Universidad Austral De Chile Facultad De Ciencias Escuela De Química Y Farmacia

Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias Escuela de Química y Farmacia

PROFESOR PATROCINANTE: Karin Jürgens Sch. INSTITUTO : Farmacia FACULTAD : Ciencias

PROFESOR CO-PATROCINANTE: Carolina Manosalva A. INSTITUTO : Farmacia FACULTAD : Ciencias

“ESTUDIO FITOQUIMICO Y TOXICOLÓGICO DE Laurelia sempervirens"

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico.

CAROLINA NATHALY SOLIS SCHWAGER

VALDIVIA-CHILE

2012

A mis tíos, por las sonrisas sabor a chocolate que me regalaron. 2

Agradecimientos

Durante el desarrollo de esta tesis tuve la fortuna de recibir el apoyo y la ayuda de innumerables personas, ya sea aportando con una palabra de ánimo o con alguna idea que me permitió a llegar a lo que hoy pueden leer. Por esto, he de agradecer:

A las profesoras Karin Jürgens y Carolina Manosalva, que estuvieron siempre guiándome, pendientes de mi avance y de resolver mis dudas, responsables de gran parte de este logro.

A don Marcelo Muñoz, por aceptar ser mi informante sin conocerme.

Al Doctor Guillermo Schmeda-Hirschman, que nos permitió trabajar en su laboratorio.

Quiero agradecerle por su buena voluntad y su increíble disposición y vocación al momento de investigar y ayudar a quienes desean investigar también.

Al profesor Joel Pardo, que siempre colaboró cuando me surgían dudas en el laboratorio.

A don Eduardo Aguayo, por su disponibilidad para ayudarme a realizar mi tarea.

A la secretaria Valeria Palma, por su buen humor y disposición.

Quiero agradecer a mis amigos, no tan amigos y a mis conocidos, porque de una u otra manera, marcaron algo en mí:

A CVXj Valdivia, por darme la oportunidad de conocer gente tan increíble y única como los miembros de mi comunidad "Aliwen".

A AIESEC Valdivia, por permitirme crecer como persona y por supuesto, gracias a las personas que la forman, por creer en mí. 3

A los alumnos de "Tecnología Farmacéutica de sólidos y líquidos" del año 2010 y de

“Farmacognosia y principios de Fitoquímica” del año 2011, porque aunque estuviera cansada de estar horas caminando, su simpatía siempre cambiaba mi día.

Al resto de los miembros de esta carrera, a los integrantes del Instituto de Farmacia y a los alumnos de esta profesión, por compartir conmigo salas, mesas en la biblioteca y distracciones.

Finalmente, quiero dar las gracias a mi familia por permitirme estudiar esta carrera, por darme la oportunidad de conocer gente increíble y de conocerme a mi misma un poco más. Y obviamente, por confiar en mí. Darles las gracias porque estaban siempre pendientes y dispuestos a disculparme gratuitamente por muchos momentos de convivencia que me he perdido con ellos. Espero que ellos al verme ahora puedan decirme si acaso ven algún cambio en mí, o si se sienten orgullosos de la que hoy escribe ante el computador.

Espero este trabajo pueda ser útil a generaciones venideras y que otros alumnos de esta carrera puedan optar a tesis de este tipo en las que ponen a prueba cada uno de los conocimientos adquiridos en la universidad. Espero se sigan transmitiendo el amor por el aprender y por la carrera.

Siempre me gustaron los árboles. 4

Índice

ÍNDICE 4

ÍNDICE DE FIGURAS 8

ÍNDICE DE TABLAS 10

ÍNDICE DE GRÁFICOS 12

LISTA DE ABREVIATURAS 13

1 RESUMEN 15

1.1 ABSTRACT 16

2 INTRODUCCIÓN 17

2.1 USO DE PLANTAS MEDICINALES EN CULTURA MAPUCHE 17

2.1.1 LAURELIA SEMPERVIRENS 18

2.1.1.1 METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN LAURELIA SEMPERVIRENS 19

2.1.1.2 PROPIEDADES DE LOS METABOLITOS SECUNDARIOS PRESENTES EN L. SEMPERVIRENS 23

2.2 HIPÓTESIS 26

2.3 OBJETIVOS 27

2.3.1 OBJETIVO GENERAL 27

2.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 27

3 MATERIALES Y MÉTODOS 28 5

3.1 MATERIALES 28

3.1.1 MATERIAL VEGETAL 28

3.1.2 LUGAR DE DESARROLLO 28

3.1.3 INSTRUMENTOS 28

3.1.4 REACTIVOS 29

3.1.5 MATERIAL DE LABORATORIO 31

3.1.6 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 33

3.2 MÉTODO 34

3.2.1 RECOLECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL 34

3.2.2 ESTUDIOS FITOQUÍMICOS 34

3.2.3 OBTENCIÓN Y FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO CRUDO 36

3.2.3.1 OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ALCOHÓLICO 36

3.2.3.2 FRACCIONAMIENTO DEL EXTRACTO ALCOHÓLICO 36

3.2.4 ANÁLISIS CUALITATIVO DE METABOLITOS PRESENTES EN LAS FRACCIONES 39

3.2.4.1 IDENTIFICACIÓN DE ALCALOIDES POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA EN PLACA 39

3.2.4.2 IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 39

3.2.4.3 IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN 41

3.2.4.3.1 ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-VIS 43

3.2.4.3.2 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE

MASAS 43

3.2.5 DETERMINACIÓN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE 44

3.2.6 DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE LOS EXTRACTOS DE L. SEMPERVIRENS 45

3.2.6.1 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA EN ARTEMIA SALINA 45 6

3.2.6.2 DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL MEDIA 48

4 RESULTADOS 51

4.1 IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN HOJAS DE L. SEMPERVIRENS 51

4.1.1 ENSAYOS FITOQUÍMICOS 51

4.1.2 IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA EN

PLACA 53

4.1.3 IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN 58

4.1.3.1 IDENTIFICACIÓN DE FLAVONOIDES POR ANÁLISIS ESPECTROFOTOMÉTRICO UV-VIS 61

4.1.3.2 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE

MASAS 62

4.2 EVALUACIÓN DEL EFECTO ANTIOXIDANTE 64

4.3 DETERMINACIÓN DE LA TOXICIDAD AGUDA DE LOS EXTRACTOS DE L. SEMPERVIRENS 66

4.3.1 DETERMINACIÓN DE CONCENTRACIÓN LETAL MEDIA EN ARTEMIA SALINA 66

4.3.2 DETERMINACIÓN DE DOSIS LETAL MEDIA EN RATONES MUS MUSCULUS 68

5 DISCUSIÓN 69

6 CONCLUSIONES 75

LITERATURA CITADA 77

ANEXOS. 85 7

ANEXO 1: CLASIFICACIÓN DEL GRADO DE TOXICIDAD EN EL MÉTODO DE TOXICIDAD AGUDA EN

NAUPLIOS DE ARTEMIA SALINA (FERNÁNDEZ-CALIENES ET AL, 2009). 85

ANEXO 2: RESUMEN DE MILILITROS ADMINISTRADOS DEL INFUSIÓN DE L. SEMPERVIRENS A CADA

UNO DE LOS RATONES SOMETIDOS AL ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA ORAL. 85

ANEXO 3: CLASIFICACIÓN DEL GRADO DE TOXICIDAD EN EL MÉTODO DE TOXICIDAD AGUDA ORAL

USANDO RATONES (REPETTO, 1997). 86

ANEXO 4: PAUTAS DE OBSERVACIÓN DE LAS CONDUCTAS CADA UNO DE LOS RATONES SOMETIDOS

AL MÉTODO “UP AND DOWN”. 86

ANEXO 5: PAUTA DE NECROPSIA DE RATONES. 95

ANEXO 6: REGISTRO DE PESOS DE RATONES USADOS EN EL ENSAYO DE TOXICIDAD AGUDA ORAL.

104

Índice de Figuras

Figura 1: De izquierda a derecha: árbol, corteza, hojas, frutos y flores de L. sempervirens. ___ 19

Figura 2: Compuestos aislados de la madera de Laurelia sempervirens (Montes et al., 1992) _ 21

Figura 3: Estructura del núcleo básico de flavonoides: 2-fenilbenzopirona. ______22

Figura 4: Estructura de flavonoides myricetina, quercetina y kamferol ______23

Figura 5: Esquema del método de obtención del extracto crudo del tejido foliar fresco de L. sempervirens, y su posterior fraccionamiento líquido-líquido, usando éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo como disolventes. ______38

Figura 6: Morfología de un nauplio de A. salina ______46

Figura 7: Quistes de A. salina deshidratados ______46

Figura 8: Cromatografía de capa fina en placa obtenida de las fracciones de EP, CH2CL2,

AcOEt, respectivamente, usando una solución de CH3Cl: MeOH 95:5 como fase móvil y reactivo de Dragendorff como revelador. ______53

Figura 9: Cromatografía de capa fina en placa de las fracciones del 10 al 18 obtenidas por cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo, observadas bajo luz UV 365 nm tras ser reveladas con el reactivo difenilbórico. ______54

Figura 10: Cromatografía de capa fina en placa de las fracciones del 19 al 26 obtenidas por cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo, observadas bajo luz UV 365 nm tras ser reveladas con el reactivo difenilbórico. ______55

Figura 11: Cromatografía de capa fina en placa de las fracciones del 27 al 30 obtenidas por cromatografía en columna del extracto de acetato de etilo, estándar de quercetina y estándar de rutina, observadas bajo luz UV 365 nm tras ser reveladas con el reactivo difenilbórico. ______55 9

Figura 12: Cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa de una muestra de 10 μl de la fracción AcOEt, utilizando método de gradiente, canales de absorción 253 nm (azul), 265nm

(verde), 365nm (rojo) y tiempo de corrida de 40 min. ______58

Figura 13: Cromatografía líquida de alta resolución con detector de arreglo de diodos (HPLC-

DAD) obtenido en la Universidad de Talca, de una muestra de 10 μl de la fracción acetato de etilo, en un tiempo de corrida de 45 min. ______59

Figura 14: Cromatografía líquida de alta resolución con detector ultravioleta (HPLC-UV) obtenido en la Universidad de Talca, de una muestra de 10 μl de la fracción acetato de etilo, en un tiempo de corrida de 45 min. ______60

Figura 15: Molécula de quercetina (PM: 302 g/mol), flavonoide identificado en una fracción de acetato de etilo extraído de hojas frescas de L. sempervirens ______63

Figura 16: Molécula de luteolina (PM: 286 g/mol), flavonoide identificado en una fracción de acetato de etilo extraído de hojas frescas de L. sempervirens ______63

Índice de Tablas

Tabla 1 Ensayos fitoquímicos realizados a la droga de L. sempervirens, para la identificación de los principales metabolitos secundarios (Samuelson, 1999; Heinrich et al., 2004)...... 35

Tabla 2: Variación de concentración de las fases móviles A (0,1% TFA en agua) y B (metanol) según el tiempo, al usar el método de gradiente en la cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa con detector de arreglo de diodos (HPLC-DAD)...... 42

Tabla 3: Porcentaje de inhibición de DPPH por estándares de ácido ascórbico a distinta concentración...... 44

Tabla 4: Concentración de la infusión de hojas de L. sempervirens administrada a cada uno de los grupos de nauplios sometidos al ensayo de toxicidad aguda...... 47

Tabla 5: Dosis del extracto de Laurelia sempervirens administrado a cada uno de los grupos de ratones usados en el ensayo de toxicidad aguda oral...... 48

Tabla 6: Resumen de resultados de los ensayos fitoquímicos realizados a hojas secas de L. sempervirens...... 52

