem einen Effekt von Annexin 1 auf den TRIF-abhängigen Signalweg. Insgesamt zeigen mehrere unabhängige Befunde, dass Annexin 1 sowohl MyD88- als auch TRIF-abhängige Signalwege der TLR inhibiert.

76 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.15. Annexin 1-vermittelte Effekte treten auch in Abwesenheit des MyD88-abhängigen Signalwegs auf. A) 1· 105 primäre murine DC aus C57/BL6 Wildtyp-Mäusen wurden für 6 h mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) vorinkubiert und mit 5 µg/mL Poly(I:C) bzw. 3 ng/mL LPS stimuliert. Die Konzentration des sezernierten Chemokins MCP-1 wurde 16 h später im ELISA gemessen. B) Wie A, hier wurden primäre murine DC aus MyD88-defizienten Mäusen verwendet.

III.7. Annexin 1 inhibiert die Signaltransduktion des TNF-Rezeptors

Die Signalwege von TLR und dem verwandten IL-1-Rezeptor weisen große Ähnlichkeiten hinsichtlich der Initiation der Signaltransduktion auf und bewirken in ähnlicher Weise eine Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB. Eine Stimulation des TNF-Rezeptors führt ebenfalls zur Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen. Hinsichtlich der Initiation der Signaltransduktion gibt es jedoch Unterschiede zwischen den TLR und dem TNF-Rezeptor (vgl. Abb.I.1. und III.16.A). Zwar spielen die Proteine RIP1 und TRADD sowohl im TNF- Rezeptor-Signalweg als auch im TRIF-abhängigen Arm der TLR-Signaltransduktion eine Rolle (Chen et al. 2008; Ermolaeva et al. 2008; Pobezinskaya et al. 2008), TNF-Rezeptoren binden jedoch nicht an die TLR-typischen Adaptoren MyD88 und TRIF, und auch weitere wichtige Schritte wie die Aktivierung der IRAKs spielen keine Rolle. Anstelle von TRAF6 hat in der TNF-Signaltransduktion TRAF2 eine wichtige Funktion. Aufgrund dieser unterschiedlichen Initiation ähnlicher proinflammatorischer Effekte bot die Untersuchung TNF-induzierter Signaltransduktion eine weitere Möglichkeit, Hinweise auf den Wirkmechanismus von Annexin 1 zu erhalten. Hierfür wurde die Induktion verschiedener proinflammatorischer mRNAs in humanen DC nach TNF-Stimulation in An- und Abwesenheit von Annexin 1 mittels quantitativer PCR bestimmt. Die Messung auf RNA-Ebene wurde gewählt, da die Mengen an sezernierten Zytokinen wie TNF und IL-8 nach TNF-Stimulation bei humanen DC spenderabhängig oft unterhalb der Detektionsgrenze des ELISAs lagen (Daten nicht gezeigt). Bei Stimulation mit in der Literatur häufig verwendeten TNF- Konzentrationen von 10-50 ng/mL wurde die Synthese bzw. Stabilität der durch TNF induzierten TNF und IL-8 mRNA durch Vorinkubation mit Annexin 1 nicht unterdrückt. In

77 III. Ergebnisse Andrea Mahr diesen Konzentrationen war jedoch die Stimulation der Zellen bereits im Sättigungsbereich (Daten nicht gezeigt). In Experimenten mit geringer Stimuluskonzentration im Bereich 0,25 bis 2 ng/mL konnte jedoch ein inhibitorischer Effekt beobachtet werden (Abb. III.16.B), der mit den nach TLR-Stimulation erhaltenen Resultaten vergleichbar war (Abb. III.16.C). Daraus wird ersichtlich, dass Annexin 1 nicht ausschließlich die TLR-Signaltransduktion inhibiert, sondern auch die Stimulierbarkeit mit proinflammatorischen Zytokinen wie TNF reduziert.

Abb. III.16. Annexin 1 inhibiert die durch das proinflammatorische Zytokin TNF vermittelte Zytokininduktion. A) Die Signaltransduktion von TNF-Rezeptor 1 (TNFR1) unterscheidet sich in den rezeptornahen Abschnitten stark von der TLR-Signaltransduktion. Nach Rekrutierung von TRADD binden RIP1 und TRAF2, wodurch es zur TRAF2-vermittelten Ubiquitinierung (Ub.) von RIP1 kommt. Dies ist die Voraussetzung für die nachfolgende Aktivierung proinflammatorischer Signalwege. Die Signaltransduktion von TLR4 weist sowohl Ähnlichkeiten (orange) als auch Unterschiede zur TNF-induzierten Signaltransduktion auf. Insbesondere gibt es Unterschiede in den rezeptornahen Abschnitten und in der Verwendung unterschiedlicher TRAFs (orange umrandet). B, C) 3· 105 primäre humane DC wurden in Anwesenheit von Polymyxin B mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht inkubiert und mit den angegebenen Konzentrationen an humanem TNF für 1 h (B) bzw. mit 4 ng/mL Pam3CSK4 für 3 h (C) stimuliert. Die Induktion der TNF mRNA wurde mittels quantitativer PCR untersucht.

78 III. Ergebnisse Andrea Mahr

III.8. Die Annexin 1-vermittelte Suppression ist an eine Proteinsynthese gekoppelt

Neben der Beeinflussung proinflammatorischer Signaltransduktion sind auch die unmit- telbaren Effekte von Interesse, die Annexin 1 in der Zelle induziert und über die in der Folge der antiinflammatorische Zustand der DC erreicht wird. Diese Fragestellung zielt in letzter Instanz auf den Rezeptor für Annexin 1 sowie dessen Signaltransduktion ab. Ob die beschriebenen Annexin 1-Rezeptoren der Neutrophilen – der FPR und seine Homologen (Walther et al. 2000; Perretti et al. 2001; Ernst et al. 2004) – im Fall von DC diese Funktion ausüben, ist noch unklar. Bislang gaben zumindest Experimente mit spezifischen Inhibitoren des FPR und seiner Homologen keine Hinweise darauf, denn diese konnten den antiinflammatorischen Effekt von Annexin 1 nicht aufheben (Daten nicht gezeigt). Auch die unmittelba- ren intrazellulären Effekte von Annexin 1 nach Rezeptorbindung sind noch unbekannt. Western Blot-Experimente zur Untersuchung der Aktivierung verschiedener bekannter Inhi- bitoren der TLR-Signaltransduktion verliefen negativ. Untersucht wurden im Einzelnen die Phosphorylierung von Akt und GSK3β, die Induktion von SOCS1 und SOCS3 sowie die Phosphorylierung von STAT3. Letztere wurde zwar durch die verwendeten Annexin 1-Präpa- rationen induziert, dies wurde jedoch durch Zugabe von Polymyxin B verhindert und war daher auf verunreinigendes LPS zurückzuführen (Daten nicht gezeigt). Obwohl nicht ausgeschlossen ist, dass bei der Wahl anderer experimenteller Bedingungen eventuell Effekte sichtbar würden, gibt es dennoch zur Zeit keinerlei Anhaltspunkte für eine Beteiligung der genannten Faktoren (Daten nicht gezeigt). Möglicherweise beinhaltet der Wirkmechanismus von Annexin 1 die Synthese antiinflammatorisch wirkender Proteine, die die Signaltransduktion entweder intrazellulär inhibieren, oder sezerniert werden und die Zelle dann autokrin beeinflussen. Erste Hinweise darauf lieferten Kinetiken, bei denen apoptotische Zellen bzw. Annexin 1 für verschieden lange Zeitintervalle vor der TLR-Stimulation mit humanen DC inkubiert wurden. Im Fall der apoptotischen Neutrophilen war eine Hemmung der TNF-Sekretion zwar selbst bei Zugabe unmittelbar vor der LPS-Stimulation erkennbar, die Hemmung war jedoch ausgeprägter, wenn die DC für vier oder zehn Stunden mit den apoptotischen Zellen vorinkubiert wurden (Abb. III.17.A). Dies weist darauf hin, dass bei dem Suppressionsmechanismus apoptotischer Zellen zumindest teilweise längerfristige Prozesse eine Rolle spielen, die eine Proteinsyn- these beinhalten könnten. Im Fall von Annexin 1 war die Vorinkubationszeit noch wichtiger. Vor allem im Fall der humanen DC wurde nur bei Inkubation über Nacht ein deutlicher und reproduzierbarer Hemmeffekt beobachtet. Bei kürzerer Inkubation war der Effekt nur schwach ausgeprägt oder nicht vorhanden (Abb. III.17.B).

79 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Um die mögliche Beteiligung einer Proteinsynthese weiter zu analysieren, wurde die Translation durch Zugabe von Cycloheximid inhibiert. Die verwendete Cycloheximid-Kon- zentration von 10 µg/mL verhinderte die Sekretion von durch 10 ng/mL LPS induziertem TNF und IL-8 vollständig (Daten nicht gezeigt), somit war die Translation effizient gehemmt. Sollte Annexin 1 seinen Effekt durch die Induktion einer Proteinsynthese vermitteln, so wäre in Anwesenheit des Inhibitors eine Aufhebung des hemmenden Effekts zu erwarten. Gemessen wurde die Menge der induzierten TNF mRNA (Abb. III.17.C-F). Während Annexin 1 ohne vorherige Zugabe von Cycloheximid die Induktion der TNF mRNA durch LPS unterdrückte (Abb. III.17.C), kam es in Anwesenheit von Cycloheximid bei DC der gleichen Präparation nach Vorinkubation mit Annexin 1 zu einer gesteigerten Produktion der RNA durch den LPS- Stimulus (Abb. III.17.D). Diese Superinduktion war in manchen Fällen noch wesentlich ausgeprägter als in dem gezeigten Experiment. Der Effekt wurde durch den Inhibitor somit nicht nur aufgehoben, sondern überraschenderweise sogar umgekehrt. Überraschend war weiterhin, dass in Anwesenheit von Cycloheximid die Inkubation mit Annexin 1 allein über Nacht bereits zu einer hohen Expression der TNF mRNA führte. Cyclo- heximid allein hatte dagegen allenfalls eine sehr schwache Erhöhung der TNF mRNA zur Folge. Diese Befunde konnten mit U-937 Zellen reproduziert werden (Daten nicht gezeigt). Äquivalente Experimente wurden auch in Anwesenheit von Polymyxin B unter Verwendung des TLR2-Liganden Pam3CSK4 durchgeführt, um Artefakte durch Endotoxin-Toleranz aus- zuschließen. Auch in diesen Experimenten ergab sich ein vergleichbares Resultat (Abb.III.17.E, F). Ein Problem bei der Verwendung von Translationsinhibitoren in Experimenten mit TLR- Stimulation ist die Superinduktion bestimmter Zytokin-mRNAs in Anwesenheit des Inhibitors, die die Interpretation der Daten erschwert. Im verwendeten System wurde die LPS-induzierte TNF mRNA durch Cycloheximid in einigen Fällen leicht erhöht, in anderen Fällen war sie nicht beeinflusst (Abb. III.17.C, D). Im Fall der Stimulation mit Pam3CSK4 war die Steigerung der TNF mRNA Synthese durch Cycloheximid wesentlich ausgeprägter (Abb.III.17.E, F). Ein denkbarer Grund für die Superinduktion könnte sein, dass IκB-Proteine nach der TLR-induzierten Degradation infolge der Translationsinhibition nicht mehr neusynthetisiert werden und dadurch die NF-κB-Aktivität steigt. Im Western Blot wurde allerdings im Fall humaner DC selbst nach 24-stündiger Inkubation mit 10 µg/mL Cycloheximid keine Reduk- tion von IκBα festgestellt. Wurden die Zellen zusätzlich mit 1 ng/mL LPS stimuliert, so war ebenfalls, unabhängig von der An- oder Abwesenheit von Cycloheximid, keine Änderung der IκBα-Menge feststellbar (Daten nicht gezeigt). Ein deutlicher Effekt von Cycloheximid zeigte sich jedoch im Western Blot auf die Phosphorylierung der p38 Kinase, die in Anwesenheit des Inhibitors innerhalb weniger Minuten stark anstieg und auch nach 20-stündiger Inkuba- tion noch unverändert hoch war (Daten nicht gezeigt).

80 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Abb. III.17. Die durch apoptotische Zellen bzw. Annexin 1 vermittelten Effekte sind abhängig von Protein- synthese. A) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 5· 105 apoptotischen Neutrophilen (aNΦ) für die angegebenen Zeitin- tervalle vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS über Nacht stimuliert. Die Konzentration des Zytokins TNF wurde im ELISA ermittelt. B) 1· 105 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 (Anx1) für die angegebenen Zeitin- tervalle vorinkubiert und mit 1 ng/mL LPS über Nacht stimuliert. Die Konzentration des Zytokins TNF wurde im ELISA ermittelt. C) 4· 105 primäre humane DC wurden mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und für 2 h mit 1 ng/mL LPS stimuliert. Die Induktion der TNF mRNA wurde in den Lysaten mittels quantitativer RT-PCR untersucht. D) Wie C, zur gleichen Präparation humaner DC wurde kurz vor der Inkubation mit Annexin 1 Cyclo- heximid (10 µg/mL) zu den Zellen gegeben. E) 4· 105 primäre humane DC wurden in Anwesenheit von Polymyxin

B mit 5 µg/mL Annexin 1 über Nacht vorinkubiert und für 3 h mit 4 ng/mL Pam3CSK4 stimuliert. Die Induktion der TNF mRNA wurde in den Lysaten mittels quantitativer RT-PCR untersucht. F) Wie E, zur gleichen Präparation humaner DC wurde kurz vor Inkubation mit Annexin 1 Cycloheximid (10 µg/mL) zu den Zellen gegeben.

81 III. Ergebnisse Andrea Mahr

Die Effekte des Inhibitors auf die TLR-induzierten Zytokin-mRNAs selbst liegen somit eventuell an einer Aktivierung der p38 Kinase und stellen einen unvermeidlichen Störfaktor dar. Zusammenfassend lässt sich dennoch schlussfolgern, dass Translationsinhibition den hemmenden Effekt von Annexin 1 ins Gegenteil umkehrt, was auf die Beteiligung einer Pro- teinsynthese hindeutet. Die Induktion proinflammatorischer mRNAs durch Annexin 1 selbst unter den Bedingungen einer Translationsinhibition ist ein Befund, dessen Ursache noch der Klärung bedarf.

82 IV. Diskussion Andrea Mahr

IV. Diskussion

Wenn DC Antigene in Form apoptotischer Zellen aufnehmen, kommt es in vivo zur Etab- lierung peripherer Toleranz (Hugues et al. 2002; Ferguson et al. 2002; Liu et al. 2002a). In vitro spiegelt sich dies in einer verminderten Stimulierbarkeit der DC durch proinflammatorische Stimuli wie TLR-Liganden wider, die sich in verminderter Zytokinsekretion, Hochregulation von Aktivierungsmarkern und Fähigkeit zur T-Zell-Stimulation äußert (Stuart et al. 2002; Williams et al. 2008; Weyd 2005; Dörner 2007). Der antiinflammatorische Effekt wird durch Moleküle auf der Oberfläche apoptotischer Zellen vermittelt, von denen bislang nur wenige beschrieben sind. Es gibt Hinweise auf eine Rolle des Thrombospondin- Rezeptors CD36 (Voll et al. 1997; Urban et al. 2001), auf die C3bi-bindenden Komplementrezeptoren CR3 (CD11b/CD18) und CR4 (CD11c/CD18) (Skoberne et al. 2006), sowie auf Phosphatidylserin (Huynh et al. 2002 ; Kim et al. 2004 ; Ramos et al. 2007 ; Park et al. 2008) und Phosphatidylserin-bindende Proteine wie Gas6, das an die Mer- Tyrosinkinase der DC bindet (Sen et al. 2007). In unserem Labor wurde als neues antiinflammatorisches Molekül auf der Oberfläche frühapoptotischer Zellen Annexin 1 identifiziert, das ebenfalls an Phosphatidylserin bindet (Weyd 2005; Dörner 2007). In einem anderen Kontext wurde es bereits als antiinflammatorisch beschrieben, vor allem als Vermittler der Glukokortikoid-Wirkung und als Inhibitor der Extravasation von Neutrophilen (Übersicht in Parente & Solito 2004; Lim & Pervaiz 2007). Zusätzlich wurde es auf apoptotischen Zellen als „Eat-me“-Signal beschrieben (Arur et al. 2003), was jedoch in unserem Labor nicht bestätigt werden konnte (Weyd 2005). Vielmehr wurde ein suppressiver Effekt auf DC nachgewiesen (Weyd 2005; Dörner 2007). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Annexin 1 ein tolerogenes Signal an DC übermittelt, indem es proinflammatorische Signaltransduktionswege hemmt. Durch eine Inhibition der TLR- induzierten Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB kommt es zu einer verminderten mRNA-Expression und Sekretion proinflammatorischer Zytokine. Der hemmende Effekt beruht vermutlich auf einer Annexin 1-induzierten Proteinsynthese und betrifft sowohl den MyD88- als auch den TRIF-abhängigen Signalweg der TLR sowie auch TNF-induzierte Signaltransduktionsprozesse.

IV.1. Apoptotische Zellen und Annexin 1 inhibieren die Sekretion proinflammatorischer Zytokine in DC

In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass apoptotische Jurkat-T-Zellen sowie apoptotische Neutrophile die LPS-induzierte TNF-Sekretion in U-937 Zellen (Abb.III.2.A) und primären humanen DC (Abb. III.2.E) hemmen. Differenzierte U-937 Zellen können apoptotische Zellen phagozytieren und reagieren auf LPS mit Zytokinsekretion sowie Expression von Aktivie- 83 IV. Diskussion Andrea Mahr rungsmarkern auf der Oberfläche. Die Fähigkeit zur T-Zell-Aktivierung ist jedoch wesentlich geringer ausgeprägt als bei primären DC. Diese Eigenschaften erlauben eine Verwendung der Zelllinie als DC-Modell (Dörner 2007). Die IL-10 Sekretion der U-937 Zellen ist im Gegensatz zu TNF nicht beeinflusst (Abb. III.2.C). In humanen DC ist ein Einfluss auf IL-10 nicht zu beurteilen, denn diese produzierten im hier verwendeten System keine signifikanten Mengen dieses Zytokins. Dies könnte zumindest teilweise an der Anwesenheit von IL-4 im Differenzierungsmedium liegen, das die IL-10 Produktion in DC hemmt (Yao et al. 2005). Die differenzielle Beeinflussung von TNF und IL-10 weist auf einen spezifischen negativ regulatorischen Effekt auf proinflammatorische Mediatoren hin. Es handelt sich also nicht um ein unspezifisches Abschalten der phagozytierenden Zellen. Auch eine Apoptose-Induktion ist ausgeschlossen, was zusätzlich durch Messung von Apoptose-Markern im FACS bestätigt wurde (Daten nicht gezeigt). Zudem ist der Effekt spezifisch für apoptotische Zellen, denn im Gegensatz zu den UV-behandelten apoptotischen Zellen zeigten J16 Zellen, die durch 20- minütige Inkubation bei 55°C nekrotisch gemacht wurden, in dem verwendeten System keine antiinflammatorischen Effekte auf primäre humane DC (Heiko Weyd, persönliche Kommuni- kation). Das gleiche Muster der Regulation von TNF und IL-10 wurde auch bei Verwendung von Annexin 1 anstelle apoptotischer Zellen beobachtet (Abb. III.2.B, D, F). Die verwendeten Annexin 1-Konzentrationen im einstelligen µg/mL-Bereich entsprechen mit hoher Wahrscheinlichkeit Konzentrationen, die in vivo auftreten können. So liegt der Annexin 1- Gehalt apoptotischer Zellen in der Größenordnung von etwa 2 µg pro Million Zellen (Dörner 2007). Apoptotische Zellen und Annexin 1 hemmen auch die Sekretion von IL-8, IL-6 und IP- 10 (Abb.III.4.B, C; Abb.III.12., III.13, und Daten nicht gezeigt). Auch in murinen Raw264.7 Zellen sowie primären murinen DC wird die Sekretion von Zytokinen und Chemokinen wie TNF (Abb.III.3) sowie MCP-1 (Abb.III.14.) unterdrückt. Im murinen System ist die Produktion von IL-10 ebenfalls negativ reguliert, wohingegen IL-13 durch die Vorbehandlung unbeeinflusst bleibt (Dörner 2007). Insgesamt beeinflussen Annexin 1 und apoptotische Zel- len die Zytokinproduktion von Phagozyten in ähnlicher Weise. Dies ist eine Indikation für eine Rolle von Annexin 1 bei der Vermittlung des antiinflammatorischen Effekts. Die endgültige Verbindung zwischen dem hemmenden Effekt apoptotischer Zellen und dem Protein Annexin 1 auf ihrer Oberfläche stellt z.B. die Blockierung des Effekts durch Annexin 1- spezifische Antikörper dar. Dies wurde für das murine System bereits gezeigt (Dörner 2007). Diese Daten sind im Einklang mit einem Großteil der Publikationen zum Einfluss apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion von DC (Urban et al. 2001 ; Stuart et al. 2002 ; Williams et al. 2008) und anderen Phagozyten (Voll et al. 1997; Fadok et al. 1998; McDonald et al. 1999 ; Huynh et al. 2002), und ergänzen sie um die Reproduzierbarkeit mit Annexin 1. Vor allem in murinen und humanen Makrophagen wurde beschrieben, dass apoptotische

84 IV. Diskussion Andrea Mahr

Zellen auch zu einer Induktion antiinflammatorischer Mediatoren wie TGFβ führen, die für die Suppression der proinflammatorischen Zytokine verantwortlich sind (Fadok et al. 1998; McDonald et al. 1999 ; Huynh et al. 2002). In humanen DC wurde jedoch beobachtet, dass TGFβ und IL-10 keine Rolle bei der Vermittlung des Effekts spielen (Stuart et al. 2002). Auch mit den nach unserem Protokoll generierten humanen DC wurde keine erhöhte Produktion von TGFβ nach Inkubation mit apoptotischen Zellen festgestellt (Daten nicht gezeigt und Weyd, persönliche Kommunikation). Für das Signal apoptotischer Zellen wurde eine Kreuz- reaktivität zwischen verschiedenen Spezies beobachtet (Cvetanovic et al. 2006). In Überein- stimmung damit wurde im hier verwendeten System ebenfalls eine Kreuzreaktivität des humanen Signals im murinen System gefunden, sowohl für apoptotische Neutrophile als auch für Annexin 1 (Abb. III.3.A, C). Im Gegensatz zu den beschriebenen Daten und trotz der rein logischen Überlegung, dass apoptotische Zellen als Träger von Selbst-Antigenen tolerogen sein sollten, gibt es auch Berichte über immunogene Effekte apoptotischer Zellen, etwa über erfolgreiche Tumor- vakzinierung und Tumortherapie mit apoptotischen Zellen in Tiermodellen (Scheffer et al. 2003). Auch die Sekretion des Chemokins IL-8 oder des murinen IL-8-Homologs MIP-2 durch Makrophagen oder Endothelzellen infolge der Aufnahme apoptotischer Zellen wurde beschrieben (Kurosaka et al. 1998; Misawa et al. 2001 ; Kirsch et al. 2007). Als kritischer Faktor für die immunogene Wirkung apoptotischer Zellen wurde die Externalisierung des Chaperons Calreticulin beschrieben. Da diese nur nach Apoptoseinduktion mit Anthrazyklinen, nicht jedoch mit Etoposid oder Mitomycin D auftrat, wurde postuliert, dass die Art der Apoptoseinduktion für die immunologische Wirkung von Bedeutung ist (Obeid et al. 2007). Bislang gibt es keine endgültige Erklärung für die beiden diametral entgegengesetzten Theorien über die anti- oder proinflammatorische Wirkung apoptotischer Zellen. Die Assozia- tion vermehrt auftretender apoptotischer Zellen mit Autoimmunkrankheiten (siehe I.6.1.) weist darauf hin, dass deren Rolle ambivalent sein kann. Möglicherweise spielt das Stadium der Apoptose eine Rolle. Es könnte sein, dass spätapoptotische (sekundärnekrotische) Zellen die DC-Reifung im Gegensatz zu frühapoptotischen Zellen fördern (Sauter et al. 2000; Ip & Lau 2004). Allerdings gibt es auch Hinweise auf eine Kontinuität des antiinflammatorischen Effekts im spätapoptotischen Stadium (Patel et al. 2006; Scaffidi et al. 2002). Möglicherweise beruhen die Unterschiede auf verschiedenen Kultivierungsmethoden der Phagozyten oder der apoptotischen Zellen. Bei einer auch nekrotische Zellen beinhaltenden Zellpräparation überwiegen womöglich die in I.6.1. erwähnten proinflammatorischen Mediatoren, die bei Verlust der Membranintegrität freigesetzt werden. Die vorliegende Arbeit unterstützt die Hypothese einer antiinflammatorischen Wirkung frühapoptotischer Zellen.