Tabla 7: Comparación entre las manchas de color presente en los cromatogramas de las sub- fracciones obtenidas de la fracción acetato de etilo (figuras 17, 18 y 19) y la coloración de algunos flavonoides y derivados del ácido cinámico en cromatografía de capa fina en placa observada con luz ultravioleta de 365 nm (Wagner, 2001)...... 56

Tabla 8: Determinación de la presencia de flavonoides a partir del análisis de los espectros obtenidos de un barrido de 200 a 600 nm a los compuestos mayoritarios identificados por el análisis HPLC de la fracción acetato de etilo ...... 61 11

Tabla 9: Resumen de los resultados obtenidos en los métodos de HPLC, HPLC-UV, HPLC-MS y HPLC-DAD a los que se sometió la muestra de la fracción de acetato de etilo...... 62

Tabla 10: Porcentajes de inhibición del radical libre DPPH por estándares de ácido ascórbico concentraciones de 4, 6 y 10 µg/ml y por el extracto metanólico de hojas secas de L. sempervirens a una concentración de 1 mg/ml...... 64

Tabla 11: Porcentaje de letalidad observada en nauplios de Artemia salina según la concentración de la infusión de L. sempervirens, tras 24 horas de exposición al ensayo de toxicidad...... 66

Índice de Gráficos

Gráfico 1: Determinación de la CL50 a partir de infusiones de partes aéreas de L. sempervirens tras el ensayo de toxicidad aguda en nauplios de Artemia salina...... 67

Lista de abreviaturas

ACN: acetonitrilo

AcOEt: acetato de etilo

CL50: concentración letal media

CH3Cl: cloroformo

CH2Cl2: diclorometano

DE: desviación estándar

DL50: dosis letal media

E.P: éter de petróleo

EtOH: etanol g: gramos

Hex: hexano

HOAc: ácido acético

HPLC: cromatografía líquida de alta resolución (High performance liquid chromatography)

L: litros

MeOH: metanol 14

mg: milígramos min: minuto ml: mililitro m.s.m.: metros sobre el nivel del mar ppm: partes por millón

Tol: tolueno

µg: microgramos

%: porcentaje

1 Resumen

Laurelia sempervirens es un árbol conocido vulgarmente como Laurel o Triwe. Este árbol crece en Chile desde la IV a la X Región de los Lagos, cuya infusión es usada por la cultura mapuche para el tratamiento de dolores estomacales y como diurético.

Se determinaron los metabolitos secundarios presentes en esta especie, por medio de ensayos fitoquímicos y de cromatografía de capa fina en placa a sus partes aéreas, aislándose alcaloides y flavonoides. Para obtener la identidad de los flavonoides el extracto crudo de L. sempervirens fue fraccionado, donde a la fracción acetato de etilo se le realizaron estudios en HPLC, HPLC-UV,

HPLC-DAD y HPLC-MS, identificándose la presencia de los flavonoides luteolina y quercetina.

Se midió el porcentaje de inhibición de radicales libres de esta especie usando el método DPPH en un extracto metanólico de concentración 1 mg/ml, obteniendo un porcentaje igual a 71,35 %.

Se evaluó la toxicidad de L. sempervirens por medio de estudios de toxicidad aguda oral en 17 ratones de la cepa Rockefeller, a los cuales se les administró una infusión de hojas secas a diferentes dosis (1600, 3200 y 6400 mg/Kg), demostrándose que el DL50 es mayor a 6400 mg/Kg, no presentando toxicidad aguda. Este estudio de toxicidad aguda también se realizó en nauplios de Artemia salina, a los cuales se les administró un infusión de hojas secas a diferentes concentraciones (10, 100 y 1000 ppm), no encontrándose toxicidad. 16

1.1 Abstract

Laurelia sempervirens is a tree commonly known as Laurel or Triwe. This tree grows in Chile from the IV to the X Region and the infusion is used by the Mapuche culture for the treatment of stomach pains and as a diuretic.

Using phytochemicals reactives and thin layer chromatography, flavonoids and alkaloids have been isolated from the drug. The identification of luteolina and quercetina in a ethyl acetate fraction was proved using HPLC-UV, HPLC-DAD and HPLC-MS, identifying the presence of flavonoids luteolin and quercetin.

The antioxidant activity of the drug was proved using the DPPH method. The extract at concentration of 1 mg/ml inhibit the activity of the radical in 71.35 %.

The acute oral toxicity of L. sempervirens was assessed using Rockefeller mice. The oral administration of leaves infusion at different doses (1600, 3200 and 6400 mg/kg), showed that the LD50 is greater than 6400 mg/kg. A biological assay with Artemia salina was also performed, the infusion of the leaves did not show toxicity against A. salina at different concentrations (10,

100 and 1000 ppm)

2 Introducción

2.1 Uso de plantas medicinales en cultura mapuche

La República de Chile, antes de la llegada los españoles, albergaba a diversas etnias tales como aymaras, onas y mapuches, entre varias otras. Pero como se ha visto en la mayoría de países con pueblos aborígenes, estas etnias van adoptando las costumbres de sus nuevos habitantes y de esta manera las suyas van quedando atrás. En Chile podemos ver que en el bicentenario de nuestra independencia aún nos encontramos con mapuches, una de las etnias que ha perdurado a través del tiempo y que ha logrado conservar en gran medida sus costumbres, su lengua y su medicina (Citarella et al., 2000).

El pueblo mapuche, a través de su historia, ha sabido darle a las plantas un uso medicinal.

Esto ha llevado a que durante los años sean muchos los científicos que hayan realizado estudios acerca de los usos de estas plantas y de su composición química, sin embargo, aun son insuficientes. Lo anterior se debe principalmente a la diversidad de plantas con las que los mapuches trabajan (se cree que son aproximadamente 200 especies), pues esto se traduce en la existencia de una variedad de principios activos que deben ser identificados y actividades biológicas a evaluar. Por otro lado, se debe evaluar la toxicidad de estas plantas y sus principios activos, para asegurar la inocuidad de las mismas.

Una de las especies utilizada por los mapuches en medicina, que cuenta con escasos estudios relacionados con su composición química y toxicidad, es Laurelia sempervirens, conocida vulgarmente como "Laurel", cuyas hojas, flores y corteza son utilizados en la medicina tradicional para tratar diversos trastornos. 18

2.1.1 Laurelia sempervirens

Laurelia sempervirens corresponde a una especie arbórea nativa que crece preferentemente en terrenos húmedos en la cordillera de la Costa y de Los Andes, por lo que se encuentra distribuida tanto en Argentina como en Chile. En nuestro país crece entre Colchagua y

Llanquihue, es decir de los 34º a 41º latitud sur (Hoffmann, 1982). Pertenece a la familia

Monimiáceae y es conocido popularmente como Laurel, Tihue o Trihue. El nombre del género

Laurelia proviene del nombre común “laurel”, mientras que el nombre de la especie

“sempervirens” deriva del latín siempreverde (Muñoz et al., 2001).

Este árbol frondoso y siempre verde, puede llegar a medir 40 metros de altura y unos 2 metros de diámetro (figura 1). Su corteza es de gran grosor, tiene perfume agradable y se desprende en placas circulares (Hoffmann, 1982). Sus hojas son perennes, simples, coriáceas, aromáticas, de lámina oblonga o lanceolada de 5,5 a 10 cm de largo por 2 a 3 cm de ancho, lustrosas y con margen dentado. Las flores son hermafroditas o unisexuales por aborto, pequeñas de 5-8 mm de largo y se encuentran en racimos de color verde-cremosas. El fruto es dehiscente, de 1,5 – 2 cm de largo y leñoso en la madurez. Las semillas son densamente pilosas, de hasta 2 cm de largo (Urbina, 2006).

Figura 1: De izquierda a derecha: árbol, corteza, hojas, frutos y flores de L. sempervirens.

Las flores, hojas y corteza son utilizadas en medicina popular. El infuso de hojas es recomendado como digestivo, diurético y analgésico (Muñoz et al., 2001). Esta infusión también es utilizada en baños de inmersión para aliviar dolores reumáticos, recomendándose también para tratar atonías del tubo digestivo y afecciones a las vías urinarias.

Las pomadas preparadas con polvo de hoja, se aplican en afecciones herpéticas

(Montenegro, 2002).

2.1.1.1 Metabolitos secundarios presentes en Laurelia sempervirens

Dentro de los compuestos actualmente aislados de esta planta, destacan los derivados de metabolitos secundarios de tipo alcaloídeos y flavonoides.

Los alcaloides forman parte de la mayoría de las plantas (más de 300 familias) y se encuentran presentes en todos sus órganos, mayoritariamente en hojas, flores, frutos, semilla, corteza y en la raíz. Si bien, la presencia de alcaloides no es vital para la planta, estos deben participar en secuencias metabólicas y no son solamente productos de desecho del metabolismo 20

(Arango, 2008) ya que pueden tener funciones de reserva para la síntesis proteica y defensa contra depredadores o plagas (ya que poseen un sabor amargo característico) (Samuelson, 1999).

Los alcaloides, pueden ser detectados por ensayos fitoquímicos como la precipitación con ayuda de reactivos de coloración tales como los reactivos de Mayer, Dragendorff, silicotúngstico, lugol y Bouchardat (Heinrich et al., 2004).

Los estudios realizados a Laurelia sempervirens indican la presencia de alcaloides complejos del tipo aporfínico y bisbencilisoquinolínico en un alto contenido en su madera

(Montes et al., 1992). Ambos tipos de alcaloides se encuentran frecuentemente en familias del orden de las Magnoliales como Annonaceae, Lauraceae, Magnoliaceae y Monimiaceae (familia a la cual pertenece L. sempervirens) (Arango, 2008).

De la madera de L. sempervirens se han aislado los alcaloides: liriodenina, oxonantenina, michelalbina, stepharina, norantenina, anonaína, isotetrandrina (figura 2) (Montes et al., 1992).

Uno de los alcaloides aislados a partir de su madera posee propiedades antimicrobianas de amplio espectro, activo frente a bacterias y hongos, lo que explicaría la buena resistencia de esta madera al ataque de los microorganismos (Montenegro, 2002). 21

Figura 2: Compuestos aislados de la madera de Laurelia sempervirens (Montes et al., 1992)

De esta especie también se aisló un alcaloide seco-bisbencilisoquinolinico, denominado seco-isotetrandrina (Muñoz et al., 2001).

Las hojas de este árbol, poseen una esencia cuyos componentes determinados hasta ahora son laurotetanina y safrol. El elevado contenido de safrol (91%) en el aceite esencial de las hojas es una advertencia para limitar su empleo por sus efectos cancerígenos en animales de experimentación (Muñoz et al., 2001).

Otros grupo de metabolitos secundarios aislado de L. sempervirens corresponde a flavonoides, los que se caracterizan por ser compuestos de bajo peso molecular y compartir en su estructura un esqueleto básico de 15 carbonos (C6-C3-C6), constituyendo dos anillos fenilos (A y 22

B), ligados mediante un anillo pirano (C) (Martínez et al., 2002; Escamilla et al., 2009).

Además, se presentan los sistemas benzoil y cinamoil asociados a las bandas de absorción características de los flavonoides. El anillo B o sistema cinamoil está asociado con la absorción de la banda I (entre 300-390 nm), mientras que la banda II (entre 250 y 280 nm) está asociado al anillo A o sistema benzoil (Hertgot et al., 1992) (figura 3).

Figura 3: Estructura del núcleo básico de flavonoides: 2-fenilbenzopirona.

De las hojas de esta especie se ha reportado la presencia de quercetina, myricetina, rutina y kamferol (figura 4) (Carvajal, 2005). 23

Figura 4: Estructura de flavonoides myricetina, quercetina y kamferol

2.1.1.2 Propiedades de los metabolitos secundarios presentes en L. sempervirens

Farmacológicamente los alcaloides presentes en esta planta, han sido caracterizados con diversas propiedades farmacológicas sobre humanos, las que son descritas a continuación:

 Liriodenina: exhibe potentes efectos citotóxicos sobre células pulmonares humanas con

adenocarcinoma (Chang et al., 2004) y actividad antifúngicas contra Candida albicans,

Trichophyton mentagrophytes y T. rubrum (Hufford et al., 1980).

 Oxonantenina: un derivado oxoaporfínico que, al igual que liriodenina, presenta

propiedades antifúngicas (Hufford et al., 1980; Cordell, 2006). 24

 Stepharina: ha demostrado tener efectos antihipertensivos y una capacidad de inhibir

colinesterasa y pseudocolinesterasa in vitro (Honda y Shigehisa, 2006), además de tener

moderada actividad espermicida (Jayasinghe et al., 1992).

 Isotetrandrina (bisbencilisoquinoleínico): ha evidenciado poseer propiedades de relajante

muscular en células del músculo uterino (D'ocón et al., 1992).

 Anonaína: provoca la apoptosis sobre células uterinas humanas con cáncer, pero el

mecanismo aún no está completamente determinado (Chen et al., 2008). Este alcaloide

además presenta efectos antiperoxidativos, actividad antibacteriana, antifúngica y efectos

inhibidores de la biosíntesis de dopamina, por lo que podría ser un potente antidepresivo

(Jae et al., 2008).

 Laurotetanina: posee capacidad atrapadora de radicales libres e inhibidora de la

peroxidación (Arango et al., 2004). Estudios recientes indican que posee capacidad

vasorelajante sobre la aorta en ratas por la supresión de la afluencia de calcio (Chen et al.,

1994).

No existen estudios que describan la existencia de propiedades farmacológicas para michelalbina, norantenina y seco-isotetrandrina, alcaloides que también ha sido aislados a partir de L. sempervirens.

El safrol por otro lado, es un aceite esencial presente en gran porcentaje en las hojas de esta planta (91%). Este compuesto ha sido categorizado como un agente tóxico tras estudios que han indicado su capacidad cancerígena en animales (Liu et al., 1999; Curtis et al., 1998).

Otro grupo de metabolitos secundarios presentes en esta planta son los flavonoides

(Carvajal, 2005), los que se caracterizan por poseer propiedades antioxidantes, ya que su 25

estructura química es capaz de transferir electrones y quelar metales (Figura 3) (Marcano y

Hasegawa, 2002; Escamilla et al., 2009). Farmacológicamente los flavonoides son usados para el tratamiento de insuficiencia venosa (Montes et al., 1992; García et al., 2002; Álvarez y Orallo,

2003), disminución de los riesgos de afecciones cardiovasculares (Hertog et al., 1992; Martínez et al., 2002) y disminución de citotoxicidad de LDL oxidadas (Rankin et al., 1993; Álvarez y

Orallo, 2003). También son usados como: antialérgicos, antiulcerosos, antiinflamatorios, antiagregantes plaquetarios y diuréticos, entre otros (Villar, 1999).

Los flavonoides quercetina, kamferol y myricetina identificados en esta especie han mostrado propiedades antitumorales (Hirpara et al., 2009; Wei et al., 1994; Nöthlings et al.,

2007). Se ha comprobado en ratas que el uso de quercetina mejora la función contráctil de el ventrículo izquierdo, reduciendo la incidencia de trastornos de la conducción cardíaca ya que mejora la circulación y previene la formación de trombos intravasculares (Hertog et al., 1992;

Martínez et al., 2002). Este flavonoide también suprime la oxidación de LDL (Martínez et al.,

2002).

De lo anterior, se puede deducir que existe una correlación entre el uso terapéutico otorgado a las preparaciones de esta plata en medicina tradicional y las propiedades descritas de los compuestos presentes en ésta. Sin embargo, se desconoce el nivel de seguridad en la administración de estas preparaciones dada la altísima presencia de safrol en sus hojas, y se ignora el porcentaje de inhibición de radicales libres de esta especie a pesar de la abundante cantidad de flavonoides descritos.

2.2 Hipótesis

1. De los extractos de Laurelia sempervirens obtenidos a partir de hojas frescas, es posible

aislar e identificar al menos un compuesto de los siguientes grupos de metabolitos:

hidratos de carbono, saponinas, flavonoides, taninos, heterósidos antraquinónicos,

compuestos con núcleo esteroídeo, alcaloide.

2. El extracto metanólico obtenido a partir de hojas secas y pulverizadas de Laurelia

sempervirens presenta actividad antioxidante.

3. La infusión de Laurelia sempervirens obtenida a partir de hojas secas es inocua ya que se

requieren dosis únicas mayores a 6,4 g/Kg administradas vía oral para producir la muerte

en el 50% de una población de ratones Mus musculus, cepa Rockefeller.

4. La infusión de Laurelia sempervirens obtenida a partir de hojas secas no posee toxicidad,

ya que se requieren concentraciones únicas mayores a 1000 µg/ml para producir la muerte

en el 50% de una población de nauplios de Artemia salina.

2.3 Objetivos

2.3.1 Objetivo general

Evaluar la composición química, toxicidad y capacidad antioxidante del extracto de

Laurelia sempervirens, obtenido a partir de sus partes aéreas.

2.3.2 Objetivos específicos

1. Obtener un extracto metanólico del material vegetal de L. sempervirens

2. Fraccionar el extracto metanólico de L. sempervirens usando un sistema de partición

líquido-líquido.

3. Aislar e identificar los metabolitos secundarios presentes en partes aéreas de L.

sempervirens a través de ensayos fitoquímicos y diversas técnicas cromatográficas.

4. Evaluar la capacidad antioxidante de un extractos metanólico de partes aéreas de L.

sempervirens mediante el ensayo de DDPH.

5. Evaluar la toxicidad de una infusión de hojas secas de L. sempervirens mediante el

ensayos de toxicidad aguda en larvas Artemia salina y en ratones Mus musculus.

3 Materiales y métodos

3.1 Materiales

3.1.1 Material vegetal

 Hojas de Laurelia sempervirens

3.1.2 Lugar de desarrollo

 Universidad Austral de Chile, Instituto de Farmacia, Valdivia

 Universidad de Talca, Instituto de Química y Recursos Naturales, Talca

3.1.3 Instrumentos

 Picadora marca Sindelen, modelo P-123

 Aparato de evaporación a presión reducida Arquimed, IKA®RV 10 basic

 Balanza analítica

 Balanza gravimétrica

 Baño de ultrasonido

 Bomba de oxígeno

 Espectrofotómetro de UV-V

 HPLC Shimadzu

o Shimadzu controlador CBM-20 A o Shimadzu auto sampler SIL-20 A o Shimadzu horno CTO-20 AC o Shimadzu bomba LC-20 AT 29

o Shimadzu degasificador DGU-20 A5 o Shimadzu columna shim-pack VP-ODS, tamaño de la columna 250Lx4.6

 HPLC-DAD

o HPLC modelo Merck Hitachi

o Integrador cromático D-7000

o Bomba L-7100

o Columna Kromasil 100 5C18

o Detector con arreglo de diodo UV L-7455

 HPLC MS

o Sistema LC Agilent 1100

o Esquire LC 4000

o Bomba inteligente 6200

o Detector UV-MS L 4000 acoplado a un EBE trisector VG Autospec

 Lámpara 100W

 Lámpara UV Arquimed modelo 3UV-34 (longitud de onda 254; 302; 355)

 Microscopio

 Secador Phillips HP-4960

 Termostato

3.1.4 Reactivos

 Acetonitrilo (C2H3N) Merck

 Acetato de etilo (C4H8O2) Merck

 Acetato de plomo (Pb (C2H3O2)4) Merck 30

 Ácido acético (C2H4O2) Merck

 Ácido cítrico (C6H8O7) Merck

 Ácido clorhídrico p.a. (HCl) Merck

 Ácido fosfórico (H3PO4) Merck

 Ácido nítrico (HNO3) Merck

 Ácido pícrico (C6H2OH (NO2)3) Merck

 Ácido sulfúrico (H2SO4) Merck

 Amoniaco (NH3) Merck

 Antrona en medio sulfúrico

 Anhidro acético ((CH3CO)2 O) Merck

 Bórax (Na2B4O7·10H2O) Merck

 Cloroformo p.a. (CHCl3) Merck

 Cloruro de Hierro (FeCl3) Merck

 Diclorometano p.a. (CH2Cl2) Merck

 DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo)

 Etanol (CH3CH2OH) Merck

 Hidróxido de Sodio p.a. (NaOH) Merk

 Licor de Fehling

 Magnesio metálico

 Metanol p.a. (CH3OH) Merck

 N-butanol (H3C-(CH2)3-OH) Merck

 N-hexano p.a. (C6H14) Merck 31

 Reactivo de Dragendorff

 Reactivo de Bouchardat

 Reactivo de Kedde

 Reactivo de Liebermann-Burchard

 Reactivo de Lugol

 Reactivo de Meyer

 Reactivo de Molisch

 Reactivo silicotúngstico

 Sephadex LH-20

 Suero fisiológico

 Sulfato de sodio p.a. (Na2SO3) Merk

 Tolueno (C6H5CH3) Merck

3.1.5 Material de laboratorio

 Agitador

 Algodón

 Arsenal de disección esterilizado

 Cámara de cromatografía (22 cm de alto; 11,5 cm de ancho; 23,5 cm de largo)

 Capilares

 Cápsula de porcelana

 Embudo de decantación

 Embudo Buchner

 Embudos de vástago de tamaño variable 32

 Gavetas plásticas

 Gradillas

 Guantes

 Jeringa

 Micropipetas Eppendorf, volumen variable

 Nueces

 Papel filtro, Advantec MFS, Inc. diámetro 11 cm, N° 2

 Pinzas

 Pipetas graduadas de diferentes volúmenes

 Pipetas Pasteur

 Placas de cromatografía en capa fina

 Placas multipocillo (marca)

 Portaobjeto y cubreobjeto

 Probetas para varios volúmenes

 Sephadex LH-20

 Sonda buco-esofágica

 Soporte universal

 Termómetro

 Tips para micropipetas

 Tubos de ensayo

 Tubos Falcon 50 ml

 Varillas de agitación 33

 Vasos precipitados para varios volúmenes

 Vidrios reloj

3.1.6 Animales de experimentación

 9 gramos de larvas deshidratadas de Artemia salina

 17 ratones Mus musculus de la cepa Rockefeller con un peso corporal de 32,8 a 45,6

gramos

3.2 Método

3.2.1 Recolección del material vegetal

El material vegetal obtenido de Laurelia sempervirens fue recolectado manualmente en abril del año 2010 en la Región de los Lagos, Chile. Luego fueron almacenados y transportados al Laboratorio de Farmacognosia y Toxicología del Instituto de Farmacia de la Universidad

Austral de Chile en Valdivia, conservando un ejemplar de referencia.

3.2.2 Estudios fitoquímicos

El total del material vegetal recolectado fue utilizado para realizar los estudios fitoquímicos de la especie por un lado y los de cromatografía por otro. De esta manera, las partes aéreas frescas de este árbol fueron separadas en dos porciones, la primera porción destinada a ensayos fitoquímicos fue secada (A); mientras que la segunda destinada a estudios cromatográficos, fue macerada y posteriormente fraccionada (B).

La porción (A) fue sometida a secado en una estufa a una temperatura de 60°C durante 3 días, tras los cuales, las hojas desecadas (149,2 gramos) fueron trituradas, conservándose en un envase metálico, desde donde se fueron extrayendo las cantidades necesarias para la realización de los estudios fitoquímicos, con la finalidad de determinar de manera cualitativa la presencia de metabolitos secundarios tales como alcaloides, flavonoides, taninos, saponinas, hidratos de carbono, compuestos con núcleo esteroídeo y heterósidos antraquinónicos (Samuelson, 1999;

Heinrich et al., 2004). 35

Si bien en todos los ensayos se usaron hojas secas, para la reacción de la cianidina se debieron usar hojas frescas, ya que los flavonoides presentes resultaron alterarse al ser expuestos a altas temperaturas.