85 IV. Diskussion Andrea Mahr

IV.2. Die Zytokinregulation erfolgt auf der Stufe der mRNA

Die Produktion von Zytokinen wird auf mehreren Ebenen stringent reguliert. Daher kann die durch Annexin 1 und apoptotische Zellen vermittelte Hemmung der Zytokinsekretion verschiedene Ursachen haben. Die meisten Zytokine werden auf der Ebene der Transkription reguliert. Die basale Expression ist meist verschwindend gering, wird durch Stimulation er- höht, und geht nach kurzer Zeit wieder auf das Ausgangsniveau zurück. Promotoren von Zytokingenen enthalten meist mehrere Bindestellen für aktivierende wie auch inhibierende Transkriptionsfaktoren (Ye & Young 1997). Denkbar ist weiterhin eine Kontrolle des RNA- Spleißens, da manche Stimuli zwar die Synthese einer prä-mRNA fördern, diese jedoch nicht prozessiert wird (Jarrous & Kaempfer 1994). Daneben gehören Zytokingene zu den Genen, die in großem Ausmaß über die Stabilität ihrer mRNA sowie über die Translationseffizienz reguliert werden. Wichtig hierfür sind cis-aktive Elemente wie die AU-reichen Elemente (ARE) am 3’ Ende der mRNA, die von ARE-bindenden Proteinen erkannt werden. Bindung des Proteins Tristetraprolin führt z.B. zu Destabilisierung der TNF mRNA, während andere Proteine wie TIA-1 (T-Zell internes Antigen 1) die Translationsrate senken. Auch stabilisie- rende Proteine wie HuR sind beschrieben worden (Brennan & Steitz 2001). Schließlich gibt es posttranslationale Regulationsschritte, wie die Spaltung von IL-1β oder TNF durch Protea- sen wie das IL-1-konvertierende Enzym (IL-1 converting enzyme, ICE, auch Caspase 1) (Fantuzzi & Dinarello 1999) oder die Metalloprotease TNF-konvertierendes Enzym (TNFα converting enzyme, TACE) (Black et al. 1997; Moss et al. 1997). Auf welcher Ebene apoptotische Zellen die Zytokinproduktion regulieren, ist noch wenig untersucht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass apoptotische Jurkat-T-Zellen die Induktion der TNF mRNA durch LPS inhibieren, während die Expression der IL-10 mRNA unverändert bleibt (Abb.III.5.A, B). Diese Daten entsprechen den Ergebnissen auf der Ebene der sezernierten Zytokine. Eine Hemmung der TNF mRNA beobachteten auch Fadok et al. 1998 in pri- mären humanen Makrophagen und Cvetanovic & Ucker 2004 in murinen Raw264.7 Makrophagen. Im Gegensatz dazu beschreiben McDonald et al. 1999 keinen Einfluss apoptotischer Zellen auf die Menge an induzierter TNF mRNA in murinen J774 Makrophagen trotz reduzierter Menge an sezerniertem TNF. Die teilweise kontroversen Daten beruhen eventuell auf den unterschiedlichen verwendeten Zelltypen. Außerdem haben Studien zum Effekt apoptotischer Zellen auf intrazelluläre Prozesse wie die mRNA-Synthese den Nachteil, dass ein gemischtes Zellsystem aus Phagozyten und apoptotischen Zellen untersucht wird. Selbst wenn die nicht phagozytierten apoptotischen Zellen vor der TLR-Stimulation oder vor der Lyse der Zellen durch Waschen entfernt werden, ist die RNA der apoptotischen Zellen in den Phagozyten noch nachweisbar und könnte das Ergebnis verfälschen. So sind geringe Mengen an CD3 mRNA in Lysaten von U-937 Zellen nachweisbar, wenn diese apoptotische Jurkat T-Zellen phagozytiert haben (Daten nicht gezeigt). CD3 kommt als Bestandteil des T-

86 IV. Diskussion Andrea Mahr

Zell-Rezeptors nicht in mononukleären Phagozyten wie den U-937 vor und stammt daher aus den aufgenommenen Jurkat-T-Zellen. Es kann davon ausgegangen werden, dass auch ein gewisser Prozentsatz an GAPDH mRNA in diesen Proben von den apoptotischen Zellen her- rührt. Da die gemessenen TNF-Transkriptmengen auf die Menge an GAPDH mRNA normiert wurden, könnte es sein, dass die Werte nach Aufnahme apoptotischer Zellen sich alleine dadurch etwas verringern. Die Verunreinigungen mit apoptotischer RNA waren sehr gering und können mit hoher Wahrscheinlichkeit nicht die Reduktion der induzierten TNF mRNA Menge um etwa 50 % erklären. Dennoch ist es bei intrazellulären Untersuchungen generell vorteil- haft, mit dem rekombinanten Protein Annexin 1 anstelle apoptotischer Zellen zu arbeiten, um mögliche Kontaminationen durch apoptotischen Zellinhalt zu vermeiden. In humanen DC führt Annexin 1 zu einer Reduktion der LPS-induzierten TNF- und IL-8 mRNAs (Abb. III.5.C, D; Abb.III.6.A, B). Genexpressionsanalysen weisen auf einen globalen hemmenden Effekt von Annexin 1 auf die TLR-induzierte Produktion proinflammatorischer Zytokine hin. Durch einstündige LPS- Stimulation stark induzierte Zytokine wie IL-1α, IL-1β, TNF, IL-12, IL-6, IL-8, IL-23, und IL-12 werden infolge einer Vorinkubation mit Annexin 1 vermindert exprimiert (Abb.III.6.C, D). Auch andere proinflammatorische Gene wie die Chemokine CCL20 und CXCL2 sind negativ reguliert, ebenso das Gen für das proinflammatorische Enzym COX2. Einige Gene wie z.B. NFKBIA sind nicht durch Annexin 1 reguliert, während eine weitere Gruppe infolge der Vorin- kubation sogar noch verstärkt induziert wird, wie etwa ISG15 und TRAF1. Es liegt also keine generelle Inhibition LPS-abhängiger Signaltransduktion vor, sondern eine differenzielle Be- einflussung. Die Genexpressionsanalysen wurden in Abwesenheit der LPS-inhibierenden Substanz Polymyxin B durchgeführt. Für die mRNAs für TNF, IL-1β und IL-8 konnte der negativ regulatorische Einfluss jedoch in zahlreichen Experimenten auch unter Ausschluss von LPS-Tole- ranz bestätigt werden. Ob die Regulation bestimmter mRNA-Transkripte auf einer Herunter- regulation der Transkription oder auf einer Destabilisierung der mRNA beruht, muss noch geklärt werden. In der Literatur finden sich Hinweise auf eine Beteiligung negativ regulatorischer Transkriptionsfaktoren am antiinflammatorischen Effekt apoptotischer Zellen (Kim et al. 2004).

IV.3. Annexin 1 inhibiert die Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB

Der antiinflammatorische Effekt apoptotischer Zellen auf die Zytokinproduktion von Pha- gozyten ist durch viele Studien belegt. Die zugrundeliegenden Veränderungen in der Signaltransduktion wurden jedoch bisher nur von wenigen Gruppen untersucht und sind somit noch nicht ausreichend charakterisiert.

87 IV. Diskussion Andrea Mahr

LPS-Stimulation führt sowohl in U-937 Zellen als auch in humanen DC zur Phosphorylie- rung der MAP-Kinasen p38 und JNK. Phosphorylierung der Erk MAP-Kinase ist ebenfalls beschrieben, ist jedoch unter den in dieser Arbeit gewählten Bedingungen nicht zu beobachten (Abb. III.8.A, B). Vermutlich beruht dies einerseits auf der relativ hohen basalen Erk-Phosphorylierung, andererseits an den geringen LPS-Konzentrationen, die gewählt wurden, um in Experimenten mit Annexin 1 einen möglichen hemmenden Effekt besser beobachten zu können. Inkubation mit Annexin 1 bewirkt in U-937 Zellen eine leicht verminderte LPS-induzierte Phosphorylierung von p38 und JNK (Abb. III.9.A, B), in humanen DC eine Inhibition sowohl der basalen als auch der LPS-induzierten Phosphorylierung von p38, Erk und JNK (Abb. III.10.A, B) und in Raw264.7 murinen Makrophagen eine Hemmung der Phosphorylierung und Aktivierung der p38 Kinase (Abb. III.11.). Der Effekt ist donorabhängig bisweilen nur schwach ausgeprägt, und kann durch Kinase-Aktivitätsmessung deutlicher beobachtet werden als durch Detektion im Western Blot. In der Literatur wurde in Überein- stimmung mit den hier beschriebenen Daten ebenfalls eine Hemmung basaler und M-CSF induzierter Erk-Phosphorylierung in murinen Makrophagen gezeigt (Patel et al. 2006; Reddy et al. 2002). Daneben ist eine Hemmung der durch AP-1 ausgelösten Transkription beschrieben worden. Dieser Transkriptionsfaktor wird ebenfalls durch MAP-Kinasen aktiviert (Cvetanovic & Ucker 2004). Abweichend von den Befunden dieser Arbeit wurde hierbei allerdings eine gesteigerte Phosphorylierung von p38 und JNK beobachtet (Patel et al. 2006). Sen et al. (2007) finden in LPS-stimulierten murinen DC keine signifikante Hemmung der Phosphorylierung von MAP-Kinasen im Vergleich zu einem signifikanten Effekt auf NF-κB. Möglicherweise beruhen die Unterschiede auf den verwendeten Zelltypen. Zudem wurden in dieser Arbeit nur die Effekte des Proteins Annexin 1 auf intrazelluläre Signaltransduktion untersucht, da apoptotische Zellen ebenfalls Signaltransduktionsmoleküle beinhalten, die nicht von denen der DC unterschieden werden können. Die Verwendung eines rekombinanten Proteins liefert daher aussagekräftigere Ergebnisse als die Verwendung apoptotischer Zellen. Die LPS-induzierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB wird durch apoptotische Zellen wie auch durch Annexin 1 um etwa 50 % reduziert (Abb.III.12.). In Übereinstimmung hiermit wurde in murinen Makrophagen eine durch Vorinkubation mit apoptotischen Zellen verminderte Aktivierbarkeit von NF-κB beschrieben. Diese ging nicht mit sichtbaren Ände- rungen der Degradation von IκBα, der nukleären Lokalisation oder der DNA-Bindung von NF-κB einher (Cvetanovic & Ucker 2004). In murinen DC wurde eine Hemmung schon auf der Stufe des IKK-Komplexes beobachtet, die durch das Molekül Gas6 auf apoptotischen Zellen vermittelt wurde. Gas6 bindet an die Mer-Tyrosinkinase und aktiviert so den PI3K- Signalweg (Sen et al. 2007). PI3K-Aktivierung durch apoptotische Zellen wird auch von Reddy et al. (2002) gezeigt. Die Effekte von Mer und anderen Proteinen der TAM (Tyro3, Axl,

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Mer)-Tyrosinkinasen auf die TLR-Signaltransduktion wurden auch mit einer Induktion von SOCS1 und SOCS3 in Verbindung gebracht (Rothlin et al. 2007). Mit Annexin 1 liegt nun ein weiteres Molekül vor, das die Aktivität von NF-κB in DC inhibieren kann. Über welchen Rezeptor dies geschieht, ist noch nicht bekannt. Studien mit spezifischen Inhibitoren lieferten keine Hinweise auf eine Beteiligung des als Annexin 1-Rezeptor beschriebenen FPR (Daten nicht gezeigt). Auch erwiesen sich vorläufige Experimente zu einer möglichen Beteiligung des PI3K-Signalwegs – der z.B. auch durch den FPR eingeleitet wird – sowie von SOCS1 und SOCS3 als negativ (Daten nicht gezeigt). Ein weiterer beschriebener Effekt apoptotischer Zellen, die Aktivierung des Transkriptionsfaktors PPARγ bzw. anderer PPARs (Johann et al. 2006 ; Ramos et al. 2007 ; Majai et al. 2007) wurde in dieser Arbeit nicht näher untersucht.

IV.4. Annexin 1 beeinflusst MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege der TLR sowie die Signaltransduktion weiterer proinflammatorischer Rezeptoren

Die TLR-Signaltransduktion umfasst Signalwege, die von verschiedenen Adaptoren abhängen. Im Wesentlichen unterscheidet man MyD88- und TRIF-abhängige Signalwege. Die Einteilung erfolgte anhand von Untersuchungen MyD88-defizienter Mäuse, die nach LPS-Stimulation die sogenannten MyD88-abhängigen Zytokine nicht produzieren können, während es nach wie vor zur Expression der MyD88-unabhängigen (TRIF-abhängigen) Zytokine kommt (Kawai et al. 2001). Nach Untersuchung TRIF-defizienter Mäuse zeigte sich, dass in Abwesenheit des TRIF-Signalwegs weder MyD88-unabhängige noch –abhängige Zytokine produziert werden. Der TRIF-Signalweg ist folglich für jegliche Zytokinsekretion essenziell (Yamamoto et al. 2003; Hoebe et al. 2003). Um zu beurteilen, welcher der beiden Signalwege von der Inhibition durch Annexin 1 betroffen ist, wurden mehrere Wege beschritten. Apoptotische Zellen und Annexin 1 hemmen nicht nur die Sekretion MyD88-abhängiger Zytokine wie TNF (Abb.III.2.), IL-8 und IL-6 (Abb.III.4.), sondern auch TRIF-abhängige Zytokine wie IP-10 (Abb.III.13.) und MCP-1 (Abb.III.15.A). Dies lässt auf eine Interferenz der Annexin 1-Signaltransduktion mit dem TRIF-Signalweg schließen, dessen Aktivierung für beide Gruppen von Zytokinen wichtig ist. Dementsprechend zeigten Experimente mit MyD88-defizienten Mäusen, dass bei aus- schließlicher Benutzung des TRIF-Signalwegs die Effekte einer LPS-Stimulation weiterhin durch Annexin 1 blockierbar sind (Abb.III.15.B). Redundante Information ergibt sich aus der Hemmbarkeit des rein TRIF-abhängigen TLR3 durch Annexin 1 (Abb.III.14.A). Offensichtlich bewirkt Annexin 1 aber auch eine Hemmung des MyD88-abhängigen Wegs, da die rein MyD88-abhängige Signaltransduktion über TLR2 (Abb.III.14.B) sowie den IL-1-Rezeptor ebenfalls betroffen ist (Abb.III.14.C). Die Signalwege von TLR und dem IL-1 Rezeptor ähneln sich hinsichtlich der Initiation der Signaltransduktion und bewirken eine Aktivierung von MAP-

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Kinasen und NF-κB. Die Stimulation des TNF Rezeptors führt ebenfalls zur Aktivierung von NF-κB und MAP-Kinasen, jedoch geschieht dies nicht über MyD88- und TRIF-abhängige Wege. Die initialen Komponenten sind vielmehr das Adaptorprotein TRADD (TNF receptor associated death domain), die Kinase RIP1 und die Ubiquitin-Ligase TRAF2 (Aggarwal 2003). Da Annexin 1 auch die Induktion der TNF-induzierten TNF mRNA inhibiert (Abb.III.16 B), beeinflusst es offensichtlich Proteine, die in beiden Signalwegen eine Rolle spielen. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen für Annexin 1 wurde beschrieben, dass apoptotische Zellen neben der LPS-Stimulation auch die Aktivierung durch CD40L und TNF hemmen (Urban et al. 2001). Ein Einfluss auf beide Arme der TLR-Signaltransduktion lässt sich mit mehreren Modellen erklären. Eine Möglichkeit ist eine Inhibition direkt am Rezeptor, wie in I.4. beschrieben. Da Annexin 1 jedoch neben der TLR-abhängigen auch die TNF-induzierte Signaltransduktion hemmt, ist eine Hemmung direkt am TLR unwahrscheinlich. Ein weiterer denkbarer Mecha- nismus ist die Inhibition eines Moleküls, das an MyD88- und TRIF-abhängigem Signalweg gleichermaßen beteiligt ist, wie z.B. TRAF6 (Hacker et al. 2000; Wang et al. 2001b; Jiang et al. 2004). Da für die TNF-Signaltransduktion jedoch TRAF2 die wesentliche Rolle spielt, ist eine TRAF6-spezifische Hemmung unwahrscheinlich. Möglicherweise werden Annexin 1- abhängig verschiedene TRAFs inhibiert. Für das laut Genexpressionsanalysen (Abb.III.7.B, C und Tabelle V.1.) durch Annexin 1 induzierte SOCS2 wurde beispielsweise gezeigt, dass es den proteasomalen Abbau von TRAF6 und TRAF2 induziert (Machado et al. 2008). Das ebenfalls induzierte A20 deubiquitiniert TRAF6 im TLR-Signalweg sowie RIP1 im TNF-Rezeptor-Signalweg (Lee et al. 2000; Boone et al. 2004). Schließlich ist auch eine Inhibition an mehreren Stellen in beiden Signalwegen denkbar, wie es für verschiedene regulatorische Mechanismen gezeigt wurde. (siehe I.4.3.). Dazu käme es unter anderem infolge der Induktion eines antiinflammatorischen Genexpressionsprogramms, wie es z.B. nach IL-10-Stimulation der Fall ist (Williams et al. 2004; Murray 2005).