Los ensayos fitoquímicos realizados se resumen en la tabla 1:

Ensayos Metabolitos

Antrona en medio sulfúrico Todo tipo de azúcares

Reactivo de Molish Azúcares reductores y no reductores

Licor de Fehling Azúcares reductores

Prueba de etanol Gomas y mucílagos

Prueba de espuma Saponinas

S.R. FeCl3 Taninos

Reacción de cianidina Flavonoides

Reacción de Liebermann Núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno

Reacción Keller-Kiliani Heterósidos cardiotónicos (heterósidos con 2-desoxiazúcares)

Reacción de Kedde Heterósidos cardiotónicos

Reacción de Baljet Heterósidos cardiotónicos

Reacción de Bornträger Heterósidos antraquinónicos

Reacción de Shouteten Heterósidos antraquinónicos

Reacción de Murexida Alcaloides derivados de núcleo purina

Reacción de Fluorescencia Alcaloides derivados de núcleo quinoleína

Reacción de Vitali Alcaloides derivados de núcleo purina

Tabla 1 Ensayos fitoquímicos realizados a la droga de L. sempervirens, para la identificación de los principales metabolitos secundarios (Samuelson, 1999; Heinrich et al., 2004). 36

La presencia de estos grupos de metabolitos se confirma mediante cromatografía en capa fina usando las fases móviles y reveladores adecuados para cada tipo de compuesto (Wagner,

2001).

3.2.3 Obtención y fraccionamiento del extracto crudo

3.2.3.1 Obtención del extracto alcohólico

Para extraer y fraccionar los compuestos presentes en la droga, la porción (B) fue triturada

(615,5 gramos), macerándose con 1,3 L de metanol y 5 ml de HCl 12N por 48 horas, trascurrido este tiempo se filtró por algodón, obteniéndose un macerado color verde, el que fue concentrado a sequedad en un rotavapor a presión reducida y 40°C de temperatura, con el fin de evaporar disolventes. Se obtuvo un extracto crudo de 29,8 gramos (4,84% rendimiento).

3.2.3.2 Fraccionamiento del extracto alcohólico

Para realizar el fraccionamiento del extracto crudo obtenido, se usó el método de partición líquido-líquido según el esquema de solventes inmiscibles, donde cada una de las fracciones estará enriquecida con los compuestos solubles en los distintos disolventes orgánicos utilizados.

En este caso, los solventes usados fueron éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo

(Wagner, 2001).

En este procedimiento de fraccionamiento, se resuspendió el total del extracto crudo concentrado con una solución de 100 ml de metanol: agua en una relación 1:1 y una vez resuspendido, se agregó a un embudo de decantación de 250 ml, en el que se fueron agregando los solventes inmiscibles de distinta polaridad, partiendo desde el menos polar, por lo que el 37

orden de uso de disolventes para la extracción fue primero con éter de petróleo, luego con diclorometano y finalmente con acetato de etilo. De esta manera, en las primeras fracciones se extraerá clorofila, mientras que en la fracción acetato de etilo se habrán solubilizado alcaloides, flavonoides y taninos (Sarker et al., 2009).

Para obtener la primera fracción, se agregaron 50 ml de éter de petróleo al embudo de decantación que contenía el extracto crudo resuspendido, se dejó decantar y una vez separadas las fases se extrajo la que contenía el éter de petróleo. Se agregaron nuevamente 50 ml de éter de petróleo, obteniéndose una segunda fracción de este solvente, la que fue recolectada en el mismo matraz de la primera. Se sigue el mismo procedimiento para cada uno de los disolventes, siempre en duplicado. Sin embargo, el último fraccionamiento con acetato de etilo no pudo ser realizado ya que la coloración verde oscura de la solución impedía ver la separación de las fases, recolectándose todo el residuo en un matraz. Se guarda un pequeño volumen de cada una de las fracciones para ser usada como estándar posteriormente y verificar que los compuestos inicialmente hallados, son los mismos que los obtenidos tras los siguientes procedimientos y manipulaciones.

Luego de que las tres fracciones han sido recolectadas y rotuladas, se concentran en rotavapor a presión reducida y 40°C de temperatura, envasándose en frascos de vidrio tapados con papel parafilm.

Tejido foliar fresco

Extracción de pigmentos por metanol (maceración)

Sobrenadante (Pigmentos más restos celulares)

Filtración por algodón Filtrado (Extracto crudo de pigmentos) Concentración a sequedad en rotavapor

Resuspendido 100 ml de solución metanol: agua (1:1)

Partición E.P.

Fase orgánica Fase acuosa (Fracción E.P.) (Refinado)

Partición CH2Cl2

Fase orgánica Fase acuosa (Fracción CH2Cl2) (Refinado).

Partición Aco-Et

Fase orgánica Fase acuosa. (Fracción AcOEt) (Refinado)

3.2.4 Análisis cualitativo de metabolitos presentes en las fracciones

3.2.4.1 Identificación de alcaloides por cromatografía de capa fina en placa

Cromatografía de capa fina en placa (TLC) es una técnica usada para determinar cualitativamente la presencia de metabolitos secundarios, y a partir de eso, analizar cuales se encuentran mayoritariamente y sus polaridades relativas (Wagner, 2001).

Las fracciones obtenidas por la separación líquido-líquido, se resuspendieron en sus respectivos disolventes y se sembraron en placas. Luego, estas placas fueron insertadas en una cámara cromatográfica eluyéndose con cuatro distintas fases móviles. La primera fase móvil utilizada fue tolueno: acetato de etilo 70:20; la segunda cloroformo: metanol: NH3 10%

80:40:1,5; la tercera hexano: acetato de etilo 4:1; y finalmente la cuarta corresponde a cloroformo: metanol 95:5. Las placas fueron reveladas con ayuda del reactivo de Dragendorff

(usado para la precipitación de alcaloides) y observadas bajo luz UV a λ 365nm (Wagner, 2001).

3.2.4.2 Identificación de flavonoides por cromatografía en columna

Para lograr aislar los metabolitos secundarios mayoritarios presentes en la fracción acetato de etilo obtenida por partición líquido-líquido, se usó el método de cromatografía en columna de filtración en gel, utilizándose Sephadex LH-20 lipofílico y disolventes orgánicos. Los compuestos presentes en esta fracción eluirán según su peso molecular de manera decreciente, es decir, primero compuestos de gran tamaño como taninos, luego flavonoides y finalmente compuestos fenólicos pequeños (Marcano y Hasegawa, 2002; Valcarcel y Gómez, 1994). 40

Se utilizó una columna de 5 cm de diámetro interno y 48 cm de altura, que fue empacada con Sephadex LH-20 como fase estacionaria. Una vez empacada la columna, se procedió a limpiarla y equilibrarla con 500 ml de una solución metanol: agua en relación 80:20. Se inyectó la muestra (fracción acetato de etilo) previamente solubilizada en metanol: agua en relación 80:20 y se agregaron 500 ml más de la misma fase móvil, para luego dejarse eluir. Posteriormente, se agregaron lentamente 500 ml de una fase móvil conteniendo solamente metanol y se fueron recolectando las fracciones cada 10 minutos, obteniéndose 34 fracciones de aproximadamente 50 ml cada una. De estas 34 fracciones, desde la número 1 hasta la 19, eluyeron con fase móvil metanol: agua en relación 80:20, mientras que las fracciones 20 a 34 lo hicieron con la segunda fase móvil, que sólo contenía metanol.

Las fracciones obtenidas se analizaron por cromatografía de capa fina en placa usando como fase móvil AcOEt: HOAc: H2O en relación 10:2:3 y se revelaron con el reactivo difenilbórico para observarlas bajo luz ultravioleta a 254 y 365 nm (Wagner, 2001).

Aquellas fracciones que mostraron la presencia de compuestos con Rf similares, fueron agrupadas y concentradas a sequedad en un rotavapor a presión reducida con baño de agua a

40°C. El objetivo de este paso fue lograr el mínimo de fracciones, pero con la mayor cantidad de compuestos presentes, obteniéndose 30 fracciones, a las que se les realizaron nuevas cromatografías en placa para analizar cualitativamente los metabolitos secundarios presentes.

Al realizar la cromatografía de las 30 fracciones finales también se sembraron estándares de los flavonoides rutina y quercetina, con el fin de determinar el origen químico de los flavonoides presentes en la fracción acetato de etilo (gliconas o agliconas). Los flavonoides pueden encontrarse como aglicona o bajo la forma de glicósidos con una o tres unidades de 41

azúcar, generalmente en los carbonos 3 y/o 7 (Martínez et al., 2002). El contenido de glucosa que posean determinará su solubilidad en esta fase móvil usada en la cromatografía y por ende, su migración, como consecuencia un flavonoides unido a glicósidos (rutina) tendrá una menor elución que una aglicona (quercetina), permitiéndonos así, clasificar los flavonoides presentes en la fracción acetato de etilo en base a su contenido de glucosa, entregando información acerca de la posible identidad de éstos.

3.2.4.3 Identificación de flavonoides por cromatografía líquida de alta resolución

La técnica HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) consiste en un tipo de cromatografía en columna, a través de la cual, se separa una mezcla de compuestos en base a las interacciones entre las sustancias analizadas y la columna. Para lograr esta separación, la mezcla de compuestos a analizar pasa por la fase estacionaria (columna formada por partículas con alguna característica química en la superficie), eluyendo con una fase móvil que es bombeada a alta presión. De esta manera, los compuestos irán siendo retenidos según la afinidad con la fase estacionaria y la alta presión ayudará a mejorar la resolución (Sierra et al., 2010).

Existen dos tipos de HPLC, de fase normal y de fase reversa. La cromatografía en fase normal separa los compuestos usando una fase estacionaria polar y una fase móvil apolar. Por otro lado, el HPLC de fase reversa usa una fase estacionaria apolar y una fase móvil de polaridad moderada, donde el tiempo de retención es mayor para las moléculas apolares; posibilitando la separación de compuestos polares, apolares y moléculas ionizables, haciéndola una técnica versátil y recomendable para la separación de muestras con variedad de compuestos. 42

La concentración de las fases móviles puede ir variando de manera programada en gradiente según las características de la mezcla a analizar, favoreciendo su elución, separación y análisis en tiempos más reducidos; convirtiendo al método de HPLC de fase reversa con gradiente en un proceso rápido y efectivo, que facilitará la identificación de la amplia gama de compuestos presentes en el extracto de AcOEt (Sierra et al., 2010; Walsh, 2007). Esto resultados serán posteriormente complementados con las técnicas de espectrofotometría y HPLC con detector de espectrometría de masa.

Para llevar a cabo el análisis de la fracción, se inyectaron 10 µl de la muestra acetato de etilo en relación 1:1 con agua, en un cromatógrafo líquido de alta resolución con detector de arreglo de diodos. Para la fase móvil se seleccionó un método de gradiente, consistente en 0,1% trifluoroacético en agua (fase A) y metanol (fase B), el que siguió el flujo indicado en la tabla 2:

Fase Móvil / Tiempo Minuto 0 Minuto 10 Minuto 45 Minuto 60

Fase móvil A TFA 92 80 75 0

Fase móvil B metanol 8 20 25 100

El flujo fue de 1 ml/min y el tiempo de la corrida fue 60 minutos. La detección de los compuestos se hizo a tres diferentes longitudes de onda: 364 nm, 265 nm y 253 nm.

3.2.4.3.1 Análisis espectrofotométrico UV-V

Los picos de los compuestos mayoritarios obtenidos por cromatografía líquida de alta resolución realizada a la fracción acetato de etilo, fueron analizados en un espectrofotómetro ultravioleta – visible para obtener los espectros de absorbancia cada uno, y determinar la posible presencia de flavonoides ligados a esas bandas de absorción, dado que los espectros de estos metabolitos secundarios muestran dos bandas características: la banda I, de mayor longitud de onda en el rango 300-390 nm asociada con la funcionalidad cinamoílo, y la banda II, entre 250-

280 nm debida al anillo aromático (figura 3) (Martínez et al., 2002).

3.2.4.3.2 Cromatografía líquida de alta resolución con detector de espectrometría de masas

Para obtener una mejor separación de los metabolitos se usó cromatografía líquida de alta resolución con detector de espectrometría de masas (HPLC-MS), técnica usada en el análisis y aislamiento de metabolitos a partir de extractos naturales complejos, ya que al comparar los espectros de masa y los tiempos de retención de las muestras con estándares se logran buenos resultados en tiempos relativamente pequeños, obteniéndose información de la estructura de los compuestos mayoritarios (Sánchez-Rabanada et al., 2003).

Para ejecutar este método se disolvieron 20 µl de la fracción acetato de etilo en MeOH: H2O en relación 1:1 hasta alcanzar una concentración aproximada de 5 mg/ml y luego, fue inyectada en el HPLC-MS. Los compuestos fueron monitorizados a 250 nm y en un espectro desde 200 a 600 nm. El análisis mediante HPLC fue realizado usando un sistema de gradiente consistente en 0,1 % TFA acido en agua (A) y metanol (B) de la siguiente manera: A 44

90% a 70% después de 10 minutos; seguido de 70% a 40% desde el minuto 10 hasta el minuto

40; a 0 desde 40 a 50 minutos. El flujo fue de 1 ml/min.

3.2.5 Determinación de capacidad antioxidante

La determinación de la capacidad antioxidante de las partes aéreas de este árbol fue mediante la evaluación de la capacidad atrapadora de radicales libres, utilizando el radical 2,2- difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) de color violeta, que absorbe a 517 nm. La reducción y estabilización de este radical por los antioxidantes da lugar a la decoloración de éste, produciendo una disminución de la absorbancia, la que se puede medir a la longitud de onda antes mencionada. El grado de decoloración de la solución de DPPH indicará la eficiencia atrapadora de los compuestos presentes en las hojas secas de L. sempervirens (Brand-Williams et al., 1995).

Para realizar esta determinación se preparó una curva de calibración a partir de estándares de ácido ascórbico de concentraciones 4, 6 y 10 µg/ml, se tomaron 750 µl de cada uno de los estándares y se les agregaron 1,5 ml de solución DPPH (20 mg/L) a cada uno y se esperaron 10 minutos antes de comenzar la lectura (tabla 3) (Sharma, 2010).

Concentración % Inhibición (*)

Ácido ascórbico10 µg/ml 68.87 ± 0.55

Ácido ascórbico 6 µg/ml 39.9 ± 2.66

Ácido ascórbico 4 µg/ml 25.4 ± 1.46

(*) Promedio de tres medidas ± desviación estándar.

Tabla 3: Porcentaje de inhibición de DPPH por estándares de ácido ascórbico a distinta concentración. 45

El blanco fue preparado con 750 µl de metanol y 1,5 ml de solución de DPPH (20 mg/L).

La absorbancia se leyó tras 10 minutos de reposo.

La muestra de Laurelia sempervirens a evaluar fue preparada a partir de 25 mg de hojas secas pulverizadas, a las que se les agregó 25 ml de metanol, resultando una solución de color amarillo verdoso de 1 mg/ml de concentración. Se tomaron 750 µl de esta solución, a los que se les agregaron 1,5 ml de solución de DPPH (20 mg/L). Se dejó reposar la mezcla por 10 minutos y se midió la absorbancia a 517 nm (Molyneux, 2004). El porcentaje de inhibición se calculó de la siguiente manera (Sharma, 2010):

% de Inhibición = [1-(absorbancia de la muestra/ absorbancia del blanco)] x 100

3.2.6 Determinación de la toxicidad aguda de los extractos de L. sempervirens

3.2.6.1 Determinación de concentración letal media en Artemia salina

Para determinar la concentración letal media del material vegetal de L. sempervirens, se usó el método de toxicidad aguda en un invertebrado llamado Artemia salina (figura 7). A este invertebrado se le administran distintas concentraciones de un extracto, y se mide la cantidad de nauplios muertos tras 24 horas de exposición, obteniéndose el valor de la concentración letal media (CL50), es decir, la concentración a la cual el 50% de los nauplios está muerto.

Para la eclosión de los huevos de Artemia salina, y desarrollo de estos individuos, se agregaron 500 ml de agua destilada en un vaso precipitado, al que se le incluyeron 9 gramos de los quistes de Artemia salina deshidratados (figura 6), conteniendo las condiciones de salinidad necesarias para su eclosión. Se utilizó un flujo constante de aire e iluminación con una lámpara de 100 w, manteniéndolos con un fotoperiodo 12:12 horas luz: oscuridad a una temperatura de 28

ºC con ayuda de un termostato y sometiéndolos a una agitación vigorosa por medio de una aireación continua del agua en el que estaban contenidos durante 48 horas con ayuda de una bomba de oxígeno (Ruiz, 2008).

Figura 6: Morfología de un nauplio de Figura 7: Quistes de A. salina A. salina deshidratados

Se preparó una infusión de hojas secas y pulverizadas de L. sempervirens, con una concentración de 1 mg/ml. Esta solución fue filtrada por algodón y a partir de ella, se fueron extrayendo 5; 0,5 y 0,05 ml, las que se diluyeron con agua destilada, para obtener concentraciones iguales a 1000, 100 y 10 µg/ml (ppm) respectivamente (Logarto et al., 2001).

Para este estudio, se usaron placas multipocillo y en cada pocillo se fueron agregando 10 individuos de Artemia salina y luego, se separaron en 3 grupos, donde cada grupo contenía 5 ml 47

de una de las soluciones de L. sempervirens preparadas anteriormente, de manera que cada pocillo contuviera una concentración diferente. Adicionalmente, un cuarto grupo contenía el blanco, en el cual se incluyeron 10 individuos de Artemia salina y luego se agregaron 5 ml de agua destilada. Se realizaron 3 réplicas por concentración, tal como se describe en la tabla 4.

Grupo N° pocillo Número de nauplios Infusión Concentración (µg/ml) 1 10 Laurelia sempervirens 10

1 2 10 Laurelia sempervirens 10

3 10 Laurelia sempervirens 10 4 10 Laurelia sempervirens 100 2 5 10 Laurelia sempervirens 100

6 10 Laurelia sempervirens 100

7 10 Laurelia sempervirens 1000

3 8 10 Laurelia sempervirens 1000 9 10 Laurelia sempervirens 1000 10 10 Agua destilada -

4 11 10 Agua destilada - 12 10 Agua destilada -

Tabla 4: Concentración de la infusión de hojas de L. sempervirens administrada a cada uno de los grupos de nauplios sometidos al ensayo de toxicidad aguda.

Se observaron tras 12 horas, registrando el número de individuos muertos, y los cambios observables en la movilidad. Los animales eran observados con lupa considerándolos muertos si no había movimiento. No se administró alimento alguno a los nauplios. Este ensayo se repitió 3 veces con el fin de evitar dentro de los resultados posibles falsos positivos debido a factores ambientales. (Repetto, 1997; Pino, 2010; McLaughlin y Rogers, 1998). 48

Se calcula la concentración letal media (CL50) por medio de una curva dosis-respuesta cuantal (Respuesta todo o nada) (Repetto, 1997) y se midió el grado de toxicidad del extracto en función del rango en que se encontraron los valores de CL50 de acuerdo con las categorías descritas en el anexo 1 (Fernández-Calienes et al., 2009).

3.2.6.2 Determinación de dosis letal media

Para determinar la dosis letal media o DL50, se usaron ratones Mus musculus de la cepa

Rockefeller, los que fueron sometidos al método alternativo de toxicidad aguda denominado “up and down”. Se eligió una dosis inicial, de acuerdo con la toxicidad teórica o prevista para esta sustancia en estudio, indicada en la hipótesis.

Para este ensayo, se usaron 17 ratones separados en 4 grupos, donde cada uno de los grupos contenía 5 ratones machos de aproximadamente 30 gramos, a excepción del grupo 4, que contenía solo 2 animales. A los primeros 3 grupos se les administró una infusión de Laurelia sempervirens por vía oral a diferentes dosis (1600, 3200 y 6400 mg/Kg). Al cuarto grupo en cambio, se le administraron 0,4 ml de blanco preparado solo con agua potable (anexo 2)

(Arencibia et al., 2009). El esquema de la administración se encuentra resumido en la tabla 5:

Grupo Número de ratones Extracto Concentración (g/ml) Dosis (mg/Kg) 1 5 Laurelia sempervirens 0,15 1600

2 5 Laurelia sempervirens 0,15 3200

3 5 Laurelia sempervirens 0,15 6400

4 2 Agua potable 0,15 -

Tabla 5: Dosis del extracto de Laurelia sempervirens administrado a cada uno de los grupos de ratones usados en el ensayo de toxicidad aguda oral. 49

Las dosis de la infusión fueron administradas vía oral utilizando para ello una jeringa con sonda buco-esofágica de polietileno (Walum, 1998). Una vez aplicadas las dosis, se observaron los animales en busca de la letalidad durante 24 horas en los siguientes intervalos de tiempo: a los

10 min, 30 min, 1 h, 6 h, 24 h. Tras registrar las respuestas positivas (animales muertos), se elaboró una curva dosis-respuesta cuantal (Respuesta todo o nada) para medir el grado de toxicidad de la infusión en función del rango en que se encontraron los valores de DL50 descritos en el anexo 3 (Repetto, 1997; OECD, 2001).

Aquellos animales que sobrevivieron, fueron observados a intervalos diarios durante una semana, para evaluar la existencia de alguna reacción tóxica posterior. Se fueron registrando los cambios físicos y conductuales durante el periodo del estudio (7 días), según los parámetros indicados en el anexo 4. Al término del ensayo (7 días), se sacrificaron los animales por dislocación cervical y se sometieron a necropsia para observar sus órganos internos macroscópicamente y visualizar la presencia o ausencia de procesos patológicos que no fueron visibles externamente (Repetto, 1997; Walum, 1998), usando los órganos del cuarto grupo de ratones como control. Las observaciones fueron registradas en una pauta de observación ilustrada en el anexo 5.

Los animales fueron mantenidos en gavetas plásticas con agua y alimento ad libitum

(dieta estándar de pellet), en un ambiente con una temperatura controlada de 20 ± 2 °C, con un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h, cuyas horas de luz correspondían al lapso comprendido entre las 07:30 y las 19:30 horas. La experimentación se realizó durante el fotoperiodo de horas de luz.

Previo al inicio de la experimentación se sometió a los animales a 2 horas de ayuno y sin agua, manteniéndolos en gavetas especiales. Luego de la administración, eran devueltos a sus gavetas. 50

Todos ellos fueron pesados cada 2 días (anexo 6) (Navarro et al., 2010; Repetto, 1997; Walum,

1998).

La disposición de los residuos animales se realizó de acuerdo a las especificaciones detalladas en el “manual de procedimientos para el manejo de residuos de la Universidad Austral de Chile”. Por lo tanto, una vez sacrificados los animales, tanto éstos como las camas usadas fueron dispuestos en bolsas plásticas gruesas de fácil manipulación, llenándose hasta ¾ de su capacidad sin exceder los 20 Kg de peso y sellada completamente. El depósito de estas bolsas se hizo en contenedores apropiados de acuerdo a las especificaciones del manual antes señalado y se solicitó el retiro diario de los residuos a la unidad responsable, para no sobrepasar las 24 horas de acopio.