IV.5. Der inhibierende Effekt von Annexin 1 ist proteinsyntheseabhängig

Der hemmende Effekt apoptotischer Zellen auf die Produktion proinflammatorischer Zytokine von Phagozyten wie humanen Monozyten (Voll et al. 1997) und murinen Raw264.7 Makrophagen (Cvetanovic & Ucker 2004) ist bei längerer Vorinkubationszeit verstärkt. Mit humanen DC konnte die Zeitabhängigkeit in dieser Arbeit bestätigt werden (Abb.III.17. A). Im Fall von Annexin 1 war die Dauer der Vorinkubation noch entscheidender als im Fall apoptotischer Zellen. Vor allem bei humanen DC erwies es sich als essenziell, über Nacht zu inku- bieren, da sonst keine oder nur sehr geringe inhibitorische Effekte beobachtet wurden (Abb.III.17.B). Möglicherweise verwenden apoptotische Zellen mehrere Mechanismen zur Hemmung von DC, von denen einige schnell wirken, während andere erst nach längerer

90 IV. Diskussion Andrea Mahr

Inkubation eine Rolle spielen. Annexin 1 könnte gemäß dieser Hypothese eines der Signale sein, deren Auswirkung erst später zum Tragen kommt. Der zeitfordernde Prozess beinhaltet vermutlich die Synthese von Proteinen. In Anwesenheit von Cycloheximid kann kein inhibitorischer Annexin 1-Effekt mehr beobachtet werden, vielmehr wird die TLR-induzierte Menge an mRNA Transkripten von TNF und IL-8 erhöht (Abb.III.17.C, D und Daten nicht gezeigt). Diese Befunde stehen im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cvetanovic & Ucker (2004) mit murinen Raw264.7 Makrophagen, die keinen Effekt von Cycloheximid auf den hemmenden Einfluss apoptotischer Zellen beobachten. Der Unterschied könnte zum einen auf der Verwendung muriner Makrophagen anstelle humaner DC beruhen, zum anderen auf der Verwendung apoptotischer Zellen vs. Annexin 1. In der vorliegenden Studie wurden wie erwähnt intrazelluläre Effekte bewusst nur unter Verwendung des rekombinanten Proteins untersucht, da apoptotisches Material die Ergebnisse verfälschen könnte. Ein Phänomen, das die Interpretation der mit Cycloheximid gewonnenen Daten erschwert, ist die Verstärkung der TLR-induzierten Transkription durch den Inhibitor selbst (Abb.III.17.D, F). Superinduktion verschiedener mRNAs durch Cycloheximid mit oder ohne zusätzliche Stimulation wurde bereits beschrieben. Ausmaß und Ursache der Induktion sind zelltypabhängig. Die Ursache kann in der Inhibition der Proteinsynthese selbst liegen, wenn labile inhibitorische Proteine für die negative Regulation der Induktion verantwortlich sind (Hayes & Zoon 1993). Derartige Proteine können z.B. die Stabilität der mRNA regulieren (Ross 1995). Zudem kann es zur Aktivierung von NF-κB kommen, wenn IκB- Proteine nicht in ausreichendem Ausmaß (re-)synthetisiert werden (Newton et al. 1996), was jedoch gemäß Western Blot-Analysen zumindest für IκBα im vorliegenden System nicht der Fall ist (Daten nicht gezeigt). Stattdessen wurde eine starke Phosphorylierung der p38 Kinase durch Cyclo- heximid gefunden (Daten nicht gezeigt), die eine mögliche Ursache für die Superinduktion darstellt. Die Aktivierung von MAP-Kinasen durch Proteinsynthese-Inhibitoren wurde bereits beschrieben. Sie ist ein Charakteristikum des durch Translationsinhibition ausgelösten ribo- toxischen Stresses, der zelltypabhängig mehr oder weniger ausgeprägt ist und ebenfalls zur Superinduktion von Zytokin-mRNAs beitragen kann (Bunyard et al. 2003; Hershko et al. 2004; Itani et al. 2003). Welche Proteine synthetisiert werden, und ob diese intrazellulär oder nach Sekretion in autokriner Weise die TLR-Signaltransduktion hemmen, kann durch Analyse der DC-Über- stände oder durch Genexpressionsanalysen nach Inkubation mit apoptotischen Zellen bzw. Annexin 1 ermittelt werden.

IV.6. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf DC

Gemäß den Ergebnissen dieser Arbeit inhibiert Annexin 1 die TLR-induzierte Transkrip- tion proinflammatorischer Zytokine auf transkriptioneller Ebene. Die Interferenz mit dem TLR-

91 IV. Diskussion Andrea Mahr

Signalweg findet oberhalb der Aktivierung von MAP-Kinasen und NF-κB statt und betrifft sowohl den MyD88- als auch den TRIF-abhängigen Weg. Neben den TLR wird auch die Signaltransduktion des TNF-Rezeptors inhibiert. Der Effekt beruht mit hoher Wahrscheinlich- keit auf der Induktion von Proteinsynthese durch Annexin 1. Die synthetisierten Proteine können intra- oder extrazellulär wirken und die Zelle antiinflammatorisch beeinflussen. Abb. IV.1. zeigt ein Modell, das diese Befunde berücksichtigt.

Abb. IV.1. Modell zum Wirkmechanismus von Annexin 1 auf humane DC. Annexin 1 beeinflusst DC durch Bindung an einen Oberflächenrezeptor, dessen Signaltransduktion die Synthese antiinflammatorischer Proteine induziert. Alternativ könnte Annexin 1 auch von der DC aufgenommen werden und intrazelluläre Zielmoleküle beeinflussen. Die synthetisierten Proteine wirken entweder intrazellulär, oder nach Sekretion in autokriner Weise. Ein mögliches intrazellulär wirkendes Protein ist SOCS2, das durch Einleitung des proteasomalen Abbaus von TRAF6 und TRAF2 die TLR- und TNF-Rezeptor-vermittelte Signalwege hemmt. Alternativ könnte es z.B. durch A20 zu Deubiquitinierung von Signalmolekülen wie TRAF6 im TLR-Signalweg sowie RIP1 im TNF-Rezeptor-Signalweg kommen. MAP-Kinase-Phosphatasen wie DUSP1 und DUSP5 könnten MAP-Kinasen inaktivieren. Auch eine Hemmung der Transkription proinflammatorisch wirkender Proteine ist denkbar, etwa des Transkriptionsfaktors Egr1. Als autokrin wirkende Faktoren könnten Zytokine wie TNF und IL-6 wirken, die ähnlich wie beim Phänomen der TNF-Toleranz zu einer verminderten Stimulierbarkeit der DC durch proinflammatorische Stimuli führen. Das durch Annexin 1 hervorgerufene Genexpressionsprogramm führt zu einer Hemmung von TLR-Signalwegen oberhalb von MAP-Kinasen und NF-κB sowie zur Hemmung der TNF-Rezeptor- induzierten Gentranskription. Bei unterdrückter Proteinsynthese (*) kann die Signaltransduktion von Annexin 1 auch proinflammatorisch sein und die TLR-Signaltransduktion verstärken.

92 IV. Diskussion Andrea Mahr

Erste Hinweise auf antiinflammatorisch wirkende Gene, die durch Annexin 1 induziert werden, ergeben sich aus den Genexpressionsanalysen (Abb. III.7.C und Tabelle V.1.). So ist das durch Annexin 1 induzierte SOCS2 ein negativer Regulator der TLR- Signaltransduktion, der in unreifen, nicht aber in reifen DC exprimiert wird (Jackson et al. 2004). SOCS2 inhibiert die JAK-STAT-abhängige Signaltransduktion verschiedener Zytokine (Yoshimura et al. 2007). Es hemmt auch Signale über TLR und den TNF-Rezeptor durch Induktion des proteasomalen Abbaus von TRAF6 und TRAF2, nachdem es durch Bindung von Lipoxin A4 an den Ah (aryl hydrocarbon)-Rezeptor sowie den FPRL1 induziert wurde (Machado et al. 2008). Letzterer soll neben Lipoxin A4 auch Annexin 1 binden (Ernst et al. 2004). Das ebenfalls induzierte A20 ist ein bekannter negativer Regulator der TLR- und TNF- Signaltransduktion (Boone et al. 2004), und die Phosphatasen DUSP1 und DUSP5 inaktivieren MAP-Kinasen (Lang et al. 2006; Mandl et al. 2005). Die Regulation muss jedoch noch durch quantitative PCR und vor allem auf Proteinebene bestätigt werden. Neben der Induktion verschiedener Gene fällt die deutliche und reproduzierbare Herunterregulation des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors Egr1 auf. Da Egr1 durch MAP- Kinasen induzierte Transkription proinflammatorischer Zytokine vermittelt, könnte eine Herunterregulation ebenfalls zum tolerogenen Effekt beitragen (Xu et al. 2001; Faour et al. 2005). Ein weiterer Befund ist die Induktion des Chemokinrezeptors CCR7, der für die Migra- tion in lymphatische Gewebe benötigt wird (Forster et al. 2008). Wichtig sind hier natürlich die Untersuchung der Induktion auf Proteinebene sowie die Oberflächenexpression. Daneben führt Annexin 1 auch zur schwachen Expression von extrazellulär wirkenden Zytokinen und Chemokinen wie TNF, IL-1β, IL-8 und CCL20. Da die Analysen in Abwesen- heit der LPS-inhibierenden Substanz Polymyxin B durchgeführt wurden, muss noch geklärt werden, inwiefern diese Induktion auf geringe Mengen an kontaminierendem LPS zurückzu- führen ist. Vorläufige Experimente weisen darauf hin, dass eine schwache Induktion der mRNAs für TNF, IL-8 und IL-1β auch unter Ausschluss von LPS-Effekten auftritt. Einige durch Annexin 1 regulierte Transkripte sind IFN-regulierte Gene. Einige dieser Gene waren jedoch nur in einer der beiden Analysen induziert (in Klammern in Abb.III.7.C), für die anderen mRNAs, wie ISG20 und GBP1, steht eine Bestätigung durch quantitative PCR noch aus. Insgesamt ist die Induktion der als proinflammatorisch geltenden Zytokine durch Annexin 1 ein vorläufiger Befund. Es könnte jedoch durchaus sein, dass eine schwache Aktivierung der DC ein Teil des Annexin 1-spezifischen Effekts ist, passend zu der Hypo- these, dass DC nach Aufnahme apoptotischer Zellen nicht völlig unreif bleiben, da sie sonst weder zur Migration in die Lymphknoten noch zur Antigen-Präsentation fähig wären (Lutz & Schuler 2002). Eine schwache Aktivierung ist auch in einigen Fällen auf der Ebene der sezernierten Proteine sowie der kostimulierenden Oberflächenmoleküle zu beobachten (Daten nicht gezeigt, sowie Weyd und Dörner, persönliche Kommunikation). Zudem wirken

93 IV. Diskussion Andrea Mahr

Zytokine wie TNF, IL-1β und IL-6 zwar proinflammatorisch, wenn sie bei der Reaktion von Phagozyten auf Pathogene in großen Mengen sezerniert werden, können für sich genom- men und in kleinen Konzentrationen jedoch antiinflammatorisch wirken, ähnlich wie man es bei der LPS-Toleranz beobachtet. Hierfür finden sich zahlreiche Beispiele: Bei der TNF- Toleranz, die durch Inkubation mit geringen Mengen an TNF ausgelöst wird, kommt es zu einer verminderten Stimulierbarkeit mit TNF und anderen proinflammatorischen Stimuli im Wesentlichen infolge der TNF-abhängigen Aktivierung des Transkriptionsfaktors C/EPBβ, der die NF-κB-abhängige Induktion proinflammatorischer Gene hemmt (Buck et al. 2001; Weber et al. 2003; Zwergal et al. 2006). Das Immunsuppressivum Rapamycin übt antiinflammatorische Effekte auf Phagozyten aus, indem es zunächst die Sekretion von IL-1β induziert, die dann in der Folge zur erhöhten Expression des TLR-inhibierenden Moleküls ST2 führt (Turnquist et al. 2008). Die durch die Bindung des MHC-Klasse 1b Moleküls HLA-G an ILT-4 ausgelöste Sekretion von IL-6 führt über STAT3-abhängige Signaltransduktion zu einer Hemmung der DC-Reifung (Liang et al. 2008). Somit ist die schwache Induktion proinflammatorischer Gene eine Möglichkeit der Toleranzinduktion. Diese Hypothese lässt sich durch Experimente mit blockierenden Antikörpern gegen die entsprechenden Zytokine untersuchen. Viele der durch Annexin 1 regulierten Gene haben keine etablierte immunologische Funktion. Da in dem gewählten experimentellen System jedoch nur sehr lange Vorinkubationszeiten mit Annexin 1 untersucht wurden, ist eine mögliche transkriptionelle Hochregulation anderer antiinflammatorischer Gene zu anderen Zeitpunkten nicht ausgeschlossen. Dies kann durch eine Kinetik untersucht werden, bei der die DC auch für kürzere Zeiten mit Annexin 1 inkubiert werden. Ähnliches gilt für eine Beurteilung des Effekts auf die durch LPS induzierten antinflammatorischen Zytokine. Um deren Regulation zu beobachten, müsste die gewählte Zeitdauer der LPS-Stimulation verlängert werden. Nach einer Stunde beobachtet man im Wesentlichen nur eine Hochregulation proinflammatorischer Gene, wäh- rend antiinflammatorische Zytokine erst nach längerer Zeit exprimiert werden.

IV.7. Rekombinantes Annexin 1 zeigt inhibitorische Effekte unabhängig von kontaminierendem LPS

Aus dem bakteriell exprimierten rekombinanten Annexin 1 konnte das kontaminierende LPS zwar weitgehend entfernt werden, dennoch blieben geringe Mengen zurück. Daher wurden zusammen mit dem Protein je nach Präparation etwa 0,02-1 EU/mL (1-100 pg/mL) LPS in die Kultur eingebracht, und es besteht die Gefahr artifizieller Effekte durch Endotoxin- Toleranz. Daher wurden wichtige Experimente dieser Arbeit in Anwesenheit des LPS-inhibierenden Reagens Polymyxin B wiederholt. Die verwendete Konzentration an Polymyxin B von 10 µg/mL inhibiert die Zytokinproduktion humaner DC durch Stimulation mit mehr als

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10 ng/mL an ultrapurem LPS (Daten nicht gezeigt). Polymyxin B ist ein kationisches Polypeptid mit einer über Amidbindung verknüpften Fettsäure. Es bindet an saure Gruppen und Fettsäuren von Lipid A im LPS-Molekül und verhindert so dessen Aktivität. Es inhibiert nicht alle LPS-Typen gleichermaßen (Cavaillon & Haeffner-Cavaillon 1986), da einige Typen aufgrund verschiedener Modifikationen eine geringere Affinität zu Polymyxin B aufweisen (Nummila et al. 1995; Rocque et al. 1988). Die Aktivität des in den Annexin 1-Präparationen enthaltenen LPS wurde jedoch durch Polymyxin B effizient inhibiert (Abb.III.4.D). Daher kann davon ausgegangen werden, dass die mit Polymyxin B reproduzierten Effekte nicht auf Endotoxin-Toleranz beruhen. Im Einzelnen wurden die Effekte auf die Sekretion der Zytokine TNF, IL-6 und IL-8 (Abb.III.4.) sowie die Regulation der mRNAs für TNF, IL-8 und IL-1β nach

Pam3CSK4-Stimulation humaner DC (Abb.III.16.C und Daten nicht gezeigt) mehrmals und damit eindeutig reproduziert. Dabei zeigte sich, dass bei Hemmung des LPS tatsächlich bisweilen weniger starke Effekte auftraten. Allerdings beruht nur ein kleiner Teil der beobachteten Effekte auf Endotoxin-Toleranz. Für U-937 Zellen müssen die entsprechenden Experimente noch unter Verwendung von Polymyxin B wiederholt werden, um die Hemmung der TNF-Produktion bei gleichbleibender Produktion von IL-10 (Abb. III.2.A-D; Abb. III.5.A, B) zu verifizieren. Die Inhibition der TNF-Signaltransduktion durch Annexin 1 (Abb.III.16.B) sowie die Aufhebung des Annexin 1-Effekts durch Cycloheximid (Abb.III.17.E, F) wurden in Anwesenheit von Polymyxin B mehrfach reproduziert. Das Gleiche gilt für die Effekte auf die TLR3-Signaltransduktion, wobei sich hier die Zugabe von Polymyxin B auch aus dem Grund als sinnvoll erwies, da das von Sigma bezogene Poly(I:C) mit großen Mengen an LPS kontaminiert war (Daten nicht gezeigt). Effekte auf die MAP-Kinasen p38 und JNK konnten in jeweils einem Experiment – wenn auch in schwacher Ausprägung – nachgewiesen werden. Die Resultate zur Inhibition der MAP-Kinasen wie auch von NF-κB bedürfen jedoch noch der Validierung (laufende Experimente). Ebenso empfiehlt sich eine Wiederholung der Genexpressionsanalysen zwecks Ausschluss der Endotoxin-Toleranz-Effekte bei der Interpretation der Daten. Insgesamt ist ein Großteil der beobachteten Effekte Annexin 1-spezifisch, für andere muss die Beteiligung von Annexin 1 noch validiert werden. Dies kann durch Durchführung der Experimente in Anwesenheit von Polymyxin B erfolgen, das LPS-Effekte verhindert. Weitere Kontrollen können dazu dienen, einen Einfluss jeglicher bakterieller Produkte auszu- schließen. Zum einen kann als negative Kontrolle ein Protein verwendet werden, das nach der gleichen Prozedur wie Annexin 1 aufgereinigt wurde und somit eine vergleichbare Menge an kontaminierenden bakteriellen Substanzen enthält. Eine Inaktivität des Kontrollproteins im verwendeten System wäre ein weiterer Hinweis für die Spezifität des Annexin 1-Effekts. In Experimenten mit Annexin 5 als Kontrollprotein zeigte sich zunächst ebenfalls ein hemmender Effekt. Da nicht auszuschließen ist, dass mehrere Annexine DC in redundanter

95 IV. Diskussion Andrea Mahr

Weise inhibieren, wird derzeit ein Antitrypsin als mögliches Kontrollprotein aufgereinigt (Björn Linke, persönliche Kommunikation). Letztendlich sollte völlig LPS-freies, aus eukaryontischen Zellen aufgereinigtes Annexin 1 sowie eine Blockierbarkeit der Effekte durch Annexin 1- spezifische Antikörper Aufschluss über die ausschließlich Annexin 1-abhängigen Phänomene geben.

IV.8. Ausblick

In dieser Arbeit wurde ein Einfluss von Annexin 1 bzw. apoptotischen Zellen auf die proinflammatorische Signaltransduktion von Phagozyten, insbesondere von DC, gezeigt. Die vermutlich am Effekt beteiligte Proteinsynthese kann durch Genexpressionsanalysen weiter untersucht werden. Die bisherigen Analysen weisen auf die Induktion einiger antiinflammatorischer Proteine hin, von denen einige, wie z.B. SOCS2 und A20, im Einklang mit der beobachteten Inhibition von MyD88- und TRIF-abhängigem Signalweg sowie der TNF- abhängigen Signaltransduktion wären. Auch ein Effekt der schwach induzierten Zytokine wie etwa TNF und IL-1β ist möglich, da diese zu Toleranz gegen weitere proinflammatorische Stimulation führen könnten. Daneben könnte die Herunterregulation von Genen wie Egr-1 oder CD14 eine Rolle spielen. Die Resultate müssen unter Ausschluss von Endotoxin- Toleranz sowie auf Proteinebene bestätigt werden. Außerdem muss in Kinetiken untersucht werden, ob nach unterschiedlich langen Inkubationszeiten mit Annexin 1 weitere mögliche Mediatoren des Effekts transkriptionell reguliert werden. Mögliche autokrine Faktoren können durch Experimente mit blockierenden Antikörpern, Zwei-Kammer-Experimente, oder Analyse der Überstände von mit apoptotischen Zellen inkubierten DC identifiziert werden. Bei ersten Versuchen mit einem Zwei-Kammer-System erwies sich als Störfaktor, dass apoptotische Neutrophile antiinflammatorische Substanzen ins Medium abgeben, die DC inhibieren und den Effekt möglicher DC-sezernierter autokriner Faktoren überlagern (Daten nicht gezeigt). An welchen Stellen TLR-Signalwege durch den Annexin 1-Effekt gehemmt werden, kann in einem System untersucht werden, in dem z.B. HEK293-Zellen mit verschiedenen Signaltransduktionsmolekülen transfiziert werden. HEK293-Zellen exprimieren keine TLR, besitzen aber die Komponenten des Signalwegs, sodass sie nach Transfektion mit TLR auf TLR-Liganden mit IL-8-Produktion reagieren (Yang et al. 1998; Chow et al. 1999). Expression verschiedener Signaltranduktionsmoleküle führt zu einer Initiation des TLR- Signalwegs an unterschiedlichen Stellen unterhalb des Rezeptors. Tritt weiterhin ein inhibitorischer Effekt von Annexin 1 auf, so weist dies auf eine Inhibition von Molekülen hin, die dem transfizierten Protein nachgeschaltet sind. Die bisherigen Daten unterstützen eine Inhibition von Molekülen, die sowohl im TLR- als auch im TNF-Rezeptor-Signalweg vorkommen, mög- licherweise TRAFs oder die allgemeinen Regulatoren von NF-κB oder MAP-Kinasen.

96 IV. Diskussion Andrea Mahr

Die Untersuchung des Wirkmechanismus von Annexin 1 trägt zur Aufklärung eines mög- lichen Mechanismus der durch apoptotische Zellen vermittelten peripheren Toleranz bei. Das Auftreten spätapototischer Zellen durch vermehrte Apoptose oder verminderte Phagozytose wurde mit der Entstehung von Autoimmunkrankheiten in Verbindung gebracht (Rosen & Casciola-Rosen 1999; Rodenburg et al. 2000). Dies könnte daran liegen, dass die Signale frühapoptotischer Zellen an Phagozyten essenziell für die Etablierung und Aufrechterhaltung der Toleranz sind. Umgekehrt haben die Beobachtungen eine Implikation für die Krebsthera- pie, da die Behandlung von Tumoren mit Chemotherapeutika oder Bestrahlung Apoptose in den Krebszellen auslöst. Dies ist zwar erwünscht im Hinblick auf die Beseitigung des Tumors, jedoch könnte als Nebeneffekt eine Induktion von Toleranz gegen Tumorantigene auftreten. Bei einer nicht vollständigen Elimination des Tumorgewebes durch die Therapie wäre dadurch mit Problemen durch verminderte Abstoßung des Tumors durch das Immun- system zu rechnen. Daher sind gängige Methoden der Krebstherapie vor diesem Hintergrund zu überdenken. Die Erzeugung von Toleranz durch apoptotische Zellen oder Annexin 1 könnte auch direkte klinische Verwendbarkeit erlangen, etwa bei der Behandlung von Allergien oder der Verhinderung von Transplantatabstoßungen (Übersicht: Morelli 2006). Im Mausmodell unter- stützt die vorherige Injektion apoptotischer Zellen des Donors die Akzeptanz eines Trans- plantats durch das Immunsystem, etwa bei Knochenmarkstransplantationen (Bittencourt et al. 2001) oder Herztransplantation (Wang et al. 2006). Auch bei der sogenannten extrakorpo- ralen Photopherese könnten apoptotische Zellen eine Rolle spielen. Diese Behandlung wird bei kutanen T-Zell-Lymphomen wie dem Sézary Syndrom eingesetzt, zeigt jedoch auch Erfolge bei der Therapie von Transplantatabstoßungen und Autoimmunerkrankungen wie Sklerodermie. Aus dem Blut des Patienten werden bei dieser Therapie Leukozyten entnommen und mit einem Psoralen-Derivat behandelt, das DNA bindet und die Zellen dadurch fotoaktiviert. Durch UV-A Bestrahlung wird DNA-Schädigung mit nachfolgender Apoptose ausgelöst und die Zellen werden reinfundiert. Nach welchem Mechanismus die Methode zur Heilung derart unterschiedlicher Erkrankungen führt, ist noch ungeklärt. Eine Theorie ist, dass die im Photopherese-Präparat enthaltenen Phagozyten die apoptotischen T-Zellen aufnehmen, wodurch sie einen tolerogenen Phänotyp erhalten und Immunreaktionen gegen Transplantate oder Autoantigene verhindern können (Peritt 2006; Oliven & Shechter 2001). Die Verfügbarkeit eines Proteins, das antiinflammatorische Effekte auf DC ausübt, stellt gegenüber der Verwendung apoptotischer Zellen einen großen Vorteil dar und würde eine wesentlich besser reproduzierbare und dosierbare Therapie ermöglichen.

97 V. Anhang Andrea Mahr

V. Anhang

V.1. Referenzen

Adachi, O., T. Kawai, K. Takeda, M. Matsumoto, H. Tsutsui, M. Sakagami, K. Nakanishi und S. Akira (1998). "Targeted disruption of the MyD88 gene results in loss of IL-1- and IL-18-mediated function." Immunity 9(1): 143-50. Adhikari, A., M. Xu und Z. J. Chen (2007). "Ubiquitin-mediated activation of TAK1 and IKK." Oncogene 26(22): 3214-26. Agrawal, S. und E. R. Kandimalla (2004). "Role of Toll-like receptors in antisense and siRNA [corrected]." Nat Biotechnol 22(12): 1533-7. Akbari, O., R. H. DeKruyff und D. T. Umetsu (2001). "Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen." Nat Immunol 2(8): 725-31. Aksoy, E., W. Vanden Berghe, S. Detienne, Z. Amraoui, K. A. Fitzgerald, G. Haegeman, M. Goldman und F. Willems (2005). "Inhibition of phosphoinositide 3-kinase enhances TRIF-dependent NF-kappa B activation and IFN-beta synthesis downstream of Toll-like receptor 3 and 4." Eur J Immunol 35(7): 2200- 9. Albert, M. L., M. Jegathesan und R. B. Darnell (2001). "Dendritic cell maturation is required for the cross- tolerization of CD8+ T cells." Nat Immunol 2(11): 1010-7. Albert, M. L., S. F. Pearce, L. M. Francisco, B. Sauter, P. Roy, R. L. Silverstein und N. Bhardwaj (1998). "Immature dendritic cells phagocytose apoptotic cells via alphavbeta5 and CD36, and cross-present antigens to cytotoxic T lymphocytes." J Exp Med 188(7): 1359-68. Alexopoulou, L., A. C. Holt, R. Medzhitov und R. A. Flavell (2001). "Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3." Nature 413(6857): 732-8. Ali, H., R. M. Richardson, B. Haribabu und R. Snyderman (1999). "Chemoattractant receptor cross- desensitization." J Biol Chem 274(10): 6027-30. Aliprantis, A. O., R. B. Yang, M. R. Mark, S. Suggett, B. Devaux, J. D. Radolf, G. R. Klimpel, P. Godowski und A. Zychlinsky (1999). "Cell activation and apoptosis by bacterial lipoproteins through toll-like receptor-2." Science 285(5428): 736-9. Aliprantis, A. O., R. B. Yang, D. S. Weiss, P. Godowski und A. Zychlinsky (2000). "The apoptotic signaling pathway activated by Toll-like receptor-2." EMBO J 19(13): 3325-36. An, H., W. Zhao, J. Hou, Y. Zhang, Y. Xie, Y. Zheng, H. Xu, C. Qian, J. Zhou, Y. Yu, S. Liu, G. Feng und X. Cao (2006). "SHP-2 phosphatase negatively regulates the TRIF adaptor protein-dependent type I interferon and proinflammatory cytokine production." Immunity 25(6): 919-28. Anderson, H. A., C. A. Maylock, J. A. Williams, C. P. Paweletz, H. Shu und E. Shacter (2003). "Serum-derived protein S binds to phosphatidylserine and stimulates the phagocytosis of apoptotic cells." Nat Immunol 4(1): 87-91. Anderson, K. V., L. Bokla und C. Nusslein-Volhard (1985a). "Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: the induction of polarity by the Toll gene product." Cell 42(3): 791-8. Anderson, K. V., G. Jurgens und C. Nusslein-Volhard (1985b). "Establishment of dorsal-ventral polarity in the Drosophila embryo: genetic studies on the role of the Toll gene product." Cell 42(3): 779-89. Ando, Y., S. Imamura, M. K. Owada und R. Kannagi (1991). "Calcium-induced intracellular cross-linking of lipocortin I by tissue transglutaminase in A431 cells. Augmentation by membrane phospholipids." J Biol Chem 266(2): 1101-8. Appel, S., V. Mirakaj, A. Bringmann, M. M. Weck, F. Grunebach und P. Brossart (2005). "PPAR-gamma agonists inhibit toll-like receptor-mediated activation of dendritic cells via the MAP kinase and NF-kappaB pathways." Blood 106(12): 3888-94. Arur, S., U. E. Uche, K. Rezaul, M. Fong, V. Scranton, A. E. Cowan, W. Mohler und D. K. Han (2003). "Annexin I is an endogenous ligand that mediates apoptotic cell engulfment." Dev Cell 4(4): 587-98. Baccala, R., K. Hoebe, D. H. Kono, B. Beutler und A. N. Theofilopoulos (2007). "TLR-dependent and TLR- independent pathways of type I interferon induction in systemic autoimmunity." Nat Med 13(5): 543-51. Baetz, A., M. Frey, K. Heeg und A. H. Dalpke (2004). "Suppressor of cytokine signaling (SOCS) proteins indirectly regulate toll-like receptor signaling in innate immune cells." J Biol Chem 279(52): 54708-15. Balasubramanian, K., J. Chandra und A. J. Schroit (1997). "Immune clearance of phosphatidylserine-expressing cells by phagocytes. The role of beta2-glycoprotein I in macrophage recognition." J Biol Chem 272(49): 31113-7. Banchereau, J. und R. M. Steinman (1998). "Dendritic cells and the control of immunity." Nature 392(6673): 245- 52. Bastian, B. C., C. Sellert, A. Seekamp, J. Romisch, E. P. Paques und E. B. Brocker (1993). "Inhibition of human skin phospholipase A2 by "lipocortins" is an indirect effect of substrate/lipocortin interaction." J Invest Dermatol 101(3): 359-63. Bausinger, H., D. Lipsker, U. Ziylan, S. Manie, J. P. Briand, J. P. Cazenave, S. Muller, J. F. Haeuw, C. Ravanat, H. de la Salle und D. Hanau (2002). "Endotoxin-free heat-shock protein 70 fails to induce APC activation." Eur J Immunol 32(12): 3708-13. Bianchi, M. E. (2007). "DAMPs, PAMPs and alarmins: all we need to know about danger." J Leukoc Biol 81(1): 1- 5. 98 V. Anhang Andrea Mahr

Binder, R. J., D. K. Han und P. K. Srivastava (2000). "CD91: a receptor for heat shock protein gp96." Nat Immunol 1(2): 151-5. Binder, R. J., J. B. Kelly, 3rd, R. E. Vatner und P. K. Srivastava (2007). "Specific immunogenicity of heat shock protein gp96 derives from chaperoned antigenic peptides and not from contaminating proteins." J Immunol 179(11): 7254-61. Bittencourt, M. C., S. Perruche, E. Contassot, S. Fresnay, M. H. Baron, R. Angonin, F. Aubin, P. Herve, P. Tiberghien und P. Saas (2001). "Intravenous injection of apoptotic leukocytes enhances bone marrow engraftment across major histocompatibility barriers." Blood 98(1): 224-30. Black, R. A., C. T. Rauch, C. J. Kozlosky, J. J. Peschon, J. L. Slack, M. F. Wolfson, B. J. Castner, K. L. Stocking, P. Reddy, S. Srinivasan, N. Nelson, N. Boiani, K. A. Schooley, M. Gerhart, R. Davis, J. N. Fitzner, R. S. Johnson, R. J. Paxton, C. J. March und D. P. Cerretti (1997). "A metalloproteinase disintegrin that releases tumour-necrosis factor-alpha from cells." Nature 385(6618): 729-33. Blankenstein, T. und T. Schuler (2002). "Cross-priming versus cross-tolerance: are two signals enough?" Trends Immunol 23(4): 171-3. Bonasio, R., M. L. Scimone, P. Schaerli, N. Grabie, A. H. Lichtman und U. H. von Andrian (2006). "Clonal deletion of thymocytes by circulating dendritic cells homing to the thymus." Nat Immunol 7(10): 1092-100. Bonifaz, L., D. Bonnyay, K. Mahnke, M. Rivera, M. C. Nussenzweig und R. M. Steinman (2002). "Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance." J Exp Med 196(12): 1627-38. Boone, D. L., E. E. Turer, E. G. Lee, R. C. Ahmad, M. T. Wheeler, C. Tsui, P. Hurley, M. Chien, S. Chai, O. Hitotsumatsu, E. McNally, C. Pickart und A. Ma (2004). "The ubiquitin-modifying enzyme A20 is required for termination of Toll-like receptor responses." Nat Immunol 5(10): 1052-60. Borisenko, G. G., S. L. Iverson, S. Ahlberg, V. E. Kagan und B. Fadeel (2004). "Milk fat globule epidermal growth factor 8 (MFG-E8) binds to oxidized phosphatidylserine: implications for macrophage clearance of apoptotic cells." Cell Death Differ 11(8): 943-5. Bose, J., A. D. Gruber, L. Helming, S. Schiebe, I. Wegener, M. Hafner, M. Beales, F. Kontgen und A. Lengeling (2004). "The phosphatidylserine receptor has essential functions during embryogenesis but not in apoptotic cell removal." J Biol 3(4): 15. Botto, M. (1998). "C1q knock-out mice for the study of complement deficiency in autoimmune disease." Exp Clin Immunogenet 15(4): 231-4. Boule, M. W., C. Broughton, F. Mackay, S. Akira, A. Marshak-Rothstein und I. R. Rifkin (2004). "Toll-like receptor 9-dependent and -independent dendritic cell activation by chromatin-immunoglobulin G complexes." J Exp Med 199(12): 1631-40. Brennan, C. M. und J. A. Steitz (2001). "HuR and mRNA stability." Cell Mol Life Sci 58(2): 266-77. Brint, E. K., D. Xu, H. Liu, A. Dunne, A. N. McKenzie, L. A. O'Neill und F. Y. Liew (2004). "ST2 is an inhibitor of interleukin 1 receptor and Toll-like receptor 4 signaling and maintains endotoxin tolerance." Nat Immunol 5(4): 373-9. Brook, M., G. Sully, A. R. Clark und J. Saklatvala (2000). "Regulation of tumour necrosis factor alpha mRNA stability by the mitogen-activated protein kinase p38 signalling cascade." FEBS Lett 483(1): 57-61. Brown, S., I. Heinisch, E. Ross, K. Shaw, C. D. Buckley und J. Savill (2002). "Apoptosis disables CD31-mediated cell detachment from phagocytes promoting binding and engulfment." Nature 418(6894): 200-3. Buck, M., L. Zhang, N. A. Halasz, T. Hunter und M. Chojkier (2001). "Nuclear export of phosphorylated C/EBPbeta mediates the inhibition of albumin expression by TNF-alpha." EMBO J 20(23): 6712-23. Bulut, Y., E. Faure, L. Thomas, O. Equils und M. Arditi (2001). "Cooperation of Toll-like receptor 2 and 6 for cellular activation by soluble tuberculosis factor and Borrelia burgdorferi outer surface protein A lipoprotein: role of Toll-interacting protein and IL-1 receptor signaling molecules in Toll-like receptor 2 signaling." J Immunol 167(2): 987-94. Bunyard, P., M. Handley, G. Pollara, K. Rutault, I. Wood, M. Chaudry, C. Alderman, J. Foreman, D. R. Katz und B. M. Chain (2003). "Ribotoxic stress activates p38 and JNK kinases and modulates the antigen- presenting activity of dendritic cells." Mol Immunol 39(13): 815-27. Burns, K., S. Janssens, B. Brissoni, N. Olivos, R. Beyaert und J. Tschopp (2003). "Inhibition of interleukin 1 receptor/Toll-like receptor signaling through the alternatively spliced, short form of MyD88 is due to its failure to recruit IRAK-4." J Exp Med 197(2): 263-8. Cambi, A. und C. G. Figdor (2003). "Dual function of C-type lectin-like receptors in the immune system." Curr Opin Cell Biol 15(5): 539-46. Carty, M., R. Goodbody, M. Schroder, J. Stack, P. N. Moynagh und A. G. Bowie (2006). "The human adaptor SARM negatively regulates adaptor protein TRIF-dependent Toll-like receptor signaling." Nat Immunol 7(10): 1074-81. Cavaillon, J. M. und N. Haeffner-Cavaillon (1986). "Polymyxin-B inhibition of LPS-induced interleukin-1 secretion by human monocytes is dependent upon the LPS origin." Mol Immunol 23(9): 965-9. Chang, C. C., R. Ciubotariu, J. S. Manavalan, J. Yuan, A. I. Colovai, F. Piazza, S. Lederman, M. Colonna, R. Cortesini, R. Dalla-Favera und N. Suciu-Foca (2002). "Tolerization of dendritic cells by T(S) cells: the crucial role of inhibitory receptors ILT3 and ILT4." Nat Immunol 3(3): 237-43. Chapman, L. P., M. J. Epton, J. C. Buckingham, J. F. Morris und H. C. Christian (2003). "Evidence for a role of the adenosine 5'-triphosphate-binding cassette transporter A1 in the externalization of annexin I from pituitary folliculo-stellate cells." Endocrinology 144(3): 1062-73.

99 V. Anhang Andrea Mahr

Chen, N. J., Chio, II, W. J. Lin, G. Duncan, H. Chau, D. Katz, H. L. Huang, K. A. Pike, Z. Hao, Y. W. Su, K. Yamamoto, R. F. de Pooter, J. C. Zuniga-Pflucker, A. Wakeham, W. C. Yeh und T. W. Mak (2008). "Beyond tumor necrosis factor receptor: TRADD signaling in toll-like receptors." Proc Natl Acad Sci U S A 105(34): 12429-34. Chen, W., M. E. Frank, W. Jin und S. M. Wahl (2001). "TGF-beta released by apoptotic T cells contributes to an immunosuppressive milieu." Immunity 14(6): 715-25. Cheng, F., H. W. Wang, A. Cuenca, M. Huang, T. Ghansah, J. Brayer, W. G. Kerr, K. Takeda, S. Akira, S. P. Schoenberger, H. Yu, R. Jove und E. M. Sotomayor (2003). "A critical role for Stat3 signaling in immune tolerance." Immunity 19(3): 425-36. Choi, K. B., F. Wong, J. M. Harlan, P. M. Chaudhary, L. Hood und A. Karsan (1998). "Lipopolysaccharide mediates endothelial apoptosis by a FADD-dependent pathway." J Biol Chem 273(32): 20185-8. Chow, J. C., D. W. Young, D. T. Golenbock, W. J. Christ und F. Gusovsky (1999). "Toll-like receptor-4 mediates lipopolysaccharide-induced signal transduction." J Biol Chem 274(16): 10689-92. Christmas, P., J. Callaway, J. Fallon, J. Jones und H. T. Haigler (1991). "Selective secretion of annexin 1, a protein without a signal sequence, by the human prostate gland." J Biol Chem 266(4): 2499-507. Chuang, T. H. und R. J. Ulevitch (2004). "Triad3A, an E3 ubiquitin-protein ligase regulating Toll-like receptors." Nat Immunol 5(5): 495-502. Cikala, M., O. Alexandrova, C. N. David, M. Proschel, B. Stiening, P. Cramer und A. Bottger (2004). "The phosphatidylserine receptor from Hydra is a nuclear protein with potential Fe(II) dependent oxygenase activity." BMC Cell Biol 5: 26. Clark, D. M., S. E. Moss, N. A. Wright und M. J. Crumpton (1991). "Expression of annexin VI (p68, 67 kDa- calelectrin) in normal human tissues: evidence for developmental regulation in B- and T-lymphocytes." Histochemistry 96(5): 405-12. Cohen, P. L., R. Caricchio, V. Abraham, T. D. Camenisch, J. C. Jennette, R. A. Roubey, H. S. Earp, G. Matsushima und E. A. Reap (2002). "Delayed apoptotic cell clearance and lupus-like autoimmunity in mice lacking the c-mer membrane tyrosine kinase." J Exp Med 196(1): 135-40. Colonna, M., G. Trinchieri und Y. J. Liu (2004). "Plasmacytoid dendritic cells in immunity." Nat Immunol 5(12): 1219-26. Comera, C. und F. Russo-Marie (1995). "Glucocorticoid-induced annexin 1 secretion by monocytes and peritoneal leukocytes." Br J Pharmacol 115(6): 1043-7. Coombes, J. L., K. R. Siddiqui, C. V. Arancibia-Carcamo, J. Hall, C. M. Sun, Y. Belkaid und F. Powrie (2007). "A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism." J Exp Med 204(8): 1757-64. Creagh, E. M. und L. A. O'Neill (2006). "TLRs, NLRs and RLRs: a trinity of pathogen sensors that co-operate in innate immunity." Trends Immunol 27(8): 352-7. Creutz, C. E. (1992). "The annexins and exocytosis." Science 258(5084): 924-31. Croxtall, J. D., S. Waheed, Q. Choudhury, R. Anand und R. J. Flower (1993). "N-terminal peptide fragments of lipocortin-1 inhibit A549 cell growth and block EGF-induced stimulation of proliferation." Int J Cancer 54(1): 153-8. Cui, P., B. Qin, N. Liu, G. Pan und D. Pei (2004). "Nuclear localization of the phosphatidylserine receptor protein via multiple nuclear localization signals." Exp Cell Res 293(1): 154-63. Cusson-Hermance, N., S. Khurana, T. H. Lee, K. A. Fitzgerald und M. A. Kelliher (2005). "Rip1 mediates the Trif- dependent toll-like receptor 3- and 4-induced NF-{kappa}B activation but does not contribute to interferon regulatory factor 3 activation." J Biol Chem 280(44): 36560-6. Cvetanovic, M., J. E. Mitchell, V. Patel, B. S. Avner, Y. Su, P. T. van der Saag, P. L. Witte, S. Fiore, J. S. Levine und D. S. Ucker (2006). "Specific recognition of apoptotic cells reveals a ubiquitous and unconventional innate immunity." J Biol Chem 281(29): 20055-67. Cvetanovic, M. und D. S. Ucker (2004). "Innate immune discrimination of apoptotic cells: repression of proinflammatory macrophage transcription is coupled directly to specific recognition." J Immunol 172(2): 880-9. Dalpke, A. H., M. D. Lehner, T. Hartung und K. Heeg (2005). "Differential effects of CpG-DNA in Toll-like receptor- 2/-4/-9 tolerance and cross-tolerance." Immunology 116(2): 203-12. Danielsen, E. M., B. van Deurs und G. H. Hansen (2003). ""Nonclassical" secretion of annexin A2 to the lumenal side of the enterocyte brush border membrane." Biochemistry 42(49): 14670-6. de Coupade, C., E. Solito und J. D. Levine (2003). "Dexamethasone enhances interaction of endogenous annexin 1 with L-selectin and triggers shedding of L-selectin in the monocytic cell line U-937." Br J Pharmacol 140(1): 133-45. Debret, R., H. El Btaouri, L. Duca, I. Rahman, S. Radke, B. Haye, J. M. Sallenave und F. Antonicelli (2003). "Annexin A1 processing is associated with caspase-dependent apoptosis in BZR cells." FEBS Lett 546(2-3): 195-202. Delamarre, L., M. Pack, H. Chang, I. Mellman und E. S. Trombetta (2005). "Differential lysosomal proteolysis in antigen-presenting cells determines antigen fate." Science 307(5715): 1630-4. Devitt, A., O. D. Moffatt, C. Raykundalia, J. D. Capra, D. L. Simmons und C. D. Gregory (1998). "Human CD14 mediates recognition and phagocytosis of apoptotic cells." Nature 392(6675): 505-9. Dhodapkar, M. V. und R. M. Steinman (2002). "Antigen-bearing immature dendritic cells induce peptide-specific CD8(+) regulatory T cells in vivo in humans." Blood 100(1): 174-7. Dhodapkar, M. V., R. M. Steinman, J. Krasovsky, C. Munz und N. Bhardwaj (2001). "Antigen-specific inhibition of effector T cell function in humans after injection of immature dendritic cells." J Exp Med 193(2): 233-8.