4 Resultados

4.1 Identificación de metabolitos secundarios en hojas de Laurelia sempervirens

4.1.1 Ensayos fitoquímicos

Se realizó una batería de ensayos fitoquímicos al material vegetal correspondiente a hojas secas y pulverizadas de L. sempervirens, entregando resultados positivos para la presencia de flavonoides y alcaloides.

Los resultados se resumen en la tabla 6:

Ensayos Metabolitos Resultado Antrona en medio sulfúrico Todo tipo de azúcares - Reactivo de Molish Azúcares reductores y no reductores - Licor de Fehling Azúcares reductores - Prueba de etanol Gomas y mucílagos - Prueba de espuma Saponinas -

S.R. FeCl3 Taninos - Reacción de cianidina Flavonoides + Reacción de Liebermann Núcleo ciclopentanoperhidrofenantreno - Heterósidos cardiotónicos Reacción Keller-Kiliani - (heterósidos con 2-desoxiazúcares) Reacción de Kedde Heterósidos cardiotónicos - Reacción de Baljet Heterósidos cardiotónicos - Reacción de Bornträger Heterósidos antraquinónicos - Reacción de Shouteten Heterósidos antraquinónicos - Reacción de Dragendorff Alcaloides + Reacción de Bouchardat Alcaloides + Reacción de lugol Alcaloides + Reacción de Meyer Alcaloides + Reacción de Murexida Alcaloides derivados de núcleo purina - Reacción de fluorescencia Alcaloides derivados de núcleo quinoleína - Reacción de Vitali Alcaloides derivados de núcleo purina - Tabla 6: Resumen de resultados de los ensayos fitoquímicos realizados a hojas secas de L. sempervirens.

4.1.2 Identificación de metabolitos secundarios por cromatografía de capa fina en placa

A través de cromatografía de capa fina en placa, los metabolitos secundarios presentes en las fracciones obtenidas tras la partición líquido-líquido fueron separados en base a sus polaridades, usándose para ello la solución hexano: acetato de etilo 4:1 como fase móvil y revelándose con el reactivo de Dragendorff, indicando la presencia de alcaloides por medio de la precipitación de color naranjo de los compuestos nitrogenados tal como se observa en la figura 8:

Figura 8: Cromatografía de capa fina en placa obtenida de las fracciones de EP, CH2CL2,

AcOEt, respectivamente, usando una solución de CH3Cl: MeOH 95:5 como fase móvil y reactivo de Dragendorff como revelador.

La cromatografía de capa fina en placa también se usó para estudiar los metabolitos secundarios presentes en cada una de las 30 fracciones obtenidas a partir de cromatografía en columna Sephadex LH-20. En este caso se uso como fase móvil una solución de AcOEt: HOAc:

H2O (10: 2: 3) y difenilbórico como revelador, obteniéndose los cromatogramas de las figuras 9,

10 y 11.

Al observar los cromatogramas de las figuras 9, 10 y 11 se visualizan manchas de colores azules, verde, amarillo y naranjo, lo que se corresponde con lo descrito en la bibliografía para la coloración de flavonoides bajo las mismas condiciones. A partir de estos resultados se puede indicar la presencia de flavonoides (flavonoles y flavonas) y derivados de ácido cinámico

(compuestos fenólicos) en las sub-fracciones de acetato de etilo 20 a 28, tal como se resume en la tabla 7:

Tipo Ejemplos Coloración de manchas Fracción con cromatograma flavonoides bajo UV - 365 nm similar

Flavonoles Quercetina, myrcetina y Naranjo – amarillo 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, sus glicósidos 24, 25, 26, 27, 28

Kaempferol, Amarillo – verde 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, isoramentina y sus 23, 24, 26, 27 glicósidos

Flavonas Luteolina y sus Naranjo 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20, 21, glicósidos 24, 25, 26, 27, 28

Apigenina y sus Amarillo – verde 12, 13, 14, 16, 17, 19, 20, 22, glicósidos 23, 24, 26, 27

Derivados de Compuestos fenólicos Azul 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, ácido 29, 30 cinámico

Al realizar las cromatografías de estas fracciones, se incluyeron estándares de quercetina

(aglicona) y rutina (glicósido) (figura 11), para comparar la migración de estos dos flavonoides con los que están presentes en la fracción de acetato de etilo y determinar si los flavonoides de las hojas de L. sempervirens poseen azúcares en su estructura. Al comparar los cromatogramas se observa que las fracciones 13 a 17 muestran un desplazamiento similar a rutina, indicando la presencia de flavonoides con azúcares unidos en su estructura (glicósidos) (Martínez et al.,

2002). 58

4.1.3 Identificación de flavonoides por cromatografía líquida de alta resolución

La fracción de acetato de etilo de concentración 1mg/ml, obtenida tras la separación líquido-líquido del extracto crudo, fue sometida a análisis por HPLC de fase reversa, en donde la fase móvil fue variando su gradiente, lográndose la separación de los metabolitos secundarios presentes en este extracto, según su polaridad. Como resultado, cada pico en la figura 12 representa a los compuestos mayoritarios en la fracción acetato de etilo, eluyendo la mayor cantidad de los metabolitos de esta fracción entre los 15 y los 25 minutos de la corrida.

Figura 12: Cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa de una muestra de 10 μl de la fracción AcOEt, utilizando método de gradiente, canales de absorción 253 nm (azul), 265nm

(verde), 365nm (rojo) y tiempo de corrida de 40 min.

Esta muestra de la fracción de acetato de etilo fue estudiada por cromatografía líquida de alta resolución con detector de arreglo de diodos y cromatografía líquida de alta resolución con detector ultravioleta en la Universidad de Talca, entregando los cromatogramas ilustrados en las figuras 13 y 14 respectivamente:

Figura 13: Cromatografía líquida de alta resolución con detector de arreglo de diodos (HPLC-

DAD) obtenido en la Universidad de Talca, de una muestra de 10 μl de la fracción acetato de etilo, en un tiempo de corrida de 45 min.

Los resultados del análisis de los cromatogramas de las figuras 12, 13 y 14 se indican en la tabla 9, junto con el análisis de la cromatografía líquida de alta resolución con detector de espectrometría en masa realizada a esta misma muestra. 61

4.1.3.1 Identificación de flavonoides por análisis espectrofotométrico UV-Vis

A los picos de los compuestos mayoritarios obtenidos del análisis por HPLC, se les realizó un barrido desde los 200 a los 600 nm en el espectrofotómetro UV-Vis para identificar sus espectros, máximos de absorbancia y la posible presencia de flavonoides responsable de ellos, sabiendo que los flavonoides poseen dos bandas características, una de mayor longitud de onda en el rango 300-390 nm y la segunda, entre 250-280 nm (Martínez et al., 2002). Los resultados se indican en la tabla 8:

Pico Rt (min) Pico de longitud de onda (nm) Posible metabolito secundario 1 17,12 352, 260h, 255 Flavonoide 2 18,83 239 - 3 19,23 336, 290h, 260h, 231 - 4 19,92 344, 265 Flavonoide 5 20,59 352, 265h, 253 Flavonoide 6 22,83 358, 287, 240h - 7 25,33 352, 255 Flavonoide 8 26,27 300, 280, 217 - 9 28,16 344, 255h, 228 - 10 28,45 349, 260h, 253 Flavonoide 11 28,83 346, 265 Flavonoide 12 29,28 352, 290h, 255 Flavonoide 13 33,57 346, 285h, 265 Flavonoide 14 34,29 352, 300h, 253 Flavonoide 15 36,64 313, 269, 234, 209 - Tabla 8: Determinación de la presencia de flavonoides a partir del análisis de los espectros obtenidos de un barrido de 200 a 600 nm a los compuestos mayoritarios identificados por el análisis HPLC de la fracción acetato de etilo

4.1.3.2 Cromatografía líquida de alta resolución con detector de espectrometría de masas

Tras la separación de los metabolitos secundarios presentes en la fracción de acetato de etilo por medio de HPLC, se realizó una cromatografía líquida de alta resolución con detector de espectrometría de masas a la misma muestra, obteniéndose los espectros de masa de las estructuras relacionadas con los compuestos mayoritarios. Estos espectros fueron comparados con los cromatogramas obtenidos por HPLC en fase reversa, HPLC-UV y HPLC-DAD

(ilustradas en las figuras 12, 13 y 14), entregando información acerca de la identidad de los flavonoides presentes en esta fracción de acetato de etilo por medio de la co-inyección de estándares de flavonoides y la comparación de sus tiempos de retención (tabla 10). Esta comparación permitió identificar la presencia de dos flavonoides: quercetina, de peso molecular igual a 302 g/mol (figura 15); y luteolina, de peso molecular igual a 286 g/mol (figura 16).

Retención Pico PM [ M+H] + e iones Identidad tentativa (min)

1 27.47 734 733, 479, 365-18= 347-94= 253 C15H10O4 = 254 301: Quercetina (302) 2 33.68 724 723 – 114 = 609 – 308 = 301 308 = 162+146 ramnosa-hexosa 707-114 = 593 – 308 =285, 479 285: luteolina (286) 3 39.09 708 479: 385, 291 308 = 162+146 ramnosa-hexosa 737-114 = 623 – 114 = 479, 461, 365 4 40.04 738 C15H10O4 = 254 479: 385, 291; 365-18= 347, 253

5 58.15 328 327-18=309, 291-18=291, 229 C17H12O7 = 328

6 59.66 374 373, 351, 273 693-214=479, 385-94=291-94=197 7 69.24 694 693: 599, 505, 411;

Tabla 9: Resumen de los resultados obtenidos en los métodos de HPLC, HPLC-UV, HPLC-MS y HPLC-DAD a los que se sometió la muestra de la fracción de acetato de etilo. 63

Figura 15: Molécula de quercetina (PM: 302 g/mol), flavonoide identificado en una fracción de acetato de etilo extraído de hojas frescas de L. sempervirens

Figura 16: Molécula de luteolina (PM: 286 g/mol), flavonoide identificado en una fracción de acetato de etilo extraído de hojas frescas de L. sempervirens 64

4.2 Evaluación del efecto antioxidante

Para evaluar el efecto antioxidante de L. sempervirens se usó el método DPPH en un extracto metanólico de las hojas secas de esta especie a una concentración de 1 mg/ml. El método DPPH permite calcular la capacidad atrapadora de radicales libre, tras la medición en un espectrofotómetro, a una longitud de onda de 517 nm, de la decoloración del radical DPPH (de color púrpura). La decoloración del radical ocurre al ser reducido y estabilizado por los antioxidantes presentes en la muestra, produciendo una disminución de la absorbancia, la que se puede medir a la longitud de onda antes mencionada (Brand-Williams et al., 1995).

Al evaluar el extracto metanólico se obtuvo una lectura de su absorbancia de 0,0897 ±

0,0943, lo que se traduce en un porcentaje de captación de radicales libres igual a 71,35 % (tabla

10).

Extracto Concentración Inhibición radical DPPH (%) (*) Extracto metanólico L. sempervirens 1 mg/ml 71,35 ± 0,297

Ácido ascórbico 10 µg/ml 68.87 ± 0.550

Ácido ascórbico 6 µg/ml 39.9 ± 2.660

Ácido ascórbico 4 µg/ml 25.4 ± 1.460

(*) Promedio de tres medidas ± desviación estándar.