100 V. Anhang Andrea Mahr

Diebold, S. S., T. Kaisho, H. Hemmi, S. Akira und C. Reis e Sousa (2004). "Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA." Science 303(5663): 1529-31. Dokka, S., D. Toledo, X. Shi, J. Ye und Y. Rojanasakul (2000). "High-efficiency gene transfection of macrophages by lipoplexes." Int J Pharm 206(1-2): 97-104. Doyle, S., S. Vaidya, R. O'Connell, H. Dadgostar, P. Dempsey, T. Wu, G. Rao, R. Sun, M. Haberland, R. Modlin und G. Cheng (2002). "IRF3 mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program." Immunity 17(3): 251-63. Dreier, R., K. W. Schmid, V. Gerke und K. Riehemann (1998). "Differential expression of annexins I, II and IV in human tissues: an immunohistochemical study." Histochem Cell Biol 110(2): 137-48. Dumitru, C. D., J. D. Ceci, C. Tsatsanis, D. Kontoyiannis, K. Stamatakis, J. H. Lin, C. Patriotis, N. A. Jenkins, N. G. Copeland, G. Kollias und P. N. Tsichlis (2000). "TNF-alpha induction by LPS is regulated posttranscriptionally via a Tpl2/ERK-dependent pathway." Cell 103(7): 1071-83. El Kasmi, K. C., J. Holst, M. Coffre, L. Mielke, A. de Pauw, N. Lhocine, A. M. Smith, R. Rutschman, D. Kaushal, Y. Shen, T. Suda, R. P. Donnelly, M. G. Myers, Jr., W. Alexander, D. A. Vignali, S. S. Watowich, M. Ernst, D. J. Hilton und P. J. Murray (2006). "General nature of the STAT3-activated anti-inflammatory response." J Immunol 177(11): 7880-8. Erdosova, B., L. Hlavkova, J. Prochazkova und V. Lichnovsky (2002). "Part of CD68+ macrophages in the clearence of apoptotic bodies in human metanephros." Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 146(2): 41-5. Ermolaeva, M. A., M. C. Michallet, N. Papadopoulou, O. Utermohlen, K. Kranidioti, G. Kollias, J. Tschopp und M. Pasparakis (2008). "Function of TRADD in tumor necrosis factor receptor 1 signaling and in TRIF- dependent inflammatory responses." Nat Immunol 9(9): 1037-46. Ernst, S., C. Lange, A. Wilbers, V. Goebeler, V. Gerke und U. Rescher (2004). "An annexin 1 N-terminal peptide activates leukocytes by triggering different members of the formyl peptide receptor family." J Immunol 172(12): 7669-76. Fadok, V. A., D. L. Bratton, A. Konowal, P. W. Freed, J. Y. Westcott und P. M. Henson (1998). "Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF." J Clin Invest 101(4): 890-8. Fadok, V. A., D. L. Bratton, D. M. Rose, A. Pearson, R. A. Ezekewitz und P. M. Henson (2000). "A receptor for phosphatidylserine-specific clearance of apoptotic cells." Nature 405(6782): 85-90. Fadok, V. A., D. R. Voelker, P. A. Campbell, J. J. Cohen, D. L. Bratton und P. M. Henson (1992). "Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages." J Immunol 148(7): 2207-16. Fan, H. und J. A. Cook (2004). "Molecular mechanisms of endotoxin tolerance." J Endotoxin Res 10(2): 71-84. Fantuzzi, G. und C. A. Dinarello (1999). "Interleukin-18 and interleukin-1 beta: two cytokine substrates for ICE (caspase-1)." J Clin Immunol 19(1): 1-11. Faour, W. H., N. Alaaeddine, A. Mancini, Q. W. He, D. Jovanovic und J. A. Di Battista (2005). "Early growth response factor-1 mediates prostaglandin E2-dependent transcriptional suppression of cytokine-induced tumor necrosis factor-alpha gene expression in human macrophages and rheumatoid arthritis-affected synovial fibroblasts." J Biol Chem 280(10): 9536-46. Ferguson, T. A., J. Herndon, B. Elzey, T. S. Griffith, S. Schoenberger und D. R. Green (2002). "Uptake of apoptotic antigen-coupled cells by lymphoid dendritic cells and cross-priming of CD8(+) T cells produce active immune unresponsiveness." J Immunol 168(11): 5589-95. Ferlazzo, V., P. D'Agostino, S. Milano, R. Caruso, S. Feo, E. Cillari und L. Parente (2003). "Anti-inflammatory effects of annexin-1: stimulation of IL-10 release and inhibition of nitric oxide synthesis." Int Immunopharmacol 3(10-11): 1363-9. Fitzgerald, K. A., E. M. Palsson-McDermott, A. G. Bowie, C. A. Jefferies, A. S. Mansell, G. Brady, E. Brint, A. Dunne, P. Gray, M. T. Harte, D. McMurray, D. E. Smith, J. E. Sims, T. A. Bird und L. A. O'Neill (2001). "Mal (MyD88-adapter-like) is required for Toll-like receptor-4 signal transduction." Nature 413(6851): 78- 83. Fitzgerald, K. A., D. C. Rowe, B. J. Barnes, D. R. Caffrey, A. Visintin, E. Latz, B. Monks, P. M. Pitha und D. T. Golenbock (2003). "LPS-TLR4 signaling to IRF-3/7 and NF-kappaB involves the toll adapters TRAM and TRIF." J Exp Med 198(7): 1043-55. Forster, R., A. C. Davalos-Misslitz und A. Rot (2008). "CCR7 and its ligands: balancing immunity and tolerance." Nat Rev Immunol 8(5): 362-71. Francis, J. W., K. J. Balazovich, J. E. Smolen, D. I. Margolis und L. A. Boxer (1992). "Human neutrophil annexin I promotes granule aggregation and modulates Ca(2+)-dependent membrane fusion." J Clin Invest 90(2): 537-44. Frobose, H., S. G. Ronn, P. E. Heding, H. Mendoza, P. Cohen, T. Mandrup-Poulsen und N. Billestrup (2006). "Suppressor of cytokine Signaling-3 inhibits interleukin-1 signaling by targeting the TRAF-6/TAK1 complex." Mol Endocrinol 20(7): 1587-96. Fukao, T. und S. Koyasu (2003). "PI3K and negative regulation of TLR signaling." Trends Immunol 24(7): 358-63. Fukao, T., M. Tanabe, Y. Terauchi, T. Ota, S. Matsuda, T. Asano, T. Kadowaki, T. Takeuchi und S. Koyasu (2002). "PI3K-mediated negative feedback regulation of IL-12 production in DCs." Nat Immunol 3(9): 875-81. Gantner, B. N., R. M. Simmons, S. J. Canavera, S. Akira und D. M. Underhill (2003). "Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2." J Exp Med 197(9): 1107-17.

101 V. Anhang Andrea Mahr

Gao, B. und M. F. Tsan (2003). "Recombinant human heat shock protein 60 does not induce the release of tumor necrosis factor alpha from murine macrophages." J Biol Chem 278(25): 22523-9. Gao, Y., J. M. Herndon, H. Zhang, T. S. Griffith und T. A. Ferguson (1998). "Antiinflammatory effects of CD95 ligand (FasL)-induced apoptosis." J Exp Med 188(5): 887-96. Gardai, S. J., K. A. McPhillips, S. C. Frasch, W. J. Janssen, A. Starefeldt, J. E. Murphy-Ullrich, D. L. Bratton, P. A. Oldenborg, M. Michalak und P. M. Henson (2005). "Cell-surface calreticulin initiates clearance of viable or apoptotic cells through trans-activation of LRP on the phagocyte." Cell 123(2): 321-34. Gerke, V., C. E. Creutz und S. E. Moss (2005). "Annexins: linking Ca2+ signalling to membrane dynamics." Nat Rev Mol Cell Biol 6(6): 449-61. Gerke, V. und S. E. Moss (2002). "Annexins: from structure to function." Physiol Rev 82(2): 331-71. Getting, S. J., R. J. Flower und M. Perretti (1997). "Inhibition of neutrophil and monocyte recruitment by endogenous and exogenous lipocortin 1." Br J Pharmacol 120(6): 1075-82. Gohda, J., T. Matsumura und J. Inoue (2004). "Cutting edge: TNFR-associated factor (TRAF) 6 is essential for MyD88-dependent pathway but not toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor-inducing IFN-beta (TRIF)-dependent pathway in TLR signaling." J Immunol 173(5): 2913-7. Guleria, I., M. Gubbels Bupp, S. Dada, B. Fife, Q. Tang, M. J. Ansari, S. Trikudanathan, N. Vadivel, P. Fiorina, H. Yagita, M. Azuma, M. Atkinson, J. A. Bluestone und M. H. Sayegh (2007). "Mechanisms of PDL1- mediated regulation of autoimmune diabetes." Clin Immunol 125(1): 16-25. Hacker, H., V. Redecke, B. Blagoev, I. Kratchmarova, L. C. Hsu, G. G. Wang, M. P. Kamps, E. Raz, H. Wagner, G. Hacker, M. Mann und M. Karin (2006). "Specificity in Toll-like receptor signalling through distinct effector functions of TRAF3 and TRAF6." Nature 439(7073): 204-7. Hacker, H., R. M. Vabulas, O. Takeuchi, K. Hoshino, S. Akira und H. Wagner (2000). "Immune cell activation by bacterial CpG-DNA through myeloid differentiation marker 88 and tumor necrosis factor receptor- associated factor (TRAF)6." J Exp Med 192(4): 595-600. Haigler, H. T., D. D. Schlaepfer und W. H. Burgess (1987). "Characterization of lipocortin I and an immunologically unrelated 33-kDa protein as epidermal growth factor receptor/kinase substrates and phospholipase A2 inhibitors." J Biol Chem 262(14): 6921-30. Hanayama, R., M. Tanaka, K. Miwa, A. Shinohara, A. Iwamatsu und S. Nagata (2002). "Identification of a factor that links apoptotic cells to phagocytes." Nature 417(6885): 182-7. Hanayama, R., M. Tanaka, K. Miyasaka, K. Aozasa, M. Koike, Y. Uchiyama und S. Nagata (2004). "Autoimmune disease and impaired uptake of apoptotic cells in MFG-E8-deficient mice." Science 304(5674): 1147-50. Hanley, P. J., B. Musset, V. Renigunta, S. H. Limberg, A. H. Dalpke, R. Sus, K. M. Heeg, R. Preisig-Muller und J. Daut (2004). "Extracellular ATP induces oscillations of intracellular Ca2+ and membrane potential and promotes transcription of IL-6 in macrophages." Proc Natl Acad Sci U S A 101(25): 9479-84. Hannon, R., J. D. Croxtall, S. J. Getting, F. Roviezzo, S. Yona, M. J. Paul-Clark, F. N. Gavins, M. Perretti, J. F. Morris, J. C. Buckingham und R. J. Flower (2003). "Aberrant inflammation and resistance to glucocorticoids in annexin 1-/- mouse." FASEB J 17(2): 253-5. Hasan, U., C. Chaffois, C. Gaillard, V. Saulnier, E. Merck, S. Tancredi, C. Guiet, F. Briere, J. Vlach, S. Lebecque, G. Trinchieri und E. E. Bates (2005). "Human TLR10 is a functional receptor, expressed by B cells and plasmacytoid dendritic cells, which activates gene transcription through MyD88." J Immunol 174(5): 2942-50. Hawiger, D., K. Inaba, Y. Dorsett, M. Guo, K. Mahnke, M. Rivera, J. V. Ravetch, R. M. Steinman und M. C. Nussenzweig (2001). "Dendritic cells induce peripheral T cell unresponsiveness under steady state conditions in vivo." J Exp Med 194(6): 769-79. Hayashi, F., K. D. Smith, A. Ozinsky, T. R. Hawn, E. C. Yi, D. R. Goodlett, J. K. Eng, S. Akira, D. M. Underhill und A. Aderem (2001). "The innate immune response to bacterial flagellin is mediated by Toll-like receptor 5." Nature 410(6832): 1099-103. Hayes, M. P. und K. C. Zoon (1993). "Priming of human monocytes for enhanced lipopolysaccharide responses: expression of alpha interferon, interferon regulatory factors, and tumor necrosis factor." Infect Immun 61(8): 3222-7. Hemmi, H., T. Kaisho, O. Takeuchi, S. Sato, H. Sanjo, K. Hoshino, T. Horiuchi, H. Tomizawa, K. Takeda und S. Akira (2002). "Small anti-viral compounds activate immune cells via the TLR7 MyD88-dependent signaling pathway." Nat Immunol 3(2): 196-200. Hemmi, H., O. Takeuchi, T. Kawai, T. Kaisho, S. Sato, H. Sanjo, M. Matsumoto, K. Hoshino, H. Wagner, K. Takeda und S. Akira (2000). "A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA." Nature 408(6813): 740-5. Hershko, D. D., B. W. Robb, C. J. Wray, G. J. Luo und P. O. Hasselgren (2004). "Superinduction of IL-6 by cycloheximide is associated with mRNA stabilization and sustained activation of p38 map kinase and NF- kappaB in cultured caco-2 cells." J Cell Biochem 91(5): 951-61. Hoebe, K., X. Du, P. Georgel, E. Janssen, K. Tabeta, S. O. Kim, J. Goode, P. Lin, N. Mann, S. Mudd, K. Crozat, S. Sovath, J. Han und B. Beutler (2003). "Identification of Lps2 as a key transducer of MyD88- independent TIR signalling." Nature 424(6950): 743-8. Hofmann, S., A. Franke, A. Fischer, G. Jacobs, M. Nothnagel, K. I. Gaede, M. Schurmann, J. Muller-Quernheim, M. Krawczak, P. Rosenstiel und S. Schreiber (2008). "Genome-wide association study identifies ANXA11 as a new susceptibility locus for sarcoidosis." Nat Genet. Hoglund, P. (2006). "Induced peripheral regulatory T cells: the family grows larger." Eur J Immunol 36(2): 264-6. Horng, T., G. M. Barton und R. Medzhitov (2001). "TIRAP: an adapter molecule in the Toll signaling pathway." Nat Immunol 2(9): 835-41.

102 V. Anhang Andrea Mahr

Huang, F. P., N. Platt, M. Wykes, J. R. Major, T. J. Powell, C. D. Jenkins und G. G. MacPherson (2000). "A discrete subpopulation of dendritic cells transports apoptotic intestinal epithelial cells to T cell areas of mesenteric lymph nodes." J Exp Med 191(3): 435-44. Hugues, S., E. Mougneau, W. Ferlin, D. Jeske, P. Hofman, D. Homann, L. Beaudoin, C. Schrike, M. Von Herrath, A. Lehuen und N. Glaichenhaus (2002). "Tolerance to islet antigens and prevention from diabetes induced by limited apoptosis of pancreatic beta cells." Immunity 16(2): 169-81. Huynh, M. L., V. A. Fadok und P. M. Henson (2002). "Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic cells promotes TGF-beta1 secretion and the resolution of inflammation." J Clin Invest 109(1): 41-50. Igney, F. H. und P. H. Krammer (2002). "Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack." J Leukoc Biol 71(6): 907-20. Ip, W. K. und Y. L. Lau (2004). "Distinct maturation of, but not migration between, human monocyte-derived dendritic cells upon ingestion of apoptotic cells of early or late phases." J Immunol 173(1): 189-96. Ishimoto, Y., K. Ohashi, K. Mizuno und T. Nakano (2000). "Promotion of the uptake of PS liposomes and apoptotic cells by a product of growth arrest-specific gene, gas6." J Biochem 127(3): 411-7. Itani, O. A., K. L. Cornish, K. Z. Liu und C. P. Thomas (2003). "Cycloheximide increases glucocorticoid-stimulated alpha -ENaC mRNA in collecting duct cells by p38 MAPK-dependent pathway." Am J Physiol Renal Physiol 284(4): F778-87. Iwami, K. I., T. Matsuguchi, A. Masuda, T. Kikuchi, T. Musikacharoen und Y. Yoshikai (2000). "Cutting edge: naturally occurring soluble form of mouse Toll-like receptor 4 inhibits lipopolysaccharide signaling." J Immunol 165(12): 6682-6. Iyoda, T., S. Shimoyama, K. Liu, Y. Omatsu, Y. Akiyama, Y. Maeda, K. Takahara, R. M. Steinman und K. Inaba (2002). "The CD8+ dendritic cell subset selectively endocytoses dying cells in culture and in vivo." J Exp Med 195(10): 1289-302. Jackson, S. H., C. R. Yu, R. M. Mahdi, S. Ebong und C. E. Egwuagu (2004). "Dendritic cell maturation requires STAT1 and is under feedback regulation by suppressors of cytokine signaling." J Immunol 172(4): 2307- 15. Janssens, S., K. Burns, E. Vercammen, J. Tschopp und R. Beyaert (2003). "MyD88S, a splice variant of MyD88, differentially modulates NF-kappaB- and AP-1-dependent gene expression." FEBS Lett 548(1-3): 103-7. Jarrous, N. und R. Kaempfer (1994). "Induction of human interleukin-1 gene expression by retinoic acid and its regulation at processing of precursor transcripts." J Biol Chem 269(37): 23141-9. Jiang, A., O. Bloom, S. Ono, W. Cui, J. Unternaehrer, S. Jiang, J. A. Whitney, J. Connolly, J. Banchereau und I. Mellman (2007). "Disruption of E-cadherin-mediated adhesion induces a functionally distinct pathway of dendritic cell maturation." Immunity 27(4): 610-24. Jiang, Z., P. Georgel, X. Du, L. Shamel, S. Sovath, S. Mudd, M. Huber, C. Kalis, S. Keck, C. Galanos, M. Freudenberg und B. Beutler (2005). "CD14 is required for MyD88-independent LPS signaling." Nat Immunol 6(6): 565-70. Jiang, Z., T. W. Mak, G. Sen und X. Li (2004). "Toll-like receptor 3-mediated activation of NF-kappaB and IRF3 diverges at Toll-IL-1 receptor domain-containing adapter inducing IFN-beta." Proc Natl Acad Sci U S A 101(10): 3533-8. Johann, A. M., A. von Knethen, D. Lindemann und B. Brune (2006). "Recognition of apoptotic cells by macrophages activates the peroxisome proliferator-activated receptor-gamma and attenuates the oxidative burst." Cell Death Differ 13(9): 1533-40. Jonuleit, H. und E. Schmitt (2003). "The regulatory T cell family: distinct subsets and their interrelations." J Immunol 171(12): 6323-7. Jonuleit, H., E. Schmitt, G. Schuler, J. Knop und A. H. Enk (2000). "Induction of interleukin 10-producing, nonproliferating CD4(+) T cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells." J Exp Med 192(9): 1213-22. Jonuleit, H., E. Schmitt, K. Steinbrink und A. H. Enk (2001). "Dendritic cells as a tool to induce anergic and regulatory T cells." Trends Immunol 22(7): 394-400. Jurk, M., F. Heil, J. Vollmer, C. Schetter, A. M. Krieg, H. Wagner, G. Lipford und S. Bauer (2002). "Human TLR7 or TLR8 independently confer responsiveness to the antiviral compound R-848." Nat Immunol 3(6): 499. Kagan, V. E., B. Gleiss, Y. Y. Tyurina, V. A. Tyurin, C. Elenstrom-Magnusson, S. X. Liu, F. B. Serinkan, A. Arroyo, J. Chandra, S. Orrenius und B. Fadeel (2002). "A role for oxidative stress in apoptosis: oxidation and externalization of phosphatidylserine is required for macrophage clearance of cells undergoing Fas- mediated apoptosis." J Immunol 169(1): 487-99. Kaiser, W. J. und M. K. Offermann (2005). "Apoptosis induced by the toll-like receptor adaptor TRIF is dependent on its receptor interacting protein homotypic interaction motif." J Immunol 174(8): 4942-52. Kaisho, T., O. Takeuchi, T. Kawai, K. Hoshino und S. Akira (2001). "Endotoxin-induced maturation of MyD88- deficient dendritic cells." J Immunol 166(9): 5688-94. Kamal, A. M., R. P. Hayhoe, A. Paramasivam, D. Cooper, R. J. Flower, E. Solito und M. Perretti (2006). "Antiflammin-2 activates the human formyl-peptide receptor like 1." ScientificWorldJournal 6: 1375-84. Kang, Y. J., B. Kusler, M. Otsuka, M. Hughes, N. Suzuki, S. Suzuki, W. C. Yeh, S. Akira, J. Han und P. P. Jones (2007). "Calcineurin negatively regulates TLR-mediated activation pathways." J Immunol 179(7): 4598- 607. Kanneganti, T. D., M. Lamkanfi und G. Nunez (2007). "Intracellular NOD-like receptors in host defense and disease." Immunity 27(4): 549-59. Kawai, T., O. Adachi, T. Ogawa, K. Takeda und S. Akira (1999). "Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin." Immunity 11(1): 115-22.

103 V. Anhang Andrea Mahr

Kawai, T. und S. Akira (2006). "TLR signaling." Cell Death Differ 13(5): 816-25. Kawai, T. und S. Akira (2007). "TLR signaling." Semin Immunol 19(1): 24-32. Kawai, T., O. Takeuchi, T. Fujita, J. Inoue, P. F. Muhlradt, S. Sato, K. Hoshino und S. Akira (2001). "Lipopolysaccharide stimulates the MyD88-independent pathway and results in activation of IFN- regulatory factor 3 and the expression of a subset of lipopolysaccharide-inducible genes." J Immunol 167(10): 5887-94. Kim, J. und K. A. Hajjar (2002). "Annexin II: a plasminogen-plasminogen activator co-receptor." Front Biosci 7: d341-8. Kim, K. M., D. K. Kim, Y. M. Park, C. K. Kim und D. S. Na (1994). "Annexin-I inhibits phospholipase A2 by specific interaction, not by substrate depletion." FEBS Lett 343(3): 251-5. Kim, S., K. B. Elkon und X. Ma (2004). "Transcriptional suppression of interleukin-12 gene expression following phagocytosis of apoptotic cells." Immunity 21(5): 643-53. Kinjyo, I., T. Hanada, K. Inagaki-Ohara, H. Mori, D. Aki, M. Ohishi, H. Yoshida, M. Kubo und A. Yoshimura (2002). "SOCS1/JAB is a negative regulator of LPS-induced macrophage activation." Immunity 17(5): 583-91. Kirsch, T., B. Swoboda und H. Nah (2000). "Activation of annexin II and V expression, terminal differentiation, mineralization and apoptosis in human osteoarthritic cartilage." Osteoarthritis Cartilage 8(4): 294-302. Kirsch, T., A. Woywodt, M. Beese, K. Wyss, J. K. Park, U. Erdbruegger, B. Hertel, H. Haller und M. Haubitz (2007). "Engulfment of apoptotic cells by microvascular endothelial cells induces proinflammatory responses." Blood 109(7): 2854-62. Kishimoto, K., K. Matsumoto und J. Ninomiya-Tsuji (2000). "TAK1 mitogen-activated protein kinase kinase kinase is activated by autophosphorylation within its activation loop." J Biol Chem 275(10): 7359-64. Kitamura, M. (1999). "NF-kappaB-mediated self defense of macrophages faced with bacteria." Eur J Immunol 29(5): 1647-55. Kobayashi, N., P. Karisola, V. Pena-Cruz, D. M. Dorfman, M. Jinushi, S. E. Umetsu, M. J. Butte, H. Nagumo, I. Chernova, B. Zhu, A. H. Sharpe, S. Ito, G. Dranoff, G. G. Kaplan, J. M. Casasnovas, D. T. Umetsu, R. H. Dekruyff und G. J. Freeman (2007). "TIM-1 and TIM-4 glycoproteins bind phosphatidylserine and mediate uptake of apoptotic cells." Immunity 27(6): 927-40. Kollermann, J., T. Schlomm, H. Bang, G. P. Schwall, C. von Eichel-Streiber, R. Simon, M. Schostak, H. Huland, W. Berg, G. Sauter, H. Klocker und A. Schrattenholz (2008). "Expression and prognostic relevance of annexin a3 in prostate cancer." Eur Urol 54(6): 1314-23. Kono, H. und K. L. Rock (2008). "How dying cells alert the immune system to danger." Nat Rev Immunol 8(4): 279-89. Kretschmer, K., I. Apostolou, D. Hawiger, K. Khazaie, M. C. Nussenzweig und H. von Boehmer (2005). "Inducing and expanding regulatory T cell populations by foreign antigen." Nat Immunol 6(12): 1219-27. Kurosaka, K., N. Watanabe und Y. Kobayashi (1998). "Production of proinflammatory cytokines by phorbol myristate acetate-treated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages after phagocytosis of apoptotic CTLL-2 cells." J Immunol 161(11): 6245-9. Kyewski, B. und L. Klein (2006). "A central role for central tolerance." Annu Rev Immunol 24: 571-606. Laemmli, U. K. (1970). "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4." Nature 227(5259): 680-5. Lang, R., M. Hammer und J. Mages (2006). "DUSP meet immunology: dual specificity MAPK phosphatases in control of the inflammatory response." J Immunol 177(11): 7497-504. Lauber, K., S. G. Blumenthal, M. Waibel und S. Wesselborg (2004). "Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses." Mol Cell 14(3): 277-87. Lauber, K., E. Bohn, S. M. Krober, Y. J. Xiao, S. G. Blumenthal, R. K. Lindemann, P. Marini, C. Wiedig, A. Zobywalski, S. Baksh, Y. Xu, I. B. Autenrieth, K. Schulze-Osthoff, C. Belka, G. Stuhler und S. Wesselborg (2003). "Apoptotic cells induce migration of phagocytes via caspase-3-mediated release of a lipid attraction signal." Cell 113(6): 717-30. Le Cabec, V., F. Russo-Marie und I. Maridonneau-Parini (1992). "Differential expression of two forms of annexin 3 in human neutrophils and monocytes and along their differentiation." Biochem Biophys Res Commun 189(3): 1471-6. Le, Y., P. M. Murphy und J. M. Wang (2002). "Formyl-peptide receptors revisited." Trends Immunol 23(11): 541-8. Learn, C. A., S. B. Mizel und C. E. McCall (2000). "mRNA and protein stability regulate the differential expression of pro- and anti-inflammatory genes in endotoxin-tolerant THP-1 cells." J Biol Chem 275(16): 12185-93. Lee, E. G., D. L. Boone, S. Chai, S. L. Libby, M. Chien, J. P. Lodolce und A. Ma (2000). "Failure to regulate TNF- induced NF-kappaB and cell death responses in A20-deficient mice." Science 289(5488): 2350-4. Lemaitre, B., E. Nicolas, L. Michaut, J. M. Reichhart und J. A. Hoffmann (1996). "The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/Toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults." Cell 86(6): 973-83. Li-Weber, M., O. Laur, K. Dern und P. H. Krammer (2000). "T cell activation-induced and HIV tat-enhanced CD95(APO-1/Fas) ligand transcription involves NF-kappaB." Eur J Immunol 30(2): 661-70. Liang, S., V. Ristich, H. Arase, J. Dausset, E. D. Carosella und A. Horuzsko (2008). "Modulation of dendritic cell differentiation by HLA-G and ILT4 requires the IL-6--STAT3 signaling pathway." Proc Natl Acad Sci U S A 105(24): 8357-62. Liew, F. Y., D. Xu, E. K. Brint und L. A. O'Neill (2005). "Negative regulation of toll-like receptor-mediated immune responses." Nat Rev Immunol 5(6): 446-58. Lim, L. H. und S. Pervaiz (2007). "Annexin 1: the new face of an old molecule." FASEB J 21(4): 968-75.

104 V. Anhang Andrea Mahr

Lim, L. H., E. Solito, F. Russo-Marie, R. J. Flower und M. Perretti (1998). "Promoting detachment of neutrophils adherent to murine postcapillary venules to control inflammation: effect of lipocortin 1." Proc Natl Acad Sci U S A 95(24): 14535-9. Ling, Q., A. T. Jacovina, A. Deora, M. Febbraio, R. Simantov, R. L. Silverstein, B. Hempstead, W. H. Mark und K. A. Hajjar (2004). "Annexin II regulates fibrin homeostasis and neoangiogenesis in vivo." J Clin Invest 113(1): 38-48. Liu, K., T. Iyoda, M. Saternus, Y. Kimura, K. Inaba und R. M. Steinman (2002a). "Immune tolerance after delivery of dying cells to dendritic cells in situ." J Exp Med 196(8): 1091-7. Liu, S. H., C. Y. Lin, S. Y. Peng, Y. M. Jeng, H. W. Pan, P. L. Lai, C. L. Liu und H. C. Hsu (2002b). "Down- regulation of annexin A10 in hepatocellular carcinoma is associated with vascular invasion, early recurrence, and poor prognosis in synergy with p53 mutation." Am J Pathol 160(5): 1831-7. Liu, Y., E. G. Shepherd und L. D. Nelin (2007). "MAPK phosphatases--regulating the immune response." Nat Rev Immunol 7(3): 202-12. Lutz, M. B. und G. Schuler (2002). "Immature, semi-mature and fully mature dendritic cells: which signals induce tolerance or immunity?" Trends Immunol 23(9): 445-9. Machado, F. S., L. Esper, A. Dias, R. Madan, Y. Gu, D. Hildeman, C. N. Serhan, C. L. Karp und J. Aliberti (2008). "Native and aspirin-triggered lipoxins control innate immunity by inducing proteasomal degradation of TRAF6." J Exp Med 205(5): 1077-86. Magendzo, K., A. Shirvan, C. Cultraro, M. Srivastava, H. B. Pollard und A. L. Burns (1991). "Alternative splicing of human synexin mRNA in brain, cardiac, and skeletal muscle alters the unique N-terminal domain." J Biol Chem 266(5): 3228-32. Mages, J., H. Dietrich und R. Lang (2007). "A genome-wide analysis of LPS tolerance in macrophages." Immunobiology 212(9-10): 723-37. Mailliard, W. S., H. T. Haigler und D. D. Schlaepfer (1996). "Calcium-dependent binding of S100C to the N- terminal domain of annexin I." J Biol Chem 271(2): 719-25. Majai, G., Z. Sarang, K. Csomos, G. Zahuczky und L. Fesus (2007). "PPARgamma-dependent regulation of human macrophages in phagocytosis of apoptotic cells." Eur J Immunol 37(5): 1343-54. Male, D. K., Brostoff, J., Roitt, I.M., Roth, D. (2006). Immunology, Mosby. Mandl, M., D. N. Slack und S. M. Keyse (2005). "Specific inactivation and nuclear anchoring of extracellular signal-regulated kinase 2 by the inducible dual-specificity protein phosphatase DUSP5." Mol Cell Biol 25(5): 1830-45. Mansell, A., R. Smith, S. L. Doyle, P. Gray, J. E. Fenner, P. J. Crack, S. E. Nicholson, D. J. Hilton, L. A. O'Neill und P. J. Hertzog (2006). "Suppressor of cytokine signaling 1 negatively regulates Toll-like receptor signaling by mediating Mal degradation." Nat Immunol 7(2): 148-55. Marshak-Rothstein, A. (2006). "Toll-like receptors in systemic autoimmune disease." Nat Rev Immunol 6(11): 823- 35. Martin, M., K. Rehani, R. S. Jope und S. M. Michalek (2005). "Toll-like receptor-mediated cytokine production is differentially regulated by glycogen synthase kinase 3." Nat Immunol 6(8): 777-84. Martin, M. U. und H. Wesche (2002). "Summary and comparison of the signaling mechanisms of the Toll/interleukin-1 receptor family." Biochim Biophys Acta 1592(3): 265-80. Masaki, T., M. Tokuda, T. Fujimura, M. Ohnishi, Y. Tai, K. Miyamoto, T. Itano, H. Matsui, S. Watanabe, K. Sogawa und et al. (1994). "Involvement of annexin I and annexin II in hepatocyte proliferation: can annexins I and II be markers for proliferative hepatocytes?" Hepatology 20(2): 425-35. Matsuzawa, A., K. Saegusa, T. Noguchi, C. Sadamitsu, H. Nishitoh, S. Nagai, S. Koyasu, K. Matsumoto, K. Takeda und H. Ichijo (2005). "ROS-dependent activation of the TRAF6-ASK1-p38 pathway is selectively required for TLR4-mediated innate immunity." Nat Immunol 6(6): 587-92. Matzinger, P. (1994). "Tolerance, danger, and the extended family." Annu Rev Immunol 12: 991-1045. Matzinger, P. (2002). "The danger model: a renewed sense of self." Science 296(5566): 301-5. Mayran, N., R. G. Parton und J. Gruenberg (2003). "Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells." EMBO J 22(13): 3242-53. McCartney-Francis, N., W. Jin und S. M. Wahl (2004). "Aberrant Toll receptor expression and endotoxin hypersensitivity in mice lacking a functional TGF-beta 1 signaling pathway." J Immunol 172(6): 3814-21. McDonald, P. P., V. A. Fadok, D. Bratton und P. M. Henson (1999). "Transcriptional and translational regulation of inflammatory mediator production by endogenous TGF-beta in macrophages that have ingested apoptotic cells." J Immunol 163(11): 6164-72. Medvedev, A. E., A. Lentschat, L. M. Wahl, D. T. Golenbock und S. N. Vogel (2002). "Dysregulation of LPS- induced Toll-like receptor 4-MyD88 complex formation and IL-1 receptor-associated kinase 1 activation in endotoxin-tolerant cells." J Immunol 169(9): 5209-16. Medzhitov, R. und C. A. Janeway, Jr. (1997). "Innate immunity: impact on the adaptive immune response." Curr Opin Immunol 9(1): 4-9. Medzhitov, R., P. Preston-Hurlburt und C. A. Janeway, Jr. (1997). "A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity." Nature 388(6640): 394-7. Medzhitov, R., P. Preston-Hurlburt, E. Kopp, A. Stadlen, C. Chen, S. Ghosh und C. A. Janeway, Jr. (1998). "MyD88 is an adaptor protein in the hToll/IL-1 receptor family signaling pathways." Mol Cell 2(2): 253-8. Mellor, A. L. und D. H. Munn (2004). "IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism." Nat Rev Immunol 4(10): 762-74.

105 V. Anhang Andrea Mahr

Menges, M., S. Rossner, C. Voigtlander, H. Schindler, N. A. Kukutsch, C. Bogdan, K. Erb, G. Schuler und M. B. Lutz (2002). "Repetitive injections of dendritic cells matured with tumor necrosis factor alpha induce antigen-specific protection of mice from autoimmunity." J Exp Med 195(1): 15-21. Mevorach, D., J. O. Mascarenhas, D. Gershov und K. B. Elkon (1998). "Complement-dependent clearance of apoptotic cells by human macrophages." J Exp Med 188(12): 2313-20. Meylan, E. und J. Tschopp (2006). "Toll-like receptors and RNA helicases: two parallel ways to trigger antiviral responses." Mol Cell 22(5): 561-9. Meylan, E., J. Tschopp und M. Karin (2006). "Intracellular pattern recognition receptors in the host response." Nature 442(7098): 39-44. Misawa, R., C. Kawagishi, N. Watanabe und Y. Kobayashi (2001). "Infiltration of neutrophils following injection of apoptotic cells into the peritoneal cavity." Apoptosis 6(6): 411-7. Mitchell, J. E., M. Cvetanovic, N. Tibrewal, V. Patel, O. R. Colamonici, M. O. Li, R. A. Flavell, J. S. Levine, R. B. Birge und D. S. Ucker (2006). "The presumptive phosphatidylserine receptor is dispensable for innate anti-inflammatory recognition and clearance of apoptotic cells." J Biol Chem 281(9): 5718-25. Miyanishi, M., K. Tada, M. Koike, Y. Uchiyama, T. Kitamura und S. Nagata (2007). "Identification of Tim4 as a phosphatidylserine receptor." Nature 450(7168): 435-9. Mizuno, H., K. Uemura, A. Moriyama, Y. Wada, K. Asai, S. Kimura und T. Kato (1997). "Glucocorticoid induced the expression of mRNA and the secretion of lipocortin 1 in rat astrocytoma cells." Brain Res 746(1-2): 256-64. Moffatt, O. D., A. Devitt, E. D. Bell, D. L. Simmons und C. D. Gregory (1999). "Macrophage recognition of ICAM-3 on apoptotic leukocytes." J Immunol 162(11): 6800-10. Montoya, M., G. Schiavoni, F. Mattei, I. Gresser, F. Belardelli, P. Borrow und D. F. Tough (2002). "Type I interferons produced by dendritic cells promote their phenotypic and functional activation." Blood 99(9): 3263-71. Morand, E. F., P. Hutchinson, A. Hargreaves, N. J. Goulding, N. W. Boyce und S. R. Holdsworth (1995). "Detection of intracellular lipocortin 1 in human leukocyte subsets." Clin Immunol Immunopathol 76(2): 195-202. Morelli, A. E. (2006). "The immune regulatory effect of apoptotic cells and exosomes on dendritic cells: its impact on transplantation." Am J Transplant 6(2): 254-61. Morelli, A. E. und A. W. Thomson (2007). "Tolerogenic dendritic cells and the quest for transplant tolerance." Nat Rev Immunol 7(8): 610-21. Morgan, R. O. und M. P. Fernandez (1998). "Expression profile and structural divergence of novel human annexin 31." FEBS Lett 434(3): 300-4. Morgan, R. O., N. A. Jenkins, D. J. Gilbert, N. G. Copeland, B. R. Balsara, J. R. Testa und M. P. Fernandez (1999). "Novel human and mouse annexin A10 are linked to the genome duplications during early chordate evolution." Genomics 60(1): 40-9. Moss, M. L., S. L. Jin, M. E. Milla, D. M. Bickett, W. Burkhart, H. L. Carter, W. J. Chen, W. C. Clay, J. R. Didsbury, D. Hassler, C. R. Hoffman, T. A. Kost, M. H. Lambert, M. A. Leesnitzer, P. McCauley, G. McGeehan, J. Mitchell, M. Moyer, G. Pahel, W. Rocque, L. K. Overton, F. Schoenen, T. Seaton, J. L. Su, J. D. Becherer und et al. (1997). "Cloning of a disintegrin metalloproteinase that processes precursor tumour- necrosis factor-alpha." Nature 385(6618): 733-6. Movitz, C. und C. Dahlgren (2000). "Endogenous cleavage of annexin I generates a truncated protein with a reduced calcium requirement for binding to neutrophil secretory vesicles and plasma membrane." Biochim Biophys Acta 1468(1-2): 231-8. Movitz, C., C. Sjolin und C. Dahlgren (1999). "Cleavage of annexin I in human neutrophils is mediated by a membrane-localized metalloprotease." Biochim Biophys Acta 1416(1-2): 101-8. Murray, P. J. (2005). "The primary mechanism of the IL-10-regulated antiinflammatory response is to selectively inhibit transcription." Proc Natl Acad Sci U S A 102(24): 8686-91. Mussunoor, S. und G. I. Murray (2008). "The role of annexins in tumour development and progression." J Pathol 216(2): 131-40. Naiki, Y., K. S. Michelsen, W. Zhang, S. Chen, T. M. Doherty und M. Arditi (2005). "Transforming growth factor- beta differentially inhibits MyD88-dependent, but not TRAM- and TRIF-dependent, lipopolysaccharide- induced TLR4 signaling." J Biol Chem 280(7): 5491-5. Nakagawa, R., T. Naka, H. Tsutsui, M. Fujimoto, A. Kimura, T. Abe, E. Seki, S. Sato, O. Takeuchi, K. Takeda, S. Akira, K. Yamanishi, I. Kawase, K. Nakanishi und T. Kishimoto (2002). "SOCS-1 participates in negative regulation of LPS responses." Immunity 17(5): 677-87. Newton, R., I. M. Adcock und P. J. Barnes (1996). "Superinduction of NF-kappa B by actinomycin D and cycloheximide in epithelial cells." Biochem Biophys Res Commun 218(2): 518-23. Nguyen, V. T., A. Ndoye und S. A. Grando (2000). "Pemphigus vulgaris antibody identifies pemphaxin. A novel keratinocyte annexin-like molecule binding acetylcholine." J Biol Chem 275(38): 29466-76. Nimah, M., B. Zhao, A. G. Denenberg, O. Bueno, J. Molkentin, H. R. Wong und T. P. Shanley (2005). "Contribution of MKP-1 regulation of p38 to endotoxin tolerance." Shock 23(1): 80-7. Nomura, F., S. Akashi, Y. Sakao, S. Sato, T. Kawai, M. Matsumoto, K. Nakanishi, M. Kimoto, K. Miyake, K. Takeda und S. Akira (2000). "Cutting edge: endotoxin tolerance in mouse peritoneal macrophages correlates with down-regulation of surface toll-like receptor 4 expression." J Immunol 164(7): 3476-9. Nummila, K., I. Kilpelainen, U. Zahringer, M. Vaara und I. M. Helander (1995). "Lipopolysaccharides of polymyxin B-resistant mutants of Escherichia coli are extensively substituted by 2-aminoethyl pyrophosphate and contain aminoarabinose in lipid A." Mol Microbiol 16(2): 271-8.