El porcentaje de inhibición de radicales libres observado en el extracto de L. sempervirens, indica que este extracto posee una importante actividad antioxidante, ya que a una concentración de 1mg/ml ha inhibido más del 50 por ciento del radical DPPH (Palomo et al.,

2009), mostrando además, una capacidad antioxidante comparable al estándar de ácido ascórbico de 10 µg/ml (68,87), un antioxidante de origen natural de gran pureza, indicando que el extracto metanólico de esta especie podría ser usado como fuente natural de antioxidantes. 66

4.3 Determinación de la toxicidad aguda de los extractos de L. sempervirens

4.3.1 Determinación de concentración letal media en Artemia salina

Para determinar la toxicidad de una infusión de hojas secas de L. sempervirens, se usó el método de toxicidad aguda en Artemia salina. A este invertebrado, se le administraron concentraciones iguales a 10, 100 y 1000 ppm de esta infusión, y tras 24 horas de exposición, se contabilizaron los nauplios muertos (respuesta positiva) (tabla 12).

Concentración N° de individuos N° de individuos con Porcentaje de (ppm) expuestos respuesta positiva respuesta (%)

10 30 0 0

100 30 4 13,3

1000 30 10 33,3

Control 30 0 0

Tabla 11: Porcentaje de letalidad observada en nauplios de Artemia salina según la concentración de la infusión de L. sempervirens, tras 24 horas de exposición al ensayo de toxicidad.

Para calcular la CL50 de cada una de las concentraciones, se realizó una curva dosis- respuesta cuantal usando los datos entregados en la tabla 12 (gráfico 1). Estos resultados no permiten el cálculo de una CL50 puntual debido a que no se observó la muerte del 50% de los nauplios en este ensayo y una extrapolación de estos resultados solo entregaría una valor estimado, pero no exacto (Repetto, 1997). Sin embargo, estos resultados si permiten evaluar el grado de toxicidad de estas infusiones, ya que al encontrarse el valor de la CL50 en un rango 67

mayor de 1000 ppm, es clasificada como una droga no tóxica (anexo 1) (Fernández-Calienes et al., 2009).

Gráfico 1: Determinación de la CL50 a partir de infusioness de partes aéreas de L. sempervirens tras el ensayo de toxicidad aguda en nauplios de Artemia salina. 68

4.3.2 Determinación de dosis letal media en ratones Mus musculus

Para determinar la toxicidad de una infusión de hojas secas de L. sempervirens, se calculó la dosis letal media DL50 usando el método de toxicidad aguda oral en 17 ratones Mus musculus de la cepa Rockefeller, a los que se les administró esta droga en dosis iguales a 1200, 3600 y

6400 mg/Kg de peso. Estos ratones fueron observados durante 7 días posteriores a su exposición a la droga, no observándose mortalidad en ninguno de los 17 animales ensayados, de acuerdo a esto, no se permite una estimación puntual de la DL50. Sin embargo, si es posible evaluar el grado de toxicidad de esta droga en ratones de la cepa Rockefeller, siendo clasificada como sin toxicidad aguda (sin prejuzgar sus efectos crónicos), dado que su DL50 es mayor a 5000 mg/Kg de peso (anexo 3) (Repetto, 1997).

Al evaluar el comportamiento de los animales sometidos a este ensayo, ninguno mostró cambios significativos en el consumo de agua, alimento, evolución del peso corporal, ni cambios en los perfiles de comportamiento, respecto al grupo control. Tampoco se observaron otros signos de toxicidad.

En la necropsia efectuada al cabo del período de estudio no se observaron alteraciones de tamaño, tono, o presencia de petequias hemorrágicas en el análisis macroscópico de corazón, pulmones, riñones, bazo, estómago y pared peritoneal de los animales tratados. Sin embargo, la observación macroscópica del hígado, mostró un incremento proporcional a la dosis administrada.

5 Discusión

Las plantas nativas de Chile presentan un gran interés por el uso medicinal que la cultura mapuche les ha dado, ejemplo de lo anterior es la gran cantidad de estudios enfocados en aislar e identificar los compuestos presentes en ellas. Una de esas plantas a las que esta cultura le atribuye propiedades terapéuticas es Laurelia sempervirens, un árbol perteneciente a la familia

Monimiaceae. Esta familia se caracteriza por la presencia de alcaloides y flavonoides (Arango,

2008).

Por medio de ensayos fitoquímicos a las partes aéreas de Laurelia sempervirens (tabla 6), se comprobó de manera cualitativa la presencia flavonoides y alcaloides (Samuelson, 1999;

Heinrich et al., 2004), cuya presencia fue reafirmada al realizar cromatografía de capa fina en placa a las fracciones obtenidas por medio de la separación líquido-líquido del extracto crudo. En el caso de los alcaloides, se realizó esta cromatografía en las fracciones de éter de petróleo, diclorometano y acetato de etilo, usando como fases móviles hexano: acetato de etilo 4:1 y cloroformo:metanol 95:5 y el reactivo Dragendorff como revelador, causando la precipitación de los alcaloides y mostrando su presencia en mayor cantidad en las fracciones de diclorometano y acetato de etilo (figura 8). Para demostrar la presencia de flavonoides por esta técnica, se usaron las fracciones provenientes de la separación por cromatografía en columna de filtración en gel del extracto acetato de etilo, AcOEt:HOAc:H2O (10:2:3) como solvente y el reactivo difenilbórico como revelador, para luego observarse bajo luz UV a una longitud de onda igual a 365 nm, detectándose la presencia de manchas anaranjadas, amarillas y verdes en las fracciones desde la

11 a la 30 (figuras 9, 10 y 11). Estos resultados reafirman la presencia de flavonoides identificados mediante reacciones fitoquímicas (tabla 6). 70

Al usar el método de cromatografía líquida de alta resolución, como método de análisis cualitativo de los metabolitos presentes en la fracción de acetato de etilo, se obtuvieron picos que correspondían a los compuestos mayoritarios (figura 12), los que al ser estudiados por espectrofotometría UV-V entregaron máximos de absorbancias con longitudes de ondas coincidentes a las de las bandas características de flavonoides, una en el rango de 300 – 390 nm, y la segunda entre los 250 – 280 nm (Martínez et al., 2002). Según estas características, 9 de los

15 picos estudiados estarían indicando la presencia de flavonoides (tabla 8).

Con el objetivo de determinar la identidad de los flavonoides presentes en la fracción de acetato de etilo, se realizaron estudios en cromatografía líquida de alta resolución, usando detectores ultravioleta (figura 13), de arreglo de diodo (figura 14) y de espectrometría de masas.

Al comparar los picos y tiempos de retención obtenidos por estos estudios por medio de co- inyección de estándares, se identificó la presencia de dos flavonoides: quercetina, de peso molecular igual a 302 g/mol (figura 15), y luteolina, de peso molecular igual a 286 g/mol (figura

16) (tabla 9). La presencia de quercetina en Laurelia sempervirens fue descrita anteriormente

(Carvajal, 2005), mientras que luteolina no ha sido reportada para este especie, siendo esta la primera referencia al respecto.

El interés por identificar flavonoides en plantas utilizadas en medicina tradicional, se debe a la variedad de propiedades farmacológicas que estos compuestos poseen. Dentro de las propiedades podemos destacar la capacidad antiinflamatoria y diurética que estos metabolitos han demostrado (Villar, 1999), lo que coincide con el uso medicinal dado a las infusiones de hojas de este árbol. Además, los flavonoides identificados en la fracción de acetato de etilo han demostrado poseer otras propiedades terapéuticas. Se ha comprobado que quercetina posee 71

propiedades antitumorales (Hirpara et al., 2009; Wei et al., 1994) y antitrombótica (Hertog et al.,

1992; Martínez et al., 2002), mientras que luteolina a demostrado poseer propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antialérgicas (Kimata et al., 2000) y modulador de la activación microgrial (Dirscherl1 et al., 2010; Theoharides, 2009).

Por otro lado, la presencia de flavonoides, un tipo de polifenoles, indica que las hojas de este árbol presentan una actividad antioxidante, dado que la estructura química de estos metabolitos posee anillos aromáticos y grupos hidroxilo que permiten que se deslocalicen los electrones, pudiendo reaccionar con radicales libres y formar un radical intermedio más estable y menos reactivo (figura 3) (Ugartondo, 2009). Para calcular esta capacidad antioxidante, se usó el método DPPH en un extracto metanólico de la droga con una concentración de 1 mg/ml, obteniéndose un porcentaje de inhibición del radicales DPPH de 71,35% (tabla 10). Este porcentaje indica que este extracto posee una importante actividad antioxidante, ya que a una concentración de 1mg/ml ha inhibido más del cincuenta por ciento (50%) del radical DPPH

(Palomo et al., 2009), mostrando además, una capacidad antioxidante comparable al estándar de

ácido ascórbico de 10 µg/ml (68,87%), un antioxidante de origen natural de gran pureza. Estos resultados convierten a esta planta en una fuente natural de compuestos antioxidantes y en una alternativa válida para la búsqueda de antioxidantes de origen natural, los que tendrían usos terapéuticos en la prevención de enfermedades cardiovasculares, neurológicas, autoinmunes, oculares, pulmonares, e incluso, cáncer, al prevenir el estrés oxidativo en células animales

(Ugartondo, 2009). 72

La evaluación de la toxicidad de las infusiones preparadas a partir de esta droga, fue realizada usando ensayos de toxicidad aguda en dos especies de animales: camarones (Artemia salina) y ratones (cepa Rockefeller).

Para realizar el ensayo de toxicidad aguda, se usaron 120 larvas desecadas de Artemia salina e infusiones preparadas de hojas secas y trituradas de L. sempervirens a diferentes concentraciones (10, 100 y 1000 ppm), considerándose tóxicas cuando la dosis letal media fuera de 1000 ppm o menor (Fernández-Calienes et al., 2009). En nuestras condiciones de trabajo, no puede reportarse un valor de CL50 puntual al no observarse la muerte del 50% de los nauplios en el ensayo. Sin embargo, estos resultados si permiten evaluar el grado de toxicidad de estas infusiones, ya que al encontrarse el valor de CL50 en un rango mayor de 1000 ppm, es clasificada como una droga no tóxica (anexo 1) (Fernández-Calienes et al., 2009).

En el ensayo de toxicidad aguda oral por el método “up and down”, se usaron ratones Mus musculus de la cepa Rockefeller, a los que se les administró una infusión de la droga a diferentes dosis (1200, 3600 y 6400 mg/Kg de peso). Estos ratones fueron observados durante 7 días posteriores a su exposición a la droga, no observándose cambios significativos en el consumo de agua, alimento y evolución del peso corporal (anexo 6), ni cambios en los perfiles de comportamiento (anexo 4), respecto al grupo control. No presentaron convulsiones o incoordinación motora, ni se detectó diarrea ni piloerección. En la necropsia efectuada al cabo del período de estudio no se observaron alteraciones de tamaño, tono, o presencia de petequias hemorrágicas en el análisis macroscópico de corazón, pulmones, riñones, bazo, estómago y pared peritoneal de los animales tratados. Tampoco se observaron otros signos de toxicidad, ni de mortalidad, de acuerdo a esto, no se permite una estimación puntual de la DL50. Sin embargo, si 73

es posible evaluar el grado de toxicidad de esta droga en ratones de la cepa Rockefeller, siendo clasificada como sin toxicidad aguda (sin prejuzgar sus efectos crónicos), dado que su DL50 es mayor a 5000 mg/Kg de peso (anexo 3) (Repetto, 1997).

Al realizar ensayos de toxicidad aguda en una infusión de hojas de L. sempervirens se ha logrado demostrar su inocuidad. Sin embargo, no se ha comprobado su seguridad en la administración en humanos, ya que se debe tener en cuenta que las plantas medicinales consisten en sistemas con una composición generalmente compleja que incluye: a) componentes farmacológicamente activos, b) componentes coadyuvantes, que modulan la actividad de los principios activos, e incluso la refuerzan, c) componentes inertes (matriz) y d) componentes potencialmente alergénicos o tóxicos (Cañigueral et al., 2003). Como consecuencia de lo anterior, el paciente al que se le administre una infusión de L. sempervirens consumirá todos los compuestos presentes en ella, pudiendo presentar efectos adversos a compuestos aún no identificados en esta especie, o bien, otras actividades biológicas no deseadas ligadas a los componentes coadyuvantes. Esto demuestra la necesidad de la realización de nuevos estudios para comprobar la calidad, seguridad y eficacia de L. sempervirens al ser administrada como un sistema complejo de componentes.