106 V. Anhang Andrea Mahr

O'Neill, L. A. und A. G. Bowie (2007). "The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signalling." Nat Rev Immunol 7(5): 353-64. Obeid, M., A. Tesniere, F. Ghiringhelli, G. M. Fimia, L. Apetoh, J. L. Perfettini, M. Castedo, G. Mignot, T. Panaretakis, N. Casares, D. Metivier, N. Larochette, P. van Endert, F. Ciccosanti, M. Piacentini, L. Zitvogel und G. Kroemer (2007). "Calreticulin exposure dictates the immunogenicity of cancer cell death." Nat Med 13(1): 54-61. Oganesyan, G., S. K. Saha, B. Guo, J. Q. He, A. Shahangian, B. Zarnegar, A. Perry und G. Cheng (2006). "Critical role of TRAF3 in the Toll-like receptor-dependent and -independent antiviral response." Nature 439(7073): 208-11. Ogden, C. A., A. deCathelineau, P. R. Hoffmann, D. Bratton, B. Ghebrehiwet, V. A. Fadok und P. M. Henson (2001). "C1q and mannose binding lectin engagement of cell surface calreticulin and CD91 initiates macropinocytosis and uptake of apoptotic cells." J Exp Med 194(6): 781-95. Oka, K., T. Sawamura, K. Kikuta, S. Itokawa, N. Kume, T. Kita und T. Masaki (1998). "Lectin-like oxidized low- density lipoprotein receptor 1 mediates phagocytosis of aged/apoptotic cells in endothelial cells." Proc Natl Acad Sci U S A 95(16): 9535-40. Oliven, A. und Y. Shechter (2001). "Extracorporeal photopheresis: a review." Blood Rev 15(2): 103-8. Oshiumi, H., M. Matsumoto, K. Funami, T. Akazawa und T. Seya (2003). "TICAM-1, an adaptor molecule that participates in Toll-like receptor 3-mediated interferon-beta induction." Nat Immunol 4(2): 161-7. Oudinet, J. P., F. Russo-Marie, J. C. Cavadore und B. Rothhut (1993). "Protein kinase C-dependent phosphorylation of annexins I and II in mesangial cells." Biochem J 292 ( Pt 1): 63-8. Parente, L. und E. Solito (2004). "Annexin 1: more than an anti-phospholipase protein." Inflamm Res 53(4): 125- 32. Park, D., A. C. Tosello-Trampont, M. R. Elliott, M. Lu, L. B. Haney, Z. Ma, A. L. Klibanov, J. W. Mandell und K. S. Ravichandran (2007). "BAI1 is an engulfment receptor for apoptotic cells upstream of the ELMO/Dock180/Rac module." Nature 450(7168): 430-4. Park, S. Y., M. Y. Jung, H. J. Kim, S. J. Lee, S. Y. Kim, B. H. Lee, T. H. Kwon, R. W. Park und I. S. Kim (2008). "Rapid cell corpse clearance by stabilin-2, a membrane phosphatidylserine receptor." Cell Death Differ 15(1): 192-201. Parnaik, R., M. C. Raff und J. Scholes (2000). "Differences between the clearance of apoptotic cells by professional and non-professional phagocytes." Curr Biol 10(14): 857-60. Patel, V. A., A. Longacre, K. Hsiao, H. Fan, F. Meng, J. E. Mitchell, J. Rauch, D. S. Ucker und J. S. Levine (2006). "Apoptotic cells, at all stages of the death process, trigger characteristic signaling events that are divergent from and dominant over those triggered by necrotic cells: Implications for the delayed clearance model of autoimmunity." J Biol Chem 281(8): 4663-70. Peritt, D. (2006). "Potential mechanisms of photopheresis in hematopoietic stem cell transplantation." Biol Blood Marrow Transplant 12(1 Suppl 2): 7-12. Perkins, N. D. (2006). "Post-translational modifications regulating the activity and function of the nuclear factor kappa B pathway." Oncogene 25(51): 6717-30. Perretti, M., J. D. Croxtall, S. K. Wheller, N. J. Goulding, R. Hannon und R. J. Flower (1996). "Mobilizing lipocortin 1 in adherent human leukocytes downregulates their transmigration." Nat Med 2(11): 1259-62. Perretti, M. und R. J. Flower (1996). "Measurement of lipocortin 1 levels in murine peripheral blood leukocytes by flow cytometry: modulation by glucocorticoids and inflammation." Br J Pharmacol 118(3): 605-10. Perretti, M. und F. N. Gavins (2003). "Annexin 1: an endogenous anti-inflammatory protein." News Physiol Sci 18: 60-4. Perretti, M., S. J. Getting, E. Solito, P. M. Murphy und J. L. Gao (2001). "Involvement of the receptor for formylated peptides in the in vivo anti-migratory actions of annexin 1 and its mimetics." Am J Pathol 158(6): 1969-73. Platt, N., R. P. da Silva und S. Gordon (1999). "Class A scavenger receptors and the phagocytosis of apoptotic cells." Immunol Lett 65(1-2): 15-9. Platt, N., H. Suzuki, Y. Kurihara, T. Kodama und S. Gordon (1996). "Role for the class A macrophage scavenger receptor in the phagocytosis of apoptotic thymocytes in vitro." Proc Natl Acad Sci U S A 93(22): 12456- 60. Pobezinskaya, Y. L., Y. S. Kim, S. Choksi, M. J. Morgan, T. Li, C. Liu und Z. Liu (2008). "The function of TRADD in signaling through tumor necrosis factor receptor 1 and TRIF-dependent Toll-like receptors." Nat Immunol 9(9): 1047-54. Poltorak, A., X. He, I. Smirnova, M. Y. Liu, C. Van Huffel, X. Du, D. Birdwell, E. Alejos, M. Silva, C. Galanos, M. Freudenberg, P. Ricciardi-Castagnoli, B. Layton und B. Beutler (1998). "Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene." Science 282(5396): 2085-8. Probst, H. C., K. McCoy, T. Okazaki, T. Honjo und M. van den Broek (2005). "Resting dendritic cells induce peripheral CD8+ T cell tolerance through PD-1 and CTLA-4." Nat Immunol 6(3): 280-6. Ramos, G. C., D. Fernandes, C. T. Charao, D. G. Souza, M. M. Teixeira und J. Assreuy (2007). "Apoptotic mimicry: phosphatidylserine liposomes reduce inflammation through activation of peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) in vivo." Br J Pharmacol 151(6): 844-50. Rand, J. H. (2000). "The pathogenic role of annexin-V in the antiphospholipid syndrome." Curr Rheumatol Rep 2(3): 246-51. Raschke, W. C., S. Baird, P. Ralph und I. Nakoinz (1978). "Functional macrophage cell lines transformed by Abelson leukemia virus." Cell 15(1): 261-7.

107 V. Anhang Andrea Mahr

Raynal, P., F. Hullin, J. M. Ragab-Thomas, J. Fauvel und H. Chap (1993). "Annexin 5 as a potential regulator of annexin 1 phosphorylation by protein kinase C. In vitro inhibition compared with quantitative data on annexin distribution in human endothelial cells." Biochem J 292 ( Pt 3): 759-65. Reddy, S. M., K. H. Hsiao, V. E. Abernethy, H. Fan, A. Longacre, W. Lieberthal, J. Rauch, J. S. Koh und J. S. Levine (2002). "Phagocytosis of apoptotic cells by macrophages induces novel signaling events leading to cytokine-independent survival and inhibition of proliferation: activation of Akt and inhibition of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2." J Immunol 169(2): 702-13. Ren, Y., R. L. Silverstein, J. Allen und J. Savill (1995). "CD36 gene transfer confers capacity for phagocytosis of cells undergoing apoptosis." J Exp Med 181(5): 1857-62. Rescher, U., V. Goebeler, A. Wilbers und V. Gerke (2006). "Proteolytic cleavage of annexin 1 by human leukocyte elastase." Biochim Biophys Acta 1763(11): 1320-4. Reutelingsperger, C. P., W. van Heerde, R. Hauptmann, C. Maassen, R. G. van Gool, P. de Leeuw und A. Tiebosch (1994). "Differential tissue expression of Annexin VIII in human." FEBS Lett 349(1): 120-4. Ristich, V., S. Liang, W. Zhang, J. Wu und A. Horuzsko (2005). "Tolerization of dendritic cells by HLA-G." Eur J Immunol 35(4): 1133-42. Rocque, W. J., S. W. Fesik, A. Haug und E. J. McGroarty (1988). "Polycation binding to isolated lipopolysaccharide from antibiotic-hypersusceptible mutant strains of Escherichia coli." Antimicrob Agents Chemother 32(3): 308-13. Rodenburg, R. J., J. M. Raats, G. J. Pruijn und W. J. van Venrooij (2000). "Cell death: a trigger of autoimmunity?" Bioessays 22(7): 627-36. Rosen, A. und L. Casciola-Rosen (1999). "Autoantigens as substrates for apoptotic proteases: implications for the pathogenesis of systemic autoimmune disease." Cell Death Differ 6(1): 6-12. Rosengarth, A. und H. Luecke (2003). "A calcium-driven conformational switch of the N-terminal and core domains of annexin A1." J Mol Biol 326(5): 1317-25. Ross, J. (1995). "mRNA stability in mammalian cells." Microbiol Rev 59(3): 423-50. Rothlin, C. V., S. Ghosh, E. I. Zuniga, M. B. Oldstone und G. Lemke (2007). "TAM receptors are pleiotropic inhibitors of the innate immune response." Cell 131(6): 1124-36. Rubartelli, A., A. Poggi und M. R. Zocchi (1997). "The selective engulfment of apoptotic bodies by dendritic cells is mediated by the alpha(v)beta3 integrin and requires intracellular and extracellular calcium." Eur J Immunol 27(8): 1893-900. Salaun, B., P. Romero und S. Lebecque (2007). "Toll-like receptors' two-edged sword: when immunity meets apoptosis." Eur J Immunol 37(12): 3311-8. Salzer, U., P. Hinterdorfer, U. Hunger, C. Borken und R. Prohaska (2002). "Ca(++)-dependent vesicle release from erythrocytes involves stomatin-specific lipid rafts, synexin (annexin VII), and sorcin." Blood 99(7): 2569-77. Sato, K. und S. Fujita (2007). "Dendritic cells: nature and classification." Allergol Int 56(3): 183-91. Sato, S., M. Sugiyama, M. Yamamoto, Y. Watanabe, T. Kawai, K. Takeda und S. Akira (2003). "Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor inducing IFN-beta (TRIF) associates with TNF receptor-associated factor 6 and TANK-binding kinase 1, and activates two distinct transcription factors, NF-kappa B and IFN- regulatory factor-3, in the Toll-like receptor signaling." J Immunol 171(8): 4304-10. Sato, S., O. Takeuchi, T. Fujita, H. Tomizawa, K. Takeda und S. Akira (2002). "A variety of microbial components induce tolerance to lipopolysaccharide by differentially affecting MyD88-dependent and -independent pathways." Int Immunol 14(7): 783-91. Sauter, B., M. L. Albert, L. Francisco, M. Larsson, S. Somersan und N. Bhardwaj (2000). "Consequences of cell death: exposure to necrotic tumor cells, but not primary tissue cells or apoptotic cells, induces the maturation of immunostimulatory dendritic cells." J Exp Med 191(3): 423-34. Savill, J., I. Dransfield, C. Gregory und C. Haslett (2002). "A blast from the past: Clearance of apoptotic cells regulates immune responses." Nature Reviews Immunology 2(12): 965-975. Savill, J., I. Dransfield, N. Hogg und C. Haslett (1990). "Vitronectin receptor-mediated phagocytosis of cells undergoing apoptosis." Nature 343(6254): 170-3. Savill, J., N. Hogg, Y. Ren und C. Haslett (1992). "Thrombospondin cooperates with CD36 and the vitronectin receptor in macrophage recognition of neutrophils undergoing apoptosis." J Clin Invest 90(4): 1513-22. Savina, A. und S. Amigorena (2007). "Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells." Immunol Rev 219: 143-56. Scaffidi, P., T. Misteli und M. E. Bianchi (2002). "Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation." Nature 418(6894): 191-5. Scheffer, S. R., H. Nave, F. Korangy, K. Schlote, R. Pabst, E. M. Jaffee, M. P. Manns und T. F. Greten (2003). "Apoptotic, but not necrotic, tumor cell vaccines induce a potent immune response in vivo." Int J Cancer 103(2): 205-11. Schneider, U., H. U. Schwenk und G. Bornkamm (1977). "Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non- Hodgkin lymphoma." Int J Cancer 19(5): 621-6. Schroeder, A., O. Mueller, S. Stocker, R. Salowsky, M. Leiber, M. Gassmann, S. Lightfoot, W. Menzel, M. Granzow und T. Ragg (2006). "The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements." BMC Mol Biol 7: 3. Scott, R. S., E. J. McMahon, S. M. Pop, E. A. Reap, R. Caricchio, P. L. Cohen, H. S. Earp und G. K. Matsushima (2001). "Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER." Nature 411(6834): 207-11.

108 V. Anhang Andrea Mahr

Sen, P., M. A. Wallet, Z. Yi, Y. Huang, M. Henderson, C. E. Mathews, H. S. Earp, G. Matsushima, A. S. Baldwin, Jr. und R. M. Tisch (2007). "Apoptotic cells induce Mer tyrosine kinase-dependent blockade of NF- kappaB activation in dendritic cells." Blood 109(2): 653-60. Seong, S. Y. und P. Matzinger (2004). "Hydrophobicity: an ancient damage-associated molecular pattern that initiates innate immune responses." Nat Rev Immunol 4(6): 469-78. Serbina, N. V., W. Kuziel, R. Flavell, S. Akira, B. Rollins und E. G. Pamer (2003). "Sequential MyD88-independent and -dependent activation of innate immune responses to intracellular bacterial infection." Immunity 19(6): 891-901. Sharif, O. und S. Knapp (2008). "From expression to signaling: Roles of TREM-1 and TREM-2 in innate immunity and bacterial infection." Immunobiology 213(9-10): 701-713. Shi, Y., J. E. Evans und K. L. Rock (2003). "Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells." Nature 425(6957): 516-21. Sioud, M. (2005). "Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single- stranded siRNAs is sequence-dependent and requires endosomal localization." J Mol Biol 348(5): 1079- 90. Sizemore, N., A. Agarwal, K. Das, N. Lerner, M. Sulak, S. Rani, R. Ransohoff, D. Shultz und G. R. Stark (2004). "Inhibitor of kappaB kinase is required to activate a subset of interferon gamma-stimulated genes." Proc Natl Acad Sci U S A 101(21): 7994-8. Skoberne, M., S. Somersan, W. Almodovar, T. Truong, K. Petrova, P. M. Henson und N. Bhardwaj (2006). "The apoptotic-cell receptor CR3, but not alphavbeta5, is a regulator of human dendritic-cell immunostimulatory function." Blood 108(3): 947-55. Skouteris, G. G. und C. H. Schroder (1996). "The hepatocyte growth factor receptor kinase-mediated phosphorylation of lipocortin-1 transduces the proliferating signal of the hepatocyte growth factor." J Biol Chem 271(44): 27266-73. Sly, L. M., M. J. Rauh, J. Kalesnikoff, C. H. Song und G. Krystal (2004). "LPS-induced upregulation of SHIP is essential for endotoxin tolerance." Immunity 21(2): 227-39. Solito, E., C. Raguenes-Nicol, C. de Coupade, A. Bisagni-Faure und F. Russo-Marie (1998). "U937 cells deprived of endogenous annexin 1 demonstrate an increased PLA2 activity." Br J Pharmacol 124(8): 1675-83. Steinbrink, K., M. Wolfl, H. Jonuleit, J. Knop und A. H. Enk (1997). "Induction of tolerance by IL-10-treated dendritic cells." J Immunol 159(10): 4772-80. Steinman, R. M., D. Hawiger, K. Liu, L. Bonifaz, D. Bonnyay, K. Mahnke, T. Iyoda, J. Ravetch, M. Dhodapkar, K. Inaba und M. Nussenzweig (2003). "Dendritic cell function in vivo during the steady state: a role in peripheral tolerance." Ann N Y Acad Sci 987: 15-25. Steinman, R. M. und M. C. Nussenzweig (2002). "Inaugural Article: Avoiding horror autotoxicus: The importance of dendritic cells in peripheral T cell tolerance." PNAS 99(1): 351-358. Stern, M., J. Savill und C. Haslett (1996). "Human monocyte-derived macrophage phagocytosis of senescent eosinophils undergoing apoptosis. Mediation by alpha v beta 3/CD36/thrombospondin recognition mechanism and lack of phlogistic response." Am J Pathol 149(3): 911-21. Strausbaugh, H. J. und S. D. Rosen (2001). "A potential role for annexin 1 as a physiologic mediator of glucocorticoid-induced L-selectin shedding from myeloid cells." J Immunol 166(10): 6294-300. Stuart, L. M., M. Lucas, C. Simpson, J. Lamb, J. Savill und A. Lacy-Hulbert (2002). "Inhibitory effects of apoptotic cell ingestion upon endotoxin-driven myeloid dendritic cell maturation." J Immunol 168(4): 1627-35. Sundstrom, C. und K. Nilsson (1976). "Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937)." Int J Cancer 17(5): 565-77. Takeda, K. und S. Akira (2005). "Toll-like receptors in innate immunity." Int Immunol 17(1): 1-14. Takeuchi, O., K. Hoshino, T. Kawai, H. Sanjo, H. Takada, T. Ogawa, K. Takeda und S. Akira (1999). "Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components." Immunity 11(4): 443-51. Takeuchi, O., T. Kawai, P. F. Muhlradt, M. Morr, J. D. Radolf, A. Zychlinsky, K. Takeda und S. Akira (2001). "Discrimination of bacterial lipoproteins by Toll-like receptor 6." Int Immunol 13(7): 933-40. Takeuchi, O., S. Sato, T. Horiuchi, K. Hoshino, K. Takeda, Z. Dong, R. L. Modlin und S. Akira (2002). "Cutting edge: role of Toll-like receptor 1 in mediating immune response to microbial lipoproteins." J Immunol 169(1): 10-4. Takizawa, F., S. Tsuji und S. Nagasawa (1996). "Enhancement of macrophage phagocytosis upon iC3b deposition on apoptotic cells." FEBS Lett 397(2-3): 269-72. Tanaka, Y. und A. J. Schroit (1983). "Insertion of fluorescent phosphatidylserine into the plasma membrane of red blood cells. Recognition by autologous macrophages." J Biol Chem 258(18): 11335-43. Taylor, P. R., A. Carugati, V. A. Fadok, H. T. Cook, M. Andrews, M. C. Carroll, J. S. Savill, P. M. Henson, M. Botto und M. J. Walport (2000). "A hierarchical role for classical pathway complement proteins in the clearance of apoptotic cells in vivo." J Exp Med 192(3): 359-66. Thomson, C. W., B. P. Lee und L. Zhang (2006). "Double-negative regulatory T cells: non-conventional regulators." Immunol Res 35(1-2): 163-78. Trinchieri, G. und A. Sher (2007). "Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence." Nat Rev Immunol 7(3): 179-90. Turnquist, H. R., G. Raimondi, A. F. Zahorchak, R. T. Fischer, Z. Wang und A. W. Thomson (2007). "Rapamycin- conditioned dendritic cells are poor stimulators of allogeneic CD4+ T cells, but enrich for antigen-specific Foxp3+ T regulatory cells and promote organ transplant tolerance." J Immunol 178(11): 7018-31.

109 V. Anhang Andrea Mahr

Turnquist, H. R., T. L. Sumpter, A. Tsung, A. F. Zahorchak, A. Nakao, G. J. Nau, F. Y. Liew, D. A. Geller und A. W. Thomson (2008). "IL-1beta-driven ST2L expression promotes maturation resistance in rapamycin- conditioned dendritic cells." J Immunol 181(1): 62-72. Uematsu, S. und S. Akira (2007). "Toll-like receptors and Type I interferons." J Biol Chem 282(21): 15319-23. Urban, B. C., N. Willcox und D. J. Roberts (2001). "A role for CD36 in the regulation of dendritic cell function." Proc Natl Acad Sci U S A 98(15): 8750-5. van 't Veer, C., P. S. van den Pangaart, M. A. van Zoelen, M. de Kruif, R. S. Birjmohun, E. S. Stroes, A. F. de Vos und T. van der Poll (2007). "Induction of IRAK-M is associated with lipopolysaccharide tolerance in a human endotoxemia model." J Immunol 179(10): 7110-20. Vandivier, R. W., C. A. Ogden, V. A. Fadok, P. R. Hoffmann, K. K. Brown, M. Botto, M. J. Walport, J. H. Fisher, P. M. Henson und K. E. Greene (2002). "Role of surfactant proteins A, D, and C1q in the clearance of apoptotic cells in vivo and in vitro: calreticulin and CD91 as a common collectin receptor complex." J Immunol 169(7): 3978-86. Vaux, D. L. und S. J. Korsmeyer (1999). "Cell death in development." Cell 96(2): 245-54. Verbovetski, I., H. Bychkov, U. Trahtemberg, I. Shapira, M. Hareuveni, O. Ben-Tal, I. Kutikov, O. Gill und D. Mevorach (2002). "Opsonization of apoptotic cells by autologous iC3b facilitates clearance by immature dendritic cells, down-regulates DR and CD86, and up-regulates CC chemokine receptor 7." J Exp Med 196(12): 1553-61. Voll, R. E., M. Herrmann, E. A. Roth, C. Stach, J. R. Kalden und I. Girkontaite (1997). "Immunosuppressive effects of apoptotic cells." Nature 390(6658): 350-1. Vollmer, J., S. Tluk, C. Schmitz, S. Hamm, M. Jurk, A. Forsbach, S. Akira, K. M. Kelly, W. H. Reeves, S. Bauer und A. M. Krieg (2005). "Immune stimulation mediated by autoantigen binding sites within small nuclear RNAs involves Toll-like receptors 7 and 8." J Exp Med 202(11): 1575-85. Vong, L., F. D'Acquisto, M. Pederzoli-Ribeil, L. Lavagno, R. J. Flower, V. Witko-Sarsat und M. Perretti (2007). "Annexin 1 cleavage in activated neutrophils: a pivotal role for proteinase 3." J Biol Chem 282(41): 29998-30004. Wajant, H., K. Pfizenmaier und P. Scheurich (2003). "Tumor necrosis factor signaling." Cell Death Differ 10(1): 45- 65. Wald, D., J. Qin, Z. Zhao, Y. Qian, M. Naramura, L. Tian, J. Towne, J. E. Sims, G. R. Stark und X. Li (2003). "SIGIRR, a negative regulator of Toll-like receptor-interleukin 1 receptor signaling." Nat Immunol 4(9): 920-7. Wallner, B. P., R. J. Mattaliano, C. Hession, R. L. Cate, R. Tizard, L. K. Sinclair, C. Foeller, E. P. Chow, J. L. Browing, K. L. Ramachandran und et al. (1986). "Cloning and expression of human lipocortin, a phospholipase A2 inhibitor with potential anti-inflammatory activity." Nature 320(6057): 77-81. Walther, A., K. Riehemann und V. Gerke (2000). "A novel ligand of the formyl peptide receptor: annexin I regulates neutrophil extravasation by interacting with the FPR." Mol Cell 5(5): 831-40. Wang, C., L. Deng, M. Hong, G. R. Akkaraju, J. Inoue und Z. J. Chen (2001a). "TAK1 is a ubiquitin-dependent kinase of MKK and IKK." Nature 412(6844): 346-51. Wang, Q., R. Dziarski, C. J. Kirschning, M. Muzio und D. Gupta (2001b). "Micrococci and peptidoglycan activate TLR2-->MyD88-->IRAK-->TRAF-->NIK-->IKK-->NF-kappaB signal transduction pathway that induces transcription of interleukin-8." Infect Immun 69(4): 2270-6. Wang, Z., A. T. Larregina, W. J. Shufesky, M. J. Perone, A. Montecalvo, A. F. Zahorchak, A. W. Thomson und A. E. Morelli (2006). "Use of the inhibitory effect of apoptotic cells on dendritic cells for graft survival via T- cell deletion and regulatory T cells." Am J Transplant 6(6): 1297-311. Watts, C., R. Zaru, A. R. Prescott, R. P. Wallin und M. A. West (2007). "Proximal effects of Toll-like receptor activation in dendritic cells." Curr Opin Immunol 19(1): 73-8. Weber, M., C. Sydlik, M. Quirling, C. Nothdurfter, A. Zwergal, P. Heiss, S. Bell, D. Neumeier, H. W. Ziegler- Heitbrock und K. Brand (2003). "Transcriptional inhibition of interleukin-8 expression in tumor necrosis factor-tolerant cells: evidence for involvement of C/EBP beta." J Biol Chem 278(26): 23586-93. West, M. A. und W. Heagy (2002). "Endotoxin tolerance: a review." Crit Care Med 30(1 Suppl): S64-73. Wice, B. M. und J. I. Gordon (1992). "A strategy for isolation of cDNAs encoding proteins affecting human intestinal epithelial cell growth and differentiation: characterization of a novel gut-specific N-myristoylated annexin." J Cell Biol 116(2): 405-22. Williams, C. A., R. A. Harry und J. D. McLeod (2008). "Apoptotic cells induce dendritic cell-mediated suppression via interferon-gamma-induced IDO." Immunology 124(1): 89-101. Williams, L., L. Bradley, A. Smith und B. Foxwell (2004). "Signal transducer and activator of transcription 3 is the dominant mediator of the anti-inflammatory effects of IL-10 in human macrophages." J Immunol 172(1): 567-76. Wilson, N. S., D. El-Sukkari, G. T. Belz, C. M. Smith, R. J. Steptoe, W. R. Heath, K. Shortman und J. A. Villadangos (2003). "Most lymphoid organ dendritic cell types are phenotypically and functionally immature." Blood 102(6): 2187-94. Xu, Z., R. Dziarski, Q. Wang, K. Swartz, K. M. Sakamoto und D. Gupta (2001). "Bacterial peptidoglycan-induced tnf-alpha transcription is mediated through the transcription factors Egr-1, Elk-1, and NF-kappaB." J Immunol 167(12): 6975-82. Yamamoto, M., T. Okamoto, K. Takeda, S. Sato, H. Sanjo, S. Uematsu, T. Saitoh, N. Yamamoto, H. Sakurai, K. J. Ishii, S. Yamaoka, T. Kawai, Y. Matsuura, O. Takeuchi und S. Akira (2006). "Key function for the Ubc13 E2 ubiquitin-conjugating enzyme in immune receptor signaling." Nat Immunol 7(9): 962-70.

110 V. Anhang Andrea Mahr

Yamamoto, M., S. Sato, H. Hemmi, H. Sanjo, S. Uematsu, T. Kaisho, K. Hoshino, O. Takeuchi, M. Kobayashi, T. Fujita, K. Takeda und S. Akira (2002a). "Essential role for TIRAP in activation of the signalling cascade shared by TLR2 and TLR4." Nature 420(6913): 324-9. Yamamoto, M., S. Sato, H. Hemmi, S. Uematsu, K. Hoshino, T. Kaisho, O. Takeuchi, K. Takeda und S. Akira (2003). "TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway." Nat Immunol 4(11): 1144-50. Yamamoto, M., S. Sato, K. Mori, K. Hoshino, O. Takeuchi, K. Takeda und S. Akira (2002b). "Cutting edge: a novel Toll/IL-1 receptor domain-containing adapter that preferentially activates the IFN-beta promoter in the Toll-like receptor signaling." J Immunol 169(12): 6668-72. Yang, R. B., M. R. Mark, A. Gray, A. Huang, M. H. Xie, M. Zhang, A. Goddard, W. I. Wood, A. L. Gurney und P. J. Godowski (1998). "Toll-like receptor-2 mediates lipopolysaccharide-induced cellular signalling." Nature 395(6699): 284-8. Yao, Y., W. Li, M. H. Kaplan und C. H. Chang (2005). "Interleukin (IL)-4 inhibits IL-10 to promote IL-12 production by dendritic cells." J Exp Med 201(12): 1899-903. Yarovinsky, F., D. Zhang, J. F. Andersen, G. L. Bannenberg, C. N. Serhan, M. S. Hayden, S. Hieny, F. S. Sutterwala, R. A. Flavell, S. Ghosh und A. Sher (2005). "TLR11 activation of dendritic cells by a protozoan profilin-like protein." Science 308(5728): 1626-9. Ye, J. und H. A. Young (1997). "Negative regulation of cytokine gene transcription." FASEB J 11(11): 825-33. Yoshimura, A., T. Naka und M. Kubo (2007). "SOCS proteins, cytokine signalling and immune regulation." Nat Rev Immunol 7(6): 454-65. Yu, H., M. Kortylewski und D. Pardoll (2007). "Crosstalk between cancer and immune cells: role of STAT3 in the tumour microenvironment." Nat Rev Immunol 7(1): 41-51. Zhang, D., G. Zhang, M. S. Hayden, M. B. Greenblatt, C. Bussey, R. A. Flavell und S. Ghosh (2004). "A toll-like receptor that prevents infection by uropathogenic bacteria." Science 303(5663): 1522-6. Zhang, G. und S. Ghosh (2002). "Negative regulation of toll-like receptor-mediated signaling by Tollip." J Biol Chem 277(9): 7059-65. Zouki, C., S. Ouellet und J. G. Filep (2000). "The anti-inflammatory peptides, antiflammins, regulate the expression of adhesion molecules on human leukocytes and prevent neutrophil adhesion to endothelial cells." FASEB J 14(3): 572-80. Zwergal, A., M. Quirling, B. Saugel, K. C. Huth, C. Sydlik, V. Poli, D. Neumeier, H. W. Ziegler-Heitbrock und K. Brand (2006). "C/EBP beta blocks p65 phosphorylation and thereby NF-kappa B-mediated transcription in TNF-tolerant cells." J Immunol 177(1): 665-72.

111 V. Anhang Andrea Mahr

V.2. Tabellen zu den Genexpressionsanalysen

Tabelle V.1. und V.2. zeigen die in zwei unabhängigen Genexpressionsanalysen reproduzierbar durch Annexin 1 positiv (V.1.) bzw. negativ regulierten (V.2.) Gene auf.

Tabelle VI.1.: Durch Annexin 1 mehr als zweifach induzierte Gene Zytokine und Chemokine CCL1 CCL19 MIP-3β CCL20 MIP-3α CCL4 MIP-1β CCL5 RANTES CCL8 MCP-2 END1 Endothelin 1 CSF-1 colony stimulating factor 1 EBI-3 Epstein Barr Virus-induziertes Gen 3 IL-15 IL-1α IL-1β IL-4I1 IL-6 IL-8 TNF

Signaltransduktionsmoleküle DUSP1 dual specificity phosphatase 1 DUSP5 dual specificity phosphatase 5 BIRC3/MALT2 baculoviral IAP repeat-containing 3 CDGAP Cdc42 GTPase-activating protein DDIT4 DNA-damage-inducible transcript 4 GADD45B growth arrest and DNA-damage-inducible, β IRAK2 IL-1 Rezeptor assoziierte Kinase 2 MARCKSL1 MARCKS-like 1 NFKB1 NF-κB p105 / p50 NFKB2 NF-κB p100 / p49 NFKBIZ NF-κB ζ OPTN Optineurin PIM1 Pim-1 Onkogen PIM3 Pim-3 Onkogen (vorhergesagt) RELB v-rel reticuloendotheliosis viral oncogene homolog B, NF-κB 3 (avian) RGS1 regulator of G-protein signalling 1 RGS16 regulator of G-protein signalling 16 RHOF ras homolog gene family, member F SLAMF1 signaling lymphocytic activation molecule family member 1 SLAMF7 SLAM family member 7 SOCS2 suppressor of cytokine signaling 2 SPRED2 sprouty-related, EVH1 domain containing 2. TBC1D4 TBC1 domain family, member 4 TNFAIP3 (A20) TNFα-induziertes Protein 3 TRAF1 TNF-Rezeptor-assoziierter Faktor 1 TRIP10 Thyroidhormon-Rezeptor-interagierendes Protein 10

112 V. Anhang Andrea Mahr

Transkriptionskontrolle BCL3 B-cell CLL/lymphoma 3 (IκB-ähnliches Molekül) BHLHB5 basic helix-loop-helix domain containing, class B, 5 CASZ1 castor zinc finger 1 EZH2 enhancer of zeste homolog 2 (Drosophila) LHX2 LIM homeobox 2 POU2F2 POU domain, class 2, transcription factor 2 (OCT2) ZC3H12A zinc finger CCCH-type containing 12A

Rezeptoren und Oberflächenmoleküle ABCA1 ATP-binding cassette, sub-family A, member 1 CCR7 chemokine (C-C motif) receptor 7 CD40 ICAM1 intercellular adhesion molecule 1 (CD54) MCOLN2 Mucolipin 2

Enzyme CYP27B1 Cytochrom P450, Familie 27, Subfamilie B, Polypeptid 1 MTHFS 5,10-Methenyltetrahydrofolat-Synthetase SOD2 Superoxid-Dismutase 2 (mitochondrial) CLC Charcot-Leyden crystal protein

IFN-induzierbar GBP1 guanylate binding protein 1, IFN-inducible ISG20 interferon stimulated exonuclease gene 20kDa

Weitere ABTB2 Ankyrin repeat and BTB (POZ) domain containing 2 ADM (AM) Adrenomedullin BTG3 BTG family, member 3 C10ORF10 chromosome 10 open reading frame 10 C15ORF48 chromosome 15 open reading frame 48 EHD1 EH-domain containing 1 GRAMD1A GRAM domain containing 1A IER3 immediate early response 3 LOC342897 similar to F-box only protein 2 LOC401433 hypothetical gene LYPD3 LY6/PLAUR domain containing 3 MGC42105 hypothetical protein MYO1G Myosin 1G PVR Poliovirus-Rezeptor SLC1A3 solute carrier family 1 (glial high affinity glutamate transporter), 3 SNX10 sorting nexin 10 TNC Tenascin C (Hexabrachion) TNFAIP2 TNFα-induziertes Protein 2 TNFAIP6 TNFα-induziertes Protein 6 TNIP2 TNFAIP3 interagierendes Protein 2 TUBB Tubulin β TUBB2B Tubulin β 2B UBD Ubiquitin D

113 V. Anhang Andrea Mahr

Tabelle VI.2.: Durch Annexin 1 mehr als zweifach inhibierte Gene Signaltransduktionsmoleküle BLNK B-cell linker (auch SLP-65, BASH) RGS18 regulator of G-protein signalling 18

Transkriptionskontrolle EGR1 early growth response 1 NFE2 nuclear factor (erythroid-derived 2) MAFB v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog B (avian)

Rezeptoren und Oberflächenmoleküle CD86 CD86 ADORA3 Adenosin A3-Rezeptor, Transkriptvariante 3 CD14 CD14 CD1D (CD1A) CD1d IL8RB IL-8-Rezeptor β MS4A6A membrane-spanning 4-domains, subfamily A, member 6A TMEM37 Transmembran-Protein 37

Weitere C17ORF44 chromosome 17 open reading frame 44 FAM19A3 (TAFA-3) family with sequence similarity 19 (chemokine (C-C motif)-like), member A3 GIMAP4 GTPase, IMAP family member 4 LOC340843 similar to protein of unknown function MARCH1 membrane-associated ring finger (C3HC4) 1

114 V. Anhang Andrea Mahr

V.3. Abkürzungsverzeichnis

7-AAD 7-Aminoactinomycin D A Adenin ABC-Transporter ATP binding cassette-Transporter AP-1 activator protein 1 APC antigen presenting cell Ask apoptosis signal regulating kinase ATF2 activating transcription factor 2 BAI1 brain-specific angiogenesis inhibitor 1 BCA bicin choninic acid BSA bovines Serumalbumin bzw. beziehungsweise cAMP cyclic adenosine monophosphate CCL CC-Chemokin-Ligand CCR CC-Chemokin-Rezeptor CD cluster of differentiation COX2 Cyclooxygenase 2 CR complement receptor CXCL CXC-Chemokin-Ligand DAC5 detector of apoptotic cells 5 DNA deoxyribonucleic acid DC dendritic cell DC-SIGN DC specific intracellular adhesion molecule 3 grabbing non-integrin DEC-205 Decalektin, 205 kDa DNAse Desoxyribonuklease dNTP Desoxyribonukleosid-Triphosphat(e) DTT Dithiothreitol ECL enhanced chemoluminescence EDTA Ethylendiamin-Tetraacetat EGF epidermal growth factor Egr1 early growth response 1 ELISA enzyme-linked immunosorbent assay Erk extracellular signal regulated kinase FACS fluorescence activated cell sorting Fc fragment crystallizable FCS fetal calf serum FITC Fluoreszein-Isothiocyanat

115 V. Anhang Andrea Mahr

fMLP Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin FoxP3 forkhead box P3 FPR Formyl-Peptid-Rezeptor FPRL FPR-like GAPDH Glycerinaldehydphosphat-Dehydrogenase Gas6 growth arrest specific 6 GBP1 guanylate binding protein 1 GFP green fluorescent protein GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor GSH Glutathion (reduziert) GSK3β Glykogensynthase-Kinase 3β HAc Essigsäure HEK293 human embryonic kidney 293 (Zelllinie) HLA Humanes Leukozyten-Antigen HMGB1 high mobility group box 1 HRP horse radish peroxidase (Meerrettich-Peroxidase) HSA Humanes Serumalbumin IDO Indolamin-2,3-Dioxygenase IFN Interferon IκBα inhibitor of NF-κB α IKK IκB-Kinase IL Interleukin ILT-4 immunoglobulin-like transcript 4 IP-10 IFNγ-inducible protein 10 (CXCL10) IPTG Isopropyl-Thiogalactosid IRAK IL-1-Rezeptor assoziierte Kinase IRF IFN-regulierender Faktor ISG IFN-stimuliertes Gen JAK Janus-Kinase JNK c-Jun N-terminale Kinase LAL Limulus Amöbozyten-Lysat LPS Lipopolysaccharid LRR Leucin rich repeat MACS magnetic cell sorting Mal / TIRAP MyD88 adaptor like / TIR domain containing adaptor protein MAPK mitogen activated protein kinase MAPKKK mitogen activated protein kinase kinase kinase MCP-1 monocyte chemoattractant protein 1 (CCL2) M-CSF macrophage colony stimulating factor

116 V. Anhang Andrea Mahr

MD2 myeloid differentiation 2 MEKK mitogen Erk kinase kinase Mer (expressed in) monocytes and tissues of endothelial and reproductive origin MFG-E8 milk fat globule EGF factor 8 MHC major histocompatibility complex MIP-2 macrophage inflammatory protein 1 MyD88 myeloid differentiation primary response gene 88 MyD88s soluble MyD88 NF-κB nuclear factor κ B NFKBIA NF-κB inhibitor, α (Gen für IκBα) NK-Zellen Natürliche Killerzellen OPD o-Phenylendiamin PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Pam2CSK4 (S)-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-I-cysteinyl- (S)-seryl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)-lysin

Pam3CSK4 N-palmitoyl-(S)-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]—I-cysteinyl- (S)-seryl-(S)-lysyl-(S)-lysyl-(S)lysyl-(S)-lysin PAMP pathogen associated molecular pattern PBS phosphate buffered saline PBST phosphate buffered saline with Tween 20 PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PKC Proteinkinase C PLA2 Phospholipase A2 PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid Poly(I:C) Polyinosin-Polycytidylsäure PPAR Peroxisom-Proliferator aktivierter Rezeptor PRR pattern recognition receptor PTX3 Pentraxin 3 RANTES regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted (CCL5) RIN RNA integrity number RIP1 Rezeptor-interagierendes Protein 1 RNA ribonucleic acid RNAse Ribonuklease SARM sterile α- and armadillo-motif-containing protein SDS sodium dodecyl sulfate SLE Systemischer Lupus Erythematodes SOCS suppressor of cytokine signalling STAT signal transducer and activator of transcription TAB TAK1-bindendes Protein

117 V. Anhang Andrea Mahr

TAK1 TGFβ-aktivierte Kinase TAM Tyro3-Axl-Mer TBK Tank-bindende Kinase TBS Tris buffered saline TBST Tris buffered saline with Tween 20 TEMED N, N, N’, N’-Tetramethylendiamin TGFβ transforming growth factor β

TH T-Helfer TIM T-Zell-Immunglobulin-und Mucin-Domäne TLR Toll-like Rezeptor TNF Tumornekrosefaktor Tpl2 tumor progression locus 2 TRAF TNF-Rezeptor assoziierter Faktor TRAM / TRIF related adaptor molecule / TICAM-2 TIR domain containing adaptor molecule 2 Treg regulatorische T-Zelle(n) TRIAD3A two RING fingers and DRIL (double ring finger linked) 3A TRIF / TIR domain containing adaptor protein inducing ifnb / TICAM-1 TIR domain containing adaptor molecule 1 U Uracil Ubc13 ubiquitin conjugating enzyme 13 Uev1A ubiquitin E2 variant 1A VEGF vascular endothelial growth factor vgl. vergleiche vs. versus, gegenüber z.B. zum Beispiel

118 V. Anhang Andrea Mahr

V.6. Erklärung

Hiermit versichere ich an Eides statt, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne fremde Hilfe angefertigt habe. Diese Arbeit wurde bisher an keiner anderen Universität oder an einem anderen Fachbereich als Dissertation, Diplomarbeit oder ähnliche Prüfungsarbeit eingereicht.

Heidelberg, im Oktober 2008-10-19

------Andrea Mahr

119 V. Anhang Andrea Mahr

V.7. Danksagung

Zunächst gilt mein Dank Prof. Dr. Peter H. Krammer für die interessante Themenstellung und die Betreuung meiner Arbeit. Ich möchte mich bedanken für seinen kritischen Blick auf Daten und Inter- pretationen und seine wissenschaftliche Unterstützung mit dem Hintergrund jahrzehntelanger Erfah- rung. Ich schätze seine Begeisterung für die Wissenschaft wie auch die kritische Herangehensweise, die er der ganzen Gruppe vermittelt. Weiterhin möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. Lutz Gissmann bedanken, der diese Arbeit als Erstgutachter betreut. Ich bin ihm dankbar für die unkomplizierte Betreuung und die beratenden Gespräche. Dr. Alexander Dalpke danke ich ganz besonders für seine Bereitschaft, mich als externer Gut- achter fachkundig zu beraten. Er hatte immer ein offenes Ohr und half mir sowohl durch seine Erfah- rungen im Gebiet der TLR-Signaltransduktion wie auch durch Reagenzien und MyD88-defiziente Mäuse. Auch Dr. Konrad Bode und Dr. Alexander Weber danke ich für hilfreiche Gespräche und Rea- genzien. Mein Dank geht auch an Dr. Bernhard Korn für die nette und fachkundige Unterstützung bei den Genexpressionsanalysen. Ein ganz besonderes Dankeschön gilt meinen Kollegen, ohne deren fachliche und moralische Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Insbesondere danke ich allen derzeitigen und ehemaligen Mitgliedern der Annexin-Gruppe: Dr. Heiko Weyd, Dr. Lucie Dörner, Dr. Dagmar Riess, Björn Linke, Isabel Vogler, Bartec Berger und Julia Winter. Die enge Zusammenarbeit in diesem Projekt war sehr fruchtbar und hat viel Spaß gemacht. Nur durch den gemeinsamen Einsatz konnte das Annexin-Projekt von so vielen Seiten beleuchtet werden, und der wissenschaftliche und technische Austausch war auch für meine Arbeit unverzichtbar. Ich danke auch der gesamten Gruppe für die große Hilfsbereitschaft und den fachlichen Rat, die die Bearbeitung meines Projekts sehr erleichtert haben. Danke für die freundschaftliche Atmosphäre, durch die mir diese Arbeit viel Freude bereitet hat. Ich danke Dr. Rüdiger Arnold und der T-Zell- Gruppe für Gespräche und Reagenzien, und Cosima Kretz für gute Ratschläge bei den Annexin-Tref- fen und ihre Hilfsbereitschaft bei technischen Fragen. Christina Falschlehner aus der Walczak-Gruppe danke ich für die Durchführung einiger quantitativer PCRs. Für hervorragende technische Hilfe möchte ich mich bei meinen Auszubildenden Ann-Catherine Klein und Christina Scheiner sowie bei Marlene Pach bedanken. Auch Sandra Pfrang, Linda Linke, Denise Eberle und Daniela Muth danke ich für ihre gelegentliche technische Hilfe. Ein Dank geht auch an Heidi Sauter für ihre administrative Unterstützung. Die Präparation humaner DC wäre nicht möglich gewesen ohne die vielen Blutspender, bei denen ich mich an dieser Stelle ebenfalls ganz herzlich bedanken möchte. Ebenso unverzichtbar waren Kol- legen, die bereit waren, frühmorgens eine halbe Stunde zu opfern, um Blut abzunehmen: Bartec Berger, Julia Heid, Dr. Annegret Kuhn, Raphael Klembt, Dr. Frank Westermann, Jan-Peter Linke, Karina Drobbe, Dr. Christoffer Gebhardt und einige andere Mediziner, die aushalfen wenn gerade Not am Mann war. Vielen Dank auch an sie. Schließlich möchte ich meinen Freunden sowie insbesondere meinen Eltern und Brüdern danken, die mich in allen Situationen tatkräftig unterstützt haben. DANKE.

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