La importancia de demostrar la seguridad, eficacia y calidad de la droga de L. sempervirens radica en la variedad de propiedades farmacológicas descritas para sus principios activos, que le permitirían ser usada como fitofármaco en el tratamiento de alergias (Kimata et al., 2000) e inflamaciones (Dirscherl1 et al., 2010; Theoharides, 2009).

Por otro lado, con la identificación de los principios activos presentes en la droga de L. sempervirens, se pueden sintetizar las estructuras de aquellos metabolitos secundarios con 74

propiedades farmacológicas más relevantes y luego, a partir de hemisíntesis, modificarlas agregando determinados radicales con el fin de cambiar, mejorar o prolongar la acción, o bien, eliminar reacciones tóxicas secundarias del compuesto dado (Cañigueral et al., 2003).

Finalmente, este estudio ha permitido identificar la presencia de luteolina por primera vez en esta droga junto con la presencia de otros compuestos ya conocidos, colaborando así en el registro de la composición química de plantas utilizadas por nuestra población y validando el uso en medicina tradicional. Por otro lado, es la primera vez que se reporta la medida de la capacidad de inhibición de radicales libres y grado de toxicidad de esta droga, aumentando así el conocimiento que se tiene acerca de las especies nativas de Chile.

6 Conclusiones

Basados en los resultados obtenidos bajo las condiciones de trabajo se puede concluir que:

 A partir de los ensayos fitoquímicos y de cromatografía de capa fina en placa realizados a

las hojas de este árbol, es posible demostrar la presencia de flavonoides y alcaloides.

 En base a los estudios realizados en cromatografía líquida de alta resolución con

detectores ultravioleta, de arreglo de diodo y de espectrometría de masa, se identificaron

los flavonoides quercetina y luteolina.

 El extracto metanólico de hojas secas de L. sempervirens de 1 mg/ml posee un porcentaje

de inhibición de radicales libres igual a 71,35%

 Mediante el ensayo de toxicidad aguda oral en Artemia salina, es posible afirmar que la

infusión del material vegetal seco de esta especie no es tóxico.

 La infusión preparada desde el material vegetal seco de L. sempervirens usado para el

ensayo de toxicidad aguda oral en ratones de la cepa Rockefeller, no evidencia toxicidad

en el comportamiento de los ratones ni en la observación macroscópica de sus órganos.

Tampoco se observa mortalidad, por lo que la infusión de esta droga no presentaría

toxicidad aguda.

En base a todos estos resultados se puede concluir que el material vegetal de L. sempervirens es inocua, posee actividad antioxidante y una amplia gama de alcaloides y flavonoides.

Con la identificación de luteolina y quercetina, ambos flavonoides que han mostrado importantes propiedades farmacológicas, es necesario realizar estudios para demostrar la calidad, seguridad y eficacia de la droga de esta especie al ser administrada como infusión, para validar su uso como fitofármaco en la medicina tradicional. 77

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Anexos.

Anexo 1: Clasificación del grado de toxicidad en el método de toxicidad aguda en nauplios de

Artemia salina (Fernández-Calienes et al, 2009).

Clasificación Concentración (ppm)

Extremadamente tóxico CL50< 10

Muy tóxico 10< CL50 <100

Moderadamente tóxico 100< CL50 <1000

No tóxico CL50> 1000

Anexo 2: Resumen de mililitros administrados del infusión de L. sempervirens a cada uno de los ratones sometidos al ensayo de toxicidad aguda oral.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4: CONTROL.

N° de Peso Dosis N° de Peso Dosis N° de Peso Dosis N° de Peso Dosis ratón (g) (ml) ratón (g) (ml) ratón (g) (ml) ratón (g) (ml)

1 40,8 0,44 6 36,4 0,78 11 36,6 1,56 16 38,9 0,4

2 32,8 0,35 7 38,4 0,82 12 37,1 1,58 17 45,6 0,4

3 41,8 0,45 8 33,4 0,71 13 41,8 1,78 - - -

4 36,3 0,39 9 38,5 0,82 14 33,0 1,42 - - -

5 35,5 0,38 10 33,3 0,71 15 33,9 1,45 - - -

Anexo 3: Clasificación del grado de toxicidad en el método de toxicidad aguda oral usando ratones (Repetto, 1997).

Clasificación Concentración (mg/Kg)

Muy tóxica DL50 < 25

Tóxica 25 < DL50 < 250

Nociva 250 < DL50 < 2000

Sin toxicidad aguda DL50> 5000

Anexo 4: Pautas de observación de las conductas cada uno de los ratones sometidos al método

“up and down”.

Pauta de observación Animal N°: 1 Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 1600 mg/Kg Peso: 40,8 gramos mL teórico: 0,4352 mL Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 mL Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 enderezamiento Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 87

Pauta de observación Animal N°: 2 Concentración: 0,15 g/mL Fecha: 17 noviembre 2010 Dosis: 1600 mg/Kg Peso: 32,80 gramos mL teórico: 0,3500 mL Sexo: masculino mL administrados: 0,4 mL Extracto: Laurelia sempervirens Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 3 Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 1600 mg/Kg Peso: 41,80 gramos mL teórico: 0,4459 mL Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 mL Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 88

Pauta de observación Animal N°: 4

Fecha: 30 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 1600 mg/Kg Peso: 36,3 gramos mL teórico: 0,3872 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 mL Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 5

Fecha: 30 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 1600 mg/Kg Peso: 35,5 gramos mL teórico: 0,3787 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 mL Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 89

Pauta de observación Animal N°: 6

Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 3200 mg/Kg Peso: 36,4 gramos mL teórico: 0,7765 mL Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,8 mL Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 7

Concentración: 0,15 g/mL Fecha: 17 noviembre 2010 Dosis: 3200 mg/Kg Sexo: masculino mL teórico: 0,8192 mL Peso: 38,4 gramos mL administrados: 0,8 mL Extracto: Laurelia sempervirens Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 90

Pauta de observación Animal N°: 8

Concentración: 0,15 g/mL Fecha: 17 noviembre 2010 Dosis: 3200 mg/Kg Sexo: masculino mL teórico: 0,7125 Peso: 33,4 gramos mL administrados: 0,7 Extracto: Laurelia sempervirens Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 9

Fecha: 30 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 3200 mg/Kg Peso: 38,5 gramos mL teórico: 0,8213 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,8 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + + + + + + + Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 91

Pauta de observación Animal N°: 10

Fecha: 30 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 3200 mg/kg Peso: 33,3 gramos mL teórico: 0,7104 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,7 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + + + + + + + Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 11

Concentración: 0,15 g/mL Fecha: 17 noviembre 2010 Dosis: 6400 mg/Kg Sexo: masculino mL teórico: 1,5616 Peso: 36,6 gramos mL administrados: 1,6 Extracto: Laurelia sempervirens Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 92

Pauta de observación Animal N°: 12

Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 6400 mg/Kg Peso: 37,10 gramos mL teórico: 1,5829 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 1,6 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 13

Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 6400 mg/Kg Peso: 41,80 gramos mL teórico: 1,7835 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 1,8 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 14

Concentración: 0,15 g/mL Fecha: 30 noviembre 2010 Dosis: 6400 mg/Kg Sexo: masculino mL teórico: 1,4208 Peso: 33,0 gramos mL administrados: 1,4 Extracto: Laurelia sempervirens Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + + + 0 0 0 0 Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 15

Fecha: 30 de noviembre 2010 Concentración: 0,15 g/mL Sexo: masculino Dosis: 6400 mg/Kg Peso: 33,9 gramos mL teórico: 1,4464 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 1,4 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d Disminución actividad motora + + + + + + 0 0 0 0 Aumento de actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 94

Pauta de observación Animal N°: 16

Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: ---- Sexo: masculino Dosis: ---- Peso: 38,9 gramos mL teórico: 0,4 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad

Pauta de observación Animal N°: 17

Fecha: 17 noviembre 2010 Concentración: --- Sexo: masculino Dosis: --- Peso: 45,6 gramos mL teórico: 0,4 Extracto: Laurelia sempervirens mL administrados: 0,4 Tiempo post administración 10min 30min 1h 6h 10h 24h 2d 3d 4d 5d 6d 7d Disminución actividad motora 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aumento de actividad motora + + 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Perdida de reflejo de enderezamiento 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas pálidas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Mucosas cianóticas 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Erección de la cola 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pilo erección 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Diarrea 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pasivo + + + + + + + + + + + + Agresivo 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 O = No hay presencia de la actividad + = Presencia moderada de la actividad ++ = Presencia de la actividad 95

Anexo 5: Pauta de necropsia de ratones.

Pauta necropsia ratón número 1

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los controles Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 2 Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los controles Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal 96

Pauta de necropsia ratón número: 3

Pauta de necropsia ratón número: 4 Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los controles Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 5 Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los controles Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 6 Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 1600 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 7 Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 1600 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 8

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 1600 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 9

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 1600 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 10

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 1600 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

100

Pauta de necropsia ratón número: 11

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 3200 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 12

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 3200 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

101

Pauta de necropsia ratón número: 13

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 3200 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 14

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 3200 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

102

Pauta de necropsia ratón número: 15

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No No - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No Si Tamaño aumentado comparado a los con dosis igual a 3200 mg/Kg Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No No - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

Pauta de necropsia ratón número: 16

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No - - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No - -

Bazo Normal Petequia hemorrágica Atrofiado Tamaño aumentado Comentario Si No No - - Pulmones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Riñones Normal Petequia hemorrágica Comentario Si No - Pared peritoneal Comentario: Su aspecto era normal

103

Pauta de necropsia ratón número: 17

Corazón Normal Detenido Latiendo Tamaño aumentado Comentario Si Si No - - Hígado Normal Petequia hemorrágica Tamaño aumentado Comentario Si No - -

104

Anexo 6: Registro de pesos de ratones usados en el ensayo de toxicidad aguda oral.

N° Extracto Dosis Peso (g) Peso (g) Peso (g) Peso (g) ∆ P Promedio ratón mg/Kg día 1 día 3 día 5 día 7 peso

1 L. sempervirens 1600 40,8 37,8 40,6 42,2 1,4 40,35

2 L. sempervirens 1600 32,8 29,8 31,5 33,7 0,9 31,95

3 L. sempervirens 1600 41,8 37,6 39,2 41,2 0,6 39,95

4 L. sempervirens 1600 36,3 33,8 38,9 - 2,6 36,33

5 L. sempervirens 1600 35,5 31,1 34,6 - 0,9 33,73

6 L. sempervirens 3200 36,4 35,2 37,0 41,0 4,6 37,40

7 L. sempervirens 3200 38,4 38,5 36,4 41,0 2,6 38,58

8 L. sempervirens 3200 33,4 33,8 34,1 36,3 2,9 34,40

9 L. sempervirens 3200 38,5 39,8 39,6 - 1,1 39,30

10 L. sempervirens 3200 33,3 34,5 35,4 - 2,1 34,40

11 L. sempervirens 6400 36,6 34,5 33,9 35,7 0,9 35,18

12 L. sempervirens 6400 37,1 34,6 34,5 38,0 0,9 36,05

13 L. sempervirens 6400 41,8 39,8 39,5 43,1 1,3 41,05

14 L. sempervirens 6400 33,0 34,6 35,0 - 2 34,20

15 L. sempervirens 6400 33,9 35,9 35,2 - 1,3 35,00

16 Agua - 38,9 36,2 35,4 38,0 0,9 37,13

17 Agua - 45,6 44,6 46,5 44,9 0,7 45,40

∆ P: diferencia de peso